Biología molecular de la célula - 3a edición

El codigo genetico 2.' posicion

1." poslcl6n 18Xtremo 5'1

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AmlnOlicidos y SUS sfmbolos

Codones

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-

BIOLOGIA MOLECULAR DE

LA

-

ELULA TERCERA EDICION

Bruce Alberts. Dennis Bray Julian Lewis • Martin Raff Keith Roberts. James D. Watson Traduddo poT

Meree Durforl i Call Catednltica de Biologfa Celular Animal y Vegetal de la Facultad de Biologfa de 1a Universidad de Barcelona

Miquel Llobera i Sande Catedriitico de Bioquimica y Bialag!a Molecular de Iii Facultad de Biologfa

de 1a Universidad de Barcelona

EDICIONES OMEGA, S.A. Plal6. 26 • 08006 Barcelona

BruceAlberlses DoclOr (Ph.D.) par la Universidad de Harvard y actualmente es Presidente de la National Academy of SCiences y Profesor de Bioqufmica y Bioffsica en la Universidad de California, San Francisco. Denllis Brayes Doctor (Ph.D.) por el Massachusetts Institute ofTechnology y actualmente esta becado por el Medical Research Council en el Departamento de Zoologia de la Universidad de Cambridge. Julian Lewis es Doctor (D.Phil.) por la Universidad de Oxford y actualmente es Senior Scientist en la Imperial Cancer Research Fund Developmental Biology Unit, de la Universidad de Oxford. Marti" Raffes Doctor (M.D.) por la Universidad de McGill y actualmente es Profesor del MRC Laboratory for Molecular Cell Biology y del Biology Department University College de Londres. Keith Roberlses Doctor (Ph.D.) por la Universidad de Cambridge y actualmente es Director del Depanmem ofCel! Biology del John Innes Institute de Norwich. James D. Watson es DoclOr (Ph.D.) por la Universidad de Indiana y actualmente es Director del Cold Spring Harbor Laboratory. Es autorde Molecular Biologyo[tlleGe/ley, con Francis Crick y Maurice Wilkins, recibi6 el Premio Nobel de Medicina y Fisiologfa en 1962.

En la traducci6n han colaborado: Ora. M. Gracia Bozzo, Ora. Roser Pagan, Ora. Montserrat Poquet. Dr. Manuel Reina, Dr. Josep Valero y Dr. Sen~n Vilar6.

Quedan rigurosamente prohibidas. sin la autorizaci6n escrita de los titulares del "Copyright", bajo las sanciones establecidas en las leyes, la reproducci6n total 0 parcial de esta obra por cualquier medio 0 procedimiento, cornprendidos la reprograffa y el tralamiemo informatlco, y la distribuci6n de ejemplares de ella mediante alquiJer o prestamo publicos, asf como la exportaci6n e importaci6n de esos cjcmplares para su distribuci6n en vema, fuera del ambito de la Comunidad Econ6mica Europea. Aul.horized translation from English language edition published by Garland Publishing. Inc. MOLECULAR BIOLOGY OF THB CEll

CI993. 1989. 1994 by BruceAlbens, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts and James D. Watson y para la edici6n espanola CI996 EdicionesOmega. SA, Barcelona ISBN 84-282-101 I-X DepOsito legal B. 23.553-96 Printed in Spain Lnd. GrM. Ferr~ Olsina, SA - VlIadomat, 158-160 int. -08015 Barcelona

Cublcrta antcrlor: III fOlograffa muestra una libra nerviosa de rala en cultlvo. Estl!. marcada con un nuorocromo asociado a un anticuerpo que reconoce el soma celular y las prolongaciones dendrftkas de la cl!lulll (amarillo). Los tenninales nerviosos (verde) de Olras neuronas (no visibles) que han eslablecido sinapsis con la celula eslan marcados con un anlicuerpo direrente. (Por conesra de Olar Mundigl y Piclro de Camilli.) Cubicna poslerior-Ios aUIOTeS, en orden alrabetico. alravesando Abbey Road en Londres, yendo a comer. La mayor parte de esla lercera edid6n Sf ha escrito en una casa situada en el lingulo de la imagen. (FotografJa de Richard Olivier.) Dedkalorla: Gavin Borden, Ultimo presidente de Garland Publishing. cunido durante Ia ascensi6n cerca del Mount McKinley. a mediadosde 1980, oon Bruce Alberts, autorde ~8iologra Molecu1ardc La celula~ y el ramoso gufa de montatla Mugs Stwnp (1940-1992).

fndice general Caracterlsticas especiales fndice de materias Agradecimientos Nota allector Nota de Los traductores

i ,

xv xvii xxxix xliii

xlv

PARTE

Introducci6n a la celuia 1. La evoluci6n de la celula

2. Pequefias moleculas, energia y biosintesis 3. Macromoleculas: estructura, forma e informaci6n 4. C6mo se estudian las celulas

3 43 93 147

PARTE

Genetica molecular 5. Funci6n de las proteinas 6. Mecanismos geneticos basicos 7. Tecnologia del DNA recombinante 8. El nueleo celular 9. EI control de la expresi6n genica

207 237 313 359 429

509

,

Glosario fndice alfabetico

III

541 589 641 697 771 843 925 977

PARTE

Las celulas en su contexto social 19. Adhesi6n celular, uniones celulares y matriz extracelular 20. Celulas germinaJes y fecundaci6n 21. Mecanismos celulares del desarrollo 22. Celulas diferenciadas y conservaci6n de los tejidos 23. EI sistema inmunitario 24. Cancer

II

PARTE

Organizaci6n interna de la celuia 10. Estructura de la membrana 11. T'ransporte de mohkuJas pequeflas a traves de la membrana y base i6nica de la excitabilidad de la membrana 12. Compartimientos intracelulares y clasificaci6n de proteinas 13. Tea-fico vesicular mediante las rutas secretora yendocftica 14. Conversi6n energetica: mitocondrias y cloroplastos 15. Transmisi6n de seflales entre celulas 16. EI citoesqueleto 17. El cicio de divisi6n celular 18. Los mecanismos de la divisi6n celular

I

1017 1083

IV

Illl

1219 1279 1345 G-l 1- J

xiii

Caracteristicas especiales Panel I-I

C£luJas eucariotas: esquema de sus principales organulos

18-19

Panel 1-2

Modelos celu.lares y tejidos con los que estan construidas las plantas 5uperiores

30-31

Panel 1-3

Algunos de los diferentes lipos de celuJas existeOles en el cuerpo de un vertebrado

36-39

Tabla 2-1

Composici6n quImica aproximada de una ceJula bacleriana

Panel 2-1

45

Propiedades qufmicas del agua y su influencia sabre el componamienlo de las moleculas biol6gicas

50-51

Panel 2-2

Enlaces y grupos qufmicos frecuentes en las moleculas biol6gicas

52-53

Panel 2-3

Algunos de los tipos de azucares encontrados habituaJrnente en las celulas

54-55

Panel 2-4

Algunos de los tipos de acidos grasos encontrados hahirualmente en las celulas y las eslructuras que (annan

56-57

Panel 2-5

Los 20 aminoa.cidos que inlervienen en la sfnlesis de las prole[nas

58-59

Pane12-6

Resumen de los principales tipos de nucle6tidos y sus derivados existentes en las celuJas

6l>-61

Tabla 3-1

Composici6n quimica aproximada de una bacteria tfpica y de una oolula de mamffero tipica

94

Tabla 3-2

Enlaces qufmicos covalemes y no covalentes

95

Panel 3-1

Principales tipos de fuerzas no covalentes d~biles que unen las moleculas entre sf

Tabla 3-3

La relacion entre las diferencias de energfa libre y las conSlantes de equiHbrio

Panel 3-2

Estructuras del DNA y del RNA

Tabla 1J-I

Comparacion de las conccmraciones i6nicas en cl interior y el exterior de una c~lula de mamffero

542

Equilibrio del agua intracelular: el problema y su soluci6n

552

,

Panel 11-1

96-97 101

104-105

Panel 11-2 Deduction de la ecuaci6n de Nernst

562

Panel 11-3 Algunos experimentos c1asicos realizados en el axon gigante del caJamar

568

Tabla 12-1

Volumenes relativos ocupados por los principales compartimientos intracelulares en una celula hepatica tipica (hepatocito)

Tabla 12-2 Cantidades relativas de tipos de membrana en dos cclulas eucariotas

591 591

Panel 12-1

Estudio de las secuencias sefial y de la translocaci6n de protefnas a traves de membranas

Panel 13-1

Estrategias utiJizadas para estudiar los mecanismos moleculares implicados en el transporte vesicular

682-683

Panel 14-1

Energfa libre y reacciones biol6gicas

714-715

Panel 16-1

Polimerizacion de la actina y la tubuJina

682-883

Panel 18-1

los seis estadios de la division celular

982-983

Pane121-1

Revisi6n de genetica chisica

Panel 21-2 Caracterfsticas generales del desarrollo temprano de las plantas con nares CapftuJo 22 A~ndice CatAlogo de las c~luJas del cuerpo humano aduho

598

1148-1149 1189

1271-1274

xv

.

Indice de materias

II

Parte

Introducci6n a la celula

Capitulo

La evolucl6n de la celula Desde lIu moiecuJas huea la prlmet'a (;t!Jula Eo condiciones prebi6ticas se pueden formar mol~ulas biol6gicas Pueden desllrrolJarse sistemas qufmicos complejo! en un enlomo lllejado de su equilibria qufmico

Los polinucle6tidos son capaces de dirigir su propia sllllesis Las molkulas aUlorrepLicantes esllin somelidas II III selecci6n natural A1gunas mollkulas espedalizadas de RNA pueden catalizar reacciones bioqufmicas La informad6n Ollyc desde los polinucle6lidos a los polipeplidos las membranas definieron la primera relula Todas las relulas aetuales utillzan el ON.... como material hereditario Resumen De los procarlolas a los ellcorlola! Las cl!lulas procariotas son estructuralmenlc simples pero bioqulmicamente diversas Las reacciones metab6licas evolucionan Comparando secuencias de DNA se pueden dcducir relaciones evolutivas Las cianobaeterias pueden fijar CO, y N, Las baeterias pueden realizar la oxidaci6n aerdbica de las moleculas nutritivas Las c~lulas eucariOias poseen varios orgJinulos caracterfsticos Las c~lulas eucariOlas dependen de las rnitocondrias para su rnetaboJismo oxldatlvo Los cloroplaslos son descendlenles de una celula procariola incorporada

,

, , 6 7 8

8 10

1 Las dlulas eucariOlas conrienen una rica dOlaci6n de membranas internas Las celulas eucariotas tienen un citoesqueleto Entre los prolOzoos se encuentran las cclulas mas compleJas conocldliS En las celulas eucariotas el material genctico esta empaquetado de fonna compleja Resllmen De las tt1ulas simples a los organlsmos plurk:elulares Las celulas se pueden asociar formando colonias

'"

25 25 26 27

27 28

21

Las dlulas de un organismo superior se especializan ycooperan La organizaci6n pluricelular depende de la cohesi6n enlre las dlulas L.1S capas de dlulas epiteliales envuelven un medio lnterno prolegldo La comunicaci6n cClula·celula controla es esquema espacial de los organismos pluricelulares La memoria celular permile el desarrollo de palrones complejos Los programas b4sicos de desarrollo tienden a ser conservados en Ia evolucidn Las cclulas somaticas del cuerpo de los venebrados mueslran m4s de 200 lipos diferentcs de cspecJalizaci6n Los genes pueden ser activados y desaclivados Comparaciones entre secuencias revelan celllenares de familias de genes 110111610gos Resumen

22

81bllograffa

43 43 45 46 47 48 49 62

las ~lulas oblienen energfa mediante la oxidaci6n de mol&:u1as biol6gicas La dcgradaci6n de una molecula organica se reali:w a trav~s de una secuencia de reacciones catallUldas enzimll.ticamenle Parle de la energfa liberada en las reacciones de oxidaci6n se acopla a la reacd6n de formaci6n de ATP La hidr6lisis del ATP genera orden en las clHulas Resumen

62

FJ allmenlo y la obtenckSn de la energfa celular 69 Las moleculas alimentidas son degradadas en Ires etapas para producir ATP 69 La g1ucolisis puede producir ATP incluso en ausencia de oxfgeno 70 EI NADH es elintermediario central ell el catabolismo oxldativo 73

11 12 12 12

l' 15

16 17

2<J

29

32 32 33

34 34 36 37 37

'1 '1

Pequeiias moleculas, energia y sfntesis Los componenlCS qulinkos de una dlula

La qufmica celular se basa en los compueslos de carbono Las cclulas ulllizan cuatro ripos Msiros de molcculas pequel'ias Los aztlcarcs son las moiccuilis alimenticilis de III celula Los acidos grasos son componellles de las membranas celulares Los amlno4cldos son las subunldades de las prOlefnas Los nucle6lidos son las subunidades del DNA y del RNA Resumen

Orden biokSgk:oyenergta El orden bioldgico resuha posible gTllcias a la Iibcrad6n de energfa calorffica por parte de las celu1as Los organismos fOiosintetizadores ulilizan la luz solar para slnletizar compuestos organicos La energ(a qufmica pasa de las plantas a los anlmales

63 63 64

65

66 66 67 69

xvii

74

Los~Irmeros biol6gicos se sinletlzan mediante la repeticiOn

aJ oldgeno impulsa la formaciOn de ATP Los aminoacidos y los nucle6tidos forman pane del cicio del N

75 16

Resumen

Resumen

n n

EI metabolismo esta dominado por el cicio del acido cltrico

e reacelones elemenlales de deshidratadOn

En la fosfonlaciOn oxidatlva, la lransferencia de eleclrones

U b50s£ntesls YI. cread6n de orden El cambio de eneTgfa Iibre de una reaa:kSn determlna sl bla puede producirse 0 no A menudo las reacdones de bios{nlesis eslan acopladas dlrectamente a la hldr6tisis del ATP Las coenzimas inlervienen en la lransferencia de delenninados grupos quImicos La estruetura de las coenzimas sugiere que se formaron en un mundo de RNA La biosfntesls neceslta poder reductor

n 78

80

CoordlnackSn entre calaboUsmo y bk>5fnlesls El melabolismo esla organizado y regulado Las vias metab6licas eslan reguladas a lraves de cambios de la actlvidad enzimatica Las reacdones catab6licas pueden revertirse mediante un apone de energl'a Las enzimas pueden activarse e inhibirse mediante modificaciones covalenles Las reacciones eslan companimenladas, lanto dentro de las c~lulas como dentro de los organismos

87 89 89 91

82

Blbllografia

91

93

Resumen

102

Addoanudclcos Los genes estlin fonnados por DNA Las mol~culas de DNA consisten en dos largas cadenas unidas por pares de bases complementarlas La estructura del DNA proporclona una explicacl6n del proceso de la herenda Los errores en el proceso de replicaci6n del DNA generan mUlaclones La secuencia de nucle6tidos de un gen delermina [a secuencia de aminoaddos de una Ilrolelna Portiones de la secuencla de DNA se copian en mollkulas de RNA para gular la sfnlesis de protelnas Las moll!culas de RNA de eucariolas son conadas y recombinadas, eliminandose secuencias intron Las secuencias de nucle6tidos del mRNA son Mleldas~ en grupos de Ires y traducidas a aminoaddos Las moll!culas de !RNA emparejan los aminoicidos con los grupos de nucle6tidos El mensaje de RNA se lee de un enremo al otro por un ribosoma A1gunas molecu.las de RNA acruan como C81aJizadores

102 102

Resumen

116

Esuuctun de lu prolefnas La fonna de una molecula proteica estll. detennlnada por

I 16

la secuencia de sus aminOlicidos Diferentes cadenas proteicas presentan esquemas de plegamiento 19uales Las prolefnas son mol~ulas asombrosamente vers4tiles Las protefnas presentan diferentes nlveles de organlzaclOn eSlructuraJ

116

(ndlce de materias

B6

Resllmen

Las interacclones especfficas de una macromolecula dependen de enlaces d~biles no covalentes 94 Una h~lice es un motivo estruetwal comun en las estrueturas biol6gicas generadas a partir de subunidades repelidas 99 La dlfusiOn es el primer paso hacia el reconoclmiento molecular 99 Los movimientos t~nnicos unen a las moiKulas y luego las separan 99 La constante de equilibria constiluye una medida de la !uen.a de interacdOn entre dos moll!culas 100 Los 'lomos y las molKulas se mueven mpidamente 101 Los proccsos de reconocimienlo molecular nunea pueden ser perfectos 101

xviii

B6 B6

81

MacromolecuIas: estructura, forma e informaci6n ProcesoI de reconoclmlento molecular

84 84

103

106 108 108 109 110 111

III

ll2 113

119 120 122

Capffulo

S

Los dominios est4n formadas par cadenas pollpeptldicas que se pUegan adelante y atrlis. generando delgadas clrcunvoludones en la superflcle de la protefna De entre la gran cantidad de cadenas polipeptldicas posibles. unicamente un nUmero relalivamenle pequeno de elias lIegaria a ser util Normalmenle las nuevas prolelnas se desarrollan por aJ{eraciones menores de prolelnas antiguas Las nuevas prOlefnas pueden desarrollarse por recomblnaci6n de dominios polipeptfdicos preexistentes Las homologlas estruetwales pueden contnbuir en la asignaciOn de !undones a las prOlefnas descubienas recientemente Las subunidades proteicas pueden ensamblarse fonnando grandeseslrucluras Un solo [ipo de subunldad proleiea puede interacdonar consigo misma fonnando agregados geom~lricos regulares A menudo las prOlefnas superenrolladas colaboran en la conslrucdOn de grandes estruCIUras en las c~lulas Las proternas pueden ensamblarse rommndo laminas, tubos 0 esferas Muchas estructuras celulares son capaces de aUloensamblarse No todas las estructuras biol6g1cas se forman por autoensamblaje

124

125

125 127

129

130 130 131 132 132

RC$ll/llcll

134 135

Las proteCnas como cataJlzadores

135

La confomlaciOn de una proterna determlna sus propiedades qurmicas El primer paso de la call1.lisis enzimll.tica es la uniOn del substrato Las enzimas aceleran las reacciones estabtlizando delenninados eslados de transickSn Las enzimas pueden facililar Ia fonnaci6n y Ia rorura de enlaces covalenles a uav& de una calaIisis adda y b4siea simultanea Ademlis, las enzimas pueden incrementar las velocidades de reacciOn fonnando enlaces covalentes Intennedios con sus subslralos las enzimas aceleran las reacciones qufmicas pero no pueden hacerlas energ~tieamelllem's favorables l.as en7Jmas pueden delenninar el senlido de una vfa acoplando detenninadas reacciones a la hidrOlisis del ATP Los complejos multienzimliticos ayudon a Incrementar la velocldad del metabolismo celular

135 137

138

139

140 140 141

Resumen

14 J 142

Blhllografia

143

C6mo se estudian las «Hulas Obscrvacl6n de la estructura de las celulas con el mlcroscoplo EI microscopio 6ptico puedc resolver detalles si/uados 1I O,21.lffi de distancia Para la observati6n microsc6pica, normalmcnte los tejldas son fijados y seccionados

147 149

150

Los diferentes componentes de la cc!lula pueden sec lenidos

selectivamente

151

Mediante la microsc:;opia de tluorescencia se pueden localizar

mo1E!culas cIllas celulas de forma especlfica Las celuJas vivas se pueden observar con nitldez en

152 Wl

microscopio de contraste de fases 0 de contcaste de fases interferencial Mediamc lecnicas elcctronieas [as im<1genes PUedCIl seT amplificadas yanalizadas Gracias aJ microscopio de barrido confocal es posible

153 154

abtencr imil.genes de complejos objetos

tridimensionales El microscopio electr6nico resuelve la estruclura tina de la cl!lula Para poder ser estudiadas al microscopio electr6nico, las muestras biol6gicas requieren una preparaci6n especial Mediante la microscopia electr6niea de barrido se pueden obtener imagenes tridimensionales EI sombreado metalleo permile el examen a alta resoluci6n de delalles superficiales, mediante el microseopio electr6nieo de transmisi6n La mieroscopia electr6nica de criofraetura y la de grabado por eongelaci6n proporeionan una nueva visi6n del interior celular La tinci6n negatlva y la microscopia crioeleetr6nica permlten observar macromoMculas a alta resoluci6n

Resumen Aisiamento ycrecimlenlo de celulas en cuilivo Las celulas de un tejido pueden ser aisladas y separadas en diversos tipos eelulares Las eelulas pueden eultivarse en una plaea de cultivo Los medios definidos qufmicamellle, libres de suero, permiten la identifieaci6n de factores de erecimienlo especffieos Las Hneas eelulares eucariOias constituyen una fuente ampliamente utilizada para la oblenci6n de celulas homogeneas Las celulas pueden fusionarse formando ctHulas hJbridas Resumen

155 157

159 161

162 162 163 165

166 166

167 168

169 170

172

Fracdonamlenlo de las celuJas y anBJlsls de sus molllkuJas Los organulos y las macromoleculas pueden separarse por ultracentrifugaei6n Los detalles moleculares de los procesos celulares complejos unicamente se pueden descifrar en sistemas libres de celulas Las protefnas pueden separase mediante cromatograffa Mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SOS pueden determinarse el tamano y la composicl6n de subunidades de una prOlefna Mediante electroforesis bidimensional sobre gel de pollacrilamida, se pueden resolver mas de 1000 protefnas sobre un mismo gel La hidr6lisis seleetiva de una proteina genera un conjunto caracterfstico de fragmentos peptfdicos Mediante maquinas automatizadas pueden analizarse secuencias cortas de aminoacidos La difracci6n de rayos X por cristales de prOlefna puede revelar la eS!nlctura exacta de una protema Tambien se puede determinar la estructura molecular utiJizando espectroscopia de resonancia magnetica nuclear (NMR) Resumen

I (

172

174 176

179 lei 183

184 185

186 187

Sigulendo el rastro y cuantLOeando las molllkulu del Interior de las celulas Los atomos radiactivos pueden ser deteetados con una gran sensibilidad Los radiois6topos se utiJizan para marcar las moMculas en las celulas y en los organismos y seguirles la pisla Las concentraciones de los iones se pueden medir mediante electrodos intracelulares Los cambios nl.pldos en las concentraciones i6nicas intracelulares se pueden medir mediante indicadores emisores de luz Existen diferentes sistemas que permiten introducir moleculas en una et'ilula para las que la membrana cclular sea impermeable La activaci6n inducida por la luz de molllkulas precursoras "empaquetadas" facilita el estudio de la dinamica intracelular se pueden utiJizar anticuerpos para deteclar y aislar molt'iculas determinadas Las lineas celulares de hibridomas constiluyen una fucnte pemlanente de anricuerpos monoclonales Resumen

199 201

BlbJlograffa

201

189

189 190 191

193

194 197 197

Parte

Genetica molecular l

172

II

Funci6n de las proteinas Las prote£nas como

maquinas

207

La uni6n de un ligando puede cambiar la conformaci6n

de una protefna Amenudo cuando dos ligandos se unen a la misma proterna, cada uno de ellos afecta la uni6n del otro Dos ligandos cuyos lugares de uni6n estan acoplados pucden afectar reciprocamente uno la uni6n del otto

fndice de materlas

208 209

210

Las transiciones alostericas colaboran en la regulaci6n del melabolismo Amenudo las prote(nas forman agregados slmetricos que sufren transiciones alostericas eooperalivas La transici6n alostt'irlca de la aspartato transcarbamilasa se conoce a nivel at6mico

210

212 212

xJx

La fosforilaci6n de prolefnas es un mecanismo para

dirigir transiciones alost~ricas en las c~lulas eucariotas Una c~lula eucariota coOlielle muchas prote(lla quinasas y fosratasas La eslruetura de la prOlefna quinasa Cdk mueslra de qu~ fonna una pr01eflla puede aetuar como un microchip Las prOlefnas que unen e hidrolizan GrP son reguladores celulares ubicuos Otras protefnas controlan la actividad de las protefnas que unenGTP, dClerminandosise ulleGDPo GTP La transici6n alost~rica de la proteilla EF-Tu nlUCSlra de que mancra pequc~as moh!culas pueden generar grandes movimientos Protefnas que hldroli7.an ATP realizan trabajo mecdnico en las celulas La estruCtura de la mlosina revela de que forma los muscuJos generan fuerza Protefnas alost~ricas unidas a membrana y dirigidas por ATP puedell actuarcomo bombas i61licas 0 trabajar en sentido inverso, sintetizando ATP las transiciolles alostericas acopladas energ~ticamente penniten a las protefnas actuar como motores, como relotes, como factores de ensambla}e 0 como transductores de infonnaci6n

214

A menudo las protefnas fonnan grandes complejos que aetuan como mdquinas proteicas

225

Resumen

225

Nacimiento, ensamblaje y muerte de las protefnas Se cree que las protefnas se pliegan a tram de un intennediario globular fundido Las chaperonas moleculares facilhan el plegamiento de las protefnas Muchas protelnas contienen series de moleculas plegadas de forma Independleme Los m6dulos confleren versatilidad y a menudo median las interacciones protelna-protefna Las prolclnas puedcn unirse unas a otras a trawls de diferentes lipas de inlenases La conexi6n y la proteolisis selecliva aseguran los ensamblajes del tipo todo 0 nada La proloolisis dependiente de ubiquitina es la responsable principal del recambio proteico selectivo en los eucariotas La vida media de una protefna puede ser detenninada por enzimas que alteran su extremo N

2.2fi

215 216 218 219

219 221 222

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224

229 230 231 231 232

234 235

BlbUografia

23S

capftulo

6

S(ntesls de RNA y de protefnas La RNA potimerasa copia el DNA a RNA: el proceso de la transcripd6n del DNA SOlo se utilizan zonas scleccionadas de un cromosoma para producir moleculas de RNA las moleculas de RNA de rransferencia actuan como adaptadores que traducen secuellcias de nude6tidos a secuencias de prote[na Unas delenninadas enzimas acoplan cada aminrnicido con su molb;ula aproplada de tRNA Los aminodcidos se van anadiendo al extremo carboxilo terminal de una cadena polipeptfdica en crecimiento EI c6digo genetioo es degenerado Los acontecimientos de la sfntesis proteica estdn catalizados sobre 1.'1 ribosoma El ribosoma se desplaza, paso a paso, a 10 largo de la cadena de mRNA Cuando 51.' a1canza uno de los tIes tipos de cod6n de lenninaci6n, la cadena proteica se tibera del ribosoma F.J proceso de iniciaci6n establece la paula de lcetum para la s[ntesis proteica En celulas eucariotas, normal mente 5610 se sintetiza un tipo de cadena polipeptldica sobre cada molecula de mRNA La unk'in de \'llrios ribosomas a una misma molecula de mRNA genera polirribosomas En los eucariotas. la yelocldad general de s[ntesis de protemas csta controlada por factores de Iniciaci6n La fidelidad de la s!ntesis de protemas estd incrementada gracias ados procesos independientcs de correcci6n de galeradas Muchos inhibidores de la s[ntesis de protcfnas en procariotas resultan utiles como antibi6ticos lC6rno c\'OIucion6 eI proceso de la s!ntesis de prolefnas?

237

Resumen

257

La mayor!a de mUlaclones de las proternas resultan perjudicialcs y son ellminadas por selecd6n natural I'ara que exista la vida tal como la conocemos, es necesario que se den estas bajas frecuencias de mutaci6n EI hceho de que las frecuencias de mutaci6n sean bajas signilica que los organismos relacionados han de estar fomtados esencialmente por las mismas protefnas Si no fueran corregidas, las alteradones esponntneas del DNA podrian cambiar rapidamente las secuencias del DNA La estabilidad de los genes depende de La reparaci6n del DNA Las alteraclones del DNA pueden ser e1lminadas por mds de una vla Las celuJas pueden producirenzimas de reparaci6n de DNA en respuesta a las alteraciones del DNA La eSlructura y las propiedades qulmicas de la doble heUce del DNA hacen que sea facil de reparar

266

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Resumen

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249

Mecanlsmos de replkacl6n del DNA Tal como ocurre para 1.'1 proceso de rCI>araci6n del DNA, el fundamento del proceso de replicaci6n es el apareamiento de bases La horquilla de replicaci6n del DNA es asim~trica El elevado grado de fidelidad del mecanlsmo de replicaci6n del DNA requlere la eristenda de una meeanismo de ~correcci6n de galeradas5610 la replicacl6n del DNA en direcci6n 5' a 3' pennite la existencia de un eficieme procesos de correcd6n deerrores Una enzima especial que polimeriza nucle6tidos sinletiza conas moleculas cebadoras de RNA sobre la cadena relTasada Vnas protelnas especiales ayudan a abrlr la doble Mllee del DNA por delante de la horquilla de replicaci6n Una moh!cula de DNA polimerasa m6v11 se mallliene unida al DNA mediante un alllllo deslizante En la horquilla de replicati6n. una serie de proternas cooperan entre sl fonnando una -mdquina de replicaci6nUn sistema de correcci6n de galeradas que e1imina los errorell de replicaci6n producidos por la m4quina de repUcaci6n

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254 254 255 257

Meeanlsmos de reparacl6n del DNA 258 Las secuencias de DNA 51.' mantienen con un elevado grado de fidelidad 258 Las frecuencias de mutaci6n observadas en «Iulas proliferativas son conslstenles con los vaIores evolutivos estimados 259

[ndice de malerias

227

Resumen

Mecanismos geneticos basicos

xx

226

259 260

260 261 263 263

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las horqullJas de replicaclon se inician en el origen las DNA to~olsomerasas cvitan que el DNA se enrede durante a replicacion La replicacion del DNA en los eucariolas es blisicamente similar a la de los procariotas

Resllmen

277

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RecomblnacHSn geneUca La re.;;ombinacion general esla guiada por interacciones de apareamielllO de bases entre cadenas oomplementarias de dos moltkulas homologas de DNA 282 La recomblnacion general puede iniciarse en una muesca de una cadena de la doble helice de DNA 283 Las reacciones de hibridacion del. DNA proporcionan un modelo seneillo para la fase de apareamiento de bases en la recomblnacion general 294 La prOlefna RccA pennite a una molOCula de una sola cadena de DNA aparearse oon una region homologa de una doble helke en E. coli 285 La recombinacidn genelica general habimalmenle mpone lffi intercamblo cruzado de cadenas 0 entrecruzamienlo 287 La oonvenion I¢nk:a SoC produce combinando procesos de recombinadon general y de s(ntesis limitada de DNA 287 Los mecanlsmos de correa:ion de efTOres pueden evilar la recombinadon genetk:a promlscua entre dos secuencias de DNA mal apareadas 288 Enzimas de recombinaclon espedfica de lugar ponen y quitan del genoma secuencias especiales de DNA 289 La recombinacion lransposicional puede insenar un elememo gem!lico movil en cualquier sccuencia de DNA 291

""

Resumen

292

VIrus, phlsmldos yelemcnlos genetlcos transponlbles Los virus son elementos gem!ticos moviles La cubierta eKterior de un virus puede scr una capsidc proteica 0 una envoltura membranosa Los genomas vfrlcos se presentan en una gran variedad de formas vfricas y pueden ser tanto de DNA como de RNA Los cromosomas vfricos codifican enzimas implicadas en la replicaeion de su licido nudeioo Tanto los virus RNA como los virus DNA se replican mediante la formacion de cadenas oomplemcntarias Los virus ulilizan la maquinaria de I..Uioo intracelular de sus ctlulas hul!sped Diferentes virus recubienos geman a panir de diferentes membranas ululares Los cromosomas vfricos pueden integnuse en los eromosomas del huesped La sfntesis continuada de algunas prolefnas vfricas puede transfonnar a las celulas en cancerosas Los \;rus lumorales RNA son relrovirus El virus del SIDA es un retrovirus Algunos elemenlos lransponib1es estan estrc.::hamente relacionados con los retrovirus Otros elementos lransponibles se transfieren directamente a sf mlsmos desde un lugar a otro del gellOma Probablemenle la mayorfa de los virus evolucionaron a pamr de plasmidos

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Resumen

307

Bibllograaa

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Reswllf:1l

I

IHbridacion de dcldos nuclelcos La hibridacion de ~cidos nucleicos proporclona un metodo sensible para la delea:lon de secuencias de!erminadas de nucle6tidos Las lransrerencias Northern y Southern facilitan la hibridaclon oon moltkulas de ~cidos nudeicos separadas elcctrofore!icamenle El an~lisis de los polimorlismos de longitud de los fragmcmos de reslrlccion (RFLP) facUita el aml.l.isis genelioo de los grandes genomas Las moleculas sinteticas de DNA facili!an el diagn6stico prenatal de enfermedades genl!licas La hibridaclon poco rigurosa pennile idenlificar genes relaclonados de fonna indirecta Las lecnicas de hibridaeion in situ penni{en localizar secueneias espedficas de acidos nucleicos en los cromosomas yen las ctlulas

Resumen

(ndiee de materias

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29' 296 297 298 300

301 301 302

30< 305

305

CapftulO

Tecnologfa del DNA recombinante Fragmenl8c16n, scparacl6n y secuenclacl6n de molkulas deDNA Las endonucleasas de reslrlcclon oorlan las moJeculas de DNA en secuencias nucleolldicas espedficas Los mapas de restriccion muestran la distribucion de pequei'ias secuenclas nucleotfdicas a 10 largo del eromosoma Las moltkulas de DNA de diferentes tamai'ios pueden separarse mediante la electroforesis en gel Las moleculas purificadas de DNA pueden ser marcadas ill vitro con radlois6topos 0 con marcadores qufmicos los fragmenlos ;llslados de DNA pueden ser rapldamente secuenclados Las huellas del DNA revelan loslugares donde las protefnas se unen a la molecuta de DNA

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7 314

315 315 317 316 31' 320 322 322

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Cionaje de DNA Se pucde conslruir una llbrerla de DNA utilizando veetores vCricos 0 veclores plasmfdicos Dos lipos de Iibrerfas de DNA cubren diferemes propOsitos Los clones cDNA comienen secuendas codificantes oolllinuas Pueden pre parse librerlas cDNA a partir de poblaciones selecclonadas de mol~ulas de mRNA Para idcntificar los clones de interes en una librerla de DNA pucde utllizarse tanto una sonda DNA como un ensayo para In prote[na expresada La traduccion ill vilro faci!lta la identificaci6n del cIon de DNA correcto La sel(.'Cc!on de clones DNA solapados permite "caminar" sabre el cromosoma hasta un gen vc.::mo de interes Se estdn construyendo librerfas genomicas de clones ordenados para organlsrnos selecclonados El clonaje posiclonal de DNA revela la presencia de genes de funciones imprevistas Mediante una reaccion de polimerizacion en cadena se pueden donar segmemos de DNA en un tubo de ensayo

331 332 333

'"

335 335 337 337 339 340

32<

Resumen

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Ingenlerla de DNA

342

32.

Se pueden constroir moleculas de DNA de cualquier secuencia uniendo fragmentos de DNA

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Es kSible producl~ndescantidades de molecuJ.as de RNA omogeneas m "ante transcription de DNA in vitro

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Utilizando \'eClores de expresion es posible producir grandes cantidades de prolefnas celulares minoritarias Los genes marcadores pennilen analizar la funcwn de 18$ secuencias de DNA reguladoras Los organismos mutanles revelan mejor la funciOn de un gen

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331

343 343 34' 345 345

xxi

Pueden fabricaf5e "a rnedJda" Cl11ulas y organismos que

contengan genes altcrados

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Los genes se puedcn redisei'iar para que produzcan

prote/nas de cualquier sccucncia que se desce HabifUalmeme las prOlefnas de fusi6n son de gran utilidad para anaHzar III funci6n proteka los genes nonnales son r;tcilmente reemplazables pot

mutantes, tanto en bacterias como ell algunos eucariotas inferiores

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Resllmen

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Blbllografl'a

356

361

Regiones distintas del mi5mo cromosoma se replican en diferente momento La cromatina muy condensada se replica lardfamente en la fase S, mienlras que la cromalina activa se replica temprano Las unidades de replicad6n lardfas coinciden con las bandas ficas en A-T en los cromosom3S metaflisicos EI pandn ordenado de aClivaci6n de los orfgenes de replicacl6n puede conlribuir a la memoria de la cl!lula Factores unidos a la cromatina aseguran que cada regi6n del DNA 5610 se replique una~"CZ A medida que el DNA se replica. se van ensamblando nuevas hislonas en la cromatina Los tel6meros son secuencias cortas. repetidas. ricas en G, que se aftaden aI extremo de los cromosomas por acci6n de la telomerasa

Genes desarroUados por ingenlerfa genetica pueden

crear mutaciones dominantes especfficas en los organismos diploides

Genes sometidos II ingenierfll genetica se pueden insenar de forma pemlancnte en III linea genninal de un raldn o de III mosca del vlnagre. produciendo animales nangenicos EI direcclonamlenlO gcnico hace posible ablener ratones trallsgenicos que carecen de delerminados genes Las phullas lransgenicas son imponantes tanto para III biologfa celular como para la agricuhura

El mlcleo celular EI DNA crom0s6mico '/ su ftnpaquelamlenlo <:ada molkula de DNA que forma un cromosoma ha de contener un cenudmero, dos lel6meros y varios orfgenes de replicilld6n La mayor parte del DNA Cfom0s6mico no codifica prote[nas esenciales ni RNA Cada gen produce una molkula de RNA La comparacl6n enlre secuendas de DNA de organismos reladonados permile diferenciar enlre regiones de DNA de secuencia conservada y no conservada Las histonas son las principales prolefnas eslruclurales en los cromosomas eucarlotas La asociaci6n de las hlslOnas con el DNA conduce a la fomlaci6n de los nucleosomas, las partfculas unitarias de 18 cromalina La posici6n de los nucleosomas en el DNA viene determinada por la lendencia del DNA a formar bucles eslrechos y por la presencia de ol.ras prOle{nas de uni6n al DNA Habitualmente los nucleosomas se empaquetan con la hlstona HI formando estruCIUros regulares de orden superior

Resume" La eslructura global de los cromosomas Los cromosomas plumulados conllcnen bucles de cromatina descondensada Tambicn se pueden apreciar domlnios eSlructurales organizados en la crorml!Jn8 interfdslca en los cromosonllls poliu!nlcos Los dl{erentes domlnlos de la cromatlna de los cromosomas po!itcnicos pueden empaquetarse y desempaquetarse como una unidad Es probable que tanto las bandas como las inlerbandas de los cromOSOlllllS polltenicos contengan genes La cromatlna est:!. menos condensada en las regiones que son transcripcionalmente activas La cromatina aCliva es bloqufmlcamelllc difcrente La heterocromalina esla muy condensada y es transcripclonalmente Inaetiva Los cromosomas mit61icos estdn formados porcromatina en su forma mas condensada Cada uno de los cromosomas mil61icos presenla un patron caraclerislico de grandes dominios estruclUrales

Resumen Replkad6n del cromosoma Secuencias espedflcas de DNA acnian como orfgenes de repUcad6n Un sistema eucariota libre de cl!lula5 replica el cromosoma de un virus de simio Los origenes de replkad6n de los cromosomas eucariotas se aetivan en grupos

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Resumell

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SlolHI, y procesamlenlo del RNA Las RNA polimerasas illlercambian subunidades cuando

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inlcian cada cadena de RNA En las cl!lulas eucarlotas, el RNA sintetiza por Ires RNA polimerasas dlferentes La RNA polimerasa II transcribe algunas secuencias de DNA mucho m:!.s frecuentemente que otras Los precursores de los RNA mcnsajeros son modificados covalelllernellle en sus dos extremos El procesamicllIo del RNA elirnina largas secuencias nuc!eotldieas del Interior de las mol~culas de RNA Los transcritos hnRNA son inmcdlalamente recubiertos por prole[na y snRNP Las secuencias intrdnlcas se eUminan de las moltkulas de RNA en forma de law Habltualmente de cada transcrito de RNA se eUminan muchas secuenclas intr6nicas £\ esludio tie la talasemia revela de que forma 13 matluracldn del RNA puetle pemlitir que las prote{nas evolucionen Probablemente la maduraci6n del RNA calalizada por el espliceosoma c~oolucion6 a partir de mecanismos de automaduraci6n E1lranspone de los mRNA al citoplasma se retrasa hasta que la maduraci6n se ha completado Los RNA rlbos6micos y los RNA de transferencia se sintellzan sobre conjuntos de genes idl!nticos dispueslos en tiindem FJ nucleolo es una mdquina produclora de ribosomas FJ nucleolo es un subcompartimiento nuclear muy organizado Despub de cada mitosis, el nucloolo se ensambla de nuevo en detenninados cromosomas Los cromosomas ocupan tenl1orios discretos en el ntlcleo lnterfasico tEstt muyordenado el ntkleol

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Resumen

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Organlzacl6n y evolucl6n del genoma nuclear 413 Los genomas se van ajustando de forma precisa por mUlaciones punluales y se remodelan radicalmente 0 aumentan de tamano por reeombinaeion genetica 413 Las seeuencias repetidas en tlindem de DNA tienden a permaneeer inaiteradas 414 La evoludon de la familia de ios genes de la globina muestra ~ue las dupJieadones al azar eonlribuycn a la evoludon e los organismos 415 Los genes que codlfican nuevasJ:rolelnas se pueden crear mediante la recombinacion e exones 417 La mayorla de las protefnas se han originado probablemcnte a partir de genes altamente fragmentados 417 Una fraccion mayotitaria del DNA de los eucariotas superiores eSlli fonnada pot seeuencias de nucleOtidos repetidas y no codificantes 41'

Las seeuendas de DNA satelite no denen ninguna funeion conocida La evoluei6n de los genomas se ha aeelerado mediante ai menos Ires tipos de elementos transponibles Los elementos uansponibles afectan frecuentemenle a la regulaeion geniea Las "explosiones de transposieion' provoean cambios ealastroficos en los genomas e incrementan ia diversidad biol6gic
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423

Resumen

423 424

BlbUograffa

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EI control de la expresl6n gcnlca Inlroducel6n aI control genlco Los distintos tipos celulares de un organismo pluriceiuiar contienen el mismo DNA Distintos tipos celulares sintelizan distintos conjuntos de protefnas Un celula puede cambiar la expresi6n de sus genes como respuesta a sel\ales extemas La expresion genica se puede reguiar en muehas de las etapas de la vra que conduce desde el DNA al RNA Y a las protelnas Resumen

Mallvos estructurales de unl6n a DNA en IllS prote(nllS de regulacl6n genlea Las prolefnas de regulacion genica se descubrieron utillzando tecnicas de genetica bacteriana El eXlerior de la heliee de DNA puede ser lefdo por prolefnas La geometrla de la doble heliee de DNA depende de la secuenda de nucleotidos Secuendas cortas de DNA son eomponentes fundamenlales de los interruptores geneticos Las protefnas de reguJacion genica contienen motivos estructuraJes que pueden leer secuencias de DNA EI motivo helice-giro-heliee es uno de los motivos de union a DNA mlis simples y comunes Las prote(nas de homeodominios son una clase especial de protefnas helice-giro-heliee Existen diferentes tipos de motivos de union a DNA en forma de dedos de zinc Las lliminas ~ tambicn pueden reeonoeer el DNA EI motivo cremallera de leucina estli implicado tanlO en ei reconocimiento del DNA como en la dimerizacion El motlvo helice-bucle-helice lambil!n esta implicado en la dimerizaci6n y la union al DNA Aun no es posible predecir la secuencia de DNA que es reconocida por una protefna reguladora Un ensayo de movilidad en gel permite deteclar COil gran facilidad prolelnas que se unen a una secuellcia especffica de DNA La cromatograffa de afinidad de DNA facilita la purifieacion de protelnas de union a secuenclas especlficas de DNA

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Resumen

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C6mo funclonan los Inlerruptores genl!dcos El represor de lripl6fano es un interruplor simple que aCliva y desactiva genes en bacterias Los aetivadores Iranscripcionaies activan los genes Un activador transcripcional y un represor Itanscripcional comrolan el operon lac

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fndice de materias

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La regulacion de la transcripcion en las celulas eucariOlas es eompleja Las RNA polinlerasas eucariotas requieren facIO res de transcripcion generales Los incrementadores 0 activadores controlan los genes a distancia Una regi6n de control eucariota estli farmada por un promOlor y por las secuencias de DNA reguladoras Muchas prote[nas aClivadoras aceletan el ensamblaje de los facIO res generales de transcripcion Las protefnas represoras p\leden inhibir la transcripcion de diferentes formas Las protefnas reguladoras de genes de celulas eueariotas ftecuentemente se ensamblan formando pequenos complejos sobre el DNA Los comple/'os interruplOres geneticos que regulan el desarrol 0 de DrosoplJila estlin formados por modulos menores EI gen eve de Drosophila estli regulado por conlroles combinatorios En mamfferos las regiones de control tambil!n estan formadas a partir de modulos reguladores sencillos Asu vez, la actividad de una protefna de regulacion genica puede estar regulada Las bacterias ulilizan subunidades intereambiables de la RNA polimerasa para colaborar en el control de la transcripci6n genica Los interruplores geneticos han evolucionado gradualmente Resumen

ESlruetura de la cromatlnft y el control de la expresl6n gcnlca La transcripcion del DNA que estli empaquelado en nucleosomas se puede aetivar Algunas formas de la cromatina impiden la transctipclon Antes de que los genes de globina de mamffero puedan lranscribirse, puede ser necesaria una etapa de descondensacion No se eonocen los mecanismos que forman la cromatina aetiva La tension superhelicoidal del DNA permite la acci6n a distancia Resumen

Mecanlsmos genetlcos que ortglnan lipos celulares elIpeclallzados Los cambios de fase de las bacterias son provocados por teorganizaciones del DNA

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xxiii

En levaduras, a1gunas prolefnas reguladoras delerminan Ia identidad del tipo celular 470 Dos prolefnas f4gicas que se reprimen mUlUamente MJ sfntesis delerminan el. eslado del baeleri6fago lambda 4n La expresi6n de una prole{na reguladora erftica puede disparar la expresi6n de una baterfa de genes siluados pordebajo (en direcd6n 3') 474 EI control g~nlco combinatorlo cs la norma en los eucariotas 475 se hereda un cromosoma X Inactlvo 476 Los genes de Drosopllihl y de Icvadura lambh!n pueden inaelivarse por caraelerislicas heredharias de su eslrUctura eromalfnica 478 Cuando las celulas de \'enebrados se dividen, puedcn heredar el palron de metUad6n del DNA 479 En las celulas de los venebrados la metilaci6n del DNA refueru las decisiones del desarrollo 480 La aetividad gen6mica heredable requiere melilaci6n del DNA 481 En los marnfreros, las islas rieas en CG estan asociadas con alrededor de 40 000 genes 482 ReSll/llell

483

Controles poSI-transcripctonaJes La atenuaei6n de la transcripcl6n causa una lerminaci6n lemprana de a1gunas molEculas de RNA La madurad6n altemativa del. RNA puede producir direrentes foemas de protei:na a panir de un mismo gen La delerminaci6n del sexo en Drosophila depende de una serie de procesos de maduraci6n a1lernaliva reglJlada del RNA

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484 484

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Un cambio en el punto de rolura del transcrito de RNA y la adki6n de poli-A puede cambiar eI extremo carboxilo terminal de una prmerna La definlci6n de gen se ha de modi6car debido aI descubrimienlo de la maduraci6n ahemativa del RNA E1lranspone de RNA desde el n6c1eo puede ser regulado Algunos RNA estan localizados en regiones especfficas del eitoplasma La edicl6n del RNA puede cambiar el sentldo del mensaJe del HNA Las celulas eueariOlas Yprocariotas utilizan estrategias diferentes para especificar ellugar de lnldo de la traducd6n en una mollX;ula de mRNA La fosforUad6n de un factor de iniciaci6n regula la sfnlesis de prolefnas Las prole[nas que se unen a la regi6n 5' Ifder de los mRNA intervienen en el oontrol traduccional negative La expresi6n g~nica put.ode eslar controlada por variaciones de la estabilidad del mRNA La degradaci6n selecliva del mRNA estl1 acoplada a la traducci6n EI control citoplasmtilico de la longilud de las cadenas de pali.A pueden afectar lal110 la lraduccl6n como la eslabilidad del mRNA Algunos mRNA contienen seftales de reconocimiento que interrumpen el proceso normal de la traducci6n Es muy probable que las reacciones catalizadas por RNA tengan un origen muy antiguo

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Resumen

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Blbliograffa

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Organizaci6n interna de la celula CaphuJo

Estructura de la membrana

10

La bleapa IIpfdlca Los llpidos de las membranas son moleculns anfipaticas

510

que eSpanlaneamente forman bicapas La hicapa lipldlca es un fluido hidimensional La fluidez de una bicapa lipldica depende de su compasici6n La bicapa Iipfdica es asimelrica En la superficie de ladas las membranas plasm~ticas hay g1ucolfpidos

510

Resume'l Protefnas de membrana Las prolelnas de membrana pueden eslar asociadas a la bicapa lipfdica de varias maneras se considera que, en la mayorfa de prote(nas transmemhrana, las regiones de la cadena polipeplldiea que CrU7.mlla bicapa lipfdlea presenlan una eonformaci6n en heliee a Las prolefnas de membrana I>ueden solubilizarse y purificarse mediante detergentes E1lado citoplasm~tico de las protelnas de membrana se puede estudiar en "fantasmas· de eriuociw La espe<:trina es una protefna del citoesquelelo asociada no covalelllemente a la cara ciloplasmtilica de la membrana del erilrocilo

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fndice de materlas

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La g1ucoforina atraviesa la bicapa Iipfdica del g16bulo rojo, formando una h~lice U sencilla La banda 3 de la membrana celular del eritrocito es ulla prOlefna de membrana multipaso que eataliza el cotransporle anl6nico La baclcriorrodopsina es una bomba de I>rolones que alraviesa In blcapa en forma de siete helices U Las parinas son protefnas transmembrann formadoras de canales que ernl4n la membrana en forma de un barril II Las prolelnas de membrana aCluan a menudo como grandes oomplejos Muchas protelnas de membrana difunden en el plano de la membrana Las c~lulas pueden connnar a lipidos y a protelnas en dorninios especfncos de la membrana La superficie celular estli recubierta con residuos de azucar Las selectinas son protefnas de membrana que se unen a carbohidratos de la superficie celular y que median adhesiones celulares transitorias en el torrente sangufneo

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Resumen

538

BiblJograffa

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Transporte de moIecuJas pequefias a traves de la membrana y base i6nica de la excitabilidad de la membrana Princlpios de InullIIporte. tram de membrana

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Las bicapas Upfdicas libres de prOlcfna son alIa mente lmpermeables a los lones Existcn dos c1ases principalcs de protcfnas de lransporte

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558

El potencial de membrana de las cilulas animales depende prindpalmentc de los canales de fuga de K' y del gradiente de I{' a traves de 18 membrana plasml'itlca Cuando se para la bomba de Na'·K', el pOlencial de reposos 5610 decae Icnlamenle La £unci6n de una Q!lula nerviosa depende de su esuuctura alargada los canales i6nlcos regulados por voltajc son los responsables de la generaci6n de pOienciales de acci6n en celulas excitables eleclricamente la mieUnizacion incrementa la velocldad y la eflclencla de la propagacion de los potenciales de accion en las c~lulas nerviosas El reglstro de zona indica que cada uno de los canales de Na' se abre siguiendo la ley deltodo 0 nada Los canales cationicos regulados por voltaje eSl4n relaclonados evoluliva yestrucluralmcnte En las sinapsis qufmicas los canales ionicos regulados por IranSmisor lransforman senales qufmicas en senales elecmcas Las sinapsis qufmicas pueden ser excitadoras o inhibidoras Los reccplOres de acetJlcolina de las uniones neuromus<;ulares son canales calidnicos reguJados por transmisor los canales i6nicos r~ados por transmlsor son las dianas principa es de la acci6n de drogas pslcoaetivas la transmisidn neuromuscular implica la activaci6n secuencial de aI menos cualro grupos de canales i6nicos regulados El potencial poslin4ptico principal de una newona reprCSCnl3 la suma espacial y temporal de muchos pe<Juenos polenciales poslsinapticos La integracidn neuronal requicre la combinaci6n de al menos tres tlpos de canales de K' diferentcs La potenciaclon a largo plaza en el hipocampo de los mamfferos depende de la entrada de Ca1. a tra~ de canales receptores NMDA Resumen

559

Blbllograf!a

a trav~ de membrana: protcfnas Iransponadoras y prolefnas de canal EJ transpone activo esla mediado por protcmas lransportadoras aoopladas a una fuente energetica La tecnologCa del DNA recombinante ha revolucionado cl estudlo de las prolefnas de lranslXlrte a trav~s de membrana Se pueden utiLizaJ" ionororos como herramientas para incrementar la permeabUidad de las membranas a detennlnados iones Resumen Prolefnas transportadoras y Iransporte activo a leavb de membrana la bombas Na'-K' de la membrana plasm4lica es unaATPasa la ATPasa de Na'-K' es necesarla para manlener el equilibrio osm6tico y estabilizarel volumen celular A1gunas bombas de ca1, tambl~n son ATPasas unidas a membrana A1gunas enzimas Iigadas a membrana que sintelizan ATP son ATPasas de transpone que setuan en sentido Opueslo Eluansporte activo puede ser Impulsado por gradientes idnicos las protcfnas de transpone impulsado por Na' de la membrana plasm4lica regulan el pH citosdlico En las d!1u.las epiteliales, la dlstrihucl6n asim~trlca de protefnas uansponadoras pennite el uanspone lranscelular de solutos A1gunas ATPasas lransportadoras de membrana son hom61ogas a lasATPasas transportadoras de eucariotas, que particlpan en la resistencla a drogas y en la fibrosis qufstica: la superfamilia de lransponadores ABC Resumen Canales IdnJros y prop'edades elearicas de las membnmas Los canales idnicos son selectivos para el ion y nuctuan entre estados abiertos y cerrados

543 543 544 545 54. 547 548

550 551 5S3

553 554 555

555 558

Compartlm.ientos intracelulares y clasificaci6n de prote(nas La conlpartlmentacl6n de las dlulas 8uperiore$ loons las c~lu.las eucariotas denen la misma colecciOn b4sica de org4nulos rodeados de membrana La relaci6n IOpol6gica de los OrgAnul05 rodeados de membrana puede ser inlerprelada en tenninos de sus orfgenes evolutivos Las prolefnas pueden desplazarse entre compartimienlOS de direrentes maneras Los ~ptidos seftal y la regidn senal deterrninan el destino celu1ar correcto de las protefnas l.alI d!lulas no pueden construir de IIOVO sus organu.los rodeados de membrana: necesitan Infonnacl6n del propio organulo Resumen FJ transporte de mollcula5 had. denlro y had. fuera del nucleo Los poros nucleaces alraviesan la envoltura nuclear

(ndlce de materlas

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CapI.uIo

Unas senales de localizacl6n nuclear dirigen las proteCnas nucleares hacla el nucleo Las macromolkulas son transponsdas activamente hacla denlro y hacla fuera del micleo a travb de los poros nucleaTes La envohura nuclear se desorganiza durante la mitosis El transporte entre el nucleo y el citosol puede ser regulado evilando el acceso a la maquinaria transponadora Resumen

12 601 603 604 605

606

EJ tcansporte de protefnas aJ Interior de mllocondrlas

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y de c1orolllast08 La translocaci6n hacia la matriz mitocondrial depende de una sefta! tfpica de la matriz La uanslocacidn hacia]a mauiz milocondrial depende del gradiente eleeuoqufmico a tram de la membrana intema yde la hidrolisis deATP

607 607 608

xxv

Las proteCnas mitocondriales son importadas hacia la matriz mediante un proceso de dos etapas. a travl!s de lugares de contacto que unen las membranas externa e lnterna Las protelnas son importadas hacia el interior de la matriz mitocondrial. en un estado desplegado La uni6n secuencial de las protelnas Importadas a las proteCnas mitondriales hsp70 'J hsp60 impulsa su translocaci6n y ayuda al plegamiento proteico El transporte de protefnas al espacio lntermembrana mltocondrlal requiere dos sefiales Para dirigir el transporte de protefnas a la membrana tilacoidal de los c1oroplastos se necesha la parricipaci6n de dos pl!ptidos seMI Resumen

Peroxisomas Los peroxisomas utilizan el oxigeno molecular y el per6xldo de hldr6geno para realizar reacciones oxidativas Una corta secuencia senal dirige la importaci6n de protefnas hacia los peroxisomas Reslllllell

EI redculo endoplasnuitloo los ribosomas adheridos a las membranas definen el ER rugosa El ER lisa es abWldante en algwms celulas especializadas Las regiolles lisas del ER pueden separarse de las rugosas mediante centrlfugacl6n Los pl!ptidos senal fueron descubiertos por primera vez en protelnas imponadas al ER

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Una partlcula de reconocimiento de senal (SRPj dirige los peptldos seftal para el ER a un receptor especlfico de la membrana del ER La translocaci6n a travl!s de la membrana del ER no siempre requiere que se estl! produciendo el crecimiento de la cadena polipeptfdica La cadena poJipeptldica pasa a travl!s de un poro acuoso en el aparato de translocaci6n EI pElptido senal del ER es eliminado de la mayorla de protelnas solubles despues de la translocaci6n En las protelnas transmembrana de un solo paso. un pElptido senallnterno permanece en la bicapa llpfdica como una he!lce a que atraviesa la membrana Combinaciones de senales de inicio y de paro de transferencia determinan la topologia de las protefnas transmembrana de multipaso las cadenas polipeptfdlcas translocadas se pliegan 'J se ensamblan en ellumen del ER rugosa La mayorla de protefnas sintetizadas en el ER rugosa son glucoslladas por la adici6n de un N-o!lgosacarido comun A1gunas protefnas de membrana, poco despues de entrar en el ER, intercambian un cola transmembrana carboxilo terminal por un glucosilfosfatidillnositol (GPIl unldo de forma covalente La rnayorfa de las bicapas lipfdicas de membrana son ensarnbladas en el ER Las proteillas de illtercambio de fosfollpidos pueden transportar fosfolfpldos desde el ER a las mitocondrias ya los peroxisomas Resumen

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Blbliograffa

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Tnifico vesicular mediante las rutas secretora y endodtica Trwlsporte desde el ER al complejo de Goigi EI complejo de Golgi estll formado por una serie de comparrimiemos ordenados Las protelnas residentes en el ER son selectivamente recuperadas de la red del cis Golgi las protefnas del Golgi vuelven al ER cuando las celulas se tratan con la droga brefeldina A En e1 complejo de Golgi se procesan las cadenas de oligosacarido las cisternas del Galgi esn!.n organlzadas en forma de series secuenciales de compartimientos de procesamiento los proteog!ucanos son ensamblados en el complejo de Galgi los carbohidratos de las membranas celulares se encuentran en la cara de la membrana que es topol6gicameme equivalente aI exterior de la celulas iCu~1 es el prop6sito de la glucosilaci6n? Resumen

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Transporte desde la red del trans Golg! 8 los IIsosomas Los lisosomas son ellugar principal de digesti6n intracelular Los lisosomas son heterogeneos las vacuolas de las plantas y de los hongos son lisosomas muy verslltiles los materiales son transponados hasta los lisosomas a traves de varias rutas Algunas protefnas citos6licas son transportadas directamente a los Iisosomas para ser degradadas Las enzimas lisosomales son c1asificadas en la red del trans Goigi por un receptor proteico unido a membrana que reconoce la manosa 6-fosfato El receptor de manosa 6-fosfato viaja como una lanzadera. adelame y atrlls, entre determinadas membranas

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fndice de materias

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Una regi6n senal en la cadena polipeptidlca proporciona la clave para marcar una enzlma lisosomal con la manosa 6-fosfato los defectos en la GIcNAc-fosfotransferasa causan una enfermedad de acumulo lisosomal en humanos

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Resumell

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Transporte desde III membrana plasmatlca vfa endosomas: endocitosis CE!lulas fagoclticas especializadas pueden ingerir grandes particulas Las vesiculas de pinocitosis se forman en la membrana plasmlltica a partir de depresiones revesridas las depresiones revestidas de datrina pueden actuar como un mecanisme concentrador Internalizando macromoleculas extracelulares especfficas las cEllulas Imponan colesterol par endocitosls mediada por receptor El material endocitado termina frecuentemente en los lisosomas Determinadas protefnas son recuperadas de los endosomas ternpranos 'J devueltas a la membrana plasrnlitlca La relaci6n entre endosornas ternpranos y lardlos es incierta las macromolE!culas pueden ser transferidas a travEls de las laminas de celulas eplteliales mediante transcitosis Las celulas epiteliales tienen dos compartimientos endosomales tempranos dlstintos pero un solo compartimlento endosomal tardio comun Resumen Transporte desde 18 red dellmns GoIg! hasla la superncle celular: exocllosls Parece que muchas protefnas y lfpidos son transponados automaticamente desde el ER y el complejo de Golgi a la superficie celular

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6GB 6GB

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Las vesfculas de secreci6n emergen por gemaci6n desde la

red del trans Goigi A menudo las rcroteCnas son procesadas proteol.ltkamente duranle Ia onnacWn de las vesiculas de secred6n Las vesIculas de secreci6n pennanecen cerca de la membrana plasmatica hasta que una seftalles hace liberar su contenido La exocltosls regulada es una respuesta localizildfl de la membrana plasmatica 'I del citoplasma sub'Jllcente Los componentes de la membrana de las vesfculas de secrecl6n se reciclan las vesfculu sinapticas se forman a partir de 105 endosomas Las celuias polarizadas diri~en las protefnas desde la red del transGoI&:'llSta el ominio apropiado de la membrana p matica

Resumen Mocanlsmos moklc:ulares deltransporte vesk:u.lu y mantenlmlento de la dJvenldad decompartim.lentos EI mantenlmiento de las difcrencias entre compllrtlmienlos requiere un aporte de energla libre Exlste rntis de un tipo de vesfculas revestidas

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EI ensamblaje del revestimienlO de clalrina conduce a la formad6n de la vesfcuia las adaptlnas reconocen protefnas transmembrana especfficas y las unen al revestlmienlo de c1atrina Las vesfculas revestldas de coat6mero median ellranspone vesicular no selectivo Ellransporte vesiculardepende de proternas reguladoras que unen GTP Parece que ARF senll1Jzll el ensamblaje 'I el desensamblaje del revestlmlento de coat6mero Marcadores protelcos de or~anulo. lIamados SNARE, colaboran en la ireccl6n deillanspone de vesfculas St' c~ que las protelnas Rab aseguran la especificidad de la uni6n de las veskulas La fusidn de vesfculas esta catalizada por una "maquinarla de fusi6n de membrana~ La prOle!na de fusi6n de membrana mejor caraClerizada est' simetizada por un virus

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Resumen

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La cadena resplratoria y la ATP slntasa A partir de las mltocondrias se pueden aislar particulas invertidas funcionales La ATP sintasa puede ser puriflcada 'I de nuevo incorporada a las membranas La ATP slnlasa puede funcionar de manera reversible, hidroli.tando ATP y bombeando H' La cadena respiratorla bombea H' a trav& de Ia membrana mltocondrlal intema Se han utilizado metodos espectr0se6picos pan Identificar muchos transportadores de electrones de Ia cadena respiratorla La cadena respiratorla contiene tres grandes complejos enzlm'tlcos lncluidos en la membrana

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Resumen

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Blbllograffa

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Conversi6n energetlca: m1tocondrlas y cIoropiastos La mltocondria La rnitocondria presellla una membrana merna 'I una membrana intema que deOne dos compartimientos Internos La oxidacl6n mitocondrial empieza cuando se generan grandes cantldades de acetil CoA a partir de plmvato 'I de ncidos grasos en el espacio de la matrjz EI cicio del dcldo cftrico oxida el gmpo acetilo del acetil CoA. generando NADH y FADH z para la cadena respiratoria En la membrana milocondrlal intema, un proceso quinliosm6tico convierte la energfa de oxidaci6n en ATP Los e1ectrones son transferldos desde el NADH hasla el oxlgeno. a trav& de tres grandes complejos enzlmatlcos respiratorios La energfa Ilberada por el paso de los electrones a 10 largo de Ia cadena respiratorla se a1macena en fonna de gradiente electroqufmico de protones 8 Ilav& de la membrana mitocondrlallntema La energfa a1maCf!nada en el gradiente elecnoqulmico de protones se utiliza para produclr ATP 'I rarlllranSportar metabolitos e lones inorgnnicos hacia e espaclo de la matrlz La rdpida conversi6n de ADP en ATP en las mltocondrlas mantiene una elevada relacl6n ATP-ADP en las celulas La diferencla entre 40' y 4G; para que la hidnSlisis de ATP sea litil para la et!lula es necesario que tenga un valor muy negativode4G La resplraci6n celular es nolablemente eficiente

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ea"....,

14

En la cltocromo oxidasa, un Cf!ntro de hierro-cobre cataliz8 de fonna e6ciente la reducci6n del 0 1 Las transferencias de electrones est'n medladas por colisiones a1eatorias que se producen entre los dado res '1105 acePto~s que difunden en la membrana mltocondrl interna Una gran calda lfpmenciaJ redox a trav!!s de cada uno de los tres complejos enzlmatlcos respiralOrios aporta energfa para el bombeo de H' EI mecanismo del bombeo de H' se conoce mejor en bacterlorrodopsina Los ion6foros de W disipan el gradiente de H', desacoplando asl el transpone de elecnones de la slnlesls de ATP Normalmente el conlrol respiralOrio restrlnge el nujo de electrones a tra~s de la cadena Exislen desacoplantes naturales que transfonnan las mltocondrlas deJ lejido adipo50 marr6n en maqulnas generadoras de calor Todas las bacterlas utllium mccanismos quimiosm6tlcos para ahorrar energfa

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""

Resumen

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Ooroplastos y fotosinlnb EI c1oroplasto es un m1embro de una familia de orgtnulos exclusivos de las planlas -105 plastidios Los cloroplastos se parecen a las mitocondrias, pero tienen un companimiento adicional Dos reacciones caracterfstlcas de los c!oroplllSIOS; la producci6n de ATP 'I de NADPH. lmpulsada par III Juz. y la conversi6n de COz en carbohidratos La fljacl6n del carbono estn cataJizadli por la ribulosa blsfosfalO carbonlasa En el cicio de fijaci6n del carbona se consumen tres mol«ulas de ATP y dos mol«u1as de NADPH por cada molenlla de COz fijada En a1gunas plantas, la fijaci6n del carbono esta companimentada para facilitarel creclmiento a concentraciones bajas de CO. La fotosfntesis depende de la fotoqulmlca de las molkuJas de clorofila Un fotosistema contiene un centro de reaccl6n y un complejo antena

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En un centro de reaccl6n, la energia capturada por la dorofila genera un dador fuene de electrones a panir deunodBlil En plantas y en cianobaclerias, Ia fotofosforilaci6n no dclica produce NADPH yATP Los c1oroplastos pueden producir ATP por fOlOfosforilaci6n ddica sin generar NAOPH £J gradiente electroqufmico de protones es similar en las mitocondrias y los cloroplastos Como la membrana mitocondrial interna, 18 membrana interna del c1oroplaslo conoene protelnas transportadoras que facilitan el intercambio de melabolitos con el chosol Los c1oroplastos lIcvan a cabo otros procesos biosintl!ticos

Resumen

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Evolucl6n de las cadenas de transporte de electrones Probablemenle las cl!lulas mas primilivas produdan ATP medianle fermentaciOn La evoluciOn de la cadena de transporte eleclr6nko conservadora de energfa capacit6 a las baclerias anaerobk:as para utilizar compuestos organicos no fennentables como fuenle de energfa Las baCterias fotosintl!ticas, suministrando una fuente inagotable de poder reduclor, supenlron el mayor obsl3cu1o de la evoluci6n de las cl!lulas Las cadenas de transporle electronico de los complejos fotosinttiticos de las cianobacterias produjeron ongeno armosfl!rico y pennitieron nuevas formas de vida

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Resumen

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Los genomas de las mllocondrlas y de los c1oroplaslos

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La bios(nlesis de las milocondrias y de los c1oroplastos

supone la contrlbuclon de dos sistemas genl!ticos diferentes

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fndice de materias

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Bibllograffa

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IS

Prlndp'os generales de la seiiallud6n celular 771 Las mol~ulas sella! extracelulares son rcconocidas por receptores especincos de la superficie 0 del interior de las celulas diana 772 Las moll!culas secretlldas median tres formas de seftaliUlcion; la paractina, 10 sindptica y la endoctina 773 La sei\aliUlcion aUlOcrina puede coordinar declsioncs 774 de grupos de celulas identicas Las uniones comunicante5 permilen que la informacion de senaliUlcion sea companida por las cl!lulas vecinas 776 Cada clHula esl;!. programada para responder a combinacloncs especlficas de moll!c::ulas senal 776 Oiferenles cl!lulas pueden responder de fonna diferenle ala misma sei\al qu{mka m La concenuacl6n de una molecuJa puede ajustarse rapidamenle 5610 sl la vida media de la molkula es cona m EI gas ondo nftrico aellia como una sei\al, uniendose directamente a una enzlma en el interior de la celula diana n9 Las hormonas esteroideas, las honnonas tiro ideas, los relinoidcs y la villimina 0 sc unen a receptores Intracelularcs que son protelnas regullldoras de genes octivados por ligando 779 Se conocen tres clases de prote(nas receplOrlis de superficie celular: las asociadas a canales ionicos, las asociadas a protefnas G y las asociadas a enz.imas 782 Los receptores de superficie celular, una vez activados, desencadenan la adicion de grupos fosfato a una red de prolemas inlracelulares 783

xxviii

Resumen

Capitukt

Transmisi6n de seiiales entre celulas

Resumen

EI crecimienlO y la divisi6n de los organulos manliene el numero de mitocondrias y de c1oroplastos en la cetula 752 Generalmenle los genomas de los c1oroplastos yde las mitocondrias son mol~ulas de DNA circulares 753 Las mitocondrias y los cloroplaslOS contienen sistemas genet.icos complelos 754 EI genoma del cloroplasto de las plan13s superiores contiene apronmadamente 120 genes 755 Los genomas mitocondriales presentan varias caracterfsticas soflJrendcmes 756 Las mitocondrias de animales conlienen el sistema genl!tico mib simple de los conocidos 757 lPor qul! los genomas mitocondriales en las plantas son tan grandes? 758 Algunos genes de org;!.nulos contlenen Intrones 758 Los genes mitocondriales se pueden distinguir de los genes nucleares gracias a su herencia no nlendeliana {citoplasm;!.tica} 759 En muchos organismo$, los genes de los org
Seiiall7.addn vfa receplOres de supertlde celular asociadas a protefnas G Las proteinas G triml!ricas transmiten la senal intracelular dcsde los receptores asociados II protefnas G Algunos receptorcs incrementan los lliveles intracelulares de AMP dcllco llctivando la odenll clclasa a traves de una protefna G cstimuladora (GJ Sc crcc que las proteinas G ttiml'irica5 se dcsensamblall cuando son aClivadas Algunos receplores disminuyen 105 niveles de AMP dclice inhibiendo la adenil ciclasa vfa una proteina G triml!rica inhibidora (G) La proteina quinasa dependienle de AMP dclico (quinasa A) media los efeclos del AMP dcUce Divenas protelna sc:rina/nconina fosfatasas revierten rapidameme los efeclO5 de la quinasa A Para utilizarel Cal< como sel\a! intracelular, las reJulas han de mantener los niveles basales de cal. muybaj05 El Cal. octua como un mensajero intracelular ubicuo Algunos f(.'Ceptorcs relacionados con protefnas G activan el proceso de sei'lalizaci6n de fosfolfpidos de inositol activando la fosfolipasa C-~ EI inositol trlsfosfato (IPJ acopla la llctivaci6n del receptor con la liberacion de Ca2 ' del Eit A menudo las oscUaciones de Cal. prolongan la respuesta inicial de cal. inducida por IPs £J diacUglicerol aCliva la proteina quinasa C (quinasa Q La calmodulina es un receplor inlracelular de Ca2' ubicuo

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1

En las celulas animates la moyorla de acciones del Ca1. se producen a lra\-es de prolefna quinasas dependienle5 de Ca"-calmodulina (quinasas CaM) Los procesos de Ca" y de AMP dcUco imcraccionan entre sf Mgunas prolcinas G lrimericas regulan dire<::tamente canales 16nicos La olfacci6n y Ia vision dependen de receplores asociados a prolefnas G y de canales i6nicos regulados poT nudooLidos ckllcos Las senales extracelulares son notablemenle amplificadas mediante la utilizacion de mensajeros intracelulares y de cascadas en.ziln3ticas Las celulas pueden responder de forma suhila a incrementos graduales de la concencrad6n de una senal exlracelular EI efcclO de a1gunas sei'lales puede ser recordado por la celula Re.sllmell

Sei\aIlzacl6n vl'a receplores de superfldc «Iular asoclados aenzlmas Los receplOres guanilalO delasa gcncran GMP cfdico dirCClarncnle Los reccplorcs para la rnayor(a de los fBclOres de credmienlO son protcfnas transmernbrana que prescnlan actividad protefna tirosina quinasa especffica Los reslduos tirosina fosforilados son recollocidos por protefnas con dominios 5HZ Las prOlclnas Ras <:onSlituyen un eslab6n <:rudal en la cascada intracelularde sel'lalizaci6n aClivada por receplOres proteina quinasa Una prolefna 5H adapaladora acopla los receplores tirosina quinasa con Ras: evidencias que provienen del desarrollo del ojo de Drosophilo Ras acliva una cascada de fosforilaciones serinaJueonina que aetiva la MAP-quinasa La activklad de los receptores asodados a lirosina quinasa depende de tirosina quinasas que no son receptores Algunos receptores son prolerna lirosina fosfalasas

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Resumtm

I

FUamenl05lnlermcdlos los filamentos intermedios son polfmeros de protefnas fib""", W et!lulas epileliales preseman una familia muy diversa de filanlentos de queratina Muchas c~lulas no epileliales presenlan sus propios filamenlos intermedios citoillasmdlicos diferendales La Idmina nuclear esla conSlilulda por un ll~ especial de prOlefnas de filamenlOS inlermedios.: as lamininas Los filamentos imermedios proporclonan cslabilidad mccdnlca a las celulas animales

Resume'l

fndlce de materlas

las prOleinas de la superfamilia TGF.~ aclivan receptores que son prOieina serina/neonina quinasas £J receptor lransmembrana NOiCh media la inhibiciOn lateral mediante un mecanlsmo d~nocido

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''1111

.12 '12 '13 '15 '1'

'17 .1. 820

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.23 823

Reslllllcn

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AdapladOn de las tt1ulu diana La adaptad6n lenla depende de Ia regulad6n por disminud6n del numero de receplores A menudo la adaptad6n r.lpida se produce por fosforilad6n de los receplores Algunas formas de adaptad6n son debidas a cambios en el proceso de sei'lali7.ad6n La adaplad6n desempel'la un papel crucial en la quimiolaxis baCleriana La qUimiOlaxis bacteriana eSld mediada por una familia de cuatro rccefclOres Iransmembrana hom6logos y por un sislema de osforilaci6n que transmilc la senal En III quimiOlaxis bacterlana, III metHad6n del receptor es responsable de la adaplllCl6n Resumen

825

805

La 16gica de la seilallzacl6n Intracelular: lecciolles de "redes neuronales" basadas en los ordenadores Las redes ncuronales basadas en el ordenador pueden ser ennenadas Las redes de sei'lalizacl6n celular pueden observarse como redes neuronales enlrenadas por la evolud6n Las redes de senalizad6n capacilan a las celulas para responder a complejos palrones de sei'lales ertracelulares Las redes setial son robuslllS Rl'fllmen

"--

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BlbliograIfa

CapilUlo

EI ciloesquelelO La naluraleza del c1loesquelelo EJ cltoplasma de una celula eucariola eSld organizado espacialmeme por 105 filamcnlos de aClina, los microtubuJos y los filamentos lntermedios La dlmlmica de los microttlbulos crnana del centrosoma l..a red microtubular puede cncontrar el centro de la <:elula Determinadas protcfnas motoras utllizan 1.. red microtubular como gu!a para posicionar los orgllnulos rodeados de membrana EI oortex de aClina puede generar y manlener la polandad celular Nonnalmemc los filamenlos de aClina y los microuibulos aCluan juntos polarizando la et!lula W funciones del ciloesqueleto son diffdles de esludiar

La utilizacion de oncogenes ~IC provocan cancer ha permitido identificar OJU os oomponentes del proceso de seFiaJizaci6n de los reccptores lirosina quinasa

16 84.

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'50 831 852 852

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85' '58

.60

Mlcrottibulos Los rnicrotubulos son cilindros huccos formados por tubulina Los microtubulos son cstructurllS muy hibiles, sensibles a drogas antimil6tlcas espcc!flcas El alargamicnto de un mtcrottlbulo es un proceso r:l.pido, micntras que la nucleacl6n de un nuevo microtubulo C'S un proceso lemo Los dos extremos de un micronibulo son diferentes y crecen a velocidades direremes Los centrosomas son ellugar primario de nucleacl6n de los microlubulos en las celulas animales En las celulas animales los microlubulos se despolimerizan y repolimerizan continuameme La hidrolisis de GTP puede explicar la ineslabilidad dinamica de los mlcrOlubulos individuales La inestabilidad dinamica de los microldbulos propordona un prindpio organi%ador par.l.1a morfogenesis celular Los microtdbulos sufren una lema ~madurad6n~como resultado de modificaciones post.uaduccionales de sus subunidades de lubulina Las prOlelnas asociadas a mlcrOlubulos (MAP) se unen a los microlubulos y modifican sus propiedades Las MAP colaboran en la generaci6n de regiones ciloplasmdticas functonalmcnte distintas La quinesina y la dinelnll dirlgcn el movimienlo de los orgdnulos a 10 largo de los rnicrotubulos

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xxix

La velocldad y la direcd6n de desplazamiento a 10 largo de los microtubulos son espccfficas del dominio globular de las protelnas motoras Resumen

Clllos y cenlrfolos Los dlios se mueven por el batido de un axonema -un complejo haz de microtubulos La dinelna dirige el movimiento de los dUos y de los fiagelos Cilios y fiagelos crecen a partir de corpusculos basales que estan muy fntimamente relacionados con los centrlolos Los centrfolos suelen aparecer por dupUcaci6n de los centrlolos preexistentes Resumen

Fliamentos de actina [.(Is filamentos de actina son delgados y fiexibles La actina y la lubulina polimerizan por mecanismos pareddos El comportamiento dinamico de los filamentos de actina requiere la hidr6lisis del ATP Las funciones de los filamentos de actina son inhibidas por drogas estabilizadoras y desestabilizadoras del pollmero La molecula de actina se une a pequeftas protefnas que ayudan a controlar su polimerizad6n M",,-\<._ ~\",I._~ml....~v.. \.\. oo~
872 873 874 674 676 877 878 879 880 8BO BBO B84 885

885

d~ ';j.'1';j.\'\<::.
microespinas y lamel\podios dinamicos que contienen actina EI borde frontal de avance de las celulas m6viles nuclea la polimerizad6n de la actina Algunas bacterias pat6genas utilizan la actina para moverse dentro y entre las celulas La polimerizad6n de la actina en el c6rtex celular esta controlada por receptores de la superficie celular Proteillas G heterOlrimericas y pequ.ei'las GTPasas transmitell sei'lales desde la superficie celuhh al c6rtex de actina Los mecanismos de polarizad6n celli@! pueden ser analizados en las celulas de levadura

667 88B

BB9

890 892 893

Resumen

894

Prote(nas de uniOn a la actina Un dtoesqueleto unido de manera sendlla a la membrana proporciona soporte mecdnico a la membrana plasmlhica de los eritrocitos

894

894

Protefnas de entrecruzamiento con diferentes propiedades organizan ensamblajes particulares de actina Las prOlefnas de uni6n a la actina con propiedades diferentes esnin construldas a panir de m6dulos semejantes La gelsolina, cuando se activa por Ca 2•• fragmenta los filamentos de actina En las celulas eucariotas se han encontrado multiples tipos de miosina En celulas no musculares pueden formarse transitoriamente ensamblajes semejantes a los musculares Los contactos focales permiten que los filamentos de actina se extiendan hacia el substrato Los microvilli ilustran de que forma los haces de filamentos entrecnlzados de actina pueden estabilizar zonas locales de la membrana plasmatica EI comportamiento de la corteza celular depende de un equilibrio de interacciones cooperativas y competitivas entre una gran colecci6n de protefnas de Uni611 a la actina La migraci6n de las celulas animales compona tres subprocesos distintos dependientes de actina EI mecanismo de la locomod6n celular puede ser disecciomtdo geneticamente Resumen

E1 cicio celular de los embrlones tempranos y la Juncl6n delMPF EI crecimlento del oocito de Xellopus estll equilibrado por la divisi6n del huevo Un regulador citoplasmatico. el MPF. contrala la entrada en la mitosis Las oscilaciones de la actividad MPF controlan el cicio de divisi6n celular

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(ndice de materias

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Blbllograffa

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Capfmlo

17 926

La replicad6n del DNA nuclear ocurre durante una fase

especffica de la Interfase: la fase 5 Paralelamente al crecimiento continuo de la ciilula, durante el cicio celular se producen una serie de procesos discretos Un sistema de control central desencadena los procesos esenciales del cicio celular El control del cicio celular es un mecanismo basado en una protefna quinasa Resumen

897

El musculo 908 Las miofibirillas estan formadas por ensambJajes repetitiyos de fllamentos gruesos y de)gados '9)t) La contracd6n se produce por el deslizamiento de los 910 filamentos de miosina y de actina entre sf Las cabezas de miosina "camlnan" hacia el extremo menos de los filamentos de actina 913 La contracd6n muscular se inlcia por un aumento repentino de la concentraci6n de Ca 2• citos6lico 915 La troponina y la troporniosina median la regulaci611 de la contracci6n delmusculo esqueletico por el Ca" 916 Otras prOlefnas accesorias mantienen la arquitectura de la 916 miofibrilla y Ie propordonan su elasticidad La misma maquinaria contractU, en una forma modil1cada. se encuentra en el muscuJo cardfaco y en el musculo liso 917 En muchas celulas, la activad6n de la miosina depende de la fosforUaci6n de la cadena Iigera de la miosina 918 Resumen 920

EI cicio de la divisi6n celuJar La estrategla general del cicio celular

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La acumulaci611 y la destrucci6n de ciclina controla la activaci6n y la inactivaci6n de MPF La degradaci6n de la ciclina desencadena la salida de la mitosis EI MPF puede actuar como autQcataHtico. estimulando su propia activaci6n EI MPF activo induce los procesos subordinados de la mitosis EI sistema de control del cicio celular permite tiempo suficiente para que se produzca una ronda de replicaci6n del DNA en cada imerfase Un bloqueo de la re-replicaci6n asegura que ningUn segmento de DNA se replique mas de una vez en cada cicio celular EI paso por la mitosis hace desaparecer el bloqueo a las re-replicaciones Resumen

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939 940 94 I

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Las levaduras y la gen~tlca molecular del slslema de

935

control del cicio celular

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El crecimiento celular requiere una Interfase prolongada 936

con puntos de control del cicio celular

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Las levaduras de fisi6n y de gemacl6n cambian de forma a medida que van progresando a 10 largo del cicio celular Las mutacioncs del cicio de division celular detienen el cicio en puntas especfficos; las mutaciones wee permiten al cicio saltarse un punta de control de tamal'io Las subunidades del MPF en las levaduras son hom6logas a las del MPF en animales La actividad del MPF esta regulada pOT fosforilaci6n y desfosforilaci6n El mecallismo de activacion del MPF controla eJ tamana de las levaduras de fisi6n Para la mayorfa de las cclulas el punta de control principal del cicio celuJar se encuclltra en ellnicio de G1 La prOle(na Cdc2 se asocia con la cidina G j para conduclr ala celula mas alia del Inieio Las clclinas G1 median rnuchos de los controles que actuan

en el lnido

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Blbllograffa

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La quinasa de lnido pone en marcha la fabricacion de los componentes necesarios para la replicacion del DNA Los controles par retroallmentadon aseguran que las cEllulas completen un proceso de cicio celular antes de comenzar el siguiente El DNA dai'iado genera una sei'ial que retrasa la mitosis Generalmente los controlesporretroalimentacion en el cicio celular dependen de sei'iales inhibidoras Resumen

La regulacion del creclmiento y de la proliferacion de las cEllulas de mamifero se estudia nonnalmente en lineas celulares cuhivadas Los faetores de credmiento estimulan In proliferacion de cEllulas de mamlfero EI crecimiemo cclular y la division celular pueden ser regulados independientemente Las celulas pueden retrasar su division entrando en un estado especializado de no-crecimiento La ausencia de suero evita el paso por el punto de control G] EI sistema de control del cicio celular puede desensamblarse nlpidamente pero solo puede ensamblarse de nuevo, lentamente Las celulas veeinas compiten par los faetores de crecimiento Las celulas animales normales en eultivo necesitan anclarse para superar el Inido Estudios en celulns cnncerosns revelanla existencin de genes implicados en el control de la proliferaci6n celular Los factores de crecirniemo desencadenan cascadas de sei'lales intracelulares Las ciclinas y la Cdk son inducidas par factores de crecimiento tras un largo retras.o La protelna retinoblastoma acttia manteniendo la proliferaci6n bajo control La probabilidad de entrar en GG aumenta can el mlrnero de divislones celulares: la senescencla celular EI euerpo se genera y se mantiene mediante complieados patrones rcguladores de la division celular Resume/l

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Controles de la division celular en los anlmales pluricelulares El sistema de control del cicio celular es m~s elaborado que el de las levaduras

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Cap{culo

Los mecanlsmos de la dlvisl6n celular

18

Vision de conjunto de la fase M Trcs caracterfsticas son exclusivas de la fase M: la condensaci6n cromosomica, el huso mitotico yelanillocontnlctil La division celular depende de la duplicaci6n del centrosoma Tradicionalmente la fase M se divide en seis estadios Los org~nulos ciloplasmMicos grandes se fragmentan durallle la fase M asegurando que se heredan correctamente Resumen

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Mitosis Laformaci6n del huso mitotico en unacelula en fase M se acompafta de cnmbios sorprendentes en las propiedades dimlmicas de los mlcrotubulos Las interacdones entre microlubulos orientados en direcciones opuestas conducen el ensamblaje del huso Los cromosomas replicados se unen a los microtubulos por sus cinetocoros En los cromosomas de la levadura los complcjos proteicos cinetoc6ricos se ensamblan siguiendo secuencias especfficas de DNA centroml!rico Los cinelOcoros capmran los microtubulos nucJeados en los palos del huso Los extrcmos ~m~s" de los microlubulos cinetoc6ricos pueden ai'iadlr y perder subunidades de tubulina mientras estan adheridos al cinetocoro Los palos del hus.o repelen los crornosomas Las cromlltidas hijas se unen a polos opuestos del huso medianle sus cinetocoros Fuerz.as bipolares equilibradas mantiellen a los cromosomas en la placa metafllsica Los microll1bulos son dinllmicos en el huso metafasico

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fndJce de materias

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Las cromatidas hermanas se separan repentillamente ell la anafase La anafase se retrasa hasta que lodos los cromosomas se posicionan en la placa rnetafasica Dos procesos diferentes separan las crornatidas en la anafase EI desensarnblaje de los microtubulos cinetoc6ricos se produce dural1le la anafase A Dos fucrzas distintas podrfan contribuir a la anafase B En la telofase se recompone la envoltura nuclear a1rededor de los grupos de cromosomas Resumen

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Cltoclnesls EI huso rnitotico detennlna ellugar de la scgmentaci6n del citoplasma durante la citocinesis EI huso se reposiciona especfficamente creando divisiones celulares asimetricas La actina y la miosina generan las fuerF.as necesarias para la segmentaci6n En casos especiales, delerminados componentes celulares se puedell segregar a ulla sola cl!lula hija En las celulas de las plantas superiores, la citocinesis ocune mediante un mecanismo especial Una red de citoesqueleto determina el plano de division de las cEllulas vegetales La elaborada fase M de los organismos superiores evoJucion6 gradualmente a partir de organismos procariotas de fisi6n Reslmlen

IOlll

BlbUografia

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xxxi

Parte

Las celulas en su contexto social

IV

Adhesi6n celular, uDiones celulares y matriz extracelular UnIOIlef; celulares

Las uniones estancas forman una barrera de pcrmeabilidad selectiva a travE!s de los cpi/elios Las uniones de anclaje coneclan el citoesqueleto entre celulas 0 entre Ja cl'iluJa y la matriz extracelular Las uniones adherentes conectan haces de fibras de actina entre cclulas 0 entre la ccluJa 'J 13 matriz extraceJular Los desmosomas conectan filamentos intemledios entre c~lu[as; [os hemidesmosomas los unen a [a lamina basal Las uniones de lipo gap ~rmite}l el paso directo de pequeflas moll!culas e 1~1\llas Los conexones de las unlones de tipo gap estan compuestos por seis subunidades La mayor parte de [as cellilas embrionarias est~n acopladas entre sf durame las primeras etapas del desarrollo mediante uniones de tipo gap La pemleabilidad de las uniones de tipo gap esta regulada En los vegetales, [os plasmodesmos realizan muchas de las funciones de [as uniones de tipo gap Resumen

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Adhesion Intercelular 1032 Existen dos vias fundamentales mediante las cua[es las celulas animales se unen para formar tejldos 1032 Las celu[as de vertebrados disociadas pueden reagregarse en tejidos organizados mediante rnecanismos de adhesion selectiva celula-celula 1033 Las cadherinas median la union celula-cl!lula rlepcndicnte de Ca~' en los vertebrados 1035 Las cadherinas median la adhesion cclula-c~lu[aa traves de un mecanismo homofilico 1036 La adhesion interceJular independicmc de Ca~' esta mediada principalmente por unas protefnas pcrtcnecienles a la superfamilla de las inmunoglobulinas 1037 Muchos tipos de moJeculas de superficie celular actuan paralelamcnte mediando la adhesion selectiva celula-cl!lula y celula-matriz 1038 Los contactos no adhesivos pueden ser los inlciadores de fen6menos de adhesion intercelulat espec(ficos de tejido que poslcriormente son orientados yestabilizados por contactos de union 1040 Resumen

lO41

La malrlze,;tracelular de los anlmales La matriz extracelular estd producida y orientada por las cl!lulas que engloba Las cadenas de Fclucosaminoglucano (GAG) ocupan grandes vohlmenes, ormando geles hidratados Parece que el adda hialuronico facilita la migracion cel\tlar durante la morfogellcsis y la reparaci6n de los tejidos Los proteoglucanos estan compuestos por cadenas de GAG unidas covalentemente a una proteina central Las cadenas de protcoglucanos pueden regular las actividades de moleculas secrcladas de sel'ializaci6n Las cadenas de GAG pueden estar altamente otganizadas en la matriz extracelular

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xxxii

fndice de materias

CapflUlo

19

Los proteoglucanos de superficie celular acman como correceplorcs Las colligcnas son las pr01c1nas mas abundames de la malriz extracelular Las moleculas de colagella son sccretadas con unas extensiones no helicoidales en cada una de las regiones terminales Despues de su secrecion. las moleculas fibrilares de procol~gena son degradadas hasta moMculas de col~gena, [as cuales se organizan en fibrillas Las cohlgenas asociadas a fibrillas organizan estas fibrillas Las cl!lulas participan de [a organizacion de las fibras de co[agena que secretan ejerciendo lensiones mec~nicas sobre la malriz La elastina confiere a los tejidos su elasticidad La fibronectina es 1m protefna extracelular adhesiva que contribuye a la adhesion de [a ce[ula a la matriz Las diversas formas de fibronectina son producto de una maduracion a1temativa del RNA Las g[ucoproteinas de [a matriz ayudall a delerminar las vias de migracion ce[lliar !...1S moleculas de colagena de tipo IV se ensamb[an formando una red laminar que facilita la formacion de [a lamina basal La lamina basal esta compuesta fundamentalmente por co[agena de tipo IV, proteoglucanos del tipo heparan su]fato, laminilla y entactina Las laminas basales realizan divcrsas y complejas funciones La degradaclon de los componentes de la matriz extracelular esta estrechamente controlada Resumen Receplores de la malriz exlracelular en celulas anlmales: las Integrlnas Las integrinas son hcterodfmeros transrnembrana Las integrinas pueden inleraccionar con el citoesqueleto para unir las celulas a la matriz extracelular Las integrin3S permiten aI citoesqueleto y a la matriz extracelular comunicarse a traves de la membrana plasmatica Las cl!lulas pueden regular la actividad de sus integrinas Las intcgrinas pucdcn activar cascadas de seflalizaci6n intracelular Resumen La pared celular de los vegetales

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La composici6n de la pared celular depcnde del tipo celulat Las fuerzas de lension de las paredes celulares permiten a las celulas vegetales desarrollar una presion de turgenda La pared celular esta constituida por mlcrofibrillas de ceJulosa ermclejidas con una red de poHsaCliridos yprotcfnas Los micron1hulos orieman la deposicion de la pared celular Resumen

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Bibliograf(a

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Cl!lulas germlnaJes y fecundacl6n Las venlajll5 del sexo

En los animales pluricelulares. 18 rase diplolde es oompleja y larga mlcnlras que la haploide es senema y cona La reproducclon sexual confiere una venlaja oompelitiva a los organismos que se encuentran en un ambienle que cambia de forma imprevisible Resumen Meiosis La meiosis implica dos divisiones nucleares en lugar de una sola La redisuibucl6n gl!:nica aumenla dcbido al entrecruzamiento entre las CTomatidas hom6logas no hermanas EI apareamlenlo meiotico crom0s6mico culmina con la formaci6n del complejo slnapton~mico Se cree que los n6dulos de recombinaci6n median los intercambios de crom4ddas los qulasmas desempei\an un Irnportante pape! en la segregaci6n cromos
Qoc:llos EI oocllo es la tinica c~lula de un animal superior que es capaz de desarrollarse produciendo un nuevo individuo

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Un oocito cst.' altamente especializado para su desarrollo lndcpendlcnte. presentando grandes reservas nutritivas y una complcja cubiena proteclOra Los oocitos se desarrollan porelapas Los oochos crecen hasla alcanzar su gran tamano por media de mecanislIlos especiales

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Resllmen

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E5pennalowlde5 los espennatozoides esI~n altamente adaplados para deposilar su DNA en un oocito En rnuchas especles de rnamf(eros los espennatozoides se producen de manera continua Res,lmen

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Fecundacldn EJ contacto con la cubiena pelucida estimula al espermatlll.Oide a sufrir la reacci6n 3CrosOrnica La reaa:i6n conical del oocito contribuye a asegurar que sea fecundado por un SlJIo esperrnatllwide Una protefna de fusl6n lransmernbrana de la membrana plasm~lica del espennatozoide calaliza la fusi6n espermatozoide-oocito EI espennatolde propordona un cenlrfolo al z.igoiO Resumen

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BlbliografTa

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D1verslfk:acldn celular en el embrlOn animallemprano 1125 Las diferenclas iniclales entre los blast6rneros de Xenopus surgen a partir de la segregaci6n espacial de delenninantes en el huevo

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fndlce de malerias

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CapjlUlo

Mecanlsmos celulares del desarroUo Movimlenlos morfog4!nlcos y la fonna del mapa corporal La polarldad del embrl6n de anfiblo depende de la polarldad del huevo La segmentacl6n produce muchas cl!lulas a partir de una cl!lula hlicial La blastula es ulla cavidad rodeada por un epitello La gastrulacl6n transforma una esfera hueca de cl!lulas en una estructura triestratlficada con un intestino prlmltlvo Los movimlentos de ~astrulaCl6n se organizan alrededor del lablo dorsal de blastoporo Camblos activos del empaquetamiento celular suministran una fuel'Ul conductora para la gastrulad6n Las Ires capas gcrminales fonnadas por la gasttulaci6n lienen destinos distintos El mesodermo situado a cada lado del eje del cuerpo se fragmenla en somitos. de los que derivan las c~lulas musculares los pa.rones cambiantes de moleculas de adhesi6n celular regulan los movimientos morfogenicos Celulas mlgratorias invaden los tejldos del embri6n de fonna estrietamente conuolada EI plano eslructural del cuerpo de los venebrados se forma primero en mlnlatura y despub se mantiene a medida que el cmbri6n crece Resumen

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lnterncciones induclivas gene ran nuevos tipos de c~lulas en un patr6n cada vez m~s detallado Un sencillo gradiente de morf6gello puede organizar un complejo patr6n de respuestas celulares Las cl!lulas pueden reaccionar de forma distinta a una senal se~un el momento en que la reciban: funci6n de un re oj intracelular [;n los mam/feros. el protegido entorno uterino permite un tlpo eXlnlOrdinario de desarrollo temprano Todas las celulas del ernbri6n animal temprano denen el mlsmo potencial de desarrollo Las cl!lulas madre embrionarias de los mamfferos muestran cdmo senales procedentes del entomo puedcn controlar el rilmo y la vfa de desarrollo Resumen Memoria eelular, detennlnad6n celuJar y el conccpto de valores poslclonalC5 A menudo las celulas quedan detennlnadas para su futuro papel especiaJizado mucho ames de que se difercncien maniliestamente EI mornen.o de la dClerminaci6n celular puede ponerse de manifiesto por medio de experimentos de uasplante La detenninaci6n y 13 diferenciaci6n celulares renejan la expresi6n de genes reguladores EI eslado de determinaci6n puede eslar contfOlado por el citoplasrna 0 puede ser Intrfnseco a los cromosomas Las ululas de los tejidos en desarrollo recuerdan sus valores posicionales EJ patron de valores posicionales controla 1a proliferaci6n ce!ular yse regula a naves de intercalad6n

Resurrwn

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EI gusano nemlitodo: los genes controladores del desarrollo y las leye5 del comportannento celular OJenorhabditis ekgons es anatomica y gen~ticamente sencillo EI desarroUo del nemiilodo es praeticamnle invariable los genes de oonlrol del desarrollo definen las leyes del comportamiento celular que generan el mafia corporal La inducclon de la vulva depcnde de un amplio conjunlo de genes controladores del desarrollo Pruebas gen~tlcas mlcr~Uin1rglcasrevelan la loglca del connol del desarro 10: el c10naje y la secuenciaclon de genes nos ayudan a descubrir su bioqufmica MUlaciones helerocnSnicas ldentifican los genes que espedfican cambios en las leyes del comportamlento celular a medida que transcurre el tiempo E1"tempo· del desarrollo no esl(rontrolado medianle el cicio de division celular Las clHulas mueren ordenadamenle como pane del prognuna de desarrollo Resumen

Los genes selectores home6dcos son esenclales para la

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Drosophila y la gen~dca molecular del palrdn

de formaclon. I. G~nesl! del mllpa corporal EI cuerpo dellnsecto se construye medianle la modulacion de un panon fundamenlal de unidades de repetici6n Drosophila Inkia su desarrollo como un sincitio Dos sislemas onogonales definen el mapa geomttrico del embrion Influencias procedentes de las Cl!:lulas que envuelven el huevo marcan el inicio del modelaje del embrion EI eje dorsoventral se define en el inlerior del embrlon mediante una prote.[na reguladora de genes con un gradiente de concentraclon intranuclear EI sistema posterior define las c~lulas germlnales y tambi~n los segmentos corporales posteriores EI mRNA locallzado en el polo anterior codifica una prolelna reguladora de genes que constituye el gradiente morfogt!nico anterior Tres dases de genes de segmenlaci6n subdivlden el embrion La expresion localizada de los genes de segmenlacion esta regulada por una jerarqufa de senales de posicion EI prodUCIO de un gen de segmenlacion conlrola la expresion de otro gen generando un palnSn delallado los genes de polaridad del huevo gap y de regia par generan un patrontransltorio que es recordado por otros genes Los genes de la polaridad de sesmento marcan las subdlvlsiones lmslcas de ca a parasegmento Resumen

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fndJce de materlas

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EI de51lrTOIlo vegetal EI desarrollo embrionario empieza con el establedmiento del eje ralz-brote y se detiene en el interior de la semiUa Los mOdulos repelitivos de una planla son generados !ecuencialmenle por los meristemos La forma de cada nueva estruetura depende de la orientacion de Ia divisiOn celular y de La expansion Cada mOdulo de la planta creee a panir de un conjunlo mlcrose6pico de primordios de un meristemo Seftales honnonales de largo alcance coordlnan los procesos del desarroUo en panes diSlanles de la planta Arabidopsls se utillza como organismo modelo para la gen~tlca molecular de las plantas Los genes selectores home6ticos definen las partes de una flor Resumen

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EI dC5at1'OJlo neural Las reservas de ncuronu generadas en el inkin del desarrollo neural no se reemplazartn posterionnente EI momento y ellugar de nadmienlo de una neurona determinanin sus conexiones Cada axon 0 dendrila se extiende gracias a un conn de crccimiento situado en su extremo El cono de crecimiento conduce ill lIil1'O a III neurita en desarrollo a trav~s de una via definlda con precision Los telldos diana liberan (actores neurotr6ficos que connolan el crecimienlo y la supervivencla de las c~lulas nerviosas Los valores posicionales de las neuronas gulan Ia formacion de mapas neuronales ordenados: doctrina de Ia espedficidad neuronal Los axones de lados opuestos de la retina responden de fonna distinla al gradiente de las molt!culas repelemes delleetum Los patrones difusos de las conexiones sinllplicas se definen mediante la eliminadon de la sinapsls dependlente de activldad La experiencia moldea el patron de conexlones sinllpticas del cerebra Reliumen

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Drosophila y Ia genetka molecular del plItron de fonnackSn.lI. Genea selec:toru home6ticos

y model_Ie de las partes del cuerpo los genes selCClores home6licos del com~le}o bithorax y del complejo Anlennapedia definen as diferencias entre parasegmentos los genes seleclores home6llcos codifican un sistema de marcadores moleculares de direccion Las regiones de control de los genes seleclores homeoticos Bctuan como chips de memoria de informacion poslcional La mosca adulta se desanolla a panir de un conjunlo de discos Imaginales que contienen In(onnacion posicional

memoria de la informaci6n posicional de las ~Iulas de los discos imaginales LosJ::enes selectores home6ticos y los genes de polaridad el segmenlo definen los companimienlos del cuerpo La expresion localizada de proteinas especfficas antecede la producclon de quelas sensitivas La inhlbiclon lateral regula el patron delallado de tipos celuhues diferenclados los genes de control de desarrollo de Drosophila {ienen homologos en los vertebrados Los mamfferos Ilenen cualro complejos HOM homologos los genes HOI definen los valores poslclonales en los vertebrados lal como ocurre en los insectos SUbconjunlos de los genes HOI se :I:resan distribuidos a 10 largo de los dos ~ onogon es de las }'emlls de las e:xIremidades e los vertebrados Resumen

1171

1171

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1172

1174

BlbUograf{a

1200 12<)1

1203 1205

1205

1Z
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1210 12l! IZIZ

capItulo

Celulas diferencladas y conservaci6n de los tejidos Manlenlmlento del est.do dlferendado La mayorCa de las ceIuJas diferendadas rocuerdan $ll canieter esenciallncluso en un nuevo entomo E1 eslado diferenciado se puede modular por 1'1 COlOma celular

Resumen

IZl9 1221 1221 1222

Tejkloseon ceIulas pennanentes Las cEluias del centro del cristalino del ojn de un aduho son residual del embri6n La mayona de las celulas permanentes renuevan sus compo(: las celulas fOlOrreceplOras de la retina Resumen

1222

RenovaclcSn por blpartlclcSn simple Las funciones del hrgado como interfase enlre el tracto dlgestivo y la sangre La pl!rdlda de celulas hep4ticllS estimula la proliferati6n de celulas hepaticas La regeneracion requiere el crecimlento coordinado de los consutuyentes de los tejidos Las celulas endoteliales revisten todos los vasos sangulneos l..as nuevas celulas endoteliales se gene ran por biparticion simple de celulas endoteliales ya existentes Los capilares se forman mediante proliferaci6n La angiogenesis esta controlada por factores de crecimiento Uberados por los lejldos proximos

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Raumen Renovaddn por medIo de cilulas madre: I. epidermis las celulas madre pueden dlvidirse sin IUnite y dar lugar a una progenie diferenciada Las celulas madre epidennicas se encuentran en la capa basal Las celulas epidennicas en diferenciaci6n sintetizan una secucncia de queratinas diferentes a medida que maduran Las celulas madre epidennlcas son un subconjunto de las celulas basales La prollferacion de las celulas basales se regula en funci6n del grosor de la epidermis Las cEilulas secretoras de la piel est:!.n agmpadas en glilnduJas que tienen su propill cim!tica de poblaci6n Resllmen Renovacl6n por medlo de celulas madre plurlpotenclales: formacl6n de las celulas sangufneas Existen U"es tipos prlncipales de gl6bulos blancos; los granulodlos, los monocitos y los Iinfocitos La produccion de los distintos tipos de celulas sangumeas en la medula 6sea se halla controlada individualmente

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1233 123' 1235 1230 1237 1238

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22

La m&luJa 6sea contiene las ~lulas madre hemalo~licas

Las cElulas madre pluripolcnciaJes dan Iugar a 1000S los lipos de celulas sangufneas EI mimero de celulas san~rneas especializadas se ampUflCa por divtsiones de celu as progenilontS determinadas Los faetores que ~an la hemalopoyesis pueden

analitarse en tlvo La erilropoyesis depende de la hormona eritropoyetina

r

Indlce de materias

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125<) 1251 1252

En la produceidn de los neutr6fi1os y de los macrofagos InOuyen mUltiples CSF Las celulas madre hematopoyelicas dependen del comaclo con cl!lulas que expresan el faclOr Steel El comportamiento de una cl!lula hematopoyl!tica depende parclalmente del azar La regulacion de la supervivencia celular es tan importante como la reguladon de III prollferadon celular

Resumen Genesis, modulacldn y regeneracldn del nnisculo esqueletlco Las nuevas celulas del musculo esqueletico se fonnan por fusi6n de los mioblastos Las fibm musculares pueden modular sus propiedades mediante cambios de las protelnas isofonnas que

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1255 1256 1256 1258

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""""n

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En el adullO perslsten algunos mioblastos como celulas madre qulescentes

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Rnumen

1'"

nbroblastos yaus lnnSformadones:: la familla de 13.5 d1u1u d~ teJldo conJuntlvo Los fibroblastos cambian sus caracterlslicas en respuesta a sei\ales de la matrizextracelular La matriz exrracelular puede innuir en la diferenciaci6n de las celulas deltejido conjuntivo, afeclando a su adhesion y a su forma Distintas mol~ulas seftal aCluan de forma secuencial regulando la produccion de adipocitos EI hueso se remodela contlnuamente por medio de las celulas que 10 constituyen Los osteoblastos segregall matriz osea, mlelltras que los osteoclastosla erosionan Durante el desarrollo, los osteocillstos erosionan el cartl1ago y se abren paso en el hUl:so La estmclura del cuerpo cst:!. estabilizada mediante su armaz6n de tejido conJuntlvo y mediante la cohesi6n selectiva de las celulas loll;

Resumen

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A~ndlce

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Blbllografla

Catillogo de las c~lulas del cuerpo humano adulto

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Capftuk!

El sistema inmunitario Base celular de la InmunJdad EI sistema inmunitario humano est' compuesto por billones de linfocilos Los linfodtos B producen las repuestas humorales con anticuerpos; los Iinfocitos T producen las respuesla mediadas por celulas Loslinfocilos se desarrolllln en los organos linfoides primarios y reacclonan con los anlfgenos extranos en los organos llnloides secundarios

1247

Z3 1280

1260 1281

1282

Los marcadores de superficie celular permiten distinguir

y separar las celulas T de las cl!lulas B Eisistema inmunitario actua mediante la selecci6n clonal La mayona de antigenos estimulan muchos clones diferentes de Iinfodtos La mayona de 10slinfociloS recirculan continuamente La memoria inmunologlca se debe a la expansi6n clonal y a la madurad6n de los linfocitos

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1266 1288

La falta de respueSla ante los ant(genos propios cs debida a una lolerancia inmunoldgica adquirida Resumen Propledades funclonales de 10. anllcuerpot Los receplores de las celulas Bespedflcos para los anllgenos son moleculas de anticuerpo Las celulas B pueden ser estimuladas a segregar anticuerpos en una placa de cuhivo Los anlicuerpos lienen dos lugares Identicos de unJ6n aI anlfgeno Una molecula de antlcuerpo estlt compuesta por dos cadenas ligeras ldt'!nlicas y dos cadenas pesadas idt'!ntlcas Existen cinco c1ases diferentes ,decadenas pesadas. cada una de las cuales tien~roPiedadeS biol6gicas dislintas Los anticue~ pueden tener cadenas Iigeras Ie 0 A. pero no e ambos tipos La intensidad de una inte11lcddn antfgeno-anticuerpo depende tanto del mlmero de lugares de unidn ocupados como de 1a afinidad de cada lugar de uni6n La utilizacl6n del oomplemento por los anticuerpos contribuye a la lucha oont11llas infecciones baeterianas Resumen La estroctun Rna de los antlcuerpol

Iigeras y las cadenas pesadas presentan regiones conslanles y regiones variables Las cadenas Iigeras y las cadenas pesadas contienen Ires regiones hipervariables cada una. que en conjunlO forman ellugar de unldn al antJgeno Las cadenas Iigeras y las cadenas pesadas estltn plegadas en dominios rcpetltivos similares Estudios por difraccidn de rayos Xhan revelado la eslruetura tridimensional de los dominios de las Ig y de sus lugares de uni6n al antlgcno Resumen

Las mol&ulas MHC y 1a presentacl6n del antrgeno

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Las cadenas

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La generacldn de la dlvcl'llidad de los antlcuerpos

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Durante el desarroUo de las ct'!lulas B. los genes de los anticuerpos se cnsmnblan a partir de segmcntos gl!nicos aisllldos cada regldn Vesta codlncada por Ollis de un segmento

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g~nico

La unidn impredsa de los segmentos gt'!nlcos aumenta la diversidad de las reglones V La hlpermutacldn somatlca dlrlglda por el antlgeno acaba de afinar las respuestas de antlcuerpos La unidn de los segmentos gt'!nJcos de los 8nticuerpos eSta regulada ast'gurando que las cl!lulas B sean monoespecrficas Cuando las ce1u1os Bson estlrnuladas por un anlfgeno. pasan de la producci6n de antlcuerpo ligado a la membrana a la produccidn de la forma segregada del mismo antlcuerpo Las celulas B pueden cambiar la clase de anticuerpo que producen Resumen Los receptoteS de las celulas T y sus subclases

Los receptores de la celula T son helerodlmeros similares a los anrlcuerpos Las diferentes r~ueslas de las ct'!lulas T e51:\n mediadas por distintas ases de celulas T Resumen

xxxvi

rndice de materlas

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a las celulas T Ex.islen dos c1ases principalcs de moh!culas MHC Esludios por difraccldn de rayos Xrevelan ellugar de unidn al antfgeno de las protelnas MHC asl como el peplido de unidn Las moleculas MHC de c1ase I y de c1ase Illienen fundones distintas Las prolefnas CD4 y CD8 actl.ian como oorreceptores de unidn a MHC en las celulas T oolaboradoras y ciloldxicas. respectivamente Resumen

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Las dhl'" T cltot6xicas

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Las cBulas T c1tol6xicas reconocen fragmenlos de prote{nas vlricas en la superficie de celulas infectadas por virus los transponadoresABC codificados por MHC trnI1sfieren fragmenlos peptfdicos desde el cltoso[ hasta Ia luzdel ER Las celulas T citotdxicas Inducen a las cBuias diana infectadas a deslruine a sf mismas Resumen

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1323

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C4!lulas T oolaboradoru y actIvad6n de las cil.ulas T reconocen fragmenlos de protefnas antll¢nicas endocitadas. asociadas con protefnas MHC de clue II Las celulas T oolaboradoras se aetivan por las ct'!lulas presentadoras de antfgeno £1 receptor de una cl!lula T forma parte de un gran complejo de sel'ializacldn en la membrana plasmlttica Para aetlvar la cl!lula T colaborad011l se requieren dos senales slmultltneas Las ct'!lulas T colaborad011l5, una vez activadas. se estlmulan a sf mismas y a Olras ct'!lulas T para proliferar mediante la secreci6n de Interleuquina-2 Para responder ante un antlgeno. la mayona de las ct'!lulas Bnecesltan la partidpaddn de las ct'!lulas T colaboradoras La aCtlvacldn de las cl!lulas B por dlulas T colaboradoras se produce tanto por sei'lales unidas a la membrana como por sel'iales segrcgadas Algunas c~lulas T colaboradoras act ivan las ct'!lulas T dtot6xlcas y los macrdfagos mediante la secrecldn de Interleu
1326

Seleccldn del repertorlo de celulas T Las celulas T ~ue reconocen pl!ptidos asociados a las O1ol&u as MHC proplas son seleccionadas posltlvamente durante su desarrollo en el timo Las celulas T en desarrollo que reaccionan fuertemente con los pt'!plidos propios unldos!l mol&ulas MIIC propias son eHminadas en el tlmo A1gunas formas alt'!licas de O1ol&ulas MliC no son efectivas en la presentacidn de antfgenos especfficos a las celulas T: genes de la respuesta inmunJlaria (/r] EI papel de las protefnas MIiC en la presentacidn del antfgeno a las ct'!lulas T proporciona una explicaddn de las reacdones de trasplante y del polimorfismo MHC Las moleculas de reconocimiento inmunilario penenecen a una antigua 5uperfamilia Resumen

1335

BlbUografia

1341

Las celulas T colaboradoras

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CallfIU]O

Cancer

J

24

£1 cancer como un proceso de mlcroevoluddn Los canceres dificrcn en fundon del tipo celular del quedcrivan La mayana de canceres derivan de una sola c~lula anormal Probablemenle 101 mayona de canceres se inician por un cambio en 13 secuencia de DNA de una celuJa Una sola mutacidn no es sufidente para causar dim::er Los canceres evolucionan mediante etapas lenlas a partir de c~lulas allcradas benignas La progresidn de los tumores implica rondas sucesivas de mUlacl6n y selecci6n nalural EJ de5arrollo de un clrn::er puede eslareslimulado par faclore:s que no aheran la secuencia de DNA de las cEluias La mayo"a de canceres se producen jXW combinaciones evitables de caU$ll5 ambtentales ~ La bUsqueda de curaciones para el er es dura pero no imposible EJ crecimienlo cancel'OSO depende a menudo de des6rdenes de la diferenciaci6n celular Para fonnar metastasis, las eEluias caneerosas han de sercapaces de cruzar la lo1mina basal Las mUlaciones que aumenlan la frecuencia de mUlaci6n aceleran eI desarrollo del clncer FJ incremento de la capacidad de mUlar de las celulas cancerosas confiere a eslas celulas una dena capacidad de evadirse de la destrocci6n producida pordrogas anticancerosas Resumen

134'

GenEtic. molecular del cAncef' Los retrovirus pueden aetuar como veclOres para los oncogenes que modifiean el componamienlO celular Los renoviros recogcn oncogenes par accidente Un retrovirus puede transformar WHI celula huesped inserlando su DNA en un lugar pr6ximo a un proto·onoogen del huesped

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(ndlce de materias

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Difercntcs investigaciones sobre la base gen~tica del cancer convergen sobre disfunciones de un mismo pequci'lo gmpo de prolo-oncogenes Un £rOlo-oncog~n pucde ser convertido en onoo~nico e muchas mancras

Las acciones de los oncogenes puede ensayarse individualmenlc 0 combinadas entre sf en tatones Iransgenicos La perdida de ulla copia de Ull gen 5upresorde (umores puede gencmf predisposicion hereditaria aI ancer La ~rdida del gen supresor de rumores de retinoblastoma illlerviene en muchos dnceres distinlos los virus de DNA tumorales aclivan la maquinaria de replicad6n del DNA de Ia celula como pane de su eslflllegia para sobrevivir Los virus de DNA tumorales activan Ia maquinaria de replicaci6n de Ia celula bloqueando la aa:i6n de los genes dave supresores de tumores MUlaciones en el gen p53 inhabililan eI freno de emergencia de la proliferaci6n celular ycollducen a una incslabilidad genElica Los clnceres colon-rec1a1es se desarrollan lentamente, a tra~ de una sueesi6n de cambios eslrocturales visibles Las mUlaciones que conducen aI clncercolon-rectal pueden ser idenlificadas euminando las celulas cancerosas y esludlando las faroilias propensas a desanolJar clncer Dcleciones geneticas en las celulas cancerosas colon-reclales revelan lugares de JM!rdlda de genes supresores de tumores Las elapas de la progresi6n lumoral puede correlacionarse con dClcrminadas mUlacioncs Cada caso dc co1ncer sc caractcriza por su propia sucesi6n de lesioncs gcnelicas

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Restlmell

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8lbllografra

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Lexico de terminos utillzados en esta edici6n allolaetose:: alolaC1osa annealing::: onion, enlace 8ntipon:: Iransl'0rte de lntercamblo antisense:: antisentido, sin sentido backstitching:: punto hacia atr(l,s

beads on a string:: cuentas ensarladas blofl '" transferencia branch migration:: migration de la cadena boundary:: limite budding yeasl '" levadura de gemaci6n bulk lesion:: gran lesion cap", capucha. caperuza capping:: fonnaci6n de la apucha 0 caperuza catabolite activator protein:: pmlCrOa activadora de los catabolitos chromosome walking" caminar por el cromosoma cleavage = fragmentacion cloth oftissue nuid = codgulo de plasma cloverleaf = estructura en hoja de tr!lbol cluster = grupo. 8gregaci6n coaled pits:: depresiones revestldas (0 recublertas) coaled vesicles:: ves{culas reveslidas (0 recubienas)

cohesive ends extremos cohesivos E

coiled coil:: hl!lice sobreenroUada combinatorial gene regulalion:: regulad6n I¢nica por combinad6n core:: micleo. zona cenuai cosmidll '" c6smidos (clones de C elegans en \"eClores del fago lambda) oouflIerpan :: complemefllario crossing-over" entrecruzamiento cross-strand exchange:: intercamblo cruzado de cadenas; entrecruzamlento decondensallon" desespirallzllcl6n deep-elch:: subllmaci6n depurination:: despurinad6n derepressed:: desreprimido (operOn inducible) directs:: gula DNA-looping model for enhancer aClion" modele de acd6n de los aetivadores mediante asas de DNA domain shuffiing '" bamjado de los dominios donor junction acceplOr:: enlace entre la regi6n dadom y la aceplora donor splice junclion:: regi6n dadora en la maduraci6n double minUle chromosomes:: pares de cromosomas diminulos down-stream:lt en direccl6 3' down regulation" reguJaci6n por disminuci6n ear vesicle'" vesicula audltiva engineered:: conSlruido in lJi/ro enhancer elemelll '" elememo aetivador ("enhancer". aumentador. activador) ezpression veclOrs '" veclores de expresi6n feedback", renoalimemad6n fingerprinl '" an.6Iisis de huellas daclilucs fiston yeasl '" levadum de fiOOn foolprinling", anaJisis de huellas frameshifting'" modificad6n de 18 paUla de leclUra freeze-drying", UofiUzacwn freeze-etch'" grabado por oongelacl6n fruit fly:: mosca del vinagre gap junctions'" unlones comunicantes, uniones de tipo "gap~ gel-mobility shift studies:: experimenlos de retencl6n en geles gene casseues '" caseues genicas gene regulalOry prolein '" protelna reguladora de genes. protelna reguladora generallranscription machinery:: maquinaria general para la llanscripci6n genetic linkage '" Iigamiento genelico hairpin:: horquilla helix-turn-helix '" helice-vueIta-helice helper virus '" virns auDliaf heleroduplex joint '" uni6n helerodliplex Holliday junCllon '" intermedio de Holliday housekeeping'" constitutive

C

xlvi

Nota de los traductorcs

hybride selection" seleccl6n de hlbridos hybride Ion" Ion hldruro (l.1) Input" aporte Insertional mutagenesis '" mutag~nesis por inserci6n Interspersed repeated DNAs: secuencias repetidas intercaladas de DNA iaclOse repressor protein" protefna represora de la lactosa lagging strand" hebra retardada, hebra retrasada lampbrush: plumulados [cromosomas) large T-antlgen: antlgeno T grande leader" gufa leading strand: hebra conductora leak" fuga (del K') left-handed" lev6gira Ugand: Iigando mapp (to): haur un mapa master gene: gen patron maling-type '" tipo de apareamlemo membrane zlppering mechanism" clerre de la membrana por cremallera midbrain" mesenuralo mismatch" error de apareamiemo natural killer" ctIu1as agresoras naturales nkk"muesca NMR:: resonanda magne..lca nuclear notochord:: notoconla nuclear run on: run on nudear nuclease-hipersensitive slle:: zona hipersensible a las nucleasas nucleosome phasing:: distribuci6n de los nudeosomas en fase off" Inactivado on:: aetivado output" salida palch: mancha. porci6n. zona patch clamp recording: rcgislro de zona patching:: parcheamlento pauem" patron pellet:: precipltado phase varlation" camblo de rase photobleaching: fotoblanqueamienlo playing head. aparnto reproductor pollmerase chain reaction:: reacci6n en cadena de 1a pollmerasa pool "aeervo primase" primasa primer" cebador prlmosome:: primosoma probe:: sonda probe (to): sondar processing" maduraci6n proofreading mechanism" verlncaci6n de lectura puff:: aSIl, protubernncla, lazo puise-field gel electrophoresis = electroforesis en gel de campo pulsante rate = propord6n, relaci6n reading frame" paUla de lectura recording patch" reglstro de zona replication bubble: burbuja de replicacl6n replication forc. horqullla de replicad6n reporter gene" gen informative restrlcuion fragmelll length polymorphism" polimorflsmo de longitud de fragmentos de restricci6n reverse genetics" gen~lica reversa, genl!!tica inversa right-handed: dextr6girol scanning: barrldo sea squirt" ascldia selfassembly = aUioensamblado self splicing: automaduntci6n selfish: egofsta. Interesado SEM = microscopla electronica de barrido SCmliki forest virus. virus semliki forest sequence-specific DNA-binding protein:: protefna que se une a secuenclas espedfkas de:! DNA shadowing = sombreado shotgun" perdigonada shulfling = mezdado, barajado M

M

Nota de los traductores

xlyU

sinaplonemal: sinaplon~mico single-slnllld DNA-binding prOlein: protefna de union aI DNA de una sola hebra sile specific recombination: recombinacion de silio especifico size: centro, lugar slot: muesca snRNP: RPNsn solid bead: superficie de cuentas space-filling model: modelo tridimensional spliceosome: espliceosoma splicing: madurati6n por corte y empalme slable transcription complex: completo transcripcional eslable staggered: escalonados, proluberamcs staggered joint: union solapada, enlace 0 union de exrremos protubcrantes start site: lugar de Initiation start sile for RNA symhesis '" IJunto de inicio de la sintesis de RNA step'" etapa Slepwise: gradualmenle SlOp codons '" codones de terminad6n strand '" hebra, cadena stringency '" rigor, grado, exigenda subslractive hybridization: hibridaci6n subslractiva subvert '" deslruir, traslomar supercoil: sobreenroUado swivel", desenml1amiento alrededor de la cadena imaeta symport '" cotransporte unldirecclonal target '" diana TATA box '" caja TATA template", patron, molde tight junction", union hermetica, union fuene, uni6n estable time-lapse microcinema: microcinematograffa a intervalos tomato bushy stunt virus: virus achaparrado peludo dellomale transcripts'" lranscritos transposable", transponlble transposases" lransposasas trigger'" poner en marcha, disparar trimming: ajuSle tum off a gene", dcsactivar un gen tum on a gene" actilr,n un gen two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis: elcclroforesis bidimensional en gel de pollacrilamida underfocus '" desenfocado unipon '" lransporte sencl1lo unwing" desenrollnr upstream'" en direcclol1 5' upstream promotor clemen I "elemento promotor en direcci6n 5', clemenlo promolor video-enhanced COnlmst lighl microscopy: microscopia de contrasle vfdeo-ampliflcadn western blotting'" lransferencia de prote[nas desde un gel de poliacrilnmlda a un mIra de nallon 0 nltrocclulosa, lrnnsfcrencia de tlpo western whisker" pelo, flceo wind" enrollar, empa
xlviii

NOla de los lraduclores

Introduccion alacelula

El scntido de la escala: estas eleclronrnicrograffas tomadas a ampliaciones cada vez mayores muestran celulas bacterianas sabre In punta de un alfi1er domestico. (Por cortesra de Tony Brain y de Science Photo Library.)

E1ectronmicrografia de barrido de dlulas de levadura en desarrollo. Estos eucariotas unicelulares generan por gemaci6n pequei'ias celulas hijas cuando se mulliplican. {Por conesia de Iva Herskowitz y Eric Sc::habatach.J

La evoluci6n de la celula

I ·Deede"mr'f~"" _Iap_ _

.De"'~

a 101 eutarlobll

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.De"~""'.'"

Todas las criaturas vivas estan fonnadas por celulas -pequefios compartimientos rodeados de membrana y lIenos de una soluci6n acuosa concentrada de compuestos qufmicos. Las rarmas mas simples de vida son celulas solitarias que se propagan dividh~ndose ell dos. Los organismos superiores, como nasolTOS mismos, son como ciudades celulares en las que grupos ~ clHulas rea1izan funciones especiaLizadas y estan tmidos por intrincados sistemas de comunicaci6n. Las ct'Hulas ocupan un punto intermedio en la escala de la complejidad biol6gica. Las estudiamos para aprender, por un lado. c6mo eslan fonnadas a partir de las mollX:ulas y, porotro. c6mo cooperan para constirnir un organiSIno tan complejo como un ser humano. Se cree que lodos los organismos, y ladas las celulas que los constituyen, descienden por evoluci6n mediante se/eccion natural de una cl!Hula ancestral comun. La evoluci6n implica dos procesos esenciales: (I) la aparici6n de una IJtlriacMrr al azar en la infonnaci6n genetica transmitida de un individuo a sus descendientes, y (2) la selecci6u de la informaci6n genetica Que ayuda a su ponador a sobrevivir y multiplicarse. La evoluci6n es el principio central de la biologfa, ya que nos ayuda a comprender la asombrosa diversidad del mundo vivo. Este capitulo, al igual que todo ellibro, se ocupa de la progresi6n desde las moleculas hasta los organismos pluricelulares. Estudia la evoluci6n de la celula, primero como unidad viva constituida par partes menores, y luego como bloque constitutivo de estructuras mayores. A lTaves de la evoluci6n presentamos los componentes y actividades celulares que se tratanin con mayor detalle en los capftulos siguientes. y en una secuencia m~s 0 menos igual. Empezando con los origenes de la primera celula en la Tierra, estudiamos c6mo las propiedades de cienos tipos de grandes moleculas permiten que se transmila y exprese la infonnaci6n hereditaria y penniten que se produzca la evoluci6n. Rodeadas por una membrana, estas molecuIas constituyen la parte esencial de una cefula que se replica a sf misma Luego describimos la rransmisi6n principal que se produjo en el transcurso de la evoluci6n, desde unas pequenas celulas parecidas a baeterias haSIa unas celulas mucho mayores y complejas, tales como las que se encuenlTan en los animales y plantas actuales. Finalmente, sugerimos la manera en que las celulas aisladas, de vida Iibre. dierol1 lugar quiUs a los grandes organismos pluricelulares, espccialjZ<1ndose y cooperando eo la fonnaci6n de 6rganos Ian complejos como el cerebro. Es evidente Que presentar la celula a trav~ de su evoluci6n tiene sus riesgos: las grandes lagunas de nuestro conocimienro s610 pueden superarse par medio de especulaciones quizas err6neas en muchos delaUes. No podemos retroceder en el tiempo para conocer los fen6menos moleculares que tuvicron lugar hace 3

miles de millones de aflos. Pero algunos sucesos antiguos han dejado muchas huellas para nuestro amilisis. Plantas ancestrales. ani males y tambien bacterias estan preservadas como f6siles. Aun mas importante, todos los organismos actuales proporcionan evidencias de las caracterfsticas de los seres vivos del pasado. Concretamente, las moleculas biol6gicas actuales son una fuente rica de informaci6n sobre el curso de la evolllci6n, ya que ponen en evidencia semejanzas fundamentales entre los mas dispares organismos vivos y nos permiten organizar las diferencias que existen enfre ellos construyendo una escala objetiva universal. Estas diferencias y similitudes moleculares representan para nosotros un problema semejante al que se enfrenta un literato que intenta establecer cwil es el texto original de un autor antiguo. comparando varios manuscritos diferentes que han sido variados por repetidas copias y ediciones. La tarea es dura y la evidencia es incomplela, pero al menos es posible proponer conjeturas inteligentes acerca de las principaJes'fases de la evoluci6n de las celulas vivas.

o

L.o--trampa o calor

Desde las moIecuias hasta la primera celula I En condiciones prebi6ticas se pueden formar moMcuJas bioI6gicas ,,2 Las condiciones que reinaban en la Tierra durante los primeros mil mill ones de aflos son aun tema de discusi611. lEstaba inicialmente (undida la sllperficie terrestre? lContenfa la atm6sfera amonfaeo, 0 metano? Sin embargo, todo el munclo parece estar de acuerdo en que la Tierra era un lugar violento, con erupciolles volcanicas, relampagos y lIuvias torrenciaJes. Existfa muy poea, 0 ningllna, eantidad de oxigeno libre, y no existfa lIna eapa de ozono que absorbiera la radiaci6n ultravioleta del sol. La radiaci6n, mediante su acci6n fotoqufmica, pudo haber contribuido a que la atm6sfera fuese rica en moleculas reaclivas y alejadas de su equiJibrio qu(mico. Es probable que bajo estas condiciones se produjeran moleculas organieas (es decir, moleculas que contienen carbo no) simples. La prueba mas clara de ello procede de experimentos de laboratorio. 5i se toman mezclas de gases como CO 2, CH 4, NH 3 YH2 , se calientan con agua y se activan mediante descargas eICctricas 0 radiaei6n ultravioleta, se observa e6mo los gases reaccionan formando pequenas moleculas organicas -por 10 general, un pequeno numero de mohkulas diferentes, eada una de elias producida en grandes cantidades (Figura I-I). Entre estos productos se cuentan diversos compuestos, taJes como el cianuro de hidr6geno (HCN) y el formaJdehfdo (HCHO). que en soluci6n acuosa sufrcn rapidamente reacciollcs posteriores (Figura 1-2). Y 10 que es mas importallte, se generan moleculas representativas de la mayorfa de las prillcipaJes c1ases de moleculas organicas encOnlradas en las celulas como aminoacidos, ClZllcares y las parinas y pirimidinas necesarias para sintetizar Illlcle6tidos. Aunque estos experimentos no pueden reproducir con loda exactitud las condiciones primitivas de la Tierra, pallen de manifieslo el hecho de que la forruaci6n de moleculas organicas es sorprendentemente facil. Y In Tierra en formaci6n tenfa inmensas ventajas sobre cualquier experimentador humano; era muy grande y podfa producir una amplia gama de condiciones. Pero, sobre todo. disponfa de mucho mas tiempa -cientos de mil10nes de afios. En tales circunslancias, parece muy posible que. en algl1n lugar y en algun momento determinados, muchas de las moleculas organicas simples que se encucntran en las celulas acruales se acumularan en concentraciones elevadas.

Pueden desarrollarse sistemas quimicos complejos en un entorno alejado de su equilibrio qufmico Las molecliJas organicas simples como los aminoacidos y los nucle6tidos se pueden asociar formando grandes polfmeros. Un aminoacido puede unirse a 4

Capltulo I : La evoluci6n de la c~lula

Figura I-I Tfpicoexperlmenloque simula las condiciones en la Tierra primil.iva. Se calienta agua en un aparalo cenado que contiene CI".. NH1 YH2 • Yse hace pasar una descarga electrica a traves de la mezcla gaseosa. En e[ tubo en U se acumuJan compuestos organicos.

HCHO

formaldehido

HCOOH

lllcido f6rmlco

HCN

cianuro de h;dr6geno

CH1COOH

dcido actltico

NHiCHiCOOH

glicina

,

CH1CHCOOH

dc,do Ilictico

OH

,

NHiCHCOOH

alanina

CH,

,

NH -CHiCOOH

aarcosina

CH, NHI-C-NHi

uraa

"

0

NH

2r HCOOH

dcido npllrtico

CH, ,

CaOH

Figura I -2 Algunos de los compuestos que se pueden fonnar en el experimenlo descrlto en 10 Figura I-I.

Los compueslos indicados en color son componentes importantes de las celulas vivas aClUaJes.

... ..

Figura 1-3 Fonnad6n de poUnude6tJdos y de pollpipUdos. Cuatro tipos de nudoolidos (aquf represenladoscon las letrasA. U, Gy C) pueden sufrir una polimerizaci6n

espontanea con ~rdida de agua. EJ

'\

producto es una mezcla de polinucle6tidos de longitud y secuencia aleatorias. De forma similar, aminmicidos de diferenles tipos, simbolizados aqu{ mediante nombres abreviados de Ires lelras, pueden polimerizar entre eUos fonnando

otro formando un enlace peptfdico. mientras que dos nucle6tidos se pueden uni.r entre cUos mediante un enlace fosfodiester. La repetici6n de estas rcaccia· nes da lugar a polfmeros lineales conocidos como polipeptidos y polinucle6tidos, rcspectivamentc. En los organismos vivos actuales, los polipeptidos --eonocidos como protelnas- y los polinucle6tidos -en forma de iicldos rlbonuclelcos (RNA) y iicldos desoxlrribonuclelcos (DNA)- son considerados habitualmente los constituyentes m;1s importantes. Un restringido conjunto de 20 amino;1cidos forman los bloques constirudvos universaJes de las protefnas, mientras que las mollkulas de RNA y DNA est;1n construidas a partir de cuatra dpos de nucle6tidos cada una. Aunque no sabemos por que se seleccionaron estos conjulltos de mon6meros en particular para biosfntesis en lugar de ouos qufmicamente similares, veremos que las propiedades qufmicas de los poJimeros correspondientes los haecn especialmcnte adecuados para desempet'iar sus funciones especfficas en la celula. Los primeros polfmeros pudieron formarse de varias maneras -par ejemplo, mediante el caJentamiento de compuestos argo1nicos secas a gracias a la actividad cataHtica de las elevadas concentraciones de poLifosfatos inorgo1nicos u otros catalizadores inorganicos crudos. Los prodUCIOS obtenidos de reacciones simiJares en el laboratorio son polfmeros de longitud variable y de seeuencia alealoria, en los que la adici6n de un aminao1cido 0 de un nucle6tido en un momento dado depende principalmenle del azar (Figura 1-3). Sin embargo, una vez formado, un poUmero puede influir sobre reacciones qufmicas posteriores acluando como un catalizador. EI origen de la vida requiri6 que en un conjunto de moh~cuJas de este tipo hubiera algunas que tuvieran, al menos en parte, una propiedad crucial: la capacidad de catalizar reacciones que generaran, direcla 0 indirectamente, la producci6n de mo1s moleculas del propio catalizador. La producci6n de catalizadores con esta propiedad aUlogenerativa especial estuvo favorecida y las molecuJas mas eficientes en generar su propia producci6n captaron los materiales crudos elimin;1ndolos de los procesos de producci6n de otras subslancias. De esla rnanera puede concebirse el desarrollo gradual de un sistema qufmico complejo de mon6meros orgIDlicos y de polimeros que actuaban juntos generando m;1s moleculas de los mismos tipos, alimentadas por materiales crudos simples del entorno. Un sistema autocalaJftJco como este tendrfa las mismas propiedades que creemos que son las caracterfsticas de la materia viva: estarfa formado par una gran cantidad de moleculas interactivas seleccionadas al azar; tenderfa a autorreproducirse; compeLirfa con OITOS sislemas dependientes de la misma materia prima; y si se eliminara esta materia prima 0 si se mantuviera a temperaluras err6neas que alteraran el balance de las velocidades de reacci6n progresarla hacia el equilibrio qufmico y ~morirfa". Pero, ique ripo de motecuJas pudo haber tenido propiedades autocataUticas como eslas? En las celulas actuales los catatizadores mas vers;1tiles son dos polipeptidos, compuestos de muchos aminoo1cidos diferentes con cadenas laterales quimicamente diversas y por tanlo capaces de adopl'ar diferentes fonnas LridiDesde las mol~ulas hasta la primera c~lu1a

polipe:ptidos. Las prole£nas aetuales estl\n fannadas a partir de un conjunlo esl3ndar de 20 tipos de amlnoacidos.

5

.....

•

+

11.11• • • •

•••

mensionales erizadas de lugares reactivos. Sin embargo aunque los polipeplidos son verstitiles como calalizadores no conocemos sistemas por los que una de es· [as mol&:ulas pueda aUlorreproducirse especificando directamente 13 fonnaci6n de otra de 13 misma secuencia.

Figura 1-4 Pollnucle6l.1dos como patNSn. Se produce el enlace prderencial entre pares de nucleOtidos (C con G y A con U) mediante enlaces qufmicos relativamente debiles (arriba). Este apareamiento permite que un polinucle6tido actue como patr6n para la sfnlesis de Olro polinucicOtido (izquierda).

Los polinucle6tidos son capaces de dirigir su propia sCnlesis' Los polinucle6lidos lienen propiedades que contrastan con las de los polipeptidos. Su capacidad como catalizadores es mas limitada pero pueden dirigir directamente 13 fonnaci6n de copias exaclas de su propia secuencia. Esta capacidad depende del apareamlenlo complementarlo de subun.idades de nuclootidos, el cual pcmtite a un polinucle6tido actuar como patr6n en 13 fonnaci6n de atro. En el caso

m~s

simple un polfmero compueslO par un nucle6tido (por ejemplo.

acido policilidflico 0 poli C) puede aLinear en su superficie las subunidadcs necesarias para genera.r Olro polinucle6tido, (en esle ejemplo el addo poliguanRico o poli G) favoreciendo asf su polimerizaci6n fonnando poli G (Figura 1·4). Debido a que las subunidades C se unen preferentemente a las subunidades G, y viceversa, a su vez la molEkula de poli G favorecera la sfntesis de mas poli C. Consideremos ahora un polinude6tido con una secuencia de subunidadcs mas compleja, concrelameme una molecula de RNA formada por cuatro tipos de nucle6tidos con las bases uracHo (U), aden ina (Al, citosina (C) y guanina (G) dispuestas siguiendo una secuencia particular. Debido al apareamienlo complemenlario entre las bases A y U, Yentre las bases G y C, cuando esta molccula se anade a lIna mezcla de nucle61idos activados y bajo condiciones adecuadas, dirigira la polimcrizaci6n de una secuencia complemenlaria a la suya. La nueva molccula de RNA resultante sera una especie de molde del original, de manera que cada A del original corresponded con una U en la copia, y asf sucesivamenteo La sect/encia de nucle6tidas de la cadena original de RNA conticnc una Informaci6n que esencialmente se conscrva en las cadenas complemel1larias recicn formadas: una segunda operaci6n de copia, tamando la cadena camplementaria como palr6n, da lugar a la secuencia original (Figura 1-5). Estos mecanismos de molde 0 patr6n complementario son elegantemente sencillos y se hallan en la base de los procesos de transferencia de informaci6n de los sistemas biol6gicos. La informaci6n genetica contenida en cada celula

LA SECUENClA ORIGINAl FORMA LA SECUENClA COMPlEMENTARIA

j 6

Capftulo 1 : La evolucl6n de la cllula

LA SECUENCIA COMPlEMENTARIA FORMA LA SECUENCIA ORIGINAL

j

Figura 1-5 Repllcacl6n de una secuencla de polinude6tldo (en este caso una molb::ula de RNA). En el paso I. la molecwa original de RNA aClua como pan6n en la fonnaci6n de una mol&:ula de RNA de secuencia complemenlaria. En el paso 2. esla molecula complementaria de RNA aClua a su \'ez como pan6n, fomando moleculas de RNA de secuencia igual a la original. Puesto que cada molec-ula pan6n puede producir numerosas copias de la hebra complemenlaria. estas reacciones pueden dar lugar a la -multiplicaci6n- de la secuencia original.

esl~

codificada en las secuencias de nucle6tidos de sus moleculas de polinucle6tidos, yesta informaci6n se transmite (heredal de generaci6n en generaci6n medianle las interacciones entre los pares de bases complementarios. Sin embargo, para que se produzcan estos mecanismos de molde se necesita la panicipaci6n de catalizadores: sin una cataJisis espedfica, la polimerizaci6n sabre un patron es lema e ineficaz y adem~s la formaci6n de r~plicas correctas est~ c1aramellle dificuhada por la existencia de reacciones competitivas. En la actualidad las funciones catalfticas que replican polinucle6tidos est~n proporcionadas par protefnas alta mente especializadas, Ilamadas enzimas. En cl ~caldo prebi6tico" quiz~ hubiera polip~ptidos primitivos que colaboraron en alguna tarea catalftica. Sin embargo la existencia de moleculas con especificidad catalftica adecuada debi6 ser escasa a no ser que el propio RNA fuese capax, de alguna manera, de favorecer su propia producci6n. Volveremos a estudiar las relaciones recfprocas entre las sfmesis de RNA y las sfntesis de protefnas, de crucial importancia en todas las c~lulas vivas. Pero primero consideraremos qll~ puede ocurrir con el RNA, ya que las moleculas de RNA pueden presentar varias propiedades catalIticas ademlis de actuar como patrones de su propia replicaci6n. Concretamente, una molecuJa de RNA con una secuencia de nucle6tidos adecuada puede actuar como catalizador en la replicaci6n apropiada de otra molecula de RNA -el patr6n- cuya secuencia puede ser arbitraria. Se cree que la especial versatilidad de las moleculas de RNA ha jugado un papel central en los procesos del origen de la vida.

Las moleculas autorreplicantes estan sometidas ala selecci6n natural]'· Las mollkulas de RNA no son unicamente cadenas de sfmbolos que contienen infomlaci6n de una manera abstracta. Tambien tienen personalidades qu(micas concretas que afectan a su componamiemo. Concretamente, la secuencia de nuc1e6tidos detemlina el modo en que la cadena se pliega en soluci6n. Del mismo modo que los nucJe6tidos de un polinucJe6tido se pueden aparear con nucle6tidos complementarios Iibrcs de su entomo formando un nuevo polfmero, tambien se pueden aparear con residuos complementarios de nllcle6tidos del propio poHmeroo Una secuencia GGGG de una regi6n de una cadena polinucleotfdica puede formar una asociaci6n reJativameme fuene con una secuencia ecce de OlTa region de la misma mol&ula. Dichas asociaciones producen diversos pliegues tridirnensionales. y eJ conjumo de la molOCuJa adopta una forma tfpica que depende completamente de la secuenda de sus nucle6tidos (Figura \-6). La estructura plegada tridimensional de un polinucle6tido afecta a su estabWdad, a su acci6n sobre otras moleculas y a su capacidad de replicaci6n. de modo que no todas las formas de polinude6tidos tendnin igual ~xlto en una mezcla de repLicaci6n. Ademlis resuha inevitable que en cualquier proceso de copia se produzcan errores y las copias imperfectas del original se iran propagando. Por 10 tanto tras repetidas replicaciones se generar:in continuamente nuevas secuencias variantes de nucle6tidos. En estudios de laboratorio se ha demostrado que los sistemas replicanres de mol~culas de RNA sufren una especie de selecci6n nalUral a traves de la cual predominan diferentes secuencias favorabies, seg(in cuaIes sean las condiciones experimentales ulilizadas. La que es mas irnponame, las moleculas de RNA pueden ser seleccionadas por su capaci· dad de unir especfficamente casi cualquier olro tipo de molecuJas. ESlo tambicn se ha demostrado en experimenws ill vitro que se inician con una preparaci6n de cortas moleculas de RNA de secuencias de nucle6tidos al azar sintelizadas ar· lifieialmente. Esta mezcla se haee pasar a tra~ de una columna lIena de una re· sina a la que se ha un ida alguna substancia determinada. las moleculas de RNA que no se unen a esta substancia pasan a trav~s de la columna y son eliminadas; el pequeno numero de moltkulas que se unen a ella es relenida y utiJizado como patr6n para dirigir la producci6n de multiples copias de su propia secuencia. Esla nueva preparaci6n de RNA, enriquecida en secuencias que se unen a la Desdc las molecuJas hasta la prlmera ~Iula

Conformacl6ndeuna RNA. EI apareamiemo de nucle6tidos enlre diferentes regiones de In propin cadena de polillucle6tido (RNA) hace que la mol«ula adopte una forma particular. Figura 1-6

mol~a de

7

substancia escogida, se utiliza entonces como material de partida para repetir de nuevo el proceso. Tras varios de estos ciclos de selecci6n y reproducci6n la mez· cia de RNA consiste en mUltiples copias de un relativamente pequeno numero de secuencias, cada una de las cuales se une a la substancia de ensayo casi espe· cfficamente. Por consiguiente. una mol6:uJa de RNA tiene dos caracterfsticas especiales: transporta informaci6n codificada en su secuencia de nucle6tidos que puede transmitir mediante el proceso de repUcaci6n, y tiene una estructura plegada \lnica que determina la manera en que interactuara con otras moleculas y responder<1. a las condiciones ambientales. Estos dos rasgos -uno de informaci6n y el otro de funci6n- son las dos propiedades esenciales que se necesitan para la evoluci6n. La secuencia de nuc1e6tidos de una molecula de RNA es analoga al genotlpo -Ia infonnaci6n hereditaria- de un organismo. La estructura tridimensional plegada es anAloga aI renollpo -Ia expresi6n de la informaci6n genetica en la que actUa la selecci6n natural.

Algunas moleculas especializadas de RNA pueden catalizar reacciones bioqufmicass La selecci6n natural depende del entomo, y para una

mol~ula de RNA que se replica, un componente mtico del entomo es el conjunto de las ouas mol6:ulas de RNA de la mezcla. Ademas de actuar como patr6n para su propia replicaci6n, estas mol~ulas de RNA pueden catalizar la rotura y la formaci6n de enlaces covalcnles, incluyendo uniones entre nucle6tidos. Por ejemplo, algunas moleculas dc RNA especializadas pueden catalizar cambios en otras moMculas de RNA cortando \a secuencia de nuc1e6odos en un punto determinado; otros opos de moleculas de RNA eliminan espontaneamcnte una porci6n de su propia secuencia y reunen los extremos cortados (un proceso conocido como ~automaduraci6n por corte y empalmc", self-splicing). Cada reacci6n catalizada por una mol~uJa de RNA depende de una ordenaci6n especffica de los alOmOS que ronnan la superficie de esta mollkula de RNA cataJftica Oa ribozima), la cual hace que algunos grupos qufmicos de uno 0 mas de sus nuc1e6tidos sean altamente reactivos. Ciertas actividades cataJiticas pudieron tener una importancia capital en el caJdo primordial. Consideremos una molecula de RNA que catalice el proceso de polimerizaci6n utiJizando cualquier mol6:ula de RNA como patr6n. (Esta aerividad ribozima se ha demostrado directamente in vitro al menos de una forma rudimemaria.) Esta molecula catalftica puede actuar sabre copias de sf misma, replicandose con elevada velocidad y el1ciencia (Figura 1-7A). Al mismo tiempo, puede promover la rcplicaci6n de orras moleculas de RNA vecinas (Figura 1-78). Algunas de cstas moleculas pueden desarrollar acciones cataliticas que ayuden 0 dificuhen la supervivencia 0 la replicaci6n del RNA en otras vfas. Si los crectos beneficiosos son recfprocos, diferentes tipos de mollkuJas de RNA, especializa· das en diferentes actividades, pueden desarrollar un sistema cooperativo que se replique con una eficiencia extraordinaria.

La informaci6n fluye desde los polinucle6tidos

a los polipeptidos' Todo 10 expueslo sugiere que haee entre 3,5 y 4 mil millones de ailos, unos sistemas autorreplicantes de moleeuJas de RNA, mezeladas con orras moleculas org<1.nicas como algunos polipeptidos simples, iniciaron, en alglln lugar de la Tie· rra, el proceso de la evoluci6n. Sistemas can diferentes dotaciones de polfmcros compitieron por los materiales precursores disponibles para construir copias de ellos mismos, tal y como compiten los organismos aClUalmenle; el exilo depcndi6 de la exactitud y de la rapidez con que se producfan las copias, y de la estabilidad de las rnismas. Sin embargo, como destacamos anterionnente, aunque la estructura de los polinuele6tidos esta bien adaptada aI almacenamiento y replicaci6n de la infor· 8

CapftuJo I : La evoluci6n de la ct!:luJa

IAJ

Figura 1-7 Dlagramadetre1lpasos luc:esivos en 10 evoluckSn dellistema aulorrepllcante de molkulas de RNA que son capaees de dlrigir la sintesls proleica.

181

Mol6cula de RNA c.lalltieo que

une nucleol,do, pIl.a .eproduci. IU mllma Heuel'\Cla de nucleolido, y PO' 10 tenlo IU mllma fo.ma.

lei Femilia de moIeculllS de RNA C11lalilie&' que SCI mantienan mUlUamenle, calaillando una de ellal II reproducci6n de I.. ~un.

EvoluciOn de nueval mollk:ul.. de RNA ce..lilicot, algunllS de lal cua1ltl unen por II sola, .m;nokido, ecl;yadol. Por .pareamiMlo de basel. un. morkul. de RNA codifteenle, eSlas mol6culal de RNA perm lIen que una secuencla de RNA ltCIue como molde 0 pIltr6n pa.a la .Inlesl. de pollmerOI de aminokidos. gene•• ndo asJ III .~.ici6n de IllS prime"l secuenciel proteul del8lminlldu gen6ticemente. De ell.lorm., estal molkulllS lICIuan como 10' prime.o, lId~tlldorftenlre un. Heuend. de nucl.olidos y una seeuencla de .minokldo•.

maci6n, suS capacidades catalfticas son lirniradas respecto a las de los polipeptidos. y en las celulas modemas la replicaci6n eficiente de los polinuclootidos es absolutamente dependiente de las proleinas. En el origen de la vida cualquier polinucle6tido que dirigi61a sfntesis de un polipeptido util debi6 tener en el ambiente competitivo de la evoluci6n una gran ventaja para sobrevivir. Sin embargo, ide que manera podia la informaci6n codificada en sus secuencias determinar las secuencias de otro tipo de polfmeros? Sin duda, los polinucle6tidos debieron actuar como catalizadores unicndo determinados aminoAcidos entre sf. En los organismos actuales, un sistema de colaboraci6n de moleculas de RNA juega un papel central en la direcci6n de la sfntesis de polipeptidos -Ia smtesis proteica- pero en el proceso lambicn colaboran otms protcfnas previamente sintelizadas. La maquinnria bioqufmica para la sfntcsis proteica estA notablemente elaborada. Una molecula de RNA contiene In informaci6n genctica de un polipeptido delerminado, en forma de c6digo, mienrras que otras moleculas de RNA actuan como adaptadores, uniendo cada una de elias un aminortcido especffico. Estos dos tipos de mol~culas de RNA forman pares de bases complementarias entre sf. pemlitiendo que las secuencias de nucle6tidos del RNA codificante dirijan la incorporaci6n de aminoAcidos especfficos, transportados por el RNA adaptador, a la cadena polipeptfdica en crccimienlo. Probablemente los precursores de estos dos tipos de moleculas de HNA dirigieron la primera sfntesis proleica sin la ayuda de prote{nas (Figura 1-7C). Dcsde las mollkuJas hasta la primera eelula

9

En la actualidad, estos procesos de ensamblaje de nuevas protefnas tiencn lugar en la superficie de los ribosomas -partfcuJas complejas compuestas par varias grandes moleculas de RNA de otro tipo, y por mas de 50 tipos diferentes de protefnas. En el Capftulo 5 veremos que este RNA ribos6mico juega un papel catalftico central en el proceso de la sfntesis proteica y constituye mas del 60 % de la masa ribosomal. AI menos en terminos evoJutivos, este RNA es el componente fundamental del ribosoma. Asf pues, parece que el RNA dirigi6 la si'ntesis primordial de protefnas, qui· zas de una forma torpe y primitiva. De esta manera eJ RNA fue capaz de crear herram!entas -en forma de protei'nas- que permitieron conseguir una biosfnte· sis mas eficiente. Algunas de estas proteLnas pudieron ser utilizadas en la replicaci6n del RNA y en el propio proceso de producci6n de herramiemas. La sfmesis de protefnas especificas bajo la direcci6n del RNA requiere la evoluci6n de un c6digo a trave:s del cual una secuencia de polinucle6tidos especifique la secuenda de aminoAcidos que formara la protefna. Este c6digo -el 00digo gelleticrr se deletrea en forma de un ~diccionario· de palabras de tres Ie· tras: diferentes tripletes de nucle6tidos codifican amino,kidos determinados. EI c6d.igo parece haber sido seleccionado arbitrariamente (tal vez sometido a algunos condicionantes), y lodavfa hayes practicamente eJ mismo en todos los organismos vivos. Esto sugiere c1aramente que todas las celulas actuales descienden de una lfnea celular primitiva que desarroll6 el mecanismo de sfntesis proteica.

Las membranas definieron la primera celula7 Uno de Jos acontecimientos cruciales que condujeron a Ja formaci6n de Ja pri· mera ceJuJa debi6 de ser eJ desarrollo de una membrana externa. Por ejemplo, las protefnas sintetizadas bajo el control de un determinado tipo de RNA no facio litarian la reproducci6n de este tipo de RNA a menos que pennanecieran en sus proximidades; ademas, mientras estas proteinas luvieran libertad para difundir entre la poblad6n de molecuJas de RNA en replicaci6n, padrla benefidar por igual a cualquier especie compelidora de RNA que estuviera presente. $i surgfa una varianle de RNA que producia un tipo superior de enzima, la nueva enzima no podfa contribuir selectiuamente a la supervivencia del RNA variante en la compelencia de este con los Olros RNA. La selecd6n de las moleculas de RNA de acuerdo con la caUdad de las protefnas que generaban no pudo empczar hasta que apareci6 alguna forma de companimiento que retuviera las protefnas producidas por cada moll!cula de RNA y que par 10 tanto hiciera que estas protc(nas quedaran disponibles s610 para el RNA que las produjo (Figura 1·8). Esta necesidad de contener es ejecutada facilmente por otro tipo dc moll!culas que poseen la sCllcilla propiedad fisicoquimica de ser alljipdticas, 10 cual consiste en que una zona de la molecula es hidrof6bica (insoluble en agual y

SIN COMPARTlMIENTOS

CON COMPARTlM1ENTOS

comPllr\lmie",lO

GG10

Capftulo I : La evolucl6n de la cBula

Figura 1·8 D1buJo esquematlco que muestra la ventaja evolutlva que suponen los compartlmlentos semeJantes a una alula. En una mezcla de moleculas de RNA autorreplicantes capaces de realizar la sfntesis proleica (laJ como se iluslra en la Figura 1-7), cualquier forma de RNA mejorada que sea eapaz de producir una protefna mas uti! debe compartir eSla prolefna con IOOas sus competidoras. Sin embargo, si el RNA eSlli encerrado en un compartimiento, como por ejemplo una membrana Iipfdiea, cuaJquier protefna que prodUZC8 quedm confinada para su uso exclusivo: entonces, el RNA puede ser selecdonado en base a su capacidad de sinletizar una prolefna mejor.

otra hidroftlica (soluble en agua). Cuando tales moleculas se encuentran en un medio acuoso se agregan poniendo en {mimo contact'o sus zonas hidrof6bicas y estableciendo contacto con el agua por sus zonas hidroHiicas. Moh~culas anfipaticas de fonna adecuada se agregan espomaneamente formando bicapas, que generan pequenas vesfculas cerradas cuyo comenido acuoso se halla aislado del medio extemo (Figura 1-9). Este fen6meno se puede reprOOucir en el tubo de ensayo simplement'e mezclando fosfolfpidos y agua: en condiciones apropiadas. se formaran pequenas vcsfculas. Todas las celulas acruales estan delimitadas por una membrana plasmlillca formada por molcculas anfipaticas -mayoritariamente fosfolfpidos- en csta configuraci6n; en las membranas celulares la bicapa lipfdica tambien contiene protcfnas anfipaticas. AI microscopio electr6nico estas membranas aparecen como laminas de aproximadamente 5 nm de grosor, con un aspecto triestratificado caracterfstico, debido aI empaquetamiento colacon-cola de las molecuJas de fosfolfpidos. Probablemcnle, las primeras celulas rodeadas de membrana se formaron por ensamblaje espontaneo de moleculas de fosfollpidos del caldo prebi6tico, incluyendo una mezcla de moleculas autorrepJicantes de RNA y orras moleculas. No est3. claro en que punto de la evoluci6n de la caraJisis biol6gica y sintesis proteica se fonnaron las primeras celulas. En cualquier caso, cuando las moleculas de RNA fueron confinadas con una membrana cerrada pudieron empezar a evolucionar eficazmente como transportadores de instrucciones gcncticas: pudicron ser seleccionadas no solamente en base a su propia estructura, sino tambien por el efecto que ejercieron sobre otras molecuJas de su mismo compartimiento. Las secuencias de nucle6ridos de las mol4kulas de RNA pudieron ser expresadas en el caracter de la celula como un todo.

Todas las celulas actuales utJlizan el DNA como material hereditario3, 6, 8 Evidentemente, el cuadra que acabamos de presentar es especulativo: no existen dams f6siJes que registreo los origenes de la primera celula. Sin embargo,los organismos actuales y los experimentos realizados proporcionan prucbas bastante convincenles de que los rasgos principales de esta historia evolutiva son corrcctos. La sfntesis prebi6tica de pequeflas moleculas, la autorreplicaci6n de las moleculas de RNA catalitico, la uaducci6n de las secuencias de RNA a secuencias de aminoacidos y el ensamblaje de las moleculas lipidicas formando compartimientos rodeados de membrana: todo esto debi6 de ocurrir durante la genesis de la celula primitiva hace unos 3,5 0 4 mil mi1lones de ailos. Resllita uti! comparar estas celulas primitivas con las celulas actuales mas sencillas, los mlcoplasmas. Son pequenas bacterias de un tipo degenerado que normalmente lIevan una vida parasitaria en estrecha asociaci6n con c~lulas vegetales 0 animales (Figura 1-10). Algunos tienen un diameuo de aproximadamente 0,3 11m y s610 contienen el acido nucleico suficiente para codificar la sfn· tesis de unas 400 protefnas diferentes. Algunas de estas protcfnas son cnzimas, otras son proternas estruclUrales; otras se hallan en el interior de la celula; otras eSI3.n incluidas en su membrana. En conjumo los micoplasmas sintetizan las pequenas moleculas esenciales que no se encuenlran accesibles en el entomo, redistribuyen la energia necesaria para conducir las reacciones biosintelicas y mantienen las condiciones apropiadas en el interior de la celula. Probablemcnte, las primeras celulas de la Tierra fueron menos sofisticadas y se dividfan mas lentamente y con menor eficicncia. Pero existfa una diferencia mas fundamental entre las celulas primitivas y un micoplasma 0 cualquier otra c~lula actual: la informaci6n hereditaria en tOOas las celulas vivas actuales esta almacenada en el DNA y no en el RNA, que es como se supone que las celulas primitivas a1macenaban la informaci6n hereditaria. Ambos tipos de polinucle6tidos se encuentran en las celulas actualcs. pera actuan de una manera cooperativa, ya que cada uno ha evolucionado en el sen lido de desempenar [areas especializadas. Pequenas diferencias qufmicas haecn que cada uno de los dos tipos Desde las moleculas hasta la primera celula

.... .

ACfITE

I'," I"

~

",

losfolipidos

Figura t -9 Formacl6n de membranas par fosfolfpldos. Dado que esl3S mol~ulas denen una cabeza hidroffiica y unas colas Iipomicas, en una inlerfase aceite-agua se alinean esponlAneamente con la cabeza hacia el agua y las colas en eI aceile. En agua se asodan fonnando bicapas vesiculares cerradas, en las cuales las colas lipoffiicas esn\n en conlaClO can olras colas y las cabezas hidroffilcas esl1n expueslas al agua.

',m Figura 1-10 Splroplasma citrll, lin mlcoplasma que crec::e en dlulas vegetales. (Par cortesfa de J. Burgess.)

II

de moleculas sean adecuadas para funciones diferentes. El DNA actua como deposilario permanente de la informaci6n genetica y a diferencia del RNA se halla en las celulas principalmente en fonna de doble hebra, compuesta por un par de moleculas complemenlarias de poLinucle6tidos. Esla estructura de doble hebra haee al DNA eelular mas robuslO y estable que el RNA; lambien detennina que el DNA sea relativamenle faciJ de replicar (vease el Capftulo 3) y pemlite que acrue un mecanismo de reparaci6n que uliliza la hebra inlacla como patr6n para la correcci6n 0 reparaci6n de la hebra lesionada asociada. El DNA dirige la sfntesis de moleculas espedficas de RNA. de nuevo par el principio de apareamiento de pares de bases complementarias, aunque el apareamiento se produce aquf entre {ipas de nucle6lidos ligeramente diferentes. Luego, las moleculas de RNA resultantes, de una sola hebra, realizan olras dos funciones primordiales: dirigen la sfntesis proleica tanto como moleculas de RNA codifrcantes (RNA me"sajeros) como de RNA catalfticos (RNA rioosdmicos y otros no mensajeros). Brevemente, se sugiere que el RNA apareci6 antes que el DNA en el proceso evolutivO, presentando las propiedades genetica y catalilica; posteriormente, el DNA tom6 el relevo de la funci6 genetica primaria y las protefn3s se constiluyeron en los principales catalizadores, mientras que el RNA qllcd6 relcgado a principal intcrmcdiario entre ambos (Figura 1·11). Con el advenimiento del DNA, las celulas pudieron ser eada vez m<1s complejas, ya que pudieron eontcner y transmitir una cantidad de informaci6n genelica mayor de la que podfa almaeenarse de forma estable en las moJeeulas de RNA.

Resumen Las c8.ulas vivas surgiero" probablemente ell la Tierra gracias a in agregacidll espontdlletJ de molkulns, lUlU aproximadnmente 3,5 mil millonet de alios. Sobre la base de nuestros COllocimientos acerca de los orgallismos actunles y de las molkulas

que contie,len, parece probable l/f4e el desarrollo de los mf!amismos autocotaUricos fundamentales para los sistemas vivie'ltes empezara con la evoilleldn de [a",ilias de molkulas de RNA que podfall catalizar su propia replicaci6", Con el tiempo, IIIUl de estas famiiias de RNA catalfticos cooperativos debid de desarrollar in IUlbilidad de dirigir in sflltesis de polipiptUlos. Fillalmente, debido a que Itl aclllmdacwn de catalizadores proteicos penllitid la eoo/m:wlI de d/ulas mAs compiejas y eficiet.tes, el DNA de doble lJebra substitllyd al RNA como moilada mtis estable para el almacenaje de las calltidades creeielltes de in[ormacidll genetica requerida por estas dlulas.

De los procariotas a los eucariotas' Se cree que lodos los organismos que viven aetualmente sobre la Tierra derivan de una unica celula primitiva nadda haee mas de tres mil millones de aoos. Esta eelula, superando a sus compelidoras, lom6 la delantera en el proceso de divisi6n celular y evoluci6n y, con el tiempo, cubri6 de verde la Tierra y cambi6 la composici6n de su atm6sfera, convirtiendola en el hogar de la vida inteligente. Los parecidos familiares entre lodos los organismos son demasiado acusados para ser explicados de otra manera. Un hilo importante a 10 largo de esle camino evolutivo se produjo haee 1,5 mil miJIones de aoos, cuando ocurri61a transici6n desde las eelulas pequeoas con una estructura intema relativamenle sendUa -las dcnominadas celulas procarlotas, que incluyen los divcrsos tipos de bacterias- hasta las eelulas eucariotas, mayores y radical mente mas complejas, tal como las encontramos hoy en los animales y plantas superiores.

las celulas procariotas son estructuralmenle simples pero bioqufmicamenle diversas 'o Las baClerlas son los organismos mas sencillos que se cneuenlran en la mayorfa de Mbitats naturales. Se trata de c61ulas esfericas 0 alargadas. gencralmente de 12

Capflulo I : La evoluci6n de la c61ula

.J.tem.. lM•• do. en.1 RNA

G

pohp6ptodol +

rudimentariOli

I

EVOlUClON DE RNA ADAPTAOOftES

...tem.. WNdOli en.1 RNA

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!

eVOLutiON DE NUEVAS ENZIMAS QUE GENERAN DNA Y LO COPlAN EN MDLt:eULAS DE RNA

c6lulu lICtu.le.

G- -Figura 1-11 Eltadl05 propueslos para la evolucl6n desde sencill05 sistemas aulornpUcanles de molecuJas de RNA hasta las dlulas actuales. AClualmcnle el DNA es el depositario de la in(ormad6n gem'idca y el RNA aClua mayoritariamente como intermediario de la smtesis prOleica.

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Figura 1-12 Estructuras y tamafi08

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II

de procarlotas. (A) Algunas celulas procariOlas dibujadas a escala. rB) Micrografia ele<:lr6nica de una secci6n longitudinal de una bacleria (Escherichia coil): el DNA celular esta concenlrado en la regi6n patida de la figura. (Pur conesia de E. Kellenberger.)

Staph)'fof;ocan

Ridlarrsia

'8' un dioimelro de varios micr6metros (Figura l-12). A menudo poseen una envoltura protectora resistente. denominada pared celulLlr. por debajo de la cual una membrana plasm
bact"..; ...

a""".6bicJI. qutl vi",... en

condK:ioneI Kid.. C111ient.. (po. e1"mplo. bKtllria. del alufr,,)

AAOUE8ACTERIAS (procarloltl.1

baallria. qutl vi",... "n condk:ioneI Alin. .

extrernas(hal6fi1as alM;oI. que redocen "I • rnetllrlO

PAOCARIOTA

ANCESTRAl

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(melanOg"n..)

baalrias gram positivas

EUBACTERIAS (procariotnl

Dc los procariotas a los eucarlotas

cianobooaeriQ (algas lI'8fde.8l\llnl

bKlerias pojrpurasloloslntetizadoras

Figura 1·13 Reladones famlUares entre lin bacteria5 actuales. Las flechas indican posibles vfas de evolud6n. El origen de las celulas eucariotas se discute mas adelanle en el texto.

13

pUeden reconocer dos gropos distintos: las eu#XU;terias, que son las formas ml1s habiluales y viven en el suelo, el agua y los organismos vivos; y las arque#XU;te· rias. que se encuentran en ambiemes Ian inc6modos como cienagas, prohmdi· dades marinas, aguas saJobres y Fuentes ~cidas calientes (Figura 1-13). Existen especies de baCierias que pueden Ulilizar como alimento praclicamente cualquier tipo de molecuJa organica, incluidos azucares, aminol1cidos, grasas, hidratos de carbono, poLipeptidos y polisacaridos. Algunas son capaces incluso de obrener los l1tomos de carbono del CO 2 y los <110mos de n.itr6geno del N2• A pesar de su simplicidad relaliva, las baclerias han sobrevivido durante ml1s ticmpo que cualquier Olro organismo y todavfa constituyen el tipo de celulas nuis abundante de III Tierra.

Las reacciones metab6licas evolucionan 10, II Una bacleria que crezca en una soluci6n salina que contenga un unico lipo de Fuente de carbona, como par ejemplo la g1ucosa, debe reaJizar un elevado numero de reacciones qu!micas. No 5610 debe obtener de la g1ucosa la energia qur· mica necesaria para muchos procesos vitales, sino que tambil~n debe utilizar los l1tomos de carbona de la g1ucosa para sintetizar todos los tipos de moleculas organicas que la c~HuJa necesita. Estas reacciones estan catalizadas por cientos de enzimas que trabajan en "cadenas" de reacciones, de forma que el produclo de una reacci6n es el sustrato de la siguiente; estas cadenas enzimaticas, denominadas uias metab6licas, se estudiarl1n en el capitulo siguiente. Probablemente cuando empez6 la vida sabre la Tierra estas elabaradas reacciones metab6licas eran poco necesarias. Las celulas padron sobrevivir y crecer gracias a las maleculas de su entoma. Pero a medida que se agataron estos recursos naturales, la competencia par estas limitadas Fuentes de recursos Fue metllboli1os esequibln

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metabolito eMqulbie

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Figura 1·14 Dosmanerasposiblesa

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nueva enzima

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Capitulo I : La evoluci6n de la dlula

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evoluclonar las vias metab6l1cas. (A) La <:t!lula de la izquierda tiene a su disposid6n una serie de substandas afines lA, B, C, D) produddas por sfntesis prebi6tka. Una de elias, la substanda D, es mctab61icamente utiJ. Cuando la cl!lula agota la reserva disponible de D, obliene una ventaja selectiva con 11'1 evolud6n de una nueva enzima que puede produdr 0 a partir de la subslanda afin C. Mediante una sene de pasos similares pueden haber 5urgido vias melab6licas fundamentalmente importantes. (B) A la derec.ha, un compueslO A metab6licamente util se halla disponible en abundanda. En el transcurso de 11'1 evolud6n apare<:e una enzima que, por casualidad, tiene la capacidad de convertir la substanda A en la substancla B. Luego se produ<:en otr05 cambio! dentro de la <:l!lula. que Ie permilen ulilizar la nueva subslanda. La apand6n de otras enzimas puede dar lugar a una larga cadena de reacr:iones.

Figural-IS

tiol

Elenlacetl~ler.

jcido e.rtxndlico

cada vez mas intensa. Los organismos que habfan desarrollado enzimas para fabricar moleculas organicas posefan una gran ventaja selectiva. De esta manera, se cree que la dotaci6n de enzimas de las celulas aumenl6 gradualmente. generando las vias metab61icas de los organismos actuates. La Figura 1-14 muestra dos maneras plausibJes por las que podria habeT surgido una via metab61ica duTame la evoluci6n.

5i las vias metab61icas evolucionaron por adici6n secuenciaJ de nuevas reacdanes enzimalicas a las ya existcnlcs, las reacciones mas antiguas. aJ igual que los anillos mas viejos del troneo de un arbol, deben de hallarse mas pr6ximas al centro del ~arbol mClab61ico", donde se sinlelizan los bloqucs constitutivos lllOleculares basicos mas esenciales. Esta posici6n central delmctabolismo esta cla· ramente ocupada par los procesos qufmicos en los que intervienen los azucares fosfato. Entre estos procesos el mas central probablemcntc es la secuencia de re· acciones conocida como glucollsls mediante la cualla glucosa puede ser degra· dada en ausencia de oxfgcno (es decir, de fonna Qflaer6bica). Las vias metab6licas mas antiguas debieron ser anaer6bicas ya que no exist!a oxigeno Jibre en la alm6sfera de la Tierra primiliva. La glucolisis se produce prncticamente en todas las celulas vivas e impuJsa la fonnaci6n del compuesto adenosfn trifosfaco 0 ATP, que es utilizado par todas las celulas como una ve~lil fuente de energfa qufmica. Algunos compuestos r;oesrer desempenan un papel fundamental en las reaeciones de uansferencia de energ{a de la glucolisis y en un gran numero de oUos procesos bioquimicos basicos en los que dos moleculas organicas (un grupo tiol y un addu carboxl1ico) se unen mediante un enlace rico en energia en el que interviene el azufre (Figura 1-15). Se ha argumentado que esta simple pero poderosa estrategia es una reliquia de procesos prebi6ticos. que relleja las reacciones que tuvieron lugar en el ambiente suJfuroso volcanico de la tierra primitiva. antes incluso de que el RNA huhiera empezado a evolucionar. Conectados a estas reacciones centrales de la glucolisis se encuentran dentos de procesos quimicos diSlintos. Algunos de ellos son responsables de la sfntesis de pequefias moleculas, muchas de las cuales SOil utilizadas en reacciones posteriores para producir los grandes polimeros especfficos del organismo. Otras reacciones se utiliZ81l para degradar a unidades qufmicas m<1s simples moleculas complejas ingeridas como ali menta. Uno de los rasgos mas notables de estas reacciones metab6licas consiste en que se producen en todos los tipos de organ ismos, 10 cual sugiere que su origen es extremadamente antiguo.

Comparando secuencias de DNA se pueden deduci.r

relaciones evolutivas '1

J

Las enzimas que catalizan las reacciones metab6licas fundamentales, sin dejar de desarrollar las mismas fundones esenciales, sufrieron modificadones progresivas a med.ida que los organismos evolucionaron hada fonnas divergemes. Por esta raz6n la secuencia de aminoacidos del mismo tipo de enzima de diferentes especies actuales proporciona un fndice extremadamente valioso de la relaci6n evolutiva existente entre esras especies. Los resultados obtenidos muestran un estrecho paralelismo entre este fndice y los proporcionados por oUos metodos. como por ejemplo el regisuo f6sil. Una fuente de informaci6n aun mas rica se halla presente en la c~lula viva en las secuencias de nucle6tidos del DNA. Metodos modernos de anlilisis pcnnilen determinar estas sec/lencias de DNA en un gran numero de especies y compararlas entre sf. Las comparaciones de secuencias altamente conservadas. que tienen un papel central y por consiguiente 15

De los procariotas a los cucarlotas --------

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hombre

hongo mllil

L __ protOlOOS eiliados L

Oictyo$te/ium

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EugMrY

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E.
durante la evoluci6n 5610 cambian lemamente, pueden poner de manifiesto parentescos entre organismos Que divergieron hace tiempo (Figura 1-16), mientras Que secuencias Que evolucionan rapidarnente pueden utilizarse para detenninar c6mo evolucionan especies fmimamente relacionadas. Es de esperar Que la continua aplicaci6n de estos metodos permitira seguir el eurso de la evoluci6n con una exaetitud sin preeedentes hasta el momento.

Figura 1-16 Relaclones evolutlvas entre los organlsmos, deducldas a partir de las secuenclas de nucle6tldos de los genes de la subunJdad rlbosdmlca pequefta. Eslos genes presentan secuencias altamenle conservadas, que han cambiado Ian lentamenle que pueden ser utilizadas para medir las relaciones filogen~ticas abarcando el conjunlo entero de los organismos vivos. Los datos sugieren que los linajes de las plantas, animales y hongos divergieron de un ancestro comlirt relativamente tarde en la historia de las dlulas eucariotas. Halobacterium y E. coli son procariotas; eI resto son eucariotas. Giardia, los rnicrosporidios, los tripanosomas. Euglena, y los protOZOOS ciliados son protistas (eucariotas unicelulares). (Adaptado de M.L Sogin. J.H. Gunderson, H.I. Elwood, R.A. Alonso and DA. Peanie, Science243:75-TI, 1989. C 1989 the AMS.)

Las cianobacterias pueden fijar CO2 YN2 13 A medida Que se intensific6 la competencia par los materiaJes crudos necesarios para sfntesis organica, los organismos eapaces de utilizar directamente de la atm6sfera atomos de carbona y de nitr6geno (en forma de COz y de Nz) tuvieron mas venlaja. Sin embargo, aunque el COz Yel N2 eran muy abundantes, tambien resuhaban muy estables, par 10 que era necesaria una gran cantidad de energfa y un elevado numero de reacciones qufmicas complicadas para transformarlos en formas utilizables -es decir, en moleculas organicas como los azl1cares simples. En el caso del CO 2, el mecanismo principal que apareci6 para conseguir esta transformaci6n fue la fotosfntesls, en la que la energfa radiante obtenida del sol se utiliza para facilitar la conversi6n de CO 2 en compuestos orglinicos. La interacci6n de la luz solar can una rnolccula de pigmento, la clorofila, excita un el~c­ tr6n que pasa a un estado de mayor energfa. Cuando el electr6n cae de nuevo a un nivel de menor energfa, la cnergra que se desprende impulsa unas rcacciones qufmicas, facilitadas y dirigidas por moleculas proteicas. Probablemente lIna de las primeras reacciones impulsadas por la luz solar fue la generaci6n de "poder reductor". Los atomos de carbono y de nitr6geno del CO 2 ydel N2 atmosfericos se hallan en un estado oxidado e inerte. Una manera de conseguir que sean n1<1s reactivos para que participen en las reacciones de biosfntesis consiste en reducirlos --es decir, en proporcionarles una mayor cantidad de electrones. EUo se consigue en varias etapas. En la primera, se Iiberan electrones de dadores debiles de electrones, y se transfieren a un dador fuerte de electrones, por medio de la dorofila, a traves de una reacci6n en la que imerviene la Iuz; en el proceso de reducci6n el dador fuene de electrones se utiliza para reducir el COlO el N l , EI estudio de los mecanismos de £o[Qsfntesis en diversas bacterias actuales sugiere Que una de las primeras fuentes de electrones fue el H;zS, siendo el producto residual primario el azufre elemental. Mas tarde se lIev6 a cabo el proceso mucho mas diffcU, pero en ultimo termino mas rentable, de obtener electrones del H20 y el 0l fue Iiberado en grandes cantidades como producto residual. Actualmente las cumobaclerias (conocidas tambien como algas azules) son una via principal a traves de la cual el carbono y el nitr6geno son transformados

• 16

Capftulo 1 : La evolucl6n de la c~lula

en molttlilas org<\nicas, penelrando asf en la bios/era. Constituyen los organis+ mos mas autosuficientes de los que viven en la actualidad. AI ser capaces de "fl· jar" el CO 2 y el N 2 en mohkuJas organicas estan capacitadas. en una primera aproximaci6n, para vivir linicamente del agua, del aire y de la luz solar; es probable que los mecanismos mediante los cuales 10 consiguen hayan pennanecido esencialmente constantes durante varios miles de miUones de anos. Conjuntamente con otras bacterias que tienen algunas de estas capacidades. crearon las condiciones adecuadas para la evoluci6n de otros tipos de organismos mas comptejos: en Cllanto alglin tipo de organismos fue capaz de sintet'izar a partir de material inorga.nico crudo la gama completa de componentes organicos celu· lares, Olros organismos pudieron subsistir alimentandose de los sintelizadores primarios y de sus productos.

Las bacterias pueden realizar la oxidaci6n aer6bica de las moleculas nutritivas 13 Actualmente mucha gente estc1 preocupada. yean raz6n, por las consecuencias ambientales de las actividades humanas. Sin embargo. en el pasado otros organismos provocaron tambien (aunque mucho mlis lentamente) cambios revolucionarios en el medio ambiente de la Tierra. Est'e cambia resuJta especialmente evidente en cuanto a la composici6n de la atm6sfera terrestre, que a traves de la fotosfntesis (proceso que Liber6 oxfgeno) fue transformandose desde una mezela prc1cticarnente carente de oxigeno hasta una mezcla en la que el oxfgeno consti· tuye un 21% del total (Figura 1-17). Puesto que el oxigeno es un elemenlo qufmico extremadamente reactivo. que puede interaccionar con la mayorfa de los constituyentes citoplasmaticos. debi6 de ser t6xico para muchos organismos primitivos. al igual que 10 es para muchas bacterias anaer6bicas actuales. Sin embargo. esta reactividad tambien proporciona una fuente de energfa quImica, y por tanto no es sorprendente que haya sido utilizada por los organismos en el transcurso de la evoluci6n. Utilizando oxfgeno, los organismos pueden oxidar de manera mas complela las moleculas que ingieren. Por ejemplo, en ausencia de oxigeno, la glucosa linicamentc puede ser degradada hasta acido laetico 0 etanol. los productos finales de la g1ucoLisis anaer6bica. Pero en presencia de oxigeno, la gJucosa puede ser degradada completamente a CO2 y H2 0. De esta manera se puede obtener mucha mc1s energia por cada grarno de g1ucosa. La energia Jiberada en la respiraci6n -Ia oxi+ daci6n aer6bica de las 1110lecuJas alimenticias- se utiliza para impulsar la sfntesis de ATP. de una manera muy parecida a la que los organismos fotosinteticos

NIVELES DE OXIGENO EN LA ATMOSfERA ('%1 10

TIEMPO

IMllES DE

~L~~~~

Figura 1-17 EI oxigeno atmos(~rico y el curso de la evolucl6n, Relaci6n entre los cambios en los niveles de oxfgeno atmosferico y algunas de las principales elapas que aI parecer ocurrieron durante la evoluci6n de los organismos vivos sobre la Tierra. Como se indica, las evidcncias geol6gicas sugieren que pasaron mas de mil millones de afios entre la aparici6n de las cianobacterias {probablemenle el primer organismo que Iiber6 oxfgenoJ yel momento en que los niveles de oxfgcllo empezaron a acumuJarse en la atm6sfera. Se cree que este illlervalo rue debido fundamemalmeme al rico apone de hielTO fefTOSO disuelto en los oreanos, que reaccion6 con el oxfgeno liberado formando enormes dep6sitos de 6xido de hierro.

imcio del acumulo

-,:=::::::::::=,,;:::=::::=:::-:::::::=::;~r6Pido d e 0, (M W' dill ;,; IIbI oct.nos 10 utltl~l

~~=::;:::::;

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011 forrn-ell)n M lo.od.no.

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prime<1l primer. liberllei6rl ~'U'llt de olllg..,o por viva. foto.lnte.la p'imer.. c6lulas fotoa.intttica.

De los procariot8s a los euearlotas

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origem de I.. c6lula. primeros foto'intMicas vertebr.dos eucarlotllt I. r..piraclOn N,6bica primeroa anim.l. .. g..,er.lia V pl.nU. plurioalulares

17

CELULA ANIMAL

seceion ultrafina de una dlula animal indiferenciada

CELULA VEGETAL ~

mitocondria membrana

_ _ elo.oplasto

---H-I

plasm'liu .etk:ulo .7"--I~ endop!asm6lic:o

~--- eilosol

centrlolo

--.,fl

,~"f--- complejo de ---IT Golgi ~r--_ citoesquelelo. --.J.l. filllmentOllO -

6 " - - - .......

fo----1f>-.311Illn'-----<

COMPLEJO OE GOLGI Un sistema de stlculos apilados, Iimitados por membrana V aplan8dos, impllcados en Ie modificacion, seleccion y empaquetamiento de macromoleculas para la secreci6n 0 para Ie 8llportacion 8 0lr08 6rganulos.

Alrededor del complejo de Golgi se

~

@~

encuentran numerosas vesiculas pequenas {!) - @~ rodoedas de membrana Ide mas de 50 oml. (?) ~~ 58 cree que transportsn material dade al 0 ~ complejo de Goigi II los diferentes

compartimentos de III ulula.

18

"""1-1 C6u1u eucariolas: esquema de sus prindpales org'n uJos.

I'

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NUCLEO

'1.-----~:.3~-'~D~'~m::;::::=--...."

El nudeo os 01 orgi!lnulo mob aparente de la celula. ESla separado del citoplasma por una envoltura farmada por dos membranas. Todo oj DNA cromos6mico se encuentra en 01 nucleo, empaquetado en fibres de

cromatine gracias 8 su 8sociaci6n con una caolidad igual de protefnes histones. EI contenldo nuclear. 01 nucleoplasma, se comuniC8 con al citolol por medic de unas aberturas de Ie envollura nuclear denominadas pores nucleares.

nue~lo; un. 16brica denlre del nUeIeo.

donde .. IIflsamblan lot ribosomes d. te

,"". crOffialina

CITOESQUELETO

MITOCONDRIAS

En 01 citosol, unes agrupaciones de filementos proteicos forman redos que Ie confiaten a III celula su forma y que

consliluven Ie base de sus movimientos. los Ifes principatos tipos de elementos del citoesquelelo son:

Aproximadamente del tamano de las bacterias. las mitocondrias son las centrales energeticas de todas las cillulas eucariotas; utilizan la energla obtenida combinando oxlgeno con moleculas nutritivas para producir ATP.

i

membrana inllma pleg.d. lorm.ndo crest.,

1. microtubulo,

~~-:;;

25nm diametro

0,5 ,m

2. filamentos tie actina

.:=

3. filamentos intermedios

1

80m diametro 10nm diametro

I., laM' termlnale, d.

el espaeio de I. m.tnz contiene una aoluciOn cancentr.d. de muchas enzlmas dilerentes

18 oKld.clOn tlenen lug••

en la m.mbr.n. lnterna

ORGANULOS ESPECIALES DE LA CeLULA VEGETAL Vacuole: Una vesicula muy grande. limitada por una membrana unitaria. que ocupa hasta el 90% dal volumen celular; Ie vacuola actua en la regulaci6n de Ie presi6n osm61ica y tambien an Ie digesti6n intrecelular.

Cioroplastos: Estos plastos, que contienen clorofila. son organulos rodeados por una doble membrana. y sa ern:uantran an todas las ptantas superiores. Un alaborado sistema da mambranas en al interior del cloroplasto contiene el aparato fotosintetizador. membrana elder....

lilacoide

membrana pl.smjtica membrana de la vacuola Uonopl8llo1 estroma

1---- -5~m -

>oJ

Pared celular: las celutas vegetale. est'n rodeadas por una pared rfgida formllda por fibrillas de celulosa depositadas en una mauiz form ada por otrOI poIisadrido•.

-<

PO'''' caluler

,[

0.1·10 II

membrane pl.",,6tica

19

producen ATP a partir de la energia de la luz solar. En ambos procesos existe una serie de reacciones de transferencia electr6nica que genera un gradieme de H+ entre el exterior y el interior de un compartimiento rodeado por una membrana; el gradienle de H' se utiliza luego para impulsar la sintesis del ATP. Actualmente, la respiraci6n es Ulilizada por la gran mayona de organismos, incluidos la mayor pane de los procarimas.

Las c~luJas eucariotas poseen varios organuJos caracterfsticoS'4 tQu~ sucedi6 con los organismos anaer6bicos, con los que habfa empezado la vida, en cuanto se hie acumulando oxfgeno molecular en la atm6sfera? En un mundo rico en oxfgeno, que no podfan utiJizar, se hallaban en franca desventaja. Es indudable que algunos se extinguieron. Otros desarrollaron la capacidad de respirar 0 encomraron nichos en los que escaseaba el oxigeno y en los que pudieron continuar un lipo de vida anaer6bica. Otros, se transformaron en predadores 0 partisitos de las celulas aer6bicas. Y algunos parece que descubrieron una estrategia de supetvivencia mds astuta y mas rica de implicaciones para el futuro: se cree que formaron una asociaci6n intima con un tipo aer6bico de celula, viviendo en simbiasis con el. ~sta es la explicaci6n mas plausible del origen de las celulas actuales de tipo cucarlola (Panel 1·1, ptigs. 18-19), que constit'uyen el tema principal de eSI'e libro. Por definici6n, y a diferencia de las celulas procariotas, las ululas eucariotas tienen un lIucleo ("caf}'OlJ~ en griego), que comiene la mayor parte del DNA celular y que esta rodeado por una doble membrana (Figura 1·18). Por consiguiente. el DNA se mantiene en un compartimiento. separado del resto del contenido celular, el citoplasma, que es donde se producen la mayorfa de las reacciones metab6licas de la celula. Ademas, en el citoplasma se pueden distinguir muchos orgdrlllios caracterfsticos. Entre ellos destacan dos pequeiios tipos de corpusculos, las mitocondrias y los cloroplastos (Figuras 1-19 y 1-20). Cada uno de ellos esta rodeado por su peopia doble membrana, que es qufmicamente diferente de la membrana que envuelve aI nudeo. La presencia de mitocondrias

Figura 1-19 Un c1oroplasto_ Micrografia electr6nica de un doroplasto de una c~lula de musgo. mostrando su extenso sistema de membranas intemas. Los sacos membranosos aplanados contienen c1orofila y esl:ln dispuestos en pilas. 0 grana. Esle c1oroplasto contiene lambi~n grandes 8Cl1mulos de almid6n. (Por cortesfa de J. Burgess.)

20

Capftulo I : La cvolucl6n de la cl!lula

Figura 1-18 EI nt'icleo celular. E1 mkleo col1tiene la mayor parte del DNA de la c~lula eucariOla. La figura 10 muestra en un corte ultrafino de una c~lula de mamffero, observada al microscopio electronico. No sabemos ct'imo y culindo se genero el mideo: en la Figura 12-5 se presenlan algLmas especulaciones sobre este origen. (Por conesra de Daniel S. Friend.)

Figura 1-20 Una mltocondrla. En casi looas las cE:lulas eucariolas.las milocondrias realizan la degradaci6n oxidativa de las mol«ulas nutrientes. Tal como se observa en esla mlcrografia electr6nica, presenlan una membrana eXlema lisa y una membrana lnterna allamenle replegada. (Por cortesfa de Daniel S. "rlend.)

constiluye un rasgo casi universal de las celulas ellcariotas·, mientras que los c1oroplaslos se encuentran I1nicamente en aqllcllas celulas eucariolas que pueden realizar fotosfnlesis --es decir, en las plantas, pero no en los animales ni en los hongos. Se cree que ambos org<1nulos tienen un origen simbi6tico.

Las ct'HuJas eucariotas dependen de las mitocondrias para su metabolismo oxidativo l5 Las mltocondrias muestran muchas similitudes con los organismos procariolas de vida libre: por ejemplo, se parecen a menudo a las bacterias en cuanto a lamano y fonna, contienen DNA, fabrican prolefnas y se reproducen dividiendose en dos. Rompiendo las celulas eucariolas y separando los elementos que las constituyen, es posible demostrar que las mitocondrias son responsables de la respiraci6n y que esle proceso no se produce en nlnguna 01Ta parte de la celula eucariota. Sin las milocondrias, las celulas de los animales y de los hongos serian organismos anaer6bicos que para oblener su energia dependerian del proceso relativameme poco eficaz y anriguo de la glucolisis. Muchas bacterias aetuales respiran iguaJ que las milocondrias, y parcee probable que las celulas eucariolas sean descendientes de organismos anaer6bicos primitivos que sobrevivieron en un mundo que habfa pasado a ser rico en oxfgeno incorporando bacterias anaer6bicas -manteniendolas en simbiosis, debido a su capacidad de consumir el oxfgeno atmosferico y producir energfa. Ciertos microorganismos aetuales muestran c1aras evidencias de la viabilidad de esta secuencia evolutiva. Existen varios dentos de especies unicelulares de organismos eucariotas que se parecen a la hipotetica celu1a eucariola ancestral en que viven en condiciones pobres de oxfgeno (por ejemplo, en el intestino de los animales) y no presentan milocondrias. Rceientemente, analisis comparalives de secuencias nuclcotfdicas han sugerido que aI menus dos grupos de eslOS organismos, los diplomolJados y los microsporidios, pudieron divergir muy lempranamente dellinaje principal de las otras celulas eucariotas (Figura 1-21). Existe olro eucariora,la ameba Pelomyxa palustris que a pesar de que carcee de milocondrias, realiza un melabolismo oxidativo hospedando bacterias aer6bicas en su citoplasma, manteniendo con elias una relaci6n simbi6tica pennanente. Por consiguiente, los diplomonados y los microsporidios por una parte y Pelomyxtl por OIra, parecen dos de los estadios propuestos en la evoluci6n de los eucariotas. • (N. del T.) Onicamcnlc los mlcrosporidlos, prololoos endopanl.sitos, carccen de milocondrias.

,

De los procariotas a los eucariotas

n......

IAI Figura 1-21 EI diplomonado Giardia. Dibujo, lal como se ve aJ microscopio 6ptico. (B) Micrografia electr6nica de una secci6n a traves del aplanado cuerpo de la celula. Se cree que Giardia es uno de los lipos celulares mas primitivos de celula eucariota. Es nuclcado (de hecho tiene dos nucleos idenlicos), presenla citoesqueleto con actina y tubulina y se desplaza mediante nagelos tfpicos que contienen microtubulos; sin embargo no tielle ni mitocondrias ni c1oroplastos ni un retfculo endoplasmatico normal ni complejo de Golgi. Estudios de secuencias de nucle6tidos indican que esta al menos tan relacionado con las bacterias como con OlIOS eucariotas. de los que debi6 de diverger en etapas lempranas de la evoluci6n. Giardia vive como un panisito en el intestino y en humanos puede causar enfennedades. (A, segUn G.D. Schmidt y LS. Roberts, Foundations of parasitology. 4th Ed. St. Louis: Times Mirror/Mosby. 1989; B, por conesfa de Dennis Feely.) (A)

2\

La adquisici6n de mitocondrias debi6 de tener muchas repercusiones. La membrana plasm<1tica, por ejcmplo, esl<1 fuenemente compromclida en el met8bolismo energetico en las celulas procariotas perc no en las eucariolas, en las que esta funci6n crucial ha sido relegada a la mi(Qcondria Parece probable que la separaci6n de funciones de)6 Iibre a la membrana plasmatica eUcar10ta para desarroUar otras caracteristicas importantes. Concretamente, dado que las celulas eucariotas no necesitan mantener un marcado gradiente de H' a trav~ dc su membrana plasmatica, tal como requieren las procariolas para la producci6n de ATP, rue posible utili1.ar cambios controlados de la pcrmeabilidad i6nica de la membrana plasm<1tica con finalidad de senales celulares. Asr, aproximadamente al mismo tiempo en que surgieron las celulas eucariolas, aparecieron en la membrana plasm<1tica varios tipos de canales i6nicos. En la actualidad, en organismos supcriores estos canales median elaborados proccsos de seflales elearicas -especialmente en el sistema nervioso- y controlan gran pane del comportamicnlo de organismos eucariotas unicelulares de vida Iibre como los protozoos (ver m<1s adelamel.

Los c1oroplaslos son descendienles de una celula procariola incorporada 16 Los cloroplastos realizan la fotosfntesis de una manera Illuy parecida a como 10 hacen las cianobacterias procariotas. caplando la luz solar en la c1orofi)a que esla unida a sus membranas. Algunos cJoroplastos guardan una estrecha semejanza ultraeSlructural con las cianobaclerias. siendo similares en lamano y en la manera en que sus membranas porladoras de cJorofila est<1n apiladas (vease Figura 1-20). Ademois, los cJoroplastos se reproducen por divisi6n y conrienen DNA, con una secuencia de nucJedtidos casi identica a la de fragmentos del cromosoma bacteriano. Todo ella sugiere cJaramente que los cJoroplaslos comparten un ancestro com6n con las cianobacterias y que evolucionaron a partir de procariotas que pasaron a vivir dentro de celulas eucariotas. Estos procanotas realizaron fotosfntesis para sus huespedes como contraprestaci6n por la protecci6n y por el ambiente nutritivo que estos (ilumos les suministraban. De hecho, la simbiosis de celulas fotosintelizadoras con ouos tipos celulares es un fen6meno comun, y se pueden encontrar algunas celulas eucariOlas actuales que contienen autenticas cianobacterias (Figura 1-22).

dMconocido .nustro pr~riotl .n.e.6bieo de los eUl;Iriolas

proca.iotl oneest••1

22

Capftulo I : La evoluclon de 18 c~lula

ci.nobacllfia

surco de segmentxi6n

Figura 1-22 Un parlente proximo de las clunobacterlas 3ctuales, que vlve en una relaclon slmblotlca pem18nenle dentro de otra celula. Los dos organismos redben elnombre conjulllo de CymlOpllOfa parado.m. La "cianobacteria" estti en el proceso de divisi6n. (Por cortesfa de Jeremy D. Pickeu-Heaps.)

Figura 1-23 H1potetlco orlgen de los eucarlotas 8cluales, por slmblosls de procarlolas aeroblcos yanaeroblcos. No se conace la relaci6n entre el momenta en que se origin6 el nLlcleo de los eucariotas y el momenta en que la Ifnea de los eucariotas se separaron de las arquebacterias y de las eubacterias.

Tabla I-I Comparaci6n entre organlsmos procariOlas yeucariotss Procarlotss

Eucariotas

Organjsmos Tamano celular Metabolismo OrgIDlUlos

bacterias y cianobacterias general mente de 1a 10 ~m en dimcnsi6n lineal anaer6bico 0 aer6bico pocos 0 ninguno

DNA

DNA circular en el ciloplasma

protistas, hongos, plantas yanimales generalmenle de 5 a 100 Ilm en dimensi6n lineal aer6bico nudeo, mitocondrias, doroplastDs, retfculo endoplasm:.\tico, elc. moleculas lineales de DNA muy largas que contienen muchas regiones no codificantes; organizado en cromosomas y rodeado por la envoltura nuclear RNA sintetizado y procesado en el nudeo; protefnas sintetizadas en el citoplasma cilOCSQueleto compueslo por filamentos proteicos; conicntcs citoplasm<1ticas, endocitosis yexocitosis separaci6n de cromosomas mediantc un aparato: ct huso mit6tico principal mente pluricclutar, con difcrenciaci6n de muchos tipos celularcs

RNA Yprotefna

RNA Yproteina sintetizados en el mismo companimiento Citoplasma sin ciloesqueleto: conientes citoplasmtHicas, endocilosis y ex.ocitosis ausentcs Divisi6n celular separaci6n de cromosomas por uni6n a la membrana plasm<\tica Organizaci6n principalmcnle unicelular celular

La Figura 1-23 muestra los orfgenes evolutivos de los eucariotas, de acuerdo con la tcoria simbi6tica. Sin embargo, debemos subrayar que las mitocondrias y los c1oroplastos muestran, ademtis de similitudes, imponantes diferencias con respccto a las bacterias aer6hicas y a las cianobacterias acroales respectivamenteo Por ejemplo, su cantidad de DNA es muy reducida, de forma que la mayor parte de las mollkulas a partir de las cuales estan constiluidos, son sintetizadas en algun otro lugar de la ct'!lula eucarlota e importadas al organulo. Si bien parece que se originaron como bacterias simbi6ticas, han sufrido importames cambios evolutivos y han pasado a ser altamente dependientes de sus huespedes y sujetos a su control. La mayorfa de los eucatiotas actuales tienen en comun las mitocondrias y toda una constelaci6n de rasgos que los distinguen de los procariotas [[abla II). Todos eslos rasgos acujan conjumamente proporcionando a las celulas eucatiotas un gran numero de capacidades diferentes de fonna que tan 5610 es posible especular sobre cu
Las celulas eucariotas contienen una rica dotaci6n de membranas internas Las celulas eucariotas suelen tener un volumen mucho mayor que las procariotas (por 10 general, mtis de mil veres superior) y contienen una cantidad proporcionalmente superior de la mayoria de materiaJes celulares; una celula humana, por ejcmplo, contiene 1000 veces mois DNA que una bacteria tfpica. Este gran tamano plantea problemas. Puesto que todas las materias primas para las reacciones de biosfntesis que se producen en cl interior de una celu!a deben emrar y salir pasando a naves de la membrana plasmatica que recubre su superficie. y puesto que en la membrana lambicn se producen imponantes reacciones, un aumento en el volumen celular exige un aumento en la superficie celular. Pero la geometrfa nos ensena que un aumento simple de 101 escala de una estructura incrementa el volumen aJ cuba de la dimensi6n lineal, mientras que el Area superficial qucda aumentada 5610 at cuadrado. Por consiguientc, si la gran celula eucariota ha de conservar la misma proporci6n de superficie respccto al volumen que presenta la celula procariota, debem suplementar su area superficial mediante drcunvoluciones, pliegues y otras transformaciones de su membrana. De los procarlotas a los eucariotas

23

·.

fA 11110

fR rugolIO

ribolOmas

mitocoodria

Es probable que esto explique en parte la compleja profusi6n de membranas intemas, que es una caraclcrfstica basica de todas las celulas eucariOlas. Las membranas roclean at n(ideo, a las mitocondrias y (en las celulas vegetates) a los c1oroplastos. Forman un compartimiento laberlntico denominado reticula endoplasmlitlco (Figura 1-24), donde son silllelizados los IIpidos y las protefnas de las membranas celulares. asr como e1 material destinado a ser exportado por la celuJa. Tamhien forman agrupaciones de s:jculos aplanados, que constituyen el complejo de Golgi (Figura 1-25), que parlicipa en la modificaci6n y en ellransporte de las moMculas fabricadas en el reticula endoplasmatico. Las memhranas rodean a los Ii.sosomas. los cuales conlienen reservas de las enrimas necesarias para la digesti6n intraceluJar, enzimas que de este modo no pueden atacar a las protemas y <'icidos nudeicos de la propia celula. De la misma manera, las membranas rodean a los peroxisomas, dondc se generan y degradan per6xidos pcligrosamente reactivos durante la oxidaci6n par el oxIgeno de varios lipos de moleculas. Las membranas tam bien forman pequefias vesiculas y, en las plantas, una gran uacuola lIena de IJquido. Todas estas estructuras rodeadas de membrana corresponden a distintos companimientos intraciloplasm<'iticos. En una reIula animal lipka, esl'OS compartimientos (u orginulos) ocupan casi la mitad del volumen celular total. EI restante companimiento del citoplasma, que induye todos los elementos celulares salvo los org;inulos delimilados por una membrana, suele recihir elnomhre de c1tosol. Todas las estructuras memhranosas que acabamos de cit'ar se encucntran dentro de la celula. Por consiguiente, tc6mo pueden ayudar a solucionar el problema mencionado al principio y suministrar a la celula un <'irea superficial que sea suficienle para su gran volumen? La respuesla es que hay un intercambio continuo entre los compartimientos internos delimhados por memhrana y el exterior de la relula. EsIO se consigue mediante la elldocitosis y la exocitosis, procesos que se presentan unicamente en las celulas eucariotas. En la endocitosis, porciolles de la membrana superficial externa se invaginan y separan por estrangulaci6n, formando unas vesfculas citoplasmaticas, rodeadas de membrana y que conliencn sustancias que se hallaban prcsentes en cl medio externo 0 que (ueron adsorbidas en la superficie cclular. Partfculas muy grandes 0 incluso celulas extrafias enleras son capturadas por fagocilosis -una forma especial de endocitosis. La exocitosis es el proceso inverso, por el cual unas vesfculas rodeadas de membrana, presentes en el intcrior de la celula, se fusionan con la membrana plasmatica y Iiberan su comenido al medio extemo. De esla manera, las membranas que limitan a los companimiemos siluados dentro de la relula incrementan cl area superficial erectiva de la celll!a para los inlercambios de materia con el media exterior. Como veremos en capflulos posteriores, las divcrsas membranas y cam partimicntos rodeados por membrana de las cclulas eucariolas han Ilegado a ser altamente especializados, algunos para la secreci6n, otros para la absorci6n, olros para procesos especificos de bios(ntesis, elc. 24

Capitulo 1 : La evoluci6n de la celula

FIgura 1-24 RetlcukJendoplasmitJoo. Micrografia electr6nica de un cone uhrafino de una dlula de mamffero, mostrando zonas lisas y zonas rugosas del reticulo endoplasmatioo {ER}. Uls regiones lisas estan implicadas en el melabolismo Iipfdico mienlras que las regiones rugosas, lapizadas de ribosomas, son lugares de sfntesis de protefnas deslinadas a abandonar eI dlosol y entrar en otros compartimienlos de la dlula. (Por cones[a de George Palade.) complejo de Goigi

I,m

Figura 1-25 El complejo de Golgi. Micrograffa electr6nica de un corte ultmfino de UlUl c~lula de mamffero, mostrando el aparato 0 complejo de Golgi, que esli1 compueslo por saCl110S membranosos aplanados dispueslos en mUltiples filas (vease tambien e1 Panel I-I, p;1gs. 18-19). EJ complejo de Golgi inlcrviene en la sfnlesis y empaquetamiento de mol«ulas deslinadas a ser scgregadas por la ~lula, asf como en el transpone de protefnas recien sinletizadas hacia el compartimiento celular adecuado. (Por conesfa de Daniel S. Friend.)

Figura 1-26 Actina. En eSla micrograffa eJeclr6nica, preparada por Ja tecnica de subJimaci6n, se observa una red dc filamentos dc actina subyacentc a la mcmbrana plasmatica de una celula animal. (Cortesfa de John HcuseL)

,OO~

Las celulas eucariotas tienen un citoesqueleto ClIanto mayor es una relula, y cuanto mas complejas y especializadas son sus estructuras inlernas, lanto mayor es la necesidad de mantener estas estructuras en sus lugarcs apropiados y de controlar sus movimienlOS. Todas las celulas eucariolas denen un esquelclo interno, el citoesqueJeto, quc confierc a la celula su fonna, su capacidad de moversc y su habWdad para distribuir sus organulos y transportarlos de una pane a olra de la relula. EI citoesquelelo esta compuesto por una red dc filamemos proleicos, de los cuales dos de los mas irnportanlcs son los filametltos de actina (Figura 1-26) Y los microtlibllJos. Los dos debieron aparecer en una ~poca muy lemprana de la evoluci6n, ya que se presenlan en lodos los eucariolas de manera casi idemica. Ambos intcrvienen en la gencraci6n de los movimientos celula· res; los filamentos de actina, por cjcmplo, pcnniten a las celulas eucariolas replar, y participan en la comracci6n muscular en los animales; mienlras quc los lllicronibulos son los principalcs elemenlOS estructurales y generadores de fuer/..l de los cjlios Ylos jlagelos -las largas proyecciones que existen en la superlicie de algunas celulas, que se mucvcn como l:Higos y que silVen de uls(rumelllos de propulsi6n. Los filalllcnios dc actina y los microtubulos (ambien son imprescindibles para los movimienlOs ullernos que tienen lugar en el citoplasma de lodas las celulas eucariolas. As{, los microtllbulos del Ii/tso mitotico son una parte esencial de la maquinaria utilizada habilualmcnlc para distribuir el DNA en dos parIes iguales entre las dos celulas hijas, cuando ulla celula cllcariola se divide. Par cOllsiguiente, la celula eucariota no se podrfa reproducir sin los microlubulos. En este y ell otros casos, el movimiento mediante difusi6n Iibre serfa demasiado ICllto 0 dcmasiado aleatorio para resullar eficaz. De hecho, a mcnudo los org{l.llllios dc una celula eucariota parecen estar adheridos de manera directa 0 indirecta al citoesqucleto ycuando se mueven, ser propulsados a 10 largo de las v{as citoesqueleticas.

Entre los protozoos se encuentran las celulas mlis complejas conocidas 17 La complejidad que puede alcanzar una celula eucariota se pone de manifiesto sobre (odo en los prol.istas (Figura 1·27). Se trala de eucariotas unicelulares, de vida generalmente Jibre, que son evolutivamente diversos (vease Figura 1-16) y que muestran una asombrosa variedad de formas y comporlamientos distintos: pucden ser fOlOsintetizadores a carnfvoros, m6viles 0 sedentarios. A menudo Sll anatomfa celular es compleja e induye estructuras tales como cirros sensoriales, fOlorreceptores, Oagelos, apendices a modo de paras, piezas bucales, Oechas urticantes y haces colltrckliles parecidos a mlisculos. Aunquc son celulas aisladas, pueden ser tan complicadas y versMiles como muchos organismos pluricelulares. Es(o es valido sobre todo para el grupo de protistas conocido como prolozoos, y est;1 particularmente bien iluslrado en el grupo conocido como cUlados.

De los procarlot3s a los eucariotas

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~

B.

~

D.

Didini14m es un prolazoo cam1voro. Tiene un cuerpo globular, de aproxima-

damenle 150 ~m de dhimelro rodeado por dos hileras de cilios: su extreme frontal es aplanado salvo una protrusi6n parecida a un hocico (Figura 1·28). Didi"ium se desplaza en el agua nadando a gran velocidad mediante el balido sincr6nico de sus cilios. Cuanda encuentra una presa apropiada, por 10 general Paramecium, OlTO ripo de protozoa, dcspide desde la regi6n de su hadeo un gran mimero de pequef'ios dardos paraJizantes. Luego Didi"ium se fija a Paramecium y 10 devora, invirtiendose como una peJola hueca y rodeando a la otra cclula. que es ran grande como el mismo. La mayor parte de este complejo comportamicnlo -nataci6n, paralizaci6n y captura de la presa- se genera por estructuras citoesqueletic.1& si~ tuadas inmediatamcnte por debajo de la membrana plasmlHica. En este c6rtex celular se encuentran, por ejemplo. los haces paralelos de microtubulos que for· man la parte central de cada cilio y que Ie permiten su movimiento de "remar". Comportamientos depredadores de este tipo y el conjunto de caracterfsticas de las que depende -tamano grande. capacidad de ragocitosis y habilidad para moverse en persecuci6n de la presa- son tfpicas de los eucariolas. De hecho es probable que estas caracterfsticas aparecieran en un esladio temprano de la evoluci6n. haciendo posible la caplura de bacterias para su domesticaci6n como mitocondrias y c1oroplastos.

En las celuJas eucariotas el material genetico esta empaquetado de forma compleja Las celulas eucariotas conlienen una gran cantidad de DNA. Como hemos dicho anteriormente. las celulas humanas contienen unas mil veces maS DNA que una bacteria tfpica. La longitud del DNA de las celulas eucariolas es Ian grande que

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Capftulo 1 : La evolucl6n de la el!lu1a

I Figura 1-27 Grupo de protJSIU. lJustrando algunas de Iu enonnes varledudes que pueden hallarse entre esla close de organlsmo8 unleelulares. Estos dibujos estan realizados a diferente escala, perc en eada caso la barra represenla 10 ~m. Los organismos en (A), (B), (E), (F) e (I) son ciliados: (C) es un euglelloide: (0) es ulla ameba; (G) es un dinoflagelado; (H) es un heliozoo. (De MA Sleigh, The Biology of Protozoa. London: Edward Amold, 1973.)

el peligro de enmaraftamiento y rotura resulta muy elevado. Probablemente por esta raWn, aparecieron unas protemas que sOlo se encuentran en los eucariotas, las histoTlas, que se unen al DNA Y 10 enrollan formando cromosomas, compaetos y manejables (Figura 1-29). EI denso empaquetamiento del DNA en los cromosomas es una parte esencial de los preparativos para la dJvisi6n celular en los eucariotas (Figura 1-30). Todos los eucariotas (salvo una pequef\a excepci6n) tienen histonas unidas a su DNA, y la importancia de estas protemas se re8eja en su notable conservacion a 10 largo de la evoluci6n: varias de las histonas de una planta de guisante son casi exactamente iguales. aminoo.cido a aminoo.cido, a las de una vaca. Las membranas que envuelven el mlc1eo de las clluJas eucariotas protegen la estructura del DNA y la delicada maquinaria de control asociada, previenen que se embrollen con el citoesqueleto m6vi1 y las resguardan de muchos de los carnbios quimicos que se producen en el citoplasma. Tambi~n permiten separar e independizar dos pasos cruciales de la expresi6n g~nica: (I) el copiado de las secuencias de DNA a secuencias de RNA Uranscripcidn del DNA) y (2) la utilizaci6n de estas secuencias de RNA para dirigir la sfntesis de prote(nas especfficas (tTadllCxi6n del RNA). En las celulas procariotas no existe la divisi6n de estos procesos en compartimientos -Ia traducci6n de las secuencias de RNA a proteEnas empieza en cuanto eslas secuencias se transcriben, incluso antes de que su sfntesis haya terminado. Pero en los eucariotas (salvo en las mitocondrias y en los c1oroplaslOs que en este aspecto, como en otros, se parecen mas a las bacterias). los dos pasos que conducen desdc el gen hasta la proterna estan estriclamente separados: la transcripci6n ocurre en el mlc1eo, la traducci6n en el citoplasma. EI RNA ha de abandonar el mlc1eo antes de poder ser utilizado para guiar la sintesis proteica. Mientras se halla en el mlc1eo sufre una serie de complicadas transformaciones, durante las cuales se eUminan unas mnas delerminadas de la molecuJa de RNA y olras se modifican (procesamiento del RNA). Dcbido a eSlas complejidades, el material genetico de una celula eucariota ofrece muchas mas oportunidades de conlrol que las existentes en las bacterias. l00lJ m

Resumen Ins d/ulas vit.w actllales se clasifican en procnrioras (bcu:rerias y organismos afim~) y ellcariotas. Almque presentall estrtlcturas relntivamenre sencillas, las dlulas procariotas puedetl ser bioqll(micametlte versdtiles y muy diferentes: porejempw, ell _las bacterias ,,,,eden ellcollrrarse tOOas itu vias merab61icas principales, inelllidos los tres procesos ellergericos flllldamentales, 0 sea la gllU:olisis, la respiraci6n y la fotOS/lltesis. Las dill/as eucariotas son mayores y mds complejas que las celu/as 1Jracarioms, y cOlltiellen "Ids DNA, ademds de otras componenres que permiten que este DNA sea modificado de mlUlera compleja. £1 DNA de la celula eucariota €Std slruMo en I'" micleo rotleado por una doble membrana, mienrras que el citoplasma contiene nlllchos orras orgdnulos rambien delimitados por una doble membrana, entre los que se cuentan las mitoco"drias, qlle reallurn la oxidaci6n de las molkulas del alimenro, yen las dlulas vegetales. los cloroplastos, que rMUzan la !otos(ntesis. Diver50S tfpos de prtlebas sllgieren q/le las mirocondrias y los cloraplasros son descendienres de cellilas lJrocariatas primitivas que se establecieroll comosimbiaflles denfro de /lI1lI gran cell/Ill anaerobica. lAS diu/as eucariotas presentan rambMn la caracter£sfica de poseer WI citoesquelelo de fi/amellros proreicos qlle ayuda a organlzar el ciroplasma y proporciona la maquinaria para el movimiento.

/

Figura 1-28 Un protozoa devorando a otto. Los ciliados son animales unicelulares que presentan una inmensa dJversidad de formas y comportamientos. La fotograffa superior muestra Didinium. un prOtowo eIliado con posce dos bandas de cilios m6viles y una protuberancln a modo de hoeleo en su extremo anterior. con la que eaptura sus presas. En la micrografia inferior Didinium esut devorando OITO protozoa, Paratrli!Cium. (Por cones(a de D. Barlow.)

De las celulas simples a los organismos pluricelulares '8 Los organismos unicelulares, tales como las bacterias y los prOlOZOOS, han tenido tanlO exito aI adaplarse a una gran variedad de ambienles distinlOS, que conslituyen mas de la mirad de la biomasa total de la Tierra. A diferencla de los

De las «luJas simples a los organismos pluriceluJaces

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organismos superiores. muchos de estos organismos unieelulares pueden sinte· tizar a partir de unos ellantos nulrienles simples todas las suslancias que ne<:esi· tan y algunos de ellos se dividen m<1s de una vez cada hora. iCu<11 fue entonces la ventaja selecliva que cOllelujo a la evoluci6n de los organismos pluricelulares? La respuesta mi\s sencilla es que los organismos pluricelulares pueden ex· plotar recursos que ninguna c~lula aislada podrfa utdizar tan bien. Estc principio, aplicado por primera vez a una simple asociaci6n de c~lulas. ha lIegado all(mite en los organismos pluricelulares que conocemos. La pluricelularidad, por ejemplo, pemlile que una planla lIegue a ser ffsicamente grande; que tenga ra!· ces en el suelo. donde un grupo de c~lulas pueden absorber agua y nutrientes; y que tenga hojas en el aire. donde Olro grupo de c~lulas puede caplar eficazmen· te energ!a radiante del sol. En el tronco de la planta exislen c~lulas especializa· das que forman conduclos para el transpone del agua y de los nUlrienles enlre las ralces y las hojas. Otro gropo de celulas especializadas fonna una capa de coneza que impide la ~rdida de agua y hace posible un ambiente interno pro· tegido (v~ase el Panel 1·2, p<1gs. 30-31). La planta en conjunto no compite direc· tamente con los organismos unicelulares por su nicho ecol6gico; ha encontrado una manera radical mente diferente de sobrevivir y multiplicarse. A medida que aparecieron los diferentes tipos de animales y piamas. alleraron el medio ambicnte en el que se produjo la evoluci6n posterior. La supervivencia en una jungla exige caracteristicas diferentes a las requeridas para 50brevivir en mar abicno. Las innovaciones en el movimiento. la percepci6n sensorial. la comunicaci6n, la organizaci6n social-todo ello permili6 a los orga· nismos eucariotas compeLir. propagarse y sobrevivir de manera cada vez mas compleja.

DNA

Flguna 1-29 D1bujoesquemalkoque Uustra como las protefnas denomlnadas hlstonas. de carga posltlva. ravorecen eI plegado del DNA en los cromosomas.

Las celulas se pueden asociar formando colonias Parece probable que uno de los primeros pasos en la evoluci6n de los organ is· mos pluricelulares fuera la asociaci6n de organismos uniceluJares formando colonias. La manera mi\s sencilla de conseguirlo consisle en que las c~llIlas hijas pennanezcan asociadas despues de cada divisi6n celular. A1gunas c~llIlas procariotas muestran incluso un componamiento social semejante. aunque de una manera primiliva. Las mixobacterias, por ejemplo, viven en el suelo y se aUmen· tan de mohkulas organicas insolubles que degradan medianle las enzimas de· gradames que segregan. Se manticnen unidas en colonias laxas, en las que las enzimas digcslivas segregadas por las diSlintas celulas se ponen en comun, con 10 que aumenta la eficiencia de la alimcntaci6n (el efeelo "flotilla"). ESlas celulas represenmn de hecho lllla sofisticaci6n maxima entre los procariotas, ya que cuando el alimento disponiblc sc agota, las cl:Hulas forman agregados mas densos y conslituyen un cuerpo fructlfero pluriccluJar (Figura 1-31), dcnlro del eual las bacterias se difcrendan a esporas que pucden sobrevivir inclllSO en condiciones extremadamente hostiles. Cuando las condiciones vuelven a ser nHis favorables, las esporas del cuerpo fructffero germinan y producen un nuevo enjambre de baclerias. Las algas verdes (que no deben ser confundidas con las ~algas azules" proca· riotas a cianobacleriasJ son eucariotas que exislen en formas unicelulares. formas coloniales y formas pluricelulares (Figura 1-32). Las diferentes especies de algas verdes se pueden estudiar en orden de complejidad. ilustnindose as! el tipo de progresi6n que ocurri6 probablemenle durante la evoluci6n de los animales y plantas superiores. las algas verdes unicelulares. como por ejemplo Chlamydomonas. se parecen a prOIOzoos nagelados, salvo en que presentan c1oroplaslos que les pennilen realizar la fOlosfmesis. En generos estrechamenle em· parentados. grupos de celulas flageladas viven en colonias, unidas por una ma· triz de mol~las extracelulares segregadas por las propias celulas. Las especies mas sencillas (las del genera eo"ium) presentan la forma de un disco c6ncavo formado por 4, 8, 160 32 c~lulas. Sus flagelos se mueven de manera independiente. pero pueslo que lodos estan orientados en la misma direcci6n pueden 28

Capftulo I ; La evolucl6n de la celula

cromosoma

Flgufll 1-30 Dlbujo esquemlitlco de celulas eucarlolas en mitosis. Ala izquierda se mueslra una celula animal ya la derecha una celula vegelal. La envohura nuclear se ha rOIO. yel DNA. una \-ez replicado, se ha condensado en dos dOlaciones complelas de cromosomas. cada una de las dos celulas en roonati6n recibe una dOlaci6n de cromosomas, los cuales son desplazados por el huso mit6tico que esta compuesto mayoritariamente por microtUbulos.

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Figura J -31 Mlcrograffa elec:tr6nlca de barrldo, de los cuerpos fruclfferos fonnados por un myxobacterlum (CllOlldromyces crocatus). Gada cucrpo fructffero, empaquetado con esporas, eSla ronnado por la agrcgaci6n y diferenciaci6n de aproximadamenle un mi1l6n de mixobaClerias. (De P.L Grilione y J. Pangborn.). Bacterial. 124:l558·I565. 1975.)

0,1 mm

propulsar a la colonia por el agua. Todas las celulas son equjvalemes entre sf, y cada una de elias se puede dividir dando lugar a una nueva colonia. En ouos generos se encuemran colonias mayores, siendo las mas espectaculares las del genero VO!IJOX, algunas de cuyas especies viven en colonias de 50 000 0 mas celuJas unidas formando una esfera hueca. En Volvox, las distintas celulas que forman una colonia estdn conectadas mediante finos puentes citoplasmdticos, de modo que el batido de sus flagelos estd coordinado para propulsar a toda la colonia como una pelota (Figura 1-32). Dentro de la colonia de Volvox existe un cieno repano del uabajo entre las celulas; un reducido m.imero de eUas se ha especial izado en la reproducci6n, sirviendo de precursoras de nuevas colonias. Las Olras celulas son tan dependientes unas de Olras que no pueden vivir aisladas, y cl organisrno rnuere si se dcstruye la colonia.

Las celulas de un organismo superior se especializan y cooperan En algunos aspectos, VollJOX es mAs parecido a un organismo pluricelular que a una simple colonia. Todes sus flagelos se mueven sincr6nicameniC cuando Itl colonia se despJaza en el agua, de forma que la colonia esta estrllctural y funcionaJmente polarizada y puede nadar hacia una fuente lejana de Iliz. Las celulas reproducloras sllclen eslar confinadas en un extreme de la colonia, donde se dividen formando nuevas colonias cn miniatura que inicialmente permancccn dcntro de la esfcra madre. Asf, y aunque de una manera primiliva, Voluox IllUCSIra los dos rasgos csenciales de lodos los organismos pluricelulares: sus celulas se especialiZlw y cooperalJ. Mediante la especializaci6n y la cooperaci6n las cclulas se combinan formando un t"inico organismo coordinado, con capacidades mayores que las de cualquiera de las partes que 10 componen. Los esquemas organizados de diferenciaci6n celular se presentan incluso en algunos procariotas. Por ejemplo, muchos tipos de cianobacterias permanecen agrupados despues de la divisi6n celular. formando cadenas fLIamentosas que pueden alcanzar hasta un metro de longitud. A 10 largo del nJamento, y a intervalos regulares, las diSlintas celulas adquieren un cardcter distintivo y se vuelven capaces de incorporar nitr6geno atmosferico en moleculas orgjnicas. Estas escasas celulas especializadas realizan la fijaci6n del nitr6geno para las celulas vednas y comparten can elias los productos. Pero las celulas eucariotas han lIegado mucho mds lcjos en este tipo de disuibuci6n organizada del lrabajo; elias, a diferencia de las celulas procariotas, son las unidades vivas a panir de las cuales est~n conslruidos lodos los organismos pluricelulares m~s complejos. De las c~lulas simples a los organismos pluriceJuJares

Lt lllve equivele en Clldill CllSO ill 50 11m

Figura 1-32 Cuatro generos de algas verdes, estrechamente emparentados, mostrando una progresi6n desde una organlzacl6n unlceluJar hasta una organizacl6n colonial ymultlcelular. (porconesfa de David Kin.)

29

LA PLANTA

epldermi. superior nervio prlnclp.1 ldel h.z1....-~,......,;...""o,!:" ~" ~

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del. ffi8sOfilo hal. eslomu lpsfltnquiml) de II epidermis inferior (del enris) Colenquim.

HOJA

La planta joven con flores que se presenta ala izquierds esta conltituide por tres tipos de 6rganos: hojas, tall05 y raices. A su vez, cada 6rgano vegetal esta formado par Ires sistemas histol6gicos: el bSsico, el dermico y el vasculer. En ultimo termino, los tres sistemas histol6gicos deriven de la aetividad proliferativa de una celula da los meristemOI apicalel del brole y de la raiz, y cada uno de elias contiene un numero relativamente redueido de tipos celulares especiali18dos. En esle Panel se describen eslos Ires sistemas histol6gicos comune., y las celulss que los forman.

LOS TRES SISTEMAS HISTOLOGICOS La divisi6n O8lul8r, el crecimiento y I. diferenciacion dan luger a sistemes histol6gicos confunciones especiali18d.s.

TALLO

TEJIOO EPlot:RMICO _I: se trata del recubrimiento extemo protector de Ie plante que asta en contacto con el media. Fecilila la capteciOn de agua y de iones en la. ralces y regula el intercambio gaseoso en las hojas y en los tallo$.

_I

TEJIOO VASCULAR: El floema y el xitema_1 forman conjuntamente un sistema vascular continuo a Ira""" de la planla. Este lejida conduce agua y solutos entre 10& organos y tambi9n proporciona sopone meeanico.

endodermis periciclo

TEJIOO BAsICO Ic::::lI: Esle tejlda de empaquetamiento y de IOporte ocupa la mayor parte del votumen de la p1anta joven. lambien interviene en Ie fabricacion V elmacenemienlo de elimento.

rnerislemol apicaletl d. r. rllz

TEJIDO BASICD

EI sistema histol6gico basico contiene tres tipo. celulares principales lIemados parenquima, col8nquima yesclerenquima.

las celulas parenqulm'tlcas 58 encuentran en todos los sistemas histolOgical. Son celulas vivas, generelmente capaces de dividirse posteriormente, y que presenten una pared celular primaria delgada. Estas celulas lienen varias funciones. Las celulas meristematicas apical V lateral de los brotes y de las ralces suministran nuevas celulas necesar;as para el crecimlento. La produccion de elimento V de almacen tiene lugar en las celulas fotosinlelicas de la hojaldenominadas celulas del mes6fi1ol V deltallo; el parenquima de reserva forma el volumen de muchos frulOI y verduras. A causa de su capacidad proliferaliva, las celules parenquimalicas actuan como c'lulas madre cicstrizendo las heridas e Interviniendo en la regeneraci6n.

EI col6nquiml est' formado por diu las vivas similaras a las celulas parenquimalicas excepto en que tienan paredes calulares muy grueses y en que habitualmente son alargadas y lSI'n empaquetadas en fibras a modo de cuerdat.. Son capaces de alargarse y de proporciona' soporte mecilnico al sistema histologico bilsico de las regiones de la planta en crecimiento. Las celulas colenquimatosas son especialmenle abundantes en las regiones subepid'rmicas de los lallos. loc.liuclones tfpicas grupo. de sopon~ cliluln en un tsllo , • fibru esclere"quim6tlcas .. hsz vascular cole"quima

de de

a

celulas meriSlemalic•• de Ie raiz

celulM del ffi8sOfilo de I. hoj.

r=l ~

30

e8lul. de trln.ferltflCis

Una celula de transferencia, una forma especializada de celula parenquimatica, 58 identiflCa f6cilmente gracias a unlS complejas invaginaciones de la pared calular primaria. EI incremento del 'rea de la membrana plasmaticB bajo lSIal paredes facilna el r'pido transporte de $OlL1Ios hacia y desdelas celulas del sistema vascular.

EI esclerenquime, como el colenquima, liene funciones de refueno y de soporte. Sin embargo, hsz de fibr.. normalmenle Mta formltdo por celulas muenss, con gruesas paredes celuleres secundarias lignificadas incapaces de alarglfSe cuando la planta creoe. los dos tipos comunes son las fibras, que a menudo forman largos haces, y las esclereidas, qOl son celulas mas cortas y ramificadas existenles .. las cubiertlS de la semille y en el frUlo.

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10 11m

Pmell·2 ModeIo8 celulares y tejklos con los que est4n constnddaslaa plantas aupertores.

Estomas

TEJIDO D~RMICO La epidermis ea la cubiarta primaria protectora

externa del cuerpo de la planta. las calulas de Ie epidermis tambien esten modificadas formando los estomas y varios tipos de pelos.

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los pelos (0 tricomas) son apendices derivados de las dlulas epidermicas. Eltiste una gran variedad de formas; normalmente se encuentran en todes las partes de la planta. los pelos intervienen en la protecci6n, absorci6n y secreci6n; ejemplos:

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Epidermis

100 101m

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] cuticula

La epidermis lnormalmenta de una sola capa de dlulas de grosorl cubre completamenta al tallo. la hoja y la ralz da la planta jovan. las dtulas estan vivas, lienan gruesas paredes celulares primarias. y estiln recubiertas apicalmente por una cutfcula aspecial con una capa externa de cera. las celulas est
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los estomas son aberturas de la epidermis, principalmente en la cara inferior de Ie hoja (envesl, que regulan el intercambio ga5OOso en la ptanta. Esten form ados pOr dos dlulas epidermicas especializadas lIamadas cdlulss guards, las cuales regulan el diametro del poro. En cada epidermis. los estomas estan distribuidoa siguiendo diferenles ordenaciones aspeciflCls de la especie.

Haces vasculares Normalmanta en las refces hey un solo haz vascular. pero en los tallos hay varios haces. En las dicotited6nees estos haces estan ordenados siguiendo una estrkta simetria radial, pero an las monocotiled6neas est
epidermis del hal de una hoja

pelos unicalulares j6vanes de la epidermis de la semilla del algod6n. Cuando estos crecen, las paredes se engruesan secundariamente con celulosa formando las fibras de algOO6n.

epidermis

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10).lm

, .. un pelo pluricelular glandular da una hola de geranio

floema

de un taUo

los pelot radicula," deHmpel'ian una importante lunciOn en la capt/loeiOn de a"ua alonas

par6nqulma

TEJIDO VASCULAR

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so 101m

EJ lloema y el xilema forman conjuntamente un h,l v.scula. Ilpieo de un Iello un sistema vascular continuo por toda la joven de un r.nunculo. planta. En plentas j6venes normal mente esten asociadas a varios tipos celulares distintos en los h&C6s vascu/ares. EI f10ema y el xUema son tejidos complejos. Sus elementos conductores estan asociados con celulas perenquimlitices que msntienen e intercambian materiales con ellos. Ademlis, varios grupos de celulas colenquimtiticas v esclerenquimetlcas proporcionan soporte meclinico.

Floema

pequel'lo elemento

plllCll er~ poro

dlula acomp. ante '.ea eriboll8

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dev.to en

membr.n& pl.sm6tice

el.ad.eul" ext.emo

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Xilema Elltilema transporta por la planta agua e iones disueltos. las principales celulas conductoras son los elementos del vaso mostradas aqul, que en la madurez son celulas muertas que hen perdido la membrana plasmlitica. La pared celular 50 ha engrosado secundademente If sa ha lignificado fuertemente. Como se ve '" en la figura, gran parte de las paredes terminales se han eliminado, 10 cual permite la formacion de tubos continuos muy largos.

• • SOJ.lm

:: 1

elemento de tubo visiOn exterN! de un erloo.o en t«:eiOn elernento de t\lbo eribolOi EI fioema participa en el transporte de los solutos organicos de la planta. las dlulas conductoras principales (elementos) estan alineades formando tubos Itamados tuoos criOOsos. los elamentos de los tubos cribosos maduros son cillulas vives. Interconectadas por perforaciones en sus paredes terminales que son plasmodesmos ampliados y modificados (placas cribosasl. Estas cillulas mantienen su membrana plasmatica pero han perdido sus nuclees y gran perte de su citoplasma; por 10 tanIo, para su mantenimiento necesitan el concurso de ce/u/as acompaflanres asociedas. Estas celulas acompanentes tianen la funcien adicional de 8Ctivar el trans porte de moleculas elimenticias solubles hacia dentro y hacia fuera de los elementos del tubo criboso a traves de las areas cribesas de ta pared.

g •• n elemento de '0"$0 m~u,o

los elementos del vaso estan fntimamente asociadoss con celulas parenquimaticas deillilema que transportan activamente solutos selecclonados hacla dentro y hacis fuera de los elementos a traves de su membrana plasmatica. Clilulas parenquim6ticas de1lrileml

31

La organizaci6n pluricelular depende de la cohesi6n entre las c~luJas Para formar un organismo pluricelular las celulas han de estar unidas entre sf de alguna manera y los eucariotas han dcsarrollado diversos sistemas para satisfacer esta necesidad. Como ya hemos dicho las celulas de Volvox no se separan por completo despues de la divisi6n celular sino que permanecen conectadas mediante puentes citoplasmaticos. En las plantas superiores, las clHulas no 5610 permanecen conectadas por puentes ciloplasmaticos (denominados plasmodesmas), sino que ademas quedan encerra~as en un rfgido conjullto de camaras con paredes celul6sicas que han segregado las propias celulas (paredes cellJlares).

Las eelulas de la mayorla de los ani males earecen de paredes rfgidas y los puentes eitoplasmalicos son poco frecuemes. En lugar de ella, las celulas se haIlan unidas par una red relativameme laxa de grandes mole.colas organicas extracelolares (denominada marriz e:ctracellllar) y por las adherencias entre sus membranas plasm~hicas. Muy a menudo las uruones lado-a-Iado entre ce.lulas las mantienen unidas formando una eapa pluricelular 0 epltello.

Las capas de c~lulas epiteliales envuelven un medio interno protegido De {ados los sistemas a traves de los que las eelulas animales estan relacionadas formando los tejidos pluricelulares, quizas la disposici6n epitelial es la que tiene una importancia mas fundamental. La eapa epitelial tiene para la evoluci6n de los organismos pluricelulares complejos un significado muy parecido al que la membrana celular tiene para la evoluci6n de las ce.lulas aisladas complejas. La imponancia de las capas epiteliales esta bien i1ustrada en otro grupo inferior de animaJes, el de los celentereos. Este grupo induye las ane.monas de mar, las medusas y los corales, asf como el pequeno organismo de agua dulce H)'tira. Los celentereos eslan constituidos por dos capas de epitelio, una eapa externa, 0 ectodermo, y una eapa inlema a endodermo. La capa endodermiea rodea una eavidad, el celenter61l, en donde se digiere el alimento (Figura 1·33). Entre las celulas endodermicas existen algunas que segregan enzimas digestivas al eelemer6n,

Figura 1·33 Organlzaci6n corporal de Hydra. (A) Hydra oligactis ell SU entorno natural: en estas especies de Hydra los tenl3culos se retraen para eapturar las presas. las proyecciones que se producen por gemaci6n del cuerpo son hijos que se separanin del padre. (8) Diagrama de la arquitectura celular del cuerpo de una Hydra tfpiea. La capa externa de cl!lulas (ectodernlO) es esencialmenle prote<:lOra, predadora y sensorial, mientras (IUe las el!lulas de la capa interna (endodermo) dcscmpenan fundamentalmcntc funciones digcslivas. Ambas capas cpitcliales tienen lambil!n una funci6n contractil 0 muscular que permite at animal moverse. Los movimientos estan coordinadas par cl!lulas nerviosas que ocupan una posici6n protejida en el interior de cada epileUo, formando una malla imerconectada. (A, par cortesIa de Richard Manuel.)

r----'.,N~DO""D,."RCMCD'____, ECTODER~O

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interSlicial

dlula epiteliomuscular

celenteron

dlula endodermo

urticante ectodermo

capa muscular

Iransvllf'Ht

IBI

32

Capitulo I : La evolucl6n de 13 ct:lula

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ClIpa mU$CUlar longitudinal

malfLzexttacelulaf lmesogl8ll1

Figura 1·34 Hydro allmentandose. Hydra puede realizar una amplia gama de actividades bastante complejas. Aquf se ha fotografiado un organiSnlO solitario captllrando con sus lentacu[os pequei'ias pulgas de agua: en elliltimo panel se halln introduclendo estas presns en su celenteron para su digesti6n. (Cortesra de Amata Homhruch.)

micntras que Olras absorben, continuando la digesti6n de las moJeculas de nulrientes que aquellas enzimas habfan transformado. AI fonnar una capa epitelial densa y coherente que impide que todas estas mol~cu.las se pierdan hacia el exterior, las celulas endodermicas crean por sf mismas un medio arnbicrHe en el celenler6n que es apropiado para sus propias tareas digeslivas. Las celulas ectodermicas, oriemadas hacia el exterior pemlanecen especializadas para el conlaCIO can el mundo exterior. En el ectodermo, por ejemplo, se haUan c~luJas que contienen una capsuJa venenosa con un dardo enrollado que puede ser disparado para matar los pequenos animales de los que se alimenta Hydra. La mayorfa de las deml1s celulas ectodermicas a endodermicas tienen propiedades parecidas a las musculares, permitiendo el movimiento de Hydra. tal como debe ha· cerlo un predador. Entre la doble capa de ectodermo y endodermo, se encuenlra otro cornpartimiento separado lanto del celenter6n como del media exterior. Aquf, se hallan las ci/ulas Ileruiosas, ocupando estrechos espacios entre las celulas epiteliales, por debajo de la superficie extema donde las IItliones ceill/ares (~cell jlltlctio1l5'1 especializadas entre las celulas epiteliales fonnan una barrera impermeable. EI animal puede cambiar su forma y moverse par medio de contracciones de celulas del epitelio semejantes a las de las c~lulas musculares. y las celulas nerviosas transmiten sci\ales eltktricas controlando y coordinando estas conlracciones (Figuras 1·33, 1-34 Y 1-35). Como veremos mas adelante, las concentrac!ones de iones orgl1nicos simples en el medio que rodea a una celula nerviosa son cruciales para su funcionamiento. La mayoria de celulas nerviosas -incluidas las nuestra5- estan disenadas para trabajar cuando se hallan en un medio que tenga una composici6n i6nica similar a la del agua de mar. Este hecho probablemenre reOeja las condiciones en las que evolucionaron las primeras celulas nerviosas. La mayorfa de celcntereos, aunque no lodos, todavfa viven en el mar. Hydra, concretamente, vive en el agu3 dulce. Es evidente que ha sido capaz de colonizar este nuevo habitat, sabre lodo, gracias a que sus celulas nerviosas se hallan contenidas en un espacio aislado del exterior mediante capas de celulas epiteliales que mantienen el ambiente interno necesario para el funcionamiento de las celulas nerviosas.

La comunicaci6n celula-celula controla el esquema espaciaJ

de los organismos pJuricelulares '9 Las celulas de Hydra no cstan lmicamente agrupadas mecanicamente y conectadas median Ie uniones que afslan el interior del ambiente exterior; tambien estan comunicadas entre sf a 10 largo de todo el cuerpo. Si se secciona un extremo de una Hydra, las celulas restantes reaccionan ante la ausencia de la parte amputaDe las dlulas simples a los organismos pJuricelulares

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Figura 1-35 Hydra nadwldo. Hydra puede nadar, deslizarse sobre Sll base

o. como muestra el dibujo, desplazarse dando'lolteretas.

33

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da adaptando sus caraClerfsticas y reordemindose regenerando un animal completa. Es evidenlc que tiertas sellales pasan de una parte del organismo a atra, gobernando el desarrollo de su esquema corporal -que presenta tentl1culos y una boca en un extrema y un pie en el otro. Adem
La memoria celular permite el desarroUo de patrones complejos Las celulas de casi todos los organismos pluricelulares proceden de la divisi6n repelida de una uniea celula precursora; eslas celulas constituyen un clofl. A medida que continua la proliferaci6n y el cion crece, algunas de las celulas, como ya hemos visto, se diferencian de las Olras en respuesta a los datos que les proporcionan las celulas vecinas, adoplando normalmente una estructura diferente, unas caracterfsticas qufmicas diferentes y una funci6n diferente. Es notable que las celulas eucariotas y su progenie persistan en sus estados especializados incluso despues de que las influencias que dirigieron originariamenle su diferenciaci6n hayan dcsaparecido -en otras palabras, estas celulas tienen una memoria. Por consiguienlc, su canicter final no esta determinado simplememe por su ambiente final, sino ml1s bien por toda la secuencia de influencias a las que han estado sometidas en el transcurso del desarrollo. Asf, a medida que el cuerpo crece y madura quedan especificados detalles progresivamente ml1s finos del esquema corporal adulto, creando un organismo de complejidad crecienle cuya forma ultima es la expresi6n de una larga historia de desarrollo que es recordada por las ctHulas.

Lns programas basicos de desarrollo tienden a ser conservados en la evoluci6n20 La estruetura final de un animal reOeja su historia evolutiva la cual, como el desarrollo. presenta una cr6nica de progreso desde 10 simple hasta 10 complejo. iCUaJ es enlonees la conexi6n entre estas dos perspectivas, la de la evoluci6n por un lado y la del desarrollo por otro? Durante la evoluci6n muchos de los dispositivos de desarrollo que surgicron en los organismos pluricelulares ml1s sencillos se han conservado como principios basicos para la construcci6n de sus descendiemes m~ complejos. Va hemas mencionado, por ejemplo, la organizaci6n de las celulas en epitelios. AJgunos de los tipos celulares especializados, como por ejemplo las celulas nerviosas, 34

CapItulo I : La evolucl6n de la celula

se encuentran a nivel de casi todo el reino animal, desde Hydra hasta el hombre. EslUdios moleculares, que discutiremas mas adelante en este libra, revelan un sorprendentemente elevado mlmero de parecidos de desarrollo a un nivel genetieo fundamental, incluso entre especies tan remota mente relacionadas como los mamfferos y los inseclOS. Adema.s, en terminos anal6micos las primeras fases del desarrollo de ani males cuyas formas adultas son radical mente diferentes son a menudo sorprendentemente similares; se necesita experiencia para distinguir, par ejemplo. un embri6n temprano de pallo de un embri6n temprano humano (Figura 1-36). Observaciones de este tipO no son dificiles de comprender. Consideremos el proceso mediante el cual. en el transcurso de la evaluci6n. aparece un nuevo rasgo anat6mico -por ejemplo. un pico a1argado. Se produce una mutaci6n alealoria que modifica la secuencia de aminoacidos de una protefna y. por 10 tanIo, su aetividad biol6gica, Esta alteraci6n puede afectar por casuatidad a las celulas responsables de la formaci6n del pica, de tal manera que produzcan un pica mas largo. Pero la mutaci6n ha de ser tambien compatible can el desarrollo del resto del organismo: s610 entonces sem propagada por la selecci6n natural. La formaci6n de un pico mas largo tendrfa poea ventaja selectiva si. en el proceso, se perdiera la lengua 0 no lIegaran a desarrollarse los ofdos. Una eatastrofe de este tipo es mucho mas probable si la mutaci6n afecta a acontecimientos que se producen en las primeras fases del desarrollo que si afecta a los que ocurren cer· ca del final. Las primeras celulas de un embri6n son como los naipes de la base de un casrillo de naipes -casi todo depende de ellas: una pequena alteraci6n de sus propiedades, probablemenlc dar
Figura 1-36 Comparaelli" del desarrollo embrlonarlo de un pez, de un annblo. de un reptll, de un p4Jaro y de una selec::c16n de mamrfero8. Los eSladios tempranos (arriba) son muy similares pero los ullimos estadlos (abajo) son mas divergenles. Los estadios tempranos estan dlbujados mas 0 menos a eseala y los ullimos estadios no. (De E. Haeekel, Anthropogenie.oder Entwiekelungsgesehichte des Menschen. Leipzig: Engelmann. 1874. Par eortesfa de the Bodleian Ubrary. Oxford.)

35

fundamentales han sido "congelados~ en procesos de desarrollo, del mismo modo que el c6digo genetico 0 los mecanismos de sfntesis proleica han quedado congelados en la organizaci6n bioqufmica basica de la celula. En cambio, las celulas producidas hacia el final del desarroUo (0 producidas lempranamenle pero que forman estrucluras accesorias como la placenta, que no se incorporan al cuerpo adulto) tienen mas Iiberlad para cambiar. Probablemente esla es la raz6n de que los embriones de las diferenles especies se parezcan a menudo enlre sf en las primeras fases y de que, a medida que se desarrollan, repilan los pasos de la evoluci6n.

Las celulas som~ticas del cuerpo de los vertebrados muestran m~s de 200 tipos diferentes de especializaci6n La riquez.a de especializaciones djferentes que se encuentra en las celulas de un animal superior es incomparablemente mayor a la que puede presentar cualquier procariola. En un venebrado se pueden distinguir facilmente m:is de 200 tipos celulares diferentes y es probable que muchos de estos lipos de c~lulas inc1uyan, bajo un mismo nombre, a un elevado mimero de variedades con diferencias sutiles. EI Panel 1-3 (pags. 38-39) mueslra una pequena selecci6n de ellos. En esta profusi6n de comportamientos especializados se puede observar, en un mismo organismo, la asombrosa versatilidad de la cclula eucariota. Gran pane de los conocimientos aCluales sobre las propiedades generales de las celulas eucariOlas procede del estudio de estos tipos especiaLizados de celulas que muestran individualmente, hasla un grade excepcional. aspeclos que son basicos para todas las celulas. Cada rasgo y cada organulo de cada prolotipo celular que hemos esbozado en el Panel 1-1 (pags. 18-19) esta desarroUado hasta un grado extraordinario 0 revelado con especial c1aridad en algl!n Lipo celular. Para lomar un ejcmplo arbitrario, consideremos la uni6n neuromllscular, en la que intervienen s610 tres tipos de cclulas: una celula muscular, una ccluJa nerviosa y una celula de Schwann. Cada una de elias desempeii.a un papel muy distinlO (Figura 1-37).

J. La c~llIla muscular se ha especializado en la conlraccidn. Su cilOplasma

prolongaci6n

de III eelulll nervioslllllx6n) dlula de Schwann generando la vaina de mielina

estci Ueno de filatnentos proteicos, incluido un elevado m"imero de filamentos de actina, dispucstos organizadamente. Existcn tambi~ll llumerosas mitocondrias distribuidas entre los filamenlos protcicos, que suministran ATP como combustible para el aparato contnictiJ. 2. La celulu nerviosa estimula al musculo a contraerse; transmite al muscu10 una sei'lal cxcitadora procedente del cerebro 0 de In medula espinaJ. Por cOllsiguiente. In cclula nerviosa es extraordinariamente alargadu: su cuerpo principal, que contiene el nucleo, puede hallarse n mas de un metro de In uni6n can el ml'isculo. EI citoesqueleto esta dcsarrollado de forma correspondiente manteniendo esta forma poco habitual de la celula y lransponando cficazmente los materiales desde un extremo al otro de la misma. Pero la especiaJizaci6n mas crucial de la ctHula nerviosa radica en su membrana plasm:hica, la cual contiene proteinas que aCluan como bombas de iones y como etmales i6nicos. provocando Ull ll1ovimiento de iones que equivalc a un nujo de electricidad. Aunque lodas las celulas contienen estos canales y bombas en sus membranas plasmaticas, la c~· lula nerviosa los ha aprovechado de tal manera que un pulso de electrici· dad se puede propagar en una fracci6n de segundo desde un extremo al otro de la celula, lransmitiendo asi una seoal. 3. Finalmente. las cclulas de Schwann estan especializadas en In produc-

ci6n masiva de membrana plasmatica, que disponen alrededor de la porddn alargada de la celula ncrviosa, depositando una lras otra sucesivas capas de membrana, como si fucra un roUo de cinta, £ormando una vaifla de mielina que aClua de aislame. 36

celulll de Schwann

Figura 1-37 Esquema de una aHula nervlosa, con sus cilu1as de Schwann asociadas. entrando en contacto con una cilu1a muscular a traves de una unldn neuromuscular. Diagrama esquemlitico.

___________.....IJ

Caphulo I : La evoluci6n de la c~lula

Los genes pueden ser activados y desactivados Diversos tipos celulares espccializados de un mismo animal 0 planta superior a menudo aparecen mn radicalmenle distintos como pucden serlo dos celuJas. EsIO puede parecer paradojico ya que lodas las celulas de un organismo pluricelular eslAn estrechamente relacionadas al haberse formado recientemente a parLir de una misma celula precursora --e16vu10 fecundado. Un linaje comlin implica genes similares; l.c6mo aparccen entonces las diferencias? En algunos casos la especializacion celuJar implica la perdida de malerial gcnetico. Un ejemplo extremo 10 constituyen los eritrocitos de los mamfferos. que en el transcurso de la diferenciacion pierdcn por completo el micleo. Pero la imnensa mayona de las cclulas de la mayor parte de espccies animales y vegetates conservan toda la infonnacion gem'itica contenida en el ovulo fecundado. La especializaci6n depende de aheraciones de la e:cpresi6" ge"ica y no de la perdida 0 adquisici6n de genes. Incluso las bactcrias no producen simuJtAneanlcnte todos sus tipos de protefnas, sino que son capaces de ajuslar el nivel de sfnlesis a las condiciones extcrnas. Las prolefnas cspccfficamcnte necesarias para cl Olctabolismo de la lactosa, por ejemplo, son produciclas par algunas baclcrias solo cuando pueden disponer de cste azucar. Otras bacterias detienenla mayor parle de los procesos metabolicos normales; cuando las condiciones son desfavorables para la proliferacion celular, algunas baClerias deLienen la mayor parte de los procesos metab6licos normales y forman esporas que presenlan una pared externa, resislente, impermeable y Wl citoplasma de composici6n alterada. Las celuJas eucariotas han desarrollado mecanismos mucho mAs complejos para controlar la expresion genica, y estos mecan.ismos afCClan a sistemas enleros de productos genicos interactivos. Los grupos de genes son activados 0 inhibidos en respuesla a sciiales lanlO extemas como inlemas. La composicion de las membranas, el citoesquclelo. los productos secretores, incluso el metabolismo y otros muchos rasgos, deben variar de manera coordinada cuando las celulas se diferencian. Los controles que hacen posible estos cambios han evolucionado en los eucariotas hasta un grado no alcanzado por los procariOlas. definiendo las complejas reglas del componamiemo celular que pueden generar un organismo pluricelular organizado a partir de un simple huevo.

Comparaciones entre secuencias revelan centenares de famllias de genes hom61ogos 12 ,21 A parte de las apariencias, la evolucion ha transformado el universe de las cosils vivientes basla un grado que no tiene parangon. Un ser humano, una mosca, una margarita, un hongo. una bacteria... parecen tan difcrentes entre sl que diffcilmente tiene scntido compararlos. Todos ellos son desccndicntes de un ancesIro comun y a medida que vamos estudiando su interior, encontramos mAs y mAs evidencias de sus orfgenes comunes. Ahora conocemos que la maquinaria molecular bAsica de la vida se ha conservado haSla un grado tal que probablemente habria sorprendido a los padres de la teorla de la evoluciOn. Como hemos visto, todas las fonnas de vida tienen esencialmente la misma quunica. basada en aminoAcidos. azucares. acidos grasos y nucle6tidos; todas sinletizan estos costituyentes qu£micos de una manera esencialmente similar; todas almacenan la informaci6n geneLica en el DNA y la expresan a trav~ del RNA y de las protefnas. EI grado de conscrvaci6n de la evoluci6n es lodavfa mas sorprendeme cuando examinamos en detalle las secuencias de nucleotidos de determinados genes y de aminoacidos en dClerminadas protefnas. La suene es que las enzimas baclerianas que catalizan cualquier reaccion en panicular. como la rOlUra de un azucar de seis carbonos en dos azucares de tres carbonos a traves de la g1ucolisis, tienen una secuencia de aminoAcidos (y una estruclura tridimensional) inequfvocamente similar a la de las enzimas qlle catalizan In misma reaccion en los seres human os. Ambas enzimas -y de forma equivalente los genes que las es37

De las c~lulas simples olios organlsmos pluricelulares --------~-

...

TIPOS CELULARES Existen mh de 200 tipos diferentes de diu III en el cuerpo humano. Se hallen formendo diversos lipos de lejidos como

EPITELIOS las diu las epiteliales forman capas celulares coherentes denominadas epitelios, que revisten las caras intarnal y externas del cuerpo. Existen muchos tipos especialilsdos de epiteliol. las colulas absorbentes lenlarocitosl Iienen Colulal cilladas: tienen muchos microvilli qU8 sa proyectan a la cilios en su luperficie libre que baten sincr6nicamente superficie libre aumentando el ar8a de absorci6n. para desplaur suslancias (p.ej., mUCOlidadel) por microvilli encima de la capa epitelial.

Celulas secreloras: se hallan en la mayorla de las capas epiteliales. Estas dlulas especializadas segregan sustancias hada la superflCie de la capa celular.

ephelios tejido conjunlivo musculo lejido nervioso la meyorla de tejidos estan formados par combinacioflBs de varias tipos celulares.

•••••••

eontllC!O i----

eilio$

I'min. boN'

las dlulas epiteliales adyacenles estan unida! mediante uniones que confieren a la capa celular su fuena meeanica y que la hacen tambien impermeable a las moleculas pequeflas. La caps descansa sobre una lamina basal.

•

He-- nUc:leo

TEJIOO CONJUNTIVO los especios entre 6rganos y tejidos del cuerpo estan ocupados por tajido conjuntivo, formado principalmeme por una red de fibras proteicas resistentel inmersas en un gel polisadrido. ESIa malriz axtracelular esla segregeda principalmante por los fibroblastos.

EI hueso elt' producido por dlula! denominadas osteoblastol, que segregan una malriz extracelutar en la que mas larde se deposilartin cristales de fosfalo calcico.

,

Dos lipos fundamentales de fibra proteica extraceluler Ion la colltgena y la elastine.

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m.WeKtraeelula,.

•

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O.leobl••to. unido. por p,olongaelones celulares

matdz IKtraelllul.r

I

las dlulas adiposas son unas de las mayores del cuerpo. Estas diu lIs son responsables de la producci6n y alm,cenamiento de grasa. EI nucleo y el citoplesml eSlim desplazados hacia la periferia de la celula por una gran gOla de Hpido.

fibrobl&.tO' en leilda eonJunllvo luo

Las uJ.. de ealeio M deposit.n .n I.

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1

TEJIOO NERVIOSO

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LlEGAOAS

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dllndrit~.

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Elax6n conduce las ser'lales electricas procedentes dal soma calular. Estas senales son producidl! PO' un flujo de iones a traves de la membrana de la .colula nervlosa.

eUfllpo 0 _ _-I10m. celul.r

las colulas nervions, 0 neuronas, estan especializadas en la comun~i6n. EI cerebro y la modula espinal. por ejemplo, est8n compuestos de una red de neuronas con celulas glial8$ de IOSt'n.

38

Unas dlulas especialiladl5, denominadas dlulas de SChwann u ollgodendrocitos, sa disponen alrededor del ax6n formalldo una vaina muhilaminar.

Panell-3 Algunos de los dHerentes tipos de ~1u1as existelltesen elcuerpo de un vertebrado.

La sinapsis es el luga' en el que la neurona forma una uni6n especlalizada con otrD neurona (0 can una colula muscular). En II sinapsis, las seneles pasan de una neurona a otra (0 de una neurona a una colula muscularl.

A menudo las celulas epiteliales secretoras estan agrupadas formando una g"ndula que se especializa en la secreci6n de una sustanda particular, Tal como se ilustra, las gllindula8 exocrinas sagrega{l determinados produclos lcomo "grimas, mucosidades y jugos gaslricOS) al interior de conductas. Les gllindulel endocrines segregan hormones a Ie conclueto sangre. dell g"ndull

MUSCUlO Mediante su contracciOn. las celulas musculares generan fuerza meclinica. En los vertebrados exislen Ires t;pos principales:

••

. •

musculo esquehHico: mueve las articulaciones por media de su contracciOn polente y rlipida. Cada musculo esta formado per un haz de fibres musculares, cada una de las cuales es une enorme c61ula plurinucleade.

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musculo

..:..:.: ::,~. tendon

SANGRE Los eritrocilOI IgiObul08 rojosl son ce!ulas muy pequerias.

normalmenle sin nucleo ni membrenas internes, y conlienen hemoglobina, protelna que se une al oxfgeno.

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1 cm'de ..ngre COnliene 5000 millones de elilfocilOI

IOlma nolmal es la de un disco biconcavo

11.1

los glObulos blancos (leucocitos) protegen de las infecciones. La sangre contiene eproximadamenle un leucocito por cada 100 glObulos rojos. Aunque vfajan por sangre. pueden pasar a traves de las paredes de los vasos sangulneos para realizar su fundOn en los tejidos vecinos. Existen varios tipcs distintos, entre eUos: IinfocilOS: responsables de las respuestas inmunitarias. tales como la producdOn de anticuerpos. macrOfagos y neutr6filos: se desplazan hacia los focos de infeccion, donde Ingieren bacterlas y residuos. • _ peq:~~':'~O~::::::~:-:::~~~~~j~~

vallO sangulnao pared de un infeccion baClarians an allajido conJuntivo - - -.....

nUtleo c81ula musculal con estriaciones trlll'lsYelSBlH

musculo Iiso: 58 hella en las paredes del tracto digestivo, la vsjiga. las arterias y las venas; estli compuesto par finas <:elulas alargedas lno estriadas), cada una con un solo nueleo. I

musculo cardiaco: de carilcter interme
C~LUlAS SENSORIAlES Entre las celulas mils complejas del cuerpo de los vertebrados se encuentran las que detectan los estfmulos externos. Las clilulas cilladas del oldo interno son las detectoras primaries del sonido. Se trata de celules epiteliales modificadas, can microvilli especlales (estereociliosl en su superficie. EI movimiento de estos eslereocilios en raspuesta a les vibraciones sonoras provoca una senel electrica que pasa al cerebro.

los eSlereocHioB son muy rfgidos porqua estlln empaquetados con filamantos de actina

C~lULAS GERMINAlES Tanto 101 espermaloloides como los Ovulos son hap/oides, es decir, que conlienen una sola dotaciOn de cromosomas. Un espermatozoide del macho se une a un Ovulo de la hem bra, formando, por sucesivas divisiones, un nuevo organismo diploids.

Los baslones de II retina del ojo son c8lulas especializadas en la respuesta a la lUI. La regi6n fotosensible contlene una gran cantidad de discos membranosos len roja) en cuyas membranas se encuentra al pigmento sensible a la lUI, la rodopsina. La luz actua como una sena! eleetrica lflecha verdet, que se transmite a dlulas nervioses del ojo, las cuales canalizan la sena! hasta 81 cerebra.

39

Angiosperm,s

Vanebrados hombre

lBoat!o,i, 9 ul..nt• Judia Ub.eo

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U,ocordadO$

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ooii ArQuebllCteriu H.lobM:te,ium

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PROCARIOTA ANCESTRAl.

Figura 1·38 Relaclonesevolutlvas entre algunos de los organlsmos mendonados en este Ubro. las ramas del arbol muestran vias de descendencia comun, pero su longilud no indica el paso del tiempo. (Tengase en cuenta as! mismo Que el eje venicai del diagrama muestra categorfas principales de organismos, pero no tiempo.J

l 40

pecifican- no s610 tienen una funci6n similar sino tambicn casi con seguridad un origen evolutivo comun. Se pueden utiliutr estas relaciones para dibujar los carninos evolutivos mas antiguos; comparando secuencias de genes y reconociendo homologias se descubren paralelismos ocultos y similitudes entre organismos diferentes. A menudo tambicn se encuemran parecidos familiares entre genes que codifican protefnas que realizan funciones relacionadas en un mismo organismo. Estos genes tambien estan reladonados evolutivamcnte y su existencia revela una estrategia basica a traves de la cual se ha originado la complejidad credente de los organismos: los genes y zonas de genes se duplican y las nuevas copias divergen de la original mediante mutad6n y recombinaci6n, para realizar nuevas fundones adicionales. De esla manera, partiendo de un numero relativamenle pequeno de genes en las celulas primilivas, la forma de vida mas compleja ha llegado a desarrollar mas de 50 000 genes, como se cree que presenla un animal o una planta superiores. A partir del estudio de un gen 0 de una prolefna, avanzamos en el conodmiento de toda una familia de genes 0 prolCfnas hom61ogos a clla. Asf la biologfa molecular subraya la unidad del mundo viviente y nos propordona herramientas para descubrir los mecanismos gencrales que estan en la base dc Sll infinita variedad de invenciones. En el pr6ximo capitulo empezaremos la discusi6n de eSIOS mecanismos con el eSllldio del componenle mas basico del kit de construcci6n biol6gica -las mohkulas pequenas a partir de las que se sintetizan todos los componentes mayores de las celulas vivas.

Resumen La evoillci6n de los gralldes organismos pillricelillares depelldi6 de la capacidad de las dl"las cilooriolas para expresar SII infomUJci611 '.ereditaria de mllcllas mal/eras difenmres y para actllar de jonna cooperaliva como ,,,, colectivo IllIico. En los an;males de los primeros desarroUosjJle probablemente la formaci6n de capas de dlllias ep;teliales qlle separaron del ambiente exterior el espacio interior del cllerpo. Ademds de eslas dlllias epileJiales tamb;~n se desarroUaron dlllUas neroiosas, c~lu­ las tIIllSclllares y ceillfas del rejido colljuntilJO, tOOas las cllales $I! llalla" aClllafmente ell fos animales mds sel/ciffos. La evolflci6n de fos a"imllfes y de las pill/ttas Sllperiores (Figura 1-38) depelldi6 de fa proollcci61t de WI ",i",ero cadll vez mayor de tipos cefllfares especializados y de melodos mas sofisticados de coordinacioll eltlre eUos, reflejal/do ,m /lIimero cada vez mayor de efaborlufos sistemlls de cOl/trol de fa expresi6n de los genes en los disti/ltos tipos cellllares.

,,,,0

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,

.Pequefias moleculas, energia y biosintesis

2 • Los eomponentfti qufa.lcot

deuuoHuJa

• Ordn bIoJ6P»yeroapa

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• a aUmento y laobtmddn del. ee1u1ar • La bIotfnIaIt c1eonl...

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"Debo anunciarles que puedo preparar wea sin necesidad de ningun rin6n oi de

ninglin animal, ya sea un hombre

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un perro." Esta frase, escrita haee 165 alios

porel joven quhnico a1em<1n Wohler, signific6 el final de la creencia en una ruer-

za vital especial existente en los organismos vivos que da lugar a sus propieda· des y prodUClOS caracterfsticos. Pero 10 que en la epoca de Wijhler fue una reve· laci6n, actualmente es de comun conocimiento -las criaturas vivas estoin hechas de compuestos qufmicos. En la visi6n contemporanea de 1a vida no hay lugar

para el vilalismo -0 para cualquier cosa que quede fuera de las leyes de la qufmi. ea y de la ffsica. £Sto no quiere decir que en biologfa ya no existan misterios: exiSlen muchas ;treas de ignorancia, tal como se pandTa de manifiesto en caprlulos posleriores. Pero deberlamos empezar a subrayar la gran canridad de fen6menos que se conocen. Actualmente, disponemos de informaci6n detallada sobre las moltkutas esenciales de la cetuta -no s610 de un reducido mlmero de molecutas, sino de mlles de elias. En muchos casos conocemos sus estructuras qufmicas exactas y sabemos COil exactitud c6mo son producidas y degradadas. En {erminos generales, conocemos c6mo ta energfa qufmica impulsa las reacciones biosinte{icas de In cetuta, c6mo aCll1an en las celulas los principios de la lerrnodimimica generando un orden molecular, y tambiE~n c6mo son controladas y coordinadas las mirfadas de cambios qurmicos que se producen continuamenle d tIn: s celulas. ,/,''/.~~ er C'l;,c. En este caprlulo y en el siguienle resumimos brevememr, ~~ufmica de liii> ~ celula viva. Aquf nos ocuparemos de los procesos en los que i~ erviltn~n las ~l\o· ~ ltkulas pequenas: de aquellos mecanismos a traves de los cUaJfis!Ja celtt1a s~nfeti- ,.~ za sus componentes qufmicos fundamentales y obtiene su en~~..rn.GaPitU1o 3liJ describe las moleculas gigantes de la celula, que son polfmeros ~)1~ ?,~lecul"'ff pequenas y cuyas propiedades son las responsables de la esp~e procesos biol6gicos y de la transferencia de la informaci6n biol6gica. ~ _

Los componentes qufmicos de una celula La qufmica celular se basa en los compuestos de carbona· Una celula viva estA compuesta por un reslringido conjumo de elementos, cuatra de los cuales (e, H, N yO) constituyen aproximadamente el 99 % de su peso. Esta composici6n difiere notablemente de la de la corteza terrestre y pone de re-

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lieve un lipa c3ractcrfstico de qufmica (Figura 2-1). Leual es esta qufmica especial y cdlllo surgi6? La substancia mas abundante de la celuJa viva es el agua. Conslituye aproxi· madamente el 70 % del peso de las celulas. La mayoria de reacciones intracelulares ocurren en un media acuoso. La vida en eSle planela empez6 en el mar, y las condiciones que reinaban en aquel ambiente primitivo imprimicron un sella pcr· manenle en la qufmica de la materia viva. Todos los organismos han sido disei\ados en base a las propiedades caraclerfsticas del agua, tales COIllO Sll cankleT polar, su habilidad para formaT enlaces de hidr6geno y su alta tensi6n superficial. Por ejemplo. el agua rodea complclamenlc a las moleculas palaTes mientras que tiende a reunir las mol~culas no polares, farmando grandes agregados. En el Pane12-1 (pAgs. 50-51) se resumen algunas prapiedades impartantes del agua. Apane del agua, la gran rnayorfa de las otras mol~culas de una c~lula son compuestos de carbona, centro de atenci6n de la quimlca org:1nlca. EI carbona destaca entre todos los elementos de la Tierra por su capacidad de formar grandes moleculas; en este aspecto Ie sigue el silicia, muy par debajo de el. Debido a su reducido tamana y a los cuatro electranes de la capa externa el atomo de carbona puede formar cuatro enlaces covalentes fuertes can otras atomos. Y, 10 que es mas import3ntc, se puede unir a atros atamos de carballo formando cadenas y anillos, gencrando nsf mol~culas grandes y complcjas cuyo tamafio no ticne un !fmite superior obvio. Los otros <1tomos abundantes en la celula (1-1, N Y 0) tambien son pequei'los y capaces de formar enlaces covalentes muy fuertes (Panel 22. pags. 52-53), Un enlace covalente tfpico de una molecula biol6gica tiene lIna cnergfa de entre 15 y 170 kcallmol. en funci6n de los titomos que esten implicados. Como par tennillo media la ellergfa termica a 1a temperatura corporal solamente es de 0,6 kcallmoJ. incluso una colisi6n energetica can oITa molecula. muy poco probable. no sera capaz de romper un enlace covalente. Sin embargo. catalizadores especfficos pueden romper a reorganizar rapidamenle los enlaces covalentes. La Biologfa es posible gracias a la combinaci6n de estabilidad de los enlaces cova· lenles en condiciones fisiol6gicas y la capacidad de los catalizadores biol6gicos (denominados enzimas) de romper y reorganizar estos enlaces de una manera controlada y en detenninadas moleculas. En principio, las simples reglas del enlace covalente entre el carbona y Olros elementos penniten un numero infinitamente elevado de compuestos. Aunque el numero de compuestos diferentes de carbono de una relula es muy grande. ullica-

44

Capftulo 2: pequenas molh:ulas. energfa y biosfntesis

Figura 2-1 AbllndllJlcla relatlva de los elementos quimlcos encontrados en la corleza lerrestre (el mundo Inanlmado), comparada con la encontrada en los tejldos blandos de los orgwllsmos vivos. La abundancia relativa se expresa como el porcentaje del mimero total de atom6s presentes. Asr, por ejemplo. aproximadamente cerca del 50 9b de los atomos de los organismos vh'Os son atomos de hidrogcno.

mente representa una diminuta fracci6n de los que son te6ricamente posibles. En algunos casos podemos encontrar una buena raz6n para explicar que esle 0 aquel compueslO reaJiza una funci6n biol6gica del'enninada; pem con mayor frccuencia parece que el compuesto "elegido'" fue una altemaliva entre orras muchas rarona· bles.. aJgo asf como un accidente (Figura 2-2). Cienos palrones y elementos de reac· ci6n, una vez establecidos en las celulas mas antiguas, fueron preservados con al· gunas variaciones a 10 largo de la evoluci6n. Aparentemente, el desarroUo de nuevas c1ases de compuestos hIe necesario 0 util en muy contadas ocasiones.

Las celuJas utilizan cuatro tipos bc1sicos de moh~culas pequefiasZ

H

Cc1 I."~) '

I

NH' '

c<xr

H C' / N.........CH

N

N

~H;

N

ro

H1

C<x>-

C'C~

I NH'

N

'

H2

c0 N

C<X>-

CH

N H

NH

Ciertas combinaciones simples de thomos -tales como los grupos metilo (-CH:J, hidroxilo (-DH). carboxilo (-CoOl·n y amino (-NH 2)- se presenlan repetidamente en las moleculas biol6gicas. Cada uno de estos grupos liene propiedades qufmicas y ffsicas distintas que influyen sobre el comportamiento de cualquicr molecula en que se presente el grupo. EI Panel 2-2 (pags. 52-53) resume los tipos principales de grupos quimicos y algunas de sus propiedades sobresalienles. Los pesos at6micos de H, C, N Y a son I, 12, 14 Y 16 respectivamente. Las molecuJas orglinlcas pequeiias de la celula tienen pesos moleculares que osciIan entre 100 y 1000 ycontienen hasta unos 30 ~tomos de carbono. NormalmenIC se hallan librcs en soluci6n, donde algunas de elias forman un acervo de intermediarios a partir de los cualcs se construyen largos polfmeros. denominados macromoleculas. Tambien existen intermedjarios esenciales en las reacciones quimicas que transfonnan la energfa derivada de los aJimentos en fonnas utiles de energia (10 cual se discute mas adelante). Las moleculas pequeiias representan una decima parte deltotaJ de materia organica de una celula y (a grandcs rasgosJ s610 existen del orden de un millar de lipos diferentes de elias (Tabla 2-). Todas las moleculas biol6gicas se sintetizan a partir de los mismos compuestos simples y se dcgradan a estos mismos compuestos, ocurriendo la sfnlesis y la degradaci6n a traves de secuencias de cambios qu(micos de aJcance limitado y siguiendo reglas precisas. Por consiguiente, los compuestos de una clHula pueden ser c1asificados en un reducido mlmero de familias dist'intas. Dado que las macromoleculas de una c~lula) que constituyen el lema del Capitulo 3 de este libro. estan formadas a panir de estas mismas moleculas pequeiias, pertenecen a sus mismas familias. A grandes rasgos, podemos dccir que las celulas poseen cuatro grandes familias de moleculas organicas pequenas: los azUcares simples. los acldos grasus, los amlnolicldos y los nucle6tidos. Cada una de estas familias conliene mllchos miembros diferentes, que prescnlan rasgos qulmicos cOlllunes. Aunque algunos compuestos celulares no pueden clasificnrse en estas categorfas, las cuatro familias, junto con las macromoleculas fonnadas a partir de eUas, constiluyen un porcentaje sorprendentemente elevado de la masa celular total ITabla 2-1).

H

c 1- c.1. . /

COO-

C' /

CH

I NH' '

H

Figura 2-2 Losorganlsmosvlvos I1nlcamente slnletlzan WI reducido nl1mero de las moleculas orginlcas. que en principia podrian produclr. De los seis aminoacidos que se muestrnn en ia figura. unicamente el de ia pane superior (ellript6fano) es sintctizado por las celulas.

Tabla 2-1 Composlci6n qufmica aproxlmada de unacelula bacteriana Porcentaje del peso celular total Agua lanes inorganicos Azlicares y precursores Amino<\cidos y precusores Nucle6tidos y precursores Acidos grasos y precursores Qlras moleculas pcquei\as Macromoleculas (prOlefnas, <\cidos nucleicos y pol.isac<\ridosl

Los componentcs quUnicos de una ~Iula

Nlimerode tlposdecada moltkula

70

I

1 I

20 250 100 100 50

0,' 0,' I

0,2

-300

26,0

-3000

45

HPH

T

H/,C-OH

t

H

C/

H

OH I

C I H

I' 'j'H H/" HO '\.~-t· 0

H 6H

IAI

181

\..._~:L0H

lEI

Los azucares son las moleculas alimenticias de la celula 3 Los azucares mo1s sencillos -los monosaC
0

celona desempefia un papel especial En primer

lugar, pueden reaccionar con un grupo hidroxilo de la misma

mol~cula convir-

liendo la mol~cula en un anillo; en esta fonna de aniJIo, pucde reconocerse el carbona del aldehfdo 0 de la cetona originales ya que es el unico que eSll1 un ida a dos tHomas de oxfgcno. En segundo lugar, una vez formado el anillo, este cmbono puede unirse a uno de los carbonos can un grupo hidroxilo de ouo azucar, generando un disacdrido (Panel 2-3, pags. 54·55). De esta misma forma la adici6n de mas monosacaridos da lugar a oligosacaridos de longitud crccicnte (trisacaridos, tctrasacaridos, y asf sucesivamente), hasta lIegar a las grandes moleculas de poUsacarldos can miles de unidades de monosacaridos. Puesto que cada monosacarido tiene varios grupos hidroxilo libres que pueden formar un enlace COil otro monosacarido (0 con algun otro compuesto), el numero de estructuras posibles de polisacaridos es enormemente elevado. Incluso un disacaride simple, formado par dos residuos de glucosa, puede existir en II variedades diferentes (Figura 2-4), mientras que tres hexosas diferentes (C 6 H I20J se puedcn unir formando varios miles de trisacaridos diferentes. Por esta raz6n resulta muy diffcH determinar la cstructura de un polisacarido determinado, ya que es neccsario conocer los lugares de uni6n de cada azucar a sus vecinos. Con los metados actuales, par ejemplo, se tarda mas ticmpo en determinar la disposici6n de media docena de azlicares unidos (por ejemplo, los de Wla glucoprotelna), que en determinar la secuencia de nucle6tidos de una moltkuJa de DNA que contenga muchos miles de nucle6lidos en la que cada unidad se une a la siguiente exactamellle de la mlsma forma). La glucosa es el principal compuesto a1imemicio de muchas c~lulas. Una seric de reacciones oxidativas (vease pag. 65) conducen desde esta hexosa hasta varios derivados mas pequenos y, finalmente, hasta CO 2 y H20. EI resultado neto se puede indicar asf: ~H 120, + 60 2

-+ GCO l + 6H 20 + energfa

En el transcurso de la degradaci6n de la glucosa se genera energfa y "poder reductor", ambos esenciaJes para las reacciones de biosfntesis, que son captados y 46 5

Capftulo 2 : Pequcftas mol&ulas, energfa y biosfntesls

Figura 2-3 La estructura del monosacarldo g1ucosa, una hexosa simple. (A) rorma de cadena abierta del azlicar. que esta en equilibrio con la forma cfclica 0 de anillo, mas eslable, que se muestra en (8). Ie) y (D) son modelos de espacio Ueno y de bolas y varillas, respeclivameme, de esla forma dclica U~~D.g1ucosa). La forma de silla (E) es una representaci6n ahemativa que se utiliza frecuememenle debido a que reneja de una forma mas exacla la estruclura del azlicar. En {A}. (8) y (E) las 0 de color rajo indican el atomo de oxfgeno del grupo aldehfdo. Para una revisKSn de las estruCluras y de las propiedades qu{micas de los azUcares. vease el Panel 2-3, pags. 54-55.

al-al

«1- 2

cl1- 3

Flguru 2-4 Once dlsacartdos ronnad05 por dos unidades de o-glucosa. Aunque se direrencian unicamente en el tipo de enlace entre las dos unidades de giucosa, son qufmicamenle direrentcs. Pucsto que los oligosacAridos asociados a las prolefnas y a los Ifpidos pueden lener mAs de seis lipos dlferentes de azucares unidos, a trav~s de enlaces como los i1ustrados a(luf, en disposiciones lineales y rarnHicadas, el numero de tipos distintos posiblcs de oligosaCliridos de que puede disponer la ulula es extremadamente elevado.

al-4

al- £>

H 20H

"..,.. ~O ....0'"

~l-a'

transportados rundamentalmente por dos mollkulas cruciales. denominadas ATP y NADH. respectivamente. Mas adelante. en este mismo capitulo discutimos la estructura y las funciones de estas dos mohkulas cruciales. Los polisac.iridos simples. compuestos s610 por residuos de g1ucosa -principalmente el glllcdgeflO en las c~lu1as animales y el almid6n en las c~lulas vegeta· Ies- son ulilizados para a1macenar energia que se utilizam en el futuro. Pero los azlicares no se ulilizan exclusivamente para la producci6n y el almacenamiento de energfa. Imponantes compuestos eslructurales extracelulares (tales como la celulosa) esu1n rormados por polisacaridos senciUos. y a menudo secuencias no repetitivas de cadenas de moleculas de azucares, mas pequefias pero mas complejas. estan unidas covalentemente a protefnas, forman do glucoprote(fllls, 0 a Hpidos, formando glucolfpidos.

Los acidos grasos son componentes de las membranas celulares" Una mol~ula de acido graso, como por ejemplo el dcido palm(tico (Figura 2-5) presenta dos regiones caraclerfsticas: una larga cadena hidrocarbonada hidror6· bica (insoluble en agua) y qufmicamente no muy reactiva, y un grupo de acido carboxilico, ionizado en soluci6n (COO-). extremadamenle hidromico (soluble en agua) y que racilmenle reacciona con un grupo hidroxilo 0 un grupo amino de otra mollkula formando ~steres y amidas. De hecho casi todas las moleculas de acido graso de una c~lula eslan uoidas covalenlemente a olras mol~culas. mediante su grupo acido carboxflico. EI gran numero de acidos grasos distilltos que se encuentran en las c~lulas difieren en caracterfsticas qufmicas lales como la longitud de la cadena hidrocarbonada y en el numero y la posici6n de los dobles enlaces carbono-carbono que contienen (Panel 2-4, pags. 56-57). Los acidos grasos son una importanle Fuente de alimento ya que pueden ser degradados produciendo por unidad de peso mas del doble de energfa uti! que produce la g1ucosa. Se almacenan en el citoplasma en forma de triacilgliceridos. compuestos de tres cadenas de acidos grasos unidas a una mol&:u1a de g1icerol (Panel 2-4, pags. 56-57); Estas mol~ulas constituyen las grasas animales que nos Los oomponentes qu(mioos de una c~lula

o~ /0

I' 1"' 1"' 1"' 1"' 1"' 1"' 1"' 1"' 1"' 1"' 1"' 1"' 1"' 1"' C", FlguraZ-S Acldo palnthico. £1 grupo Acido carboxilico (en rojo) estA represenlado en ronna ionizada. En el centro se presenta un modelo de bolas y varillas y a la derecha un modelo tridimensional de espacio lIeno.

47

grupo amUl
grupo carbololo

H

I HN-C-COOH z I CH,

+ -

pH7

H

I

_

H)N-C-COO

I

CH, f~.

ionizadll

son familiares en nuesua experiencia diaria. Cuando es necesario oblener ener· gia, las cadenas de acido graso pueden ser liberadas de los lriacilgliceridos y ser degradadas haSla unidades de dos carbonos. A continuaci6n, estas unjdades de dos carbonos, que constilUyen el grupo acetilo de una rnoleCllla hidrosoluble denominada acetil GoA, son degradadas a lraves de varias reacciones que liberan energfa y que describiremos mas adelante. Pero la funci6n mas importante de los acidos grasos reside en la construcci6n de las membranas de la celula. Estas finas capas semipermeables que limitan a lodas las celulas y envuelvcn sus organulos internos cstan compllestas fUIldamentalmente de fosfoUpldos, pequefias moleculas que se parecen a los triaciglireridos en que estan conSlruidas en su mayor parte a partir de a.cidos grasos y gJicerol. En los fosfolipidos. sin embargo. el g1icerol esta unido ados cadenas de acido graso y no a Ires. Ellugar reslante del glicerol esla acoplado a un grupo (osfato, que a su vez esta unido a otro pequeno compueslO hidromico como la etallolamino, la COlilla 0 la serino. Cada molecula de fosfolfpido Hene una cola hidrof6bica --compuesta por las dos cadenas de acido graso- y una cabeza polar hidroFilica en la que se encuentra el fosfalo. Si se coloca una pequena cantidad de fosfolfpido en agua. se extendem sobre la superficie fonnando una monDeapa de moleculas de fosfolipido: en eSla lamina las colas de las molecuJas quedan densamente empaquetadas unas con OUas y dirigidas hacia el aire y las cabezas se hallan en contacto con el agua (Panel 2·4. pags. 56·57). Dos de estas laminas se pueden combinar. cola contra cola. formando un "sandwich~' de fosfolfpidos. 0 blcapa IIpldlca, una estructura extraordinariamente importante que es la base eslructural de todas las membranas celuJares (como se discllte en el Capflulo 10).

Figura 2·6 EI am..inoacldo alanlna. En la c~lula, ell la que el pH es cercano a 7, cl aminoacido se halla en fonna ionizada. Sin embargo, aI ser incorporado a una cadena polipeptfdica las cargas de los gropos amino y carboxilo del aminoacido Iibre desaparec:::en_ A la derocha de las f6nnulas eslructurales se mueslran modelos de bolas y varillas y de espacio lIeno. En el caso de la alanina, la cadcna lateral es un gropo -eHJ •

aXlremo amino delllc;~a

TN-H Ph.

H-¢-CHrO

o-~

,

N-H

Ser

H-C-OI1-OH

Glu

N-H 0 tt-t-CH,-CH,-ef.

o-~ I

()o~

Los aminoacidos son las subunidades de las prote(nasS

-

,

N-H

Los aminoacidos comunes son quimicamenle variados. pero lodos ellos contienen un grupo de acido carboxfiico y un grupo amino, ambos unidos al mismo alomo de carbono (Figura 2-6). Se ulilizan como subunidades en la sintesis de las prolelnas, que son largos polfmeros lineales de aminoacidos unidos cabezacola mediante un enlace peptfdico entre el grupo carboXl1ico de un aminoacido y el grupo amino del aminoacido siguiente (Figura 2-7). Aunque exislen muchos aminoacidos posibles. en las proteinas 5610 hay 20 aminoo.cidos comunes, cada uno de eUos con una cadelJa lateral diferente unida alll.lomo de carbona a (Panel 2·5, pags. 58-59). EsIOS mismos 20 aminoacidos se presentan una y otra vez en tOOas las proteinas, incJuidas las producidas por las bacterias. las plantas y los animales. Aunque la selecci6n de estos 20 aminoll.cidos probablemente sea un ejemplo de un accidenle evolutivo. la versatilidad quimica que proporcionan es de una importancia vital. Por ejemplo. 5 de los 20 aminoacidos presentan cadenas lalerales que pueden lransportar una carga (Figura 2-8) mientras que los Olros no estll.n cargados pero son reactivos de formas diferel1les (Panel 2-5, pags. 58·59). COOlO veremos, las propiedades de las cadenas laterales de los aminmkidos detenninan las propiedades de las proteinas y constiluyen la base de las dislintas y sofisticadas funciones desempefiadas por elias. 48

Capilulo Z: Pequefias mol&:ulllS, energfa y biosfntesis

lV'

,

0

-

,H

H-C-CH1-CH2~CH2-CH1-N-W

()ooa
;

'H

~

.l(1r.mo ca.boxilo

d. la cadena

F1gunl2-7 Pequefia parte de Wla molkula protelca. mostrando cuatro amlnokldos. Cada aminoacido est:! unido a1 siguienle mediante un enlace covalenle que rec:::ibe el nombre de enlace peptldico. Uno de estos enlaces peptfdicos se destaca sombrcado de amarillo. Por 10 lanto, las protcfnas se denominan a voces polipeptidos. Las cmleflos laremles de los aminoacidos se rellrl.'Sclltan en rojo y los ;l.tomos de un aminollcido (cl acido glUiamico) se dcstacan mediante el sombreadogris.

I I

NH

H,,,

t I I

HN

CH C'

pH

rOO ell l

1

I <:;H z

t I

,

COOH

I

CH,

pI-! elevado, los addos carboxfiicos

tlenden a estaT cargados y las aminas sin carga, a un pH bajo sucede 10 contraria -los acidos carboxflicos careccn de carga y las aminas esu1n cargadas. £1 pH en el que estan cargados exactamente la miwd de los residuos de acido carboXllico 0 amina, recibe el nombre de pK del aminoacido en cuesli6n. En 1a celu1a, el pH es pr6ximo a 7, y casi lados los acidos carboxflicos y las aminas se encuentran en forma cargada.

I H

HN

:-JF "

,CH

COOH

C

CH,

c;H,

I

I

<;H1

~p'l1ieo

ieido

ieido glutlimieo

pl(-4,7

pl(~.,7

soluci6n acuosa toman H' fonnanda un ion de carga positiva (que no recibe ningUn nombre especial). Eslas

dcpende del pH de la soluci6n. A un

I

<;:H z

g1utamato. Con las ammas 5e produ~ una sltuaci6n parecida ya que en

rcacciones son rnpidamcnlc reversibles. y la cantidad presenle de las dos farmas. con carga y sin carga,

HC-N

I

Flgurta2-8 La carga de las cadenas lalcrales de los aminoacldos depende del pH. En soluci6n acuosa los 4cidos carboxflicos pierden f4cilmenlc un H', formaode un ion de carga negativa que se nambra mediante el 5ufijo ~ -ala·', como poT ejemplo aspartato 0

hislidinl

Irgininl

pK.10,2

pK_12

Los nucle6tidos son las subunidades del DNA y del RNA' En los nucle6tidos, uno de los diversos compuestos cfclicos que contienen nitr6gena (dcnominados a menudo bases porque en soluciones
Figura 2·9 Estructura qu(mlea del adenosfn trIfosfato (ATP). Se rnuestra un modeJo de espacios ttenos (A), un modelo de bolas y varillas (8) y la f6rmula estruclUrai (C). N6lese la presencia de cargas negalivas en eada uno de los lIes fosfalOS.

IdenOllnl

IAI

Los componcntes qufmlcos de unacelula

IBI

lei

49

ENLACES DE HIDRCGENO Debido a que asttln polarlzedes, dos molecules de agua adyacentes pueden formar une union conoelda como enlace de hidrOgeno. los anlaces de hidrOgeno tienen una fuena de alrededor de 1/20 la de un enlace covalante.

,. I

,.

Los enlaces de hidr6geno son mas fuertes cuando los 3 atomos sa encuentran en linea recta.

0-1" H

longitudes de enlece

H

26

enlace (jfI hidr6geno

H

enlece de hidr6geno O,28nm

'/"" O-H-OL.-..-J

0,104 nm

enlace covalente

ESTRUCTURA DEL AGUA las moleculas de ague 58 unen entre 51 transitoriamente formando una red a traves de enlaces de hidrogeno.lncluso a 3r<:, un 15% de las moleculas de agua &stan unidas cada una a I otras 4, en un ensamblaje de vida corta conocido como -agrupaci6n oscilante-.

La naturaleza cohasiva del agua as responsabla de muchas de sus propiedades eldraordinerias, tales como la elevadatensi6n superficial, el alto celor especlfico Vel elevado calor de vaporizaci6n.

MOLECULAS HIDROFILICAS E HIDROFCSICAS

las moleculas no polares interrumpen la eSlruetura dal agua formada por enlaces de H, sin formar interacciones favorables con molkulas de agua. Por 10 tento son hidrof6bicas Vcasi insolubles en ague.

Debido a su naturaleze polar, les molecules de egua se agrupan alrededor de los iones Vde otras moleculas polares.

I

H

H-O

,

H

0

O-H

,

H

, I

H

H ............ H

I

H

0

H

, I

H

•

H,

/

H

0

I

H

uIIIH-O

-;\I

CI

O-H

O-H

H 0

H

".

H-O

I

H

O-H

,

H

I 0,

H

O-H

las mol6euhts que puaden acomodarse en estructuras de eSle tipo, formadas por mol6culaa de agua unidas por enlaces de hidrOgeno, son hidrofilicas y relativamente solubles en agua.

50

Panel2-1 PropIedadet fI',{mk'M del .... y IU inJIuenda ~ eI comport.amlentode'" mok!cuIaI bIoIdIkas

H

~

H

MOLECULAS HIDROFOBICAS Y ESTRUCTURAS ACUOSAS

Las molecules que 80n no polaras y no pueden formar enlaces de hidr6geno ~omo los hidrocarbonos- 5610 lienen una solubilidad en agua limileda, V se denominan hidrof6bicas. Cuando estes molecules se aneuenlran en agua, se forman 8 su alrededor estrueturas ordenades de molecules de agua. Eslas cajes semejentes a hielo son relativamenle mas ordenadas que al agua libra y generan unll disminud6n de entropla del media. En Ie figura se muestra parte de una de estes estrUCfura5 (en rajal alrededor de un hidrocarbono (en negro),

En Ie as'fuetura intacta cada atomo de oxigeno lefreu/os rojas) puede estar coordinado

tetra6dricemente con

OIrOS

cuatro.

Elagua, por sl mlsmll, liene una ligera tendencia a

Acmos Y BASES

ionizer.e. 8CtulIndo tento como acido debit y como

base debit Cuando actuB como 'cido libars un prot6n,

Un kido as una molecule que, en soluci6n. cede un ion H+ (prOI6nl. Por ejemplo,

I

0

\

,0

----->.

CH,-C

CH,-\

~

generando un ion hidroxilo. Cuenda actue como base acepta un prolon formando un jon hidronio. En saludan &Cuola Ie mayona de protones estjn como iones

+

hidronio.

0-

OH

O-H

",,'"

/

prolon

boH

Ji

un ion H+ (proton). Por ejemplo,

H'

be,e

/

prOlon

0

0

+

H

'tido

jon hidrOl
pH

H

H

/ 0\

H-O

H

ion hidronio

OSMOSIS 512 soluclones acuosss estlin separadas por una membrana que

cone. deWen

,H

molts/litro

La seidel de una solucion se define como Ie

,,'

", ", ".

concentracion de iones H+ que posee. Por comodidad. ulilizamos Ie ascals de pH en Ie que

Pars el agua pure

H

IQ

\

H

Una base 85 una molecule que, en soludon. Beaple

/

JI ~

~


". ".

;~~

,,'

10 '0

10

11

10 11

10

I)

10 '"

r I

1 2

,

, 5

,

6 6

9

" " " " "

unicamente permite el paso de las moleculas de agua, esta pahr' hada la soluci6n que contiene Ie mayor concentreci6n de molecules solubles, un proceso denominado 6smosis.

. ••• .

·. . . . •· • • •... •• . ., . ... . . :.'.:'.~ .. :·:.'.::1'. . . ... •••••••• ::.'. ·.'!···:···::':I : ... .......... . . " .' ...'. ...-..:-,.;..,;-.. .... : •• • • • • •..• •.• .~:•. ~. ~ ~ "':':1'.

•

-~

'.' ..

Este movimienlo del agua desde una soluci6n hipot6nica a una soluci6n hipert6nica, puede provocar un aumento de Ie presi6n hidrostjtica en el compartimiento hipert6nico. Dos loluciones que lengan concentraciones identicas de solutos, es decir, que sean osm6ticamente equilibredss, se dice que son isot6nicas.

51

ESQUELETOS CARBONADOS El papel car8cterlatico del carbona en Ie celuls S8 debe 8 su cep8cided de format enlaces covatentes con Olros

o estrueturas ramificadas

alamos de carbono. Asl. 101 atomos de carbono 58 pueden unir formondo cadenas.

__"./c""

o anill05

V

/C __

-C-C-

--C/

"C--

/\

I ,.p'~P'- \ /\ /\ /\ I Ulmbien como

V V V

/".

representMlo

\

Ulmbi6n como

>-<

reprnentitdo tambien eomo

ENLACES COVALENTES

CO

HIDROCARBUROS

Un enlace cov,lente SIt forma cuando dos lhomos se BCefClln luficientemente V campartan uno 0 mal de sus electrones. En un enlace lenciUo Ie camparta un electron de cada uno de los dos atomos; en un enlace dobls S8 campartan un total de cuatro electrones.

EI carbona y el hidr6geno forman juntos unos compuestos estables denominados hidrocarburos. Son no palates. no forman enlaces de hidr6geno Y. par 10 general, son insolubles en agua.

Cade 'Iomo forma un nurnefo delerminado de enlaces covalentes, siguiendo una distribuci6n espaciel definide. Por ejemplo, 91 carbona

fonne cuetro enlaces Hocilla. distribuidos hacis los vertices de un telraedro mienlr.s que 81 nitr6geno forma ues enlaces sencillos V al oxlgeno forme dOl enlaces seociliOi. distribuidos como se muestra en este panel.

Dos thomos unidos por dos o mils enlaces covalentes no pueden rotar libremenle alrededor del eje del enlace. Esta restricc;:i6n constituye ef factor limitante principal sobre la distribucion tridimensional de muchas macromoleculas.

Los dobles enlaceslienen una distribucion especial diferente.

t

H

H

H-~­

I H-C-H I

I

H

H

metlno

grupomfliiO

/

CH,

H,C

\

RESONANCIA Y AROMATICIDAD La cadena de carbonos pueden incluir dobles enlaces. Si estos se encuentran en atomos de carbonosalternos, los eleC1rones de enlace se mueven dentro de la molecula, estabilizando la eslructura en un fenomeno conocido como resonancia.

\-1 \-1 / \ I \

I

/ t \

\

C

C-C

/

/ \

H

C

;-\-<-\-1 / / \

\

CH,

H,C

C-C

/ 1\ /

CH,

H,C

Cuando se produce resonancla en un compuesto clclico, se genera un ani1lo aromatico.

H

la estruetura verdadera sa halla entre eSlas dos

\

/

H

H

?

H

-

,

/

H

H

,

CH,

H,C H

\ CH, /

H,C H

#"

\

H

/

CH,

H,C H

I~=-:~o

H

I

52 PaDelZ.Z ......, . . . . . . . .••...._ _ ... moMn. . '*~.

\ /

CH,

plIRe de II c:.denI de un icido gnollO

COMPUESTOS C-o

COMPUESTOS C-N

Muchas compuestos biol6gicos contienan un carbona unida a un 0)(lg800. Por ejemplo:

las aminas V amidas son dos importantes ejemplos de compuestos que conlienen un carbona unida a un nitr6geno. En aQua. las aminal 58 combinan con un ion H' y quedan

H

alcohol

I

EI-OH fee/be 81 nombre

I

de grupo hidroxilo.

-C-OH

cargadas positivamente.

I I

H aldehldo

,0

-c 'H

\

celona

C~O

cl 'eido carbo:lCflico

- cI

/H

-C-N-W

l

EI

Por consiguiente. son basicas.

e-o recibe el nombre

Las amidas se forman por la combinacion de un acido y una amina. Son mas estables Que los esteres. A diferencia de las aminas. en solucion acuosa no poseen carga. Un ejemplo 10 constituye el enlace peptldico.

de grupo carbonila.

0

,0

EI--eOOH recibe el nambr. de grupa carboxilo. En 81 H~

agua pierda un i6n

'OH

\H

+

-C

'OH

y S8

-C(

convierte en -COO-.

I

H

Los estares estan farmadas por la combinaci6n de un aeido y un alcohol:

lIsteres

,0

I -C-C + I ~ I 'oH HO-CI kido

+

H,O

EI nitrogeno se presente tambien en diversos compuestos clclicos: purines y pirimidinas NH,

I ,0

I

-(-C

+ HlO

N

I 'o-CI

A

C

/H

I U citosina (una pirimidinal O?C ..... N..... C....... H

~

ester

alcohol

I I

N-C-

FOSFATOS EI fosfato inorganico as un ion estable farm ada

Sa pueden formar esteres fosfato entre un fosfato y

e partir del acido fosf6rico, H3PO... A menudo se represente como PI_

un grupo hidroxilo libre.

o

II ·O-p-o·

I

-C-OH

I

?

+ 1"10- P-O·

6"

I

OH

La combinacion de un fosfato y un grupo carboxilo.

,0 -C

'OH 0

0

0

0

I + HO-P-OI

I -O-P-OH + I 0"

de dos

~

0"

II

..m~n repreMntlodo

- l\

+

0

I I 0"

0

~ ~

-C-O-0 I

un anhldrido etido.

ro~

H,O

-C

O-P-O-

0

I HO-P-OI 0"

mes grupos fosfato, da lugar

0

~

lamb)'" repreftlrltado I como

I ? -C-O-p-O· I 6"

'0--0

0

I I -O-P-O-P-O~ + I I0"

,0

18mb~n

H,o

_.

representedo

-0--0-0

0"

53

HEXOSAS n.6

Los monosadridos son aldehfdos 0 cetonas

las hexosas mlls comune, son glueosa H

fruetoR

I H-C-OH

I

que lienen lambie" dos 0 mils grupos de

H

C

I

H-C-O

H-(-OH

I

HO-C-H

I

H

I

H-(-OH

I

H-C-OH

H-C-OH

H-C-OH

H-C-OH

I I

H

I

H-C-OH

0

I

H-(-OH

I

CHzOH

I

H-C-OH

I

H-C-OH

I

I

H

'c' I

0

H-C-OH

'c" I

H-(-OH

I

H

hidroxilo. Su fOrmula ganefel as (CH 20ln. Loa mils simples son las Irioses (n. 3) tales como

I

HO-(-H

Una pentosa frecuente as

(-<) (>-0)

0

"

PENTOSAS n. 5

MONOSACARIDOS

H

ribosa

glicerlldehfdo luna aldosa) CH 20H

I

C-O I

o-glucosa (forma de cadena abierta) (.

CHzOH

o-ribosa (forme de cadena abierta)

dihidroxiacetona (una caIOla)

CH I OH

I

'<;--OH

7/H

(/H

,(

C

FORMACION DEL ANILLO

H/" HO'''7H ~3--{' 0 H

Et gropo aldehldo 0 cetona de un IZUcar puede reaccionar con un grupo hidrOltilo.

OH

\

-C

/

H

"0

H

I

+ HO-(- I

H

I

H

I

-C-O-(-

I

OH

\

I

En los azucares mayoras (n > 4 l, esto puede ocurrir denlro de Ie miama molecula, formlindose un soilla

de 506 miembros.

SISTEMA DE NUMERACION los 'Iomos de carbone de un 8ZUcaf a-o-glucoSI

S8 numeran a partir del elctremo mas cercano al aldehldo 0 Ie cetona.

ESTEREOISOMEROS

ISOMEROS

FORMASoYl

Los monosecaridos tienen muchos is6meros Clue (Jnicamente se diferencien en la orientaci6n de sus grupos hidroxilo -par ejemplo, III glucosa, III galactose y III mllnosa son isOmeros entre st

HO

~

HQ

Dos isameros Clue sean imagenes sspecularss uno del otro tienen las mismas propiedades C1ufmicas y por ello reciben eI mismo nombre, distinguiendolos mediante el prefi}o DOL

HPHO

o-glU<:Ola

OH

QH

gluco...

manON

galllC'lON

54

Panel2-03 Algunos dc los lipos de anicares encontrados habllualmcnle en las ctHulas.

OH

ENLACESaY~

DEAIVADOS DE LOS AZllcAAES

El grupo hidroxilo del carbono que presente el

aldehldo 0 II cetona puede pasar raptdamente de

Los grupos hidroICilo de un monosacarido simple pueden ser sustituidos por alros grupes. Por ejemplo:

una posici6n a otr•. Estas dos posiciones reciben el nombre de a y It

~O\

HO

~

OH

~ ~ ~ , , OH

HO

........ hldroxiloP

Hl0HO

HO

OOHO

HO

OH

NH,

OH

Q-gluconmlna

6cido l>glucur6nico

HO

HO

H20HO

OH

NH

C=o

En CUBOIO un 8zUcar se une a otro. 58 congela III forma a o~.

CH,

OLiGOSACAAIDOS COMPLEJOS En muchos casos, una secuencia de azucares as no repetitiv8. Son posibles muchas moleculas diferenles. rales oligosadridos complejos suelen estar uoidas 8

protelnas

0 8

lipidos.

, , CH, NH

NH I

(=0

~-O

un oligosadrido de grupo Hllgufneo

CH,

OH

55

Existen centenares de tipos distlntos de tlcidas gre508. Algunos tlenen uno 0 mas dobles

ACIDOS GRASOS FRECUENTES

enlaces y sa dice Que son insaturados.

Sa Irata de ileidas carboKllicos con

una large cola hidrocarboneda.

COOH

COOH

COOH

CH,

CH,

CH,

I

I CH, I

I

I CH, I CH, I CH, I CH, I CH, I CH, I CH, I CH, I CH, I

CH,

I

CH,

I CH, I CH, I CH,

I

CH,

I

CH,

I I CH, I CH, I CH, I CH, I CH, I

ikido

I

Ie..

CH,

CH,

I

CH,

I

CH,

I I

CH, CH,

CH,

~'mflico

CH,

-0

C

I

I I CH, I CH, I CH, I

CH, Eata dobls enlace origins une inclinaci6n

/ en Ie cadena hidrocarbonada. EI resto de Ie cadena

puede girar

CH,

libremente a traves

I

de los otros enlaces

CH,

e-c.

I II CH I CH, I CH, I CH, I CH, I CH, I CH, I CH, I

CH

CH,

kido

kitto

..I"rico

olelCo

te,.l

tel"

GRUPO CARBOXILO SI esttilibra, el grupe carboxilo de

un tlcldo grasa se loniza.

Para con mayor frecuencia estlll

unida

II

otros grupes formando

eslares

~o

C,

I 0-(-

I a.mldas.

0

,;

,,~o

estdrico

AGREGADOS L1P!DICOS

POLIISOPRENOIDES largos polfmeros lineales de isopreno

los 6cidos grasos tlenen una cabala hidrofilica V una cola hldrof6bica.

0-

I I

En el agua pueden formar una petreuls superficial 0 pequei'las

O-P-O-

o

micalas. Sus derivados pueden formar grandes agregados unidos por Juenas hidrof6bicas:

los triacilglicllrldos forman grendes

Los fosfollpidos Y glucollpido. forman bicepss

gatas asfliriess en 81 citoplasma celular.

Iipldic8S que se cierra" sabre ,f mismes V constituyen Ie base de todes las membranas celulsres.

-

200nm om.1iI

- =:;=-

J---- 4 om - - - I

GLUcoLIplDOS Al igual que los fosfollpidos. estos compuestos estan forrnados por una r8gi60 hidrof6bica, que contiene dos largas colas hldrocarbonadss. y una regl6n polar, que contiene en este csso uno 0 mas

residuas de azucar, perc no fosfalo. H

I

OH

I

H

0

,

cr~'rH' C-NH I

regi6n hidrof6bka

I

o

residuo de azucar

un glucollpido simple

dolkol fosfato-utilizado para transportar los azucares activados duranta la slntasis asociada a membrana de las glU<:oprotelnas y de algunos polisac8ridos.

57

El AMINOACIDO

Elatomo de carbono a as asimetrico. por 10

ISOMEROS OPTICOS

que 8ldsten dos isomercs especulares Co estereoisOmeros). 0 y l.

La f6rmula general de un aminoacido es

7~ Momo de e.rbono u gropo __-Il;!l)....(!;.r-iili~

amino

grl,lpo earboxilo

R:~gfUPOIN e-dena lalllf;lli

L

Habitualmente R es una cadena leteral de entre 20 polible•. A pH 7 81 grupo amino V 81 grupo carboxilo

estan ionizedos.

R

FAMILIAS DE AMINOACIDOS

las protelna. constao exclusivemente de aminoacidos l.

CADENAS LATERAlES BAslCAS lisina

Los emino6cidos comunes

.. clasifican segun 5i sus c.damlslaterales son 6ctdas

!)jaicas pol.res no cargadas

(lys

0

KI

H

histidine

fArg 0 RI

IHisoHI

H

H

0

I I -N-C-CI I H

arginine

formas; por medio de tres latres y por medio de

una 80la lelra. AsI: alanine. Ala _ A

58

I

~N-C-C-

I

H

<;H1

I

CH! CH!

no polare' EsIOS 20 eminoacidos se pueden abreviar de dos

0

I

CH,

I -

CH,

I -

NH,

+

ESla grupo as muy

CH

1

baBieD. va que su

I

cargl positIva esta estllbilillld por resonaocia.

NH

1

'H1N

Panel2--5 Los 20 am1ncNkIdOl que Jntervlenen en la smlesl. de las prote{nas.

I

~C l\H 1

0

I I -N-C-CI I H CH1 I

;*;.

Estos nitr6genos tienen unllllfinidad rellltivlImente debil por el H" V s610 son pardalmenle positivos a pH neulrO.

CAOENAS LATERALES ACIOAS

CAOENAS LATERALES NO POLARES

6cido a~.rtic;o

6cido lutamico

(Asp 0 OJ

IGluoE)

H

H

0

I

I

0

I I

I

I

0

I n -N-(-(I I H

glicina IGlyoGI

H

-N-C-C-

-N-C-CH

H

I

CHI

H

I

I

alanina

I

(AlaoA)

(ValoV)

I

H

H

CHI CH,

;C, o 0-

vali

0

I I -N-(-CI I

/, 0-

o

H

(H,

H

/

,

CH

CH J

Los amil'lOkidos cuyal caden".. Ilteraies no polares no c.Ilr;adu IOn falallvamenta hidrofflicos y normalmente Ie situ,n en el elrtarior de las protein." miantfes que las cadena. lalMelel de aminokidOI no polaf81 t[eoden II agregarse en eI interior de 1.1 proteln.s. los aminoacidos ron cadenas lateraln 6eldas IOn muy polare. y casi siempn!llM hellen en la luperflcie de las mol6cuta, proteicas.

G.Gly H_Hil I.lleu K. Lys L. Leu

A.Ala

C.ey, 0 • ..., E.Glu F. Pha

S_Ser T_Thr

P.Pro

V_Val W_Trp

Q_Gln R.Arg

I

V_Tyr

-

(Gin

0

H

n

I

NLPH' I

-"'-C-cI

I

H

H)

treonlna

tirosina (Tyr 0 V)

H

I I -N-C-CI I H

OH EI Qrupo

0

---oH es polar.

i

. 00

CH-CH I

0

FI

H

U

-N-C-CCli J

0

I I -N-(-CI I

H.,

H

0

I I -N-(-(I I H

metlonin

tript6fer)Q

(Meto Ml

(Trp

S-CH,

IThr 0 n

0

I

I

I II -N-C-CI I H CH J I CH I '

Aunque Ie amide N no esta cargada

I

(Phe

H 0

CH,

(Ser 0 $)

I

0

I I -N-C-CI I H CHz I

I

(Hz

fenilalanine

(In realidld Ct-I( II un iminokidol

0 Q)

CH

CH,

prolina

II un pH "aulrO, .s polar.

H

/

CH)

CH 1

/

0

I I -N-(-CI I H

CH

CH z

CHI

;C o

H

0

I I I (Hz I

H 0

-N-C-C-

I

H

(Pro 0 PI

(Asn 0 N)

H

(11eu 0 II

CH J

_.. I

(Leu 0 U

/

CADENAS LATERALES POLARES NO CARGADAS

H

isoleucine

H

M_Mat N.Asn

CHl

leucina

-N-(-(-

El c6difitO de una leue, en orden alfabetico;

0

I I -N-C-CI I

(Hz

H

I

H

I (Hz I

W)

H

0

I II -N-(-(I I H

(Hz

N H

0

I

-N-(-C-

I

0

cistefna (Cys oC)

'H

Las ciste!nas apareadas permiten que se formen enlaces disulfuro en las prOlelnes.

'------00

58

o

BASES

II

C

HC'

I C

He

Hcf N It c I

adenine /N .... C

NH

I u I

NH,

uracilo

-vc~

N H

0

las bases son compuestos clclic08 con N,

va sean purinas 0

pirimidinas.

cltosln.

;./c~

He N H

0

H,C

"C He

timina

T

I C

H

~v~o

PURINA

HC C

NOMENCLATURA

BASE

Los nombres pueden inducir a confusi6n, pero las llbreviaturas son clares.

NUCLEOSIOO

ABREV,

Los nucle6tidos se ebrevian

con Ires letres mayuscules, adenina

adenosine

A

de Ie siguleme maner.:

guanine

guanosina

G

AMP _ adenosine mOflofosfato dAMP _ desoxiadenosina monofosfato

chasina

citidina

C

uracilo

uridina

U

limina

limidina

T

BASE + AZUCAR • NUCLfD§.IOO

UDP

• uddina difosfato

ATP

• adenosine trifoslato

LOS NUCLE6TIOOS TIENEN OTRAS MUCHAS FUNCIONES

Transportsn energla en sus enlaces acido-anhfdrido. que son fkilmente

hidroHzablel. NH,

o

0

0-

0-

0

(NN

I II II "'"O-P-O-P-O- P-O-CH I I I '

ejemplo: ATP (0

0

0-

Dl

OH

OH

NH,

Sa combinen con alros grupes formando coenzimas.

77 -c

HS-C

I

H

I

H

17~

-N-(

I

H

~7~H17

1

Y

-c -( -N - ( - ( -c -( -0- p-o- p-o -CH I HI

H

I

H

I

I

I

HQ CH)H

I

0-

ejemplo: eoenzime AlCoA)

I

0-

N

'

~......

OH

OH

En la calula son utilizedos como molecules ser'lalizadores especfficas.

ejemplo: AMP cfclico (cAMP)

0--CH 2 0

o=p---O

OH

I

0-

61

Cada nucle6tido se nomhra en referenda a la tlnica base que contiene (Panel 26, pags. 60-61). Los nucle6tidos pueden actuar como transportadores de energfa qufmica. Destaca el ester trifosfato de adenina, ATP (Figura 2-9), que participa en la transferenda de energfa en cientos de reacdones celuJares distintas. Su fosfato terminal se afiade utilizando la energfa de la oxidad6n de los alimentos, y puede ser faciJmente separado por hidr6lisis liberando energ[a, la cual es utilizada en cualquier lugar de la celula en reacciones biosinteticas energeticameOle desfavorables. Como discutiremos mas adelante, otros derivados de nucie6tidos acll1an de transportadores de grupos quJmicos particuJares como .atomos de hidrogeno o residuos de azucar, desde una molecuJa a otra. Adem~, un derivado crclico de la adenina que cOOliene fosfato, el AMP cfclico, se utiliza como molkula universal de senalizaci6n dentro de las celulas y controla la velocidad de numerosas reacciones intracelulares diferentes. La importancia especial de los nucle6tidos estriba en el a1macenamiento de la informaci6n biol6gica. Los nucle6tidos constituyen los elementos de construcci6n de los licidos nudelcos, largos polimeros en los que las subunidades de nucie6tidos est.an unidas covalentemente gracias a la fonnaci6n de un ~ter fosfato entre el grupo hidroxilo 3' del residuo de azuca.r de un nucle6tido y el grupo fosfato 5' del nucie6tido siglliente (Figura 2-10). Existen dos tipos principales de .acidos nucleicos que se diferencian en el tipo de azlicar de su esqueleto polimerico. Los que se basan en el azlicar rioosa reciben el nombre de 'cldos rlbonudelcos,O RNA, y contienen las bases A, V, G y C. Los que se basan en In desoxirribosa (en la que el hidroxilo de la posici6n 2' de la rlbosa esta sustituido por un hidr6genol se denominan addos desoxirribonucleicos, 0 DNA Ycontienen las bases A, T, G YC. La secuencia de las bases de un polimero de DNA 0 RNA representa la informaci6n genetica de la celula viva. La capacidad de las bases de diferentes moleculas de .acido nucleico para reconocerse unas a olras mediante interacciones no covalentes (denominadas apareamienlo de bases) --G con C y A con T (eo el DNA) 0 con U (en el RNA)- coostituye, tal como se explicam en el Capitulo 3, la base de toda 13 herencia y la evoluci6n.

elortremo 5' de Ie cadena

o

o I I o I

-O-p-O

NH, N

CH,

....

"'

N)

o I I o I

·O-p--O

CH,

o I

Resumen Los organlsmos viuos SO" sistemas qufmicos alll6nomos, qlle se alltopropagan. Escdn fonllados por 1111 COlljlltltO caracterlstico pero limiUulo de peqllenas moMculas baslldas en el carbono que esellcialmente son las mlsmas en todas las especies vilIlentes, Las pri"ciJHlfes categorlas SOli: lLukares, dcidos grasos, aminoocidos y '11I_ clootfdos. /.,os azlkares constitllyell ullafuellte prlmQ.ria deenergfa qllfmica para las ceiulas y son illcorporados a polisacdridos para ei almace,U1mfellto de ellergfa. Los dcidos grasos SOli tambLeIl importalltes para el almacenamiemo de ellergia, peru su flmcia'1l11M siglliflcarilJ(l estriba en la formacian de las membraflas de lD. celllia. Los polfmeros formados por amilloocidos constituye" macromofecufas 1I0tabiemerite diversas y versdtiles colJocidas como prote/nas. /.,os lIuclootidos desempelJan WI papel central ellla transferellcia de ertergfa y tamblen son las sllbll/lidades a partir de las cllales se constmyerr las macromoleculas de jnformaci6n, RNA y DNA

Orden biol6gico y energfa7 Las celulas han de obedecer las leyes de la ffsica y de la qu[mica. Las reglas de la Illeeanica y de la transformaci6n de una fonna de energfa en otra se aplican a una celula igual que a una mtiquina de vapor. Sin embargo, es necesario admitir que una celula tiene unos rasgos asombrosos que, a primera vista, parecen colocarla en una categorfa especial. Es bien conocido que con el tiempo las cosas abandonadas 3 su suene pasan a quedar desordenadas: los edificios se derrum· ban, los organismos muertos se descomponen, elc. Esta tendencia general se 62

Caprtulo 2 : Pequenas mol~uJas, energfa y biosCntesis

·O-p=o

I utremo 3' de la cadena

Figura 2-10 Un breve fragmento de l'icldo desoxlrrlbonuclelco (DNA) de cuotro nuclc6tldos. Uno de los enlaces fosfodicsler, que Ilne nucle6tidos adyacentes, se destaca en amarillo y uno de los nucle6tidos se deslaca sombreado en gris. EI DNA Y su parlente prt'iximo el RNA son los addos nucleicos de la celula.

halla expresada en la segunda ley de fa lermodindmica, que afirma que el grado de desorden del universo (0 de cualquier sistema aislado) s610 puede aumentar. La asombroso es que los organismos vivos mantienen. a todos los niveles. un alto grado de orden; y como se alimentan, se desarrollan y crecen, parece que crean este orden a partir de materiales alimenticios que carecen de el. EI orden resulta c1aramente aparente en grandes estructuras como el ala de una mariposa o el ojo de un pulpo, en estructuras intracitoplasmaticas como una mitocondria o un cilio, 0 en la forma y disposici6n de las moleculas a partir de las que estall construidas estas eslructuras. Las atomos que las const..ituyen han sido capturados, en ultimo termino, desde su estado relalivamente desorganizado del media ambiente y unidos formando una estruclura determinada. Incluso una celula que no crezca, requiere para sobrevivir unos procesos constantes de ordenaci6n, puesto que todas sus estrucruras organizadas estan sujetas a aheraciones y deben ser reparadas continuamente. i,C6mo es esto posible desde el punto de vista termodinamico? Veremos que la respuesta se balla en el hecho de que la celula emite conslantemente calor a su ambiente y. por consiguiente. no es un sistema aislado en el sentido termodinamico del termino. entorno

c6lula

EI orden biol6gico resulta posible gracias a la Iiberaci6n de energfa calorlfica por parte de las c~lulas8 Como acabarnos de ver, la segunda ley de la tennodinamica afinna que la cantidad de orden del universo (es decir, de la celula mas su enlomo) siempre debe disminuir. Por consiguiente, el aumento de orden dentro de la celula viva ha de ir acompanado de un aumento aun mayor de desorden en el ambiente de la celula. EI calor es energia en su forma mas desordenada --el choque al azar de las moleculas- y la celula cede calor aI medio mediante reacciones que ordenan las moleculas que la celula contiene. EI incremento del movimiento aI azar, incluidas las diSlOrsiones de los enlaces, de las moleculas del resto de universo genera un desorden que compensa con creces el incremento de orden en la cclula, lal como requieren las leyes de la termodinamica para los procesos espontaneos. De eS(a forma, la Iiberaci6n de calor de una ccllLla al medio Ie permitc ordenarse intemamente al mismo liempo que el universo en su conjunto se vuelve mas desordenado (Figura 2-11). Es importante precisar que la celula no consigue nada produciendo calor a menos que las reacciones productoras de calor esten asociadas con los procesos que generan orden molecular en la celula. Se dice que las reacciones asociadas de esla forma estan acopladas. tal como explicaremos mas adelante. La que dis{ingue el metabolismo de una celula de la combusti6n ruinosa de un fuego es el estrecho acoplamienlo que existe entre la producci6n de calor y el incremento de orden. La generaci6n de orden en el interior de las celulas se produce a expensas de la degradaci6n de combustible energetico. Para las plantas la energfa deriva ini· cialmente de la radiaci6n eleclromagnelica del sol; para los animales deriva de la energfa almacenadll en los enlaces covalentes de las moleculas organicas que ingieren. Sin embargo, como estos nutrientes han sido producidos, a su vez, por organismos fOlosintetizadores como las plantas verdes, de hecho el sol es la fuente ultima de energfa para ambos lipos de organismos.

Los organismos fotosintetizadores utilizan la luz solar para sintetizar compuestos orgdnicos9 La energfa solar entra en el mundo vivo (la biosfera) gracias a la fOlosfntesis que realizan los organjsmos fotosintetizadores -plantas 0 bacterias. En la fotosfntesis, la energfa electromagnetica se transfonna en energfa de enlace quimico. AI misrno tiempo, una parte de la energia de la luz solar se transforma en energia calorifica, y la liberaci6n de este calor al entomo incrementa el desorden del universo y, par consiguiente, irnpulsa el proceso fotosintetico.

Orden biol6gico yenergfa

I

Figura 2-11 AmUlsls lermodlnamlco simple de una cBula viva. En el esquema superior las mol&:ulas de la celula y del resto del universo (su entomo) se han representado en un estado relativamcnte desordenado. En el esquema inferior, la celula (gris) ha liberado calor por medio de una reacci6n que ordena las moleculas de su inlerior (verde). B calor incrementa el desorden en el entomo de la celula. de forma que aunque la celula crezca y se divida se cumple el segundo principio de la termodinamica. 63

Las reacciones de la fotosfntesis se describen con detalle en el Capftulo 14. En tenninos generales. podemos decir que se pueden distinguir dos etapas distintas. En la primera elapa Oa de las reacciOlles actilXUias por !£liltz ofase IlIInil1osa). la radiaci6n visible captada por una molecula de pigmento impulsa la transferencia de electrones desde el agua hasta el NADPH, yal mismo tiempo proporciona la energfa necesaria para la smtesis de ATP. En la segunda (la fase oscura). el ATP y el NADPH se utilizan para impulsar una serie de reacciones de "fijaci6n de carbono~', en las que el COzdel airese utiLiza para formarmolOCulasde azucar (Figura 2-12). EI resultado llclo de la fOlosfnlesis. en 10 que se refiere a la plama verde. se puede resumir en la siguieme ecuaci6n:

SOL

/1\

energfa + COl + HlO -+ azucar + 0z Esla ecuaci6n simple esconde la compleja natura1eza de las reacciones de la fase oscura. que abarcan numerosas reacdones consecutivas. Adem<\s, y aunque la fijaci6n inidal del COl da lugar a azucares, las reacciones metab6licas subsiguiemes los convienen nipidamente en otras moltkulas. grandes y pequenas. esenciales para la celula vegetal.

La energfa qufmka pasa de las plantas a los animales Los animales y otros organismos no rotosintetizadores no pueden capturar directamente la energfa de la luz solar y, par ello. han de sobrevivir gracias a la energfa ~de segunda mana'" que obtienen aI ingerir plantas 0 a la de "tercera mano~'. obtenida al comer otros animales. Las moleculas orgmicas producidas por las celulas vegetales suministran a los organismos que se alimentan de elias tanto elementos estructurales para la construcci6n como combustible. Todos los tipos de moleculas vegetales pueden servir para este prop6sitO -azucares. proteinas, polisac<\ridos, lfpidos y otros muchos compuestos. No todas las transacciones entre plantas y animales son unidireccionales. Las plantas. los animales y los microorganismos han existido junlos en este pianela durante lanto liempo que muchos se han convertido en una parte esencial del medio ambiente de los olros. Por ejemplo, el oxfgeno Iiberado durante la fotosfmesis se consume en la combuSli6n de las moleculas organicas reaJizada por casi todos los organismos. y algunas de las moleculas de CO 2 que hoy se "lijan~) en moleculas organicas mayo res en una hoja verde mediante la rotos(ntesis, anteayer fueron liberadas a la alm6srera pOT la respiraci6n de lin animal. Asf, la utiIizaci6n del carbono es lin proceso dclico qlle abarca el conjunto de 130 biosrera y cruza los lfmites de los organismos individuales (Figura 2-13). Analogamente, los

COMBusTION '(EROSION

64

CapftuJo 2 : pequenas molKulas, energfa y biosmtesis

Figura 2-12 La (OlOS{ntesls. Las dos fases de la fOlosfnlesis en una planta

verde.

Figura 2-13 EI cicio del carbono. Los thomas de carbona se incorporan a lAS mol~culas org:lnicas del mundo vivo gracias a la aClividad fOlosinlelizadora de las plantas. las bacterias ylas algas marinas. Pasan luego a los animales, a los microorganismos yal material org:lnico del suelo y de los oc~anos, a trav~s de vfas cfclicas. El COl welve a la atm6sfera cuando las moleculas organicas son oxidadas por las celulas o quemadas por el hombre en forma de combustibles f{jsiles.

IAI

18' FORMA06N DE

UN ENLACE COVALENTE

+

.~",f'.'!1!!

'"

..,

elflremo

ATOMQ 2

tiene una ca,ga parcial posit,vlI

I I

H-C-H

M" /......,.,_.J~ A,TOMO 1

H

MOL.£CULA

H

metana

esteelfl..emo lien. una

I

urge

.".ei,1 M98tivlI clebido. un exc:eso de elee1rones

H

I I

0 X

H-C-OH

Flgun2·14 OxJdacl6n y reducd6n. (A) Cuando dos :l.lomos ronnan un enlace covalente, uno de los
H metanal

"C=O /

H formalOehldo

favorable dentro de la celula. H

~itomos de nilr6gcno. de f6sforo y de azufre pueden seguirse. en principio. desde una molecula biol6gica a otm. a tm~ de unos cielos similares aJ del carbono.

I

H

. 8

I "

HO

/

C-O

6cido f6rmico

Las c~lulas obtienen energfa mediante la oxidacion de moleculas biol6gicas 10 Los
I

O-C-=O dioxido de carbono

65

asequibles). En cste caso el efeclo neto es la adici6n de un .homo de hidr6geno a . 13 molecula

I el\8rgi'de e<:livac::,6n

A pesar de que en esla reacci6n panicipa un prot6n y un electr6n. (en lugar de solamente un electr6n), las lJidrogeflaciolles de este tipo son reducciones y las reacciones conU'arias, las desllidrogetlacionesson oxidaciones. La comhusLi6n de los maleriales alimenticios en una celuJa convierte los

alomos de C y de H de las mollkulas organicas (en las que se haUan en un eslado relativamentc rico en electrones, 0 sea, reducido) en CO2 YH20, compuestos en los que el C y el H han cedido electrones y. por consiguicntc. estan aJtamente oxidados. EI paso de electrones desde el carbona y el hidrogeno hast3 el oxIgeno perm.itc a lodos estos .homos a1canzar un estado mas estable. y por cUo la transfonnaci6n es energeticamente favorable.

La degradaci6n de una mol&ula orgamca se realiza a traves de

una secuencia de reacciones catalizadas enzimliticamente '1 Aunque la fonna energ~l..icamente mas favorable del carbono es el CO 2 Y la del hidr6geno es el H20, un organismo vivo no desaparece transfonnl1ndose en humo por la misma raz6n que este Iibro no empieza a arder en cualquier momento: en ambos casos las molecuJas existen en niveles energ~ticos metaeslables y necesitan una energfa de aclivacl6n (Figura 2-15) para poder transformarse en configuraciones ml1s estables. En el caso del Libro. la energfa de activaci6n puede ser suminisuada por una ceriJla encendida Para una c~lula viva. la combusl..i6n se puede obtener de una manera ml1s controlada. EI papel de la ceriLia 10 realiza una colisi6n energ~tica poco habitual de una mol~cula can otra. Ademl1s. las unicas moleculas que reaccionan son las que se hallan unidas a la superficie de las ellzimas. Como se explica en el Capfrulo 3. las enzimas son catalizadores proteicos altameme especializados. Como lodos los deml1s tipos de calalizadores, aceleran las reacciones reduciendo la energfa de activaci6n de un cambio qufmico determinado. Las enzimas se unen fuertemente a las moleculas de su substrato y las mantienen de lal forma que reducen notablemente la energfa de activaci6n de una determinada reacci6n que reardena algunos enlaces covalentes. AI reducir selectivamenle la energfa de activaci6n de una determinada reacci6n de las que puede sufrir la moll!:cula unida, las enzimas determinan cuaI de las diferenles vfas alternativas de rotura 0 formaci6n de enlaces covalentes se producirl1 (Figura 2-16). El producto liberado par la enzima tras la reacci6n enziml1tica podrl1 unirse a una segunda cnzima que catalice otra reacci6n. De esta manera, cada una de las muchas moll!:culas de una celula pasan de una a otra enzima siguiendo vfas espeC£jicas de reacciones. determinando asi la qufmica celuJar. Ml1s adelante discutiremos algunas vias centrales del metabolismo energelico. EI exito de los organismos vivos se puede atribuir a la habilidad de las celulas para producir muchos tipos diferentes de enzimas. cada uno con propiedades especfficas. Cada enzima tiene una forma unica y une un conjunto determinado de moleculas (liamadas substratos). de tal manera que la enzima acelera una reacci6n delerminada normalmente unas 10]4 veces. Como ouos catalizadores, las moltkulas de la enzima no cambian despues de participar en u.na reacci6n y par 10 tanto pueden actuar una y otTa vez.

Parte de la energfa Hberada en las reacciones de oxidaci6n se acopla a la reacci6n de formaci6n de ATPI2 Las celuJas obtienen energfa util a partir de la "combusti6n" de la g1ucosa. uoica-

mente porque la queman de una manera muy compleja y controlada. Mediante vias de reacci6n dirigidas par enzimas, las reacciones qufrnicas de s[ntesis, 0 reacciones anab6licas, que generan el orden biol6gico, estl1n estrechamente 66

Capitulo 2: Pequeftas molecuJas, energfa y biosfntesis

proceso de I, reaa;:i6n _

FIgura 2-15 EI princlplo de la energfa de &ctlvacl6n. EI compuesto X se halla en un estado metaestable ya que sl se lJ"llIIsfonna en el compuesto Y se Iiberant energla. Sin embargo, esta transici6n no ocurrirt a menos que X pueda adquirir la energfa de actiuaei6n suficiente de su enlomo (mediante colisiones poco habituales con otras molkulas) para suint la reacci6n.

Figura 2-16 CatMlsls enwmitlca.

no c.l.liz.d.

'AI

caUllillis enzim'tic. de I••ellCCiOn 1

- _ motecul. con _IMfgla

media

much. mol4cul.. tienen c.ntidad • -Via

UfIII

Mlflciltnte ~r. Mguir .. reaoci6n catllllzlMUl enzim"icamente

casi no h.y ",018(111&8 qUll "nglWll. canti~

de energil tan

elevade ~ri. PI" MgIII... tNCd6n en IlJsencI. de

'"

Trn&

energi. PO' molkul, -

acopladas a las reacciones de degradaci6n, 0 catabOlicas, que proporcionan la encrgfa. La diferencia crucial entre una reacci6n acoplada y una reacci6n no acoplada se ilustra mediante una analogfa mectinica en la Figura 2-17, en la que una reacci6n qufmica energeticamente favorable se representa por las rocas que caen desde un acantilado. Normalmente la energra cinetica de las rocas que caen se desperdiciarfa completamente en forma del calor generado cuando chocan contra el suelo (secci6n A). Pero mediante un cuidadoso dispositivo parte de la energfa cinetica podrfa ser utilizada para accionar una rueda de palas que eleva un cubo de agua (secci6n B). Puesto que en la seed6n Bias rocas 5610 puOOen lJegar aI suelo accionando la ruOOa de palas, decimos que la reaeci6n espontlinea de la cafda de las rocas ha sido acoplada directamente a la reaeci6n no espontlinea de elevaei6n del cuba de agua. Dado que ahora pane de la energfa se utiliza para realizar un lrabajo, las rocas lJegan al suelo con una velocidad menorque en la secci6n A y se pierde menos energfa en forma de calor. En las celulas las enzimas desempei'ian el papel de la rueda de palas de nllestra analogfa, y acoplan la combusti6n esponttinea de los alimentos a reacdanes que generan el nllcle6sido lrifosfato, ATP. De la misma forma que la energ(a aCllffiuJada en el cubo de agua elevado de la Figura 2-17 se pllede lltilizar poco a poco para impulsar diversas mtiquinas hidmuLicas (secci6n C), el ATP aenia como dador convenienle y vers
(A) Un modelo de caja que iJustra de que fonna las enzimas dirigen a las molecuJas a naves de vfas delerminadas. En este modelo, la pe/ora verde representa el substrato polencial de una enzima, (compuesto X) el cual se desplaza arriba y abajo de niveles energ~lioos a causa del conslante bombardeo de las molkulas de agua que coliswnan con ella. Las cuano paredes de la caja represenlan las barreras de energfa de aetivaci6n para cuatro reacciones qurmicas diferentcs cnergeticamenle favorables. En la caja de In izquierda no se produce ninguna de eslas reacciones, ya que la energfa disponible gracias a las colisiones es insuficlente para superar nioguna de las barreras energelicas. En la caja de la derecha. la catalisis enzimatica reduce la energfa de activaci6n t'inicamcnte para la reacci6n nt'imero I. Asf permite que, con la energfa disponiblc, se produzca esta reacei6n de forma que eJ compuesto Xse uansfonna en eJ compuesto Y. Entonces. el compuesto Yse puede unir a Olra enzima que 10 lransforme en el compuesto Z. yasf sucesivamente. (B) Dislribuci6n de cnerg(as Cll una poblnci6n de moleculas identicas. Para que se produzca una reacci6n qufmica determinada, la energfa de la molkula (en forma de movimientos de traslaci6n, vibraci6n y rOlaci6n) ha de eu:eder la energfa de aClivaci6n; en la mayorfa de los casas eslO nunca ocurre si no se produce una cattilisis enzimalica.

La hidr6lisis del ATP genera orden en las ctHuJas l3 tDe que forma aciUa el ATP como transportador de energ(a qu(mica? En las con-

diciones existentes en el citoplasma, la hidr6lisis del ATP Hberando fosfato inorg~nico (PI)' se produce gracias a la cal~lisis de una enzima, y Iibera una gran cantidad de energfa utilizable. Un grupo quImico que se halle unido mediante un Orden bioJ6gico y energfa

67

IAI

181

lei

TRABAJO

linL

.. _01, ein«ic:a .. tr.ntllorma

unicamenlll en energr. e.Jorff~

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de .. energl. aneta M utilize e+trY,ndo

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I'I'IoflI'IOI

enlace reactivo de este lipo sen1 transferido a otm molecula; por ello se puede considerar que el fosfato leonina! del ATP se balla en un eslado cu:livado. EI enlace que se Tompe en esta reacci6n de hidr6lisis recibe. a veces, el nombre de elllace de alta e"ergfa. Sin embargo. esle enJace no tiene nada de especial. Sim· plemenlc ocurre que en soluci6n acuosa la h..idr6lisis del ATP genera dos moleculas (ADP y PJ de energra mucho menor.

Muchas de las reacciones qu£rnicas de la celuJa son energeticamcmc desfavorables. Estas reacciones son impulsadas por la energia liberada en la hidr61isis del ATP a [raves de enzirnas que acoplan directamente la reacci6n dctcrminada desfavorable con la reacci6n favorable de la hidr61isis del ATP. Entre estas reaedenes se encuentran las que intervienen en la sfntesis de las mol~culas biol6gicas, en el nansporte activo de las moleculas a naves de las membranas celulares yen la generaci6n de fuerza y de movimiento. Estos proceses desempcl'an un papel vital en el establedmiemo del orden biol6gico. Por ejemplo, las macramo· leeulas formadas en las reacdones de biosfntesis transportan informaci6n, cata· Uzan reacciones especfficas y son ensambladas en estructuras altamente orde· nadas. Vnas bombas situadas en las membranas mantienen la composici6n interna especial de las celulas y permiten que las sefiales pasen al interior de las

.nergll ...quible parlilralMlo telular y par. ~Ilteti. qulmiea

-o-[-oH Ho-[-o-f +

68

Capftule 2 : Pequeftas molkulas. energfa y biosfntesis

III _gr. potencial .Imacenada en el Cllbo de IIgIJll fievado H puede utilizer par. impulsar dlvufSilS m6quinu hldr6uliea$.

Flgun 2-17 Esquema de un modelo meClinico que Uustra eI princlpio de acoplamJento de las reacdones qul'mJcas. La reacci6n esponillnea mostrnda en (A) puede servir como analogfa de la oxidaci6n directa de la g1ucosa a COl y H20, que unicamente produce calor. En (81, la misma reacci6n csta acoplada a una segunda reacci6n; esta segunda reacci6n puede servir como analogia de la sfnlesis de ATP. La energia producida en una fomm mas versatil, en (8) puede ser utilizada para impulsar otras procesos celulares, como se ve en (C). ElATPes 13 forma de energ(a mas versalil de las c~lulas.

FlguraZ-18 LamolecuJadeATP slrve como lransportadorde energfa en las c:eluJas. Como se indica, la formaci6n de ATP desde ADP y fosfalO inorganico, energ~ticamente desfavorable, esta acoplada a la oxldaci6n de molecuJas alimenticias. energil!:ticamenle favorable (rease la Figura 2-17B). La hidr6lisisde esteATP hasta ADP y fosfato inorganico proporclona la energfa IleCf!Saria para impulsar muchas reacdones celulares imponanles.

cl!lulas y entre elias. Finalmente. la producci6n de fuerza y de movimiento permite que el contenido ciloplasmatico de la cl!luJa sea organizado y que las propias celuJas se desplacen y se ensamblen fonnando tejidos.

Resumen Las dlula.! vivas estdn altamente ordenada.s y, porcons/glliellte. IUln de generar orden dentro de ella.! mismas para sobrevivir y crear. Desde el punto de vista tenllodirufmico esto solo es pasibie gracias a mla elltrada cont/mlD de energfa, parte de la ellalias dlElias ceden a Sll efllomo e"forma de calor. La energfa procede en ,iftimo term/no tk la radlacit'hl electromaguetica del sol, que im/mua la fonl/ocMn de moMClIlas organicas e'J los organismosfotosi",etizadores como las plantas verdes. Los anlmales obtiene'J Sll energfa ingir/endo estas molkulas orgdnicas y oxiddndolas en una serie de reaeeiom~s catalizada.s ellzimdticamente y aooplada.s a laformaci6n de ATP. En todas 1m dlldm el ATP es 1m dador general de energ(n y sullidr6Usis. energeticamente favorable. esta acoplada a olTas reaee/olles, implllsmulo diversos procesos energet/camente desfavomblet que genera" el elevado grado de orden esencitJI para la vida.

EI alimento y la obtenci6n de la energfa celular J4 Las moIeculas alimenticias son degradadas en tres etapas, para producir ATP Las protefnas, los Ifpidos y los poJisac
4

EI alimento y la obtenci6n de la energfa celular

69

ETAP" 1: t"nsform8d6n de ...

gr.""

gral1d.. mol4cullt ~ tubunidade,

........

_do.

£TAP" 2: ~.mc16n de 1ft

-

iIubunodades"mpl.. '-UI1IOeti1 CoA. produc:ci6n de _

tarltics.d lifnitacle;

--

de "TP 'I' de HAOH

ETAP" 3: ollideciOn~

pade•• eduda. en la.m. d. NAOH

del aeelil CoA hMta H~yCOt.

.compaflada de Ie

produedOn de una lJfan centided de "TP Yda NAOH

fOll'orilllCi6n oxid.tiv. 0,

La glucolisis puede producir ATP incluso en ausencia de oxfgeno La pane mas imponante de la fase 2 del catabolismo es una secuenda de reacdones conodda como g1ucoUsls -Ia !isis (rotura) de la glucosa. La glucolisis pue-

de producir ATP en ausenda de oxfgeno, y probablemente apareci6 pronto en la historia de la vida, antes de que las actividades de los organismos fOiosinl61icos introdujeran oxigeno en la atm6sfera. En la glucolisis una mol6cula de glucosa, de seis alamos de carbono, se Iransforma en dos moleculas de piruvato, de tres atomos de carbono cada una. Esta conversi6n se produce a travb.i de una secuenda de nueve elapas enz.iml1ticas que generan intemlediarios que contienen fosfato (Figura 2-21). La aHula hidroliza dos mollkulas de ATP para impulsar las primeras etapas, pero produce cuatro mollkulas de ATP en las elapas finales, de forma que se produce una gananda nela de ATP. Desde un punto de vista 16gico, la secuenda de reacdones se puede dividir en Ires panes: (I) en las elapas I a 4, la glucosa se Iransforma en dos mollkulas de Ires atomos de carbona cada una, el glicera/dehfdo 3-fosfalo, transformad6n 70

Capitulo 2 : Pequeftas mollk:ulas, energfa y bioslntesis

Figura 2-19 D1agrama slmpliflcado de las Ires etapas del catabollsmo que conducen desde eI aJimento huta los productos reslduaJes. Esta serie de reacciones produce ATP, que luego es utilizado para impulsar reacciones de biosfntesis y otros procesos celulares que requieren energia.

coenzima A

grupo 8Cetllo

I

Figura 2-20 EI acetll coenzlma A (acetll CoAl, Este intermediario

II

"" <;>"" ",C-~-s-{-h-t-{-h

o

H H H

H H

Hi'"

1--t-

H

6H

? ? -+o-p-o-P

H}H

melab6lico crucial se genera cuando los grupos acedia producidos en la rase 2 del calabolismo se unen covalenlemenle al coenzima A(CoA).

6- 6-

",0-" [ ' - - - _ acet8tO

"j"'"

"" <;>"" <;> "-s-{-{-~-t-{-{-~-t-t H H H

H H H

6H

? ? --{-o-p-o-p

H)H

6- 6-

CoA

que rcquiere un aporte de energfa en forma de hidr6lisis de ATP para surninistrar dos fosfatos; (2) en las reacciones 5 y 6, el grupo aldehfdo del gliceraldehfdo 3-fosfato se oxida a
71

I

1

.....

1

1

glucose 6-10"-'10

I

,

IruetOM 6·fosfato

I

,

1

Figura 2-21 GI ueoUsls. Cada ulla de las reacciones mostradas aquf estli catalizada por una enzimn djferentc. En la serie de reac dones dcsignadas como paso 4, un azuc ar de seis carbones es transfonnado e n dos azucares de tIes carbon as, de m odo que a panir de esle paso el numem de moleculas cs el doble. Las reac dalles 5 y 6 (en la rolla amarilla) son Ias responsables de la sfnlesis nela de moleculas de ATP y de NADH (~ase Fi gura 2-22).

1

glUCOH

3

1 fructON 1.8-bislosf'IO I

• I--l

dihidfoNcel:OfWI to.fIIto

1

I

1

glarltde/'lldo 3-tosfalo

"'I

®

'1l!il!llI

5

"', "'I

l,3-tMsfosfogliceralo

•

1

I o'c/

I CHOH I

'D

I

3·toslogtieerllo

2-fol'oglicllrl1o

'·1

fot'a.nolpiruvfl1o

•

IlJI=ido I

CHzo(!)

I

rHS~

7

"'I

H

1 I

9

'D

REACCION

•

2xl_~P_"_W_'_"__

FIgura 2·22 Reaccloncs 5 y 6 de la g1ucolisls. En eSlas reacciones 13 oxidaci6n de un aldehldo a un dcido carboxflico eSIl'i acopJada a la formaci6n de ATP yde NA.DH (vease lambicn Figura 2-21). Como se Indica aquf, la reacd6n 5 empieza cuando la enzima gliceraldelJido 3-fosfato deshidrogenastl (vease Figura 3-4.2) fonna un enlace covalente con el carbono del grupo aldehldo del gliceraldehfdo 3-fosfato. Oespu~. el hldrogeno (como Ion hidruro -un prot6n con dos electrones) es eliminado del gTUpo aldehfdo del gliceraldehldo 3-fosfato y se transfiere aI importaRle transportador de hidr6geno NAO' (vease Figura .2-24), Esle paso de oxidaci6n genera un grupo carbonilo de un azucar unido a la enzima mediaRle un enlace de alta energfa (mostrado en raja). Enlonees. un ion fosfato (Pi) de la soluci6n rompe este enlace generando en su lugar un enlace azucar-fosfalo de alta energfa (enlace rojo). En estas dos wtlmas reacciones la enzima ha acoplado el proceso energeticamente favorable de oxidaci6n de un aldehfdo con la fonnaci6n energeticameRle desfavorable de un enlace fosfato de alta energfa, pennitiendo que la segunda reacci6n sea dirigida por la primera. Finalmente, en e1 paso 6 de la g1ucoUsis el grupo fosfalO reactivo recientemente creado es transferido aI ADP para formar ATP, de}ando un grupo carboJdlico libre en el azlica! oxidado.

72

Capftulo 2: Pequeftas molecuJas, energfa y biosfntesis

REAcclON

•

o

co,

0,

CIClO

CoA

FOSFORILACION

DEL ACIDO CITRICO

H,O

OXIDATIVA

e....

NAO" IADPI .. Pi

El NADH es el intermediario central en el catabolismo oxidativo La generaci6n anaer6hica de ATP a partir de glucosa y a traves de las reacciones de la glucolisis es relativamente ineficiente. Los productos finales de 1a glucolisis anaer6hica concienen aun una gran cantidad de energfa qufmica que puede seT Iiberada mediante su oxldaci6n posterior. La evoluci6n del catoboUsmo oxidativa (respiraci6n celular) 5610 result6 posible despues de que el ox:fgeno molecular se huhiera acumulado en la atm6sfera terrestre, como resultado de la fotosfntesis realizada por las cianohacrerias. Antes de ella, los procesos catab6licos anaer6bicos habfan dominado la vida sabre la Tierra. La adici6n aI proceso catab6lico de una fase dependienle de oxfgeno (fase 3 de la Figura 2-19) proporcion6 a las celulas un merodo mucha mas potenre y eficaz de extraer energfa de las moleculas alimenticias. ESla tercera fase empieza con el ciclo del dcido e(trieo (denominado tambien cicio de los acidos tricarboxflicos 0 tambien, cicio de Krebs) y termina can la fosforilaci6n oxidativa, procesos que se producen tanto en las baclerias aer6bicas como en las mitocondrias de las celulas eucariotas. En la Figura 2-23 se presenta una versi6n simplificada de los dos procesos centrales del catabolismo oxidativo, En primer lugar, en el cicio del acido cftrico los gnlpos acetilo de las moleculas de acelil CoA son oxidados hasta CO 2 Y NADH. A cominuaci6n, en el proceso de fosforilaci6n oxidaliva el NADH generado reacciona con el oxigeno molecular (02) produciendo ATP y H20, a traves de una complicada serie de etapas que implicah un transporte de electrones a traves de una membrana.

Figura 2-23 Esquema slmpllflcado de la etapa 3 del catabollsmo. EI proceso produce primariamente grandes call1idades deATP a panir deADPy de fosfato inorganico (1'1)' EI cicio del acido dtrico produce NADH, que lucgo es utilizado para dirigir In producci6n de ATP a traves de la fosforilaci6n oxidativa. Asf pues, el NADH actua como intennediario celHral en la oxidaci6n de grupos acetilo hasta CO 2 y H20 (Iambien juega un papel similar, aunque en menor cantidad, el FADH 2).

!

Flgura2-24 EI NAn' yel NADn. Estas dos moleculas son los Iransponadores de electrones mas importantes en las reacciones catab6licas. Sus estrucruras se muestran en (A). NAO' es la abrevintura de Ilicotinamida adcliina dillucleolido, reflejando el hecho de que 1'1 mitad derecha de la moJecula, tal como se indica en el dibujo, es el monofosfata de adcnosina (AMP), La parte de la molecula del NAD' conocida como cl anWo de nicolinamida (sombreada en gris) es capaz de aceptar dos electrones y un prot6n (en total un ion hidruro, H-), fonnando NADH. En esta forma rcducida, el aniUo de nicotinamida tiene una estabilidad reducida debido a que ya no csta cstabilizada por resonancia. Como consecuencia de clio, el ion hidruro incorporado eSta activado en el scntido de que es facilmente transferido a Olras moleculas. (B) Ejemplo de una reacci6n en la que participan el NAD' y el NADH, En la oxidaci6n bio16gica de una moleculn de substrata. como un alcohol. el substrato pierde dos atomos de hidr6geno. Uno de elias se al'lade como ion hidruro al NAD', produciendo NADH, mienlras que cl otro se Iibera a la soluci6n como un prot6n [H').

EI alimento y 1a obtenci6n de energfa celular

73

IAI

Ho-H c ,fP N p

o~~

p

0

HI

p

0 RIBOSA

161

i

H-C-OH + NAD' - -

I

i

c=o

+ NADt1 + H'

"

NH,

EI NADH, intermediario central en estos procesos, tambien 10 encontramos como un producto de la glucolisis (vease Figura 2-22). Es un imporante transporrador de pader reductor en las celulas. Como se ilustra en la Figura 2-24, est~ formado par la adici6n de un nudeo de hidr6geno y des electrones (un ion hidruro 1-1-) a la adenina nicotinamida dinude6tido (NAD'). Debido a que esta adici6n tiene lugar de una forma tal que el ion hidruro queda asociado a Irav~ de una uni6n rica en cnergfa, el NADH actua en la celula como una fuenle adecuada de electIones f<1cilmente transferibles, de una forma semejante a como el ATP acrua como una fuente adecuada de grupes fosfato f<1cilmente uansferibles.

El metabolismo esta dominado por el cicio del acido cftrico 1S La funci6n primaria del cicio del <1cido cflrico consiste en oxidar los gropos acetilo que entran en el cicio en fonna de molecuJas de acetil CoA. Las reacciones

fonnan un cicio porque el grupe acedlo no se oxida directamente, sino despu~ de haberse unido covalentemente a una molecula mayor, el oro/acetato, que se regenera al final de cada vuelta del cicio. Tal como se i1ustra en la Figura 2-25, el cicio empieza con la reacci6n que tiene lugar entre el acetil CoA y el oxalacetato, fonnando una molkula de un <1cido tricarboxilico denominada dcido cftr;co (0 citraro). Luego se producen una serie de reacciones en las que dos de los seis .1wmos de carbona del citrato se oxidan a CO2 , fonnando otra mol~cula de oxalacetato, que inicia de nuevo el cicio. (Puesto que los carbonos que entran en cada cicio se incorporan en lugares del citrato diferentes a los que se oxidan a CO2, no seran oxidados hasta despu~s de varias vueltas del cicio.) EI CO2 producido en estas reacciones sale de la mitocondria (0 de la bacteria) por difusi6n y abandona de la c~luJa. La energfa que se libera cuando se oxidan los enlaces C-H y C-C del citrato puede ser capturada de varias maneras diferentes en el transcurso del cicio del

1C$lll CoA

Olfll'C$t&to

4C

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1m . H' _~;::::'::::::"'L:.J

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co,

k--I!1mI.H· 50

®

74

co,

capftulo 2: Pequeftas moltkulas, energfa y biosfntesis

Figura 2-25 El cicio del acldo cftrlco. En las milOcondrias y en las baclerias aerobicas los grupos acelilo producidos a partir del piruvalo se oxidan Ilosierionnente. Los lIlOmos de carbona de los gropos acelilo se Iransforman en CO z' mientras que los lIlomos de hidr6geno se transfieren a las moleculas lransponadoras NAO' y FAD. Alamos adicionales de oxigeno e hidr6geno entran en el cicio en fonna de agua en los pasos indicados con un aSlerisco (oJ. El ntlmero de carbonos de cada molecula se indica en el recuadro blanco. Para mas detaUes ~aseFigura 14-14.

acido dtrico. En lin paso del cicio (de succinil CoA a succinato) se genera un enlace fosfato rico en energfa mediante un mecanismo parecido al que se ha descrilO ames para la glucolisis. EI resto de la energfa de oxidaci6n que se captura en el cicio se canaliza hacia la conversi6n de moleculas transportadoras de hidr6geno -0 iones hidruro- en sus formas reduddas; en cada vuella del cicio. tres moleculas de NAD' se convierten en NADH y un j1oll(n aden(/? dimtc/ootido (FAD) se convierle en FADH 2• La energfa transportada por el hidr6geno aClivado de estas moltkuJas transportadoras se utiliza en las reacciones de la fosforilaciol1 oxidatioo (que serA considerada con mas detalle mAs adelanle). las tinicas reae· dones descritas aquf que requieren oxfgeno molecular de la atm6sFera. Los atomos de oxigeno adieionales necesarios para producir COl a partir de los grupos acetilo que enttan en el cicio del acido citrieo no son suministrados por el oxfgeno molecuJar. sino por el agua. En cada vueha del cicio. Ires moleculas de agua se rompen y sus Atomos de oxigeno se utilizan produciendo CO2, Algunos de sus Atomos de hidr6geno emran a Formar parte de molkuJas del sustrato y. como los Atomos de hidr6geno de los grupos acelilo, final mente semn lransferidos a molkulas transportadoras como el NADH. En la c~lula eucariota, las mitocondrias son el cemro donde confluyen todos los procesos catab6licos, tamo si empiezan desde azticares, desde grasas 0 desde protefnas. En efecto, adem;1s del piruvato, los acidos grasos y algunos aminoacidos tambien pasan desde el citosol a las mitocondrias. y all( son transformados a acetiJ CoA 0 a alguno de los Olros intermediarios del cicio del Acido cftrico. La mitocondria tambien acttia como punto de partida de reacciones de biosllllesis. al producir unos compuestos de carbono vitales. [ales como el oxalacetato y el a·celoglutarato. Estas sustancias pueden ser transferidas de nuevo desde la mitocondria al citosol donde aCltian como precwsoras para la sfntesis de mole· culas esenciales, como por ejemplo algunos aminoacidos.

En la fosforilaci6n oxidativa, la transferencia de electrones aJ oxfgeno impuJsa la formaci6n de ATpIO, 16 La fosforIJacl6n oxldatlva es el tiltimo paso del catabolismo y el proceso en que se Iibera la mayor parte de la energfa merab6lica. En esle proceso, las moleculas de NADH y de FADH 2 transl1eren aI oxfgeno molecuJar (02) los electrones que han obtenido de la oxidaci6n de las moleculas alimenticias. La reacci6n, que for· mal mente es equivalente a la combusti6n del hidr6gello en el aire forrnando agua, Iibera una gran cantidad de energfa qufmica. Parte de esta energfa sc utiliza para producir la mayor parte del ATP de la celula; el resto se Iibera en forma de calor. Aunque el proccso qufmico general de la oxidaci6n del NADH y del FADH 2 implica una transferencia de hidr6geno hasta el oxigeno, cada .itomo de hidr6geno se transl1ere como un electron y un prot6n (el ntideo de hidr6geno, 1-1'). Esto es posible debido a que el atomo de hidr6geno puede ser facilmente disociado en el electr6n y el pro16n (H+) que 10 constituyen. Entonces. el electr6n puede ser transferido por separado a una molecuJa que tinicamente acepta elec. trones, mientras que el prot6n permanece en la soluci6n acuosa. Por el mismo razonamielllo. si sc transfiere un electr6n a una molecula que lenga una fuerte afinidad por el hidr6geno, automaticamente se reconstituira un alomo de hidr6geno tomando un prot6n de la soluci6n. En el rranscurso de la fosforilaci6n oxi· dativa los electrones del NADH y del FADH 2 descienden a 10 largo de una cadena de moleculas transportadoras, conocida como cadena de transporle electron]· co. La presencia 0 ausencia de Atomos de hidr6geno illlactos depende de la naturaleza del transportador. En una celula eucariota, esta serie de transferendas elcctr6nicas a 10 largo de la cadena de transporte elcctr6nico ocune en la membrana mitocondrlal in. tema. en la que se hallan lodas las mol&:ulas transportadoras. En cada paso de la transferencia, los eleclrones caen a un nivel energetico mas bajo, hasta que al final son transferidos a las molkulas de oxfgeno. Cada molecula de oxfgeno (02) EJ alimento y la obtencl6n de energfa celular

75

.. toma cuatro electrones de la cadena de transporte de electrones y cuatro protones de la soluci6n acuosa (onnando dos moleculas de agua. Las molecuJas de oxfgeno tienen una gran afinidad por los electrones, por 10 que los electrones unidos aI oxfgeno se encuentran en su estado energetico m<1s bajo. La cadena de transpone de electrones es importante para la celula porque la energia que se Iibera cuando estos electrones caen a estados energeticos mas bajos se aprovecha de una manera remarcable. Como describimos en el Capftu10 14, transferencias particulares de electrones hacen que se bombeen protones a trav~ de la membrana, desde el compartimiento mitocondrial interno hacia el exterior (Figura 2-26). Asf, se genera un gradieme electroqufmico de protones a traves de la membrana mitocondrial iOlerna_ Asu vel.. este gradieOle impulsa un flujo de protones a traves de un complejo enzimarico especial de la misma membrana mitocondrial haciendo que la enzima (A TP simasa) ai'iada un grupo fosfato al ADP, generando por consiguiente ATP dentro de la mitocondria. Finalmente, el ATP recien sintetizado se transfiere desde la mitocondria al resto de la celula.

Los aminmicidos y los nucle6tidos forman parte del cicio del nitr6geno Hasla aquf hemos centrado nuestra discusi6n fundamentalmcl1te en el metabolismo de los carbohidratos. No hemos hablado aun del metabolismo del njtr6geno 0 del azufre. Estos dos elementos son constituyentes de las protefnas y de los <1cidos nudeicos, los cuales son las dos dases de macromoleculas mas importantes en la celula y constituyen aproximadamente las dos terceras partes de su peso seco. Los atomos de njtr6geno y de azufre pasan desde un compuesto hasta otro y entre los organismos y su ambiente a traves de una serie de cidos reversibles. Aunque el nitr6geno molecular es abundante en la atm6sfera terrestre, en (onna de gas es no reactivo qufmicameOle. Onicamente a1gunas especies vivientes son capaces de incorporarlo a moleculas orgarucas, proceso denominado 6jacl6n del nltrogeno. La fijaci6n del nitr6geno ocurre en ciertos microorganismos y en algunos procesos geofisicos, como por ejemplo en la desca.rga de un rayo. Es esencial para toda la bios(era, pues sin esta fijaci6n no existirfa la vida en este planeta. Pero unicameOle una pequefla parte de los compuestos niuogenados de los organismos actuales representa productos frescos de fijaci6n del nitr6geno atmosferico. La mayor parte del nitr6geno organico ha est ado en circulaci6n duraOle mucho tiempo. pasando de un organismo vivo a olro. Por consigllieme, se puede decir que las reacciones de fijaci6n del nitr6geno realizan la funci6n de mantener !lena aI maximo la reserva total de nitr6geno. Los vertebrados reciben pnicticamente todo su nitr6geno a traves de la ingesta de prote!nas y de acidos nlldeicos. En el cuerpo estas macromoleculas se descomponen en sus componentes, amino:1cidos y nucle6tidos. los cuales luego son repolimerizados generando nuevas protemas y acidos nudeicos 0 son utilizados para sintctizar otras moleculas. Aproximadamente la mitad dc los 20 amino~cidos existcntes en las protefnas son amilloocidos esellciales (Figura 2·27) para los venebrados: no pueden ser sintetizados a partir de otros ingred.ientes de la dieta. Los otros aminoacidos sf que pueden ser sintetizados, utilizando una enonne diversidad de materiales, inc1uyendo intermediarios del cicio del acido chrico. Los aminoacidos esenciales son producidos en ouos organismos, generalmente a traves de rutas largas y energeticamente costosas que en el transcurso de la evoluci6n de los vertebrados se han ido perdiendo_ Los nucle6tidos necesarios para producir RNA y DNA pueden ser sintetizados utiJizando vias biosintcticas especializadas: no existen "nude6tidos esenciales"' que dcban ser proporcionados por la dieta. Todos los nitr6genos de las bases puricas i pirimidfnicas (y tambien algunos de los carbonos) derivan de los abundantes aminoacidos glutamina, acido aspanico y glitina, mientras que los azucares ribosa y desoxirrihosa derivan de la glucosa. 76

Capftulo 2 : Pequei'ias moleculas, cncrgfa ybiosfntesis

Figura 2·26 Generad6n de un gradJentede U' a tram de una membrana, medJante reacclonell de transportc electronJco. Un electrOn de aha energfa (pOT ejemplo, derivado de la oJddaciOn de un melabolilo) reeorre secuencialmenle los transportadores A, Bye hasla un estado energ~tico inferior. En eSle esquema ellransporlador Best! dispueslo en la membrana de tal mallera que mientras pasa el electrOn toma el H' de unlado de la membrana y 10 libcra aJ otro lado. EJ gradientc resultante de H' corresponde a una ranna de encrgfa aJmacenada. utilizada por atras protefnas de membrana de la miwcondria para ravorecer la ronnaci6n de ATP. como sediscUle en el Capitulo 14.

Los aminoacidos que no son utilizados en procesos de biosfntesis pueden ser oxidados generando energfa metab6lica. Muchos de SllS alomos de carbono y de hidr6geno forman\n COlO H20 mientras que sus atomos de hidr6geno seran transport ados a traves de varias formas y apareceran como urea, que es ex· crelada. Cada aminoacido es procesado de forma diferente y existe una conste· laci6n entera de reacciones enzimaticas para su catabolismo.

LOS AMINOAclOOS ESENClALES TREONINA MEnONINA LlSINA VAUNA

Resumen

LfUCINA

Las cilulas allimales obliemm la ellergfa a partir del alimento, sigrlielUlo Ires fases. En lalase I las prolefllas, los polisaafridos y las grasas SOli trmufomrooos a moM·

culas petlueiias mediallte reacciolles exlTacelulo.res. Ell 10. I~ 2, estlu moleculas Pf!illleiias SOIl tlegrtulo.das tlentro de ias dlulas, prod'4ciendo aatil GoA y ,,"a pe. quena canlidad de ATP y de NADH. /!.stas son las unicas reaccionf!S qlle pllede'l proporeionar ellergfa ,m ausenda de OX.£geIlO. En ia I~ 3, las molkulas de aatil GoA SO'I degrtuitulns ell las mitoco,rdrias, prod.u;;endo CO: Y dlomos de Ilidr6gello que se Imell a molk.das transportoooras, como por ejemplo el NADH. Los eleclro/les de los dlomos de hidr6geno ptUall a traves de mUi compleja cadena de transportations, que c'JIIdllce fillalmente a 10. reducci6n del oxfgeno molecular fomUindo agrUl. ImplIlsado$ por 10. energfa liberada en utos pasos de transferellcia de eleclrollu, los protOlles (II') SOl. traluporrados al exterior de In mitoco,.dria. EI gratliellle electroqufnrioo tie prololles res,dtallle a travis de 10. membrana mitocotldrial i,,'ema se IItiliza pam inrplllsar la $flltesis de la mayor parte del ATP alular.

ISOLfUCINA HlSTIDlNA FEN1LALANlNA TRJPTOFANO

Figura 2·27 Los nueve amlnOliddos

esenclales. Estos aminoacidos no pueden ser sintetizados por las celulas humanas y por 10 tanto deben ser suminislrados en la dieta.

La biosfntesis y la creaci6n de orden I7 En un momenta cualquiera en una celula se produccn miles de reacciones qufmi· cas diferentes. Las reacciones estan asociadas formando cadenas y redes. en las que el producto de una rcacci6n se convierte en el subslrato de la reacci6n siguienIe. La mayoria de las reacciones qu(micas celuJares pueden clasificarse de manera aproximada, seg(ill pertenezcan al catabolismo 0 a la biosinlesis (anabolismo). Va hemos discutido las reacciones catab6licas, por 10 que ahora vamos a estudiar las reacciones de biosfntesis. Estos procesos empiezan en los compuestos intermediarios de la glucolisis y del cicio del <1cido dtrico (yen otros compueslos rclacionados con estos) ygeneran las mayo res y m<1s complejas molecuJas de la celula.

EI cambio de energ(a libre de una reacci6n determina

si esta puede producirse 0

00 18

A pesar de que las cnzimas aceleran las reacciones energeticamente favorables, no pueden forzar que las rcacciones energeticamente desfavorables tcngan lugar. En una analogfa con el agua, las enzimas por sf solas no pueden hacer que cl agua fluya cuesta arriba. Sin embargo las celulas han de hacerlo para poder ere· eer y dividirse; han de formar moleculas altamente ordenadas y ricas en energfa a partir de moleculas pequeflas y senciUas. Hemos visto que, de una manera general, esto sc rcaliza mediante enzimas que acoplan reacciones energcticamente favorables que consumen energfa (derivada fundamental mente del sol) y que producen calor. a reacciones energeticamenre desfavorables que producen orden. Vamos a examinar en detalle c6mo se realiza este acoplamiento. En primer lugar debcmos considerar mas cuidadosamente el termino "energClicamente favorable que hemos estado utilizando con bastante Iigereza sin definirlo. Como se explica aI principio, para que una reacci6n qufmica tenga lu· gar esponttineamente unicamente ha de producir un incremento nero de desor· den en el universo. EI desorden se incrementa cuando la energia util <enegfa que puede ser derivada para producir trabajo) se disipa en forma de calor: el criterio de incremenlo de desorden puede expresarse de forma cuantilativa con la energia IIbre, G. ~ta se define de manera que los cambios de su valor, indicados por M

,

La

blosfntesls y la creacl6n de orden

77

,

h

• .dC, miden la cantidad de desorden creado en el universo cuando tienen lugar

una reacci6n. Las reacciones energt1ricamenre favorables son, por definici6n, aqllellas que Iiberan una gran cantidad de energfa Iibre, 0 en otras palabras, las que tienen un valor negarillO de aG elevado y por tamo crean mucho desorden. Un ejemplo familiar a escala macrosc6pica puede ser la "reacci6n~ por la que un muelle comprimido se relaja hasta su estado expandido, liberando al medio en forma de calor la energfa elastica que almacenaba. Las reacciones energeticamente favorables. con un .dG < O. presentan una elevada lendencia a ocurrir esponuineamenle, aUllque su velocidad dependern de otros faclores, tales como la existencia de ellzimas espedficas (vease mas adelanle). En cambio. las reaa;iQlles energericamente desfavorabJes. con un valor positivo de aG, como aquellas en las que dos aminoacidos se unen entre sf fonnando un enlace peptfdico, generan orden en el universo y por 10 tanto no se pueden producir espontaneamente. Reacciones energeticamente desfavorables como estas 5610 se producirnn si estan acopladas a una segunda reacci6n que tenga un valor de aG suficientemente negativo como para que el6G del proceso completo tambien resulte negativo. EI curso de la mayorfa de las reacciones puede predecirse cuantitativamenteo Se han recogido una gran cantidad de datos tennodimimicos que hacen posible calcular los cambios de energfa libre para la mayorfa de las reacciones mas importanles de la eelula. Emonces, el cambio global de energfa Iibre para una via es la simple suma de los cambios de energia Iibre de cada una de las reacciones que la componen. Consideremos por ejemplo dos reacciones: X--+YyC--+O con valores de aG de + 1 Y-13 kcal/mol respectivameme. (Hay que reeordar que un mol son 6 x 102' moleculas de la substancia_) Si estas dos reacciones pueden ser acopladas. el aG de la reacci6n acoplada sera de -12 keal/mol. Asf. la reacci6n desfavorable X --+ Y, que no ocurrira espomaneanlente, puede ser impulsa· da por la reaeci6n favorable C --+ 0, siempre que exista un meeanismo mediame el cuallas dos reacciones plledan ser acopladas.

A menudo las reacdones de biosfnlesis estan acopladas directamente a la hidr6lisis del ATP Consideremos una reacci6n dpica de biosfntesis en la que dos mon6meros, A y B, han de unirse a traves de una reacd6n de deshidralacl6n (denorninada lam· bien de cOlldensaci6n) en la que se libera agua:

A-H + B-OH -+ A-B + Hp

De forma casi invariable, la reacci6n inversa (denominada hJdr611slsJ, en la que el agua Tompe el compuesto farmada por el enlace covalente A·B, sera la reae· ci6n energeticamente favorable. Por ejemplo, este es el caso de la hidr6lisis a sus suhunidades de las protefnas, los
OH, implica una secuencia de reacciones a uaWs de las cuales la s£ntesis cnergclicamenle desfavorable del compuesto deseado se aeapla a una reacci6n energclicamente mas favorable (vease Figura 2-17). Como se explica en la Figura 2-28 la hidr6lisis del ATP tiene un aG muy negativo y es la fueme habitual de energia Iibre que se uliliza para impulsar las reacciones biosinteticas de la ceJula. En la via aeoplada desde A-H y 8-01i hasta A-B,la energia de hidr6lisis del ATP transfonna primero B-OH en un compueslo iOlennedio de mayor energia, que luego reacciona directa.mente eon A-H dando A-B. EI mecanismo mas simple eonsiste en la transferentia de un fosfato desde el ATP hasta B-OH fonnando B-OPOJ (0 sea, 8-0-®), en cuyo caso la via de reacciones unicamenle estara fonnada por dos pasos:

I. 8-0H +ATP --+ B-O-®+ ADP 2. A-H + B-O-®--+ A-B + PI 78

Capftulo 2 : Pequeftas moll~culas, energfa y biosintesis t

adeoolina trifolfato

,,{-o-[-o-f H,O

r

-o-P-QH

--1

'"

fosfato

Figura 2-28 Hidrolisls del ATP. La hidr6lisis del fosfato terminal del ATP libera, depcndiendo de las condiciones intracelulares. enne II y 13 kcal/mol de energfa utilizable. Esta reacci6n tiene un o.G muy negativo debido a varios faclOres. La Iiberaci6n del grupo fosfato terminal elimina una repulsi6n desfavorable entre cargas negativas adyacentes. Ademas. el ion fosfato inorganico {PJ Iiberado esta estabilizado por resonancia y por la fonnadon favorable de un enlace de hidrogeno con el agua.

adenosit\8 dlfolfato

Puesto que el intennediario B-O-® se fonna s610 lransiloriamente. las rcacciones g10bales que se producen son: A-H + B-OH --+ A-B Y ATP -+ ADP + PI

La primera reacci6n. de por sf energeticamente desfavorable. es impulsada a producirse acopl<1ndola directamenle a la segunda reacci6n energclicamenlc favorable (la hidr6lisis dcl ATP). Un ejemplo de reacci6n biosintelica acoplada de este lipo es la sfntesis del amino<1cido g1utamina. mostrada en la Figura 2-29. EI AG de la hidr61isis del ATP a ADP y fosfato inorganico (PI) depende de las concentraciones de los tres reactantes. y en las condiciones habituales de una celula es enlre -II y-13 kcallmol. En principio, esta reacci6n de hidr6lisis puede utilizarse para impulsar una reacci6n desfavorable con un AG de, qllizas. +10 kcal/mol, siempre que exisla una vfa de reacciones adecuada. Para alglmas reacciones de bios(ntesis, sin embargo, ~13 kcal/mol pllede ser insuficiente. En estos casos, la reacci6n de hidr6lisis del ATP puede ser alterada de manera que inicialmente produzca AMP y pirofosfato (PP j ). EI pirofosfato sen!. hidrolizado en segundo paso (Figura 2-30). En su conjunto el proceso produce un cambio de energfa libre total disponible de aproximadamente -26 kcal/mol. tC6mo se acopla la energfa de hidr6lisis del pirofosfam a una reacci6n biosintetica? Se pucdc iluslrar una de las vfas considerando de nuevo la sfntesis del compuesto A-B a panir de A-H y B-OH. Mediante una eozima apropiada. B-OH puede ser converlido a l1aves de su reacci6n con el ATP en un intcrmediario de alta energfa B-O-®-®. La reacci60 completa consla ahora de Ires pasos: I. B-OI-1 + ATP -+ B-O-®-® + AMP

2.A-H + B-O-®-®-+A-B + PPI

3. PPI + H20 -+ 21'1 Ylas reacciones g10bales son A-H+B-OH-+A-B y ATP+H 20-+AMP+2PI Dado que una eouma acelera por iguallas direcciones hacia adelante y hacia amb de la reacci6n que calaliza. el compuesto A-B puede ser deslruido por recombinaci6n can pirofosfato (el inverso del paso 2). Pem la reacci6n energeticamente favorable de la hidr6lisis del pirofosfato (paso 3) eslabiliza el compuesto La biosmtesis y ia creacl6n de orden

'cido glullimico

glutlmina

Figura Z~Z9 Ejemplo de reaccl6n bioslnU!tJca de deshldratacl6n Impulsada por la hldr6l1sis del ATP. En primer lugar, el acido g1utAmico es transfonnado en un intermediario fosforiiado de alIa energfa (que corresponde ai compueslO B-O-® descrilo en el texto), el cual reacciona con el amonio fonnando glutamina. En esle ejemplo, ambos pasos lienen lugaren ia superficie de ia misma enzima, la glwamina sinroso. Ob~rvese que, para mayor c1aridad, esIas moioculas se mueslran en sus formas no cargadas.

79

o

",I

o~

C/

,)-0

H

CH,

I

C-O

I

, "o C

+

@

cr

piruva10

0, /0 C

I

CH,

co,

I I

Figura 2-32 Transferencla de un grupo carboxlJo mediante la coenzlma blotlna. La biolina (mostmda en verde) actlla como molKula tmnsponadom del gropo carbonlo (en raja), En la secuenda de reacciones mostradas aquf, la biotina eslcl unida covalenlemenle a la enuma piruvalo carboxilasa. Un grupo carboxilo activado, derivado de un ion bicarbonalo (UCOi) se acopla a la biolina a Imves de una reacci6n que requiere un apone de energfa procedente de la hidr6lisis de una mol~ula de ATP. A continuacion eSle grupo carboxito se transfiere al gropO mClilo del piruvaw fonnando oxalaCClalO.

C=O

o

C

o

" "-

0-

O>U,lacelllto pirUVlllo

~rboxilllSll

rimas actuaJes, como el ATP, el aeetil CoA y el NADH. De acuerdo con este punta de vista, estas moleculas debieron evolucionar con un nucledtido unido cava-

lentemente debido a 1a utilidad que suponia este nucle6tido para la uni6n de la 7-DEHiDROCOlESTEROl

coenzima en un mundo de RNA.

La biosfntesis necesita poder reductor Hemos visto como en las c~lulas se producen continuamente reacciones de oxidaci6n y de reducci6n. La energfa qu{mica de las mohkll..Ias alimenticias se Libera mediante reacciones de oxidaci6n, mientras que para producir moleculas biol6gicas la cetula necesita -entre otras casas- lIevar a cabo una serie de reae· cioncs de reducci6n que requieren un aporte de energfa qufmica. Aplicando el principio de las reacdones acopladas que hemos descrito en p:1ginas anteriores, las c~lulas canalizan directamente la energfa qufmica derivada del catabolismo hada la sfntesis del NADH (por ejemplo, vease Figura 2-22), EI enlace de alta energfa que se forma entre cl hidr6gcno y el anillo de nicotinamida, dando lugar al NADH proportiona energfa para reacdones enzimalicas dcsfavorables, trans· firiendo el hjdr6geno (como ion hidruro) a otra mol~ula. Por ello se dice que el NADH, y tambien el NADPH (estrechamente relacionado con el y en el que se puede convenir can faciLidad) son transponadores de "poder reductor". Ambos se utilizan como coenzimas en numerosos tipos de reacciones de reducci6n. Para saber c6mo ocune la transferencia de hidr6geno en la practica. consi· deremos un solo paso de biosfntesis: la Ultima reacci6n de la via de sfntesis de la mol~ula lipfdica co/esterol. En esta reacei6n. dos atomos de hidr6geno se anaden al anillo csteroide polidclico. reduciendo un doble enJace carbono-carbono. Como en la mayona de reacciones de biosfmesis. los constituyentes de los dos ~1tomos de bidr6geno que son nccesarios en esta reacci6n son suministrados en forma de ion hidruro del NADPH mas un prot6n (HO) de la soluci6n (H- + Ho = 2H) (Figura 2·33). Como en el NADH, el ion hidruro del NADPH que debe ser transferido forma parte de un anillo de nicotinamida y se separa facilmeme debido a que el anillo puede adoptar un estado aromMico mlts estable si pierde el ion hidruro (vease Figura 2-24). Por consiguiente, tanto el NADH como el NADPH mantienen este ion hidruro a traves de un enlace de alta energfa y, a

82

Capflulo 2 : Pequefias mollkulas. energfa y biosfntesis

m::mD. H'

COlESTEROl

Figura 2-33 Fase final de una de la5 rulllS de biosintesis que conducen a la formaci6n del colesterol. La reduccion del enlace C=C se consigue medianle la transferencia de un Ion hidruro procedente de la mol~ula lransportadora NADPH, mas un prolon (U') de la soluci6n,

Figura 2·34 La eSI.n1ctura del NADPH. Se diferencia de la del NADH (vl'!asc Figura 2-24) I1nicamcnte por la presencia de un grupo fosfato adicionaJ. eI cual permite que el NADPH sea reconocido selcctivamente por enzimas implicadas en la biosfnlesis.

.nillode nlcotln.mld.

partir de el, puedeo transferirlo a olra molecuJa siempre que exista la enzima adecuada para catalizar la transferencia. La diferencia eOlle el NADH y el NADPH es trivial desde el punto de vista quimico: el NADPH tiene un grupo fosfato mas. en una zona de la molecula ale· jada de la regi6n activa (Figura 2-34). Este grupo fosfato extra carece de importancia para la reacci6n de transferencia del ion hidnuo. pero sirve de asa para unir el NADPH como coenzima. Por regia general, el NADH se une a enzimas que catalizan reacciones catab6licas. mienuas que el NADPH acnla con enzimas que catalizan reacciones de biosfntesis. AI tener las dos coenzimas que actuan en procesos diferentes. la celula puede mantener la relaci6n NADPH:NADJ» alta para aponar el poder reductor necesario para los procesos de biosfntesis mientras que. simuJtl1neamente. puede mantener la relaci6n ADH:NAO' baja para tener NAD' disponible para aceptar electrones durante el catabolismo.

o

cb

AClOOS NUCLEICOS

glUCOM

. . o

glue6geno

0-·-----·

o

tl tl o

Inergfa de I. hidroli,i, del nliCleoeido IrifOllfalO

I

o-p-o-

o

H

~ H 0

H

gluc6geno

RNA

CH,oH

~O\j -.J'F-(L

o=p-oI o

7 ,0

~,O

--~--C-C-N-C-C

I

R

N-C-C

I

H

11

HtO

1I

H,o J

,

energl. de I. hidroli,;, del nliClaO,ldo trllo.f.to

emlnokldO

I'?

0

01-1

PRorelNAS protein.

I

0-----

H"

R I

I

o OH I D=P-oI o I

O-p-oI o nliCle6lido

OH

I

I

,oH

tl tl o

OH

CH,

I

CH,

" OH

OH

OH

RNA

energf. de I. hidrOll,i, del nliCleo.ido trlfO$f.lo

OH

OH

Figura 2-35 Sfntesls de macromolkuJu. Esbozo de las reacciones de polimerizaci6n mediante las cuales se sinlctizan Ires dases de polimeros biol6gicos, mostrando que en I I I I 1 , 0 cada caso 1a sfntesis Implica la perdida de agua (deshidrataci6nl. En la figura no se --·--C-C-N-C-C-N-C-C I I HI I RI 'OH mueslra el consumo de nude6sidos trifosfato ahamente energeticos, necesaria para R H H activar cada mon6mero antes de su adici6n. Por el conuario, la reaccion inversa -Ia proIeln. degradacl6n de los tres tipos de polfmeros- se produce mediante la simple adici6n de agua (hidr6Iisis). H

0

R

0

H

La blos{ntesls y la creacl6n de orden

83

POllMERIZACION POR LA CABEZA (p.

e;" PflOTEfNAS. AC1DOS GRASOS)

_ _"'0+."'0

/'

-1 _...."-'0 .\v (';\

\.!.I

cede mon6melo Ilenspone un enlece rico en energ;e que ser6 utilizedo pere I, edici6n de, mooomelo siguiente

+

POLIMERIZAC'ON POR LA COLA

0~+0').-J1

Las principales macromollkulas sintetizadas por las relulas son los polinucle6lidos (DNA y RNA), los polisadridos y las proteinas. Son extraordinariarnente diversos en cuanto a eslructura, e induyen las mollkulas mas complejas conocidas. A pesar de eUo. se simetizan a partir de un numero relativamente reducido de pequenas mol&:ulas (denominadas momjmeros a sublmid"desl. a travt!s de una reslringida gama de reacciones qufmicas, En la Figura 2-35 se muesua un esbozo sobresimplificado del mecanismo de adici6n de mon6meros a las protefnas, a los polinude6tidos y a los polisae
Resumen Normnlmenle In lddr61isis tift AlP se QlX)pIa a n!(I(riones mergetuxmrellte tle:sfauombles, CQnl{) In biosllitesis de ""u:romolllCulas, mMimlte In tmnsferellcin de gnlpos fosfato fonluuuIo illrennedinrios fosforllados rmctivos. Como aJwra Ja maa:i6t1 ",rergitica~ menle dafavorable se lUlIII,ft1o orergericaJ,rentefavorable, se dJa ~ eI A17' lmpldsn Ja rma:i6u. Lm moIkulns pollmhwl.S conw las protef,aas, los tfddos uucldcos y 101 poIisa· afrldo.s. se ",rsambJall a partir de pequeiia.s nwlkulns precursoms actlmdtu medJonle n!I':ItI:ioues repetidn.s de deshidrotiJd6u lmpulsadas de esta fonnn. Orms molkulns rMb

capftulo 2: Pequcnas mollkulas, energfa ybiosfntesis

(;\

-1

I

cede mooomero !rllnspone un enlllCe rico en energle

0"'~P~'~

Los polfmeros biol6gicos se sintetizan mediante la repetici6n de reacciones elementales de deshidrataci6n

84

(p. ej., DNA, RNA, POUSAcARIDOS)

Figura 2-36 lntennedlarlos actlvados en reacclones de polimerizacl6n. Se compara el crecimiento de poiimeros por la cabeza y por la cola.

Figura 2-37 {pdgina opuesta} A1gunas de las reacclones qufmicas que se producen en la ceiula. tA} El esquema mucslra unas 500 reacciones metab61icas comunes, represemando cada especie qillmica con un cfrculo. En rojo se presentan las reacciones cenlrales de la glucolisis y del cicio del ~cido cftrico. Una ce1ula de mamffero Ifpica sinteliza masde 10 000 prolemas diferemes. la mayor pane de las cuales son enzimas. En el segmenlo escogido de fonna arbirraria en esle laberinlo metab6lico (sombreado en amarillo). se sinletiza coleslerol a panir del acetil CoA. Aia derecha y por deba;o dellaberinto, este segmenlO escogido se muestra con mayor detalle (8).

Iret

molkul., de aeelil CoA

2C0A5H-1 ~H2COO;o CH J-Cj=-CH 2C, OH SCoA 1'lldroximeti1glutlrtl CoA

-----J..r-- 22 NADPH NADP~

2 CoASH -

~H2COO­

CH)-C-CH 2-CH 10H

OH

l-opemenil pirofolfeto

ISOMERIZA~~

CH,

CH1-C-CHCHP-@-® dimeti'-ljl pltofotl.to

CfH1 ~Hl CHl -C=CHCH 2CH 2-C=CHCHP-@-® g6ta"ir p;tofosfeto

~

IAI

i.openI8nir

pirofosfeto

PP,

~Hl ~Hl ~Hl CHrC=CHCH2CH2-C=CHCH2CH2-C=CHCHp-(f)-® fflmesil pitof06f.to

J.--

2 Pf',

NAOf'H

-t--- NADP+

DOS MOlECUlAS CON[lENSADAS

I HOI~""-/

(

I

HO'~""-/

NADP'NADPH +W

0;0101l8roI

7·dehldrocolesterO!

lanosterol

escl.lal."o

'" 85

tiutU, delwmiluwu roenzimas, tmnsflenm otms grupos qllfmicos en el trtlnScurso de In biosfntesis: el NADPH por ejemplo. tmlufli!re llidr6ge1lO en fon"a Iii? "n prot6n y dos el«:trtnln (lOll hidroroJ. mientms que el acetil GoA tmnsJkre KrulJ'OS acet/lo.

Coordinaci6n entre catabolismo y bioslntesis1 9 EI melabolismo eslti organizado y regulado La Figura 2-37 nos da una idea de 10 complicada que resulta una celula cuando se considera como una m~quina qufmica; la figura es un esquema que tan s610 muesua algunas de las etapas enz.im~ticas de una celula. Todas estas reacciones tienen lugar en una celuJa que tiene menos de 0.1 mm de di~melro. y cada una de elJas requiere la participaci6n de una enl.ima, la cuaJ, a su vel.. es el producto de una serie de reacciones de uansferencia de informaci6n y de sfnlesis proteica. Para una molecula pequei'ia tfpica -por ejemplo, el aminm1cido ser;lla- podemos encontrar mas de media docena de enl.imas que pueden modificarlo de diferentes maneras: uniendolo al AMP (adenilarlol preparandolo para la sfntesis de prolefnas, degradarlo a glidna, transformarlo en piruvalo preparandolo para su oxldacl6n, acetilarlo mediante aeeti! CoA 0 transferirlo a un acido graso produdendo fosfatidilserina. Todas eSlas diferentes vfas compilen por la misma molecula de serina. AI mismo tiempo se esta produdendo una lucha similar a eSla. para miles de pequei'ias moleculas. Se podrfa pensar que lodo el sistema debe eslar equUibrado tan finamente que cualquier trastomo menor. tal como un cambio temporal de la diela, pod ria lener resuhadlJs desaslrosos. De hecho. la celula es asombrosamenle estable. Siempre que es penurbada, reacciona hasta recuperar su estado inicial. Puede adaptarse y continuar su funci6n de una manera coherente durante periodos de ayuno 0 de enfennedad. MUlaciones de muchos tipos puedcn eliminar una reacci6n de una delenninada vfa, y a pesar de ella -siempre que se cumplan denos requisitos minimos-Ia celula sobrevive. Esto es asf porque en las celulas existe una elaborada red de mecanismos de control que regulan y coordinan la velocidad de sus reaeeiones. Algunos de los niveles superiores de control se estudiaran en capfluJos posteriores. Aquf nos limitaremos a deseribir los mecanismos mas simples que regulan el flujo de pequei'ias moleculas a traves de las diferenles vfas metab6licas.

Las ¥fas melab6licas eSlan reguladas a traves de cambios de la actividad enzimatica20 Las concenlraciones de las diversas moleculas pequef~as de LIlla celula estan amoniguadas freme a cambios importantes, mediante un proceso conoddo como rcgulacl6n por retroallmentacl6n (feedback) que adapta el flujo de metabolitos a traves de una via detenninada mediante un aumento 0 una disminuci6n temporal de la actividad de enzimas cruciales. Por ejemplo. la enzima inicial de una serie de reacciones suele estar inhibida por retroaJimeutaci611 IIegativa del producto fmal de eSla via: si se acumulan grandes cantidades del producto finaJ. automaticamenle queda inhibida la entrada de mas precursores a la vfa (Figura 2·38). Cuando las vfas se ramifican 0 se cruzan, cosa que sucede a menudo, generalmenle existen varios punloS de control mediante diferentes produclos fmales. La complejidad de estos procesos de control por retroalimenlaci6n queda ilustrada en la Figura 2·39, que muestra el esquema de regu1aci6n enzimatica observado en un grupo de vias metab6licas de aminoacidos relacionados. La regulaci6n por retroalimentaci6n puede actuar casi inslanlaneamente y es reversible; ademas. un produclo final dado puede activar enl.imas conductoras de otras vfas e inhibir enl.imas que producen su propia sfntesis. Se conoce bien la base molecular de este tipo de comrol pero debido a que su estudio requiere unos conocimientos determinados sobre la estruclura de las proternas, no entraremos en el hasta el Capftulo 5. 86

Capitulo 2: Pequenas mol&:ulas. energfa y bloslntesls

Las reacciones catab6licas pueden revertirse mediante un aporte de energfa21 Regulando unas cuantas enzimas de pumos clave de la red melab6lica pueden consegujrse cambios a gran escala que afecten el metabolismo de toda la relula. Por ejemplo, un patr6n especial de regulaci6n por retroalimenlaci6n pcrmite que una relula pase de la degradaci6n de glucosa a la biosmtesis de glucosa (denomjnada gluconeogenesis). La necesidad de la g1uconeog~nesis es especialmente aguda en los pcrfodos de ejercicio violemo, cuando la gJucosa necesaria para la comracci6n muscular debe ser generada por las celulas hep<1.ticas, y tambien en perfodos de ayuno, en los que, para sobrevivir, la glucosa debe ser sintetizada a partir del gJicerol de las grasas y de los arnino<1.cidos. La degradaci6n normal de la gJucosa hasta piruvato, por la gJucolisis, est<1. eatalizada por Varlas enzimas que acnian en serie. La mayorfa de las reaeciones catalizadas por estas enzimas son f<1.cilmente reversibles, pero tres de estas reae· ciones (los mlmeros 1,3 Y9 en la secuencia de la Figura 2·21) son c1arameme irreversibles. De hecho, el importame cambio de energfa Iibre que se produce en estas reacciones es 10 que normalmeme impulsa la secuencia de reacciones en la direcci6n de la degradaci6n de la g1ucosa. Para que las reacciones se produzcan en direcci6n opuesta y se pueda formar g1ucosa a partir de piruvato, es necesario superar cada una de eSlas tres reacciones. Ella se consigue medianle tres reacciones a1ternaLivas, catalizadas enzimMicamente, que son impulsadas "cuesta arriba~ gracias a un aporte de energfa qufmica (Figura 2-40). Asr, cuando una moJecula de glucosa se degrada ados molecuJas de piruvato, se generan dos

"p"rt310

inhibici6n pol rllll(Hlimenl&ci6n

YJ Z

FIgura 2·38 lnhlblcl6n por retroalimenlaci6n de una via de biosrntesis. cada letra represenla una pequel\a molecula diferente, y cada flecha negra simboliza una reaccion catalizada por una enzima direrenle. El prodUCIO final Z inhibe la primera enl.ima que es la unica que 10 sinleliza. de ronna que Z conlrola su propio nivel en la celula.. se trata de un ejemplo de retroalimemaciOn negatilJa (feedback negativo).

Figura 2-39 Inhlblclon por retroalimentad6n en la slntesls de los amlnod.c1dos IIslna, metJonlna, treonlna e lsoleuclna, en las baclertas. En este diagrama cada reaction catalizada por una enzima esta representada por unaf/echo llegra. mientras que las llechas rojas indican las posiciones en las que los productos "retroalimentan" inhibiendo las enzimas. Observese que tres enzimas diferentes (denominadas isoenzimas) calalizan la rcacci6n inicial, y que cada una de elias esta inhibida por un producto distinto.

•

Coordinacl6n entre calabolismo y blosfntesis

87

Figura 2·40 Comparacl6n entre las reacclones que producen g1ucosa durante la g1uconeog~nesls y las reacclones que degradan la g1ucosa durante la g1ucollsls. Las reacciones de dcgradaci6n {g1ucolfticasl son cnergthicamenle ravorables (el cambio de energfa Iibre es inferior a cero), mienlras que las reacciones de sinlesis requieren un aporle de energfa. Para sinletizar glucosa se necesitan direrentes -enzimas de derivaci6n~ necesarias para -sahar" las reacciones 1,3 Y9 de la g1ucolisis. El fluio total de compuestos entre la g1ucosa y el piruvato est~ detenninado poT mecanismos de control por retroalimentaci6n que aettian controlando el metabolismo de las moleculas que participan en estos Ires pasos.

P,

H,o glueou 6-fosfato

, fruetosa 6--fosfato

P, 3

H,o fructon l,&.bi.fosfBto

• p,--.j

P,

,

HAD' ,

l,3-bisfoslogllceralo

,

x2

_.

, 3-lolfoglicer'lO

"

7 2-!osloglieerllto

, lostoonol iWYlllo

" "

loopl

CO, AD 9

olUllaoe"to

" ADP

CO,

" moh~culas

de ATP pero la reacci6n inversa de la gluconeogenesis requiere cuatro ATP y dos mohkulas de GTP, 10 Cllal, en lotal, es equivalenlc a la hidr6lisis de seis moleculas de ATP por carla moltkula de glucosa sintctizada. las reacciones de desvfo de la Figura 2-40 deben estar conrroladas. de rna· oera que se degrade glucosa rapidamcme cuando se necesile energia y se'sintc· lice g1ucosa cuando 1a celula este repleta de energia. Si ~as reacciones pudieran producirse en ambos sentidos sin restricciones, enviarian grandes cantidades de moh~culas de

88

Caprlulo 2 : Pequeiias mol&ulas, energfa y biosfntesis

metabolitos hacia adelame y hacia amb, siguiendo unos ciclos fl1tiles que con· sumirian grandes cantidades de ATP sin ningl1n objetivo concrelO. La elegancia de estos mecanismos de control puede i1ustrarse con un ejem· plo clave. EI paso 3 de la g1ucolisis es una de las reacciones que debe ser superada durante la fonnaci6n de g1ucosa (v~ase Figura 2-40). Normalmente el paso implica la adici6n a la fructosa 6-fosfalO de un grupo fosfato procedente del ATP, y esta cataLizado por la enzima fosfofructoquinasa. Esta enzima es aClivada por AMP, ADP Y fosfato inorganico e inhibida por ATP, cilrato y
Las enzimas pueden activarse e inhibirse mediante modificaciones covalentesU Los sistemas de control por relroalimentaci6n que acabamos de describir 'permiten que las velocidades de las secuencias de reacciones esten reguladas de manera continua y aUlomatica, segundo a segundo, en respuesta a flllCt1l3ciones del metabolismo. Las celulas disponen de varios disposilivos para regular las enzimas cuando los cambios de su aclividad han de ser mas prolongados, del orden de minUlos u horas. ESlos sistemas impUcan In modificaci6n covalenIe reversible de las enzimas. Casi siempre estas modificaciones se consiguen medjanle la adici6n de un grupo fosfato a un residuo dctcrminado de serina, de lreonjna 0 de tirosina de la enzima. EI fosfato procede del ATP y su transferencia esla calalizada por una familia de enzimas conocidas como prote{na qllinasas. En el Capftulo 5 describiremos como la fosforilaci6n puede alterar la fonna de una enzima, aumenlando 0 inhibiendo su actividad_ La eliminaci6n posterior del grupo fosfato, que reviene el efeclo de la fosforilaci6n, se consigue mediante una segunda enzima denominada protefllfl fosfatasa. La modificaci6n covalenle de las enzimas afiade otra dimensi6n aI control metab6lico, ya que pennile que las vfas de reacci6n especfficas sean reguladas por seflales (como las homlOnas y factores de crecimiento) que no estan relacionadas con los propios intermediarios metab6licos.

Las reacciones estan compartimentadas, tanto dentTO de las c~lulas como dentro de los organismos23 No lodas las reacciones metab61icas de una celula se producen dentro del mis· rno compartimienlo citoplasmatico. Pueslo que diferentes enzimas se hallan en diferentes compartimientos de la celula, el Oujo de los componentes quimicos esta canalizado, tanto fisica como qufmicamente.

8 Irlmeros de

lipoamida reductase· transllCatllasa

+ 12 mol6culas de dihidrolipoil deshldrogenasa

Coordinacion entre calabolismo y biosfntesis

• 24 molkulas de piruvato desurbo"ilase

Figura 2-41 Estructura de la

piruvato-deshJdrogenasa. Esle complejo enzimfitico cataUza 1[1 conveni6n de pirnvato en acetiJ eoA. Se trata de un ejemplo de un gran complejo multienzilmitico en el que los intermediarios de la reacci6n pasan direclamente de unas enzimas a Otras.

89

La forma m~s simple de esla segregaci6n espacial se produce cuando dos enzimas que calalizan reacciones secuenciales forman un complejo enzimalico, y el produclo de la primera enzima no ha de difundir a traves del citosol para encontrar la segunda enzima. En cuanto ha terminado la primera reacci6n empieza la segunda. Algunos grandes agregados enzim~ticos realizan tada una sene de reacciones sin perder el contacto con el substrato. Por ejemplo, la oansformaci6n del piruvalo en acetil GoA ocurre en tres pasos qufmicos que se producen sobre ellruslllo gran complejo enzimatico (Figura 2-41); en la s[ntesis de los ticidos grasos, una secuencia de reacciones alin mas larga est~ calalizada por un Unico conjunto de enzimas. No resulla sorprendente que algunos de los mayores complejos enzim~licosest~n destinados a la sfntesis de macromolOCulas como las proleinas y el DNA. EI siguiente nivel de segregaci6n espacial en las relulas se refiere aI confinamiemo de enzimas relacionadas funcionalmeme dentro de la misma membrana 0 dentro de los compartimienlos acuosos de un orgAnulo que esl~ rodeado por una membrana. EJ melabolismo oxidativo de la g1ucosa constituye un buen ejemplo de ello. Despues de la gtucolisis. el piruvato se oansporta activamente desde eI cit'osol hasta eI compartimiento interno de la mitocondria, el cual contiene lodas las enzimas y metabolitos que intervienen en el cicio del ~cido citrico (Figura 2-42). Ademo1s la propia membrana mitocondrial intema contiene todas las enzimas que catalizan las reacciones siguientes de la fosfonlaci6n oxidativa, incluidas las enzimas implica· das en la transferencia de electrones desde eI NADH al 02 Ylas implicadas en la s{ntesis del ATP. Porconsiguiente, la milocondria puede ser considerada como una pequefia f.ibrica produetora de ATP. An3.logamente, otros organulos celulares, como el n(ieleo, el complejo de Golgi y los lisosomas, pueden ser considerados como companimiemos especializados donde se encuenoan confinadas enzimas relacionadas funcionalmente y que realizan tareas especfficas. En cierto sentido, la c~lula viva es como una ciudad, con muchos servicios especializados concentrados en diferemes areas, intensamenle inlerconecladas por diversas vias de comunicaci6n. La organizaci6n espacial de los organismos pluricelulares se extiende m~s aM de la c~lula individual. Los diferentes lejidos del cuerpo lienen diferentes gropos de enzimas y realizan conlribuciones dislintas a la qufmica del organismo complelo. Ademas de las diferencias entre los diferemes tipos de c~lulas de un mismo organislllo en cuanlo a productos especializados como las hormonas 0 los anticuerpos, tambi~n ex.isten diferencias considerables en cuanto a las vias melab6li· cas uhabhuales~. Aunque pnlcticamente todas las celulas contienen las enzimas de la glucolisis, del cicio del acido cftnco, de la sfntesis y de la degradaci6n de los Ifpidos y del metabolismo de los aminoacidos, los niveles de eSlos procesos en los diferentes tejidos estan regulados de forma diferente. Las c~lulas nerviosas, que probablemente son las c~lulas m~s ex.igentes del cuerpo, carecen casi toralmente de reservas de gluc6geno y de atidos grasos, dependiendo casi por completo del aporte de glucosa de la sangre. Las c~lulas hep~ticas proporcionan glucosa a las 11bras musculares que se coniracn activamente, y reciclan de nuevo a glucosa eJ acido I~clico producido por estas celulas museulares (Figura 2·43). Toclos los tipos de reJulas tienen sus rasgos metab61icos caracteristicos y cooperan inlensamente, lanto en el eslado nomlal como en la respuesla al ejercicio, al estres y al hambre.

90

Capftulo 2 : Pequeftas mol~ulas, energfa y bios[ntesis

glucoli,l, en .1 cltoeol

Figura 2-42 Segregacldn de los dlversos pasos de la degradacldn de la \ glucosa en la celula eucarlota. La gtucolisis se produce en el citosol, mientras que Jas reacciones del cicio del tlcido cltrico y de la fosforiJaci6n oxidativa ocurren unicamente cnlas mitocondrias.

Figura 2-43 Representacldn esquemlhlca de la cooperacldn metabdllca entre las cBulas hepaticas y las fibras muscula.res. EI principal combustible de las fibras musculares en activa contracci6n es la glucosa, gran parte de la cual estoi suministrada por las celulas hep.aticas. El oicido loictico, prodUClO final de la degradaci6n anaer6bica de la g1ucosa por g1ucolisis en el musculo, se transforma de nuevo en g1ucosa en el hfgado mediante el proceso de gluconeogenesis.

Resumen Los mucl,os miles tk reaeeiones quEmicas distintas realizadas sitlwltdllet1menle por "na celtd" estdn estreclmmente coordhuulas. Diversos mectlnismos de control regrdm, las m:tivltUules de las etlZimas clave, en respuesla " las oo"diciones cambitmles de la celula. Una forn,,, con",n de regulaciOn estriba ell Ia in/'ibicion por retroalimentadon, rdpidallleme reversible, ejercida por el prod'u:to filltd sobre Ia primera ellZima de 111m uEa. Una forma mas prolongada de regulac/on '",plica Ia modijicaci611 q"Emica de IIna emi",a porotra enz.inra, a nrenudo mediantefosforiIacwn. Comb/naciOlles de mecanlsmos reguladores plleden prod"c/r CIImbios importalltes y prolongados ell el metabollsmo de Ia celllla. No todas las reneeiones celulares se prodllcen ik"tro del m;smo oompartimiellto intracellllar, de fornul que la segregad6n espadal, mediante membranas intenuu, permite que 10$ Orglfnulos Sf! espedalicen en Inreas bioqllEmicas.

""'y

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91

Macromoh~culas:

estructura, forma e informacion

3 .-....

AI considerar 1a mrnsici6n desde las pequenas molecuJas de la celula hasta las macromoleculas gigantes, asistimos a mucha mAs que a un simple aumenlo de [amaflo. Aunque las protemas. los acidos nucleicos y los polisacAridos estan construidos a partir de 1m3 colecci6n restringida de aminoacidos. nucle6tidos y aziicares respectivamcmc, pueden presentar propiedades unicas y realmenle sorprendentes, que les confieren unas caracterfsticas muy lejanas a sus precursores qufmicos. Las rnacromolcculas biol6gicas estan compucstas de varios cientos -a veccs de millones- de .homos unidos entre elias fonnando disposicioncs espadales definidas de forma muy precisa. Cada una de eslas macrornoleculas contiene una infonnaci6n fiUy espedfica. Incorporadas a su estruclura, existen series de mensajes biol6gicos que pueden ser lefdos cuanda estas macromolecuJas internccionan con orras mol~­ culas, penniti~ndoles desarroUar una funci6n detenninada. En esle capitulo examinaremos las estructuras de las macromolkulas, dedicando un inleres especial a las protemas y a los
......-

azlH:ares. aminoikidos y nuciaotido, .0,5·' nm

••

prOleina. globulares

~2-'O

nm

Procesos de reconocimiento molecular' Las

macromol~culas

tienen un peso molecular que normalmente oscila entre

10 000 Y I miJI6n, y un lamano intermedio entre las moleculas organicas de la c~lula. tratadas en el Caprlulo 2, y los grandes agregados macromoleculares y organulos, que sen\n objeto de estudio de capltulos posteriores (Figura 3-1). Una pequefla molecu]a, la del ab'lla, constituye e[ 70% de la masa total de [a celula;

casi todo el resto de la masa son macromoleculas (Tabla 3-1). Tal como se ha descril'O en el Capitulo 2, una macromolecula se ensambla a panir de subunidades de peso molecular menor. que se 'afladen una tras otra fonnando un largo polimero a modo de cadena (vcase Figura 2·35). Generalmente, en la construcci6n de cada cadena participa u.nicamente una familia de subunidades: los aminoacidos se unen a otros aminoacidos fonnando las protcfnas, los nucle6tidos se unen a orros nucle6tidos formando los acidos nucleicos; y los azu.carcs se unen a Olros azu.cares formando los polisacaridos. Puesto que la secuencia exacla de las subunidades cs crucial para la funci6n de una molecu-

ribosoma _30 nm

Figura 3-1 Comparacl6n entre el tamafto de las moleculas proteicas y el de otTOS componentes celulares. Los ribosomas son importantes agregados macromoleculares compuestos por unas 60 protefnas y moleculas de RNA.

93

Tabla 3-1 Composlcl6n qufmlc:a aproxlmada de una baclerla tfplca y de una celula de mamffero Ifpica Porcenlaje del peso tolal de la eelula E. ooIi

Componente

H,O lanes inorgtnicos (Na', K', Mgz', Cat., CI-, etc.) Algunos metaboLitos pequenos Prote{nas RNA ONA

FosfoHpidos Olros Ifpidos Polisacaridos

Baaeria

Ciluta de mamifero

70

70

I

I

3

3

15 6 I

18

2

3

2

2

1,1 0,25 2

4xlo-9 cm 3 2000

Volumen celular total: Volumen celular relativo:

Las prOlefnas. los polisacaridos, el DNA y el RNA son macromoleculas. Los Ifpidos generaimenIe no se c1asifican como macromoh!culas, a pesar de que lienen algunas de sus caraclerlsricas; por ejemplo, la mayorfa de ellos se sintClium como polfmeros lineales de una mol~ula menor (el grupo acetil de acetil CoAl y se aUlocnsamblan formando grandes estructur3s {membranasl. N6lese que eI agua y las proreinas comprenden la mayor pane de la masa lanto de las celulas de mamffero como de las bacrerias.

la, su biosfntesis requiere me<:anismos que aseguren que cada subunidad adecuada se coloque en el polfmero en la posici6n exacta de la cadena.

Las interacciones especfficas de una macromol~cu]a dependen de enlaces d~biles no covalentesZ Una cadena macromolecular se mantiene unida por medio de enlaces covafemes, que son suficientemente fuenes como para preservar la secuencia de subunidades durante largos periodos de tiempo. A pesar de que la secllencla de subunidades determina la informaci6n contenida en una macromohkula, la utilizacion de esta infonmtci6n depende en gran medida de otros enlaces mllcho mas debiles, los enlaces 110 coualeTlles. Estos enlaces dcbilcs se fonnan entre diferentes regiones de la misma macromolecula, y tambicn entrc difcrcnles macromoleculas. Por clio, est'Os enlaces detenninan en gran medida tanlO la eSlmClura tridimensional de las cadenas macromoleculares como la manera en que eslas estruCIUras interaccionan entre si. Los enlaces no covalentes que se presentan en las moleculas biol6gicas, suelen c1asificarse en tres tipos: enlaces 16n1OO5. enlaces de hIdr6geno y atracclones de van der Waals. Dlra imponante fuerza debil se genera por la estructura tridimensional del agua, la cual tiende a UniT los gropos hidrof6bicos con el fin de minimizar su efeclo destructor de la red de moleculas de agua unidas por enlaces de hidr6geno (vease Panel 2-1, p~gs. SO-51). Esla expulsion de la soluci6n acuosa genera 10 que algunas veces se considera como un cuano lipo de enlace

Figura 3-Z Energfas comparallvas de algunos aconteclmlentos molecula.res Importantes de la celula. N6tese que

",,~

C-c

,~;::===::==F::::::=

ENERG.;rICO CONTENIOO IkceVmoll 0,1

94

.,.,,

Capftulo 3: Macromoleculas: estructura, fonna e informacl6n

los valores de energia se muestran en una escaJa logar((mica.

•

iOn

e ~.,

Tabla 3-2 Enlaces qu(mlcos covalentes y no covalentes Fuerza (kcaUmol)11 po de enlace

Longitud (nro)

Covalente 16nico Hidr6geno Alrncciones de van der Waals (por oitomo)

0,15 0,25

En ellKKlo

En el agltil

90

90 3 I

80

0,30

4 0,1

0,35

0,1

'La fuerza de un enlace se puede medir 00010 la energia necesaria para romperlo, que aquf se presenta en kalorias por mol (kca!/moll. (Una tilocalorfa es la call1idad de energia necesaria para incremenlar en ,- C la lemperatura de 1000 g de agua. Una unidad allernativa de uso 00mun es el kilojoule. kJ, igual a 0,24 kcal.) La fuerza de cada enlace son los lttomos que eslan impllcados en su formad6n. y del ambiente preciso en el que se halla el enlace; los valores de la labia 501amente son, por 10 tanto. una gufa aproximada. N6tese que cl ambiente 8CU050 de una celula disminuye enormemente la fuerza de los enlaces i6nioos y de hidr6geno entre mol&:ulas diferentes a las de agua (PaneI3-!, pags. 96-97). La longitud de enlace es la diSlancia entre los ccnlros de los atomos diferenlcs al hidr6gcno que participan en el enlace.

d~bil

no covalente. En el Panel 3-1, paginas 96-97, se exponen las caracteristicas principales de estos cuatro tipos de enlaces debiles. En un medio acuoso. los enlaces no covalenles son de 30 a 300 veces mas d~biles que los enlaces covalentes (Tabla 3-2) y s610 (jgeramente mas fuertes que la energfa media de las colisiones termicas a 37°C (Figura 3-2). Por consiguieme, un unico enlace no covalente -a diferencia de 10 que ocurre con un enlace covalente- resulta demasiado debit para resistir los movimientos lermicos que tienden a separar las molk:ulas, por 10 que son necesarios numerosos enlaces no covalentes para manrener unidas dos superficies moleculares. Entre dos superficies 5610 se pueden formar un elevado numero de enlaces no covalentes si exislen un elevado numero de alomos de estas superficies que esten adaptados unos a los Olros (Figura 3-3), 10 cual determina la especificidad de reconocimiento biol6gico, como ocurre entre una enzima y su substrata, Como se explica en la parte superior del Panel 3-1, los atomos se comportan casi como si fueran pesadas esferas de un radio delerminado (su "radio de van der Waals"l. EI requerimienlo de que dos Momos no pueden solaparse limita los angulos de enlace posiblcs de una cadena polipeptfdica (Figura 3-4). Estas y otras inlcracciones estericas reducen substancialmente el numero de disposiciones tridimensionalcs (0 conforll1acionesl que son posiblcs. A pesar de ella, una larga cadena flexible como por ejemplo la de una prote(na, puede plegarse en un numero enorme de diferentcs posibilidades, teniendo cada conformaci6n

II~ - - W))

))

Il

/

•

II ))

.~

Figura 3-3 Enlaces no covalentes. Mancra en que los enlaces d~biles median los procesos de reconocimienlo entre las macromoleculas.

las 'lIperf,(:iM de las mol6cllin A V B VA VC seMla~n m.1 V un~mente .on CIIPKft de form.r unes clIllnlM enl.en cl4!ibiles; el moYimiento Iillrmk;:o las separ. rli~menle

•

"'~

III molkulll A encuentra ,I'z'r

01rlll molkul.. lB. C V01

111I ,uperflCies de las moikullll A V 0 se adaplIIn bien. por 10 que

((

Procesos de reconocimlento molecular

pueden formar un numero sufoc:iente de enlaces d41bil" que permite resiSlir el moy;mlenlO I'rmlco, permanec:iendo unldlll

95

FUERZAS DE VAN DER WAALS Cada tipo de 810mo liene un radio, conocido como radio de van der Waall, en el que las fuer:MS de van der Waals eSlan equilibradas.

A una dist80cia corta, 2 .homos cualesquiera mueSlren una debit inteftlcci6n de enlace debido a sus carges eleetricas fluctuantes. Esta fuerza recibe 91 nombre de 81r8cci6n de van der Waals. Sin embargo dos lhomos se repelen muy energeticamente 5i 58 los ltCefCa damasiado. Esta repulsi6n de van der Waals desempefla

un papel importante limitaodo las posibles conformacionas de una malku!a. 1.2

A

(0.12 om)

:; .. ..-------------'

.

2.0 A.

(0,2 rom)

1.5 A.

1.4A.

{O,15roml

(O,14roml

Dos atomos 58 atraen entre si por fuenas de van der Waals haste que Ie distancis entre ellos iguale Ie suma de sus radios de van der Waals.. A pesar de que estes atracciones de van der Waals son individualmente muy debiles, pueden ser importantes cuando dos superficies macromolecularal Ie adaptan muy bien una a olra.

ENLACES QUIMICOS DEBILES

o

Las moleculas orgllroicas pueden interaccioner con otras mohkulas a Iraves de fuerzes no covalenles de alcaroce reducido.

dill8ncillllnirl 101 "omos-

equilibrio dll varo dllr Waall optlmo aro 111111 puroto

ENLACES DE HIDRC>GENO Un atomo de hidr6geno as com partido por dos atomos lambos electronegativos, como 81 0 V el Nl formlmdose un enlace de hidr6geno.

~",NH 1111111111111 II

lIolace eoVa11l011l _ 0.1 nm de largo

Tlpicamente, los enlaces quimicos debiles tienen una fuerza 20 veces inferior a la de un enlace covalenle. 5610 son suficientemenle fuertes para fljer dOl mol8c:ulas cuando se forma simultaneamenle un numero elevado de ellos.

enlKII dellidrOgeno _ 0,2 rom dlliargo

LOl enlaces de hidr6geno son mas fuertes cuando los tres lhomos se hallan en linea recta:

"/N-HIIIIIIIIIIOl'

"O-H 11111111110",

Ejemplos en macromoleculas: Dos cadenas polipeptldical de aminollcidos unidas por enlaces de hidrOgeno. I I

I

I I

I

ENLACES DE HIDRC>GENO EN EL AGUA Les rnohlculas que pueden formar enlaces de hidr6geno coro otras lambhln pueden, allernativamente. former enlaces de hidr6geno con molecules de agua. Debido a esta compelencia con las moleculas de ague los enlaces de hidr6geno form ados entre dos moleculas disueltas en agua son relalivamenle debilas. llrolace pIIptldieo

C-OI1lIlIlII1 H-N

I

R-(-H

I

R-C-H

I I (=01111111111 H-N I I

I

t+-C-R

I

C-

I

I

I I

Dos bases, G y C, unidas par enlaces de hidrOgeno en el DNA 0 en el RNA. H

H, (-C

r

H-(

N-C

/

I

)N-H.O~

I

~(

I

I

N_H-N

~OnDl!IIH- N"

(

'H

1

-(--C-N

-c

I

I

H

I

cI

INTERACCIONES HIDROFOSICAS EI aQua unal08 grupos hidrof6bicos con objeto de minimizer los efeelos destructores de estos grupos sobre Ie red de enlaces de hidrOgeno del agu8. A menudo se dice que los grupos hidrof6bicos que se manlienen unidas de asIa

manera estiin uoidal por ·puentes hidrof6bicos·. paser de que Ie atracci6n esta generada en raelided por una repulsi6n de las molecules de ague.

8

ENLACES IONICOS EN SOLUCIONES ACUOSAS Los grupos cargedos eShin prOlegidos por sus inlereccian" eon las mohkulas de agUB. Por ella, los enlaces i6nicos

en solucion &Cuosa son bastante debiles.

,0 , ° °I 0 -o-p-o

-c

ENLACES IONICOS

10

Las inlefacciones ionicas 58 producen entre grupos tOlalmante cargados (enlace ionical

0-

o entre grupos parcialmenta cargados.

,.

~))IIII(~L : : - -

H

I

H

I_

H-O- H

/

00

06:0 x::Y

Ademas, los enlaces ionicDs sa debilitan par la presencia de sales, cuyos atomos forman los conlraiones que se distribuyen alrededor de los iones de carga opuesta.

,.

CI

N~·

0

~))IIII((l'C(I

Na~

La medida de Ie intensldad de la desestabilizaci6n de la interaccl6n par sales supone una estima cuantitatlva del numero total de enlaces i6nicos implicados. donde D. constante diehktrica (l para el vado, 80 para el agua)

r. distancia de separaci6n En ausencia de agua, les fuen.as i6nicas son muy intenses. Son responsebles de Ie dureze de minerales tales como el marmol yel IIgala.

crista! de NaCI

De todos modos, los enlaces i6nicos son muy importantes en los sistemas biol6gicos. Una enzime que se una a un substrato cergado positivamente a menudo presentarll en ellugar apropiado un resto de eminoacido cargedo negetivemente.

IAI

IImino'cido

HJ

,

o II

I

/C

"'" 'cIV I'

C'YJ

N

I H

~; ~ lrc "" II 0

enlaces polipeptfdicos

Figura 3·4 Umltaclones esterlcas de los lingulos de enlace en una cadena pollpeptfdlca. (Al Cada aminoacido conlribuye con Ires enlaces (en mja) a su cadena polipeptfdica. EI enlace peptfdico es plano (sombreado en grisJ y no pCITTlite rotaci6n. Por el contrario, se puede producir rotaci6n sobre del enlace C~- C ~a esle Angulo de rotaci6n se Ie denomina psi (\jfl- y sobre el enlace N~ C~-a este lingula de rotaci6n se Ie denomina phi (!.pl. EI grupo R representa W13 cadena lateral de un aminoacido. (B) La conformaci6n de los alamos principales de una cadena proteica viene determinada por un par de angulos psi y phi para carla amino;kido; dehido a las colisiones estericas entre los aminoacidos, la mayorfa de los pares de angulns phi y psi no tienen lugar. En esle gnifico, Hamado de Ramachandran, cada punta representa un par de angulos obsetvados en protefnas. (B, de 1. Richardson, Adv. Prot. Cllem. 34:, 174-175, 1981.)

phi

181

una colecci6n diIerente de interacciones debiJes denlro de la cadena, yes la fuerza total de eslas interacciones 10 que determina que confomlaciones se formanin. La mayona de protefnas de una celula se pliegan de forma estable de una sola manera: durante el curso de la evoluci6n la secuencia de subunidades de aminoacidos ha sido seleccionada de fonna que una delerminada confonnaci6n puede formar muchas mas interacciones favorables en la propia cadena que cualquier otra. Figura 3-5 Cuando varlas subunldades se unen entre sf de una fonna regular. se genera una hellce. En primer termino se presenla la interacci6n entre dos subunidades y delras aparecen las helices que resullan de eSla interacci6n. Las helices que se presentan aquf son de (Al dos, (B) tees a (el y (D) seis unidades par vuella. En la parte superior de la figura se puede obsetvar la disposici6n de las subunidades desde la parte superior de cada helice. N6tese que la Mlice (D) liene un paso de vuelta mas ancho que la ht'!licc (e).

IAI

98

181

ICI

IDI

Capftulo 3: Macromohkulas: estructura, forma e informacl6n

Una helice es un motivo estructural cornun en las estructuras biol6gicas generadas a partir de subunidades repetidas3 A menudo, las estructuras biol6gicas estan formadas por subunidades que son muy similares las unns a las OlIas -<:omo aminoacidos 0 nucle6tidos-. formando una larga cadena repetitiva. Si todas las subunidades son identicas. normalmente ocurre que las adyacentes en la cadena se unen de una unica manera, ajustando sus posiciones relativas de forma que se minim..ice la energfa libre de contacto entre elias. En eSle caso. cada subunidad se colocam exactamente en la misma posici6n en rclaci6n a sus Subwlidades adyacentes, de modo que la subunidad 3 se unim a la subunidad 2 de la misma forma en la que la subunidad 2 se ha unido a la suhunidad I. y asf sucesivamente. Debido a que es muy raro que las subunidades se unan formando una linea recta, generalmente estas uniones originan una hellce -una estructura regular que se parece a Wla escaIera de caraeal. como se ilustra en la Figura 3-5. En funci6n de la direcci6n de giro de la escalera dc caracol. 13 helice se denomina dextr6gira 0 lev6gira (Figura 3-6). Esta caracteristica no varia cuando la helice se coloea cabeza abajo, pero es la inversa cuando se reOeja en un espejo. las helices son elementos habiluales de las estructuras biol6gicas, tanto si las suhunidades son moleculas pequefias que estan unidas entre sf de fonna covalente (como en el DNA), como si son grandes moleculas proteicas unidas entre sf por fuerzas no covalentes (como en los fLIamemos de actina). Esto no es sorprendenlc. Una helice es una estructura que en absoluto es excepcional, generada simplemcnte por la uni6n, una conlIa olIa, de muchas subunidades simjlares, de forma que cada una adopta exaClamente la misma relaci6n espacial con la subunidad anterior.

La difusi6n es el primer paso hacia el reconocimiento molecular"

......

levOgir8

hel;':' dextr6girll

Figura 3-6 Comparad6n entre una hBlce 1ev6glra y alTa denr6glra. Como referenda. es uti! recordar que

los lomillos habiluales. que avanzan cuando se les hace girar en el sentido de las agujas de un reloj, son dextr6giros. N6tese que cualquier helice conserva el mismo sentido de giro (y por 10 tanto su caraclerfslica de seT dcxlr6gira 0 1ev6gira) aunque se la coloque boca abajo.

Para que dos moleculas se unan entre sf deben entrar en estrecho contacto. EsIO

se consigue gracias a los movimientos termicos que hacen que las moleculas se desplacen, 0 (il/llndal/, desde sus posiciones de partida. Puesto que las moleculas de un Jrquido colisionan y se separan f
Los movimientos termicos unen a las moleculas yluego las separan· Los encuentros entre dos macromoleculas 0 entre una macromolecula y una molecula pequena, se producen al azar, por difusi6n simple. Un encuentro puede condllcir inmcdiatamente a la fonnaci6n de un complejo (en cuyo caso se Procesos de reconocimlento molecular

Flgum 3-7 Un recorrido aI azar. Las

molOOtlas de una solud6n se desplazan aI azar debido a continuas colisiones con Olras molecuJas. Este movimiento permile a las pequenas moMculas difundir de una zona a otra de la ce:lula en perfodos de tiempo sorprendenlcmente cartos; pueden dlfundir a traves de looa una cetula tfpica de mamIfero en menos de un segundo. 99

dice que la velocidad de formaci6n es(a Iimitada por /(1 clift/sian). A)(ernalivamente, la velocidad de formaci6n del complejo puede ser mas lema, por necesitar que se produzca un reajuste de la estruc(ura de una a de ambas mohkulas, antes de que las superficies interactivas puedan adaptarse una a la otra, de forma que a menudo las dos moleculas que colisionan se separaran una de la otra, sin lIegar a unirse. En ambos casas, cuando las dos moleculas interactivas se han acercado suficientemente una a la aim, forman entre elias mUltiples enlaces d~· biJes, que persislen hasta que el movimiento termico aJ azar hace que las moleculns se disocien de nuevo (Figura 3-3). Par regia general, cuanta mas fucrtc es la uni6n de las rnoleculas que forman cl complejo, lanto mas baja es su velocidad de disociaci6n. En un casa extrema, la energfa total de los enlaces formados puede ser insignificanle en comparaci6n can la del movimiento lemlico, par 10 que las dos moleculas se disociaran tan ntpidamente como se han unido. En el otro caso extremo, la energfa (otal de los enlaces es tan alta que la disociaci6n se produce muy raramente. Las interacciones fuenes se producen en la reluJa cuando la funci6n biol6gica requiere que las dos macromoleculas permanezcan estrechamente asociadas durante largo tiempo -por ejemplo, en el caso de una prote[na regu1adora que debe permanecer unida al DNA para inhibir la expresi6n de un gen. Las imeracciones dcbiles se producen cuando la funci6n requiere un cambia r.1pido de la estructura del complejo -por ejemplo, cuando las dos protefnas que interaccionan han de cambiar de pareja, durante los movimientos de una maquina proteica.

La constante de equilibrio constituye una medida de la fuerza de interacci6n entre dos moltkulas5 La fuerza exacta del enlace entre dos moleculas es un fndice uti! de la especificidad de su interaci6n. Para ilustrar c6mo se mjde la fuerza de enlace, considcre-

Yelocided de COf\I!el'lte disoeillCiOn - de ditoeiae!6n

I<

100 nm

Figura 3-8 MacromolOCulas en el cltoplasma celular. FJ dibujo esta hecho

aproximadamente a escala, e ilustra eI abarrotamiento que existe en el citoplasma Onicamente se represeman las macromol&ulas: los RNA se han dibujado en azul, los nbosomas en verde y las proleinas en rojo. En el ciroplasma las macromolecuJas difunden de una (onna relativamente lenta debido a que imern.ccionan con muchas ouas macromoltkulas; por el contrario, las moltkulas pequei'ias difunden casi tan r;ipidamente como 10 hacen en cl a~;ua. (Adaptado a panir de D.S. Goodsell, Trends ill Biocllem. Sci. 16:203-206, 1991.l

EJEMPlO: LI COI'aCenlreci6n de

lID' moIecul. de II> que hay un. soI.lI ~ en u"" ~Iul. lrpb de mlImlfero Ide un yolumen .proxim.oo de 2000 pm~ IS .prOl
concentrllCiOn de AB

....IOClded de dl$OCi-elOn _ ... IA81

2

IAI_tO"'M y [81_10"'M yeloeidad de conatente de asoeieci6n - uoeieci6n

I<

eoneentracl6n de A

I<

coneentreci6n de B

Ylloeidad de uociacl6n. 1co..1AI lSI

Supongemol qae te prote'l'le A II ul'le I Ie proteil'le 8 eon ul'le K _ 101M-'. Le relecl6n entre el numero de molilcules de A unida! y el de molilculee de A libr.. ser' [ABlIIAI, y como [A8l_ K[81 • n01 M '1(10'" Ml _ 10

IAI

EN El EQUILIBRia;

yeloeided de '$OC;acioo _ veloeid.d da di$OCiaclOn to..lAl [81 - loA IA8l tA81 to.. lAI181 .....

K

c:onsu1\le

de equihbrio

podemol "perer que dentro de III cillule de cede di.~ mol6eules de A que 58 helleo uoides. 8. UN> elltil litKe. Repiti,ndo los cl>lculos ~re K .. 10'" M-'. obMfVeremos que unite""nle elrede
1'1gun 3-9 Princlplo del equilibrio. El equilibrio entre las moleculas Ay BYel complejo AB se mantiene gracias aI balance entre las dos reacciones opuestas indicadas en (I) y (2). Como se expresa en (3), la relaci6n entre la constante de asociaci6n y la dedisociaci6n es igual a la coflStame de equilibria (10 para la reacci6n. Las mol&:ulas Ay Bhan de chocar para poder reaccionar por 10 que la velocidad de sfntesis del complejo AB C5 proporcional al producto de las concentraciones individuales de los reactantes Ay B. Por eso en 1'1 expresi6n final de Kaparece el producto IAI x IB], donde I ) indica "concentraci6n deMo Como se ha definido tradicionalmente, en la ecuaci6n de un equilibrio qu(mico las concentracioncs de los productos aparecen en el numeradory las de los compueslos que reaccionan, en el denorninador. As!, la constanle de equilibrio en (3) es para la reacc16n de asociacion A + B -+ AB, mientras que la invcrsa de esta fracci6n serla la constallle de equilibrio para la reacci6n de disociacioll AB -+ A+ B. Sin embargo, al rererirse a interacdones de uni6n scncilia, es menos conruSO hablar de constmlte tie afillidad 0 coflstaflte de asociacion (en litros por mol); cuanto mayor es el valor de la conSlante de asociaci6n (K,.l, mayor es la fuerza de uni6n entre Ay B. EI reclproco de K. es la constance de disor;iacion (en moles por iiuo); cuanto menor es el valor de la constanle de disociaci6n (KJ mayor es la fuerza de uni6n entre Ay B.

100

Capitulo 3: MacromolecuJas: eslructura, forma e informaci6n

mas una reacci6n en la que la moltkula A se une a la moh~cula B. Esta reacci6n continuara hasla alcanzar un PUllto de equilibrio, en el cualla velocidad de formaci6n y 1a de disociaci6n son iguales (Figura 3-9). Las concelllraciones de A, de By del complejo AB en eSle punto de equilibria se pueden utilizar para determinar una conSlanle de equilibria (K) para la reacci6n, tal como se explica en la Figura 3-9. Esla conStante recibe a veces el nombre de consliUlle de afinldad, y habilualmente se lltiliza como medida de la fuerza de enlace entre dos moll~cu­ las; cuanto mds fuerte sea el enlace. tanto mds elevado sera el vaJor de la cons· lante de afinidad. La constante de equilibrio de una reacci6n en la que se en]azan dos mollku· las esta directamente relacionada con el cambio de energia libre estandar del enlace (60'). median Ie la ecuaci6n descrita en la Tabla 3-3. En eSla labia lambien se indican los valores de 60' correspondiemes a varios valores de K. En sistemas biol6gicos, las constantes de afinidad para interacciones de enlace senci110 norrnalmeme oscilan entre 1()3 y 10llliuosfmol; esto corresponde a energias de enlace en el intervalo de 4 a 17 kcalfmol, que puede provenir de unos 4 a 17 enlaces de hidr6geno.

Tabla 3-3 La relacl6n entre las dlferenclas de energfa IIbre y las conslantes de equilibria Constanle de lAB]

=K

IAIiBI

(lilros/mol)

(kcallmol)

10' 10' 10' 10'

-7,1 -5,7 -4.3 -2,8 -1,4

10

o

I 10-' lO-z

Los litomos y las moleculas se mueven rlipidamente6 las reacciones quimicas de una celula tienen lugar a velocidades asombrosamente elevadas. Una molecu]a de una enzima tipica, por ejemplo. cataliza unas 1000 reacciones por segundo y aJgunas enzimas como la catalasa pueden conse· guir velocidades de mas de 1()6 reacciones por segundo. Cada reacci6n requiere que una molecula de enzima se encuemre con otra de substrato, por 10 que velo· cidades como eslas 5610 son posibles gracias a que las moleculas se mueven a velocidades suficientemente rapidas. Los movimienlos de las moleculas pueden c1asificarse de forma general en tres calegorfas: (I) el movimiento de una molecula de un lugar a Olro (movimienlo de translaci6n), (2) el rapido movimiento alras y adelante de los :l.tomos unidos de forma covaleme respeclo a OlrO (vibraci6n), y (3) las rOlaciones. Todos estos movimiemos son importanles para unir entre sf las superficies de moleculas que interaccionan. Las velocidades de los movimientos moleculares pueden medirse por diversas tecnicas especlrosc6picas. que indican que una gran prolefna globular esta girando constanlemente, rotando sobre su eje, alrededor de un mil16n de veces por segundo. Las velocidades de enCllentros par difusi6n originados por movirnienlOs de lraslaci6n son proporcionales a la concentraci6n de la molecula que difunde. Si el ATP, por ejemplo, se haUa presente a su concenlraci6n illlracelular habitual de I mM, cada lugar de una molecula proteica sera bombardeado con moleculas de ATP por unas 106 colisiones aJ azar cada segundo. Para una concelllraci6n de ATP 10 veces menor, el numero de colisiones descenderfa a 105 • y asf sucesivamente. De forma eXlremadamente rapida, en cuanto dos moleculas han colisionado y se hallan en una orientaci6n relativa adecuada, puede producirse entre elias una reacci6n qufmica. Teniendo en cuenta 10 rapidamente que se mueven y reaccionan las moleculas, las velocidades de cataJisis enzimalica observadas no parecen Ian eXlraordinarias.

Energfa IIbre deAB menos energfa libre deA+B

equlllbrio

1,4 2,8

10~

4,3

10·

5,7

10~

7, I

Si 5C permite que la reacOOn A + B ~ Uegue al equilibrio. las canlidades relativas de A. B y AS dependentn de las diferen· cias de energfa libre. 6(7. entre ellos. los vaiores de la tabla conesponden a 3~ (3100t..1. Yestm calculados a partir de la ccuaci6n

IABI [AliBI

Ml'=-RTln--

o lAB!

,-A(;"

--=e

[AliBI

1 frT

=e

-1'.(;"106138

'

Aqul. toG" viene dado en kllocalorlas por mol y repre5enta la dilerencia de energla llbre en condiciones estandar (en las que todos los componentes se hallan a concCnlradones de 1,0 molesflitro); T cs la temperatura en grados Kelvin (oK). Princlpios similares a estos se aplican ineluso al easo mas sencillo de una reacei6n A ~ A", segun el eual una molecula pucde inlerconvertirse entre dos estados Ay A' que se diferencian en un derto valor de IJ.G". En el equilibrio. la relacl6n entre eJ mlmero de moleculas de ambos tipos es igual a la relad6n

INI = e-I'.O"IR"f.

IAI

Los procesos de reconocimiento molecular nunca pueden ser perfectos? Todas las moleculas lienen energia -Ia energia cinetica de sus movimienlos de traslaci6n, de vibraci6n y de rotacion y la energfa potencial almacenada en sus distribuciones electronicas. A traves de las ooUsiones moleculares, esta energfa se dislribuye aleatoriamente a (Odos los alomos presentes, de forma que la rnayorfa de alomos tendr.!n niveles de energia cercanos aJ valor media, y tan 5610 una pequena proporci6n de eUos presemaran niveles energelicos muy altos. A pesar de que las oonforrnaciones 0 estados favorables que adople una molecula Procesos de reconoclmiento molecular

As!. a panir deesta labia podcmos ver que.

si la tnmsid6nA -tAO tiene un cambio de energla llbre fa\'Orable de 4,3 kcal/mol. en el equilibria habra mas de 1000 moleculas en el esladoA' que en el csladoA.

101

senin las que supongan menor energfa libre (veanse pags. 78-79). como consecuencia de colisiones extraordinariamente violentas se producen estados de alta energfa. Es posible calcular la probabilidad de que, a una temperatura dada un atomo 0 una molecula este en un estado de una determinada energfa (vease Tabla 3-3). La probabilidad de un estado de alta energfa disminuye respecto a la de uno de baja energfa a medida que la diferencia entre los valores de la energfa Iibre de ambos aumenta. Sin embrago, esta probabilidad unicamente es igl.lal a cera cuando la diferencia de energfa es infinita. Debido a que las colisiones moleculares son fortuit as, de vez en cuando ocurren pequenas "reacciones secundarias". A consecuencia de ello, una celula comete errares continuamente. Se produciran ocasionalmente incluso las reacciones que son energeticamente muy desfavorables. Por ejemplo, dos aromos unidos uno al otro por un enlace covalente, pueden ocasionalmente estar sometidos a una energfa especial de colisi6n, y separarse. Analogamente. la espe· eificidad de una enzima por su substrato no puede ser absoluta ya que el reeonocimiento de una molecula como diferente de otra nunca puede ser perfecto. Unieamente se podrfan evitar por completo los errores si la celula desarrollara mecanismos que tuvieran diferencias de energfa infinitas entre las alternativas. Puesto que esto no es posible, las celulas se yen forzadas a toterar un cierto nivel de error, y han desarrollado una gran variedad de reacciones espeeiales de reparaci6n para corregir los errores mas perjudiciales. Por otro lado, los errores son esenciales para la vida. Si no fuera par las equivocaciones ocasionales en el proceso de mantenimiento de las secuencias de DNA, probablemente la evoluci6n no habrfa tenido lugar.

Resumen La secuencia de subunidLuies de una macromotecula contiene una inJontlacwn que determina el perfil tridimensional de su Silperfkie. Este perfil, a Sil vez, controla el reconocimlento entre una molkula y otra 0 entre distintas zonas de una misma molkuia, mediante enlaces dibiles, no covalentes. Las fuerzas de atraccwn son de cltatro tipos: enlaces 16nicos, atracciones de van der Waals, enlaces de hidrogeno e interacciones entre grupos no polares causadas par su expulsiOn hidroJ6blca del aglut. Dos molkulas se reconocerdn Ilna a otra mediante un proceso en el que primero se encuentran por difusiOn al azar, se unen de Jonna transitorla y luego se dlsocian. Generalmente, la Jilerza de esta interaccwn se expresar ell Jonna de una constante de eqllillbrio. Puesto qlle la linica manera de conseguir que el reconoclmiellto sea InJalible consiste en hacer que la energfa de enlace sea infinitamente grande, las cilllias vivas constantemente cometen errores; los que son intolerables son corregidos mediante procesos especiales de reparacwn.

A.cidos nucleicos· Los genes estan formados por DNA9 Desde que el hombre ha sembrado cosechas 0 ctiado animaJes, resulta obvio que cada semilla 0 cada 6vulo fecundado debe de contener escondido un plan 0 diseno para el desarrollo del organismo. En la epoca modema, la ciencia de la genetica se desarroll6 alrededor de la premisa de que existfan onos elementos invisibles portadores de informaci6n, denominados genes, que son distribuidos a cada una de las celulas hijas cuando la celula madre se divide. Por consiguiente, antes de dividirse una celula ha de hacer una copia de sus genes para pader ceder a sus celulas hijas una colecci6n completa de ellos. Los genes de los espermatozoides y de los 6vulos transmiten la informaci6n genetica de una generaci6n a la siguiente. La herencia de los caracteres biol6gicos debe implicar la existencia de esquemas de
Capftulo 3: Macromolecu]as: estructura, forma e informacion

de eSlas moltkulas resultaba diffcil de imaginar. iQU~ Iipo de molecula podrfa ser almacenada en una celula, dirigir las actividades de un organismo en desarroUo y ademcts sercapaz de una replicaci6n exacla y casi i1imilada? Hacia finales del siglo XIX, los bi610gos habfan reconocido ya que los trans· ponadores de la informaci6n hereditaria eran los cromosomas que resullan visibles en el nueleo cuando una c~lula empieza a dividirse. Pero la evidencia de que es el ctcido desoxirribonucleico (DNA) de estos cromosomas la substancia de la que estern formados los genes se obtuvo mucho mcts tarde a partir de unos estudios sobre bacterias. En 1944 se demosrr6 que la adici6n de DNA purificado de una cepa de bacteria a otra cepa tigeramente diferenle, conferfa a esta segun· da cepa propiedades heredilarias caracteristicas de la primera. Como hasla en· tonces se habfa crefdo que tan s610 las prolefnas presentaban una complejidad conformacional suficiente como para ser ponadoras de la informaci6n gen~tica, este descubrimiento conslituy6 una sorpresa y no fue aceptado de forma general hasta principio de los afios 1950. Acrualmente, la idea de que el DNA contiene la informaci6n genetica -almacenada en su larga cadena de nucle6tidos- es tan fundamental para el pensamiento biol6gico que a veces rcsulta diffcil darse cuenta del enorme abismo inteleClual que llen6 este concepto.

Las moleculas de DNA consislen en dos largas cadenas unidas por pares de bases complemenlarias 1o AI considerar la simpUcidad de la qufmica del DNA resulta comprensible que los genetistas ruvieran dificuhades en aceplar que el DNA es la csencia de los genes. Una cadena de DNA es un largo polfmero no ramificado, compueslo unicamente por cuatro tipos de subunidades. Estas subunidades son los desoxirribonucle6tidos que contienen las bases adenina (A), citosina (0, guanina (G) y tintina m. Los nucJe6lidos estctn unidos por enlaces covaIentes fosfodiester entre el carbona 5' de un grupo desoxirribosa y el carbona 3' del siguienle (Panel 2-6, pctgs. 60-61). Los cuatro tipos de bases eSlern fijados a esla cadena de azucar fosfalo repetitiva, casi como cuatro tipos diferentes de cuentas ensanadas en un coUar. iC6mo una larga cadena de nucJe6tidos puede codificar las instfUcciones para lodo un organismo, 0 incluso linicamente para una sola c~lula? Y, ic6mo pueden copiarse estos mensajes de una generaci6n de celulas a la siguiente? Las respueslas se hallan en la estructura t.ridimensional de la molecula de DNA.

Figura 3-10 La doble h~Uce de DNA.

Una corta seccilin de la doble del DNA. Se presentan cuatro pares de bases complementarias. Las bases se representan en gris y los azlkares desoxiribosa en azul. (8) La ht!:lice vista desde uno de sus extremos. Nlitese que las dos hebras del DNA avanzan en direcciones opuestas y que cada par de bases se manliene unido por dos 0 Ires enlaces de hidr6geno (~ase lambit!:n Panel 3·2. pags. 104· (A)

h~lice

105).

final S'de til e~tremo

oode"

S' arriba

eje de Ie • "fliu

"

3'0

01

)"-....0

o aZUellr o O-~,O-

enteeede hidrOgeno

IAI

ACldos nucleicos

~

,?:.=:J\

.... r

o

enlace fosfodiesler

extremo

lou

181

3' arriba

103

DNAYANA

ESQUELETO DE AZUCAA FOSFATO DEL ANA

En esta mitad del panel sa presents Ie estructura del ANA y en Ie otre mitad Ie del DNA. Tanto el DNA como el ANA son polimeros lineales de nucleotidos (....ease Panel 2-6. poigs. 60-61). EI RNA sa diferencia del DNA en Ires aspectos:

1. Ie columna vertebral de azucer fosfato presenta ribose en lugar de desoxirribosa

G,)-----,base

ribose

BKtremo 5'

r:

2. presents Ie base de uracilo (U) en lugar de limine (T)

aI'

".-cr10

o\

,~o

a'" \ o~)

3. existe en forma de habra sancilla en luger de una haliee de dabls habra.

!

union 3'

union 5'

N " , " ,o'f\

o

!

\

j

enlace foslodiesler

G'(\1.Iii-.... V.......

0 .......

0"'" \

Cf

LAS CUATAO BASES DEL ANA guanine

cito.ina

adenine

1"'

a

II

H............. C, ...... H N C

~

,~

0-7 'N ........

'H

C

Nr "'c "",N~ I II ~CH C H/

"'''N'' C -

_1-

'C..

HE BAA SENCILLA DE ANA EI RNA as una habra sancilla, para presenta conas zonas de apareamientos de bases complementarias que pueden formarse por un proceso al azar. Estas regiones de apareamiento de bases pueden verse en electronmicrografias como ramas de la cadena extendida.

ELECTAONMICAOGAAFIA DEL ANA

esqueleto azucar fosfato

(COr1es{a de Peter Welieuer.1

104

Pane;l3·2 Estrueturasdel DNA ydel RNA.

ESQUELETO DE AZUCAR FOSFATO DEL DNA

LAS CUATRO BASES DEL DNA FORMANDO DOS PARES DE BASES

r.;:l---~--~b8se e~tremo

S' desoxirribose

,,0

0 C • ..I _".H_..I _. 3, N

N

&<\EInl~

N

(

esqueleto de ezuc8r fosfato

La formaci6n especifica de enlaces de hidr6geno entre G y C y entre A V T (A y U en 91 RNA) genera los peres de bases complementaries.

DOBLE HELICE DEL DNA En una molecule de DNA, sa encuenlran apareadas dos

3'

cadenas antiparalelas cuyas secuencias de nucle6tidos son complementaries, generando una doble helice dextr6gira de aproJ(imadamente 10 pares de nucle6tidos por vuelte de Ie haliee. En Ie parte superior de asia figure se presents una ilustraci6n esqueml!ltica y en Ie inferior un modelo llano de 18 doble hal ice del DNA.

5'

5'

6strra principal

OSIris se<:undaria

A principios de los alios 1950, analisis por difracci6n de rayos Xde muestras de DNA estiradas hast'a conseguir libras, sugirieron que la molecula de DNA es un polfmero helicoidal (ormado por dos hebras. No era sorprendenle que el DNA tuviera una estructura helicoidal pues, como ya hemos visto, es muy frecueme la formaci6n de una helice si cada una de las subunidades vecinas de un polimero esta onentada regularmente. Pero el hecho de que el DNA tenga dos hebras fue crucial. Constiruy6 el dato que condujo, en 1953, a la construccl6n de un modelo que se adaptaba al esquema de difracci6n de rayos X observado y, can ella, solucionaba el rompeeahezas de la eshUctura y de la funci6n del DNA. Un rasgo esencial del modelo consistfa en que todas las bases de la molocula de DNA se haUan en el interior de la doble helice, mientras que los arucares fosfato se disponen en el exterior. Esta distribuci6n supone que las bases de una de las hebras deben estar extraordinariamente cerca de las de la 01Ta hebra, y el modele propuesto requerfa un apareamiento complementario entre una base ponca (A 0 G, cada una de las cuales presenta dos anillos) de una de las cadenas y una base pirimidInica IT 0 C, cada una de las cuales presenta un solo anillo, por 10 que es de menortamafio que una base pUrica) de la otta cadena (Figura 3-10). Tanto la evidencia obtenida a partir de los primeros experimentos bioqufmicos como las condusiones derivadas de los modelos moleculares sugirieron que el apareamlento de bases complementarlas (tambicn llamado pares de bases de Watson y Crick) se formaran entre A y T por un lado y entre G y C por otro. Los anlilisis bioquImicos de preparaciones de DNA de diferemes especies han demostrado que, a pesar de que la composici6n de nucle6tidos del DNA varia notablemente (por ejemplo, desde un 13% a un 36% de residuQs de A en el DNA de diferentes tipos de bacterias), se cumple una regia general que dice que, cuantitativamente, IGI =ICI y (AI =ITI. La conshUcci6n de modelos moleculares revel6 que el nl1mero de enJaces de hidrogeno efectivos que pueden formarse entre G y C 0 emre A y T era mayor que para otra combinaci6n cualquiera de es· tas bases. Asf pues, el modelo de doble Mlice para el DNA explicaba de forma elegame la bioqufmica cuantitativa.

La estructura del DNA proporciona una explicaci6n del proceso de la herencia 11 Un gen comiene informaci6n biol6gica en una forma que ha de ser copiada exactameme y transmitida desde cada cclula a todas sus celulas hijas. Las imp Ii· caciones del descubrimiento de la doble helice del DNA rueron imponantes, ya que la estructura suglrl6 inmediatamente c6mo se efectuaba la transfercncia de informaci6n. Puesto que cada hebra contiene una secuencia de nucle6tidos que es exactamente complemenlaria de la secuencia de nucle6tidos de la otra hebra, en realidad ambas hebras contienen la misma informaci6n genetica. Si llamamos a las dos hebras A y A', la hebra A puede servir de molde 0 patr61l para prodllcir una nueva hebra A', mientras que de la misma forma la hebra A' puede milizarse para producir una nueva hebra A. Asf, la informaci6n genetica puede ser copiada mediante un proceso en el cualla hebra A se separa de la hebra A' permitiendo que cada una de ambas hebras sirva de patr6n para la producci6n de una nueva hebra complementaria. Como consecuencia directa del mecanismo de apareamiento de bases, resuha evidente que el DNA contiene informaci6n gracias a la secuencia lineal de

Flgun 3-11 Secuenda del DNA del gen humano que codJDca la Il-globlna. EI gen codifica una de las dos subunidades de la molecuta de Ia hemoglobina, que en todos los indivlduos adultos rranspona el oxfgeno por 1a sangre. Solamente se presenta la secuencia de una de las dos hebras del DNA (1a ~cadena codificanle"l, ya que Ia om Dene la secuencia complemenlaria. La secuencia debe leerse de izquierda a derecha y en Uneas sucesivas de arriba a abajo de la p4gina, como si se tratara de un tenD !lonnal en espano!.

106

Caprtulo 3 : MacromoltkuJas: eshUctura, forma e informacl6n

CCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCA ATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAG CCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAG CCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACAC AACTGTGT'I'CACTAGCAACTCAAACAGACA CCATGG'I'GCACCTGACTCCTGAGGAGAAGT CTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGA ACGTGGATGAAGTTGG'l'GGTGAGGCCCTGG GCAGGT'I'GGTATCAAGGTTACAAGACAGGT TTAAGGAGACCAATAGAAAC'I'Q>GCATGTG GAGACAGAGAAGACTCTTGGGTTTCTGATA GGCACTCACTCTCTcGCCTATTGGTCTAT 'MTCCCACCC'I'TN:iGCTGCTGG'I'GGTCTAC ~TC'I"TTGAGTCCTTT

GGGGAT'CTGTCCACTCCTGATG:TGT1'ATG GGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAG ~AGTGATOGCCTG

~CTTT c=ACGlGGA~ AGTCTA~rGlIIICIlIOC

eCl ICI I I IClAI'GGTTAAGrTCAn:JrCA.T ~IW;N;a;T~

AGM.'1'GGGAAACAGACGTGA'I'TGCATCA GTG'rGGAAG1'Ct'TCGT'lTrAGTI'TC 'MT1'ATT1'GC1'GT1'CATAACAATTGTTTTC 1 I 1 IGn IM1'TC'I'TGCl I ICI lilt t I tI CTTCTCCGCM.1'TTTTACTATTATACTTAA TGCCTTAACA'M'G'l'GTATAACAAAAGGAAA TATC'1'CTGAGA.TACATTAAGTAACT1'AAAA AAAAAJ::TTTACACAGTCTGCCTAGTACATT ACTA'1'1'TGGAATATATGTGTGCTTATTTGC ATATTCATAATCTCCCTACTTTATTTTCTT TTAT'lTTTMTTGATACATMTCATTATAC ATATTTATGGGTTAAAGTGTAATGTTTTM TATGTGTACACATATTGACCAAATCAGGGT AATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCT TTCTTCTTTTAA"fATACTTTTTTGTTTATC TTATTTCTAATACTTTCCCTAA"fC'l'CTTTC TTTCAGGGCMTAATGATACAATGTATCA"f GCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATMCAG TGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAAT AT'I'TCTGCATATAAATATTTCTGCATATAA ATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTG CTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTC TGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTG GATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTT GCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCcr CCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTG TGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATT CACCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAA AGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGC CCACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCTTGC TGTCCAATTTCTATTAAAGGTTOCTTTGTT CCCTAAGTCCAACTACTAAAC~TA

TTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTG CCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAA. TGATGTATTTAAATTATTTCTGAATATTTT ACTA.a..a_".AGGGAA.TG1'GGGAGGT'CAG'r TTTAAAACATAAAGAAATGATGAGCTGTTC AAACCTTGGGAAAA TACACTATATCTTAAA C"rCCA~ crM'l'GCACA~CCTGA'l'GC

CTATGCCTTATTCATCCC1'CAGAAAAGGAT

TCTTGTAGAGGCTTGATTTGCAGGTTAAAG 11 I lOCTATGCTGTATTTTACATTACn'AT TGTTTTAGCTGTCCl'CATGAATGTCI 1I It:

3'

Clldenll plltr6n

Figura 3-12 Sfntesls de DNA. La adici6n de un desoxirribonucle6lido al extremo 3' de una cadena polinucleolidica es la reacci6n fundamental a traves de la cuaJ se sintetiza el DNA. Como se muestra en la figura, es el apareamiento de bases entre el ribonucle6tido que se anade y una hebra ya existenle de DNA (la hebra patron) 10 que condiciona que la nueva hebra de DNA tenga una secuencia de nucle6tidos compiemenraria.

clldllna reci'n

5' sintetizlldll

BASE

I I 11111

0 BASE

'fH' 0, O""p-O, 0

BASE

11I1I1I1

BASE

0

,

CH,

0,

O-p-o,

0

000 II II II -O-P-O-P-O-P-O-CH I

0-

I

0-

I

0-

L,=,--,IIIIIIIIIl--='ASE=-------.J 2

OH daSOKirribonucle6aido trifoafato qua antra

~-------'~' 0 BASE

~H2 0

O..,P-o, o

sus nucle6tidos. Cada nucle6tido -A, C, ToG- puede ser considerado como una letra de un alfabeto sencillo de cuatro letras que es utilizado para escribir los mensajes biol6gicos en forma lineal en una ~cinta de teleimpresora". Los organismos se diferencias entre sf porque sus respectivas moleculas de DNA poseen diferentes secuencias de nucle6tidos, y por consiguiente, diferentes mensajes biol6gicos. Puesto que el nllmero de posibles secuencias diferentes en una cadena de DNA de 11 nucle6tidos de largo es de 4~, la variedad biol6gica que se puede generar utilizando una modesta longitud de DNA es, en principio, enorme. Una celula animal trpica contiene un metro de DNA (3 x 109 nucle6tidos). Utilizando un abecedario lineal de cuatro letras, un gen humano extraordinariamente pequeno puede llenar una cuarta parte de una pagina de texto (Figura 3-11), mientras que la informaci6n genetica exislente en una celula humana permitiria lIenar un libra de mas de 500 000 paginas. Aunque el principia en el que se basa la replicaci6n genica es elegame y simple, la maquinaria real con la que se realiza esta copia en la celula es compUcada y esta compuesta par un complejo de prate(nas que forman una "maquina de replicaci6n". La reacci6n fundamental es la indicada en la Figura 3-12, en la que la enzima DNA polimerasa cataliza la adici6n de un desoxirribonucle6tido at extrema 3' de una cadena de DNA. Cada nucle6tido anadido a la cadena es, en realidad, un desoxirribonucle6sido trifosfato; la liberci6n del pirofosfato de este nucle6tido activado y su hidr6lisis posterior proporcionan la energfa para la reacci6n de repllcacl6n del DNA, convirtiendola de forma efectiva en una reaeci6n irreversible.

Acldos nuclelcos

107

La replicaci6n de una helice de DNA empieza por la separaci6n local de sus dos hebras de DNA complementarias. Cada hebra actua luego como patr6n para la formaci6n de una nueva molecula de DNA, mediante la adici6n secuencial de desoxirribonucle6sidos trifosfato. EI nucle6tido que debe ser anadido en cada caso se selecciona mediante un proceso durante el cual se fonna un par de bases complememarias con el nucledtido siguieme de la hebra patr6n madre, gener~ndose as{ una hebra hija de DNA que tiene una secuencia complementaria a la de la hebra patr6n (Figura 3-12). La infonnaci6n genetica se duplica en su totalidad -es deeir, se Ilegan a formar dos dobles helices completas de DNA, cada una de las cuales es identica en cuanto a secuencia de nucle6tidos a la helice de DNA madre que sirvi6 de pau6n. Puesto que al aeabar el proceso, cada molecula de DNA hija esta fonnada por una cadena original y otra recien sillletizada, se dice que el mecanismo de replicaci6n es semiconservativo (Figura 3-13).

dobls htllics partsrne dB DNA

~

~

A

REPlICACION

Los errores en el proceso de replicaci6n del DNA generan mutaciones lZ Una de las caracterfsticas m-'s impresionantes de la replicacl6n del DNA es su exactitud. Se utilizan diversos mecanisrnos "carrectores de galcradas" para eliminar llucle6tidos situados incorrectamente; como consccucncia de ella, la secuenda de nucle6tidos de una lllolecula de DNA se copia con menos de Ull error por cada 10'" nucle6tidos anadidos. Sin embargo, de vez en cuando la maquinaria de la repHcaci6n salta 0 ai\ade algunos nucle6tidos, 0 coloca Ulla T donde deberfa existir una C. 0 una A en lugar de una G. Cada uno de los cambios de este tipo en la secuencia de DNA constituye un error genetico lIamado mutaci6n, que seni copiado en todas las generaciones futuras de celulas, ya que las secuenclas de DNA "equivocadas~ se copian tan fielmente como las ·correetas". La consecuencia de un error de estc tipo puede ser muy importante, ya que un solo cambia de un nucle6tido puede tener grandes efeetos sobre la celula, dependiendo dellugar donde haya oeurrido la mutaci6n. A principios de los anos 1940, los genetistas demostraron de fonna concluyente que los genes especifican la estructura de las protefnas. Por eso, una mutaci6n en un gen causada por una alteraci6n en la seeuencia de su DNA puede acarrear la inactivaci6n de una protefna y no producir ningl1n efecto, por 10 que se Ie llama muraci6n sifenciosa. Muy raramente, una mutaci6n origina un gen con una funci6n util, mejorada 0 nueva. En este caso los organismos ponadores de la mutaci6n tendrAn una vemaja, ya traves de la selecci6n natural el gen mutado puede Ilcgar a substituir con cl ticmpo al gen original de la poblaci6n.

La secuencia de nucle6tidos de un gen determina la secuencia de aminmicidos de una prote(na l3 EI DNA es relativamente inerte qufmicamente. La informaci6n que contiene se expresa indirectamente a traves de ouas moleculas: el DNA dirige la sfntesis de RNA especfficos y de moleculas de protefna que, a su vez, dctcrminan las propiedades ffsicas y quimicas de la celula. Aproximadamente aI mismo tiempo en que los biofisicos analizaban la estructura tridimensional del DNA por difracci6n de rayos X, los bioqu[micos estudiaban intensamente la estructura qufmica de las protefnas. Se sabia ya que las protefnas son cadenas de anlina<\cidos unidos por enlaces peptfdicos secuenciales, pero todavfa no se conoela con certeza que cada tipo de protefnas consiste en una secuencia caracterlstica de aminoacidos; pero a principios de los ai\os 1950, cuando se lIeg6 a conacer la secuencia de la pequeiia proteina insulina (Figura 3-14), se descubri6 que cada tipo de protefna consiste en una secuencia de amino~cidos lipica. AI igual que el conocimiento de la estructura del DNA ejerci6 una influencia crucial sobre la composici6n de la base molecular de la genetica y de la herencia, la determinaci6n de la secuencia de la insulina conSlituy6 la clave para comprender la estructura y la funci6n de las protefnas. Si la in108

Capftulo 3: Macromoleculas: eslructura, forma e Inform:tcl6n

htllices de DNA hijal:

Figura 3-13 La repllcacl6n semlconservatJva del DNA. En cada cicio de replicaci6n, cada una de las dos hebras de DNA son utilizadas como palron para la fonnaci6n de una hebra complemenlaria de DNA. Por consiguieme, las hebras originales permanecen inalleradas a 10 largo de muchas gcncraciones celularcs.

Cadena A

s,

s,

G-I-V-E-a-C-C-A-5-V-C-5-L-Y-a-L-E-N~Y~C~N ,

I

~

,

21

.....5

Cadena B 5, S, P-V-N-O-H-l-C-G-S-H-l-V-E-A-l-V-L-V-C-G-e-R-G-F-F-Y-T-P-K-A ,

30

sui ina tenia una secuencia definida, geneticamente determinada, 10 mas probable era que lambicn la luvieran las demas proteinas. Ademas, parecfa razonable suponer que las propiedades de una protefna dependerfan del orden exacto en el que se hallaran dispueslos sus aminoacidos constituyentes. Tanto el DNA como las prolefnas estan compuestos por una secuencia lineal de subunidades, y el ana..lisis bioquimico de las protefnas producidas por genes mUlantcs demoslr6 que las dos secuencias son co-lineales --es decir, 105 nuc1e6tides del DNA esuin dispuestos en un orden que coresponde al orden de 105 aminoa.cidos en la prolefna que especifican. Result6 evidenle que la secuencia del D A contiene una especificaci6n codificada de la secuencia prolcica. La prcgunta central de la biologfa molecular pas6 a ser entonces c6mo una celula tra~ duce una secuencia de nucle6lidos del DNA a una secuencia de aminoacidos de una prolcfna.

Figura 3-14 Set:uencla de amln04c1dosde la Insullna bovina. La insuJina es una protefna muy pequena formada por dos cadenas polipeplfdicas. Wla de 21 y la olta de 30 residuos de a.minml.cidos. Cada cadena presenta ulla secuencia de aminoll.cidos caracteristica delerminada gem'!ticamenle. Los sfmbolos de una letra utilizados para nombrar los aminotcides son los que se indican en el Panel 2-5, pll.gs. 58-59; los enlaces s-s indicados en roja son enlaces disulfuro enlte residues de cisleina.lnicialmenle la proleina se sinletiza como una unica larga cadena polipeptfdica (coclificada par un (jnico gen), la coal se divide poslerionnenle rormando las des cadenas.

Porciones de la secuencia de DNA se copian en moleculas de RNA para guiar la sfntesis de protefnas l4 La sfntesis de una protefna implica copiar regiones especfficas del DNA (los genes) en otro lipo de polinucle6lido quimica y funcionalmente diferente, conoci-

do como tic1do r1bonuc1elco 0 RNA. AI igual que el DNA, el RNA esta compuesto por una secuencia lineal de nucle6tidos, pero presenta dos pequei\as diferencias qulmicas respeclo al DNA: (I) el esqueleto de azticar fosfato del RNA conliene r1bosa en Iugar de desoxirribosa, y (2) la base timina (n esta substituida por uraci10 (Ul, una base muy estrechamenle relacionada que tambien se aparea con A (vease Panel 3-2, pags. 104-105). El RNA contiene toda la informaci6n de la secuencia de DNA de la que ha sido copiado y mantiene las propiedades del DNA de apareamiento de bases. Las molcclilas de HNA se sintelizan a traves de un proceso conocido como Iranscrlpcl6n del DNA, que en muchos aspectos se parece al de la replicaci6n del DNA, ya que lIna de las dos hebras del DNA acttia como patr6n sobre el que sc examinan las posibilidades de apareamiento de bases de los ribonucle6tidos. Cuando se consigue un bllen ajllste con el DNA patr6n, el ribOtlllcle6tido es incorporado como una unidad ligada covalentemente. De esta forma. la cadena de RNA que esta creciendo 10 hace llude6tido a nude6tido. La transcripci6n del DNA se diferencia de la replicaci6n el DNA en varios puntos imponantes. Por ejemplo, el RNA producido no permanece asociado al DNA. Inmedialamente detras de la regi6n en la que se aftaden los ribonucle6lidos, la helice original del DNA se forma de nuevo y la molecula de RNA se separa. Por consigl.liente. las moleculas de RNA tienen una sola hebra. Adem;\s, las moleculas de RNA son relativamente cortas en comparaci6n con las de DNA, ya que son copiadas a partir de una regi6n limilada del DNA -suficienle para produdr una 0 varias protefnas (Figura 3-15). A los transcrilos de RNA que dirlgen la sfntesis de molcculas de prolefna, se les llama moleculas de RNA mensaJero (mRNA). Otros Iranscrilos de RNA actUan como RNA de rransferellcia (tRNA) 0 bien forman los componenles del RNA ribos6mico (rRNA) 0 parlfculas ribonudeoproleicas mas pequei\as. La cantidad de RNA sintelizado a partir de una regi6n delerminada de DNA esta controlada por prote(nos regu/adoras de ta actividad genica. que se unen a lugares especfficos del DNA cerca de las secuencias codifical1les de un gen. En cualquier celula y en cualquier momelllo dado, algunos genes se esu1n ulilizanAcidos nucieicos

109

EUCARIOTAS

PROCARIOTAS

.'''''

..

ONA ~-.,....--

mRNA proteitWI

I I

TJlAHSCllO'OOH TJIAOUCCION

mRN'~A::~::::-:: ~

TRADUCCION

do para sinlelizar RNA en grandes cantidades mientras que otros genes no se lranscriben en absoluto. En cada generaci6n celular, a partir de un gen activo pueden sintelizarse centenares de transcritos de RNA a partir del mismo segmento de DNA. Cada mollkula de mRNA puede ser traducida dando lugar a muchas centenares de copias de una cadena polipeptidica, por la que la informaci6n conlenida en una pequena regi6n del DNA puede dirigir la slntesis de millones de copias de una proterna delenninada. La prorema jibro(na, por ejem1'10, es el componente mayoritario de la seda. En cada ~Iula de la glandula de la seda, un solo gen de fibrofna genera I ()4 copias de mRNA. cada una de las cuales dirige 1a sfntesis de 1(}'i mollkulas de fibrofna -produciendose un 10lal de l(}'t moleculas de fibroina en 5610 4 dfas.

Las mohkulas de RNA de eucariotas son cortadas y recombinadas, e1imin~ndose secuencias intr6n lS En las c~lulas bacterianas la mayarra de las proteinas estAn codificadas por una unica secucncia de DNA, larga e ininlerrumpida, que se copia sin ninguna alteraci6n 0 rnodificaci6n previa, producicndo una mohkula de mRNA. En 1977, los bi61ogos rnoleculares quedaron asombrados ante el descubrimienlo de que la mayorfa de los genes eucariotas presentan sus secuencias codificantes
Capftulo 3: Macromoleculas: cstructura, fonna e informacl6n

Figura 3-15 La transferencla de lnfonnacl6n desde el DNA hasta la proteina. La lransferencia tiene lugar a travl!s de un Inlennediario de RNA lIamado RNA mensajero (mRNA). En las c~lulas procariolas el proceso es ro1s simple que en las celulas eucariolas. En eucariotas, las regiones codificanles del DNA (situadas en los exones, dibujados en color) est.tn separadas por regiones no codificantes (Jlamadas inrrones). Tal como se indica en la figura, eslos intrones pueden eliminarse a tra~ de una reacci6n, C8lalizada por enzimas, de maduraci6n por corte y empalme (splicing) del RNA, fonnando asf Wla mol&:uJa de mRNA.

1.- posici6n

(ox1:romo 5')

2.- posici6n

3." posici6n (oxtromo 3')

U

C

A

G

Ph. Ph.

Ty, Ty,

L" L"

Soc Soc Soc Soc

STOP STOP

C" C" T',

C

L" L" L" L"

Pm P,o P,o Pm

His His Glo Glo

A,g A,g A,g A,g

A

110 II. II.

Aoo Aoo

Soc Soc

U

Mol

Th, Th, Th, Th,

LV' LV'

A,g A,g

A G

G

V.I V" V.I V.I

AI. AI. Alo AI.

Ao, Ao,

G' Gly Gly Gly

U

I

U

GI, GI,

STOP

I U

C A G

u C A G

Figura 3·16 EJ c6dlgo genetlco, En el transcurso de la sfntesis proteica, los grupos de tres nucle6tidos (codollcs) de una rno1ecula de mHNA son lraducidos a aminmtcidos de acucrdo con las rcglas indicadas aquf. Los codones GUG y GAG, par ejemplo. se traducen a v;\lina ya acido glutamico respectivamcnte, Observese que los codones que presentan U a C como segundo nucle6tido tienden a codificar los aminoacidos mas hidrof6bicos (comparese con el Panel 2-5, pags.58-59).

C

C A G

combinaci6n genetica entre exones, probablemence este lipo de disposici6n geniea ha side extraordinariamente importante en los albores de la histeria de la evoluci6n de los genes -acelerando los procesos por medio de los cuaJes los organismos desarrollaron nuevas protefnas a partir de partes de otras ya existenles, en lugar de tener que desarrollar completamente nuevas secllencias.

Las secuencias de nucle6tidos del mRNA son "Iefdas" en grupos de tres y traducidas a amino
r

5'

,~~~~!AU -leu-S,,--v.I--Thr-

=

Las moteculas de tRNA emparejan los amino
- Ser--A"--L,,--Pro-

3 .....

~ ~ iollol.Iio ioli.Il.IIo -

Gln-A,g--Ty,-Hi.-

Figura 3·17 Las tres pautas de lectura posibles en la senlesls proleica. En el proceso de traducci6n deuna secuencia de nucle6tidas (awl) en una secuencia de amillmicidas (IJerdeJ,la secuencia de nucle6tidos de un mRNA es lefda desde el extrema 5' hacia el extrema 3', en grupos consccutivos de 3 nucle6tidos. Par consiguiente, segl1n cua! sea la "paUla de lectura" utilizada, cada secuencia de RNA puede codificar, en principio, Ires secuencias de aminoacidos completamente difercntes entre sf.

III

nucl&6tido 1

nucl&6tido 76

union del .minokldo nucl&6lldo 711 (elctremo J') nucleotido 1 (extrema 5')

(eKtremo J' con un aminoacido unido)

"'58:=~~~~~

55·18

58-" G

,,-<6;===== 23·9 -

...

,I----10.a5

4s.-10'-----

H

",----

inleraccion.. poco habitual.. enlre bMM

'81

anlico06n

un amino~cido y un gropo de tres nucle6lidos. Estos adapladores son un gropo de pequei"tas mol~ulas de RNA conocidas como RNA de transferencia (tRNA). cada una de las cuales liene una longitud de unos 80 nucle6tidos. Una molt'icula de IRNA presenta una confonnaci6n tridimensional plegada, Que se mantiene en parte por interacciones no covalentes de apareamientos de bases como las Que manlienen unidas las dos hebras de la ht'ilice de DNA. Sin embargo, en la mol~cuJa de IRNA. Que es de una sola hebra, los pares de bases complementarios se forman entre residuos de nucle6tidos de la misma cadena. la cual hace Que la mol~cula de tRNA se pLiegue de una forma caraclerfSlica. Que es importanle para su funci6n de adaplador. Cuatro cortos segmentos de la moI~cula presenlan una estructura en doble h~lice, dando lugar a una mol~cula que parece un "cruce en lr~bol~ en dos dimensiones. Esle cruce en Irebol esta mas plegado formando una conformaci6n en forma de L que se manliene por interacciones de enlaces de hidr6geno mas comptejas (Figura 3·18). En cada extremo de la "L" exislen dos grupos de residuos de nucle6tidos desapareados, que son especialrnenle importantes para la funci6n de la molecula de IHNA en la s(nlesis de protefnas: uno de los grupos forma el Clmicod6f1, cuyas bases pueden aparearse con las de un triplete complementario de una molecula de rnHNA eel cod6n), mientras que La secuellcia CC4 del extremo 3' de la molecula de tllNA esta unido de forma covalentc a lIna secllcncia de aminoacidos (Figura 3-l8A).

EI mensaje de RNA se lee de un extremo aI otro por un ribosomal 8 EI proceso de reconocimiento de los codones, Que transfiere 13 informaci6n gcnetica del mRNA vfa tRNA a la proterna, depende de inleraccioncs entre pares de bases del mismo tipo de las que median la transferencia de informaci6n genetica del DNA al DNA ydel DNA al RNA (Figura 3-19). Sin embargo, la mec~nica de ordenaci6n de las mol~culas de tRNA sobre el mRNA es complicada y requiere de la presencia de un rlbosoma, que es un complejo de m~s de 50 prolefnas diferemes asociadas a varias mol~cuJas de RNA estruClural (rRNAl. Cada ribosoma es una gran m~quina sintetizadora de prolefnas en la Que las moltkulas de IRNA se colocan por sf mismas para leer el mensaje gen~lico codificado en la secuencia de las mol~ulas de mRNA. El ribosoma encuenlra primero un punlo especf· fico de inicio en la mol~ula de mRNA, Que establece la paula de lectura y deter· mina el extremo amino terminal de la prolefna. Luego, a medida que el ribosoma se desplaza a 10 largo de la moltkula de mR A, va lraduciendo, cod6n a cod6n, la secuencia de nucle6lidos a secuencia de amino~cidos, utilizando

112

Caprlulo 3: Macromolkulas: estructura, fonna e informaci6n

lei

Figura 3-18 tRNA para Ja fenUalanlna en Jevadura. (AI La molenl1a esta dibujada adoptando una conformaci6n de "cruce en trebor para dCSlacar los pares de bases complementarios (harras grises carlas) que se forman en regiones helicoidales internas de la molecula. {B) Se muestr.l. en forma de esquema la conformad6n real de la molecula, basada en anaIisis por difracd6n de rayos X. Los pares de bases complementarios se indican como oorras grises largas. Ademas, en roja se presentan los nucle6tidos que panicipan en interacciones no habituales de apareamiemo de bases y que mantienen unidas diferemes zonas de la rnolecula. Eslas parejas estan numeradas y conecladas por /flleas de color rojo tanto en (Al como en (B). En (B) los pares de bases estan nurnerados. (e) Una de las intcracciones de apareamiento de bases poco habituales. Aqu1, una base intcracciona a traves de enlaces de hidr6geno con olras dos; algunas de eSlas Mtriples bases~ colaboran para manlener plegada esta molecula de tRNA.

5'

E

"iif~~Jl"i1i1ii,i!i~m~R~N~A

3'

U A A AGe G U G

DNA

5'

T'-

z

i

c

C

Pro

cadena de mRNAen

:recim;ento

5'

IAI

'81

A

A

c

c

• ~

tRNA emrante, .lltrlrno.-",,::::c:-::::::::-:-:::::-- eldremo ellrgMto con un amino - cadena pollpeploda carboxHo aminokido IIfl crecimiento

moleculas de tRNA para ai'\adir aminoacidos al extrema por el que In cadena poJipeptfdica esta creciendo (Figura 3-20). Cuando un ribosoma tlega a1 final del mensaje. tanlO ~I como el extrema carboxilo terminal de la protefna reci~n sintc· tizada se Jiberan del extrema 3' de la moJecuJa de mRNA y quedan libres en el citoplasma. Los ribosomas actuan con una eficiencia notable: en I segundo. un solo ribosoma bacteriano anade aproximadamente unos 20 aminoacidos a una cadena polipeplfdica en formaci6n. En el Capitulo 6 se ofrecen mas detalJes sobre la estructura de los ribosomas y sabre el mecanisme de la sfntesis prOleica.

Algunas mol~u1as de RNA actuan como catalizadores l9 TradicionaLmente se ha considerado que las moltkulas de RNA son simples cadenas de nucle6tidos. con una qu£mica relativamente poco interesante. En 1981. esta concepci6n qued6 destrozada por el descubrimiento de una molecuJa de RNA con actividad cataHtica, con un tipo de reactividad qufmica tan sofisticada como la que los bioqllfmicos habran asociado exclusivamente a las prote{nas. Las moleculas de RNA ribos6mico de los protozoos cHiados Tetrahymena se sintetizan inicialmente como un largo precursor. a partir del cua! se sintetiza uno de los rRNA por una reacci6n de corte y empalme (splicing) del RNA. [...1 sorpresa surgi6 ante e[ descubrimienlo de que eSla reacci6n de corte y empalme podfa desarrolIarse in vitro en ausencia de protefnas. Por consiguiente, se demoslr6 que la secuenda intr6n presenta una actividad cataUtica, semejante a la dc una cnzima que lJeva a cabo la reacci6n de dos etapas que se illistra en la Figura 3-21. A continuaci6n, se sintetiz6 en un tubo de ensayo la secllencia de 400 nuc1e6tidos de

,,,

Figura 3-19 Aujo de informacIOn en III sfntesls proteica. (A) Los nucle6ddos de 1a molkula de mRNA se unen formando una copia complementaria de un segmento de una hebra de DNA (B) Luego, estos nucle6tidos, en grupes de trcs. se unen a conjuntos complementarios de tres nucle6ddos de la regi6n anticod6n de delenninadas mol~las de tRNA En el oun extremo de cada dpo de las molecuJas de !RNA, un aminoocido detenninado se mantiene unido a tTaves de un enlace de aha energia, ycuando se produce el apareamiento, este aminoacido es anadido a1 extremo en crecimiento de la cadena proteica AsLla traducci6n de la secuencia de nucle6tidos del mRNA a una secuencia de aminrnkidos depcnde del aparamiento de bases complernentarias entre un cod6n del mRNA y eJ anticod6n correspondiente del tHNA. Por consiguienlc, la base molecular de la trallsferencia de informaci6n Cilia traducci6n es Illuy similar a la de la replicacl6n y a la de la transcripci6n del DNA, N6tese que tanto la sfntesis como la traducci6n del mRNA se inician en el extrema 5',

....b...nid.de. ,ibo.6mlca• •eparad..

ribosoma

mRNA

elltremo J'

eJrtremo 5'

polipeptido en clllc,miento

Acidos nucJelcos

)

Figura 3-20 Sfntesis de una protefna por ribosomos unJdos a una molkula de mRNA. Los ribosomas ~ unen a una senal de iniciaci6n que se halla cercana al extremo 5' de la molecuJa de mRNA y luego se desplazan hacia eI extrema 3', sinletizando la pIOIei'na a medida que avanzan. A menudo varios ribosomas se desplazan simultaneamente sabre un mismo mRNA, de fonna que cada uno de elias fabrica una cadena polipeptktica independiente pern Kt~tica a las otras; tOOa esla eslruetura recibe el nombre de polirribosoma.

113

n.,

nucle6tido /

mo16culs de ANA

5':::=U~CU~~G~ GUAA=::03'

precursore

sllCuencia

del intr6n

I 3'~

5':::~U~CU GUAA~:::3'

intermlldiario

GA 5'

transitorio

A

Figura 3-21 Una mol&:ula de RNA automadurativa. EI diagrama muestra la reacci6n de automaduraci6n en la que una secuencia intr6n cataliza su propia escisi6n de una mol~eula de RNA ribosomal en Tetrahymena. Como se muestra en la figura, el proeeso se inicia cuando un nucle6tido G se af~ade a la secuencia del intr6n. y en esta reacci6n se rompe la cadena de RNA; entonees, el nuevo extrema 3' de la cadena de RNA ataea al otro extremo del intr6n, completlindose la reacci6n.

A

I molkula daRNA madufa

5': ::1lZ!i!ZIi!'.IZI UCUUAA c=z::::::l!::: 3'

+

G~G3'

5'

A

secuencla

A

dellntron eliminllda

iongitud del intr6n y se comprob6 que era capaz de plegarse formando una compleja superficie y podia actuar como una enzima en reacciones con atras moltkulas de RNA. Puede, por ejemplo, juntar dos substratos determinados -un nucle6tido de guanina y una cadena de RNA- y catalizar su uni6n covalente cortando 1a cadena de RNA en un lugar especffico (Figura 3·22). En esta reacci6n tipo, de la cllal el primer paso se presenta simu\ado en 1a Figura 3-21, 1a propia secuencia intr6n acma de fonna repetitiva cortando numerosas cadenas de RNA. A pesar de que la maduraci6n del RNA por corte y empalme se realiza habitualmente par sistemas que no son autocatalfticos (vease Capitulo 8), en diferentes tipos de celulas, incluyendo hongos y bacterias. se han descrito RNA automadurativos can secuencias intt6n relacionadas con la de Te-

Figura 3·22 Unareaccl6n catallzada por la secuencla lntnSnica purl.Ocada

mol~cula de

RNA substrato

+ G

\ nucle6tido

mo"",~ ~

productos RNA

celli/ilea de ANA

114

Capftulo 3 : Maeromoll~eulas: estruetura. forma e informacion

de Tetrahymena. En esta reacci6n, que eorresponde aI primer paso de1a Figura 3-21, tanto el substrato espedfieo -una molerola de RNA- como un nucleOtido G se mantlenen estrechamente unidos a la superficie de la molecula catalftiea de RNA EnlOnces el nucleOtido se une eovalentemente a la mol6:ula de RNA substrato rompiendola en un lugar detenninado. La liberaci6n de las dos cadenas de RNA resultantes deja libre la secuencia del intr6n p'ara posteriores ciclos de reacci6n.

OCH)

0,

T

HO

/,C=O

NH

i\;

o

ENLACE

OH 5-

•c

puromicina, una mo!l!cula que mimetiz8 un

-~

PEPTfolCO

c c

•

RECll:N FORMADO

+

unido til C·te.minal de un poliptlptido en crecimiento (azul)

trahymena. Este hecho sugiere que estas secuencias de RNA podrfan haber aparecido antes de que las IIneas evolutivas de las celulas procariotas divergieran, haee 1,5 mil millones de aims. Recientemente se han descubierto a1gunas otras familias de RNA catalfticos. Por ejemplo, la mayorfa de los tRNA se sintetizan inicialmente como un RNA precursor mas largo, y se ha descrito una mol~cula de RNA que juega el papel catalftico principal en un complejo RNA-proteina que reconoce estos precursores y los corta en lugares especfficos. Se conace tam bien una secuencia catalftica de RNA que desempena una funci6n importante en e( cicio vital de numerosos viroides de plantas. Todavfa es mas destacable que ahora se sospecha que los ribosomas ejercen su funci6n principalmente por catalisis basada en moltkulas de RNA, de forma que las protefnas del ribosoma jugarfan un papel de apoyo de los RNA ribos6rnicos (rRNA), que constituyen mas de la mitad de la masa del ri· bosoma. EI rRNA largo, por ejemplo, tiene una actividad peptidil transferasa que puede catalizar la formaci6n de nuevos enlaces peptfdicos (Figura 3-23). lC6mo Ie es posible a una molecula de RNA actuar como una enzima? EI ejemplo del tRNA indica que las moleculas de RNA pueden plegarse de rormas altamente espedficas. En la Figura 3-24 se presenta una estructura tridimensional propuesta para el nucleo de la secuencia intr6n automadurativa de Tetrahymena. Interacciones entre diferentes zonas de esta molecula de tRNA (amUogas a los poco habituales enJaces de hidr6geno en mo1eculas de tRNA -vease Figura 3-18) son responsables de plegados posteriores que generan una compleja superficie

"

•...gII_Ii'";';";";;.,...... 81(6n

18'

c

• •

"

mimetiz8 un IRNA (raja)

, 5'-1

c

(

~

eminoacillRNA

Acidos nudeicos

!N-",mil m
CH l

_...

IAI

¢J..

l . - 3'

81(6n

Figura 3-23 Una reaocl6n peptldll transferasa eatallzada por una mol~ula de RNA rlbosdmleo desprotelnlzada. La moltkula de puromicina mimetiza un tRNA cargado con el aminmicido tirosina y en las celulas aetua como un potente inhibidor de la sfntesis de prote'nas aiiadiendose aI extremo en crecimiento de una cadena polipeptfcUca. En este modelo de reacci6n el extremo de la cadena polipeptfdica en crecimiento esta mimetizado por un hexanuc1e6tido (ell rojo, representando un tRNA) que esta unldo covalentememe a la N-formil metionina (que representa el polipeptido). Una gran molecula de rRNA aitameme purificada cataliza la adici6n de puromizina a la N-formil metionina, formando un nuevo enlace peptfdico y liberando el hexanuc1e6tido.

Figura 3-24 Visl6n tridimensional del micleo eataUtlco de la secuencla Intr6nlca de RNA ilustradaen las Flguras3.21 y3.22. (Al La molecula plegada, con las interacciones de enlaces de hidr6geno en rojo. Esta molecula, de unos 240 nuc1e6tidos, se presenta inmediatamente despues del corte inieal del extrema 5' del intr6n (amarillo). (B) Dibujo esquermhico de la molecula presentada en (A), en su forma desplegada. (Adaptado de L Jaeger, E. Westhoffy F. Michel,). Mol. Bioi. 221: 1153·1164, 1991.)

115

tridimensional con actividad cataUtica. Una yuxtaposici6n de atomos poco fTecuente puede estirar enlaces covalentes y, par 10 tanto, conseguir que determinados alOmOS de la cadena plegada del RNA sean exrraordinariamente reactivos. Como se explica en el Capitulo I, el descubrimiento de las mol&:ulas de RNA con actividad catalftica ha cambiado profundamente nuestra visi6n de romo aparecieron las prillleras celulas.

Resumen La i"fornuu:l611 gem!tica se Iralla ell la secue"cia lineal de ,wcloot/dos tiel DNA. CacM moUClila {k DNA CQlIs/sm etl Illla doble I,illee formatlil a partir de dos Ilebras

complemelltarlas de nuclootitlos, emfJ'.rejadas metliame elllaces {k Iritlrogeno elltre los pares de bases G-C y A· T. La duplicaci611 de la informacl611 gelletica se prodlU:e medil'lnte la polimerlznci6n de lUra nuelJll hebra complementaria decada IHla de las dos hebrll$ prlmitillll$ de la doble hilice, durante ei proceso de replicad61l del DNA. Ln expresi6n de In informad6n genetlca almacenada ell el DNA comprende Ia traducd6n de lllra secuencia lineal de nllcle6tidos del DNA a llna seclJencia co-liJlool de amit,06cidm de utra prote(na. U" segmellto acDtado de DNA se copia primero e" una hebra complementaria de RNA. £Ste trmucrito primarlo es cortado y mempalmado (spliced) elimind,ldose las S«lIellclas de intrones y gelleralldo IIna molkula de mRNA. Finalmellle, el mRNA es rradlfcido a protelna a travis de "11 complejo conjlllllo de reacciom!s que tienen lugar ell lUi rlbosoma. LAs ami,,06eltlos Iltillzados para in slntesls proteiea son ,widos primero a una famllia de molkulas de tRNA, ealla IIna de las cuales reemlOce, mediante InteraeelOlles de apareamle'lto de bases eom"leme"larlas, gTllpos determlnados de tres "uclootidos del mRNA. A courinutu:i6I1, la secuellcia de "ucloolidos del mRNA es lelda de un extremo al otro en gmpos de Ires, de acuerdo con un c6digo genet/co universal. Orras molkulas de RNA acrdan ell las celulas como agentes cataUticos semejaures a las emlmas. £SIns ",olleulas de RNA se pliegall generando ulla sllperjicle que contiene lIuele6tldos que lum adqllirido IIlIa reacrividad extraordi'raria. U"O de ettos catalizndores es el rRNA grallde del ribosoma, que catallza Ia fonrurci6" de enlaces peptfdicos dumnte In s(ntesis proteien.

Estructura de las protefnasZo Las celulas estan fonnadas en gran parte por protefnas, que constituyen m<1s de la mitad del peso seco de la celula (Tabla 3-1). las prolefnas determinan la forma y la estroclura de la celula y tambien actuan como los principales instrurnentos de reconocimiento molecular y como catalizadores. A pesar de que es derto que el DNA almacena la informaci6n para generar una celula enlera, tiene poca influencia directa sobre los proc:esos celulares. EI gen de la hemoglobina, por ejemplo, no puede transportar oxfgeno: esta es una propiedad de la prote(na especificada por el gen. Las moleculas de DNA y de RNA son cadenas de nucle6tidos, quimicamente muy semejantes entre sf. En cambio, las protefnas estan formadas par un conjunto de 20 amino:1cidos muy diferentes, cada uno de los cuales presenta una pelsonalidad quflllica distinta (vease Panel 2-5, pags. 58-59). Esta variedad hace posible la enonne vetsatiLidad de las propiedades qu(micas observada en las distintas protefnas, y posiblemente explica por que durante la evoluci6n se han seleccionado las prolefnas en lugar de las Illoleculas de RNA para catalizar la mayorfa de las reacciones celulares.

La forma de una moJecula proteica esta determinada par la secuencia de sus aminoacidoszl Muchos de los enlaces de una larga cadena palipeptidica permiten la libre rotaci6n de los alomos que unen, 10 eua) confiere a) esqueleto de la prOlefna una gran flexibilidad. Por 10 tanto, cualquier mol&:ula proteica puede, en principio. 116

Capitulo 3 : Macromol~ulas: estructura, forma e informacl6n

adoptar un mlmero iii mit ado de formas diferentes (con!ormaciolles). Sin embargo, la mayorfa de las cadenas polipeptfdicas se pliegan adoptando una sola can· formaci6n particular. Esto es debido a que los esqueletos de los diferentes aminoacidos, a modo de cadenas lateraJes de la cadena principal, sc asocian entre sf y con el agua formando varios enlaces no covalentes debiles (vease Panel 3-1, pags. 96·97). Sicmpre que las eadenas laterales apropiadas se encuentren en posiciones cruciales en la cadena, se desarroUaran irnponantes fuerzas que haeen que una conformaci6n particular sea especiaJmente estable. La mayorfa de las proteinas pueden plegarse espantaneamente en su forma oorrceta. Debido al tralamiento oon algunos disolventes. puede conseguirse que una protefna se despliegue, 0 desllatllralice, obteniendose una cadcna polipeptfdica flexible que ha perdido su eonfonnaci6n nativa. NonnalmcllIe cuando se relira el solvente desnaturalizante, la proleina se pliega espantaneamente adoptando su conformaci6n original, 10 cual indica que tada la inforrnaci6n necesaria para detenninar el plegamiento se halla contenida exclusivarnente la secuencia de aminoaeidos. Uno de los factores mlis importantes que condicionan el plcgamiento de una protcfna es la disuibuci6n de sus cadenas laterales palares y no palares. Las cadenas latcrales hidrof6bicas. muy abundantes, tienden a agruparse en el interior de la moltkula, 10 cualles permite evitar el contacto con el entorno acuoso (como las gOlas de aceite se vuelven a unir despues de haber sido dispersadas meclinicarnente en el agua). Par el contrario. las eadenas laterales palares tienden a disponerse cerea de la parte externa de la moltkula proteica. donde pueden interactuar con el agua y con otras moleculas polares (Figura 3-25). Puesto que los enlaces peptfdicos tambien son polares, tienden a interactuar entre si y can las cadenas lateraJes polares. para formar enlaces de hidr6geno (Figura 3·26); casi lodos los residuos palares enterrados dentro de la protcfna est:1n apareados de esta forma (Figura 3·27). As! pues, los enlaces de hidr6gcno desempenan un papel impartante en mantener unidas diferentes rcgiones de la cadena palipeptfdica de una molecula proteica plegada, y son de una importancia crucial para muchas de las interacciones de enlace observadas en las superficies de las proteinas.

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1'$ cadellllS I'terel_ polllle&. "tu,des en I' supelficie exterior de I' mol6cur.. ptHtden form,r enl,ces de hidlOgeno

confOlmllci6n pl~ad, en un amblente I(:U050

Figura 3·25 PJegado de una prolerna adoptando una conformaeleSn globular. Las cadenas laterales de los aminoocidos polares tienden a situarse en cl exterior de la prote'na, donde pucden interacdonar can el agua; las cadenas laterales de los aminoacidos no polares quedan enterradas en el interior. formando un mlclco hidrof6bico "escondido" del agua.

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Estructura de las prolefnas

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Flgun 3-26 Enlaces de hJdnSgeno.

Algunos de los enlaces de hidr6geno (indicados en color) que se pueden fonnar enlJe los amino.kidos de una proterna. Los enlaces peplidicos se presentan sombreados en gris.

117

Figura 3-27 DetaIles de enlaces de hldr6gcno en una prolefna. En esta regi6n de la enzhna lisozima, se forman enlaces de hidr6geno entre dos caJenas laterales [azul), entre una cadena lateral y un ~l.tomo de un enlace peptfJico (amarillo) 0 entre l\tomos de Jos enlaces peptidicos (rojol. Para referenda, vease Figura 3-26. (Seglln CX Mathews y K.E. van Holde. Biochemistry. Redwood City. CA.: Benjamin/Cummings, 1990.)

Las protefnas secremdas 0 las protefnas de la superficie celular a menudo forman enlaces covalelltes adicionales intracatenarios. De forma mas notable, la formaci6n de enlaces dlsuLfuro (tambien denominados enlaces $-$) entre los dos grupos -$H de dos cistcfnas cercanas de una cadena polipeptfdica plegada (Figura 3-28) a menudo sirven para estabilizar la estructura tridimensional de protefnas extracelulares. Estos enlaces no son necesarios para el plegamiento espedfico de las protefnas ya que el plegamiento de las prolefnas normal mente tiene lugar en presencia de agentes reductores que impiden In formaci6n de enlaces S-S. De hecho. muy raramente se forman enlaces S-S (si es que se forman alguna vez) en moleculas proteicas que se hallen en el citosol. ya que la elevada concentraci6n de agentes reductores -SH en el citosol rompe estos enlaces. EI resultado neto de todas las interacciones individuales entre aminoacidos consiste en que la mayorfa de las moleculas proleicas se pliegan espontaneameme adoptando conformaciones caraclenslicas y definidas de forma predsa. Las que sol'l. compactas y g10bulares tienen un mlc1eo interno compuesto de grupos de cadenas laterales hidrof6bicas -dispueslas siguiendo lIna ordenaci6n densa, casi cristalina- mienlras que la superficie exterior, muy compleja e irregular, esta fommda por las cadenns laterales mas polares. La localizaci6n y las caracterfsticas qufmicas de los difercntes atomos de esta intrincada superficie, hacen que cada protefna sea Unica y permiten a la molecula fijarse a otras superficies macromoleculares y a ciertas moltkulas pequeflas (vease mas adelante). Desde los puntos de vista qufmico y estructural, las protefnas son las moleculas conocidas mas sofisticadas.

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Capitulo 3 :·Macromoleculas: estructura, forma e informacl6n

Figura 3-28 Formaci61l de un enlace disulfuro. El dibujo ilustra lao. fonnaci6n de un enlace Jisulfuro (covalentel entre las cadenas lateraJes de residuos de cistefna vecinos. en una proterna.

Diferentes cadenas proteicas presentan esquemas de plegamiento iguaJes22 Aunque l'Oda la infonnaci6n necesaria para el plegamiento de una cadena proleka se halla contenida en su secuencia de aminoacidos, aun no hemos aprcndido a ~Iecr" esta informaci6n y asi poder predecir la estruClUra tridimensional detallada de una proteina a partir de Sll sccuencia. Por consiguiente, la conformaci6n plegada s610 puede ser determinada mediante un elaborado oTllilisis par difracci6n de rayos X de cristales de la prolerna, 0 si la prolc(na es muy pequena por tecnicas de resonancia magnetica nuclear (vease Capitulo 4). Hasla ahora can estas tecnicas se han analizado completamente mas de 100 tipos de protei· nas. Cada una de eslas proteinas tiene una confonnaci6n especffica Ian irregular y complicada que necesitariamos un capitulo entero de esle libro para describir lodos los delalles I.ridimensionales de cada una de cUas. AI comparar las estructuras tridimensionales dc diferentes mol6:ulas proteicas, se pone de manifiesto que, aunque la confonnaci6n completa de cada protefna es unka, cn diferentes regiones de eslas macromolecuJas aparecen repetidos varios esquemas de plcgamicnto. Dos de estos esqucmas son particularmente frecuentes, porque resuJtan de las interacciones regulares par enlaces de hidr6geno entre los prapios enlaces pcptfdicos mcts que entre las cadenas laterales de algunos amino:kidos. Ambos patrones de plegamiento fueron predichos correclamente en 1951 at estudiar los modelos basados en los difercntes esquemas de difracei6n de rayos X de la seda y del cabello. Los dos patrones regulares de plegamienlo descubiertos entonces reciben hoyel nombre de Idmina 13, que se presenla en la fibrofna de la seda, y de helia a, que se presenta en la protema a-queratina de la piel y de sus fonnaciones tales como el cabello, las uiias y las plumas. EI mideo de la mayorfa (aunque no de todas) de las prolefnas globulares presenla extcnsas regiones de Ilbnlna p. En el ejemplo de la Figura 3·29, que mues· Ira parte de una molecula de anlicuerpo, se forma una Idmi"a p onripara/efa

I~ 2.5nm

1 QOC\eN ~ter.1 de un .minokkto .......

y

Figura 3·Z9 La hi-mina 8 es una estruetura frecuente fonnada por zonas de cadenas poUpeptfdkas en las protefnas g1obuJares. En la parte superiorse muestra un dominio de 115 aminoticldos de una moMcula de inmunoglobulina: consiSle en una estructura en fonna de sandwich de dos ltiminas 11, una de las cuales se presenta en color. En la parte inferior se muestra en detaIle una I!mina 11 antiparalela perfecta, siendo R las cadenas laterales de los amin04cidos. O~rvese que cada enlace peptfdico est! unido a traves de un enlace de hidrogeno a un enlace peptfdico vecino. Las estructuras lamtnares reales de Ins prolefnns globulares suelen ser alga menos regulares que la lamina 11 dibuJada aquf, y adem!s la mayana de I"minas se hailan ligeramente defonnadas (v~ase Figura 3-31).

1.39 nm

Eslructura de las prolefnas

119

NN,

IAI

181

cuando una cadena polipeptidica extcndida se pliega sobre sf misma hacia adelanle y hacia atnis, de forma que cada secci6n de la cadena queda orientada en direcci6n opuesta a la de las secciones inmediatas. EslO da lugar a una estructu· ra muy rfgida que se maOliene por enlaces de hidr6geno entre los enlaces pePljdicos de las cadenas vecinas. A menudo lanto las laminas p antiparalelas como las ldmillas p paralelas. estrechamente relacionadas con las anlcriores (rannadas por regiones de cadenas polipeptfdicas que estan orientadas en la misma direcci6nl, actuan como una llama sobre 1a que se estruclura la prolcfna globular. Se genera una hB.lce a cuando una misma cadena polipeptfdica gira regularmente sobre si misma dando lugar a un cilindro rfgido en el que carla enlace peptfdico eSla unida regularmente por enlaces de hidr6geno a otros enlaces peptfdicos vecinos de la cadena. Muchas proternas g10bulares contienen breves regiones de eSlas helices Cl (Figura 3-30). Las porciones de las prolefnas transmembrana que atraviesan la bicapa lipfdica casi siernpre son helices a debido a las constricciOllCS impuestas por el ambiente lipfdico hidrof6bico (veasc Capftulo 10). Normalmente, una Milke a aislacla no es estable par sf sola en ambientes acuosos. Sin embargo, dos helices a idenlicas que presenten una disposici6n repClitiva de cadenas lalerales no polares se enrollan progresivamenlc una alrededor de la otra formando una estruClura especialmenle cslable denominada litlice sllperenrollada (vease p
Las proteinas son moleculas asombrosamente versi1tiles13 Debido a la variedad de las cadenas laterales de sus aminm\cidos, las protefnas son notablemente versatiles en cuanto al tipo de estructuras que pueden fonnar. Veamos. por ejemplo, dos abundantes protefnas segregadas por las celulas del lejido conjuntivo -Ia col
Capftulo 3: Macromol~cu1as:estructura, forma C Informacl6n

Figura 3-30 Una hBlce 0 es olra eslructura rrecuenle ronnada por zonas de la cadena poUpeptldlca de una protcrna. (A) La molecula de mioglobina. cuya funci6n es uansportaroxfgeno, tiene 153 amin~cidos de longilud y presenla una helice a (dibujada en color). (B) Delalle de una helice a perfecta. (C) Como en el caso de la lamina jJ, cada enlace pepddico esnl. unido a un enlace peptfdico vecino a lraVeS de un enlace de hidr6geno. ObsclVcse que para mayor c1aridad en (B) se han ornitido tanto las cadenas laterales Ique sobresalen radialmente a todo 10 largo de la helicey que en (el se sei'lalan como Rl como los <'ltomos de hidrogeno en el carbono IX de cada aminollcido (vease lambien Figura 3-31).

Figura 3-31 Modelos espadaJes compactas de una hellce Q y de una himIna P con (derecha) y sin (lu/lderdnj las cadena' laternJes de sus amlnoacldos. (AI Una helice a (parle de la estruClura de 13

IA)

mioglobinal. {OJ Una regi6n de

lAmina I! (parte de la eslruetura de un dominio de una inmunogiobuJinal. En las rotogrnfias de la izquierda. cada cadena lateral esl
181

colagena estan, a su vez, empaquetadas fonnando fibrillas en las que las molecuJas de colagena adyacenles eslan unidas por enlaces covalentes cruzados entre los residuos vednos de Iisina. dando a las fibriLlas una enorme resislencia a la tensi6n (Figura 3-32). fibrll elhlicll

JJ(m:I~=:::;i:!====E~::;:::;:j[;::0j-secc'6n corte de una 5Onm_l~:i l~. __ fib"UlIdflcolligenll /

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1 1,5nm IAI

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1

EXTENSION

tripl. htil,c;e de

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molkuta de elaslina

~~'"Iaaftruz.do

Figura 3-32 Contraste entre la coL1igena y la elastina. ••••••
Estructura de las prote(nas

RElAJACION

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•••••••

I.'

121

La elastina es un caso que se encuentra en el extrema opuesto. Sus cadenas poJipeptfdicas, relativamente libres y desestructuradas, estan unidas por enlaces covalentes cruzados, generando una trama elAstica parecida aI caucho que permite que tejidos tales como los de las arterias y de los pulmones se defonnen y dilaten sin sufrir ninglln dano. Tal como se ilustra en la Figura 3-32, la elasticidad es debida a la capacidad de las distintas molttlilas prOleicas para desenrolIarse de manera reversible cada vez que se les apUque una fuerza de tensi6n. Hay que destacar que la misma estructura qufmica bAsica -una cadena de aminoo.cidos- pueda formar tantas estructuras diferentes: una trama elAstica semejante aI caucho (elastina), un cable inextensible con una resistencia a la tensi6n semejante a la del acero (coIAgena) 0 cualqujer otra de entre la amplia variedad de superficies catalfticas de las protemas globulares que act(jan como enzimas. La Figura 3·33 ilustra y compara la gama de fonnas que en principio podrfa adoplar una cadena polipeptfdica de 300 aminoAcidos de longitud. Como ya hemos dicho, la confonnaci6n adoptada realmente por una protefna delerminada depende de su secuencia de aminoacidos.

triple htlice

deeol8gena de 29 nO' de longitud

""auae

45 nm de largo

Las prote{nas presentan diferentes niveles de organizaci6n estructuralZ4 AJ describir la estruetura de una protema, resulta (jtil distinguir varios niveles de organizaci6n. La secuencia de aminoAcidos se denomina estruetura prlmaria de la prolefna. Las interaociones regulares de enlaces de hidr6geno entre fragmenlos contiguos de la cadena polipeptidica dan lugar a Mikes a y a lAminas p, 10 eual constituye la estructura secundaria de la prolema. AdemAs, ciertas combinaciones de MUces a y himinas p se empaquetan fonnando unidades g10bulares enlazadas de forma compacta, cada una de las cuales se deoominan domlnlo proteico. Nonnalmente los dominios est1n construidos a partir de una zona de una cadena polipeptrdica de entre 50 y 350 aminoacidos, y parece que son las unidades basicas a partir de las cuales se construyen las prote(nas (v~ase mas adelantel. Mientras que las protefnas mas pequefias pueden presentar un solo dominio, las protemas mayores presentan varios de ellos, nonnalmente conectados por cadenas polipeptrdicas de longilud relativamente variable. Finalmente, los polip~p­ tidos individuales a menudo se asocian constituyendo subunidades de mol~culas mayores, a veces denominadas agregados moleculares 0 romplejos proteicos, en los cuales las subunidades estan unidas entre sf por un elevado mimero de d~bi­ les interacciones no covalentes; en el caso de protefnas extracelulares, a menudo estas interacciones eSlan estabilizadas por enlaces disulfuro. La estructura tridimensional de una vrotefna puede representarse de diferentes maneras. Consideremos la extraordinariamente pequefia protefna inhibidora de la tripsina pancreatica basica (BPTI, de Basic Pancreatic Trypsin Inhibitor), que contiene 58 residuos de aminoacido plegados en un solo dominio. La BPTI puede representarse como una imagen estereosc6pica mostrando todos sus atomos a excepci6n de los de hidr6geno (Figura 3·34A) 0 como un modelo molecular espacial en eJ que la mayorfa de los detalles no puedan observarse de fonna muy clara (Figura 3-34B). Tambien puede representarse de una forma mas esquematica, omitiendo todas las cadenas laterales de los residuos de aminoacidos y todos los atomos reales, de forma que sea foicil de seguir el curso de la cadena polipcptfdica principal (Figuras 3-34C. DyE). Una prote(na de tamano medio tiene alrededor de seis veres mAs residuos de aminoAcidos que la BPTI, y muchas protefnas son de un tamafio mas de 20 veces mayor. Dibujos esquemAticos como e;los son fundamenlales para representar la estructura de protefnas grandes como estas. En este libro se utilizarAn de forma habitual. La Figura 3-35 muestra romo se puede resolver la estructura de una gran pro· tema en diferentes niveles de organizaci6n, consuuyendo cada nivel sobre el anterior de una fonna jertrquica Estos niveles de complejidad organizatIva creciente pueden corresponder a las etapas a traves de las que una protema acabada de sintetizar se va plegando hasta alcanzar su estructura nativa dentro de la relula.

122

Capftulo 3: Macromol~as:estructura, fonna e infonnaci6n

"mine PdII 7>(7)(0,8nm

we.e de 4,3 nm dediAmetro C8'dene extendide de ·100 nm de Iongitud

Figura 3-33 A1gunas Connas y lamaftos que puede presenlar una molkula protelca liplca de 300 reslduos de amInOl(cldos de longltud. La estructura adoptada estll. determlnada por la secuencla de aminoll.cidos. (Adaptado de D.E. Metzler, Bioqufmica. Barcelona: Ediciones Omega SA. 19B1.)

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Figura 3-34 Proteina Inhlbidora de la trlpslna pancrelitlca bulca (BPTI, de Basic Pancreatic Trypsln inhibitor). Conformaci6n tridimensional de esta pequena protefna, vista en 5 representaciones utilizadas habitualmenlc. (A) Representaci6n estcreosc6pica que muestra la posici6n de todos los ;itomos exceplo los de hidr6geno. La cadena principal se presenta en Uncas gruesas y las cadenas laterales en !foeas finas. {BJ Modelo molecular mostrando el radio de van derWaals de todos los atomos (vease Panel 3-1, pags. 96-97). (C) Modelo de esqueleto de alambre compuesto por ]foeas que conectan los carbonos ex a 10 largo del esqueleto polipeptfdico. (OJ uModelo de cinea" que representa todas las regiones de interacciones regulates por enlaces de hidr6geno, en forma de helices (helices a) 0 como grupos de llechas (laminas lJ),las cuales apuntan hacia el extremo carboxilo terminal de la cadena. (E) "Modelo de tubo" que muestra el curso de la cadena polipeptldica omitiendo cuaJquier detalle de ella. En los (res paneles de la pane inferior de Ja figura el motiuo en IlOrqllilla beta se ha dibujado en verde. Tengase en cuenta que el nudeo de todas las protefnas globulares esta dcnsamenle empaquetado de ,homos. Por 10 tanto, la impresi6n de una estructura abiena producida por la observaci6n de los modelos (C), (0) Y{El es enganosa. (8 y C poc conesfa de Richard J. Feldmann; A y 0 por cortesia de Jane Richardson.)

123

dominio

aubunldad proteica (mon6merol estructure H(:underie

estructural8rcierie

Los dominios esttin form ados por cadenas polipeptfdicas que se pliegan adelante y atras, generando delgadas circunvoluciones en la superficie de la protefna2A Un dominio proteico puede concebirse como la unidad estructural basica de una eslructura proteica. EI nucleo de cada dominic esta compueslo fundamentalmente par un conjumo interconectado de laminas p, helices a 0 de ambas casas. Eslas eslructllras secundarias regulares estan favorecidas debido a que permilen la formaci6n de una gran canlidad de enlaces de h..idr6geno entre los alOmOS del esqueleto de la proteina, 10 cual es esencial para estabilizar el inlerior del dominio, donde el agua no es asequible para ronnar enlaces de hidr6geno con el oxfgeno polar del carbonilo 0 con el hidr6geno de la amida del enlace peptfdico. Existe un numero Iimitado de maneras de combinar helices (X con laminas P para fonnar una estructura globular, par 10 que determinadas cornbinaciones de estos elementos, denominadas motlvos, !;e presentan repetidamente en el nue1eo de muchas protefnas no relacionadas entre sf. Un ejemplo de ello 10 constiwye el motjlJO ell 110rqllilla beta encomrado en la BPTI (coloreado en verde en la Figura 3-340). Consiste en dos cadenas j3 antiparalelas unidas por una fina vuella formada por un asa de la cadena polipeptidica. Otro ejemplo es el motiuo beta·alfa-beta, en el que dos cadenas p paraJelas eslan conecladas par un tramo de MLice 0. (Figura 3-36). En el Capi'lulo 9 se comenlan olros motivos comunes, como los diferentes motivos asociados a DNA enconlrados en diversas familias de prOlefnas reguladoras de genes. Varias combinaciones de motivos fonnan el dominio proteico, en el cualla cadena polipeptfdica tiende a curvarse arriba y abajo a 10 largo de lOda la estructura, a veces fonnando una lamina p 0 una helice n, y cambiando de direcci6n suhitamente dando una vuelta cerrada cuando Uega a la superficie del dominic. Como resuhado de ello, un dominio tipico es una eslructura compacta, la superfide de la cual esta recubierta de asas protuberames de cadenas polipeptidicas (Figura 3-37). las regioTles eTl asa, de longitud variable y superficie irregular, a menudo forman los lugares de uni6n para otras moleculas. Debido a que las regiones en asa estan expuestas al agua, son ricas en aminoacidos hidrof(licos, por 10 que frecuentememe se pueden prededr sus posiciones a partir de un estudio detallado de la secuencia de amino:icidos de la proteina. 124

Capftulo 3 : Macromol~ulas: estructura, fonna e lnfonnaci6n

mol6cula proteice (dlmarol estructure cuetarnaria

Figura 3·35 Tres nlveles de organlzacl6n de una protelna. La estruetura tridimensional de una prote{na puede describirse en Il~rminos de diferentes niveles de plegamicnto. cada uno de los cuales se colIslruye sobre el nivel precedenle de una fonna jernrquica Aquf, estos niveles se iluslran utilizando la protefna activadora de catabolito (CAP, de Catabolite Activator Protein). una pro(cfna reguladora de genes bacterianos que presenta dos dominios. Cuando el dominio mayor se une a AMP dc1ico pravoca un cambio de conformaci6n dc la protelna que permite al dom.inio mcnor unirsc a una secuencia especflica dc DNA. La secuencia de aminotkiclos se denomina estrucrura pr;mar;a y cl primer !livel de plegamiemo estructura secunda,ia. Tal como se indica sombreado en amarilto. la combinaci6n de los niveles de plegamiento segundo y tercero mostrados aqui. se denomina habitualmeme esrrucrura rercinria yel roano nivel Oa uni6n de subunidades) estructum cllaternaria de una prolefna. (Modificado de un dibujo de lane Richardson.)

De entre la gran cantidad de cadenas polipeptfdicas posibles, linicamente un nlimeco relativamente pequeno de elias llegaria a sec litH Puesta que cada uno de los 20 aminaacidos es qufmicamenle distinto y cada uno de elias puede, en principio, presentarse en cualquier pasici6n de una cadena proteica, exislen 20 x 20 x 20 x 20 =160 000 pasibles cadenas polipeptfdicas diferentes de 4 aminaacidos de langitud 0, amUogamente, 20" posibles cadenas polipeptfdicas diferenles de " aminmkidos de longitud. Ase se padrfan producir mas de 1(fl90 prolefnas diferentes de una longitud de 300 aminoacidas, es dedr, de un {amana normal. Sabemos sin embargo que tinicamente un pequeno llumero de estas posibles protefnas adopcarfa una conformaci6n tridimensional estable. La gran mayorfa de cadenas tendrfa un gran 1ll1mero de con formaciones diferentes de energfa aproximadamellle igual, cada una de elias con propiedades qufmicas distilHas. Estas protefnas con propiedades tan variables no sedan Ihiles, y par consiguiente, sedan eliminadas por la selecci6n natural durallle el transcurso de la evoluci6n. Las protefnas actuales tienen una estructura y unas propicdades qufmicas sorprendentemente sofisticadas debido a sus propiedades tinicas de plegado. No s610 sucede que la secuenda de aminoacidos es tal que condiciona que s610 resulte extremadamente estable una sola de las conformaciones pasihies, sino que ademas esta conformaci6n tiene la forma y las propiedades qufmicas adecuadas para permitir que la protefna real ice una funci6n catalftica 0 estructural determinada en la celula. Las protefnas estan construidas de una rnanera tan precisa que el cambio de tan s610 unos cuantos alomos de un amino
Figura 3-36 Ejemplo de un mollvo protelco habitual. En el motiva betaalfa-beta, dos cadenas pllralelas adyacentes que forman una lamina ~ estan conectadas a traves de una helice 0:. Como en el caso del motivo de horquilla bela. destacado en la Figur
Normalmente las nuevas proteCnas se desarrollan por alteraciones menores de proteCnas antiguas 25 Las celuJas disponen de mecanismos geneticos que permiten que durante la evoluci6n los genes se dupliquen, se modifiquen y se recombinen. Por consiguiente, una vez se ha desarrollado una protefna con propiedades de superficie titHes, su estruc{Ura basica puede ser incorporada a muchas orras prorefnas. A menudo, las prolefnas de funci6n relacionada aunque diferente, de organismos

'A, £Structura de las protefnas

'81

,e,

Figura 3-37 Modelos de cinlade In eslructura tridimensional de algunos domlnlos de prolefnas organlzados de fonna dlferenle. (A) Citocromo b~. una prote(na de dominio unico compuesto casi completamente par helices 0(B) Dominio que Wle NAD' de la lactico deshidrogcnasa. compuesto poruna combinaci6n de helices (( y de laminas~. (Cl Dominio variable de una cadena ligera de una ilrnmnoglobulina, compuesto por un &1.ndwich de dos laminas~. En estos tres ejemplos las helices a sc presentiUl en v"erde mientras que las cadenas organizadas en laminas ~ se sefialan como flechtlS rojtlS. N6tese que generahnente la cadena polipeplidica cruza hacia adelante y hacia atras a !TaveS de todo el dominio, adoplando curvas cerradas solamente en la supcrficie de la proteina. A menudo las regiolles ell asa (amarillo) oonstituyen los lugares de lmi6n de Olras moleculas. (Dibujos por oortes(a de Jane Richardson.)

125

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149

186

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1111 II

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W .. T.p .. tnptotano V .. r.,.. .. tirosi....

actuales. tienen secuencias de aminoacidos similares. Se ha crefdo que estas familias de protefnas evolucionaron a partir de un gen ancestral unico que durante el transcurso de la evoluci6n se duplic6 dando Jugar a alros genes en los que gradualmente se fuemn acumulando diferentes mutadones. genenlndose asf prolemas con funciones nuevas. Consideremos la familia de las enzimas que degradan prOle{nas (enzimas proleolfticasl denominadas serlna proteasas. que inc1uye a las enzimas digestivas qu.imotripsina, tripsina y elastasa y a1gunas de las proteasas de la cascada enzimc1tica de la coaguJad6n de la sangre y de la fijad6n del complemento. AI comparar dos de estas prolemas se observa que aJrededor de un 40% de las posidones de sus secuendas estc1n ocupadas por el mismo aminoc1ddo (vl!ase Figura 3·38). La semejanza de sus conformaciones tridimensionales, delerminadas medianle crislalograffa de rayos X, es aun mas notable: la mayor parte de los complicados giros y wehas de sus cadenas polipeptidicas. de varios cienlOs de aminoc1cidos. son idl!nlicos (Figura 3-39). EI caso de las serina proleasas se repite en cenlenares de otros casas de familias proteicas. En muchos casos, la secuendas de aminoacidos han divergido mucho mtis que en el caso de las serina proleasas, de forma que no podemos estar seguros de In relaci6n familiar entre dos protefnas sin determinar sus estructuras lridimensionales. Por ejemplo, las protefnas a2 de levadura y la protefna

flgura 3-38 (A) Comparacl6n de las secuenclas de am1noliddos de d05 mlembros de la famUia de enzImas serina proteasas. Se mueslran las zonas carboxilo terminales (aminoacid05149 a 245) de las dos protefnas. Los aminoacidos identicos se presenlan conectados por barras de color y se destaca el residua de serina dellugar activo de la enzima (posici6n 195). En las secciones de la cadena polipepUdica encerradas en cajas amarillas, cada aminoacido ocupa una posici6n espacial allamente equivaJente en 1a estructura tridimensional de las dos enzimas (vease Figunt. 3·39). (B) Los e6digos estandar de una letra y de tres lerras que se utilizan para designar los amino4cidos. (Modificado de J. Greer, Proc. NaIL Acad.. ScL USA. n: 3393-

3397. 1980.)

.

HOOC

aUIMOTIlIPSlNA

(AI

126

181

CapftuJo 3: Macromoll!culas: eslnlctura, (orma e lnfannad6n

Figura 3-39 ComparaclcSn entre las confonnaclones de las dos serlna proteasas presentadas en la Flgun 3-38. La elastasa se presenla en (A) y la quimotripsina en (B). A pesar de que ambas protefnas solamente tienen iguales los aminoacidos que se senalan en vertk, sus confonnaciones son muy similares. E1lugar activo. senalado con un drculo mjo. presenta un residuo activo de serina {vease Figura 3·5n. La quimolripsina presenta mas de dos extremos de cadenas palipepUdicas ya que se forma par la rolura proteolftica del quimotripsin6geno. un precursor inactivo.

IAi

181

• •

NH,

lei levlldur. • • • TfllTlfNWiT!I1i'ifilnf'fiT'l H,NGHRFTKENVRllESWfAKNIENPYLDTKGlENLMKNTSLSI K I RTAFSSEOk~~lK8EINEN-

S COOH

·-RYLTERRROQLSSELGlN

0r0«Jph1l.

angrelada de Drosopllikl son dos proteinas regu1adoras de genes de la familia homeodominio. Solo son iguales en 17 de sus 60 residuos de amino<1cidos. de forma que 5610 resuha evidenle la relaci6n que exisle entre ambas cuando se comparan sus estructuras tridimensionales (Figura 3-40). A menudo. los diferentes miembros de una gran familia de protefnas (ienen funciones baslanles diferentes. Algunos de los cambios de amino:icidos que direrencian estas enzimas fueron seleccionados en el transcurso de la evoluci6n probablemente porque daban tugar a cambios en la especificidad del subslralo y en las propiedades reguJadoras. confirUindoles las distintas funciones que presentan en la actualidad. Otros cam bios de aminoacidos parecen ser "neutros", no teniendo efectos ni beneficiosos ni perjudicales sobre la estruclUra y la funci6n basicas de una prole(na. Pues[Q que la mutaci6n es un proceso aleatorio, tamblen debieron producirse muchos cambios perjudiciales que alteraron la cstructura tridimensional de eslas protefnas 10 suficiente como que resultaran inactivas. Estas prote(nas inaclivas debieron perderse en cuanto los organismos individuales que las producfan se encontraron en una situaci6n de dcsvcntaja y fueron eHminados por la selecci6n ninura!. Por consiguiente no debe sorprendemos que las celulas contengan grupos enteros de cadenas polipeptfdicas annes que lienen ancestros comunes pero funciones diferentes.

figunl3-40 Comparad6n de homodomJnJos de unI6n at DNA de dos organlsRlOSseparados pol' mas de mJl mUlones de mas de evolucl6n. (A) Eslrucrura esquemalica. (8) Localizaci6n de las posiciones de los carbonos Q. las estructuras tridimensionales mostradas fueron delerminadas par cristalografia de rayos Xde la protefna a2 de la levadura (verde) y de la protefna angrelada de Ormopllila (raja). (C) Comparacl6n de las secuencias de amino3cidos de la rcgi6n de las protefnas mostradas en (A) y (B). Los puntos lIaranjll senalan la poslci6n de un inserto de Ires aminoacidos de la proteina a2. (Adaptado de C. Wolberger el at. Cell

67: 517-526, 1991.)

Las nuevas protefuas pueden desarrollarse por recombinaci6n de dominios polipeptfdicos preexistentes26 Cuando una relula ha producido un cierto nurnero de superficies proteicas estables, se pueden generar nuevas superficies con diferemes propiedades de uni6n, mediante la combinaci6n de dos 0 mas protefnas a traves de imeracciones no covalemes, produciendo un complejo prote;co. Este proceso de uni6n de protefnas g10buJares que genera agregados proteicos mayores y funcionales es habitual en las celuJas. Muchos complejos proteicos tienen pesos molecuJares de mas de un mill6n de daltons, a pesar de que un una cadena polipeptfdica tfpica liene un peso molecular de aJrededor de 40 ()()() daltons (entre 300 y 400 amlnoacidos) y de que un numero relativamente reducido de cadenas alcanza un tamaf\o tres veces superior a este. Un camino alternativo de generar una nueva prOle(na a partir de cadenas preexistemes consiste en unir las secuencias de DNA correspondiemes, pradu· ciendose un gen que codifica una larga cadena polipeptfdica unica. Se cree que Estruetura de las protefnas

127

dominio X

dominio A

dominio X

dominio B

las prolefnas en las que diferenles zonas se pliegan de fomla independicnte en dominios g10bulares distinlos, han evolucionado de esta forma, quizas despu~s de existir duranle prolongados periodos de liempo como complejos proleicos fonnados a partir de polip~ptidos independienles. Muchas proteinas (ienen una estructura "muhidominio~ de este tipo, y tal como cabrfa esperar a rafz de las consideracioncs evolulivas mencionadas antes, a menudo ocurre que un punto importante de uni6n a otra molecula se encuentra en ellugar en el que se yuxtaponen dos dominios diferentes (Figura 3-4l). Asi, en el casa de la protefna multidominio cuya eslructura tridimensional se muestra en la Figura 3-42, la superficie prOleica de un dominio que une NAn- aparentemente se combina con la superficie de un segundo dominio que une un azucar, constiluyendo parte de un proceso de evoluci6n de un lugar activo que uriliza NAn- para catalizar la oxidaci6n de un azl1car. Exislc OIra manera, especialmente frecuente en las largas protefnas fibrosas como la colagena, de rculilizar una secuencia de aminoacidos (veasc Figura 3-32). En estos casas se forma lIna estructura a partir de ml1hiples repeticiones inlernas de una. secuencia ancestral de aminoacidos. Es evidente que la uni6n de secuencias de aminoacidos a traves de la uni6n de secuencias preexislcnlcs de DNA codificante es una eslTalegia mucho mas eficaz para la celuJa que la allernativa de oblener nuevas secuencias proteicas mediante mUlaci6n aleatoria del

Figura 3-4l Evolucl6n de un nuevo lugarde unl6n a un Uganda. EI principio general par el cual la yuxlaposici6n en el curso de la evoluci6n de superficies de proteina sepamdas ha permitido incrementar el numero de prolefnas que presentan nuevos lugares de uni6n para alms mol~culas {ligolldos. v~ase pilg. 135}. Como se indica aqui. a menudo los lugares que interaccionan con los ligandosse Iocalizan en la inlerfase enl.re los dos dominios proleicos y estan fonnados por regiones en asa de la superficie de la proleina (~ase tambi~n Figura 3-42).

DNA.

Figura 3-42 Estructura de la endma g1ucoUtica g1iceraldehfdo 3-fosfalo deshldrogcnasa. La protefna est<'i compuesta por dos dominios, (lue aquf sc prcsclllall en colores diferentes. con rcgiones de h(!lice a (represenladas I>or cilindros) y zonas de l<'imina ~ (representadas como flechas). Los detalles de la reacci6n que cataliz..1 eSla cnzima se muestran en la Figura 2-22. N61ese que los Ires substralos que inlerviencn en la reacci6n se unen a la enzima en una regi6n inlermedia entre los dos dominios. (por cortesia de Alan J. WonacOH.)

128

Capitulo 3 : Macromol&:uJas: eslfUClura, forma e informaci6n

•

EGF

PRon::fNA CAP H2N

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REPRESOR LAC HIN"

H:N

COOH

eOOH

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PROTEfNA aUINASA OEPENDIENTE DE cGMP

eOOH

H2N<{l

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•

•

COOH

SU8UNlDAD REGULAOORA DE LA pROTEINA aUINASA DEPENDlENTE DE cAMP HIN CDOH

PlA$MINOGENO HlN • • • • • • COOH

IAI

IB)

100 lImirn>&cidos

Las homologfas estructurales pueden contribuir en la asignaci6n de funciones a las protemas descubiertas recientementeZ1 EI desarrollo de ttknicas de secuenciaci6n nipida del DNA ha penni lido determinar la secuencia de amino<1cidos de un gran numera de protefnas a partir de

las secuencias de nucJe6tidos de sus genes. Asi, el disponer de una siempre credente base de datos sobre protefnas haec posible realizar de forma rutinaria un esrudio exhaustivo pOT ordenador para buscar posibles secuencias hom61ogas enlle la de una prolefna acabada de simetizary las de otr3S protefnas estudiadas previamentc. A pcsar de que, poT ahara, solarneme se han secuenciado un pequeno porcentaje del total de protefnas de los organismos cucariOtas, resuha habimal ya enconlrar que una protefna que se acaba de secuenciar es hom610ga a alguna regi6n de otra protefna conocida, 10 cual indica que la mayorfa de las protefnas pueden descender de un numero de tipos de protefnas ancestrales relativamente reducido. Como era de esperar, a menudo las secuencias de muchas protefnas grandes muestran signos de haber evolucionado a traves de la uni6n de dominios preexistenles generando nuevas combinaciones de ellos, un proceso conocido como barajado de dominios rdomain shuffling") (Figura 3-43). Estos estudios comparativos entre proteinas lambien son imporlantes debido a que normal mente una relaci6n esuuctural supone una relaci6n funcional. Asf, el descubrir una homologfa entre la secuencia de aminoacidos de la protefna estudiada y la de una prote[na de funci6n conocida puede suponer el ahorro de muchos ai\os de investigaci6n. Tales homologfas enlTe secuencias indica ron, por ejemplo, que algunos genes reguladores del cicio celular en celulas de levadura y olros genes que inducen la transformaci6n de celulas de mamffero en celulas cancerosas son protefna quinasas. De eSla forma se pudo reconocer que muchas de las prolefnas que controlan la genesis de la forma de la mosca del vinagre Drosophila son protefnas reguJadoras de genes, mientras que otras protefnas lam bien implicadas en este control se pudieron clasificar como serina proteasas. EI descubrimiento de homologfas entre dominios tambien puede ser uti! en otro sentido. Resulta mucho mas diffcil determinar la estructura tridimensional de una protefna que conocer SU secuencia de aminoacidos. Sin embargo, es 1'0sible intuir la conformaci6n de un dominio de una protefna que se acaba de secuenciar si este dominio es hom61ogo a ouo dominio de una prolefna cuya conformaci6n ha sido determinada anleriormenre par difracci6n de rayos X. Asumiendo que los giros y torcimientos de las cadenas polipeplfdicas estAn conservados en ambas protefnas a pesar de las diferencias que eristan en la secuencia de amino
Estructura de las protefnas

Figura 3-43 Barajado de domlnlos. Durante la evoluci6n de las prolefnas se produjo un extenso harajado de bloques de secuencias de protefna (mddu/os proteicos). En la figura, las zonas senaladas con marC8S de la misma forma y color eslan relacionadas evolulivamenle pero no son id~nticas. (A) La prote£na activadora de gen por catabolilos (CAP, de Catabolile Cen Activalor Prolein) presenta un dominio {lridngliia azul} que se une especfficamente a una secuencia de DNA, y un segundo dominio (rectdngula roja) que une AMP cfclico (v~ase Figura 3-35). EI dominio que se une a DNA esta relacionado con el de muchas olTas prolernas reguladoras de genes, como las protefnas represoras lac y cro. Ademas, se han encamrado das capias del dominio que une AMP ddlco en prote(na quinasas de eucariotas reguladas por la uni6n de nude6tidos cfclicos. (B) Las serina proteasas sernejantes a quimotripsina estan farmadas par das dominios (marro/lJ. En algunas proteasas relaciomldas que estlln fuertemente reguladas y mas especializadas los dos dominias proteasa estan coneclados a uno 0 mas dominios hom6logos a dominios encolltrados en el faclor de crecimiento epidemtico (llexdgollo verde), a la protefna que une calcio (trial/gulo amarillo) 0 aI nominio ~kringle~ (clUldrado azul) que conlienen tres enlaces disulfuro i1uernos.

129

dlmero

Figura 3-44 Formad6n de un dfmero. partlrde un 1010 tJpo de subunJdad protek:a. Una protefna con un solo lugar de uni6n que reconozca una zona de sf misma. a menudo genera dfmeros siml!tricos. Normalmente, estos dfmeros se asoclan con otras subunidades £ormando tetnimeros yagregados mayores (no se muestra).

Las subunidades proteicas pueden ensamblarse

forrnando grandes estrueturas21 Los mismos principios que penniten que varios dominios proteicos se asocien formando lugares de uni6n, tambi~n permiten la formaci6n de estructuras mucho mayores en la c~lula. las estrueturas supramoleculares tales como los complejos enzim~ticos, los ribosomas, los filamentos proteicos, los virus y las membranas no se sintetizan en forma de moltkulas gigantes unidas covalentemente; en Jugar de eUo se forman por agregados no covalentes de muchas moltkulas prefonnadas, que en la estruclura final se denominan subunidades. EI uso de subunidades pequei'las para construir grandes estructuras presenta varias ventajas: (I) la construcci6n de una gran estructura a partir de una 0 aJgunas subunidades menores repetidas reduce la cantidad de infonnacl6n gen~tica necesaria; (2) puesto que las subunidades se asocian a trav~ de mUltiples enlaces de energfa relativamente baja, tanto el ensamblaje como la disgregaci6n resultan f~ci1es de conuolar; y (3) el ensamblaje de subunidades minimiza los errores en la slntesis de la estructwa ya que en el uanscwso del ensamblaje pueden actuar mecanismos de correcci6n que exduyan las subunidades defectuosas.

Figura 3-45 Modelo de clot. de un d£mero formado. partir de dos lubunldades protelClll'lldintlClll'l (mon6men:MI). La prote!na mos[rada es la protefna activadora de gen por catabolito (CAP) de bacteria ilustrada previamente en la Figwa 3-35. (Por cortes!a de 'ane Richardson.)

Un solo tipo de subunidad proteica puede interaccionar consigo misma formando agregados geom~tricos reguJares 29 51 una protefna tiene un lugar de uni6n que es complementarlo de una regi6n de su propia superOcie, se ensamblar~ espontaneamente formando una estructura mayor. En el caso m~s sencillo, un centro de uni6n se reconoce a sf mlsmo y forrna un dfmero slmt!trlco. Muchas enzimas y otras protefnas forman dfmeros de

eJtrueturn ensamDh.d...

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Inillo

de uniOn

130

Cap{tuJo 3: MacromolkuJas: estnletura, forma e lnformacldn

Figura 3-46 Cuando un 1010 tJpo de lubunJdad protelca Interacdon. collligo misma, se pueden generar anWos 0 hiUces. En la Figura-3-S se muestra c6mo se forma una hiLice; se genera un onillo en lugar de una hillce si las subunidades se unen entre eUas, deteni~ndose el crecimiento de 10 cadena.

Figura 3-47 Un marnenlo de acdna. En este imponanle filamento, que se discule en detalle en el C8.pftulo 16, existen aproximadameme dos subwtidades proteicas g10bulares por vuelta. este tipo, que frecuentemente acn1an como subunidades en la formaci6n de agregados mayores (Figuras 3-44 y 3-45). Si ellugar de uni6n de una protefna es complementario de una regi6n de su superficie Que no incluya al propio lugar de uni6n, se formant una cadena de subunidades. Determinadas orientaciones de los dos lugares de uni6n harAn que la cadena se clerre pronto sabre sf misma formando un anillo de subunidades (Figura 3-46). Sin embargo es mas frecuente que se produzca un largo polfmero de subunidades; cuando cada subunidad se una a la siguiente de forma idenLica, las subunidades del poUmero se dispondrtn siguiendo una helice prolongada indefinidamente (vease Figura 3-5). Unfilamento de actina, por ejemplo, es una estructura helicoidal formada a partir de una sola subunidad: una prOlerna globular denominada actina; los filamentos de actina son componemes mayoritarios del citosol de la mayorfa de las celulas eucariotas (Figura 3-47). Como discutimos mas adelan1e las protemas g10bulares tambien pueden asociarse con moltkulas semejantes formando grandes himinas 0 rubos (vease Figura 3-49).

A menudo las protemas superenroUadas colaboran en la construcci6n de grandes estructuras en las C~luJas30 Normalmente cuando la resistencia mectnica es especialmente importan1e, los agregados supramoleculares se consrruyen a paror de subunidades fibrosas en lugar de subunidades g1obulares. Es10S agregados pueden estabilizarse por un gran mlmero de regiones de comaC10S protema-pro1efna que se producen cuan-

l

b.nd. dl .mlno6cldo. hldrof6blco. ".- V "d"

11 nm

J HOOC

COOH

O,!inm IAl

Estruetura de las prolelnas

181

ICI

Flgu ra 3-48 Estructura de una heIke luperenroUada. En (A) se presenta una h~lica a sencilla, con las cadenas laterales de los amino4.cidos sucesivos sef\aladas siguiendo la secuencia de siele elementos "abcdefg" (de abajo a arriba). En esta secuencia los amlno4.cidos ·a" y ·d" colnciden sobre la superficie del cillndro formando una "banda" (seftalada en rajo) que gim lentamenle alrededor de la h~lice a. Tfplcamente, las prolemas que forman h~llces superenrolladas tienen amino4.cidos hidrof6bicos en las posiclones ~a- y ·d~. Por 10 tanIO, como se mucstra en (B), las dos h~lices a pueden enroscarse una sobre la otra de fonna que las cadenas laleralcs hldrof6blcas de una h~lice a" interaccionen con las cadenas laterales hidrof6bicas de Ia otTa, mienuas que las OlraS cadenas laterales, mAs hidroffiicas, quedan expuestas Iibremenle al enlomo acuoso. (C) La cstruClum al6mica de una h8ice superenrollada, determinada por cristalograffa de myos x.. Las cadenas laterales en mjo son hidrof6bicas. (C, de T. Alber, Curr. Opin. Genn. DeveL 2:205-210, 1992. 0 Currem Science.)

131

.-

I'mina amp'qllet.d/l de forma heKagonml

IUbo •

.ubunid8'd

lubo hellcoida'

do las subunidades se enrollan una respeclo a la otra fonnando una hCliee multihebra. Una unidad estruetural particulannenle estable utilizada repctidamenle en esle sentido. es la denominada hellce superenrollada (coiled-coU). Se forma por el apareamiento de dos subunidades de helice a que tienen una distribuci6n repetida de cadenas laterales no polares. Normalmente las dos subunidades de helice a son idenlicas y corren en paralelo (es decir. en la misma direcci6n amino-carboxilo terminal). Se enroUan gradualmeme una alrededor de la otra generando un filamemo rfgido de un dioimetro de unos 2 nm (Figura 3·48). En algunas familias de prolefnas reguladoras de genes las helices superenroUadas actuan como dominios de dimerizaci6n. Mas frecuemememe. una hClice superenrollada puede extenderse mas de 100 nm y actuar como un bloque de construcci6n de una gran estruclura fibrosa. como el filamenlo fino en la celula muscular.

Las prote'nas pueden ensamblarse formando laminas, tubos 0 esferas31 Algunas subunidadcs proleicas se ensamblan formando laminas planas en las que las subunidades sc disponell siguiendo un patr6n de anillos hexagollales. A veces. las protefnas especializadas en trallsporte a IraveS de memhrallas presentan una disposici6n de este tipo en el interior de la bicapa lipfdica. Un pequeno cambio de la geometrra de las subunidades puede hacer que una lamina hexagonal se convierta en un tubo (Figura 3-49) 0, si se producen lllaS eambios, en lIna esfera hueca. Moleculas proleicas tubulares y esfericas quc se uncn especfficamente al UNA y al DNA forman la cubiena de los virus. La formaci6n de eSlructuras cerradas, como anillos, tubos y esferas, proporciona una estabilidad adicional al incremenlar el numero de enlaces que se puedcll formar entre las suhunidades proteicas. Ademas, debido a que estrllclUras como eSlas se forman por interaciones coaperativas mutua mente dependienles entre subunidades, puede inducirse la formaci6n a la disgregaci6n del complejo a Iraves de cambios relativamenle peqllenos que afeclen a las Sllhunidades individuales. EsIOS prindpios quedan ilustrados de forma espectacular en las protefnas cdpsides de muchos virus simples que adoplan la forma de una esfera hueca. A menudo. eSlas cubiertas estan farmadas par dentos de subunidades proteicas identicas que envuelven y protegen el addo nucleico vfrico (Figura 3-50). La protefna de estas c<1psides ha de lener une estructura panicularmenle adaptable, ya que ha de establecer muchos tipos diferel1les de conlaCIOS y tam· bien alterar su dispasici6n para pennitir la salida del addo nucleico al iniciar la multiplicaci6n wrica cuanda el virus ha entrada en la celula.

Muchas estructuras celulares son capaces de autoensamblarse'2 La infonnaci6n necesaria para el ensamblaje de muchas agregados macromole· Clllares celulares ha de hallarse en las propias subunidades. ya que en condido-

132

Capftulo 3: Macromol~ulas:estructura, forma e infonnaci6n

Figura 3-49 Las subunldades proteicas globuJares empaquctadas de forma hexagonal pueden generar tanto una himina plana como un

Ires dlmeros

Pllrt(culll lneomplet.I

1_;0,0

do

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dominio de cortez,

b.uo
partJcul' virica

Figura 3-50 Estructura de un virus esrerlco. En muchos virus se empaquclan subunidadades proteicas idcnticas generando un caparaz6n esferico {una capside) que contiene el genoma vfrico compueslo de RNA 0 de DNA (vcase Figura 6-72). Por razones geomclricas, no se pueden empaquelar de una forma simelrica precisa m6s de 60 subunidades idCnlicas. Sin embargo, cuando pUeden existir pequei'las irregularidades estrucrurales, se pUede generar una capside mayor utilizando m6s subunidades. Por ejemplo, el virus del tomate achaparrado rTBSV, de Tomato Bushy Stunl Virus) es esferico, de unos 33 run de di1metro, formado par 180 copias identicas de una protema de la dpside de 386 amino6cidos y un genoma de RNA de 4500 nucle6tidos. Para formar una c4pside tan grande.la proleina ha de poder colocarse en Ires ambienles alga diferentes, cada uno de los cuales se presenta en color en la panicula de la figura. Tambien se muestra una propuesta sobre el proceso de ensamblaje; la estructura tridimensional precisa se ha determinado par difracci6n de rayos X. (Dibujos par cortesia de Sieve Harrison.)

intlletll

190 dlme.oll

nes adecuadas las subunidades aisladas puedes ensamblarse espont<1neamente en el tubo de ensayo dando lugar a la estruclura final. £1 primer agregado macromolecular del que se dcmostr6 que era capaz de autoensamblarse a partir de sus elementos constituyentes fue cl virus del mosaico del rabaCD (TMV, de Tobacco Mosaic Virus). Este virus es una larga varilJa en la que un cilindro de pro· tefna se halla dispuesto a1rededor de un nucleo helicoidal de RNA (Figura 3·51). Si se mezclan en soluci6n el RNA y las subunidades proleicas disociadas, se ob· serva que se recombinan formando partfculas vfricas completamente activas. EI proceso de ensamblaje es sorprendentemente complejo e incluye la formaci6n de anillos dobles de protefna que actuan como intermediarios que se anaden a la cubierta vfrica en crecimiento. Otro agregado macromolecular complejo que se puede reensamblar a partir de sus elementos constituyentes es el ribosoma bacteriano. Eslos ribosomas es· tan compuestos por unus 55 ll1ol~culas proteicas diferentes y 3 moleculas dire· rcntes de rUNA. Si los 58 componcntes se incuban en condiciones apropiadas, es· pontaneamcnte forman la estructura original. L.o que es mas importantc, estos ribosontas rcconstruidos son capaces de lIevar a cabo sfntesis proleica. Como cabia espcrar, el proceso de rccnsamblaje de los ribosomas sigue una vfa especffica: primero ciertas protefnas se fijan aI RNA; luego, eSle complejo es reconocido por otras prOlefnas, y asf sucesivamente hasta que la estructura esta completa. Todavfa no esta claro c6mo se regulan algunos de los procesos mas complicados de autocnsamblaje. Por ejemplo, parece que muchas estructuras de la c~­ Illla ticncn una longitud exactamente definida, que es muchas vcces superior a Estructura de las prOieinas

133

la de las macromoleculas que las componen. En muchos casos todavfa constiruye un enigma c6mo se consigue esta deterrninaci6n de la longitud. En la Figura 3-52 se Uustran tres posibles mecanismos de este proceso. En el caso mas send110, un nucleo proteico u otra macromolecula proporciona un soporte que determilla el lamano final del ensamblaje. <e es el mecanismo que determina la longitud de la particula TMV en la que el nucleo esta constituldo por la cadena de RNA. De forma similar se ha demostrado que es una protefna de nucleo la que dctermina la longitud de los filamentos finos del musculo y de las largas colas de algunos virus bacterianos (Figura 3-53).

No todas las estructuras biol6gicas se forman par autoensamblaje33 Algunas estructuras celulares mamenidas por enlaces no covalentes no son capaces de autoensamblarse. Una mitocondria, un cilio 0 una miofibrilla no pueden formarse espontAneamente a partir de una solud6n de sus componentes macromoleculares porque parte de la informaci6n necesaria para el ensamblaje es suministrada por enzimas especiales y por otras proternas celulares que realizan la fund6n de plantiUa 0 patr6n y que no aparecen en la estructura final una vez ensamblada. Incluso a1gunas estructuras pequei\as carecen de a1guno de los ingredientes necesarios para su ensamblaje. Por ejemplo en la rormad6n de un pequeno virus bacteriano la estructura de la cabeza, compuesta por un solo tipo de suhunidad proteica, se ensambla sabre un annaz6n transitorio compuesto par una segunda protema. Puesto que esta segunda protefna no aparece en la partfcula vfrica fmal, la estructura no puede reensamblarse espontaneamente despu~s de haber side disgregada. Se conocen olras ejemplos en los que la degradaci6n proteolftica es un paso esendal e irreversible del proceso de cnsamblaje. eSte es el caso de las capsldes de dertos virus bacterianos e incluso de algunos agregados proteicos senciUos, como por ejemplo la protefna estructural colagena y la hormona insulina (Figura 3-54). Sobre la base de estos ejemplos relativamente simples parece muy probable que el ensamblaje de una estructura Ian compleja como una mitocondria 0 un cilio irnplique por un lado una ordenaci6n espadal y temporal suministrada por otros componentes celulares. y por otro procesos irreversibles catalizados por enzimas degradativas.

(AI ENSAMBlAJE SOBRE UN NUCLfO

134

(Sl TENSION ACUMULAOA

lCI PIE DE REV

CapUulo 3: Macromoll!culas: estructura, fonna e infonnacldn

181

Figura 3-51 Estruetura del virus del mosalco del tabaco. (A) Mierograffa electrdnica del virus del mosaieo del tabaco [fMv, de Tobacco Mosaic Virus) fonnado par una uniea larga molecula de RNA rodeada por una cubiena proteica ciHndrica que estA compuesta por una densa disposicidn helicoidal de subunidades proteicas identicas. (H) Modelo que muestra pane de la estruetura del TMV. Una molecuJa de RNA de una sola hebra, de 6000 nucle6tldos, se empaqueta fonnando una cubierta helicoidal consnuida a partir de 2130 copias de una protefna de cubierta de 158 residuas de amino'c1do de longirud. En ellUbo de ensayo a partir de RNA purificado y de molkulas de proteina se pueden autoensamblar partfculas del virus con plena capacldad de Infeccl6n. (A por conesfa de Robley Williams; Bpor cortesia de Richard J. Feldmann.) Figura 3-52 Tres poslbles sistemas a

travts de los que se pUede formar un gran agregado protelco de una longttud delermlnada. (A) Coensamblaje a 10 largo de un nucleo proteico a1argado 0 de otm macromolb;ula, las cuales acnian como dispositivo de med.ida de longitud (H) EI final del ensamblaje se produce debido a la tensl6n que se aeWnula en la estruetUr8 poliml!:rica a medida que se van ai'ladiendo mas subunidades, de forma que a panir de una dena longltud, la energfa necesaria para anadir otra subunidad a la cadena es excesiva. (C) Ensamblaje tipo "pie de rey", en el cuai dos tiposde moleculas semejantes a un rodillo, de longitud diferente, forman un complejo escalonado que croce hasta que sus finales coincideD exactamente.

Resumen LA conf0muu:i6n triLI/mens/annl de una molkukl proleka estd detem,inadn por su semmda de Qminodcldos. LA estrudUm pkgtula estd esMblUuula por intema:iones no colJaknta entre dlferenus ZOtJaS de In caderul polipeptfdiaJ. Los aminodcidos cu)'O residuo es hidrof6bim tientltm a "gruptJIV m eltnterlor de Ia molkula; las inlemcd~ nn I.omles por enlaces de hldr6gmo entre los f!tIlaas peptfdlcos vedlUlS tum lugar a h6lca a y 14minas p. prolefnas RconstTuyen a pal1irde unldadi!:s modulLtres que son reg10nn gtolJlllares conoddas wmo domlnlos; tfpkaltU'nle las proteJnm pequeiUu presenUJn un unico domlnio mientras que las protefnas m4s grande:s tienen oorWs dominios un.idos mITe sf a trtwh de wrtas zonas de lao c:adi'nn polipeptfdka. A medida qUI! las protefnasfueron evoludona~ los domlnlos fueron modifiaindose y rombiJufndos#! ron otros domlnlos co1U~ndoseas( nlmw prote(ruu. Las proteCnas pueden unine entre sf fonnando gra'ules estructuras a travis de las mlsmas fuerzas no coMlenle$ que determinan el plegado de las protefnas. Las

,.',U;#UU

protefmu que presentan lugare. de uni6" para .u propla .uperjkle se pueden en.amblarfonnando dfmero., anillo. cerratlos estmctllras esferlcas 0 polfmero.llellcoldales. Algumu mezda.s th protefnas y th tkido. nudelco• •e puetkn emamblar eS/Jotltdtleamente en 1m tllbo th ensayo produdendo estructllras romplejas pern m,u:Jro. procesos th etlsamblaje pre.entan pasos irreversible. de modo que no todas las e.tnu:turas de la dlula .on capace. th reensamblarse e.ponttfneamente de.· puh de haber .ido disoc:ltufns ell IIU elementos comtltuyentes.

Las protefnas como catalizadores" las propiedades qUfmicas de una molecula proleica dependen casi complela-

mente de los residuos de amin04cidos que quedan expueslos en su superficie y que son capaces de formar enlaces Mbiles no covalenles con otras moJeculas. Cuando una molecu)a proleica se une a otra molecula, a esta segunda moJecula se la denomina Ugando. Puesto que la inleracci6n eficaz entre una molecuIa proleica y un Iigando requiere que se fonnen simult4neamente emre ambas moleculas varios enlaces debiJes, los unJcos Ugandos que se pueden fijar fuenemente a una prolefna determinada son los que se adaptan exactamente a su superficie. La regi6n de una protefna que se asocia con un Ugando recibe el nombre de lugar de unl6n de dicha protefna y suele tener forma de cavidad, constituida por una disposici6n espedfica de amin04cidos en la superficle de la protefna. A menudo estos amin04cidos pertenecen a zonas muy distantes de la cadena polipeptfdica (Figura 3-55) y represenlan una pequefia fraccl6n del numero tOlal de aminoo1cidos presentes. EI resto de la molecula proteica es necesario para manlener la cadena polipeptfdica en posici6n correcta y para sumlnislrar lugares de unJ6n adicionales con finalidad reguladora; normahnente el interior de la protefna unicamente es imponanle en coanlo confiere a la superficie de la molecula una forma y una rigidez adecuadas.

l00"m

Figura 3-53 E1ectronmJcrograf(a del baeterl6rago lambda. La punta de la cola del virus se une espedficamente a una protefna detenninada de Ia superficie de una c8u1a bacteriana, y a conlinuad6n un DNA densamenle empaquer:ado, Siluado en Ia cabeza de:! virus, es lnyectado a Ia U1ula a tra~ de Ia cola del virus. La cola liene una longitud precisa, determinada por eI mecanismo que se muestra en Ia FiguI1l3-52A proJntulin.

G

( zC SH

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Itll.bilindo por

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elimlnKi6n del p6p1ido de unl6n. quedando ,$I un. molkuJ. camp,,", de Insulin.,

La conformaci6n de una protema determina

I.

sus propiedades qufmicas 20 A menudo los residuos superficiales de una proteina interaccionan de tal manera que alleran la reactividad qufmica de algunos residuos detenninados de aminoAcidos. Estas interaciones son de diferentes tipos.

S-SI !

=

7 Figura 3-54 La honnona pollpeptfdka insulina no puede fonnarse de

nuevo de forma espontinea II se rompen sus puentes d1su1furo. se simetiza como una gran prolerna (proinsulina},la cual es dividida por una enzima despu~s de que la cadena polipeplfdica se haya plegado adoptando una forma especffica. La escisi6n de parle de la cadena polipeptldlca de la proinsulina supone una ~rdida irreparable de la infonnaci6n necesaria para que la proteina se pliegue espOnlll.neamente aqoptando su conformaci6n normal.

1

Las protemas como catalizadores

dJ.uJturo

S-S

I, redueci6n "p.r.

irreverslblemenlt

+.

[ las cIos cadenas

SH

SH

.'SH ~i"""-",;SH

SH !

SH )

=

135

Figura 3-55 Lugar de unl6n a llgando de la prote(na activadora de un gen por catabollto (CAP, de Catabolite Gene Activator Protein). La uni6n por enlaces de hidr6geno entre CAP y su ligando, el AMP cfclico (verde) se determind6 por analisis cristalogrMico de rayos X del complejo. Como se indica, las dos subunidades id~nticas del dimero cooperan rormando este lugar de uni6n (v~ase lambi~n Figura 3-45). (por conesfa de Tom Sieitz.)

En primer lugar, zonas vecinas de la cadena polipeptfdica pueden inleraccionar de manera que reslrinjan el acceso de moh~cuJas de agua a olras zonas de la superficie prOlcica. Puesto que las mol~culas de agua tienden a forma enlaces de hidr6geno, compiten con los Iigandos por cienos residuos de amino~cidos de la superficie protcica (Figura 3-56). Por oonsiguiente, la intensidad de los enlaces de hidr6geno (y de las interacciones i6nicas) entre las prolefnas y sus Iigandos queda ahamcnte incrementada cuando las moJeculas de agua son excluidas. A primera vista resuha diffcil imaginar un mecanismo que pueda excluir de la superficie de una prolefna una mol~cula tan pequefla como la del agua sin afectar el acceso del propio ligando. Sin embargo, y debido a su clara tendencia a formar enlaces de hidr6gcno. las moleculas de agua se haHan formando una amptia fed mantenida por estos enlaces (vease Panel 2-1, p~gs. 50-51) y a menudo el separarse de la red e introducirse en una grieta de la superficie proteica resulla energt'hicarnente desfavorabte para las distintas molcculas individllales. En segundo lugar, la agrupaci6n de residuos de aminoacidos polares vecinos puede attcrar Sll rcaclividad. Por ejemplo, si debido at plegamicnto de ta protcfna varias cadenas laterales con carga negativa son inducidas a agruparse, en conlra de su reputsi6n mutua, ta afinidad de cada residua de aminoacido por un ion de carga positiva aumel1la marcadamente. Determinadas cadenas laterales pueden tambien interaccionar una con otra a traves de enlaces de hidr6geno, los cuales pueden activar grupos laterales normalmente no reactivos (como el -CHzOH de la serina, que se mueSlra en la Figura 3-57) transfonnandolos en grupos altamente reactivos capaces de intervenir en reacciones que generan 0 rompen enlaces covalentes delerminados. Por consiguiente, la superficie de cada molecula proteica tiene una reactividad quimica caracterfslica que depende no s610 de las cadenas lalerales de aminoacidos que quedan al descubierto, sino que depende tambien de la exacta orienlaci6n de eslas cadenas el1lre sL Por esta raz6n, dos confonnaciones Iigeramente diferentes de la misma molecula proteica pueden ser enormemente direrentes en cuanto a sus propiedades quLmicas. A menudo, cuando la reactividad de las cadenas laterales resulla insuficiente, las proleLnas utilizan la ayuda de detenninadas molecuJas no polipeptldicas que fijan a su superficie. Estos Iigandos actuan de coenzimas en las reacciones catalizadas enzimaticamente y pueden estar tan fuertemente unidas a la prolef136

CapCluJo 3: Macromol6:ulas: estructura, fonna e infonnaci6n

1l

Figura 3-56 Compelencla por la formacl6n de enlaces de hldr6geno. La habilidad de las moleculas de agua para ravorecer la rormaci6n de enlaces de hidr6geno oon grupos de la superficie de la protefna reduce notablemente la tendencia de estos grupos a unirse unos con otros.

II

I

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(-0'-'

H-N

...... C::::" ~

""I:N

C=C

H

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'-"1/

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H

H

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H-O-CH

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II

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I

2

I H

oa que lIegan a format pane efectiva de la propia prolcfna. Ejemplos de este caso los hallamos en los grupos hema (que contienen hierro) de la hemoglobina y de los citocromos, en la r;ami"a pirofas/ato de las enzimas implicadas en la transferencia de grupos aldehido y en la biotina de las enzimas que participan ell la transfercncia de grupos carboxilo. La mayana de coenzimas son mollkulas organicas muy complcjas, seleccionadas en base a la reactividad qUlmica Que adquieren cuando se unen a 1a 5uperficie de una proteins. Ademas de su lugar reactivo, una coenzima tiene alros residuos que la fijao a su proteina huesped (Figura 3-58). La Figura 3-59A mueslra un modelo espadal compaclo de una enzima un ida a su cocnzima.

EJ primer paso de la cataIisis enzim;itica es la unj6n del substrato35 Una de las fundones m:is imponanlcs de las proteinas consisle en actuar como enzimas. catalizando reacciones qufmicas determinadas. En eSle caso elligando es la mohkula de substrata y la uni6n del substrata a la enzima es un preludio esencial de la reacci6n qufmica (Figura 3-59B). Si denominamos a In enzillla E, al subslrato S y al producto P, la reacd6n basica es E + S ~ ES ;::: EP;::: E + P. A partir de esta simple represcntaci6n de una reacd6n catalizada por una cnzima, podemos vcr que existe un Ifmile a la camidad de subslrato que cada mor.kula de enzima puede pracesar en un tiempo dado. Si se incremcnta In concentraci6n de substrata, la velocidad a la que se forma el produclo tam bien se incrementa, hasta alcanzar un valor maximo (Figura 3-60). En este punta la moltkula de cozima sc halla saturada de substrata y la veloddad de reacci6n (dcnominada Vn'b) depcnde unicamentc de In velocidad a la que sea procesada la malccula de substrata. Est'a veladdad dividida par la concentraci6n de la enzima constituye caenzime

<:entra leKtivo

Las proleCnas como catalizadores

! ...

c -8 '·--HIIIHN? 'N-H:: Q-CH --.r.... \

IBOrdenaclon de los enlacn de hidr6geno

.. \

I

/

c=c

..... I

, .......

Figura 3·57 Un amino;icldo exlraordJnarlamente reactivo en el lugaractivode llDa enzima. EI ejemplo que se muestra es la "triada catalftica· que se preselUa en la quimotripsina, en la elastasa y en Olras serina proteasas (vease Figura 3-39). La cadena lateral del Jidda aspartico induce a la hislidina a eliminar el prol6n de la serina 195,10 cual aCliva la senna para fonnar un enlace covalenle can el substrata de la enzima hidrolizando un enlace peptfdico como se i1ustra en la Figura 3-64.

Figura ]-58 Coenzimas. Las coenzimas, como la tiamina pirofosfato [fPPJ mostrada aquf en gris. SOil l>Cquenas moleculas que se unen a la superficie de una enzima permitiendole catalizar reacciones especfficas. La reactividad del TPP depende de suo Atomo de carbona "acfdico·, que imcrcambia rnpidamente su Atomo de hidr6geno por un Aloma d;carbona de una molecuJa de substrata. Probablemente Otra5 regiones de la molecula de TPP acnian como ~asas· mediante las cuales la enzima manliene ala coenzima en posici6n correcta. Probablemente las coenzimas evoludonaron primero en un "mundo de RNA ~ • donde se unfan a moleculas de RNA para colaborar con elias en los procesos de catAlisis (se discute en eI Capflulo t).

137

Figura 3-59 Modelo! de espaclo Ueno, genendos por ordenadorI de dOl enzimas. En (A) se presenta el c1u)(:romo c unido a su coenzima hemo. En (8) se presenta la lisozima de la clara de huevo, con un substrato oUgosactrido unldo. En ambos casas el Uganda unldo se presenta en mjo. (Por cortesfa de Richard J. Feldmann.)

IAI

101

el m1mero de recambio. A menudo el m1mero de recamhio es de aproximada· mente 1000 mollkulas de substrato procesadas cada segundo por cada mol&:ula de enzima pero puede Jlegar a alcanzar valores mayores en casos extremos. EI otro parAmerro cin~tico utiJizado con frecuencia para cat8cterizar a una enzima es su ~, que es la concentraci6n de substato que permile aJcanzar la mitad de la velocidad mwma de la reacci6n (Figura 3-60). Una KM baja significa que 1a enz.ima alcanza su mAxima velocidad catalitica a una baja concenrraddn del substrata, y por 10 general indica que la enzima se une a su substrata fiUy fuertemente.

Las enzimas aceleran las reacciones estabilizando determinados

estados de transici6n36 Las enzimas consiguen que las reacciones qufmicas se produzcan a velocidades extremadamente allas -mucha mc1s que a traves de cualquier cauUisis sintetica. Esta eficiencia puede ser atrlbuida a varios factores. En primer lugar, la enzima actua aumentando la concentracl6n local de las mol~culas de substraro en ellugar catalltico y manteniendo los alomos adecuados en una orientaci6n correcta para 1a reacci6n que se producira a continuaci6n. Sin embargo, 10 mas imporlame es que una parte de la energfa de fijaci6n contribuye directamente a la catalisis. Antes de formar los productos finales de 1a reacci6n, las mol~culas del substrata pasan a traves de una serie de formas intermedias de geometrfa y distribuci6n electr6nica a1teradas y son las energfas libres de estas rormas intermedias y en especial las de los estad05 de translci6n mas inestables, los principales determinantes de la velocidad de la reacci6n. Las enzimas presentan mayor aft· nidad por estos estados inestables de transici6n de los substratos que por sus

~

138

conc.ntraclon d. lubllrllto-

Capftulo 3: Macromoloculas: estructura, forma e Informacl6n

Figura 3-60 Cln~ca enzlmlhlca. La velocidad de una reacci6n enziImhica (V) aumeRla cuando aurnenta la concentracl6n del substrato, hasta alcanzar un valor mUimo (V..J. En este puntO, todos los lugaTes de unl6n al substrata de las molecuJ.as enzim!ticas I!Stlln ocupados;"y la velocidad de la reaccl6n est! Iimitada por la velocidad del proceso de cal
formas estables, y estas interacciones disminuyen las energfas de los estados de transici6n acelerando as! una reacci6n determinada (Figura 3·61). Una clara demostraci6n de c6mo al estabilizar un estado de transicl6n se puede incrementar enonnemente la velocldad de la reacci6n la constituye la producci6n intencionada de anticuerpos que acttlan como enzimas. Consideremos por ejemplo la hidJ"6lisis de un enlace amida, que es similar aI enlace peptfdico que une aminolicidos adyacentes en las protemas. En una soluci6n acuosa un enlace amida se hldroliz.a muy lentamente mediante el mecanismo ilustrado en la Figura 3-62A. En el compuesto intennedio central, 0 estado de transici6n, el carbono car· bonilo se halla unido a euatro litomos situados en los v~rtices de un tetraedro. Se puede obtener un antieuerpo que actUe como una enzima generando anticuerpos que se unan fueltemente a un anAlogo estable de este compuesto intermedio terraedrico, muy inestable, tal como se ilustra en la Figura 3-628. Este anticuerpo catalftico se une aI compuesto intennedio tetraedrico y 10 estabiliza, incrementando as! mlls de 10000 veces la velocidad de hidr6lisis espontanea del enlace amida.

Las enzimas pueden facilitar la formaci6n y la rotura de enlaces

covalentes a trav6i de una catalisis acida y bcisica simultaneaS7 Las enzimas son mejores cataliz.adores que los antieuerpos catalfticos. Ademlis de unirse fuertemente al estado de transici6n, ellugar activo de una enzima contiene atomos situados en el espacio de fonna precisa que aceleran la reacci6n a1terando la distribuci6n de los electrones de los atomos implicados en la fonna· ci6n y la rotura de los enlaces covalentes. Los enlaces peptfdicos, por ejemplo, pueden ser hidJ"olizados en ausencia de una enzima exponiendo un polipeptido a una base fuerte 0 a un acido fuerte, como se explica en la Figura 3-638 y C. Sin embargo, las enzimas son tlnicas en hacer posible la catAlisis acida y blisica simultanea, ya que impiden que los residuos acidos y bllsicos necesarios se combinen unos con otros (como ocurrirla si estuvieran en soluci6n) aI mantenerlos unidos a la rfgida estructura de Ja protefna (Figura 3-630). Hay que precisar la adecuaci6n entre una enzima y su substrato. Un pequeno cambia introducido mediante ingenierfa gen~tica en ellugar activo de una enzima puede tener consecuencias extraordinarias. Por ejemplo, aI reemplazar illl c1cido g1utamico por un l1cido aspArtico en una enzima se desplaza la posici6n del ion carboxilato catalftico alrededor de 1A (aproximadamente el radio de un l1tomo de hidr6geno), y eUo es suficiente para reducir la actividad de la enzima mis de clen veces.

progreso _ de la raeoei6n eIMugla de 8ctiveci6n pera una reecci6n eelalinda

Figura 3-61 Las enz.lmll5 aceleran las reacclones qubnicas dismlnuye:ndo 1& eoergfa de actJvad6n. A menudo tanto las reacciones no catalizadas (A) como la cataHzada por una enrima (8) se producen a tra~ de diversos estados de transici6n. El eslado de transici6n de mayor energfa (S' y ES') es el que detennina la energfa de activaci6n y Iimita la velocidad de la reacci6n (S=subslrato; P=producto de la reacci6n).

FIgura 3-62 AntJcuerpoa calalfllcos.

(AI HIDROLISIS DE UN ENLACE AMIDA

La estabUizaci6n de un estado de

,

--N-H + H

o~-H

H

IBI ANAlOGO DEL ESTAOQ DE TRANSICIClN PARA LA HIQftOUSlS DE LA AMIDA

o

II _c~/\_

¢'~;>-o NO

,

Las protefnas como catalizadores

energla de actlvecion para una raecei6n no ceta1izllda

0

}-OH

translcl6n por un anticuerpo genera una enzima. (A) La reacci6n de la hlclr6Usis de un enlace amida se produce a lra~ de un imermedio tetraidrico, que es el eslado de Iransici6n de alta energfa de la reacci6n. (B) La mol~ula mostrada a la izquierda se uni6 covaientemenle a una proteina y se utiliz6 como anlfgeno para generar un anlicuerpo que result6 unirse fuertemenle a la regi6n de la mol~u1a sei'lalada en amarillo. Este anticuerpo tambien se une fuertemente aI eslado de Iransici6n en (A), por 10 que actua como una enzima que calaliza eficientemenle la hidr6lisis del enlace amida de la molecuJa que se mueslra a laderecha

139

,,0,

,,0, N

N

0 LENTO

-N H

RAP100

RAPlDO

/C"H

eH

, e,0

d=J , ,0

00

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IN no catjliSl,

181

0

MUY

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~lti.6clda

1<1 caUihsi. bbica

I

101

eatf,litis ik:ida y b'5lU

Ademas, las enzimas pueden incrementar las velocidades de reacci6n formando enlaces covalentes intermedios con sus subslTatos31 Ademas de los mecanismos comentados antes. muchas enzimas aceJeran la velocidad de Ia reacci6n que eataUzan interaetuando de manera covalente con uno de sus substratos, de modo que el substrato queda unido a un residuo de aminoocido 0 a una molecuJa de coenzima. Generalmente cuando un substrata entra en ellugar de uni6n de la enzima. se une oovalentemente a ella y entonces reacciona con un segundo substrato sabre la superficie de la enzima que rompe el enlace covalente que se aeaba de ronnar. AI final de cada cicio de reacciones se regenera la enzima Iibre. Consideremos. par ejemplo. el mecanismo de acci6n de las serina proleasas. La reacci6n que catalizan. la hidr6lisis de un enlace peptidico. esta enormemente acelerada debido a la afinidad de la enzima por el compuslO intennediario tetraedrico de 13 reacci6n. Pero una serina proteasa hace mucho mas que 10 quc hace un tfpico anticucrpo calalilico: en lugar de esperar a que una mollkula de oxfgeno del agua ataque el carbono carbonilo, hace que la reacci6n transcurra mucho Iluis ropidamente ulili7..ando en primer lugar para eSle fin una cadena laleral de un aminoacido siruada en el lugar adecuado (la serina activada de la Figura 3-57). Este paso rompe el enlace pcplfdico pero Iibera la enzima unida eovalentemenle al gnlpo earboxllo. Enlonees, en un segundo paso muy rapido, esle eompuesto intennedio covalellle se destruye por la adici6n catalizada enzimatieamente de una molecula de agua, 10 eual completa la reacci6n y regenera la enzima libre (Figura 3-64). A pesar de que est'a reacd6n en dos etapas es menos directa que la reacd6n en una clapa (en la que cl at;ua se ailadc direemmente al enlace peptfdieo), es mucho mas rapida debido a que cada ctapa liene una energfa de aclivaci6n relativamcnle baja.

Las enzimas aceleran las reacciones qufmicas pero no pueden hacerlas energ~licamentemas favorables Par muy Sofislicada que sea una enzima. no puede haecr que la reacci6n qufmica que calaJiza resulte m~s 0 menos favorable desde el plUltO de vista energetico. La enzima no puede alterar In direrencia de energfa Iibre que exisle entre los substralOS iniciaJes y los prodUCIOS finales de la reacci6n. Como ocurrc en las simples interacciones de enlace antes mencionadas, cuaJquier reacci6n qufmica tiene un puntO de equilibrio en el que los flujos de la reacci6n en arnbas dirccciones son iguales; por consiguienle. en esle punto ya no se produce ninglin cambia nelo de concentrnci6n (vease Figura 3-9). $i una enzima acelera la velocidad de la rcacci6n en un sen lido A + B -t AB en un factor de I ()'I. tambien debe acelerar en un factor de 10' la velocidad de la reacci6n contraria AB -t A + B. EI cociellleentre las velocidades de una y olra reacciones depende unicamente de las concemraciones de A. de B y de AB. FJ punlo de equilibria es siempre exactamente el mismo. independicntemente de si la reacci6n csta catalizada par una enzima 0 no. 140

Capftulo 3 : Macromolb::ulas: estructura. fonna e infonnacl6n

Figura 3-63 Cal3llsls aclda y cat3llsls baslea. {A} EI inicio de la reacci6n no c3taJizada que se presenta enla Figura 3-62A se ha dibujado aqu!. Ulilizando eI sombreado en azul como un indicador esquematico de la diSIribuci6n eloclronica del agua yde los enlaces carbonilo. (8) Un acido tiende a dar un prol6n (H') a Olras .homos. En combinaci6n con el oxigeno del carbonilo, un acido haee que los electrones tiendan a separarse del carbona carbonilo, haciendo que esle 'Iomo alraiga mucho mas fuertememe eI oxfgeno electronegativo de la molecula de agua que ataca el enlace. (C) Una base tiendea caplar 1-1-: en eombinaci6n cun un hidrOgeno de la molecula de agua atacante, una base haee que los eloctrones se desplaeen hacia el oxfgeno de la moll!cula de agua. haciendo que cunstituya un grupo mas reactivo del carbona carbonilo. {OJ AI presentar una dis posicion adocuada de alomos en su superficie. una enzima puede realizar una eal3lisis acida y basica simultaneamcnlC.

...

So,

'I.0-. \\c /C

---CH1

0

I'" /

H ~

~

Hi.;) -'

NH

a'H

---CH1

1

C~NHl

0

---CH 1,

0

~ /C

O-c

'O-C/

,ubslrfllO polipeptfdico

I

a

NH

~

'H

Ita....~COOH

~COOH

H

H"~)

H

tA,

...

inlermedi.,10 'e'rHdrico

-'

HNH

~COOH primer

~ptido

tiber.

H

,.,

,e, Interme(li,rio lelllledllco

So, ---CH 2

,O-C\\ 0

C /

NH~

I

o H

N.

'H

H.. ; )

-'

'0'

H

lEI

Las enzimas pueden determinar el sentido de una vfa acoplando determinadas reacciones a la hidr6lisis del ATp39 La celuJa viva es un sislema quimico que se halla lejos del equilibrio. EI producto

de cada enzima suele actuar como substrato de olra enzima de 1a vfa metab6lica yes consumido rapidamenle. to que es mas importante. por medio de las vfas catalizadas enzimaticamente descrilas en el CapftuJo 2, muchas reacciones son impuJsadas en una direcci6n gracias a su acoplamiemo a la h..idr6lisis energeticamente favorable del ATP a ADP y fosfato inorganico. Para que eSla cstralegia sea efectiva, los niveles de ATP se manlienen en unos vaJores nada ccrcanos a los de equilibrio, con un cocienle elevado entre ATP y sus producloS de hidr6lisis (vease Capftulo 14). Por consiguiente, este acelVO de ATP acnla como una "balerfa de reserva" mameniendo un flujo continuo de alomos y de energfa a traves de la celula a trav~ de vfas determinadas por las enzimas presemes. Para un sistema vivo.la proximidad al equilibrio qufmico significa degeneraci6n y muerte.

Los complejos multienzim.hicos ayudan a incrementar la velocidad del melabolismo celular"O La eficiencia de las enzimas respecto a su fund6n accleradora de las reacciones qufmicas es crucial para el mantenimiento de la vida. En efecto, las cclulas hall de luchar contra procesos inevitables de degencraci61l que avanzan inexorablemente hacia el equilibrio qufmico. 5i las velocidades de las reacdoncs deseables no fueran superiores a las de las recciones opuestas, la celula pronlo morirfa. Midiendo la velocidad de utilizaci6n del ATP podemos tener una idea aproximada de la velocidad a la que se procude el metaboJismo celular. Una celula tfpica de mamrfero recambia (es decir, degrada por completo y substituye) todo su acervo de ATP, cada I 02 minulos. Para cada celula esta renovaci6n representa la utilizaci6n de una 107 moleculas de ATP por segundo (y para el cucrpo humano, aproximadamente un gramo de ATP cada minuto).

Las protefnas como calallzadores

,F)

Figura 3-64 A1gunas enzlmas forman enlaCe!! covalenCe!! con lIUll sublllraCos. En el ejemplo mosrrado aquf, un grupo carbonilo de una cadena polipeptldica (en verde) fonna un enlace oovalente con un re!!iduo de serina activado especfficamenle (vease Figura 3·57) de una serina proleasa (en grisl, el cual rompe la cadena polipeptldica. Cuando la porci6n no unida de In cadena pollpeplJdica se ha ale/lido por difusi6n, se produce un segundo paso en el cual una molecula de agua hidroliza el nuevo enlace covalente fonnado. separando asf la porci6n de la cadena polipeplldica de la superficie de la enzima y liberando la serina para ouo cicio de reacci6n. N6tese que en esta reacci6n los inlcrmediarios tClraedricos ineslables {en tq"ari/lol son los estados de uansici6n, y que ambos son cSlabilizados por In enzima.

141

La velocidad de las reacciones celulares es elevada gracias a la eficiencia de los cataJizadores enzimaticos. De hecho. muchas enzimas importantes trabajan de una forma tan eficiente que es imposible mejorarla: en eslOs casos el factor Jimilante de la velocidad de la reacci6n no es la velocidad intrfnseca de la acci6n enzimatica sino la frecuencia a la que la enzima imeraciona con Sll substrato. De una reacci6n como l!sta se dice que esta limitada por la difllsi6n. 5i una reacci6n esta limjtada por la difusi6n, su velocidad depende de las concentraciones de la enzima y del substrato. Asi, para que una secuencia de reo acciones se produzca con gran rapidez ha de existir una elevada concenlraci6n de cada uno de los intermediarios melabOlicos y de cada una de las enzimas que intelVienen en eUa. Dado el enorme mlmero de reacciones diferentes que se desarrollan en una cl!lula, existen !fOlites a las concentraciones que se pueden aicanzar de los substratos. De hecho. la mayorfa de metabolitos se hallan a concentraciones micromolares (10-4 M) Y las enzimas a concenrraciones mucho menores. tC6mo es posible mamener velocidades metab6licas muy elevadas? La respuesla reside en la organizaci6n espacial de los componentes ce1u1arcs. Las velocidades de reacci6n pueden ser incremenradas sin aumenlar la concentmci6n de los substratos, reuniendo las diversas enzimas implicadas en una secuencia de reacciones y formando un gran complejo proteico denominado complejo multienziJlll1tico. De esta manera. el producto de la enzima A es transferido directamente a la enzima 8, y asr sucesivamente hasla el prodUClO final, con 10 que las velocidades de difusi6n no Iimitan la velocidad de reacci6n ni siquiera cuando la concentraci6n de substrato en toda la celula es muy baja. Estos complejos multienz.imaticos son muy frecuentes (en la Figura 2-41 se mostraba la estructura de uno de eUos, la piruvato deshidrogenasal e intelVienen en casi todos los aspectos del metabolismo, incluyendo los procesos geneticos centrales del DNA y del RNA, y en la sintesis de prote(nas. De hecho es posible que muy pocas enz.imas de las relulas eucariotas difundan Iibremente en soluci6n. Par el comrario, la mayona de las enz.imas pueden haber desarroUado zonas de uni6n que les permitan conccntrarse can otras prot'e(nas de funci6n relacionada en determinadas regiones de la celula, incrementandose asf la velocidad y la eficiencia de las reacciones que catalizan. Las celulas disponen ademas de otro sistema de incrementar la velocidad de las reacciones metab6Ucas. tste depende del enorme sistema de membranas in· tracelulares de las celulas eucariotas. Estas membranas pueden segregar ciertas substancias y las enzimas que aetuan sobre elias, dentro del mismo compartimien to rodeado de membrana, como el reticulo endoplasmacico 0 el nucJeo celular. Si, por ejemplo. e[ compartimienlo oeupa un total de un 10% del voillmen cellllar, la concenlraci6n de los reactanles dentro del compartimienlo ser!o 10 veces mayor que en una celulo similar no compartimentada (Figura 3-65). Las reacciones que podrfan estar Hmitadas por la velocidad de difusi6n. pueden de esta manera incrementar su velocidad en este mismo factor. En el Capitulo 5 se dan mas detalles de In estructura y funci6n de las protefnas. En el se discute de que forma las celulas construyen diminulas maquinas proteicas.

Resumen La jiUl£/(m biol6gica de una protefna tkpende de ins propiedades qufm/CtU thtalla-

dns de su Sllperftcle. Los lugares de "nidn para lignndos estnn constituldos por ctlVldndn de la superfide en IllS Qurles dilWSllS ctJLIenns llItemks se localimn de una formn preci.s:n gmdas al plegtrmieuto de In protefna. Dt!estnfomm, Inscadenas Intemles de am/nodclilos IIornudmellte no reoct;oos puede hallarse activadas. lAs em/mIlS acelemn ellormemente las veIoddndef de las rMccli11ln unJendose a los esUJdos de trans/ddn de alia energfa, de unn fomUl esp«;la/mellte intensa; IlImbUn desarrollan caMIisis dddtu y bdsiCtU ,imultdneamente. A mf'nlldo, Ins velocidatles de las rwu:d.o1U!S enzinuftlCllS son 'Lin rtfpldas que dnialmente esMn lim/tndas por III difiui6m las veloddades putden /ncremenlarse min nufs Illas enzimas que actUnn iii! fomlll • cuenc:ial se halla IInldasfonnando lin m/sma complejo muflienzinufti.co 0 s/ las enzimas y SIU "4bstratos se halllln cvlljiruulas en el m/smo compartimienlo de III ciluIa.

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Capftulo 3: Macromolkulas: estructura, forma e informaci6n

....• .. ... ... .• ...... . ... •••

Figura 3-65 Compartlmentacl6n. Se puede conseguir un gran incremento en la concentraci6n de las moleculas interactuantes al confinarlas en el mismo compartimiento rodeado de membrana. en una celula eucariota.

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Como se estudian las celulas

4

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Las c~lulas son pequenas y complejas. Resulta dificiJ observar su eslructura y descubrir su composici6n molecular, perc todavfa resuJta mc1s diffcil dilucidar c6mo fundooan sus componentes. Lo que podemos aprender sobre las ce;lulas depende de las hcrramientas que tengamos a nuestra disposici6n; de hecho, los mayores avances de la ciencia son frecuentemente fruto de la introducci6n de nuevas tecnicas de estudio. Por consiguiente, para entender la biologfa celular

contemponinea es nccesario conacer alga acerca de estos melodos de estudio. En este capitulo vamos a revisar brevemente algunos de los principales metodos usarlos para esludiar las celulas. Empezaremos con las tecnicas utilizadas para examinar las celulas como un todo y despues continuaremos con las Mcnicas utilizadas para analizar sus constituyentes macromoleculares. Nuestro pumo de partida seni la microscopia; la biologia celular empez6 con la microscopia 6ptica, la cua! todavia es una herramienta esencial, junto con los imaginativos Inventos m<1.s recientes basados en haces de clcetrones y otras fonnas de radiaci6n. Desde la observaci6n pasiva, nos desplazaremos hasta la intervenci6n aCliva: consideraremos c6lllo las celulas de diferemes tipos pueden ser separadas de los tejidos y crecer fuera del cuerpo, y c6mo se pueden romper las celulas y aislar de fonna punl sus orgfululos y constituyemes macromolecularcs. Por ultimo, discutiremos c6mo podemos detcetar, seguir y cuantificar los lipos individllales de moJecuias e iones en el imcnor de la celula. La tecnologfa del DNA recombinante ha revolucionado nuestro conocimicnto sabre la funci6n celular, pero debido a que se lrala de un apartado importame en sf mismo y depende del conocimiento de los mecanismos gcneticos bAsicos, este conjunlo de poderosas metodos se considera en detalle en el Capftulo 7. A pesar de que los mClodos lienen una impollancia bAsica, 10 que rcsulta realmenle interesame es 10 que nos permiten descubrir. Por 10 lanto, proponernos que el presente capflulo se utilice como referenda y se lea en conjund6n con los 11ltimos capftulos dellibro, mas que como una imroducci6n a elias.

Observaci6n de la estructura de las celulas con el microscopio I Una celula animal (fpica mide entre 19 y 20 ~m de di<1.metro, es decir, unas cinco veces menos que la menor partfcula visible a simple vista. Por ella, hasta que no se dispuso de buenos microscopios 6pticos, a principios del siglo XIX, no se descubri6 que lodos los tejidos vegetales y animales son agregados de c~lulas. Este descubrimienlo, propuesto por Schleiden y Schwann en 1838 como la leorla celular, marca el nacimiento formal de la biologia celular. 147

Las c~lulas animales no s610 son diminutas, sino que tambi~n son incoloras y trasllicidas; par ello, el descubrimiento de las principales caracterfstieas inter· nas de las c~lulas dependi6 del hallazgo, a finales del siglo XiX, de diversos colorantes que proporcionaron el contraste sufieiente para haeerlas visibles. A principios de los afios 1940 se desarroll6 el microscopio electr6nico. mueho mas poderoso que el 6pLico. Sin embargo, antes de que su utilizaci6n permiLiera el eonocimiento detallado de las complejidades de la estruetura intema de la celula, se hizo necesario el desarrollo de nuevas tecnicas para la preservaci6n y coloraci6n de las clHulas. Hasta ahora la microscopia depende tanto de las tecnicas para la preparaci6n del especimen como del rendimiento del propio microscopia. En las secciones que siguen, vamos a discutir tanto los instrumentos como la preparaci6n de las muestra, y empezaremos por el microscopio 6ptico. La Figura 4-1 muestra el grado de detalle que puede a1canzarse can la microseopia 6pLica modema en eomparaci6n con el de la microscopia electr6nica. En la Tabla 4-1 se resumen algunos de los hitos hist6ricos en el desarrollo de la microseopia 6ptica. bacterl.

Tabla 4-1 Algunos descubrlmlenlos en In hlstorla de In mlcroscoplll 6ptlca 1611 Kepler sugiri6 una manera de construir un microscopio compueslo. 1655 Hooke miliz6 un microscopio compueslO para descubrir unas pequenas celdiUas en cortes de eorcho, a las que denomin6 ~c~lulas~. 1674 Leeuwenhoek infonn6 de su descubrimienlO de los protozoos. Nueve anos mlis larde observ6 bacterias par primera vez. 1833 Brown public6 sus observaciones microsc6picas de las orqufdeas y describi6 cJaramente elmic1eo celular. 1838 Schlelden y Schwann propusieron la teoria celular. afirmando que la eeluJa nucleada es la unidad estructural y funcional de las plantas y de los animales. 1857 Kolllker describi61as mitocondrias de las celulas musculares. 1876 Abbt: analiz.6los efectos de la difracci6n en la fonnaci6n de la imagen en el microscopio y mostr6 la manera de optimizar el diseno de los microscopios. 1879 Flemming describi6 con gran cJaridad el comportamiento de los cromosomas durante la mitosis de las ct!:lulas animales. 1881 Rettlus describi6 muchos tejidos animales con una precisi6n que lodavfa no ha sido superada por ningun especialista de microscopia 6plica. En las dos dt!:cadas siguientcs, tanto el como CnJai y Olros hist61ogos disei'iaron mt!:todos de tinci6n y establecieron las bases de la anatomfa microsc6pica. 1882 Koch utiliz6 colorantes de anilina para tei'iir microorganismos e idenLific6 las bacterias que causan la tuberculosis y el c6lera. Enlas dos d6cadas siguientes OIrOS bacteri61ogos como KJebs y Pasteur idenLificaron los agentes causantes de otras muchas enfermedades, examinando al microscopio preparaciones tei'iidas. 1686 zeiss construy6 una serie de lelltes, siguiendo las leyes de Abbe, que permitieron a los especialistas en microscopia la resoluci6n de estructuras siluadas en los Ifmiles te6ricos de la resoluci6n de la luz visible. 1898 Goigi observ6 y descubri6 por primera vezel complejo de Golgi, impregnando las ~Iulas con nitrato de plata. 1924 Lacassagne y colaboradores desarrollaron la primer tecnica autorradiogrMica para localizar el polonio radiactivo en muestras biol6gicas. 1930 Lcbedeff disefi6 y construy6 el primer microscopio de contraste interferencial. En 1932 lernieke invent6 el microscopio de contraste de fases. Estos adelantos pennitieron observar por primera vez en detalle c~lulas vivas no tenidas. 1941 Coons utiliz6 anticuerpos acoplados a colorantes f1uorescenles para detectar anlfgenos celuJares. 1952 NomllJ'S1d ide6 y patem6 el sistema de contrasle interferencial para el microscopio 6ptico, que aun lIeva su nombre. 1981 Allen e Inoue perfeccionaron la microscopia 6ptica de contraste vfdeoamplificada. 1988 Se generaliza el uso de los microscopios de rastreo confocal.

148

Capftulo 4: C6mo se estudlanlas celuJas

vln...

ribo.olTll

0.1 om (I

Al

Figura 4· J Poder de resolucl6n. Tamai'ios de las celulas y de sus coml>onentes, dibujados sabre una escala logarftmica, indicando el intervalo de resolucl6n del ojo humano y de los microscopios 6plico y electr6nico. En microscopia se utilizan normaimenle las siguienles unidadcs de longilud: 11m (micr6melro) = I~m nm (nan6melro) = I~m A(unidad AngstrOm) = IOID m

2 ONDAS EN FASE

2 ONOAS OESFASAOAS

Figura 4-2 Interferenda entre oodas lumLnosas. Cuando dos ondas de luz se comhinan enfa.se, la amplilud de 1a onda resultante es mayor y la luminosidad queda incrementada. Dos ondas de luz desfasadas se anulan parclaJmente una a Otnl., produciendo una onda de menor amplilud, y por consiguiente, de menor intensidad luminosa.

OS(;urid.d

,,, EI microscopio 6ptico puede resolver detalles situados a 0,2 J.lrn de distancia 2 En general, un haz de una radiaci6n de una longitud de onda determinada no puede uLilizarse para examinar detalles estructurales mucho mas pequefios que su propia longitud de onda: e5to supone una limitaci6n fundamental de los microscopios. As! pues, el lfmite de resoluci6n de un microscopio 6ptico esta delenninado por la longitud de onda de la luz visible, que abarca desde 0,4 J.1ffi (para el violeta) basta 0,7 J.Lm (para el mjo lejano). En la prnetica, las bacterias y las mitocondrias. que tienen aproximadamente 500 run {O,S ~l de diametro, son las estrueturas mas pcqueiias que se pueden observar nftidamente aI mi· croscopio 6ptico; los detalJes mas pequeiios que estas dimensiones quedan os· curecidos por los efectos de la nalura1eza ondulatoria de la Iuz. Para comprender el porque de este efecto, hemos de estudiar 10 que Ie sucede a un haz de ondas luminosas cuando atraviesa las lentes de un microscopio. Dada su naturaleza ondulatoria. la luz no sigue exactamente la linea recta idealizada de sus rayos pred.icha por la 6ptica geometrica. Por el contrario. cuando las ondas luminosas viajan a traves de un sislema 6ptico 10 haeen por una diversidad de rutas tigeramente direrentes, de manera que se interfieren eOlre elias generando efectos opticas de difraai6n. Si dos trenes de ondas que alcanzan el mismo punto por diferentes caminos estan exaclamente en fase, con coincidencia de las crestas y de los scnos, se refuerzan cl uno al otro aumentando la luminosidad. Por el contrario, si los trenes de ondas estan desfasados, intcrfieren uno con otro y se an ulan total 0 parcialmente (Figura 4-2). La incidencia de la luz sobre un objeto altera las relaciones de fase de las ondas lum..inosas, produciendo complejos efectos de interferencia. A gran aumento la sombra de un borde recto, por ejemplo, iluminado con una luz de longitud de onda unifor· me, aparece como un conjunto de Iineas paralelas. mientras que la de una mancha circular apareee como un conjunto de aomos concentricos (Figura 4-3). Por la misma raWn, observado a lrave. del microscopio un punto aparece como un disco borroso, mientras que dos objetos puntuales prdximos entre sf ofreeen imagenes superpuest'as y pueden Ilegar a confundirse en una sola imagen. La perfecci6n de las lenles, por alia que sea, no puede supcrar esta Iimitaci6n im· puesta por la naturaleza ondulatoria de la Iuz. La separaci6n liJnite a la que dos objetos pueden verse scparados -conocida como lfrn.Ite de resolud6o- depende tanto de la longitud de onda de la luz como de la apertura nwnerica de las lentes del sistema utilizado (Figura 44). En las mejores condiciones posibles: con luz violeta Oongitud de onda, ), = 0,4 ~) Yuna apertura nwnerica de 1,4, ellfmitc de resoluci6n trorico que se puede obtener con el microscopio 6ptico es tan 5610 de 0.2 J.Lrn. Esta resoluci6n ya fue a1canzada por los fabricantes de microscopios a finales del siglo XIX y con los microscopios con· tempor6neos producidos en seric, muy raramente se alcanza. Aunque es posible Obscrvaci6n de la estruclum de las ct!lulas con el microscoplo

•

Figura 4-3 Efectos de borde. F.feclos de inlerferencia observados a gran aumcnto cuando 1a luz pasa por el borde de un ohjelo s6lido colocado entre la ruente de luz y cl ohservador.

149

LEoms

RESOlUCtON: el poder de rlsoluelon de un microscopio depende de Ie emplitud del cono de iluminllciOn Y. por 10 tanto, de I•• lente.

objelivo V oonden.ador. 5e calcule con II f6rmule

IMAGEN

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I. lentl objetivo eolecle un cone de lUI gt:l'Ieflndo unelmegen

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Figura 4·4 Apertura numerica. Paso de los rayos luminosos cuando atraviesan una muestra transparente en un microscopio, ilustrando el concepto de apertura numerica y su relaci6n con ellfmite de resoluci6n.

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e_ m'tad de" .lnchu,. angul" del cono de r.yos oolectedol por I, lente objellvo dude un punla lfpico de I.

muestrelcomo ,. maxima enehur." de 180". I' "Ilor de senD IIliene un

I' Ienle coodenAdor enloea un eooo de ,eyol luminosos en ~ uno de los

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punlOll de te mlHlSlr.

APEI'l'TURA NUMefUCA: en Ia ee::~ .nterior. el nlor n wn9 .. denomll\ll tlpeftUf. numlkica de ~ Ientes IAN) y .. una funciOn 0. 11,1 CIIPKidad de eoI«:c.r I. Iuz. p• .-Ienln MCIIS nt. valor no puede ... ",,'(Of de 1 pero~.. Ienl" sumerQidM .n _ite puede lleQollr .... de 1,4. CUanlO mayor ... III .pertUrll numliriCII

(per. Iw b1l1nu .. ul,llle no<m.lmenta eI velor de 0,53 j.lml milYOl' 85" resoluci6n y I. brillantel de II Imagen \11 ~.nu" es importante en microscopie de fluoresoenci.l. Sin emNrgo. estI ventllja se obtielMl • 'Kpens.. de dillll<'lCiM de Ir.bajo muy tofUS V de profundidlldn de

movimienlo del brllZO del micr6tomo

CIImpo muy pequen...

muestr1l iocluida en

~(Y~~:::;:~'O ~

agrandar una imagen tanto como se desee -po ej .• proyecta.ndola sobre una pantaUa- nunca resulta posible resolver aI m..icroscopio 6ptico dos objetos que esten separados menos de 0,2 ~m: dichos objetos apareceran como uno solo.

Mas adelante podremos ver c6mo la interferencia y la difracci6n pueden ser utilizadas para estudiar celulas vivas sin teiiir. En primer lugar vamos a esnldiar c6mo se pucden hacer preparaciones permanentes de celulas para su observaci6n al microscopio y c6mo se utiJizan los colorantes qufmicos en estas preparadones para incremCIHar la visibiJidad de las estructuras celuJares.

150

Capftulo 4 : C6mo se estudian las cl!lulas

fi~

cinlll de cortes .abre el porUObjelOl, tenidos y monlados con un cubr&objelos

Para la observaci6n microsc6pica, normalmente los tejidos son fijados y seccionados Para hacer preparaciones permanentes que despues puedan ser tei'lidas y visuaIizadas al microscopio, en primer lugar las celulas se han de tratar can un fijador que las inmovilice. las mate y las preserve. En terminos qufmicos, 101 tljacl6n hace a las celulas permeables a los colorantes y establece puentes cruzados entre sus molcculas, de modo que estas queden estabilizadas y bloqllcadas en su posici6n original. Algunos de los primeros procedimientos de fijaci6n consistfan en una breve inmersi6n cn acidos a en disolventes organicos tales como el alcohol. Los proccdimientos acttlales suelen comprender aldehfdos activos, particularmente el formaldehfdo y el glutaraldehfdo, que forman enlaces covalentes con los grupos amino libres de las protc(nas y par 10 lanto forman puentes cruzados entre prolefnas adyacentes. La mayorfa de las muestras de tejidos son demasiado gruesas para que sus relulas sean examinadas directamenle a alta resoluci6n. Por consiguienle. despu~ de la fijaci6n. los lejidos suelen ser cortados en finas rebanadas (secciones). con un micrOtomo, una maquina dOl ada de una cuchilla de melal muy afilada que (unciona de manera parecida a un cortafiambres (Figura 4·5). Las secciones que se utilizan para ser observadas al microscopio 6ptico. normalmenle tienen entre) y 10 ~m de grosor y son extendidas en la superficie de un portaobjelos. Por 10 general los tejidos son muy blandos y fragiles, incluso despu~ de la fijaci6n, de forma que antes de la obtenci6n de los cortes, es necesario IncJuJrlos

cintll de cartn

ocular

lenle objetlve

EXAMEN Al MICROSCOPIO 6POCO

Figura ...5 Obtend6n de secdones de

un telldo. Un lejido induido se corta un micrOlomo, como paso previo para su observaci6n al microscopio

con

6ptico.

en un medio de soporte. Los medios mas utilizados son ceras 0 resinas. En esta· do Hquido, estos medias penetran y rodean todo ellejido; entonces, pueden ser endurecidos (por enfriamiento 0 por polimerizaci6n) para formar un bloque 00lido que pueda ser conado facilmente con el micr610mo. Existe el grave peligro de que cualquier tratamiento ulilizado para la fijaci6n pueda a1terar de manera no deseada la estruetura de la celula 0 sus consliluyentes molecuJares. La congelaci6n rapida proporciona un melodo alternativo que, de algona manera, evita eSle peligro eliminando la nccesidad de fijaci6n y de inclusi6n. EI tejido congelado puede ser conado direclamente con un criOSlato -un micr610mo especial que se manliene en una camara frfa. Aunque, las sec· clones par congelacl6n conseguidas de esta manera lienen la ventaja de evirar algunos artefactos, pueden presenrar otro ripo de complicaciones: la estrllctllra nativa de algunas molt'kuJas como las protefnas estct bien conservada pero normalmente la estructura de las Cellilas se rompe por los crisrales de hielo. Habitualmenle, el paso siguiente aI de obtenci6n de las secciones (por cualquier metodo) es su tinci6n.

Los diferentes componentes de la celula pueden sec tefiidos selectivamente3 EI comenido de la mayorfa de las celulas (de las que el agua represema un 70% de su peso) no presenta demasiados elementos que impidan el paso de los rayos de luz. Por ello, casi todas las celulas en su estado nawral, aunque esten lijadas y seccionadas, son casi invisibles al microscopio 6ptico convencional. Una manera de hacerlas visibles es tenirlas con colorantes organicos selectivos. A principios del siglo XIX la demanda de coloralllcs para tenir los productos de la industria lexlil condujo a un perfodo fe:rul para la qu(mica organica. Se observ6 que algunos de los coloranles teiUan los lejidos biol6gicos y que sorprendentemente, a menudo mostraban una preferencia por determinados componentes de la celuJa -el nueleo 0 las membranas, por ejemplo- haciendo visibles eslas estructuras internas. En la actualidad disponemos de una rica variedad de colorantes organicos, con nombres tan pintorescos como uerde de malaq/lira, negro Suddn 0 azul de Coomassie, cada uno de los cuales presenta una afinidad especCfica por cienos componentes celulares. EI colorante Ilematoxilina, por ejemplo, tiene afinidad por las molt'kulas con carga negativa, y por ello revela la distribuci6n del DNA, del RNA y de las protefnas acidas de la celula (Figura 4-6). No obstante, desconocemos la base qufmica de la especilicidad de muchos colomntes.

Figura 4·6 Una sec:cl6n de leJlda tefiida. Secci6n de piel humana, tenida COli una combinaci6n de coiorantes, hemalOxiiina y rosina, que se utilizan habilualmente en histologl'a

Observaci6n de la estructura de las celuJas con el microscopio

151

Flgura4-7 Sistema6ptkodeun modeIno mk:ro8ropio de OUOl't!lilOenda. FJ juego de flItros consla de dos fLItros de

FUENTE

3 Ngundo filtro de corte; eUmlne las Hllal.. de fluorll5Cflr'H:ia no deNedes y deja pllSllr Ie fluorllllC&ncla verde de emisiOn, de 520 a 560 nm

H

OELUZ • •

2

et98Jo de renurA ordenadas: r.lleiela Iw de Iongilud de onda

2

menor de 510 om pe.o lransm;le la lut de longilud de onda _ _---' aupefior a510 nm 1

pri~

corte (I Y3J y de un espejo dicrok:o (de nmUl1lS ordenadas) (2). En esl.e ejemplo se mue:strn un juego de 61tros adewado para la detecci6n de Ia f1:uoresc::encia de la Ouorescefna. En esle Iipo de microscopios es especialmente importanle que la lenteobjet.ivo tenga

una elevada apenura numerica, ya que para una amplificaci6n dada la brillantez de la imagen fiuorescenle es proporcionaJ a la CUarla palencia de la apenura nu~rica ('I6lse tambien Figura4-4).

filtro de corte: unoc.ment.

deia pasar Ie Iu.t lllul de una

Iongilud de onde entre .50 y ~ nm

lente objetivo

~o_o

La relativa (alta de especificidad de estos colorantes a nivel molecular ha esti· mulado el disefto de procedimienlos de linci6n mas racionales y seleclivos y ha permitido en particular el desarrollo de m~todos que revelan protefnas espedficas y olras macromoleculas celulares. Existe. sin embargo, el problema de consegulr una sensibilidad adecuada para estos prop6sitos. Como una c~lula cualquiera prescnta pocas copias de cada una de la mayorla de las macromol&:ulas, a menudo una 0 dos molecuJas de colorante unidas a cada macromolecuJa resultan invisibles. Una posibWdad de resolver este problema consiste en incrementar eI numero de molecuJas de colorante asociadas a cada macromol&:ula individual. Asf, a1gunas enzimas pueden ser locaJizadas en las oHulas mediante su actividad catalftica: cuando son expuestas a un substrato molecular apropiado. cada mol~­ cula de enzima genera muchas mol&:ulas visibles de producto, las cuales pueden ser localizadas. Un m~todo alternativo al problema de la sensibilidad consiste en la utilizaci6n de compuestos Ouorescentcs, como explicamos a continuaci6n.

Mediante Ia microscopia de fluorescencia se pueden localizar moMculas en las c~lulas de forma especffica· las moleculas nuorescentes absorbcn la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda mas larga. Si un componente de este tipo es i1uminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a trav~ de un filtro que sdlo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo OSCUto. La intensidad y el color de la luz es una propiedad caracterfstica de la molecula nuorescente utilizada. Los colorantes Ouorescentes utilizados para la tinci6n celular son detectados con la ayuda del mlcroscopio de Duorescencia. Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepci6n de que la luz incidente, procedente de una potente fuente, atraviesa dos series de filtros -uno para interceptar la luz antes de que lIegue a la muestra yotro para filtrar la Iliz obtenida a partir de la muestra. EI primer mtro se selecciona de manera que s610 permita el paso de las longitudes de onda que excilan a un dcterminado colorante nuorescente, mientras que el segundo filtro bloquea esta luz y permite el paso de las longitudes de onda emitidas cuando el colorante emite nuorescencia (Figura 4-7). la microscopia de fluorescencia se utiliza habitualmente para detectar especfficamente protefnas u otras moleculas en c~lulas y tejidos. Una tecnica muy 152

Capftulo 4: C6mo se estudian las c~luJas

eo

fluore_lna lverdel

tetremetilrodemin8lrojel

Agura4-8 CokwantesOoorescentes. Estruetura de 13 ftoorescefna y de 13 tetramelilrodamina, dos coIonmles ulilizados habilualmenle en mkroscopia de Ouorescencia. La ftuoresceina emile luz amariIJo.\'crdosa cuando se aetNa con luz de una Iongitud de ollda... adecuada. micntrns que 13 rodamina emile luz raja. Las zonas de las mol6culas que sesei'laJan en "amnja indican la posici6n de un grupa qufmicamente

reactivo; nonnalmente. en esta posici6n se fonna un enlace covaJenle entre el coloffintc y una protefna (u oU'a molecvla). Direromes versiones comerciaJes de estos coloranles con difcrentes tiposde grupos reactivos permilc utilizarlos axno diana de grupos -SH 0 de grupos -NH z de prolefnas.

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utilizada y potenle consisle en acoplar covalentemenle un colorante fluorescente a mol~las de un anticuerpo, el cual se puede utilizar entonces como un reactivo muy especffico y verscitil que se une selectivamente a las macromol~ulas que reconoce en las c~lulas 0 en la matriz extracelular. Con esta finalidad, frecuenlemente se utilizan dos colorantes tluorescentes: lafluorescelna, que cuando es excilada por luz azul emite una tluorescencia amarillo-verdosa intensa, y la rodamina, que cuando es excitada con una luz verde-amarilla emile una fluorescencia de color rojo inlenso (Figura 4-8). Acoplando una mol~uJa a la fluorescefna y otta a la radamina, en la misma celuJa puede delenninarse la dislribuci6n de dos molecuJas diferentes; ambas mol~las son delecladas separadamente en el microscopio cambiando las dos series de mtros, uno especffico para cada colorante. Como se mueSlra en la Figura 4-9, de la mjsma fonna se pueden utilizar ttes coloranles fluorescenles para distinguir tres tipos de mol~culas en la misma c~lula. Acrualmente se han desarrollado importanles melodos, que expljcaremos posteriormenle, que capacilan a la microscopia de fluorescencia para seguir cambios en la concentraci6n yen la locaJjzaci6n de moleculas especfficas en el interior de la celula lIiva (vease pag. 195).

Las celulas vivas se pueden observar con nitidez en un microscopio de contraste de fases 0 de contraste de fases interferenciaJ2. s La posibilidad de que algunos componentes de la celuJa puedan perderse 0 distorsionase durante la preparaci6n de las muestras no ha dejado de preocupar a los especialistas en microscopia. La unica solud6n a eSle problema es examinar

(A)

luz Incident!

(8)

Observacl6n de la eslructura de las ceJ.ulas con el microscopio

tuz incid!nte

Figura 4-9 Mlcroscopla de fluorescencla. Micrograffas de una zona de la superficie de un embri6n temprano de Drosophila, en el que se han marcado los microlubulos con un anticuerpo acoplado a Duorescelna (panel de la iulllierda) y los filamentos de aClina con un anlicuerpo acoplado a rodamina (panel centra/). Ademots, los cromosomas se han marcado con un tercer colorante que unicamenle emite Duorescencia cuando se une a DNA (panel de la derecha). En este estadio, lodos los nucleos del embri6n comparten un mismo citoplasma. y est4n en el estadio de melafase de la mitosis. Las tres micrografias fueron tomadas en la misma regi6n de un embri6n fijado, utilizando Ires juegos de filtros diferentes en el microscopio de Duorescencia (vease lambi~n Figura 4-7). (Porconesla de Tim Karr.)

Flgura4-10 Dosslstemaspara Incrementar el contraste en el mlcroscoplo 6ptlco. En (A), las zonas tel'lidas de la ccluJa reducen la amplitud de las ondas Juminosas de una longitud de onda determinada que pasan a traves de ellas. De esta forma se obtiene una imagen en color de la c~Hula. visible mediante la observaci6n habituaL En (B), la luz que pasa a trav6l de la c~lula viva, no leftida, no suITe ningUn caQlbio importanle de amplitud y. por consiguiente, muchos de sus detalles no se pueden observar directamente, aunque se amplifique enonnemente la imagen; sin embargo, se producen cambios de lase en las ondas luminosas cuando estas pasan traves de la c~lula. y estas alleraciones puedcn hacerse visibles aprovechando efectos de interferencia utilizando un microscopio de contraste de fases 0 de oontraste de fases interferencial.

153

las celulas mientras aun estdn vivas. sin ninglin tipo de fijaci6n ni de congelaci6n. Para este prop6sito son utiles microscopios con sistemas 6pticos especiales. Cuando la luz pasa a trav~ de una celula viva, la rase de la onda luminosa varfa en relaci6n aI fndke de refracci6n de la celula: la luz que pasa a trav~ de una zona relativamenre gruesa 0 densa de la celula. como por ejemplo el nucleo. se retrasa y su rase queda desplazada de ronna correspondiente respeclo a la de la luz que ha pasado a traves de una regi6n adyaceme de ciloplasma. mds fina. E! mlcroscoplo de conlrasle de fases y el mlcroscopio de conlrasle de fases Inlerferencial aprovechan los erectos de intenerencia que se producen cuando se combinan estos dos grupos de ondas. creando de esla forma una imagen de la eslructura celular (Figura 4- 10). Ambos tipos de microscopios 6pticos se utilizan habitualmente para visualizar celulas vivas. Una manera mtis sencilla de observar algunas de las caracterfsticas de una celula no tef'lida consiste en utilizar luz dispersada por sus diversos componentes. En el mlcroscoplo de campo oscuro, los rayas luminasas del sistema de Buminaci6n son dirigidos dcsde la parte lateral, par 10 que s610 penelra en las Icnles del microscopic la luz dispersada. Por consiguiente. la ct'Hula aparece como un objelo i1uminado sabre un fonda negro. La Figura 4-11 muestra im<1genes de una misma celula oblenidas mediante cuatro tipos diferentes de microscopios 6pticos. Una de las grandes vcmajas del microscopio de contraste de fases, del microscopio de contraste de fases interferencial y del microscopic de campo oscura estriba en que los tres permiten observar las celulas en acci6n y estudiar los movimicntos implicados en procesos como la mitosis 0 la mjgraci6n celular. Puesto que muchos movimientos son demasiado lentos para ser observados a tiempo real, normalmente resulta uti! hacer peliculas 0 vfdeos por el sistema de aceleraci6n de movimiento (microcinematografia). En estos casos. se tOlllan fotograffas sucesivas. separadas por breves perfodos de tiempo. de modo que cuando la pelfcula 0 el video registrados se proyeclan a la velocidad normal los acontecimjenlOS aparecen muy aceJerados.

Mediante l~nicas electr6nicas las imagenes pueden ser amplificadas y analizadas6 Reciemememe. los slslemas electnSnicos de imagenes y la tccnologfa asociada de procesamlento de imligenes han tenido un impaclo importame en la microscopia 6plica. No 5610 han permitido superar ciertas Iimhaciones prticlicas de los microscopios (debidas a limilaciones en el sistema 6ptico). sino que tambien han superado dos limllaciones fundamenlales del ojo humano: el ojo no 154

Capflulo 4: C6mo se estudlan las ce:Julas

Flgur. 4-11 Cuatro tipos de mlcroscoplo 6ptk:o. (1\) Imagen de un fibroblasto en cultivo obtenida mediante la transmision directa de luz a ltavl'!s de la cl'!lula, locnica conocida como micrCJSCOpia de campo claro. Las otras imll.genes fueron obtenidas Ulilizando las tl'!cnicas descritas en cI texlo: (8) microscopia de contraSle de rases; (0 microscopia de contrasle de fases inlerferencial de Nomarski: y (O) microscopia de campo OSCUTO. Con los microscopios mll.s modemos se pueden oblener los cuatro tipos de imll.gcnes, simplememe cambiando algunos de los sistemas opticos.

•

puede ver luz extremadamente Mbil y no puede pcrcibir pequeflas direrencias en intensidad de luz sobre un rondo brillante. El primero de estos problemas puede solucionarse adaplando a un microscopio una clmara de vfdeo altamente sensible a la luz (del tipo de las que se utilizan para vigilancia nocturnal. Con eUa es posible observar relulas durante largos perfodos de dempo y con muy baja inlensidad de luz, evitando de esta manera los erectos dai'iinos de la 102 intensa (y caliente) prolongada. Estos sistemas de illtellslfu:addn de inufgenes son especialmcmc importantes para visualizar molfkulas fluorescenles en las eelulas vivas. Dado que las imoigenes producidas por las clmaras de video son de tipo electr6n.ico. pueden ser digitalizadas, imroducidas en un ordenador y procesadas de varios modos para extracr inrormaci6n latente en estas imligenes. Este procesamiento de fa imagen haee posible la eompensaci6n de los fallos 6ptieos de los mieroscopios, pudiendo alcanzar el limite te6rico de resoluci6n del microscopio 6ptico. Por otra pane, utilizando sistemas de video acoplados a procesadores de imagenes puede incrementarse el contraste, superandose las limitaciones del ojo en la detecci6n de pequefias diferencias. A pesar de que este procesamiento tambi~n incrementa los efectos aleatorios de las irregularidades del sistema 6ptico, este "ruido" puede eliminarse electr6nicamente restando una imagen de un area cn blanco del campo de observaci6n. De esta manera, pequefios objetos transparentes que antes eran imposibles de distinguir del fondo, pueden ser visibles. EI alto contraste alcanzable en la microscopia de inlerferencia asistida por ordenador haee posible la visualizaci6n de pequefios objetos tales como microtubulos (Figura 4-12), los cuales tienen un diametro de 0,025 p.m, menor de una dfk.ima parte de la longhud de onda de la lux. Los micronibulos individuales tambien pueden ser vistos en un microscopio de fluorescencia si previameme han sido marcados con Ouorescencia (vease Figura 4-62). En ambos casas, sin embargo, los inevitables efectos de difracci6n dan una imagen a1tamente borrosa, de fonna que estos microrubulos aparecen con un wametto de at menos 0,2 J1Ol, 10 cual haee imposible distinguir un microtUbuio sencillo de un haz de varios microtubulos.

Gracias al microscopio de barrido confocal es posible obtener im~genes de complejos objetos tridimensionales 7 Como hemos visto, para poder ohselVar un tejido aI microscopio 6ptico convencional, se ha de conar en ~cciones; cuamo mds £inas sean las secciones mas definidas seran las imagenes. En el proceso de oblenci6n de las secciones, sin embargo, se pierde informaci6n respecto a la tercera dimensi6n. i,C6mo entonces se puede obtener una imagen de la arquitectura tridimensional de una celula o de un lejido? i,C6mo se puede ver la estrucrura tridimensional de una muestra que por una u otta raz6n no puede haber side previamente cortada en secciones? $i se observa una muestra fina con un microscopio 6ptico convencional, la imagen obtenida al enfocar un nivel determinado resuha degradada y borrosa por la informaci6n que queda fuera de foco de las zonas de la muestra situadas encima y debajo del plano focal. A pesar de que este problema se puede superar mediante complejos procesadores de imagenes apJicados a las im<1genes de los diferentes pianos locales, el metodo resulla leoto y COSIOSO desde el punlo de vista infonn<1tico. EI mlcroscoplo de barrldo confocal aporta otta soluci6n, mAs direcla, para conseguir el mismo resuhado final: utiliza metodos electr6nicos de imagen que permiten enfocar un plano escogido de una mueSlra fina eliminando 1a luz que proviene de las zonas fuera de foco superiores e inferiores a esle plano. Asf se obtiene una imagen nftida de una fina sea:i6n 6pricn. A panir de series de secciones 6pticas de este tipo oblenidas a diferentes profundidades, archivadas en un ordenador, resulta sencillo reconstruir una imagen tridimensional. El microscopio de barrido confocal es para los microscopistas 10 que la TAC (tomograffa axial computadorizada) de barrido fue (par diferentes razones) para Obscrvaci6n de 1a eslructura de las celulas oon el microscoplo

Figura 4-12 AmpUando los Umltes de al microscopio eJectronico de microtUbuios no ten.Jdos, visualizados por microscopia de contraste de fases interferencial seguida de un procesamiento e1ectr6nk:o de iml1genes. W Imagen original no proct:sad.a. (B) Resultado final del proceso electr6nico que incrementa marca.damente el contrastey roouceel Mruido M . Apesar de que los microlubulos unicamente lienen O,0251J.rn de dil1metro, aparecen como unos ftJamentos mas gruesos debido a efectos de difracci6n. (Par oortesfa de Bruce Schnapp.) detecd6n.im~enes

155

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181

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de Ia muestnl estll en loco. se enfOCil en el diafragma If alcanza II detector

Ia Iw q.... procede 0&1 rMlo de punlas de t, muestt. estin hler. de foco del diafragma. pof 10 q.... _'n e>«;luidoa cui compleu~del

detector

Figura 4-13 El mlcroscoplo de barrldo confocal de fluorescencla . Este simple diagrama muestra que la disposid6n basica de los componentes 6plicos es similar a la del microscopio de fluorescenda esltndar mostrado en la Figura 4-7, exceptoen que en ~stese utiliza un laser para i1uminar una pequei'ia mancha de luz cuya imagen se enfoca en un solo punto de la muestra (A). La Ouorescencia emitida par este punto de la mueslra se enfoca en un segundo (confocal) diafragma (8). La IlIZ emilida par el resto de la muestra no se enfoca en este diafragma, por 10 que no contribuinl. a fonnar la imagen final (q. Mediante un barrido de 1a mancha de luz par tada la muestra se obliene una imagen bidimensional rouy tina exactamente del plano de foco, la cual no estJi. degradada significativamente par 1a IlIZ procedente de otras regiones de la muestra.

los radi61ogos para estudiar el cuerpo humano: ambos sistemas proporcionan imagenes detalladas de secciones del interior de una estructura intacta. Los detalles 6plicos del microscopio de barrido confocal son complejos. pero la idea Msica cs sencWa. como se i1ustra en la Figura 4-13. Generalmenlc el microscopio utiJiza una 6ptica Ouoresceme (~ase Figura 4-7), pero en lugar de illlminar tada Ja muestra a 1a vez. como se haec habitualmente. en carla inslanle el sistema 6ptico enfoca un pequeno punto luminoso en una profundidad detcrmi· nada de la muestra. Se necesila una fuente de lux que produzca puntas luminosos muy briJlantes; habitualmente se utilizan fuentes laser cuya luz haya pasado a traves de un diafragma. La fluorescencia emitida par el material iluminado se recoge y produce una imagen a la entrada de un detector de luz adecuado. Sc coloca un diafragma en el detector, en ellugar que es confoctll con el punto luminoso ~ue es precisamente donde los rayos luminosos emitidos por el punta iluminado de la muestra estan enfocados. Asi, la luz de este punto de la muestra converge sobrc esta apertura y entra en el detector. Conlrariamente, la luz que proviene de las regiones fuera del plano focal del punto luminoso tambien eSI<1n fuera de foco en el diafragma, por 10 que resulla ell gran manera excluida del detector (Figura 4-14). Para oblener una imagen bidime:lsi~n?, se recoge secucncialmcnte la infonnaci6n de cada punto luminoso de p ana focal mediante un barrido par todo el campo a observar (como ocurre en una pantalla de televisi6n) y se presenta en Figura 4-14 Comparacl6n entre la mlcroscopla convenclonal y la confocal. Estas dos micrografias proceden del mismo embri6n intaeto de DrosopfliJa en eslado de g4,slrula, tenido con una sonda Ouorescente para filarnentos de aClina. La imagen convendonal no procesada (A) resulta borrosa debido a 1a presencia de eslrueturas fluorescentes situadas par encima y par debajo del plano focal. En la imagen confocal (B) esla infonnaci6n fuera de foco se ha eliminado, resultando una bien definida secci6n 6ptica de la ~Iula del embri6n. (Por conesfa de Richard Warn y Peter Shaw.)

156

Capftulo 4: Cdma se cstudian las relulas

Tabla 4·2 Prlnclpales aconteclmlentos en la evolucl6n del mlcroscoplo electronloo y de su apIJcacl6n a la blologfa celular 1897 I.J. Thomson anunci61a exlstencia de partfeulas cargadas negativamente. ml'is

tarde denominadas eEoclranes. 1924 de BrogUe propuso que un electr6n en movimiento tiene un comportamient'o

ondulante. 1926 Busch demostro que era posible enfocar un haz de electrones utilizando una

1931 1935 1939 1944 1945 1948 1952

1953

1956

1957 1957

1959 1959

1963 1965 1968 1975

1979

lenle magn~tica cilfndrica. Asf estableci610s fundarnentos de la 6ptica electr6nica. Ruska y colaboradores oonstruyeron el primer microscopio electr6nico de tl'ansmisi6n. Knoll demostr6 que era posible construir un mieroscopio electrdnico de barrido. Tres ailos mlis tarde. Von Ardenne construy6 un prototipo. Siemens constnlyd el primer mieroscopio electr6nico de transmisi6n oomercial. WUllams y Wyckoff introdujeron la t~nica de la metalizaci6n de las muestras. Porter, Claude y Fullan utilizaron el microscopio eleeu6nico para observar dlulas cultivadas. despu~ de fijarlas y contrastarlas con 0506' Pease y Baker obtuvieron cortes finos (0,1·0.2 J.lm de grosor) de material biol6gioo. Palade, Porter y Sj&trand desarrollaron m~todos de fijaci6n y de obtenci6n de cortes uhrafinos que permitieron observar por primera vez muchos organulos intracelulares. En una de las primeras aplicaciones de estas t~nicas. H.E. Huxley demostro que el muscuJo esquel~tico contiene ordenaciones superpuestas de flJarnentos proteicos. apoyando asf la hip6tesis de los ~fiIamentos deslizantes~ de la contracci6n muscular. Porter y Blum diseilaron el primer u1tramicrdtomo que foe ampliamente aceptado. incorporando muchas de las caraeteristicas introducidas con anterioridad por Claude y SJ&trand. Glauert y colaboradores demostraron que la resina epoxi Amldire era un medio de inclusi6n altamente efieaz para la microscopia electr6nica. Cinco ailos mas tarde. Lun introdujo otTa resina Epa" para la inclusi6n. Robertson describi61a estructura trilaminar de la membrana eelular, observada por primera vez at microscopio electrdnico. Las t~nicas de criofractura desarrolladas inicialmente por Steere fueron perfecdonadas por Moor y MiihJethaier. Mas tarde (1966), Branton demostr6 que la criofractura permite visualizar el interior de la membrana. Slnger uliliz6 anticucrpos acoplados a ferritina para deleetar mol~cuJas de la c~lula al microscopio electr6nico. Brenner y Home desarrollaron la t~enica de la tinci6n negativa, invent'ada cuatro anos anles por Hall, convirti~ndola en una l~cnica de aplicaci6n rutinaria para vlsuaJizar virus, bacterias y fiJamentos proteicos. SabaUnl, Bensch y Hartnett introdujeron el glutaraldehfdo (generalmente seguido de OS06) como fijador mas utilizado en microscopia electr6nica. Cambridge Instruments construy6 el primer microscopio eleclr6nico de barrido, de tipo comercial. de Rosier y Klug describieron las tecnicas para la reoonstrucci6n de las estructuras tridimensionales a partir de micrograffas electronicas. Hen.derson y Unwln detenninaron por primera vcz la estructura de una protefna de membrana mediante reconstrucci6n por ordenador de micrograffas electr6nicas de muestras no tef'iidas. Heuser, Reese y colaboradores desarrollaron una t~nica de grabado pro(undo con una alta resoluci6n, basada en una congelaci6n muy ntpida.

son enfoeados fonnando una imagen -de una manera anlloga a como se (anna la imagen en el microscopio 6ptico- sobre una plaea (otografica a sabre una pantalla fluorescente. Puesto que los eleclTones que han sido dispersados han desaparecido del haz, las regiones densas de la muestra aparecen como lireas de un flujo bajo de elecnones. que aparecen negras.

158

Capftulo 4: C6mo se estudian las c6ulas

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I f::l I---fuente lumlno.. <j:::>-l80tes eondensadot"'"

b,~~:=-

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IMAGEN SOBRE UNA PANTAlLA

Figura 4- J 7 CaraclerfstJcas prtnclpales de un mlcroscoplo 6ptlco, de un mlcroscoplo eJectr6nlco de Iransmlsl6n y de un mlcroscoplo elec:tr6nlco de barrldo. EI dibujo pone de relieve las similitudes generales del disei'io de estos tipos de microscopios. Mienlrns que las lentes del microscopio 6ptico son de vidrio. las del microscopio eleclr6nico son bobinas magneticas. Los dos tipos de microscopios electronicos requieren que la muestra se coloque en el vado.

"c,0

H IMAGEN

IMAGEN SOBRE UNA PANTAlLA FUJOflESCfNTE

08SERVAOA

OlRECTAMENTE

MICROSCOPlO

MfOlOSCOPlO ELECTRONICO DE TRANSMISIQN

0f'TIC0

I I CH, I CH, I CH,

MICAOSCOPlO ELECTRONICO

DE BAARlDO

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o Para podec sec estudiadas at microscopio electr6nico, las muestras biol6gicas requieren una preparaci6n especial9 En los primeros tiempos de su aplicaci6n a materiales biol6gicos, el microscopio eleclr6nico revel6 la existencia en las cEHulas de una gran camidad de estructu· ras inimaginables. Sin embargo. antes de que se pudieran hacer estes descubrimjentos. los espeeialistas en microscopia electr6nica tuvieron que dcsarrollar nuevos procedimientos de inclusi6n, de corte y de linci6n de los lejidos. Puesto que las muestras para microseopia eleetr6nica han de ser expucstas a un vado muy inlenso, no es posible la observaei6n de las mueSlras vivas y hu· medas. Normalmente los lejidos son protegidos por fijaci6n -primero con gill' tarafdehfdo. que une eovalentemenle las mohkulas proteicas a SliS vecinas, y despues con tetr6xido de osmio, que une y estabiliza las bicapas lipfdicas y tam· bien las protefnas (Figura 4-18). Puesto que los eleetrones tienen un poder pe· netrante mlly limitado, normal mente los tejidos fijados son eortados en seecio· nes eXlremadamente as (de 50 a 100 nm de espesor-aproximadamente 1/200 del espesor de una celula) antes de pader observarlos. Esto se logra deshidratando la muestra e infiltn1ndola con una resina monomeriea que polimeriza formando un bloque s6lido de phistico; el bloque se puede cortar mediante L1na euchilJa de vidrio 0 de diamante, en un micr6tomo especial (ultramicr610mo). Estas seccio1les ultrafinas, libres de agua y de otros solventes vol
no

Observaclon de la estrueluta de las ~ulas con el microscopio

H

glutataldehldo

Figura 4-18 Dos f1jadores qufmlcos que se utlllzan habltualmente en mlcroscopla eleclronlca. Los dos grupos reaclivos a1dehfdo del glutaraldehfdo Ie penniten establecer enlaces cruzados entre diversos tipos de moleculas. fonnando uniones covalemes entre ellos. EI tetr6xido de osmio es reducido por numerosos compuestos organicos con los que forma complejos mediame puentes cnlzarlos. Resullll especialrnente uti! para la fijaci6n de las membranas celulares, ya que reacciona con los dobles enlaces c-c existentes en muchos
tejma de cobre recubiert. con una pellcula de carbona vIa de plhtico

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cinll de cortes setiado. ultlafinos ~ un. muelttta

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I - - - 3 mm-----ool

FJsura4-19 EsquemadcunareJlUa de cobre utllizada como soporle de los corles ultrafinos de una muestra, en la mlcroscopla electr6nlca de tnmsmlsl6n.

159

pared celular

milocondria pinto vacuol.

nUcleo

Complejo de Golgi

10 11m

En algunos casos, en seccioncs ultrafinas se pueden localizar determinadas macromollkulas mediante t~cnicas adaptadas de la microscopia 6ptica. Cierms enzimas celulares pueden ser detectadas incubando la muestra con un substrato cuya reacci6n conduzca aJ dep6sito locaJ de un precipitado denso a los electrones (Figura 4-21). Alternativamente, como veremos en las p<1gs. 197-198, direreotes anticuerpos pueden acoplarse a una enzima indicadora (normal mente

Figura 4-20 Seccl6n ult.rafina de una c~lula apical de la rafz de una grammea, cont.raslada can osmlo y otros lanes de melales pesados. Se observan facilmente la pared celular, el nl1c1eo, las vacuolas. las mitocondrias. el reticula endoplasmatico, el complejo de Goigi y los ribosomas. (Por conesfa de Brian Gunning.)

Figura 4-21 ElectrollllUcrografia de una c~lula, mostrando la local1zacl6n de una delermlnada enzlma (la nucle6tJdo dHosfalasa) en eI complejo de Goigi Una secci6n ullrafina de la clilula se ineuM con un substrato que, aI reaccionar con la enzima, fonn6 un precipitado electrodenso. (Por conesfa de Daniel S. Friend.)

160

Capftulo 4: C6mo se estudlan las c~lulas

peroxidasa) 0 a una molecula densa a los electrones (normalmente pequenas es· feras de oro metl1.lico, denominadas partfculas de oro c%idtJ!) y ser utUizados para localizar las macromoleculas que reconocen (vease Figura 4-63).

Mediante la microscopia electr6nica de barrido se pueden obtener imligenes tridimensionales 'o Efectivamente, las secdones ultrafinas son cones bidimensionales de un tejido y no revelan la disposid6n tridimensional de los componentes celulares. Aunque la tercera dimensi6n puede ser reconstruida a pamr de dentos de secciones seriadas (Figura 4-22), ello supone un proceso largo y tedjoso. Afonunadamente existen sistemas mas direcCOS de obtener una imagen tridimensional. Uno de estos sistemas consiste en examinar las muestras con un mlcroscoplo electrdnlco de barrido (SEM, de Scanning Electron Microscope). que suele ser mas pequeno y sencillo que el microscopio electr6nico de transmi· si6n. Mientras que el microscopio elcctr6nico de transmisi6n utiliza los elcctrones que han atravesado la muestra, el microscopio electr6nico de barrldo utiliza los elcctrones dispersados 0 emitidos a partir de la superfide de la muestra. La muestra a examinar se fija, se sea y se recubre con una capa delgada de un metal pesado. A continuaci6n la muestra es barrida por un haz foealizado de elcc· trones. La cantidad de electrones dispersados 0 emitidos cuando este haz primario bombardea consecutivamente cada uno de los puntos de la superficie metalica es medido y uLilizado para controlar la intensidad del segundo haz, que se mueve sincr6nicamente con el haz primario y forma una imagen sobre una pantalla de televisi6n. De esta manera se construye una imagen completa y muy ampliada de la supcrficie de la muestra. La tecnica de SEM proporciona una tremenda profundidad de foeo; ademas, debido a que el grado de dispersi6n de los elcctrones depende del Angulo relativo entre el haz y la superficie. 1a imagen tiene puntos brillanles y sombras oscuras que Ie confieren un aspeclo tridimensional (Figura 4-23). Sin embargo solamente sc pueden examinar detalles superficiales, y en la mayorfa de mode-

9

Figura 4-22 ReconstnJcd6n lrldlmenslonal a partir de secdones serladas. Amenudo las secciones ultratinas individuales conducen a impresiones erroneas. En este ejemplo, la mayona de las secdones de una c~lula que contiene una mitocondria ramificada parecen comener dos 0 lres mitocondrias diferentes. Ademas, a partir de las secciones 4 y 7 se podrfa deducir que una mitocondria se halla en el proceso de divisi6n. Sin embargo, a partir de los cortes seriados se puede reconSlruir la verdadera forma tridimensional.

Figura 4-23 Mlcroscopla electr6nlca de barrldo. Eleclronmicrograffa obtenida con un microscopio de barrido, moslrando la disposici6n c6nica que adoptan los estereocilios que se proyeclan desde la superficie de las celulas ciliadas del ofdo interno tAl. Para comparar,la misma estruclura se muestra observada por microscopia 6ptica de contraste de fases interferencial (B) y por microscopia electr6nica de secd6n fina (C). (Por cortesfa de Richard Jacobs y James Hudspeth.)

Observacl6n de la eslrUetuta de las cl'!:Julas con eJ microscopio

161

los de SEM la resoluci6n alcanzable no es muy elevada (aproximadamente 10 nm, con un aumento efectivo de hasta 20000 veces); por consiguiente, est'a t~cnica se utiBza para estudiar c~lulas enreras 0 tejidos y no organulos celuJares (v~ase Figura 4-32).

EI sombreado metalico permite el examen a alta resoluci6n de detalles superficiaJes, mediante el microscopio electr6nico de transmisi6n II EI microscopio electr6nico de rransmisi6n puede ser ulilizado para estudiar la

superficie de una muestra -y generalmente a mayor resoluci6n que en un microscopio electr6nico de barrido- de fonna que pueden verse macromolkulas individuales. Al igual que para la microscopia electr6nica de barrido, sobre la muestra seca se evapora una fina pelicula de un metal pesado, como el platino. El metal se vapori7.a desde un angulo oblkuo de manera que se forma una capa que en algunos lugares es mas gruesa que en otros -un proceso conocido como sombreado porque se crea un efecto de sombras que da una imagen can apariencia tridimensional. Algunas muestras cubiertas de esta manera son suficiememente fmas 0 suficientemente pequelias para que el haz de electrones penetre en elias directamente; ~te es el caso de las mol~ulas, los virus y las paredes celulares (Figura 4-24). Pero para el caso de las muestras mas gruesas, el material organico ha de ser eliminado por disoluci6n despues del sombreado, de fonna que tan 5610 quede la fina repliw metAlica de la superficie de la muestTa. La r~pliea se refuerza con una peUcuJa de carbono para que pueda ser colocada en una rejiUa y examinada al microscopio electr6nico de transmisi6n de la manera habitual (Figura 4-25).

Figura 4-24 Electroron.lcrografIllS de molkulas aisladas de la protein. mJoslna que han sJdo sombreadll5 con platloo. La miosina es uno de los componentes principales del aparalo cont:r.ielil del mUsculo; como se mueslra aquf, se compone de dos cabezas giobulares unidas por un talla coml1n. (Por cortes!a de Anhur Elliot.)

muestrfl

81 me",l pesadoevlPO~_de un fillmenlO ~sombrel~

La microscopia electr6nica de criofractura y la de grabado

por congelaci6n proporcionan una nueva visi6n del interior celular lZ Qtros dos m~todos que utilizan r~plicas metalicas han sido particularmente utiles en Ja biologfa cclular. Uno de ellos, el de la microscopia electr6nica de erlo· fraetura, constituye un sistema de visualizar el interior de las membranas celulares. Las c~lulas se congelan a la temperatura del nitr6geno Uquido (-196"Cl en presencia de un crioproteclor (un anlicongelante) para impedir la distorsi6n provocada par la fonnaci6n de cristales de hielo, yel bloque se fracciona con la hoja de una cuchilla. A menudo, el plano de fractura pasa a trav~s del centro hidrof6bieo de las bicapas Iipfdicas, exponiendo as( el interior de las membranas cclula~ res. Las caras de fractura resultantes se metalizan con platino, y las r~plicas se observan al microscopio electr6nico (como en la Figura 4-25). Estas r~plicas estan Ilenas de pequenas protuberancias, !lamadas partfcillas intramembralla, que corresponden a grandes proternas de la membrana. Esta t~cnica proporciona una via adetuada y espectacular para visualizar la distribuci6n de este tipo de prote(nas en el plano de la membrana (Figura 4-26). Qtro m~todo importante de r~plica es la microscopia de grabado par congelacl6n (freeze-etch), que puede ser utilizado para examinar tanto el interior como el exterior de las celulas. En esta t~enica las c~lulas tambien se congelan muy rapidamente -utilizando por ejemplo un dispositivo especial para colocar la muestra contra un bloque de cobre congelado por ejemplo can helio I{quido- y el bloque congelado se fragmenta con la hoja de una cuchilla, como acabamos de describir. Pero en este easo el nivel de hielo disminuye alrededor de las c~lulas (y en menor medida dentro de las c~lulas) mediante la subLimaci6n del agua en el vado a medida que aumenta la temperatura (un proceso denominado deshidratad6n porcongelaci6n) (Figura 4-27). Las zonas de la c~lula expuestas a est'e proceso de grabado son sombreadas como antes, para conseguir una replica de platina. Esta l~nica expone estructuras del interior de la c~Jula y puede revelar su organizaci6n tridimensional con una c1aridad excepcional (Figura 4-28). 162

Capftulo 4 : Cdmo se estudian las celuJas

lemuestra

/

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,~~~ pelleull protectori de cerbono eVlporedl er.clme de II muestrl

I

I

Ie r'pilci SI coioci Bobre II SUperflcll de un potente dlsolvente a fin da ellmlnlr II mUllstrl

4

Ie r'plice H IIVI Y recoge con una rlljml de cobra para BU llXernen micrOlC6plco

,_aI Figura 4-25 Preparad6n de una dpUca melallzada de Iasuperflcle de una muestra. Observese que el grosor del metal refteja los contomos de la 5uperficie de la muestra original.

Figura 4·26 E1ectronmlcrograffa de una crlo(ractura de la membrana del lJlacolde de un c1oroplaslO de una celula vegetal. Las membranas del tilacoide, que Uevan a cabo la fOlosfntesis, se encuenlran apiladas en mulliples capas (vease Figura 14-39). E! plano de fraclura se ha desplazado de capa a capa, pasando a lraves de cada bicapa Iipfdica y exponiendo las prolemas lransmembrana que tienen un lamano en el inlerior de la bicapa suficiente para harer sombra y aparecer como particulas intramembrana en esta replica de platina. Las pankulas mayores que se aprecian en la membrana son eI fotosistemall completo -un complejo de multiples protefnas. (Por cortesfa de LA. Siaehelin.)

L.-J 0,1

j.lm

PuCSlO que 10 que se observa aI microscopio son las replicas metcilicas sombrea-

das y no las propias mucstras, ambos metodos. la criofraetura y el sombreado por

congelaci6n, pueden utilizarse para estuwar celuJas congeladas sin (jjar. evit<1ndose pues el riesgo de obtener anefaetos producidos por el proceso de la fijaci6n.

La tinci6n negativa y la microscopia crioelectr6nica permiten observar macromoltkulas a alta resoluci6n 13 Aunque las macromollkulas aisladas, tales como el DNA 0 las grandes prote{nas, pueden seT f<1cilmcnte visualizadas con el microscopio electr6nico si se vaporizan con un metal pesado para darles contraste (vease Figura 4·24), se pueden visuali· zar sus dctalles finos utiJizando tlnci6n negaliva. En este caso, las mollkuJas colocadas sobre lIna fina pelfcula de carb6n (que resulra casi transparente a los electrones), se lavan con una soJllci6n concentrada de una sal de un metal pesado, como eJ acetato de uranilo. Una vez seca la muestra, una pelfcula muy fina de la sal metalica cubre la pellcllia de carb6n por todas partes cxccpto por donde ha sido cxcluida debido a la presencia de ulla macromolecula adsorbida. Puesto que

(Al FRACTURA

In dOB cefes de frseturs de Ie membrene elfteme de Is envoltur. nucleer

FIgura 4-21 La mlcroscopla electnSnlca por criofnctura. La mueSlra es rapidamence congelada y el bloque de hielo es fraclurado can una cuchilla (A). Enconces, el nivel de hielo se reduce por sublimacion del agua en el vado, de fonna que las eSlructuras de la celula que se encuentran cerca del plano de fractura quedan al dcscubierto (6). Acontinuacion, se prepara una replica de la superficie todavfa congelada (tal como se describe en la Figura 4-25) y se cxmnina al microscopio clcctr6nico de lransmisi6n.

(Sl GRABAOO

PlIInlcule hielo greNdo inlermembrene cilOPlasme! gfa~

Buperl"ocie elrterne de la membrana pl~'lice y del or~nulo rodeado de membrana

~~

Observaclon de la estructun de las c~lulas con el microscopio

163

Figura 4·28 Ordenacl6n regular de los nJarnentos protelcos de un ml1sculo de insecto. Para obtener esta imagen, las celulas musculares fueron nipidamcnte congeladas en belio Hquido. fraclUradas a traves del citoillasma Ysomctidas a grabado profundo. Luego. se preparo una replica metalizada que se examin6 a gran aumento. (Por conesfa de Roger Cooke y John Heuser.)

0,1 11m

la macromollkula pennite que los electrones pasen mucho mas racilmente que a traves del metal pesado circundante. se crea una imagen inversa 0 negativa de la macromolOCula. La tinci6n negativa es especial mente util para visualizar grandes agregados macromolecuJares. tales como virus 0 ribosomas. y para observar la estructura en subunidades de los 6lamentos pmteicos (Figura 4-29). Tanto la tinci6n negativa como el sombreado son capaces de proporcionar visiones de alto contraste de la superficie de pequenos conjuntos macmmolecu· lares; ambas tlknicas, sin embargo, tienen una resoluci6n limitada por el tama· no menor de las part{culas mctaLicas utiJizadas en el sombreado 0 en la tinci6n. Metodos mas recientes proporcionan una altemativa que ha pennitido la visua· lizaci6n directa a alta resoluci6n de incluso las caracteristicas internas de estruc· turas trid.imensionales tales como los virus. En esta tecnica. lIamada mlcrosco· pia crloelec:trdnJca. sobre una rejilla de microscopia se prepara una capa muy delgada (-100 nm) de muestra hidratada que es rapidamcnte congelada. Se requiere un porta-objetos especial para colocar esta muestra a -IGCrC cn cl vado del microscopio. donde puede ser visualizada directamente sin neccsidad de fl· jaci6n, tinci6n, 0 sccado. La homogeneidad de la capa de agua vitrificada y la utilizaci6n del contraste de rases bajo foco pennite la obtenci6n de im
164

Capftulo 4 : C6mo se estudlan las a9.ulas

Figura 4-30 Mlcrosoopla electr6n1ca de un virus. W VlJUS Semlild forest no teNdo en un capa fina de agua vitrificada, observado aI microscopio crioelectronico a -16QOC. Como en microscopia 6ptica, el contraste de rases se puede utilizar para obtener Ulla imagen de una muestra no lefiida. Mediante m~todos de prot:esamiento de imagcnes se puede t:ombinar un gran numero de estas imagenes produciendo una imagen tridimensional de alia resoluci6n. (Par t:ones{a de Stephen Fuller.)

molecular es necesario combinar la informaci6n obtenida de muchas moleculas con el fin de eliminar los errores alcalorios de la imligenes individuales. Esto cs posible para virus 0 filamenlos proteicos, en los que las suhunidades individuales se presentan ordenadas de forma regular y repetida; tambicn es posible para cualqu..ier substancia que pueda formar ordenamienlOS cristatinos en dos dimensiones en los que una gran cantidad de mollkulas presenten una orientaci6n identica y posiciones espaciales regulares. Sabre una microfotografia de un ordenamient'O de cualqu..ier tipo se pueden aplicar las ttknicas de procesamiento de imagenes para obtener la imagen media de una moltkula individual. revelando asf dClalles oscurecidos por el "ruido" aleatorio de la fotograffa original. Este sistema de reconslrucci6n de imagencs ha permitido oblener con una resoluci6n de 3,5 nm la estructura interna de virus recubiertos y oblcncr la forma de una molecula individual de protefna a la extraordinaria resoluci6n de 0,35 nm (vease Figura 10-31). Sin embargo, la microscopia electr6nica, incluso en sus formas mas sofisticadas, no consigue obtener una descripci6n completa de la estructura molecular, ya que los atomos en una molecula estAn separados por distancias de tan 0010 0, I 00,2 om. Para resolver la cstructura molecular a detalle at6mico, se necesita otra tecnica que utilice rayos Xen lugar de electrones.

Resumen Actualmente disponemos de muelms tunlcas de mlcroscopia 6ptlca (Iue nos permiten la observac16n de las dlulLu. Las dlulas que han sido fiJadns y teiiidas se pueden estudiar al mlcroscoplo 6ptlco convenclonal, mlentras ql,e para localiulr molkulas espedficas en las dlulas u pueden utiliulr anticuerpos marcados y estudiar su localizaci6n mediante el mlcrosc:opio de fluorescenda. El microsc:opio de barrido confocal proporciona finas ucciones 6pticas y puede utiliulrse para no. conslTUir inufgenes trilIimensionola. Ltu dlulas vilJQ.S u pueden oburvar utllizon00 tknkas de contraste defuses. contraste de fases Inurferen.clal 0 6pticas de enmpo oscuro. Todos los tipos de microscopla 6ptlca son mas fdciks utillzando tienlau electr6nlcas de procesanrlento de lnrtfgenes, las cunles amplijican fa sensibilldad e increme,.Um la resollU:16I1. Par" determinar la eslructura detailada de las membranas y de los organulos celulares se requiere ulla re$Oluci6n mayor, la cunl se pl4ede aluuuar con el microscopio electr6nico de lTansmisi6n. Se pueden obtener inufgenes trldimensionoks de las &uperficies de dlulas y tejidos mediante micrwcopia electr6nica M barrido. mienlTas que el interior de las membranas y tk las dlillas puede oburvarse, rap«tivamente. mediante la crlofractura y la microscopia de grabado por congelacl6n. Tamblin puede lIiswllizone ftkilmente Ia fonna de macromoUc:ulas aisladas, d han s/dq prelliamente $Ombreatlas con un metal pesado 0 contorneadiJs por tinci6n negativa, "tilizando la nrlcroscopia electr6nica.

Observacl6n de la estructura de las ctlulas con el microscoplo

165

Aislamiento y crecimiento de celulas en cultivo 14 A pesar de que al microscopio pueden ohservarse las estructuras de los orga-ou-

los y de las macromol~culas de 13 cl!lula, 13 comprensidn molecular de 13 celula requiere un anMisis bioqu[mico detallado. Desgrnciadamente los procedimienlOS bioqufmicos requieren gran cantidad de celulas y siempre empiezan rompiendolas. Si 1a muestra es un trow de tcjido, se mezclaran entre sf fragmentos de IOOas sus cclu1as y 5i, como ocurre en Ja mayana de los casos, eJ tejido tenia celulas de varios tipos diferentes. se originara una gran confusi6n. Con el objclo de preservar toda la informaci6n que sea posible sobre carla uno de los tipos celulares. los bi61ogos celulares han desarroUado tecnicas de disociaci6n de celulas a partir de los tejidos y de separaci6n de los distintos tipos celulares. Como resuhado de estas tecnicas, pueden analizarse poblaciones relativamente homogeneas de celulas -ya sea directamente 0 despues de que su numero se haya incrementado notablemenle permitiendo que las celulas proliferen en cultivo.

Las c~lulas de un tejido pueden ser aisladas y separadas en diversos tipos celulares 15 EI primer paso del aislamiento de celulas a partir de un tejido que contiene una mezcla de tipos celulares consiste en romper la matriz eXlracelular y las uniones interceluJares Que mamienen unidas entre sf las celulas. Normalmcnte las mejores recuperaciones de celulas disociadas viables son las obtenidas de tejidos fetales 0 neonatales, tipicamente tratandolos con enzimas proteolitfcas (como la uipsina y la colagenasa) y con agentes (como el acido etilendiamfn lelraacetico o EDTA (de ethylendiaminlelraacetic acid)) Que une, 0 quela, cl Caz. del Que depende la adhesi6n celula-celula. Entonces. los lejidos pueden ser disociados en celulas individuates y viables, mediante agitaci6n suave. Para separar los diferentes lipos celulares a panir de una suspensi6n celular mixta se utilizan diversos metodos. Uno de ellos consiste en aprovechar las dirercntes propiedades fisicas de las celulas. Por ejemplo, las celulas grandes pueden separarse de las pequenas y las celulas densas de las ligeras. mediante centrifugaci6n. Estas tecnicas se describirtin al hablar de la scparaci6n de organuJos y de macromoleculas, para 10 cual fueron desarrolladas originalmente. Qua aproximaci6n se basa en la tendencia de algunos lipos celulares a adherirse fuertemente al cristal 0 at plastico, 10 cual permile separarlas de celulas que se adhieran menos fuenemente. Una mejora importante de esta ultima tecnica dependc de las propiedades especfficas de uni6n de los anticuerpos. Los anticuerpos que se unen especfficamente a la superficie de un solo tipo celular de un tejido pueden acoplarse a varios tipos de matrices --como colAgeno, esferas de polisacAridos 0 pltistico- formando una silperficie de afillidad a la que unicamente se uniran las celulas reconocidas par los anticuerpos. Las celulas unidas se recuperan mas tarde mediante agilaci6n suave, mediante el tratamiento con Iripsina para digerir las protefnas Que median la adhesi6n, o. en el caso de matrices digeribles (como la colagena). mediante la degradaci6n de la propia matriz can enzimas (como la colagenasa). La lecnica mas sofislicada de scparaci6n celuJar sc basa en el marcaje especffico de las celulas con anticuerpos acoplados a un colorante Ouorescente y poslerior separaci6n de las celulas marcadas de las no marcadas mediante un c1aslflcador celular actlvado por Ouorescencia. En este aparato las celulas pasao en "ma india" a traves de un haz laser determinandose la fluorescencia de cada celuJa. Un poco mas adelante de la corriente de celulas. una boquilla vibraloria forma diminUlas gotitas. la mayorfa de las cuales contienen una 0 ninguna celula. Las gotitas Que cOnlienen una sola celuJa reciben autom,1licamenle una carga electrica positiva 0 negativa en el momento de fomlarse, dependjendo de si la celula es fluoresccnte 0 no 10 es; a continuaci6n, las gotitas son desviadas por lin intenso campo elect rico hada un contenedor apropiado. Los grupos de 166

Capftulo 4: C6mo se esludlan las c~lulas

-----------

I)"l

,----:::I--boquilla de vibrldor

uhr-onieo - - lIUSfMIMi6n eelular

"!'la' que cafaa IUgolll$ IIIi..r dOlectores

peQuetlo g.upo de GOtas carglldas negalivament8 - [ cJebido • Ie detllCCi6n

de una eelu" fluo<escente

-

pequeflos grupos de

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gotas cargadn positiv8men" debido • Ie delllCCi6f1 de uoa

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ee1ula no flt.>OfeteC!nl8

.2000 V

Figura 4-31 Selecdonador de dlulas acLivado por nuorescenda. Cuando una aHuia pasa a trav~ del rayo hiser, es seleccionada de acuerdo

con su f1uoresceneia. las gotitas que contienen una sola dlula reciben una carga ncgativa 0 positiva, segUn sea 120 celula fluorescente 0 no. Luego. las gotitas son desviadas mediante un campo electrico, en funei6n de su carga, hac!s los tubas de recog!da. Tengase en cuenta que 120 concentraci6n celular debe ser 1201 que 120 mayorfa de las gOlitas no contengan ninguna celula; 120 mayor parte de las gotitas. pues. fluiran aI contenedor residual, junto con las gOlitas que conlengan mas de una dlula. E$le mismo aparato se puede utilizar tambien para separar CTOmosomas marcados con fluorescencia de OITOS no marcados. proporcionando un valioso material de partida para el aislamiento y mapaje de genes.

eoleetor(le dlulu

'.ueo par. 901" no duvi.da,

celuJas que se forman ocasionalmente son deleetados por su mayor dispersi6n de luz y no reciben carga, de forma que caen en un contenedor residual. Eslas m
Cuando. medianle alguno de los metodos rnencionados, se ha obtenido lIna poblaci6n uniforme de celuJas, esta poblaci6n puede utilizarse directamenle para analisis bioqufmicos. Alternativamente, esta poblaci6n celular constituye un material de partida adecuado para cl cuJtivo celular, permitiendo esludiar el complejo comportamienlo de las celuJas bajo las condiciones eslrictamcnle definidas de una placa de cultivo.

Las ceJ.ulas pueden cultivarse en una placa de cultivo l6 La mayona de tipos celulares tanto vegetales como animales sobreviven, se multiplican e incluso expresan propiedades diferenciales en una placa de cullivo en condiciones adecuadas. Las relulas pueden visualizarse 201 microscopio 0 analizarse bioqu£micamenle, y se pueden estudiar los efeclos de 120 adici6n 0 eliminaci6n de moleculas detenninadas tales como hormonas 0 factores de crecimien· to. Ademas, en cultivos mixtos pueden estudiarse las interacciones entre un tipo celulary otTO. A menudo se dice que los experimenlos con celulas cultivadas han sido realizados in vitro (literal mente "en vidrio~) para diferenciarlos de los experi men los rcali7.ados en organismos intactos, que se dice que han sido realizados in vivo (literalmente "en el organismo vivo"). Estos dos terminos pueden resultar confusos porque a menudo se utiUzan en un sentido diferente por los bioqufmicos, para los que in vitro se refiere a las reacciones bioqufmicas que se producen fuera de la celula mientras que in vivo se refiere a cualquier reacci6n que se produce dentTO de una celula viva.

Aislamiento y crecimienlo de ~Iulas en cuJtlvo

167

• EI cultivo de tejidos empez6 en 1907 con un experimento dcstinado a finalizar una controversia de In ncurobiologfa. La h..ip6tesis que se examinaha era conocida bajo el nombre de teorfa neuronal. la cual afinnaba que cada fibra ncrviasa es una prolongaci6n de una sola celula nerviosa y no el produclo de 13 fusi6n de varias celuJas. Para dilucidar esta polemica se coJocaron pequenos rragmentos de medula espinal en plasma coagulado en una camara humeda y caliente y se obscrvaron aI m..icroscopio a intervalos regulares de tiempo. AI cabo de un dea mas 0 menos, se pudo observar que las distintas celuJas nerviosas emidan prolongaciones largas y finas hada el plasma coagulado. De esta mancra qued6 demostrada la teorla neuronal y se establecieron las bases de 13 revoluci6n del cuhivQ celular. Los experimentos originales de 1907 implicaban el cultivo de pcqueflos fragmentos de tejido. 0 explantes. En la actualidad. los cullivos se preparan habitualmente a partir de suspensiones de celulas oblenidas por disociaci6n de te· jidos. como se ha descrito mas arriba. A duerencia de las baclerias. la mayor par· te de las celulas de los tejidos no estan adaptadas a creccr en suspcnsi6n, de forma que necesitan una superficie s61ida sobre la que poder ctecer y dividirse. Actualmenle este soportc 10 const.ituye una supcrficie de plastico de una plaea de cultivo (Figura 4·32). Sin embargo distintos t.ipos celulares tienen rcquerimientos direrentes. de forma que algunos de eUos no creccn 0 no se diferencian a menos que la plaea de cuhivo esle recubierta de componenles de malriz extra· celular. como el col<1geno 0 la laminina. Los cultivos preparados directamente a partir de los lejidos de un organis· mo. con 0 sin fraccionamiento previo. reciben el nombre de culUvos primarios. En la mayorfa de los casas, las celulas de los cultivos primarios puetlen recupe· rarse de la placa de cult.ivo y utilizarse para format un gran numero de culUvos sec:undarios. De esta forma las celulas puetlen ser subcuhivadas repetidamenl'e durnnl'e semanas 0 meses. A menudo estas celulas muestran propietlades dife· renciadas dpicas de sus orlgenes: los fibroblaSIOS continuan segregando coh\geno; las celulas derivadas del musculo esqueJetico embrionario se fllsionan formando fibras musculares gigantes que se contraen esponlaneamenle en la placa de cu.ltivo; las Ct:!luJas nerviosas emilen axones que son excilables electricamcnle y que eSlablecen sinapsis con ott3S celulas nerviosas; las celulas epiteliales for· man exlens..1S laminas con muchas de las propiedades de un epitelio intacto. ?oesto que estos fen6mcnos se producen en los cultivos, resllitan accesibles al eSludio a Iraves de sistemas y tecnicas que no se pueden aplicar en los tejidos inmetos.

Los medios definidos quimicamente, libres de suero, permiten la identificaci6n de factores de crecimiento espec(ficosl 7 Hast'a principios de los ailOs 1970 el cultivo de tejidos era algo asf como lIna mezcla de ciencia y brujerfa. Aunque los coagulos plasmaticos ftleron sllbstilllidos por piacas de medios Ifquidos conteniendo cantldades especfficas de pcque· flas mohkulas como sales, g1ucosa. aminoacidos, y vitaminas, la mayorfa de los medios incillfan lambicn una proporci6n mal definida de una mezcla de macromoleculas en fonna de suero de cabaUo 0 de suero fetal de temera, 0 un exu3cto crudo de embri6n de poUo. EsIOS medios todavia se utilizan aelualmcnle para la mayorfa de cultivos rutinatios ITabla 4-3) pero resultan inadecuados para el esludio de las necesidades de macromoleculas que un tipo eelular delerminado riene para prosperar y runcionar nonnalmente. Esla dificullad ha conducido al desarroUo de medios Iibres de suero dejinidos quimicamente. Ademas de las pequenas molecuJas habituales esl'OS metlios deli· nidos cont.ienen una 0 m~s proteinas especificas que la mayorfa de celulas necesitan para sobrevivir y proljferar en cult.ivo. Enlre eUas se encuentrnn los (actores de creclmlento que estimuJan la proliferaci6n y la transferri/Ul que transporta hierro aI interior de las celulas. La mayorfa de las molecuJas senalizadoras prolei· cas extracelulares esenciales para la supervivencia, desarroUo y proliferaci6n de 168

CapftuJo 4: C6mo se estudjan las celulas

LJ

10~m

Figura 4-32 Ululas en cultivo. Electronrnicrografia de barrido de fibroblastos de rata creciendo sobre una 5uperficie phistica en cuhivo de tejidos. (POl cortesfa de Guenter Albrecht -Buehler.)

Tabla 4-3 Composlci6n de un medio tJplco adecuado para el cutlvo de ceJulas de mam(fero

Aminolicidos

Vltamlnas

Sal..

Varlos

Arginina Cisterna Glutamina Histidina lsoleucina Leucina Usina Metionina Fenilalanina Treonina Tript6fano Tirosina Valina

Biolina Colina Folato Nicotinamida Pantotenato Piridoxal Tiamina Ribonavina

NaCI Ka NaH,P0 4 NAHC01 CaCI 2 MgCI,

Glucosa Penicilina Eslreptomicina Raja fenol Suero total

Prolefnas (necesarlas en medlos qufmlcamente definldos, Jlbres de suero) Insulina Transferrina Factores de credmiento espedfico

La glucosa se utiliza a concentraclones de 5 a 10 rnM. Todos los aminoAcidos son de la forma Lycon una ados excepciones se utilizan a can· cenlrac!oneli de 0.1 a 0,2 rnM: las vilaminfls se utHizan a concentraclones 100 veces menores, es declr. alrededor de I ~M. EI suere, que gene· ralmente es de caballo 0 de lemera, se ai\ade hasta (onnar ellO% del 'IOlumen total. La penicilina y la eSlreptomicina son antibi6ticos que se utllizan para inhibir el crecimlento de las bacterias. EI rejo (enol es un colorante indicador del pH, que pennlte seguir la variacl6n de color para asegurar que el pH sea de 7,4 apreximadamenle. Generalmente los cultivos se mantienen en recipienteli de plistico 0 de vidrio, con una superflcie preparada adecuadamenle que penni· ta la adherencla de las cilulas. Los recipientes se conservan en una estu(a de culti'lO a 370<:. en una alm6s(era de 5'" de CO. y95'" de aire.

deterrninados tipos celulares se han descubierto a trave. de estudios de cultivos celulares y la busqueda de nuevas mohkulas ha sido enorrnemente facilitada por la asequibilidad de medios definidos quimicameme y Iibres de suero.

Las Ifneas celulares eucariotas constituyen una fuenle ampliamente utilizada para la obtenci6n de c~lulas homogeneas l8 La mayorfa de las celulas de los vertebrados mueren tras un m'imero fin ito de di·

visiones en cultivo: por ejemplo. las celulas cUlaneas humanas en CUllivo sobreviven durante algunos meses. dividiendose unicamente entre 50 y 100 veces an· tes de moriT. Se sugiri6 que esta vida Iimitada estaba relacionada con la vida lirnitada del animal del que derivan las celulas. Sin embargo, en cultivo ocasionaJmenle surgen algunas celuJas que han sufrido algun cambio genetico que las haec realmente inmortales. Estas celulas proliferan indefinidamente y pueden propagarse como una linea celular (Tabla 4-4). Las Iineas celulares preparadas a partir de celulas cancerosas difieren de las preparadas a partir de celulas normales, en varios aspectos; por ejemplo. a me· nudo las Uneas de celulas cancerosas crecen sin fijarse a ninguna superficie y proliferan en una placa de cultjvo hasta una densidad mucho mayor que la de las celulas norrnales. Experimentalmente pueden inducirse propiedades similares a e.tas en celulas norrnales mediante la transformad611 con un virus 0 con una substantia qu£mica inductora de tumores. Las !£neas celulares transforrnadas resuhantes son capaces de provocar tumores si se inyectan a un animal Las Ifneas celulares, tanto transformadas como no transfonnadas, resultan extremadamente utiles para la investigaci6n celular como fuente de un numero muy elevado de celulas de un tipo uniforme. especialmente porque se pueden guardar en nitr6geno Iiquido a -196°C durante un perfodo indefinido de tiempo, y des· pues de descongeladas todavfa son viables. Sin embargo, es imponante recono· cer que las celulas de ambos tipos de lineas celulares casi siempre difieren de sus celulas progenitoras de los tejidos de las que derivan, en algunas caracteriSlicas imporlantes. AJslamiento y credmiento de celulas en cultivo

Tabla 4·4 A1gunas !£neas celulares utlllzadas habltualmente Unea ceJular· 3T3 BHK21

MOCK HeLa PtK I L6

PCl2 SP2

Tlpo celular y orlgen fibroblasto (rat6n) fibroblasto (hamsler sirio) celula epitelial (perro) celula epiteUal (humana) celula epitelial (rata canguro) mioblasto (rata) celula cromafinica (rata) celula plasmcttica (rat6nj

• Muchas de estas \[neas celulares den· van de Iwnores. Todas ellas son capaccs de mulliplicarse indefinidamente en cui· livo y expresan por 10 menos algunas de las propiedades diferenciales de su ori· gen celular. Las celulas BHK 21, HeLa y $P 2 son capaces de crecer en suspen· si6n: las olras lineas celulares requieren un substrato de cultivo s6lido para multlplicarse.

169

)

po

A pesar de que todas las ctHulas de una !fnea celular son fiUy similares entre sf, a menudo no son identicas. La uniformidad genetica de una linea celular puede mejorarse con el donaje celular, mediante el cual se afsla una tlnica celula y se Ie permite proliferar hasta formar una gran colonia. Un clon es cualquier poblaci6n de celulas derivadas de una unica celula ancestral. Una de las aplicaciones mas imponantes del c10naje celular ha sido el aislamiento de Ifneas celulares mutantes con defectos en determinados genes. A menudo el estudio de las celulas que son defectuosas en una protefna determinada revela muchos datos sobre la funci6n que tiene esta prolefna en las celulas normales.

Las celulas pueden fusionarse formando celulas hfbridas l9 Es posible fusionar una celula con otra fonnando una celula combinada con dos nucleos separados, denominada heterocarlonte. La fusi6n se suele realizar tra-

tando una suspensi6n de celulas con ciertos virus inactivados 0 con polietilen glicol, que a1tera las membranas plasmaticas de las celulas de tal forma que estas tienden a fusionarse entre sf. Los heterocariontes ofrecen la posibilidad de mezelar los componentes de dos celulas diferentes para estudiar sus interacciones. Por ejemplo, el nueleo inerte de un eritrocito de polio cuando es expuesto por fusi6n celular aI citoplasma de una celula en cultivo en crecimiento, se reactiva produciendo RNA y con el tiempo, replicando su DNA. La primera prueba directa de que las protefnas de membrana son capaces de desplazarse en el pIano de la membrana plasmatica se OblUVO de un experimento en el que se fusionaron celulas de ral6n con celulas humanas: aunque las protefnas de superficie de las celulas de rat6n y de la celula humana inicialmente estaban confinadas en sus propias mitades de la membrana plasrnMica del heterocarionte, rapidamente difundieron y se mezclaron por toda la superficie de la celula. Con el tiempo, el heterocarionte sufrira una mitosis, produciendose una c~­ lula hfbrlda en la que las dos envolturas nucleares se han disgregado permitiendo que todos los cromosomas se agrupen en un gran m1c1eo unico (Figura 4-33). Aunque estas celulas hlbridas puedan ser c10nadas generando Ifneas celulares hfbridas, las celulas hfbridas iniciales tienden a ser inestables y a perder cromosomas. Por razones desconocidas estas celulas hfbridas hombre-rat6n pierden de forma predominante cromosomas humanos. Estos cromosomas se pierden de manera a1eatoria, dando lugar a diversas Uneas celulares hfbridas hombre-rat6n diferentes, cada una de las cuales contiene algunos (0 uno solo) cromosomas humanos. Este fen6meno ha permitido determinar la localizaci6n de genes en el genoma humano. Por ejemplo, llnicamente las celulas hfbridas que contienen el cromosoma humano II sintetizan la insulina hrnnana, 10 cual indica que eJ gen que codifica la insulina se halla situado en el cromosoma 11. Estas mistres clones de c4ilules hlbridas. ceda uno de los cuales conserva un nCimero reducldo de cromOBomas humenos diferentes iunto con toda la dotaclon cromosomlca del raton

SUSPENSION Of DOS TlPOS CELULARES. CENTRlfUGACION Y AOICION Of UN AGENTE DE fUSION fUSION CELULAR Y fORMACION DE HETEROCARIDNTES,

EL MEDIO SELECTIVO SOLO PERMITE PROUFERAR A LOS HETEROCARIONTES.

QUE POSTERIOAMENTE:::::=::;~ SON CULTlVADOS -::: ~ _."" . . (i) .......

-- '6J

'"

fibrOblesto humano

170

c4ilula tumoral de raton

'"'"'

LOS CUALES SE CONVIERTE~N!j,~~t:: EN CElULAS HfBRIDAS I QUE POSTERIORMENTE SERAN CLONADAS

heterocarionte

Capitulo 4 : C6mo se estudlan las celulas

c4ilule hfbride

Figura 4-33 Produccl6n de celu)as hlbrldas. Celulas humanas se iusionan con celulas de ral6n. produciendose heterocariontes (cada uno de ellos conteniendo dos 0 mlis nucleos) que posleriormente danin lugar a celulas hfbridas (cada unade elias can un Unico micleo fusionado). Estas ctHulas hJbridas en particular resultan titHes para 10caJizar genes humanos en los cromosomas. ya que la mayorfa de fos cromosomas humanos se pierden n'ipidamenle de manera aleatoria, con 10 que quedan clones que conservan tan 5610 uno 0 unos cuantos genes. A menudo, las celulas hfbridas producidas por fusi6n de otros tipos celulares conservan Ja mayorfa de sus cromosomas.

Tabla4-5 Algunos de los hllos en el desarroUo del cuilivo de telldos 1885 Roux demostr6 que las ci!lulas embrionarias de polio pueden manlenerse vivas en una soluci6n salina, fuera del cuerpo del animal. 1907 Harrison cultiv6 mi!dula espinal de anfibio en un coagulo Iinflitico, demostrando asf que los axones se producen como prolongaciones de eelulas nerviosas. 1910 Rous indujo un tumor utilizando un extracto filtrado de ci!lulas tumorales de polio, que mas tarde se demostr6 que contenfan un virus de RNA (virus del sarcoma de Rous). 1913 Carrel demoslr6 que las eelulas podfan crecer en cultivo durante mucho tiempo, siempre que fueran alimentadas regularrnente y bajo condiciones asepticas. 1948 Earle y colaboradores aislaron eelulas de 120 Ifnea celular L y demostraron que en cultivo tisular forman clones de celulas. 1952 Gey y colaboradores estableeieron una Unea continua de celulas derivada de carcinoma cervical humano, que mas tarde se convirti6 en 120 eonocida Ifnea eelular HeLa. 1954 LevI-Montaldnl y colaboradores demostraron que el faclor de crecimiento nervioso (NGF, de Nerve Growth Factor) estimula el erecimienlo de los axones en cultivo. 1955 Eagle desarroll61a primera investigaci6n sistematica sobre los requerimientos nutricionales escnciales de las celulas en eultivo y encontr6 que las celulas animaJes se pueden propagar en una mezcla definida de pequefias moleculas suplemenlada con una reducida proporci6n de protefnas sericas. 1956 Puck y colaboradores seleccionaron mutantes con requerimientos de crecimiento alterados a partir de ceJulas HeLa en cultivo. 1958 Ternln y Rubin desarrollaron un metodo cuantitativo para 120 infeeci6n de cultivos de eelulas de poUo mediante eillirus del sarcoma de Rous purificado. En 120 d~da siguiente Stoker, Dulbecco, Green y otros vir61ogos establecieronlas caracteristicas de 6ta y de otras transformaciones rlricas. 1961 Hayfllck y Moorhead demostraron que los fibroblastos humanos en cultivo mueren tras un numero fin ito de divisiones. 1964 L1uJe8eld introdujo el medio HAT para el crecimiento selectivo de hlbrldos celulares somaticos. Junto con 120 teenica de 13 fusi6n eelular, este medio hizo accesible 120 genetica de las eelulas somaticas. Kato yTakeuchl obtuvieron una planta compieta de zanahoria a panir de una sola celula de rafz de zanahoria manlenida en cultivo. 1965 Ham introdujo un medio definido, sin suero, capaz de permitir el crecimiento clonal de ciertas eelulas de mamffero. Harris y Watkins produjeron los primeros heterocariontes de celulas de mam(fero, mediante la fllsi6n indllcida yfricamente de celulas humanas y de ci!lulas de rat6n. 1968 Augustl-Tocco y SalO adaptaron 201 cullivo ei!lulas nerviosas tumorales de rat6n (neuroblastoma) y aislaron clones que eran excitables electricamente y producfan prolongaciones nerviosas. En esta epoca se aislaron otras celulas diferenciadas, entre elias Ifneas celulares hepaticas y de musculo esqucletico. 1975 Kohler y Milstein produjeron las primeras IIneas cellilares de hibrldomas que scgregaban anticuerpos monoclonales. 1976 Sato y colaboradores publicaron el primero de una serie de inforrnes, demostrando que para creeer en un medio sin suero, las Ifneas celulares diferentes requieren mezclas diferentes de hormonas y de factores de crecimiento. 1977 Wigier y Axel y colaboradores desarrolJaron un eficiente metodo pard. introducir genes humanos de copia linica en el interior de celulas cultivadas, adaptando los metodos desarroUados inicialmente por Graham y van der Eb.

mas celulas hibridas lambien se utilizan como fuente de DNA humano para prcparar Iibrerfas de DNA de cromosomas humanos. Mas adelante en este capftulo aprenderemos de que forma se han utilizado las celuJas hibridas en la producci6n de anticuerpos monoclonales. Aislamiento y credmlento de celulas en cuJtivo

171

)

En la Tabla 4-5 se enumeran algunas de las etapas mas importantes del desarrollo del cultivo en tejidos.

Resumen Habitlullmente los teJldos de organlsmos mllY jO'lenes se plletlen disociar en sus componentes celulares, a partir de los cludes p"eden purljiMne diferentes tipos celulares individunJes, los cuaks pueden utilizarse para su andlisis bioqulmico 0 para establecer c.Iltivos celulares. Mltc/uu tipas de c/lldiU animales y vegetales $0breviven y prallferan ell 'ilia placa de crdtil/O si se In smninistra el "'edio de CllltilJO adecuado contenielldo nutrlentes y factores de crecimie"to espedflcos. Aunqlle la mayorla tk las ciluw allimaks mueren despuh de un nd"'era flnito de divislones, en los adtivos surgen espontallMmente UtuU c/lulas variantes inmortales que pueden ser mnnlenldas lndejinld/lmente como llneas celulares. Los clones derlvados de UM "niM dl"ln ancestral hacen pasible aislnr poblnciones "niformes de cilulas n",tantes con tkfectos ell UM saln pratelna.. Plteden jusiOlrane dos tipas diferentes de cilulasfamufndose heterocarlontes (celulas con dos ndcleos), que pueden utillzane para esnullar las interacciones entre los componentes tk las dos celulas orlg;Mles. Con el tiempo los '.elerocarlontes fomran ciluw hlbrldns (con un nlfe/eo fuslonado), las cualn praporciOlum un mitada nlllY adecwulo para loetdizar ge'teS ell los cromosanuu.

Fraccionamiento de las celulas y amllisis de sus moleculaszo Aunque los an;flisis bioqufmicos requieren la disgregad6n de la delicada analOmfa de la cl!lula, se han desarrolJado ml!todos suaves de separad6n que preservan la funci6n de los diversos componentes celulares. De la misma forma que un tejido puede ser disgregado en sus diferemes lipos celulares vivos, tambi~n la celula puede ser fracdonada en sus organu.los y macromoll!culas fundonales. En eSla secd6n vamos a centrarnos en los melodos que permiten [a purificaci6n de organulos y de macromol~culas. En el Capitulo 7 se discuten las poderosas tecnicas del DNA recombinante, utilizadas para analizar genes y prolefnas.

materilll en $8dimentllCio"

Los organulos y las macromoltkulas pueden separarse por ultracentrifugaci6n 21 Las c~lllias pueden disgregarse de varias maneras: pueden somelerse a shock osm6tico 0 a vibraciones ultras6nicas, pueden hacerse pasar a trav~s de un pequeno orifido 0 pueden molerse. Estos procedimientos rompen muchas de las membranas de la celula (inc1uidas la membrana plasmatica y las membranas del reticulo endoplasmalico) y los fragmelllos se unen inme
Capftulo 4 : C6mo se estudian las ~Iulas

molor

Figura 4-34 La ultracentrifuga preparatlva. La muestra se coloca en unos tubos que quedan insertados en un aniIlo de orificios cilindricos de un rotormetaIico. La rnpida rotaci6n dcl rotor genera unas fuerz.as centrifugas enormes. que provocan la sedimentaci6n de las partfculas de la muestra. EI vado disminuye el rozamienlO, con 10 que el rotor no se calienta tanto y eI sistema de refrigeraci6n puede manlener la

muesua a 40<:..

velocidades de giro (Figura 4-34). Este tratamiento separa los componentes celulares en funci6n de su tamano Y Sll densidad: en general. las unidades mayores experimentan mayores fuerzas centrffugas y se desplazan par el tuba mas rapidamente. A una velocidad relativamente reducida sedimentan los componemes de tamano mayor, como los nudeas y las celulas enteras, formando un precipi!'ado (pellet) en el fonda del tubo de la cemrffuga; a una velocidad alga superior se deposila un precipitado de milOcondrias, y a velocidades aun mas allas y con perfodos de cemrifugaci6n mas prolongados, se pueden recoger primero las pequei\as vesfculas cerradas y luego los ribosomas (Figura 4-35). Todas estas (racciones son impuras pero se pueden eliminar muchos de sus contaminantes resuspendiendo de nuevo los precipi£ados y repitiendo varias veces el procedjmiento descrito de cemrifugaci6n. EI m~todo de centrifugaci6n constituye el primer paso de la mayorfa de fraccionamiemos, pero 5610 separa los componentes que son muy diferentes en tamano. Se puede obtener un mayor grado de separaci6n colocando el homagenado como una eslrecha banda en la parte superior de una soluci6n salina diluida que Ilene el tubo de centrffuga. Cuando se centrifuga, los diversos componentes de la mezcla se desplazan a traves de la soluci6n salina como series de bandas distintas. cada una a difereme velocidad, en un proceso denominado velocldad de sedlmentacl6n (Figura 4-36). Para que el proceso sea efectivo. las bandas deben ser protegidas del mezclado por convecci6n, 10 cual sucede habitualmente cuando una soluci6n densa (por ejemplo, una que comenga organulos) se halJa en la parte superior de otra de menor densidad (Ia soluci6n salina). Esto se consigue rellenando el tubo de centrifuga con un gradiente de sacarosa preparado con un aparato especial de mezclado; el gradienle de delJsidad resultante, con la zona mas densa en el fonda del tubo, consigue que cada una de las regiones de la soluci6n salina sea mas densa que cualquier soluci6n superior evhando asf el mezclado por convecci6n que djslOrsionarfa la separaci6n. Cuando el homogenado es sedimemado a traves de estos gradientes de densidad, los diferentes componentes celulares se separan en distintas bandas que pueden ser recolectadas individualmente. La velocidad a la que sedimenta cada uno de los componcntes depende fundamental mente de su tamano y de su forma, y suele expresarse como coeficiente de sedimentaci6n 0 IJ{li0r s. Las ultracenlrffugas aCluales pueden alcanzar velocidades superiores a 80 000 rpm y producir fuerzas de mas de 500 000 veces la de la gravedad. A estas enormes fuerzas se pueden separar entre sf en funci6n de su tamaf\o inclllso las macromoleculas peqllei'ias como las moleculas de tRNA y las enzimas sencillas. Rlitinariamente se ulilizan los coeficientes de sedimentaci6n de los complejos macromoleculares para determinar la masa total del complejo y, par tanto, el numero de subunidades de cada tipo que presentan. La ultracentrffllga se utiliza tam bien para separar los componentes cellilares en funci6n de su demidad de flotaci6n, independiemememe de su tamai'lO. En eSle caso, la muestra normalmente se hace sedimentar a traves de un gradiente discontinuo que contiene una concenuaci6n mllY elevada de sacarosa 0 de cloruro de cesio. Cada componeme celular empieza a descender par el gradiente como en la Figura 4-36, hasta que lIega a una zona en la que la densidad de la 50luci6n es igual a Sll propia densidad. En este lugar del tuba el componente flola y ya no puede desplazarse mas. Por consiguiente, en el tubo de la centrffuga se forman series de bandas distintas, siendo las bandas que contienen los componentes de mayor densidad de flotaci6n las que se halJan mas cerca del fondo del tuba de centrffuga. EI metodo, denominado equilibria de sedimenlacl6n, es suficientemente sensible para separar macromoleculas que han incorporado i56topos pesados, como el l3(: 0 el 15N de las mismas macromolecuJas no marcadas. De hecho, el metoda del c10rura de cesio fue desarrollado, en 1957, para separar el DNA marcado del no marcado producido despues de la exposici6n de una poblaci6n de bacterias en crecimiento a precursores de nucle6tidos can UN; este experiment'o c1asico proporcion61a prueba directa de la replicaci6n semiconservativa del DNA. Fraccionamiento de las ce.lulas y anlllisis de sus moleculas

homogenado celular

CENTRIFUGAC16N A VELOCIOAO BA.JA

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SOBRENAOANTE SOMETlDO A CENTAIFUGACl6N A VELOCIDAD MUY ALTA

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Figura 4-35 Fracclonamlento celular por centrtrugacl6n. Ccntrifugaciones rcpelidas a velocidades progresivameme mayores fmcclOllan!.n los extractos celulares en sus componenle5. En general, cuanlo menor sea el tamaflo del componente subcelular mayor ser.l.la fuerza centrffuga necesaria para s&limentarlo. Los valores tipicos de las di\'ersas etapas de cenlrifugaci6n mostradas en la figura son las siguienles: vel. baja: 1000 veres la gravedad durante 10 minutos vel. media: 20000 veces la gravedad duranle 20 minulos vet aha: 80 000 veres la gravedad durante I hora vel. muy ISO OOOveces la gravedad alta: durante 3 horns

173

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Los detalJes moleculares de los procesos celulares complejos unicamente se pueden descifrar en sistemas lib res de c~luJas22 Los estudios de org<1nulos y de olros grandes componentes subcelulares oblenidos por ultracentrifugaci6n han constituido avances muy importanle en la determinaci6n de la !llllciones de los diferentes componentes de 1a celula. Asf por ejemplo, diferentes experimentos sabre mitocondrias y cloroplastos purificados por cenlrifugaci6n demostraron la funci6n central de estos org<1riulos en las interconversiones energlhicas. Analogamente, las vesfculas formadas de nuevo a partir de fragmentos del retfculo endoplasmatico liso y rugoso (microsomas) han sido separadas unas de Olras y analizadas como modelos funcionales de es· tos mismos compartimentos en las celuJas intactas. Una eXlensi6n de eSla aproximaci6n hace posible estudiar otros procesos biol6gicos Iibres de todas las complejas reacciones laterales que ocunen en la celula, y sin las constricciones de tener que mantener las celuJas como un todo. Por eUo, los extractos celulares fraccionados que mantienen su funci6n biol6gica (denominados sistemas IIbres de celulas) son ampliamente utilizados en biologfa celuJar. Uno de los primeros exitos de este sistema de estudio fue la deducci6n del mecanismo de s{ntesis proteica. EI punto de partida 10 constituy6 un extracto ceo lular crudo que era capaz de traducir las molecutas de RNA a protefna. EI fraccio· namiento de cste extracto dio lugar a ribosomas, tRNA y varias enzimas, que, en conjunto, constituyen la maquinaria de la sfnlesis proteica. Una vez se dispuso de los componentes individuales purificados, fue posible ponerJos 0 quitarlos uno a uno del media de incubaci6n, consiguiendose asf definir el papel exaeto de cada uno de esros componentes. Mcis tarde se utiliz6 este mismo sistema de traducci6n in vitro para descifrar el c6digo genetico, usando polirribosomas sintcticos de se· 174

CapftuJo4: C6mo se esludian las celuJas

P1gunt 4-36 Comparacl6n entre los metodos de velocldad de sedJmentad6n yequillbrto desedlmentad6n. En velocidad de sedbnentaci6n W,la muestra se coloca sobre una soluci6n diluida de sacarosa y los componentes subcelulares sedimenlan a diferentes vekx:idades de acuerdo con su lamano. Para estabilizar las bandas que sedbnentan y evitar que se mezclen por fen6menos de convecci6n originados por pequenas diferendas de lemperarura 0 de concentraci6n de los solulOS. eI tuoo contiene un gradiente continuo de sacarosa que aumenta de concenlntCi6n hacia cl fonda del moo {tfpicamenle desde 5~ a ~ de sacarosa}. Despue; de la cenuifugaci6n, los diferentes componenles pueden recogerse por separado: el sistema mas sencillo de hacerlo consiste en periorar eJ tuOO de la cenlrffuga y recoger cl media gota a gola, lal como i1usl:r.lla figura. En el equilibria de sedimeotad6n (8) cuando los componentes subcelulares se cenuifugan en un gradienle, pueden despiazaise arriba y abajo hasla que a1canzan una mna en que su densidad esta comprendida entre Iasdensidades vecinas del gradiente. Aunque aquf se presenta un gradiente de sacarosa, para scparaci6n de prolemas y de acidos nucieicos se utilizan habitualmente gradientes de densidad preparodos con cioruro de cesio. las bandas finales, en cl equilibrio, se pueden recoger como en (A).

cuencia conocida como ~RNA mensajero" (mRNA) para ser lraducido. Hayen dfn se utilizan diversos sistemas de traducci6n in vitro para determinar romo las protefnas recicn sintetizadas son clasificadas y dirigidas a diversos compartimentos intracelulares y tambicn para identificar las protefnas que son codificadas por preparaciones purificadas de mRNA -un paso imponante en los metodos de clonnje genico. En la Tabla 4-6 se presentan algunos de los hitos del desarrollo de los metodos utilizados en el fraccionamiento de extractos celulares. Una gran cantidad de la informaci6n que hoy en dfa conocemos acerca de la biologfa molecular de la celula, se ha descubierto estudiando sistemas Iibres de celulas. Para clrar algunos de los muchos ejemplos, estudios de este tipo se han utilizado para analizar los detaUes molecuJares de la replicaci6n y In transcripci6n del DNA, de la maduraci6n por corte y empalme del RNA (splicing), de la contracci6n muscular y del movimiento de partlculas a 10 largo de los microttibulos. Los sistemas Iibres de celulas se han utilizado en estudios de procesos tan complejos y a1tamente organizados como el cicio de divisi6n celuJar, In separaci6n de cromosomas sabre el huso mit6tico y los procesos de transporte vesicular implicados en los desplazamientos de las protemas desde el retfcuJo endopl;1smico, a traves del complejo de Golgi hasta la membrana plasm<1.tica. EI amllisis de un sistema libre de ~luJas supone la sepnraci6n completa final de 10dos sus componentes macrornoleculares individuales y en particular de tOOas sus prote{nas. Ahora consideraremos c6mo se puede lograr esta separaci6n.

Tabla 4-6 Algunos de los prindpales aoonteclm1entos del desarrollo de la uJtracentrlfuga y de la preparacl6n de extractos Ubres de celuJas 1897 Buchner demostro que los extractos de levadura. libres de celulas, pueden fermentar los azucares produciendo di6xido de carbono y etanol, con 10 que se establecieron las bases de la enzimologfa. 1926 Svedberg desarroU61a primera ultracentrlfuga analitica y In utiliz6 para estimar el peso molecular de la hemoglobina, que cifr6 en 68 000 daltons. 1935 Plckels y Beams introdujeron varias caracterfsticas nuevas en el discl\o de la ultracentrffuga, que condujeron a su utilizaci6n como instrumento preparalivo. 1938 Behrens emple61a ultracentrifugaci6n diferencial para separar los micleos del citoplasma de celulas hepaticas, tecnica que luego desarrollaron Claude, 8rachet, Hogeboon y otros durante los mos 1940 y principios de los 1950 para el fraccionamiento de organulos celulares. 1939 Hut demostr6 que los cloroplastos aislados, cuando se i1uminaban, podian efectuar reacciones de fotoS(n1esis. 1949 Szem;-Gyttrgyt demostr6 que las miofibrillas aisladas de celulas de musculo esqueletico se cOutraen aI anadirlesATP. En 1955 Hofmann-Berling desarro1l6 un sistema libre de celulas similar a este para eSludiar el movimiento ciliar. 1951 Brakke utiliz61a centrifugaci6n en gradiente de densidad en soluciones de sacarosa para purificar un virus vegetal. 1954 de Duve aisl6lisosomas por centrifugaci6n y, mas tarde, peroxisomas. 1954 Zamecnlk y colaboradores desarrollaron el primer sislema libre de celulas que reali.taba sfntesis proteica. Aello sigui6 una decada de intensa actividad de investigaci6n, duranle la cual fue dilucidado el c6digo genetico. 1957 Meselson, Stahl y Vlnograd desarrollaron la centrifugaci6n en gradiente de densidad en soluciones de doruro de cesio para separar <1.cidos nudeicos. 1975 Dobberstein y Blobel demostraron la translocaci6n de protefnas a traves de membranas, en sistemas libres de celulas. 1976 Neher y Sakmann desarrollaron el registro de zona para medir la actividad de canales i6nicos aislados. 1983 Lohka YMasuJ produjeron extractos concentrados a panir de huevos que ;11 vitro realizaban el cicio celuJar completo. 1984 Rothman y colaboradores reconstiruyeron in vitro el trtl.fico de vesfcuJas de Golgi utilizando un sistema libre de celulas.

Fracclonamlento de las cBuJas y anliUsls de sus molkulas

115

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Las prote(nas pueden separarse mediante cromatograffa23 Uno de los m~lodos de utilidad m
Figura 4-37 Separacl6n de moleculas pequeftas mediante cromatograffa 50bre papel. Despues de aplicar la muestra en un exlremo del papel (el "origen") y de secarla, se permile que una soluci6n que contiene una mez.cla de dos disolventes fluya lentamente a 10 largo del papel por capilaridad, Los diferentes componentes de la muestra se desplazan 50bre el papel a velocidades distinlas, en funci6n de su solubilidad relativa en el solvente que es adsorbido preferentemente por el papel. EI desarrollo de esla lecnica revolucion61os anaJisis bioquimicos durante los anos 1940,

una mancha en una hoja de material absorbente, que puede ser papel (cromatografla de papefJ 0 una hoja de phtslico 0 de cristal recubierta de una fina capa de un material absorbeme inerte. como celulosa 0 gel de silice (cromacogra!fa ell capa final. A conlinuaci6n, se deja que una mezcla de disolventes. como por ejemplo el agua y un alcohol. impregne la hoja desde uno de sus extremos: a medida que elliquido se va desplazando a lraves de la hoja, va separando las mol/!culas de la muestra en funci6n de su solubiJidaa en cada uno de los dos disolventes. los disolventes se escogen de forma que uno de eUos se adsorba con mayor intensidad en el material absorbente que el otto formando una capa de disolvente estacionaria en la superficie de la hoja. En cada regi6n de la hoja las moleculas se equilibran entre el disolvente estacionario y el m6vil: las que son mas solubles en el disolvenle ruertemente adsorbido son relativamente relardadas porque consumen mas liempo en la eapa eSlacionaria, mientras que las que son mas solubles en el olro disolvenle se mueven mas rapidamente. Despues de un cierto numero de horas, la hoja se seca y se tine para localizar la siruaci6n de las diferentes molceulas (Figura 4·37). Las prolcfnas se suelen fraccionar mediante la cromalOgrafla ell columlla, en la que una mezcla de prOlcinas en soluci6n se haec pasar a lraves de lIna co.olvenle uplicldo de forml .plic8l::i6n continul I lu purte superior dul. columna de,de un de la mueev. grun dep6,ito de solvente

Figura 4-38 Separaci6n de moleculas mediante cromatograffa en columna. La muestra se aplica en la parte superior de una columna cilfndrica de vidrio 0 de phistico, que comiene una matriz s6lida permeable, por ejemplo de eelulosa, inmersa en un solvcnte, A continuaci6n se haee pasar lentamente a naves de la columna una gran canlidad de solvente, recogiendolo en tubos separados a medida que sale de la parte inferior de la colwnna, Los di"ersos com~ponentes de la muestra se desplazan a distintas velocidades a traves de la columna quedando asf rraccionados en tubas distintos.

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Capflulo 4 : C6mo se estudian las cclulas

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ICl CROMATOGRAFfA DE AFINIDAD

Figura 4-39 Tres lJpos de matriz utlllzad05 en cromatogTB.na. En la cromatografia de intercambio i6nico (A) la rnatriz insoluble presenta cargas i6nicas que retardan las molkulas de carga opuesta. Las matrices utilizadas habitualmenle para separar protefnas son la dietilaminoetilcelulosa (DEAE-c:elulosa). de carga positiva. y la carboximetilcelulosa (eMcelulosa) y la fosfocelulosa, de carga negativa. La fuerza de uni6n entre las mol~ulas disueltas y la matm de imen::ambio ionico depende de la fuerza i6nia y del pH de la soluci6n eluyente que alraviesa la columna, panimelros que pueden variarse de una manera sislemtitica (como en la Figura 4-401 para conseguir una separaci6n mas dectiva_ En la cromalografia de mlraci6n en gel (8)la malriz es inene pero porosa. las molkulas suficienlemenle pequeilas para peneuar en el interior de la matriz se reuasan y viajan mtis lemameme a lrav~ de la columna. En el comercio exislen bolitas de polisactiridos con puentes cruzados (dextrano 0 agarosa) en una amplia gama de tamafios de para adecuadas para el rraccionamiento de molk:ulas de diversos pesos moleculares, desde menos de 500 hasta mas de 5 x 10' dalions. La cromalOgraffa de afinidad (0 utiliza una malriz insoluble que estti unida covaJenlemente a un ligando especifico, como por ejemplo una molkula de anlicuerpo 0 un subslrato enzimtitico. que se unirti a una prolefna determinada de la mueslra. Las mol~ulas de enzima que se han unido a substralOS inmovilizados en columnas de eSle tipo se puerlen eluir con una soluci6n concenlrada del substralo en forma Iibre. mientras que molkulas que se han unido a amicuerpos inmovilizados pueden eluirse disociando el complejo anlfgeno-amicuerpo con soludones concentradas de sales 0 con soluciones de pH alto 0 bajo. Amenudo se consiguen purificadones elevadas con un solo paso a traves de estas columnas. lumna que contiene una matriz s6lida porosa. Las diferentes protefnas de In mezcia se van retrasando mAs 0 menos a causa de su interacci6n con la matriz de la columna y pueden recogerse por separado en su estado fundonal nativo a medida que fluyen por el extremo inferior de la columna (Figura 4-38). En fund6n del tipo de matriz que se utiJice, las protefnas se pueden separar seg(m su carga (cromatograffa de intereambio i6nico), su hidrofobiddad (cromatograffa hidrof6biea), su tamaf'io (cromatograffa de filtraci6nj, 0 su capaddad para unirse a determinados grupos qufmieos (cromatograffa de afinidad). Actualmente se comercializan un gran mlmero de tipos diferentes de matriz para cromamgraffa (Figura 4-39). Las columnas de imercambio i61lico estan lIenas de pequenas bolitas que comienen cargas positivas 0 negativas, de modo que las protefnas se separan en fund6n de la disposid6n de cargas de su superfide. Las columnas 1Iidrof6bicas estan llenas de unas bolitas con cadenas laterales hidrof6bicas que sobresalen de elias, de modo que las protefnas que tengan regiolles hidrof6bicas al descubierto quedan retardadas en su tn1nsito por la columna. Las COlllmTlas defiltraci6Tl eTl gel, que separan protefnas en fund6n de su tamano, comienen diminUlas bolhas porosas: a medida que van descendiendo por la columna, las mol~culas sufidemememe pequefias para penetrar en los poros pasan sucesivamente por el interior de esras esferas, mientras que las moIlkulas mlis grandes permanecen en la solud6n Ouyendo entre las esferas, y por 10 tanto, eluyen Ollis rlipidameme a traves de la columna y salen primero. Ademas de permitir la separad6n de las moltXuJas, la cromatograffa de filtraci6n en gel constituye un buen sistema para determinar el tamaf'io de las moltXulas. Este tipo de cromatograffa en columna no produce fracdones altamenle purificadas sl se parte de una mezcla compleja de protefnas: un unico paso a trav~ de una columna suele incrementar la propord6n en la mezcla de una protefna determinada en no ma..s de veinte veces. Pueslo que la mayorfa de las protefnas Fracclonamiento de las ee:lulas y amUisis de sus mol~uJas

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Figura 4-40 PuriOcad6n de prote'nas por cromatografCa. Resultados Ifpicos que se obtienen cuando se utilizan sllcesivamenle tres pasos cromalograficos diferentes para purificar una protefna.. En esle ejemplo se fraceion6 un extraCIO complelo hacl~ndolo pasar primero a Iraves de una resina de inlercambio i6nico empaquelada en una columna (A). La columna se lav6 y las protefnas se eluyeron haciendo pasar desde la parte superior de la columna una soluci6n de sal a una concentraci6n progresivamenle mayor. Las protelnas con menor afinidad por la resina de intercambio i6nico pasaron direclamente a Ira\'~ de la columna y fueron recogidas en las primeras fracciones eluidas que salieron por la parte inferior de la columna. Las restantes prolefnas fueron eluidas de manera secuencial de acuerdo con su afinidad por la resina -las unidas mAs intensamente necesilaron una concentraci6n de sal mas elevada para ser eluidas. La prolefna de inler~ sali6 en fonna de un pequeno pico y se deleclo por su aClividad enzim:ttica. Las fracciones con actividad fueron recogidas y aplicadas a una segunda columna de fl1traci6n en gel {B). La posicion de eluci6n de la prole(na lodavfa impura fue delerminada de nuevo por su actividad enzimalica, y las fracciones aclivas fueron recogidas y purificadas hasta homogeneidad medianle una columna de afinidad (e) que conlenfa inmovilizado un substrato de la enzima.

numero de fr.celona, _ "----J se rKogan Vmete len estes frKelones, que eho.e eontlenen Ie protelne eltemente pl.lrlfieeda

representan individualmente menos del 1/1000 de Ja protefna celuJar total, para conseguir purificarlas suele ser necesario utilizar sucesivamente varios tipos di· ferentes de columnas para conseguir la pweza suficiente (Figura 4-40). Un procedimiento ml1s eficiente, conocido como cromatograffa de aflnIdad, utiliza interacciones de enlace, importantes desde el punto de vista biol6gico, que se producen en la superficie de las protefnas. Por ejemplo, si un substrato enziml1tico se acopla covalentemente a una matm inerte, como pueden ser pequefias esferas de un polisacoirido, la enzima espedfica de este substrato fijado a la columna serl1 retenida en la matrix y podrl1 ser eluida navada) en forma casi pura. De fonna similar, puede inmovilizarse un DNA cono de secuencia disenada es· pecfficamente y utilizarse para purificar protemas que se unan al DNA y que reo conozcan esta secuencia de nucle6tidos en los cromosomas (Figura 9-23). Alternativamente, se pued.en acoplar anticuerpos espedficos a una mal.riZ para purificar mol~u1as proteicas reconocidas par los anticuerpos. Debido a la elevada especificidad de estas coJumnas de afinidad, algunas veces se pueden conseguir, en un solo paso, purificaciones del orden de 1000 a 10 000 veces. 178

Capftulo 4 : C6mo se estudlan las cl!lulas

11 ooiiIU

La resoluci6n de las columnas convencionales de cromatograffa estl1 limitada por la falta de homogeneidad de las matrices (como la celulosa), la cual genera un flujo desigual de los disolventes a traves de la columna. Se han desarrolJado nuevas resinas cromatognUicas (la mayorfa basadas en compuestos de s!lice) en forma de diminutas esferas (de 3 a 10 J.lm de diameuo) que pueden ser empaquetadas mediante un aparato especial formando un lecho uniforme en la colunma. Con estas colwnnas de cromatografia liquida de alta resolud6n (HPLC. de Higll Performance Liquid Chromatography) se a1canza un alto grado de separaci6n. Como las colwnnas de HPLC contienen partfcu1as empaqueradas de forma muy compacta, la velocidad de Oujo a traves de eUas es practicamente nuJa a menos que se apliquen a1tas presiones. Por esta raz6n, normalmente estas matrices se empaquetan en cilindros de acero y requieren un sistema sofisticado de bombas y vaJvulas para forzar a Ouir el disolvente a lraveS de la columna a la presi6n suficiente para producir un flujo deseado de aproximadamente un volumen de columna por minuto. En la cromatograffa en columna convencional, la velocidad de flujo debe ser lenta (a menudo de aproximadamente un volumen de columna por hora) para dar tiempo a los solutos a que se fraccionen en equilibrio con el interior de las grandes partlcuJas de la matriz. En la HPLC los solutos se equUibran rapidamente con el interior de las diminutas esferas, de manera que solutos con diferentes afinidades por la matriz son separados entre sf de forma muy eficiente, siempre a rapida velocidad de flujo. Esto pennite que muchos fraccionamientos puedan realizarse en cuesti6n de minutos, mientras que para obtener una separaci6n pobre en la cromatograffa convencional se requieren horas. Por consiguieme, la HPLC se ha convertido en el metodo escogido para muchas separaciones de protemas y de pequeflas molecuJas.

Mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, pueden determinarse el tamafio y la composici6n de subunidades de una protema2.4

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SH 50s

Flgura4-41 EldetergentedodecU .uUato a6dIco (SOS) YeI &gente reduclor tJ-mercaptoelan01. EsIOS dos reactivos qufmicos se ulillzan para solubilizar prolemas para elecrroforesis en gel de poliacrilamida con SOS. EI 50S se presenta aquf en su fonna lonizada.

Las prQ(efnas suelen tener una carga neta positiva 0 negativa, que refleja la de los aminoacidos cargados que contienen. Si se aplica un campo electrico a una soluci6n que contenga una molecula proteica, la prorefna migrara a una veloci· dad que dependera de su carga neta, de su tamaflo y de su forma. Esta tecnica, conocida como electroCoresl.s, se utiliz6 inicialmente para separar mezclas de prote!nas tanto libres en soluciones acuosas como incluidas en una matriz s61ida porosa tal como el almid6n. A mediados de los aflos 1960 se desarroU6 una versi6n modificada de este mtitodo --<:onocida como electroCoresis en gel de pollacrUamlda con 5DS (0 5DS-PAGE, de SDS PolyAcrilamide-GeI Electrophoresis), que ha revolucionado los sistemas de anaJisis rutinarios de las protemas. Como matrlz inerte a traves de la que migran las prote!nas, se utiliza un gel de poliacrilamida can numerosos puentes cruzados. Normalmente el gel se prepara inmedlatamente antes de utilizarse mediante la polimerizaci6n a partir de los mon6meros; el tamaflo del poro del gel puede ajustarse de forma que sea el adecuado para retrasar la mi· graci6n de las moleculas proteicas de interes. Las prote!nas no se colocan en una soluci6n acuosa simple, sino en una soluci6n que contiene un patente detergente de carga negativa, el dodecll sulfato s6d1oo, 0 SDS (de Sodium Dodecyl Sulfate) (Figura 4-41). Como este detergente se une a las regiones hidrof6bicas de las molecuJas proteicas, haciendo que se desplieguen las cadenas polipeptfdicas, las diferentes molecuJas proteicas quedan liberadas de sus asociaciones con otras moleculas proteicas 0 lip!dicas y se disuelven libremente en la soluci6n del detergente. Ademas, se suele afladir un agente reductor como el mercaproetanol (Figura 4·41) con objeto de romper los enlaces s-s que pudieran existir en las prote{nas, de forma que puedan analizarse separadamente todos los polipeptidos constitutivos de las moleculas que tengan varias subunidades. LQue sucede cuando una mezcla de protemas solubilizadas con 50S se somete a electroforesis a traves de una lAmina de gel de poliacrilamida1 Cada moFracdonamJento de las cBulas y anlUlsls de sus molkulas

179

IAI

ml,lllstrll cargada en el gel mediante una pipeta

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eLECTROfORESIS EN GEL DE POUACR1LAMlDA

Figura 4--.Z Electroforesls en gd de poliacrlJamlda con 5DS (5DS-PAGE). (A) Aparato. (8) Las distintas cadenas polipeptfdicas forman un complejo con

las molkulas cargadas negalivamente de dodecil suUalo s6dico {50S} y. enlances, migran en forma de complejo protelfla-SDS cargado negalivamenle. a lI'avl!s de un gel poroso de poliacrilamida. PueslO que 18 velocidad de migraci6n en estas condiciones es mayor cuaola menor sea cl poli~plido. esla t~nica puedc utilizarse para determinar de una forma aproximada el peso molecular de una cadena polipeptfdica, asf como la composici6n de subunidades de una prole£na. Sin embargo, si la protelna conllene una gran cantldad de carbohidratos, se desplazara de fonna an6mala por el gel, de forma que su peso molecular aparente estlmado por la SDS-PAGE sera err6neo.

li!cula de protelna se une a una gran cantidad de moli!culas del de(ergente, cargadas negalivamente, que anulan la carga intrfnseca de la protefna y hacen que cuando se aplica un voltaje la protefna migre hada el elec(rodo positlvo. Las protefnas del misma lamana tienden a componarse de forma idcntica ya que (I) su estructura naliva est<1 completamente desplegada por el SOS, por 10 que presentan la misma forma, y (2) unen la misma cantidad de SOS y por tanto lienen la misma cantidad de carga negativa. Las protefnas grandes, con mayor carga, est<1n sujetas a grandes fuerzas electricas pero tambicn a mayores resist endas. En soluci6n libre. ambos efectos podrfan contrarrestarse, perc en las redes del gel de poliacrilamida, que actua como un filtro molecular. las grandes prOlernas son remrdadas mucho m
CapftuJo 4: C6mo se estudian las celulas

Pigura 443 AmUlsls de mueslras proteicas por eleclroforesls en gel de pollacrllamlda con 5DS. La fOlOgraffa mueslra un gel que se ha utilizado para deteclar las protefnas presentes en los sucesivos eSladJos de la purificaci6n de una enzima. EI carril izquierdo (carril I) contiene la mezela compleja de prolefnas en el exlraclO celular de panida, y cada uno de los carnIes sucesivos analizan las proteinas oblenidas despu~ de un fraccionamienlO cromatografico de la muestra de proteinas analizada en el carril anterior (v~ase Figura 4-40). En cada carri! secarg61a misma cantidad de protefna (10 ~gl. Normalmenle, cada proteina aparececomo una fina banda tel'lida; sin embargo, las bandas se ensanchan cuando contienen demasiada proleina. (Por cortesla de Tim Formosa.)

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proteico. En la Figura 4·43 se presenta una fOlografia de un gel utilizado para analizar cada una de las sucesivas elapas de la purificaci6n de una protefna.

Mediante electroforesis bidimensional sobre gel de poliacrHamida, se pueden resolver mas de 1000 proternas sobre un mismo geJ2S

15 000

Dado que en un cromatograma las bandas muy pr6ximas lienden a superponerse, cualquier m~lodo unidimensional de separaci6n, como la eleclroforcsis en gel de poliacrilamida con SDS 0 la cromatografia, s610 pueden resolver un m1mero relativamente reducido de prolefnas (par 10 general menos de SO). Par el comrario. la electroforesls bidimensional sabre gel, que combina dos procedimientos diferenles de separaci6n, puede ser utilizada para resolver mj,s de 1000 prolefnas diferentes, en forma de un mapa proleico bidimensional. En el primer paso, las prolefnas son separadas en funci6n de su carga. La muestra se disuelveen un volumen reducido de una soluci6n que contcnga un delergenle no i6nico (no cargado) y un reactivo desnaturalizante como la urea 0 el mercaploelanol. Esta soluci6n disuelve. desnaruraliza y disocia lodas las cadcnas polipeptldicas sin allerar su carga intrfnseca. Luego. las cadenas polipeplfdicas son fraccionadas mediante un procedimiemo denominado cnfoque lsoclectrlco 0 Isoelectroenfoque, que se basa en el hecho de que la carga nela de una molecula proleica varia con el pH de la soluci6n. Para cada protefna existe un pH caracter{slico, denominado pUf/lO isoefectrico, al que la proterna no prescnta carga nela y. por 10 tanto, no migrant en un campo eltktrico. En el isoeleclroenfoque [as prolefnas son sometidas a electroforesis en un tubo estrecho de gel de poliacrilamida en el que se ba establecido un gradienle de pH mediante unas mezclas de amortiguadores especlales. Cada protefna se desplaza hasta la zona de gradiente que presenla un pH igual a su punto isoehktrico. y alli pennanece inm6vil (Figura 4-44). J!sla es la primera dimcnsi6n de la electroforesis bidimensional sobre gel. En el segundo paso, el estrecho gel que contiene las protefnas separadas sc somete otra vez a electroforesis, perc en una direcci6n perpendicular a la utiliza· da en el primer paso. Esta vez se aiiade 50S, y las prolefnas son separadas en

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Fraccionamiento de las relulas y amUisis de sus molkulas

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Figura 4-44 Separaci6n de mol«:ulas proleicas por isoelectroenfoque. A pH bajo (elcvada concentraci6n de H') los gru!)OS ~cido carboxilo de las protcfnas ticnen tendencia a quedar sin carga (-COOl·I) y los grupos nitrogcnados b~sicos. a quedar cargados {por ejemplo. -NHJ'J confiriendo a la rnayorla de las proteinas una carga neta positiva. Aun pH elevado. los gropos ~cido carboxilo eSlan ca.rgados negalivamente (-COO-) y los grupos blisicos tienden a estar sin_carga (por ejemplo. -NH z), confiriendo a la mayorfa de las protefnas una carga neta negativa. Asu pH isoelkrrico una proleina ca.rece de carga neta debido a que las cargas positivas y negalivas se anwan. AsI, cuando un tubo que conliene un determinado gradiente de pH se somete a un campo el~lrico intenso, cada tipo de protefna migra hasta formar una banda bien delimitada en su pH isoel~trico, como se muestra en la iluslraci6n.

181

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gradieote lIStable de pH _

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Figura 4-45 Electrororesls bidimensional sobre gel de poUacrUamlda. En este gel se separan todas las protelnas de una bacleria E. coli; cada mancha corresponde a una cadena polipeptfdica diferente. Las protefnas fueron separadas primero de acuerdo con sus puntos isoel&:tricos mediante isoelectroenfoque, de izquierda a derecha Despu~ fueron £racclonadas de nuevo segl1n sus pesos moleculares medJanle electroforesis en presencia de SDS, de arriba a abajo. Observese que las distintas protelnas se hallan presentes en cantidades muy dlferentes. La bacteria fue alimentada con una mezcla de aminoacidos marcados COD radiois6topos, de manera que tOOas sus protefnas resultaron radiaetivas y pudieron fllcilmente delectarse mediante autorradiografia (vease pag. 191}. (Por conesfa de Patrick O'Farrell)

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funci6n de su tamano. como en el caso de la 50S-PAGE de una dimensi6n: el estrecho gel original se empapa en 50S y se sirna en un borde de una I.t\mina de gel de poliacrilamida-SOS. a trav~ del cual cada caetf"r. _polipeptCdica migra formando una mancha discrela. esta es la segunda dimensi6n de la electroforcsis bidimensional sobre gel de poliacriJamida. Las unicas protefnas que no se resolvedan serfan las que tuvieran un tamano identico y un punto isoeh!ctrico idenlico, 10 cual es relativamente poco frecuente. Par este sistema pueden deleclarse sobre el gel incluso cantidades lraza de cada una de las cadenas polipeptfdicas, mediante diversos procedimientos de tinci6n -0 por medjo de autorradiograffa si la muestra estaba marcada con un radiois6topo. En un mismo gel bidimensional se pueden scparar hasta 2000 cadenas polipeptCdicas -10 cual consrituye la mayor parte de las prolefnas de una bacteria- (Figura 4-45). Este sistema liene un poder de resoluci6n tan elevado que pennile diferenciar fdcilmente dos protefnas identicas entre sf que solamente se diferencian en un solo amino~cido cargado. Teas su resoluci6n tanto en geles unidimensionales como bidimensionales, una delerminada protefna puede identificarse exponiendo IOdas las protefnas presences a un anticuerpo especffico que ha side acoplado a un is6topo radiactivo, a una enzima facilmente detectable 0 a un colorante l1uorescente. Por conveniencia, normalmente esto se realiza despues de que todas las protefnas presentes en el gel se han transferido (mediante "blotting") a una lamina de papel de nitrocelulosa, como describiremos mas adelante para los
Figura 4-46 Transferenda de tlpo Western (Western blotting) 0 Immunoblottlng. TOOas las protefnas de dlulas del tabaco en divisiOn mantenidas en cultivo se separaron prirnero mediante electroforesis bidimensional sobre gel de poliacrilamida, como se muestra en la Figura 4-45, Ysus posiciones se revelaron mediante una tinciOn sensible a las protefnas (A,). Las protelhas separadas en un gel identico a! anterior se transfirieron a un papel de nltroeelulosa, eI cua! se incubti con un anticuerpo que reconoce las protefnas que durante la mitosis resultan fosforiladas en reslduos de treOnina. Se revel61a posici6n de la docena de prOlefnas de este tipo que son reconocldas por este anticuerpo, mediante un segundo anticuerpo unido a unaenzima (B). (DeJA. Traas,A.F. Bevan. I.H. Doonan, J. Cordewenery P.l. Shaw. PlantjoumaJ2:723-732, l992, con penniso de Blackwell Scientific Publ)

ripe Western (Western blottillg)(Figura 4-46). "'t

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182

Capftulo 4: C6mo se estudJan lu cBuJu

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Tabla 4·7 Hltos en el desarrollo de la crornatograffa y de la electrororesls y de su apllcaclon a las rnol6:ulas blologicas 1833 Faraday describi6 las leyes rundamentales sobre el paso de la electricldad a

traves de soludones i6nicas. 1850 Runge separ6 compuestos qufmicos inorgAnioos en fund6n de su adsorci6n

1906 1933 1942 1946

1955

1956

1959

1966 1975

dUerencial sobre el papel. t6:nica precursora de las posteriores separadones cromatograficas. Tswett invent6la cromatografla en columna, pasando extractos de petr61eo de hojas de plantas a traves de colurnnas de greda en palvo. Tlsellus introdujo la electororesis para separar protefnas en solud6n. Martin y Synge desarrollaron la cromatograffa de partici6n, que dos anos mas tarde condujo a la crornatograffa en papeL Steln y Moore determinaton por primera vez la composici6n de aminoaddos de una protefna utilizando inidalrnente una columna cromatografica de alrnid6n y desanollando posteriormente la cromatograffa sobre resinas intercambiadoras de iones. Smithies utiliz6 geles preparados con almid6n para separar las protefnas sericas mediante electroforesis. Sanger cornpleto el antiisis de la secuenda de aminoacidos de la insulina bovina, que fue la primera protefna que se secuendo. Ingram produjo las primeras -huellas dactilares- de protelnas, demostrando que la direrencia entre la hemoglobina de la anemia falciforme }' la hemoglobina normal radica en la variad6n de un solo aminoaddo. Raymond introdujo los geles de poliacrilamida, mejores que los de almid6n, para separar protefnas por electroforesis: en los anos siguientes, OrnSleln y Davis desarrollaron mejores sistemas de amortiguadores que permitieron la separaci6n a elevada resolud6n. Malzel introdujo el uso del dodecil sulfato s6dioo (50S) para mejorar la electroforesis en gel de poliacrilamida de las protelnas. O'Farrell idoo el sistema bidimensional sobre gel para anaHzar mezclas de protelnas; la electroforesis en gel de poliacrilamida con SOS se combin6 con la separad6n segun el punto isoelectrico.

En la Tabla 4·7 se presentan algunos hitos en el desarrollo de la cromatogra· ffa y la electroforesis,

protelna nelive

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lA INCUBACION CON TRtPSINA GENERA UNA MEZClA Of PEPTlDOS

I

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lA CROMATOGRAFlA Y LA ELECTROFDRESIS PRODUCEN UN MAPA DE DOS DIMENSIONES, "HUELLA DACTllAR", DIAGN6STICD DE lA PROTEINA

I

La hidr6lisis selectiva de una proteCna genera un conjunto caracterCstico de fragmentos pepdd.icos 26 Aunque el peso molecular y el punto isoelectrico son rasgos caracterlsticos de una protefna, la identificad6n inequfvoca de una protefna se basa, en ultimo t~rmino, en la determinad6n de su secuencia de aminoaddos. La primera fase de este proceso, que consiste en la rotura de la proteina en fragmentos mds pe· quenos, puede propordonar por sf misma mucha informaci6n uti! que ayude a caracterizar la mol~cula. Disponemos de enzimas proteolfticas y de reactivos quimicos que rompen las protefnas entre determinados residuos de aminoad· dos (Tabla 4·8). La enzima IripsillQ, por ejemplo, cona por ellado carboxilo de los residuas de Iisina 0 de arginina, mientras que el compuesto qu{mico bromu· ro de ciandgeno cona los enlaces peptfdicos proximos a los residuos de metioni· na. Puesto que estas enzimas y compuestos quimicos aCluan en un numero rela· tivamente reduddo de lugares de una proteina, lienden a produdr un numero relativamente pequeno de p~ptidos, que son baslante largos. Si una mezcla de ~ptidos como ~sta se sepala mediante cromatograffa 0 elecuoforesis, el patr6n resultante,o mapa peplfdico, tiene un valor de diagn6stico de la protefna a par· tir de la cual fueron generados los peptidos, y a veces recibe el nombre de "hue· Ua daetilar" de la protefna (Figura 4·47). La detenninaci6n de las "hueUas daetilares" de las protefnas fue desarroUa· da en 1956 como un sistema para comparar la hemogJoblna normal con la forma Fracdonamlento de las ~Iulas y an4lisis de sus mol~as

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Figura 4·47 ConfecehSn de un mapa peplfdJco, 0 hueUa dactllar, de una protefna. En esle casc, la protefna fue digerida oon uipsina, genenindose una mezcla de numerosos fragmentos polipeptfdicos pequenos diferentes. que luego se fraccionaron en dos dimensiones mediante electroforesis y cromatografia de panici6n. EI patr6n de manchas obtenido tiene valor diagn6stico para la protefna analizada.

\83

Tabla 4·8 Algunos de los reactlvos utUlzados nonnalmente para romper los enlaces peptldlcos de las proleCnas AmlnOlictdo 1

Amlnolictdo 2

LysoArg Phe. Trp 0 Tyr Glu

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cualquiera

cualquiera

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Eflzima

Tripsina Quimotripsina Prateasa VB Compuesto qll(mico Bromuro de cian6geno 2·Nitro·5·tiocianobenzoato

Se indica la especificldad por 105 amin04cidos de ambos Iados del enlace que se rompe. El gru. po carooxiJo del aminoocido I se Iibera por la rotura; este aminoticldo queda a la izquierda del enlace pepddico tal como se escribe normalmente (ve3Se Panel 2-5. p,tgs.. 58·59).

mutante de la protefna encontrada en pacientes que sufien de anemia [aId/orme. Se encontr6 un solo ~plido diferente entre ambas formas de hemoglobina. diferencia que mc1s tarde se atribuy6 a un solo aminoc1cido cargado, demostrlin· dose por primera vez que una mutaci6n puede cambiar un solo aminmtcido de una protefna.

Mediante mliiquinas automatizadas pueden anaJizarse secuencias cortas de arninoliicidosZ7' Cuando una protefna ha sido fragmentada en pequenos peptidos. el siguiente paso 16gico del anAlisis consiste en determinar la secuencia de aminol1cidos de cada fragmento pepddico aislado. Esto se realiza mediante una serie repetida de reacciones qUfmicas, proceso ideado originalmente en 1967. Primeramente el peptido se expone a un compuesto qufmico que linicamente forma un enlace covalente con el grupo amino Iibre del extremo amino terminal del peptido. Luego, este compuesto quJmico es activado mediante su exposici6n a un <1cido debil, con 10 que se rompe especfficamente el enlace peplfdico que une el ami· no<1cido amino terminal a la cadena polipeptfdica; seguidamente el aminmkido que se ha separado se identifica utilizando metodos cromatogr<1ficos. A conti· nuaci6n, el peptido restante, que tiene un amino<1cido menos, se somete a la misma secuencia de reacciones, y as( sucesivamente hasta que lodos los aminol1cidos del peptido hayan sido determinados. La naturaleza reilerativa de estas reacciones conduce por s( misma a la automatizaci6n; existen ml1quinas comerciales. denominadas secuencladores de aminolfcldos, que permiten la determinaci6n autom<1tica de la secuencia de aminoc1cidos de fragmentos peptfdicos. El paso final del proceso consiSle en co· locar las secuencias de aminol1cidos de los diferentes fragmenlos peptfdicos en el orden en que se presentan en la cadena peptfdica intacta. Tradicionalmente esto se realiza comparando y superponiendo las secuencias de diferellles grupos de fragmentos peptfdicos obtenidos mediante fraccionamiento de la misma prOlefna utilizando dUerentes enzimas proteolfticas. Los adelantos tecnol6gicos han aumentado marcadamenle la velocidad y la sensibUidad de la delerminaci6n de la secuencia de amino<1cidos de protefnas. permiriendo el anAiisis de muestras djminutas; en una sola nache y a partir de pocos microgramos de prorcfna -Ia cantidad djsponible a partir de una unica banda en un gel de poUacrilamida- se puede obtener la secuencia de varias docenas de amino~cidos del extremo ammo tenninal de un peptido. Esle procedimienlo ha resultado imponante para caracterizar muchas prolefnas celulares minoritarias, como los receptores para las honnonas esteroideas y polipeptIdi· cas. Frecuentemente la determinaci6n de tan s610 20 aminol1cidos de la secuen· 184

Capflulo 4: C6mo se estudian las ~Iulas

cia de una proleina es suficienre para lograr diseftar una sonda de DNA que permita c10nar su gen (vease Figura 7-27). Una vez se ha aislado el gen, el resto de la secuencia de amino:jcidos de la prolefna se puede deducir en referencia al c6digo genelico. &la es una gran ventaja porque, incluso con automatizaci6n, la delerminaci6n directa de la secuencia completa de una proteina resulta ser una larea dificil. Una proleina de 100 residuos puede ser secuenciada en un mes de trabajo imenso, pero la dificultad se incrementa extraordinariamente tanlO con la longilud de la cadena polipeptidica como con las particularidades qufmicas de los fragmentos peplfdicos individuales que impiden que el proceso sea rutinario. Dado que la secuenciaci6n del DNA puede hacerse de una forma m:js ropida y sencilla (vease Capitulo 7), generalmente las secuencias de la mayoria de las protefnas se delenninan, en la actualidad, a panir de la secuencia de nucle6tidos de su gen.

La difracci6n de cayos Xpor crislaJes de prOlelna puede revelar la

eslCuctura exacta de una protema2tl Apartir de la secuencia de aminoAcidos de una protefna pueden a menudo predecirse los elementos de la estructura secundaria de la proteina, como las ht!1ices a que alraviesan la membrana, asf como el parecido de la proteina con otras protefnas conocidas. Sin embargo por ahora no es posible deducir de forma segura el plegamiento tridimensional de la protema a partir de su secucncia de amino~cidos, y sin conocer la estruClura detallada no es posible comprender las bases molecuJares de su funci6n. La principal tecruca que se ha utilizado para delenninar la estructura tridimensional de las molecuJas, incluidas las prolefnas a nivel at6mico, es la crlstalograHa de rayos X. Los rayos X, como la loz, son una forma de radiaci6n electromagnetica, pero de una longitud de onda mucho menor, tfpicamente de alrededor de 0,1 nm (el di~metro de un <1tomo de hidr6geno). Si se dirige un haz estrecho y paralelo de rayos Xa una muestra de una proleina pura, la mayorfa de los rayos X pasar~n a su traves. Sin embargo una pequei'la fracci6n de euos seran dispersados por los <1lomos de la muestra. Si la muestra es un cristal bien ordenado, los haces dispersados se reforzaran unos a otros en ciertos puntos (vease Figura 4-2) yaparecer~n como manchas de difracci6n cuando los rayos X sean recogidos sobre un delector (Figura 4-48). La posici6n e intensidad de cada mancha en el patr6n de dJrraccl6n de rayes Xcontiene informaci6n sobre las posiciones de los a.tomos en el criSlal qlle intentamos dedllcir. La dedllcci6n de la estructura lridimensional de una gran molccula a partir del palr6n de difracci6n de su crislal es una tarea compleja, y no se consigui6 para una mohkula de prolefna hasta 1960. Recientemenle los amllisis de difracci6n de rayos X se han aUlOmatizado cada vez mas, y ahara el proceso mtis lenlO es el de la producci6n de cristales proteicos adecuados. Ella requiere grandes cantidades de una protefna muy pura y a menudo, supone allOS de lanteo en la busqueda de las condiciones de crislalizaci6n adecuadas. Todavfa hay muchas prolefnas, especial mente proteinas de membrana, que han resislido lodos los intemos de crislalizaci6n. EI produclo inmediato de un analisis de un patron de difracci6n es un com· plejo mapa tridimensional de densidades elecu6nicas. Interprelar este mapa resulta una tarea complicada, y requiere la secuencia de amino<1cidos de la protei· na. Fundamenlalmenle mediante prueba y error se consigue correlacionar la secuencia y el mapa de densidades electr6rucas mediante un ordenador, intentando conseguir el mejor resuhado. La fiabiLidad del modele al6mjco final depende de la resoluci6n de los datos crislalOgraficos iniciales: una resoluci6n de 0,5 nm puede producir un mapa de baja resoluci6n del esqueleto polipeptfdico, mientras que una resoluci6n de 0,15 nm permite situar todos los ~lomos (excepto los de hidr6geno) en la moltkuJa. A menudo, un modelo at6mico completo resulta demasiado complejo para ser observado directamente, pero a partir de c! se pueden derivar versiones simplificadas que muestren las caracteristicas esFracdonamlento de las ctlulas y am'ilisis de sus moltkulas

185

Figura 4-48 Crlstalografla de rayos X. (A) Cristal proteico de ribulosa bisfosfato carboxilasa, una enzima que jucga un papel crucial en la fijaci6n de CO~ durante In fotos!ntesis. (B), Patr6n de difracci6n de rayos X obtenido a partir del cristal. (el Modelo simplificado de la estructura de la protema obtenido a partir de 1a informaci6n de la difracci6n de myos X. EI modelo at6mioo complelo es diffcil de intcrpretar. pero esta versi6n muestra clammente sus caracterfsticas eslrueturales (h~lices a en verde, laminas II en raja). (A, porcortesfa de C. Bmnden: B, porcortesfa de). Hajdu e I. Andersson: C, adaptado del original cedido por B. Furugren.l

IAI

tructurales esenciales de 1a estructura (vease Figura 3-34). Mediante cristalograffa de rayos X se ha determinado la estructura de varios centenares de protefnas, 10 cual es suficienre para empezar a entrever familias de estructuras comunes. A menudo, estas estructuras resultan mas conservadas durante la evoluci6n que las secllcncias de aminoacidos que las forman. Tambi~n se puede determinar la estructura molecular utilizando espectroscopia de resonancia magn~tica nuclear (NMR)"

La espectroscopia de resonancla magnetlca nuclear (NMR, de Nuclear Magnetic Resonance) se habra utilizado para analizar la estructura de pequenas moleculas y actuaJmente se utiliza cada vcz mas para estudiar la escructura de pequefias proternas 0 de dominios proteicos. A diferencia de la cristalografl'a de rayos X, la NMR no requiere tener una muestra cristalizada; simplemente necesita un pequefio volumen de una soluci6n proteica concentrada, la cuaJ se coloca en un fuerte campo magnetico. Algunos nticleos atllmicos, particulannente los de hidrllgeno, denen un momento magnetico 0 esp(n: es decir, tienen una magnetizacilln intrfnseca, como una barra magnetica. EI espfn se alinea en el interior de un fuerte campo magnl!tico, pero puede variarse a un estado semiaJineado aJ ser excitado en respuesta a una aplicaci6n de pulsos de radiofrecuencia (RF) de radiacilln electromagnetica Cuando los nticleos de hidrogeno excitados se relajan a su estado alineado, emiten radiaci6n RF.la coaJ puede ser medida y expresada en fonna de espectro. La naruraleza de la radiacilln emitida depende del ambiente de cada nueleo de hidrogeno, de fonna que si se excita un nticleo influintla absorci6n y la emisi6n de ra-

186

Caprtulo4: C6mose estudian lascBuias

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diaci6n de otto nudeo que esl~ suficienlemenle cerca de ~1. Por tanto es posible. mediante una ingeniosa elaboraci6n de la tecnica b<\sica de NMR conodda como NMR bidimensional, distinguir las se~ales procedentes de nudeos de hidr6geno de diferentes residuos de amin04ddos e identificac y medir los pequenos cambios de estas senales que ocurren cuando estos nucleos de hidr6geno se acercan sufiden· temente como para interactuar entre sf: la magnitud del cambio revela la dislanda entre el par de 4tomos de hidr6geno que interactlian. De esta fonna. la NMR pue· de aportar informad6n sobre las distancias entre zonas de la moltxula de prOlefna. Combinando esta inronnad6n con la de la secuenda de amin04cidos, es posible. en principio, descubrir la estructura tridimensional de la protefna (Figura 4-49). Por razones tt!cnicas, por espcctroscopia de NMR solamente se pueden detenninar las estructuras de pequenas protefnas, como m4x.imo de entre 15000 Y 20000 dahons, y resulta muy improbable que el m~lodo pueda abordar el estudio de mol~culas mayores de 30 000-40 000 daltons. Sin embargo, muchos dominios funcjonales de protcfnas son mucho mas pequei'los que estos tamanos, y a menudo pueden obtenerse en forma de estructuras estables, analizables por NMR. Ello resulta especialmenle uti! cuando la protefna se ha resistjdo a ser cris· talizada. Por ejemplo, de csta forma se han determinado las estrucluras de los dominios de uni6n a DNA de varias protemas reguladoras de genes. La NMR tambit!n se utiliza con ~xito para investigar moJeculas no proteicas, y por ejem· plo resulta valiosa como m~todo para descubrir las estructuras de las complejas cadenas hidrocarbonadas lalerales de las glucoprotefnas. En la Tabla 4·9 se recogen algunos hitos del desarrollo de la cristalograffa de rayos X y de la NMR.

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Figura 4-49 Espectroscopla de NMR. ejemplo de los dalos oblenidos a panir de un aparato de NMR. se lrala de un espectro bidimensional de NMR derivado del dominio carboxilo terminal de la enzima celulasa. Las manchas representan inleracciones enlre ;jtomos de hldr6geno que en la protefna son casi vecinos. Direrentes programas de c;jlculo par ordenador junto con la secuencia de aminoAcidos, que debe ser conocida, permiten derivar posibles estructuras compatibles. En (B) se presentan superpucstas 10 estructuras, cada una de las cuales satisrace tan bien como las dem;js las distancias de cOllstrlcci6n caJculadas. EI conjunto de estructuras constituye un buen indicador de la estructura tridimensional mas probable. (Par conesfa de P. Kraulis.) (A),

Resumen Las poblaciones celulnres plrethn ser analizadas bioqu{micamente. disgregtfndolas y jraccionando su contenido por ultracentrifugaci6tL Posterlores jracclonilmlenlos

permiten el desarrollo de sistemas libres de dlulas; estos sistemll$ son necesarlos para determinar los tktalln mokculares de procesos cel"lnres compleJos. De esta manera, adlUJlmente se eshulian. por ejempw, la s(ntesis proteJea, la replicaci6n del DNA, la maduraci6n del RNA Y llarlos ripos de rransporre intracelldar. £1 peso molea,lary In composJd6n de subunidades de incluso m"y peq"enll$ cantittaths de Unil prote(na u pueden determinilr mediante ekc:troforesis en gel de poliacrllnnddLf con SDS. En electroforesis bldimensJonal en gellns protefnas u re:suelven como mandl/IS separtulns mminnte lsoel.ectroenfoque en Unil dimell$16n seguJdo de elec· trofore:sls en gel de poUm:rilnmida con SDS en In segundo dJmensi6n. Esuu separaFraccionamiento de las «Iulas y an4lisis de sus moloculas

187

Tabla 4-9 Hltos del desarrollo de 18 crlstalograffa por rayos X y de su llpIJcacl6n a las mol&:uJas blol6g1cas 1864 Hoppe-Seyler cristalizaron ydieron nombre a la protefna hemoglobina. 1895 Rontgen observ6 que cuando los rayos cal6djcos (electrones) inciden sabre lin blanco de metal, se produce una nueva forma de radiaci6n penetranle. que denomin6 rayos X.

1912 von Laue obtuvo los primeros modelos de difracci6n de rayos X. hacienda pasar rayos X a trav~ de un crislal de sulfuro de zinc. W.l- Bragg propuso una relaci6n simple entre un patron de difracci6n de rayos X y la disposici6n de los l1tomos en el crislal que produce este palr6n. 1926 Summer obtuvo cristales de la enzima ureasa a panir de extractos de judras. y demostr6 que las protefnas tiellen actividad calalftica. 1931 Pauling public6 sus primeros ensayos sobre ~Ia naturaleza del enlace qufmico", detallando las reglas del enlaee covalente. 1934 Bernal y Crowfoot presenraron los primeros modelos delallados de difraeci6n de rayos Xde una protefna, oblenidos a partir de crislales de la enzima pepsina. 1935 Patterson desarroll6 un m~todo analitieo para detenninar las distancias inlerat6micas a partir de los datos de difracci6n de rayos X. 1941 Astbury obtuvo el primer patron de difracci6n de rayos X del DNA. 1951 Paulin y Corey propusieron la estructura de una oonfomlaci6n helicoidal de una cadena de aminoo.cidos L, -Ia heliee a- y la estruclUra de la himina tJ" la presencia de las cuales mAs tarde fue descrila en numerosas protefnas. 1953 Watson y Crick propusieron el modelo de doble helice del DNA, basandose en los patrones de diITacci6n de rayos Xobtenidos por Franldln y Wllldns. 1954 Perutz y colaboradores desarrollaron m~todos de atomos pesados para solucionar el problema de fases en la cristalograffa de las protefnas. 1960 Kendrew describi6 la primera estruelura detallada de una proterna (la mioglobina de cachalote) hasta una resoluci6n de 0,2 nm, y Perutz propuso una eSlruetura de resoluci6n menor de la hemoglobina, una prolerna mayor que la anlerior. 1966 Phillips describi61a eSlructura de la Lisozima,la primera enzima que fue analizada en detalle. 1971 ICimcr propuso la ulilizaci6n de NMR bidimensional, y Wuthrich y colaboradores durante los primeros afios de la decada de 1980 utllizaron por primera vez cSle metodo para resolver la cstructura de una protefna. 1976 Kim y Rich, y K1ug y colaboradores describieron la cstructura tridimensional del tRNA, dClcrminada mediante difracci6n de rayos X. 1977-1978 Holmes y KJug detcrminaron la estructura del virus del mosaieo del tabaco (TMV), y Harrison y Rossman determinaron la estruetura dc dos pequefios virus esfCricos. 1985 Michel y colaboradorcs determinaron la primera eS[TUctura de una prolcfna Iransmembrana (un lugarde reacci6n fotosintetico) mediante eristalograffa de rayos X. Hcnderson yeolaboradores ob[uvieron la estruetura de la baeteriorrodopsina, una praterna transmembrana, mediante melodos de microscopia elcctr6nica entre 1975 y 1990.

clones elet:troforiticas plledetl apllcarse 111Cluso a prote(t/as que t/om.almente SOli ilUolubln en agua. Las prot.e{nas mayorltarlas de extraetOS cellllares solubles plteden ser purlftcadas por cromatogrofta en columna; dependiendo del tipo de matm de la colullllla, se pueden sepam prote(nas biol6gicamenle activas, en fimci6n de Stl peso mol«,,Iar, de su hldrofoblddad, de sus auacterlstkas de carga, 0 de su aJinidNt por otras molkulas. En umr purljlcacl6n tfpica, Ia muestra se pam sucrsivametlte a travis th! varlas columnas diferentes -las fracciom!s enrlqlU!cidas obtenidas elf ,ma COI"""M se apUcan a Ia columna siguiente. Una ve:z que Ia prote(na iM sido purlftcada '.asta homogeneidad, se pueden estudiar con detalle sus actividaLks blol6gicas. AdemAs, se plteth determimrr umr pequeRa pord6n de su secuencia de amlnodcuros y, sabre ella, se puetk donar Ia secuencia de DNA qIU codiftca la prote(na rompleta; a par188

Capftulo 4: Cdn10 se estudian las celulas

tir de In secuencia de nu€te6tidos del DNA cwruulo se pltede deducir la secuencia ch aminoacidos IYstante. La secuencia de aminotkilWs e$ necesaria para chiem';· nar Ie estructurn tridimensional de una prole{na, pero no e$ suficiente. Para deter· minar esta esiruclllrn a una resoluL:l6n at6mica, las prote{1UU mayores se han de crislalizar y esllUJiar por difraccl6n de rayos X La estruetura ch pequeiias prole{· IUJ$ en soluci6n se p.tede delerminar utlUzando an4.llsls de resonaru;ia I7UlgnitlM nuclear.

Siguiendo el rastro y cuantificando las molt~culas del interior de las celulas Los metodos c1asicos de microscopia ofrecen buenas visiones de la arquileclUra de la celuJa, pero no demasiada informaci6n sobre la qu{mica celular. En biologfa celular a menudo resulta importanle delerminar las cantidades de delerminadas mohkuJas y conocer d6nde se haUan localizadas en el interior de la c~lula y de que manera cambia su cantidad 0 loca1izaci6n en respuesta a seliales extraceluJares. Las moleculas de interes varian desde pequelios iones inorganicos como el Ca2. 0 el W hasla grandes moltkulas como determinadas protefnas, moIlkulas de RNA 0 de DNA. Se han desarrollado melOdos sensibles para cuantificar cada uno de eslos lipos de moleculas y para seguir el comportamienlo dimlmico de la mayorfa de elias en las celulas vivas. En esta secci6n describimos de que manera se pueden introducir sondas especfficas en el interior de la celula viva para monitorizar las condiciones qufmicas del citosol. Adem3S se presentan otros dos melOdos de detecci6n ampliamente utilizados en biologfa celular: los que utilizan radiois6topos y los que ulilizan anticilerpos. Ambos metodos son capaces de detectar con una gran sensibilidad una moltkuJa determinada en una mezcla compleja: en condiciones 6ptimas pueden detcctar menos de 1000 copias de una moltkula en una muestra.

Los atomos radiactivos pueden ser detectados con una gran sensibilidad30 La mayorfa de los elementos que se presentan en la naturaleza son una mezcla de isdtopos ligeramente diferentes. Estos is6topos se diferencian entre sf por la masa de sus mlc1eos at6micos, pero como tienen el mismo mlmero de electrones, tienen las mismas propiedades qllfmicas. Los 1lI1c1cos de los is6topos radiactivos, 0 racliois6topos, son inestables y sufren desintegraciones de forma alealoria en el tiempo, produciendo diferentes alomos. En el transcurso de estas desintegraciones emilen partfculas energeticas subat6micas como electrones, 0 radiaciones como los rayos"!. Utilizando sistemas de s{ntesis qufmica para incorporar uno 0 mas alomos radiactivos a pequeflas moltkulas de interes, como un azocar 0 un amino<1cido, se puede seguir el destino de esta moltkula durante cualquier reacci6n biol6gica. Aunque los radiois6ropos naturales son poco frecuenles (a causa de su ineslabilidadl, se pueden producir en grandes cantidades en reaClores nucleares en los que diferentes
Tabla 4-1 0 Algunos radlols610POS uUllzados habltualmenle en la invesllgacl6n biol6glca

Perlodo de semi·

ls6topo

up 1111

"S

"C "Ca 'H

deslntegracl6n 14 dfas

8,1 dIas 87 dIas 5570 anos 164 dfas 12,3 anos

Los isdtopos estan enumerad05 en orden decrecienle de la energfa de 1a radiaci6n ~ (electroncs) que emiten. EI IS'! tambl~n emite radiaci6n 1. EI periodo de semldesinlegmcidn es el tiempo necesario para que se desintegre un 50' de los lhomos de un isdtopo.

189

traordinariamente sensibles: en condiciones favorables pueden dctectar casi to· das las desintcgraciones que se producen -y par 10 tanto casi todos los alamos radiaclivos que se dcsinlcgran.

Los radiois6topos se utilizan para marcar las moleculas en las celulas y en los organismos y seguirles la pista31 Una de las primeras aplicaciones de la radiactividad a la biologfa consisti6 en se· guir la rula qufmica del carbono durante la fOlosmlesis. Se manruvieron algas

verdes unicelulares en una atm6sfera que contenla CO2 marcado radiactivamenIe ('CC0 2) y, lras pcrfodos variables de tiempo despu~s de haber side expueslos a la luz solar, se separaron sus conlenidos solubles medianle cromalograffa en papel. Colocando una hoja de pelicula fotogrAfica sobre el cromalograma seeo se delectaron las pequefias molkulas que eonteman ICC derivado del CO 2, De esta manera se identificaron los principales componentes de la via (otosinlelica, des· de el CO2 hasta el azuear. Las molkulas radiaetivas pueden ser utilizadas para seguir el curso de casi lodos los proceses celulares. Un experimento tipico puede consistir en aiiadir a las c~lulas un precursor en su forma radiactiva. Las mol~culas radiactivas se mezclaran con las moleculas preexistentes no marcadas; ambos tipos de moleculas semn tratados de forma identica por la c~lula ya que wlo se diferencian cn el peso de su n!.ideo at6mico. Se podrcin seguir los cambios de la locaJizaci6n 0 de la forma qufmica de las moleculas radiactivas en funci6n del tiempo. A menudo, se puede aumcnt3l" la resoluci6n de estos experimentos utilizando un protocolo de marcaje denominado de pulso y caza, en el que el material radiaclivo (el plllso) se aftade linicamente durante un perfodo de liempo muy cono y des· pues es eliminado mediante lavado ysubstituido par moleculas no radiaclivas. A inlervalos regulares de tiempo se taman muestras y en cada una de elias se identifiea la forma qufmiea a se loealiza la radiaclividad (la caul) (Figura 4·50). Los experimentos de pulso y caza combinados con la aUlorradiograffa (vease mas adelante) han sido imponantes par ejemplo para dilucidar el camino seguido por las protefnas de secreci6n desde el reticulo endopM.smico hasta el exterior celular (Figura 4-51). EI mareaje radioisot6pico solamente es valioso como sistema para diferen· dar moleculas que son qufmicamente identicas pero que tienen historias dire· rentes -por eJemplo, moleculas que se diferencian en su momento de sfntesis. De esta manera, por ejemplo, se demostr6 que casi lodas las moleculas de una celula viva son degradadas y reemplazadas por otras cominuamente, incluso cuando la c~lula no est1\. creciendo y aparenlemente se encucntra en cSlado es· racionario. ESlos procesos de "recambio" que algunas veces tiene lugar muy lentamentc. scrfan imposibles de detectar sin el uso de radiois6topos. Actualmenle casi todas las pequeflas moleculas comunes estan disponibles comercialmente en forma radiactiva y practicamente cualquier moleeula biol6gica, por muy complicada que sea, puede marcarse can radiact'ividad. Los com· puestos se pueden marear con radiactividad incorporando alomos radiactivos en posiciones determinadas de su estructura, 10 cual permite seguir los diferenPULSO

190

Capftulo 4 : C6mo se estudlan las cBulas

Figura 4-50 L6g1ca de un . experimento tfpico de pulso yawl utUlzando radlois6lopos. Los recipientes marcados con A, 8, CYD representan companimentos diferentes de la aHula (delectados mediante tec:nicas de aUlorradiografia ode fraccionamiento celular) 0 bien compuestos qufmicos diSllnlOS (detectados mediante cromalografia U OlroS metodos qufmicos). En la Figura 4-51 se presentan resultados reales de un experimento de pulso ycaza

tes destinos de distintas zonas de una misma molecuJa durante las reacciones

biol6gicas (Figura 4-52). Una de las aplicaciones importantes de la radiactividad a la biologfa celular consiste en la localizaci6n por autorradlograffa de compuestos radiactivos en secciones de celulas enleras 0 de lejidos. En este procedimiento las celulas vivas son expuestas brevemente a un puJso de un compuesto radiactivo delenninado y se incuban durante un periodo variable de tiempo -para permitir que el com· puesto se incorpore- antes de fijarlas y tratarlas para microscopia 6ptica 0 elec· tronica. Cada preparaci6n es recubierta posteriormente con una tina pelfcuJa de una emulsi6n fotognifica y se coloca en la obscuridad varios dfas durante los cuales parte del radiois6topo se desintegra. Entonces la emulsi6n se revela y se delermina la posici6n de la radiactividad en cada celula mediante la posici6n de los granos oscuros de plaIa generados (vease Figura 4-51). Asf por ejempto, la incubaci6n de celulas con un precursor radiactivo del DNA (limidina 'H), muestra que el DNA se slntetiza en el mlc1eo y permanece all£. En cambio el marcaJe de la celulas con un precursor radiactivo de RNA (Ilridina JH) revela que el RNA se sintetiza inicialmente en el mlc1eo de la celula perc que luego se desplaza rapidamente hacia el citoplasma. Las moleculas marcadas con radiactividad tambien pueden ser detectadas por autorradiograffa despues de haber sido separadas de otras mol~culas mediante electroforesis en gel: de esta manera sc detecta habilualmente la posici6n tanto de las protefnas (vease Figura 4-45) como de los <1cidos nucleicos (vease Figura 7-5). Adem<1s cuando se luilizan moleculas de acidos nucleicos marcadas radiactivamente como sondas para buscar mol~culas de c1cidos nucleicos complememarias a elias, se utiliza la autorradiogra[fa para detectar la posici6n y la camidad de eSlas moJeculas que sc hibrldan con la sonda, tanto sobre un gel como sobre la secci6n de un tejido (vease Figura 7-20).

Las concentraciones de los iones se pueden medir

mediante electrodos intracelulares32. Una posibiJidad de estudiar la qUlJnica de una celula viva individual consiste en inserlar la punta de una fina pipeta de vidrio direclamente en el inlerior de la celula, una lecnica desarroUada por los electrofisi61ogos para estudiar vohajes y Rujos de corrienle a traves de la membrana plasmatica. Para ello se confeccionan microeJectrodos inlracelulares a partir de finos tubos de vidrio estirados al fuego hasla que la punta tenga un diAmetro de una fracci6n de micr6melro. Estos tubos se Uenan con una soluci6n conductora (normalmente una sal simple como el KCI en agua). La punta del microelectrodo puede ser introducida en el ciloplasma a traves de la membrana plasmatica, la cual se cierra alrededor del Siguiendo eI rastro y cuanliflcando las molkulas del interior de las ~Iulas

Figura 4-5J AUlorradlograffa al mlcroscoplo electr6nico. Resullad05 de un experimento de pulso y caza en el que ~Iulas B pancre,hicas se mantuvieron durante 5 minul05 con leucina 'H (el pulso) ya conlinuaci6n se colocaron en un medio con un gran exceso de leucina no marcada (la caza). Una gran cantidad del aminocicido se incorpora a la insulina. la cua! es una proteina de secreci6n. Tras 10 minulos de caza, la protefna marcada se ha desplazado desde el retfculo endoplasmatico rugosa hasta las cislemas del Goigi W, donde se puede localizar mediante los granos negros de plata de la emutsi6n fotogralica. Tras los 45 minutes de cllza siguientes la prote(na marcada se encuentra en los granulos de secreci6n electrodensos (B). Los pequefios granos de plata redondeados que se aprecian aquf se han producido utjJjzando un revelador fotogrMico especial y no deben confundirse con los PUntOS negros similares que aparecen en los m~todos de marcaje inmunol6gico (por ejemplo, en la Figura 4-63). Experimentossimilares a los de la figura resuJlaron imponanles para establecer las rulas Intracelulares de las prolefnas de secreciOn reeien slntetizadas. (Conesia de LOrci, en Diabetes 31;538-565,1982. C 1982 American DiabelesAssociation Inc.)

191

Figura 4-52 Moleculas marcadas radlol50t6plcamente. Tres rarmas radiactivas deIATP, disponibles comercialmente. Los ~tomos radiactivos se mueslran en rojo. Tambien se indica la nomenclatura utilizada para identificar la posici6n y eltipo de los atomos radiactivos.

ATPI2.s.lHl

tubo adhiricndose fntimamenle al vidrio de forma que la celula se altera relativamente poco. Los microelectrodos son utiles para estudiar el interior celular de dos maneras: pueden ser transformados en sondas para medir las concentraciones intracelulares de iones inorganicos comunes como el H~, el Na', el K', cl CI-, el Ca 2• y el Mg2., y pueden utilizarse como micropipetas para inyectar rnoleculas en las cclulas. EI principio que permite medir las concenlraciones i6nicas can un microeleclTodo es el miSlllO que el del pHmetro corrienle. La tendencia de los iones a difundir a favor de su gradiente de concentraci6n puede ser equilibrada por un campo elcctrico de sentido opuesto; cuanto mayor sea el gradiellie de concentraci6n mayor tendni que ser el campo ehktrico. Asr, la magnilud del campo electrico necesario para mantener el gradicnte de conccntraci6n en un equilibrio estable nos proporciona una medida de la magnitud del gradienle de concentraci6n. Para determinar la concentraci6n de un ion determinado se ha de miJizar un material que solamente sea permeable a eSle ion, formar con este material una lamina 0 barrera Ysituarla entre la soluci6n del ion cuya coneenlraci6n queremos determinar y una soluci6n patr6n de concentraci6n del ion conocida. La diferencia de potencial electrico a traves de la membrana selectiva cuando no exista flujo de iones sera directamente proportional a la relaci6n de concentraciones del ion delenninado a ambos lados de dicha membrana (La teoria relacionada con el lransporte i6nico a traves de la membrana plasmatica se explica en el Panel 11-2.) En la practica. la punta del microelectrodo se lJena con un compuesto organico apropiado que hace de barrera permeable selectiva aI ion escogido cuya cOllcentraci6n se desea medir. Entonces, se inserta el microelectrodo junlo can un microelectrodo de referencia en el imerior de una ~Iula, como se muestra en 1a Figura 4-53. 192

Caprlulo 4: C6mose estudlan las celulas

voltfmelro etectrodo Ion-..lectivo

precinto de gom.

soIuci6n de ICCI de concenltlClOn

de I YJ'--_-electrodo refereno::ia

conoeida

conductor de plata

resina intereambladora de iones unleamente permeable all('

""

'81

Mas recientemente la tecnica de microelectrodos se ha adaptado a1 eslUruO del transporte i6nico a traves de canales prateicos especializados (denominados canales i6nicos) situados en una pequena cantidad de membrana plasmlhica. En este caso, un micraelectrodo de vidrio de larga punta se presiona suavemente sobre la membrana plasmlhica de una celula, en lugar de intraducirlo en la celula atravesando elicha membrana (Figura 4-54). EntOllces resulta posible eslUdiar el comportamienro electrico de la pequena zona de membrana que queda recubriendo la punta del electrodo, se haUe todavia unida a la celula 0 separada de ella (Figura 4-55). Esta tecnica, conocida como reglslro zonal ("patch-clamp recording") ha revolucionado el estudio de los canales i6nicos. Como se explica en el CapituJo II, consthuye una de las pocas tecnicas de biologfa celular que permite estudiar a tiempo realla funci6n de una sola molecula prateica.

Figura 4·53 Mlcroelectrodo lonselectlvo ullUzado para medlr la concentracl6n Intracelular de un determlnado Ion. En (A) se muestTa el disposilivo experimental. (8) i1ustra 1a conslrucci6n de un microelectrodo permeable seleclivamenle al K·. En general, la punla del microelectrodo ion-selec.tivo intracelular est;j construida de un cristal especial 0 eSla llena de un compuesto orgAnico especial que la hace permeable exclusivamente al ion escogido. El reslo dellUbo esta lIeno de una solucl6n acuosa del ion a una concentracl6n conocida, en la que se halla $umergido un conductor metaJlco que est<'i conectado a un tenninal de un voltfmetro. E1 otro terminal del volt{metro est<'i conectado de forma similar a un microelectrodo de vtdrio, que actua de referencia, el Cllal tiene la puma abiena y conliene una soluci6n conductora sencilla. Ambos mlcroelectrodos. empaquelados conjuntamente. atraviesan la membrana plasrnrttica de la cl!lula que se quiere eSludiar. El voltaje que mide el \'oltimelro, que es igual a la diferencla de potencial a traves de la barrera permeable selectivamenle. revela la concemracl6n del ion en la et!:lula..

Los cambios rtipidos en las concentraciones i6nicas intracelulares se pueden medir mediante indicadores emisores de luz33 Los electrodos sensibles a iones unicamente revelan la concentraci6n i6nica de un punto de la celula. Ademas, su respuesta es lenta y en ocasiones irregular para iones que se hallen presentes a concentraciones muy bajas, como es el caso del Cal... Por ello. estos electrodos no son adecuados para medir los rapidos y transitorios cambios intracelulares de la concentraci6n de Ca2., que tan impormntes son en la resplieSta celuJar a sei'iales extracelll.lares. Estos cambios pueden ser analizados mediante la utiJizaci6n de indicadores i6nicos sensibles, cuya emisi6n de luz refleja la concentraci6n local del ion. Algunos de estOS indicadores son luminiscentes (emiten luz espontaneamente) mientras que otras son fluorescentes (emilen luz cuando son expuestos a 1a luz). La aecuori"a es una protefna luminiscente, aislada a partir de ciertas medusas marinas, que emite luzen presencia de Ca2. y responde a los cambios de concentraci6n de Ca2. en el

Figura 4-54 Mlcroplpetas utlllzadas para el reglstro zonal ("patch-clamp rec::ordlng"). Se muestra unA cflulA en bast6n del ojo de una saJamandra, manlenida por una plpeta de sllccl6n mlentras que una pipeta de v1drlo de punla fina, presionada contra la ci'!lula de forma que el vtdrio se haila en fntimo contacto con la membrana plasm~tica, actOa de microelectrodo. Generalmente se utiliza un anilugio electr6nico para mantener el voltaje conslante y a un valor delerminado. (De T.O. Lamb. H.R. Matthews y V.Torre, ]. Physiol. 37:315-349, 1986.)

Siguiendo el rastro y cuantificando las mollkulas dellntertor de las dlulas

193

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mlcrop!pete

de ...idrio

_+-_-;j uoi6n Iler""'ice

cenellOnko

C1TOPlASMA

-----:::::::----

lA) ZONA DE LA MEMBRANA UNIOA ALActLULA

lSI ZONA DE LA MEMBRANA SEPARAOA DE LA ctLULA (CON EXPOSICION DE LA CARA crrOPlASMA fICA)

ICI CONFIGURACt6N EN "ctLULA TOTAl"

(0) ZONA DE LA MEMBRANASEPARAOA DE LA ctLULA (CON EXPOSICION DE LA CARA EXTRACElULARI

intervalo de 0,5 a 10 mM. Si por ejemplo se microinyecta en un huevo, la aecuorina emite un destello de luz en respuesta a la subita y localizada Iiberaci6n de Ca2. que se produce en el interior del citoplasma cuando el huevo es fertiliwdo (Figura 4-56). Recienlemenle se han sintetiwdo indicadores fluorescentes de Ca 2 • que se unen hlertemente al Ca 2" y que cuando estan lib res son excirados a longitudes de onda Iigeramente mas largas que cuando estan unidos a el. Midiendo la proporci6n de inlensidad nuoresccnte a las dos longitudes de onda de excitaci6n, puede determinarse la proporci6n de concentraciones entre el indicador unido a Ca 2• y el indicador libre. Esta diferencia proporciona una medida precisa de la concentraci6n de Ca 2' Iibre. Dos populares indicadores de este tipo, denominados qui,,-2 y{llra-2, son utiles para estudiar los cambios de las concentraciones intracelulares de Ca 2 • en diferentes zonas de la celuJa, visualizandolas mediante un microscopic de fluorescencia (Figura 4-57). Existen indicadores nllorescentes semejantes a estos (Hiles para medir otros iones; par ejemplo, algunos de elias se utilizan para medir H', Ypor 10 tanto, el pH intracelular. Algunos de estos indicadores pueden entrar en las celuJas por difusi6n, par 10 que no se han de microinyectar, 10 cual permitc controlar aJ microscopio de fluorescencia un gran mimero de celuJas simuhaneamente. La construcci6n de nuevos tipos de indicadores y su utilizaci6n con los modernos metodos de amilisis de imagenes pueden hacer posible el desarrollo de mlHodos rapidos y precisos similares a estos que nos penn.itan analizar las variaciones de las concemraciones intracelulares de djferentes pequenas moleculas.

Existen diferentes sistemas que permiten introducir mol~uJas en una celula para las que la membrana celular sea impermeable34 A menudo resulta uti! poder introducir en la celuJa mol~uJas que no puedan atravesar la membrana, como anticuerpos que reconocen determjnadas protefnas intracelulares, prOle{nas celulares normales que han sido marcadas con un 194

Caprtulo 4 : C6mo se estudlan las ceJulas

Flgura4-55 lascuatro conflguraclones eslandar utUlzadas para el reglstro zonal. En primer lugar.la boca de la pipeta de registro se presiona conna la membrana celular de forma que se forme una uni6n henn~tica (arriba). Entoncesse puede regisuar la corriente que entra en la pipeta a trav~ de la zona de membrana (A) unida a Ia celula 0 (B) separada de ella. exponiendo la superficie citoplasmalica de la membrana plasmatica. Altemativarnenle. la zona de membrana se puede romper mediante una succi6n suave. de forma que el interior del electrodo quede en comunicaci6n directa con el imerior de lac~lula (Cl: en esta ultima configuraci6n en ·c~lula total" se puede registrar el componarniento elktrico de la c~lula de fonna similar a como se haria con un microelectrodo, pero con la opci6n adicional de poder alterar la composici6n quimica de la c~lula permitiendo que diferentes compuestos difundan desde la pipeta, de punta relativamente ancha, aI citoplasma. La configuraci6n (D) se obliene a trav~ de la configuraci6n (C) separando la pipela de la c~lula de fonna que un fragmento de la membrana plasmatica adyacente se repliegue sobre la punta de la pipeta, sellandose a ella. En (D) se hal1a expuesta no la superficie ciloplasmatica de la membrana (como ocurre en (8)1 sino la superficie exterior de la membrana.

Figura 4·56 La protefna luminlscente aecuorlna emile luz en presencia de Cat. IIbre. En esta figura se ha inyeclado aecuorina a un huevo de pez medaka.la cual lia difundido por el dlosol. Aconlinuaci6n. el huevo se ha fecundado con un espennalozoide, y se lia examinado con la ayuda de un intcnsificador de imagenes. Las cuatro fOlograflas que se presentan aquf fueron lomadas a intervalos de 10 segundos mirando hada abajo el punto donde entr6 el espermatozoide. Las imttgenes revelan una onda de Iiberaci6n de calcio libre en el dtosol a panir de reservorios intracelulares juslo por dcbajo dellugar donde enlr6 el espennalozoide, tal como se indica en el diagrama de la izquierda. (fotograflas reproduddasde I.e. Gilkey. LF. laffe, E.B. Ridgway y G.T. Reynolds. J. Cell Bioi. 76:448-466. 1978. Con permlso de copyright de The Rockefeller University Press.)

compuesto fluorescente 0 moleculas que afectan la conducta de la celula. Una aproximaci6n consisle en microinyectar eslos compuestos a la celula a traves de una micropipela de vidrio. Una tecnica espe<:ialmente uli! es la denominada dtoqubnica analoga fluorescente, mediante la cual una protefna delerminada se acopla a un colorante fluorescenle y se microinyecla en una celula; de esta rorrna, se puede seguir el destino de la proleina inyeclada can un microscopic de Ouorescencia, a medida que la celula crece y se divide. Si se marca lubulina (Ia subunidad de los microlubulos) por ejemplo con un colorante que emila fluorescencia en el rojo. se puede seguir la dinamica de los microlubulos segundo a segundo en la reluJa viva (Figura 4-58). Tambien se pueden microinyeclar antieuerpos en una celula, para bloquear la runci6n de la molecula que reconocen. Por ejemplo, la inyecci6n de antieuerpos anti-miosina-II en un huevo recundado de erizo de mar impide que el huevo se divida en dos, a pesar de que la divisi6n nuclear se produce normalmente. Esla observaci6n demostr6 que la miosina desempei'la un papel esencial en el proceso contr<1ctil que divide el eiloplasma durante la divisi6n celular. pero que no es necesaria para la divisi6n nuclear (vease Figura 18-34). A pesar de que la microinyecci6n es una teeniea ampliamenle utilizada, supone la inyecci6n de cada eeluJa una por una; por esta raz6n solamente resuha posible estudiar varios eiellios de celulas simultaneamente. Olras aproximaciones pcrmiten permeabilizar simultaneamenle grandes poblaciones de celulas. Par ejemplo, utilizando potcntes ehoques electrieos 0 agentes qufmieos. como bajas concentraciones de dctergentes, se puede romper parcial mente la eSlruetura de la membrana plasm<1tiea de la celula, haciendola mas permeable. La teeniea eleelriCa tiene la ventaja de generar grandes poros en la membrana plasmaliea. sin daf\ar las membranas intraeelulares. Los poras se mantienen abiertos durante intervalos de liempo que pueden oscilar entre millutos y horas, dependiendo del tipo celular utilizado y de la c1ase de choque elect rico que se aplique; asf, a traves de los paras las macromoltkuJas pueden enlrar (y salir) del dlosol r<1pidamente. Si el tralamienlo ha side limitado, un elevado porcentaje de las celulas tratadas consigue reparar sus membranas plasmaticas y sobrcvive.

Figura 4-57 Visuallzacl6n Inlncelular de la concenlracl6n de Cat. utllb.ando un Indleador nuorescenle. EI ramificado ~rbol de dendritBS de una el!:lula de Purldnje del cerebra recibe mas de 100 000 sinapsis de otras neuronas. La senal de salida de la eelula se transporta por un unico axOn, que aquf se ve saliendo del cuerpo eelular en la parte inferior de la rigura. Esla imagen de la concentrad6n intracelular de calcio de una dlula de PurkinJe (del cerebra de un cobaya) se obtuvo utilizando una ctmara de gran sensibilidad y el indicador fluorescente sensible al cr-. fura·2. La eoncemraci6n de Caz-libre esl~ represenlada por diferentes colores, siendo la mayor concenlradOn el color rojo y la menor el azul. las mayores eoneentraciones de cr- se presentan en los cemenares de ramas de denditras. (Porcones{a de D.W. Tank, IA Connor, M. Sugimori y R.R. Uinas.) Siguiendo eI raslro y cuantificando las moleculas dellnlerior de las eelulas

195

.

Figura 4·58 Cltoqufmlca Duorescente amfloga. Micrograffa f1uorescente del borde conductor de un fibroblasto que ha sido inyectado con tubuJina marcada con rodamina. Los microtubulos de toda la cliluJa han incorporado las molkulas de tubuJina marcadas. Asf. se puede detectar los microlubulos individualmente y se puede seguirsu componamiento dilllimico medianle un sistema de ordenadorque incremenle la imagen. como se muestra aquL A pesar de que parece que los microrubulos tienen WlOS 0.25 11m de grosor, se trata de un efecto 6ptico; en realidad su diametro es de tan 5610 una dOCima pane de este valor. (Por cortes{a de P. Sammeh y G. Sorisy.)

Un tercer m~todo para introducir grandes moleculas en la c~lulas consiste en provoear la fusi6n can la membrana plasmatica de vesiculas de membrana que contengan estas mollkulas. Estos tres m~todos. ampliamente utilizados en biologla celular. se ilustran en la Figura 4-59.

~~:ij~ ~:::!:

mk:roplpetll de vidrio conlenirtndo Ie IUbsUlncia X

_-...4\:.. .-....

.:eMa eolocada en una solueion de la substancia X. entre dos electrodos. y lujeta II lhocks elktricol muycorlOi '.'

......

.

~

If -/J .~.

mlcrolnyeccl6n de la aublrtancill X en la c'lula

vesicYlII limlteda par membrana• conteniendo la $\lb$tancia X

~

.

I los poros tranlitoriol practicadoilln la mllmbrana permiten que la subltencla X entra en la cllluia antel de que" vuelvlln a solder

I

la fusion de membranas inducida. antre III vlliculll y la membrana plasmiltica de la cillula diana, libera la substancia X en el citoplasma

I

I tA,

I ,.,

Figura 4-59 Metodas ulillzados para lntroduclr en una dlula una substancla para la cualla membrana es Impenneable. En (A) la substancia es inye<:lada a trav!!s de una micropipela, aplicando una presi6n o. si la subslantia eSla cargada ell!ctricamente, aplicando un vollaje que obligue a la substantia a pasar al interior de la c!!lula como una comente i6nica (tocnica denominada iOnfo!oresis). En (B) la membrana celular se haee lransitoriamente penneable a la substantia que queremos inlroducir. rompiendo la estruetura de Ia membrana mediante un breve pero intenso shock. ell!ctrico (por ejemplo de 2000 voltios por centimetro durante 200 microsegundosl. En Ie) se usa un sistema de fusi6n de membranas. Se pueden cargar vesiculas rodeadas de membrana con la subSlanda deseada y luego inducirlas a fusionarse con la cl!lula diana.

196

Capftulo 4 : Cdmo se estudian las celuJas

,e,

La activaci6n inducida por la luz de mol~culas precursoras

"empaquetadas" facilita el estudio de la dimimica intracelular35 La complejidad y rapidez de muchos procesos intracelulares, como la acci6n de

las mollkulas sei'lal 0 el movimiento de las protefnas del citoesqueleto, los hace diffciles de estudiar a nivel unicelular. Idealmente, cualquier mol~cula de inter~s se puede inuoducir en una c~lula viva en un momento preciso y en un lugar de la c~lula determinado, y posterionnente seguir su comportamiento, as{ como la respuesta de la c~lula. Sin embargo, la microinyecci6n es limitada debido a la di· ficullad de controlar ellugar y el momento de la descarga del compuesto que se microinyecta. Una aproximaci6n mucho mas poderosa supone sintetizar una forma inactiva de la molkula de interes, introducirla en la ~Iula y aclivarla subitamente y en un lugar escogido de la ~Iula enfocando sabre eUa un fino haz de luz. Se han sintetizado precursores inaclivos fotosensibles de este lillO, denominados molkulas empaquetadas, de una gran variedad de pequei'las molkulas, incluyendo el Ca2., el AMP dclico, eI GTP Yel inositol trifosfato. las molecuJas empaquetadas se pueden introduci.r en las ceJuias vivas mediante cualquiera de los m~todos descritos en la Figura 4-59, y posteriormente se pueden activa.r mediante un fuene pulso de luz p.rocedente de un laser (Figura 4-60). Se puede utilizar un microscopio para enfocar el haz de luz sobre cualquier regi6n de la ~Iu· la. de forma que el experimentador puede controlar exactamente d6nde y cuando se liberacl la molkula. De esta fonna. par ejemplo, se pueden estudiar los efectos instantaneos de la Iiberaci6n en el citosol de una molkula seii.a1 intJacelular. las molkulas empaquetadas Ouorescentes son herramientas con un gran futuro. Se construyen uniendo un colorante fluorescente fotoactivable a una prote{na purificada. Es importante que la protema modificada siga siendo biol6gicamente activa: a diferencia de 10 que ocurre con el marcaje con radjoisdtopos (cuya diferencia linicamente consiste en el m1mero de neutrones del nudeo del atomo marcado), el marcaje con colorantes empaquetados Ouorescentes ai\ade a la superficie de la protefna un gran gropo extra, el cual faciJmente puede alte· rar las propiedades de la prote(na. Mediante prueba y error suele encontrarse facilmente un protocolo de marcaje salisfactorio. Cuando se dispone de una protefna marcada biol6gicamente ac(iva, resulta posible seguir su comportamiento en el interior de las c~lulas vivas. Por ejemplo, se puede introducir tubulina marcada con fluorescefna empaquetada en los microtubulos del huso mit6tico: cuando se i1umina una pequei'la regi6n del huso mit6lico con un laser, la tubulina marcada se vuelve fluorescente, de forma que ahora se puede seguir su movimiento a 10 largo de los microtlibulos del huso (Figura 4-61). En principio, esta misma t~cnica se puede aplicar a cualquier protefna.

Se pueden utillzar anticuerpos para detectar y alslar rnoltkulas determinadas36 1..05 anticuerpos son protemas producidas por los vertebrados como defensa contra las infecciones (v~ase Capftulo 23). Se diferencian del resto de las protefnas en que son producidos en millones de formas diferentes, cada una de las

2.......... ............. Xtm'l 'eX

•

2 u. . . . . lItIdtb6du

SiguJendo el rastro y cuantificando las mol6:ulas del interior de las ~Iulas

FlgUl1l4-60 Molecules empaquetadas. Esquema general que muestra de qu~ fonna un deri9ado de una mol~la empaquetada sensible a la luz (aquJ designada XJ se puede convertir, mediante un flash de luz UV, en su fonna Iibre activa Incluso los iones eaz' .se pueden empaquetar indirectamente; en este caso se utiliza .un quelante de cr-, el cua! se inactiva JX)r fot6lisis, Iiberando asr eI ca 2• que Ueva unido.

197

...

F1gura 4-61 Detennlnacl6n del Oujo de mkrottibulosen eI huso mlt6lJco utllizando Duoresce£na empaquetada unJda a tubullna. (A) Un huso en metafase fonnado in vitro a partir de un extracto de huevos de Xenopus ha incorporado tres marcadores fluorescentes; tubulina unida a rodamina (rojo) para marcar todos los microtubulos, un colorante azul unido aI DNA que marca los cromosomas y Ouorescefna empaquetada unida a tubulina, que lambien se incorpora en todos los mlcrotlibulos pero que resulla invisible debido a que no es Ouorescente hasta que no haya sido activada por luz uJtravioleta En (8) se utiliza un haz de luz ultravioleta para desempaquelar localmeme la f1uoresce[na empaquetada unida a tubulina principalmeme en el lado izquierdo de la placa metaf4sica. Durante los siguientes minutos (despues de un minuto y medio en C y de dos minutos y medio en D) se observa que la senal de tubulina unida a fluorescefna desempaquetada se desplaza hacia el polo Izquierdo del huso, 10 cual indica que la tubulina se desplaza continuamente hacia los polos a pesar de que el huso (visuallzado a traves de la f1uorescencia de la tubulina marcada con rodamina roja) perrnanece casi inalterada. (De K.E. Sawin yT.J. Mitchison.J. Cell. Bioi. 112:941-954, 1991, con permiso de copyrighl de l11e Rockefeller University Press.)

cuales tiene un lugar de uni6n difcrcnt'e que reconoce espedfica~ente a una mol~cuJa diana (denominada amfgello). La exacta especificidad de los anticuerpos frente a los antfgenos los convierte en poderosas herramientas para la biologfa celular. Marcados con colorantes fluorescentes (fluorocromos) resultan muy valiosos para localizar en las celulas detenninadas mollkulas mediante microscopia de fluorescencia (Figura 4-62); marcados con partfculas densas a los electrones, como pueden ser esferas de oro coloidal, se utilizan para localizar con una alta resoluci6n moleculas determinadas aI microscopio electr6nico (Figura 4-63). Como herramientas biol6gicas se utilizan para delectar y cuantificar moleculas en extrac(Qs celuJares y para identificar protefnas delerminadas, despues de que estas hayan sido aisladas por electroforesis en gel de poliacrilamida (vease Figura 4-46). Los anticuerpos se pueden acoplar a una matriz inene con el fin de formar una columna de afinidad, la cual se uliliza para purificar macromoleculas especfficas a partir de un extracto celular, 0 en el caso de que la molecula se halle en la superficie de la cclula, para seleccionar ripos determinados de celulas vivas a partir de una poblaci6n heterogenea. Frecuenlemente, la sensibilidad de los anticuerpos como sondas para la detecci6n de molcculas determinadas en las celulas y en los tcjidos se incremenla

10 11m

Figura 4-62 Inmunofluorescencla. Electronmicrograffa de la zona cortical de una celula epitelial en cuJtivo, mostrando la distribuci6n de los microlubulos y de OlroS filamentos. (8) La misma ~rea pero tei'iida con un al\licuerpo Ouorescente anti-tubulina, la subunidad proteica de los microtubulos, utilizando la tlknica de la inmunociloqufmica indirllCla (vease Figura 4-64). las fiechas indican mlcrottlbulos individuales f~cilmente reconocibles en ambas figuras. (De M. Osborn, R. Webster y K. Weber, f. Cell. BioL 77;R27-R34, 1978. Reproducido can penniso de copyright de The Rockefeller University Press.) (A)

IAI 10",m

196

Capftulo 4: C6mo se estudian las celulas

mediante metodos de amplificaci6n de sefial. Por ejemplo, a pesar de que se puede unir directamente una molecula marcadora, como un colorante fluorescente, a un anticuerpo que ser<1 utilizado para el reconocimiento especffico (el anticuerpo primario), se consigue una sefial mayor utilizando el anticuerpo primario y luego detect<1ndolo con un grupo de anticlIerpos secundarios que se unan a el (Figura 4-64). Los metodos de amplificaci6n m<1s sensibles utilizan una enzima como molecula marcadora, unida al anticuerpo secundario. Asf por ejemplo, se puede utilizar la fosfatasa alcalina, una enzima que en presencia de los reactivos adecuados produce fosfato inorg
Las lfneas celulares de hibridomas constituyen una fuente permanente de anticuerpos monoclonales31 En 1976 qued6 solucionado el problema de la heterogeneidad de los anticuerpos gracias aI desarrollo de una nueva tecnica que revolucion6 el uso de los anticuerpos como herramientas para la biologfa celular. La tecnica se basa en propagar un clon de celulas a partir de una unico linfocito B secretor de anticuerpos, con 10 que se pueden obtener grandes cantidades de anticuerpos. El problema pr<1ctico, sin embargo, es que los linfocitos B tienen una vida limitada en cultivo. Para solucionar esta limitaci6n, se fusionan Unfocitos B individuales productores de anticuerpos, procedentes de un rat6n 0 una rata inmunizados, con celulas derivadas de un- tumor "inmortal" de linfocitos B. De la mezcla heterogenea resultante de celulas hfbridas se seleccionan aquellos hfbridos que presentan tanto la capacidad de producir un determinado anticuerpo como la capacidad de multiplicarse indefinidamente en cultivo. Estos hlbrldomas se anticuerpos primarios: anticuerpos de conaio dirigidos contra el antlgono A antlgono A inmovilizado

~~

anticuarpos secundarios: anlicuorpos dirigidos contra el enticuarpo de conoiD. acoplados can una molecule marcadora

~

marcador /

lL~-L~~

Siguiendo el rastro y cuantificando las moleculas del interior de las celulas

lisosoma

1

nucloo dense

"m

Figura 4-63 InmunoiocaJizacl6n en mlcroscoplaelectnSnlca. Micrograffa electr6nica de una celula seeretora de insulina, en la que las moJecuias de insulina se han marcado con anticuerpos anti-insulina unidos a pequefias esferas de oro coloidal (cada una de las cuales aparccen como puntos negros). La mayor parte de la insulina se halla almacenada en las zonas densas de las vesfculas secretoras; adem(is, a1gunas de estas zonas densas se degradan vfa lisosomas. (De L Orci, Diaberologia 28:528-546, 1985.)

Figura 4-64 Inmunocltoqufmlca Indlrecla. EI metodo es muy sensible debido a que el anticuerpo primario es a su vez reconocido por muchas mo1eeulas del anticuerpo secundario. El anlicuerpo secundario esta unido covalentemente a una moJecula marcadora que 10 haee Meilmente detectable. Entre las mo1eeulas marcadoras mas ulilizadas se encuenlran los eolorantes fluorescefna y rodamina (para microscopia de fluoreseencia), la enzima peroxidasa de rahano (tanto para microscopia 6plica convencional como para microscopia electr6nica).la ferrilina {protefna que contiene hierro} 0 esferas de oro coloidal (para microseopia electr6nica) y las enzimas fosfatasa a1calina 0 peroxidasa (para su detecci6n bioqufmica).

199

7

r.ton inmunil.do con el entlgeno X

c6lull productoft de

• otlcuerpos ao(i-X

line. celul'f muteote derlv.d. de uo tumor de Iiolocito. B

4.'..

~

----ee

"•

(e$ta. dllul.. cracenio

lodefiommeol8 en uo media normal pero morir'o en el medlo Mlectivol

liofoeitOI B (monr'" • 101I poeoI dl.. de cultivol

~ , FUSION

produetOI de II fulioo coIocados en muhipln places de C\lltivo

I

1.·.....·.·II.w.\!1 I

I

.oticuerpo ent].X MQ.egeOO

I

uoamenl8 101 hibridomu creceo eo el media Mlectivo

ubJ.1 I,.

permiti, que dllulas .. mutllpliquen y comprober I, eJlmenei, de .nticuerpos .oti-X en el sobren.deote 101 ctonn po.itivos conetituyeo un. fuentl contiou. de eotlcuerpo Inti-X

propagan como clones individuales, cada uno de los cuales conslituye una fuente permanente y estable de un antlcuerpo monoclonal (Figura 4-65). ESle anticuerpo reconocera un unico tipo de lugar antigenico -por ejemplo, un grupo determinado de seis eadenas laterales de aminoacidos de la superficie de una prote(na. EI hecho de que la especificidad sea uniforme haee de est'Os anticuerpos monoclonales una herramienta mucho mas uti! que los antisueros convencionales, los cuales normalmente contienen una mezcla de anticuerpos que reconocen una gran variedad de diferentes determinantes antigenicos, incluso en macromoll~cuJas pequenas. Sin embargo, la mayor venlaja de la lecnica de los hibridomas consisle en que se pueden producir anticuerpos monoclonaJes contra moleculas no purificadas, que unicamente constituyen un componente minoritario de una mezcla compleja. En un antisuero ordinaria oblenido contra una mezcla, el ntimero de molecuJas de anticuerpo que reconocen los componentes minoritarios de la mezcla puede ser demasiado pequeno para lIegar a ser utilizable. Perc si los linfocitos B que producen lodos estos anticuerpos se hallan en hibridomas y se selecciona un cion hibrid6mico a partir de esta gran mezcla de clones, eSle cion determinado se puede propagar indefinidamente con 10 que se producini el anticuerpo deseado en grandes cantidades. Por 10 tanto, en principio se puede generar un anticuerpo monoclonal contra cualquier prote(na de una mezcla biol6gica; una vez se ha conseguido el anticuerpo, se puede utilizar como sonda 200

Cap{tuJo 4 : C6mo se estudian las c8u1as

Figura 4-65 Preparacl6n de hlbrldomas que segreguen anllcuerpos monoclonales homog61eos contra un antigeno delennlnado 00. EI medio de crecimienlo selectivo utilizado condene un inhibidor (la aminopterinal que bloquea las rut3S nonnales de biosfntesis a travk de las que se sintetizan los nucle6tidos. Por consiguiente, las relulas han de utilizar una rula paralela para sintetiz.ar sus tcidos nucleicos, y la Ifnea celular mulante a la que se fusionan los linfocitos B nonnales es derectuosa para esta via Puesto que ninguno de los dos tipos celulares utilizados para la fusi6n initial puede vivir separado del otro, tan ~Io sobreviven las relulas hfbridas.

espedfica tamo para averiguar y 10caJizar la protefna que induce su formad6n como para purificar esta protefna y estudiar su estructura y su fund6n. Dado que unicamente se han aislado el 5% de las 10 000 protefnas que tiene aproximadamente una c~lula de mamffero, muchos de los anticuerpos monoclonales generados cOntra mezclas impuras de protefnas identifican nuevas protefnas en extrac{OS celuJares fracdonados. Con la utilizad6n de los anticuerpos monodonales y la tecnologfa del donnje g~nico (v~ase mas adelante) no va a ser diffdlla identificaci6n y caraclerizaci6n de nuevas protefnas y de nuevos genes; el problema sera detenninar su funci6n, ya menudo el sistema m<1s poleme de hacerlo es utilizando la tecnologfa del DNA recombinante, como se discule en el Capftulo 7.

Resumen Adualmente u dispone de Will gran mlmero de tk'Jicas que pem.ltetl det.ectar, "Uldlry seglllr casl C1UJlqlller molkuln de intem en el illterior de 1I1U1 d""a. C'UJIq.der moliCldn plleck ur "mnrcnda" mediante In iJu:orporaci61l de UIlO 0 "ufs dtomas mdlm:tivos. Los mkleos de estos dtomos se desintegran, emitiendo UIUI radlncl6,. ql4(! pennlte tktectar In molbla marcadn y rrtuQr sus movlmielltos y Sll metabolismo en In dlula. Entre el elevado mfmero de aplicacio1U!s de los radiois6topm a In biologia ulular, u puede destncnr el a,uSlisis de las mas metnb6llcas mediante mltodos de Plltso Y ctI.UI Y La det.emllnnc16n de un elevado ndmero de molkulas "ullvldualmente mediante La autorradiograjUL Los coloralltesjluorescetltes tambiin se puedell IIti1lzar para medlr las conestltraclones de defem,illados iOlles en cllulas imlividllnles. ;ncluso ell zonas colll:retas de una dlllla. Los micrcH!lectrodos de vidrio, que empezaron a ur lmpresclndibles en el estlldlo de potenclales de membralUl y de corr/elltes 16nlcas a travh de In membrtma plasmdtica. nct'UJlmente proporc;otlnll una altenratlva para medlr las conuntraclOlles illtraulJlLares de lones detem.itlados. Tamblill pUedeli Jltlliulrse como mlcroplpetas para inyectar a las cllulas molkulas para IllS qlle las membranas son Impem.eables. oomo protelnas marcadns ootljllloresuinn yatltiClIerpos. Se puede segllir el comportamiento dituSmloo y los mOlllmientos de mucl.os tipos de malkllias ell ",ra el'uln ,'iva cotlstruyendo "Il precllrsor lnaet/I/O "empatluetlldo", el clUJI puede ser itJtrodueido etl ",Ia dlJI1n y act/llaliO ell IIna regi6" dererminada deln d/llia mediante IlIla reaccl6n estlmulada por La luz. Los ant/cuerpos tambiln son lIerramlentas uersdtiles y senslbles para detectar y localiulr molk,das blol6gicas detenllinndns. Los uertebrados producen mlJiones de molkutas de alltlcuerpo distitltas, cadn Imn de las cludes tielle w, Illgar de unM" qlle recolloce IUIa regi6" determillmla de Imn macromoMcllla. La tlentca (wi IIlbridoma permite la obtellci6n, en cnntidades casi illmitathu, de anrJcl~e'1)os moIloclollales, CO'I /Ilia especiftctllad ",liea. Se puedell obteller tUltlcuerpos mouoelotudes COlltra, ell principlo, cualqllier macromoikuln cel/llar; estos m.tlcllerpos moIloclonales plleden ser utilizados para Jocalizar y pllriftcar la moilclIlLI que el a"ticJlerpo recolloce y, por 10 menos en algullos casos, mrallzar suJII/.cid".

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enetica molecular

II Fund6n de las protefnas Mecanlsmos gen~ICOI blislCOfJ

Tecnologfa del DNA recombinante

EI ndcleo celular EI control de 18 expresl6n

geruca

E1ectronmicrograffa de barrido de cromosomas

humanos en metafase.

Wor corlesfa de Terry D. Allen.)

~~

~ ~.

~e ~

~

e ~~~ ~ ~ e ill ~ • ~

Serie de seis irnagenes de un modeJo anal6mico de un poliovirus, cuya estructura tridimensional se conace con exactitud a partir de crislalograffa de cayos X. Carla imagen esta ampliada tres veces respecto a la anterior, hasta que al final podemos ver una regi6n del virus a nivel de resoluci6n al6mica. En el centro de la ultima imagen puede verse claramentc la cadena laleral del aminoacido tript6fano. (Por cartesia de James Hogle).

undon de las proteinas

5 • las protefnas como

ml1qulnas • Nacimiento, ensamblaJe y muerte de las protefnas

protefnas constituyen la mayor parte de la masa seca de la celula y desempelas funciones predominantes de la mayoria de los procesos biol6gicos. Sin bargo, para pader entender 10 que son las protefnas, primero hay que inteneolender c6mo es una celula. En el CapItulo 3 presentamos una introducci6n mental de 1a estruc(Ura de las protefnas, junto con una visi6n general de las cromoleculas biol6gicas, discutiendo su qUlmica y su conformaci6n. Sin emo. las protefnas no son s610 rfgidos grumos de material de superficie qufmiente reactiva. Disponen de zonas m6viles estructuradas de manera muy edsa, cuyas actiones mecanicas estan acopladas con cveotos qufmicos. Precicote es este acoplamiento entre qUlmica y movimiento 10 que provee a las teinas de capacidades extraordinarias que estan en la base de todos los pro· os dinamicos de las celulas vivas. Sin comprender c6mo acnJan las protefnas rna rnoleculas can zonas rn6viles resulta dificil apreciar el resto de la biologfa lular. En este capitulo, que inicia las secciones mas avanzadas del Iibro, utilizas ejemplos seleccionados para mostrar de que manera funcionan las protef, no s610 como catalizadores sino tambien como sofisticados transdUClOres movimientos, integradores de sefiales, y componentes de maquinas proteicompuestas par muchas subunidades. La discusi6n se basa en avances que revclado las estructuras tridimensionales detalladas de muchas prot.efnas; alta los principios generales e intenta sen tar las bases de descripciones de tructuras cclulares especfficas y de procesos que se detallan en capftulos posriores. En la ultima pane del caphulo describimos la vida y la muerte de las protei· F -desde su plegamiento, guiado por chaperones moleculares, hasta su desrucci6n por proteolisis dirigida- poniendo enfasis en la constmcci6n molecular la mayona de las protefnas y de los complejos proteicos.

s protefnas como maquinas ~

§

pezaremos considerando de que manera se puede alterar la conformaci6n de a protefna dehido a la uni6n de olra molecula denominada Ugando. Demosemos las profundas implicaciones de este fen6meno aparentemente simple cribiendo algunas de las muchas maneras por las que las celulas utilizan [as teraciones de las proteinas inducidas por ligandos.

207

0-

O·

0-

0-

I I I -O-P-O-P-O-P-O-CH 8 U I ' 000

0ATP

+

I

o=p-oI o

0-

I I 0 - r - 0 - P -O-CH II II '

o

+

0

ADP

I

CH,

HO

.,~

glucou 5-fosfato

La uni6n de un ligando puede cambiar la conformaci6n

de una protefna

l

El primer ejcmplo lrata de la enzima hexoquinasa, la cual csla presente en casi Iaclas las relulas. Esta enzima cataliza una etapa temprana del metaboUsmo de los azucares -Ia transferencia del fosfato terminal de una molccula de ATP a la glucosa, formando g1ucosa 6-fosfato (como se discule en el Capitulo 2). La hcxoquinasa se une fuertemcnte a g1ucosa, 10 cual incrementa notablemente la afinidad de la enzima por el ATP, que se une a un lugar vecino de la protelna. Entonces, algunas cadenas latcrales de determinados aminoacidos de la protefna catalizan la transferencia del fosfato, y los dos prodUCIOS -Ia glucosa 6-fosfato y el ADP- se liberan, acabando el cicio de reacci6n (Figura 5-1). La hexoquinasa de levadura esta compuesta por dos dominios. Los lugares de uni6n para la g1ucosa y para el ATP sc haHan en una hendidura situada enlle estos dominios, y cuando la glucosa se une, los dominios sc desplazan uno hacia el o(ro cerrando la hendidura (Figura 5-2). Estc Lipo de desplazamienro de dominios en respuesta a la uni6n de un ligando es un proceso habitual y facil de explicar. En el caso de la hcxoquinasa, en la cara interna de cada dominio exislen lugares de uni6n para diferenles zonas de la molccula de glucosa. EI cambio desfavorable de la energfa libre de la protcfna que ocurre cuando los dominios se desplazan uno respccto al otro cerrando la hcndidura queda mas que compensado por la energfa libre Iiberada cuando la hendidura se cierra sobre la glucosa; en olras palabras, los enlaces no covalentes que forma la glucosa con la protcfna ~unen" los dos dominios, uno contra otro, haciendo que la protcfna salte de una conformad6n abierta a Olra ccrrada.

dominio 1

dominio 2

208

CapftuJo 5; Funci6n de las proteinas

F ~ra 5-1 La reacci6n catalizada por la hexoquinasa. En el primer paso de la degradaci6n de la g1ucosa se transfiere un grupe> fosfalo desde el ATP hasta la g1ucosa, fonnando g1ucosa 6-fosfato. Emonces la g1ucosa 6-fosfalo es procesada mediante series de Olras enzimas que calalizan la cadena de reacciones conocidas como g1ucolisis. La g1ucolisis lransfonna la g1ucosa en piruvato y produce una ganancia neta de moleculas de ATP para la celula (vease Figura 2-21).

mea 5-2 E1 camblo de conformaci6n de la hexoqulnasa causado par la unl6n de g1ucosa. las Uneas trazan el Clnso del esqueleto hidrocarbonado de la hexoquinasa. Estas eslruCluras fueron delenninadas por analisis de difracci6n de rayos X de criSlales de la prOlelna, sin y con g1ucosa. La uni6n de g1ucosa cambia Ia proleina desde una confonnaci6n abierta a una confonnaci6n t:errada.

Como diSCUlimos a continuacion, las proteinas cuyos cambios de conformaci6n acoplan dos lugares de uni6n separados de su molecula, han sido seleccionadas durante la evoluci6n ya que penniten a la celula relacionar la presencia de una molecula a la presencia 0 ausencia de cualquicr otra molecula. Este tipo de acoplamiento conformacional se denomina a/osteria. Una protefna cuya actividad esla regulada de esla fonna se denomina proceina a/osu!rica y la uansici6n que surre se denomina transici6n alosterlca .

Dos Iigandos cuyos lugares de uni6n estan acoplados pueden afectar recfprocamente la uni6n del otro2: Cuando dos Iigandos prefieren unirse a la misma conformaci6n de una prote(na aloslcrica, consideraciones lennodimimicas basicas aseguran que cada Iigando incrementa la afinidad de la protema por el Olro Iigando. ESle concepto se denomina conex16n (linkage). Esta bien i1ustrado por el ejemplo considcrado en la Figura 5-5, en el que la uni6n de la glucosa a la hexoquinasa incrementa la afinidad de la enzima por la molt~cula X, y viceversa. La relad6n de conexi6n es cuantitalivamcnte rcciproca de forma, por ejemplo, que si la glucosa dene un gran efeclo sabre la union de X, X tambien tendra un gran efeclo sobre la uni6n de glucosa. Si dos Iigandos se unen a conformaciones diferelltes de una protelna alosterica, 1<1 conexi6n sera negativa. Por regia general un Iignndo estabiliza la conformaci6n particular de la proteina a la que se une; si esta conformacion es diferente de la favorecida par el otTO Iigando, la union del primer ligando dillcultara la uni6n del segundo Ugando. As!, si el cambio de conformacion inducido por la glucosa reduce la afinidad de In proteina por la mo[ecula X, In uni6n de X disminuira [n afinidnd de la proteina por la glucosa (Figura 5-6). Las relaciones mostradas esquem
Las transiciones alostericas colaboran en la regulaci6n del metabolismo3 Como describimos en el Capitulo 2, a menudo el produclo final de una via melab6lica inhibe la enzima que inicia dicha via. Debido a csta retroa/imelltaciolllle-

210

Capftulo 5: Funcl6n de las protefnas

Figura 5-5 Uni6n cooperatlva causada por el acopJamiento conformacional enlre dos lugares de unl6n distantes. En cste ejemplo tanto la glucosa como la molecula X se unen mejor a la confom13ci6n cerrada de una proteina con dos dominios. Tanto la glucosa como la subslancia X dirigen [a proleina hacia su confonnaci6n cerrada, por 10 que cada ligando colabora con el otro p.Ha que se una a la proleina. Asi pues, sc dice que la glucosa y la molecula X se unen de fonna cooperaliva a la proteina. L1 figura es muy similar a las Figuras 5-3 y 5-4; la (mica diferencia es que mientras que ellugar de uni6n para el ATP se localiza en la hendidura de la hexoquinasa. ellugar de uni6n para la molCcula X se localiza fuera de esta hendidura.

Figura 5-6 Uni6n competltlva generada por el acoplamicnto conformacional entre dos lugares de uni6n distantes entre sf. EI diseiio de esta figura es el mismo que el descrito para la Figura 5-5, pero aquf la molecula Xprefiere unirse a la conformaci6n abierta, mientras la glucosa prefiere la cerrada, Ahara la glucosa y la molecula Xdirigen In proteina hacia conformaciones opuestas (cerrada y abierta respectivamente). por 10 que la presencia de uno de los ligandos interfiere con la uni6n del otro.

sobre el flujo de la via, la concentrad6n intracelular del producto final se ~::;~e aproximadamente constame a pesar de los grandes cambios de las nes quimicas de la celula. En este tipo de reglilaci611 por retroinhibici6n 'dones alostericas son esenciales. Por ejemplo, las enzimas que actlian .., -~od'pio de una via generalmente pueden existir en dos conformaciones. Una es aCliva y une al substrato en su lugar activo catalizando su conversi6n -a substanda de la via. La otra es una conformaci6n inactiva que une al ",,,,,,-,aD final de la via en un lugar diferente, ellugar regulador. Cuando se acue:J. producto final se une a la enzima transformandola en su conformad6n n~ase Figura 2-38). fua enzima que participa en una via metab6lica tambien puede ser aetivada rransici6n alosterica inducida por la uni6n de un ligando. En este caso el ,~~:~es una molecula que se acumula cuando la ceJula es defidente en un no de la via; como elligando se une preferentemente a la forma activa de . a, dirige la enzima hacia su conformati6n activa. Muchas enzimas que .cpan en procesos catab6licos que producen ATP propordonan ejemplos de .:roalimentaci6n positiva; estas enzimas son estimuladas por un incremenconcentraci6n de ADP, que (iene lugar cuando los niveles de ATP dismiPara estas enzimas el ADP tiene un papel puramente regulador, en conron el papel de substrata que juega el ATP en la funci6n de la hexoquinasa.

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• 15ubllnidad 2 slIbllnidades ~~/4 slIb"nidadas

• 5 concentraci6n de inhibidor_

",~","'nascomo maquinas

Figura 5-7 Cinetica de actividad enzimatica respccto a la concentraci6n de Ugando inhibldor, para enzimas a10stericas fonnadas por diferente mimero de subunidades. En el caso de una enzima can una sola subunidad (linea roja).la disminuci6n desde e190% hasta el 10% de actividad (indicada par pllnlOS en la curva) requiere un incremento en la concentracion de inhibidor de unas 100 veces. La actividad enzimatica se calcula a partir de la relacion de e(lui!ibrio simple K=[I] (PI/liP]. donde P es la protelna activa, I es el inhibidor e IP es la proteina inactiva unida al inhibidor. ~sta es la curva que se aplicarfa a cualquicr union simple emre dos molcculas Ay B (vcase Figura 3-9) . Comrariameme una enzima alosterica formada por varias subunidades puede responder a variaciones de la concentracion de inhibidor de una manera semejante a un interruptor: la respuesta escalonada se debe a que el ligando se une a la protefna de una forma cooperativa. como se explica en la Figura 5-8. La /fllea verde represema el resullado tetirico esperado en el caso de union cooperativa de dos moleculas de inhibidor a una enzima alosterica con 2 subunidades, y la lillea' azlll el resultado te6rico esperado de una enrima con 4 subunidades. Como indican los pumos de las CUlvas. las enzimas mas complejas caen del 90% allO% de actividad can incrementos menores de la concentraci6n de inhibidor que la enzima compuesta por una sola subunidad.

211

·

;

'Hguru 5-8 Una tnmsid6n cooperaUva aJosterlca. Diagrama esquematico que ilustra de que forma la conformad6n de una subunidad pucde afcctar la de sus ve<:inas, en una proteifla simetrica compuesta por dos subunidades alostcricas identicas. La union de una sola molecula de un ligando Inhibidor (amarillo) a una subunidad de la enzima se produce con dificultad debido a que modifica la conformaci6n de esta subunidad, y por 10 tanto destruye la simetrfa de la enzima. Sin embargo, cuando se ha completado este cambio conformacional, la energia obtenida aI recuperar la estructura simetrica de la protefna hace que la segunda conformadon una elligando mucha mAs fdcilmente, sufriendo el mismo cambio conformacional que la otra subunidad. La union de la pomera molecula de ligando incrementa la afinidad de la OIra subunidad por la misma molecula de ligando. por 10 que la respucsta de la enzima a variaciones de la concentraci6n delligando es mucha mas marcada que la de una enzima monomerica (~ase la Figura 5-7).

A menudo las protefnas fonnan agregados simetricos que sufren transiciones alostericas cooperativas-4 Una enz.ima que estl~ regulada por retroalimenta~i6n negativa y que conste de una sola subunidad con un unico lugar regulador, puede disminuir desde el9O% hasta el 10% de actividad en respuesta a un incremento de unas 100 veces de la concentraci6n delligando inhibidor (Figura 5-7.U"ea raja). Aparentemente, las respuesl'as de este tipo no son suficientemente marcadas para una regulaci6n celular 6ptima, y la mayona de enzimas que sc acuvan 0 inhiben por la uni6n de un ligando consisien en agregados simetricos de subunidades identicas. Medjante esta disposici6n, la uni6n de una molecula de ligando al lugar de uni6n de una de las subunidades puede provocar una alteraci6n alostcrica en esta subunidad que puede ser transmitida a la otra subunidad vecina, favoreciendo asi que esta tambien una otra molecula de ligando. Como resultado de esta transici6n alosterica cooperariva, una variaci6n relativamenle pequeiia de la coneentraci6n delligando en la celula puede hacer pasar todo el agregado de una conformaci6n casi complctamente activa a otra casi completamentc inactiva, a viceversa (Figura 5-7, ff"ea azul). Los principios que permiten que se produzca una transici6n cooperativa del ~todo 0 nada~ son mas facHes de visualizar en el caso de una enzima formada por un dimero simCtrico. En el ejemplo mostrado en la Figura 5-8, la primera molccula delligando inhibidor se une con una gran dificultad ya que Sll uni6n destruye una interacci6n favorable entre las dos molcculas idenlicas del dimero. Sin embargo, ahora se une mucho mas facilmente la segunda molecula de Iigando ya que su uni6n recupera los contactos mon6mcro-mon6mero del dfmero simetrico (y tam bien inaclivando completamcnte la enzima). Puede obtenerse una respuesta incluso mas marcada a la uni6n de un ligando mediante agregados mayo res, como en el caso de la enzima formada par 12 cadcnas polipeptfdicas que discutiremos a continuaci6n.

La transici6n alosterica de la aspartato transcarbamilasa

se conoce a nivel at6micos

Una de las enzimas utilizadas en los primeros estudios de retroalimcntaci6n negativa es la aspartato transcarbamilasa de E. coli. Cataliza la importante reacci6n carbamilfosfato + aspartato -+ N-carbamilaspartato, que inicia la sintesis del anillo pirimidinico de los nucle6tidos C, U YT. Uno de los productos finales de esta vfa, el chosin trifosfato (CfP), se une a la enzima inactivandola cuando las concentraciones de CfP son elevadas. La aspartato transcarbamilasa es un gran complejo formado por seis subunidades reguladoras y seis subunidades cataliticas. Las subunidades cataliticas estan dispuestas en forma de dos trimcros. cada uno de elias dispuesto como un triAngulo equilatero. Ambos trimeros se mantiencn uno contra otro a traves de 212

CapUulo 5: Fund6n de las proteinas

enzlme ective

~

ENZJMA INACT1VA: ESTAOO T

subunidadel reguladoras. / X /....~

1

l'Igura 5-9 Translcl6n entre los estados R yT en la enzima aspartato tnUlscarbamilasa. La enzima esta compuesta por un complejo de seis subunidades catalfticas y seis subunidades reguladoras. La eslructura de las fonnas inaetivas (estado n y de las foooas aetiyas {esfado mse han determinado por cristalograffa de rayos X. La cnzima se inhibc cuando aumenta la concentraci6n deCfP. Cada una de las subunidadcs reguladoras puede unir una mo1ecula de CTP, cl cual es uno de los productos finales de la via. Mediante esta regulaci6n por retroalimcntaci6n ncgativa se impidc que la via produzca m:1s cantidad de CTP de la que nccesita la c~lula. (Basado en K.L Krause. K. W. Volz Y W.N. lipscomb. Proc. Natf. Acad. Sci. USA82:1643-1647.1985).

'om ENZIMAACTlVA: ESTAOO R

UTa 5·10 Parte dellnterruptor sl(no de la subunldad catalftlca de la aspartato transcarbamilasa. Variaciones en las interacciones entre enlaces de hidr6geno indicadas son parcialmente responsables del -saito· que sufre ellugar activo de esta eozima desde la conformaci6n activa (amarilla) a la inactiva. Los enlaces de hidrogeno se indican como finas Ifneas rojas. Los aminoacidos que participan en las interacciones entre las dos subunidades se indican en rojo mienlras que los que fonnan eI lugar activo de la enzima se muestran en azul. La parte superior de la figura mueslra ellugar catalftico en el interior de la enzima; la parte inferior muestra la superficic externa de la cnzima. (Adaptado de E.R. Kantrowitz yW.N. lipscomb, Trends Biochem. Sci. 15:53-59.1990,)

estado T tinactivol

estado R (activol

213

las subunidades reguladoras, que hacen de puente entre elias. La molccula com· pleta puede sufrir transiciones aloslericas del ~todo 0 nada" entre dos conforma· ciones, los estados T ("tenso") y R ("relajado") (Figura 5-9). La uni6n de los subslratos (carbamilfosfato y aspartato) a los trimeros cata· Hticos empuja a la aspartato transcarbamilasa a su estado R, cataliticamente ac· tivo, del que entonees se disocian las moleculas de CIl', reguladoras. Contrariamente, la uni6n de CfP a los dfmeros reguladores empuja la enzima a su estado T, cataliticamente inactivo, del cual se disocian los subslratos. Este "tira y anoja" entre el Cfr y los subslratos es identico, en principio, al descrito previamente en la Figura 5-6 para el caso de una protefna alostcrica mas sencilla. Sin embargo, aqui el tira y anoja ocurre en una molecula simctrica con muchos lugares de uni6n, por 10 que el efecto es una lransici6n alosterica cooperativa que puede aClivar la enzima rapidamente cuando se acumulan los suhslratos (transformandala en su eSlado H) 0 inactivarla repentinamente cuando se acumula err (transformandola en su estado n. Una combinaei6n de bioqufmica y de cristalograffa de rayos X ha rcvclado una gran cantidad de fascinantes detalles de esta transici6n alosterica. Cada subunidad reguladora tiene dos dominies, y la uni6n de erp haec que ambos dominios se desplacen une respecto al etre, de forma que actuan como un clevador que hace rotar los Ir(meres catalfticos acercandolos entre sf, en el estado T (vease Figura 5-9). Cuando esto ocurre se forman enlaces de hidr6geno entre las subunidades catalfticas opuestas que ensanchan la hendidura que forma el lugar activo en cada subunidad cataUtica, destruycndo asi los lugares de uni6n para el substrato (Figura 5·10). Anadiendo grandes cantidades de substrato se obtiene el efccto contrario, favoreciendo la fonnaci6n del estado R mediante la uni6n de molecuJas de substrato en la hendidura de cada subunidad catalftica y oponiendose asi aI cambio conformacional descrito. Las conformaciones intennedias entre los estados R y T son inestables, de fonna que la enzima fundamentalmente salta entre las fonnas R y T, produciendose una mezcla de ambas farmas. la composici6n de la eual varia en funci6n de las eoncentraciones relativas de erp y de substratos.

La fosforilaci6n de proteinas es un mecanismo

habitual de dirigir transiciones alostericas en las celulas eucariotas6

•

En una bacteria como E. coli la actividad de las protefnas esta regulada funda· mentalmente por una miriada de pequefias moleculas de la celula, que se unen espedficamente a dcterminadas proteinas causando transidones alostericas que contrelan la actividad de estas protefnas. Muchas de las protefnas reguladas de esta manera son enzimas que catalizan reacciones melab6!icas; otras transducen sefiales 0 activan 0 inactivan genes (como ejemplo, vease la Figura 9·27). Sin embargo, algunas protefnas bacterianas estan controladas de forma diferenIe -mediante la uni6n covalente de un grupo fosfato a una cadena lateral de un aminoaddo. Cada grupo fosfato tiene dos cargas negativas, por 10 cual su uni6n a una protefna puede generar un cambio eslruclural, por ejemplo atrayendo entre sf ados grupos de aminoacidos cargados positivamente (Figura 5-11). A su vez, un cambio de este tipo que ocurra en un lugar de la proteina puede alterar la confonnad6n de otra zona de la protema -por ejemplo controlando a1ostericamente la actividad de un lugar de uni6n aiejado. La fosforilaci6n reversible de las protefnas es la estrategia mas utilizada para controlar la actividad en las celulas eucariotas. Se cree que mas del 10% de las to 000 protefnas de una celula tipica de mamffero se fosfarilan. EI fosfato se transfiere desde una molecula de ATP mediante una prorefna qU;lIasa y es elimi· nado mediante una protefnQ fosfatasa. Las celulas eucariotas contiencn una gran variedild de estas enzimas, muchas de las cuales juegan un papel central en la sefializaci6n inlracelular (como se discute en al Capftulo IS). 214

Capitulo 5: Funcl6n de las protefnas

grupo fosfato

II ura 5-11 lnnuencla de un gropo fosfalo sabre una proteina. EI grupo (os(ato. cargado negalhoamente, que se muestm aquiesta unido covalentemente a una cadena lateral de una treonina de la proteina quinasa dependiente de AMP cfelice que se discute en el Capitulo 15. Como se determin6 por cristalograffa de rayos x, el fosfato esta rodeado de diversas t:adet\'3.s \"3.\.era\es de am\no:ic\.dos t.a,~aui.\'" \l1:l",\'\w'3.men\e lie\a \ll\.)\l\'3.

prO\el.na. lJ\dapmdo de S.S, Tay\or el a\., AtutU. Rev. Cell. BioI. Iblo'1.9-<\G2, 1992. ClI992 Annual Reviews Inc.)

:::~eucariota contiene muchas protefna quinasas . ._ _ quinasas que fosferilan protefnas cn las celulas eucariotas pertenefamilia de enzimas, las cuales contienen un dominio catalftico de ~:~:~im,os mas adelante. "'''''~",ndo las diferencias en la secuencia de aminoacidos entre los una familia proteica puede construirse un "arbol evolutivo~, que al a el patr6n de dupJicaci6n genica y de divergencia que ha dado lu(vease Figura 8-76). En la Figura 5-13 se presenta un arbol evolutema quinasas. No resulta sorprendente que a menudo las quinafunciones relacionadas se localicen en ramas vecinas del arbol: todas las proteina quinasas que participan en procesos de Sei'laliza.'*'~ I05forilando cadenas laterales de tirosina se hallan agrupadas en la :,:~:::::r izquierda del fuho\. las otras Quinasas mostradas fosfori.\an cade serina 0 de trconina. y muchas de elias estan agrupadas. al pa-

:

5-12 Estroclura tridimensional de un dominlo proteina quJnasa. dUUellira del dominio quinasa de la quinasa dependien,e de AMP cfdico. "'Upt'rpuestas al dibujo de la es'ructura, las cabezas de flec1la rojas indican .nares en que se han encontrado insertos de entre 5 y 100 aminoacidos en miembros de la familia de protefna quinasas. Estos insertos estan ocalizados en asas sobre la superficie de la enzima, donde otros ligandos lDleractuan con la protelna. Asi. los insertos difcrencian las distintas quinasas -:onfuiendoles la capacidad de interaccionar can otras protefnlls, EI ATP dador de un grupo fosfato en la reacciOn) y el peptido que sera fosforilado unen en el Jugar activo de la enzima, que llbarca desde el asa que une el g;rupo fosfato (amarillo) hasta el asa catalitica (naranja). (Adaptado de DR Knighton et aL Science235:407-414. 1991.0 1991theAAAS.)

!I!!!!'__ como maquinas

215

Cdc 7

, MA>

. •

Arbol e\loluti\lo de algunas prote{na qulnasas. A pesar de que las cclulas eucariotas superiores contiencn cenlenares de tales enzimas, en fa figura s6lo se mueSlran algunas de las que se discuten en este libra.

I,

KSSl ERKl

.ecepto. POGF subf :Ie liroslll' ~ llaseS

receptor

Cdk2

EGF

Cd02

s~

quinalUl dependiente de AMP eielico

LcIc

quinlllUl depend'ente de GMP eklico P'Olelllll quinllSlI C

RlIf Mos

uin8SlI de la ' clIden, lige.a de la miosina

quinllf.l dependienlll de CII '/Calmodulinll

~iClieCdO,C,-­ de ,e<-eploru de Ie

,

recer, segun su funci6n --en la seftalizaci6n transmembrana, en la amplificaci6n de scnales, en cl control del cicio celular, elc. En la Figura 5-14 se i1ustra la reacci6n basica catalizada por una protefna quinasa. Un gropo fosfato es transferido desdc una molecula de ATP hasta un grupo hidroxilo de una cadena laleral de una serina, una trcenina 0 una tirosina de una protefna. Esta reacci6n es esencialmente unidireccional debido a la gran cantidad de energia libre liberada cuando se rompe el enlace fosfalo-fosfalo, produciendose ADP (vease Figura 2-28). Sin embargo, las fosforilaciones calalizadas por prote(na quinasas pueden revertirse mediante un segundo gropo de enzimas denominadas protema fosfatasas, las cuales eliminan el fosfato (vease Figura 5-14). Hay varias familias de protefna fosfalasas, algunas de las cuales son muy especfficas eliminando grupos fosfato unicamenle de una 0 unas cuantas protefnas, mienlras que otras son relalivamente inespecfficas, actuando sobre una gran diversidad de protefnas. EI nivel de fosforiJaci6n de una protefna dcterminada en una celula en un momento dado dcpende de las actividades relativas de las protefna quinasas y fosfalasas que actuan sobre ella.

La estructura de la proteina quinasa Cdk muestra de qu~ forma una proteina puede actuar como un microchips EI centenar de protefna quinasas diferentes que tiene una celula eucariota estan organizadas en complejas redes de etapas senalizadoras que ayudan a coordinar

r- ~

Las enzlmas que

contro\an \a foslort\ad6n de las 9ro\e{na!!. en \a!!.d]u\as.la teacci6n

PRO~iNAQUINASA~

=;,'. . ~ senna. treonine

_

•

o tirosina

-

"-

PRoreINAFO$fATASA

I

p,

216

:2)0 =--.J

Capftulo 5: Funci6n de las protefnas

0I -p-o-

•

o

catalizada por una ptotema quinasa afiade un fosfato a una cadena lateral. de un aminoocido. mientras que la teacci.6n cat-alb.ada pot una {os{alasa e!imina este fosfato.

celulares, dirigen el ciclo celular y transmiten sefiales extracelula",,..-,,,de la celula, Muchas de las sefiales implicadas han de ser integra."n.fica,das. Cada protefna quinasa (y otras protefnas sefializadoras) acmemos de procesamiento, 0 "microchips" en los procesos de Una parte importante de la regulaci6n de estas proteinas proviene e ejercen los fosfatos que les afJ.aden otras protefna quinasas de la ..."'·....na,dos grupos fosfato activan la proteina mientras que otros grupos ema quinasa dependiente de c1clina (Cdk, de Cyclin-Dependent constituye un buen ejemplo de un elemento de procesamiento Las quinasas de esta clase son los componentes centrales del siste-n celular de las celulas eucariotas (como se discute en el Capitulo celula de vertebrado, una enzima Cdk se act iva e inhibe sucesivaIl!lD'aS la celula atraviesa las diferentes fases de su cicio de divisi6n, y activada afecla a varios aspectos del comportamiento celular a trafteclOS sobre las prolefnas que fosforila. Ahora conocemos la estruc""""...nsional de las enzimas de esta importante clase de protefna quina-....izaremos para demostrar de que forma una protefna puede actuar microchip. ema Cdk s610 es activa como protefna quinasa cuando esta unida a Uamada ciefina. Sin embargo, como se ilustra en la Figura 5-151a riclina s610 es una de las tres entradas de informaci6n necesarias Ia Cdk ademas, se ha de afiadir un fosfato a una cadena lateral de ..."".......ada treonina y se ha de eliminar otro grupo fosfato de la protefna unido covalentemente a una cadena lateral de una determinada tila Cdk integra un conjunto especifico de componentes celulares NH,

ENTRADAS is"'' ha anadido este fosfato?

la Cdk qu;nasa s"" act iva s610 silas respuestas a todas las preguntas son si SALIDA

Figura5-15 UnaCdkcomoun elemento integrador. En el Capitulo 17 se discute la funci6n de cstos reguladores centrales sobre el cicio celular.

lugar de act;vaci6n

161 ~

__--I-I de la fosforilaci6n

+ + +

activaci6n de la losforilaci6n sobre lreonina

-t-~ pfiptido

AT'

Estntctura tridimensional de una Cdk. (A) Diagrama de la estructura .aa:minada por amllisis de difracci6n de rayos X. En rojo claro se muestra p '...~ IDientras que sus tres fosfatos se representan en amarillo. (B) El proceso ~. . ,.oaD. activaci6n de la enzima ineluye la fosforilaci6n de una treonina Clllizada en la cola de una asa flexible (rojo) que, de no eSlar fosforilada, &:QSO del substrato proteico allugar activo del dominio quinasa. Esta activaci6n _ _ _,..=Ia uni6n de cielina, como se ilustra cn la Figura 5-17. (A, adaptado de U"'_.ftal., Namre363:595·602, 1993. © 1993 Macmillan Magazines Lid.)

• •I!!'"' como maquinas

fosfolreonina

217

-una ciclina, una protefna quinasa y una protefna fosfatasa- y se activa unicamente en el caso de que cada uno de estos componentes adquiera su estado de actividad adecuado. Por ejemplo, algunas ciclinas aumentan y disminuyen de concentraci6n en determinadas etapas del ciclo celular, incrementando gradualmente de cantidad hasta que repentinamente empiezan a ser destruidas en un punto determinado del ciclo. La repentina destrucci6n de una ciclina (por proteolisis dirigidal inmediatamente inhibira ulla enzima Cdk determinada, 10 cual constituye un importante sistema de controlar determinados procesos intracelulares, como por ejemplo la mitosis. La estructura tridimensional de la Cdk (Figura 5-16A) sugiere una explicaci6n molecular para la rcgulaci6n de esta enzima. La protefna Cdk en sf misma es inactiva, por dos razones: su lugar de uni6n al AlP esta distorsionado yexiste una asa de unos 20 aminoacidos que bloquea el acceso del substrato al centro activo. La uni6n de la ciclina par un lado eUmina la distorsi6n y par otro permite la adici6n de un grupo fosfato activador a la cola del asa flexible; se cree que este fosfato es alrafdo por un hueco formado por aminmkidos eargados positivamente, de forma que el asa se estira y baja permitiendo el acceso allugar activo (Figura 5-J613). Sin embargo, la uni6n de la ciclina tambicn pcrmite la rapida adici6n de un fosfato inhibidor, que interfiere t:0n ellugar del ATP, 10 cua[ coloca la Cdk en un estado inactivo. Finalmente, la quinasa es aelivada cuando una fosfatasa especflica elimina el fosfato inhibidor (Figura 5~ 17).

Las proteinas que unen e hidrolizan GTP son reguladores celulares ubicuos!l

°

Hemos descrito de que forma la celula puedc utilizar la adici6n la eliminaci6n de grupos fosfato de una protefna para controlar la aClividad de la protefna. En los ejemplos discutidos hasta ahora eI fosfato es transferido desde una molecula de AlP a una cadena lateral de un aminoacido de la protefna, a traves de una reacci6n catalizada por una prolefna quinasa espedfica. Las celulas eucariotas tambien utilizan otra vfa para controlar [a actividad de las proteinas mediante la adici6n 0 eliminaci6n de fosfatos. En este caso, el fosfato no se afiade directamente a la protefna; por el contrario, forma parte del dinucle6tido de guanina GTP, el cual se une fuertemente a la protefna. Cuando la proteina esta unida a GTP, es activa. La perdida del grupo fosfato ocurre cuando el GTP unido es hidrolizado a GDP, a traves de una reacci6n catalizada por la propia protefna; cuando la proleina esta unida a GDP, es inactiva. Las protefnas que unen GTP (tambien denominadas GTPasas debido a que tambien cataUzan la hidr6lisis de GIP) constituyen una gran familia de protefnas, que tienen un dominio globular de uni6n a GTP similar. Cuando el GIP unido es hidrolizado a GOP, este dominio sufre un cambio de conformaci6n que inactiva la proteina. En la Figura 5-1B se ilustra la estructura tridimensional de una pequefia proteina que une GIP, denominada Ras.

P inhibidor

asa que bloquea el lugar del substrato

A

B

ENZIMA INACTIVA

,, ,,

c

,,

,,

D

P aclivador ENZIMA ACTIVA

L- LA OEGRAOACI6N OE LA CICLINA RESTAURA LA ENZIMA INACTIVA ~ 218

Capftulo 5: Funci6n de las protefnas

Figura 5-17 Modelo detailado de la activaci6n de la Cdk. Este modelo. basado en la estructura tridimensional de la Cdk, explica por que Cdkse inacliva s610 si se cumplen las tres condiciones diferentes que se indican en la Figura 5-15. En el paso A se une una cidina. 10 cual conduce a la uni6n del fosfato inhibidoren el paso B. La fosforilaci6n activadora se produce en el paso C, peru la enzima s610 se aeliva despues de que se haya eliminado el fosfato inhibidor, en el paso D. La degradaci6n repentina de la cidina, tras el paso D, hace que la enzima se inactive, liber
Figura 5-18 Estructura de la proteina Ras, en su forma unida a GTP. Esta protelna relativameme pequena ilustra la estructura de un dominio de uni6n a GTP. que se halla presente en otras protefnas que unen GTP (como ejemplo, vease Figura 5-20). Las regiones mostradas en roja cambian su conformaci6n cuando la moleCllla de GTP es hidrollzada a GOP y fosfato inorganieo por la proteina; el GOP queda unido a la protelna mienlras que el fosfato inorganieo es Iiberildo. Mas adelante se explica el papel especial que juega la «heliee interruptor en las proteinas relacionadas can Ras (vease Hgura n

5-20).

........ Ras juega un papel crucial en la seflalizaci6n celular (como 5e .apflUlo IS). Unida a GTP es acliva y estimula cascadas de fosfori"emas en la celula. Sin embargo, generalmeole esta en su forma a GOP. 5e activa cuando cambia la moil~cula de GOP que tiene de GTP, en respuesta a senales extracelulares como facto res de se unen a receplores de la membrana plasmMica (vease Figura teina Ras actlia como un interruptor si-no, cuya actividad esta la presencia 0 ausencia de un fosfato extra sabre una molecula la actividad de la proteina Cdk esta controlada par la presengrupos fosfato sabre determinadas cadenas laterales de aminoguraS-17).

etnas controlan la actividad de las protefnas GYP, determinando si se une GDP 0 GTPIO . 13 proteina Ras y de otras protefnas que unen GTP esta controlareguladoras que determinan cuando se une GOP y cuando "'idad de la proteina Cdk esta controlada por ciclinas, prote(na ema fosfatasas. Ras se inactiva por una proteina activadora de ••c,. Je GTPase-Accivating Protein), la cual se une a la proteina Ras in-.lrolizar la molecula de GTP que Beva unida, formandp GOP -que rtemente a ella- y fosfato inorganico (PI) -que es rapidamente ema Ras quedara en su conformaci6n inactiva, unida a GOP, nie con una proteina liberadora de nucle6tidos de guanina e Nucleotide Releasing Protein), la cual se une al complejo laccc..lo que Ras Iibere su GOP. El lugar, ahora vacio, de uni6n a nupado inmediatamente por una molecula de Grp (el GTP esta aula a concenlraciones mucho mayores que las de GOP), por 10 ... Ras mediante la adid6n il1directa del fosfato eliminado por la ;Po Asi, en derto sentido los papeles de GAP y de GNRP son anaproteina fosfatasa y de la protefna quinasa, respecrivamente (Fi-

~

1"""""

lliil:io.. alosterica de la protema EF-1\I muestra de que manera ..-ecuIas pueden generar grandes movimientos ll t'S uno de los miembros de una familia de GTPasas regllladoras -;«Ia una de las cuales esta farmada par un dominio de uni6n a

- -_ _.m~f1llinas

219

ENTRADA DE LA SENAL

ENTRADA DE LA SENAL

PROTEINA QUINASA

o

'A~P~PC:P'

GAP

PROTEiNA FOSFATADA

'c

~ ~"-

SALIDA DE LA SENAL

SALIDA DE LA SENAL

Q

P

"

(AI SENALIZACION POR FOSFORILACION

(8) SENALIZACION POR PROTEiNA aUE UNE GTP

GTP de unos 200 aminoacidos. En el transcurso de la evolucion, este dominio tambien se ha unido a otros dominios proteicos, generando una gran familia de protefnas que unen GTP, entre las que se hallan las proteinas G trimericas asociadas a receptores (discutidas en el Capitulo IS), proteinas reguladoras del tn1fico de vesiculas entre compartimientos intracelulares (discutidas en el Capitulo 13) y proteinas que se unen al RNA de transferencia y que son necesarias para que se produzca la sintesis proteica en los ribosomas (discutidas en el Capitulo 6). En cada caSD, una importante actividad biologica esta controlada por un cambio en la conformacion de la protefna, producido por la hidrolisis de GTP en un dominio semejante a Ras. La proteina EF-Tu proporciona un buen ejemplo de como acttian los componentes de esta familia de proteinas. EF-Tu es una molecula muy abundante en celulas bacterianas, donde acttia como un factor de elongacion en la sfntesis proteica, cargando en el ribosoma cada moleCll1a aminoacil-tRNA. La molecula de tRNA forma un fntimo complejo con la forma de EF-Tu unida a GTP. En este complejo el aminoacido unido al tRNA esta enmascarado; su desenmascaramiento, necesario para que se produzca la sintesis proteica, tiene lugar sobre el ribosoma cuando el tRNA es liberado tras la hidr6lisis del GTP unido a EF-Tu (la Figura 6-31 ilustra el funcionamiento de EF-Tu, preciso como un reloj). La estructura tridimensional de EF-Tu, tanto en su forma unida a GTP como a GOP, se ha determinado par cristalografia de rayos X. Estos estudios revelan como ocurre el desenmascaramiento del tRNA. La disociacion del fosfato inorganico (PI). procedente de la reaccion GTP-+ GOP + P;, genera una ligerfsima detormaci.6n I.de unas decimas de nan6metro) del \u'?,ar de uni.6n a G'TP, tal como ocune en la pTOte'ma 1\as. 'Es\e '\igero movimien\o, equiva'\ente imicamente a a\gunas veces el di{l.lnetTO de un atomo de hidr6geno, genera un cambia de con-

lCJl:maC\Cm I:\ue. se. \1m\1a'ba a l() 1aI'b() de. una \1\e.1.<\ cmcial de. n.e\i.e,e (1, l\amada helice interruptor, en el dominio semejante a Ras de 10. protelna. AI parecer 10. helice interruptor actua como un pestillo que se une espedficamente a una zona de otro dominio de 10. molckula, manteniendo \0. proteina en una cantormaci.6n «cerrada". E\ cambia de contormacion desem:adenado pOI \a hidr6\isis de Gl'P hace que 10. helice interruptor se desenganche, dejando que los dominios de 10. protelna, ahora separados, se desplacen una distancia de unas 4 nanometws, \i.berando aSI la molecula de tRNA que estaba unida (Figura 5-20). Este ejemplo pone de manifiesro de que forma las celulas aprovechan 7a~­ bios qUlmicos sencilJos que oeurren sobre la superficie de pequeilos dommlOs 220

Capitulo 5 : Funci6n de las protefnas

Hgura5-19 Comparaci6nentrelos dos principales mecanismos de seiializaci6n de las celulas eueariotas. En ambos casas una prolefna de seiial es activada mediante la adici6n de un grupo fosfalo, e inactivada mediante la eliminaci6n de este fosfaw. Para enfatizar las simililudes de ambos procesos, ATP y GTP se han dibujado comoAPPP y GPPP, YADP YGDP como APP y GPP respectivamente, Como se muestra en la Figura 5-17, la adici6n de un fosfato a una protefna tambien puede inhibirla.

lugar /'\. de union / ' deltRNA

dominio 1

hlltlice interruptor dominio 2

dominio 3

IBI

teicos para modificar grandes protefnas con sofisticadas funciones. En la ici6n de Has a EF-Tu hemos entrado en un mundo que "huele" a biologfa.

teinas que hidl'Olizan ATP realizan trabajo mecanico las celulas 12 cambios alostericos de forma pueden utilizarse para regular reacciones qui-:as. pero tambien para generar movimientos ordenados en las celulas. SulI'lgartlos, por ejemplo, que se necesita una protefna que "camine" a 10 largo de :ina hilo, como es el caso de una molecula de DNA. En la Figura 5-21 se ...estra esquematicamente c6mo una proteina alosterica puede hacerlo adopuna serie de cambios conformacionales. Sin embargo, si no hubiera nada dirigiera estas modificaciones para que siguieran una secuenda ordenada, ~"'''' perfectameme reversibles y la protefna se desplazarfa al azar, arriba y a 10 largo del filamento. Podemos considerar la situaci6n desde otro punto de vista. Como el movidireccional de una protefna produce (rabajo. las leyes de la termodimldieen que un movimiento como este ha de consumir energia libre de otra de 10 contrario la protefna podrfa utilizarse para eonstruir una maquina imiento continuo). Por 10 tanto, sean cuales fueren las modificaciones mttoduzcamos en el modelo mostrado en la Figura 5·21, como ailadir liganque favorezcan determinadas conformaciones, sin un aporte de energia la a proteica deambulara sin rumbo. .como se puede conseguir que las modificaciones conformacionales sean ;-eccionales? Para lograr que todo el cicio se produzca en una direcd6n ron que una cualquiera de sus etapas sea irreversible. Una manera de "."'"",00 ~':. \l\\'\\'l:a:<:. c\ ro..~c'Q:t\\.",mo C\ue ac.abamm; de describir Qara diri.gi.r las a.\o'2>\et\c.as en una tm:M.cu\o. ""u)\eko. melii..an\e \30. ni..uT6\\ilS <\e Con. debido a la gran cantidad de energia libre que se \ibera cuando se ~~:~"'~:GfP, resuha muy improbable que la proteina EF-Tu pueda ailadir • e una molecula de fosfato al GOP, invirtiendo asf la hidr6lisis de

p..,.-",

r<.'''''''

Figura 5-20 EI gran camblo conformaclonal de EF-Tu esta producldo poe la hldr6lisls de GTP. (Al Estructura tridimensional de EF-Tu cuando une GTr. El dominio superior es hom6logo a la protefna Ras y la Mike n en rojo es la ~helice interruptor~ que se desplaza cuando el GTP se ha hidrolizado, como se muestra en la Figura 5·18. (B) EI cambio de conformaci6n de la helice interruptor en el dominio I hace que los dominios 2 y 3 giren, como una sola unidad. unos 90" hacia el observador.liberando el tRNA. {A, adaptado de Berchtold et al.. Nature 365:126-132,1993. © 1993, Macmillan Magazines Ltd; B. par concsia de Mathias Sprinzl y Rolf Hilgcnfcld.l

221

Figura 5·21 Una prote(na alosterlca "que anda". Apesar de que sus tres conformaciones diferenles Ie permilen desplazarse al azar adclame 'J atnis miCnlras se mantiene unida a un filamento.la prote(na no puede moverse uniformemente en una sola direcciOn.

I t GTP. Este mismo principio se aplica a la hidr6lisis del ATP, y la mayoria de las proleinas que son capaces de caminar en una direcci6n recorriendo largas distancias (la lIamadas mOlOres proteicos) 10 hacen hidrolizando ATP. En el modelo allamente esquematico de la Figura 5-22,la uni6n de ATP impulsa la transfonnaci6n del motor proteico de la conformaci6n I a la conformaci6n 2. Entonces, el ATP unido se hidroliza produciendo ADP y fosfalo inorganico (P~, \0 cual genera un cambio de la confonnaci.6n 2 a \a conformad6n 3. Finalmente. la Iiberaci6n del ADP y del PI' que estaban unidos a La protefna, impulsa a la protefna de nuevo a adoplar la conformaci6n 1. Las transiciones I ~ 2 --+ 3 --+ 1 estan impulsadas por la energfa de hidr6lisis del ATP, por 10 que estas series de cambios conformacionales seran efectivamente irreversibles en condiciones fisiol6gicas (es decir, la probabilidad de que el ADP se recombine con Pj formando ADP por la ruta 1 --+ 3 --+ 2 --i 1 es extremadamente baja). Asf pues, el cicio entero de reacciones se producirn unicamente en una direcci6n, haciendo que la molecula proteica se desplace siempre hacia la derecha en este ejemplo. Muchos protefnas generan movimientos direccionales a traves de este mecanismo, incluyendo las DNA lie/icasas, enz.imas que se impulsan a si mismas a 10 largo del DNA a velocidades Ian elevadas como 1000 nucleOtidos por segundo.

La estructura de la miosina revela de que forma los muscuJos generan fuerza l3 En el Capitulo 16 discutimos de que manera diversos movimientos celulares estan producidos por motores proteicos que se desplaz.an rapidamenle a 10 largo de filamentos proteicos, dirigidos par ciclos repetidos de hidr6lisis de ATP (vease Figura 5-22). EI mejor conocido de estos motores proteicos es la miosina, cuyos movimientos dirigidos a 10 largo de filamentos de actina genera movimientos intracelulares y conlracci6n muscular. Las estructuras tridimensionales de la miosina (y de la actina) se han determinado mediante amllisis de cristalografia de rayos X, 10 cual nos permile vislumbrar el mecanismo interno de un motor biol6gico. La estructura del dominic de la cabeza de la miosina (Figura 5-23) sugiere de que forma la hidr6lisis de ATP se puede acoplar a la generaci6n de fuerza. 5e cree que la uni6n y la hidr6lisis del ATP generan una serie de cambios de conformaci6n ordenados que desplazan la punta de la cabeza unos 5 nan6metlOs, como se Hustra esquematicamente en la Figura 5-24). Este movimienlO, acoplado a la formaci6n y rotura de interacciones con la actina, repitiendose en cada cicio de hidr6lisis del ATP, propulsa la moltkula de miosina unidireccional· mente a 10 largo del filamento de actina (vease Figura 16-91). Asf en la miosina, como en la prolefna EF-Tu discutida anteriormente. una pequefia penurbaci6n del lugar de uni6n del nucle6lido, a traves de transiciones alostericas que aumentan el efecto, genera movimientos proteicos ordenados mucho mas acusados, que estan en la base de la biologfa celular.

It

UNION

DE AlP

~===, HIOROLISIS

C::==:::::::;:==3 I

llBERACION

Flgun. 5-22 Una protema alostt:rlca "motor". Una transicion ordenada entre tres confonnaciones esui impulsada par la hidr61isis de una molkula de ATP unida a ella. Dcbido a que una deestas transiciones esui acoplada a la hidt6lisis de ATP. el cicio es esendalmente irreversible. AI repetirse el cicio la protefna se desplaza siempre en la misma direccion (hacia la derecha en la figural a 10 largo del fiJamento .

•

222

Capftulo 5 : Fun<:i6n de las prole[nas

0bF>+® ADP

Lugar de uni6n de la actina

~

Figura 5-23 Estructura de la cabeza de la mloslna. En este diagrama estereosc6pico del dominio cabeza de la miosina. se produce hidr6lisis de ATP en eill/gar activo. ELC indica la cadena Iigera eseneial (de Essential Ught Chain) mientras que RLC indica la cadena ligera reguladora (de Regulatory Light Chain); ambas contribuyen. a 10 largo de la cadena pesada de la miosina. al dominio cabeza. (De I. Rayment et al.. Science 261:50-58. 1993. © 1993 the AAAS.)

ElC

(einas alostericas unidas a membrana y dirigidas por ATP en actuar como bombas i6nicas 0 trabajar en sentido ~"''fSO, sintetizando ATp14

mas de generar fuerza mecanica, las proteinas alostericas pueden lltilizar la ""'Zia de la hidr6lisis del ATP para realizar otras formas de trabajo, como el especifico de iones al interior 0 al exterior de la ceJula. Un importante 10 al respecto es la ATPasa Na'·K'. que se encuenlra en la membrana plasp-"""de todas las celulas animales, y que bombea 3 Na' hacia el exterior de la y 2 K' hacia el interior en cada cicio de cambios conformacionales dirigi~r la hidr6lisis del ATP (vease Figura II-II). En la mayorfa de las celulas oomba impulsada par A'TV consume mas del 30% del total de In energia que ••, ....,re la celula. Bombeando continuamente Na' hacia el exterior y K+ hacia el ~r, mantiene la concenrraci6n de Na+ mucho menor en el interior de la cee en el exterior y la de K+ mucho mayor en el interior que en el exterior, -~do asf dos gradiente i6nicos (en direcciones opuestas) a traves de la .'c""b,rana plasm
,

, ,, , , ":::.l',_,einas como maquinas

,, ,, ,, ,,, ,

uni6n e hidr61isis deATP

Figura 5-24 Vision conceptual de un gran cambio de conformacl6n en la miosma, probablemente causado por la union e hidr6lisis deATP. Este modelo eSla basado en la estructura mostrada en la Figura 5-23. En el siguiente paso en el proceso de hidr6lisis. la molecula de fosfato inorganico produeida (arribn) se Ilbera ala soluei6n. (Segtln L Rayment et al., Science 261 :58-65. 1993. © 1993 the AAAS.)

223

Las bombas alostericas asociadas a membrana dirigidas por la hidr6lisis de ATP tambien pueden actuar en sentido inverso, utilizando la energfa del gradiente i6nico para sintetizar ATP. De hecho, la energfa asequible en el gradiente de H· a traves de la membrana mitocondrial interna se utiliza de esta forma por el complejo proteico aloslerico unido a membrana, ATP sintasa, el cual sintetiza la mayor parte del ATP que necesita la celula animal, tal como disculiremos en el Capftulo 14.

Las transiciones alostericas acopladas energeticamente permiten a las proteinas actuar como motores, como relojes, como facto res de ensamblaje 0 como transductores de informaci6n '5 Muchas protefnas sufren cambios conformacionales ordenados acoplados a la liberaci6n de energfa que se produce cuando un nucle6sido trifosfalO (t"mlo ATP como GTP) se hidroliza a nucle6sido difosfato (ADP 0 GOP rcspectivamenle). Algunos de estos cam bios comprenden la union covalente del grupo fosfato a la protcfna (fosforilaci6n proteica), pero muchos Olros no, como la miosina. Generalmcnte cada cambio se desencadcna par un evcnto especffico (la uni6n de la miosina a la actina, por ejemplo, desencadena la hidr6lisis de ATP por la miosina), 10 cual marca una direccion y ordena las inleracciones de las macromolecu-

las en la celula. La capacidad de Ulilizar la cnergfa de un nudc6sido trifosfato para dirigir cambios alostericos en protefnas ha resultado crucial para la evoluci6n de las celulas, exactamcnte de la misma forma en que Ja capacidad de utiJizar Ja energia eJectrica ha resultado crucial para el desarrollo de la recnologfa moderna. En ambos casos se han abierto cnormes posibilidades para desarrollar aparatos utHes. Por ejemplo, protefnas como Cdk actuan como interruptores integradores sofisticados (vease Figura 5-15), recibiendo la informaci6n del entomo de la cclula y del estado del cicio celular y utilizandola para coordinar el comportamiento de la celula. Motores proteicos, como la miosina, se desplazan unidireccionalmente a 10 largo de filamentos generando varios tipos de movimientos y generando orden en el interior de la celula. Proteinas como EF-Tu acttian como instrumentos medidores de tiempo, mejorando la fidelidad de importantes reacciones biol6gicas (vease Figura 6-31). Otras prote(nas utilizan la energia Iiberada par la hidr6lisis de un nucle6sido trifosfato para catalizar el ensamblaje de detenninados complejos proteicos. En la Figura 5-25 se recoge un resumen de estas diferentes posibilidades.

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Capitulo 5 : Fund6n de las protefnas

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I

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p

TRANSDUCTOR DE INFORMACI6N

224

Figura 5-25 Algunos dlspositlvos fahricados con prole(nas. En eSlos ejcmplos In cllcrgfa dc hidr6lisis de nuclc6sido trifosfato se utiliza para dirigir cambios de conformaci6n en prote(nas alostericas. (Al Un trnnsductor de informaci6n, como una prote(na quinasa. (Bl Un motor, como la miosina. (Cl Un reloj, como EF·Tu que relrasa el ensamblaje de un complejo activo para asegurar que los complejos incorrectos se disocien {Unea (/fscontinua). (D) Un factor de ensamblaje que genera grandes estructuras.

MOTOR

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FI~ra "'-2.1 Una "mliqulna protelca". A menudo, los complejos prolcicos contienen una 0 mlls subunidades que pueden moverse de una forma ordenada, dirigidas por un cambia energelico favorable que ticne lugar en una molecula de substrato unida aI complejo (vease Figura 5-22). Movimientos proteicos de esle tipo son especialmente utiles para la cclula si ocurren en un gran complejo proteico en el que, como se ilUSlra aqui. se pueden coordinar las aClividades de varias subunidades.

~

menudo las prote(nas forman grandes complejos

lue actuan como maquinas proteicas l6 ~ el progreso desde las pequefias protefnas hasta las grandes proteinas formalas por muchas dominios. las funciones que puede realizar una proteina son :ada vez mas elaboradas. Sin embargo, las tareas mas imprevisibles las Ilcvan a :abo grandes agrcgados prolcicos fomlados por muchas subunidades indiviluales. Actualmente es posible reconstruir la mayoria de los procesos biol6gicos m. un sistema libre de celulas en el tubo de ensayo, y como puede observarse !ada proceso central de una cclula -como la replicaci6n del DNA, del RNA 0 la ilntesis de protefnas, la formaci6n de vesiculas 0 la seflalizaci6n transmembrala- esta catalizado por un complejo de mas de 10 protefnas. En eslas mliquinas ~rotelcas la hidr61isis de moleculas de nucle6sidos trifosfato (ATP 0 GTP) unidas Ila propia maquina dirige cambios de conformaci6n ordenados en las protefnas IOdividuales, permitiendo que todas las proteinas del complejo se muevan de nrma coordinada. Dc esta forma, par ejemplo, las enzimas apropiadas se desplazan directamente hacia posiciones donde son necesarias para producir reacHones cn serie, en lugar de esperar a que se produzcan colisiones aleatorias de ~da uno de los componentes necesarios. En la Figura 5-26 se ilustra una analopa mecanica sencilla. Las celulas han desarrollado maquinas proteicas por la misma raz6n que los bumanos hemos inventado maquinas mecanicas y electr6nicas: las manipulanones que eslan espacial y lemporalmente coordinadas a traves de procesos de uni6n son mucho mas eficientes desarrollando casi cualquier tarea que la ulilir.aci6n secuencial de cada uno de los acontecimientos individuales.

Resumen las prolefruu alostiricas cambian reversiblemente th oonfornuu:i6n cuando thter..imulos Ugundos 51! unen a.1Il superficie. A menudo los cambios producidos par lin ligando afectan a atro Ugando, y este tipo th relaciOn entre dDs lugures th unron de ligandos proporc:iofUI un mecanlsmo crucial de regular procesos celulares. Por rjemplo, los procesos metabOllcos estlfn oontrolados par rerroaUmentm:wn: algu-s molimlas pequenas inhiben y otras actioon a enzimas iniciales thl proceso. Gnreralmente las enz/11UJS reguladas de esta nrnnera forman ensamblajes simitripennitiendo qlle 51! prodlucan cambios oonfonnacionnies cooperativos que gen respuestas escalonadas a los ligandos.

225

-~.~----------------~

l.o' co.mblo!> de ton{onn.o.ci.6n de \u.s VTolebuu vueden eslo.r d\riwoos de unn mattern Iwidirecc:iOllaJ por In utilizacion tk energfa qllfmica. Por ejemplo, aooplando cambias alostericos a la hit/rolisis de ATP las protefnas puedell tksarrollar rrabajo util, como generar IIna fuerza meainica 0 oombear jOlles a tmiffls de ulla membrum1. Las estructllras tridimensionales de varias protelnas, determilllidas por cristalografla lie raros X. han revelado de quefomul un pequeno cambia local generado por In i.idr6Usis de lin mu:k6sidD trifas/alo u amplifica dnndo I"gar cambiol mayores en alTOs '''gares de In protefna; de esta forma estas proteltulS SOl! capaces de actuar como tmnsductores de in!onJllu;i6n, matares, relojes 0 factores de ellSllmblaje. Se lamlan "mdquinas protelc:as" altamente eficiemes mediante in incorpomci61l de lIIuduu $ubunidades proteiau dl{erentes a ,m gran agregado, en el clud los mouimielltos alostericos de cadn col1l,xmente individual est4n coominados para realiLar In mayorla. si no todns, las reacciones biol6giros.

Nacimiento, ensamblaje y muerte de las protefnas Hemos descrito algunos de los extraordinarios inslrumcntos celulares formados por protefnas. Ahora consideraremos de que manera se forman y se deslruyen eslOS instrumentos. EI mccanismo de la sintesis proteica se discute en olra par· Ie. Ahora empezaremos considerando c6mo se pliega y c6mo se ensambla una proteina a medida que va abandonando el ribosoma en forma de cadena polipeptidica.

Se cree que las protefnas se pliegan a traves de un intermediario globular fundido 17 Muchas prolefnas purificadas se pliegan ill vitro de forma adecuada despues de haber sido desplegadas. por 10 que durante muchos aFlos se pens6 que las prolef-

PROCESOD£ PlEGAOO AcnVADO

PROCESOS DESACTIVAOOS

globulo fundido

/

catalisis por chllperon~

~~

proteina P.......

correctamente

226

~~"'.IUI chaP8r~

Capitulo 5 : Funci6n de las protemas

ACCIDENTES IRRECUPERABLES

Figura 5-27 VIsl6n actual del plegamiento proteico. Una proteina acabada de sintetizar nipidamel11e adquiere un estado de "globulo fundido" (vease Figura 5-28). Despues, mas lelltamellte. se producen plegamielllOs a traves de multiples etapas, algunas de las cual~ produdrlan la muerte de la proterna sin la ayuda de chaperollas moleculares. AJgunas moleculas pueden no conseguir plegarse correctamente y seran reconoddas y degradadas por enzimas proteolfticas (vcase Figura 5-39).

Figura 5-28 Estructura de un gl6bulo fundido. (Al La forma de gl6bulo fundido del dtocromo b562 es mas abierta y menos ordenada que la protefna nativa, moslrada en {Bl. N6tese que el gl6bulo fundido comiene la mayor pane de la estruetura secundaria de la forma nativa. aunque los fmales de las helices a estrin deshilachados y una de estas helices s610 estri formada pardalmente. (Por cortesfa de Joshua Wand).

IAI

IBI

-.:="""adoptar todas las conformadones posibles mientras se van pleganque consiguen adoptar la conformaci6n de menor energfa posible, la

ne que es el estado correcta de la prote(na. Ahara sabemos que esro pesar de las ahas veloddades que adquieren los movimiemos mole_=,.'~ una protefna (vease pag. 101), para cualquier prmeina grande existen _=',ov", mas conformaciones posibles de las que se pueden explorar duran_ segundos que tarda la proteina en plegarse. Ademas, la existencia rnutantes que tiellen defectos especfficos de plegamiento indica _ la evoluci6n se ha ida seleccionando una secuencia de aminoaci,",,,,"",,,nada, no s6lo en funci6n de las propiedades de la estructura final n por la capacidad de plegarse rapidamclltc adoptando su confordad de algunas proteinas purificadas y desnaturalizadas de recu:>-ucurras nativas par si mismas ha hecha pasible disecar experimenesos del plegamiento de las proteinas. Las protefnas se pliegan .xmando estructuras en las que se ha fonnado la mayor parte de la estructura secundaria final (helices 0: y laminas 13) y en las ""~,,,,,,,,,,,tos se disponen de una forma cxtraordinariamente semejame a :1Ja 5·27). Esta conformad6n extraordinariamente abierta y flexi......--:-:='-.... gl6blllo fLmdido (mohen globule) (Figura 5-28) es el punta de ft'lCe'SO relativamente lento en el que se producen muchos ajustes ~."'-'="-=' ~erales intentando formar correctamente la estructura terdaria. ::::~ ~-eriores hada la conformad6n final se han de produdr diferen~ de ellos pueden condudr a plegamientos incorrectos a no la colaborad6n de una chaperona molecll/ar. protefnas especuya fond6n consiste en ayudar a otras protefnas a plegarse emucturas estables y activas (Figura 5-27).

:

....,,,=,,,,.., :

:::::,mOleCUlares fadlitan l8 de las proteinas

rculares se identificaron por primera vex en las bacterias. mutantes de E. coli que eran incapaces de utilizar bactef£."plicarse. Estos mutantes producen versiones ligeramenp:mentes de la maquinaria de chaparones, reladonada estI"fs par calor 60 y 70 (hsp60 Yhsp70, de Heat-Shock Pro""...""=defectuosas en determinadas etapas del ensamblaje

'::.~; :::::

•

".lo1Il!!i5!!!iiiEV muene de las protefnas

227

deSCIlI111da por proteoljS4

mllquinarill

r!f ribosomll

maquinarill semejlll'\le a hsp60

maquinaria semejllnte a hsp60

protelna plegada correctamente

proteina plegada correcta

Las celulas eucariotas tienen familias de protefnas hsp60 y hsp70, de forma que diferentes miemhros de las familias actuan en compartimientos cclulares distintos. Asi, como discutimos en el Capitulo 12, las mitocondrias contienen sus propias moleculas hsp60 y hsp70, diferentes de las que actuan en el dtoso], yen el reticulo endoplasmatico existe una hsp especial OIamada Blp) que colabora en el plegamiento de las proteinas. Tanto las proteinas hsp60 como las hsp70 actuan con un reduddo numero de protefnas asociadas, cuando colaboran en el plegamiento de otras proteinas. Presentan afinidad por las zonas hidrof6hicas asequibles que muestran las protefnas plegadas de forma incompleta e hidrolizan ATP, posiblemente uniendose y liberandose de su proteina en cada cicio de hidr61isis del ATP. Originalmeme se pens6 que las chaperonas moleculares s610 actuaban impidiendo la agregaci6n promiscua de las protefnas todavia no plegadas (de ahf su nombre; chaperon signifiea "dama de compania de senoritas"). Sin embargo ahora se cree que tambien interactuan mas fntimamente con sus "c1ientes" produciendo efectos que podrian asemejarse a un "masaje proteico". Las chaperonas se unen a las regiones hidrof6bicas expuestas, y dan un masaje a las regiones de la protefna que estan medio plegadas a partir del intermediario globular fundido, eamhiando su estructura de tal manera que proporciona a la proteina otra posibilidad de plegarse (vease Figura 5-27). En otros aspectos los dos tipos de proteinas hsp actuan de forum diferenle. Se cree que la maquinaria hsp70 actua precozmentc en la vida de lUla proteina, uniendose a eadenas de unos siete aminoacidos hidrof6bicos antes de que la protefna se libere del ribosoma (Figura 5-29). Por el contrario, las protefnas semejantes a hsp60 forman una estructura parecida a un gran barril (Figura 5-30) que actua mas tarde en la vida de la proteina; se cree que esta chaperona fonna una "camara de aislamiento" dentro de la cual se colocan las proteinas a media plegar, y se les facilita un entomo favorable dande puedan intentar volverse a plegar (vease Figura 5-29). Estas chaperonas moleculares se denominan proteflJas de estres par calor debido a que su s{ntesis se incrementa natablemenle tras una breve exposici6n

10Qnm

228

Capitulo 5 : Funci6n de las protefnas

10 nm

Figura 5-29 Dos famillas de chaperonas molec::ulares. Las protefnas hsp70 acluan de forma lemprana, reconociendo pequcii.as zonas de la superficie de las protefllA Las protefnas semejames a hsp60 aCluan mas larde y forman una especie de contenedor denlro del se transfieren las protefnas que todao no se han plegado completameme. ambos casos, ciclos repetidos de hidr611sis de ATP contribuyen a que proteinas hsp sigan cietos de uni6n l Jiberaei6n de la prOleina e1iente, facilitando su plegamienlO.

Figum 5-30 Estructura de una chaperona semejante a hsp60, determlnada por mlcroscopia electronlca. En (A) se muestra un gran numero de paniculas contrastadas negativameme y en (B) un modele tridimensional de una de cslas partfculas. obtenido par melOdos de procesamicmo de imagenes basados en ordenador. Tanto en procariotas como en cllcariotas se encuentran estructuras simiJares, parccidas a un gran barril. A este lipo de proleina se It' denomina hsp60 en las mitocondrias. groEl en bacterias y Tep·I en el citosol de las celulas de vertebrados. (A, de B.M. Phipps el aI., EMBO). 10:1711-1722,1991; B, de B.M. Phipps et aL Nature361:475·477, 1993. © Macmillan Magazines Ltd.)

a elevadas temperaturas (por ejemplo, 42°C). Ello parece retlejar de retroalimentaci6n que responde a un incremento de la cantimedio desplegadas (como las producidas por las elevadas lemConna que se incrementa la sintesis de chaperonas que ayudan a i"Olverse a plegar. :~

:

temas contienen series de moh~culas plegadas mdependiente l9

'lIegamiento de una protefna acabada de sinlelizar empieza conla nLimero de dominios estructurales estables, que se ~ con unidades funcionales, y que parecen tener orfgenes evolulivos En otros aparmdos dellibro discutimos los proccsos por los que se e"o'Olucionado las protcfnas, poniendo de relieve de que manera se - proteinas mediante el barajado de exones que codificaban domide proteinas utiles (veanse pags. 413-424). La evoluci6n ha de estos dominios en forma de unidades plegadas que retie..,,"""".. induso c.uano.() son separados de la proteina -bien sea par . ...,'" -'a, bien, de manera mas eficiente, por tecnicas de ingenierfa minios proteicos de este tipo, que muy a menudo panicipan en :~~::ti,·o de exones, se denominan m6dulos; ahora que conocemos de DNA de centenares de genes, se ha puesto de manifiesto la im~:;;.,_.JIldeterminado

"""""_:"lIDOS

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•

:

:~~~~.,.:"': m6dulos.

proteicos tienen tipicamente entre 40 y 100 aminoacidos de tamano y Sll capacidad de plegarse indepcndientemente :~';;:,,;:: detcrminar la estructura tridimensional de muchos de ellos en Ie tecnicas de NMR de elevada resoluci6n, la cual es una alter-~=_'flte a la cristalografia de rayos X. En la Figura 5-31 se i1ustran al~eii.o

•

• .J cit! complemenlo 3e conllol

modulo de -"rloglobulina

mOdulo de fibrone<:tina lipo 1

m6dulo de factor de crecimieflto

mOdulo de fibronEK:tina de lipo 3

m6dulo kringle

• _ _L~blajey muerte de las protefnas

Figura 5-31 Estructuras tridimensionales de algunos m6dulos proteicos. En estos diagramas, las zonas de Iamirlil ~ se presentan como flee/laS y los extremos NyC estan marcados como bolas rojas. (Adaptado de M. Baron, D.G. Norman e J.D. Campbell, Trends Biocliem. Sci. 16: 1317, 1991 yD.}. Leahye{ aI., Science 258:987·991, 1992. © de AMS.)

229

N.N

• guoos m6dulos tfpicas. Cada uno de elias tiene un nl\c1eo con una eSlructura estable farmada por cadenas 0 por laminas 13, del que salen asas de cadenas polipeptidicas menos ordcnadas (mostradas en uerde). Idealmente las asas estan sifuadas formando lugarcs de uni6n para atras mohkulas. como se ha dcmostrado para el plegado de las inmunoglobulinas que foe rcconocido primero en las moleculas de anticuerpo (~ase Figura 23·35). Es posible que el exita evolUlivo de los m6dulos basados en laminas ~ se deba al hecho de que constituyeron unidades adecuadas para la generaci6n de nuevas lugares ~ uni6n para ligandos. a traves de variaciones en estas asas que sobresalen del n(ideo del m6dulo.

il :17 Larga estructura formada a partir de series de mOd en Hnea. Aqui se muestran cineo m6dulos de fibronectina de tipo 3 formando una disposici6n repetitiv Eslrueturas similares se encuenmm varias mol6culas de matriz extracelular. Se cree que interaed entre cadenas laterales de los exrrem de los m6dulos proporcionan rigide:l. las cstructuras de eSle lipo.

Los m6dulos confieren versatilidad y a menudo median

las interacciones protefna-proteina I9, 20 Una segunda caracterfstica de los m6dulos proteicos que explica su utilidad es la facilidad can la que pueden ser integrados en otras protefnas. Cinco de los seis m6dulos que se i1ustran en la Figura 5-31 tienen sus extremos C y N (sei'lalados con bolas rajas) en extremos opucstos del m6dulo. Estas disposiciones ~en linea" significan que cuando un DNA que codifica un m6dulo de este tipo se duplica en tandem, 10 cual es habitual en la evoluci6n de los genes (como se discute en el Capitulo 8). los m6dulos duplicados sc pueden acomodar facilmente en la protelna. De esta forma estos m6dulos pueden unirse en serle tanlO consigo mismos (Figura 5-32) como con otros m6dulos en !fnea, fonnando largas estruc~ turas. Habimalmente se encuentran estructuras rfgidas y largas compueslas por series de m6dulos, tanto en moleculas de la maniz extracelular como en regiones de protefnas receptoras sitlladas en la sllperficie celular. Oiros m6dulos, como el ~kringle que se mlleSlra en la Figura 5-31. son de tipo "enchufe". Tras redistribucioncs gen6micas pucden ser facilmcntc acomodados en forma de inserto en una regi6n de un asa de otra proteina. Algunos de estos m6dulos acttian como lugares de uni6n espedficos de otras prolefnas 0 de otras estructuras celulares. Un ejemplo importante al respecto es el dominio SH2. que puede unirsc fuertemente a una regi6n de una cadena polipeptidica que contenga cadenas laterales fosforiladas de lirosina. Como cada dominio SH2 tambien reconoce otras caracteristicas dcl polipeplido. s610 se une al sub~ grupo de proteinas que contiencn tirosinas fosforiladas. La presencia de domimos SH2 en una proteina Ie permite formar complejos con protefnas que se fosforilen en tirosinas en respuesta a procesos de scnalizaci6n celular (Figura 5-33).

dominio SH2

una prOlei... quinasa

loslorila la prolalna A

230

Capftulo 5 : Funci6n de las proteinas

--::1"'l:=:!t-"1

'as proteina, A V8 saanumblan

lira 3 Los domlnlos 5HZ median las reacclones de ensamblaje de las protefnas que dcpcnden de fosforllaclones. En la Figura 15-49 se ilustra la estruetura de un dorninio 5H2. que tiene ta forma de un m6dulo tipo "enchufe".

, '\( superficie 1 superfi<;ie 2

'I IA)

lei

SUPERFICIE·CUERDA

SUPERFICIE·SUPERFICIE

complejos proteicos que S8 forman y se deshacen como resultado de carnIa fosforilaci6n de la prorefna juegan un papel central en la transducci6n ","'lesextracelulares en sefiales intracelulares. como se describe en el Capf-

Figura 5-34 Tres sistemas a traves de los que se pueden unir entre sf dos protefnas. 5610 se muestran las zonas que interactuan de las dos protefnas. (A) Una superficie rfgida de una proteina puede unirse a una larga asa de cadena polipeptfdica (una "cuerda") de otm proteina. (8) Dos helices 0: pueden unirse entre sf formando una helice superenrollada. (C) A menudo dos superficies rfgidas complementarias unen entre sf dos prolcfnas.

teinas pueden unirse unas a otras a traves """"ntes tipos de interfases irUlaS pueden unirse entre sf al menDS de [res mancras: en muchos casos .,,,",,,"n de 1a superlicie de una protefna contacta con un asa extendida de .~'"",a polipeprfdica (una "cuerda") de otra protclna (Figura 5-34A). Las inde este tipo permitcn, por ejemplo, que e1 dominio SH2 reconozca rilarla de otra protefna, y tam bien permiten a una prmcfna quinasa _",,:".as protefnas que fosforilara (vease Figura 5-168). _:mdo tipo de inleracciones entre la superficie de dos protefnas consis:';~~:iento de dos helices a, una de cada protcfna, formando una helice a (Figura 5-348). Este tipo de interacciones entre protc(nas se halla 1lII!"".... tamilias de proteinas reguladoras de genes, como se discute en el Ca-

_=0·...' :

=bargo, el sistema mas comun de interacci6n entre dos protefnas conacoplamiento preciso entre dos superficies rfgidas, una de cada pro5-34Cl. Las inreracciones de este tipo puedell ser muy fuertes, ya Uf' fannar un elevado numero de enlaces si las superficies se acoplan - misma raz6n, eSlas interacciones superficie-superficie pueden ser "rri'~ ....n amenre especfficas, permitiendo que una protefna seleccione a determinada de entre los muchos miles de protefnas que presenta aJC
.""00' D Yla proteolisis selectiva aseguran los ensamblajes 00

nada

as forman grandes agregados can otras proteinas. Ella requiere 'erna se una selectivamente a Olras protefnas simultaneamente. resu.lta crucial que cada complejo proteico se forme de modo efi-

~)

J Y

..........~~

complejo fuorte

. .----~~.~..........."'rt'" .1... I.." nrntf'fnas

la lJni6n de Y facilita la uni6n de X complejo d~bil

f'lgura 5-35 La coneJd6n facillta un ensambiaje de tipo todo 0 nada de los compleJos prote!cos. Como se indica, cada una de las dos protefnas X e Y inducen un cambio alosterico en una tereera proterna (mostrada en azul), que permile la uni6n de la otm protefna. Como resultado de ella, solamente el complejo formado par las tres protefnas es suficientemente fuerte para existir en la celula, 10 cual resul{a efectivo en el ensamblaje del tipo todo a nada.

231

ciente, y que otros complejos parciales, cuya formacion interferirfa can la funcion del complejo final, se formen en cantidades mfnimas. Por ella, debe haber mecanismos que aseguren que los ensamblajes se produzcan por sistemas del todo 0 nada. Un mecanismo importante radica en el fen6meno de la collexi6n (linkage), que hemos descrito antes. Gracias a la conex.i6n, si un ligando cambia la conformacion de una protefna alosterica de forma que la protefna se una a otro ligando de forma mas eficiente, el segundo Iigando puede, a su vez, incrementar 1a afinidad de la protefna por el primer Ugando (vease Figura 5-5). Este mismo principio se aplica a las interacciones protefna-proteina. Cuando dos protefnas se unen entre sf, a menudo una de elias incrementa su afinidad par una tercera protefna. Debido a esta conex.i6n el complejo de las tres proteinas sent mas estable que cI complejo de una sola protefna. Un mecanismo de este tipo puede produdr un ensamblaje dellipo todo 0 nada (Figura 3-35). Aunque se produzcan mecanismos de ensamblaje del tipo todo a nada que dirijan la conformacion de complejos proteicos completos, a no ser que la celula presente las cantidades exactas de las proporciones adecuadas de cada protefna del complejo, sobraran protefnas no ensambladas. De hecho, la celulas no siempre producen sus componentes en las cantidades precisas; sin embargo, las celulas son capaces de degradar selectivamente cualquier complejo proteico mal ensamblado (Figura 5-36). Asf pues, las cclulas necesitan disponer de un sofisticado sistema para identificar las protefnas ensambladas de forma anormal y para destruirlas. Efectivamente, las celulas eucariotas contienen un elaborado conjull1o de protefnas que permile dirigir especfficamente los ensamblajes incompletos de eSle tipo hacia la maquinaria de degradacion proteica, como discutiremos a cominuacion.

La proteolisis dependiente de ubiquitina es la responsable

principal del recambio proteico selectivo en los eucariotas21 Una de las fundones de los mecanismos intracelulares de proteolisis es, como acabamos de decir, reconocer y eliminar las pratefnas no ensambladas. Otra de las funciones consiste en desechar las protefnas daiiadas 0 mal plegadas (vease Figura 5-27). Otra es conferir una carta vida media a ciertas prareinas normales cuya concentracion ha de cambiar nipidamente en respuesta a alteraciones del estado de la celula; muchas de estas protefnas de carta vida son degradadas n1pidamente de forma habitual, mientras que otras, especialmente las ciclinas, son estables hasta que son degradadas repentinamente en un determinado momenta del cicio celular. Aquf discutiremos fundamentalmente como se degradan las protefnas en el citosol, pera tambien se praducen procesos importantes de degradacion en el retfculo endoplasmatico (ER) y. como se discute en el Capftulo 13, en los Usosomas. La mayorfa de las proteinas que son degradadas en el citosol son liberadas a grandes complejos proteicos denominados proteosomas, de los que hay mll-

Figura 5-36 La proteollsls de los componentes sobrantes de un complejo protelco Implde que St' acumulen en la celula. La degrada.

estable

mostrada aqui requiere que una proteina no ensamblada sea reconocida por enzimas que Ie agreguen ubiquitina. de forma covalente. como se discute en eI PROTEOLISIS

sus<:eptible de

degradad6n

232

Capftolo 5 : Funcl6n de las protcfnas

100 om

dispersas por toda la celula. Cada proteosoma consiste en un cHinarmada por multiples proteasas distintas, cuyos lugares activos, al una camara central. Cada extremo del cilindro esta ~cerrado" complejo proleico formado por al menos 10 tipos de polipeptidos, cuales hidrolizan ATP (Figura 5~37). Se cree que estos tapones ionan las protefnas que deberan ser deslruidas, unil~ndose a =-"dci'endolas en la camara del cilindro; alii las protefnas son degrada.....os peptidos, los cuales son Iiberados al exterior. -""",,~mas actuan sobre protefnas que han sido marcadas especffica_ su destrucci6n, mediante la adici6n covalente de una pequena pro·tina (Figura 5-38). La ubiquitina existe en todas las celulas, Iibre ntemente a protefnas. La mayorfa de las protefnas ubiquitinadas ~,...das para ser degradadas. (Algunas proteinas de larga vida como las ien estan ubiquitinadas, pero en estos casos la funci6n de la ubionocida.) Diferentes procesos proteollticos depelldiel/tes de llbi,;,...zan enzimas que conjugan ubiquitina, estruclUralmeme similares diferentes, asociadas con subunidades de reconocimiento que las - las protefnas que presentan alguna seflal determinada de degradaa de conjugaci6n afiade ubiquitina a un residuo de lisina de la . y posteriormente ai'Jade series de ubiquitinas adicionales, forcadena multiubiquitina (Figura 5-39), la cual, al parecer, es reconoetteptor proteico especffico del proteosoma. teinas desnatura\izadas 0 mal p\egada~, a~i como \a~ ?Ioteinas que oacidas oxidados 0 anormales, son reconocidas y degradadas por .-~~ -:-nteolftico dependieme de ubiquitina. Probablemente, las enzimas ---,,,,,oubiquitina reconocen sei'Jales que estas protefnas tienen expuestas ",,=::r ido a su mal plegamiento 0 a su alteraci6n qu(mica; se cree que essecuencias de aminoacidos 0 motivos conformacionales que en nonnales se hallan en su interior. es decir. inasequibles. :eso proteolftico que reconazca y destruya las protefnas anormales distinguir entre proteinas camp/etas que tienen conformaciones - - •. - rIa gran cantidad de polipeptidos que estan creciendo sobre los

ra 5-38 Estrqctura tridimensional de la ublqultina. Esta proleina tiene 76 residuos de aminoacido. La adici6n dc cadcnas de ubiquitina a ')fOteina provoca que esta protefna sea degradada por el proteosoma Figura 5-39}. (Basada en S. Vijay-Kumar. C.E. Bugg, K.D. Wilkinson y Cook. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3582-3585. 1985.)

~_..... fll5aJD.blaje y muerte de las protefnas

10 nm

Figura 5~37 Un proteosoma. En (A) se muestra un gran numero de particulas contrastadas negativamentc. En (B) sc presenta un modclo tridimcnsional de un complejo de proteosoma complelo, obtenido por procesamiento de imagenes en un ordenador. se presentan muchas copias de estas estructuras, distribuidas por toda la celula, dondc actuan como bid6n de basura para las prolefnas cclularcs no deseadas. (Micrograffas clecu6nicas por cortcsla de Wolfgang Baumeister, de I.M. Peters et al.,]. Mol. BioL 234: 1993.)

luga. de uni6n a unas cadenas laterales de lisina de proteinas /

eaOH

"Utleo hiafO\6bico globular

233

proteine citos61ica diana grupo amino E NH --- de Ie cadena 1 lateral de una lisina

T ~

complejo ubiquitina-proteina

P-P,

•

NH,

,

H,N

complejo enz;mjtico

de ubiquitinar:iOn

,

2

O.C--O-~-C

H'N~

CooH

ubiquitina

ura 5·39 DegTadad6n protelca dependlente de ublquillna. En el paso I, una protefna diana (conteniendo una senal de degradaci6n) es rcconocida por el complejo enzimatico de ubiquitinaci6n. Entonces. en el paso 2. series repetidas de reacciones bioquimicas unen molkulas de ubiquitina entre sf, produciendo una cadena de multiubiquitina. unida al gropo amino t de una cadena lateral de una lisina de la protema diana. Finalmente..en el paso 3, el proleosoma cona la protelna diana en series de pequenos fragmentos. ribosomas (as1 como los polipeptidos que acaban de ser liberados de los ribosomas) y que todavia no han adoptado su conformaci6n plegada normal. Puede demostrarse experimentalmente que este no es un problema trivial: si sc anade puromicina a las celulas -un inhibidar de la smtesis de las prolefnas-Ias proler· nas que se acaban de forma prematura son eliminadas rapidamenlc mcdiante un proceso dependiente de ubiquitina. Una posibilidad es que las protefnas formadas normalmente esten protegidas temporalmente por la maquinaria de traducci6n 0 por mohkulas de chaperones. Otra posibilidad serfa que las proleinas nacientes y acabadas de sinletizar son de hecho vulnerables a la proleolisis pero se pliegan adoptando su conformacion nativa muy rapidamenle, antes de poder ser marcadas para su deslfucci6n por proteolisis.

La vida media de una protefna puede sec detecminada

por enzimas que alteran su extremo N22 Una caracterfstica que tiene una influencia importante en la estabilidad de una protefna es la naturaleza del primer aminoacido (del extremo N) de su cadena polipeptfdica. Hay una estrecha relaci6n, denominada la regia N·terminoi entre la vida media in vivo de una protefna y la identidad de Sll aminoacido N-terminal. En lodos los organismos estudiados, desde baclcrias hasla mam[feros, existen dislintas versiones de la regia N-tenninaJ. Los aminoacidos Mel, Ser, Thr, Ala, Val. Cys, Gly y Pro, par ejemplo. protegen las protefnas en la levadura S. cerevisiaecuando se presentan en el extrema N; estos aminoacidos no son reconocidos por los componentes de marcaje del proceso de la regia N-terminal mientras que los mros 12 aminoacidos atraen un ataque proteolftico. Todavia se han de identificar la mayorfa de las protefnas que son rapidamcnle degradadas por el sistema de la regia N-Ierminal (que actua tanto en el citoplasma como en el nucleo). Sin embargo, se sabe que no es frecuente la presencia de aminoacidos desestabilizantes en el extremo N de las protefnas del citosol. pero que es habitual en las proleinas que han sido uansportadas a otros compartimienlOs. Por clio, una hipmetica funci6n del proceso de la regia N-Ierminal serra degradar las protefnas que normalmente actuan en el ER, en el complejo de Golgi 0 en otros compartimientos delimitados par membrana. pero que por alguna raWn se han quedado 0 han vuelto al cilosol. No se conace lodavia de que fonna se expenen los aminoacidos desestabilizantes en el extremo N de las proteinas acabadas de sintetizar. Como se discute 234

Cap(tulo 5: funci6n de las proteinas

~-i--o

_ _0_'

, 0 U",RA"ON A

'----'I J

UN PftOTEOSOM.A

COOH

pequeo'los pl!ptidos

inicialmente todas las prmeinas son sintetizadas con una mefonnil-mctionina en las bactcrias) en su extremo N. A menu. que es un aminoacido estabilizante en 1a regia N-tenninal, es - .lila aminopeplidasa especifica. Sin embargo. las aminopeplida..etualmente eliminan la metionina N-tenninal si y 5610 si el seida rambit!lt es un aminoacido estabilizante en la regia N-tenniconocemos las proteasas que producen substratos fisiol6gicos ta regia N-tcrminal, ni las secuencias que son reconocidas como Ilisis. -noaddos N-terminales desestabilizantes. como cl aspartato y el n reconocidos directamentc por el componente scnalizador del regia N-terminal. En lugar de clio. son modificados par la enzima "uoteina transferasa, que une 13 arginina. uno de los aminoacidos es reconodbles directamente. al extrema N de las protefnas que "\iUtato 0 glutamato como aminoacido N-terminal. Asf. la arginina ldo desestabilizante primario en la regIa N-terminal, mientras y el glutamato son aminoacidos desestabilizantes secll/ldarios. laS existcn tambicn aminoacidos desestabili7.3ntes rerciarios -Ia g1utamina- los cuales desestabilizan a traves de su Iransformar una amidasa especffica, a los aminoacidos desestabilizanles se+ ata y glutamato. se da el casu de que el aminoacido N-lerminal de una prolefna a hidr6lisis por los reactivos utilizados en los secuenciadores de protcfnas lienen un aminoacido N-lenninal modificado ("bIDmodificaci6n mas frecuente es la acetilaci6n. Se cree que esta moun papel prolegiendo las proteinas de larga vida de ser dcgrada0, experimemos recientes con mutantes de levaduras que - principales especies de acetilasas N-terminales, muestran que la ~tas protefnas no acetiladas siguen manteniendo vidas largas. Asi. a :"J-acetilaci6n de estas protefnas esta por dcscifrar.

....~ _ _nto de Sit nacimiento, ellUlI ribosoma, Imsta Sit I1Il1erte IJor proteoli:::':::::::.~"": prote{nas son aCOllllJmiadas por chaperones moleculdres y por de slipervivellcia cllya f/luciOn es "dar nUlSajes" a Sll forma. repa• •"., ~rlas. Las prote{Ims mal plegadas SOli irulucidas. en primer lugar, a r correctamente mediaute la participaci61l tk los chaperones more__,',,"'D 0 IlSp70; si esto fracasa. son acopladn.s a IIbiqllitilta y, as{, marcadas ......Uhu ell los proteosOJlms. las prote{rms estall compuesUlS por dominios modulares disaetos "" evolllcwn se han yuxtapuesto par dupliroci6n y barajado de las se-

:

rjicos para otras molkula.s, inclll}'erulo otras prote{lItu, y a memulo las protelnas se erunmblenformando grandes complejos. El prillcipio aplica de que lonna las cilula.s Illilizan las lraJlSiciollu ulosteric:as r estos complejos proteioos, por sistemas del todD 0 rmda.

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22. Varshavsky, A. The N-end rule. Cefl69:725-735, 1992...

MecanisDlOS geneticos basicos

La capacidad de las celulas de mantener un elevado grado de orden dentro de un universo caotico, depende de la informacion genetica que se expresa, se mantiene y a veces mejora, mediante los procesos geneticos basicos -la sfntesis de protefnas y del RNA, la reparaci6n del DNA, la replicaci6n del DNA y la recombinaci6n genetica. En estos procesos, que producen y mantienen las protefnas y los acidos nucleicos de una celula (Figura 6-1) la informacion de una secuencia lineal de nucleotidos se utiliza para especificar otra cadena lineal de nucleotidos (una molecula de DNA 0 de RNA) 0 una cadena lineal de aminoacidos (una molecula proteica). Por ella, los acontecimientos sobre los que se basan los procesos geneticos son unidimensionales y conceptualmente simples, en comparacion con la mayorfa de los procesos celulares, los cuales son el resultado de la informacion contenida en las complejas superficies tridimensionales de las moleculas proteicas. Quiza esta sea la razon de que entendamos mejor los mecanismas geneticos que muchos otros procesos celulares. En este capftulo examinaremos la maquinaria molecular que repara, replica yen ocasiones altera el DNA celular. Veremos que la maquinaria depende de enzimas que cortan, copian y recombinan secuencias de nucleotidos. Tambien veremos que estas y otras enzimas pueden ser parasitadas por virus, plasmidos y elementos geneticos transponibles, los cuales no solo dirigen su propia replicacion sino que tambien pueden alterar el genoma celular mediante procesos de recombinacion genetica. Sin embargo, en primer lugar reconsideraremos un topico central mencionado brevemente en el Capftulo 3 -los mecanismos de sfntesis de RNA y de protefnas.

Sintesis de RNA y de proteinas

7

replicaci6n del DNA reparaci6n del DNA recombinaci6n genetica (

DNA

3. •'

i1 IimliIIIW-5,3' transcripci6n del DNA (sintesis de RNA)

J

RNA

5' " . . " , . . " , , , , , , , . . , 13' ~TL-JL-JL-JL-JL-J codones

1

sintesis de proteinas PROTEfNA

H2N~COOH aminoacidos

Figura 6-1 Los procesos geneticos basicos. Se cree que los procesos que se muestran aqui se producen en todas las celulas actuales. Probablemente, sin embargo, en etapas muy tempranas de la evoluci6n de la vida existieron celulas mas sencillas que no tenian ni DNA ni proteinas (vease Figura 1-11). N6tese c6mo una secuencia de tres nucle6tidos (un cod6n) de una molecula de RNA codifica un aminoacido determinado de una proteina.

Las protefnas constituyen mas de la mitad de la masa seca total de una celula, y su sintesis es de importancia capital para el mantenimiento, crecimiento y desarrollo de la celula. Se produce en los ribosomas. Depende de la colaboracion entre diversos tipos de moleculas de RNA y empieza con una serie de etapas preparatorias. Primero, sobre el DNA que codifica la protefna que se va a sintetizar, se ha de copiar una molecula de RNA mensajero (mRNA). Mientras tanto, en el citoplasma, cada uno de los 20 aminoacidos a partir de los cuales se construira la protefna, se han de unir a su molecula especffica de RNA de transferencia (tRNA), y las subunidades del ribosoma sobre el cual se va a generar la nueva protefna, 237

se han de volver a cargar con factores proteicos auxiliares. La sfntesis de protefnas comienza cuando todos estos componentes se encuentran en el citoplasma y forman un ribosoma funcional. Cuando una molecula de mRNA se desplaza progresivamente a traves de cada ribosoma, la secuencia de nucleotidos de la molecula de mRNA es traducida a la secuencia de aminoacidos correspondiente, produciendo una cadena proteica determinada, especificada por la secuencia de DNA de su gen. Empezaremos por considerar como se sintetizan en la celula las diferentes moleculas de RNA.

La RNA polimerasa copia el DNA a RNA: el proceso de la transcripci6n del DNA! El RNA se sintetiza sobre un molde de DNA, a traves de un proceso conocido como transcripci6n del DNA. La transcripcion genera los mRNA que transportan la informacion para la sfntesis de las protefnas, los RNA de transferencia, los RNA ribosomales y otros tipos de moleculas de RNA con propiedades estructurales y catalfticas. Estas moleculas de RNA son sintetizadas por enzimas RNA polimerasa, que generan una copia de RNA de una secuencia de DNA. En celulas eucariotas tres tipos de moleculas de RNA polimerasa sintetizan diferentes tipos de RNA,

Figura 6- 2 Sintesis de una moh~cula de RNA por la RNA polimerasa. La

RNA polimer·asa

5'

3'

3'

5'

HELICE DE DNA ABRIENDOSE

lugar de inicio de la transcripcion

5'

3'

3'

5'

INICIACION DE UNA CADENA DE RNA POR UNION DE LOS DOS PRIMEROS RIBONUCLEOSIDOS TRIFOSFATO 5'

3'

3'

5'

ELONGACION DE LA CADENA DE RNA EN DIRECCION 5' A 3'. POR LA ADICION DE RIBONUCLEOSIDOS TRIFOSFATO 5'

3'

3'

5' desplazamiento _ - - - - - ' ' continuo de la cadena de RNA y nueva formacion de la helice de DNA

corta region de helice de DNA/RNA

5' 3'

3'

5' ERMINACION Y L1BERACION DE LA POLIMERASA Y DE LA CADENA DE RNA ACABADA }

238

Capftulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

5':;;;

enzima se une ala secuencia promotor del DNA e inicia la sfntesis a partir de esta senal promotor. Completa la sfntesis hasta la senal de terminaci6n. Tras ello, la polimerasa y la cadena completa de RNA se liberan. Durante la elongaci6n de la cadena de RNA,la polimerizaci6n alcanza una velocidad de 30 nude6tidos par segundo a 37°C. Por consiguiente, una cadena de RNA de 5000 nucle6tidos tarda unos tres minutos en sintetizarse.

cadena patron de DNA

Reacciones de elongacion de la cadena, catalizada por una enzima RNA polimerasa. En cada paso, se seleeciona un nuevo ribonucleosido trifosfato en hase a su capacidad de formar pares de bases con la cadena de DNA expuesta, que actlia como molde 0 patron; entonees, un ribonucleosido monofosfato se agrega al extremo 3'-OH de la cadena de RNA en crecimiento (flecha de color rojo) y se libera un pirofosfato (dtomos dibujados en ro;o). Asi la nueva cadena de RNA crece nucleotido a nucleotido, en direccion 5' -a-3', y su secuencia es complementaria a la de la cadena patron de DNA. La reaccion esta impulsada tanto por la variacion favorable de energia libre que acompafia la liberacion del pirofosfato, como par la subsiguiente hidrolisis del pirofosfato hasta fosfato inorganico (vease Figura 2-30).

3'

cadena de RNA en crecimiento

I

5'

oI

-o-p=o

e,-------.'IIIIIIIIIL...--_-----'

I

oI

H2C

oI

OH

-o-p=o I

BASE

oI

H2 C

3'

oII

0

II

~

OH

OH

\.)(

-0-P-0-P-0-P-0-CH 2 I

I

I

0_

0_

0_ OH

OH

ribonucleosido trifosfato entrante

direccion 5' a 3' del. crecimiento de la cadena

5'

como se describe en el Capitulo 8. Se cree que estas RNA polimerasas han derivado durante la evolucion de una unica enzima presente en las bacterias, que media toda la sintesis de RNA bacteriano. La RNA polimerasa bacteriana es una gran enzima formada por multiples subunidades, asociada con varias subunidades proteicas adicionales que entran y salen del complejo DNA-polimerasa en diferentes momentos de la transcripcion. Moltkulas libres de RNA polimerasa colisionan aleatoriamente con el cromosoma bacteriano, uniendose muy debilmente a la mayor parte del DNA. Sin embargo, la polimerasa se une muy fuertemente cuando entra en contacto con una secuencia especffica de DNA, Hamada el promotor, que contiene ellugar de iniciaci6n para la sintesis del RNA, y sefiala ellugar en el que debe iniciarse la sintesis del RNA. Las reacciones que se producen a continuacion se sefialan en la Figura 6-2. Despues de unirse al promotor, la RNA polimerasa abre una region localizada de la doble helice, de forma que expone los nucleotidos de ambas cadenas de una pequefia zona de DNA. Una de las dos cadenas expuestas del DNA actua como patron para el apareamiento de bases complementarias con monomeros de ribonucleosido trifosfato entrantes, dos de los cuales son unidos entre si por la polimerasa y se inicia una cadena de RNA. Entonces, la molecula de polimerasa se mueve progresivamente a 10 largo del DNA, desenroHando la helice de DNA 10 necesario para exponer una nueva region de la cadena patron para el apareamiento de bases. De esta forma, la cadena de RNA va creciendo nucleotido a nucleotido en direccion 5' -a-3' (Figura 6-3). El proceso de elongacion de la cadena continua hasta que la enzima encuentra una segunda secuencia especial Sfntesis de RNA y de protefnas

239

(A) SENAL DE INICIO

-35

I

-10

+1

I

J

I

5' - T A G T G T A III j[J IliT GAT A G A A G C ACT C T A clllIIlllllllllll C T C A A TAG G T C C A C G 3' A T C A CAT A ACT G T ACT A T C T T C G T GAG AT GAT A T A A GAG T TAT C C A G G T G C -

I

1 5'.

lugar de inicio

cadena patron de DNA

!

3' DNA 5'

TRANSCRIPCI6N

3'

RNA

(8) SENAL DE TERMINACI6N

5' -

3' -

C C C A C T T C C G [fl/llllfl!llillJf'/!iffl!1"ff4 AWfI!//I$fIJI!iIi'f; A ACT T T C T T T A A T G A G G G T G T C G G C G G T C A A G G C G A C C G C C G T A A A AT T G A A A G A A AT T ACT -

1

cadena patron de DNA/ 5' -

TRANSCRIPCI6N

C C C A C A G C C G C C A G U lie:: C; C U G G C G G C

-OH 3'

1

transcrito de RNA

PLEGADO RAplDO DEL RNA

UCc U

G

GIIIIII C A 111111 U CIIIIII G CIIIIII G GIIIIIIC CIIIIII G CIIIIIIG GIIIIII C A

cadena de RNA plegada colabora en la terminacion de la cadena

/\

li

5 ' - CCCAC

-OH 3'

del DNA, la senal de stop (terminaci6n), en cuyo momento la polimerasa se para, liberandose tanto del DNA patron como de la cadena de RNA recien formada. Por convenio, cuando se habla de una secuencia de DNA asociada a un gen, se trata de la secuencia que no es la patron y se escribe en direccion 5' a 3'. Este convenio se ha adoptado ya que la secuencia que no es la patron corresponde a la secuencia del RNA que se fabrica. En la Figura 6-4 se presentan las secuencias de nucleotidos que actuan como lugares de inicio y de terminacion para la RNA polimerasa bacteriana. Las secuencias de nucleotidos encontradas en muchos ejemplos de un tipo particular de region de DNA (como un promotor) se denominan secuencias consenso. En las bacterias, los promotores fuertes (los que estan asociados a genes que producen

lugar de entrada del ribonucleosido trifosfato cadena de RNA desplazada

3' 5'

lugar que vuelve a enrollar

lugar que desenrolla

corta region de helice RNA/DNA

240

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

3'

5'

Jigura 0-4 Senalesdeinicioyde tenninaci6n para la sfntesis de RNA por una RNA pollinerasa bacteriana. Aqui la cadena inferior de DNA es la cadena patron y la secuencia de la cadena superior corresponde a la del RNA que se sintetiza (notese la substituci6n de U del RNAporT en eIDNA). (A) Lapolimerasa empieza a transcribir en ellugar de inicio. Dos cortas secuencias (sombreadas en verde) situadas a entre -35 y -10 nucleotidos del inicio, determinan d6nde se ha de unir la polimerasa; relativamente cercanas a ellas, dos secuencias de hexanucle6tidos, espaciadas adecuadamente una de otra, especifican el promotor de la mayona de genes de E. coli. (B) Una senal de terrninaci6n (stop). La RNA polimerasa de E. coli se para cuando sintetiza varias U consecutivas (sombreadas en azul) a partir de una serle complementaria de varias A consecutivas de la cadena patron siempre que haya acabado de sintetizar una secuencia de nucleotidos de RNA autocomplementaria (sombreada en verde), la cual nipidamente formara una helice en horquilla que es crucial para parar la transcripcion. La secuencia de nucleotidos de la regi6n autocomplementaria puede ser muy variable. Figum 0-5 DesenroUarniento ynuevo enroUarniento del DNA por la RNA pollinerasa. A medida que la molecula de RNA polimerasa avanza, va desenrollando continuamente la doble helice de DNA por delante dellugar donde se produce la polimerizacion y volviendo a enrollar las dos cadenas de DNA por detras de este lugar, desplazando la cadena de RNA acabada de formar. Sin embargo, de forma transitorla se forma una corta region de helice RNA-DNA y el RNA final se libera como una molecula de una sola cadena, copia de una de las dos cadenas del DNA

grandes cantidades de mRNA) tienen secuencias que se aparean fuertemente con las secuencias promotoras consenso (como en la Figura 6-4A) mientras que los promotores debiles (los que estan asociados con genes que producen cantidades relativamente pequenas de mRNA) se aparean peor con estas secuencias. 3',

8610 se utilizan zonas seleccionadas de un cromosoma para producir moIeculas de RNA2 A medida que una molecula de RNA polimerasa se va desplazando a 10 largo del DNA, en ellugar activo de la enzima se va formando una doble helice RNA-DNA. Esta helice es muy corta ya que, en cuanto la polimerasa ha acabado de pasar, se vuelve a formar la doble helice DNA-DNA que desplaza la cadena de RNA recien formada (Figura 6-5). Como resultado de todo ello, cada cadena completa de RNA se libera del patron de DNA como una molecula libre de una sola cadena, y de una longitud aproximada de entre 70 y 10 000 nucleotidos. En principio, cualquier region de la doble Mlice del DNA podria ser copiada ados moleculas de RNA diferentes -una copia de cada una de las dos cadenas del DNA. Sin embargo, en cada region del DNA unicamente una de las dos cadenas se utiliza como patron. La cadena de RNA formada tiene una secuencia de nucleotidos equivalente a la de la otra cadena no utilizada como patron. La cadena que sera copiada varia a 10 largo de cada molecula de DNA, y en cada gen viene determinada por el promotor. Como se ilustra en la Figura 6-4 un promotor es una secuencia de DNA orientada que situa a la RNA polimerasa en una u otra direccion y esta orientacion determina cual de las dos cadenas de DNA sera copiada (Figura 6-6). En genes vecinos la cadena de DNA que sera copiada a RNA puede ser diferente 0 la misma (Figura 6-7). Tanto la RNA polimerasa bacteriana como las RNA polimerasas de eucariotas son unas moleculas complicadas, formadas por multiples subunidades y una masa total de mas de 500 000 daltons. Sin embargo, algunos virus bacterianos codifican RNA polimerasas de una sola cadena, de una quinta parte de esta masa y que catalizan la sintesis de RNA como minima tan bien como la enzima de la celula huesped. Posiblemente la presencia de multiples subunidades es importante desde el punto de vista de la regulacion de la sintesis de RNA, que todavia no se ha definido completamente. En este breve esquema de la transcripcion del DNA hemos omitido muchos detalles: en muchos casos han de ocurrir otros procesos complejos antes de que se pueda producir una molecula de mRNA. Por ejemplo, las proteinas reguladoras de la expresi6n genica colaboran en la determinacion de las regiones del DNA que seran transcritas por la RNA polimerasa, desempenando asi un papel importante en cuanto a determinar que proteinas seran sintetizadas por una celulao Ademas, aunque en los procariotas las moleculas de mRNA se sintetizan directamente por transcripcion del DNA, en las celulas eucariotas superiores la mayoria de transcritos de RNA son considerablemente alterados -mediante un proceso denominado maduraci6n par corte y empalme (splicing) del RNA- antes de abandonar al nucleo celular y entrar en el citoplasma como moleculas de mRNA. Todos estos aspectos de la produccion de mRNA seran estudiados con detalle en los Capitulos 8 y 9, donde consideramos el nucleo celular y el control de la expresion genica, respectivamente. Ahora supongamos que una celula ha

.... 11==

5'

\

gen a

II

3'

transcritos de RNA

cromosoma de E. coli

gen b

I

~

gen c

,oo£boo ,

I 5000 pares de nucle6tidos

Sfntesis de RNA y de protefnas

.

1= gen f

~

cccccccccccccc

3'

~II II gen 9

5'

I

5'-==========; \ 3'1I!!I GGGGGGGGGGGGGG

doble helice de DNA

\

Figura 6-6 La orientaci6n de la RNA polimerasa determina cuaJ. de las dos cadenas de DNA actuara de patr6n. Puesto que la cadena de DNA que actua como patron ha de ser recorrida desde su extremo 3' hasta el extremo 5' (vease Figura 6-3), la direccion en la que se desplace la RNA polimerasa determinani, como se indica en este diagrama, cua! de las dos cadenas de DNA sera utilizada.como patron para la sfntesis de RNA. A su vez, la direcci6n del movimiento de la RNA polimerasa viene determinada por la orientaci6n de la secuencia promotor a la que la RNA polimerasa se une inicialmente.

Figura 6-7 Direcciones de transcripci6n a 10 largo de una corta porci6n de un cromosoma bacteriano. N6tese c6mo algunos genes son transcritos a partir de una cadena de DNA mientras que otros 10 son a partir de la otra cadena de DNA. En la figura se muestra aproximadamente el 0,2% del cromosoma de E. coli. (Adaptado de D.L. Daniels et aI., Science 257: 771777,1992.)

241

producido moleculas funcionales de mRNA y procedamos a estudiar como estas moIeculas dirigen la sfntesis de protefnas.

Las moIeculas de RNA de transferencia actuan como adaptadores que traducen secuencias de nucle6tidos a secuencias de proteina3 Todas las celulas contienen un conjunto de moleculas de RNA de transferencia (tRNA), cada una de la cuales es una pequefia molecula de RNA (la mayorfa de elIas tienen una longitud de entre 70 y 90 nucleotidos). Los tRNA se unen por uno de sus extremos a un codon especffico de la moIecula de mRNA y por el otro aI aminmicido especffico para este codon, y de esta forma permiten que los aminoacidos se alineen de acuerdo con la secuencia de nucleotidos del mRNA. Cada tRNA esta disefiado para transportar uno solo de los 20 aminoacidos que se utiIizan para la sfntesis de protefnas: un tRNA que transporta glicina se denomina tRNAGLY, y asf sucesivamente. Cada uno de los 20 aminoacidos tiene, como mfnimo, un tipo de tRNA asignado, mientras que la mayona de aminoacidos disponen de varios tipos de tRNA. Antes de que un aminoacido se incorpore a una cadena proteica, se une por su extrema carboxilo al extrema 3' de una molecula apropiada de tRNA. Esta union cumple dos funciones. La primera y mas importante, unir covalentemente cada aminoacido con un tRNA que presenta un anticod6n adecuado -el anticodon es la secuencia de tres nucleotidos complementaria del codon de tres nucleotidos de la secuencia de mRNA, especffica de este aminoacido. El apareamiento codon-anticodon permite que cada aminoacido se coloque en una cadena de protefna en crecimiento de acuerdo con 10 que se establezca en la secuencia de nucleotidos del mRNA, consiguiendo asf que el codigo genetico se utilice para traducir la secuencia de nucleotidos a secuencia proteica. Esta es la funcion "adaptadora" esencial de la molecula de tRNA: con uno de sus extremos unido a un aminoacido y el otro apareado con un codon, el tRNA convierte secuencias de nucleotidos en secuencia de aminoacidos. La segunda funcion de la union del aminoacido consiste en activar el aminoacido, generando en su extrema carboxflico una union rica en energfa, de forma que pueda reaccionar con el gropo amino del aminoacido siguiente en la secuencia formando un enlace peptidico. El proceso de activacion es necesario para la sfntesis proteica ya que los aminoacidos no activados no se pueden afiadir directamente a la cadena polipeptidica en crecimiento. (Por el contrario, el proceso reverso, en el cual se hidroliza un enlace peptidico por la adicion de una molecula de agua es energeticamente favorable y puede ocurrir espontaneamente.) La funcion de una molecula de tRNA depende de su estructura tridimensional, que se halla plegada de forma muy precisa. Algunos tRNA se han cristalizado y por anaIisis de difraccion de rayos X se ha podido determinar su estructura

el aminoacido se une aqui

OH extreme 3'

extreme 5'

asaT

nucle6tidos modificados

l-----.J

anticod6n

Figura 6-8 La estructura en "hoja de trebol" del tRNA. Se trata de una visi6n de la molecula mostrada en la Figura 6-9, despues de desplegarla parcialmente. Existen muchas moleculas diferentes de tRNA, incluyendo como minima una por cada aminoacido diferente. A pesar de que estas diferentes moleculas de tRNA se diferencian en su secuencia de nucle6tidos, todas presentan los tres tallos acabados en asa y un brazo aceptor de un aminoacido. La molecula de tRNA de la figura transporta fenilalanina (Phe), por 10 que se denomina tRNAPhe. En todas las moltkulas de tRNA el aminmicido se une al residuo A de la secuencia CCA del extrema 3' de la molecula. En barras rojas se presentan apareamientos de bases complementarias.

Figura 6-9 La estructura plegada de una molecula de tRNA tipica. Dos visiones de la conformaci6n tridimensional de la molecula, determinada por difracci6n de rayos X N6tese que la moIecula tiene forma de L, con uno de sus extremos adaptado para aceptar el aminoacido, yel otro extrema contiene los tres nucle6tidos del anticod6n. Cada asa esta coloreada de acuerdo con la Figura 6-8.

242

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

H£N~O/H

o

~

H H

S

/H N

H

adici6n a U de dos hidr6genos (dihidro U)

adici6n a G de dos grupos metilo IN, N-dimetil G)

I

N~O

H

adici6n a A de un grupo isopentenil (N'-isopentenil A)

tridimensional completa. Para plegar una molecula de tRNA se requiere tanto el apareamiento de bases complementarias como interacciones poco habituales entre bases (vease Figura 3-18). Las secuencias de nucleotidos de las moleculas de tRNA de muchos organismos diferentes revelan que las moleculas de tRNA pueden formar los bucles y las zonas de bases apareadas necesarias para formar una estructura de "cruce de carreteras en forma de trebol" (Figura 6-8), y que posteriormente esta estructura se pliega adoptando la conformacion en forma de L detectada en los amilisis cristalograficos. En la estructura nativa, el aminoacido se une a un extremo de la "L" mientras que el anticodon se localiza en el otro extrema (Figura 6-9). Los nucleotidos que forman parte de una cadena de acidos nucleicos completa (tal y como ocurre con los aminoacidos de las protefnas), pueden ser modificados covalentemente, modificandose asf la actividad biologica de la molecula de acido nucleico. Modificaciones post-transcripcionales de este tipo son especialmente comunes en las moleculas de tRNA, las cuales presentan muchos nucleotidos diferentes modificados (Figura 6-10). Algunas de estas modificaciones de los nucleotidos afectan a la conformacion y apareamiento de bases del anticodon, facilitando el reconocimiento del codon del mRNA apropiado por la molecula de tRNA.

Unas determinadas enzimas acoplan cada aminmicido con su molecula apropiada de tRNA4 Es la molecula de tRNA, y no el aminoacido que esta lleva unido, la que determina ellugar en el que sera afiadido el aminoacido durante la sfntesis de protefnas. Esto fue establecido a traves de un ingenioso experimento en el cual un aminoacido (la cistefna) fue transformado qufmicamente en otro aminoacido diferente

R I

H 2 N-C

I H

-c

OH

.p-0 aminoacido

"OH tRNA

R I .p-0 H 2 N-C-C,-

~

.

~8denina

aminoacido adenilado

AMP

Sfntesis de RNA y de protefnas

R

I

H N-C-C.p2

~,adeftina

N

I

H

"

0 0

substituci6n de un oxfgeno de U por un sulfuro (4-tiouridina)

Figura 6-10 Algunos de los nucle6tidos poco usuales encontrados en las moleculas de tRNA. Estos nucle6tidos se producen por modificaci6n covalente de nucle6tidos normales, despues de haberse incorporado a la cadena de RNA. En la mayoria de las moleculas de tRNA, a1rededor del 10% de los nucle6tidos estilll modificados (vease Figura 6-8).

Figura 6-11 Activaci6n de los aminOlicidos. Las dos etapas del proceso a traves del que se activa un aminoacido (cuya cadena lateral aqui se indica como R) para la sintesis de proteina, mediante una enzima aminoacil-tRNA sintetasa. Como se indica, se utiliza la energia de hidr6lisis del ATP para unir, mediante un enlace de alta energia, cada aminoacido a su molecula de tRNA. En primer lugar el aminoacido se activa mediante la uni6n de su grupo carboxilo a un AMP, formando una aminodcido adenilado; la formaci6n del enlace con el AMP, que normalmente es una reacci6n desvaforable, esta favorecida pOI la hidr6lisis de la molecula de ATP que cede el AMP. Sin abandonar la enzima sintetasa, el grupo carboxilo unido aI AMP es transferido a un grupo hidroxilo del azucar del extrema 3' de la molecula de tRNA. Esta transferencia une el aminoacido, mediante un enlace ester activado, aI tRNA formando la molecula final de aminoacil-tRNA. La enzima sintetasa no se muestra en la figura.

243

(A)

(B)

aminoacil tRNA

,--I I I I

I I

L

0

~

/

0

T

H-T-R NH z

I I I

o~

/

C

I

H-C-R

I

NH z

aminoacido

Figura 6-12 Estructura del enlace aminoacil-tRNA. El extremo carboxilo del aminoacido forma un enlace ester con la ribosa. Como la hidrolisis de este enlace ester esta asociada con una variacion de energia libre muy favorable, se dice que un aminoacido unido de esta forma esta activado. (A) Esquema de la estructura. (B) Estructura real correspondiente a la region recuadrada de (A). Como en la Figura 6-11, el "grupo R" del aminoacido indica una de las 20 cadenas laterales posibles (vease Panel 2-5, pags. 58 y 59).

(la alanina), y posteriormente fue unido al tRNA especifico de la cisteina. Cuando estas moIeculas de tRNA "hfbridas" se utilizaron para la sintesis de proteinas en un sistema libre de celulas, en cada uno de los puntos en los que se utilizo este tRNA se inserto el aminmicido incorrecto. Asi pues, la fidelidad del proceso de sintesis de proteinas depende de la fidelidad del mecanismo que normalmente une especificamente cada uno de los aminoacidos activados con sus moIeculas de tRNA correspondientes. iDe que manera una molecula de tRNA acaba unida covalentemente a uno de los 20 aminoacidos que precisamente es su pareja apropiada? El mecanismo depende de la actividad de las enzimas denominadas aminoacil-tRNA sintetasas, que acoplan cada aminoacido a su grupo de moleculas de tRNA apropiadas. Existe una enzima sintetasa diferente para cada aminoacido (20 sintetasas en total): una de ellas une glicina a todas las moleculas tRNAGly, otra une alanina a todas las moIeculas tRNAAla, y asi sucesivamente. La reaccion de acoplamiento que genera una molecula de amionacil-tRNA esta catalizada en dos etapas, tal como ilustra la Figura 6-11. En la Figura 6-12 se muestra la estructura del enlace aminoacido-RNA. A pesar de que las moleculas de tRNA actuan como el adaptador final en la etapa de transformacion de la secuencia de nucleotidos a secuencia de aminoacidos, las enzimas aminoacil-tRNA sintetasas son adaptadores de la misma importancia para el proceso de decodificacion (Figura 6-13). Asi, el codigo genetico es traducido por medio de dos conjuntos de adaptadores que actuan secuencialmente, cada uno de los cuales empareja una superficie molecular a otra con una gran especificidad; su accion combinada asocia cada secuencia de tres nucleotidos de la molecuIa de mRNA -cada codon- con su aminoacido determinado (Figura 6-14).

Los aminoacidos se van afiadiendo al extremo carboxilo terminal de una cadena polipeptidica en crecimiento La reaccion fundamental de la sintesis proteica es la formacion de un enlace peptidico entre el grupo carboxilo del extremo de una cadena polipeptfdica en crecimiento y el grupo amino libre de un aminoacido. Por consiguiente, una cadena proteica se sintetiza paso a paso desde su extrema amino terminal hasta su extremo carboxilo terminal. A 10 largo de todo el proceso, el extremo carboxilo de la cadena polipeptidica permanece activado por su union covalente a una moIecula de tRNA (una molecula de peptidil-tRNA). Este enlace covalente rico en energia se rompe en cada ciclo de reacciones, pero inmediatamente es substituido por otro enlace identico con el aminoacido que se acaba de afiadir a la cadena (Figura 6-15). Asi, cada aminoacido que es afiadido lleva consigo la energia de activacion necesaria, no para su propia adicion a la cadena sino para la del siguiente aminoacido -10 cual constituye un ejemplo de un tipo de polimerizacion "por la cabeza" descrito en el Capitulo 2 (Figura 2-36). 244

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

Figura 6-13 Reconocimiento de una molecula de tRNA por su aminoaciltRNA sintetasa. Para este tRNA (tRNAGln), la presencia de determinados nucleotidos tanto del anticodon (en La parte inferior) como del prazo del tRNA que acepta el aminoacido permiten que el tRNA sea reconocido especificamente por la sintetasa (azul). (Por cortesia de Tom Steitz.)

aminoacido (tript6fano)

tRNA especffico del tript6fano (tRNATrP)

uni6n del tript6fano al tRNATrp

el tRNATrp se une al cod6n UGG

RESULTADO NETO: EL TRIPT6FANO ES SELECCIONADO POR SU COD6N

5'

3' mRNA

El c6digo genetico es degenerado 5 En el transcurso de la sfntesis de protefnas, la maquinaria de la traducci6n se desplaza en direcci6n 5'-a-3' a 10 largo de una molecula de mRNA, y lee la secuencia de nucle6tidos de este mRNA de tres en tres. Como hemos visto, cada aminmicido esta especificado por un triplete de nucle6tidos (cod6n) de la molecula de mRNA que se aparea con una secuencia de tres nucle6tidos complementaria, del extremo anticod6n de una molecula de tRNA determinada. Puesto que tan s610 uno de las muchos tipos de moleculas de tRNA de una celula puede aparearse con cada cod6n, el cod6n determina el residuo de aminoacido especffico que sera afiadido al extremo de la cadena polipeptfdica en crecimiento (Figura 6-16). El RNA esta compuesto por cuatro tipos de nucle6tidos, por 10 que existen 64 posibles secuencias diferentes de tres nucle6tidos (4 x 4 x 4), y la mayorfa de ellas se presentan en alglin lugar de la secuencia de la mayorfa de las moleculas de tRNA. Tres de estas 64 secuencias no codifican ninglin aminoacido sino que determinan el final de una cadena polipeptfdica; reciben el nombre de codones

Figura 6-14 El c6digo genetlco se traduce por medio de dos "adaptadores" asociados secuencialmente. EI primer adaptador es la enzima aminoacil-tRNA sintetasa, que acopla un aminoacido determinado a su tRNA correspondiente; el segundo adaptador es la moIecula de tRNA cuyo anticod6n se une a la secuencia de nucIe6tidos apropiada (cod6n) del mRNA. Un error en cualquiera de estos dos procesos hara que el aminoacido que se incorpora a la protefna sea err6neo.

H 0

H 0 I II

---.,......---1~

H2 N-C-C I R1

H 2 N-

I

II

-C

T R]

o

H H 0

I

I

II

N-C-C-N I R3

I H

-C

,f

Oft peptidil tRNA unido al extremo carboxilo de la cadena polipeptfdica en crecimiento

molecula de tRNA Iiberada de su uni6n al peptido

Figura 6-15 Incorporaci6n de un aminoacido a una prote{na. Una cadena polipeptfdica crece por la adici6n progresiva de aminoacidos a su extrema carboxilo terminal. La formaci6n de cada enlace peptfdico es energeticamente favorable debido a que el carboxilo terminal de la cadena en crecimiento ha sido activado mediante su uni6n covalente a una molecula de tRNA. La uni6n peptidil-tRNA que activa el extrema en crecimiento se regenera en cada cicIo. Las cadenas laterales de los aminoacidos se han abreviado como R], R2 , R3 Y R4 • Como referencia, todos los atomos del segundo aminoacido de la cadena polipeptfdica estan sombreados en gris.

Sintesis de RNA y de prote{nas

nueva molecula de tRNA unida al extremo carboxilo de la cadena polipeptfdica en crecimiento

245

Figura ll-I (; Decodificaci6n de una molecula de mRNA. Cada aminmicido que es aftadido al extrema en crecimiento de una cadena polipeptfdica, es seleccionado mediante el apareamiento de bases complementarias entre el anticod6n de la molecula de tRNA que 10 transporta y el cod6n siguiente.de la cadena de mRNA.

cadena polipeptfdica en crecimiento

de terminaci6n (stop codonsJ. Por 10 tanto, quedan 61 codones para especificar unicamente 20 aminmicidos diferentes. Por esta raz6n, la mayoria de los aminoacidos estan representados por mas de un cod6n (Figura 6-17) por 10 que se dice que el c6digo genetico es degenerado. Dos aminoacidos, metionina y tript6fano, tan s610 tienen un cod6n cada uno. Estos aminoacidos son los menos abundantes de las proteinas. La degeneraci6n del c6digo genetico implica 0 que existe mas de un tRNA para cada aminoacido 0 que una misma molecula de tRNA puede aparearse con mas de un cod6n. De hecho se producen ambas cosas. Para algunos aminoacidos existe mas de una molecula de tRNA, y algunas moIeculas de tRNA estan construidas de tal manera que unicamente exigen un apareamiento exacto de las dos primeras posiciones del cod6n, de forma que pueden tolerar un adaptaci6n defectuosa (0 balanceo) en la tercera. Este balanceo en el apareamiento de bases explica por que muchos de los codones alternativos para un mismo aminmicido se diferencian entre ellos unicamente en el tercer nucle6tido (vease Figura 6-17). El balanceD estandar de pares de bases hace posible acomodar los 20 aminoacidos a 61 codones con tan s610 31 moleculas diferentes de tRNA; en una mitocondria animal, un "balanceo" mayor permite que se produzca sintesis de proteinas con tan s610 22 moIeculas diferentes de tRNA (vease Capitulo 14).

50Illliiliiiiil_...........iAI!~

aminoacil tRNA

2

III

/

•••

Los acontecimientos de la sfntesis proteica estan catalizados sobre el ribosoma6 Las reacciones de la sintesis de proteinas que acabamos de describir necesitan que una compleja maquinaria catalitica las guie. Por ejemplo, el extrema de la cadena polipeptfdica por el que se produce el crecimiento debe mantenerse alineado con la moIecula de mRNA para asegurar que cada cod6n sucesivo del mRNA encaje de forma precisa con el anticod6n de una molecula de tRNA, y no se salte un nucle6tido, ya que ello cambiaria la pauta de lectura (vease Figura 317). Este y todos los demas acontecimientos de la sintesis de proteinas estan catalizados por los ribosomas, que son grandes complejos de moleculas de RNA y de proteina. Los ribosomas de procariotas son muy similares a los de eucariotas en cuanto a disefio y funci6n. Cada uno de ellos esta compuesto por una subunidad pequefia y una subunidad grande, que se mantienen juntas formando un complejo de una masa de varios millones de daltons (Figura 6-18). La subunidad pequefia se une al mRNA y a las moleculas de tRNA, mientras que la subunidad grande cataliza la formaci6n de los enlaces peptidicos. Mas de la mitad del peso de un ribosoma es RNA, y cada dia es mas evidente que el RNA ribos6mico (rRNA) desempefia un papel central en las actividades cataliticas del ribosoma. A pesar de que la moIecula de rRNA de la subunidad pequefia del ribosoma tiene un tamafio variable en funci6n del organismo de que se trate, su complicado plegamiento esta muy conservado (Figura 6-19); tambien existen claras homologias entre las moleculas de rRNA de las subunidaAGA AGG GCA CGA GCC CGC GCG CGG GCU CGU

GAC GAU

AAC AAU

UGC UGU

GAA GAG

Ala

Arg

Asp

Asn

Cys

A

R

D

N

C

246

CAA CAG

GGA GGC GGG GGU

CAC CAU

Glu

Gin

Gly

His

E

Q

G

H

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

UUA UUG CUA AUA CUC AUC CUG AAA AUU CUU AAG lie

Figura 6-17 El c6digo genetico. Debajo de la abreviatura de tres letras de cada aminoacido, se presenta la abreviatura estandar de una letra. Los codones estcin escritos con el nucle6tido 5' terminal a la izquieItla. Observese que la mayona de los aminoacidos estan representados por mas de un codon y que normalmente la variaci6n reside en el tercer nucle6tido (vease tambien Figura 3-16).

AUG

UUC UUU

CCA CCC CCG CCU

AGC AGU UCA UCC UCG UCU

ACA ACC ACG ACU

UGG

UAC UAU

GUA GUC GUG GUU

UAA UAG UGA stop

Leu

Lys

Met

Phe

Pro

Ser

Thr

Trp

Tyr

Val

L

K

M

F

P

S

T

W

y

V

subunidad pequeiia

T

-

+

subunidad grande

25 nm

1 ribosoma

Figura 6-18 mribosoma. Modelo tridimensional del ribosoma bacteriano visto desde dos angulos diferentes. En esta estructura se han determinado las posiciones de muchas protefnas ribosomales mediante microscopia electr6nica, tanto para visualizar las posiciones en las que se unen anticuerpos especfficos como para medir la emisi6n de neutrones de ribosomas que contienen una 0 varias protefnas deuteradas. (A partir de JA. Lake, Ann. Rev. Biochem. 54:507530, 1985. © 1985 por Annual Reviews Inc.)

des grandes de los ribosomas de diferentes organismos. Los ribosomas contienen un elevado mlmero de proteinas (Figura 6-20), pero muchas de elIas tienen una secuencia muy poco conservada durante la evolucion, e incIuso un mlmero sorprendente de elIas no parecen ser esenciales para la funcion del ribosoma. Sin embargo se ha sugerido que las proteinas ribosomales incrementan la funcion de los rRNA y que son las moleculas de RNA y no las moIeculas de proteina del ribosoma las que catalizan la mayona de las reacciones del ribosoma.

EI ribosoma se desplaza, paso a paso, a 10 largo de la cadena de mRNA7

Figura 6-19 EstnIctura del rRNA en la subunidad pequefia. Este modelo del rRNA 16S de E. coli es indicativo del complejo plegamiento que esta en la base de las actividades cataliticas de los RNA del ribosoma. La moIecula de rRNA 16S contiene 1540 nucle6tidos, yesta plegada en tres dominios: e15' (azul), el central (raja) y e13' (verde). (Adaptado de S. Stem, B. Weiser y H.P. Noller, ]. Mol. Bioi. 204:447-481, 1988)

Un ribosoma contiene tres lugares de union para moleculas de RNA: uno para mRNA y dos para tRNA. Un lugar, lIamado ellugar de uni6n peptidil-tRNA 0 Iugar P acoge ala moIecula de tRNA que esta unida al extrema de la cadena polipeptidica en crecimiento. Otro lugar, lIamado Iugar de uni6n aminoacil-tRNA 0 Iugar A acoge a la molecula de tRNA entrante cargada con un aminoacido. Para que una molecula de tRNA se una fuertemente a cualquiera de estos dos lugares es necesario que su anticodon forme los pares de bases adecuados con el codon complementario de la moIecula de mRNA que esta unida al ribosoma. Los lugares Ay P estan tan cerca el uno del otro que las dos moIeculas de tRNA se yen forzadas a aparearse con codones adyacentes de la molecula de mRNA (Figura 6-21). EI proceso de elongacion de la cadena polipeptidica sobre un ribosoma se puede considerar como un cicIo de tres etapas discretas (Figura 6-22): 1. En la etapa 1, una molecula de aminoacil-tRNA queda unida allugar A va-

cante del ribosoma (adyacente allugar P, que esta ocupado) mediante la formacion de pares de bases con los tres nucIeotidos del mRNA (codon) que estan expuestos en ellugar A. 2. En la etapa 2, el extremo carboxilo de la cadena polipeptidica se desacopla de la moIecula de tRNA dellugar P y se une a traves de un enlace peptidico al aminoacido que se halla unido a la molecula de tRNA que se halla en el lugar A. Esta reaccion central de la sintesis de proteinas (vease Figura 6-15) esta catalizada por una enzima peptidil transferasa. Recientes experimentos de sintesis proteica con ribosomas han demostrado que esta catalisis esta mediada no por una proteina sino por una region especifica de la Sintesis de RNA y de proteinas

247

808

708

M 2 500 000

/

508

308

M 1 600 000

/

rRNA 58

c::::; 120 nucle6tidos

\

rRNA 238

608

2900 nucle6tidos

1540 nucle6tidos

408

/ \~

/

rRNA 58

rRNA 168

~

/

M 2 800 000

M 900 000

eJ2?SS

M 4200 000

c::::;

120 nucle6tidos

rRNA 288

rRNA5,88

~

c::=; 160 nucle6tidos

M 1 400 000

/

rRNA 188

Ǥ 1900 nucle6tidos

4700 nucle6tidos

34 proteinas

21 proteinas

-49 proteinas

molecula mayor de rRNA de la subunidad mayor del ribosoma (vease Figura 3-23).

3. En la etapa 3 el nuevo peptidil-tRNA del lugar A se transloca allugar P cuando el ribosoma se desplaza a 10 largo de la molecula de mRNA. Esta etapa requiere energfa y esta impulsada por series de cambios conformacionales de uno de los componentes del ribosoma, mediante la hidr6lisis de una molecula de GTP. Como una parte del proceso de translocaci6n de la etapa 3, la molecula libre de tRNA que se ha generado en ellugar P durante la etapa 2 se libera del ribosorna y vuelve a formar parte del acervo citoplasmcitico de moleculas de tRNA. Asf, al completarse la etapa 3, ellugar A, que se halla desocupado, puede aceptar una

subunidad grande del ribosoma lugar de uni6n al mRNA

peptidil tRNA

subunidad pequeiia del ribosoma

5'

---+.........-....

I----t-- aminoacil tRNA

3'

mRNA

Figura 6-21 Los tres lugares principales de uni6n de un ribosoma a moleculas de RNA. Ala izquierda se presenta un ribosoma vacio y a la derecha un ribosoma cargado. La representaci6n del ribosoma utilizada en esta y en las tres figuras siguientes es muy esquemMica. Para una visi6n mas exacta, veanse Figuras 6-18 y 6-25.

248

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

-33 proteinas

Figura 6-20 Comparaci6n de las estructuras de los ribosomas de la celula procariota y de la celula eucariota. Normalmente, los componentes ribosomales se designan por sus "valores de S", los cuales indican su velocidad de sedimentaci6n en una ultracentrffuga. Vease c6mo a pesar de las diferencias en cuanto a mlmero y tamafto de sus rRNA y de sus protefnas, ambos tipos de ribosomas tienen una estructura casi identica y actuan de forma muy similar. Por ejemplo, a pesar de que los rRNA 18S y 28S del ribosoma eucariota contienen muchos nucle6tidos extra que no se encuentran en sus anaIogos bacterianos, estos nucle6tidos estan presentes en multiples insertos que al parecer sobresalen como asas, de forma que la estructura basica de cada rRNA es muy semejante.

Figura 6-22 Fase de elongaci6n de la sintesis proteica sobre un ribosoma. EI cicio de tres etapas representado aqui se repite una y otra vez durante la sintesis de una cadena de proteina. En la etapa 1, una molecula de aminoaciltRNA se une allugar A del ribosoma; en la etapa 2 se forma un nuevo enlace peptidico; en la etapa 3, el ribosoma se desplaza una distancia de tres nucle6tidos a 10 largo de la cadena de mRNA, liberando la molecula de tRNA anterior y "reseteando" el ribosoma, de forma que se puede unir el nuevo aminoacil-tRNA. Como se indica en la Figura 6-21, ellugar P se ha dibujado a la izquierda del cromosoma y ellugar A a la derecha.

nueva molecula de tRNA unida al siguiente aminoacido, la cual vuelve de nuevo a iniciar el ciclo. En condiciones optimas, en una bacteria cada ciclo tarda alrededor de 1/20 de segundo, de forma que la sintesis de una proteina de tamafio medio de 400 aminoacidos se lleva a cabo en unos 20 segundos. Los ribosomas se desplazan a 10 largo de una molecula de mRNA en direccion 5'-a-3', la cual tambien es la direccion de la sintesis del RNA (vease Figura 6-3). En la mayoria de las celulas, la sintesis de proteinas consume mas cantidad de energia que cualquier otro proceso biosintetico. Para sintetizar cada uno de los enlaces peptidicos se utilizan por 10 menos cuatro enlaces fosfato ricos en energia: dos de estos enlaces fosfato se requieren para cargar cada molecula de tRNA con su aminoacido (vease Figura 6-11) y los otros dos impulsan las etapas del ciclo de reacciones que tienen lugar en el ribosoma durante la sintesis propiamente dicha -uno se utiliza en la union del aminoacil-tRNA en la etapa 1 (vease Figura 6-31) y el otro en la traslocacion del ribosoma en la etapa 3.

Cuando se alcanza uno de los tres tipos de codon de terminacion, la cadena proteica se libera del ribosoma8 Tres de los 64 codones posibles (UAA, UAG Y UGA) de una molecula de mRNA son codones de terminacion (stop codons), que finalizan el proceso de la traduccion. Unas proteinas citoplasmciticas denominadasfactores de liberaci6n se unen directamente a cualquier codon de terminacion que llegue allugar A del ribosorna. Esta union modifica la actividad de la peptidil-transferasa, haciendo que ahora catalice la adicion, al peptidil-tRNA, de una molecula de agua en lugar de la de un grupo amino libre de un aminoacido. Como consecuencia de esta reaccion el extremo carboxilo de la cadena polipeptidica en crecimiento queda libre de su union a una molecula de tRNA. Como normalmente la cadena polipeptidica en crecimiento se hallaba unida al ribosoma exclusivamente a traves de esta union, inmediatamente queda libre en el citoplasma. Entonces, el ribosoma libera el mRNA y se disocia en sus dos subunidades (Figura 6-23), las cuales podran volver a ensamblarse sobre otra molecula de mRNA, iniciando asi un nuevo proceso de sintesis mediante el proceso que describiremos a continuacion.

....;.a.Iii.GilA 3'

El proceso de iniciacion establece la pauta de lectura para la sfntesis proteica9 En principio, una secuencia de RNA puede ser decodificada mediante una de las tres pautas de lectura diferentes posibles, cada una de las cuales determinara una cadena polipeptidica completamente diferente (vease Figura 3-17). Lo que determina cual sera la pauta de lectura utilizada realmente es la union del ribosoma a la molecula de mRNA. Durante la fase de iniciaci6n de la sintesis proteica, las dos subunidades del ribosoma se unen entre si en el punto exacto del mRNA en el que ha de empezar la cadena polipeptidica. El proceso de iniciacion es complicado, y comprende varias etapas catalizadas por proteinas denominadas factores de iniciaci6n (IF, de Initiation Factors), algunos de los cuales esta compuesto, a su vez, por varias cadenas polipeptidicas. Debido a la complejidad del proceso, muchos de los detalles de Sfntesis de RNA y de protefnas

249

Figura 6-23 Fase final de la smtesis proteica. La uni6n del factor de liberaci6n a un cod6n de terminaci6n finaliza la traducci6n; el polipeptido completo se libera y el ribosoma se disocia en sus dos subunidades independientes.

I

--'• •iJllII.UyC"G 3' •

UNION

r-IN~L

tlnn--__.

~L

mRNA

AUG

FACTOR DE L1BERACION A UN CODON DE TERMINACION

• • •lIIjI.UCyG 3' •

subunidad ribos6mica pequefia con faclores de iniciaci6n unidos

5'----111

LA BUSQUEDA LE • PER MITE RECON ELCODDN DE INICIACIDN UNIE EL IRNA DE INI

I

IRNA iniciador en el lugar P

5'----11

"'--3' SE UNE UN AMINOACIL IRNA (elapa 1)

5'---" "'--3'

SE FORMAEL PRIMER ENLACE PEPTfDICO (elapa 2)

AUGAACUGGUAGCGAUCG

5' " " " " " " " ' ' ' ' 3'

5'----111 "--3' etc.

iniciaci6n todavia no estan bien establecidos. Sin embargo, esta claro que cada ribosoma se ensambla sobre una molecula de mRNA, siguiendo dos etapas; unicamente despues de que la subunidad pequefia del ribosoma unida a los factores de iniciaci6n encuentre el cod6n de iniciaci6n (AUG, vease a continuaci6n) se podra unir la subunidad mayor del ribosoma. Antes de que el ribosoma pueda empezar una nueva cadena de proteina, ha de unir una molecula de aminoacil-tRNA en su lugar P, donde normalmente unicamente se hallan unidas moleculas de peptidil-tRNA. (Como hemos explicado previamente, durante la etapa 3 del proceso de elongaci6n el peptidil-tRNA se transloca allugar P). Para este proceso se requiere la participaci6n de una molecula especial de tRNA. Este tRNA iniciador provee el aminoacido que inicia 250

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

Figura 6-24 Fase de iniciaci6n de la sfntesis proteica. Las etapas 1 y 2 se refieren a las de la reacci6n de elongaci6n mostrada en la Figura 6-22.

la cadena proteica, y siempre transporta metionina (aminoformil metionina en bacterias). En eucariotas la moIecula de tRNA iniciadora se ha de cargar en la subunidad pequefia del ribosoma despues de que se haya unido a una molecula de mRNA. Un importante factor de iniciaci6n llamado factor de iniciacion 2 de eucariotas (eIF-2, de Eucaryotic Initiation Factor 2) es necesario para colocar el tRNA iniciador sobre la subunidad pequefia. Una molecula de eIF-2 se une fuertemente a cada moIecula de tRNA iniciadora en cuanto este tRNA adquiere la metionina, yen algunas celulas la velocidad de todo el proceso de sfntesis de protefnas esta controlado por este factor de iniciaci6n (vease Figura 9-82). Como se describe con mas detalle en la pr6xima secci6n, la subunidad pequefia del ribosoma ayuda a la moIecula de tRNA iniciadora que lleva unida a encontrar un cod6n especial AUG (el codon de iniciacion) en la moIecula de mRNA. En cuanto estp ha ocurrido, los diferentes factores de iniciaci6n que previamente se habfan asociado con la subunidad pequena del ribosoma se liberan, permitiendo que una subunidad grande de ribosoma se una con la pequefia. Debido a que la molecula de tRNA iniciador esta unida en ellugar P del ribosoma, la sfntesis de la cadena proteica puede iniciarse directamente mediante la uni6n de una segunda molecula de aminoacil-tRNA allugar A del ribosoma (Figura 6-24). De esta forma se ensambla un ribosoma completo y funcional con una cadena de mRNA engarzada (Figura 6-25). A continuaci6n se desarrollan las etapas posteriores de la fase de elongaci6n de la sfntesis de protefnas, tal como hemos descrito anteriormente (vease Figura 6-22). Como todas las cadenas polipeptfdicas has sido iniciadas por una moIecula de tRNA iniciadora, todas las protefnas recien sintetizadas tienen una metionina (el derivado aminoformil de la metionina en bacterias) como residuo extremo amino. A menudo, esta metionina es eliminada muy poco despues de que se haya incorporado, mediante la acci6n de una aminopeptidasa especffica; este proceso de reajuste es importante ya que el aminoacido colocado ala izquierda del extremo amino puede determinar la vida media de la protefna en la celula mediante su efecto sobre un sistema de degradaci6n dependiente de ubiquitina (vease Figura 5-39). Evidentemente, ellugar correcto de iniciaci6n sobre la molecula de mRNA ha de ser seleccionado por la subunidad pequefia en concierto con los factores de iniciaci6n pero en ausencia de la subunidad grande, por 10 cual probablemente los ribosomas se forman a partir de dos subunidades independientes. Acontinuaci6n consideraremos c6mo se produce este proceso de selecci6n. 7-metilguanosina

HO

extremo S' del mRNA

OH

uni6n trifosfato S'-a-S'

Sfntesis de RNA y de protemas

'~\ -~ 'f.. molecula detRNA ) entrante

Figura 6-25 Modelo tridimensional de un ribosoma bacteriano que se halla actuando. La subunidad pequefia (verde oscuro) y la subunidad grande (verde claro) fonnan un complejo a traves del cual se va deslizando el mRNA. A pesar de que se desconocen las vias exactas por las que transcurren el mRNA y la proteina naciente, se sabe que la adici6n de un arninoacido tiene lugar en la regi6n general mostrada, con los tRNA unidos al "bolsillo" formado entre las subunidades mayor y menor. (Modificado a partir de lA Lake, Annu. Rev. Biochem. 54:507-530, 1985. © 1985 por Annual Reviews Inc.)

Figura 6-26 Estructura de la "capucha" ("cap") del extremo 5' de las moleculas de mRNA eucariotas. N6tese la poco habitual uni6n 5'-a-5' de la 7-metilguanosina, cargada positivamente, y de la metilaci6n del grupo 2' hidroxilo de la primera ribosa del RNA. (EI segundo azucar no esta nunca metilado.)

251

~ p p ~p)ll-.I'llII_. __. _ . _• •_ • •_"~

AUG

5' <±)G

5'

1

AUG

AUG

1

3'

•••~~~~~~~~~~••••••• AAAAA

C!p~

AUG 5'cap

I

clave: •

lugares de uni6n al ribosoma

secuencias codificantes

•

secuencias no codificantes

•

codonesde terminaci6n

En celulas eucariotas, normalmente s6lo se sintetiza un tipo de cadena polipeptidica sobre cada molecula de mRNAIO Tipicamente, una moIecula de RNA mensajero contiene varias secuencias AUG, cada una de las cuales puede codificar metionina. En eucariotas, sin .embargo, normalmente tan solo una de estas secuencias sera reconocida por el tRNA iniciador, actuando asi como codon de iniciacion. lComo puede el ribosoma distinguir este codon de iniciacion? Los RNA de eucariotas (a excepcion de los que se sintetizan en mitocondrias y cloroplastos) son profundamente modificados en el nucleo inmediatamente despues de su transcripcion (vease Capitulo 8). Dos de estas modificaciones mas generales son la adicion de una estructura de "capucha" ("cap"), compuesta de un residuo de 7-metilguanosina unido al trifosfato del extrema 5' (Figura 6-26), y la adicion de una cadena de unos 200 residuos adenflicos ("poli A") al extrema 3'. Todavfa no esta bien establecido el papel que juega el "poli A" en el proceso de traduccion (vease Figura 9-87). Sin embargo, se sabe que la estructura en "capucha" del extrema 5' es esencial para la sintesis de proteinas. Experimentos llevados a cabo con extractos de celulas eucariotas han demostrado que la subunidad pequefia del ribosoma se une primero al extremo 5' de una cadena de mRNA ayudada por el reconocimiento de la capucha 5' (Figura 6-24). Entonces, esta subunidad se desplaza a 10 largo de la cadena de mRNA transportando su molecula de tRNA iniciador en busca de un codon AUG de iniciacion. Aparentemente, los requerimientos de un codon de iniciacion no son muy exigentes, ya que habitualmente la subunidad pequefia selecciona el primer AUG que encuentra; sin embargo, parece que en este proceso de seleccion son importantes algunos nucleotidos cercanos al AUG. En la mayoria de los RNA de eucariotas en cuanto se ha seleccionado un codon de iniciacion cercano al extrema 5' ya no se utilizara como codon de iniciacion ninguno de los otros muchos codones AUG mas alejados de la cadena. Como resultado de todo esto, normalmente sobre cada molecula de mRNA tan solo se sintetiza un tipo de cadena polipeptidica (para excepciones, vease pag. 498). En las bacterias el mecanismo de seleccion de codones de iniciacion es diferente. Los mRNA de bacteria no tienen estructura en capucha en 5'. En lugar de ello, presentan una secuencia de iniciacion especifica de mas de 6 nucleotidos de longitud, que puede presentarse en multiples lugares de la misma molecula de mRNA. Estas secuencias estan situadas entre cuatro y siete nucleotidos en direccion 5' a partir del AUG, y generan pares de bases con una region especifica 252

Capitulo 6: Mecanismos geneticos basicos

Figura 6-27 Comparaci6n entre las estructuras de las moleculas de RNA mensajero de procarlotas y eucarlotas. A pesar de que ambos tipos de mRNA se sintetizan con un grupo trifosfato en el extremo 5', la molecula de mRNA eucariota adquiere rapidamente una capucha en el extrema 5', que es una parte de la estructura que la subunidad pequefia del ribosoma reconoce. Por 10 tanto, la sintesis proteica empieza en un cod6n de iniciaci6n cercano al extremo 5' del mRNA. En los procariotas, por el contrario, el extrema 5' no tiene ninglin significado especial. En el interior de una cadena de mRNA pueden existir muchos lugares de uni6n al ribosoma (denominadas secuencias Shine-Dalgarno) , cada uno de los cuales dara lugar a la sintesis de una proteina diferente.

Un polirribosoma. Dihujo esquelll
cadena polipeptidica completa

100 nm

del rRNA en el ribosoma, sefialando el inicio del proceso de sintesis de proteinas en este codon de iniciacion cercano. Los ribosomas bacterianos, a diferencia de los ribosomas de eucariotas, se unen directamente a una zona interna de una rnolecula de mRNA, reconociendo un codon de iniciacion e iniciando una cadena polipeptidica. Como resultado de ello, normalmente los RNA mensajeros de bacteria son policistr6nicos -10 cual significa que codifican multiples proteinas traducidas por separado a partir de la misma molecula de mRNA. Por el contrario, los mRNA de eucariotas son tipicamente monocistr6nicos, es decir, sobre cada molecula de mensajero unicamente se traduce una unica especie de cadena polipeptidica (vease Figura 6-27). (A)

100 nm

La union de varios ribosomas a una misma moIecula de mRNA genera polirribosomas 11 La sintesis completa de una proteina dura entre 20 y 60 segundos de promedio. Incluso durante este breve intervalo de tiempo, normalmente tienen lugar multiples iniciaciones sobre cada molecula de mRNA que esta siendo traducida. En cuanto un ribosoma ha traducido una secuencia de aminoacidos suficientemente larga como para dejar libre el camino, un nuevo ribosoma salta sobre el extrema 5' de la rnoIecula de mRNA. Las moleculas de mRNA como esta, denominadas polirribosomas 0 polisomas, estan formadas por varios ribosomas colocados sobre el misrno mRNA y espaciados unicamente unos 80 nucleotidos (Figuras 6-28 y 6-29). Los

Figlll"a (j-29 Electronmicrografias de un polirribosoma tipico de una celula eucariota. (A) Sublimaci6n profunda; (B) secci6n ultrafina. Generalrnente el citoplasrna celular esta lieno de polirribosomas como este, algunos de los cuales se deben hallar libres en el citosol y otms adhefidos a membrana. (A, cortesia de John Heuser; B, cortesia de George Palade.)

Sintesis de RNA y de proteinas

(8)

400 nm

253

polirribosomas son caracterfsticos de las celulas. Pueden ser aislados y separados de los ribosomas sencillos del citosol mediante lisis celular y ultracentrifugaci6n (Figura 6-30). El mRNA purificado a partir de estos polirribosomas puede utilizarse para determinar si la protefna codificada por una secuencia determinada de DNA esta siendo sintetizada activamente en estas celulas utilizadas para preparar los polirribosomas. Estas moleculas de mRNA tambien pueden utilizarse como material de partida para la preparaci6n de librerfas especializadas de cDNA (como se discute en el Capitulo 7). En los eucariotas la envoltura nuclear mantiene separados los procesos de transcripci6n y de sintesis de protefnas. Sin embargo en los procariotas el RNA es accesible a los ribosomas en cuanto se sintetiza. Asf, los ribosomas empiezan a sintetizar una cadena polipeptidica por el extrema 5' de la molecula de mRNA naciente y van siguiendo detras de la RNA polimerasa a medida que esta completa la cadena de mRNA

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Como discutiremos en el Capftulo 17, las celulas de un organismo pluricelular s610 se multiplican cuando se encuentran en un medio en el que son estimuladas por factores espedficos de crecimiento. A pesar de que los mecanismos a traves de los que actuan los factores de crecimiento todavia no estan completamente establecidos, uno de sus mayores efectos ha de ser el incrementar la velocidad de todo el proceso de sfntesis proteica, ya que las celulas duplican su contenido de proteina antes de dividirse. iQue es 10 que deterrnina la velocidad de sfntesis de protefnas? Cuando se depriva a celulas eucariotas en cultivo de nutrientes, se produce una marcada reducci6n de la velocidad de la iniciaci6n de la cadena polipeptidica. Esta reducci6n es el resultado de la inactivaci6n del factor de iniciaci6n de la sfntesis eIF-2 (vease Figura 9-82). Los factores de iniciaci6n necesarios para la sfntesis de protefnas son mucho mas numerosos y complejos en eucariotas que en procariotas, a pesar de que al parecer realizan la misma funci6n basica en ambos casos. Muchos de los componentes adicionales pueden se protefnas reguladoras que responden a diferentes factores de crecimiento, colaborando en la coordinaci6n del crecimiento y de la proliferaci6n en los Olganismos pluricelulares. En las bacterias son necesarios controles menos complejos ya que generalmente crecen todo 10 rapidamente que les permite la asequibilidad de nutrientes del medio.

La fidelidad de la sintesis de proteinas esta incrementada gracias ados procesos independientes de correcci6n de galeradas13 El porcentaje de errores en la sfntesis de protefnas puede estimarse siguiendo la frecuencia de incorporaci6n de un aminoacido en una proteina que normalmente carece de dicho aminoacido. Se pueden observar asi porcentajes de error de alrededor de un aminOlicido incorporado err6neamente pOl cada 104 aminoacidos incorporados, 10 cual significa que unicamente una de cada 25 moleculas de protefna de tamafio medio (de unos 400 aminoacidos) deberfa contener un error. La fidelidad del proceso decodificador depende de la precisi6n de los dos principales mecanismos de adaptaci6n discutidos anteriormente: la uni6n de cada aminoacido a su molecula correspondiente de tRNA y el apareamiento de bases de los codones del mRNA con los anticodones del tRNA (vease Figura 614). No es sorprendente que las celulas hayan desarrollado mecanismos de "correcci6n de galeradas" 0 "verificaci6n de lectura" (proofreading) que les permitan reducir el numero de errores en estos dos procesos cruciales de la sintesis de protefnas. Para disminuir el numero de errores en estos dos procesos, se utilizan dos mecanismos fundamentalmente diferentes, cada uno de los cuales es representativo de dos estrategias utilizadas en otros procesos celulares. Ambos suponen 254

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

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Figura 6-30 Aislamiento de polirribosomas. Los polirribosomas se pueden separar de los ribosomas sencillos (y de sus subunidades) por sedimentaci6n de una ultracentrifugaci6n. Este metodo se basa en el hecho de que en un fuerte campo gravitacionallos grandes agregados moleculares se mueven mas rapidamente que los pequefios. Generalmente la sedimentaci6n se realiza a traves de un gradiente de sacarosa para evitar mezclas por convecci6n. N6tese que la mayona de las cadenas polipeptidicas en crecimiento (linea raja) estan asociadas al polirribosoma.

aminoacil tRNA unido

~ctO'd' ,'oogoc"" cadena polipeptidica en crecimiento

t

factor de elongaci6n

~ elongaci6n de la cadena (etapas 2 y 3)

/

RNA mensajero lugar P lugar A

camino de salida de las mohkulas de tRNA incorrectas

el consumo de energfa libre ya que, como se ha discutido en el Capftulo 2, el incremento del orden en la celula tiene un precio. Para mejorar la exactitud de la union del aminoacido al tRNA se utiliza un mecanismo relativamente sencillo. Muchas aminoacH-tRNA sintetasas tienen dos lugares activos diferentes, uno que lleva a cabo la reaccion de carga mostrada anteriormente (Figura 6-11) y el otro que reconoce un amino
Figura 6-31 La correcci6n cinetica de pruebas selecciona la molecula correcta de tRNA sobre el ribosoma. En esta visi6n mas detallada de la etapa 1 de la fase de elongaci6n de la sintesis de proteinas, se Hustra c6mo, en el acontecimiento inicial de uni6n, una molecula de aminoacH-tRNA unido al factor de elongaci6n se aparea transitoriamente con el cod6n del lugar A. Este apareamiento dispara la hidr6lisis de GTP por el factor de elongaci6n, 10 cual permite que el factor se disocie de la molecula de aminoacH-tRNA, la cual ahora puede colocarse correctamente en ellugar A y participar en la elongaci6n de la cadena (vease Figura 6-22). Asi en el mecanismo de sintesis de proteinas existe un tiempo de espera entre la uni6n de la molecula de aminoacHtRNA y su asequibilidad para la sintesis de proteina. Como resultado de ello, unicamente los tRNA que tienen el anticod6n correcto pueden permanecer apareados al mRNA durante un tiempo suficientemente largo como para ser afiadidos a la cadena polipeptidica en crecimiento. El factor de elongaci6n, que es una proteina abundante, se designa como EF-Tu en los procariotas y como EF-l en eucariotas. En la Figura 5-20 se Hustra el extraordinario cambio de la estructura tridimensional de EF-Tu generado par la hidr6lisis de GTP.

Muchos inhibidores de la sintesis de proteinas en procariotas resultan utiles como antibi6ticosl 4 Muchos de los antibioticos mas eficaces utilizados en la medicina moderna actuan inhibiendo la sfntesis proteica bacteriana. Algunos de estos farmacos aprovechan las diferencias estructurales y funcionales que existen entre los ribosomas de procariotas y de eucariotas, a fin de afectar preferentemente a los ribosomas de procariotas. Esta selectividad permite utilizar algunos de estos comSfntesis de RNA y de protefnas

255

Tabla 6-1 Inhibidores de la sintesis de RNA 0 de la de proteinas Inhibidor

Efectosespecificos

Actuando unicamente sobre procariotas* Tetraciclina bloquea la uni6n de los aminoacil-tRNA allugar A del ribosoma Estreptomicina impide la transici6n desde el complejo de iniciaci6n ala elongaci6n de la cadena por el ribosoma, y provoca errores de decodificaci6n Cloranfenicol bloquea la reacci6n de la peptidil transferasa en los ribosomas (etapa 2 de la Figura 6-22) Eritromicina bloquea la reacci6n de translocaci6n en los ribosomas (etapa 3 de la Figura 6-22) Rifamicina bloquea la iniciaci6n de las cadenas de RNA uniendose a la RNA polimerasa (impide la sintesis de RNA) Actuando sobre procariotas y sobre eucariotas Puromicina se une al extremo de la cadena en crecimiento provocando la liberaci6n prematura de las cadenas polipeptidicas en formaci6n Actinomicina D se une al DNA bloqueando el movimiento de la RNA polimerasa (impide la sintesis de RNA) Actuando unicamente sobre eucariotas Cicloheximida bloquea la reacci6n de translocaci6n en los ribosomas (etapa 3 de la Figura 6-22) Anisomicina bloquea la reacci6n de la peptidil transferasa en los ribosomas (etapa 2 de la Figura 6-22) a-Amanitina bloquea la sintesis de mRNA preferentemente por medio de la uni6n a la RNA polimerasa II *A menudo, los ribosomas de las mitocondrias (y de los cloroplastos) de eucariotas se parecen a los de los procariotas en su sensibilidad frente a los inhibidores. Por ello, algunos de estos antibi6ticos pueden tener efectos perjudiciales sobre las mitocondrias de humanos.

puestos en el cuerpo humano a concentraciones relativamente elevadas sin que resulten demasiado t6xicos. Debido a que los diferentes antibi6ticos se unen a regiones diferentes de los ribosomas bacterianos, a menudo inhiben pasos diferentes del proceso de sintesis. En la Tabla 6-1 se muestran algunos de los antibi6ticos mas habituales de este grupo, indicandose sus efectos especificos. La tabla tambien presenta otros inhibidores de la sintesis de proteinas utilizados habitualmente, algunos de los cuales actuan sobre las celulas eucariotas; evidentemente estos ultimos no pueden utilizarse como antibi6ticos. Muchos de los compuestos enumerados en la Tabla 6-1 bloquean especificamente diferentes pasos del proceso que ocurre desde el DNA hasta la proteina, por 10 que son utiles en estudios bio16gicos. Entre los farmacos utilizados mas habitualmente en experimentos de este tipo, estan el cloranfenicol, la cicloheximida y la puromicina, todos los cuales inhiben especificamente la sintesis de proteinas. En una celula eucariota, por ejemplo, el cloranfenicol unicamente inhibe la sintesis proteica de los ribosomas de las mitocondrias (y de los doroplastos en las plantas), 10 cual refleja probablemente el origen procariota de estos organulos (vease Capitulo 14). Por otra parte, la cidoheximida unicamente afecta a los ribosomas del citosol. La diferente sensibilidad a estos farmacos del proceso de sintesis de proteina proporciona un poderoso sistema para determinar en que compartimiento celular se produce la traducci6n de una proteina determinada. La puromicina es especialmente interesante ya que es un analogo estructural de una molecula de tRNA unida a un aminoacido; el ribosoma la confunde con un aminoacido autentico y la incorpora covalentemente al extrema carboxilo terminal de la cadena polipeptidica en crecimiento, causando asi la terminaci6n prematura y la liberaci6n de este polipeptido (vease Figura 3-23). Como podria esperarse, la puromicina inhibe todos los tipos de sintesis de proteinas. 256

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

iC6mo evolucion6 el proceso de la sintesis de proteinas?15 Los procesos moleculares relacionados con la sfntesis de protefnas parecen inexplicablemente complejos. A pesar de que podemos describir muchos de elIos, no tienen ningtin sentido conceptual respecto a c6mo se producen la transcripci6n del DNA, la reparaci6n de DNA y la replicaci6n del DNA. Tal como hemos visto, en los organismos actuales la sfntesis de protefnas se centra en una maquina ribonucleoproteica muy grande, el ribosoma, que consiste en una serie de protefnas dispuestas alrededor de un mlcleo de moleculas de rRNA. iPor que existen toda esta serie de moleculas de rRNA y c6mo lIegaron a desempefiar un papel tan dominante en la estructura y en la funci6n del ribosoma? Antes de que se descubriera el mRNA, a principios de los afios 1960, se sospechaba que la gran cantidad de RNA que existe en los ribosomas actuaba como "mensajero", transportando informaci6n genetica del DNA a las protefnas. Ahora sabemos, sin embargo, que todos los ribosomas de una celula presentan un juego identico de moIeculas de rRNA, las cuales no desempefian ninguna funci6n de informaci6n de este tipo. En los ribosomas bacterianos se ha demostrado que pequefias regiones de algunos rRNA tienen funciones catalfticas en el proceso de sfntesis de protefnas. Como hemos mencionado el rRNA mayor de la subunidad mayor del ribosoma tiene actividad peptidil transferasa; ademas, el rRNA de la subunidad pequefia del ribosoma forma una pequefia heIice por apareamiento de bases, con la secuencia de iniciaci6n de las moleculas bacterianas de mRNA, la cual permite colocar el cod6n de iniciaci6n AUG vecino sobre ellugar P. Se forman una gran variedad de interacciones de este tipo entre las moleculas de tRNA y los rRNA de bacterias, a pesar de que en estas interacciones participan bases del rRNA alejadas en la secuencia de nucle6tidos, 10 cual sugiere eomplejos conjuntos de interacciones que dependen de la estructura terciaria de los rRNA. , La sfntesis de protefnas tambien depende, de una forma fundamental, de una gran cantidad de protefnas diferentes que se hallan unidas a los rRNA en los ribosomas (vease Figura 6-20). La complejidad de un proceso que depende de un mimero tan elevado de componentes diferentes que interactuan entre sf ha heeho que muchos bi610gos hayan perdido la esperanza de poder lIegar a conoeer c6mo se produjo la evoluci6n del proceso de sfntesis de protefnas. Sin embargo, los descubrimientos recientes acerca de las moleculas de RNA con actividad enzimatica han aportado un nuevo punto de vista sobre el proceso. Como se discute en el Capftulo 1, probablemente las primeras reacciones biol6gicas utilizaron moleculas de RNA, y no de protefna, como catalizadores. En las celulas primitivas, las moleculas de tRNA debieron de generar superficies catalfticas sobre sf mismas, que les permitieron unirse especfficamente a aminoacidos sin neeesitar la participaci6n de las enzimas aminoacil-tRNA sintetasas. De forma parecida, las moleculas de rRNA debieron de ser suficientes por sf solas para eonstituirse como un "ribosoma" completo, plegandose de formas complicadas y generando un intrincado conjunto de superficies que guiaron el apareamiento de los tRNA con los codones del mRNA y catalizaron la polimerizaci6n de los aminoacidos unidos a los tRNA (vease Figura 1-7). A 10 largo del curso de la evoluci6n, se han agregado protefnas individuales a esta maquinaria, cada una de elIas haciendo el proceso un poco mas exacto yeficiente, 0 afiadiendo controles de regulaci6n. Desde este punto de vista la gran cantidad de RNA de los ribosomas actuales puede ser un remanente de una etapa muy temprana de la evoluci6n, antes de que las protefnas hubieran lIegado a dominar la catalisis biol6gica.

Resumen Antes de que pueda iniciarse la slntesis de una determinada protelna, ha de sintetizarse el mRNA correspondiente mediante el proceso de transcripci6n del DNA. Entonees, una subunidad pequena del ribosoma se une a la molecula de mRNA en un Sfntesis de RNA y de protefnas

257

codOn de iniciacion (AUG) que es reconocido por una molecula determinada de tRNA. A continuacion una subunidad mayor de ribosoma se une completando el ribosoma e iniciando la fase de elongaciOn de la sfntesis de protefnas. Durante esta fase, los aminoacil-tRNA, cada uno de los cuales transporta un aminoticido determinado, se unen secuencialmente al codOn apropiado del mRNA a traves de la formacion de pares de bases complementarias con el anticodOn del tRNA. Cada uno de los aminoticidos es aiiadido al extremo carboxilo terminal de la cadena polipeptfdica en crecimiento, mediante un cicio de tres etapas secuenciales: uniOn del aminoacil-tRNA, formaciOn de un enlace peptfdico, y translocaci6n del ribosoma. El ribosoma progresa codOn a codOn en direccion 5'-a-3' a 10 largo de la motecula de mRNA, hasta que alcanza uno de los tres tipos de codones de terminaciOn que existen. Entonces, un factor de liberacion se une al codOn de terminaciOn, con 10 que se Jinaliza la traduccion y el polipeptido acabado se libera del ribosoma. Los ribosomas de las celulas procariotas son muy homologos a los de las celulas eucariotas, a pesar de que se presentan diferencias substanciales entre ellos en cuanto al numero y al tamano de sus componentes de rRNA y de protefna. El papel predominante de los rRNA en la estruetura y funcion de los ribosomas puede reflejar el origen ancestral del proceso de sfntesis de protefnas, el cual parece que evoluciono en un ambiente dominado por la catdlisis mediada por los RNA.

Mecanismos de reparaci6n del DNA16 La supervivencia a largo plazo de una especie puede aumentar gracias a cambios geneticos pero la supervivencia de los individuos requiere estabilidad genetica. El mantenimiento de esta estabilidad genetica no s6lo requiere que exista un mecanismo extremadamente exacto de copia de las secuencias de DNA antes de cada divisi6n celular, sino que tambien requiere que exista un mecanismo que permita reparar las numerosas lesiones accidentales del DNA que ocurren continuamenteo La mayoria de los cambios espontaneos de este tipo que tienen lugar en el DNA son transitorios ya que inmediatamente son eliminados mediante un proceso de correcci6n denominado reparacion del DNA. Tan s6lo muy de vez en cuando uno de estos procesos de mantenimiento del DNA no se produce 0 fracasa, 10 cual supone la producci6n de un cambio permanente en el DNA. Un cambio de este tipo se denomina mutaci6n. Si una mutaci6n se produce en una posici6n vital de la secuencia del DNA puede provocar la muerte del organismo. Antes de pasar a estudiar estos mecanismos de replicaci6n y de reparaci6n del DNA, examinaremos brevemente c6mo se van manteniendo las secuencias de DNA de una generaci6n a la siguiente.

Las secuencias de DNA se mantienen con un elevado grado de fidelidad 17 La velocidad en que se producen cambios estables en las secuencias de DNA (la frecuencia de mutacion) s6lo puede estimarse de forma indirecta. Uno de los sistemas consiste en comparar la secuencia de aminmicidos de una proteina determinada pero procedente de varias especies distintas. El porcentaje de aminOlicidos diferentes se puede comparar con el mlmero estimado de arios transcurridos desde que las dos especies se separaron de su antepasado comun, tal como se determina a partir de registros f6sHes. De esta manera se puede calcular el promedio de arios que se necesitan para que un cambio genetico se fije como una alteraci6n en un aminoacido de una proteina. Debido a que cada uno de los cambio de este tipo reflejara probablemente la alteraci6n de un solo nucle6tido en la secuencia del DNA del gen que codifica esta proteina, este valor puede ser utilizado para estimar la media del numero de arios que han de transcurrir para que se produzca una mutaci6n estable en el gen. Calculos como estos siempre subestiman la frecuencia real de mutaci6n, ya que la mayorfa de las mutaciones deben afectar a la funci6n de la proteina, y de258

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

ben desaparecer de la poblaci6n por selecci6n natural. Sin embargo, existe una familia de proteinas cuya secuencia parece no ser importante, por 10 que los genes que las codifican pueden acumular mutaciones sin sufrir ningl1n tipo de selecci6n en contra. Estas proteinas son los fibrinopeptidos -fragmentos de 20 residuos de aminoacidos que son eliminados de la proteina fibrin6geno cuando esta se activa dando lugar a lafibrina, durante el proceso de la coagulaci6n de la sangre. Dado que la funci6n de los fibrinopeptidos aparentemente no depende de su secuencia de aminoacidos, pueden tolerar cualquier cambio que se produzca en su secuencia. EI anaIisis de la secuencia de los fibrinopeptidos indica que una proteina de tamafio medio de 400 aminoacidos puede verse alterada aleatoriamente por una variaci6n en un aminoacido cada 200 000 afios. Mas recientemente, la tecnologia de secuenciaci6n del DNA ha hecho posible comparar las secuencias de nucle6tidos del genoma que no codifican para protefna. La comparaci6n de secuencias de este tipo en varias especies de mamiferos ha permitido obtener caIculos de la frecuencia de mutaci6n durante la evoluci6n, que estan en estrecho acuerdo con las obtenidas a partir de los estudios de los fibrinopeptidos.

Las frecuencias de mutaci6n observadas en celulas proliferativas son ~onsistentes con los valores evolutivos estimados1 8 La frecuencia de mutaci6n puede ser estimada de manera mas directa, observando la velocidad a la que aparecen cambios geneticos espontaneos en una gran poblaci6n de celulas observadas durante un periodo de tiempo relativamente corto. Ello puede llevarse a cabo estimando la frecuencia con la que aparecen nuevos mutantes en poblaciones muy grandes de animales (por ejemplo, colonias de la mosca del vinagre 0 colonias de ratones), 0 estudiando alteraciones en proteinas especificas de celulas que crecen en cultivo. Los valores obtenidos siguiendo ambos tipos de estrategia unicamente son aproximados pero concuerdan con una frecuencia de un cambio en un par de bases par cada 109 pares de bases, en cada generaci6n celular. Por consiguiente, un gen que codifique una proteina de tamafio medio (que contenga unos 103 pares de bases codificantes) sufrira una mutaci6n cada 106 generaciones celulares. Este numero es, al menos aproximadamente, consistente con la frecuencia de mutaci6n estimada descrita antes, segl1n la cual se produce una mutaci6n en un gen de tamafio medio cada 200 000 afios.

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La mayorfa de mutaciones de las protefnas resultan perjudiciales y son eliminadas por selecci6n natural 19 Cuando se representa el numero de aminoacidos diferentes de una determinada protefna en dos organismos que difieren respecto al tiempo transcurrido desde que estos organismos divergieron durante la evoluci6n, se obtiene una linea razonablemente recta. Es decir, cuanto mas tiempo haga que los arganismos divergieron, mayor es el numero de diferencias que existen entre sus proteinas. Por conveniencia, la pendiente de esta recta se puede expresar en terminos de "unidad de periodo evolutivo" para esta proteina, es decir, el promedio de tiempo necesario para que en una secuencia de 100 residuos de aminoacidos aparezca un cambio de un aminoacido. Cuando se comparan varias protefnas, se observa que cada una de ellas presenta una velocidad de evoluci6n diferente pero caracterfstica (Figura 6-32). Puesto que se supone que todos los pares de bases del DNA deben estar sujetos a la misma frecuencia aproximada de mutaci6n al azar, estas diferencias en las frecuencias deben reflejar diferencias en la probabilidad de que un organismo con una mutaci6n al azar en la proteina de que se trata pueda sobrevivir y propagarse. Evidentemente cambios en la secuencia de aminmicidos son mucho mas nocivos para algunas proteinas que para otras. A partir de la Tabla 6-2 podemos estimar que aproximadamente 6 de cada 7 cambios al azar de aminoacidos son perjudiciales para la hemoglobina, 29 de cada Mecanismos de reparaci6n del DNA

200

400

600

800

1000

millones de arias desde la divergencia de las especies

Figura 6-32 Diferentes protefnas evolucionan a velocidades muy diferentes. Comparaci6n entre las frecuencias de cambio de aminoacidos encontradas en la hemoglobina, en el citocromo c y en los fibrinopeptidos. La hemoglobina y el citocromo c han variado mucho mas lentamente durante la evoluci6n que los fibrinopeptidos. Para determinar los indices de mlmero de cambios por ano (como se expresa en la Tabla 6-2), es importante destacar que dos organismos que divergieron de un antepasado comun hace 100 millones de afios se hallan separados entre si por 200 millones de anos de tiempo evolutivo.

259

Tabla 6-2 Frecuencias observadas de cambio de las secuencias de aminOllcidos de varias proteinas a 10 largo del tiempo evolutivo Proteina

Fibrinopeptido Hemogiobina Citocromo c HistonaH4

Unidad de tiempo evolutivo* (en millones de anos) 0,7 5

21 500

'La "unidad de tiempo evolutivo" se defme como el tiempo promedio necesario para que aparezca el cambio de un aminOlicido aceptable en la protefna indicada, por cada 100 aminoacidos de la protefna.

30 10 son para el citocromo c, y pnicticamente todos son contraproducentes

para la histona H4. Puede asumirse que los individuos que fueron portadores de mutaciones perjudiciales de este tipo fueron eliminados de la poblaci6n por selecci6n natural.

Para que exista la vida tal como la conocemos, es necesario que se den bajas frecuencias de mutaci6n19 Debido a que la mayoria de las mutaciones son perjudiciales, ninguna especie puede permitir que se acumulen en grandes cantidades en sus celulas germinales. Mas adelante discutiremos por que la frecuencia de mutaci6n observada, a pesar de ser tan baja, al parecer limita a unas 60 000 el mlmero de proteinas esenciales que cualquier organismo puede codificar en su linea germinal. Como extensi6n de este mismo argumento, una frecuencia de mutaci6n diez veces superior limitarfa a un organismo a unas 6000 proteinas esenciales. En este caso, la evoluci6n probablemente se habria detenido en un organismo no mas complejo que la mosca del vinagre. Mientras que las celulas germinales han de estar protegidas contra elevadas frecuencias de mutaci6n para mantener la especie, las otras celulas de un organismo pluricelular (sus celulas somdticas) han de estar protegidas de cambios geneticos para poder salvaguardar el individuo. Los cambios de nucle6tidos en la celulas som
EI hecho de que las frecuencias de mutaci6n sean bajas significa que los organismos relacionados han de estar formados esencialmente por las mismas proteinas20 Los humanos, como genero diferenciado de los grandes simios, existen desde hace tan s610 unos cuantos millones de afios. Por consiguiente cada gen ha teni260

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

URACILO DESAMINACION por hidr61isis espontanea (p. ej., citosina a uracilo)

desplazamiento tautomerico

GUANINA

DESPURINACION por hidr61isis espontanea (p. ej., eliminaci6n de guanina)

do la posibilidad de acumular un numero relativamente reducido de cambios de nuele6tidos, y la mayoria de estos cambios habnin sido eliminados por selecci6n natural. AI comparar, por ejemplo, un humano con un mono se observa que las molecuIas de citocromo c difieren unicamente en un 1% de sus residuos de aminmicidos y las de hemoglobina en un 4%. Una gran parte de nuestra herencia genetica debi6 de configurarse antes de que apareciera Homo sapiens, durante la evoluci6n de los mamiferos (que se inici6 hace unos 300 millones de afios), o ineluso antes. Debido a que las proteinas de mamiferos tan diferentes como las ballenas y los hombres son muy similares entre si, los cambios evolutivos que han dado lugar a estas espectaculares diferencias morfol6gicas entre los diferentes mamiferos han tenido que producirse con un numero sorprendentemente bajo de cambios en los materiales de que estamos formados. Por el contrario, se cree que los principales responsables de estas diferencias morfol6gicas son diferencias en el patr6n temporal y espacial de la expresi6n genica durante el desarrollo embrionario, que determina el tamafio, la forma y otras caracterfsticas del adulto. En el Capitulo 8 discutiremos los mecanismos que probablemente constituyen la base de estos cambios en la expresi6n genica durante la evoluci6n.

Figura 6-33 Desaminaci6n y despurlnaci6n. Estas reacciones hidroliticas son dos reacciones qufmicas espontaneas frecuentes, que originan graves lesiones del DNA de las nHulas. La figura s610 muestra un ejemplo especffico de cada tipo de reacci6n.

Si no fueran corregidas, las alteraciones espontaneas del DNA podrian cambiar rapidamente las secuencias del DNA21 EI fisico Erwin Schroedinger sefial6 en 1945 que, fuese cual fuese la naturaleza quimica del material hereditario (desconocida en aquel momento), un gen tenia que ser extremadamente pequefio y estar formado de pocos Momos. En caso contrario, el elevado numero de genes necesarios para generar un organismo no cabria en el nueleo celular. Por otro lado, y debido a su reducido tamafio, cabia esperar que un gen sufriera importantes cambios como consecuencia de reacdones espontaneas inducidas por colisiones termicas aleatorias con moleculas del disolvente. Esto planteaba un grave problema, ya que los datos geneticos implican que los genes esten compuestos de una substancia extraordinariamente estable, en la cuallos cambios espontaneos (mutaciones) se producen con una frecuencia muy baja. Este dilema es real. EI DNA sufre cambios importantes debido a fluctuaciones termicas. Actualmente sabemos, por ejemplo, que cada dia se pierden unas Mecanismos de reparaci6n del DNA

261

O-.-CH

--p=o

/10-

-------p=o

/10-

-------p=o

/10-

_

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- - - - - - - p=O

/10-

0

(A)

Figura 6-34 Resumen de las alteraciones espontaneas que requieren reparaci6n del DNA. (A) Se indican los lugares de cada nucleotido que se sabe que se modifican por oxidacion espontanea (flechas rajas), ataque hidrolitico (flechas azules) 0 metilacion descontrolada por el dador de grupos metilo S-adenosil metionina (flechas verdes); la frecuencia de cada proceso se indica por el grosor de cada flecha. En la Figura 6-33 se ilustran con mas detalle los dos tipos de procesos hidroliticos mas frecuentes. (B) Estructura de un dfmero de timina, un tipo de alteracion introducida en el DNA de celulas expuestas a radiacion ultravioleta (como la luz solar). Se puede formar un dfmero similar entre dos bases de pirimidina vecinas cualesquiera (residuos CoT) del DNA. (A, a partir de T. Lindahl, Nature 362: 709-715, 1993. © 1993 Macmillan Magazines Ltd.)

I (B)

5000 bases puricas (adenina y guanina) del DNA de cada celula humana debido

a la destrucci6n termica de enlaces N-glucosidicos entre estas bases y la desoxirribosa (despurinaci6n). An81ogamente, se estima que la desaminaci6n de citosina a uracHo en el DNA se produce a una velocidad de 100 cambios por genoma y dia (Figura 6-33). Las bases del DNA tambien estan sujetas a cambios debido, por un lado, ala acci6n de metabolitos reactivos (como las formas reactivas del oxfgeno) que pueden alterar la capacidad de apareamiento de las bases, y por otro, a la acci6n de la luz ultravioleta del sol, que puede favorecer la formaci6n de un enlace covalente entre dos bases de pirimidina en el DNA (formandose, por ejemplo, un dimero de timina, como el que se muestra en la Figura 6-34B). Estos son s610 algunos de los muchos cambios que pueden 'ocurrir en nuestro DNA (Figura 6-34A). Cabria esperar que la mayoria de estos cambios condujesen ala eliminaci6n de uno 0 mas pares de bases de la cadena hija de DNA despues de la replicaci6n del DNA, 0 a la substitucion de un par de bases (por ejemplo, cada desaminaci6n C ~ U transformaria un par de bases C-G en un par de bases T-A, puesto que el U es muy parecido ala T, y forma un par de bases complementarias con A). Como hemos visto, una elevada frecuencia de cambios de este tipo tendria consecuencias desastrosas para los organismos. 262

Canftulo 6 : Mecaoismos e:eneticos bcisicos

Figura 6-35 Reparacion del DNA. Las tres etapas comunes de la mayona de tipos de procesos de reparaci6n del DNA son la escisi6n (etapa 1), resintesis (etapa 2) y nueva uni6n (etapa 3). En la etapa 1 se elimina la zona alterada; en las etapas 2 y 3 se repone la secuencia de DNA original. La DNA polimerasa llena el hueco generado en el proceso de escisi6n (etapa 2) y la DNA ligasa suelda el extrema del trozo recien sintetizado al resto de la cadena (etapa 3). EI proceso de la soldadura consiste en la nueva formaci6n del enlace fosfodiester rota (vease Figura 6-37).

esqueleto de azucar fosfato pares de bases unidas ] por un enlace de hidr6geno

copia 1 copia 2

I

ALTERACION DE LA co PIA 1

copia 1

La estabilidad de los genes depende de la reparaci6n del DNA22 A pesar de los miles de cambios al azar que se producen cada dfa en el DNA de una celula humana debido a la energfa termica, en una celula promedio s610 se acumulan unos cuantos cambios (mutaciones) estables cada ano. Hoy sabemos que menos de uno de cada mil cambios accidentales de las bases del DNA provoca una mutaci6n; el resto de los cambios son eliminados, con una eficacia extraordinaria, mediante el proceso de reparaci6n del DNA. Existe una amplia variedad de mecanismos de reparaci6n, cada uno de ellos catalizados por un conjunto diferente de enzimas. Casi todos dependen de la existencia de dos copias de la informacion genica, una en cada cadena de la doble helice del DNA: si la secuencia de una de las cadenas cambia accidentalmente, la informacion no se pierde irreversiblemente ya que todavia queda una segunda copia de la informaci6n en la secuencia de nucle6tidos de la otra cadena. El proceso basico de la reparaci6n del DNA se ilustra esquematicamente en la Figura 6-35. Tal como se indica en ella, el proceso supone tres etapas: 1. La porci6n alterada de la cadena de DNA es reconocida y eliminada por unas enzimas especiales llamadas nucleasas de reparaci6n del DNA, que hi-

drolizan los enlaces fosfodiester que unen los nucleotidos alterados al resto de la molecula de DNA. Ello produce un "hueco" en esta region de la helice de DNA. 2. Otra enzima, la DNA polimerasa. se une al extrema 3'-OH de la cadena cortada de DNA y va colocando nucleotidos, uno a uno, utilizando la informaci6n "correcta" de la otra cadena (patr6n).

copia 2

etapa 1

j

ELiMINACION DE LA REGION ALTERADA DE LA COPIA 1

IIILIII 3' 5'

copia 1 copia 2

copia 1

etapa 2

LA DNA POLIMERASA SINTETIZA UNA NUEVA COPIA 1 SOBRE LA COPIA 2, INTACTA, QUE TODAVfA SE CONSERVA

etapa 3

LA DNA L1GASA SUELDA LA MUESCA

I DJDDI.

copia 2

j

copia 1 copia 2 RESULTADO NETO: SE RECUPERAN DOS COPlAS CORRECTAS

3. El hueco, 0 muesca de la cadena danada desaparece cuando el peptido que ha sintetizado la DNA polimerasa se suelda gracias a la acci6n de una tercer tipo de enzima, la DNA ligasa, 10 cual completa el proceso de restauraci6n. Tanto la DNA polimerasa como la DNA ligasa juegan un importantfsimo papel general en el metabolismo del DNA; ambas actuan, por ejemplo, en los procesos de la replicacion y de la reparaci6n del DNA. En las Figuras 6-36 y 6-37 se ilustran las reacciones que catalizan estas dos enzimas.

Las alteraciones del DNA pueden ser eliminadas por mas de una via23 Los detalles de la etapa de escision en el proceso de reparacion del DNA dependen del tipo de alteraci6n de que se trate. Por ejemplo, la despurinacion, que es con diferencia la lesion mas frecuente de las que tienen lugar en el DNA, produce un azucar desoxirribosa que ha perdido su base (vease Figura 6-33). Este azucar es rapidamente reconocido por la enzima AP endonucleasa, la cual corta el esqueleto fosfodiester del DNA en ellado 5' dellugar alterado. Despues de la escisi6n de un residuo azucar-fosfato por una enzima fosfodiesterasa, se recupera la secuencia de DNA inalterada mediante la acci6n de una DNA polimerasa y una DNA ligasa (vease Figura 6-35). Una via de reparaci6n relacionada con esta, denominada reparaci6n por eliminaci6n de bases implica la actuaci6n de una bateria de enzimas diferentes Mecanismos de reparacion del DNA

263

desoxirribonucleosido trifosfato HO entrante

~'~P -..... HO

desoxirribonucle6sido trifosfato entrante

::;,3'-=-==-=-....5..:. cadena p P P _ cebadora

.. -

"=-'='I'='I'='~-=t

.-.....................""--".......-...P-. -

5'

cadena patron

3'

direcci6n 5' a 3' de crecimiento jl........, HO de la cadena "c----'

p

p

P

P

P

P

p

p

p

p (8)

(A)

llamadas DNA glucosilasas. Cada DNA glucosilasa reconoce a un tipo de base de DNA alterada y cataliza su eliminaci6n hidrolftica. Existen como minima seis tipos de estas enzimas, entre las que se encuentran las que eliminan C desaminadas, A desaminadas, diferentes tipos de bases alquiladas u oxidadas, bases con anillos abiertos y bases en las que un enlace doble carbono-carbono se ha convertido accidentalmente en un enlace sencillo carbono-carbono. Como ejemplo del mecanismo general que actua en todos los casos, en la Figura 6-38A se presenta la eliminaci6n de una C desaminada por la uracil DNA glucosilasa. La reacci6n de la DNA glucosilasa produce un azucar desoxirribosa que ha perdido su base. Dado que este azucar fosfato es el mismo substrato reconocido pOI la AP endonucleasa, los pasos siguientes en el proceso de reparaci6n tienen lugar de la misma forma que para los lugares despurinados. La importancia de la eliminaci6n de las bases de DNA desaminadas accidentalmente ha sido demostrada directamente. En bacterias mutantes que carecen de la enzima uracil DNA glucosilasa, la frecuencia normalmente baja de cambio espontaneo de un par de bases C-G a un par de bases T-A aumenta unas veinte veces. Las celulas disponen de una via de reparaci6n por eliminaci6n de nucle6tidos capaz de eliminar casi cualquier tipo de lesi6n del DNA que genere un cambio importante en la doble helice del DNA. Entre las "grandes lesiones" se encuentran las que se generan a traves de la reacci6n covalente de las bases del DNA con grandes moleculas de hidrocarbonos (como el compuesto carcin6geno

5'1

enlace fosfodiester roto

I I

I

I I

pI

"jp

pi

"Tp

p

p

PI

"jp

Pi

"TP p

p

p

p

p

pi

"Tp

p

pl:

"Tp

pI

P p

I I

I I

P Pl pI 3'1

I I

I

:::IP "Tp I 15'

I I

I I

Figura 6-37 Reacci6n catalizada por la DNA ligasa. Esta enzima suelda un enlace fosfodiester roto. Tal como se muestra, la DNA ligasa utiliza una molecula de ATP para activar el extrema 5' de la muesca (etapa 1) antes de formar el nuevo enlace (etapa 2). De esta forma, la reacci6n energeticamente desfavorable de soldadura de la muesca esta desplazada por el proceso energeticamente favorable de hidr6lisis del ATP. En el sfndrome de Bloom, una enfermedad humana hereditaria, los individuos presentan una deficiencia parcial de DNA ligasa y, en consecuencia, son deficitarios en el proceso de reparaci6n del DNA, 10 cual supone un incremento dramatico de la incidencia de cancer.

264

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

Figura 6-36 La enzima DNA polimerasa. (A) Reacci6n catalizada par la DNA polimerasa. Esta enzima cataliza la adici6n de un desoxirribonucle6tido al extrema 3'OH de una cadena de polinucle6tidos (la cadena cebadora) que se halla apareada a una segunda cadena patron. La nueva cadena de DNA crece en direcci6n 5' a 3'. Debido a que cada uno de los desoxirribonucle6tidos trifosfato que van entrando han de aparearse con los de la cadena patr6n para poder ser reconocidos por la polimerasa, esta cadena determina cual de los cuatro posibles desoxirribonucle6tidos (A, C, GoT) sera afiadido en cada momento. Como en el caso de la RNA polimerasa, la reacci6n esta impulsada por una variaci6n muy favorable de energia (vease Figura 6-3). (B) Estructura de una molecula de DNA polimerasa de E. coli, deterrninada por cristalograffa de rayos X. Este dibujo Hustra c6mo, al parecer, actl1a la polimerasa durante la sfntesis del DNA durante el proceso de reparaci6n. (B, adaptado de L.S. Beese, V. DerbyshireyT.A. Steitz. Science 260;352-355, 1993. © 1993 the MAS.)

dimero de pirimidinas C desaminada

I

/ 5'

A

GCTUATCC

pares de bases ] unidas por enlaces 3'~~~141l!1~~~11 de hidrogeno CGAGTAGG

U-1 GCT

5'

C T A C G G T C T ACT A T G G pares de bases ] unidas por enlaces de hidrogeno

3'

T A C C

G

URACIL DNA GLUCOSILASA

A G G T C T ACT A T

ATCC

IIIiIIII

helice de DNA con una base perdida

GAT G C C A GAT GAT A C C

..............

CGAGTAGG

A

DNA HELICASA

LA AP ENDONUCLEASA Y UNA FOSFODIESTERASA ELiMINAN EL AZUCAR FOSFATO

II

GCT

C T A

ATCC

JlLlll[

helice de DNA con un hueco de un nucleotido

CGAGTAGG

1

C G G T C T ACT A T G

DNA POLIMERASA YDNA L1GASA

G

m

r

GATGCCAGATGATACC DNA POLIMERASA Y DNALIGASA

1

GCT_CATCC

C T A C G G T C T ACT A T G G

CGAGTAGG

GATGCCAGATGATACC

lIIIIIII

helice de DNA con un hueco de 12 nucle6tidos

Figura 6-38 Comparaci6n entre los dos principales sistemas de reparaci6n del DNA. (A) Reparaci6n por eliminaci6n de bases. Este proceso empieza con una DNA glucosilasa. En este caso la enzima uracil DNA glucosilasa elimina una citosina accidentalmente desaminada. Tras la acci6n de esta glucosilasa (0 otra DNA glucosilasa que reconoce otro tipo de alteraci6n) el azucar fosfato con la base perdida es eliminado mediante la acci6n secuencial de la AP endonucleasa y de una fosfodiesterasa, las mismas enzimas que inician la reparaci6n de lugares despurinados. Entonces, el hueco de un solo nucle6tido es rellenado por la DNA polimerasa y la DNA ligasa. El resultado neto es que el U que se gener6 por una desaminaci6n accidental ha sido cambiado, recuperandose una C. El nombre de la AP endonucleasa proviene del hecho de que reconoce cualquier lugar de la helice del DNA que contenga un azucar desoxirribosa cuya base se haya perdido. Estos lugares pueden aparecer tanto por la perdida de una purina (lugares apurfnicos) como por la perdida de una pirimidina (lugares apirimidfnicos). (B) Reparaci6n por eliminaci6n de nucle6tidos. Despues de que un complejo multienzimatico reconozca una gran lesi6n, como un dfmero de pirimidinas (vease Figura 6-34B), se realiza un corte a cada lado de la lesi6n y una DNA helicasa asociada elimina toda la zona dafiada de la cadena. El complejo multienzimatico de las bacterias deja el hueco de 12 nucle6tidos que se muestra en la figura; el que se produce en el DNA de humanos es mas del doble de grande.

benzopireno) 0 con varios dfmeros de pirimidina T-T, T-C YC-C generados por la accion de la luz solar. En estos casos existe un gran complejo multienzimatico que "rastrea" el DNA buscando, en lugar de un determinado cambio de una base por otra, distorsiones de la doble helice. Cuando se detecta una gran lesion el esqueleto fosfodiester de la cadena anormal que contiene la lesion (un oligonucleotido) es cortado a cada lado de la distorsion y se elimina de la doble helice del DNA mediante la accion de una enzima DNA helicasa (como se discute mas adelante). A continuacion, se repara el pequeno hueco producido en la cadena del DNA, mediante los metodos habituales, mediante una DNA polimerasa y una DNA ligasa (Figura 6-38B). La importancia de estos procesos de reparacion se refleja en la gran inversion que realizan las celulas en el mantenimiento de enzimas de reparacion del DNA. Un extenso anaIisis genetico de una levadura sugiere que cada celula conMecanismos de reparaci6n del DNA

265

tiene mas de 50 tipos diferentes de genes que codifican funciones de reparaci6n del DNA. Se cree que en la especie humana los p£Ocesos de reparaci6n del DNA son al menos tan complejos como en la levadura. Los individuos que presentan la anormalidad genetica xeroderma pigmentosum, por ejemplo, son deficitarios en una gran cantidad de procesos de reparaci6n que, segUn puede comp£Obarse mediante ancilisis genetico, requieren como minima siete p£Oductos genicos diferentes. Estos individuos desarrollan severas lesiones de piel, como el cancer de piel, debido ala acumulaci6n de dime£Os de pirimidina en las celulas que se halIan expuestas al sol.

Las celulas pueden producir enzimas de reparaci6n de DNA en respuesta a las alteraciones del DNA24 Las celulas han desarrollado varios mecanismos que les permiten sobrevivir en un mundo agresivo. A menudo, una agresi6n ambiental extrema activa una baterfa de genes cuyos p£Oductos p£Otegen a la celula de los efectos de la agresi6n. Uno de los mecanismos de este tipo que expresan todas las celulas es la respuesta al shock termico, la cUal es evocada por la exposici6n de las celulas a temperaturas anormalmente altas; entre las proteinas "de shock termico" ("heat-shockproteins") que se inducen se encuentran algunas de las que al parecer colaboran en la estabilizaci6n y en la reparaci6n de las p£Oteinas celulares parcialmente desnaturalizadas (vease Figura 5-29). Muchas celulas presentan tambien mecanismos que les permiten sintetizar enzimas de reparaci6n del DNA en respuesta a una alteraci6n severa del DNA. El ejemplo mejor estudiado es la respuesta SOS en E. coli. En esta bacteria, cualquier bloqueo de la replicaci6n del DNA genera una senal (al parecer se trata de un exceso de DNA de una sola cadena) que induce un incremento de la transcripci6n de mas de 15 genes diferentes, muchos de los cuales codifican p£Oteinas que actl1an en la reparaci6n del DNA. En primer lugar la senal activa la p£Oteina RecA de E. coli (vease mas adelante) que destruye una p£Oteina reguladora de un gen que actua negativamente (un represor), la cual a su vez normalmente suprime la transcripci6n de la colecci6n completa de genes del SOS. Estudios sobre bacterias mutantes deficitarias en diferentes partes de la respuesta indican que las p£Oteinas que se sintetizan en esta respuesta tienen dos efectos. En primer lugar, y tal como era de esperar, la inducci6n de enzimas de reparaci6n del DNA incrementa la supervivencia de la celula. Cuando mutantes deficitarios en estos factores de la respuesta SOS son tratados con algUn agente que altera el DNA, como la radiaci6ri ultravioleta, una p£Oporci6n extraordinariamente elevada de ellos mueren. En segundo lugar, incrementa marcadamente el nume£O de errores que se producen en la copia de las secuencias del DNA por 10 que algunas de las p£Oteinas que se sintetizan en estos momentos aparecen con elevadas frecuencias de mutaci6n, por 10 que tambien aumenta la variabilidad genetica de la poblaci6n. Esta parte de la respuesta tiene un pequeno efecto en la supervivencia a corto plazo; posiblemente se trata de una ventaja ya que incrementa las probabilidades de que sobreviva una celula mutante mejor adaptada. El sistema de reparaci6n del DNA que se activa durante la respuesta SOS no es el unico sistema reparador de DNA inducible que se conoce. Las bacterias tienen ot£O sistema que se activa especfficamente por la presencia de nucle6tidos metilados en el DNA, Yexiste como minima un sistema inducible de reparaci6n del DNA en las celulas de levadura. Tambien se ha descrito que algunas celulas eucariotas se adaptan a las alteraciones del DNA de una forma similar a la que hemos descrito para bacterias.

La estructura y las propiedades quimicas de la doble helice del DNA hacEm que sea facil de reparar25 La doble helice del DNA parece una estructura 6ptima para ser reparada. Como se discute en el Capitulo 1, se cree que el RNA apareci6 durante la evoluci6n an266

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

DESAMINACION DE A

DESAMINACION DE G

DESAMINACION DE 5-METll C

r hipoxantina (A)

xantina

5-metil citosina (B)

tes que el DNA y es probable que inicialmente el c6digo genetico estuviera escrito en los cuatro nucle6tidos A, C, G YU. Ello plantea par que se reemplaz61a U del RNA por la T (que es 5-metil U) del DNA. Hemos visto que la desaminaci6n espontanea de C la transfarma en U, pero que este hecho es inofensivo gracias a la uracil DNA glucosilasa (Figura 6-38A). Podemos imaginar que cualquier enzima de reparaci6n encargada de detectar y eliminar estos accidentes no podria distinguir estos nucle6tidos de los nucle6tidos U normales de una molecula de DNA que contuviera U. Por ello, no es sorprendente que no se utilice U en el DNA. Esta linea de argumentaci6n esta corroborada por la observaci6n de que cada posible proceso de desaminaci6n en el DNA produce una base no habitual, la cual, por 10 tanto, puede ser detectada y eliminada directamente mediante una DNA glucosilasa especifica. La hipoxantina, par ejemplo, es la base purica mas simple que es capaz de aparearse especificamente con C. Sin embargo la hipoxantina es el producto directo de la desaminaci6n de A. La adici6n de un segundo grupo amino ala hipoxantina genera G, la cual no puede formarse espontaneamente a partir de A por desaminaci6n espontanea y cuyo producto de desaminaci6n es tambien unico (Figura 6-39A). En el DNA de los vertebrados ocurre una situaci6n especial, ya que algunos nucle6tidos C determinados estan metilados en secuencias CG especificas de genes inactivos 00 cual se discute en el Capitulo 9). Como se ilustra en la Figura 6-39B, la desaminaci6n accidental de estos nucle6tidos C metilados produce el nucle6tido natural T, el cual forma un apareamiento err6neo con el nucle6tido G de la otra cadena del DNA. Para colabarar en la protecci6n de estos nucle6tidos C metilados contra estas mutaciones, una DNA glucosilasa especial reconoce los nucle6tidos de T en las secuencias TG, eliminando T. Sin embargo, este mecanismo de reparaci6n del DNA debe ser relativamente ineficiente ya que los nucle6tidos C metilados son lugares habituales de mutaci6n en el DNA de los vertebrados. Aunque en el DNA de humanos solamente alrededor del 3% de los nucle6tidos C estan metilados, las mutaciones en estos nucle6tidos constituyen aproximadamente una tercera parte de las mutaciones de una sola base que se han observado en enfermedades hereditarias humanas (vease tambien Figura 9-71). Mientras que las propiedades quimicas de las bases aseguran que los procesos de desaminaci6n seran detectados, la reparaci6n exacta -y la respuesta fundamental del dilema de Schroedinger- depende de la existencia de diferentes copias de la informaci6n genetica en las dos cadenas de la doble helice. Tan s610 en el caso muy improbable de que ambas copias se lesionen simultaneamente en el mismo par de bases, la celula se quedara sin ninguna copia "buena" para utilizarla como patr6n de la reparaci6n del DNA. Incluso en este caso, se han desarrollado mecanismos que en algunos casos son capaces de reparar la alteraci6n. Estos mecanismos de reparaci6n requieren que en la celula se halle presente una segunda helice de DNA de la misma secuencia, y utilizan mecanismos Mecanismos de reparaci6n del DNA

timina

Figura 6-39 Desaminacl6n de nucle6tidos de DNA. En cada caso el Momo de oxfgeno afiadido a partir de la reacci6n con el agua esta coloreado en raja. (A) Los productos de desaminaci6n espontanea de A y de G se pueden reconocer como no naturales cuando ocurren en el DNA, por 10 que son facilmente detectados y reparados. La desaminaci6n de C a U esta ilustrada en la Figura 6-33 y T no tiene grupo amino para desaminar. (B) En el DNA de vertebrados un escaso porcentaje de los nucle6tidos C estan metilados, 10 cual contribuye al control de la expresi6n genica. Cuando estos 5-metil nucle6tidos C se desaminan accidentalmente, forman T. Esta T se apareara con una G de la cadena opuesta, formando un par de bases equivocado.

267

de recombinaci6n genica para transferir la informaci6n perdida desde una helice de DNA a la otra -un proceso denominado conversion genica, tal como discutiremos mas adelante. Unicamente en algunos virus muy pequefios, cuyos genomas tienen unos pocos cientos de nucle6tidos, la informaci6n genetica es almacenada en DNA de una sola cadena 0 en moIeculas de RNA. Los tipos de sistemas de reparaci6n que hemos descrito no pueden actuar en estos casos, y la probabilidad de que en estos virus ocurra un cambio de un nucle6tido es muy elevada. Parece que unicamente los organismos cuyos genomas sean muy pequefios pueden permitirse codificar su informaci6n genetica en estructuras que no sean una doble helice deDNA.

Resumen La fidelidad con la que se mantienen las secuencias del DNA en los eucariotas supe-

riores puede ser estimada a partir de las frecuencias de cambio durante la evolucion de las prote£nas no esenciales y de las secuencias de DNA no codificante. Esta fidelidad es tan elevada que una linea germinal de mamifero, con un genoma de 3 x 1(J9 pares de bases, estd sujeta a una media de tan solo entre lOy 20 cambios de pares de bases cada ano. Sin embargo resulta inevitable que en una celula tipica de mamifero los diferentes procesos qu£micos lesionen cada dia miles de nucleotidos del DNA. La informacion genetica se puede almacenar de forma estable en la secuencias del DNA gracias a que existen numerosos tipos de enzimas de reparacion que "patrullan" continuamente el DNAy reemplazan los nucleotidos alterados. El proceso de reparacion del DNA depende de la presencia de una copia de la informacion genetica en cada cadena de la doble Mlice del DNA. Una lesion accidental de una de las dos cadenas se puede eliminar mediante la accion de una enzima de reparaci6n, sintetizdndose a continuaci6n la cadena correcta a partir de la informaci6n de la cadena no alterada. La mayor parte de las alteraciones en las bases del DNA son eliminadas mediante uno de dos procesos principales. En la reparacion por eliminacion de bases una base alterada es eliminada mediante una enzima DNA glicosilasa, seguida de la eliminaciOn del azucarfosfato resultante. En la reparaci6n por eliminaci6n de nucle6tidos, una pequeiia region de la cadena vecina a la alteraci6n es eliminada de la helice del DNA, como un oligonucle6tido. En ambos casos el pequeno "hueco" que queda en la helice de DNA es rellenado mediante la acci6n secuencial de una DNA polimerasa y una DNA ligasa.

Mecanismos de replicaci6n del DNA26 Ademas de mantener la integridad de las secuencias del DNA mediante los mecanismos de reparaci6n del DNA, todos los organismos vivos han de duplicar su DNA de una forma muy exacta, antes de cadadivisi6n celular. La replicacion del DNA supone unas velocidades de polimerizaci6n de aproximadamente 500 nucle6tidos por segundo en las bacterias, y de unos 50 nucle6tidos por segundo en los mamiferos. Evidentemente, las enzimas de replicaci6n han de ser exactas y nipidas. La rapidez y la exactitud se consiguen mediante un complejo multienzimatico de varias proteinas que dirige el proceso y constituye una complicada "maquina de replicaci6n".

Tal como ocurre para el proceso de reparaci6n del DNA, el fundamento del proceso de replicaci6n es el apareamiento de bases27 La utilizaci6n del DNA como patron se refiere al proceso en el que la secuencia de nucle6tidos del DNA (0 de determinadas zonas del DNA) es copiada mediante el apareamiento de bases complementarias (A con T 0 con U y G con C), pro268

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

duciendo asi una secuencia de acido nucleico (de DNA 0 de RNA) complementaria a la patr6n. El proceso comporta el reconocimiento de cada nucle6tido del DNA por un nucle6tido complementario no polimerizado y requiere que las dos cadenas de la helice de DNA se separen por 10 menos un momenta para que los grupos dadores y aceptores de los enlaces de hidr6geno de cada base queden libres para el apareamiento de las bases. De esta forma se alinean ordenadamente los nucle6tidos libres adecuados y polimerizan mediante una reacci6n catalizada enzimaticamente, formando una nueva cadena de acido nucleico. En 1957 se descubri6 la primera de estas enzimas que catalizan la polimerizaci6n de nucle6tidos, la DNA polimerasa. Se demostr6 que los substratos de esta enzima son los desoxirribonucle6sidos trifosfato, los cuales son polimerizados sobre una cadena patr6n de DNA. El mecanismo de esta reacci6n es el que se ha descrito en la Figura 6-36 para la reparaci6n del DNA. Este descubrimiento llev6 al posterior aislamiento de la RNA polimerasa, de la que se supuso, correctamente, que utilizaba ribonucle6sidos trifosfato como substrato. Durante la replicaci6n del DNA, cada cadena del DNA antiguo actua como patr6n de la formaci6n de una nueva cadena entera. Dado que cada una de las dos celulas hijas de una celula que se divide hereda una helice de DNA que contiene una cadena antigua y otra acabada de sintetizar (vease la Figura 3-13), se dice que el DNA se replica de manera "semiconservativa" por la DNA polimerasa.

La horquilla de replicaci6n del DNA es asimetrica28 AnaIisis autorradiograticos efectuados a principios de los afios 1960 sobre cromosomas enteros en replicaci6n marcados con un breve pulso de timidina 3H, un precursor del DNA, revelaron la existencia de una regi6n concreta de replicaci6n que se desplaza a 10 largo de la doble helice paterna de DNA. Debido a su estructura en forma de Y, esta regi6n activa del DNA recibe el nombre de horquilla de replicaci6n del DNA. En la horquilla de replicaci6n se sintetiza el DNA de las dos helices hijas mediante un complejo multienzimatico que contiene la DNA polimerasa. Inicialmente el mecanismo mas sencillo de replicaci6n del DNA parecia ser el crecimiento continuo de las dos nuevas cadenas, nucle6tido a nucle6tido, a medida que la horquilla de replicaci6n se desplazaba de un extremo a otro de la molecula del DNA. Pero debido a que en la helice de DNA las dos cadenas se hallan en orientaci6n antiparalela (vease Figura 3-10 y Panel 3-2, pags. 104-105), este mecanismo requeriria que una de las cadenas hijas creciera en direcci6n 5' a 3' y la otra en direcci6n 3' a 5'. Una horquilla de replicaci6n de este tipo requeriria dos enzimas DNA polimerasa diferentes. Una de ellas polimerizaria en direcci6n 5' a 3', de forma que cada nucle6tido trifosfato entrante transportara la activaci6n del trifosfato necesaria para su propia activaci6n, mientras que la otra enzima deberia desplazarse en direcci6n 3' as', actuando segt1n el mecanismo denominado "creci-

p

P

3'

P

P

5' azucar

5'~OH3 trifosfato

Mecanismos de replicaci6n del DNA

base

Figura 6-40 Modelo incorrecto de la replicaci6n del DNA. A pesar de que el mecanismo que se indica en la figura pueda parecer el mecanismo mas sencillo para la replicaci6n del DNA, no es el que utiliza la celula. N6tese que en este esquema las dos cadenas de DNA hijas crecerfan de forma continua, utilizando la energfa de hidr6lisis de los fosfatos amarillos para afiadir el nucle6tido siguiente a cada cadena. Ello requerirfa que las cadenas pudieran crecer tanto en la direcci6n 5' a 3' (abajo) yen la direcci6n 3' a 5' (arriba). Nunca se ha descubierto la existencia de uQa enzima que catalice la polimerizaci6n de nucle6tidos en direcci6n 3' as'.

269

Figura 6-41 Estructura de una horquilla de replicaci6n del DNA. Debido a que las dos cadenas de DNA (coloreadas) se sintetizan en la direcci6n 5' a 3', el DNA sintetizado sobre la cadena retrasada es producido en forma de cortas moleculas de DNA, denominadas fragmentos de Okazaki.

5'

hebra patron conductora

hebra patron retrasada

3'

5'

3'

5'

miento por la cabeza" en el que el extremo de la cadena de DNA que esta creciendo transporta la activacion del trifosfato necesaria para la adicion del nucleotido siguiente. A pesar de que la polimerizacion "por la cabeza" tiene lugar en diversos procesos bioqufmicos (vease Figura 2-36), no ocurre en la sfntesis del DNA; nunca se ha encontrado una DNA polimerasa que actue en direccion 3' a 5' (Figura 6-40). leomo se consigue, pues, la sintesis del DNA en direccion 3' a 5'? La respuesta fue sugerida por primera vez a finales de los afios 1960 gracias a experirnentos en los que a una preparacion de bacterias en crecirniento se afiadfa durante breves segundos una preparacion de timidina 3H altamente radiactiva, de forma que unicamente resultaba marcada radiactivamente la zona de DNA que se acababa de replicar, es decir, justo detras de la horquilla de replicacion. Este sistema selectivo de marcaje revelola existencia de zonas de DNA en la horquilla de crecimiento de la bacteria de entre 1000 y 2000 nucleotidos de longitud, que hoy se conocen con el nombre de fragmentos de Okazaki. (Mas tarde se describieron intermediarios de replicacion como estos en eucariotas, pero de una longitud de tan solo entre 100 y 200 nucleotidos.) Se demostro que estos fragmentos de Okazaki se sintetizan Unicamente en direccion 5' a 3', Yque despues de su sfntesis se unen entre sf generando largas cadenas de DNA, mediante la enzima DNA ligasa, la misma enzima que rellena y suelda los "huecos" durante la reparacion del DNA (vease Figura 6-37). Una horquilla de replicacion tiene una estructura asimetrica. La cadena hija de DNA que se sintetiza de manera continua recibe el nombre de cadena conductora, y se sintetiza antes que la cadena hija, que se sintetiza de forma discontinua y que recibe el nombre de cadena retrasada. La sfntesis de la cadena retrasada es mas lenta debido a que debe esperar a que la cadena conductora exponga la cadena patron sobre la que se sintetizara cada uno de los fragmentos de Okazaki (Figura 6-41). La sfntesis de la cadena conductora mediante un mecanismo discontinuo de "punto hacia atras" significa que para la replicacion del DNA unicamente se necesita la DNA polimerasa 5' a 3'.

EI elevado grado de fidelidad del mecanismo de replicaci6n del DNA requiere la existencia de un mecanismo de "correcci6n de galeradas"29 La fidelidad del proceso de copia durante la replicacion del DNA es tan alta que solo se produce, aproximadamente, un error en la replicacion de cada 109 pares de bases, tal como requiere el mantenimiento del genoma de los mamfferos, de 3 x 109 pares de bases de DNA. Esta fidelidad es mucho mas alta que la esperada, 270

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

dado que las parejas estandar de bases complementarias no son las unicas posibles. Por ejemplo, pequefios cambios en la geometrfa de la helice permitiran que se formen dos enlaces de hidr6geno entre G y T en el DNA. Ademas, en el DNA normal aparecen transitoriamente formas tautomericas raras de las cuatro bases del DNA, en proporciones de 1 parte por cada 104 0105 • Estas formas no se aparean correctamente a no ser que haya cambios en la geometria de la helice: por ejemplo, la escasa forma tautomerica de C se aparea con A en lugar de con G. Si la DNA polimerasa acepta que se formen apareamientos incorrectos de bases entre un desoxirribonucle6sido trifosfato entrante y el patr6n de DNA, el nucle6tido incorrecto sera incorporado en la nueva cadena de DNA, produciendose una mutaci6n. La elevada fidelidad del proceso de replicaci6n del DNA depende de mecanismos de "correcci6n de galeradas" 0 "verificaci6n de lectura" (proofreading mechanism) que elimina errores generados de esta forma. Un importante proceso de "correcci6n de galeradas" depende de las espedales propiedades de la enzima DNA polimerasa. A diferencia de las RNA polimerasas, las DNA polimerasas no inician una nueva cadena de nucle6tidos uniendo entre si dos nucle6tidos trifosfato: necesitan de forma absoluta la presencia de un extrema 3' -OR de una cadena cebadora sobre la que afiadir los nucle6tidos siguientes (vease Figura 6-36). Ademas, las moleculas de DNA que presentan errores de apareamiento (0 con falta de algl.1n apareamiento) de nucle6tidos en el extremo 3' -OR de la cadena cebadora no son efectivas como cadena patr6n. Las moIeculas de DNA polimerasa son capaces de trabajar con cadenas de DNA defectuosas de este tipo mediante la utilizaci6n de una subunidad 0 dominio catalitico que corta cualquier residuo desapareado del final de la cadena cebadora. El proceso de corte mediante esta actividad correctora exonucleasa 3' a 5' continua hasta que se ha eliminado un numero de nucle6tidos del extrema 3' suficiente como para regenerar un extremo con bases apareadas que pueda cebar la sintesis de DNA. De esta forma, la DNA polimerasa actua como una enzima "autocorrectora" que va eliminando sus propios errores de polimerizaci6n a medida que avanza por el DNA. La Figura 6-42 Hustra c6mo puede esperarse que este proceso de "autocorrecci6n" elimine los errores de apareamiento de bases. El requerimiento de la presencia de un extremo de DNA formado por un perfecto apareamiento de bases es esencial para que se den las propiedades de "autocorrecci6n" de la DNA polimerasa. Para una enzima de este tipo, aparentemente no es posible iniciar la sintesis en completa ausencia de un cebador sin perder ninguna de sus caracteristicas discriminatorias entre bases apareadas y desapareadas del extremo 3' -OR en crecimiento. Por el contrario, las enzimas RNA polimerasas implicadas en la transcripci6n genica no necesitan ser autocorrectoras: los errores en la transcripci6n del RNA no pasan a la generaci6n siguiente, y la existencia ocasional de una molecula defectuosa no es relevante. Las RNA polimerasas son capaces de iniciar una nueva cadena de polinucle6tidos en ausencia de cebador, y se observa una frecuencia de error de aproximadamente 1 de cada 10\ tanto en la sintesis del RNA como en los procesos de traducci6n de las secuencias de mRNA a secuencias de proteina.

o~

~~

habra cebadora

T

T

T

T

""- ) OH.-/

p

5'_

3'_

P A

~

~~O/-(

P P P P P P P _ A A A A A A A

A

\

una forma tautomerica rara de C (C*) se aparea con A y as! se incorpora a la hebra cebadora por la DNA polimerasa

I

hebr~ patron

T

C*

~)_~Ol-\

~~

T

T

P

P

T

P

C*

P

OH

p P P P P P P P AAA A A A A A A ei nipido desplazamiento tautomerico de C* a citosina normal (C) destruye su apareamiento con A

T

l

T

T

P

P

P

T (, P

0'0

P

A A ei extrema 3'·OH no apareado de la hebra cebadora bloquea su alargamiento posterior por acci6n de la DNA polimerasa

T

T P

l 1 T

P

C rPW=-OH

~

T (, P P

T

~ ~~O/-(

1a actividad de la exonucleasa 3' a 5' unida a la DNA polimerasa, genera un extremo 3'-OH con bases apareadas en la hebra cebadora

-nuT

0'0

T

T

--AAA

0H

AAAAAA

la DNA polimerasa continua el proceso de adici6n de nucle6tidos al extremo 3'-OH de la hebra cebadora

8610 la replicaci6n del DNA en direcci6n 5' a 3' permite la existencia de un eficiente proceso de correcci6n de errores Probablemente la necesidad de que el proceso sea exacto explica por que la replicaci6n del DNA unicamente tiene lugar en la direcci6n 5' a 3' de la cadena. Si existiera una DNA polimerasa que afiadiera desoxirribonucle6sidos trifosfato de forma que produjera el crecimiento de la cadena en direcci6n 3' a 5', el extremo 5' en crecimiento transportaria el trifosfato activador en lugar de hacerlo el mononucle6tido entrante. En este caso los errores de polimerizaci6n no serian simplemente eliminados por hidr6lisis ya que la sintesis de un extrema 5' desnudo terminaria inmediatamente la sintesis de DNA. Por consiguiente resulta mucho mas facH corregir una base mal apareada que acaba de ser afiadida al extremo 3' Mecanismos de replicaci6n del DNA

Figura 6-42 "Correcci6n de galeradas" 0 "verificaci6n de lectura" durante la replicaci6n del DNA.

271

que una base que ha side afiadida al extrema 5' de una cadena de DNA. Por 10 tanto, aunque el tipo de mecanisme necesario para la replicacion del DNA que se muestra en la Figura 6-41 parece a primera vista mucho mas complejo que el incorrecto mecanisme de la Figura 6-40, resulta mucho mas exacto porque supone la sintesis de DNA unicamente en direccion 5' a 3'.

::3' DNA primasa

Una enzima especial que polimeriza nucle6tidos sintetiza cortas moleculas cebadoras de RNA sobre la cadena retrasada30 Para el caso de la cadena conductora unicamente es necesario un cebador especial al inicio de la replicacion; en cuanto se ha establecido la horquilla de replicacion, la DNA polimerasa dispone continuamente de un extremo de cadena con bases apareadas sobre el que sintetizar la nueva cadena. Sin embargo la DNA polimerasa dellado retrasado de la horquilla completa un corto fragmento de DNA en tan solo 4 segundos, tras 10 cual ha de empezar a sintetizar otro fragmento completamente nuevo en un punto situado mas adelante de la cadena patron (Figura 6-41). Para generar estas cadenas cebadoras de bases apareadas que son necesarias para que actue la DNA polimerasa, se necesita un mecanismo especial. El mecanismo incluye una enzima denominada RNA primasa (del ingles "primer", cebador, 0 tambien enzima generadora de cadenas cebadoras de RNA) que utiliza ribonucleosidos trifosfato para sintetizar cebadores (primers) de RNA cortos (Figura 6-43). En los eucariotas, estos cebadores tienen aproximadamente 10 nucleotidos de longitud y son sintetizados a intervalos sobre la cadena retrasada, para despues ser elongados mediante la DNA polimerasa constituyendo los fragmentos de Okazaki. La sintesis de cada fragmento de Okazaki acaba cuando esta DNA polimerasa se encuentra con el RNA cebador unido al extrema 5' del fragmento anterior de DNA. Para producir una cadena continua de DNA a partir del gran numero de fragmentos sintetizados sobre la cadena retrasada, rapidamente actua un sistema especial de reparacion del DNA que eli. mina el RNA cebador y 10 substituye por DNA. A continuacion, la ligasa une el extremo 3' de cada fragmento de DNA al extrema 5' del fragmento anterior, completando asi el proceso (Figura 6-44). iPor que se ha de sintetizar un RNA cebador, que luego se tendni que eliminar, en lugar de utilizar un cebador de DNA que no seria necesario eliminar? El argumento de que una polimerasa autocorrectora no puede iniciar cadenas de novo tambien implica 10 contrario: una enzima capaz de iniciar cadenas de novo no puede presentar un sistema eficiente de autocorreccion. Por consiguiente, cualquier enzima que inicie la sintesis de los fragmentos de Okazaki producini, necesariamente, una copia relativamente incorrecta (con por 10 menos un error cada 105 bases). Incluso aunque la cantidad que se conserva de esta copia en el producto final constituye una parte tan pequefia como el 5 % del genoma total (por ejemplo 10 nucleotidos por cada fragmento de DNA de 200 nucleotidos), el incremento resultante de la frecuencia general de mutacion seria enorme. Por consiguiente, parece razonable concluir que la utilizacion de moleculas de RNA como cebador en lugar de moleculas de DNA debio suponer una poderosa ventaja, ya que los ribonucleotidos del cebador marcan automaticamente estas secuencias como "copia mala" que debe ser eliminada.

::3' Figura 6-43 Sintesis del cebador de RNA. Representaci6n esquematica de la reacci6n catalizada por la RNA primasa, la enzima que sintetiza los cebadores de RNA cortos sobre la cadena retrasada. A diferencia de la DNA polimerasa, esta enzima puede iniciar una nueva cadena polinucleotfdica uniendo entre sf dos nucle6sidos trifosfato. La primasa se detiene despues de la sfntesis de un polinucle6tido corto dejando el extrema 3' de este cebador a disposici6n de la DNA polimerasa.

RNA cebador

sintesis de un nuevo cebador de RNA. lIevada a cabo par la RNA primasa

3'====_=5~' __~3~'~"=5~'_ r S I cadena retrasada patron

jla DNA polimerasa se une al nuevo cebador de RNA. iniciando un nuevo fragmento de Okazaki

3':====_=5~'3~'~.==:_=~5'_ r

S

I

ia DNA polimerasa acaba el fragmento de DNA

3':::::_=:::::_:5~'_3'

5'

el viejo cebador de RNA es eliminado y remplazado por DNA j

Figura 6-44 Sintesis de uno de los muchos fragmentos de DNA sobre la cadena retrasada. En los eucariotas, los cebadores de RNA sobre la cadena retrasada se presentan a intervalos de unos 200 nucle6tidos, y cada uno de ellos tiene unos 10 nucle6tidos de longitud. El cebador es eliminado por una enzima especial de reparaci6n que reconoce una hebra de RNA de una helice RNAIDNA y la elimina; ello produce una hendidura que es rellenada pOI una DNA polimerasa y una DNA ligasa, como hemos visto para el proceso de reparaci6n de DNA (vease Figura 6-35).

272

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

3' :::::':::::::_:~5~'_ j 3':::::::::::_:~5~' _r s 5'

3'

la soldadura de las hendi.dura.s mediante la DNA ligasa une fragmentos de Okazaki a la, nueva cadena de DNA en " crecimiento

Figura 6-45 Ensayo utilizado para medir la actividad de las DNA helicasas. Un corto fragmento de DNA se hibrida con una larga cadena de DNA de cadena sencilla, formando una regi6n de doble helice. A medida que la helicasa va avanzando por la cadena de DNA de cadena sencilla, la doble helice se va deshaciendo, liberando el fragmento corto de DNA. Esta reacci6n requiere la presencia tanto de la proteina helicasa como de ATP. El movimiento de la helicasa esta alimentado energeticamente par la hidr6lisis del ATP (vease Figura 5-22).

""""""","";""11111111111;111;1""'1111111 la DNA helicasa se une

j

Unas proteinas especiales ayudan a abrir la doble helice del DNA por delante de la horquilla de replicaci6n31 La doble helice de DNA ha de ir abril~ndose nipidamente por delante de la harquilla de replicaci6n, de maneraque los desoxirriboncle6sidos trifosfato entrantes puedan aparearse con los de la cadena patr6n. Sin embargo, la doble helice de DNA es muy estable en condiciones normales: los pares de bases estan tan bien encajados en su lugar, que para separar las dos cadenas en el tuba de ensayo se requieren temperaturas pr6ximas a las de ebullici6n del agua. Por esta raz6n, para poder copiar una moIecula de DNA, la mayorfa de las DNA polimerasas requieren que la cadena patr6n se haya separado de su cadena complementaria. Para abrir la doble helice y poner al descubierto la cadena patr6n del DNA que sera copiada por la DNA polimerasa, son necesarias unas proteinas adicionales. Dos tipos de protefnas de replicaci6n contribuyen a este proceso -las DNA helicasas y las protefnas de uni6n al DNA de una sola hebra. Las DNA helicasas fueron inicialmente aisladas como protefnas que hidrolizan AIP cuando se unen a moIeculas de DNA de una sola cadena. Como se describe en el Capftulo 5, la hidr6lisis de AIP puede hacer variar de forma cfclica la forma de una molecula proteica, permitiendo a la protefna realizar alglin trabajo mecanico. Las DNA helicasas utilizan este principio para desplazarse rapidamente a 10 largo de cadenas de DNA de una sola cadena; cuando encuentran una regi6n de doble helice, contimlan desplazandose par la misma cadena, desenroUado asf la helice (Figura 6-45). Previamente hemos descrito como actua una helicasa de reparaci6n especial en la reparaci6n par eliminaci6n de nucle6tidos (vease Figura 6-38B). EI desenrollamiento de la helice de DNA patr6n en la horquilla de replicacion puede, en principio, estar catalizada par dos DNA helicasas que actuan de forma concertada, una de elIas desplazandose par la cadena conductara y la otra desplazandose por la cadena retrasada. Estas dos helicasas deberian desplazarse en direcciones opuestas a 10 largo de una moIecula de DNA de cadena sencilla, y par 10 tanto, deberfan ser dos enzimas diferentes. En efecto, ambos tipos de DNA helicasa existen, pero algunos estudios en bacterias demuestran que la DNA helicasa que desempefia el papel principal es la de la cadena conductara, par razones que pronto quedaran aclaradas. Las proteinas desestabilizadoras de la helice -tambien lIamadas protefnas de union a DNA de una sola cadena (SSB, de Single Strand DNA-Binding proteins) se unen a cadenas de DNA abiertas, sin recubrir las bases de la cadena, las cuales, por 10 tanto, quedan disponibles para actuar como patr6n. Estas protefnas no son capaces de abrir directamente una larga cadena de DNA, pero colaboran con las helicasas estabilizando la confarmaci6n desenrollada de las cadenas sencillas. Ademas, su uni6n cooperativa recubre completamente las regiones de DNA de cadena sencilla de la cadena retrasada previniendo asf la formaci6n de cortas helices en forma de harquilla que impedirian la actuaci6n de la DNA polimerasa (Figura 6-46).

"

Una molecula de DNA polimerasa m6vil se mantiene unida al DNA mediante un anillo deslizante32 La mayarfa de las DNA polimerasas s610 sintetizan, par sf mismas, cortas cadenas de nucle6tidos antes de separarse del DNA patr6n. Esta tendencia a dejar raMecanismos de replicaci6n del DNA

273

regi6n de una sola cadena de DNA patr6n. presentando cortas regiones en ...... forma de "h~rquilla" por apareamlento de bases mon6meros de proteina que desestabilizan lahelice

5'

,~ ~

.-

_ " .

3' m~",,-

la uni6n cooperativa de la proteina estira la cadena

pidamente la moIecula de DNA permite a la moltkula de DNA polimerasa, que acaba de sintetizar un fragmento de Okazaki sobre la hebra retrasada, reciclarse nipidamente, empezando de nuevo a sintetizar el siguiente fragmento de Okazaki sobre la misma hebra. Sin embargo, esta nipida disociaci6n supondria una dificultad para que la polimerasa sintetizara largas cadenas de DNA en la horquilla de replicaci6n, si no existiera una proteina accesoria que actua como una abrazadera regulada. Esta abrazadera mantiene la polimerasa firmemente unida al DNA cuando se desplaza, pero la libera en cuanto la polimerasa separa. iC6mo puede impedir una abrazadera que la polimerasa se disocie sin impedir al mismo tiempo que la polimerasa se desplace rapidamente a 10 largo de la molecula de DNA? La estructura tridimensional de la proteina abrazadera, determinada por difracci6n de rayos X, indica que esta proteina forma un amplio anillo alrededor de la helice de DNA. Un lado del anillo se une a la DNA polimerasa, y el anillo completo se desliza libremente a medida que la polimerasa se desplaza a 10 largo de la cadena de DNA (Figura 6-47). El ensamblaje de la abrazadera alrededor del DNA requiere hidr6lisis de ATP por proteinas accesorias especiales que se unen ala abrazadera y al DNA; se desconoce c6mo se desensambla la abrazadera cuando se separa del DNA.

Figura 6-46 Efecto de las proteinas que se unen a una sola hebra sobre la estructura de DNA de una sola hebra. Debido a que cada molecula proteica se une preferentemente a otra molecula que ya se ha unido previamente (union cooperativa), sobre las cadenas monocatenarias de DNA se forman largas hileras de estas prote(nas. Esta uni6n cooperativa provoca un estiramiento de la cadena patr6n de DNA, facilitando el proceso de polimerizaci6n. Las "helices en horquilla" que aparecen en la molecula de DNA de cadena sencilla se producen por apareamiento de bases entre cortas regiones de secuencias complementarias dentro de la propia cadena; son semejantes a las pequefias helices que se forman en todas las moIeculas de RNA.

Figura 6-47 El anillo deslizante regulado que une la DNA polimerasa al DNA. (A) Estructura del anillo deslizante de E. coli, con una helice de DNA afiadida para indicar c6mo se coloca la prote(na aIrededor del DNA. En las celulas eucariotas existe una prote(na similar. (B) llustraci6n esquematica de c6mo se cree que la abrazadera une una moIecula m6vil de DNA polimerasa aI DNA. (A, de x.-P. Kong et aI., Cell 69:425-437, 1992. © Cell Press.)

DNA polimerasa

5'"",,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,... 3'

..

r-

'.«.

" " ' " deslizante

5'"""""""",,,,,,,,,,,,,,

3'...........................

(B)

(A)

274

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

dos mitades de la abrazadera

polimerasa unida alDNA

Figura 6-48 Protelnas de la horqullla de replicaci6n del DNA, Se ilustran los principales tipos de proteinas que actl1an en la horquilla de replicaci6n, mostrando sus posiciones en el DNA.

\.~~cadena conductora patr6n

~

c~de~a recian slntetlzada

"

DNA polimerasa sobre la cadena conductora

_

- \o\,,~ halice de DNA padre

~

"

el pr6ximo fragmento de Okazaki empezara aqui ~

~NA2ce:b:a:do;r~~; ~~~::

fragmento de Oka~~~i.:/

__

DNA helicasa

DNA primasa

protefnas que se unen a una sola hebra

cadena retrasada patr6n DNA polimerasa sobre la cadena retrasada (acabando de sintetizar un fragmento de Okazaki)

En la horquilla de replicaci6n, una serie de protefuas cooperan entre sf formando una "maquina de replicaci6n"33 Apesar de que hemos presentado la replicaci6n del DNA como un proceso en el que participan una serie de protefnas de replicaci6n que actuan independientemente unas de las otras, en realidad muchas de estas protefnas se hallan unidas entre sf fo.rmando un gran complejo multienzimatico que se desplaza rapidamente a 16 largo del DNA. Este complejo puede compararse con una diminuta maquina de coser compuesta por piezas proteicas y accionada por la hidr6lisis de moleculas de nucle6sido trifosfato. A pesar de que este complejo de replicaci6n s610 se ha caracterizado completamente en la bacteria E. coli y en algunos de sus virus, el de los eucariotas es muy similar (vease pag. 383). Las funciones de las subunidades de esta "maquina de replicaci6n" se resumen en el diagrama bidimensional de la Figura 6-48 que muestra el complejo de replicaci6n completo. En la horquilla de replicaci6n actuan dos moleculas de DNA polimerasa identicas, una en la cadena conductora y la otra en la cadena retrasada. La helice de DNA se va abriendo mediante la acci6n de la molecula de DNA polimerasa de la cadena conductora que actua de forma concertada con una molecula de DNA helicasa que se va desplazando por la cadena retrasada; la apertura de la helice esta favorecida por moleculas de protefnas desestabilizadoras de la doble helice, que se unen de forma cooperativa. Mientras que la molecula de la DNA polimerasa que actua sobre la cadena conductora puede proceder de una forma continua, la molecula de DNA polimerasa que actua sobre la cadena retrasada ha de volver a empezar a intervalos, utilizando como cebador cortos segmentos de RNA sintetizados por una molecula de RNA primasa. La eficiencia de replicaci6n aumenta notablemente gracias a la estrecha asociaci6n de todos estos componentes proteicos. La molecula de primasa se une directamente a la DNA helicasa, formando una unidad sobre la cadena conductora, denominada prlmo~oma.Alimentado por la DNA helicasa, el primosorna se desplaza con la horqullia y va sintetizando cebadores de RNA a medida de avanza. De forma similar, la molecula de DNA polimerasa que sintetiza DNA sobre la cadena retrasada se desplaza de forma coordinada con el resto de protefnas, sintetizando una sucesi6n de fragmentos de Okazaki; para acomodar este ordenamiento, se cree que la cadena patr6n de DNA se va plegando de nuevo tal como se indica en la Figura 6-49. Asf pues, las protefnas de replicaci6n se mantienen unidas entre sf formando una gran unidad (masa total> 106 daltons) que Mecanismos de replicaci6n del DNA

275

cadena conductora patr6n

DNA primasa

DNA llelicasa '(\;\\ '"

~

\.:~~

cebador

fragmento de Okazaki

DNA polimerasa sobre la cadena retrasada (acabando de sintetizar un fragmento de Okazaki)

c?de~a

cadena retrasada patr6n

:":\.~~

:":\.~

- : . \.: recian slntetlzada --- \.:

se desplaza nipidamente a 10 largo del DNA, permitiendo la sfntesis de DNA en las dos direcciones de la horquilla de una forma coordinada y eficiente. Esta maquina de replicaci6n de DNA va dejando tras de sf series de fragmentos de Okazaki sobre la cadena retrasada, los cuales todavfa contienen en sus extremos 5' los pequefios trozos de RNA que actuaron como cebadores para su sfntesis. Estos trozos de RNA deberein ser eliminados y los fragmentos de DNA deberan ser unidos entre sf mediante enzimas reparadoras de DNA que actuarein detnis de la horquilla de replicaci6n (vease Figura 6-44).

Un sistema de correcci6n de galeradas que elimina los errores de replicaci6n producidos por la maquina de replicaci6n34 Las bacterias como E. coli son capaces de dividirse cada 30 minutos, por 10 que es relativamente sencillo estudiar grandes poblaciones buscando raros mutantes que tengan alterados determinados procesos. Una clase interesante de mutantes son los que contienen los llamados genes mutadores que incrementan de forma notable la frecuencia de mutaci6n espontanea. No es sorprendente que estos genes mutadores codifiquen una forma defectuosa de la exonucleasa correctora de pruebas 3' a 5' (discutida antes), que es una subunidad de la enzima DNA polimerasa (vease Figura 6-42). Cuando esta protefna es defectuosa, la DNA polimerasa ya no corrige de forma efectiva y en el DNA se van acumulando una serie de errores de replicaci6n, que normalmente son eliminados. EI estudio de otros mutantes de E. coli que presentan proporciones de mutaciones anormalmente elevadas ha permitido descubrir otro sistema de lectura

Figura 6-50 Modelo de la correcci6n de errores de apareamiento en eucariotas. Las dos protefnas que se muestran estan presentes tanto en bacterias como en celulas eucariotas: MutS se une especificamente a una pareja de bases err6nea mientras que MutL recorre el DNA vecino buscando una hendidura. Cuando encuentra una hendidura MutL dispara la degradaci6n de la cadena cortada, a todo 10 largo de la hendidura. Como en los eucariotas las hendiduras se encuentran fundamentalmente en las cadenas acabadas de replicar, se eliminan selectivamente los errores de replicaci6n. En las bacterias el mecanismo es el mismo excepto en que en el complejo otra protefna (MutH) corta las secuencias GATC no metiladas (es decir, acabadas de replicarl. iniciando el proceso que se ilustra aquf. Conocemos el mecanismo porque estas reacciones se han podido reconstituir en un sistema libre de celulas conteniendo protefnas bacterianas purificadas y DNA.

276

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

Figura 6-49 Una horquilla de replicaci6n en tres dimensiones. Visi6n actual de la situaci6n de las protefnas de replicaci6n sobre la horquilla de replicaci6n, cuando la horquilla se desplaza. Se ha modificado la estructura bidimensional de la Figura 6-48, plegando el DNA sobre la cadena conductora de forma que la molecula de la DNA polimerasa de la cadena retrasada y la molecula de la DNA polimerasa de la cadena conductora formen un complejo enzimatico. Este proceso de plegamiento tambien' consigue que el extremo 3' de cada complejo de Okazaki quede situado cerca dellugar de inicio del siguiimte fragmento de Okazaki (comparese con la Figura 6-48). Debido a que la DNA polimerasa de la cadena retrasada se une a las otras protefnas de replicaci6n, puede reutilizarse continuamente para sintetizar fragmentos de Okazaki; de esta forma, deja facilmente el fragmento de DNA que acaba de sintetizar y se desplaza hasta el fragmento de cebador de RNA, necesario para que se inicie la sfntesis del nuevo fragmento de DNA. N6tese que una de las helices de DNA hijas se dirige hacia la parte inferior derecha, mientras que la otra 10 hace hacia la parte superior izquierda de la figura.

r

r error de una hebra acabada de sintetizar

~ MutS

MutL

1

UNION DE PROTEfNAS CORRECTORAS DE ERRORES

1

EL RASTREO DEL DNA DETECTA HUECOS EN LA NUEVA HEBRA DE DNA

1

ELiMINACION DE LA HEBRA

SfNTESIS REPARADORA DE DNA

1

de pruebas 0 de verificaci6n de lectura que normalmente elimina errores de replicaci6n que no son detectados por el sistema de la exonucleasa. Este sistema de correccion de errores de apareamiento (mismatch proofreading) (tambien denominado sistema de reparaci6n de errores de apareamiento, mismatch repair system) se diferencia del sistema de reparaci6n del DNA que hemos descrito previamente en que no depende de la presencia de nucle6tidos anormales en el DNA que puedan ser reconocidos y eliminados. En lugar de ello, este sistema detecta la distorsi6n sobre el exterior de la helice que resulta de un desajuste entre bases normales que no son complementarias. Si este sistema de correcci6n de galeradas reconociera simplemente un error de ajuste en una cadena de DNA acabada de replicar y eliminara aleatoriamente uno de los dos nucle6tidos que no encajan, podria cometer el error de "corregir" la cadena patr6n original, de forma que una de cada dos ocasiones mantendria el error. Para que un sistema de correcci6n de galeradas sea realmente efectivo, ha de ser capaz de distinguir cmil es el nucle6tido equivocado y eliminarlo de la cadena (el error de replicaci6n) de forma especifica. El sistema de reconocimiento utilizado por el sistema de correcci6n de errores de apareamiento de E. coli depende de la metilaci6n de determinados residuos A del DNA. Transcurrido un cierto tiempo despues de que A se haya incorporado a la cadena de DNA acabada de sintetizar, se afiaden grupos metilo a todos los residuos A que se encuentren en la secuencia GATe. Debido a que unicamente contendnin secuencias GATC no metiladas las cadenas acabadas de sintetizar y que se hallen justo detnis de la horquilla de replicaci6n, sera posible distinguir estas cadenas de las originales que se han utilizado como patr6n. Mas recientemente se han descubierto proteinas en eucariotas que son hom610gas en su secuencia de aminoacidos a algunas de las proteinas bacterianas que catalizan la correcci6n de errores. Como era de esperar, cuando en una celula de levadura se eliminan los genes que codifican estas proteinas, la proporci6n de mutaciones puede incrementarse en mas de 100 veces. Sin embargo, puede haber algunas diferencias importantes entre los mecanismos de correcci6n de errores de bacterias y de eucariotas, ya que el mecanismo para distinguir la cadena acabada de sintetizar de la cadena patr6n en donde se halle un error no puede depender de la metilaci6n del DNA como en las bacterias, pues algunos eucariotas, como las levaduras y Drosophila, no metilan ninguna base de su DNA. Se sabe que las cadenas de DNA acabadas de sintetizar estan repletas de muescas en numerosos lugares, y se ha sugerido que en las celulas eucariotas estas muescas (nicks, roturas de una de las dos cadenas) constituyen la sefial que dirige las correcciones a la cadena adecuada (Figura 6-50).

Las horquillas de replicaci6n se inician en el origen de la replicaci6n35

origen de replicaci6n II

i!i!ii!i!!;III!!!!;I!I!!!!i!!!!!!l!!i!!!!:i:::!'!I!II:iiiiiiililillill,

APERTU~A LOCAL DE LA HELICE DE

I

DNA

11111illllllllllllI111111Iiilliii:iiiiliiC> SINTESIS DEL RNA CEBADOR

III i

1

'I II 111I1I11i11

LA NUEVA CADENA DE DNA INICIA LA S[NTESIS DE LA CADENA CONDUCTORA

",' Ii II'

LAS CADENAS CEBADORAS DE RNA INICIAN LA SfNTESIS DE CADENAS ADICIONALES DE DNA

1

I

~.Jlililiiliiliiiillliiiiiilj"".'ililillilill"~ liii"" ~ «,"';:

l!\\il\jt!"!!i"~I'I'I}llilllliilllilllll\ll\\i~\ ~'

• horquilla 1

horquilla 2 •

5e generan cl05 horquillas de replicaclon cornplctas, una de las cuales sn dcSpt L:1 fifJ\Hil, y Id utril que S8 despli:lz;:1 hdCid Id dcrt~ch;:1, con la cadena CO!lc1uctora en la par1e inferiur y la cadena retrasach-l (~I-l lil iJdrtc superior

Figura 6-51 Iniciaci6n de la horquilla de replicaci6n. La figura ilustra el proceso que participa en la iniciaci6n de la horquilla de replicaci6n, en el origen de la replicaci6n (vease tambien Figura 6-52).

Tanto en las bacterias como en los mamiferos, las horquillas de replicaci6n se originan en una estructura denominada burbuja de replicaci6n, una regi6n en la que las dos cadenas de la helice de DNA se separan una de la otra, actuando como patr6n para la sintesis de DNA (Figura 6-51). Se ha demostrado que en las bacterias, en las levaduras y en varios tipos de virus que crecen sobre celulas eucariotas las burbujas de replicaci6n se generan en secuencias especiales de DNA que reciben el nombre de origenes de replicacion y que pueden tener una longitud de 300 nucle6tidos. Por razones que no resultan claras, en los cromosomas de mamiferos resulta muy diffcil caracterizar estos origenes de replicaci6n a nivel molecular. En el caso de algunos origenes de replicaci6n bien definidos, ha sido posible reproducir in vitro la reacci6n de la horquilla de replicaci6n. Estos estudios in vitro revelan que en bacterias y en virus bacterianos, la formaci6n de la horquilla se produce como se ilustra en la Figura 6-52. Multiples copias de unas prote(nas iniciadoras se unen a lugares especificos del origen de replicaci6n enrollando el DNA a su alrededor y formando un gran complejo DNA-proteina. Entonces, este complejo une la DNA helicasa y la coloca sobre una zona de DNA de una sola cadena, Mecanismos de replicaci6n del DNA

277

origen de replicaci6n helice paterna rl-------'---"----'--.:...:....:.----'-----,1 de DNA

I I

UNION DE LA PROTEfNA DE INICIACION AL ORIGEN DE REPLICACION

UNION DE LA DNA HELICASA A LA PROTEfNA DE INICIACION

LA HELICASA SE UNE ALDNA

J

I I I

LA HELICASA ABRE LA HELICE Y UNE LA PRIMASA, FORMANDO EL PRIMOSOMA

DNA primasa

DNA cebador del RNA

polimerasa

Figura 6-52 Protefnas que inician la repllcaci6n del DNA. 5e indican los principales tipos de protefnas que participan en la formaci6n de la horquilla de replicaci6n en el origen de replicaci6n de E. coli y del bacteri6fago lambda. El conocimiento de los mecanismos que aqui se indican se obtuvo de estudios in vitro mediante la utilizaci6n de mezclas de proteinas altamente purificadas. Las etapas posteriores generanin la iniciaci6n de tres cadenas mas de DNA (vease Figura 6-51) mediante un mecanismo que todavia no esta aclarado. Para la replicaci6n de E. coli, la proteina de iniciaci6n es la proteina dnaA y el primosoma esta compuesto por las proteinas dnaB (DNA helicasa) y dnaG (RNA primasa).

LA S[NTESIS DEL CEBADOR PERMITE QUE LA DNA POLIMERASA INICIE LA PRIMERA CADENA DE DNA

en una region adyacente ala helice. Tambien se une la DNA primasa formando un primosoma, el cual se desplaza a partir del origen y genera un cebador de RNA que inicia la primera cadena de DNA. Rapidamente, las otras proteinas se ensamblan formando dos complejos proteicos de replicacion que se desplazan a partir de este origen en direcciones opuestas (vease Figura 6-51); asf, se continua sintetizando DNA hasta que se ha replicado todo el DNA patron de cada horquilla. En el Capitulo 8 se discute en detalle la iniciaci6n de la horquilla de replicacion en los cromosomas de eucariotas. .

Las DNA topoisomerasas evitan que el DNA se enrede durante la replicaci6n36 Cuando hemos descrito (de forma incorrecta) la helice de DNA como una "escalera" plana, hemos ignorado el "problema del enrollamiento y empaquetamiento" que se presenta durante la replicacion del DNA. Cada 10 pares de bases replicadas en la horquilla corresponden a una vuelta completa del DNA que se replica alrededor del eje de la doble helice. Por consiguiente, para que la horquilla de replicacion pueda desplazarse, todo el cromosoma que se halla por delante de la horquilla tendrfa que girar rapidamente (Figura 6-53), 10 cual exigirfa la utilizacion de grandes cantidades de energfa para el caso de los cromosomas largos. Durante la replicacion del DNA se utiliza una estrategia altemativa: unas protefnas conocidas como DNA topoisomerasas forman un "eslab6n giratorio" en la helice del DNA. Puede pensarse que una DNA topoisomerasa es una especie de nucleasa reversible que se une covalentemente a un fosfato del DNA rompiendo un enlace fosfodiester de una cadena del DNA. Dado que el enlace covalente que une la topoisomerasa al fosfato del DNA retiene la energfa del enlace fosfodiester roto, la reaccion de rotura es reversible; la nueva formaci6n del enlace fosfodiester es rapida y no requiere ninglin aporte adicional de energfa. En este aspecto el mecanismo de union es diferente al que presenta la enzima DNA ligasa, que hemos discutido previamente (vease Figura 6-37). 278

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

5'

cadena de DNA acabada _de sintetizar 5'

Figura 6-53 El "problema del enrollamiento" que aparece durante el proceso de repllcaci6n del DNA. 5i se trata de una horquilla de replicaci6n bacteriana que se desplaza a 500 nucle6tidos por segundo, la helice paterna de DNA, anterior a la horquilla, ha de girar a 50 revoluciones por segundo.

Figura 6-54 Reacci6n reversible de formaci6n de una muesca en el DNA, catallzada por una enzima DNA topoisomerasa I eucariota. Tal como se indica, estas enzimas forman un enlace covalente transitorio con el DNA, permitiendo asf la libre rotaci6n alrededor del enlace covalente unido al fosfato azul.

resultado de ello, la replicaci6n del DNA podrei ocurrir con la rotaci6n de tinicamente un corto tramo de helice -la zona que se halla justa por delante de la horquilla. El problema amilogo a este que aparece durante la transcripci6n del DNA, se resuelve de una forma similar a la descrita. Un segundo tipo de DNA topoisomerasa (la topoisomerasa II) forma una uni6n covalente con ambas cadenas de la helice de DNA al mismo tiempo, generando transitoriamente una rotura en las dos cadenas del DNA. Estas enzimas se activan por determinadas zonas del cromosoma en las que dos dobles helices se cruzan entre sf. Cuando la topoisomerasa se une a un lugar de cruce como este, (1) rompe una de las dobles helices, de forma reversible, generando una "puerta", (2) hace que la otra doble helice pase a traves de esta rotura, y (3) vuelve a unir las cadenas de DNA que habfa rota y se separa del DNA. De esta forma, las DNA topoisomerasas de tipo II pueden separar de forma eficiente dos cfrculos de DNA entrelazados (Figura 6-55). Esta misma reacci6n evita que se generen los graves problemas de embrollamiento que, de otra forma, aparecerfan durante la replicaci6n del DNA. Por ejemplo, se han aislado unas celulas de levadura mutantes que producen, en lugar de la topoisomerasa II normal, una versi6n que se inactiva a 37°C. Cuando las levaduras mutantes se calientan hasta esta temperatura, sus cromosomas se entrelazan de forma que en el proceso de la mitosis no pueden separarse. La utilidad de la topoisomerasa II para desenmarafiar los cromosomas puede ser facilmente comprendida por cualquiera que haya intentado deshacer un lio de un hilo de pescar sin la ayuda de unas tijeras.

La replicaci6n del DNA en los eucariotas es basicamente similar a la de los procariotas37 La mayorfa de 10 que conocemos respecto ala replicaci6n del DNA procede de estudios sobre sistemas multienzimaticos purificados a partir de bacterias y de bacteri6fagos, que son capaces de realizar in vitro la replicaci6n del DNA. El desarrollo de estos sistemas en los afios 1970 fue facilitado en gran manera gracias a la disponibilidad de mutantes en diversos genes de replicaci6n que pudieron utilizarse para identificar y purificar las correspondientes protefnas de replicaci6n. Mucho menos es 10 que se conoce acerca de los detalles de la enzimologfa de la replicaci6n del DNA en eucariotas, sobre todo debido a 10 diffcil que resulta obtener mutantes deficientes en procesos de replicaci6n. Sin embargo, los mecanismos basicos de la replicaci6n del DNA, incluyendo la geometrfa de la horquilla de replicaci6n y los componentes de la maquina de replicaci6n multiproteica, son similares en los eucariotas y en los procariotas fvease Figura 8-35). La principal diferencia estriba en que el DNA eucariota no se replica en forma de DNA desnudo sino en forma de cromatina, en la cual el DNA esta estrechamente asociado a unas protefnas denominadas histonas. Tal como se describe en el Capftulo 8, estas histonas forman unas estructuras parecidas a discos sobre las que se enrolla el DNA eucariota, generando una unidad estructural repetitiva denominada nucleosoma. Los nucleosomas estan distribuidos a 10 largo del DNA, a intervalos de 200 pares de bases, 10 cual puede explicar por que en los eucariotas los fragmentos de Okazaki se sintetizan sobre la cadena retrasada a intervalos de entre 100 y 200 nucleotidos en lugar de a intervalos de entre 1000 y 2000 nucle6tidos como ocurre en las bacterias. Los nucleosomas tambien pueden actuar como barreras que frenan ligeramente el movimiento de las moleculas de DNA polimerasa, 10 cual puede explicar por que las horquillas de replicaci6n se desplazan a una decima parte de la velocidad a la que se desplazan las horquillas de replicaci6n en las bacterias.

Resumen Una DNA polimerasa autocorrectora cataliza la polimerizacion de nucleotidos en direcciOn 5' a 3', copiando un patron de DNA con una fldelidad notable. Puesto que las dos cadenas de una doble helice de DNA son antiparalelas, esta slntesis 5' a 3' 280

Capitulo 6 : Mecanismos gemWcos,basicos

GD r-O (J) I

+

dos dobles helices de DNA circular estan entrelazadas

una DNA topoisomerasa de tipo II se une de manera covalente y reversible a las dos cadenas del DNA, interrumpiendo la doble helice verde y generando una "puerta" proteica

la puerta de la topoisomerasa se abre y se cierra. dejando pasar la otra helice de DNA

OO O0 .

t'-O

laS2dObies helices de DNA circular se han separado

la reaci6n inversade

~o~~/~~te

de la topOisomerasa restaura una doble helice intacta

Figura 6-55 DNA topoisomerasa II. Ejemplo de una reaccion de "paso a traves de la helice de DNA", catalizada por una topoisomerasa de tipo II. A diferencia de la topoisomerasa de tipo I, estas enzimas requieren la hidr6lisis de ATP, yalgunas de elias puede introducir en el DNA tension superhelicoidal (vease pag. 468). En eucariotas las topoisomerasas de tipo II se hallan exclusivamente en celulas proliferantes; en parte por esta razon, se utilizan como populares dianas para farmacos anticancerosos.

del DNA solo puede ocurrir de forma continua en una de las dos cadenas (la cadena conductora) de la horquilla de replicacion. En la cadena retrasada se sintetizan pequeftos fragmentos de DNA mediante un proceso de "pespunte". Debido a que la DNA polimerasa autocorrectora no puede iniciar la sintesis de una cadena de DNA, estos fragmentos de DNA sobre la cadena retrasada se inician mediante cortas moleculas de cebador de RNA, las cuales serlin eliminadas mas tarde y substituidas porDNA. La replicacion del DNA requiere la cooperacion de muchas proteinas, entre las cuales se encuentran: (1) una DNA polimerasa y una DNA primasa, que catalizan la polimerizaci6n de nucleosidos trlfosfato, (2) DNA helicasas y proteinas desestabilizadoras de la helice, que colaboran en abrir la helice de DNA que se va a copiar, (3) una DNA ligasa y una enzima que degrada los cebadores de RNA, uniendo los fragmentos de DNA de la cadena retrasada sintetizados de forma discontinua, (4) una DNA topoisomerasa que actdan solventando problemas de enrollamiento y enmaranamiento de la helice, y (5) proteinas iniciadoras que se unen a secuencias determinadas de DNA en el origen de la replicacion y catalizan la formacion de una horquilla de replicacion en este lugar. En ellugar de origen de la replicaciOn, seforma una estructura proteina-DNA especializada que entonces carga una DNA helicasa sobre el DNA patron. Entonces se agregan otras prote{nas formando una "mtiquina de replicaciOn" multienzimtitica, que cataliza la sintesis del DNA.

Recombinaci6n genetica38 En las dos secciones anteriores hemos estudiado los mecanismos a traves de los cuales las secuencias de DNA de las celulas se mantienen con muy pocos cambios, de generaci6n en generaci6n. A pesar de que esta estabilidad genetica es' crucial para la supervivencia a corto plazo, a largo plazo la supervivencia de los organismos puede depender de la variaci6n genetica, mediante la cualla celula puede adaptarse a las variaciones del ambiente. Asi, una propiedad importante del DNA en las celulas es su capacidad de experimentar reordenaciones que pueden hacer variar tanto las combinaciones particulares de genes que se hallan presentes en el genoma de cualquier individuo como el programa y el nivel de expresi6n de estos genes. Estas reordenaciones de DNA estan generadas mediante la recombinaci6n genetica. Se conocen dos grandes tipos de procesos de recombinaci6n genetica: la recombinaci6n general y la recombinaci6n especificade lugar. En la recombinaci6n general, el intercambio genico se produce entre secuencias hom6logas del DNA, generalmente localizadas sobre dos copias del mismo cromosoma. Uno de los ejemplos mas importantes al respecto es el intercambio de secciones entre cromosomas hom6logos en el transcurso de la meiosis. Este "entrecruzamiento" ("crossing-over") se produce entre cromosomas que se hallan estrechamente superpuestos durante las primeras etapas de la formaci6n de 6vulos y espermatozoides (se estudia en el Capitulo 20), y permite que diferentes versiones (alelos) del mismo gen se presenten y sean probadas en combinaci6n con otros genes, 10 cual incrementa la posibilidad de que por 10 menos algunos miembros de una poblaci6n sobrevivan en un ambiente cambiante. A pesar de que la meiosis s6lo se produce en los eucariotas, la ventaja de este tipo de intercambio de genes es tan grande que el apareamiento y la reordenaci6n de los genes mediante la recombinaci6n general se han extendido tambien a las bacterias. La recombinaci6n especifica de lugar no se produce unicamente entre DNA hom6logos. Por el contrario, el intercambio se produce entre cortas secuencias de nucle6tidos (sobre una 0 ambas moleculas de DNA que participan) reconocidas especificamente por una enzima de recombinaci6n especifica de lugar. As! pues, la recombinaci6n especifica de lugar altera las posiciones relativas de las secuencias de nucle6tidos en los genomas. En algunos casos, estos cambios estan disefiados y organizados, tal como ocurre cuando un virus bacteriano inteRecombinaci6n genetica

dos dobles helices hom61ogas de DNA

moleculas de DNA que se han entrecruzado

Figura 6-56 Recombinaci6n general. La rotUTa y nueva uni6n de dos dobles helices hom6logas da lugar ados moIeculas de DNA "entrecruzadas".

281

grade en un cromosoma bacteriano es inducido a dejar el cromosoma bajo condiciones de estres (vease Figura 6-80); en otros casos, los cambios son aleatorios, como sucede cuando la secuencia de DNA de un elemento transponible se inserta de forma aleatoria en un lugar del cromosorpa. AI igual que para la replicaci6n del DNA, la mayor parte de 10 que sabemos acerca de la bioquimica de la recombinaci6n genetica procede de estudios realizados sobre organismos sencillos, especialmente sobre E. coli y sobre virus.

moleculas de DNA que se han entrecruzado

La recombinaci6n general esbi guiada por interacciones de apareamiento de bases entre cadenas complementarias de dos moIeculas hom61ogas de DNA39 La recombinaci6n general implica la existencia de unos intermediarios del intercambio entre cadenas de DNA, dificiles de entender. A pesar de que la via exacta que se sigue en el proceso de recombinaci6n general puede ser ligeramente distinta en organismos diferentes, detallados amilisis geneticos de virus sobre el apareamiento de bacterias y de hongos sugieren que el resultado general de este proceso de recombinaci6n siempre es el mismo: (1) dos moleculas hom610gas de DNA se "entrecruzan", es decir, sus dobles helices se rompen y los dos extremos rotos se unen con los extremos opuestos formando de nuevo dos dobles helices intactas, pero cada una de elIas compuesta por partes de cada una de las dos moleculas iniciales de DNA (Figura 6-56). (2) Ellugar de intercambio (es decir, ellugar de la Figura 6-56 en el que la doble Mlice de color rojo se une a la doble helice verde) se puede producir en cualquier lugar de la secuencia de nucle6tidos de las dos mOlecUIas de DNA que participan en el proceso. (3) En ellugar de intercarnbio, una cadena de una de las moIeculas de DNA queda unida mediante apareamiento de bases a la otra molecula de DNA, genenindose

III i IIIIIII iii Iii Ii i iii iii i '"

1"11 I I I I I I I I I I I I I I I I I II

union heteroduplex, donde las cadenas procedentes de dos helices de DNA diferentes forman oares de bases

Figura 6-57 Una uni6n heteroduplex. Esta estructura junta dos moIeculas de DNA en ellugar donde se han entrecruzado. Este tipo de uni6n tiene, a menudo, varios cientos de nucle6tidos de longitud.

proteina recBCD

+ 111111!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!IIIIIIIII1II1111IIII11111111111111111111I11I11II111111IIII1I1111111

I I

UNION AL FINAL DE LA DOBLE HELICE Y POSTERIOR DESPLAZAMIENTO

lugar de \ reconocimiento lazo de cadena sencilla de DNA, que se va desplazando

ROTURA POR LA SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO

Ihi"hi"!i"!iill!i"iII"~I"iII"iII"""I""""""'''''''''ii1!i''!i''hihi!i'''IIII'''''' 3'

I

DESPLAZAMIENTO DEL ·PELO· DE UNA SOLA CADENA

3'

282

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos blisicos

Figura 6-58 Una forma de iniciar un proceso de recombinaci6n. La RecBCD es una enzima necesaria para que se produzca la recombinaci6n general en E. coli. La proteina entra en el DNA desde uno de sus extremos y, entonces, utiliza energia derivada de la hidr6lisis de moIeculas de ATP que se hallan unidas para autopropulsarse en una direcci6n determinada a 10 largo del DNA a una velocidad aproximada de unos 300 nucle6tidos por segundo. En un lugar especial de reconocimiento (una secuencia de DNA de 8 nucle6tidos desperdigada por el cromosoma de E. coll) se corta el lazo que ha sido generado por la proteina recBCD y que se va desplazando, y entonces, tal como se muestra en la figura, se genera un "pelo" monocadena que sobresale de la doble helice. Este "pelo" puede iniciar el proceso de recombinaci6n genetica apareandose con una Mlice hom610ga (vease Figura 6-59).

+

muesca

•

una de las cadenas queda al descubierto

intercambio inicial entre cadenas

I

una union solapada (que normalmente se denomina union heteroduplex) entre las dos dobles helices (Figura 6-57). La regi6n heteroduplex puede tener una longitud de varios cientos de bases apareadas; mas adelante se explicara c6mo se forman estas uniones. (4) En ellugar de intercambio no se altera la secuencia de nucle6tidos; el proceso de rotura y uni6n ocurre de una forma tan precisa, que ni se pierde ni se gana un s610 nucle6tido. A pesar de esta precisi6n la recombinaci6n general crea moIeculas de DNA cuya secuencia es nueva: la uni6n heteroduplex puede contener un pequeno numero de errores en el apareamiento de bases, y 10 que es mas importante, habitualmente los dos DNA que se entrecruzan no son exactamente el mismo a cada lado de la uni6n. El mecanismo general de recombinaci6n asegura que s610 se produzcan intercambios entre dos regiones de doble helice de DNA que presenten secuencias notablemente hom610gas. La formaci6n de una uni6n heteroduplex requiere esta homologia ya que en ella participa una larga regi6n de apareamiento entre bases complementarias entre una cadena de una de las dobles helices originales y una cadena de la otra doble helice. Pero, lc6mo se forma esta regi6n heteroduplex y c6mo se reconocen entre sf las dos regiones del DNA en la zona de entrecruzamiento? Por 10 que sabemos, el proceso de reconocimiento ocurre mediante interacciones directas de apareamiento de bases. La formaci6n de pares de bases entre cadenas complementarias de dos moleculas de DNA dirige el proceso de recombinaci6n general, permitiendo que este ocurra unicamente entre largas regiones de DNA cuyas secuencias se hallen apareadas.

Figura 6-59 EI intercambio inicial de cadenas entre dos dobles helices hom61ogas de DNA que estlin sufriendo un proceso de recombinaci6n general. La formaci6n de una muesca en una cadena del DNA libera dicha cadena, la cual invade la segunda helice y forma una corta regi6n de apareamiento entre bases. Solamente pueden aparearse de esta forma, y por 10 tanto iniciar un proceso de recombinaci6n general, dos moleculas de DNA cuya secuencia de nucle6tidos sea complementaria. Se sabe que existen algunas enzimas que pueden catalizar cada uno de los pasos mostrados en la figura (veanse Figuras 6-58 y 6-62).

La recombinaci6n general puede iniciarse en una muesca de una cadena de la doble helice de DNA40 Cada una de las dos cadenas de una molecula de DNA se halla enrollada de forma helicoidal alrededor de la otra. Por consiguiente, solamente se pueden producir largas interacciones entre bases de dos dobles helices si primero se genera una muesca (nick) en una cadena de una de elIas que permita los procesos de desenrollamiento y nuevo enrollamiento de las cadenas, procesos necesarios para que se produzca un heteroduplex con otra moIecula de DNA. Por esta misrna raz6n, cualquier intercambio de cadenas entre dos dobles helices de DNA requiere al menos dos muescas, una en una de las cadenas de cada una de las dos dobles helices que interactuan. Finalmente, para que se produzca la uni6n heteroduplex que se muestra en la Figura 6-57, cada una de las cuatro cadenas presentes se ha de cortar para que pueda unirse a otra cadena diferente. En la recombinaci6n general, estos procesos de formaci6n de las muescas y nueva uni6n estan coordinados de forma que unicamente se producen cuando se hallan presentes dos helices de DNA que presentan dos largas regiones de secuencia complementaria. A partir de diferentes fuentes resulta evidente que para que se inicie el proceso de recombinaci6n general es suficiente con que se produzca una sola Recombinaci6n genetica

283

interacciones que no producen apareamiento

interacciones que producen apareamiento

A

A

A

A C D

A

B

B

RAplDO PROGRESO "EN CREMALLERA" C C

C

B

NUCLEACI6N DE LA HELICE C

I

E D

D E

A

A

C E

E

E

E

E

D

D

E

E

D "'-

E

muesca en una cadena de una molecula de DNA. Por ejemplo, agentes qufmicos o tipos de radiaci6n que introducen una muesca en una cadena, desencadenan un proceso de recombinaci6n genetica. Ademas, se ha demostrado que una de las protefnas especiales que son necesarias para que se produzca la recombinaci6n en E. coli -la protefna RecBCD- produce muescas en las cadenas sencillas de las moleculas de DNA. La protefna RecBCD tambien es una DNA helicasa que hidroliza ATP y se desplaza a 10 largo de la helice de DNA exponiendo transitoriamente sus cadenas. Combinando sus actividades nucleasa y helicasa, la protefna RecBCD genera un "pelo" de una sola cadena en la doble heIice de DNA (Figura 6-58). En la Figura 6-59 se muestra de que forma este "pelo" puede iniciar una interacci6n de apareamiento de bases entre dos dobles helices complementarias que se hallen estiradas.

Las reacciones de hibridaci6n del DNA proporcionan un modelo sencillo para la fase de apareamiento de bases en la recombinaci6n general41 En su forma mas sencilla, la reacci6n central de apareamiento de bases de la recombinaci6n general puede ser simulada en un tubo de ensayo permitiendo que una doble helice de DNA se forme de nuevo a partir de sus cadenas separadas. Este proceso, denominado renaturalizaci6n del DNA 0 hibridaci6n del DNA tiene lugar cuando una rara colisi6n al azar yuxtapone secuencias nucleotfdicas complementarias de dos cadenas sencillas de DNA, 10 cual permite la formaci6n de una corta zona de doble helice entre elIas. Este proceso relativamente lento de nucleaci6n de fa helice viene seguido de un proceso "en cremallera" muy rapido, en el que la doble helice crece aumentando al maximo el mlmero de interacciones entre pares de bases (Figura 6-60). La formaci6n, de esta manera, de una doble helice requiere que las cadenas de DNA se hallen en una conformaci6n abierta, desplegada. Por esta raz6n, las reacciones de hibridaci6n in vitro. se desarrollan a elevadas temperaturas 0 en presencia de disolventes organicos como la formamida; estas condiciones permiten "fundir" las cortas helices en horquilla que se forman cuando se producen interacciones entre pares de bases en una cadena que se pliega sobre sf misma. Las celulas bacterianas no pueden soportar condiciones tan severas como estas, por 10 que para abrir las helices utilizan una protefna desestabilizadora de la helice, la protefna SSE. Esta protefna es esencial en E. coli tanto para la replicaci6n del DNA como para la recombinaci6n general; se une fuertemente de forma cooperativa al esqueleto de azl1car-fosfato de cualquier regi6n de una sola cadena de DNA, colocandola en una conformaci6n extendida con sus bases asequibles. (vease Figura 6-46). En esta conformaci6n extendida, una cadena de DNA puede formar pares de bases tanto con una molecula de nucle6sido trifosfato (en el 284

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos ba.sicos

Figura 6-60 Hibridaci6n del DNA. Se vuelven a formar dobles helices de DNA a partir de sus cadenas separadas a traves de reacciones que dependen de la colisi6n al azar de dos cadenas complementarias (vease pag. 322). Muchas de estas colisiones no son productivas, como se muestra a la izquierda, pero algunas de ellas dan lugar a cortas regiones en las que se producen apareamiento entre bases (nucleaci6n del DNA). Entonces, un rapido proceso "en cremallera" completa cada helice. Cada cadena de DNA puede utilizar este proceso de "prueba y error" para encontrar su pareja complementaria entre los millones de cadenas de DNA no apareadas. AI parecer, todos los procesos de recombinaci6n general se inician mediante un reconocimiento de cadenas complementarias mediante este sistema de "prueba y error".

Figura 6-61 Estructura de la proteina RecA. Se muestra una cadena de tres mon6meros de RecA, con la posici6n del ATP marcada en rojo. Las esferas blancas muestran las posiciones posibles que ocupan los filamentos de DNA de cadena sencilla, de forma que cada tres nucle6tidos (tres esferas) interaccionarian con cada mon6mero de RecA. (De R.M. Story, LT. Weber y T.A. Steitz. Nature 256:318-325,1992. © 1992 Macmillan Magazines Ltd.)

proceso de replicaci6n del DNA) como con secciones complementarias de otra cadena de DNA (en el proceso de recombinaci6n genetical. Cuando las reacciones de hibridaci6n se desarrollan in vitro bajo condiciones que reproducen las del interior de la celula, la proteina SSB actua a una velocidad 1000 veces superior a la de la nucleaci6n de la helice de DNA, esto es, a la velocidad general del proceso de formaci6n de la doble helice.

La proteina RecA permite a una moIecula de una sola cadena de DNA aparearse con una regi6n hom6loga de una doble helice enE. COli 42 El proceso de recombinaci6n genetica general es algo mas complejo que las simples reacciones de hibridaci6n descritas anteriormente. En el curso de la recombinaci6n general una hebra de DNA derivada de una doble helice puede invadir otra doble helice (vease Figura 6-59). En E. coli, este proceso requiere la participaci6n de la proteina RecA, producida por el gen reeA, gen que en 1965 fue identificado como esencial para la recombinaci6n entre cromosomas. Largamente perseguido por los bioquimicos, en 1976 este escurridizo producto genico fue finalmente purificado hasta homogeneidad y pudo ser caracterizado en detalle (Figura 6-61). Como proteina desestabilizadora de la doble Mlice (SSB), la proteina RecA se une fuertemente a una cadena de DNA, formando agregados altamente cooperativos, dando lugar a un filamento nucleoproteico. Este filamento tiene algunas propiedades caracterfsticas. Por ejemplo, tiene mas de un lugar de uni6n al DNA, por 10 que puede unirse simultaneamente y mantener juntas a una cadena sencilla y a una doble helice de DNA. Estos lugares permiten a la proteina RecA catalizar una reacci6n de varias etapas (denominada sinapsis) entre una doble helice de DNA y una regi6n hom610ga de una cadena de DNA. La etapa crucial de la sinapsis ocurre cuando una regi6n de homologia es identificada mediante un apareamiento inicial de bases entre secuencias complementarias de nucle6tidos. En este caso en la etapa de nucleaci6n participa una estructura de triple cadena en la que el DNA de cadena sencilla forma apareamientos no habituales de bases con el surco mayor del DNA de doble heIice (Figura 6-62). Esta interacci6n inicia al proceso de apareamiento mostrado previamente en la Figura 6-59, y de esta forma inicia el intercambio de cadenas entre dos dobles helices recombinantes de DNA. Diversos estudios in vitro sugieren que la proteina SSB de E. coli coopera con la proteina RecA facilitando estas reacciones. Recombinaci6n genetica

285

DNA DE ENTRADA

DNA DE SALIDA

5' 3'

Una vez se ha producido el proceso de sinapsis, la corta region heteroduplex farmada por cadenas procedentes de dos moltkulas diferentes de DNA se alarga mediante una migraci6n de las cadenas dirigida por una proteina, que tambien esta catalizada par la protefna RecA. La migraci6n de la bifurcaci6n 0 de las cadenas (branch migration) puede producirse en cualquier punta en el que dos cadenas sencillas de DNA de la misma secuencia intenten emparejarse con la misma cadena complementaria; una region no apareada de una de las cadenas sencillas de DNA desplazara a otra cadena sencilla que se halle apareada, de forma que el punto de la bifurcacion se desplazara sin que vaffe el numero total de pares de bases del DNA. El punto de bifurcacion tiende a desplazarse espontaneamente en ambas direcciones, de forma que no resultarfa sencillo que el proceso de recombinacion se completara de forma eficiente (Figura 6-63A). Debido a que la protefna RecA cataliza la migracion unidireccional del punto de bifurcacion, facilmente se produce una region heteroduplex de varios cientos de pares de bases de longitud (Figura 6-63B). La catalisis de la migracion de la bifurcacion depende de otra propiedad de la protefna RecA. Ademas de presentar dos lugares de union al DNA, la protefna RecA es una ATPasa DNA-dependiente con un lugar adicional para unir e hidrolizar ATP. Cuando la proteina esta unida aATP se asocia mucho mas fuertemente con DNA que cuando esta unida a ADP. Ademas, las moleculas RecA unidas a ATP se unen preferentemente a un extremo de un filamento de proteinas RecA, y entonces el ATP se hidroliza a ADP. Los filamentos de proteinas RecA que se forman sobre el DNA pueden entonces presentar muchas de las propiedades dinamicas de uni6nque presentan los filamentos del citoesqueleto farmados a partir de actina 0 de tubulina (discutidas en el Capitulo 16); par ejemplo, esta cadena proteica presenta la habilidad de girar como una noria, de forma unidireccional, a 10 largo de una cadena de DNA, 10 cual puede dirigir la reacci6n de migraci6n de la bifurcacion, tal como se muestra en la Figura 6-638.

ITi~:::::::::::::::::::;:::;;;~l;

3' 3'

5'

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3'

III~jjljill

direcci6n del ensamblaje de las proteinas RecA

t

-.

!I~:::;::::::::::::::::;;:;;;::;:::;;~" (A) MIGRACION ESPONTANEA DE LAS CADENAS

2R6

(B) MIGRACION DIRIGIDA POR PROTEfNA

r.lInftnl0 I'> : Mecanismos I!eneticos basicos

Figura 6-62 Sinapsis de DNA catalizada por la protema RecA. Experimentos in vitra indican que entre estructuras de una sola cadena de DNA recubierta de protefnas RecA (rajo) y una doble helice (verde), se forman diferentes tipos de complejos. En primer lugar, se forma un complejo sin que se produzca apareamiento de bases que se transforma en un complejo con apareamiento de bases en cuanto se encuentra una regi6n de secuencia hom610ga. Probablemente este complejo es inestable ya que esta formado por una forma de DNA poco usual, y genera un DNA heteroduplex (una hebra verde y la otra raja) mas una hebra sencilla desplazada de la helice original (verde); asf, la estructura mostrada en este diagrama migra hacia la izquierda enrollando el DNA de "entrada" y produciendo el DNA "de salida". El resultado neto es un intercambio de hebras identico al descrito anteriormente en la Figura 6-59. (Adaptado de S.C. West, Annu. Rev. Biochem. 61:603-640, 1992. © Annual Reviews Inc.)

Figura 6-63 Dos tipos de migraci6n de las cadenas, observados en experimentos in vitro. (A) La migraci6n espontanea es un tipo de proceso en el que las cadenas se mueven arriba y abajo, de forma aleatoria, con 10 que progresa muy poco sobre distancias largas. Por el contrario, la migraci6n dirigida por la protefna RecA (B) se produce a una \Telocidad uniforme y en una sola direcci6n; puede estar dirigida par el ensamblaje polarizado del filamento de protefnas RecA sobre la cadena sencilla de DNA, la cual ocurre en la direcci6n indicada. Ademas, en la recombinaci6n participan helicasas que catalizan la migraci6n de cadenas dirigida por protefnas, incluso con mas eficiencia.

La recombinaci6n genetica general habitualmente supone un intercambio cruzado de cadenas 0 entrecruzamiento 43 Parece que el paso mas dificil y mas lento del proceso de recombinaci6n genica general es el intercambio de una cadena sencilla entre las dos dobles helices (vease Figura 6-59). Tras este intercambio inicial, parece que la ampliaci6n de la regi6n de apareamiento y el establecimiento de otros intercambios entre cadenas de las dos dobles helices que se hallan en estrecho contacto son procesos rapidos. Durante estos procesos, a menudo se produce la eliminaci6n de una pequefia cantidad de nude6tidos y la resintesis local de DNA, de forma parecida a como ocurre en los procesos de reparaci6n del DNA. Debido al elevado mlmero de posibilidades que pueden darse, es facH que diferentes organismos puedan seguir diferentes pasos en este punto. En la mayoria de los casos, sin embargo, se forma una importante estructura intermediaria, un intercambio cruzado de cadenas 0 entrecruzamiento (cross-strand exchange), en la que participan las dos helices de DNA. En la Figura 6-64 se muestra una de las vias mas sencillas a traves de la cual se puede formar esta estructura: En el intercambio cruzado de cadenas (tambien denominado "union de Holliday") las dos helices homologas de DNA que inicialmente se aparearon se mantienen unidas mediante el intercambio mutuo de dos de las cuatro cadenas presentes, una de cada helice. Para mantener esta estructura no es necesario que se rompan pares de bases; la estructura presenta dos propiedades importantes: (1) el punto de intercambio entre las dos dobles helices hom610gas de DNA (en la Figura 6-64, ellugar donde las dos cadenas se cruzan) puede migrar rapidamente en una u otra direcci6n siguiendo las helices, mediante una migracion de doble cadena; (2) el intercambio cruzado de cadenas consta de dos pares de cadenas: uno de cadenas cruzadas y el otro de cadenas no cruzadas. Sin embargo, la estructura puede isomerizar al sufrir la serie de movimientos de rotacion que se muestran en la Figura 6-65, de forma que las dos cadenas que originalmente no se entrecruzaban ahora si que se entrecruzan, y viceversa. Con el fin de regenerar dos helices de DNA separadas y de conduir asi el proceso de apareamiento, las dos cadenas entrecruzadas se han de cortaro Si las dos cadenas entrecruzadas se cortan antes de la isomerizaci6n del entrecruzamiento, las dos helices originales de DNA se separan en forma casi inalterada, habiendose intercambiado un fragmento muy corto de DNA de una sola cadena. Sin embargo, si las dos cadenas entrecruzadas se cortan despues del proceso de isomerizaci6n, un trozo de cada una de las dos helices originales quedara unido, mediante una uni6n heteroduplex, a una zona de la otra helice de DNA: en otras palabras, las dos helices de DNA se habran entrecruzado (vease Figura 6-65). La isomerizacion de las cadenas cruzadas puede ocurrir espontaneamente a una cierta velocidad, pero tambien puede estar dirigida enzimaticamente 0 regulada por las celulas de alguna otra forma. Probablemente, durante la meiosis se produce algtin tipo de control, cuando las dos dobles helices de DNA que se emparejan se constrifien en una elaborada estructura denominada complejo sinaptonemico (como se discute en el Capitulo 20).

des helices hem61egadas de DNA

FORMACl6N DE UNA MUESCA E INTERCAMBIO DE CADENAS

FORMACl6N DE UNA

I MUESCA E INTERCAMBIO + DE CADENAS

I UNI6N DE LAS + CADENAS ROTAS

des meh3culas de DNA unidas per un entrecruzamiente de cadenas

Figura 6-64 Formaci6n de un entrecruzamiento de cadenas. Existen muchas vias diferentes que pueden conducir desde un entrecruzamiento entre cadenas (vease Figura 6-59) a un intercambio de cadenas, aunque en la figura se muestre una sola de ellas.

La conversi6n genica se produce combinando procesos de recombinaci6n general y de sfntesis limitada de DNA44 Una ley fundamental de la genetica dice que la contribuci6n genetica de cada uno de los padres al hijo es identica: se hereda un juego completo de genes del padre y otro de la madre. Asi, cuando una celula diploide entra en meiosis produciendo cuatro celulas haploides (vease Capitulo 20), exactamente la mitad de los genes de estas celulas han de proceder de la madre (los genes que la celula diploide hered6 de la madre) y la otra mitad, del padre (los genes que la celula diploide hered6 del padre). En un animal pluricelular, como es el caso del hombre, no es posible comprobar directamente si se cumple esta predicci6n, pero en Recombinaci6n genetica

287

Figura ()-()5 Isomerizaci6n de un entrecruzamiento de cadenas. Si no se ha producido la isomerizaci6n, el corte de las dos cadenas cruzadas finaliza el intercambio sin que se haya producido entrecruzamiento. Si se produce isomerizaci6n (etapas B y el, el proceso de corte de las dos cadenas produce dos moleculas de DNA que se han entrecruzado (abajol. Por consiguiente, se cree que la isomerizaci6n es necesaria para que el proceso de rotura y nueva uni6n de dos dobles helices hom610gas de DNA de lugar a una recombinaci6n general. La etapa Aya se ha ilustrado antes (vease Figura 6-64).

dos cromosomas hom61ogos

A

otros organismos, como en los hongos, en los que es posible recuperar y analizar cada una de las cuatro celulashijas producidas por meiosis a partir de una unica celula, se pueden encontrar muchos casos en los que aparentemente se han violado las reglas geneticas estandar. Por ejemplo, ocasionalmente la meiosis produce tres copias de la version materna (alelos) de un gen y una sola copia del alelo paterno, 10 cual pone de manifiesto que una de las dos copias del alelo paterno ha sido cambiada a una copia del alelo materno. Este fenomeno se conoce como conversion genica. A menudo ocurre en asociacion con los procesos de recombinaci6n genetica general, y se cree que es importante en la evolucion de ciertos genes (vease Figura 8-74). Parece ser que la conversion genica tiene unas consecuencias directas sobre los mecanismos de recombinacion general y de reparacion del DNA. Durante la meiosis, se forman uniones heteroduplex en los lugares de entrecruzamiento de cromosomas homologos maternos y paternos. Si las secuencias maternas y paternas son ligeramente diferentes, la union heteroduplex puede incluir algunos errores de apareamiento de bases. Estos errores en la doble helice pueden ser corregidos por la maquinaria de reparacion del DNA, la cual puede eliminar los nucleotidos de la cadena paterna y reemplazarlos por nucleotidos complementarios a los de la cadena materna, 0 viceversa. La consecuencia de ese sistema de reparaci6n sera una conversion genica. Tambien se puede dar una conversion genica mediante otros mecanismos, pero todos ellos requieren la existencia de algun tipo de proceso de recombinacion que una entre sf dos copias de dos secuencias de DNA fuertemente relacionadas. Debido a que se genera una copia extra de una de las dos secuencias de DNA, en el proceso tambien ha de participar una pequefia parte de biosfntesis de DNA. Estudios geneticos muestran que normalmente la conversion genica afecta a pequefias zonas de DNA, y que en muchos casos unicamente se cambia una parte de un gen. La conversion genica tambien puede ocurrir en celulas en mitosis, aunque esto solo se produce raramente. Tal como ocurre en celulas en meiosis, probablemente los procesos de conversion genica que se producen en las celulas en mitosis aparecen como consecuencia de procesos de reparacion de aparejamiento de bases en el DNA heteroduplex. En la Figura 6-66 se ilustra otro mecanismo que probablemente se produce en celulas en mitosis y en celulas en meiosis.

FORMACI6N DE UNA ESTRUCTURA DE INTERCAMBIO DE CADENAS CRUZADAS

j

CORTE DE LAS DOS CADENAS DE DNA CRUZADAS

Los mecanismos de correcci6n de errores pueden evitar la recombinaci6n genetica promiscua entre dos secuencias de DNA mal apareadas 45 Como hemos discutido antes, la recombinaci6n general se dispara cuando dos cadenas de DNA de secuencia complementaria se emparejan formando un heteroduplex entre dos dobles helices (vease Figura 6-64). Experimentos lIevados a cabo in vitro con protefna RecA purificada muestran que puede ocurrir el emparejamiento de forma eficiente incluso cuando las secuencias del DNA no se apareen bien -por ejemplo, cuando solo un promedio de cuatro de cada cinco nucleotidos formen parejas de bases. Siendo asf, ide que forma pueden las celulas de vertebrados evitar la recombinaci6n general promiscua entre los varios cen288

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

cromosomas que se han entrecruzado

muesca

S

/

~

••••••••••••••••••••••••••••••••).1•••••••••••• 3'

5' 3'

helice de DNA

5' helice de DNA

la DNA polimerasa desplaza una cadena de la helice roja; entonces, esta hebra se aparea con la helice verde

1

etapa 1

.........................................

.........E- .

la DNA polimerasa se para, el exceso de DNA de cadena sencilla es degradado por nucleasas y todos los cortes reparados

1

etapa 2

, ............................................... la replicaci6n normal del DNA produce tres alelos rojos y un alelo verde del gen X

1

etapa 3

Figura 6-66 Proceso de recombinaci6n general que puede causar conversi6n genica. EI proceso empieza cuando se produce una muesca en una de las cadenas de la helice de DNA raja. En la etapa Iia DNA polimerasa inicia la sintesis de una copia extra de una de las cadenas de la Mlice raja, desplazando la copia original como una hebra sencilla. Esta hebra sencilla se aparea con la region homologa de la Mike verde, como se muestra en la Figura 6-59. En la etapa 2, la corta region no apareada de la cadena verde producida en la etapa I es degradada, completandose la transferencia de secuencias de nucleotidos. EI resultado normalmente se observa en el siguiente cicio celular, despues de que la replicacion del DNA haya separado las dos cadenas no apareadas (etapa 3). Como se describe en el texto, la reparacion de errores de apareamiento de pares de bases en una union heteroduplex tambien produce conversion genica.

RESULTADO NETO: UN ALELO VERDE DEL GEN X SE HA CONVERTIDO EN UN ALELO ROJO

tenares de copias de DNA de secuencias estrechamente relacionadas que se haHan repetidas en sus genomas- (vease pag. 423) ? A pesar de que no conocemos la respuesta a esta pregunta, diversos estudios en bacterias y levaduras han demostrado que los mismos sistemas de correcci6n de errores de apareamiento que eliminan los errores de replicaci6n (vease Figura 6-50) tambien interrumpen los procesos de recombinaci6n genetica general entre secuencias de DNA que se emparejan de forma imperfecta. Se conoce, por ejemplo, que los genes hom610gos de las dos bacterias estrechamente relacionadas Escherichia coli y Salmonella typhimurium generalmente no se recombinan, a pesar de que, como sabemos, sus secuencias de nucle6tidos son identicas en un 80%; sin embargo, cuando el sistema de correcci6n de errores de apareamiento se halla inactivado por mutaci6n, la frecuencia de estos procesos de recombinaci6n interespecies se incrementa unas 1000 veces. As!, sabemos que el sistema de correcci6n de errores de apareamiento reconoce normalmente las bases mal apareadas de un intercambio de cadenas inicial e impide los pasos posteriores necesarios para que se produzca la rotura y nueva uni6n de las dos helices emparejadas. Este mecanismo protege el genoma bacteriano de cambios de secuencia que, de otra forma, se producirian mediante recombinaci6n con moleculas de DNA que ocasionalmente entran en la celula. Se cree que en las celulas de vertebrados, que contienen muchas secuencias de DNA estrechamente relacionadas, este mismo tipo de sistema de correcci6n ayuda a impedir que se produzcan procesos de recombinaci6n promiscua que, de otra forma, mezclarian el genoma (Figura 6-67).

Enzimas de recombinaci6n especffica de lugar ponen y quitan del genoma secuencias especiales de DNA46 Adiferencia de la recombinaci6n general, la recombinaci6n genetica especitlca de Ingar esta guiada por una enzima de recombinaci6n que reconoce secuenRecombinaci6n genetica

289

/

secuencias repetidas, similares pero no identicas " "

1 1 LA DETECCI6N DE UN ERROR ABORTA EL APAREAMIENTO E IMPIDE LA RECOMBINACI6N

!,rmRCAMBIO DE CADENAS

j

r= - -

=?::v=e:~::~--=c=~~_

1

OCURRE RECOMBINACI6N 51 LA CORRECCI6N DE ERRORE5 FALLA

+

cias especfficas de nucle6tidos presentes en una 0 en ambas mohkulas de DNA que se recombinan. No es necesario que se produzca un apareamiento de bases entre las moleculas de DNA que se recombinan, e incluso cuando este se produce, la uni6n heteroduplex que se forma es tan s610 de unos cuantos pares de bases de longitud. Separando y volviendo a unir moltkulas de DNA de doble hebra en lugares determinados, este tipo de recombinaci6n permite que varios tipos de secuencias de DNA se desplacen dentro y entre cromosomas. La recombinaci6n especffica de lugar fue descubierta como el sistema mediante el cual un virus bacteriano, el bacteri6fago lambda, traslada su genoma dentro y fuera del cromosoma de E. coli. En su estado integrado el virus esta escondido en el cromosoma bacteriano y se replica como parte del DNA del huesped. Cuando el virus entra en una celula, se sintetiza una enzima codificada por el genoma del virus, la llamada integrasa lambda. Esta enzima cataliza un proceso de recombinaci6n que se inicia cuando mUltiples copias de la proteina integrasa se unen fuertemente a una secuencia especial del DNA del cromosoma circular del bacteri6fago. Ahora, el complejo resultante DNA-proteina puede unirse a otra secuencia especial de DNA del cromosoma bacteriano, uniendo estrechamente entre sf el cromosoma de la bacteria y del bacteri6fago. Entonces, la integrasa cataliza las reacciones necesarias de corte yempalme, utilizando una corta regi6n de homologia de secuencia para formar en el punto de uni6n una diminuta uni6n heteroduplex (Figura 6-68). La integrasa se parece a una DNA topoisomerasa en que forma una uni6n covalente reversible con el DNA en ellugar en el que rompe la cadena de DNA. El mismo tipo de mecanismo de recombinaci6n especffica de lugar puede realizarse a la inversa por el bacteri6fago lambda, permitiendole salir de su lugar de integraci6n en el cromosoma de E. coli para multiplicarse rapidamente en la celula bacteriana. Esta reacci6n de eliminaci6n esta catalizada por un complejo de la enzima integrasa y otra protefna del bacteri6fago, la cual se sintetiza por el virus unicamente cuando la celula huesped esta estresada. Si los lugares reconocidos por una enzima de recombinaci6n como esta se sueltan, entonces el DNA comprendido entre ellos en lugar de ser eliminado sera invertido (vease Figura 9-57). Muchas otras enzimas que catalizan procesos de recombinaci6n especifica de lugar se parecen a la integrasa lambda en que requieren una corta regi6n de secuencias identicas de DNA sobre las dos regiones de la helice de DNA que se 290

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos blisicos

Figura 6-67 La correcci6n de errores impide que se produzca recombinaci6n general a partir de genomas desestabilizados que contienen secuencias repetidas. Estudios en bacterias y levaduras sugieren que el sistema de correcci6n de errores descrito previamente en la Figura 6-50 tiene la funci6n adicional descrita aqui.

cromosoma circular del bacteriofago lambda

( secuencias de lugar de union

cromosoma bacteriano

-=======::::::====== LA INTEGRASA SE UNE

CATAuSIS DE ROTURA Y NUEVA UNION DE LA DOBLE

1

complejo proteico de la integrasa lambda

!

1

=H=EBRA=§;;~S·ii2~;P=_

t-=======:::-::::=======:::::=====LAINTEGRASA SE DISOCIA

I

Figura 6-68 La inserci6n de DNA del bacteri6fago lambda en el cromosoma bacteriano. En este ejemplo de reeombinaci6n especifiea de lugar la enzima integrasa lambda se une a una secuencia de DNA "de union" de eada cromosoma, mientras haee cortes que generan eortas seeuencias hom6logas de DNA; entonees la integrasa cambia las hebras y las une, formando una uni6n heterodl1plex de 7 pares de bases de longitud. Cada una de las reacciones de rotma de cadenas y de uni6n de eadenas requiere nuevas uniones, que estan producidas por la DNA topoisomerasa, mientras que la energia de rotma de un enlace fosfodiester se almacena en una union covalente transitoria entre el DNA y la enzima (vease Figura 6-64).

I

DNA del bacteriofago integrado en el cromosoma bacteria no

van a unir. Debido a este requerimiento, cada una de las enzimas de esta clase es relativamente exigente respecto a las secuencias de DNA que recombina, de forma que puede esperarse que catalice un proceso determinado de uni6n que sea litil para el virus, el plasmido, el elemento transponible 0 la celula que la presenteo Estas enzimas pueden utilizarse como herramientas en animales transgenicos para estudiar la influenciade determinados genes sobre el comportamiento celular, como se ilustra en la Figura 6-69. Las enzimas de recombinaci6n especifica de lugar que cortan y vuelven a unir dos dobles helices de DNA, a menudo 10 hacen de una manera reversible: como el caso del bacteri6fago lambda, el mismo sistema enzimatico que une dos moleculas de DNA tambien puede separarlas de nuevo, recuperando de forma precisa la secuencia de ambas moleculas originales de DNA. Por ella, este tipo de recombinaci6n se denomina recombinaci6n conservativa espec(fica de lugar para distinguirla de la recombinaci6n transposicional espec(fica de lugar, mecanisticamente diferente, que exponemos a continuaci6n.

La recombinaci6n transposicional puede insertar un elemento genetico m6vil en cualquier secuencia de DNA47 Muchas secuencias m6viles de DNA, incluyendo muchos virus y elementos transponibles, codifican integrasas que insertan su DNA en un cromosoma a traves de un mecanisme diferente del que utiliza el bacteri6fago lambda. Como la integrasa lambda, cada una de estas enzimas reconoce una secuencia especifica de DNA del elemento genetico m6vil cuya recombinaci6n cataliza. A diferencia de la enzima de lambda, sin embargo, estas enzimas no requieren una secuencia de DNA "diana" especifica y no forman ninguna uni6n heterodliplex. En lugar de ello, introducen cortes en ambos extremos de la secuencia lineal de DNA del elemento genetico m6vil y catalizan un ataque directo de estos extremos de DNA sobre la molecula de DNA diana, rompiendo dos enlaces fosfodiester cercanos de la molecula diana. Debido a como estan construidos estos cortes, en la molecula de DNA recombinante quedan dos pequeuos huecos de una sola heliRecombinaci6n genetica

291

unidad de transcripci6n

gen de interes sin el promotor

lugares reconocidos por la enzima de recombinaci6n

I

gen marcador

---<=

ACTIVACI6N TEMPORAL DE LA ENZIMA DE RECOMBINACI6N

~~_:.

cromosoma

(A)

•• ~ . ..... . . 41

(B)

promotor

lugar de terminaci6n

•

,

•

•

I

•

celulas ocasionales pierden el gen marcador y expresan el gen de interes

cada una de las celulas de un cion de celulas que ha perdido el gen marcador expresara el gen de interes

ce, una a cada extremo del elemento m6vil; estos huecos son rellenados par una DNA polimerasa, completandose asi el proceso de recombinaci6n. Tal como se ilustra en la Figura 6-70, este mecanismo genera una carta duplicaci6n de la secuencia de DNA diana adyacente; estas duplicaciones flanqueantes constituyen el sella que permite reconocer un proceso de recombinaci6n especifica de lugar, de este tipo. A partir del bacteri6fago Mu se ha purificado en forma activa una integrasa de este tipo. Como la integrasa del bacteri6fago lambda, realiza todas las operaciones de corte y empalme sin necesidad de ninguna fuente de energia (como el ATP). Existen enzimas semejantes a esta en organismos tan diversos como las bacterias, las moscas del vinagre y los humanos -como discutiremos mas adelante, todos estos arganismos contienen elementos geneticos m6viles.

Resumen Los mecanismos de recombinacion genetica permiten que grandes zonas del DNA de doble helice puedan desplazarse de un cromosoma a otro. Existen dos grandes clases de sistemas de recombinacion. En la recombinacion general, las reacciones iniciales se basan en extensas interacciones entre pares de bases de cadenas de las dos dobles helices de DNA que se recombinan. Como resultado de ello, solamente se produce recombinacion general entre dos moMculas de DNA que sean homologas, y aunque el proceso traslada secciones de DNA entre cromosomas, normalmente no altera ni la secuencia ni el orden de los genes en el cromosoma. Por otra parte, la recombinacion espec(jica de lugar altera las posiciones relativas de las secuencias de nucleotidos en los cromosomas, debido a que las reacciones de apareamiento dependen del reconocimiento, mediado por una prote£na, de las dos secuencias de DNA que se recombinan, de forma que no es necesaria la presencia de una larga secuencia homologa. Los mas comunes son dos tipos de mecanismos de recombinacion especificos de lugar: (1) recombinaciOn conservativa espec(jica de lugar, que produce un heteroduplex muy corto y por 10 tanto requiere alguna zona de secuencia de DNA que sea la misma en las dos moMculas de DNA, Y (2) la recombinaciOn transposicional espec(jica de lugar, que no produce heteroduplex y habitualmente no requiere ninguna secuencia espec(jica sobre el DNA diana. 292

gen de interes

1M

PROLIFERACI6N CELULAR

41

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

gen marcador eliminado del cromosoma

:_~

cromosoma con el gen de interes activo

proteina marcadora

INCREMENTO BREVE DE TEMPERATURA DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO _

a

!

+

Figura 6-69 Utilizaci6n de una enzima de recombinaci6n especffica de Iugar para activar un gen en un grupo de celulas en un animal transgenico. La moltkula de DNA mostrada ha sido disefiada de forma que el gen de interes s610 se transcribe cuando se activa una enzima de recombinaci6n especifica de lugar, la cual elimina el gen marcador y une el promotor cerca del gen de interes. La enzima de recombinaci6n esta codificada por otra molecula de DNA (no se muestra en la figura) que se ha disefiado de forma que s610 se produzca la enzima cuando aumenta la temperatura. Arnbas moleculas de DNA se introducen en los cromosomas del mismo animal transgenico. Cuando la temperatura de este animal se incrementa de forma transitoria, se produce un breve incremento masivo de la sintesis de la enzima de recombinaci6n, la cual produce una reorganizaci6n del DNA en una celula ocasional, eliminandose el gen marcador y activandose simultaneamente en gen de interes. (B) La estrategia puede utilizarse para activar permanentemente un gen de interes en pequefios clones de celulas de un animal en desarrollo. Los clones pueden ser identificados por la perdida del producto del gen marcador el cual, por ejemplo, puede variar la pigmentaci6n de la celula. Asi pues, esta tecnica permite estudiar el efecto de la expresi6n de cualquier gen de interes en un grupo de celulas de un animal intacto.

DNAvirico

I

I

l

0

enlace fosfodiester

~ C-l' . P 0/· ---+ "H i

3'

2:NA

V J

5'3'

3'5'

3'h

la muesca es rellenada por la reparaci6n del DNA

l

00

grupo atacante

/

C-5'

% C-C-9..·t'\'··9-

5' ======-==:::;5'

l

/

-C-O

H!'3'-l' ,rn"o virico sobre el DNA diana

3'5'

c Ji '

integrasa la integrasa corta la secuencia m6vil de DNA

~3'=::!::Ii==:;5'

cromosoma 5' diana

,

3'

3'

H

5'3'

3'5'

cromosoma .;.5'=:::::;:::;D=N=A=v=ir=ic=o=in=te=g::r=ad::;:o:::;::=::;3' diana 3' ~ 5' cortas repeticiones de la secuencia de DNA diana

~

0

H

JJ

(A)

nuevo enlace

/

fOSfOdieste~O 3-;-C

/0

P

00

Virus, phismidos y elementos geneticos transponibles 48 En la descripci6n que hemos realizado de los mecanismos geneticos basicos, hemos destacado su ventaja selectiva para la celula. Hemos visto que la supervivencia de la celula a corto plazo depende por completo del mantenimiento de la informaci6n genetica mediante el proceso de reparaci6n del DNA, mientras que la multiplicaci6n de la celula requiere que se produzca una replicaci6n del DNA rapida y exacta. En una escala de tiempo mas larga, la aparici6n de variantes geneticas, de las que depende la evoluci6n de las especies, esta grandemente facilitada por la reordenaci6n de los genes y las ocasionales redisposiciones de secuencias del DNA generadas por la recombinaci6n genetica. Ahora vamos a examinar un grupo de elementos que al parecer actd.an como parasitos, alterando en su propio beneficio los mecanismos geneticos de la celula. Estos elementos geneticos son interesantes en si mismos. Ademas, como pueden utilizar a fondo el metabolismo de la celula huesped para poder multiplicarse, se usan como poderosas herramientas para estudiar la maquinaria normal de la celula. Muchas secuencias de DNA pueden replicarse de forma independiente del resto del genoma. Estas secuencias presentan diferentes grados de independencia de sus celulas huesped. De ellas, los cromosomas de los virus son los mas independientes porque tienen un revestimiento proteico que les permite moverse libremente de una celula a otra. En diferentes grados, los virus estan estrechamente relacionados con los pldsmidos y con los elementos transponibles, que son secuencias de DNA que carecen de revestimiento, por 10 que son mas dependientes de las celulas huesped y han de replicarse dentro de una unica celula y su descendencia. Todavfa mas primitivas son algunas secuencias de DNA, de las que se sospecha que son m6viles porque se encuentran repetidas muchas veces en cada cromosoma celular. Sin embargo, se desplazan 0 se multiplican tan raramente que no esta claro si deben ser consideradas como elementos geneticos independientes. Empezamos la discusi6n con los virus, que son los elementos m6viles mejor conocidos. Seguiremos con las propiedades de los plasmidos y de los elementos transponibles, algunos de los cuales tienen un gran parecido con los virus y, de hecho, pueden haber sido sus antecesores. Las secuencias de DNA muy repetitivas de los cromosomas de vertebrados, se discuten en el Capitulo 8.

Los virus son elementos geneticos m6viles49

~ prot6n

delagua

C-5' 3'

O-C/ H/ ---+ grupo que se libera

(8)

Figura 6-70 Recombinaci6n transposicional especifica de lugar. (A) Generalidades de los procesos de rotura y nueva uni6n de una hebra que conducen a la integraci6n del DNA lineal de doble hebra de un retrovirus (raja) en un cromosoma de una celula animal (azul). En una etapa endonucleasa inicial, la enzima integrasa hace una muesca en una hebra a cada uno de los extremos de la secuencia de DNA virico, exponiendo un grupo 3'-OH que sobresale. Cada uno de estos extremos 3'-OH dirige el ataque de un enlace fosfodiester sobre la cadena opuesta de un lugar seleccionado al azar de un cromosoma diana. Ello inserta la secuencia de DNA virico en el cromosoma diana, dejando cortas muescas a cada lado, que son rellenadas por procesos de reparaci6n del DNA. Debido a que la muesca se liena, este tipo de mecanismo produce cortas repeticiones de la secuencia de DNA diana (de entre 3 y 12 nucle6tidos de longitud, en negro, dependiendo de la enzima integrasa) a cada lado del segmento de DNA integrado. (B) Una visi6n a nivel at6mico del ataque por un extrema de una cadena de DNA de (A) a un enlace fosfodiester del DNA diana (azul). Este mecanismo se parece al usado en la maduraci6n del RNA yes claramente diferente de la actividad semejante a topoisomerasa de la integrasa lambda. (Adaptado de K. Mizuuchi,J. BioI. Chern. 267:2127321276, 1992.)

Los virus fueron descritos por primera vez como agentes causantes de enfermedades, que se pueden multiplicar unicamente en el interior de celulas y que, en virtud de su diminuto tamafio, atraviesan los filtros ultrafinos que retienen inVirus, plasmidos y elementos geneticos transponibles

293

cluso las bacterias mas pequenas. Antes de la utilizaci6n del microscopio, la naturaleza de los virus era oscura, aunque se sospechaba que podian ser genes desnudos que de alguna manera habian adquirido la capacidad de desplazarse de una celula a otra. El desarrollo de la ultracentrifugaci6n, hacia los anos 1930, hizo posible la separaci6n de los virus de los componentes de las celulas huesped, y a principios de los anos 1940 se generaliz6 la idea de que todos los virus contienen acidos nucleicos. La idea de que los virus realizan funciones semejantes a las de los genes se confirm6 gracias a estudios realizados en virus de bacterias (bacteri6fagos). En 1952 se demostr6 que el DNA del bacteri6fago T4, pero no su proteina, penetra en la celula huesped bacteriana e inicia los procesos de replicaci6n que conducen a la producci6n de varios cientos de virus dentro de cada celula infectada. Estas observaciones hicieron considerar a los virus como elementos geneticos rodeados de una cubierta protectora que les permite desplazarse de una celuIa a otra. A menudo, la multiplicaci6n virica per se es letal para las celulas dentro de las que se produce; en muchos casos, la celula infectada, repleta de virus, se rompe (se lisa) permitiendo asi a los virus hijos acceder a celulas vecinas. Muchas de las manifestaciones clinicas de la infecci6n virica reflejan este efecto citolitico de los virus. Par ejemplo, tanto los granitos de herpes formados par el virus del herpes como las lesiones causadas par la viruela reflejan la rotura de las celulas epiteliales de un area local de la pie!. El tipo de acido nucleico de un virus, la estructura de su envoltura, la manera que tiene de entrar en la celula huesped y su mecanismo de replicaci6n dentro de la celula huesped, varian considerablemente de un tipo de virus a otro.

La cubierta exterior de un virus puede ser una capside proteica o una envoltura membranosa50 Inicialmente se pens6 que la cubierta externa de los virus estaba formada por un s610 tipo de moIecula proteica. Se creia que las infecciones viricas empezaban por la separaci6n del cromosoma virico (su acido nucleico) de la cubierta proteica, y que a continuaci6n se producia la replicaci6n del cromosoma dentro de la celula huesped, generandose muchas copias identicas. Despues de la sintesis de nuevas copias de la envoltura proteica especifica del virus sobre moleculas de RNA mensajero codificadas por el virus, podia producirse la formaci6n de particulas viricas hijas mediante el ensamblaje espontaneo de esta cubierta proteica rodeando los cromosomas viricos hijos (Figura 6-71). Ahara se sabe que estas ideas sobresimplifican extraardinariamente la diversidad de ciclos vitales viricos que existen. Por ejemplo, la proteina de cubierta que rodea el acido nucleico de la mayoria de los virus (la capside) contiene mas de un tipo de cadena polipeptidica, a menudo dispuesta en varias capas (Figura 6-72). En muchos virus, ademas, la capside proteica esta recubierta a su vez par una membrana formada por una bicapa lipidica que contiene proteinas. Muchos de estos virus recubiertos adquieren su envoltura durante el proceso de brote de la membrana plasmatica (Figura 6-73). Este proceso de gemaci6n permite a las particulas viricas abandonar la celula sin romper la membrana plasmatica y, par 10 tanto, sin matar a la celula. En la Figura 6-74 se presentan electronmicrografias que enfatizan las diferencias que existen entre las envolturas viricas.

Los genomas viricos se presentan en una gran variedad de formas viricas y pueden ser tanto de DNA como de RNA51 Como hemos visto anteriarmente la doble helice de DNA es estable y faci! de reparar. Si una cadena de un polinucle6tido se estropea de farma accidental, su cadena complementaria permite que la alteraci6n pueda ser corregida de forma adecuada. Sin embargo, este proceso de reparaci6n no es importante para el caso de los pequenos cromosomas viricos que tan s610 contienen varios cientos 294

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

••••• /DNA virus { a ••~.:" proteina de la cubierta PENETRACION EN UNA CElULA Y lIBERACION DEL DNA

·or

.... ..... .. . =:::==

/

...........

TRANSCRIPCION

/'

------------- RNA

1

TRADUCCION

DNA

"

REPLICACION ===DNA

\::~~·i~~ ~ delaC;bie~ ENSAMBLAJE DE LAS PARTfCULAS VfRICAS HIJAS Y SALIDA DE LA CElULA

Figura 6-71 El cicio vital vfrico mas sencillo. EI virus hipotetico mostrado aqui esta formado por una pequefia molecula de DNA de doble cadena, que codifica una sola proteina de la capside virica. Ninguno de los virus conocidos es tan sencillo.

de nucle6tidos. La probabilidad de ser alterados accidentalmente es muy pequefia comparada con el riesgo que tiene un genoma celular que contiene millones de nucle6tidos. Asi pues, la informaci6n genetica de un virus puede almacenarse y transportarse en varios tipos de formas no usuales, como el RNA en lugar del DNA. Un cromosoma virico puede ser una cadena sencilla de RNA, una helice de doble

>

protefnas transmembrana de la envoltura vfrica

.... .-.. .....

protefna de la capside

~omosoma

vfrico (DNAo RNA)

bicapa

la nucleocapside induce el ensamblaje de las protefnas de envoltura

GEMACION

Iipfdica~-

virus hijos

(A)

L-.-J

100 nm

(B)

Virus, plasmidos y elementos genetieos transponibles

Figura 6-72 Capsides de algunos virus, a eseala. (A) Virus del tomate achaparrado peludo; (B) poliovirus; (C) virus de simio 40 (SV40); (D) virus necrosante satelite del tabaco. Las estructuras de todas estas capsides han sido determinadas por cristalograffa de rayos Xy se conocen a nivel at6mico. (Por cortesfa de Robert Grant, Stephan Crainic y James M. Hogle.)

Figura 6-73 Adquisici6n de una envoltura viriea. (A) Electronmicrograffa electr6nica de un corte ultrafino de una celula animal de la que estan saliendo por gemaci6n varias copias de un virus con envoltura (virus Semliki forest). (B) Visi6n esquematica del ensamblaje de la envoltura y del proceso de gemaci6n. Mientras que la bicapa lipfdica que rodea la capside es parasitada directamente a partir de la membrana plasmatica de la celula huesped, las l1nicas protefnas de esta bicapa lipfdica estan codificadas por el genoma virico. (Por cortesfa de M. Olsen yG. Griffiths).

295

Figura 6- 74 Las envolturas de los virus. (A) Electronmicrografias con tinci6n negativa, (todas ala misma escala) de partfculas viricas. (A) Bacteri6fago T4, un virus de DNA, muy grande, que infecta a E. coli. El DNA se halla en la cabeza del bacteri6fago y es "inyectado" a la bacteria a traves de la cola cilindrica. (B) Virus X de la patata, un virus vegetal fIlamentoso que contiene un genoma de RNA. (C) Adenovirus, un virus de DNA que puede infectar celula humanas. La superficie extema de este virus esta formada por una capside proteica. (D) Virus de la gripe, un virus animal muy grande que tiene DNA y cuya capside proteica esta rodeada por una envoltura de tipo bicapa lipidica, que contiene una especie de espinas de glucoproteinas viricas. (A por cortesfa de James Paulson; B por cortesfa de Graham Hills; C por cortesfa de Mei Lie Wong; D por cortesfa de R.c. Williams y H.W. FisheL)

cadena de RNA, una cadena circular sencilla 0 una cadena sencilla y lineal de DNA. Ademas, a pesar de que algunos cromosomas viricos son dobles helices lineales, tambien son habituales dobles helices circulares de DNA y dobles helices lineales mas complejas. Por ejemplo, algunos virus tienen moleculas proteicas unidas covalentemente a los extremos 5' de sus cadenas de DNA; las dobles helices de DNA de los poxvirus, muy grandes, tienen sus cadenas opuestas unidas covalentemente por sus extremos a traves de uniones fosfodiester (Figura 6-75).

Los eromosomas virieos eodifiean enzimas implieadas en la replieaci6n de su acido nucleieo 52 Cada tipo de genoma requiere trucos enzim
RNA de una sola hebra ...-_~

DNA de doble hebra circular

--- -

DNA de una sola hebra

RNA de doble hebra

DNA de doble hebra con los extremos soldados

DNA de una sola hebra circular

o

C======:JO

DNA de doble hebra

DNA de doble hebra con proteinas terminales unidas covalentemente

•

•

Figura 6-75 Dibujo esquematieo de diversos tlpos de genomas virieos. Los virus mas pequefios s610 contienen unos cuantos genes, y pueden presentar un genoma de DNA 0 de RNA; los virus mayores contienen cientos de genes y tienen un genoma de DNA de doble cadena. Algunos ejemplos de estos tipos de virus: hebra sencilia de RNA -virus del mosaico del tabaco, bacteri6fago R17, polivirus; doble hebra de RNA -reovirus; hebra sencilla de DNA -parvovirus; hebra sencilla circular de DNA -bacteri6fagos M13, <j>X174; doble hebra circular de DNA -SV4Q Ypoliomavirus; DNA de doble hebra -bacteri6fago T4, herpes virus; DNA de doble hebra con proteinas terminales asociadas covalentemente -adenovirus; DNA de doble hebra con extremos soldados covalentemente -poxvirus. Los extremos peculiares de algunas de estas moleculas de DNA (asf como sus formas circulares) superan la dificultad de la replicaci6n de los liltimos nucle6tidos del final de la cadena de DNA (veanse pags. 362 y 389).

296

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

tre los cuales al menos 30 aseguran la nipida replicaci6n del cromosoma T4 en su celula huesped, E. coli (Figura 6-76). La replicaci6n del DNA de T4 presenta la caracteristica especial de que en su DNA se incorpora 5-hidroximetil-C en lugar de C. La composici6n de bases poco usual del DNA de T4 hace que se pueda distinguir facilmente del DNA del huesped, y asi protegerse selectivamente de la acci6n de nucIeasas tambien codificadas en el genoma de T4, las cuales degradan pues unicamente el DNA de E. coli. Otras proteinas alteran las moleculas de RNA polimerasa de la celula huesped de modo que a diferentes estadios de infecci6n transcriben diferentes juegos de genes del bacteri6fago, de forma apropiada a las necesidades del fago. Los virus mas pequefios de DNA, como el virus del simio SV40 y el diminuto bacteri6fago M13, transportan una cantidad de informaci6n genetica mucho menor. Estos virus dependen mucho mas de las enzimas de la celula huesped, para llevar a cabo la sintesis de su DNA, parasitando la mayoria de las proteinas de replicaci6n del DNA de la celula huesped. Sin embargo, la mayoria de los virus de DNA codifican proteinas que inician selectivamente la sintesis de su DNA, reconociendo una secuencia especial de nucIe6tidos en el virus que actua como origen de replicaci6n. Este hecho es esencial ya que asi el virus puede superar las sefiales celulares de control que, de otro modo, harian que el DNA virico se replicara de acuerdo con el DNA de la celula huesped, es decir, duplicandose tan s610 en cada cicIo celular. Todavia no comprendemos c6mo las celulas eucariotas consiguen regular la sintesis de su DNA. Los mecanismos utilizados por los virus para escaparse de esta regulaci6n -los cuales resultan mucho mas accesibles para ser estudiados- pueden suponer avances en el estudio de estos mecanismos reguladores. Los virus RNA presentan unos requerimientos muy especializados para su replicaci6n, ya que para reproducir sus genomas, han de copiar las moleculas de RNA, 10 cual significa polimerizar nucIe6sidos trifosfato sobre un patr6n de RNA. Normalmente las celulas no tienen enzimas que lleven a cabo estas reacciones, par 10 que para poder replicarse, incIuso los pequefios virus RNA han de codificar sus propias enzimas polimerasa dependientes de RNA. A continuaci6n vamos a estudiar con mas detalle algunos mecanismos de replicaci6n de varios tipos de virus.

Tanto los virus RNA como los virus DNA se replican mediante la formaci6n de cadenas complementarias53

o-

~ subu.nidades de la DNA topolsomerasa

- - DNA helicasa ______ DNA primasa - - DNA helicasa - - DNA polimerasa "

subunidades de la DNA polimerasa

50-

miles de pares de nucJeotidos

100-

- - DNA ligasa

_ _ proteina de union a DNA de una sola hebra - - subunidad de la DNA topoisomerasa

Figura 6-76 El cromosoma del bacteri6fago T4, mostrando la situaci6n de los mas de 30 genes que intervienen en la replicaci6n del DNA de T4. El genoma del bacteri6fago T4 esta formado por mas de 169 000 pares de nucle6tidos que codifican mas de 300 protefnas diferentes.

La replicaci6n de los genomas de los virus RNA, como en el caso de la replicaci6n del DNA, tiene lugar a traves de la formaci6n de cadenas complementarias. En la mayoria de los casos de virus RNA, este proceso esta catalizado por enzimas RNA polimerasas RNA-dependientes (replicasas). Estas enzimas estan codificadas por el cromosoma RNA virico y a menudo se incorporan a las particulas viricas hijas, de forma que en cuanto uno de estos virus penetra en una celula, inmediatamente se empieza a replicar el RNA virico. En todos los casos, las replicasas se hallan empaquetadas dentro de la capside de los virus llamados virus RNA de cadena negativa, como es el caso del virus de la gripe y el virus de la estomatitis vesicular. Los virus de cadena negativa se denominan de esta manera porque la cadena que infecta no codifica proteinas, sino que es su cadena complementaria la que transporta las secuencias codificantes. Por ella, la cadena que infecta no puede actuar en ausencia de una replicasa que ya este formada previamente. Por el contrario, el RNA de los virus RNA de cadena positiva, como es el caso de los polivirus, pueden actuar como mRNA, y producir una replicasa en cuanto entra en la celula; por ello el genoma desnudo es, en si mismo, infeccioso. La sintesis del RNA virico siempre empieza en el extrema 3' del RNA patr6n, empezando en el extrema 5' de la nueva molecula de RNA virico y progresando en direcci6n 5' a 3' hasta que alcanza el extremo 5' del RNA patr6n. Para la sintesis del RNA virico no existen mecanismos correctores de errores, y las frecuenVirus, phismidos y elementos geneticos transponibles

297

cias de error son similares a las que se presentan en la transcripci6n del DNA (alrededor de un error por cada 104 nucle6tidos sintetizados). Esta no es una deficiencia demasiado importante ya que el cromosoma RNA es relativamente corto. Por ello, los genomas de todos los virus RNA son mas cortos que los de los grandes virus DNA. Todos los virus DNA comienzan su replicaci6n en un origen de replicaci6n en el que se une una proteina iniciadora especial que atrae a las enzimas de replicaci6n de la celula huesped (Figura 8-34). Sin embargo, existen muchos procesos diferentes de replicaci6n. La complejidad de estos diferentes esquemas de replicaci6n refleja, en parte, los problemas de replicar los extremos de una molecula lineal sencilla de DNA, utilizando una DNA polimerasa que no puede empezar la sintesis sin un cebador (veanse pags. 270-271). Los virus DNA han solucionado este problema de maneras muy diversas: algunos tienen genomas circulares de DNA, los cuales, pues, no tienen extremos; otros tienen genomas lineales de DNA que repiten sus secuencias terminales 0 que acaban en un lazo; otros tienen unas proteinas terminales especiales que actuan directamente de cebadores de la DNA polimerasa (vease Figura 6-75).

Los virus utilizan la maquinaria de tnffico intracelular de sus celulas huesped54 Todos los virus tienen una cantidad limitada de acido nucleico en su genoma, por 10 que han de parasitar procesos de la celula huesped para la mayoria de las etapas de su producci6n. De hecho, debido a que habitualmente los productos viricos se sintetizan en grandes cantidades durante la infecci6n y debido tambien a que durante su ciclo vital los virus siguen una ruta secuencial a traves de los compartimientos de la celula huesped, las celulas infectadas por virus se han utilizado como importantes modelos para trazar las rutas de transporte intracelular y para estudiar que reacciones biosinteticas esenciales estan compartimentalizadas en las celulas eucariotas. Los virus recubiertos que afectan a las celulas animales, en los cuales el genoma esta incluido en una membrana de bicapa lipidica, han utilizado la compartimentalizaci6n de la celula hasta un grado especialmente preciso. Seguir el ciclo vital de un virus recubierto es hacer un "tour" a traves de la celula. Un ejemplo bien estudiado es el virus Semliki forest, que consiste en un genoma de cadena sencilla de RNA rodeado por una cdpside formado por una envoltura eicosaedrica (20 caras) dispuesta de forma regular y compuesta por muchas copias de una proteina (denominada proteina C). La nucleocdpside (genoma + capside) esta rodeada por una bicapa lipidica situada muy cerca, que contiene unicamente tres tipos de cadenas polipeptidicas, codificadas por el RNA virico. Estas protemas de envoltura forman heterotrimeros situados en la bicapa lipidica y

proteinas de envoltura (A)

298

proteina C de la capside

bicapa lipidica

Figura 6-77 Estructura del virus Semliki forest. Dibujo esquemMico de una secci6n transversal (A) y visi6n tridimensional propuesta (B) del virus. (C) Reconstrucci6n tridimensional de la superficie del virus obtenida por micrograffas crioelectr6nicas de especimenes no contrastados. EI virus tiene una masa total de 46 millones de daltons. (B, adaptado de s.c. Harrison, Curro Opin. Struct. Biol. 2:293-299,

1992. Current Science; C, por cortesfa de Stephen Fuller.)

20 nm (8)

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

(C)

que interacruan con la proteina C de la nucleonipside, uniendo la membrana con la nucleocapside (Figura 6-77). Las zonas glucosiladas de las proteinas de envoltura siempre estan situadas en el exterior de la bicapa lipidica, y cada trfmero forma una "espina" que al microscopio electr6nico se ve sobresaliendo de la superficie del virus (Figura 6-77C). La infecci6n se inicia cuando una proteina de envoltura del virus se une a una proteina de una celula normal que actua como su receptor en la membrana plasmatica de la celula huesped. Entonces el virus utiliza el proceso endocftico normal de la celula para entrar en ella mediante endocitosis mediada por receptor, y es liberado a los endosomas vecinos (como se discute en el Capitulo 13). Sin embargo, en lugar de ser transferido desde los endosomas a los lisosomas, el virus se escapa de los endosomas gracias a las propiedades especiales de una de sus proteinas de envoltura. AI pH acido del endosoma esta proteina hace que la envoltura virica se fusione con la membrana del endosoma, liberando la nucleocapside desnuda en el citosol. La nucleocapside pierde su cubierta en el citosol, liberando el RNA virico, que entonces es traducido por los ribosomas de la celula huesped produciendo una RNA polimerasa codificada por el virus. Esta enzima, a su vez, produce muchas copias del RNA virico, algunas de las cuales actuan como moleculas de mRNA dirigiendo la sintesis de proteinas estructurales del virus -la proteina C de la capside y las tres proteinas de la envoltura. Las proteinas de la capside y de la envoltura, recien sintetizadas, siguen vias separadas a traves del citoplasma. Las proteinas de la envoltura, como las proteinas de la membrana plasmcitica de la celula huesped, son sintetizadas en los ribosomas que se hallan unidos al ER rugosa; por el contrario, la proteina de la capside, como las proteinas citos6licas de la celula, se sintetiza por ribosomas que no se hallan unidos a membrana. Las proteinas recien sintetizadas de la capside se unen al RNA virico recientemente replicado, formando nuevas nucleVirus, pllismidos y elementos geneticos transponibles

Figura 6-78 CicIo vital del virus Semliki forest. EI virus parasita la celula huesped para la mayor parte de sus procesos biosinteticos.

299

ocapsides. Las proteinas de la envoltura, por el contrario, son insertadas en la membrana del ER, donde son glucosiladas, transportadas hasta el complejo de Golgi y liberadas a la membrana plasmatica (Figura 6-78). Finalmente las nucleocapsides viricas y las proteinas de la envoltura se encuentran en la membrana plasmcitica. Como resultado de una interacci6n especffica con un grupo de proteinas de envoltura, la nucleocapside forma una gema cuya envoltura contiene proteinas de envoltura embebidas en lfpidos de la celula huesped. Por ultimo, la gema se libera, de forma que aparece un nuevo virus independiente de la celula. El agrupamiento de las proteinas de la envoltura mientras se ensamblan alrededor de la nucleocapside durante la gemaci6n virica hace que las proteinas plasmaticas de la celula huesped queden excluidas de la partfcula virica final.

Diferentes virus recubiertos geman a partir de diferentes membranas celulares 55 Todas las proteinas de envoltura viricas son proteinas transmembrana que son sintetizadas en el ER. Como otras proteinas del ER, transportan senales que las dirigen a determinadas membranas de la celula (vease Capitulo 13). Su localizaci6n final determina ellugar en que se producira la gemaci6n de los virus. Las Ifneas celulares epiteliales, por ejemplo, pueden formar laminas celulares polarizadas cuando se cultivan sobre superficies apropiadas como filtros porosos recubiertos de colagena. Cuando estas celulas polarizadas, que mantienen diferentes dominios de membrana plasmatica basolateral y apical son infectadas por virus, algunos de ellos (como el virus de la gripe) geman exclusivamente a partir de la membrana plasmcitica apical mientras que otros (como el virus de Semliki forest y el virus de la estomatitis vesicular) geman exclusivamente a partir de la membrana plasmcitica basolateral (Figura 6-79). Esta polaridad de gemaci6n indica que las proteinas de envoltura presentan senales de direccionamiento apical 0 basolateral, las cuales dirigen las proteinas a un solo dominio de la superficie celular; las proteinas, a su vez, hacen que el virus se ensamble en este dominio. Otros virus tienen proteinas de envoltura con diferentes tipos de senales de direccionamiento. Por ejemplo, Herpes virus es un virus de DNA que se replica

el virus de la gripe gema unicamente a partir de la membrana plasmatica apical

300

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

Figura 6-79 Dos virus recubiertos que geman a partir de dos dominios de la membrana plasmatica diferentes. Las electronmicrografias muestran que un tipo de virus recubierto gema a partir de la membrana apical mientras que el otTO 10 hace a partir de la membrana plasmatica basolateral de la misma celula epitelial mantenida en cultivQ. Estas celulas crecen con su superficie basal en contacto con la placa de cultivo. El area marcada en cada esquema corresponde a la electronmicrografia que se indica. (Micrograffas por cortesia de E. Rodriguez-Bouland yD.D. SabatinL)

el virus de la estomatitis vesicular gema unicamente a partir de la membrana plasmatica basolateral

en el mlcleo, donde se ensambla la nucleocapside, y luego adquiere una envoltura mediante gemaci6n a traves de la membrana nuclear interna en ellumen del reticulo endoplasmcitico; asf pues, las protefnas de la envoltura han de ser transportadas especfficamente desde la membrana del reticulo endoplasmcitico a la membrana interna nuclear, probablemente via la bicapa lipfdica que rodea los poros nucleares. Por el contrario, flavivirus gema directamente en ellumen del retfculo endoplasmcitico y bunyavirus gema en el complejo de Golgi, 10 cual indica que sus protefnas de envoltura transportan senales para su retenci6n en el reticulo endoplasmcitico y en las membranas del Golgi respectivamente. Tras la gemaci6n, las partfculas recubiertas de los virus herpes, flavivirus y bunyavirus quedan solubles en el lumen del retfculo endoplasmcitico y del Golgi, y se desplazan hacia la superficie celular exactamente como si fueran protefnas de secreci6n; en la red trans del Golgi se incorporan a vesfculas de transporte y son secretados de la celula por el proceso de secreci6n constitutiva (discutido en el Capitulo 13).

Los eromosomas virieos pueden integrarse en los eromosomas del huesped56 No siempre el resultado final de la entrada de un cromosoma virico en una celula es su inmediata multiplicaci6n produciendo un gran numero de virus hijos. Muehos virus entran en un estado de latencia en el que sus genomas se hallan presentes en la celula huesped pero en forma inactiva, de forma que no producen progenie. La latencia virica se descubri6 cuando se observ6 que la exposici6n de baeterias aparentemente no infectadas por virus a los rayos ultravioleta inducfa la formaci6n de progenie de bacteri6fagos. Experimentos posteriores demostraron que estas bacterias lisogenicas contienen en su cromosoma un cromosoma virieo latente pero completo. Estos cromosomas viricos integrados reciben el nombre de provirus. Los bacteri6fagos que pueden integrar su DNA en los cromosomas bacterianos se conocen como bacteri6fagos temperados. El ejemplo prototfpico es el bacteri6fago lambda, que ya hemos estudiado. Normalmente, cuando lambda infecta una celula huesped E. coli adecuada, se multiplica produciendo varios cientos de particulas hijas que son liberadas cuando la celula bacteriana se lisa; este proceso se denomina infecci6n Utica. Mas raramente, los extremos libres de las moleeulas de DNA infectantes se unen formando un DNA circular que queda integrado en el cromosoma circular huesped de E. coli mediante un proceso de reeombinaci6n especffico de lugar. La bacteria lisogenica resultante, que transporta el cromosoma provirico lambda, se multiplica normalmente hasta que se somete a una agresi6n ambiental, tal como la exposici6n a luz ultravioleta 0 a radiaciones ionizantes. La debilitaci6n resultante de la celula induce al virus integrado a dejar el cromosoma del huesped y a comenzar un ciclo normal de replieaci6n virica. De esta forma, el provirus integrado no ha de perecer necesariamente con la celula huesped lesionada sino que tiene la oportunidad de eseapar hacia otras celulas de E. coli (Figura 6-80).

La sfntesis eontinuada de algunas protefnas virieas puede transformar a las eelulas en eaneerosas 57 Las eelulas animales, asi como las bacterias, pueden ofrecer una alternativa de erecimiento lftico a los virus. Las celulas permisivas permiten a los virus DNA multiplicarse lfticamente, 10 cual destruye la celula. Las celulas no permisivas permiten entrar a los virus DNA pero no les permiten multiplicarse lfticamente; en un pequeno porcentaje de estas celulas, el cromosoma virico puede integrarse en el genoma de la celula huesped, donde es replicado can el cromosoma huesped, 0 puede formar un plasmido -una moltkula circular de DNA- que se replica de una forma controlada sin matar a la celula. Algunas veces estas infecciones no permisivas producen un cambio genetico en la celula huesped, llevandola a Virus, plasmidosy elementos geneticos transponibles

301

celula bacteriana cromosoma huesped

bacteriofago , lambda

~

ADSORCION DE LA CELULA HUESPED E INYECCION DEL DNA

1

EL DNA ADOPTA FORMA CIRCULAR

INTEGRACION DEL DNA EN EL CROMOSOMA HUESPED

DIVISION

r

CELULA~

SfNTESIS DE LAS PROTEfNAS VIRICAS NECESARIAS PARA LA FORMACION DE LOS NUEVOS VIRUS

acontecimiento de induccion

)

EL DNA VfRICO INTEGRADO SE REPLICA JUNTO CON EL CROMOSOMA HUESPED PRODUCIENDO NUEVAS COPIAS DE DNA VfRICO INTEGRADO

vfA L1S0GENICA

j

REPLICACION RAplDA DEL DNA VfRICO L1BRE Y EMPAQUETAMIENTO EN PARTICULAS VIRICAS

1

LA L1SIS CELULAR LIBERA UN GRAN NUMERO DE VIRUS L1BRES

.z,-;,

VfALfTICA

proliferar de una forma descontrolada, transformandose pues en su equivalente canceroso. En este caso, el virus DNA se denomina virus DNA tumoral y el proceso transformaci6n neopldsica mediada por virus. Los virus tumorales de DNA mas extensamente estudiados son dos papovavirus, el SV40 y el polioma. Su capacidad transformante se atribuye a algunas proteinas viricas que cooperan dirigiendo las celulas quiescentes a proliferar -es decir, dirigen las celulas de la fase Go a la fase S. En las celulas permisivas, el cambio a la fase S (la fase del ciclo celular en la que se sintetiza el DNA) hace que el virus disponga de todas las enzimas replicantes de la celula huesped, enzimas que son necesarias para la sintesis del DNA virico. La sintesis de estas proteina viricas por un provirus en una celula no permisiva se produce superando algunos de los mecanismos normales de control del crecimiento de la celula y de toda su descendencia. De esta manera se sabe que algunos virus de DNA tumorales que infectan a humanos contribuyen al desarrollo de algunos tipos de canceres humanos (aunque se sabe que en la gran mayoria de canceres humanos no participan virus tumorales).

Los virus tumorales RNA son retrovirus58 Para uno de los grupos de virus RNA, el de los llamados virus tumorales RNA, la infecci6n de una celula permisiva conduce a menudo a una liberaci6n no letal (por gemaci6n) de virus hijos a partir de la superficie de la celula y simultanea302

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

Figura 6-80 Cicio vital del bacteri6fago lambda. EI genoma lambda contiene unos 50 000 pares de nucle6tidos y codifica unas 50 protefnas. Su DNA de doble cadena puede presentarse en forma lineal y en forma circular. Tal como muestra la figura, en la bacteria E. coli el bacteri6fago se puede multiplicar por via Utica 0 por via lisogenica. Cuando el bacteri6fago se hace crecer en estado lisogenico, una lesi6n de la celula hace que el DNA virico integrado (provirus) salga del cromosoma huesped e inicie el crecimiento Utico. La entrada y salida del DNA del cromosoma son acontecimientos de recombinaci6n genetica especificos de lugar, catalizados por la protefna integrasa de lambda (vease Figura 6-68).

Figura 6-81 Transcriptasa inversa. (A) Estructura tridimensional de la enzima de HN-l (el virus del SlDA), detenninada por cristalografia de rayos X. (B) Vision esquemMica de un modelo sobre su actividad sobre un RNA patron. Notese que el dominio polimerasa (aTrUlrilla) tiene un dominio RNAsa (raja) unido covalentemente que degrada una hebra de RNA en una Mlice RNAIDNA Esta actividad ayuda a la polimerasa a convertir la Mlice lnbrida inidal en una doble Mlice de DNA (A, por cortesfa de Tom Steitz; B, adaptado a partir de LA Kohlstaedt et al., Science 256:1783-1790, 1992. © 1992 theAAAS.)

5' hebra de RNA patr6n el lugar activo de la polimerasa sintetiza una hebra de DNA

\

direcci6n del desplazamiento de la enzima

\ (A)

(B)

mente a un cambio genetico en la celula infectada que la transforma en cancerosa. EI mecanismo a traves del cuallos virus RNA pueden generar una alteraci6n genetica permanente no qued6 acIarado hasta que se descubri6 la enzima transcriptasa inversa, la cual transcribe las cadenas de RNA de estos virus a DNA complementario que se integra en el genoma de la celula huesped. Los virus tumorales RNA -entre los que se cuentan el primer virus tumoral bien conocido, el virus del sarcoma de Rous- son miembros de una gran cIase de virus conocida como retrovirus. Estos virus se denominan de esta manera porque en una parte de su cicIo vital revierten los procesos normales de transcripci6n del DNA a RNA. La enzima transcriptasa inversa es una DNA polimerasa poco habitual que puede utilizar como patr6n tanto RNA como DNA (Figura 6-81); esta codificada por el RNA del retrovirus y se halla empaquetada dentro de cada capside virica durante la producci6n de nuevas particulas viricas. Cuando el RNA de una sola cadena del retrovirus entra en la celula, la transcriptasa inversa transportada en el interior de la capside primero hace una copia en DNA de la cadena de RNA, dando lugar a una helice hibrida DNA-RNA que es utilizada por la misma enzirna para generar una doble helice de dos cadenas de DNA. Los dos extremos de

DNA

Figura 6-82 CicIo vital de un retrovirus. EI genoma del retrovirus consiste en una moIecula de RNA de unos 8500 nucleotidos; en cada partfcula virica se hallan empaquetadas dos de estas moleculas. La enzima transcriptasa inversa es una DNA polimerasa que primero produce una copia de DNA a partir de la molecula del RNA virico y luego produce una segunda cadena de DNA sobre la primera copia de DNA, generando asf una copia de doble Mlice de DNA a partir del genoma de RNA La integradon de este DNA de doble cadena en el cromosoma huesped, catalizada por una protefna virica es necesaria para la sfntesis de nuevas moleculas de RNA virico por la RNA polimerasa de la celula huesped.

INTEGRACION DE LA COPIA DE DNA EN EL CROMOSOMA HUESPED DNA integrado

DNA

LA TRANSCRIPTASA INVERSA PRODUCE UNA DOBLE HELICE DNNRNA Y UNA DOBLE HELICE DNNDNA

RNA

c: •

t RNA DNA

t

TRANSCRIPCION RNA

muchas.~=~~~~=-

copias de RNA

TRADUCCION

capside

1 -

1

proteina de la capside PENETRACION EN LA CELULA Y PERDIDA DE LA ENVOLTURA

+

~

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..., \'

proteina de la envoltura ~ ~ " . ,

+ transcriptasa inversa

Virus, plasmidos y elementos geneticos transponibles

1/ \ \; ~';

ENSAMBLAJE DE MUCHAS PARTfcULAS ViRICAS. CADA UNA CONTENIENDO TRANSCRIPTASA INVERSA

•• •••• 303

la molecula de DNA lineal del virus son reconocidos por una integrasa codificada por el virus, que cataliza la inserci6n del DNA virico en pnicticamente cualquier sitio del cromosoma celular del huesped (vease Figura 6-70). El siguiente paso del proceso de infecci6n es la transcripci6n del DNA virieo integrado mediante una RNA polimerasa de la celula huesped, produciendo grandes cantidades de moIeculas de RNA viricos identicas al genoma original. Finalmente, estas moleculas de RNA son traducidas generando una capside, una envoltura y proteinas con actividad transcriptasa inversa. Estas proteinas se empaquetan con el RNA generando nuevas particulas viricas que salen de la celula por gemaci6n de la membrana plasmatica (vease Figura 6-82). Tanto los virus tumorales RNA como los DNA transforman las celulas porque la presencia permanente del DNA virico en la celula produce la sintesis de nuevas proteinas que alteran el control de la proliferaci6n de la celula huesped. Los genes que codifican estas proteinas se denominan oncogenes. A diferencia de los virus tumorales DNA, cuyos oncogenes tipicamente codifican proteinas viricas esenciales para la multiplicaci6n del virus, los oncogenes transportados por los virus tumorales RNA son versiones modificadas de genes normales de la celula huesped que no son necesarias para la replicaci6n del virus. Dado que en la capside del retrovirus tinicamente se puede empaquetar una cantidad limitada de RNA, a menudo las secuencias oncogenicas adquiridas reemplazan una parte esencial del genoma del retrovirus. En los Capitulos 15 y 24 discutiremos de que forma los oncogenes viricos han proporcionado indicios importantes sobre las causas y sobre la naturaleza del cancer y de los mecanismos normales que controlan el crecimiento y la divisi6n en los animales pluricelulares. Tambien discutiremos de que manera la integraci6n al azar del DNA virico en los genomas puede alterar los genes normales, afectando asi el comportamiento celular (vease Figura 24-24).

EI virus del SIDA es un retrovirus 59 En 1982 apareci6 una nueva enfermedad de transmisi6n sexual que fue asociada a una forma no habitual de cancer (el sarcoma de Kaposi) y una gran variedad de infecciones no habituales. Ambos problemas reflejan una severa deficiencia del sistema inmunitario -especificamente de los linfocitos T colaboradores (T helpers)- por 10 que la enfermedad se denomin6 sindrome de inmunodeficiencia adquirida, SIDA (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS). Cultivando linfocitos de pacientes en una fase inicial de la enfermedad, se aisl6 un retrovirus que ahora se sabe que es el agente causal del SIDA, enfermedad que se ha diseminado rapidamente como una epidemia y que amenaza con causar la muerte de millones de personas en todo el mundo. El retrovirus, llamado virus de la inmunodeficiencia humana (HW, de Human Immunodeficiency Virus) entra en los linfocitos T colaboradores uniendose a una proteina de membrana plasmcitica funcionalmente importante denominada CD4 (discutida en el Capitulo 23). El virus HN tiene dos caracteristicas que Ie hacen especialmente mortifero. En primer lugar, el virus acaba matando las celulas T colaboradoras que infecta en lugar de vivir en simbiosis con ellas como hacen la mayoria de los demas retrovirus, y las celulas T colaboradoras son de vital importancia en nuestra defensa contra la infecci6n. En segundo lugar, el provirus tiende a permanecer en un estado de latencia en los cromosomas de una celula infectada sin producir virus hasta que es activado por un suceso raro y desconocido; esta habilidad de esconderse complica enormemente cualquier intento de tratar la infecci6n con farmacos antiviricos. La mayoria de la investigaci6n actual sobre el SIDA intenta entender el cicIo vital de HIV. Ya se ha determinado la secuencia completa de nucIe6tidos del RNA virico. Ello ha hecho posible identificar y estudiar cada una de las proteinas que codifica. Se esta utilizando la estructura tridimensional de su transcriptasa inversa (vease Figura 6-81) para colaborar en el diseno de nuevos farmacos que inhiban la enzima. En la Figura 6-83 se presenta un mapa genetico de HN que muestra los nueve genes de este retrovirus. 304

Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

~

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•

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• vpu

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caperuza5~,• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •IIIIIIIII~11IIII-113' ' - - - - - - - - - extremos repetidos - - - - - - - - - - ' .

12

I 111111121 gag 211121111

•

env

pol

Algunos elementos transponibles estan estrechamente relacionados con los retrovirus60 Debido a que muchos virus pueden entrar y salir de los cromosomas de sus celulas huesped, se cree que cualquier cromosoma grande debe contener varios provirus. Probablemente estos genomas tambien contienen diversas secuencias m6viles de DNA, que no forman partfculas viricas y que no pueden abandonar la celula. Estos elementos transponibles tienen una longitud media que oscila desde algunos cientos a varios miles de pares de bases, y normalmente en cada celula hay multiples copias de ellos. Estos elementos pueden ser considerados como diminutos panisitos que estan escondidos en los cromosomas. Ocasionalmente, cada elemento transponible puede activarse para desplazarse a otro lugar del DNA de la misma celula, un proceso denominado transposici6n catalizado por su propia enzima de recombinaci6n especifica de lugar. Estas integrasas, tambien denominadas transposasas, a menudo estan codificadas en el DNA del propio elemento de transposici6n. La mayoria de los elementos transponibles se desplazan muy raramente (la mayorfa de los elementos de las bacterias, tan s610 una vez cada 105 generaciones celulares aproximadamente), por 10 que a menudo resulta diffcil distinguirlos de partes no m6viles del cromosoma. No se conoce si la activaci6n de su desplazamiento es muy rapida 0 no. Las transposiciones se pueden producir por varios mecanismos. Una gran familia de elementos transponibles utilizan un mecanismo que es indentico a una parte del ciclo vital de un retrovirus. Estos elementos, denominados retrotransposones, estan presentes en organismos tan diversos como las levaduras, las moscas y los mamfferos. Uno de los retrotransposones mejor conocidos es el denominado elemento Tyl de las levaduras. La primera etapa de su transposici6n es la transcripci6n de todo el elemento transponible, produciendo una copia RNA del elemento, que tiene una longitud de mas de 5000 nucle6tidos. Este transcrito codifica una enzima transcriptasa inversa que hace una copia de la molecula de RNA a DNA de doble cadena a traves de un intermediario hfbrido RNA/DNA que imita los primeros estadios del proceso de infecci6n por un retrovirus (vease Figura 6-82). La analogfa continua ya que la molecula de DNA circular utiliza una integrasa para integrarse en un lugar del cromosoma seleccionado al azar. A pesar del enorme parecido con el retrovirus, el elemento Tyl no tiene una envoltura proteica funcional, por 10 que s610 puede desplazarse por el interior de una celula y de su progenie.

Figura 6-83 Mapa del genoma del HIV. El genoma consta de unos 9000 nucle6tidos y contiene nueve genes, cuyas localizaciones se seiialan en verdey en rojo. Tres de los nueve genes (los verdes) son comunes a todos los retrovirus: gag codifica protefnas de capside, env codifica protefnas de envoltura y pol codifica la transcriptasa inversa (vease Figura 6-81) y la integrasa (vease Figura 6-70). EI genoma HlV es extraordinariamente complejo, ya que contiene seis pequeiios genes (en rojo) ademas de los tres (en verde) que normalmente son necesarios para el ciclo vital del retrovirus. AI menos algunos de estos pequeiios genes codifican protefnas que regulan la expresi6n de genes viricos y es tentador especular que es esta complejidad extra 10 que hace a HlV tan mortffero. Como indican las lfneas rojas, para producir las protefnas Rev y Tat hace falta que se produzca maduraci6n del RNA (splicing, vease Figura 8-7).

Otros elementos transponibles se transfieren directamente a sf mismos desde un lugar a otro del genoma61 A diferencia de 10 que ocurre con los retrotransposones, muchos elementos transponibles parecen no poder existir libres fuera del cromosoma del huesped; las transposasas que catalizan sus desplazamientos pueden actuar sobre el DNA del elemento transponible siempre que este este integrado en el cromosoma del huesped. La transposasa se une a una corta secuencia que esta repetida en una orientaci6n opuesta a cada extremo del elemento, permitiendo asf que estos extremos se puedan unir mientras se cataliza el posterior proceso de recombinaVirus, phismidos y elementos geneticos transponibles

305

cortas secuencias repetidas invertidas

_,I ,

\',

elemento transponible en el cromosoma dador A

_[

intermediarios transitorios

5' 3'

5' 3'

, ,

+

l

3~

ci6n. Para el caso de algunos elementos transponibles, el mecanismo de transposici6n difiere unicamente en que la moIecula lineal de DNA que se va a integrar ha de ser eliminada de una moIecula de DNA mas larga, dejando una muesca en el cromosoma vacante (Figura 6-84). Posteriormente, esta muesca se vuelve a soldar, pero en el proceso a menudo la secuencia de DNA es alterada, 10 cual produce una mutaci6n en el antiguo lugar del cromosoma. Otros elementos transponibles se replican cuando se desplazan. En el caso mejor estudiado, en primer lugar se genera una conexi6n covalente entre el elemento transponible y un lugar diana seleccionado al azar; entonces esta conexi6n dispara la sfntesis localizada de DNA que genera una copia del elemento transponible replicado insertada en un nuevo lugar del cromosoma, mientras que la otra copia permanece en ellugar original (Figura 6-85). El mecanismo esta estrechamente relacionado con el mecanismo no replicativo que acabamos de describir y comienza casi de la misma manera; de hecho, algunos elementos transponibles se pueden desplazar mediante ambos sistemas. Ademas de desplazarse por sf mismos, todos los tipos de elementos transponibles pueden, de forma ocasional, desplazar 0 reordenar secuencias de DNA vecinas del genoma de la celula huesped. Por ejemplo, frecuentemente generan deleciones de secuencias adyacentes de nucle6tidos, 0 las transportan a otros lugares. La presencia de elementos transponibles hace que las reordenaciones de las secuencias del DNA de los cromosomas sean mucho menos estables de 10 que se habfa creido previamente, y probablemente los elementos transponibles son responsables de muchos cambios evolutivos importantes del genoma (como se discute en el Capitulo 8). iTambien son importantes los elementos transponibles desde el punto de vista evolutivo como los precursores mas antiguos de los virus? A pesar de que casi con toda seguridad los precursores de los retrovirus fueron retrotransposones, todos los elementos transponibles actuales dependen muy claramente de los mecanismos basados en las reacciones del DNA. Sin embargo, se cree que celulas muy primitivas debieron tener genomas de RNA en lugar de DNA, de forma que hemos de contemplar el metabolismo del RNA como el origen Ultimo de los virus.

Probablemente la mayoria de los virus evolucionaron a partir de plasmidos62 Incluso los virus mas grandes, dependen en gran medida de sus celulas huesped para la biosintesis: por ejemplo, no se conoce ningdn virus que sea capaz de sintetizar sus propios ribosomas 0 de generar el ATP que necesita. Evidentemente, por tanto, las celulas han debido desarrollarse antes que los virus. Probablemente, los precursores de los primeros virus fueron pequenos fragmentos de acido nucleico que desarrollaron la capacidad de multiplicarse de forma independiente de los cromosomas de sus celulas huesped. Estos elementos de replicaci6n independiente, llamados plasmidos, pueden replicarse indefinidamente fuera del cromosoma huesped. Existen plasmidos de DNA y plasmidos de RNA y, como ocurre con los virus, contienen una secuencia especial de nucle6tidos que actua Capitulo 6 : Mecanismos geneticos basicos

cromosoma dador vuelto a unir

5'

cromosoma diana B

306

]

&

3'

~

3' w_ _

/

5'

cortas secuencias repetidas de DNA diana en el cromosoma B

Figura 6-84 Desplazamiento directo de un elemento transponible de un Iugar a otro de un cromosoma. Los elementos transponibles de este tipo pueden ser reconocidos por sus "secuencias de DNA repetidas invertidas" (en naranja) de sus extremos. Diferentes experimentos demuestran que la repetici6n de estas secuencias, las cuales pueden ser de tan s610 20 nucle6tidos, es todo 10 que necesitan para sufrir una transposici6n mediante una transposasa especial asociada con el elemento. El mecanismo mostrado aqui esta estrechamente relacionado con el utilizado por un retrovirus para integrar su DNA de doble hebra en un cromosoma (comparese con la Figura 6-70). A pesar de que la hendidura izquierda del cromosoma dador se lIena, a menudo el proceso altera la secuencia de DNA, generando una mutaci6n en ellugar dador (no se muestra).

como origen de replicaci6n. Sin embargo, a diferencia de los virus, los plasmidos no pueden sintetizar una envoltura proteica y por 10 tanto no pueden desplazarse facilmente de una celula a otra. Los primeros plasmidos RNA debieron parecerse a los viroides encontrados en algunas celulas vegetales. Estas pequefias moleculas circulares de RNA de tan s610 300 0 400 nucle6tidos de longitud se replican a pesar de que no codifican ninguna protefna. Al no tener envoltura proteica, los viroides existen como moleculas de RNA desnudo y tinicamente pasan de una planta a otra cuando las superficies de las celulas dadora y aceptora se hallan alteradas, de forma que no existe una barrera de membrana para el paso de los viroides. Puede esperarse que bajo la presi6n de la selecci6n natural, estos elementos de replicaci6n independiente adquirieran secuencias de nucle6tidos de la celula huesped que les facilitaran su propia multiplicaci6n, entre las que habrfa secuencias que codifican protefnas. En efecto, algunos plasmidos actuales son bastante complejos, codificando protefnas y moleculas de RNA que regulan su replicaci6n y protefnas que controlan su separaci6n en celulas hijas. Los mayores plasmidos conocidos son cadenas circulares de doble helice de DNA de mas de 100 000 pares de bases de longitud. Probablemente, el primer virus apareci6 cuando un plasmido RNA adquiri6 un gen que codificaba una protefna de capside. Sin embargo, una capside puede contener una pequefia cantidad de acido nucleico; asf pues, un virus esta limitado al mlmero de genes que puede contener. Destinados a conseguir la maxima utilidad de su limitado genoma, algunos pequefios virus evolucionaron solapando genes, estrategia seglin la cual una zona de la secuencia de nucle6tidos que codifica una protefna, es utilizada (en la misma 0 en otra pauta de lectura) para codificar una segunda protefna. Otros virus desarrollaron capsides mayores, con 10 que pudieron acomodar mayor mlmero de genes. Dotados de su habilidad tinica de transferir secuencias de acidos nucleicos a traves de barreras de especie, los virus jugaron casi con toda seguridad un importante papel en la evoluci6n de los organismos que infectaron. Muchos de ellos se recombinaron frecuentemente con el genoma de su celula huesped y con alglin otro genoma, y de esta forma, pudieron tomar al azar pequefias piezas del cromosoma del huesped y trasladarlas a otras celulas 0 a otros organismos. Ademas, las copias integradas del DNA virico (provirus) han llegado a convertirse en una parte normal del genoma de la mayorfa de los organismos. Como ejemplos de provirus como estos pueden citarse la familia de bacteri6fagos lambda y eillamado retrovirus end6geno, encontrado en numerosas copias en el genoma de los vertebrados. El DNA virico integrado puede ser alterado de forma que ya no pueda producir un virus completo pero que todavia pueda codificar protefnas, algunas de las cuales pueden ser titiles para la celula huesped. Asf pues, tal como ocurre con el proceso de la reproducci6n sexual, los virus pueden acelerar la evoluci6n facilitando el mezclado de los acervos de genes. El proceso por el cuallas secuencias de DNA se transfieren entre genomas de diferentes celula huesped mediante un virus, se denomina transducci6n del DNA. Algunos virus que transducen DNA con frecuencias particularmente altas, son utilizados en investigaci6n para trasladar genes de una celula a otra. Los virus y sus parientes pr6ximos, los plasmidos y los elementos transponibles, tambien son importantes para la biologfa celular en muchos otros aspectos. Gracias a su relativa simplicidad, por ejemplo, los estudios sobre su reproducci6n han progresado de una forma extraordinariamente rapida y han iluminado muchos de los mecanismos geneticos basicos de la celula. Ademas, tanto los virus como los plasmidos han sido elementos cruciales en el desarrollo de la tecnologfa del DNA recombinante, que describiremos en el Capitulo 7.

Resumen Los virus son partfculas infecciosas formadas por una molkula de DNA 0 de RNA (el genama vfricoJ empaquetada en una cdpside proteica, la cual, en el caso de los VIrUS,

plasmidos y elementos geneticos transponibles

elemento genetico transponible en un cromosoma

complejo proteico formado

1

1

serie de complicados procesos en los cuales la secuencia de DNA transponible es replicada e insertada en un nuevo lugar

I

nueva copia insertada

Figura 6-85 Desplazamiento repllcativo de un eleniento transponible en el interior de un cromosoma. EI elemento que se muestra se replica durante la transposici6n, de forma que su movimiento tiene lugar sin que el elemento se escinda de su lugar original. Las dos secuencias repetidas invertidas de DNA que nonnalmente tlanquean los dos extremos de los elementos transponibles, se indican en naranja. AI iniciarse la transposici6n, la transposasa corta una de las dos cadenas de DNA a cada extremo del elemento transponible, y entonces el elemento actua como patr6n para la sfntesis de DNA. Esta sfntesis empieza por la adici6n de nucle6tidos a los extremos 3' de las secuencias de DNA del cromosoma. Se conocen mas detalles de este proceso, pero son demasiado complejos para poder ser ilustrados aqul.

307

virus recubiertos, estd rodeada por una membrana del tipo de una bicapa lipidica. Tanto la estructura del genoma vlrico como sus sistema de replicaci6n varia considerablemente de un tipo de virus a otro. Un virus puede multiplicarse unicamente en el interior de una celula huesped, cuyos mecanismos geneticos controla en beneficio de su propia reproducci6n. Un resultado habitual de la infecciOn vlrica es la lisis de la celula infectada, con liberaci6n de partlculas vlricas infecciosas. En algunos casos, sin embargo, el cromosoma vlrico se integra en un cromosoma de la celula huesped, donde es replicado como un provirus con el genoma huesped. Se cree que muchos virus han evolucionado a partir de pldsmidos, que son moleculas de DNA 0 de RNA autorreplicantes pero sin la capacidad de envolverse por sl sOlas en una cubierta proteica. Los elementos transponibles son secuencias de DNA que se diferencian de los virus en que unicamente son capaces de multiplicarse en el interior de su celula huesped yen las celulas descendientes de ella; como los pldsmidos, no pueden existir de forma establefuera de las celulas pero a diferencia de los pldsmidos, normalmente se replican como una parte integrante de un cromosoma. Sin embargo, algunos elementos transponibles estdn estrechamente relacionados con los retrovirus y pueden desplazarse de un sitio a otro del genoma mediante la transcripci6n inversa de un intermediario de RNA. A pesar de que tanto los virus como los elementos transponibles pueden considerarse como partisitos, muchas de las reordenaciones de las secuencias de DNA que ellos generan son importantes para la evoluci6n de las celulas y de los organismos.

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Tecnologia del DNA recolDbinante

Hasta principios de los afios 70, el DNA era la molecula de la celula que planteaba mas dificultades para su anaIisis bioqufmico. Enormemente larga y qufmicamente mon6tona, la secuencia de nucle6tidos del DNA tan s6lo podia ser estudiada a traves de caminos indirectos -tales como la determinaci6n de la secuencia de las protefnas 0 del RNA, 0 el anaIisis genetico. Actualmente la situaci6n ha cambiado por completo. De ser la macromoIecula celular mas diffcil de analizar, el DNA ha pasado a ser la mas facil de estudiar. Hoy en dfa es posible separar regiones determinadas del DNA, obtenerlas en cantidades practicamente ilimitadas y determinar su secuencia de nucle6tidos a una velocidad de varios cientos de nucle6tidos al dfa. Mediante variaciones sobre estas mismas tecnicas, un gen puede ser alterado (sometido a ingenierfa) y ser transferido a celulas en cultivo 0 (con mas dificultad) a la linea germinal de animales, donde el gen modificado se incorpora como parte funcional y permanente del genoma. Estos adelantos tecnicos han tenido un impacto espectacular en la biologfa celular, permitiendo el estudio de las celulas y sus macromoIeculas mediante sistemas que antes eran inimaginables. Por ejemplo, han proporcionado la manera de determinar las funciones de muchas protefnas recien descubiertas y de sus dominios y de desenmarafiar los complejos mecanismos que regulan la expresi6n genica en eucariotas. Tambien han hecho posible disponer de grandes cantidades de protefnas minoritarias que regulan el desarrollo y la proliferaci6n celular. A nivel comercial resulta muy prometedor el uso de tecnicas de este tipo para la producci6n a gran escala de hormonas proteicas y de vacunas que antes eran disponibles I1nicamente con un gran coste y trabajo. La tecnologla del DNA recombinante constituye una mezcla de tecnicas, algunas de las cuales son nuevas y otras han sido adoptadas de otros campos de la ciencia, como la genetica microbiana (vease Tabla 7-1). Las mas importantes son: 1.

la rotura especffica del DNA mediante nucleasas de restriccion, que facilita enormemente el aislamiento y la manipulaci6n de los genes individuales;

2. la secuenciacion rapida de todos los nucle6tidos de un fragmento purificado de DNA, que hace posible determinar los limites precisos de un gen y de la secuencia de aminoacidos que codifica; 3. la hibridacion de los dcidos nucleicos que hace posible localizar secuencias determinadas de DNA 0 de RNA, con una gran exactitud y sensibilidad, utilizando la capacidad que tienen estas moleculas de unirse a secuencias complementarias de otros acidos nucleicos; 313

4.

el clonaje del DNA, mediante el cual se puede conseguir que un fragmento de DNA se integre en un elemento genico autorreplicante (pIasmido 0 virus) que habita en una bacteria, de tal manera que una molecula simple de DNA puede ser reproducida generando muchos miles de millones de copias identicas; y

5.

la ingenieria genetica, mediante la cual se pueden alterar secuencias de DNA produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pueden reinsertar en celulas u organismos.

En este capftulo se describini como la tecnologfa del DNA recombinante ha creado nuevas vias de aproximacion experimental que han revolucionado el estudio de la biologfa celular.

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3'~~5' CORTE

Fragmentaci6n, separaci6n y secuenciaci6n de moleculas de DNA 1 Antes de los afios 70 parecfa imposible aislar un gen de un cromosoma. A diferencia de las protefnas, los genes no existen en las celulas como entidades independientes, sino como regiones de una molecula de DNA de gran tamafio. Aunque las moleculas de DNA se pueden fragmentar mecanicamente al azar en pequefios trozos, un fragmento que contenga un gen aislado sera uno entre cientos de miles de otros fragmentos, indiferenciables por su tamafio. leomo se puede purificar un gen? Debido a que todas las moleculas de DNA estan formadas por una mezcla aproximadamente equivalente de los mismos cuatro nucleotidos no pueden separarse, como se hace con las protefnas, segl1n procedimien-

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3'~~5' CORTE

Tabla 7 -1 Algunas de las etapas principales del desarrollo de la tecnologia del DNA recombinante Miescher aisl6 por primera vez el DNA. Avery demostr6 que es el DNA y no la protefna el que contiene la informaci6n genetica durante la transformaci6n bacteriana. Watson y Crick propusieron el modelo de la doble Mlice para la 1953 estructura del DNA, basado en los resultados de rayos X de Franklin y Willdns. Kornberg descubri6 la DNA polimerasa, la enzima que ahora se utiliza 1957 para producir sondas de DNA marcadas. Marmur y Doty descubrieron la renaturalizaci6n del DNA, estableciendo 1961 la especificidad y la posibilidad de las reacciones de hibridaci6n de los acidos nuclE~icos. Arber proporcion6 la primera evidencia de la existencia de las nucleasas 1962 de restricci6n del DNA, que condujo a su posterior purrificaci6n y utilizaci6n en la caracterizaci6n de la secuencia del DNA por parte de Nathans y H. Smith. Nirenberg, Ochoa y Khorana dilucidaron el c6digo genetico. 1966 Gellert descubri6 la DNA ligasa, la enzima utilizada para unir fragmentos 1967 de DNA. 1972-1973 Se desarrollaron las tecnicas de clonaje del DNA en los laboratorios de Boyer, Cohen, Berg y colaboradores, en la Universidad de Stanford y en la Universidad de California en San Francisco. Southern desarro1l6la hibridaci6n tras transferencia sobre gel, para la 1975 detecci6n de secuencias especfficas de DNA. 1975-1977 Sanger y Barrell y Maxam y Gilbert desarrollaron metodos rapidos de secuenciaci6n del DNA. 1981-1982 Palmiter y Brinster produjeron un raton transgenico; Spradling y Rubin produjeron moscas del vinagre transgenicas. Mullis y colaboradores inventaron la reacci6n en cadena de la 1985 polimerasa (PCR, de Polimerase Chain Reaction).

1869 1944

314

Capftulo 7: Tecnologfa del DNA recombinante

"ii " s

3'o@~5' CORTE

Figura 7-1 Secuencias de nucle6tidos del DNA reconocidas por cuatro nucleasas de restricci6n ampliamente utilizadas. Como ocurre en estos ejemplos, estas secuencias suelen tener seis pares de bases y ser "palindr6micas" (esto es, las secuencias de ambas hebras son iguales entre sf si se gira la helice 180 grados alrededor del centro de la corta regi6n de helice que es reconocida). Las enzimas cortan las dos cadenas de DNA en ellugar de la secuencia de reconocimiento 0 cerca de ella. En el caso de algunas enzimas como Hpa I, el corte libera extremos romos; en otros casos como por ejemplo Eco RI, Hind III y Pst I, el corte es escalonado y crea extremos cohesivos. Las nucleasas de restricci6n se obtienen de varias especies de bacterias: Hpa I de Hemophilus parainjluenzae, Eco HI de Escherichia coli, Hind III de Hemophilus injluenzae y Pst I es de Providencia stuartii.

tos basados en su diferente carga, composici6n 0 propiedades de uni6n. Ademas, aunque fuera posible disefiar un procedimiento de aislamiento, la cantidad de DNA necesaria para aislar un gen en cantidad util para experimentos posteriares serfa muy elevada. La soluci6n a todos estos problemas apareci6 con el descubrimiento de las endonucleasas de restricci6n. Estas enzimas, que pueden aislarse de bacterias, cortan la molecula de DNA de doble cadena en lugares discretos definidos por la secuencia de nucle6tidos, produciendo fragmentos de DNA de doble cadena de tamafios definidos. Distintas especies de bacteria fabrican diferentes endonucleasas de restricci6n con distintas especificidades de secuencia, y es relativarnente facil encontrar una endonucleasa de restricci6n que libere un fragmento de DNA que incluya a un determinado gen. El tarnafio del fragmento liberado puede ser utilizado para purificar parcialmente el gen de una mezcla. Mas importante aun, el fragmento de DNA sirve, frecuentemente, como material de partida para la produc~ ci6n del gen muy puro en cantidades ilimitadas mediante clonaje del DNA. Empezaremos esta secci6n explicando c6mo se utilizan las endonucleasas de restricci6n para producir fragmentos de DNA, y c6mo estas moleculas de DNA (y otras) se separan en funci6n de su tamafio. A continuaci6n expondremos c6mo, despues de purificar y amplificar el fragmento de DNA mediante clonaje, se puede determinar la secuencia en que se encuentran los nucle6tidos en la molecula, mediante la secuenciaci6n.

Las endonucleasas de restricci6n cortan las moleculas de DNA en secuencias nucleotfdicas especfficas2 Muchas bacterias producen unas enzimas denominadas nucleasas de restriccion, que las protegen, degradando las moleculas de DNA que han sido transportadas al interior de las bacterias par los virus. Cada enzima reconoce una secuencia especffica del DNA de entre cuatro y ocho nucle6tidos. Cuando estas secuencias se presentan en el genoma de la propia bacteria, estan "camufladas" gracias a la metilaci6n de un residuo A 0 de un residuo C; cuando estas secuencias se presentan en un DNA extrafio, generalmente no se hallan metiladas y son por tanto atacadas por la nucleasa de restricci6n. Se han purificado muchas nucleasas de restricci6n de diferentes especies bacterianas y actualmente existen mas de 100 de estas enzimas comercializadas, la mayona de las cuales reconocen diferentes secuencias de nucle6tidos. Algunas endonucleasas de restricci6n cortan el DNA generando secuencias cortas de DNA de cadena sencilla en los extremos del fragmento (Figura 7-1). Este tipo de extremos se denomina cohesivo pues es complementario en secuencia al que genera la misma endonucleasa de restricci6n en cualquier otro fragmento (Figura 7-2). Los extremos cohesivos permiten unir facilmente fragmentos de DNA obtenidos con la misma endonucleasa de restricci6n (0 con otra que genere los mismos extremos cohesivos). Las moleculas de DNA producidas mediante la uni6n de dos 0 mas fragmentos de DNA se denominan moleculas de DNA recombinantes, y han hecho posible nuevas aproximaciones al estudio de los procesos biol6gicos.

, ,,, i i i ATAT ,,, , i i i + ,,, TTAA AATT ,,,, i TTAA ,,,, i TAAT

5' 31

I

i

3' 5'

i

3' 5'

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uni6n

5' 3'

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AATT i i i i i i TTAA

i i i

3' 5'

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TAAT

+

i

i i

3' 5' 3' 5' 3' 5'

Figura 7-2 Muchos tipos de nucleasas de restriccl6n producen fragmentos de DNA con extremos cohesivos. Los fragmentos de DNA que tengan los mismos extremos cohesivos se pueden unir mediante apareamiento de bases complementarias entre sus extremos cohesivos, tal como se ilustra en la figura. En este ejemplo, los dos fragmentos de DNA que se unen entre sf fueron producidos por la nucleasa de restricci6n Eco RI (vease Figura 7-1).

Los mapas de restricci6n muestran la distribuci6n de pequefias secuencias nucleotfdicas a 10 largo del cromosoma3 Una nucleasa de restricci6n determinada cortara cualquier doble helice de DNA extrafda de una celula, generando una serie de fragmentos de DNA (conocidos como fragmentos de restriccion). Comparando los tamafios de los fragmentos de restricci6n generados a partir de una regi6n genica determinada tras el tratamiento con una combinaci6n de diferentes nucleasas de restricci6n, se puede construir un mapa de restriccion de esta regi6n que muestre la localizaci6n de cada punto de corte (de restricci6n) en relaci6n con los puntos de restricci6n vecinos (Figura 7-3). Dado que cada nucleasa de restricci6n reconoce diferentes Fragmentaci6n, separaci6n y secuenciaci6n de mohkulas de DNA

315

molecula de DNA de 10kb

EXPERIMENTO

Jl

...-----

(

el corte con las nucleasas de restricci6n A y B conjuntamente genera tres fragrentos

_,

el corte con la nucleasa de restricci6n A genera dos fragmentos

el corte con la nucleasa de restricci6n B genera dos fragmentos

1

CONCLUSION: La enzima A corta cerca de un extremo de la molecula. La enzima B puede cortar tanto en el mismo extremo como cerca del otro extremo. EI tamaiio de los fragmentos generados por ambas enzimas actuando conjuntamente elimina la primera alternativa y permite concluir que el orden de corte de las nucleasas de restricci6n es el que se muestra aqui.

A

B

T

1

T

2kb===

2kb=

3kb=

3kb===

8kb======

7kb======

3kb

5kb

2kb

10kb - - - - - '

L-

5kb==== suma = 10kb

suma = 10kb

suma = 10kb

secuencias cortas de DNA, un mapa de restricci6n refleja la disposici6n de secuencias de nucle6tidos especfficas en la regi6n. Esto significa que se pueden comparar diferentes regiones de DNA (comparando sus mapas de restricci6n), sin tener que determinar sus secuencias de nucle6tidos. Por ejemplo, comparando los mapas de restricci6n que se presentan en la Figura 7-4, podemos determinar que las regiones del cromosoma que codifican las cadenas de hemoglobina en el hombre, en el orangutan y en el chimpance han permanecido fundamentalmente inalteradas durante los entre 5 y 10 millones de afios transcurridos desde que estas especies divergieron por primera vez. Los mapas de restricci6n tambien son importantes para el clonaje del DNA y para la ingenieria genetica, permitiendo localizar un gen de interes en un fragmento de restricci6n determinado y facilitando asf su aislamiento.

abc

9

~f

dd*

i

hbmihmf 9

Figura 7-3 Mapa de restrlcci6n. Sencillo ejemplo que ilustra c6mo se distribuyen los lugares de corte de diferentes nucleasas de restricci6n (conocidos como dianas de restricci6n), unos respecto a otros, sobre moltkulas de DNA de doble helice, dando lugar a un mapa de restricci6n. (kb = kilobases; una abreviatura que designa tanto 1000 nucle6tidos como 1000 pares de nucle6tidos.)

hbmihc ma d

b 9

abc

e

d

9

mf

i

hbmihmf 9

hbmihc ma d

h b ihef i 9

h b ihc

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gOb 9

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chimpance pigmeo

Ii mwmooll

gorila

~\W._l\I\\\II\I\_ _l.a~a_~_~."11Jdlll.IAII ~llnJ.11II

orangutan

_ l I f i l i l l i l .11111111111111 111m .1.llb II Iiii III I

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10

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I

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11111

e

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chimpance

gib6n

fe

~;il\l1Ul!_~ll\lli:.J.J.:III1II~~nlll1llll1lIlblU ".l.[((lm~lId.2bllJ.I!.lllIlIiLIlIIIIIIIIIlIIIll.I.111lII1II1II 1212

humano

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I I III 11111s1I11

9

III

f

1121111121111_121111. 11111111111111111

cb 9

f

Ilkllll 211 1111

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III

a f Ibab _1211111 • •1111111111112111111i11

40

miles de pares de nucle6tidos de DNA

Figura 7-4 Mapas de restrlcci6n de DNA humano y de DNA procedente de varios primates, de un grupo de genes que codiflcan la hemoglobina. En cada mapa, los dos cuadrados rojos indican las posiciones del DNA que corresponden a los dos genes de la a-globina. Cada letra representa un punto de corte de una nucleasa de restricci6n diferente. Como en la Figura 7-3, la 10calizaci6n de cada uno de los cortes se determin6 comparando los tamafios de los fragmentos de DNA generados al tratar los DNA con las diferentes nucleasas de restricci6n tanto de forma individual como en distintas combinaciones. Es de destacar que el chimpance, el primate mas pr6ximo al hombre, presenta el mapa de restricci6n mas parecido, mientras que el gib6n, que de los considerados es el mas alejado, presenta el mapa mas divergente -incluyendo tres inserciones de DNA. (Por cortesfa de Elisabeth Zimmer y Allan Wilson.)

316

Capitulo 7: Tecnologia del DNA recombinante

Figura 7-5 La electroforesis en gel es una poderosa tecnica que permite separar moleculas de DNA en funci6n de su tarnaiio. En los tres ejemplos que se presentan aquf, la electroforesis va de arriba a abajo, de forma que las moltkulas mayores de DNA -y por ello de movimiento mas lento- estan cerca de la parte superior del gel. En (A) se utiliza un gel de poliacrilamida de poros pequefios para fraccionar moltkulas de DNA de cadena l1nica. En el rango de tamafios de 10 a 500 nucle6tidos, pueden separarse unas de otras las moltkulas cuyo tamafio se diferencia en tan s610 un nucle6tido. En este ejemplo, los carriles dell al4 representan los productos de cuatro reacciones diferentes de secuenciaci6n de DNA. El DNA a secuenciar se ha replicado artificialmente a partir de un extremo fijo hacia un punto variable de terminaci6n, produciendo una serie de replicas parciales de longitud variada. (En la Figura 7-8 se explica c6mo se obtiene este conjunto de replicas parciales.) En el carril 1 se encuentran las replicas parciales que terminan en G; en el carri121as que terminan en A; en el carri13 aquellas terminadas en T; y en el carril 4 las que terminan en C. Debido a que las moleculas de DNA del experimento se encuentran marcadas radiactivamente sus posiciones se pueden determinar mediante autorradiograffa, como se muestra. En (B) se utiliza un gel de agarosa de poros de tamafio medio para separar moleculas de DNA de doble hebra. Este metodo es mas utilizable en el rango de tamafios de 300 a 10 000 pares de nucle6tidos. Estas moleculas de DNA son fragmentos de restricci6n producidos a partir del genoma de un virus bacteriano, y se han detectado mediante la fluorescencia que emiten despues de ser tefiidos con bromuro de etidio. En (C) se ha utilizado la tecnica de electroforesis en gel de agarosa de campo pulsante para separar 16 cromosomas diferentes de levadura (S. cerevisiae) cuyo tamafio oscila entre 220 000 Y2 500 000 pares de nucle6tidos. El DNA se ha tefiido como en (B). Sobre este tipo de geles se pueden separar moltkulas de DNA de tamafios tan grandes como 107 pares de nucle6tidos. (A, por cortesia de Leander Lauffer y Peter Walter; B, por cortesfa de Ken Kreuzer; C, de D. Vollrath y RW. Davis, Nucleic Acids Res. 15:7876, 1987. Con autorizaci6n de Oxford University Press.)

carriles

1 234

-6000

pares de nucle6tidos

-1000 (8)

12415-

-2,5 millones

7/

16-

Las moIeculas de DNA de diferentes tamaiios pueden separarse mediante la electroforesis en ge14 Durante los primeros arios de la decada de 1970 se descubri6 que se podia determinar con exactitud la longitud y la pureza de las moleculas de DNA utilizando los mismos metodos de electroforesis en gel que se habfan demostrado titiles para el ancilisis de las cadenas proteicas. Actualmente el proceso es mas sencillo que para las proteinas; dado que en las moleculas de acido nucleico cada nucle6tido presenta una tinica carga negativa, no es necesario utilizar el detergente cargado negativamente SDS que se requiere para conseguir que las moleculas de proteina se muevan de una manera uniforme hacia el electrodo positivo. Para el caso de fragmentos de DNA menores de 500 nucle6tidos de largo, existen geles de poliacrilamida especialmente disefiados que permiten la separaci6n de moleculas que se diferencien en un solo nucle6tido de longitud (Figura 7-5A). No obstante, los poros de los geles de poliacrilamida son demasiado pequefios para permitir que moleculas largas de DNA puedan atravesarlos; para separar estas moleculas en funci6n de su tamafio, se utilizan geles mucho mas porosos formados par soluciones diluidas de agarosa (un polisacarido aislado de algas marinas) (Figura 7-5B). Ambos metodos de separaci6n de DNA son ampliamente utilizados tanto con finalidad analitica como preparativa. Una variaci6n reciente de la electroforesis en agarosa, llamada electroforesis en gel de campo pulsante, hace posible la separaci6n de moleculas enormes de DNA. La electroforesis en gel ordinaria no consigue separar estas moleculas porque el campo electrico uniforme las extiende adoptando configuraciones serpenteantes que viajan a traves del gel a una velocidad que es independiente de su longitud. Pero, alteraciones frecuentes en la direcci6n del campo electrico fuerzan a las moleculas a reorientarse para poderse desplazar. Este proceso de reorientaci6n es mas lento cuanto mayor es la molecula y por ella las moleculas progresivamente mas largas se van retrasando respecto a las mas cortas. Por ello, Fragmentaci6n, separaci6n y secuenciaci6n de moIeculas de DNA

13-

-950000

'"

E o ~ 2§ 14~ 10~

pares de nucle6tidos

11-

o 5Ci; 8E c 9-

-610000

,"

361-

(A)

-220000

(C)

317

en geles de campo pulsante los cromosomas enteros tanto bacterianos como de levaduras aparecen como bandas discretas y pueden ser aislados e identificados en base a su tamafio (Figura 7-5C). Un cromosoma tipieo de mamifero, de 108 pares de bases, es demasiado grande para poderlo aislar aun con este metodo, pero si que pueden aislarse e identificarse grandes regiones si el DNA cromosomieo se corta primero con endonucleasas de restriecion que reconocen secuencias muy poco frecuentes (por ejemplo, una vez cada 106 0107 pares de bases). Evidentemente, en los geles de agarosa 0 de poliacrHamida las bandas de DNA seran invisibles a menos que el DNA este marcado 0 tefiido de alguna manera. Un metoda sensible de tincion del DNA consiste en sumergir el gel despues de la electroforesis en el colorante bromuro de etidio que, cuando se halla unido al DNA, es fluorescente con luz ultravioleta (Figura 7-5B y C). Un metoda de deteccion incluso mas sensible que este consiste en la incorporacion de un radioisotopo a la molecula de DNA antes de la electroforesis; habitualmente se utiliza el 32p ya que puede ser incorporado en los fosfatos del DNA y emite particulas p muy energetieas que son faciles de detectar por autorradiografia (Figura 7-5A).

Las moIeculas purificadas de DNA pueden ser marcadas in vitro con radiois6topos 0 con marcadores quimicos5 Para afiadir distintas marcas a las moleculas de DNA aisladas se utilizan fundamentalmente dos sistemas. El primero utiliza una enzima de E. coli, la DNA polimerasa I , para insertar un gran mlmero de nucle6tidos radiactivos (habitualmente marcados con 32P) 0 compuestos quimieos en cada molecula de DNA (Figura 7-6A) generando asi "sondas de DNA" altamente marcadas para las reacciones de hibridaci6n de acidos nucleieos (vease mas adelante). El segundo metodo utiliza la enzima polinucle6tido quinasa de bacteri6fagos para transferir un tInieo 32p marcado desde el ATP hasta extremo 5' de cada cadena de DNA (Figura 7-6B). Dado que la quinasa incorpora un s610 32p en cada hebra de DNA, estas cadenas de DNA no son 10 suficientemente radiactivas como para utilizarlas como sondas; pero dado que solo estan marcadas en uno de sus extremos, son extraordinariamente tItHes para la secuenciaci6n del DNA y para el estudio de las huellas del DNA ("footprinting"), tal como explicaremos a continuaci6n. 318

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

Figura 7-6 Para marcar con radiactlvldad las moleculas de DNA, se utllizan rutlnarlamente dos procedimientos. (A) La DNA polimerasa I marca todos los nucle6tidos de una molecula de DNA, y por 10 tanto puede utilizarse para generar sondas de DNA muy marcadas radiactivamente. (B) La polinucle6tido quinasa marca I1nicamente los extremos 5' de las hebras de DNA; asi pues, cuando despues de marcar se fracciona la molecula de DNA mediante nucleasas de restricci6n, tal como se muestra en la figura, pueden obtenerse facilmente moleculas que contengan una I1nica hebra marcada en el extrema 5'. El metodo en (A) se emplea para producir tambien moleculas de DNA no radiactivo que contienen un marcador quimico especifico que puede ser detectado con un anticuerpo adecuado (vease Figura 7-18).

fragmento inicial de DNA de una sola hebra marcado con 32p en su extrema 5' . ._ _•

3~p

3'

III I I II IIi

\9--

3~p

lugar de rotura

un procedimiento quimico que rompe la cadena por los residuos A genera fragmentos radiactivos de diferentes longitudes

I

IIII1 I

\9

3~J11

U

t

I

(A)

G A

18 17

14 13 12 11 10 9

Ii III

8

1111

7

6 5

3~... 1111_1111111111111111111111111111.11 fragmentos radiactivos

C

16 15

\9 111111111111111111111_

3~p

T

4

t

fragmentos no marcados

3

I

estos fragmentos son separados por electroforesis en gel en funci6n estrictamente de su longitud; por autorradiografra se detectaran unicamente los fragmentos radiactivos

2

(B)

5'

la secuencia de DNA, lerda directamente desde la parte inferior del gel a la superior, es rGCACrr GAACGCAi GCT 1 1 8

Los fragmentos aislados de DNA pueden ser rlipidamente secuenciados6 Afinales de los anos 70 se desarrollaron metodos que permitieron determinar de manera simple y nipida la secuencia nucleotfdica de cualquier fragmento de DNA purificado. Como resultado de ello, se han obtenido las secuencias de DNA completas de muchos cientos de genes de mamfferos, incluyendo los que codifican la insulina, la hemoglobina, el interferon y el citocromo c. La cantidad de informacion respecto a secuencias de DNA es muy grande (muchos millones de nucleotidos) por 10 que deben utilizarse ordenadores para almacenarla y analizarla. Se han determinado varias secuencias continuas de DNA de mas de 105 pares de nucleotidos; entre elIas se encuentran el genoma entero del virus de Epstein-Barr (que infecta a humanos y causa la infeccion de mononucleosis) y el genoma entero de cloroplasto vegetal, asf como el cromosoma completo de la levadura. Se han descrito dos potentes metodos de secuenciaci6n del DNA: en la Figura 7-7 se describe el metodo qu(mieo, y en la Figura 7-8 el metodo enzimatieo. Este ultimo metodo, basado en la sintesis in vitro de DNA en presencia de nucle6sidos trifosfato terminadores de cadena, se ha convertido en el metoda mas comun para secuenciar el DNA. Estos dos metodos de secuenciaci6n del DNA son tan rapidos y seguros que, tal como se ha indicado anteriormente, el sistema mas facil y exacto de determinar la secuencia de aminoacidos de una protefna consiste en determinar la secuencia de nucleotidos de su gen: se genera un clon de cDNA a partir del mRNA apropiado (ver mas adelante), se determina la secuencia de nucleotidos y se utiliza el c6digo genetico como diccionario para traducir esta secuencia en una secuencia de aminoacidos. Aunque en principio existen seis pautas diferentes de lectura por medio de las cuales la secuencia de DNA se puede traducir a proteina (tres por cada hebra), generalmente se reconoce la correcta por ser la unica que no presenta un gran numero de eodones de terminaei6n (Figura 7-9). Habitualmente se determina una pequeno trozo de la secuencia de aminoacidos de la protefna pUrificada para confirmar la secuencia determinada a partir del DNA. A medida que se han perfeccionado los metodos de determinaci6n de secuencia de DNA, los cientfficos han empezado a vislumbrar la posibilidad de determinar la secuencia completa del genoma humano, unos 3 x 109 pares de bases. Debido a que dicha secuencia contendrfa la secuencia de todos los RNA y de todas las protefFragmentaci6n, separaci6n y secuenciaci6n de moIeculas de DNA

Figura 7 -7 Metodo qufmico de secuenciaci6n de DNA. (A) El proceso se inicia con la obtencion de un conjunto de moleculas de DNA de doble cadena marcadas en un extrema por el metodo descrito en la Figura 7 -6B. En la primera etapa las cadenas de la doble helice se disocian y se someten a un tratamiento suave con un agente qUfmico que destruye una de las cuatro bases (en este caso los residuos A). Debido a que el tratamiento es suave solo se rompe una A por molecula, al azar. Esto genera una colecci6n de fragmentos de DNA de diferentes longitudes, que reflejan los lugares en que se encontraban las A en el DNA original. Los fragmentos se separan en un gel y se detectan por autorradiograffa: solamente los fragmentos que poseen un extrema 5' terminal fosfato 32p aparecen en el gel y su tamafio indica la distancia desde el extrema marcado hasta la base A. (B) Para determinar la secuencia completa, se realizan procedimientos similares a cuatro muestras separadas de la misma moltkula de DNA marcada en su extrema 5', utilizando compuestos qufmicos que rompan el DNA de forma preferente por T en la primera muestra, por C en la segunda, por G en la tercera y por A en la cuarta. Los fragmentos resultantes son separados en carriles paralelos del mismo gel, como los que se muestran en la Figura 7-5A, obteniendose un patron de bandas de DNA radiactivas a partir de las cuales se lee la secuencia de DNA. El nucle6tido mas cercano al extrema 5' de la secuencia se determina mirando el gel al nivell (en la parte inferior del gel) y observando en que carril aparece la banda (T). El mismo procedimiento se utiliza para determinar el nive12, luego para e13 y asf sucesivamente, hasta obtener la secuencia completa. La ilustraci6n presenta el metodo de manera idealizada; en realidad los tratamientos qufmicos son menos especfficos de 10 que se muestra.

319

(A)

precursores desoxirribonucle6sido C pequena cantidad de C GA ----- didesoxirribonucle6sido trifosfato normales (dATP, dCTP, dGTP y T A rG ICT trifosfato (ddATP) dTTP) TAT C G A AACI TC A T

Ad

GrG~~r

cebador para la DNA poilmerasa 5' \

la incorporaci6n (infrecuente) de didesoxirribonucle6sido bloquea el crecimiento posterior de la molecula de DNA

)

~GCTACCTGCATGGA 3'

CGATGGACGTACCTCTGAAGCG"I11~

/ molecula de DNA de una sola hebra a secuenciar

-

5'.I.nUI BUIIIIIIII

(8)

3'

5'

3' ] DNA de doble hebra

5'

3' 'CG,rAT)If:A~ITC}l\GG,rC 5' 5'_3' cebador marcado

DNA de una sola hebra

+ DNA polimerasa + exceso de dATP dTTP dCTP dGTP

1+ ddATP

1+ ddCTP

_ATGTCA

1+ ddGTP

_AT

_ATGTC

_ATG

_ATGT

_ATGTCAGTC

_ATGTCAG

rr=-

IIIIIATGTCAGTCCA _ATGTCAGT _ATGTCAGTCC IIIIIATGTCAGTCCAG

j

3'

5' A

T

C

G

nas posibles que se necesitan para configurar un ser humano, su conocimiento nos proveerfa de un "diccionario del ser humano", que podrfa facilitar el futuro estudio de la celula y de los tejidos. La secuenciacion del DNA a esta escala implica necesariamente el desarrollo de metodos de secuenciacion automatizados que reduzcan considerablemente el costa de la secuenciacion al menos en cinco veces.

Las huellas del DNA revelan los lugares donde las proteinas se unen ala moIecula de DNA7 Se puede utilizar una modificacion de una tecnica de secuenciacion de DNA para determinar las secuencias nucleotfdicas reconocidas par las protefnas de union al DNA. Algunas de estas protefnas juegan un papel central en la determinacion de la activacion de algunos genes en una celula determinada, mediante su union a secuencias de DNA reguladoras, las cuales habitualmente se localizan fuera de la regiones codificadoras del gen. Para entender como actuan estas protefnas, es importante identificar las secuencias especfficas de DNA a las que se

320

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

Figura 7-8 Metodo enziJDlltico de secuenciaci6n de DNA. (A) El DNA a secuenciar se utiliza por la DNA polimerasa como molde en la sfntesis in vitro, de una serie de replicas parciales que comienzan siempre en el mismo sitio, pero que terminan en puntos diferentes a 10 largo de la cadena de DNA. La clave de este metoda radica en la utilizaci6n de didesoxirribonucle6sidos trifosfato, que no tienen el grupo desoxirribosa 3'-OH, presente en los nucle6tidos normales; cuando un nucle6tido modificado de esta forma se incorpora a una cadena de DNA, bloquea la adici6n del nucle6tido siguiente. En el ejemplo que se muestra, el didesoxi ATP (ddATP) compite con un exceso de desoxiATP (dATP), de modo que cada cadena de DNA sintetizada en el tubo de ensayo por la DNA polimerasa I terminani al azar en una A diferente de la secuencia. Esta reacci6n genera, por tanto, una escalera de fragmentas de DNA similar a la mostrada anteriormente por el metoda qufmica (Figura 7-7); estos fragmentos se detectanin gracias a un marcaje (qufmico 0 radiactivo) que incorpora a bien el oligonucle6tido (naranja) 0 uno de los desoxirribonucle6sido trifosfatos (verde) usados para extender la cadena de DNA. (B) Para determinar la secuencia completa, se utilizan cuatro nucle6sido trifosfatos terminadores de cadena (raja) diferentes en cuatro reacciones de sfntesis separadas, sobre el mismo molde de DNA. Cuando los productas de estas cuatro reacciones se analizan en cuatro carriles paralelos en un gel de poliacrilamida, la secuencia de DNA puede deducirse de una manera amiloga a como se hace en el metoda qufmico descrito en la Figura 7-7B.

Figura 7-9 LocaUzacl6n de las reglones de secuencla de DNA que coditlcan una protefna. En principio, cualquier regi6n de la secuencia de DNA puede codificar seis diferentes secuencias de aminoacido, dado que cada una de las tres pautas de lectura de cada hebra se puede utilizar para codif'icar un polipeptido. La secuencia de nucle6tidos siempre se lee en sentido 5'-a-3', y codif'ica un polipeptido desde su extremo amino (N) a su extremo carboxilo (e). En una secuencia de nucle6tidos al azar se deberfa encontrar una secuencia de terminaci6n para la sfntesis de proteina cada 21 aminoacidos de media (una vez cada 63 nucle6tidos). En esta muestra de 48 nucle6tidos cada una de esas seftales (codones de terminaci6n) se han coloreado en verde; Unicamente la pauta de lectura 2 no contiene ninguno. (B) Bl1squeda en una secuencia de 1700 pares de bases de DNA de una posible secuencia codificante de protefna. La informaci6n se representa como en (A), en verde para cada cod6n de terminaci6n. Todas las posibles regiones entre seftales de inicio y terminaci6n de sfntesis de protefna (vease pag. 249) se representan como barras rojas. S610 la pauta de lectura 1 codifica una protema, de 475 aminoacidos de longitud. Figura 7-10 Tecnica de las huellas de DNA (DNA footprlnting). (A) Este metoda requiere de una molecula de DNA marcada radiactivamente en un extremo (vease Figura 7-6B). La protefna que se muestra se une fuertemente a una secuencia espedfica de DNA de siete nucle6tidos de longitud, protegiendo asi a estos siete nucle6tidos del agente que fragmentara la cadena. Si se desarrolla esta misma reacci6n sin la protefna que se une al DNA, en el gel se puede observar un escalonado completo de bandas (no se muestra). (B) Un registro real de huella utilizado para determinar ellugar de uni6n para una protefna humana que estimula la transcripci6n de determinados genes eucariotas. Estos resultados permiten localizar ellugar de uni6n unos 60 nucle6tidos en direcci6n 5' a partir del lugar de inicio de la sfntesis del RNA. El agente que se utiliz6 para fraccionar la cadena fue una pequefta molecula con hierro que normalmente corta en cada enlace fosfodiester con aproximadamente la misma frecuencia. (B, por cortesia de Michele Sawadogo y Robert Roeder.)

321

unen. EI metodo estandar utilizado con esta finalidad es el denominado huella en el DNA (DNA footprinting). Se marca con 32p un fragmento puro de DNA por uno de sus extrema (vease Figura 7-6B) Ya continuacion se corta con una nudeasa 0 con un reactivo que produzca cortes al azar en los enlaces fosfodiester de la doble helice del DNA. Los subfragmentos resultantes de la hebra marcada se separan en un gel y se detectan por autorradiograffa, de forma que se puede comparar el patron de bandas de un DNA fragmentado en presencia de una protefna que se una a el con el patron del mismo DNA fragmentado en ausencia de tal protefna. Cuando la protefna se halla presente, cubre los nucleotidos de la zona del DNA a la que se une, protegiendo la rotura de los enlaces fosfodiester. En consecuencia, los fragmentos marcados que contienen ellugar de union del DNA a la protefna desapareceran, dejando un hueco en el patron del gelllamado "huella" (footprint) (Figura 7-lOA). En la Figura 7-lOB se muestra la huella de una protefna que activa la transcripcion de un gen eucariota.

Resumen La tecnolog(a del DNA recombinante ha revolucionado el estudio de la celula. El

desarrollo de esta tecnolog(a no fue nunca previsto ni planeado. Por el contrario, es el fruto de la confluencia de multitud de nuevas habilidtules de los investigadores trabajando en distintas dreas para manipular las secuencias de DNA, que en un momenta dado se hacen 10 sujicientemente poderosas como para permitir a los investigadores aislar cualquier gen deseado, y, despues de su amplijicaciOn, determinar su estructura en detalle, tanto a nivel genico como de sus productos. Elementos esenciales de esta tecnolog(a son la capacidad de trocear los cromosomas en fragmentos con extremos conocidos, y los metodos de separacion y secuenciaciOn de dichos fragmentos. La fragmentacion del cromosoma se realiza mediante enzimas producidas por bacterias y que estas usan para destruir las moleculas de DNA invasoras. Estas enzimas, denominadas endonucleasas de restricciOn, se purijican y se utilizan para cortar el DNA de doble cadena en secuencias cortas especificas. Los fragmentos resultantes de DNA se pueden separar unos de otros en funcion de su tamano mediante electroforesis, desplazando la meula de fragmentos a traves de los poros de un gel. En ciertas condiciones se pueden separar moleculas de DNA que difieran en unicamente una base, y visualizarlas como bandas discretas. Los metodos de secuenciacion utilizan estos potentes metodos de separacion: despues de la electroforesis, se determina la secuencia de nucleotidos de una molecula de DNA a partir del patron de bandas de DNA marcado que se observa cuando uno de sus extremos estd marcado y el otro termina aleatoriamente en un nucleotido seleccionado unico (A, G, CoT).

cromosoma que contiene 1 copia del gen A

cromosoma que contiene 5 copias del gen A

1 I fragmentaci6n y desnaturalizaci6n del DNA cromos6mico

fragmentos de DNA de una sola hebra

1_-- (

':l./'"\,~("" .....1J-rf" rJ- > l,

--_I

h~r..(/~"

adici6n de una sonda de DNA cion ada y radiactiva, e incubaci6n para ~;;:;;;~ permitir que se produzca la hibridaci6n

-r.__-. _'<-..

Hibridaci6n de acidos nucleicos8 Cuando una solucion acuosa de DNA se calienta a lOO°C 0 se expone a un pH muyalto (pH ~ 13), se rompen las bases complementarias que normalmente mantienen unidas entre sf a las dos cadenas de la doble helice y la doble helice se disocia rapidamente en dos hebras separadas. Durante muchos aiios se considero que este proceso, llamado desnaturalizaci6n del DNA, era irreversible. Sin embargo, en 1961 se descubri6 que si se mantienen hebras complementarias de DNA a 65°C durante un perfodo prolongado, forman de nuevo una doble helice (proceso denominado renaturallzacion 0 hibridacion del DNA). Reacciones de hibridaci6n similares a esta se producen entre dos cadenas cualesquiera de acido nudeico de una sola hebra (DNA:DNA, RNA:RNA 0 RNA:DNA) siempre que ambas cadenas tengan una secuencia de nudeotidas complementaria. En esta secci6n se explicara c6mo se pueden utilizar estas reacciones especificas de hibridacion para detectar y caracterizar secuencias nudeotfdicas especificas tanto en moleculas de RNA como de DNA. 322

Capitulo 7 : Tecnologfa del DNA recombinante

Figura 7-11 Medida del m1mero de copias de un determinado gen en una muestra de DNA, mediante hibridacion de DNA. En estos experimentos se utiliza un fragmento de DNA de una sola hebra, al que habitualmente se denomina sonda de DNA. La sonda puede estar marcada de forma especial de modo que pueda ser distinguida del enorme exceso de DNA cromos6mico. En este ejemplo, la marca es un is6topo radiactivo; alternativamente, como marca se pueden utilizar nucle6tidos marcados qufmicamente (vease Figura 7-18).

5' :=====::;11:111===11:1112:11:':1'j; 3 5' ---------3' ex6n 1

intr6n

ex6n 2

1

3'

• •lIlil~ImlIIl!l~~I$IIlI!!i iiMI.ml Ilmlill DNA gen6mico clonado

RNA mensajero

51

secuencia intr6nica

DESNATURALIZACION DEL DNA E HIBRIDACION CON RNA

3'~5'DNA

5'

3' RNA

DNA degradado

: ....

\

3' -&'·UII

1

EL TRATAMIENTO CON LA NUCLEASA S1 DEGRADA LAS MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO DE UNA SOLA HEBRA Ii

mil

Figura 7-12 Uso de la teeniea de hibridaci6n de acidos nucleieos para determinar la regi6n de un fragmento clonado que esta presente en una

molecula de RNA. El metodo mostrado se basa en el uso de una nucleasa que unicamente corte la cadena de DNA no apareada con RNA. Tal como se muestra, se determinan las posidones de los intrones en los genes eucariotas; de la misma forma se puede determinar el inido y final de una molecula de RNA.

..... 5'

3'

5'

'"

"iii ~

ex6n 2 ex6n 1

~

~

a;

gel de agarosa alcalino

La hibridaci6n de acidos nucleicos proporciona un metoda sensible

para la detecci6n de secuencias determinadas de nucle6tidos9 La velocidad de formaci6n de la doble belice esta limitada por la velocidad a la que colisionan las dos cadenas complementarias del acido nucleico, la cual depende de la concentraci6n de las cadenas en la soluci6n. Por 10 tanto, la velocidad de hibridaci6n puede utilizarse para determinar la concentraci6n de cualquier secuencia determinada de DNA 0 de RNA en el seno de una mezcla de otras secuencias. Este ensayo requiere un fragmento pure de una cadena sencilla de DNA cuya secuencia sea complementaria a la del acido nucleico (DNA 0 RNA) que se desea detectar; el DNA se puede obtener por clonaje 0, si la secuencia es corta, se puede sintetizar por metodos quimicos. En cualquier caso, el fragmento de DNA debe estar marcado (mediante radiois6topo 0 por un metodo quimico) de forma que durante el curso de la reacci6n de hibridaci6n se pueda seguir su incorporaci6n a moleculas de doble cadena. La moIecula de DNA de cadena sencilla utilizada de esta forma como indicador se denomina sonda de DNA (probe); una sonda de DNA puede comprender desde 5 hasta miles de nucle6tidos de longitud. Las reacciones de hibridaci6n mediante sondas de DNA son tan sensibles y selectivas que pueden utilizarse para detectar secuencias complementarias cuya concentraci6n sea incluso de una sola moIecula por celula (Figura 7-11). Asi, es posible determinar el m1mero de copias de una secuencia particular de DNA (la contenida en la sonda) que se hallan presentes en el genoma celular. Se puede utilizar esta misma tecnica para buscar genes relacionados pero no identicos; por ejemplo, una vez ha side clonado un gen interesante a partir de ratones 0 gallinas, se puede utilizar una parte de esta secuencia para localizar el gen correspondiente en humanos. Alternativamente, la sondas de DNA pueden utilizarse en reacciones de hibridaci6n con RNA en lugar de DNA, para detectar cuando una celula esta expresando un gen determinado. En este caso, se hibrida una sonda de DNA que contiene parte de la secuencia del gen, con RNA purificado a partir de la celula en cuesti6n, con el fin de determinar si el RNA celular contiene moIeculas complementarias al Hibridaci6n de acidos nudeicos

323

DNA de la sonda, y si es asf, que cantidad. En metodos mas elaborados, la sonda de DNA se trata con nucleasas especfficas despues de la hibridaci6n para determinar las regiones exactas de la sonda que se han apareado con moleculas de RNA de la celula. De esta forma se pueden determinar los lugares de principio y final para la transcripci6n del RNA; de la misma manera se pueden identificar de forma precisa los lfmites de las regiones de los transcritos primarios que son cortadas y eliminadas durante la rnaduraci6n por corte y ernpalrne (splicing) (vease Figura 7-12). Durante. el desarrollo embrionario un gran mlmero de genes se expresan 0 se reprimen siguiendo patrones elaborados. La hibridaci6n de sondas de DNA con RNA de la celula permite determinar cuando un gen particular se expresa 0 no; ademas, cuando la expresi6n de un gen se altera, se puede determinar si el cambio es debido a controles que actuan sobre la transcripci6n, sobre la maduraci6n del RNA 0 sobre la traducci6n de las moleculas de mRNA maduro a protefna. La utilizaci6n de los metodos de hibridaci6n se halla tan extendida en la biologfa celular que es diffcil imaginar c6mo se podrfa haber estudiado sin ellos la estructura y la expresi6n genica.

Las transferencias Northern y Southern facilitan la hibridaci6n con moleculas de acidos nucleicos separadas electroforeticamente lO A menudo las sondas de DNA se utilizan en combinaci6n con la electroforesis en gel para detectar moIeculas de acidos nucleicos que tengan una secuencia complementaria a toda 0 a una parte de la sonda. Antes de llevar a cabo la reacci6n de hibridaci6n, la electroforesis separa las diferentes moleculas de RNA 0 de DNA de una mezcla, de acuerdo con su tamafio; podremos estar seguros de que la hibridaci6n fue especffica si con la sonda se marcan moIeculas de un unico 0 de muy pocos tamafios. Ademas, la informaci6n obtenida respecto al tamafio puede ser muy valiosa en sf misma. Un ejemplo servira para ilustrar este punto. Supongamos que se desea determinar la naturaleza del defecto de un rat6n mutante que produce cantidades anormalmente bajas de alburnina, una protefna que segrega el hfgado a la sangre, normalmente en grandes cantidades. En primer lugar, habra que recolectar muestras de tejido hepatica identicas de un rat6n mutante y de uno normal (este ultimo servira de control); las celulas se disgregan con un detergente fuerte para inactivar las nucleasas celulares, que en caso contrario podrfan degradar los acidos nucleicos. A continuaci6n, se separa el RNA y el DNA de los otros componentes celulares: las protefnas presentes se desnaturalizan completamente y se eliminan mediante extracciones continuadas con fenol -un potente solvente organico que es parcialmente miscible en agua; los acidos nucleicos, que permanecen en la fase acuosa, se precipitan con alcohol para separarlos de las moIeculas pequefias de la celula. Entonces se separa el DNA del RNA aprovechando su diferente solubilidad en alcohol y se degrada cualquier acido nucleico contaminante de los tipos que no queremos estudiar, mediante tratamiento con enzimas altamente especfficas -tanto RNasas como DNasas. Para analizar los RNA que codifican la albumina, mediante una sonda de DNA que reconozca a este RNA, se utiliza una tecnica Hamada transferencia Northern (Northern blotting). Primero, mediante electroforesis en gel las diferentes moleculas de RNA intacto se separan en bandas, tanto de los hfgados mutantes como de los normales. Entonces, para hacer que las moleculas de RNA sean accesibles a las sondas de DNA, se hace una replica del gel mediante la transferencia de las moIeculas de RNA desde el gel de la electroforesis hasta una hoja de papel de nitrocelulosa 0 de nailon. Las moleculas de RNA que se hibridan con la sonda de DNA radiactiva (por contener parte de la secuencia normal del gen de la albumina) se localizan mediante la incubaci6n del papel con una sohici6n que contenga la sonda y detectando la sonda hibridada por autorradiograffa, 0 mediante metodos qufmicos (Figura 7-13). Dado que las moleculas pequefias de acidos nucleicos se desplazan mas rapidamente a traves del gel que 324

Capitulo 7 : Tecnologfa del DNA recombinante

filtro de nitrocelulosa con acidos nucleicos fuertemente unidos

bloque de papel absorbente filtro de nitrocelulosa

patrones de RNA marcados, utilizados como marcadores de tamaiio

gel de agarosa

ACIDOS NUCLEICOS SEPARADOS DE ACUERDO CON SU TAMANO, MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

esponja soluci6n tamp6n ACIDOS GRASOS SEPARADOS, TRANSFERIDOS A UN PAPEL DE NITROCELULOSA POR SUCCION DEL TAMPON A TRAVES DEL GEL Y DEL PAPEL

Figura 7-13 Deteccion de moIeculas de RNA 0 de DNA de una secuencia especifica, mediante hibridacion sobre filtro. En un gel de electroforesis se pueden fraccionar tanto mezclas de mollkulas de RNA de cadena sencilla (transferencia Northern) como moltkulas de DNA de doble cadena producidas por digesti6n con una nucleasa de restricci6n (transferencia Southern). Todas las moltkulas, separadas, se transfieren a una membrana de nailon 0 de nitrocelulosa, por capilaridad. EI filtro se expone a la sonda de DNA marcado durante un tiempo prolongado, en condiciones en que se favorece la hibridaci6n. Posteriormente el filtro es lavado intensamente de forma que s610 aquellas moltkulas de RNA 0 de DNA que estan inmovilizadas en el filtro y que hibridan con la sonda, queden marcadas, las cuales aparecen como bandas en el filtro. En el caso de la transferencia Southern es necesario separar las dos hebras de DNA en el filtro antes del proceso de hibridaci6n, 10 que se consigue exponiendo el DNA a condiciones alcalinas desnaturalizantes despues de la electroforesis.

FILTRO CON LOS ACIDOS NUCLEICOS SEPARADOS HIBRIDADOS CON LA SONDA MARCADA bolsa de plastico sell ada

DESPUES DE ELiMINAR LA SONDA MARCADA, LAS BANDAS COMPLEMENTARIAS A LA SONDA SE REVELAN MEDIANTE METODOS DE DETECCION ESPECfFICOS DEL MARCAJE

posici6n de los marcadores de tamano

bandas detectadas

las mas grandes, se puede determinar el tamaiio de las moIeculas de RNA de eada una de las bandas que se unen a la sonda, utilizando como referencia la migraci6n de moleculas de RNA de tamaiio conocido (patrones de RNA). De esta manera se puede descubrir que las celulas hepaticas del rat6n afectado fabrican albl1mina de tamaiio normal y en cantidades narmales; alternativamente podria ocurrir que el RNA de la albl1mina se detectara en cantidades muy reducidas. Otra posibilidad seria que el RNA de la albl1mina mutante fuese anarmalmente carta, y par 10 tanto, se desplazara a traves del gel muy rapidamente. En este easo la transferencia del gel se podria volver a estudiar mediante sondas de DNA mas selectivas que revelasen que zona del RNA esta ausente. Para caracterizar la estructura del gen de la albumina en el rat6n afectado se utiliza un metoda anaIogo, Hamado transferencia Southern (Southern blotting) que en lugar de analizar en RNA, estudia el DNA. En primer lugar, mediante nucleasas de restricci6n se corta el DNA aislado generando fragmentos que se puedan separar facilmente. A continuaci6n, los fragmentos se separan de acuerdo can su tamaiio mediante electroforesis en gel y mediante transferencia e hibridaci6n se identifican los fragmentos que son complementarios a la sonda de DNA para la albumina, tal como se ha descrito para el caso del RNA (vease Figura 7-13). Repitiendo este procedimiento pero utilizando diferentes nuc1easas de restricci6n, se puede construir un mapa de restricci6n de la regi6n del genoma que codifica la albumina. Sobre este mapa se puede determinar si el gen de la albl1mina ha sido reordenado en los ratones afectados -por ejemplo, mediante la Hibridaci6n de acidos nUcleicos

325

lugares de corte (dianas) de la nucleasa de restriccion

cortar, desnaturalizar e hibridar

+

,..

i

(8)

,

:t

cortar, desnaturalizar e hibridar

cambio de un unico nucleotido

(C)

,.t

.:t..

cortar, desnaturalizar e hibridar

L--J

+

duplicaci6n de secuencia en A, 8 y C, la sonda RFlP ( _ detecta fragmentos de DNA de diferentes tamaiios

)

delecion 0 insercion de una secuencia corta de DNA, pero sin embargo no es posible detectar de este modo la presencia de sustituciones de una unica base.

EI amilisis de los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricci6n (RFLP) facilita el amilisis genetico de los grandes genomas l l Los genomas de gran tamafio se pueden mapar tanto fisica como geneticamenteo Los mapas ffsicos se basan en el amilisis directo de las moIeculas de DNA que constituyen cada cromosoma. Incluyen tanto mapas rl.e restriccion como colecciones ordenadas de clones genomicos de DNA (vease Figura 7-29), que se pueden considerar como representaciones incompletas 0 parciales del mapa fisico compIeto que sena la secuencia lineal continua de todos los nucleotidos que forman el genoma. Los mapas geneticos de Iigamiento, a diferencia de los anteriores, se basan en la frecuencia de entrecruzamiento de dos 0 mas caracterfsticas que sirven de marcadores en el cruzamiento. Un marcador genetico puede ser cualquier lugar en el genoma que, cuando varia, produce variaciones apreciables en el individuo que 10 porta haciendolo distinguible del resto de la poblacion. Si la modificacion es muy poco frecuente se la denomina mutaci6n; si es comun, se la denomina polimorfismo. Los mapas geneticos de ligamiento se construyen siguiendo el patron de heredabilidad de tales variantes geneticas. Tradicionalmente, los mapas de ligamiento han dependido de la identificacion de mutaciones por sus caracteristicas fenotipicas como el color de los ojos o los grupos sanguineos. Recientemente los metodos del DNA recombinante han permitido utilizar como marcadores geneticos pequefias secuencias de DNA que pueden diferir entre individuos de la poblacion sin producir ningl1n efecto detectable en el organismo. Uno de los marcadores geneticos de este tipo mas utilizados se basa en que pequefios cambios en la secuencia de DNA pueden modificar los patrones de corte de las endonucleasas de restriccion. Por ejemplo, una substitucion de una base en una region del cromosoma puede alterar una secuencia de reconocimiento de una endonucleasa de restriccion, produciendo importantes diferencias en las longitudes de ciertos fragmentos de restriccion del DNA en esa zona. Asimismo pueden variar las longitudes de los fragmentos de restriccion debido a pequefias inserciones 0 delecciones que afecten a un numero reducido de bases. A estas pequefias diferencias entre individuos se las denomina polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricci6n (RFLP, de Restriction Fragment Length Polymorphism). Un RFLP es tanto mas util cuanto mas frecuente sea la poblacion, ya que existe una probabilidad mayor de que los padres de un cierto individuo porten marcadores diferenciables. Esta es una de las razones de que la base de los marcadores RFLP mas utiles sean las secuencias cortas repetidas que se encuentran en numero muy variable en los diferentes individuos (Figura 7-14). Los RFLP son utiles para el mapaje genetico gracias a que las diferencias de tamafio de fragmentos que un individuo hereda se detectan con gran facilidad 326

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

Figura 7-14 Algunos de los cambios de la secuencia de DNA que produceD un polimorflsmo de 10Dgitud de los fragmeDtos de restricci6n (RFLP). (Al En muchos individuos de la poblaci6n, una nucleasa de restricci6n corta en tres lugares distintos el DNA c£Omos6mico que se muestra, p£Oduciendo dos fragmentos de DNA; uno de los cuales puede detectarse par hibridaci6n con una sonda DNA mediante transferencia Southern. (Bl En ot£Os ejemplos del mismo c£Omosoma se observa que el cambia de un nucle6tido en la secuencia reconocida por la nucleasa de restricci6n evita que esta actue en la diana central. En estos casos la sonda marcada detecta un fragmento de DNA de tamafio mayor como un RFLP. (el Aun mas, en otros cromosomas se ha producido una duplicaci6n de parte de la secuencia de modo que se produce un aumento en el tamafio del fragmento de DNA detectado con la sonda marcada. Este tipo de RFLP es comun en regiones que contienen secuencias cortas muy repetidas, tales como GTGTGT....; el numero de veces que se repite la secuencia corta es muy variable en la poblaci6n, de forma que cada individuo contiene un mlmero diferente (de 4 a 40l de repeticiones en cada locus concreto. A este tipo de repeticiones se las conoce como microsatlHites 0 VNTR (de Variable Number afTandem Repeat: numero variable de repeticianes en tandem).

lugares de corte (dianas) de la nucleasa de restricci6n

~

~ 3m (cromosoma

ELECTROFORESIS EN GEL Y TRANSFERENCIA SOUTHERN CON SaNDA DE DNA MARCADA

materno)

. . 3p (cromosoma : ~~~~~~====== . . paterno)

t

la diana de restricci6nj CORTAR EL DNA CON UNA desaparecida crea NUCLEASA DE RESTR"CCION un RFLP

.... ....

-I11III

IIIIiIIIIiiIIII

I11III I11III

3m ==3m

==3P

LT

fragmento detectado por la sonda de DNA

3p

la sonda detecta diferentes fragmentos de DNA para las regiones hom610gas de los cromosomas materna y paterno, revelando un RFLP

Figura 7-15 Detecci6n de un RFLP por transferencia Southern. En este ejemplo se utiliza el metodo para diferenciar los cromosomas paterno y materno en una regi6n del cromosoma 3 de un individuo. Una variante de este metodo utiliza peR (vease Figura 7-32) para amplificar selectivamente la regi6n de DNA apropiada, antes del tratamiento con la nucleasa de restricci6n. En ese casu los fragmentos de restricci6n son mucho mas abundantes que otros fragmentos de DNA de la muestra y se pueden visualizar directamente tifiendo el gel, evitando la necesidad de transferencia e hibridaci6n con sondas marcadas.

mediante transferencia Southern utilizandouna sonda DNA complementaria a dieha region (Figura 7-15). Ademas, los RFLP permiten relacionar el mapa genetieo con el mapa ffsieo: por un lado sirven como verdaderos marcadores geneticos, como el color de ojos; por otro lado las sondas DNA que permiten detectarlos son secuencias DNA que se pueden localizar con relativa facilidad en el mapa ffsieo mediante hibridacion de DNA. Si se localizan dos marcadores genetieos en dos cromosomas diferentes, la heredabilidad de ambos es independiente, es decir la probabilidad de coheredabilidad es de 50:50. Esto tambien es cierto para aquelios marcadores que se encuentren en los extremos opuestos de un mismo cromosoma, debido a la elevada probabilidad de que se separen a causa de la alta frecuencia de entrecruzamiento que tiene lugar en la meiosis, durante la farmacion de oocitos y de esperma. Cuanto mas cercanos se encuentren en el cromosoma tanto mayor es la probabilidad de no ser separados par entrecruzamientos entre elios y por 10 tanto ser coheredados par la progenie (ligados). Mediante el estudio de la coheredabilidad en grandes grupos familiares de un gen de interes (por ejemplo, alglin gen relacionado con determinada enfermedad) y un gran mlmero de RFLP individuales, se pueden identificar ciertos RFLP que cohereden frecuentemente con dieho gen (ello requiere el estudio de gran n11mero de individuos, como se explica en la Figura 7-16). Por tanto, se pueden localizar las secuencias de DNA que rodean a dieho gen. A partir de ahf es posible, en algunos casos, identificar incluso el DNA del propio gen, mediante tecnieas que se describen mas adelante (vease Figura 7-30). De este modo se han conseguido identificar los genes responsables de algunas enfermedades humanas, permitiendo que sean analizadas en detalle las protefnas que codifican. Esta claro (vease Figura 7-16) que cuanto mas pr6ximo se localiee un marcador RFLP al gen mutante de interes, tanto mas facil resulta localizar sin ambigiiedades dieho gen. Para facilitar dieho estudio se esta realizando un gran esfuerzo para establecer un mapa de alta resoluci6n de distribuci6n de RFLP del genoma humano, con miles de marcadores RFLP espaciados 106 nucle6tidos de media. Dos marcadores separados esta distancia deberfan coheredarse una media de 99 de cada 100 casos. Con dieho tipo de mapa sera relativamente facil utilizar en humanos estudios de ligamiento genetieo para localizar un gen que ha sido identifieado solo por el efecto de su mutaci6n, permitiendo su localizaci6n en uno 0 en unos cuantos clones gen6mieos muy grandes de una librerfa gen6miea ordenada. Su aislamiento podrfa realizarse entonces rapidamente.

Las moIeculas sinteticas de DNA facilitan el diagn6stico prenatal de enfermedades geneticas 12 AI mismo tiempo que los mierobi610gos desarroliaban las tecnicas de clonaje del DNA, los qufmieos arganieos mejoraron los metodos para sintetizar cadenas Hibridaci6n de I1cidos nucleicos

327

par de cromosomas materna con la enfermedad

par de cromosomas paterno sa no

gen defectuoso causante de la "'-enfermedad "'-marcador RFLP -------unicamente en esta copia del cromosoma

~

oocito - - - - - r - - - - - e s p e r m a

CONCLUSI6N: el gen causante de la enfermedad cohereda con el marcador RFLP de la madre enferma en el 75% de la progenie que padece la enfermedad. Si se observa la misma correlacion en otras familias que sufren esta enfermedad el gen causante de ella se localizara en este cromosoma, en una posicion cercana al marcador RFLP.

cortas de DNA. Actualmente estos oligonucle6tidos de DNA se fabrican de forma rutinaria mediante maquinas que, en una noche, pueden construir automaticamente cUalquier secuencia de hasta 120 nucle6tidos de largo. Esta capacidad para fabricar moleculas de DNA de secuencia deseada hace posible redisefiar genes a voluntad, 10 cual constituye una herramienta importante de la ingenieria genetica como se explicara mas adelante. Otro usa importante de dichos oligonucle6tidos sinteticos es el de sondas marcadas para detectar las secuencias gen6micas correspondientes mediante hibridaci6n de DNA. Mediante el empleo de diferentes temperaturas en la reacci6n de hibridaci6n es posible escoger la severidad de la hibridaci6n: por encima de cierta temperatura s610 hibridaran aquellas secuencias que sean identicas, 10 que permite detectar genes mutantes, de gran utilidad en el diagn6stico prenatal de enfermedades hereditarias. Mas de 3000 enfermedades geneticas humanas son atribuibles a defectos en genes. La mayoria de estas mutaciones son recesivas: unicamente son perjudiciales en los individuos que heredan de ambos padres la copia defectuosa del gen. Un objetivo importante de la medicina moderna consiste en la identificaci6n, antes del nacimiento, de los fetos que portan las dos copias defectuosas del gen, de forma que si 10 desea, la madre puede interrumpir el embarazo. En la anemia falciforme, por ejemplo, se conoce cual es la alteraci6n exacta de nucle6tidos del gen mutante (la secuencia GAG se halla cambiada por GTG en la hebra de DNA que codifica la cadena ~ de la hemoglobina). Para el diagn6stico prenatal de esta alteraci6n se sintetizan dos oligonucle6tidos de DNA -uno correspondiente a la secuencia del gen normal en la regi6n de la mutaci6n y el otro correspondiente a la secuencia mutante. Manteniendo esta cortas secuencias (de aproximadamente 20 nucleotidos) y seleccionando una temperatura de hibridacion a la que solo sean estables las helices perfectamente apareadas, estos oligonucle6tidos se pueden utilizar como sondas para distinguir entre las dos formas del gen. Asf pues dichos oligonucle6tidos pueden utilizarse como sondas marcadas para diferenciar entre dos formas del gen mediante transferencia Southern del DNA aislado de celulas fetales recolectadas mediante amniocentesis. Un feto portador de dos copias del gen de la cadena ~ se detectara facilmente pues s610 presentara hibridaci6n con el oligonucle6tido complementario a la secuencia de DNA mutante. El diagn6stico supone el aislamiento de DNA de celulas fetales obtenidas mediante amniocentesis y la utilizaci6n de las sondas de oligonucle6328

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

Figura 7-16 AnaIisis de entrecruzamiento genetico utilizando un marcador RFLP. En el ejemplo se estudia la coheredabilidad de un fenotipo humano (en este caso una enfermedad genetical con un marcador RFLP. Si los individuos que heredan la eilfermedad tambien heredan casi siempre el marcador RFLP, el gen que causa la enfermedad y el marcador RFLP estanin probablemente pr6ximos en el cromosoma, como se muestra en la figura. Para demostrar que un ligamiento es estadfsticamente significativo se han de analizar cientos de individuos. Es de destacar que el ligarniento no sera absoluto excepto si el marcador RFLP se localiza en el mismo gen. En los demas casos el RFLP y la enferrnedad genetica se separaran con una cierta frecuencia debido al entrecruzamiento mei6tico durante la formaci6n del oocito 0 del esperma: es 10 que ha ocurrido en el caso del par de cromosomas de la derecha.

tidos sobre una transferencia Southern. Un feto afectado se puede reconocer porque su DNA se hibridizani unicamente con el oligonucle6tido que es complementario de la secuencia del DNA mutante. En el caso de muchas otras anomalfas geneticas no se conoce la variaci6n exacta de la secuencia de nucle6tidos. Sin embargo, es posible el diagn6stico prenatal de un m1mero cada vez mayor de estas anomalfas mediante transferencia Southern para analizar las variaciones especfficas del genoma humane (RFLP en la Figura 7-16) que, segt1n se sabe, estan fntimamente unidas al gen defectuoso. Se pueden utilizar metodos similares para determinar la susceptibilidad individual a sufrir una determinada enfermedad. Por ejemplo, individuos que han heredado copias an6malas de ciertos genes presentan un riesgo superior de padecer ciertas formas de cancer, por 10 que deben tomar medidas preventivas para incrementar en 10 posible sus posibilidades de disfrutar de una vida sana.

La hibridaci6n poco rigurosa permite identificar genes relacionados de forma indirecta13 Durante la evoluci6n aparecen nuevos genes mediante mecanismos de duplicaci6n y divergencia de genes antiguos y mediante la reutilizaci6n de regiones de genes antiguos para generar nuevas combinaciones. Por esta raz6n, muchos genes tienen una familia de parientes pr6ximos en alguna parte del genoma, y es probable que algunos de enos tengan una funci6n relacionada. Se requieren metodos laboriosos para aislar los clones de DNA correspondientes al primer miembro de unafamilia genica de este tipo. Sin embargo, utilizando las secuencias de este primer gen como sondas de DNA, se pueden aislar de una forma.relativamente sencilla otros genes que producen protefnas que tienen funciones relacionadas. Dado que es improbable que los nuevos genes tengan secuencias

B

v ~

~

+

mezcla de moleculas de DNA de una sola h

""

~E F

_------1"----_

(

1

hibridaci6n en formamida al

hibridaci6n en formamida al

50%. a 42°C

50%. a 35°C

!

B

1: __ unicamente A forma una doble helice estable HIBRIDACICN RIGUROSA

Hibridaci6n de licidos nucleicos

! l/~

Figura 7-17 Comparaci6n de las condiciones de hibridaci6n rlgurosas (stringent) y poco rigurosas (reduced stringency). En la reacci6n de la izquierda (condiciones rigurosas), la soluci6n se ha colocado pocos grados por debajo de la temperatura a la que desnaturaliza una helice de DNA perfecta (su temperatura de fusion), de forma que las helices imperfectas que se pueden formar bajo las condiciones poco rigurosas de hibridaci6n de la derecha son inestables. Para encontrar genes que no son identicos pero que estan relacionados con el gen A, se utilizan las condiciones de hibridaci6n poco rigurosa de la derecha.

c~~ tanto A como C y E forman dobles helices estables HIBRIDACICN POCO RIGUROSA

329

o

esta regi6n es aun accesible para el apareamiento de bases con A

H

o 0 0 ~ O~~-O-~-O-~-O 0

I

0-

I

0-

I

0-

OH H

Figura 7-18 Unmarcadorqub:nico para las sondas de DNA. EI nucle6tido modificado que se muestra puede ser incorporado al DNA por la DNA polimerasa, de forma que la molecula de DNA se puede utilizar como sonda y detectarse de forma eficiente. La base del nucle6tido que se muestra es un amilogo de la timina, en la que se ha reemplazado el grupo metilo en T con un espaciador unido al esteriode vegetal digoxigenina. Se puede visualizar mediante un anticuerpo especffico unido a un marcador visible como un colorante fluorescente. Otras moIeculas, como la biotina por ejemplo, se pueden unir a los nucle6tidos, y se detectan de un modo similar.

identicas, las hibridaciones con la sonda de DNA se realizan en condiciones "poco rigurosas" (reduced stringency) -definidas como aquellas condiciones que permiten apareamientos imperfectos con la secuencia de la sonda, formando una doble helice estable (Figura 7-17). A pesar de que la utilizaci6n de condiciones poco rigurosas de hibridaci6n conlleva el riesgo de obtener una senal falsa de una regi6n aleatoria que presente una corta secuencia hom610ga en una secuencia de DNA no relacionada, es~os falsos positivos se pueden eliminar mediante una investigaci6n mas profunda. Este metoda constituye una de las utilidades mas potentes de la tecnologfa del DNA recombinante. Por ejemplo, esta aproximaci6n ha permitido aislar una familia completa de proteinas de uni6n al DNA que actuan como directores de la expresi6n genica durante el desarrollo embrionario en Drosophila. Esta tecnica tambien ha hecho posible el aislamiento de miembros de esta misma familia genica de otros organismos, incluyendo el hombre.

Las tecnicas de hibridaci6n in situ permiten localizar secuencias especfficas de acidos nucleicos en los cromosomas y en las celulas14 Los acidos nucleicos, como otras macromoleculas, ocupan posiciones muy determinadas en las celulas y en los tejidos, de forma que cuando estas moleculas se extraen por homogeneizaci6n, se pierde una gran cantidad de informaci6n potencial. Por ello, se han desarrollado tecnicas en las que, de forma similar a como se utilizan los anticuerpos marcados, se utilizan in situ sondas de acido nucleico para localizar secuencias determinadas de acidos nUcleicos, tanto en cromosomas como en determinados tipos celulares. Estas tecnicas se denominan hibridaclon in situ. Sondas altamente marcadas con is6topos radiactivos pueden ser hibridadas con cromosomas que hayan sido expuestos brevemente a un pH muy elevado para romper los pares de bases de su DNA. Asi pueden visualizarse las regiones cromos6micas que han fijado la sonda durante la hibridaci6n. Originalmente estos metodos se desarrollaron utilizando sondas DNA muy radiactivas, que se detectaban mediante autorradiograffa. Sin embargo es posible mejorar la resoluci6n espacial del metodo si se utilizan sondas de DNA marcadas qufmicamente en lugar de radiactivamente. Para ella las sondas se sintetizan con nucle6tidos especiales que incorporan cierta cadena lateral (Figura 7-18), y las sondas hibridadas se detectan mediante anticuerpos (u otros ligandos) que reconocen especificamente dicha cadena lateral (Figura 7-19). Tambien se han desarrollado metodos de hibridaci6n in situ para poner de manifiesto la distribuci6n de moleculas de RNA determinadas en celulas en el in330

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

Figura 7 -19 Hibrldacl6n in situ para localizar genes especfficos en los cromosomas. En la figura se han utilizado seis sondas diferentes para determinar la posici6n de su secuencia nucleotfdica en el cromosoma 5 en metafase. Las sondas estaban marcadas quimicamente y se han detectado mediante anticuerpos marcados con fluorocromos. Se muestran las dos copias del cromosoma 5 alineadas. Cada sonda detecta dos puntos en cada cromosoma dado que un cromosoma metafasico tiene su DNA replicado y , por ella contiene dos helicEls de DNA identicas (vease Figura 8-4). (Cortesia de David C. Ward.)

100 IJrn

terior de tejidos. En este caso los tejidos no se exponen a pH alto para que el DNA cromos6mico se mantenga en forma de doble hebra y no pueda unirse ala sonda. En lugar de ello, el tejido se fija suavemente de manera que el RNA se mantenga de tal forma que pueda hibridarse cuando el tejido se incube con una sonda de DNA complementaria. De esta forma se pueden observar los cambios de patr6n de expresi6n genica en los tejidos. Por ejemplo, en el embri6n de Drosophila estos patrones han proporcionado nuevas ideas sobre los mecanismos que diferencian las celulas que se hallan en posiciones diferentes durante el desarrollo (Figura 7-20).

Figura 7-20 Hibrldaci6n in situ para la locallzaci6n de RNA en los tejidos. Autorradiograffa de una secci6n de un embri6n muy joven de Drosophila que se ha sometido a hibridaci6n in situ utilizando una sonda radiactiva de DNA complementaria de un gen que participa en el desarrollo de los segmentos. La sonda se ha hibridado con el RNA del embri6n, y el patr6n de distribuci6n de los granos de plata expuestos revela que el RNA sintetizado sobre el gen (llamado ftz) se localiza en bandas altemas de tres 0 cuatro celulas de grqsor, a 10 largo del embri6n. En este estadio del desarrollo (blastodermo celular), el embri6n contiene unas 6000 celulas. (De E. Hafen, A. Kuriowa yW,J. Gehring, Cell 37:833-841, 1984 © Cell Press.)

Resumen En las reacciones de hibridaci6n de dcidos nucleicos, las cadenas sencillas de DNA 0 tle RNA colisionan al azar unas con otras, probando rtipidamente miles de millones tle posibles apareamientos. En condiciones severas de hibridaci6n (una combinadOn tle solvente y temperatura en las que una doble helke pe1fecta es estable), dos cadenas se apareardn formando una molkula."hfbrida" solamente si sus secuencias son muy complementarias. La enorme especiflcidad de la reacciOn de hibridacwn permite que se pueda marcar cualquier molkula sencilla de DNA 0 RNA Y utilizarla como sonda para encontrar su cadena complementarla incluso en una celula 0 extracto celular que contenga millones secuencias de DNA 0 RNA dlferentes. Frecuentemente se utilizan sondas de este tipo para detectar los dcidos nucleicos que corresponden a genes tleterminados, tanto para facllitar su purificaci6n y caracterizaci6n a partir de extractos celulares, como para localizarlos en el interior de las celulas, teJidos y organismos. Asimismo, utilizando reacciones de hibridaci6n poco rigurosas, se puede utilizar una sonda preparada a partir de un gen de un organismo dado para detectar los genes que estdn relaclonados evolutivamente -tanto en el mismo organismo, donde los genes relaclonadosformarlan parte de unafamilia genica, como en otros organismos, donde pondria de maniftesto la historia evolutiva de dieha secuencia.

Clonaje de DNA15 Mediante las tecnicas de clonaje de DNA un fragmento de DNA que contiene un gen de interes se inserta en el genoma de DNA purificado de un elemento genetieo autorreplicante -generalmente un virus 0 un pllismido. Por ejemplo, es posible unir, en el tuba de ensayo, un fragmento de DNA que contiene un gen humana con el cromosoma de un virus bacteriano, e introducir la nueva molecula de DNA recombinante en una celula bacteriana. A partir de una unica molecula recombinante que infecta a una unica bacteria, los mecanismos de replicaci6n normales del virus pueden producir mas de 10 12 moleculas de DNA virico identicas cada dia, amplificando asi el DNA humano insertado. EI plasmido 0 virus usado de esta forma se conoce como vector de clonaje, y se dice que el DNA propagado mediante inserci6n en el se ha clonado. Clonaje de DNA

331

plasmido de DNA circular

plasmido de DNA lineal con los extremos cohesivos

A

APAREAMIENTO

Q.nJ:lC::~;Y CORTE MEDIANTE

'

UNA NUCLEASA DE RESTRICCION

~AATTT iI', TOJ: ' ~i

j ,

i

I

~

UNION COVALENTE POR ACCION DE LA DNA L1GASA plasmido que contiene un inserto de DNA cromos6mico

TTAA uno de los muchos fragmentos de DNA producidos al cortar un cromosoma de DNA con la misma nucleasa de restricci6n

Figura 7-21 Formaciondeuna molt~culade DNA recombinante.

Se puede eonstruir una libreria de DNA utilizando veetores videos 0 veetores plasmfdicos1 6 Para clonar un gen se empieza construyendo una librer(a de DNA (una genoteca) -una colecci6n de fragmentos de DNA clonado, incluyendo (probablemente) al menos un fragmento que contenga el gen de interes. La genoteca puede construirse utilizando como vector tanto virus como plasmidos, y en general se mantiene en una poblaci6n de celulas bacterianas. Los principios basicos de los metodos utilizados para clonar genes son los mismos para cualquier tipo de vector utilizado, aunque pueden diferir en algunos detalles. Para simplificar, en este capitulo ignoraremos estas diferencias, e ilustraremos los metodos en referencia al clonaje en phismidos. Los vectores plasmfdicos utilizados para el clonaje de genes son pequefias moleculas circulares de DNA de doble cadena, derivadas de grandes plasmidos que aparecen de forma natural en bacterias. Generalmente suponen una pequefia parte del total del DNA de la celula huesped, pero pueden ser separados facilmente gracias a su menor tamafio respecto a las moleculas de DNA de los cromosomas, las cuales son mucho mayores y sedimentan por centrifugaci6n. Para utilizar los plasmidos circulares de DNA como vectores de clonaje, una vez purificados se cortan con una nucleasa de restricci6n para generar moleculas lineales. El DNA de la celula que se va a utilizar en la construcci6n de la genoteca tambien es cortado con la misma nucleasa de restricci6n, y los fragmentos de restricci6n resultantes (entre los que se encuentran los que contienen el DNA que va a ser clonado) se afiaden a los plasmidos cortados y se cierran, formando moleculas circulares de DNA recombinante. Estas moleculas recombinantes, que contienen insertos de DNA ajeno, son unidas covalentemente mediante la enzima DNA ligasa (Figura 7-21). El siguiente paso en la preparaci6n de la genoteca consiste en introducir las moleculas circulares de DNA recombinante en bacterias que se han hecho temporalmente permeables al DNA; se dice que estas celulas han sido transfectadas con el plasmido. A medida que estas celulas crecen y se dividen, los plasmidos recombinantes tambien se van replicando y produciendo un m1mero enorme de copias de DNA circulares que contienen el DNA ajeno (Figura 7-22). Muchos plasmidos bacterianos transportan genes que les confieren resistencia a los antibi6ticos, una propiedad que puede utilizarse para seleccionar las celulas que han sido Figura 7-22 Purificacion y ampliflcacion de una secuencia espec{flca de DNA por clonaje de DNA en una bacteria. Cada bacteria que contiene un plasmido recombinante se desarrolla en una colonia de celulas identicas, visible como un punto sobre placas de agar nutritivo. Inoculando la colonia de interes en un cultivo lfquido se puede obtener un gran mlmero de moleculas de DNA plasmidicas, cada una de las cuales contiene el mismo fragmento de DNA insertado.

332

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

Los extremos cohesivos producidos por muchas nucleasas de restricci6n permiten que dos fragmentos de DNA se unan mediante interacciones entre pares de bases complementarias (vease Figura 7-2). Los fragmentos de DNA unidos de esta manera pueden soldarse de forma covalente a traves de una reacci6n muy eficiente catalizada por la enzima DNA ligasa. En este ejemplo, se forma un plasmido recombinante que contiene un inserto de DNA cromos6mico.

un gran numero de plasmidos, cada uno de los cuales contiene un inserto de DNA diferente. uno de los cuales es el que nos interesa

0000 0000 00

........ I

I

I

l

l

l

solamente son resistentes al antibi6tico y crecen las bacterias que portan un plasmido

b4 *d*d

A

ensayo para las colonias que contienen el cion de DNA que interesa. Estas colonias se inoculan en un gran cultivo

1

I' ••

I 000 80

purificaci6n del DNA plasmidico

mRNA

5'

3' AAAAAAA

UNION DEL CEBADOR

1

5'

1

5'

3' SE HACE UNA COPIA EN DNA MEDIANTE LA TRANSCRIPTASA INVERSA

-

tf'tf'ttf' TTTTTTT 3'

5' 3'

Htf'tf't TTTTTTT

3'

5'

TRATAMIENTO CON ALCALI PARA DEGRADAR EL RNA

1 J..------------I

3'

el ex.tremo 3' del eDNA forma lazos en horquilla

-TTTTTTT

LA DNA POLIMERASA UTILIZA ESTOS BUCLES EN HORQUILLA COMO CEBADORES PARA SINTETIZAR UNA CADENA COMPLEMENTARIA

5'

3'

ffi'1-,

A'f1\.1'I'l-.

A'f1\.11~ A'f1\.1'~ A'f1\...~

A'f1\.1"ttf'tf'tf'

'UP
I

5'

TRATAMIENTO CON NUCLEASA S1 PARA ROMPER EL BUCLE

5' 3

3'

tf'ttf'tt TTTTTTT 5'

eopia de eDNA de doble cadena realizada a partir de un mRNA original

Figura 7-23 Sfntesis de eDNA. Se obtiene una eopia en DNA (eDNA) de una moIeeula de mRNA mediante la enzima transeriptasa inversa (vease pag. 303), formandose asf una heliee hfbrida DNA/RNA. El tratamiento del hfbrido DNA/RNA con aIeali degrada seleetivamente el RNA hasta nucle6tidos. La cadena sencilla de cDNA que permanece es copiada por la DNA polimerasa formando una doble heliee de cDNA. Tal como se indica, tanto la transcriptasa inversa como la DNA polimerasa requieren un eebador para poder iniciar la sfntesis. En el easo de la transeripci6n inversa se utiliza un pequeno oligonude6tido, en este ejemplo se ha hibridado un oligo(dT) con la larga cola poli-A earacterfstiea del extrema 3' de la mayoria de mRNA. Es de destacar que la mayor parte de las moleculas de eDNA producidas carecen de extremos eohesivos; las moIeculas que poseen extremos romos se pueden donar mediante diferentes proeedimientos que son similares (pero menos eficientes) a los descritos en la Figura 7-21.

transfectadas con exito; si la bacteria se hace crecer en presencia del antibi6tico, solamente sobreviviran las celulas que contengan los plasmidos. Cada una de las bacterias que fue transfectada contendra, en general, un fragmento de DNA insertado diferente; este inserto sera heredado por toda las celulas de la progenie de la bacteria que formaran una pequefia colonia en una placa de cultivo. La colecci6n de muchas pequefias bacterias supervivientes contiene la Iibrena de DNA, formada por un gran mlmero de insertos de DNA diferentes. El problema es que s610 unas cuantas de ellas tendran insertos de DNA con el gen de interes. Es necesario identificar dichas bacterias a fin de recuperar el DNA de interes en forma pura y en cantidades titHes. Antes de describir c6mo puede hacerse esto, es necesario describir una segunda estrategia en la construcci6n de Iibrerias de DNA muy utilizada en el clonaje de genes.

Dos tipos de librerias de DNA cumplen diferentes prop6sitos1 7 El procedimiento de cortar el genoma completo de una celula mediante una nucleasa de restricci6n, tal como se acaba de describir, en ocasiones recibe el nombre de aproximaci6n de la "perdigonada" al clonaje de genes. Produce una gran cantidad de fragmentos de DNA -para una celula de mamffero, del orden de un mill6n- que generaran por tanto millones de colonias diferentes de celulas transfectadas. Cada una de estas colonias estara compuesta por un clon derivado de una sola celula antecesora, y por 10 tanto, contendni un pIa.smido recombinante con un inserto de la misma secuencia de DNA gen6mico. Se dice que un plasmido como este contiene un clon de DNA gen6mico, y la colecci6n completa de plasmidos se denomina una libreria de DNA gen6mico. Sin embargo, debido a que el DNA gen6mico se ha cortado al azar en pequefios fragmentos, t1nicamente algunos de estos fragmentos contendran genes enteros; muchos de ellos tan s610 contendran una parte de un gen y la mayona de los clones de DNA gen6mico obtenidos del DNA de una celula eucariota superior contendran DNA no codificante, el cual, como se vera en el Capitulo 8, constituye la mayor parte del DNA de estos genomas. Clonaje de DNA

333

,--- gen A --,

If

gen B

iii i i' I Iii 1 ill 111111111~I 1111II! 111111111Iii icrom~~~mico 11111 ex6n

intr6n

1

11

TRANSCRIPCI6N

1

mRNA

CLONAJE DE DNA

-

I

11111

1

--- -----

MADURACI6N DEL RNA

_

I

-

transcritos deRNA -

fragmentos de DNA

1

gen B

"1111111111

1

DNA n.o transcnto

DIGESTI6N POR UNA NUCLEASA DE RESTRICCI6N

== == lImUl1

,--- gen A --,

1

I

TRANSCRIPCI6N INVERSA Y CLONAJE

--

clones de DNA gen6mico

•

•

clones de cDNA

Una estrategia altemativa consiste en iniciar el proceso de clonaje seleccionando las secuencias de DNA que se transcriben a RNA, y que, por 10 tanto, probablemente corresponden a genes. Ello se realiza mediante la extracci6n del mRNA (0 de una subfraccion purificada del mRNA) de las celulas, ya continuacion, haciendo una copia de DNA eomplementario (eDNA) de cada una de las moleculas de mRNA presentes; esta reacci6n esta catalizada por la enzima transcriptasa inversa de retrovirus, la cual sintetiza una cadena de DNA sobre un molde de RNA. Las moleculas de DNA de una sola cadena sintetizadas por la transcriptasa inversa se transforman en moleculas de DNA de doble cadena mediante la DNA polimerasa, y estas moleculas se insertan en vectores viricos 0 plasmidicos y se clonan (Figura 7-23). Cada uno de los clones obtenidos de esta forma se denomina clon de eDNA, y la colecci6n completa de clones derivados de una preparacion de mRNA constituye una librena de eDNA. Existen importantes diferencias entre los clones de DNA genomico y los clones de cDNA Los clones gen6micos representan una muestra al azar de todas las secuencias de DNA de un organismo, y salvo muy raras excepciones, sera el mismo independientemente del tipo celular que se haya utilizado para prepararlo. Par el contrario, los clones de cDNA solo contienen las regiones del genoma que se han transcrito a mRNA; las celulas de diferentes tejidos contienen diferentes juegos de moleculas de mRNA, por 10 que se obtendra una libreria de cDNA diferente en funcion del tipo celular empleado para su construcci6n.

Los clones de eDNA eontienen seeuencias eodifieantes eontinuas 18 La utilizacion de una libreria de cDNA para el clonaje de genes tiene varias ventajas. Asi, algunas celulas especializadas producen grandes cantidades de determinadas proteinas y en estos casos la cantidad de mRNA que codifica esta proteina se produce en un exceso tal que la libreria de cDNA preparada a partir de estas celulas estara muy enriquecida en las moleculas cDNA que codifican esta proteina, 10 cual facilita la identificacion del clan deseado en la libreria (Figura 7-24). Por ejemplo, la hemoglobina se fabrica en grandes cantidades en los eritrocitos en desarrollo; por ella los genes de globinas fueron de los primeros en ser clonados.

334

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

Figura 7 -24 Difertmcias entre clones de eDNA y clones gen6mieos. En este ejemplo, el gen Ase transcribe muy poco mientras que el gen B10 hace frecuentemente, y ambos genes contienen intrones (verde). En los clones de DNA gen6micos se incluyen tanto los intrones como el DNA no transcrito, de forma que muchos clones contendran s610 una parte de la secuencia codificante de un gen. En los clones de cDNA no hay secuencias de intrones ya que se han eliminado en el proceso de maduraci6n del RNA para formar el mRNA, y por ella contienen una secuencia codificante continua.

La caracterfstica mas importante de los clones de cDNA es que contienen la secuencia ininterrumpida de un gen. Frecuentemente los genes eucariotas consisten en pequefias secuencias cortas de DNA codificante (exones) separadas por regiones largas de DNA no codificante (intrones); la producci6n del mRNA supone la eliminaci6n de las secuencias no codificantes del transcrito de RNA inicial y la union entre sf de todas las secuencias codificantes. Ni las celulas bacterianas ni las levaduras realizan estas modificaciones sobre el RNA producido a partir de un gen de una celula eucariota. Asf pues, si la intencion del proceso de clonaje estriba tanto en deducir la secuencia de aminoacidos de una protefna a partir de la del DNA, como en producir grandes cantidades de la protefna expresando el gen clonado en una bacteria 0 en una levadura, es mucho mejor partir del cDNA. Las librerfas gen6micas (genotecas) y las librerfas de cDNA constituyen recursos inagotables ampliamente utilizados en investigaci6n. Hoy en dfa, muchas de estas librerfas son tambien asequibles comercialmente.

linfoeitos T

<jr...r<) f"o.J

~

Iinfoeitos B

mRNA de los linfocitos T

(~ LA TRANSCRIPTASA INVERSA ~~~ SINTETIZA DNA

Pueden prepararse Iibrerias de eDNA a partir de poblaciones seleccionadas de moltkulas de mRNA19 Cuando se prepara cDNA a partir de celulas que expresan el gen de interes a niveles extremadamente altos, la mayorfa de los clones pueden contener la secuencia del gen, la cual puede asf seleccionarse con un esfuerzo mfnimo. Para el caso de genes transcritos de forma menos abundante, antes de hacer la librerfa de cDNA pueden utilizarse diversos metodos para enriquecer la poblaci6n de RNA con el mRNA de interes. Por ejemplo, si se dispone de un anticuerpo contra la protefna, puede utilizarse para precipitar selectivamente los polirribosomas aislados (veanse pags. 253-254) que contengan las cadenas en crecimiento del polipeptido de que se trate. Como estos ribosomas tambien contienen el mRNA que codifica la protefna, el precipitado estara enriquecido en el mRNA deseado, en un factor de aproximadamente 1000 veces. El procedimiento de la hibridaci6n substractiva supone una potente alternativa para enriquecer la mezcla con una secuencia particular de nucleotidos, antes de proceder al clonaje de los cDNA. Este procedimiento de seleccion puede utilizarse, por ejemplo, si se dispone de dos tipos celulares estrechamente relacionados procedentes de organismos de la misma especie, pero tales que s610 uno de ellos produzca la protefna 0 protefnas de interes. Fue utilizado inicialmente para identificar protefnas receptoras de superficie presentes en los linfocitos T y no presentes en los linfocitos B. Tambien puede utilizarse cuando una celula que expresa la protefna tiene una mutante que no la expresa. EI primer paso del proceso consiste en sintetizar las moleculas de cDNA utilizando el mRNA del tipo celular que fabrica la protefna de interes. A continuaci6n, estos cDNA se hibridan con un gran exceso de moIeculas de mRNA del segundo tipo celular. El escaso mlmero de secuencias de cDNA que no encuentran pareja de mRNA complementaria, y que por 10 tanto probablemente representan las secuencias de mRNA que tinicamente estan presentes en el primer tipo celular, son purificadas por un procedimiento bioqufmico sencillo (una columna de hidroxiapatita) que separa las moleculas de acidos nucleicos de cadena sencilla de las de doble cadena (Figura 7-25). Ademas de constituir un poderoso sistema para clonar los genes cuyos productos estan restringidos a un determinado tipo celular especializado, las librerfas de cDNA preparadas tras hibridaci6n substractiva son titiles para definir las diferencias de expresion genica entre dos tipos celulares relacionados.

Para identificar los clones de interes en una Iibreria de DNA puede utilizarse tanto una sonda de DNA como un ensayo para la protefna expresada20 A menudo la etapa mas diffcil del proceso de clonaje de genes consiste en identificar las escasas colonias de la librerfa que contienen los fragmentos de DNA de interes. Esto es especialmente cierto en el caso de librerfas gen6micas, en las Clonaje de DNA

eopias de eDNA

HIBRIDACI6N CON EXCESO DE mRNA PROCEDENTE ~-.-'" DE LOS L1NFOCITOS B

eDNA de los eseasos mRNA presentes unieamente en los linfoeitos T

UNA COLUMNA DE HIDROXIAPATITA ELiMINA TODOS LOS HIBRIDOS DNA/RNA

eDNA purifieados que eorresponden a los mRNA earaeteristieos de los Iinfoeitos T

Figura 7-25 Hibridacion substractiva. Aquf la Menica se utiliza para purifiear clones de eDNA raros que eorn)sponden a mRNA, presentes en linfocitos T pero no en linfocitos B. Como ambos tipos eeliuares estan muy relacionados, muehos de los mRNA seran eomunes a ambos tipos celulares; el metodo de hibridaci6n substractiva es, por ello, una potente herramienta para obtener preparaciones enriquecidas en las moleculas especializadas que diferencian ambas celulas.

335

disco de papel absorbente

INCUBAR CON LA SONDA Y LAVAR colonias que contienen el plasmido de interes

sonda de DNA marcada radiactivamente

placa de petri con colonias de bacterias que contienen phlsmidos recombinantes

.. ::~;'I _ _,""""""",,",..L

RECOGER EL DISCO DE PAPEL DE LA PLACA PARA OBTENER LA R~PLlCA DE LAS COLONIAS

"

DNAunido al papel

L1SADO DE LAS BACTERIAS Y DESNATURALIZACION DEL DNA

Figura 7-26 Una ttknica eflciente que normalmente se utlliza para encontrar las colonias bacterlanas que contienen un clon de cDNA determinado. Se hace una replica del cultivo presionando un disco de papel absorbente contra la superficie. Esta replica se trata con aIcali (para romper las celulas y desnaturallzar el DNA plasmfdico) y se hibrida con una sonda radiactiva de DNA. Las colonias que se han hibridado con la sonda se detectan por autorradiograffa (vease tambien Figura 7-22).

que para identificar un determinado gen de mamffero se ha de identificar una celula bacteriana de entre un mill6n de celulas. La tecnica utilizada mas frecuentemente consiste en una forma de hibridaci6n in situ, que aprovecha la exquisita especificidad de las interacciones entre pares de bases que se producen entre dos moleculas complementarias de acidos nucleicos. Se transfieren (blotting) a un filtro colonias crecidas en placas de cultivo, de forma que quedan adheridos algunos miembros de cada colonia bacteriana. Estas colonias adheridas, conocidas como replicas, se tratan con aIcali y se incuban con una sonda radiactiva de DNA que contiene parte de la secuencia del gen que va a ser seleccionado (Figura 7-26). Si es necesario, de esta forma se pueden estudiar millones de clones bacterianos hasta encontrar uno que hibride con la sonda. Para encontrar el clon que interesa es necesario disponer de la sonda adecuada. C6mo construirla dependera de la informaci6n de que se disponga del gen a clonar. En muchos casos, la protefna de interes ha sido identificada mediante estudios bioqufmicos y purificada en pequefias cantidades. Una cantidad tan pequefia como unos cuantos microgramos de la protefna pura es suficiente para determinar la secuencia de los 30 primeros aminoacidos. Utilizando el c6digo genetico, a partir de esta secuencia de aminoacidos se puede deducir la secuencia correspondiente de nucle6tidos (con algunas ambigiiedades que corresponden a aquellos aminoacidos que son codificados por diferentes codones). Entonces, utilizando metodos qufmicos, se sintetizan dos juegos de oligonucle6tidos escogidos para reconocer diferentes zonas de la secuencia de nucle6tidos predicha del gen (Figura 7-27). Aquellas colonias de celulas que hibriden con ambos nucle6tidos son buenos candidatos para contener el gen deseado, y se afslan para una caracterizaci6n posterior (vease mas adelante). Las sondas tambien se pueden obtener de otras formas. Si se dispone de anticuerpos que reconozcan la protefna producida por el gen, es posible marcarlos y utilizarlos como sonda para encontrar aquel clon que sea productor de la protefna, y por ella que contendra el gen buscado. Tambien se puede usar como sonda cualquier otro ligando capaz de unirse a la proteina codificada por el gen: 336

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

EXPONER EL PAPEL A LA PELICULA '\ FOTOGRAFICA

posici6n de las colonias deseadas detectadas por autorradiografia

region conocida de una secuencia de aminoacidos

H2N--- • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •--COOH codones posibles

5' GGA GGC GGG GGU

GUA GUC GUG GUU

AGA AUG GAC UGG AAC UAC GAA CCA UUA AGC AGG GAU AAU UAU GAG CCC UUG AGU CGA CCG CUA UCA CGC CCU CUC UCC CGG CUG UCG CGU CUU UCU

ACA UGG GAA AUG AAC CAA UGG UUC GUA AGA ACC GAG AAU CAG UUU GUC AGG ACG GUG CGA ACU GUU CGC CGG CGU

GCA GCC GCG GCU

3'

regiones de secuencia codificante con menor ambigi.iedad

oligonucleotidos sinteticos usados como sondas (16 posibilidades)

(8 posibilidades)

si codifica un proteina receptara, por ejemplo, elligando que normalmente se une es un buen candidato a sonda especifica. Siempre que sea necesario detectar la proteina codificada par el gen y el propio gen, es necesario construir un tipo de libreria de cDNA especial. Se prepara utilizando vectores viricos 0 plasmidicos especiales, denominados vectores de expresi6n, que permiten la sintesis de grandes cantidades de la proteina codificada par el DNA ex6geno en las bacterias transfectadas.

La traducci6n in vitro facilita la identificaci6n del clon de DNA correcto21 Cualquier metoda que se utilice para aislar clones especificos a partir de librerias gen6micas 0 librerias de cDNA detecta muchos falsos positivos. Se necesita, pues, una dosis suplementaria de ingenio para discriminar entre estos clones y los autenticamente positivos. La tarea se facilita cuando el clon deseado codifica una proteina que ha sido bien caracterizada mediante otros sistemas. En este caso, se comprobara, mediante diferentes metodos, si alguno de los fragmentos de DNA clonados codifica la proteina apropiada. Por ejemplo, el DNA clonado se puede insertar en un vector de expresi6n, de modo que la proteina se produzca en grandes cantidades en bacterias. Asimismo se puede obtener la molecula de RNA correspondiente del DNA clonado, ya sea mediante sintesis in vitro con RNA polimerasa purificada (vease Figura 7-36), 0 mediante una tecnica denominada selecci6n de hfbridos. En este Ultimo metodo se mezcla RNA celular en un gran exceso con moleculas de una sola hebra del DNA candidato, y los hibridos DNA/RNA se utilizan para poder aislar las moleculas de mRNA complementarias de la mezcla. El mRNA purificado de esta forma se utiliza para la sintesis de proteina en un sistema libre de celulas con aminoacidos radiactivos, y la proteina radiactiva producida se caracteriza y se compara con la esperada a partir del clon DNA buscado. La coincidencia de resultados en alguna de estas aproximaciones es la que nos permitira concluir que el fragmento de DNA clonado codifica la proteina buscada.

Figura 7-27 Selecci6n de regiones de una secuencia de aminmicidos conocida para hacer sondas sinteticas de oligonucle6tidos. De hecho, una secuencia de nucle6tidos determinada codifica una sola protefna, pero la degeneraci6n del c6digo genetico significa que varias secuencias de nucle6tidos diferentes codifican la misma protefna, y es imposible anticipar emil de elIas sera la correcta. Debido a que es deseable utilizar como sonda una mezcla de oligonucle6tidos con una proporci6n de la secuencia correcta de nucle6tidos tan alta como sea posible, se escogen las secuencias con menos indeterminaciones, como se muestra en la figura. En este ejemplo se deben sintetizar los 8 oligonucle6tidos muy similares que se indican, que se usaran como sonda sobre una librerfa de DNA, y la mezcla de los 16 oligonucle6tidos se utilizara para verificar por hibridaci6n todos los posibles clones positivos de la primera busqueda, a fin de encontrar los que codifican la proteina deseada. Cada oligonucle6tido se marca en el extrema 5' despues de ser sintetizado por metodos qufmicos (vease Figura 7-6B); altemativamente, el oligonucle6tido se puede marcar en el propio proceso de sfntesis mediante la incorporaci6n de un nucle6tido modificado (vease Figura 7-18).

La selecci6n de clones de DNA solapados permite "caminar" por el cromosoma hasta un gen vecino de interes22 Muchos de los genes mas interesantes -par ejemplo los que controlan el desarro110- se conocen tan s6lo a traves de ancilisis geneticos de mutantes en organismos tales como la mosca del vinagre Drosophila y el nemcitodo Caenorhabditis elegans. Los productos proteicos de estos genes son conocidos y pueden hallarse en cantidades muy pequefias en unas cuantas celulas, 0 producirse unicamente durante un determinado estadio del desarrollo. Sin embargo, es posible establecer mapas cromos6micos que reflejen las posiciones relativas de los diferentes genes en el Clonaje de DNA

337

•

-

•••

t PREPARAR UNA SONDA DEL EXTREMO DEL CLON A

cion A

t EMPLEAR LA SONDA PARA IDENTIFICAR EL NUEVO CLON

-

a::::;·: ,;;:;;:.:\::,::;;;,:;::;:.

t PREPARAR UNA SONDA DEL EXTREMO DEL CLON B

cion B

t EMPLEAR LA SONDA PARA IDENTIFICAR EL NUEVO

::;:\!; '1\;: :;:::.

RESULTADO: UNA COLECCI6N DE CLONES DE DNA SOLAPADOS Y ORDENADOS QUE CUBREN TODA LA REGI6N CROMOs6MICA

CLON

t etc.

cion C

• t

t

cion D

etc. gen clonado previamente 0 marcador genetico

E~H;1 h" :'; lI'''! l'

• • W,,;.LI (""H.·,,;:.:l DNA cromos6mico

'" WI!

i I

)

nuevo gen de interes direcci6n del "paseo" por el cromosoma

cromosoma a partir de estudios de ligamiento (vease Figura 7-16). Cuando un gen mapado se ha clonado, se pueden identificar los clones de una libreria de DNA gen6mico que corresponden a genes vecinos, utilizando una tecnica conocida como "caminar por el cromosoma". Una vez identificados estos, se caracterizan mediante las tecnicas descritas en este capitulo a fin de identificar su estructura y su funci6n. El proceso de "caminar por el cromosoma" se inicia a partir de un clon de DNA 0 un marcador RFLP del que se sabe que esta muy pr6ximo al gen de interes. Un extrema de este clon se utiliza para preparar una sonda DNA que se usara para localizar clones gen6micos mediante hibridaci6n. Despues de aislar este segundo clon se utiliza el extrema mas alejado del anterior para preparar una segunda sonda DNA, que tambien se utilizara para aislar nuevos clones gen6micos. De este modo se puede ir caminando por el cromosoma, clon a clon, en pasos de unos 30 000 pares de bases 0 mas, en ambas direcciones (Figura 7-28). Pero, ic6mo se puede determinar cuando se ha acabado el gen de interes (identificado originalmente mediante una mutaci6n deleterea), dado que el camino recorrido generalmente es demasiado largo para poder determinar la secuencia completa de DNA? En el caso de organismos muy utilizados en experimentaci6n como moscas del vinagre, nematodos, Arabidopsis, levaduras y ratones, la prueba definitiva se obtiene al introducir la forma correcta del gen en un individuo mutante, produciendo un organismo transgenico (vease Figuras 7-45 y 7-49). Si la mutaci6n original era recesiva, el individuo transgenico debe recuperar la funci6n normal. En otras ocasiones, como en el caso del estudio de los genes humanos, no es posible obtener transgenicos y por ello se aplican criterios menos severos, como se describe mas adelante (vease Figura 7-30).

l --- 1II\lIIll1I

_

clones en vectores c6smidos

_

_ _ 1IIIIllIllllI _

1IIIIIlI\\\\\lI_ II\IIIlIIlIIIII

__

II\IIIlIIlIIIII

1IIIIlIIIIIIIII1IIIIIlI\\\\\lI_

clones enYAC

1IIIIlIIIIIIIII_

[-~~~;;;; :-.'

cromosoma 3

;'

IIlIIIIIIIIlIII. .IIlIIIIIIIIlIII unc-32

sup5

- 300 000 pares de bases

338

Figura 7-28 Utilizaci6ndel solapamiento de clones de DNA para encontrar un nuevo gen, mediante la tecnica de "caminar por el cromosoma". Para aumentar la velocidad del proceso, resulta optimo utilizar mollkulas de DNA clonadas muy largas. Para localizar el cion siguiente mediante el procedimiento de "caminar por el DNA", se purifica un fragmento carta de DNA (y se marca radiactiva 0 qufmicamente) de uno de los extremos del clan identificado anteriormente: si se utiliza el extrema derecho, par ejemplo, el avance se realizani hacia la derecha, como se ilustra en el ejemplo. La utilizacion de pequefios fragmentos del extremo del clan reduce la probabilidad de que la sanda contenga secuencias de DNA repetidas que hibridarfan con numerosos clones de diferentes regiones del genoma, con 10 que se interrumpiria el "paseo".

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

Figura 7-29 Clones de DNA gen6micos solapados. La coleccion de clones que se muestran cubren una pequefia region del cromosoma del gusano nematodo Caenorhabditis elegans y representa un 0,3 % del genoma total. (Adaptado de J. Sulston et al., Nature 356: 37-41, 1992. © 1992 MacMillan Magazines Ltd.)

ETAPA

1 -

(

I

gen humano mutado, localizado en algun lugar de este mill6n de pares de bases ~

~ )

(

)

marcador RFLP X

5

marcador RFLP Y

----------------------------solapamiento de clones de DNA

ETAPA

2

-

(

-7

x

Y

(

)

-

secuencias de DNA conservadas en el rat6n

ETAPA

3

-

,<

(

-7

X

~

~

\

•

\

• ~•

(

Y

5

Y

5

Y

5

-

secuencias de DNA conservadas que codifican un mRNA adecuado ETAPA

4

-

(

-7

X

~

~

(

-

gen cuya secuencia esta alterada en los humanos que presentan el fenotipo mutante ETAPA

5 -I

(

X

•/

(

-

Se estan construyendo librerias gen6micas de clones ordenados para organismos seleccionados23 Sera mucho mas sencillo identificar genes mutantes a medida que se conozca mas completa y sistematicamente la secuencia del genoma normal. Utilizando metodos relacionadQs con los descritos para "caminar por el cromosoma", ha sido posible ordenar (mapar) un juego casi completo de grandes clones gen6rnicos a 10 largo de los cromosomas de la bacteria E. coli, la levadura Saccharomyces cerevisiae, la mosca del vinagre Drosophila, la planta Arabidopsis y el nematodo C. elegans. Estos grandes clones, cada uno de los cuales tiene aproximadamente 30 000 pares de bases de longitud, se han preparado en vectores del bacteri6fago lambda llainados c6smidos, los cuales se han disefiado especialmente para aceptar unicamente grandes insertos de DNA. Son necesarios algunos miles de clones c6smidos para cubrir todo el genoma de un organismo como C. elegans 0 Drosophila. Para mapar todo el genoma humano siguiendo este sistema, se tendrfan que ordenar mas de 100 000 de estos clones c6srnidos, 10 cual, aunque es tecnicamente posible, llevarfa mucho tiempo. Ademas, se pueden clonar fragmentos de DNA humano mas de 10 veces mas largos que los clones c6srnidos (300 000 hasta 1,5 millones de pares de bases) en forma de cromosomas artificiales en celulas de levadura (YAC, de Yeast Artificial Chromosomes, cromosomas artificiales de levadura); en principio el genoma humano se puede mapar con 10 000 clones de este tipo (vease Figura 8-5). Sin duda, en un futuro pr6ximo seran asequibles un conjunto de clones gen6micos de librerfas de DNA centralizadas para el uso de todos los investigadores. Para cada organismo de los que se estudian habitualmente existira una librerfa completa, en la que cada inserto de DNA estara catalogado de acuerdo con su cromosoma de origen, y numerado secuencialmente con respecto a la posici6n de todos los demas fragmentos de DNA derivados del mismo cromosorna. Asf, se podra empezar a "caminar por un cromosoma", simplemente obteniendo de la librerfa todos los clones que cubren la regi6n del genoma que contiene el gen mutante de interes.

Clonaje de DNA

Figura 7-30 Clonaje posicional. El p£Ocedimiento requiere la utiIizaci6n de un gen humano mutante cuya herencia pueda detectarse en muchos grupos familiares gracias al fenotipo que causa dicha mutaci6n. Etapa 1, mapaje genetico: se identifican marcadores RFLP, que coheredan con el fenotipo mutante, y se utilizan para posicionar el gen en margen de unas 106 pares de bases (una megabase, alrededor dell % de la longitud de un c£Omosoma humano tipico). Etapa 2, ensamblaje de una librerta de clones ordenados: se obtienen clones de DNA

gen6mico que cubran la totalidad de la regi6n comprendida entre dos marcadores RFLP que flanquean el gen. Etapa 3, busqueda de secuencias de DNA conservadas: se identifican las porciones de cada clon DNA que hibridan con DNA de rat6n; unicamente las regiones del c£Omosoma humano cuya secuencia de nucle6tidos sea importante, estanin suficientemente conservadas durante la evoluci6n para formar una helice hibrida de DNA (una de las hebras de DNA humano y la otra de DNA de rat6n). Etapa 4, busqueda de mRNA adecuados: las secuencias de DNA que mas p£Obablemente contienen el gen mutante son el subconjunto de secuencias de DNA conservadas que codifican mRNA en los tejidos en los que se expresa el fenotipo mutante. Etapa 5, bUsqueda de diferencias entre las secuencias de DNA de los genes mutantes. Cuando se analizan las

mutaciones deletereas de un gen humano tipico, alrededor de 1 de cada 10 resulta ser una delecci6n facilmente detectable por analisis Southern como una cambio del tamafio de un fragmento de restricci6n. Por esta raz6n, generalmente se empieza estudiando el DNA de muchos pacientes humanos que padezcan la misma enfermedad, utilizando sondas identificadas en la etapa 4, buscando cambicis de este tipo. Si la mutaci6n no es detectable como una delecci6n, para identificar al gen de interes se deberan utilizar ot£Os metodos mas laboriosos que sean capaces de detectar cambios de una sola base.

339

El clonaje posicional de DNA revela la presencia de genes de funciones imprevistas24 Miles de enfermedades geneticas humanas son debidas a alteraciones en un solo gen. La comprensi6n que tenemos de dichas enfermedades esta siendo revolucionada por la tecnologfa del DNA, que permite donarlo y secuenciarlo, revelando los defectos precisos de cada paciente. De esta forma se ha p04ido demostrar que la causa de la distrofia muscular de Duchennne es una proteina an6mala del citoesqueleto en las celulas musculares, y que la fibrosis quistica es debida a un canal de doro an6malo en las celulas epiteliales. Estos conocimientos permiten afinar el diagnostico, y disenar nuevos tratamientos. A pesar de que las tecnicas que se han utilizado para aislar diferentes genes humanos han diferido dependiendo de la enfermedad que producen, recientemente se ha desarrollado una aproximacion que permitira aislar cualquier gen humano responsable de un rasgo 0 causante de una enfermedad. Se ha denominado clonaje posicional pues parte de un mapa de ligamiento que permite localizar el gen en el genoma (Figura 7-30). Cuando esta aproximacion es directa puede suponer la dedicaci6n de 10 a 100 personas en un ano para aislar un gen. Sera mucho mas sencillo una vez que se disponga de tecnologias de secuenciacion de DNA mucho mas rapidas y automaticas, y que se conozca la secuencia completa del DNA del genoma humano: el mapaje genetico indicara inmediatamente que genes son los primeros candidatos, permitiendo su analisis directo en los pacientes individuales. Es probable que se puedan analizar de este modo las funciones de miles de genes humanos.

Mediante una reaccion de polimerizacion en cadena se pueden clonar segmentos de DNA en un tubo de ensayo25 La asequibilidad de DNA polimerasas purificadas y de oligonudeotidos de DNA sintetizados quimicamente ha hecho posible donar rapidamente secuencias determinadas de DNA, sin necesidad de utilizar ninguna celula viva. La tecnica, denominada reacci6n en cadena de la polimerasa (peR, de Polymerase Chain Reaction) permite amplificar mas de mil millones de veces un DNA obtenido a partir de una region seleccionada de un genoma, siempre y cuando previamente se conozca al menos una parte de su secuencia de nudeotidos. En primer lugar se utilizan porciones de la secuencia que rodean la region que va a ser amplificada, para disenar dos oligonucleotidos sinteticos de DNA, cada uno de los cuales es complementario de cada una de las cadenas de la doble helice de DNA, y que corresponden a sitios opuestos de la region a amplificar. Estos oligonudeotidos se utilizan como cebadores para la sintesis in vitro de DNA, catalizada por una DNA polimerasa, y determinan los extremos del fragmento final de DNA que se obtiene (Figura 7-31). El principio de la tecnica PCR se ilustra en la Figura 7-32. Cada cido de reacci6n requiere un breve calentamiento para separar las dos cadenas del DNA genomico de doble helice (etapa 1). EI exito de la tecnica depende del uso de una DNA polimerasa especial aislada de una bacteria term6fila y que es mucho mas estable a temperaturas elevadas que la polimerasa comun, de modo que no se desnaturaliza por calentamientos repetidos. EI enfriamiento posterior del DNA en presencia de un gran exceso de los dos oligonudeotidos permite su hibridaci6n especifica con las secuencias complementarias de DNA (etapa 2). La mezda se incuba con DNA polimerasa y los cll;atro desoxirribonucle6sidos trifosfato, de forma que las regiones del DNA que se hallan en direccion 3' de los cebadores, se sintetizan selectivamente (etapa 3). Para conseguir una amplificaci6n especifica del DNA se requieren 20 0 30 ciclos de reacciones. Cada cido dura aproximadamente 5 minutos, y un procedimiento automatico permite el donaje en un sistema libre de celulas de un fragmento de DNA, en pocas horas, comparado con el tiempo de varios dias que se requiere para el donaje por los metodos estandar. 340

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

cadenas de DNA complementarias separadas

_ _ _ _ _ 5'

3'

cebadores p 5'• • • • • es..eC.if.iC.O.S'&- 3'

!

sintesis de DNA 5'

3'

3'

X pares de nucle6tidos

Figura 7-31 lnicio de la reacci6n en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificaci6n de secuencias especfficas de nucle6tidos in vitro. El DNA aislado de celulas se calienta para separar su dos cadenas complementarias. Estas cadenas se hibridan con un gran exceso de dos oligonucle6tidos (de 15 a 20 nucle6tidos de longitud) sintetizados por metodos qufmicos y que son identicos a secuencias que distan entre sf X nucle6tidos (donde Xvaria generalmente entre 50 y 2000 nucle6tidos). Los dos oligonucle6tidos actuan como cebadores para la sfntesis in vitro de DNA catalizada por la DNA polimerasa, que copia la secuencia de DNA que hay entre ambos oligonucle6tidos.

Figura 7-32 Ampliflcaci6n por PCR. EI metodo PCR produce, en cada cicIo de sintesis de DNA, una cantidad doble de la precedente, de una moleculade tamafio unico. Cada cicIo esta formado por tres etapas, como se describe en el texto. Despues de muchos cicIos de reacci6n la poblaci6n de moleculas de DNA esta dominada por un fragmento de DNA unico, de X pares de bases, siempre que la muestra de DNA original contenga la secuencia que se esperaba que existiera entre los dos oligonucIe6tidos. En el ejemplo, tres cicIos de reacci6n han producido 16 cadenas de DNA, 8 de las cuales tienen la misma longitud (amarillo); pero despues de tres cicIos mas, 240 de las 256 cadenas seran de X nucIe6tidos de longitud.

EI metodo PCR es extremadamente sensible: en una muestra puede detectar una sola molecula de DNA. De una forma similar se pueden analizar cantidades traza de RNA, transformando este RNA en secuencias DNA mediante la acci6n de la transcriptasa inversa. La tecnica de clonaje mediante PCR esta substituyendo con rapidez a la de transferencia Southern para el diagn6stico de enfermedades geneticas y para la detecci6n de infecciones viricas muy tenues. Tambien constituye una tecnica prometedora para la medicina forense, ya que permite analizar cantidades pequefias de sangre u otros tejidos -tan pequefias como una sola celula- e identificar a la persona de la que procede pOI sus caracteristicas geneticas (Figura 7-33).

Resumen El clonaje de DNA permite seleccionar una copia de cualquier secuencia de RNA 0 de DNA entre millones de otras secuencias de una celula, produciendo cantidades ilimitadas de ella en forma pura. Las secuencias de DNA son amplijicadas despues de cortar el DNA cromos6mico con una nucleasa de restricci6n e insertar los fragmentos de DNA resultantes en el cromosoma de un elemento genetico autorreplicante (un ptasmido 0 un virus). Cuando se utiliza un ptasmido como vector, la "libreria gen6mica de DNA" resultante se mantiene en el interior de millones de celulas baeterianas, cada una de las cuales porta un fragmento diferente de DNA clonado. La colonia portadora del fragmento de interes se identiftca mediante hibridaci6n con una sonda DNA, 0, despues de expresar el gen 0 el fragmento genico clonado en la celula huesped, mediante un sistema que detecte el producto genico deseado. Las celulas de la colonia identijicada se dejan proliferar produciendo grandes cantidades delfragmento de DNA deseado. Clonaje de DNA

341

huella genetica por PCR VNTR1

cromosoma materna

VNTR2

VNTR3

cromosoma paterno

individuo secuencias repetidas de un locus VNTR

A

cebadores para amplificaci6n PCR

tI

PCR

I I ~

individuo

8

electroforesis -

(A)

0

5

numero de repeticiones 10 15 20 25 30

PCR 35

I I II I I III I I I I II II I

individuo

C

electroforesis ~

~

~

3 pares de cromosomas hom61ogos

(8)

El proeedimiento que se utiliza para aislar clones de DNA euya seeueneia eorresponda a la de un mRNA es el mismo, con la exeepei6n de que, en vez de utilizar fragmentos gen6mieos al azar, el material de partida es un DNA obtenido mediante eopia de un mRNA, denominado eDNA. A difereneia de los clones gen6mieos, los clones de eDNA eareeen de seeuencias intr6nieas, siendo por ello los clones de eleeei6n para expresar y earacterizar el produeto proteieo de un gen. El metodo PCR es una nueva forma de clonaje de DNA que se realiza en un sistema libre de celulas, utilizando una DNA polimerasa termoestable purifleada. Este tipo de amplijieaei6n de DNA supone un eonocimiento previo de la seeueneia geniea pues son neeesarios dos oligonucle6tidos sintetieos que flanqueen la seeuencia a amplijiear. Sin embargo, el metodo de clonaje por PCR tiene la ventaja de ser mueho mas rapido y sencillo que los metodos de clonaje estandar.

Ingenieria de DNA26 Los metodos que se han descrito hasta el momenta en este capitulo permiten en principio determinar la organizaci6n y la secuencia nucleotidica de cualquier cromosoma, incluyendo aquellos que forman el genoma humano. En esta secci6n se describinin variaciones y modificaciones de dichos metodos que han revolucionado el estudio de las funciones de los genes, los RNA y las proteinas. 342

Capitulo 7 : Tecnologfa del DNA recombinante

Figura 7-33 UsodePCRenmedicina forense. (A) Si se utilizan dos oligonucle6tidos que flanquean un microsatelite particular, 0 secuencia VNTR (vease Figura 7-14Cl, para amplificar un DNA por PCR, se obtienen diferentes bandas de DNA para cada individuo. Una de estas bandas contiene la secuencia VNTR repetida que fue heredada de la madre y la otra contiene la secuencia VNTR repetida que foe heredada del padre. (B) La gran cantidad de bandas de DNA obtenidas de un conjunto de diferentes reacciones PCR, cada una de las cuales amplifica el DNA de una secuencia VNTR diferente, pueden utilizarse como "huella genetica" para identificar a cada individuo de forma casi exclusiva. El material de partida en la reacci6n PCR puede ser un simple cabello olvidado en la escena de un crimen.

Se pueden construir moIeculas de DNA de cualquier secuencia uniendo fragmentos de DNA27 Como hemos visto, las moIeculas de DNA recombinante se obtienen generalmente usando la enzima DNA ligasa para unir dos moleculas de DNA con extremos cohesivos compatibles. En el caso de la construcci6n de una librerfa de DNA, uno de los fragmentos de DNA es el vector, derivado de un pl
Es posible producir grandes cantidades de moIeculas de RNA homogeneas mediante transcripci6n de DNA in vitro28 Las moleculas de RNA puras son de utilidad en numerosos estudios de biologfa celular. En el caso de que el RNA codifique una protefna, disponer de grandes secuencia codificante A

secuencias codificantes a unir secuencia codificante B

SEPARACION DE HE BRAS Y UNION DE CEBADORES PCR CON COLAS 5' (<:J ) QUE CONTIENEN D1ANAS DE RESTRICCION

1

5' 3'

5'

...

111!!!!!!~---3'

3'I11III 5'~

I

Figura 7-34 El clonaje seriado de DNA puede utilizarse para unir una serie de fragmentos de DNA procedentes de diferentes genes. Todas las moilkulas que se representan son de doble hebra. Despues de cada etapa de inserci6n de DNA, el plasmido es clonado para purificar y amplificar la nueva molecula recombinante. El plasmido recombinante es cortado con una nucleasa de restricci6n y utilizado como vector para el siguiente fragmento de DNA.

IIIIIIII5'

I ====:5'

MUCHOS CICLOS DE PCR PRODUCEN COPIAS DE LAS SECUENCIAS A Y B CON LOS EXTREMOS MODIFICADOS DESEADOS

3':==~15' 13'

5'1

3"01 5'CI

A

3'

B

1 A

CORTAR LOS EXTREMOS CON LA NUCLEASA DE RESTRICCION

••

1

I . UNION DE LOS

~RAGMENT~

B

union exacta de la secuencia codificante A con la secuencia codificante B

Ingenieria de DNA

Figura 7-35 La "manufactura" de los extremos de los fragmentos de DNA facilita la precisi6n de su uni6n. La reacci6n peR permite modificar los ! extremos de cualquier fragmento de DNA que va a ser amplificado, para facilitar su clonaje. Los oligonucle6tidos sinteticos usados aqui como cebadores contienen extremos 5' elegidos para crear una diana de corte para una nucleasa de restricci6n particular.

343

cantidades de esa especie pura facilitani el estudio, por ejemplo, de la maduracion del RNA y de la sfntesis de la protefna; si el RNA tiene una funcion catalftica, esta actividad podni ser analizada en sistemas libres de celulas. Sin embargo, un gran ntimero de los RNA celulares se encuentran en pequefias cantidades, y es muy diffcil su purificaci6n de los muchos miles de otros RNA presentes en un extracto celular. La ingenierfa genetica proporciona el mejor sistema de purificar especies puras de RNA, gracias a hacer accesible moldes de DNA puros que permiten producir cualquier molecula de RNA. Esta tecnica utiliza RNA polimerasas viricas que son especialmente eficientes. Para preparar el molde de DNA apropiado, se elona el DNA que codifica el RNA de forma que se una a un segundo fragmento de DNA que contenga la sefial de inicio (promotor) para la RNA polimerasa virica. Esta molecula de DNA recombinante pura se mezela con la RNA polimerasa virica y los cuatro ribonuele6sidos trifosfato utilizados en la sfntesis de RNA. Durante una incubacion a 37°C se produce gran cantidad del RNA deseado mediante transcripci6n in vitro (Figura 7-36).

Utilizando vectores de expresi6n es posible producir grandes cantidades de proteinas celulares minoritarias29 Hasta hace muy poco, las unicas protefnas de una celula que podfan estudiarse con facilidad eran las relativamente mas abundantes. A partir de varios cientos de gramos de celulas se puede purificar una protefna abundante -que constituya ell % 0 mas de la protefna total- mediante pasos cromatograficos secuenciales, llegando a obtener quizas 0,1 g (100 mg) de protefna pura. Esta cantidad de protefna es suficiente para realizar una secuenciacion de aminoacidos convencional, para desarrollar un an8.lisis detallado de su actividad biol6gica 0 enzimatica (si es conocida) y para generar anticuerpos que puedan ser utilizados para localizar la protefna en el interior de la celula. Ademas, si se consigue obtener cristales apropiados (10 cual normalmente constituye una tarea diffcil), sera posible determinar la estructura tridimensional de la protefna mediante tecnicas de difracci6n de rayos X. De esta manera, se han analizado la estructura y la funci6n de muchas protefnas abundantes, entre las que se hallan la hemoglobina, la tripsina, algunas inmunoglobulinas y la lisozima. La inmensa mayorfa de los miles de protefnas diferentes de una sola celula eucariota, ineluidas algunas de las protefnas mas interesantes, se hallan presentes en cantidades muy reducidas. Resulta extremadamente diffcil, cuando no es imposible, obtener mas de unos cuantos miligramos de material puro de la mayoria de estas proteinas minoritarias. Una de las contribuciones mas trascendentales del elonaje del DNA y de la ingenierfa genetica a la biologfa celular es que han hecho posible la manufactura en grandes cantidades de cualquiera de las protefnas celulares, ineluyendo las minoritarias. En principio es posible producir grandes cantidades de una proteina pura si se sintetiza gran cantidad de mRNA que codifica dicha proteina y despues se traduce en un sistema libre de celulas que contenga los numerosos componentes necesarios para la sfntesis de proteinas, ineluyendo ribosomas, RNA de transferencia, enzimas de traduccion, etc. Esta aproximacion se usa en ocasiones aunque es mucho mas eficiente producir tanto el mRNA como la protefna en una celula viva, utilizando un vector de expresi6n (Figura 7-37). Este vector esta disefiado para producir grandes cantidades de mRNA estable que sera traducido eficientemente a proteina en el interior de la bacteria, levadura, 0 celula de mamifero. A fin de evitar que la elevada sfntesis de la protefna extrafia interfiera con el crecimiento de la celula transfectada, los vectores de expresion se suelen disefiar de modo que la sintesis de la protefna extrafia se inicie poco antes de recolectar las celulas (Figura 7-38). Debido a que la protefna deseada fabricada por un vector de expresion se produce en el interior dela celula, ha de purificarse del resto de las protefnas de la celula huesped mediante cromatografia, tras la lisis celular; pero debido a que se halla en cantidades importantes (entre un 1% Yun 10% del total de la protefna celular), habitualmente la purificaci6n puede conseguirse facilmente en unas cuantas eta-

344

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

moleeula de DNA de doble hebra, eonstruida por ingenieria genetiea

(-.lIIIIIlIi--I11111!!,-....) seeue~?la que espeelflea el RNA CORTE CON UNA NUCLEASA DE RESTRICCION

promotor virieo

I

+

!

INCUBACION CON RNA POLIMERASA MAs NUCLEOSIDO TRIFOSFATOS

...._~­ 1

(

RNA [

5' 5'

t

3' 3'

I

ELiMINAR EL DNA ~ Y LA PROTEfNA

moleeulas de RNA puras

Figura 7-36 Se pueden obtener in vitro grandes cantidades de cualquier molecuia de RNA usando una RNA polimerasa virica. Para utilizar estas enzimas extraordinariamente eficientes es necesario que en el molde de DNA este construido de forma que la corta secuencia de DNA que especifica el promotor virica sea adyacente a la secuencia de DNA que codifica la molecula de RNA que se va a sintetizar. Como se indica, el extremo 3' del RNA se determina al cortar el molde DNA con una nucleasa de restricci6n de diana unica.

Figura 7-37 Producci6n de grandes cantidades de una protema por clonaje de una secuencia codificante de una proteina en un vector de expresi6n plasmidico. EI pllismido se ha construido de forma que contiene un

promotor muy activo, capaz de dirigir la sfntesis de una gran cantidad del mRNA que codifica la protefna, en las celulas transfectadas.

pas. Existe una gran variedad de vectores de expresi6n, cada uno de los cuales esta construido para que actue en el tipo celular en el que se va a producir la protefna. De esta forma, las celulas pueden ser inducidas a fabricar grandes cantidades de protefnas utiles desde el punto de vista medico -como insulina y hormona del crecimiento humanas, interfer6n y antfgenos vfricos para producir vacunas. De forma mas general, estos metodos hacen posible producir protefnas en cantidades suficientemente grandes para poder estudiar detalles de su estructura y de su funci6n, qu~ antes estaban reservados unicamente a unas cuantas protefnas.

Los genes marcadores permiten analizar la funci6n de las secuencias de DNA reguladoras30 La transcripci6n de un gen esta controlada por secuencias de DNA reguladoras que no se transcriben. Estas secuencias determinan que celulas expresaran el gen y bajo que condiciones, como se explica en el Capftulo 9. En eucariotas superiores dichas secuencias se pueden encontrar situadas a muchos miles de pares de bases par delante 0 por detras de las secuencias que se transcriben, y actuan en diferentes combinaciones controlando la expresi6n genica. Las secuencias de DNA reguladoras de un gen se pueden identificar mediante una manipulaci6n que supone reemplazar parte de la secuencia codificante par otra diferente (denominada secuencia marcadora) seleccionada, debido a que la protefna que codifica se detecta con facilidad mediante tinci6n citol6gica simple 0 ensayo enzimtitico. Las secuencias reguladoras se identificaran uniendo diferentes regiones de secuencia anterior 0 posterior del gen a la secuencia marcadora. Cuando se transfecten celulas con estas moleculas de DNA recombinante el nivel de expresi6n de la protefna marcadora, el momenta en que se produce esta y la especificidad celular, reflejaran la funci6n de las secuencias reguladoras que contiene cada construcci6n de DNA (Figura 7-39).

Los organismos mutantes revelan mejor la funci6n de un gen

31

Supongamos que se ha clonado un gen que codifica una protefna recien descubierta. lC6mo podremos descubrir la funci6n que desarrolla esta protefna en la celula? Este es un problema actualmente muy habitual en biologfa celular, pero sorprendentemente diffcil de resolver, ya que ni la estructura tridimensional de la protefna ni la secuencia completa de nucle6tidos de su gen son sufidentes para determinar la funci6n de la protefna. Ademas, muchas protefnas -tales como las que tienen funciones estructurales en la celula 0 las que normalmente forman parte de un gran complejo enzimtitico- carecen de una actividad obvia cuando estan separadas de los otros componentes de su unidad funcional.

vector de expresi6n plasmidico, DNA de doble hebra

«. >Z

)

«

»

INSERTAR LA SECUENC~A DE DNA QUE CODIFICA LA PROTEfNA

(---_..)

TRANSFECTAR CELULAS CON EL DNA RECOMBINANTE

...

(--~ ) t

RNA sobre-expresado

protelna sobre-expresada

tiempo a 42°C

DNA helicasa

Figura 7-38 Producci6n de grandes cantidades de una proteina utilizando un vector de expresi6n plasmidico. En este ejemplo se han transfectado

bacterias con la secuencia codificante de una enzima, la DNA helicasa (flecha); la transcripci6n de esta secuencia codificante se encuentra bajo el control de un promotor virico que es activo unicamente a temperaturas de 37°C 0 superiores. Se ha analizado la protefna celular total por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, tanto de bacterias cultivadas a 25°C (no se produce helicasa), como de las mismas bacterias cultivadas a 42°C durante dos horas. (Fotograffa cortesfa de Jack Barry.) Ingenieria de DNA

345

(Al MCILEC:U!J!l,S [)ECINAORIIGIl\IAU:S secuencia codificante de la proteina X

celulas

'A

normal 1 "

2

secu~ncias

reguladoras que determinan la expresi6n del gen X

lugar de inicio de la sintesis de RNA

patr6n normal de expresi6n del gen X

,

_ _ _~_~_~"Z1R!.!I!I!iIe!I]I!J! 3

F'

secuencia codificante de la proteina marcadora Y

recombinada

2

E

CIIlIIIIII

3 /

BCD

c::::::::=

-

CIIlIIIIII

(B)

-----3-~ ---2~--~~111!·:!!-

····2····~·i.·.I]:!I]]11 (Cl CONCLUSIONES -Ia secuencia reguladora 3 activa el gen X en las celulas B -Ia secuencia reguladora 2 activa el gen X en las celulas D, E y F -Ia secuencia reguladora 1 inactiva el gen X en las celulas D

Una aproximacion que ya hemos comentado (vease Capitulo 4), consiste en inactivar la proteina a estudiar mediante un anticuerpo especffico y observar como esto afecta a las celulas. A pesar de que esta estrategia proporciona una poderosa via para estudiar la funcion proteica, para el caso de un proteina intracelular el efecto es transitorio ya que el anticuerpo microinyectado se diluye durante la proliferacion celular 0 es destruido por degradacion intracelular. Asimismo, muchos anticuerpos -incluso los que se unen fuertemente a alguna region de la proteina diana- son incapaces de bloquear la funcion de la proteina. Las aproximaciones geneticas proporcionan una solucion convincente a este problema. Los organismos mutantes que carecen de una determinada proteina pueden indicar nipidamente cwil es la funcion de la molecula normal. Aun son mas utiles los mutantes que sintetizan una version de la proteina que es sensible a la temperatura, es decir, que se inactiva por un pequeno aumento (0 disminucion) de la temperatura del medio, pues en esos mutantes la anomalfa puede ser manifestada 0 no simplemente modificando la temperatura. Antes del desarrollo de la tecnologia del clonaje de DNA se identificaron numerosos genes mediante esta aproximacion, determinando los procesos afectados por la mutacion. La aproximacion genetica ha sido aplicable de forma mas general a los organismos que se reproducen muy rapidamente -como las bacterias, las levaduras, los gusanos nematodos y las moscas del vinagre. Tratando estos organismos con agentes que alteran su DNA (mutagenos), se pueden aislar nipidamente un gran numero de mutantes y detectar y aislar los que presentan un defecto particular que interese. Por ejemplo, mediante el estudio de poblaciones de bacterias tratadas con un mutageno que detenga la sintesis de DNA cuando las bacterias se transfieren desde 30°C hasta 42°C, se aislaron muchos mutantes sensibles a la temperatura en los genes que codifican las proteinas bacterianas necesarias para la replicacion del DNA. Posteriormente, estos mutantes fueron utilizados para identificar y caracterizar las proteinas correspondientes responsables de la replicaci6n del DNA. De una forma similar se ha utilizado la aproximacion genetica para demostrar la funci6n de las enzimas implicadas en las principales rutas 346

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

Figura 7-39 Uso de una proteina marcadora para localizar las regiones de DNA reguladoras que determinan el patr6n de expresi6n de un gen. En este ejemplo la seeuencia eodifieante de la proteina X se reemplaza par la secuencia eodificante de la proteina Y, y se Ie afiaden diferentes eombinaciones de fragmentos de DNA que eontienen seeuencias eandidatas a ser reguladoras. Se mide la eapacidad de expresion de las moleeulas recombinantes en una eoleecion de eelulas de mamifero transfeetadas. En los estudios sobre eelulas eueariotas se suelen utilizar dos genes mareadares, la enzima ~-galaetosidasa(~-gal) y la claranfenicol aeeti! transferasa (CAT). Ambas son enzimas baeterianas y su presencia se mide faei!mente mediante ensayos de actividad enzimcitica simples y muy sensibles sin que interfieran las enzimas del huesped.

metabolicas debacterias, asf como para descubrir numerosos productos genicos responsables del desarrollo ordenado del embrion de Drosophila. Los humanos no nos reproducimos nipidamente, ni tampoco somos tratados intencionadamente con mutagenos. Ademas, cualquier humano que presente un defecto serio en algl1n proceso esencial, como el de la replicacion del DNA, morira antes de nacer. No obstante, en la poblacion humana aparecen espontaneamente algunas mutaciones que son compatibles con la vida -por ejemplo defectos en lisosomas 0 en receptores de la superficie celular, especificos de tejido. EI anaHsis de los fenotipos de los individuos afectados, conjuntamente con estudios de sus celulas cultivadas, han aportado pruebas unicas sobre importantes funciones celulares. A pesar de que estos mutantes son extremadamente escasos, se ponen de manifiesto de forma muy eficaz debido a una caracteristica especifica de los humanos: los individuos mutantes llaman la atencion sobre sf mismos buscando cuidados medicos especiales.

Pueden fabricarse "a medida" celulas y organismos que contengan genes alterados32 Apesar de que normalmente no resulta dificil obtener mutantes deficientes en un determinado proceso, como pueden ser los procesos de la replicacion del DNA 0 del desarrollo del ojo, el encontrar una mutacion que suponga el defecto de una protefna determinada puede suponer muchos afios de trabajo. Recientemente la tecnologia del DNA recombinante ha hecho posible una aproximacion genetica diferente a este problema, mediante la cual se parte de una protefna y se genera una celula 0 un organismo mutante en el que la protefna (0 su expresion) sea anomala. Dado que esta nueva aproximacion invierte la direccion tradicional del anaHsis genetico (del gen ala protefna), habitualmente se la denomina genetica inversa. La genetica inversa parte de una protefna que haya sido aislada de una celula y que presente propiedades interesantes. Si el punto de partida es una protefna, se clona el gen que la codifica y se determina su secuencia de nucleotidos. Posteriormente se altera la secuencia bioqufmicamente, creando un gen mutante que codifique una version alterada de la protefna. El gen mutante se transfiere a un celula, en la que puede integrarse a un cromosoma mediante recombinacion genetica y pasar a formar parte de la dotacion permanente del genoma celular. Si el gen se expresa, la celula y todos sus descendientes sintetizaran una protefna alterada. Si la celula original utilizada para la transferencia del gen es un huevo fecundado, se podra obtener un organismo completo que contenga el gen mutanteo Algunos de estos organismos transgenicos transmitiran el gen alterado a su progenie como una parte de su linea germinal. Actualmente se realizan de forma rutinaria transformaciones geneticas de este tipo sobre organismo tan complejos como la mosca del vinagre y algunos mamfferos (Figura 7-45). De hecho es tecnicamente posible transformar de esta forma incluso organismos humanos, si bien estos experimentos no se realizan por temor a las aberraciones imprevisibles que pueden darse en tales individuos.

Los genes se pueden redisefiar para que produzcan protefnas de cualquier secuencia que se desee33 Con la finalidad de facilitar los estudios de genetica inversa, es posible modificar tanto la secuencia codificante de un gen como sus regiones de regulacion de modo que se modifiquen tanto las propiedades de la protefna, como la cantidad de ella que se sintetiza 0 el tipo celular en que se produce. Para alterar los genes de forma mas sutil (a menudo es deseable que la protefna que codifican difiera de la original en un solo 0 en unos cuantos aminoacidos) son necesarias tecnicas especiales. El primer paso consiste en la sfntesis qufmica de una corta molecula de DNA que contenga la porcion alterada de la secuencia nucleotfdica del gen. Este oligonucleotido sintetico de DNA se hibrida con un plasmido de DNA de una sola cadena que contenga la secuencia de DNA

Ingenieria de DNA

347

que se quiera alterar, utilizando condiciones que permitan el apareamiento imperfecto de cadenas de DNA (Figura 7-40). EI oligonucleotido sintetico se utiliza ahara como cebador para la sfntesis de DNA mediante la DNA polimerasa, genenindose asf una doble helice de DNA que incorpora al gen la secuencia alterada. A continuacion, el gen modificado se inserta en un vector de expresion de forma que la protefna redisenada se pueda sintetizar en gran cantidad, suficiente para estudios detallados. Utilizando esta tecnica se pueden cambiar determinados aminoacidos de una protefna y analizar que parte de la cadena polipeptfdica es importante en procesos tan importantes como su plegamiento, las interacciones protefna-ligando 0 la cataIisis enzimMica.

Habitualmente las proteinas de fusi6n son de gran utilidad para analizar la funci6n proteica34 En una protefna se suelen encontrar regiones de pocos aminoacidos que son responsables de determinar su localizacion en la celula, 0 su estabilidad despues de ser sintetizada. Estas regiones especificas de la protefna se pueden identificar fusionandolas con una protefna marcadora, facilmente detectable, que carezca de dichas regiones, y siguiendo su comportamiento en la celula (Figura 7-41). Estas protefnas de fusi6n se producen mediante las tecnicas del DNA recombinante que se han descrito previamente. Par ejemplo, numerosas protefnas nucleares contienen una 0 mas secuencias cortas especificas que acman de senal para su importacion par el mlcleo, despues de ser sintetizadas en el citosol. Se han conseguido identificar dichas regiones uniendo artificialmente, mediante la tecnica de fusion genica, diferentes regiones de protefnas nucleares a una protefna citoplasmatica. 348

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

Figura 7-40 Utilizaci6n de oligonucle6tidos sinteticos para modificar las regiones de los genes que codifican proteinas. Unicamente se muestran dos de los muchos tipos de cambios que se pueden generar mediante la ingenierfa genetica, utilizando sistemas como este. Por ejemplo, con un oligonude6tido apropiado se puede substituir mas de un aminoacido cada vez, 0 se pueden eliminar uno 0 mas aminoacidos. Como se indica, dado quepor este procedimiento s610 se altera una de las dos cadenas del DNA del pIasmido recombinante, tinicamente la mitad de las celulas transfectadas acabaran conteniendo el plasmido que presente el gen mutante deseado. N6tese que en la figura no se ilustra la mayoria de la secuencia del plasmido.

region funcional de la

~ protefna marcadora

~

"l

protefna X aiiadida a la protefna marcadora

epftopo aiiadido a la proteina X

epitopo aiiadido a la protefna X

el estudio del efecto de la region transferida sobre la protefna marcadora permite determinar la funcion de dicha region

la determinacion del comportamiento del epftopo en la celula permite estudiar la funcion de la region mutada de la protefna

Figura 7-41 Dos estrategias para el estudio de la funcion de las protefnas que utilizan ingenierfa genetica. En la estrategia A, se anade una nueva funci6n a una proteina marcadora mediante su uni6n a un pequeno fragmento de la proteina normal X. En la estrategia B, se realizan pequenas modificaciones ala proteina normal X, y su comportamiento es seguido, a fin de compararlo con el de la proteina normal, gracias ala detecci6n de un pequeno epitopo anadido en uno de sus extremos. Ambas estrategias se han utilizado para analizar la estructura y la funci6n de las senales de transporte al micleo que se encuentran en las proteinas nucleares (vease Capitulo 12).

Sin embargo, no es posible transferir en forma de una secuencia corta de aminOlicidos todas las senales importantes que contienen las proteinas, a una proteina marcadora. Por ejemplo, la senal responsable del transporte al lisosorna desde el complejo de Golgi, de las enzimas lisosomales. recien sintetizadas consiste en una "regi6n senal", cuya formaci6n requiere. que la enzima lisosomal se pliegue correctamente de forma que zonas distantes en la secuencia queden localizadas pr6ximas en el espacio. Para identificar estos casos se puede utilizar la estrategia de marcaje de epftopos. Tambien se ha de producir una proteina de fusi6n, pero en este caso a la proteina normal se Ie anade un peptido corto de 8 a 12 aminOlicidos (el "epitopo") que es reconocido por un anticuerpo -de ahi su nombre. Asi, mediante el uso del anticuerpo anti-epitopo, es posible seguir las proteinas de fusi6n en las celulas incluso en presencia de una gran cantidad de proteina normal, siendo por tanto posible determinar el efecto sobre la localizaci6n celular de cualquier alteraci6n de aminOlicidos en la proteina de fusi6n (estrategia Ben la Figura 7-41).

Los genes normales son facilmente reemplazables por mutantes, tanto en bacterias como en algunos eucariotas inferiores35 A diferencia de los eucariotas superiores (que son pluricelulares y diploides), las

bacterias, las levaduras y el hongo filamentoso Dictyostelium existen generalmente como celulas individuales haploides. En estos organismos es posible substituir, con elevada frecuencia, un gen normal por otro introducido en forma de molecula de DNA artificial, mediante recombinaci6n hom6loga (vease pag. 281), de forma que es facil producir celulas en las que el gen mutante substituya al gen normal (Figura 7-42A). De esta forma es posible que las celulas produzcan gen normal X

==-u

==--:===========~= cromosoma

(A)

REEMPLAZAMIENTO G~NICO

EL GEN MUTANTE REEMPLAZA EL GEN NORMAL

l

==-I--===~=

:~..

s610 es activo el gen mutante

Ingenierfa de DNA

(8)

+ gen mutante X

ADICI6N GENICA

EL GEN MUTANTE SE INSERTA EN UN NUEVO LUGAR DEL CROMOSOMA

l ==-l ==-'l1li1====:===~ ambos genes son activos

Figura 7-42 Reemplazarniento y adicion genicos. Es posible reinsertar, en los cromosomas de un organismo, un gen que ha sido alterado. En bacterias y en organismos haploides como la levadura, frecuentemente se reemplaza el gen normal, en un proceso denominado reemplazamiento genico (Al; en estos casos s610 permanece en la celula el gen mutante. En los eucariotas superiores es mas frecuente el fen6meno de adici6n genica que el de reemplazamiento genico; en esos casos la celula u organismo transformados contienen el gen mutado ademas del gen normal.

349

una forma alterada de la proteina 0 de la molecula de RNA en lugar de la forma normal de la moIecula. Si el gen mutante es completamente inactivo y su producto genico realiza una funcion esencial, la celula morin!; pero en aquellos casos en los que la mutacion sea menos severa, pueden usarse para reemplazar al gen normal, de forma que la celula mutante sobreviva, aunque el proceso para el que se requiere el gen sea anomalo. Con frecuencia el mutante de eleccion es uno que presente un producto sensible a la temperatura, que funcione normalmente a una temperatura pero que se inactive cuando las celulas sean colocadas a una temperatura superior 0 inferior. La capacidad de realizar reemplazamientos genicos en eucariotas superiores, unido a la potencia del analisis genico estandar en estos organismos haploides, es la causa que explica en gran parte por que los estudios sobre estos organismos han sido tan importantes para desentrafiar aquellos procesos que son comunes a todos los eucariotas. Los reemplazamientos genicos son mucho menos frecuentes en eucariotas superiores por razones que atin se desconocen.

Genes desarrollados por ingenierfa genetica pueden crear mutaciones dominantes especificas en los organismos diploides 36 Los eucariotas superiores, como los mamiferos 0 la mosca del vinagre, son diploides, es decir, tienen dos copias de cada cromosoma. Ademas, la transfeccion con un gen modificado conduce generalmente a una adici6n genica mas que a un reemplazamiento genico: el gen modificado se inserta en una posicion al azar en el genoma, de modo que la celula (0 el organismo) acaba con un gen mutado ademas de sus copias normales (Figura 7-42B). Dado que en el caso de eucariotas superiores es mucho mas facH obtener una adicion genica que un reemplazamiento genico, podria ser enormemente litH el poder generar mutaciones dominantes negativas, de forma que un gen modificado fuera capaz de inactivar a sus copias normales en la celula. Una aproximacion ingeniosa y prometedora consigue este objetivo aprovechando la especificidad de la reaccion de hibridacion entre dos cadenas complementarias de acido nucleico. Normalmente solo se transcribe a RNA una de las dos hebras de una zona determinada de la doble helice de DNA, siempre la misma para cada gen. Si mediante la ingenieria genetica se fabrica un gen clonado de tal manera que solo se transcriba la hebra opuesta del DNA, el resultado sera un RNA antisentido que presentara una secuencia complementaria a la de los transcritos de RNA normales. Cuando se sintetiza en cantidades suficientes, a menudo

cromosoma

gen normal X

ADICI6N GENICA

gen X alterado para producir RNA antisentido

- =:=~""":=:s==:==1I!!i'>

TRANSCRIPCI6N RNA normal


--III!III..-j.~

J

l

RNA antisentido

T

:;:===.~

•

doble he lice de RNA

LA FORMACI6N DE UNA DOBLE HELICE RNA/RNA IMPIDE LA SINTESIS DE LA PROTEINA PRODUCTO DEL GEN NORMAL X

350

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

Figura 7-43 Estrategia del RNA antisentido para obtener mutantes negativos dominantes. Los genes mutantes que se han construido de forma que se produzca RNA antisentido, es decir la secuencia de RNA complementaria a la producida por el gen normal X, pueden hacer que se forme RNA de doble cadena en el interior de la celula. Si se produce una gran cantidad de RNA antisentido, podni hibridar -e inactivar- una gran parte del RNA normal del gen X. A pesar de que en el futudo es posible que de esta forma se puedan inactivar genes en la actualidad ha dado buenos resultados con algunos genes y no con otros.

complejo de proteina normal

ACTIVO

complejo de proteina mutante

INACTIVO

complejo de proteina normal y mutante

INACTIVO

el RNA antisentido se hibridani con el RNA "con sentido" fabricado por los genes normales, inhibiendo asi la sintesis de la proteina correspondiente (Figura 7-43). Un metoda similar consiste en sintetizar cortas moleculas de acido nucleico por metodos quimicos 0 enzim
Figura 7-44 Efecto dominante negativo de una protefna. En el ejemplo. un gen se modifica para producir una protefna mutante que impida que las copias normales de la misma protefna realicen su funcian. En este caso la protefna normal ha de formar un complejo de varias subunidades para ser activo, y la proteina mutante bloquea la funcian, pues al unirse al complejo 10 hace inactivo. De esta forma una I1nica copia de un gen mutante localizado en cualquier parte del genoma puede inactivar los productos normales producidos por otras copias genicas.

Genes sometidos a ingenierfa genetica se pueden insertar de forma permanente en la linea germinal de un rat6n o de la mosca del vinagre, produciendo animales transgenicos37 La ultima prueba de la funci6n de un gen alterado consiste en reinsertarlo en un organismo y estudiar que efectos produce. Idealmente, parece que 10 mejor seria reemplazar el gen normal por el gen alterado, de forma que pueda analizarse la funci6n de la proteina mutante en ausencia de la proteina normal. Como se ha descrito previamente, esto s610 puede conseguirse plenamente en el caso de algunos organismos haploides, pero en el caso de los eucariotas superiores, los fen6menos de integraci6n que conduzcan a un reemplazamiento de genes ocurren muy raramente. El DNA extrafio puede, por el contrario, integrarse facilmente al azar en el genoma. Por ejemplo, en mamiferos los fragmentos lineales de DNA introducidos son rapidamente unidos por sus extremos mediante enzimas celulares, formando largos tandems que normalmente son integrados en el cromosoma aleatoriamente. A este respecto, los oocitos fecundados de mamifero se comportan como las demas celulas de mamifero. Un oocito de rat6n al Ingenieria de DNA

351

•

oocito fecund ado

@

50}m

50?m

0

embrion temprano

l

~

MICROINYECCION DEL GEN DE INTERES, EN FORMA DE DNA LINEAL, EN EL PRONUCLEO MASCULINO

C:I

~ MICROINYECCION DEL GEN ~ DE INTERES INSERTADO EN LA SECUENCIA DE DNA DE UN ELEMENTO TRANSPONIBLE

l

I +

embrionO

Q:rion

INTRODUCCION DE VARIOS EM BRIONES DE ESTE TIPO EN UN RATON PSEUDOPRENADO

NACIMIENTO

Figura 7-45 Comparaci6n entre los procesos estandar utilizados para obtener ratones y Drosophila transgenicos. En estos ejemplos, el gen inyectado en el oocito del rat6n da lugar a un cambio en el color de la piel mientras que el gen inyectado en el embri6n de la mosca da lugar a un cambio de color en el ojo. En ambos organismos se ha encontrado que algunos de los animales transgenicos tienen insertos de DNA en mas de un lugar del cromosoma.

. .:

celulas germinales primordiales ALGUNOS EMBRIONES SE CONVIERTEN EN MOSCAS CUYAS CELULAS GERMINALES CONTIENEN EL GEN DE INTERES

embrion normal

1

•

-'

~ ~

TODAS LAS MOSCAS SUPERVIVIENTES SE CRUZAN PARA BUSCAR EL GEN EN LAS CELULAS GERMINALES

embri6n ftz- transformado con el gen ftz 200IJm LI

RATON TRANSGENICO

DROSOPHILA TRANSGENICA

copias del gen, ordenadas en tandem, se insertan al azar en un cromosoma de cada celula gen I

gen gen gen I

cadena de genes ordenados en tandem

una copia sencilla del gen se inserta al azar en un cromosoma de cada celula

-

gen

<)

extremos DNA del elemento transponible

que se Ie han inyectado 200 copias de una molecula lineal de DNA, probablemente dara lugar a un rat6n que contendra en alglin lugar aleatorio de uno de sus cromosomas un tandem de copias del gen inyectado (Figura 7-45). Si el cromosoma modificado tambien se halla presente en las celulas de la linea germinal (oocitos y espermatozoides), el rat6n pasara a su descendencia los genes que ha adoptado: los animales que han sido alterados de forma permanente de esta manera se denominan organismos transgenicos, y a los genes extranos, transgenes. Generalmente el gen normal tambien esta presente, por 10 que s610 se manifestaran los efectos dominantes de la modificaci6n. A pesar de ello, los animales transgenicos han aportado informaci6n muy valiosa para entender c6mo 352

.

embrion ftz-

TRAS UNA BIOPSIA, SE ESTUDIA LA PRESENCIA DEL GEN EN LAS CELULAS SOMATICAS DE LOS DESCENDIENTES, Y EN LOS RATONES SELECCIONADOS QUE SE HAN CRUZADO, SE ESTUDIA LA PRESENCIA DEL GEN EN SUS CELULAS GERMINALES

--

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Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

--'

Figura 7-46 Rescate genetico. Comparaci6n entre una larva de Drosophila normal y dos larvas mutantes que contienen genes Jtz defectuosos. Una de las larvas con un gen defectuoso (jtz-) ha sido transformada mediante la inyecci6n, en un huevo de uno de sus ancestros, de un clon de DNA que contiene el gen jtz de secuencia normal. Esta secuencia de DNA afiadida se ha integrado de forma permanente en uno de los cromosomas de la mosca, de forma que se hereda y expresa fielmente. EI gen Jtz es necesario para el desarrollo normal de la mosca, y la adici6n de este gen al genoma provoca la recuperaci6n de los segmentos de la larva, que habfan desaparecido en el organismo jtz-. Para detalles de la tecnica utilizada para conseguir animales transgenicos, vease Figura 7-45. (Por cortesfa de Walter Gehring.)

preparacion del gen modificado por ingenieria genetica DNA c1onado del gen diana

I"e ELiMINAR LA REGION CENTRAL Y REEMPLAZARLA CON EL GEN neo

1 t

ANADIR EL GEN tk

P") el gen neo confiere resistencia a la droga X (A) fenomeno frecuente de recombinacion no homologa

'~I ':1'111"'" ;

I

(B) fenomeno infrecuente de

recombinacion homologa 1['Z]:''\I'IIlI'• • • • •1

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( el gen tk confiere sensibilidad a la droga Y

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sensii:idad a ; la droga Y

LA CELULA MUERE

ri

!esistencia":>la ausencia del gen la droga X confiere a la celulas resistencia a la droga

r

Figura 7-47 Inactivaci6n genica selectiva por recombinaci6n hom61oga en el rat6n. DNA c1onado de raton se modifica por ingenieria genetica de modo que se Ie inserta un gen bacteriano, denominado neo, que, tras integraci6n en un cromosoma de rat6n, confiere a las celulas la resistencia a una droga (droga X) que en caso contrario resultaria leta!. En un extremo del DNA c1onado de rat6n se afiade un gen virieo, el gen tk. La integraci6n de tk en un cromosoma de rat6n hace sensibles a las celulas a otra droga (droga Y). La mayor parte de las inserciones que tienen lugar en el cromosoma son a! azar, y casi siempre incluyen ambos extremos del DNA modificado (A). Si se seleccionan las celulas, poco frecuentes, capaces de crecer en presencia de ambas drogas, se obtendnin colonias de celulas en las que se ha incorporado, por recombinaci6n hom610ga, el centro del DNA modificado sin los extremos; muchas de estas celulas mostranin un reemplazamiento genico similar al mostrado en (B).

LA CELULA SOBREVIVE

se regulan los genes de mamifero y como ciertos genes (denominados oncogenes) producen cancer. Tambien es posible producir moscas del vinagre transgenicas, en las que copias tinicas de un gen se han insertado al azar en el genoma de Drosophila. En este caso la estrategia consiste en insertar primero el fragmento de DNA entre las dos secuencias terminales de un elemento transponible particular de Drosophila, denominado elemento P. Las secuencias terminales del elemento P Ie permiten integrarse en los cromosomas de Drosophila si la enzima transposasa del elemento P tambien se halla presente (vease pag. 305). Por 10 tanto, para hacer moscas del vinagre transgenicas, el DNA adecuadamente modificado se inyecta en un embrion muy joven de la mosca del vinagre con un plasmido que contenga el gen que codifica la transposasa. Normalmente, cuando se hace esto y como resultado del proceso de transposicion, el gen inyectado entra en la linea germinal en forma de una copia tinica (Figuras 7-45 Y7-46).

cerebro medio

cerebelo

El direccionamiento genico hace posible obtener ratones transgenicos que carecen de determinados genes38 Si se introduce una molecula de DNA que contiene un gen de raton mutado en una celula de raton, frecuentemente se inserta al azar en el cromosoma, pero una vez de cada mil, reemplazara una de las dos copias del gen normal por recombinacion homologa. Aprovechando estos fenomenos infrecuentes "de direccionamiento genico" (gene targeting) es posible inactivar cualquier gen en una celula de raton por reemplazamiento genico. Este metodo se completa con el proceso en dos etapas que se describe a continuacion, permitiendo la obtencion de un raton con un gen defectuoso. En primer lugar, el fragmento de DNA que contiene el gen mutante deseado (0 parte del gen) se transfecta en una linea especial de celulas germinales pluriIngenierfa de DNA

Figura 7-48 Rat6n transgenico en que se han ellminado, por recombinaci6n hom61oga, ambas copias de un gen del factor de crecimiento Wnt-l. CA) Secci6n de cerebro de un embrion normal. (B) Secci6n de cerebro de un embri6n mutante, que carece de cerebelo y de la mayor parte del cerebro medio, y morini in utero. (Fotografias cortesia de Mario CapecchL) 353

discos tomados de hoja de tabaco

-1lT-

discos de hoja incubados con Agrobacteria modificada por ingenieria genetica durante 24 h.

callos ~I medio selectivo s610 _ - - - - _ / ~ermite proliferar a las celulas vegetales que han adquirido el DNA de la bacteria

tallos

crecimiento de la plantula enraizada (A)

planta adulta que porta el transgen que estaba originalmente en la bacteria

citoplasma transgen de interes

gen marcador seleccionable

plasmido recombinante en Agrobacterium

~~~L~~!~~~~-! repeticiones de 25 pares de nucle6tidos del T-DNA

(8)

EL DNA SE EXTRAE DEL pLASMIDO EN FORMA LINEAL Y SE TRANSFIERE DIRECTAMENTE A LA CELULA VEGETAL. DONDE SE INTEGRARA EN EL CROMOSOMA VEGETAL

potentes derivadas del embrion (denominadas celulas madre embrionarias 0 celulas ES -de Embrionic Stem Cells), que crecen en cultivo celular. Tras un perfodo de proliferacion celular, las escasas colonias de celulas en las que se ha podido producir un reemplazamiento genico, se afslan mediante doble seleccion con drogas (Figura 7-47). De entre elIas se identifican las colonias correctas mediante PCR 0 transferencia Southern: contendnin secuencias de DNA recombinante en las que el fragmento insertado ha reemplazado todo 0 parte de una copia del gen normal. En la segunda etapa, celulas individuales de la colonia identificada se recogen con una micropipeta y se inyectan en un embrion temprano de rat6n. Las celulas madre embrionarias transfectadas colaboran con las celulas del embrion huesped para formar el rat6n de apariencia normal (vease Figura 2132); una gran parte de estos animales quimericos, induyendo en casos favorables celulas de la linea germinal, proceden de las celulas madre modificadas arti354

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

Figura 7-49 Procedimiento utilizado para obtener una planta transgenica. (A) Esquema del proceso. Se corta un disco de una hoja y se cultiva en presencia de Agrobacteria portadora de un phismido que contiene tanto un marcador seleccionable como el transgen deseado. Las celulas de la periferia del disco, heridas, secretan substancias que atraen Agrobacteria,la cualles inyecta el DNA. S610 sobreviven aquellas celulas que expresan el marcador selectivo, es decir aquellas que han recibido el DNA adecuado, y formanin un callo. Manipulando los factores de crecimiento que recibe el callo se puede inducir la formaci6n de tallos que enraizaran y se desarrollaran dando lugar a una planta adulta portadora del transgen. (B) Preparaci6n del plasmido recombinante y su transferencia ala celula de la planta. Un plasmido de Agrobacterium, portador de la secuencia de T-DNA se modifica para incluir un marcador seleccionable (por ejemplo, el gen de resistencia a kanamicina) y el transgen deseado, entre los 25 pares de bases repetidos del T-DNA CuandoAgrobacterium reconoce una celula vegetal, inyecta una cadena de DNA en el citoplasma de la celula utilizando el mecanismo que normalmente transfiere la secuencia de T-DNA.

ficialmente. Estos animales se cruzan para obtener machos y hembras, cada uno de los cuales son heterocigotos para el reemplazamiento genico (es decir, tienen una copia normal y una copia mutante del gen). Cuando se cruzan estos dos ratones, una cuarta parte de su descendencia debe ser homocigota respecto al gen modificado. El estudio de estos homocigotos permite examinar la funci6n del gen modificado en ausencia del gen normal. La capacidad de preparar ratones transgenicos que carecen de un gen normal conocido ha sido un gran avance, y actualmente esta tecnica se utiliza ampliamente para analizar las funciones de diversos genes de mamffero (Figura 7-48).

Las plantas transgenicas son importantes tanto para la biologia celular como para la agricultura39 Cuando una planta sufre un dafio en muchos casos puede reparar el dafio mediante un proceso por el cual celulas diferenciadas se "desdiferencian", proliferan y rediferencian en otros tipos celulares. En algunos casos las celulas desdiferenciadas pueden llegar a formar un meristemo apical, que puede generar una planta completamente nueva, incluyendo los gametos. Esta notable plasticidad de las celulas vegetales puede ser utilizada para generar plantas transgenicas a partir de celulas cultivadas. Cuando se cultiva un trozo de tejido de una planta en un medio esteril que contiene nutrientes y factores de crecimiento adecuados, muchas de las celulas son estimuladas a crecer indefinidamente de una forma desorganizada, produciendo una masa de celulas relativamente indiferenciadas denominada callo. Si se manipulan adecuadamente los nutrientes y los reguladores del crecimiento, es posible inducir la formaci6n de meristemos apicales y radiculares en el callo, pudiendo, en muchas especies, regenerar la planta completa. Los cultivos de callos se pueden disociar tambien mecanicamente en celulas aisladas, que creceran y se dividiran como un cultivo en suspensi6n. En un gran mimero de plantas -entre las que se incluyen el tabaco, la petunia, la zanahoria, la patata y Arabidopsis- a partir de celulas aisladas se pueden obtener pequefios grupos de celulas (un clon), a partir de los cuales se puede regenerar una planta completa. Del mismo modo que se puede obtener un rat6n transgenico por manipulaci6n genetica de celulas embrionarias en cultivo, pueden obtenerse plantas transgenicas a partir de celulas vegetales aisladas cultivadas, transfectadas con DNA (Figura 7-49). La capacidad de producir plantas transgenicas ha acelerado el progreso en muchas areas de la biologfa celular vegetal. Ha jugado un papel importante, por ejemplo, en el aislamiento de receptores para los reguladores del crecimiento y en el analisis de los mecanismos de morfogenesis y de expresi6n genica en plantas. Ha abierto nuevas posibilidades en agricultura que pueden beneficiar tanto al agricultor como al consumidor. Ha hecho posible, por ejemplo, modificar el contenido de lfpidos, almid6n y protefnas de reserva almacenadas en las semilias, aumentar la resistencia de las plantas a plagas y virus, y crear plantas modificadas que toleran habitats extremos como margenes de concentraci6n de sal 0 suelos encharcados. La mayor parte de los avances en la comprensi6n del desarrollo animal procede de estudios sobre la mosca del vinagre Drosophila y del nematodo Caenorhabditis elegans, que son abordables para el analisis genetico extensivo asf como para la manipulaci6n experimental. Los progresos en la biologia del desarrollo de las plantas han sido mucho mas lentos comparativamente. La mayor parte de los organismos que se han encontrado mas adecuados para el analisis genetico tienen ciclos vitales largos y genomas enormes, 10 cual ha hecho de su estudio genetico clasico y molecular una labor que requiere mucho tiempo y esfuerzo. Por ella se ha dedicado especial atenci6n a una planta pequefia de crecimiento rapido, Arabidopsis thaliana, que tiene grandes ventajas para ser escogida como "planta modelo" (vease Figura 21-93). Ingenierfa de DNA

355

Resumen La tecnologfa del DNA recombinante ha revolucionado el estudio de la celula. Las tecnicas de ingenieria del DNA pueden utilizarse para crear cualquier gen mutante e insertarlo en el cromosoma de las celulas, de forma que pase a ser una parte permanente del genoma. Si la celula utilizada para esta transferencia de genes es un huevo fecundado (para un animal) 0 una celula vegetal totipotente en cultivo, se obtendrdn organismos transgenicos que expresardn el gen mutante y 10 pasardn a su progenie. Es especialmente importante para el bi6logo celular la posibilidad que proporciona esta tecnologfa de alterar celulas de manera espectjica -permitiendo discernir el efecto que tiene sobre una celula el cambio de una sola protefna que ha sido mutada intencionadamente por tecnicas de "genetica inversa". Las consecuencias prdcticas de la tecnologfa del DNA recombinante tambien abarcan otras posibilidades. Se pueden utilizar las bacterias, las levaduras 0 incluso celulas de mamifero para, mediante ingenierfa genetica, producir una protefna en grandes cantidades, 10 cual hace posible analizar en detalle la estructura y la funci6n de esta protefna, 0 utilizar la protefna como una vacuna 0 como un fdrmaco con jinalidad medica.

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£1 DNA de una celula eucariota se halla confinado en el nlieleo, que ocupa alrededor del 10% del volumen celular. EI nudeo esta delimilado por una envo!tura flllclear (armada por dos membranas concentricas. Estas membranas estern perforadas a intervalos por poms nucleaTes. a traves de los cuaJes se produce el lransporte activo de determinadas molecuJas entre el nucleo y el choplasma. La envollura nuclear estc1. conectada directamente con la membrana del reticula endopl
Como ocurre con los procariolas actuaJes, muy probablememe los ancestros de las cl!luJas eucariotas carecfan de nudeo; s610 podemos especular por qu~ apareci6 durante la evoluci6n un compartimiento nuclear separado, que aisla al DNA de la aetividad del citoplasma. Dos caracterfsticas especiales de las ctilulas cucariotas nos sugieren posibles expticaciones. Una de elias es la existencia del citocsqueleto, compuesto principalmcnte por microtubllios y filamentos de actina, responsable del movimienlo de la celula. Las bacterias, cuyo DNA se encucntra en C011lacto directo con el citoplasma, carecen de dichos filamentos y

DNA y p,olelnas .soe~dllt lc,omeli~l

filemenl," inlermecllol

mic'Olubulos

memb,,,ne nuel"" externe] I I membrene nuclear interna enyo lure nue ear

FIgura &-1 Seccl6n tnrnsversal de un n!.icleo celuJar trpico. La envoltura nuclear estli fonnada por dos membranas de las cuales la exterior es continua con la membrana del reticulo endoplasmlitico (vease tambien Figura 12-9). Las bicapas lipfdicas de las membranas nucleares intema y extema estill asociadas en los poros nucleares. Dos redes de filamentos intermedios (verde) proporcionan soportc meclinico a la envohura nuclear; los filamentos del interior del mlc1eo forman una fina Mmino nllclear. EI espacio inlerior del rel£Culo endoplllsrnrttico (lumen del ER) se ha coloreado en amarillo.

359

se desplazan mediante estructuras externas como los flagelos. Por ello, una de las funciones de la envoltura nuclear de los eucariotas podr(a ser la de proteger las largas y fragHes mohkulas de DNA de las fuerzas mecanicas generadas por los filamentos citoplasmaticos. . . Una segunda caracterfstica diferencial de las celulas eucariotas es la existencia de un procesamiento del RNA previo a su traducci6n a protefna. En las celulas procariolas [a s(ntesis del RNA (transcripci6n) y la sfntesis de prolefnas (traducci6n) tienen lugar simultaneamente: los ribosomas traducen el extremo 5' de la molecula de RNA mientras todavia se eSla transcribiendo su extremo 3'. Por ello existen pocas oportunidades de modificar el RNA antes de ser traducido a protefna. En eucariotas, por el contrario, la transcripci6n (nuclear) esta separada tanto temporal como espacialmente de la traducci6n (citoplasrnatica). Los transcritos de RNA en el nucleo se empaquelan inmediatamente en complejos ribonucleoproteicos y son sometidos aI proceso de madllracion ("splicing") del RNA, en el cual se eliminan algunas zonas de la secuencia de nucle6tidos. Las protefnas de empaquetamienlo se desprenden cuando ha finalizado la maduraci6n del RNA, y esle es transportado desde el nucleo aI citosol, donde los ribosomas empiezan a traducir el RNA a protefna (vease Figura 8-2). Tal como se vera mas adelante, el proceso de maduraci6n del RNA es una etapa intermedia importante en la transmisi6n de informaci6n genelica en eucariotas. Para la cclula supone un cierto numero de ventajas, incluyendo la capacidad de permitir que un mismo gell codifique mas de una protefna. Todo ello podria ayudar a explicar por que las celulas eucariotas tienen un nucleo en el que se puede desarrollar la maduraci6n del RNA en ausencia de interferencias por parte de los ribosomas (Figura 8-3). En este capitulo se describira c6mo las proteinas empaquetan el DNA en cromosomas, c6mo estos se pliegan y se organizan en el nucleo, y c6mo se replican durante cada cicio de divisi6n celular. Posteriormente se diSCUlira la sfntesis y el procesamiento de RNA, y finalmenle se describira c6mo se organiza la informaci6n en el genoma eucariola, y c6mo se ha alcanzado dicha organizaci6n durante la evoluci6n. La envohura nuclear se analiza en detalle en el CapituJo 12 en relaci6n con el transporte selectivo de macromolecuJas desde y hacia el nueleo. AlIi lam bien se presenta un esquema hipotetico de c6mo podrfa haber evolucionado el compartimiento nuclear (vease Figura 12-5).

envoltura nuclear

360

Capitulo 8 : EI nuelco celular

membrana plasm6tica

envoi lura nuclear

NUCLEO

======ONA I •••••• RNA

TAANSCA'Pcl6N OEL ONA

~ I

.. :

MADU~ACI6N

PDR CORTE Y EMPALME DEL

__ RNA

TRANSPORTE DEL RNA

~,.

ri~sr:l: ~

r ":1-TR"ADUCCI6N DEL RNA MENSAJERO

" " protelna C1TOSOL

Figura 8-2 Sfntesls de protefnas (DNA --+ RNA --+ protefna) en eucar:lotas. Las celu1as eucariotas han desarrollado numerosos eompartimientos rodeados de membrana que separan los diferentes grupos de reacciones enzimatieas, 10 que las haee mas eficientes. El n(icleo es uno de estos compartimienlos. La envoltura nuclear mantiene a los ribosomas fundonales fuera del nucleo, evitando que los uanscritos de RNA sean uaducidos a protefnas, hasta que hayan sido proeesados extensamente y Iransportados al exterior del n(icleo. al citosol. Asf pues, las elapas de maduraci6n y de transporte del RNA se inlerponen entre la transcripci6n del DNA y la traducci6n del RNA.

Figura 8-3 La envoltura nuclear mantlene el compartlmlento nuclear llbre de organulos c1toplasmatlcos. Esta imagen obtenida con el microscopio eleetr6nieo muestra una seeci6n ultrafina de un huevo de erizo de mar, con un n(icleo contrastado de una forma extraordinariamente uniforme y un dtoplasma densarnente lIeno de organuJos. (Par conesla de David Begg y Tim Hunt.)

EI DNA cromos6mico y su empaquetamiento i Durante los primeros 40 anos de eSle siglo los bi61ogos descartaban la posibiljdad de que eJ DNA de los cromosomas eucariolas oontuviera la informaci6n genetica. debido fundamental mente a que creran que los I1cidos nucleicos estaban

(armadas unicamente por una secuencia repetida de cualro nucle6tidos (tal como AGCfAGCfAGCr...). Sin embargo, acrualmente sabemos que una moMcula de DNA es un polimero lineal extraordinariamente largo y no ramificado, que contiene muchas millones de nucle6tidos organizados siguiendo una secuencia regular pero no aJ azaT, y que la informaci6n genelica de una celula estl1 contenida en el orden lineal de los nucietStidos de su DNA. EI c6digo genetico estl1 escrito con "palabras~ de Ires nucle6tidos (codolles. cada uno de los cuales

especilica un aminoacido. como se describe en Capitulo 6) que solventan el problema de acumular una gran canlidad de infonnaci6n genctica en un reducido espacio: cada miJI6n de "Ielras~ (nucle6lidos) ocupa una distancia lineal de s610 3,4 x lOs nm (0,034 em) y un volmnen de alrededor de 10' nm J {Io-IS cmll. Cada molecula de DNA sc cmpaqueta en un cromosoma; cl lotal de informaci6n genetica contenida en los cromosomas de un organismo constiluye su gcnoma. EI genoma de la bacteria E. coli eSla fonnado par 4,7 x 1()6 parejas de nucle6tidos de DNA, en una linica rnolecula de DNA de doble helice (un cromosoma). Por el contrario, el genoma humano estA formada por 3 x 109 parejas de nucle6lidos, en 24 cromasomas {22 autosomas diferentes y 2 cromosomas sexuales diferentesl. es decir esta formado por 24 moleculas de DNA distintas --cada una de las cuales conticne enlre 50 x 10' Y 250 x 1()6 pares de bases de DNA. Las moleculas de DNA de ese tamano tienen una longitud de entre 1,7 Y 8.5 em cuando estan descnrolladas, y una vez se han eliminado las prote[nas cromos6micas pueden rompcrsc debido aI menor efeeto mecanico. En los organismos diploides, como nosotros mismos. existen dos copias de cada tipo de cromosoma, uno heredado de la madre y el 01(0 procedenre del padre (con la excepci6n de los cromosomas sexuales en los machos, en los que el cromosoma Yprocede del padre y el X de la madre). Asf, una celula humana tfpica contiene 46 cromosomas y 6 x 1()9 parejas de nuc!e6tidos de DNA. Otros mamiferos presentan genomas de un lamano similar a eSle. Te6ricamente. esta cantidad de DNA se podrfa empaquetar en un cubo de 1,9 Il-m de lado. A efeclos comparativos, 6 x 109 letras en este Iibro podrfan ocupar mas de un miU6n de paginas, y serfa necesario un espacio unas 10 11 veces mayor. En esta secci6n se consideraran las relaciones que existen entre las moleculas de DNA, los genes y los cromosomas, analizando c6mo se pliega el DNA formando una eSl(uctura compacta y ordenada -el cromosoma- que alin asf permite el acceso a su informaci6n genetica. Es importanle recordar que los crornosomas de una celula cambian su estructura y actividad en funci6n de la fase del cicio celular: en mitosis, ofase M, se encuentran muy condensados y son transcripcionalmente inactives; en la atra fase, mucho mas larga, del cicio celular, denominada interfase. estan mucho menos condensados y son activos din· giendo continuamenle la sfntesis de RNA.

Cada molecula de DNA que forma un cromosoma ha de contener un centr6mero, dos tel6meros y varios orfgenes de replicaci6nz Para que una molecula de DNA fonne un cromosoma funcional debe ser capaz de algo mas que de dirigir la sfntesis de RNA: ha de ser capaz de propagarse, lransmitiendose eficazmente de una generaci6n a la siguiente. Ello requiere tIes tipos de secuencias especializadas en el DNA. cada una de las cuales sirve para uni.r las prole[nas que gu[an los mecanismos de replicaci6n y la segregaci6n de los cromosomus. Estudiando levaduras, cuyos cromasomas de pequeno tamano son senciIJos de manipular con los metodas del DNA rccombinanle, se han padido identificar las secuencias de DNA mfnimas necesarias para estas funciones. Se han identificado dos de los Ires elementos anteriores eSludiando pequenas EI DNA cromos6mico y su empaquetamiento

361

moleculas de DNA circular que se pueden replicar como pldsmidos en celulas de la levadura Saccharomyces cereuisiae. Para poderse replicar, estas moleculas necesitan una secuencia de nucle6tidos especffica que actt1a como orlgen de repllcacl6n del DNA; como se vera mas adelante, es posible identificar los numerosos or(genes de repJicaci6n presentes en cada cromosoma de levadura par la capacidad que confieren a una molecliia de DNA que contenga uno de ellos, de replicarse independientemente del cromosoma huesped. Un segundo elemenlO de secuencia denominado centr6mero es el responsable de unir la molecula de DNA que 10 contiene al huso mit6tico durame la divisi6n celular. Cada uno de los cromosomas de levadura comiene un solo cemr6mero. Cuando esta secuencia se inserta en un plasmido, asegura que cuando la celula se divida, cada una de las celulas hijas recibira una de las dos replicas de la molecula de DNA del plasmido recien duplicado. EI tercer element a imprescindible es el tel6mero; es necesario que exista uno de elias en cada extremo del cromosoma lineal. Si un cromosoma circular que contenga un centr6mero y un origen de replicaci6n se rompe en un punta, de forma que aparecen dos extremos de DNA libres, COlllinua teniendo la capacidad de duplicarse y de unirse al huso mit6tico, pero pllede lIegar a perderse en las celulas de la progenie. Ello es debido a que la replicaci6n de ambas cadenas en la horquilla de repJicaci6n requiere la presencia de una secllencia adyacente ala secuencia a replica! que actue de molde para un cebador de RNA (vease Figura 6-44). Dado que nunca podra haber un patr6n de este tipo para los t1ltimos nucle6tidos de una molecula de DNA lineal, seran necesarios mecanismos especiales para impedir que en cada cicio cellilar estas hebras de DNA se vayan acortando. Este problema de la "replicaci6n del extremo", 10 han resuelto las baclerias y muchos virus teniendo como cromosoma una molecula circular de DNA. Las celulas eucariotas han desarrollado una secuencia telomerica especial situada en los extremos de cada cromosoma. Esta secuencia repetida sencilla es amplificada peri6dicamente por una enzima especial. denominada relomerasa, 10 cual compensa la perdida de algunos nucle6tidos del DNA telomerico que se produce en cada cicio celular y permite que el cromosoma lineal se repJique completamente. En la Figura 8-4 se resumen las fundones de los tres elementos de secuencia del DNA que son necesarios para que un cromosoma lineal de levadura se transmita integro de generad6n en generaci6n. Estos elementos de secuencia son relativamente cortos (tfpicamente menos de 1000 pares de bases cada uno) y por ello solamente utilizan una pequefi.a fracci6n de la capacidad de almacenar informaci6n del cromosoma. Son los tres mismos tipos de elementos que al parecer son necesarios para mantener un cromosoma en las celulas human as, ape-

secuencia lelomlirica-

G,

S

G,

M

eecullncia _ del origen de rapliC8ci6n

+ secuancia cenlromlirica

~

burbuja de replicaci6n

362

CapItulo 8 : EI nucleo celular

c1nelo<;oro

~

cromosomas hijos an c~lul6s separadss

Figura 8-4 Funclones de las Ires secuenclas de DNA necesarlas para produclr un cromosoma eucarlola lineal estable. Cada cromosoma tiene muchos origcnes de replicaci6n, un cemr6mero y dos tel6mcros. El cemr6mero mantiene unidas Jas dos copias del cromosoma y las une-a Iraves de un complejo de protelnas denominado cinelocoro- aJ huso mit6tico, de forma que durante la mitosis se distribuye una copia a cada celuJa hija. En la parle superior de los diagramas se indican [as fases del ciclo celuJar correspondiel1tes a las diferentes fases de replicaci6n y scgregaci6n del cromosoma. /

VECTOft CROMOS6M1CO ARTIFICIAl DE LEVADURA

ORI A

DNA HUMANO

CEN

•

•

,

Tn ~mH1

BamHl OlGESOON CON BamH1 y EeoR1

m • • • • • AORI

+ •••• '

brew dere<;ho

br"o Izquierdo

m •

-

Tn

~N

fragmentOI cromos6micol grandes

UNI6N DE DNA Y TAANSFORMACl6N DE LAS C~LULAS DE LEVADURA

AORI

CEN

" ..._ _

" • --tl~r. Vi'nl, Oi)" 'I II

5,6 x 10' pares de nucleOlidos

•

,

II

-

Tn

F1xun 8·5 Construccl6n de un cromosoma artificial de levadura (VAG, de '"yeast artificial chromosome"). Un vectorYAC pennile el donaje de moleculas de DNA de gran lamana. TEL.. CEN yORI son respeclivamcnte las secucncias del lel6mero, cenlr6mcro y dcl origcn de replicaci6n de DNA de la levadllra Saccharomyces cerevisiae. BamU 1y EcoR I son Ins nlldeasas de restricci6n que conan la doble helice de DNA. Las secuencias denominadas Ay B codifican enztmas que se utilizan como marcadores que se pueden seleccionar para pennilir el aislamienlo rapido de las ct!:lulas de levadura lransformadas ponadoras de un crornosoma artificial. (Adaptado de D.T. Burke, G.F. Carle y M.V. Olson. Sciellce236: 606-812, 1987. Cll987 AAAS.)

I

hasta 10' pares de nucleOlidos 3,9 x 101 peru de nucle6lidos

CROMOSOMA ARTIFICiAl DE LEVAOURA CON DNA HUMANO INSCRTADO

sar de que hasta el momento en el hombre s610 se han caracterizado bien las sc· cuencias telomericas. Aunque la versi6n de levadura de dichas secuencias no es funcional en celulas de eucariQlas superiores. los mctodos de DNA recombinante han permitido unir los elementos de secuencia de levadura a molecuJas de DNA humano, que entonces pueden replicarse en celulas de levadura como cramosomas artificlaJes. De esta forma se pueden utilizar ululas de levadura para preparar Iibrerias de DNA gen6mico humano (vease pag. 339) en las que cada clon DNA (propagado como un cromosoma artificial) puede cOnlener alrededor de I mjIJ6n de pares de bases de secuencia de DNA humano (Figura 8-5).

La mayor parte del DNA cromos6mico no codifica

prote(nas esenciales ni RNN Parece que en los genom3s de los organismos superiores existe un gran exceso de DNA. Desde mucho tiempo antes de que fuera posible examinar directamen· te la secuencias de nucle6tidos del DNA fue evidente que las cantidades relativas de D A del genoma haploide de diferentes organismos no estaban sistematicamente relacionadas con la complejidad del organismo. Las celulas humanas, por ejemplo, contienen alrededor de 700 veces mas DNA que la bacleria E. coli miemras que algunos anfibios y relulas de plantas conticnen 30 veces mas DNA que las cclulas humanas (vcase Figura 8·6). Adem<\s el contenido e1e DNA de los genomas de diferenles cspecies de anfibios puede variar hasta lOa vcces, Los genclistas de poblaciones inlcntaron estimar que canlidad del DNA de los organistllos superiorcs codifica prolcfnas esencialcs 0 moleculas de RNA, basandose en la siguiente aproximaci6n indirecta, Cualquier gen esll1, inevitable· mente, sometido a un riesgo de mUlaci6n -un fen6meno accidental que altera. aI azar, determinados nude6tidos. Mientras mayor sea el numero de genes de un organismo tanto mayor sera la probabilidad de que se produzca una mutaci6n en al menos uno de eUos. Debido a que muchas mutaciones destruyen la funci6n del gen en el que se producen. la tasa de mUlaci6n fija 1I111fmile del nu· mero de genes esencialcs de los que cualquier organismo pucde dcpender para El DNA cromos6mico ysu empaquetamiento

363

micoplaSlTlll

,

BACTERlAS

E. coil :

;

llMIdur. HQNGOS

Jiil.....

\lulun'. azucena

PlANTAS INSECTOS

"'!'!'''.

MOlUsecS • _ _

t.burdt't PECES CARTlLAGINQSOS

..

:~;::';l~.",~= ~1. lfit6n

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TElEOsTEos ANF1810S

REPTtLES pAJAAOS humano MAMIFEROS

1~

1~

r,

r

II

1i,rr

1~ 1~ 1~ numero de pares de nl.lCleotidos por gerlOma haploide

10'0

r111r1

10"

su supervivencia: si son demasiados, el desastre es casi seguro, como serfa el caso de una compleja maquina que dependiera de muchos componentes que pueden faDar. CoD este argumento y con la velocidad de mutaci6n obselVada se concluye que s610 un pequeno porcenlaje del genoma de los mamfferos esla implicado en la reguJaci6n 0 codificaci6n de prolefnas esenciaJes. Posleriormenle veremos que esta conclusi6n esla apoyada por otras evidencias. La consecuencia mas imponante de la argumenlaci6n anlerior es que, aunque el genoma de mamffero conliene en principio una caOlidad de DNA suficienle para codificar alrededor de 3 millones de prolefnas de tamano media (3 x 10' nucle6Iidos), la fidelidad limitada con la que se manLienen las secuencias de DNA implica que Ilingun mamffero (ni cualquier otro organislllo) puede estar formado par mas de unas 60 000 protefnas esenciales. As! pues, desde el punto de vista genetico, los humanos no pueden ser mas de 10 veces mas complejos que la mosca del vinagre Drosopl,ila, de la que se ha estimado que tiene unos 5000 genes esenciales. Cua]quiera que sea la misi6n del DNA no esencial que se halla presente en los crornosomas de los organismos superiores {se disclilira mas adclantel. 105 datos que se mueslran en la Figura 8-6 dejan claro que, para una celula, el presentar una gran cantidad de DNA extra no representa ninguna Iimitaci6n importante. Mas aun, frecuentemente las regiones codificantes esenciales estan interrumpidas por largas secuencias de DNA no codificanle.

Cada gen produce una molecula de RNA4 La funci6n primaria del genoma es codificar molecuJas de RNA. Regianes seleccionadas de la secuencia de nucle6tidos de DNA son copiadas en fonna de secuencias complementarias de RNA, el cual 0 bien codifica una protema (si es mRNA), 0 forma un RNA Mestructural", como las moleculas de RNA de lransporte (tRNA) 0 de RNA ribosomal (rRNA). Cada regi6n de la Mike de DNA que produce una molecula de RNA funcional constiluye un gen. En los eucariotas superiores son habituales los genes de mas de 100 000 pares de nucle6tidos, y algunos comienen mas de 2 millones de pares de nucle6tidos ITabla 8-1); sin embargo, para codificar una protefna de tamano media (farmada por 300 0 400 amino:1cidos) solamente son necesarios lOOO pares de bases. La mayor parte del DNA extra esta formado por largas secuencias de DNA no codificante interrumpidas por fragmentos relativamenle cortos de DNA codi364

Capftulo 8: EI nucleo celular

Figura 8-6 No exJste relacl6n entre la cantldad de DNA y Ja oompleJldad del organlslno. La cantidad de DNA del genoma haploide varia en un rango de 100000 veces desde el procariola de menor lamano -el micoplasma- a las celulas mll.s voluminosas de algunas plantas yanfibios. Es de destacar que el tamano del genoma humano (3)( 10' pares de nucle6tidos) es mucho menor que el de muehos organismos que parecen ser m1s seneillos.

Tabla 8-l Tamaiio de aJgunos genes humanos en miles de nuclc6Udos

p-g1obina

Insulina Protefna quinasa C A1bumina Calalasa Receptor LOL FaclorVlll TIroglobulina Distrofina*

TamaRo

Tamano

delgen

delmRNA

Nl1merode intrones

1.5

0,.

2

1,7 II

0,'

25

2,1

2 7 14 12 17

1,4

I,.

3'

.5 186

5.5

300 m:1s de 2000

8.7

25

9

3. mas de

17

50

• Una forma an6mala de este gen causa la diSlrofia muscular de Duchenne. El tamai\o del gen especlficado corrcsponde tanto a la rcgi6n que se transcribe como a las regiones de DNA reguJadoras pr6ximas (compHado de datos suministrados por Victor McKusickl.

fieanle. Las secueneias codifieantes se denominan exones y las seeuencias inlermedias (no eodifieanles) se denominan intrones. Duranle el proeeso de conversi6n de las moltkuJas de RNA (Iranscritas desde un gen y par clio denominadas trmw::ritos primarios de RNA), a moleculas de mRNA, se eliminan las secuencias imr6nicas (vease Figura 8-2); esle proceso se denomina maduraci6f1 del RNA ("RNA splicing"), que se disculini mas adelante. los grandes genes eSlan rormados por una larga secuencia de exones e inIrones alternos; la mayor parte del gen esta rormado por secuencias intr6nicas. Ademas, cada gen conticne S€Clleflcias reguladoras que son responsables de ase· gurar que el gen se transcribe en el momenta y en el tipo celular adecuado. En el Capftulo 9 se discmira el runcionamiento de dichas secuencias reguladoras. Muchas secuencias reguladoras se encuentran localizadas por delanle ("upstream", en direcci6n 5') dellugar donde se inicia la transcripei6n del RNA, pero tambicn se pueden localizar por debajo. ("do\omstream~,en direcci6n 3') dellugar donde finaliza la transcripci6n del RNA, 0 incluso en los intrones y exones. En la Figura 8-7 se i1ustra esquclm1ticamcnte un cromosoma tfpico de vertebrados, y se delalIa la organizaci6n de uno de sus muchos genes. cromo,oma de 1,5

If

1oJ' pl"'e. de r\l.lcle6tido.; contiene IIprOlfimadamentll 3000 gene.

,.---_-----'J~-::--

r

II.

r =

..

0.5% del cromosom.; conli,n, 15 genes

:.1 • •

----,

I.

•

1

I:

1

un 9'n de 1ft poll'" (Ie nuele6tidos

I ! ~:::~~:;'~~3IB'BI~3'E~IE'~I~E31~~~~'~~~~1~~.~~~= I

I' I

I I ...gi6
I

I

I

II

I

intr6n

I

elf On

TAANSCRIPCION DEL DNA

5'

I

I

f I I f tr,lnacr;IO prim'lio de RNA

El DNA cromos6mico ysu cmpaquclamiento

3'

I'

I

f

I

MADURACION DEL RNA 5'_3' mRNA

f

!J,"~;,

introniC8 SlK:uenci. e>t6nica

Figura 8·7 Org8Jll.zacldn de los genes en un cromosoma tfplco de vertebrado. Unas protefnas que se unen a las regiones reguladoras del DNA condicionan que un detennlnado gen se transcriba 0 no; aunque en el esquema se han reprcscmado las secuencias reguladoras en direccidn 5' del gen, tambien pueden Localizarse en el interior de los intrones. en los exoncs 0 en la regidn situada en direccitin 3' del gen, las secuencias de los introncs son eliminadas del transcrito primario de RNA que codifica una prolefna, produci~ndose una molecula de RNA mensajero (mRNA). Los valores que se indican en la figura ace rca del numero de genes por cromosoma son una estima ,"fnima,

365

noacidos, de modo que cualquier cambio en cualquier posici6n resulta delet~· reo para 1a c~lula. Esta suposici6n se ha podido verificar en levaduras, en las que es posible mUlar in vitro una histona dada e introducirla en el genoma de la Ievadura en lugar del gen normal. Como se predijo. se observ6 que la mayor parte de las mutaciones eran letales; algunas que no 10 eran producfan cambios en el patr6n normal de expresi6n g~nica (discutido en el Capitulo 9). Las histonas HI son mayores (fonnadas por unos 220 aminoacidos) y han sido menos conservadas evolutivamente que las histonas nucleos6micas.

La asociaci6n de las histonas con el DNA conduce a la formaci6n de los nucleosomas, las partfculas unitarias de la cromatina7 $i se desenrollara la doble h~lice de DNA de cada uno de los cromosomas humanos, 130 cadena resultante podrfa rodear el nucleo de la c~lula miles de veces. Las histonas cumplen un papel primordial en el empaquetamienlo de forma ordenada de est'a enormemente larga molecula de DNA en el interior de un 1ll1cleo de tan s610 unos cuantos micr6metros de diametro. Su papel en el empaqueta· rniento del DNA es importallle par una segunda raz6n. Como se ha podido ver, no IOdo el DNA del cromosoma esta empaquetado de la misma forma; parece que la manera en la que se encuentra empaquelada una dctcrminada regi6n del genoma en la cromatina de un determinado lipo celular influye en la actividad de los genes que contiene. Nuestra comprensi6n de 130 est.ructura de la cromatina recibi6 un fuerte impulso con la descripci6n de la unidad fundamental de empaquetamiento. conocida por nucleosoma, que confiere a esta el aspecto de una "cadena de cuentas~ cuando se observa al microscopio elect.r6nico despues de tratamiemos que deshaecn los empaquetamiemos de orden superior (Figura 8-9). La larga "cadena~ de DNA puede romperse en "cuentas" de nucleosoma por digesti6n mediante enzimas que degradan el DNA, como por ejemplo con la enzima bacteriana nuc1easa micrococal (las enzimas que degradan tanto el DNA como el RNA se denominan nucleasas, las enzimas que solamente degradan el DNA se denominan desoxirrilxmucleasas. 0 DNasas). Una digesti6n corta con nucleasa micrococal 5610 degrada el DNA existente entre los nucleosomas. EI resto se encuentra protegido de la digesti6n y permanece como fragmentos de DNA de doble cadena de unos 146 pares de nucle61idos de longitud. unidos a un complejo especffico de 8 histonas nucleos6micas (el octdmero de IJislOllas). Los nucleosomas obtcnidos par este m~todo se han conseguido cristalizar y analizar mediante difracci6n de rayos X. Cada partfcula tiene una forma de disco, con lm diametro de alrededor de II nm y eontienc dos copias de cada una de las 4 histon
EI DNA cromo56mico y su empaquetamlento

Figura 8-9 Nucleosomas observados al mlcroscoplo electronico. Estas eleclronmicrograffas muestran fihras de crornatina, anles y despues de ser expucstas a tratamientos que dcscomprimen 0 "descondensan~ la estructum nativa, produciendo la forma de ~cadena de cuentas~. La estructurn nathoa conocida como fibra de 30 nm (se discule m:l.s adelante) se muestra en IA). La fanna descondensada de "cadena de cuentas~ de la cromatina se muestra en (8), a los mismos aumentos. En la Figura 8-30 se presentan dibujos esquem:l.ticos de las relaciones exiSlcntes entre estas dos formas de la cromatina. Estas electronmicrografias fueron tomadas por medio de modificaciones del procedimienlo explicado en la Figura 8-45. lA, por cortesfa de Barbara Hamlako: B,l>or cortesfa de Victoria Foe.)

367

181 DNA espaciador

histon8S de centro del nucleosoma

LA NUCLEASA

I ··.o· rrES~:'AaDDR . -DIGIERE El DNA

I

I cuenta () nucleos6mica

I

unidad repetida de 200 pares de

nuclootidos

WT

,\nm

libarada

l

DISOCIACI6N A ELEVAQA CONCENTRACI6N DE SAL

Jj oc"mi c:..z nucleo hist6nico

I

DNA duplex de

DISOCIACI 6 N

146 pares de bases

1

H2A

H2B

"'

"'

En la cramatina no digerida, el DNA se extiende como una doble helice continua entre los Iludeosomas. Cada nucleosoma esta separado del siguiente por una regi6n de DNA espaciador, de longilud variable cone 0 y 80 pares de nucle6tidos. Los Ilucleosomas se repiten a intclValos de 200 pares de nucle6tidos (vease Figura 8-10). Asf pues, un gen eucariota de JO 000 nucle6tidos de longitud podrfa estar asociado a 50 nucleosomas. y cada celula humana, con 6 x 109 pares de bases, puede contener unos 3 x 107 nucleosomas.

La posici6n de los nudeosomas en el DNA viene determinada por la tendencia del DNA a formar budes estrechos y por la presencia de otras protefnas de uni6n al DNA8 Expetimentos in vitro can cromatina aislada sugieren que en condiciones fisio16gicas los ocuimeros de histonas generalmente permanecen flios en una posici6n determinada del DNA, puesto que su intcnsa uni6n al DNA evita su dcslizamiento a uno y otro lado a 10 largo de la helice del DNA. Existen dos factorcs principales que determinan la posici6n de los nucleosomas sobre el DNA. Uno es la dificultad de doblar la doble helice en dos vueltas cerradas alredcdor del octamero de histonas, un proceso que requiere una compresi6n importantc del surco estrecho de la helice. Dado que las secuencias ricas en A·T en el surco estrecho Se comprimen mas facilmente que las ricas en G-C, cada octamero de histona tiende a colocarse por sf mismo en el DNA de forma que incremente al maximo la riqueza en A-T del SlUCO estrecho de la helice de DNA (Figura 8-1l) . ......... Asf pues, un segmento de DNA que contenga regiones cortas ricas en A-T, separadas por vueltas enteras de DNA, sera mucho mas facil de doblar alrededor del nucleosoma que una regi6n de DNA que no tenga estaS propiedades. Esto pro368

Capftulo 8 : EI m1cleo celular

Figura 8·10 Naturaleza del nucleosoma. En CA) se observan dos orientaciones de la cstruetura tridimensional del octamero de histonas; el modo en que el DNA se enrolla a su alrededor se representa por un tuba azul (superior) y por una serie de Hneas paralelas (inferior). Dos dfmeros H2A-H2B (azul) flanquean un tetrameros H3-H4. Asf, el oetamero de histonas esta cornpucsto por dos de cada una de las histonas H2A. 1-12B, 1-13 Y1-14, con una masa total de 100 000 dahons. (B) EI nucleosoma esta farmado por dos vueltas completas de DNA (83 pares de bases por vuelta) alrededor de un nucleo oetamerico de histonas, mas el DNA separador adyacente. La parle del nucleosoma que hasta ahora hemos denominado "cuenta" nucleos6mica se libera de la cromatina por digesti6n del DNA con nucleasa microcoea1. En eada "euenta" de nucleosoma, alrededor de 146 pares de nucle6tidos de doble heliee de DNA (alrededor de 1,8 vueltas) permanecen enrollados alrededor de un nucleo octamerico de histonas. (A, eortesia de Evangclos Moudrianakis.)

Flgura8-11 Curvatura del DNA en un nucleosoma. La hetice de DNA da dos vueltas alrededor del octamero de histonas. Este diagrama esta dibujado aproximadamente a escala para illistrar c6mo se eomprime el surco menor en la parte inleriordel giro. Debido a ciertas caracter(sticas eSlructurales de la molCcula de DNA, las parejas A-T tienden a aeomodarse preferencialmente en el surco menor. DNA del nucleosoma

bablemente explica el caso de localizadones muy predsas de nudeosomas sobre el DNA, como es el caso de los genes de rRNA 5S, cada uno de los cuales tiene un unico nudeosoma en una posici6n lmica. Si se mezda in vitro el DNA de genes rRNA 5S con una mezcla de las cuatro histonas nucleos6micas puras, se produce la formad6n de nucleosomas en la misma posid6n en que se eneuentran in vivo. Sin embargo, parece que para la mayor parte de las secuencias de DNA del cromosoma no existe una localizaci6n preferencial de los nucleosomas; el nucleosoma puede oeupar cualquiera de una serie de posiciones posibles en la secuencia de DNA. El segundo factor que influye en el posicionamiento de los nUcleosomas es la presencia de otras proteinas unidas fntimamente al DNA que evitan la formaci6n de nucleosomas. Por esta raz6n algunas regiones del DNA carecen de nudeosomas, incluso en regiones de miles de pares de bases de longitud. Estas regiones pueden deteetarse mediante el tratamiento del nudeo eelular eon eantidades muy pequenas de lIna desoxirribonucleasa I (DNasa I), enzima que a estas bajas concentraciones s610 digiere las secuencias de DNA Iibres de nucleosomas y no los cortos segmentos de DNA espaciador que se hallan entre elias. Frecuentemente eslos lugares hipersenslbles a nucleasas coinciden con las regiones reguladoras de los genes (Figura 8-12). La primera evidencia que apoy6 esta hip6tesis procedi6 de experimentos realizados can el virus de simio SV40, cuyo cromosoma, circular, esta organizado utilizando las histonas producidas por la CIHula huesped. En el cromosoma de SV40 se localiza frecuentemente una regi6n de 300 pares de bases libre de nucleosomas siluada muy cerca de las secuencias en las que se inicia la sfntesis del DNA y RNA vfrico. Aunque en esta regi6n se unen varias protefnas de uni6n a DNA espedficas de secuencia, no 10 protegen de la degradaci6n par nudeasas como 10 haee el Iludeosoma, raz6n por la cual es una zona sensible a DNasa I. Por defecto el DNA en las celulas eucariotas se encuemra asociado com pletamente con nUcleosomas, y muchas de las regiones libres de nudeosomas estan generadas por acci6n de las prolefnas de regulaci6n genica como parte del proeeso de aetivaei6n de la transeripci6n del DNA (discutida en el Capftulo 9). En aquellos lugares en los que los nudeosomas se sillian de forma precisa, podna haber exisljdo una presi6n selectiva para manlener el DNA espaciador adyacente Iibre de nudeosomas, para facililar su reconocimiento por las protefnas de uni6n a DNA especfficas de secuencia.

Habitualmente los nucleosomas se empaquetan con la histona Hl formando estructuras regulares de orden superior9 EI DNA espaciador que conecta nUcleosomas adyacentes puede ser de longitud variada dado que los nucleosomas se posicionan en funci6n de la flexibilidad local de la helice de DNA y de la distribuci6n de otras protefnas unidas a secuenEI DNA eromos6mico y su empaquetamiento

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H3 H4

H2A H28

H1

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103 pares de nucle6tidos

Figura 8·12 Locallzaci6n de los sltlos hlpersenslbles a nucieasas de las reglones reguladoras de los genes actlvos. Los genes mostrados cadifiean histonas (HI, HM, H26, 1-l3y H4) en Drosophila. Las j1echas IlOrizontales representnn cada uno de los genes en la direcci6n de la transcripci6n del DNA, que siempre tiene lugar desde el extrema 5' al extrema 3' del rranscrito. Aunque los lugares hipersensibles a In nucleasa rj7.ecllas rajas verticales) se suelen presentar en los extremos 5' de un gen, como se ilustra nqllf, plleden encontrarse en cualquier alra posici6n (vcase Figura 9-34).

369

IAI

cias especfficas del DNA. A pesar de que en la mayor parte del DNA cromos6mico se fonnan largas cadenas de nucleosomas. en una ceJula viva es poco probable que la cromatioa se disponga en la forma de "collar de cuentas~. En lugar de ello, los nucJeosomas se empaquetan uno sabre ono adoplando disposiciones regulares en las que el DNA se encuentra incluso mas condensado. Asf pues, si se obscrvan al microscopio electr6nico nucleos celulares somelidos a lisis suave, se aprecia c6mo la mayor parte de la cromatioa se encuentra organizada en fibras de un diametra de aJrededor de 30 om, que es considerablemente superior 31 diametro de la cromatioa en forma de "coUar de cuentas". En la Figura 8-13 se representa uno de los modelos que se han propuesto para explicar de que forma los nucleosomas estan empaquetados en la libra de cromatina de 30 nm. Tales modelos represenlan una estructura ide·alizada, dado que tanto la variaci6n de longilud del DNA espaciador producida por las preferencias de situaci6n de los nuc!eosomas, como la presencia ocasional de secuencias de DNA libres de nuc!eosomas produciran irreguJaridades en la estructura de la libra de 30 nm (v~a­ se Figura 8-14). Se cree que las mol~cuJas de histona HI. de las que existen seis subtipos muy relacionados en una c~lula de mamffero, son responsables del empaquetamienlo de los nucleosomas formando la eslructura de libra de 30 om. En la molecula de la histona HI se puede diferenciar una regi6n globular central, l11uy conservada evolutivamenle. unida a los "brazos" amino y carboxilo tenninales, menos conservados. Cada molecula de histona HI se une a traves de su regi6n globular a un lugar unico del nucleosoma, mientras que los brazos entran cn contacto con Olros lugares de las histonas del nucleo 0 de los nucleosomas adya· centes, permitiendo que se empaqueten de forma repetida regularmcllte (Figura 8-15).

Resumen Ull gell se define como u"a secllellcia nucleotfdlca ell ulla molecula tie DNA que aetlla como ,ma ,mltILJtlfltllcional para la producci6" de Will molecula tie RNA. Ull cromosoma estd fomuulo ,ror una molkula uniea de DNA lineal muy larga qlle colltlene IIna serle numerosa de genes. Utrn molkulLl de DNA cromos6mico colltiene asimismo otros tres tipos de secuetu:las de nucledtidos fw.clollalmente lmportnntes: orlgenes de replia.ci6" y tel6meros. que permitetlla correcta replicacl611 tiel DNA, Y el centromero. que es Ilecesarlo para 'mlr ILl molk"lt' tie DNA at I",so mlt6tico. asegr,ratUlo Sll segregaci6" predsa en las celJdas hijas. El gelloma Illlploltie I",mano cotltietle 3 x pares de m,cle6tidos, distribllidos ell 22 a"tosomas y 2

1('

Flgum8-13 La nbrade cromalina de 30 nm. Modelo propuesto para cxplicar c6mo la forma dc ·cadcna de cucntas~ de la cromatina se empaquela Cll la libra de 30 nm, observada en microscopia elcclr6nica (veasc Figura 8·9AI en (A) vista superior. y en {BI viSla lateral. Esle lipo de empaquetamiemo s610 requiere una molecula de hislOna HI por nudeosoma (no mostrado en la figural. Aunque se conoce la posici6n en que se une la hiSlona HI aJ nudeosoma (vease Figura 8-15), se desconoce su posici6n en eSla fibra. (Vcase tambicn Figura 8-14.)

Figura 8-14 Regiones Ilbres de nucleosomas en la fibra de 30 nm. Secci6n esqucll11hica de [a cromalina mostrando la intcrrupci6n dc su CSlructura regular par regiones conas cn las que el DNA cromos6mico es cxtraordinariamente sensible a 13 digcsli6n por DNasa I. En cada uno de esos silios hipersensibles a nudeasas, parcce que un nudeosoma ha sido desplazado dcl DNA por una 0 mas prolcrnas dc uni6n a DNA espccfficas de secucncia. En el capftulo 9 se discUie de que fonna son capac~ eslas prolCroas de unirse fuenemente aIDNA.

1 fibril de JOtlm

370

C3pftulo 8 : EI nucleo celular

cromosomas sex.udes. Se cree fl"e s610 IUra pequenn parte de esle DNA cod/fica protelnas. En dlulas eucariotas el DNA se ellCllentra ,mido a lIt1a masa /grurl de ',istonns, fonntlndo lllUI unillad repetitlva de partlculas de DNAy proleltla detlominadas ",,cleosomas. EI ""e1rosa",a etUffomrtulo por un n/ideo Ot:lamirico de prote(nns l.is· tonas alretkdor del Clurl el DNA dn dos vueltas. La fadllilad em, In que lin segme"to de DNA p.tede dohlnrse sufklimtemetlte para enoolver el mideo de histonns depen. de de su sec.rencla mu:leotldica. A.mque lray excepc/ones, los nucleosomas u sueun empaqllelnrjllntos, COli in ayuda de moMculas de In hisrona HI, adoprando dlsposit:iones regrdnres qllefomran linn fibra th 3Q nm

"'''i "Ob'':. COOH H2N " , . " . . , . hl,ton.. HI

nuclftlsomll H1SEUNEA UNA REGION

La estructura global de los cromosomas Habiendo descrito el DNA y las prolefnas a partir de las que se organiza el cromasoOla, a continuaci6n abordaremos la organizaci6n del cromasoma en una esca[a mayor. Si un cromosoma humano se estirara de forma que lJegara a presentar en toda su longitud la estructura de fibra de 30 nm, alcanzarfa aproximadamenle 0, I em de [ongitud, y podrfa rodear el nLideo celular l1u1s de 100 veces. Es evidente que debe existir un nive[ de compactaci6n superior. EI DNA no s6[0 se empaqueta con histonas en nudeosomas espaciados regularmente, que a su vez se empaquetan en la fibra de 30 nm, sino que es empaquelado y organizado por otras protelna en una serie de subdominios de diferenle naturaleza. Esle empaquetamiento de orden superior es uno de los aspectos ml1s fascinantes y menos conocidos de la cromatina_ Aunque las bases moleculares son aUn un misterio. se cree que eSle empaquelamiento liene un papel crucial en la regulaci6n de la transcripci6n genica_ En esta secci6n se explicarti 10 que se conoce de la estrucfUra de nivel superior de la cromatina y se examinarnn las evidencias que demuestran su importancia funcional.

Los cromosomas plumulados contienen bucles de cromatina descondensada 'o Aunque empaquetados en forma de cromatina. la mayor parte de los cromosomas en las cclulas interfasicas (no en milosis) son demasiado finos y enmarafiados para que se puedan visualizar con claridad. Sin embargo, en algunos casos excepdonales. es posible observar la estructura completa de un cromosoma interf<1.sico. Par ejemplo, los cromosomas de los oodtos en crecimiento apareados en la meiosis (huevos inmaduros) son muy activos en cuanta a sfntesis de RNA, y suelen presentar grandes y esponjosos budes de cramatina recubiertos de RNA reden uanscrito empaquetado en comp[ejos de RNA-protefna. Debido a eSle forro del DNA. estos cromosomas plumulados son daramente visib[es induso al microscopio 6plico. con el que se ve que estan organizados en una serie de grandes budes de cromatina que se extienden a partir de un eje cromos6mi00 lineal (Figura 8-16). En la Figura 8-17 se represenla esquemAticamenle la estructura del cromosorna plumulado. Desde el eje del cromosoma se exlienden grandes bucles de CTOmatina descondensada. Mediante experimentos de hibridaci6n de acidos nucleicos se ha podido demostrar que cada bude siempre contiene los mismos genes, y que pennanece extendido de la misma fonna durante el crecimiento del oocito. Otros experimentos han demostrado que la mayor parte del DNA del bude se esl~ transcribiendo aClivamente en RNA. Sin embargo, la mayor parte de la cramalina no se encuentra en los budes sino que pennanece muy condensada en los crom6meros. que generalmenle no se transcriben. Se ha propuesto un modelo general de cromosoma basado en estos estudios. en el que las fibras de 30 nm se extenderfan perpendicularmenle al eje mayor del cromosoma (Figura 8-18). Los cromosomas plumulados son un buen ejemplo de una caracterfslica recurrente de la cromatina que se analizar~ en esta secci6n -cuando [a cromatina La eSlruclura global de los croll1osomas

I

ESPEdFICA DEL NUClEOSOMA

I) El EMPAQUETAMIENTO Of LOS NUCLEOSOMAS ESTA MEDIAOO PaR LA HISTONA H1

Flgun8-15 Mecanismoporelcualse cree que la hl$lona HI ayudaa empaquelar los nuclC050mas adyacenles. £1 nucleo globular de HI se une a cada nucleosoma cerca del lugar donde la doble helice de DNA enlra y sale del octamero de hiSlonas. Cuando esla presente la histona HI. (lucdan protegidos de la digesti6n con nucleasa micrococal 166 pares de bases del DNA. respecto a los 146 pares de bases de los nucleosomas que carecen de HI (vease Figura 8-10).

37\

Figura 8·16 Mlcrograffa 6pllca de un cromosoma plumuJado de un oocIlO de anfiblo. En una rase inicial de la diferenciaci6n, cada cromosoma se replica para empezar 1a meiosis, y los cromosomas hom61ogos replicados se aparean ronnando esla eslrnctura muy ext.endida que contiene un total de cuatra cromatidas. EI eslado de cromosomas en escobill6n puede persistir durante meses 0 ai'los mientras el oocito elabora posteriormente un acl1.mulo de mRNA y de olros mnteriales que seran utilizados para su desarrollo en un nuevo individuo. (Conesfa de Joseph G. Gall.)

se transcribe acLivamenie se encuenlra en una estruclUra ext'endida; cuando la cromat'ina estc1 condensada, es inactiva; y las unidades estructurales de regulaci6n son regiones grandes, domini os bien definidos.

f--------O.5mm--------< CROMOSOMAS PlUMULADOS APAREAOOS

qui..ma

crom6mero

-¥~lJ[}--- 81e REGION DE UN SOLO CROMOSOMA

Figura 8-17 Estnlctura de un uomosoma plwnulado. EI conjumo de cromosomas plumulados en muchos anfibios contiene un total de aproximadamente 10000 budes cramalfnicos diferentes, quedando el DNA restante muy condensado en los cromt1meros. Cada bude corresponde 1I. una secuencia panicular de DNA. Cada cl!lula contiene cuatro copias de cada bude, dado que cada uno de los cromosomas consiste en dos crom:ltldas hcrmanas muy juntas, como se Tlluestra en In pane superior del esquema. Esta estructura en cuatra hebras es muy caracteristica de eSla lase del desarrollo del oocito (Ia rase diplotl'!nica de la meiosis, vl'!ase Figura 20-9).

I

PEQUENA REGION

DEL CROMOSOMA CROMATIOAS MOSTRANOO LAS HERMANAS

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cromatina eapaciadora entre dife,enl.. crom6merOi

372

Capftulo 8: EI micleo celular

•

cromatina elflendida

1111

crom6mero lormado de c,omalina muy condenll8da

se pueden apreciar dorninios estructurales organizados en 13 cromatina interfasica en los cromosomas poJjt~nicosll

Tambi~n

Por una espccializaci6n (diferente a la descrita en los cromosomas plumulados), tambil~n es posible visualizar la eSlructura de la cromalina en cienas cclulas de insectos. Muchas de las celulas de las larvas de mosca crecen hasla alcanzar tamanos enormes despuCs de repeLidos ciclos de sintesis de DNA que no van seguidos de divisi6n celular. Las celuJas gigantes resuhanles cenlienen miles de veces la dOlaci611 normal de DNA. Una celula con una dotaci6n de DNA mayor de la normal, y, como es habitual, con mas cromosomas de 10 normal, se denemina poliploide. Sin embargo en algunos tipos celulares de la larva de la mosca, Ladas las copias de los cromosomas se disponen de forma contigua formando un unico cromosoma politbJico gigante. EI heche observado en algunas cclulas gi-

dominio en bvcle

plole(n" que formen el eje del ClomotOffi8

Figura 8-18 Modelo de eslruclura del cromosoma. Se muestra una secci6n de un CTomosoma plegado rormando una serle de dominies en bude, cada uno de los coales pesiblemente contiene entre 20 OOOy 100000 pares de nucle6tidos en fonna de DNA de doble cadena condensado en la fibra de cromatina de 30 nm.

cromosomes mitatico. normeln e Ie m..."e eecele

bre~o l~quierdo del crOmOtome 3

Figura 8·19 Dlbujo detallado de lodo cl conJunia de cromosomas pollll!nlcos de una ghindula sallval dc Drosof,II11n. ESIOS cromosomas han sido extendidos para su visualizaci6n. aplaslandolos contra un portaobjelos. Drosophila tiene cuatro pares de cromosomas. y en el esquema se encuentran las cuatro parejas. Pero cada cromosoma csta lntimamente apareado con su hom6logo, (de modo que aparece como Wla eslruclura Unica). 10 cual no ocurre en la mayor panc de los nudeos (exceplo en meiosis). Normalmenle los cualro cromosomas polil~nicosse encuentran unidos per regiones pr6ximas a los centromeros que se agregan ronnando un ·cromocenlrounico de gran lamano (regi6n coloreada); en esla preparaci6n. sin embargo. el CTomocentro se ha rolO en dos partes per erecto del proceso de extensi6n empleado. (Modificado de T. S. Painter, I. Hered. 25: 465-476, 1934.)

373

gantes de insectos que pasan directamente de un estado polit~nico a un estado poliploide demuestra que la estructura b<1sica de un cromosoma polit~nico debe ser similar a la de un cromosoma normal. Los cromosomas poUt~nlcos son faciJrnente visibles al microscopio 6ptico dcbido a su gran tamano y a que aI disponerse las diferentes cadenas de cromatina una a1lado de otra con gran precisi6n, aumenta mucho el diametro del cromosoma y evita el enrollamiento. Son cromosomas interfasicos activos transcripcionalmeme, como los cromosomas plumulados. La politenia se ha estudiado especialmente en las c~lulas de las glandulas salivares de 1a larva Drosophila, en las cuales el DNA se ha replicado a 10 largo de 10 cidos sin separaci6n de las cromatidas hennanas de forma que se aLinean 1024 (= 2 UI) cadenas id~nticas (Figura 8-19). En los cromosomas polit~nicos observados con microscopia 6ptica son visibles bnndas oscuras e itlterl){lIIdas clams (Figura 8-20). Cada una de las bandas e interbandas corresponde a un conjullto de 1024 secuencias id~nticas de DNA dispuestas en paralelo. Alrededor del 85% del DNA de los cromosomas politenicos corresponde a las bandas, y el 15% reslante a las interbandas. La cromatina de las bandas se tifle mas que 130 de las interbandas debido a su mayor grado de empaquetamiento (Figura 8-2 n. Se estima que, dependiendo de su tamano, cada una de las bandas contiene de 3000 a 300 000 pares de bases par fibra de cromatina. Dado que cada una de las bandas puedc reconocerse par su tamano y su posici6n, se han numcrado para djsponer de un mapa del cromosoma politenico. En el genoma de Drosophila se conocen apraximadamente 5000 bandas y 5000 interbandas.

Los diferenles dominios de la cromalina de los cromosomas politenicos pueden empaquelarse y desempaquelarse como una unidad l 2: Mucho antes de que se conociera la estructura de la cromatina, estudios sobre los cromosomas politenicos revelaron que la transcripci6n genica va acompaflada de un cambio impon3me en el empaquetamiento del DNA, dado que es frecuente que bandas cromos6micas concretas se descondenscn cuando los genes que contienen se activan, y se vuclvan a condensar cuando estos genes se hacen quiescentes. En cada momento se pueden identificar las regiones de un cromosoma polit~nico que son transcritas, marcando las celulas durante un carta perfodo de licmpo can el precursor radiactivo midina-lH y localizando por flutorradiograffa los RNA transcritos (Figura 8-22). Estc amtiisis revela que las regiones cromos6micas mas activas estan descondcnsadas, formando los puffs cromos6mJcos, facilmente observables.

Figura 8-20 Mlcrograffa obtenlda con el mlcros«:oplo optlco de una porclon de cromosoma poUt~nlco de una glandula saliva! de Drosophila. 50 pueden apreciar con c1aridad los diferenles palrones reconocibles en bandas cromosamicas. Las bandas son regiones que presenlan elevadas concentraciones de cromatina. Se encucntran en los cromosomas interf;1slcos y constituyen una caracterfstica especial de los crornosornas politenicos gigantes. (Par cortesfa de Joseph G. Gall.)

Figura 8-ZI Electroninlcrograffa de un corte ultrafino de una pequeoa

porclon de un cromosoma poUt~nk:o de Drosophila. se pueden distinguir c!aramente unas bandas de distinto grosor (BJ separadas por interbandas (I) formadas par cromatina menos condensada. (Por conesfa de Viek.ko Sorsa.) ( B

374

Capftulo 8: EI nuc1co cclular

•

Uno de los principalcs factores que conuolan la aclividad de los genes de los cromosomas politt'!nicos de Drosophila es la honnona esteroidea ecdisolla, cuyos niveles aumentan y disminuyen peri6dicamenle durante el desarrollo larvario, indudendo la transcripci6n de los diferentes genes que codifican las proteinas que necesita la larva del insecto para cada muda y para la fase de pupa. A medida que el organismo pasa a travt'!s de la~ distintas fases del desarrollo, surgen nuevas puffs y desaparccen los antcriores, al ser activadas y dcsaclivadas las unidadcs de transcripci6n, y se producen diferentes RNt\ y protcfnas (Figura 8-23). Del estudio de los puffs, especia]mente cuando son relativamente pequefias y aun se pueden dislinguir las bandas de los crolllosomas, parece deducirse que la mayorfa de puffs provienen del desenrollamiento de una unica banda cromos6mica (Figura 8-24). EI estudio de elecuonmicrograffas de secciones ultrafinas de estos puffs muestra c6mo el 0 A de la cromatina estA mucho menos condensado que en la libra de cromatina de 30 nm. Estas observaciones sugieren que la cromatina de una banda puede descondensar como una unidad durante 1a uanscripci6n.

Es probable que tanto las bandas como las interbandas de los cromosomas politenicos contengan genes!') EI hecho de que el pau6n de las bandas e interbandas de los cromosomas pol itt'!nioos de Drosophila sea lijo sugiri6 a los primeros citogenetistas que cada banda

podria corresponder a un gen Unico. Los estudios de fTecuencia mutacional que han permitido a los genetistas estimar que Drosophila tendria alrededor de 5000 genes, un numero aproximadamente igual aJ numero de bandas cromos6micas, apoyan esta hip6tesis. Ademas, cuando se realizaron experimentos intensivos de aislamiento de mutantes correspondientes a una pequefia regi6n de cromosoma que contiene alrededor de 50 bandas, se aislaron 50 genes esenciates. Aunque con estas tt'!cnicas no es posible determinar si un determinado gen se encuentra en una banda 0 en una interbanda, las obscrvaciones sugieren que una banda de tamafio media podrfa contener las secuencias de DNA codificantes de una protefna esencial. Resultados mas recientes, y el hecho de que en los anaJisis gent'!ticos descrilOS anterionnente no se habnan tenido en cuenta aquellos genes que no son

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eSla 3utorradiograffa de un

cromosoma (de la glandula salival del insecta Cllirotlomus tertlans) marcado con uridina-Jlt se apreclan los lugaTes de smtesis de RNA como zonas cubiertas con granos de plata oscuros, en proporci6n a su actividad. (De C. Pelling, Cllromosoma 15:71-122, 1964.)

Figura 8-23 Puffs cromos6mlcos.

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Figura 8-Z2 Sintesls de RNA a 10 largo de un cromosoma pollt~nJcogtgante.

•

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Serie temporal de fOlografras que muestran c6mo se forman y desapareccll]os ~puffs" cnlos cromosomas polilenicos de Drosoplliln melallogaslcr, durante el desarrollo larvario. Se muestra una regi6n del bmw izquierdo del cromosoma 3. Presenta 5 grandes ·puffs" en las ululas de la ghindula salival, carla uno de los cuales es activo durante Ull corto perfodo de liempo. La serie dccambios que se mueSlran

en la flgura tienen lugar durante un per(odo de 22 horas, y siguen un patr6n reproducible durante el desarrollo del organismo. (Por conesfa de Mkhael Ashburner.)

Z

~

375

esenciales para la supervivencia en el laboratorio (donde los depredadores no existen y se facilitan tanto la comida como el apareamiento). hacen improbable la veracidad de la hip6tesis "una banda un gen". Por ejemplo, se ha cJonado un fragmento continuo de 315 000 pares de bases del genoma de Drosophila, y se han usado zonas de este fragmentos para localizar todos aquellos mRNA producidos en esta regi6n. Asf se localizaron 3 veces mas mRNA que bandas correspondfan a esa rcgi6n del genoma, indican do que cada banda contienc probablemente varios genes. Ademas, en los cromosomas politenicos se ha mostrado directamente que se produce mRNA tanto de bandas como de interbandas. Aunque aun es motivo de controversia, se ha propuesto que en los cromosomas politenicos el DNA se organiza en bucJes de forma similar a como 10 hace en los cromosomas plwnulados. De acuerdo con esle modelo la formaci6n de puffs corresponderfa a la descondensaci6n de uno 0 mas de los dominios en bucJe. Independientemente de que este modelo sea correcto 0 no, los resultados anteriores muestran que al menos algunos cromosomas interfasicos se encuentran organizados en una estructura de dominios secuenciaJes perfectamente definidos, cada uno de los cuales contendrfa tfpicamente un pequeno nlunero de genes cuya transcripci6n estarfa regulada de forma coordinada. Podrfa ser que todos los cromosomas interfasicos se enconlraran empaquetados en estructuras ordenadas de acuerdo con los mismos principios.

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10"m

Figura 8·24 Autorradlograffa de un puff alslado de un cromosoma polltenlco. En la pardon de cromosoma que se deslaca se eSla produdelldo sfntesis de RNA, por 10 cual presenta ntarcaje can uridina·JH. (Par cortesfa de Jose Bonner.)

La cromatina est:i menos condensada en las regiones que son transcripcionaimente activas l4 Estudios de los puffs de los cromosomas politenicos sugieren que la estructura de la cromatina de los genes transcritos se encuentra descondensada selectivamente. Apoyan esta sugerencia experimentos de diferente naturaJeza. Cuando se alslan nucJeos de celulas de vertebrados y se exponen a la enzima DNasa I, aJrededor del 10 % del genoma se degrada preferencialmente. Aunque una pequefia parte de estas secuencias degradadas corresponden a los lugares hipersensibles que se han descrito anteriormente, la mayor parte corresponde a genes que se estaban transcribiendo: por ejemplo, en diferentes tipos celulares del mismo

gen qlJe sera lranscrito dentro de elglJnas horas

981'\ que se esta tr8nscribiendo ectiv8menle e RNA

regiOne~

TRATAMIENTO CON DNase I PANCREATICA

CrOm8tins condens8da normelmenta

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376

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~ Capftulo 8: EI m1cIeo celular

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~ DNA degrededo

Figura 8-25 Dlgesti6n de la cromatlnacon DNasa I. La enzima corta en primer lugar par los lugares hipersensibles a las nucleasas (no visibles aquf, vease Figura 8-12) y luego degrada de fonna selecliva DNA tanto de los genes que se transcriben activamente como de los que han sido activados pero aun no han comenzado a transcribirse.

organismo se degradan diferenles secuencias de DNA en funci6n de que genes se estahan transcribiendo en estos tipos celulares, Cabe remarcar que induso aquelJos genes que se nanscriben muy pocas veces en cada generaci6n celular, son sensibles a la acci6n de la nucleasa, 10 que indicarfa que es mas un estado especial de la cromatina que el proceso de uanscripci6n de DNA en sf mismo 10 que haee a est'as regiones especialmente aecesibles a la digesti6n (Figura 8-25). La cromatina en este estado accesible se denomina cromatlna aetlva, y parece que su estruetura eSla allerada de forma que el empaquelamiento de los nucleosomas es mellOr.

La cromatina activa es bioqufmicamente diferente l5 tOUe diferencia la eromatina aetiva de la inactiva? La respuesta a esta pregunta requerira la purificaci6n y caracterizaci6n de las protefnas cromos6micas que son propias de cada una de elias, Se han realizado algunos avances hacia esa meta can el desarrollo de melOdos bioqufmicos disei'lados para aislar cromatina activa basandose en Sll estado relativamente descondensado. EI anaIisis de las proteinas eromos6micas de la fracci6n de cromatina activa sugiere 10 siguiente: (1) la histona Hl parece unirse COil menos fuerza a al menos algun tipo de eromatina activa; algunos subtipos particulares de esta histona podrfan estar representados preferentemenle. (2) Aunque en la cromatina activa las cuatro histonas nucleos6micos estan presenles en cantidades normales, parecen estar altarnente aeetiladas cuando se comparan con las mismas histonas de la cromatina inactiva. (3) La histona nucleos6mica H2B parece eSlar menos fosforilada en la cromatina inactiva, (4) La cromatina activa esta muy enriquecida en una forma v~iante menor de la hislona H2A que se encuentra en muchas especies, incluida Drosophila y el hombre. (5) Los nudeosomas de la cromalina activa se unen seleetivamente ados pequei'las proteinas cromos6micas similares, denominadas HMG 14 YHMG 17, De'acuerdo con su presencia exdllsivamente en la cromatina activa estas proteinas del "grupo de elevada movilidad" (HMG, de High-Mobility-Group) se encuentran en cantidad suficiente para unirse a I de cada 10 nucleosomas de la cromatina total; ademas, su secuencia de aminoacidos ha side muy conservada durante la evoluci6n, 10 que implica que cumplen funciones imponantes,

Figura 8-26 La heterocromatlna es lnactlva transcripclonalmente.

envottura nuclear

helerocromat,na perifllrica

La estructura global de los cromosomas

Autorradiograffa de una seccion ultrafina de un nucleo celular de una ceJula que ha sido marcada can un pulso de uridina- 3 H para marcar los lugares donde se produce la sfntesis del RNA (granos de plata), Las areas bu:mcas son regiones de heterocromalina, que tiende a empaquelarse en la region interior de la envoltura nuclear. NormaJmente la heterocromalina suele lefiirse de oscuro en las eleclronmicrograf(as (por ejemplo, vease Figura 8-71), pero debido aJ metoda especial de preparacion de eSla muestra han quedado de color claro. Como se puede observar, Ja mayor pan.e de la sfntesis de RNA tiene lugar en la eucromatina que rodea las areas de heterocromalina. (Por cortesfa de Stan Fakan.) 377

Todos 0 alguno de estos cam bios podrian jugar un papel importante en el desempaquetamiento de la eromatina de los genes activos, contribuyendo a haeer el DNA aeeesible como molde para la sfntesis de RNA; sin embargo son neeesarios mas resultados experimentales para poder eomprobar esta idea. En el Capitulo 9 se exponen los mecanismos que pueden controlar la transici6n entre eromatina aetiva e inacriva.

CTomosoms i

j

ceotr6mefo

La heterocromatina esta muy condensada yes transcripcionalmente inactiva l6 Los estudios realizados en los alios 30 con microcopia 6plica diferenciaron entre dos tipos de cromatina en el mlcleo inlerfasieo: una forma altamente eondensada denominada hererocromatina y todo el reSlO, que esta menos eondensada, denominada eucromatlna. La heteroeromatina fue identificada originalmente porque perrnaneee extraordinariamente compaetada durante la interfase; posteriormente se encontr6 que era transcripcionalmente inacriva (Figura 8-26). En una celula tipica en interfase, aproximadamente el 10% del genoma se encuentra empaquetado en heterocromatina. Aetualmente parece claro, por 10 que se ha descrito anteriormente, que la eucromatina existe al menos bajo dos formas: alrededor del 10% esta en la forma de cromatina activa, que es la menos condensada, mientras el resto es eucromatina inactiva, que esta mas condensada que la eucromatina activa pero menos que la heterocromatina. Asf pues se cree que la heterocromatina podrfa ser una clase especial de cromatina inactiva en transcripci6n que podrfa tener otras funciones. Par ejemplo, en mamfferos y en muchos otros eucariotas superiores el DNA que rodea a cada centr6mero esta formado por secuencias de nucle6tidos simples y repetidas. Este DNA satelite constituye la mayor parte de la heteroeromatina en dichos organismos.

'--'

CTom,l.,tids

Figura 8·27 DlbuJo de un cromosoma metafli.slco tiplco. Cada crOlmitida hija conliene una de las dos molcculas hijas idCllIicas de DNA que se han generado previamente en el ciclo cclular por la replicaci6n del DNA.

Los cromosomas mit6ticos estan formados por cromatina en su forma mas condensada 17 Con excepci6n de unos cuantos casos muy especializados, como son los cromosomas plumulados y politenicos descritos anteriormente, la mayor parte de los cromosomas en interfase estan demasiado extendidos, son tan delgados, yestan tan entremezclados que no son deteetables. Por el comrario, los cromosomas de casi todas las eelulas son perfectamente visibles durante la mitosis, cuando se empaquetan formando unas estructuras mucho mas condensadas. Este empaquetamiento, que reduce una longitud de DNA de 0,5 cm a alrededor de 5 11m, haec posible que el huso mit6tico segregue los cromosomas en las celulas hijas sin romperlos. Esta condensaci6n esta acompafiada de la fosforilaci6n de todas las histonas HI de la celula en cinco de sus residuos de serina. Debido a que la histona HI colabora en el empaquetamiento de los nucleosomas (vease Figura 8·15), parece probable que su fosforilaci6n desempeile un papel causal en la eondensaci6n de los cromosomas. La Figura 8-27 muestra un cromosoma mJt6tico tfpico durante la memfase mit6tiea. Las dos moleculas de DNA hijas producidas par replieaci6n del DNA durante la fase S del cicio de divisi6n celular, estan plegadas por separado, formando dos cromosomas hermanos (den om in ados cromdtidas hermallas) mantenidos juntos POt sus centr6meros. Normalmente, estos cromosomas mit6ticos estan cubiettos por diversas moleculas, entre las que se cuentan grandes camidades de tibonucleoprotefnas. Una vez eliminada est a envoltura, en las electronmicrograffas se puede observar que cada cromatida esta organizada en bucles de ctomatina que proceden de un eje central (Figuras 8-28 y 8-29). Algunos experimentos demuestran que el orden en que aparecen detetminadas ca· racterfs(ieas visibles de un eromosoma mit6tico representa, aproximadamente, el arden de los genes a 10 largo de la molecula de DNA. Para ilustrar el modo .tan organizado como se pliega y empaqueta la larga helice de DNA, en la Figura 8-30 se ha reptesenrado cada cromAlida como una serie de dominios en bucle 378

Capftulo 8: EI m1c1co celular

'--'

0.1

~m

Figura 8-28 Electronmlcrograf!a de barrldo de una regl6n cereana a un extremo de un cromosoma m1t6tico t(plco. Se cree que cada protuberancia representa la parte superior de un dominio en forma de bude. Es de destacar que es posible diferenciar c1arameilte las dos cronuhidas hermanas tal como se han representado en la Figura 8-27. (De M.P. Marsden y U.K. Laemmli. Cell 17: 849-858.1979, © Cell Press.)

Figura 8-29 Electronmicrograffa de una sola cromatida de un cromosoma mltotlco. EI cromosoma (de un insecto) fue tralado para revelar los bucles de fibras cromat!nicas que proceden de un eje central de la cromatida. Estas micrograffas apoyan la idea de que en todos los cromosomas la cromatina esta doblada en series de dominios en forma de bucle (vease Figura 8-18). (Por cortesfa de Victoria Foe.)

Tnm

fregmento cono de une doble h6lice de DNA

'1.

T 1

11 nm

crometine en te forma de 'cadene de cuentes' 0 'cuentn ensartadas·

Figura 8-30 Modelo del empaquetamlento de la cromatlna. I1uslracion esquematica de algunos de los muchos grados de empaquelamiento de la cromalina que se han poslulado para explicar el allo grado de empaquelamiento del cromosoma metafasico.

T

nucleosomes compeetedos en lorma de fibre de crometine de 30 nm

30 nm

secc,6n del cromosome en una forme eKtllnd,de

T

""om

1

§_

_~o~od~••<.. ~ .~

de un cr.omosome metefAslCO

•

,

ctomosome m.ufA&lco completo

La estructura global de los cromosomas

"

,

,

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T

70Qnm

1 T

1400nm

379

IBI

muy pr6ximos, organizados en una helice compacta; tam bien se representan cs· quematicamente todas las clapas de empaquelamiento que podrfan preceder a esta estructura. Se cree que la forma condensada de la cromatina que constituye los cromosomas mit6ticos es similar a la de la heterocromatina en Sll grade de compactaci6n. No es sorprendente que se haya dererminado que los cromosomas mit6ticos son inactivos transcripcionalmente: la sfntesis de RNA cesa cuando el cromosoma se condensa. Probablemente 1a condensaci6n de la cromatina impide el acceso de la RNA polimerasa aJ DNA, aunque tam bien podrfan estar implicados arras faelates.

Cada uno de los cromosomas mit6ticos presenta un patr6n caractedstico de grandes dominios estructurales 18 EI conjunto de los 46 cromosomas humanos en mitosis se denomina el carlollpo humano. Metodos de tinci6n ideados durante los wtimos 25 afJos han permitido la identificaci6n inequfvoca de cada uno de los cromosomas. Algunos de estos metodos requieren la tinci6n de los cromosomas mit6ticos con colorantes que son fluorescentes linicamente cuando se fijan a cieTlos tipos de secuencias de DNA. Aunque estos colorantes tienen una especificidad muy baja y parecen distinguir sobre todo entre el DNA rico en pares de bases A-T (bandas G) y el DNA rico en pares de bases G-C (bandas R), dan lugar en cada cromosoma mit6tico a un atractivo patr6n reproducible de finas bandas (vease Figura 8-31). De esta forma cada cromosoma se puede identificar y numerar, como se ilustra en la Figura 8-32. Se sabe que tanto las bandas G como las R contienen genes. Estas bandas no estan relacionadas con las descritas previamente en los cromosomas politenicos de insectos, que se cree corresponden a regiones de cromatioa condensada; en los cromosomas mit6ticos humanos, toda la cromatina esta condensada y las bandas se forman por la uni6n selectiva de tiertos colorantes. Mientras que en una banda de un cromosoma politenico parece haber s610 unos cuantos genes, una banda tfpica de un cariotipo humano contiene algunos centenares de ellos. Examinando los cromosomas humanos durante las primeras etapas de la mitosis, cuando estan menos condensados que en la metafase, ha side posible establecer que la dotaci6n haploide total contiene por 10 menos 2000 band as diferenciables de DNA rico en pares de bases A-T. Estas bandas se fusionan progresivamente a medida que avanza la coodensaci6n durante la mitosis, dando lugar a un mlmero menor de bandas mas gruesas. Las bandas de los cromosomas mit6ticos se han detectado en especies tan diversas como la mosca y el hombre. Adetmis, el patr6n de bandas exacto de un dcterminado cromosoma ha permanecido inalterado durante largos perfodos de tientpo; par ejemplo, se han localizado cromosomas con un patr6n de band as comparable al humano, en chimpances, en gorilas y en orangutanes (aunque en 380

Capitulo 8: EI nuclen celular

Flgura8-31 Micrograf!asde nuorescenda de tres parejas de cromosomas humanos mostrando el patron de bandas. En {Al los cromosomas fueron tellidos call el colnrante Hoescht33258 especilico del par de bases A-T que tifte las bandas G, yell (8) con ei colorante olivomicina, especffico del par de bases G-C que tii'ie las bandas R. Las baITas indican la posici6n del centr6mero. Obscrvese que estos patrones de las bandas son el reverso el uno del otro. ya que las bandas que son claras en (Al son oscuras en (8), y viceversa. Las bandas G tambien se ti!"ien can el metodo de Giemsa -de ahf su nombre- mientras que las bandas R deben su nombre al hecho de ser el patr6n "reverso" de las bandas G. (De K.F. Jorgenson, ).1-1. Van de Sande, y e.c. Lin. ClJromosoma 68: 287-302, 1978.)

Figura 8-32 Mapa estandar del

patron de bandas de cada cromosoma

3

1 4

5

8

10

11

8

"

del carlotlpo humano. Este mapa se dctennin6 en la ctapa dc prometafase mit6lica. Los cromosomas del I al22 eSI:in ordenados segull su tamano; una celula diploide contiene dos de cada uno de estos cromosomas, adem:is de dos cromosomas X (hembra) 0 un X y un Y (macho). Las 850 bandas que se muestran en el esquema son bandas G, que se tifien con reactivos que parecen ser especificos para las secuencias ricas en A· T. Las proruberancias coioreadas en verde sobre los cromosomas 13. 14, 15. 21 y22 indican la posici6n de los genes que codifiean los RNA ribos6micos grandes; las Irneas uerdes marean la posici6n de . caela centr6mero. (Adaptado de U. Franke. Cytogenet. Ceil Genet. 31 : 2432. 1981.)

2

-~-i-~-~- -~

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16 14

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20

50 mlilones de pares de nucleOtidos de DNA

22

•

el hombre se ha producido la fusi6n de dos cromosomas, 10 cual ha dado [ugar a los 46 cromosomas que presenta a diferencia de los 48 de las atras especies citadas). Esto sugiere que la organizaci6n espacial de los cromosomas que ponen de manifiesto las bandas puede seT de gran importancia para la funci6n cromos6mica. El porque de la exislencia de estas bandas constituye un misterio. Incluso las mas fillas de elias representadas en la Figura 8-32 podrfan contener mas de un mi1l6n de pares de nucJe6tidos, que es casi el tamaflo de un genoma bacteTiano, yes de esperar que la composici6n media de pares de bases sea alealOria en eslOs grandes fragmenros de DNA.

Resumen Los cromosomas se CkSCOluWlISatl generalmente durante in interfme, de forma que es diflcil discernir su estrllchlra. Existell ,wtables excepciones, como par ejemplo los especializados cromosomas plul1J11indos tk los oocitos de vertebrudos 0 los cromosomas poUlinicos de cilldas secretoras gigalltes tk i"sectos. Los estudios tk ambos tjpos de cromosomas interftisicos sugieren que cada tum de las largas moUculas de DNA de uti cromosoma esttf divididn e" 1111 gratl mimero de dominios discretos que se pUegatJ de matJertl lliferente. Tanto en los cromosomas plwmdados como en los politetJicos las regiotJes que esttfll sintetiza"do activamente RNA SOli las menos condensadas. Deforma similar, como se estima por la se'lSibilidLul a lI"cleasas, alrededar tkl 10% tkl DNA de las cilulas en hlterfase tk vertebrados se encuen(ratl ell mla conformaciOn relativameflte tkscontk'lSadt, {I'le se correladolla COli la (rallscripcion tkl DNA ell diclJaszollas. Esta "cromatina activa" es biOllu{micamentedistillta de las regiones mtis condensadas, illactivas, tk in cromatitJa. La estructura global de los cromosomas

381

Todos los cromosomas fUlqllieren ,ma conformaciOn altamente co,uie/lsatla durante In mitosis. C"ando se Wiell defomm espec£fica, los cromosomas mit6ticos presentan Ima estnlctllra en bandas {I"e pem,ite reconocer sill ambigll('{latles a cada ,mo de los cromosomas; estLU bamlas colltiellell milfolles de pares de ''''cle6tidos y sarI el reflejo de ,um ',e'ereogeneidad de la estnlctllra del cromosoma qlle min no se compre,lde.

Replicaci6n del cromosoma Antes de que una celula se divida. ha de realizar una copia de cada uno de sus cromosomas, proceso que realiza durame una parte de la inlerfase denominada fase de sfntesis de DNA 0 rase 5 del cicio celular; a la parte del cicio celular que precede a la fase 5 se Ie denomina Gap 1 (de Mintervalo") 0 GI' Ya la que Ie sigue Gap 2,0 Gz (vease Figura 17-3). En una celula eucariota tfpica la rase 5 dura aproxim3damente 8 horas. AI final, cada cromosoma se ha replicado produciendo dos copias completas, que pennanecen unidas por sus centr6meros hasta la rase M que Ie sigue poco despues (Figura 8-27). La duplicaci6n de los cromosomas requiere tanto la replicaci6n de la larga moltkula de DNA de cada cromosoma como el ensamblaje de un nuevo conjunlo de prorcmas cromos6micas sobre esle DNA, ronnando la cromatina. En el Capitulo 6 se discute la enzimologfa de la replicaci6n del DNA y se describe la estrucrura de la IlOrq"illa de replieDdo", en la que se produce la sfntesis de DNA siguiendo un mecanismo semiconselVativo (veanse Figuras 6-48 y 6-49). En el Capftulo 17 se considera c6010 esta regulado el inicio de la rase S, en el seno de una discusi6n mas general sobre el control del cicio celular. En la presente secci6n describimos el patron de rases de la replicaci6n de los cromosomas eucariotas y su relaci6n con la esrructura del cromosoma.

Secuencias espedficas de DNA acruan como orfgenes de replicaci6n l9 En el CapItulo 6 se vio que se han caracterizado los orfgenes de replicaci6n en bacterias como secuencias especfficas de DNA que permiren a la maquinaria de replicaci6n del DNA unirse a la doble helice y desplazarse ell direcciones opueslas, formando las llorquiflas de replicaci6n. Par analogia, es de espcrar que los origenes de replicad6n eucariola tambien sean secuencias especfficas de DNA. Como se mcnclon6 previamcnte, la blisqueda de orfgenes de replicaci6n en los cromosomas eucariotas ha sido especialmentc fructffera en las celulas de In Ievadura Saccharomyces cereuisiae. Los pOlentes melodos que se han dcsnrrollado para su aislamiento se basan en el uso de unas celulas Tllutanles de Icvadura que carecen de un gen esencial, de forma que s610 sobrevivin\n en cl media sclectivo si se les agrega un plasmido que porte una copia funcional del gen perdido. Cuando se introduce en la celula de levadura un plasmido bacteriano que poria el gen esencial, no sera capaz de replicarse independientemente del cromosoma huesped porque el origen de replicaci6n bacteriano no fUllciona en la celula de levadura. SI se insertan fragmentos al azar de genoma de levadura en un plasmido bacreriano, una pequefla fracci6n de las moleculas recombinantes ponar<1 un origen de replicaci6n de levadura, y por eUo sera capaz de replicarse en celulas de levadura. AqueUas celulas mutantes de levadura que porten dicho pl,bmido podran prolirerar en medio selectivo pues se les ha apollado una copia funcional del gen normal (Figura 8-33). Las secuencias de DNA identificadas por su presencia en plasmidos aislados de estas celulas se han denominado sewellcias de replicadotl awo/loma (ARS, de AUlOnomously Replicating Sequences). Recientemente se han aislado un cierto nu.mero de ARS, demostrandose que se trata de autenticos orfgenes de replicaci6n cromos6micos, justificando la estrategia que se ha seguido en su aislamiento. Se ha demostrado que una secuencia de II nucle6tidos, la secuencia central consenso, es esencial para la funci6n de origen de replicaci6n en levadura; todos 382

GapftuJo 8: EI micleo celular

,egmento de DNA de levadura que conl;ene una seeuenci8 ARS

I,.um.nlo d. DNA de lev.du.a, seleccionado alua, \

CJ

vector plamfdi<:o q~oo",;.~ el gen de I. histidina

HOS

HOS

I

I

introduc:e;Qn del

DNA p18$mklioo en ~lul.. de levadura que ca,ecen

del gen de histidin8 y que.

pol'

Figura 8·33 Estrotegla utlllzada para Identlncar secuenclas de repllcacl6n aut6noma en levaduras. Una secuencia de DNA identificada de esta forma se denomin6 inicialmente secuencia de replicaci6n aUl6noma 0 ARS, pues capacita 31 pl4smido que la contiene a replicarse Iibremente en 1a c~Hula hu&ped s.in necesidad de incorporarse en sus cromosomas.

10 U1nto. no puedlln crece' en iIlUsenciill

de hi,tidiM

I

ctllula, 1'8n,lorm8das obtenid8S con un. I.ecuenci,l bIIj8 8n I,lS que 31 DNA del pl.hmido Sll h8 integr8do 8n el Cfomosoma de I. lev.du••

ctlluills trllnslorm8das obtenidss con un.lrecuenci. elev.d. en I,. que los c1rculos de DNA plllSmidico H replican independientemente del Cfomosoma hUMped

origen de replicaeian de SV40

\ los orfgenes de repLicaci6n conocidos contienen copias casi identicas de dicha secuencia, espaciadas en una regi6n de unos 100 nucle6tidos. Eslas secuencias de DNA son reconocida por un gran complejo de protefnas que parece que esta implicado en el proceso de iniciaci6n. Aunque se han idelltificado a1gunas probabies secuencias de origen de replicaci6n en eucariotas, hasta el momenta no se canacen las protefnas que se unen a elias.

DNA

~-[!]

~

.nl!geno T

[!][!] CAMBIO

CONFORMACIONAL EN EL ANTfGENO T

Un sistema eucariota libre de celulas replica el cromosoma de un virus de simio'lO En una bacteria un complejo multienzimatico que incluye la DNA polimerasa, la DNA primasa y la DNA helicasa desplaza la horquilJa de rcplicaci6n (vease Figu· ras 6-48 y 6-49); este complejo se ensambla en el origcn de rcplicaci6n a traves de una reacci6n que requiere la presencia de una protcfna iniciadora que se une espccflicamente aJ origen de replicaci6n en el DNA (v~ase Figura 6·52). Se han hechos nwncrosos intentos para reconstruir el sislema de replicaci6n eucariota en el tubo de ensayo. Para eUo serfa necesario identificar lodas las enzimas necesarias y describir la funci6n de cada una de elias en la horquilla de replicaci6n. EI sistema de replicaci6n ill vitro que mejor ha funcionado por el momento permite la replicaci6n del virus de simio SV40. ESle virus parasita la relula huesped, usando de esta celula lodo 10 necesario para su replicaci6n, con excepci6n de una protefna, el amfgeno T de SV40, una prot'eina multifuncional de gran tamano que permite al virus evitar los commies normales y por ella replicarse mas deprisa que la ~lula huesped. AI origen de replicaci6n de SV40 se unen dos hexameros del antfgeno T, reconociendo el exterior de la doble helice. Despues, en un proceso Que no se comprende bien, el antigeno T unido cambia de conformad6n separando las dos hebras de DNA del origen. Esta interesante protefna tiene una tercera funci6n: utilizando la energfa de hidr6lisis del ATP acIlia como DNA heLicasa, desplazandose a 10 largo del DNA y separando las dos hebras a su paso, ronnando una burbuja de replicacion (Figura 8·34). Los com· ponentcs celuJares de la maquinaria de replicaci6n sc cnsamblan en la burbuja fonnando dos horquillos de repUcocl6n que se desplazan dcsde el origen en direcciones opuestas. Replicaci6n del cromosoma

==:@¢c==:

r=:

Flguf1l 8-34 Iniclaci6n de la repllcacl6n del DNA del genom8 del virus SV40. La prolefna de iniciaci6n (antfgeno T) es codificada por el virus, y reconoce especi(icamente los origcnes de repUcaci6n viricos. Despues de abrir la doble helice de DNA en el origen, el antigeno Taenia como una DNA helicasa, desplazandose desde el origen y aI mlsmo tiempo abriendo la doble Mlice. Acontinuaci6n los componentes celulares de la maquinaria de replicaci6n se cnsamblan en la burbuja de replicaci6n formando las horquillas de replicaci6n (vcase Figura 8-35).

383

.

"

~tr6n de 1. CIldeol gur.

DNA heliCll$ll

ceblldor de RNA

,••omlllnio de Ok.llki

1'r'll~noTu

hom6Iogo oeM••)

/

proternlll de union I Ie cadena sencill. de DNA

DNA polimeras.«

(sabre ,I patrOn dele caden. ret.ned.l

Aunque la horquilla de replicaci6n es similar a la que se encucntra en procarioms. los experimenlos con SV40 han mostrado que en eucariotas existen al menos dos tipos diferenles de DNA poLimerasa: DNA polimerasa (l (alfa) en la cadena retrasada, y la DNA polimerasa delta l) (delIa) en la cadena gufa (Figura 8·35). En los procariotas, sin embargo, en ambas hebras de la horquilla de repli· caci6n actua un mismo tipo de DNA polimerasa (vease Figura 6·48). Todavfa no se ha descubierto la prote(na que nonnalmenle inicia la replicaci6n de los cromosomas de mamfrero. Por cUo se desconoce si aClua en la horquilla como el anlfgeno T, a modo de DNA helicasa, 0 bien. si como en los procariotas. se necesita una protelnn iniciadora espedfica y la DNA helicasa.

Los orfgenes de replicaci6n de los cromosomas eucariotas se activan en grupos21

•

En el Capftulo 6 se describe c6mo, en las bacterias, se inician dos horquillas de replicaci6n en cada origen y c6mo avanzan en direcciones 0plleslas. desplazandose a lIna velocidad de alrcdcdor de 500 nucle6tidos por segundo hasta que se ha replicado la tOlalidad del DNA circular del eromosoma. El tamafto del genorna bacteriano es pequeno, de modo que las dos horquillas permilcn duplicar lodo el cromosoma en menos de 40 minutos. Dado el Iamano muy superior de la mayor parte de los cromosomas eucariotas, parece poco probable que s~ repljcaci6n se inicie en un unico origen. En los primeros aftos de la deeada de 1960 se desarroU6 un metodo que permhi6 el estudio del mecanismo general de replicaci6n del cromosoma eucariotao Se hacen crecer celulas humanas en cultivo. exponiendolas durante perfodos cortos de tiempo a timidina- 3 H, con 10 que se consigue que el DNA sintetizado durante ese tiempo sea fuertemente radiactivo. La disLribuci6n del DNA radiactiva se determina por autorradiograffa: se obtiene el DNA de las celulas mediante lisis suave. se extiende sobre un portaobjetos de vidrio y se recubre con una emulsi6n fotogrMica. Los tiempos de marcaje utilizados son cortos, de modo que la horquiUa de replicaci6n reeorre 5610 unos cuantOS micr6melros, 10 cua! se pone de manifiesto a! microscopio 6ptico en forma de Ifneas de granos de plata a 10 largo de la molecula de DNA. a pesar de que esta no es visible a! microscopio 6plico. De este modo es posible determinar tanto la velocidad de replicaci6n como la direcci6n en la que se desplazan las horquillas de replicaci6n (Figura 8-36). A partir de las velocidades estimadas mediante diferentes liempos de 384

Capflulo 8: EI ndelco celular

Figura 8-35 Horqullla de repllcackSn en mamfferos. Esla horquilla se ha esquematizado de fonna que destaque la homologfa con 1a horquilla de replicaci6n baeteriana descrila en e1 Capflulo 6. Aunque ambas horquillas utUlzan los mismos componenles baskos, 1a horquilla de mamiferos difiere en dos aspectos imponantes. FJ1 primer lugar. se emplean dos DNA polimerasas. una para la cadena gufa y oua para la relrasada Es bastaOle probable que la polimerasa de la cadena gura est~ adaplada a manlener una uni6n ruerte con el DNA, mientras que la polimerasa de la cadena retrasada debe scr capaz de soltarse del molde y volvcrse a unir cuando se sintetiza el nuevo fragmcnto de Okazaki. En st..'gUndo lugar, In DNA primasa de mamffcros es una subunidad de la DNA polimerasa de la cadena relrasada, mielllras que en baclerias esta asociada con la DNA helicasa.

--

--

DNA

origen de replic8ci6n

PULsa DE 10 MINUTOS DE MARCAJE CON TIMIDINA· 3H

IAI granos de pleta

(B)

LA ·CAZA" EN EL MEDIC NO MARCADO DURANTE 10 MINUTOS REDUCE lOS NIVELES DE PRECURSOR INCQRPQAADO

====;~:.:..:..:..:.~r"""~~~.J:~-r~W1~'~.~~Il:i'~'~(!i4?i&~4~_~.:..:.:···~:l==:>=== burbuje de replicacl6n

burbuja de replicaci6n

marcaje, se deduce que la horquilla de replicaci6n se desplaza a unos 50 nuc1e6tidos por segundo. ESla velocidad es una decima parte de la velocidad estimada de dcsplazamicnto de la horquilla de replicaci6n en bacterias, 10 cual probablemente refleja 1a dificultad que supone replicar el DNA estrechamente empaquelado en 1a cromatina. . Tal como se ha comentado anteriormente, se cree que un cromosoma humana de tamaf\.o media esta farmado por una molecula de DNA de unos 150 millones de pares de nucle6tidos. La replicaci6n de una mohkula de este tamano a partir de una horquilla de repHcaci6n que se desplazara a una velocidad de 50 nucle6tidos por segundo, requerirfa 0,02 x 150 x l()& =3 x 106 segundos (alrededor de 800 horas). Como se esperaba, los experimentos antes descrilos revelaron que en cada eromosoma eucariota en replieaci6n aetuan numerosas horquillas de replicaci6n que se desplazan simultaneamente. Mas aun, exislen regiones del cromosoma que presentan numerosas horquillas de replieaci6n muy juntas, mienlras que otras regiones del mismo eromosoma no presenta ninguna. Qtros experimentos posteriores han demOSlrado 10 siguiente: (1) los orfgenes de replicaci6n tienden a ser activados en grupos de enlre 20 y 80 unidades (denominados unidades de replicaci6n). (2) A 10 largo de la fase S se van activando nuevas unidades de replieaci6n hasla que todo el DNA esta replieado; (3) Dentro de una unidad de replieaci6n, los orfgenes de replicaci6n estan espaciados a intelValos de entre 30 000 Y 300 000 pares de nucle6tidos; posiblemente exista un unieo origen de replieaci6n par bucle de la cromatina. (4) Como oeurre en las baeterias, las horquillas de replicaci6n se forman por parejas y se desplazan en sentidos opuestos desde un punto de origen comun dando lugar a una burbuja de replicaci6n; dichas horquillas se detienen s610 euando se eneuentran con otra burbuja de replieaci6n en erecimiento 0 cuando alcanzan un extremo del eromosoma. De esta manera muehas horquillas de replieaci6n pueden actuar de fonna independiente sobre cada eromosoma y formar de este modo dos helices hermanas completas de DNA (vease Figura 8-36).

Figura 8-36 Los expcrlmentos que demostraron el patr6n de desplazamlento de las horqulllas de repllcacl6n durante la rase s. El DNA de nueva sfntesis en las celulas humanas en cultivo se marc6 brevemente COil un pulso de timidina tritiada (timidina-lH) de elevada actividad especffica. En eJ experimento que se iJustra en (Al Jas celulas se lisaron y el DNA se extendi6 sobre un portaobjelos de vidria que fue recubierto por una emuJsi6n ratognl.fica. Tras algunos meses de exposici6n se reve16la emulsi6n, y apareci6 una \fnea de granos de plata sobre el DNA radiactivo. E1 experimento en (B) es igual que el de A pero despues del nlarcaje las celulas se incubaron en un media libre de radiactividad, con 10 cual el DNA sintetizado qued6 mareado menos intensamente. Se observ6 que las parejas de trazas oseuras en (B) presentaban regiones de mellor marcaje en direcciones opuestas, demostrando eJ desplazamiellto bidireccional de Ja horquilta de replicaci6n a partir de un origen de replicaci6n comun (vease Figura 6-51). En esta figura se presenta el DNA coloreado en raja unicamenle como una ayuda para la interpretaci6n del autorrad.iograma; el DNA no marcado no es visible en estos experimentos. Se cree que una horquill!l de repJicaci6n s610 se detiene cuando encuentra oITa horquil1a desplazandose en direcci6n opuesta 0 cuando alcanza el extrema de un cromosoma; de esta forma se replica la totalidad del DNA.

Regiones distintas del mismo cromosoma se replican en diferente momento2.2 La replicaci6n del DNA en la regi6n situada entre dos orfgenes de replicaci6n,

requiere tan s610 a1rededor de 1 hora para completarse, segun las estimas realizadas de las mayores distancias conoeidas entre orfgenes de replicaci6n y la velocidad de desplazamiento de la horquilla de replicaci6n. Sin embargo, en las cclulas de mamffero la rase S dura alrededor de 8 horas. Esto implica que no todos los orfgenes de replicaci6n son activados simuhaneamente Y.que cada unidad de replicaci6n (que contiene un grupo de entre 20 y 80 orfgenes de replicaci6n) este replicando s610 dmante una pequena parte de la fase S.

Repllcacl6n del cromosoma

385

iExiste una activaci6n al azar de las diferentcs unidades de replicaci6n, 0 bien existe un orden definido de replicaci6n de las diferentes regiones del genorna? Un experimento que puede responder a esta pregunta consiste en el marcaje de poblaciones celulares sincronizadas, con el analogo de la timidina bromodesoxiuridina (BrdU), durallle diferentes perfodos de tiempo a 10 largo de la fase S. Posteriormente, en la fase M, se pueden reconocer las regiones del cromosorna rnit6tico que han incorporado BrdU en su DNA gracias a su distintas propiedades de tinci6n, 0 mediante el uso de anticuerpos anti-BrdU. Los resultados muestran que diferentes regiones de cada cromosoma se replican en un orden reproducible dtuante la fase S (Figura 8-37). Ademas, como era de esperar a partir de la observaci6n de grupos de horquillas de replicaci6n visualizados por autorradiograffa, el momento en que se realiza la replicaci6n est a coordinado en grandes regiones de cromosoma.

La cromatina muy condensada se replica tardfamente en la fase 5, mientras que la cromatina activa se replica tempran0 23 Parece que el orden en que se activan los orfgenes de replicaci6n depende, aI menos en parte, de la estructura de la cromatina en la que se encuentren. Se describi6, por ejemplo, que durante la interfase la heterocromatina permanece en una conformaci6n fiUy condensada (similar a la cromatina mit6tica), mientras que la cromatina activa adquiere una conformaci6n descondensada que probablemente es necesaria para permitir la sfntesis de RNA. La heterocromatina se replica muy tardfamente en la fase S, sugiriendo que el orden de replicaci6n esta relacionado con el empaquetamiento del DNA en la cromatina. Esta sugerencia esta de acuerdo con el orden en que se replican los dos cromosomas X en una celula de hernbra de mamffero. A pesar de que ambos cromosomas contienen esencialmente las rnismas secuencias de DNA, unicamente uno de ellos es activo transcripcionalmente mientras que el otro no 10 es (se discute en el Capftulo 9). Casi todo el crornosorna X inactivo se encuentra condensado en heterocromatina y su DNA se replica tardfamente al final de la fase S, mientras que su horn610go activo esta menos condensado y se replica a 10 largo de toda la fase S. Estos hechos apoyan la hip6tesis de que las regiones del genorna cuya cromatina esta menos condensada durante la interfase, y por ello son mas accesibles a la maquinaria de replicaci6n, se replican primero. Experimentos de autorradiograffa muestran que las horquillas de replicaci6n se desplazan a velocidades similares a 10 largo de toda la fase S, de forma que el grado de condensaci6n de la cromatina afectarfa a1 tiempo de iniciaci6n de las horquillas de replicaci6n pero no a su velocidad una vez formadas. La relaci6n que se ha sugerido entre la estructura de la cromatina y el momento en el que se produce la replicaci6n del DNA se apoya asimismo en estudios en los que se ha medido el momento en el que se replican determinados genes. Los resultados muestran que en todas las celulas estudiadas, los genes constitutivos, que estan siempre activos, se replican muy temprano ell la fase S en todas las celulas estudiadas. Por el contra rio, los genes que s610 son activos en unos cuantos tipos celulares generalmente se replican temprano en la fase S en las celulas en que son activos y mas tarde en las que son inactivos.

Las unidades de replicaci6n tardfas coinciden con las bandas ricas en A-Ten los cromosomas metafasicos24 Parece que muchas de las unidades de replicaci6n corresponden a distintas bandas cromos6micas que se hacen visibles mediante varios procesos de fijaci6n y tinci6n usados para obtener los cariotipos. Como se ha dcscrito previamente, en el complemento haploide de cromosomas de una celula de mamffero, durante las primeras fases de la mitosis se pueden distinguir unas 2000 bandas oscuras, las bandas dcas en A- T (bandas G), separadas por un tlumero igual de bandas claras ricas en G-C (bandas R). Es curiosa que las bandas ricas en A-T Y 386

Capftulo 8: EI nucJeo celular

Figura 8-37 D1ferentes reglones de un cromosoma se replican en dlferentes momentos de la fase S. Estas micrografias, obtenidas con el microscopiu optico, muestTan cromosomas mitoticos tenidos en los que se ha marcado de forma diferendaJ eJ DNA en replicad6n durante intervalos definidos de la fase S. En estos experimenlOs, las celulas se hicieron crecer en presencia de BrrlU (un amilogo de limidina) yen allsencia de timidina para marcar el DNA unifonnemente. Desplles las celulas fueron expueslas a pulsos breves de timidina en ausenda de BrdU durante la fase S temprana, media 0 tardia. Dado que el DNA sintetizado durante el pulso con timid ina es DNA de doble helice con timidina en una cadena y BrdU en la otTa, se tine mas intensamente que el otro DNA (que contiene BrdU en las dos cadenas) yse visualiza como bandas brillantes fjlechas) en estos negativos. Las lfneas discontinuas conectan posidones similares de las tres copias del cromosoma mostrado. (Por cones(a de Elton Stubblefield.)

las bandas ricas en G-C se repliquen en diferentes momenlOs de la fase S. ExperimenlOS como el descrito en la Figura 8-37 sugieren que la mayor parte de las bandas ricas en G-C se rcplican durante la primera mitad de la fase S mientras que la mayor parte de las bandas ficas en A-T 10 hacen en la segunda mit ad de la rase S. Se ha sugerido que los genes de expresi6n conSlitutiva se encuentran localizados fundamentalmente en las bandas ricas en G-C. mientras que los genes de expresi6n especffica de lipo celular -Ia gran mayorfa de los cualcs ser~11 inaclivos en muchas c~luJas- estan situados en las bandas ficas en A-T. Como se coment6 previamente. actualmente consriruye un complelo misterio por qu~ el genoma de los mamfferos ha de estar segregado en eslOS grandes bloques aJ· lemos de cromalina -muchos de eUos de un tamano similar a un genoma baCleriano. Tambi~n se desconoce cuantos de los orfgenes de replicaci6n presentes en una unidad de repJicaei6n se aclivan aJ mismo tiempo. Un posibilidad es que la eromatina de las unidades de replicaei6n tardfas permanezca condensada aun despu~ del final de la rase M, y 5610 se descondense en la segunda milad de la fase S. permitiendo 5610 enronees el aceeso simuJtaneo a todos sus orfgenes de replicaci6n. En este caso, la replicaci6n "todo 0 nada- del DNA de una unidad de replicaci6n podrfa ser el reflejo de la descondensaci6n en bloque de grandes dominios de cromatina.

EI patr6n ordenado de activaci6n de los orfgenes de replicaci6n puede contribuir a la memoria de la c~luJa25 En huevos en divisi6n de muchas especies. ell los cuaJes se encucnlran almaeenadas grandes cantidades de los componentes dc la eromalina (como las hisro· nas) que se precisan para fabricar un nuevo nudeo, la fase S es ex(remadamente breve. Como se i1uslra en la Figura 8-38, una corta fase S implica el usa de un numero excepcionalmente grande de orfgenes de replicaci6n espaciados a intervaJos de s610 unos euantos miles de pares de nucle6tidos (a diferencia de las decenas 0 centenares de miles de pares de nucle6tidos que separan los orfgenes de replicaci6n durante el desarrollo mas tardfo). EI hecho de que cuaJquier DNA ex(fano introducido en el interior de un huevo de rana feeundado se replique, parece indiear que posiblemente en ese modelo eelular no se requiera una sceuencia especffiea de DNA para formac un origen de replicaei6n. Asf pues, la replicaci6n del DNA puede considerarse como un proceso potencialmente muy n1pido que en algunas c~luJas esta sujelo a un complejo sistema de regulaci6n que reslringe la iniciaci6n de las horquillas de replicaci6n, de modo que diferentes regiones del genoma se replican en diferentes mOtnenlos. Se ha sugerido, por ejemplo, que la eromatina que se replica temprano se ensambla en parte can una serie de protefnas eromos6micas especiales que se han producido durante la fase GI' de modo que euando una regi6n cromos6mica se ha deseondensado formando cromatina act iva, su ceplicaci6n temprana haec que reclute prolefnas que Ie ayudaran a mantener su estado descondensado de una generaci6n a la siguieote. Desde este punta de vista, el momento en que se produce la replicaci6n del DNA eontribuiria al proeeso de la memoria celular que faci.lita la transcripci6n continua de los genes expresados.

,

Figura 8·38 En nucleos embrionarios en divisl6n nliplda actoan un gran nomero de orlgenes de repUcackSn. En estas elccLronmicrograHas de cromalina descondensada de un embri6n lemprano de Drosophila, se observa que las burbujas de replicaci6n (flechas) eslm muy pr6ximas. En eSle embri6n los perfodos entre algunas divisiones nucleares sucesivas son de unos 10 minulos. Debido a que los orfgenes de replicackSn ulilizados son muy proldmos (distan 5610 unos cuantos miles de nucle6tidos), 5610 se requiere alrededor de un minuto para replicar el DNA exhllell1e entre ellos. (Por conesfa de Victoria Foe.) RepUcacl6n del cromosoma

387

Factores unidos a la cromatina aseguran que cada regi6n del DNA s610 se replique una vez 26 En una fase S normal, cl genoma se ha de replicar completo y una sola vcz. Tal como se ha descrito previamente, en muchas celulas eucariolas el proceso de replicaci6n del DNA es asincr6nico y puede durar baslante tiempo. Debido a que los origenes de replicaci6n se activan en diferentes momentos en diferenles regiones del cromosoma, hacia la pane media y final de la fase S, algunos ya han sido replicados completamente mienU"as otros aun no han empezado a hacerlo. Asf pues se plantea un imponante problema de "regisrro~ durante las etapas media y final de la fase S. Aquellos orfgenes de replicaci6n ya utilizados se han duplicado, y son, aI menos respecto a sus secuencias de DNA, esencialmente iguales a los que aun no se han activado. Sin embargo, en cada fase S cada origen de replicaci6n debe ser utilizado una sola vez. iC6mo se puede controlar eSle proceso? Algunos experimentos de fusi6n celular han aponado importantes c1aves para la comprensi6n del problema. Cuando se fusionan celulas en fase S con celulas en fase G.. se induce la sfntesis de D A en el ntlcleo de las celulas en fase G,tlo cual sugiere que la transici6n de fase GI as est'ii mediada par un activador de la sfnlesis de DNA, que difunde. Por el comrario, cuando las celulas en fase S se fusionan con cl!lulas en fase G2 (es decir, celulas que acaban de complelar la fase S), en el ntlcleo G2 no se induce la s(ntesis de DNA. Dado que la sfntesis de DNA contintla inalterada en el ntlcleo en fase S, implica que el ntlcleo en G2 es incapaz de iniciar nuevos procesos de replicaci6n porque todo su DNA se encuenlra bloqueado de alguna forma. Por ejemplo, un inhibidor Que no difunde de la replicaci6n puede haberse unido fuertemente aI DNA. Un inhibidor de escas caracterfsticas que se uniera a la cromatina recien formada en In cola de las horquillas de replicaci6n podrfa explicar el hecho de que el DNA replicado una vez no volviera a hacerlo dentro de la misma fase S (vease Figura 8-39A). Otra alternativa igualmente plausible consistirfa en la existencia de unas proteinas iniciadoras 0 "factores permisivos~, unidas debilmente at DNA, que serran necesarias para la replicaci6n y que se destruirfan 0 inactivarfan por el paso de la horquilla de replicaci6n (1;igura 8-39B). Sea cual sea la naturaleza del bloqueo de la re-replicaci6n del DNA, ha de ser eliminado en el momento de la mitosis (0 un poco antes), ya que {ras la divisi6n celular, el DNA del ntlcleo G1 que aparece en las celulas hijas ya no estti protegido de la replicaci6n. Se ha padido observar que los fragmentos de DNA bacteriano que se replican cuando se inyectan en un huevo fertilizado de rana pueden quedar 3fecta-

IAI

Figura 8-39 Dos mecanlsmos que lie han propuesto para expUcar el bloqueo de la re-repllcacI6n. Esle bloqueo, que protege aI DNA repl.icado de una poSierior replicaci6n en el mismo cicio celular, es crucial para marcar las zonas ya replicadas, pero se desconoce su nalUraleza molecular. Normalmente, el bloqueo lermina durante la mitosis, aunque en algunos lipos celulares especializados (las cl'!lulas salivares gigantes de Drosophila. por ejemplo) se elimina el bloqueo sin necesidad de milosis, hacienda posible la formaci6n de cromosomas poIite"icos gigantes. (A) Modelo basado en la adici6n de un inhibidor a tada la cromatina ya replicada; (8) madelo basado en la presencia de una proteina iniciadora, o "factores pennisivos~, que aCluarian una unica vez y que deberfan unirse al DNA s610 durante la milosis.

181 protein.. Iniciodorn unidas dlibilmente

DNA

/ I \ ~ONA

G,

I ~

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I

h61ic:es de DNA hi.., de Ie etomolino pl"olegido

prolel.no

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• 388

Capitulo 8: EI ntlcleo celuJar

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MITOSIS PERMITE QUE SE UNAN Al DNA OTRAS Pfl:OTEINAS INICtADORAS

==f*=t= ==t=t===t==

dos por un bloqueo de la re-replicaci6n. Asl pues, el mecanismo responsable del bloqueo no puede depender de un origen de replicaci6n aJlamente especffico. EI bloqueo no afecta al virus SV40, probablemente debido a que su antfgeno T suo minislra tanto las funciones de iniciador como de DNA helicasa. subsliluyendo a los componentes celulares amllogos y evadiendo de esle modo los comroles a los que estan sujetos.

Amedida que el DNA se replica, se van ensarnblando nuevas histonas en la cromatina27 En cada cicio celular son necesarias una gran camidad de hiSlonas, aproximadamenle la misma C3filidad en masa que el DNA sintelizado, para fonnar la nueva cromalina. Por esta raz6n, muchos organismos poseen varias copias de cada uno de los genes de las hislonas. Por ejemplo, en las c~HuJas de venebrado se encuentran alrededor de 20 copias de un grupo de secuencias, carla uno de los cuales contiene los cinco genes de las histonas. Adiferencia de 10 que sucede con muchas protefnns. que se sintetizan continuamcnte a 10 largo de toda In interfase, las histonas se sinteliznn mayoritnrinmente en la fase S, durante III que el nivel de los mRNA de hiSlonas se incremenla uoas 50 veces como resulmdo del efeclo combinado de un aumento de la velocidad de transcripci6n y una reducci6n de su velocidad de degradaci6n. De· bido a un mecanismo que depende de las propiedades especiales de su extremo 3' (se discule en el Capitulo 9) cuando la sfntesis de DNA lermina al [mal de la rase S (0 cuando se aiiaden inhibidores que detienen la sfnlesis de DNA prematuramcnle), los mRNA de las histonas mayores se degradan en cuesti6n de minUlos. Por el contrario, las moleculas de histona son nOlablemente eslables y pueden sobrevivir toda la vida de In celula. La estrecha relaci6n entre la Slntesis de DNA y la de histonas puede ser debida a un meeanismo de retroalimentaci6n que conlrole los niveles de histonas libres asegurando que ~te sea el adecuado para la canlidad de DNA de nueva s(ntesis. Cuando las hislonas se han ensamblado en nucleosomas, raramente. 0 nun· ca, Iiberan el DNA al que eslan unidas. Sin embargo, a medida que la horquiJIa de replicaci6n avanza, ha de alravesar de alguna forma los nucleosomas pal'ernos, los cuales parecen eslar adaptados a pennitir el paso a su traves lamo para la transcripci6n como para la replicaci6n. Seglin una de las hip6tesis propueslas, cada nucleosoma se dividirfa durante la replicaci6n del DNA en dos Ymedios nucleosomas", permitiendo el acceso de la DNA polimerasa al DNA nucleos6mi· co desenrollado (Figura 8·40). EI DNA de nueva sfntcsis ccrcano a una horquilla de replicaci6n hereda las histonas palernas, pero tambi~n necesha de una cierta canlidad de histonas de nueva sfntesis para complelar su empaquetamiento en cromalina (v~ase Figura 8·40). Exislen algunas evidencias que sugieren que un ensamblador de nudeosomas viajaria con la horquilla de replicaci6n, empaquelando el DNA recien sinlClizado, en cuanlo emerge de la maquinaria de replicaci6n. La cromatina de nueva sfnlesis requiere, sin embargo. al menos una hora para eslar complelamente madura; hasta esle momento, por ejemplo, las histonas nuevas son mas sensibles de 10 normal a enzimas que son capaces de modificarlas. Desconocemas cuales son las diferencias qufmicas entre la cromatina madura y la inmadura, pero se cree que la maduraci6n implica tanto modificaciones covalentes de las histonas como uni6n de otras protefnas a la cromatina.

Los tel6meros son secuencias cortas, repetidas, ricas en G, que se made" at extremo de los cromosomas par acci6n de la telomera.sa28 Como ya se ha descrito, la DNA polimerasa no puede replicar completamente el extrema de una molecula lineal de DNA de un modo ordinario, y clio ha conducido al desarrollo de unas secuencias de DNA especialcs lIamadas tel6meros, situadas en el extremo de los cromosornas eucariotas. Estas secuencias que son simUares Repllcacl6n del cromosoma

389

regiOn centrlll del nucleoSOlnll

=====i~'''d'';'::C::

nuevlII caden.as de DNA 185 dos mitlldet de III Ionll cantral del nuclaosoma", encuentran unidas a una de las moltk:uln hljas de DNA

horquilill dll repllcacion

El

L

NUClE9S0~SE

VUElVE A ENSAMBLAR

R~===================='pronto otro oct,mero de hilton.. "

un;r' a asIa

~ooo====ti2T========= ~7=1n~~~~}a

entre sf en organismos Ian diferentes como los protozoos, los hongos.las plantas y los mamrreros, consisten en muchas copias de secuencias cartas, en tandem, que comienen bloques de G. En humanos esla secuencia es GGGl"A. EI problema de replicar los extremos de los cromosomas esta resueho de manera ingeniosa por acci6n de la enzima telomerasa. Esla enzima reconoce la cadena rica en G de una secuencia telomerica repetida y 1a aJarga en direcci6n 5' a 3'. En ausencia de una cadena de DNA complemenlario, la telomerasa simeliza una copia de la secuencia repclida empleando un molde RNA que es un componente de la propia cnzima. La cnzima contiene, por lanto, la informaci6n necesaria para manlener las caracter{sticas de la secuencia telomerica. Despues de varios cidos de extensi6n por la lelomerasa, se puede completar la replicaci6n dcl extrema del cromosoma empleando dichas extensiones como molde para la s{nlesis de la cadena complememaria por 1a DNA polimerasa (Figura 8-41). Dado que el proceso de rceorte y recuperaci6n de las secuencias del lel6mero esta equilibrado 0010 aproximadamenle, cada extrema de cromosoma conliene un numero variable de repeliciones en tandem, que, en general, son de varios dentos de pares de bases de longilud.

Resumen £Studios In vitro ikl vinu de slmlo SV40 como sistema modelo sugieren que tonto en las cilultu eucarloUl$ como en las procarloliU la repllcacl6n ikE DNA Sf! inicia con Ia un16n al DNA th .,,10 DNA Ilelicasa, mediada par una protelna iniciadora que, d su ve:t, Sf! halla unldn tl1 orlgen de replicad6n. En el orlgen de replicaci6n Sf! fonna una bUrbUJd de repllau:16n parefecto de dos horquillas de replicncwn que Sf! dleJdn una de Ia otra. En los eucarlottu superlores, parece que durante Ia fase S los orlgent!S de replicaci6n vednos Sf! activan en grupos, denominados Ullidades de re· pllcad6n, cuyos orlgenes Sf! hallan Sf!parados unos 100 000 nucle6ruros de media. Dado qlle Ia horquilla de replicaci6n se desplaza a Imos 50 nllcle6tidos par segun· do, s6Io Sf! necesitarln una hord para la s£ntesis de DNA de llna unldtul de replica. cl6n. A traves de una ftlSe S tlplCd de 8 horas se van acrivatuIo las dijere'Jtes ,mldn·

390

Capftulo 8: EI nudeo celuJar

Figura 840 Modelo especulal1vo que muestra cOmo 51! podrfa abrlr un nudeosoma para pennllir la repUcacl6n del DNA. Despuk de que pase la horquilla de replicad6n. el nucleosoma 51! reensamblarfa. De esle modo las histonas del mlcleo pennanecerian en 1000 momento unidas a1 DNA. A pesar de que segUn eJ diagrama los v;ejos nucleosomas se heredan inlaclOS por la helice de DNA sintelizada sabre la cadena conduClora. exislen ev;dendas de que eI nucleosoma se ha heredado inlacto por cualquiera de las dos hebras hermanas de la molecula de DNA. Asimismo, isle es solamente uno de [os muchos modelos diferentes posibles.

.&

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eadeNl paterna

J'

TTGGGGlTGGGGTIGGGGTTG iMAACCCC .... 5" c:ade1lII .eQl!n s,ntel".cl., ,ncomplet.

LA TUOMERASA

se UNE

I

J'

I

I

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG aimesi. por I Meece CCCAAC . . aecl6n d. r. S' telomer... LA TELOMERASA MARGA LOS EXTREMOS 3' lelomer.sa con RNA plltr6n unido

(.Inl''';' de ONA sobre un mold. RNA)

I

AAeece

TERMINACION DE LA CADENA

RETRASADA PaR LA DNA POUMERASA (,Intes" de DNA sob•• un molds DNA)

I I

I

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TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTrG

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S'

J'

lTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG ecce CCCCAACCCCAACCCC •

DNA

S'

polimer&$ll

tks de replicaci6n &lgldendo una secue",;la detenrlinada en parte por In estmctllm

mas

de,fU cromatina, slendo las regiones oolldensada$ de In cromatina las ,UUnlit! tn iniciar ,1" replicaci6n. La correspondencia entre ,midndes de repllcaci6n y las

Figura 8·41 Repllcaclon del tel6mero. La figura resume las reacciones implicadas en la fonnaci6n de las secuencias repetidas ricas en G que fonnan los extremos de los cromosomas (leI6meros) de diversos organismos eucariotas, tal como sugieren los experimenlos realizados en el ciliado Tetrallymena. La cadena incomllieta recien sintetizada es copiada en la cadena retrasada de la horquilla de replicaci6n (vcase Figura 6-41). Como se ha indicado, la telomerasa es un complejo de prolefna y RNA que conliene un patron de RNA para la sfntesis de una secuencia telomerica rica en G. Eslas repeticiones son GGGlTG en Tetrallymella, pem son GGGITA en humanos 'i Gl_l"" en la levadura Saccharomycescercllisiae. Se cree que la cadena relrasada se completa can la acci6n de la DNA polimeras..1 Ct. que pona la actividad primasa en una de sus subunidndes (vt'!ase Figura 8-35).

bandas que contlenen millonts de ,Jares de bases observadas en los cromosomas mJt6tk:os ew:arlotclS sugieren que las ,midades de re/'llcacMn ,wdrlan correspo"der a dominios estnlct"raws diferentes de ia cromatilla l",erfllsien. Despues deqm~ ptue In horquilln de repliau:i6n, in estmctllra de ia croltlati'la Ie recupera mediante In adici6n a las antiguM histonaslleredadas por las lIIolklllas de DNA hijas. de mtevas histonns y de otras prote(IIas cromos6micas.. Se prodlU:e ,m bloqlU!O JoroJ de Ja re-repJk:tu:i6n, de naturaJez.a tksconocida. qlle illlpide que se prothu£a una nueva repliMCi6n de las regiones ya repliaulas, Ilasta que et cromosoma pase por una mitosis; este bJoqueo es necesario para asegurar qlle aula regi6n de DNA se repliqlle IIna soia lJf!Z etl aulafaseS. La repliau:i6n de los extremos de los cromosonuu se resueJve oon IIna estnlctll' m renninaJ espedalizada (el reMmeroJ y lma enzima (In retomerasaJ que extie,ule ala estructura IItltizando un moltk! RNA que es parte de In propia leJomemsn.

Sfntesis y procesamiento del RNA Hasta aqu! hemos considerado de qu~ forma se organi7..an los cromosomas en glandes complejos de DNA y proteinas, y romo se duplican estos complejos antes de que una cl!lula se divida. Sin embargo, la principal funci6n de un cromosoma es actuar como un molde para la sfntesis de moleculas de RNA, ya que s610 asf la cl!luJa puede utilizar la infomlaci6n gen~rica almacenada en los cromosomas. En Ia cl!lula sc produce una gran cantidad de sintesis de RNA: la velocidad a 1a que se incorporan los nucle6tidos al RNA durante la interfase es 20 veces mayor que la velocidad a la que se incorporan al DNA durante la fase S. La sfntesis de RNA, tambi~n denominada transcrlpc::16n del DNA, es un proceso muy selectivo. En la mayona de las cl!luJas de mamffero 5610 se copian a sccuencias de RNA funcionales (RNA mensajero maduro 0 RNA estructural) alredcdar del I % de las secuencias de llucle6tidos del DNA. La selccci6n ticnc lugar a dos niveles, que se abordanin, par ese orden en csta sccci6n: (1) se transcribe 5610 una parte de la secuencia de DNA, produciendo RNA nucleares, y (2) tan s610 una pequena porci6n de las secuencias de nucle6t.idos de los RNA nucleares sobrevive tOOas las ctapas del proceso de maduraci6n del RNA que preceden a la exportaci6n de las moleculas de RNA al citoplasma. Comenzaremos describiendo las RNA polimerasas, las enzimas que catalizan tada la transcripci6n del DNA. Sfntesls y procesamlento del RNA

391

HINI

lubunidad W de E. coli 11407 .minojcidOII • • H.I II

Iev.dur.

HtNl.

•

Drosophif.

HtNI.

•

..

•1

•• ••

Figura 8-42 Orlgen cornun de las

I

•

• •

I

COOH

•

S •••

RNA pollmerasas baclerlanas y COOH

• • • • • • • • COOH

Las RNA polimerasas intercambian subunidades cuando inician cada cadena de RNA29 Como se describi6 someramente en el Capitulo 6, la transcripci6n se InICla cuando la molecula de RNA polimerasa se une a una secuencia promotora del DNA de doble helice. A continuaci6n, en una etapa de iniciaci6n compleja no bien comprendida, las dos cadenas de DNA se separan loca[mente formando un complejo abierto. En esta elapa la cadena molde queda expuesta, y puede iniciarse la sfntesis del RNA complementario. Entonces la polimerasa empieza a dcsplazarse a 10 largo de III cadena molde, extendiendo [a cadena de RNA en crccimiento en la direcci6n 5' a 3' mediante la adici6n secuencial de ribonucle6tidos trifosfato, hasta que alcan7A1 una sel/at de para rterminnci6/1 0 SlOp) momento en el que la cadena de RNA formada y la molecula de RNA polimerasa se separan del DNA. Cada molecula de RNA representa, pues, una copia en cadena senciUa de la secuencia nucleotidica de una cadena de DNA de una regi6n relativamente pequei\a del genoma (vease Figura 6-2). Este segmento transcrito de DNA se denomina unkind de tmnscripci611. Generalmente las RNA pollmerasas estan fonnadas por multiples cadenas polipeptfdicas de pesos moleculares de 500 000 daltons 0 maS. Las enzimas de bacterias y de eucariOlas est
figura 8-43 DLagrama esquemalico de las efapa5 de la Inklad6n de la sintesls de RNA (transcripd6n del DNA) Cltlallzada por La RNA pollmerasa. Las etapas que se indican se han descrito gracias a esrudios reaiizados sobre la enzima de £ wli. Se muestm una molicula de DNA querontiene una secuencia promotom para la potimemsa de £ coli. La enzima [onna en primer lugar un romplejo cermdo en eI que las doscadenas de DNA pennanecell rompJetametlte apareadas. En la siguiente elapa,la enzima calaliza la separad6n de las des cadenas un poco mAs de una vueha de la h8icede DNA. I"onnando un complejo abierro en eI que eI molde queda expuesto para eI inicio de la cadena de RNA. Sin embargo Ia polimerasa que Ueva unida Ia subunidad G se romporta como si esluviera fijada aI promolor. parece incapazde avanzarcon 13 elongaci6n de la cadena de RNA y [recucntemente reviene aI complejo cerrddo liberando una cona cadena de RNA. Tal como se indica, la conversi6n a una polimerasa aetiva que aiarga la cadena de RNA requiere la Iiberad6n de los raetores de iniciaci6n (la SubWlidad G en el caso de la enzima de £ roll) y gcneralrncllIe supone la uni6n de otras protefnas que actt1an como [actores de elongaci6n.

392

Capftulo 8: EI nucleo celular

eucarlolas. La sirnilitud de las secuencias de aminoocidos entre la subunidad po de la RNA polimerasa de E. coli Yla subunidad mayor de la RNA polimerasa II eucariota sugiere un origen e\'olutivo cornun para las enzimas de baclerias y de celulas eucariolas. Se cree que la subunidad P' se une al DNA. las secuencias de las regiones destacadas como barrll5 verde! tienen una homologia superior al70% entre levadura y Drosopllila, y m:b del 40% entre Drosoplli/a y £ coli. Una secuencla llnica de fund6n desconocida (de siete aminod.c1dos) se rcpitc 26 vcces en el extremo carboxilo de la subunidad de levadura y m<'is de 40 veces en la subunidad de Drosophila (10 cual se indica aquf mediante e(rcl/los tJl?rdes). Ellias repcticiones se fosforilan como parle del proceso que inkia la slntesis de una cadena de RNA en eucariolas (vease Figura 9-30). (De A.L Greenlear el al., en RNA Polymerases and the Regulation orTranscription [W.S. Reznikoffel aI., eds.l, pp. 459-464, New Yorl, Elsevier, 1987.) lubunidad (J

\.~ . . . . . . . . . . . . . . . .-

lorm. iniei.t de II RNA poIim.r...

\ , ,

...-.... 1

.

UNION DE lOS FACTORES DE ElONGACION •

complejo cerrado

complejo Ibi.rto

+U':U~~~LA (J

•

lonna d.- I. RNA polimerna en • I.se de .longKi6n ':oon~-"-,

•

""r:c:en. s'

de FlNA naclenta

SINTESIS MASI\lA DE RNA

ci6n --que son imporlantes para el credmiento y la terminaci6n de la cadena. Los faclores de elongaci6n incluyen algunas protefnas que, aunque bien caracterizadas, tienen fllnciones min no comprendidas completamente. EI inicio de la transcripci6n es un punto de control imponante mediante el cualla c~lllla puede regular la expresi6n de un gen; por esta rawn se discutira en detalle en el Capilulo 9.

En las ctHulas eucariotas. el RNA se sintetiza por tres RNA polimerasas diferentes30 8 mecanismo de la transcripci6n del DNA es simiJar en ClHulas eucariotas y en celulas procariotas como E. coli, pero la maquinaria es considerablemente mas compleja en los eucariotas. En eucariOlas tan diversos como levadura y el hombre, por ejemplo, hay tres tipos de RNA polimerasas, cada uno de los cuales es responsable de la transcripci6n de diferentes grupos de genes. Estas enzimas -denaminadas RNA polimerasas I, JI Y 111- son estructuralmente similares entre sf y tienen algunas subunidades en camlin aunque otras subunidades son caracterfslicas de cada una de elias. Cada una de estas enzimas es mas compleja que la RNA polimerasa de £. coli y se cree que estiin fonnadas por 10 a mas cadenas po_ Iipeptfdicas. alra diferencia importante entre la enzima bacleriana y la eucariola es que, mienlras la enzima bacteriana purificada puede unirse directamente a1 promotor. las polimerasas eucariolas requieren la presencia de proteinas de iniciaci6n adicionales que se unan a1 DNA antes de que la enzima pueda hacerlo. Es por ello que hasta 1979 no fueron accesibles sistemas con todos los componentes necesarios para hacer posible el estudio in vitro de los mecanismos de iniciaci6n en c~lulas eucariotas. Dado que las proteinas de iniciaci6n y sus imeracciones con las polimerasas estan fntimanlente relacionadas con el control del inicio de la transcripci6n, sc discutiran en detalle en el Capfrulo 9. Inicialmeme, las tres RNA polimerasas eucarimas se diferenciaron entre sf por sus diferencias qufmicas durante la purificaci6n asf como por su sensibilidad a a-amallililla, una toxina aislada a partir del hongo venenoso Amanita phafloides. La RNA polimerasa I no se ve afectada por la (X-amanilina, la RNA polimerasa lies muy sensible ala (oxilla y la RNA pollmerasa III es moderadamente sensible. La scnsibilidad de la sfntesis de RNA ala (X-amanitina es todavfa un metodo habitual para delerminar que polimerasa es la responsable de la transcripci6n de un determinado gen. Estos estudios indican que lOdos los genes cuyos mRNA scran traducidos posleriormente a prolefna, son transcritos por la RNA pollmcrasa II. las otms dos polimerasas transcriben exclusivamente RNA que tiene funciones cataHticas 0 estructuralcs principal mente como parte de la maquinaria de sfntesis de protefnas: la pollmcrasa I produce los RNA ribos6micos de gran tamaf'io y la pollmerasa III produce una ciena variedad de RNA de pequef'io tamano y muy cstables -incluyendo el pequeno RNA ribos6mico 55 y los RNA de transferencia. Sin embargo, la mayor parte de los RNA pequefios que forman las snRNP, que seran descritas mcis adelante cuando se considere el procesamiento de RNA. son lranscritos por la RNA polimerasa II. Las cclulas de mamffcro contienen tipicamente alrededor de 20 000 a 40000 moleculas de cada una de las RNA polimerasas, y los resultados de estudios realizados con celulas en cultivo muestran que las concentraciones de dichas enzimas estan reguladas individual mente de acuerdo con la velocidad de crecimiento celular.

La RNA polimerasa II transcribe algunas secuencias de DNA mucho mas frecuenlemente que otras3l Dado que la RNA polimerasa II es la que sintetiza lodos los precursores de mRNA y por ella detennina qu~ protemas sintetizara una c~lula, la mayor pane de la descripci6n que sigue se centrara en sus actividades y en las caracterfsticas de sus productos. Aunque los experimentos realizados con polimerasas purificaSfntesis y procesamiento del RNA

10~m

Figura 8-44 Un ndeleo celular tfplco v1suallz.ado mediante microscopla electr6nlca uliUzando el procedlmienlo descrlto en la Figura &.45. Se puede observar c6mo sale del nudeo lisado una gran cantidad de cromalina. 5610 la cromalina mM extema de esta marafla estara suficientemenle descondensada como para que sea posible observaria con detalle a mayor aumento. (Por cones!a de Victoria Foe.)

393

das y ractores de transcripci6n j" vitro son esenciales para establecer el mecanismo de la transcripci6n, tambien se pueden aprender muchos aspectos del patr6n de transcripci6n de una celuJa, observando al microscopio electr6nico genes en acci6n, con su RNA poLimerasa ~cazada" en el acto de transcripci6n. Electronmicrograrfas de secciones ultrafinas de nucleos interfasicos mues· tran acumulos granulares de cromatina (vease Figura 8·71), pero revelan muy poco acerca de c6mo son transcritos los genes. Se obtienen imagenes mucho mas informativas si se rompe el nucleo y se extiende la cromatina sobre una rejilIa ponamuestras del microscopio electr6nico (Figuras 8-44 y 8-45). En el punto mas alejado del nucleo lisado la cromatina esta 10 suficicntemente descondensada como para poder observar las estructuras de fibras de cromatina en cuen· tas ensartadas que se mostr6 previameme en la Figura 8·98. Las molt~culas de RNA polimerasa implicadas en la transcripci6n aparecen como partfculas globulares unidas a una molecula de RNA. Habitualmente las partIculas que represeman moleculas de RNA polimerasa II activas se observan como unidades individuales, sin moleculas vecinas. Esto indica que la mayorfa de los genes se transcrihen con poca frecuencia a precursores de mRNA, de modo que la RNA polimerasa finaliza completamente la mmscripci6n antes de que otra molecula la inicie de nuevo. Sin embargo, en ocasiones se ha observado que muchas moleculas de RNA polimerasa (y sus transcritos de RNA asociados) se hallan juntas, rormando un grupo. Estos grupos apareeen sobre los relativameme pocos genes que se transcriben con gran frecuencia (Figura 8·46). La longitud de las moll!culas de RNA que se unen a estos grupos se incrementa en el sentido de la transcripci6n, produciendo un patron caracterfstico. Este patron define el lugar de inicio y de paro de la RNA polimerasa II para una tmidad transcripcional especffica (Figura 8-47). Estudios bioqufmicos han confirmado y arnpLiado los resultados obtenidos con la microscopia eleetr6nica, Uegandose a tres conclusiones principales :

gol. que cOllliene cjlulll I b.j. con<:entrloCi6n de SliM

I

,

.. det.rgente .. polieni6n

I

r6pid.menle .. recubren COil ulle aoluci6n concentrade de llaIfflSl reciplenle de pl611ico

~~I~:::I-Ii"dO

lJ::::~;t'0IUCi61l

de SIC. rosa rejili.

10' nllei.o. Ie 111111 lellilmenle y I. cromllill' Ie d6lconden••

I

cenlrifugaci6n

I

~ ~~:$-::s:.....

':?:--;,.";.::..";-&."'t

"-

"""-

I

las de los procariotas, inician y terminan la transcripci6n en lugares espeer· ficos del cromosoma.

G

2. La longitud media de la molkula de RNA ya lerminada, producida por la RNA polimerasa II en una unidad de transcripci6n, es de aproximadameme

3. Aunque la uelocidad de crecimielllO de la cadena observada para todos los RNA es de alrededor de 30 nucle6tidos por segundo, diferentes sitios de

raSlO. celul.rfll

l .oll>flm:f-ir-'.....

I. las moleculas de RNA polimerasa de celulas eucariotas, como ocurre con

7000 nuc1e6tidos, aunque son bastante rrecuenles las moleculas de RNA de longitudes que oscilan entre 10 000 Y20 000 nude6tidos. Eslas longitudes, superiores a los 1200 ll11cledlidos de RNA necesarios para codificar una prot'cfna media de 400 amino<1cidos, ponen de manificSIO que la estructura de los genes eucariotas es peculiar, particularmente debido a la presencia de largos intrones, que, como se verl1 mas adelanle. son eliminados posteriormente del RNA.

celul.r

•

rejiJI. con los

nlicleollilldot

I

COnlr•• lldo y .-nT"lno sombreldo can meille. pelldol

1

obllrv.ci6n de II cromlllnl II mlcroscoplo .lectr6nico

Figura 8·45 Metodo para exllllUnar la cromatlna de un mideo celular mediante m1croscopla electronlca. Los mldeos son primero lisados. se eliminan los reslOS celulares y la cromalina se extiende sobre una rejilla. F1gw"a .... EI«tronmkrognffa" una regi6n de cromatina portadora de un sen que est' sJendo transcrito a una [rec:uenda extraordlnariamente

elevada. Se pueden observar muchas molkulas de RNA polimerasa II con sus transc:rilOS en crecimienlo.la direcci6n de la Iranscripci6n es de izquierda a dereclta {vease Figura 8-471. (Dc V.E. Foe, L E. Wilkinson yC.O. Laird, Q!{f 9: 131-146, 1976.01976 Cell Press.)

394

Capftulo 8: El mldeo celular

tr.nserito

Tabla 8-2 Poblacl6n de moleculas de mRNA de una ellula de mamlTero Hplca Copiaspor cB.uJa de eada secuencia demRNA Clase abundante 12000 Clase intermedia 300 Clase poco frecucnte 15

N6merode secuenclu de mRNA dHerenles de cada c1ase x x x

4 500 11000

N6mero total de mol6=ulas demRNA de cada clase

= = =

d,RNA

unldo

dirllCCi6n de despl.zamienlo de" polin..-rn. y de C:r«:imi,nto de III c:adeNi de RNA

•

48000 150000 165000

It

La clasificacionlle los mRNA en s610 tres clases discretas es bastante arbitraria; en muchlls ce-

lulas se observa una distribuci6n mas continua en cuanto a abundancla se refiere. Sin embargo, en una celula se pueden observar un tOlal de 10000 a 20 000 especles diferentes de milNA, estando la mayor parte de elias presentes a concentraciones muy baJas (de 5 a 15 mollX:ulas par celula). La mayor parte del RNA citoplasmallco es rRNA, y sOlo del 3 al 5% es mRNA. una relaci6n consistenle can la presencia de alrededor de 10 ribosomas par molecula de mRNA. Este tipo particular de teula de mamifero conriene en 5U citoplasma alrededor de 360 000 molkulas de mRNA.

inicio para RNA potimerasa II tienen diferentes !reclle"cias de i"iciaci611, de forma que ciertos genes se transcriben con frecuencias mils elevadas que otros. Como se indica en la Tabla 8-2, la mayorfa de los genes que se transcriben s610 forman unas cuantas moleculas de mRNA.

S'

J

lfI~al de Iniclo

DNA de doble Mlic,

Figun 8-47 Unidad de lTanscr:lpd6n Ideal.lzada. EI esquema muestra romo la imagen obtenida con el microscopio electr6nico (vease Figura 8-46) demuestra tanto la direcci6n de 1a transcripcion como loslugares de inicio y final de la unidad.

Los precursores de los RNA mensajeros son modificados covalentemente en sus dos extremos32 En las celuJas eucariotas el mRNA se produce en varias etapas. Las molecuJas de RNA recien sintetizadas en el nllclco por la RNA polimerasa II se denominan transcritos primarios: a todos eslos transcritos se les dio el nombre de RNA heterogeneo nuclear (hnRNA) por la gran variabilidad que existfa en el lamano del RNA, en contraste can el menor tamano y mas uniforme de las secuencias de RNA que codifican protefnas. En seguida veremos que la mayor parte de esta variabilidad se debe a la presencia de largas secuencias intr6nicas en los lranscrilOS primarios. Estos lranscrilos son modificados en sus extremos S' y 3' a medida que se simetizan, de una forma caraclerfstica que los diferencia c1aramente de los producidos por las Olras RNA polimerasas. Estas modilicaciones se utilizarils posteriormeme en el ciloplasma como seliales de que dichos transcritos han de ser traducidos a proteinas. En primer lugar, al extremo S' de la molecula de UNA (el primer extrema sintelizado duranle la transcripci6n) se Ie aiiade una capenua (cap) mediante la adici6n de un nucle6tido G metilado. Esta modificaci6n (capping) ocurre casi inmediatamente, despues de que se hayan sintetizado tan 5610 unos 30 nuclc6tidos, y supone la condensaci6n del grupo trifosfato de una molecula de GTP can un difosfato del extrema 5' del transcrito inicial (Figura 8-48). Posleriormente, esta caperuza 5' jugara un papel importante en la iniciaci6n de la sfnlesis de

,,"rllmo 5' del transerito mRNA S' pppNpNp

3' ••

ppNpNp

••

GpppNpNp

Figura 8-48 Reacclones de rormacl6n de la caperuza en el extremo 5' de los transcr:ltos de la RNA pollmerasa II. EI exiremo en caperuza final contiene un nuevo enlace S'-S' entre ci residuo 7-metil G cargado posilivamcnte y el extremo 5' del transcr!to RNA (vease Figura 6-26). Se cree que al menos algunas de las enzimas necesarias para este proceso estan unidas a la HNA polimerasa ll, ya que a los transcritos de las RNA I)olimerasas J y III no se les anaden caperuzas, y a que esta reacci6n ticne lugar muy poco desp'-!es de iniciarse la transcripci6n de la cadena de RNA. La letra N se utiliza para representar cualquiera de los cuauo ribonucle6lidos. aunque el nucle6tido que suele iniciar una cadena de RNA lucie ser una purina (A 0 G). (De A.J. Shatldn, Bioessays 7: 275·2n, 1987.0 tCSU Press.)

S[ntesi5 y procesamienlo del RNA

I e I

_

aflaclil un grupo de metilo.'. b...

e

CHJ -GpppNpNp

••

al'iadir un grupo de metilo. I. ribo..

CHJ-GpppNpNp

••

I CH,

395

fllCtor de

elongaci6n RNA polimefasa II

I

luger de inicio del RNA

.,

lugar de union de / ... eol.. poll-A

DNA

• tnlnscrito de

=:::!~.~~~R~N~,"=K=.="='="===F:Ofl=MAC=="'=N=DE==LA=CAPE==R=U=ZA==== oGPf>~

• ELONGAclON DE LA CADENA

~

5' cap

o

~CRECI.M'ENTO DE LACA-DENA

•

Gppp

-----~ CONTINUA, PERO EL TRANSCRITO COR~CARECE DE CAPERUZA EN EL

_..r-__

EXTREMO 5' Y ES DEGRAOADO RAplDAMENTE

8 Gppp

~---___

.3'

• -IJ

ADlelON DE

COLAS POll·A

~

- ...... -~

l

/1 /

TERMINACION

8

~s' e.p

-------~,~......-::~~-=-~~:~" polt A

prolefnas; ademas, parece que esla caperuza proteje al transcrito de RNA en ere· cimiento de su degradaci6n.

En muchas transcrilos de RNA polimerasa II, el extrema 3' se define no por el final de la rranscripci6n sino por una segunda modificaci6n, segiin 1a cual el transcrito en crecimiento cs cortado en un lugar especffico y al extrema 3' cortado se Ie af'iade una cadena de poll-A mediante 1a acci6n de una polimerasa diferente. La sei'lal para el corte consiste en la aparici6n en la cadena de RNA de la secuencia AAUAAA localizada entre 10 y 30 nucle6tidos par dclante dellugar de corte, ademas de unas secuencias poco caracterizadas par detr;1s dcllugar de corte. Inmediatamente despues del corte, una enzima poUmerasa de poli-A anade de 100 a 200 residuos de acido adenRico (en forma de poli-A) al extremo 3' de la cadena de RNA completando el transcrlto prlmarlo de RNA. Sin embargo, la polimerasa continua transcribiendo de forma infructuosa durante cientos 0 miles de nuc1e6tidos, haSla que se produce el final de la transcripci6n en alguno de los lugares de terminaci6n posteriores; probablemente, la molecula extra de RNA generada de esta forma carecera de la caperuza en 5' y sera degradada rapidamente (Figura 8-49). La cola poH-A parece tener varias funciones. (I) Como se describira despues, colabora en la exportaci6n del mRNA maduro desde el nucleo; (2) se cree que influye en la estabUidad de al menus algunos mRNA en el citoplasma; (3) pareee servir como una senal de reconocimiento para el ribosoma que se requiere para una traducci6n eficiente del mRNA Esta ultima funci6n -en combinaci6n con la caperuza 5'- podrfa permitir a un ribosoma determinar si el mRNA esta intacto antes de consumir energfa y precursores al iniciar su Iraducci6n. Aunque los transcrilos de la RNA polimerasa II suponen mds de la mitad del RNA que sitlletiza una celula, como se vera mas adelante estos transcritos son

396

Capftulo 8: El nucleo celular

FlguraB-49 SCnteslsdeun lranscrllo prfmarlo de RNA (un precursor de mRNA) por la RNA poUmerasa II. Esle diagrama se inicia can una polimerasa que acaba de empezar la smtesis de una cadena de RNA (elapa 4 de la Figura 8-43). EJ reconocimiento de una senal de poliadenilaci6n provoca el corte de 13 cadena en crecimiento y 13 poliadenilaci6n. En las levaduras, la pollmerasa lermina la sEmesis poco despu&, perc en las cilulas eucariotas superiores frecuenlemente continua la Iranscripcl6n durante miles de l1ucl~lidos mas. Parece que cuando la RNA polimerasa ha poliadenilado el transcrito, cambia sus propiedades; ya no cs capaz de seguir cortando y poliadcnilando las secuencias postcriores, y tlene una mayor probabilidad de responder a las sef'iales de terminaci6n de la cadena y de Iiberarse. La hip6tesis mas simple, que se presenla en la figura, es que despu~ del corte del transcrilo se Iibere un factor de elongaci6n (0 mas de uno) de la polimerasa.

Tabla 8-3 Datos selecclonados sobre eanlldades de RNA en una e~lula de mam(rero l(plca

Precursores del rRNA nuclear

Cantldad conslante (porcentaje del RNA celular total)

Porcentaje de la s(ntesls de RNA total

4

39

J., rRNA citoplasm:1tico hnRNA nuclear

71

7

58

J., mRNA citoplasmatico RNA pequenos estables (la mayor pane tRNA)

3

15

3

Los datos iocluidos en la labia proceden del an4l.isis de una \fnea celular de fibroblastos de Ta' tOO (d1ulas L) en cwtNo. Cada celula contiene Z6 pg de RNA (5 x 10" nude6tklos de RNA), de los cua!el alrededor del 14"" estan loca1izados en el nucleo celular. (As( pues, el nueleo conliene unas dos veces mu DNA que RNA.) Durante la imerfase. cada minUio polimerizan a RNA una media de 200 x 10' nucledtidos., 10 cual corresponde aproximadamente a 20 \leres la \leloci· dad de IOfntesilO de DNA durante la fase S. Hay que destacar que aunque la mayor pane del RNA sinletizado sea hoRN.... la mayor pane se degrada en el nueleo. Como resultado de ello. eI mRNA produeldo. panir del hnRNA es 5610 una fracci6n minontaria del RNA total de la celula. (ModiflClldode B.P. Brandhorsl y E.H. McConkey,). MoL BioL 85: 451-563.1974.)

inestables, y por 10 tanto de vida corta. Asf pues, el hnRNA del micleo celular y el mRNA citoplasmatico, derivado de ~I, 5610 constituyen una pequena parte del total de RNA de una celula ffabla 8-3). A pesar de que su concenlraci6n es relativamente baja, estas moh~culas de RNA se pueden purificar de forma eficiente gracias a la presencia de sus largas colas de poH-A. Cuando se hace pasar una mezda de RNA celular total a traves de una columna cromatogn1fica lIena de poli dT unido a un soporte s6lido, el apareamiento complementario de las bases entre T y A haec que las molcculas que presentan colas poH-A queden retenidas en la columna; posteriormente, estas molecuJas unidas pueden Iiberarse para su analisis. Este procedimiento se lltiliza ampliamente para separar las 1110leculas de hnRNA y de mRNA de las de RNA ribos6mico y de RNA de transfercncia, predominantcs en la celula. OnieamclHc tiencn caperuzas 5' y colas poH-A los transcritos de la RNA poli. merasa II. Esto parecc deberse a que tanto la reacci6n de formaci6n de la caperuza como la de adici6n de poli A son llevadas a cabo por enzimas que se unen selectivamente a la RNA polimerasa II. As( pues, si un gen que normalmente se transcribe por la polimerasa II, se separa de su promotor mediante metodos de DNA reeombinanle y se une a un promotor reconocido por la RNA polimerasa [ o por la polimerasa III, los transcritos de RNA producidos por dichas polimerasas no seran modificados por adici6n de caperuzas 0 poliadenilados. Los requerimien lOS para la formaci6n de la caperuza y para la poliadenilaci6n de los precursores de los mRNA podrfa explicar par que en los eucariotas eSlos RNA son sintetizados por un tipo espedfico de RNA poljmerasa.

EI procesamiento del RNA elimina largas secuencias nucleotfdicas del interior de las moleculas de RNA33 EI descubrimiento cn 19n de los genes imerrumpidos fue completamentc inesperado. Estudios previos realizados en bacterias mostraron que sus genes estaban formados por una cadena continua de nucle6tidos, necesarios para codificar 13 secuencia de amino:kidos de una protefna, y no parecfa exislir ninguna Srnlesis y procesarnienlo del RNA

397

raz6n obvia para que un gen tuviera que estar organizado de Olra manera. Los primeros indicios de que los genes de c~lulas eucariotas no eran continuos como los genes bacterianos se produjeron cuando los nuevos m~lOdos que perrnitieron comparar con precisi6n las secuencias de DNA y de mRNA se aplicaron a los mRNA producidos por un adCtlov;m.s humano (un virus DNA de gran tamano). La regi6n del DNA vfrico responsable de la codificaci6n de estos RNA contenfa secuencias que no se encontraban en los RNA maduros. R~pidamenle se descart6 la posibilidad de que b.;ta fuera una caracteristica propia de los virus, ya que se encontraron resultado similares en el gen de la tl-g1obina y en el de la ovoalbu.mina de venebrados. Como se ha citado previamente. las secuencias presentes en el DNA y omitidas en el RNA se conocen como ;mrotles, mientras que las presentes en ambas moleculas se denominan exOIJe5 (veanse Figuras 8-SO y 8-51). Antes del descubrimiento de los intrones era un misterio el significado del hnRNA y su relaci6n con el mRNA. Se conoda desde hada tiempo que la mayor parte del RNA sintetizado por la RNA polimerasa II era degradado con rapidez en el nucleo. Las mol~culas de hnRNA de celulas en cuhivo pueden ser marcadas radiactivamente por exposici6n breve a uridina- 3 J.! y scguidas durante un largo perfodo de liempo. Este tipo de experimento mostr6 que eltamailO medio de las moltkulas de hnRNA en la poblaci6n marcada decrece con rapidez, desde una media de 7000 nucle6tidos, hasta alcanzar el tamaf\o de las mol~culas de mRNA citoplasmaticas (una media de 1500 nucle6tidos) despu~s de s610 30 mi· nutos; aproximadamente 31 mismo tiempo, moleculas de RNA marcadas radiactivamente empezaban a abandonar el nucleo como moleculas de mRNA. Sin embargo, tan 5610 el 5% de la masa del hnRNA marcado alcanzaba alguna vez el citoplasma; el resto se degradaba en pequenos fragmemos en el !lucleo a 10 largo de un perfodo de una hora. Parecfa un extrailo derToche. EI misterio se hiw aun mayor cuando se supo que a pesar de que las molecuJas de hnRNA se hadan cada vez mas cortas, mantenfan SU caperuza 5' y su cola poli-A en 3'. El descubrimiento de los intrones aport6 la explicaci6n de este misterio: el transcrito primario de RNA es una copia complera del gen, que contiene tanto las secuencias de los exones como de los intrones, y estas uhimas se eliminan del interior del transcrito de RNA produciendo una molecula de mRNA que co· difica directamente una protefna (v~ase Figura 3·15). Las secuencias codificantes de RNA de cada extrema de la secuencia de un ex6n se unen con las del ex6n adyacente eliminado las secuencias de intr6n comprendidas entre elias, siguiendo una reacci6n denominada maduracl6n del RNA par corte y empalrne (RNA splicing). La maduraci6n del RNA ticne lugar en el m1c1eo, fuera del alcance de los ribosomas; el RNA se exporta al citoplasma unicarnentc cuando cl procesarnicnto ya ha lerminado. Debido a que muchos genes de mamffero conlienen mucha mas cantidad de secuencia de intrones que de exones (vease Tabla 8-1, pag. 365). la maduraci6n del RNA puede explicar la conversi6n de moleculas de hnRNA muy largas en moleculas de mRNA citoplasmatico mucho menores. Antes de discutir la distribuci6n de los intrones en los genes eucariotas y algunas de sus consecuencias para la funci6n celuJar, es necesario explicar de qu~ fonna la maquinaria enzimlitica de la maduraci6n del RNA reconoce y elimina las secuencias de los intrones.

Los transcritos hnRNA son inmediatamente recubiertos por prote(nas y snRNJ»4 A diferencia de 10 que OCUrTe en las bacterias, en los eucariotas parece que el RNA reci~n sintefizado se condensa inmediatamente formando una serle de partIculas ribonucleoproteicas muy pr6ximas. Cada una de elias est~ fonnada por unos 500 nucle6tidos de RNA recubiertos de un abundante complejo de protefnas que actua empaquctando y condensando todos los transcritos de RNA en crecimiento, de una forma que recuerda a los complejos de DNA y proleinas de los nucleosomas. Estas partfculas hnRNP (de Heterogeneous Nuclear Ribonu· 398

CapftuJo 6: EI nucleo eelular

bucl. del il'll'On

cola poli·"

Flgura8-SO Prlmera evidencla de la exIstencia de lnlrones en los genes eucarlolas. La evidencia fue aportada por la teenica de los "budes R" II1cdianie la cual al microscopio electr6nico se visualizan complejos de mRNA y DNA apareados. Se purinca un mRNA extraordinariamente abundante, como el de la li-globina 0 el de la ovoalbt.imina, a partir de las cl!!lulas especializadas que 10 producen. Cuando esla preparaci6n de mRNA de cadena sencilla se hibrida, en una soluci6n apropiada. con un fragmenlo de DNA donado de doble cadena que cOnliene el gen que codifica el lORNA, el RNA puede desplazar una de las cadenas del DNA e hibridarse en las regiones en las que exisla una complementariedad de secuencia, fomando regiones de helice DNA-RNA. las regiones de DNA que no se hibridan con las secuencias de RNA se visualizan daramenle como budes de DNA de doble cadena. Cada uno de estos budes (numerados dell III 6) corresponden a un intr6n de la sccucncia del gen.

Figura 8-51 Regl6n transcrlta del gen de la p-g1oblna humana. Se indica la secuencia de la cadena de DNA que corresponde a la secuencia de mRNA, can la secuencia correspondiente al transcrilo primario limitada Jlor una l(nea de color verdey los nucle61idos de las tres regiones codificantes (exones) sombreados en amarii/o. Es de destacar que el ex6n I comprende una secuencia lfder 5', yque el ex6n 3 comprende una secuencia 3' no traducida; aunque estas secuencias se hallan en el mRNA no codifican aminoacidos. Se han recuadrado los nucle6tidos GTy AG, muy conservados, en el inicio y final de los introncs (vease Figura 8·53); tambicn se sefiala con un recuadro ellugar de corte del transcrito primario y la sefial de poliadenilaci6n cerca del extrema 3' del gen (AATAM, vease Figura 8·49).

cleoprotein Particles, particulas riborlucleoproteicas nucleares heterogelleas) resultantes pueden ser purificadas despues de tratar ligeramente los nucleos con ribonucleasas a concentraciones suficientes para degradar s610 el RNA espaciadar que existe entre ellas. Cada partfcula tlene un diametro de unos 20 mn, que es el doble del de un nucleosoma, y el nudeo proteico, mucho mas complejo y menos caracterizado, esta formado al menos por ocho prolefnas distintas. A excepci6n de las histonas, las protefnas que forman este nucleo son las mas ahundantes del nucleo de la celula. A1gunas de elias contienen un dominio de W10S 80 aminoacidos, repetido frecuentemente, y com un a muchas otras protefnas de uni6n a RNA. Las partfculas hnRNP suelen distorsionarse por las lecnicas dasicas de preparaci6n de extensiones de cromatina para la observaci6n al microscopio electr6nico de genes en fase de transcripci6n (vease Figura 8-45). Sin embargo estas micrograffas revelan la existencia sobre muchos transcritos de RNA de unas partfculas especialmente estables y menos frecuentes, cuya posici6n sugiere que juegan un papel en la maduraci6n del RNA. ESlas panfculas se generan muy rapidamente sobre secuencias especfficas de RNA -en las uniones intr6n-ex6n 0 cerca de ellas- y, cuando el transcrilO crece, estas particulas se unen en parejas dando lugar a un complejo mayor que se cree es el espliceosoma (de "splicing", maduraci6n), que cataliza la maduraci6n del RNA (Figura 8·52). AnaIisis bioqufmicos han revelado que en el nucleo se encuentran muchos complejos de protefnas con pequefias moleculas de RNA (generalmeme RNA de 250 nucle6tidos 0 menos). A estos complejos se les denomina arbitrariamente RNA VI, U2, ... , V12. Estos complejos conocidos como ribonucleoprote(nas nucleares pequeiias (snRNP, de Small Nuclear RihoNucleoProleins y pronunciado "snurps") recuerdan a los ribosomas, pues cada uno de ellos contiene un conjunto de prote(nas que esta acomplejado con una molecula de RNA estahle. Sin embargo son mucho menores que los ribosomas -250 000 dalrons frente a los 4,5 millones de dallons de un ribosoma- y tienen una relaci6n proteina/RNA algo superior. A1gunas protefnas se encuentran en difercntes partfculas mientras que Olras son especfficas de un solo tipo de elias. Este hecho se pudo demostrar por primera vez en el suero de enfermos de lupus erilomatoso sisremico, enfermedad en la que se fabrican anticuerpos dirigidos contra una 0 mas protefnas de sus snRNP: por ejempl0, se localiz6 un anticuerpo que reconocfa las partfcu.las snRNP VI, U2, VS Y V4/U6, Yahora sabemos que todas estas partfculas tienen una protefna en comun. Parece que las snRNP individuales reconocen secuencias especfficas del aci· do nucleico mediante la complementariedad de bases RNA-RNA. A1gunas estan irnplicadas en la maduraci6n del RNA; se sabe que una de elias esta implicada en la reacci6n de corte que genera el extremo 3' de los RNA de histonas rech~n sintetizados, mientras que las funciones de las otras es desconocida. La evidencia de que las snRNP participan en la maduraci6n del RNA procede de experimentos de procesamiento de RNA in vitro, as( como de analisis de levaduras rnutantes en a1guno de los componentes de la snRNP. Sfntesis y procesamiento del RNA

CCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCA

ATC'I'ACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAG CCAGGGCTGGGCATAAAAG'I'CAGGGCAGAG CCATCTATTGCTT

5' ]

~

.Ji

~

TTr1'C>TlGcAA

TGATGTATTTAAATTATTTCTGAATATTTT ACTAAAAAGGGAA TGTGGGAGGTCAGTGCA TTTAAAACATAAAGAAATGATGAGCTGTTC AMCCTTGGGAAAATACACTATATCTIAAA

3'

CTCCATGAAAGAAGGTGAGGCTGCAACCAG

CTAATGCACATTGGCAACAGCCCCTGATGC CTATGCCTTATTCATCCCTCAGAAAAGGAT TCTTGTAGAGGCTTGATTTGCAGGTTAAAG

TTT'TGCTATGCTGTATTTTACAITACTTAT TGTTTTAGCTGTCCTCATGAl\TGTClllrc

399

Figura 8-52 Espllceosomas. Eloclronmicrografias de cromatlna descondcnsada mOSlrando grandcs oomplcjos ribonucleoproteicos ensamblados en los lugares de corte 5' y 3· fonnando el espficeosomn. Apanir de un gen codificante de una protelna del corion de Drosophila, se estan produciendo transcrilos RNA, de modo que se han delcnninado las posiciones de los lugares de corte sobre ellranscrilo primario de RNA. Como se observa en el esquema (8) la mayor pane de los Iranscritos de RNA tienen una 0 dos grandcs paniculas RNP ccrca de sus eXlremos 5', En la parte inferior se mucstra un esquema del gen. Cuando en un transcrito se presentan dos part(culas lcfrclilos abler/OS de (Bl], tienen un lamano medio de 25 nm y se presentan en las proxlmidades de los lugares de corte 5' y 3' de la pequena secuem:ia intronica (228 nucle6tidos), cerea del extremo 5' de los Iranscrilos. Frecuentemenle, los transcritos mas madums. y mas largos de los dos genes presentan una parllcula de mayor lamano [cfrcllfos wrtlnen (B}I en la region del intr6n. que probablemente es el resullado de la asociacKin estable de las dos partfculas menores y que represenla eI espliceosoma ensamblado. Dado que en algunas ocasiones (incluyendo el ejemplo mostrado en esta figural el proceso de cOrle y eliminacion de los intrones tiene lugar mientras el extremo 3' de 101 moJecula eSla siendo tr
Las secuencias intr6nicas se eliminan de las mol~culas de RNA en forma de lazo35 Los intrones tienen un lamano que oscila desde 80 hasla ml1s de 10000 nucle6lidos. A diferencia de los exones, su secuencia de nucle6tidos exacta no parece ser importante. Asf pues los intrones han acumulado una gran cantidad de mutacianes durante la evaluci6n; en Illuchas casas es posible alterar la mayor parte de la secuencia de un intr6n sin que la funcianalidad del gen se yea afectada. Todo ella ha lIevado a la idea de que las secuencias inlr6nicas no lienen ninguna funci6n sino que son "chatarra~ gentH.ica, hip6tesis que se discutir.1 con detalle al final del capitulo. las linicas secuencias de los intrones que estan muy conservadas son las que son necesarias para su eliminaci6n. Asf pues, en cada uno de los extremos de un inu6n exislen secuencias consenso que son casi identicas en todos los intrones conocidos, y que no se pueden a1lerar sin afectar gravemenle el proceso de maduraci6n normal del transcrito de RNA. En la Figura 8-53 se muestran estas secuencias de fronlera dellugar de corte 5' (Iugar dador) y del lugar de corte 3' (lugar aceptor) de los intrones de eucariotas superiores. las reacciones de corte y posterior empalme se han de realizar can una gran precisi6n, ya que un error en un solo nucle6lido haria variar la paula de lectura de la secuencia del mRNA resultanle, produciendo un mensaje sin sentido. La via por la que se eliminan las secuencias intronicas de los lranscrilOS primarios de RNA se ha deducido median Ie estudios in vitro en los cllalcs se prepara, mediante la transcripci6n con RNA polimerasa purificada de un fragmenlo de DNA adecuado, una especic unica de RNA que contienc lin lJnico intr6n (vease Figura 7-36). Cuando se anaclen esl'aS moleculas de RNA a un cxtraeto eelular. empieza la maduraci6n a traves de una reaeci6n enzim<1tica en dos etapas, las cuales requieren una incubaci6n prolongada con ATP, la presencia de determinadas prolefnas en el eXlraelO, las partfculas snRNP U I, U2, US, Y U4/U6, Yuna serie de protefnas adicionales; eslOs componentes se ensamblan formando un gran complejo ribonucleoproleico, el espliceosoma. La earaeterizaci6n de las especies de RNA que aparecen como intermediarios durante la reacci6n y de las partfculas snRNP necesarias lIev6 aI descubrimienlO de que el inlr6n se escinde en forma de /tao, siguiendo las vfas de maduraci6n que se muestran en las Figuras 8-54 y 8-55. Se han descrito algunas funciones individuates para a1gunas de las snRNP. Por ejemplo snRNP U I se une allugar de corte 5' del inu6n guiado por la complemenlariedad de secuencia del RNA U I con la secuencia de nueve nuc1e6tidos consenso (v~ase Figura 8-53). Debido a que el RNA es capaz de aetuar como una

FIgura 8-53 Secuencia consenso para usados en 18 marlurad6n del RNA en los eucariolas superiores. La secuenda indicada corresponde a la de la cadena de RNA: los dinucle6tidos casi invarianle5, GU y AG, de ambos extremos del intron se han dCSlacado en amarillo (v~ase lambil!n Figura 8-51). ~ lugares de corte 5' y3'

..euenelll

lMCuenei.

,'·"d~.cu""';~"I

C

--,,"'~I";"~I~"C"'---

A

5·--0 AGGU 0 AGU

A

400

G AG 0 --- 3' A

A

G

te(:ueocl. conlenSQ 5' para el lugar de corte 5' ("Iugar dador")

punto de r/lmllicllci6n A

Capflulo 8: Elnucleo cclular

secuenei. ;3;~_

sllCuencia consenw 3' para ellugar de corte 3' ("lugalllCeptor")

lugar de corte 5'

U1 snRNP

secuenc(a 5'

U2 snRNP

luger de corte 3'

se<:uenc(a del inlran

secuencia

'-,'ii"".'~'ii·ii'"~!=:;~==~~~=~;:::;=:::J.'i',diiiel exon 3'

US, U4/U6.

Y6

etc.

molecula pretu"Ora demRNA

EN$AM8lAJE DEL ESPUCEOSOMA

-::::=::"

US

ETAPA 1 FORMACION DEL LAZO Y CORTE PaR El LUGAR DE COATE S'

"-~~'~\:;j.-" UO/U.

-'\u.

,'_IioI£~

~

~-"

ETAPA2

CORTE POR El LUGAR DE CORTE 3' Y UNION DE lOS EXONES

secuencla del inlrOO libentdo

::::::;:~~~~ en forma de I.s.lO lter6 ~ degradado del nUc:1eo1

+

U, ""

••••••• S· • 3'

mRNA ~uro lsecuencia. ,xOOica. unidasl

enzima, tanto el RNA como los componentes proteicos del espliceosoma podnan ser los responsables de cataJizar eJ corte y la formaci6n de las uniones covalentes necesarios en la maduraci6n del RNA.

Habitualmente de cada transcrito de RNA se eliminan muchas secuencias intr6nicas36 Debido a que el espliceosoma parece reconocer fundamentalmente una secuencia consenso que delimita la frontera del intr6n (y estas secuencias consenso son similares para todas las secuencias de intr6n), ellugar de corle 5' (Iugar dador) del extrema de un intr6n se puede unir allugar de corte 3' (Jugar aceptor) de Cllalquier atro intr6n. Asf pues, cuanda se crea artificialmente una tllolecula de RNA, con lugarcs dadores y aceptores de diferentes intrones insenados, frecuelllemen. te el RNA existcnte entre ellos es reconocido por el espliccosoma yeliminado. A la vista de este resultado, es sorprendenre que los genes de los vertebrados contengan haSla 50 intrones (vease Tabla 8-1, pag, 365). 5i durante la madura. ci6n del RNA se desaparea cllalquiera de los lugares de corte 5' con cualquiera de los 3', podrfan perderse algunas secuencias codificantes del mRNA, can consecuencias desastrosas. Sin embargo la maquJnaria de maduraci6n del RNA previene, de alguna forma, estos errores, garantizando que cada Iugar de corte 5' s610 se aparee con ellugar de corte 3' mas pr6ximo siluado en sentido 5'·3' en la

Flgun 8·55 Eslruc'UI'1l de la cadena nunlfk:ada de RNA que se fonna dunnle la maduncl6n del RNA. EJ nucleOtido A mostrado en amarillo en la figura es el nucleOlido que se destaca en la Figura 8-54. La ramificaci6n se fonna en la primera elapa de la reacciOn de maduradOn iluslrada all{, cuando el extremo 5' del intron se acopla covalenlemenle a12' -OH de la ribosa del nucleOtido AIocalizado a unos 30 nucleOtidos del extremo 3' de la secuencia dellntron. La cadena ramificada pennanece en ellnlr6n escindido yes responsablede su fonna en lazo (veRSe Figura 8-54). Sentesls y p~lenlo del RNA

Figun 8·54 Mecanismo de maduracl6n por corte y empalme del RNA. La maduradOn del RNA esla catalizada por el espliceosoma formado poria uniOn de las snRNP VI, U2, US Y U4/U6 (mostradas como clrculos verdes) y de OlrOS componentes (no mostrados). Despues del ensamblaje del espliceosoma, la reacdOn tiene lugar en dos elapas: en la etapa I un nucleOtido A especial de Ia secuencia intr6nica siluado cerca dellugar de cone 3' reacciona con la secuenda de conedellugar 5', la cual es cortada; el eXlremo 5' conado de la secuenda del inlr6n se une covalentemente a este nucle6tidoA. fonnando un nucleOtido ramificado, como se aprecia en la Figura 8-55. En la etapa 2, el extremo 3'-OH del primer exOn que estaba expuesto en la primera elapa, se anade al inkio del segundo ex6n, cortando la mol~ula por ellugar de cone 3'; las dos secuencias ex6nicas quedan unidas y el intr6n se libera en fonna de lazo. EJ complejo completo del espliceosoma sedimenta a 605,10 que indica que es casltan grande como un ribosoma. Estas reacdones de madurad6n tienen lugar en el mlc1eo y producen moleculas de mRNA a partir de los transcritos primarios de RNA (moleculas precursoras de los mRNA).

'~-------------\

oI "" _ o-p-o I

O~o_ ~(l

/

extrema S' de la secuencia dellnlr6n

? O-'-Ol~!fl o-p-o- ~ ~

i,~ ? "" ~o-r~ o-~-o-

IX

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,

extreme 3' de Ia sec:uencla del intr6fo

? I

. . _---,1r

401

trBnscrilo primuio de RNA inicio

slICuencia

paro

rD3 ~TD:"~' 6T""'"

,

@GPpp-l

0'

slICuenciB

7". \f'

Al

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02 A2 04 A4 ~8OOO

~k D6 A6

07

)

A7

I

AAA-OH 3'

-.J

nucleotidos

I

SECUENCIAS INTR6NICAS ELiMINAOAS POR LA MAOURACI6N DEL RNA

inicio (±)Gppp-

I

para

I

"

AAA-OH 3'

mRNA

TRAOUCCI6N

H,N

-11l1li111- COOH

protelnB

ovoBlbuminB

secuencia Uneal del RNA (Figura 8-56). $e desconoce c6mo se produce este apareamiento secuencial de los lugares de corte, aunque se cree que el ensamblaje del espJiceosoma, ya durante el crecimiento del transcrito de RNA (vease Figura 8-52), juega un papel importante en cuanto a asegurar el apareamienlo correcto de los lugares de corte. Ademas, existen evidencias de que la conformaci6n tridimensional adoptada por las secuencias de intrones y exones en ellranscrito de RNA es importante. Sin embargo, se vera en el Capftulo 9 que este patr6n de maduraci6n sencillo 5'-3' puede modificarse por mecanismos de control especializados que permitirfan a illl gen unico producir diferentes mRNA y de esta forma diferentes protefnas.

El estudio de la talasemia revela de que forma la maduraci6n del RNA puede permitir que las protefuas evolucionen!J7 Las lecnicas del DNA recombinante han hecho de los mutantes humanos un recurso cada vez mas importame para los estudios geneticos de los mecanismos celulares. Por ejemplo, existe un grupo de enfermedades geneticas humanas denominadas sl:ndromes de talasemla, que en el individuo afectado producen un nivel anormalmente bajo de hemoglobina -la prolefna transportadora del oxfgeno en la sangre. En mas de 50 de estos mulanles se ha delerminado la alteraci6n de la secuencia del DNA; en una gran parte de ellos se presentan alteraciones en el patr6n de la maduraci6n del RNA. As!, se ha detectado que un cambio de un nucle6tido puede inactivar un lugar de corte. Sorprendentemente, a partir del analisis de los mRNA producidos en estos individuos mutantes se ha observado que la perdida de un lugar de corte no evita la eliminaci6n de ese intr6n sino que en muchos casos ellugar de corte complementario se une a un lugar de corte "crfptico" situado en las proximidades; frecuentemente se generan una serie de maduraciones a1ternativas, de modo que en lugar de producirse una sola protefna se generan una serie de prOlefnas alleradas (vease Figura 8-57). Otros cambios de un nucle6lido crean un nuevo lugar de corte cambiando una secuencia de un intr6n 0 ex6n en una secuencia consenso de maduraci6n. Estos resultados apoyan la idea de que en los eucariotas superiores 1a maduraci6n del RNA es un proceso flexible, y sugieren que las variaciones del patr6n de maduraci6n causadas por mutaciones al azar podrfan ser una via importante en la evoluci6n de genes y organismos. 402

Capflulo 8 : EI nllcleo celular

Figura 8-56 Maduracl6n del transcrlto prlmarlo de RNA del gen de la ovoaJbtimlna de gallina. El esquema muestra la eliminaci6n ordenada de siete intrones, necesaria para oblener una moh~cula de mRNA funcional. Ellugar de corte 5' (lugar dador) se sel'lala can una 0 y ellugar de corte 3' (\ugar aceptor) con una A.

(AI TRANSCRITO PRIMARIO DE LA ~GLDBINA DE UN ADULTO NORMAL ex6n

ex6n

(B) EL CAMBia DE UN NUCLEOTIDO GENERA OTRO LUGAR DE CORTE

ex6n

_'''_C',,''oo:2_/~-:::::::: :.0::,,_....,;':.

AAAA

intrones

_A1"_--"'-.-------- -"'-~mRNA con el ex6n 2 meyor

se forma \In mRNA normal e penir de los tres exones

(C) CAMBia OE UN SOLO NUCLEOTIDO QUE DESTRUYE UN LUGAR DE CORTE NORMAL Y PERMITE LA APARICION DE LUGARES DE COATE ·cAfPTICOS" ALTERNATIVOS

-,w-...__-:,:- ------------ "--- AAAA verios mANA con \In ex6n 1 BConado 0 elergado

mRNA con \In ex6n extra insenedo entre los exones 2 V 3

(D) CAMBia DE UN NUCLEOTIDO QUE DESTRUYE UNA SENAL DE POlIADENILACION

_'->W__"'::::::::: ::~:_:WF=!!EE===:J AAAA

•

mRNA con \lne rogi6n 3' no trad\lcide enormelmente lerga

-<_:::>::::_~AAAA mRNA con 01 ox6n 3 alergedo

Probablemente la maduraci6n del RNA catalizada por el espliceosoma evolucion6 a partir de mecanismos de automaduraci6n36 El descubrimiento del intermediario en lazo en la maduraci6n nuclear de los RNA confundi6 inicialmente a los bi610gos moleculares. ;,Por que se utiliza esta vfa compleja cuando aparentemente parece mas simple unu los lugares de corte 5' y 3' en una primera etapa, y luego cortar y volver a unir? La respuesta parece encontrarse en la manera como evolucion6 el espliceosoma. Como se ha explicado en el Capftulo I, se cree que las primeras celulas utilizaban moleculas de RNA --en lugar de protefnas- como catalizadores principales y que almacenaban [a informaci6n genetica en moleculas de RNA --en lugar de moleculas de DNA. Posiblemente, en aquellos tiempos las reacciones de corte y empalme de RNA catalizadas por RNA jugaron un importante papel; aun existen algunos intrones que presentan capacidad de autorrecorte -por ejemplo, en [os genes nucleares de rRNA de Tetrahymena, en e[ bacteri6fago T4, y en algunos genes mitocondriales y de cloroplaslos. Una secuencia intr6nica con automaduraci6n se puede identificar en el tubo de ensayo incubando una mo[ecu[a de RNA pura que contenga la secuencia intr6nica y observando la reacci6n de maduraci6n; tambien se puede identificar a partir de la propia secuencia del RNA, dado que una gran parte de esta ha de ser conservada para que al plegarse forme una superficie catalftica en ia molecula del RNA. Se pueden diferenciar dos gropos principales de intrones con capacidad de automaduraci6n. Los intrones del gmpo I, que inician [a reacci6n de automaduraci6n uniendo un nucle6tido G a la secuencia del intr6n; la G es activada formando e] grupo que rompera el primero de los enlaces fosfodiester cortado durante el proceso de maduraci6n (el enlace del [ugar de corte 5'). En los intrones del grupo Jl el grupo atacante es un residuo A especialmente reactivo, y se genera un intermediario en lazo. El resto de los mecanismos de la reacci6n son similares. Se cree que ambos representan vesligios de mecanismos muy primitivos (Figura 8-58). AI parecer durante la evoluci6n del proceso de madwaci6n del RNA nuclear, se ha conservado la vfa de reacci6n utilizada por los intrones de automaduraci6n del tipo II, siendo reemplazada la funci6n catalftica por un espliceosoma independiente. As£. [os pequei'ios RNA U1 YU2 podrfan ser, por ejemplo, [os remanentes de las Sfntesis y procesamiento del RNA

Figura 8·57 Ejemplos de procesamlento anonnal del transcrlto primarlo de la p·g1oblna en humanos con 13·talasemla. Ellugar afectado por la mutad6n se ha senaJado con una cabeza negra de

jlecha. Las cajas coloreadas en azul oscuro representan los tres exones normaJes, mostrados previamellte en la Figura 8-51, y las Uneascominuas rajas unen los lugares de corte 5' y 3' utilizados en la madurad6n del transcrito primario de RNA produddo por el gen. Las cajas coloreadas de azul claro indican nuevas secuendas que debido a Ja mutaci6n quedan incluidas en la mohkula final de mRNA, Hayque destacar que cuando una mutaci6n elimina un Jugar de corte normal. aparecen uno 0 mas lugares de corte ~crfpticos" alternativos, que se aparean con eJ Jugar de corte remanente, como ocurre en (C). (De 5.1'1. Orkin en The MoJecular Basis of Blood Diseases [G. Stanatoyannopoulos et aI. eds.], pp. 106-126. Philadelphia: Saunders, 1987.)

403

Grupo I de intrOMs de eutOmadurllOi6n

Grupo II de Intrones de automaduraciOn

sllOuencia 3' de un e)(6n

·LI."3'

seeuencia 5' de un e)(6n

mol6cula de RNA precursora

5''''_

seeuencia 3' de un e)(6n

'\::_.3'

G

5'

..........,

0"

intermediario transitodo

3'

~_3'

I

5'

5n

lam secuencia intr6nica escindida

0"

+

3'

Figura 8-58 Las dos c1ases oonocidas de intrones de aUlomaduracl6n. Los intrones del grupo I unen un nucle6tido G libre a un lugar espedfieo para iniciar el proceso (vease Figura 321). Los inlIones del grupo II usan, para el mismo prop6sito, un nucle6tido A especialmente reactivo de la propia secuencia del intr6n. Se han dibujado los dos mecanismos resaltando sus similitudes. En ambos mecanismos participan proteinas que comribuyen n aeelerar In reacci6n, pero la eatalisis esta producida por el RNA del intr6n. El mecanismo utilizado por los intrones del grupo II forma un lazo, recordando la vfa catalizada p~r el esplieeosoma (compararconla Figura 8-54). (DeT.R. Ceeh, Cel/44: 207·210, 1986.@Cell Press.)

3'

0" secuencia de los e)(Ones unidoB

3'

secuencias catalfticas que originalmente estuvieron presentes en los intrones. Probablemente al desaparecer las funciones calaliticas de los intrones y pasar al espliceosoma desaparecieron tambien las Iimitaciones a In evoluci6n de las sccuencias inrr6nicas, permitiendo que muchas de elias evolucionaran rapidamente.

El transporte de los mRNA al citoplasma se retrasa hasta que la maduraci6n se ha completado 39 Se cree que las moleculas de rnRNA rnaduras son reconocidas por protefnas receploras del complejo del poro nuclear y transportadas activamente al citoplasrna (discutido en el Capftulo 12). Por el comrario, las principales protefnas de las parlfculas hnRNP y varias de las rnoleculas de procesamiento unidas al RNA estan confinadas en el nucleo, aunque ocasionalmente algunas de elias pasan aJ citoplasma con el mRNA antes de ser separadas nipidamente y devueltas al nucleo (Figura 8-59). 5'

protelnaB citoplasmlitlcDB de uni6n al RNA

InrtiCU".'e-.-\.~

RN'

A>, __ protein, de uni6n a poli·A

IAI

404

161

Capftulo 8: El nucleo celular

200 I'm

FIgura 8-59 Transporte de moleculas de mRNA a lraw!s de los poros nucleares. (A) lIustraci6n esqucmatica del cambio que al parecer ocurre en las protcfnas unidas a la molecula de RNA cuando se desplazan hacia el exterior del nucleo. (B) Electronmicrografia de una gran molecula de mRNA producida en una glandula salival de insecto: aparentemente, esta molecuia [j1eclla) ha sido ~cazada" en el momento en que salfa del micleo al citoplasma. (B, de'B.j. Stevens yH. Swift,f. Gel/Bioi 31: 55~ 71-: 1966, ~n.pel1lliso de copyright de The"Rocke¥eller ~ University Press.)

Estudios reaHzados en mutantes de levadura sugieren que para los RNA que contienen intrones este proceso s610 es posible cuando ha finalizado completamenle la maduraci6n del RNA. Cuando una mutaci6n crca un defecto en la maquinaria de maduraci6n, los precursores del mRNA no procesados pcrmanecen en el nucleo, mientras que los mRNA que no necesilan maduraci6n {Io que induye la mayor parle de los mRNA en esta sencilla c~lula eucariotal. son transportados normalmente al citoplasma. Esta observaci6n es consistenle con la idea de que los RNA son retenidos por los componenles de los espliceosomas, que at parecer forman grandes agregados en el interior de los nucleos eucariolas. Estos agregados podrfa.l1 aClUar como "islas de maduraci6n~ (Figura 8-60); aunque se desconoce c6mo est
Los RNA ribos6micos y los RNA de transferencia se sintetizan sobre conjuntos de genes id~nt.icos dispuestos en tandem 40 Muchas de las protefnas mayoritarias de una c~luJa diferenciada. como por ejemplo la hemoglobina de los eritrocilOs 0 la mioglobina de la fibra muscular. son sintetizados a partir de genes que estan presentes en una sola copia par genoma haploide. Estas protefnas son abundantes porque cada una de las muchas moltx:ulas de mRNA transcritas a partir deJ gen puede ser traducida generando unas 10 mol~culas por minuto. Normalmente csto producira en cada nueva generaci6n celular mas de 10 000 mol~culas de protefna por molecula de mRNA. Sin embargo, este proceso de amplificaci6n no es posible para la sfntesis de los RNA que forman los ribosomas, ya que las moleculas de RNA son el producto linal del gen. Para poder construir sus 10 miLIones de ribosomas, cada c~lula eucariola superior ha de sintetizar en cada generaci6n celular mas de 10 millOllCS de capias de cada uno de los tipos de mol~cuJas RNA ribos6micas. De hecho la c~­ lula puede producir cantidades adccuadas de eSlos rRNA gracias a que dispone de multiples copias de los genes rRNA que codifica.l1 RNA ribos6micos. Induso E. coli necesita siele capias de los genes rRNA para manlener las necesidades celularcs de ribosomas. las c~lulas humanas contienen alrededor de 200 capias de genes rRNA por genoma haploide, dispersas en pequenos grupos sabre cinco cromosomas diferentes, mienlras que Xenopus contiene alrededor de 600 copias en lIll grupo unico situado en un solo cromosoma. En las celulas cucarioms. las capias multiples de cada uno de los genes de rRNA, alta mente conservados, se localizan organizadas en tandem en las que cada gen (dc 8000 a 13000 nucle6tidos de longitud. dependiendo del organismo) se encuentra separado del adyacente por una secuencia de DNA no transcrita denominada DNA espaciador, el cual puede variar mucho en cuanlo a lamano y a sccucncia. Como se ven1 posteriormentc las capias multiples de los genes organizados en tandem tienden a coevolucionar. La organizaci6n en tlindem de los genes rRNA es facil de visualizar en pre· paraciones de cromatina extendida. debido a su organizaci6n repetida y a que son lranscritos con gran frecuencia. Las mol~cuJas de RNA polimerasa y los transcritos asociados a elias estan tan densamente empaquetados (aproximadamente 100 por gen) que los lranscritos se observan situados perpendicularmenIe al eje de la moll!cula de DNA. de forma que cada unidad de transcripci6n presenta eJ aspecto de un "
Figura 8-60 Poslbles "Islas de

maduracl6n" (spUcing Islands). Inmunofluorescencia de un nudeo de fibroblasto humano con un anticuerpo monoclonal que detecta las paniculas snRNP imphcadas en la maduraci6n de los precursores de las mol«u1as de mRNA. Las partfculassnRNP se presenlan como grandes agregados, que podrfan actuar como "islas de maduraci6n~. EI anlicuerpo delecta prolefnas especilicas que estan presentes en algunas de las snRNP que acluan en el espliceosoma. (POl cortesfa de N. RingcrlZ.)

405

Figura 8-61 Transcrlpdon de los genes rRNA organlzados en tandem, vtsuallzados can el microscoplo electronlco. En la imagen superior,

a menor aumento, se observa claramente el patron altemo de genes en transcripcion activa y de DNA espaciador no transcrito. AI parecer las partfculas mayores del extrema 5' de cada uno de los transcritos de cada rRNA (imagell illferior) representan el inicio del ensamblaje del ribosoma; las moleculas de RNA polimerasa tambil!n son daramente visibles como series de puntos a 10 largo del DNA. (Fotograffa superior de V.E. Foe, Cold Spring HarborSymp. Quant. Bioi. 42: 723-740, 1976; fotograffa inferior par cortesfa de Ulrich Scheer.)

rRNA queda elaramente definido por la desaparici6n sdbita de las moleculas de RNA polimerasa y de sus transcritos, Los genes rRNA son Iranscriros por la RNA polimerasa I; cada gen produce el mismo transcrito, En humanos, este transcrito se conoce como rRNA 45$ y tiene una longitud de 13000 nuele6tidos. Antes de que abandone el ndeleo formando parte de particulas ribos6micas ensambladas, el rRNA 455 es cortado produciendo una copia de cada uno de los rRNA 285 (aJrededor de 5000 nucle6tidos), de los rRNA 185 (aJrededor de 2000 nuele6tidos) y de los rRNA 5,85 (aproximadamente 160 nucle6ridos). AI obtenerse los tres rRNA a partir del mismo transcrit'o se asegura una producci6n equilibrada de eUos, La secuencia remanente de cada transcrito primario (unos 6000 nuele6tidos) se degrada en el nddeo (Figura 8-62). 5e cree que estas secuencias extra podrian jugar un papeltemporal en el ensamblaje del ribosoma, que se inicia n\pidameme con la uni6n de aJgunas protefnas al transcrito rRNA 455 en el nLieleo. Otro conjunto de genes organizados en tandem y separados por DNA espaciador no transcrito es el que codifica el rRNA 55 de la subunidad ribos6mica grande (el dnico rRNA que se transcribe de forma aislada), Los genes de rRNA 55 s610 tienen 120 pares de nude6tidos de longitud y, como ocurre con un gran nd-

ANA 455 precursor del rANA

s

P"~~~~~~~~;:=::. I

I-

13000 nucle6tidos

PAOCE5AMIENTO DEL RNA

S'

regiones de 1& sll(:uencia nucleotldlc& que 5e degr&dsn

rRN~,85

rANA 185 3'

S' 3'

I-OH

~

. . . .'iiRNiiAiiii'.8S.1111!

~

3' • rRNA 55 producido S' 3' en OlrO lugar

incorporado en Is subunidad ribos6mice pllquei'ia

406

Capftulo 8: EI m1cleo celular

incorporlldo en la 5ubunidlld ribos6mics grande

Figura 8-62 Patron de procesamlento de la molecula prec::ursora RNA 455 en tres RNA riboscSmicos separados. Casi la mitad

de las secuencias nudeotfdicas de este precursor se degradan en el nucleo,

mero de genes que codifican RNA de pequeno tamano (especialmeme los genes de tRNA), son transcritos por la RNA pofimerasa 1/1. En el hombre existen alrededar de 2000 genes de rRNA 55 organizados en tandem en un unico grupo situado lejos de los Olros genes rRNA. 5e desconoce la raz6n de que este tipo de rRNA se transcriba de forma aislada.

EI nucleolo es una maquina productora de ribosomas 40 transcripci6n continua de multiples copias genicas asegura lin aporte adecuado de moleculas de rRNA, que son rapidameme empaquetadas can las protefnas ribosomales formando ribosomas. EI empaquetamiento se realiza en el nucleo, en una estmctura de gran tamano y bien diferenciada denominada el nucleolo. EI nucleolo contiene grandes bucles de DNA procedentes de varios cromosomas, cada uno de los cuales contiene uno 0 mas grupos de genes rRNA. Cada uno de estos grupos se denomina regi6n organizadora nucleolar. Los genes son transcritos con gran frecllencia par la RNA polimerasa I. EI inicio del empaquetamiento de los rRNA puede obselVarse a1 microscopio electr6nico: el extremo 5' de cada rranscrito se line a un granulo rico en proteina (vease Figura 8-61). Estos gninulos, los cuales no se ha obselVado que interaccionen con ninglin otro tipo de transcrito, represenlan probablemente la primera interacci6n RNA-protein a que tiene lugar en el nucteolo. La funci6n biosintetica delnucleolo se puede poner de manifiesto por marcaje radiactivo mediante pulsos cortos con uridina- 3 H. Despues de vaTios pulsos, separados por intelValos en los que se incuha con un medio no marcado, se pueden separar los genes rRNA del cromosoma mediante fraccionamiento subcelular, y se puede conseguir un aislamiento del nucleolo marcado, en forma bastante pura (Figura 8·63). Estos experimentos han moslrado que el transcrito de 455 es empaquetado formando un gran complejo con proteinas procedentes del citoplasma donde se sintetizan tadas las prote[nas de la celula. En eSla etapa se incorporan tanto la mayor parte de las 80 prote[nas que forman el ribosoma como el rRNA 55. Para el procesamienlo del rRNA 455 y para dirigir el proceso de ensamblaje son necesarias otras moleculas. Asf pues, el nucleolo contiene otras prolefnas de uni6n a1 RNA Yciertas partfculas ribonucleoproleicas (incluyendo snRNP U3), las coales, segl1n parece, colaboran en la construcci6n de los ribosomas. Cuando las subunidades ribo56micas son exportadas aI citoplasma en su forma definitiva, eslOS componentes permanecen en el nucleo. Un componente especialmente notable de estos complejos es la nucleolina, una protefna de uni6n a RNA, abundante y bien caraclerizada, que aI parecer 5610 recubre transcritos ribos6rnicos; esta protefna se tine can plata, tal como ocurre con el nucleolo. A medida que se procesa, la molecula de rRNA 455 va perdiendo algo de RNA y de prolefna y luego se divide fonnando los diferenles prectusores de las

La

10 cromosomas interftlsicos dascondensados contribuyen e Ie formaci6n del nucillolo con sus bucles de DNA proouctores de rRNA

-

ROTURA MECANICA

envoltura

nu~,~,,~.:,::::=:::""

Sfntesis y procesamiento del RNA

nucleO aislado con bucles cromos6micoa rotos

Figura 8-63 EI nucloolo. Represemaci6n muy esquematica de una celula humana, en la que se muestran las aportaciones a un (mico gran nucleoiD de los bucles de crornatina que contienen los genes de rRNA de 10 cromosomas diferentes. Los nucleolos purificados resultan muy utiles para los estudios bioqufmicos de la funci6n nucleolar; para oblener estos nucleulos, los bucles de la cromatina se han de separar mecanicamente de sus cromosomas, lal como se muestra en el dibujo.

407

bucle de DNA orgllnl~ador nuc;leol,r Q8n rRNA

TRANSCRIPClON

.....

I

prec::oaor

~ de rANA 46S

• •

·.·-------~I

protei",s

ribosOmil:lls producidas

M"

c::itoplnm.

-,

.."...... .'..

~~~~ proleil:a

•

•

..." "".---..j NUCl.EOlO

_-~

RNA Y prot.i",

.etidados. impbcadol en ,,~o

N6cuo

CfTOSOL

c:=-

(

El TRANSPORTE V:::J LA ) ACTlVActON GENERAN RlBOSOMAS FUNCIONAlES rRNA

rANA 5,8S

185

.RNA 28S

lIUbunidlld

40S

rlINA 55

S~ ~ J.V.t

subunidlld

60S

subunidades ribos6micas: mayor y mellor (Figura 8-64). A los 30 minutos del pulso de marcaje radiaclivo, emergen del nucleo y aparecen en el ciloplasma celular las primeras suhunidades ribos6micas pequenas maduras, con su rBNA 185. EI ensamblaje de la subunidad ribos6mica mayor madura, con sus rBNA 285,5,85 Y55, (arda alrededor de una hora en aparccer; por ello, el nucl~olo con· tiene mas subunidades ribosomicas grandes incompletas que subunidades pequeiias incomplel8s. Las ultimas elapas de la maduraci6n ribos6micas s610 se producen cuando estas subunidades son lJansferidas al ciloplasma. Esle retraso evita que ribosomas funcionales puedan tener acceso en el nucleo a las moleculas de hnRNA, 10dav{a procesadas de forma incompleta.

EI nucMolo es un subcompartimiento nuclear muy organizado4 • A la vista de 10 que se conoce actualmente sabre 1a funci6n del nucl~olo, es posible explicar pane de su estructura. AI microscopio optico, el gran nuch~olo esferoidal es la estructura mi1s palente del nucleo de una relula no mit6tica. Fue estudiado can delenimiento por los primeros citologos de tal modo que en una revisi6n aparecida en 1898 ya se pudieron char unas 700 referencias. En la deeada de 1940, los cil61ogos habfan demostrado que el nucl~lo contiene elevadas concentraciones de RNA y de protefnas; pero su funci6n principal en la sfntesis del RNA ribos6mico y en el ensamblaje de los ribosomas no fue descubiena hasta los af\os 60. 408

Capitulo 8: EI nucleo celular

Figura 8·64 Funcl6n del nuclrolo en la sflltesls de los riboSOffilI5. EI transcrito rRNA 455 se empaqueta en una gran panJcula ribonucleoproleica que conliene muchas proteinas ribos6micas procedentes del ciloplasma. Mientras permanece en el nuclrolo, elerlas regiones de esla partfcula son eliminadas a medida que se transforma en las subunidades rib0s6micas inmaduras mayor y menOL Se cree que estas dos subunidades 5610 a1canzan su forma funelonal final cuando son lransponadas individualmente a tra~ de los poms nucleares hacia eI ciloplasma celuJar.

heterocromatina perifltrica

envoi lura nuclear

nucleoio

componente granular

••", .."".

-~"

centro fibrilar

IAI

AI microscopic electr6nico se pueden observar algunos de los delalles de la organizaci6n nucleolar. A diferencia de los organulos citoplasmati~os, el nucleo10 carece de membrana que 10 delimite; en vez de ello, parece estar constituido por la uni6n especffica que forman entre sf, como una gran malla y de una rnanera aun desconocida. los precursores ribos6micos no lerminados. En una electronmicrograffa representativa en el nticleo se pueden distinguir tres regiones parcialmenle diferenciadas (Figura 8-65): (1) un componenre debilmel1le contrastado, el centro fibrilar, que cOl1liene DNA que no esta siendo transcrito activamente, (2) un comp0rlente fibrilar derlso que contiene moltkulas de RNA en proceso de transcripci6n; y (3) un componente granular, que contiene precursores de las particulas ribosomales maduras. EI tamano del nucleolo refleja su actividad, y par ello varIa notablemente en los diferentes lipos celulares y puede variar dentro de una misma celula. Por ejemplo, el nucleolo es muy pequeno en ciertas celulas vegetales en estado de latencia, pero puede ocupar hasta el 25% del volumen nuclear lotal en celulas que esten produciendo cantidades de protefna anormalmente elevadas. Las diferencias de tamai'io se deben en gran medida a las variaciones del componente granular, que probablemente esta regulada a nivel de la Iranscripci6n genica ribos6mica: la cromatina cxtendida observada con el microscopio electr6nico muestra que tanto la fracci6n de genes ribos6micos activados como la velocidad a la que se transcribe cada gen pueden variar seglin las circunSlancias.

IB)

Figura 8-65 Electronmlcrograf(a de una secclon ullranna de un nucleolo de un nbroblaslo humano, mostrando sus tres zonas diferentes. (Al Vista del mlcleo entero. (8) Imagen a mayor aumento del nucleolo. (Por cortes(a de E.G. Jordan y M.J. McGovern.)

Despu~s de cada mitosis, el nucleolo se ensambla de nuevo en determinados cromosomas42

EI aspecto del nucleolo cambia espectacularmente durante las distintas fases del cicio celular. A medida que la celula se aproxima a la mitosis, el nucleolo disminuye de tamano y luego, euando los cromosomas se condensan y se detiene 10talmente la sfntesis de RNA, desaparece: en general las celulas metafasicas no tienen nucleolo. Cuando se inicia de nuevo la sfntesis de RNA ribos6mico, al final de la mitosis (en la lelofase), reaparecen diminutos nucteolos en las localizadones cromos6micas de los genes de RNA ribos6mico (Figura 8-66). En el hombre, los genes de RNA ribos6mico estan localizados cerca del extremo de cada uno de los 5 cromosomas distintos que se muestran en la Figura Sfntesls y procesamlento del RNA

409

8-32 (es decir, en 10 de los 46 cromosomas de una celula diploidel. Por consi· guiente, despues de la mitosis de una celula humana se forman 10 pequei'ios nu· clt~olos aunque rara vez se pueden observar ya que ereeen rapidamente y se fu· sionan formando el gran nucleolo tfpico de la celula interfasica (Figura 8·67). i.Que sueede con el RNA y con las prolefnas componentes del nuclrolo que se ha disgregado duranle la mitosis? Parece Que par 10 menos una parle de estos eomponenles qlleda distribuida sobre la superficie de lodos los eromosomas met'afasicos y es Iransportada a los nucleos de las dos eelulas hijas. Cuando, durante la telofase. los cromosomas se deseondensan, estos componentes nucleolares "viejos" ayudan a restablecer los nuclrolos que aparecen nuevamente.

Los cromosomas ocupan territorios discretos en el nucleo interf~sico.43 Como acahamos de ver, cuando se forma el nucleolo, determinados genes, loca· lizados en diferentes cromosomas, se encuentran reunidos. i,Estan las olras parIes del cromosoma tam bien ordenadas no-al azar en el nucleo? Est'a pregllnta, planteada por los cienlificos de finales del siglo diecinueve, todavfa no ha side respondida salisfacloriameme. Exisle un cierto orden en la configuraci6n que siempre tienen los cromosomas aI finalizar la milosis. Justo antes de Que la celula se divida, los cromosomas son atrafdos hacia cada uno de los dos palos de huso mit6tieo, mediame micrOlubulos unidos a los centromeros; asf pues, los centromeros marcan el camino, y los brazos distales de los eromosomas (terminados en los tel6merosl 10 siguen despues. En muchos mlc1eos interf~icos, los cromosomas tienden a retener esla orientaci6n, denominada orientaci611 RabJ, durante loda la interfase, con sus cen· Ir6meros dirigidos hacia un polo del nudeo y sus tel6meros dirigidos hacia el polo opuesto (Figura 8-GSA). En algunos casas, el nudeo esta orientado de forma especffica en la eelula: en el embri6n lemprano de Drosophila, por ejemplo. lodos los centr6meros se dirigen hacia la cara apical (Figura 8-688). Eslas orienlaciones nu· c1eates fijas podrfan tener imponantes efeclos sabre la polaridad celular, aunque es diffcil disei'lar experimentos que permilan eslUdiar eSla posibilidad. En muehas celulas los cromosomas no se pueden distingulr entre sf durante la inlerfase. Por ello, es diffciJ asegurar e6mo estan realmenle dispueslos. Sin embargo, los eromosomas politenicos giganles de la larva de Drosophila son una exccpci6n de este principio. En este caso, las bandas eromos6mieas se plleden observar con la suficienle c1aridad como para determinar las posiciones especf· ficas de detcrminados genes en los nucleos intactos, mediame secciones 6plicas y 16cnlcas de reconSlrucci6n. Los resultados de estos analisis sugieren que cl conjunto de los eromosomas inlerfasicos no estan muy ordenados: aunque se t'icnde a mantcner la orienlaci6n Rabl, frecuentemente ocurre que dos eelulas aparentemcnte idcnticas presentan distribuciones diferentes de eromosomas.

(!) enYOllllra~

nuc;lear

nucl60lo

G G G

G,

(!)

I

disoeia06n nllCleolar

I

CY 0,-,... '

:

, ', ..../ ,-, , ',

,,,.-

I

met.llI5lI ana''''

, __I

@ @ • o. @ @ (j)

preparaci6n de la mitosil

telo'_

,

'0 •

reaSOCiaciOn nucleolar

G,

preparaci6n para I. replitaciOn del DNA

G G (;) (;)

replitaci6n del DNA

Figura 8·66 CambJos morfoldglcos del nucleolo de una celula humana durante el cicio celular. En este diagrama 5610 se ha represenlado el nticleo celular. En muchas celulas eueariotas \a membrana nuclear se rompe durante la mitosis, 10 cual se ha indieado con I(neas discontinuas.

Flgun. 8-67 Fusl6n nucleolar. Micrografias obtenidas con el microscopio 6ptico. de fibroblastos humanos en cultivo. mostrando varias etapas de la rusi6n de los nucleolos. (Por cones(a de E.G. Jordan y J. McGovem.) 410

Capftulo 8: El nucleo celular

Figura 8-68 Orlenlacl6n polarizada de los cromosomas en las ctHulas Interfllslcas del embrl6n temprano de Drosophila. (Al Diagramas de la orieIHaci6n R3bl, con lodos los tel6meros apuntando hada el polo opuesto. En el embri6n, cada nl1c1eo se alarga, tal como se muestra en 13 figura, (B) MicrografTa a poco aumento del embri6n de Drosoplli/a en cI estado de blaslodermo celular. Los cromosomas de cada nl1e1eo interfdsico sc han tei'iido COli un colorante Iluorescente, Hay que destacar que 1a regi6n mds tei'iida (el cromocentro). que contiene las regiones cemromericas de cada uno de los cuatro cromosomas (v~se Figura 8-19), esta orientada hacia la superficie exterior del embri6n y por ello se dirige hada la membrana apical de cada una de las ct!:lulas. (Por conesfa de John sedat.)

VISTA LATERAL

DEL NUCLEO

telOmero.

centrOmeros erlvohur. nucle..

IAI

EI analisis de los cromosomas politenicos indica tambien que eada eromo· soma ocupa su propio lerritorio en el nucleo interfasico -es decir. que los dire· rentes eromosomas no estan entremezclados eompletamente (Figura 8·69). Otros experimentos han mostrado que los cromosomas no politenieos tambien tienden a ocupar regiones concretas y restringidas en el nucleo interfasieo. Ex· perimentos de hibridaci6n in sitll con una sonda de DNA apropiada, por ejemplo, pueden seguir un solo cromosoma en celulas htbridas de mamffero en cultiva (Figura 8-70). Parece que la mayor parte del DNA de cada cromosoma ocupa unicamente una pequefia porci6n del nucleo interfasico, 10 cual sugiere que cada cromosoma permanece condensado y organizado mientras permite que al· gunas zonas de sU DNA sean aetivas en la s£ntesis de RNA.

iEstli muy ordenado el micleo?44 EI interior del nudeo no es una mezcla at azar de lodos sus componentes: RNA. DNA Yprotefnas. Va hemos descrito que el nucleolo esta organizado como una maquina eficiente de construcci6n de ribosomas. y que aparentemente algunos grupos de componentes de esplieeosomas estan organizados en islas de maduraci6n del RNA (vease Figura 8-60). EI orden tambien es apreciable al observar electronmicrograffas de las regiones situadas alrededor de los poras nucleares: la cromatina que se encucntra unida a la membrana nuclear intema (cromatina extraordinariamente condensada y por eUo daramente visible en las electronmicrograffas) estrt cxcluida de una regi6n considerable de las proximidades yalrededor de los poros nucleares. delimitando una via entre el citoplasma y el nucleoplasma (vease Figura 8-71), Ademrts. en algunos casas se ha encontrado que los paras nucleares estrtn bien organizados en la envoltura nuclear (vcase Figura 8-72). Este orden podrfa ser el rcflejo de la organizaci6n propia de la lrtmina nuclear a la que el poro est'rt unido, iExiste en el inrcrior del nucleo un esqueleto, anaJogo al citoesquelcto, sobre el que se organicen los componentes nucleares? Muchas bi610gos cel11lares creen

Sfntesis y procesamiento del RNA

,.,

Figura 8-69 Pareja de imagenes estereosc:6plcas trld1mellslonales de la dlsposlcl6n de los cromosomas polllt!:nlcos de un nticleo senclllo de las gllindulas sallvales de Drosoplllla. La estructura esferica es elnuclt!:olo; In posici6n de cada cromosoma se representa por una linea que recorrerfn el eje del cromosoma. Los tel6meros tienden a silllarse en la supcrficie de la envoltura nuclear opuesta a la zona en la que se situa el nuclt!:olo. donde se agrupan todos los centromeros. Los cromosomas de estos micleos no quedan enmarai'iados nunea. pero sus pliegues precisos y su disposici6n respecto a los cromosomas vecinos varia de un nl1c1eo a otro. Aparte de esto. los nucleos son idt!:ntJcos. (Para ser miradas con los ojos cruzados; por cortesfa de Mark Hochstrasser y John Sedat.) 411

lei

que sf. La matriz Iluclear 0 (Illdamio se ha definido como e\ material insoluble que perrnanece en el nucleo despul!s de Lilla serie de elapas bioqufmicas de exlracci6n. Se ha demostrado que algunas de las prote(nas que 10 constituyen unen secucncias de DNA denominadas regiones SAR 0 MAR (de regiones asociadas a la matriz (Matrix-Associated Regions) 0 regiones asociadas al andamio (ScaffoldAssociated Regions). $e ha poslulado que estas secuencias de DNA sedan las que

Flgura8-70 Marcajeselectlvodeun cromosoma en el m1cleo de una ctHula de mamfrero en cultlvo, durante la Inlerfase. En (A) y (8), a la derecha se mueslra un nodeo inlerfasico Iibre de restos ciloplasm~licos, mientras que a la izquierda se ven cromosomas mil6ticos procedenles de una segunda celula. W Resuhados de la hibridad6n in situ (usando una sonda nuorescenle) para detectar un cromosoma humano en una lInea celular hlbrida hombre-hamster. En (8) se muestra la misma preparaci6n pero con lodo el DNA marcado con un segundo colorante fluoresccntc. (C) Dibujo esqllcmihico del crQmOSQma humano en el nuclco inlcrfl'lstco mostrado en (Al, a una cscala ligeramellle superior. (A y B por conesfa de Joyce A. Kobori y David R. Cox.)

forman la base de los bucles de 105 cromosomas (vease Figura 8-18). Mediante es-

tos ILlgares de uni6n de los cromosomas. la marriz podrla ayudar a ordenar los cromosomas, localizando genes, y regular la rranscripci6n y replicaci6n del DNA denlro del nucleo. Sin embargo aun se debate 5i la matriz celular es una estructu· ra presente 0 no en celuJas intactas, debido a que sus componentes eslructuraJes todavfa no se han podido identificar completamenle.

Resumen La RNA pollmerasa, elizillla que cataliza In trallscripd6" tiel DNA, es uua molkula rompleja formadtl por mJlarru cadenas polipeprtdicas. En las dlulas ellcariotas existe" tres RNA polimerasns dellomiruulas I, II Y Ill, relac:iO'uu/as elJOlutivamente entre s{ y COil In RNA polimerastl bacterialta, y que presentan algrmas slIb,lllidades ell cO'",ln, Se cree que despuis tie Inic:iar la transcrlpci611, cada enzima libera "'Ia 0 mm s"b"nidades y se Ime a otms enzimas IIecesarias !Jara el creeimiellto, Ia termi· lIacl611 y la modificaci611 tie in catleml tie RNA. IA mayor parte del mRNA tie las cellllas se protluce por 1111 proceso complejo qlle Ie bllela COllin s{lItesis del RNA Ileteragellea II"clear OmRNAj. La RNA polime· rastlll IJratluce el trallscrUo primario ImRNA. Posterlonmmle ,e Ie aflade un lIucle6·

Figura 8-71 Electronmkrograffa del micleo de una dlula de mamffero. Es

de destacar que la cromatina condensada que rodea la envoltura nuclear esta exduida de las regiones pr6x1mas a los poros nucleates. (Par conesfa de Larry Gerace.)

envolture nucleer

.....

nuclur

crometine condensede mlcleo

412

Cnpftulo8:Elnucleocellilar

tido especial a su extremo 5' y es cortado y poliadenilado ell su extrema 3'. /lab/tunlmente, las molklllas de RNA modlFI.CtUltu estdn sujeras allno 0 nub procesos tie recorte de las Sf!Cueliclas intT6"icas, ell los eludes estas Sf!Cllencias stm ellml,uulas del hnRNA. por fUur reacci6n ootaliznda por fUur gran partfcIlIn ribonltcleoproteica denomlnadn espliceosoma. E" este proa!so de madIlNlcl6", se elimlna Iii mayor parte de In masa del transcrito primario de RNA, Y se degrada en elmicleo. Como resultado de ello, lIImque la rasa de produccl6n de ImRNA sllpone tfpicamente Iii mltad de Iii sflltesls thl RNA rotal, el mRNA prodlleido represellla s610 alretfedor del 3% de In OOlltidad de RNA presellte en ellalquier momento ell In celuln. A difenmefa de los genes tille eotliflooll proteb,as, transerltos por la RNA pollmerasa ll, los genes que codifietm III mayor parte tie fos RNA estruetllrafes SOil trallscritos por las RNA poiimerasas I y llJ. eenerafmente estos genes esufI, presentes en el gelloma ell ,miltiples coplas y esttfll orgmlizados en grupos de gimes e" M,,demo La RNA polimerasa III prodllce IIl1a gtlnlll de molkulas de RNA pequenos y estables, elltu las qlle se lJalliin los tRNA y el pequefio RNA 5S del rlbosoma. IA RNA polimerasa I prodllU la gra" molk,da precllT"Sora de rRNA (RNA 455) qlM co"tle'le los rRNA mayores. Con Iii exupci6" tie los ribosomas de eloroplastos y mltocondrias, tados los ribosomas celllinres se e"samblan ,m el n1tcliolo -lin orgtfnulo intranuclear fonnado alrededor de los genes de rRNA orgallluuJos en Mntiem, que se 'U1Cllentran Telmldos a pesar de estar sitlJados en dlfeTelltes cromosomtu.

Organizaci6n y evoluci6n del genoma nuclear Gran pane de la hisloria evoluliva se halla grabada en los genomas de los organismos aCluales y se puede descifrar a partir de un an:Uisis cuidadoso de sus secuencias de DNA. Hasla el momento se han secuenciado decenas de millones de nucle6tidos y ya podemos empezar a intuiT c6mo han evolucionado durame demos de millones de aiios los genes que codifican ciertas proteinas. Los estudios sobre cambios ocasionales que ocurren en los cromosomas acluales proporcionan c1aves adicionales para comprender los mecanismos que se han producido por un cambio evolutivo en el pasado. En esta secci6n se consideranm algunos de los principios generales que han surgido a panir de estos estudios de genetica molecular, haciendo enfasis en la organizaci6n y evoluci6n del genoma nuclear de los eucariolas superiores.

Figura 8·72 ElectronmJcrograffa oblenlda por crlofraclura de la envoltura nuclear alargada de una· espora de helecho. se deslaea 10 disposicl6n ordenada en lfneas paraJelas de los compJejos de poros nuclearcs. En las envolturas nucleares de olras eelulas se han dcscrilO tanto grupos concenrrados de poros nucleares como areas extraordinariamente libres de ellos, especialmenle orientados con respeclo a Olms estruetums de la celula. (Por eones!a de Don H. Nonhcote: de K. Robens y D. H. Nonhcole. Atlerose. Acta7J: 102-120.1971.)

Los genomas se van ajustando de forma precisa por mutaciones puntuales y se remodelan radicalmente 0 aumentan de tamaiio por recombinaci6n gen~tica45 las secuencias de nucle6lidos del DNA se han de replicar con precisi6n. y se han de conservar. En el Caphulo 6 se explican los elaborados mecanismos de la repljcad6n y de la reparaci6n del DNA que penniten que las secuencias de DNA se hereden con una fidelidad exuaordinaria; s610 cambian al azar aproximadamenIe un par de nucle6tidos por mil cada 200 000 afios. Pero incluso siendo asf, en una poblaci6n de 10 000 individuos cada subsliluci6n posible de nucle6tidos ser~ ensayada unas 50 veces en ellranscurso de un mill6n de anos, 10 cua! es un cono lapso de liempo en relaci6n al de evoluci6n de las especies. La mayor pane de la variabiJidad creada de esta forma ser~ desvenlajosa para el organismo y en la poblaci6n sem seleccionada en contra. Por el conlrario, cuando una variame poco frecuente sea ventajosa seni rapidameme propagada por selecci6n natural. En consecuencia, puede esperarse que en cualquier especie dada la funci6n de la mayoria de los genes se in1 optimizando por mutaci6n pumual al aznr y selecd6n. Las mutaciones puntuales son un mecanismo eficienle para el ajuste preciso del genoma, y los progresos evolutivos a largo plazo han de depender de cambios geneticos mlls radicales. La recombinaci6n genclica provoca grandes reajusles del genoma con una frecuencia sorprendeme: el genoma puede expanOrgartizaci6n y evoluci6n del genoma nuclear

413

dirse 0 conlraerse por duplicaci6n 0 deleci6n; SUS diferentes zonas se pueden translocar de una regi6n a otra generando nuevas combinaciones. Las zonas que componen los genes -los exones y los elementos reguladores- se pueden metdar como si fueran m6dulos independientes generando proteinas que tienen funciones complelamenle nuevas. Ademas, las capias duplicadas de los genes tienden a divergir por mUlaciones posteriores y se especializan en funciones su· tilmente difcrenlcs. Poreslos sistemas el genoma puede evolucionar volvicndose cada vez mas complejo y sofislicado. En un mamffero, por ejemplo. exislen multiples formas variantes de casi lodos los genes: diferentes genes de aClinas para los diferentes lipos de celulas contracliles, diferentes genes de opsillas para la percepci6n de las luces de diferenles colores, diferentes genes de la colagena para los diferellles tipos de lejidos conjuntivos, etc. La expresi6n de cada gen esta regulada de acuerdo a sus funciones precisas y especificas. Ademas, la secuenciaci6n del DNA pone de manifiesto que muchos genes comparten segmen· tos modulares parecidos, pero apane de ello. son muy diferentes: se encuentran can frecuencia motivos de secuencia comunes en proteinas no relacionadas de otra forma. La recombinaci6n genelica, proceso en el que un cromosoma intercambia malerial genetico con otro, es fundamental para crear estas familias de genes y de segmenlOS genicos. En el CapftuJo 6 se discutieron los mecanismos molecula· res tanlO de la recombinaci6n general como de la recombinaci6n espedfica. Aqui se consideran1.n algunos de sus efeclos sobre el genoma.

Las secuencias repetidas en tandem de DNA tienden a permanecer inalteradas46 Habituahnente las duplicaciones genicas se atribuyen a raros accidentes catalizados por alguna de las enzimas que median ptocesos recombinanles. Sin embargo, los eucariotas superiores poseen un eficiente sislema enzimatico capaz de unir los dos exlremos de una molecula de DNA rota, por 10 que tanlO las duplicaciones como las inversiones, deleciones y translocaciones de segmenlos de DNA lambicn pueden ocurrir como consecuencia de una uni6n em\tica de frag· memos de cromosomas que se habran rota, de alguna forma, en mas de un lugar. Cuando varias secuencias duplicadas de DNA se unen cabeza con cola, se dice que estan repelidas e'l td'idem. Cuando aparece una primera repetici6n en tandem, se puede eXlender rapidamente a grandes series de repeliciones en 16.ndem mediante fen6menos de enlrecruzamiento desigual aun entre crornalidas hermanas, dado que la gran cantidad de secuencias apareables es L11' substrata ideal para la recombinaci6n general (Figura 8-73). La duplicaci6n de DNA seguida de entrecnlzamiento sccucncial desigual produce la amplificacion del DNA, un proceso que frecuenlemenle contribuye a la formad6n de cancer incremenlando el nlimero de copias de cierlos genes {proto-oncogenes} que facilitan la aparici6n de cancer (veasc Figura 24·27). Los genes repctidos en tandem aumentan y disminuyen de numero debido a entrecruzamiento desigual (vease Figura 8-73). Por 10 lanlO, podria esperarse que 5610 se mantengall en grandes cantidades par selecci6n natural si las copias extra son bcneficiosas para el organismo. Ya hemos hablado de los cientos de genes repelidos en tandem que codifican el precursor mayor del RNA ribos6mico; estas copias de genes son necesarias para mantener la demanda de nuevos ribosomas de las celulas en credmiento. De manera similar, los vertebrados lienen grupos de genes repelidos en IAndem que codifican OlroS RNA estrUClurales, incluyendo el rRNA 55, los snRNA U I YU2, Yalgunos grupos de genes repelj· dos de las histonas que producen grandes cantidades de las histonas necesarias durante cada fase 5. 5e podria esperar que en el transcurso de la evoluci6n las secuencias de los genes que manlienen una disposici6n en t
Capftulo 8; EI nucleo celular

DNA ropetido en t6ndem

/ \

• • • I • • • • •

",COM"NA"ON

+

Figura 8·73 Una familla de genes repetldos organlzados en tltndem gana y plerde copias con frecuenda debldo a procesos de enlreCruzamlenlo deslgual entre los cromosomas hennanos que contlenen los genes. Este fen6meno es frecuente debido a que las largas regiones de secuencia de DNA hom610g0 son un buen substrato para el proceso de recombinaci6n gen~tica general (discutido en el Capitulo 6).

genes ,---------repetidos---------, en t~ndem conversi6n

11 muteci6n

expansT6n

J

contracci6n

J

conversi6n

conversi6n

I conversi6n

I

etc. IA) HOMOGENEIZACION POR RECOMBINACION OESIGUAL ENTRE CROMOSOMAS HERMANOS

etc. IBI HOMOGENEIZACION POR CONVERSION Gl:NICA

alterasen una 0 algunas de las copias del gen; ademas, muchos de los cambios de nucle6tidos ocurridos en las largas regiones no transcritas podrfan no tener consecuencias funcionales. Sin embargo, generalmente las secuencias de los genes repetidos en tandem y sus DNA espaciadores son casi identicos. Se cree que dos son los mecanismos responsables de este hecho. Primero, fen6menos recurrentes de entrecruzamiento desigual pueden causar la expansion 0 la contracci6n de las disposiciones en tandem, y simulaciones por ordenador demuestran que esto tiende a mantener las mismas secuencias (Figura 8-74A). Segundo, la cOllversi61l genica -proceso por el cual una porci6n de secuencia de DNA cambia aI copiar una secuencia similar presente en un lugar diferente del genoma, como se describe en el Capftulo 6 (Figura 8-748)- pllede actllar homogeneizando las secuencias de DNA relacionadas. Aunque la conversi6n genica no requiere que los genes esten repetidos en u1ndem, en los eucariotas superiores parece que es mas frecuente entre aquelJos que se encuencran pr6x:imos. EI desplazamiento de una copia de un gen dispuesto en tandem hasta otra localizaci6n cromos6mica 10 protegera de ambas ill.fluencias homogeneizadoras. Asf pues, la translocacl6n genica accidental es lIna etapa importante en la evoluci6n de nuevos genes: permite a la secuencia translocada evolucionar independientemente, de modo que pueda adquirir lluevas funciones que puedan beneficiar al organismo.

Figura 8-74 Dos procesos que contribuyen a mantener iguales entre sf a todas las sec:uenclas de DNA organlzadas en tandem. (Al El continuo incremento y reducci6n del mlmero de copias genicas en una organizaci6n en tandem, producidos por la recombinaci6n desigual (vease Figura 8-73) ticnde a homogenizar todas las secuencias genicas asociadas. . (B) En la conversi6n genies una copia del gen Bcnia como molde, pasando la totalidad 0 parte de su sccuencia a una segunda copia del gen. En los eucariotas superiores eSle proceso se presenta cllsi exclusivamente entre copias de genes situadas pr6ximas en cl cromosoma: en los eucariotas infcriores como hongos, donde se ha estudiado con mayor detalle, no esta rcsrringido a genes pr6ximos.

La evoluci6n de la familia de los genes de la globina muestra que las duplicaciones al azar contribuyen a la evoluci6n de los organismos47 Ademas de generar nuevos conjunlos de genes repetidos en tandem, las duplicaciones de DNA han jugado un papel general mas importante en la evoluci6n de nuevas protefnas. La familia de los genes de las globinas proporciona un buen ejemplo de ello, pues su historia evolutiva ha sido especialmeme estudiada. Las inconfundibles hornologfas en cuanto a la secuencia de aminoacidos y a la eslructura que existe entre los genes aClUales de globina indican que lodos ellos han de derivar de un gen ancestral cornun a pesar de que algunos de ellos ocupen ahora localizaciones ampliamente separadas en el genoma de los mamlferos. Considerando las diferentes formas de la protelna en organismos pertenecientes a diferentes niveles de la escala filogenetica, podemos reconstruir algunos de los fen6menos del pasado que han dado lugar a las diversas formas de hemogJobina transportadoras de oxfgeno. Una molecula como la hemoglobina debe necesariamente permitir a los organisrnos pluricelulares que la posean crecer hasta adquirir un gran tamano, puesto que los grandes animales no pueden Organlzacl6n y evolucl6n del genoma nuclear

415

confiar la oxigenaci6n adecuada de sus lcjidos.exclusivamenle a la difusi6n del oxfgeno a traves de la superficie corpor'll. A consccuencia de clio sc enCUetllran moleculas similares a la hemoglobina en lodos los verlebrados y en algunos invertebrados. La molecula lransportadora de oxfgeno m~s primitiva es una cadena polipeptfdica de globina de unos 150 aminoacidos, que se encuentra en muchos gusanos marinos, en insectos y en peces primilivos. Sin embargo, la molecula de hemoglobina de los venebrados superiores esta compuesla por dos tipos de cadenas de gJobina. Parece que hace unos 500 millones de ailos, durante la evoluci6n de los peces superiores ocurrieron unas mUiaciones y duplicaciones genicas. Estos fen6menos eslablecieron inicialmenle dos genes de g10binas Iigeramente diferentes, que codificaban las cadenas de hemoglobina ( l y ~ en el genoma de cada individuo. En los venebrados superiores cada molecula de hemoglobina es un complejo de dos cadenas a y dos cadenas ~ (Figura 8-75). Esta eSlructura es mucho m
CapftuJo 8 : EI nucleo celular

la globlna de cadena tinlea une una moltK:ula da mdgeno

lugar de uni6n del OJllgeno al grupo hemo

EVOLUCION Of UNASEGUNOA CADENAOE

GLOBINAPOR

OUPLICAC16N Gl,NICA SEGUIOA Of

MUTAClON

globina de euatro cadena. que una euatlo moltkulas de oxlgeno de forma cooptK"ativa

Figura 8-75 Comparacl6n de la estructura de las g10blnas de cadena dnlca yde cuatro cadenas. La globina de cuatro cadenas mostrada es la hemoglobina, que es un complejo de dos cadenas de globlna ex ydos ~. La globina de cadena sencilla forma, en algunos invertebrados, un dCmero que se asocia cuando une oxCgeno, 10 que represcntarfa un intcmlcdiario en la evoluci6n de las globinas de cuatro cadenas.

Los genes que codjfjcan nuevas protefnas se pueden crear mediante la recombinaci6n de exones 45 EI papel de la duplicaci6n de DNA en la evoluci6n no esta limitado a la generaci6n de grandes familias gcnicas. Tambien puede ser importante en la generaci6n de genes sencillos. La prolefnas codificadas por los genes creados de esta fonna pueden ser reconocidos por la presencia de dominios proteicos similarcs repelidos, los cuales pueden eSlar unidos covalentemente enlrc sf, formando series. Por ejemplo, las inmunoglobulinas (Figura 8-77) y las albuminas, asf como muchas prolefnas fibrosas (como las colagenas) estan codificadas por genes que han evolucionado por duplicaciones repetidas- de una secuencia de DNA primordial. En genes que han evolucionado de esta manera, y tambicn en muchos OlroS genes, a menudo ocurre que cada ex6n codifica una unidad proteica plegada individual, 0 dominio. Se cree que la organizaci6n de las secuencias codificantes del DNA en fonna de estos exones separados por largos intrones, ha facililado de forma notable la evoluci6n de nuevas protefnas. Por ejemplo, las duplicaciones necesarias para fonnar un solo gen codificante de una proteina con dominios repetidos pueden ocurrir por TOtura y reuni6n del DNA en cualquiera de los largos intrones 0 en cualquier punlo de un ex6n codificante de un dominio proteico util; si no hubiera intrones, en el gen original s610 podria haber unos cuantos lugares en los cuales un intercambio por recombinaci6n entre moleculas hennanas de DNA podna duplicar el dominio. Los imrones, al permitir que la duplicaci6n tenga lugar potencialmente en mumos puntos en lugar de tan solo unos cuantos, incrementan en gran medida la probabilidad de que ocurra un fen6meno de duplicaci6n favorable. Por csta misma raz6n, la presencia de intrones incrementa en gran medida la probabilidad de que un fen6meno de recombinaci6n fortuito genere un hfbrido funcional a1 unir dos secuencias de DNA inicialmente separadas que codifican distintos dominios proteicos de forma que ambos dominios se conserven en la prote(na hfbrida que codifica el nuevo gen (vcase Figura 8-81, por ejemplol. En . muchas protefnas acluales se pueden ver los resultados esperados de estas recombinaciones (vease Figura 3·43). Asr, se cree que la gran separaci6n cntre los exones que codifican dominios individuales en los eucariotas superiores acelera el proceso por el cuallos fen6menos de recombinaci6n genetica al azar gencran nuevas proteinas utiles. Esto pod ria ayudar a explicar el exito de la evoluci6n de estos organismos tan complejos.

cromosoma

cromo,oml

,----, "

11

YlriOS genes (I

,

fl'

,

,

\ / I //

\ '00

•

Agura 8-76 Esquema evolutlyo de las cadenas de gJobina portadorns de oxfgeno en la 5llIlgre de los anlmaJes. EI esquema haee enfasis en la familia de las globinas IJ. Una duplicaci6n recienle del gen de la cadena yprodujo 'f y 't. que son eadenas fetales de tipo IJ con runciones identicas. En la parte superior de la figura se muestran las localizaciones de los genes de globina cn cl genoma humano.

ndena

~sada

La mayorfa de las protefnas se han originado probablemente

a partir de genes altamente fragmentados 48 El descubrimiento, en 1977, de los genes fragmemados. fue incsperado. Hasta entonces todos los genes que se habfan analizado con detalle eran genes baclerianos, los cuales no tienen intrones. Las bacterias tampoco lienen mlcleo ni sistemas de membranas intern as, tienen genomas mas pequei'ios que cl de las ceIulas eucariOtas y tradicionalmeme se considera que se parecen a las celulas mas sencillas a partir de las que han derivado las celulas eucariotas. No es sorpren· dent'e que la mayona de los bi610gos pensaran inicialmente que los introncs eran un rasgo extrafio y aparecido tardiameme en la linea de los eucariOtas. Sin embargo, ahora parece mas probable que los genes fragmemados tengan un origen muy antiguo y que las bact'erias hayan perdido sus intrones despucs de que hayan evolucionado sus protefnas. La idea de que los imrones son muy antiguos es compatible con los conceptos actuales de la evolucion proleica mediante recombinaci6n de prueba yerror de exones que codifican distilltos dominios proteicos. Ademas, se han obtcnido evidencias del antiguo origen de los inlrones mediante el examen del gen que codifica la ubicua triosafosfaro isomerasa. La triosafosfato isomerasa desempefia un papel esencial en el melabolismo de tOOas las celulas, catalizando la inlerOrganizacl6n y evolucl6n del genoma nuclear

cadena ligera

HOOC

COOH

Figura 8-77 Esquema representando Wla molecula de antlcuerpo (inmunoglobullna). Esta molecula es un complejo de dos cadenas pesadas y dos ligeras. idenlicas enlre sf. eada una de las cadenas pesadas contiene cuatro dominios similares unidos covalcnlemcnle. mientras que las cadenas Iigeras contienen dos de estoS dominios. cada dominio est' codificado por un ex6n diferente, yse cree Que todos ellos han evolucionado por duplicaciones seriadas a partir de un eron ancestral unico. 417

,

50 IImlno6cidol

posiel6n de 10. Inlronel en el mlliz

IAI

H,N

I

I

r

•

I

eaOH

posicion de 1oI1nt,OnM en 101 Yertebf"ado.

IBI

progenoltl

1111111111111

,

eubKteri.. que formeron los eIoropllltos y I.. milOCOt"ldti..

••• ------

I

j

-f. coil

S.CfII'~

(bacterial

llevadure'

IIIIIIIIIIIII~ I

I •••••• A$pergillu.

I......'

I

1.1. lUll marz (planll.l

.

I ......

o

yerteb.1IdolI (animal"'

conversi6n entre cl gliceraldehfdo-3 fosfato y la dihjdroxiacetona fosfato -un

paso central en In glucolisis y en In gluconeogenesis (vease Figura 2-21 l, Comparando la secuencia de aminoacidos de esta enzima de varios organismos es posihie deducir que la enzima cvolucion6 antes de la divergencia de los procariotas y

los cucariotas, a partir de un ancestro cornun; las secuencias de amino
Capitulo 8: EI m1c1eo celular

Figura 6·76 EI antiguo origen de los genes fragmentados. (A) Comparaci6n entre la eslmctura de los cxones del gcn de la triosafosfato isomerasa de las plantas y de los animales. Las posicioncs de los intrones que son Id~nlicas en cl mm {grano} y en los vertebrndos se han marcado con cabezas de fJccha IIerdes. y las que son diferenles, con cabezas de fJedUl awles. Dado que se eslima ellicmpo de divergencia entre planlas y animales en mil millones de aoos.los intrones deben compartir el mismo origen. (8) Esbom de romo puede haber evolucionado un gen delerminado. Las secuencias ex6nicas se muestran en roja y las intr6nicas en gris. El gen i1ustrado codifica una hipotetica prolefna necesaria para todas las celulas. Como la triDsa· fosfato isomerasa, esta protema debe haber evolucionado a1canzando su eslmctura uidimensional final anles de que los Iinajes de las eubaeterias, arquebaeterias y eucariolas se separaran de una celula antecesora comtln -designada como ~progenote~. La linea disconlinua uerde marca los momentos aproximados en que se produjeron fen6menos de endosimbiosis que dieron lugar a las milocondrias y a los doroplaslos (veanse pags. 21-22). (A. de W. Gilben, M. Marchionni y G. McKnight, Cell 46: 151-154, 1967. CCeIl Press.)

Tabla 8·4 Las lres famlllas prlnclpaJes de elementos transponlbles Estrnctura COrias

Genes en el elemento completo codifica transposasa

Sistemas de desplazamlento

eodifica una transeriptasa inversa y se parece a un retrovirus

se desplaza vfa un intermediario de RNA producido por el promotor en el LTR

codifiea una lnanscriptasainversa

se desplaza vfa un intennediario de RNA que probablemenle esta producido par un promOlor vecino

repeticlones invertidas en cada extremo

repeticiones terminales largas y repetidas de forma directa (LTRO) en los extremos

Poli-A en el extremo 3' del transcrilO de RNA; a menudo en el extremo S' esui lruncado

se desplaza como DNA, ya sea por escisi6n 0 siguiendo la vfa replicativa

EJemplos elemento P (Drosophila) Ae-Os (maiz) Tn3 e lSI (£ coli) Tam3 (drag6n) Copia (DrosoplJilnJ Ty (Ievadura) THE-I (humanos) Bsl (mafz) elemento F (Dro.soplllla) LI (humanos) Cin4 (maa)

Elitos elementos tlenen una longitud de enlle 2000 y 12000 pares de nucleOtidos: cada familia contiene muchos miembros, de los que en esla labia se reladoJ1M algunos, °LTR, de long reunlna! repeats.

de uno de sus intrones. Dado que la perdida de imrones requiere la uni6n exacta de las secuendas de DNA codificanles, se supone que este nuevo gen surgi6 a partir de una incorporaci6n poco freeuente en el genoma de una copia de DNA del mRNA del gen apropiado, del cual se habfan eljminado con precisi6n los intrones. Actualmente sabemos que los RNA mensajeros se pueden copiar en DNA a travf!s de la actividad de la lranscriptasa i,wcrsa (vease pag. 303), y se cree que las enzimas de recombinaci6n podrian permitir ocasionaLmente que estas copias se aparcaran con la secuencia original, la cualluego serfa "corrcgida" a una forma Iibre de intrones por un proceso de conversi6n g~nica. Esle mecanismo de perdida de intrones se ha podido demostrar en ellaboralorio empleado las polentes lecnicas de analisis genetico disponibles en S. cerelJisiae, Las transcriplasas illversas no se requieren en las vias geneticas mas importantes, pero son producidas en las celulas por elementos transponibles especfficos (v~ase Tabla 8-4), nsf como por lodos los retrovirus. Como se vera mas adelanle, la produccl6n de copias DNA de fragmentos de genoma mediante transcripci6n inversa ha contribuido de diferellles formas a la evoluci6n de los genomas de los organismos superiores.

Una fracci6n mayoritaria del DNA de los eucariotas superiores est:i form ada por secuencias de nucle6tidos repetidas y no codificantes49 Los genomas de las clilulas eucariolas no s610 contiencn intrones, sino que lambif!n presentan un gran mimero de copias de otras secuencias de DNA, aparentemente no esenciales. que no codifican protefnas. La presencia de estas secuencias repctidas de DNA en los eucariotas superiores se puso de manifiesto en primer lugar medianle una tecnica de hibridaci6n que mide el numero de copias genicas. En estc proceso el genoma se rompe mecanicamente en conos fragmenlOS de DNA de doble helice. de aproximadamente 1000 pares de nucle6tidos, y estos fragmemos se desnaturalizan produdendose cadenas sencillas de DNA. La velocidad con In cual los fragmemos de DNA de cadena sencilla de la mezcla se welven a unir fonnando fragmemos de doble hebra, en condiciones en las que la confonnati6n de la doble b~lice es eSlable, depende de cuanlO liempo tarde cada fragmento en encontrar una secuencia complemenlaria con la que aparearse, 10 que a su vez depende de la concentraci6n de los fragmemos

Organizad6n y evoluct6n del genoma nuclear

419

ATAAACTATAAACTATAAACT

DNA

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5' J'=

TATTTGATATTTGATATTTGA

3' S'

adecuados en la mezcla. Generalmente esta reacci6n es muy lema. Por ejemplo, el genoma haploide de una c~lula de mamIfero formam. aproximadamente 6 millones de fragmentos de 1000 nucle6tidos cada uno; cualquier fragmento cuya secuencia se halle en una sola copia tendra que colisionar al azar con 6 miJIones de cadenas no compJememarias para encontrar la suya. Cuando el DNA de una celula humana se analiza de esta forma en condicio-

nes que requieran un emparejamienlo perfecto (condiciones de elevada severidad, vease Figura 7-17), alrededor del 70 % de las hebras de DNA se aparean tan lentamente como se podr(a esperar para una gran colecci6n de fragmcnlos de secuencia unica (no repetida). requiriendo varios dfas para un apareamiento completo. Pero el 30% rest ante de las hebras se unen mucho mas rapidamente. Est'as hebras contienen secuencias que estan repetidas much as veces en el genorna, y por 10 tanto colisionan con una hebra complemenlaria de una forma relativamente rei-pida. La mayorfa de estas secuencias de DNA altamente repetidas no codifican prOle(nas. y son de dos tipos: aproximadamcnte una tercera parte son DNA slllelites repetidos en tandem, de los que trataremos a continuaci6n. y el resto son DNA repetidos illtercalados. La mayorfa de estas tiltimas secuencias de DNA derivan de unas cuantas secuencias de DNA transponibles que se han multiplicado hasta dar lugar a un alto numero de copias en el genoma humano.

Las secuencias de DNA satl!lite no tienen ninguna funci6n conocida59 Nonnalmente. las hebras de DNA que en un experimento tipo como el que se acaba de describir forman doble hebra mas rapidamente son repeticiones en tandem muy largas de una secuencia de nuc1e6tidos carta (Figura 8-79). La unidad repeliliva de una secuencia de este tipo puede estar compuesta de tan 5610 uno 0 dos nucle6tidos; sin embargo, muchas de las repeliciones son largas, yen mamfferos estan formadas tfpicamente por variantes de una corta secuencia organizada en repeticiones de unos cuantos centenares de nude6tidos. Estas repeticiones en tandem de una secuencia senci11a se denominan DNA satelites debide a que las primeras secuendas de este tipo que fuerOll descubiertas tenian una proporci6n poco habitual de nucle6tidos, 10 que hizo posible su aislamiento del grueso del DNA celular como un componente minoritario (0 "sattmte"). Generalmente las secuencias de DNA sat~lite no se transcriben y muy a menudo estan localizadas en la helerocromatina asociada con las regiones centromericas de los cromosomas. En algunos mantfferos, un solo tipo de secuencia satelite constituye el 10% 0 mas del DNA, e incluso puede Uegar a ocupar un braze eOlero de un cromosoma. de tal modo que la celula contiene mUiones de copias de la secuencia repetida basica. Parece que las secuencias sat~Lite de DNA han cambiado en el curso de la evoluci6n de una fonna extraordinariamente rapida, e incluse han cambiado sus posiciones en los cromosomas. Por ejemplo, cuando se comparan dos cro· mosomas mit6ticos hom610gos de cualquier humano, algunas de las secuencias de DNA satelite se encuentran dispuestas de manera notablemente diferente en los dos cromosomas. Ademas, en contraste con el alto grado de conservaci6n de las sccuencias de DNA de cualquier parte del genoma, general mente existen marcadas diferencias en las secuencias del DNA sat~lite de dos especies Intimamente relacionadas. Todavfa no se ha encontrado ninguna funci6n para las secuencias de DNA satelite: por elmomento, los experimentos disenados para demoslrar que estas secuencias participan en el aparcamiento de cromosomas 0 en la organizaci6n nuclear no han conseguido revelar ningun tipo de evidencia 420

Cap((ulo 8: EI nucleo celular

Figura 8·79 DNA satellte. Se muestra una secuencia senciUa de DNA satelite de Drosopllila. Consiste en muchas repeticiones de una secuencia de siete nude6tidos organizadas en serie, y se presentan en miUones de copias por genoma haploide de Drosophila.

en este sentido. Par 10 tanto se ha sugerido que estas secuencias repetidas son una forma extrema de secuencias "de DNA egofsta", cuyas propiedades aseguran su propia rctcnci6n en el genoma pero que no hacen nada para ayudar a la supervivencia de las clilulas que los contienen. Otras secuencias que habilualmente se consideran como egofslas son los elementos rrallspollibles, que explicamos a conlinuaci6n.

La evoluci6n de los genomas se ha acelerado mediante al menos

tres tipos de elementos transponibles:a

Generalmente los genomas contienen muchas variedades de elementos transponlbles. Estos segmentos de DNA IUeron descritos por primera va en el mafz, y varios de ellos han sido secuenciados y caracterizados. Los elementos transponibles de eucariotas se han estudiado muy ampliamente en Drosophila, donde se conacen mAs de 30 variedades, que oscilan entre 2000 y 10 000 pares de nucle6tidos de longitud y est<1n presentes en mimero de entre 5 y JO copias por cl:lula diploide. Se pueden distinguir a) menos tres grandes c1ases de elementos transponibles en funci6n de las peculiaridades de organizaci6n de su secuencia (Tabla 8·4). Algunos elementos se desplazan de un lugar a ouo entre cromosomas, en forma de DNA, mientras que muchos otros se mueven via un intennediario de RNA, como se describe en el CapItulo 6. En cualquier casa se pueden multiplicar y extender desde un lugar de un genoma a multitud de otros puntos, comport
elemenlO eromosome trensponible 123456789 .. ABCDEF

! ~ I

INSEROON DEL ELEMENTO TRANSPONIBLE EN UN NUEVO LUGAR DEL CAOMOSOMA,

123458ABCOEF58789 duplicaci6n de Ie MCOIIncie del h.oger de inserei6n 123458A58789

-=i~

i

Incomplete del elemento Irenlj)OOiblll

CAMBIOS DE SECUENClA PROVOCAOOS POR EL ELEMENTO TRANSPONIBLE

123456511789 0

i

1234566556789 0

ncl-.i6n preciu dejendo .. duplicaci60

Organlzacl6n yevolucl6n del genoma nuclear

.1

i

esclsiOn con MCuencie elllfll in\/enidll

..,.... 1258789

0

etei.iQn eon delfleiOn

Figura 8·80 Algunos camblos producldos en el DNA cromos6mJco por los elementos transponlbles. La inserci6n de los elementos transponibles siempre provoca una pequei'la duplicad6n de la secuencia dellugar de inserci6n. de entre 3 a 12 pares de bases. dependiendo del elemento transponible. Las enzimas de recombinaci6n especifica de lugar asociadas con el elemento transponible pueden produdr su eliminaci6n del cromosoma. proceso en el que frecuentemente no se recupera la secuencia del DNA cromos6mico original. como se muestra en los roatro eje:mplos.

421

elemenlos trens e~6n

1A

e~6n

2A

nibles e~6n

3A

/ le,min.les repetidOll

GEN A Que conUene dos elemenlOs Irensponibl8ll slmillr8ll en loslntron8ll ESOSION ANOMAlA DEL EXON 2A POR UNA TRANSPOSASA QUE RECONOCE LOS TERMINALES REPETlDOS

.....+--t'f \ / uOn 2A

fregmento del GEN A

e~On

e~6n 38

18 ex6n 28

~1~E'~I:

lNSERClON EN EL INTERIOR DEL GEN 8 e~On

18 e~6n 28

e~On

2A

ex6n 3B

/

GEN B con un e~On eXlr.

shuffling), por 10 que estos elementos pueden ayudar a crear nuevas genes (Figura 8-81).

Los elementos transponibles afectan frecuentemente ala regulaci6n g~nicaS: Se ha observado que, can frecuenda. las redistribudones de las secuendas de DNA provocadas par los elementos lransponibles alteran el momenta, el nivel, a el patr6n espadal de expresi6n de los genes cercanos. sin afectar 13 secuenda de la proterna 0 del RNA que codifica el gen. Eslo puede cambiar un aspecto sulil del desarrollo del animal planta. como la forma de un ojo de una flor. Podrfa esperarse que la mayorfa de estos cambios en la regulad6n genica fueran perjudidales para un organismo, pero algunos de eUos podrian aportar nuevas benefidos y de esta ma.l1era se extenderian en la poblaci6n por selecd6n natural. Los ereclos sobre la regulaci6n genica son comunes, en parte, debido a que el movimiento de un elemento Iransponible suele arrastrar con el nuevas secuencias que aCllIan como lugares de uni6n para protefnas de uni6n a DNA espedficas de secuencia. incluyendo lransposasas y las protefnas que regulan In transcripci6n del DNA del clemen to transponible. Por 10 tanto, estas secuencias pueden actuar como sccuencias reguJadoras denominadas Increme.l1tadores 0 actlvadores (enhancers) (vease pag. 451), y afectar la uanscripci6n de genes 10Caliz.1dos en las proximidades. Frecuentemente est'Os efectns son la causa de la evoluci6n de las celulas cancerosas, en las que se pueden crear oncogenes por la transposici6n de tales secuencias reguladoras en las proximidades de un proto· oncogen, como se describirA en el Capftulo 24. La organizaci6n de los genomas de los eucariota superiores, can largas secuencias de DNA no codincanle intercaladas can secuencias comparativamente cortas de DNA codificante, proporciona un c6modo ~campo de jucgo" para 1a integraci6n y supresi6n de secuencias de DNA m6viles. Dado que la transcripci6n genica pucde estar regulada desde dislancias de decenas 0 miles de pares de nucle6lidos de un promolor, pod ria esperarse que muchos de los cambios resuhanles en el genoma arectaran a Ja expresi6n genica; par cl conlrario, cabe esperar que relativamcnte pocos cambios rompieran los conos exones que contienen las secuencias codificantcs. tEste gran exceso de DNA no codificante de los eucariota superiores puede habcrse vista favorecido par la selecci6n durante la evoluci6n a consecucncia de Ja fJexibilidad reguJadora que proportiona a los organismos que presentan una gran variedad de elementos lransponibles? Lo que se conoce sobre los sistemas reguladores que controla.l1 los genes de los orga.l1ismos eucariotas superiores es consistente con esta posibilidad. Al parecer Jos amplificadores, como los exones.

°

422

Capftulo 8: EI nuclen celular

°

Figura 8·81 Ejemplo de baraJado de exones que puede estu provocado por los elementos transponlbles. Cualldo ocurre que dos elementos del mislnO tipo (DNA raja) se insertan uno cerca del otro en el cromosoma, los mecanismos de Iransposici6n pueden usar los extremos de dos elememos diferenles {en lugar de los dos extremos del mismo elemenlol y de esla forma se desplazara el DNA que habra entre ellos a un nuevo sitio del cromosoma. Dado que los intrones son relalivamente m!s largos que los exones. es frecuente la inserd6n de un nuevo ex6n en el interior de un intron preexistenle.

acnian como m6dulos direrentes; la aClividad de un gen depende de la suma de influencias recibidas por su promolOr a partir de un conjunto de amplificadores (vease Figura 9·44). AI desplazar estos m6duJos activadores por lodo el genoma, los elementos transponibles pueden permitir que la regulaci6n genica sea optimi7.ada para la supcrvivencia de los organismos a largo plazo.

Las 'jexplosiones de transposici6n" provocan cambios catastr6ficos en los genomas e incrementan la diversidad biol6gica53 Otro rasgo unico que caracteriza a los elementos transponibles como mUldgenos es su tendencia a sufrir Largos periodos quiescentes durante los cuales pennanecen fijos en sus posiciones cromosOmicas, seguidos por un periodo de intenso movimicnlo. Su transposici6n, y por consib'Uiente so acci6n mutagenica, se activa de vcz en cuando en unos cuantos individuos de una poblaci6n de organismos. EsIOS cambios calaSlr6ficos en los genolllas, denominados explosiones de trallSposici6n (transposition bUTStS), pueden implicar transposiciones casi simultaneas de varios tipos de elemenlos transponibles. Las explosiones de transposici6n fueron observadas por vez primera en las plantas de maiz que eslaban sujetas a rolUra cromos6mica repetida. Tambien rueron observadas en cruces enlre cierlas cepas de moscas -un ren6meno conocido como disgenesis hfbrida. Cuando OCUITcn en la linea germinal, illducen multiples cambios en el genoma de la progcnie individual dc la mosca 0 In plantn. Mediante cl cambio simullaneo de varias propiedades de un organismo, las explosiones de lransposici6n incrementan la probabiJidad de que dos nuevos rasgos que son utiles conjunlamente pero de nulo valor seleclivo por si mismos, aparezcan en un individuo de una poblaci6n. En varios tipos de plantas existen evidencias de que las explosiones de transposici6n pueden ser activadas por esIres ambienlal severo, creando una variedad de organismos de la progenie modificados al azar, algunos de los cuales pueden adaptarse mejor a las nuevas condiciones que sus padres. Parece que, al menos en estas plantas, ha evolucionado un mecanismo de activaci6n de los elememos lransponibles para que aclIjen como mutagenos y creen un amplio rango de organismos variantes cuando esta variaci6n es mas necesaria. Asi, los elementos lransponibles no son necesariamenle parasilos desorganizadores; por el contra rio, ocasionalmente pueden actuar como simbiontes utiles que colaboran en la supervivencia, a largo plazo, de las especies cuyos genomas habitan.

Aproximadamente un 10% del genoma humano consiste en dos familias de elementos transponibles54 EI DNA de los primales es especial, al menos en un aspecto: comiene un elevado nl1mero de copias de dos secuencias de DNA transponibles que parecen haber invadido nuestros cromosomas. Ambas secuencias se desplazan mediante un proceso mediado por RNA que requiere de la presencia de una transcriptasa inversa. Uno de elias es el elemenlo Iransponible L1, que se parcce aI elemenlo F de Drosophila, y al elemento Cin4 delmafz; al parecer codifica una transcriptasa inversa (vease Tabla 8·4, pag. 419). Los elementos tTansponibles han evolucionado en general con sistemas de control par retroalimentaci6n que Iimitan severamente su mimero en cada celula (salvando por 10 tanto a la celula de un desastre potencial); sin embargo, el elemento LI en los humanos constituye aproximadamente un 4 % de la masa tOlal del genoma. Menos habitual incluso es la secuenclaAlu, que es muy corta (aproximadamente 300 pares de nucle6tidos) y que se desplaza igual que un elemento transponible, creando duplicaciones especificas de lugar cuando se inserta. Sill embargo, deriv6 a partir de un gCll de RNA 7SL, internamcnte delecionado de una celula huesped, el Cllal codifica el componcnte RNA de la partfcula de reconocimienlO de senal (SRP) que actua en la sintesis proteica (vease Figura 12-39); por 10 tanto no esla claro si la secuencia Alu se tiene que considerar como un eleOrganlzacl6n y evoluci6n del genoma nuclear

423

mento rransponible 0 como un pseudogen m6vil, poco habitual. Estd presente en aproximadamente SOO 000 copias por genoma haploide y conslituye un 5% del DNA humano; par 10 tanto esl
Resumen Las secuencUu de DNA ftmciotudes de los KE'nonuu de los eucarlotas superlores po-

recen esror couslrllidas a partir de peqll.eiios m6dulos gelllficos de al mellos dos Iipas. Los ",6dulos de secuencUu codiftctlllles esldn oombinados ell nmWtud de formas producielldo prote{nas, mlenlra$ que los ",6d"los de U!'CuencUu regllUuloras esldn repartidos a 10 largo de gralldes extenslones de secuellclas 110 codlJlctmtes y regJllan In expres16n de los genes. Tanto las sec"ellclas codlf1cantes COIIIO las reg"ladoras Upicamel/te se orgallium ell mOdulos mellores a Ilnos Clumtos clentos de IUlcte6tidos, y en conjlltlto solo sllpmre'lllIItI peqlleilafracc16n del tolal de DNA. En los gellomas se prodllC:e IUlll graIl uarletlml de procesos de recomb"racMn gellefica, que provocall la tllI.plicacJ6n y trallslacad6n al lULlr de Ins UCllellclas de DNA. AIgzmos tie estos cambios t:reIIII dl.plicados de genes enteros, de los que pr.edell emlucionar IIuevas ft,nciolles. Otros produam nuevas prote{nas me:u:lnudo uones 0 mOOiftcnnrkJ In expresM/I de lliejos gelles al expollerlos a nuevas SKuencUu reguladora.s. Este tipo de mez.cln de secuencia.s, de gran imparranda para la euoluci6n de los organlsmos, se ve mllY faciUtada por In estnlCfura partida de los genes de los eucarlotas superlores y por el 1l«lw de que alOS genes esufn j'rocllelltemente controlados por secuellcias reguladoras alejadns. En los gelwmas existen nlllc1lOs tipos de erementos fransponibles. Colectiuamellte, collsfifllyen "Ids del 10% de la IIlllSQ del gelloma de Drosophila y de los llertebrados. Ocasionalmellte, en las dlillas germinales OCllrren "exploslones de trailSposici6n" que IJfOlJOCall llUlCllos clltllbios Ileredltarlos ell la expresi6n gelllca del intlilliduo. Se cree que los elementos transponibles "all jU8{1{lo "n papel evollltilJO especial ell In generacl611lW In tliversltlad de los orgtltllsmos.

Bibliograffa

Mcuenciu AJu humllnll$

,

500 000 c:opias

MclHlncillS B' de rllt6fl

,--,

......

00'000

60

Figura 8-82 Patron de evolucl6n propueslo para las abundantes secuendasAlu humanas. En el genoma de ral6n se encuenlra 81, un elemento transponible similar aAlu. Se cree que ambas secuenclas de DNA transponlbles han evolucionado a partir dcl gen RNA 7SL Sin embargo, basados en la distribuci6n y homologla de secuencia de estos elementos altamente repetidas, se cree que el mayor incremento del numera de copias ha tenida lugar independienlemente en cl rat6n yen el hombre. (Adaptada de P.L Deininger y G.R. Daniels, Trends Gen.

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,.

(A,

10'

Palrones de expresi6n g~nica dependientes de posici6n. en cualro embriones transg~nicos direrentes de Drosophila. Cada embri6n liene, insertada en su genoma, una sola copia de una gen de la fI'galactosidasa bacteriana. Dependiendo del cromosoma en el que se haya producido la Inserci6n, distinlOs activadores cercanos de Drosophila hacen que el gen se exprese siguiendo un patron que corresponde a (A) traquea y mesoectodermo, (O) sistema nervioso, (el celulas gHales del sistema nervloso central mas un patron repetilivo en cada segmento, 0 (D) mt'iscul0. (Por conesfa de Yuh-Nul1gJan.)

Patrones de expresiongenica dependientes de posicion, en cuatro embriones transgenicos diferentes de Drosophila. Cada embrion tiene, insertada en su genoma, una sola copia de una gen de la ~-galactosidasa bacteriana. Dependiendo del cromosoma en el que se haya producido la insercion, distintos activadores cercanos de Drosophila hacen que el gen se exprese siguiendo un patron que corresponde a (A) traquea y mesoectodermo, (B) sistema nervioso, (C) celulas gliales del sistema nervioso central mas un patron repetitivo en cada segmento, 0 (D) musculo. (Par cortesfa de Yuh-Nung Jan.)

EI control de la expresi6n genica

El DNA de un organismo codifica todas las moleculas de RNA y de proteina necesarias para la construccion de sus celulas. Sin embargo, la descripcion completa de la secuencia de DNA de un genoma -tanto los pocos millones de nucleotidos de una bacteria como los escasos miles de millones de nucleotidos del genoma humano- no nos permitiria reconstruir un organismo, como tampoco podriamos reconstruir una obra de Shakespeare a partir de una lista de palabras inglesas. En ambos casos el problema radica en saber como se utilizan los elementos de secuencia de DNA 0 las palabras de la lista. lEn que condiciones se produce cada uno de los productos genicos y, una vez producido, que hace? En este capitulo se abordanl la primera parte de este problema -las reglas que determinan que en cada celula solo se expresen especificamente una seleccion de genes. Los mecanismos que controlan la expresion de los genes actuan a varios niveles, que trataremos aqui. Sin embargo, el capitulo se inicia con una introduccion a algunos de los principios basicos del control genico en los organismos pluricelulares.

Introducci6n at control genico Los distintos tipos celulares de un organismo superior suelen diferir profundamente tanto en estructura como en funcion. Si comparamos, por ejemplo, una neurona de mamifero con un linfocito, observaremos que las diferencias son tan grandes que se hace dificil imaginar que ambas celulas contienen el mismo genoma. Por esta razon y porque la diferenciacion celular suele ser irreversible, los biologos inicialmente sospecharon que durante el proceso de diferenciacion de las celulas los genes se deberian perder de modo selectivo. Sin embargo, actualmente sabemos que la diferenciacion celular depende generalmente de cambios en la expresion genica y no de la perdida de genes.

Los distintos tipos celulares de un organismo pluricelular contienen el mismo DNAl Los tipos celulares de un organismo pluricelular se diferencian unos de otros porque sintetizan y acumulan distintos juegos de moIeculas de RNA y de proteinas. Ello 10 consiguen sin alterar de modo irreversible su DNA. La mejor evidencia de la conservacion del genoma durante la diferenciacion celular proviene de una serie de experimentos clasicos con ranas. Cuando se inyecta el nUcleo de una 429

--,--

-

seccion de zanahoria

~

-masa celular en proliferacion

-celulas separadas en un medio liquido enriquecido

una sola celula

cion organizado de celulas en division

celula totalmente diferenciada de rana en un huevo cuyo mlcleo ha sido eliminado, el mlcleo "dador" inyectado es capaz de programar el huevo receptor para que produzca un renacuajo normal. El renacuajo contiene un espectro completo de celulas diferenciadas, las cuales han adquirido sus secuencias de DNA a partir del m'i.cleo de la celula dadora original, 10 cual significa que la celula dadora diferenciada no ha perdido ninguna secuencia importante de DNA. En experimentos realizados con varias piantas se ha llegado a una conclusi6n similar. En estos experimentos se cultivaron fragmentos de tejido diferenciado en un medio de cultivo sintetico y de estos fragmentos se disociaron celulas individuales. A menudo cada una de estas celulas es capaz de regenerar una planta adulta entera (Figura 9-1). Otra prueba de que durante el desarrollo de los vertebrados ni se pierden ni se reorganizan grandes bloques de DNA proviene de la comparaci6n de los patrones de bandas que se detectan en los cromosomas mit6ticos condensados de distintos tipos celulares (vease Figura 8-32). SegUn este criterio, parece que los conjuntos de cromosomas de todas las celulas diferenciadas del cuerpo humano son identicos. Ademas, la comparaci6n de los genomas de diferentes celulas, basados en tecnicas de DNA recombinante, muestran, por 10 general, que los cambios de expresi6n genica que subyacen al desarrollo de los organismos pluricelulares no van acompafiados de cambios en las secuencias de DNA de los genes correspondientes (para una excepci6n importante de este principio, vease Figura23-27).

Distintos tipos celulares sintetizan distintos conjuntos de protefnas2 Un primer paso para tratar de entender la diferenciaci6n celular podrfa consistir en averiguar cuantas diferencias existen entre dos tipos celulares dados. Aunque la respuesta a esta cuesti6n fundamental todavia se nos escapa, podemos hacer algunas afirmaciones generales: 1. Muchos procesos son comunes a todas las celulas. Por 10 tanto, dos celulas

cualesquiera de un organismo presentaran muchas proteinas en comun. Entre elIas se encuentran algunas proteinas abundantes que suelen ser faciles de analizar, como por ejemplo las proteinas estructurales principales del citoesqueleto y de los cromosomas, algunas de las protefnas esenciales para las membranas del reticulo endoplasmtitico y del complejo de Golgi y las protefnas ribosomales. Muchas protefnas poco abundantes, como las distintas enzimas implicadas en las reacciones centrales del metabolismo, tambien son comunes a todos los tipos celulares. 2. Algunas proteinas son abundantes en las celulas especializadas en las que actuan pero no se pueden detectar en ningun otro tipo celular, aunque se utilicen metodos muy sensibles. La hemoglobina, por ejemplo, s6lo se puede detectar en los eritrocitos. 3. Si se comparan las, aproximadamente, 2000 proteinas mas abundantes (las que se hallan presentesen mas de 50 000 copias por celula) de distintos tipos celulares del mismo organismo, utilizando electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida, sorprendentemente se detectan muy pocas 430

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

embrion joven

planta joven

,

zanahoria

Figura 9-1 Regeneraci6n de una planta completa a partir de una Unica celula diferenciada. En muchos tipos de plantas, las celulas diferenciadas retienen la capacidad de "desdiferenciaci6n" de modo que una sola celula puede generar un clan de celulas descendientes, que despues podrei dar lugar a una planta entera.

diferencias. Tanto si se comparan dos lineas celulares en cultivo (por ejemplo lineas de celulas musculares y nerviosas) como si se escogen celulas de dos tejidos de roedor (por ejemplo el higado y el pulmon), la inmensa mayoria de las proteinas que se detectan en ambos tipos celulares se sintetizan en proporciones que difieren en menos de cinco veces; en los dos tipos celulares solo aparecen en cantidades muy diferentes un pequeno porcentaje de las proteinas. Estudios sobre el numero de secuencias de mRNA distintas de una celula sugieren que cada celula tipica de un eucariota superior sintetiza entre 10 000 Y 20 000 proteinas distintas. La mayoria de ellas son demasiado escasas para que puedan ser detectadas a partir de extractos celulares mediante electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida. Si estas proteinas celulares menores difieren entre las diferentes tipos celulares en la misma magnitud en la que difieren las proteinas abundantes, 10 cual es 10 mas probable, es posible que el numero de proteinas diferentes suficientes para crear grandes diferencias de morfologia y comportamiento celular sea bastante pequeno (quiza solo de varios cientos).

Una celula puede cambiar la expresi6n de sus genes como respuesta a sefiales externas3 La mayor parte de las celulas especializadas de un organismo pluricelular son capaces de alterar su patron de expresion genica como respuesta a senales extracelulares. Por ejemplo, si se expone una celula del higado a una hormona glucocorticoide, se incrementa dramaticamente el nivel de produccion de algunas proteinas especificas. Los glucocorticoides se liberan durante periodos de ayuno o de ejercicio intenso e indican al higado la necesidad de producir mas glucosa a partir de aminoacidos u otras pequenas moleculas; el conjunto de las proteinas cuya produccion se induce incluye enzimas como la tirosina aminotransferasa, que contribuye a convertir tirosina en glucosa. La produccion de estas proteinas recupera sus niveles normales cuando la hormona desaparece. Otros tipos celulares responden a los glucocorticoides de diferente manera. Por ejemplo, los adipocitos reducen la produccion de tirosina aminotransferasa, mientras que otros tipos celulares no responden a los glucocorticoides de ninguna forma. Estos ejemplos ilustran una caracteristica general de la especializacion celular -frecuentemente diferentes tipos celulares responden en diferente forma a la misma senal extracelular. Subyaciendo a esta especializacion existe una serie de rasgos que no cambian, y que confieren a cada tipo celular sus propiedades caracteristicas. Estos rasgos reflejan la expresion constante de diferentes conjuntos de genes.

La expresi6n genica se puede regular en muchas de las etapas de la via que conduce desde el DNA al RNA Ya las proteinas4 Si las diferencias que existen entre los distintos tipos de celulas dependen de los genes concretos que estas celulas expresan, la que nivel se ejerce el control de la expresion genica? La via que conduce desde el DNA a las proteinas esta formada par muchas etapas, y en principio todas ellas se pueden regular. Asi, las celulas pueden controlar la sintesis de proteinas (1) regulando el momenta y la frecuencia de la transcripcion de genes concretos (control transcripcional), (2) controlando el modo de maduracion 0 procesamiento de los transcritos primarios de RNA (control del procesamiento del RNA), (3) seleccionando los mRNA maduros que van a ser exportados al citoplasma (control del transporte de RNA), (4) seleccionando los mRNA citoplasmaticos que van a ser traducidos por ribosomas (control traduccional), (5) desestabilizando selectivamente algunas moleculas de mRNA citoplasm
431

-

1 control transcripcional

- ~ ..

N.U ... C.. L .•. E ...•O.. . .

2

control del procesamiento del RNA

CITOPLASM. A.

3 control del transporte del RNA

--

degradaci6n 5 control de la de los mRNA

control traduccional

4

control de la actividad proteica 6

II1II-

Para la mayoria de genes, los controles transcripcionales son los mas importantes. Esto tiene sentido ya que de todos los posibles puntos de control ilustrados en la Figura 9-2 solamente el control transcripcional asegura que no se sinteticen intermediarios superfluos. A continuacion se describiran los componentes de DNA y proteinas que regulan la iniciacion de la transcripcion genica. AI final del capitulo se describiran los otros mecanismos que permiten regular la expresion de los genes.

Resumen EI genoma de una celula contiene en La secuencia de su DNA la informacion para producir miles de protefnas y moIeculas de RNA diferentes. Una celuLa expresa, tfpicamente, solo algunos de sus genes, y los diferentes tipos celuLares de los organismos pluriceluLares se forman porque expresan diferentes conjuntos de genes. Ademas, las celulas pueden cambiar el patron de expresion de sus genes en respuesta a cambios en su ambiente, tales como seiiales que provengan de otras celulas. Aunque totlas las etapas implicadas en La expresion de un gen pueden en principio estar reguladas, el punta de control mas importante en La mayorfa de los genes es La iniciacion de la trascripcion a RNA.

Motivos estructurales de union a DNA en las proteinas de regulacion genica5 lComo puede una celula determinar cuaIes de sus miles de genes se han de

transcribir? Como se ha expuesto en el Capitulo 8, la transcripcion de cada gen esta controlada por una region de DNA proxima allugar donde se inicia la transcripcion. AIgunas regiones reguladoras son simples y actuan como interruptores activados por una senal unica. Otras regiones reguladoras son complejas y actuan a modo de minusculos microprocesadores, respondiendo a una variedad de senales, que interpretan e integran para decidir si activan 0 no el gen vecino. Sean simples 0 complejos, estos dispositivos interruptores constan de dos tipos de componentes fundamentales : (1) cortas secuencias de DNA definidas, y (2) proteinas de regulaci6n genica que las reconocen y se unen a elIas. Iniciaremos la discusion de las proteinas de regulacion genica describiendo como fueron descubiertas.

Las proteinas de regulacion genica se descubrieron utilizando tecnicas de genetica bacteriana6 Los analisis geneticos realizados en bacterias durante los anos cincuenta aportaron las primeras evidencias de la existencia de proteinas de regulaci6n genica capaces de activar 0 desactivar conjuntos especificos de genes. Unos de estos reguladores, el represor lambda, esta codificado por un virus bacteriano, el bacteri6fago lambda. El represor inactiva los genes del virus que codifican los compo432

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

Figura 9-2 Seis etapas en las que se puede controlar la expresi6n genica en los eucariotas. En este capitulo s610 se comentan las etapas de la 1 ala 5. La regulaci6n de la actividad proteica (etapa 6) se describe en el Capitulo 5; esta incluye activaci6n e inactivaci6n reversible par fosforilaci6n proteica asi como inactivaci6n irreversible por degradaci6n proteolftica.

nentes proteicos de las nuevas partfculas viricas y por ella capacitan al genoma virico para permanecer en el cromosoma bacteriano como un pasajero silencioso, multiplicandose con la bacteria cuando las condiciones son favorables al crecimiento bacteriano (vease Figura 6-80). El represor lambda fue de las primeras proteinas de regulaci6n genica que se caracterizaron, y continua siendo una de las mejor conocidas como se vera mas adelante. Otros reguladores bacterianos responden a condiciones nutricionales inactivando conjuntos de genes que codifican grupos de enzimas del metabolismo que ya no se necesitan. Por ejemplo, el represor lac, la primera de estas proteinas bacterianas que se descubri6, inactiva la producci6n de proteinas implicadas en el metabolismo de la lactosa cuando esta no se encuentra disponible en el medio. La primera etapa hacia la comprensi6n de la regulaci6n de los genes fue el aislamiento de cepas de bacteria y de bacteri6fago lambda mutantes incapaces de inactivar determinados grupos de genes. En aquel tiempo se propuso, y posteriormente se demostr6, que la mayona de esos mutantes eran deficitarios en proteinas que actuaran como represores especificos de esos grupos de genes. Debido a que estas proteinas, como la mayona de las proteinas reguladoras, se encuentran en pequefias cantidades, su aislamiento fue muy dificil y largo. Se purificaron mediante fraccionamiento de extractos celulares en series de columnas cromatograficas (veanse pags. 176-179). Una vez aisladas, se observ6 que las proteinas se unian a secuencias de DNA pr6ximas a los genes que regulaban. Las secuencias de DNA que reconocian fueron determinadas mediante una combinaci6n de genetica clasica, secuenciaci6n de DNA y experimentos de huella en el DNA (descritos en el Capitulo 7).

El exterior de la helice de DNA puede ser leido por proteinas7 Tal como se ha descrito en el Capitulo 3, el DNA de un cromosoma esta formado por una doble helice muy larga (Figura 9-3). Las proteinas reguladoras deben reconocer secuencias especificas en el interior de esta estructura. En un principio se pens6 que para ser capaces de distinguir una secuencia de DNA de la otra, estas proteinas deberian acceder a los enlaces de hidr6geno entre pares de bases en el interior de la doble helice. Sin embargo, actualmente se sabe que las proteinas reguladoras pueden reconocer la informaci6n acerca de la secuencia de DNA desde el exterior de la doble helice, sin necesidad de abrirla. El borde de cada par de bases esta expuesto en la superficie de la doble helice, presentando un patr6n caracteristico de aceptores y dadores de enlaces de hidr6geno y parches hidrof6bicos reconocibles por proteinas, tanto en el surco mayor como en el menor (Figura 9-4). Pero, unicamente en el surco mayor los patrones son unicos para cada uno de los cuatro apareamientos de bases (Figura 9-5). Esta es la raz6n de que la mayona de las proteinas de regulaci6n genica se unan al surco mayor, como se vera. A pesar de que los rasgos mas importantes reconocidos por las proteinas reguladoras son los grupos dadores y aceptores de enlaces de hidr6geno, no son los unicos; la secuencia de nucle6tidos determina asimismo la geometria global de la doble helice.

surco manor

surco mayor

La geometrfa de la doble helice de DNA depende de la secuencia de nucle6tidos8 Durante los 20 afios siguientes al descubrimiento de la doble helice del DNA en 1953, se pens6 que el DNA tenia siempre la misma estructura mon6tona, con exactamente 36° de giro de helice entre pares de nucle6tidos adyacentes (10 pares de bases por vuelta de la helice) y una geometria helicoidal uniforme. Sin embargo esta visi6n, que procedia del estudio estructural de mezclas de DNA heterogeneo, cambi6 cuando se resolvieron las primeras estructuras tridimensionales de secuencias cortas de DNA mediante cristalografia de rayos X y espectroscopia NMR. Mientras que los primeros estudios mostraban una imagen meMotivos estructurales de uni6n a DNA en las protefnas de regulaci6n genica

Figura 9-3 Estructura de doble helice del DNA. Se sefiala el surco mayor y el menor en el exterior de la doble helice. Los Momos se han coloreado coma sigue: carbono, azul oscuro; nitrogeno, azul claro; hidrogeno, blanco; oxigeno, rojo; fosfora, amarillo.

433

surcO maYor

surco maYOr

• SUrco men of sufCO maYor

surco maYOr

.

I\II\H-N

Figura 9-4 C6mo es posible reconocer los apareamientos de bases a partir de sus bordes sin necesidad de abrir la doble helice. Se muestran las cuatro configuraciones posibles de pares de bases, con los dadores de enlaces de hidr6geno indicados en azul, los aceptores de enlace de hidr6geno en rajo y los propios enlaces de hidr6geno como series de lfneas rajas cortas y paralelas. Los grupos metilo que forman protuberancias hidrof6bicas se han indicado en amarillo, y los ;itomos de hidr6geno que estan unidos a carbono y son por tanto inaccesibles a los enlaces de hidr6geno se sefialan en blanco.

Surco menOf

dia de una molecula de DNA idealizada, los ultimos mostraron que cualquier secuencia nucleotfdica presenta irregularidades locales, como pares de bases inclinados 0 angulos de giro mayores 0 menores a 36°. Estos rasgos unicos pueden ser reconocidos por las protefnas reguladoras. Un caso especialmente remarcable de estructura distinta a la mas comun es la que se observa en el caso de secuencias nucleotfdicas que producen la curvatura de la doble helice. Algunas secuencias (por ejemplo, AAAANNN, donde N puede ser cualquier base excepto A) forman una doble helice con una irregularidad pronunciada que produce una curvatura moderada; si esta secuencia se repite a intervalos de 10 nucle6tidos en una larga molecula de DNA las curvaturas se suman y estas moleculas aparecen inusualmente curvadas cuando se observan con el microscopio electr6nico (Figura 9-6).

surco menor

surco mayor

CLAVE:

G

C

G

C

A

T

A

T

C

G

C

G

T

A

T

A

•

= H aceptor de enlaces

de hidr6geno

434

Capftulo 9 : EI control de la expresi6n genica

•

o o

= H dador de enlaces

de hidr6geno = atomo de hidr6geno = grupo metilo

Figura 9-5 Un c6digo de reconocimiento del DNA. EI borde de cada base, visto directamente desde el surco mayor 0 desde el surco menor, contiene un patr6n distintivo de aceptores y dadores de enlaces de hidr6geno y de grupos metilo. Cada uno de los cuatro apareamientos de bases posibles proyecta un patr6n de rasgos unicos. Sin embargo desde el surco menor se confunden los patrones para G-C yC-GyparaA-Ty T-A. EI c6digo de colores es el mismo que se ha utilizado en la Figura 9-4.

Figura 9-6 Electronmicrograffa de fragmentos de helices de DNA muy curvadas. Los fragmentos de DNA proceden del pequeno DNA circular mitocondrial de un tripanosoma. A pesar de que los fragmentos s610 tienen unos 200 pares de bases, muchos de ellos se han doblado hasta formar un cfrculo completo. Un DNA normal de este tamafio s610 podria doblarse hasta producir arcos de una cuarta parte de una estas circunferencias (una curvatura Iigera y uniforme hacia la derecha). (De J. Griffith, M. Bleyman, C.A. Rauch, P.A. Kitchin y P. T. Englund, Cell 46 : 71 7724, 1986. © Cell Press.)

Un rasgo relacionado e igualmente importante de la estructura del DNA es la deformabilidad de la doble helice. Para una proteina que debe reconocer y unirse a una secuencia concreta de DNA, debe existir un apareamiento estrecho entre el DNA y la proteina, y frecuentemente la conformacion normal del DNA se distorsiona para aumentar este apareamiento (Figura 9-7). El coste energetico de tal distorsion depende de la secuencia nucleotidica. En el Capitulo 8 ya se discutio un caso similar en relacion con el ensamblaje del nucleosoma: algunas secuencias de DNA soportan mejor que otras la curvatura que se requiere para rodear el nucleosoma. De una manera similar, algunas proteinas reguladoras inducen una curvatura brusca en el DNA cuando se unen a el (Figura 9-8). En general, dichas proteinas reconocen secuencias de DNA que se curvan con facilidad.

Secuencias cortas de DNA son componentes fundamentales de los interruptores geneticos9 Ya hemos visto como se puede detectar una secuencia nucleotidica especifica como un patron de rasgos estructurales en la superficie de la doble helice del DNA. Secuencias nucleotidicas particulares, cada una de ellas con una longitud de menos de 20 pares de bases, actuan como componentes fundamentales de los interruptores geneticos, al actuar como lugares de reconocimiento para la uni6n de proteinas de regulaci6n genica especificas. Se han identificado centenares de estas secuencias de DNA, cada una de ellas reconocida por una unica proteina reguladora 0 por una serie de ellas muy relacionadas. En la Tabla 9-1 se listan algunos ejemplos de estas proteinas junto con las secuencias que reconocen. Ahora volvamos a las proteinas de regulaci6n genica -el segundo. componente fundamental de los interruptores geneticos- que reconocen cortas secuencias de DNA especificas contenidas en una doble helice mucho mayor.

(A)

(B)

Figura 9-7 Deformaci6n del DNA inducida por la uni6n de protefnas. La figura muestra los cambios en la estructura del DNA, desde la forma regular de B-DNA (A) a una forma distorsionada de B-DNA (B), que se observa cuando una protefna reguladora bien conocida (el represor del bacteri6fago 434) se une a secuencias especfficas de DNA. La facilidad con la que esta secuencia de DNA se deforma afecta frecuentemente a la afinidad con la que la protefna se une a ella.

Las proteinas de regulaci6n genica contienen motivos estructurales que pueden leer secuencias de DNAlO En biologia, el reconocimiento molecular generalmente se basa en el ajuste exacto entre las superficies de dos moleculas, y el estudio de las proteinas de regulaci6n genica ha suministrado algunos de los ejemplos mas evidentes de este principio. Una proteina de regulaci6n genica reconoce una secuencia de DNA especifica porque la superficie de la proteina es complementaria a la superficie de la molecula de DNA, con sus rasgos estructurales caracteristicos en esa regi6n. En la mayona de los casos la proteina establece un gran numero de contactos con el DNA, incluyendo enlaces de hidrogeno, enlaces i6nicos e interaccioMotivos estructurales de uni6n a DNA en las protefnas de regulaci6n genica

Figura 9-8 Curvatura del DNA inducida por la uni6n de la proteina activada por catabollto (CAP). CAP es una protefna reguladora de E. coli. Si la protefna no esta unida la helice de DNA es recta.

435

Tabla 9-1 Algunas proteinas reguladoras y las seeuencias de DNA que reeonoeen

Bacterias

Nombre

Seeuencia de DNA reeonocida*

represor lac

AATTGTGAGCGGATAACAATT TTAACACTCGCCTATTGTTAA TGTGAGTTAGCTCACT ACACTCAATCGAGTGA TATCACCGCCAGAGGTA ATAGTGGCGGTCTCCAT CGGAGGACTGTCCTCCG GCCTCCTGACAGGAGGC CATGTAATT GTACATTAA ATGACTCAT TACTGAGTA AACGGGTTAA TTGCCCAATT GGGATTAGA CCCTAATCT GGGCGG CCCGCC ATGCAAAT TACGTTTA TGATAG ACTATC

CAP

represor lambda

Levaduras

GAL4 MATa2 GCN4

Drosophila

Krlippel Bicoid

Mamiferos

Spl Oct-l GATA-l

• Cada una de las protefnas de esta tabla puede reconocer un conjunto de secuencias de DNA estrechamente relacionadas entre sf, pero por conveniencia en la tabla s610 se indica una secuencia para cada protefna.

nes hidrof6bicas. Aunque cada uno de los contactos es debil, los 20 0 mas contactos que se establecen en la interfase DNA-protefna actuan conjuntamente asegurando una interacci6n que es altamente especffica y muy fuerte (Figura 9-9). De hecho, las interacciones DNA-protefna se encuentran entre las interacciones moleculares mas fuertes y especfficas de las conocidas en biologfa. Aunque cada uno de los ejemplos de reconocimiento protefna-DNA es unico en sus detalles, los ·estudios de cristalograffa de rayos X y de espectroscopia

Figura 9-9 Uni6n de una protefna reguladora at sureo mayor del DNA. S610 se muestra un tipo de contacto sencillo. Tfpicamente la superficie de interacci6n entre la protefna y el DNA ha de presentar 20 0 mas de estos contactos, implicando diferentes aminoacidos, de forma que cada uno de ellos contribuye ala energfa de uni6n de la interacci6n protefna-DNA.

436

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

Figura 9-10 EI motivo estructural de uni6n a DNA helice-giro-helice. EI motivo se muestra en (A), donde cada cfrculo blanco representa el carbona central de un aminoacido. La helice a carboxilo terminal (rojo) se denomina helice de reconocimiento ya que participa en el reconocimiento de las secuencias espedficas en el DNA. Como se muestra en (B) esta helice se ajusta al surco mayor del DNA donde entra en contacto con las bases apareadas (vease tambien Figura 9-4).

heliee de reeonocimiento

COOH (6)

(A)

NMR de alrededor de 30 complejos de proteinas reguladoras con sus secuencias especificas han mostrado que la mayor parte de dichas proteinas contienen uno de entre una pequefia serle de motivos estructurales de uni6n a DNA. Cada uno de estos motivos utiliza tanto helices a como laminas 13 para unirse al surco mayor del DNA; este surco, como ya se ha visto, contiene suficiente informaci6npara permitir distinguir una secuencia de DNA de cualquier otra. El ajuste es tan bueno que es tentador especular que las dimensiones de las unidades estructurales basicas de los acidos nucleicos y de las proteinas evolucionaron juntas para permitir que estas moleculas se pudieran ajustar mejoL

El motivo helice-giro-helice es uno de los motivos de uni6n a DNA mas simples y comunesl l El primer motivo estructural de uni6n a DNA que se descubrl6 fue el hence-girohence. Identificado orlginalmente en proteinas bacterlanas, se ha encontrado en centenares de proteinas de uni6n a DNA tanto eucariotas como procariotas. Consta de dos helices a conectadas pOI una corta cadena de aminoacidos, que forma el "giro". Las dos helices se mantienen en un cierto cingulo fundamentalmente pOI interacciones entre ambas helices. La helice mas pr6xima al extrema carboxilo se denomina la helice de reconocimiento pues se adapta al surco mayor del DNA; las cadenas laterales de sus aminoacidos, que difieren de una proteina a otra, juegan un papel muy importante en el reconocimiento de las secuencias de DNA especificas a las que se une la proteina (Figura 9-10). Aparte de la regi6n de helice-giro-Mlice la estructura de las proteinas que contienen este motivo varia enormemente (Figura 9-11). Asipues, cada proteina

represor del tript6fano

proteina ero de lambda

fragmento de la proteina represora de lambda

Motivos estructurales de uni6n a DNA en las protefnas de regulaci6n genica

Figura 9-11 A1gunas protemas helice-giro-helice de uni6n al DNA. Todas las protefnas se unen al DNA como dfmeros en los que las dos copias de la helice de reconocimiento (cilindro rojo) estan separadas por exactamente una vuelta de la doble Mlice (3,4 nm). La segunda Mlice del motivo Mlice-giro-helice se ha coloreado en azul, como en la Figura 9-10. El represor lambda y la protefna cro controlan la expresi6n de genes del bacteri6fago lambda, y el represor de tript6fano y la protefna activadora de catabolito (CAP), controlan grupos de genes de E. coli.

fragmento de CAP

DNA

437

presenta su motivo helice-giro-helice al DNA de una forma unica, un rasgo que se cree que aumenta la versatilidad del motivo helice-giro-helice al aumentar el numero de secuencias de DNA con el motivo se pueden reconocer. Ademas, en la mayoria de estas proteinas partes de la cadena polipeptidica que estan fuera del dominio helice-giro-helice tambien establecen contactos importantes con el DNA, ayudando a obtener interacciones ajustadas muy finamente. El grupo de proteinas heIice-giro~helice que aparece en la Figura 9-11 demuestra un rasgo comtin a muchas proteinas de union a secuencias especificas de DNA. Se unen como dimeros simetricos a secuencias de DNA que estan formadas por dos "medios-lugares" muy similares, tambien organizados simetricamente (Figura 9-12). Esta disposicion permite que cada monomero proteico establezca un conjunto casi identico de contactos e incrementa enormemente la afinidad de union: como primera aproximacion, al duplicar el numero de contactos se duplica la energia libre de la interaccion pero se eleva al cuadrado la constante de afinidad.

3' 5'

Figura 9-12 Una secuencia especffica de DNA reconocida por la protefua cro del bacteri6fago lambda. Los nucle6tidos coloreados en verde se . encuentran dispuestos simetricamente, permitiendo que cada mitad de la secuencia especffica sea reconocida de la misma manera por una subunidad de una proteina dimerica, tambien mostrada en verde.

Las proteinas de homeodominios son una clase especial de proteinas helice-giro-helice 12 Poco despues de que se descubrieran las primeras proteinas de regulacion genica en bacterias, analisis geneticos en la mosca del vinagre Drosophila permitieron descubrir una clase de genes importantes, los genes selectores home6ticos, que juegan un papel importante organizando el desarrollo de la mosca. Como se describira en el Capitulo 21, se ha demostrado que estos genes tambien participan de forma destacada en el control del desarrollo de animales superiores. Mutaciones en estos genes producen el cambio de una parte del cuerpo de una mosca en otra parte, demostrando que las proteinas que codifican controlan interruptores del desarrollo. Cuando se determinaron las secuencias de algunos de los genes selectores home6ticos a principios de la decada de 1980, se demostr6 que cada uno de ellos contenia una secuencia casi identica de unos 60 aminoacidos que definia este tipo de proteina y a la que se denomin6 homeodominio. AI resolverse la estructura tridimensional del homeodominio se descubri6 que sostenia un motivo helice-giro-helice similar al de las proteinas reguladoras bacterianas, aportando una de las primeras indicaciones de que los principios de la regulaci6n genica establecidos en bacterias tambien son validos para los organismos superiores. S610 en Drosophila, se han descrito mas de 60 proteinas homeodominio y se han identificado proteinas con homeodominio en practicamente todos los organismos que se han estudiado, desde la levadura hasta el hombre. En la Figura 9-13 se muestra la estructura del homeodominio unido a su secuencia de DNA especifica. Mientras que el motivo helice-giro-helice de las pro-

438

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

Figura 9-13 Un homeodominio unido a su secuencia especffica en el DNA. EI homeodominio se pliega en tres helices que se empaquetan estrechamente por interacciones hidrof6bicas (A). La regi6n que contiene las helices 2 y 3 se parece mucho al motivo estructural helicegiro-helice, con la helice de reconocimiento (rojo) estableciendo contactos importantes con el surco mayor (B). Por ejemplo, la asparagina de la helice 3 entra en contacto con una adenina tal como se muestra en la Figura 9-9. Tambien se establecen contactos con pares de bases en el surco menor mediante un brazo flexible unido a la helice 1. EI homeodominio mostrado aqui procede de una proteina reguladora de levadura, pero es casi identico ados homeodominios de Drosophila que interaccionan con el DNA de forma similar. (Adaptado de C. Wolberger et al., Cell 67: 517-528,1991. ©Cell Press.)

25 23

HOOC---N'K,

3

/H R/ ,

C,

V

G

I

Q,

/ H 19

I

R

E

I

R

l I

5

~

~ 5

l

6 C

I

I I

I

,K

,

(A)

1 V /K/ --- NH2

/ /

F 10

V

E

12

teinas reguladoras bacterianas esta frecuentemente inmerso en diferentes regiones estructurales, el motivo helice-giro-helice de los homeodominios esta siempre rodeado por la misma estructura (que forma el resto del homeodominio), 10 cual sugiere que el motivo es presentado al DNA siempre de la misma forma basica. Ademas, estudios estructurales muestran que proteinas de levaduras y de Drosophila con homeodominio reconocen el DNA casi de la misma forma, a pesar de que existe :una identidad entre ellos de s610 17 de 10s.()O aminoacidos.

Existen diferentes tipos de motivos de union a DNA en forma de dedos de zinc 13 El motivo helice-giro-helice esta formado exclusivamente por aminoacidos. Sin embargo, un segundo grupo importante de motivos de uni6n a DNA utiliza una o mas moIeculas de zinc como elemento estructural. Aunque todos los motivos que utilizan zinc se han denominado dedos de zinc (zinc fingers), esto se refiere s610 a su aspecto en diagramas esquem
Figura 9-14 Un tipo de proteina con dedo de zinc. Esta protefna pertenece a la familia de protefnas con dedos de zinc CyS"Cys-His-His, llamadas asf por los aminml.cidos que unen el zinc. Este dedo de zinc procede de una protefna de rana, de funci6n desconocida. (A) Dibujo esquematico de la secuencia de aminoacidos del dedo de zinc. (B) La estructura tridimensional del dedo de zinc esta formada por una lamina ~ antiparalela (aminoacidos 1 all0), seguida de una helice a (aminoacidos 12 al24). Los cuatro aminoacidos que unen el zinc (Cys 3, Cys 6, His 19 e His 23) mantienen fuertemente unido un extrema de la heIice a al otro extrema de la lamina ~. (Adaptado de M.S. Lee et al., Science 245: 635-637, 1989. © 1989 the AASS.)

Figura9-15 Uni6naDNAdeuna proteina con dedo de zinc. (A) La estructura de un fragmento de una protefna reguladora del rat6n unida a su secuencia espedfica en el DNA. Esta protefna reconoce el DNA a traves de tres dedos de zinc del tipo Cys-CysHis-His (vease Figura 9-14) organizados en repetici6n directa. (B) Los tres dedos de zinc tienen secuencias de aminoacidos similares y entran en contacto con el DNA de forma similar. Tanto entAl como en (B) el Momo de zinc de cada dedo se ha representado como una pequefia esfera. (Adaptado de N. Pavletich y C. Pabo, Science 252: 819-817, 1991. © 1991 the MAS.)

COOH COOH

(A)

(8)

Motivos estructurales de uni6n a DNA en las proteinas de regulaci6n genica

439

Figura 9-16 Una proteina con declo de zinc de la familia de los receptores intracelulares, unida a su secuencia especffica de DNA. Este es un ejemplo de una proteina con dedo de zinc del tipo Cys-Cys-Cys-Cys, denominada asi por los aminoacidos que unen el Momo de zinc. Se muestra un dimero de la proteina de union aI DNA (rojo) , y se han eliminado todas las cadenas lateraIes excepto las coloreadas en amarillo, que forman contactos con el DNA (verde). (Adaptado de B.F. Luisi et aI., Nature 352: 497-505, 1991. © 1991 Macmillan Magazines Ltd.; fotograffa cortesia de Jay Thomas.)

simple, formada por una helice a y una lamina ~, mantenidas unidas por el zinc (Figura 9-14B). Este tipo de dedo de zinc se encuentra frecuentemente agrupado con otros dedos de zinc adicionales, organizados uno detnis de otro de modo que la helice a pueda contactar con el surco mayor del DNA, formando una serie casi continua de helice a a 10 largo del surco. De esta forma se obtiene una interaccion DNA-protefna fuerte y especffica a traves de la repeticion de una unidad estructural basica (Figura 9-15). Una ventaja particular de este motivo es que la fuerza y especificidad de la interaccion DNA-protefna se pudo ajustar durante la evolucion mediante cambios en el mlmero de repeticiones de los dedos de zinc. Resulta diffcil de imaginar como podrfan organizarse en forma de dominios repetidos cualquiera de los otros motivos que se discuten en esta seccion. El otro tipo de dedos de zinc se encuentra en la gran familia de protefnas receptoras intracelulares (descritas en el Capftulo 15). Forma una estructura diferente (similar al motivo procariota helice-giro-helice) en el que dos helices a se mantienen juntas mediante dos Momos de zinc. De forma similar a las protefnas helice-giro-helice, forman dfmeros que permiten a una de las dos helices a de cada subunidad interaccionar con el surco mayor del DNA (Figura 9-16). Aunque la estructura de los dos tipos de dedos de zinc es diferente, comparten dos rasgos importantes: ambas utilizan zinc como elemento estructural y ambas utilizan la helice a para reconocer el surco mayor del DNA.

Las laminas p tambien pueden reconocer el DNN4 En los motivos de union a DNA descritos hasta el momenta tan solo se utilizaban helices a como estructura capaz de reconocer secuencias especfficas de DNA. Sin embargo, un grupo de protefnas reguladoras ha desarrollado una estrategia de reconocimiento diferente y no menos ingeniosa. En este caso la informacion sobre la superficie del surco mayor es lefda por una lamina ~ de dos hebras, con las cadenas laterales de los aminoacidos extendidas desde la lamina hacia el DNA, como se muestra en la Figura 9-17. Como en el caso del reconocimiento mediante helice a, este motivo en lamina ~ puede reconocer muchas secuencias de DNA diferentes; la secuencia de DNA exacta reconocida depende de los aminoacidos que formen la lamina 13.

El motivo cremallera de leucina esta implicado tanto en el reconocimiento del DNA como en la dimerizaci6n 15 Muchas protefnas reguladoras reconocen el DNA como dfmeros, probablemente debido a que, como se ha visto, se trata de una forma simple de alcanzar una elevada especificidad de union (vease Figura 9-12). Habitualmente, la region de 440

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

1a proteina responsable de la dimerizaci6n es diferente a la que es responsable de la uni6n al DNA (vease Figura 9-11). Sin embargo, un motivo combina ambas funciones de una forma elegante y econ6mica, el motivo del cremallera de leudna. Se denomina asi por la forma en que dos helices a, una de cada mon6mero, se mantienen unidas formando un corto enrollamiento (descrito en el Capitulo 3). Las helices se mantienen unidas por interacciones entre las cadenas laterales hidrof6bicas de algunos aminmicidos (frecuentemente leucinas), que se extienden desde un lado de cada helice. Exactamente despues del dominio de dimerizaci6n, las dos helices a se separan una de otra formando una estructura en forma de Y, 10 que permite a sus cadenas laterales contactar con el surco mayor del DNA. Asi pues el dimero pinza la doble helice como una pinza de tender ropa en un tendedero (Figura 9-18). Las proteinas reguladoras que contienen una cremallera de leucina pueden formar tanto homodimeros, en los que los dos mon6meros son identicos, como heterodimeros, en los que los mon6meros son diferentes. Debido a que los heterodfmeros se forman tfpicamente a partir de proteinas con especificidad de uni6n al DNA diferente, la capacidad de la cremallera de leucina de formar heterodfmeros incrementa enormemente el repertorio de especificidades de uni6n a DNA que pueden presentar estas protefnas. Por ejemplo, en la Figura 9-19 se muestran tres posibles especificidades de secuencia que se podrian obtener con s610 dos mon6meros, mientras que se podrian obtener seis a partir de unicamente tres mon6meros, y asf sucesivamente. Este es un ejemplo de control combinatorio, en el que son las combinaciones de protefnas, mas que las protefnas individuales, las que controlan un proceso celular. Es uno de los mecanismos mas importantes que utilizan las celulas eucariotas para controlar la expresi6n genica. Como se discutira mas adelante, la formaci6n de complejos heterodimericos entre protefnas reguladoras es uno de los varios posibles mecanismos combinatorios para el control de la expresi6n genica. Existen numerosos tipos de protefnas con cremalleras de leucina, y no todas elIas pueden formar heterodimeros con cualquier otra. De otra manera, la cantidad de interrelaciones entre los circuitos de regulaci6n genica de una celula seria tan grande como para producir el caos. Que un heterodimero se forme 0 no

Figura 9-17 La proteina represora bacteriana met. La protefna represora bacteriana met regula los genes que catalizan la sfntesis de metionina. Cuando este aminoacido es abundante, se une al represor causando un cambio en la estructura de la protefna que Ie permite unirse fuertemente al DNA, inactivando la sfntesis de las enzimas. (A) Para poder unirse fuertemente al DNA, el represor met ha de estar acomplejado con S-adenosil metionina, mostrada en rojo. Se muestra en verde una subunidad de la protefna dirnerica, y la otra se muestra en azul. Las dos laminas ~ que se unen al DNA estan formadas por una cadena de cada subunidad, mostradas en azul oscuro y verde oscuro. (B) Diagrama simplificado del represor met unido al DNA, que muestra como las laminas ~ de doble hebra del represor se unen al surco mayor del DNA. Para una mayor claridad se han omitido las otras regiones del represor (A, adaptado de W. Somers y S. Phillips, Curro Opin. Struc. BioI. 1: 89-98, 1991, © Current Sciences; B, adaptado de S. Phillips, Nature 359: 387-393, 1992. © 1992 Macmillan Magazines Ltd.)

Figura 9-18 Un dfmero en cremallera de leucina unido al DNA. Dos dominios de union al DNA en forma de helice a (abajo) dimerizan a traves de la region de la cremallera de leucina ("leucine zipper") (arriba) formando una estructura en Yinvertida. Cada uno de los brazos de la Yesta formado por una helice a simple, una de cada monomero, que entra en contacto con la secuencia especffica de DNA en el surco mayor. Cada una de las helices a se une a una mitad de la estructura simetrica del DNA. (Adaptado de T.E. Ellenberger et al., Cell 71: 1223-1237, 1992. © Cell Press.)

'Motivos estructurales de uni6n a DNA en las proteinas de regulaci6n genica

441

DNA

:3J.a1.1ill:

depende de c6mo se ajusten las superficies hidrof6bicas de las dos helices a que forman la cremallera, 10 que a su vez depende de la secuencia de aminoacidos de las dos regiones de la cremallera. Asf, cada protefna de la celula que tenga una cremallera de leucina s6lo podra formar dfmeros con una pequena fracci6n de otras protefnas con cremalleras de leucina.

EI motivo helice-bucle-helice tambien esta implicado en la dimerizacion y la union al DNA16

Figura 9-19 La heterodimerizaci6n de proteinas con cremalleras de leucina permite alterar su especificidad de uni6n al DNA. Los homodfmeros de cremallera de leucina se unen a secuencias de DNA simetricas, como se muestra en los dibujos de la izquierda y del centro. Estas dos protefnas reconocen diferentes secuencias de DNA, como se indica por las regiones coloreada en rajo y azul en el DNA. Estos dos mon6meros diferentes se pueden combinar formando un heterodfmero que ahora reconoce una molecula de DNA hfbrida compuesta por una regi6n raja y una azul.

Otro motivo importante de uni6n al DNA, relacionado con el dedo de leucina, es el motivo helice-bucle-helice (HLH, de Helix-Loop-Helix), que no se ha de confundir con el h(Hice-giro-helice descrito pieviamente. Un motivo HLH esta formado por una helice a corta conectada por un bucle a una helice a mas larga, La flexibilidad del bucle permite que una de las helices se doble y quede alineada con la otra. Como se observa en la Figura 9-20, esta estructura de dos helices se une tanto al DNA como al motivo HLH de otra protefna con motivo HLH. Del mismo modo que las protefnas con dedo de leucina, esta segunda protefna puede ser la misma (obteniendose un homodfmero) 0 diferente (obteniendose un hctcrodfmero), y es la helice a que sale de la superficie de dimerizaci6n la que establece contactos especfficos con el DNA. Algunas de las protefnas HLH carecen de la extensi6n de helice a responsable de la uni6n al DNA. Estas protefnas truncadas pueden formar heterodfmeros con protefnas con motivo HLH completo, pero los heterodfmeros son incapaces de unirse estrechamente al DNA ya que s610 pueden formar la mitad de los contactos necesarios, Asi pues, la heterodimerizaci6n aporta a la celula tanto un medio de crear dfmeros con una especificidad de secuencia de DNA hibrida, como un litH mecanismo de control que permitirfa a una celula iriactivar protefnas reguladoras especfficas (Figura 9-21).

Aun no es posible predecir la secuencia de DNA que es reconocida por una protefna reguladora 17 Los motivos de uni6n a DNA que se han descrito previamente aportan un soporte estructural desde el que se extienden las cadenas laterales de los aminoacidos contactando con pares de bases especfficos en el DNA. Seria razonable pregun-

Figura 9-20 Un dimero de proteina helice-bude-helice unido al DNA. Los cuatro mon6meros se mantienen unidos en un haz de cuatro helices: cada mon6mero contribuye con dos helices a conectadas mediante un bucle flexible de protefna (rajo). A las dos helices a que se proyectan desde el ovillo se une una secuencia de DNA especffica. (Adaptado de FerreD'Arnare et aI., Nature 363: 38-45, 1993. © 1993 Macmillan Magazines Ltd.)

442

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

homodimero HLH activo

heterodimero HLH inactivo

DNA

tarse si se trata de un codigo de apareamiento aminmicido-par de bases sencillo: por ejemplo, ies siempre el par de bases G-C el que se une a un cierto aminmicido? La respuesta parece ser no. En el Capftulo 3 se describio que a partir de solo 20 aminmicidos era posible obtener superficies de pnicticamente cualquier forma y naturaleza qufmica, y una protefna reguladora utiliza diferentes combinaciones de las cadenas laterales de sus aminoacidos para crear una superficie que sea exactamente complementaria a la de la secuencia de DNA que reconoce. Parece. por 10 tanto que un mismo par de bases puede ser reconocido de muchas formas. Sin embargo, es posible que pronto los biologos moleculares puedan entender suficientemente bien el reconocimiento de DNA-protefna como para poder disefiar protefnas que reconozcan cualquier secuencia de DNA.

Figura 9-21 Regulacion inhibidora por las proteinas HLH truncadas. F.l motivo HLH es responsable tanto de la dimerizacion como de la union a DNA. Ala izquierda, un homodimero HLH reconoce una secuencia simetrica de DNA. A la derecha, la union de una protefna HLH completa a una protefna HLH truncada que carece de la helice ex de union al DNA forma un heterodfmero incapaz de unirse fuertemente al DNA. Si la protefna truncada esta presente en ex~eso puede bloquear la homodimerizacion de la protefna completa y de este modo impedir su union al DNA.

Un ensayo de movilidad en gel permite detectar con gran facilidad protefnas que se unen a una secuencia especffica de DNN8 Los analisis geneticos que fueron la clave para aislar las protefnas reguladoras de bacterias, levaduras y Drosophila son muchas veces imposibles dellevar a cabo en vertebrados. Por ello, el aislamiento de las protefnas de regulacion genica de los vertebrados tuvo que esperar al desarrollo de diferentes aproximaciones experimentales. Muchas de ellas se basan en la deteccion en un extracto celular de una protefna de union a DNA que reconoce especfficamente una secuencia de la que se sabe es importante para controlar la expresion de un gen particular. La forma mas comiln de detectar protefnas de union a secuencias especfficas de DNA es usar una tecnica que se basa en el efecto que tiene la union de una proteina sobre la migracion de moleculas de DNA en un gel, bajo un campo electrico. Una molecula de DNA esta fuertemente cargada negativ<;lmente, por 10 que cuando se somete a un campo electrico se desplaza con rapidez hacia el electrodo positivo. En geles de poliacrilamida las moleculas de DNA se separan en base a su tamafio debido a que las moleculas menores son capaces de penetrar con mayor facilidad que las mayores en la fina malla del gel. La presencia de moleculas de protefna unidas a las moleculas de DNA provocaran un desplazamiento mas lento del DNA a traves del gel; en generalla movilidad del DNA se reducira tanto mas cuanto mayor sea el tamafio de la molecula de protefna unida. Este fenomeno es la base del andlisis de retraso en gel (gel-mobility shift assay), que permite detectar incluso trazas de protefnas de union a DNA especfficas de secuencia. En este ensayo se utiliza un fragmento corto de DNA, de longitud y secuencia determinadas (producido por clonaje de DNA 0 por sfntesis qufmica) que es marcado.radiactivamente y se mezcla con un extracto celular; la mezcla se carga en un gel de poliacrilamida y se analiza por electroforesis. Si el fragmento de DNA corresponde a una region cromosomica en la que, por ejemplo, se unen varias protefnas de union a secuencias especfficas, laautorradiograffa revelara una serie de bandas de DNA, cada una de las cuales sufrini un retraso distinto, 10 que representa diferentes complejos DNA-protefna. Las protefnas responsables de Motivos estructurales de uni6n a DNA en las protefnas de regulaci6n genica

443

fragmento de DNA radiactivo

fragmento de DNA radiactivo + extracto celular

.C1

1III!I ,

C4

~C2

~C5 ~C3 • C6 _ _ _ _ _ _ DNA libre

.,c:t

~

Co CI>

"0

c:

'0

'u ~

E CI>

<.>

c:

o<.>

e (/)

C1

'0;

C4

~

C2

C5 C3 C6 DNA libre (A)

resultado del gel

C1-

~

-C4 -C5

~

a;

I

-~ -DNAlibre <±lL-----L__.L.-_----L_ _..l-_ _--l (B)

10 20 30 40 numero de fracci6n eluida de la columna con una concentraci6n creciente de sales

cada una de las bandas de retraso en el gel se pueden ir separando unas de otras mediante fraccionamiento del extracto celular (vease Figura 9-22).

La cromatografia de afinidad de DNA facilita la purificaci6n de proteinas de uni6n a secuencias especificas de DNA19 Una vez se conoce la secuencia de DNA reconocida por una proteina reguladora, es posible utilizar un metodo de purificaci6n particularmente potente, denominado cromatograffa de afinidad de DNA. Por metodos quimicos se sintetiza un oligonucle6tido de doble cadena de la secuencia adecuada, y se une a una matriz porosa insoluble, como por ejemplo la agarosa; la matriz con el oligonucle6tido unido se utiliza para construir una columna que unin! selectivamente las proteinas que reconozcan la secuencia de DNA (Figura 9-23). De esta forma se han conseguido sin gran esfuerzo purificaciones tan grandes como de 10 000 veces. Aunque en los eucariotas superiores muchas de las proteinas que se unen a secuencias especfficas de DNA estan presentes en unos cuantos miles de copias en cada celula (y generalmente s6lo representan un 1/ 50 000 de la proteina total de la celula), mediante cromatograffa de afinidad es posible aislar suficiente cantidad de proteina pura como para obtener una secuencia parcial del extrema amino terminal. A partir de esta secuencia se puede sintetizar un oligonucle6tido que puede utilizarse como sonda para identificar el clon de cDNA correspondiente, ya que hibridara especificamente con la secuencia que codifica la proteina (descrito en el Capitulo 7). El clon perrnite conocer la secuencia de aminoacidos completa y producir la proteina en cantidades ilimitadas. En algunos casos, el clon cDNA que codifica una proteina de uni6n a DNA especffica de secuencia, se ha obtenido de una forma mas directa utilizando un segundo metoda aun mas potente que la cromatograffa de afinidad a DNA. Este metodo se inicia con una genoteca de cDNA construida con un vector de expresian apropiado (descrito en el Capitulo 7). Una colonia individual de bacterias (si el vector de expresi6n es un plasmido), 0 una placa de lisis (si el vector usado es un virus) producira grandes cantidades de la proteina que codifica el cDNA 444

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

Figura 9-22 Amllisis de retraso en gel. EI principio del ensayo se muestra esquematicamente en (A). Se mezcla un extracto de una linea celular productora de anticuerpos con un fragmento de DNA marcado radiactivamente, que contiene alrededor de 160 nucle6tidos de una secuencia de DNA reguladora de un gen que codifica la cadena ligera del anticuerpo producida por la linea celular. EI efecto de las protefnas del extracto sobre la movilidad del fragmento de DNA se analiza por electroforesis seguida de autorradiograffa. Los fragmentos de DNA libres se desplazan rapidamente hacia la base del gel, mientras que los que se unen a protefnas son retardados; la observaci6n de 6 bandas de retraso sugiere que en el extracto existen 6 diferentes protefnas de uni6n a DNA especfficas de secuencia (indicadas como Cl a C6). (Para una mayor simplicidad los fragmentos de DNA con mas de una protefna unida se han omitido en la figura.) En (Bl, el extracto fue fraccionado por una tecnica cromatografica estandar (arriba) y cada fracci6n se mezcl6 con el fragmento radiactivo de DNA y se carg6 en un carrH de un gel de poliacrilamida, analizeindose como en (A). (B, modificado de C. Scheidereit, A. Heguyy R.G. Roeder. Cell, 51: 783793, 1987. © Cell Press.)

todas las proteinas celulares ETAPA 1

••• • •• • • •••

columna con una matriz que contiene DNA de muchas secuencias diferentes

ETAPA2

• • • •• • •

·: .

columna con una matriz que contiene 5610

el lavado con soluciones de salinidad media eluye • todas las proteinas no .: es ecificas para ~.

el lavado con soluciones de baja salinidad eluye las proteinas que no se unen a DNA

el lavado con soluciones de salinidad media eluye muchas protein as que se unen a DNA

proteinas de uni6n a DNA de la etapa 1

-1

••

•

... •• •• ••

ellavado con soluciones de salinidad elevada eluye las escasas proteinas que • especificamente

~ • •

••

que contiene. Para localizar la colonia que produce la proteina buscada se utiliza como sonda el oligonucleotido que contiene la secuencia de union especifica, marcado radiactivamente, para hibridar replicas en filtros de miles de colonias individuales (vease Figura 7-26). Se seleccionan las pocas colonias que produzcan la protefna que se une especificamente al oligonucleotido marcado, se purifican y se analizan para localizar la que produce la proteina buscada. Debido a que estas tecnicas han sido desarrolladas recientemente, solo se han podido caracterizar algunos de los muchos cientos de proteinas de union a DNA especificas de secuencia que se cree estan presentes en las celulas de los eucariotas superiores.

Figura 9-23 Cromatograffa de afinidad de DNA. En la primera etapa todas las proteinas que pueden unir DNA se separan del resto de las proteinas celulares en una columna que contiene una gran cantidad de secuencias diferentes de DNA. La mayoria de las proteinas de uni6n a secuencias especificas de DNA tienen en general una afinidad debit por el DNA (no especifica) y son retenidas en la columna. Esta afinidad es debida fundamentalmente a interacciones i6nicas, de forma que las protefnas pueden ser eluidas de la columna mediante soluciones de una concentraci6n salina moderada. En una segunda etapa, la mezcla de proteinas de uni6n a DNA se pasa a traves de una columna que contiene exclusivamente DNA de una secuencia particular. Tipicamente la mayoria de proteinas de uni6n a DNA se uninin, debilmente, mediante interacciones inespecificas. Estas senln eluidas de nuevo mediante soluciones de salinidad moderada, dejando en la columna aquellas proteinas (generalmente una 0 muy pocas) que se unen especificamente, y por ella firmemente, ala secuencia de DNA particular. Estas proteinas retenidas se pueden eluir utilizando soluciones de elevada concentraci6n de sales.

Resumen Las protefnas de regulaci6n genica reconocen cortas secuencias espedficas de DNA de doble helice y de ese modo determinan cOOles de los miles de genes de una celula se

han de transcribir. Se han identificado centenares de protefnas de regulaciOn genica en un amplia variedad de organismos. Aunque cada una de estas protefnas tiene una serle de rasgos unicos, muchas se unen al DNA como homodfmeros 0 heterodfmeros que reconocen al DNA mediante uno de entre un pequeno numero de motivos estructurales, que incluyen el motivo helice-giro-helice, el homeodominio, los dedos de zinc, las cremalleras de leucina y el motivo helice-bucle-helice. La secuencia de aminodcidos que se pliega en el dominio de reconocimiento determina la secuencia de DNA que sera reconocida. Se han desarrollado algunas potentes tecnicas para identificar y purificar las protefnas de uniOn a secuencias especificas de DNA.

Como funcionan los interruptores geneticos 20 En la seccion anterior se han descrito los componentes basicos de los interruptores geneticos -las proteinas de regulacion genica y las secuencias especificas de DNA que estas proteina reconocen. En esta seccion se discutira como actl1an estos componentes para activar e inactivar genes como respuesta a una variedad de sefiales. C6mo funcionan los interruptores geneticos

445

Hace solo 40 anos la idea de que los genes se podfan activar e inactivar fue revolucionaria. Este concepto fue un gran avance, y nacio del estudiode como las bacterias eran capaces de adaptarse a cambios en la composici6n del medio de crecimiento. Estudios paralelos realizados con el bacteri6fago lambda llegaron a muchas conclusiones similares y contribuyeron a establecer las bases de 10 que sabemos actualmente respecto a c6mo se regula la expresi6n de los genes. A las celulas eucariotas se aplican los mismos principios aunque la enorme complejidad de la regulaci6n genica en los organismos superiores, combinada con la complicacion de que el DNA en dichos organismos se encuentra empaquetado en forma de cromatina, crea nuevas posibilidades para el control, como se vera mas adelante. Comenzaremos, sin embargo, con el ejemplo mas sencillo -un interruptor abiertol cerrado en bacterias que responde a una senal unica.

EI represor de tript6fano es un interruptor simple que activa y desactiva genes en bacterias21 EI cromosoma de la bacteria E. coli, un organismo unicelular, esta formado por una molecula de DNA circular de alrededor de 5 x 106 pares de nucleotidos. Este DNA es sufidente para codificar 4000 protefnas, aunque simultaneamente solo se fabrican algunas de estas protefnas. E. coli regula la expresi6n de muchos de sus genes de acuerdo con la disponibilidad de fuentes de alimento que son accesibles en el medio. Son cinco los genes que en E. coli codifican la produccion del aminoacido tript6fano, y estan organizados en un grupo en el cromosoma, transcribiendose desde un unico promotor como una larga molecula de mRNA (Figura 9-24). Tal como se ha descrito en el Capitulo 6, el promotor es la secuencia de DNA especffica que dirige la union de la RNA polimerasa al DNA, abriendo la doble helice e iniciando la sfntesis de una molecula de RNA. Sin embargo, cuando hay triptOfano presente en el medio y este penetra en la celula (por ejemplo cuando la bacteria se encuentra en el tracto digestivo de un animal que acaba de ingerir protefnas), estas enzimas ya no se necesitan y su producci6n se detiene. Actualmente conocemos con gran detalle las bases moleculares de este interruptor. Dentro del promotor que dirige la transcripci6n de los genes biosinteticos de triptofano se encuentra un operador. Este operador es simplemente una corta secuencia de DNA regulador, de secuencia definida, que es reconocida por una protefna reguladora helice-giro-helice denominada represor del tript6fano (vease Figura 9-11). El promotor y el operador se encuentran organizados de forma que cuando el operador esta unido al represor del triptOfano se bloquea el acceso de la RNA polimerasa al promotor, de modo que se impide la expresion de las enzimas productoras de tript6fano (Figura 9-25). Este bloqueo esta regulado de una forma ingeniosa: la protefna represora solo puede unirse al DNA del operador cuando se ha unido a su vez ados moltkulas del aminoacido triptOfano. Como se ve en la Figura 9-26, la union de tript6fano desplaza los motivos helice-giro-helice del represor de modo que se pueden presentar de manera apropiada en el surco mayor del DNA; sin triptOfano, los motivos quedan en el interior de la protefna y la protefna es incapaz de unirse al operador. Asf pues, el represor del triptOfano es un dispositivo simple que controla la produccion de las enzimas biosinteticas del triptofano, activando 0 desactivando dicha producci6n en funcion de la disponibilidad de triptofano libre. A este promotor

,------,

_II

.....

E

D

C

B

cromosoma de E. coli

l molecula de mRNA

~

~

• •

~

~

~

• ... •

enzimas de la biosfntesis del tript6fano

446

A

Capitulo 9 : EI control de la eipresi6n genica

Figura 9-24 Los genes agrupados que codiflcan la sfntesis del trlpt6fano en E. coli. Estos cinco genes se transcriben como una sola moIecuia de mRNA, rasgo que permite que su expresi6n sea regulada de manera coordinada. Los grupos de genes transcritos como un unico mRNA son comunes en bacterias. A cada uno de esos grupos se Ie denomina un oper6n.

promotor I

I

-35

+1

L-.J

operador

~

tript6fano

.Ai' represor inactivo •

•

inicio de transcripci6n

RNA polimerasa

===--.----'~ -

• •1-==jilepresor a:ivo

mRNA~

LOS GENES ESTAN ACTIVOS

LOS GENES ESTAN INACTIVOS

modo de regulaci6n se Ie denomina control negativo ya que la forma activa de la proteina de uni6n a DNA desactiva los genes, y a las proteinas reguladoras que actuan de este modo se las denomina represores transcripcionales 0 protefnas represoras genicas.

Los activadores transcripcionales activan los genes22 En el Capitulo 6 se vio que la RNA polimerasa de E. coli puede unirse a un promotor e iniciar la transcripci6n del DNA. Sin embargo, algunos promotores bacterianos son poco funcionales por si mismos, ya sea porque son poco reconocidos por la RNA polimerasa 0 porque esta tiene dificultades en abrir la helice de DNA en el inicio de la transcripci6n. En cualquier caso estos promotores de escasa funci6n pueden recuperar la funcion normal mediante proteinas reguladoras que se unen en un lugar proximo del DNA, contactando con la RNA polimerasa de forma que incrementan enormemente la probabilidad de que se inicie el transcrito. Este modo de regulacion se denomina control positivo porque la forma activa de la proteina de union al DNA activa los genes, y las proteina reguladoras que funcionan de este modo se denominan activadores transcripcionales 0 protefnas activadoras genicas. Como en el caso del control negativo por un represor transcripcional, un activador transcripcional puede actuar como un interruptor genetico simple. Por ejemplo, la proteina activadora bacteriana CAP (de Catabolite Activator Protein, proteina activadora por catabolito), activa los genes que capacitan a E. coli para

Figura 9-25 Activaci6n y desactivaci6n de los genes para el tript6fano. Si el nivel de triptofano en el interior de la celula es bajo, la RNA polimerasa se une al promotor y transcribe los cinco genes del operon de tript6fano (trp). Sin embargo, si el nivel de triptofano es alto, el represor de tript6fano se activa uniendose al operador, impidiendo la union de la RNA polimerasa al promotor. Siempre que el nivel de tript6fano se reduzca, el represor libera su triptofano y se inactiva, permitiendo que la polimerasa inicie la transcripcion de estos genes.

Figura 9-26 La union del tript6fano a la proteina represora del tript6fano cambia la confonnaci6n del represor. El cambio conformacional capacita a esta protefna reguiadora para unirse fuertemente a una secuencia especffica de DNA y bloquear la transcripcion de los genes que codifican las enzimas necesarias para la produccion de tript6fano (eloperon trp). En la figura se muestra la estructura tridimensional de esta protefna bacteriana con motivos helice-giro-helice, tanto unida al triptofano como libre, determinada pOl difraccion de rayos X. La union del triptofano aumenta la distancia entre las dos helices de reconocimiento del homodfmero, permitiendo al represor adaptarse estrechamente al operador. (Adaptado de R. Zhang y et al., Nature 327:591-597,1987. © 1987 Macmillan Magazines Ltd.)

tript6fano

~

l

LOS GENES ESTAN ACTIVOS

Como funcionan los interruptores geneticos

LOS GENES ESTAN INACTIVOS

447

(A)

REGULACI6N NEGATIVA una protein a activadora unida impide la transcripci6n

(6)

protefna activadora unida

proteina represora unida UN LlGANDO SE UNE A LA PROTEINA REGULADORA Y LA SEPARA DEL DNA

REGULACI6N POSITIVA una proteina activadora unida permite la transcripci6n

:?8~

RNA polimerasa

G_E_N_I_N_A_CT_I_V_O

f\ i * II

GEN ACTIVO

mRNA

Jf\ ~

LA ADICI6N DEL UGANDO ACTIVA EL GEN POROUE SEPARA LA PROTEfNA REPRESORA

~It

LA EUMINACI6N DEL UGANDO ACTIVA EL GEN POROUE SEPARA LA PROTEfNA REPRESORA

proteina

represor inactivo

GEN ACTIVO

r.

Un activador transcripcional y un represor transcripcional controlan el oper6n lac 23 Es posible disefiar interruptores geneticos mas complicados combinando controles negativos y positivos. Por ejemplo, el operon lac en E. coli, a diferencia del operon trp, esta controlado por controles transcripcionales negativos y positivos: el represor lac y la protefna CAP respectivamente. El operon lac codifica las protefnas necesarias para transportar el disacarido lactosa al interior de la celula para su utilizacion metabolica. CAP, como ya se ha visto, capacita a la Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

mRNA 5'

3'

•

proteina

LA EUMINACI6N DEL UGANDO DESACTIVA EL GEN POROUE SEPARA LA PROTEfNA ACTIVADORA

usar fuentes alternativas de carbono cuando la glucosa, su fuente preferida, no es accesible. La disminucion de los niveles de glucosa en el medio induce un incremento del nivel de la moh~cula sefializadora intracelular AMP ciclico (cAMP), que se une ala protefna CAP, capacitandola para unirse a secuencias de DNA especificas proximas a ciertos promotores, y de este modo activa los genes adecuados. En este caso la expresion del gen diana es inducida 0 reprimida en funcion de que los niveles de cAMP sean altos 0 bajos respectivamente. En la Figura 9-27 se resumen las diferentes maneras en que se puede controlar un gen por control positivo 0 negativo. Los activadores y los represores transcripcionales tienen un disefio similar en muchos aspectos. Por ejemplo, tanto el represor del triptofano como el activador transcripcional CAP presentan un motivo helice-giro-helice y requieren la presencia de un pequefio cofactor para unirse al DNA. De hecho, se sabe que algunas protefnas bacterianas (incluyendo CAP y el represor del bacteriofago lambda) actuan como activadoras 0 como represoras en funcion de la posicion exacta de la secuencia de DNA que reconocen en relacion al promotor: si ellugar de union a la protefna solapa el promotor, la polimerasa no puede unirse y la protefna actua como represor (Figura 9-28).

448

•

LA ADICI6N DEL UGANDO DESACTIVA EL GEN POROUE SEPARA LA PROTEfNA ACTIVADORA

GEN INACTIVO UN LIGAN DO SE UNE A LA PROTEINA REGULADORA CAPACITANDOLA PARA UNIRSE ALDNA

3'

5'

Figura 9-27 Resumen de los mecanismos que utilizan las protefnas reguladoras de genes para controlar la transcripci6n en los procariotas. (A) Regulaci6n negativa; (B) regulaci6n positiva. Observese que la adici6n de un ligando inductor puede activar un gen ya sea separando del DNA a una protefna represora de genes (panel superior izquierdo) , 0 capacitando a una protefna activadora de genes para que se una al DNA (panel inferior derecho). Del mismo modo, la adici6n de un ligando inhibidor puede desactivar un gen separando del DNA a una protefna activadora de genes (panel superior derecho) 0 capacitando a una protefna represora de genes para que se una al DNA (panel inferior izquierdo).

Figura 9-28 Algunas proteinas reguladores bacterianas actuan bien activadores 0 como represores de la transcripcion dependiendo del emplazamiento concreto de sus secuencias de union al DNA. Un ejemplo de ella es el represor del bacteri6fago lambda. La proteina actua como un activador transcripcional aportando un contacto favorable a la RNA polimerasa (arriba). En la parte inferior de la figura el operador se localiza un par de bases mas pr6ximo al promotor, y en vez de ayudar a la polimerasa, ahora compite con esta por la uni6n al DNA. EI represor lambda reconoce a su operador mediante un motivo helice-giro-helice, como se muestra en la Figura 9-11.

bacteria para utilizar fuentes de carbono altemativas a la glucosa, como por ejemplo la lactosa. Serfa sin embargo im1til para CAP inducir el oper6n lac si no hubiera lactosa disponible, y el represor lac asegura que el oper6n lac este inactivo en ausencia de lactosa. Esta organizaci6n permite al oper6n lac responder integrando dos seiiales diferentes, de forma que s610 se activa cuando las condiciones son las adecuadas: no debe de haber glucosa pero sf lactosa. Cualquier otra de las tres combinaciones posibles de seiiales mantiene al oper6n inactivo (Figura 9-29). La 16gica simple de este interruptor genetico atrajo la atenci6n de los bi610gos desde hace 50 aftos. Como se ha explicado anteriormente, las bases moleculares de este interruptor fueron descubiertas gracias a una combinaci6n de genetica y bioqufmica y aport6 los primeros detalles sobre c6mo se realiza el control de la expresi6n de los genes. Aunque en los organismos superiores se utilizan las mismas estrategias para controlar la expresi6n genica, los interruptores geneticos son mucho mas complejos.

represor de lambda

RNA polimerasa

7...JIL...1- - - - , I - - - J

operador

promotor la transcripcion es activada por el represor de lambda

~ L...I_ _--,1_ _----1

operador

promotor la transcripcion es reprimida por el represor de lambda

La regulaci6n de la transcripci6n en las celulas eucariotas es compleja 24 El mecanismo de interruptor sensible ados seiiales que controla el oper6n lac es elegante y sencillo. Sin embargo, es diffcil imaginar la complejidad que se aiiade al sistema cuando se han de tener en cuenta muchas mas seiiales que pueden lugar de union lugar de de la RNA union polimerasa de CAP (promotor)

Figura 9-29 Control dual del operon lugar de inicio para la sintesis de RNA

I

·

,--------, I

_1!;\~'$')'14,tll"!!. ~

gen lacZ

operador

-80

-40

--

40

80

LI_--'-_--LI_--'-_--L_--'-_--L1_ - - , -_ _I

+GLUCOSA +LACTOSA

+GLUCOSA -LACTOSA

CAP

-GLUCOSA -LACTOSA

OPERON INACTIVO porque CAP no esta unida

'. ";>Ii •

represor

• \' ,,}',":,Y

pares de nucleotidos

represor ;"i"; ;~~~%~

-GLUCOSA +LACTOSA

OPERON INACTIVO tanto porque el represor lac esta unido como porque la proteina CAP no 10 esta OPERON INACTIVO porque el represor lac esta unido

lac. Los niveles de glucosa y de lactosa

controlan el inicio de la transcripcion del operon lac a traves de sus efectos sobre la proteina represora de lac y sobre CAP. La adicion de lactosa incrementa la concentraci6n de alolactosa, que se une a la proteina represora y la separa del DNA. La adicion de glucosa reduce el nivel de AMP ciclico; como la proteina represora CAP ya no tiene AMP ciclico unido, la proteina CAP se libera del DNA y el oper6n se activa. En la Figura 9-8 se muestra como la proteina CAP induce una curvatura en el DNA al unirse; aqui no se muestra para simplificar el esquema. LacZ, el primer gen del operon lac, codifica la enzima p-galactosidasa, que rompe la lactosa en galactosa y glucosa.

OPERON ACTIVO RNA

C6mo funcionan los interruptores geneticos

~.~

449

regular la transcripcion del operon: el espacio necesario para colocar secuencias reguladoras desbordaria nipidamente todo el espacio disponible leomo han conseguido los eucariotas superar estas limitaciones y crear interruptores geneticos mas complejos? La regulacion de la transcripcion en los eucariotas difiere de la de las bacterias en dos aspectos fundamentales. En primer lugar, las RNA polimerasas eucariotas no pueden iniciar la transcripcion por si mismas. Requieren la presencia de una serie de proteinas, denominadas facto res generales de transcripci6n, que han de ensamblarse en el promotor antes de que la transcripcion pueda iniciarse. Este proceso de ensamblaje presenta multiples etapas en las que la velocidad de inicio de la transcripcion puede aumentar 0 disminuir como respuesta a sefiales de regulacion, y muchos proteinas reguladoras eucariotas actuan influyendo en estas etapas. En segundo lugar, muchas proteinas reguladoras de eucariotas pueden actuar incluso cuando se encuentran unidas al DNA a miles de nucleotidos de distancia del promotor que regulan, 10 que significa que un determinado promotor puede estar controlado por un numero casi ilimitado de secuencias reguladoras dispersas por el DNA. A continuacion consideraremos estas dos caracteristicas de la regulacion genica eucariota.

Las RNA polimerasas eucariotas requieren factores de transcripci6n generales25 EI descubrimiento inicial de que las RNA polimerasas eucariotas purificadas no podian iniciar la transcripcion in vitro llevo al descubrimiento y purificacion de proteinas adicionales, los denominados factores generales de transcripci6n, necesarios para este proceso. Estas proteinas no son simplemente subunidades perdidas de la polimerasa; tienen que ensamblarse formando un complejo sobre el DNA en ellugar promotor con el fin de poder reclutar a la RNA polimerasa en ese lugar. La Figura 9-30 muestra como se cree que se ensamblan los factores genera~ les de transcripcion en los promotores utilizados por la RNA polimerasa II (Pol II), la polimerasa que transcribe la gran mayoria de los genes eucariotas. El proceso de ensamblaje se inicia con la union de TFIID a la secuencia TATA, una secuencia corta de DNA de doble cadena formada esencialmente por nucleotidos T y A. La secuencia TATA es un componente de casi todos los promotores utilizados por Pol II y se encuentra localizada tipicamente 25 nucleotidos por delante dellugar de inicio de transcripcion. TFIID esta compuesto por muchas subunidades; la responsable de reconocer la secuencia TATA se denomina TBP (de TATA Binding Protein) (Figura 9-31). Una vez se ha unido TFIID a su lugar de union en el DNA, los demas factores de transcripcion y la RNA Pol II tambien seunen. Despues de que la RNA Pol II se haya unido al promotor, se ha de separar del complejo de factores generales de transcripcion para poder iniciar la trans-

r-. •t------';1 TATAA

TFIID

TFIIB

TFIIH

Figura 9-30 Ensamblaje de los factores generales de transcripci6n necesarios para la iniciaci6n de la transcripci6n por la RNA polimerasa II. , En la primera etapa TFIID se une especfficamente ala secuencia TATA. A continuaci6n TFIIB se une al complejo, seguido par la RNA polimerasa II (Pol II) acompafiada de TFIIF. A continuaci6n TFIIE y TFIIH se unen al complejo. En presencia de ATP, TFIIH fosforila Pol II, can 10 que se activa la funci6n polimerasa y se inicia la transcripci6n. Ellugar de fosforilaci6n es una larga cola polipeptfdica que se extiende desde la subunidad mayor de Pol II. En los mamiferos esta formada par 52 repeticiones de la secuencia de aminoacidos YSPTSPS (vease Figura 8-42) y las que son fosforiladas son las cadenas laterales de los aminoacidos serina (S) y treonina (T) de esta secuencia. Los facto res generales de transcripci6n han sido muy conservados evolutivamente: par ejemplo, algunos de ellos,aislados a partir de celulas humanas, pueden ser reemplazados par los equivalentes delevadura.

450

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

l

RNA polimerasa II

l

actividad protefna quinasa (TFH

•

SE INICIA LA TRANSCRIPCION

COOH

cripci6n. Una etapa clave en el inicio de la transcripci6n es la realizada par TFIIH, una subunidad de la cual es una quinasa que fosforila Pol II. AI menos en algunos promotores parece que esta fosforilaci6n libera la polimerasa y permite que se inicie la transcripci6n. Las otras dos RNA polimerasas que se encuentran en eucariotas, RNA polimerasa I (Poll) y RNA polimerasa III (Pol III), tambien requieren una serie de factores generales de transcripci6n. Aunque TBP es necesario para las tres polimerasas, los demas factares son diferentes de los que se ensamblan en los promotares Pol II, y la uni6n de TBP en los promotares Pol I y Pol III no depende de una secuencia TATA en el DNA.

Figura 9-31 Estructura tridimensional de TBP. La estructura de esta subunidad de TFIID recuerda una silla de montar que se adapta a la doble helice de DNA. Aunque la proteina presenta una gran simetria, esta formada por una tinica cadena polipeptidica. Es probable que originalmente esta proteina fuera un dimero, y que el gen codificante del mon6mero original se duplicara y fusionara a 10 largo de la evoluci6n. TBP reconoce el DNA mediante un motivo diferente a los discutidos en este capitulo. No se conoce ninguna otra proteina que se una al DNA de la misma forma, 10 que quizas sea un reflejo del papel tinico de TBP en la celula: participa en el inicio de la transcripci6n de todos los genes. Aunque no se muestra en la figura, el DNA es deformado severamente por la uni6n de TBP. Esta deformaci6n -dos rizos separados por una zona de DNA desenrollado- puede ser una marca que ayude a atraer a los demas factores generales de transcripci6n. (Adaptado de D.B. Nikolov et al., Nature 360: 4045, 1992. © 1992 Macmillan Magazines Ltd.)

Los incrementadores 0 activadores controlan los genes a distancia26 Result6 una gran sorpresa para muchos bi610gos la demostraci6n, en 1979, de que DNA situado a miles de nucle6tidos de distancia de un promotor eucariota puede activar la transcripci6n desde el promotor. Actualmente se sabe que estas secuencias incrementadoras a activadoras (enhancers) actuan como lugares de uni6n de proteinas reguladoras que activan a incrementan la transcripci6n y que este tipo de "acci6n a distancia" es mas la regIa que la excepci6n para las proteinas reguladoras en las celulas eucariotas. Este fen6meno tambien ocurre,

RNA polimerasa bacteriana en un complejo cerrado

NtrC

::-II..._-~~~~==== .. incrementador o activador

r=:promotor

ADP

interm.edi~~iO~~ de actlvaclon en bucle

::-11

1 GENACTIVO

(A)

Como funcionan los interruptores geneticos

Figura 9-32 Activacion genica a distancia. (A) NtrC es una proteina de regulaci6n genica bacteriana que activa la transcripci6n facilitando la transici6n entre el complejo cerrado y el abierto de la RNA polimerasa (descrito en el Capitulo 8). Aunque no es frecuente en las RNA polimerasas bacterianas, la transici6n que estimula NtrC requiere la hidr6lisis de ATP. (B) Se puede ver en las micrografias de microscopia electr6nica la interacci6n de NtrC y RNA polimerasa, asi como el bude de DNA que las separa. Aunque la activaci6n genica mediante budes de DNA es poco frecuente en bacterias, es tipica de las proteinas reguladoras eucariotas. (B, cortesia de Harrison Echols.)

451

doble halice de DNA

100

~

E '">

80

0-e

J! Q) c:

60

-0

100 pares de nucle6tidos

or:; E

40 1: Q) 0

c: 0 0

20 0

(AI

500 pares de nucle6tidos

(8)

(C)

aunque con menor frecuencia, en procariotas. ieOmo pueden ejercer su funcion estas protefnas a tales distancias? Se han propuesto muchos modelos, pero parece que el mas simple serfa el mas correcto. El DNA existente entre el incrementador y el promotor se doblarfa permitiendo que las protefnas unidas al incrementador interactuaran directamente con uno de los factores generales de transcripcion 0 con la propia RNA polimerasa (Figura 9-32). El DNA actuarfa como una cuerda, provocando que las protefnas unidas al incrementador, incluso a miles de nucleotidos de distancia, colisionen repetidamente con las protefnas unidas al promotor. Este es el mismo efecto que se esperarfa obtener incrementando la concentracion local de protefna en el promotor (Figura 9-33).

Una regi6n de control eucariota esta formada por un promotor y por las secuencias de DNA reguladoras 27 Debido a que las protefnas reguladoras pueden controlar la transcripcion incluso cuando se encuentran unidas al DNA lejos del promotor, las secuencias de DNA que controlan la expresion de un gen pueden estar dispersas sobre largas extensiones de DNA. Aquf se utiliza el termino regi6n de control del gen para indicar las secuencias de DNA necesarias para iniciar la transcripcion del gen, y las necesarias para regular la frecuencia con que tiene lugar esa iniciacion. Asf pues, un promotor eucariota consta de un promotor, donde se ensamblan los factores generales de transcripcion y la polimerasa, mas todas las secuencias regulado. ras a las que se unen las protefnas reguladoras para controlar la velocidad de ese proceso de ensamblaje sobre el promotor (Figura 9-34). En eucariotas superiores no es inusual encontrar las secuencias reguladoras a distancias tan largas como 50 000 pares de bases, aunque la mayor parte de las secuencias de DNA actuan como DNA "espaciador" y no son reconocidas por ninguna protefna reguladora. En este capftulo utilizamos el termino gen para indicar el DNA que se transcribe en RNA (vease Figura 9-34), aunque seglin la idea clasica de gen deberfa incluir tambien la region de control. Las diferentes definiciones proceden de los modos distintos en que historicamente se han ido identificando los genes, y los descubrimientos modernos han complicado el sentido de este termino -mas adelante, en este mismo capftulo, volveremos a esta idea. Aunque muchas protefnas reguladoras se unen a secuencias incrementadoras y activan la transcripcion genica, algunas actuan como reguiadores negativos, como se vera mas adelante. En contraste con el pequeno numero de factores generales de transcripcion, que son protefnas abundantes y se ensamblan en los promotores de todos los genes transcritos por Pol II, existen miles de diferen452

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

1000 1500 500 separacion de los lugares de uni6n en pares de nucle6tidos

2000

Figura 9-33 La uni6n de dos proteinas a lugares dlstantes de la doble hetice de DNA puede aumentar considerablemente la probabllidad de que ambas proteinas interactt1en. (A) La union de una proteina a la otra mediante una asa de DNA de 500 pares de nucleotidos aumenta su frecuencia de colision. En la figura, la intensidad de azul retleja la probabilidad de que la proteina raja se encuentre en cada una de las posiciones del espacio respecto de la proteina blanca. (B) La tlexibilidad del DNA es tal que una secuencia cualquiera forma un pliegue de 90 0 , de vertice redondeado, cada 200 pares de nucleotidos aproximadamente. Asi, cuando dos proteinas estan unidas por solo 100 pares de nucleotidos, su contacto queda relativamente restringido. En estos casos, la interaccion proteica es mucho mas facH si los dos lugares de union para las proteinas estan separados por una distancia mUltiple de 10 pares de nucleotidos, la cual sitl1a a ambas proteinas sobre la misma cara de la helice de DNA (que contiene 10 nucleotidos por vuelta) y, por 10 tanto, en el interior del bucle de DNA, donde mas facHmente pueden interactuar. (C) Concentracion efectiva teorica de la proteina raja en la posicion donde esta unida la proteina blanca, en funcion de la separacion entre ambas. (C, cortesia de Gregory Bellomy, modificaci6n de M.C. MossingyM.T. Record, Science 233:889-892, 1986. © 1986 the AAAS.)

facto res generales de transcripci6n I I

protefnas de regulaci6n genica gen X -----,

secuencia reguladora

DNA espaciador .

I

~D

promotor

t

transcrito de RNA

la regi6n de control del gen X

tes protefnas reguladoras. Estas protefnas varian de gen a gen, y cada UN.a se encuentra presente en cantidades muy pequefias en cada celula. Muchas de ellas reconocen su secuencia especffica de uni6n utilizando uno de los motivos estructurales de uni6n a DNA que hemos descrito previamente. Estas protefnas permiten que cada gen pueda ser activado 0 desactivado especfficamente. En cada tipo celular de un eucariota superior existe una colecci6n diferente de protefnas reguladoras.

Muchas proteinas activadoras aceleran el ensamblaje de los factores generales de transcripci6n28 La mayorfa de las protefnas reguladoras que activan la transcripci6n de los genes -es decir la mayor parte de las protefnas activadoras genicas- tienen un disefio modular que consta de al menos dos dominios. Habitualmente uno de ellos contiene uno de los motivos estructurales capaces de reconocer una secuencia reguladora especffica en el DNA que hemos descrito previamente. En el caso mas sencillo existe s610 otro dominio que entra en contacto con la maquinaria de transcripci6n y acelera la frecuencia de inicio de transcripci6n. Este tipo de disefio modular fue demostrado mediante experimentos en los cuales me-

(A)

. [ protelna GAL4

~~ ~~t~~~~racfdico 0

dominio de GAL4 de uni6n al DNA

il1l'4'\'1iill

gen lacZ

\i® TATA

GEN ACTIVO RNA

(B)

p~ot~f~a

[I!£ o

qUlmerica lexAGAL4

I;M lugar de uni6n al DNA de GAL4

TATA

lugar de uni6n al DNA de lexA

TATA

GEN INACTIVO

•

GEN ACTIVO RNA

Como funcionan los interruptores geneticos

Figura 9-34 Region de control de un gen eueariota tipieo. EI promotor es la secuencia de DNA donde se ensamblan los facto res generales de transcripci6n y la polimerasa. EI rasgo mas importante del promotor es la caja TATA, una corta secuencia de pares de bases A-T YT-A que es reconocida por el factor general de transcripci6n TFIlD. EI punto de inicio de la transcripci6n esta localizado tfpicamente a 25 pares de bases por debajo de la secuencia TATA. Las secuencias reguladoras actuan como lugares de uni6n para las protefnas reguladoras, cuya presencia en el DNA afecta la velocidad de iniciaci6n de la transcripci6n. Estas secuencias se pueden encontrar adyacentes al promotor, muy lejanas por delante de el 0 incluso por detras. Se cree que los bucles de DNA permitirfan que las protefnas situadas en cualquiera de estas posiciones interactuaran con las protefnas que se ensamblan en el promotor. Mientras que los facto res generales de transcripci6n son similares para todos los genes transcritos por la RNA polimerasa II, las protefnas reguladoras y las posiciones de sus secuencias de uni6n en relaci6n con el promotor son distintas para cada gen.

Figura 9-35 Estruetura modular de una protema de aetivacion geniea. Esquema de un experimento de cambio de dominios proteicos que revela que las funciones de uni6n a DNA y de activad6n de la transcripd6n residen en diferentes dominios de la protefna activadora genica GAlA de levaduras. Es posible reconstituir un activador funcional a partir de una pord6n del extrema carboxilo de la protefna GAlA si se fusiona, mediante tecnicas de fusi6n genica, con el dominio de uni6n a DNA de una protefna reguladora bacteriana (la protefna lexA). Cuando la protefna hIbrida resultante, levadura-bacteria, es producida en celulas de levadura, activara la transcripci6n de los genes de levadura que presenten insertada en su proximidad la secuenda de reconocirniento de la protefna bacteriana. (A) La activad6n normal del gen por la protefna GAlA. (B) La protefna reguladora quimerica requiere la secuencia de uni6n a DNA de lexA para su actividad. Normalmente GAlA es responsable de activar la transcripci6n de los genes de levadura que codifican las enzimas que convierten galactosa en glucosa. Para los experimentos que se muestran en la figura se fusionaron la regi6n de control de esos genes con el gen lacZ de E. coli, que codifica la enzima ~-galactosidasa (vease Figura 9-29). ~-galactosidasa es una enzima muy facil de detectar, y por ello es un marcador conveniente para seguir los niveles de expresi6n determinados por una regi6n de control genico; lacZ sirve como un gen marcador (vease pag. 345).

453

Figura 9-36 Modelo para la acci6n de los activadores acidicos. La proteina activadora genica GAlA, unida al DNA en la vecindad del promotor, facilita la incorporaci6n de TFIIB al naciente complejo de factores generales de transcripci6n. Las proteinas activadoras unidas al DNA incrementan la velocidad de transcripci6n hasta 1000 veces, 10 que es consistente con una afinidad debil y no especifica entre el activador y los facto res generales de transcripci6n (un cambio en la afinidad de 1000 veces corresponde a un ~G de -4 kcal/mol, que puede alcanzarse por unos cuantos enlaces no covalentes debiles).

diante tecnicas de ingenierfa genetica se crearon protefnas hfbridas que contenfan el dominio de activacion de una protefna fusionado con el dominio de union a DNA de otra protefna diferente (Figura 9-35). En una de las clases de protefnas activadoras genicas, el dominio de activaci6n presenta en su superficie un gmpo de aminmicidos cargados negativamente (acfdicos). Estos activadores acidicos actuan acelerando el ensamblaje de los factores generales de transcripci6n en el promotor. En principio, cualquiera de las etapas de ensamblaje que se muestran en la Figura 9-30 puede ser la etapa limitante en el proceso de inicio de la transcripci6n. En algunos promotores la etapa limitante es la entrada de TFIIB en el complejo, y se cree que los activadores acfdicos contribuyen a superar esta limitaci6n facilitando al ensamblaje de TFIIB en el complejo (Figura 9-36). Otras protefnas activadoras parecen actuar uniendo TFIID al DNA, mientras que otras pueden activar latranscripci6n por diferentes mecanismos. En principio, el proceso de ensamblaje en el promotor podrfa tener mas de una etapa limitante, y el nive! maximo de transcripci6n podrfa depender de varios activadores genicos unidos a la regi6n anterior, de modo que cada uno de ellos acelerarfa una etapa diferente. Asf, no resulta diffcil comprender c6mo varias protefnas reguladoras, cada una de ellas unida a una secuencia reguladora diferente, podrfan controlar la transcripci6n de un gen eucariota. Pero, independientemente de cum sea el mecanismo preciso de acci6n, para que una protefna reguladora pueda influir en la transcripci6n de su promotor diana ha de estar unida directa 0 indirectamente al DNA.

Las proteinas represoras pueden inhibir la transcripci6n de diferentes formas 29 Las proteinas activadoras eucariotas actuan de una manera similar en principio a la que hemos descrito para los activadores genicos bacterianos: catalizan la acci6n de la polimerasa contactando con la maquinaria de transcripci6n. Sin embargo, no todas las protefnas reguladoras eucariotas activan la transcripci6n. Tal como hemos indicado, muchas de ellas actuan como proteinas represoras genicas impidiendo la transcripci6n. A diferencia de los represores bacterianos muchas de estas protefnas no actuan compitiendo con la polimerasa por el acceso al DNA. A pesar de que su mecanismo preciso aun no esta completamente establecido, parece que diferentes represores tienen diferentes mecanismos de accion, tres de los cuales se describen en la Figura 9-37. Ademas de las protefnas represoras que actuan sobre genes individuales, las celulas eucariotas pueden utilizar otros mecanismos para impedir la expresi6n de los genes en grandes regiones del cromosoma. Este mecanismo se basa en la modificaci6n de la estmctura de la cromatina, 10 cual se discutira mas adelante.

Las proteinas reguladoras de genes de celulas eucariotas frecuentemente se ensamblan formando pequeiios complejos sobre el DNA30 Aunque algunas protefnas reguladoras de celulas eucariotas puede actuar independientemente, la mayorfa de ellas forman parte de un complejoformado por 454

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

secuencia de union a DNA para GAL4

..

"

: ,

\

rGA~ TFIID

TFIIB

~-"',.~!i!iii~;;;::: • TATA GEN

(A)

uni6n competitiva al DNA

-.

~

TATA

~gar

/ de uni6n lugar de uni6n del represor del activador (8)

bloqueo de la superficie de activaci6n

•

4WA%¥ TATA

II

lugar de uni6n del activador

lugar de uni6n del represor

.....__d-;\,

lugar de uni6n

(C)

interacci6n directa con los facto res generales de transcripci6n

1

lugar de uni6n del activador

Figura 9-37 Tres maneras de actuar de las proteinas represoras eucariotas. En el primero CAl las proteinas activadoras y represoras compiten por la union a la misma secuencia de DNA regulador. En la segunda CBl ambas proteinas pueden unir DNA, pero el represor forma un complejo can el dominio de activaci6n del activador, evitando que entre en contacto can la maquinaria de transcripcion. En el tercero cel el represor interacciona can un nacicntc complejo de facto res generales de transcripcion, impidiendo que el proceso de ensamblaje continue. En la Figura 9-21 se ilustra un cuarto mecanismo de control negativo: la inactivacion de activadores genicos por heterodimerizaci6n.

TFIID TATA

diferentes polipeptidos, cada uno de los cuales tiene una funcion distinta. Frecuentemente el complejo se ensambla unicamente en presencia de la secuencia de DNA adecuada. Por ejemplo, en algunos casos bien estudiados, dos proteinas reguladoras con una baja afinidad una de la otra cooperan para unirse a una secuencia de DNA, secuencia a la que son incapaces de unirse por si mismas independientemente. Una vez unidas al DNA, el dimero expone una superficie que es reconocida por una tercera proteina portadora de un dominio de activacion que activa la transcripcion (Figura 9-38). Este ejemplo ilustra un principio general importante: interacciones proteina-proteina que son demasiado debiles para ensamblar las proteinas en solucion pueden ser suficientes para producir el ensamblaje sobre el DNA; de esta forma la secuencia de DNA actuaria como un centro de nucleacion para el ensamblaje de complejos de proteinas. Una proteina reguladora determinada puede participar en mas de un tipo de complejo regulador. Una proteina puede actuar en un caso como parte de un complejo que activa la transcripcion, y en otro caso como parte de un complejo que la inhibe (vease Figura 9-38). Asi pues, individualmente las proteinas reguladoras eucariotas no tienen ninguna funcion activadora 0 represora pero actuan como unidades reguladoras que se utilizan para construir complejos cuya funcion final dependera del ensamblaje de todos sus componentes. Ya hemos visto como la formacion de los heterodimeros de proteinas reguladoras en solucion suponia un mecanisme de control combinatorio de la expresion de los genes. EI ensamblaje de pequenos complejos de proteinas reguladoras sobre el DNA es un segundo mecanismo de control combinatoric (vease Figura 9-38). (A) EN SOLUCl6N • ,

~

. ...........

• • It

(8) EN DNA TRANSCRIPCl6N "'ACTIVADORA

'!!!III

TRANSCRIPCI6N REPRESORA

~>~'I~JI GEN ACTIVO

C6mo funcionan los interruptores geneticos

GEN INACTIVO

Figura 9-38 A menudo, las proteinas reguladoras de genes eucariotas se ensamblan sobre el DNA formando pequefios complejos. En CAl se muestran cinco proteinas reguladoras de genes. La naturaleza de la funcion del complejo que forman depende de la especificidad de la secuencia de DNA que nuclea su ensamblaje. En CBl un complejo activa la transcripci6n genica mientras que otro complejo reprime la transcripcion. Notese que la proteina dibujada en verde forma parte tanto del complejo de activacion como del de represi6n.

455

0000000

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Kruppel

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Figura 9-39 Distribuci6n no uniforme de cuatro proteinas reguladoras en un embri6n temprano de Drosophila. En este estadio el embrion es un sincitio, con muchos nucleos en un citoplasma comun. Aunque no estci claro en estos dibujos, todas las protefnas se concentran en los nucleos.

OO~

Los complejos interruptores geneticos que regulan el desarrollo de Drosophila estan formados por m6dulos menores 31 Dado que las proteinas reguladoras se pueden situar en muchos lugares a 10 largo de largas distancias en el DNA, que pueden ensamblarse formando complejos en cada uno de estos lugares y que los complejos pueden influir de diferentes maneras sobre el ensamblaje ordenado de los factores generales de transcripcion en el promotor, podria existir un numero casi ilimitado de posibilidades de crear interruptores geneticos complejos para el control de la expresion de los genes eucariotas. Un ejemplo especialmente interesante de un complejo de ese tipo, un interruptor genetico de multiples componentes, es el que controla la transcripcion del gen de Drosophila even-skipped (eve), la expresion del cual juega un papel importante en el desarrollo del embrion de Drosophila. Si el gen se inactiva por mutacion, muchas partes del embrion no se forman, y el embrion muere en una fase temprana del desarrollo. Tal como se discute en el Capitulo 21, en la etapa mas temprana del desarrollo en la que se expresa eve, el embrion es una unica celula gigante que contiene multiples nucleos y un solo citoplasma comun. El citoplasma no es uniforme, sino que contiene una mezcla de proteinas reguladoras que se distribuyen no uniformemente a 10 largo del eje del embrion, suministrando informaci6n posicional para distinguir entre una parte del embrion y otra (Figura 9-39). (En el Capitulo 21 se describe como se establecen estas diferencias.) Aunque inicialmente los nucleos son identicos, rapidamente empiezan a expresar genes diferentes ya que estan expuestos a diferentes proteinas reguladoras. Por ejemplo, el nucleo proximo al extremo anterior del embrion en desarrollo esta expuesto a un conjunto de proteinas reguladoras diferente al que influye en el nucleo del extremo posterior del embrion. Las secuencias de DNA regulador del gen eve estan disenadas para "leer" las concentraciones de las proteinas reguladoras en cada posicion a 10 largo del eje del embrion, interptetando esta informacion, de forma que el gen eve se expresa en siete franjas, cada una de las cuales tiene una anchura de cinco a seis nucleos, y situadas con precision sobre el eje anteroposterior del embrion (Figura 9-40). lComo se ha podido procesar esta informacion? A pesar de que los detalIes moleculares aun no son conocidos, del estudio de eve y de otros genes de Drosophila con una regulacion similar ya se han podido extraer algunos principios generales. La region reguladora del gen eve es muy larga (aproximadamente 20 000 pares de nucleotidos). Esta formada por una serie de modulos reguladores simples, cada uno de los cuales contiene multiples secuencias reguladoras y es responsable de una franja de expresion de eve en el embri6n. Esta organizacion modular se demuestra en experimentos en los que un modulo concreto (por ejemplo, el que especifica la franja 2) se extrae de su posicion normal delante del gen, se situa delante de un gen marcador y se reintroduce en el genoma de Drosophila (Figura 9-41A). Cuando se examinan embriones en desarrollo derivados de las 456

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

Figura 9-40 Las siete franjas de la proteina codificada por el gen evenskipped (eve) en un embri6n de Drosophila en desarrollo. Dos horas y media despues de la fecundacion, el huevo se fijo y tino con anticuerpos que reconocen la protefna Eve (verde) y anticuerpos que reconocen la protefna Giant (roja). Cuando las protefnas Eve y Giant se encuentran presentes ala vez, la tincion aparece amarilla. En este momento del desarrollo el huevo contiene aproximadamente 4000 nucleos. Tanto la protefna Eve como Giant se encuentran situadas en el nucleo, y las franjas de eve tienen una anchura de unos cuatro nucleos. En la Figura 9-39 se muestra el patron de tincion de la protefna Giant. (Cortesfa de Michael Levine).

m6dulo de la franja 3

m6dulo de m6dulo de la franja 2 la franja 7

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TATA

J

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TATA

m6dulo de la franja 2

gen eve

(B)

gen lacZ

(A)

(C)

moscas portadoras de la construcci6n de DNA, se observa la expresi6n del gen marcador exactamente en la posici6n de la franja 2 (Figura 9-41B). Experimentos similares a este demuestran la existencia de otros m6dulos reguladores, cada uno de los cuales especifica una de las otras seis franjas.

EI gen eve de Drosophila esta regulado por controles combinatorios32 El estudio detallado del m6dulo regulador de la franja 2 ha dado indicios de c6mo "lee" e interpreta la informaci6n posicional. Esta regi6n contiene secuencias de reconocimiento para dos protefnas reguladoras (Bicoid y Hunchback) que activan la transcripci6n de eve, y para otras dos protefnas reguladoras (Kriippel y Giant) que reprimen su transcripci6n (Figura 9-42). (Las protefnas reguladoras de Drosophila suelen tener nombres descriptivos que reflejan el fenotipo que resulta de la inactivaci6n por mutaci6n del gen que las codifica.) Las concentraciones relativas de estas cuatro protefnas determinan que complejos se formanin en el m6dulo de la franja 2 que activan la transcripci6n del gen eve. La Figura 9-43 muestra las distribuciones de las cuatro protefnas reguladoras en la regi6n del embri6n de Drosophila donde se forma la franja 2. Aunque no se conocen los detalles exactos, es probable que para inactivar el m6dulo de la franja 2 sea suficiente que cualquiera de los dos represores este unido al DNA, mientras que para activarlo al maximo sea necesario que se unan ambos activadares Bicoid y Hunchback. Asf pues, esta unidad integra las cuatro informaciones posicionales de forma que el modulo de la franja 2 se activa (yen consecuencia se activa la transcripci6n del gen eve) s610 en aquellos mlcleos en los que los niveles tanto de Hunchback como de Bicoid son elevados y no exista ni Kriippel ni Giant. Esta combinaci6n de activadores y represores solo ocurre en una region del embri6n temprano; asf pues, en cualquier otro caso el m6dulo de la franja 2 esta inactivo (y por ella es silencioso). Previamente hemos descrito dos mecanismos de control combinatorio de la expresi6n genica -heterodimerizaci6n de las protefnas reguladoras en soluci6n (vease Figura 9-19) y ensamblaje de combinaciones de protefnas reguladoras en pequenos complejos en el DNA (vease Figura 9-38). Es bastante probable que ambos mecanismos participen en la compleja regulaci6n de la expresi6n de eve.

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m6dulo de la franja 2: 480 pares de nucie6tidos - - - - - - - - '

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Bicoid y su lugar - - - deuni6n

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Hunchback y su --'---- lugar de uni6n

T

C6mo funcionan los interruptores geneticos

Figura 9-41 Experimento demostrativo de la construcci6n modular de la regi6n reguladora de eve. (A) Se tom6 una regi6n de 480 pares de nucle6tidos de la regi6n reguladora de eve y se insert6 por delante de un promotor que controla la sintesis de ~-galactosidasa(el producto del gen lacZ de E. coll). (B) Cuando se introdujo esta construcci6n artificial en el genoma de embriones de Drosophila, los embriones expresaron ~-galactosidasa (detectable mediante tinci6n histoquimica) precisamente en la posici6n de la segunda de las siete franjas de eve (C). (B YC, cortesia de Stephen Small y Michael Levine.) Figura 9-42 Detalle del m6dulo de la franja 2 de eve. EI segmento de la regi6n de control de eve identificado en la figura anterior contiene secuencias reguladoras, cada una de las cuales une alguna de cuatro proteinas reguladoras. A partir de experimentos geneticos sabemos que estas cuatro proteinas son responsables de la expresion correcta de la franja 2 de eve. Por ejemplo, las moscas deficientes en los dos activadores Bicoid y Hunchback no expresan la franja 2 de eve de forma eficiente. Cuando las moscas son deficientes en cualquiera de los dos represores, Giant y Kriippel, la franja 2 se hace mas amplia cubriendo una zona anormalmente grande del embrion. Las regiones de union a DNA para estas proteinas se han determinado a partir de su clonaje, sobrexpresion en E. coli, purificaci6n y experimentos de determinacion de huella en el DNA ifootprinting), tal como se ha descrito en el Capitulo 7. EI diagrama superior muestra que en algunos casos las secuencias de union se pueden solapar de forma que las proteinas pueden competir por su union al DNA. Por ejemplo, se cree que la union de Kriippel y Bicoid en ellugar situado mas a la derecha es mutuamente excluyente.

457

aquf se forma la franja 2 de eve i

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Ademas, la regulaci6n del m6dulo de la franja 2 descrita ilustra un tercer tipo de control combinatorio. Dado que las secuencias reguladoras del m6dulo de la franja 2 se encuentran repetidas y dispersas por todo el DNA, se pueden unir simultaneamente muchos conjuntos de proteinas reguladoras, influyendo asi at promotor del gen. El promotor integra sobre la transcripci6n las influencias de todas las protefnas unidas (Figura 9-44). La regulaci6n de la expresi6n de eve es un ejemplo extremo de control combinatorio. Siete combinaciones de proteinas reguladoras -una combinaci6n para cada franja- activan la expresi6n de eve, mientras que muchas otras combinaciones (todas las que se encuentran en las regiones entre franjas) mantienen el gen silencioso. Se cree que los otros m6dulos de franja tienen un diseno similar at descrito para el m6dulo de franja 2, siendo capaces de leer informaci6n posicional suministrada por otras combinaciones de proteinas reguladoras. La regi6n de control completa ocupa 20 000 pares de nucle6tidos y es capaz de unir mas de 20 protefnas distintas. Asi pues, una regi6n compleja y grande esta construida a partir de una serie de m6dulos de menor tamafio, cada uno de los cuales esta formado por una serie de secuencias cortas de DNA reconocidas por proteinas reguladoras especificas. Un requerimiento importante de esta estrategia es la ausencia de relaciones entre los m6dulos: el estado de uno de los m6dulos no influye sobre el de los restantes. Se desconoce c6mo se consigue este aislamiento molecular. Sin embargo, de esta forma un unico gen puede responder a una enorme cantidad de senates combinadas.

Figura 9-43 Distribuci6n de las protemas reguladoras responsables de asegurar que eve se exprese en la franja 2. La distribuci6n de estas proteinas se determin6 mediante tinci6n de ~n embri6n de Drosophila con anticuerpos dirigidos contra cada una de las cuatro proteinas (Figura 939). La expresi6n de eve en la franja 2 ocurre s610 en la posici6n donde los dos activadores (Bicoid y Hunchback) estan presentes y los dos represores (Giant y Kriippel) ausentes. Por ejemplo, en embriones de moscas que carecen de Kriippella franja 2 se expande en direcci6n posterior. De una manera similar, la franja 2 se expande en direcci6n posterior si las secuencias de uni6n a DNA de Kriippel se inactivan mediante mutaci6n y esta regi6n se reintroduce en el genoma. EI propio gen eve codifica una proteina reguladora que, despues de que se establezca su patron de distribucion en siete franjas, regula a su vez la expresi6n de otros genes de Drosophila. A medida que progresa el desarrollo, el embrion se subdivide en regiones cada vez mas finas que daran lugar finalmente a las diferentes partes del cuerpo de una mosca adulta, tal como se describe en el Capitulo 21.

En mamiferos las regiones de control tambien estan formadas a partir de m6dulos reguladores sencillos33 Se ha estimado que un cierto porcentaje de la capacidad de codificaci6n de un genoma de mamifero esta dedicado a la sintesis de proteinas que actuan como complejo activador fuerte

complejo de proteinas reguladoras silencioso

RNA polimerasa y factores generales de transcripcion

TATA

458

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

Figura 9-44 Integraci6n en un promotor. Varios grupos de p~oteinas reguladoras pueden actuar. conjuntamente influyendo sobre un promotor, como hacen en el modulo de la franja 2 de eve ilustrada previamente en la Figura 9-42. Aun no se conoce en detalle como se consigue la integraci6n de numerosas senales.

, . . . - - - - - - - - regiones de control genico - - - - - - - - , lugar de adici6n de poli-A

l DNA 400 pares de nUcle~6~t~id~o:.s_ -----~

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GATA-l

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GATA-l

GATA-l

GATA-l

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+2200

reguladores de la transcripci6n genica. Esto es un reflejo de los complejos controles que regulan la expresi6n de los genes en los mamiferos. Por ejemplo, es frecuente encontrar un gen con una r~gi6n de control con una longitud de 50 000 pares de nuele6tidos, en la que muchos m6dulos, cada uno de los cuales contiene un cierto numero de secuencias reguladoras que unen proteinas reguladoras, se encuentran separados por largas secuencias de DNA espaciador. Uno de los ejemplos mejor conocidos de regi6n reguladora compleja en mamiferos es la del gen de ~-globinahumann, que se expresa exelusivamente en los eritrocitos y en un momenta determinado de su desarrollo. La expresi6n del gen esta controlada por un conjunto complejo de proteinas reguladoras, algunas de las cuales actuan como activadores y otras como represores (Figura 9-45). Se cree que las concentraciones (0 actividades) de muchas de estas proteinas reguladoras cambian durante el desarrollo, y que s610 una combinaci6n particular de todas elIas induce la transcripci6n del gen. Como se vera mas adelante, el gen de la ~-globina se encuentra sometido a un segundo nivel de control, superior, que implica cambios en la estructura de la cromatina.

Asu vez, la actividad de una proteina de regulaci6n genica puede estar regulada34 La estrategias de regulaci6n del gen eve y del gen humano de la ~-globina son similares en cuanto a que la regi6n de control responde a una amplia serie de proteinas reguladoras. Sin embargo, el caso de Drosophila es poco frecuente en cuanto a que es la distribuci6n espacial de las proteinas reguladoras en el citoplasma la responsable de controlar la expresi6n del gen. Ya se ha dicho que el embri6n temprano de Drosophila es una unica celula gigante que contiene miles de nueleos en un citoplasma comun y que las proteinas reguladoras se encuentran distribuidas en complejos patrones espaciales de forma que distintos nueleos estan expuestos a diferentes concentraciones de las proteinas. Estas proteinas reguladoras entran al nueleo activando 0 reprimiendo directamente la transcripci6n de sus genes diana. En muchos embriones de otros organismos los diferentes nudeos se hallan en celulas diferentes, y la informaci6n posicional extracelular debe o bien pasar a traves de la membrana plasmlitica 0 bien, mas a menudo, generar sefiales en el citosol que puedan llegar a influir en el genoma. El mecanismo por el que las sefiales extracelulares comunican su mensaje a traves de la membrana plasmatica se describe en el Capitulo 15. Aqui s610 abordaremos las etapas finales de las cascadas de sefializaci6n intracelular activada por sefiales extracelulares -las etapas en las que se modifican las proteinas reguladoras. En muchos casos la proteina reguladora se encuentra en el interior de la celula en una forma inactiva, que otra sefial puede modificar, activandola. Por

C6mo funcionan los interruptores geneticos

+2400

Figura 9-45 Modelo para el control del gen de f3-globina humano. El diagrama muestra algunas de las protefnas reguladoras que se cree que controlan la expresion durante el desarrollo de los eritrocitos (vease Figura 9-52). Algunas de las protefnas mostradas, como CP1, se encuentran en muchos tipos celulares, mientras que otras, como GATA-1, son propias de algunos tipos celulares, incluyendo a los eritrocitos, y por ello se cree que contribuyen a la expresion especffica de tipo celular de los genes de Pglobina. Tal como se indica con las flechas de dos cabezas, algunas de las secuencias de GATA-1 se solapan con las de otras proteinas reguladoras; se cree que la ocupacion de estos lugares por GATA-1 excluye la union de otras proteinas. (Adaptado de B. Emerson, En 'Gene Expression: General and Cell-Type Specific' [M. Karin ed.] pp. 116-161. Boston: Birkhauser, 1993.)

459

SiNTESIS DE LA PROTEfNA

UNION A UN UGANDO

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INACTIVA

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ACTIVA

FOSFORILACION DE LA PROTEfNA

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RNA polimerasa can la subunidad virica semejante a sigma

proteina inhibidora

f-v F --

Figura H-46 Algunos mecanismos de regulaci6n de la actividad de las prote{nas reguladoras en las celulas eucariotas. (A) La protefna reguladora de genes s610 se sintetiza cuando es necesaria y sufre una proteolisis nipida que evita su acumulaci6n. (B) Activaci6n par uni6n a un ligando. (e) Activaci6n par fosforilaci6n. (D) Formaci6n de un complejo con otra protefna que actua como dominio activador de la transcripci6n. (E) Desenmascaramiento de un dominio de activaci6n par fosfarilaci6n de una protefna inhibidora. (F) Estimulaci6n de la entrada al nueleo por eliminaci6n de una protefna inhibidara que mantenia ala protefna incapaz de entrar al nueleo.

Ya hemos resaltado la importancia de las protefnas reguladaras que se unen a las secuencias reguladoras de DNA e indican al aparato transcripcional si se ha de iniciar 0 no la sfntesis de la cadena de RNA. Aunque este es el principal mecanismo de control del inicio de la transcripci6n tanto en eucariotas como en procariotas, algunas bacterias y sus virus utilizan una estrategia adicional basada en las subunidades de la RNA polimerasa intercambiables. Como se describi6 ya en el Capftulo 8 , la subunidad sigma (aJ es necesaria para que la RNA polimerasa reconozca un promotor. Algunas bacterias producen diferentes subunidades sigma, cada una de las cuales puede interactuar con el nucleo de la RNA polimerasa y dirigirla especfficamente hacia diferentes promotares. Esta estrategia permite desactivar un gran grupo de genes y activar otro simplemente reemplazando una subunidad sigma por otra. La estrategia es eficiente pues evita la necesidad de actuar sobre los genes uno a uno, y es utilizada frecuentemente por los virus para activar conjuntos de genes nipida y secuencialmente (Figura 9-47).

...

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uni6n al DNA

Las bacterias utilizan subunidades intercambiables de la RNA polimerasa para colaborar en el control de la transcripci6n genica35

~

'='

.inhibidor

ejemplo, la protefna puede ser activada par fosforilaci6n catalizada por una protefna quinasa, 0 puede liberarse de un complejo que de otro modo mantendrfa a la protefna reguladora secuestrada en el citosol impidiendo su entrada al nucleo. En la Figura 9-46 se ilustran estas y otras farmas de controlar la actividad de las protefnas reguladoras.

RNA polimerasa can el factor sigma de la bacteria

ESTIMULACION DE LA ENTRADA AL NUCLEO

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(DNA VfRICO

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34

genes medias

genes tardios

Figura 9-47 Subunidades intercambiables de la RNA polimerasa como estrategia de control de la expresi6n genica en virus bacterianos. El virus bacteriano SPO 1, que infecta a la bacteria B. subtilis, utiliza la polimerasa bacteriana para transcribir sus genes tempranos. Uno de los genes tempranos, denominado 28, codifica un factar similar a la subunidad sigma que se une a la RNA polimerasa, desplazando ala subunidad sigma bacteriana. Esta nueva forma de polimerasa inicia especfficamente la transcripci6n de los genes "medios" de SPOl. Uno de los genes medios codifica otra subunidad similar a la subunidad sigma, desplazando a su vez al factor producto del gen 28 y dirigiendo ahora la RNA polimerasa a la transcripci6n de los genes "tardfos". Este Ultimo grupo de genes codifica las protefnas que empaquetanin el cromosoma virico en una cubierta virica y lisanin la celula. Asf pues, esta estrategia permite que se expresen una serie de genes viricos en un orden particular, permitiendo un control nipido, controlado temparalmente, de la replicaci6n virica.

460

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

CAGATTGAAACGTCa::: GGCCG AAAACAAAATCAACAAA CAGATTGAAACGTCGrGGCCAAAAACAAAATCAACAAA

Drosophila melanogaster

~~

U~

n

-----v-

--==:_-t1_============ -==: C-V-inicio del RNA 100 pares de nucle6tidos

En un cierto sentido, los eucariotas utilizan una estrategia similar al disponer de tres RNA polimerasas (I, II, YIII), que comparten algunas de sus subunidades. Por contraste, los procariotas utilizan el mismo mlcleo basico de RNA polimerasa, que modifican con diferentes subunidades sigma.

Los interruptores geneticos han evolucionado gradualmente Hemos visto que las regiones de control de los genes eucariotas se distribuyen sobre largos fragmentos del DNA, mientras que las de los procariotas estan pr6ximas al inicio de transcripci6n. Sin embargo, algunas proteinas reguladoras procariotas reconocen secuencias de DNA localizadas a muchos pares de nucle6tidos del promotor. El ejemplo del bucle de DNA en E. coli mostrado en la Figura 9-32 se parece al mecanismo por el cuallas proteinas reguladoras eucariotas actuan a distancia. De hecho, este caso fue uno de los primeros ejemplos de formaci6n de bucles en el DNA implicados en la regulaci6n de los genes e influy6 en gran medida en los estudios posteriores de las proteinas de regulaci6n genica eucariotas. Parece probable que el desarrollo de los interruptores genicos en estructuras densamente empaquetadas a partir de interruptores mayores sea la respuesta a una presi6n evolutiva de las bacterias hacia el mantenimiento de un genorna de pequeno tamano. (Este mismo argumento se ha utilizado para justificar la ausencia de intrones en las bacterias, como se ha visto en el Capitulo 8.) Sin embargo, esta compresi6n tiene un coste, yes el de imaginar c6mo pueden modificarse con facilidad para incluir nuevos niveles de control. La forma extendida de las regiones de control eucariota, con m6dulos reguladores discretos separados por largas secuencias de DNA espaciados, podrian facilitar el mezclado de los m6dulos durante la evoluci6n, tanto para crear nuevos circuitos reguladores como para modificar los ya existentes. Desentranar la historia evolutiva de las regiones de control representa un reto fascinante, y muchas de las claves podran encontrarse elIas secuencias de DNA actuales (Figura 9-48).

inicio de la secuencia codificante de la protein a engrailed

Figura 9-48 Comparaci6n entre partes de la regi6n reguladora situada en direcci6n 5' a partir del gen engrailed de dos especies de Drosophila. Se presenta la comparaci6n de las secuencias de Drosophila melanogastery de Drosophila virilis, senalandose en rojo las secuencias con un 90% de identidad. En la parte superior se indica a modo de ejemplo la secuencia real de un fragmento comparado. Las secuencias conservadas senalan posiblemente los lugares donde se deben unir importantes protefnas reguladoras, mientras que los bucles indican lugares donde han ocurrido inserciones 0 deleciones de nucle6tidos, ya que estas dos especies han evolucionado desde un ancestro comtin hace alrededor de 60 millones de anos. (Por cortesfa de Judith A. Kassis y Patrick H. O'Farrell.)

Resumen La transcripci6n de cada uno de los genes en las celulas es activada

0 desactivada por protetnas de regulaci6n genica. En procariotas estas protetnas se unen habitualmente a secuencias espectficas de DNA proximas allugar de inicio de la transcripcion por la RNA polimerasa y, dependiendo de la naturaleza de la prote(na reguladora y de la localizacion precisa de su secuencia de union, pueden tanto

C6mo funcionan los interruptores geneticos

461

activar como reprimir la transcripcion del gen. Sin embargo, la flexibilidad de la doble helice de DNA permite que protefnas unidas en lugares distantes influyan en la RNA polimerasa en ellugar promotor, al doblarse el DNA que los separa. Esta accion a distancia es muy comun en las celulas eucariotas, en las que protefnas reguladoras unidas a secuencias distantes miles de nucleotidos del promotor controlan la expresion del gen. Aunque las RNA polimerasas procariotas pueden iniciar la transcripcion por sf mismas, las polimerasas eucariotas requieren el ensamblaje previa sobre el lugar promotor de factores generales de transcripciOn. Estos factores se ensamblan en un cierto orden, que se inicia con la union del TFIID ala secuencia TATA, una secuencia de DNA situatla justa por delante de muchos lugares de inicio de laRNA polimerasa. El proceso de ensamblaje ordenado de los factores generales de transcripciOn presenta varias etapas en las que se puede regular la iniciaciOn de la transcripciOn, y se cree que muchas protefnas reguladoras de los genes eucariotas actlian facilitando (control positivo) 0 limitando (control negativo) este proceso de ensamblaje. Mientras que la transcripcion de un determinado gen procariota solo estd controlada por una 0 dos protefnas reguladoras, la regulacion de los genes eucariotas es mucho mas compleja, de acuerdo con el gran tamaiio de su genoma y la gran variedad de tipos celulares que presentan. Por ejemplo, la region de control del gen eve de Drosophila comprende 20 000 pares de nucleotidos de DNA Y tiene secuencias de union para mas de 20 protefnas reguladoras. Algunas de estas protefnas son activadores transcripcionales, mientras que otras son represores transcripcionales. Estas protefnas se unen a secuencias reguladoras organizadas en una serie de modulos reguladores dispersos a 10 largo del DNA.

Estructura de la cromatina y el control de la expresi6n genica36 Como se describi6 en el Capitulo 8, los genomas de las celulas eucariotas se encuentran muy compactados, consiguiendose que las largas moleculas de DNA quepan en el interior de la celula y puedan ser manejadas facilmente. EI primer nivel de compactaci6n es el enrollamiento del DNA alrededor de las histonas formando los nucleosomas. EI segundo nivel de compactaci6n consiste en que los nucleosomas se empaquetan en fibras de 30 nm, Finalmente, en la heterocromatina, confinada a determinadas regiones del genoma que en interfase muestran una estructura extraordinariamente condensada, se observa un orden de empaquetamiento todavia superior. lC6mo pueden acceder al DNA del interior de esta estructura densamente empaquetada los factores generales de transcripci6n y las proteinas reguladoras? Y, lc6mo afecta el empaquetamiento de la cromatina al"control de la e~pre­ si6n genica? En esta secci6n veremos que de los estudios de la estructura de la cromatina y sus efectos sobre la expresi6n genica se han podido extraer dos principios generales. En primer lugar, los nucleosomas no son ningtin obstaculo serio ni para las proteinas reguladoras ni para las RNA polimerasas. Los incrementadores pueden actuar a pesar de ellos, las histonas que bloquean un promotor pueden ser desplazadas y, una vez ha comenzado la transcripci6n, Pol II puede transcribir a traves de los nucleosomas sin desorganizarlos. Incluso las polimerasas bacterianas, que no encuentran nucleosomas in vivo, pueden transcribir a su traves, 10 cual sugiere que el nucleosoma esta construido de modo que pueda ser atravesado con facilidad (Figura 9-49).EI segundo principio general es que algunas formas de empaquetamiento del DNA de orden superior hacen el DNA inaccesible tanto para las proteinas reguladoras como para los factores generales de transcripci6n. Asi el empaquetamiento del DNA en estructuras de orden superior juega un papel clave en el control de la expresi6n genica en eucariotas, sirviendo para mantener silenciosas grandes secciones del genorna -en algunos casos de forma reversible y en otros de forma irreversible. 462

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

dimero H2A-H2B

(A)

(B)

dimero H3-H4

(0)

(C)

RNA polimerasa abandonando el nucieosoma

Figura 9-49 Modelo hipotetlco para explicar la capacidad de las RNA polimerasas para transcrlbir a traves de los nucleosomas sin provocar su desplazamiento. La polimerasa primero desplaza un dfmero H2A-H2B (vease Figura 8-10), 10 que permite su entrada en el nucleosoma. En la siguiente etapa, la polimerasa empujarfa el DNA, alejandolo del dfmero H3-H4 que se encuentra a continuaci6n, continuando la transcripci6n. El dfmero H2A-H2B desplazado es recapturado por el nucleosoma, y se desplaza el otro dfmero H2A-H2B situado simetricamente, permitiendo repetir el proceso y la salida de la polimerasa del nucleosoma. (De K.E. van Holde et al., ]. Bioi. Chern. 267: 2837-2840,1992.)

La transcripci6n del DNA que esta empaquetado en nucleosomas se puede activar 37 En la seccion anterior vimos un modelo sencillo de como la transcripcion de un gen era activada por una proteina reguladora (vease Figura 9-36).tComo se ha de modificar dicho modelo para tener en cuenta la presencia de los nucleosomas ? Para empezar por el principio, tde que forma afectan los nucleosomas la union de las proteinas activadoras a las secuencias reguladoras en el DNA? En algunos casos las secuencias reguladoras se encuentran en cortas regiones libres de nucleosomas, de forma que no existe ninglin impedimento para esta interaccion. No se sabe como ciertas regiones se mantienen libres de nucleosomas, aunque, como ya se describio en el Capitulo 8, ciertas regiones de DNA son demasiado rigidas y no admiten la torsion necesaria para la formacion del nucleosoma. Sin embargo, en otros casos la secuencia reguladora se encuentra empaquetada en un nucleosoma, 10 cual no impide que al menos algunas proteinas activadoras puedan reconocerla y unirse a ella. La proteina reguladora, una vez unida, parece desestabilizar el nucleosoma, que entonces se desensambla al menos parcialmente. Aun se desconoce que tipos de proteinas reguladoras pueden conseguir este efecto y como tiene lugar. En cambio, los factores generales de transcripcion parecen incapaces de ensamblarse sobre un promotor empaquetado en un nucleosoma. De hecho, este grado de empaquetamiento podria haber evolucionado al menos en parte en el sentido de asegurar que no se produzca una iniciacion de la transcripcion, debil o banal (es decir iniciacion sin la union previa de una proteina activadora). Sin embargo, parece que la union de una proteina activadora a miles de nucleotidos de distancia podria desplazar, aparentemente, un nucleosoma del promotor y entonces seria posible el ensamblaje de los factores generales de transcripcion. El desplazamiento podria ocurrir bien como consecuencia de una actividad distinta de la proteina activadora, 0 ser una consecuencia indirecta de los contactos que la proteina activadora establece con los factores generales de transcripcion para facilitar su ensamblaje en el DNA (Figura 9-50).

Algunas formas de la cromatina impiden la transcripci6n38 Aunque se puede transcribir DNA empaquetado en nucleosomas, en algunas formas especiales de cromatina el DNA parece ser inaccesible a las proteinas activadoras. Se cree que estas formas inactivas de la cromatina, que incluyen a la Estructura de la cromatina y control de la expresi6n genica

463

lugar de uni6n del activador

protefna activadora

TATA EL ACTIVADOR DIRECTAMENTE DESENSAMBLA LOS NUCLEOSOMAS

~ V"

".,...----~TATA EL ACTIVADOR TAMBIEN FACILITA EL ENSAMBLAJE DE LOS FACTORES GENERALES DE TRANSCRIPCION

cromatina especialmente condensada denominada heterocromatina (descrita en el Capftulo 8), contienen protefnas especiales que hacen que su DNA sea especialmente inaccesible. Observaciones realizadas en la levadura S. cerevisiae ilustran c6mo algunos tipos de cromatina pueden impedir la transcripci6n de un gen. El gen ADE2, cuya expresi6n es facilmente detectable, se expresa constantemente en su posici6n normal del cromosoma. Sin embargo, cuando se transloca experimentalmente al extrema de un cromosoma su transcripci6n se detiene, aunque la celula contenga todas las protefnas que se requieren para transcribirlo. El DNA pr6ximo al extrema de los cromosomas (los tel6meros) esta empaquetado en una forma de cromatina especialmente inaccesible, y se cree que ese tipo de empaquetamiento es el responsable de mantener al gen ADE2 translocado inactivo, proceso denominado silenciamiento. El silenciamiento de genes localizados cerca del extrema del cromosoma se extiende por unos 10 000 pares de nucle6tidos y se ha observado en muchos genes ademas de ADE2; el efecto de silenciamiento parece reducirse gradualmente a medida que se incrementa la distancia desde el te16mero. El mecanisme de silenciamiento no es conocido, pero parece que supone un ensamblaje cooperative de protefnas en el DNA que, una vez establecido, es heredable a traves de la replicaci6n del DNA (vease Figura 9-51A). El silenciamiento del gen ADE2 es un ejemplo de un efecto de posici6n, en el que la actividad de un gen es dependiente de su posici6n en el genoma. Los efectos de posici6n se detectaron en primer lugar en Drosophila (Figura 9-51B), pero en la actualidad ya se han descrito en muchos otros organismos, y se cree que son un reflejo de los diferentes grados de empaquetamiento de la cromatina en diferentes puntos del cromosoma, y de la tendencia de estos estados a extenderse incluyendo a los genes situados en las proximidades. Posteriormente, cuando analicemos los mecanismos de la memoria celular, volveremos a esta idea. 464

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

Figura 9-50 Un modelo que expllcarfa el desplazamiento de los nucleosomas durante la iniciaci6n de la transcrlpci6n en eucarlotas. Una protefna activadora unida poseerfa una segunda actividad de eliminaci6n de los nucleosomas del promotor, exponil~ndolo a los facto res generales de transcripci6n que podrian ensamblarse. En un modelo distinto, no mostrado aquf, el desplazamiento de los nucleosomas ocurre como consecuencia de la inducci6n del ensamblaje de los factores generales de transcripci6n; la protefna activadora, por ejemplo, puede permitir el ensamblaje inicial de los factores generales de transcripci6n en presencia de un nucleosoma y, una vez ensamblados, estos factores desestabilizarfan el nucleosoma. Se conoce muy poco el mecanismo subyacente al desplazamiento de los nucleosomas. Las histonas pueden sencillamente soltarse del DNA, 0, de acuerdo con un modelo alternativo, permanecer unidas a el (vease Figura 8-40).

(A)

o •

tel6mero

tel6mero """'j

~<:~:>,~UJ.j::;

"""""'-

gen ADE2 en su posici6n normal en el cromosoma

colonia blanca de celulas de levadura

gen ADE2 pr6ximo al tel6mero

colonia roja de celulas de levadura con sectores blancos

(B)

gen white en una posici6n normal

:<*:~~\~\'**;®

heterocromatina

~

/

.~

~

inversi6n cromos6mica infrecuente

:

'~'4"$;r\~I"

gen white pr6ximo a la heterocromatina

Antes de que los genes de globina de mamffero puedan transcribirse, puede ser necesaria una etapa de descondensaci6n39 Otro ejemplo de c6mo la cromatina condensada puede evitar la expresi6n genica procede de los estudios de los grupos de genes de ~ globina de pollos y de humanos. Los cinco genes del grupo, que se extienden sobre 50 000 pares de nucle6tidos de DNA, se transcriben exclusivamente en celulas eritrobhisticas (es decir, celulas sangufneas dellinaje de los eritrocitos). Asimismo, cada gen es activado en una etapa diferente del desarrollo (Figura 9-52) y en diferentes 6rganos: el gen de E globina se expresa en el saco vitelino embrionario, el y en el saco vitelino y en el hfgado fetal, y el 0 y el ~ inicialmente en la medula 6sea adulta. Previamente hemos descrito (vease Figura 9-45) una serie de protefnas necesarias para activar al gen humano de la ~ globina en el momenta y lugar adecuados; cada uno de los otros genes de globina tiene una serie de protefnas reguladoras similares, muchas de las cuales son comunes a varios de ellos. Sin embargo, ademas de la regulaci6n individual de cada uno de los genes de globina, parece que el grupo de genes esta sujeto a otro control de activaci6n/inhibici6n que supone cambios globales en la estructura de la cromatina. Algunas de las primeras evidencias de estos cambios proceden de estudios de los genes de globina a digestion por DNasaI en micleos aislados. En celulas en las que los genes de globina no se expresan, el DNA de dichos genes es resistente a DNasaI, 10 cual indica que se encuentra empaquetado en forma de cromatina condensada. En cambio, en celulas eritroblasticas todo el grupo es sensible a la DNasaI, 10 que es un indicio de que la estructura de la cromatina localmente ha cambiado, haciendo al DNA mas accesible ala enzima. EI DNA se encuentra aun empaquetado en nucleosomas, pero se han perdido los niveles de empaquetamiento de orden superior. Este cambio en el grado de empaquetaEstructura de la cromatina y control de la expresi6n genica

Figura 9-51 Efectos de posicion en la expresi6n genica. (A) EI gen ADE2 de levadura en su posici6n cramos6mica normal se expresa en todas las celulas de levadura. Cuando se desplaza a una posici6n pr6xima al extremo del cromosoma de levadura, el gen se silencia en muchas pero no en todas las celulas de la poblaci6n. La ausencia del producto genico de ADE2 provoca un bloqueo en la via biosintetica de adenina, con 10 que se acumula un pigmento roio. La celula fundadora de la colonia que presenta varios sectores tenfa el genADE2 inactivo, por 10 que la mayor parte de la colonia es roja. Normalmente las colonias de levadura son blancas. Las secciones blancas en los bordes de la colonia roja son clones de celulas en las que el genADE2 se ha activado espontaneamente. La presencia de estos sectores indica que los estados activos 0 inactivos del gen ADE2 son heredables cuando el gen se encuentra pr6ximo al tel6mera, un tema que se discute en la pr6xima secci6n. (B) Los efectos de posici6n se pueden observar tambien en el caso del gen white de Drosophila. Las moscas salvaies poseedoras de un gen white tienen los oios raios. Si el gen white se inactiva por mutaci6n, los ojos se vuelven blancos (de ahf el nombre del gen). En moscas con una inversi6n cramos6mica que desplaza al gen white cerca de la regi6n heteracromatfnica, las moscas tienen los ojos moteados, con manchas rajas y blancas. Las manchas blancas representan celulas en las que el gen white es silencioso, y las manchas rajas representan areas en las que se expresa el gen white. Se cree que las diferencias se deben a 10 lejos que se expanda la heteracramatina durante el desarrollo temprano del oio. Como en el caso del gen ADE2 de levadura, una vez establecido, el estado de expresi6n de white es heredable, praduciendo grupos de muchas celulas que expresan white y grupos de celulas en las que white es silencioso. (De 1.1. Sandell y VA Zakian, Trends Cell Biol. 2: 10-14, 1992.)

465

'c"

100 000 pares de nucle6tidos

:0 o

locus de grupo de genes del tipo control de la de la ~ globina region I I

~~.~ gen de la

~

globina

C>

'"

"t:l

~

'';:

'"

~ III

'iii

'" 0 .~

12

24

36

III

t

12

NACIMIENTO (A)

24

36

48

edad en semanas

(8)

miento del DNA ocurre aun antes de que se inicie la transcripcion de los genes de globinas, sugiriendo que los genes estan regulados en dos etapas. En la primera etapa, la cromatina que contiene el grupo de genes de globina se descondensa, 10 cual al parecer facilita el acceso de algunas de las proteinas reguladoras al DNA. En la segunda etapa, las proteinas reguladoras restantes se ensamblan en el DNA y dirigen la transcripcion de cada uno de los genes (Figura 9-53). Se cree que los cambios extensos que sufre la estructura de la cromatina propios de la primera etapa requieren una region de DNA denominada region de control del locus 0 LCR (de Locus Control Region), que se encuentran a bastante distancia por delante del grupo de genes (vease Figura 9-52). Ha side posible establecer la importancia de la LCR a partir del estudio de ciertos pacientes con un tipo concreto de talasemia, una forma severa de anemia., Se ha visto que en estos pacientes ellocus de ~ globina se mantiene silencioso en las celulas eritroblasticas, a pesar de tener el gen de ~ globina y las regiones reguladores intactas; el defecto consiste en la delecion de ciertas zonas que eliminan total 0 parcialmente la LCR. Asimismo, el gen de ~ globina en las celulas eritroblasticas se mantiene resistente a DNasaI, 10 que indica que es incapaz de seguir el proceso normal de descondensacion propio del desarrollo de las celulas eritroblasticas. Experimentos posteriores utilizando ratones transgenicos han confirmado el gran efecto que LCR tiene sobre la expresion de los genes de globina. Por ejemplo, cuando el gen de ~ globina humano y sus regiones reguladoras (las mostradas en la Figura 9-45) se insertan en diferentes regiones del genoma del raton, el gen se expresa en un nivel bajo, dependiendo del lugar de insercion. Este comportamiento es tipico de los genes de mamifero, e indica que la posicion del gen afecta su expresion (Tabla 9-2). Cuando se incluye la LCR con el gen, el gen de ~ globina se expresa a un nivel elevado en las celulas eritrobhisticas independientemente dellugar de insercion, indicando que la LCR puede superar los efectos de posicion. Aunque se han identificado algunas proteinas que se unen a LCR, se desconoce cwil es el mecanisme que modifica la estructura del locus completo de la ~ globina. En la siguiente seccion exponemos algunas de las ideas que podrian explicar como se producen estos cambios.

Figura 9-52 EI grupo de los genes del tipo de la II globina de humanos. (A) La regi6n cromos6mica grande comprtmde 100 000 pares de nucle6tidos, y contiene los cinco genes de gIobina y una regi6n de control del locus (descrita en el texto). (B) Variaciones de la expresi6n de los genes del tipo de la p globina durante varias fases del desarrollo de los humanos. Cada una de las cadenas de globina codificadas par estos genes se combina con una cadena de la a. globina formando la hemoglobina de los gl6bulos rojos. (A, segl1n F. Grosveld, G.B. van Assendelft, D.H. Greaves, y G. Kollias, Cell 51:975-985, 1987. © Cell Press.)

~,

ETAPA 1 SE AlTERA LA ESTRUCTURA DE LA CROMATINA

~

~ ETAPA2 SE ACTIVA El GEN

!

RNA polimerasa

\.

protein a reguladora

RNA

No se conocen los mecanismos que forman la cromatina activa El modelo hipotetico para explicar la activacion global de las globinas, que se esquematiza en la Figura 9-53, implica que en los eucariotas existen proteinas de union a secuencias especificas de DNA que actl1an descondensando la cromatina en un area local del cromosoma que podria tener decerias de miles de pares de nucleotidos de longitud. Alternativamente, los cambios en la estructura de la cromatina observados en los genes activos podrian ser una consecuencia automcitica, mas que un requisito previo, del ensamblaje de factores de transcripcion, de la RNA polimerasa, 0 de ambos, en un promotor. Hemos visto que el ensamblaje de los factores generales de transcripcion en los promotores parece acompafiarse de cambios en la distribucion de los nucleosomas en ellugar de ensamblaje; posiblemente esta pequefia perturbacion se pueda transmitir a largas distancias por alglin mecanisme de propagaci6n desconocido. 466

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

Figura 9-53 Las dos etapas por las cuales se actlvan algunos genes, incluidos los del grupo de genes de las globinas. En la etapa 1 se modifica la estructura de una gran regi6n de la cromatina, descondensandose en preparaci6n para la transcripci6n. En la etapa 2, las protefnas reguladoras (representadas en este esquema simplificado por una unica protefna) se unen a lugares especfficos de la cromatina induciendo la sfntesis del RNA (transcripci6n).

Tabla 9-2 La expresi6n de un gen transferido a un rat6n generalmente presenta efectos de posici6n del cromosoma, con diferentes niveles de actividad genica en animales transgenicos derivados de forma independiente Porcentaje del total de mRNA en Saco Copias genicas vitelino Hfgado Est6mago Cerebro por celula Gen end6geno Animal transgenico 1 Animal transgenico 2 Animal transgenico 3 Animal transgenico 4

20

5 1 30 13 0,4

3,4 4,8 4,4 0,4

0,1

0

2

0,1 1,3 4,7 0

0 0 0 0

4 4 4 12

En estos experimentos llevados a cabo con el gen de la aifa-fetoprotefna de raton, el fragmento de DNA inyectado en el huevo del raton fertilizado incluye 14000 pares de nucleotidos de secuencia 5'-flanqueante, donde se localizan tres incrementadores (enhancers) que afectan la expresion de este gen. Se utiliz6 la tecnica de hibridizacion para comparar el nivel de mRNA producido por el gen inyectado con el que normaimente produce el gen endogeno de la aifa-fetoproteina en los tejidos fetaies indicados. (Datos de R.E. Hammer et ai., Science 235:53, 1987.)

Tengan 0 no los eucariotas protefnas capaces de descondensar dominios de la cromatina, es valioso especular acerca de c6mo podrfan hacerlo estas protefnas. Actualmente s6lo podemos imaginar este rilecanismo. En la Figura 9-54 se esquematizan tres posibilidades. Se trata de tres modelos muy distintos, 10 cual es un indicio de 10 lejos que estamos de comprender la transici6n entre la cromatina activa e inactiva.

La tensi6n superhelicoidal del DNA pennite la acci6n a distancia40 Uno de los tres modelos que se recogen en la Figura 9-54 implica la existencia de cambios topo16gicos en un bucle cerrado de DNA de doble cadena que conduce a

wa~

:c ----1------.· locus de control

.

cromatlna norma I en el dominio'en bucle

C

delareg~·

LUGAR DE LA NUCLEACI6N

PUNTa DE ENTRADA DE LA PROTEiNA QUE SE DESPLAZA

1

PUNTa DE GIRO ACTIVO DEL DOMINIO DE CROMATINA CONSTRENIDA

1

[() 0 :J L j

I

ALTERACI6N DE LA CROMATINA, CATALIZADA paR PRaTE fNA

I'-.

\-

I

LA TENSI6N SUPERHELICOIDAL ALTERA LA CROMATINA

PARA EL ENSAMBLAJE a DESENSAMBLAJE DE PROTEiNAS DE CUBIERTA SaBRE LA :1ATINA

~~~

.~

cIt

Figura 9-54 Tres modelos propuestos para explicar la influencia a gran distancia de una regi6n dominio de control sobre la actlvidad genica. Se postula que el bucle de cromatina mostrado representa un dominio cromosomico en bucle completo (descrito en el Capitulo 8), que puede contener mas de 100 000 pares de nucleotidos de DNA. Cada modelo propone una funci6n diferente para el lugar LCR. EI mecanismo actual causante de los efectos a gran distancia es desconocido, y se podrfan proponer otros mecanismos.

GAN~NCIA

LA a PERDIDA DE PROTEiNAS DE CUBIERTA ALTERA LA ESTRUCTURA DE LA CROMATINA

----1----_--.11

cromatina activa

Estructura de la cromatina y control de la expresi6n genica

467

DNA con un extremo libre

DNA con los extremos fijos

I~~~~~~~~'"'O\

1--~~~~~~~~~'"'4

'\\\::\,~,

I

I

desenrollamiento de 10 pares de bases del DNA (una vuelta de laMlice)

desenrollamiento de 10 pares de bases del DNA (una vue Ita de la halice)

~.,\ ~., ,~""'OV...o---...:;~ "-'" .~ ~;0\,,"'-... ""'\;~.

ilL I'lli.

la halice de DNA ha de girar una vuelta

la hal ice de DNA forma un sobreenrollamiento (B)

(A)

la formaci6n de DNA sobreenrollado, una conformaci6n que adopta el DNA en respuesta a una tension superhelicoidal. El DNA sobreenrollado se ha podido estudiar especialmente en pequefias moleculas circulares, como los cromosomas de algunos virus y phismidos. Sin embargo, estas rnismas consideraciones se pueden aplicar a cualquier regi6n de DNA cuyos extremos sean incapaces de rotar libremente -como por ejemplo en un bucle de cromatina anclado firmemente a la base. En la Figura 9-55 se ilustra una manera sencilla de visualizar las limitaciones topo16gicas que provoca el sobreenrollamiento del DNA. En un DNA de doble cadena cuyos extremos esten fijos se forma un sobreenrollamiento para compensar cada 10 pares de nucle6tidos que se han abierto (desenrollado) en la helice; la formaci6n de este sobreenrollamiento es favorable energeticamente pues permite al resto de las regiones en las que las bases aun permanecen apareadas recuperar el giro normal de la helice. En bacterias como E. coli existe un tipo especial de DNA topoisomerasa II, denominada DNA girasa, que, empleando la energfa de hidr6lisis del ATP, sobreenrolla constantemente el DNA, manteniendolo siempre bajo tensi6n. Estos sobreenrollamientos son sobreenrollamientos negativos, y tienen el sentido de giro opuesto a los sobreenrollamientos positivos que se muestran en la Figura 9-55 y que se forman cuando una regi6n de la doble helice se abre. Asf, cuando se abre una regi6n de la doble helice de DNA en una bacteria, mas que crearse un sobreenrollamiento positivo, 10 que ocurre es que se elimina un sobreenrollarniento negativo. Dado que durante este proceso se reduce la tensi6n superhelicoidal del DNA, la apertura de la doble helice de DNA en E. coli es energeticamente favorable comparada con la apertura de la doble helice de un DNA que no este sobreenrollado. Las DNA topoisomerasas de tipo II eucariotas eliminan tensi6n superhelicoidal mas que producirla (se describe en el Capftulo 8). Por ello, la mayor parte del DNA de una celula eucariota no esta bajo tensi6n. Sin embargo el desenrollamiento de la doble helice esta asociado con la etapa de iniciaci6n de la transcripci6n. Ademas, una molecula de RNA polimerasa en movimiento (asf como otras protefnas que desenrollan el DNA) tendera a generar tensi6n superhelicoidal positiva en el DNA por delante y tensi6n superhelicoidal negativa por detras (Figura 9-56). Asf, estos efectos topo16gicos podrfan generar tales fuerzas en un

SOBREENROLLAMIENTO NEGATIVO se facilita la apertura de la helice

468

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

SOBREENROLLAMIENTO POSITIVO se dificulta la apertura de la helice

Figura 9-55 La tensi6n superhelicoidal del DNA origina su sobreenrollamiento. (A) En el caso de una moltkula de DNA con un extrema libre (0 con un corte que actue como un pivote de giro), la doble helice de DNA gira una vuelta cada 10 pares de nucle6tidos que se abren. (B) 5i se impide la rotaci6n, la tensi6n superhelicoidal que se genera en el DNA abre la helice. Una forma de acomodar esta tensi6n es incrementar el giro de la helice de forma que haya 11 pares de nucle6tidos en vez de 10 por vuelta de helice, como en el ejemplo; sin embargo, la doble helice de DNA resiste dicha deformaci6n dobhindose en bucles sobreenrollados. De este modo se forma un sobreenrollamiento en el DNA por cada 10 pares de bases abiertas. El sobreenrollamiento formado aquf es un sobreenrollamiento positivo (vease Figura 9-56).

Figura 9-56 Sobreenrollamiento de un segmento de DNA debido a una protefna que patrulla la doble helice de DNA. Los dos extremos del DNA que se muestran son incapaces de rotar uno respecto al otro libremente, y se asume que la protefna que se desplaza tambien es incapaz de rotar libremente. En estas condiciones el movimiento de la protefna causani la acumulaci6n de un exceso de vueltas de helice por delante y un deficit de vueltas por detnis, como se muestra en la figura. Las evidencias experimentales sugieren que una molecula de RNA polimerasa en movimiento produce sobreenrollamiento de este modo; la tensi6n superhelicoidal que genera por delante hace mas dificil abrir la doble helice, pero esta tensi6n ha de facilitar la liberaci6n del DNA de los nucleosomas ya que la separaci6n del DNA de las histonas del nucleo del nucleosoma ayuda a rela:jar la tensi6n superhelicoidal positiva.

lugar concreto que se propagaran a traves de todo un dominio de la cromatina. Sin embargo aun se desconoce si algun fen6meno de este tipo esta implicado en los cambios a gran escala de la estructura de la cromatina.

Resumen Los genomas de los organismos eucariotas esttin empaquetados en la cromatina. Algunas formas de cromatina estdn tan condensadas que los genes que contienen son silenciosos transcripcionalmente. A pesar de que se desconocen los detalles de este tipo de empaquetamiento, se cree que podrla tratarse de un mecanismo utilizado por las celulas para silenciar grandes regiones de sus genomas. En algunos casos es posible revertir este silenciamiento, activtindose los genes que conten(an, pero la manera en que ocurre es tambien desconocida. En formas de cromatina menos condensada el DNA se encuentra aun empaquetado en forma de nucleosomas. Los nucleosomas posicionados en el punto de inicio de la transcripci6n bloquean el ensamblaje de los factores generales de transcripci6n. Estos nucleosomas parecen desplazarse, por un mecanismo desconocido, cuando la transcripci6n se activa por prote(nas reguladoras.

Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados 41 Aunque los organismos unicelulares han de ser capaces de activar y desactivar genes, los organismos pluricelulares ademas requieren interruptores geneticos capaces de generar y mantener sus diferentes tipos celulares. En particular, cuando una celula de un organismo pluricelular se diferenciil hacia un tipo celular determinado, generalmente la elecci6n de destino se mantiene a 10 largo de muchas generaciones celulares, 10 que significa que los cambios de expresi6n genica implicados en la elecci6n deben recordarse. Este fen6meno de memoria celular es un requisito previo para la creaci6n de tejidos organizados y para el mantenimiento de tipos celulares diferenciados. Por el contrario, los cambios simples de la expresi6n de los genes tanto en eucariotas como en procariotas son temporales; por ejemplo, el represor de triptOfano reprime la expresi6n de los genes del triptOfano en la bacteria unicamente en presencia de tript6fano; en cuanto desaparece del medio los genes son activados de nuevo, y los descendientes no tendnin memoria de que sus antecesores fueron expuestos al tript6fano. Sin embargo, incluso en los procariotas es posible heredar algunos cambios en la expresi6n genica. En esta secci6n examinaremos de que forma los mecanismos de regulaci6n genica pueden combinarse entre sf para formar interruptores que, una vez activados, sean recordados por las sucesivas generaciones celulares. Empezaremos considerando algunos de los mecanismos geneticos mejor conocidos de diferenciaci6n celular que actuan en bacterias y en levaduras.

Los cambios de fase de las bacterias son provocados por reorganizaciones del DNA42 Hemos visto que en las celulas eucariotas la diferenciaci6n generalmente no implica cambios detectables en las secuencias de DNA. En cambio, en algunos procariotas se pueden alcanzar patrones de regulaci6n genica hereditarios a base de reorganizaciones especificas del DNA que activan 0 desactivan a genes concretos. Dado que todos los cambios que se producen en una secuencia de DNA son copiados con exactitud en las replicaciones posteriores del DNA, cualquier estado de actividad genica alterado se heredara por toda la progenie de la celula en la que se ha dado la reorganizaci6n. En principio, algunas de estas reorganizaciones son reversibles y en tales casos, si consideramos perfodos de tiempo suficientemente largos, se establecen patrones de actividad genica alternante. . Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados

469

segmento que se invierte I

I

promotor

H2

(A)

ACTIVO RNA

ACTIVO

ACTIVO

+

...

t

ijJ.l/J.-

protefna H2

promotor

c:=

promotor H1

;;C:r

•••

(8)

represor

C:::]ili '.l t ••

+

•••

INACTIV6

*.i

el represor bloquea la sfntesis de H1

_---'/

protefna represora

H2

represor

INACTIVO

INACTIVO

promotor H1

c:::

ACTIVO ACTIVO

+

segmento que se invierte

RNA

+

....

•

f>.fI

protefna H1

En la bacteria Salmonella se presenta un mecanismo de diferenciaci6n celular de este tipo, conocido por cambio de fase, que ha sido muy estudiado. Aunque en eucariotas superiores no existe el modo de diferenciaci6n equivalente, sf tiene un efecto importante sobre ellos, ya que es el mecanismo que utilizan algunas de las bacterias causantes de enfermedades para i.Ll ser detectadas por el sistema inmune. El cambio de la expresi6n genica en Salmonella se produce por la inversi6n esponidica de un segmento especffico de DNA de 1000 pares de nucle6tidos que afecta la expresi6n de la protefna de la superficie celular flagelina, para la que la bacteria tiene dos genes. La inversi6n esta catalizada por una enzirna de· recombinaci6n especffica de lugar, 10 que cambia la orientaci6n de un promotor situado en el interior de los 1000 pares de nucle6tidos que se invierten. Con el promotor en una de las orientaciones la bacteria sintetiza un tipo de flagelina; con el promotor en la otra orientaci6n la bacteria sintetiza el otro tipo de flagelina (Figura 9-57). Dado que las inversiones se dan muy raramente, cuando se producen se generan clones enteros de bacterias con un tipo u otro de flagelina. Probablemente este fen6meno del cambio de fase evolucion6 porque protege a la poblaci6n bacteriana contra la respuesta inmune de sus huespedes vertebrados. Si el huesped fabrica anticuerpos contra un tipo de flagelina, las escasas bacterias cuya flagelina sea distinta debido a una inversi6n genica podran sobrevivir y multiplicarse. Las bacterias que se afslan de los medios naturales suelen presentar cambios de fase para uno 0 varios rasgos fenotfpicos, pero generalmente estas "inestabilidades" se eliminan en las cepas estandar dellaboratorio. S610 se han estudiado unos cuantos mecanismos subyacentes a este proceso y no todos consisten en inversiones de segmentos de DNA. Por ejemplo, una bacteria que provoca una enfermedad humana de transmisi6n sexual comun (Neisseria gonorrhoeae) evita el ataque inmune mediante una variaci6n hereditaria de las propiedades de su superficie, que se genera por conversion genica (descrito en el Capftulo 6) mas que por inversi6n genica. Este mecanismo depende de la protefna de recombinaci6n RecA, y transfiere secuencias de DNA desde "cassettes genicas" silenciosas a un gen que se expresa; este mecanismo tiene la ventaja de que genera mas de 100 variantes de una protefna mayoritaria de la superficie bacteriana.

En levaduras, algunas proteinas reguladoras determinan la identidad del tipo celular 43 Debido fundamentalmente a su gran facilidad de crecimiento y de manipulaci6n genetica, las levaduras se han analizado con gran detalle como organismo 470

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

Figura 9-57 Cambios en la expresi6n genica mediante inversiones de DNA en bacterias. Transcripci6n altemante de dos genes de flagelina en una bacteria Salmonella, causada por un suceso sencillo de recombinaci6n especifica de lugar que invierte un pequeno segmento de DNA que contiene un promotor, de modo que en la orientaci6n (Al activa la transcripci6n del gen HZ de flagelina asi como la proteina represora que bloquea la expresi6n del gen de flagelina HI. Cuando el promotor se invierte (B), deja de activar al gen HZ y al represor, y el gen HI que ahora esta libre de represi6n, se expresa. El mecanismo de recombinaci6n se activa raramente (alrededor de una vez en 105 divisiones celularesl. Asi, la producci6n de uno u otro tipo de flagelina tiende a ser hereditaria en cada clon de celulas.

modelo para el estudio de los mecanismos de control genico en eucariotas. La levadura comun de panadero, Saccharomyces cerevisiae, ha sido especialmente util por su capacidad de diferenciarse en tres tipos celulares, aunque el mecanismo difiere en algunos aspectos basicos del que usan las celulas de plantas y animales. S. cerevisiae es un eucariota unicelular que puede existir tanto en estado haploide como diploide. Las celulas diploides se forman por un proceso denominado apareamiento, en el que dos celulas haploides se fusionan. Para que dos celulas haploides se puedan aparear han de diferir en su tipo de apareamiento (sexo). En Saccharomyces cerevisiae, existen dos tipos de apareamiento, a y a, especializados en el apareamiento mutuo. Cada uno de allos produce un molecula senal especifica (factor de apareamiento) que difunde, y una protefna receptora. Estas moleculas capacitan a la levadura, respectivamente, para comunicarse y para reconocerse y fusionarse con celulas del tipo contrario. Las celulas diploides resultantes, denominadas at a, presentan caracterfsticas propias que las distinguen de los tipos parentales: no son aptas para el apareamiento pero pueden formar esporas (esporular), generando celulas haploides por meiosis en situaciones de carencia de nutrientes. Los mecanismos por los cuales se establecen y mantienen estos tres tipos de celulas ilustran algunas de las estrategias que se han descrito previamente para cambiar el patron de expresion genica. El tipo de apareamiento de la celula haploide viene determinado por un unico locus genetico, ellocus del tipo de apareamiento (MAT, de Mating-Type Locus), que en la celula de tipo a codifica una unica protefna reguladora, aI, y en una celula de tipo a codifica dos protefnas reguladoras, al y a2. La protefna al no tiene ningl1n efecto sobre la propia celula de tipo a, pero 10 tendra sobre la celula diploide resultante del apareamiento: mientras tanto la celula de tipo a fabrica la protefna reguladora por defecto. En cambio, la protefna a2 actua en la celula a como un represor transcripcional que reprime los genes especificos de a, mientras que al actua como un activador transcripcional que activa los genes especificos de a. Cuando se fusionan las ce-

proteinas reguladoras producidas por el locus MA T

conjunto de genes controlados por MA T

tipo celular

MCM1

a

a

aSG ACTIVO

a (haploide)

aSG INACTIVO hSG

a1 (sin efecto)

aII

a

ACTIVO

MCM1

l-a2

a (haploide)

aSG INACTIVO

a 1 . MCM1 aSG

a1

ACTIVO

a2

a

hSG

II a

a

ACTIVO

MCM1

l-a2

a/a (diploide)

aSG INACTIVO aSG INACTIVO

a2

a1

a2-t~a1 I

Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados

hSG INACTIVO

Figura 9-58 Control del tipo celular en levadura. El tipo celular en levaduras esta controlado pOI tres proteinas reguladoras (aI, a2 y all producidas por ellocus MAT. Se transcriben diferentes grupos de genes en las celulas haploides de tipo a, a y diploides (tipo a/a). Las celulas haploides expresan una serie de genes especificos de celula haploide (hSG) y o bien un grupo de genes especificos de a (aSG) 0 de a (aSG). Las celulas diploides no expresan ninguno de estos genes. Las proteinas aI, 0.2, yal controlan muchos genes diana en cada tipo de celula mediante su uni6n, en diferentes combinaciones, a las secuencias reguladoras situadas por delante de estos genes. Es de destacar que la proteina 0.1 es activadora, mientras que 0.2 es represora, yambas actuan en combinaci6n con una proteina reguiadora ubicua deno~inadaMCMl. En la celula diploide, 0.2 y al forman un heterodimero que desactiva un grupo distinto de genes (entre los que se incluye el gen que codifica la proteina activadora 0.1) de los que inactivaba 0.2 y MCMl. Este ejemplo relativamente simple de control genico es un buen ejemplo de control combinatorio de la expresi6n genica (vease Figura 9-38). Las proteinas al y 0.2 reconocen en ambos casos su secuencia de uni6n mediante un homeodominio (vease Figura 9-13).

471

lulas de los dos tipos de apareamiento la combinacion de las protefnas reguladoras al y a2 genera un patron de expresion genica completamente distinto al de cualquiera de las celulas progenitoras. En la Figura 9-58 se esquematiza el mecanismo por el cuallos genes especfficos del tipo de apareamiento se expresan en cada uno de los tres tipos celulares. Se trata de uno de los primeros ejemplos de control genico combinatorio y min es uno de los mejor conocidos a nivel molecular. Aunque en muchos laboratorios las cepas de S. cerevisiae se mantienen estables durante muchas generaciones, algunas cepas aisladas del medio natural cambian repetidamente entre los tipos celulares a y a por un mecanismo de reorganizacion genica que recuerda el de cambio de fase en N. gonorrhoeae, aunque el mecanismo en detalle parece ser particular de levadura. En cada uno de los extremos del locus MAT del cromosoma de la levadura existe un locus silencioso que codifica las protefnas reguladoras especfficas del tipo de apareamiento: en un lado codifica al y a2, y en el otro al. En cada division celular sucesiva el gen activo en ellocus MAT es eliminado y substituido por una nueva copia del locus silencioso del tipo de apareamiento opuesto. Este mecanismo se ha denominado mecanismo cassette pues el cambio supone eliminar un gen de la posicion "activa" y su substitucion por otro. El cambio es reversible porque aunque el gen original en ellocus MAT se elimina, queda siempre una copia silenciosa en el genoma. Nuevas copias de DNA realizadas a partir de los genes silenciosos actuan como cassettes desechables que seran insertadas alternativamente en el locus MAT que actua como "cabezallector" (Figura 9-59). Resultados de tests geneticos sugieren que las cassettes silenciosas se mantienen inactivas por el mismo mecanismo que silencia los genes localizados en el extremo de los cromosomas de levadura (vease Figura 9-51A): el DNA en un locus silencioso parece estar empaquetado en forma de cromatina inactiva.

Dos proteinas fagicas que se reprimen mutuamente su sintesis determinan el estado del bacteri6fago lambda44 La observacion de que a partir de la informacion genica de un solo nueleo somatico se pueda desarrollar un vertebrado 0 una planta elimina la posibilidad de que los cambios irreversibles en el DNA sean la causa principal de la diferenciacion de las celulas eucariotas superiores (a pesar de que estos constituyen una parte esencial del proceso de diferenciacion de los linfocitos -descrito en el Ca-

gen silencioso tipo"

locus MAT

gen silencioso tipo a

se inserta la cassette a nueva

TIPO DE APAREAMIENTO

ex

se elimina la cassette " antigua

TIPO DE APAREAMIENTO

se inserta una cassette lZ nueva

472

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

a

Figura 9-59 Modelo de las cassettes para la alternancia de tipo de apareamiento en la levadura. EI cambia de cassettes se da por un proceso de conversi6n genica que se dispara cuando la nucleasa realiza un corte de doble cadena en una secuencia especffica del DNA en el locus MAT. A continuaci6n se elimina el DNA cerca del corte y se substituye par una copia de la cassette silenciosa del tipo de apareamiento opuesto.

pitulo 23). Aunque, en principio, los cambios reversibles de secuencias de DNA, similares a los descritos en los casos de Salmonella y de las levaduras, pueden ser responsables de algunos de los cambios hereditarios de expresi6n genica que se observan en los organismos eucariotas superiores, actualmente no disponemos de ninguna evidencia que demuestre su existencia. Sin embargo, existen otros mecanismos, como los que ya se han descrito en este capitulo, que son capaces de producir un patr6n de expresi6n genica hereditario que presente una serie de estados discretos estables. En las celulas eucariotas no se comprende completamente ninguno de estos mecanismos, pero los estudios sobre el bacteri6fago lambda han aportado mucha informaci6n a nivel molecular, de un interruptor genetico que puede alternar, "flip-flop", entre dos estados estables, 10 que podrfa ser un modelo de interruptor que tambien actuara en el desarrollo de los eucariotas superiores. Previamente hemos descrito que este virus bacteriano puede permanecer integrado en el DNA de una celula de E. coli en condiciones favorables, de forma que se replica automaticamente cada vez que la bacteria se divide, en lugar de multiplicarse en el citoplasma y matar a su huesped. El cambio entre estos dos estados viene mediado por dos proteinas codificadas por el genoma virico. El genoma consta de unos 50 genes que en los dos estados se transcriben siguiendo patrones muy diferentes. Por ejemplo, en un virus que se ha de integrar se producini la proteina integrasa, necesaria para insertar el DNA del virus en el genorna de la bacteria y al mismo tiempo se han de reprimir la producci6n de las proteinas viricas implicadas en la replicaci6n del virus. Una vez se ha escogido entre uno de los dos patrones de expresi6n, este se mantiene estable. No podemos aqui detenernos en los detalles de este complejo sistema: regulador de la expresi6n genica, pero destacaremos algunas de sus caracteristicas generales. En el coraz6n del sistema se encuentran dos proteinas reguladoras de genes sintetizadas por,el virus: la proteina represora lambda (proteina el), descrita anteriormente, y la proteina ero. Estas proteinas bloquean cada una de ellas la sintesis de la otra, organizaci6n que permite tinicamente dos estados posibles. En el estado 1 (el estado de profago) el represor lambda ocupa el operador, bloqueando la sintesis de represor y tambien activando su propia sintesis. En el estado 2 (el estado Utico) la proteina cro ocupa un lugar diferente en el operador, bloqueando la sintesis del represor y activando su propia sintesis (Figura 9-60). En el estado de profago la mayor parte del DNA del virus integrado de forma estable no se transcribe; en el estado lftico este DNA se transcribe extensamente, se replica, se empaqueta en nuevos bacteri6fagos, y se libera cuando se lisa la celula huesped. Cuando la bacteria huesped va creciendo bien, el virus tiende a adoptar el estado 1, permitiendo que el DNA del virus se vaya multiplicando nipidamente, conjuntamente con el cromosoma huesped. Cuando se dana la celula huesped, un virus integrado se transforma del estado 1 al estado 2, se multiplica en el citoplasma de la celula y se escapa rapidamente de ella. Esta conversi6n esta inducida por proteinas reguladoras bacterianas que inactivan la proteina represora. Sin embargo, en ausencia de tales interferencias el represor de lambda bloquea tanto la producci6n de la proteina cro como activa su propia sintesis, y este bude de retroalimentaci6n positiva es el que ayuda a mantener el estado de profa-

astado astable 1: estado de profago sa sintetiza la proteina represora de lambda

eI • ACTIVO

•

estado estable 2: estado Utieo se sintetiza la proteina ero

ero

eI

INACTIVO

INACTIVO

ero opera or

RNA

•

I '..

represor de lambda

RNA proteina ero

Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados

• ACTIVO

• •

Figura 9-60 Version simplificada del sistema regulador de tipo interruptor, que determina el estilo de crecimiento del bactericSfago lambda en la celula huesped E. coli. En el estado estable 1 (estado de profago) el bacteriofago sintetiza la protefna represora en grandes cantidades, que activa su propia sfntesis e inactiva la sfntesis de varias protefnas del fago, entre las que se cuenta la protefna cro. En el estado estable 2 (estado lftico) el bacteriOfago sintetiza la protefna cro en grandes cantidades, la cual inactiva la sfntesis del represor, de forma que se sintetizan muchas protefnas vfricas y comienza la replicacion libre del DNA del virus en la celula de E. coli, produciendo finalmente numerosas partfculas vfricas y matando la celula. Este ejemplo muestra como dos protefnas reguladoras pueden combinarse en un circuito produciendo dos estados estables. Como se muestra en la Figura 9-11, tanto el represor lambda como la protefna cro reconocen el operador mediante un motivo helice-giro-helice.

473

T

el efecto de la senal puntual es recordado par tadas las celulas descendientes

Figura 9-61 Diagrama esquematico que muestra c6mo un bucle de retroalimentaci6n positiva puede generar memoria celular. La protefna A es una protefna reguladora que activa su propia transcripci6n. Todos los descendientes de la celula original recordanin que la celiIla progenitora recibi6la senal que inici6 la producci6n de la protefna.

la proteina A no se sintetiza ya que normalmente es necesaria para su propia transcripci6n

go estable. Los bucles de retroalimentacion positiva son un rasgo caracteristico de muchos circuitos de memoria celular (Figura 9-61). Un principio general importante que se deriva del caso del bacteriofago lambda es que s'e puede conseguir un sofisticado patron de comportamiento con un escaso mlmero de proteinas reguladoras de genes que afectan reciprocamente su sintesis y su actividad. Sabemos que las celulas eucariotas utilizan variaciones de esta sencilla estrategia para establecer y mantener patrones de expresion genica hereditarios. Por ejemplo, algunas proteinas reguladoras implicadas en el establecimiento del plan de desarrollo de Drosophila (descrito en el Capitulo 21), estimulan su propia transcripcion, de modo que se crea un bucle de retroalimentacion positiva que estimula su sintesis continuada; al mismo tiempo estas proteinas reprimen la transcripcion de los genes que codifican otras proteinas reguladoras importantes.

La expresi6n de una proteina reguladora critica puede disparar la expresion de una bateria de genes situados por debajo (en direccion 3')45 En general se trata de una combinacion de proteinas reguladoras, mas que de una proteina unica, la que determina donde y cuando se ha de transcribir un gen eucariota. Pero aunque el control sea combinatorio, una unica proteina puede ser decisiva para cambiar una celula de una via de desarrollo 0 estadQ de diferenciacion a otro. Un ejemplo notable procede de los estudios de diferenciacion de una fibra muscular in vitro. Una fibra muscular esqueIetica de mamifero tipica es extremadamente larga y contiene muchos nucleos. Se forma por fusion de muchas celulas precursoras denominadas mioblastos. La fibra muscular madura se diferencia de otras celulas por un gran numero de proteinas caracteristicas, que incluyen tipos especificos de actina, miosina, tropomiosina y troponina (todas elIas forman parte del sistema contractil), creatina fosfoquinasa (propia del metabolismo tipico de las celulas musculares), y receptores de acetilcolina (que hacen a la membrana sensible a la estimulacion nerviosa). En mioblastos proliferantes estas proteinas especificas de musculo y sus mRNA estan ausentes 0 se encuentran presentes en baja concentracion. Cuando los mioblastos empiezan a fusionarse unos con otros, todos estos genes se activan en un proceso coordinado que es parte de la transformacion general que presenta su patron de expresion genica. Todo este programa de diferenciacion del musculo puede desencadenarse en fibroblastos de la piel en cultivo y en algunos otros tipos celulares introdu474

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

Figura 9-62 Efecto de la expresi6n de la protefna MyoD en fibroblastos. Como se muestra en la micrografia de inmunofluorescencia, los fibroblastos de la piel se han convertido en celulas musculares por efecto de la expresi6n inducida experimentalmente del gen myoD. Los fibroblastos crecieron en cultivo, yfueron transfectados tres dfas antes de la observaci6n con un L----.J 20 ~m plasmido recombinante que contiene la secuencia codificante de myoD. Aunque s610 un porcentaje pequeno de los fibroblastos incorpora el DNA y produce la protefna MyoD, estas celulas se fusionan formando miotubulos alargados, que se muestran tenidos con anticuerpos que detectan una protefna especffica del musculo. Las celulas tenidas estan mezcladas con una capa confluente de fibroblastos, cuyos nucleos se pueden apreciar en la imagen. Cultivos control transfectados con otro plasmido no contienen celulas musculares.

ciendo cualquier gen que codifica uno de los miembros de una familia de protefnas helice-bucle-helice -las denominadas proteinas miogenicas (por ejemplo MyoD, Myf5 0 miogenina)- que normalmente se expresan unicamente en fibras musculares (Figura 9-62). En el DNA adyacente a muchos genes especfficos de musculo se pueden detectar secuencias de union a estas protefnas. A partir de estudios con ratones transgenicos parece que el modo de accion de MyoD y MyfS implica la activacion de miogenina: si se elimina el gen de miogenina por insercion genomica dirigida, las celulas musculares no pueden diferenciarse. Es probable que tanto los fibroblastos como otros tipos celulares que se convierten en fibras musculares por las protefnas miogenicas hayan acumulado una serie de protefnas reguladoras que pueden cooperar con las protefnas miogenicas activando los genes especfficos del musculo. Desde este punta de vista serfa una combinaci6n de protefnas reguladoras, mas que una simple protefna, la que determiriarfa la diferenciacion celular. Esta idea es consistente con el hecho de que algunos tipos celulares no se convierten en fibras musculares por accion de miogenina 0 protefnas relacionadas; dichas celulas, probablemente no habrfan acumulado las otras protefnas reguladoras necesarias. A continuacion veremos como el control combinatorio tiene implicaciones importantes tanto para la evolucion como para el desarrollo de los organismos pluricelulares.

El control genico combinatorio es la norma en los eucariotas46 Ya hemos discutido como pueden actuar de modo combinado multiples protefnas reguladoras controlando la expresion de un determinado gen. Sin embargo, Figura 9-63 La importancia para el desarrollo del control combinatorio.

celula embrionaria

INDUCCI6N DE LA PROTEfNA REGULADORA

•

IIZQUIERDA I

I DERECHA I

celula A

celula B

INDUCCI6N DE LAS PROTEfNAS REGULADORAS •

celula C

celula D

celula E

INDUCCI6N DE LAS PROTE[NAS REGULADORAS.

celula G

celula H

celula I

celula J

celula K

celula L

celula F

Y

•

celula M

Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados

Este esquema muestra c6mo las combinaciones de unas cuantas protefnas reguladoras pueden generar muchos tipos celulares diferentes durante el desarrollo. En este esquema simple la decisi6n de sintetizar una de' un par de protefnas reguladoras (representadas por cfrculos numerados) se toma deJ>pues de cada divisi6n celular. Siendo conscientes de su posici6n en el embri6n, la celula hija situada hacia la izquierda del embri6n siempre escoge sintetizar la protefna par, mientras que la situada hacia la derecha en el embri6n sintetizanin la impar. Se asume quela producci6n de cada protefna reguladora es autoperpetuante (contribuyendo asf a la memoria celular). Asf pues, las celulas en un clon en crecimiento contendrfan un mlmero creciente de protefnas reguladoras. Es de destacar que en este ejemplo, puramente hipotetico, se han generado ocho tipos celulares (G a N) con cinco protefnas reguladoras diferentes. Si se continua el esquema, se pueden llegar a especificar 10 000 tipos celulares con s610 25 protefnas reguladoras diferentes.

celula N

475

como demuestra el ejemplo de las protefnas miogenicas, el control combinatorio significa min mas: no solo cada uno de los genes esta regulado por la accion de numerosas protefnas reguladoras, sino que cada protefna reguladora participa en el control de muchos genes. Ademas, aunque algunas protefnas reguladoras como MyoD 0 miogenina son especfficas de un unico tipo celular, es mas frecuente que una protefna reguladora determinada este activa en una variedad de tipos celulares, en diferentes partes del cuerpo y en distintos momentos del desarrollo. En la Figura 9-63 se ilustra esquematicamente como el control genico combinatorio hace posible generar una gran cantidad de complejidad biologica con un numero relativamente reducido de protefnas reguladoras. El control combinatorio permite que una protefna reguladora dada no tenga necesariamente una funcion unica y claramente definida, como por ejemplo la de activacion de un grupo determinado de genes 0 la de determinacion de un cierto tipo celular. En lugar de ello, puede tener diferentes funciones que se solapan con las de las otras protefnas reguladoras. Estas protefnas se podrfan comparar con las palabras de un idioma: se utilizan con diferentes sentidos en una variedad de contextos y raramente se utilizan aisladas; una combinacion adecuada es la que contiene la informacion necesaria para especificar un proceso de regulacion genica. Una consecuencia del control genico combinatorio es que el efecto de afiadir una nueva protefna reguladora a una celula dependera de la historia anterior de la celula, pues esta historia determina que protefnas reguladoras se encuentran ya presentes en la celula. Asf durante el desarrollo una celula puede acumular una serie de protefnas reguladoras que pueden no alterar la expresion genica. Cuando se expresa el ultimo miembro de la combinacion requerida de protefnas reguladoras, se completa el mensaje regulador, provocando grandes cambios en el patron de expresion genica. Este modelo, como ya hemos visto, puede explicar el fenomeno de transformacion dramcitico de un fibroblasto en una fibra muscular por la adicion de una unica protefna reguladora. Asimismo podrfa justificar la diferencia, descrita en el Capftulo 21, entre los procesos de determinacion celular, por los cuales una celula queda determinada a seguir una cierta ruta de diferenciacion y un destino, y el proceso de diferenciacion celular por el cual una celula determinada expresa su caracter especializado. Un rasgo esencial de estas ideas es que, una vez que se empieza a expresar una protefna reguladora, puede actuar manteniendo su propia expresion, contribuyendo de este modo a la memoria celular como se discutira de nuevo mas adelante. El control genico combinatorio tiene otra importante consecuencia para la evolucion. Dado que las protefnas reguladoras no son exclusivas de un circuito de regulacion 0 de un gen diana particular, cambio sutiles en elIas pueden producir cambios substanciales en el comportamiento de las celulas.

Se hereda un cromosoma X inactivo47 Hemos visto anteriormente que las protefnas reguladoras pueden producir patrones de expresion genica heredables tanto en celulas eucariotas como procariotas. En la Figura 9-61 se ilustra un posible mecanismo, basado en un bucle de retroalimentacion positiva en el control de la expresion de un gen. Exclusivamente en eucariotas existe un mecanismo adicional, que permite que se herede el patron de organizacion de la cromatina. Posiblemente el ejemplo mas dramatico al respecto sea la inactivacion de uno de los dos cromosomas X en las celulas de las hembras de mamffero. Los cromosomas X e Y son los cromosomas sexuales de los mamfferos: todas las celulas femeninas contienen dos cromosomas X, mientras que las masculinas contienen un cromosoma X y un cromosoma Y. Probablemente debido a que una dosis doble de los productos del cromosoma X podrfa resultar letal, las celulas femeninas han desarrollado un mecanismo para mantener inactivado permanentemente en cada celula uno de los dos cromosomas X. En el raton esto ocurre entre el tercero y el sexto dfas de desarrollo, cuando, en cada celula uno 476

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

celula de un embrion temprano

Figura 9-114 Inactivaci6n del X. Herencia clonal de un cromosoma X condensado e inactivo, que tiene lugar en las hembras de los mamfferos.

Xm

CONDENSACION DE UN CROMOSOMA X SELECCIONADO AL AZAR

HERENCIA DIRECTA DEL PATRON DE CONDENSACION DEL CROMOSOMA

'--

----'1 L-I

en este cion solo es activo el cromosoma X m

-'

en este cion solo es activo el cromosoma X p

de los dos cromosomas X, al azar, se condensa en forma de heterocromatina. Este cromosoma se puede ver al mieroscopio optieo durante la interfase como una estructura diferente conocida como corpusculo de Barr, localizado cerca de la membrana nuclear, y se replica al final de la fase S. La mayor parte de su DNA no se transcribe. Este cromosoma X inactivo se hereda fielmente, por 10 que cada hembra es un mosaieo compuesto de grupos clonales de celulas en los que s610 es activo el cromosoma X heredado del padre CXp) y otro mlmero aproximadarnente igual de grupos de celulas en las que tinieamente es activo el cromosomaXheredado de la madre 0Cm). En general, en el animal adulto tanto las celulas que expresan ~ como las que expresan ~ se distribuyen en pequefios grupos, 10 cual refleja la tendencia de las celulas hijas de permanecer cerca unas de las otras durante las tiltimas etapas del desarrollo embrionario y del crecimiento (Figura 9-64). El proceso de condensacion que forma la cromatina condensada (heterocromatina) en un cromosoma X tiene la tendencia a producirse de forma continua a 10 largo del cromosoma. Ello se ha demostrado mediante estudios utilizando animales mutantes en los que uno de los cromosomas X se ha unido a una porcion de un autosoma (un cromosoma no sexual). En estos cromosomas hfbridos a menudo sucede que algunas regiones del autosoma que son adyacentes al cromosoma X inactivado se encuentran condensadas en heterocromatina de forma que los genes que contienen se encuentran inactivados de una manera hereditaria. Esto sugiere que la inactivacion del cromosoma X se produce mediante un proceso cooperativo, que puede imaginarse como una especie de "cristalizacion" de la cromatina que se extiende desde un lugar de nucleacion situado en el cromosoma X. De hecho, se ha localizado genetieamente un tinieo Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados

477

12345 t

limite

genes I

+

12345

'i

~

~

1 2 3 4 5

~

4 5

1 2 3 4 5

•

~

•

~

1 2 3 4 5

~

proliferaci6n de la celula

~

~

~

cion de celulas con el gen 1 inactivo

cion de celulas con los genes 1, 2 Y 3 inactivos

cion de celulas sin ningun gen inactivo

12345

it'*

eucromatina

(A)

(8)

centro de inactivaci6n en el cromosoma X: fragmentos rotos de cromosoma X no sufren inactivaci6n a menos' que induyan dicho centro. Una vez se ha establecido la estructura condensada de la cromatina, un proceso desconocido hace que la estructura sea heredada de esta forma durante todas las sucesivas replicaciones del DNA. Sin embargo este cambio no es absolutamente permanente ya que el cromosoma X inactivado se reactiva en el proceso de formaci6n de las celulas germinales en la hembra.

Los genes de Drosophila y de levadura tambien pueden inactivarse por caracterfsticas hereditarias de su estructura cromatinica48 Hemos descrito dos ejemplos de efectos de posici6n sobre la expresi6n genica -uno en Drosophila y otro en levadura- que se parecen en diferentes aspectos a la inactivaci6n del cromosoma X (vease Figura 9-51). En ambos casos, una forma especfficamente condensada de cromatina impide la expresi6n de algunos genes, y en ambos casos el estado de condensacion de la cromatina es hereditario. En las moscas que presentan reordenaciones cromos6micas, fenomenos de separaci6n y reagrupamitmto que situan la mitad de una regi6n de heterocromatina cerea de una region de eucromatina tienden a inactivar los genes eucromatfnicos cercanos. La situacion es amiloga a la fusi6n de un autosoma de mamifero con un cromosoma X inactivado, tal como se acaba de describir; los fen6menos de inactivacion son muy similares a estos: la zona de inactivacion se expande desde el punto de separaci6n del cromosoma hasta cubrir uno 0 mas genes. Ademas, mientras que el grado del efecto de expansion es diferente en diferentes celulas, la zona inactivada establecida en una celula embrionaria se hereda de una manera estable por toda la progenie celular (Figura 9-65). El ejemplo de efecto de posici6n que se describe en la Figura 9-51 tambien comparte algunos rasgos con la inactivaci6n del cromosoma X, como son el efecto de expansion y la heredabilidad del estado de condensacion de la cromatina. Aun no ha sido probado que lainactivacion del cromosoma X y los efectos de posicion ob~ervados en moscas tengan un mecanismo comun, pero el paralelismo entre ellos es notable. La identificaci6n y clonaje recientemente de algunos genes de Drosophila y de levadura necesarios para el efecto de posicion permitira descubrir, probablemente, los mecanismos moleculares implicados en estos fenomenos. En la Figura 9-66 se muestra un esquema hipotetico de c6mo podria explicarse el efecto de expansi6n y la naturaleza hereditaria del estado de condensacion de la cromatina. Independientemente de su base molecular, el empaquetamiento de determinadas regiones del genoma formando cromatina condensada es un tipode mecanismo regulador que no se presenta en las bacterias. El fen6meno crucial de esta forma de regulaci6n genica exc1usiva de los eucariotas es el almacen de 478

1 2 3

pronto en el embri6n en desarrollo, se forma la heterocromatina y se extiende sobre la eucromatina vecina hasta distancias diferentes en diferentes celulas

~SLOCACI6N l b~C~'OMOSOMAS heterocromatina

12345

'E

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

Figura 9-65 Fen6meno de variegaci6n por efecto de posici6n en Drosophila. (A) Normalmente, la heterocromatina (rojo) no ocupa las regiones adyacentes de eucromatina (verde) debido ala existencia de limites especiales de secuencias, de naturaleza desconocida. Sin embargo, en algunas moscas que heredan ciertas translocaciones cromos6micas, este limite no esta presente. (B) Durante las primeras fases del desarrollo de estas' moscas, la heterocromatina se extiende sobre el DNA cromosomico vecino, alcanzando diferentes distancias en celulas diferentes. Pronto, esta expansion se detiene, pero el patron establecido de heterocromatina se hereda, de tal modo que se producen grandes clones de celulas descendientes que presentan los mismos genes vecinos condensados en forma de heterocromatina, y por 10 tanto, inactivos (de aquf la apariencia "variegada" de algunas de estas moscas; vease Figura 9-5IB). Este fenomeno se asemeja en muchos aspectos a la inactivacion del cromosoma X que se produce en los mamfferos.

....... .............. ,'t), gen inactivo

kPLICACION DEL DNA

""I ~~o~~~~.~:~~:Ltel una unIon cooperativa

gen activo

~CCOJ REPLICACION DEL

D~

I-

~.CO.C-~

no se unen proteinas

proteina libre

~

I

~OIC lOS DOS GENES HIJOS SON INACTIVOS

lOS DOS GENES HIJOS SON ACTIVOS

una memoria estable de estados genicos en una estructura cromatfnica hereditaria, en lugar de tratarse de un mecanisme de retroalimentacion estable de genes autorreguladores de protefnas reguladoras que pueden difundir de un lade a otro del nticleo. Se desconoce si los mecanismos de este tipo acttian solo en grandes regiones inactivas de los cromosomas 0 si tambil~n pueden hacerlo a nivel de uno 0 de unos cuantos genes.

Cuando las celulas de vertebrados se dividen, pueden heredar el patr6n de metilaci6n del DNA49 Los nucleotidos del DNA pueden ser modificados de forma covalente, yen vertebrados la metilacion de citosina parece constituir un mecanisme importante para distinguir genes activos de los que no 10 son. La molecula de 5-metilcitosina (5-metil C), tiene la misma relacion con la citosina que la timidina con el uracilo, y de manera similar no afecta al apareamiento de bases (Figura 9-67). La metilacion en el DNA de vertebrados esta restringida a los nucleotidos citosina (C) en 'la secuencia CG, que esta apareada exactamente con la misma secuencia (en direccion opuesta) de la otra hebra de la helice del DNA. Consecuentemente, un sencillo mecanisme permite que un patron preexistente de metilaci6n del DNA se herede directamente por las moleculas de DNA hijas. Una enzima Hamada metilasa de mantenimiento acttia preferentemente sobre las secuencias CG apareadas previamente con una secuencia CG metilada. A consecuencia de eHo, el patron preexistente de metilacion de la cadena parental de DNA acttia como un molde para la metilacion de las cadenas de DNA hijas, haciendo que el patron sea heredado directamente a traves de la replicacion del DNA (Figura 9-68). Las bacterias producen enzimas que han sido muy titiles para el estudio de la metilacion en las celulas de vertebrados. Utilizan la metilacion en A 0 en C en una secuencia especffica a fin de protegerse de la accion de sus propias nucleasas de restriccion. Por ejemplo, la nucleasa de restriccion HpaII, corta la secuencia CCGG siempre y cuando la C central no este metilada. Asf la susceptibilidad de una molecula de DNA a ser cortada por la HpaII puede utilizarse para detectar si determinados puntos del DNA estan metilados 0 no. La heredabilidad de los patrones de metilacion en vertebrados se puede estudiar en celulas en cultiva utilizando en primer lugar enzimas metiladoras bacterianas para introducir grupos metilo en las citosinas, y despues utilizando nucleasas de restriccion para seguir la heredabilidad de dichos grupos. La enzima utilizada normalmente para introducir bases 5-metil C en secuencias determinadas CG es la enzima HpaII metilasa, que normalmente protege a la bacteria contra su propia nuclea-

Figura 9-67 Formaci6n de 5-metilcitosina por metilaci6n de una citosina en la doble helice del DNA. En los vertebrados este fenomeno esta restringido a citosinas (Cl escogidas que forman parte de la secuencia CG. Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados

Figura 9-66 Esquema general que permite la herencia directa de estados de expresi6n de genes durante la replicaci6n del DNA. En este modelo hipotetico, porciones de un grupo de protefnas reguladoras de la expresion genica, que se unen entre sf de forma cooperativa, se transfieren directamente desde la helice paterna de DNA (arriba a la izquierdal a ambas Mlices hijas. Entonces, el grupo de protefnas heredado de cada una de las helices hijas provoca que se unan a el otras copias de la misma protefna reguladora. Como la union es cooperativa, el DNA sintetizado a partir de una Mlice paterna de DNA identica a la anterior, pero que no presenta las protefnas unidas (arriba a la derechal, permanecera libre de ellas. Si estas protefnas unidas inactivan la transcripcion de un determinado gen, el estado inactivo del gen se heredani directamente, como en el ejemplo. Si la union cooperativa de las protefnas requiere secuencias especfficas de DNA, estos fenomenos estanin limitados a regiones de control genico especfficas; sin embargo, si la union se puede propagar a todo 10 largo del cromosoma, podrfa explicar el efecto de expansion asociado con los estados heredables de la cromatina que se discute en el texto.

citosina H

5-metilcitosina H

H

H

metilacion

479

CH 3

CH3

I

I

citosina no metilada

\

y

CH

I

ACGTATCGT

5'

citosina metilada

3'1,1I.WUII.5' I

ACGTATCGT 5'

3'

3'1I.WUII.5' TGCATAGCA

__ m_et_i1a_c_i6_n....... ::

TGCATAGCA

3.

replicaci6n del DNA

no reconocido por una enzima metilante de mantenimiento

II.WUII.:: ACGTATCGT

3'

TGCATAGCA

I

I

CH3

reconocido por una enzima metilante de mantenimiento CH 3

I

I

CH 3 metilaci6n

.

ACGTATCGT 5'!I"li~~~3'

III1I11II

3' . . . . . . . . . . . 5' TGCATAGCA

I CH3

sa de restriccion. Si se utiliza esta enzima para metilar la C central de la secuencia CCGG de una molecuia clonada de DNA que luego se introduce en una celula de vertebrado, se puede demostrar que el patron de metilacion se mantiene como hemos descrito: cada secuencia individual metilada CG se mantiene a 10 largo de muchas divisiones, mientras que las secuencias CG no metiladas permanecen sin metilar. La existencia de la metilasa de mantenimiento explica la herencia automlitica de nucleotidos 5-metil C, pero dado que normalmente no metila DNA no metilado previamente, no puede explicar como se afiadio el primer grupo metilo a un organismo vertebrado. Si se inyecta DNA completamente carente de metilacion a un huevo de raton fertilizado, se afiadinin grupos metilo a casi cada secuencia CG (con una importante excepcion que se discutira mas adelante). Se cree que este efecto es debido a otra actividad metilasa de establecimiento presente en el huevo. Como se vera, la metilacion de novo tambien ocurre durante los procesos de diferenciacion de celulas especializadas, aunque se desconoce como se realiza.

En las celulas de los vertebrados la metHacion del DNA refuerza las decisiones del desarroll0 50 Aunque en un principio se propuso que la metilacion del DNA podrfa jugar un papel dominante en la generacion de los diferentes tipos celulares de mamfferos, actualmente se Ie reconoce un papel mas suti!. En algunos invertebrados, incluyendo a Drosophila, el DNA no esta metilado y sin embargo el proceso de diversificacion de los diferentes tipos celulares parece ser similar entre Drosophila y los vertebrados. Algunas observaciones apoyan la idea de que la metilacion del DNA en vertebrados esta relacionada con la inactivacion genica, pero que solo es un mecanismo de refuerzo de una decision adoptada previamente por otro mecanismo. Asf pues experimentos con la enzima Hpall demuestran que en general el DNA de los genes inactivos esta mas fuertemente metilado que el de los genes activos. Sin embargo, cuando un gen que estaba inactivo se activa durante el desarrollo pierde parte de su metilacion unicamente despues de haber sido activado. De manera similar, el cromosoma X femenino descrito anteriormente, primero se condensa e inactiva, y solo posteriormente incrementa el nivel de metilacion de sus genes. Entonces, ique hace la metilacion? Y, icual es su utilidad para el organismo? Tenemos al menos dos indicios importantes al respecto. Primero, se puede preparar el DNA correspondiente a un gen de actina especffico de musculo en dos formas, una completamente metilada y otra sin metilar. Cuando estas dos versiones del gen se introducen en celulas musculares en cultivo, ambas se transcriben 480

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

Figura 9-68 De que forma se pueden heredar con precisi6n los patrones de metilaci6n del DNA. En los DNA de vertebrados, una gran cantidad de las bases de citosina de la secuencia CG estan metHadas (vease Figura 9-67). Dada la existencia de una enzima metHante dirigida par grupos metHo (la metHasa de mantenimiento), una vez se ha establecido un determinado patron de metHacion del DNA, cada punto de metHacion se hereda en el DNA descendiente, tal como se muestra en esta figura. Esto implica que los cambios en los patrones de metHacion del DNA se pueden perpetuar en toda la progenie de una celula.

"".'& i,rn"~"pci'" protefnas

factores generales

GEN ACTIVO

• PERDIDA DE LAS PROTEiNAS REGULADORAS

I I

&

GEN INACTIVO PERO MEN GOTEO u

NUEVA MEnlAC'ON DEL DNA

Figura 9-69 De que forma la metilaci6n del DNA puede ayudar a inactlvar genes. La uni6n de las proteinas reguladoras y de los factores generales de transcripci6n cerca de un promotor activo impide la metilaci6n del DNA por un mecanismo desconocido. Si la mayona de estas proteinas de uni6n al DNA especfficas de secuencia se disocian, como ocurre cuando el gen se inactiva, la secuencia de DNA puede metilarse, 10 que impedini que se unan otras proteinas e inactivara completamente el gen.

~HHHHi-----

=_6

UN'ON DEPROrriNAS

.MET"C_

GEN COMPLETAMENTE INACTIVO

a la misma elevada velocidad. Sin embargo, cuando se introducen en fibroblastos, que normalmente no transcriben el gen, el gen no metilado es transcrito a nivel bajo pero mucho mas alto que el del gen ex6geno metilado 0 que el del gen end6geno del fibroblasto (que tambien esta metilado), que no se transcriben en absoluto. Segundo, a partir de experimentos bioquimicos se ha podido identificar en vertebrados una proteina que se une fuertemente al DNA Yque contiene nucle6tidos 5-metil C agrupados. Se cree que la uni6n de esta proteina empaqueta el DNA metilado de tal forma que 10 hace especialmente resistente ala activaci6n por la maquinaria de transcripci6n. Estos experimentos sugieren que la metilaci6n del DNA se utiliza en vertebrados fundamentalmente para asegurar que cuando un gen se inactiva quede completamente inactivado (Figura 9-69). Los experimentos realizados para comprobar si una secuencia de DNA que se transcribe con gran frecuencia en un tipo celular determinado de vertebrado 10 hace 0 no en otro tipo celular han demostrado diferencias de velocidad de transcripci6n entre dos tipos celulares del orden de mas de 106 veces. Genes inactivos de vertebrados se transcriben mucho menos que genes inactivos de bacterias, en los que las mayores diferencias conocidas en cuanto a la velocidad de transcripci6n entre genes expresados y no expresados son de aproximadamente 1000 veces. La metilaci6n del DNA podria ser la responsable de al menos una parte de esta diferencia. Ademas, como se vera mas adelante, la metilaci6n del DNA es necesaria para al menos un tipo de memoria celular.

La actividad gen6mica heredable requiere la metilaci6n del DNA51 La celulas de mamfferos son diploides, conteniendo un grupo de genes heredado , del padre y otro de la madre. Se han encontrado pocos casos en los que la expresi6n de un gen dependa de si se ha heredado del padre 0 de la madre. Este fen6menD se ha denominado actividad gen6mica heredable 0 marcaje del genoma (genomic imprinting). Aunque no fue descubierto de ese modo, se han observado ejemplos notables en experimentos con ratones transgenicos. Por ejemplo, es posible obtener ratones transgenicos en los que una de las dos copias normales del gen que codifica elfactor de crecimiento similar ala insulina-2 (IGF-2, de Insulinlike Growth Factor-2") se ha inactivado por mutaci6n. Este rat6n, heterocigoto, se Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados

481

desarrolla normalmente si el gen defectivo Igf-2 procede de la madre, pero presentan graves anomalias, creciendo solamente la mitad de 10 que es normal, si el gen defectivo Igf-2 procede del padre. La explicaci6n se obtuvo del anaIisis posterior de estos ratones transgenicos y de ratones normales. Tanto en los ratones normales como en los transgenicos s610 se transcribe la copia del gen Igf-2 paterno, mientras que el gen obtenido de la madre es silencioso: se dice en este caso que el gen obtenido de la madre ha sido marcado (imprinted). Aunque los mecanismos de marcaje del genoma no estan daros, es muy probable que participe la metilaci6n del DNA. Asi, en ratones transgenicos defectivos en la metilasa de mantenimiento, el marcaje del gen Igf-2 materna no se produce 10 que nos indica que el mecanismo que permite diferenciar las copias materna y paterna del gen Igf-2 implica la metilaci6n del DNA. Tambien es muy interesante el hecho de que los ratones que carecen de metilasa de mantenimiento mueran en el estado de embriones tempranos. Esto podria ser la consecuencia de un marcaje del genoma defectuoso, pero tambien se podria argtiir que el fallo primario fuese la imposibilidad de reforzar las decisiones del desarrollo por metilaci6n del DNA, 10 que conduciria a que los miles de genes inactivos que existen en una celula de vertebrados mantuvieran una velocidad de transcripci6n minima.

En los mamiferos, las islas ricas en CG estan asociadas con alrededor de 40 000 genes52 Debido al funcionamiento de la via de reparaci6n de DNA, los residuos C metilados en el genoma tienden a ser eliminados en el curso de la evoluci6n. La desaminaci6n accidental de una C no metilada da lugar a U, base que habitualmente no esta presente en el DNA, por 10 que es reconocida facilmente por la enzima de reparaci6n de DNA, la uracilo DNA glucosilasa, eliminada y luego reemplazada por una C (se describe en el Capitulo 6). Pero la desaminaci6n accidental de una 5-metil C no puede ser reparada de este modo, porque el producto de la . desaminaci6n es una T que, por 10 tanto, no se puede diferenciar de los otros residuos T no mutantes del DNA. Aunque existe un sistema especial de reparaci6n para eliminar estos mutantes T (vease pag. 267), muchas de estas desaminaciones no son detectadas, por 10 que los residuos C del genoma que estan metilados tienden a mutar a T durante la evoluci6n. A 10 largo de la evoluci6n mas de tres de cada cuatro CG se han perdido por este sistema, dejando a los vertebrados con una deficiencia notable en este dinude6tido. Las secuencias CG que todavia existen estan distribuidas de una forma desigual por el genoma; en determinadas regiones, de 1000 a 2000 pares de bases de longitud, las secuencias CG estan presentes a densidades de entre 10 y 20 veces su densidad media en todo el genoma; estas zonas reciben el nombre de Islas CG. Estas islas, con algunas notables excepciones, parecen mantenerse no metiladas en todos los tipos celulares. Se ha observado que rodean los promotores de los llamados genes de mantenimiento (housekeeping genes) -genes isla CG intrones

exones de la dihidrofolato reductasa

5'

RNA

DNA

~ 3'

gen de la hipoxantina fosforribosil transferasa i'iii·"!!"'ii'W;kj"::;'_·

5'

-"!i,i'!E!
·Ii'i'i·.';"- "'i;'.."·i,'·..·i,:i"!;~/i':"

RNA

"·-"'·'·""f.',',":",i'·;,'.'!·t -')ii';-;'"

'···'·''''if.'4~;;.'_O"

~ 3'

DNA

Figura 9-70 Las Islas CG que rodean a los promotores en tres genes constitutivos de mamfferos. Los recuadros amarillos muestran la longitud de cada isla. Observese tambien que, como ocurre con la mayorfa de los genes de mamffero, los exones (rojo oscuro) son cortos en relaci6n con los intrones (rojo claro). (Adaptado de A.P. Bird, Trends Genet. 3:342-347, 1987.)

10000 pares de nucle6tidos

482

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

.,-

DNA DE UN ANCESTRO DE LOS INVERTEBRADOS metilaci6n de la mayorfa de secuencias CG en la linea germinal

muchos millones de aiios de evoluci6n

I

I

1000 pares de nucle6tidos

I

5'

j•

....

RNA

i an; ·-----·D·N·~·D·:-:·~-V·ER·:·'·B·R·A·D·O·S s

Figura 9-71 Un mecanismo que explica tanto las marcadas deficiencias de secuencia CG como la presencia de islas CG en los genomas de los vertebrados. Las lfneas negras marcan la localizaci6n de un dinucle6tido CG no metilado en la secuencia de DNA, mientras que las lfneas rojas marcan la localizaci6n de un dinucle6tido CG metilado.

•

isla CG

que codifican el elevado mlmero de proteinas que son esenciales para la viabilidad celular y que, por 10 tanto, se expresan en muchas celulas (Figura 9-70). Ademas, muchos de los genes especijicos de tejidos, que codifican proteinas necesarias s610 en determinados tipos de celulas, tambien estan asociados con las islas CG. La distribuci6n de las islas CG puede explicarse si se asume que la metilaci6n CG fue adoptada en vertebrados como un mecanismo de evitar el inicio de la transcripci6n en los segmentos inactivos del genoma (Figura 9-71). En celulas de la linea germinal de vertebrados -ellinaje celular que da lugar a oocitos y a espermatozoides- la mayor parte del genoma esta inactivo y metilado. Durante largos periodos de tiempo de evoluci6n, sus secuencias CG metiladas se han perdido por medio de fen6menos de desaminaci6n accidental que no han sido reparados correctamente. Sin embargo, las secuencias CG de las regiones que rodean los promotores de muchos genes, induyendo sus genes de mantenimiento, se mantienen no metiladas en las celulas de la linea germinal, y por 10 tanto pueden ser reparadas despues de fen6menos de desaminaci6n espontanea. Estas regiones se han conservado como islas CG. El genoma de mamifero (aproximadamente 3 x 109 pares de nude6tidos) contiene un mlmero estimado de 40 000 islas CG. La mayoria de las islas marcan los extremos 5' de la unidad de transcripci6n y por 10 tanto, probablemente del gen. Puesto que es posible donar especificamente el DNA situado alrededor de las islas CG, esta tecnica proporciona un buen metodo para encontrar nuevos genes.

Resumen La gran cantidad de tipos celulares de los animales y de las plantas se genera por medio de mecanismos que provocan que en diferentes celulas se transcriban diferentes genes. Muchas celulas animales especializadas pueden mantener sus caracteres tlpicos cuando crecen en cultivo, por 10 que los mecanismos reguladores de la expresi6n genica que estan implicados en la generaci6n de estos tipos celulares han de ser estables y heredables, dotando a la celula de una memoria de la historia de su desarrollo. Los procariotas y las levaduras proporcionan modelos de sistemas que son accesibles para estudiar los mecanismos de la regulaci6n genica. Algunos de estos mecanismos pueden ser relevantes en la generaci6n de tipos celulares especializados de los eucariotas superiores. Uno de estos mecanismos implica una interacci6n competitiva entre dos (0 mas) protefnas patr6n de regulaci6n genica, cada una de las cuales estimula su propia sfntesis e inhibe la sfntesis de la otra: esto crea un mecanismo de flip-flop que hace alternar a la celula entre dos patrones de expresi6n alternativos. Los bucles de retroalimentaci6n positiva directa 0 indirecta, que permiten a las protefnas reguladoras mantener su propia sfntesis, son un mecanismo general de la memoria celular. En los eucariotas la transcripci6n estd controlada generalmente por combinaciones de protefnas reguladoras. Se cree que cada tipo celular en un eucariota superior contiene una combinacwn especial de protefnas reguladoras que aseguran la

Mecanismos geneticos que originan tipos celulares especializados

483

expresi6n de exclusivamente los genes apropiados para ese tipo de celula. Una protelna reguladora se puede expresar en diferentes circunstancias y en general estti implicada en el control de muchos genes. Ademds de las protelnas de regulaci6n que difunden, en los eucariotas tambien se utilizan ciertos estados de compactaci6n de la cromatina, heredables, para regular la expresiOn genica. En vertebrados tambien participa la metilaci6n del DNA, especialmente para reforzar las decisiones sobre expresiOn de los genes que se han tornado previamente por otros mecanismos.

Controles post-transcripcionales Aunque las fonnas predominantes de regulaci6n de la mayorfa de los genes son los controles de la iniciaci6n de la transcripci6n genica, otros controles pueden actuar posteriormente en la via del RNA a la protefna modulando la cantidad de producto genico que se produce. Aunque estos controles post-transcripcionales, que acttian despues de que la RNA polimerasa se haya unido al promotor y haya iniciado la transcripci6n, son menos frecuentes que los controles transcripcionales, son cruciales para muchos genes. Parece como si cada una de las etapas que pueda ser regulada en la expresi6n genica, sera regulada en alguna circunstancia para algunos genes. Consideraremos las variantes de regulaci6n post-transcripcional en un orden temporal, de acuerdo con la secuencia de procesos con los que se va encontrando una molecula de RNA desde que comienza la transcripci6n (Figura 9-72).

La atenuaci6n de la transcripci6n causa una terminaci6n temprana de algunas moIecuias de RNA53 En bacterias la expresi6n de ciertos genes es inhibida por la terminaci6n prematura de la transcripci6n, en un fen6meno denominado atenuacion de la transcripcion. En algunos de estos casos la cadena de RNA naciente adopta una estructura que provoca interacciones con la RNA polimerasa que abortan su transcripci6n. Cuando se requiere el producto genico, ciertas protefnas reguladoras se unen a la cadena de RNA naciente e interfieren con la atenuaci6n, permitiendo de ese modo que se termine la transcripci6n. En los eucariotas la atenuaci6n de la transcripci6n ocurre segtin una variedad de mecanismos. Por ejemplo, tanto en adenovirus como en HIV (el virus causante del SIDA), las protefnas que se ensamblan en el promotor parecen poder detenninar si la polimerasa puede pasar a traves de ciertos lugares de atenuaci6n mas adelante. Estas protefnas pueden diferir de una celula a otra, y la celula puede controlar el grado de atenuaci6n para genes particulares.

INICIO DE LA TRANSCRIPCION POSIBLE ATENUACION MADURACION V CORTE DEL EXTREMO 3' EXPORTACION DESDE EL NUCLEO

Tal como se ha descrito en el Capftulo 8, muchos genes se transcriben en primer lugar en fonna de precursores largos de mRNA que son recortados por una serie de etapas de procesarniento, al final de las coales se obtiene la moMcula madura de mRNA. Una de esas etapas es la maduraci6n del RNA por corte y empalme (RNA splicing), en la que se eliminan las secuencias intr6nicas del precursor del mRNA. Frecuentemente una celula puede madurar un precursor de diferentes fonnas, de modo que se pueden obtener polipeptidos finales diferentes a partir de un mismo gen -segtin un proceso que se denomina maduracion altemativa del RNA (Figura 9-73). Una proporci6n substancial de los genes de los eucariotas superiores produce mUltiples protefnas de este modo. Cuando existen diferentes posibilidades de maduraci6n en varias posiciones del transcrito, un tinico gen puede producir docenas de protefnas diferentes. Sin embargo, las altemativas en el proceso de maduraci6n son frecuentemente mucho mas limitadas, y s6lo 484

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

t-

se detiene

secuencias de mRNA no funcionales

~ reten~lon ..

en el nucleo

---it ti--LOCALIZACION ESPACIAL EN EL CITOPLASMA POSIBLE EDICION DEL RNA

La maduraci6n altemativa del RNA puede producir diferentes formas de proteina a partir de un mismo gen54

~a transcripci6n

J~

INICIO DE LA TRADUCCION

POSIBLE RECODIFICACION TRADUCCIONAL POSIBLE ESTABILIZACION t>EL RNA

l __~_--.. l )

• .

!

t! t-

traducci6n bloqueada

RNA degradado

CONTINUA LA SINTESIS DE PROTEINA

Figura 9-72 Posibles controles posttranscripcionales de la expresi6n genica. Es probable que en un gen determinado s610 se utilice alguno de estos controles.

1 2

1 2

1

2

1

2

Figura 9-73 Cuatro patrones de maduracl6n altemativa de RNA. En cada caso Madura un solo tipo de transcrito de RNA de dos formas alternativas, produciendo dos mRNA distintos (l y 2). Los recuadros azul oscuro indican secuencias ex6nicas que se presentan en ambos mRNA. Los recuadros azul claro indican secuencias ex6nicas que s610 se presentan en uno de los mRNA; estos recuadros estan unidos pOI lfneas rojas para indicar d6nde se eliminan las secuencias intr6nicas (amarillas). (Adaptado con permiso de A. Andreadis, M. E. Gallego, y B. NadalGinard, Annu. Rev. Cell BioI. 3:207-242, 1987. © 1987 Annual Reviews, Inc.)

se pueden obtener algunos tipos de protefnas a partir de cada unidad de transcripci6n. En algunos casos la maduraci6n alternativa del RNA ocurre porque existe una "ambigiiedad de intr6n": el mecanismo estandar de espliceosoma que elimina los intrones (descrito en el Capftulo 8) es incapaz de distinguir claramente entre dos 0 mas apareamientos alternativos de puntos de maduraci6n 5' y 3', de tal modo que en diferentes ocasiones se toman diferentes decisiones de forma fortuita. Cuando ocurre este fen6meno de maduraci6n alternativa constitutiva, se producen varias versiones de protefna codificada por el gen en todas las celulas en las que este se expresa. Sin embargo, en muchos casos la maduraci6n alternativa del RNA no es constitutiva sino que esta regulada. En los casos mas simples la maduraci6n alternativa permite pasar de sintetizar protefnas no funcionales a protefnas funcionales. Por ejemplo, la transposasa que cataliza la transposici6n del elemento P de Drosophila se produce en una forma funcional en celulas germinales y en una forma no funcional en celulas somaticas de la mosca, permitiendo al elemento P extenderse por el genoma de la mosca sin causar dafios en las celulas somaticas. La diferencia en la actividad del elemento transponible viene provocada por una secuencia intr6nica del RNA de la transposasa que s6lo se elimina en la celulas germinales. La maduraci6n del RNA se puede regular tanto negativamente, mediante una molecula reguladora que evita que la maquinaria de maduraci6n acceda a una secuencia de maduraci6n determinada en el RNA, 0 positivamente, mediante una protefna reguladora que dirige la maquinaria de maduraci6n hacia una secuencia de procesamiento que de otra forma quedarfa oculta (Figura 9-74). En el caso de la transposasa de Drosophila, la etapa clave del procesamiento esta bloqueada en las celulas somaticas por regulaci6n negativa. Ademas de cambiar la producci6n de una protefna funcional por otra no funcional, 0 a la inversa, la regulaci6n de la maduraci6n del RNA puede generar versiones diferentes de la protefna en diferentes tipos celulares, de acuerdo con las necesidades de la celula. Por ejemplo, de este modo se produce en las celulas nerviosas una variante especializada de la protefna tirosina quinasa codificada por el proto-oncogen src (Figura 9-75). Las variantes especfficas de tipo celular de otras protefnas se producen del mismo modo.

La determinaci6n del sexo en Drosophila depende de una serie de procesos de maduraci6n alternativa regulada del RNA55 En Drosophila la sefial primaria que determina si a mosca se desarrol1ara como macho 0 hembra es la relaci6n cromosomas XI autosomas. Individuos con una reControles post-transcripcionales

485

*-

represor

(A) CONTROL NEGATIVO

rio •transcrito primaII:::::::::J_ _•

m,',,";" hloq,,,"

____-==

_ _ _ _ _ _ _ mRNA

mRNA

•

activador

(B) CONTROL POSITIVO

transcrito prima rio

_-===-

mRNA

Figura 9-74 Control negativo y positivo de la maduraci6n altemativa del RNA. (A) Control negativo, en el que un represor se une a un transcrito primario en el tejido 2, evitando de ese modo que la maquinaria de maduraci6n elimine la secuencia del intr6n. (B) Control positivo, en el que la maquinaria de maduraci6n es incapaz de eliminar una secuencia intr6nica particular sin ayuda de una proteina activadora.

_ _ _ _ _ _ _ mRNA

lacion cromosomas XI autosomas de 1 (narmalmente dos cromosomas Xy dos series de autosomas) se desarrollan como hembras, mientras que los que presentan una relacion de 0,5 (normalmente un cromosoma Xy dos series de autosomas) se desarrollan como machos. Esta relacion parece determinarse de alglin modo en las primeras fases del desarrollo y desde entonces es recordada por cada celula. Hay tres productos genicos cruciales que estan implicados en la transmision de la informacion sobre esta relacion a muchos otros genes que especificaran los rasgos propios de machos y hembras (Figura 9-76). En la Figura 9-77 se indica que la determinacion del sexo en Drosophila depende de una cascada de fenomenos de maduracion regulada del RNA, que implican a estos tres productos genicos. La determinacion del sexo en Drosophila aporta el ejemplo mejor conocido de una cascada de regulacion basada en la maduracion del RNA. No esta claro par que la mosca utiliza esta estrategia. Dtros organismos (nematodos, por ejemplo) utilizan un sistema completamente diferente para la determinacion del sexo -basado en controles transcripcionales y traduccionales. Ademas, la via de determinacion de macho en Drosophila requiere que se produzcan continuamente una serie de moleculas de RNA no funcionales, 10 que parece ser un gasto innecesario. Se especula que esta cascada de maduracion del RNA es un antiguo mecanisme de control, procedente de una etapa evolutiva en la que el RNA era la molecula biologica predominante y los controles de la expresion genica debfan basarse completamente en interacciones RNA-RNA.

Un cambio en el punto de rotura del transcrito de RNA y la adici6n de poli A pueden cambiar el extremo

carboxilo terminal de una proteina56 En eucariotas el extremo 3' de una molecula de mRNA no esta determinado, como en bacterias, par la finalizacion de la sfntesis de RNA por la RNA polimerasa. Por el contrario, esta determinado par una reaccion de rotura del RNA que disposicion de los exones que codifican protefna del gen src

DNA

2 3

4

A

5

6789101112

1000 pares de nucleotidos celulas nerviosas

mayorfa de las celulas

H2N

eOOH 23456789101112

protefna Src de 533 aminoacidos

486

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

H2N

eOOH 2 3A45 6 7 8 9 10 11 12

protefna Src de 539 aminoacidos

Figura 9-75 La maduraci6n altemativa regulada del RNA produce fonnas especiflcas del tipo celular de un producto genico. Aqui se representa el proceso de generaci6n de dos proteina quinasas ligeramente distintas a partir del gen src, porque la secuencia del ex6n A s610 se incluye en la forma propia de las celulas nerviosas. La forma neural de la proteina Src contiene un lugar de fosforilaci6n extra y se cree que ademas tiene una actividad especifica superior. En el esquema s610 se muestran los exones que codifican proteina (coloreados) (el ex6n 1, que forma la secuencia 5' lider del mRNA, no se muestra). (SegUn J.B. Levy et al., Mol. Cell BioI. 7:4142-4145,1987.)

esta catalizada por otros factores mientras el transcrito se esta alargando (vease Figura 8-49). Una celula puede controlar ellugar de corte de modo que cambie el extremo carboxilo de la proteina resultante (que esta codificado por el extremo 3' del mRNA). Un cambio de este tipo que ha sido bien estudiado es el que media el cambio en la sintesis de moleculas de anticuerpo, de unidas a la membrana a secretadas, durante el desarrollo de los linfocitos B. Muy pronto durante la vida de una celula B, el anticuerpo que produce dicha celula se ancla en la membrana plasmatica, y alIi actua como receptor del antigeno. La estimulaci6n por el antigeno hace que estas celulas se multipliquen y empiecen a secretar su anticuerpo. La forma secretada del anticuerpo es identica a la forma unida a la membrana, excepto en cuanto a su extrema carboxilo terminal. En el caso de la forma unida a la membrana, en este extremo la proteina tiene una larga cadena de aminoacidos hidrof6bicos que atraviesa la bicapa lipidica de la membrana, mientras que en el caso de la forma secretada, presenta una cadena mucho mas corta de aminoacidos hidrofi1icos. Por 10 tanto, el cambio de la forma unida a la membrana a la forma secretada requiere una secuencia diferente de nucle6tidos en el extremo 3' del mRNA; esta diferencia se consigue a traves del cambio en la longitud del transcrito primario de RNA causado por un cambio en el lugar de corte del RNA, como se describe en la Figura 9-78.

La definici6n de gen se ha de modificar debido al descubrimiento de la maduraci6n alternativa del RNA57 El descubrimiento de que habitualmente los genes eucariotas contienen intrones y de que sus secuencias codificantes se pueden unir de varias formas ha planteado nuevas cuestiones sobre la definici6n de 10 que es un gen. El gen fue definido por primera vez en terminos moleculares a principios de los afios 40, a partir del trabajo sobre genetica bioquimica del hongo Neurospora. Desde entonces, un gen ha sido definido operacionalmente como una regi6n del genoma que se segrega durante la meiosis como una sola unidad y que da lugar a un rasgo definible en terminos fenotipicos, tal como ojos rojos 0 blancos en Drosophila 0 semillas lisas 0 rugosas en los guisantes. Los trabajos en Neurospora mostraron que la mayoria de genes corresponden a una regi6n del genoma que dirige la sintesis de una sola enzima. Esto permiti6 enunciar la hip6tesis de que un gen codifica una cadena polipeptidica. La hip6tesis result6 ser extremadamente provechosa para la investigaci6n posterior; a medida que se iban descubriendo mas detalles sobre los mecanismos de la expresi6n genica, durante los afios 60, se fue identificando un gen como una porci6n de DNA que es transcrito en RNA y que codifica una sola cadena polipeptidica (0 un solo RNA estructural, como moleculas de tRNA 0 de rRNA). El descubrimiento de los genes partidos a finales de los afios 70 se pudo encajar facilmente en la definici6n original de gen a condicion de que se considerara que una cadena polipeptidica estuviera especificada por el RNA transcrito a partir de alguna secuencia de DNA. Sin embargo, ahora esta claro que muchas secuencias de DNA de las celulas de los eucariotas superiores producen dos 0 mas proteinas distintas mediante la maduraci6n alternativa del RNA. Entonces, lc6mo se tiene que definir un gen? En los casos relativamente raros en los que a partir de una sola unidad de transcripci6n se produzcan dos proteinas eucariotas muy diferentes, se considera que las dos proteinas est an codificadas por genes distintos que se solapan en el cromosoma. Sin embargo, parece complicar la cuesti6n de forma innecesaria el considerar que la mayoria de las proteinas modificadas producidas por maduracion alternativa del RNA derivan de genes solapados. Una alternativa mas razonable es la de modificar la definici6n original de gen y considerar como gen a cualquier secuencia de DNA que es transcrita como una unica unidad y que codifica un conjunto de cadenas polipeptidicas relacionadas Cisoformas proteicas). Esta definici6n de gen tambien comprende a aquellas secuencias de DNA que codifican variantes producidas por procesos post-transcripcionales diferentes a Controles post-transcripcionales

mosca macho

0

hembra

Figura 9-76 Determinaci6n del sexo en Drosophila. Los productos genicos que se muestran act11an en una cascada secuencial para determinar el sexo de una mosca de acuerdo con la relacion entre cromosomas Xy autosomas. Los genes se denominan sex-lethal (Sxl), transformer (tra) y doublesex (dsx) debido a los fenotipos

que resultan cuando son inactivados por mutacion. La funcion de estos productos genicos es transmitir la informacion acerca de la relacion cromosomas X/autosomas a los muchos otros genes que estan implicados en la generacion de los fenotipos relacionados con el sexo. Estos otros genes acttian como dos juegos alternativos: aquellos que especifican rasgos de hembra y aquellos que especifican los rasgos de macho (vease Figura 9-77).

487

",'.""':1;:"'"

lugar de corte

1II1II1II~oqueado

3' 3'

~

eel

proteIn a producida no funcional

lugar de corte regulado 3'

r:.

AI ~

proteina Sxl funcional

I~gar

~ ~

protelna producida no funcional

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proteina Tra

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'".""~. F'IM\\l!

protelna N Dsx L

400 aa

l

C

I

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REPRIME LOS GENES DE DIFERENCIACI6N DE HEMBRA

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REPRIME LOS GENES DE DIFERENCIACI6N DE MACHO

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DESARROLLO DE MACHO

DESARROLLO DE HEMBRA

la maduraci6n alternativa de RNA, tales como el desplazamiento de pauta en los ribosomas (ribosomal frameshifting), y la edici6n del RNA (RNA editing), que se describinin mas adelante.

EI transporte de RNA desde el m1cleo puede ser regulado58 Parece ser que un transcrito primario de RNA es al menos diez veces mas largo que la molecula de mRNA madura que se genera a partir de el por maduraci6n por corte y empalme del RNA. Se ha estimado incluso que s610 una veinteava parte aproximadamente de la masa total del RNA fabricado abandona el m1cleo celular. Por 10 tanto, parece que una fracci6n substancial de los transcritos primarios (quizas la mitad) pueden ser completamente degradados en el m1cleo sin lIegar a generar ninguna molecula de RNA que alcance el citoplasma. Los RNA descartados pueden ser aquellos a partir de cuya secuencia no se pueda fabricar ninguna molecula de mRNA; por otro lado, algunos RNA pueden representar moleculas potenciales de mRNA, funcionales unicamente en algunos tipos celulares, no lIegando en los otros a alcanzar el citoplasma. Esto puede conseguirse mediante su direccionamiento selectivo hacia la degradaci6n intranuclear, 0 porque se les bloquea selectivamente la salida del nucleo. A pesar de que existen pocas evidencias s6lidas para cualquiera de estos tipos de control, cada uno de ellos es una posibilidad real. En particular, se sabe que la exportaci6n de RNA a traves de los poros nucleares es un proceso activo que requiere en muchos casos que los RNA tengan una caperuza especial en el extrema 5' y una cadena poli-A en el extremo 3' (descrito en el Capftulo 8). Requerimientos de este tipo tienen sentido pues mantienen lejos del citoplasma una serie de moleculas de RNA desechables (como por ejemplo las secuencias 488

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

Figura 9-77 La cascada de cambios en la expresl6n de genes que determlnan el sexo de una mosca depende de la maduracl6n altematlva del RNA. Una relaci6n entre cromosomas Xy autosomas de 0,5 produce el desarrollo de un macho. Ser macho es la salida por "defecto" en la que ambos genes Sxl y tra se transcriben pero sus RNA son procesados constitutivamente para producir moIeculas de RNA no funcionales, y el transcrito dsx madura para producir una protefna que inactiva los genes que especifican los rasgos de hembra. Una relaci6n entre cromosomas Xy autosoma de 1 dispara la via de diferenciaci6n en el embri6n al activar temporalmente un promotor en el gen Sxl que controla la sfntesis de una protefna Sxl funcional. Sxl es una protefna reguladora de la maduraci6n con dos lugares de acci6n: (1) se une a un transcrito Sxl producido constitutivamente, produciendo una maduraci6n especffica de hembra que contribuye a la producci6n continua de una protefna Sxl funcional, y (2) se une al RNA de tra que se produce constitutivamente, produciendo una maduraci6n alternativa del transcrito, de forma que se produce una protefna reguladora Tra inactiva. La protefna Tra actda como la protefna constitutiva Tra-2 produciendo la forma de maduraci6n del RNA de dsx especffica de hembra; este codifica una forma femenina de la protefna Dsx, que inactiva especfficamente los rasgos masculinos. Los componentes de esta via fueron identificados inicialmente a traves del estudio de mutantes de Drosophila que tenfan alterado su desarrollo sexual. El gen dsx obtuvo su nombre (sexo doble 0 doublesex) de la observaci6n de que las moscas que carecen de este producto genico expresan rasgos tanto masculinos como femeninos. Observese que cuando tanto la protefna Sxl como Tra se unen a los lugares especfficos en el RNA, Sxl es un represor que actda negativarnente bloqueando un corte, mientras que Tra actda positivamente como activador que induce un corte (vease Figura 9-74).

el RNA se corta por el RNA se corta por aquf, dando lugar al aquf, dando lugar al transcrito corto transcrito largo punto de maduracf6n 5' punto de maduracf6n 3' (dador)! (sceptor)

I +

5'

I +

I

hid

f

3'

3'

5'

II

TRANSCRIPCION

_-----------------J

(

codon de para I dajOr

t

....

1 __--I

cod6n de para II

acelPtor

d,,:d6"

I

• • • • •I=::::]~C=J:. . . . . . 0.·.. . .AAAAAA (

l""

• • • • • •11:1=:J_I=:JIAAAAAA 3'

3'

(

no se elimfns Is secuencia intr6n porque se ha perdido la uni6n del aceptor de maduraci6n

secuencia intr6nica eliminada por procesamiento del RNA

.1IIIlI

codon de para II

1

I

• • • • • •IIt==:J·~I.~:::::JAAAAAA3'

3'

1

TRADUCCION

====:::I••••

COOH

TRADUCCION

:========••1-

I

peptido terminal hidrof6bico

intr6nicas eliminadas en el proceso de maduraci6n). Sin embargo, tener los extremos adecuados no es suficiente para el transporte: cada moltkula de mRNA permanece confinada en el m1cleo hasta que todos los componentes del espliceosoma se han separado de el (Figura 8-54). Asi pues, cualquier mecanismo que evite que se termine el proceso de maduraci6n del RNA puede, en principio, bloquear la salida de estos RNA del m1cleo.

Algunos RNA esbm localizados en regiones especificas del citoplasma59 Cuando una nueva molecula de mRNA eucariota pasa a traves de un poro nuclear y alcanza el citoplasma, se encuentra con ribosomas que 10 traducen en una cadena polipeptidica. Si la cadena de mRNA codifica una proteina que esta destinada ala secreci6n 0 a expresarse en la superficie celular, sera dirigida hacia el reticulo endoplasmatico (ER) por una secuencia senal situada en el extremo amino de la proteina; la secuencia senal sera reconocida por el mecanismo de dasificaci6n de proteinas de la celula en cuanto sea sintetizada. Este mecanismo direcciona todo el complejo, mRNA, ribosoma y proteina naciente, hacia la membrana del ER, donde se sintetizara el resto de la cadena polipeptidica, como se describe en el Capitulo 12. En los demas casos la proteina es sintetizada en ribosomas libres en el citoplasma, donde las senales presentes en la propia secuencia del polipeptido la pueden dirigir hacia otros compartimientos del interior de la celula. Ademas existen otros casos en los que los mRNA son dirigidos hacia posiciones intracelulares especificas por senales existentes en la propia secuencia de mRNA y antes de que sea traducida en una secuencia de aminoacidos. Estas seControles post-transcripcionales

h

cod6n de para I dador

• • • • • • • • •IILILI:, I·.•. AAAAAA

r'' " I

~

caOH

peptido hidrofilico terminal

Figura 9-78 La regulacl6n del punto de segnientaci6n del RNA y la adici6n de poll A determinan 811a molecwa de anticuerpo sera secretada 0 permanecera onida a la membrana. En los linfocitos B no estimulados (izquierda) se produce un largo transcrito de RNA; la secuencia intr6nica que se halla cerca de su extrema 3' es eliminada por maduraci6n del RNA dando lugar a una moIecula de mRNA que codifica una molecula de anticuerpo que se unira a membrana. Por el contrario, despues de la estimulaci6n por el antfgeno (derecha) el transcrito primario de RNA es cortado por delante dellugar de maduraci6n, junto a la secuencia del Ultimo ex6n. Como resultado de ello, algunas secuencias del intr6n que es eliminado del transcrito largo permanecen como secuencias codificantes en el transcrito corto. Estas son las secuencias que codifican la porci6n hidroffiica del extrema carboxilo terminal de la molecula de anticuerpo secretada.

489

nales se localizan generalmente en la region 3' no traducida (UTR) de la moIecula de mRNA -la regi6n comprendida entre el cod6n de paro de la traducci6n y el punto de inicio de la cadena poli-A (vease Figura 9-78). Un ejemplo notable de ello se produce en el huevo de Drosophila, en el que el mRNA que codifica la proteina genica bicoide se une al citoesqueleto cortical del extremo anterior del huevo en desarrollo. Cuando se dispara la traducci6n de este transcrito por la fecundaci6n, se genera un gradiente de la proteina bicoide que tendni un papel fundamental en el control del desarrollo de la parte anterior del embri6n (mostrado en la Figura 9-39 y descrito con mayor detalle en el Capitulo 21). Algunos mRNA de las celulas somaticas se situan de manera similar. Por ejemplo, en los fibroblastos de mamifero en cultivo, el mRNA que codifica actina se localiza en el c6rtex rico en filamentos de actina debido a una senal UTR 3', posiblemente debido a que es ventajoso para la celula situar los mRNA pr6ximos a los lugares en los que se van a necesitar las proteinas que codifican. Esta forma de control genico post-transcripcional, donde el mRNA se situa en una parte de la celula, se ha conocido recientemente y aun no esta claro cuantos mRNA se situan de este modo. En la Figura 9-79 se ilustra el papel de las UTR en ellocalizaci6n de los mRNA en regiones particulares del citoplasma.

La edicion del RNA puede cambiar el sentido del mensaje del RNA60 Los mecanismos moleculares utilizados por las celulas han sido una continua fuente de sorpresas. Un ejemplo de ello es el fen6meno de maduracion trans de RNA, que ocurre en todos los transcritos en tripanosomas (el protozoo parasito responsable de la enfermedad del sueno). Todos los mRNA de los tripanosomas poseen una secuencia lider 5' con caperuza que se transcribe aparte y que luego se anade al extrema 5' de los transcritos RNA mediante maduraci6n del RNA por corte y empalme de dos moIeculas inicialmente no relacionadas entre sf. Esta maduraci6n trans tambien se utiliza para anadir un lfder 5' a varios mRNA de los nematodos y para combinar los transcritos de RNA separados que forman la secuencia codificante de algunas proteinas de mitocondrias y cloroplastos en las celulas de las plantas. La maduraci6n por corte y empalme entre transcritos puede proporcionar un atajo para la evoluci6n de nuevas proteinas; los pocos casos que se conocen de uni6n de exones de este modo pueden ser remanentes evolutivos de un proceso mas extenso que predomin6 en las celulas ancestrales.

regi6n reguladora de Drosophila

gen bacteriano para UTR 3' l3-galactosidasa a estudiar (gen lacZl ,-------,

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _••

SECUENCIA DE DNA RECOMBINANTE INSERTADA EN EL GENOMA DE DROSOPHILA transcrito de RNA sonda complementaria empleada para la hibridaci6n

(A)

in situ tres posibles destinos para la localizaci6n de mRNA en las celulas epiteliales de un embri6n temprano de Drosophila apical

I

basal

(B)

490

UTR 3' deslocalizada

UTR 3' basal

•

UTR3' apical

(C)

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

Figura 9-79 Importancia de la UTR en la localizaci6n de mRNA en regiones especfflcas del citoplasma. Drosophila puede ser transfectada con una molecula de DNA recombinante que codifica un mRNA en el que una secuencia marcadora bacteriana (codificando ~-galactosidasa) esta unida a una secuencia UTR 3' escogida. De acuerdo con la eleccion de la UTR 3', en las celulas embrionarias el mRNA puede estar deslocalizado, localizado en su region basal 0 en su region apical. (A) La molecula de DNA recombinante utilizada para analizar los efectos de los diferentes UTR 3'. (B) La hibridacion in situ (para las secuencias de ~-galactosidasa)muestra que la region UTR 3' determina la localizacion del mRNA en la celula embrionaria. (C) Fotograffa de un mRNA localizado apicalmente detectado por hibridacion in situ. Las celulas que contienen este mRNA estan organizadas en franjas a 10 largo del eje del embrion (C, cortesfa de David Ish-Horowitz).

Otro mecanismo sorprendente es el proceso denominado edicion del RNA que altera enormemente los transcritos de RNA. En este proceso, descubierto en transcritos que codifican proteinas en las mitocondrias de los tripanosomas, se insertan uno 0 mas U (0 se eliminan, aunque con menor frecuencia) en regiones seleccionadas del transcrito, provocando grandes modificaciones tanto en la pauta de lectura original como en la secuencia, con 10 que cambia el sentido del mensaje. En el caso de algunos genes, la edici6n es tan extensa que mas de la mitad de la secuencia son nucle6tidos U que se han insertado durante el proceso de edici6n. La informaci6n que especifica exactamente c6mo se ha de editar el transcrito inicial de RNA esta contenida en las moleculas de RNA de 40 a 80 nucle6tidos de longitud que se transcriben por separado. Los denominados RNA guia tienen un extremo 5' que es complementario en secuencia a un extremo de la regi6n del transcrito que se ha de editar; a continuaci6n existe una secuencia que especifica el conjunto de nucle6tidos que se han de insertar en el transcrito y posteriormente una serie continua de nucle6tidos U. El mecanismo de edici6n es sorprendentemente complejo, transfiriendo los nucle6tidos U del extrema 3' del RNA guia directamente al transcrito, tal como se ilustra en la Figura 9-80. Tambien se ha encontrado edici6n extensa de secuencias de RNA en las mitocondrias de muchas plantas, de modo que casi cada mRNA se edita de una forma u otra. Sin embargo, en este caso las bases se cambian de C a U en el RNA, sin inserciones ni deleciones de nucle6tidos. Frecuentemente muchas de las C presentes en la molecula de mRNA estan afectadas por la edici6n, cambiandose elIO % 0 mas de los aminoacidos que codifica el mRNA. S610 podemos especular acerca de las razones que justifican que el tripanosoma 0 las mitocondrias de plantas hagan un uso tan extenso de la edici6n del RNA. Las sugerencias que parecen mas razonables parten de la premisa de que el sistema genetico mitocondrial es primitivo. Existen evidencias de que la edici6n esta regulada de forma que se produzcan diferentes mRNA en diferentes condiciones, de modo que la edici6n del RNA deberfa entenderse como una forma primitiva de cambiar la expresi6n de los genes. Los tripanosomas son euca-

c::

3'

~---------5'

RNAguia 2

-L--3'

cola poli-U

5

'

RNAguia 1

--------~~""'!"'!'~~~~-3' IIIIIIIIII

~j

APAREAMIENTO CON EL RNA GU[A 1

lugares con nucle6tidos U ausentes

5'----------__

C--""-J ~

nucle6tidos en el RNA guia especificando nucle6tidos U ausentes

3

'L

5'

"""'!"'!"""!'~-- .........

3'

EDICION SEGUIDA POR EL APAREAMIENTO AL RNA GU[A 2

1 l~5'

Figura 9-80 Edlci6n del RNA en la mltocondrla de los trlpanosomas. Los RNA guia tienen en su extremo 3' una serle de poly U, que ceden los nucle6tidos U a determinados lugares del transcrito de RNA que no se aparean con el RNA guia; asi la cola poly-U se va acortando a medida que se va produciendo la edici6n del RNA (no se muestra). La edici6n se inicia generalmente cerca del extremo 3' Y progresa hacia el extrema 5' del transcrito de RNA, como se muestra, debido a que la "secuencia de anclaje" en el extrema 5' de muchos RNA guia puede aparearse s6lo can las secuencias editadas.

5'----------i~!""1'!"I~1~1~1--------3'

t

EDICION

nucle6tidos U insertados

5'---------------~-3' Controles post-transcripcionales

491

riotas unicelulares muy antiguos que se separaron muy pronto de la linea evolutiva que conduce a las plantas, a los animales y a las levaduras (vease Figura 116). Posiblemente, la versi6n extremada de la edici6n del RNA que tiene lugar en sus mitocondrlas es un rasgo de las celulas primitivas de las que procede, en las cuales es probable que la mayor parte de la catalisis fuera realizada por moleculas de RNA en vez de por proteinas. La edici6n del RNA, en una versi6n mucho mas reducida, tambien se produce en los mamfferos. El primer caso descrito corresponde al gen de la apolipoprotefna B, en el que el proceso de edici6n del RNA crea dos tipos de transcritos: en uno de enos el cambio de C por U crea un cod6n de paro que produce una forma truncada de esta proteina de gran tamafio, y que se expresa de forma especffica de tejido. En otro caso un cambio en el centro de la molecula de mRNA cambia un solo aminmicido en un canal i6nico del cerebro, alterando la permeabilidad del canal al Ca2+. En el caso de la apolipoproteina B la edici6n se realiza de una forma muy directa: una protefna se une a una secuencia especffica del mRNA y cataliza la desaminaci6n de C aU. Se desconoce si en los otros casos de edici6n del RNA en mamfferos y plantas este proceso esta catalizado por protefnas en esta misma forma, 0 si se utilizan cortos moldes de RNA como en tripanosomas. A continuaci6n describimos los controles que actlian sobre la traducci6n de los mRNA a protefnas.

Las celulas eucariotas y procariotas utllizan estrategias diferentes para especificar ellugar de inicio de la traducci6n en una molecula de mRNA61 En el mRNA de bacterias siempre se encuentra, unos cuantos nucle6tidos por delante del cod6n de inicio AUG, una secuencia de seis nucle6tidos muy conservada, la secuencia Shine-Dalgarno. Esta secuencia se aparea con el RNA 16S de la subunidad ribos6mica pequena situando correctamente el cod6n de iniciaci6n AUG en el ribosoma. Esta interacci6n es muy importante para una buena eficiencia de iniciaci6n y aporta a la celula bacteriana un mecanismo sencillo para regular la sintesis de proteinas. Muchos de los mecanismos de control traduccional en bacterias suponen el bloqueo de la secuencia Shine-Dalgarno, ya sea cubriendola con una protefna unida 0 bien incorporandola en una regi6n de apareamiento de bases en la molecula de mRNA. Los mRNA de eucariotas no contienen secuencias Shine-Dalgarno. En su lugar, la selecci6n de un cod6n AUG como inicio de la traducci6n viene determinada fundamentalmente por la proximidad al extremo caperuza 5' de la molecula de mRNA, que es ellugar por el que la subunidad ribos6mica pequena se une al mRNA e inicia la busqueda de un cod6n de inicio AUG (descrito en el Capftulo 6). Los nucle6tidos que rodean inmediatamente ellugar de inicio de la traducci6n tambien influyen en la eficiencia con que sera reconocido el cod6n AUG durante el proceso de busqueda. Si este lugar de reconocimiento es suflcientemente debil, las subunidades ribos6micas buscadoras ignoraran el primer cod6n AUG y podran escoger el segundo cod6n AUG en su lugar. Este fen6meno, denominado barrido impreciso Oeaky scanning) es una estrategia empleada frecuentemente para producir dos 0 mas protefnas a partir del mismo mRNA, que difieran en su extremo amino terminal. Por ejemplo, permite a algunos genes producir la misma protefna con y sin peptido senal unido a su extremo amino, de forma que la misma proteina se pueda dirigir ados compartimientos celulares diferentes. Otra importante diferencia entre la traducci6n procariota y eucariota es que los ribosomas eucariotas se disocian rapidamente del mRNA cuando termina la traducci6n. Asf, la reiniciaci6n en un cod6n AUG intemo de una pauta de lectura abierta es mucho menos eficiente en eucariotas que en procariotas. Juntando estas dos diferencias -la busqueda que se realiza a partir del extrema 5' y la capacidad limitada que tienen de empezar la traducci6n a partir de un cod6n AUG 492

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

metionil-tRNA iniciador

e1F-2 activo

mRNA

subunidad ribos6mica 605

.---Lf

Pi subunidad ribos6mica 405

e1F-2 inactivo

intemo- se podrfa explicar por que la inmensa mayona de los mRNA eucariotas codifican una Unica proteina y por que habitualmente el primer cod6n AUG desde el extremo 5' es ellugar de inicio de la traducci6n. Unos cuantos mRNA eucariotas y viricos inician su traducci6n mediante un mecanismo ligeramente diferente que supone la iniciaci6n en el interior mas que una busqueda a partir del extremo. Estos mRNA contiene secuencias nucleotidicas complejas, denominadas lugares de entrada del ribosoma internos, donde se unen los ribosomas independientemente de la estructura caperuza 5', iniciando la transcripci6n en el primer cod6n AUG que encuentran. Los detalles de este mecanismo son desconocidos.

Figura 9-81 El papel de eIF-2 en la iniciaci6n de la sintesis de proteinas.

La fosforilaci6n de un factor de iniciaci6n

regula la sintesis de proteinas62 Las celulas eucariotas reducen su velocidad de sintesis de proteinas en respuesta

a una gran variedad de situaciones, que incluyen la carencia de factores de crecimiento, la infecci6n por virus, el choque termico y la entrada en la fase M del cido celular. Se cree que la mayor parte de esta regulaci6n es responsabilidad del factor de iniciaci6n eIF-2, el cual es fosforilado por proteina quinasas especificas, 10 que reduce la velocidad de sintesis de proteinas. En la Figura 9-81 se esquematiza la funci6n normal de eIF-2. Esta proteina forma un complejo con GTP e interviene en la uni6n del metionil-tRNA iniciador a la subunidad ribos6rnica pequefia, que a su vez se unira al extrema caperuza 5' y comenzara el barrido a 10 largo del mRNA. Cuando se reconoce el cod6n AUG, el GTP unido se hidroliza a GDP por acci6n de la proteina eIF-2, provocandose un cambio conformacional de esta y liberandose de la subunidad ribos6rnica pequefia. En ese momenta se une una subunidad ribos6rnica grande formando un ribosoma completo capaz de iniciar la sintesis de proteinas. Debido a que e1F-2 se une fuertemente a GDP, es necesaria la acci6n de una proteina de liberaci6n del nucle6tido de guanina (vease Figura 15-50), denominada eIF-2B, para liberar el GDP de forma que e1F-2 pueda unir una nueva molecula de GTP y ser reutilizada (Figura 9-82A). La reutilizaci6n del e1F-2 no es posible cuando esta fosforilado, pues en ese caso la uni6n de e1F-2 y eIF-2B es especialmente fuerte, 10 que impide que se realice el intercambio de nucle6tidos. En una celula existe mucha mas cantidad de e1F-2 que de eIF-2B, de forma que incluso una pequefia fracci6n de e1F-2 puede atrapar a casi todo el eIF-2B accesible, con 10 cual se evitarfa la reutilizaci6n incluso del e1F-2 no fosforilado, 10 que reduce en gran medida la sintesis de proteinas (Figura 9-82B). Cuando se reduce la actividad de un factor general de traducci6n, como elF2, sena de esperar una reducci6n de la traducci6n de todos los mRNA por igual. Sin embargo, al contrario de 10 esperado, la fosforilaci6n de e1F-2 tiene efectos Controles post-transcripcionales

493

protefna liberadora de nucle6tido guanina, eIF-2B

e1F-2 inactivo

•

(

e1F-2 activo

Figura 9-82 El cicio de eIF-2. (A) El reciclaje del factor e1F-2 mediante una enzima liberadora del nucle6tido de guanina (eIF-2B). (B) La fosforilaci6n de e1F-2 controla la sintesis de proteinas al secuestrar eIF-2B.

( A)

eIF-2B

t

e1F-2 inactivo

~

•

~ PROTEfNA

•

QUINASA FOSFORILA e1F-2

(B)

GOP

I

e1F-2 FOSFORILADO SECUESTRA TODO EL eIF-2B, FORMAN DO UN COMPLEJO INACTIVO

selectivos, y se observa incluso activaci6n de la traducci6n de mRNA especificos. Por ejemplo, este mecanismo permite a las levaduras adaptarse al ayuno de ciertos nutrientes, mediante la reducci6n de la sintesis de todas las proteinas excepto de aquellas que se necesitan para la sintesis de los nutrientes ausentes. Los detalles de este proceso se han estudiado en un mRNA especifico de levaduras que codifica una proteina denominada GCN4, proteina reguladora necesaria para la activaci6n de muchos genes que codifican proteinas importantes para la sintesis de aminoacidos. La proteina GCN4 se produce por una activaci6n especifica de la traducci6n de su mRNA producida por una deficiencia de aminoacidos en el medio, inducida por la fosforilaci6n de eIF-2. La reducci6n de la actividad de eIF-2 produce un aumento de la sintesis de la proteina GCN4 por un mecanismo complejo basado en la competici6n entre lugares de inicio de traducci6n correctos e incorrectos cerca del extrema 5' del mRNA de GCN4. La regulaci6n del nivel de eIF-2 tambien es importante para las celulas de mamifero como parte del mecanismo por el cual pueden ser inducidas a entrar en un estado estable no proliferativo (denominado Go) en el que la velocidad de sintesis de proteinas de reduce a alrededar de una quinta parte de la velocidad habitual en las celulas proliferantes (descrito en el Capitulo 17).

Las proteinas que se unen a la regi6n 5' lider de los mRNA intervienen en el control traduccional negativ063 Algunas moleculas de mRNA yen bloqueada su traducci6n par protefnas represoras de fa traducci6n que se unen al extrema 5' del mRNA cerca del extremo, donde deberia iniciarse la traducci6n. Este tipo de mecanismo se denomina control traduccional negativo (Figura 9-83). Fue descubierto por vez primera en mRNA

Figura 9-83 Control traduccional negativo. Esta forma de control es ejercida por una proteina de uni6n a una secuencia especifica de RNA que actua como un represor de la traducci6n. La uni6n.de la proteina a una molecula de mRNA reduce la velocidad de traducci6n de este mRNA. Se conocen algunos casos de este tipo de control traduccional; la ilustraci6n se refiere al mecanismo que induce la sintesis de ferritina (una proteina de almacenamiento de hierro) cuando la concentraci6n de hierro libre en el citosol se reduce; la proteina represora de la traducci6n sensible a los niveles de hierro se denomina aconitasa (vease tambien Figura 9-86).

494

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

5'..R AUG

!

HzN

PARO ~ '3' COOH ACTIVO .

protefna PARO 5'

AUG

~

no se sintetiza proteina protefna represora de la traducci6n

3' INACTIVO

LA ESTABILIDAD DE LOS mRNA NATURALES

5' 5'

secuencia codificante 3' UTR i 1'-' AAA3' AAA 3'

5'--------lS3'

mRNA de globina

ESTABLE

> 10 horas

~

mRNA de factor INESTABLE de crecimiento mRNA de histona

LASfNTESIS DEL DNA MODUlASU ESTABILIDAD

30 minutos 1 hora cuando la celula esta sintetizando DNA. pero 12 minutos cuando la celula no sintetiza DNA

bacterias en las que permite a las proteinas ribos6micas presentes en exceso reprimir la traducci6n de sus propios mRNA -constituyendo un mecanisme de regulaci6n par retroalimentaci6n negativa. En las celulas eucariotas una forma de control negative traduccional particularmente bien estudiada permite que la sintesis de la proteinaferritina, de almacenamiento de hierro, se ajuste nipidamente al nivel de iones de hierro solubles. La regulaci6n par hierro depende de una secuencia de aproximadamente 30 nucle6tidos en la secuencia lider 5' de la molecula de mRNA de la ferritina. Este elemento de respuesta al hierro se pliega formando una estructura en forma de bucle que se une a una proteina represora de la traducci6n denominada aeonitasa, que bloquea la traducci6n de cualquier secuencia de RNA que se encuentre par detnis (vease Figura 9-83). La aconitasa es una proteina que une hierro y la exposici6n de la celula al hierro produce su disociaci6n del mRNA de la ferritina, liberando el bloqueo de la traducci6n e incrementando la producci6n de ferritina hasta 100 veces.

Figura 9-84 Establlidad del RNA. Tres RNA distintos con vidas medias muy diferentes. La degradaci6n continua y nipida de las moltkulas de mRNA que codifican varios factores de crecimiento permite que su concentraci6n vade con rapidez en respuesta a senales extracelulares. La vida media del RNA del factor de crecimiento viene determinada por una senal, que condiciona su nipida degradaci6n, en la regi6n 3' no traducida (UTR 3') (vease Figura 9-85). Las histonas son necesarias especialmente para construir la nueva cromatina formada durante la sfntesis del DNA; un cambio notable en su estabilidad ayuda a confinar la sfntesis de histonas ala fase Sdel cicio celular.

La expresi6n genica puede estar controlada por variaciones de la estabilidad del mRNA64 La mayoria de los RNA de una celula bacteriana son muy inestables: tienen un periodo de vida media de aproximadamente 3 minutos. Debido a que los mRNA bacterianos se sintetizan y degradan con rapidez, las bacterias pueden adaptarse nipidamente a los cambios ambientales. Los mRNA de las celulas eucariotas son mas estables. Algunos, como los que codifican la ~-globina, tienen un periodo de vida media de mas de 10 horas. Sin embargo, otros tienen un periodo de vida media de menos de 30 minutos. A menudo, los mRNA inestables codifican proteinas reguladaras, tales como factores de crecimiento y proteinas de regulaci6n genica, cuyos niveles cambian nipidamente en las celulas (Figura 9-84). Muchos de estos mRNA son inestables debido a que contienen secuencias especificas que estimulan su degradaci6n. Por ejemplo, cuando mediante tecnicas de DNA recombinante se transfiere la secuencia larga rica en nucle6tidos A y U en la regi6n 3' no traducida (UTR) de algunos mRNA inestables, a otros mRNA estables, estos se vuelven inestables. Esta secuencia rica en AU parece acelerar la degradaci6n del mRNA estimulando la eliminaci6n de la cola poli-A que se encuentra en el extremo 3' de muchos mRNA eucariotas. Contrariamente, otros mRNA inestables contienen lugares de reconacimiento para endonucleasas especificas que cartan el mRNA en sus regiones UTR 3' (Figura 9-85). La estabilidad de un mRNA puede cambiar en respuesta a senales extracelulares. Asi par ejemplo, las harmonas esteroideas afectan a una celula no s610 incrementando la transcripci6n de determinados genes sino tambien incrementando la estabilidad de varios de sus mRNA. Por el contrario, la adici6n de iones hierro a las celulas reduce la estabilidad del mRNA que codifica la proteina receptara que se une a la proteina de uni6n al hierro transferrina, con 10 que se reduce la producci6n del receptor. Parece ser que la desestabilizaci6n del mRNA del receptor de transferrina esta mediada par la misma proteina de uni6n al Controles post-transcripcionales

495

DOS MECANISMOS EUCARIOTAS PARA LA DEGRADACI6N DEL mRNA

5'

I

secuencia codificante 3' UTR Ii I mil 1ji!§!li\\l1AAAAA 3'

5'

II'

L...J

l l

secuencia rica en AU P=::IIlI\\'IIlA 3'

5'

5'

degradaci6n

Mill

Figura 9-85 Control de la degradaci6n del RNA. Determinadas secuencias especiales en la regi6n 3' no traducida (UTRl de los mRNA inestables son las responsables de su nipida degradaci6n. Como se ha indicado, las secuencias ricas en AU que se encuentran en las UTR 3' de muchos mRNA de vida carta son las responsables de la eliminaci6n nipida de la cola poli-A, 10 que hace inestable aI mRNA. Otros mRNA contienen secuencias en su UTR 3' que actl1an como lugares de corte para endonudeasas especificas.

AAAAA 3'

AAAAA 3'

degradaci6n

una secuencia de 50 nucle6tidos rica en AU y conservada evolutivamente en la regi6n UTR 3' favorece la eliminaci6n de la cola poli-A, 10 que hace que el mRNA sea inestable

una secuencia repetida en la secuencia UTR 3' permite el corte de la regi6n UTR 3' por una endonucleasa especffica. Los fragmentos son degradados con rapidez

RNA que controla la traducci6n del mRNA de la ferritina. En este caso, la aconitasa se une ala UTR 3' del mRNA del receptor de transferrina provocando un incremento en la producci6n de receptor, probablemente al impedir la acci6n de secuencias que, de otra manera, activarian la degradaci6n del mRNA. Cuando se afiade hierro la aconitasa es liberada del mRNA con 10 que se reduce la estabilidad de este (Figura 9-86).

La degradaci6n selectiva del mRNA esta acoplada a la traducci6n65 El control de la estabilidad del mRNA en celulas eucariotas se comprende mejor para el caso de los mRNA que codifican histonas. Estos mRNA tienen una vida media de aproximadamente 1 hora durante la fase S del cielo celular (cuando se necesitan nuevas histonas) pero se degradan en cuesti6n de minutos cuando se detiene la sfntesis de DNA. Si se inhibe la sfntesis de DNA con una droga durante la fase S, los mRNA de las histonas se vuelven inestables inmediatamente, quizas porque la acumulaci6n de histonas libres en ausencia de DNA que unir aumenta la velocidad de su degradaci6n. La regulaci6n de la estabilidad de las histonas depende de un corto tallo y un buele 3' que reemplaza la cola poli-A del extremo 3' de otros mRNA (vease figura 9-84). Despues de que el mRNA de las histonas se haya sintetizado por la CARENCIA DE HIERRO aconitasa citos61ica

aconitasa citos61ica

5'_...,.....

mRNA de ferritina

~

AAA 3'

mRNA del receptor de transferrina 5' . . iliiiiiiiiiiiiiiiil

~

bloqueo de la traducci6n

_

AAA3'

el mRNA es estable y se traduce

SE SINTETIZA RECEPTOR DE TRANSFERRINA

EXCESO DE HIERRO

mRNA del receptor mRNA de ferritina

5'

5,IIIIIIIIIIIide . .transferrina .iiiiliiiii..._ _

••

~ el mRNA se degrada

--- - AAA 3' ~ el mRNA se traduce SE SINTETIZA FERRITINA (A)

496

:~"'.I_

AAA3'

...

ll_!._l_ _I!I._ccCc'~"'w'c

~!:. .~ i i _ - = = (B)

Capitulo 9 : EI control de la expresi6n genica

i

Figura 9-86 Dos controles posttraduccionales controlados par hIerro. En respuesta a un incremento en la concentraci6n citos6lica de hierro, una celula aumenta su sfntesis de ferritina para unir el hierro extra (Al y reduce la sfntesis de receptores de transferrina para reducir la importaci6n de hierro (B). Ambas respuestas estan mediadas por la misma protefna reguladora de respuesta aI hierro, la aconitasa, que reconoce rasgos comunes en las estructuras en tallo y bude de los mRNA que codifican la ferritina y el receptor de transferrina. Cuando la aconitasa une hierro, se disocia del mRNA. Debido a que el receptor de transferrina y la ferritina estan reguladas por diferentes tipos de mecanismos, sus niveles responden de forma opuesta a las concentraciones de hierro, a pesar de estar regulados par la misma protefna sensible aI hierro. (Adaptado de M.W. Hentze et aI., Science 238: 1570-1573, 1987; J.L. Casey et aI., Science, 240: 924-928, 1988.)

RNA polimerasa II, una reacci6n de segmentaci6n especial, que requiere un apareamiento de bases con un pequeno RNA de una particula ribonucleoproteica crea este extremo 3'. Si por metodos de DNA recombinante se transfiere este extrema 3' a otros mRNA, tambien se vuelven inestables cuando se para la sintesis de DNA. Por 10 tanto, como ocurre en otros tipos de mRNA, la velocidad de degradaci6n esta fuertemente influida por senales pr6ximas al extremo 3', donde se cree que empieza la degradaci6n del RNA. Si en medio de una secuencia codificante de un mRNA de una histona se inserta un cod6n de paro, el mRNA ya no se degrada rapidamente. Por 10 tanto se ha sugerido que la nucleasa responsable de la degradaci6n de los mRNA se une al ribosoma y que la mayor parte del mRNA de la histona ha de ser traducido antes de que la nucleasa pueda empezar a digerir el extrema 3' del mRNA. Esta hip6tesis podria explicar por que la mayona de los mRNA inestables se estabilizan selectivamente cuando las celulas se tratan con el inhibidor de la sintesis proteica cicloheximida. El acoplamiento de la degradaci6n del mRNA a la traducci6n puede ser un mecanisme para asegurar que las moleculas de mRNA recien sintetizadas en una celula eucariota no sean destruidas hasta que se hayan traducido al menos una vez.

EI control citoplasmatico de la longitud de las cadenas de poli-A puede afectar tanto ala traducci6n como ala estabilldad del mRNA66 La poliadenilaci6n inicial de una molecula de RNA (descrita en el Capitulo 8) tiene lugar en el mlcleo aparentemente de forma automatica para casi todos los precur': sores de mRNA eucariotas (siendo una excepci6n los mRNA de las histonas descritos previamente). Una vez en el citoplasma,las colas poli-A de 200 nucle6tidos de longitud de muchos transcritos, son recortadas paulatinamente durante algunos dfas. No se han observado colas poli-A mas cortas de 30 residuos A, 10 que sugiere que esta sena la longitud minima necesaria para la estabilidad del mRNA. Asimismo, la longitud de algunas colas poli A esta controlada especfficamente, bien por adici6n selectiva de poli-A bien por eliminaci6n selectiva de poli A (Figura 9-87A). Docitos y huevos en maduraci6n constituyen un ejemplo notable de control de la expresi6n genica mediante adici6n de poli A a mRNA especfficos. En estas celulas gigantes parecen estar inactivas muchas de las vias de degradaci6n de mRNA, de forma que las celulas puedan fabricar grandes cantidades de mRNA como preparaci6n para la fertilizaci6n. Muchos de los mRNA se almacenan con

l l

mRNA

Figura 9-87 EI control de la longitud de la cola poH-A afecta tanto ala estabUidad como ala traducci6n del mRNA. (A) la mayoria de los mRNA tiene colas poH-A que exceden la longitud minima de 30 residuos A. Las colas de determinados mRNA pueden alargarse 0 cortarse especfficamente en el citosol, 10 cual influye en la traducci6n de estos mRNA. (B) Se ha propuesto un modelo para expHcar la estimulaci6n de la traducci6n que se observa al incrementar la longitud de la cola poH-A. Las subunidades ribos6micas grandes pueden ser recicladas directamente, una vez han acabado la cadena proteica, desde cerca del extremo 3' de una molecula de mRNA al extrema 5' para iniciar de nuevo la sintesis de una molecula de proteina, por proteinas especiales de uni6n a la secuencia poH-A (rojo). subunidad ribos6mica pequena en el cod6n de iniciaci6n

corte y adici6n de la cola pol i-A

alargamiento de la cola poli-A

NUCLEO

--_.....)

(~------­

CITOSOL

, tt ,

conjunto de mRNA traducibles

subunidad ribos6mica grande LAS PROTEfNAS UNIDAS A LA COLA POLl-A CATALIZAN LA ENTRADA DE LA SUBUNIDAD RIBOSCMICA GRANDE

perdida gradual de poli-A de todos los mRNA

J

...

l ...... .,.

degradaci6n rapida de mRNA

(A)

Controles post-transcripcionales

(B)

inicio de la traducci6n por el ribosoma completo

497

colas poli-A de s610 10 a 30 residuos A en sus extremos 3' yen esta forma no se traducen. En ciertos momentos del desarrollo, cuando son necesarios los productos codificados por estos mensajeros, se les anade poli A al extrema 3', 10 que estimula notablemente la iniciaci6n de su traducci6n. En la Figura 9-87B se explica c6mo la adici6n de poli A al extremo 3' puede afec:tar al inicio de la traducci6n pr6ximo al extrema 5' del mRNA.

Algunos mRNA contienen sefiales de reconocimiento que interrumpen el proceso normal de la traduccion67 Los controles traduccionales descritos hasta el momenta afectan la velocidad con la cual se inician las nuevas cadenas de protefna sobre una molecula de RNA. Normalmente, la traducci6n, una vez se ha iniciado, llega automaticamente hasta el final, Sin embargo, existen casos especiales, en los que por un proceso denominado recodificaci6n traduccional se puede modificar la protefna que finalmente se produce. La forma de recodificaci6n observada con mayor frecuencia es la de cambio de pauta de lectura traduccional. Este tipo de recodificaci6n es muy frecuente en retrovirus, permitiendoles sintetizar mas de una protefna a partir de un mismo mRNA. Estos virus suelen producir tanto las protefnas de la capside (proteinas Gag) como la transcriptasa inversa y la integrasa (proteinas Pol) a partir del mismo transcrito de mRNA. Los virus necesitan muchas mas copias de la protefna Gag que de la protefna Pol, y muchos de ellos consiguen ajustar sus producciones relativas teniendo los genes gagy pol en pautas de lectura diferentes, con un cod6n de para al final de las secuencias codificantes de gag que puede ser eliminado por un cambio de pauta de lectura traduccional poco frecuente. El cambio de pauta de lectura ocurre exclusivamente en un cod6n particular y requiere una senal de recodificaci6n, que parece que es un rasgo estructural de la secuencia de RNA siguiente a este lugar (Figura 9-88) Principios similares a este se utilizan en algunas otras formas de recodificaci6n en lugares especfficos del mRNA. Asf pues, se han descrito senales de recodificaci6n que provocan un cambio de pauta de lectura de +1 en lugar del-l que actua en los RNA viricos y que se muestra en la Figura 9-88. En otras ocasiones la secuencia nucleotfdica que rodea al cod6n de paro 10 hace ser debil, de forma que se afiaden aminoacidos adicionales al final de la cadena polipeptfdica. Mas sorprendente aun es el mecanisme descubierto recientemente que inserta el aminoacido modificado selenocisteina en una cadena proteica. La selenocistefna, que es esencial para la funci6n de algunas enzimas, contiene un Momo de selenio en lugar del atomo de azufre de la cistefna y se encuentra unida a una molecula de tRNA especial. El tRNA tiene afinidad hacia una senal de recodificaci6n presente en las moleculas de mRNA que codifican protefnas que utilizan selenocistefna. La selenocistefna se incorpora en codones UGA especiales, que en muchos otros casos podrfan haber servido como codones de paro deteniendo la sfntesis de protefnas.

SIN CAMBIO DE PAUTA DE LECTURA (90% de los ribosomas)

498

CAMBIO DE PAUTA DE LECTURA (10% de los ribosomasl

Capitulo 9 : El control de la expresi6n genica

Figura 9-88 El cambio de pauta de lectura traduccional es necesario para producir la transcriptasa inversa y la integrasa de un retrovirus. La transcriptasa inversa virica y la integrasa se producen por el corte de la gran protefna de fusi6n Gag-Pol, mientras que las protefnas de la capside del virus se producen a partir del corte de la protefna Gag, mas abundante. Tanto la protefna Gag como la protefna de fusi6n se inician en el mismo punta, pero la protefna Gag termina en un cod6n de para de la misma pauta de lectura (no mostrado); el cambia de pauta de lectura indicado elimina este cod6n de paro, permitiendo la sfntesis de la protefna de fusi6n mas larga. EI cambia de pauta de lectura ocurre debido a que ciertos rasgos de la estructura local'del RNA (induyendo un bude de RNA que no se muestra) hacen que el tRNALeu unido aI extrema carboxilo del polipeptido en crecimiento se deslice un nude6tido hacia atras sobre el ribosoma, de modo que ya no se aparea can el cod6n UUA que ha especificado su incorporaci6n, sino can el cod6n UUU; el siguiente cod6n en la nueva pauta de lectura (AGG) especifica una arginina en lugar de una glicina. La secuencia que se muestra procede del virus del SIDA, HIV. (Adaptado de T. Jacks et aI., Nature 331: 280-283, 1988.)

cola

3'

EL RNA I REGULADOR SE UNEALRNAII ELRNAIY EL RNA II FORMAN UNA HELICE PERFECTA

3'

RNAI

forma activa del RNA II

Es muy probable que las reacciones catalizadas por RNA tengan un origen muy antiguo 68 Todos los mecanismos de control post-transcripcional descritos en esta secci6n dependen de que una determinada molecula de RNA sea reconocida especfficamente para un tratamiento especial, como la maduraci6n edici6n 0 degradaci6n. En algunos casos este reconocimiento esta realizado por proteinas especializadas de uni6n al RNA. Sin embargo, en otros casos, el reconocimiento de secuencias de RNA especfficas es nevado a cabo por otras moleculas de RNA que utilizan el apareamiento RNA-RNA como parte de su mecanismo de reconocimiento. Por ejemplo, se sabe que los apareamientos RNA-RNA juegan un papel importante en la traducci6n, en la maduraci6n del RNA en otras formas de procesamiento del RNA y en la edici6n del RNA que tiene lugar en tripanosomas. Intentando diseccionar los mecanismos de control post-transcripcional se ha entrado de neno en el mundo del RNA. Las moleculas de RNA tienen otros papeles reguladores en la celulas. La estrategia del RNA antisentido para la manipulaci6n experimental de celulas consiste en impedir que las celulas expresen un gen determinado (vease pag. 350) mimetizando un mecanismo normal del que se sabe que regula la expresi6n de algunos genes seleccionados en bacterias, y puede ser que la celula 10 utilice mas ampliamente de 10 que hasta ahora se habia creido. Un ejemplo bien conocido de este tipo de mecanismo es el que forma el control por retroalimentaci6n de la iniciaci6n de la replicaci6n del DNA de una gran familia de plasmidos de DNA bacterianos. Este controllimita el numero de copias de plasmido que una celula puede contener, evitando que el plasmido mate a la celula por un exceso de replicaci6n (Figura 9-89). Los estudios de las reacciones catalizadas por el RNA son de un gran interes desde el punto de vista evolutivo. Tal como describimos en el Capitulo 1, parece que las primeras celulas carecfan de DNA y podrian haber contenido pocas 0 ninguna proteina. Muchas de las reacciones catalizadas por RNA parecen ser f6siles moleculares -descendientes de la compleja red de reacciones catalizadas por RNA que se cree dominaron el metabolismo hace 3,5 mil millones de afios. La tecnologia del DNA recombinante ha permitido que, utilizando RNA polimerasas, se puedan producir in vitro grandes cantidades de RNA puros de una secuencia determinada cualquiera (vease Figura 7-36), haciendo posible estudiar la quimica detallada de las reacciones catalizadas por RNA. A partir de la comprensi6n de muchas de estas reacciones, los bi610gos tienen la esperanza de ser capaces de trazar la via por la cual evolucion6 la primera celula viva.

forma inactiva del RNA II

Figura 9-89 Estrategia del RNA antisentido para regular el munero de phismidos en una bacteria. La interacci6n reguladora entre dos moleculas de RNA mantiene constante el mimero de copias de pllismido en la familia ColEl de los pllismidos de DNA bacteriano. El RNA I (de aproximadamente 100 nucle6tidos de largo) es un RNA regulador que inhibe la actividad del RNA II (de aproximadamente 500 nucle6tidos de largo) en la iniciaci6n de la replicaci6n del DNA del pllismido. La concentraci6n del RNA I se incrementa en proporci6n al mimero de moltkulas de DNA plasmfdico en la celula, de modo que a medida que el mimero aumenta se inhibe su replicaci6n. El RNA I tiene una secuencia complementaria a la del extrema 5' del RNA II. En el RNA II, la secuencia 2 es complementaria tanto de la secuencia 1 como de la secuencia 3, y se desplaza de una a la otra mediante su uni6n al RNA I; por 10 tanto el RNA I altera la conformaci6n de la secuencia 4 inactivando el RNA II. (Seglin H. Masukata y J. Tomizawa, Cell 44:125136,1986.)

Resumen Muchos de los pasos de la ruta que va desde el RNA hasta la prote{na estdn regulados por las celulas para controlar la expresiOn genica. Se cree que la mayoria de los genes estdn regulados en multiples niveles, aunque habitualmente predomina el Controles post-transcripcionales

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control de la iniciacion de la transcripcion (control transcripcionalJ. Sin embargo, algunos genes son transcritos a un nivel constante y activados y desactivados exclusivamente por mecanismos reguladores post-transcripcionales. Estos procesos incluyen (1) la atenuacion del transcrito por su prematura ftnalizaciOn, (2) seleccion alternativa del punto de maduracion, (3) control de la jormacion del extremo 3' por ruptura y adiciOn de poli-A, (4) control del transporte desde el nu.eleo al citoplasma, (5) localizacion de mRNA en lugares particulares de la celula, (6) edicion del RNA, (7) control de la iniciacion de la traduccion, (8) degradaciOn regulada del mRNA, y (9) recodiftcacion traduccional. La mayorla de estos procesos de control requieren el reconocimiento de secuencias espectjicas 0 de estructuras que sean reguladas en la molecula de RNA. Este reconocimiento se puede llevar a cabo ya sea por una prote{na reguladora 0 por una molecula reguladora de RNA.

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Organizacion interna de lacelula

EJeclronmicrograffa de vesiculas sencillas y recubiertas de la carn. inlema de la membrana plasm4tica de una celuJa heptitica de rat6n. Tambit!:n

se pueden observar numerosos mamenlos de queratina. (De N. Hirokaway ,. Heuser, Cefl30:395-406, 1982.)

Simulad6n por ordenador de una bicapa de fosfolipidos de 0,8 nm en el agua. Los alOmOS de f6srom se muestran en verde, los de nitr6geno en azuloscuro, los de oxfgeno Iipfdico en rojo, los grupos lenninales de las cadenas en magenta y otms alomos de carbona en gris; los alomos de hidr6geno del carbono se han omitido. las molOCul.as de agua se muestran en amarillo (oxfgeno) y blanco (hidr6genol. (De R.M. Venable, Y. Zhang. B.J. HardyyR.W. Paslor, Science 262:223·228, 1993.)

Estructura de lamembrana

10 ·....··de---.

Las membranas celulares son cruciales para la vida celular. La membrana plasmttlIca roden a la celula, deHniendo su extcnsi6n y mamcniendo las diferencias esendales entre el contenido de 1a celula y su entomo. Dentro de la celula eucariota, las membranas del retfculo endoplttsm..ico, del complejo de Golgi, de las mitocondrias

y de atros org
membrana plasmatica comiene tambien prolefnas que actlian como sensores de senales eXlernas, permitiendo que la celula carnhie en respuesta a indicaciones ambienlales; estas proteinas sensoras, 0 receptores, transficrcn informaci6n, en lugar de iones 0 de moltkulas, a tra~ de la membrana. Aunque realicen diferentes funciones, todas las membranas biol6gicas tienen una estructura basica comun: una finfsima capa de moltkulas Ijpfdicas y proteicas, que se mantienen unidas fundamental mente par interacciones no co· valentes. Las membranas celutares son estruclUras dinamicas, nuidas y la mayorfa de sus moltkulas son capaces de desplazarse en el plano de la membrana.

i 1

] ~~..

',m IA)

Figura 10·1 Trcs visiones de una membrana celuiar. (Al E1eclronmicrograffa de una membrana plasmatka (de un eritrocito humano) en secc::i6n transversal. (B y C) Dibujos esqucmaticos que mucstran en dos y tres dimensiones la membrana cclular. (A, por cortesfa de Daniel S. Friend.)

lipidiCll

molecula de lIpide molkula de prole!na

'8'

de IIpido

mOlecule de prolelne

lei

509

Las mollkulas Iipfd.icas est<1n dispuestas en forma de una dohle capa continua de unos 5 nm de grosor (Figura 10-1 I. Esta bicapa lipfdica constiluye la estructura blisica de la membrana y actlia de barrera relativamente impermeable al paso de la mayona de moltkuJas hidrosolubles. Las moltkulas proteicas, que normalmente se hallan "disueltas" en la bicapa lipid.ica, median la mayona del resto de funciones de la membrana, por ejemplo transportando mollkulas especfficas a trav~s de ella 0 catalizando reacciones asociadas a la membrana, como la sfntesis de ATP. Algunas protefnas de membrana acnian de eslabones estructurales que relacionan la membrana plasmlitica con el citoesqueleto y/o con la matriz extracelular de las c~lulas adyacentes, mientras que otras prote(nas acruan como receptores que reciben y transducen las senales qurmicas procedentes del entomo celular. Como podna esperarse, las membranas son estructuras asim~­ tncas: la composici6n Jipfdica y proteica de sus caras interna y exlerna es diferente reOejando las diferentes funciones realizadas por ambas superficies. En este capitulo consideraremos la estructura y la organizaci6n de los dos constituyentes principales de las membranas biol6gieas -los Ifpidos y las proternas. Si bien prestaremos especial alenei6n a la membrana plasmMica, muehos de los eonceptos son aplicables a las membranas intcrnas. Las funciones de las membranas eelulares se eonsiderarlin posteriormente. Su papel en la sfntesis del ATP seni diseutido en el Capftulo 14; su papel en el transpone transmembranoso de pequenas mollkulas, en el Caprtulo II y su papel en la transmisi6n eelular de senales y en la adhesi6n eelular, en los Capftulos 15 y 19. En los Capftulos 12 Y •J3 se discutin1n las earactensticas de las membranas internas de 1a relula (endomembranas) y el rn1fico de protefnas a traves y entre elias.

La bicapa lipfdica I La blcapa llpfdica ha sido establecida como la base universal de la estruetura de la membrana celular. Es (lieil de ohservar en una electronmierograffa convencional, aunque son necesarias Ilknicas especializadas, como difracci6n de rayos Xy tl!cnicas de eriofractura, para revelar los delalles de su organizaci6n. La estruetura en bicapa puede alribuirse a las propiedades espec:;iales de las mollkulas lipfdicas, que haeen que dichas mollkuJas se ensamblen espontlineamente formando bicapas, incluso en sencWas condiciones anificiales.

Los lfpidos de las membranas son moIeculas anfipciticas que espontaneamente forman bicapas l Las mol~culas Iipidieas son insolubles en agua pero se disuelven facilmente en disolvenles orgAnieos. Constituyen aproximadamente un 50 % de la masa de la mayorfa de las memhranas plasmaticas de las c~lulas animales, siendo easi todo el resto protemas. Existen unas 5 x 1()6 mollkuJas Iipfdicas en una secci6n de bicapa lipfdica de I JllIl x I (.lm, 0 aproximadamente 10' mol~u1as Iipidicas en la membrana plasmlitiea de una relula animal pequena. Todas las mollkulas lipidicas en las membranas celulares son anfipdticas (0 anfiffiicas) -es decir, tienen un extremo hidroftJico ("que se siente atrafdo por el agua" 0 polar) Yun extremo hidrof6bico ("que rehuye el agua" 0 no polar). Las mas abundanles de estas mol~­ culas son los fosfolfpidos. Los fosfolipidos tienen una cobeza polar y dos colas hidrocarbonndas hidrof6bicas (Figura 10-2). Las colas suelen ser Acidos grasos, y pueden tener diferente longitud (nonnalmente contienen de 14 a 24 Atomos de carbono). Normalmente una de las colas presenta uno 0 mcis dobles enlaces cis (es decir, es insaturada) mientras que la otra nonnalmente no tiene dobles enlaces (es decir, es saturada). Como se muestra en la Figura 10-2, cada doble enlace cis genera una suave curvatura en la cadena. Las difercncias de longitud y de grado de saturaci6n entre las eolas hidrocarbonadas son imponantes porque afectan la capacidad de las moll!culas de fosfolfpidos para empaquetarse una contra otra y, por 10 tanto, afectan la fluidez de la membrana (vease m~s adelante). 510

Capftulo 10: Estructurade la membrana

grupo polar lhidrofllicol de III abeza

c-o c-o

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2

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doble enlace

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IAI

181

101

Figura 10·2 Las zonas de una mol&:uJa de fosfollpldo. La fosfalidilcolina, represenlada de forma esquematica (A), como f6rmula qufmica (B), como modele espacial compacta (0 yen forma de sfmbolo (0). La curvalura debida al doble enlace cis esta exagerada en los dibujos para hacerla mas visible. La forma y la naturaleza anfipo1liea de las mol~las Iipfdicas es 10 que determina que estas mollkulas formen espontAneamente bieapas lipfdicas en soluci6n acuosa. Cuando las moltkuJas anfipo1ticas se eneuentran rodeadas par todas panes par un ambiente aeuoso, licnden a agregarse de tal manera que sus colas hidrof6bicas se esconden en el interior y sus cabezas hidromicas quedan expuestas a! agua. Dependiendo de Sll forma, pueden conseguir esta disposici6n, de una de dos maneras: plleden formar micelas esf~ricas, con las colas bacia e1 interior, a pueden formac lo1minas bimoleculares, 0 bicapas, can las colas hidrof6bicas escondidas entre dos capas de cabezas hidromicas (Figura 10-3). Debido a su forma eUi:ndrica, la mayorfa de los fosfolfpidos de membrana forman espontAneamente bieapas en un entomo acuosa. Adcmo1s, estas bicapas Upfdieas tienden a cerrarse sabre sf mismas fonnando eompartimientos hennctieos. eliminando asf los bordes Ubres en los que las colas hidrof6bicas podrfan estar en contaeto con el agua. Por esta misma raz6n, los companimientos formados por bicapas lipfdicas tienden a cerrarse de nuevo despues de haber sido mtos. Ademas de sus propiedades de autoensamblaje y de autosellado, una bicapa lipfdica liene olras earaeterfsticas que haeen de eUa una eslructura idea! para constituir las membranas eeluJares. Una de las mo1s importantes es su nuidez. que, como veremos, es crucial para muchas de sus funciones.

La bicapa Lipfdica es un tluido bidimensionaF Sorprendentemente. no fue hasta principios de los aftos 1970 que los investigadores reconocieron por primera vez que las distintas moleculas Iipfdieas pueden difundir Ubrememe dentm de las bicapas Iipfdicas. La demostraci6n inicial procede de unos estudios sabre bicapas Iipfdicas sinteticas. Dos tipos de estas bicapas sinteticas han La bicapa lipfdica

micela lipldica

Flgun 10.3 Mil::e1adelJpldosy blcapa Upfdlca vistas en settl6n transversal. Las molt'iculas de lfpido forman, cspontaneamente, estructuras como ~stas ell cl agua. La forma de la molecula Iipfdica determina curti de estas eSlructuras se forma. Las molKulas lipfdicas en forma de cufta (arriba) forman micelas, mienlras que las mol~as de fosfolipidos de fonna dlfndrica (abajo) fonnan bicapas.

511

resultado muy utiles en los estudios experirnentales: (I) bicapas producidas en forma de vesiculas esfericas, denominadas Uposomas, cuyo tamafio puede variar de 25 nm a I J.U1l de diametro segUn cual sea el sistema de preparaci6n (Figura 10-4), y (2) bicapas planas, denominadas membranas neg:rm, formadas a lraves de un agujero situado en una separaci6n entre dos compartimientos acuosos (Figura 10-5). Se han utiHzado diversas t~nicas para med.ir el desplazamiento de las moleculas lipfdicas y de sus diferentes regiones. Por ejemplo. se pucde construir una mol~ula Iipfdica cuyo grupo de cabeza polar Ueve una marca de espln", tal como un gropo nitroxilo (:>N-D), Que contiene un electr6n desapareado cuyo espin genera una senal paramagnetica Que se puede medir mediante espectroscopia de resonancia de espfn electr6nico (ESR, de Electron Spin Resonance'). (Los principios de esla tecnica son similares a los de la resonancia magnetica nuclear. Que se disCUlen en el Capfmlo 4). Mediante el espectro ESR se puede medir el movimienlo y la orienlaci6n de un Ifpido marcado denlro de una bicapa. Estos estudios demuestran Que las moleculas de fosfolfpido de las bicapas artificiales rarameme migran de un lado a otro de la monocapa. Este proceso. denominado "flip-flop", se produce menos de una vez al mes en cllalquier molecu]a lipfdica. Por otro lado, las moleculas lipfdicas intercambian facilmenle su Illgar con el de las moleculas vecinas deniro de una monocapa (_\07 veces por segundo). Ello da lugar a una nip ida difusi6n lateral, con un coeficiente de difusi6n (0) de aproximadamente 1()-3 cm 2 /segundo. 10 cual significa Que una moh~cula lipfdica promedio difunde la longilud de una gran celula bacleriana (-211m) en aproximadamenle 1 segundo. Adem:is, estos eslUdios indican Que las moleculas Iipfdicas giran con gran rapidez alrededor de sus ejes longiludinales y que sus cadenas hidrocarbonadas son flexibles (Figura 10-6). Vnos estudios similares han sido realizados con moleculas lipfdicas marcadas, en membranas biol6gicas aisladas y en celulas enteras relativamenle sencilias como micoplasmas, bacterias y g16bulos rojos (erilrocitos) anucleados. En general, los resultados de estos estudios son los mismos Que los Que se obtienen con bicapas artificiales, y demuestran Que el componenle lipfdico de las membranas biol6gicas es un I{Quido bidimensional en el que las moleculas constituyemes son Iibres de moverse lateralmente; aI igual que en las bicapas sinlelicas, las moleculas de fosfolJpido se hallan restringidas a su propia monocapa. Este confinamiento crea un problema para su sintesis. Los fosfolfpidos son sintetil.3dos s610 en una de las monocapas de la membrana, la cual se sintetiza principalmente en la monocapa citos6lica de la membrana del retfculo endoplasmatico {ER, de Endoplasmic Reticulum); si ninguna de estas moleculas recientemente formadas pudiera migrar hacia la ona mitad de la bicapa lipfdica, no se podrfa formar mas bicapa. Este problema se soluciona gracias a un tipo especial de enzimas unidas aI ER lIamadas tTamlocadoras de JosJolfpidos, que catalizan un ro1pido flip-flop de fosfolfpidos especfficos desde la monocapa donde han sido sintelizados hasta la rnonocapa opuesta, como se discule en el Capitulo 12. M

.... ....

E·

Figura to-4 Uposomas. (AI Electronmicrograffa de vesrculas de fosfolfpldos (liposomasl en agua. sin fijar ni lenir. N6tese que la eSlruclura bilaminar de las vesiculas es claramente aparente. (B) Dibujo de un pequeno liposoma esferico visto en seccl6n transversal. Normalmente los Iiposomas se utilizan como modelo de membrana en estudios expcrimemales. (A, par conesfa de Jean Lell8ull.)

dilusi6n lateral

:.0:::

\

, I flip-flop

/ I blcIo~

Ilpldic:a (membrana ""lIral

FlguT'8 10-5 Representacl6n en seccl6n tnrnsversaJ de una blcapa lIpfdJca slnu!tlca, denomJnada membrana negra. Esta bicapa planar se fonna a traves de un pequeno agujero en una pared que separa dos compartimlentos acuosas. l.as membranas negras se mUlzan para medir las propledBdes de permeabilldad de las membranas Brtificlales.

512

Capftulo 10: EStrucIUTll de la membrana

:1~~Y8l ,ow"e)

, I

FlguT'810-S Movllidad de los fosfoUpldos. Los lipos de movimienlOS posibles de las moleculas de fosfolfpido en una bicapBlipfdica.

La fluidez de una bicapa lipidica depende de su composici6n 3 La fluidez de las membranas celulares es biol6gicamentc imponante. Algunos procesos de transpone y a1gunas actividades enzim<1.ticas, por ejemplo, pueden

detenerse cuando la viscosidad de la bicapa se incrementa experimentalmente mas aU~ de un nivel umbra!. La nuidez de una bicapa lipfdica depende tanto de su composici6n como de la temperatura, como ha side demostrado por estudios en bicapas sinteticas. Una bicapa simetica, producida a partir de un unico tipo de fosfolfpido, pass de un estado Uquido a unestado cristalino rigido (0 gel) en un punto de congelaci6n caracterfstico. Este cambio de estado recibe el nombre de traflsicio" de/ase, y la temperatura a la que se produce es m~s baja (es decir, la membrana resulta mas diffcil d~ congelar) si las cadenas hidrocarbonadas son conas 0 tienen dobles enlaces cis. Una mellor longitud de la cadena reduce la tendencia de las colas hidrocarbonadas a interaccionar entre sf. y los dobles enlaces cis producen pliegues en las cadenas hid.rocarbonadas que dificultan su empaquetamiemo, de forma que las membranas permanecen fluidas a temperatums mas bajas (Figura 10·7). Bacterias, levaduras y otros organismos cuyas temperaturas varfan con la de su entoroo, controlan la composici6n de los acidos grasos de sus Ifpidos de membrana para mantener una fluidez relativamente COllstante; en caso de que la temperawra disminuya se sintetizan acidos grasos can mas dobles enlaces cis. de manera que evitan una perdida de fluidez de la bicapa por efecto de la disminuci6n de la temperatura. Sin embargo, la bicapa Jipidica de muchas membranas celulares no est3 compuesta exclusivamente por fosfoUpidos; habitualmente contienen ademas, colesterol y glucolipidos. Las membranas plasmaticas de eucariotas contienen cantidades especialmente elevadas de colesterol (Figura 10-8) -hasta una proporci6n de m.as de una molecula de colesterol por cada molecula de fosfoUpido. Las moleculas de colesterol refuerzan el car.acter de barrera permeable de la bicapa Iipfdica. Se orientan en la bicapa con sus grupos hidroxilo pr6ximos a las cabezas polares de las moleculas de fosfolipidos; sus anillos esteroides, pianos y rfgidos, interacroan can -yen parte inmovilizan- las regiones de las cadenas hidrocarbonadas que son mas cercanas a los gropos polares de la cabeza, dejando el resto de la cadena m.as flexible (Figura 10-9). AI disminuir la movilidad de los primeros grupos CH1 de las cadenas hidrocarbonadas de las moleculas de fosfoIfpidos, el colesterol hace a la bicapa Iipidica m.as rfgida en eSla regi6n y de ese modo disminuye la permeabilidad de la bicapa a moleculas solubles pequenas. Aunquc de eSla manera el coleslerol tiende a hacer menos fluidas las bicapas Jipfdicas, a las a1tas concenlraciOllcs en que se presenta en la mayorfa de las mcmbranas plasllHiticas de eucariotas lambien impide que las cadenas hidrocarbonadas se junten y cristalicen. De esta manera, el colesterol inhibe posibles transiciones de fase.

OH

""'""

hidrOCllrbornldel inNluredN eon dab," enlllCel cis

Figura 10-7 lnOuencladelosdobles enlaces cis en las cadenas hldrocarbonadas.la presencia de dobles enlaces hace m
Figura 10·8 Estruetura del colesterol.

molccula de colesterol, rcprcsentada mediante su f6rmula (Al. mediante un esquema (B) y mediante un modelo espacial compacta (C). La

] grupo poler de CIlbele

_rueture pl.ner rlgida

de lot enillos _el"1)id&of;

CHJ "cH) CH

,

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grupo hidrOCllrbonedo no poler de cole

1CHHz

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CH J

IAI

La blcapa llpfdlca

CH J

(8),

513

• En la Tabla 10-1 se com para la composici6n Lipfdica de distintas membranas biol6gicas. Observese que a menudo las membranas plasml1ticas baclerianas est
La bicapa lip£dica es asimetrica 4 En las membranas plasm<1ticas que han sido analizadas. la composici6n Iipfdica de las dos mitades de la bicapa lipfdica es marcadamenle diferente. En la membrana del gl6bulo rajo humano, la mayorfa de las moleculas Iiprdicas que tienen colina -{CH3hN'CH 2CH 20H- en su grupo de cabeza (que es, fosfatidilcolina yes-

Tabla 10-1 Composlcl6n IIpfdlca aproxlmada de dlierentes membranas celulares Porcenlaje de lipldo total en peso

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514

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Colesterol Fosfatidiletanolamina Fosfatidilserina Fosfatidilcolina Es6ngomielina Glucolfpidos Otros

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Capftulo 10: Estructura de la membrana

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por at eolesterol

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fluida

•

Figura 10-9 FJ coleslerol en una bkapa Upfdlca. Dibujo esquemlitico

de una molecula de colesterol inleractuando con dos molecuJas de fosfoHpido en una de las laminas de una bicapa lipfdfca.

CH, CHl.....

l ...... cH J

°7'fH'

'fH'

?

Q=-p-00

I

?" ? 'fH-'fH-CH' It 7H -0

Figura 10-10 Cuatrodelos prtnclpaJes rosrolfpldos de las membranas plasmlhlcas de las d1ulu de mamffero. O~rvese que lantO en CSla figura como en las siguienles, los diferenles grupos de la cabez.a se represe.ntan mediante sfmbolos diferentes. Todas las mollkulas Upfdicas que se presentan derivan del gticerol excepto la esfingomlelina que deriva de la serina.

H

fotfatidiletanolamina

fosfatidilserlna

fosfatidilcolina

nfingomielina

fingomielinal se enCUenlTan en la mitad exterior de la bicapa IipCdica, mientras que la mayona' de moMculas de fosfolfpido que contienen un grupo amino primario terminal (fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina) se hallan en la mitad interior (Figura 10-11). Dado que la fosfatidilserina, de carga negativa, estc1localizada en la monocapa interior, existe una importante diferencia de carga entre las dos monocapas. La mayorfa de las membranas de una c~lula eucariota, induyendo la membrana plasmc1tica, se sintetizan en el relfculo endoplasmc1tico (ER) yes alii donde se genera la asimetrfa de los fosfoUpidos por translocadores que trasladan especificamente mol~culas de fosfol.fpidos de una monocapa a otra (se discute en el Capftulo 12). Esta asimelrfa Iipfdica puede ser funcionalmente importante. La enzima prore(na quinasa C, por ejemplo, se activa en respuesta a variadas sef'iales extracelulares; se une a la cara citoplasmatica de la membrana, donde se haUa concentrada la fosfatidilserina, y requiere este fosfolfpido cargado negativamente para actuar. De modo similar los fosfolipidos de inositol se concentran en la cara citoplasmatica de la membrana plasmatica de la c~lula eucariota. Estos fosfolfpidos minoritarios son escindidos en dos fragmentos por enzimas especfficas que son activadas por sei\ales extracelulares. Ambos fragmentos actUan luego dentro de la c~lula como mensajeros solubles que permiten la difusi6n de la sei\al hacia el interior de la re!ula, como se discutim en el Capitulo 15.

La blcapa Upfdlca

ESPACIO EXTRACElUlAR

FlguralO-11 ladJstribud6n aslmt!:triCll de los rosrolfpldos yde los g1ucoUpldos en la blCllp8 Upfdlca de los g16bulos rajos humanos. Los

CITOSOL

sfmbolos utllizados para los rosfolfpidos son los inlroducidos en la Figura 10-10. Ademn, los glucolfpidos se han dibujado con grupos de cabeza polar de forma hexagonal (azul). se cree que el coleslerol {no dibujadol se dlstrlbuye casi a partes iguales en ambas monocapas.

515

En la superficie de todas las membrana plasmaticas hay glucolfpidos' Las mol~culas Iipidicas que presenlan una asimetrfa mlls marcada en cuanto a su distribuci6n en las membranas celulares son las mol~culas Iipfdicas que contienen azucares denominadas g1ucoUpJdos. Estas asombrosas moleculas se encuentran exclusivamente en la mitad no citoplasmlitica de la bicapa Iipfdica. donde aI parecer se autoasodan formando microagregados medianle la fonnaci6n de enlaces de hidr6geno entre eUas. En la membrana plasmatica sus gropos az.ucar qued.an aI descubierto en la superficie de la cl!lula (Figura 10-11).10 cual sugiere que deben desempenar alguna funci6n en las interacciones de la cl!lula con su entomo. La distribuci6n asimetrica de los glucolfpidos en la bicapa resulta de la adici6n de gropos azucar a las moleculas Iipfdicas en el lumen del complejo de Goigi. el cual es topograficamente equivalenle aJ exterior de la relula (se discute en el Capftulo 13). Los glueolfpidos se presentan probablemenle en las membranas plasmliticas de todas las celulas ani males, constiluyendo aproximadamente un 5% de las moleeulas lipfdicas de la monocapa exterior. Ademas se encuentran en algunas membranas intracelulares. Los glucolfpidos mas eomplejos. los gangU6sldos, conticnen oligosacaridos con uno 0 m<1s residuos de acido si;1!ico, 10 que les proporciona una earga neta negativa (Figura 10-12). Los gangli6sidos son mlls abundanles en la membrana plasmAtica de las celulas nerviosas. en donde cons tituyen aproximadamenle un 5-10% de la masa Iipfdica total. aunque tambien se encuentran en casi todos los tipos celulares en cantidades mucho mas rcducidas_ Hasta el momento se han identificado mas de 40 gangli6sidos diferenles. Por ahora no se dispone mas que de indicios acerca de cuaJes podrfan ser las funciones de los g1ucoUpidos. Una posible pista procede de su localizaci6n: en la membrana plasmatica de las celulas epiteliales, por ejemplo. los g1ucolipidos se eneuentran confinados en la superficie apical, donde podrfan ayudar a proteger la membrana de las condiciones adversas que rrecuenlemente existen allf (como pH bajo y enzimas degradativas). Los g1ucoUpidos con carga, como los ganglj6sidos. pued.en tener importancia debido a sus efectos eltktricos: su presencia alterarfa el campo electrico a tIav~ de la membrana y la concentraci6n de iones -especialmente Caz,_ en su superficie extema. Los g1ucolfpidos pueden tambil!n 4

"7 " i i 0

H-~H-~H2

0

H-~H-~H2

H7H

H7H

"

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-0

-0

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tHO" HOH

r

H 20H

(A) llBIaclocBrebr6sido

516

(8) llBnllli6sido G M,

Capftulo to: Estructura de la membrana

Figura 10·12 Molkulasde g1ucoUpldos. Los galactocerebr6sldos (Al son lIamados glucoUpidos lIf!utros porque el azlicar que fonna su grupo de cabeza noesI4 cargado. Un gang.li6sido (B) siempre conliene uno o m4s residuos de 4cido si41ico (tambitn lIamado 4cido N-acetil neuramfnico 0 NANA) cargados negalivamente. cuya eslruetura se muestra en (C). Mientras que en bacterias y en plantas casi lodos los g1ucol£pidos derivan del glicerol. como la mayorfa de fosfolfpidos, en las ct~lulas animates casi siempre se generan a partir de es6ngosina. un alcohol amino derivado de la serillu• como en el caso del fosfolfpldo I$fingomielina (vtase Figura 10-10). Gal = galaclosa; Glc = glucosa. GalNAc~= N-acetil galaclosamina; eSlos Ires aztlcares no eSl4n cargados.

=

desempcnar un papel en el aislamiento electrica, ya que se hallan en gran cami· dad en la mitad no ciloplasmatica de la bicapa de la membrana mielfnica. que aisla electricamente los axones de la celula nerviosa. Ademas se cree que desempefian alguna funci6n en los procesos de reconocimiento celular. EI gangli6sido GM1 (vease Figura 10-12), por ejemplo. acrua como receptor de superficie ceJular para 1a taxilla bacteriana que provoca la diarrea dcbilitant'c del wlera. La toxina del c61cra tinicamente se fija y pelletTa en aquellas cclulas que tienen GM1 en su superficic. incluidas las celulas del epilclio intestinal. Su ingreso en la ce\ula provoca un incremento prolongado de la concentraci6n intracelular de AMP cfclico (se discute en el Caphulo J5), la cual genera, en cl imestino, un gran eflujo de Na' y de agua. Aunque la fijaci6n de las loxinas bacterianas no puede ser la funci6n normal de los gangli6sidos, estas observaciones sugieren que eslos glucolfpidos tambi(!n pueden actuar como recept'Ores de moltkulas extracelulares habituales. Esta suposici6n se apoya en la evidencia crecieme de que los glucolipidos pueden ayudar a las c(!lulas a unirse a la matrix extrace)ular y a olras c(!)ulas. como disculiremos mas adelame.

Resumen La! membrunas blol6gicas estd" formlldas por una doble Cllpa continua de molicuUu lipfdkus. en la que est4n inmeruu INJrUu proteftuu de membrana. Esta bienpa lipfdic:a es fluUla. y Uu distintus moUculas lipfdicas ptu!den dijundir rtfpidanf1mte dentro de ." propla monocapa. La mayorla de las moUculns lipfdictu, sill embargo. cad nUIIea realizan de forma espolltdnea flip-flop de una monOCllpa a la otra. La! molkulas lipfdic:as de Uu membranus son anfipdtictu y aigrmus de ellas (losfosfol(pidos), CUtlniW se colocall en agrill, se ,men espolltdneamellte entre sfformaniW blcapas; las blcapasfonnan CO"")(Irtimientos cerrcuros que tiellell una gran tendencla u valverse a ,mir si se rompen. Existen tres clases pritlcllJllles de molic,,las lipfdicas de membrana -los fosfoU'Jidos, el co/esterol y los glucol(pidos- Y In composicl6n lipfdlcll de III monocapa utemn es difcmmte a to. de In intemn, 10 ql.e refkja las diferentes Junclones de las dos c:aras de una membrana celular. En las membranas plasmAlicas de los difere,rtes tipos de cilulas, al igual que en los diversos compartimientos membranosos internos de las ciiulas eucarlotas, u prrsetllan diferentes mez.clas de Upidos. Algunas prote(nas unidas a La membrana 1U!a!sitan Upidos con grupas polares espedfioos para aduar. /0 que al parecer explialrla, al menos en parte, por qui las membranas elu:ariotas conliemn ripos tatl diversos de molkulas llpfdictu.

Proteinas de membrana"

•

Aunque la estructura b;isica de las membranas biol6gicas esta detenninada por la bicapa lipfdica. la mayorfa de sus funciones especfficas estan desempenadas por protefnas. Por consiguiente, la cantidad y el tipo de protefnas de una membrana son muy variables: en la vaina de mielina, cuya funci6n principal consiste en aislar los axones nerviosos, menos de un 25% de la masa de la membrana es protefna, mientras que en las membranas dedicadas a la transducci6n energ(!tica (tales como las membranas internas de las mitocondrias y de los c1oroplaslosl aproximadamente un 75% de su masa es prolefna. La membrana plaslll<1tica normal esta situada entre ambos extremos, con aproximadamenle un 50% de la masa toml en forma de protema. Debido a que las moleculas lipfdicas son pequeflas en comparaci6n con las proteicas, en todos los casas hay mas mol(!culas lipfdicas que proteicas -alrededor de 50 moleculas de Ifpidos por cada moltkula de protefna en una membrana que contenga un 50% de protefna en masa. Como los Ifpidos de membrana, es comun que las prolefnas de membrana lIeven adosadas cadenas de oligosacaridos. Asf la superficie que la c(!lula presema al exterior posee una gran cantidad de carbohidratos, 10 que forma un gfucocafiz 0 Cllbierta ceill/ar (discutido mas adelante). Prole{nas de membrana

517

Las protefnas de membrana pueden estar asociadas ala bicapa lipfdica de varias maneras7 Las distintas protefnas de membrana est'an asociadas a las membranas de diferemes maneras, como se i1ust'ra en la Figura 10-13. Muehas protefnas de membrana atraviesan la bicapa lipfdiea, de forma que parte de su masa se situa a eada lado de la membrana (ejemplos 1 y 2 de la Figura 10-13). Como sus vecinas Iipfdieas, estas protemas transmembrana son anfipatieas, tienen regiones que son hidrof6bicas y regiolles hidroffJicas. Las regiones hidrof6bieas se situan en el interior de 1a membrana y se relacionan con las colas hidrof6bieas de las molt!colas lipfdieas del interior de la bicapa. Las regiones hidroffiieas se haJlan expuestas aI medio aeuoso de ambos lados de la membrana. EI ead.eter hidrof6bico de a1gunas de estas protefnas aumenta por la uni6n eovaJente de una 0 mas cadenas de acido graso que se encuentren insenadas en la mitad citoplasmatica de la bieapa (vt!ase el ejemplo 1 de la Figura 10-13). Otras proteinas de membrana se localizan en el chosol y se asocian con la bicapa tan wlo a travt!s de una 0 mas cadenas de acidos grasos a las que estan unidas covaJentemente, 0 por otro tipo de cadenas Iipfdicas Ilamadas grllpos prenil (vease el ejemplo 3 de la Figura 10-13 y la Figura 10-14). Existen otras prot'efnas eompletamente expueslas a la superficie celular extema, ancladas a la bicapa unicamente por medio de una uni6n covaJente (vfa un oligosaearido especffico) aI fosfatidilinosit'ol de la monoeapa lipfdiea externa de la membrana plasmatica{vease el ejemplo 4 de la Figura 10-13). Las proteinas unidas a lfpidos del ejemplo 3 se han generado como proteinas solubles en el citosol y posterionnente se han trasladado directamente hacia las membranas uniendolas eovalememente a un grupo lipidieo (Figura 1014). Las protefnas del ejemplo 4, sin embargo, se sintetizan como protefnas transmembrana de "paso unito.. en el ERi mientras pennanecen en el ER, el segmento transmembranoso de la protefna se escinde y se Ie aflade un glucosllfosralldillnosilol (GPI, de glyeosylphosphalidylinositoll, de forma que la prOleina queda llnida a la superfieie no citoplasmatica de la membrana 0010 por medio de eSle andaje (vease Capftulo 12). Las proteinas que se unen a la membrana con un GPI de anclaje se distinguen faeilmente mediante el uso de la enzima fosfolipasa C especffica para fosfatidilinositol. que separa especffieamente eslas protefnas de sus anclajes, separandolas asi de la membrana. A1gunas protefnas que no ocupan totalmente el interior hidrof6bieo de la bieapa lipidica estan unidas a una u OlTa cara de la membrana mediante interaeciones no covalentes con otras protefnas de membrana (veanse los ejemplos 5 y 6 de la Figura 10-13). Muchas de elias puedcn ser liberadas de la membrana mediante procedimiclltos de extracci6n relat'ivamente suaves, como la exposici6n a

b••", [

lipldiea

518

Capitulo 10: Estruetura de la membrana

Figura 10-13 Selssl.stemasde asoclad6n de las protemas con la membrana Uprdica. Se cree que la mayorfa de proteinas transmembrana atraviesan la bieapa como una helice a. unica (I) 0 en fonna de mUltiples helices a. (2); algunas de estas protemas de ·paso unico" y de ·paso multiple" estan unidas covalentemente a cadenas de aodos grasos insertados en la monocapa citoplasmatica (I). Otras protemas de membrana estan unidas a la membrana Unicamente a traves de su uni6n covalente a un lipido, como una cadena de acido graso 0 un grupo prenil de la monocapa cilOplasmalica (3) 0 bien, menos habitualmente, a uav6i de un oligosacarido a un fosfolfpido minoritario, el fosfalidilinositol. en la monocapa nocitoplasmi1tica (4). Finalmenle, muchas protefnas estan unidas a la membrana tan 5610 mediante interacciones no covalentes con otras protefnas de membrana (5) y (6). En la Figura 10-14 se iJustra c6mo se fonna la estructura de (3). Los detalles de estos diversos sistemas a traves de los cuales las protefnas de membrana se asocinn con la bicapa lipfdica, se discutcn en el Capftulo 12.

tAl

IB)

proleina unlda a la n'lembrana par un. cadena de kido g,aso

proleina unlds .Ia n'lfln'lbrana par un grupa prenil

I

o

-f- CI H-N / !/" enaSOl

~::r:.[-

,

C-O

enlece .mid. entre un glupo amino termlna'yun kido greso

-.r ~

O - CH,

CH, ~

f' '"

enla<:a tioelel

1_ _ entre una cisteina

,~po ''',''

N\/\f\J\/'vC-O·.·

-t.r<..J-(CH,.....

Ie) anclaje miristil

(0) ane'aja farnni'

Figura 10-14 La unl6n covalentc de cualqulera de los dos tJpcM de grupos Upklkos puede ayudar a localizar una protdna solubledentro de una membrana, despu& de su sfutesls en eI c1losol. (AI Una cadena de kido graso {mirfstico 0 palmfticol se une a un grupo amino terminal de una glicina por medio de un enlace amida. (B) Un grupo prenil (sea famesil 0 un grupo geranilgeranil mAs largo-ambos relacionados con el coleslerol) se haUa unido, mediante un enlace !iot!:ler, a un residuo cislerna situado a cuatro residuos del carboxilo terminal Tras esla prenilnci6n.los Ires amlnmkldos termlnales son separados de la cadena y el nuevo carboxilo terminal se metila antes de ser insertado en la membrana. las estructuras de los dos Hpidos que slrven de anc1aje, se ilustran en la parte inferior: (C) un anc1aje miristil (una cadena de llcido graso saturado de 14 carbonos), y (0) un anclaje famesil (una cadena hidrocarbonada insalurada de 15 carbonos).

solueiones de muy alta 0 baja fuerza i6nica 0 de pH extremo. que interfieren con las interacciones proteicas pero mantienen intacta la bicapa Jipfdica. De manera operacional a estas prote(nas se les denomina protefnas perlfl!rlcas de membrana. Por el contrario las protefnas transmembrana. varias protefnas unidas a la bicapa por cadenas de acidos grasos y algunas otras protefnas fntimamente unidas a la membrana, no pueden ser Iiberadas por estos me:todos. por 10 que se les denomina protefnas integrates de membrana. Habitualmente la manera en que una protei'na se asocia a la bicapa Iipfdica es un indjcativo de la funci6n de la prole(na. Asf, s610 las protefnas transmembrana pueden acruar en ambos lados de la bicapa 0 traosponar moleculas a trav~ de ella. Algunos receptores celulares de superficie, por ejemplo, son protefnas transmembrana que se unen a las moleculas seflal en el espacio extraceluJar y generan diferentes seflales intracelulares en el lado opuesto de la membrana plasmatica. Por el contrario, las protefnas que s610 actlian en un lado de la bicapa Iipfdica, generalmente esran asociadas can la monocapa lipfdica 0 con el dominio proteico de aquellado de la membrana. Por ejemplo, un grupo de protefnas relacionadas con la sei'iaJizaci6n intracelular estan unidas a la cara citos6lica de la membrana plasmatica por uno 0 mas grupos Iipfdicos a los que eslan covalentemente unidas.

Se considera que, en la mayorfa de proteinas transmembrana, las regiones de la cadena polipeptfdica que cruzan la bicapa lipfdica presentan una conformaci6n en helice a6.11 Una protefna transmembrana se orienta siempre en un unico sentido deotro de la membrana. Este hecho refleja tanto la asimetrfa del sistema mediante el cual la prolefna se ha sintetizado e insertado en la bicapa Lipfdica en el ER, como la diferencia entre las funciones que desempefian los dominios citoplasmatico y no citoplasmatico de la protefna. Estos dominios estan separados por segmemos de la cadena polipeptfdica que atraviesan la membrana. se hallan en contacto con el ambiente hidrof6bico de la bicapa Iipfdica y estan compuestos, en gran parte. por residuos de amino~cidos de cadena lateral no polar. Debido a que las uniones peptfdicas son en sf mismas polares y dado qu.e el agua no esta presente Protcfnas de membrana

519

Figura 10·15 Un segmento de una cadena pollpeptfdlca que atravlesa la blcapallpfdJca en fomla de hellce ex. En la figura s610 se ha dibujado el esqueleto del carbono ( l de la cadena polipeptfdica, con los amino<\cidos hidrof6blcos en verde y amarillo. EI segmento polipeptfdico que se muestra en la figura es una parte del centro de reacci6n fotosint~tico bacteriano que se i1ustra en la Figura 10-33, cuya estructura fue determinada por andlisis de difracci6n de rayos X. (Basado en datos de J. Deisenhofer el aI., Nature 318:618·624, 1985. yde H. Michel et al.. EMBOJ. 5:1149·1158.1986.)

en este ambiente. lodas las umones peptfdicas penenecientes a la porci6n de la cadena embebida en la bicapa tienden a formar enlaces de h..idr6geno entre sf. Esle lipo de uniones se maximiza si la cadena polipeptldica forma una h~lice are· gular al cruzar la bicapa; se cree que la mayoria de los segmentos de las cadenas polipeptfdicas que alraviesan la membrana se hallan en esla confonnaci6n (Figu· ra 10·15): en las protemas transmembrana de paso tlnlco la cadena polipeplfdica crma una sola vez (~ase el ejemplo 1 de la Figura 10·13), mientras que en las protefnas transmembrana de muJtlpaso la cadena polipeplfdica cruza multiples veces la bicapa (v~ase el ejemplo 2 de la Figura 10-13). Una manera altemativa de que las uniones peptfdicas puedan satisfacer sus requerimientos de enlaces de hi· dr6geno es que las multiples hebras transmembrana de la cadena polipePlfdica se dispongan en lAmina P fonnando un ~barril cerrado~ (denominado barril (JJ. (AI GLUCOFORINA

8

_L-~_J-,------.J o 50 100

8L-_ _~ o

numero de amino'cidO

100

~_ 200

numero de amlno'cidO

1-1gura 10·16 LocalIzaci6n en una cadena pollpeptfdlca, medlanle el uso de gniflcos de hldropatfa, de potenclales segmentos en hellce a que atravlcslm la membrana. L, encrgfa !ibm neeesaria para transferir segmcntos suceslvos de ulla cadena polipeptfdica de un solvente no polar aI agua se calcula a partir de la composici6n aminoacfdica de cada segrnento usando los datos de un modele de componentes. Estos c4Iculos se realizan para segmentos de un tamano fijo, (usualmcnte alrededor de 10 residuos de amino<1cidos), comcnzando COil cada aminoocido succsivo de la cadena. EI ~fndice de hkIropatfa~ del segmento se esquematiza en el eje Ycomo funci6n de su localizaci6n en la cadena. Un valor positivo indica que se necesita energfa libm para la traflsferencia hacia el agua (es decir, que el segmento es hidrof6bico) yel \'il1or asignado es un fndice de la tantidad de energfa que se necesita. Los picos del fndice de hidropati"a aparecen en la posici6n de los segmentos hidrof6bicos de la secuencia de aminoocidos. Se ilustran dos ejemplos de las proteInas de membrana que se disculen posterionneme en este capftuJo: (A) la g1ucoforina dene un unico segmento que auaviesa 1a membrana en h8i.ce a y un pica col'TeSpOndiente en el test de hidropat!a: (8) Ia baeteriorrodopsina tielle siete segment05 que atraviesan la membrana en hBice a y siele picos correspondientes en el gr.Uico de hidropalfa (Adaptado de D. Eisenberg. Annu. Rev. Biochem. 53:595-624, 1964.)

520

Capftulo 10: Estructura de la membrana

ESPACIO 200) EXTRACELULAR

ClTosal

Esta estructura de muJtipaso transmembrana se observa en las poritlas, unas protefnas que trataremos m
Las protefnas de membrana pueden solubilizarse

ollgosacllri~os

8H

Figura 16-17 Unatfplcaprotefna transmembrana de "paso dnlco". N6tese que 1a cadena polipeptIdica alraviesa la bicapa lipfdica en fonna de h~lice (l dextr6gira y que tanto las cadenas de ollgosacarido como los enlaces disulfuro se hallan en la superfidc no citos61ica de 18 membrana, No se fonnan enlaces disulfuro entre los grupos sulfhidrilo localizados en el domino dtoplasm
y purificarse mediante detergentes9 En general, las protefnas transmembrana (y tambien algunas otras protefnas fuertemente unidas a la membrana) pueden ser sotubilizadas unicamente par medio de agentes que rompan las asociaciones hidrof6bicas y destruyan la bicapa lipfdica. De entre estos compuestos que alteran las propiedades bioquimicas de la membrana. los m~s utiles son los detel'gentes. pequenas moleculas anfipaticas que tienden a fonnar micelas en el agua (Figura 10-18). AI mezclarlos can las membranas, los extremos hidrof6bicos de las moleculas de detergente se unen a las regiones hidrof6bicas de la zona externa de las protefnas de membrana. desplazando asf las molecuJas Upfdicas. PueslO que el otro extremo de las molecula de detergente es polar. 1a uni6n detergenl.e-protefna tiende a disolver en agua a las protein as de membrana (a pesar de que algunas moleculas lipfdicas inl.ensamente asociadas a las prolefnas quedan unidas a estos complejos; vease Figura 1O-19). Los extremos polares (hidrof11icos) de los detcrgentes puedell estar cargados (ser i6nicos) como en el caso del dodecil slIl/alo sOdico (50S. de Sodium Dodecyl SuJfate~) 0 no cargados (ser no i6nicos) como en el caso de los delergentes de tipo Trit6n. En la Figura 10-20 se presenla la estructura de estos delergentes de uso comun. Con delergemes i6nicos fuertes como el 50S, pueden solubilizarse incluso las protefnas de membrana mas hidrof6bicas. 10 cual permite su analisis mediante electroforesis en gel de poliacriIamida con SDS (vease Capftulo 4), un pro· cedimiento que ha revolucionado el estudio de las protefnas de membrana. AJ Prote{nas de membrana

rii~~~~;J

cola hidrol6bica

grupo de e.be!ll hldrofilico

~ 10-18 Miceladedete'1lenleen el agua, vista en secc:16n transversal. Las moltkuias de detergenle son . anfip4ticas debido a que lienen un extremo polar y otro extremo no polar.

521

+

prolelna de membrana

mice'., de detergen'e

'"' una bicapa llpldica

mon6me,os de dele,gente

Figura 10-19 SolubUizaclcSn de protefnas de membrana con un dctergente suave. EI detergente desbarata la estructura de la bicapa lipfdica y coloca las protefnas en solucicSn en forma de complejos protefna-Ifpido-detergente. Los fosfolfpidos de la membrana tambien se solubilizan por el delergente.

J +

compIe;o hidrosoluble de protelna·llpido-delllrgenle

mk:eln solublOi

mixu, oe

lipido-de,e,gente

unirse a sus "nucleos hidrof6bicos", e5(OS dctcrgentes fuertes despliegan (desnaturalizan) las prolefnas, inactiVlindoLas y por tanto, haci~ndolas no utilizables para esrudios funcionaJes. No obstante, las protefnas pueden ser f~cilmenle purificadas en su forma desnaturalizada por el 5DS. y en algunos casas, aI eliminar el detergente, las prolefnas purificadas pueden ser renaruralizadas. con recuperaci6n de su actividad funcionaJ. Muchas protefnas hidroC6bicas de membrana pueden ser solubiJizadas y posteriormente purificadas en forma activa, a veces complcl'amen£e nomlal, mediante el uso de dctcrgentes suaves, como el Trit6n X-IOO, que se une a los segmentos de la prote(na que atraviesan 1a membrana. De eSla manera se pucden reconstruir sistemas de protefnas de membrana funcionalmente acrivos a partir de sus componentes purificados, 10 que proporciona un poderoso medio de am1lisis de la activtdad de dichos sistemas.

CHr-{HJ CHj

CH,

I

CH]-~-CHj

:J'C''iH

'(H H, H,

Ellado citoplasrnatico de las protefnas de membrana se puede estudiar en "fantasmas" de eritrocito 10 Se tiene mds informaci6n de la membrana plasmatica del gl6bulo rojo hllmano (Figura 10-22) que de cualquier otra membrana eucariola, 10 cual es debido a dis· timas causas. Los gl6bulos rojos se pueden oblener en gran Illimero (por ejcmplo de los bancos de sangre) y cstan relativarnente poco contaminados por otros Iipos celulares. Dado que no ticnen ni !lucleo n.i organulos intracelulares. la unica membrana que poseen es la membrana plasm
Capitulo J0: Estructura de la membrana

H docedillulfato sOdico

Trit6n X·1OO

(SOS)

Figura 10-20 Estrueturadedos detergentes utl1lzados habltualmcnle. EI dodecil sulfalO s6dico (SDS), un detergenle ani6nico, y elTril6n X-IOO, un delergente no i6nico. La porci6n hidrof6bica de cada delergcnte se muesrra en verde, y la porci6n hkIroffiica en azuL OWrvese que la zona marcada entre corchetes del Trit6n X·lOO se repite unas ocho

,.."..

ATP_NIl··K·

• CrrOSOL

'""!!~"~~""S' '''''''] ~Pt tU. .... ~ """ hptd~

~ ill:'"

protelnll. de membrane aolubilizadas

~ , .\

:.

~

-:

"

'.,

.,' I .

.. ", ,

mlCele. de deterl18nt, ~ monomerol

-)ffi"·; + :~~'(: :;~I:' .1

mlcel.. de Upido-detergenle

•

t.

~.

:. ,J PURlFICACION DE

:'JI/!K,' - - - - . I

EliMINACION DEL DETERGENTE

'!flit,: AQICION DE FOSFOl!PlOOS lm~cl&dos

det... gento)

plasmlhica de la mayorla de las celulas

animales; uliliza la energfa de hidr6lisis delATP para bombear Na' hacia fuera de la celula y K' hacia el Interior, como se discute en el CapftuJo 11 .

AlP... Ne'-K'

,~:;~"

'"

:""" .....

..

Figura 10·21 U50dedetergentes suaves parasolubUizaT. punDcary reconstltuir slstemu de protefuu de membrana fundonales. En esle ejemplo se purifican molOCulas funcionales de la ATPasa Na'-K' y se incorporan a vesiculas de fosfolfpidos. La ATPasa Na'·K' es una bomba i6nica que se halla presente en la membrana

eon

,,·r.

.... .

o

('-----

.. ' ,

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•

"J.'

mice'•• de delergenta .. mon6merOi

AW... N.'-K' i_po.oDd
das iflvertidas (Figura 10-23), es posible estudiar por scparado los ladas extcmo e

interno (citoplasmdticol de la membrana. EI usa de los fanlasmas de eritrocito soldados y no soldados hizo posible demostrar por primcra vez que algunas prou:fnas de membrana atraviesan la bicapa Iipfdica (vease mAs adelante) y que la composici6n lipfdica de las dos mitades de la bicapa es diferente. Estos hechos, al igual que muchos principios b:isicos demostrados iniciaLmente en membranas de eritrocim, se han generalizado a las membranas de las celulas nucleadas. Flgun 10-22 FJectronmicrognft'. de barrido de eritrocltos humllIIOI. Las celulas deReR una fonna bic6Rcava y carecen de n"c1eo. (Por cortesfa de Bernadette Chailley.l

Prote(nas de membrana

523

~

·

:

fentume permeable

~C <SOLOAOO • fantuma aoldaclo <0

USIS HIPQTONICA

'Ill....'

vulcul.. vuell" del reds

la o riemaci6n" de una proreina de membrana puede delerminarse de varias O1aneras. Una de elias consiste en utiJizar un reactivo marcador (por ejemplo, uno que comenga una marca radiacliva 0 fluorescenle) que se una covalen· temenle, y que sea soluble en agua, es dedr, que no pueda penelrar en la bicapa. por 10 que 5610 se unira a grupos espedficos del lado asequible de la membrana. A conlinuaci6n, se solubilizan las O1embranas can un detergente. se separan las protefnas por eleclroforesis en gel de poliacrilamida can SDS. las protefnas marcadas se deteclan ya sea por su radiactividad (mediante autorradiograffa sobre gel) 0 por su fluorescencia (exponiendo el gel a luz uluaviolela). Ulilizando este sistema de marc;aje vectorial es posible determinar c601o se halJa orientada una prolefna de membrana en dicha membrana. delectada como una banda sobre el gel: par ejemplo, si se marca lanto desde ellado externo (cuando se marcan cclulas intactas 0 fantasmas con la membrana soldada) como desde el lado inlerno (citoplasmatico, cuando se marcan vesfculas invertidas). debe ualarse de una prolefna transmembrana. Una via alternativa a ~sta consiste en exponer tanto la superficie eXlerna como la superficie imerna a enzimas proteoIflicas que no atraviesen la membrana: si una protefna queda parcialmenre digerida por eSle lralamienlo de ambas superficies, debe trararse de una prolefna rransmembrana. Ademas, para determinar si una zona especffica de una prolefna lransmembrana esra expuesta a un lado u otro de la membrana, se pueden ulilizar anticuerpos marcados que se unen unicamente a una determinada reo gi6n de la protefna. Al estudiar las protefnas de la membrana plasmMica del gl6bulo roje humano mediante electroforesis en gel de poliacrilamida Call SDS, se dctectan aproximadamente 15 bandas proteicas principales, cuyos pesos moleculares oscilan entre 15000 Y250 000. Tres de estas protefnas -Ia espectrina, la gillcoforina y la banda 3- constituyen mas del 60% (en peso) de la protefna lotal de la membrana (Figura 1O-24). Cada una de eslas Ires prolefnas esla dispuesla en la membrana de diferellle manera. Por clio las utilizaremos como ejemplo de las Ires maneras principales conocidas en que las proteinas se asocian can las membra· nas, no ~Io en los gl6bulos rojos, sino lambien en otros tipos celulares.

Figura IO-Z3 Preparacl6n de fantasmas de eritroclto, soldados y no soldados. y de vesiculas Ndel derecho" y"del reves". Tal como se ha indicado, los erilrocitos se rompen en un unico punto, produciendo fantasmas con un solo agujero. Las vesfculas mas pequei'ias se producen rompiendo mecanicamente los ranlasmas; la orientaci6n de 13 membrana en eslas vesfculas puede ser lanto con la earn exterior original hacia el exterior 0 vueha del re~. dependiendo de las condiciones i6nicas ulilizadas durante el procedirnienlo de rotuta.

M

La espectrina es una prote(na del citoesqueleto asociada

no covalentemente a la cara citoplasmatica de la membrana del eritrocito ll Muchas de las moleculas de proleina asociadas con la membrana del eritrocilo humano son prolefnas perifericas de membrana asociadas con eJ lado citoplasmalico de la bicapa Iipfdica. la mas abundante de eslas proteinas es la especlrina, una barra larga. delgada y flexible, de aproximadamente 100 nm de longitud, que consliluye aproximadamenle e125% de la masa total de las protefnas aso· ciadas a la membrana (unas 2,5 x lOS copias por celula). Constituye el principal componente del entramado proteico (el ciroesquefelO) que se extiende por el in524

Capftulo 10 : Eslructura de la membrana

.....

molecular aproximado

/ ' espectrin. (l espectrin. II ..........oquinna

prolelne 100 000 JO 000 82

band. 3 glucoforffUI -proteln.a banda 4, 1

ooo-ii

'" 000

'A'

--lI

-.etin.

'81

Figura 10-24 Patron de electroforesls en gel de poUacrlJamlda con SOS de las proternas de la membrana de gJ6bulos rojos humanos. EJ gel en (AJ esta teilido con azul de Coomassie. Fl dibujo {BJ indica la posici6n en el gel de a1gunas de

las prOleinas mayoritarias; la gJucoforina se muestra en color roja para dislinguirla de la proteina banda 3. En el dibujo se han omitido olms bandas del gel. La gran cantidad de carbohidralOs de las molecu.las de glucoforina retarda so migraci6n, por 10 que lie desplazan casi tan lentamente como las molecutas de la protefna banda 3, que son mocha mayores. (A, porconesla de Ted Steck.l

CAOENAo

eaOH

union flellible entre dom;niOI

domlnlo de 106 llmlnokldOI de longllud

CAOENAII (A)

Flguna 10-25 Mole.:ullU de especuina de eritrocltos humanos. La prOle£na esl<1 dibujada esqucmaticamente en (A) y tal como se ve al microscopio elecu6nico cn (B). Cada heterodfmcro de espectrina consiste en dos cadenas polipeplfdicas antiparalelas, flexibles y Iigeramente emrelazadas, !Iamadas 0y~, que se unen entre sf mediame multiples enlaces no covalentes que se presenlan incluso en ambos extremos. Ala izquierda esla el extrema "cabeza" fosforilado, donde se asocian dos dfmf'rns, formando un tetramero. Tanto la cadena a como la cadena ~ eSldn compuestas principalmente de dominios repetidos de 106 aminoacidos de longilud. En (8) las mol&:ulas de espectrina se han sombreado con platino. (A, adaplado de D.W. Speicher y V.T. Marchesi, Nalure311:177-180, 1984; 8, porcortesfa de D.M. Shotton, can penniso de D.M. Shotton, B.E. Burke y D. Branlon,!. Mol. Bioi. 131:303-329, 1979, CAcademic Press Inc.lLondon) Ltd.)

'B!

l00nm

terior de la membrana celular del eritrocito, rnanteniendo la integridad eSlructu· ral y la forma bic6ncava de su membrana (vease Figura 10-22): si se ext rae el dtoesqueleto de los fantasmas de erilrocilo en soluciones de baja fuerza i6nica, la membrana se fragmenta formando pequefias vesfculas. La espt::cuina es un heterodfmero formado por dos grandes subunidades estructuralmente similares (Figura 10-25). Los heterodfmcros se autoasocian cabeza con cabeza, formando lerrameros de 200 nm de largo. Las colas de cinco o seis tetrameros se enlazan entre sf mediante su uni6n a filamentos conos de actina y a otras protefnas ciloesquelthicas (entre eUas, la prote/na banda 4,1) formando un "complejo de uni6n". EI resullado final es una red deformable que se extiende pOl" tulia la superflcie citoplasmalica de la membrana (vease Figura 10-26). ESle citoesqueleto basado en la espectrina permite al eritrocito resistir el esrres que sufre su membrana a medida que es empujado a traves de los esrrechos capHares. Ralones y humanos que poseen anomalfas geneticas en la espec· trina, presentan anemia y sus gl6bulos rajos son esfericos (en lugar de c6ncavos) y anormalmente fragiles; la severidad de la anemia se incrementa con el grado de deficiencia de la espectrina. La protefna que es la principal responsable de sujetar el cilocsqueleto de espectrina a la membrana plasm<1tica del eritrocito se identific6 mediante la uni6n de cspectrina marcada radiaclivamente a membranas de gl6bulos rojos de las que se habfan retirado espectrina y orras protefnas perifericas. Estos experimentos demostraron que la uni6n de la espectrina depende de una gran prolefna intracclular de uni6n Uamalia anquJrlna, que se une tanlO a la espectrina como al dominio dloplasrn<1tico de la protefna transmembrana banda 3 (vease Figura 10-26). La anquirina conecta algunas moleculas de la protefna banda 3 a la espectrina, unieodo asf la red de espectrina a la membrana; tambien reduce notablemente la velocidad de difusi6n de las moleculas de banda 3 en la bicapa Iipfdica. EI ciloesqueleto de espectrina tam bien se une a la membrana a rraves de otro mccunismo que dcpende t.I~ la prolefna banda 4,1 mencionada con anterioridad. Esta prolerna, que se une a la especrrina y a la actina, tambien se une al dominio ciloplasmatico de la proterna banda 3 y a la gillcoforina, la oua protef· oa transmembrana mayoritaria en los eritrocitos. Por debajo de la membrana plasmatica de las celulas nucleadas exiSle una red de dtoesqueleto analoga a la descrila, pero mucho mas elaborada y compticada. Esta red, que constituye la regi611 c..:ortical (0 c6rtex) del dlOplasma, es rica

161

Protemas de membrana

525

----""

.etin.

protefna banda 4,1

aducina

npectrina

tropomfo.in.

lAl

gJucoforina 100nm

Agura 10-26 El cltoesqueleto basado en la espectrlna dellado cltoplumitJco de la membrana del erltroelto humano. Dibujo esquemlitico (A) y electronmicrograffa (B). La disposid6n que se muestra en (Al se ha deducido principalmenle a partir de estudios sobre las interncciones in v;rro de protefnas purifieadas. Los drmeros de espectrina asociadas cabeza-concabeza forman tetrimeros que se haJlan unidos formando una red por medio de complejos de uni6n compuestos de conos filamentos de actina (que cOnlienen unos 13 mon6meros de actina), tropomiosinaque probablemente determina 13 longitud de los filamentos de actina, proteina banda 4, I Y aducina (aumentado en la casilJa de la Lzquierda). El citoesqueleto estli unido a la membrana mediante la W1I6n indirecta de los letrlimeros de espectrina a algunas protcfnas banda 3, a trav~s de moleculas de anquirina y tambi~n por medio de la uni6n de la proterna banda 4,1 ala glucoforina {no se muestra]_ La electronmicrograffa de (B) mueslra eI citoesqueleto de la earn clloplasmlitiea de la membrana del eritrocito despu& de su fijaci6n y tinci6n negativa. La red de espectrina se ha estirado a prop6sito para pennitir observar los detalles de su estruClura; en la d!lula normal, la trama mostrada debe ocupar unicamente una decima parte de esta lirea. (B, por cones(a de T. Byers y D. Branton, Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 82:6153·6157, 1985.l

en filamemos de actina que at parecer se unen a la membrana plasmatica de numerosas maneras, En el c6rtex de c~lulas nucleadas tam bien existen proternas estructuralmente hom610gas a la espectrina, a la anquirina y ala protefna banda 4,1, perc su organizaci6n y funci6n no son tan conocidas como 10 son en los eritrocitos. El citoesqueleto cortical de celulas nucleadas y su interacci6n con la membrana plasmMica se discuten en el Capftulo 16.

La glucoforina attaviesa la blcapa Iipfdica del gl6bulo mjo, fonnando una h~lice a senciUa lO La giucofortna es una de las dos protefnas mayoritarias que se hallan expuestas

en la superficie externa del g16bulo rojo humane y fue la primera prote!na de memb.{ana de la que se pudo determinar su secuencia campleta de aminaaci· dos, Como la prore(na modele nansmembrana de la Figura 10-17, la g1ucoforina es una pequef\a glucopcotefna transmembrana (131 residuos de aminoacido) de paso unico que se halla colocada con la mayorta de su masa en la superflcle ex· terna de la membrana, donde se localiza su cola amino terminal hidrofflica. En esta zona de la protefna se hallan unidos todos los carbohidratos (aproximadamente unos 100 residuos de azucar distribuidos en 16 cadenas laterates distintas de oligosacaridos), que representan el 60% de la masa total de la molecula. De hecho, la gran mayoria del total de carbohidratos de superficie del eritrocito (inc1uyendo mas del 909b del Acido siAUco, y por 10 tanto la mayor pane de la carga 526

Capftulo 10: Estructura de la membrana

181

negaliva de superficie de la celula) estl1n unidos a moJeculas de glucoforina. EI extremo carboxilo terminal hidrofflico de la glucoforina esll1 expuesto hacia el citoplasma. mientras que exisle un segmento a-helicoidal hidrof6bico de unos 23 aminol1cidos de longitud. que atraviesa la bicapa no polar (vease Figura 1O-16A). A pesar de que en cada celuJa hay ml1s de un miJI6n de moleculas de glucoforina, todavfa se desconoce la funci6n de esta g1ucoprotefna. De hecho, los individuos cuyos erilrocilos carecen de esta protefna parecen estar pcrfectamentc sanos. Aunque la g1ucoforina es exclusiva de los gl6bu[os rojos, su estructura es representativa de una c1ase frecuenle de prmemas de membrana que atraviesan la bicapa lipfdica en forma de helice a. Por ejemplo. muchos receplOres de superficie penenecen a esta c1ase de prote{nas.

prolel~

Ir.n.membran.

direa:i6n de frllCl.UrI

bicapa IIpldica

FRACTURA CON CUCHILLA

La banda 3 de la membrana celular del eritrocito es una protefna

de membrana multipaso que cataljza cl cotransporte ani6nico 12 A diferencia de 10 que sucede con la glucoforina. se sabe que la protelna banda 3 desempena un papel importante en la funci6n de la celula. Su nombre deriva de la posici6n relativa que ocupa respeclo a las otras prote{nas de membrana en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (vease Figura LO-24). Como la glucoforina. la banda 3 es una protefna transmembrana. pero de mUltiple paso, que atraviesa la membrana en una confonnaci6n altamente plegada: at parecer la cadena polipepddica (aproximadamente 930 residuos de amino<1.cido de longitud) atraviesa la bicapa hasl"a 14 veces. eada gl6buJo rojo contiene aproximadamente 10' cadenas polipeptfdicas banda 3. que {onnan dfmeros en la membrana. La principal funci6n de los gl6bulos rojos es la de transportar O~ desde los pulmones hasta los tejidos y ayudar al transporte de CO 2 desde los tejidos hast a los pulmones. La prolefna banda 3 es de importancia crucial en [a segunda de estas funciones. EI CO 2 es 5610 levemenle soluble en agua y por ello es transpor· tado por el plasma sangufneo en forma de bicarbonato (HCO;>. que se fonna y se rompe dentro de los g16bulos rojos par una el12.ima que catali.za la reacci6n HzO + CO z H HCOi + H'. La protefna banda 3 actua como un transportador de aniones. que pennite que el HCO; cruce la membrana intercambiandose can CI-. A) hacer que la membrana del eritrocito sea libremente permeable al HCOi. este transponador incrementa la cantidad de CO2 que la sangre puede lIevar hasta los pulmones. Tras aplicar la tecnica de la criorractura (por la cuallas celulas son congeladas en nitr6geno Hquido y el bloque resultante de hielo se fractura can una cuchilla) pueden verse at microscopio e[ectr6n.ico las protefnas banda 3 como par-

car. P

cara de IrllCl.ura E

carl de fractura P

al detcubierto

al descubierto

Figura 10-27 EJectTonmlerograffa oblenJda tras erlorractura. EI dibujo muestra c6mo esta lcemea orrece Im~genes del Imerior hidrorobico de 1a mitad eitoplasm~liea(0 protopJasmatica) de la bicapa (denominada cara P) y de la milad extema de la bicapa (denominada cara E). Despu~s del proceso de criofractura ilustrado aquf, IllS l;:llrllS de rractura se mctalizan con platino y carbOn, por digestion se elimina el material org~nico y la r~plica de platino resullame se observa al microscopio electr6nico (~ase tambi~n Figura 4-27).

Rgura 10-28 Electronmlcrograffa de crio£raclun. de g16buJos roJos humanO$. Observese que la rlf'nsidad de las partfculas inlramembrana es superior en la cara protoplasmatica (P) que en Is canl externa (E). (Por cortesia de L Engstrom y D. Branton.)

car. E

Protemas de membrana

527

plano de la fraetura 81lua eldracelular

_.do

cOr"Qelada

citoplasma

_.do

congailldo

gJucofOliIlll

CITOSOL

trw/as ;lItramembralla diferenciadas. HI plano de la fraclUra tiende a pasar a trav~s

de la mitad hidrof6bica de los Ifpidos de la membrana, separando las membranas en sus dos monocapas (Figura 10-27). Las caras de !raclura expuestas se metalizan con platina, y la r~plica de platino resultame se observa al microscopia eleclr6nico. Cuando se estudian de esta manera,las membranas celulares de los eritrocitos humanos aparecen salpicadas de particulas intennembrana de tamano relativamente homog~neo (7,5 nm de diametro) y dislribuidas al azar (Figura 10-28). Se cree que estas partfculas son principalmente mollkulas de banda 3: cuando se reconstituyen bicapas Iipfdicas sinteticas con mollkulas de protefna banda 3 y las bicapas se fracturan, se observan estas tfpicas particulas inter· membrana de 7,5 run. La Figura 10-29 ilustra la raz6n por la que par criofractura de membranas celulares de gl6bulos rojos se observan las mol~ulas de banda 3 pero probablememe no las moleculas de g1ucoforina. En el Capftulo II se considera c6mo una protefna transmembrana como la banda 3 puede, en principio, pennitir el transporte pasivo de mol~culas polares a traves de la bicapa no polar. Pero para un detallado conocimiento de c6mo funciona realmente una prote(na transportadora se necesita la infonnaci6n exacta sabre su disposici6n tridimensional en la bicapa. La primera protefna de transporte en la membrana plasmatica de la que se conociemn estos dctalles es una protefna denominada bacteriorrodopsi"a, que en la membrana plasmatica de ciertas bacterias aCllla como una bomba de protones (H') activada por la luz. La estructura de la bacteriorrodopsina es similar a la de muchas Olras proteinas de membrana y merece que se Ie dedique un breve par~ntesis aquJ.

La bacteriorrodopsina es una bomba de prolones que atraviesa

la bicapa en forma de siele helices 0. 13 La ~membrana purpura" de la bacteria Halobacterillm Italobillm es una mancha especializada de la membrana plasmatica Que coniiene un unico tipo de molecula proteica,la bacteriorrodopslna (Figura 10-30). Cada mollkula de bacteriorrodopsina contiene un unico grupo Que absorbe la 102, 0 crom6£oro (denominado retina!), Que da a la protefna su color purpura; el retinal est<'i relacionado con la vitamina Ayes identico al crom6foro encontrado en la rodopsina del bastoncito retiniano de los venebrados (se discute en el CapflUlo 15). El retinal estA unido covalentemente a un residuo de lisina de la proterna; cuando es activado por un fot6n de luz, el crom6foro excitado cambia inmediatamente de forma provocando una serie de pequenos cam bios conformacionales en la protefna, 10 que da lugar a la transferencia de uno 0 dos H' desde el interior hasta el exterior

528

CapftuJo 10 : Estructura de la membrana

Figura 10-29 Probables destlnos de las molocuJas de g1ucoforina y de 10 protema banda 3 de la membnna del eritroc:llo durante 13 criofractura.

Cuando la bicapa Iipfdica se parte, 0 la milad inlerior 0 la milad exterior de

cada protefna trnnsmembrana es extrafda de la monocapa congelada a la que esta asociada; la prolefna tiende a pe.nnanf"Cf'r en 18 monoc:apa en 18 que se haUa la mayor parte de su volumen. Por esta raz6n, las molkulas de la protefna banda 3 nonnalmente quedan asociadas a la earn de (ractura interna (Pl; puesto que tienen suficicnte masa por encima del plano de (ractura, pueden observarse como l>artfculas intramembrana. NormaJmente las mol&:ulas de

glucoforin8 pennanecen unidas a la cara de (ractura exterior (El, pera se cree que sus colas ciloplasmdticas lifm!'n una masa insuficienle para Que sean vistas.

F1sun 10·30 D1bujoesquemliueode la bacteria lIalobat:rerium haJoblum que muestra las manchas pWpUJ'll de

membrana que conUenen las molecutas de bacteriorrodopslnL Eslas bacterias, que viven en aguas s:tlohre.o; c10ncle se hallan expuestas a grandes cantidades de luz solar, han dcsarrollado una gran canlidad de protefnas activadas por la luz, inc1uyendo la bacteriorrodopsina que es una bomba de protones activada por la luz presente en su membrana plasmlltlca.

•

Figura to·31 Estructura tridimensIonal de una moikub de

CITOPlASMA

'om

'"-==:

baeteliorrodopsina. La cadena pollpeptfdlca cruza Ja blcapa en forma de siete hilices a. Se muestra la localizaci6n del crom6foro y el probable camino que siguen los protones durante el cido de bombeo activado por la Iuz. Se cree que al ser activado por un fot6n. el crom6foro pasa un II' a la cadena lateral del acido aspartico 85 (esfera rosa marcada 85). Posteriormente, se cree que otras tres transrerencias de H' completan el cicio -desde el addo aspartico 85 a1 espacio extraeelular, dt:l>de eI acillo asp4nlco 96 (csfem rosa marcoda 96) a1 cromMoro y desde el dtosel al addo aspMtico 96 (vt!ase

Figura 14·36). (Adaptado de R. Henderson et al). MoL BioL 213:899929,1990.)

ESPACIO

EXTRACElULAR

• de la ceJula (~ase Figura 14·36). Baja luz brillante cada mol~cula de baeteriorro-

dopsina puede bombear varios cientos de protones por segundo. La transferencia de protanes impulsada pot la luz establece un gradiente de H- a trav~ de 1a membrana plasm,h..ica, que a su vez impuJsa la sfntesis de ATP pot una segunda proteina de la membr:ma plasm:1lica de In celuJa. Asf 18 bacteriorrodopsina cs

parte de un transductor de energfa solar que provee a la relula bacteriana de energfa. Para poder comprcnder la funci6n de una protema transmembrana multi· paso a rtivel molecular, sera. necesario locali~r con precisi6n cada uno de sus atamos, 10 cual generalmentc requierc estudios de difracci6n de rayos X de grandes cristales tridimensionales de In prolefna. Dada su naturaleza anfipMica.

estas prote(nas son extremadamente dif(Ciles de cristalizar. Sin embargo, las numerosas molk:ulas de baeteriorrodopsina de la membrana purpura estan ordenadas en forma de un cristal bidimensional planar, 10 que ha hecho posible determinar su estructura tridimensional y su orientaci6n en la membrana, hasta una resoluci6n de 0,3 nm, por medio de una aproximaci6n altemativa que usa una combinaci6n de microscopia electr6nica y an:llisis de difrncci6n clcctr6nica. Esle procedimiento (denominado crislalograjIa elecrronica) es anl1Jogo al estudio de los cristales tridimensionales de proteinas solubles mediante el anaJisis de la difracci6n de rayos X. aunque por dicho m~todo se obtienen menos detalies estrueturales. Como se i1ustra en la Figura 10-31, estos estudios han demostrado que cada molk:ula de bacteriorrodopsina estl1 plegada en siete Mlices (l densamente empaqueladas (cada una de unos 25 aminoacidos) que pasan en angulo mas 0 menos recto a traves de la bicapa lipfdica. La bacteriorrodopsina es un miembro de Wla gran superfamilia de prolefnas de membrana, de estructuras similares pero can funciones diferentcs. Asf por ejemplo, la protefna receptora de luz, rodopsina, de los bastones de la retina de vertebrados y muchos receplores proleicos celuJares de superficie que se unen a mollkulas mensajems extraceluJares. tambi~n est~ plegados en siete hilices (X

Protefnas de membrana

529

'81 mon6mero. de perina

membrana bactarlana aKtarna

J

transmemhrana. Estas protefnas no actuan como transportadores sino como transductores de sefiales; cada una responde a una sefial extracelular activando otra protefna dentro de la c~lu1a, la cual genera una sefial qufmica en el dtosol. como se discute en el Capftulo 15.

Las porlnas son prote(uas transmembrana formadoras de

canales que cruzan la membrana en forma de un barril JJ 14 Como se discuti6 con anterioridad, algunas protefnas transmemhrana multipaso no tienen sus segmenlOS transmemhrana organizados en forma de h~lices (l sino de una lamina ~ cerrada (un barril ~). Los ejemplos mejor estudiados de este tipo de prote(n~" "nn las porinas. que se encuentran en la membrana externa de muchas bacterias. Estas protefnas pertenecen a un pequeno grupo de protefnas transmembrana cuya estruetura at6mica ha sido determinada completamente mediante eristalograffa de rayos x.. Muehas baeterias, entre elias £ coli, tienen una membrana extema que rodea su membrana plasmatica (v&se Figura 11-14). La membrana externa esta perforada por varia!> parinas fonnadoras de canales. 10 que pennite a detenninados solutos h..idroffficos de hasta 600 daltons difundir a tra~ de la bicapa Lipfdica externa. Las porinas (y las protefnas fonnadoras de canales relacionadas estrueturalmente con elias de la membrana de mitocondrias y cloroplastos) tienen una lamina ~ en tugar de una helice ex como estructura transmembranosa primordial. La estructura at6mica de una porina aislada de la membrana externa de una Meteria rotosint~tica se determin6 mediante cristaJowaffa de rayos X en J 990. Consiste de un trfmero en el que cada mon6mero fonna un barril ~ tubular, que atraviesa la bicapa Iipfdica y canriene un canallieno de agua en su centro. EI barril estil formado a partir de 16 cadenas antiparalelas de l&nina p, que se curvan 10 suficiente como para fonnac una estruetura eiUndrica (Figura 10-32). Cadenas palaces laterales revisten el interior del canal aeuoso, mientras que cadenas no polares se proyectan desde el exterior del barril interactuando con el nucloo hidrof6bico de la bicapa lipfdica. 530

Capftulo 10: Estructura de la membrana

FlgurnlO-32 Estruetura trldlmenalonal de un trimero de porto. de Rhodobtu:ter CApsulahu

detennlnado porcri$Wognffa de rayos X. W Cada mon6mero consiste en un bamlll de 16 cadenas

antiparalelas que (orman un canal transmembrana Ileno de agua. (B) Los mon6meros se asocian apretadamente formando trfmeros, los cuaies poseen tres canales separados para la difusi6n de solutos pequefios a travtls de la membrana bacteriana eXlema. Una larga espiral de la cadena polipeptfdica (se muestra en raja), que conecta dos cadenas Il. se proyeeta hada eJ interior del lumen de carla canal. estrech4ndolo hasta fonnar una secci6n tranlIversai de 0,6)( 1nm. V\daptado de M.S. Weiss et al.• FEBS Leu. 280: 379-382.1991.)

Figura 10·33 Estrnctura tridimensional del centro de reacd6n rotoslnt~tlcode la bacteria Rhodopseudomonas viridis. La estnlctura se determin6 par amilisis de difraccl6n de rayos X de cristales de este complejo proleico lransmembrana. EI complejo esta formado par cuatro subunidades, 1.. M, H Y un cltocromo. Las subunidades L y M forman el nudeo del centro de reacci6n y cada una contiene cinco helices (l que atraviesan la bleapa Iipfdica La localizaci6n de varias coenzimu rranspanadoras de electrones se muestra en negro. (Adaplado de un dibujo de J. Richardson, basado en datos de J. Deisenhofer, O. Epp, K. Mild, R. Huber y H. Michel, Nature318:618-624, 1985.)

Las prote(nas de membrana acwan a menudo

como grandes complejosl5 Hasta la fecha la mas compleja estructura de una protefna transmemhrana que ja· mas ha sido cstudiada mediame crislalograffa de rayos X es el centro de reacci61l !otosinrerico hacleriano, cuyn estruclura at6mica se defini6 en 1985. Los resultados de estc anaIisis fueron de importancia general en la hiologfa de memhranas par· que dcmostraron par primera vez que multiples polipeplidos pueden asociarse en una membrana formando una compleja maquinaria proteica (Figura 10·33). En el Capftulo 14 disculimos c6mo acluan eSlos complejos folosintelicos capturando la energfa lumfnica y us:1ndola para bombear H' a traves de la membrana. A menudo las prole{nas de membrana estan dispuestas forrnando grandes complejos, no wlo para captar varias formas de energia, sino tambien para transducir las senaJes extracelulares en intracelulares (10 Cllal se discute en el Capitulo 15).

Much.. protemas de membrana difunden en el plano de la membrana l6 Como ocurre con los Upidos de membrana, las pWle£nas no saltan (j1ip·f1op) a traves de la bicapa, sino que giran alrededor de un eje aproximadameme perpendicular al plano de la bicapa (difwi6n rotaciona/). Ademas, muchas prolernas de membrana son capaces de desplazarse lateralmente por la membrana (difusidn latera/). La primera evidencia de que algunas prote£nas de la membra· na plasmaLica son m6viles en el plano de la membrana fue obtenida en 1970 mediante un experimento en el que se rusionaron artil'icialmente reluJas de rat6n con cl!lulas humanas, produciendo cl!luJas hibridas (heterocorionres). Para Protefnas de membrana

531

distinguir las protefnas de membrana plasmatica de rat6n de las humanas se utilizaron dos anticuerpos con distinlO marcaje. Aunque al principio las proteinas de rat6n y las humanas estaban confinadas a su propia mitad del heterocarlome reclt!n formado, las dos ciases de protefnas difundieron y se mezciaron ocupando. a la media hora, toda la superficie del heterocarionte (Figura 10-34). Poco despues Sf obtuvieron otras evidencias de la movilidad proteica de la membrana gracias al descubrimiento de los procesos lIamados agrupamiento (patching) y formaciDn de caperuzn (capping). Cuando los Iigandos. como los anticuerpos. que tienen mM de un lugar de uni6n (par ella lIamados Iigandos mulltlJQlemes) Sf unen a protefnas espedficas de la superficie celular. las proteinas tienden a agregarse. mediante enlaces cruzados, formando grandes grupos (patches), )0 cual indica que las proteinas son capaces de desplazarse lateralmente por la bicapa Iipfdica. Una vez ronnados los agregados en la superficie de una c~luJa capaz de moverse, como un leucocito, son trasladados activamente a uno d~ los palos celuJares. formando una caperuza (0 ~cap", Figura 10-35).

C~LULA

Cl:LULA

DE RATON

~

HUMANA

V

- - protafn. )( de membrana

prolel", de IFUSION CElUlAR membren.

proteloe de membr.n.

AGRUPAMENTo HETEROCARIONTE

protelna Y de membrana

~ adlCi6n d•• nticuerpoe .n~X

1 grupode pfoteinal X

enlic:uerpol lAl contra protelnllS de membrana humane, me«:edo. con

.nlicuerpos I AI contre proteIn. de membf".oe e de rat6n, mercedOI con

nuorescencll leI

•

>-e rodamlna leI

FORMACIONI DE UNA CAPERUZA

tiempo. 0 mlnutOI INCUBACION A 37"C

• tiempo • «l minutos

Figura 10-34 Experimento que muestra 18 mezclade protefnu de membrana

plaMniitica que se produce en dlulu hfbrldas rat6n-humanas. Inicialmente las prolefnas de rat6n y las protefnas humanas est"n con6nadas a sus proplas mitades de la membrana plasmatica del heterocarionte reden fonnado, pero se van entremezclando. Los dos anticuerpos que se usan para visualizar las protefnas se pueden distinguir en un microscopio de f1uorescenda dado que la fluorescefna es verde y la rodamina es roja. {Basado en observadones de LO. Fryey M. Edidin,J. Cell SCi. 7:319-335, 1970, con la autorizaci6n de The Company of Biologists.) 532

Capftulo 10: Estructura de la membrana

caperwa de proteIn.. X

Figura 10-35 Agrupamlentoy fonnad6n de una caperuza de una protefna de la superflde a!lular en un leucoclto. Los anticuerpos bivalentes enlrecruzan las molOCulas proteicas a las que se unen. Esto hace que estas moloculas formen grandes grupos, los cuales son arrastrados activamCntC hacla el extremo posterior de la celula y ronnan una "caperuza.· EI. centrosoma, que gobiema la polaridad antero-poslerior de la celula, se mueslra en Ilamllja.

.............. ~ Itt MARCil,

1

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RECUPERA,CI6N

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• 18)

La velocidad de difusi6n lateral de las proteinas de membrana puede medirse utilizando la tecnica de rccllperaci6n de fluorescellcia despues de [Ofobianqueamiento (FRAP, de Fluorescence Recovery After Photobleaching). Habitualmente este metoda camparta el marcaje de 13 proteina de superficie que se prelcnde estudiar. con un Iigando especffico nuorescentc. como un anticucrpo Ouarescentc. (Es imponante que se utilicen los fragmentos monovalenlcs de los anticuerpos, que 5610 poseen un Jugar de uni6n al antfgeno, para evilar la rormaci6n de enlaces cruzados entre moleculas vecinas.) wego, elligando Ouorescente es blanqueado en una pequci'la oirea mediante un rayo l:iser, y se mide el tiempo que tardan las protefnas de membrana adyacentes que transportan mol~ulas de anticuerpo fluorescente no blanqueadas, hasta difundir en el area blanqueada (Figura 10-36). A partir de estas mediciones se puedcn caJcular los cocficientes de difusi6n de la protc(na de superficle celular que habfa sido marcada. Los valores de los coeficientes de' difusi6n para las diferentes prOlefnas de membrana en celulas diferentes son muy variables, pero estan tfpicamente comprendidos entre una decima 0 una centesima parte de los valores correspondientes para las molecuJas de fosfolfpidos de la misma membrana.

Flgun. to-37 Dlagr-ama de una ct!!luJa epilellal en el que see rnuestn. como una protefna de membn.na plasmaUca see haJla connnada en un dominio particular de la membrana, La protcfna A(enla zona apical de la membrana) y la protefna B(en la zona basal y basolaterall pueden dlfundir laleralmenle en sus dominios respeclivos pem no pueden entrar en el Olm, en parte debido a la uni6n celular especial denominada unldn estrecha 0 estanaJ. 19ualmenle, las molOCulas Iip[dicas de la monocapa exterior (no ciloplasml1lica) de la membrana plasmatica, tampoco pueden difundir entre ambos dominios, pem los Irpidos de la monocapa inlerior (ciloplasmatica) s[ pueden haccllu (IIU ~ muestra),

Prote[nas de membrana

BlANOUEO

•

~

I

=

liempo_

Ie)

FIgura 1D-36 MedlckSn de la veJoddad de difusl6n lateral de una prole£na de membrana plasm'tka, mediante la Iknlca FRAP. Una prolefna espec{fica se mares. sabre la superficie de la celula, con un anticuerpo monovalenle nuorescenle que se une sola mente a esta protefna (para simpUficar. no se muestran Olras protefnas). Lucgo se blanquean los anticuerpos de una pequena area ulilizando un biser, la intensidad de 1a nuorescencia se va recuperando a medida que la molOOtlas blanqueadas difunden hada el resto de Ja supert'icie celular y que las moleculas no blanqueadas difunden a la zona iluminada con ell{iser. (Vista lateral en A y superficial en B.) (e) Grllfico que muestra la velocidad de rccupcraci6n, Cuanlo mayor es el coeficiente de difusi6n de la prolefna de membrana, mayor es la velocidad de recuperaci6n.

protei.". A

membrana plasmjllea apical membrana

prOlelna B

pla5m'lice

lat8f1l1

I

Ijmina Dasel

533

Figura 10-38 Tres domlnlos de la membrana plasmdOca de esperma de cobaya, deflnidos medJante antJcuerpos monoclonales. (A) es Ull t:S({ut:llla ul;ll;lspt:rma de cobaya y cada uno de los Ires pares de micrografIas (8), (e) y (0) muestra una tinci6n inmunoOuorescente de superfieie celuJar utilizando diferentes anticuerpos monoclonales (a la derecha) junto a una micrograffa de oontraste de fase de la misma celula (a la izquierda). £1 anticuerpo utilizado en (8) 5610 marca la eabeza anterior del espennalozoide, el de (C) 5610 marea la pane posterior de lacabeza yel de (D) 5610 marca la cola. (Cortesia de Selena Carroll y IA) Diana Myles.)

]

perte anterior de Ie ClIbele

]

de Ie eebeze

perte POlteriw

Las c~lu]as pueden confinar a IIpidos y a protemas en dominios especfficos de la membrana l7 8 reconocimiento de que las membranas biol6gicas son Ou.idos bidimensiona· les constituy6 un gran avance en la comprensi6n de la estructura y de la funci6n de la membrana. Ha quedado claro, sin embargo, que la representaciOn de la membrana como un mar Iipfdico en el cual tOOas las protefnas flotan libremente, es una sobresimplificaci6n. Muchas c~lulas tienen sistemas que les penniten lirnitar sus protefnas de membrana en dominios especfficos de la bicapa lipidica continua. Por ejemplo, en c~lulas epiteliales como las que revisten el intestino 0 los tt1bulos del rif16n, cienas enzimas de la membrana plasmc1lica y algunas proternas de transpone estc1n Iimitadas a la superficie apical de la c~lulas mientras que ouas protefnas se hallan confinadas a las superficies basal y lateral (Figura 10-37). Esta distribuci6n asimetrica de las protefnas es a rnenudo esencial para la funci6n del epitelio, como se discute en el Capitulo II. La composici6n Iipidiea de estos dos dominios de membrana tambi~n es diferente, 10 cual demuesrra que las celulas epiteliales pueden evitar la difusi6n de las moleculas lipidicas y protelcas entre los domlnlos. Experimentos con !ipidos marcados, no obstante, sugieren que s610 estc1n confinadas de esta manera las moleculas Iipfdicas de la monocapa externa. Se cree que la separaci6n tanto de moleculas de prole(na como de moJElculas Jipfdicas se mantiene, aI menos en parte, por las barreras formadas por un ripo especffico de uniones intercelulares (IIamadas wliolles estrechas 0 estancas, discutidas en el Capftulo 19). Esta claro que las protefnas de membrana que forman estas unlones Intercelulares no pueden dlfundir lateralmente entre las membranas que estdn interactuando Una celula tambien puede crear dominios de membrana sin utilizar uniones inlercelulares. El espermatozoide de mamfferos, por ejemplo, es una celula aislada que presenta varias zonas estructural y funcionalrnente distintas delimitadas por una membrana plasm~tica continua. Cuando se observa un espermalOzoide por microscupia de IrllnunoOuorescencla utUlzando dlferemes antlCuerpos que reaccionen con antfgenos de superficie, se constata que la membrana plasmc1tica presenta aI menos tres dominios diferentes (Figura 10-38). En algunos casos, los antfgenos son capaces de difundir dentro de los Iimites de su propio dominio: se desconoce c6mo se evita que abandonen dichos dominios. En los dos ejemplos que se aeaban de considerar, tanto la difusi6n de las moleculas de Ifpidos COIllU la lit: proldnas t::Han cunIinada a domlnlos especlallzados dentro de una membrana plasmatiea continua. Las celulas tambien tienen sistemas mas drnsticos para inmovilizar cienas protemas de membrana. Uno de eUos es[~ c1aramente representado en la membrana pliIpura de Halo-, bacterium. Alii las moleculas de bacteriorrodopsina se ensamblan formando grandes cristales bidimensionales en los que las moleculas proteicas individuales est6.n relativamente fijas unas respecto a las otras; los gnuu.ll:s agrt:K
534

Capitulo 10: Estructura de la membrana

Figura 10-39 euatm sistemas medlante)os cuales se puede restringlr la movUklad lateral de detennlnadas proteinas de membrana plasmll.tlca. Las proteinas pueden aUloensamblarse formando grandes agregados (como en el caso de Ja bacteriorrodopsina en la membrana pUrpura de Halobacterium) W; pueden estar rrabadas por interacciones con agregados macromoleculares del exterior (D) 0 del interior {C} de la celula, 0 pueden interactuar con prOlefnas de la superficie de otra celula (D).

eSle tipo difunden Illuy lentamellt~. VII sisL~ma mas eumlln de rcsrrlngir la movilidad lateral de prote(nas de membrana especfficas consiste en unirlas a ensamblajes macromoleculares del interior 0 del exterior de la c~lula. Hemos visto romo algunas protemas de la membrana del eritrocito estl1n ancladas aI citoes· queleto interior, en OtrOS tipos celulares, las prote(nas de la membrana plasmatica pueden anclarse al ciroesqueleto 0 a la matriz extracelular 0 a ambos. En la Pigura 10-39 se resumen los cuatro sistemas de imnuvilizar prut~inas espedfieas de membrana.

lAl

•

,.,

rei

La superficie celular esta recubierta con residuos de azl1c.ar

l8

Las prote(nas de membrana, por regia general, no sobresalen desnudas al exterior celular, sino que esti1n decoradas, cubiertas 0 escondidas pur carbuhiuratus presenles en la superficie de lodas las c~lu1as eucariotas. Estos carbohidralOS se encuentran en rorma de cadenas de oligosacarido unidas covalenlemente a las prOle[nas de membrana (glucoprote(nas) ya Irpidos (g1ucolfpidos) y como cadenas de polisacaridos de molkulas proreoglucanos inregrales de membrana. Los proteogJucanos, que consisten en largas cadenas de polisacaridos unidas cava· Icntcmente a un nucleo proteico, se encuentran principalmente en eJ exterior celular como pane de la malriz extracelular (discutida en el Capitulo 19); pem en el caso de los proteoglucanos inlegrales de membrana, el nucleo proteico se eXliende a lraves de la bicapa lipfdica 0 esla anclado a la bicapa mediante un g1ucosilfosfatidWnositol (GPl). E1termino cubierra ceJular 0 gJucocdliz se utiliza a menudo para describir la zona de 10 superficic celular rica en ca.rboh.idralos. Esta zona puede ser visualizada por medio de diversos colorantes, como el rojo de rmenio (Figura 10-40), 0 tambi~n por su afinidad a prote(nas que se unen a carbohidralos, Ilamadas lectJnas, que pueden ser marcadas con una tinci6n fluorescente u otro marcador visible. A pesar de que la mayor parte de los carbohidratos est'an unidos a moltkulas inlT(nsecas de la membrana plasmAtica, habitualmente el glucocaliz contiene odem6.s glucoprotcfnos y protcoglucanos que han sido secrctados al espacio cx-

glucocjlil

ciloplasma

Flgum 10-40 lacublertacelular,o g1ucocMiL Electromicrograffa de la superfide de un Iinfocito COnll'lt.~faclo con rojo de rutenio para mostrar la cubierta celular. (Por cortes!a de A.. M. Glauert y G. M. W. Cook..)

nUcleo

200nm

Prolc(nas de membrana

535

glucoprote!nll IfllnSmembrenll

glucoprOlefnll edllOrbida

• • residuo de IlIlIcal

cubier1' celuillf Iglucocjlizl

uacelular y que luego son adsorbidos en la superficie celular (Figura 10-41). Muchas de estas macromohkulas adsorbidas son componentes de la matriz extracelular, de forma que ellJmite donde termina la membrana plasmthica y donde se inicia la mauiz extracelular es s610 una cuesti6n semantica. Las cadenas laterales de oligosacaridos de las glucoprote(nas y de los glucolJpidos son extremadamente diversas en cuanto a la organizaci6n de sus azucares. A pesar de que habitualmente contienen menos de 15 residuos glucfdicos, eSlos residuos eSlan a menudo ramificados y los azucares pueden estar unidos entre sf mediante diversos enlaces covalentes. Esta distribuci6n es c1aramente diferente de la de los residuos de aminoacidos de una cadena polipeptidica, que eslan unidos por uniones peptfdicas id~nticas. AI unirse entre sf, tres residuos gIucfdicos pueden incluso formar cienlos de lrisacciridos diferentes. En principio la diversidad y la posici6n expuesta de eslos polisac
Las selectinas son protemas de membrana que se unen a carbohidratos de la superficie celular y que median adhesiones celuJares transitorias en el torrente sanguineo l9 Uno de los ejemplos mejor comprendidos del reconocimiento protefna-carbohidram se dOl en las respuestas innamatorias. cuando los Linfocitos (de la c1ase denominada lIelltrdfilos) son reclutados desde la sangre hacia una zona de inllamaci6n en un Icjido. usualmente para ayodar a combatir una infecei6n local. Inicialmente, los neutr6fi1os se adhieren suavemente a las relulas endoteliales que limitan los vasos sangufneos de la zona y poslerionnente se adhieren mas fuertemente y migran fuera de los Yasos sangu(neos. arrasu.indose entre las relulas endoteliales adyacentes. EJ inicio del proceso de adhesi6n implica el rceonocimient'o prolefna-carbohidrato. Los mediadores qufmicos locales Iiberados 536

Caprlulo 10: Estructura de la membrana

Figura 10·41 D1agramaslmplificado

de lacublerta celular (gIucoc8llzl. La cubierta cehilar esta fonnada por las cadenas laterales de oligosacaridos de los glucolfpidos y de las glucoprotefnas intcgrales de membrana y por cadenas de polisaclridos de protooglucanos integraJes de membrana. Ademas, en muchas celulas los proteoglucanos y g1ucoprolcmas adsorbidos {no mostrados aquO oontribuyen a la fonnaci6n del glucocatiz.. N6tese que todos los carbohidratos se hallan en la superficie no citoplasmatica de la membrana.

glu<:oproteln. glucolipido oligosac.6rido

>

dominlo lectin. dominio tem.ianl•• EGF

•

dominlo. repetldo. SEl£CTlNA P

'A)

'BI

Figura 10·42 La Inleraccldn protefna-carbohldrato que lnlcla la adhesldn tran,ltoria de neutr6rnos al.. c:4lullUi endoteUaJes en las zonas de lnDamacl6n. (A) El dominio lcelina de una P-selectina se une a1 oligosac4.rido espedfioo moslrado en (8), que esui presente lanto en la gluooprotefna de la superfide celular como en las mol&:ulas de g1uoolfpido. EI dominio lectina de las selectinas es hom61ogo a los dominios lectina encontrados en muchas otms prolefnas animales que se unen a carbohidralos; dado que la uni6n a sus Ugandos giucfdicos requiere Ca 2-. se les llama {«duns de tipo C En (0 se muestra la eSlruClura tridimensional de uno de estos dominios lectina, detenninado por cristalograffa de rayos X; su enlace glucrdioo aparece de color azul. Gal galactosa; GIcNAc Nacelilglucosamina; Fuc ruoosa; NANA 4cido sialico.

=

=

=

cOOt< lei

=

por las c~lulas en el IUj;1;ar de la inflamaci6n seiializan a las celulas endoteliales de la regi6n para que expresen una g1ucoprote[na transmembrana denominada P-seleeti/lO, que pcrtenece a la familia de moleculas de adhesi6n celula-celuJa lJamada selectlnas. Las selectinas contienen un dominio leclina de uni6n a carbohidratos, en el extremo de un ensanchado ~tallo" proteico que se extiende desdc la superficic ccluJar (Figura IO·42A). EI dominio de lcclina de Ja P-selectina reconoce ci oligosacdrido especffico, como se muestra en la Figura 10-428. Dado que este oJigosac
537

Resumen Mlentras qm la bialpa IIptdlctJ detennlnn la estruetunll bdslca de hu membranas bio~ las proteltUU SOfi Ius TeSfNrlSUbles de la mayorla tk las ftmclones de 1m membranas, adUando de receptores espedfkos, enzimas 0 prote{1UJ$ de transporte y arras mm:hasfundones. Muchas prote{nlU de membrana atravieulII la blcapa IIpfdiaJ: en algfUuu de eslas prou{nas transmembrana Ia t:iUU?na th polipepridos crum la blcapa como Ima l,iUce a dnica (prote{ruu de paso dnico)j en otras, incluidas hu responsables thl transporn transmembrana de lones y otras pequeRas molkuw solublu en agua. ~ eadelra pullpt:ptldial cruza fa blcapa uarilU veces, ya $Men serlesth hilicuo: a como ltfmiruu p enfomuJ thun barril cerrtUlo (prote{1UJ$ de paso mdltiple). Drras prou{ruu a.socUJdas a la membrana no atrn"leson la biM· pa peru en Mmblo se hallan unldas a una Mm u otra tk Ia membrana. Muc#UU tk estas prote{nQS se unen a prote{ruu trnnsmembrana mediante interacclones no covalentes. pero arras estdn unld4s por medlo de la uni6n covalente a grupos UpUli· cos. Como oc;-urn am las molkulus Upldicas de In blcapa, muchas prote(nas de membrana son capaces de difundir rtfpldamente en el plano de la membrana. Par otro lado, las dlulas tlenen sistemas para InmovUlzar prote{ruu espee{jicas de membrana y para conflnar lamo prou{nas de membrana como molklltns lip{dicas a domin/os particulares de una bicapa IIpidica continua. fn la membrana phumdllca de lodas las dluhu eucarlotlU, Ia mayorla de las prote{nas que qlUdall al descubierto wbre In 6uperflcle celular y algunas de las molkulm lipUlicas de la monocnptJ UpfdlctJ merna tienen cadenas de oligosacdrldos unldtu coualentemente. Algunas numbranQS plasmdtictu ramblen contknen moliadas Integrates tk proteoglucanos con auknas de pollsacdrldos erpuntas a la superJfcie. Esta cubierta de azdcares ayuda a proteger fa superJfcle celular del dano mt'Ctfnioo y qu{mlco, y algunas de hu cadenas th oligosactfrldos son reconoc;-Idas por prote{ruu que se mum a carbolddl'atQS de In sIIpt:rJlcie cehllar (lectlnas) ql# intervlenen en procesos de atlhesi6n dhlla-dlula. espec{jlcos y transilorios.

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Capitulo 10: Estructura de la membrana

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Transporte de pequenas cl Illelllbran .; de la excitab Dlelllbrana

-

Debido a su interior hidrof6bico, la bicapa lipidica de una celula constituye una barrera altamente impermeable ala mayoria de las moleculas polares. Esta funcion de barrera es de una importancia crucial ya que permite a la celula mantener en su citosol ciertos solutos a concentraciones diferentes a las que estan en el fluido extracelular y en cada uno de los compartimientos intracelulares envueltos por una membrana. Sin embargo, para poder utilizar esta barrera las celulas han tenido que desarrollar sistemas para transportar especificamente moleculas hidrosolubles a traves de sus membranas y asi poder ingerir los nutrientes esenciales, excretar los productos residuales del metabolismo y regular las concentraciones intracelulares de iones. El transporte de iones inorganicos y de pequefias moleculas organicas hidrosolubles a traves de la bicapa lipidica se consigue mediante proteinas transmembrana especializadas, cada una de las cuales es responsable de la transferencia de una molecuia 0 un ion especificos 0 de un grupo de moleculas 0 iones afines. Las celulas tambien pueden transportar a traves de sus membranas macromoleculas e incluso grandes particulas, pero los mecanismos que intervienen en estos casos son muy diferentes de los utilizados para transferir pequefias moleculas, por 10 que se estudian en los Capitulos 12 y 13. La importancia del transporte a traves de las membranas queda puesta de manifiesto por el hecho de que casi e120% de los genes identificados hasta ahora en E. coli estan asociados a estos procesos de transporte. Iniciamos esta capitulo considerando algunos principios generales que guiaran nuestra discusi6n sobre la manera en que las pequefias moleculas cruzan las membranas celulares. Por 10 tanto consideraremos las dos clases principales de proteinas de membrana que median el transporte: las proteinas transportadoras, las cuales tienen partes m6viles que les permiten transportar moleculas especificas a traves de la membrana, y las proteinas de canal, que forman un estrecho poro hidrof6bico que permite el desplazamiento pasivo de pequefios iones inorganicos. Las proteinas transportadoras pueden acoplarse a una fuente de energia y catalizan un transporte activo; la combinaci6n de una permeabilidad selectiva pasiva y un transporte activo genera grandes diferencias de composici6n del citosol respecto al fluido extracelular (Tabla 11-1) 0 al fluido del interior de los organulos envueltos en membrana. Concretamente, generando diferencias de concentraci6n i6nica a traves de la bicapa lipidica, las membranas celulares son capaces de almacenar energia potencial en forma de gradientes electroquimicos, los cuales se utilizan para impulsar varios procesos de transporte, para transportar sefiales electricas en celulas excitables eIectricamente y (en mitocondrias, cloroplastos y bacterias) para fabricar la mayor parte 541

Tabla 11-1 Comparacl6n de las concentraclones i6nicas en el interior y el exterior de una ceIula de mamffero Componente

Concentraci6n intracelular

Concentracl6n extracelular

(mM)

(mM)

5-15

145

Cationes Na+ K+

Mg2+

Ca2+

140 0,5

5

10-4

7 x 10"""5 (10-7,2 M

H+

0

pH 7,2)

1-2 1-2 4 x 10-5 (10-7,4 M

0

pH 7,4)

Aniones· CI-

5-15

110

• Puesto que la celula debe tener la misma cantidad de cargas + que - (es decir, ha de ser eIectricamente neutral, ademas de CI- la celula contiene muchos otros aniones que no se presentan en esta tabla; de hecho, la mayona de los constituyenes celulares estan cargados negativamente (HCOi, P043-, protefnas, acidos nucleicos, metabolitos que contienen grupos fosfato y carboxilo, etc.). Las concentraciones dadas para Ca"+ y Mg"+ corresponden a las de los iones libres. En las celulas, hay un total de aproximadamente 20 mM Mg"+ Y 1-2 mM Ca"+ pero en su mayor parte ambos cationes estan unidos a protefnas y a otras substancias; en el caso del Ca"+, una elevada cantidad se encuentra almacenada en vados organulos.

del ATP celular. Centramos la discusi6n principalmente en el transporte a traves de la membrana plasmcitica pero, como discutiremos en capitulos posteriores, en las otras membranas de la celula eucariota existen mecanismos similares a los que describiremos. En la Ultima parte de este capitulo centramos la atenci6n principalmente en las funciones de los canales i6nicos de las celulas nerviosas, ya que es en estas celulas donde las proteinas de canal adquieren el maximo nivel de sofisticaci6n, permitiendo que redes de celulas nerviosas desarroUen las extraordinarias caracteristicas de las que es capaz el cerebro humano.

MOLECULAS

HIOR0F68ICAS

Principios de transporte a traves de membrana l lniciamos esta secci6n describiendo las propiedades de permeabilidad de bicapas lipidicas sinteticas, libres de proteina. A continuaci6n, introducimos algunos terminos utilizados para describir los diversos tipos de transporte a traves de membrana y algunas estrategias para caracterizar las proteinas y los procesos que participan en eUos.

Las bicapas lipfdicas libres de protefna son altamente impermeables a los iones2 . Con tiempo suficiente, practicamente cualquier molecula acabara difundiendo a traves de una bicapa lipidica libre de proteina a favor de su gradiente de concentraci6n. Sin embargo, la velocidad a la que se produce esta difusi6n varia enormemente, dependiendo en parte del tamafio de la molecula y, principalmente, de su solubilidad relativa en aceite. En general, cuanto menor es la molecula y cuanto mas soluble en aceite (es decir, cuanto mas hidrof6bica 0 no polar es) mas rapidamente difunde a traves de una bicapa. Las moleculas pequenas no polares tales como el O2 (32 daltons) yel CO2 (44 daltons), se disuelven facilmente en las bicapas lipidicas y por 10 tanto difunden con rapidez a traves de eUas. Las moIeculas polares no cargadas tambien difunden rapidamente a traves de una bicapa si su tamafio es suficientemente reducido. Por ejemplo, el agua (18 daltons), el etanol (46 daltons) y la urea (60 daltons) atraviesan rapidamente una bicapa; el glicerol (92 daltons) 10 hace con menor rapidez, y la glucosa (180 daltons) practicamente no la atraviesa (Figura 11~1). 542

Capitulo 11 : Transporte de moleculas pequefias a traves de la membrana

GRANDES MOLECULAS POLARES NO CARGADAS

•

~

bicapa lipidica artificial

Figura 11-1 Permeabilldad relativa de una bicapa Upidica sintetica a diferentes tipos de molecuIas. Cuanto menor sea la molecula y,lo que es mas importante, cuanto menor sea el mlmero de enlaces de hidr6geno que establezca can el agua, mas rapidamente difundira a traves de la membrana.

Por el contrario, las bicapas lipidicas son altamente impermeables a todas las moIeculas cargadas (iones), por muy pequefias que sean: la carga y el elevado grado de hidratacion de tales moleculas les impiden penetrar en la fase hidrocarbonada de la bicapa. Asi, las bicapas sinteticas son 109 veces mas permeables al agua que a los iones, incluso a los de reducido tamafio como el Na+ 0 el K+ (Figura 11-2).

permeabilidad elevada

10~2

10

Existen dos clases principales de protefnas de transporte a traves de membrana: protefnas transportadoras y protefnas de canal 1 Como las bicapas lipidicas sinteticas, las membranas celulares permiten el paso por simple difusi6n del agua y de las moleculas no polares. Sin embargo, las membranas celularestambien son permeables a diver~as moleculas polares que atraviesan con gran lentitud las bicapas lipidicas sinteticas, tales como iones, azucares, aminoacidos, nucleotidos y muchos metabolitos celulares. Unas proteinas de membrana especiales son las responsables de la transferencia de estos solutos a traves de las membranas celulares. Estas proteinas, que reciben el nombre de proteinas de transporte a traves de membrana, se presentan en muchas formas y en todos los tipos de membranas biologicas. Cada proteina esta destinada al transporte de un tipo particular de moleculas (tales como iones, azucares 0 aminoacidos) y con frecuencia unicamente de una cierta especie molecular de la clase. La especificidad de las proteinas de transporte fue sugerida por primera vez a mediados de los afios 1950 gracias a unos estudios en los que se encontro que unas mutaciones en un solo gen suprimian la capacidad de las bacterias para transportar unos azucares determinados a traves de su membrana plasmatica. Actualmente se han descubierto mutaciones similares en personas que sufren diversas enfermedades hereditarias, las cuales afectan al transporte de un soluto determinado en el rifion, en el intestino 0 en ambos tejidos. Por ejemplo, los individuos que presentan la enfermedad genetica cistinuria son incapaces de transportar ciertos aminoacidos (incluyendo la cistina, el dimero formado por la union, a traves de un enlace disulfuro, de dos cisteinas) tanto desde la orina como desde el intestino hacia la sangre; de la acumulacion de cistina en la orina resulta la formacion de "piedras" de cistina en los rifiones. Todas las proteinas de transporte a traves de membrana que han sido estudiadas con detalle suficiente para poder establecer su orientacion en la membrana, son proteinas transmembrana multipaso -es decir, su cadena polipeptidica atraviesa la membrana varias veces. Se cree que estas proteinas establecen una via continua de proteina a traves de la membrana, permitiendo asi el transporte de solutos especificos sin que lleguen a entrar en contacto directo con el interior hidrofobico de la bicapa lipidica. Existen dos clases mayoritarias de proteinas de transporte de membranas: las proteinas transportadoras y las proteinas de canal. Las proteinas transportadoras (tambien denominadas transportadores, carriers 0 permeasas) se unen al soluto especifico que va a ser transportado y sOOen una serie de cambios conformacionales que permiten la transferencia del soluto a traves de la membrana. Por otro lado, las proteinas de canal no se unen al soluto sino que forman poros hidrofi1icos que atraviesan la bicapa lipidica; cuando estos poros estlin abiertos permiten que determinados solutos (habitualmente iones inorganicos de tamafio y carga apropiados) puedan pasar a su traves, y por 10 tanto atravesar la membrana (Figura 11-3). No sorprende que el transporte a traves de las proteinas de canal se produzca a velocidad mucho mayor que a traves de proteinas de transporte.

4

urea glicerol _

10 6 tript6fano _ glucosa -

10 8

K+Na+-

10~12

10~14

permeabilidad baja

Figura 11-2 Coeflcientes de permeabilidad (cm/seg) para el paso de diversas moltkulas a traves de bicapas lipidicas sinteticas. EI flujo de un soluto a traves de la bicapa es direetamente proporcional a la diferencia de sus eoneentraciones a los dos lados de la membrana. Multiplieando esta diferencia de eoneentraci6n (en moles/em3) por el eoeficiente de permeabilidad (em/seg) se obtiene el flujo del soluto en moles por segundo por eentimetro cuadrado de membrana. Por ejemplo, una diferencia de eoneentraci6n de tript6fano de 10-4 moles/em3 (10-4/10-3 L =0,1 M) producirfa un flujo de 10-4 moll em3 x 10-7 em/seg = 1O-11 moles/seg a traves de 1 em2 de membrana, es decir, de 6 x 104 moltkulas/seg a traves de 1 f.l.m 2 de membrana.

EI transporte activo esta mediado por protefnas transportadoras acopladas a una fuente energetica1,3 Todas las proteinas de canal y muchas proteinas de transporte tan solo permiten que los solutos atraviesen la membrana de forma pasiva ("cuesta abajo") -un proceso llamado transporte pasivo (0 difusi6n facllitada). Si la molecula Principios de transporte a traves de membrana

543

]

-

bicapa Iipfdica

[

lugar de uni6n al soluto

poro acuoso (A) PROTEfNA TRANSPORTADORA

transportada carece de carga, la direcci6n del transporte pasivo viene determinada tan s610 por la diferencia de concentraci6n a los dos lados de la membrana (su gradiente de concentraci6n). Sin embargo, si el soluto tiene una carga neta, su transporte se ve influido tanto por su gradiente de concentraci6n como por el gradiente electrico a traves de la membrana (el potencial de membrana). El gradiente de concentraci6n y el gradiente electrico pueden combinarse para calcular la fuerza neta de direcci6n del flujo, 0 gradiente electroqu{mico, para cada soluto cargado. En el Capftulo 14 discutimos este aspecto mas detalladamente. De hecho, casi todas la membranas plasmMicas tienen una diferencia de potencial (gradiente de voltaje) a traves de ellas, siendo habitualmente el interior negativo con respecto al exterior. Esta diferencia de potencial favorece la entrada a las celulas de iones cargados positivamente y se opone a la entrada de iones cargados negativamente. Las celulas tambien necesitan protefnas de transporte que bombeen activamente ciertos solutos a traves de la membrana en contra de su gradiente electroqufmico ("cuesta arriba"); este proceso, conocido como transporte activo, esta siempre mediado por protefnas transportadoras. En el transporte activo la actividad bombeadora de la protefna de transporte es direccional ya que, tal como explicaremos mas adelante, esta acoplada a una fuente de energfa metab6lica como la hidr6lisis del ATP 0 a un gradiente i6nico. Asf pues, el transporte mediado por protefnas de transporte puede ser activo 0 pasivo, mientras que el transporte mediado por protefnas de canal siempre es pasivo (Figura 11-4).

(B) PROTEfNA DE CANAL

Figura 11-3 Vision esquematica de dos clases de protemas de transporte a traves de membrana. Se cree que las protefnas transportadoras alteman dos conformaciones de forma que ellugar de uni6n al soluto es accesible secuencialmente desde un lado de la bicapa, y luego desde el otro lado. Por el contrario, una protefna de canal forma un poro lleno de agua que atraviesa la bicapa, a traves del cual pueden difundir determinados iones.

La tecnologia del DNA recombinante ha revolucionado el estudio de las proteinas de transporte a traves de membrana4 Debido ala dificultad de obtener cristales tridimensionales de las protefnas que atraviesan la membrana varias veces para estudios de cristalograffa de rayos X, no conocemos la estructura tridimensional detallada de las protefnas de transporte a traves de membrana a las que nos referiremos. Por ello, no entendemos los mecanismos moleculares que estas protefnas utilizan para transportar deter-

mohlcula transportada

O~OI ;

canal

bicapa [ Iipfdica

difusi6n simple

difusi6n mediada , por canal

difusi6n mediada por transportador,

TRANS PORTE PASIVO (DIFUSI6N FACILITADA)

544

TRANSPORTE ACTIVO

Capitulo 11 : Transporte de moleculas pequefias a traves de la membrana

Figura 11-4 Comparacion entre un transporte pasivo a favor de un gradiente electroquimico y un transporte activo en contra de un gradiente electroquimico. Mientras que la difusi6n simple y el transporte pasivo mediados por protefnas de transporte (difusi6n facilitada) ocurren espontaneamente, el transporte activo requiere de una entrada de energfa metab6lica. Unicamente las protefnas transportadoras pueden realizar transporte activo, mientras que tanto las protefnas transportadoras como las protefnas de canal pueden mediar difusi6n facilitada.

minados solutos a traves de la bicapa lipfdica. Sin embargo mediante otros metodos se han obtenido importantes datos, especialmente mediante la tecnologfa del DNA recombinante. Una vez se ha clonado y secuenciado el DNA que codifica una protefna transportadora, se puede deducir la secuencia de aminoacidos de la cadena polipeptidica y se puede estimar el mlmero de helices a transmembrana mediante el analisis de graficos de hidropatfa (se discute en el Capftulo 10). Se pueden utilizar anticuerpos desarrollados contra peptidos sinteticos que corresponden a determinados segmentos de la cadena polipeptfdica para determinar que segmentos se hallan expuestos a uno y otro lado de la membrana. Ademas, se puede alterar la secuencia de DNA que codifica zonas especificas de la protefna mediante mutagenesis especifica de lugar, y el mRNA mutante correspondiente se puede inyectar a celulas de mamffero mantenidas en cultivo 0 a oocitos de Xenopus, donde dirigira la sfntesis de protefnas mutantes cuya actividad transportadora puede entonces estudiarse facilmente. De esta forma, se pueden identificar los residuos de aminoacido y los segmentos de protefna que son funcionalmente importantes. Sin embargo, los resultados de estos estudios deben interpretarse con precauci6n ya que a veces una pequena carga en una zona de la protefna puede tener grandes efectos en la conformaci6n de toda la protefna y, por 10 tanto, en su funci6n, incluso aunque la zona alterada no participe directamente en la funci6n estudiada. Sin embargo, como veremos, esta estrategia ha resultado ser de una gran utilidad. La tecnologfa del DNA recombinante tambien ha contribuido de otra manera at conocimiento de las protefnas de transporte a traves de membrana. Cuando se ha aislado el DNA que codifica una protefna, generalmente resulta relativamente sencillo utilizar este DNA como sonda para aislar secuencias de DNA relacionadas que codifican protefnas hom610gas. Estos estudios han revelado que el transporte a traves de membrana esta mediado por un mlmero sorprendentemente pequeno de familias de protefnas, cuyos miembros tienen estructuras relacionadas entre sf y, probablemente, mecanismos de acci6n relacionados y un origen evolutivo comun. Sin embargo una familia determinada puede contener un gran numero de protefnas diferentes, e incluso a menudo los miembros de una familia pueden presentar muchas variantes (denominadas isoformas) producidas tanto por genes diferentes a traves de transcritos de RNA procesados de forma diferente a partir de un mismo gen. En algunos casos las isoformas difieren en su actividad transportadora, en su momenta de expresi6n durante el desarrollo, en su distribuci6n tisular, en su 10calizaci6n en la celula 0 en cualquier combinaci6n de estas propiedades. En otros casos, el sentido de esta heterogeneidad resulta poco claro. Antes de discutir con detalle las diferentes clases de protefnas transportadoras a traves de membrana y los conocimientos conseguidos mediante estas tecnicas, consideraremos brevemente otra clase de moleculas que pueden incrementar selectivamente la permeabilidad de las bicapas lipfdicas. Estas moleculas proporcionan un ejemplo sencillo de alguno de los principios discutidos anteriormente. ion transportado

Se pueden utilizar ion6foros como herramientas para incrementar la permeabilidad de las membranas a determinados iones5 Los ion6foros son pequenas moleculas hidrof6bicas que se disuelven en las bicapas lipfdicas e incrementan su permeabilidad a determinados iones inorganicos. La mayorfa de ellos estan sintetizados por microorganismos (probablemente como armas contra competidores 0 contra presas). Son ampliamente utilizados por los bi610gos celulares en estudios sobre membranas sinteticas, celulas 0 organulos celulares, como herramientas para incrementar la permeabilidad i6nica de la membrana. Existen dos clases de ion6foros -transportadores m6viles y formadores de canal (Figura 11-5). Ambos tipos actuan rodeando la carga del ion transportado de forma que pueda atravesar el interior hidrof6bico Principios de transporte a traves de membrana

bicapa [ lipfdica

formador del canal

transportador m6vil

Figura 11-5 Un transportador i6nico m6vil y un ion6foro formador de canal. En ambos casos el flujo neto de iones se produce unicamente a favor de gradiente electroqufmico.

545

Figura 11-6 Estructura de un canal de gramicidina. El canal esta formado

(B)

o

(e)

(A)

0 0

(D)

de la bicapa lipfdica. Dado que los ion6foros no estan acoplados a fuentes de energfa, s610 perrniten el movimiento neto de iones a favor de su gradiente electroqufmico. La valinomicina es un ejemplo de un transportador m6vil. Se trata de un polimero en forma de anillo que transporta K+ a favor de su gradiente electroqufmico, tomando K+ de un lado de la membrana, difundiendo a traves de la bicapa, y liberando el K+ al otro. El ion6foro A23187 constituye otro ejemplo de transportador ionico movil, pero transporta cationes divalentes como Ca2+ y Mg2+. Normalmente actua como una lanzadera intercambiadora de iones, transportando dos H+ hacia el exterior de la celula por cada cation divalente que transporta hacia el interior celular. Cuando una celula se expone aA23187, el Ca2+entra al citosol desde el liquido extracelular a favor de su enorrne gradiente electroqufmico. Por ello, este ion6foro se utiliza ampliamente en biologia celular para incrementar las concentraciones de Ca2+libre en el citosol, mimetizando asi algunos mecanismos de sefializaci6n celular (discutidos en el Capitulo 15). La gramicidina A es un ejemplo de ion6foro forrnador de canal. Se trata de un peptido lineal de unicamente 15 residuos de aminmkido, todos ellos con una cadena lateral hidrof6bica, por 10 que constituye el canal i6nico mas sencillo y mejor caracterizado de los conocidos. Se cree que dos moIeculas de gramicidina se unen, cola con cola, a traves de la bicapa lipidica formando un canal transmembrana (Figura 11-6), que permite selectivamente que los iones monovalentes fluyan a favor de sus gradientes electroquimicos. Estos dimeros son inestables y se estan formando y disociando constantemente, de forma que el tiempo medio de apertura de estos canales es alrededor de 1 segundo. Con un elevado gradiente electroquimico la gramicidina A puede transportar unos 20 000 cationes por canal abierto cada milisegundo, 10 cual es 1000 veces mas de 10 que puede transportar una molecula de transportador m6vil en el mismo tiempo. La gramicidina es sintetizada por ciertas bacterias, quizas para matar otros microorganismos colapsando los gradientes de H+, Na+ y K+, que son esenciales para la supervivencia de la celula; ha sido utilizada con exito como antibi6tico.

Resumen Las bieapas lipfdicas son altamente impermeables a la mayoria de moteculas polares. Para transportar pequenas moteeulas solubles en agua haeia el interior 0 hacia

el exterior de las eelulas 0 de los eompartimientos intracelulares delimitados por membrana, las membranas eelulares eontienen varias protetnas de transporte, eada una de las cuales es responsable de transferir un determinado soluto 0 elase de solutos a traves de la membrana. Existen dos elases de protetnas de transporte a traves de membrana -transportadoras y de canal; ambas forman vias eontinuas de transporte a traves de la bicapa lipfdica. Mientras que el transporte mediado por protetnas transportadoras puede ser activo 0 pasivo, el mediado por protetnas de 546

Capitulo 11 : Transporte de moIeculas pequeiias a traves de la membrana

por la asociaci6n de dos peptidos identicos por sus extremos amino terminales. Cada cadena esta plegada formando una helice ~ como una lamina ~ enrollada. (A) Vista lateral y (B) vista superior. Los esqueletos peptidicos que rodean el canal se muestran en azul y en verde oscuro mientras que en verde claro se representa el espacio ocupado por las cadenas laterales hidrof6bicas que sobresalen. La bicapa lipfdica se muestra en gris. (C) muestra el tamafio de los iones K+ no hidratados mientras que (D) muestra una vista superior de una helice a que atraviesa la membrana, para compararla con la helice ~. N6tese que la helice a no forma poro, de manera que por sf sola no puede formar canal. (De S. Weinstein, B.A. Wallace, E.R. Blout, I.S. MorrowyW. Veatch, Proc. Natl. Acad. Sci. 76:4230, 1979.)

canal es siempre pasivo. Los iOnOforos, pequeiias moleculas hidrof6bicas sintetizadm por microorganismos, pueden utilizarse en estudios de celulas u orgdnulos

como herramientas para incrementar la permeabilidad de las membranas celulares a determinados iones inorgdnicos.

~ o

a. ~

Vmax

~.,

"C "C

~

'<3

Proteinas transportadoras y transporte activo a traves de membranal, 6

¥2Vmax

o a; > KM

El proceso por el cual una proteina transportadora transfiere una molecula de soluto a traves de la bicapa lipidica se parece a una reacci6n enzima-substrato, y los transportadores implicados en este proceso se comportan como enzimas especializadas ligadas a la membrana. Cada tipo de proteina transportadora tiene uno 0 mas lugares de uni6n especificos para su soluto (substrato). Cuando el transportador esta saturado (es decir, cuando todos estos lugares de uni6n estan ocupados), la velocidad de transporte es mcixima. Esta velocidad, indicada como Vmax' es caracteristica del.transportador. Cada proteina transportadora tiene ademas una constante caracteristica de uni6n para su soluto, K w igual a la concentraci6n del soluto cuando la velocidad de transporte es la mitad del valor mciximo (Figura 11-7). Como con las enzimas, la uni6n del soluto puede ser bloqueada especificamente por inhibidores competitivos (que compiten por el mismo lugar de uni6n y que pueden ser transportados 0 no por el transportador) o por inhibidores no competitivos (que se unen a algiln otro lugar y que alteran especificamente la estructura del transportador). Sin embargo, a diferencia de las reacciones enzima-substrato normales, el soluto transportado no suele ser modificado covalentemente por la proteina transportadora. Algunas proteinas de transporte simplemente transportan un soluto de un lado a otro de la membrana a una velocidad determinada por la Vmax Yla KM ; reciben el nombre de transportadores sencillos 0 uniportes (uniporters). Otras, de cinetica mas compleja, actuan como transportadores acoplados (coupled transporters), en los que la transferencia de un soluto depende de la transferencia simultanea 0 secuencial de un segundo soluto, ya sea en la misma direcci6n [transporte unidireccional 0 simporte (symport)) 0 en direcci6n opuesta [transporte de intercambio 0 antiporte (antiport)] (Figura 11-8). La mayoria de las celulas animales, por ejemplo, toman glucosa del fluido extracelular, donde la concentraci6n del azucar es alta en relaci6n a la del citosol, mediante un transporte pasivo a traves de transportadores de glucosa que actuan como transportadores sencillos. Existen varios de estos transportadores de glucosa, todos elIos pertenecientes ala misma familia de proteinas hom610gas con 12 posibles helices ex transmembrana. En cambio, las celulas intestinales y las renales captan glucosa de la luz del intestino y de los tubulos del rift6n respectivamente, donde la concentraci6n del azucar es baja. Estas celulas transportan la glucosa a traves de su membrana plasmcitica mediante un transporte unidireccional con Na+. Como se

mohlcula transportada

/

~.

)J..

I I

! UNIPORTE

I

ion cotransportado

Or.

~(.. b;o.~

~

~

/\

/\

SIMPORTE

lipfdica

concentracion d e la molecula transportada

Figura 11-7 Comparaci6n entre la cim!tica de la difusi6n simple y la de difusi6n mediada por transportador. Mientras que la velocidad de la primera siempre es proporcional a la concentraci6n de soluto, la de la segunda alcanza un maximo Wmax) cuando la proteina de transporte esta saturada. Cuando el transporte se produce a mitad de la velocidad maxima, la concentraci6n de soluto se aproxima a la constante de union (KM ) del transportador para el soluto y es anaIoga a la KM de una enzima para su substrato. La grMica se refiere a un transportador que transporta un soluto; las cineticas del transporte acoplado de dos 0 mas solutos (vease el texto) son mas complejas, aunque muestran basicamente el mismo fen6meno.

Figura 11-8 Tres tipos de transporte mediado por transportadores. El diagrama esquematico muestra proteinas transportadoras actuando como un transportador sencillo (uniporteJ, como un transportador acoplado unidireccional (simporte) y como un transportador acoplado de intercambio (antiporte).

•

ANTI PORTE I

transporte acoplado

Protefnas transportadoras y transporte activo a traves de membrana

547

"pong"

<====>

"ping"

0°

00 0 n

gradiente electrnuimico

proteina transportadora que media la difusi6n facilitada

discute en el Capitulo 10, la proteina banda 3, del eritrocito humano es un transportador anionico que intercambia Cl- por HC03. Aunque se desconocen los detalles moleculares, se cree que las proteinas . transportadoras transfieren los solutos a traves de la bicapa mediante un cambio conformacional reversible que alternativamente expone primero el lugar de union al soluto a una cara de la membrana y luego a la otra. En la Figura 11-9 se muestra un modelo esquem
La bomba de Na+-K+ de la membrana plasmatica es unaATPasa7 La concentracion de K+ en el interior celular es tipicamente de 10 a 20 veces mas alta q~e en el exterior, mientras que ocurre 10 contrario para el Na+ (vease Tabla 11-1, pag. 542). Estas diferencias de concentracion se mantienen mediante una bomba de Na+-K+ que se halla en la membrana plasm
Capitulo 11 : Transporte de moltkulas pequefias a traves de la membrana

Figura 11-9 Modelo hipotetico que muestra de que forma un cambio de conformaci6n de una protema transportadora podria medlar la difusi6n facilitada de un soluto. La protefna transportadora puede existir en dos estados de conformaci6n diferentes: en el estado "pong" los lugares de uni6n para el soluto A son accesibles desde el exterior de la bicapa; en el estado "ping" estos mismos lugares de uni6n son accesibles desde el 01£0 lado de la bicapa. Se propone que las transiciones entre ambos estados se producen al azar, de forma completamente reversible. Por 10 tanto, si la concentraci6n de A es mayor en el exterior de la bicapa, se unini una mayor cantidad de A a la protefna transportadora de conformaci6n "pong", produciendose un transporte neto de A a favor de su gradiente elec1£oqufmico.

• I

o

n

gradiente electroqufmico de sodio

gradiente electroqufmico de potasio

l•

~

e

Figura 11-10 LaATPasadeNa+-K+. Esta protefna transportadora bombea activamente Na+ hacia el exterior y K+ hacia e1 interior de 1a ce1u1a, en contra de sus gradientes electroqufmicos. Por cada molecula de ATP hidrolizada dentro de la celu1a, se bombean tres Na+ hacia el exterior y dos K+ hacia el interior. La ouabafna, inhibidor especffico de 1a bomba, y el K+ compiten por e1 mismo lugar dellado externo de la ATPasa.

mas adelante, durante la propagaci6n del impulso nervioso ganan continuamente pequefias cantidades de Na+ y pierden pequefias cantidades de K+, la cantidad de energia utilizada en la bomba de Na+-K+ se acerca a los dos tercios de los requerimientos totales energeticos de la celula. Un progreso importante en el conocimiento de la bomba de Na+-K+ se realiZQ en 1957 gracias al descubrimiento de una enzima que hidroliza el ATP a ADP y fosfato y que necesita Na+ y K+ para su actividad 6ptima. Un dato importante que relacion6 esta ATPasa de Na+-K+ con la bomba de Na+-K+ fue la obseivaci6n de que un inhibidor conocido de la bomba, la ouabaina, tambien inhibe la ATPasa. Pero la prueba crucial de que la hidr6lisis del ATP proporciona de alguna manera la energia para impulsar la bomba se obtuvo en unos estudios efectuados con fantasmas de eritrocito en los que podfan variarse las concentraciones de iones, ATP y farmacos a ambos lados de la membrana, observandose luego los efectos sobre el transporte i6nico y sobre la hidr6lisis del ATP. Se encontr6 que (1) el transporte de Na+ y de K+ esta estrechamente acoplado a la hidr6lisis del ATP, de tal modo que un proceso no puede producirse sin el otro; (2) el transporte i6nico y la hidr6lisis del ATP s610 pueden ocurrir cuando existe Na+ y ATP dentro de los fantasmas, y K+ en el exterior; (3) la ouabafna unicamente tiene efectos inhibidores cuando se encuentra fuera de los fantasmas, donde compite por el centro de uni6n del K+; y (4) por cada molecula de ATP hidrolizada (cada molecula de ATPasa puede hidrolizar 100 moleculas de ATP por segundo), se bombean tres Na+ hacia el exterior y dos K+ hacia el interior (Figura 11-10). Aunque estos experimentos suministraron evidencias concIuyentes de que el ATP proporciona la energia necesaria para el bombeo de iones Na+ y K+ a trayeS de la membrana plasmMica, no explicaban c6mo se halla acoplada la hidr6lisis del ATP al transporte i6nico. Una explicaci6n parcial se obtuvo con el hallazgo de que durante el cicIo de bombeo el grupo fosfato terminal del ATP se transfiere a un residuo de acido aspartico de la ATPasa y luego este grupo fosfato se hidroliza, como se explica en la Figura 11-11. En fantasmas de eritrocito la bomba Na+-K+ puede revertirse, produciendo ATP: cuando experimentalmente se incrementan los gradientes de Na+ y de K+ hasta el punto en que la energia almacenada en estos gradientes electroqufmicos es mayor que la energfa qufmica de la hidr6lisis del ATP, estos iones se desplazan a favor de sus gradientes electroqufmicos y se sintetiza ATP a partir de ADP Yfosfato porlaATPasa de Na+-K+. Asf pues, la forma fosforilada de laATPasa (paso 2 en la Figura 11-11) puede relajarse ya sea donando su fosfato al ADP (del paso 2 al paso 1) 0 cambiando su conformaci6n (del paso 2 al paso 3). EI hecho de que el exceso de la variaci6n de energfa libre se utilice para sintetizar ATP o para bombear Na+ hacia afuera del fantasma depende de las concentraciones relativas de ATP, ADP Yfosfato y de los gradientes electroqufmicos de Na+ y de K+. La ATPasa de Na+-K+ se ha purificado y se ha visto que consiste en una gran subunidad catalftica transmembrana de multipaso (aproximadamente de 1000 Protefnas transportadoras y transporte activo a traves de membrana

549

1 ESPACIO EXTRACELULAR

residuos de aminoacido de longitud) y en una glucoprotefna mas pequefia, de paso unico, asociada a ella. La subunidad catalftica tiene centros de uni6n para Na+ y para ATP en su superficie citoplasmlitica, y para K+ en su superficie externa y durante el ciclo de bombeo se fosforila y desfosforila de forma reversible. La funci6n de la glucoprotefna es incierta, aunque se sabe que es necesaria para el transporte intracelular de la subunidad catalftica hasta la membrana plasmlitica. Se puede reconstituir una bomba Na+-K+ funcional a partir del complejo purificado: la ATPasa se solubiliza en detergente, se purifica y se mezcla con los fosfolipidos adecuados; cuando se elimina el detergente, se han formado vesiculas de membrana que en presencia de ATP bombean Na+ y K+ en direcciones opuestas (vease Figura 10-22).

La ATPasa de Na+-K+ es necesaria para mantener el equilibrio osm6tico y estabilizar el volumen celularB Debido a que la ATPasa de Na+-K+ bombea tres iones cargados positivamente hacia el exterior de la celula por cada dos que bombea hacia el interior, es electrogenica; es decir, dirige una corriente neta a traves de la membrana tendiendo a crear un potencial electrico, con el interior negativo en relaci6n al exterior. Sin embargo, este efecto de la bomba en sf mismo no contribuye mas de un 10% al potencial de membrana. Como veremos, el 90 % restante depende tan s610 indirectamente de la bomba. Por otra parte, la ATPasa de Na+-K+ desempefia un papel mas directo en la regulaci6n del volumen celular: controla las concentraciones de solutos dentro de la celula, y por consiguiente regula las fuerzas osm6ticas que pueden hacer que la celula se hinche 0 se retraiga (Figura 11-12). Como se explica en el Panel 11-1, las celulas contienen una gran concentraci6n de solutos incluyendo numerosas moleculas organicas cargadas negativamente (los denominados aniones 550

Capitulo 11 : Transporte de moltkulas pequeiias a traves de la membrana

Figura 11-11 Modelo esquematico del cicio de bombeo de la ATPasa de Na+-K+. La uni6n del Na+ (1) yla posterior fosforilaci6n por ATP (2) en la cara citoplasmatica de la ATPasa inducen a la protefna a un cambio de conformaci6n que transfiere el Na+ a traves de la membrana y 10 libera al exterior (3). A continuaci6n, la uni6n de K+ sobre la superficie exterior (4) y la consiguiente desfosforilaci6n (5) devuelven a la protefna a su conformaci6n original, transfiriendo el K+ a traves de la membrana y libenindolo en el citosol (6). Estos cambios de conformaci6n son anaIogos a las transiciones ping ~ pong que se muestran en la Figura 11-9, a excepci6n de que en este caso la fosforilaci6n dependiente de Na+ y la desfosforilaci6n dependiente de K+ de la protefna, que ocurren de una manera ordenada, permiten a la protefna realizar un trabajo util. A pesar de que, para simplificar, se ha dibujado un solo lugar de uni6n al Na+ y un solo lugar de uni6n al K+, en realidad la bomba presenta tres lugares de uni6n al Na+ y dos al K+. Ademas, aunque se ha demostrado que la ATPasa salta entre dos estados conformacionales, existen evidencias de que ella ocurre a traves de series de cambios conformacionales mas complejos durante el cicIo real de bombeo.

ERITROCITO

concentraci6n i6nica del espacio extracelular

crenado

normal

hinchado

HIPERT6NlCA

ISOT6NICA

HlPOT6NICA

e.

Iisado

MUY HIPOT6NICA

jijos) Ylos cationes que las acompafian y que son necesarios para equilibrar la carga, todos los cuales generan un elevado gradiente osm6tico que tiende a "chupar" agua hacia el interior de la celula. En las celulas animales este efecto es contrarrestado por un gradiente osm6tico opuesto generado a causa de las elevadas concentraciones de iones inorgamcos -sobre todo de Na+ y de a-- del medio extracelular. LaATPasa de Na+-K+ mantiene el equilibrio osm6tico bombeando Na+ hacia el exterior, que vuelve a entrar a favor de su gradiente electroquimico; el ase mantiene en el exterior debido al potencial de membrana. La importancia de la ATPasa de Na+-K+ en el control del volumen celular se pone de manifiesto por el hecho de que las celulas animales se hinchan y pueden llegar a reventar si se tratan con ouabaina, que inhibe la ATPasa de Na+-K+. Evidentemente, las celulas disponen de otros sistemas de solucionar sus problemas osm6ticos. Las celulas vegetales y muchas bacterias estan protegidas contra el hinchamiento excesivo y la rotura mediante paredes celulares semirrigidas que rodean sus membranas plasmaticas; en las amebas el exceso de agua que penetra por 6smosis se recoge en unas vacuolas contractiles que vierten peri6dicamente su contenido al exterior (vease Paneill-l). Pero para la mayona de las celulas de los animales, laATPasa de Na+-K+ resulta crucial.

Figura 11-12 Respuestadeun erltroclto bumano a cambios de la osmolaridad (tambien denominada tonicltkul) del Boldo extracelular. Debido a que la membrana plasmlitica es libremente permeable at agua, el agua se desplazara bacia el interior 0 bacia el exterior de las celulas a favor de su gradiente de concentraci6n, un proceso denominado osmosis. Si las celulas se colocan en una soluci6n hipotonica (por ejemplo, una soluci6n que contenga una baja concentraci6n de soluto, y por 10 tanto una elevada concentraci6n de agua), se producrra un movimiento neto de agua hacia el interior de las celulas, originando su hinchamiento y explosion (lisado). Contrariamente, si las celulas se colocan en una soluci6n hiperronica, se encogerlin.

Algunas bombas de Ca2+ tambien son ATPasas unidas a membrana9 Las celulas eucariotas mantienen unas concentraciones de Ca2+muy bajas en el citosol (_10-7 M), en comparaci6n con las concentraciones extracelulares de Caz+, mucho mas elevadas (-lo-a M). Asi, una entrada de Caz+, aunque sea pequena, a la celula, incrementa significativamente la concentraci6n de Ca2+libre en el citosol. El tlujo de Ca2+a favor de gradiente de concentraci6n en respuesta a senales extracelulares constituye una forma rapida de transmisi6n de estas senales a traves de la membrana plasmatica. Por 10 tanto el mantenimiento de un elevado gradiente de Ca2+ es importante para la celula. El gradiente de Caz+se mantiene en parte por la acci6n de bombas de Ca2+que existen en la membrana plasmatica, las cuales transportan Ca2+de forma activa hacia el exterior de la celula. Se sabe que una de estas bombas es una ATPasa, mientras que la otra es un transportador de intercambio (antiporte) impulsada por el gradiente electroqwmica de Na+. La bomba de Caz+mejor conocida es una ATPasa unida a la membrana del reticulo sarcoplasmdtico de las fibras musculares. El reticulo sarcoplasmatico -una tipo especializado de reticulo endoplasmatico- forma una red de sacos tubulares en el citoplasma de las celulas musculares que acma como reservorio intracelular de CaZ+. (Cuando un potencial de acci6n despolariza la membrana de la celula muscular, se libera CaZ+del reticulo sarcoplasmatico hacia el citosol, estimulando la contracci6n muscular, como se discute en el Capitulo 16.) La bomba de Caz+, que constituye alrededor del 90% de la proteina de membrana del organulo, es la responsable del bombeo del Ca2+desde el citosol hacia el interior del reticulo sarcoplasmlitico. (El reticulo endoplasmatico de las celulas no musculares contiene una ATPasa dependiente de Caz+similar a esta, aunque en menor cantidad, por 10 que es mas dificil de purificar.)

Protemas transportadoras y transporte activo a traves de membrana

551

ORIGEN DE LA OSMOLARIDAD INTRACELULAR <±)

<±) <±)

8 8

8 <±) Las macromoleculas por sf mismas contribuyen muy poco a la osmolaridad del interior celular ya que, a pesar de su gran tamai'io, cada una de elias cuenta como una sola molecula y hay relativamente pocas de elias en comparacion con el numero de pequei'ias moleculas que hay en la celula. Sin embargo, la mayo ria de macromoleculas biologicas estan muy cargadas y atraen muchos iones inorganicos de carga opuesta. Debido a su elevado numero, estos contraiones contribuyen de forma importante a la osmolaridad intracelular.

Como resultado del transporte activo y de los procesos metabolicos, la celula contiene una elevada concentracion de pequeiias moleculas organicas, tales como azucares, aminoacidos y nucleotidos, para las cuales la membrana plasmatica es impermeable. Como la mayorfa de estos metabolitos estan cargados, tam bien atraen contraiones. Tanto los pequei'ios metabolitos como sus contraiones tienen una repercusion importante en la osmolaridad intracelular.

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EL PROBLEMA

8

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Normalmente la osmolaridad dellfquido extracelular es debida principal mente a pequeiios iones inorganicos. Estos iones se filtran lentamente a traves de la membrana plasmatica hacia el interior de la celula. Si no son bombeados hacia el exterior y si no existen otras moleculas en el interior de la celula que interactuen con ellos influyendo en su distribucion, pueden lIegar a equilibrarse manteniendo la misma concentracion dentro y fuera de la celula. Pero la presencia en la celula de macromoleculas cargadas y de metabolitos que atraen a estos iones genera el efecto Donnan: hace que en el equilibrio, la concentracion total de iones inorganicos (y por tanto, su contribucion a la osmolaridadl sea mayor dentro que fuera de lei celula.

Debido a los facto res enunciados mas arriba, <±) una celula que no controle su osmolaridad tendra en su interior una concentracion total de solutos mayor que en el exterior. Como resultado de ellO, la concentracion 8 de agua sera mayor en el exterior que en el interior de la celula. Esta diferencia en la concentracion de agua a traves de la membrana plasmatica hara que el agua se desplace continua mente hacia el interior de la celula debido al proceso de osmosis, 8 causando su rotura.

LA SOLUCION Las celulas animales y las bacterias controlan su osmolaridad intracelular bombeando activamente hacia el exterior iones inorganicos, como el Na+, de forma que su citosol contiene una concentracion total de iones inorganicos menor que la del fluido extracelular, compensando asf su exceso de solutos organicos.

Las celulas vegetales evitan su hinchamiento mediante su pared rfgida, de forma que pueden tolerar diferencias osmoticas a traves de sus membranas plasmaticas: aparece una preslon interior que, en el equilibrio, impide que entre mas agua.

Muchos protozoos consiguen no hincharse de agua a pesar de que mantienen una diferencia osmotica a traves de la membrana plasmatica, expulsando agua periodicamente mediante vacuolas contractiles especiales.

8 <±)

8

8

8

8

La ATPasa de Ca2+puede ser analizada bioqufmicamente mediante los mismos metodos que los utilizados para laATPasa de Na+-K+ y se ha encontrado que ambas bombas actuan de una forma muy similar. En efecto, estudios de secuenciacion de DNA indican que las ATPasas de Na+-K+ y de Ca2+son protefnas homologas. En cada caso, la gran subunidad catalftica se presenta en varias isoformas, se cree que tiene alrededor de 10 posibles helices a que atraviesan la membrana y que se fosforila y desfosforila durante el ciclo de bombeo.

Algunas enzimas ligadas a membrana que sintetizan ATP son ATPasas de transporte que actuan en sentido opuesto lO Tanto la membrana plasmlitica de las bacterias como la membrana interna de las mitocondrias y la membrana tilacoidal de los cloroplastos presentan una enzima analoga a las dos ATPasas de transporte mencionadas anteriormente, pem que normalmente actua en sentido opuesto. En lugar de ser la hidrolisis del ATP la que impulsa el transporte ionico, en este caso es un gradiente de H+ a traves de estas membranas el que dirige la sfntesis de ATP a partir de ADP y fosfato. Este gradiente de H+ se genera durante el proceso de transporte de electrones de la fosforilacion oxidativa (en bacterias aerobicas y en mitocondrias) 0 mediante la bomba de H+ activada por la luz (bacteriorrodopsina) en Halobacterium. Como ocurre con las ATPasas de transporte, la enzima que normalmente sintetiza ATP, Hamada ATP sintasa, puede trabajar en ambas direcciones dependiendo de las condiciones: puede hidrolizar ATP y bombear H+ a traves de la membrana 0 puede sintetizar ATP cuando fluyen H+ a traves de la enzima en la direcci6n opuesta. En la mayorfa de las celulas, la ATP sintasa es responsable de la generaci6n de la mayorfa del ATP celular, como se discute en detalle en el Capftulo 14.

EI transporte activo puede ser impulsado por gradientes i6nicos l l Muchos sistemas de transporte activo no son impulsados directamente por la hidrolisis del ATP sino por la energfa almacenada en gradientes ionicos. La energfa libre liberada durante el desplazamiento de un ion inorganico a favor de su gradiente electroqufmico se utiliza como fuerza impulsora para bombear otros solutos en contra de sus gradientes electroqufmicos. Asf pues, todas estas protefnas actuan como transportadores acoplados -algunos como transportadores unidireccionales, otros como transportadores de intercambio. En la membrana plasmatica de las celulas animales el ion cotransportado cuyo gradiente electroqufmico proporciona la fuerza impulsora para el transporte activo de una segunda molecula normalmente es el Na+. El Na+ que entra en la celula durante este transporte es bombeado hacia el exterior mediante la ATPasa de Na+-K+, la cual, al mantener el gradiente de Na+, impulsa indirectamente el transporte de las otras moleculas que se cotransportan con el Na+. (Por esta razon se dice que los transportadores impulsados por iones median transportes activos secundarios, mientras que se dice que las ATPasas median transportes activos primarios.) Las celulas epiteliales del intestino y del rinon, por ejemplo, contienen varios sistemas de transporte unidireccional a traves de la membrana plasmatica que son impulsados por el gradiente de Na+. Cada sistema importa especfficamente ala celula un pequeno grupo de azucares 0 de aminoacidos relacionados. En estos sistemas el soluto y el Na+ se unen a diferentes lugares de la protefna transportadora; el Na+ tiende a entrar a la celula a favor de su gradiente electroqufmico, por 10 que, en cierto sentido, "arrastra" al azucar 0 al aminoacido hacia el interior de la celula. Cuanto mayor sea el gradiente electroqufmico de Na+, mayor sera la velocidad de entrada del soluto ala celula; por el contrario, si la concentracion de Na+ en el fluido extracelular se reduce fuertemente, el transporte de soluto se detiene. En bacterias y en levaduras, asf como en muchos organulos envueltos por membrana de las celulas animales, la mayorfa de los sistemas de transporte actiProtefnas transportadoras y transporte activo a traves de membrana

553

vo impulsados por gradientes i6nicos dependen del gradiente de H+ y no del de Na+, 10 cual refleja la predominancia en estas membranas de las ATPasas de H+ respecto ala pnictica ausencia de ATPasas de Na+. El transporte activo de muchos azucares y aminoacidos en bacterias, por ejemplo, esta impulsado por el gradiente de H+ a traves de la membrana plasmatica.

Las proteinas de transporte impulsado por Na+ de la membrana plasmatica regulan el pH citos6lico1 2 La estructura y la funci6n de la mayorfa de las macromoleculas estan notablemente influenciadas por el pH, y la mayoria de ellas actuan de forma 6ptima a un pH determinado. Por ejemplo, las enzimas lisosomales actuan mejor al bajo pH (-5) de los lisosomas mientras que las enzimas citos6licas actuan mejor a pH casi neutro (-7,2) del citosol. Por 10 tanto, resulta crucial que las celulas controlen el pH de sus compartimientos intracelulares. La mayoria de la celulas tienen en su membrana plasmatica uno a varios tipos de sistemas de transporte de intercambio impulsados por Na+, que regulan el pH intracelular (citos6lico) (pH) manteniendolo alrededor de 7,2. Estas proteinas usan la energia almacenada en el gradiente de Na+ para reducir la acidez eliminando el exceso de iones H+ consumidos 0 producidos en la celula a consecuencia de las reacciones que producen H+. Se utilizan dos mecanismos: los H+ son transportados directamente al exterior de la celula 0 se importa HC03- al interior de la celula para neutralizar los H+ del citosol. Uno de estos transportadores de intercambio que utiliza el primer mecanismo es un intercambiador de Na+-H+ que acopla la entrada de Na+ a la salida de H+. Otro transportador, que utiliza una combinaci6n de ambos mecanismos, es un intercambiador de CI--HCO; impulsado por Na+ que acopla la entrada de Na+ y de HC03" a la salida de Cl- y H+ (de forma que entra NaHC0 3 y sale HCn. El transportador Cl--HC03" impulsado por Na+ es dos veces mas efectivo que el transportador de Na+-K+, en el sentido de que por cada Na+ que entra en la celula bombea hacia el exterior un H+ y neutraliza otro H+. Si existe HC03" asequible, como ocurre habitualmente, este transportador es el mas importante en la regulaci6n del pHi. Ambos transportadores de intercambio estan regulados por el pHi' incrementando su actividad cuando el pHi desciende. En algunas celulas existe un tercer transportador dependiente de Na+ que desempefia un papel importante en la regulaci6n del pHi. Este transportador unidireccional de Na+-HC03 transporta un Na+ al interior de la celula con uno 0 varios iones HC03". En contraste con los otros dos transportadores que acabamos de describir, este simporte es electrogenico ya que su efecto neto es transportar cargas negativas al interior de la celula. Cuanto menor es el voltaje en el interior de la celula, mayor es su transporte. En consecuencia, en las celulas que presentan este transportador -principalmente las celulas de la glia del sistema nervioso- el pHi es sensible a cambios en el potencial de membrana. Parece que esta sensibilidad permite a estas celulas colaborar en la regulaci6n del pH extracelular local del cerebro en respuesta a cambios de su actividad electrica. Un intercambiador de CI--HC03 independiente de Na+, similar a la proteina banda 3 de la membrana de los eritrocitos discutida en al Capitulo 10, tambien juega un papel importante en la regulaci6n del pHi de algunas celulas nucleadas. Como los transportadores dependientes de Na+, el intercambiador de Cl--HC03" esta regulado por el pHi' pero en este caso el desplazamiento de HC03" se produce normalmente hacia el exterior de la celula, a favor de su gradiente de concentraci6n. La velocidad de eflujo de HC03" y de influjo de Cl- incrementa cuando el pHi aumenta, disminuyendo asi el pHi cuando el citosol empieza a ser demasiado alcalino. Como se discute en el Capitulo 13, el bajo pH de los lisosomas, asi como el de los endosomas y de las vesiculas de secreci6n, se mantiene por ATPasas dependientes de H+ que utilizan energia de hidr6lisis de ATP para bombear H+ desde el citosol hacia el interior de estos organulos. 554

Capitulo 11 : Transporte de moleculas pequefias a traves de la membrana

En las celulas epiteliales, la distribuci6n asimetrica de protefnas transportadoras permite el transporte transcelular de solutos13 En las celulas epiteliales, como las que participan en la absorci6n de los nutrientes del intestino, las proteinas transportadoras se hallan distribuidas de manera asimetrica en la membrana plasmatica y gracias a ello contribuyen al transporte transcelular de los solutos absorbidos. Tal como muestra la Figura 11-13, los transportadores unidireccionales acoplados a Na+ localizados en el dominio apical (absortivo) de la membrana plasmatica transportan nutrientes de forma activa hacia el interior de la celula, generando marcados gradientes de concentraci6n, mientras que en el dominio basal y lateral (basolateral) existen otras proteinas de transporte, independientes de Na+, que permiten que los nutrientes abandonen la celula a favor de su gradiente de concentraci6n. La ATPasa de Na+-K+ que mantiene el gradiente de Na+ a traves de la membrana plasmatica de estas celulas esta localizada en el dominio basolateral. Se cree que tanto las celulas renales como las intestinales utilizan unos mecanismos parecidos a este para bombear el agua desde un espacio extracelular a otro. En muchas de estas celulas epiteliales, la superficie de la membrana plasmatica se halla notablemente incrementada mediante la formaci6n de miles de microvilli, que se proyectan en forma de finas evaginaciones digitiformes de la superficie apical de cada celula (Figura 11-13). Estos microvilli pueden aumentar el area total de absorci6n de una celula mas de 25 veces, incrementando asi en gran medida su capacidad de transporte.

Algunas ATPasas transportadoras de membrana son hom6logas a las ATPasas transportadoras de eucariotas, que participan en la resistencia a drogas y en la fibrosis qufstica: la superfamilia de transportadores AB04 EI Ultimo tipo de proteinas transportadoras que presentaremos es una familia de ATPasas transportadoras de una gran importancia clinica, a pesar de que sus

microvilli del dominic apical transporte unidireccional de glucosa dirigido por Na+ dominic lateral

uni6n estrecha

epitelio intestinal

protefna transportadora que permite la difusi6n facilitada de glucosa

dominic basal fluido extracelular

BAJO

Protefnas transportadoras y transporte activo a traves de membrana

Figura II -13 La distribuci6n asimetrica de las proteinas transportadoras en la membrana plasmatica de una celula epitelial intestinal da lugar al transporte transcelular de glucosa a traves del epitelio intestinal. EI proceso que se muestra genera el transporte de glucosa desde la luz del intestino hasta el fluido extracelular (desde donde pasa a la sangre). La glucosa se bombea hacia el interior de la celula a traves del dominio apical de la membrana por un cotransporte unidireccional de glucosa impulsado por el Na+, y la glucosa pasa al exterior de la celula (a favor de su gradiente de concentraci6n) mediante difusi6n facilitada, por una protefna transportadora de glucosa diferente, existente en los dominios basal y lateral. El gradiente de Na+ que impulsa el transporte acoplado unidireccional (simporte) de glucosa se mantiene mediante laATPasa de Na+-K+ del dominio basolateral de la membrana plasmatica, que mantiene baja la concentraci6n intracelular de Na+. Las celulas adyacentes estan conectadas entre sf mediante uniones impermeables (llamadas uniones estrechas 0 estancas), las cuales desempefian una funci6n dual en el proceso de transporte ilustrado aquf: impiden que los solutos atraviesen los epitelios entre las celulas, permitiendo asf que el gradiente de concentraci6n de glucosa se mantenga a traves de la lamina de celulas, y tambien actl1an como barreras de difusi6n en la membrana plasmatica, confinando las diversas protefnas transportadoras a sus respectivos dominios de membrana (vease Figura 10-37).

555

lipopolisacarido porina

bicapa

f

25 nm

1

Iipidica~

externa

lipoproteina peptidoglucano protefna soluble en el espacio periplasmatico

L

espaCi~

periplasmatico

r

protefna de transporte

bicapa lipidica/L interna

funciones normales en las celulas eucariotas se han descrito muy recientementeo La primera de estas proteinas en ser caracterizada se encontr6 en bacterias. Ya hemos mencionado que la membrana plasmatica de todas las bacterias contiene proteinas transportadoras que utilizan el gradiente de H+ a traves de la membrana para bombear varios nutrientes hacia el interior de la celula. Muchas de elIas tambien tienen ATPasas de transporte que utilizan la energia de hidr6lisis del ATP para importar varios tipos de azucares, aminoacidos y pequefios peptidos. En bacterias como E. coli, que tienen doble membrana (Figura 11-14), las ATPasas de transporte se hallan localizadas en la membrana interna; existen mecanismos auxiliares que permiten captar los nutrientes y cederlos a los transportadores (Figura 11-15). Las ATPasas de transporte de la membrana plasmlitica de las bacterias pertenecen a la familia de proteinas de transporte mas amplia y diversa de las conocidas. Se denomina superfamilia de transportadores ABC porque cada uno de sus miembros contiene un "cassette" de uni6n al ATP (ATP-binding cassette) altamente conservado (Figura 11-16). Se han descrito mas de 50 transportadores ABC y, aunque habitualmente cada uno de ellos es especifico de un substrato 0 de una clase de substratos determinados, la variedad de substratos transportados por esta superfamilia es enorme, incluyendo aminoacidos, azucares, polisacaridos, peptidos e incluso proteinas. Mientras que la mayoria de los miembros de esta familia han sido descritos en procariotas, el numero de transportadores

soluto EXTERIOR CELULAR MEMBRANA [ • • • • • EXTERNA

Figura J J -J 4 Visi6n esquematica de una pequefia secci6n de la doble membrana de una bacteriaE. coli. La membrana intema es la membrana plasmatica de la celula. Entre las bicapas lipfdicas intema y extema existe un peptidoglucano rfgido y muy poroso, compuesto de protefnas y polisacaridos, que constituye la pared celular bacteriana; esta unido a moleculas lipoproteicas de la membrana extema y llena el espacio periplasmdtico (solo se muestra una pequefia parte del peptidoglucano). Este espacio tambien contiene diversas moleculas proteicas solubles. Los illamentos dibujados a trazos verdes de la parte superior de la figura representan las cadenas de polisacarido de unas moleculas especiales de polisacarido que forman una monocapa extema en la membrana extema; para mayor claridad Unicamente se han dibujado algunas de estas cadenas. Las bacterias que presentan doble membrana se denominan gram negativas porque no retienen el colorante azul oscuro utilizado en este procedimiento de tincion. Las bacterias que presentan una sola membrana (y finas paredes celulares), como los estaillococos y los estreptococos, retienen el colorante azul, por 10 que son denominadas gram positivas; su Unica membrana es analoga a la membrana intema (plasmatica) de las bacterias gram negativas.

Figura 11-15 Sistema auxiliar de transporte asociado con las ATPasas de transporte de bacterias con doble membrana. El soluto difunde a traves de protefnas formadoras de canal (llamadas porinas) de la membrana exterior y se unen a una proteina

periplasmdtica que se une a substratos.

ESPACIO PERIPLASMATICO

MEMBRANA [ INTERNA (PLASMATICA)

556

Capitulo 11 : Transporte de moltkulas pequefias a traves de la membrana

Como resultado de ello, la protefna que se une al substrato sufre un cambio de conformacion que Ie permite unirse a una protefna transportadora de la membrana plasmatica, la cual toma el soluto y 10 transfiere activamente a traves de la bicapa mediante una reaccion dirigida por la hidrolisis del ATP. Para mayor sencillez del dibujo, se ha omitido el peptidoglucano; su porosa estructura permite que tanto las protefnas que se unen a los substratos como los solutos solubles en agua se desplacen por difusion simple a traves de el.

,

Tabla 11-2 Algunas familias de protemas transportadoras Familia*

Miembros representativos

Transportadores de azucares

transportadores pasivos de glucosa en celulas de mamffero algunos transportadores de azucares impulsados por H+, en bacterias ATPasas de Na+-K+ ATPasas de Ca2+ ATPasa de resistencia a multiples drogas (MDR) en celulas de mamffero ATPasas dependientes de protefnas de union a substratos periplasm
ATPasas de transporte de cationes Transportadores ABC

P. falciparum

Transportadores de intercambio (antiporters) de aniones (CI--HCOi) Transportadores de intercambio de cationes Transportadores de intercambio de cationes/aniones Transportadores unidireccionales impulsados por Na+

exportadores de feromonas de acoplamiento sexual, en levadura bomba de peptidos, en la membrana del ER de vertebrados protefna reguladora transmembrana de fibrosis qufstica (CFTR) protefna banda 3 en eritrocitos intercambiador de aniones, en otras celulas intercambiador de Na+-H+ intercambiador de Cl--HCOi dependiente de Na Transportador unidireccional de glucosa y Na+, en celulas intestinales Transportador unidireccional de prolina y Na+, en bacterias Transportador unidireccional de Na+-HCOi, en celulas gliales

dominios de union al ATP

Figura 11-16 Dibujo esquematico de un transportador ABC tfpico. (A) Diagrama topo16gico. (B) Disposici6n hipotetica de la cadena polipeptfdica en la membrana. EI transportador esta compuesto por cuatro dominios: dos dominios muy hidrof6bicos, cada uno de elIos con seis posibles segmentos intramembrana que de alguna forma deben participar en el proceso de translocacion, y dos dominios catalfticos que unenATP (0 "cassettes"). EI algunos casos las dos mitades del transportador estan formadas por un mismo polipeptido (como en la figura) mientras que en otros estan formados por dos polipeptidos diferentes.

* Los miembros de una misma familia son similares entre sf en cuanto a secuencia de aminoacidos y, pOl 10 tanto, se cree que han evolucionado a partir de una protefna ancestral comun.

descritos en eucariotas es cada vez mayor. EI primero en ser identificado se descubri6 gracias a su capacidad de bombear drogas hidrof6bicas hacia el exterior de celulas eucariotas. Uno de estos transportadores es la protema de resistencia a mUltiples drogas (MDR, de MultiDrug Resistance) cuya sobreexpresi6n en celulas cancerosas humanas puede hacerlas simultaneamente resistentes a una gran variedad de drogas citot6xicas no relacionadas qufmicamente que son ampliamente utilizadas en la terapia del cancer. EI tratamiento con una de estas drogas puede provocar la selecci6n de las celulas que sobreexpresan la protefna transportadora MDR; el transportador bombea la droga hacia el exterior de la celula, reduciendo asf su toxicidad y confiriendo resistencia a la celula contra una gran variedad de agentes terapeuticos. En el protozoo Plasmodium falciparum se produce un fen6meno relacionado con este e igualmente siniestro, que causa la malaria. Mas de 200 millones de personas han sido infectadas por este parasito, que sigue siendo la mayor causa de muerte en humanos, matando mas de un mill6n de personas cada ano. EI control de la malaria se ve entorpecido por el desarrollo de resistencia a la droga antimalarica cloroquina; se ha detectado un P. falciparum resistente que ha amplificado el gen que codifica el transportador ABC que transporta cloroquina hacia el exterior de la celula. EI numero de miembros conocidos de la superfamilia ABC de transportadores en las celulas eucariotas crece rapidamente, y la Cunci6n normal de algunos de elios va siendo cada vez mas clara. En levaduras, un transportador ABC es el responsable

Protefnas transportadoras y transporte activo a traves de membrana

557

de exportar una feromona de acoplamiento sexual (un peptido de 13 aminoacidos) a traves de la membrana plasmatica de la celula de levadura. En la mayoria de las celulas de vertebrados, un transportador ABC de la membrana del reticulo endoplasmatico (ER) transporta activamente desde el citosol hasta el interior del ER una gran variedad de peptidos producidos por la degradaci6n de protefnas. Se trata de la primera etapa de un proceso de gran importancia en la supervisi6n de las celulas por el sistema inmune (se discute en el Capftulo 23). Los fragmentos de protefna transportados, una vez han entrado al ER, pueden ser transportados ala superficie celular donde son presentados para que los linfocitos T citot6xicos puedan reconocerlos; si resultan ser extrafios al individuo (como por ejemplo si derivan de un virus del interior de la celula), los linfocitos T matan a la celula que los presenta. Otro miembro de la familia ABC ha sido descubierto mediante estudios de la enfermedad genetica comtin denominada fibrosis quistica. Esta enfermedad esta causada por una mutaci6n en un gen que codifica un transportador ABC que acttia como un canal de Cl- en la membrana plasmcitica de las celulas epiteliales. El canal es poco habitual en cuanto a que para abrirse requiere la hidr6lisis de ATP y la fosforilaci6n dependiente de AMP cfclico. Debido a que existen evidencias de que la protefna MDR tambien puede actuar como canal de Cl- en algunas celulas (en este caso, no regulado por AMP cfclico sino por el volumen celular), parece claro que al menos algunos transportadores ABC pueden actuar como transportadores y como canales i6nicos. Sin embargo, todavfa resulta un misterio de que forma los transportadores ABC pueden actuar de estas dos maneras tan diferentes y transferir a traves de la membrana estos tipos de moIeculas tan distintos. En la Tabla 11-2 se resumen algunas de las familias de las protefnas transportadoras de las que hemos tratado.

Resumen Las prote{nas transportadoras se unen a determinados solutos y los transportan a

traves de la bicapa lipidica, mediante cambios conformacionales que exponen el lugar de uni6n al soluto secuencialmente a uno y luego al otro lado de la membrana. Algunas prote{nas transportadoras simplemente transportan un soluto "cuesta abajo", mientras que otras pueden actuar como bombas transportando un soluto "cuesta arriba" en contra de su gradiente electroquimico, utilizando para ello energia de hidr6lisis delATP 0 unflujo "cuesta abajo" de otro soluto (como el Na+) para impulsar las series de cambios de conformaci6n necesarios. Estudios de clonaje y secuenciaci6n de DNA muestran que las protefnas transportadoras pertenecen a un pequeno numero de familias, cada una de las cuales contiene protefnas de secuencias de aminoacidos similares que probablemente han evolucionado a partir de una protefna ancestral comun, y que actnan a traves de un mecanismo similar. La familia de ATPasas transportadoras de cationes, que incluye la ubieua bomba Na+[(+, constituye un ejemplo importante de ello; cada una de estas ATPasas contiene una gran subunidad catalftica que secuencialmente es fosforilada y desfosforilada durante el ciclo de bombeo. La superfamilia de transportadores ABC es especialmente importante desde el punto de vista clfnieo: incluye protefnas que son responsables de la fibrosis qufstica, y tambien protefnas que confieren resistencia a drogas en celulas cancerosas yen parasitos causantes de la malaria.

Canales ionicos y propiedades electricas de las melnbranas 15 A diferencia de las protefnas transportadoras, las proteinas de canal forman poros hidrofflicos que atraviesan la membrana. Una clase de protefnas de canal que se encuentra en practicamente todos los grupos de animales forma las uniones comunicantes (gap junctions) entre dos celulas adyacentes; cada membrana 558

Capitulo 11 : Transporte de moleculas pequefias a traves de la membrana

plasmatica contribuye de la misma forma a la formacion del canal, que conecta los citoplasmas de ambas celulas. Estos canales se discuten en el Capitulo 19, por 10 que aqui no trataremos de ellos. Tanto las uniones comunicantes como las porinas, las proteinas formadoras de canal de las membranas externas de las bacterias, mitocondrias y cloroplastos (discutidas en el Capitulo 10), tienen poros relativamente grandes y permisivos, que resultarfan desastrosos si conectaran directamente el interior de una celula con el espacio extracelular. Por el contrario, la mayorfa de proteinas de canal de la membrana plasmcitica de las celulas animales y vegetales conectan el citosol con el exterior celular, por 10 que necesariamente han de tener poros estrechos altamente selectivos. Estas proteinas estan relacionadas especfficamente con el transporte de iones inorganicos, por 10 que se denominan canales i6nicos. Respecto ala eficiencia de transporte, los canales tienen ventaja sobre los transportadores ya que a traves de cada canal pueden pasar mas de 1 millon de iones cada segundo, 10 cual es una velocidad mas de 1000 veces superior que eltransporte mediado por cualquier transportador conocido. Por otro lado, los canales ionicos no pueden estar acoplados a una fuente energetica, de forma que el transporte que median siempre es pasivo ("cuesta abajo"). Asi, la funcion de los canales ionicos es permitir que iones inorganicos especfficos, mayoritariamente Na+, K+, Ca2 +, 0 Cl-, puedan difundir a favor de su gradiente electroquimico a traves de la bicapa lipidica. Esto no quiere decir, sin embargo, que el transporte a traves de canales ionicos no este regulado. Por el contrario, veremos que la capacidad de regular el flujo de iones es esencial para la funcion de muchos tipos celulares. Concretamente, las celulas nerviosas se han especializado en la utilizacion de canales ionicos, y consideraremos de que forma utilizan una gran variedad de tales canales para recibir, conducir y transmitir sefiales.

Los canales i6nicos son selectivos para el ion y tluctuan entre estados abiertos y cerrados1 5 Dos propiedades importantes diferencian los canales ionicos de los simples poros acuosos. En primer lugar, presentan selectividad i6nica, es decir, permiten que algunos iones puedan pasar y otros no. Esto sugiere que sus poros deben ser suficientemente estrechos en algunos lugares como para permitir que los iones entren en contacto intimo con las paredes del canal, de tal manera que solo los iones de tamafio y carga adecuados puedan atravesarlos. Se cree que para poder pasar a traves de la parte mas estrecha del canal, los iones que atraviesan los canales (en fila) tienen que deshacerse de la mayor parte 0 de todas las moleculas de agua que llevan asociadas; este hecho limita la velocidad maxima de paso. Asi, cuando aumenta la concentracion de un ion, el flujo de tal ion a traves del canal aumenta proporcionalmente hasta que se alcanzan los niveles de saturacion, momenta en que se llega a la velocidad maxima de transporte. La segunda diferencia importante entre los canales ionicos y los simples poros acuosos consiste en que los canales ionicos no estan abiertos continuamenteo En lugar de ello, tienen "puertas" que se abren brevemente y luego se cierran de nuevo, tal como se muestra esquemciticamente en la Figura 11-17. En la ma-

bicapa[ lipfdica

superficie hidrof6bica

superficie hidrofflica

filtro selectivo a iones en el poro acuoso

Canales i6nicos y propiedades electricas de las membranas

Figura 11-17 Dibujo esquematico de un canal i6nico tfpico, que Ouctda entre las conformaciones cerrada y abierta. Una protefna transmembrana, vista en seccion transversal, forma un poro acuoso a traves de la bicapa lipfdica, unicamente cuando la compuerta esta abierta. Se cree que las paredes internas del poro se hallan recubiertas de cadenas laterales de aminoacidos polares, mientras que las cadenas laterales hidrofobicas interactuan con la bicapa lipfdica. EI poro se estrecha hasta alcanzar, en una region determinada, dimensiones atomicas (el "filtro selectivo de iones"); esta region determina principalmente la selectividad i6nica del canal. 559

reguladas par valtaje

reguladas par liganda (Iiganda extracelular)

reguladas par liganda (liganda intracelular)

reguladas mecanicamente

CERRADOS

ABIERTOS

yaria de los casos las puertas se abren en respuesta a estfmulos especfficos. Los

principales tipos de estimulos que se sabe que causan la abertura de los canales ionicos son cambios en el voltaje a traves de la membrana (canales regulados por voltaje), estimulaciones mecanicas (canales regulados mectinicamente) y la union de un ligando (canales regulados por ligando). Elligando puede ser un mediadar extracelular -especfficamente un neurotransmisor (canales regulados por transmisor) 0 un mediadar intracelular, como un ion (canales regulados por ion), 0 un nucleotido (canales regulados por nucle6tido) (Figura 11-18). La actividad de muchos canales ionicos esta regulada, ademas, por fosforilacion y desfosfarilacion de proteinas; este tipo de regulacion se discute en el caso de los canales regulados par nucleotido, en el Capitulo 15. Hasta ahara se han descrito mas de 100 tipos de canales ionicos, y todavfa se estan descubriendo mas. Son responsables de la excitabilidad electrica del mtisculo y median la mayorfa de formas de sefiales electricas en el sistema nervioso. Una celula nerviosa tipica contiene 10 tipos diferentes 0 mas de canales ionicos, localizados en diferentes dominios de su membrana plasmlitica. Sin embargo, estos canales no solo se presentan en celulas excitables electricamente, sino que tambien se hallan en todas las celulas animales y vegetales y tambien en microorganismos: por ejemplo, los canales ionicos son los responsables de propagar la respuesta de cerrar las hojas de la mimosa, y permiten que los paramecios unicelulares cambien de direccion despues de colisionar. Quizas los canales ionicos mas comunes son los permeables principalmente al K+, que se encuentran en la membrana plasmatica de casi todas las celulas animales. Un importante subconjunto de estos canales se abre incluso en celulas no estimuladas ("en reposo") por 10 que habitualmente se les denomina canales de fuga de K+. Aunque este termino se refiere a una gran variedad de canales de K+ diferentes, dependiendo del tipo celular de que se trate, tienen una funcion comtin: haciendo que la membrana plasmlitica sea mucho mas permeable al K+ que a cualquier otro ion, juegan un papel critico en el mantenimiento del potencial de membrana -la diferencia de potencial que se presenta a traves de todas las membranas plasmliticas.

El potencial de membrana de las celulas animales depende principalmente de los canales de fuga de K+ y del gradiente de K+ a traves de la membrana plasmatica15,16 Cuando existe una diferencia de carga electrica entre ambos lados de una membrana, debido a un ligero exceso de iones positivos sobre los negativos en uno de los lados y un ligero defecto en el otro lado, aparece un potencial de membrana. 560

Capitulo 11 : Transporte de moleculas pequefias a traves de la membrana

Figura 11-18 Canales i6nicos regulados. Dibujo esquematico de los diferentes sistemas a traves de los cuales se pueden regular los canales i6nicos.

Estas diferencias de carga pueden producirse tanto por un transporte activo electrogenico (vease pag. 550) como por difusi6n i6nica pasiva. Veremos en el Capitulo 14 que la mayor parte del potencial de membrana de la mitocondria esta generado por la bomba electrogenica de H+ de la membrana intema de la mitocondria. Las bombas electrogenicas tambien generan las mayor parte del potencial electrico a traves de la membrana plasmMica de las celulas vegetales y de hongos. Sin embargo en las celulas animales tipicas son los movimientos pasivos de los iones los principales responsables del potencial electrico a traves de la membrana plasmMica. Como se ha explicado anteriormente, la ATPasa de Na+-K+ ayuda a mantener el equilibrio osm6tico a traves de la membrana plasmatica, manteniendo baja la concentraci6n intracelular de Na+. Como en el interior celular hay poco Na+, tienen que existir otros cationes en cantidades abundantes que equilibren la carga de los aniones fijos celulares -las moleculas cargadas negativamente que estan confinadas en el interior celular. Este papel de equilibrador de cargas esta desempenado principalmente por el K+, que es bombeado activamente al interior celular por laATPasa de Na+-K+ y que tambien puede desplazarse libremente hacia el interior 0 el exterior de la celula a traves de los canales de fuga de K+. Debido a la presencia de estos canales, el K+ se mantiene practicamente en un equilibrio en el que la fuerza electrica, ejercida por un exceso de cargas negativas del interior de la celula, atrayendo el K+ hacia el interior de la celula, equilibra la tendencia del K+ a salir a favor de su gradiente de concentraci6n. El potencial de membrana es la manifestaci6n de esta fuerza electrica y se puede calcular su valor de equilibrio a partir del valor del gradiente de concentraci6n del K+. Los argumentos siguientes pueden ayudar a aclarar este concepto. Supongamos que inicialmente no existe gradiente de voltaje a traves de la membrana plasmMica (el potencial de membrana es cero) pero que la concentraci6n de K+ es elevada en el interior de la celula y baja en el exterior. El K+ tendera a salir de la celula a traves de los canales de fuga del K+, impulsado por su gradiente de concentraci6n. A medida que el K+ vaya fluyendo hacia el exterior de la celula, dejara detras suyo una carga neta negativa, creando asi un campo electrico 0 potencial de membrana que tendera a impulsar de nuevo el K+ hacia el interior de la celula. El reflujo neto de K+ cesara cuando el potencial de membrana alcance un valor tal que la fuerza electrica que genere sobre el K+ equilibre exactamente el efecto del gradiente de concentraci6n de este ion -es decir, cuando su gradiente electroquimico de K+ sea cero. AI mismo tiempo, los iones Cl- se equilibran de manera similar a como ocurre con el K+, pero dado que su carga es negativa, el potencial de membrana mantiene la mayoria de estos iones fuera de la celula. Esta condici6n de equilibrio en la que no hay flujo neto de corriente electrica a traves de la membrana, define el potencial de reposo de la membrana para esta .celula ideal. Una f6rmula sencilla pero muy importante, la ecuaci6n de Nemst, expresa la condici6n de equilibrio de manera cuantitativa y, tal como se explica en el Panel 11-2, permite calcular el potencial de reposo te6rico de la membrana si se conoce la relaci6n de concentraciones i6nicas intema y extema. Sin embargo, como la membrana plasmatica de una celula real no es exclusivamente permeable a K+ y a Cl-, el potencial de reposo real generalmente no es exactamente igual al que predice la ecuaci6n de Nemst para el K+ y el Cl-.

Cuando se para la bomba de Na+-K+, el potencial de reposo s610 decae lentamente l5, 16 El mlmero de iones que se han de desplazar a traves de la membrana para generar el potencial de membrana es insignificante. Asi se puede pensar que el potencial de membrana aparece debido a movimientos de carga que mantienen las concentraciones de los iones practicamente inalteradas, y que se produce por diferencias muy leves del mlmero de iones negativos y positivos que hay a las dos lados de la membrana (Figura 11-19). Ademas, generalmente estos movimientos de carga son rapidos, del orden de tan s610 unos cuantos milisegundos 0 menos. Canales i6nicos y propiedades electricas de las membranas

561

LA ECUACI6N DE NERNST Y EL FLUJO DE IONES EI flujo de cualquier ion a traves de una protefna canal de membrana esta dirigido por el gradiente electroqufmico de este ion. Este gradiente representa la combinacion de dos facto res: el gradiente de voltaje y el gradiente de concentracion del ion a traves de la membrana. Cuando estas dos influencias se equilibran una con otra, el gradiente electroqufmico del ion

es cero y no se produce flujo neto del ion a traves del canal. EI gradiente de voltaje (potencial de membrana) en el que se alcanza este equilibrio, se denomina potencial de equilibrio del ion. Puede calcularse mediante una ecuacion que sera deducida a continuacion, lIamada ecuacion de Nernst.

La ecuacion de Nernst es:

donde

v = potencial de equilibrio en voltios (potencial interne menos el potencial externo) Co Y Ci = concentraciones externa (de "outside") e interna del ion, respectivamente

R

= constante de los gases (2 cal

mor' °K-')

T = temperatura absoluta (oK)

F = constante de Faraday (2,3 x 104 cal V-, mol-')

z = valencia (carga) del ion In = logaritmo de base e

La ecuacion de Nernst puede deducirse de la siguiente forma: Una moh~cula en soluci6n (un soluto) siempre se mueve desde una regi6n de elevada concentraci6n hacia una regi6n de baja concentraci6n, simplemente debido a la presi6n de los nUmeros. Consecuentemente, el movimiento a favor de gradiente de concentracion viene acompaliado de una variaci6n favorable de energfa libre (dG < 0), mientras que el movimiento en contra de gradiente de concentraci6n viene acompaliado de una variaci6n desfavorable de energfa Iibre (dG> 0). (EI concepto de energfa libre se introduce y discute en el Panel 14-1, pags. 714-715.) La variaci6n de energfa Iibre por mol de soluto que se ha desplazado a traves de la membrana plasmMica (dGconc ) es igual a -RTIn Co / Cj • Si el soluto es un ion, al moverse hacia el interior de una celula a traves de una membrana en la que se mantiene un voltaje V en el interior respecto al exterior, generara una variaci6n adicional de energfa libre (por mol de soluto:que se haya desplazado) de dGvolt = zFV. En el punta en el que el gradiente de concentraci6n y el de voltaje se hallen compensados exactamente, dGconc + dGvolt = 0 y la distribuci6n del ion se hallara en equilibrio a traves de la membrana. Asf

zFV-RT In Co =0

Cj

y por tanto

v=

RT In Co = 2,3 RT log,o Co zF Ci zF Ci

Para un ion monovalente,

2,3

FRT = 58 mV a 20°C

y 61,5 mV a 37°C

Asf pues, para un ion dado a 37°C, V= + 61,5 mV para Co / Cj = 10, mientras que V = 0 para Co / Ci = 1., Por ejemplo, el potencial de equilibrio del K+ (VK) es de 61,5 10g,o([K+lo / [K+l j ) milivoltios (-89 mV para una celula tfpica cuando [K+l o = 5 mM y [K+l j = 140 mM). A VK, no existe flujo neto de K+ a traves de la membrana. De forma similar, cuando el potencial de membrana alcanza un valor de 61,5 10glO([Na+lo /lNa+]il, el potencial de equilibrio del Na+ (VNa ), no existira flujo neto de Na+. Para cualquier potencial de membrana particular, VM , la fuerza neta que tiende a empujar hacia el exterior de la celula a un determinado tipo de ion es proporcional a la diferencia entre VM y el potencial de equilibrio del ion: asf, para el K+ es VM - VK y para el Na+ es VM - VNa • EI numero de iones que forman la lamina de carga adyacente a la membrana es despreciable comparado con el numero total de iones del interior de la celula. Por ejemplo, el desplazamiento de 6000 iones Na+ a traves de 1 Ilm2 de membrana transportara suficiente carga para cambiar el potencial de membrana unos 100 mY. Como existen unos 3 x 107 iones Na+ en 1 Ilm3 de citosol, este desplazamiento de carga tendra un efecto despreciable sobre los gradientes de concentraci6n a traves de la membrana.

+ - + - + - + - + - + - + + - + - + - + - + - + - + +-+-+-+ + - + - + + - + - + - + - + - + - + + - + - + - + - + - + - + + - + - + - + -+-+-+-

+-+-+-+ - + - + - + +-+-+-+ - + - + - + + - + - + - + + - + - + +-+-+-+ - + - + ++-+-+-+ - + - + - + +-+-+-+ -

+ -

+ -

+ -

equilibria exacto de cargas a cada lade de la membrana; potencial de membrana = 0

+ - + + - + + - + + - + + - + + +

+

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+ -

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+ + - + + - + + - + + - + + - + + -

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+ - + - + + + + + - + - + + + + + + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + + + + + - + -

una pequena cantidad de iones positivos (rajo) atraviesan la membrana de izquierda a derecha, dejando tras de sf sus contraiones negativos (rojo); este hecho provoca la aparici6n de un potencial de membrana diferente de cera

Resulta clarificador considerar que Ie ocurre al potencial de membrana si la ATPasa de Na+-K+ se inactiva de repente. Primero, se produce un bajada suave e inmediata del potencial de membrana. Esto se debe a que la bomba es electrogenica y cuando se mantiene activa contribuye ligeramente a mantener el potencial de membrana ya que extrae tres Na+ por cada dos K+ que introduce en la celula. Sin embargo, al cerrar la bomba no se eliminan los componentes principales del potencial de reposo, que como se ha esbozado anteriormente esta generado por un mecanismo de equilibrio del K+. Este desequilibrio persiste mientras se mantenga baja la concentraci6n de Na+ en el interior de la celula y alta la de K+ en el exterior -normalmente varios minutos. No obstante, la membrana plasm
Figura I I - I 9 Un pequeno flujo de lones transporta suficiente cantidad de carga para generar una gran varlaci6n del potencial de membrana. Los iones que incrementan el potencial de membrana se hallan situados en una fina capa superficial « 1 nm) muy cerca de la membrana, que se mantiene unida a ella debido a su atracci6n eIectrica con los iones de carga opuesta (contraiones) delotro lado de la membrana. Para una ctHula tipica, 1 microculombio de carga (6 x 1012 iones monovalentes) par centfmetro cuadrado de membrana transferidos de un lado a otro de la membrana genera una carga de aproximadamente 1 V. Esto significa, par ejemplo, que en una celula esferica de 10 ~m de dhimetro, el mlmero de iones K+ que han de fluir hacia el exterior de la celula para generar una variaci6n del potencial de membrana de 100 mY, linicamente es de 11100000 parte del total de iones K+ del citosol.

La funci6n de una celula nerviosa depende de su estructura alargada 15 La tarea fundamental de la neurona es recibir, conducir y transmitir senales. Para realizar estas funciones, normalmente las neuronas son extremadamente alargadas: una celula nerviosa de un ser humano, que se extienda desde la medula espinal hasta un musculo del pie, puede tener un metro de largo. Cada Canales i6nicos y propiedades electricas de las membranas

563

.--:.~~._ ~==================:::~r~;;

cuerpo 0 soma celular

ax6n (desde menos de 1 mm hasta mas de 1 m de largo)

dendritas

ramificaciones terminales del ax6n

neurona consta de un cuerpo 0 soma celular (que contiene el mlcleo) y un cierto mimero de largas y delgadas proyecciones que irradian desde este soma hacia el exterior. Generalmente tienen un largo ax6n, que conduce las sefiales desde el soma celular hacia dianas distantes y varias dendritas, mas cortas y ramificadas, que se extienden desde el soma celular como antenas, proporcionando una extensa superficie que Ie permite a la neurona recibir sefiales procedentes de los axones de otras celulas nerviosas (Figura 11-20). Las sefiales tambien se reciben en el propio soma celular. Habitualmente el ax6n se divide en su extremo distal en numerosas ramas de forma que puede transmitir su mensaje a muchas celulas diana simultaneamente. Ademas, la extensi6n de las ramificaciones de las dendritas puede ser muy grande -en algunos casos 10 suficiente como para que una sola neurona reciba hasta 100 000 contactos. A pesar del variado significado de las sefiales transportadas par las diferentes clases de neuronas, la forma de estas sefiales es siempre la misma: cambios del potencial electrico a traves de la membrana plasmcitica de la neurona. La comunicaci6n tiene lugar debido a que una alteraci6n electrica producida en una zona de la celula se propaga hacia otras zonas. Esta alteraci6n se ida debilitando al aumentar la distancia a la que se propaga a partir del origen, a no ser que se gaste energfa para amplificarla a medida que se propaga. En distancias cortas esta atenuaci6n carece de importancia; de hecho muchas neuronas pequefias conducen sus sefiales de manera pasiva, sin amplificaci6n. Para comunicaciones a largas distancias, sin embargo, esta propagaci6n pasiva es inadecuada. Asf, las neuronas mayores utilizan un mecanismo de sefializaci6n activo que constituye uno de sus rasgos mas sorprendentes: un estfmulo electrico que sobrepasa una cierta intensidad umbral desencadena una explosi6n de actividad electrica que se propaga rapidamente a 10 largo de la membrana plasmcitica de la neurona y que se mantiene por una amplificaci6n automatica a 10 largo de todo el recorrido. Esta onda viajera de excitaci6n electrica, conocida como potencial de acci6n 0 impulso nervioso, puede transportar un mensaje sin atenuaci6n desde un extrema de una neurona hasta el otro, a velocidades tan rapidas como 100 m/ seg 0 mas. Los potenciales de acci6n son consecuencia directa de la acci6n de los canales regulados por voltaje, como veremos a continuaci6n

membrana polarizada ]

/

cerrado

membrana despolarizada

inactivado

564

abierto

Capitulo 11 : Transporte de moleculas pequefias a traves de la membrana

Figura 11-20 Diagrama esquematico de una neurona tfpica de vertebrado. Las flechas indican la direcci6n en la que se transportan las senales. EI ax6n conduce las senales en sentido de alejarse del soma celular mientras que las multiples dendritas reciben senales de los axones de otras neuronas. Las terminales nerviosas acaban sobre las dendritas 0 el soma celular de otras neuronas 0 sobre otros tipos celulares, como fibras musculares 0 celulas glandulares.

Figura 11-21 ElcanaldeNa+ regulado.por voltaje puede adoptar como minimo tres conformaciones (estados). Fuerzas internas, representadas aquf como atracciones entre cargas de diferentes zonas del canal, estabilizan cada uno de los estados contra pequenas desestabilizaciones, pero una colisi6n suficientemente violenta con otras moIeculas puede ocasionar que el canal "salte" de uno a otro de estos estados. EI estado de menor energfa depende del potencial de membrana ya que las diferentes conformaciones tienen diferentes distribuciones de cargas. Cuando la membrana esta en reposo (muy polarizada) la conformaci6n de menor energfa libre, y por tanto la mas estable, es la cerrada. Cuando la membrana se encuentra despolarizada, la conformaci6n abierta tiene una energfa menor, por 10 que el canal tiene una alta probabilidad de abrirse. Sin embargo, la energfa libre de la conformaci6n inactivada es todavia menor, por 10 que, despues de un perfodo de tiempo aleatorio dedicado a este estado abierto, el canal se inactiva. Asf pues, la conformaci6n abierta corresponde a un estado metaestable que unicamente puede existir de forma transitoria. Las jlechas en rajo indican la secuencia de alteraciones que se producen como consecuencia de una despolarizaci6n subita mientras que lajlecha en negro indica el retorno a la conformaci6n original ya que es el estado de menor energfa despues de que la membrana se ha repolarizado.

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2

tiempo (milisegundos)

Los canales i6nicos regulados por voltaje son los responsables dela generaci6n de potenciales de acci6n en celulas excitables eIectricamente 15• 17 La membrana plasmatica de todas las celulas excitables electricamente (no solo de las neuronas sino tambien de las fibras musculares, celulas endocrinas y oocitos) presentan canales i6nicos regulados por voltaje, que son los responsables de la generacion de los potenciales de accion. Un potencial de accion se dispara par una despolarizaci6n de la membrana -es decir, por una variacion del potencial de membrana hasta un valor menos negativo. (Veremos mas adelante de que forma esta variacion puede estar causada por la accion de un neurotransmisor). En las celulas nerviosas y en las fibras musculares esqueleticas. un estfmulo que provoca una despolarizacion parcial de la membrana genera inmediatamente la apertura de los canales de Na+ regulados por voltaje, 10 cual permite que entre en la celula una pequefia cantidad de Na+ a favor de su gradiente electroqufmico. El influjo de cargas positivas despolariza min mas la membrana, por 10 que se abren mas canales de Na+, que admiten mas iones Na+, cuya entrada genera una mayor despolarizacion de la membrana. Este proceso continua de una manera auto-amplificante hasta que el potencial de la region determinada de la membrana haya variado desde su valor de reposo -de aproximadamente -70 mVhasta el potencial de equilibrio del Na+ -de aproximadamente +50 mV- (vease Panel 11-2, pag. 562). En este punto, cuando la fuerza electroqufmica neta impulsora del flujo de Na+ es casi cero, la celula podrfa alcanzar un nuevo estado de reposo con todos sus canales de Na+ abiertos permanentemente si la conformaci6n abierta de los canales de Na+ fuese estable. La celula se salva de este tipo de espasmo electrico permanente porque los canales de Na+ tienen un mecanismo de inactivacion automatica que hace que los canales se cierren rapidamente incluso cuando la membrana todavfa esta despolarizada. Los canales de Na+ permanecen en este estado inactivado, en el que no pueden volverse a abrir, hasta pasados algunos milisegundos despues que el potencial de membrana recupere su valor negativo inicial. En la Figura 11-21 se ilustran esquematicamente estos tres estados distintos del canal de Na+ regulado por voltaje -cerrado, abierto, e inactivado. En la Figura 11-22 se indica la contribucion de estas variaciones al aumento y la disminucion del potencial deaccion. Canales i6nicos y propiedades electricas de las membranas

Figura j 1·22 Un potencial de accion. Un potencial de acci6n se dispara par un breve pulso de corriente (mostrado en el grafteo superior) que despolariza parcialmente la membrana. como se muestra en el gnifico de potencial de membrana respecto al tiempo (grafteo intermedio). La eurva en verde muestra que el potencial de membrana puede simplemente relajarse de nuevo hacia el potencial de reposo tras el estimulo despolarizador si la membrana no tuviera canales i6nicos regulados par voltaje; este retorno relativamente suave del potencial de membrana a su valor inicial de -70 mV en ausencia de canales de Na+ es automatico debido al eflujo de K+ a traves de los canales de K+, el cuailleva a la membrana de nuevo al potencial de equilibrio de K'. La eurva en rajo muestra el curso del potencial de accion causado por la apertura y posterior inactivaci6n de los canales de Na+ regulados par voltaje, cuyo estado se muestra en la parte inferior de la figura. La membrana no puede disparar un segundo potencial de accion hasta que los canales de Na+ hayan vuelto ala conformaci6n cerrada (vease Figura 11-21); hasta este momento, la membrana se encuentra en un estado refractario a la estimulaci6n.

565

propagaci6n

(A)

o

3

2

tiempo (milisegundos)

(8)

vista instantanea a t = 0 propagaci6n cerrado

abierto

inactivado

repolarizada

cerrado

despolarizada

repose

vista instantanea a t = 1 milisegundo propagaci6n cerrado

repolarizada

inactivado

abierto' cerrado

despolarizada

repose

La descripci6n que hemos hecho hasta aquf del potencial de acci6n unicamente afecta a una pequefia parci6n de la membrana plasmlitica. Sin embargo, la despolarizaci6n auto-amplificante de esta porci6n es suficiente para despolarizar regiones vecinas. en las cuales se produce este mismo cicio. De esta manera el potencial de acci6n se propaga desde un punto inicial de despolarizaci6n por toda la membrana plasmlitica, como se muestra en la Figura 11-23. Ademas de la inactivaci6n de los canales de Na+, en muchas celulas nerviosas actlia un segundo mecanismo que ayuda a la membrana plasmatica activada 566

Capftulo 11 : Transporte de moh~culas pequeiias a traves de la membrana

Figura 11-23 Propagaci6n de un potencial de acci6n a 10 largo de un ax6n. (A) muestra los voltajes que se registrarfan en un conjunto de electrodos intracelulares colocados a intervalos en el axon. (B) muestra los cambios en los canales de Na+ y los flujos de corriente (lineas de color marron) que dan lugar a la perturbacion migratoria del potencial de membrana. La region del axon que presenta la membrana despolarizada. esta coloreada en raja. Notese que un potencial de accion solo puede viajar a partir dellugar donde se produce la despolarizacion porque la inactivacion de los canales de Na+ impide que la despolarizacion se extienda hacia atras. (Vease tambien Figura 11-22.)

a recuperar mas rapidamente su potencial negativo original, y asf poder transmitir un segundo impulso. Los canales de K+ regulados por voltaje se abren, de forma que el influjo transitorio de Na+ es rapidamente contrarrestado por un eflujo de K+, que en muy poco tiempo situa a la membrana en el potencial de equilibrio del K+ incluso antes de que se haya completado la inactivacion de los canales de Na+. Estos canales de K+ responden a cambios del potencial de membrana de forma muy semejante a como 10 hacen los canales de Na+, aunque con una cinetica ligeramente mas lenta; por esta razon, a menudo se les denomina canales de K+ retardados. Los mecanismos electroquimicos del potencial de accion fueron establecidos por primera vez gracias a unas famosas series de experimentos realizados en las decadas de 1940 y 1950. Debido a que las tecnicas de estudio de los procesos electricos en celulas pequefias todavia no se habian desarrollado, los experimentos utilizaron las neuronas gigantes del calamar. A pesar de los muchos avances tecnicos realizados desde entonces, la logica de los analisis originales todavia continua sirviendo de modelo hoy en dia. En el Panel 11-3 se resumen algunos de los experimentos clave originales.

La mielinizaci6n incrementa la velocidad y la eficiencia de la propagaci6n de los potenciales de acci6n en las celulas nerviosas 15,18 Los axones de muchas neuronas de vertebrados se hallan aislados por una vaina de mielina, la cual incrementa notablemente la velocidad a la que el axon conduce un potencial de accion. La importancia de la mielinizacion se pone dramaticamente de manifiesto por la enfermedad desmielinizante de la esclerosis multiple, en la que la vaina de mielina de algunas regiones del sistema nervioso central se halla destruida por un mecanismo todavia desconocido; cuando esto ocurre, la velocidad de propagacion de los impulsos nerviosos se reduce notablemente, a menudo con consecuencias neurologicas devastadoras. La mielina esta formada por celulas accesorias especializadas, denominadas celulas gliales -eelulas de Schwann en los nervios perifericos y oligodendrocitos en el sistema nervioso central. Estas celulas gliales depositan, una sobre otra, capas de su propia membrana plasmMica formando una apretada espiral alrededor del axon (Figura 11-24), aislando asi la membrana del axon de forma que a su traves casi no se escapa corriente. La vaina esta interrumpida a intervalos regulares por n6dulos de Ranvier, donde se concentran casi todos los canales de Na+ del axon. Debido a que las porciones del axon que estan recubiertas por la vaina tienen excelentes propiedades de cable (se comportan electricamente mucho mejor que los extraordinariamente bien disefiados cables submarinos telegraficos), la despolarizacion de la membrana en un nodulo se transmite de forma pasiva casi inmediatamente hasta el nodulo siguiente, un proceso denominado conducci6n saltataria. Este tipo de conduccion tiene dos ventajas principales: los potenciales de accion viajan mas rapidamente y se ahorra energia metabolica ya que la excitaci6n activa queda restringida a las reducidas regiones de la membrana plasmMica del axon situadas en los n6dulos de Ranvier.

EI registro de zona indica que cada uno de los canales de Na+ se abre siguiendo la ley del todo 0 nada IS, 19 Las membranas plasmMicas de las neuronas y de las fibras musculares esqueleticas contienen muchos miles de canales de Na+ regulados por voltaje, y la corriente que atraviesa la membrana es la suma de las corrientes que fluyen a traves de todos ellos. Esta corriente agregada puede ser registrada con un microelectrodo, tal como se describe en la Figura 11-23. Sin embargo, tambien es posible registrar las corrientes que fluyen a traves de canales individuales. Ello se consigue mediante la tecnica del registro de zona (patch-clamp recording), un metodo que revolucion6 el estudio de los canales ionicos permitiendo estudiar el transCanales i6nicos y propiedades electricas de las membranas

567

1. Los potenciales de accion se registran con un electrodo intracelular EI axon gigante de calamar tiene un diametro aproximado de 0,5-1 mm V una longitud de varios centfmetros. En el eje de la celula se puede introducir un electrodo en forma de tuba capilar de vidrio que contiene una solucion conductora, de manera que su punta quede situada dentro del citoplasma. Con su avuda, se puede medir la diferencia de voltaje entre el interior V el exterior de la celula -es decir, el potencial de membrana- cuando un potencial de accion pasa rapidamente por el electrodo. EI potencial de accion se desencadena por una breve descarga electrica en un extrema del axon. No importa de que extrema se trate, va que la excitacion puede viajar en cualquier direccion; tampoco importa la intensidad de la descarga mientras exceda un cierto umbral: el potencial de accion es "todo 0 nada".

2. EI potencial de accion solo depende de la membrana plasmatica de la neurona V de los gradientes de Na+ V K+ a traves de ella Los tres iones mas abundantes, tanto en el interior como en el exterior del axon, son Na+, K+ V CI-. Como en otras celulas, la bomba de Na+-K+ mantiene un gradiente de concentracion: la concentracion de Na+ es unas 9 veces menor en el interior del axon que en el exterior, mientras que la concentracion de K+ es 20 veces mayor en el interior. LQue iones son importantes para los potenciales de accion? EI axon gigante del calamar es tan grande V robusto que es posible extraer su citoplasma, como se hace con la pasta dentifrica de un tuba

V despues rellenarlo con soluciones artificiales puras de Na+, K+ CI- 0 S042-. De manera notable, si (V solo si) las concentraciones de Na+ V K+ en el interior V el exterior del axon se aproximan aI encontradas de manera natural, el axon propaga potenciales de accion de forma normal. La parte importante de la celula en la senalizacion electrica, por 10 tanto, ha de ser la membrana; los iones importantes son el Na+ V K+; sus gradientes de concentraci . a traves de la membrana han de proporcionar una fuente de energia libre suficiente para impulsar el potencial de accion, ya que se supone que las demas fuentes de energia metaboliea han sido eliminadas mediante la perfusion.

canula

En reposo, la membrana es principalmente permeable al K+; se vuelve transitoriamente permeable al Na+ durante el potencial de accion En reposo, el potencial de membrana es cercano al potencial de equilibrio para el K+. Cuando se cambia la concentracion externa de K+, el potencial de reposo cambia bruscamente de acuerdo con la ecuacion de Nernst para el K+ (vease Panel 11-2). En reposo, por tanto, la membrana es principal mente permeable al K+: los canales de fuga de K+ constituven la principal ruta ionica a traves de la membrana. Si se varia la concentracion externa de Na+, no se altera el potencial de reposo. Sin embargo, la altura del pica del potencial de accion varia marcadamente, de acuerdo con la ecuacion de Nernst para el Na+. Durante el potencial de accion, por 10 tanto, la membrana parece ser permeable principal mente al Na+: se abren los canales de Na+. En la segunda parte del potencial de accion, el potencial de membrana vuelve a un valor negativo que depende de la concentracion externa

4. EI voltaje constante revela como el potencial de membrana controla la apertura V el cierre de los canales ionicos EI potencial de membrana se mantiene constante en el axon, haciendo pasar una corriente electrica a traves de un hila metalico descubierto V colocado en el eje del axon; con otro electrodo intracelular se pueden seguir las variaciones del potencial de la membrana. Cuando la membrana se desplaza bruscamente de su potencial de reposo V se mantiene en un estado despolarizado (A), los canales de Na+ se abren rapidamente hasta que la permeabilidad de la membrana para el Na+ es mucho mayor que para el K+; entonces se cierran de nuevo de manera espontanea. Los canales de K+ tambien se abren pero con un cierto retraso, de manera que la permeabilidad para el K+ aumenta cuando cae la permeabilidad para el Na+ (8). Si ahora se repite muv rapidamente el experimento, haciendo volver brevemente la membrana al potencial de reposo V despolarizandola de nuevo, la respuesta es diferente: la despolarizacion prolongada ha hecho que los canales de Na+ entren en un estado inactivado V la segunda despolarizacion no produce una subida V una bajada del potencial de membrana similar a la primera. La recuperacion de los canales de este estado supone un intervalo de tiempo relativamente largo-de

i"

IIIIIIBIBIIIII. . liqUidO de perfusi6n flujo de Iiquido de perfusi6n

axoplasma

~tltll!l!i:il1ji'!ll"il~"\\l)!!Jl\\\i1\I\' • • membrana del ax6n gigante

de K+ , V se situa incluso mas cerca del potencial de equilibrio para el K+ que el propio potencial de reposo: la membrana ha perdido su permeabilidad para el Na+ V todavia se ha vuelto m permeable al K+ que antes -es decir, los canales de Na+ se han cerrado, V se han abierto canales adicionales de K+.

Forma del potencial de aeci6n cuando el medio externo contiene ell00%, 50%, 0 el 33% de la concentraci6n normal de Na+.

10 milisegundos- que transcurre mientras el potencial de membrana se mantiene repolarizado (en reposo). En un axon sin voltaje constante, la espiga del potencial de accion esta producida por un avalancha de Na+ a traves de los canales de Na+ abiertos; la inactivacion de estos V la apertura de los de K+ devuelve la membrana al potencial de reposo.

'AI~] J abierto

)81

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Figura 11-24 Mielinizaci6n. (A) Esquema de un axon mielinizado de un nervio periferico. Cada celula de Schwann deposita su membrana plasm
1~m

porte a traves de una unica molecula proteica de canal situada en una pequefia porci6n de membrana que se halle cubriendo la punta de una micropipeta (Figura 11-25). Esta simple pero poderosa tecnica permite estudiar las propiedades detalladas de los canales i6nicos de cualquier tipo celular-, y ello ha llevado a descubrir que incluso las celulas que no son excitables electricamente tienen habitualmente en su membrana plasmMica varios canales i6nicos regulados. Muchas de estas celulas, como las levaduras, son demasiado pequefias para poder ser estudiadas pOl el metodo electrofisio16gico tradicional de implantar un microelectrodo en el interior de la celula. El registro de zona indica que cada uno de los canales de Na+ regulados por voltaje se abre siguiendo la ley de todo 0 nada: los tiempos de apertura y cierre son aleatorios pero cuando el canal esta abierto, siempre tiene la misma conductancia, permitiendo que pasen unos 8000 iones pOl segundo a su traves. Por 10 tanto, la corriente agregada que atraviesa la membrana de una celula entera, a traves de una gran poblaci6n de canales de Na+, no indica el grado de apertura de un canal tipico individual sino el numero total de canales de su membrana que se hallan abiertos en un momenta dado (Figura 11-26). El fen6meno de regulaci6n por voltaje puede ser entendido en terminos de simples principios fisicos elementales. El interior de una neurona 0 de una fibra muscular en reposo tiene un potencial electrico de unos 50-100 mV mas negativo que el medio externo. Esta diferencia de potencial puede parecer pequefia, pero dado que se produce a traves de una membrana plasmatica de tan s610 5 nm de grosOl, el gradiente de voltaje resultante es de aproximadamente 100000 V/cm. Por 10 tanto, las proteinas de la membrana estan sujetas a un campo electrico muy grande. Estas proteinas, como todas las demas, presentan en su superficie varios grupos cargados y diversas uniones polarizadas entre sus Momos. Por consiguiente, el campo electrico genera fuerzas sobre su estructura molecular. Canales i6nicos y propiedades electricas de las membranas

569

succi6n suave

1--1 ~m-l

Probablemente las variaciones del campo eIectrieo de la membrana afectan de forma insignificante a muchas de las protefnas de membrana. Sin embargo, los canales i6nieos regulados par voltaje pueden adoptar varias conformaciones altemativas cuyas estabilidades dependen de la intensidad del campo electrieo. Cada conformaci6n es estable frente a pequefias alteraciones, pero puede saltar ("flip") a otra conformaci6n si sufre una sacudida suficiente par los movimientos termicos aleatorios del entomo, altenindose la estabilidad relativa de las conformaciones abierta, cerrada e inactivada (vease Figura 11-21).

Figura 11- 25 Tecnica de registro de zona. Debido a que la uni6n entre la boca de la micropipeta y la membrana es muy intensa, la corriente unicamente puede entrar 0 salir de la micropipeta atravesando los canales de la zona de membrana que recubre la boca de la micropipeta. Se utiliza un dispositivo electr6nico que permite mantener el potencial de membrana a un valor constante predeterminado mientras se registra la corriente i6nica que atraviesa los canales individuales. La ventaja de trabajar con la zona de membrana separada de la celula es que resulta mas facH alterar la composici6n de la soluci6n a cada lado de la membrana, para estudiar el efecto de diferentes solutos sabre el comportamiento del canal. La zona de membrana separada del resto de la celula tambien puede colocarse en la orientaci6n opuesta, con la cara citoplasmatica de la membrana hacia ellumen de la pipeta (veanse tambien Figuras 4-54 y 4-55).

Los canales cati6nicos regulados por voltaje estan relacionados evolutiva y estructuralmente20 Los canales de Na+ no constituyen el tinieo tipo de canal cati6nieo regulado par voltaje que puede generar un potencial de acci6n: par ejemplo, los potenciales de acci6n de algunas fibras musculares, oocitos y celulas endocrinas no dependen de canales de Na+ sino de canales de Ca2+ regulados por voltaje. Ademas, en algunos tipos de celulas que narmalmente no son eIectrieamente activas se hallan canales de Na+, de K+ 0 de Ca2+regulados por voltaje, cuya funci6n es desconocida. En cada una de estas tres clases de canales cati6nieos regulados par voltaje existe una sorprendente diversidad estructural y funcional, generada tanto Figura 11-26 Registros de corriente a traves de un tinico canal de Na+ regulado por voltaje. Se utiliza una diminuta zona de membrana plasmcitica separada de una celula muscular de embri6n de rata (vease Figura 11-25). La membrana foe despolarizada por un abrupto incremento de potencial, como se indica en (A). Los tres registros de corriente que se presentan en (B) provienen de tres experimentos realizados sabre la misma zona de membrana. Cada una de las variaciones mayores de corriente de (B) representan la apertura y el cierre de un solo canal. El estudio comparativo de los tres registros muestra que, a pesar de que los tiempos de apertura y cierre del canal varian considerablemente, la velocidad a la que la corriente fluye a traves del canal abierto es pnicticamente constante. Las fluctuaciones menores del registro de corriente provienen principalmente de ruido electrico de fondo del aparato de medida. En (C) semuestra la suma de corrientes medidas en 144 repeticiones del mismo experimento. Esta corriente agregada es equivalente a la corriente de Na+ habitual que se podrfa observar a traves de una zona de membrana que contuviera 144 canales. Comparando (B) y (C) se puede observar que la variaci6n temporal de voltaje de la corriente agregada refleja la probabilidad de que cualquier canal individual se encuentre en el estado abierto; esta probabilidad disminuye con el tiempo a medida que los canales de la membrana despolarizada adoptan su conformaci6n inactivada. (Datos de J. Patlak y R. Horn,]. Gen. Physiol. 79:333-351, 1982, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

570

Capitulo 11 : Transporte de moleculas pequefias a traves de la membrana

potencial de -40 (A) membrana -90

:;~r:;~~S;;~~~~

(mV) (B)

o 1

corriente de la zona de membrana

0 1 0

(pA)

1

(C)

o corriente agregada

o

40

80

tiempo (milisegundos)

lJ

bicapa lipidica

(A)

CITOSOL

COOH

(B)

por multiples genes como par maduraci6n alternativa de los transcritos de RNA producidos a partir de un mismo gen. Sin embargo, la secuencias de aminoacidos conocidas de los canales de Na+, K+ y Ca2+regulados par voltaje muestran elevados grados de similitud, 10 cual sugiere que todos ellos pertenecen a una gran superfamilia de p£Oteinas relacionadas evolutiva y estructuralmente. Cada tipo de canal cati6nico regulado por voltaje esta compuesto de cuat£O dominios p£Oteicos hom610gos (en el caso de los canales de Na+ y de Ca2+) 0 de cuatro subunidades identicas (en el caso de los canales de K+). Se cree que estos cuatro dominios 0 subunidades se disponen a modo de costillas de un barril, £0deando un po£O central, como se ilustra en la Figura 11-27. Los canales de K+ son especialmente adecuados para estudiar las relaciones entre la estructura y la funci6n de los canales cati6nicos regulados por voltaje, ya que no estan farmados por una gran cadena polipeptidica sino par subunidades identicas relativamente pequefias. La secuencia de aminoacidos sugiere que cada una de las subunidades de un canal de K+ contiene seis helices a que atraviesan la membrana, aunque, de forma sorprendente, parece que ninguna de ellas forma el po£O que conduce los iones. Diversos estudios utilizando tecnicas de DNA recombinante sobre proteinas de canal de K+ modificadas sugieren que un segmento de una cadena polipeptidica de 20 aminoacidos se extiende a traves de la membrana formando una lamina ~ antiparalela que bardea el po£O: cuando se intercambia este elemento entre dos canales de K+ con diferentes p£Opiedades de permeabilidad, se observa que las caracteristicas de permeabilidad dependen unicamente de este segmento. Se ha utilizado una ap£Oximaci6n similar para identificar otras dos impartantes regiones funcionales de las proteinas de canal de K+. Los 19 residuos amino terminales de al menos una de estas p£Oteinas participan en la rapida inactivaci6n del canal. Si se altera esta regi6n, la cinetica de inactivaci6n del canal cambia, y si la regi6n se elimina completamente, se elimina la inactivaci6n. Asomb£Osamente, en este ultimo caso se puede recuperar la inactivaci6n expoCanales i6nicos y propiedades eltktricas de las membranas

Figura 11-27 Modelo de la estructura dal canal de K +regulado por voltaje. (A) Diagrama topol6gico mostrando los principales dominios funcionales de la cadena polipeptfdica de una subunidad, con las seis posibles helices 0: transmembrana marcadas dell al 6. Se cree que las subunidades, cada una de unos 600 aminmicidos, se ensamblan formando un poro transmembrana; en (B) s610 se muestran dos de ellas. En los canales de Na+ y de Ca2+regulados por voltaje las 4 subunidades son dominios de una unica larga cadena polipeptfdica, pera se cree que su estructura general es similar a esta. Parece que el segmento de 20 aminoacidos (que se muestra en rajo) situado en la regi6n de uni6n entre las helices 5 y 6 se extiende a traves de la membrana como dos laminas ~ antiparalelas formando el pora, como se muestra en la figura. La cuarta helice 0: (azul) tiene resfduos cargados positivamente en casi cada tercera posici6n, 10 cual al parecer Ie permite actuar como un sensor al voltaje. AI menos en algunos canales de K+ el dominio amino terminal participa en la rapida inactivaci6n del canal, como se ilustra en la Figura 11-28.

571

REPOSO

ABIERTO

INACTIVADO

niendo la cara citoplasmatica de la membrana plasm
En las sinapsis quimicas los canales i6nicos regulados por transmisor transforman sefiales quimicas en sefiales eIectricas 15 Las senales neuronales se transmiten de una celula a otra a traves de lugares especializados de contacto conocidos como sinapsis. El mecanismo habitual de transmision es indirecto. Las celulas se hallan aisladas electricamente una de otra, estando la celula presintiptica separada de la celula postsintiptica por una estrecha hendidura sintiptica. Un cambio del potencial electrico en la celula presinaptica desencadena la liberacion de una pequena molecula senal conocida como neurotransmisor, el cual se almacena en vesiculas sintipticas rodeadas de membrana y se libera por exocitosis. El neurotransmisor difunde rapidamente a traves de la hendidura simiptica y provoca un cambio electrico en la celula postsinaptica a traves de un canal i6nico regulado por transmisor (Figura 11-29). Una vez el neurotransmisor ha sido secretado, es rapidamente eliminado, bien por enzimas especfficas de la hendidura sinaptica bien por recaptacion -tanto por la terminal nerviosa que 10 ha liberado como por las celulas gliales vecinas. La recaptacion esta mediada por varios tipos de protefnas transportadoras de neurotransmisor dependientes de Na+. La rapida eliminacion asegura la precision espacial y temporal de la senalizacion en la sinapsis: evita que el neurotransmisor afecte a las celulas vecinas y limpia la hendidura sinaptica antes de que se produzca el nuevo pulso de liberaci6n de neurotransmisor, de forma que ala celula postsinaptica se Ie puede comunicar el ritmo, repetido y rapido, de los procesos senalizadores. Como veremos, la senalizaci6n a traves de sinapsis quimicas de este tipo es mucho mas vers
Capitulo 11 : Transporte de moleculas pequenas a traves de la membrana

Figura 11- 28 El modelo de "bola y cadena" para la rapida inactivaci6n de un canal de K+ regulado por voltaje. Cuando la membrana se despolariza el canal se abre yempieza a conducir iones. Entonces, el canal abierto es susceptible de ocluirse (inactivarse) por la "bola" de 19 aminoacidos del extrema amino terminal, que esta unida al propio canal mediante un segmento de cadena polipeptfdica desplegado que actua como una "cadena". Para simplificar s610 se muestran dos bolas; de hecho existen 4 de elias, una de cada subunidad. Se cree que un mecanismo similar a este, utilizando un segmento diferente de la cadena polipeptfdica, actua en la inactivaci6n del canal de Na+. terminal nervioso neurotransmisor en vesiculas hendidura sinaptica _ _ _--canal regulado por transmisor celula diana postsimlptica SINAPSIS QUfMICA EN REPOSO

membrana plasmatica de la celula diana

SINAPSIS QUfMICA ACTIVA

Figura 11-29 Una sinapsis quimica. Cuando un potencial de acci6n alcanza al terminal nervioso, estimula a dicho terminal a liberar su neurotransmisor; el neurotransmisor se halla contenido en vesiculas sinapticas y se libera al exterior celular cuando las vesiculas se fusionan con la membrana plasmatica del terminal nervioso. El neurotransmisor liberado se une a los canales i6nicos regulados por transmisor concentrados en la zona sinaptica de la membrana plasmatica de la celula diana, abriendolos. El flujo de iones resultante altera el potencial de membrana de la celula diana, transmitiendo asi una senal desde el nervio excitador.

Los canales i6nicos regulados por transmisor estan especializados en la rapida conversion de senales qufmicas extracelulares en senales eIectricas, en las sinapsis qufmicas. Los canales se hallan concentrados en la membrana plasm
Las sinapsis qufmicas pueden ser excitadoras o inhibidoras 15,21 Los canales ionicos regulados por transmisor difieren en algunos aspectos importantes. En primer lugar, como los receptores, tienen un lugar de union altamente selectivo para el neurotransmisor liberado desde el terminal nervioso presinaptico. En segundo lugar, como los canales, son selectivos al tipo de ion que dejan pasar a traves de la membrana; ella determina la naturaleza de la respuesta postsinaptica. Los neurotransmisores excitadores, como la acetilcolina, el glutamato y la serotonina, abren canales cationicos que generan un influjo de Na+ que despolariza la membrana postsinaptica hacia el potencial umbral que dispara un potencial de accion. Los neurotransmisores inhibidores como el ticido y-aminobutirico (GABA) y la glicina, por el contrario, abren canales de Cl-, 10 cual suprime el disparo, polarizando la membrana postsinaptica. Ya hemos discutido como la apertura de los canales ionicos despolariza una membrana. El efecto de la apertura de los canales de Cl- puede entenderse de la siguiente manera. La concentracion de Cl- es mucho mayor fuera que dentro de la celula (vease Tabla 11-1, pag. 542). Por esta razon, la apertura de los canales de Cl- tendera a hiperpolarizar la membrana al entrar mas iones eloro cargados negativamente al interior de la celula, a no ser que el potencial de membrana sea tan negativo que sea insuficiente para contrarrestar el elevado gradiente de Cl-. (De hecho, en muchas neuronas el potencial de equilibrio para el Cl- es cercano al potencial de reposo, 0 ineluso es mas negativo.) En aquel caso, la apertura de los canales de Cl- hace mas diffcil despolarizar la membrana y, por 10 tanto, excitar la celula. La importancia de los neurotransmisores inhibidores se demuestra por los efectos de las toxinas que bloquean su accion: la estricnina, por ejemplo, se une a los receptores de glicina bloqueando la accion de la glicina, 10 cual causa espasmos, convulsiones y la muerte. No todas las senales qufmicas del sistema nervioso, sin embargo, actuan a traves de canales ionicos regulados por ligando. Muchas de las moleculas senal que son secretadas por los terminales nerviosos, ineluidos una gran variedad de neuropeptidos, se unen a receptores que regulan, indirectamente, canales ionicos. Estos receptores, denominados receptores relacionados con proteina G y receptores relacionados con enzimas se discuten en detalle en el Capftulo 15. Mientras que la senalizacion mediada por neurotransmisores excitadores e inhibidores que se unen a canales ionicos regulados por transmisor generalmente es inmediata, simpIe y breve, la senalizacion mediada por receptores relacionados con protefnas G y por receptores relacionados con enzimas tiende a ser mucho mas lenta y mas compleja, asf como de consecuencias mas duraderas. Canales i6nicos y propiedades electricas de las membranas

573

Los receptores de acetilcolina de las uniones neuromusculares son canales cati6nicos regulados por transmisor22 El ejemplo mejor estudiado de canales i6nieos regulados por transmisor es el receptor de acetilcolina de las fibras musculares esqueIetieas. Este canal se abre transitoriamente por la liberaci6n de acetilcolina del terminal nervioso, en una sinapsis neuromuscular -una sinapsis especializada entre una neurona motora y una fibra muscular esqueIetiea (Figura 11-30). Este tipo de sinapsis ha sido estudiada intensamente ya que es facilmente accesible a los estudios electrofisio16gieos, a diferencia de la mayorfa de sinapsis del sistema nervioso central. El receptor de acetilcolina ocupa un lugar especial en la historia de los canales i6nieos. Fue el primer canal i6nieo que fue purificado, el primero del que se conoci6 la secuencia completa de aminoacidos, el primero en ser reconstituido funcionalmente en bieapas lipfdieas sintetieas y el primero para el que se registr6 la senal eIectriea de un solo canal abierto. Su gen tambien fue el primer gen de una proteina de canal que fue clonado y secuenciado. AI menos existen dos razones que explican el rapido progreso en la purificaci6n y caracterizaci6n de este receptor. En primer lugar, existe una fuente extraordinariamente riea de este receptor en los 6rganos eIectrieos de los peces electricos y de las rayas (estos 6rganos son mtisculos modificados disenados para descargar un gran shock electrico sobre su presa). En segundo lugar, existen neurotoxinas (como la abungarotoxina) en el veneno de ciertas serpientes, que se unen a dieho receptor con una elevada afinidad (K. = 109 litros/mol) y especificidad, por 10 que pueden ser utilizadas para purificarlo por cromatografia de afinidad. Tambien se puede utilizar a-bungarotoxina fluorescente 0 marcada con radiactividad para localizar y cuantificar los receptores de acetilcolina. De esta forma, se ha visto que el receptor se halla densamente empaquetado en la zona de la sinapsis neuromuscular de la membrana plasm
/ ocupado y cerrado

574

fibra muscular

ax6n mielinizado

nervio

terminales ax6nicos L-.J

10 11m

Figura 11-30 Electronmlcrograffa de barrido a bajo aumento de una sinapsis neuromuscular de rana. Se muestra la terminaci6n de un unico ax6n sobre una tibra muscular esqueletica. (De 1. Desaki yY. Uehara, ]. Neurocyto[10:101-110, 1981, con permiso de Chapman & Hall.)

Figura 11-31 Tres conformaciones del receptor de acetilcolina. La uni6n de dos moleculas de acetilcolina abre este canal i6nico regulado por transmisor. Sin embargo, incluso cuando se halla unido a acetilcolina, el receptor s610 se halla en la conformaci6n abierta muy brevemente, antes de que el canal se vuelva a cerrar. Entonces la acetilcolina se disocia del receptor, 10 cual permite al receptor volver a su conformaci6n original.

no ocupado y cerrado

ocupado yabierto

Capitulo 11 : Transporte de moleculas pequeiias a traves de la membrana

'Y

0

lugares de union a acetilcolina

f

4nm

1 compuerta

Una vez se ha liberado del neurotransmisor al que se habia unido, el receptor de acetilcolina revierte a su estado inicial de reposo. Se ha determinado la forma general del receptor de acetilcolina y la disposicion de sus subunidades, mediante una combinacion de microscopia electronica y difraccion de rayos X de angulo pequeno sobre cristales bidimensionales: las cinco subunidades estan dispuestas en anillo formando un canal transmembrana lleno de agua, que consiste en un estrecho poro a traves de la bicapa lipidica rodeado por zonas cilindricas de la molecula (Figura 11-32). En cada uno de los extremos del poro, unos grupos de residuos de aminoacido cargados negativamente ayudan a excluir los iones negativos y facilitan que los iones positivos de diametro menor de 0,65 nm atraviesen el poro. El trafico normal consiste principalmente en iones Na+ y K+, Y algunos iones Caz+. Asi, a diferencia de los canales cationicos regulados por voltaje, este canal tiene una baja selectividad a los cationes y la contribucion relativa de los diferentes cationes a la corriente a traves de los canales depende fundamentalmente de sus concentraciones y de las fuerzas electroquimicas que los impulsan. Cuando la membrana de la fibra muscular se halla en su potencial de reposo, la fuerza neta de impulso del K+ es cercana a cero ya que el gradiente de voltaje equilibra casi totalmente el gradiente de concentracion de K+ a traves de la membrana (vease Panel 11-2, pag. 562). Para el Na+, por el contrario, el gradiente de voltaje y el gradiente de concentracion actuan en la misma direccion, impulsando el ion al interior de la celula. (Lo mismo es valida para el CaZ+, pero la concentracion extracelular de Caz+es mucho menor que la de Na+, de forma que el Caz+contribuye muy ligeramente a la corriente de entrada total.) Asi pues, la apertura de los canales receptores de acetilcolina provoca un gran influjo neto de iones Na+ (unos 30 000 iones por canal cada milisegundo). Este influjo causa una despolarizacion de la membrana que senaliza al musculo a contraerse, como discutiremos mas adelante.

Figura 11-32 Modelo de la estructura del receptor de acetllcolina. Cinco subunidades hom610gas (a, a, /3, YY 0) se combinan formando un poro acuoso transmembrana. El poro esta constituido por un anillo de cinco helices a transmembrana, una de cada subunidad. Probablemente el anillo de helices a esta rodeado por un aro de lamina /3 transmembrana formada por los otros segmentos transmembrana de las cinco subunidades. Parece que en su conformaci6n cerrada el poro se halla ocluido por las cadenas laterales hidrof6bicas de cinco residuos de leucina, uno de cada helice a, que forman una compuerta cerca del centro de la bicapa lipfdica. Las cadenas laterales cargadas negativamente situadas a cada lado del poro aseguran que linicamente atravesaran el poro iones cargados positivamente. Las dos subunidades a contienen un lugar de uni6n a la acetilcolina; cuando la acetilcolina se une a los dos lugares de uni6n, el canal sufre un cambio de conformaci6n que abre la compuerta, posiblemente gracias a un desplazamiento de los residuos de leucina. (Adaptado de N. Unwin, Cell/Neuron 72/10 [Supl.) 3141, 1993 © Cell Press.)

Los canales i6nicos regulados por transmisor son las manas principales de la acci6n de drogas psicoactivas23 Los canales ionicos que se abren directamente en respuesta a los neurotransmisores acetilcolina, serotonina, GABA y glicina, contienen subunidades que son estructuralmente similares entre si, 10 cual sugiere que estan relacionadas evolutivamente y que probablemente forman poros transmembrana de la misma manera, aunque su especificidad para el neurotransmisor y su selectividad para el ion sean distintas. Los canales ionicos regulados por glutamato estan formados por una familia distinta de subunidades, pero al parecer tienen un estructura general similar. En cada caso, el canal esta formado por subunidades polipeptidicas homologas, las cuales probablemente forman un pentamero que se asemeja al receptor de acetilcolina (vease Figura 11-32). La comparacion de las Figuras Canales i6nicos y propiedades elcktricas de las membranas

575

Figura 11-33 Tres clases de protemas de canal. Posible relaci6n entre el mlmero de subunidades proteicas y el diametro del poro. (Adaptado de B. Hille, Ionic Channels of Excitable Membranes, 2a • ed. Sunderland, MA: Sinauer, 1992.) canales cati6nicos regulados por voltaje

canales i6nicos regulados por transmisor

uniones comunicantes (0 de tipo "gap")

11-27 Y11-32 pone de manifiesto las diferencias entre estos canales y los canales cationicos regulados por voltaje, los cuales estan formados por un anillo de cuatro subunidades (0 dominios). Quiza como resultado de ello, los canales regulados por transmisor tienen poros mas anchos y, por tanto, son menos estrictos en su selectividad a iones. Las uniones comunicantes, formadas por un anillo de seis subunidades, tienen poros mas anchos que permiten el paso de iones inorganicos y de pequefias moleculas organicas (se discute en el Capitulo 19). Esta posible relacion entre mimero de subunidades y la amplitud del poro se ilustra en la Figura 11-33. Cada uno de los tipos de canales ionicos regulados por transmisor tienen formas alternativas de cada subunidad, codificadas por genes diferentes 0 generadas por la maduracion alternativa del RNA del mismo producto genico. Todo ello se combina de diferente forma generando un conjunto de subtipos de canales extraordinariamente diverso, con diferentes afinidades para el ligando, diferentes conductancias de canal, diferentes velocidades de apertura y cierre y diferentes sensibilidades a drogas y toxinas. Las neuronas de los vertebrados, por ejemplo, tienen canales ionicos regulados por acetilcolina que se diferencian de los de las fibras musculares en que habitualmente estan formados por dos subunidades de un tipo y tres de otro; sin embargo existen al menos siete genes que codifican diferentes versiones del primer tipo de subunidades y al menos tres que codifican diferentes versiones del segundo, con una diversidad afiadida debida a la maduracion alternativa del RNA. Se pueden caracterizar diferentes subconjuntos de neuronas sensibles a acetilcolina, con diferentes funciones en el cerebro, debido a diferentes combinaciones de estas subunidades. Ello, en principio y con alguna utilizacion en la practica, permite disefiar drogas que tengan como diana reducidos grupos de neuronas 0 de sinapsis, influyendo asi especificamente determinadas funciones cerebrales. De hecho, los canales ionicos regulados por transmisor han sido durante mucho tiempo importantes dianas para las drogas. Un cirujano, por ejemplo, puede hacer que los musculos se relajen durante una operacion bloqueando los receptores de acetilcolina de las fibras musculares esqueleticas con curare, una droga vegetal que se utilizo originariamente por los indios sudamericanos para envenenar sus flechas. La mayoria de drogas utilizadas en el tratamiento del insomnio, de la ansiedad, de la depresion y de la esquizofrenia, ejercen sus efectos sobre las sinapsis quimicas y muchas de elIas actuan uniendose a canales ionicos regulados por transmisor: tanto los barbituratos como los tranquilizantes, como el Valium y el Librium, por ejemplo, se unen a los receptores de GABA potenciando su accion inhibidora al permitir que concentraciones mas bajas de GABA abran los canales de Cl-. La nueva biologia molecular de los canales revela la diversidad y los detalles de su estructura, permitiendo asi disefiar una nueva generacion de drogas psicoactivas que actuaran mas selectivamente aligerando el sufrimiento de las enfermedades mentales. Los canales ionicos son los componentes moleculares basicos a partir de los cuales se construyen los elementos neuronales de la computacion y la sefializacion biologica. Para poder entrever como pueden llegar a ser de sofisticadas las funciones de estos elementos, consideramos ahora varios ejemplos que demuestran como actlian conjuntamente varios grupos de canales en la comunicacion sinaptica entre celulas excitables electricamente. 576

Capitulo 11 : Transporte de moleculas pequefias a traves de la membrana

La transmisi6n neuromuscular implica la activaci6n secuencial de al menos cuatro grupos de canales i6nicos regulados1 5 La importancia que tienen para las celulas excitables eIectricamente los canales i6nicos regulados puede ilustrarse siguiendo el proceso por el cual un impulso nervioso estimula la contraccion de una celula muscular. Esta respuesta aparentemente simple requiere la activacion secuencial de al menos cuatro grupos de canales ionicos regulados -todos ellos en pocos milisegundos (Figura 11-34). 1. EI proceso se inicia cuando un impulso nervioso llega al terminal nervioso

y despolariza la membrana plasmMica. La despolarizacion abre transitoriamente los canales de Ca2+ regulados por voItaje de esta membrana. Dado que la concentracion de Ca2+fuera de la celulas es mas de 1000 veces mayor que la concentracion libre del interior de las celulas, el Ca2+fluye hacia el interior del terminal nervioso. EI incremento de la concentracion de Ca2+ en el citoplasma del terminal dispara la liberacion localizada de acetilcolina en la hendidura sinaptica. 2. La acetilcolina liberada se une a los receptores de acetilcolina de la membrana plasmMica postsinaptica de'la fibra muscular, abriendo transitoriamente los canales cationicos que se hallan asociados a estos receptores. EI influjo de Na+ que se genera provoca una despolarizacion localizada de la membrana. 3. La despolarizacion de la membrana plasmMica de la fibra muscular abre los canales de Na+ regulados por voltaje de esta membrana, permitiendo la entrada de mas Na+, el cual despolariza la membrana. A su vez, esta despolarizacion abre mas canales de Na+ regulados por voltaje, de forma que se forma una despolarizacion auto-propagante (un potencial de accion) que se extiende por toda la membrana plasmMica (vease Figura 11-23). 4. La despolarizacion generalizada de la membrana plasmMica de la fibra muscular provoca la apertura transitoria de canales ionicos de regiones especializadas (los tubulos transversos [T] -discutidos en el Capitulo 16) de esta membrana. Esta apertura causa la apertura transitoria de canales de liberaci6n de Ca2+ de regiones adyacentes de la membrana del reticulo sarcoplasmMico, la cual provoca la liberacion al citosol de Ca2+almacenado en el reticulo sarcoplasmMico. Este incremento repentino en la concentracion citosolica de Ca2+provoca la contraccion de las miofibrillas de la fibra muscular. Todavia no conocemos cual es el mecanismo mediante el cual la activacion de los canales de Ca2 +regulados por voltaje de la membrana del tubulo T conduce a la apertura de los canales de liberacion de Ca2 +de

SINAPSIS NEUROMUSCULAR EN REPOSO

Figura 11-34 Sistema de canales i6nicos de una sinapsis neuromuscular. Estos canales i6nicos regulados son esenciales para la estimulaci6n de la contracci6n muscular par un impulso nemoso. Los difere,ntes canales estan numerados siguiendo la secuencia en la que se abren, tal como se describe en el texto.

UNION NEUROMUSCULAR ACTIVADA

CANAL DE Ca 2+ REGULADO POR VOLTAJE ~ CANAL CAT1QNICO REGULADO POR ACETILCOLINA CANAL DE Na+ REGULADO POR VOLTAJE

reticulo sarcoplasmatico

membrana plasmatica muscular

CANALREGULADO DE L1BERACION DE Ca 2 +

Canales i6nicos y propiedades electricas de las membranas

577

I

0.1 mm dendrita

1 terminaciones presinapticas

la membrana del reticulo sarcoplasmatico. Sin embargo, ambas membranas se hallan en intima contacto y ambos tipos de canales se hallan juntos formando una estructura especializada (vease Figura 16-92). Por 10 tanto, es posible que un cambio de conformacion inducido por voltaje del canal de Ca2+ de la membrana plasm
EI potencial postsimiptico principal de una neurona representa la suma espacial y temporal de muchos pequefios potenciales postsimipticos1 5,24 En el sistema nervioso central una sola neurona puede recibir sefiales de miles de otras neuronas. Por ejemplo, sobre una neurona motora media de la medula espinal realizan sinapsis varios miles de terminales nerviosos; su soma celular y sus dendritas estan casi completamente cubiertos por elIas (Figura 11-35). Algunas de estas sinapsis transmiten sefiales desde el cerebro 0 desde la medula espinal; otras transportan informacion sensorial desde los musculos 0 desde la piel. La motoneurona puede combinar la informacion que recibe de todas estas fuentes y reacciona generando potenciales de accion 0 permaneciendo en reposo. De las muchas sinapsis que existen sobre una neurona, algunas tienden a excitarla y otras a inhibirla. El neurotransmisor liberado en una sinapsis excitadora causa una ligera despolarizaci6n de la membrana postsinaptica denominada potencial postsinaptico excitador (PSP, de postsinaptic potencial) mientras que el neurotransmisor liberado en una sinapsis inhibidora generalmente causa una pequefia hiperpolarizacion denominada PSP inhibidor. Como la membrana de las dendritas y del soma celular de la neurona contiene pocos canales de Na+ 578

Capitulo 11 : Transporte de moleculas pequefias a traves de la membrana

Figura 11-35 Soma celular de una motoneurona de la medula espinal. Sobre el soma celular y las dendritas existen muchos miles de sinapsis farmadas por terminaciones nerviosas. Estas sinapsis suministran senales de otras zonas del organismo controlando el desencadenamiento de potenciales de acci6n a 10 largo del ax6n de esta gran celula.

2

-0

'"c.0

0

~

5

0

10

Q)

tiempo (milisegundos)

"0

co

'0 c:

!

0

c. 0; "0

'" E

2

'0 c:

Figura 11-36 Principio de la suma temporal. Cada potencial de acci6n presimiptico que llega a una sinapsis produce un pequeno potencial postsimiptico (PSP) (lineas negras). Cuando llegan sucesivamente varios potenciales de acci6n a una misma sinapsis, cada PSP producido se anade a la cola del PSP precedente, generando un PSP combinado principal (lfneas verdes). Cuanto mayor es la frecuencia de llegada de potenciales de acci6n, mayor es el tamano del PSP combinado.

Q)

0 c.

>

0

E

0

5

10 tiempo (milisegundos)

0

u

"-5-

.",

c:

'iii

'iii 0 c.

co

4

'0 c:

Q)

'0

c. 2

o

o

5

10 tiempo (milisegundos)

regulados por voltaje, generalmente un solo PSP no es suficiente para desencadenar un potencial de acci6n. Por el contrario, cada senal aferente queda teflejada fielmente en un PSP de una magnitud graduada, que decrece con la distancia a partir dellugar de la sinapsis. Si las senales llegan simultaneamente a varias sinapsis de la misma regi6n del arbol dendrftico, el PSP total de esta zona sera, a grandes rasgos, la suma de los PSP individuales, de forma que los PSP inhibidores contribuyen de manera negativa a esta suma total. Los PSP de las regiones vecinas se propagan pasivamente a otras regiones y convergen en el soma celular. Como el soma celular es relativamente pequeno comparado con el arbol dendrftico, el potencial de membrana del soma celular y de sus alrededores inmediatos sera mas 0 menos uniforme y estara compuesto por los efectos de todas las senales que llegan a la celula, cuya importancia dependera de la distancia a la que se encuentra la sinapsis del soma celular. Se dice, por 10 tanto, que el potencial postsinaptico pri\lcipal (PSP principal) del soma celular representa una suma espacial de todos los estfmulos recibidos. Si predominan las senales excitadoras, se generani una despolarizaci6n; si predominan las senales inhibidoras, se producira una hiperpolarizaci6n. Mientras que la suma espacial combina los efectos de las senales recibidas en diferentes lugares de la membrana, la suma temporal combina los efectos de las senales recibidas en momentos distintos. Si un potencial de acci6n llega a una sinapsis y desencadena la liberaci6n de un neurotransmisor antes de que un PSP haya decafdo completamente, el segundo PSP se anade a la cola remanente del primero. Si llegan muchos potenciales de acci6n siguiendo una sucesi6n rapida, cada PSP se anade a la cola del PSP precedente construyendo un PSP principal mantenido cuya magnitud refleja la velocidad de disparo de la neurona presinaptica (Figura 11-36). Esta es la esencia de la sumaci6n temporal: traduce lafrecuencia de las senales de entrada en magnitud de un PSP neto. Canales i6nicos y propiedades electricas de las membranas

579

(A)

(B)

OJ

a.

'(3

c:

.~

C-

oo

C-

O

;;

E -70

100

200

tiempo (milisegundos)

100

200

tiempo (milisegundos)

Conjuntamente, las sumaciones temporal y espacial proporcionan los medios mediante los cuales las velocidades de descarga de muchas neuronas presimipticas controlan el potencial de membrana (el PSP principal) del soma de una sola celula postsinaptica. El ultimo paso en la integraci6n neuronal realizado par la celula postsinaptica es la generaci6n de una senal de salida, normalmente en farma de potenciales de acci6n, con el fin de retransmitir una senal a otras celulas. La senal de salida es un reflejo de la magnitud del PSP principal del soma celular. Sin embargo, mientras que el PSP principal es una variable graduada de manera continua, los potenciales de acci6n son de tipo todo 0 nada y de tamafio uniforme. La unica variable existente en la senalizaci6n mediante potenciales de acci6n es el intervalo de tiempo entre un potencial de acci6n y el siguiente. Por 10 tanto, para la transmisi6n a grandes distancias, la magnitud del PSP principal se traduce, 0 se codifica, en la frecuencia de descarga de los potenciales de acci6n (Figura 11-37). Esta codificaci6n se consigue gracias a un grupo especial de canales i6nicos regulados que se encuentran presentes a una densidad elevada en la base del ax6n, en un punto adyacente al soma celular, en una regi6n conocida como el cono 0 colina ax6nica (vease Figura 11-35).

La integracl6n neuronal requiere la combinaci6n de al menos tres tipos de canales de K+ diferentes 15• 25 Hemos visto que la intensidad de la estimulaci6n recibida par una neurona se codifica. en las transmisiones a larga distancia, como frecuencia de potenciales de acci6n que dispara la neurona: cuanto mayor sea la estimulaci6n mayor es la frecuencia de los potenciales de acci6n. Los potenciales de acci6n se inician en el cono ax6nico, unica regi6n de cada neurona en la que los canales de Na+ regulados par voltaje son completos. Sin embargo, para realizar esta funci6n especial de codificaci6n, la membrana del cono ax6nico contiene como minima otros cuatro tipos de canales i6nicos -tres de ellos selectivos para el K+ y uno selectivo para el Ca2+. Las tres variedades de canales de K+ presentan propiedades diferentes; nos referiremos a ellos con los nombres de canales de K+ activados retardados, tempranos y activados por Ca2+. Para comprender par que son necesarios varios tipos de canal, consideremos primero el comportamiento que se observaria si los unicos canales regulados por voltaje que existieran en la celula nerviosa fueran los canales de Na+. Por debajo de un cierto umbral de estimulaci6n sinaptica, la despolarizaci6n de la membrana del cono ax6nico seria insuficiente para desencadenar un potencial de acci6n. AI aumentar gradualmente la estimulaci6n, se cruzaria el umbral; los canales de Na+ se abririan y se dispararia un potencial de acci6n. El potencial de acci6n terminaria de la manera habitual, par inactivaci6n de los canales de Na+. Antes de que se pudiera disparar otro potencial de acci6n, estos canales deberian recuperarse de su inactivaci6n. Pero esto requeriria que el voltaje de la membrana volviera a un valor muy negativo, 580

Capitulo 11 : Transporte de moleculas pequefias a traves de la membrana

Figura 11-37 Codificaci6n del PSP principal en forma de frecuencia de descarga de potenciales de ,acci6n en un ax6n. Comparando (Al con (Bl se observa que la frecuencia de descarga de cada ax6n aumenta con el incremento del PSP principal; en (el se resume la relaci6n general entre ambos panimetros.

cosa que no se produciria mientras se mantuviera el intenso estimulo despolarizante (del PSP). Por consiguiente, se necesita otro tipo de canal para repolarizar la membrana despues de cada potencial de accion y preparar a la celula para que inicie otro potencial de accion. Esta tarea la llevan a cabo los canales de K+ retardados, que ya vimos previamente al estudiar la propagacion del potencial de accion (vease pag. 565). Estos canales estan regulados por voltaje pero debido ala lentitud de su cinetica solo se abren durante la fase de descenso del potencial de accion, cuando los canales de Na+ estan inactivos. Su apertura permite una salida de K+ que conduce la membrana de nuevo al potencial de equilibrio del K+. Este potencial es tan negativo que los canales de Na+ se recuperan nipidamente de su estado inactivado. La repolarizacion de la membrana provoca tambien el cierre de los propios canales de K+ retardados. Ahora el cono axonico se halla en condiciones basales, de forma que el estimulo despolarizante procedente de las senales sinapticas aferentes es capaz de generar un nuevo potencial de accion. De esta manera la estimulacion sostenida de las dendritas y del soma celular conduce ala descarga repetitiva del axon. Sin embargo, la descarga repetitiva no es suficiente por si sola. La frecuencia de descarga tiene que reflejar la intensidad de la estimulacion y un simple sistema de canales de Na+ y de canales de K+ retardados es insuficiente para ello. Por debajo de un cierto Divel umbral de estimulacion constante la celula no producira descargas en absoluto; por encima de este umbral empezara bruscamente a producir descargas a una velocidad relativamente rapida. Los canales de K+ tempranos solucionan este problema. Estos canales tambien estan regulados por voltaje y se abren cuando se despolariza la membrana, pero su sensibilidad especifica al voltaje y las cineticas de inactivacion son tales que actuan reduciendo la velocidad de descarga a unos niveles de estimulacion que estan inmediatamente por encima del umbral necesario para generar la descarga. Asi, ayudan a eliminar la discontinuidad en la relacion entre la velocidad de descarga y la intensidad de la estimulacion. El resultado de ella es una velocidad de descarga que es proporcional a la intensidad del estimulo despolarizante dentro de un margen muy amplio (vease Figura 11-37). Normalmente, el proceso de codificacion se modula posteriormente por los otros dos tipos de canales ionicos del cono axonico que se mencionaron al principio -los canales de Ca2+ regulados por voltaje y los canales de J<+ activados por Ca2+. Estos canales acttian conjuntamente disminuyendo la respuesta de la celula a una estimulacion constante invariable -un proceso denominado adaptaci6n. Los canales de Ca2+son similares a los canales de Ca2+que intervienen en la liberacion del neurotransrnisor de los terminales axonicos presinapticos; se abren cuando se dispara un potencial de accion, permitiendo la entrada de Ca2+al interior del axon. El canal de K+ activado por Ca2+es estructural y funcionalmente diferente de cualquier otro tipo de canal descrito anteriormente. Se abre en respuesta a una elevaci6n de la concentracion de Ca2+en la cara citoplasmMica de la membrana de la celula nerviosa. Supongamos que se aplica un intenso estimulo despolarizante durante un largo periodo de tiempo, que desencadena un largo tren de potenciales de accion. Cada potencial de accion permite una breve entrada de Ca2+a traves de los canales de Ca2+regulados por voltaje, de modo que la concentracion intracelular de Ca2+aumenta gradualmente hasta un nivel elevado suficiente para abrir los canales de K+ activados por Ca2+. El aumento resultante de la permeabilidad de la membrana al K+ hace que la membrana sea mas dificil de despolarizar, incrementando el retraso entre un potencial de accion y el siguiente. De esta manera, una neurona que es estimulada continuamente durante un periodo de tiempo prolongado, disminuye gradualmente su capacidad de respuesta al estimulo constante. Este fenomeno, que tambien puede aparecer por otros mecanismos, permite a una neurona, y de hecho al sistema nervioso en general, reaccionar de forma sensible a un cambio, incluso cuando el nivel basal de estimulacion es muyelevado. Esta es una de las estrategias que nos permite, por ejemplo, sentir un contacto sobre el hombro e ignorar, en cambio, la presion constante de nuestros vestidos. En el Capitulo 15 discutimos con mas detalle los procesos de la adaptacion. Canales i6nicos y propiedades electricas de las membranas

581

Otras neuronas realizan integraciones diferentes, reaccionando a sus senales de entrada de miles de maneras diferentes, 10 cual refleja el diferente surtido de miembros de diferentes familias de canales i6nicos que presentan en sus membranas. Por ejemplo, en el sistema nervioso de los vertebrados existen al menos cinco tipos conocidos de canales de Ca2+ regulados por voltaje. La multiplicidad de genes permite generar una multitud de diferentes tipos de neuronas cuyo comportamiento electrico corresponda perfectamente a la tarea particular que ejecutan. Una de las propiedades cruciales de los sistemas nerviosos es la capacidad de aprender y de recardar, 10 cual parece depender fundamentalmente de cambios a largo plazo de determinadas sinapsis. Concluimos este capitulo considerando un remarcable tipo de canal i6nico que participa de forma especial en algunas formas de aprendizaje y memoria. Se halla localizado en muchas sinapsis del sistema nervioso central, donde esta regulado tanto por voltaje como par el glutamato, neurotransmisar excitadar. Tambien es ellugar de acci6n de la droga psicoactiva fenciclidina, 0 polvo de angel.

La potenciaci6n a largo plazo en el hipocampo de los mamfferos depende de la entrada de Ca2 + a traves de canales receptores de NMDA26 Pnicticamente todos los animales pueden aprender, pero parece que los mamiferos pueden hacerlo excepcionalmente bien (0 eso es 10 que a nosotros nos gusta creer). En el cerebro de los mamiferos, el hipocampo, una regi6n del c6rtex cerebral, juega un papel especial en el aprendizaje: cuando es destruido en ambos lados del cerebro se pierde notablemente la capacidad de generar nuevos recuerdos, aunque los que se establecieron previamente hace tiempo, permanecen. De manera correspondiente, algunas sinapsis del hipocampo presentan dram
Capitulo 11 : Transporte de moltkulas pequefias a traves de la membrana

el glutamato liberado por un terminal nervioso presimlptico activado abre canales receptores de glutamato no de NMDA, permitiendo un influjo de Na+ que despolariza la membrana postsinaptica

celula presinaptica

glutamato

la desfolarizaci6n elimina el Mg +que bloquea los canales receptores de NMDA, 10 cual (unidos a glutamato) permite que entre Ca 2+ a la celula postsi naptica

r

o

Mg 2 + receptor NMDA

receptor de glutamato no de NMDA

membrana despolarizada

cuando se satisfacen simultaneamente dos condiciones: el receptor ha de estar unido al neurotransmisor glutamato y la membrana ha de estar intensamente despolarizada. La segunda condicion es necesaria para liberar Mgz+, que normalmente bloquea el canal en reposo, y significa que los receptores NMDA solo se activan cuando los canales convencionales regulados por glutamato se hallan activados y la membrana despolarizada. Los receptores NMDA son crfticos para la potenciacion a largo plazo. Cuando se bloquean selectivamente mediante un inhibidor especffico, la potenciacion a largo plazo no aparece, aunque la transmision simiptica continua normalmente. Un animal tratado con este inhibidor se comporta normalmente pero es incapaz de aprender tareas del tipo que, segUn se cree, depende del hipocampo. lComo intervienen los receptores NMDA en estos efectos extraordinarios? La respuesta radica en que estos canales, cuando estan abiertos, son altamente permeables al CaZ+, que actua como mensajero intracelular cerca de su lugar de entrada al interior de la celula postsinaptica, desencadenando los cambios locales responsables de la potenciacion a largo plazo. La potenciacion a largo plazo se previene cuando se mantienen los niveles de CaZ+ artificialmente bajos en la celula postsimiptica inyectando el quelante de CaZ+ EGTA, y puede ser inducida elevando transitoriamente la concentracion extracelular de Caz+ hasta niveles artificialmente altos. La naturaleza de los cambios a largo plazo desencadenados por el Caz+ es incierta, aunque parece que implican alteraciones estructurales de la sinapsis. Los cambios a largo plazo se inician en la celula postsimiptica pero tambien afectan a la celula presinaptica de forma que liberan mas glutamato del normal cuando se activan posteriormente. La naturaleza de estos ultimos cambios en la celula presimiptica es incierta, pero parece claro que algt1n mensaje puede pasar de forma retrograda de la celula postsinaptica a la presimiptica cuando se induce la potenciacion a largo plazo. La naturaleza de la senal retrograda todavia es desconocida, aunque como candidatos se han sugerido el oxido nitrico y el mon6xido de carbono. En la Figura 11-38 se presenta un modelo tentativo de algunas de las etapas de la inducci6n de la potenciacion a largo plazo. Ademas de los cambios a largo plazo de las celulas presimipticas, ilustrados en la Figura 11-38, tambien se producen cambios a largo plazo en la celula postsinaptica que contribuyen ala potenciacion a largo plazo. Existen evidencias de que los receptores NMDA juegan un papel importante en el fenomeno relacionado con el aprendizaje, no s610 en el hipocampo sino tambien en otras zonas del cerebro. En el Capitulo 21 veremos, ademas, que los receptores NMDA juegan un papel crucial en el ajuste del patron anatomico de conexiones simipticas en base a la experiencia durante el desarrollo del sistema nervioso. Asi, los neurotransmisores liberados en las sinapsis, ademas de provocar senales eIectricas transitorias, tambien pueden alterar las concentraciones de meCanales i6nicos y propiedades ehktricas de las membranas

el incremento de Ca 2+ en el citosol induce a la celula postsinaptica a producir una senal retr6grada que actua sobre el terminal nervioso presinaptico

I

la senal retr6grada produce un cambio a largo plaza que permite al terminal liberar una mayor cantidad de glutamato cuando sea activado de nuevo

Figura 11-38 Eventos de sefializaci6n en la potenciaci6n a largo plazo.

583

Tabla 11-3 Algunas faroilias de canales i6nicos Familia*

Subfamllias representativas

Canales cati6nicos regulados par voltaje

canal de Na+ regulado par voltaje canales de K+ regulados par voltaje (induyendo los retardados y los tempranos) voltajes de Ca2+regulados par canal canales cati6nicos regulados par acetilcolina canales cati6nicos regulados por serotonina canales cati6nicos regulados par glutamato** canales de Cl- regulados par GABA canales de Cl- regulados par glicina

Canales i6nicos regulados par transmisar

excitadares

}

inhibidares

* Los miembros de una misma familia son similares en secuencia de aminmicidos y, por 10 tanto, se cree que derivan de un ancestro comiln; dentro de las subfamilias, el parecido es habitualmente mayor. ** Estos canales estan formados por distintas familias de subunidades pero se cree que tienen una estructura global similar a la de los otros canales i6nicos regulados por transmisor.

diadores intracelulares que conllevan cambios a largo plazo en la eficacia de la transmisi6n simlptica. Todavia no conocemos, sin embargo, de que forma estos cambios se prolongan durante semanas, meses 0 durante toda la vida, a pesar del recambio normal de los constituyentes de la celula. En la Tabla 11-3 se resumen algunas de las familias de canales de las que hemos tratado en este capitulo.

Resumen Las protefnas de canalforman poros acuosos a traves de la bicapa lipfdica y permi-

ten a los iones inorganicos de un tamano y carga adecuados atravesarla a favor de su gradiente electroqufmico, a velocidades que son unas 1000 veces superiores a las conseguidas por cualquier transportador conocido. Estos canales ionicos estan regulados y habitualmente se abren de forma transitoria en respuesta a perturbaciones especificas de la membrana, como un cambio en el potencial de membrana (canales regulados por voltaje) 0 la union de un neurotransmisor (canales regulados por transmisor). En la mayorfa de las celulas de animales, el canal retardado de K+ desempena un papel importante en la generaeion del potencial de reposo en la membrana plasmatica. Los canales cationicos regulados por voltaje son responsables de la generaeion de los potenciales de accion auto-amplificantes en las celulas excitables electricamente, como las neuronas y fibras musculares esqueleticas. Los canales ionicos regulados por transmisor convierten senales qufmicas en etectricas en las sinapsis qUfmicas: los neurotransmisores excitadores, como la aeetilcolina y el glutamato, abren de forma transitoria canales cationicos regulados por transmisor, despolarizando asf la membrana postsinaptica haeia el potencial de disparo, para iniciar un potencial de aecion; los neurotransmisores inhibidores, como el GABAy la glicina, abren canales de Cl- regulados por transmisor, suprimen la generaei6n del potencial de aecion al hacer la membrana postsindptica mas polarizada. Se cree que una subclase especial de canales ionicos regulados por glutamato, denominados canales receptores NMDA, son muy permeables al Ca2 +, el cual puede desencadenar cambios a largo plazo en las sinapsis, los cuales al parecer participan en algunasformas de aprendizaje y de memoria. Los canales i6nicos aetUan juntos de formas muy complejas, controlando el comportamiento de las celulas electricas excitables. Una neurona tfpica, por ejem584

Capitulo 11 : Transporte de mohkulas pequefias a traves de la membrana

L

plo, recibe miles de senales excitadoras e inhibidoras, combintindolas mediante sumaci6n temporal y espacial y produciendo un potencial postsinaptico (PSP) principal en el soma celular. La magnitud del PSP principal se traduce en velocidad de generaci6n de potenciales de acci6n por medio de canales cati6nicos de la membrana del cono ax6nico.

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Compartimientos intracelulares y clasificacion de proteinas

12 --,_ ........ .1lI_.,...-.. -a.. COIDf*1I

mlKldn de ... aIuIIII ... altNw · 1 I _ d e_ _

IDterIorde·. .• ........ ,de ~

- PtiOiidlGiI_

-II reIfeuIo,~z mflII.

A direrencia de las baclerias. que generalmeme constan de un unico comparti· miemo rodeado por una membrana plasmatica, la celuJa eucariota es{~ suhdivi· dida en compartimientos rodeados por membrana, que son funcionalmenle distimos. Cada companimiemo U organulo conliene su propia colecci6n de enzimas. atras mol~ulas especiaUzadas y un complejo sistema de distribuci6n que lranspona especHicamcmc los compuestos de un compartimiento a OIrO. Para entender la celula eucariota es necesario conocer 10 que sucede en cada uno de estos compartirnientos. c6mo se desplazan las mohkulas entre eUos y c6mo se generan los compartimicntos a sf mismos y se conservan. Las prolcfnas juegan un papel central en la compartimentaci6n de Wla ctHula eucariot3. Catalizan las reacciones que tienen lugM en cada org
La compartimentaci6n de las celulas superiores En esta secci6n introducloria vamos a dar una visi6n general de los distintos comparlimientos de la c~lulas y de las relaciones que exislen entre ellos. Para poder hacerlo, hemos organizado los organulos conceprualmenle en un pequeflo numero de familias, revisando wmo las protemas se djrigen a organuJos especfficos y c6mo atraviesan las membranas de los organulos.

Todas las c~lulas eucariotas tienen la misma colecci6n basica de organulos rodeados de membranal Muchos procesos bioqufmicos vilales ocurren en 0 sabre superficies de memo brana. Asr, el metabolismo Iipidieo esl
r'

pe1'ollisoma

-t,H11

i:"'lf-t- complejo de Golgl mitocondrla retfeulo endopl8lm6tlco

\111-1- eon polirriboiomat

unlda,'I IU membr,na pollrribosomas libra

nUcleo

>----15Iim

.1

mas unidas a membranas y la fosforilaci6n oxidativa y 1a fotosfntesis requieren una membrana semipermeable para acoplar el transporte de H+ con la smtesis de ATP. Adem~s. los sistemas de membranas intracelulares no 0010 proporcionan un area extra de membrana. sino que crean companimientos que estlin se· parados del dtosol, dando a la c~lula espacios acuosos funcionalmente especializados. Como la bicapa lipfdica de los organuJos de membrana es impermeable ala mayoria de las moleculas hidrofl1icas, la membrana de cada orgAnulo ha de disponer de protefnas transportadoras que son responsables de 1a importaci6n 0 exportaci6n de metabolitos especfficos. Cada membrana de un orgo1oulo ha de tener tambi~n un mecanismo de imponaci6n y de incorporaci6n al orgAnuJo de las protefnas espec(ficas que hacen que dicho orgAnulo sea unico. En la Figura 12-1 se iJustran los compartimientos mAs imponantes comunes a todas las c~luJas eucariotas. El nacleo contiene el genoma principal y es ellugar m;is imponante de s(ntesis de DNA y de RNA.. EI citoplasma que 10 circunda consiste en el citosol y los orgdnulos citoplasmo1ticos suspendidos en ~1. El citosol constituye un poco mas de la mitad del volumen total de la c~lula y es el lugar donde no s610 tiene lugar la sfntesis de protefnas sino tambi~n donde se desarroHan la mayona de las reacciones del metabolismo intermediario celular -es decir, el elevado mlmero de reacciones mediante las cuales algunas mol~culas pequenas son dcgradadas y otras son sintetizadas proporcionando los elementos para la construcci6n de las macromol~culas (se explica en el Capftulo 2). Aproximadamente la mitad del o1rea total de membrana de una c~lula se uti· liza para englobar los espacios laberfnticos del reticulo endoplasmdtico (ER). El ER presenta muchos ribosomas unidos a su superficie citoplasmo1tica. los cuales sintetizan protefnas integrates de membrana y protemas solubles destinadas a ser segregadas 0 a ser transponadas a otros organulos. Veremos que existe una diferencia imponante entre el sistema a tTaves del cuallas protemas son dirigidas aI ER 0 a otros organulos citoplasmo1ticos: mientras que las pTOtefnas son translocadas a otros orgo1nulos solamente cuando su sfntesis ha concluido, son translo· cadas al ER durante su sfntesis. por 10 que los ribosomas sobre los que se estlin produciendo esto1n unidos a la membrana del ER. EI ER tambi~n produce los Ifpidos del resto de la c~lula y tambi~n acnJa como a1mac~n de iones Ca 2•• EI complejo de Golgi consiste en una serie de compartimientos organizados en forma de sa· cos discoidales Ilamados cistemus del Golgi; recibe lfpidos y protefnas del ER y las disrribuye hacia diferentes destinos intracelulares. generalmente modifico1ndolas covalentemente durante el viaje. las mitocondrias y (en las plantas) los cJoroplastos, generan la mayor parte del ATP que se utiliza para desplazar las reacciones biosint~ticas que requieren un aporte de energfa Iibre. Los lisosomas presentan enzimas digestivas que de· 590

Capftula 12: Compartimientos Intracelulares ydaslflcacl6n de protelnas

Figura 12·1 Los prlnclpales oompartlrnJentos lntracelulares de una d1ula animal. El c1tosol (grisl, el retfcula endoplasm4.tico, eI complejo de Golgi, el nl1cleo, las mitocondrias, los endosomas,los lisosomas y los peroxisomas son diferentes oompartimientos que se hallan aislados del resto de la celula mediante, at menos, una membrana dotada de penneabilidad selectiva.

Tabla 12-1 Volumenes relaUvos ocupados por los prlnclpales compartlmlenlos lntracelulares en una c~lula hepallca tfplca (hepalocllo) Compartlmlento IntrnceluJar

PorcenlaJe del volumen celuJar total

Citosol Mitooondria Vesfculas del ER rugoso Veskulas del ER liso y de Golgi Nucleos Peroxisomas usosomas Endosomas

Numero aproxlmado por celula*

5'

1

22 9

1700 1

6 6

1

.00 300

1 1 1

200

se cree que lodas las cislemas del retkulo endoplasmatico liso y rugosa eslan conectadas, formando un unico gran compartimiento. En cada celu1a el complejo de GoIgi esta organlzado en un nl1mero discmo de grupos de ci$temas aplladas (dictiosomas) ytodavfa no se ha estab1ecido claramente el grado de interconexi6n entre cUos. o

gradan tanto orgAnulos muenos como maccomoltkuJas y partfculas captadas del exterior de la ce:lula por endodtosis. En su camino hada los Jisosomas, las macromollkulas y las partfcuJas endocitadas primero han de pasar por una serie de companimiemos Jlamados endOSQmas. Los peroxisomas (tambi~n conocidos como microcuerpos) son pequenos compartimientos vesiculares que canrienen enzimas que panidpan en diversas reacciones oxidativas. En general, cada orgoinulo rodeado por membrana realiza el mismo dpo de funcioncs boisicas en (0dos los tipos celulares pero varia en abundancia y puede (ener propiedades adicionaJes que difieren de un dpo celuJar a otro de acuerdo con las funciones especiaJizadas de las ce:lulas djferenciadas. En su conjunto, estos orglinuJos ocupan casi la mitad del volumen celular [fabla 12-1), y se requiere una gran canridad de membranas intracelulares para fabricarlos (odos. Asf, en las dos celulas de mamffero que se analizan en la Tabla 12-2.

Tabla 12-2 Canlldades relatlvas de tlpos de membrana en dos celulas eucarlotas PorcentaJe de membrana celular total Tipo de membrana

Hepatoci{o·

Celula exocrina pancrc,hlca o

Membrana plasmlhka 2 5 Membrana del ER rugosa 35 60 Membrana del ER lisa 16
La compartlmentacl6n

de las ~Iulas superiores

591

lisosom..

Figura 12-2 Electronmlcrograffa de una parte de una cBula hepitlca vista en seccl6n transversal. Se indican ejemplos de la mayona de los principales companimientos intracelulares. (Por conesr" de Daniel S. Friend.)

IAI

161

el retfculo endoplasmatico tiene una superficie de membrana total que es 25 y 12 veces mayor respectivamenle que la membrana plasmatica. En term..inos de superficie y de masa, pues, en la mayorfa de la celulas eucariOlas la membrana plasm<1tica es s610 una membrana minoritaria (Figura 12-2). Los org<1nulos rodeados de membrana no se hallan dislribuidos al azar en el citosol; por el contrario, a menlldo oCllpan posiciones caracterfsticas. Asf, en la mayorfa de celulas el complejo de Goigi esta cerca del mkleo mientras que la red de tubulos del ER se extiende a partir del nudeo por todo el dtosol. Estas distribuciones caraeterfsticas parecen depender de las interacciones de los organulos con el ciloesqueleto: por ejemplo, la localizaci6n del ER y del complejo de Goigi depende de la red de microtubulos. Si se despolimerizan experimentalmente los microtubulos con una droga, el complejo de Golgi se fragmenta y se dispersa por toda 1a celula y la red del ER se colapsa hacia el centro celular, 0 centrosoma, a partir del cual emerge la red de microtubulos (vease Capftulo 16).

La relaci6n topol6gica de los organulos rodeados de membrana

puede sec interpcetada en

t~rminos de

sus orfgenes evolutivos2

Para entender la relad6n que existe entre los compartimienlos de la celula, resuha uti! considerar c6mo pueden haber evolucionado. Se cree que los precUTsores de las primeras celulas eucariotas fueroll organismos parecidos abaeterias, los cuales generalmente tienen membrana plasmatica pero no membranas inlemas. En estas celulas, por 10 tanto, la membrana plasmlitica realiza todas las funciones dependientes de membrana, como el bombeo de protones, 1a sfntesis de ATP, y 1a sfntesis de Ifpidos. No obstante, las celulas eucariotas actuales tie592

Capftulo J 2 : Compartimientos intracelulares y c1asificacl6n de prolelnas

(CI

Figura 12-3 Organlzacl6n de membranas espcciallzadas en las bacterias. (Al ZOnas (patches) de la superficie cclular, consislenles en prolefnas espedalizadas de membrana. (8) Zonas invaginadas de membrana plasmatica que incremenlan la cantidad de membrana disponible para funciones cspecializadas. como por ejemplo, para fotosfntesis. (C) internalizaciOn de las zonas invaginadas de membrana, lonnando vesfculas cuya eara interior es lopol6gicamente equivaJenle a la cara exterior de la celula En algunos tipos de baclerias fOlosinteticas se presentan vesfculas de membrana de este lipo; su relacl6n tOpo16gica con la superficie de la celula es similar a la del ER, la del complejo de Golgi, la de los endosomas y la de los lisosomas en las ~1u1as eucariotas.

nen una dimensi6n lineal entre 10 y 30 veces mayor y un volumen entre 1000 y 10000 veces mayor que una bacteria tfpica como E. coli. Se puede proponer que la profusi6n de membranas intemas responde en parte a una adaptaci6n a esl.e incremento en tamai'lo: las cclulas eucariotas tienen una relaci6n entre superficie y volumen mucho menor, de fonna que probablemente el lirea de su membrana plasmlitica es demasiado pequefia para conl.ener la gran cantidad de fun· ciones vitales ligadas a membrana que presenta una eelula. Evidenl.emenl.e. 1a evoluci6n de las membranas intemas ha sido paralela a la especializaci6n de la funci6n de las membranas. En algunas bacterias actuales existen zonas (patches) especializadas de la membrana plasmatica en las que se presentan una colecci6n determinada de proteinas de membrana que reaJizan una serle de funciones relacionadas (Figura 12-3A). Estas porciones especializadas de membrana, tales como la "membrana pUrpura~ en HaJobaclerium que contiene bacteriorrOOopsina (se discute en el Capitulo 10) 0 los cromat6foros en las bacterias fotosinteticas (se discute en el CapitulO 14), representan org.1nulos primitivos. En algunas baeterias fotosinteticas, estas zonas de membrana se han transformado en zonas mlis elaboradas concretAndose en invaginaciones de la membrana plasmlitica (Figura 12-38), mienrras que en orras bacterias parece que estas invaginaciones se han separado completamente de 1a membrana plasm:1tica formando vesfculas cerradas intracelulares rodeadas de membrana, cspecializadas en la fotosmtesis (Figura 12-30. Puede esperarse que un organulo eucariota que se haya originado por el procedimiento que se iJustra en la Figura 12-3 tenga un interior topol6gicamen· te equivalente al exterior de la celula. Veremos que este es el caso del ER. del complejo de Golgi, del endosoma y del Iisosoma -asf como del gran mlmero de intermediarios vesiculares de las vias secretora y endocltica (vesiculas de IrollSporle). Podemos por tanto pensar que todos estos org.1nulos son miembros de la misma familia y que, tal como veremos en detaUe en el pr6ximo capftulo, sus interiores se comunican intensamente entre sf yean el exterior de la celula vfa ve· sfculas de transporte que emergen par gemaci6n de un organulo y se fusionan con otro (Figura 12-4). En bacterias los ribosomas se haUan unidos ala cara cjtos6lica de la membrana plasmlitica por 10 que el origen evolutivo de la membrana del ER a partir de la membrana plasmatica puede explicar por que en las celulas eucariotas los ribosomas se encuentran unidos a la membrana del ER. Este esquema evollluvO tambien ofrece una explicaci6n razonable para la arquitectura del nudeo, con su doble membrana. En las bacterias un unico cro· mosoma esta unido a puntos especiales del interior de la membrana plasmatica. Es por 10 tanto posible que la doble envoltura nuclear se originara como una invaginaci6n profunda de la membrana plasmlitica, tal como se mucstra en la Figura 12-5A. Este esquema podrfa explicar por que el compartimienl.o nuclear es topol6gicamente equivalente al citosol. De hecho, en las c~lulas eucariotas superiores la envoltura nuclear se rompe durante la mitosis, permitiendo que el contenido nuclear se disperse por el citosol, una situaci6n que nUllca sucede con el conlenido de ningtin otro orglinulo delimitado por membrana. Tal y

fR rug

m~",.". envoltur. intern. nllCl..,

[

membnn. u,~

La compartlmentaci6n de las ~Iulas superiores

compleio

Yftkula

de Go4gi

0. !Me,eo:i6n

Figura 12-4 Relaclones topo16glcas entre los compartlmlentos de una c~lu1a eucarlota. Los espacios topol6gicamente equlvalentes se presentan en raja. Los cicJos de gemaci6n y fusi6n permilen en principio que cualquier lumen se comunique con cualquier Olro y con el exterior celular. Lajlechas azules indican la direcci6n de salida del trtifico de vesfculas desde el ER hasta el complejo de Goigi y la membrana plasmatica (o los Iisosomas) y los puntas negros representan proteinas que son segregadas por la relula. Algunos organulos sin embargo-de forma mas notable las mitocondrias y (en plantas) los c1oroplasl05- no panicipan en esta comunicaci6n vesicular por 10 que estan aislados del tnifico entre organulos que se muestra aqu{,

593

tAl VIA EVOLUTIVA PROPUESTA PARA EL NUCLEO V PARA EL RETICULO ENDOPLASMATtCO nlieleo ~Iula proearlota .ncear.l

membrana nuclear interna membrana

,-,

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DNA ribosomn unidos

a membnma complejo de poro nuclear tSI VfA EVOLUTlVA PROPUESTA PARA LA MITOCONORIA

tPc4ilula aucarlota

.nce'tr.1

como tambien predice el esquema de la Figura 12-5A. el espacio entre las dos membranas nucleares es topol6gicamente equivalente al exterior de la celuJa y es continuo con ellumen del ER. Como se discute en el Capftulo 14, las mitocondfias y los c1oroplastos difieren de los otros organulos rodeados de membrana en que presentan su propio genoma. La naturaleza de estos genomas y la estrecha simililud existente entre las protemas de estos orgAnulos y las de algunas bact'erias actuales sugiere c1aramente que las mitocondrias y los c1oroplastos evolucionaron a partir de bactefias que fueron ~engullidas~ por otras celulas con las que inicialmente vivieron en simbiosis (se explica en los Capftulos 1 Y 14). De acuerdo con el esquema hipotetico de la Figura 12-56, la membrana mteroa de las m..itocondrias y de los c1oroplastos corresponde a la membrana plasmatica original de las bactefias, mientras que el lumen de estos organulos evolucion6 a partir del citoplasma bacteriano. Como podrfa esperarse de sus orfgenes. estos organulos permanecen aislados del extenso trMico de vesfculas que conecta el interior de la mayoria de los organulos entre sf y con el exterior de la celula. Este esquema evolulivo agrupa los principales comparlimientos intracelulares de la celulas eucariotas en cinco grupos: (1) el nucleo y el dlosol, que se comunican entre sf a traves de los poros Il/lcleares. par 10 que son topol6gicamente continuos (a pesar de ser funcionalmente diferenles); (2) lodos los organulos que acnian en las rutas de secreci6n y de endocilosis -incluyendo el ER, el complejo de Golgi, los endosomas. los Iisosomas, y numerosas c1ases de vesfculas de transporte; (3) las mitocondrias; (4) los plastos (s610 en plantas); y (5) los peroxisomas (cuyos ongenes evolutivos seran explicados mas adelante).

Las protefnas pueden desplazarse entre compartimientos de diferentes maneras' Todas las protefnas empiezan a ser sintetizadas en el citosol, exceplo las que son sintetizadas en los ribosomas de las mitocondrias y de los plastos. Su destino siguiente depende de su secuencia de aminoacidos, que puede presentar senates de c1aslOcaci6n que dirigen su reparto hacia posiciones fuero del citosol. Muchas proteinas no presenlan senales de c1asificaci6n y, en consecuencia. permanecen en el citosol como residentes pennanentes. Sin embargo, muchas otras tienen sei'lales de c1asificaci6n especfficas que las dirigen desde el citosol hacia el nucleo, el ER. las mitocondrias, los plaslos (en plantas), 0 los peroxisomas; las 594

CapftuJo 12: Compartlmlentos Intracelulares y cJasiflcacl6n de prolefnas

Figura 12·5 1Up6lesls sobre el orlgen evolulivo de algunos orgulUlos rodeados de membrana. Los orfgenes de las mitocondrias, de los cJoroplastos, del ER y del nucleo celular pueden explicar las relaciones tOpol6giCM existentes entre estos compartimientos intracelulares en celulas eucariotas. (A) Posible via para la evoluci6n del ER y del nUcleo. En a1gunas bacterias el DNA se halla unido a una Invaginaci6n de la membrana plasm!lica llamada mesosoma. En celulas procariotas rouy primilivas, una invaginaci6n de este tipa pudo dar lugar a una envoltura alrededor del DNA permitiendo todavfa el acceso del DNA a1 citosol celular (necesaria para pennitir que el DNA pueda dirigir la sfntesis de prote{nas). Probablemente esta envoltura se gener6 completamente a partir de la membrana plasm!tica. produciendo un compartimiento Iimitado par una doble membrana. Tal como se i1ustra.la envoltura nuclear est! organizada mediante una capa fibrosa denominada I4mina nuclear, que est! atravesada por canales de comunicaci6n denominados complejOJ de poro nucleares. Dado que el nucleo est! rodeado par dos membranas que continuan donde son atravesadas por estos pams, ellumen del nucleo es topal6gicamente equivalente aI citosol. Ellumen del ER es continuo con el espacio que se halla entre las membranas nucleares inlerna y externa, y es topol6gicamente equivalenle can el espacio extracelular. (B) Se cree que las mltocondrias (y los c1oroplastos) se originaron mediante la incorporaci6n de una bacteria a una celula eucariota. Estas bacterias retuvieron su autonomia. Esta hip6tesis puede explicar par que ellumen de estos org4nulos permanece aislado del extenso tr.ifico de vesiculas que interconecta ellumen de muchos otros compartimientos intracelulares.

Figura 12-6 Durante el transporte de las ves(culas se mantiene la "polarldad" de la membrana. N6lese que tanlO para las prolefnas como para los Iipidos la oricmaci6n original del comparlimienlo dador se mantiene en la membrana del compartimiemo diana y que los maleriales solubles son lransferidos de lumen a lumen.

bicllplllipldiclI p.oteinll de membr'l'lll conlenido del lumel'l

cOMPARnMlENTO senales de c1asificaci6n tambien pueden dirigir el transporte desde el ER hacia otros destinos celuJares. Para enlender los principios generales por los que actuan las senales de c1asificaci6n, es irnportante distinguir ues sistemas fundamentales diferentes mediante los cuales las prote(nas se desplazan desde un compartimiento a olro. (I) EI trafico de pmteinas entre el citosol y el nucleo tiene lugar entre espacios topol6gicamente equivalentcs, los cuates estan en continuidad a traves de los complejos de poro nucleares. Este proceso se llama transporte regulado porque el complejo de porn nuclear actua como puertas selectivas que pueden Iransportar activamente macromoleculas espedficas y ensamblajes macromoleculares, aunque lambien permiten difusi6n libre de moleculas pequenas. (2) En el transporte transmembrana, tramlocadores proleicos unidos a la membrana dirigen ellransporte espedfico de protefnas a traves de la membrana desde el citosol hacia un espacio que es lopol6gicamenle distinto. Generalmente, la molecula de proteina transportada ha de desplegarse para poder deslizarse a traves de la membrana. Por ejemplo el transporte inicial de determinadas proteinas desde el citosol hacia ellumen del ER a hacia el interior de las mitocondrias tiene lugar de este modo. (3) En el transporte vesicular, las vesiculas de fransporle cargan protemas desde un compartimiento a otro. A medida que la membrana de un compartimiento va produciendo vesfculas por gemaci6n, estas vesiculas capturan un cargamento de mollXulas del lumen del compartimiemo. Tras el transpone y la fusi6n can la membrana de otto compartimiemo, est'as vesfculas descargan su cargamento en el interior de este otro compartimiemo. Par ejempia la rransferencia de prot'efnas solubles desde el ER al complejo de Golgi tiene lugar par este mecanismo. Dado que las protefnas transponadas no atraviesan la membrana, 5610 se desplazan entre compartimientos que son topol6gicamente equivalentes (Figura 12-6). En el Capitulo 13 explicaremos can mas detalle el transpone vesicular. Los Ires sistemas mediante los que se transportan las praternas entre distintos compartimientos se resumen en la Figura 12-7. Cada uno de los tres sistemas de transferencia proteica gcneratmente est<1n guiados sclectivamente por prolefnas receptoras complemenlarias que se hallan Figura 12-7 "Mapa de carreleras" slmpUncado dellrlinco prolelco. Las protefnas pueden desplazarse de un companimiellto a otro por media de un transporte regulado (ell raja). por medio de Iransporte transmembrana (azul). 0 por medio de transporte vesicular (verde). Las sei'lales que dirigen el camino de una protefna determinada a trav6 del sistema, determinando su localizaci6n definiliva en la celula, estan contenidas en la secuenda de aminoacidos de la prote(na. B viaje comienza con la sfnlcsis de una protcina sobre un ribosoma y leonina cuando se ha alcanzado el destino final. En cada una de las cstaciones intermedias (fE!C'uadrosJ se toma una dedsi6n respecto a si la prole{na sem retenida en eI compartimiento a bien continuant el viaje. En principio. se requicre una sei'lal detenninada tanto para relener la proleina en el companimienlo como para no retenerla. E1 destino a1temalivo es la rota porde/octo (en auscncia de sei'lal). Por ejemplo, el transpone vesicular de prolcfnas desde el ER, a lraves del complejo de Golgi, hasta la superficle celular. parece que no necesita ninguna senal especifica; las sei'lales de retenci6n especificas se requieren por consiguiente para retener las proteinas en el ER y en el complejo de Golgi, cuyas proteinas especializadas residen allf. Utilizaremos repelidamente esta figura como gu{a a traves de esle capitulo y del siguienle. destacando la rula panicular que sera explicada. La

compartlmentaclon de las c~lulas superlores

DAOOA

veak:ul. que Ie

'l~"---- gemaciOn, produce PO' cU'fO GEMAClON

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contenido Villi le.tr.l'lspo<1ado

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FUSI6N

COMPARTIMIENTO OIANA

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PEROXISOMA

NUCLEO

Pt..Asnoos

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RE'T1CUlO ENOOf'I.ASMAnco

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PROTEfNA PLEGAOA

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en el orgMulo de destino. Por ejemplo, si una proteina grande ha de ser importada hacia el nucleo, ha de tener una sefial de clasificaci6n que sea reconocida par protefnas receptoras asociadas con el complejo de paro nuclear. Si una prolefna ha de ser transferida directameme a traves de una membrana. ha de tener una senal de dasificaci6n que sea reconocida par eltranslocador de la membrana que tiene que atravesar. Del mismo modo. si una proteina ha de ser incorporada en cierto tipo de vesfculas de transporte 0 retenida en ciertos org:1nulos. sus sei'iales de c1asificaci6n han de ser reconocidas par un receptor complementario de la membrana apropiada.

Los p~ptidos sefial y la regi6n sefial determinan el destino celular correcto de las protemas 4 Existen al menos dos tipos de sei'iales de c1asificaci6n en.las prolefnas. Uno de eUos reside en una regi6n continua de la secuencia de amino:1cidos. tfpicamente de 15-60 residuos de largo. Este peptido seoal es a menudo (pero no siempre) eliminado de la protelna por una peptldasa de seoal especializada, una vez se ha ejecutado la decisi6n de c1asificaci6n. EI otro tipo de sei'ial consiSle en una disposici6n tridimensional caracterfstica de los aromos de la superficie de la protefna, que se forma cuando se pliega la protefna. Los restos de aminoacidos que conslituyen la regl6n seil.aI pueden ser bastante distanles el uno del Olro en la secuencia lineal de aminoacidos. y generalmenle permanecen en la prolefna madura (Figura 12-8). Los peptidos sei'ial son utilizados para dirigir las protefnas desde el dtosol al ER, a las mitocondrias, a los cloroplaslos. a los peroxisomas y al nueleo y tambien son utilizados para retener las protefnas en el ER. Las regiones sei'ial identifican ciertas enzimas que han de ser marcadas can residuos de azucar especfficos que luego dirigen a las protefnas desde el complejo de Golgi a los lisosomas; las regiones sei'ial tambien se utilizan en otros pasos de e1asificaci6n que estan menos caracl'erizados. Para espccificar los diferentes destinos celulares se utili..zan diferenles tipos de peptidos selia!. En general. las prolefnas que estM destinadas a ser transferidas al ER tienen, en su extremo amino lenninal, peptidos sei'ial que en la parte central de su secuencia presentan entre 5 y IO residuos de amino~cidos hidrof6· bicos. La mayoria de estas protefnas pasaran despues desde el ER al complejo de Golgi; no obstante. las protefnas que presentan en su extremo carboxilo lerminal una secuencia detenninada de cuatro aminoacidos son retenidas pennanentemente en el ER. las proleCnas destinadas a las mitocondrias tienen peptidos sefial en los que se alleman restos de aminoacidos cargados posirivamenle con restos de aminoacidos hidrof6bicos. las protemas destinadas a los peroxisomas tienen habilualmente una secuencia de tres aminM.cidos en su extrema carboxi10. Muchas prolefnas destinadas al n(ideo tienen peptidos sei\al fonnados par una agrupaci6n de residuos de aminoacidos cargados positivamente. la cual se 596

Capitulo 12: Compartlmientos lntracelulares y c1asificaci6n de protemas

Figura 12-8 Los dos sistemas mediante los que se puede codlflcar una seftal de lransporle en una protelna. (Al La senal se halla en una secuencia seneiUa ydisereta de aminoacidos, Uamada peptido seftal, que se halla expuesta en la protefna plegada. Amenudo los peptidos seftal se presentan en uno de los extremos de la cadena polipeptfdica (tal como se presenta en la figural, pero tambi~n se pueden Iocalizar en cualquier otto lugar de la proleina (Bl Se puede formar una regiOn seftai mediante la yuxtaposici6n de aminoacidos procedentes de regiones que se hallaban lJsicamente separadas antes de que la protefna se plegara {como se muestra en 1a figural; a1temativamente, la sei\al puede estar fonnada por zonas separadas de Ia superficie de la protefna plegada que se halJan separadas entre sf por distancias fijas. En cualquier caso,la seftal de transporte depende de la conformaciOn tridimensional de la protefna. Por esta raz6n, este tipo de seflal resulta dilJcil ellocaJizar de fonna precisa.

Tabla 12-3 AJgunas secuendas tfplcas de ~ptidos senaJ Pund6n del peptido senaJ

EJemplo de pePl..ldO scnal

Importaci6n al ER

'H1 N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu- Leu-Leu-Val

Gly-l1e-Leu-Phe-Trp-Ala -Thr-Glu-Ala-GluGln-Leu·Thr·Lys·Cys·Glu-VaI-Phe·GlnRetenci6n en ellumen del ER Importaci6n a la mitoeondria

lmportaci6n aI m1c1eo Importaci6n a los peroxisomas Uni6n a membrana a IraV~ de la uni6n eovalenle del extrema amino terminal allicido mirfstico

-Lys-Asp-Glu- Leu-COO'H1 N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-lle-Arg-PhePhe-Lys-Pro-A1a-Thr-Arg-Thr- Leu-Cys-SerSer-Arg-Tyr-Leu-Leu-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg·Lys-Val-Ser-Lys·Leu'H1 N-Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Lys-Pro-Lys-

Los residuos de aminoliddos carglldos positivlImeme se muestran en rojo y los Cllrgados negadvamente en verde. En el reculldro amarillo se indlCli un gran bloque de amlnoliddos hidrof6blcos. HJN' Indica el extremo lImino tcnninal de III protefna y COO- el carboxilo terminal.

encuenlra habitualmente en lugares internos de la cadena polipeplfdica_ En la Tabla 12-3 se muestTan algunos p(iptidos seftal tfpieos. La importancia de cada uno de estos p(iptidos senal en el destino de las prolemas se ha visto en experimentos en los que el p~plido ha sido transferido desde una protefna a otra mediante t~cnicas de ingenierfa genetica: por ejemplo, colocando el peptido sef'lal amjno terminal que especifica para el ER, aI principio de una protefna citos6lica, se consigue que ahora la prolefna se dirija al ER. Todos los p~plidos senal que se hallan unidos a protefnas que tienen el mismo destine son funcionalmente intercambiables aunqlle sus seellencias de amjnoAcidos puedan variar mucho. A menudo. parece que para los procesos de reconocimienro, las propiedades ffsicas de estos p~ptidos seoal. tales como la hidrofobicidad, son mas importantes que la secuencia exacla de aminoacidos. Las regiones seftal son mucho m;1s dificiles de analizar que los peptidos scnal; en consecuencia. se conoce mucho menos sobre su eslruclUra. Debido a que resuJtan de un patr6n complejo de plcgamiento proleico tridimensional, no pueden simplemente lransferirse de una protefna a otra. En el Panel 12-1 (pag. 598) se ilustran los principales mClodos para estudiar e6mo se dirigen las protefnas desde el dlosol a un compartimiento espeeflico y c6mo se translocan a trav~s de las membranas.

Las celulas no pueden construir de novo sus organuJos rodeados

de membrana: necesitan informaci6n del propio orgd.nulos

Cuando una c~lula se reproduce y se divide. tiene que duplicar sus org:1nulos rodeados de membrana. Normalmente las reJulas realizan esta duplicaci6n agrandando los orglinulos mediante la incorporaci6n en ellos de nuevas mol&:u1as, y la posterior divisi6n de estos orglinulos agrandados. Posteriormente, los orglinuJos hijos son diSlribuidos entre las dos eelulas hijas. Esta herencia es escnciaI ya quc una celula no puede fabricar de novo eSlas membranas. Par ejemplo, si se elimina completamente el ER de la celuJa, l.c6mo puede rceotlSlruirlo la celula? Las protemas de membrana que definen el ER y realizan muchas de su funciones clave son produclos del propio ER. No se puede fabricar un nuevo ER sin la exislencia previa de un ER. 0 aI menos de una membrana que contenga los translocadores necesarios para importar protefnas especfficas hacia el ER (y que carezca de los lranslocadores de Olros organulos, necesarios para importar prole(nas). Asf, parece que la informaci6n necesaria para construir un organulo rodeado de membrana no reside 5610 en el DNA que especifica las protcfnas del orglinulo. La compartlmentacl6n de las celulas superiores

597

Aproximaci6n par transfecci6n para definir secuencias senal Un sistema de mostrar que una secuencia sanal es necesaria y suficiente para dirigir una protelna hacia un compartimiento intracelular deteminado consiste en crear una protelna de fusi6n en la que la secuencia senal sa halle unida. mediante tecnicas de ingenieria genetica, a una protelna que normalmente es residente en el citosoL Despues de transfectuar celulas con el eDNA que codifica esta prOlelna, se determina la localizaci6n de Ie protel{ta de fusi6n mediante inmunomarcaje 0 por fraccionamiento celular. MCuenci• .."..1. 0 b

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Aproximaci6n bioqulmica para estudiar el mecanismo de transtocaci6n de la protelna En este caso, una protelna marcada que contiene una secuencia senal especifica es transportada in vitro al interior de organulos aislados. Generalmente la protelna marcada es producida por traducci6n en un sistema libre de dlulas de un mANA que codifica la proteina; sa utilizan aminoacidos radiactivos para mSrcar la protelna seabads de sintetizar de forma que pueda diSlinguirse de las muchas otras protelnss que se hallan presentee en al sistema da traducci6n in vitro. Habituatmenta se utilizan tres metodos para determinar si la proteina msrcada se ha translocado al organulo;",..-:.,.,.,...=""=",..,.,-::;",,=,,, 1. proteJnII marcedIi 2. seevenet."", _ eUmiMdI c:otr.c:donI con .. oro'nukJ mediante UftII protMA .-pec:ffiCII .... ,,1\1I ~

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AJterando la secueocia senal utilizando mutagenesis dirigida puede determinarseque caracteristicas estructurales son importantes para su funci6n.

Aproximaci6n genetica para el estudio del mecanismo de translocaci6n de protelnss

an al CiIOSol: la cliluia viva sin naceaila, hillidina como nutriante

no ..cutncto • .,...,. at media de Incub.tci6n. _~.""Ii

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Utilizando estos ensayos in vitro puede determinarse qua componentes (prOleinas, ATP, GTP, etc.) son necesarios para procesos de transcripci6n.

Para estudiar la translocaci6n de protelnas habitualmente se utilizan cetulas da levadura con mutaciones en genes que codifican componentes de la maquinarla de translocsci6n. Debido 0 que las calulas mutontes que no pueden translocar protelnss a travas da sus membranas moriran, el truco consista en disenar una estrategia que parmita aislar las mutaciones que unicamenta causan un defecto parcial an la translocaci6n de protelnas.

en~lma

aparato de transloellClon

ta elU;ma S8 ha d;rigido al ER: I. celula muara at colocarla en un medlo sin hlstidina

no tode I. enzima M

hall. an al ER:" cilula vive .unque M coloque an euteneia de histidina aparlllo de tran~, moan..

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Una via consiste en utillzar la inganiarla genatica para disenar diu las especiales de levadura. Por ejemplo, Is enzima histidinol deshidrogenasa raside normal mente en al citosol, donde es necesaria para producir el amin6acido asencial histidina a partir de su precursor histidino!. Se construye una cepa de levadura an la que el gen da la histidinol reductasa asta substituido por un gan construido de forma que codifique una protelna de fusi6n con una secuencla senal extra que diriga la protelna 01 interior del retlculo endoplasmalico (ER). Cuando estas dlulas sa hacen cracer en ousencia de histidina, mueren debido a que toda la histidinol deshidrogenasa esta sacuestrada en el EA, donda no es fuocional. Sin embargo, las dlulas con mutaciones que inactivan parcialmente el mecanismo de translocaci6n de protelnas desde el citosol al ER sobreviviran debido a que habra suficiente cantidad de deshidrogenasa relenida en el citosol para producir la histidina necesaria. A menudo se obtienen celulas en las que la protaina mutante todavla actua parcialmente a temperatura normal pero que es completamente inactiva a temperaturas elevadas. Una dlula que transporte una de estas mutaciones sensibles a la temperatura muere a temperaturas elevadas, tenga 0 no histidina, ya que no puede transportar ninguna proteina al ER. Ello permite identiflC8r el gen normal que fue modificado por Ie mutaci6n, mediante la transfecci6n de la dlula mutante con un vector plasmldico de Ievadura en el que se han clonado fragmentos al azar de DNA gen6mico: el fragmento especlflCO de DNA que recupara la celula mutante cuando sa hace crecer a una temperatura elevada sera el que codiflC8 la versi6n salveje del gen mutante.

. . . . . . . JIll lIa ..........._ ......... ' . . . b ......)Qj(MadepnMefnu.b'h'6Jdellleiilf.nna..

Tamblen se requiere la inforrnaci6n epigemUica en fonna de aI menos una pro· tefna caracterfstica en la membrana del organulo, y eSla infonnaci6n es transmitida desde la celula padre a las de la progenie en fonna del propio orgo1nulo. Probablemente esta lnfonnaci6n es esencial para la propagaci6n de la organizaci6n celular en compartimientos, aI igual que la infonnaci6n en DNA es esencial para la propagaci6n de las secuencias de nuele6tidos y de aminoo1cidos.

Resumen lAs diuJas nu:arlottu conUm.en membNUUU illt1'act!hll4U1!$ que enderran aui la mltad tk IU volumm tot4J. en complll'1imlentos inlrtJceluJal1!$ indillldutdlzados lJamo,. dos orpf.nuios. En rodtu las c6ulas euauiow los prindpales tipos de orgdnulos r&deddos de membrana son el redcuJo endoplasm4tlco, el compkjo de Golgl. el nUdftJ, las mltoc:ondrlas, los Usosonuu, los mdosomm y los peroxJsomns; las dluJas wptales contienen. tJd.rm4s. plsstos. como por ejemplo los doropkutos. Cada orpf.nuJo contlene prolelnm ctU'tJCRrlstiau que Msarrollan susjiuu:Wnes CtU'tICferlstiau. Culutdo la prole/na th un orgdmllo acaba th seT sinleti:uul4, encuent1'tJ el ca· mlno esp«:iflco que IuJ th segulrtk$de el ribosoma dotuh IuJ sldo slnletluula hasta el orgdnulo do,.. tu:fJUlnf. gui4d4 por una senal esp«:iJU:a que u holla prrsenle en su seCIUUlCU, de aminodddos y qlU! aetda como un plptido seilal 0 como una re· gUSn seMl. Los plptldos Y las reglones seiMl son reconocidos por prole/lUIS r«epto· nu complDMntarlAs presentes en los ol'Jlfnulos th destino. lAs prole/lUIS q~ ac:tJtan

en el dlosol no prrsentan plptidos 0 reglon.es seilal y por 10 tanto pemulrtl!an en el dtosol dapuh. seT dntetizados.

EI transporte de moleculas hacia dentro y hacia fuera del nucleo· La envoltura nudear encierra el DNA y define el companimiemo nuclear. Esto1

fonnada por dos membranas concentricas que, tal como hemos vista, son continuas can el reUcuJo endoplasmo1tico. A pesar de que la membrana nuclear inlerna y la extema son continuas, las dos membranas presentan distinla composi· ci6n prOleica. La membrana nuclear intema contiene protefnas especfficas que actdan como lugares de uni6n de la ldmina nuclear que la soporta. Esla memo brana esto1 rodeada por la membrana nuclear extema, la cual sc parece enor· memente a la membrana del retfculo endoplasmAtico, que forma un continuo can ella (Figura 12·9). Como la membrana del ER rugoso, esta membrana externa esta generalmente lapizada por ribosomas que se hallan trabajando en la sfntesis de protefnas. Las protefnas fabricadas en estos ribosomas son transportadas al espacio entre las membranas intema y externa (el espacio perinuclear), el cual a su vez es continuo can la luz del ER (vease Figura 12-9). Existe un tnUko bidireccional continuo entre el citosol yel nUdeo. La gran camidad de protefnas que actt1an en el nddeo -incluyendo las hislonas, las DNA y RNA polimerasas, las prote(nas reguladoras de genes y las protefnas de procesamiemo del RNA- son importadas de forma selecliva desde el citosol hacia el compartimienlo nuclear, donde son fabricadas. AI mismo liempo, los tRNA y mRNA son sintetizados en e) compartimiento nudear y luego son exportados aI cilosol. AI igual que el proceso de importaci6n, el proceso de exportaci6n es selectivo; por ejemplo, los mRNA 5610 son exportados si han side modificados correctamente en el nueleo por reacciones de procesamiento de RNA. En algunos casas el proceso de lransporte es complejo: por ejemplo, las prole(nas ribos6micas son fabricadas en el cilosol, importadas aJ nueleo -donde se ensamblan can RNA ribos6mlcos recien fabricados, fonnando partIculasy luego son exportadas de nuevo aI citosol como parte de la subunidad ribos6mica, cada uno de estos pasas implica transporte selectivo a lraves de la envoltura nuclear. El transporte de molecuJas hacla dentro y bacia fuera del nucleo

crrOSQl

Jl

II NUCLEO

II

PEROXISOMA

PlASnoos

MITOCONQRIA

RETICUlO ENOOPlASMAncol

H I GOLGI I L1S0S0MA ENOOSOMA

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19

VES (CULAS ~I SECRECION

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SUPERFICIE CfLULAR

599

membrana nliCleer eKterna membrana de! ER lumen del ER

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perinuclear

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16mi~

nuclear

nuclear

Los poros nucleares atraviesan la envoltura nuclear1 En todas las celulas eucariotas, desde las levaduras hasta las humanas. la envoltura nuclear estd perforada por los poros 'Illcleares. Cada poro eslli consliluido por en una gran estructura discoidal conocida como el complejo del pora nuclear. que se ha eslimado que tiene un peso molecular de alrededor de 125 miUones de dahons y se cree que eSld compuesto por mas de 100 prolefnas diferentes. ordenadas segun una sorprendenle simetrfa onogonal (Figuras 12-10 y 12-11). Cada complejo de poro presenta uno 0 mas canales acuosos abienos, a lraves de los cuales pueden difundir pasivamente las moleculas solubles en agua que son mlis pequenas de un determinado tamano. EllamaFlo erectivo de eslos canales ha sido determinado inyectando moleculas marcadas (que no son componentes nucleares) en el citosol y midiendo luego la velocidad de difusi6n hacia el mlc1eo. Las moleculas pequenas (5000 daltons 0 menos) difunden ran nipidamente que puede considerarse que la envoltura nuclear es Iibremente permeable a elias. Una prolefna de 17000 daitons tarda 2 minulos en equilibrarse enlre cl citoplasma y el nueleo; Ulla protefna de 44 000 daltons tarda 30 minut'Os. Una protcfna globular mayor de 60 000 dahons parece que es cornpletamente incapaz de enlrar en el nucleo. Un andlisis cuantilativo de eSIOS daloS sugiere que el pora !luclear Hene un canal cilfndrico Ileno de agua de aproximactamenle 9 nm

Figura 12-9 La envoltura nuclear. La envoltura nuclear de doble membrana eslli. atravesada por poros nucleares y es cominua con el redculo endoplasmalico. No se mueslran los ribosomas que se hallan unidos en la eara cilos6lica de la membrana del ER yen la membrana eXlema del nucleo.

Figura 12-10 Disposld6n de los complejos de porn nucleares en la envollura nuclear. (A) Esbozo que muestra una pcquei'ia regi6n de la envo]tura nuclear. En una secci6n lransversal el complejo de porn nuclear aparece compueslO de tres panes: (I) un componentecolumnar que fonna el grueso de la pared del poro; (2) un componeme anular, que extiende -radios· hacia el centro del poTO; y (3) un componeme luminal, que esla fonnado por una gran glucoprolefna lransmembrana que se cree que panicipa en el anclaje del complejo a la membrana nuclear. Ademas. existen fibriUas que sobresalen desde la cara citos61ica 0 desde la cara nuclear del complejo. En la parte nuclear las fibrillas convergen fonnando eSlructuras en fonna de jaula. las cuales se muestran en una fotograffa de microscopia electr6nica de la cara nuclear de la envoltura nuclear de un oocito (B). (B, de M.W. Goldberg y T.D. AUen.). cell Bioi. 119:1429-1440, 1992. con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

lIObunidad anular

envohura

;!!!~~J nuclear NUCLfO

.ubun~

columna,

membrana nuclear

interne

W 600

jaula nuclear ~~

Capftulo 12: Compartlmlenlos lntracelulares yclasificaci6n de proternas

181

Figura 12-] 1 Elet:tronmlcrograffa y ret:ollstnJcclon Informatica de compleJos de poro nuclear. (Al y (B): diferentes Ilerspectivas de complejos de poros nucleares liberados de la ellvoltura con detergente y contrastados por tinci6n negativa. En (B) algunos complejos de pOTO pueden verse de lado. (el Reconstrucciones tridimensionales mediante ordenador que muestran vistas desde arriba, inclinada y de lado de complejos de poro. (De J.E. Hinshawy R. Milligan, Cell 69: 1133-1141, 1992. @Cell Press.)

ICI

de diametro y 15 nm de largo; esle canal puede acupar 56[0 una pequei'la fracci6n del volumen total del pora (Figura 12- 12). Dado que muchas protefnas celulares son demasiado grandes para pasar por difusi6n a traves de los poros nucleares, la envoltura nuclear permite que el compartimienlo nuclear y el citosol mantengan diferentes conjuntos de protefnas. Par ejemplo, los ribosomas cilOplaslllMicos maduros tienen un diametro de 30 nm, por 10 que no pueden difundir a traves de los canales de 9 om; su exclusi6n del nucleo asegura que tada la sfntesis proteica estan1limitadaen el dlosol. Pero, tc6mo impona el nlicleo las grandes moleculas que necesita, como las DNA y RNA polimerasas cuyas subunidades lienen pesos molecuJares de cntre 100 000 Y 200 000 daltons? Como explicaremos mas adelante, estas y muchas otras moleculas de proleina y de RNA se unen a proteinas receptoras localizadas en los co.mplejos de poro y luego son transporladas activamenre a lraves de la envoltura nuclear mediante los complejos de poro.

Unas sefiales de localizaci6n nuclear dirigen las prote(nas nucleares hacia el micleo 6 En general, cuanto mas activa sea la transcripci6n nuclear, mayor sent el mlmero de complejos de poro presentes en la envoltura nuclear. La envoltura nuclear

IlImlll'lO de las p,oteinlls Queentran en el mlcleo po, difusi6n libre

EI trans porte de molecuJas hacia dentro y hacia fuera delllllcleo

tamllno de las p,otelnas que ent'lln en ei n"c1eo mediante trllnsporte activo

Figura 12-12 Poslblesv1asde dlfuslon Ubre a traves del complejo de pora nuclear. El dibujo muestra un hipotetico diafragma insenado en el interior del pora para restringir el tamafio del poro del canal abieno a 9 nm, que es el tamailo de poro estimado a partir de medidas de difusi6n. Nueve nan6metros es un diametro menor que la abertura central observada en las imagenes de los complejos de poro nuclear obtenidas a partir de eleclronmicrograffas (0 a partir de medidas durante el transporte activo cuando se dilata el poro para permitir el transporte de partfculas de hasta 26 nm de diametro). Por 10 tanto es probable que algunos componentes del poro se pierdan durante la preparaci6n de las muestras para microscopia clectr6nica y que estos sean los que en condiciones normales IimilCn la Iibre difusi6n a Iraves de la abertura central. Estos componentes pueden formar un diafragma (0 un tap6n) que se abra 0 se cierre pennitiendo el paso de grandes objetos durante el transpoTfe activo, que esta mediado por una senal de clasificaci6n (se explica mas adelante). Apesar de que en algunas preparaciones pueden observarse unos tapones, no esta claro si son componentes del complejo de paro 0 material que esta siendo transportado a traves suyo. Las reconstrucciones [ridimensionales por ordenador sugieren que los canales que permiten la libre difusi6n podrfan no estar localizados en el centro del complejo de poro pero sf cerca del borde entre los componentes coluffinares (vease Figura 12-1 OA); eslo podrfa significar que la difusion pasiva yel t.ransporte activo tienen lugar a [TaVeS de diferentes partes del cOllllllejo de pora.

601

(Al LOCALIZACION DEL ANTIGENO T QUE PRESENTA LA SE ....AL DE IMPORTACION NUCLEAR DEL TIPO SALVAJE

Pro-Pro,--j!!ilHiliHIRHiillf-l.- Val-

(Bl LOCALIZACION DEL ANTIGENO T ~UE PRESENTA UNA SE .... AL DE IMPORTACION NUCLEAR MUTADA ...,1111.

Pro-Pro,--j.Hffil~__-Il__-II. Val..../11\,...

de una celula f[pica de mamffero confiene entre 3000 y 4000 complejos de poro. Si la celula esta sintetizando DNA, necesita importar aproximadamente loe moleculas de histona desde el citoplasma cada 3 minutes para poder empaquetar el DNA recien sintetizado en forma de cromatina, 10 cual significa que, por termino medio, cada pora ha de transponar alrededor de 100 moJeculas de histona por minuto. Si la celula esta creciendo rapidamente, eada poro tambien ha de transportar por termino medio 6 subunidades ribos6micas mayo res y menores recien ensambladas por minUlO, desde el nDcleo, donde son producidas, hasta el citosol. donde son utilizadas. Yesto es s610 una muy pequena parte dellrafico total que pasa a traves de los poros nucleares. Cuando las protefnas del nDcleo son extrafdas experimentalmente y microinyectadas de nuevo en el citosol, incluso las mas grandes se vuelven a acumular en el mlcleo de una forma eficiente. La seleetividad de eSla importaci6n nuclear reside en las senaJes de localizaci6n nuclear, que s610 eSlan presentes en las protefnas nucleares. Estas senales se han definido con precisi6n en muchas protefnas nucleares utilizando la teenologfa del DNA reeombinante. Pueden estar situadas en eualquier lugar de la secuencia de aminoacidos y generalmente consisten en una seeuencia eorta (tfpieamente de enlre cuatro y oeho aminoacidos), que es diferente en diferentes protefnas nucleares pero que es rica en los aminoacidos cargados positivamente Iisina y arginina, y general mente presenta prolina. En muehas protefnas nucleares esta secuencia eSla pari ida en dos bloques de dos a cuatro aminoacidos cada uno, con los bloques separados uno del otro par aproximadarnente diez aminoacidos. Se cree que las senales forman bucles en la superficie de las protefnas. Las sei'lales de localizaci6n nuclear fueron idenlificadas en primer lugar en la protelna codificada por el virus SV40 Hamada anrfgeno T, la cual es neeesaria para la replicaci6n del DNA virico en el nDcleo de la celula huesped. Normalmente el anlfgeno T se acumula en el nDcleo poco tiempo despues de ser sinletizado en el citosol. No obstante, una mutaci6n en un unico aminoacido impide el transporte al nDcleo (Figura 12-13). Asumiendo que esta mutaci6n se localiza en una seeuencia senal de importaci6n a1 nDcleo, se fusionaron cortas secuencias de DNA que eodifiean eSla regi6n del antfgeno T normal, con un gen que codifiea una prolefna citos6lica. Se dererminaron las secuencias mas conas que hacian que la prolefna de "fusi6n" resuhante fuera importada al mlc1eo, y asf se pudo demostrar que la sei'lal de importaci6n nuclear del antfgeno T era una secuencia de oeho aminoacidos contiguos localizados en una regi6n in lema de la cadena polipeptfdiea (vease Figura 12-13). Experimenlos posteriores demostraron que la seeuencia senal tambien puede ser funcional si es sinletizada como un pequeno peplido y unida qui"micarnenle a una lisina seleecionada al azar de una protefna, la eual, en caso de no recibir eSle peptido, permaneceri"a en el citoplasma, 10 cual sugiere que la loealizaci6n precisa en la protefna de la senal de importaci6n al micleo, no es importanre. De hecho, muehas protei"nas nucleares presentan mas de una senal de localizaci6n nuclear. 602

CapfluJo 12: Compartlmienlos intraceluJares y c1aslflcaci6n de protefnas

FIgura 12-13 La funcl6n delasenal de locallzacl6n nuclear. Fotografias de inmunofluorescencia que mueslran la loealizaci6n celular del antfgeno T del SV4Q conteniendo a no un peptido corto que aelda como senal de localizaci6n nulear. La forma salvaje de la protefna del antigeno T contiene Ja secuencia rica en lisina que se indica y que es importada a su lugar de acci6n en el nuc!eo, como se demuestra mediante una tinci6n inmunofluorescenle can un anticuerpo contra el antfgeno T (A). 5i el antfgeno T presenta una seilal de loealizaci6n nuclear alterada (una treonina que reemplaza a una lisina) permanece en el dtoso! {Bl. (De D. Kalderon. B. Roberts, W. Richardson y A. Smith, Cell 39:499-509, 1964 © Cell Press.)

0,1. cabell

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oro eoIoidal

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nlJc:leoplasminl ,ldillCtiva

cabel" ,adillCtlv"

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MICAOINYECCION EN El CITOPLASMA DE OOCITOS DE XENOPUS

INCUBAC!6N

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OETECOON MEDIANTE AUTORRAOlOGRAFIA

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CAPTACION EN LOS NUCLEOS

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NO CAPTACION

OETECClON POR EM

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CAPTACION EN LOS NUCLEOS

CAPTACION EN LOS NUCLEOS A TAAV~S DE LOS POAOS NUClEAAES

Las rnacrornoleculas son transportadas activamente hacia dentro y hacia fuera del nucleo a traves de los poros nucleares9

Figura 12·14 Captacl6n de prole{nas nucleares a Iravn de los compleJos de poro nucleares. La flllcleoplasmilla es una gran pratefna pentamerica del nlicleo, que presenta dominios diferentes en la cabeza y en la cola. Las cabezas pueden ser separadas de las colas mediante fragmenlaci6n proteolflica limitada. Cuando se inyectan moJecuJas intactas de nucleoplasmina en el ciloplasma de un coeito de rana. se acumulan rnpidamenle en el nucleo a pesar de que al parecer son demasiado voluminosas como para pader difundir pasivameme a traves del coml>lejo de I>oro nuclear. La senal necesaria para esla importaci6n nuclear reside en el dominio de Ia cola, ya que el nucleo capla rnpidamente las colas de la proteina pera no las cabezas. EI papel de los poros nucleares ell cSta imporlaci6n dirigida por senal se puede demOSlrar medianle eleclronmicroscopia uliliz.ando colas de nucleoplasmina acopladas a esferas de oro coloidal, que son ftidlmente visualizables debldo a su elevada elcclrodensidad. La uni6n de las colas de nucleoplasmina dirigen la enlrada de las partfculas de ora a traves de los poros nucleares (vease Figura 12-15).

EI transpone activo de procefnas nucleares a traves de los paras nucleares puede ser visualizado directamente recubriendo partfcuJas de oro can una proteina nuclear, inyectando estas particulas en el citosol, y siguiendo su destino por electronmicroscopia (Figuras 12-)4 y 12-15). La inleracci6n inicial de una prolefna nuclear can el complejo de para nuclear requiere una 0 mas protcfnas citos6licas que se unen a las seftales de loealizaci6n nuclear y colaboran dirigiendo a la prolefna nuclear hacia el complejo de poro, donde parece que se une a las fibriUas que se proyeclan a partir del ani110 del complejo. Entonces, la protefna nuclear se desplaza hacia el centro del complejo de poro, donde es aetivamente transportada a lraves de la envoltura nuclear mediante un proceso que requiere la hidr61isis de ATP (Figura 12-16). Figura 12-15 VisuaJlzacl6n del proc::eso de Importad6n espedlica de una prote(na a travn de los poros nucleaTeS. E1eclfOnmicrografia que muestra las esferasde oro ooIoidal revistiendo nucleoplasmina (vease Figura 12-14) entrando en el nucleo a lraves de los poras nucleares (indicados mediante corcheles rojos). Cuando las esfcras de oro coloidal se recubren con la regi6n de la cola de moleculas de nucleoplasm ina se obtlenen resultados similares a esIOS. Estas panfculas de oro lienen un diamelro mayor que el canal de difusi6n del complejo de pora. 10 cual implica que. para permitir su paso. se ha inducido a abrirse un pora. Dado que las panfculas de oro se alinean en el citosol antes de emrar en contaeto y de enlrar en el complejo de poro. se ha sugerido que las fibrillas que se eXlienden hacia el citosol a panir del complejo de pora (vease Figura 12-IOA) guran a las partfculas hacia su deslino. (DeC. Feldherr. E. Kallenbach y N. Schultz.f. Cell Bioi. 99:22162222. 1964, con permiso de copyright deThe Rockefeller University Press.) EI transporte de mol6::uJas hacia dentro y hacia fuera del m'icleo

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factore. citos6lico.

PASO 1

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UNION; NOse REOUIERE ATP

PASO 2

TRANSPORTE: SE REOUIERE ATP

I

•

NUCLEO

Estudios realizados con varios t'amanos de particulas de oro indican que durante el proceso de transporte la abertura se puede dilatar hasta alcanzar 26 nm de diameuo: parece que una estructura muy poco definida en el centro del complejo de pora act(ia igual que un diafragma de apertura controlada (close-fining). abrie:ndose 10 necesario cuando es activado por una senal de una protefna de grnndes dimensiones (ve:ase Figura 12-12). La base molecular de este mecanismo y el mecanismo a trave:s del que aCl(ia bombeando macramole:culas hacia demro y hacia fuera del n(ideo todav!a constituye un misterio. Parece probable que la exportaci6n de nuevas subunidades ribosomales y de RNA mensajero a trav~ de los poras nucleares dependa de un sistema de rransporte selectivo. 5i se utilizan esferas de oro de 20 nm de dilimetro similares a las utilizadas en la Figura 12-15, se recubren con pequenas mole:culas de RNA (tRNA 0 RNA 55) de forma similar a como se realiz6 en los experimemos de nuc1eoplasmina. y luego se inyectan en el n(icleo de un oocito de rana. son rlipidamenle transportadas a trave:s de los poros hacia el citoplasma. 5i. por otro lado, estas partfculas son inyectadas en el citoplasma del OOcil0, no son transponadas hacia el n(icleo sino que permanecen en el citoplasma. Parece que, ademcis de contener receptores que reconocen las senales de importaci6n nuclear, el poro comiene uno 0 mas receptores que reconocen moleculas de RNA (0 las protefnas unidas a elias) destinadas at dtosol. Utilizando diferentes tamanos de partfculas de oro, unas cubiertas por RNA e inyectadas en el n(icleo y otras recubiertas con senates proleicas de imponaci6n nuclear, se puede observar que un mismo complejo de poro permite el trMico en ambas direcciones. EI mecanismo de transporte macromolecular a traves de los poros nucleares es fundamental mente distinto a los mecanismos de transporte implicados en la transferencia de protefnas a traves de las membranas de otros organulos. La principal diferencla radica en el becho que ellransporte nuclear no tlene lugar a traves de un transponador proteico que atraviesa una 0 mas bicapacas lipfdicas sino a traves de un gran poro acuoso regulado. Parece que las protefnas Ilucleares son transportadas a traves de los paras, manleniendo dichas prolefnas su confonnaci6n completamente plegada, como ocurre con una subunidad ribosomal que es transportada como una panfcula ensamblada; por e\ comrario. para ser transportadas a atros orgIDllllos, las protefnas tienen que desplegarse durante su transporte, como expl..icaremos mas adelante.

La envoltura nuclear se desorganiza durante la mitosis 1o La himlna nuclear es una red de subunidades proteicas interconecladas deno-

minadas laminlnas nucleares. Son un tipo especial de filamentos intennedios {expl..icado en el Capftulo 16} que poJimerizan fonnando una red bidimensional (Figura 12-17). Se cree que la l:imina nuclear da fonna y estabilidad la envohura nu.clear, a la cual se halla anclada por la uni6n de los poras nucleares y la membrana nuclear intema. Tambi~n se cree que la cromatina interacciona directamente con la llimina nuclear, por 10 que la lcimina proporciona un uni6n estrucrural entre el DNA y la envoltura nuclear. 604

CapftuJo 12: Compartlmlentos lntraceluJares y c1aslficaci6n de protefnas

Figura 12-16 RepresentacleSn altamcnte esquematica del mecanlsmo de transporte activo a traves de los poros nudeares. Las prolemas y las eslruClUras implicadas en el proceso de transpone activo no son conocidas. Sin embargo, sabemos que para la unieSn inidal de las proleinas nucleares al complejo se necesitan una coleccieSn diversa de proleinascilos61icas reladonadas. Estas protemas, Uamadas nudeoporinas, contienen un azUcar simple (la N-acetilglucosaminal que ayuda a su identificaci6n medianle el uso de lectinas y de anticuerpos espedficos. No se muestran las fibrillas que se proyectan a partir del complejo de poro y que se cree que ayudan a guiar a las protefnas nudeares al centro delporo.

Figura 12-17 Lahimlnanuclear. Eleclronmicrograffas de pordones de la Ill.mina nuclear en un DOCito de Xenoplls preparado por sublimad6n y sombrcado mct41ico. La lamina eSlli. fonnada por una red regular de filamentos inlermedios especializados. {Por cOrlesia de Ueli AebLl

poro nuclear

\

DNA membrana "...clear interne

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It

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OSfORILACI6NDE LAS lAMtNINAS

FusION DE LOS CROMOSOMAS ENVUEtTOS

NUCU:O EN INTERFASE

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FusION DE LAS VEsicULAS DE LA ENVOtTURA NUCLEAR

I

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lamininas

lasfolil.des

PROFASf

DE LAS LAMININAS

TELOFASE TEMPRANA

Cuando el Hudeo se desorganiza durante la mitosis, la lamina nuclear se despolimeriza, al menos parcialmente. como consccuencia de In fosforilaci6n de las lamininas nucleares en el inicio de 1a mitosis. Al mismo liempo, los poras nu· c1eares se desorganizan en sus diversos componenles. La despolimerizaci6n de la lamina nuclear es probablemente un requisito previa para que la envo[tura nu· clear se rompa fonnando vesfculas de membrana las cuales, con el contenido nuclear, se dispersan por todo el cilOsol. La reorganizaci6n de la lamina nuclear tienen lugar cuando las lamininas nucleares son desfosforiladas y, como resultado de eUo, repolimerizan en las supcrficie de los cromosomas; entonces, la lamina nuclear reorganizada une las veskulas de la envollura membranosa nuclear, las cuales se fusionan entre sf formando de nuevo una envoltura alrededor de cada cromosoma 0 grupo de cromosomas. Durante eSle proceso los complejos de poro nucleares tambien se rcorganizan. Los cromosomas envueltos se agrupan y sus membranas se fusionan formando una sola envollura nuclear. la eual importa activamente tadas las pratefnas que presentan sei'iales de localizaci6n nuclear (Figura 12·18). Dado que la nueva envollura nuclear esta situada muy cerca de la superficie de los cromosomas, excluye todas las protefnas de la celula excepto las que estan unidas a los cromosomas mit6licos. Por 10 tanto, las proleinas grandes se manlienen fuera del ndcleo interfasico a menos que presenten sei'iales de localizaci6n nuclear. las seiiales de localizaci6n nuclear no son eliminadas despues del transporte bacia el ndcleo. Se supone que eSlo es asf porque las proteinas nucleares han de ser importadas aI ndelco vacias veces, despues de cada divisi6n celular. Por el contrario, cuando una moltkula de prole(na ha sido importada a cualquier otro organulo rodeado de membrana, se transmite de generaci6n a generaci6n en el interior del compartimiento y nllnca ha de ser translocada de nuevo. En esle caso el peptido seoal de estas moleculas es a men lido eliminado desplles de la translocaci6n proteica.

Figura 12·18 Rotura y nueva fomUlcl6n de la envoi lura nuclear durante la mitosis. Se cree que la fosforilacl6n de las lamininas ayuda a disparar el desensamblaje de 13 Ijmina nuclear, 10 eual a su \"e'l. causa la rolunl. en (onna de vesfculas de la envohura nuclear. Parece que la desfosforilaci6n de la 14minas ayuda a revertir el proceso.

£1 transporte entre el mlc1eo y el citosol puede ser regulado evitando el acceso a la maquinaria transport adoral I Como se explica en el Capftulo 9, la actividad de algunas prolernas de regulaci6n g~nica esta controlada manteniendo estas protefnas fuera del compartimiento E1 transporte de moJ~las hacla dentro y hacia fuera del nudeo

605

,el'lal de lou!iuci6n nuclear lugar de uni6n hOrmOI'l' de 18 hormol'la .steroidea

t

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envoltura nuclear

,--,

CITOSOL

NUCU;:O

~""-P«O~A

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tUII'IICripci6n

dominic
COMPLEJO RECEPTOR INACTlVO EN EL CITOSOL

LA UNION DE LA HORMONA UBERA LA hsp90 Y EXPONE LA SENAL DE LOCAUZACION NUCLEAR

UNION DEL RECEPTOR ACTlVO AL DNA ACTlVANOO LA TRANSCRIPC\ON

nuclear hasta que son necesarias en dicho compartimiento. La senal de localizad6n nuclear de estas protefnas puede ser inactivada por fosforilad6n. Otras, se unen a protefnas citos6licas inhibidoras que 0 bien las retienen en el dtosol-probablemente mediante interacciones con el citoesquelet'O 0 con organulos especfficos- 0 bien enmascaran sus sel"a1es de localizaci6n nuclear. Cuando la c~Hula recibe el estfmulo apropiado, la proteina es liberada de su anclaje citos61ico 0 de sus sistema de enmascaramiemo yes uansponada hacia el nuc1eo (Figura 12-19). La exponaci6n de RNA desde el nucleo puede estar controlada de una manera similar. Como la importaci6n activa hacia el nucleo, la exportaci6n tambien requ.iere una sel"a1: en el caso de la mayorla de moleculas de RNA mensajero, esta sei\a1la proporciona una modificaci6n caracterfstica, la estcuctura de caperuza (cap) en el extrema 5' del RNA (se explica en el Capitulo 8). Los RNA premensajeros procesados de fonna incompleta denen esta caperuza, pero est<\n unidos a la maquinaria nuclear de transcripci6n y de maduraci6n, la cual s610 Iibera la molecula de RNA cuando se ha completado su procesamiento: estudios geneticos realizados en levaduras han demostrado que las mutaciones que evitan que el RNA pre-mensajero se relacione correctamente con la maquinaria de maduraci6n provocan la exponaci6n de RNA no maduro. Onos RNA, como el UNA de transferencia 0 el RNA ribos6mico, que no presentan la estruclur3 en caperuza en el extrema 5', primero han de ensamblarse con protefnas y entonces son exportados como parte de estos complejos. Posiblemente las sel"ales de exponaci6n nuclear se encuentran en las subunidades proteicas de estos complejos, y estas sef\aJes se activan despues del ensamblaje correcto con los componentes de RNA. Sin embargo, no conocemos todavfa la naturaleza de estas seiiales.

Resumen La envoU"ra nllclear estd fOntullM por "na membrana nuclear lnterna]l otra externa. La membmua 1IIlclear externa es continlUl con la ",embrallU del ER, ]I el espacio entre bta]l la membrana nm:War intertul es continuo COil ellumell ckl ER. Las molkulas de RNA, que sonfabrlautas en el ndcleo, y las sllbllllidades rlbos6",1cas, qlU~ son ensambladas camblin en el ndcleo, son exportadtu al cltosol, mle,lIrus que todns las protefnas q'le son flltlelonales en elmi.cleo I,an sido silltetluulas en el elrosol e Importadas. El illtercambio de materin1es elltre eilidcleo y el dtosol tlene '''gar a traves de los poros mu;leares qlre proporr:iOllUli IIl1a ufa de paso a tmves de la envolWra nuclear. Las protefnas qlre presentan seMles de importad6n n"clear SOil tralUportadas adiuamente haeia el nlkko a traves de los poros. mkntras qlre las molk"las de RNA Y las s"b"nldadn rlbosomales reciin fabrkadas son lransportadas adlvamente hacia a/llera, a traves de los poros. Dado qlU! este pipttdn senal no es elimi,uulo, las protefnas "ueleares plleden ser importadas varias Pea'S, tid como se requlere cada uez: q,re el nrfeleo u desorgnniUl en la mitosis. El lralUporte de las protefnas ,,,,eleares y de las molkulas de RNA a travis de los paros se Pltede reguMreuitando ell1Ca!'so deestas molkillas a M maquinaria tk transportede los poros nlu;leares.

606

Capftulo 12 : Compartimientos intracelulares y c1asificaci6n de protefnas

Figura 12-19 La Importacl6n nuclear del receptor de g1ucocortlcoldes. EI receptor de glucocorticoides es una prolefna reguladora de genes que en las celulas no Iratadas con honnonas se halla en el citosol unida a la prolefna chaperona hsp90. Cuando se activa por la union de la hormona esteroidea apropiada, la protefna hsp90 se libera y el receptor se dirige aI nucleo gracias a una senal de localizacion nuclear; una vez se halla en el nucleo. se une a secuencias espedficas de DNA y regula la lranscripciondeunacoleodonde genes discreta. (Se explica en los Capftulos 9 y 15.)

El transporte de protefnas al interior de mitocondrias y de cloroplastosl 2

CITOSOL

Il

J

Tal como se explica en el Capitulo 14, las mitocondrias y los c1oroplaslos son organu]os de dohle membrana que se especializan en la sfntesis de ATP, utilizando la energfa producida mediante el transporte electr6nico y la fosforilaci6n oxidativa en las mitocondrias y mediante la fosforilaci6n fotosintetica en los cloroplastos. A pesar de que ambos organulos contienen su pro pia DNA y su maquinaria para la sfntesis proteica. la mayorfa de sus protcinas estan codificadas en el mldeo celular y son imporladas desde e[ dlosol. Ademas, cada protefna importada ha de alcanzar el subcompartimiento determinado en el que es funcional. En las mitocondrias exislen dos subcompartimienlos: el espaclo de la matriz y el espacio lntermembrana. Estos compartimientos estan definidos por las dos membranas mitocondriales: la membrana interna, que encierra el espacio de la matriz y la membrana cxterna que se haHa en contacto con el citosol (Figura 12-20A). En los cloroplastos existen estos dos subcompartimientos mas otro adicional, el Ilamado espacio rilacoidal, que est a delimitado par la membrana tilacoidal (Figura 12-208). Cada uno de estos subcompanimientos contiene una colecci6n especffica de protefnas. Por 10 taOlo, el credmieOlo de las mitocondrias y de los cloroplastos mediante la importaci6n de protefnas citoplasmaticas constituye una proeza, que irnplica la traslocaci6n selectiva de estas prorefnas a traves de vaTias membranas sucesivamente hasta alcanzar el lugar apropiado. Las protefnas codificadas por los genomas de estos organulos. que son relativamente pocas, estan localizadas principalmente en la membrana interna de las mitocondrias y en la membrana tilacoidal de los doroplastos. Generalmente los polipeptidos codificados por los organulos forman subunidades de complejos proteicos cuyas otras subunidades estan codificadas por genes nucleaTes y, por 10 tanto, son irnportadas desde el dtosol. La formaci6n de estos complejos protei cos hfbridos requiere una sfntesis equilibrada de los dos ripos de subunidades; el mecanisme a traves del cual esta coordinada la sfntesis proteica en dos tipos diferentes de ribosomas localizados en dos membranas separadas, constiluye actualmente un misterio.

NUCLEO

PEROXISOMA pLASTIDOS

MITOCONDRIA

I

RETlcULO ENOOPLASMATICO

,u. GOLGI L1S0S0MA ENDOSOMA

I

1r

I

~

VESICULAS DE SECRECION

I

11

SUPERFICIE CELULAR

La translocaci6n bacia la matriz mitocondrial depende de una sefial tfpica de la matrizl3 Generalmente, las protefnas imponadas a la matTiz mitocondrial son captadas desde el citosol uno 0 dos minutos despues de su liberaci6n desde los polirribosomas Iibres. Casi siempre estas protefnas prccursoras mltocondriales poseen un peptido senal (de entre 20 y 80 residuos de aminoacidosl en su extrema arni-

(A) MITOCONDRIA

(BI CLOROPLASTO

espacio entre membrenes membrana intarne especio antra mambranes

membrane Illacoidel

aspacio da la matriz (eslromal

EI transporte de protefnas at interior de mitocondrias y de c1oroplastos

Figura 12-20 Los suboompartlmlentos de la rnItocondria y del cioroplasto. La topologfa del cloroplasto puede derivarse de la topologfa de la milocondria de una forma sencilia: peUizcando las invaginaciones de la membrana mitocondrial intema para dar lugar a vesfculas. se puede generar un compartimiellto que es topol6gicamenle equivalente aI de las vesiculas del tilacoide de los cloroplastos. Las vesiculas deltilacoide podrfan haber evolucionado de este modo.

607

Figura 12-21 Un peptido senal para ia importaci6n deprote{nas a ia mhocondrla. La citocromo oxidasa es un gran complejo multiprotcico localizado en la membrana mitocondrial interna, donde actua como la enzima terminal de la cadena de lransporte eleclr6nico (se explica en el Capfrulo 14). (Al Los 12 primeros amino
no. Cuando las protefnas han sido importadas, el peptido seftal es rapidamente climinado par una proteasa especffica (una peptidasa de seiialJ de la matriz mitocondrial y probablemente degradado hasta aminoacidos en la matriz. EI peptido seftal puede ser extraordinariamente sencillo. Experimentos de genetica molecular en los que se utiliza un peptido seftal de longitud progresivamente menor, han demostrado que para seftalizar la importaci6n mitocondrial s610 son necesarios 12 aminoacidos en su extremo amino terminal. La uni6n experimental de estos 12 residuos a cualquier protefna citop!'1"imatica hace que la proteina resultanle sea dirigida a la matriz mitocondnal. Estudios de la ffsica de peptidos seftal completos sllgieren que estos peptidos seftal pueden formar estructuras anfipMicas de helice 0., en las que todos los restos cargados positivamente se localizan en un lado de la helice y todos los restos hidrof6bicos se distribuyen'en el lado opuesto (Figura 12-21). $e cree que esta configuraci6n es reconocida por protefnas receptoras especfficas de la superficie milOcondrial.

La translocaci6n hacia la matriz mitocondrial depende

del gradiente electroquimico a traves de la membrana interna y de la hidr6lisis de ATpl4 . Casi todo 10 que conocemos ace rca de los mecanismos moleculares de la importaci6n proteica a las mitocondrias 10 hemos aprendido del amilisis de sistemas de transporte reconstituidos en sistemas libres de cclllias. En primer lugar, se purifican mitocondrias por centTifugaci6n diferencial a partir de Wl homogeneizado de celulas. A continuaci6n. estas mitocondrias se incuban con protefnas precursoras mitocondriales marcadas radiactivamente. Generalmente las proternas precursoras purificadas son transportadas hacia el interior de estas mitocondrias de forma nipida y eficiente durante una breve incubaci6n in vitro. Cambiando las condiciones de estos experimelllos in vitro, es posible establecer los reqllerimientos bioqu(micos del transporte de protefnas hacia el interior de las mitocondrias. Tadas las farmas de transporte y de desplazamiento vectorial requieren energ(a. En rnuchos sistemas biol6gicos la energfa esta suministrada por la hidr61isis de ATP. No obstante, en el caso de la importaci6n mitocondrial tam bien se requiere un gradiente electroqufmico a traves de la membrana mitocondrial interna. Este gradiente se mantiene por el bombeo'de H' desde ia matriz al espacio incermembrana durante el transporte electr6nico, impulsado por los procesos de transporte electr6nico en la membrana interna. La membrana mitocondrial externa al igual que las bacterias gram negativas (vease Figura 11-14). presentan grandes cantidades de una prolc(na formadora de poros Hamada porina, par que son libremente penneables a los ioncs organicos y a los metabolitos (aunque no a la mayorfa de protefnas) de modo que no es necesario mantener ningUn gradiente a su traves. La energfa del gradienle electroqufmico a 608

Capftulo 12: Compartimientos intracclulares y c1asificaci6n de protefnas

\8

traves de la membrana interna se utiliza como una baterfa para impulsar la biosfntesis de la mayor parte del ATP de la celula, pero tambien se utiliza para ayudar a impulsar la importaci6n de protefnas dotadas del peptido seftal de importaci6n mitocondrial, que est:! cargado positivamente: cuando se anaden ion6foros que disipan el potencial de membrana mitocondrial, se bloquea la importaci6n de protefnas a la mitocondria. Todavfa no conocemos de que forma el gradiente electroqufmico colabora impulsando la translocaci6n proteica. La funci6n de la hidr6lisis del ATP se conoce mucho mejor, como veremos mas adelante.

Las protefnas mitocondriales son importadas hacia la matriz mediante un proceso de dos etapas, a traves de lugares de contacto que unen las membranas externa e internalS Como primer paso en la importaci6n mitocondrial, las protefnas precursoras mitocondriales tienen que unirse a protefnas receptoras que se encuentran en la membrana mitocondrial externa y reconocen los peptidos senal mitocondriaJes. La etapa siguiente es el proceso de translocaci6n en sf mismo. La protefna puede aJcanzar la matriz mitocondriaJ cruzando las dos mem. branas una por una, 0 pasando a traves de ambas membranas a la vez. Para distinguir entre estas dos posibilidades, un sistema de importaci6n libre de celulas se enfrfa hasta temperaturas bajas, atrapando las protefnas en aJgl1n paso intermedio del proceso de translocaci6n. Las protefnas que se detectan en este paso tienen su extremo amino tcnninal en el espacio de la matriz (como 10 indica el hecho de que su peptido sefiaJ ya haya sido eliminados por la proteasa de matriz), pero la mayor parte de la protefna todavfa puede ser atacada desde el exterior de la mitocondria por enzimas proteoliticas afiadidas externamcnte (Figura 12-22). Este resultado demuestra que para cntrar cn la matriz las protefnas precursoras pasan a traves de ambas membranas mitocondriales a la vez. Se cree que existen dos protefnas transportadoras, una en la membrana extema y la otra en la interna, y que sus funciones habitualmente se hallan acopladas permitiendo el transpone a traves de ambas membranas al misffio tiempo. Los electronmicroscopistas han detectado numerosos puntes de centacte en los cuales parece que se unen las membranas mitocondriales externa e intema, 10 cual sugiere que los procesos de translocaci6n se producen en 0 cerca de estos puntos. Aunque las protefnas precursoras son transportadas a trayes de ambas membranas a la vez, esta claro a partir de los experimentos descritos en la Figura 12-22 que el proceso de imponaci6n tiene lugar en dos etapas distintas y que s610 la segunda se bloquea por temperaturas bajas. De ambas, la penetraci6n inicial, que no se afecta por las bajas ternperaturas, es la que requiere el potencial de membrana: cuando una preparaci6n enfriada de mitocondrias que contienen intermediarios parciaJrnente translocados, se vuelven a calentar, el pro-

5e necesite el potencial de membrana

5'C

r-~"'-'

Figura 12-22 Las prolefnas que son transportadas a la malrlz mllocondrial alravlesan de fonna transltorla tanlO la membrana extema como la Intema de la mllocondrla, Cuando se incuban milocondrias aisladas a 5 <>C con un precursor de una prole(na, el precursor s610 se Iransloca parcialmenle. En la matriz mitocondrial se elimina el peptido sei'ial amino terminal (en raja); la mayor parte de la cadena polipeptldica permanece fuera de la mitocondria donde es accesible a enzimas proteolfticas. AI volver a calentar la preparaci6n a 25 <>C, el proceso de translocaci6n se completa. Una vez se halla en el interior de la mitocondria, la cadena polipeptfdica esta protegida de las enzimas proleolfticas aftadidas desde el exterior a menos que tambien se anada un delergente para romper las membranas mitocondriales, 10 que pennite la digesti6n de las protemas importadas.

se n&Cesita la hidr61isis de

ATP 2S"C

!

+ proteasa

EI transporle de prole(nas allnterlor de mJtocondrias y de c1oroplastos

~'P"'"'' 1

+ detergenta

609

INSERCION EN LA MEMBRANA, IMPULSADA PDR EL GRADIENTE ELECTROOufMICO

precursor de la protelna

membrana milocondriallnlerna

11/(r~" RECONOCIMIENTO

protelr.8 raceptora

ROTURA MEOIANTE

CITOSOL

MATRIZ

lugar de '-f i N A PEPTIOAS& conlaClO enlre____ OE SErilAL las membranas ~ LA TRANSLOCACION \ protelna mltocondrlal A LA MATRIZ ~ mad ... ra REOUIERE ATP

/

PlIplido sellal elimir.ado

ceso de importaci6n se completa nipidamente (Figura 12-22), incluso aunque el potencial de membrana a traves de la membrana interna se haya disipado. Sin embargo, esta segunda etapa del proceso de transporte requiere ATP. Por 10 tanto la primera etapa, que implica la inserci6n del peptido seilal y de las seeuencias adyaeente en el interior de ambas membranas mitocondriales, es impulsada por el gradiente eleetroqufmieo, y Ja segunda rase, en la cual el resto de cadena polipeptfdica se desplaza hacia la matriz, requiere tanto hidr6lisis de ATP como una temperatura fisiol6gica (Figura 12-23).

Las proteinas son importadas hacia el interior de la matriz mitocondrial, en un estado desplegado l6 EI transporte de las prote(nas precursoras mitocondriales a traves de los puntos de contacto de las membranas mitocondriales esta guiado por los miembros de la familia de las proleinas chaperonas, [as cuales se expliean en el Capitulo 5. Es diffcil de imaginar c6mo una protefna pJegada soluble en agua puede pasar a traves de dos (0 incluso a t.raves de una) bicapas Iipfdicas mientras manliene su conformaci6n tridimensional nativa. Se sabe que las protefnas citos6licas de lipo chaperona (llamadas chaperoninas) penenecientes a la familia de las hsp70, ademas de asegurar el correcto plegamiento de protefnas citos6licas, tienen una funci6n importante en la imponaci6n de proleinas tanto hacia el interior de las mitocondrias como hacia el ER, mediante su uni6n a los precursores en su esta· do desplegado durante la translocaci6n. Como se explica en el Capitulo 5, la Iiberaei6n de los polipeptidos recien sintetizados de la familia de prolefnas chaperonas hsp70 requiere la hidr6lisis de ATP, 10 eual supone parcialmente la dependencia del ATP de las ultimas rases de la imponaei6n mitocondrial. Las primeras evidencias sobre la funci6n esencial de las protefnas ehaperonas en la t.ranslocaci6n a traves de las membranas celulares intern as se obtuvieron en estudios geneticos de levaduras. Cuando se inaclivan los genes que codifiean ciertos miembros de la familia hsp70 de las protefnas chaperonas, los precursores mitocondriales no son importados hacia las mitocondrias y se aeumulan en el citosol. Se cree que los precursores recien sintetizados, a medida que son Iiberados de los polirribosomas en el citosol, se unen a las proteinas hsp70, las cuales evitan la agregaci6n 0 el plegamiento espontaneo de las protefnas precursoras antes de que se unan a los translocadores proteicos de la membrana de destino. La energfa liberada por la hidr6lisis de ATP se utiliza para Iiberar a las protefnas hsp70 unidas a medida que las prote(nas translocadas pasan a traves de la membrana. Experimentalmente, la necesidad de hsp70 y de ATP en el dtosol puede evitarse si las proteinas se mantienen desplegadas artificialmente, per ejemplo, mediante un paso de desnaturalizaci6n en L1na solud6n concentrada de urea. 610

Capftulo 12: Compartimientos lntracelulares y clasificaci6n de protefnas

Figura 12-23 Importaclon de protefnas par la mltocondrla. EI peptido sci'lal amino terminal del precursor proteico es reconocido por reccptores que al parecer existen en la membrana externa de la mitocondria. Se cree que la protelna es lranslocada a traves de ambas membranas mitocondriales, a travl!s de lugares espedales de contacto 0 muy cerca de cUos. Este transporte esta impuJsado inicialmente por eJ gradiente electroqufmico existente a traves de la membrana interna, ydespues por la hidr6lisis de ATP. En la matriz milocondrial. el peptido senal es eliminado por una peptidasa de senal, formandose la proteina madura. EI peptido sei'lallibre es n'ipidamcme degradado.

-

t;'p;

membrana mitocondrial externa

espscio intermembrene

Q......

;nembrana mitocondrial '"terna /"'"

MATRIZ hsp70 mitocondrial

La uni6n secuencial de las protefnas importadas a las protefnas mitocondriales hsp70 y hsp60 impulsa su translocaci6n yayuda el plegamiento proteico 17

Figura 12-24 La Importacl6n de prote(nas hacla 1a maim mitocondrlal requlere protemas hsp70 en ambos lados de 1a doble membrana mllocondrlal. Despues de 1'1 inserci6n inicial del peptido sei'ial y de las porciones adyacentes de la cadena pelipeptfdica, la cadena desplegada se desliza a traves de lin canal que atraviesa ambas membranas. La hsp70citos6lica unida se libera de la prote(na par media de lIna reacci6n que depende de la hidr6lisis de ATP. De forma concomitante, la 1Jsp70 mitocolldrial se une a regiones de la cadena polipeptfdica que se hallan expuestas en la matriz. estirando asf la prote(na hacia el interior de la mitocondria.

Las prolefnas importadas no s610 son dirigidas a las mitocondrias por las proteinas chaperonas: una vez han sido Iiberadas en el interior, son recibidas en la matriz par proteinas eSlrechamenee relacionadas con las hsp70. La hsp70 milocOrldrial es crucial en procesos de importaci6n ya que las mitocondrias que contienen form as mutantes de la protefna no son capaces de importar protefnas precursoras. AI igual que su pariente citos6lico, la hsp70 mitocondrial tiene una alta afinidad para las cadenas polipeptidicas no plegadas, y se une fuenemenle a las protefnas imponadas a medida que emergen de los translocadores. A coneinuaci6n la hsp70 libera la protefna mediante una reacci6n dependiente de ATP. Este cicio de uni6n y posterior liberaci6n dependiente de energfa puede proporcionar la fuerza impulsora para la importaci6n proteica despues de que la prolefna se haya insertado inicialmente en el translocador (Figura 12-24): la uni6n secuencial de muchas hsp70 mitocondriales puede empujar la protefna desplegada a traves del canal transmembrana hacia la matriz. Despues de la interacci6n inicial con la hsp70 mitocondrial, muchas proteinas importadas son transferidas a otra protefna chaperona. la hsp60 miloco,,drial. Tal como se explica en el Capftulo 5, la hsp60 se pega a las cadenas polipeptfdicas no plegadas facilitando su plegamiento mediante una reacci6n dependiente de ATP. La mayor parte de nuestro conocimiento aClual sabre la funci6n de la hsp60 como protefna facilitadora del plegamienlo deriva de eslUdios sabre la importaci6n de protefnas en las mitocondrias.

EI transporte de protefnas al espacio intermembrana mitocondrial requiere dos sefiales l8 Muchas de las funciones de las mitocondrias requieren protefnas que estan integradas en la membrana mitocondrial interna a bien que actuan en el espacio intermembrana. Estas protefnas son transportadas desde el citosol mediante los mismos mecanismos que transportan protefnas hacia la matriz, pero mediante varios sistemas se evita que finalicen su viaje en la matriz. En muchos casos las protefnas precursoras son inicialmente transferidas hacia la matriz, tal como se ilustra en la Figura 12-23. No obstante, estas protefnas presentan una secuencia de aminoacidos muy hidrof6bica, situada muy eSlrategicamente despues del peptido senal amino terminal que inicia la importaci6n. Una vez el peptido senal ha sido eliminado por la proteasa de la matriz, la secuencia hidrof6bica actoa como un peptido senal para volver a translocar la protefna de nuevo desde la matriz a traves de la membrana interna. Posiblemente el paso final de esta ruta implica un mecanisme similar al utilizado para dirigir protefnas codificadas par las mitocondrias a traves de la membrana intema (Figura 12-25A). Mas adelante veremos que un mecanismo parecido se utiliza para translocar protefnas hacia 0 E1 transporte de protcmas allnterior de mllocondrias y de c1oroplastos

611

protelna dfIla membrana inlerna

proteina de la membrana interne

CITOSOl

-'-/~

....

MAT""

piptido aetNIl

w

sfmeSIS PAOTEICA MITOCQNORlAL

,.,

lei

a trav~s de la membrana del ER y de la membrana plasmatiea proeariota, donde ha sido esmdiado mlis intensamente. Una ruta altemaliva hacia la membrana intema puede evitar la excursi6n hacia la matriz. EI translocador en la membrana interna se une a la secuencia hidrof6biea que sigue al peptido sef\al amino terminal que inicia la importaci6n y evita Iransroeaciones posteriores a Iraves de la membrana interna. Los dos translocadores en las membranas externa e interna se dcsacoplan. 10 eual provoca quc el resto de la protefna sea empujada hacia el espacio intermembrana (Fi· gura 12·258). Diferemes prolcfnas pueden utilizar una u olra de estas dos rutas hacia la membrana interna 0 hacia el espacio imermembrana. No esta claro emil de elias es la mas utilizada. DespueJ de que las prote[nas destinadas a la membrana interna hayan sido insertadas en la membrana, una proteasa imermembrana las fraeciona, Iiberando la cadena polipepddjca madura como una prote[na soluble (Figura 12-25C). Finalmente, muchas de estas prole[nas se encuentran unidas, como prolefnas de membranas perifericas, a la superficie extema de la membrana rrulocondrial intema, donde forman subunidades de complejos proteicos que tambien contienen protefnas transmembrana.

Para dirigir el transporte de protemas a la membrana tUacoidai de los cloroplastos se necesita la participaci6n de dos peptidos seiial l9 EI transporte de prote[nas hacia el interior de los c1oroplastos se parece en muchos aspectos a1 transpone hacia el interior de las mitocondrias: ambos transpones se producen de manera post-transcripcional, ambos requieren energfa, y ambos utilizan peptidos sel'Jal hidrof6bicos amino terminales que se eliminan despues de haber sido utilizados. 5i embargo, existe al menos una diferencia im· portante: las mitocondrias utilizan el gradiente eleclroqufmico a traves de su membrana interna para ayudar a impulsar el transporte, micntras que los cloroplastos, que tienen un gradienle electroquimico a traves de sus tilacoides pero no de su membrana interna, parece que s610 utilizan la hidr61isis de ATP como aporte energetico para la import'ad6n a lraves de su envohura extema de doble membrana. A pesar de que los peptidos senal para el transporte aI interior de los c1oro· plaslos son semejantes a los descritos anleriormente para ellransporte a milocondrias, en las celulas vegetales se hallan presentes tanto mitocondrias como c1oroplaslos, y las protefnas han de escoger de manera adecuada entre eUos. En plantas, por ejemplo, si una enzima bacteriana se une experimentalmeme a una secuencia amino terminal de una prote[na mitocondrial, es dirigida especfficamente a las mitocondrias mientras que si se une experimentalmente a una sccuencia amino terminal de una prote[na de c1oroplaslo, penetTa en los c1oroplastos. Por 10 tanto, probablemente los receptores de importaci6n de cada organulo pueden reconocer las diferentes secuencias senal. Los c1oroplastos tienen un compartimiento extra rodeado de membrana, el dlacolde. Muchas protefnas de los c1oroplastos, entre las que se encuentran las subunidades proteicas del sistema fotosintetico y de la ATP sintasa, son trans612

Capftulo 12: Compartimlenlos IntraceJulares yclasificaci6n de protefnas

1

Figura 12·25 La importacl6n de protelnll8 desde el cltosol a1 espaclo Intermembrana 0 a la membrana Intenla de la mltocondrla. (Al Se cree algunas prolCfnas, para desplazarse desde el dlosol a la membrana interna, sigucn una mla que requiem la parlicij)ad6n de dos peplidos senal y de dos fen6menos de Iranslocacl6n. En primcr lugar, la prolelna es transpOTlada al espado de la matrlz, como mucstTa la Figura 12·23. Sin embargo. la eliminad6n del ~ptido sefta! (en rojo) utilizado para este lranspoTle inicial desenmascara un ~plido sef'ial hidrof6bico {elllUuallja} adyacelUe siruado en el nuevo extrema amino. ula senal haec que la prote{na se Inserle en la membrana interna mediante el mismo sistema par el que se inserlan en esla membrana las proternas codificadas por el genoma milocondrial. (8) Segtin un mecanismo alternativo, la secuencia hidrof6bica que sigue a la sefial que dlrige hacia la matriz se une a un translocador y detiene la translocaci6n a lraveS de la membrana interna. EllIonces el resto de la protelna es empujada hacia el espacio intermcmbrana y la secuencia hidrof6blca se Iibera en el interior de 18 membrana inlema. Esle mecanismo se denomina la ruta de paro de transferencia y se explica en detalle m~s adelante. (e) AJgunas protelnas solubles del espado illlennembrana pueden utilizar tambien las nllas mostradas en (A) yen (8) anles de ser libcradas al cspado intennembrana por una segunda peplidasa de seoal (con su lugar activo en el espacio intennembrana). la cual elintina el ~ptido sefta! hidrof6bico.

peptido ael'lal de e1oroplaato

CITOSOL

L1MINACICIN OEL

E$TROMA

"PTIOO SE.Al Df'PLASTO

prote(na precuraora de tilacoide receptor CUVII existencla ae propone membrana exlerna

-~j-

TRAN$LOCAC10N AL ESTROMA OEPENOIENTE DE ATP

--

TRAN ALE TILAC membrana dellilllCOide

p4ptldo 8el'lal de t1lllcolde acceaible ~,

OCACION CIO AL

.,

proteins mlldure en el eaPtieio del tilacoide

Figura 12·26 La Iranslocacl6n aI espaclo tilacoidal de los c1oroplastos. L.1 caden.1 polipeptfdica precursom contiene un peptido sef'i.11 amino terminal de c1oropl.1sto (ell rojo), seguido inmediatamente por un pcptido senal de tilacoide (en naranjal. EI peptido sef'ial de cloroplasto inicia la transloeaci6n aI eSlroma a traves de un lugar de contaeto entre membran.1s, medianle un mecanismo similar al ulilizado para la translocaci6n a la matriz mitocondrial. Entonces, este peptide senal es eliminado, desenmascarando el peptido seiial de tilacoide, el eual inicia la lranslocaci6n a lra~s de la membrana del tilacoide.

ponadas desde el citosol hasta la membrana tilacoidal. Como en el caso de algunos preeursores milocondriales, estas protefnas son transponadas a su destino final a traves de un proeeso en dos pasos. Primero pasan a traves de la envoltura de doble membrana hacia el espacio de la matriz del cloroplaslo (llamado el estroms) y luego son nanslocadas hacia la membrana tilaeoidal (0 a traves de esta membrana hacia el espacio tiJacoidall. Los preeursores de estas proleinas tienen, a continuaci6n del peptido selial amino terminal del c1oroplasto, un peplido senal hidrof6bieo dellilacoide. Despues de que el peplido senal amino terminal haya side utiJizado para importar a la prolefna al estroma, es eliminado por una proleasa selial del estroma (amiloga a la proteasa senal de la matriz mitoeondria\J. Esta hidr6lisis desenmascara el peptido selial del tilacoide, el eual entonees inicia el transporte a traves de la membrana tilacoidal (Figura 12-26). 19ual que en el caso de las mitocondrias, el segundo paso es la via utilizada para insertar las protefnas eodificadas por el c1oroplasto en la membrana tiJacoidal; probablemelUe el transloeador proteico que se utiliza es originario del anteeesor bacteriano de los cloroplastos.

Resumen A pesar de que las mitocondrias y los cloroplastos tienen sus propios sistemas ge· neticos, s6io producen una pequena proporclOn de sus propias protefnas. De IledlO, an;bos orgdtmlos importan desde el citosolla tnayorla de sus proteinas, utilizando en ambos casos mecanlsmos similares. Los procesos de transporte han sido muy estudiados etJ t',itocondrlas, especialmente en levaduras. Una prolefna es translocada ai espacio de la matriz mitocondrlal mediatlte ei paso a traves de lugares de adllesMn entre ias membranas extema e intema, llamados lugares de contaeto. La trmlSloeacMn en las mitocondrias estd impulsada por la IIidrolisis de ATP Y por el gradlente electroqufmico a traves de ia membrana intema, mientras que la tratlSiocacion etl los cloroplastos solo estd impulsada por la Ilidrolisis del ATP. La proteina transportada atravlesa las membranas de las mltocondrias y de ios cloroplastos elt e;tado desplegado. Las protefnas chaperonas de la familia de las IISp70 citosolicas mantienen las proteinas precursoras en un estado desplegado competente con la tramlocacwn. La I1Sp70 milocondrial se une a la cadena polipetfdica que esta llegando a la matriz y parece que la implllsa luwla ei interior. Una vez que la proteina se I.alla en ia matriz, otra proteina de estres, la hsp60, ayuda ai plegamietlto de la proteina. 56io las protebJas que contie,.en un peptido se,lai especiflco son translocadns Ilacia el interior de las mitocotldrias y los cloroplastos. EI peptidQ senal se Imlla generalmetlte en ei extremo amino termitlal yes eliminado desplles tk la importacioll. EI trallsporte a la membra'Ja intema puede teller lugar como 1m segll1.do paso sl en la prote{na importada se Jralla presente un pep· EI transporte de protefnas al interior de mitocondrias y de c1oroplastos

613

tldo seiialllidroj6bioo; este segundo peptido senal es desenmasarmdo cuamlo se eli· mina el primer plptido senaL De iguaijonPU!, en el caso de los cloroplastos In i",port0d6n dade el estroma hasta el tilncoith requiere un segundo piptido seilaL

Peroxisomas 20

I

CITOSOl

Los peroxlsomas se diferencian de las mitocondrias y de los c1oroplaslos en muchos aspectos, entre los que cabe deslacar que estos org<1nulos eSI<1n rodeados por una unica membrana, y no preselllan ni DNA ni ribosomas, A pesar de estas diferencias, se cree que los peroxisomas est<1n formados por un proceso similar de importaci6n especffica de protefnas (y de Ifpidos) del citoso!' No obstante, dado que los peroxisomas no poseen genoma, ladas sus prolefnas han de proceder del citOsol. Par eUo, los peroxisomas se parecen at ER en que son org<1nulos aUlorreplicames, delimilados por una membrana unilaria y que existen sin genoma propio. Dado que no volveremos a Iralar de los peroxisomas en OlrO lugar de esle libro, vamos ahora a detenemos a considerar las funciones de esla familia diversa de organulos, antes de hablar de su biosfnlesis. Los peroxisomas se encuentran en todas las celulas eucariotas. Presenlan enzimas oxidativas. como la calalasa y la /lralO oxidasa, a tan altas concentraciones que en algunas celulas los peroxisomas se reconocen en electronmicrograffas por la presencia de un nucleoide cristali no, principal mente compuesto de urato oxidasa (Figura 12-27). Como en el caso de las mitocondrias, los peroxi""''llas son los principales lugares de utilizaci6n de oxigeno. Una hip6tesis es que los peroxisomas son un vestigio de un org:inulo antiguo, que en los amecesores primitivos de las celulas eucariolas realizaba todo el metabolismo del ox:fgeno. Cuando el oxigeno producido por las baclerias fotosinteticas empez6 a acumuJarse en la alm6sfera pod ria haber resultado altameme t6xico para la mayoria de las celulas. Los peroxisomas pudieron haber contribuido a disminuir la concemraci6n de oxigeno en eSlas celulas, a la vez que permitian utilizar su reactividad qufmica para realizar reae· ciones oxidativas utiles. De acuerdo con esle punto de visla. el desarrollo poste· rior de las milocondrias hizo que los peroxisomas se volvieran a1tamellle obsoletos. dado que muchas de las reacciones que ellos realizaban sin producir energfa fueron acopladas a la formaci6n de ATP por medio de la fosforilaci6n oxidaliva. Por 10 lanto, las reacciones oxidalivas que realizan aClualmente los peroxisomas podrian ser las que siguen siendo uliles a pesar de la presencia de las mitocondrias.

1

J NUCLEO

PEROXISOMA

MITOCONORIA

pLASTIDOS

RETlcUlO ENDOPLASMAnco

.u.

GOlGI LlSOSOMA

K:

II9VESlcULAS DEI SECRECION

ENOOSOMA

lr

11

SUPERFICIE CElULAR

Los peroxisomas utilizan el oxfgeno molecular y el per6xido de hidr6geno para realizar reacciones oxidativasZI Los peroxisomas se denominan asf porque generalmente contienen una 0 m<1s enzimas que ulilizan oxfgeno molecular para eliminar atomos de hidr6geno a panir de substralos organicos espedficos (aquf designados como R) a naves de una reacci6n oxidativa que produce per6xido de IIidr6gello (HPJ: Rl-4 + O2 -+ R + H 20 2 La calalasa Uliliza el H20 2 generado por olras enzimas del org<1nulo para oxidar diversas substancias -como fenoles, acido f6rmico, formaldehfdo, yalcohol- median Ie lIna reacei6n de "peroxidaci6n": H 20 2 + H'H 2 -+ R'+ 2Hp. Este tipo de reaccl6n oxidativa es particularmente importante en el hfgado y en las celulas de rii\6n. cuyos peroxisomas destoxifican una gran variedad de moleculas t6xicas que emran en la circulaci6n. Casi la mhad del elanol que bebemos es oxidado a acelaldehfdo de esla manera. Adem<1s, cuando se acumula un exceso de H20 2en la c~Hula, la cat'alasa lransforma H 20 2a H20 (2H 20 2 -+ 2l-40 + 02)' Una de las funciones principales de las reacciones oxidalivas realizadas en los peroxisomas es la hidr61isis de las moleculas de licidos grasos, En un proceso

614

Capitulo 12: Compartimlenlos lntracelulares yclasificad6n de protemas

L--J

200 nm

Figura 12-27 E1ectronmlcrogrllrfa de peroxfsomas de una celula de hfgado de rata. Las indusiones

Ires

paracrislalinas electrodensas corresponden a la enzima uralo oxidasa. (Por cortesfa de Daniel S. Friend.)

Figura 12·28 E1ectronmk:rograffas de dos tJpos de peroxisomas encontrados en celulas vegetales. (A) Peroxisoma de las halas, con un micleo paracristalino. de una c~lula del mes6fi1o de una hoja de tabaco. Se cree que la estrecha asoclaci6n del peroxisoma con el c1amplas!o facilil3 el inlercambio de materiales eOlre estos organulos durante la fOlorrespiraci6n. (B) Peroxisomas de una ctHula de un ootiledon almacenadora de !fpidas, de una semilla de lomate, 4 dfas despues de genninar. En este caso, los peroxisomas (glioxisomas) estotn asociadas con los cuerpos lipfdicos en los que se almacenan los !fpidas. 10 Cllal reneja el pape] central de estos giioxisomas en 13 moviliz.ad6n de los Ifpidas y en su utilizacl6n para gluconeog~nesisdurante 13 gcrminaci6n de la semilla. (A porcortesfa de P.I. Grubery E.H. Newcomb; 5, porcortesfa de S.E. Frederick y E.H. Newcomb.)

Uamado Il oxidaciofl, las cadenas alquilo de los ~cidos grasos son acortadas secuencialmente en bloques de dos ~tomos de carbona que son convertidos en aceti] CoA y exponados desde los peroxisomas aI citosol para su reutiJizaci6n en reacciones biosint~ticas. La p oxidaci6n en celuJas de mamffero tiene lugar tanto en mitocondrias como en peroxisomas, sin embargo en levaduras y c~lulas vegetales esta imponante reacci6n se encuentra exclusivamente en los peroxisornas. Los peroxisomas son org~nuJos extraordinariamente diversos: en distintas c~lulas de un mismo organisrno pueden contener incluso rnuy distintos tipos de enzirnas. Tarnbien pueden adaptarse de manera rernarcable a condiciones carnbiantes. Par ejemplo, las celulas de levadura que crecen con azucar tienen peroxisomas pequef'os, pero cuando crecen en metanol desarrollan grandes peroxisomas capaces de degradar ~cidos grasos hasta acetil CoA por ,media de la Il oxidaci6n. En las plamas, los peroxisomas lienen funciones importantes. Se han estudiado intensamente dos tipos muy diferentes. Un tipo de peroxisomas est~ presente en las hojas, donde cataliza la oxidaci6n de un producto colateral de la reacci6n crucial que transforma el CO 2 en carbohidratos (Figura 12-28A). Este proceso se denominafotorrespiracion porque utiliza 02 y Iibera CO2_ EI otro tipo de peroxisomas se halla presente en las semiUas en genninaci6n, donde desem-

III

Peroxisomas

615

pcnan una funci6n esencial transformando los
Una corta secuencia sefial dirige la importaci6n de prote{nas hacia los peroxisomas22 Una secuencia especffica de tres amino
Resumen Los peroxisomas esufn especlaIlzados en la realizaci6n de reacdotlcs oxidatilltl$ qlU Ilfiliz.an OX/geM molecular. Generan per6xidiJ de hidr6gello, que es utilizado confines oxIdativos, y destruyen el erceso de per6xidD de hidr6geno por medio de la caUl· In.sa que contienen. Como en el caso de 1m mitocondrla.s y de los cloroplastos, los peroxLsorruu son orgtfnulos autorreplicantes. Dado que no presentan nl DNA ni ribosonuu, tienen qlU importar todas sus prote/1IDS desde el cltosol. Utla scclUncia especffica de tres aminod~idDs situada cerca del extremo carboxilo de muchas de eslas prote{1IDS acnfa como una seilal de Importaci6n peroxisomnL

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perpxisom.

pl'"olelnll receptor. npeeffica que cal.liza I. Imponacl6n de prot.""..

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CRECJMfE~O PaR -1;'91

CAPTAoON DE PROTEINAS ClTOSOUCAS ESPEdFlCAS

f' 4t

Figura 12-29 Modelo del proceso a trav~del cualseensamblan los

peroxJsomas. La membrana de 105 peroxisomas conliene prolefnas receptoras de imponaci6n. Todas las protefnas peroxisomales, incluyendo las nuevas copias del propio receptor de imponaci6n, eslill sinlelizadas por los ribosomas citos6licos y despuk son transponadas hasta el orgli~ulo. Asf pues, los peroxisomas se forman unicamente a partir de Olros peroxisomas ya fonnados, mediante un proceso de crecimiento y fisl6n. Probablemente los Ifpidos necesarios para fonnar las nuevas membranas peroxls0f!1ales tambi~n son imponados. Mll.s adclante explicaremos c6mo los lfpldos fabricados en el ER pueden ser lransportados a trav~s del ellosol hllSllllos orgll.nulos. 616

Capftulo 12: Compartlmlentos Intracelulares y c1aslf1cacl6n de protefllas

.,..?>~

peroxi.omu IIIJo.

El reticulo endoplasmatico 23 Todas las celulas eucariotas tienen un reticula endoplasmllUoo (ER de Endoplasmic Reticulum). Su membrana constituye nonnalmenle mas de la mitad del total de la membrana de 1a celula (vease Tabla 12-2). Est;! organizado en (anna de una red laberlntica de tubulos ramificados y de s
I

CITOSOl

IL

1

PEROXISOMA

NUCLEO

PLAsnoos

I MITOCONDRIA

IRETlCulO ENOOPlASMAncol

H GOlGI llSOSOMA

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I

II 19

ENOOSOMA

1r

VEsiculAS DE SECRECION

I

II

SUPERFICIE C'ElULAR

Los ribosomas adheridos a las membranas definen el ER rugoso Z4 EI ER extrae detenninadas protefnas desde el dtosol a medida que son sintetizadas. Estas protemas son de dos tipos: (I) protefnas transmembrana, que 5610 son parcialmente nanslocadas a traves de la membrana del ER y que, por tanto, se mantienen incluidas en ella, y (2) protemas solubles en agua, que son completamente translocadas a (raves de la membrana del ER y Iiberadas allumen. Algunas de las prote(nas transmembrana se mantienen en el ER, pero muchas otcas estan deSlinadas a residir en la membrana plasmtitica 0 en la membrana de otro orgtinolo. mientras que las protefnas solubles en agua estan destinadas aI lumen de un organulo 0 a ser segregadas. Todas estas prote(nas, independientemente de su destino posterior, son dirigidas a la membrana del ER por el mismo tipo de p~pti· do senal y translocadas a trav~s de la membrana mediante el mismo mecanismo. En las c~lulas de mamffero la imponaci6n de prolefnas al ER empieza antes de que la cadena polipeptfdica se haya acabado de sintetizar --es decir, tiene lugar a nivel cotraduccional. Este hecho diferencia este proceso del de la importaci6n a las mitocondrias, a los c1oroplastos, al mlc1eo, y a los peroxisomas, en los cuales la importaci6n es post-traducclonal y requiere diferentes tipos de peptidos senal. Dado que habitualmente un extremo de la proteina esta translocado en el interior del ER mientras el resto de la cadena polipeptfdica se esta fabricando, la Figura 12-30 EI reticula

endoplasm'tlco. Micrograffa f1uorescente de una c:elula c:u1tivada de mamlrero, tefiida ron un antic;uerpo que se une a una protelna retenida en el ER. EI ER se extientle como una red por todo el dtoplasma de la ct!:lula, de fonna que todas las regiones del dlosol se hallan cercanas a alguna porci6n de la membrana del ER. (Por cortesfa de Hugh Pelham.)

•

El retfculo endoplasmlitlco

617

Figura 12-31 ElERrugoso. Electronmicrograffa que muestra el ER rugoso, el cual recibe su nombre de los ribosomas que se hallan en la superficie cit0s6lica. (Conesfa de L Orcl.)

protc(na llllnCa es Iiberada aJ citosoJ y par consiguielltc no existe eJ peligro dc que se pliegue antes de alcanzar el translocador de la membrana. Contrariamenre al caso de importaci6n posHraduccional de protefnas hacia el interior de las mitocondrias y de los c1oroplaslos, en el caso de la importaci6n de protefnas al ER las chaperoninas citos6licas no son necesarias para mantencr a la protcfna desplegada. EI ribosoma que esta sintelizando la protefna esta unido directamente a la membrana del ER. Estos ribosomas unidos a membrana recubren la superficie de la membrana del ER, dando lugar a las regiones lIamadas reticulo endoplasm.h.lco rugoso (Figura 12-31). Par 10 tanto, en el dtosol existen dos poblaciones de ribosomas, separadas espacialmente. Los ribosomas unJdos a membrana, unidos a la cara citos6lica de la membrana del ER, se dedican a la sintesis de protefnas que simultanea· menle se translocan al interior del ER. Los ribosomas Jibres, no unidos a ninguna membrana, fabrican todas las demas protefnas codificadas por el genoma nuclear. Los ribosomas unidos a membrana y los ribosomas Iibres son estructural y funcionalmente identicos. Difieren 5610 en las prolefnas que eslan fabricando en un momento dado. Cuando un ribosoma empieza a fabricar una proteina con un pept.ldo senal para el ER, la propia senal dirige a! ribosoma a la membrana del ER. Dado que muchos ribosomas pueden unirse simultaneamente a una misma mol~cula de mRNA, normal mente se forma lin poUrrlbosoma, el ella! se line a la membrana de ER a trav~s de mtiltiples cadenas polipeprfdicns en crecimienlo (Figura 12-32). Cada uno de los ribosomas asociados can una molecula de mRNA de este tipo puede volver a! citosol en cunnto termina la traducci6n, cerca del extremo 3' de la molecula de mRNA. No obsrante, el mRNA por sf mismo tiende a permanecer unido a la membrana del ER debido a la interacci6n de una poblaci6n cambiante de ribosomas que se mantienen unidos a la membrana mediante un receptor rihos6mico que los ayudan a mantenerse aUf. Por el cont.rario. si una molecula de mRNA codifica una proteina que no tiene el ~ptido senal para el ER, el polirribosoma que forma permanece libre en el dlosol y la prolefna prodUCIO de esta sfntesis es Iiberada en el propio citosol. Par 10 tanto, s610 se unen a las membranas rugosas del ER las moleculas de mRNA que codifican protefnas que tienen un peptide senal para el ER; las rnoleculas de mRNA que codifican todas la dernl1s protetnas, permanecen Iibres en el citosol. Se cree que cada ribosorna individual se rnueve al azar entre estas dos poblaciones de molecuJas de mRNA segregadas (Figwa 12-33).

EI ER lisa es abundante en aJgunas celulas especiaJizadas25 las regiones del ER que carecen de ribosomas unidos se denorninan retfculo endoplasnllitlco Usa, 0 ER lisa. En una gran rnayoria de celulas estas regiones son cscasas, y s610 exlste una pequena regi6n del ER que es parcial mente lisa y par618

Capftula 12: Comparlimlentos lnlracelulares y c1asificacl6n de prolefnas

Flgunl 12-32 PoUrrlbosomas. Electronmicrograffa de una secciOn u1trafina de polirribosomas unidos a la membrana del ER. En algunos lugares el plano de la secciOn carta a trav~ del ER en paralelo a la membrana, dando una visiOn del patrOn en roseta de los polirribosomas. (Par cortesfa de George Palade.)

10. mRNA que codifiCllrl una

polirrioosoml lib.e

prote!PlII citos61ictJ permllrlecen librss en 81 <:;\0.01 \

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en III CIIOIOI

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de r'bosom., en II titosol

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10. mRNA qUI oodiflClll'I protein.. que Mr'" dirigidas heea. el

ER permlneun unidol

,J.atmembnnll

tel'\11 doER

pollrriboeoma uflldo. I,

membr_ del ER, II lIa"" r:te multiples 0ItdeI'l ••

_'M

Figura 12-33 lUbosomas llbres y unldos a membrana. Tanto para sintelizar las protefnas que permanecernn en el dtosol como para sintelizar las que seran transporladas al ER, se uliliza el misma aeervo de ribosomas. 1.0 que dirige al ribosoma correspondieme a la membrana del ER es 1a presencia del ptiptido sella! para ER en la cadena polipeptfdica que se esl~ sinletizando. La molt:cula de mRNA puede pennanecer unida a! ER, fonnando parte de un polinibosoma, mientras que los ribosomas que se van desplazando sobre ella son reciclados; aI final de cada cicio de sfntesis de proteina. las subunidades del ribosoma se liberan volvil!ndose a incorporar al acervo comun del Cilosol.

cialmenle rugosa. Est'a regi6n se denomina elementos transicionaJes porque de eUa emergen las vesfculas que lransponan proteinas y Ifpidos recien sintctizados hacia el complejo de Golgi. No obstante, en determinadas celulas especializadas el ER liso es abundanle y tiene atras funciones. Concrctamente, es particularmente predominantc en celulas especializadas en el metabolismo lipfdico. Por ejemplo, las celulas que sinlelizan hormonas esteroideas a partir del colesterol (ienen un ER Iiso muy amplio que comiene las enzimas necesarias para rabricar colesleral y para modificarlo dando lugar a las hormonas (vease Figura 12-34). El principal tipo cellLlar del hfgado, el hepalocito, nos proporciona otro ejemplo. Es el principal lugar de producci6n de particulas lipoproteicas pa.ra la exportaci6n: estas partfculas transportan los Ifpidos por la corrieme sangu{nea a olros lugares del organismo. Las enzimas que simetizan los componenlCS lipfdicos de las Iipoprolefnas estan locaLizadas en la membrana del ER Iiso, la cual taro bien contiene enzimas que catalizan una serie de reacciones que desloxifican las drogas liposolubles y compuestos producidos por el metabolismo que resultan perjudiciales. Las reacciones ciedesloxificacion mas estudiadas estan catalizadas por la familia de enzimas de la familia de la cilocromo P450, las cuales catalizan una serie de rcacciones sabre dragas solubles en Ifpidos 0 sabre metabolitos que de otro modo podrfan acumularse a niveles t6xicos en las membranas celulares. y las convicrtcn Cll meleculas suficientemenre hidrosolubles como para abandonar la celula y ser secretadas por la orina. Puesto que el ER rugoso no puede albergar por sf mismo un numero suficienlemenle elcvado dc estas y de otras enzimas ncccsarias para estes procesos, una proporci6n importante de la membrana del hepatocito consiste normalmente en ER lisa (Figura 12-35 y vease Tabla 12-2). Figura 12-34 Abundante ER 1150 en una celuJa secrelora de hormonas esteroJdeas. Esla electronmicrografia es de una ctilula de Leydig secretora de lesloslerona de los testfculos humanos.

El retfculo endoplasmlitlco

619

Figura 12-35 Reconstruccl6n tridimensional del ER rugosa y 1150 de una celula heplillca. El ER rugosa forma ordenados montones de cistcrnas planas, cada una de las cuales tiene un espacfo luminal de cnte 20 y 30 nm de ancho. La membrana del ER lisa esta conectada a estas cisternas y forma una fina red de tubulos de entre 30 y 60 nm de diametro. (De R.V. Krstif, Ultrastructure ofthe Mammalian Cell. New York: Springer-Verlag, 1979.)

Cuando la circulaci6n recibe grandes cantidades de ciertos compuestos, tales como la droga fenobarbital, el hfgado sintetiza en cantidades extraordinariamente elevadas las enzimas de destoxificaci6n, y en unos cuantos dras el ER lisa duplica su area superficial. Tras la eliminaci6n de la droga, el exceso de membranas del ER lisa parece eliminarse especfficamenle a traves de un proceso dependiente de Iisosomas Ham ado autofagocirosis (explicado en el Capftulo 13). Se desconoce c6mo se regulan estos espectaculares cambios. Gtra funci6n del ER en la mayorfa de celulas eucariotas es la de secuestrar Ca 2• del dtosol. La liberaci6n de Ca 2• en el citosol a partir del ER, y su posterior recaptura, median muchas respuestas rapidas a las sefiales extracelulares, como se explica en el Capftulo 15. EI almacenamiento de Ca 2> en ellumen del ER esta facilitado por las altas concentradones de protefnas de uni6n a Ca2> presentes en el ER. En algunos tipos celuJares, quizas en la mayorfa de ellos, existen regiones especfficas del ER especializadas en el almacenamiento de Ca 2>. Por ejemplo, las celulas muscuJares tienen una abundante regi6n especializada del ER liso, Hamada reticulo sarcoplasmdtico, la cual secuestra Ca 2 > del citosol por medio de una ATPasa de Ca2• que bombea Ca 2;; la liberaci6n de Ca 2• y la posterior recaptaci6n del Ca2.. POt el retfculo sarcoplasmatico median la contracci6n rapida y la relajaci6n de la miofibrillas durante cada cicio de contracci6n muscuJar (explicado en el Capftulo 16). A continuad6n explicaremos las dos funciones mas importantes del ER: la sfntesis y modificad6n de protefnas, y la sfntesis de lfpidos.

Las regiones lisas del ER pueden separarse de las rugosas mediante centrifugaci6n26 Para estudiar las funciones y las caracterfsticas bioqufmicas del reticula endaplasmMico, es necesario aislar su membrana. A primera vista, esto puede parecer una tarea imposible ya que el ER esta extraordinariamente entremezclado con oleos componentes del citoplasma. Afortunadamente, cuando se rompen par homogeneizaci6n los tejidos a cclulas, el ER se fragmenta en numerosas vesfculas pequei'ias y eerradas (-100 nm de diametra), denominadas mIcrosomas, que resultan relativamente faeiles de purifiear. Los microsomas derivados del ER rugoso estan tapizados de ribosomas, y reciben el nombre de microsomas rllgosos. Los ribosomas se encuentran siempre en la superficie exterior de dichos mierosamas, siendo su interior biaqufmieamente equivalente al espado luminal del ER (Figura 12-36). Dado que pueden ser purificados en su forma funcional, los microsomas rugosos son especialmente litiles para el estudio de muchos procesos que realiza el ER rugoso. Para el bioqufmico representan autenticas pequeilas versiones del ER rugoso, todavia capaces de sintetizar protefnas, glueosilar protefnas y sintetizar Ifpidos. 620

Capftulo 12: Compartimiemos intracelulares y c1asillcacl6n de protefnas

'------'

IAI

200nm

18(

En estos homogenados tambh~n se encuentran muchas vesfculas de ramana similar aI de los microsomas rugosos, pem sin rihosomas unidos a elIas. Estos microsomas Usos derivan en parte de porciones lisas del ER y en parte de fragmentos vesiculados de la membrana plasmatica, del complejo de Golgi, de los endosomas y de las milocondrias (la proporci6n depende del tipo de tejido de que se trate): Por consiguiente, mientras que los microsomas mgosos pueden sec equiparados a porciones rugosas del ER, los orfgenes de los microsomas lisos no resultan faciles de determinar. Una excepci6n importame la constituye el hfgada. Debido a las enormes cantidades de ER lisa existentes en el hepalocito, la mayor parte de los microsomas Usos de los homogenados hepaticos derivan del ER liso. Como los ribosomas contienen grandes cantidades de RNA, los microsomas rugosos son mas densos que los mlcrosomas Iisos. Por consiguiente, los microsomas rugosos pueden separarse de los demas mediante una cenlrifugaci6n en equilibrio (Figura 12-37). Cuando se comparan propiedades tales como la actividad enzimatica 0 la composici6n polipeptfdica de los microsomas rugosos con las de los lisos oblenidos de un tejido como el hfgado, se observa que son notablemente similares, aunque no identlcas: aparentemente la mayorfa de los componentes de la membrana del ER pueden difundir libremente entre las regiones rugosa y lisa de la membrana, tal como cabrfa esperar de un sistema de flujo continuo de membrana. No obstante, los mlcrosbmas rugosos presentan mas de 20 protefnas que no estan presentes en los microsomas lisos, demoslJando Que debe de existir algun mecanismo restrictivo para un conjunto de proleinas de la

ER'".:'7R'

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mezcle homoge· nalzede

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centrlfugscloPl

microsomes lisos y mlcrosomes rugosos

los mlcrosomes lisos tie nan menor densidad. por 10 que dejen de sedimentsr y floten e concentraciOPles menores de sscsross

'------' 200 nm

Figura 12-36 Electronmlcrografias de rlbosomas. Cuando se rompen celulas par homogeneizaci6n, las cisternas del ER rugoso (Aj se fragmentan formando pequenas vesfculas cerradas, denominadas microsomas rugasos {Bj. De forma similar, el ER lisa se fragmenta formando pequeftas vesfculas que carecen de ribosomas, yque se denominan microsamas Usos. (A, cortesfa de Daniel S. Friend; B, cortesfa de George Palade.}

Figura 12-37 Procedimlento de aJslamJento utiilzado para purlficar mlcrosomas rugosos y iisos a partir del ER. Cuando los dos tipos de microsomas se sedimentan hasta el equilibria a Iraves de un gradiente de sacarosa, se separar
los microsomas rugosos tlenen una elevada densided, por 10 qua dejsPl de sedimenter y flolan a concePllraciOPles de Sllcarose elevades

tuba COPl un gredlenle de concentrecioPles crecientes de secsrose

EI ret{culo endoplasmlUlco

621

subunidades ribosomicas libres

proteins receptora IIsocilldll a un poro

5' mRNA

membrana del ER. Algunas de las protefnas de este conjunto aylldan a mantener unidos los ribosomas al ER rugoso, mientras que OlTas posiblemente producen la forma aplanada de esta parte del ER (vease Figura 12-35). No esr
Los peptidos sefial fueron descubiertos por primera vez en protefnas importadas al ERz7 Los peptidos serial (y con ellos la estrategia basada en la utilizaci6n de un peptido sei\al para dirigir el transpone de proteinas) Cueron descubienos par primera vez, a principios de los arios 70, en protefnas de secreci6n que son translocadas a traves de la membrana del ER como primer paso hacia su final descarga de la celula. En el experimento clave el mRNA codificante de una protefna de secre· ci6n fue traducido mediante ribosomas in vitro. Cuando de este sistema libre de celulas se omitfan los microsomas, la protefna sintetizada era ligeramente mayor que la protefna normal secretada; esta longitud extra era debida a la presencia de un peptido /fder amino terminal. No obstante, en presencia de microsomas derivados del reticulo endoplasmatico rugoso se producfa una protefna de tamano correcto. Estos resultados fueron explicados mediante la hip6cesis de la seoal, la cual postulaba que la secuencia lider actua de peptido senal dirigiendo la protefna de secreci6n hacia la membrana del ER; una vez en ella y antes de que la cadena polipeptidica este completa, el peptido es hidrolizado por una peptidasa de seflal de la membrana del ER (Figura 12-38). De acuerdo con la hip6tesis de la seflal, la protefna secretada ha de ser empujada allumen del microsoma durante su sfntesis in vitro. Esto puede ser demostrado mediante un tratamiento con proteasas: una protefna recien sintetizada fabricada en ausencia de microsomas es degradada al afiadir una proteasa, mientras que la misma protefna pero fabricada en presencia de microsomas permanece intacta, a consecuencia de la protecci6n que Ie proporciona la membrana microsomal. Cuando en un sistema in vitro similar a este se traducen proteinas que carecen de peptido seflal, estas protefnas no son importadas a los microsomas y par 10 tanto permanecen susceptibles al tratamiento con proteasas. La hip6tesis de la sef'ial ha sido comprobada cuidadosamente mediante experimentos geneticos y bioqufmicos, y pllede aplicarse tanto a celuJas vegetales 622

Capftuio 12: CompanimJemos IntTacclulares y c1asificaci6n de prote(nas

Figura l2-38 La hlp6tesls seRal original. Visi6n simplificada de la translocaci6n de una protefna a travt'!s de la membrana del ER, tal como se propuso originalmente. Cuando el peptido seii.al emerge del ribosoma, dirige al ribosoma hacia un receptor proteico de la membrana del ER. Se postula que a medida que va siendo sintetizado, el polipt'!ptido se va translocando a travt'!s de la membrana del ER rugoso, atravesando un pora proteico asociado con el receptor. EI peptido seii.al es eliminado durante el proceso de traducci6n y la proteina madura es liberada allumen del ER inmediatamente despues de ser sintetizada. En la acrualidad sabemos que en tt'!rminos generales la hip6lesis es correcta, pero ademas de los componentes que se muestran en esta figura, son necesarios otTOS. Por ejemplo, la peptidasa de seii.al es un complejo formado por cinco diferentes cadenas polipeptfdicas unidas a la membrana, con un complejo aparentemente asociado con cada para de translocaci6n.

como animaJes, a translocaciones proteicas a uaves de membranas plasmJl.ticas de procariotas y. como hemos visto, a las membranas de mitocondrias, c1oroplastos y peroxisomas. Ademas. los peptidos lider amino terminales gufan no s610 las protefnas de secrcci6n sino tambien los precursores de todas las prOlefnas fabricadas en el ER. incluyendo las protefnas solubles y las protefnas de membrana. La funci6n de senalizaci6n de est'Os peptidos lider ha side demosLrada dircctamcnte mediante la utilizaci6n de nknicas de DNA recombinante. uniendo secuencias senaJ a proteinas que normalmente no las presentan; las proteinas de fusi6n resultantes son dirigidas aJ ER. Los sistemas libres de celulas en los que se produce transporte de protefnas han proporcionado poderosos procedimientos de ensayo para identificar, purifiear y estudiar los diversos componentes de la maquinaria molecular responsa· ble del proceso de importaci6n de protefnas aI ER.

Una partfcula de reconocimiento de senal (SRPj dirige los peptidos seftal para el ER a un receptor especffico de la membrana del ER2tI EI peptido senal es dirigido a la membrana del ER por 10 menos medianle dos componentes: una panJcuJa de reconoclmJento de la sefial (SRP. de SignaJ-Recognition Particle~), que se une aI peptido senal y viaja de forma cfclica entre la membrana del ER y el citosol, y un receptor de SRP. tambien conocido como profef"a desembarcadero (docking). presente en la membrana del ER. La SRP fue descubierta al observarse que lavando microsomas con soluci6n salina se elimi· naba su capacidad de importar proteinas de secreci6n. Esta capacidad de impor· taci6n puede restablecerse afladiendo a la preparaci6n de microsomas el sobre· nadante que contiene el extracto salino. A partir de este extraclo se purific6 el Ufactor de translocaci6n" y se delermin6 que era una panicula compleja fonnada por seis eadenas polipeptfdicas unidas a una pequefia molecula de RNA (Figura 12-39). La SRP y el receptor de SRP estan presentes en todas las celulas eucariotas y lambien posiblemente en las celuJas procariolas. A medida que el peptido va emergiendo del ribosoma, la SRP se va uniendo aI peptido seflal. Esto provoca una pausa en la s(nlesis proteica, 10 que posiblemente da al ribosoma tiempo suficiente para unirse a la membrana del ER anles de que se complete la sfntesis de la cadena polipeprfdica, asegurando asf que la protefna no se Iiberan\ al citosol. ESlo puede proporcionar un mecanismo de se· guridad ya que mllchas protefnas de secreci6n y prolefnas lisosomales son hi· drolasas que pueden provocar estragos en el cilosol. Las cellilas que secretan grandes cantidades de hidrolasas toman la precauci6n anadida de disponer de altas concentraclones de inhibidores de hidrolasas en su citoso!. Una vez formado. el complejo ribosoma-SRP se une al receptor de SRP, el cual es una protefna integral de membrana expuesta en la superficie citos6lica de la membrana del ER rugoso. Enlances la SRP es liberada, y un aparalo de translocaci6n todavfa poco caracterizado transfiere la cadena polipeprfdica naciente a trav~s de la membrana (Figura 12-40). Dado que una de las protefnas SRP y ambas cadenas del receptor de SRP contienen dominios de uni6n a GTP, se cree que los eambios conformacionales que Iienen lugar duranle los ciclos de uni6n de GTP e hidr6lisis (explicado en el Capftulo 5) aseguran que la Iiberaci6n de la SRP lenga lugar 5610 despues de que el ribosoma se haya acoplado correetamente con el aparato de translocaci6n en la membrana del ER.

La translocaci6n a traves de la membrana del ER no siempre

requiere que se este produciendo el crecimiento de la cadena polipeptfdica" Como hemos viSIO. la translocaci6n de protemas aI interior de las milocondrias. de los c1oroplastos y de los peroxisomas es posl-tradllccional. es decir que se produce despues de que la proteina haya sido sintetizada completamente y se haya Iiberado aJ citosol. mientras que nonnalmente la rranslocaci6n a travts de EI reticula endaplasm4tlco

SRP RNA

domlnlo de rlH:onoclmlento del P1!ptldo ae"al

-~~--~ domlnlo de para de la tradllCCI6n lugar de uni6n SRP·receptor

25 nm

Figura 12-39 OlbuJo muy esquematlco de la partkula de reconoclmlenta de la sefta) (SRP). Una SRP es un complejo alargado que contiene seis subunidades proleicas y una molecu.J.a de RNA (SRP RNA). Un extremo de la SRP se une a un peptido sef'lal de la cadena polipeptfdica en crecimiento. mientras que el otro extrema se une aI ribosoma y frena la traducci6n. EI RNA de la partlcula puede interaetuar con el RNA ribos6mica. (Adaptada de V. Siegel Y P. Waiter.Nmure320:82-84, 1986.)

623

particula de llICOOOCimiento de Ia Ml\eIISRP)

~

/1""~""'"

SRP OESPlAZADA Y AEClCLAOA

\.

" LA SRPUNlOAAL 8OSOMA 51: UNE AL RECEPTOR DE SRP DE LA MEMBRANA DEL

LA UNION DE LA SRP CAUSA UNA PAUSA EN LA TRAOUCaON

EA SELECTlVAMENTE ~ptido sefilllltll

III cadenll poIipeplldQ nacientll

proteinll receptora de la ......... SRP 81'\ la mamb'ana del ER rugosa

FIgun 12-40 De que fonna los peptldos senal y la SRP dlrigen los rlbosomas a la membrana del ER. Se cree que la SRP yel receplOr de SRP acUlan de forma concertada. La SRP se une a1 peptido seftal que se halla expuesto y al ribosoma, induciendo una pausa ell la lraducd6n. EI receptor de SRP de la membrana del ER, que esla formado por dos cadenas polipeptidicas, une el complejo SRP·ribosoma. A trav~ de una compleja reacci6n todavfa rnuy poco conocida que implica multiples prOlcfnas de uni6n a GTP, la SRP es Ilberada dcjando al ribosoma sobre la membrana del ER. Enlonces un aparato de translocad6n de la membrana del ER fonnada par varias subunidades praleicas inserta la cadena polipeptfdica en la membrana y la transfiere a leaves de la bicapa Iipfdica.

la membrana del ER sucede durante la traducci6n (es decir, es cocmducc:iollaf). ESlo explica par que los ribosomas se unen a la membrana del ER perc no a la cara citoplasmatica de otros organulos. Un ribosoma unido al ER nlgoso puede utilizar la energfa de la sfntesis proteica para forzar a la cadena polipeptfdica en crecimiento a traves del canal formado par el translocador en la membrana del ER. No obslante, estudios recientes de translocaci6n in vitro en el ER han de· mostrado que una pequena minoria de determinados precursores proteicos pueden ser importados aI interior del ER desPll~S de que se haya terminado su sfnlesis, demostrando lIsf que la Iranslocaci6n no siempre requiere de la traduc· ci6n continua. La translocaci6n proteica posHraduccional puede tener lugar in· c1uso de modo mas frecuente a Iraves de la membrana del ER en celulas de levadllras y a trav~ de la membrana plasmdlica baeteriana (la cual se cree estd evolutivamente relacionada con el ER; v~ase Figura 12·5). En ambos casos la translocaci6n requiere hidr61isis de ATP, y en tjacterias tambi~n es necesario un gradieme electroqufmico. A partir de componentes bactcrianos se ha reconsli· tuido un aparato dc Iranslocaci6n; uno de estos componcnlcs es una ATPasa que se cree que ayuda a cnsartar la protefna en la membrana (Figura 12-41). Dado que las protefnas que utilizan una ruta de translocaci6n post·traduccional son Uheradas primero en el citosol, su plegamiento se evita mediante su un.i6n a proteinas chaperonas citos6licas, tal como hemos visto que sucede en la irnpor· taci6n post·traduccional hacia el interior de m..itocondrias ycloroplastos.

La cadena polipeplfdica pasa a

trav~s

de un pora acuoso

en el aparato de translocaci6n30 Durante mucho tiempo se ha discutido si las cadenas polipcptidicas son transfe· ridas a traves de la membrana del ER, en comacto directo con la bicapa Iipfdica o a traves de un poro de un translocador proteico. En la actualidad existen fuerres evidencias de la existencia de un translocador proleico. Normalmente, el 624

Capftulo 1Z: Compartimlentos intracelulares y c1asificacl6n de protefnas

.

COOH

COOH

CITOSOL

complejo de translocaci6n impulsado por energla

Figura 12-41 Translocacl6nde una protefna a traves de la membrana plasmatlca bacterlana. En este modelo esquematico, despues de que un receptor del aparato de translocaci6n se haya unido al peptido sefial amino terminal de una protefna, un translocador prateico impulsado por energfa empuja la prote[na a traves de la membrana, desplegando la cadena polipeptfdica durante el proceso. La energfa es proporcionada por la hidr61isis de ATP y por un gradiente electraqu'mico a trav1!s de la membrana.

poro del translocador esta tapado con la cadena polipeptfdica que esta en transito a traves de la membrana. Sin embargo, cuando experimentalmente las cadenas nadentes se liberan de los ribosomas mediante la droga puramidna, los poras pueden ser detectados mediante corrientes i6nicas que Duyen a traves suyo. A pesar de que los poros son 10 sufidentemente grandes para permitir el paso de una cadena polipeptfdica desplegada, se derran cuando el ribosoma es eliminado de la membrana (Figura 12-42). Par 10 tanto el para parece ser una estructura dinamica, abriendose cuando un ribosoma can una cadena polipeptfdica naciente se une a la membrana y cerrandose cuando el ribosoma se Iibera despues de que la sfntesis de la protefna haya finalizado.

El peptido sefta! del ER es eliminado de la mayorfa de prolefnas solubles despu':;s de la translocaci6n31 Hemos visto que en los cloroplastos y en las mitocondrias los peptidos sefial son eliminados de las pratefnas precursoras despues de cruzar la membrana. De modo pareddo, los peptidos amino terminales sefial para el ER son eliminados mediante una peptidasa sefial situada en la cara luminal de la membrana del ER. Sin embargo, el peptido por sf mismo no es sufidente para que se produzca la hidr6lisis de la senal por la peptidasa: se requiere un punto de hidr6lisis adyacente que es reconoddo por la peptidasa. Mas adelante veremos que los peptidos senal del ER no se "encuentran en el extremo amino terminal sino en el interior de la cadena polipeptfdica, no presentan estos puntos de reconodmiento y nunca son eliminados. Por el comrario, sirven para retener protefnas transmembrana en 1a bicapa lipfdica despues de que se ha terminado el proceso de translocad6n. EI peptido amino terminal sefial para el ER de una protefna soluble tiene por sf mismo dos fundones de sefiaJizad6n: ademas de dirigir la protefna a la membrana del ER, se cree que acttia como senal de lnlelo de transferenela, permaneciendo unido al aparato de translocad6n, mientras que el Testo de la pro-

CONTROL LOS 10NES NO PUEDEN PASAR A TRAV~S DEL TRANSLOCADOR PROTEICO

EXPERIMENTAL LOS laNES PASAN L1BREMENTE A TRAV~S DEL TRANSLOCADOR PROTEICO

1-c~-">!cnOSOL Iii puromicina libera la cadena polipeptfdic8 del ribosoma

El retfculo endoplasmlitlco

Figura 12-42 DemostraclcSn de la existencla de poro!! acuosos de translocaclcSn protelca en la membrana del ER. EI diseno experimental es similar al mostrado en la Figura 10-5, con una bicapa lipfdica que separa dos companimientos acuosos. Cuando se anaden micrasomas rugosos a uno de los compartimientos, ocasionalmente se fusionan can la bicapa lipfdica incorporando una porci6n de la membrana del ER (con ribosomas) a la bicapa. Cuanda se ai'lade la draga puramicina (en azul ascl/ra) a eSle mismo compartimiento, se une covalentemente al extremo carbaxilo terminal de la cadena polipeptfdica y la libera del ribosomll; en estas condiciones se pueclen detectar poras de tamano unifonne debido a incrementos puntua!es en la conductllncia el1!ctrica a trav1!s de la membrana (el flujo i6nica responsable del incremento en la conductancla eIectrica se indica can laflecha amarilla). Si los ribosamas se eliminan de la membrana mediante lavados con soluciones de concentraci6n elevada de una sal, los poras no se detectan, 10 cua! indica que la uni6n de los ribosomas son necesarios para abrir (0 ensamblar) el pora (no se muestra).

625

••

••

••

Iranslocador prOleico

inae1ivo

Coati

LA PEPTlDASA DE SENAl LIBERA LA PROTEINA MADURA AlINTERIM DEL lUMEN DEL ER

lema va atravesando la membrana y ronnando un gran bucle en ellumen del ER. Una vez que el extrema carboxilo ha pasado a traves de la membrana. el peptido sei\a1 es liberado del poro de translocaci6n, hidrolizado por la peptidasa de senal. y rapidamentc degradado hasta aminoacidos mediante otras proteasas del ER, mientras que la prolefna es liberada aI interior del lumen del ER (Figura 12-43).

En las prote{nas transmembrana de un solo paso, un p~ptido senal interne permanece en la bicapa lipidica como una helice <X que atraviesa la membrana32 El proceso de trallslocaci6n de las protefnas destinadas a pcrmanecer en la membrana es mas complejo que el de las protefnas solubles, ya que algunas zonas de la cadena polipeptfdica son translocadas a traves de la bicapa lipfdica miemras que otras no 10 son. Sin embargo, todos los tipos de inserci6n de las prOlefnas de membrana pueden ser consideradas como variantes de la secuen· cia de fen6menos que acabamos de describir para la transferencia de prolcfnas solubles en la luz del ER. Empezarcmos describiendo las Ires vfas a {raves de las cuales las protc(nas transmcmbrana de paso unico (veasc Figura 10·13) son insertadas en el ER. En el casu m<1s simple, un peptido senal amino terminal inicia In nanslocaci6n igual que para el casu de una proleina soluble, pero un segmento adicional hidrof6bico de la cadena polipeptfdica frena el proceso de transferencia antes de que toda la cadena polipeptfdjca se haya translocado. Esle pe:ptJdo de paro de t.ranSferencia ancla la proteina en la membrana despues de que el peptido senal del ER (iniciador de transferencia) sea Iiberado del translocador y eJiminado (Figura 12-44). EI peptido de paro de transferencia fonna un solo segmento a helicoidal que atraviesa la membrana, con el extremo amino lenninal de la proteina en la cara luminal de la membrana y el exuemo carhoxilo en la cara citos6lica En los Otros dos casos el peptido senal no se haUara en el extremo amino tenninal de la prolefna sino que es inlerno. AI igual que los peptidos sei\al amino lenninales, el peptido senal interno es reconocido por la SRP, la cual siNe de puente entre el ribosoma que fabrica la proteina y la membrana del ER y actua como sellal de inicio de transferencia que empieza la translocaci6n de la proteina. Despues de Iiberarse dellransJocador, el peplido intemo de inicio de trans626

Capftulo 12: Compartimientos lntraceJulares y c1asificacl6n de prote(nas

Figura 12·43 Translocacl6n de una protefna soluble a traves de la membrana del Elt En esle modelo hipotetico se postula que el trnnslocador proteico de la membrana puede estar en dos estados alternativos -activo e inactivo. Cuando se une un peptido senaJ para el ER (que acn1a como iniciador de la transferencial el translocador adopta un estado activo y comienza a transrerir la cadena polipeptrdica a trav~ de la membrana lipidica, como un bucle. Es este estado ronna un poro acuoso a trav~ de la membrana que puede ser detectado elcctrofisiol6gicamente si la cadena polipepddica es liberada (vease Figura 12-42). Cuando la proteina ha sido lranslocada complelamente, el lranslocador reviene a una confonnad6n inaetiva que ya no puede oonducir iones a lEaves de la membrana, pero que esta abieno a la bicapa Iiprdica, pe.nnitiendo que el peptido senal hidrof6bico difunda hada el exterior de la bicapa, donde es rapidamente degradado. Para mayor daridad, en ~ta y en las dos figuras siguientes los ribosomas se han omitido del dibujo.

II

•• CITOSQL

luga. de union del

luger de uni6n del

P!iptido llidrof6bico

pllptldo hidrof6bico de inicio de

de para de I transferencia

LUMEN

trllllsferencill

protelnll trenslOClldo'lI

Figura 12-44 C6moselntegraenla membrwla del ER una prote(na transmembrana de un solo paso con un peptido seoal conado. En este modele hipotclico el praceso de translocaci6n cOlranslocaci6n se irilcia por un pt'!ptido seiial amirlo terminal de ER (rajo) que actlia como una seoal de inicio de transferencia, como en la Figura 12-43, Sin embargo, ademas del pt'!ptido de inicio de transferencia la protefna contiene un pt'!ptido de para de transferencia (llarallja). Cuando el pcptido seoal de para de transferencia entra en el translocador e interactua con un lugar de uni6n delerminado, el translocador pasa a su estado inactivo y descarga la proteina lateralmente en la bicapa lipfdica,

ferenda permanece en la bicapa Iipfdica como lIna helice (l que atraviesa la membrana. Sin embargo los peplidos internos de inicio de transferencia se pueden unir al aparato de translocaci6n en cuaiquicra de las dos direcciones, y la orientaci6n del peptido de inicio de transferencia inscnado determina, a su vez, que segmento proteico {el que precede 0 e! que sigue at peptido de inicio de transferenciaJ se desplazara a traves de la membrana hacia ellumen del ER. En un caso la prOlcfna de membrana resuhante tcndra su extrema carboxiJo en la eara luminal (Figura 12-45A) mientras que en el otro en ellado luminal estara su extrema amino (Figura 12-458). La orientaci6n del peptide de inicio de transferencia depende de la distribuci6n de los aminoacidos cargados vecinos, tal como se describe en el pie de la figura.

Combinaciones de sefiales de inicio y de paro de transferencia determinan la topologfa de las protefuas transmembrana de multipaso33 En las protefnas transmembrana de multipaso la cadena polipeplJdica atraviesa repetidamenle, de una pane a otra, la bicapa lipidica (vease Figura 10-13), Se cree que en eslas prole(nas un peptide senal interno actua como seflal de inicio de transferencia iniciando la Iranslocaci6n, la cual continua haSla que se alcanza un peptido de paro de transferencia. En las proteinas de doble paso, por ejemplo, el polipeplido se libera de la bicapa en eSle estadio (Figura 12-46). Las proteinas multipaso mas complejas, en las cuales exislen muchas helices Ct. hidraf6bicas que atraviesan la bicapa, un segundo peptido de inicio de Iransferencia reinicia la translocaci6n,de la cadena, la cual se produce hasta que se alcanza el siguiente peptido de final de transferencia, y asf sucesivamente para posteriores peptidos de inicio y de para de transferencia (Figura 12-47). Una secuencia sefial hidrof6bica determinada actuara como un peptido de inicio 0 de paro dependiendo de su localizaci6n en la cadena polipeptfdica, ya que se puede cambiar su funci6n si se modifica su localizaci6n en la protefna utilizando tecnicas de DNA recombinante, As! la distinci6n entre peptidos de inicio y de paro de transferencia depende, fundamentalmente, del orden en el que se suceden en la cadena polipepHdica naciente. Parecc que la SRP empieza buscando los segmentos hidrof6hicos de la cadena polipept!dica desplegada empezando por su extremo amino terminal, y va progresando hacia el extremo carboxilo terminal, en la misma direcci6n en la que se sintetiza la protefna. La SRP reconoce el primer segmento apropiado y por 10 tanto fija la "pauta de lecrura": si se ha iniciado la translocaci6n. el pr6ximo segmento hidrof6hico adecuaEl reticula endaplasmlitica

627

NN.

prolel",.

~dUfa ltfl

I, membra",. ct.1 ER

-• I' secuencill ""'alae

-

•

Innn. en direcel6n

opuesta

'" NN.

mad"",

protei",. en I, membrana del ER

do sen1 reconocido como un p~ptido de para de lransferencia, 10 cual originara que la regi6n de la cadena polipeptfdica comprendida entre ambos segmentos hidror6bicos resulte ensanada a trav~s de 1a membrana. Un proceso similar de bl1squeda continua hasta que todas las regiones hidrof6hicas de la prolefna se insenan en la membrana. Puesto que las protefnas de membrana siempre son insertadas a partir de la eara citos6lica del ER y siguiendo este sistema programado. todas las capias de la misma cadena polipeptfdica tendedn la misma orientaci6n general en la bicapa. EsIO genera una membrana del ER asimetrica en la que los dominios de prolefna expuestos en una cara son diferentes de los que esuin expuestos en la otra. Esta asimetrfa se mantiene durante los diversos procesos de gemaci6n y fusi6n de membrana que se producen at transportar las protefnas fabricadas en el ER a otras membranas celulares (explicado en el Capftulo 13). Por 10 tanto la via por la cual una protefna recien sintetizada es insertada en la membrana del ER de· termina la orientaci6n de la prOlefna tambien en otras membranas. Cuando en el laboratorio se disocian proternas de una membrana y se reo constituyen en vesiculas lipfdicas artificiales, general mente se obtiene una mezcia al az.ar de orientaciones demro·fuera de las protefnas. Par ella, parece que la asimetrfa de las prote(nas que se observa en las membranas celulares no es debida a las propiedactes inherentes de la prote(na sino que es eJ resultado del proceso por el que las prote(nas son insenadas en la membrana del ER desde el citosol.

628

Capftulo 12: Compartlmientos lntracelulares y claslficad6n de protemas

Figura 12-45 C6mo una protema transmembrana de un solo paso con un ~plldo seftaJ interno se integra en la membrana del Eft. En este modelo hipotelico un peptido seRal ER interno que aCllla como sella! de inicio de transferencia se une al translocador de tal Conna que su extrema cargado m1s positivamente pennanece en el citosol. Si en la cadena existen mlis aminoll.c1dos cargados posltivamente Inmedlatamente antes del nt1cleo hldrof6blco del peptido de fnldo de transferencfa de los que hay despues de el, en el extremo carboxilo terminal, el peptido de inicio de transCerenda se inserta en ellranslocador en In orientaci6n mostrada en (A) y el brazo carbonic terminal del bude insenado se desliza a tra~ de la membrana. Sin embargo, si existen m1s aminMcidos cargados positivamente inmediatamente despues del m1deo hidroC6blco del peptido de fnido de transferenda de los que hay antes de el, en su extremo amino terminal, el peptido de Inleio de transferenda se inserta en el translocador en la orientaci6n mostrada en (B). y seni el braze amino terminal del bude insertado el que se deslizar' a traves de In membrana. Debido a que la translocaci6n no puede Inlclarse antes de que salga del ribosoma una secuencia de Inicio de Iranslocaci6n, la translocaci6n de In porcl6n amino lerminal de la protema mostrada en (B) solamente puede ocurrir despues de que se haya sintetizado completamente esta secuencla. N6tese que existen dos camlnos para Insertar una protelna transmembrana de un solo paso cuyos aminoiicidos amino terminales se localicen en ellumen del ER: el que se muestra en In Figura 12-44 yel quese muestra aquf.

eOOH

CooH

P'plido de pero de Irensferenele

NH,

P'Ptido de inieio de trensferenele

Figura 12-46 C6mo se Integra en la membrana del ER una proteina de doble paso con una secuencla seow Interna. En este modelo hipotetice un peptido sel'lal para el ER interne aCllla como una sel'lal de inicio de transferencia (como en la Figura 1245) e inicia la transferencia del brazo carboxilo tenninal de la cadena polipeptldica. Cuando entra en el translocador un peptido senal de paro de transferencia, descllrga lateralmente la proteina en la membrana.

protefne rnlldura de doble paso a traves de fa rnernbrsne

Las cadenas polipeptfdicas translocadas se pliegan y se ensamblan en ellumen del ER rugoso 34 Muchas de las prote(nas presentes ellumen del ER solameme esta.n en (fansito, en ruta hacia otros destinos; sin embrago, oltas residen normalmente en el ER y se hallan en elevadas concemraciones. Estas prote{nas resldentes del ER preseman en su extrema carboxilo terminal una senal de retenci6n del ER, de cuatro amino<1cidos, que es responsable de que la protefna quede retenida en el ER (vease Tabla 12-3). Algunas de estas protefnas actuan como catalizadores que ayudan a otras muchas protefnas que son translocadas aI ER a plegarse y a ensamblarse de forma correcta. Una de estas protefnas residentes del ER es la protefna disulfuro isomerasa (PDf), la eual cataliza la oxidacion de los grupos sulfbidrilo libres (SH) formando enlaces disulfuro (S·S). La mayorfa de los residuos cistefna de los dominios proteicos expuestos aI espacio extracelular 0 a11umen de los org<1nulos est<1n unidos por puentes disulfuro. Sin embargo, los enlaces disulfuro no se forman en los dominios expuestos al citosol debido al ambiente reductor de este ambiente.

COOH CITQSQL

LUMEN

100

numero de arnlno'cldos

El reticula endaplasmlitica

200

ICI

Figura 12-47 Inserclon de 10 proteina multlpaso de membrana rodopslna en 18 membrana del ER. La rodopsina es la protefna sensible a la luz de los fotorreceptores de las celulas en baSion de la retina de los mamfferos. (Al Un gnifico de hidrofobicidad identifica siele cortas regiones hidrofobicas en la rodopslna. (B) La region amino terminal acrna como peptido de inicio de transferenda, responsable de que la region amino terminal anterior atraviese la membrana del ER. Los peptidos hldrof6bicos siguientes actuarlin a1ternativamente de inlclo de transferencla y de paro de transferencia. (C) La rodopslna madura, una vez integrada, tiene su extremo amino terminallocalizado en ellumen del ER y su extremo amino terminallocalizado en el dtosol. Los lIexdgonos azules represent3Jl oligosacliridos unidos covalentemente.

629

Otra proteina residente del ER es una proteina chaperona conodda como proteina de unJ6n (DiP, de binding protein), que estructuralmente esta reladonada con las protefnas hsp70, y como elias reconoce protefnas plegadas incorrectamente, y tambien subunidades proteicas que no han sido ensambladas en sus complejos otigomericos finales. Se cree que BiP, al igual que otras proteinas chaperonas, se une a secuendas de aminoaddos expuestos que normalmente estan escondidos en el interior de las cadenas polipeptfdicas que estan correClamellle plegadas 0 ensambladas. Cuando BiP se ha unido evita la agregad6n de las protefnas y ayuda a mantener las proteinas en el ER (y por tanto fuera del complejo de Goigi y de otras elapas posteriores de la ruta se secreci6n); tambien aYl.lda a que las protefnas se plieguen correctamente. Como en el caso de las proteinas de la familia hsp70, las cuales unen proteinas no plegadas en el dlosol y fadlitan su importad6n hacia las mitocondrias y hacia los c1oroplastos, la protefna RiP hidroliza ATP para obtener la energfa necesaria para plegar las protefnas. Como hemos visto anteriormellle para la hsp70 mitocondrial (vease Figura 12-24), la uni6n de HiP a una cadena polipeptfdica que esta emergiendo en ellumen del ER puede ayudar a estirar la protefna hacia el interior del ER. Este proceso puede ser particularmente importante en prolefnas que enlran en el ER tras su traducd6n, ya que en este caso no existen ribosomas unidos a la membrana que empujen a la proteina nadente a traves del translocador durante su sintesis.

H0 I U N-C-C-;X I

I

rj Thr ""

HjCH' t =0

cadEl08 latEl.ral de 8spa.aglo8

I NH

La mayorfa de proteinas sintetizadas en el ER rugoso son

glucosUadas par la adici6n de un N-oligosacarido comtin35 La adici6n covalenle de azucares a las protefnas es una de las principales fundones biosinteticas del ER. La mayorfa de las protefnas solubles y unidas a la membrana que son fabricadas en ellumen del ER, incluyendo las destinadas a ser transportadas al complejo de Golgi, a los Iisosomas, a la membrana plasmatica 0 al espacio extracelular, son glucoprotefnas. Por el contrario, muy pocas protefnas del dtosol estan glucosiladas, y las que 10 estan contienen una modificad6n de azucares muy simple: la adici6n de un grupo N-acetilglucosamina a un residuo serina 0 !reooina de la proteina. Un avance importante en la comprensi6n del proceso de glucosUad6n proteica fue el descubrimienro de que en el ER se transfiere en b/oque a las prote(nas un oligosacArido prefonnado (compuesto de N-acetilglucosamina, manosa y glucasa y conteniendo un total de 14 residuos de azucar). Dado que este oligosacArido siempre es transferido al grupo NH z de la cadena lateral de un residuo de asparagina, se Ie denomina N-oligosacdrido (N-linked) 0 unido a asparagina (Figura 12-48). La transferencia esta catalizada por una enzima, una transferasa de oligosacdrido que se halla unida a la membrana, y cuyo lugar activo esta expuesto a la superfide luminal de la membrana del ER, 10 cual explica par que las proteinas dtos6licas no son glucosiladas de esta manera. EI oligosaciirido precursor se mantiene en la membrana del ER mediante una molecula lipfdica especial lIamada doUcol y es transferido a la asparagina diana a traves de una sola etapa enzimatica inmediatamente despues de que este aminoacido aparezca en ellumen del ER durante la translocad6n de la protefna (Figura 12-49). Dado que muchas protefnas son importadas al ER de forma cotraducdonal, casi siempre los N-oligosacaridos son af'iadidos durante la sfntesis proteica. EI oligosacarido precursor unido a lipido se une al dolicol mediante un enlace fosfato de alta energfa, el cual proporciona la energfa de activad6n necesaria para la reacci6n de glucosilad6n ilustrada en la Figura 12-49. EI oligosacarido se va construyendo antes de ser transferido a la protefna, azucar a azucar, unido a esta molecula de lfpido que, a su vez, esta unido a la membrana. Los azucares son activados primero en el dtosol mediante la fonnaci6n de intermediarios azucar-nllcfootido, que ceden su azucar (directa 0 indirectamente) allfpido, siguiendo una secuencia ordenada. En parte a traves de este proceso, el oligosacarido unido al Iipido es translocado desde la cara cilos6lica a la luminal de la membrana del ER (Figura 12·50). 630

Capftulo 12: Compartimlenlos IntraceluJares y cJasificaci6n de prolefnas

glucosa • • maoosa· • N·acetil glucosamioa.

0

Figura 12-48 Estructuradel 0llgOS8ctirido unldo 8 asparaglna (uDldo a N) que es aftadldo a la mayona de las protemas en la membrana del ER rugoso. Los cinco residuos de azucar mostrados en el recuadro gris forman la ~regi6n central" de este oligosacarido. En cl complejo de Goigi se produce una profunda reordenaci6n y recorte de los azucares y en muchas prolefnas I.1nlcamente sobreviven a este proceso estos cinco residuos. Solamente se gJucosilan las asparaginas que se hallan en la secuenciaAsn·X-SeroAsn· X- Tllr, siendo Xcualquier aminoacido Que no sea la prolina. Eslas dos secucncias se presentan en frecuencias mucho menores en g1ucoprotefnas Que en protefnas citos61icas no glucosiladas; evidentemente ha habido una presi6n selecliva en contra de estas secuencias durante la evoluci6n de las protefnas, probablemenle porque \a glucosiJaci6n en demasiados residuos podrfa interferir con el plegamiento de la protefna.

-

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•• NH,

NH,

b~pa

lipidic. de Ie membrana del ER

LUMEN

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5~Men t-5~ ·SALTO"t"FLIP-flOf>"1 EN LA MEMBRANA

P

P (GlcNAelr(Mllnll

dador de mll00u, construldo • pa.r1ir de dolicol 'OS,.lo., de GDP-mII00N

3X~~ IGIcI:rlM.n),jGlcNAcll

EI retfcuJo endoplasmlitlco

P

dador de glueoN c:onltru;cto • pan;r de dollcol 'osf,lo Y UDP'i!Juco...

Figura 12-49 GlucosJlacl6n de una proteIn. en el ER. Gasi Inmediatamente despues de que la cadena pOlipeplfdica entre en el lumen, se glucosila sobre los residuos de asparaguina diana. EI oligosacMido que se muestra en la Figura 12·48 se trans6ere a I. asparaguina como una unidad intacta, a tra~s de una reacei6n catalizada por la oligosacaril transferasa, una enzima unida a membrana Existe una copia de esta enzima asociada con cada l.nlI1Slocador proteico de I. membrana del ER.

figura 12-50 Slntesls del precUJ'SOr del oUgosadrido unJdo a Upklo de I. de I. membrana del ER rugoso. EI oligosacarido se va cooslruyendo azucar a az6car, sobre ellipido transponador dolicol (un poliisoprenoide. vease Panel 2-4). El dolicol es largo y muy hidrof6bico; sus 22 unidades de cinco carbonos pueden atravesar el grosor de la bicapa lipfdica mas de tres veces, de Conna que el oligosacarido que se une a! el queda firmemente anclado a la membrana. EI primer grupo de azucar se une a! dolicol a traves de un enlace plrofosfato. Este enlace de alta energfa activa el oligosacarido para su transferencia desde ellfpido hasta una cadena lateral de la asparagina de un polipeptido naciente sobre la cara luminal del ER rugoso. La sfntesis del oligonucle6tido comienza en la cara citos6lica de la membrana del ER, y continua sobre la cara luminal, despues de que el lfpido intermediario (Man)s (GlcNAch haya sido transferido (por flip-nop) a !raves de la membrana. Todas las reacciones postcriores de lransferencia de glucosilos que se producen en la cara lumina! del ER se producen a panir de dolicol.P.glucosa y de dolicol-Pmanosa; cslos monosacaridos, unidos a lipidos, que se hallan activados, se sintetizan a panir de dolicol fosfato y de UDP-g1ucosao GDP-manosa sobre la cara cit0s6lica del ER, y posterionnente, segUn parece, son transponados (por flip-nop) a traves de la membrana del ER. Abreviaturas; GlcNAc = N-acetilglucosamina; Man = manosa; Glc = g1ucosa.

631

Toda la diversidad de estructuras de N-oligosacaridos que se presentan en las glucoprorefnas maduras se produce por modificaci6n posterior de la estructura de oligosacarido precursora. Todavfa en el ER, se eliminan de los oligosacaridos de muchas glucoprotefnas tres residuos de glucosa y uno de manosa (vease Figura 12-48). Estos ~recortes" 0 ~procesamiento" del oligosacarido continuan en el complejo de Goigi. y se explican en el Capftulo 13. Los N-oligosacaridos son, can gran diferencia, los oligosacaridos mas cornunes de los que se encuentran en las glucoprotefnas. Menos frecuentemente, los oligosacaridos estan unidos al grupo hidroxilo de la cadena lateral de un residuo de serina, de treonina 0 de hidroxilisina. Estos O-oligosacdridos se forman en el complejo de Golgi a traves de vfas que aun no son conocidas completamente (se discute en el Capftulo 13).

Algunas protefnas de membrana, poco despues de entrar en el ER, intercambian una cola transmembrana carboxilo terminal por un glucosilfosfatidilinositol (GPI) unido de forma covalente 36 Como hemos explicado en el Capftulo 10, algunas enzimas citos6licas catalizan la adici6n covalente de un acido graso a determinadas prote(nas, colahorando en la direccionalidad de estas protefnas hacia las membranas celulares. En el ER rugoso se produce un proceso catalizado por enzimas relacionado con este: el extremo carboxilo de algunas protefnas de membrana destinadas a la membrana plasmatica se unen de forma covalente a un residua de azucar de un glucolipido. Esta uni6n se forma en el lumen del ER a traves del mecanismo i1ustrado en la Figura 12-51. y afiade a la protefna un andale de g1ucosUfosfatldlUnosltol (GPI, de glycosylphosphatidilinositol) que contiene dos acidos grasos. En el mismo proceso se elimina el segmento transmemhrana de las protefnas. Cada vez es mayor el numero de protefnas conocidas de la membrana plasmAtica que son modificadas de esta manera. Dado que estas protefnas eSlan unidas al exterior de la membrana plasmatica exclusivamente a traves de su anclaje GPI, en principio pueden ser liberadas de las celulas en fonna soluble en respuesta a sefiales que activen una fosfolipasa de la membrana plasmatica. Por ejemplo, los parasitos Iripanosoma utilizan este mecanismo para liberar su cubierta de prolefnas unidas a GPI si son atacados por el sistema inmunilario.

La mayorfa de las bicapas lipfdicas de membrana son ensambladas en el ER37 La membrana del ER produce casi todos los lfpidos de membrana necesarios para la elaboraci6n de nuevas memhranas celuJares, incluyendo los fosfolfpidos y el colesterol. E! principal fosfolfpido fabricado es la fosfatidilcolina (tambien

CITOSOL

eaOH

glucosil foslatidilinositol

p

proteina I,Inida

covaler'lternenle a un IIpldo que Ie enela e la

membrena

632

Capftulo 12 : Compartlmientos intracelulares y c1asiflcaci6n de protefnas

F1guraI2-S1 Unl6naunanclajede g1ucosllfosfaddiUnosltol. En cuanlo la sfntesis de la protefna ha fmalizado,la protefna precursora pennanece unida a Ie membrana del ER a traves de una secuencia hidrof6bica carboxilo terminal de entre 15 y 20 residuos de aminoacido, de forma que el resto de la protefna queda en ellumen del ER. En menos de un minuto, una enzima del ER corta la protefna, libenindola de su extremo carbmdlo terminal, que la unfa a la membrana, y simultaneamente une el nuevo extremo carboxilo tenninal a un grupo amino de un inlermediario gJucosii. fosfatidilinositol prefonnado. La sei'ial que especifica eSla modificaci6n se halla contenida en la secuencia hidrof6bica carboxilo terminal y en algunos aminoacidos adyacentes a ella sobre la eara luminal de la membrana del ER; si esta sei'ial es ai'iadida a atras protefnas, estas tambien son modlficadas de esta fonna. Debido a este anclaje Iipfdico al que se une de fonna covalenle, la protema permanece unida a la membrana; todos sus restos de aminoacido se hallan expuestos a la cara luminal del ER y, por 10 tanto, sobresaldran hacia el exterior celular si la protefna es transponada a la membrana plasmatica.

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LUMEN

lIamado lecitina), que puede formarse en tres etapas a partir de dos o1cidos gra· sas, glicerofosfato y colina. Cada etapa esta catalizada por enzimas de la memo brana del ER que tienen sus lugares activos dispuestos hacia el drosal, donde se encuentran los metabolitos necesarios. Por 10 tanto las srntesis de fosfoHpidos riene lugar excJusivamente en la mitad citos6lica de la bicapa lipfdica. Ella primera etapa, las aei! transferasas afiaden consecutivamente dos !icidos grasos al glicerofosfato produciendo dcida fosfaddico, un compuesto que es suficientemente insoluble en agua como para permanecer en la bicapa lipfdica despues de sec sintetizado. Esta etapa es la que haee ereeer la bicapa lipfdica. Las otras elapas posteriores determinan el grupo de eabeza de la mol~cula lipfdiea reci~n sintetizada, y por 10 tanto la naturaleza qufmica de la bicapa, pero no suponen un erecimiento nelO de la membrana (Figura 12-52). Los otras dos fosfolfpidos mayoritarios de membrana -Ia fosfatidiletanolamina {PEl y la fosfatidilserina (PSl- al igual que el fosfolfpido minorilario fosfatidiJinositol (PI), son sinlelizados de esta manera. Como la sfntesis de fosfolfpidos tiene lugar en la mitad citos6liea de la bicapa lipfdica, ha de existir un mecanismo que transfiera alguna de las mol~culas de fosfolfpido reeien sintetizados hacia la otra mitad de la bicapa. En bicapas Iipfdi· cas sint~ticas, los Ifpidos no son capaces de "sallar" ("flip", de flip-Oop) de esla manera. En el ER, sin embargo, los rosrolipidos se equiJibran a tra~ de la mem· brana en cuesti6n de minutos, 10 cual es al menos unas tOO 000 veces mc'is rc'ipido de 10 que puede representar el Dip-flop espontlineo. Se cree que eSle movimiento rc'ipido transbicapa eSlc'i mediado por translocadores de fosfolfpldos especfficos de grupos de cabeza. Concretamente, parece que la membrana del ER contiene un translocador (una "flipasa") que transfiere, entre la cara citoplasmc'itica E1 retfculo endoplasm4tlco

Figura 12-52 Sfntesls de fosfattdJlcolina. Este fosfolfpido es sintetizado a partir de aeil coenzima A (aeil graso CoAl, g1iceroI3-fosfalo y eitldfn-blsfosfocolina (COP-colina).

633

y la cara luminal, fosfolfpidos que conlengan colina -pero no elanolamina-, se· rina, 0 fosfolipidos que conlengan inosilol. Esto significa que la fosfatidilcolina alcanza la cara luminal mucho mt\s rapidamente que los otros fosfolfpidos. De esta fonna el translocador mantiene la bicapa y es responsable de la distribuci6n asimetrica de los Upidos en la bicapa (Figura 12·53). El ER tambien produce colesterol y ceramida. La ceramida es fabricada por condensaci6n del aminot\cido serina can un ctcido graso hasta fonna el amino alcohol esfingosina; luego se afiade un segundo ctcido graso, fonn
Las protemas de intercambio de fosfolfpidos pueden transportar fosfolfpidos desde el ER a las mitocondrias y a los peroxisomas38 Como se discute en el Capftulo 13, la membrana plasmcttica y las membranas del complejo de Golgi, de los Iisosomas y de los endosomas forman parte de un sistema de membranas que se comunica can el ER por media de vesfculas de transpone que transfieren tanto las proteinas como los IJpidos. Las mitocon· drias, los plastos y los peroxisomas no fonnan parte de este sistema, por 10 que requieren mecanismos diferentes para la irnportaci6n de protefnas y de Ifpidos necesaria para su crecimiento. Va hemos visto que la mayorfa de las proteinas de mitocondrias y plastos y todas las de los peroxisomas son imponadas posHra· duccionalmente desde el dtosol. Aunque las mitocondrias modifican algunos de los Ifpidos que imponan, no sintetizan Ifpidos de nouo; en cambio, tienen que obtener eSlOS Ifpidos por transferencia desde el ER, donde son simetizados, 0 tienen que oblenerlos de fonna menos dJrecta desde el ER por medio de otras membranas celuJares. En cualquier caso son necesarios mecanismos especiales para que se produzca la transferencia. En experimentos in lJitro se ha demostrado que unas proteinas de transporte solubles en agua -Ilamadas protefnas de lntercamblo de fosfolfpldos (0 prote(· 1Ias de tra1ls!erellcia de !os!ollpidosl- tienen la capacidad de transferir moleculas individuales de fosfolipidos entre membranas. Cada protefna de intercambio reo conoce s610 determinados tipos espccfficos de fosfolfpido. La transferenda entre bicapas lipfdicas se produce cuando la prOlefna "extrac una mollkula de fosfo](· pido de una membrana y luego difunde por la celuJa can ellfpido "enterrado en su lugar de un.i6n. Cuando encuentra otm membrana, la prolefna de intercambio tiende a descargar la mollkula de fosfolLpido en la nueva bicapa (Figura 12-54). Se ha propuesto que la fosfatidiJserina es imponada a la milocondria de esta rnanera. siendo luego descarboxilada para recuperar la fosfatidiJetanolamina, mien· tras que la fosfatictilcolina es imponada intaeta. Las proteinas de intercambio actuan distribuyendo fosfolfpidos al azar entre todas las membranas de la celula. En principio, de este proceso de intercambio al aur puede resuJtar un transpone neto de Ifpidos desde una membrana rica en detenninados lipidos a otra pobre en ellos, pennitiendo que las moleculas de fosfatidilcolina y fosfatidilserina, por ejemplo, sean transferidas desde el ER, donde son sintetizadas, hasta la membrana milocondrial 0 hasta la membrana peroxisomal. Puede ser que las mitocondrias y los peroxisomas sean los unicos org
M

634

Caprtulo 12: Companlmlentos Intracelulares y c1astncacl6n de protefnas

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bica~ lipidic. asim6t,ju del ,etlculo endoplaafMtico

lA S1NTESIS De UPlOOS ANAoE FOSFOUPlOOS A lA MITAO CllosOUCA Of lA BICAPA

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UNA PROTEINA ESPECIFlCA CATALlZA El ·SALTO"I-FUP", Of OET'ERMINADAS MOLt!:CUlAS De FOSFOl[PIOO DeSDe lA MIlAO clTOS6ucA A lA MllAO LUMINAl

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Figura 12-53 Papel de los transloc:adores Upfdlcos en la blosfntesls de la blcapa UpfdlCL las nuevas mol~u1as Iipfdicas se van ai'tadiendo exclusivamente a la milad cit0s6lica de la bicapa y no pueden "sahaT" (flip) de forma esponuinea de una monocapa Iipfdica a la otra. Por ella, para que se produzca Ja transferencia de determinadas molOCulas a la mitad luminal y asf 1a membrana pueda crecer como una bicapa, se hace necesaria la participaci6n de protefnas translocadoras de fosfolfpidos ("mpasas"). Debido a que la Oipasa de Ja membrana del ER reconoce preferenlCmente y transfiere grupos de cabeza que contengan colina, se genera una membrana asimetrica con la monocapa luminal (1a cual produce la mltlld exterior de la bicapa de la membrana plasmatica) altamente enriqueclda en fosfatidilcolina.

Figura 12-54 Protefnas lntercambladoras de fosfoUpldos. Debido a que los fosfolfpidos son insolubles en agua, su transferencia entre membranas requiere la participaci6n de una protelna transponadora. Las protefnas de intercambio de fosfolfpidos son moleculas hidrosolubles que transportan una sola molecula de fosfoHpido a la vez: pueden tamar una molecula lipfdica de una membrana y liberarla en otra membrana, redistribuyendo asf los fosfolfpidos entre los compartimientos rodeados de membrana. La transferencia de fosfatidilcolilla (PC) desde el ER hada la mitocondria puede ocurrir. en principio, sin aporte exterior de energfa debido a que la concentraci6n de PC es alta en la membrana del ER (donde se sintetiza) y baja en la membrana mitocondrial externa. Puede predecirse que debe existir una flipasa en la membrana mitocondrial externa que equilibrc las concentraciones de lfpidos entre las dos mirades de Ja membranas externa, y un mecanismo de transferencia de Ifpidos entre la membrana milOcondriaJ externa y la interna. Sin embargo. estos procesos todavfa no se han descubierto.

membrllnll del ER

grupo de cabela de III fosfatidilcolina

citosol

protelna intercemb;edore de fosfolipidos

Resumen La extensa red del ER actda de Jtibrica de produccMn de casi tados los Upidos celulares. Adenuis, la mayor parte de la sfntesls proteica celldar tiene Illgar en la slJperficie citos61itx1 del ER: todas las prote{nas destinadas a la secrecwn y todas las prote{nas destinadns al prapio ER, at complejo de Golgi, a los llsosomas, a los elUlosolnas y ala membrana plasm4tica, primero son imponadas al interior del ER desde el dtosoL En ellumen del ER las protefnas se pliegan y oligomerium, se Jonnan los enItu:es dlsulfuro y se aiiadenlos N-oligosacdridos. S610 son importadns al interior del ER las protefnas que presentQlI WI peptido senal hldrof6bko. EI peptido selial es reconocido por una partfcula de reconocimLento de senal (SRP, de Signal Recognition Particle) que se wle a la cadena polipeptldka naclente y al ribosoma y dirige tado el conjwlto a una protefna receptora de la superJicie de la membrana del ER. Esta unian a la membrana inkia 1111 proceso de translocacwn qUi! arrastra un buck de la cadella polipeptfdica a traves de la membrana del ER a travh de un poro hidrofllico de ,wa protefna trQl,stocadora. Las prote{nas soillbies destinadas al lume" del ER, a ser secretadas 0 a ser transferidas alillmen de otros orgdnulos, primera pasall completamente al interior del lumen del ER. Las protefnas tralrsmembrana destilladas al ER 0 a otras membranas de la dlula, son translocadas a traves de la membrana del ER pero no SOli llberadas ai interior del lumen sino que pennanecen ancladas a la bicapa a travh de una 0 nuts regiones de su cadena polipeptfdka, o../lellt:oidales, que atrauiesDl' la membrana. Estas pordones Ilidrofablcas de la protefna pueden aetuar durante el proceso de transloctu:wn, bien como piptido de Inkio de transferencla 0 bien como senal de para de transferenda. Cuanda ,m pollpeptido colltlelle varios peptldos de Inkio de transfere"ciayde para de transJerencla, atrauesard m"cllIl$ veces la bicapa. La asimetrla de fa s{ntesis de Upidos, inserclan proteica y glucosilaci611 en el ER establece la polaridad de las membranas de todos los demm orgdnulos que son abastecidos con lfpidos y protefnas de membrana por el ER.

EI retfculo endoplasmatico

635

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639

Trmco vesicular mediante las rutas secretora y endocitica

Todas las

~Iulas

han de comunicarse con su entomo. En una

c~lula

procariota

esta comunicaci6n tiene lugar a traves de su membrana plasm
ejemplo, las enzimas digestivas son secrctadas hacia el exterior ceJular y los pcquenos metaboLitos generados por 1a digesti6n son captados por proteinas de transpone presentes en la membrana plasmatica Por el comrario, las c~lulas cuca· riatas han adquirido un elaborado sistema membranoso interno que les permile captar las macromol~ulas por un proceso denominado endocitosis, y ponerlas en contacto con enzimas digestivas que se almacenan intracelularmente en los IiSOSOffias; como consecuencia de ello, a medida que se van produciendo, los metabolitos de la digesti6n van saliendo de los lisosomas directamentc hacia el dtasol. Ademas de proporcionar un sistema de regulaci6n de la digesti6n de las macromol~ulas mediante la vfa endocfrica, el sistema membranoso interno permite que las c~lulas eucariotas puedan regular Ja Iiberaci6n al exterior de las pro· tefnas y glucidos acabados de sintetizar. Todas las mol~ulas que viajan a 10 largo de eSla vfa biosinu!tica y secretora pasan por numerosos companimiemos, por 10 que la celuJa puede modificar esta molecula en varios pasos controlados, almacenarla hasta que se necesile, y entonces descargarla en un dominio de la superficie celular determinado mediante un proceso Hamado exocitosis. En la Figura 13-1 se muestran las rutas endochica y la biosinletica-secretora. CITOSOl

mOSOl

NUClEO MrTOCONORlA

PEROX/SOMA

PlAsnoos

RE'T1cUlO ENDOPLASMAnco

lIS0S0MA ENOOSOMA

SUPERFICIE CElULAR

Figura 13·1 las rotas secretora y endodtlca. En este ~mapa de carreteras~ sobre el tTifico de las proternas biosintetizadas. que fue inuoducido en el Capftulo 12, aparecen coloreadas tanto la rula secretora como la endocftica.

GEMACIQN

Figura 13-2 Tmnsporteveslcular.las vesfculas de transporte emergen por gcmaci6n de un compartimienlo Yse fusionan con olro.

641

lisosome

O =G-endosome

membrana nuclear

0 I / 0/ o

reticula endoplasm'tlco

o '------'"-------'

red del dictiocis 80ma Goigi

=:;-'

L'

red del trans Goigi

endosome temprano

~

e'TOSOL

--@_ vesicula SlICretora

complejo de Goigi

Ellumen de carla uno de los compartimientos que participan en la rula bio· en la endocftica es topol6gicamente equivaleme al exterior de la celula. Ademas, lodos los compartimienlos estan en cOffilUlicaci6n permanente entre sf, por 10 menos mediante las numerosas vesiculas de transporte que continuamente emergen por gemaci6n de una membrana y se fusionan con otta (Figura 13·2). EJ traftco esta altamente organizado: la via biosintthica-secretora va hacia afuera desde el ER a1 complejo de Golgi y a la superficie celular. con una ruta lateral que va a los lisosomas; por otro lado, la ¥fa endocftica va bacia adentro, desde la membrana plasmatica a los endosomas y lisosomas (Figura 13-3). Para poder realizar su funci6n, cada vesfcula de transporte que emerge de un compartimiento ha de IOmar s610 las protefnas apropiadas y unicamente ha de fusionarse con la membrana diana apropiada. Asi, por ejemplo, una vesicula que va del complejo de Golgi a la membrana plasmatica no puede lIevarse prolefnas que deben residir en el complejo' de Golgi, y s610 ha de fusionarse con la membrana plasmatica y no con olros organulos. Asimismo, a pesar de participar en eSle Dujo constante de componentes de membrana, cada organulo ha de mantener su propia identidad diferencial. En este capitulo consideraremos la funci6n del complejo de Golgi, de los Iisosomas, de las vesiculas de secreci6n y de los endosomas, y veremos las vfas par las cuales estos organulos estan interconectados. En la parte final consideraremos los mecanismos moleculares de la gemaci6n fusi6n que se dan en todo transpone vesicular, y discutiremos el problema fundamental de c6mo, a pesar de este transporte, se mantienen las di ferencias en los compartimientos. sint~tica·secretoray

Figura 13·3 Loscompartlmlentos lntracelulares de una c~luJa eucariota lmpllcados en la nita bloslntelJcasecretora y en la vfa endodlJca. Cada compartimiento Iimita un espacio que es topo16gicamentc equivalcntc al exterior de la c~lula. Un lumen cualquiera se comunica con otro cualquiera mediante vesiculas de transporte. En la TUta biosinteticasecretora (flec1Jas rojas) las proleInas son transportadas desde el ER a la membrana plasm:Hica 0 (vfa endosomas tardfos) a los lisosomas. En la TUta endocftica (J1echas verdes) las moJeculas son ingeridas mediante vesiculas fonnadas a partir de la membrana plasmatica, conducidas a los endosomas tempranos y, vfa endosomas lardios, a los Iisosomas. Muchas moJeculas endocitadas son recuperadas de los endosomas tempranos y retornadas a la superficie celular para ser reutilizadas; de forma similar, algunas mol~culas son recuperadas de los endosomas tardIos ydevueltas al complejo de Golgi, y algunas son recuperadas del Golgi y devueltas al ER. Todas eSlas TUtas de recuperaci6n se muestran can las jlechas llZllles.

y

CITOSOL

4

Transporte desde el ER al complejo de Goigi I

I I

Il

1

PEROXISOMA

NUCLEO

pLASTIDOS

MITQCONDRIA

RETlcULO ENOOPLASMATIC

Como ya hemos vista en cl Capitulo 12, las protefnas sintetizadas de novo entran en la ruta biosintthica-secrelOra cuando atraviesan la membrana del ER desde cl citosol. EI transporte posterior, desde el ER al complejo de Goigi y desde este a la superficie celular 0 a cualquier otro sitio, tiene lugar a traves de vesiculas. Estas vesiculas transfieren las protefnas de una membrana a otra 0 de un lumen a otro, mediante ciclos de gemaci6n y fusi6n (vease Figura 12-7). La via que va desde el ER, pasando por el complejo de Golgi, hasta la superficie celular se llama a menudo via por deJecta ya que parece que las proteinas no necesitan pre642

Capitulo 13 : Tranco vesicular mediante las rutas secretora yendodtica

.& GOLGI L1S0S0MA

r

I

Ilbt vEsrcuLA~sl SECRETORAS

ENDOSOMA

H SUPERFICIE CELULAR

I

sentar detenninadas sei'iales para seguirla: cualquier protefna que entre en el ER (y se pliegue y se forme correctamente) seni transportada automaticamente a lraves del complejo de Goigi hacia la superficie celular, a menos que contenga sei'iales que 0 bien la detengan en algUn compartimiento de la ruta a bien la desvien, pasando por el complejo de Golgi, hacia los lisosomas 0 las vesfculas de secrcci6n. En esta secci6n vamos a centramos en el complejo de Golgl, que es un importante punta de sfntesis g1ucfdica y un lugar de c1asificaci6n y distribuci6n de los productos del ER. Muchos de los polisaco1ridos celulares son sintetizados en el complejo de Golgi, entre eUos la pcctina y la hemicelulosa de la pared celular de las plantas y la mayorfa de los g1ucosaminoglucanos de la matriz extracelular de las c~luJas animales (v~ase Capftulo 19). Pero el complejo de Golgi lambi~n constituye una zona de paso de los productos del ER, de manera que una gran parte de los g1ucidos que fabrica el Golgi se unen como cadcnas de oligosacAridos a las protefnas y Ifpidos que el ER Ie cnvfa. Algunos oligosacaridos actuan como sei'iales que dirigen dcterminadas protefnas hacia vesfculas que las enviaro1n a los Iisosomas; Olras prQ(emas y Upidos, una vez adquiridos los oligosacAridos apropiados en el complejo de Golgi, son distribuidas mediante vesfculas de transporte a otras partes de la c~lula.

EI complejo de Goigi estli formado por una serie de compartimientos ordenados% EI complejo de Golgi se localiza normalmente cerca del nuclen celular, y en una c~lula animal a menudo est<1 cerca del cenrrosoma, 0 centro celillar. Est<1 farmado por una serie de cisternas Limitadas por una membrana y de forma aplanada que se parecen a un mont6n de platos. Normalmente estes dlctlosomas del GoIgI preseman emre cuatro y seis cisl'emas (Figura 13·4). EI mimero de dictiosomas del Goigi por c~lula varia enormemente en funci6n del tipo celuJar: algunas c~lulas animales tienen un gran dictiosoma, mientras que ciertas c~lulas vegetales presentan cientos de dictiosomas muy pequei'ios. Multitud de pequefias vesfculas se hallan asociadas a los dictiosomas del Golgi, agrupadas en la cara contigua al ER y a 10 largo de los anillos dilatados de cada cisterna (v6asc Figura 13-4). Se cree que estas ves{culas del Colgi son vesfculas de transporte de protefnas y de Upidos hacia y desde el Golgi y entre las cistemas del Golgi. Durante su paso a traves del complejo de Golgi, las moleculas transportadas suf'ren una serie de modificaciones covaJentes ordenadas.

Figura 134 El complejo de GolgL W Dibujo tridimensional del complejo de Golgi, a partir de micrografras de una ~Iula se<:retora animal. (8) E1ectronmlcrograrra de un complejo de Golgi de una ctlula vegetal (del alga verde Chlam}'lomonasJ, visto en seccl6n transversal. se pueden observar dos dictiosomas. Generalmentc, en las celulas vegetales el complejo de Golgi es mb diferenclado y esta mas c1aramente separado de los OlTOS sistemas membranosos intracelulares que en las c~lulas animales. (A, a panir deA. Rambourge Y. C1ennont, Eur.J. Cell BioL 51;189-200, 1990; B, por conesfa de George Palade.)

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Transporte desde el ER aI complejo de Golgt

InIns

,., 643

MeteeiOn de muc:u•• Ir...e, de la $Uperftele .p;eal

Flgun. 13-5 Cilula caUclforme del Intestino delgado. Esla dlula esta especializada en la sec.rec.i6n de mucus. una mezda de g1ucoproteinas y de proteogiucanos sintetizados en el ER y en el complejo de Golgi. El complejo de Golgi esta altamente polarizado, 10 cuaJ facllita la descarga del mucus mediante exocitosis en la superficie apical de la cll!lula. (De R.V.Krst~, Uustrated Encyclopedia of Human Histology. New York.: Springer-Verlag, 1984.)

Los dicliosomas del Goigi tienen dos caras diSlinlas: una cara cis (0 cara de entrada) y una cara trans (0 cara de salida). Ambas caras eSlan. conectadas a unos companimiemos especiales, (ormados por una red de eslTUcturas tubula res y cisternas, que son, respectivameme, la red del cis Golgi ({ambi~n llamada compartimienro imermediario 0 de salvamento) y la red del trans Golgi. Las protemas y Ifpidos entran por la red del cis Golgi en vesfculas de lranspone que provienen del ER y salen por la red del trans Golgi en vesfculas de transporte con destino a la superficie celular 0 a otro compartimiemo. Se cree que ambas redes son importantes en la c1asificaci6n de las protefnas: las protefnas que entran en la red cis pueden seguir a trav~s del Goigi 0 bien volver al ER; las proteinas que salen de la red trans estl1n c1asificadas segUn su destino sea los lisosomas, las vesfculas de secreci6n 0 la superficie celular. EI complejo de Golgi es prominenle en las relulas que eslcrn especializadas en la secreci6n, tales como las relulas caJiciformes del epilelio intestinal, las cuales secrelan al intestino grandes cantidades de maco rico en polisacl1ridos. En c~lulas de este tipo, se forman grandes vesiculas a partir de la cara traIlS del complejo de Golgi, el cual se encara hacia el dominio de la membrana plasmatica por el qu~ tiene lugar la secreci6n (Figura 13-5).

vesfculll con mucus

4

complejo~_~

de Golgi

Las prote(nas residentes en el ER son selectivamente recuperadas de la red del cis Golgl' Las vesfculas destinadas aI complejo de Golgi emergen desde regiones especiatizadas del ER lIamadas elementos translclonales, cuya membrana no ceoe ribosomas adheridos y se encuentra a menudo entre el ER rugoso y el complejo de Golgi (Figura 13-6). Se cree que eslas vesfculas no son selectivas. Transponan cualquier proteina desde el ER al complejo de Golgi, aunque puede haber senales que favorezcan este proceso. No obstante, existe un requerimiento esencial para que una proteina salga del ER: ha de estar correctamente plegada y formada. Las protefnas que no tienen la conformaci6n correcta 0 que estl1n incompletas son retenidas, 0 bien unidas a la protefna de uni6n especial HiP (discutido en el Capitulo 12) 0 bien formando agregados que no pueden ser empaquelados, y final-

10",m

Figura 13-6 Electronmkrografiade los elementos transkionaletll y de la ER rugose red del cis Goigi. De los elementos transicionaJes del ER emergen vesfculas de transporte por gemaci6n; estos elementos transicionales estan elemenlo. casi completamente libres de transicion.l" ribosomas y se fuslonan can 18 red del cis Golgi, trans6r1endo asf protemas y red del lfpidos acabados de sintetizar desde el cis Go"'l ER hasla el complejo de Golgi. (Por cortesia de Brij J. Gupta.) membf.na n...elee.

644

Capitulo 13: TrlUlco vesicular mediante las rutas secretora y endodUca

Figura J 3-7 Meam.lsmo utlllzado para retenee lu protemll5 resldft1tes en eI ER. Las prolefnas residenles en el ER que se escapan haem la red del cis

recttpl:or proteic:o

rllsldllnte lin

illER

protlllnll resldllntll lin illER

~-.I._

~''"==--'' ~,=~ red del dietiosom. red d., cis Goigi

tre". GoIgI

menle son degradadas en el propio ER. AsI pues, la salida desde el ER puede ser considerada como un control de calidad: si la prote(na no se pliega 0 no se forma correctamente, es descartada. De hecho, el ER parece que es uno de los prindpales lugares de la ce:lula donde se degradan protemas (los otros son los lisosomas, como veremos mAs adelante, y el dtosol, como vimos en el CapItulo 5). Las proteInas que estAn bien plegadas no necesitan ninguna sei'ial especffica para que sean transportadas fuera del ER, pero aqueUas que, como la prOlefna SiP, se encuentran en el lumen del ER necesitan una sei'ial para quedarse en e:l. Esta retenci6n de las protefnas solubles residentes en el ER estA mediada por una sei'lal de c1asificaci6n constituida por una corta secuencia, de cuatro aminoAci· dos: KDEL (lys-Asp-Glu-Leu) u otta similar (ve:ase Tabla 12-3). Si, por ejemplo, mediante ingenierfa gene:tica se elimina esta senal de retenci6n en ER de la protefna BiP, se observa romo esta prote(na es secretada al exterior de la ce:lula; y si la seoal se transfiere a una protefna que normalmente es secretada, ahora queda retenida en el ER. Esta senal de retenci6n no consisre en un anclaje de las prolefnas residenles en ellumen del ER sino en una recuperaci6n selectiva despue:s de que hayan sido transportadas en vesfculas y descargadas en la red del cis Golgi. En la red del cis Golgi, un receptor de membrana especffico une a todas las protefnas que presenran la sei'ial de retenciOn en ER y las empaqueta en vesfculas de transpone especiales que las devuelve al ER. As! pues, para estas protefnas residentes el ER es como una prisiOn abierta: no hay nada que implda que salgan, pero si 10 hacen, son transponadas de nuevo aI interior del ER (Figura 13-7).

Golgi son devueJtas aI ER medianle transpone vesicular. Un receptor de membrana en la red cis Golgi captura las prolefnas y las conduce, en vesfculas de transpone, hacia el ER. Las condiciones i6nicas presenle5 en el ER separan las protefnas de su receptor, de forma que el receptor regresa a la red del cis Golgi para ser reutilizado. Se han enconlrado tambi~n receptores que reconocen la sella! de relenci6n en ER en las cistemas cis. medial y trans del Golgi. De esta manera, la recuperaci6n de protefnas del ER empieza en la red del cis Golgi, peeo la ruta de retorno tambi~n funciona en las clsternas mAs trans del Golgi. En ellumen del ER se producen Inleracciones enlte las prolefnas resldentes en el ER, que ayudan a su relenci6n. Estas interacclones retardan la salida de las protefnas del ER en relaci6n con las protefnas que han de ser secreladas (prOlefnas de secreci6n). En experimentos en los que se ha eliminado la sei'tal de relenci6n de Eft de la prolema BiP, se observa c6mo la BiP abandona eJ ER Yes secretada por las cBuJas: ahora bien, su saijda del ER tiene lugar mas lenlamenle que las prolefnas de secreci6n bonafide, 10 cual indica que BiP es parcialmenle relenida en el ER mediante interacciones d~biles con otras prolcfnas.

Las protefnas del Golgi vuelven al ER cuando las c~lulas se tratan con la droga brefeldina A4 EI continuo retorno de las protefnas residentes en el ER desde la red del cis Golgi implica que el transporte entre estos dos orgAnulos tiene lugar en ambas direc· ciones. Como ya se menciona en el pie de la Figura 13-7, los receptores que reconacen la seftal de retenci6n en ER se encuentran tambie:n en los compartimientos mts trans del Golgi, de manera que quizA existe una ruta de retorno desde ellos al ER. La importancia de esta ruta de retorno se ilustra muy bien usando la droga brefeldlna A, la cual bloquea la secreciOn de protefnas ya que desorganiza el complejo de Gotgi. En ce:lulas tratadas con brefeldina A, el complejo de Golgi desaparece y sus proteInas se acaban encontrando en el ER, donde se mezclan con las propias del ER. Cuando se elimina la droga, el complejo de Golgi se vuelve a organizar y sus protemas retoman a sus companimientos (Figura 13-8). Para explicar estas observadones, se ha propuesto que la brefeldina A bloquea el transpone hacia delante -desde el ER aI complejo de Golgi- sin afecfar Transporte desde el ER aI complejo de Golgi

645

Figura 13-8 Electronmlcrografl'as que muestran el efecto del tralamlenlo can brereldlna Asobre el complejo de Goigt. Una tinci6n histoquImica pennile ver la locaIizaci6n de una enzima del Golgi (una manosidasal anles (AI y dos boras despue. (B) del tralamiento con brereldina Asabre fibroblaslos en cullivo. N6tcse que despues del tratamiento, la enzima pasa de las cislemas cis y medial del Goigi aI ER Y a la membrana nuclear, que es continua con el ER. (Por cortesfa de Jennifer Uppmcott-S<:hwartz y Lydia Yuan.)

ER

compleio de Golgi

al transporte de retorno -desde el Goigi al ER (Figura 13-9). En este sentido, la droga provocarfa que las protefnas del complejo de Goigi se vaciasen al ER mediante la ruta de retorno y, cuando la droga desapareciese,la via hacia delante se encargarfa de devolver las protefnas del Golgi a sus companimientos.

En el complejo de Golgi se procesan las cadenas de oligosacaridoS Como se ha descrito en el Capitulo 12, en el ER se af\ade un mismo tipo de N· oUgosawldo a muchas prote[nas diferentes, y este oligosacarido sc modifica profundamente mientras las prote{nas todavfa estan en el ER. En el complejo de Golgi se producen modificaciones posteriores, dependiendo de la protema. EI resultado es que en las g1ucoprotefnas de mamffero se encuemran dos grandes tipos de N-oligosacliridos, los oligosacdridos complejos y los oligosacdridos ricos ell marlosa. Algunas veces ambos tipos de oligosacaridos estan unidos (en lugares diferentes) a la misma cadena polipeptfdica. Los oligosacWidos ricos en rnanosa no presentan azucares que hayan sido aftadidos en el complejo de Golgi. 5610 contienen dos N-acetilglucosaminas y muchos residuos de manosa. cuyo numero a menudo se acerca al numero de residuos que se haUan presentes en el precursor del oligosaclirido original unido a Upido, del ER. Por el contrario, los oUgosac4ridos complejos pueden tener mas de las dos moleculas de N-acelilg1ucosamjna originales y tambien pueden presentar un numero variable de ga-

RUTA HAClA DELANTE lbloqulII&d1l por III brlllfllldlnll A)

ER / "",,'''' red del f'lln, Golgi

RUTA DE RETORNO (bloquIII8dII por 1111 nocodlllOIi

646

CapUulo 13: TnUico veslcuJar mediante las rutas secretora yendocftica

Figura 13·9 Ruta de retorno propuesta que va desde e1 complejo de Golgt at ER. Mientras que la rula hacia delante precisa de vesrcu1as de lransporte y tiene lugar independienlemenle de los mlcronlbulos, se cree que la rota de retorno preclsa de unos tubuJos membranosos que emergen del complejo de Golgi hacia e1 ER siguiendo los microlubuJos (los cuales son fragmentados por drogas como el nocodazol). Como ya hemos dicho alllcrionnente, la brefeldina Aevita la uni6n de las cubiertas que son necesarias para la gemaci6n de las vesfcu1as de transporte, de manera que bloquea los pasos del transporte vesicular hacia dclante y mantiene intacto el proceso de transporte hacta atr~s, dependienle de lubulos de membrana.

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...H ,H

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CLAVE

o.

II/-acelilglucosamina IGlcNAcI

• • manou IManl • • galactON IGall

ijJ. (6cido I;'I;CO, 0 NANA)

kido l\I·ecetilneur.mfnico

ICI

lactosas y de residuos de
las cisternas del Goigi estan organizadas en forma de series secuenciales de compartimientos de procesamientofi Las proleinas exportadas desde el ER entran aJ primero de los compartimienlos del Goigi (el compartlmlento cis), que se cree que es continuo con la red del cis Golgi; luego se desplazan al siguiente compartimiento (el compartlmlento m~· dial, fonnado por la cislerna central del dictiosomaJ, y fmalmente se desplazan al compartlm.lento trans, donde se complela la g1ucosilaci6n. Se cree que ellumen del compartimienlo trails continua con la red del trans Golgi, donde las prote{nas se segregan en diferemes vesiculas de transporte y se Iiberan a sus dCSlinos finales -Ia membrana plasmatica, los lisosomas, 0 las vesiculas de secreci6n. Estas rulas de procesamjenlo de oligosacAridos lienen lugar seglin una se· cuencia ordenada en el dictiosoma, en el que cada cisterna contiene sus propias enzimas. Las protefnas se madifican a trav~ de sucesivas etapas a medida que van de cistema en cislerna a traves del dietiosoma, de fonna que las cistemas constituyen una unidad de procesamienlo multiple. Esta companimemaci6n podrfa parecer innecesaria, ya que cada cnzima s610 aClua sobre su glucoprotef· na despu~s de que haya sido convenientemenle procesada por la enzima anle· rior. Sin embargo, parece claro que el procesamiento tiene lugar lanlO en una secuencia espacial como en una secuencia bioqufmica: asf, las enzimas que catalizan las primeras etapas se localizan en las cislemas mas cis del dictiosoma, mientras que las que cata1izan las wtimas etapas se encuenlran en las cisternas mAs trans. Transporte desde el ER at complejo de Golgf

Rgura13-10 EJemplosdelasdos clues prlndpales de ollgosadrldos unldos a asparagina (N-ollgosac4ridos) enconlrados en g1ucoprotefn811 maduras. En {BJ se mueSlra un oligosacdrido complejo y en (C) un oligosacdrido rico en manosa. Todo oligosaclrido complejo conSla de una region central (en color en A) que deriva del N-oligosaclrido original aftadido en el ER y que consla de forma caracteristica de dos N.acelilglucosaminas (GIcNAc) y lres manosas (Man). Adem4$, exiSle una region tennirwl que contiene un numero variable de unidades de trisacaridos (N·acetilglucosaminagalaclOsa-acido siaJico) unidas al nucleo de manosas. Frecuentemenle la regi6n tenninal esta truncada y conliene 5610 GIcNAc y galactosa (Gal) 05610 GIcNAc. Nonnalmenle se puede afladir un residuo de fucosa at nucleo de GIcNAc unido a la asparagina (Asn). AIr pues, aunque las elapas de procesamienlo Yposlerior adici6n de azucares estan ordenadas eslrietamenle, los oLigosacaridos complejos pueden ser helerogeneos: por ejemplo, mientras que el oligosacMido complejo que se muestra en la figura liene Ires ramas terminales, lambit'!n es habitual encontrar oligosacaridos con dos 0 con cuatro ramas, en fUllci6n de la glucoproleina de que se trale y de la ct'!lula en la que se fabrique_ Tambi~n se encuenlran oligosacaridos ·hibridos~ con una rama de Man y Olra de GIcNAc-Gal. Los tres aminoacldos que en eSla figura se presenlan en color conslituyen la secuencia reconocida por la enzima oligosacaril transferasa que anade el oligosaclrido iniclal a la prolefna. Abreviaturas: Ser = serina; 11tr = lreonina; X = cualquier aminoacldo.

647

,,

..•

•

glucosidasa I manosida5a I del Goigi

glucosldasa II

'

•••

'

ma.nosidasa dal ER

N-acetllglucosamina transferasa I

manosldasa II del Golgi

l!I"A"' ,, "'r

se obtiene el oligosacllrido completo al atladir dos GlcNAc, tres Gal ytres NANA

I Oel pr6ximo se afiade aqu!

,.,.-~

CLAVE:

0 .. N-acetilglucosamina (GlcNAcl

. . . mano5alMan!

. . . glucosa lGlcl

Figura] 3-1] Procesamlenlo de los ollgosacliridos en el ER y en el complejo de Golgi. EI proceso es altamente ordenado, de forma que cada uno de los pasos depende de las reacciones anteriores de cada serle. EI procesamiento comienza en el ER con la eliminacl6n de los residuos de glucosa del oligosacarido inicialmente transferido a la prote[na. A continuaci6n, una manosidasa de la membrana del ER elimina un determinado residuo de manOS8. En los dictiosomas del GoIgi, la manosidasa I elimina tres residuos mas de manosa y la N-acetilglucosamina transferasa I afiade un residuo de GIcNAc, 10 cual permite que la manosidasa II elimine dos residuos mas de manosa. As!, se obtlene el nucleo final de tres residuos de manosa que se presenta en un oligosacarido complejo. En este estadio, el enlace que existe entre los dos residuos de GIcNAc del nucleo del oligosacarido se vuelve resistente al ataque de una endoglucosidasa altamente espec[fica (Endo-H). Todas las estructuras posleriores son resistentes a Endo-H, por 10 que se utiliza el tralamiento con esta enzima para distinguir los complejos de oligosacaridos ricos en manosa. Por ultimo, como se muestra en la Figura 13-10, se afiaden residuos de GlcNAc, de galactosa y de acido sialico. Algunos oligosacaridos pueden escaparse del procesamiemo del complejo de Golgi, mientras que Olros seguiran el proceso que se muestra, con algunas variantes. La complejidad del proceso depeode del tipo de prolefna y de la localizaci6n en la protefna del residuo de asparagina al que se halla unido el oligosacarido.

UDP-GlcNAc

UDP-Gal

CMP-NANA

glucoprotelrla

- - rlucla6sido difosfatasa

648

Capftulo 13: Tratico vesicular mediante las rulas secretora y endodtlca

Flgura13·12 Elapasftnalesenla sfntesls de un oligosacl1rldo complejo. La adici6n progresiva de residuos de azucar se produce en los companimientos de las cistemas del complejo de Golgi. Tres tipos de enzimas glucosil transferasa acnlan de forma secuencial, uti1izando como substrato azucares que han sido activados mediante su uni6n a determinados nucle6tidos (los que se indican en la figural. Las membranas de las cisternas del Golgi conlienen protefnas transponadoras transmembrana especfficas que permiten a cada azucar-nucle6tido eotrar por intercambio con su producto nucle6tido monofosfato. que es liberado despues de que el azucar se una a la protefna en la cara luminal (no se muestra). En la pane superior de la figura se muestra la estruclura de los compuestos azucarnucle6tido UDP-N-acetilglucosamlna, UDP-galacrosa y CMP-N-acido acetilneuramCnico.

Figura 1~13 Contnlstado hlstoqu(mlco que demuestnl que el complejo de Golgt esul bloqu&nlcamente poJartzado. La serle de electTonmicrograffas muestra e1 complejo de Golgi sin contTastar (A), contrastado con osmio (B), el cua] es reducido preferentemenle por las cisternas del companimienw cis, y contrastado revel.ando la localizaci6n de una enzima especffica (e y OJ. La enzima nucle6sido difosfatasa (v~ase Figura 13·12) Sf! haUa en las cisternas del transGolgi (C), mienl.nlS que la enzima fosfatasa 'cida marca la red del trails Golgi (D). (Por conesfa de Daniel S. Friend.)

Se cree que el transporte de protefnas entre las diferentes cisternas del Golgi tiene lugar mediante vesiculas de transporte, las cuales surgen por gemaci6n de una cisterna y se fusionan con la siguienre. Se supone que las vesiculas que se desplazan entre las cisternas del Golgi no selecciollan la carga, como ya sucedfa con las que viajan desde el ER al complejo de Golgi. AsI, cualquier protefna soluble 0 de membrana que no sea considerada residente puede entrar en las vesiculas de transporte y desplazarse a trav~s de la ruta biosint~tica-secretoradesde la cisterna cis a la trans pasando por la medial. Casi todo 10 que sabemos sobre el mecanismo molecular del transpone vesicular fue descrito originalmeme utilizando sistemas in vitro para medir el transporte proteico entre las cisternas del Golgi (vease Panel 13-1, pags. 682-663). Los electronmicroscopistas han visto pequenos nibulos membranosos que parecen interconectar algunos dictiosomas, y es posible que a trav~ de eslas estruclUras tenga lugar alglin tipo de transferencia de material desde una cisterna a la siguiente. Las diferencias funcionales entre las subdivisiones cis, medial y traIlS del complejo de Golgi fueron descubiertas mediante la localizaci6n, lanlO por fraccionamiento fisico del organulo como por eleclTonmicroscopia marcando con anlicuerpas las enzimas implicadas en el procesamiento de los N-oligosacaridos en distintas regiones del organulo. Por ejemplo, se encontr6 que la separaci6n de los residuos de manosa y la adici6n de N-acetilglucosamina tenfa lugar en el comparlimiento medial, mientras que la adici6n de galaetosa y de acido siAlico ocurrfa en el companimiento trans y en la red del trans Golgi (Figura 13-13). La compartimentaci6n funcional del complejo de Golgi esta resumida en la Figura 13-14.

Los proleoglucanos son ensarnblados en el complejo de GoIgF No s610 son las cadenas de N-oligosacArido de las protefnas las que son alteradas a medida que las prolefnas pasan a traves de las cislernas del GoIgi, en su camino desde el ER a sus deslinos finales; muchas prolefnas lambicn son modificadas de olras fonnas. Por ejemplo, algunas prolefnas tienen azucares afiadidos a los grupos OH de las cadenas laterales de determinadas serinas 0 (reoninas. Como el crecimiento de las cadenas de N-oligosac<1ridos, esta O-g1ucosllacltSn esta calalizada por series de enzimas glucosillransferasas que utilizan compuestos azucar-nucle6tide en ellumen del Golgi para anadir residuos de azlicar, uno a uno, a una prolefna. Habirualmente primero se anade la N-acetilgalactosamina, y a continuaci6n un numero variable (desde unes pocos a 100 mas) de reslduos de amcar. De tOOas las protefnas glucosiladas, las que 10 estan mas son algunas prate('las nucleares de proteogluamos, las cuales son modificadas en el complejo de Golgi produciendo proteoglucanos. Tal como se explica en el Capflulo 19, esto implica la polimerizaci6n de una 0 mas cadenas de glucosaminog/uCQtlo (largos polfmeros no ramificados compueslos por unidades repetidas de disac<1ridosl vfa una uni6n a xilosa en las serinas de las protefnas nucleares. Muchos prOleoglucanos son secrelados y pasan a ser componentes de la matriz extracelular, mientras que otros permanecen anclados a la membrana plasmalica. DtTOS constituyen el componente principal de substancias como el moco que es secretado formando una cubierta protectora sobre muchos epitelios. Los azt1cares incorporados a los g1ucosaminoglucanos son altamente sulfatados inmediatamente despues de que los polfmeros se hayan fonnado en el complejo de Golgi, 10 cual ayuda a dar la elevada carga negativa que presentan los proTransporte desde el ER a1 complejo de Golgi

649

teoglucanos. Algunos residuos de tirosina tambien son sulfatados en eSle estadio. En ambos casos la sulfataci6n depende de un dador de sulfato (3'-fosfoadenosina5'-fosfosulfato,o PAPS, de 3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate), que es transportado desde el dtosol a1lumen del compartimiento tram del Golgi,

Los carbohidratos de las membranas celulares se encuentran en la cara de la membrana que es topol6gice.mente equivalente at exterior de la celula8 Dado que lodos los oligosacliridos son incorporados en cl lade luminal del ER y del complejo dc Golgi, 13 distribuci6n de carbohidratos en las protefnas de membrana y en los Ifpidos es asimetriea. Tal como ocurre con la asimctrfa de la bicapa lipfdica, la orientaei6n asimetrica de estas moleculas glueosiladas se mantiene durante su transporte a la membrana plasmlitica, a las vesfeulas de secreci6n, 0 a los Iisosomas. Por 10 tanto, los oligosacaridos de todas las glueoprotefnas y glucolfpidos de las membranas intraeelulares correspondientes se encucntran encarados hada el lade luminal, mientras que en la membrana plasmatica se encuentran encarados hada el exterior de la celula (Figura 13-15),

iCual es el prop6sito de la glucosilaci6n?9 &iste una diferencia imponantc entre la construcd6n de un oligosacarido y la sintesis de ouas macromoleculas como el DNA, el RNA 0 las protefnas, Mientras que los
650

Caprtulo 13 : TnUico vesicular mediante las rutns secretora yendodtica

Figura 13-14 Compartimentacl6n runclonal del complejo de Goigl. La localizaci6n de cada una de las etapas de procesamiento que se muestran en la figura ha sido determinada por medio de la combinaci6n de tecnicas, cnlre las que se encuenlran el subfraccionamienlo de las membranas del complejo de Goigi y la eleclronmicroscopia tras la linci6n con anlicuerpos especfficos contra a1gunas de las enzimas espedficas de procesamienlo. La localizaci6n de muchas 011'35 reacciones de procesa.miento todavfa no ha side detenninada. A pesar de que 5610 se ha podido demost1'3r la existencia de lrCS compartimiemos de cistemas. a veces cada uno de eUos esta rormado per un grupa de dos 0 mas cistemas secuenciales, y es pesible que haya subdivisiones aun per descubrir. Tambien podrla ser que hubiese 5610 Ires compartimientos funcionalmente disdlltos y que las cistemas extra reprcsentascn mt11tiples copias de uno de las Ires unidades funcionales. No obstante. no esta claro si cada enzima esta restringida a una cisterna conereta 0 si su distribuci6n varia a 10 largo del dictiosoma -de mane1'3 que las enzimas que aetlian primero estan presenles mayoritariamente en las cisternas cis del Golgi, mientras que las que aCllian mas larde eSlan sobretodo en las cistemas traIlS del Golgi.

'!',",CCn._--jj-_VIIS{Cule de tral1sporte

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,-",--",,_veS[CUlil da tral1sporte

=-

polirribosomas Ul1idOB II membrill1l1

1111 illER

Figura 13·15 Los azucares de las glucoprotefnas de membrana y de los gll.lcoJipldos estan orlentados hacla afuera del choso!. La orientaci6n que liene una protcina transmembrana en la membrana del ER se mantiene cl.lando esta protefna es lransportada a otras membranas. Los puntos coloreados del final de cada molecula de gJucoproteina representan el N-oligosacarido atiadido a las proleinas en ellumen del ER. N6tese que estos residuos de azlicar estan confinados en ellumen de cada uno de los organulos internos de la clliula, y que despues de que la vesicula de transporte se haya fusionado con la membrana plasmatica aparecen expueslos hacia el espacio extracelular. Lo mismo sirve para los residuos de azucar de los gillcolfpidos y los O-oligosacaridos producidos en el complejo de Goigi.

formando parte de los glucolfpidos y de las glucoprolefnas desempenen funciones irnportantes, aunque todavia se desconocen la mayorfa de estas funciones. La N-glucosilaci6n, por ejemplo, es predominanle en todos los eucariotas. incluyendo las levaduras. pero no se present a en procariotas. En la mayorfa de las protefnas transportadas a traves del ER y del complejo de Goigi -un proceso que es exclusivo de las celulas eucariotas- se hallan presentes uno 0 mas N-oligosacaridos. por 10 que se crey6 que su funci6n era la de colaborar en los procesos de transporte. No obstante, por regia general las drogas que bloquean determinados pasos de la glucosilaci6n no interfieren con el transpone (con la importante excepci6n del transpone a los lisosomas, que se explicara mas adeIan Ie). Ademas, las celuJas mulantes que tienen bloqueados varios pasos de glllcosilaci6n del Golgi son viables en cultivo y transportan protefnas normalmente. En ausencia de g1ucosilaci6n la mayorfa de la protefnas retienen sus actividades normaJes, aunque algunas no se pliegan correctamenle sin sus oligosacaridos normaJes, y por 10 tanto precipitan ell et ER y no son transportadas.

Figura 13-16 Estrl.lctura tridimensional de un pequeno N-oligosacarldo. La estruClUra fue determinada por am\lisis cristalognifico de rayos X de una glucoprote{na, Este oligosacarido tan s610 comiene 6 residuos de azlicar, mientras que el N-oligosac<\rido transferido inicialmente a las protefnas en el ER tiene 14 residuos de azucar (vease Figura 12-48). (A) Modelo del esqueleto del compllesto, en el que se muestran lodos los atamos excepto los de hidr6geno; (B) modelo espacial en el que la asparagina se presenta en negro. (Por cortesia de Hichard Feldmann.) IAI

Transporte desde el ER at complejo de Golgi

IBI

651

Dado que las cadenas de azucar denen una IJexibilidad limitada, inc1uso los N-oligosaearidos mas pequenos sobresalen de la superficie de las glueoprotef4 nas (Figura 13-16), de forma que pueden limitar [a aproximaci6n de otras rna· cromoleeulas a la superfide de la glucoprotefna. De esta manera, por ejemplo, la presencia de oligosacaridos tiende a haeer que una glucoprotefna sea relativamente resistenre a la digesti6n par proreasas. Podrfa ser que los oligosacaridos provinieran originalmente de una celula eucariota ancestral que tuviera una cubierta protectora, la eual, a diferenda de la rfgida pared celular bacleriana, permitiera a la celula una derta libertad para cambiar de forma y para moverse. Desde enronces los oligosaearidos pueden haber sido modificados en el sentido de que tambien sean titHes para otros fines: por ejemplo, las seleetinas ~polisa· cMidos unidos a [as protefnas de la superficie celular- intelVienen en la adhesi6n entre dos ce[ulas, como ya se vio en el Capftulo 10.

Resumen El complejo de Golgi recibe las proteinas ruMII silltetizadas y los lfpidos del ER, Y los distrlbuye a la membrana plasmdtica, a los lisosomas y a las vesiculas de secrecion. Se trata de una estmctura polarlzado., foromda par una a mds hlleras de cisternas en forma de disco, organizadas como series de por 10 menos tres compartimientos secuenclales distintos bioquimica Yftmcionalmente, llamatlos cis, medIal y trans. Las cistenuu cis y trans esttfll conectadas a estaciolles de clasificacion, llamadas la red del cis y trans Golgi, respectivamente. Las proteinas bien plegadas son transportadas indiscrlminadilmente desde ellumen y la membrana del ER a la red del cis Golgi, pera las resldentes del ER son devueltas. Las proteinas destinadas a las vesiculas secretoras, a La membrana plasmdt/ca y a los lisosomas se desplazan a tralJf!s del diet/osoma en la direcciOn cis a trans, pasando desde una cisterna a la sigidente, en serie. Finalmente, las proteinas alcmJUln La red del trans Golgi, desde donde eada tipo de proteina parte a su dest/"o finai. Todas estas etapas de trans· porte tienen lugar mediante vesiculas, las cuales surge" por gemaciOlI de ""a membralUl y se[usionan con otm. El complejo de Golgi, a diferencio. del ER, contiene nlltchos compuestos tl.Zucarnucle6tUW; una diversidad de enzimas glucosU transferasas utilizan estos sltbstra-tos para realizar reaa:lones de glucosilaciOn, tanto en moMculas de lfpido como {ie proteilUl, a medlda que ~tas van pasando a traws del complejo de Golgi. Los N-oligosactfridos, par eJemplo, que se anaden a las proteinas ell el ER, son a menudo modificados por elimllUldon de residlws de manosa y par lUilciOn de azlkareslUiieionales -como ia N-acetilgiucosamilla, la galactosa y el tfcldo sitflico. Ademds, el Golgi es ellugar donde se produce ia O-giucosilaciOn y donde las cadenas de glucosamilwglucanos se ailaden a las proteinas centrales de proteoglucano formmukJ proteoglucallOS. En el ultimo compartimiento del Golgi tamblin tiene lugar ia sulfataciOn de tl.ZUcares de proteoglucanos y de detenninadas t/rosilUlS de las proteinas. CITOSOL

'fransporte desde la red del trans Golgi a los lisosomas AI parecer, todas las prmefnas que pasan a traves del complejo de Golgi, excepto las que son retenidas en el como residentes permanentes, son clasifieadas en la red del trans Golgi de aeuerdo con su destino final. E[ mecanismo de clasificaci6n esta especialmente bien estudiado para el caso de las protefnas destinadas al lumen de los Iisosomas. En esta secci6n vamos a considerar este proeeso de transporte selectivo. Empezaremos con una breve descripci6n de la estruetura y de 1a funci6n de los Iisosomas.

1

Los Usosomas son vesfculas membranosas que contienen enzimas hidrolfticas urilizadas para [a digesti6n intraeelular control ada de macromoleculas. Contie652

Capftulo 13: Trafico vesicular medJante las rutns secretora y endocftica

L

NUCLEO

PEROXISOMA pLASTIDOS

MITOCONORIA

,

RETlcULO ENOOPLASMATICoj

GOLGI

J
L1S0S0MA

Los lisosomas son ellugar principal de digesti6n intracelular 10

I

VESiCULAS",,! SECAETORAS

ENDOSOMA pi

1r

SUPEAFICIE CELULAA

I

Flgun 13-17 Usosomas. Las 0,05-0,5 tim

-..

HIOflOlASAS

AooAs

gltJc>o»idaslts lipaM

Ia.f.....s

sulfltasn loslolipuas

hidrolasas 'c1das son enzimas hidrolfticas que estlin activas en condiciones 'c.idas. Blumen se mantiene a un pH 'tido mediante la acciOn de una bomba de H' siluada en la membrana. la cual utiliza la energia de hidrOlisis del ATP para bombear H' al interior dellisosoma.

ClTOSO<.

nen alrededor de 40 tipos de enzimas hidroliticas, entre las que se encuentran proteasas, nucleasas. glucosidasas, lipasas. rosfolipasas, rosfatasas. y sulfatasas. Todas elias son hldrolasas addas. cuya actividad 6plima se expresa a un pH cercano a 5, que es el pH que se mantiene en el interior de los Iisosomas. En este sentido el cilosol est~ doblemente protegido contra el alaque de su propio sistema digestivo. Normalmenle. la membrana del lisosoma mantiene las enzimas alejadas del citosol. pero en el caso incluso de que se produzca alguna fuga, la dependencia ~cida de la actividad de eSlas enzimas protege el contenido del cilosol (cuyo pH es de aproximadamente 7,2). Como en el caso de otros org~nulos intracelulares, ellisosoma no sOlo contiene una dotaci6n caracterfstica de enzimas sino una membrana envolvenie tambien caracterfstica. La membrana Iisosomal contiene, por ejemplo, prolefnas de transporte que permiten que se escapen los productos finales de la digesti6n de macromoleculas. como los amino~cidos. azl1cares y nucle6tidos, de tal manera que estos productos puedan ser excretados 0 reutilizados por la celula. Tambien contiene una bomba de protones que utiliza la energia de hidr61isis del ATP para bombear H' al interior del Iisosoma, manleniendo asi el lumen a un pH ~cido (Figura 13·17). La mayarfa de las proteinas de la membrana Iisosomal estan altamente glucosiladas, 10 cual puede ayudar a protegerlas de las prOleasas Iisosomales del lumen. Como veremos mas adelante, los materiales endocitados son inicialmenle descargados a unos organulos lIamados endosomas antes de ser liberados a los lisosomas. Los endosomas tamblen lienen bombas de H' que mantienen su lumen a un pH bajo. aunque no tan bajo como el de los lisosomas
Figura 13-18 EI bajo pH de los Usosomas y endosomas. Las protelnas marcadas con una sonda fluorescente sensible .11 pH (fluoresceina) y que son endocitadas por las cl!lulas. pucdcn ser ulilil.adas para medir el pH en end050mas y Iisosomas. Los diferentes colores son una muestra del pH que 13 sonda fluorescente enCUCtllra en estos organulos. El pH en los IiSOSOrllllS (raja) cs alrededor de 5, mientras que el pH en los diversos tipos de endosomas (azul y verde) va de 5,5 a 6.5. Este ml!todo fue usado originalmenle en la dl!cada de 1890 por Metchnikoff, quien alimentaba cl!lulas fagodticas medianle partfculas de tomasol y observaba c6mo variaba su color del azul aI rojo despul!s de la ingestiOn. (Por cortesfa de Fred Maxfield y Kenneth Dunn.)

Transporte desde la red del trans Golgi a los Usosomas

653

Figura 13-19 Vlsuallzacl6n h1stoquimlca de los llsosomas. Eleclronmicrograffa de dos secdones de una celula contrasladas para poner de manifiesto la localizad6n de la fosfatasa <'icida, una enzima marcadora de Iisosomas. Los grandes organulos rodeados de membrana, que conlicnen precipilados densos de fosfato de plomo son lisosomas. Su diversa morfologfa reneja variadones de la cantidad yde 1a naturalcza del malerial que esutn digiriendo. Los precipitados sc producen cuando ellejido fijado con glularaldehrdo (para fijar las enzimas en su sitio) se incuba con un subslrato de la fosfalasa en presencia de iones plomo. En el panel superior se indican mediante jlechas rajas dos pequei'ias vesiculas que probablemenle trnnsponan hidrolasas desde el complejo de Golgi. (Por conesia de Daniel S. Friend.)

Los Usosomas son heterog~neosll Los Iisosomas fueron inkialmenle descubiertos mediante el fraccionamiento bioqufmico de extractos celulares, y mas tarde fueron observados al microscopio electr6nico. Son extraordinariamente diversos en cuanto a forma y lamano, pero por procesos histoqufmicos pueden ser identificados como miembros de una familia unica de org1nulos, utilizando el precipitado producido por la acci6n de una hidrolasa 4cida sobre su substrato, para mosuar que org1nulos contienen la enzima (Figura 13-19). Ulilizando esle criterio, los lisosomas se halJan en Ladas las relulas eucariotas. La heterogeneidad de la morfologfa Lisosomal contrasla con la uniformidad relativa de la mayorfa de los demas org1nulos celulares. La diversidad refleja la ampLia variedad de funciones digestivas mediadas por las h.idrolasas <1cidas, como la digesti6n de desechos intra y extracelulares, la digesli6n de microorganismos fagocitados, e incluso la nutrici6n celular. Por esta raz6n, a veces se considera a los Iisosomas como una colecci6n helerogenea de org4nulos distinlOS cuya caracterfslica cornun es un elevado contenido de enzimas hidrolflicas. Como veremos a continuaci6n, es especialmente dificil aplicar una definici6n mas ajuslada que esta en las celulas vegetales.

Las vacuolas de las plantas y de los hongos son lisosomas muy versatiles 'Z La mayorfa de ctHulas vegelales y hongos (incluyendo las levaduras) lienen Wla 0

varias vesiculas muy grandes y Ilenas de fluido. lIamadas vacuolas, que ocupan m4s del 30% del volumen celular -cerca del 90% en algunos tipos cellilarcs (Figura 13-20). Las vacuolas se parecen a los Iisosomas de las cclulas animalcs porque tienen numcrosas enzimas hidroliticas, perc sus funciones son muy diversas. Las vacuolas vegetales pueden actuar como almacen de nlltrientes y de produclos de desecho, como compartimiento de degradaci6n, incrementando el volumen celular de una forma econ6mica (Figura 13-21), y controlando la presi6n de turgencia (la presi6n osm6tica que empuja hacia afuera la pared celular y que impide que 1a planta se marchite). En una misma celula se encuentran a menudo difcrenlcs vacuolas con diferentes funciones (por ejemplo, digesti6n y a1macenamiento). La vacuola es importanle como aparalO homeoSlatico, perrnitiendo a las celulas vegelales resislir grandes variaciones de su entomo. Por ejemplo, cuando el pH del medio disminuye, el Dujo de H' hacia el cilosol es controlado, aI menos en parte, aumentando ellransporte de H+ a la vacuola. de manera que el pH del chosol se rnantiene constanle. De fonna parecida, muchas cf!lulas vegelales mantienen una presi6n de lurgencia casi constanle a pesar de grandes cambios en la osmolaridad del fluido que les rodea. Esto 10 consiguen cambiando la presi6n osm6tica del cilosol y de la vacuola --en parte por la hidr6lisis y resfntesis controlada en la vacuola de algunos polimeros como el polifosfato, y en parte por la alteraci6n del transporte de azucares, aminolicidos y ouos melabolitos a 654

CapCtuio 13: TrMIco vesicular medianle las rutas secretora y endodtlca

Figura 13-20 Lasvaeuolasdeuna eeiula vegetal. Esta electronmicrograffa de eelulas de una haja javen de tabaeo muestTa c6mo el citoplasma estli reducido, debido a la enorme vacuola, a una delgada capa que contiene numerosos cloroplastos dispuestos contra la pared celular. La membrana de la vacuola recibe el nombre de tonoplasto. (Por cortesla de ,. Burgess.)

IraVeS de las membranas plasmatica y vacuolar. La presi6n de lurgenda controla estos flujos regulando las actividades de los diferentes transportadores de cada bicapa lipidica. Las substandas almacenadas en las vacuo[as vegetales varian entre las direrentes especies, desde la goma al opio yal aromatizante del ajo. A menudo, los productos almacenados iienen una fund6n melab6lica. Por ejemplo, las proteinas pueden ser guardadas durante aftos en las vacuolas de algunas celulas de muchas semillas, como los guisantes y las judfas. Cuando estas semillas germinan, las protefnas son hidrolizadas y los aminoacidos que se movilizan propordonan alimento al embri6n. Los antodanos, pigmentos que se encuenlran en las vacuolas, dan color a los petalos de muchas flores atrayendo los inseclos polinizadores, mientras que las moleculas nodvas que se tiberan de las vacuo[as cuando una planta es comida 0 dafiada, proporcionan un sistema de defensa contra los depredadores.

cordones citoplllsm.!Jticos pllred celulsr va/ola

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G~

Transporte desde la red del trans Golgl a los Iisosomas

.

II

1/

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Figura 13-21 EI papel de la vacuola en e) control del tamalio de las eeluias vegetales. Es posible conseguir un aumento del volumen celular sin que se produzca un aumento del volumen del citosol. La relaj8ci6n local de la pared permite una expansi6n celular impulsada por la turgencia que conlleva la captaci6n de agua en el interior de una vacuola en expansi6n (vease Figura 19-67). Finalmenle el ciloplasma queda confinado a un delgado estrato periferico, comunicado can la regi6n perinuclear mediante cordones citoplasmMicos transvacuolares que contienen haces de filamentos de actina (no se muestran).

655

Los materiales son transportados hasta los lisosomas a traves de varias rutas l3 En general, los Iisosomas son puntos de encuentro donde convergen diferentes corrientes del tnifico inlracelular. Las enzimas digestivas son descargadas a ellos mediante una ruta que va por el ER y el complejo de Golgi, mientras que las substancias que deben ser digeridas Ilegan a ellos a traves de por 10 menos tres vfas. De eslas tres vfas, la mejor estudiada es la que siguen las macromoleculas que SOil endocitadas. De forma breve (mas adelante discutiremos los detallesJ, las moleculas endocitadas son inicialmenle transferidas a unas vesiculas intracelulares pequenas e irregulares, lIamadas endosomas tempranos. Desde elias, algunas de las moleculas endociladas son seleccionadas y recicladas a la membrana plasmarica, mientras que otras se dirigen a los endosomas tardfos. Allf, los materiales que van a ser digeridos se encuentran con las hidrolasas lisosomales que provienen del complejo de Golgi, debido a la fusi6n de las vesiculas de transporte de am bas mtas. EI interior de los endosomas tardios es medianamente acido (pH -6), Yse cree que es ellugar donde empieza la digesti6n hidrol!tica de las molecuJas endocitadas. A partir de los endosomas tardfos se forman los Iisosomas, a pesar de que no se sabe exactamente c6mo ocurre. Durante este proceso de conversi6n, algunas moleculas de la membrana de los endosomas son eliminadas y se produce una disminuci6n del pH interno. Todas las celulas disponen de una segunda ruta que aporta maleriales a los lisosomas para su degradaci6n, mediame la cual pueden ser destruidas partes obsoletas de la propia celula -un proceso denominac1o autofagia. En una celula hepatica, por ejemplo, una mitocondria tiene und \ .Ja media de 10 dfas. En las imagenes de microscopia elcctr6nica de celulas normales se pueden observar lisosomas conteniendo (y probablementc digiriendo) mitocondrias asf como otras organulos. Al parecer, el proceso de digestj6n supone que el organulo sea envueho por membranas derivadas del En, gencrandose un alllOfagosoma. Se cree que el autofagosoma se fusiona con un lisosoma (o un endosoma tard(o). El proceso esta altamente regulado, de forma que durante la remodelaci6n celular se pueden seleccionar diferentes componentes celulares y ser destinados a su destrucci6n: por ejemplo. el ER Iiso que prolifera en una celula hepatica en respuesta a la droga pentobarbital (discutido en el Capflulo 12) es eliminado selectivamente por medio de la autofagia cuando esta draga es retirada. Como veremos mas adelante. la tercera ruta que proporciona materiales a los lisosomas s610 tiene lugar en celulas que estan especializadas en lafagocitosis de grandes partfculas y de microorganismos. Estas celulas (macr6fagos y neutr6fi1os en vertehrados) pueden ingerir grandes objems y fonnar un Jagosoma. Se cree que el fagosoma se transfarma en lisosoma de la misma fanna que hemos explicado para el caso del autofagosoma. Estas tres rutas se resumen en la Figura 13-22.

Algunas protefnas citos6licas son transportadas directamente a los lisosomas para ser degradadas l4 Podrfa existir una cuarta nita de degradaci6n proteica que condujese hasta los Iisosomas: algunas protcfnas poseen ciertas senales en su superficie [Uamadas se· cuencias KFERQ, de Iisina (K), fenilalanina (Fl, glutamato (EJ,.arginina (R) y glutamina (Q)) que son responsables de su selecci6n para ser descargadas en los lisosomas y degradadas. Es pasible que las secuencias KFERQ unan estas protefllas a determinados organulos que vayan a ser autofagocilados, de manera que de forma indirecta tambien serfan destruidas. Alternativamente, puede existir un transportador especffico en la membrana dellisosoma que reconozca estas senales y transfiera directamente las prolefnas a traves de la membrana lisosomal. Se conocen antecedentes de mecanismos no convencionales que desplazan protefnas a traves de las membranas. Algunas de las protefnas que son secretadas al exterior de la celula, como el factor basico de crecimiento de los fibroblastos 0 la interleuquina-I, Ilegan a la superficie celular sin haber pasado nunca por la ruta 656

Capftulo 13: Tnifico vesicular mediante las rutas secretora y endocftica

f&go90m&

Figura 13-22 Tres rutas de degradacl6n en los IIsosomas. Cada mta conduce a la digesti6n intracelular de materiales derivados de diferentes orfgenes. Los compartimientos resultantes de estas tres mtas pueden, a veces, ser diferenciados morfol6gicamente -a ello se deben los terminos "autofagolisosoma". "fagolisosoma", etc, No obstante, estos lisosomas s610 pueden diferenciarse por los diferentes materiales que estan digiriendo,

&utof&gi&

clasica a traves del ER y del complejo de Goigi. En la mayorfa de los casos no se conoce que membrana es atravesada por la prote(na 0 c6mo se cataliza su Iransporte transmembrana. En el caso de un pequeno peptido de levaduras, el faclor feromona a, se sabe que el transporte tiene lugar directamente a traves de la membrana plasmatica mediante una bomba proteica impulsada por ATP que pertenece a la familia proteica de los transportadores ABC (discutido en el Capitulo 11). Asf, es posible que bombas parecidas a esta proporcionen sistemas de transporte "privados", cada uno de ellos especializado en la transferencia de un pequeno y especifico grupo de pTOtefnas a traves de una membrana en particular.

Las enzimas lisosomales son clasificadas en la red del trans Goigi por un receptor proteico unido a membrana que reconoce la manosa 6-fosfatol 5 Ahora consideraremos con mas decalle el sistema que conduce la otra mitad del trMico hasta los lisosomas -las hidrolasas lisosomales especializadas y las protefnas de membrana. Ambos tipos de protefnas se sintetizan en el ER rugoso y son transportadas a traves del complejo de Goigi. Las vesiculas de transporte que conducen estas protein as hasta los endosomas tardfos -los cuales forman mas tarde los lisosomas- parten de la red del trans Golgi, incorporando las proteinas lisosomales y excluyendo todas las demas protefnas, que seran empaquetadas en otras vesfculas de transporte y seran descargadas en otros lugares. tC6mo son reconocidas y seleccionadas las prote(nas Iisosomales can la precisi6n necesaria? Para las hidrolasas lisosomales la respuesta es conocida. Estas hidrolasas presentan un solo marcador en forma de grupos de manosa 6-fosfato (M6P), los cuales son aftadidos exdusivamente a los N-oligosacciridos de estas enzimas lisosomaJes solubles, probablemente mientras estan en ellumen de la red del cis Goigi. Los grupos M6P son reconocidos por los receptores M6P, que son protefnas transmembrana presentes en la red del trans Golgi. Estos receptores unen a las hidrolasas lisosomaJes y ayudan a concentrarlas en vesiculas de transporte especfficas que surgen por gemaci6n de ia red del trans Goigi y acaban fusiomindose con los endosomas tardios, descargando su contenido en ellumen de estos organulos. Como veremos mas adelante, los receptores M6P son empaquetados en vesiculas de transporte espedficas en la red del trans Golgi mediante unas proteinas de recubrimiento especiales que se ensamblan en la sup~rficie citos6lica de la membrana y permiten la gemaci6n de las vesiculas ~esde la red del trans Golgi. Transporte desde la red del trans Goigi a los lisosomas

657

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TAANSPORTE DEPENOIENTE DE RECEPTOR

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UNI6N Al RECEPTOR M6P

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RECIClAJE DEL RECEPTOR

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• EI receptor de manosa 6·fosfato viaja como una lanzadera, adelante y atr:is, entre determinadas membranas l6 EI receptor de la manOS3 6-fosfato une su oligosacarido especffico a pH 7 en la red del trans Goigi y 10 Iibera a pH 6, que es el pH del interior de los endosomas lardios. Asi en CUaniD L1egan al interior de estos endosomas tardios, las enzimas lisosomales se disocian de los receplores M6P y empiezan a digerir el material endocitado transferido desde los cndosomas tempranos. Una vez han liberado las enzimas, los receptores son recuperados y devueltos a la membrana de la red del trails Golgi, mediante ves!culas de transpone que surgen por gemaci6n de los endosomas tardios (Figura 13-23). No se sabe si el Iranspone de vuella al complejo de Golgi requiere un peptido seflal especffico en la cola ciloptasm<1tica del receptor M6P 0 sl tielle lugar por defecto. Este proceso de reciclaje de membralla desde el endosoma tardfo bacia el complejo de Golgi es similar al reciclaje que ocurre entre otros subcompartimientos de las rutas secretora yendocitica que veremos m<1s adelantc. EI proceso de claslficaci6n de las bidrolasas lisosomales es el modelo mejor conocldo de los diversos fen6menos de clasificacl6n mediados por vesfculas de Iransporte que lienen lugar en las celulas eucariotas. Aunque no es probable que en todos los casos se utilice un marcador oligosaearido. la estrategia general es seguramente t(pica de Olros proeesos de clasifieacl6n mediados por vcsfculas. La earga es reconoclda y recogida por los receptores de earga unidos a la membrana, durante el proceso de gemacl6n de vesfculas espeeifieas reeuhienas de c1atrina. Estas ues{clIlas cargadas se fusionan eon una membrana diana espeeifica. la earga es liberada en cl eompartimiento diana y los reeeplores vadas vuelven a su compartimiento original. No toda la earga que esta destinada a aeabar en los Jisosomas lIega a su destino. Pareee que algunas de las hidrolasas lisosomales consiguen escapar del proeeso de empaquetamiento en la red del trails Golgi y son transponadas, vfa la tuta por defecto, a la superficie eelular, desde donde son secretadas al nuido extracelular. No obstante, algunos receptores M6P tambien van a la membrana plasm,Hiea para rccapturar a las hidrolasas lisosomales escapadas y devolverlas mediante endocilosis mediada por reaplor a los Lisosomas vfa endosomas tcmpranos y tardIos. Esta mta basl4rero foe originalmente descubierta en celulas humanas que eran geneticamente defcctuosas en una hidrolasa lisosomal espedfica. Un ejem-

658

FlguraI3-Z3 Transportedelas hldrolasas UsosomaJes reclbJ slntellzadas a los Usosomas. los precursores de las hidrolasas son cliquctados con grupos manosa 6-loslalo (M6P) en la red del cis Golgi. y separados de looas las demas prolcfnas en la red dellTans Goigi. Esta separaci6n ocurre porque las vesiculas rccubiertas con c1atrina que emergen I)or gemaci6n de la red dellrallS Goigi presenlan elevadas concentraciones de receptores espccfficos de manosa 6·fosfato, los cuales unen las hidrolasas Iisosomales. Estas vesiculas se fusionan con los endosomas tardfos. AJ bajo pH de los endosomas tardlos. las hidrolasas se disocian de sus nx:eptores. los cuales se rccicJan hacia el complejo de Golgi para ser reutiJizados en siguienles rondas de transporte. La posterior eliminaci6n del foslato de la manosa de las hidrolasas disminuye la probabilidad de que las hidrolasas vuelvan de nuevo al complejo de Goigi. unidas al receptor.

Capftulo 13: Tr.1fI.co vesicular mediante las rutas SCCTetora yendocltica 7

plo de ella es la enfermedad de Hurler. en la cualla enzima necesaria para la rotura de los glucosaminoglucanos no es funcional. En estos individuos mutantes se acumulan en los lisosomas grandes cantidades de compuestos no digeridos. Por esta raz6n estas enfermedades se conocen con el nombre de enfermedades de aClhnlllo lisosomal. euando se cuhivan las celulas de individuos mutatlleS, se observan los mismos defectos intracelulares. No obstante, si se hace un cocultivo enfre las celulas mulantes y celulas de un individuo normal, dejan de observarse los defectos. Las celulas mutantes son rescatadas porque pueden caplar del medio de cultivo la hidrolasa Iisosomal que no tienen. Mas adelante veremos c6mo el estudio de estas enfermedades han permilido conocer una parte importante del mecanismo de clasificaci6n de las hidrolasas Iisosomales.

Una regi6n sefial en la cadena polipeptfdka proporciona la clave para marcar una enzima lisosomal con la manosa 6-fosfatol 7 EI sistema de clasificaci6n que segrega las hidrolasas lisosomales y las dirige hacia los endosomas tardios funciona porque en el complejo de Golgi se anaden grupos de manosa 6-fosfato tan s610 a las glucoprotein as adecuadas. ESle marcaje especffico requiere un reconodmiento tam bien especffico de las hidrolasas por la enzima del Golgi responsable de afiadir los grupos M6P. Dado que todas las glucoprotefnas abandonan el ER con las cadenas de N·oligosacaridos identicas, la senal para anadir las unidades M6P a los oligosacaridos ha de residir en alguna parte de la cadena polipeplfdica de cada hidrolasa. La adici6n de grupos M6P a las hidrolasas lisosomales est a catalizada por dos enzimas que act11an de rnanera secuencial (Figura 13-24). La primera es una fosfotransferasa con un lugar de reconocimiemo que une especfficamente la hidrolasa, y un lllgarcatalitico; la senal reconodda por ellugar de reconodmiento no es un peptido senal sino una regi6n senal dependiente de conformad6n (vease Figura 12-8). Cuando la hidrolasa esta unida, la fosfotransferasa aflade grupos GlcNAc·P a una 0 dos de las manosas de cada cadena de oligosacarido (Figura 13-25). Entonces una segunda enzima elimina el residuo GlcNAc. creando el marcador de la manosa 6-fosfato (vease Figura 13-24). La mayorfa de las hidrolasas lisosomales tienen varios oligosacaridos, par 10 que adquieren muchos residuos de M6P, 10 cual amplifica enonnemente la senal. As!, mientras que una hidrolasa lisosomal se une al sHio de reconodmiento de la fosfolransferasa con una constante de afinidad (K,) de aproximadamente 105litros/moI. la hidrolasa multifosforilada se une al receptor M6P con una Ka de aproximadamente 109 litros/mol. 10 eua] supone un incremento en la afinidad de 10 000 veces.

H

,

I

GICNAC

Los defeclos en la GlcNAc-fosfotransferasa causan una enfermedad de acumulo Iisosomal en humanos 18 Las enfermedades de aClimulo lisosomai estan causadas por defectos geneticos que afectan a una 0 mas de las hidrolasas Iisosomales, 10 cual provoca una acu1I1ulaci6n en los lisosomas de sus substratos no digeridos. Este acumulo tiene Figura 13-24 Sfntesls del marcador manosa6·fosfato sobre una hldrolasa IlsosomaJ. La sfntesis ocurre en dos pasos. En primer lugar, la GIcNAc fosfotransferasa transfiere residuos de GlcNAc-P a la posici6n 6 de diversos residuos de manosa de los N-oligosacaridos de la hidrolasa tisosomal. En segundo lugar, una fosfogluCQsidasa etimina el residuo GlcNAc. generando el marcador manosa 6-fosfato. La prirnera enzima esta activada espedficarnentc par una zona sefial presente en las hidrolasas lisosornales (vease Figura 13-25), mientras que la fosfoglucosidasa es una cnzima no espedfica. Esta rnodificaci6n de determinados residuos de manosa en la red del cis Golgi protege las manosas de ser eliminadas por las manosidasas que mas tarde encontrarlin en el cornpartimiento medial del Golgi. Transporte desde la red del trans Golgi a los Usosomas

fosfotrlll"lsforaso

It

G.N", fO$foglucosids&a

0- 0-

I t'H2

manoss 6-fosfato

659

hidrolan li.o.omal

UNI6N DE LA ZONA SCNAl

~

llUGAROE

RECONOCIMIENTO

P

1IlfP\'P'--~ UNl6N AllUGAR UOP-Gk:NAc

CATALfncO

TRANSFERENClA

DElGRUeo Gk:NAc -(t) A UNAMANOSA DEllUGAR CATAL1nCo

~

l!I0 UMP

luger calaHtico

consecuencias patol6gicas profundas. Habilualmente, se producen como consecuencia de una mutaci6n en un gen estruclural que codifica una hidrolasa lisosomal; este es el caso de la enfermedad de Hurler, mencionada anleriormente. No obstante, la forma m
Resumen Los llsosomas esUfn especializados ell In digesti6n illtracellllnr. Co"tieflen protefnas de membrana caracterlstlcas y IIna ampliLI varledad de el/.zimas '.idrol(tic:as qlle trabaJan meJora pH 5, que es el pH /ntemo tk las llsosamas. El pH dc/do tk los 660

Capitulo 13: Tranco vesicular mediante las rutas secrctora yendocfUca

lug., dtI fGConocimienlO

hid,ol.sa 1;_O~1 con un grupo GIcNAe-W unido a una manon de un ol;gosa~rido

Figura 13-25 Reconoclmlento de una hldroluallsosamal. La enzima GlcNAc fosfotransferasa, que reconoce las hidrolasas lisosomales en el complejo de Golgi. tiene un lugar cataHtico y un lugar de rf!(;onocimlento separados. E1lugar catalftico une N·oligosacMidos ricos en manosa y UOP-GIcNAc. Ellugar de reconocimiento se une a una zona senal que I1nicamente se encuentra sabre la superfiae de las hidrolasas lisosomales.

llsosomas se numtiene por Will bomba de ATP de su membrana, que imp"lsa protones. Las prote£nas lisosomales recMn slntetizadas son transferidas al IlImerJ del ER, son transportadas a tra~ (ul complejo de Golgi, y '"ego condlU:idas por medlo de ves£cul.as de tmnsporte desde la red del trans Golgi a los elUwsomas tardfos. Las hidrol.asas lisosomales contlene" N-oligosactfrilWs ql~ son modijietUlos (;(JlJ(l.lentemellte de "na forma caraeterlst/ea en la red del cis Golgi, de manera ql~e sus residuos de manosa son fosforiltufos. Estos grllpos de ulllnosa 6-fosfato (M6P) son reconocidos por UII receptor de la red del trans Golgi, el cual separa las IJidrolasas del nsto de las moleculas y aylul.a a empaqlletarlas en el Interior de ves£culas de transporte, las cuales desCllrgtUl su conten/do ell los emtosomas tard£os y desplI~s en los lisosomas. Estas ves£eulas de tmnsporle aetlia" como 1m serv/do de transporte que desplaza el receptor M6P de 1m '"gar a otro, e"tn la red del trans Golgi y los e"dosomas tard£os. El hajo pH de los endosonuu tard£os disocia las lIidrolasas lisosomales de Sll receptor, luu:iendo que el transporte de las hidrolasas sea Imidinee/anal.

Transporte desde la membrana plasmatica via endosomas: endocitosisl 9 Las rutas que llevan hacia los lisosomas desde la superficie celuiar empiezan con la endocltosis, mediante la cuallas celulas captan macromohkulas, sustancias particuladas y, en casos especiales, otras celulas. La substancia que va a ser ingerida es rodeada progresivamenle por una pequena porci6n de la membrana plasmatica, que primero se invagina y luego se es· {rangula formando una vesfcula intracelular que contiene el material ingerido. En funci6n del tipo de vesfculas que se forman, se pueden discinguir dos tipos de endocitosis: la pillocirosis ("bebida de la celula"), que implica la ingesti6n de fJuidos y de solutos vfa pequenas vesfculas (S150 nm de diametro); y lafagocitosis ("comida de la celula") que compona la ingesti6n de grandes partfculas tales como microorganismos 0 restos celuiares, mediante grandes vesiculas llamadasfagosomas, generalmente de diametro superior a 250 nm. Aunque la mayorfa de las celulas eucariotas ingieren continuamente fluidos y solutos par pinocitosis, las grandes particulas son ingeridas principalmente par celuJas fagocfticas especializadas.

CITOSOL

j

Jl PEROXISOMA

NUCLEO MITOCONDRIA

pLASTIDOS

!RET[CULO ENDOPLASMATICol GOLGI

USOSOM~I I~

VES[CULA:sl SECRETORAS

I ENOOSOMA

1t SUPERFICIE CELULAR

Colulas fagocfticas especializadas pueden ingerir grandes partfcuJas20 La fagocitosis es una forma especial de endocitosis en la que se ingieren grandes partfculas, tales como microorganismos y restos de celulas, vfa grandes vesfculas de endocitosis llamadas fagosomas. En los protozoos, la fagocilosis constituye un sistema de alimentaci6n: las grandes partfculas atrapadas en los fagosomas acaban en los lisosomas, y los productos de los procesos digestivos posteriores pasan al dtoplasma donde son utilizados como alimento. La mayor(a de las ceo lulas de los organismos pluricelulares son incapaces de ingerir grandes partfculas de forma eficaz. En el intestino, las grandes partfculas de alimento son fraccionadas fuera de las celulas antes de ser captadas por elias. En la mayorfa de los animales la fagocitosis es importante en otras procesos diferentes al de la nutrici6n, y la lIevan a cabo celulas especializadas que son fagocitos "profesionales". En los mamfferos existen dos tipos de gl6bulos blancos que actuan como fagoci{as: los macr6fagos (que ademas de encontrarse en la sangre, se hallan ampliamente distribuidos en los lejidosl y los neut:n:Sfiios. Estos dos tipos de celulas proceden de un precursor cornun (discutido en Caprtulo 22), y nos defienden contra las infecciones mediante la ingesti6n de los microorganismos invasores. Los macr6fagos tambien desempenan un importante papel en la eliminaci6n tanto de celulas viejas y lesionadas como de restos celulares. En terminos cuantitativos, esta ultima funci6n es la mas importante: en cada uno de nosotros los macr6fagos fagocitan mas de 1011 eritrocitos viejos cada dia. Transporte desde la membrana plasml!tica via endosomas: endocitosls

661

Mientras que las vesiculas endocfticas implicadas en la pinocitosis son pequeJ1as y uniformes, el diametro de los fagosomas esta determinado por el tipo de partfcuJas que ingieren. y pueden lJegar a ser tan grandes como la propia celula fagocftica (Figura 13-26). Los fagosomas se fusion an con los lisosomas, yel material ingerido es degradado; en los Iisosomas permanecen subslaneias no digeribles, formando cuerpos residuales. Algunos de los componenles de la membrana plasmalica inrernalizada son reeuperados del fagosoma medianle vesiculas de transporte y devueltos a la membrana plasllHltiea. Para que una partfcula sea fagoeitada, primero ha de unirse a la superfide del fagocito. No obSlallle, no se ingieren todas las partfculas que pueden unirse. Los fagocitos tienen toda una gama de receptores de superficie especializados que se encuentran unidos funcionalmente a la maquinaria fagocftiea de la celulao A difereneia de la pinoeitosis, que es un proceso eonstitutivo que oeurre eontinuamente, la fagocitosis es un proceso regulado en el que los receptores activados transmiten la selial al interior de la celula, iniciandose la respuesta. Los reguladores mejor caraeterizados de este proceso son los antieuerpos, que nos protegen contra los microorganismos infeeeiosos uniendose a su superficie formando una cubierta en la que las colas de los antiellerpos (llamadas regiones Fe) se hallan expuestas al exterior. Esta eubierta de antieuerpos es reeonocida enlonees por los receptores Fc de la superficie de los maer6fagos y de los neutr6fi1os (vease Figura 23·20). La uni6n de part[culas recubierlas por anticuerpos a estos receplores induce a la celula fagocftiea a extender pseud6podos que engullen a la partkula, formando un fagosoma (Figura 13-27). Se han caraClerizado algunas olras clases de r"C''" (Ores que provocan fagocitosis: por ejemplo, los que reconocen el complemenlo (una c1ase de moleculas que circulan por la sangre y que colaboran con los anticuerpos marcando las celulas indeseables para ser destiuidas, discutido en Capitulo 23), y los que reconocen directamente oligosacaridos de la superficie de dertos microorganismos. No se sabe que receptores de los macr6fagos reconocen las celulas viejas 0 daiiadas, aunque se sospecha que en algunos casos estan implicadas las protefnas de adhesi6n eelular de la familia de las integrinas (discutido en Capftulo 22).

Figura 13·26 Fagocitosls por un macr6fago. Electronmicrografla de barrido de un macrMago de rat6n fagocitando dos eritrocitos modificados quimicamente. Las flee/I'as rojas indican los bordes de las finas extensiones (pseud6podosJ del macr6fago que se proyectan como collares engullendo los eritrocitos. (Por cOrlesfa de Jean Paul Revel.l

Las vesiculas de pinocitosis se forman en la membrana plasmatica a partir de depresiones revestidas 21 Pnkticamenle lodas la celulas eucariotas ingieren continuamente zonas de su membrana plasmatica en forma de pequefias vesiculas pinocflicas (endocfticas)

bacteri~

-jr-.c---e-pseud6pOdo

membr~n8

pl8sm~tlca

662

Capftulo 13: TrMico vesicular mediante las rutas secretora yendodtica

Figura 13-27 Fagocitosls por un neutr6fiJo. Electronmicrograffa de WI neutr6filo fagocitando una bacteria que se hallaba en proceso de divisi6n. (Por cOrlesfa de Dorothy F. Bainton.)

L-..J

0.1 11m

que posteriormente relaman a la superficie de la celula. La velocidad a la que se internaliza la membrana plasm
Figura 13-28 Formacl6n de vesCculas revestidas de c1atrlna a partir de la membrana plasmatlca. Electronmicrograffas que ilustran la probable secuencia de acontecimientos durante la formaci6n de una vesfcula rcvestida de clatrina a partir de una dcpresi6n revestida de clatrina. Las depresiones y las vesiculas revestidas que apareeen en las fotograffas son mueho mayores que las que se presentan en las celulas de tamano normal. InteMenen en la eaptaci6n de lipoprolefnas en un gran oocito de gallina, fonnando la yema del huevo. En In superficie extracelular de la membrana plasm
Las depresiones revestidas de clatrina pueden actuar como un mecanismo concentrador internalizando macromoleculas extracelulares especfficas22 En la mayorfa de celulas anirnales, las qepresiones y las vesfculas revestidas de clatrina proporcionan una ruta eficiente para captar macromaleculas especffiTransporte desde la membrana plasmalica vea endosomas: endocitosis

663

cas del fluido extracelular, un proceso Ilamado endocltosis mediada por receptor. Las macromoleculas se unen a receptores complementarios de la superficie celular (protefnas transmembrana), se acumulan en depresiones revestidas, y entran en la celula en forma de complejos receptor·macromolecuJa en vesfculas recubiertas de clatrina. EI proceso es muy similar al empaquetamienro de las hi· drolasas Hsosomales en el complejo de Goigi. AlIf, como hemos visto, las molecu· las que han de ser transportadas tambien se unen a receptores especfficos de la membrana (receptores M6P) y son capturadas en vesiculas de membrana que abandonan el compartimiento y se desplazan por el citosol. Ademas, la gemaci6n desde el complejo de Golgi de vesfculas cargadas can las enzimas lisosomales tambien tienen lugar mediante un revestimiento de clatrina (vease Figura 13·23). Como discutiremos mas adelante, se supone que, tanto para la membrana plas· matica como para la del Golgi, la formaci6n del recubrimiento en la cara citos6li· ca es la responsable de la invaginaci6n. La endocitosis mediada por receptores proporciona un mecanisme de con· centraci6n selectivo que incrementa la eficiencia de la internalizaci6n de deter· minados ligandos mas de 1000 veces. De esta manera se pueden captar especffi· camente y en grandes cantidades componentes incluso minoritarios del fluido extracelular, sin internalizar el gran volumen correspondiente de fluido extrace· lular. Un ejemplo bien conocido y fisiol6gicamente importante es el proceso mediante el cuallas celulas de los mamfferos captan el colesterol.

Las celulas importan colesterol par endocitosis mediada par receptor 23 Muchas celulas animales captan colesterol por endocitosis mediada por recep· tor y asf adquieren la mayor parte del colesterol que necesitan para la sfntesis de las membranas. 5i esta ingesti6n se bloquea, el colesterol se acumula en la san· gre y puede contribuir a la formaci6n en las paredes de los vasos sangufneos de plaeas ateroscler6ticas (dep6sitos de 1fpidos y de tejido fibroso que causan apo· plejfas e infartos de miocardio al impedir la' circulaci6n sangufnea). De hecho, fue a traves del estudio de humanos con una alta predisposici6n genetica por la aterosclerosis que se conoci6 por primera vez el mecanismo de endocitosis me· diada por receptor. La mayor parte del colesterol se transporta en la sangre unido a protefnas, formando unas partfculas conocidas como llpoprotefnas de baJa densldad, 0 LOL (de Low Density Upoproteins; Figura 13·29). Cuando la celula necesita co· lesterol para la sfntesis de membranas, produce protefnas receptoras de LDL y las insecta en su membrana plasmatica. Una vez en la membrana, los receptores de LDL difunden hasta asociarse con depresiones revestidas de clatrina que se hallan en proceso de fonnaci6n (Figura 13-30A). Dado que las depresiones reo

LDL

I IAI re<:eplor proleico de LOL h.lgar de union a la depreslon revest ida

depruion revestlde de cletrine

IBI membrana pl8lm'tlce

664

Capitulo 13: TrMico vesicular medIante las mtas secretora y endocftica

22 nm

moillcula de lodoHpido mohk:ula de tlster de coleSlerol protrusion superficlel de Ie molkule proleice

Figura 13·29 Upoprote£na de baja densldad (LDL). Cada partfcula esferica tiene una masa de 3 x IQ6 daltons. En la regi6n central contiene alrededor de 1500 mol~culas de ~steres de colesterol esterificado con acidos grasos de cadena larga. Esta regi6n central esta rodeada de una monocapa Iipfdica de unas BOO mol~culas de fosfolfpido y unas 500 de colesterol no esterificado. Ademas presenta una unica mol~cula de protefna, de unos 500 000 daltons, que organiza la partfcula y que es la responsable de la uni6n especffica de las LOL a las protefnas receptoras de la superficie de las c~lulas.

Figura] 3·30 Re<:eptores normales y mutantes de LDL. (Al Protefnas receptoras de LDL unidas a una depresi6n revestida de la membrana plasmJ1tica de una c~lula nonnal. EI receptor humano de LDL es una glucoprotefna transmembrana de paso unico compuesla de unos B40 residuos de aminoJ1cido, de los cuales unicamente 50 se hallan en ellado citoplasmatico de la membrana. (B) Celula mutanle en la que las protefnas receptoras de LOL son anormales porque carecen del dominic eiloplasmJ1tlco que les pennite unirse a las vesfculas revestldas. Estas e~lulas unen LOL pero no pueden eaptarlas. En la mayona de poblaciones humanas, uno de cada 500 individuos liene un gen que codifiea un receptor de LOL a1terado, y como consecuencia de ella, liene una elevada probabilidad de morir prematuramente de un infano de miocardia debido a la aterosclerosis.

vestidas se separan constantemente de la membrana formando vesfculas revestidas, cualquier partfcula de LOL que se halle unida a los receptores en las depresiones revestidas es n\pidarnente internalizada. Despues de desprenderse de su cubierta de c1atrina, las vesfculas de endocitosis liberan su contenido en los endosomas tempranos, que se encuentran cerca de la periferia celular. Una vez en eJ compartimiento endosomal, las LOL pasan a los endosomas lardios y de ellos a los Iisosomas, donde se hidrolizan los esteres de colesterol dando lugar a colesterol Iibre, que de esta forma queda a disposici6n de la celula para la biosfntesis de membrana. 5i se acumula demasiado colesterollibre en la celula, esla detiene tanto la sfntesis de colesterol como la sfntesis de protefnas receptoras de LDL, con 10 que la celula produce y absorbe menos colesterol. Esta via regulada para la absorci6n del colesterol est~ perturbada en algunos individuos que heredan unos genes defectuosos para la producci6n de protefnas receptoras de LDL y, por consiguiente, sus celulas no pueden captar LDL de la sangre. Los niveles elevados de colesterol en sangre resuJtantes predisponen a estos individuos a una aterosclerosis prematura, y la mayona de ellos mueren a una edad temprana de un infarto de miocardio como consecuencia de alteraciones de las arterias coronarias. La anomalfa se puede atribuir al receptor de LDL, el eual puede estar ausente 0 ser defectuoso -bien en su lugar de uni6n extracelular para las LDL 0 bien en ellugar de uni6n intraeelular que fija el receptor aI revestimiento de las depresiones revestidas de clatrina (vease Figura 13·30B). En este wtimo caso, el numero de protefnas receptoras que unen las LDL es normal, pero no pueden localizarse en las regiones revestidas con clatrina de la membrana plasm~tica. Aunque las LDL se unen a la superficie de estas eelulas mutantes, no se incorporan a la celula. Este hecho demuestra directamente la importancia que tienen las depresiones revestidas de clatrina respecto a la endocitosis mediada por receptor del colesterol. Se han deseritom~sde 25 reeeptores diferentes que participan en la endociIOsis mediad a por receptor de diferentes tipos de moleculas, y todos ellos aparememente uti!izan la misma ruta de las depresiones revestidas de clatrina. Muchos de estos receptores, como el receptor de las LDL, entran en las depresiones revestidas independientemente de si se han unido 0 no a sus ligandos especffi· cos; otros entran s610 si se han unido a su ligando especffico, 10 cual sugiere que es necesario un cambio conformacional induido por elligando para- Ilegar a las depresiones. No obstante, no todas las protefnas de la membrana plasm~tica se aeumulan en depresiones revestidas de clatrina, 10 cual indica que estas depresiones acnJan como mtros moleculares recogiendo ciertas protefnas de la membrana plasm~tica (receptores) y excluyendo a otras. Estudios de electronmicroscopia de celulas cultivadas expuestas a diferentes Iigandos (que se han marcado para hacerlos m~s visibles al microscopio elecrr6nico) han demostrado que en una misma depresi6n revestida se agrupan muchas c1ases de receptores. La membrana plasm~rica de una depresi6n revestida de clatrina puede acumular probablemente unos 1000 receptores de varias clases. Aunque todos los comple· jos receptor-ligando que utilizan esta ruta endocftiea terminan aparentemente en el mismo compartimiento endosomal, el destino posterior de las moleculas endocitadas varia, como veremos ahara.

EI material endocitado termina frecuentemente en los lisosomas24 El compartimJento endosomal puede ser reconocido al microscopic electr6nico anadiendo aI medio extracelular una molecuJa facilmente detectable, como la enzima peroxidasa, y pennitiendo que las celulas la capren por endocitosis a diferentes tiempos. La distribuci6n de la molecula despues de ser caprada revela que el compartimiento endosomal es como una serie de tubulos heterogeneos rodeados de membrana y vesfculas que se distribuyen desde la periferia de la celula hasta la regi6n perinuclear, donde a menudo se observan cerca, aunque ffsicamente separados, del complejo de Golgi. Mediante estos experimentos de marcaje pueden distinguirse rapidameme dos series de endosomas: aI cabo de un mi· Transporte desde la membrana plasm~t1ca vfa endosomas: endocltosls *

665

nuto, las mol&:ulas endocitadas aparecen en los endosomas tempranos, justa par debajo de la membrana plasmo1tica, y al cabo de 5-15 minutos en los endosomas tardios, allado del complejo de Golgi y cerca del nucleo (Figura 13-31). Como ya mencionamos, el inlerior del compartim..ienlo endosomal es o1cido (pH -6) debido a la presencia en 13 membrana del endosoma de bombas dirigi· das por ATP que bombcan H· desde el citosol hacia ellumen. En general, los endosomas tardios son mo1s ticidos que los tempranos. Este ambiente o1cido juega un papel crucial en la funci6n de estos orgo1nulos. Se cree que una ATPasa de Ho vacuolar similar 0 identica a esta es la responsable de la acidificaci6n de todos los orgAnuJos endociticos y exocfticos. incluyendo ragosomas, lisosomas. delerminados compartimientos del complejo de Golgi y muchas vesrculas secretoras y de transporte. Va hemos visto c6mo los materiales endocitados que 1Iegan a los endosomas t'ardfos se mezclan con hidrolasas Iisosomales recien sintetizadas y acaban en los Iisosamas. No obstante, muchas moleculas se salvan cspecfficamente de su ,cslrucci6n y son recidadas desde los endosomas tcmpranos hacia la membrana plasmtitica, mediante vesfculas de transporte. Como resultado de ella, s610 se degradan las moleculas endocitadas que no son recuperadas de los endosomas.

Determinadas prote(nas son recuperadas de los endosomas tempranos y devueltas a la membrana plasmliticalS EI compartimiento endosomal primario actua como la principal estaci6n de c1asificaci6n en la rula endocftica, tal como 10 hace la red del trans Golgi en la vfa biosintelica-secretora. En el ambiente o1cido del endosoma temprano, muchos receptores internalizados cambian su conformaci6n y liberan su Iigando, como tambien ocurre en los receplores M6P con sus hidrolasas Iisosomales en los aun mo1s o1cidos endosomas lardios. Normalmente, los Iigandos endocilados que se disocian de sus receptores en el endosoma temprano estAn predestinados a ser destruidos en los Iisosomas, conjuntamente con los otros contenidos del endosoma no unidos a membrana. No obstante, algunos otros I,igandos endocitados permaneccn unidos a sus receptores y companen su destino. EI destino de los receplores -y de algunos Iigandos unidos a ellos- varia segUn cl tipo de receplor de que se trate: (1) la mayona de ellos retoman al mismo dominio de la membrana plasm:itica de donde proceden; (2) algunos viajan has666

CaprtuJo 13: Tr;1flco vesicular mcdJante las rutas secretora y endocftlca

Figura 13·31 Relacl6nentrelos end050mas tardlos y otros compartJmlentos membran05OS. (A) CeluJas cultivadas de riMn de hamster ;oven (BHK, de Baby Hamster Kidney) fueron Incubadas en una soluci6n conteniendo la enzima peroxidasa. durante IS minutos, 10 cual es suficiente para que 1a peroxidasa sea caplada por endocitosis de fase Ouida y transportada hasta los endosomas lardfos. pero no suficiente para que haya lIegado a los lisosomas. Despu& de que las celulas fuesen fijadas y expuCSlas a un substrato de In peroxidasa, el produclo de la reacci6n se hizo denso a los electrones mediante la fijaci6n con teu6xido de osmio. (8) Reconstrucciones seriadas de endosomas tardfos (azul), EH (amarillo), y complejo de Goigi (raja) a partir de electronmicrograflas, una de las cuales se muestra en (A). La reconstrucci6n fue dibujada a parlir de 18 secciones ultrafinas seriadas. En (Al el nucleo se indica con una N y en (B) se muestra en verde. (A, de M. Marsh. G. Griffiths. G. Dean. I. Mellman y A. Helenius. Proc. NOlL Acad. Sci. U~ 83:2899-2903, 1986: B, por cortes!a de Man: Marsh.)

Figura 13-32 Poslbles desHnos de los receptores transmembrana que han sldo endocitados. Se muestran tres rutas que parten del compartimiemo endosomal en una cclula epitelial. Los receptores que no son recuperados especfficamente de los endosomas siguen la ruta desde el compartimiento endosomal hasta los iisosomas, donde son degradados. Los receptores recuperados pueden retornar tanlo a1 mismo dominio de la membrana plasmAtica del que partieron (reciclajel como a un dominio diferente de la membrana plasmalica (transcitosis). Si el ligando que es endocilado con su receptor sigue unido a el en el entomo l'icido del endosoma, seguira la misma ruta que el receptor; en caso eontrario, sera deseargado en los lisosomas.

la los lisosomas, donde son degradados; y (3) otros relOman a un dominio diferente de la membrana plasmatiea, mediando asf un proceso Uamado transcilosis (Figura 13-32). EI receptor de LOL sigue la primera de estas rutas. Se disoda de su ligando LOL en el endosoma y es reciclado hacia la membrana plasmarica para su reutilizaci6n, mientras que la LOL descargada es transportada a los Iisosomas (Figura 13-33). Un reciclaje similar a este, aunque mas complejo, riene lugar despues de la endocitosis de la transfcrrlna, una prolefna que transporta hierro por la sangre. EI receptor de la transferrina de la superfide celular descarga la transferrina, con el hierro unido, en los endosomas tempranos mediante un proceso de endocitosis mediada por receptor. EI bajo pH del endosoma haee que la transferrina libere el hierro que Iransporta. La transferrina Iibre de hierro (Ilamada apotransferrina) permaneee unida a su receptor y es reciclada a la membrana plasmalica como un complejo receplor-apotransferrina. Cuando relorna al pH neutro del fluido extracelular, la apolransferrina se disocia del receptor, par 10 que puede volver a unir hierro y empezar de nuevo el cicio. De esta forma, la rransferrina actua como una lanzadera entre el fluido extracelular y el compartimiento endosomal, evitando entrar en co.nlacto con los lisosomas y repartiendo el hierro que las celulas necesitan para crecer. La segunda ruta que pueden seguir a partir de los endosomas los receplOres endodtados es la que sigue el receptor que une a1faclorde crecimieflto epidermico (EGF, de Epidermal Growth Factor), una pequella protefna que eSlimula la divisi6n de las celulas de la epidermis y de otros tipos celulares. A diferenda de los receptores de LOL, estos receptores unicamente se acumulan en depresiones revesridas despues de haber unido EGF. Ademas, muchos de ellos no se redclan

~ de

membraM pla$mjl~

lOt

CITOSOl ENDOClTOSIS

\

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vesicula ~' EliMINACION DEL revntida .... REVESTIMIENTO

"

-

endosoma temprano

APARICION DE VESICULAS DE TRANSPORTE

FUSION CON EL ENOOSOMA

COleSlerOI libre

....; ..... ::'. '

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RETORNO DE LOS RECEPTORES OE LOLA LA MEMBRANA PLASMATICA

\

I

.,-~...... I .. ....' : :.'......

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•

••

enzimas hidrolfticas

li.osoma

Transporte desde la membrana plasm~lica via endosomas: endocitosis

1. recichtjt

~lisosoma mambrana plasmatica basolate.al

nucleo

•

Figura 13·33 Endocltosisde LOL medlada por receptor. N6tese que en" el ambienle acido del endosoma, la •b LDL se disocia de su receptor. Despues de una serie de pasos (vease Figura 13-34), la WL acaba en los lisosomas, donde se degrada y se libera en forma libre el colesterol que contenfa. EI receptor proteico de LDL vuelve a la membrana plasml'itica vfa lransporte de vesfculas que, tal como se muestra en la figura. brotan de la regi6n tubular del endosoma. Para simplificar el dibujo, se muestra un solo receptor de LDL que entra en la celula y que relorna a la membrana plasmatica. Estc ocupado 0 no. tfpicamente cada receptor de LDL realiza un cicio completo. hacia ademro y de nuevo hacia la memhrami de la celula, cada 10 minutos, dando un total de varios ciemos de vueltas en su vida media de 20 horas.

667

Figura 13-34 La vfa endocftJca desde la membrana plasmatlca a los Ilsosomas. Ellransporte desde los endosomas tempranos a los endosomas lardios tiene lugar mediante grandes ves(culas de transporte endosomal, las cuales contienen una gran cantidad de membrana invaginada y por ella reciben el nombre de cuerpos muitivesicuiares. No esta claro sl deben ser considerados como elldosomas de mediana edad que se desplazan hacia el interior celular a medida que madman, 0 bien como unos compartimientos de transporte distintos. Su movimiento tiene lugar mediame microtubulos y puede ser experimentalmente bloqueado con drogas que los despolimericen. Finalmente, puede que los endosomas tardfos se conviertan en lisosomas. Entre los endosomas temprallos y la superficie celular existen unas vesfculas de transporte que reciclan material. mientras que otro tipo de vesfculas hacen 10 mismo entre los endosomas tardios y la red del/fans Golgi.

"C>\ erldosoma temprerlO

La relaci6n entre endosomas tempranos y tardfos es incierta26 No esta claro c6mo se desplazan las moleculas endocitadas de un compartimiento endosomal a otto y acaban en los lisosomas. Una hip6tesis serfa que los . endosomas tempranos van desplazandose lentamente hacia el interior de 10. celula y pasan a ser endosomas tardfos; estos se convierten en lisosomas como resultado de su fusi6n can las vesiculas que transportan hidrolasas desde 10. red del trans Golgi, de su continuo reciclaje de 10. membrana y de su incremento de 10. acidificaci6n. Olra hip6tesis serfa que los endosomas lempranos y tardios son dos compartimientos separados y que el transporte entre elias tlene lugar a traYeS de un compartimiento intermediario de transporte -mediante una red dinamica de tUbulos 0 mediante el desprendimiento de trozos del endosoma temprano que son transportados aI interior celular, donde se fusionan con los endosomas tardios (Figura 13-34). Los endosomas tempra~s y tardios se diferencian, en reaUdad, en su composici6n proteica: concretamente, estan asociados con diferentes protefnas rab, las cuales son importantes para dirigir el transporte vesicular, como veremos mas adelante (vease Tabla 13-1, pag. 689).

Las macromoleculas pueden ser transferidas a traves de las himinas de celulas epiteUales mediante transcitosis 27 Algunos receptores de la superficie de las celulas epiteUales polarizadas transfieren macromoleculas espedficas desde un espacio extracelular a otro, mediante un proceso Uamado transcitosls. Estos receptores siguen la tercera via descrita a partir de los endosomas (vease Figura 13-32). Las ratas recien nacidas, por ejemplo, obtienen anticuerpos de la leche materna (que les ayudan a protegerse de las infecciones) transportandolos a traves de su epiteUo intestinal. EI lumen del intestino es algo acido, y a esee bajo pH los anticuerpos de la leche se unen a receptores especfficos de la superficie apical (absortiva) de la celulas epiteliales del intestino y son internalizados via depresiones y vesiculas revestidas de cJatrina, y transferidos a los endosomas tempranos. Los complejos receptor-anticuerpo permanecen intactos en los endosomas y son recuperados en vesfculas de transporte que se fusionan con el dominio basolateral de la membrana plasmatica. Al ser expuestos al pH neutro del fluido extracelular, los anticuerpos se disocian de sus receptores y entran en el torrente circulatorio de los recien nacidos. En la madre, la secreci6n de estos anticuerpos a la leche tam bien tiene lugar por transcitosis, pero en direcci6n opuesta, desde la sangre hasta la leche. Otras ma666

Capitulo 13 : Tnillco vesicular mediante las rulas sccrClora y cndocftica

~

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0 /

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I

microtubulo

TAANSPORTE MEDIAOO PaR

MICROTUBULOS

erldosome tardio

sino que acaban en los lisosomas, donde son degradados con el EGF. Por consiguiente, la uni6n de EGF conUeva un descenso en la concenlraci6n de los receptores de EGF en la superficie celular -un proceso llarnado regulaci6n por disminuci6n (down regulation). Como resultado de ella, la concentraci6n delligando sefial en el medio cxtracelular regula el numero de maleculas de receptor complementario de la superficie de la celula diana (discutido en Capftulo 15).

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red del tr,rlS

Goigi

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membrana@)_ plasmAliea apical endosoma temprano basalaleral

-()

membrana plnmAtie. apical

I

Figura 13·35 Dos compartlmlentos endosomales tempranos dlstlntos en una c~JuJa epltellal. Los dominios basolateraJ y apical de la membrana plasmtitica comunican con dislinlos compartimientos endosomales tempranos, a pesar de que las mol~ulas endocltadas en ambos dominios que no tienen senales para su reciclaje 0 lransellosis se encuentnln en un compartimlenlo endosomal tardio comun anles de ser digerldas en los llsosomas.

membfana

pl..mlilie. basalalefal

•

•

mfferos, incluidos los humanos, tambie;n transportan anlicuerpos a la leche de esta manera, pero los anticuerpos permanecen en el intestino del reei~n naeido y no entran, como pasa en las ratas, en el torreme ciTculatorio. EI hecho de que los diferentes receptores puedan seguir diferentes caminos a partir de los endosomas impliea que, ademas de un lugar de uni6n para el Ligando y olro para la depresi6n revestida, muchos receptores tambi~n han de presentar senales de c1asificaei6n que los gufen desde el endosoma hasta la vesfcula de transporte apropiada, y por 10 tanto a la membrana adecuada de la c~lu­ la. Se deseonoce todavia la naturaleza de estas senales.

Las celuJas epiteliales tienen dos compartimientos endosomales tempranos distintos pero un solo compartimiento endosomal tardio comun.28 En e~lulas epiteliales polarizadas, la endocitosis ocurre tanto en el dominio basolateral de la membrana plasm
Resumen Las dluku ingkren maeromolkulns por endocitosis: tkterminadas regionn tk 10 membrana plasnuftktl se invag/nan y se desprenden !omumao vesiculas etuloclli. cas; mudlaS tk laJ particulas y molkuJas endocitattas acaban en los lisosomas,

doruli son degradadn.s. lA endocitosis tiene lugar tanto constitutilJQmenle como en respuestn a seiinln e..rtracelulores. lA en.dodtosis es tan frecuenle en mucluu dluJas que una importantefrtu:d6n tk 10 membrana plasnuftico es intemalizada cada hom. Los componentes tk 10 membrana plasnuftktl {prote{nas y lfpUlDsJ son continuamenle tkuueltos a 10 superficie celulor mediante un gran cklo endocftico-uodtko medlado prlru:ipal·

Transporte desde la membrana plasmti.tiea vfa endosomas: endocilOSis

669

mente par depresiones y veslc.das revestida$ de clatrlna. Muchos receptores de Ia superjide celular que SIt unen a nuu:romolkulas umu:elulares espedJicas acaban loaJliz4IIdou en Ins depreswnn revestidas de ctatrlna y, "or io wnW, son internalizndos en veslculas tw:ubkruu de tlatrlna -un proce.so denominado endodtosis mediada por rt!Uptor. Las veslculas endocfticas N!lJle$tidas piertkn nfpidamente su cu· bkrta de clatrlnn y SIt [wronan con los endosonuu temprano$. La mnyorla de ligatulos SIt separan de sus reaptons en el ambiente dcido de los endosonuu y actI· ban en los lisosonuu, mientras que Ia mayorln de reaptons son redclado.s a Ia su· perftciecelular mediante ueslculas de transporte, y son reutilizados. Pero los compk· jos receptor·ligatulo pueden seguir otms ndm desde el compartimiento endosomaL En algunos casos tanto el receptor como eiligando acaban degrtuldndose e" los liso· somas, dando lugar a Ia "regulaei6n por disminucwn del receptor. En otros casas, ambos son transferldos a un dominio de Ia membrana plasnuftiat diferente y, por 10 tanto, elligando es liberado por exocitosis en una superficie de Ia dlula diferente de In deorigen -un proce.so llanuulo transcitosis. H

CITOSOl

Transporte desde la red del trans Golgi hasta la superficie celular: exocitosis29 NUClEO

Habiendo considerado el sistema digestivo interno de la celula y los diversos ti· pos de trarko de membranas que convergen en los lisosomas, ahora volveremos al complejo de Goigi y examinaremos las rutas secretoras que conducen al exte· rior celular, Norrnalmente, las vesiculas de transporfC destinadas a la membrana plasm<1tica abandonan el trans Golgi siguiendo un flujo constante. Las protefnas de membrana y los Ifpidos de estas vesfculas aportan nuevos componente a la membrana plasm<1tica celular, mientras que las prote{nas solubles de estas vesf· culas son secretadas al espacio extraceluJar. La fusi6n de las vesfcuJas con la membrana plasm:itica se llama exocllosis. De esla forma, por ejemplo, las cl!lu· las producen y secretan la mayoria de los proteogJucanos y g1ucoprotefnas de la matriz e:ctrtu:elillar, como se discule en el Capitulo 19. Todas las cl!lulas necesilan esla ruta de secrecl6n constitutiva. No obslante, las uluJas especializadas en la secreci6n disponen de una segunda nlla seerelo· ra en la que las protefnas solubles y otras subslancias se almacenan primero en vesiculas de sec;reci611 y son segregadas m<1s tarde. ~Ia es la ruta de secrecl6n reo gtdada, que se encuenna principalmeme en cl!lulas especializadas en secrelar rapidamenle productos como las hormonas, neuronansmisores 0 enzimas di· gestivas, cuando es necesario (Figura 13-36). En eSla secci6n considerarcmos el papel del complejo de Golgi en eSlas des rutas de secred6n y compararcmos los mecanismos que intervienen en ambas.

Parece que muchas protefnas y Ifpidos son transportados automaticamente desde el ER y el complejo de Golgi ala superficie celuJar 30 En una celula capaz de realizar secreci6n reguJada, antes de abandonar la red del trans Golg! se han de separar por 10 menos tres tipos de prolefnas: las desli· nadas a los Iisosomas (vfa endosomas tardfos), las destinadas a las vesfculas de secreci6n y las deslinadas a ser descargadas inmediatamente en la superficie ceo lular. Va hemos visto que las protefnas destinadas a los Iisosomas son seleccio· nadas para su empaquetamiento en vesfculas de Iransporte especfficas (me· diante la M6P en el caso de las hidrolasas lisosemales), y se cree que sel'iales an:ilogas a estas dirigen las prote{nas cmpaquetadas al interior de las vesfculas de secreci6n. La mayorfa de las otras protefnas son transportadas directamenle a la superficie celular mediante una rum par derecto no selectiva (las prolefnas que deben ser selectivamente dirigidas a un dominio de la superficie celuJar 0 a otro son excepciones) (Figura 13·3n. Asf, se ha propuesto que en una cl!lula no 670

CapftuJo 13: Tr.1flco vesicular mediante las rutas secrelora y endocftica

MITOCONDRIA

PEROXlSOMA

PlASnoos

RETiCUla ENDOPLASMATICO

SUPERFIOE CElUlAA

proteinlll r&ci'n "rllet'lWS PlIr. Stl SlCrecl6n constllullv.

lipldos de membrana pllllm6tlca rec"n .intetizados

....-'

- \

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SECRECION CONSTfTUT1VA fuli6n de membr1ln. no regulMie

protltint. de membr.nt plllm6ticl reci6n ,inletlzeda.

C1TOSOl

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aMlal d. tipo ~

hormontl 0 d. nttllOlr_mitor

tr.n.ducc'On dtlsel'ial

\ complejo de Goigi

SECREC16N REGULADA

ve.lcula de .&CreciOn que elmllcena prOIl/nU de .&creccI6n y Olru 'llblrtanci••

polarizada, tal como las celulas de la serie blanca de la sangre 0 los fibroblastos. si las proleinas del lumen del ER no son especfficamente relenidas como residentes del ER 0 del complejo de Golgi 0 no son seleccionadas para las rutas que llevan a la secreci6n regulada 0 a los Jisosomas, seran autom4ticamente transportadas a traves del complejo de Golgi hasta la superficie celular mediante la via secretom constilul.iva. Veremos que en celulas polarizadas, en las que se han de transferir diferentes productos a diferemes dominios de la superficie celular, las opciones son un poco m4s complejas.

Las vesfcuJas de secreci6n emergen por gemaci6n desde 10 red del trans Golgl" Las celuJas que est4n especializadas en secrelar rapidamente algunos de sus producfoS en respuesta a una senal concentran y almacenan estos produClOS en vesfculas de secrecl6n (frecuentemente denominadas grd/lulos de secrecion 0 IJesfculas de nucleo demo porque se obselVan micleos densos cuando se miran al microscopic elecII6nico). Las vesfculas de secreci6n se forman por gemaci6n de vesfculas recubienas de clatrina, a panir de la red del tram Golgi, y libetan su

melela de protelnll

cl..lrlClClOn

oesviO MEDIAOO POR UNA SEtiiAl HACIA lOS USOSOMAS

• /

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r~orde

mana,. IHotfato

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complejo de GOI;!

Transporte desde la red del 'rails Goigi hasta la superflcle celular: exocllosls

flBur8l3-36 Larntadesecred6n regulada y constltutiva. Las dos rulas divergen en la red del traIlS Golgi. Muchas prolefnas solub1es son segregadas continuamente de Ia c6u1a a tnl.v~ de la nita ~ St'tTrdOn oonstitutim (tamb~n Uamada nita par defectol. que acnia en lodas las cetu1as. Esta v{a lambH!n nutre a Ia membrana plasmatica con protdnas y IIpidos acabados de sinletizar. Las ci1u1as especiaJizadas en 18 secreci6n wnbilm disponen de una rota de S«reCi6n reglilada, medianle la cual detenninadas protefnasde la red del. tmnsGolgi son conducidas en vesfculas de secreci6n. donde las prOiemas son empaqueladas y concentradas hasta que unasenal cxtracelularestimula su sccrcci6n. La sccrcci6n regulada de PC
osm6tica excesi\'amente elevada.

Figura 13·37 Los procesos de dasUlcacl6n de prote(nas en la red del 'rons Goigi meJor conocldoa. Las prolefnas marcadas con manosa 6·fosfalo son dirigidas hacia los Jisosomas (via endosomas tardfos) mediante vesIculas de transporle recubienas de c1atrina (v~ase Figura 13-23). Las protefnas cuyas senales les dlrlgen hacla vesrculas de secrecl6n son concentradas en grandes vesrculas recublertas de c1atrlna, que rapidamente pierden su recubrimiento transformllndose en vesiculas de secrecl6n -un proceso que I1nlcamente liene lugar en c~lulas secretoras especializadas. Al parecer. en c~lulas no polarizadas.las protefnas que no presentan caraClerislicas especiales son lransportadas hacla la superficie celular por defeclO a Ira\"6 de la ruta de secreci60 coostirutiva En cilulas polarizadas. sin embargo, las prolefnas de secreci6n y las de membrana plasmatica son dirigidas selectivamenle hacia el dominio apical o hacia el dominio basolaleral de la membrana plasmalica, de forma que al menos una de estas dos rulas ha de eSlar medlada por una senal, como veremos mlls adelantc.

671

conlenido al exterior celular en respuesta a una senal eXlraceluJar. El produclo secretado puede ser tanlo una mollkula pequefia (como la histamina) como una proteina (como una honnona 0 una enlima digestiva). Las protefnas destinadas a las vesiculas de secreci6n (a menudo denomlnadas proreinas de secreciOn) son empaquetadas en vesfculas adecuadas en la red del (ram Goigi. En este caso, parece que el mecanismo implica la agregaci6n selectiva de las protefnas de secreci6n. Estos agregados se pueden deteclar al microscopio electr6nico como material electrodenso en el lumen de la red del trans Goigi. Se desconoce cual es la ~senal de clasificaci6n" que dirige a las protefnas de secreci6n a estos agregados, pero se cree que es una zona senal que presentan muchas protefnas de esta c1ase. $i un gen que codifica una prote(na de secreci6n se transfiere a una c61ula secretora de otro tipo, que normal mente no fabrica esta protefna, la proteina extrafta se empaqueta de manera apropiada en vesiculas de secreci6n. Tampoco se conace c6mo se segregan los agregados de las prolefnas de secreci6n en las vesfculas secretoras. Las vesiculas de secreci6n contienen protefnas de membrana especiates, algunas de las cuates pueden actuar como recep· tores uniendo el material agregado en la red del (railS Golgi. No obstante, los agregados son demasiado grandes para que cada mollkula de la protefna secretada pueda unirse a su propio receptor, como se propone para el U'anspone de enzimas Iisosomales. La captura de los agregados en las vesiculas de secreci6n puede parecerse mas a la caplaci6n de panfculas por fagocilosis en la superficie celular, la cual tambh~n puede estar mediada por membranas revestidas de c1atrina. Despues de que las vesfculas de secreci6n inrnaduras emerjan de la red del trans Golgl, su cubierta de c1atrina es eliminada y su contenido se condensa attn mas -hasta unas 200 veces respeclO a su concenlraci6n en el lumen del Goigi (Figura 13-38). La condensaci6n tiene lugar de repente y parece que es debida a la acidificaci6n del lumen de la vesfcula, inducida por una bomba de H- impulsada por ATP de la membrana de la vesfcula. Debido a que las vesiculas maduras son tan densas, la relula secretora libera grandes cantidades de material por exocitosis en cuanlO es necesario (Figura 13·39).

A menudo las protefnas son procesadas proteolfticamente durante la formaci6n de las vesfcuJas de secreci6n32 La condensaci6n no es el unico proceso por el que se ven afectadas las protefnas de secreci6n a medida que las vesfculas de secreci6n maduran. Muchas hormonas polipeplfdicas y neuropepUdos, asf como muchas enzimas hidrolfticas secretadas, se sintetizan como prOlefnas precursoras inaclivas, a partir de las cuales tienen que ser Iiberadas las mol~culas aclivas por proleolisis. Se cree que esta hi-

FIgura 13-38 Formacl6n de vesfculas de .secred6n. Esla electronmicrografTa

mUC$lra algunas vesiculas de sccreci6n rormdndose a panir de la red del traIlS Golgi en una ct'Hula ~ del pdncreas secretora de insulina. Para locaJizar las moleculas de clatrina se ha utilizado un anticuerpo conjugado con esferas de oro coloidal (puntos negrQs). Las vesfculas de secreci6n inmaduras (cabezas de flecha negras), que conlienen la prolema precursora de la insuHna (proinsulinaj, se hallan revestidas de c1atrina En cuanto la vesfcula se ha fonnado, esle recubrimiento de datrina es rapidamenle eliminado, ya que no se encuentra en las vesIculas de secreci6n maduras, las cuales tienen un nudeo muy denso (cabezas de flec/la vadas). (Por cortesfa de Lelio Orcl.)

Figura t3-39 Exocltosls de vesfcuh15 de secrecl6n. La eleclronmicrografia mueslra 1a liberad6n de insulina desde una vesfcula de secreci6n de una c~lula ~ pancreatica. (Par cortes{a de Lelia Ord. de LOrd, J-D. Vassali, y A. Perrclet, Sci. Am. 256: 85·94,1988.)

672

Capftulo 13 : Tntfico vesicular mediante las mlas secreton. yendodlica

pro-opioconina H,N

_ido

..""

/

-

corticolropina

I

IACTNI

u-MSH

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p-tipotropina

I

p-MSH

IHndorlina

dr61isis empieza en la red del trans Golgi, y continua en las vesiculas de secreci6n ya veces en el fluido extracelular despul!s de que haya ocurrido la secreci6n. Muchas polipl!ptidos secre£ados tienen, por ejemplo, una prosecuencia amino terminal que es eliminada justo antes de la secreci6n, formAndose la protefna madura. Estas protefnas se sintetizan, pues, como preproprole{nas, en las que la preseclUmcia consisle en el pl!ptido senal del ER que se elimina en el ER rugoso. En OlroS casas las moll!culas peptfdicas senal se sintetizan como poliprote{nas que contienen ml1ltiples copias de una ntisma secuencia aminoacfdica. En casas aun mM complejos una variedad de moll!culas peptfdicas senal son sinletizadas como partes de una linica poliprotefna que es la precursora de los mUltiples productos finales, los cuales son cortados individualmente a panir de la cadena polipeptfdica inicial; la misma poliprotefna puede ser procesada de formas diferentes produciendo diferentes pl!ptidos en diferentes tipos celulares (Figura 13-40). iPor qu~ es tan cornun el procesarniento proteolftico en la ruta de secreci6n? Algunos de los peptidos producidos asf, como las encefalinas (neuropeptidos de cinco aminoAcidos con una actividad parecida a la morfina), son demasiado cortos en sus fonnas maduras para ser cotransportados hacia ellumen del ER 0 para poder tener las senales necesarias para empaquetarse en las vesiculas secretofaS. En el caso de las enzimas hidroUticas secretadas, 0 de cualquier proteina cuya actividad pueda ser peligrosa en el interior de la ~Iula, el retraso en la activaci6n por rotura hasta que la prot'ema lIega a una vesicula de secreci6n 0 hasta que ha sido secretada, proporciona una clara vemaja en la prevenci6n de que acme prematuramente dentro de la ceJuia en la que ha sido simetizada.

FIBUra 13·40 Rutasallematlvasde procesamlento de Ia prohormona pro-oplocortlna. los cones iniciales son realizados por proteasas unidas a la membrana que conan cerca de pares de residuos aminoacidos cargados positivamente (Lys-Arg. LysLys, Arg-Lys, 0 Arg-Arg). Mediante reacciones accesorias se obtienen los productos de secreci6n finales. Diferentes tipos celulares tienen diferenles tipos de enzimas, de manera que el mismo precursor prohormonal pucde ser usado para producir dlferentes hormonas peptfdicas. Por ejemplo, en el16bulo anterior de la hip6fi.sis a panir de la pro-opioconina 5610 se producen la conicitropina (ACTH) y la P-lipotropina, mientras que en el 16bulo intennedio se producen principalmente a·MSH, y-Iipotropina, P-MSH Yp·endorfma.

Las vesfculas de secreci6n permanecen cerca de la membrana plasmatica hasta que una sefiaJ les hace liberar su contenido!l5 Una vez cargada, una vesfcula secretora tiene que ir allugar de secreci6n, donde debe esperar hasta que la cl!lula reciba la senal de secreci6n. En algunas cl!lulas ellugar de secreci6n estA lejos del complejo de Golgi. Las celulas nervlosas proporcionan el ejemplo mM extremo. Las prote(nas de secreci6n, como los neurotransmisores peptidicos que deben ser Iiberados aI final del ax6n, son sintetizadas y empaquetadas en vesfculas del cuerpo celular, donde se sittlan los ribosomas, el ER y el complejo de Golgi. Entonces deben viajar a 10 largo del ax6n hasta a1canzar el terminal ax6nico -una distancia muy cona 0 de mM de un metro. Como se vio en el Capftulo 16, las vesiculas utilizan protemas motoras unidas a su superficie para propulsarse a 10 largo de los nticrorubuJos axonales, la oriemaci6n de los cuales gufa este trMico a 10 largo del ax6n en la direcci6n apropiada. En las celulas epiteJiaies polarizadas los microtubuJos pueden tener un papel similar dirigiendo las vesfculas de secreci6n hacia la superficie que corresponda. La ultima etapa de la ruta secretora regulada es la Iiberaci6n del produclo por exocitosis. La senal de secreci6n es a menudo un mensajero qufmico, como una hormona, que se une a los receptores de la superficie celular. La aClivaci6n de estos receptores genera senales intraceluJares, que incluyen a menudo un incremento transitorio de la concentraci6n de Caz. Iibre en el citosol. En el caso de un ax6n nervioso, la senal de exocitosis nonnalmente es una excitaci6n ell!ctrica Transporte desde la red del trans Golgi hasta la superficle celular: exocitosls

673

-un potencial de acci6n- que se ha producido par la uni6n de un transmisor qufmico a los receptores de la superficie celular. EI potencial de acci6n provoca una entrada de Cal. en el terminal ax6nico a traves de canales de Cal + dependientes de voltaje. Mediante un mecanismo desconocido, la repentina entrada de Cal., 0 alglin otro lipo de sei\al intracelular en la celuJa secretora, dispara la exocitosis, provocando que las vesfculas de secreci6n se fusionen con la membrana plasmatica y liberen su contenido al espacio extracelular.

La exocitosis reguJada es una respuesta localizada de la membrana plasm'tica y del citoplasma subyacente 34 La histamina es una pequei\a mol6:u1a segregada por las celuJas cebadas, mediante la ruta regulada, como respuesta a Iigandos especfficos que se unen a los receptores de su superficie. La histamina es la responsable de muchos sfotomas desagradables, tales como el prurilo 0 los estornudos, que acompai\an a las reacciones alergicas. Si se incuban celulas cebadas en un media que contenga un estimulante soluble, se observa que la exocitosis se produce par toda la superficie celular (Figura 13-41). Sin embargo, esta no es una respuesta generaHzada de tada la celula, ya que si el ligando estimulador est a artilicialmente fijado a una superficie s61ida de modo que 5610 puede interaccianar can una regi6n localizada de la superficie de la celula cebada, la exocitosis queda restringida a la regi6n en la que la celula entra en contacto con elligando (Figura 13-42). Clarameme, distintos segmentos de la membrana plasmarica pueden actuar con independencia del resto de la membrana. Como resultado de elio, la celula cebada, a diferenda de una celula nerviosa. no responde como un todo cuando esta estimulada; la aClivaci6n de los receplOres, las sefiales intracelulares resultantes y la exocitosis posterior estan localizadas en la regi6n particular de la celula que ha sido exdtada.

Figura 13-41 ElcctronmJcrograffas que muestran el pnx:eso de exocltosls en ct:lulas cebadas de rata. La celula de (A) no ha sido estimulada. La c~lula de (B) ha sldo aetivada, por un ligando extracelular soluble, para segregar la histamina que tenfa almacenada. Las vesiculas que contienen hislamina aparecen oscuras, mienlras que las que la han liberado son c1aras. EI material que queda en las vesiculas vadas consiste en una red de proleoglucanos a la que nonnalmenle se halla unida la hislamina almacenada. Cuanda la vesicula secretora se ha fusionado can la membrana plasmatica, la membrana de la vesicula sccrelOra actua normalmente como diana a la cual se unen otms vesfculas de sccreci6n. AsI, la c~lula de (8) presenta grandes cavidades delimitadas por las membmnas fusionadas de muchas vesiculas secretoras vadas. que ahora se hallan en continuidad con la membrana plasmtitica. Esta continuidad no siempre es patente en el plano del corte realizado a lraves de la c~lula. (De D. Lawson, C. Fewtrell, B. Gomperu y M. Raff. j. Exp. Med. 142:391-402,1975. con penniso de copyright de The Rockefeller University Press.)

nocleo

Los componentes de la membrana de las vesfculas de secreci6n se reciclan 3S Cuando una vesfcula secretora se fusiona con la membrana plasmatica, su contenido se descarga desde la celula por exocitosis y su membrana pasa a formar Figura 13-42 La exocltosls como una respuesta locaI.Izada. EJcclfOnmicrogrnfia de una c;~lula cebada que ha sldo estimulada para segregar histamina por un eslimulante acoplado a una amplia esfcm s6lida. La exocitosis se ha producido unicamcntc en [a region de la c~lula que se halla cn contaeto can esta superficie. (Dc D. Lawson, C. Fewtrcll y M. Raff. j. Cell. Bioi. 79:394-400, 1978. can pennlso de copyright de The Rockcfeller Unlvcrsity Prcss.)

674

Capftulo 13: Trafico vesicular mediante las rutas secretora y endodtica

superficie regi6n de e~ocitolil

parte de la membrana plasmatica. Este hecho podrfa incrementar notablemente el area de [a superficie de [a membrana p[asmatica, pero s610 ocurre de forma transitoria ya que constantemente son eliminados de la superficie ce[ular componentes de membrana mediante endocitosis, y este proceso es por 10 menos tan rapido como 10 ha sido el de adici6n de componentes por exocitosis. Est'a eliminaci6n devuelve las prote(nas de [a membrana de la vesicula secretora a la red del trans Goigi (probablememe vfa endosomas), donde pueden ser utilizadas de nuevo. Este recidaje mantiene un estado estacionario de distribuci6n de componentes de membrana entre los diversos compartimientos celulares. La cantidad de membrana vesicular que se afiade temporalmente a la membrana plasmMica puede ser enorme: cuando una celula acinar del pancreas es estimulada para secretar sus enzimas digestivas, en la membrana plasmatica apical (cuya area es de s610 30 J.Im 2) se insertan aproximadamente 900 J.l.m~ de membrana vesicular.

Las vesiculas simipticas se forman a partir de los endosomas36 Las CIHuias nerviosas (y algw1as celulas endocrinas) tienen dos tipos de vesiculas secretoras. Como acabamos de ver, estas celulas empaquetan protefnas y peptidos en vesiculas de secreci6n de contenido denso por la ruta tipica, y son liberadas mediante la ruta de secreci6n regulada. No obslante, eslas celulas utilizan ademas otra c1ase especializada de pequefias vesiculas de secreci6n (-50 nm de diametro) que se forman de manera diferente. ESlas vesiculas slmiplicas almacenan neurotransmisores pequefios, como la acetilcolina, el glutamato y el acido y+aminobutfrico (GABA), que se usan en las sinapsis qllfmicas para que dos celulas se comuniquen rapidamenle (y, en algunos tejidos endocrinos, en comunicaciones locales). Cuando un potencial de acci6n lIega al terminal nervioso, las vesiculas Iiberan Sll contenido en una fracci6n de un milisegundo -algllnas neuronas disparan mas de 1000 veces por segundo- Iiberando vesiculas simipticas cada vez. Esto precisa un nipido relleno de las vesiculas, que al parecer no se generan a partir de la membrana del Golgi, sino mediante reciclaje local de la membrana plasmalica, como se indica a continuaci6n. Se supone que los componentes de la membrana de las vesiculas sinaplicas son descargados inicialmente a la membrana plasmatica mediante la rula de secreci6n constitutiva y entonces son recuperados por endocitosis y transferidos a los endosomas, desde los cuales se agrupan y surgen por gemaci6n para formar las vesiculas sinapticas. Los componentes de la membrana de las vesiculas incluyen transportadores especializados en la captaci6n de neurotransmisores del cilosol, donde son sintetizados. Una vez lien as con el neurotransmisor, las vesfculas vuelven a la membrana plasm
Las celulas polarizadas dirigen las proteinas desde la red del trans Golgi hasta el dominio apropiado de la membrana plasmatica!37 La mayorfa de las celulas de los tejidos estan polarizadas y lienen dos (ya veces mas) dominios de membrana diferentes hacia los cuales van dirigidos diferen+ tes tipos de vesiculas secremras. Aparece, pues, el problema general de c6mo se organiza la salida del complejo de Goigi para que se manlengan las diferencias enlre un dominio membranoso y olro. Una eel lila epitelial tfpica, por ejemplo, tiene lin dominio apical, que da al lumen y que a men lido tiene estfllcturas especializadas como los cilios 0 los microvilli, y un dorninio basolateral, que comprende el resto de la celula. Los dos dominios estan separados por un anillo de uniones estrechas 0 eslancas (vease Figura 23-35). Estas uniones especializadas Transpone desde la red del trafts Goigi hasla la superficie celular: exocitosls

675

(DLiBERACI6N DE LOS COMPONENTES DE LA VESICULA SINAPTICA EN LA MEMBRANA PLASMATICA @ENDOCITOSIS DE LOS COMPONENTES DE LA VESICULA SINAPTICA Y L1BERACI6N EN EL ENDOSOMA @GEMACI6N DE LA VESICULA SINAPTICA DESDE EL ENDOSOMA

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entre celulas (discutidas en el Capitulo 19) impiden que las prolefnas. y los lfpidos en la hemimembrana exterior, se desplacen entre las regiones apical y basolateral, de manera que no 5610 la composici6n proteica sino tam bien 1a lipfdica de los dos dominios de membrana son diferentes. Concretamente, la regi6n de la membrana apical esta muy enriquecida en glucolfpidos, los cuales se piensa que protegen a esta superficie del dana que puedan producir, por ejemplo, las enzimas digestivas y el bajo pH que se encuentra en lugares como ellumen del intestino. Las protefnas de la membrana plasmatica que eshin unidas a 1a bicapa lipfdica mediante un glucosilfosfatidilinosilol {GPO !ambien se encuentran exc1usivamente en la membrana plasmalica apical. Si a una proteina que normalmente es transferida a la superficie basolateral se Ie anade. mediante manipulaci6n genetica, una secuencia de uni6n a un GPI, se observa que la protefna es descargada en la superficie apical. Las proteinas unidas a GPI parecen asociarse con glucolfpidos y pueden ser transportadas a la misma regi6n de la superficie celular como resuJtado de esta asociaci6n. Sin embargo. se desconoce c6mo tiene lugar esta selecci6n. En principio, las diferencias entre los dominios de la membrana plasm
Capftulo 13 : Tnifico vesicular mediante las rutas sccrctora yendocflica

@CARGADEL NEUROTRANSMISOR A LA VESiCULA SINApTICA @SECRECI6NDEL NEUROTRANSMISOR POR EXOCITOSIS EN RESPUESTA A LA ACTIVACI6N CELULAR

Figura 13-43 La formacion de vesiculas slmiptlcas. Estas vesiculas diminutas y unifonnes se encuentran s610 en celulas nerviosas y en algunas celulas endocrinas, donde almacenan y secretan pequenos neurotransmlsores.

v..leul~ de

vesk;ul~

tr~nsporte

lr~nsporte

basol~IIIr~1

~pie.1

de'

IA) CLASIFICACtON DIRECTA DE LAS PRDTEINAS DE MEMBRANA EN LA REO OEl TRANS GOlGt

endotom.

lemp'~no

b.soleleral

Figura 13·44 CiasIRcacl6n de las prote{nas de la membrana plasmlhlca en una celula epltellal polarizada. Las prolefnas recien sinlelizadas pueden a1canzar su dominio de la membrana plasmll.tica apropiado mediante una vfa directa (AI 0 indirecta (8). En la vfa indirecta una prote{na es recuperada del dominio de la membrana plasmll.tica inapropiado por endocilosis y luego transportada aI dominio CQrreclo via endosomas tempranos -eli decir, por lranscitosis.

IBI CLASIFICACION INDIRECTA vIA ENOOSOMAS

indirectameme vfa endosomas (Figura 13·44); en otros casas 5610 las protei:nas destinadas a uno de los dos dominios membranosos tienen una sei'tal de c1asificaci6n, mientras que el otro dominio no requiere de ninguna sefial (yes alcanzado por una ruta por defecto). Una c~lula nerviosa es un ejemplo Iimile de c~lula polarizada: la membrana plasmAtica de su terminal ax6nico esla especializada en enviar sei'tales a olras c~luJas, y la membrana plasmatica de su soma celular y dendritas esta especializada en recibir sei'taJes de otras cl!luJas nerviosas. Estos dos lipos de dominios de la membrana plasmatica no son 5610 funcionaJmente distinlOS sino que tambi~n Henen una composici6n proleica distinta. Estudios del trMico de proteinas en c~lulas nerviosas en CUllivo indican que, en 10 que respecla a rransporte vesicular desde la red del trans Golgi a la superficie celular. la membrana plasmalica del soma celular nervioso y de las dendritas es equivalente a la membrana basolateral de una celula epitelial polarizada, mientras que la membrana plasmatica del ax6n y de los lerminales nerviosos es equivalente a la membrana apical de la misma celula (Figura 13-45). Asf, una protefna que eSle destinada a un dominio espec!fico en una celula epitelial. lambien 10 eS[a, y en el dominio equivalenle, en una celula nerviosa.

termlnalet nelVl~s

•• membrane plnm'tice

bnolaterel dendritas

ee!Ules epitel••••

Resumen lAs proteflUU plUden ser secretadas de Ima dlula por uocitosis a travis de una

roto. regul.adtJ 0 COnstirutilHL En las rulas reguladtu las nwlkulas son alnuu:enadiu ~n vufculas de secreci6n 0 en vesiculas sln4pticas, las cualn no u Jusionan con Ia membrana plasm4.tica liberaruro su contenido, hasta ql.e u recibe una seiial ulracelular. Este empaquetamlento dentro de estas ueskuta.s. que tlene lugar en Ia red del trans Golgi, (IS prec:edJdo por una colUknsaci6n selectiva de las protefnas. Las vesfculas silUfptlau son proplas de las dJulas nerviosas y d~ aJgulUU dlulas endocrllUUi u forman a partir de los endosomas y son responsables de Ia secrecwn regldada de pequeiios neurotransmisores. Mientras que las nltas regrlladas s610 actdan en c:ilulas ~ espedaliuulas, en todas las c:ilulas existe una nita de secreci6n constitutiva:lf'ray lin trallsporte vesicular continuo dew Ia red del trans Golgi a la membrana plasmatlca.

Transporte desde la red del trailS Goigi hasta la superflcle celular: exochosls

-c6lul.

Figura 13-45 Comparad6n entre dos tJpos de dlulas polarlzadas. Teniendo $dlo en cuenta los mecanismos utilizados para dirigir las prolefnas

hacia los diferentes dominios de una la membrana plasm
677

Las protefnas fabricadas en el ER son automdticamente rransferidas a la red del trans Golgi y tkspu~ a la membrana plasnuftica a traves tk la rum coustitutiva, par tkfecto, a menos que sean captadtu en otras mtas 0 retenidas par seiiales tk clasificacidn especlflcas. No obstante, en las dlulas palarizadas las mtas de tralUpam desde la red del trans Golgi a fa membrana plasmtftica preseutan un control selectiIJo asegurando que diferentes tipos de protefnas de membrarUl y llpidos sean transferidos a los tlominios de la membrana plasmdtica apropiados.

Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos"" Ahora vamos a tratar la cuesti6n mas importante del treifico vesicular. Hemos visto que la celula contiene 10 0 mas compartimientlJ, Iimitados por membrana, qu(micamente distintos y que el transporte vesicular media un intercambio conrinuo de componentes entre ellos (vease Figura 13-3). En presencia de este intercambio masivo, ic6mo mantiene su caracter especializado cada compartimiento? Para contestar a esta pregunta primero hay que considerar que es 10 que define el caracter de un compartimiento. Por encima de todo, parece que es la naturaleza de la membrana que 10 delimita: los marcadores expuestos en la superficie citos6lica de la membrana gufan la direcci6n de las vesfculas, asegurando que s610 se fusionen con el compartimiento adecuado, dictando por 10 tanto el patr6n del trafico entre un companimiemo y otro. Una vez detenninada la presencia de distimos marcadores para cada compartimiento, el problema radica en explicar c6mo se mantienen componemes especfficos de membrana a una concentraci6n elevada en un compartimiento y baja en otro. La respuesta depende, fundamentalmente, del mecanisme de formaci6n de las vesiculas de transporte y de fusi6n, por el cual zonas de la membrana, enriquecidas 0 no de componentes espedficos, son transferidas de un compartimiento a otro. Ya hemos visto c6mo la generaci6n de una vesfcula de transporte conlleva el ensamblaje de una cubierta especial en la cara citos6lica de la membrana que genera la vesfcula. Estas cubierta actlian como un dispositivo que "chupa" la membrana rica en ciertas prote(nas y pobre en otras hacia afuera del compartimiento, de forma que las protefnas pueden ser transponadas de forma espedfica a otro compartimiento. Consideraremos c6mo se forman estas cubienas y de que estan compuestas. Tambien comentaremos c6mo lIegan las prote(nas a la membrana diana correcta y c6mo se fusionan entonces descargando su contenido en el6rgano correspondiente. Veremos c6mo una combinaci6n de genetica y bioqufmica ha descubierto una variedad de prOlefnas de uni6n a GTP que ayudan a controlar el transporte vesicular. Acoplando la hidr6lisis de GTP a otros procesos catalfticos, ayudan a controlar la direcci6n del transporte vesicular uniendo la Iiberaci6n y la fusi6n de vesfculas al gasto de energfa libre, y garantizan su fidelidad velando por la precisi6n con la que la vesfcula de transporte reconoce su membrana diana espedfica. Las estrategias geneticas y bioqufmicas basicas que se han utilizado para estudiar la maquinaria molecular implicada en el transporte vesicular estan perfiladas en el Panel 13-1, paginas 682-683. De todos modos, antes de comentar los detalles de la maquinaria, es util tratar el problema desde su base, estudiando los principios basicos generales que se deben aplicar a cualquier proceso de transporte vesicular unidireccional.

• EJ mantenimiento de las diferencias entre compartimientos requiere un aporte de energfa libre38

S~gamos que tenemos dos compartimientos, delimitados por membrana, conectados por vesfculas de transporte que circulan de uno a otro, y que la diferencia entre ambos compartimientos radica s610 en la concentraci6n de un uni678

Capftulo 13 : Trafico vesicular mediante las rutas secretora yendocftica

CITOSOL

NUCLEO

PEROXISOMA

MITOCONDRIA

pLASTIDOS

RETICULO ENDOPLASMATICO GOLGI LlSOSOMA ENDOSOMA

SUPERFICIE CELULAR

lanzadera de vesIculas de Irllnsporte

compartimienlO A

compartimiento B

o proteina P

co tipo P de protefna unida a membrana. Si el sistema se deja que tienda aI equilibrio, a traves del trMico de vesiculas de transporte entre los compartimienlOs las concentraciones de P se equilibrarlan y la diferencia entre compartimientos desaparecerfa. La diferencia puede ser mantenida utilizando energfa libre para transferir activamente moltkulas de P en una direcci6n, en contra de su gradien+ te de concentraci6n. La protefna P podrfa ser secuestrada en la membrana formadora de vesfculas de transporte del compartimiento en el cual esla a baja concentraci6n, par ejemplo, y mantenerse fuera de las vesfculas en formaci6n de los compartimientos en los que esta en concentraci6n elevada. Esto serfa posible gracias a un cambio de conformaci6n de la prolefna conducido directa 0 indirectamenle por la hidr61isis de ATP 0 GTP en la membrana generadora de vesfculas por gemaci6n (Figura 13-46). Aunque este ejemplo es mucho mas simple que cu'!.!quier sistema conocido usado por las celulas, Hustrar por que tiene que haber un aporte de energfa Iibre que medie el transporte directional selectiva de vesfculas de transporte, entre compartimientos rodeados de membrana. El transporte direccional selectivo es de una importancia central en la organizaci6n de la celula eucariota. Empezaremos nuestra discusi6n de los mecanismos moleculares que Ie sirven de base considerando c6mo se forman las vesfcu+ las de transporte.

Existe mas de un tipo de vesiculas revestidas 39 La mayorfa de vesfculas de transpone se forman a partir de regiones revestidas especializadas de la membrana, por 10 que generan vesiculas revestidas de una red de prolefnas distintas de las que recubren la superficie citos61ica. Antes de que la vesfcula se fusione con la membrana receptora, este recubrimiento ha de eliminarse para permitir que las dos membranas interaccionen directamente. Existen dos tipos de vesfculas revestidas bien caracterizadas -las revestidas de c1atrina y las revestidas de coat6mero (de coat, cubierta) (Figura 13-47). Las

Figura 13-46 La energfa qufmlca es utlllzada para consegulr que en el trans porte vesicular sea unldirec:c1onal. En este ejempJo hipotetico, la protefna P es una bomba de I-{' dependienlede ATP. La concenlraci6n de protones en el compartimiento A es baja y alia en el compartimiento H. Debido a la alta concentraci6n de P en el compartimiento H, ellumen de este organuJo poseera un pH mucho menor que eJ compartimiento A. Si P sufre un cambio de conformaci6n dependiente de pH que Ie permita cnlrar en las vesfculas que se forman a partir del compartimiento A (pH eJevado) pero que a su vez Ie impide entrar en las vesrculas que se producen a partir del compartimiento B (pH bajo), el flujo de P es unidireccional. Mientras se mantenga la diferencia de pH entre ambos compartimientos debido a la utilizaci6n continua de energfa libre en forma de hidr6lisis de ATP para mantener la bomba de H'. se conservara el gradieme de concentraci6n de P entre los dos compartimielltos. Como comentamos en el Capftulo 12, la mayorfa de las membranas nunca se crean de novo sino que crecen por expansi6n de membrana ya existente. Por 10 tanto, aunque este modelo simple no explica c6mo se fonn6 inidalmente el gradiente de P entre los compartimientos, proporciolla un ejemplo de c6mo la celula puede ulilizar energfa para mantener el can'icter de sus compartimienlos.

Figura 13-47 Comparacl6n entre las veskulas revestldas de ciatrlna y las revestldas de coat6mero. (AJ Electronmicrograffa de vesfculas revestidas de clatrina. (B) E1ectronmicrograffa de cistemas del Golgi de un sistema libre de celulas en el cual aparecen por gemaci6n vesfculas revestidas de coat6mero en el tubo de ensayo. Observese c6mo las vesfculas revestidas de datrina lienen una estructura regular mas obvia. (Cortesfa de Lelio Orci. de L. Orci, B. Glick y J. Rothman. CeIl46:171-164, 1986 © Cell Press.)

, 100nm

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181

lOOnm

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Mecanlsmos moleculares del transpone vesicular y mantenlmiento de la diversidad de compartimlentos

679

Figura t3·48 Caveolasenla membrana plasmltlJca de un flbroblaslo humano. (Al Elecuonmicrograffa de fibroblastos en secci6n transversal mostrando las caveolas como indentaciones profundas de la membrana plasmll.tica. (B) Electronmicrograffa de gravado por congelaci6n que muestra numerosas caveolas en la cara citoplasmll.tica de la membrana plasmll.tica. Su cubierta parece que estll. constituida por hebras distribuidas concenlricamenle. que oontienen la protelna caveolina. Observese que las caveolas dlfieren en tamano y eSlructura de las depresiones revestidas de clatrina. una de las CUBics se observa en la parte superior derecha de (B). (Gonesfa de R.G.W. Anderson, de K.G. Rothberg el al., Cell 68:673-682, 1992.@CellPress.)

(AI

IS'

ves(cu/as revescidas de clatrina, como hemos vista antcriormente, median el transporte selcctivo de los receptores transmembrana. como el receptor M6P desde 1a red del trans Goigi. 0 el receptor de LDL desde la membrana plasmatica, ambos con cualquier molkula soluble Que se haya unida a cUOS, quedando atmpada en el lumen de la vesfcula. Las ues(culas reuesridas de coat6mero, por el conlTario, median el transpone vesicular no selectivo desde el ER y las cistemas del Golgi. Puede haber un tercer tipo de vesfcuJa revestida. La membrana plasmatica

de la mayorfa de celulas presenta invaginaciones morfol6gica y bioquimicamen+ te diferenciadas. denominadas caurolas (Figura 13-48); aunque su funci6n es indena, una posibilidad serfa que estas caveolas generaran vesiculas revestidas de caveoJina. Si esto es asf, no esta claro qu~ transportarfan estas vesfculas ni cual serfa su destino, y par ahara no se pude decir nada mc\s de eUas. Parece que las vesiculas revestidas median la transCerencia direccionaJ de tipos especfficos de membrana. Normalmente esta transfercncia eSIt\ equiJibrada por un flujo de membrana en direcci6n opuesla, tamo en forma de vesfculas de tipos no tan caracterizados. como por medio de sacos alargados 0 tubulos de membrana que avanzan a 10 largo de los microrubulos (v~ase Figura 13·9).

El ensamblaje del revestimiento de clatrina conduce ala formaci6n de la vesfcula 40 EI principaJ componente proteico de las vesCcuJas recublertas de clatrina es la propia clatrina, un complejo proleico aJlamente conservado a 10 largo de la evoluci6n. Consist'e en tres cadenas polipeptfdicas grandes y tres pequenas que juntas forman una estruclura de tres patas denominada frisquelion. Los trisqueLions de c1atnna se unen dando lugar a un esquelelo en forma de cesto convexo formada por hex3:gonos y pentligonos, generando depresiones revestidas en la cam ciloplasmlitica de las membranas (Figura 13-49). Baja condiciones adecuadas en el tubo de ensayo, los trisquelions aislados se reasocian espontlineamente formando agregados~picamentepali~dricos, incluso en ausencia de las vesfculas de membrana que estos cestos normalmente incluyen (Figura 13-50). Se cree que la formaci6n de una yema revestida de c1atrina se produce por . fuerzas generadas par el ensamblaje de las protefnas de la cubierta sobre la superficie cilos6lica de la membrana (Figura 13-51). No se conoce que inicia el proceso de uni6n a una regi6n particular de la membrana oi c6mo se libera la ~/

680

Capftulo 13: TrMlco vesicular mediante las rutas sccretora y endodtlca

Figura 13-49 Depreslones revestldas de clatrlna y vesiCulas. Esta eJec1ronmicrograffa por grabado por congelaci6n muestra numerosas depresiones revcstidas de c1atrina y vesiculas en la superficie interior de la membrana plasmll.tica de fibroblaSlos en cultivo. Las celuJas se congelan nipidamente en helio Ifquido, se fracturan y se graban por congelaci6n para exponer la superficie de la membrana plasm~tica. (De I.Heuser, ). Cell Bioi. 84:560-683, 1980, con permiso de copyrighl de The Rockefeller University Press.)

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'8' Figura 13-50 EslnJetura de la cublerta de c1atrina. (A) Eleetronmicrograrra de trisquelions de c1atrina sombreados con platino. Aunque no puede observarse en las micrograrras, cada trisquelion esta compuesto par 3 cadenas pesadas y 3 cadenas Iigeras de c1atrina. (B) Dibujo esquematico de la distribuci6n probable de los trisquelions en la superficie de las vesfculas revestidas de c1atrina. Se muestran dos trisquelions, las cadenas pesadas de uno se han dibujado en rojo y las del otro en grit: las cadenas Iigeras de ambos se presenlan en amarillo. La distribuci6n superpuesta del los brazos llexibles del trisquelion proporclona fuerza mecdnica y llexibilidad. Ob~rvese que el final de cada brazo del trisquelion se dobla hacla dentro, por 10 que su dominio amino terminal forma una cublerta intermedla. (e) Reconstruccl6n tridimensional de la cubiena de clatrina compuesta por 36 trlsquelions organizados en una red de 12 penuigonos y 6 heJffigonos. La cublerta pollgonal exterior. en raja, representa las patas superpuestas de los trisquellons de c1atrina: la cublerta Intermedia, en verde, eSla formada por los dominlos amino termlnales de los trlsquelions: y la cubierta interior. en lUlIl, rcpresenla las protefnas adaptadoras que comentaremos mas adelante. Aunque la cubierta mostrada es demaslado pequel'la para incluir una vesfcula de membrana, los reveslimlentos de clatrina de las vesfculas estan construldos de forma similar a lSsta, a partir de 12 pentdgonos yun numero superior de hexagonos. tA, de E. Ungewlckell y D. Branlon, Nature 289:420-422, 19B I, Cl 19BI Macrnl11an Journals Ltd.; B, de I.S.Nathke et aI., CeIl68:899-910, 1992. e Cell Press: C. de G.P.A. Vigers, RA. Crowtbery B.M.F. Pearse, EMBO). 5:2079-2085, 1986.)

DESENSAMBLAJE DE LA CUBIERTA

'NSAMIllAJI! --J"FORMACl6N DELACUBIERTA

OELAYEMA

FORMAOON DE LA VESfCULA

Figura 13-51 Ensamblajey desensamblaJe de la cubler18 de c1atrlna. Parece que el ensamblaje de 'la cubierta de clatrina induce una curvatura en la membrana que conduce a la formaci6n de yemas revestidas de tamal'lo unifonne. EI desprendimiento de la yerna formando una vesfcula supone el proceso mas complejo de fusi6n de membrana, que comentaremos mas adelante. Aunque las cubiertas eSI3n constituidas por muchos componenles proteicos, en este esquema simpli6cado 5610 se muestra la datrina. EI revestimiento de las vesfculas recubiertas de datrina se elimina inmediatamente despu~ de la fonnaci6n de la vesfcula, mientras que, como verernos mas adelanle, la cubiena de coat6mero se elimina despu& de que las vesiculas entren en contaeto con su membrana diana.

Mecan..lsmos moJeculares del transporte vesicular y mantenlmJento de 1a dJversldad de compartimientos

681

SISTEMAS L1BRES DE CELULAS PARA EL ESTUDIO DE LOS COMPONENTES Y QEL MECANISMO DEL TRANS PORTE VESICULAR EI transporte vesicular puede sar reconstituido en sistemas lihres de celulas. La primera vel qua sa consigui6 fue para at case de los dictiosomas del complejo de Goigi. Cuando se aislen los dictiosomas y sa incuban en presencia de cilosol y de ATP como fuente de energla, las vesiculas emergen paf gemaci6n desde los bordes de los dictiosomas y parece que transporten proteinas entre las cisternas. Siguiendo al procasamiento progresivo de los ofigosacaridos de una glucoprotefna y su desplazamienlo entre un compartimiento del Goigi y al siguiente, as posible seguir al proceso del transporte vesicular. Para seguir al transporte, sa incuban juntas dos poblaciones de dictiosomas de Golgi. La poblaci6n ~dadora~ se alsla a partir de celulas mutantes que carecen de la enzima N-acetilglucosamina (GlcNAc) transferasa I V que han sido infectadas con un virus; debido a la mutaci6n, la principal glucoprotelna vlrica no puede ser modificada con GlcNAc en el complejo de Goigi de la celulas. EI dictiosoma dal Goigi ~ecaptor~ asttl aislado de la celulas salvajes no infectadas V que por 10 tanto contienen una copie correcta de GlcNAc transferasa I. pero carecen de la glucoprotefna virica. En la mezda de dictiosomes del Goigi la protelna vfrica adquiere GlcNAc, 10 cual indica que el Goigi dador se fusion a con al compartimiento medial del Goigi aceptor. Este transporte dependiente de glucosilaci6n puede seguirse midiendo la transferancie de 3H-GlcNAc desde UDP_3H-GlcNAc a la glucoprotafna vldca. EI transporte s610 se produce en presencia de ATP V de ciloso!. Fraccionando el cttosol. se han idantificado protelnas aspeclficas citos6licas necesarias para la formaci6n V la fusi6n de las vesiculas de transporte.

SE INCUBAN JUNTOS + CITOSOL + ATP + 3H-GlcNAc

DICTIOSOMA OIL GOlGI OADOR

otenOSOMA DEL

LGIACEPTOR

trans

no so ariado GlcNAc a III glucoproloina virico

se lIi'lade 3H-GlcNAc a III glucoproleina en la cisterna mediBI

Sistemas Iibres de celulas similares a este se han utilizado para estudiar el transporte desde la red medial hasta la red del trans Golgi, desde la red del trans Goigi hasta la membrana plasmtltica. desde los endosomas hasta los lisosomas y desde la red del trans Golg; hasta los endosomes tardlos.

APROXIMACIONES GENETICAS AL ESTUDIO DEL TRANS PORTE VESICULAR

los estudios geneticos de celulas de levadura mutantes deficientes en la secrecci6n a temperatura elevada hen permitido identificar mas de 25 genes que participan en la via de secreci6n. Muchos de estos genes mutantes codifican protelnas sensibles a temperatura, las cuales a 25°C actuan normal mente. pero cuando se eleva la temperatura a 35°C. algunes de elias fracasan an el transporte de protefnes desde et EA haste al complejo de Goigi. otras desde una cisterna a olra del Golg!. y otras desde el complejo de Golgt hasta la vacuole (ellisosome de les levadurasJ 0 hasta la membrana plasmtltica. Une vez se identifican, por este sistema, algunas protefnas necesarias para que se produzca la secreci6n, se pueden identificar ganes que codifican proteinas que interaccionan con elias mediante un fen6meno lIamado supresi6n multicopla. Una protefna mutante sensible a la temperatura elevada a menudo tiene una afinidad demasiado baja por las protelnas con las que habitualmenle interacciona y se une. Sin embargo, si las protelnas de interacci6n se producen a una concentraci6n muy superior a la normal, se da una uni6n suficiente para paliar el defecto. Para ello, celules de levadura con una mutaci6n sensible a la temperatura en un gen que participa en el transporte de vesiculas, se transfectan con un vector plesmfdico de levadura en la cual se han clonado fragmentos al azar de DNA gen6mico de levadure. Como el pltlsmido se mantiene en las celulas en un numero de copias elevado, los que porten genes intaetos sobreproduciran el producto normal del gen y permitirtln a un reducido numero de celulas sobrevivir a temperatura elevada. los fragmentos de DNA relevantes, que probablamente codifican protefnas que interaccionan con la protelna mutada original, pueden ser aislados de tas celulas supervivientes. las aproximaciones geneticas y bioqulmiCB6 se complementan, y muchas de las protelnas implicadas en el transporte vesicular hen
682

PaDel13·1 Estrategias udlb:adas per. estudi.r los mecanismos moleculares impUcados en eI transporteWllkular.-

SISTEMAS DE CELULAS SEMI·INTACTAS PARA EL ESTUDIO DEL l'RANSPORTE VESICULAR glucoprotelna VSV bloqueada enla red del trans Gol9i

Ellransporte de vesiculas tamblen puede esludiarse en dlulss cuya membrane plasmillica haye sido previemente permeabilizada perl! permitir librementa 81 paso, hacia

denlro 0 hecla luera, de molecules pequenas y de macromolecules. La permeebilizsci6n se consigue

mediante rOlUra flsies 0 mediante 81 tntlamiento con tOllinas baeterionas que abren grandes orificios en la membrana plasmatica. estas celulas semi-inlactas son particulermente Utile. pare estudiar 01 transporte desde sistemas de membrana extendide que se fragmentan durante los procedimientos de homogeneizaci6n convencionales, como liS al easa del ER y de Ie fed del trsns Goigi.

Las dlulss semi-inlaet85 58 han vtitizado para aistar vesiculas de transporte que median el transporte desde la red del trans Golgi hasta la membrana plamlltica apical. Las celu!as 58 cultivan a una temperatura baja {NC) de manera que el tr'flCO de membrena desde la red del rrans Goigi hasta la superflde de la celula estll bloqueado, y por 10 tanto la protelna vlrica principal 58 halla atrapada en el trans Golgi tAl. Cuando las celulas 58 permeabilizan ldepositando un uozo de papel de nitrocelulosa sobre elias y posteriormente retir'ndolo para romper la membranal. el dtosol sale de las dlulas dejando los sistemas de membrana (B). Entonces se levanta el bloqueo por temperatura y 58 anade chosel fresco y ATP, 10 cual h&Ce que las vesiculas que contienen la glucoproteina vinca se desprendan de la red del trans Golgi por gemaci6n y salgan de las celulas semi-intactas a uaves de los orificios de la membrana plasmatica IC). las vesiculas sa recogen V se purifican usando un anticuerpo que reconozca la cola citoplasmlltica de la glucoproleina transmembrana del virus, 10 cual permite identificar las proteinas que configuran la5 vesiculas de transporte.

IB) 200C membr.na pl.smitica .pteal

agujMeada medi.nte PlIpel de nit.ocelulosa

(CI 370C

+citosol +ATP

bloqueado por mutantes

GH"~

10J anli(;ulrpo conua la cola cill0s6lica d. Ie glucoprotelna "'rio>

bloqueado por mutantes A,B,C

bloqueado por mutanles 0,'"

las protelnas de transporte apic.ll 58 puritican mediante IU union I una columna con un 8n1icuerpo especfflCO

683

yema formando la vesicula revestida. Una vez la vesicula se desprende, la cuhierta se pierde rapidamenle. EI mecanismo por el cual se desprende tam poco se conoce, pero se ha demostrado que in vitro una proteina chaperona de la familia hsp70 actDa como una ATPasa de eliminacion de to. cubierta que utiliza la energfa de la hidr6lisis de ATP para eliminar la cuhierta de las vesiculas revestidas de datrina. Sin embargo, en la c~lula ha de actuar alglin mecanismo de control adicional para evitar que la cubierta de clatrina se elimine de la yema revestida de datrina antes de que tenga tiempo de formar una vesfcula, a pesar de que la cubierta persiste mas tiempo en la yema que en la vesfcula. Una posibilidad es que la perdida de la cubierta este controlada por Ca2., el cual puede unirse a las cadenas ligeras de clatrina y desestabilizar la cubierta de clalrina. Las bombas de Ca~' de la membrana plasmatica bomhean Ca2+ hacia el exterior de la celula y por 10 tanto la concentraci6n de Ca~' se mantiene extremadamente baja en 1a cara citos6lica de la membrana, 10 cual permite que las depresiones se manlengan revestidas; pero una vez las vesfculas revestidas se forman y migran alejandose de la membrana, se encuentran con concentraciones de Ca2+ mayores, que podrfan desencadenar la perdida del revestimiento. Normalmente las vesfcuJas pinocfticas revestidas de datrina son de tamano pequeno y uniforme, pero la datrina tambien esta irnplicada en la formaci6n de vesiculas mayores, tanto de vesiculas de secreci6n que contienen grandes agregados de proteina como de fagosomas que contienen grandes partfculas. En estos casos la c1alrina no forma revestimientos completos sino que se concenlra en detenninadas zonas de las vesiculas que se forman. Parece que la formaci6n de los parches de datrina ayudan a que la membrana se doble, pero el gran tamafio de la carga unida a los receptores evita que la membrana se pliegue 10 sufidente como para pennitir que se fonne un revestimiento completo.

Las adaptinas reconocen protemas transmembrana especfficas y las nnen al revestimiento de clatrina41 Se cree que el ensamblaje de la cubierta de las vesfculas revestidas tiene dos fundones como minimo: proporciona la fuerza mecanica para "estirar" hacia el exterior la membrana, fonnando una yema, y ayuda a capturar receptores de membrana especfficos junto con las moleculas a las que estan unido~. Una se-

~If~

~".~ t

ELiMINACION Of VEsiCULAS

--L FORMACION OE VEsicULAS

rlK:eplor de carga

k-----" clatrina

684

Capitulo 13 : TnUlco vesicular mediante las rutas secretora y endocftica

Figura 13-52 Transporteselectlvo

medJado porves(culas revestldas de

c1atrtna. Las adaptinas se unen tanto a los trisquelions de c1atrina como a los receptores de carga.

gunda moltkula principal de recubrimiento presente en estas vesiculas, un complejo formado por muchas subunidades Uamado adaptina, participa en ambas funciones. Las adaptinas son necesarias tanto para unir el revestimiemo de clatrina a la membrana como para atrapar diversos receptores proteicos transmembrana, los cuales capturan mollkulas especfficas en el interior de la vesicula. De este modo un grupo seleccionado de moleculas a transportar, unidas a sus receptores de carga especlficos, se incorporan allumen de cada una de las vesiculas de transporte revestidas de clatrina acabadas de formar (Figura 13-52). Las vesiculas revestidas de clatrina no son todas iguales. Hemos visto, por ejemplo, que algunas de elias, las que participan en el tn\nsito desde el complejo de Golgi hasta los endosomas tardios, son ricas en receptores M6P; otras, que participan en la ruta desde la membrana plasmatica a los endosomas tempranos, son ricas en receptores de compuestos extracelulares como las LOL. Aunque parece que el revestimiento de clatrina en si mismo es el mismo en cada caso, las adaptinas son diferentes y median la captura de diferentes receptores. Las adaptinas reconocen peptidos sefial en la cola citoplasmatica de los receptores. Una secuencia caracterfstica de cuatro residuos de aminoacido, que parece que fonna un giro brusco en la cadena polipeptfdica, es una parte esencial de la sena/ de elldocitosis compartida par los receptores de la superficie celular que participan en la endocitosis mediada por receptor a partir de la membrana plasmMica (Figura 13-53). Por el contrario, en la red del trans Golgi las adaptinas reconocen una secuencia de aminoacidos fosforilados enla zona carboxilo tenninal de los receptores M6P.

Las vesiculas revestidas de coat6mero median el transporte vesicular no selectivo42

motecula de carga

membrana pla,malica

adepllna

Figura 13-53 Pcptldo seoaJ para la endo<:ltosls. Se cree que los diversos reeeplOres proteicos de superficie eelular que son endocitados en las vesfeulas de c1atrina eompartcn esta sel'lal, la eual es reconocida por las adaptinas que aetllan en la endocitosis mediada por receptor desde la membrana plasmatica. Los aminoacidos mostrados aquf son una parte esenciaJ de la senal.

Se cree que las vesiculas revestldas de coat6mero median el transpone vesicular no selectivo de la ruta por defecto, que induye el transporte desde el reticulo endoplasmatico al complejo de Golgi, de una cisterna del Golgi a otra y desde la red del trans Golgi a la membrana plasmatica (Figura 13-54). Ninguno de estos procesos de transpone requieren que las vesiculas que se forman capturen una carga especffica en su lumen. El revestimiento de estas vesfculas consiste en parte en un gran complejo proteico lIamado coal6mero, formado par siete subunidades proteicas de revestimiento (liamadas COP, de coat protein). Por 10 menos una de elias, presenta homologfa de secuencia con las adaptinas de las vesiculas revestidas de c1atrina, pero existen importantes diferencias de comportamiemo entre el revestimiento de coat6mero y el de c1atrina. AI contrario que las cubiertas de clatrina, las de coat6meros no se autoensamblan sino que necesitan ATP que dirija su forma-

endosoma

;Off

Ir,\I)

I

'--

membrana plasmaticll

ER

Figura 13-54 Transporteveslcular sclC(:t1vo y no sclectlvo en cclulas no polarizadas. Se postula que el transporte no selectivo (eonstitutivo) (j1echas azules) esta mediado por vesiculas revestidas de eoat6mero, mientras que diversas formas de transporte seleclivo (mediado par senal) (jIechas rajas) se lleva a cabo mediante vesiculas revestidas de clatrina. En eelulas polarizadas se requiere una vfa adieional desde la red del trans Golgi mediada porscnaJ.

'-c==-'=~'L..--...J 1I6!Ilc1iia secretora dietiosoma red del ~ trans Goigi

Mccanismos molcculares del transporte veslculary mantenimiento de la diversldad de compartimientos

685

ci6n y en lugar de separarse en cuanto la vesicula se desprende de la membrana dadora, la cubierta de coat6mero se mantiene hasta que la vesicula alcanza su membrana diana. Parece que tanto el ensamblaje como el desensamblaje del revestimiento de coat6mero depende de una protefna denominada ARF, que tambien podrfa participar en el ensamblaje de las cuhiertas de clalrina. Es una de las much as proteinas de uni6n a GTP que son componentes clave en el control del transporte vesicular. Antes de comentar las particularidades de ARF, nos detendremos a revisar algunas propiedades de regulaci6n generales de las proteinas de uni6n a GTP.

EI transporte vesicular depende de protefnas reguladoras que unen GTP43 Como se comenta en el Capitulo 5, las celulas contienen extensas familias de proteinas reguladoras que unen GTP. Estas proteinas actuan como interruptores moleculares que pueden alteroar entre dos estados conformacionales -uno activo, onido a GTP yotro inactivo, unido a GOP- y acttian como reguladores de muchos procesos celulares complejos. Las protefnas de uni6n a GTP acruan en un ciclo que depende tipicamente de dos componentes auxiliares: una prote(na liberadora de Il/lcle6tidos de guanina (GNRP, de Guanine Nucleotide Releasing Protein) que cataliza el intercarnhio de GOP por GTP y una proteflla activadora de GTPasa (GAP, de GTPase Activating Protein) que desencadena la hidr6lisis del GTP unido. Muchas protefnas reguladoras que unen GTP tienen un grupo Iipfdico unido covalentemente que les permite unirse a la membrana, y parlicipan en una gran variedad de procesos dependientes de membrana en la celula. 5e han descrito dos clases estructuralmente distintas: las proteinas de UIli61l 0 GTP mOllOmericas (tambien lIamadas GTPaso monomericas), constituidas por una sola cadena polipeptfdica, y las prote(nas de uni6,1 a GTP trimericas (tambien lIamadas proteinos Gl, constituidas por tres subunidades distintas. Aunque estudios con inhibidores muestran que ambas clases de protefnas juegan un papel esencial en e1 transporte vesicular, las funciones de las GTPasas monomericas estan mas claras, por 10 que trataremos de elias aquf.

Parece que ARF sefializa el ensamblaje y el desensamblaje del revestimiento de coat6mero 44 ARF es una GTPasa monomerica con una cola de acido graso, y se cree que juega un papel crucial en el ensamblaje y desensamblaje del revestimiento de coat6mero. En el citosol se encuentra alta mente concentrada en la forma descargada, unida a GOP. Parece que la membrana dadora desde donde va a generarse una vesicula revestida de coat6mero contiene una protefna especffica Iiberadora de nucle6tidos de guanina que hace que ARF Iibere su GOP y una GTP en su lugar (la concentraci6n de GTP en el chosol es mayor que la de GOP). 5e cree que la uni6n de GTP hace que ARF exponga la cola de acido graso, que se inserta en la bicapa Iipidica de la membrana dadora. Cuando ARF se ha unido, reduta las subunidades del coat6mero, que se unen a el. EI ensamblaje de la cubierta de coat6mero, formado por ARF can GTP y por las protefnas de coat6mero, estira la membrana induciendola a que forme una yema, que entonces se desprende como 10 hace una vesicula revestida (Figura 13-55). Cuando la vesicula revestida de coat6mero alcanza su membrana de destino, una protefna especffica de la membrana diana, activadora de GTPasa, activa ARF para que hidrolice el GTP que lIeva unido hasta GOP. 5e cree que esto provoca un cambio de conformaci6n en la protefna ARF de manera que la cadena de acido graso se desprende de la membrana, causando el desensamblaje del revestimiento y permitiendo que se produzca la fusi6n de la membrana, como veremos. Por 10 tanto ARF puede considerarse como una proteina que detecta las 686

Capflulo 13: Tr
vesicula reeubierte de coet6mero

ARF·GOP

inactive y soluble



cole de 'cido graso

coel6mero

'l1

membranJ dedora

proM/ne Iiberadora 1M nucle6tldos de gu.nln'IGNRPI

,,"_ _R

IAI

IBI

eireunstancias y genera la senal apropiada, tanto para el ensamblaje de la cubierta y la gemaci6n de la vesfcula como para el desprendimiento de la cubierta y su fusi6n a la membrana, como sera el caso. Aun mas importante, si existe una prOlefna liberadora de nucle6tidos de guanina en la membrana dadora y una proteina activadora de GTPasa en la membrana receptora, la direcci6n de transporte esta definida: mediante el cicio de hidr6lisis de GTP y el intercambio GDP/GTP, ARF facilita la transferencia en una "olea direcci6n.

FIgura 13-55 Modelo actual sobre la fonnacl6n de las vesfculas revestldas de coat6mero. (A) La proteina ARFGOP, soluble e inactiva, se une a una protefna liberadora de nucle6lidos de guanina (GNRP) en la membrana dadora, 10 cual provoca que ARF libere su GOP yse una a GTP, EI GTP desencadena un cambio conformacional en ARF dejando expuesta su cadena de acido graso, que se inserta en la membrana dadora, (B) Ahora, la protefna ARF-GTP activa unida a la membrana recluta subunidades de coat6mero de la membrana. Esto haee que la membrana forme una yema. El posterior acontecimiento de fusi6n de membrana separa y Jibera la vesfcula revestida. La droga brefeldina A bloquea la formaci6n de la cubiena de coat6mero inhibiendo la reacci6n de intereambio de GDP porGTP. Ello bloquea el trafico de las vesfculas revestidas de c1atrina desde el ER a traves del complejo de Galgi, haciendo que el complejo de Galgi vacfe su contenido en el ER, como se explica en la pagina 646.

Marcadores proteicos de organulo, Uamados SNARE, colaboran en la direcci6n del transporte de vesiculas 45 Las vesiculas de transporte, sean 0 no selectivas allOmar la carga del compartimiento dador, han de ser a1tamente selectivas en coanto a la membrana diana a la que se fusionan, Esto sugiere que todos los tipos de vesiculas de transporte de la celula han de expresar marcadores de superficie que las identifiquen segun su origen y su carga, y que sean reconocidos por receptores de las membranas diana. Aunque el mecanismo de este reconocimiento no se conoce, existe una hip6tesis atractiva que supone la participaci6n de unas prolefnas denominadas SNARE (por razones que se comentan mas adelante), de las cuales existen gropos complementarios v-SNARE en la membrana de la vesicula y t-SNARE en la membrana diana (t de larget. diana) (Figura 13-56). Las prolefnas SNARE estan bien caracterizadas en las celulas nerviosas, en las cuales se cree que median la uni6n de las vesiculas sinaptieas a la membrana plasmMica dellerminal nervio-

o

N\8..PQ!Mh

-0-Oc-

,

COMPARTlMIENTO

Figura 13-56 Papel propuesto para las protefnas SNARE en la dlreccl6n del transporteveslcular. Grupos complementarios de SNARE en las vesfculas (v-SNARE) y de SNARE en las membranas diana (t-SNARE) determinan la selectividad del contaclO de las vesfculas de lransporte con su membrana diana. Las protefnas v-SNARE, que estAn coempaquetadas con las protelnas de la cubiena durante la fonnaci6n por gemaci6n de las vesiculas de transporte desde la membrana dadara, se unell a las I-SNARE complementarias de la membrana diana.

Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversldad de compartimientos

687

Figura 13-57 Papel propuesto para las protelnas Rab garantl7.ando la especlftcldad de la unl6n entre lu vesfculas de transporte y I. protelM liberlldore de nucle6tiOoll de guanine

!

y-SNARE

yulcule de trans porte R.b·GOP

soluble

~_

•

~grupo Ilpld.co

\

so en preparaci6n para la exocitosis: en la vesicula simtptica existe una v-SNARE yen la cara ciloplasmAlica de la membrana plasmAtica existe una t-SNARE complementaria.

Se cree que las protemas Rab aseguran la especificidad de la uni6n de las vesfcuJas 46 En la relula exislen muchos sistemas de membrana por 10 que el proceso de uni6n de las distintas veslcuJas ha de ser altamente selectivo. Una vesfcula puede inspeccionar muchas membranas potencialmente diana antes de que su v-SNARE encuentre una I-SNARE complementaria. Segun un punto de vista, este proceso crucial de reconocimicnto estA controlado por miembros de una familia de protefnas GTPasas monom~ricas lIamadas protel'nas Rab, que controlan que la interacci6n entre v-SNARE y t·SNARE sea correcta. SegUn este enfoque. las protefnas Rab estAn unidas a la superficie de las vesiculas revestidas que se estAn formando en la membrana dadora. Cuando una vesicula encuentra la membrana djana adecuada. la uni6n de v-SNARE a (-SNARE permite que la veslcuJa permanezca unida durante el tiempo necesario para que la proteina Rab hidrolice el GTP que lIew unido, 10 cua! bloquea a la vesfcuJa en la membrana diana. preparAndola para la fusi6n posterior con eUa (Figura )3-57). Las c~lulas eucarioras tienen muchos tipos de proteinas Rab. cada una de las cuales estA asociada con un orgAnulo rodeado de membrana particular que participa en la vfa de secreci6n 0 en la vfa endocflica. Cada uno de estos orgAnulos presenta por 10 menos una prOlefna Rab en la superficie chos6lica (Tabla 131). La primera prote(na Rab (Ilamada Sec4) fue descubierta en levaduras mediante la selecci6n de mutaciones (Ilamadas mutaciones SEq que interfieren en el proceso de secreci6n. Posteriormente se vio que se trataba de un componente de las vesfculas de secreci6n necesario para su uni6n a la membrana plasmlitica; las mutaciones que los modifican evitan que las vesfculas de secreci6n viertan su contenido at exterior. Las secuencias de amino~cidosde estas protefnas Rab son mas diferentes entre sf en su zona carboxilo terminal; experimemos de inter688

Caprtulo 13: Tr.1fico vesicular mediante las rutassecretora y endocftlca

me.mbrana diana. La prote!na liberadora de nucle6tidos de guanina en la membrana dadora reconoce una proleina Rab especifica y la induce a inlercambiar su GOP por GTP. Este cambio altera la conformaci6n de la proteina Rab, exponiendo su grupo lipfdico unido covalenlemente, el cual anda la proterna Rab a la membrana. La proteina Rab-GTP pennanece unlda a la superfiele de la vesicula de transporte despu6; de que ~Ia se separe de la membrana dadora. Una prole[na v-SNARE de la superfiele de la vesfcula se une a una I-SNARE de la membrana diana. inmovilizando parelalmenle la vesicula. Entonees, la prolefna Rab hidroliza su GTP anclando la vesfcula a la membrana diana y libentndose aI eltosol como Rab-GOP, desde donde puede ser reutillzada en una nueva ronda de transporte. La vesfcula se fuslona entonces can la membrana diana. N61ese que los revestimientos de la vesfcula han sido omitidos del esquema para mayor c1aridad.

Tabla 13-1 LocaUzaciones subcelulares de algunas protefnas Rab Proteina-

Organulo

Rab! (YPT!) Rab2 Rab3A Rab4 Rab5 Rab6 Rab7 Rab9 Sec4

ER Y complejo de Golgi ER transidonal, red del cis Goigi vesfculas de secred6n endosomas tempranos membrana plasmatica dsternas del trans y del medial Golgi endosomas tardfos endosomas tardfos, red del fTans Goigi vesfculas de secreci6n

• Todas estas protefnas se han hallado en protefnas de levadura.

c~lulas

de mamffero excepto Sec4 e Yf'T1, que son

cambia de extremos usando tecnicas de ingenierfa genetica indican que es precisamente este extrema el que determina la localizaci6n intracelular de cada miembro de la familia, probablemente permitiendole que se una a un factor da· dor de nucle6tidos de guanina complementario, situado en la superficie del or· ganulo particular (vease Figura 13-57). Antes de que las SNARE fueran las candidatas como las proteinas marcadoras de organulos que gufan el transporte de vesfculas, se crefa que las protefnas Rab ejercfan esta funei6n por su notable distribuci6n especffica entre los organulos. Sin embargo, actualmente se sabe que algunas protefnas Rab son funcionalmente intercambiables, ya que mediante experimentos de ingenierfa se ha podido localizarlas en otros organulos. Por 10 tanto no pueden constituir la unica explicaci6n de la selectividad del transporte vesicular.

La fusi6n de vesiculas esta catalizada por una umaquinaria

de fusi6n de membrana"-41 Cuando la vesfcula de transporte ha reconoeido su membrana diana y se ha uni· do a eUa, la vesfcula ha de liberar su carga mediante la fusi6n de membrana. Sin embargo, la fusi6n de la membrana no se produce siempre inmediatamente. Como hemos visto, en la exoeitosis regulada la fusi6n no ocurre hasta que es desencadenada por una senal extracelular. La uni6n y la fusiOn son dos procesos distintos y separables. Es posible, por ejemplo, evitar la fusiOn perc no la uni6o, manteniendo los niveles de Ca2+ eitos6lico rouy bajos. Ello provoca la acumulaciOn de vesfculas unidas, pem no fusionadas, con su membrana diana. La uni6n sOlo requiere que las dos mem-

SNAP vesicula de transporte Inmovilizada

NSF

~,

IG@Rllb-GDP

ENSAMBLAJE DE LA . . MAQUINARIA DE FUSION

MEMBRANA " '_ _'" DE FUSION

Figura 13-58 Modelo actual sabre la fusl6n de vesfculas medlada por prolefna. Una compleja maquinaria de fusi6n cataliza la fusi6n de una vesfcula de transporte con su membrana diana. S610 han sido caracterizados dos de los componentes proteicos del complejo de fusi6n: NSF (proteina de fusi6n sensible a N-etilmaleimida, de Nethylmaleimide-sensitivejilsion protein) y SNAP (protefnas solubles de acoplamiento a NSF, de soluble NSF attachment proteins). (NEM es un compuesto quimico que modifica los grupos Ubres SH expuestos en las superficies proteicas y por 10 tanto inactiva prolefnas cuyos gropos SH expuestos scan necesarios para su actividad.) Las prolefnas SNARE fueron identificadas por primera vez como receptores de SNAP (de aquf su nombre): unen lanto v-SNARE como I-SNARE. La uni6n de SNAP pennile que NSF se una. Este complejo, con la ayuda de acil Coa y prolefnas aun no identificadas. calaliza la fusi6n de las dos bicapas lipfdicas. NSF es una ATPasa que hidroliza ATP liberando el complejo una vez ha realizado su trabajo (no se muestra).

Mecanismos molcculares del transporte vesicular y mantenimlento de la diversidad de compartlmientos

689

kido nucleieo vlrieo cubierta del viru' ESPACIO E~ACElULAR

CITOSOL

iiMiC--I-- proteins

de fusi6n

ENDOCITOSIS DE UN VIRUS RECUBIERTO Y TRANSPORTE HASTA UN ENDOSOMA. LA OlSMINUCI6N DEL pH EXPONE lOS lUGARES HIDROF6BICOS DE LAS PROTEINAS DE FUSI6N

'--------' O,21Jm

IAI

Figura 13-59 Entrada en las celulas de una plaga de virus de ave. (Al Electronmicrograffas que muestrall c6mo es endocitado un virus en una vesicula reveslida de c1atrina, c6mo es conducido a un endosoma. y c6mo se escapa de el fusionandose con la membrana del endosoma. (B) Dibujo esquematico de la forma en que unas protefnas de fusi6n de la sUllerficie del virus median su salida del endosoma. (A, cortesfa de Karl Matlin y Hubert Reggio, de K.S. Mallin et al.. 1. Cell BioI. 91:601-613,1981, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

LAS REGIONES HIDROF6BICAS DE LAS PROTEfNAS OE FUSI6N Sf INSERTAN EN LA MEMBRANA DEENDOSOMA

I

branas se acerquen 10 suficiente como para permitir que las protefnas que sobresalen de la bieapa lipfdica interaccionen entre sf y se adhieran. La fusi6n requiere una aproximaci6n mayor, quedando las membranas a 1,5 nm una de otra de manera que puedan juntarse. Para que se produzca esta apro:d.maci6n, se ha de desplazar el agua de la superficie hidrofflica de la membrana -proceso que es altamente desfavorable desde el punto de vista energetico. Parece probable que todas las fusiones de membrana en las celulas sean catalizadas por protefoas de fusi6n especializadas que proporcionen un camino para atravesar esta barrera energetica. EI mecanismo todavfa se conoce muy mal. En el caso de las vesfculas de transporte revestidas de coat6mero, por 10 menos, la fusi6n con la membrana diana requiere ATP, GTP, acil CoA, y diversos componentes proteicos. Se conocen dos componentes proteicos, denominadas NSF y SNAP (por razones que se explican en el pie de la Figura 13-58), que reaccionan de forma cfclica con las membranas que se van a fusionar y el citosol. Las SNAP se unen tanto a v-SNARE de la membrana de la vesicula como a t-SNARE de la membrana diana, iniciando el ensamblaje del aparato de fusi6n, el cual cataliza la fusi6n de las dos bicapas lipfdicas en la interfase membranosa de la vesfcula diana (Figura 13-58).

La protefna de fusi6n de membrana mejor caracterizada

est3. sintetizada por un virus 48 La fusi6n de membranas es importante en otros procesos ademas de serlo en el transporte de vesiculas; se conocen can detatle las fusiones de membrana mas simples, que son las catalizadas par protefnas viricas de fusi6n vfricas. Las proteinas viricas de fusi6n juegan un papel crucial permitiendo la entrada de los virus recubiertos (los cuales tienen una cubierta membranosa de tipo bicapa lipfdica) al interior de las celulas que infectan (comentado en el Capftulo 6). Los virus como el virus de la gripe, par ejemplo, entran en la cclula par endocitosis mediada por receptor y son transportados hasta los endosomas. EI bajo pH de los endosomas activa una proleinas de fusi6n de la cllbierta del virus que cataliza la fusi6n del virus can las membranas del endosoma, permitiendo asf al acido nucleico vf· rico escapar a.l citoso!, donde se puede replicar (Figura 13-59). 690

Capitulo 13: TrMico vesicular mediante las rutas sccretora y endodlica

FUSI6N DE LAS BICAPAS Y lIBERACI6N DEL ACIOO NUClEICO EN EL CITOSOl

J

IB(

~CITOSOL

protelne de fusl6n de Ie gripe en la membrana peplidos de Ie cltlule 1 hidrof6bicos de fusi6n. escondidos

1

CAMBIO CONFORMACIONAL QUE EXPONE LOS P~PTIOOS DE FUSI6N HIDROF6BICOS

membrana plesmltlice de la cltlule 2 CITOSOL DE LA C~LULA 2

pH bsjo

(A)

sncfaje trsnsmembrans

181

lei

CITOSOL DE LA C~LULA 1

Figura 13..60 Modelo para expUcar como una protefna de fusl6n de membrana catallza la fusion de la blcapa IIpCdlca. Una celula que expresa en su superficie la proteina de fusion de la gripe se fusiona nl.pidamcnte can sus celulas vecinas una vez sc ha expuesto a pH bajo. Los procesos de fusion se producen a traves de un paso inlermedio (0 y E) en el que solo se fusionan las capas lipidicas extcriorcs de la membrana, mientras que las dos capas internas se mantienen separadas. Incluso se han oblenido formas mUlanles de la protefna de fusion que permilen que la reaccion se desarrolle solo hasta este eslado intermedio.

Se han c1onado los genes que codifican varias protefnas de fusi6n y se han utilizado para transfectar celulas eucariot'as en cultivo. Estas celulas Iransfectadas expresan las prote[nas vfricas en su superficie, y bajo condiciones adecuadas se fusionan entre sf formando celulas gigantes multinucleadas. En el caso mejor estudiado, el del virus de la gripe. la estructura tridimensional de la protefna de fusi6n ha sido determinada por cristalograHa de rayos X. Se ha demostrado que el pH bajo induce un cambio de conformaci6n importante en la protefna de fusi6n, que expone una regi6n hidrof6bica. antes escondida, en la superficie de la prote'na, que ahora puede interaccionar con 1a bicapa lipfdica de 1a membrana diana. Parece que una agrupaci6n de regiones hidrof6bicas de este tipo en protefnas de fusi6n muy cercanas une las dos bicapas Iip[dicas manteniendolas muy cerca una de la otra, de forma que se desestabilizan y se fusionan {Figura 13-601. Recientemente, en mamffero se ha identificado una protefna semejante a las vfricas. y se cree que media la fusi6n de las membranas plasmaricas del esperma y del huevo que se produce en la fecundaci6n (se comenta en el Capftulo 20). Como resaltan todos estos ejemplos, bajo circunstancias normales las membranas no se fusionan facilmenle. La fusi6n de membranas requiere 1a participaci6n de protefnas especiales y esta. sometida a commies selectivos -una restricci6n que es crucial tanto para mantener la identidad de la celula en sf misrna como para mantener la individualidad de cada uno de los compartimienlos imracelulares.

Resumen Las diferenciWi entre los compartimientos membranosos de una uiula se mantienen gracias a un aporte de energla libre, que im/lulsa el transporte selectiuo y diri· gido de componentes particulares de membrana desde un compartimiento a otro. Las ves{culas de transporte se generan a partir de regi.ones revestida.! especializadas de la membrana dadora. El ensamblnje de In cubierta colabora en In formm:i6n de la ves{cula. Existen dos lipos bien caracterizados de ves{culas revestida.!: las ves{culas revestida.! de datrina, que median el transporte vesicular selectiuo tksde la membrana pULSmdtica y la red del trans Golgi, y las ves{culas relJf!stidas de coat6· mero, que permiten el transporn vesicular no selectluo dew el ER a las cisternas del Golgi. Las adaptinas proporcionan una uni6n molecular elltre las cubiertas de clatrina y los receptores espec{jicos de membrana y por to tanto medlan la captaciOn selectiva de moleculas a transportar por las ves{c"las revestida.! de clatrina. Las ves{culas revestidas han de perder su cubierta parafusionarse con la membra-

Mccanismos moleculares dellransporte vesicular y mantenimienlo de la diversldad de compartlmienlos

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na diana apropiada: en cuanto las ves£Clllas entrmJ en contacto con Sil membrana diana, los revestimientos de clatrinase pierden. Diversos tipos de GTPasas monomericas. incillyendo ARF y las prote{1Ul$ nab, partieipan en Ia regulnci6n de varias etapas del transporte vesicillar, incluyendo la genuu:i6n de las IIf!s{clllas, el contm:to COli la membrana diana y la fusiOn. Las prote{1Ul$ ARF, Rub, Y v-SNARE se incorporan a las ves{cillas de transporte dllrante la gemaci6n y aseguran q"~ las ves{w.1as s610 entregllen su colltellido al compartimiento rodeado de membrana apropiado: se cree que ARF media el ensamblaje de In cubierta de coat6mero (y probabiemente el de clatrinaJ y el desensamblaje de In cubierta de coat6mero, mientras que las prote{1Ul$ Rub parece que asegllran Ia especiflcidad de uniOn anclando la veskula a la membrana diana cuando interm:cimum SNARE complemenmrias de la membrana diana y de la veS{Cllla. Por 10 ronto, la fusi6n de membranas esttf catalizada por varias prote{1Ul$ citos6licas, inclllyemw SNAP y NSF, que se unen entre s{formando un complejo de fusiOn en el lugar de anclaje.

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Blbllograffa

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695

Mitocondrias parecidas a caracoles de una por electronmicroscopia de alto vohaje.

c~lula epitelial de

caracol, visualizada

Conversion energetica: mitocondrias y cloropla~tos

Las mJtocondrlas. que estlin presentes en todas las celulas, y los plastos (espe· cialmentc los c1oroplastos) que se presentan exclusivamenle en las plantas. transfonnan la energfa en rarmas utiJizables para impulsar reacciones celulares. De acuerdo con su importancia en el metabolismo. generalmente constituyen una parte importante del volumen celular total. En electronmicrograrfas una de las caracterfsticas morfol6gicas de las milocondrias y de los c1oroplastos es la gran cantidad de membrana intcrna que contienen. Como veremos, esla membrana juega un papel crucial en la funci6n de estos orgdnulos transformadores de energfa mediante la provisi6n de un substrata estructural para los procesos de lransporte de electrones. Aunque las milocondrias convierten la energia derivada de combustibles qufmicos y los e1oroplastos convierten la energia derivada de la luz solar, los dos tipos de organulos se organizan de manera similar; ademas, ambos producen grandes cantidades de ATP a traves del mismo mecanismo. Esta deslacada can· c1usi6n surgi6 de los detallados estudios lIevados a cabo durante los ultimos treinta anos. La ruta eomun mediante la eua! las mitocondrias, los e1oroplaslos y hast'a las bacterias se proveen de energfa para sus funciones biol6gicas actua a traves de un proceso conocido como el acoplamiento quimiosm6tico. La energfa de los nulrienles y de la luz solar es utilizada para impulsar una bomba de protones (bomba de W) unida a la membrana que transfiere protones de un lade al Olro de la membrana. Estas bombas generan un gradiellte efectroqufmico de protones a traves de la membrana que es utilizado en varias reaeciones que requieren energia cuando los protones son captados por protefnas asociadas a la membrana (Figura 14-0. Concrelamente, entre estas maquinas se encuentra la enzima ATP sintasa, que U1iJiza la energia del flujo de protones para sinlelizar ATP a par· tir de ADP y PI' Otras prole(nas acoplan el flujo de protones a! transpone de de· lerminados metabolitos dentro y fuera de los organulos. En las bacterias el gra· dienle electroqu[mico de prolones es por s( solo tan importante como almaren de energfa directamente utilizable como por el ATP que este genera: el gradieme no wlo impulsa muchos procesos de transpone sino que tambien impulsa la rolaci6n rapida del Dagelo bacteriano. 10 que permite la motiJidad bacreriana en media acuoso. iDe qu~ forma la energfa derivada de los nutrientes 0 de la luz impulsa las bombas de H' que estan en el nueleo del mecanismo quimiosm6lico? La respuesta radica en las reacciones en las que los elecrro"es son transferidos de un componente a otro. En la mitocondria, por ejemplo. los electrones liberados de

IIIlect.ones de ellllvada enlllrg,a

gradilllnllll elecl.oqulmico de prOlones

Iransmembrene

/1\

Iransporte

.ln11ll8i8

activo a

d.

Ir.v4i. dill I. membrane

1m

rOlaci6n del f111~10

bacter1eno

Figura 14-1 AcoplamJento qulmJosm6Llco. La energfa procedente de la luz solar 0 de la oxidaci6n de los a1imemos. se utiliza en primer lugar para generar un

gradiente elecrroquimico de protones a

trav& de la membrana. Esle gradiente constituye un a1macen Yersatil de energfa y se utiliza para impulsat diversas reocciones de la m1locondria, de los doroplaslOS y de las bacterias. 697

MITOCONORIA

CLOROPLASTO

I"

I"

.•. fotoeisteme

fotosisteme cicio del 'cide e!lrico

"

~

l

ckllode

__

,---(fljacl(Jn del

J

IAI

..

clfliono

IBI productos

una molecula glucfdica en el curso de su degradaci6n hasta COl son transferidos hasta el 01 a traves de una ruta complicada, reduciendo el 0 1 hasla formar agua. La energfa libre liberada cuando los eleclrones pierden energfa por esta vfa de un estado de alta energfa a un estado de baja energfa es utilizada para impulsar las bombas de protones como parte de un elaborado proceso de transporte de electrones que tiene lugar en la membrana mitocondrial principal. EI mecanismo es amilogo a.l de una celula electrica que impulsa corriente elecnica a traves de un conjunto de motores elecnicos. Pero en los sistemas biol6gicos los electrones no son transporlados de un lugar a otro mediante hilos conductores, sino por molecuJas difusibles que pueden recoger electrones en un lugar y enlregarlos en otro. Uno de los mas importantes de estos transportadores de elecrrones es el NAO', que puede captar dos electrones (mas un H+) para convertirse en NADH, que es una pequena molecula soluble en agua que transporta electrones desde los lugares en que se degradan las moJeculas hasta el primero de una serie de transportadores incluidos en la membrana mitocondrial. Estos Iransportadores difunden en el plano de la membrana y transportan su carga de electrones desde una bomba de H' a olra. La tercera bomba de H' de la serie cataliza la transferencia final de los electrones al 01 (Figura 14-2A). EI conjunlo completo de protefnas y moleculas pequeflas implicadas en esta secuencia ordenada de transportadores de electrones en la membrana se denomina cadena de transporte de electrones. Aunque el c1oroplasto puede ser descrito en lerminos similares y algunos de sus componentes principales son muy similares a los de la mitocondria, la membrana del c1oroplasto comiene algunos componentes cruciales no encontrados en la membrana mitocondrial. Es mas, entre esos componentes estan losfotosistemas, en los que la energfa luminosa es capturada y preparada para la transferencia de electTones, de manera anaIoga a como hacen las fOlocelulas fabricadas por el hombre en paneles solares, absorbiendo la energfa luminosa y utilizandola para impuJsar corriente elect rica. La fuerza motriz del electr6n generada por los fotosistemas del c1oroplasto impulsa el transporte de electrones en dire£ci6n opuesta a la que hemos descrito para el caso de las mitocondrias: los electrones son recogidos desde la molecula del agua produciendo 02 y son donados (vfa NADPH) al COl' para sintetizar carbohidratos. De esta forma el c1oroplasto genera 02 y carbohidralOS, mientras que la mitocondria los consume (Figura 14-28). Generalmente, se cree que los organulos de eucariotas transformadores de energfa evolucionaron desde procariotas que fueron endocitados por celulas eucariotas prirnitivas y desarrollaron una relaci6n simbi6tica con ellos, hace aproximadamente 1,5 x lO~aflos. Esto explicarfa por que las mitocondrias y los c1oroplastos contienen su propio DNA, que codifica algunas de sus protefnas. Desde 698

1

Caprtulo 14 : Conversi6n energetlca: mitocondrias y c1oroplastos

produetos

Figura 14-2 Lamltocondriayel c1oroplaslo como aparatos de transformacl6n de energfa. Las enlradas se indican can flechas verde claro. los productos en azul y eJ sentido del flujo eleclr6nico can flechas rojas. N6tese que la fuerza electromolriz generada por los dos fotosistemas de los c1oroplaslOs permile aI c1oroplaslO (8) impulsar una rransferencia electr6nica desde el H20 aJ carbohidralO, ell sentido comrario aJ de la transferencia electr6nica de las mitocondrias.

- - - 20 minulos

•

Figura 14·3 Plastlcldad mltocondrial. Cuanda se observa una milOcondria en una celuJa viva, se aprecian en ella rapidos cambios de fonna.

su captaci6n inicial par una celula huesped estos organulos han perdido gran parte de su genoma y han L1egado a depender notablemente de prot'einas que son codificadas por genes en el nucleo celular, sinteti7..adas en el citosol yentonees imponadas al organulo. De forma reciproca, las celulas huesped han lIegado a depender de estos organulos tanto por la gran cantidad de ATP que necesitan para Uevar a cabo la biosfntesis, el bomboo de iones, y la motilidad como por detenninadas reacciones biosinreticas que ocurren dentro de ellos.

La mitocondria 1 La mitocondria ocupa una parte substancial del volumen citoplasmAtico de las celulas eucariotas, y han side esencialcs para la evoluci6n de los animales pluricelulares. Sin las mitocondrias las celulas animales actuales depcnderfan de la g1uc6lisis anaer6hica para fonnar ATP. Sin embargo, cuando la g1ucosa es convenida en piruvalo a traves de la g1ucolisis, s610 se libera una pequena fracci6n del total de la energfa lihre pOlencialmente disponible de la g1ucosa. En las mito· condrias el metabolismo de los azticares esta integrado: el piruvato es importado dentro de la mitocondria y oxidado por el oxfgeno molecular (02) a CO 2 y Hp. La cnergfa liberada es almacenada de una forma tan eficiente que por cada molecula de g111cosa oxidada se prodllcen aproximadamente 30 moleculas de ATP. Por el contrario, wlo dos moleculas de ATP son producidas a partir de la glucolisis. Las mitocondrias suelen descrihirse como cilindros alargados y rfgidos, de un diamclro comprendido entre 0,5 y I I-'m y parecidos a bacterias. Sin embargo, la microcinematograffa a intervalos de liempo de las celulas vivas revela que las mitocondrias son organulos c1aramente m6viles y plasticos, que camhian constanlemente de fonna (Figura 14-3) e incluso que se fusionan unos con otros y se vuelven a separar. Cuando se desplazan por el citoplasma, las mitocondrias apa· recen a rnenudo asociadas a los microtubulos (Figura 14-4),10 que quizas determina la orientaci6n y la distribuci6n tfpica de las mitocondrias en los diferentes tipos celuJares. Asf, las mitocondrias de algunas celulas forman largos filamentos o cadenas m6viles, mientras que olras se mantienen en una posici6n fija en la que pueden proporcionar ATP directamente en lugares de consumo anormalmente elevado de ATP -por ejemplo, exiSlen un gran n(imero de mitocondrias empaquetadas entre las miofibrillas adyacenles en las celulas del musculo cardfa· co,o mitocondrias densamente agrupadas a1rededor del flagelo en los espennatozoides (Figura 14·5). Aunque su tamano es suficiente como para ser observadas al microscopio 6ptico -fueron identificadas por primera vez en el siglo XIX- el verdadero progreso en el conocimiento de su funci6n dependi6 de procedimientos para aislar mi-

La mJtocondria

Figura 14-4 Relaciones entre las milocondrlas y los mlcrOll1bulos. (A) Micrografia 6plica de cadenas de milocondrias alargadas observadas en una celula viva de mamrrero mantenida en cultivo. La celula fue contrastada con un colorante vital fluorescente (la rodamina 123) que marca especfficamente las mitocondrias. (B) Micrograffa de inmunofluorescencia de In misma celula anterior pero fijada y contraslada con anticuerpos nuorescemes que se unell a los microtUbulos. N6tese que las milocondrias tienden a alinearse a 10 largo de los micronibulos. (Por conesfa de Lan 50 Chen.)

699

Figura 14-5 Locallzacl6n de las mltocondrias en el musculo canlJaco y en 1a cola del espennatozolde, cerca de los 1ugares en los que se utllizan grandes cantklades deATP. Durante el desarrollo del flagelo de la cola del espermatozoide, onos microl\ibulos se enroscan de forma helicoidal a1rededor del axoncma, donde aI parecer condicionan la localizaci6n de las mitocondrias en la cola; despucs, estos microtubulos desaparecen. MUSCULO CAROIACO

COLA OEL ESPERMATOZOIOE

toeondrias intactas, desarrollados en 1948. Por euestiones tecnicas, la mayoria de los estudios bioquimicos se han realizado en mitoeondrias purificadas de hfgado; eada celula hepatica contiene entre 1000 y 2000 de estos organulos, los cuales ocupan aproximadamente una quinta parte del volumen celular.

La mitocondria presenla una membrana externa y una membrana interna que defme dos compartimientos internosZ Cada mitocondria esta limitada por dos membranas altamente especializadas, que desempeftan un papel crucial en las actividades de la mitoeondria. Ambas membranas definen dos eompartimientos mitocondriales diferentes: el espaclo de la matrlz, interno, y un espacio intermembranoso mas estreeho que el ante· rior. 51 las mitocondrias purificadas se rompen suavemente y luego se fraccio· nan sus distintos componentes (Figura 14·6), se puede determinar la composici6n bioqufmica de cada membrana y de los espacios delimitados por elias. Tal como se presenta en la Figura 14-7, cada uno contiene una colecci6n determina· da de protefnas. La membrana ex:terna eontiene numerosas copias de una proteina de transpone, Hamada parina (vease Capftulo 10), que forma grandes canales acuosos a traves de la bieapa lipidica. As!, esta membrana se parece a un tamiz permeable a todas las moleculas de menos de 5000 daltons, incluidas pequeftas prote!nas. Estas moleeulas pueden penetrar en el espacio intermembranoso perc 1a mayoria de elias no pueden atravesar la membrana interna, que es impermeable. Esto signifiea que, rnientras que el espacio intermembranoso es qu!micamente equivalente al citosol respecto a las pequeiias moltkulas que conriene, el espacio de la matriz eontiene un grupo de pequeiias moleeulas altamente seleccionado. Como explicaremos con detalle mas adelante, el principal compartimiento de la mitocondria desde el punto de vista funcional es la matriz y la membrana interna que 10 delimita. La membrana mitocondrial interna esta altamente especializada. Contiene una elevada proporci6n del fosfolfpido "doble" cardiolipina, que contiene cuatro acidos grasos que al parecer eolaboran en conseguir que la membrana sea espeeialmente impermeable a los iones. Tambil~n presenta diversas protefnas de transporte que hacen a la membrana permeable selectiva-

Figura 14-6 Fracclonamlento de mltocondrias purificadas en sus componentes. Estas tecnicas han hecho posible estudiar las diferentes prolefnas de cada compartimiento mitocondrial. EI metodo mostrado, que permite el procesamienlo de un gran mimero de mitocondrias al mismo tiempo, aprovecha el hecho de que en un media con una fuerza osm6tica baja, el agua fluye hacia dentm de la mitocondria y dilata el espacio matricial (amarillo). Mientras que las crestas de In membrana mitocondrial interna la permiten desplegarse para acomodarse a In expansi6n, la membrana externa -que no tiene pliegues- se rompe, liberanda una estructura compuesta s610 por la membrana interna yla matriz.

700

Capftulo 14 : Conversion energelica: mitocondrias y c1oroplastos

MITOCONORIA

metriz

INTACT~A';~G"'9?;;';';::membrene externs membrana Interna espacio intermembrane en un medio de baie osmolaridad, el influio de agua hace que la mitocondria se hinche V que Ie membrane externa se rompa, liberendo el contenido del espacio intermembrana; la membrene interna permanoce intecta

I

la centrlfugaci6n consigue que el contanido del espacio intermEtmbrena quede en la fracci6n no sedimentads

······ D....

.' .' ...... : .. '.:

ESPACIO INTERMEMBRANA Is trsnsferencia e un medio de osmolaridad elevada provoca la retracci6n

la centrifug&ci6n en gradiente de densldad separs la membrana elcterne de la mitocondrie de la matriz V Is membrana que la rodea

Ie rotura V centrifugaci6n separa la membrana interna de los componentes de la matrlz

·0"-

.l"'~ _ 0

o~oo

• "'0 0- 0 MEMBRANA lNTERNA

MATRIZ

MEMBRANA EXTERNA

Figura 14·7 Organizacl6n general de una mJtocondria. En eJ hfgado se estima que un 67"(, de la totalidad de las praternas mitocondriales se encuentran en la matm, un 21'" se encuentran en la membrana mitocondrial imerna, un 6% en Is membrana externa yOlro 6% cn eI espacio intermembranoso. Como se Indica a contlnuaci6n, cada una de estas cuatro regiones cunticne un equipo especial de proteinas que fntemene en distintas funciones. (Cones!a de Daniel S. Friend.)

'-----' '00 nm

Matriz. La matnz contiene una mezda alta mente concantrads de cientos de eozlmas. incluyando las que son necesarias para Ie oxidaci6n del piruvato y los kidos grasos y para el cicio de acido

cllrico. La mal,iz tambian conliene diversas copias idlmlicas del genoma de DNA mitocondrial, ribosomes mitocondriales especiales, IRNA y varias enzimas requeridas para la expresi6n de los genes mitocondriales.

Membran'!'nterna. La membrana interna S6 encuentra replegada en numaras crestas, que aumentan considerablemente su superficie lotal. Cootien proteinss con Ires tipos de funciones: 111 squallss que realizan las reacciones de oxidaci6n de Ie cadena respiratoris, (2) un complejo enzimatico Itamado A TP sintsss que produce ATP en la matoz, y (3J proteinas de transpone especfficas que regulan el paso de metabolitos dentm y fuera de la matriz. Dado que se establece un gradiente electroquimico a traves de esta membrana por la cadena respiratoria que impulsa la ATP sintasa, es importante que la membrana sea impermeable a la mayoria de iones. Membrana externa. Gracias a que esta contiene una gran proteina formadora de canales Wamada porina), la membrana externa es permeable a todas las moleculas can un peso molecular inferior a 5000 daltons. Otras protelnas de esta membrana son las enzimas implicadas en la sintesis mitocondrial de IIpidos y las enzimas que transforman en la matriz los substratos lipfdicos en formas metabolizables. Esp.cio intermembrana. Este espacio contiene varias enzimas que utilizan la salida de ATP de la matriz para fosforilar otros nucle6tidos.

La mitocondrla

701

mente a las pequenas mol~culas que son metabolizadas 0 que son necesarias por las numerosas cllzimas mitocondriales que se hallan concentradas en el espacio de la marriz. Entre estas enzimas se encuentran las que metabolizan el piruvato y los acidos grasos hasta aceril CoA y las que oxidan el aceti! CoA en el cicio del acido cftrico. Los principales productos finales de esta oxidaci6n son el CO 2, que es eliminado de la cclula, y el NADH, que constituye la principal fuente de electrones que serlin transponados a trav~s de la cadena resplratoria -nombre que recibe la cadena de transporte de electrones de la mitocondria. Las enzimas de ia cadena respiratoria estan situadas en la membrana rnitocondrial interna y son esenciales 'Para todo el proceso de la fosforilaci6n oxidativa, que genera la mayorfa del ATP de ia cclula animal. La membrana mitocondriai interna suele estar muy replegada en el espacio de la matriz, formando una serie de dobleces denominados crestas. Estas invaginaciones aumentan notablemente el area de la membrana interna, de forma que en las c~lulas de hfgado, por ejemplo, constituyen alrededor de una tcrccra parte del total de la membrana de la c~lula. EI mlmero de crestas de las mitacondrias de las cclulas del musculo cardfaco es tres veces mayor que el de las mitocondrias de lIna cclula hepatica, debido probablemente a la mayor dcmanda de ATP de la cclulas del coraz6n. Ademas de las diferencias morfol6gicas, tam bien existen diferencias substanciales en las enzimas milocondriales de diferentes tipas celulares. Sin embargo, en este capftulo prescindiremos de estas diferencias y centraremos nuestra atenci6n en las enzimas y en las propiedades que son comunes a todas las mitocondrias.

La oxidaci6n mitocondrial empieza cuando se generan grandes

cantidades de acetil CoA a partir de piruvato y de acidos grasos en el espacio de la matriz 3 EI metabolismo oxidativo de las mitocondrias utiliza como combustibles mayoritarios el piruvato y los
702

Capftulo 14 : Conversi6n energetica: mitocondrias y c1oroplastos

Figura 14·9 Gn.sa. (A) FOlograffa obtcnida con el microscopio _electr6nico de una inclusi6n lipfdica en el citoplasma que oontiene lriacilgliceridos.la princi!J3.l rorma de reserva de grasa. (8) Estruetura de un lriacilgli~rido,con su porci6n de

o I

CH - 0 - ( -

g1icerol en cofor verde. e
(A,

por oortesfa

de Daniel S. Friend.)

o I

CH 2-O-C -

tol_ de icido 9'-.0

IB}

Para asegurar un aporte cOIHinuado de combustible para el metabolismo oxidativo, las celulas ani males almacenan
miofibritla

milocondri.

Figura 14·10 Goludegrasadeuna celula de ml1sculo canUaco. Las gotas esul.n rodeadas de rnitocondrias, las

cuales oxidan los acidos grasos derivados de los lriacilgliceridos de la gata.

703

o

acil graso CoA

acil greso CoA IIcorllldo eo dos carbooos

R-CH-CH- CH-C 2

2

f

2

"SCM "-

0

repetici6n del cicio ...

R-CHr- C

"",-

"

$C0I\

acetil CoA

o

-

R-CHrCH=CH -C's<:'"oA

I-

G:iASH)

oII

R-CH

OH H

0

I

R-CHrC- C - C

C-CH _C-Y

;-

~ _

I

~~

Figura 14-11 CIcio de oJddaci6n de los ncldas grasos. EI cicio estll catalizado par series de cuatro enzimas, en la malriz miwcondrial. Tal como se indica en la figura, cada vuelta del cicio acorta elllcido graso en dos carbonos (que se n'luestran en color rajo) y genera una moltkula de acetil eoA, una molecula de NADH y una de FADH z. EI NADH es soluble en la mauiz. Par el contrario, el FADH 2 pennanece fuertemente unido a la enzima acil graso eoA desllidrogenasa; sus dos electrones pueden ser transferidos rrtpidamente a la cadena respiraloria de la membrana mitocondrial interna, con 10 que se regenera FAD.

H,O 0 -Y

M

INADol .H'

Cuando las necesidades aumentan, el gluc6geno es hidrolizado liberando glucosa I-fosfato, substrato de la glucolisis. Las reacciones de la glucolisis convierten las molecu!as de la glucosa, de seis aromos de carbono, (y tam bien de otros azucares relacionadosl en dos moleculas de piruvato, de tres carbonos, las cuales lodavia contienen la mayor parte de la energfa que se puede obtener de la oxidaci6n de los azucares. Esta energfa s610 se obtiene despues de que el piruvato haya sido transportado desde el citosol hasta la matriz de la mitocondria, donde

Figura 14-12 Elcctronmlcrograffa y dlbujo esquematlco de Wl granulo de gluc6geno. EI gluc6geno es la forma principal de reserva de carbohidraws de las cellilas de los vertebrados. Es un polfmero de glllcosa, y cada gninulo de g1uc6geno es una sola molecula muy ramificada. La sfntesis y la degradaci6n del gluc6geno estan catalizadas por enzimas unidas a la supetficie de los gnl.nulos: la enzima de biosintesis 0 g/ucogenosilltasa yla enzima de degradaci6n 0 g/uc6geno josforilasa. {Par cortesia de Robert Fletlerick y Daniel S. Friend.}

, \,

, i

domloio catlliitico

cadenas ramificadn formadas por residuos de glucoslI de una molkula de gluc6geno

'.domioio rllgulador

gr'oulos de gluc6geoo en el citoplasma de una c"ula del higlldo

704

monocapa de mol6culas de eozlma cubriendo un gr'nulo de gluc6gllno

Capitulo 14 : Conversl6n energetica: mltocondrias y c1oroplastos

dfmoro de gluc6geno fosforilasa

Figura 14·13 Reaccionesquecatallza el complejo de la piruvalO

se encuentra can un gran complejo mullienzim
deshldrogenasa. El complejo transforma el piruvato en acelil GoA. en la matriz mitocondrial: en eSla reacci6n lambien se produce NADH. A.B, YC son las Ires enzimas piruvato descarboxilasa, lipoamida reductasa transacetilasa y dihidrolipoil desllfdroge"asa, cuyas actlvidades eSI!n acopladas lal como se mueSlra en la figura. En la Figura 2-41 se muestra la eslructura del complejo enzimdlico; esle complejo tambien presenla una proteina quinasa y una proteina fosfalasa que regulan la actividad de la piruvalo deshidrogenasa, inhibiendola cuando los nlveles de ATP son altos.

El cicio del acido cftrico oxida el grupo acetilo del acetil CoAt generando NADH y FADH 2 para la cadena respiraloria-4 En el siglo XIX, unos bi610gos observaron que en ausencia de aire (en condiciones anaer6bicas) las c~lulas producen acido lactico (0 etanol) mientras que en pre· sen cia de aire (en condiciones aer6bicas) utilizan O2 y producen COz y HzO. Los esfuerzos que se reatizaron pata definir las vias del metabolismo aer6bico se centraron en el estudio de la oxidaci6n del piruvato y condujeron at descubrimiento, en 1937, del cicio del 4c1do cftrico, tambi~n conocido como el cicio de los dcidos rricarboxflicos 0 cicio de Krebs. En la mayorfa de las c~lulas, el cicio del
mJtocondria

705

J.........

acetil CoA

o

.HJIt'

!SCQA siguiente cicio

CoA$H oxalacatato

1l00H

IIH, , ,

HO-C-aOOH (H,

800H

"""0\

H·:: ~ (OOH

(H,

riOOH

IIH, ,

malato

I

t--

H-C ....OOH isocitrato

,

H-C-OH

H,O

800H

.OOH

BH

fumarato u-<:atoglutarato

"

(H I (OOH

succinato

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(H,

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IijlOOH

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1

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H 0

~04tH THz l'

CoASt!

DOOH

succ,n,l CoA

(H,

m:D

"OOH,~ H (m=H' II

Figura 14·14 EI cicio del acldo cflrlco. Los intermediarios se muestran en forma de acidos libres, aunque en realidad los grupos carboxilo esul.n ionizados. Cada una de las reacciones indicadas esta catalizada por una enzima diferente, locaJizada en la membrana mitocondriaL Los dos carbonos procedentes del acelil eoA que entran en esta vuelta del cicio (sombreados en color rojo) seran transformados en CO 2 en posteriores vueltas del cicio. Los dos atamos de carbono que son Iransformados en COl en esta vuella del cicio se sei'lalan con una C de color azul. En cada vuelta se forman Ires moleculas de NADH y una de GTP, la cual se puede transfOflllar en ATP mediante la reacci6n de intercambio GTP + ADP--t GOP + ATP. Ademas. se forma una molecula de FADH 2, que permanece unida a una protefna formando parte del complejo de la succinato des/lidrogellasa en la membrana mitocondrial interna; este complejo transfiere directamente los electrones transporlados por el FADH 2 a la ubiquinona (vease mas adelanle).

o

(

1102

A":;,---- (QASH

,

5(qA

GOP

"

110,

respiratoria. Por el contrario, el NADH forma un acervo de equivalentes reducidos en la matriz mitocondrial y transfiere sus electrones despues de que se produzca una colisi6n al azar con una enzima deshidrogenasa unida a la membrana. Ahora vamos a considerar de que forma se utiliza para sintetizar ATP la energfa almacenada en estos electrones.

En la membrana mitocondriaJ internal un proceso quimiosm6tico convierte la energ£a de oxidaci6n en Alps Aunque el cicio del acido cftrico forma parte del metabolismo aer6bico, ninguna de las reacciones que \levan a la producci6n de NADH y FADH 2 lItilizan directamente oxfgeno molecular. Casi toda la energfa disponible a partir de la combllsti6n de los carbohidratos, grasas y olros nutrientes, obtenidos de los substratos par el NAD' y el FAD, se almacena inicialmente en forma de electrones de alta energfa. Estos electrones, transportados por el NADH y el FADH 2, reaccionan con el oxfgeno molecular a traves de la cadena respiratoria. Para describir estas ultimas reacciones se utiliza el termino de fosforilaci6n oxJdativa ya que la gran cantidad de energfa que se Iibera de elias es utilizada par las enzimas de la mem706

Capltulo l4: Conversi6n energthica: mitocondrias y c1oroplastos

------"-

bran a interna de la mitocondria para impulsar la transformaci6n de ADP + PI hasta ATP (Figufa 14-15). Como ya hcmos mencionado, la producci6n de ATP por In fosforilaci6n oxidntiva en la cadena rcspiratoria depende de un proceso quimiosm6tico. Cuando fue propuesto por primera vez en 1961, este mecanismo resolvi6 un antiguo rompecabezas de la biologfa celular. No obstante, la idea resultaba tan original que fueron ne<:esarios varios ailos para acumular las pruebas suficientes para que fuera aceptada de forma general. Anterionnente se crefa que la energfa para la sfntesis del ATP vCa la cadena respiratoria era suministrada por el mismo proceso que actua durante las fosforilaciones a nivel de substrato: es decir, se crefa que la energfa de oxidaci6n era utilizada para producir un enlace de alta energfa entre un grupo fosfato y a1giin compuesto intennedio. y que la conversi6n de ADP en ATP era impulsada par la energfa que se liberaba al romperse este enlace. Sin embargo, a pesar de los intensos esfuerzos que se realizaron. nunea se pudieron lIegar a dete<:tar estos intennediarios. Un resumen de nuestra visi6n actual del metabolismo energetico mitacondrial se representa en la Figura 14-16. Segtin la llip6tesis qllimiosl1Iotica, los intermediarios qufmicos de alia energfa son substituidos por una conexi6n enlre procesos qufmicos rquimio") y procesos de transporte {"osm6tico del Griego OSI1IOS, empujarl -de ahf el nombre de acoplamJenlo quimlosm6tlco (Tabla 14-1). Cuando los electrones de alta energfa de los hidr6genos del NADH y del FADH1 son lransferidos a 10 largo de la cadena respiratoria de la membrana mitocondrial intema, la energfa que se libera cada vez que pasan de una moMcula transportadora a la siguiente es utilizada para bombear prolones (H') a traves de la membrana inlema, desde la matriz mitocondrial hasta el espacio intermembranoso. ESlo genera un gradieme eler:troquimico de protones a traves de la membrana mitoeondrial interna. y el f1ujo de H' a favor de este gradiente es utilizado, mediante una enzima Iigada a la membrana. la ATP simastl, para impulsar la conversi6n de ADP + PI en ATP, eomplelando asf el proeeso de la fosforiJaei6n oxidativa. En 10 que queda de esta secci6n vamos a esbozar brevemenle el tipo de reaeciones que haeen posible la fosforilaci6n oxidativa, dejando los detalles para mas tarde. M

,

, uv/tt

IicldQf; gfa

plruveto

"

membr.ne Interne membr.nll externe

8cldos ijfnos

&clltH CoA /

cicio de

"ida

cilrico

H'

La mitocondrla 7

H"

H'

/'--WIlll-......--1I-- _

11m + H' + ~02

\..

plocesos de

[NAO'I + H20

)

trenlformllci6n IInllrg8t~

I"'-fOSFORILACIO:-" .. ~ OXIOATlVA '"

~+PI

aD+H20

Figura 14-15 Prlncipal red de transformacion energetlca catallzada pur la mltocondria. En este proceso defosfori1lu:i6n oxidatilXJ, la membrana mitocondrial interna actlia como una maquina de interconversi6n energetica, transformando pane de la energCa de oxidation del NAOH {y del FADH 2l en energCa de enlace fosfato deiATP.

FIgura l4-l6 Reswnendel metaboUsmo energetlco mJtocondrlal. EI piruvato y los acidos grasos que eottan en la mitocondria son procesados a acetil CoA y son metabolizados par eJ cicio delllcido dtrico, produciendose NADH (y FADH~, que no se muestra en la figural. En el proceso de la fosforiJacion oxidativa, los electrones de alia energfa del NADJ-I (y del FADH 1 ) se transfieren al oxfgeno mediante la cadena respiratoria de la membrana mitocondrial interna, produciendose ATP mediante un mecanismo quimiosmotico. EI NADH generado en el citosol por la glucolisis tambien transfiere electrones a la cadena respiratoria (no se muestra en la figural. Dado que el NADH no puede pasar a traves de la membrana mitocondrial interna, la transferencia electr6nica desde el NADH citos6lico se ha de efectuar de manera indirecta por medio de un (de entre varios) sistema de "Ianzadera-, que transpona otros compuestos reducidos al interior de la mitocondria; despues de ser oxidado, este compuesto vuelve at citosol, donde es rcducido de nuevo por eI NADH_

707

Tabla 14-1 Acoplamlento qulmlosm6tlco La hip6tesis quimiosm6tica, tal como fue propuesta a principios de la decada de 1960, consiste en cuaHo postulados independienres. En terminos de funci6n mitacandrial, fueron: 1. La cadena respiratorla miLOcondrial de la membrana interna transloca protones; cuando se transportan electrones a traves de la cadena, bombea H' hacia afuera del espacio de la matriz. 2. EI complejo mitocondrialATP sintasa tambien transloca protones a traves de la membrana interna: al ser reversible, puede utilizar energfa de la hidr6lisis del ATP para bombear H' a traves de la membrana, pero si existe un gradiente electroquImico de protanes suficiente, los protones fluyen en direcci6n opllesta a traves del complejo impulsando la sfntcsis de ATP. 3. La membrana mitocondrial interna esta equipada con una serle de protefnas transportadoras que median la entrada y la salida de metabolitos esenciales yde determinados iones inorganicos. 4. La membrana mitocondrial interna es impemleable a H', OH- y, en general, a caliones y aniones

Los electrones son transferidos desde el NADH hasta el oxfgeno, a traves de tres grandes complejos enzimaticos respiratorios6 Aunqlle el mecanismo a traves del que se aprovecha la energfa por la cadena respiratoria difiere del de otras reacciones metab6licas, el principio es el mismo. Se consigue que la reacci6n energeticamente favorable H2 + Ih02 4 Hp se produzca a traves de muchos pequef'ios pasos, de forma que la mayor parte de la energfa de esta reacci6n pueda ser transformada en una forma de almacenamienro en vcz de ser Iiberada al medio en forma de calor. Tal y como ocurre en la formaci6n de ATP y de NADH en la glucolisis 0 en el cicio del acido cftrico, esto impHca que la reacci6n debe realizarse a traves de una vfa indirecta. La cadena respiratoria es una vfa t1nica en cuanto a que en ella los atomos de hidr6geno son escindidos en protones y electrones. Los electrones pasan a HaveS de una serie

'A'

'81

H,

\1

-.."".,

LlBERACION EXPLOSIVA Of ENERGIA CALORfFICA

H,

!

eSCiSi6rlerl prolorles yeleetrones

2W

+

2&

la mayor parte de la anergfa aa aprovecha y sa transforma en una forma de almacenamianto

~

"-=r--1

2H

708

Capftulo 14: Conversl6n energetlca: mitocondrlas y c1oroplastos

Figura 14-17 Comparacl6ndelas oxldaclones blol6g1cas con la combustl6n. En esta ilustraci6n se muestra c6mo la mayor parte de la energfa que se liberarfa en forma de calor si se quemara el hidr6geno (Al se utiliza y se almacena en forma ulil poe medio de la cadena de transporte eleclr6nico de la membrana milocondrial interna (B). EI resto de la energfa de oxldaci61l se Iibera par la mitocondria en forma de calor. En realidad, los protones y los clectrones que se mllestrall aqllf se obtienen de los atemos de hidr6geno que se hallan unidos covalentemente a moleculas de NADH 0 de FADH 2 (vllase Figura 14-18).

.mhol

H

.doh...

Yo

1

H

H

R -C+O'

"I" H H,

C

H 1 C

C

1

R-C+O' 1

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H

H

"

R -C+O'

".

H"

1

R -C#O

......C-NH1

I

0

H/ C N C'H 1

]NAD'I

RESUMEN:

,......-,HH ~ +NAO+ $Ubstrllto

-

C)

+ NAOli + W

substrlto oxidlldo

de transportadores de electrones de la membrana mitocondrlal interna. En algunos pasos a 10 largo de esta cadena los protones y los elecrrones se recombinan temporalmeme. Pero s610 cuando los electrones alcanzan el final de esta cadena de transporte electr6nico, se devuelven los protones para neutralizar las cargas negativas creadas por la adici6n final de electrones a la mol&:ula de o:dgeno (Figura 14·ln. ESludiaremos el proceso de oxidaci6n empezando por el NADH, el mas imporlanle colector de eleclrones derivados de la oxidaci6n de las mol~culas de los nutrientes. Cada atomo de hidr6geno consla de un electr6n (e-) y un prot6n (H'). En el Capitulo 2, ya explicamos el mecanismo por el que el NAOH capta los eleclrones, 10 cual se muestra can mas delalle en la Figura 14-18. Como clarifica este ejemplo, cada molecula de NADH no transporta un ion hidr6geno sino un iOIl hidruro (un atomo de hidr6geno m<1s un electr6n adicional, aI que podemos indicar como H:-, ilustrando como un puma cada uno de sus dos elec· trones). Sin embargo, y Pllcsto que en las soluciones acuosas los protones estan disponibles libremente, el transporte de lin ion hidruro par el NAOH equivale a transportar dos Momos de hidr6geno, es decir, una molecula de hidr6geno (H:-+ W --+ H 2).

EI transporte de electrones empieza en el momenta en que el ion hidrwo se libera del NADH, regener<1ndose NAn", y se convierte en un prot6n y dos eleetroncs (H:---+ H' + 2e-). Estos dos electroncs son transreridos al primero de una serie de m<1s de 15 transportadorcs diferenlcs de electrones que se hallan en la cadena respiratoria. Los electrones empiezan con una energfa muy alia, que van perdiendo a medida que pasan a 10 largo de la cadena. La mayor parte de las veces los eleclrones pasan de un Morna metalico a otro, cada uno de los cuales est<1 estrechameme unido a una moltkula de protefna que altera la afinidad electr6nica del <1tomo metAlico. M;1s adelante se explicaran con detalle los direrentes tipos de transportadores electr6nicos de la cadena respiratoria. Pero 10 que es mas importante es el elevado numero de enzimas implicadas en este proceso que se encuentran agrupadas en tres grandes complejos e"zimdticos respiratorios, cada uno de los cuales presenta protefnas transmembrana que sostienen firmemenle el complejo en la membrana mitocondrial interna. Cada complejo de la cadena tiene mayor afinidad par los electrones que su predecesor, de forma que los elecLTones pasan secuencialmente de un complejo aI otro hasta que finalmente son transferidos aI oxfgeno, el cual tiene una afinidad par los electrones mayor que la de cualquier complejo de la cadena. La mltocondrla

Figura 14-t8 LaoJddacl6n blol6glca de un alcohol a un aJdehfdo. Del alcohol se eliminan los componenles de dos '-lOmos de hidrogeno complelOS: un ion hidruro es trnnsfcrido aI NAn' Yun prol6n escapa ala solud6n acuosa. Ell la figura se muestra unicamemc la porci6n del anma de nicotinamida de las moleculas de NAO' y de NADH (v~ase Figura 2-24). Las reacdones que se iluslran aqu{ se desarroUan sabre la superfide de una protelna, yest.in C8talizadas por grupos qulmicos especfficos de la enzima alcohol deshidrogenasa (que no se muestra). (Modificado con permiso de P.P. Cook, N.j. Oppenheimery W.W. Cleland. Biocllemistry20;1817-1825.1981.

01981 American Chemical Society.)

709

La energfa liberada por el paso de los electrones a 10 largo

de la cadena respiratoria se almacena en forma de gradiente electroquimico de protones a traves de la membrana mitocondrial interna7 La flllima asociaci6n existente entre los transportadores de electrones y las mo-

leculas de protefna hace posible la fosforilaci6n oxidativa. Las protefnas gufan a los electrones a 10 largo de la cadena respiratoria. de tal manera que los etectrones se desplazan secuencialmente de un complejo enzimatico al otro -sin que haya cortocircuitos. Es importante que la transfcrencia de electrones este acoplada a la captaci6n y liberaci6n de prolOnes y a los cambios alostericos de determinadas moleculas de protefna, de tal manera que el flujo energeticamente favorable de electrones bombea protones (H') a traves de la membrana interna desde el compartimiento de la matriz hasla el espacio intermembrana. Este desplazamiento de protones tiene dos consecuencias principales. (1) Genera un gradiente de pH a traves de la membrana milocondrial interna, can un valor de pH mayor en la matriz que en el cilosol en donde suelc ser cercano a 7. (EI pH del espacio intermembrana es equivalente al del cilosol ya que las moleculas pequefias se equilibran libremente a traves de la membrana cxterna de la mitocondria.) (2) Genera un gradiente de voltaje (potencial de membrana) a traves de la membrana mitocondrial interna, negativo en el interior y positivo en el exterior (que es el resullado del flujo neto de salida de iones positivos). El gradiente de pH (~pH) empuja a los H' de nuevo hacia adentro y a los OH- hacia afuera de la matriz, reforzando asf el efectn del potencial de membrana (6 V) que actua atrayendo hacia la matriz a cualqUler ion positive y empujando hacia el eXlerior a cualquier ion negativo. En conjunto, estas dos fuerzas constituyen un gradlentc elcctroqufmJco de protones (Figura 14-19). El gradiente electroqufmico de prolones ejerce Wla fuerza prot6n-motrlz, la cual puede medirse en unidades de milivoltios (mV). eada 6pH de una unidad de pH tiene un efecto equivalenle a un potencial de membrana de aproximadamente 60 mY, par 10 que la fuena pr0l6n-motriz total es igual a6V-6O(6pH). En una celula !fpica, la fuerza prol6n-motriz a traves de la membrana interna de una mitocondria en respiraci6n es de unos 200 mVy esta constituida por un potencial de membrana de WlOS 140 mVy de un gradiente de pH de alrededor de -I unidad de pH.

La energia almacenada en el gradiente electroqufmico de

protones se utiliza para producir ATP y para transportar metabolitos e iones inorganicos hacia el espacio de la matriz8 La membrana mitocondrial intema contiene Wla extraordinaria cantidad de protefna: un 70% de su peso seeo son protemas mientras que el otro 30% son fosfolipidos. Muchas de estas protefnas fonnan pane de la cadena de transporte electr6nico, la cual establece el gradiente electroqufmico de protones a traves de la membrana. Otro

w mambrana mitocondrial intarna

[

luana prot6n· potancial da motriz dabida al membrana

liP.

8V

w w Beida

w

membrana mitocondrial interna

[

-------

........

fuena prot6nmotriz dabid8 81 con::.dBprotonas

"'

H' H' H' H' H'

8pH W

H'

elcelina

710

Caphulo 14: Conversl6n energetIca: mitocondrias y cloroplastos

"'

Figura) 4-) 9 Los dos componentes del gradJente electroqu(mlco de protones, La fuerza prot6n-motriz total a traves de la membrana mitocondrial interna esta compuesta par una gran fuerza debida aI potencial de membrana (designada tradicionalmente como.1'f' par los expertos, pero que en eSle libro se indica como.1. \I) y por Wla pequeiia fuerza debida aI gradiente de concentraci6n de protones (.1pH). Ambas fuerzas actl1an en el senlido de impulsar prOlones hacia el espacio de la matriz milocondrial.

componente mayoritario de la membrana mitocondrial es la enzima A7P silltasa, que cataliza la sfntesis de ATP. Se trata de un gran complejo proteico a traves del cual los protones fluyen hacia la matriz a favor de su gradiente electroqufmico. Como si se tratara de una turbina, este complejo proteico ttansfonna una forma de energfa en otta, sintetizando ATP a partir de ADP y Pi en la matriz mitocondrial, a ttaves de una reacci6n que esta acoplada al flujo de protones hacia la matriz (Figura 14-20). La sfntesis de ATP no es, sin embargo, el unico proceso que esta impulsado por el gradiente electroqu!mico de protones. Las enzimas de la matriz milocondrial, donde tienen lugar el cicio del acido cftrico y otras reacciones metab6licas, han de abaslecerse con elevadas concentraciones de substratos, y la ATP sintasa se ha de abastecer con ADP y fosfato. As! pues, han de ser transportados a traves de la membrana mitocondrial intema un elevado numero de substratos cargados. Este transporte se realiza gracias a la acci6n de varios transportadores proteicos de membrana, muchos de los cuales transportan activamente moleculas especfficas en contra de sus gradientes electroqufmicos, procesos que requieren un aporte de energfa. Como se explic6 en el Capitulo 11, a menudo esta energia procede del cotransporte de oua molecula a favor de su gradiente electroqufmico. EI transpone de ADP hacia el espacio de la mauiz, por ejemplo, esta mediado por un sistema antipone de ADP-ATP: por carla molecula de ADP que entra, sale una molecula de ATP a favor de su gradiente electroqufmico (la salida de una carga negativa es favorable). El transporte de fosfato hacia la matriz esta mediado por una protefna transponadora que acopla el movimiento de fosfato hacia adentro con el flujo de protones hacia adentro, a favor de su gradiente electroquimico, de tal manera que el fosfato es arrastrado con ellos. EI piruvato es transportado hacia la matriz de la misma manera (Figura 14-21). EI gradiente electroquimico de protones se utiliza tambien para imporlar Ca 2., el cual se cree que es importante en la regulaci6n de algunas enzimas mitocondriales; la importaci6n de Ca 2' hacia la mitocondria puede ser importante para eliminarlo del citosol cuando sus niveles empiezan a ser peligrosos. Se utiliza mayor cantidad de energia del gradiente electroqufmico de protones, para transportar moltkulas e iones hacia la mitocondria, que para impulsar la ATP sintasa. Si por ejemplo se incuban mitocondrias aisladas en presencia de elevadas concenlraciones de Ca2., la producci6n de ATP cesa completamente; toda la energfa de su gradiente electroqufmico de protones se utiliza para bombear Ca2• hacia la matriz. De forma similar, en unas celulas especializadas el gradiente electroqufmico de protones se cortocircuita, de tal manera que sus mitocondrias producen calor en lugar de ATP como se explica mas adelante. La utilizaci6n de energfa almacenada en el gradienle electroqufmico de protones puede regularse par las celulas de tal manera que, en un momenta dado, se puede dirigir hacia aquellas actividades que sean mas necesarias.

La rapida conversi6n de ADP en ATP en las mitocondrias mantiene una elevada relaci6n ATP-ADP en las celulas8 A consecuencia del antiporte de la membrana interna que bombea ADP hacia la matriz mitocondrial intercambiandolo con ATP (vease Figura 14-21), las moltkulas de ADP producidas en el citosol por la hidr6lisis del ATP, penetran rapidamente en las mitocondrias para ser recargadas a ATP, mientras que las moleculas de ATP formadas en la matriz mitocondrial mediante la fosforilaci6n oxidativa son rapidamente bombeadas hacia el ciIOSO], que es donde son necesarias. Una molecula t(pica de ATP del cuerpo humano eorra y sale de la mitocondria miles de veces al df~ (tal como ocurre tambien con el ADP), manteniendo la conceorraci6n de ATP en la celula unas 10 veces superior a la deADP. Como hemos discutido en el Capftulo 2, las enzimas biosinteticas de las celulas gufan a sus substratos a 10 largo de cadenas de reacciones especfficas, impulsando a menudo reacciones energeticamente desfavorables al acoplarlas con la hidr6lisis del ATP, que es energeticamente favorable (vease Figura 2-29). De esta forma, los elevados niveles de ATP se utilizan para impuJsar procesos celulares, de La mltocondria

H' cadtlrll de Iranaporte

H'

.1ectr6rlico

ATe

sintau MATRIZ

membrana intema

membrana aXlama

Figura 14·20 Mecanlsmo general de la fosforilacl6n oxldatlva. Cuando un electr6n de alta energfa es transferido a 10 largo de la cadena de trans porte electr6nico, parte de la energla liberada se utiliza para impulsar la acci6n de tres complejos enzimaticos respiratorios que bombean protones hacia el exterior del espacio de la matriz. EsIOS prolones generan un gradiente electroqufmico de protones a traves de la membrana mitocondrlal interna que impulsa a los protones a volver hacia la matriz a traves de la ATP sintasa, un complejo proteico transmembrana que utiliza la energla del flujo de protones para sintetizar ATP a partir de ADP YPI en la matriz.

711

Figura 14-21 Algunos procesosde trasporte acllvo Impulsados por el gradlenle electroqulmlco a traves de la membrana mltocondrlallntema. La carga de carla una de las moleculas transportadas se indica con respecto aI potencial de membrana, que es ncgativo en el interior. La membrana mitocondrial externa es permeable a lodos estos compuestos. Para una discusi6n sobre los mecanismos de transporte de membrana, vease el Capftulo 11.

el gradiente de vOltaje Impulsa el intercambio ADP-ATP

ADF"

H'

el gradiente de pH impulsa la entrada de piruvato plruvato

el gradiente de pH impulsa la entrada de fosfato

H'

la misma forma como se puede utilizar una baterfa para accionar maquinas eltktricas: si la actividad de las mitocondrias se detiene, el nivel de ATP disminuye y la baterfa celular se descarga, de forma que, finalmente, las reacciones energeticamente desfavorables ya no pueden ser impuJsadas par la hidr6lisis del ATP. Podrfa parecer que esta situaci6n no se alcanza hasla que la concentraci6n de ATP es cera. Sin embargo, se alcanza a concentraciones de ATP que dependen de la concentraci6n de ADP y de PI' Para explicar el porque, hemos de considerar algunos principios elementaJes de la termodinamica.

La diferencia entre ~Go y ~G: para que la Wdr6lisis de ATP sea util para la c~lula es necesario que tenga un valor muy negativo de ~G9 La segunda ley de la lennodinamica dice que las reacciones qufmicas discurren

espontaneamente en la direcci6n que corresponde a un aumenlO del desorden del universo. En el Capftulo 2 ya indicamos que las reacciones que Iiberan energfa aJ medio en forma de calor (tales como la hidr6lisis del ATP) tienden a aumentar el desorden del universo al incrementar los movimientos aleatorios de las moleculas. Por eSla raz6n, las reacciones discurren convirtiendo la energfa Iibre (energfa disponible para realizar un trabajo) en calor. Asf, la reacci6n A ;: 8 discrnrira en la direcci6n A --+ 8 cuando el cambio de energfa Iibre asociado, tl.G, es negativo, del mismo modo que cuando un muelle lensado se deja subitamente de estirar libera su energfa almacenada en forma de calor. Sin embargo, para una reacci6n qurmica, tl.G no s610 depende de la energfa almacenada en cada molecula individual, sino tambien de las concentraciones de las mohkulas en la mezda de reacci6n. Esto es porque, para una reacci6n reversible A;: 8, un ex-' ceso de 8 sabre A tendeni a impulsar la reacci6n en direcci6n 8 --+ A; es decir, habra mas moleculas haciendo la (ransici6n 8 --+ A que moleculas haciendo la transici6n en sentido contrario. No esta daro cuat es valor de la diferencia de concentraci6n necesario para compensar una cantidad de calor liberada dada; esto depende de cambios en la entropfa que pueden ser calculados como se describi6 en el Panel 14-1, pags. 714-715. Para una reacci6n dada, el 6G se descompone en la suma de dos partes: la primera, denominada varlacl6n de energfa Ubre estandar. 6eo, depende de las caracterfsticas intrfnsecas de las moJeculas que reaccionan; la segunda depende de sus concentraciones. Para la reacci6n simple A --+ 8,

712

Capitulo 14 : Conversi6n energetica: mitocondrlas y c1oroplastos

_____________________________.......:.10.

I-

3~

am

hidr61isis

.

velocldad de hldr61isis

IAopl •

® ,

.elacion

constanta

relacion constants

concentracion deATP

de hidr611sis

,

de slntesls

cone. de 2

IAopl •

®

slntelis

velocidad de slntesis

asi,

am

constants

ADP

,

cone. de

Jl

cone. de

fosfato

cone. de fosfato

concentraci6n

, . derelacion sintesls

ADP

.

ADP

,

cone. de ATP

• constanta de Itquilibrio K

ralaci6n

eonst,lnte de slotesis

x cone. de

fosfato

relaci6n constente de hidrtolisis

relaci6n conSlllnte de !lidr6l,sis

deATP

cone. de

. .

EN El EQUILIBRIO: velocidsd de slntesis vslocidlld de hidr61isis

IIbreYiando.

IADPII@1

• K

[ATPI

4 En el equilibria, la reacci6n no tiene un efecta neto en el desorden del unlverso. asl que oG. O. Por esta ,alon, en el equilibria,

Para Is reaccion

am

, IAOpl

•®

-RTIn

se utilizs la siguiente ecuaci6n:

"'G.,.,(1'.RTln

IADP]I@J .AG" IATPJ

Pero las concantreciones de los reactivos en el equilibria deben satislacer la reacci6n da equilibria:

fADPII@1

IADPJI@I

IATPI

• K

lATPJ Donde"'G y fj,(J' est~n expresados en kilocalorlas por moL Rea la constante de los gases (2 x 10-3 kcal/mol 01(;), T es Ie temperatura abaoiula l°l(;), y lodas las concentraciones est~n expnlsadas en moles por litro. Cuendo las concentraciones de todos los compuestos reacclonentes son iguales a 1 M, fj,G _ fj,C1' (ya que RTln 1 .0). Par consiguiente, ,.,(1' es una constante definida como la variaci6n de energle libre est~ndar para Ie reecci6n.

Par esta raz6n, en elequilibrio, tJ.(1' _ -RTIn K Vemos asl, que tJ.(1' indica el punta de equilibria para una. reeccl6n, y tJ.G Indica 10 IIle/lldll que ast~ una reeccl6n dal equilibria. tJ.G es una medida de la ·fuerza impulsora" de una r8acci6n qulmica, como la fuerza prot6n motriz 10 es para la translocaci6n de protones.

donde [AI Y[B] representan las concentraciones de A y de B, y In es ellogaritmo neperiano. De esta manera, t::.G" iguaJa el valor de flG cuando las concentraciones molares de A y de B son iguaJes (In 1= 0). El equilibrio qufmico se alcanza cuando el efecro de la concentraci6n esta equilibrado por el efecto de t::.G", asf que no se produce un cambio neto de energfa Iibre para impulsar la reacci6n en cualquier direcci6nj entonces t::.G =0, y las concentraciones de Ay B son tales que

IBI

-RTIn [AI = t::.G"

10 que significa que hay un equilibrio qufmico cuando

l!!!.= e-6G'I//T [AI

Figura 14-22 Relacl6n Mslca entre las varlaclones de energ{a libre y el equlllbrio, llustradas para la reaccl6n de hldnSllsls delATP. Las constantes de velocidad en los recuadros (I) y (2) se determinan en experimentos en los que se mide In acumulaci6n del producto en fullci6n del tiempo. La constante de equilibrio que se muestra aquf, K. viene dada en moles par Iitro. (Para una discusi6n sabre la energfa libre, vease Panel 14-1. p<1gs. 714-715, y para una definici6n de la constante de equilibria, v~ase Figura 3-9.)

Cuando el ATP se hidroliza a ADP y PI' a las condiciones que normaJmenle existen ell la celula, la variaci6n de energ(a Iibre del proceso esta entre -11 y-13 kcaJ/mol. Este t::.G es ex.tremadamente favorable y requiere que la concentraci6n de ATP en la celuJa se manlenga alta en relaci6n a la de ADP y a la de PI' En "condiciones eSlandar", en las que tanto el ATP como elADP y el PI se haUan presen· tes a la misma concentraci6n de 1 mol por litre, el t::.G para la hidr6lisis del ATP -llamada variaci6n de energfa fibre esufndaro t::.G" de la reacci6n- es unicamente de -7,3 kcallmol. A concentraciones de ATP todavia mas bajas en relaci6n con las de ADP y PI ' el t::.G Ilegara a ser igual a cero. En este punto, la velocidad a la que se uniran el ADP i el Pj formando ATP sera igual a la velocidad a la que se hidrolizara el ATP formando ADP YPI' En otras palabras, cuando t::.G= 0 la reacci6n se halla en equilibria (Figura 14-22). Es t::.G Y no t::.G" el valor que indica 10 lejos que una reacci6n dada eSla del equilibrio y 10 que determina si una reacci6n puede ser utilizada 0 no para imLa milocondrla

713

LA IMPORTANCIA DE LA ENERGIA L1BRE PARA LAS C~LULAS La vida es posible gracias a una compleje red de reacciones qulmicas inleraetuantes que lienen lugar en todas las celules. Ob5ftrvendo las reacciones metab6licas que componen eSla rad. uno puede suponer que la c6lula debe Jener la habilidad de desarrollar enzimas capaces de lIevar a cabo cualquier reacci6n que la c6lula necesite. Pero en realidad asto no es asi. A pesar de que las enzimas son poderosos catalizadores, unicamente puaden acelerar las reacctones que sean termodinamicamente posibles. Las otras reacciones unicamente son posibles porque se Koplan a reaceiones muv favorables que las impufsan.

La cuesti6n de si una reacci6n puede aeunir espontaneamenle. 0 por el conlrario. necesita acoplarse a otra reacci6n, es de una imponancia capital para la biologla calular. La respuesta sa obtiene elT relaci6n a una cantidad Ilamada la energia libre: la variaci6n total de energla libre que 58 produce a traves de un conjunto de reaociones determina si este gropo de reacciones puede 0 no tener lugar. En este Panel explicaremos algunas de las ideas fundamentales -derivadas de una rama especial de Ie qulmk:a V de la fisice, lIamada fermO(Jin.lmica- que son necesarias para entender 10 que es la energfa libre V por qu6 es tan imponante para las c6lulas.

LA ENERGIA L1BERADA POR CAM BIOS EN LOS ENLACES QUIMICOS ES TRANSFORMADA EN CALOR

CA-JA

MAR

' - - - - - - - UNIVERSO

...J

Un sistema carrado sa define como un conjunto de molkulas que no intercambian materia con el resto del universo (por ejemplo, la -c6Iula-eaja- que sa muestra mb arriba). Cualquier sistema como 6ste presanta moleculas con una energfa total E. Esta energfa sa distribuve entre diferentes formas: como energla de translaci6n de les moleculas, cOmo su energla de vibraci6n, como su energle de enlace entre los alomos individuales que formen las moleculas. Supongamos que en el siSlema liene luger una reacci6n.La primera lev de la lermodin6mica restringe el tipo de reacci6n que puede tener lugar en el sistama: eSlablece que -en cualquier proteso, la energfa lotal del sistema se mantiene conSlante-. Por ejemplo, supongamos que en el sistema cerrado tiene lugar la reaccl6n A -+ B, V que esta reaccl6n fibere una gran cantidad de energla qulmica de enlace. Inlcialmente, esta energfa incrementara la intensidad de los movimienlOS moleculares (de translaci6n, de vibraci6n y de rotaci6n) an el sislama. 10 cual equivale a un aumento de latemperatura. Sin embargo, este incremento delos movimientos pronto sara trensfarido fuera del sistema a traves de

series de colisiones moleculeres que en primer lugar calenlaran Iss paredes de la caja y posteriormente el mundo exterior (representado en nuestro ejemplo por el mar). AI final, el sistema vuelve a su temperatura inicial, en el momento en el que toda la anergla de enlace qufmico ha sido trensformada en energfa calorffica y transferida fuera de la caja al medio exterior. De acuerdo con la primer ley, la variaci6n de la energfa en la caja (.6Ec.j., que indicaremos como.6El debe ser Igual y de signo contrario a la variacl6n de energla calorlfica transferida, la cual podemos indicar como h: es decir,.6E. -h. Asl pues, cuando el calor abandona el sistema, la canlidad de energia disminuye en la caje. E tambien puede variar durante una reacci6n debido al trabajo reefizado en el mundo exterior. Supongamos por ejemplo que durante una reacci6n determinada sa produce un pequeno incremento del volumen (.6 V) de Ie caja. Dado que para poder expandirse, las paredes de la caja deben empujar contra la presi6n constante (PI del madio exterior, eSla expansi6n supone la reaHzaci6n de un trabajo en el mundo exterior y requiere energla. La energla utiUzada es P(.6V! que. de acuerdo con la primera ley, debe raducir la energla de la caja (E) en una cantidad igual a la utilizada para prodocir aste traba;jo. En muchas reacciones, la energla qufmica de enlace es transformada en trabajo V celor. La ftnralp(a {H)es una funci6n compuesta que incluve ambas formas de energfa (H _ E -+ PVI. Para sar rigurosos. en un sistema cerrado, as la variaci6n de la entalpla (.6H) , y no la variaci6n da la energla. la que es igual a la cantidad de calor transferida al mundo exterior durante una reacci6n.las reacciones en las que Hdisminuye libersn calor al medio y se denominan -exotermicas· mientras que las reacciones en las cuales H incrementa absorben calor del medio y se denominan "'endotarmicas~. Asl, -h • .6H. Sin embargo. debido a que la variaci6n de volumen que ocurre durante la mayoda de la reacciones biol6gicas, es despreciable, puede aproximarse:

LA SEGUNDA LEY DE LA TERMODINAMICA Consldaremos un reeipiente en al que hay 1000 monedas. dilpuestas todas elias de cara hacia arriba. Si al recipiente 58 agita vigorosamente, sometiendo a las monadas a movimientos aleatorios del mismo tipo de los que experimentan todas las molkulas debido a sus frecuentes colisiones con otras molecules, puede asperarse que al final, aproximadamente la mitad de las monedas se enconuaran orianladas de cara hacia abaio. EI motivo de esta reorientaci6n as que tan 1610 axisle un camino para rain'taurar el estado iniciallcada moneda con la cara hatia arriba). mientras que existen muchos caminos diferentes (aproximadamente unos 10298 ) para alcanzar un estado compuesto

714 Panell4-) Ene... llbre y reacdones blol6ltc:as.

por el mismo numaro de caras V de cruces; de hecho, hay mochos mas caminos para alcanzar un estado 50:50 que par. conseguir cualquier ouo astado. Cada estado tiene una posibilidad de soceder, que as proportional al numero de vias por las que dicho astado se puede alcanzar. La segunda ley de la termodinamica estabfece que "los sistemas cambiaran espont6neamenta dasde astados de probabilidad baja de ocurrir, hacia estados de probabilidad elevada-. Dado que los estados de baja probabilidad son mas ~ordenados- que los estados de alta probabilidad, la segundalay tambien se puede axpresar como: "el universo cambia constantemente an el sentido de convertirsa an mas desordenado-.

LA ENTROpIA, S La segunda ley (a diferencia de la primere) permite predecir 18 direccion de una reacci6n determinada. Sin embargo. para poder utilizerls en este santido. es necesario disponer de una medide de la

probabilidad de un eSlado. es deeir, de su grado de desorden. Esla medide as la entropfa (S). La entropla es una funci6n logeritmica de Ie probabilidad tal que Ie var;aci6n de emrop!s (60S) que S9 produce cuando Ie reacei6n A...., B convierte un mol de A en un mol de B, as:

6S.Rln

Ip.

dande PA Y Po son las posibilidades de los dos estados Aye, R as Ie constanta de los gases (2 cal grado-1 mol-'), y 6Sse mide en unidades de enlropla (ue). En nuestro ejemplo inieial de las mil monades, Ie probabilidad relative de que sa presenten lodes las caras lastado A) respecto a la situaciOn da mitad de caras y mitad da cruces (astado BI es igual. al numero de caminos diferentes a traves de los que se pueden alcanzar cada uno de estos dos estados. Se puade calcular que PA _1 Y PB _10001(5001 x SOOIl- 10298. Asl pues, la variaciOn de entropfa producida por la reorientaciOn de las

monedas cuando la caja es agitada vigorosamante y se obllene ef mismo nLimero de cares que de cruces, es R In (0 298 ), es dadr, aproximadamente iguaf a 1370 ue por mol de cajas da este tipo (6 x 1023 cajas). Asi pues, debido a que anteriormente se ha definido 05 como positiva para la transiciOn del estado A af estado B (Ps !PA > 1), fas reacciones con un gran incremento de 5 (esto es, las reacciones que tengan una oS > 0) se harran favorecidas, es decir, se producirlm espontl§neamente. Como se discute en af Capitulo 2, la energia caforifiea provoca una conmociOn afeatoria de fas mofecufas. Dado que fa transterencia de cafor desde un sistema cerrado af medio incremanta el numero de disposiciones diferentes que pueden adoptar fas molecufas def medio exterior, incrementa fa entropfa del medio. Se puede damostrar qua la liberadOn de una determinada cantidad de energia caloritica tiene un etecto de desorden mayor a temperaturas bajas que a aftas, y qua, como se definiO anteriormente, ef vafor para la J),5 def medio (J),5ma ,), es iguaf a fa cantidad de cafor transferida desde ef sistema (h) af medio dividida por la temperatura (T):

LA ENERGIA LlBRE DE GIBBS, G AI trabajar con un sistema biolOgico cerrado, nos puede interesar disponer de un sistema sendtto de predecir sl una reacciOn va a tener lugar 0 no en al sistama. Hamos vista que la cuestiOn crucial es si, al producirse la reacciOn, la variaciOn de entropla del universo es positiva 0 negativa. En nuestro sistema ideatizado de la celulacaja, la variaciOn de entropia en el universe tiene dos componentes -Ia variaciOn de entropfa para el sistema cerrado de la caja y la variaciOn da antropfa en al mar circundant&- y ambos componentes deben ser considarados conjuntamante para cualquier tipo de predicciOn que se haga. Por ejemplo, es posible que una reacciOn absorba calor, haga disminuir la entropia del mar (o.5mar < 0) Y cause un gran incremento del desorden en el interior de la caja (J),5caja > 0), de manera qua la variaciOn total t..5unlve"JOt..5mar + t..5caia sea mayor que O. En esta caso la reacciOn sucedera espontaneamente siempre que durante la reaceiOn al mar cada calor a la caja. Un ejemplo de reaceiOn de este tipo es la disoluciOn da cloruro sOdico an un vaso da pracipitados conteniendo agua (la Mcaja M). Esta reacciOn tiena lugar espontanaamente a pasar da que la temparatura del agua sube cuando la sal sa disualva. los qulmicos han encontrado Litil detinir nuevas Hfunciones compuestas Mque describen combinacionesde propiedades fisicas del sistema. Las propiedades que sa pueden combinar son: la temperatura (T), la presiOn (Pl, el volumen IV), la energia (E), y la entropfa (5). La entalpfa (HI es una de estas funciones compuestas. Pero la tunciOn compuesta mlls utit para los biOlogos es. con diferencia, Ie energia fibre de Gibbs, G. Esta funciOn es util como estrategia de contaje que permite dedudr los cambios de entropfa del universo resultantes de reaceiones quimicas en la caja, evitando cualquier consideradOn sobre los cambios de entropia an al mer. Para una caja de volumen Va presiOn P, la definiciOn de G es

donde Hes la entalpfa descrita antes (E + PV), Tes Ie temperatura absoluta y 5 es la entropfa. Cada uno de estos parametros esta refarido unicamente al intarior de la caja. Durante una reacciOn que se produzca en la caja, la variaciOn de la anargla libre (Ia G de los productos menos la G de los substratos inidales) se senala como J),G, y como ahora demostraremos, es una medida directa de la cantidad de desorden generado en el universo cuando tiene lugar la reacdOn.

A temperatura constanta, la variaciOn de energfa libre (t..G) durante la reacciOn as igual a oH- Tto5. Como toH _ -h, el calor absorbido del mar, tenemos

-AG_-!Jt+ TAS ·4G-h+TAS Y -AGIr-IIIT+4$ Pero como hlTes igual a la variaciOn de antropfa dal mar (05ma,), y.1.5 en la reacciOn anterior es to5caja , tenemos

-AGIT-ASw..+

-AS.

Podemos concluir que una reacciOn se producira en la direcciOn an la que suponga que la variaciOn de energfa libre (oG) sea menor que cero, porqua en este caso, cuando tenga lugar la reacciOn se producira una variadOn positiva da la anlfopla del universo. Asf, la variaci6n de la anergia Iibre as una medida directa de la Vlrlaci6n de la entropia del universo, Para una serie eompleja de reaeeiones aeopladas en las qua participen muehas moh!ieulas diferentes, la variad6n total de energra libre sa puede medir simplemente sumando la anergia Iibre de todas las especies moleculares despues de la reacci6n y comparando este valor con la suma de la energfa libre antes de la reaceiOn; los valores de energla libre da los compuestos ml§s comunes sa puedan eneontrar en tablas publieadas. De esta manera se puede predaeir la direcei6n da una raacd6n determinada y, en consacuencia, refutar Meilmente cualquier meeanismo propuesto. Asl, pO'" ejemplo, de los valores observados para la magnitud del gradienta alactroquimico de protones a lfaveS de la membrana mitocondrial interna. se pueda asegurar que la enzima AlP sintetasa raquiere al paso de mes de un prot6n por cada molecula de AlP que sintetiza, EI valor de toG de una reaeei6n es una medida diracta del grado de desplazamiento del equilibrio da dicha reaeei6n. El elevado valor negativo qua presenta la eelula para la hidr61isis de AlP simplementa rafleja el hacho de que las eelutas mantienen la reacei6n da hidr61isis del AlP unas 10 veees alejada del valor de equilibrio. Si una reaeci6n alcanza el equilibrio,"toG _ 0, la reacei6n tiene lugar a la misma velocidad en un sentido qua en al otro. Para la hidr6tisis del AlP, el equilibrio se aleanza euando la gran mayor!a del AlP ha sido hidroli2ado, tal como ocurre en una eelula muerta.

715

pulsar orras reacciones. Debido a que la eficiente conversi6n de ADP en ATP en la mitocondria mantiene una concentraci6n de ATP elevada en relaci6n a la de ADP y de PI' la reacci6n de hidr61isis del ATP se mantiene muy lejos del equilibrio, por 10 que tl.G tiene un valor muy negativo. Si no existiera eSle desequilibrio, la hidr6lisis del ATP no se podrfa utiJizar para impulsar las reacciones de la celula, de forma que mllchas reacciones biosintelicas se producirfan ~hacia atn1s~ en lugar de ~hacia adelante".

La respiraci6n celulac es notablemente eficiente lO Por medio de la fosforilaci6n oxidativa, cada par de electrones del NADH propor· cionan energfa para la fonnaci6n de aproximadamente 2,5 molecllias de ATP. El par de electrones del FADH 2, que liene una energfa algo mas baja, unicamente ge· nera aproximadamente 1,5 moleculas de ATP. En total. a partir de cada moltkllia de acetil CoA que entra en el cicio del acido dtrico se forman aproximadamcntc 10 O1oleculas de ATP, 10 que significa que a partir de una molecula de glucosa se producen unas 20 O1oleculas de ATP y 84 a partir de una molecuJa de palmitato. un acido graso de 16 atomos de carbono. Si tambien se incluyen las rcacciones energeticas que se producen antes de que se forme el acetil GoA. la oxidaci6n oompleta de una molOCu..la de glucosa produce un rendimiento neto aproximado de 30 moleculas de ATP. rnientras que a partir de la oxidaci6n completa de una rnalerola de palmitato se producen aproximadamente 1JO moleculas de ATP netas. Estas cifras son vaJores maximos aproximados. ya que la cantidad de ATP producido en la milocondria depende del porcentaje de energfa del gradiente electroquimico que se utiUce para ouos fines diferentes a la smtesis de ATP. Cuando se comparan las variaciones de energfa Iibre de la combusti6n directa de grasas y de hidratos de carbono hasta CO2 y H20 con la cantidad lotal de energfa almacenada en enlaces fosfato del ATP duranle las correspondientes oxidaciones biol6gicas, se observa que a menudo la eficiencia con que se transforma la energfa de oxidaci6n en energia de enlace de fosfato del ATP es superior al40%. Este valor es considerablemente superior al de la eficiencia de la mayorfa de los aparalos de conversi6n energetica no biol6gica. Si las celulas trabajaran con un rendimiento igual al que tienen un motor electrico 0 un motor de gasolina (entre 10% y 20%), un organismo deberfa comer de una fomla voraz para mant.enerse vivo. Adcmc1.s, pucsto que la energfa no utilizada se libera en forma de calor, los organismos de gran volumen tendrfan que desarroUar l1leCaniSlllos mas eficientes para poder ceder este calor al medio. Los eswdiantes a veces se preguntan por que las interconversiones celulares siguen estas vfas tan complcjas. De hecho, la oxidaei6n de los azucares hasta CO 2 y H2 0 podrfa realizarse mas directamenre, eliminando el cicio del dcido cftrico y muchos de las pasos de la cadena respiratoria. De esta forma, la respiraci6n hubiera resultado mas fdeil de estudiar pero el resuhado habrfa sido desastroso para la celula. La oxidaci6n produce inmensas cantidades de energfa libre que s610 a pequeiias dosis puede ser utilizada de forma eficiente. Las vfas oxidativas complejas implican muchos intermediarios, cada uno de los cuales se dife· rencia de su predecesor en algunos detalles. Como resullado de ello, la energfa Iiberada se fraceiona en pequef'ios paquetes que pueden ser convertidos de for· rna eficiente en enlaces de alta energfa de mo1ect!las utiles, como el ATP y el NADH mediante reacciones acopladas (vease Figura 2-17).

Resumen La mitocondrla real1zn Ia mayorla tU las oxidaciones q/U se prodUCt!n en Ia cilula y genera Ia mayor parte del ATP que Sf? genera en las dlulas animales. La matrlz mitocondrial mntiene una gran ooriedad de enzimas, entre las q/U se 'ulilan las que oxidan el piruOOIO y los tfcidos grasos hasta tu:etil GoA, Y las enzimas del cicio del dcido dtrlm. ql,e oxidllll este acetil GoA hasta CO;r En estas reac:dones se prod,u:en grandes Mntidlula tk NADH (y tk FADHJ. La energla dLsponibk re$ulUmle tk Ia

716

CaphuJo 14 : Conversi6n energ~tlca: m.itocondrias y doroplaslOS

combiruu;wn del oxfgeno con los electrones reaaillQ$ rrtUlsportados por el NADH y el FADH7 se utiUzn medumte llna cadena de trall$porte electronico qlre se halla inc:luidn en In membrana interna de In mitocondria y q.4e recibe el nombre de cadena respiratoria. La cadena respiratoria bombea protona h&1n el exterior de la malriz mitocondrial, generando asf un gnuJlente ekc:troqufmico de protones al que conm· buyen tanto el potencial de membrana como In diferencla de pH. ate gnuJie"te trall$membrana se utilizo, a su tIt!%o para slnteliuu ATP y para impulstlr el trans· porte activo de detem'inados metabolltos a traves de In membrana mitocondrinl Intema. La comblnacl6n de estas reacciones es in respDIl$lIbk de lin eFlCienre intercambio de ATP·ADP entre In mitocondrin y el eltosol qlle m.ant/ene elaceroo celillar de ATP aitamente cargaLIo, de forma qlre el ATP pllede ser Iltllizado para illll,,,lsar muchas de las retICC/ones celulares que requieren e"erg(a.

La cadena respiratoria y la ATP sintasa II

membrana interna

membrana aldarna

MfTOCONDRlA DlSGREGAOA POR UL TRASONIDOS

I

ptJ0c> 0

~

0

Q\i: ...... ;~.........

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vesiculAS CON LA CARA

Despues de estas consideraciones generales sabre la funci6n de las mitocondrias, pasemos a esrudiar con mayor detalle la cadena respiratoria -Ia cadena de transporte de electrones que es tan crucial para todo el metabolismo oxidativo. La mayona de los elementos de la cadena san componentes intrfnsecos de la membrana mitocondrial interna, y suministran algunos de los ejemplos nuts daros de las complejas interaceiones que puedan tener lugar entre protefnas individuales en una membrana biol6gica.

A partir de las rnitocondrias se pueden aislar partfculas invertidas funcionales l2 La cadena respiratoria es relativamente inaccesible a la manipuJaci6n experimental en las milocondrias intactas. Fragmentando las mitocondrias mediante ultrasonidos, es posible aislar partfcufas submitocotldriafes que estan formadas por crestas rotas que se han fusionado de nuevo, constituyendo pequenas vesIculas cerradas de unos 100 nm de dicimetro (Figura 14-23). Cuando estas partlculas submitocondriales se examinan al microscopio electr6nico. se aprecia que su superficie est<1 recubierta de pequenas esferas que se hallan unidas a 1£1 membrana mediante unos finos pedunculos (Figura 14·24). En las mitocondrias intactas se observa que estas estructuras semejantes a un "chupa-chups" se hallan localizadas en la sup~e i"tema (de la matriz) de la membrana intema. Asf pues, las partfclllas sllbmitocondriales son vesfculas de membrana interna revertidas, de forma que la superficie que inicialmeme estaba dirigida hacia la matriz ahora est<1 cxpuesta al medio circundame. Por consiguieme, facilmcnte se les puede suministrar metabolitos para los que la membrana es impermeable, que normalmente se encuentran en el companimiento de la matriz.. Cuando se les anade NADH, ADP Yfosfato inorg:1nico. estas panfculas transportan electrones desde el NADH hasta el 02 y acoplan esta oxidaci6n a la sfntesis de ATP, catalizando la reacci6n ADP + PI ~ ATP. Este sistema libre de celulas proporciona un sistema de ensayo que haec posible la purificaci6n, en su forma fundonal, de muchas protefnas responsables de la fosforiJaci6n oxidaliva.

INTERNA EN CONTACTO

CON EL EXTERIOA OBTENtOAS A PARTIR DE FRAGMENTOS DE MEMBRANA INTERNA REfUSIONAOOS

c:l::Fo¢o 00

°

partlcl.llaa aubmltocondrlales purlficadas

Figura 14-23 Preparacldn de parU"culas 5ubmltocondrlales a partir de rnltocondrlas purificadas. Las partfculas son trazos de crestas disgregadas que fonnan vesfculas cerradas.

La ATP sintasa puede ser purificada y de nuevo incorporada

a las membranas l3 Los primeros experimemos que demostraron que las diferentes protefnas de la membrana que camlizan la fosforilaci6n oxidativa pueden ser separadas unas de ouas sin perder actividad, fueron realizados en 1960. Las minusculas esferas proteicas que recubren la superficie de las partIculas submitocondriales fuerOIl separadas de las particulas, dejando el palo del chupa-chups y las otras protefnas intrfnsecas de membrana en la membrana de la panfcula. Las particulas desnudas de esferas podian todavfa oxidar NADH en presencia de oxfgeno, pero La cadena respiratoria y la ATP smtasa

'---' l00nm

Figura 14-24 EJeclronmlcrograflade partfculas 5ubmllocondrlaJes. Esta preparaci6n se ha contrastado en negalivo. (Coru~5fa de Erraim Racker.)

717

\

ya no podfan sintetizar ATP. POT atro lado, las esferas purificadas podfan actuar como ATPasas, hidrolizando ATP a ADP YPi' Cuando las esferas purificadas (denominadas ATPasasFj ) se afiadieron de nuevo a las panfculas suhmitocondriales desnudas, las partfculas reconstituidas volvieron a sintetizar ATP a partir de ADPy Pi'

Estudios posteriores demostraron que la ATPasaP j forma parte de un complejo transmembrana mayor (de unes 500 000 daltonsl que conriene, por 10 menos, nueve cadenas polipeptfdicas diferentes (Figura 14-25) y que actualmente se denomina ATP slntasa (0 rambien ATPasaFoFl)' La ATP sinrasa supone aproximadamente un 15% de la protefna total de la membrana interna; en membranas de cloroplastos y de bacterias se hallan presentes complejos enzimaticos

muy similares a eSle. La porci6n transmembrana del complejo proteico actua como un transportador de W y la porci6n ATPasaF I (Ia cabeza del chupa-chups) sintetiza ATP cuando los protones pasan a traves suyo a favor de gradiente electroqufmico. Cuando la ATPasaF 1 se separa del transportador de H\ s610 actua en sentido inverso, catalizando la hidr6lisis de ATP. Una de las demostraciones mas convincentes de la funci6n de la ATP sintasa se obtuvD en un experimento realizado en 1974. En aquel momenta ya se habfan desarrollado algunos metodos que permitfan transferir protefnas inlegrales de membrana solubilizadas can detergente a vesiculas Iipfdicas (Iiposomas) formadas a partir de fosfolfpidos purificados. Asf, fue posible formar una membrana hfbrida que contenia ATP sintasa mitocondrial purificada y bacteriorrodopsina -una bomba de protones activada por la luz, estudiada en el CapItulo 10- pero ninguna de las protefnas de la cadena respiratoria mitocondrial. Cuando estas vesfculas eran expuestas a la luz, los protones bombeados hacia el interior del lumen de la vesfcula por la bacteriorrodopsina, flufan de nuevo hacia el exterior a traves de la ATP sintasa, produciendo ATP en el medio externo (Figura 14-26). Puesto que la interacci6n directa entre una bomba bacteriana de protones y una ATP sintasa de mamffero parecfa altamente improbable, este experimento sugiri6 claramente que en las mitocondrias la traslocaci6n de protones impulsada por el transporte de electrones por un lado y la sfntesis de ATP par otro, son dos acontecimiencos diferentes.

bacteriorrodopsins purificsds

"

ATP sinlsss purificsda

+ detergente +

ADICIQN DE FOSFOL!PIDOS Y ELiMINACl6N DEL DETERGENTE

718

Capftulo 14: Conversi6n energetlca: mitocondrias y c1oroplastos

trsnsportsdor de H+ transmembrans

Figura 14-25 LaATP slntasa. Como ya se ha indicado. la porci6n ATPasaF, se fonna de subunidades multiples (/etras griegas). como ocurre can el transportadorde H' fransmembrana.

Figura 14-26 Esquema de un experimento que demuestra de qu~ fonna un nujo simple de protones puede Impulsar la acc16n de laATP slntasa. Combinando una bomba baCferiana de prolones aClivada par la luz (1a bacteriorrodopsina). unaATP sintasa purificada a partir de mitocondrias de coraz6n de buey y fosfolfpidos, se produjeron vesfculas que sintetizaban ATP en respuesta a un esdmulo luminoso.

H'

H'

H'

H'

oH'

F,

I----- 9

om -----+

La AlP sintasa puede fimcionar de manera reversible, hidrolizando ATP y bombeando H+ 13 La ATP sintasa puede utilizar un flujo de protanes a favor de gradiente electroqufmico para sintclizar ATP, pem tambien puede urilizar la energfa de hidr61isis del ATP para bombear H" a traves de la membrana mirocondrial interna (Figura 14-27). As! pues, aCl1.la como un efemento de acoplamicnto reversible. intercon-

virtiendo un gradiente electroqufmico de protanes en energfas qufmicas de enlace y viceversa. La direcci6n en que actua depende del balance entre el valor del gradiente electroqufmico de protanes y el 6G local para la hidr6lisis de ATP. EI complejo enzimatico se denomina ATP sintasa porque normalmenle sintetiza ATP gracias al impulso del gran gradiente electroqufmico de prolOnes que se mantiene por la cadena respiratoria (Figura 14-20). EI mlmero exaclO de protones necesarios para simetizar una molecula de ATP no se conoce can exactitud. De todas formas, para facilirar los calculos que describiremos mas adelante, asumiremos que la ATP simasa sintetiza una molecula de ATP por cada 3 protones impulsados a traves de ella. En un momento dado, el que la ATP sintasa sinterize a hidrolize ATP depende del balance exacto entre la variaci6n de energfa Iibre favorable para que los tres prot ones atraviesen la membrana, hacia.la matriz (6G3lt., que es negativa) y la variaci6n de energfa libre desfavorable para la sfntesis de ATP en la matriz (6G. fn ,esl'okj\.l"P' que es positiva). Como ya discutimos, el valor de 6Gslnleo1 'okATP depende de las concemraciones exacras de los tres compuestos que reaecionan ATP, ADP Y PI en la ma!riz mitocondrial (vease Figura 14-22). Por olra parte, el valor de 6G~1l' es proporcional al valor de la fuerza prot6n-motriz a !raves de la membrana mitocondrial interna. EI sigl.liente ejempl0 ayudara a explicar de que forma afecla a la A"~'P sintasa el equilibria entre estas dos variaciones de energfa libre. Como se explica en el pie de la Figura 14·27, un unieo prot6n que penetra en la matriz a favor de un gradiente de 200 mY, libera una energfa libre de 4,6 kcal/mol; la energfa libre Iiberada para el movimiento de tres protones es ellri· pie (6G~II' = -13,8 kcal/mo\J. As!, si la fuerza prot6n-motriz se mantiene conslante a 200 mY, la ATP sintasa sintetizara ATP hasta que se alcance una relaci6n de ATP respecto con ADP i P, tal que 6G'ftllesl'deATP sea igual a +13,8 kcallmol (aquf 6G,rn,osi'okj\.TP + 6G~If+=O). En este pun to, no existini ni sfntesis ni hidr61isis neta de ATP mediada por la ATP sintasa. Supongamos que, de pronto, se hidroliza una gran cantidad de ATP debido a reaecianes que requieren energfa en el citosol -cayendo la relaci6n ATP/ADP de la matriz. En esta situaci6n el valor de 6G,rn,esl'deATP disminuira (vease Figura 14-22), y la ATP sintasa comenzara a sintetizar de nuevo ATP, para restablecer la relaci6n ATP/ADP original. Alternaljvamente, si de pronto la fucrza prot6n-moLa cadena respiralorla y la ATP sinlasa

Figura 14-27 LaATPslntasaesun mecanlsmo acoplador reversible que Inlen::onvlerte las energ(as del gradlente elec:troqu{mlco de prolones y los enlaces qu{mlcos. La ATP sintasa puede slntetizar ATP mediante [a utilizaci6n de la fuerza prot6n-morriz (izqllierdal y tambien puede bombear protones en contra de su gradit!'n1e electroqufmico mediante la hidr6lisis de ATP (dereclla). Como se ha exp[icado en el texto, en un cada momento la direcci6n de su actuaci6n depende de la variaci6n de energfa libre neta para los procesos acoplados de translocaci6n de H' a traves de la membrana y la s(ntesis de ATP a partir deADPyPI' Previa mente, mostramos c6mo la variaci6n de la energfa libre (aG) para la hidr6lisis deATP depende de las concentraciones de [os tres reactivos ATP, ADPy P, (Figura 14-22); el aG para la translocaci6n de los protones a traves de la membrana es proporcional a [a fuerza prot6n-motriz. E1 factor de conversi6n entre ellos es el faraday. Asf. .6.GIl' = -0.023 (fuerza prot6nmotriz}. donde 6GIl , se expresa en kilocalorias por mol (kcal/mol) y la fuerza prot6n-motriz en milivoltios (mY). Para un gradiente electroqufmico de H' de 200 mV lendremos un .6.Gu• = -4,6 kcal/moL

719

lriz disminuye y entonees se mamiene constante pero a un valor dc 160 mY. en· lances .1GSll ' variara a -I J ,0 keal/mol. <;omo resultado de clio, la ATP simasa co· menzant a hidrolizar una parte del ATP de la mauiz hasta que sc alcance un nuevo equilibrio de ATP a ADP y Pj (donde .1G..n...... deAw = +11 kcal/mol), ctc. Como vercmos mas adelante, en muchas bacterias la ATP sinlasa revierte el sentido de su acci6n durante la transici6n enlre el melabolismo aerobioo y anaer6bico. La reversibilidad de la ATP sintasa es una propiedad compartida par Olras protefnas de membrana que aooplan el bomboo de iones con la sfntesis 0 hidr61isis de ATP. Por ejemplo, tanto la bomba de Na'-K' como la de Caz, ,descritas en el Capftulo II, hidrolizan ATP y utilizan la energfa Iiberada para bombear los iones a traves de la membrana. Si cualquiera de estas bombas estuviera expuesla a un valor anonnalmeme elevado del gradiente de los iones que transporta, actuarfa en sen lido contrario-sintelizandoATP a partir de ADP YPI en lugar de hidrolizar10. De esta manera, como ocurre can laATP simasa, estas bombas son capaces de convertir directameme la encrgfa elccuoqufmica a1macenada en un gradiente i6nioo transmembrana en cnergfa de enlace fosfaro deIATP.

La cadena respiratoria bombea H+ a traves de la membrana

mitocondriaJ interna 14 La cadena respiratoria induida en la membrana m..itocondrial imema normal-

mente genera el gradieme elcctroquimioo de protones que impulsa la sfntesis de ATP. La capacidad de la cadena respiratoria para traslocar H' hacia aluera de la matriz se puede poner de manifiesto experimentalmente bajo ciertas condiciones. Por ejemplo, se puede tratar una suspensi6n de mitocondrias aisladas con un substrato adecuado para la oxidaci6n Yse puede bloquear el flujo de protones a traves de la ATP simasa. En ausenda de aire, la administraci6n de una pequefia camidad de oxfgeno a esta preparaci6n causa una breve incremento de la respiraci6n. de I 02 segundos antes de que todo el oxigeno haya sido consumido. Durame este brusco incremenlo de la respiraci6n se puede medir con un sensible electrodo de pH la subita acidificaci6n del medio que resultn de In salida de H' desde el espacio de la matriz. En un experirnemo similar Llevado a cabo can una suspensi6n de pnrtfculas submitocondriales, el medio se alcaliniza cuando se agrega el oxlgeno. ya que los H' son bombeados hacia detltro de cada vesicula debido a su orientaci6n invert ida.

Se han utilizado m~todos espectrosc6picos para identificar muchos transportadores de electrones de la cadena respiratoria 15 Muehos de los transportadores de electrones de la cadena rcspiratoria absorben In luz visible y eambian de color cuando son oxidados 0 reducidos. En general. cada uno de ellos tiene su propio espectro de absorci6n y su reactividad, suficientemente caractcrfslicos como para poder seguir espectrosc6picamente su comportamiemo inc!uso en mezclas crudas. Gracias a esta caracterfstica, fue posible purificar estos componentes mucho antes de que se conocicran sus funciones exactas. Asf, los citocromos fueron dcscubiertos en 1925 como compuestos que sufren una rttpida oxidaci6n y reducci6n, en organismos vivos tan dispares como las bacterias, levaduras e insectos. Mediante la observad6n de c~lulas Y lejidos con un espcctroscopio, se identificaron Ires tipos de citocromos en base a SU espectro de absorci6n caracterislico y rueron denominados citocromos a, bye. Esta nomenclatura se mantiene en la acrualidad a pesar de que se sabe que las c~lulas contienen varios dtocromos de cada tipo, y que la c1asificaci6n en tipos no es fundonalmente importante. Los cltocromos conslituyen una familia de protefnas coloreadas que tienen en comun la presencia de un grl4po "emo, cuyo tttomo de hierro pasa del estado ferrico (Fe III) al estado ferraso (Fe II) cada vez que acepta un electr6n. EI grupo hema consiste en un anillo de porfirina con un atomo de hierro rucrtemente en720

Capftulo 14 : Conversi6n energ~tica: mitocondrias y c1oroplastos

lazado y sostenido por cuatro :1tomos de nitr6geno de las esquinas de un cuadrado (Figura 14·28). Un anillo de porfirina relacionado con este, unido a hierro en la hemoglobina y a magnesio en la doroma, es el responsable del color rojo de la sangre y del color verde de las hojas. EI citocromo que se conoce mejor de la cadena respiraloria es el citocromo c, cuya estructura uidimensional ha sido determinada por cristalografTa de rayos X (Figura 14-29). Las prole/nas de llierro-azu[re constituyen otTa familia de transportadores de electrones. Estas prolefnas presentan entre dos y cuatro atomos de hierro unidos a un mimero igual de .homos de azufre y a cadenas laterales de cistefna, formando un centro de hlerro-azufre en la proteina (Figura 14-30). En la cadena respiratoria existen mas centros de hierro-azufre que citocromos, pero su detecci6n espectrosc6pica requiere la utiJizaci6n de especnoscopia de resonancia de espfn electronico (ESR, de Electron Spin Resonance), por 10 que est:1n menos caracterizados que los citocromos. EI mas sencillo de los transportadores de electrones es una pequefla molecula hidrof6bica disuelta en la bicapa lipidica conocida como IIbiqllinona 0 coenzima Q. Una qulnona (Q) puede aceptar 0 ceder uno 0 dos electrones, y por cada electr6n que transporta acepta temporalmente un prot6n del medio (Figura 14-31). Ademas de los seis grupos hemo diferentes unidos a citocromos, de mas de seis centros de hierro-azufre y de la ubiquinona, tambien acruan como transportadores de electrones desde el NADH hasta el oxfgeno, dos :1tom05 de cobre y una Oavina que se hallan fuenemente unidos a prolefnas de la cadena respiraloria. La vfa implica aproximadamente 40 protefnas diferentes en total. EI orden de los transponadores de elecuones ha sido detenninado mediante sofisticados metodos espectrosc6picos (Figura 14·32), y muchas de las protefnas fueron inicialmente aisladas y purificadas como polipeptidos individuales. No obstante, para com· prender el funcionamiento real de la cadena respiratoria hay que tener en cuenta que las protefnas est<1n organizadas en tres grandes complejos enzimaticos.

COOH

I

COOH

I I

CH,

CH,

CH,

CH,

I

H,C

FJgun. 14·28 Estructura del gropo hemo unJdo covalentemente aI

dlocromo c. EI anillo de porfirina se muestra en azul. En la cadena respiraloria hay 5 cilocromos diferentes. Dado que en dtocromos diferentes los gropos heme presentan algunas diferencias estrueturales y esuin unidos a sus respectivas protefnas de manera diferellte, cada uno de los dtocromos tiene diferenle afinidad por los electrones.

La cadena respiratoria contiene tres grandes complejos enzimaticos incluidos en la membrana interna l6 Las prote(nas de membrana son diffciles de purificar en forma de complejos in· tactas, porque Son insolubles en la mayarfa de soluciones acuosas, y algunos de Figura 14-29 Estructura tridimensional del c1tocromo c, un Iransportador de electrones de la cadena de transporte electrdnlco. Esta pequena prolefna contiene algo mb de 100 amillollcidos yse une a la membrana de manera bastanle laxa, mediante inleracciones i6nicas (vease Figura 14-33). EI titomode hierro (en CQlor narallja) colocado sobre el grupe hemo (ell CQlor azul) puede transponar un solo electrOn (vease lambicn Figura 3-59).

La cadena respiratorla y 1a ATP sintasa

721

I

Figura 14-30 Estructura de dos Opes de centros de hlerro-azum. (Al Un cenlro dellipo 2Fe2S. (Bl Un centro del tipo 4Fe4S. Aunque conlienen muchos alomos de hierro, cada centro de hierro-azufre 5610 puede Iransportar un electron a la vez. En la cadena respiratoria exiSlen mas de seis cenlros de hierro-azufre diferentes.

""Cys ,/V1Cys ,

x~ s,

s,

VC~,p'

lA, los detergentes que se requieren para solubilizarlas puedcn destruir las interaedanes normales protefna-pratefna. Sin embargo, a principios de la decada de 1960 se descuhri6 que los detergentes i6nicos relativamente suaves como el desoxicolato pueden solubilizar. en forma nativa, componentes delerminados de la membrana milocondrial intema. Eslu penniti6 identificar y purificar los Ires principales complejos enzJrn,hJcos respiratorios, unidos a la membrana, de la via que va desde el NADH hasta el oxfgeno (Figura 14-33). Como veremos. carla uno de estos complejos actlia como una bomba de H- impulsada por un transpone de eJectrones; sin embargo. estos complejos fueron caracterizados inidalmente en funci6n de los lransponadores de electrones que contienen y con los que interactuan. I.

EI complejo NADH deshldrogenasa es el mayor de los complejos enzimMicos respiralOrios. con una masa de aproximadamente 800 000 daltons y mas de 22 cadenas polipeptidicas. Acepla electrones del NADH y los trans{jere a travl!s de una flavina y al menos cinco cennos de hierro-azufre a la ubiquinona. que nansfiere sus electrones a un segundo complejo enzimatieo respiralOrio, el complejo b-c,.

2.

EI complejo cllocromo b-c , conliene por 10 menos 8 cadenas polipeptfdicas diferentes. y parece que se presenta en fonna de dfmero de unos 500 000 dallons. Cada mon6mero contiene Ires grupos hemo unidos a dtocromos. y una prolerna hierro-azufre. EI complejo acepta electrones de la ubiquinona y los lransfiere al citocromo c, que transporta su electr6n hasla el complejo de fa citocromo oxidasa.

3. EI complejo de In dlocromo oxJdasa (dtocromo aaJ ) es el complejo mejor caraclerizada de los tres. Bsla (armada por, al menos. 9 cadenas polipeplfdicas diferentes. y sc afsln como un dfmero de unos 300 000 daltons; cada mon6mero conlienc dos cilocromos y dos ,Homos de cobre. £1 complejo acepla electroncs del dlocromo c y los cede al oxfgeno.

e- ...

O .....CH J

0

H,C

H·

-CH~ 0

e- ...

O ....CH)

H'

-CH~

0

H,C

O·

0

H,C

O-CH)

0

w. hidrolObQ hidrourbonlda

ubiMmlquinoni (rlMlieallibreJ

722

ubOquil'lOl (dihldroubOqUinonlJ

Capftulo 14 : Conversl6n energ~lica: milocondrias y c1oroplaslos

FlguTB 14-31 las quinonas. Cada uno de estos transporladores de electrones capta un prol6n del ambienle acuoso par cada elec[r6n que acept'a, y puede Iransportar uno 0 dos electrones como parle de un atQmo de hidr6geno (color amarl/lo). Cuando cede sus eleclrones al siguienle Iransponador de la cadena, eSIOS protones se liberan. En las mitocondrias la quinona es la ubiquinona (coenzima OJ, que se mueslra aquf; la larga cola hidrof6bica que ancla la ubiquinona a la membrana COllSla generaJmenle de 6 a 10 unidades de isopreno (de cinco carbonos cada una). En las planlas. el lransponador de electrones correspondienle es la plasloquinona. casi id~ntica a la ubiquinona. Para simplificar. tanlo a la ubiquinona como a la plastoquinona se les denomina qllinona. abreviada como Q.

-,.-.-.-.,-0, r-0-0-0-0 ,--0-0°.-.-0, '--0- -.-.-0,

(A)

CONDICIONES NORMAlfS

IBI CONOtCtONES ANAeA6B1CAS control

r

pareialmente oxidadOt:

I

I

complel8mente reducido

Inhibldor

adiel6n repentina de oxlgeno

I

!

reducido

I

!

ox~do

I

I

M prod..- u.... 0'- dol oxidaci6n que 1M va deapla1ando eN i1quiel'da a derecM

,

Los citocromos, los centros de hierro-azufre y los atomos de cobre, s610 pueden transportar un electr6n a la vez. Sin embargo, cada NADH cede dos electrones y cada molecuJa de O2 debe recibir cuatro electrones para producir agua. Existen varios puntos de recolecci6n y de dispersi6n de electrones a 10 largo de la cadena de transporte de electrones en los que se reajustan estas diferencias en el ntimero de electrones.

En la citocromo oxidasa, un centro de hierro-cobre cataliza de forma eficiente la reducci6n del 0 2 17 Debido a que el oxfgeno tiene una gran afinidad por los electrones, libera una gran cantidad de energfa Libre cuando es reducido formando agua. De esta manera,la evoluci6n de la respiraci6n celuJar, en la que el 0 , es convertido en agua, capacit6 a los organismos para obtener mucha mi1s energia que la que podfan obtener a partir del metabolismo anaer6bico. Es por eUo por 10 que probablemente todos los organismos superiores respiran. En cualquier caso, para poder utilizar el O2 de este modo, los sistemas biol6gicos requieren disponer de unos procesos qufmicos muy sofisticados. Podemos tolerar el 02 en el aire que respiramos porque Ie cuesta captar el primer electr6n, por 10 que su reacci6n inicial en las celulas esti1 finamente controlada por la cataLisis enzimatica. Pero un vez que una molecula de 02 haya captado un electr6n, fonnando un radical super6xido (° 2-), este se convierte en peligrosamente reactivo y captarl1tres electrones adicionales de donde sea. La celuJa puede utilizar el 02 para la respiraci6n s610 porque la citocromo oxidasa sitlia el 02 en un centro bimetl1Jico especial (Figura 14-34B), donde se mantiene unido entre un .homo de hierro Iigado a un grupo hemo ya un
FIgura 14-32 MefodosgeneraJes utUlzados para deferminar la lrayedoria de 1M electrones a 10 largo de la cadena de lransporle electrtSnlco. EI grado de oxidllci6n de los transportadores electr6nicos II. b. c, y d se puede seguir de forma continua CSludiando su CSpeClfO, ya que el del eslado oxidado es diferenle al del eslado reducido. En esle esquema un aumenlO en el grado de oxidacion se indica en color rojo oscuro. (A) En condiciones normaJes. lodos los transponadores se hallan en un estado parcialmeme oxidado. La adici6n de WI inhibidor espedfico hace que los transportadores siluados a favor de la corrienle de eleclrones se oxiden mas (roja claro) y los lransportadores situados en direcdon contraria de la corrienle de electrones se reduzcan. (8) En ausencla de oxfgeno. todos los lransportadores se hallan en estado complelamente reducido (gris). La adicion subita de oxfgeno hace que cada Iransportador se lransforme en su forma parcialmenle oxidada, con un relraso que es mayor para la mayoria de los transponadores silUados a favor de la corriente de electrones.

I

o

""-

ESPACIO INTERMEMBRANA

membrana miloconclri,l inlem,

[

amI+ H'

ESPACIO DE LA MATAIZ

Figura 14·33 Paso de loselectrones II travis de los Ires complejo!

10nm

tNAD'!

La cadena respiratorla y la ATP slntasa

-

enzlmadco5 resplratorlos. En la figura se observan las formas y lamai'los reilltivos de tres cornplejos e01.imaticos respiratorios. Eslas eslructuras tridimensionales de baja resoludon fueron oblenidas a partir de im4genes de criSlales bidimensionales (hojas cristalinas) visualizadas a1 microscopio eleclronico a varios 4ngulos de inclinacion. Durante la transferencia de dos eleclroncs del NADH a1 oxfgcno (Iff/cas rojas).la ublquinona y el citocromo c hacen la funcion de Iransporladores entre los complejO$.

723

paso de electrones bombeo de protones

entrada de electrones

.,

H

membrsns mitocondrial interns

ESPAC1Q DE LA MATRIZ

"

IAi subunidad I subunidad II I

Figura 14·34 La reaccl6n del O2 can los electrones en la dlocromo

I

complejo de la citocromo oxidass

,.>-r- +--e .

,., e-

,.

..

O,

2.

•

•

2.

2',

• siguiente cicio

,.

~

•

.' , 2H'

lei

,.

2.

. ••

2.

~O

• /0

~h W

O~ • '0

,. •

) 2. '0- •

~

W

" "

2",0

trones; s610 entonces los dos atomos de la molecula de oxfgeno seran Iiberados como dos moJeculas de agua, sin ningun peligro (Figura 14-34C). Aunque la citocromo oxidasa contiene muchas subunidades proteicas, la mayorfa de elias tienen un papel secundario, ayudando a regular tanto la actividad como el ensamblaje de las Ires subunidades que forman el mkleo de la enrima. Una de las subunidades de este mlcleo contiene el centro bimeuilico donde se une el oxfgeno, y es responsable del bombeo de cuatro protones que se transfieren a traves de la membrana mitocondrial interna por cada molecula de origeno que se reduce a agua (Figura 14·34). 724

Capftulo 14 : Conversl6n energetlca: mltocondrlas y cloroplaslos

oxJdasa. (A) Disposici6n de Jos lransponadores de electrones en la dtocromo oxidasa. La subunidad I, que tiene 12 helices 0. transmembranll. eontiene 2 ,'i!omos de hierro unidos a 2 gropos hemo; uno de estos aetua como un punta captador de electrones que los transfiere al centro bimetaJico (enmarcado en un rectdngulo blanco), formado par el otTO atomo de hierro y par un atomo de cohre opuesto muy cereano. Hay que destaear que par cada molecula de O2 que reacciona son bombeados fuera de la matriz4 H' y que eslO requiere un total de 4 electrones. (B) Una visi6n ampliada del centro bimela1ico de hierro-cobre con el O2 unido. (el Un esquema de la via utilizada para la reducci6n del oxigeno, dando una idea de la eomplejidad de las reaeciones implieadas. Los electrones se rep resell tan como puntos rajas hasta que se ineorporan a los atomos de hidr6geno (amarillo). (Basado en el modelo de G. T. Babcock y M. Wikstrom, Natllre356:301·309. 1992. @1992.MacmillanMagazinesLtd.)

..

-

$e cslima que la reacci6n de la dlocromo oxidasa utiliza un 90% del consumo tOlal de oxfgeno de la mayorfa de las celuJas. La toxicidad de venenos como el cianuro y la azida se basa en su capacidad de unirse fuenemenle a eSle complejo, bloqueando asi cualquier tipo de transporte electr6nico.

Las transrerencias de elect.rones estan mediad as por colisiones aleatorias que se producen entre los dado res y los aceptores que difunden en la membrana mitocondrial interna l8 Los dos componentes que transportan los electrones enlre los Ires complejos enzim<\Licos principales de la cadena respiraloria -Ia ubiquinona y el dlocremo cdifunden rnpidamente en el plano de la membrana. Las colisiones que se pueden esperar entre estos dos transportadores m6viJes y los complejos enzimjticos pueden explicar las velocidades observadas de rransferencia de electrones (cada complejo cede y recibe un electron cada 5 a 20 milisegundos). Asf pues, para explicar la lransferencia de electrones en la bicapa Iipidica no es necesario poslUlar la existencia de una cadena de proleinas ordenada estructuralmente: de hecho, parece que los Ires complejos enzim<\Licos existen en el plano de la membrana interna como enlidades independientes, de forma que la transferencia ordenada de electrones se debe a la especificidad de las interacciones funcionales entre los componentes de la cadena. Esta idea se ve refof7..3da por la observaci6n de que varios de los componcnles de la cadena respiraloria se halJan presenres en cantidades baslante diferentes. En las miiocondrias de ooraz6n, por ejemplo, se estima que por cada molecula del complejo de la NADH deshidrogenasa existen 3 moleculas de complejo b-c.. 7 moleculas de complejo de la cilOcromo oxidasa, 9 moleculas de dtocromo c, y 50 moleculas de ubiquinona; en otros Lipos celulares se presentan proporciones muy difercnles. EsIOS componentes forman una cadena en la que cada uno interactua espedficamente con el transportador adyaceme en la secucncia mostrada en la Figura 14-33, y hay un f1ujo neta de electrones desde la NADH deshidrogenasa a la cilocremo oxidasa porque cada uno de los complejos enzimalicos de la secuencia presenta una afinidad mayor por los eleclrones que su predecesor. La afinidad que presenta una moh'!cula por los clcctrones es su potencial redox. Como esrudiaremos a conrinuaci6n, las diferencias de potencial redox de un transporlador de electrones y el siguiente se utiliza para bombear prOlones fuera de la matriz mitocondrial.

Una gran carda del potencial redox a traves de cada uno de los tres complejos enzim:iticos respiratorios aporta energfa para el bombeo de H+ 19 A los pares de componcnles, tales como el H 20 y Ih0 2 0 el NADH y el NAD' se les

denomina pares redox conjugados, ya que uno de los componellles se convierte en el olro mediante la adici6n de uno 0 mas electrones mas uno 0 mas protones -los prOlOnes estan ya djsponibles en cualquier soluci6n acuosa. As!, por ejcmplo, Ih0 2 + 2e- + 2H' --+ H 20

Muchos lectores sabran que una mezcla equimolar de los miembros de un par ~presi6n de H'" definida, 0 pH, que es una medida de la constante de disociaci6n del :icido. De la misma forma, una mezcla equimolar de los miembros de un par conjugado redox mantiene una ~presi6n de electrones" definida, 0 polenclal redox (reducci6n-oxidaci6n), E, que es una medida de la afmidad del transportador de electrones par los electrones. Colocando electrodos en contacto con soluciones que conlengan los pares redox conjugados apropiados, uno puede medir el potencial redox de cada uno de los diversos transportadores de electrones que panicipan en las reacciones biol6gicas de oxidaci6n-reducci6n. En los sistemas biol6gicos el potencial redox

co"jllgado dcido-base aClua como tamp6n, manten.iendo una

La cadena resplratoria y la ATP slntasa

725 j

se determina a pH 7,0, al que IH'J = 1O~7 M. Los pares de compuestos que presentan un potencial redox mas negativo tienen menor afinidad por los electrones y por esta raz6n comienen transportadores can una fuerte tendencia a donar eleclrones, mientras que los pares que presentan pOlenciales redox mas positivos tienen mayor afmidad por los electrones y, consecuenlemente, contienen transportadores con una fuerte tendencia a aceptar electrones. De esta manera, una mezda 50-50 de NADH y NAD' tiene lUl potencial redox de -320 mV, 10 cual indica que el NADH tiene una fuerte tendencia a donar electronesj una mezda 50-50 de HzO y IhO z tiene un potencial redox de +820 mV, 10 cual indica que el Oz tiene una fuerte tendencia a aceptar elcctrones. Se pueden determinar los potenciales redox de todos los transportadores de electrones de la cadena respiratoria que se puedan distinguir por su especlro, y se observa que van aumentando a medida que uno va pasando por la cadena de transponadores de clcctrones. Dado que la mayoria de citocromos presentan unos pOlcnciales redox mas altos que los de los centros de hierro-azufre, generalmente actuan como transportadores de eleclrones cerca del extremo del Oz de la cadena respiratoria, mientras que las protefnas hierro-azufre actuan como transponadores cerca del extremo del NADH . . En la Figura 14-35 se muestra un esquema de los potenciales redox medidos a 10 largo de la cadena respiratoria. Los potenciales caen en tres grandes escalones, uno a traves de cada complejo enzimMico principal. La variaci6n de pOlencial redox entre cada dos transportadores de electrones cs directamente proporcional a la energfa libre liberada por cada electr6n transferido entre ellos (vease Figura 14-35). Cada complejo actua como un clemento transformador de energfa, utilizando esta variaci6n en energfa librc para bombear prolones a traves de la membrana interna, creando de csta manera un gradiente electroqufmico de protones a traves de la membrana. Esta transformaci6n se puede poner de manifiesto mediante la incorporaci6n a Iiposomas de cada uno de los complejos purificados: cuando se afiaden un dador y un aceplor de eleclrones apropiados, de forma que los electrones atraviesen el complejo, los H+ se traslocaran a traves de la membrana delliposoma.

EI mecanismo del bombeo de H" se conoce mejor en bacteriorrodopsina20 Debido a que algunos complejos enzimaticos de la cadena respiratoria bombean un prol6n por electr6n a traves de la membrana mitocondrial interna mientras nH' NAOH

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726

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electrones

Capftuto 14: Conversi6n energetica: mitocondrias y cloroplaslos

0

•

Figura 14-35 El polenclal redox (IndJcado como ~ 0 ~) aumenla a medlda que los elcctrones f1uycn hacla abajo de la cadena resplratorla, hacla el oxfgeno. La variaci6n de energfa libre estandard, 6Go, para la transferencia de cada uno de los dos elcclrones cedidos por la moh~cula de NADH puede oblenerse en la escala de ordenadas de la derccha (6G = -n(O,023) 6E,;, donde 11 es cl mimero de electroncs Iransferidos a IraveS de una variaci6n de potencial redox de 6E,; mY). Los electrones fluyen a IraveS de un complejo enzimatico pasaudo de manera secuencial a los cuatro 0 mas lransponadores de electrones de cada complejo. Como se indica, parle de la variaci6n favorable de energfa libre es ulilizada por cada complejo enzim:itico para bombear protones a IraveS de la membrana mitocondrial intema. No se conoce con exaclirud cmil es el numero de protones bombeados por eleclr6n (n); se estima que la NADIi deshidrogenasa y los complejos b-c, bombean dos H' por electr6n, mientras que el complejo de la citocromo oxidasa s610 bombea WlO.

Los dos eleclrones transportados desde el FADH z' generados a panir de la oxidaci6n de los acidos grasos (vease Figura 14-11) ydel cicio del acido cftrico (vease Figura 14-14), pasan directamellte a la ubiquinona. Poresta raz6n, inducen menos bombco de H' que los dos electrolles que provienen del NADH (no mostrado).

ONFOfl captaci6n de protones

Iiberaci6n protones

DENTRO

~

•Zw w

FUERA

DISM1NUClON DE LA AFINIDAD POR LOS H' (alta -bejal

de~

captacl6n de protones

AUMENTO DE LA AFINIDAD POR LOS H' jbaja- altal

Figura 14-36 8ombeo de protones. ESIe modelo general del bombeo de H'

que otros bombean dos, el mecanismo molecular mediante el que el transporte de electrones se acopla al bombeo de protones parece ser diferente para c?da uno de los tres complejos enzimdticos. Se desconocen los detalles del mecanismo por el que acWan. En el caso del complejo b-cl' las quinonas c1aramente participan en este mecanismo. Como mencionamos anteriormente, una quinona capta un prot6n del medio acuoso por cada electr6n que Iransporta y 10 libera cua.l1do Iibera el electr6n (vease Figura 14-30. Ellibre desplazamiento de la ubiquinona por la bicapa lipidica Ie permite aceptar electrones cerca de la superficie interna de la membrana y donarlos al complejo b-c 1 cerca de la superficie extern a, transfiriendose asf un prot6n a traves de la bicapa por cada electr6n transportado. Sin embargo, por cada electr6n se bombean dos protones a traves del complejo b-c 1: existen evidencias del Uamado cicio Q, ell el que la ubiquinona se recic1a a traves del complejo en un sentido detenninado, que hace posible esta transferencia dos por uno. Los cambios alostericos de las conformaciones proteicas determinados por el transpone elecrr6nico tam bien pueden bombear H', tal como la ATP sintasa trabajando en sentido inverso bombea H' hidrolizando ATP. Tanto para el complejo de la NADH deshidrogenasa como para el complejo de la citocromo oxidasa, parece probable que el transporte de electrones determine de manera ordenada los cam bios alostericos de conformaci6n de las protefnas que provocan que una parte de la protefna bombee H' a traves de la membrana mitocondrial interna. Este tipo de bombeo de protones esta bien estudiado para la bacteriorrodopsina, una bomba prot6nica impulsada por Juz que se encuentra en la membrana plasm.atica de ciertas bactcrias altamente especializadas (vease Figura 10-32). En la Figura 14-36 se presenta un mecanisme general para el bombeo de H' basado en estudios estructurales y funcionales de esta protefna.

impulsado par energfa se basa en el mecanismo que parece que utiliza la bacteriorrodopsina. La prate/na lJ"ansmembrana mostrada es impulsada a seguir cambios ordenados de confonnadones, designadas aquf como A, B YC. En la conformad6n C la pratefna tiene una baja afinidad para los H' causando la liberaci6n de un H' al exterior de la bicapa lipfdica; en la conformad6n A, la protefna tiene una afinidad muy alta por los H', favoredcndo su captad6n hada dentro de la bicapa lip'dica. Como se indica, la transid6n de la confonnad6n B a la C es energeticamente desfavorable. pero esta impulsada a realizarse par el acoplamictllo con una reacd6n energeticamente favorable que ocurre en algun silio de la protefna (jIeclla azul). Los otras cambios conformacionaJes. conducen a estados de menor energfa y discurrcn espontaneamenle. Dc este modo. el dcloA -4 B -4 C -4 A s610 va en un sentido, favoredendo el bombeo de los H' dcsde denrro hacia fuera. En el caso de la bacteriorrodopsina, la energfa para la transici6n B -4 C esta prapordonada par la luz, mientras que en la mitocondria esta cncrgfa csta propordonada par el transporte electr6nico.

Los ion6foros de H+ disipan el gradiente de H+ J desacoplando asf el transporte de electrones de la smtesis de ATP 21 Desde los ailos 1940 se sabe que varias substancias, como eI2,4-dinitrofenol, act(Jan como agentes desacoplalltes, desacoplando el transporle de electrones de la sfntesis de ATP. La adici6n de estos compuestos organicos de bajo peso molecular a las celulas detiene la sfnlesis de ATP en las mitocondrias, sin bloquear el La

cadena respiratorla y la ATP slntasa

727

consumo de oxfgcno. En presencia de este agenre desacoplante, el transportc de electrones continua a gran velocidad pero no se genera ningun tipo de gradiente de H·. La explicaci6n de eSlo es tan elegante como sencilla: los agentes desaco· planles aCIt'ian como transportadores de H+ (ion6foros de H·l. col1stituyendo una via para el nujo de H· a trav~s de la membrana milocondrial interna alternaliva a la de la ATP sintasa. Como consecuencia de este ~conocircuilO". la fuerza prot6n-motriz se disipa completamente por 10 que ya no se puede sintetizar ATP.

Normalmente el control respiratorio restringe el flujo de electrones a traves de la cadenaZ2 Cuando se ai'lade un desacoplador tal como el dinirrofenol a las oolulas. las miro· condrias aumenlan substancialmente la captad6n de oxfgeno debido a un aumen· to en la velocidad de transporte de eleclrones. Este aumento reneja la existencia de un control respiratorio. Se cree que el control acnia a trav~s del efccto inhibidor dirccto que tlene el gradiente elcctroquimico de protones sabre la veloci· dad de transporte de electrones. Cuando el gradiente se elimina por acci6n de un desacoplador. el transporte de electrones discurre a la mc1xima velocidad posible, de una manera descontrolada. A medida que el gradiente aumenta. el transporte de electrones se vuelve mas difi"cil y el proceso se welve mds lento, Ademlis. si experimemalmente se genera un fuene gradiente electroqufmico artificial de protones a travbi de la membrana imerna, el transporte normal de electrones se para por completo y se detecta unflujo inuerso de electrotles en al· gunas secciones de la cadena respiratoria. Esta observaci6n sugiere que el con· trol respiratorio reneja un equilibrio simple entre la variaci6n de energfa Iibre del bamboo de protones ligado al transporte de electrones y la variaci6n de energla Iibre del transporte de electrones -es decir. la magnitud del gradiente elcclroqufmico de protones afecta tanto a la velocidad como a la direcci6n del transpone de elecrrones, ral como afccra a la direccionalidad de la ATP simasa (v~ase Figura 14·27). El control respiratorio es 5610 una pane de un sistema compartimentado muy elaborado de comroles por retroalimentaci6n que coord ina las velocidades de la glucolisis, la hidr6lisis de los acidos grasos. el cicio del acido cftrico y el transporte de electrones. Las velocidades de todos estos procesos se ajustan a la relaci6n ATP/ADP. aumentando cuando se produce un aumento de la uriliza· ci6n de ATP que provoca una disminuci6n de csta relaci6n. La ATP simasa de la membrana mitocondrial interna, por cjcmplo, trabaja a velocidad mayor cuan· do aument'a la concentraci6n de sus dos substratos ADP y PI' Al aumentar la actio vidad de la enzima, aumenta el Oujo de protones hacia en interior de la matriz, disipandose mas n1pidamcnte el gradiente electroqufmico de protones. A su vez, el descenso de este gradientc activa la velocidad del transporte electr6nico. Sistemas de control similares a ~ste. incluida la retroinhibici6n ncgativa por ATP de varias enzimas clave (para un ejemplo. v~ase Figura 14-13), adaptan por ejemplo la velocidad de producci6n de NADH a la de utilizaci6n de NADH en la cadena respiratoria. Como result ado de todos estos mecanismos de comrol, du· rante un perfodo de ejercicio intenso, el cuerpo oxida grasas y azucares a una ve· locidad entre 5 y 10 veces superior a la que se produce durante Ull perlodo de re· poso.

Existell desacoplantes naturales que transforman las mitocondrias del tejido adiposo marr6n en maquinas generadoras de caJor D En algunas c~lulas adiposas especializadas la respiraci6n mitocondrial est<1 desacoplada de la slntesis de ATP de forma natural. En estas c~lulas. conocldas como adipocitos del tejido adiposo marr6n 0 de la grasa parda, la mayor parte de la energfa de oxidaci6n se disipa en fonna de calor en lugar de ser transfor· 728

Capftulo 14: Conversi6n energet.ica: mitocondrias ycloroplastos

mada en ATP. La membrana intema de las grandes mitocondrlas de estas c6111las, contienen una protefna de transporte que permite a los protones Ouir a lraves de la membrana a favor de su gradicnte electroqufmico, sin activar 1a ATP sinlasa. A consecuenda de eUo. las celulas oxidan sus reservas dc grasa a lIna gran velocidad, produciendo m~s calor que ATP. Por clio, los Icjidos quc con Lie· nen lejido adiposo marr6n acluan como "almohadillas caJefactoras" que reani· man a los animales hibernantes y que protegen del fTio las ~reas sensibles el reo den naddo humano.

ATP slntasa

Todas las bacterias utiUzan mecanismos quimiosmoticos para ahorrar energfaz" Las baeterias utilizan fuenles de energia enonnemente diversas. Como las celulas eucariotas. algunas bacterlas sintetizan ATP a partir de azucares, oxid~ndolos hasta COl y HzO a lraves de la glucolisis y del cicio del acido cftrico; eslas bacterias tienen en su membrana plasmatica una cadena respiratoria muy similar a la de la membrana mitocondrial inlema. Otras bacterias son anaer6bicas estrlclas por 10 que oblienen la energfa exclusivamenle de la g1ucolisis (fennenlaci6n) 0 de una cadena electr6nica que utiliza como aceptor fmal de eleclrones una moI~ula diferenle al oxIgeno. Estos aceptores a1temativos pueden ser un compueslo nitrogenado (nitratos 0 nitritos). un compuesto de azufre (sulfalos 0 sulfitos) 0 un compuesto organico (fumaratos 0 carbonatos). Los elcclrones son transferidos a estos aceptores mediante una serle de transportadores de electrones que se hallan en la membrana plasmalica. semejames a los que se encuentran en las cadenas respiratorias mitocondriales. A pesar de esta diversidad. la membrana plasmatica de la mayorfa de las bacterias presenla una ATP sintasa muy similar a la de las milocondrias (y a la de los cloroplastos). En las bacterias aer6bicas, exisle una cadena de transporte de electrones que eSlablece la fuerza prot6n-motriz que impulsa la ATP sintasa a generar ATP. En las bacterias anaer6bicas que carecen de cadena de transporte electr6nico, eSla ATP sinlasa aClua en sentido inverso. utiJizando el ATP producido en la glucolisis para generar una fuerza prot6n- mOlriz a traves de la membrana plasmalica bacleriana. Asf, la mayorfa de las bacl'erias, incluidas las anaer6hicas eSlrictas. manlie· nen una fuerza prot6n-motriz a traves de su membrana plasm:itica. EI gradiente eleclroqufmico de protones se utiliza para impliisar el motor flagelar que penni· te la motilidad de la bacteria: el Na· es bombeado afuera dc las bacterias por un sistema de antiporte de Na··H' que desempena la funci6n de la ATPasa de Na'K' de la celulas clIcar!olas; la mayorfa de aminoacidos y azucares son transportados de esta manera en las baclerias: el transp.orle activo de nulrienles tiellde a estar mediado par un sistema de simporte impulsado par H' (Figura 14-37) ell el que el metabolito dcseado es arrastrado hacia el interior de la celula jUlllamente con uno 0 mas protones. En las celulas animales, por el cont.rario, la mayorfa del Iransporte hacia el interior a traves de la membrana plasmalica es impliisado por el gradientc de Na' eSlablecido por la ATPasa de Na'-K'. Entre los diSlinlOS tipos de baclerias, existen algunas que son capaces de adaplarse a vivir en ambienles muy alcalinos y deben manlener su ciloplasma a un pH fisiol6gico. Para estas celuJas, cualquier intento de generar un gradiente elecrroqufmico de prolones serfa opuesto al elevado gradiente de concclllraci6n de protones en direcci6n contraria (mas H' en el interior que en el exterior). Probablemente por esla raz6n. aI algunas de estas bacterias substituy6 el Na' por H' en todos sus meca.nismos quimiosm6ticos. Su cadena respiraloria bombea Na' hacia el exterior de la reJula, sus sislemas de transporte eslan acoplados a un simporte de Na' hacia adentro. su motor Dagelar esta irnpulsado por un Oujo de Na' hacia adcnlro, y la responsable de la mayor parte de su sfnlesis de ATP parece ser una ATP sinlasa impulsada por Na'. La exislcncia de estas bacterias demuestra que el principio de la quimiosmosis es mds fundamental que el gradienle elcclroqufmico de protones en el que se basa nonnalmente. La cadena

resplralorla y la ATP slntasa

membrana plllIImMica

baeterief\ll

Figura 14·37 Transportelmpulsado por protones en las baeterias. Una fuerza prot6n-rnotriz generada a traves de la membrana plasmatica bombea nutrientes hacia el interior de la celula ysodio hacia el exterior. En (Al, se esta generando un gradiente electroqufmico de protones en una bacteria anaerobica, mediante una cadena respiratoria. Luego. este gradiente sera utilizado por la ATP sintasa para producir ATP. Tambien sera utilizado para transportar algunos nutrientes aI interior de la bacteria. En {B),la misma bacteria pero en condiciones anaerobicas, obtendra el ATPde la g1ucolisis. Pane de esteATP sera hidrolizado por la ATP sintasa generando una fuerza prot6n.motriz transmembrana que impulsani los procesos de transporte. 729

Resumen La cadena resplratoria de In membrann mitocondrial internn rontiene tres complejos eruinufticos prlndpales, impiicados en Ia transfereru:ia de electrones desde el NAnH hasta el aT CadLJ uno de estos rompIejos puede ser purlficado e ituertado en vesfadm lipCdkiu sint~ticas, demostrtfndose asi que bamboon protones cuatulD se transponan electrones a su travis. En In membrann nativa. In ubiquinonn y el dtocramo c son transportadores m6viles th electrones que van y vienen th llno a otro complejo enzinuftiro, completando In cadena de transporte electr6nico. La vEa del flujo th electrones es: NAnH -t complejo th In NAnH desllidrogenasa -t ubiquino· nn -t romplejo b-c, -t citocromo C -t complejo de In dtocromo oxidasa -t OIigeno molecular (OJ. Los romplejos eruimdtiros resplrntorlos aroplnn el transporte de electrones, energericamenre favorable, al bombeo de protones haeia el exterior de In nratriz.. El gradiente electroqllfmico resIIltanle se lltillzil para fabrkar ATP mediante otro complejo proteico transmembrmUl, In ATP slntasa, a traves del cllal los protones jlllyen de nllevo hada la nrotrlz. La ATP sinrasa es lin mecanismo acopkulor reversible que normalmelJle transfornro elflllja de prolanes hacia adentro de La mirooondrla ell ellerg(a de enlnce fosfato del ATP, catallzilncro la reaeeMII ADP + P, -t ATP, pero qlle, si se redllce el gradiente electroqu{mioo de protond, rambiin puede IJidrolizar ATP y bombear electrones en direcci6n opllesta. Su presencia universal en mltocondrlas, cloroplastos y bacterias restifica su Importancia central en los nu?canismos quimlosm6tioos de las celuw.

Cloroplastos y fotosfntesis 25 Todos los animales y la mayorfa de los microorganismos conffan en una continuada captaci6n de glandes camidades de compuestos org;1nicos de su ambieme. Estos compuestos aponan los esqueletos carbonados para la biosfntesis y la energfa metab6lica que impulsa todos los procesos celulares. Se cree que los primeros orgarnsmos de la Tierra primitiva tenian acceso a una abundancia de compuestos organicos de origen geoquimico (vease Capftulo I), pero la mayoria de estos compuestos origin ales se agOtaron hace miles de millones de ailos. Desde ese perfodo pnkticamente todos los materiales organicos que han necesitado las celulas vivas han sido producidos par orgallismosfotosinrericos, incluyendo muchos tipos de bacterias fotosint~ticas. Las cianobaclerlas, que son las bacterias fotosinteticas mas cvolucionadas, lienen lInos requerimientos nutricionales minimos. Estas bactcrias utilizan los electrones del agua y la energfa de la luz solar para convertir el CO2 atmosft:!rico en compuestos organicos. En el curso de la hidr61isis del agua len la reacci6n llH 20 + "C02 .!!!!.., (CH20)~ + ll021, liberan a la atm6sfera el oxigcno necesario para la fosforilaci6n oxidativa. Como veremos se cree que la evoluci6n de las cianobacterias a partir de bacterias fotosint~ticas m<1s primitivas hizo posible por primera vez el desarrollo de las fonnas aer6bicas de vida. En las plantas, que se desarroJlaron m<1s tarde, la fotosfnlesis se realiza en un organulo intracelular especializado --el c1oroplasto. Los c1oroplastos realizan la fOlosfntesis durante las horas de luz solar. Los productos de la fotos{ntesis son utiJizados directamente por las celulas fotosinteticas para la biosfntesis y tambien son transfonnados en azucares de bajo peso molecular (nonnalmente sacarosa) que son exponados para satisfacer las necesidades memb6licas de muchas de las celuJas no fotosinteticas de la pianta. Altemativamente, los productos pueden ser almacenados como polisac<1ridos osm6ticamente inenes (normalmente almid6n) que se guardan disponible como una fuente de azucar para una utiJizaci6n futma. Las evidencias bioqu[micas sugieren que los c1oroplastos son descendjentes de bacterias fOlosinteticas productoras de oxigeno que fueron endocitadas y vivieron en simbiosis can c~lulas primilivas eucariotas. Tambien se cree que, en 730

Capftulo 14: Conversi6n cnerg(!tica: mitocondrias y c1oroplastos

'i-_-!grano. d'!'_4~ ""l

lllmidon

general, las mltocondrias son descendientes de bacterias endocil3das. Probablemenle, la gran cantidad de diferencias Que hay entre c1oroplaslos y milocondrias

refieja tanto el hecho de que provienen de antetesores bacterianos diferentes como su posterior divergencia evolutiva. Sin embargo, los mecanismos fundamentales impJicados en la smtesis de ATP irnpulsada por la luz. en los c1oroplasIDS. y los que esti\n implicados en la smlesis de ATP impulsacta por la respiraci6n, en las mitocondrias, son muy parecidos.

El c1oroplasto es un miembro de una familia de org:inulos exclusivos de las plantas -los plastidios 26 EI c1oroplaslO es el micmbro ml1s prommente de la familia de los plastldlos. Los plastidios se presentan en lodas las c~lulas vivas de las plantas, cada lipo celular tiene su propio complemento caracterfstico. Todos los plastidios tienen una serie de caraClerfsticas comunes. Lo mas notable de elias es que todos los plaslidios de una especie de planta concreta contienen multiples copias del mismo genoma, relativamente corto (vease Tabla 14·3, pag. 754) y estan rodeados por una envolrura compuesta por dos membranas concentricas. Todos los plastid los se desarrollan a partir de los propfastidios, que son lInos organulos relativamenle pequenos presentes en las celulas inmaduras de los meristemos de la planta (Figura 14-38A). Los proplastidios se desarrollan en funci6n de los requerimientos de cada celula diferenciada y ellipo de proplaslidio viene determinado en gran parte par el genoma nuclear. 8i se hace crcccr una hoja en la oscuridad, sus proplastidios aumentaran de tamano y se t'ransformaran en etiop/oslOS, los cuales presentan un eje semicristalino de membranas internas que contiene una clorofila amarilla precursora en lugar de la clorofila. Cuando son expuestos a la luz, los etioplastos rapidamente se transforman en cloroplaslos mediante la conversi6n de este precursor a c1orofila y sintetizando nuevas membranas, pigmentos, enzimas fotosinteticos y componenles de la cadena de transporte electr6nico. Los leucopfoslOS son plastidios que aparecen en la epidermis y en muchos tejidos internos que no se vuelven verdes ni fotosinteticos. Son Iigeramenle mas grandes que los proplastidios. EI amiIoplasto es una forma comon de leucoplasto (Figura 14-388), que acumula almid6n en los [ejidos de reserva. En algona plantas, tales como las patatas, los amiloplastos pueden lIegar a ser Ian grandes como una celula animal de tamano medio. Es importante darse cuenta que los plastidios no 5610 son lugares en los que tiene lugar la fotosfntesis ni la deposici6n de materiales de reserva. Las plantas han utilizado sus plastidios para la compartimentaci6n celular del metabolismo intermediario. Los plastidios producen mucha mas energfa y mas poder reductor (en forma de ATP y NADPH) que los que son utilizados para las reacciones biosinteticas de la planta. La sfntesis de las purinas y pirimidinas. la mayorfa de C1oroplastos y fotosfntesls

Figura 14-38 D1ve:rsidad de los plastldlos. (A) Un propla.stidio de una cl!lula de rafz de una planta de judias. Ob~rvese la doble membrana: la membrana mterna resalla la relativa escasez de membranas inlemas. (B) Tres amiloplastos (un fonna de leucoplaslO) 0 plastidios a1maccnadores de a1mid6n. en una pUllla de la ra.fz de soja. (De B. Gunning y M. Steer. Ultrastructure and the Biology of Plant Cells. Londres: Arnold. 1975.)

731

I - - - 211m---r

HOJA

CLOROPLASTO

epidermis superior

epidermis inferior membrane membrene externll interna espllcio intermembrllnoso

Figura 14-39 EI cloroplaslo. Este organulo fotosintetico presenta tres membranas distintas (Ia membrana extema, la membrana intema y la membrana tilacoidal) que delimitan t'res compartimientos intemos diferentes (el espacio intemlembranoso, el estroma y el espacio tilacoidal). La membrana tilacoidal contiene todos los sistemas generadores de energfa del c1oroplasto. En las electronmicrograffas, esta membrana aparece formando unidades separadas que delimitan vesfculas aplanadas (vcase Figura 14-40), pero probablemente estan unidas formando una sola membrana muy plegada en cada c1oroplasto. Como se indica en la figura. los distintos tilacoides eSlan interconectados. y lienden a agruparse formando agregados denominados grana.

/

erlVolture del cloroplesto

0.5 I'm

'AI

• 181

732

CapftuJo 14: Conyersl6n energ~tica: mitocondrias y c1oroplaslos

Figura 14-40 E1ectronmlcrograffa de cloroplastos. (A) Una hoja de trigo en la que exisle una gran vacuola rodeada por una tina franja de ciloplasma can cloroplastos. (B) 5ecci6n u1trafina de un solo cloroplasto, mostrando los granulos de almid6n y gotas Iipfdicas que se han acumulado en el estroma como resultado de los procesos de biosfntesis que se producen en este lugar. (e, Una visi6n a mayor aumento de los grana, mostrando las mernbranas tilacoidaies aplanadas. (Par cortesfa de K. Plasldlt.)

21lm - - - l membrana intem.

~¥"-- 85pKio intermembrMlU _ _ j/ "tro~_-nr.

Figura 14~41 Comparaci6n entre una mltooondria y un cloroplasto. EI cioroplasto suelc ser mucho mayor y conliene una membrana tilacoidal y un espacio lilacoidal. La membrana inlcma de la milorondria estli plegada fonnando creslas.

DN.----~

MlTOCONORIA

r[bosonuos

--\\

membrana tHacoidill

----\\,,~ CLOROf>\.ASTO

los arninoacidos y de todos los acidos grasos de las plantas tiene lugar en los plastidios. mientras que en las c(;lulas anima.les todos estos compuestos SOil prodllcidos en el citosol.

Los cloroplastos se parecen a las mitocondrias, pero tienen un compartimiento adicional 21 Los c1oroplasto& reaJizan sus interconversiones energericas mediante mecanismos quimiosm6ticos. tal como 10 hacen Las mitocondrias, y su organizaci6n se basa en los mismos principios (Figuras 14-39 y 14-40). Ambos tipos presentan una membrana extema altamente penneable, una membrana mteroa mucho menos penneable, en la que estan induidas proteinas transportadoras especiales, y un estrecho espacio intermembrana. La membrana interna envuelve un gran espacio Uamado estroma, que es analogo a la matriz mitocondriaJ yeontiene varias enzimas, ribosomas, RNA y DNA. En cualqllier easo, existe una importante diferencia entre la organizaci6n de las mitocondrias y de los doroplaslos. Generalrnente la membrana interna del doroplasto no esta plegada en erestas y no eontiene una cadena transportadora de eleetrones. En lugar de ello, tanto la cadena de Iransporte de electrones como el sistema fotosintetico de absorci6n de la luz y una ATP sintasa se loealizan en ulla lereera membrana distinta que forma un eonjunto de saeos pianos apilados, los tIIacoldes (vease Figura 14-39). Se cree que ellumen de cada tilaeoide eSla eoneetado con ellumen de los otros tilacoides. definiendo asf un tercer com partimiento interno Uamado el espacio t;ulCoidal que delimita con el estroma mediante la membrann tilacoidal. En la Figura 14-41 se ilustran las similitudes y diferencias ultraestrueturales entre las mitoeondrias y los c1oroplastos. En general, se puede imaginar el c1oroplasto como una mitocondria mAs grande en la que las crestas se han eonvertido en series de partfculas submitocondriales intereonectadas situadas en el espacio de la matriz. EJ extremo prominente de la ATP sintasa del c1oroplasto. donde se sintetiza el ATP, sobresaIe de la membrana tilacoidal hacia el estroma, como si sobresaliera de la matriz desde la membrana de cada cresta milocondrial.

Dos reacciones caracterfsticas de los cloroplastos: la producci6n de ATP y de NADPH, impulsada por la luz, y la conversi6n de CO2 en carbohidratos25 La gran eantidad de reacciones que se produeen durante la fOlosfntesis, se pue-

den agrupar en dos grandes eategorfas. (I) En las reacclones fOloslnttHlcas de transferencla de electrones (algunas veees Ilamadas las "reaeciones de la rase lumlnosa"), la encrgfa derivada de la luz solar aetiva un electr6n de 1a cloroflla, Cloroplastos y fOlosfntesis

733

10 cual permite que este electr6n se desplace a 10 largo de una cadena de oxidaci6n de la membrana tilacoidal, de manera amiloga a como se desplazan los electrones a 10 largo de la cadena respiratoria de las mitocondrias. La clorofila obliene sus eleclrones del agua, can la liberaci6n de 02' Este proceso de transporte electr6nico bombea pralones a traves de la membrana liiacoidaJ, y la fuerza prot6n-motriz resultante impulsa el proceso de sfntesis de ATP en el estroma. AI mismo tiempo, las reacciones de transpone electr6nico generan eleclrones de alta energfa (junto con W) que Iransforman el NAD?' en NADPH. Todas eslas reacciones se producen en el c1oroplasto. (2) En las reacclones de fijacl6n del carbona (llamadas tambil~n "reacciones de la fase oscura"), el ATP y el NADPH producidos en las reacciones fOlosinteticas de transferencia de electrones se ulilizan como fuente de energfa y de poder reduclor, respectivamenie, para impulsar la Iransformaci6n de CO 2 en carbohidralOS. Las reacciones de fijaci6n de carbo no, que empiezan en el estroma del c1oroplasto y conlint1an en el cilosol celular, producen sacarosa en las hojas de la planla; desde donde es exporlada a olras tejidos como fuente de moleculas organicas y de energfa para el crecimiento. Asf. In formaci6n de oxfgeno (que necesita directamente la energia de la luzl y la conversi6n del di6xido de carbono en carbohidralOs (que necesita, tan s610 indirectamente, la energfa de la luzl, son dos procesos fotosintelicos c1aramente separados el uno del otro (Figura 14-42). No obstante, como veremos, existen elaborados mecanismos de retroalimentaci6n que interconectan ambos procesos, equilibrando la biosfnlesis. Por ejemplo, las variaciones en los requerimientos celulares de ATP y de NADPH regulan la producci6n de estas moleculas en la membrana del tilacoide; tambicn ocurre que varias de las enzimas del cloroplasto que son necesarias para la fijaci6n del carbono se inaclivan en la oscuridad y se reactivan por los procesos de transporte eleclr6nico estimulados por la luz.

CITQSOL

Figura 14-42 EI proceso de la rotosfRlesls en un cloroplasto. En la primera serie de reacciones, el agua se oxida y se libera oxfgeno, mientras que en la segunda serle de reacciones el di6xido de carbono es asiml1ado (fijado) produciendo carbohidratos.

La fijaci6n del carbono esta catalizada por la ribulosa bisfosfato carboxilasa 211 En este capitulo bemos visco que las celulas producen ATP aprovechando la gran cantidad de energfa libre que se libera cuando los carbohidratos son oxidados hasta CO 2 y H2 0. Par consiguieme, es evidente que la reacci6n inversa en la que el CO 2 y el H20 se combinan formando carbohidralos ha de ser una reacci6n muy desfavorable. En consecuencia, esla sfntesis debe estar acoplada a otras reacciones muy favorables que la impulsen. La Figura 14-43 i1ustra la reacci6n central en la que un atomo de carbono inorganico se transforma en un carbono organico: el CO 2 de la alm6sfera se combina con el compuesto de cinco carbonos, la ribulosa 1,5·bisfosfato, y con agua, para dar dos moleculas de tres carbOllOS, el 3-fosfoglicerato. Esta reacci6n de "fijaci6n del carbono", que fue descllbierta en 1948, se produce en el estroma del c1oroplaslo y eSla catalizada por lIna gran cnzima Hamada ribulosa bisfosfato carboxilasa (-500 000 daltonsl. Puesto que cada mollkliia de enzima lrabaja con

o

0

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I

H~C~OH

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carbono

734

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H~C-OH

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dO. mol&culas de 3·foafoglicerato

Capftulo 14: Conversi6n energetica: mltocondrias ycloroplastos

Figura 14-43 La reaccl6n Inlchtl de la fljacl6n del carbono. Esta reacci6n, en la que el di6xido de carbona se transforma en carbona organico, se desarrolla en el estroma del cloroplaslO y esta catalizada por la enzima ribulosa bisfosfato carboxilasa, que es muy abundante. El producto, 3-fosfoglicerato, el cuallambit'!n es un importante intermediario de la glucolisis; cuando la enzima adiciona oxfgeno en lugar de CO 2, los dos ,llomos de carbono que se presentan en color azul se utilizan para generar fosfogiicolato (vt'!ase mas adelante).

bastanle lentitud (transforma unas 3 moltkulas de substrato por segundo. en comparaci6n con las 1000 mol~culas por segundo de una enzima tfpical, es nccesario que en cada cloroplasto exislan muchas copias de ella. A menudo, III ribulosa bisfosfato carboxilasa represenla mas del 50% del 10lal de protefna del cloroplaslo, y se cree que es la prolefna mas abundanle de la Tierra.

En el cicio de fijaci6n del carbono se consumen tres moleculas de ATP y dos moleculas de NADPH por cada mol~cuJa de CO, fijada 29

•

La reacci6n de fijaci6n del COz es energ~licamente favorable gracias a la reaClividad del compuesto rico en energfa riblllosa I,S-bufosfata a! que se ai'iade cada mol~cuJa de COz (Figura 14-43). Pero para que se produzca un aporte de ribulosa l,5-bisfosfalo se requieren una serie de reacciones que consuman grandes cantidades de NADPH y ATP. La elaborada via a lrav~ de la cua! se regenera este compuesto se descubri6 gracias a un experimenlo que cOllstituye uno de los mayores ~xiIOS en el uso de los radiois6topos. Como se mueSlra en 1a Figura 1444, gracias a la ribulosa bisfosfalo carboxilasa se fijan 3 mollkulas de COz produci~ndose 6 molttulas de 3-fosfoglicerato (con un tOla! de 6 x 3 = 18 atomos de carbono: 3 procedentes del COz Y 15 de 1a ribulosa I,S-bisfosfatoJ. Los 18 atomos de carbono recorren entonces un cicio de reacciones que regeneran las 3 mol~­ cuJas de ribulosa I,S-bisfosfato que fueron utilizadas en el primer paso de fijaci6n del carbono (3 x 5 =15 l1tomos de carbono). Asf, el proceso genera una moI~cula de gliceraldehfdo 3-fosfata (3 l1tomos de carbona) como ganancia neta. En este cicio de ftjacl6n del carbona (0 cicio de Calvin-Benson). se consumen 3

tres mol6eul1l5

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lrllmol6euln

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,c ~--,r:m \ - - - - - - 61ADPI

I~-;="':'OI6eUlllS 3C

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cInco mol6eula.

. . ".ot6cu. . . . 001 lijedll ~tnIento MItO de m'-"do

Figura 14-44 Cicio de OJacldn del carbono, que forma mol&ulas orglinlcas a partir de CO z y de HzO. El numero de alomos de carbono de cada lipo de mol~cula se indica en los recuadros blancos. Emre el g1iceraldehrdo 3-£os£ato y la ribulosa 5-fosfato hay una gran cantidad de imermediarios, que en este esquema sc han omitido en aras de una mayor claridad. Tampoco se representa la emrada de agua en cl cicio.

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IoCIW . . . . . ." . . . MlO ' " ftllllW MOIIIoJ... _AlP.,. . . ,."....... do .......

H-C=O I H-C-OH I CH,O

AZUCAAES• .4aOOS GRASOS. AMlNOAcJOOS

..

C1oroplaslos y fotosfntesls

735

moleculas de ATP y 2 moleculas de NADPH por cada molecula de COz que se transforma en carbohidrato. La ecuaci6n neta es 3COz + 9ATP + 6NADPH + agua -i' gliceraldehfdo 3-fosfato + 8PI + 9ADP + 6NADP' En consecuencia, para la formaci6n de moleculas organicas a partir de COz Y HzO' se requiere energfa de enlacefosfalo (en forma de ATP) y poder reductor (en forma de NADPH). Mas adelante volveremos sobre este punto. EI gliceraldehfdo 3-fosfato produddo en los cloroplastos a trav~ del cicio de fijaci6n del carbono es un al.ucar de tres carbonos que tambien se utiliza como intennediario central en 1a g1ucolisis. Gran parte de este al.Ucar es exportado at chosol donde puede ser rapidamente transfonnado en fruclOsa 6-fosfato y g1ucosa I-fosfato mediante la inversi6n de varias reacciones en la g1ucolisis (vease Figura 2-21). Luego, la glucosa I-fosfato es transformada en el azucarnucle6tido UDP-glucosa, que se combina con la fructosa 6-fosfam formando sacarosa fosfato, el intennediario precursor del disac8rido sacarosa. La sacarosa es la fonna principal de transporte de azucares en las celulas vegetates, como 10 es la g1ucosa en las celulas ani males: aI igual que la glucosa, que es transponada en la sangre de los ani males, la sacarosa es exponada desde las hojas a uaves de los haces vasculares, proporcionando los carbohidratos requeridos por el resto de la plama. La mayor parte del g1iceraldehfdo 3-fosfato que permanece en el cloroplasto es uansformado en almid6n en el estroma. AI igual que el gluc6geno en las celulas animales, el a1m1d6n es un gran polfmero de glucosa que se utiliza como reserva de carbohidratos. La producci6n de almid6n csla regulada de tal manera que se produce y almacena en grandes granos en el estroma del cloroplasto (vease Figura 14-388) durante perfodos de exceso de capacidad fotosintetica. Esto sucede a traves de reacciones que se producen en el estroma, inversas de las que rienen lugar en 1a glucolisis: transfonnan el gLiceraldehfdo 3-fosfalo en glucosa I-fosfato, que enlonces se utiliza para producir el azucar-nucle6lido ADP-gJucosa, el precursor inmediato del almid6n. Durante la nache, el almid6n es hidrolizado para proveer de energfa a las necesidades metab6licas de la planla.

En algunas plantas, Ja fijaci6n del carbono esta compartimentada para facilitar el crecimiento a concentraciones bajas de COlO Aunque la ribulosa bisfosfato carboxilasa afiade preferentcmente una molecula de COz a la ribulosa I,S-bisfosfato, puede tambien utilizar 02 ademas de CO2, y si la conccntraci6n de CO2 cs baja, af\adira 02. Este es el primer paso de una v(a Hamada [otorrespiraci61l, cuyo cfccto es consumir 02 y liberar CO2 sin la producci6n de ahnacenes de energfa uti!. En muchas plamas, aproximadamente una tcrcera pane del CO2 fijado se pierde de nuevo como resultado de 1a fotorrespiraci6n. La fomrrcspiraci6n resulta dominante en condiciones secas y calurosas en las que las plantas se ven forzadas a cerrar sus estomas (los poros de inlercambio gaseoso de su hojas) con el fin de evitar un perdida excesiva de agua. Esto provoca una caida extraordinaria de los niveles de COz en la hoja, favoreciendo la fotorrespiraci6n. No obstame, en las hojas de muchas plantas que viven en ambientes caJidos y secos, como acurre con los cereales y con la cana de azucar, tiene lugar una adaptaci6n especial. En estas planlas, el cicio de fijaci6n del carbono moslrado en la Figura 14-44 tiene lugar 5610 en los c1oroplaslos de las diu/as ltinico-VQS€ulares, que contienen toda la ribulosa bisfosfalO carboxilasa de la planla. Eslas celulas estAn protegidas del aire y rodeadas por una capa especiali· zada de dlulas del mes6jilo que "bombean~ CO2 hacia las celulas lunico·vasculares, abasteciendo a 18 ribulosa bisfosfalO carboxilasa con una alta concentrad6n de CO2, que disminuye en gran medida la fotorrespiraci6n. La bomba de CO 2 es un cicio de reacciones que empieza con un paso especial de fijaci6n del CO 2, catalizado en el dtosol de las celulas del mes6fi1o por 736

Caprtulo 14 : Conversi6n energetica: mitocondrias y c1oroplastos

'AOJAS C. clo,opla.to

.....

epidermis

celulas del me&6filo

celulat tunico-vasculare.

h..

h..

vascular

vascula'

estoma

epidermis

cloropl..to

celu'-s del

Figura 14·45 Comparacl6ndela analOm(a de 1a hoja de una planta <; y de una planta C•. Las celulas dibujadas en color verde contienen cloroplastos que lIevan a cabo el cicio normal de fijaci6n del carbono. En las plantas C.' las celulas del mes6fi1o no fijan carbono sino que estan especiali7..adas en el bombeo de COl' Y gem~ran una elevada relaci6n 001;°2 en las ce:lulas ulnico-vasculares. que son las unicas ce:lulas de eslas plantas en las que tiene lugar el cicio de fijaci6n del carbono. Los haces vasculares lransportan la sacarosa producida en la hoja hasla OlIOS lejidos.

,~

CH,

una enzima que une di6xido de carbona (en fonna de bicarbonato) con aha afl· nidad y 10 combina con una moMcula activada de tres carbonos formando una molecula de cualTO carbonos. La molecula de cualtO carbonos difunde a las ct:!Iulas tunico-vasculares, donde es transformado Iiberando el CO 2 Y generando una molecula de tres carbonos. EI cicio de bombeo se completa cuanda este compuesto de tres carbonos vuelve a las ct:!lulas del mes6fi1o y es lTansformado en su forma original activada. Las plantas que fijan CO2 en las que el CO 2 es ini· cialmenle capturado mediante su conversi6n en un compuesto que contiene cuatro carbonos, reciben el nombre de plantas C(. Todas las demas plantas reci· ben el nombre de plantas CJ (Figura 14-45) porque capturan el CO 2 directamente en un compuesto de tres carbonos, el 3-fosfog(jceralO. Como sucede en cualquier proceso de transporte vectorial, el bomboo de CO 2 en las ct:!lulas tunico-vasculares de las plantas C. cuesta energfa. En los am· bientes secos y calurosos, este coste es normaJmente muy inferior a In pt:!rdida por fotorrespiraci6n de las plantas CJ , por 10 que las plantas C, tienen una venlajn potencial. Ademas, dado que las plantas C. pueden realizar la fotosfntcsis en el interior de las hojas a concentraciones de CO~ mas bajas, necesitan abrir menos sus estomas y por 10 tanto pueden fijar aproximadamenlC el doble de carbono neto por unidad de agua perdida que las plantas Cr

I

CH

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H

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H/ /

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CH, I

CH, I

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La fotosmtesis depende de la fotoqufmica

de las mol~culas de clorofila31 Habiendo estudiado las reacciones de fijaci6n del carbono, vamos a retornar ala cuesti6n de c6mo las reacciones fotosintt:!licas de transferencia de electrones ge· neran el ATP y cl NADH necesarios para impulsar la producci6n de los carbohidralos en 1a planta a partir de CO 2 y H 20 (vt:!ase Figura 14-42). La encrgfa necesaria deriva de la luz solar capmda pOT las moleculas de clorofila (Figura 14·46). EI proceso de conversi6n energetica empieza cuando una molt:!cula de c1orol1la cs excitada por un cuanto de luz (un (Ol6n) y un electron se desplaza de un orbital molecular a otro de mayor energfa. Esta molecula excilada es inestable y tiende a volver a su estado original no excitado por una de eslas tres posibles vias: (I) mediante la conversi6n de la energfa extra en calor (movimientos moleculares) 0 por alguna combinaci6n de calor y luz de una longitud de onda mas larga (nuorescencia), tal como ocurre cuando la energia lumfnica es absorbida por una molecula aislada de clorofila en soluci6n; (2) mediant'e la lTansferencia de energfa -pero no del electr6n- directamente a una molecula de c1orofila vecina, por un proceso denominado trans!erencia de energia par resonmlcia; 0 (3) mediante la trans(erencia del electr6n de alta energia a otra moll!cula cercana (un acepror de electroflcs) y retornando a su eSlado original tomando un electr6n de baja Cloroplastos y rotosfntesis

regi6n hldrof6bica de Is cola

Figura 14-46 EsU'Uetura de la c1orofila. Un alOmO de magnesio esta unido a un anmo de porfirina, que estJl. relacionado con el anillo de porfirina que une hierro en el grupo hemo (comparar con la Figura 14-28). En los enlaces sei'lalados en color, los electrones estan deslocalizados.

737

......,

molllk:ula eltCitllda de elorofila

Il'IOIkula ue.lllda de

dorofita

moIecuia ellci'lllda de elorofila

molkula excitada de dorofila

I Ui

\

, -I"'" electr6rl

EXCITACION

POSIBLES

VIAS O£ DECAIMIENTO

1

decalmlerl!o por tiberaci6rl de lUi V de calor

decalmierllo par por rlt$()nancill

decllimierlto por trllnsferencias

Un fotosistema contiene un centro de reacci6n y un complejo antena32 Cicoos complejos muhiproleicos, lIamados fotoslstemas, catalizan la transformaci6n de la energfa lumfnica capturada por moleculas excitadas de dorofHa, en formas utiles de energfa. Un fotosistcma consiste en dos componentes estrechamente unidos: un CCTlfTO de reacciOIl [oloqllfmico, que consiste en un complejo de prmefnas y moleculas de c1orofHa que captan la energfa solar convirticndola en energfa quim.ica, y un complejo atHena, que consistc en moleculas de pigmento que capturan la encrgfa solar y la canalizan aI centro de reacci6n. EI complejo antena es importante para el aprovechamiemo de la luz.. En los c1oroplastos, los complejos antena consisten en agrupaciones de varios cientos de molecuJas de c1orofila unidas entre sf por proteinas que las fijan fuertemente sobre la membrana tilacoidal. Segtin la planta de que se trate, en cada complejo lambien exislen canlidades variables de pigmentos accesorios, denominados CllrDte1loides, que ayudan a captar la luz de otras longitudes de onda, y que tambien se hallan localizados en cada complejo. Cuando una molecula de c1orofila del complejo antena es excitada, la energfa es nipidameme transferida dcsde una molecula a In otra, mediante transferencia energetica por resonancia, hasta que alcanza un par especial de moleculas de dorofila en el centro fOloqufmico de reacci6n. Por 10 tanto cada complejo antena actua a modo de "embudo~, que rccoge la energfa lumjnosa y la dirige hacia un unico centro de reacci6n especffico que la puede utilizar can cficiencia (Figura 14-48).

738

KeptOf'

3 suces,vllS de electronea

energfa de a1guna otra molt!cula (un dador de eJectrOfles, Figura 14-47). Los dos ti!timos mecanismos desempenan un papel esencial en la fotosfntesis.

~P41r "PtlCial~ de molkula de clorofila del c.ntro de reacQ6n

o>Udllda

BI-ll

2 trarlaferencia erlerglitica

LUZ

elolofila

---

....... ....." ollidado

molkulasde clorofila en el complejo proteico de la antena

complejo prote'napigmento del c.ntro de reacci6n

Capitulo t4: Conversi6n energt:!tica: mitocondrias y c1oroplaslos

Figura 14-47 Tres poslbles vfas que puede segulr una molku1a excIUKfa de c1orofUa para votver- a su estado original. no excItado. Mediante el PJOceso 1, la energfa luminosa absorbida por una molecuJa de c1orofila se libera completamente en forma de luz y c.,lor. Por el contrario. en la fotosfntesis las mol~lIlas de dorofila slgllcn el proceso 2 en el complejo all lena y el proccso 3 en el centro de reacci6n, como se describe en el texto.

FIgura ......48 Unfotoslstemaconsta de en un Cftllro de reac:d6n y una antena. Las molecuJas A(dadores de electrones> y las moleculas B (aceptores de electrones) difieren de acuerdo con el fOlosistema.

par especial de moltlculas de clorofile

feofitina

quinone fuenemente unide

Figura 14·49 D1sposlcl6n de los transportadores de ele<:lrones en un centro de reacci6n fotosinh~tico bacleriano, determinada por crlslalograffa de rayos X. Ttll como se indica en la figura, las moIeculas de pigmento eSlan colocadlls en el interior de una protelna transmembranll y envueltlls por III bicapa lipidica. Un clectr6n Cll el pllr espedlll es excitlldo por resonancia desde un complejo llntena clorofJ1ico (proceso 2 en III Figura 14-47), y luego. el electr6n excitado es transferido desde el par especial a la quinona (vease Figura 14-50).

CITOSOL

EI centro de reaccl6n fotoqu{mlco es un pigmento protcico transmembrana que se halla en eJ coraz6n de la fotosfOlesis. Se cree que se origin6 hace mas de 3 mil millones de anos en una bacteria fotosintetica primiliva. El par especial de moleculas de c1orofila del centro de reacci6n actUa como una trampa de cuantos de excitaci6n porque su electr6n excitado pasa inmediatamente a una cadena de aceptores de electrones que se hallan situados de forma precisa en el mismo complejo proteico (Figura 14-49). Mediante el nipido desplazamiento del electr6n de alta energfa lejos de las c1orofilas, el centro de reacci6n 10 transfiere a un ambiente donde es mucho mas estable. Por consiguiente, el electr6n es restablecido convenientemente para reacciones fotoqufmicas posteriores que requieren mas tiempo para lIevarse a cabo.

En un centro de reacci6n, la energfa capturada por la clorofila genera un dador fuerte de electrones a partir de uno debiP3 Las transferencias de electrones implicadas en las reacciones fOloqufmicas descritas recientemente han sido
739

Figura 14-50 Trllnsferenda electronh:a que tiene lugar en el cenlro de tellcdon (otoqu(mlcode la bacteria purpura. se cree que cn el fotosislcma II de las plamas. relacionado cvolulivamcnte liene lugar una serie de reacciones similar a esta. Enla pane superior derecha de la figuta se mUCSlra un diagrama csquem<'ilico que indica tas moloculas que Iransportan electroncs,las cuales son las de la Figura 14-49 mas una quinona imercambiable {QJ y una quinona libremenle movil (Q) disuelta en la bicapa lipfdica. Los Iransponadores de eleclrones del I al5 se unen en una posicion especffica de una protelna transmembrana de 596 aminoacidos, formada por dos subunidades di(erenles (vease Figura 10-33). Tras la excilaci6n por un fOl6n de luz, un electr6n de alta energ(a pasa de una molocula de pigmenlo a otra. generando una carga de separacion lal como se muestra debajo en los pasos de ta secuencia de Ahasta D, en la que la molocula de pigmemo que transpona electrones de aha energl"a esla indicada en color verde. La elapa Ese desarrolla muy lentamente. Una vez liberada en la bicapa, la quinona con dos electronesacepta dos protoncs y pierde su cargo (vease Figura 14-31).

-.aro._

LUZ

p,r especlsl de moillculas de ctorofila

~

clorofils

prolelne

leofitina

I•

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motllcula libl"e de quinonelQ)

moillcula de qulnona fu8ftemente unldal(W

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3 pic:osegundos (3 1I 10 12 segundosl

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2711 nanosegundos 100 mic:rosegundot ,epetic:i6n de intereambio de 10' paso, desde Ia quinona en

"-,ta

En plantas y en cianobaclerias, fa fotofosforilaci6n no ciclica produce NADPH y ATP3t.:w En las planras y en las cianobaclerias la fOlOsfnresis produce directameme tame ATP como NADH mediante un proceso en dos pasos Uamado fotofosforilacl6n no cfcUca. Dado que se ulilizan dos fotosistemas en serie para $r energia a un electr6n, este electr6n puede ser lransferido por toda la vfa desde el agua hasta NADPH. Debido a que los electrones de alta energia pasan a trav~s de fotosistemas acoplados generando NADPH, parte de su energia es desviada para la sfntesis deATP. En el primero de los dos fOlOsistemas -denominado forosisrema1l por razones hiSl6ricas- los oxfgenos de dos moleculas de agua se unen a un grupo de ~l.tomos de manganeso de lIno enzirna hidrolitica, todavfa poco estudiada. que posibilita que los eleclrones sean eliminados uno a uno rellenando los agujeros generados por la luz en el centro de reacci6n de las moleculas de cloronla. En cuanto los cuatro electrones de las dos moleculas de agua se han eliminado (10 que requiere cuatro quantos de luz), la enzima Iibera el 02' Asf plies, el fOlosistema II cataliza la reacci6n 21-1 2 4 fotones --+ 4W + 4e-. 02' EI nucleo del centro de reacci6n del fotosistemaIi es hom6logo al cenlro de reacci6n bacteriano descrito anteriormente, y tambien produce fuerles dadores de electrones en forma de moleculas de quinona reducida en la membrana. Las quinonas ceden sus electrones a una bomba de protones lIamada complejo bs '/' que se parece notablemente aI complejo b-cl de la cadena respiratoria milocondrial y a un complejo emparentado en las baclerias. Como en las mitocondrias, el complejo bombea 1-1' al espacio lilacoidal a traves de la membrana del lilacoide (0 fuera del Cilosol a traves de la membrana plasmatica en cianobaclerias), y el gradiente eleclroqufmico resultante impulsa la sintesis de ATP por la ATP sintasa (Figuras 14-51 y 14-52). El aceptor final de electrones de esla cadena de transporte electr6nico es el segundo fOlosistema f/Olosislema I), que acepta el electr6n del agujero dejado por la luz en el centro de reacci6n de su molecula de c1orofila. Cada electr6n que entra el fotosistema I es elevado a un nivel energetico mas alto, 10 que Ie pennitira pasar aI centro de hierro-azufre de la ferrodoxina e impulsar la reducci6n de NADP' hasta NADPH; este ultimo paso tambien implica la caplura de un prot6n del medio (Figura 14-52).

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Capftulo 14: Conversl6n energetica; mitocondrias ycloroplastos

.1 lugar

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antena

H'

membrana [ tilllcoidal

enlima que dascompona 81 agua • + 4H' ESPACIO TILACOIDAL _

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El esquema de la fotosfntesis que se presenta en la Figura 14-52 se conoce como el esquema Z. Par media de sus dos pasas de activaci6n electr6nica, calalizados eada uno por lin fotasistema, un electr6n es transferido desde el agua, que normalmente fija sus electrones muy fuertemente (potencial redox = +820 mV), hast'a el NADPH, que normal mente fija sus electrones de forma mas debil (potencial redox = -320 mY). Un solo Clianto de luz visible no dispone de suficiente

Figura 14·51 Flulo de electrones que se produce en la membrana tllacoldal durante Ja fOlOsfntesls. Los transportadores de electrones m6yiJes de la cadena son la plastoquinona (que se parece a la ubiquinona de las milocondria), la plastocianina (una pequefia protefna que comiene cobre) y la ferrodoxina (una pequefla proterna que contiene un centro de hierroazufre). E1 complejo b6 -fes muy similar al complejo b-c l de la mitocondria y al complejo b-c de las bacterias (yeaSe Figura 14-61): los tres complejos aceplan electrones desde quinonas y bombean protones. Observese que tanto los H' liberados en la oxidaci6n del agua como el H' captado durante la formaci6n del NADPH, tambien comribuyen a la generaci6n del gradiente elecrroqufmico de protones que impulsa la sflUesis de ATP mediante una sintasa prescnte en esta misma membrcna [no se muestra),

energfa para activar un electr6n desde la base del fotosistemall hasta el extrema superior del fotosistema I, la cual representa probablemente la variaci6n de energfa necesaria para transferir un electr6n desde el agua hasta el NADP', EI usa de dos fatosistemas separados supone que queda suficiente cantidad de energfa para que la cadena de transporte eleclr6nico que une los dos fotosistemas bombee H' a tra~es de la membrana tilacoidal (0 la membrana plasmatica

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Cloroplastos y fotosfntesls

•

Figura 14-52 Varlaclones del potencial redox para el paso de electrones durante 10. fotosfntesls. EI potencial redox de cada especie molecular se indica por su posici6n a 10 largo del eje vertical. EI fOlOsistemall es similar al centro de reacci6n de las bacterias purpura, EI fotosistema J es diferente: transfiere electrones desde su clorofila excitada a trayes de series de centros de reacci6n de hierro-azufre fuertemente unidos, EI flujo neto de electrones a lraves de los dos fotosistemas unidos en serie va desde el agua hasla el NADP', Y produce NADPH y ATP, que se sintetiza por una ATP sintasa (no indicada aquO que utiliza el gradiente electroqufmico de protones producido por los tres lugares de actividad de protones que se resaltan en la Figura 14-51. Este esquema Z para la producci6n de ATP se denorrtinafotofosforiiacion 110 cfclica, para distinguirlo del esquema cfclico que s610 utiliza el fotosisterna I (vt'!ase texto),

741

I.

de las cianobacterias), 10 cuaJ permite a la ATP sintasa aprovechar parte de la energfa electr6nica derivada de Ja luz para producir ATP.

MITOCONDRIA p",

Los cloroplastos pueden producir ATP por fotofosforiJaci6n cfclica sin generar NADPH31.35 En el esquema de fOlofosforilaci6n no dclica que acabamos de mencionar, los eleclrones altamente energelicos que dejan el fOlosistemall son utiJizados para generar ATP y son transferidos al fOlosistema I para impulsar la producci6n de NADPH. EsIO produce un poco mo1s de una molecuJa de ATP por cada par de electrones que pasan del agua hasta el NADP' generando una molecula de NADPH. Pem para la fijaci6n del carbona se neeesita 1,5 molecuJas de ATP par NADPH (vease Figura 14-44). Para producir mas ATP, en algunas especies los cloroplastos pueden utilizar el fO(Qsistema I de un modo dclico, de fonna que se produzca ATP en lugar de NADPH. En eSle proceso, lIamado fOlOfosforilaci6n cfc/icn, los electrones de aha energia del fOlosistema I son lransferidos de nuevo al complejo b,-f en lugar de ser Iransferidos al NADP', Yel eleetr6n can una energia inferior es entonces reciclado hada el fotosiSlema l. El unico resultado nelO, al igual que la conversi6n de una pane de la energfa lumfnica en calor. es que el H' es bombeado a trav~ de la membrana tilacoidal mediante el complejo b,-f aumentando el gradiente electroqufmico de protones que impuJsa laATP sintasa. En resumen, la fOlofosrorilaci6n dclica impLica s610 el rOlosistcma I, que produce ATP sin la fonnaci6n de NADPH ni de 02' De esla manera, las actividades relaLivas de los flujos dclicos y no dclicos de eleetrones pueden delenninar cuAnta energfa lumfnica se transforma en pader recluctor (NADPH) y cu<1nta en enlaces fosfato de alta energia (ATP).

membrana

externil

/

.;.;:),:::=II=Zi~ pHS

membnlna

tilacoidal

pH8

ClOROPlASTO

EI gradiente electroquJrnico de protones es similar en las mitocondrias y los cloroplastos36 La presencia del espacio tilacoidal divide el cloroplasto en tres compartimienlos

internos, en lugar de dos como ocurre en la mitocondria. En cualquier caso, el erecto neto de la translocaci6n de H' en los dos organulos es similar. En la Figura 14-53 se i1ustra c6mo se bombea el W desde el estroma (pH 8) hast a el espacio lilacoidal en los c1oroplaslOs (pH aproximadamente 5), creando un gradiente de 3 a 3.5 unidades de pH. Esto representa una fuerza prol6n-molriz de aproximadamente 200 mV a Iraves de la membrana Lilacoidal (Ia mayor parle del cllaJ es debida al gradicntc de pH mas que al potencial de membrana), que impulsa la sfnlesis de ATP mediante la ATP sinlasa integrada en esla membrana. Como el estroma, Ja matriz mitocondrial tlene un pH de aproximadamente 8, pero en eSle caso esn'l generado por el bombeo de protones de Ja mitocondria hada eJ dtosol (pH de aproximadamenle 7), en lugar de hacia un espacio interior del organulo. Asf, el gradiente de pH es relativamente pequeilo, y la mayorfa de la fuena prot6n-molfiz a traves de la membrana mitocondrial interna, que es aproximadameme la misma qlJe la de la membrana tilacoidal del c1oroplasto, eSla generada por el potencial de membrana resultante. En cualquier caso. tanlO para las mitocondrias como para los c1oroplastos, el lugar calaIftico de la ATP sintasa se encuenlra a un pH de aproximadamente 8 y se localjza en un gran comparLimienlo del organulo (matriz 0 estroma) donde se incluyen enzimas solubles. Consecuenlemente. es allf donde se produce todo el ATP del org<1nuJo (Figura 14-53). Aunque hay muchas similitudes entre las mitocondrias y los c1oroplastos. la estructura de los cloroplastos hace que el estudio de sus procesos de transporte de electrones y protones sea mas racil: a traves de la rotura de las membranas interna y externa de un c1oroplasto. los discos tilacoidales aislados pueden ablenerse intactos. Estos tilacoides se pareeen a las panfcuJas submilocondriales que contienen una membrana en la que la cadena de transpone de elee1rones tiene sus lugares de ulilizaci6n para el NADP', ADP, YfosfalO libremente accesi742

Capftulo 14: Conversl6n energetica: mitocondrias ycloroplastos

,

.ATP.inlasa

Figura 14-53 Comparacl6n de los Oulos de protones yde la orlentacl6n de la ATP slntasa que se presentan en las mltocondrlas yen los c1oroplastos. Los companimiemos que tienen un pH similar se representan en el mismo color. La fUeiL.a prot6n-motriz a naves de Iii membrana tiJacoldai consiste mayoritariamente en un gradiente de pH; 18 alta perrneabilidad de esta membrana al Mg2. Ya los iones CIpermite que eI flujo de estos iones dlsipe la mayorfa del polencial de membrana. Probablemente, las mitocondrlas no pueden IOlerar un pH de 10 en su matriz. y porello requieren gencrarfuerzas prol6n-mOlrices sin que exisla polencial de membrana.

bles aI exterior. Pero los tilacoides aislados manlienen su eSlructura nativa iniacta y son mucho m.is activos que las partfculas submitocondriales aisladas. Par esta raz6n varios de los experimentos que en un principia demostraron el papel central de los mecanismos quimiosm6ticos se realizaron con c1oroplastos y no con mitOcondrias.

Como la membrana mitocondrial interna, la membrana interna del cloroplasto contiene proteCnas transportadoras que facllitan el intercambio de metabolitos con el citosol:'S7 Si los c1oroplastos se afslan de manera que se dejan intactas sus membranas inlernas, se puede demostrar que esta membrana dene una permeabilidad select iva, reflejando la presencia de protefnas Iransportadoras espedficas. Adem~s, la mayor parte del g1iceraldehIdo 3-fosfato producido por la fijaci6n de CO 2 en el estroma del c1oroplasto es transportado fuera del c1oroplaslo por un eficienle sistema antiporte que intercambia azucares-fosfato de 3litomos de carbono por fosfato inorgAnico. Normalmente, el g1iceraldehfdo 3-fosfalo suministra al citosol una abundante fuente de carbohidralos que es utilizada por la celula como punlo de partida de otros muchos procesos de biosfntesis -incluyendo la producci6n de sacarosa para su exponad6n. Pero su utilidad no termina aqui. Cuando el gliceraldehJdo 3-fosfalo lIega al dlosol, es rapidamente Iransformado (mediante parte de la via glucolftica) de nuevo en 3-fosfogHcerato, generando una molecula de ATP y otra de NADH. (Una reacd6n de dos pasos en senlido inverso, muy similar, que forma el gliceraldehfdo 3-fosfato en el cicio de fijacl6n del carbono -vease la Figura 14-44.) Par consiguiente.la exponaci6n de gliceraldehfdo 3-fosfalo del c1oroplasto suministra aI resto de la celula. no s610 la principal Fuente de carbono fijado sino lambicn el pader reductor y el ATP necesarios para el metabolismo fuera del c1oroplastO.

Los cloroplastos Uevan a cabo otros procesos biosinteticos Ademas de la fotosfnlesis. el c1oroplaslo tambien realiza otros procesos biosinteticos. Todos los acidos grasos de la celula y un numero determinado de aminoacidos. por ejemplo. estan sintelizados por enzimas del estroma del c1oroplaslo. En el c1oroplasto. el poder reduclor de los electrones activados por la luz impulsa la reducci6n de los nitritos (NOil a amonfaco CNH:J; este amonfaco proporciona a la planta el nitr6geno necesario para la sfntesis de aminoacidos y de nucle6tidos. Por consiguiente, la imponancia melab6lica del c1oroplasto para las plantas y las algas es mucho mJis amplia que su papel en el proceso de la fotosfntesis.

Resumen Los cloroplastos y Ins bacteritufotosintiticas obtie,ren los electrones de aita ellergfa

por medio de f010sistemas que captumn los e.lectrones udtados crumdo la luz solar n absorbida por las molkulas de cloroJlla. Los founistemas nUSn compualos por un complejo antena unldo a un centro de lWU'Ci6n fotoqu{mico, qlle es predsamen"" te un complejo ordenado de prote{1UU y pigmentos en dOllde Ilene lugar La fotoqutmica de La fotos{ntesls. El mejor centro de reacci6n!otoqll{mica conocido es, con diferenda, el de la bacteria ptlrpum fotosintitica, del que se conoce La estrllchlm tridimensional completa. Mientras que estas bact.erlas s610 coutienell UII ,illico fotosistema, en cloropliutos y cianobacterias existen dos ti,JOS de fotosistemas. Los dos fotosistemas estdll normalmellte IIgados en serie y tra,ujierell los electrolles desde el agua Ilasta el NADP' fomJalldo NADPH, COli La producci611 collcomitanle de un gradiente electroqu{mico trammembrana; el ox(gello molecular (OJ se gellera como producto secundario. En compartu:i6n con liu mitocondria.J, los cloroplastos tienen ,,"a membrana adidonal (La membrana tilacoidal) y un espacio interno (el espacio tilacoidal). To-

Cloroplastos y (olos{nlesis

743

•

dos los procesos de transporte electron/co tiemm lugar en ILl membrana tilLlcoldal: para prodllc/r ATP, el proMn es bombeado htu:ia el espat;/o tilacoidali ,m fluio Inverso de protones a travis de una ATP s/"tasa prodU£e el ATP en el estroma del cloroplasto. EsteATP se rlt/liza en conjwu;wf' con eI NADPII prod/u:itto enlLlfotosfnlesis para implllsar ,m gran ",imero de reaa:/ones biosinliticas en el estroma del cloroplasto, incluyef'do ellmportante cicio de jijaci6n del carbono, que genera carbohidratos a partir de CO;r ]111I10 con otros productos del claroplaslo, esle carbohldrato se exporta ar citasol de la cilllla, donde -en forma de gliceraldel,fdo 3-fosfato- propomalllm carbona orgdnko, ATP, y potIer reductor al retIa de In cilllla.

Evoluci6n de las cadenas de transporte de electrones 38 Mucho de 10 que se conoce sobre la estructura. funci6n y evoluci6n de las ct!!lulas y organismos puede relacionarse con sus necesidades energt!!ticas. Hemos visto que los mecanismos fundamentales para utUizar energfa de fuentes Ian dispares como la luz y la oxidaci6n de la glucosa son los mismos. Aparentemente un mt!!todo efectivo para sintetizar ATP surgi6 en una evoluci6n temprana y desde entonces ha sido conservado con 5610 pequeiias variaciones. iC6mo surgieron los primeros componenles individuales cruciales lales como la ATP sintasa. las bombas prot6nicas generadoras de poder reduclOf y los fotosistemas? Las hip6tesis sobre acontecimientos que sucedieron en una escala temporal evoluliva son diffciles de probar. Pero disponemos de pislas. lanto respecto a las muy diferentes cadenas de transpone electr6nico primitivas que sobreviven actualmeme en algunas bacterias como respecto a evidencias geol6gicas en relaci6n aI ambiente de la Tierra de hace miles de miUones de arias.

Probablemente las celuJas mas primitivas produdan ATP mediante fermentaci6n 39 Como explicamos en el CapItulo I, se cree que las primeras ct!!lulas vivas aparecieroo haee mas de 3,5 x JO~ arlOS, cuando la Tierra no tenia mas de 109 anos. Probablemente las vfas met'ab6licas mas prim.itivas que producfan ATP se paredan a las actuales formas de fermentaci6n debido a la falta de oxfgeno en el ambieme y a la presencia de moleeulas organicas producidas geoqufmicamemc. En el proceso de la fennentacl6n el ATP se produce mediante un proceso de fosforilaci6n que utiliza la cnergfa Iiberada cuando una molt!!cula organica rica en hidr6geno, tal como la glucosa, se oxida parcialmentc (vt!!ase Figura 2-14). AJ no disponer de oxfgeno como aeeptor, los eleetrones que provienen de las moleculas organicas oxidadas ticnen que ser transferidos (vfa NADH 0 NADPH) a una moleeula organica difcrcnte (0 a una parte diferente de la misma mOleCllla), que consecuentemente se reduce. A1 final del proceso fermemativo. una (0 varias) de las moleculas organicas prodllcidas se excretan aI medio como productos metab6licos residuales; otros, lales como el piruvato, son retenidos por la ct!!lula para la biosfntesis. Los productos excretados son distintos en diferentes organismos, pero tienden a ser acidos organicos (compuestos carbonados con un grupo COOH). En las ct!!luJas bacterianas los mas importantes son el acido lactico (que lambicn se acumuJa en la glucolisis anaer6bica en los mamiferos) y"acidos como el f6rmico, el act!!(ico, el propi6nico, el butfrico y el sucdnico. En la Figura 14-54 se i1ustran dos vfas fermentalivas de las bacterias actuales.

La evoluci6n de la cadena de transporte electr6nico conservadora

de energfa capacit6 a las bacterias anaer6bicas para utilizar compuestos org3nicos no fennentables como Fuente de energ£a40 Los procesos de fermentaci6n prirnitivos no 5610 habrfan generado el ATP sino tambit!!n el poder reductor (en forma de NADH 0 de NADPH) necesarios para la 744

Capflulo 14 : Conversl6n energ~tica: m.itocondrias y cloroplastos

(A) FERMENTAC~N QUE PROOUCE LA EXCRECION DE ACIDO LAcTICO

~ 2~

2NAO o

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2~2NAOH -~1----2NAO° ~

I

piruvato piruvalO

2H

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(SI FERMENTAOON QUE PROOUCE lA EXCRECION DE AcIOO SUCdNJCO

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A:

piruvat°T Lfum.~,oL •

Co,

Figura 14-54 Dos lipos de procesos de fermentacl6n. Los produetos finales se destaean en recuadros de color verde. En ambos easos se utiliz.an dos moMeulas de NAO° por cada mol&:ula de gtucosa que sufre la glueolisis y eslas son regeneradas mediante la transferencia de iones hidruro desde el NAOH. En (A) los iones hidruro son transferidos hasla el piruvato. produciendo dos moleculas de aeido laetico que es excretado. En (8) los dos iones hidruros se lransfieren sueesivamente desde dos molOCulas de NAOH hasta compueslos derivados del piruvalo, producicndo acido succfnico. Par cada mol«ula de acido 5uccfnko cxcretada, se guarda una molkula de piruvalo (roja) para procesos de bios{mesis en el imerior eclular. Tanto en (A) como en (B) se ha de cxeretar un acido orgillico para poder valver a simetizar NAD' y pennilir que la g1uoolisis cominue en ausencia de oxfgcno.

biosfntesis esencial, y probablemente aJgunas de las principaJes vias melab6licas evolucionaron mientras la fermenlaci6n era la unica forma de produccl6n de energfa. Sin embargo, con el liempo, las aClividades melab6licas de esos organismos prpcariotas cambiaron el medio ambiente circunda.llle. forzando a los organismos a desarrollar nuevas vfas bioqufrnicas. La acumulaci6n de proouctos residuales de fermentaci6n, por ejemplo, pudo provocar la siguiente serie de cambios: £Stadio 1. La excreci6n continua de acidos organkos disminuy6 el pH del me. dio ambiente. favoreciendo la evoluci6n de protefnas que actuaban como bombas lransmembrana de l-!' que bombeaban l-!' hacia el exterior de la celula can el objetivo de protegerla de los efectos peligrosos de la acidificaci6n intracelular. Una de esas bombas pudo haber utilizado la energfa procedente de la hidr6lisis del ATP y asf mismo pudo haber side la antecesora de la ATP simasa actual. Bsradio2. AI mismo ticmpo que los acidos organicos no fermentables se aCllmulaban en el media ambiente y favorecfan la evoluci6n de una bomba de 1·1' consumidora de ATP. el apone de nutrientes fermen· tables de origen geoqufmico. que suministraba la encrgfa a las bombas y a olros procesos celulares, fue dismjnuyendo. Ello favoreci6 a las bacterias que podfan excrelar H' sin hidrolizar AT? 10 que les permilfa conscrvar el ATP para otras aClividades celulares. De este tipo de presiones seleclivas pudjeron haber surgido las primeras protefnas unidas a membrana que utilizaron el transporle de elec· trones enlre moleculas de difereme potencial redox como fueme de energfa para transponar H' a traves de la membrana plasm<'ilica. AI· gunas de esas protefnas debieron encontrar sus dadores y aceptores de eJectrones entre los <'icidos organicos no fermenrables que acumulaban. Muchas de esas proteinas transponadoras de eleclrones se encuentran en las bacterias actuales: por ejemplo. algunas bacterias que creceo en <'icido f6rmico bombean Ho utilizando una peque· fia cantidad de energfa redox derivada de la transferencia de electro-

Evolucl6n de las cadenas de lranspone de electrones

745

gr.dientl elec:troqu(mleo deprotonn

211'

+ fumarlto

suocinll:o

nes desde ellicido f6nnico al fumarato (Figura 14-55). Dlf3S lienen componentes transponadores de elecuones similares dedicados so· lameme a la oxidaci6n y reducci6n de substratos inorglinicos (vease Figura 14·57, porejemplo). Estadio3. A la larga, algunas bacterias desarrollaron sistemas de Iransporte electr6nico que bombeaban H+, que fueron suficientemente eficien· les para oblener mas energia redox de la que necesilaban para mantener su pH interno. Ahara bien, las bacterias que disponfan de los dos tipos de bombas de H+ presentaban una ventaja. En esas celulas un gran gradicnte eleclroqufmico de protones generado por un excesivo bomboo de H+ permitfa el relorno de los protones a la celuJa a traves de bombas de H+ impulsadas por ATP, haciendolas actuar at reves, ya que funcionaban como ATP sintasas produciendo ATP. Debido a que estas bacterias requerian cada vez menos aporte de nuIrienles fermentables, proliferaron a expensas de sus vecinos. En la Figura 14-56 se resumen estos Ires eSladios hipotclicos en la evoluci6n de los mecanismos de la fosforilaci6n oxidativa.

Figura 14·55 LaoxJdacl6ndelacido f6rmJco de a1gunas bacterlas acluales. En tales bacterias anaer6bicas, incluyendo £. coli, la oxidaci6n de ll.cido f6nnico estll. mediada por una cadena de transporte de eleclrones conservadora de energra, de la membrana celular. Tal como se indica en la figura, los reactivos de eSle proccso son acido f6rmico y fumaralo y los produclos, succinato y COl' N61ese que los H' segeneran fuera de la «Iula y se utilizan denrro de la cE:lula.lo cual equivale a bombear H' hacia el exterior celular. Asi pues, este sistema de lranspone de electrones ligado a membrana puede generar un gradienle electroqufmico de prolones a lraves de la membrana. EI potencial redox del par ll.cido f6nnico-C0 2 es de -420 mV, mientras queel del par fumarato-succinato es de +30 mY.

P, ESTAOIO 1

Las bacterias rotosinteticas, swninistrando una fuente inagotable de poder reductof, superaron el mayor obstaculo de la evoluci6n de las celulas-41 Las et'apas evolut'ivas que hemos mencionado habrfan resueho cl problema de mantencr un pH intracelular neutro y una fuente abundantc de cnergfa, pero habrfan dejado sin soluci6n olro problema tambien muy grave. La disminuci6n de la cantidad de nutrientes orglinicos fermentables significaba que se debra en· contrar una fuente de carbona alternativa, para producir los azucares que se utiIiz.aban como precursores de otras mllchas molecuJas de la celula. EI di6xido de carbono de la atm6sfera constiluia una abundante fuente potencial de carbona. Sin embargo, 1a conversi6n de di6xido de carbono en una molccula org:inica, como por ejemplo un carbohjdralo, requiere que el di6xido de carbono fijado sea reducido por un fuene dador electr6nico, como el NADH a el NADPH, capaz de suministrar los dos electrones necesarios para generar una unidad de (CH 20) a panir de cada CO2 (vease Figura 14-44). En las primcras etapas de la evoluci6n celular debieron abundar agentes reductores fuenes como eslos, procedentes de los procesos de fennentaci6n. Pero a medida que el apone de nUlrientes fermentables disminufa, y empez6 a aClUar una ATP sintasa unida a membrana produciendo la mayor parte del ATP de las celuJas, tambicn debi6 empez.ar a disminuir el apone abundante de NADH y de OlTOS agentes reductores. Por clio, result6 imprescindible que las celuJas desarrollaran un nuevo sistema de generar una fuenle de poder reduetor. 746

Capftulo 14: Convcrsi6n energe:tica: mitocondrlas ycloroplaslos

ESTAOIO 2

.ESTAOIO J

Figura 14·56 Evolucl6n de los mecanlsmos de £osforiJad6n oxJdatlvL se muestra una posible secuencia.

podllr redOClor form.oo &qui debldo 1IIIujo In.....-o deeleclronellmpul..do pol'" 'II grediente de H'

gradienle de H' lormedo por 'II bombeo de H' hllCie el eXlerior de Ie dlule durlnte II trlnslerarM:ia de electron..

, H'

-

.-......

........

Probablemente, los principales dadores disponibles de electrones fueron los acidos organicos producidos por el metabolismo anaer6bico de los carbohidratos, a1gunas molecuJas inorganicas como el sulfuro de hidr6geno (HzS) gencradas geoquImicamente, y el agua. Sin embargo, el poder reductor de estas moleculas resulla demasiado debil para poder ser utilizado en la fijaci6n del di6xido de carbono. Probablemente, la utilizaci6n de un gradiente electroqu{mico de electrones a {raves de la membrana plasmatica para impulsar un flujo inverso de elcc[fones, genero un suminiSlIO temprano de dadores fuertes de electrones. Este proceso requiri6 la evoluci6n de complejos enzimaticos unidos a membrana semejantes a la NADH deshidrogenasa; mecanismos de esle lipo sobreviven lOOavia en el melabolismo anaer6bico de a1gunas bacterias actuales (Figura 14-57). EI principal avance en el metabolismo energetico fue, sin embargo, el desarrollo de centros de reacci6n fOloqu{micos que pueden utilizar energfa solar para producir dirCClamente moleeulas como el NADH. Se cree que eslO sucedi6 haee mas de 3 x IO~ af'lOs en los organismos ancestrales de las baClerias verdes del azufre. Actualmente. las baclerias verdes del azufre utilizan energfa luminosa para transferir atomos de hidr6geno (como un electr6n mas un prot6n) desde cl HzS al NADPH; de esla (orma, se crea el fuerte poder reduclor necesario para la fijaci6n de carballO (Figura 14-58). Como los electrones eliminados del HzS se haUan a un pOlencial redox mas negativo que los del H20 (-230 mY eomparados a +820 mY del H20), un cuanto de luz absorbida par el unico (o(Qsistema de esas bacterias es suficienle para eonseguir un potencial redox suficientemente alto para generar NADPH a lraves de una cadena de transporte de electrones fotosintetica relativamente sencilla.

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H'

-300

-200

Figura 14-58 l-lujogeneraJde electrones en una fonna relatlvamente primitlva de fot05lntesls observada en bacterlas verdes del azufre actuaJes. EJ fotosistema de una bacteria verde se parece al fotosistema I de las plantas y de las cianobacterias en que utiliza series de cenlros de hierro-azufre como aceplores primarios de electrones, los cuales ceden finalmente sus electrones de alta energia a la fe"odoxina (Fd).

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S. 2 H'

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I~

direcci6n dill f1ujo eM fitelronee

Evo1ucl6n de las cadenas de lranspone de electrones

Figura 14-57 A1gunas de las vias del transporte de electrones de las bacterlas actuaJes. Estas vfas generan todo el ATP y el poder reductor celular a panir de 1a oxidaci6n de moltkulas inorg
• 747

Las cadenas de transporte electr6nico de los complejos fotosinteticos de las cianobacterias produjeron oxfgeno atmosferico y permitieron nuevas rormas de vida 4z Parece ser que el siguiente paso que se produjo con el desarrollo de las cianobaclerias hace unos 3 x 1()9 anos consisli6 en la evoluci6n de organ.ismos capaees de ulilizar agua como fuente de eleclrones para reducir el CO 2, EsIO permiti6 la evoluci6n de una enzima h..idrolizadora de la moltkula del agua y lambien requiri6 un segundo fOlosislema que ac(Uara en serie con el primero haciendo de puente por encima de la enorme diferencia de polencial redox exislente entre el H20 y el NADPH. las homologfas estructurales que existen entre fotosistemas actuales sugieren que este cambio implic6 la cooperaci6n de un fotosistema derivado de las bacterias verdes (folosistema I) con un fotosislema derivado de las baclerias purpuras (folosislema 11). Las consecuencias biol6gicas de este paso evolutivo se manifeslaron haec mucho liempo. AI principio, habra organismos cuyas demandas quimicas a su medio ambienle eran mfnimas, por 10 que se extendian yevolucionaban por vias que las bacterias fotosinteticas primitivas, que necesitaban HzS 0 acidos organicos como fuentes de electrones, no podian seguir. Consec;uememenIe se acumulaban grandes ca.nlidades de maleriales organicos reducidos. sintetizados biol6gicamente. Ademas, el oxfgeno por primera vez entr6 en la atm6sfera. EI oxigeno es altamente t6xico porque las reacciones de oxidaci6n que calaliza pueden alterar aI azar mollXulas biol6gicas. Por ejemplo, muchas baclerias anaer6bicas aClUales mucren rapidameme cuando son expueslas al aire. Por 10 lanto, los organismos de la Tierra primit.iva tuvieron que desarrollar mecanismos de protecci6n contra el incremento de los niveles de 02 en el ambienle. Los recien lIegados evolutivamenlc, como nOSOlros mismos, presentan numerosos mecanismos de desloxilicaci6n que protegen las enzimas de los efectos adversos del oxfgeno. EI incremento de los niveles del oxfgeno atmosferico fue inicialmente muy lento y permiti6 una evoluci6n gradual de medidas protectoras. Los mares primit.ivos tenian grandes canLidades de hjerro ferroso (Fe[lIlJ, y casi todo el oxigeno producido por las bacterias fotosinteticas primitivas fue utilizado en transformar el Fe(ll) en Fe(III). Esta conversi6n caus6 la precipitaci6n de enormes cantidades de 6xidos ferricos. Los exlensos aeumulos de hierro, que nacieron hace aproximadamentc 2,7 x 10~ anos, permiten dalar el incremento evolulivo de las cianobaeterias. Haec aproximadamente 2 x 1O~ anos, el sllministro de hierro ferroso se agot6, y ces6 In deposici6n de precipitaciones de hierro. Las evidencias gcol6gieas sllgieren que enlonees empezaron a aumcnlar los niveles de oxfgeno en la atm6sfera, aleanzando los niveles actuales haec entre 0,5 y 1,5 X 109 anos (Figura 14-59).

Figura 14-59 Relacl6n entre las

variaciones de los niveles atmosf&icos de oxfgeno y aJgunos de los prlnclpaJes esladios que se debleron producir durante la evolucl6n de los organismos vivos sobre laTierra. Tal como se indica en la figura, existcn evidendas geol6gicas que sugieren que hubo mas de mil miilones de anos de inlervalo entre la aparid6n de las danobaclerias (las cualcs, segUn se cree, fueron los primeros organismos que liberaron oxfgeno) y el momento en que el oxfgeno se empezO a acumular en las atmosfera en grandes cantidades. Este retraso fuc debido prineipalmente a las grandes cantidades de hierro fcrroso disucho en los oceanos. que reaccion6 con el oxfgeno liberado formalldo cnorrnes depOsitos de oxidos de hierro.

20 NIVELES DE OX(GENOEN

LA ATMOSfERA 1%' 10

Iniclo do un rtipldo ,cumulo de O:l...!agOtlml,nIO (lilt Fr' de lot ~l'IO'l

•

prj"..,... !Nnw

y

M\imalet; m... Iticel... I,.es

748

Caprtulo 14: Conversi6n energ~tica: mitocondrias ycioropJastos

.

EUCARIOTAS PROCARIOTAS

E.coJi

_

rilobllcter,a

ATMOSFERA

~O~X~'D~A~N~T~E~_{==~~ ....,''';''''~,.;,;O,,'_....I t.,.""",...d~ ATMOSFERA REOUCTORA

-

...

lotoslntesis H2S batteries fermenlador81 enceslrales

La disponibilidad de oxfgeno hizo posible el desarrollo de bacterias que dependfan del metabolismo aer6bico para producir ATP. Como hemos explicado anteriormente, estos organismos pudieron utilizar la gran cantidad de energfa Iiberada en la degradaci6n de carbohidratos y de otras moleculas organicas redLlcidas hasta CO 2 y H20. Los componentes de los complejos de transporte electr6nico preexistentes fueron modificados, generandose ulia citocromo oxidasa, de forma que los electrones obtenidos a partir de subsuatos organicos e inorg{micos pudieron ser transportados hasta el 02' como aceptor final de electrones. Muchas bacterias pt.'"lrpura fOlOsinteticas actuales pueden alternar enlre la fotosfntesis y la respiraci6n, dependiendo de la disponibilidad de luz y de oxfgeno, mediante sorprendentes reorganizaciones secundarias en sus cadenas de transparle de electrones. Como resultado de la fotosfntesis se acumularon materiales organicos en la Tierra, 10 que provoc6 que a1gunas bacterias fotosinreticas (incluyendo las precursoras de E. cofl) perdieran su capacidad de sobrevivir s610 de la energfa de la luz y se volvieran ellleramente dependientes de la respiraci6n. Se'cree que las primeras mitocondrias surgieron hace 1,5 x 1O~ ai'ios, cuando eslas bacterias dependienres de la respiraci6n se transformaron en endosimbiontes de celulas primitivas eucariotas. Posteriormente, los descendientes de estas celulas eucariotas aer6bicas primitivas endocitarOtl una bacteria fotosintetica que se convirti6 en el precursor de los c1oroplastos; no obstante, los c1oroplastos actuales procedentes de diferentes tipos de algas son suficieiHemente distintos entre sf como para sugerir que evolucionaron separadamente en diferentes linajes. La Figura 14-60 esboza algunas de estas vfas evolutivas. La evoluci6n siempre es conservativa utilizando panes antiguas y construyendo sobre elias nuevas procesos. Por clio, probablemente todavia sobreviven,

Evoluci6n de las cadenas de transporte de electrones

Figura 14-60 Arbol flIogenetico de Is probable evolucl6n de las mltocondrlas y los doroplastos y de sus ancestros bacterlanos. Parece que la respiraci6n de oXfgeno comenz6 su desarrollo hace 2 x IO~ anos: tal como se indica, parece ser que evolucion6 independientemente en las Ifneas verde. !)urpura yazul-verdosas (cianobacterias) de bacterias fotosinleticas. Se cree que una bacleria purpura aer6bica que debi6 de perder su capacidad para realizar fotosfntesis: dio lugar a las mitocondrias, mientras que algunas bacterias azul-verdosas diferentes dieron lugar a los cJoroplastos. Analisis det'alJados de secuencias de nucle6tidos sugieren que las mitocondrias surgieron de bacterias parecidas a las rizobacterias, las agrobacterias y a las rickettsias -Ires especies estrechamente relacionadas que generan asociaciones lmimas con las celulas eucariotas actuales.

749

Figura 14-61 ComparaclcSn de los tlpos de cadenas transportadoras de electtones, quese dlscuten en esle ClIpCtuio. Las bacterias, los c1oroplaSIOS y las milocondrias COl1licnen un complejo enzim~lico unido a membr.ma que es muy semejanle a1 complejo b-c, de las mitocondrias. Estos complejos caplan elecuones del uansponador quinona {designado como QJ y bombean H' a trav6 de sus respectivas membranas. Ademcis. en sislemas in ,duo reconstituidos.los di(erel1les complejos pueden SUbsliluirse uno por olroy las secuencias de aminolkidos de sus componentcs proteicos indican que esl~n rclacionados evolulivamente. tr'e$

vo

aunque en fanna aherada, en los eucariotas superiores actuales paries de 13 cadena de transpone electr6nlco de las baclerias anaer6bicas de haee m<1s de tres a cuatra mil millones de aoos. Por ejemplo, CxiSlc una notable bomologia en cuanto a estructura y funci6n entre un complejo enzim,Hico que bombea protones en el segmento central de la cadena respiraloria mitocondrial (el complejo b-c l ) y los segmentos correspondienlcs de las cadenas de transporte clectr6nico de las bacterias y de los c1oroplaslos actuales (Figura 14-61).

Resumen Al parecer, las dlulas primUivaJ [uern" organismos pareddos a las ooderias ac· tuaks, que vivum en un medio rico en molkulns organicas all4menCe reduddas, de orlgen geoqu(mlco, en eltralUCurso de denlOS de millo1U!$ de aitos. Probahlemente, esMs dlultu prlmirivas obtenlan In mnyor parte de s" ATP medltmte 10. transformacron tk esuu molkulas organicas redudLlm en dlvemn acido.s organicos, que eran £X£:r"eUUlos como productos tk da«ho. All pue:s, esuu fennenttuiones acidiflctlron el medio, to cuai pudo 1uJber sido 10. causa tk 10. eooiuci6n tk las prinU'rtlS

bombas tk 1/- unidas a membrana, que penniJieron mantener un pH neutro en el interior tk 10. ciiula. Las propiedLules tl.e las bacterim actuales slIgieren que en ute ambiente anaerobi£o aparederon una bomba tk no inrpulsada par el transparte electroni£o y lIna bonrba de H- inrpldsada par ATP. La invers16n del sentido tki funcionanriento de In bonrba tk H- inrpldsada por ATP Pluto pernritlr qllefllncio· nnse conro una ATP sintasa. Al desarrollo.rse cmknas de transparte electroni£o mas efectivas. se pud6 utiliznr para generar ATP ILl energla liberadn por 1m reacciones 750

Cap(lulo 14 : Convcrsi6n encrg~llca: milocondrias y c1oroplaslos

redox efltre 1tI0lec.das j,rorgdllicas ylo La ellergia acumulada ell compuestos "0 fer· mefltables. La proliferacl611 de btKterlas qu~ utilizaban moIeclllas organicas preformadas conro jI,ente de carbono y (Ie potier redm:tor, no pudo llegar muy leJos, y(' que estas moIeculas orgd,,'cas eran generadas con UIUJ gran lentitJUt par los procesos geoqu{. mlcos. Por coluiglliente, el agotamiento de los numentes orgdllicos ferme"tables condklotW probablemente La elJOluci611 de las bacterlas forosi"titicas, que podia" "tllizar dl6xldo de carbono para prodmir carbohidralas. Combilratldo fragme"tos de las cade,ra.s de tratlsporre electronlco deso.rrolladas COli anteriorldad, las bacterias fotasintitlcas llegaron a desarrolLar un !oroslstema qllB utillzaba energfa luminasa para generar el NADPH necestlrlo para LafiJaci6t1 del Mrbo"o. La posterior aparld6n en las clanobaeterlas, de codenasfotosintiticas de trans,HJrte eiectronlco nu1s romplejas, penniti6 que se pudiera IItiiizar el agua, en I!lgar de dadores de electrones menos abundantes y que eran utilizados por otras bacterlas fotosilluacas, como dador de eiectrones para lafomr.aci6n del NADPH. De esUl forma, La vida plldo proliferar en grandes dreas de la Tierra, par 10 q.U! se valvieron a acu"",lar molkulas organicas rMlU:idas. Hace aproxinuuJamente 2 mil miliones de ai'los eE oxlge"o liberado por La fotos(ntesls de las cianobacterlas empez6 a acum"larse ell La atm6sfera. Cum&do tanto las molkllias orgtfnicas romo el axlgena llegaron ill ser abundantes, las cnde,ra.s de tramparte electr6nico se adaptarotl a transportar electrones desde el NAnH hasra el oxfgeno, y en muchas baeterlas se desarroll6 un metabolisma aerobico ejkiente. En las mitocondrlas de los eucarlotas se presentan emcramente estos mlsmos mecanismos aerObicos. y exisren considerables evidendas de qlU tanto las milocondrlas conro los cloroplastos elJOllu:ionarotJ a partir de baeterias aerobicas quefllBran endocitadas porcilulns e"carlotas primitiuas.

Los genomas de las mitocondrias y de los c1oroplastos Para poder seguir el ritmo de crecimiento y divisi6n celular, las c~luJas han de generar nuevos orgc1nulos citoplasmc1ticos. Tambien han de reponer los orgc1nulos que son degradados como parte del proceso continuo de recambio de org:inulos que se produce en las celulas no proUferativas. La biosintesis de orgc1nulos supone la sfntesis ordenada de las prote(nas y de los Ifpidos necesarios, asf como el transporte de cada componelHe al subcompartimiento del orgc1nulo adecua· do. En el Capitulo 12 explicc1bamos la transferencia de proteinas y Upidos hacia el interior de las mitocondrias y de los cloroplastos desde cualquier sitio de la c~· lula. Aquf describimos las contribuciones que hacen estos org
La biosfntesis de las mitocondrias y de los cloroplastos supone la contribuci6n de dos sistemas genetlcos diferentes 43 Mientras que la mayorfa de las protefnas de las mitocondrias y de los cloroplastos estc1n codificadas por el DNA nuclear y son importadas hacia el org
751

NOClf~

CITOSOl

~~N6L

DNA geOOmiCOT RNA

~'dJ

Figura 14-62 Resumen de la blosCntesls de las protefnas en las mllOcondrlas y en los cloropluslos. Cadajlecha roja indica ellugar de acci6n de un inhibidor que es especffico para la sfntesis de protefnas. en los organulos 0 en el citosol.

RNA

cicloheximida

protelna prllCursoril

MlioCONDRIA

o CLOROPLASTO DNA del

org,nUlo. RNA tcridinss o alldio

T

clor.nfenicol, eritromlcln&

o tetracicllna

heximida, por ejemplo, inhibe la slntesis citos61ica de protefnas, pero no inhibe la sfntesis proteica de los organulos. Por el contraria, varios antibi6ticos (COIllO el c1oranfenicol, la tetraciclina y la eritromicina) inhiben la s(ntesis de prolcfnas en las mitocondrias y en los cloroplasros. pero tienen poco cfceto sobre la sfntesis de prolcfnas citos6lica (Figura 14-62). ES{Qs inhihidores se utilizan ampliamente en los estudios sabre la funci6n de estos organulos.

~ I

EI crecimiento y la divisi6n de los organulos mantiene eillumero de mitocondrias y de cloroplastos en la celula44 Las mitocondrias y los cloroplastos no se sinletizan nunca de 1I0VO. 5iempre surgen por crecimiento y divisi6n de c1oroplastos y mitocondrias ya existentes. Las observaciones de celulas vivas indican que las mitocondrias no s610 se divi· den, sino que tambien se fusionan una con olra. Sin embargo, cada organulo ha de duplicar su masa y luego dividirse por la mitad un promedio de una vez por cada generaci6n celular. Estudios con el microscopio electr6nico sugieren que la divisi6n de estos organulos empieza con la invaginaci6n de la membrana interna, tal como ocune en la divisi6n celular de muchas bacterias (Figuras 14·63 y 14·64),10 cual imptica que se lrata de un proceso controlado y no de un aeontecimiento causado por un estrangulamiento casual. En la mayorfa de las celulas, los diferentes organulos lransformadores de ener· gfa se dividen durante la intetfase, en desfase con el proceso de divisi6n celular 0 con el de la divisi6n de los otros organulos. De forma anaJoga, la replicaci6n del DNA de los organulos no se produce unicamente durante la rase 5, cuando se reali· za la replieaci6n del DNA nuclear, sino a 10 largo de todo el cicio celular. Parece que las moleculas de DNA de los organulos individuales se seleccionan al azar para su replicaci6n, de manera que durante un cicio celular detenninado algunas de eUas pueden replicarse mas de una vez y otras no Uegar a replicarse. De eualquier modo, en condiciones constantes el proceso eSla regulado asegurando que e~ nl1mero to· tal de moleculas de DNA se duplique en cada cicio celular, de ral manera que cada tipo eelular mantiene Wla cantidad constanle de DNA de los organulos. 752

Caphulo 14: Conversi6n energ~tica: mitocondrias yc1oroplastos

Figura 14-63 Dlagrama de una division mhocondrlal. La via mostrada aqu( ha sido postulada a partir de fotograflas estaticas de mitocondrias en divisi6n, como la de la Figura 14-64.

Figura 14-65 Electronmlcrograffa de una molecula de DNA mllocondrlal animal durante el proceso de repllcacl6n del DNA. EI gcnoma de DNA circular se ha replicado unicamente entre los dos pumos scnalados con f1echas (llebras amarillas). (Cortesia de David Clayton.)

FIgura 14-64 E1eclronmlcrograffade una mltocondria en d1visl6n de una

ct:lula heplbka. (Conesfa de Daniel S. Friend.)

EI mimero de org~nulos que se presentan en cada celula puede estar regulado de acuerdo a las necesidades de la celula; por ejemplo, si un l1lusculo esque1t~lico en reposo se estimula repetidamente durante un periodo prolongado de liempo, se observa un gran incremento de la canlidad 100ai de milocondrias (del orden de 5 a to veces). Por otra parte, en circunslancias especiaJes. la divisi6n de los organulos est~ controlada con precisi6n por la celulas: asf en algunas algas que contienen un solo 0 unos cuantos c1oroplaslos, el organulo se divide juslo antes de la citocinesis, en un plano que es identico aJ ruturo plano de la divisi6n.

Generalmente los genomas de los cloroplaslos y de las mitocondrias son mol~culasde DNA circulares45 Las moleculas de DNA de los orgAnulos son relalivamenle pequenas y simples, y excepto en los genomas mitocondriales de algunas algas y protozoos, son circuTabla 14·2 Tamano de los genomas de los orglinulos* Tlpode DNA

Tamano (en miles de pares de lIucle6tldos)

DNA de c1oroplastos Plantas superiores Chlamydomonas (alga verde) DNA de mltocondrlas Animales Oncluyendo los gusanos plalelmintos, los inseclos y los mamfferos) Plantas supcriores Hongos Scilizosaccllllromyces pombe (Ievaduras de fisi6n) Aspergillus lIidulans Neurospora cmssa Saccharom}'CeS cerevisiae (Ievadura de gemaci6n) Clilamydomollas (alga verde)

120·200 180

16-19 150-2500 17

32 60

78 16 (molecula lineal)

PrOIOZOOS

Trypanosoma brncei Paramecium

22 40 (molecuta lineal)

• Estos genomas son mole:uJas de DNA circular a menos que se indique 10 conlrario.

Los genomas de las mllocondrlas y de los c1oroplastos

753

Tabla J 4-3 CanUdades relallvas de DNA de los organuJos de dlrerentes dluJas y tcJidos MolecuJ.as de DNA Organlsmo

TeJldoo PO' lIpo celuJar orgUiulo

DNA mltocondrlal Rata L.evadurao Rana DNA del c1oroplasto

hfgado vegetativo huevo

5-10 2-50 5-10

1000 I-SO

vegetativo hojas

80 20-40

I 20-40

ClIlnmydomollas

Ma{z

Organulos porceluJa

10'

• La gran variad6n del numero y lamafto de las mitocondrias por c6ula en las levaduras es de-

bida a la fusmn y fragmenlaci6n de milocondrias.

lares. EI genoma de los c1oroplaslOS (que es identico aI genoma de los otros plastidios de la planta) tiene un tamai'io similar en todos los orgarnsmos examinados. pero el genoma mitocondrial es mucho mayor en las plantas que en los anjmales [Tabla 14·2). Muchas mohkulas de DNA de los orgwulos tienen aproximadamente el mismo tamafio que el DNA tfpico de los virus. En los mamiferos. por ejcmplo. el genoma mitocondriaJ es un DNA circular de unos 16500 pares de bases (menos de IO-S veres el tamano dcl genoma nuclear). En ani males tan diversos como Drosophila y el erizo de mar, el genoma mitocondrial es aproximadamente del mismo tamano (Figura 14-65). No obstante, las plantas tienen un gcnoma mitocondrial circular que es entre 10 y 150 veces mas grande. dependiendo de la planta. Los mas grandes de estos genomas son aproximadamente la mitad del tamano de los genomas baclerianos tfpicos. que tambien son moleculas circulares de DNA. Todas las milocondrias y los c1oroplastos contienen multiples copias de la molecula de DNA del orglinulo rrabla 14-3). Normalmente. cstas mohkulas de DNA estan distribuidas en varias grupos separados, sHuados en la matriz de la mitocondria 0 en el estroma del cloroplasto, donde a1 parecer estan unidos a la membrana interna. A pesar de que no se conace c6ma est<1 empaquetado este DNA, es probable que la estructura del genoma se parezca m<1s a la de las bacterias que a la de la cromatina eucariota. Por ejemplo, como en el caso de las bacterias, en los c1oroplastos y en las mitocondrias no hay histonas. En las celulas de mamffero el DNA mitocondrial constituye menos del 1% del DNA celular total. Sin embargo. en otras celulas -como en las de las hojas de las plantas superiores 0 en los grandes oocitos de los anfibios- los org<1nulos transformadores de energfa pueden contener una proporci6n mucho mayor del DNA total de la celula (vease Tabla 14-3) y. por consigujente. en ellos se produce una mayor proporci6n de RNA y sfntesis proteica total.

Las mitocondrias y los cloroplastos contienen sistemas geneticos completos.46 A pesar del reducido numero de protefnas codificadas en su genoma. las milocondrias y los plastidios lIevan a cabo replicaci6n de su DNA. lranscripci6n del DNA y sfntesis proteica. Estos procesos se producen en la matriz de las milocondrias y en el estroma de los c1oroplastos. Aunque las protefnas que llevan a cabo estos procesos geneticos son exclusivas del organulo, la mayorfa de elias est<1n codificadas en el genoma nuclear. Este hecho es tanto mas sorprendeme por 754

CapftuJo 14: Convenl6n energEtica: mitocondrias y c1oroplastos

coanto que la maquinaria de sfntesis proteica de los orgAllulos se parece mas a la de las bacterias que a la de los eucariotas. Esta similitud es particularmente grande en el caso de los c1oroplastos: Los ribosomas de los c1oroplastos son muy similares a los ribosomas de E. coli, tanto respecto a su sensibilidad frente a diversos antibi6ticos (tales como el c1oranfenicol, la estreptomicina, la eritromicina y la tetraciclina), como respecto a su estructura. No 5610 son extremadamente parecidas las secuencias de nucle6tidos de los RNA ribo56micos respecro a las de los clo· roplastos y de E. coli, sino que los ribosomas del cloroplasto son capaces de utilizar los tRNA ribosomales para realjzar sfntesis proteica. En todos los aspectos, los ribosomas de los c1oroplaslOs difieren de los que se hallan en el citosol de la misma cclula de la planta. 2. En los c1oroplastos la s(ntesis proteica empieza con la N-fomlilmetionina, al igual que en las bacterias, y no con la metionina como ocurre en el citosol de las celulas eucariotas. 3. A diferencia del DNA nuclear, el DNA del c1oroplasto puede ser transcrito par la enzima HNA polirnerasa de E. coli, produciendo rnolcculas de mRNA del c1oroplasto, que pueden se traducidas de fonna cficiente por un siste· rna sintetizador de protefnas de E. coli. I.

Aunque los sistemas genelicos mitocondriales son menos similares a los de las bacterias actuales de 10 que 10 son los sistemas geneticos de los c1oroplastos, sus ribosomas son tambicn sensibles a los antibi6ticos antibacterianos y la sfntesis proteica en mitocondrias tambien empieza can la N-fonnilmetionina.

EI genoma del c1oroplaslo de las plantas superiores contiene aproximadamente 120 genes 4? Los genomas de cloroplastos mejor estudiados son los de las plantas y de las algas verdes, moleculas de DNA circular muy simjlares entre sf. Sc ha detenninado la secuencia completa de nucle6tidos de los c1oroplastos del tabaco y de las hepdticas. Los resultados indican que est'as dos plantas superiores Icjanamcntc emparemadas comienen en sus cloroplastos genes casi idcnticos. Ademas de cuatro RNA ribos6micos, estos genomas codifican aproximadameme 20 protefnas ribosomales del c1oroplasto, determinadas subunidades de la RNA polimerasa del c1oroplasto, varias protcfnas que forman parte de los fotosistemas I y 11, suhunidades de la ATP sintasa, porciones de complejos enzimaticos de la cadena de transporte de electrones, una de las dos suhunidades de la rihulosa bisfosfato carhoxiJasa y 30 moleculas de tUNA (Figura 14-66). Ademas, parece que las secuencias de DNA presentes codHican al menos 40 protefnas cuyas funciones son desconocidas. Parad6jicamellte, todas las proteinas conocidas codificadas en el c1oroplasto fonnan parte de grandes complejos proteicos que tambien contienen una 0 mds subunidades codificadas en el nuclco. Las posibles razones de este hecho se discutiran mas adelante. Las similitudes entre los genomas de los cloroplastos y de las bacterias son notables. Las secuencias reguladoras basicas, como los promotores de la transcripci6n y los terminadores, son practicamente identicas en los dos casas. Las secuencias proteicas codificadas en c1oroplastos son claramente reconocibles como bacterianas, y varias agrupaciones de genes con funciones relacionadas (por ejemplo, los que codifican para protefnas ribosomales) est<1.n organizados de la misma manera en los genomas de los cloroplastos, de E. coli y de las ciano· bacterias. Son necesarios detalJados estudios comparacivos de un gran numero de se· cuencias nucleotfdicas hom610gas para trazar la vfa evolutiva desde las bacterias hasta los cloroplastos, pero ya pueden esbozarse varias conclusiones. (l) Los cloroplastos de las plantas superiores evolucionaron a partir de bacterlas fotosinteticas. (2) EI genoma del c1oroplasto se ha mantenido estable al.menos durante va· Los genomas de las mltocondrlas y de los c1oroplastos

755

CLAVE:

genes tRNA genes ds protefnas ribos6mices genes del fotoslsteme I o

genes del fotosislema II genes de Ie AlP sinlasa genes del compleio ~·f genes de Ie RNA polimerese genes que codiflcen el compleio de Ie NADH deshidrogenase

Figura 14-66 Organlzad6n del genoma de los c1oroplastos de heplillcas. 5e ha determinado la secuencia completa de nucle6tidos. La organizaci6n del genoma del cloroplasto es muy similar en lodas las plamas superiores, pem el tamafio varia enlre especies, dependicndo de la canlidad que haya presente en las dos co!)ias de DNA que flanquea los genes que codifican los RNA ribos6micos 16$ y 235 de los c1oroplaslos.

longilud 10lel del genome_ 121024 pares de nucle6tldos

ribulosa blsfosfato carooxllase

rios miles de millones de anos, el momento estimado en el que se produjo la divergencia entre las hepalicas y el tabaco. (3) Muchos de los genes de la bacteria original pueden ser identificados en el genoma nuclear, donde fueron transferidos y mantcnidos de forma eSlable. En plantas superiores, por ejemplo, dos tercios de las casi 60 protefnas rihosomales del c1oroplasto estan codificadas en el nucleo celular, aunque los genes tienen un claro ancestro bacteriano, y los ribosomas del cloroplasto relienen todavfa sus propiedades bacterianas originales.

Los genomas mitocondriales presentan varias caracterfsticas sorprendentes48 EI genoma del cloroplasto no fue el primer genoma de un organulo que fue completamente secuenciado. EI tamafio relativamente pequeno del genoma mitocondrial humano 10 convirti6 en un material anactivo para los genetistas moleculares equipados con las lecnicas recien desarrolladas de secuenciaci6n de DNA, yen 1981 se public6 la secuencia completa de sus 16 569 nucle6tidos. Comparando esta secuencia con las de tRNA mitocondriales conocidas y con las secu'encias parciales de aminoacidos disponibles de las protefnas codificadas par el DNA mitocondrial, fue posible localizar todos los genes mitocondriales humanos en la moJecula circular de DNA (Figura 14-67).

L

Figura 14-67 Organlzacl6n del genoma mltocondrial humano. El genoma contienc 2 genes rRNA, 22 genes tRNA y 13 secuencias que codifican prolefnas. Tambien se han secuenciado completamente los DNA de OIrOS genomas mitocondriales de algunos animales, ytienen los mismos genes y la misma organizaci6n de genes.

subunidades de Ie AlP sinleSa subunidedes de la cltocromo oxidase ----~

- - - -_ _-.."O"ubunidedes de Ie NAOH deshldrogensse

que codifice prolelne •• •::1. - regi6n (13 en lolel)

•

subunidedes de Is NADH deshidrogenase

• gen tRNA (22 en totel)

longitud lolal dei genome. 16 569 peres de beses

rRNA

756

16S

rRNA 12S

ori en

Capftulo 14: Conversi6n energetica: mitocondrias y c1oroplastos

re Ilcaci6n

citocromo b

Tabla 14-4 AJgunas dlfercnclas entre el c6dlgo genetlco "universal" y algunos c6dlgos gcnt'!tlcos mltocondrialcs·

- - - - -mltocondrlales -----C6d~gos

Cod6n

UGA AUA CUA AGA AGG

Plantas STOP

lie Leu

}

kg

kg

• En eursiva yen color se seftalan los e6digos que difieren del e6digo ·unlversal",

Comparando los genomas del nudeo, de los doroplastos y de las bacterias con el genoma milocondrial humano se pueden observar varios rasgos sorprendentes. (I) A diferencia de otros genomas, casi todos los nude6tidos parecen formar parte de secuencias que codifican, ya sea para protefnas 0 para molt~cu­ las de rRNA 0 de tRNA. Dado que estas secuencias codificantes estAn practicamente una a continuaci6n de oua, queda muy poco espacio para las secuencias de DNA reguJadoras. (2) Aunque en el citosol y en los c1oroplastos existen aI menos 30 0 mAs mole;culas de tRNA djferemes que especifican aminoAcidos, 5610 se requieren 22 mol&:ulas de tRNA para la sfmesis proteica mitocondrial. Las reglas normales de apareamiento cod6n-anticod6n estAn relajadas en las mitocondrias, de modo que muchas moltkuJas de tRNA reconocen cualquicra de los cuatro nucle6tidos de la tereera posici6n (f1uctuante 0 de balanceo), Esta lectura de "2 de cada 3" permite que un tRNA se aparee con uno cualquiera de los cuatro codones y pemlita la sfntesis proteica con menos mole;culas de tRNA. (3) Quiz:is 10 mAs sorprendente aparezca aI comparar las secuencias ge;nicas mitocondriales y las secuencias de aminoacidos de las protefnas correspondientes, ya que se concluye que en las mitocondrias el c6digo gent!tico estA alterado, de modo que 4 de los 64 codones tienen "signifieados" diferentes de los que tiellen en otros gcnomas (Tabla 14-4). La observaci6n de que el c6digo genetico es casi el mismo en todos los organismos proporciona fuerles evidencias de que todas la ct!lulas evolucionaron a partir de un antcpasado comun, Entonces. tc6mo pueden explicarse las diferencias en el c6digo gene;tico de las mitocondrias? Una indicaci6n procede del reciente descubrimicJ1to de que el c6digo genetico mitocondrial es difcrente en diferentes organismos. Asf UGA, que en todos las ce;luJas es un cod6n de term inaci6n, se lee como tript6fano en las mitocondrias de mamfferos, de hongos y de protozoos. pero es una seflal de stop en las mitocondrias de las plantas. De manera similar, el cod6n AGG que normalmente codifica arginina, codifica parada en las mitoeondrias de los mamfferos y codifica serina en Drosophila (ve;ase Tabla 14-4). Esta variaci6n sugiere que en el c6digo gene;tico de las milocondrias aparece una variaci6n aI azar. Seguramente. el extraordinariamente pequeno numero de proteinas codificadas por el genoma mitocondrial haee que un cam· bio ocasional en el significado de un cod6n raro sea tolerable, nuenuas que un cambio de este tipo en un gran genoma podria a1terar la funci6n de muchas proteinas y por 10 tanto destruir la celula.

Las mitocondrias de animaJes contienen el sistema gen~tico mlis simple de los conocidos49 Estudios comparativos entre las secuencias de DNA de diferentes organismos revelan que la velocidad de substituci6n de nucle6tidos durante la evoJuci6n ha Los genomas de las mltocondrias y de los c1oroplastos

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side 10 veces mayor en los genomas mitocondriales que en los nucleares, 10 cual posiblemente se dcba a la reducida fidelidad de los sistema de rcplicaci6n y/o reparaci6n en el DNA mitocondrial. Dado que en las mitocondrias de las c~llIlas animaJes 5610 se han de replicar y expresar en forma de RNA y de prolcfna lInos 16500 nucledtidos de DNA aproximadamente. la lasa de errores par Il/lcloorido copiado por la replicaci6n de DNA, manlcnido por la reparaci6n de DNA, trans-

erito por la RNA polimerasa, 0 Iraducido a prolefna por los ribosomas milocon. driales. puede ser relativamcnte aha sin que se altere ninguno de los relaliva· mente pocos produclos g~nicos. Esto puede explicar por qu~ los mecanismos que realizan estos procesos son relativamente simples comparados can los ulilizados can el mismo prop6sito en olras partes de la celula. Por ejemplo, aunque no se ha probado adecuadamente, se puede esperar que la presencia de Ian s610 22 lipos de tRNA y el extraordinariamente pequeno tamano de los rRNA (inferior ados lercios deltamano de los rRNA de E. coli) pueden reducir la fidelidad de la sfntesis proleica en la milocondria. La relalivamente elevada velocidad de la evoluci6n de los genes mitocondriales hace que las comparaciones entre las secuencias de DNA mitocondriales sean especial mente tililes para estimar las fechas de sucesos evolulivos relalivamente recientes. lales como las fases del desarrollo de los primates.

iPor qu~ los genomas mitocondriales en las plantas son tan grandes?50 Los genomas milocondriales de las plantas son mucho mas grandes que los de las c~luJas animales. y su contenido en DNA varia de fonna importanlc. oscilando desde aproximadamente ISO 000 hasta aproximadamente 2,5 x 10' pares de nucle6lidos. Sin embargo, al parecer estos genomas milocondriales de las plantas codifican muy pocas prolefnas mas que los genomas milocondriales de animales. La paradoja se complica con la observaci6n de que en una familia de plantas, las cucurbilaceas, el tamaiJo de los genomas mitocondriales varia tanto como siete veces. Ademas, el alga verde Chlamydomonas liene un genoma milOcondriallineal de tan s610 16000 pares de nucle6tidos, el mismo lamano que el presente en animaleS". Aunque todavfa se dispone de poca informaci6n sobre las secuencias de las moleculas de DNA mitocondriales de las plantas superiores, se han secuenciado casi todos los 70 000 pares de nucle6tidos del gran genoma mitoeondrial de la Ievadura Saccharomyces cerevjsjae, del que s610 lIna tercera parte aproximadamente codifica protefna. Estos hallazgos suscitan la posibilidad de que gran parle del DNA extra de las mitocondrias de levadura, y posiblemente lam bien de las mitocondrias vegctales en general, sea un "DNA de desecho" de poea imporlancia para el organismo.

Algunos genes de org(1nulos contienen intrones 51 EI procesamiento de los RNA precursores desempci'ia un papel importamc en los dos sistemas miloeondriales eSludiados can mas delalJe -el humano y el de levadura. En c~lulas humanas, las dos hebras del DNA mitocondrial son Iranscritas a la misma velocidad a partir de una sola regi6n promotora en cada hebra, producicndo dos moleculas diferellles de RNA gigantes, cada una de las euales comiene una copia com piela de cada hebra del DNA. Por 10 lanto, la Iranscripci6n es complelamente siml!lrica. Los transcritos heehos sabre una hebra -lIamada la 1Iebra pesada <1Iebra H, de "heavy") debido a su densidad en CsCI- son proeesados completamente mediante la acci6n de nucleasas que los fragmentan, produciendo las dos mol&:ulas de rRNA, la mayorfa de las mol&:ulas de IRNA y unas 10 moleeulas de RNA que presentan poli-A. Por el contrario. el pro· cesamiemo del transcrito de la Ilebm ligera (liebra L. de ~light") produce s610 ocho moll!culas de tRNA y un pequeno RNA que contiene poli-A; aparentemen. te, el 90 % reslante de este transcrito (que es complemenlario de las secuencias 758

Capitulo 14 : Conversl6n energ~tica: mitocondrias y doroplaslos

codil1cantes sintetizadas en la olta hebra) cOllliene informacl6n no util, yes de· gradado. Los RNA que presentan poli-A son los mRNA mitocondriales: aunque les falta la estructura de capucha ("cap~) en su extremo 5', tienen una cola de poli-A en su extremo 3' que se af\ade despu~ de la transcripci6n mediante una polimerasa de poli-A mitocondrial. A diferencia de los genes humanos mitocondriales. algunos genes mitocondriales de plantas y de hongos (incluyendo las levadurasl presentan intTones. que deben ser eliminados por maduraci6n por corte y empalme ("splicing") del RNA. Tambien se presentan inlrones en unos 20 genes de c1oroplastos vegetales. Muchos de los intrones de genes de org:1nulos consisten en secuencias de nuc1ootidos emparentadas que son capaces de madurar por sf solos fuera de los transcritos de RNA. mediante catllisis mediada por RNA (vease p1g. 113). aunque generalmente estas reacclones de automaduraci6n (self-splicing) est1n facilitadas por protefnas. La presencia de intrones en los genes de org:1nulos es sorprendente. ya que en los genes de las bacterias, cuyos antepasados se cree que dieron lugar a las mitocondrias y a los c1oroplastos de las plantas, no se hallan intrones similares a estos. En las levaduras es posible que un mismo gen mitocondrial tenga un intr6n ell ulla cadena pero no en la otra. AI parecer. estos ~intrones opciollales" son capaces de desplazarse, entrando 0 saliendo de los genomas. igual que los elementos transponibles. Par otro lado. en otros genes mitocondriales de levadura se han haUado intrones en una posici6n correspondiente del genoma de las mitocondrias de Aspergillus y de Neurospora, 10 que implica que eSlos intrones fueron heredados a partir de un antepasado comun de estos tres hongos. Parece probable que las secuencias de los intrones tengan un origen muy antiguo y que se hayan perdido en muchas bacterias pero que se hayan conservado preferencialmente en aqueUos genomas de orglnulos en los que la maduraci6n del RNA este regulada. colaborando en el control de la expresi6n genica.

Los genes mitocondriales se pueden distingui,r de los genes nucleares gracias a su herencia no mendeliana (citoplasmlitica)S2 La mayorfa de experimentos realizados sobre los mecanismos de la biogenesis

mitocondrial han sido realizados en Saccharomyces cerevisiae Oevadura del pan). Existen diversas razones para ello. En primer lugar. eSlas levaduras tienen la capacidad de sobrevivir excilisivamente de la glucolisis si se cultivan en pre- . sencia de glucosa y, por 10 tanto, sin utilizar las mitocondrias, las cuales son necesarias para la fosforilaci6n oxidativa. Este hecho pennite a est as celulas sobrevivir con mutaciones de su DNA mitocondrial 0 nuclear que afectan dnisti~ camente la biogenesis mitocondrial; este tipo de Illutaciones resulta letal en casi todos los eucariotas. En segundo lugar, las levaduras son eucariotas unicelulares simples. f:1ciles de cultivar y de caracterizar bioqufmicamente. Por tiltimo. normalmente estas celuJas de la levadura se reproducen asexualmente mediante gemaci6n (mitosis asimetrica). pero lam bien se pueden reprodudr sexualmente. Duranle su reproducci6n sexual. dos celulas haploides se fusionan fonnando un zigoto diploide que puede crecer mit6ticamente 0 bien dividirse por meiosis produciendo de nuevo celulas haploides. La capacidad de controlar en ellaboratorio la allemancia entre reproducci6n sexual y asexual fadlita enormemente su amtJisis genetico. Dado que las mutaciones en los genes mitocondriales no se heredan de acuerdo a las leyes mendelianas que gobiernan la herencia de los genes nucleares, los estudios geneticos revelan cuales de los genes implicados en la fund6n mitocondrial se localizan en el nucleo y cu:1les en la milOcondria. En la Figura 14-68 se illistra un ejemplo de herencla no mendeliana (cUo· plasmatJca) de los genes milocondriales en una celula haploide de levadura. En este ejemplo, el gen mutante hace que la sfntesis de proteena sea resislente al c1oranfenicol. Cuando una celula haploide resistente al c1oranfenicol se aparea con con una celula de fcnotipo salvaje sensible al c1oranfenicol. cl zigoro diploiLos genomas de las mHocondrlas y de los c1oroplaslos

759

mutllllte de levadura haploide resistente a eloranfenieol

levadura haploide salvaje

levadura diploide

I

! I /'1

A /" I

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I

SEGREGACI6N MITOTICA GRADUAL DE LAS MITOCONDRIAS DURANTE MUCHOS CICLOS DEL CRECIMIENTO VEGETATIVO

. ' ~ • t"-..

MEIOSIS DURANTE LA ESPORULACION • ....... DE LAS Cl!LULAS / \ "' DIPLOIDES \

+ f'.....

todo la progenie es resisteflte al eioraflfenieoi

I'-. ..........

toda Ie progeflie es sensible 01 eloranfenieol

de resultame contendra una mezcla de mitocondrias mutantes y salvajes. Pero cuando sufra la mirosis para producir una celula hija diploide. las mitocondrias mutantes y salvajes senin distribuidas al azar entre la celula madre y la hija, por 10 que cada celula hija es probable que herede mas mirocondrias mutantes 0 mas salvajes. En sucesivas divisiones mit6ticas, tanto las mitocondrias mutantes como las salvajes seran gradualmente eliminadas de algunas celulas hijas mediante el mismo proceso aleatorio, dejando mitocondrias de un solo tipo. A partir de entonces, toda la progenie de est a celula hija tendra mitocondrias geneticamente identicas. Con el tiempo, este proceso aleatorio, Hamado segregaci6n mit6tica, produce una progenie diploide de celula5 de levadura con un 5610 lipo de DNA mitocondrial. Cuando estas celulas diploides sufren meiosis y forman cuano celulas haploides hijas, cada una de estas celulas hijas recibira los mismos genes mitocondriales. Este tipo de herencia se denomina lIO mendeliana 0 citoplasmatica, en eontraposici6n con la hereneia mendeliana de los genes nuc1eares (vease Figura 14-68). Cuando esto oelUre, se demuestra que el gen en euesti6n se localiza fuera de los eromosomas nucleares y por 10 tanto, esta situado probablemente en las mitocondrias.

En muchos organismos, los genes de los organulos se heredan de la madre53 Las eotlsecuencias de la herencia eitoplasmatica son mas profundas para algunos organismos, incluido el hombre, que para las levaduras. En las levaduras, 760

Capftulo 14: Conversi6n energetica: mitocondrias y c1oroplastos

Figura 14-68 OJrerel1cias entre los patrones de herencia de los genes mltocondriales y nucleares en la levadura. Para cada gen nuclear, dos de las cuatro celulas que resultan de la meiosis heredan el gen procedente de una de las celulas haploides parenterales originales, y las otras dos celulas heredan el gen procedente de la OWl c~lula (llerencia mendelialla). En cambio, y debido a la segregaci6n mit6tica de las mitocondrias duranle el crecimiento vegetativo (vease texto). es posible que las cuatro celulas que resultan de la meiosis heredell los genes mitocondriales de una de las dos c~lulas haploides originales [llerencia cilOpiasmdlica 0 110 mendeiiana). En este ejemplo, el gen mitocondrial puede mutar haciendo que la sfntesis de protefnas en la mitocondria sea resistente al c1oranfcnicol, un inhibidor de la sintesis de protcfnas que actua espedficamente sobre los organulos transformadores de encrgia y sobre las bactcrias. Las celulas de levadura que conlienen el gen mUlado pueden ser detectadas por su capacidad de crecimienlO en presencia de c1oranfenicol sobre un subslfato. como por ejemplo el gJicerol. que no se utiliza en la glucolisis. Can la gJucoJisis bloqueada, la milocondria funcional ha de proporcionar ATPy, par tanto. s610 crecerrtn las cl!lulas que contengan mitocondrias resistentes al c1oranfenicol.

cuando dos c~lulas haploides se aparean. ambas son de igual lamano y por 10 lanlO contribuyen por igual a la dOlaci6n del DNA mitocondrial del zigolo (v~a­ se Figura 14-68). Por consiguienle. en la levadura la herencia milocondrial es biparemal: ambos progenitores contribuyen por igual al acervo de genes mitocondriales de la progenie (aunque. como hemos visto. t.ras varias generaciones de crecimiento vegelativo, a menudo la progenie individual conliene milocondrias procedentes de uno solo de los progenitores). En los ani males superiores. en cambio. el 6vulo aporta siempre al zigoto mucho mjs cilOplasma que el espermalOwide -en algunos animales, el espermatozoide no aporta nada de citoplasma al zigolo. Por consiguiente, cabe esperar que en los animales superiores. la herencia mitocondrial sea uniparelllal (mas exactamente. materna). En algunos animales de laboratorio se ha podido demostrar esta herellcia malema, utilizando dos cepas que se diferencian en sU DNA mitocondrial. Cuando los animales que presentan DNA milocondrial del tipo A se cruzan con animales dellipo n, la progenie presenta s610 DNA milocondrial del tipo materno. De forma similar, siguiendo en grandes familias la diSIribuci6n de secuencias varianles de DNA mitocondrial. se ha demostrado que el DNA mitocondrial humano sc hereda por via materna. En aproximadamente dos terceras panes de las plan las superiores, los c10roplaslos patemos masculinos (contenidos en los granos de polen) no entran en el zigoto. de tal manera que lanlO el DNA de los c1oroplaslos como el de las mitocondrias se hercdan por \'fa materna. En otras plantas, los c1oroplaslos del polen emran en el zigolo, haciendo que la herencia de los c1oroplastos sea biparental. En estas plantas. la presencia de cloroplastos defeclivos son la causa de la variegqci61l: mediante la segregaci6n mit6tica se puede producir una tllezcla de c1oroplastos normal.es y defectuosos en un zigoto durante el crecimienlO y desarrollo de la planla. produciendo por 10 tanto porciones allernantes verdes y blancas en las hojas. Las porciones verdes contienen los c1oroplaslos normales, mientras que las blancas contienen los c1oroplaslos defecluosos.

Los mutantes diminutos en levadura demuestran la extraordinaria importancia del nucleo celular en la biog~nesis mitocondrial S4 Diversos estudios gen~ticos en levadura han resultado de una gran imporlancia para el analisis de la biog~nesis milocondrial. Un ejemplo notabJe de eSIO 10 conslituyen los eSludios de mulanles de levadura que conlienen grandes deleciones en su DNA milocondrial. de manera que toda la sfntesis proteica mitocondrial se haHa anulada. Como era de esperar, estos murantes no pueden producir mitocondrias funcionales en la respiraci6n. A algunos de estos mutallles les faha todo el DNA mitocondrial. Dado que estos mutanles forman colonias eXlraordinariamente pequeftas cuando crecen en un medio con baja call1idad de glucosa, lodos los mutantes con estas mitocondrias defecruosas se denominan mlltatlles dimitlutos citoplasmaticos. Los mutanles diminutos no pueden sintetizar protefnas en sus mitocondrias y. por 10 tanto, no pueden tener mitocondrias que produzcan ATP. pero a pesar de todo tienen milocondrias. Estas mitocondrias tienen una membrana externa normal y una membrana interna que presenra crestas pobremente desarrolladas (Figura 14-69) y contienen praclicamente toelas las prolefnas milocondriales que estan codificadas por los genes nucleares importados desde el dlosol -inc1uyendo las DNA y RNA polimerasas, loelas las enzimas del cicio del <'icido cftrico y muchas prote(nas de la membrana inlerna- demostrando claramenle la extraordinaria importancia del mlcleo en la biog~nesis mitocondrial. Los mutanles diminutos lambi~n demuestran que lin organulo que se divide par fisi6n puede replicarse indefinidamente en el citoplasma de c~llllas ellcariotas proliferantes, incluso en ausencia complera de su propio genoma. Muchos bi61ogos crecn que normalmente los peroxisomas se replican de esta manera (v~ase Figura 12-29). Para el caso de los c1oroplasloS. los equivalenles m<'is cercanos a los murantes diminutos mitocondriales de las levaduras son los murantes de algas uniceLos genomas de las milocondrias yde los c1oroplastos

Figura 14-69 EJectf'Onmk:rograffas de secc:lones uhrafinas de celulll5 de levadura. Qlostrando la estructura de mitocondrlas nonnaJes (A) yde mitocondrlas de un mutanle dimlnuto que care<::e de todos los prodUC10S g~nicos codillcados par las mltocondrias (B). En los mulanles diminuIOS lodos los producIOS gcnicos

codificados en In mitocondria se pierden. y por ello, el organulo eSla fonnado exclusivamente a partir de

protefnas codificadas en el m1c1eo de la celula. (Par conesfa de Barbara Stevens.)

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r lulares como la Euglena. Celulas de este tipo, en las que no tiene lugar la sintesis proteica en los c1oroplastos. presentan doroplastos y son perfeclamente viables si se les proporcionan substratos oxidables. No obstante, si en las plantas se bloquea el desarrollo de los c1oroplaslos maduros, ya sea situando las plantas en la oscuridad 0 bien debido a que el DNA del c1oroplasto es defectuoso 0 esta ausenIe, las plantas mueren en cuanlO se agOlan sus reservas de alimento.

Las mitocondrias y los c1oroplastos contienen protefnas espedficas de tejidoSS En determinados tipos celulares las mitocondrias pueden tener funciones especializadas. EI cicio de la urea, por ejemplo, es la via melab6lica central de que disponen los mamfferos para la degradad6n de los compuestos que contienen nitr6geno. Estos productos son secretados por la orilla en forma de urea. Varios pasos de este cicio estan catalizados. en la malriz mitocondrial, por enzimas codifieadas en el nl1c1eo. La sfntesis de urea s610 se realiza en algunos tejidos, como el hfgado, y 5610 en estos tejidos se produce la sfntesi5 y eltransporte hasta la miloeondria de estas enzimas. Ademas, los complejos enzimatieos respiratorios de la membrana mitocondrial interna de los mamfferos contienen varias subunidades codificadas par el nucleo que son espedficas de lejido y que aI parecer aetl1an como reguladoras del transporte electr6nico. Asi, algunos humanos que padecen una delerminada enfcrmedad muscular genetica tienen una subunidad defectuosa de la dtocromo oxidasa; dado que esta subunidad es especffica de la celulas del muscuJo esqueletico, las celulas musculares de coraz6n fundonan normalmeme. permjtiendo que los individuos sobrevivan. Tal como cabria esperar, tambien se encuentran diferencias especfficas de tejido en protefnas de c1oroplastos codificadas por el nudeo celular.

Las mitocondrias irnportan la mayor parte de sus lfpidos mjentras que los cloroplastos producen la mayor parte de ellos56 La biosfntesis de nuevas c1oToplastos y de milocondrias requiere Jipidos, ;icictos

nudeicos y protefnas. Los c1oroplastos tienden a producir los Ifpidos que necesitan. En las hojas de 1a espill3ca, por ejemplo, tada la s[nlesis celular de ;icidos grasos riene lugar en los c1oroplastos, mientras que su desaturaci6n tiene lugar ell otTO lugar de la celula. Los grandes glucolfpidos del c1oroplasto tambien se producen localmente. L1S milocondrias, por el contra rio, importan la mayor parte de sus lfpidos. En las c~lulas animales, los fosfolfpidos fosfatidilcolina y fosfatidilserina. se sinICli7..an en cl rctfculo endoplasll1titico y [uego se transfieren a la membrana exlerna de la mitocondria. Ademas de descarboxilar la fosfalidilserina importada lransformandola en fosfalidilemnolamina, la principal reacci6n de la biosfntesis de lfpidos catalizada por la mitocondria es la transfonnaci6n de los lfpidos importados hasta cardioljpina (bisfosfatidilglicerol). La cardiolipina es un fosfolfpido ~doble" que contiene cuatro colas de acidos grasos; se halla principalmente en la membrana mitocondrial interna y constituye aproximadamente un 20% de su contenido lipidico total. En el Capftulo 12 ya se estudi6 en delalle la importame cuesli6n de c6mo prOle(nas citos6licas especlficas son importadas a las mitocondrias y a los c10roplastos.

Probablemente. tanto las mitocondrias como los cloroplastos han evolucionado a partir de bacterias endosimbi6ticas57 Como vimos en el Capftulo I, el canteter procariota de los sistemas geneticos de los organulos celulares, especialmente notable en el caso de los c1oroplastos, sugiere que las mitocondrias y los c1oroplastos evolucionaron a partir de bacterias que fucron endodtadas haee mas de mil millones de arlOS. De acuerdo con la hi762

Capftulo 14 : Conversl6n energe:Uca: mHocondrias y c1oroplastos

Figura 14-70 Rutaevolutlvasugerlda sobre orlgen de la mltocondrla. Microsporidia y Giardia son dos eucariotas unicelulares anaer6bicos actuales (protozoos) que carecen de mitocondrias. Su secuencia de rRNA sugiere que existe una gran distancia evolutiva entre ellos y resto de los eucariolas, por 10 que se ha postulado que sus parientes ancestrales tambien fueron anaer6bicos yparecidos a los primeros eucariotas que incorporaron los precursores de las mitocondrias.

c61ula procariota anaer6bica prim,ltiva

DNA~'I j

~MACION DEL NUCLEO

~~

::::::;~" ~!!/

[IJ

,",', ''',,',''",,,,,,,,1 son m,tocondnas

CELUlA·-CE=U-'CAAIOT='=~A~'NC:'--'O~RPO=

UNA RD UNA CELULA PRQCAFUOTA AERCIUCA MEDIANTE ENDOCtTOSIS

c61ula eucariota con un procariota endosimbionte aer6bico

c61ula eucariota actual

c61ula eUCllriotll anaer6blCll actual

mitocondria

nucleo

pOtesls endosimbi6dca, las celulas eucariotas aparecieron en forma de orgall.ismos anaer6bicos sin mitocondrias ni e1oroplastos, y luego establecieron lIna relaci6n endosimbi6tica estable con un tipo de bacterias, utilizando su sistema de fosforilaci6n oxidativa (Figura 14-70). EI proceso de endocitosis que condujo al desarrollo de las mitocondrias se produjo cuando el oxfgeno apareci6 en la atm6sfera en cantidades substanciales, haee aproximadamente 1,5 x lOy aftos, antes de que los animales y las plantas se separaran (vease Figura 14-59). AI parecer, los e1oroplastos de las plantas y de las algas han derivado posteriormente a partir de WI suceso endocftico que implie6 a una bacteria fOlOsintetica productora de oxigeno. Para explicar los diferentes pigmentos y propiedades de los cloroplastos que se encuentran en las aetuales plamas superiores y en las algas verdes, se asume que por los menos tuvieron lugar tres sucesos separados de este tipo. Dado que la mayorfa de los genes que codifican las protefnas actuales se halIan en el nDdeo celular, parece probable que durante la evolueiOn eucariota se produjera una extensa transferencia de genes desde el organulo aI DNA del nDcleo. Esto explicarfa par que algunos de los genes del odeleo que codifican protefnas mitoeondriales se parecen a los genes bacterianos: por ejemplo, la secuencia de aminoAcidos del extremo amino terminal de la enzima mitocondrial super6xido disf1Illtasa de gallina se parece mucho mas al segmento correspondienle de la misma enzima de una bacteria que a la super6xido dismutasa del dtosol de las mismas celulas ellcariotas. Mas evidencias de que este tipo de transferencias de DNA sucedieron durante la evoluti6n surge del descubrimiento de algunas secuencias de DNA no codificames del DNA nuclear que parecen ser de origen mitocondrial reciente; aparentemente se han integrado dentro del genorna nuclear como ~ DNA de desecho". lQUe tipo de bacteria dio lugar a las mitocondrias? Am'ilisis mas recientes de secuencias de protefnas y nucle6tidos proporcionan la principal evidencia para Los genomas de las mitocondrlas y de los cloroplastos

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DNA mitocondrlal transcritos de RNA membrana mitocondrial interna

membrana mitocondrial eKterna

RNA polimerase mitocondrial

-!-!,_---l

amino-__ 'cldM

amlno6tl!

tfIllliA

tubunIdId JUburIiGId rlbaD'nIca IItaO'lioI

~ I ;,...--

"'--_... -

...

. . .. '- l)1i1oWldrle

ON' .............

....

aminoacll-tRNA ,intlllas mitocondriale.

enlimas mltocondrialea de la replicaci6n del DNA

conftgurar el arbol evolutivo presentado previamente en la Figura 14-60. Parece que las mitocondrias descicnden de un tipo particular de bacteria purpura fotosintetica que previamente perdi6 la capacidad de realizar fotosfntesis y que qued6 unicamente can una cadena respiratoria. Sin embargo, igual que para los c1oroplaslOs, no esta claro si todas las mitocondrias se originaron a partir de un s610 suceso endosimbi6tico 0 no. Por ejemplo, las milOcondrias de los protozoos tienen rasgos procariotas distintivos, pero algunas de elias son suficientemente diferentes de las mitocondrias de las plantas y de los animales como para sugerir un origen diferente.

iPor que los cloroplastos y las mitocondrias tienen sus propios sistemas geneticOS?58 ~Por

que las mitocondrias y los cloroplaslOs necesican sus propios sistemas geneticos, si olros organulos, como los peroxisomas y los lisosomas, no los tienen? La pregunta no es trivial, ya que mantener un sistema genetico diferente resulta costoso: mas de 90 protefnas -incluyendo las proteinas ribos6micas, las aminoacil-tRNA sintasas, las DNA y RNA polimcrasas, y las enzimas de procesamienro y de modificaci6n del RNA- se han de codificar por genes nucleares, especialmente para este fin (Figura 14-71). Las secuencias de aminoacidos de la mayorfa de las prote(nas de mitocondrias y c1oroplastos difieren de las secuencias de las protefnas correspondientes del mlc1eo y del citosol y no existe ninguna raz6n

764

Caphulo 14 : Conversl6n energetica: mitocondrias y c1oroplastos

Figura 14-71 Orfgcncsdelas protc(nas y RNA mltocondrlales. Las protefnas importadas del eitosol desempenan una importante funei6n en el siSlema genetieo de la mitoeondria y eonstituyen la mayor parte de las protefnas del organulo. La mitoeondria s610 eontrlbuye a su sistema genetieo con los mRNA, los rRNA y los tRNA. En este diagrama no se indican las protefnas adicionales eodifieades por el mlcleo que regtdan la expresi6n de los genes mitoeondriales individuales a niveles post-transeri peionales.

para pensar que estos orgtinulos tengan relativameme pocas protefnas en comun can el resto de 101 c~lula. Esto significa que el n(ieleo debe suministrar como mfnimo 90 genes para mantener el sistema gen~lico de cada organulo. La raz6n de eSle arreglo Ian costoso no estti elara, y 101 esperanza de que el conocimielllo de 101 secuencia de nuele6tidos del genoma de las milOcondrias y de los eloroplastos proporcione 101 respuesla definitiva, hOI resuhado fallida. No se nos ocurren razones imperiosas por las que las protefnas de las milOcondrias tengan que eSlar producidas en las propias mitocondrias y no puedan eslar sinlclizadas en ci cilosol. En cierlo momemo se sugiri6 que algunas protefnas lienen que estar sintetizadas en el imerior del organuJo, ya que son demasiado hidwf6bicas para poder lIegar desde cl cilosol hasta su lugar en 101 membrana mitocondrial. No obslante, estudios mas recicmes haecn que esla explicaci6n sea inverosfmil. En muchos casos, subunidades ineluso altamenle hidrof6bicas estan sintelizadas en el citosol. Ademas, aunque las distinlas subunidades proteicas de los diferentes complejos enzimtilicos mitocondriales eslan a1tamenle conservadas a 10 largo de la evoluci6n, no esta conservado su lugar de sfntesis. La diversidad en la locaJizaci6n de los genes que cOOifican subunidades de protefnas funcionalmente equivalentes en diferenles organismos es dificiI de explicar por cualquier hip6tesis que postu!e una ventaja evolutiva espedfica de los sislemas gen~ticos de las milocondrias 0 de los c1oroplastos actuales. Quizas el sislema gen~tico de los organulos sea un catlej6n evolulivo sin salida. En I~nninos de 101 hip6lesis endosimbi6tica, eslO pOOrfa significar que los procesos por los que los endosimbionles transfirieron 101 mayorfa de sus genes OIl nUcleo se pararon antes de complctarse. Posleriores lransformaciones se han padido descarlar, en el caso de las mitocondrias, por recientes alreraciones en el c6digo gen~lico milocondrial que convirtieron los genes milocondriales rcmanentes en no funcionales si eran lransferidos at mlc1eo.

Resumen Las mUocondrlas y los cloroplaslos cream y se dilliden mediatile prtH:#SOS coordbm-

dos que reqf4lenm lu colllribm:i611 de dos sislemas gelletlcos lliJerelltes -el del orgdlIulo y el dellllicleo cellliar. Ln mayorla de las prole(lIas de eslos orgatulios esllfn codlficlUlas por el DNA ,,,,clear, esllf" slnletlzadas e" el cltosol y lllego sml IraIlSportllllas b,dillldllllimellle III orgallldo. S;'I embllrgo, algllllQS prole(JIlu tiel orgaIIldo y IdgWIOS RNA esltfll cotliflCIUlos por el DNA del orgatlllio y SOil si1ltellztulos en el proplo orgall/do. HI ge'lOlIlll milOCOtldriallmmatlO cOlllletle aproximadtlmenle 16500 IIIlcle6Hdos y codificll 2 moteculas de RNA ribos6mlco, 22 moleculas de RNA de tral/.sJeretlcln y 13 Cwlellas polipeptfdicas diJeretltes. El getlomn de los clorollllUtos es llproxlnradame1lte 10 vcces nrayorqlle el de las mitocondrias y cotltietle Imos 120 genes. Sin embargo, ell mlltlmles en los qfle el getlOmll del orgdmdtJ no es JUIIciotlal, se I}/Iemur Jommr orgdtlulos pardalmente fimciollales y en catltldndes 'lOrmales, 10 cllal demuestra la extraordinnrla lmportam:ia qlre tietle el ",icko ell lu biogenesis de ambos orgamdos. Los r#.bosomas de 'os cloroplastos se paret:en enomleme"te a los rlbosomas bacterimlos, mie,,'ras qlre los rlbosomas milocondriales ","estran slmiIitluJes y tllJeretlcias qlle dlficultml mucllo mtis el estudio de su orlgen. A'gunas sllll/W,uJes proleiau sllgierell que las mUocolldrias y los cloroplastos se originnroll clumdo 111m dlula ell€arlota primitiva esrableci6 u,m relaci6l1 endosimbl6tlca esiabIe COli 1111/1 bacleria: se cree que IUla bacleria putpflra dio lugar a las miltx:tmdrlas y qfre, mas larde, "n parienle lie ""a cimtobacterla dio lugar a los cloroplaslos de las plumas. Almq"e nmdlOS de los genes de eslas antiiJIUlS bacterlas lodnvla son Jimdonnles para producir prole{nas del orgdnulo, mll€lU)s de ellos lIan quedado inlegrados ell el getloma mu;lear, dOIl~te cotJifican emlmas semejanles a las de las baclerias, qm SOli siJlletlzndas en los rlbosomas del cilosol y luego fransportadns al orgti",tlo. los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos

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769

Transmision de sefiales entre celulas

15 '==C'::... 10

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EJ registro fOsil sugicre que hace 3,5 mil millones de afios ya existfan sofislicados organismos unicclulares pareddos a las bacterias actuales, pem que al parecer fueron necesarios Olros 2,5 mil millones de anas para que apareciera el primer organismo pluricelular (veasc Figura 1-17). tPor que la pluricelularidad lard6 lanto en cvolu· donar? Aunquc no podemos conocer la respuesta parece que esla cuesli6n est<1 reo lacionada con la ncccsidad de los organismos pluricelulares de elaborar senales que pennilieran a sus celulas comunicarse entre sf, de fanna que pudieran coordinar su comportamicnlo en beneficio del organismo como un todD. Las senales in-

tercelulares. inrerprcladas por complejas maquinarias de la celula que responde a elias, pennile a carla celula detcrminar SlI posici6n y su papel cspeciali7..1do en el cuerpo y, por ejemplo, asegurar que cada celula se divida unicameme cuando sus \lccinas dictcn que clio puede ser posible. La importancia de eSIOS ;'comroles sociales" sobre la divisi6n celular sc hace aparente cuando el control falla, dando lugar a un cancer, que habilualmcnle mala el organismo pluricelular. A medida que vamos disponiendo de tecnicas safisticadas y pOlCllles que nos penni ten estudiar las'celulas y los mecanismos que ulilizan para cotnunicarse entre sf, lenlarncntc vamos comprendiendo los proccsos dc sef\alizaci6n que Lltilizan los eucariotas superiores. Una celula animal contienc un elaborado sistema de protefnas que Ie pcrmite responder a senales que provienen de otras celulas. EI sistema incluye protcfnas receptoras de la superficie celular, prolefnas receptoras intracclularcs. protefna quinasas, prolefna fosfatasas. protefnas quc unen GTP y el enormc nUlllero de prolefnas intracelulares con las que intcraCluan estas prolcfllas de seflal. Ell cste capftuJo djsculimos en primer lugar los principios generales de la seiializaci6n intcrceluJar. En las dos sccciones sib'Uicntes consideramos las dos principales familias de protefnas receptoras de la superficie celular, y c6mo generan seflaJes intracelulares. A continuaci6n examinamos de que forma las celulas se adaplan conlinllamente para responder de fonna sensible a peqlleflos cambios de concentraci6n de molecuJas seoal extracelulares. Finalmenle considemmos una anaJogfa de las redes neuronales. basada en los ordenadores. que nos proporciona sugcrcl1cias sabre la forma en que trabajan las complejas redes de seflales intraceluJares.

Principios generales de la sefializaci6n celular' Casi con loda seguridad los mccanismos que permilcn a una celuJa innuir en el comportamiemo de olra celula ya existIan en el mundo de los organismos un ice771

SEfijALlZACION POR MOLECULAS SEGREGADAS

CfLULA SENAL

00_

molkola sanal

•

CELULA DIANA

Figura IS·) Sefta1lzacl6n Intercelular en anlmales. Se ilustran dos sistemas a traves de los que las celulas animales se comunican entre sf.

SENAUZACION POR MOl1:CUlAS UNIDAS A MEMBRANA PlAsMAnCA

CELULA SENAL

CELULA DIANA RECEPTORES DE SUPERFICIE CELUlAR

mollkula 5e~1

receptor

lulares mucho antes de que los organismos pluricelulares aparecieran sobre la Tierra. Algunas evidencias de ello provienen de estudios reaJizados en eucariOtas unicelulares actuales, como las levaduras. A pesar de que normalmenle eslas celulas lIevan una vida independiente, pueden comunicarse entre sl, y cada una de eUas puede influir en In proliferaci6n de OlTa. en preparaci6n del acoplamiento sexual. En la levadura de gemaci6n Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo, cuan· do un individuo haploide esl;1 preparado para el acoplamiento, segrega un peplido denominado factor de acoplamiemo que constituye una senaJ para que las celulas cuyo tipo de acoplamienlo es el contrario dejen de proliferar y se preparen para la conjugaci6n; la fusi6n de dos celuJas haploides de lipo de acopla..mienlo contrario produce una celula diploide, la cual enlonces puede sufrir una meiosis y esporular, generando celuJas haploides con una nueva dOlaci6n de genes. Estudios sobre levaduras mUlanles que son incapaces de acoplarse han permitido identificar muchas protefnas que son necesarias para este proceso de seflalizaci6n. Estas proternas forman una red de sefiaJizaci6n que induye receplo· res de superficie celular. protefnas que unen GTP y protefna quinasas, cada una de las cuales Hene parienles cercanos entre las prolefnas que participan en la se· nalizaci6n de las celulas ani males. Sin embargo, a traves de la duplicaci6n genica y de la divergencia, los sistemas de sefiaJizaci6n de los ani males se han vuelto much a mas claborados que los de las levaduras.

Las moltkulas senal extraceluJares son reconocidas por receptores especfficos de la superficie 0 del interior de las celulas diana 2 Mientras que las celulus de levudura se comunican elllre eUas para acoplarse. se· cretando divcrsos tipos de pequefios peplidos, las celuJas de los ani males supcrio· res se comunican mediante cenlenares de tipos de moleculas seilal, incJuycndo proleinas, pequcnos peptidos, aminoacidos, nude6lidos, eSleroides, relinoides, derivados de acidos grasos, e incluso gases disuehos como el 6xido nftrico y cl mon6xido de carbono. La mayona de estas moltkulas seliaJ eSlan secreladas por las cell/las se/laf mediante exocilosis (vease Capflulo 13). Dtms se libemn pordifu· si6n a traves de la membrana plasmatica y 5610 inOuyen en las celulas que eSlan en contacto con la celula seii.alizadom (Figura 15-1). Sea cual sea la nal'uraleza de la molecula seii.al, la celllia diana responde mediante una prolefna especffica denominada receptor. Se une espedficamenle a la molecula senaJ, y entonces inicia una respuesla en la celula diana. Muchas de las moleculas senal extracelulares acruan a concenrraciones muy bajas (tfpicamenle SIO"Ml, y los receplores que las reconocen usualmenle se unen a elias con una elevada afinidad (constante de afmidad K. ~ 10' !itros/mol; vease Figura 3-9). En la mayona de los casos los receptores son protefnas transmembrana de 772

Capftulo)5 : Transmisl6n de seiiales enlTe c€lulas

receptor de la IJllperl"lCie celolar

membra"a plasmMica

mOI6cola lienal hktrofiliea RECEPTORESINTRACELULARES

peqoelia molltcol. ....---.... /se~1 hidlol6biCll

Plolef~ ~.O"'.....

lla"lpor1aoola

receptor i"tracelolar

Flgurn 15-2 Las moleculas senal extracelulares se unen a receplores de III superflcle celular 0 a receptores Intrllcelulares. La mayoria de las rnolcculas sei'ial son hidrofilicas, por 10 que son incapaces de alravesar dircctamente la membrana plasmlltica; en lugar de ella. se unen a receptores de la superllcie de la celula los cuales, a su vez. generan una 0 varias sei'iales ell et inlerior de la celula diana. Por el comrario. algunas pequei'ias mol&:ulas senal difunden a traves de 13 membrana plasmalica y se unen a receplOres situados en el interior de la celula diana --en el citosol o en el nucleo (como se observa en la figural. Muchas de eSlas pcquefias moleculas sena! son hidrof6bicas y casi insolubles en soluciones acuosas: por ello. son lransponadas a (raves del lorreme sangufneo y de otros fluidos cxtracelulares. unidas a prolcfnas lransponadoras. de las que han de disociarse antes de enlrar a la ctHula diana.

las superficie de las celulas diana; cuando se unen a una l1lolecula senal ext racelular (un Ugal1do) se vuelven activos, de forma que generan una cascada de senales intracelulares que alteran el componamiento de la celula. En algunos casos, sin embargo. los receptores eSlan situados en el interior de la celula diana, yelJigando senal enlra a la celula para activarlos: eSlas moleculas senaJ, por 10 tanto. han de ser suficienlemente pequefias e hidror6bicas para poder difundir a Iraves de la membrana plasm:Hica (Figura 15-2). En este caphulo nos centraremos fundamentalmente en el eslUdio de la comunicaci6n entre celuJas animales mediada por sefiales quimicas segregadas. Este enfasis reneja el escado actuaJ de conocimientos sobre ellema: las molcculas segregadas son mucho mas faciles de estudiar que las molecuJas unidas a membrana. por 10 que conocemos muchos mas delaJles de su aCluaci6n. La senalizaci6n dependiente de conlacto. via molecuJas unidas a membrana. es mucho mas dificil de esludiar y por eUo mucha peor canocida. pera es de crucial imponancia especialmente durante el desarroUo y en la respuesta inmune; como veremos mas adelante. la base molecuJar de este sislema de comunicaci6n puede ser similar a la de la senaJizaci6n a distancia.

Las moleculas secreladas median tres formas de seiializaci6n: la paracrina,la sim:iptica y la endocrina2 Las moleculas selial que segrega una celula pueden ser transponadas a largas distancias para que actuen sobre cclulas diana muy alejadas. a pueden aCluar como medJadores locales afeclando unicamenle las cclulas del ambiente inmedialo de la celula senaJ. Esle l1JIimo proceso se denomina seiiaJlzacl6n paracrlna (Figura 15·3A). Para que las sefiaJes paracrinas solamente afeclen a las cclulas diana mas cercanas. es necesario que las moleculas senal segrcgadas no puedan difundir mucho; por esla raz6n habituaJmente son capladas nipidamenIe por las celulas diana vecinas. destruidas por enzimas extracelulares 0 inmoviIizadas por la marriz extracelular. Para un organismo pluricelular. grande y complejo, la senalizaci6n de cort'O alcance no es suficiente para coardinar el componamienlo de sus ctHulas. Por ello han evolucionado cOlljunlos de celulas especializadas en la senalizaci611 entre panes del cuerpo muy separadas entre Sl. Las mas sofisticadas de elias son las celulas nerviosas, 0 neuronas. las cuaJes tfpicamente emiten largas prolongadones (axones) que cntran en contacto con celulas diana alejadas. Cuando es activada por senales del ambieJHe 0 de Olras celuJas nerviosas, la neurona envfa impulsos eleclricos (polendalcs de acd6n) a 10 largo de su ax6n; cuando uno de estos impulsos lIega al terminal nervioso, en el eXlremo del ax6n. estimula al ler· minal para que scgregue una senal qufmica denominada neurolransmlsor. El terminal nervioso enlra en cantaclo con su ctHula diana a traves de lIniones celulares espedales denominadas SifWpsis quimicas.las cuales parecen eSlar disefiadas para asegurar que el lleurotransmisor sea Iiberado sobre la membrana posisinaplica de la celula diana. rapida y especificamente (Figura 15-38). Eslc lAI

PARACRINA

181

segregadas. En las seiializaciones paracrina. sinaptica y endocrina se uliJizan muchos tipos iguales de moleculas sefial. Las diferencias cruciales radican en la velocidad y en la sele<:tividad con las que son liberadas las senales a sus celulas diana. (CI

SINAPnCA

Ilna",11 qulmica

~Iula

Figura 15-3 Tres fonnas de

senallzacl6n medladas por molCc:lllas

ENOOCRINA

dlula endoc'ina

~

"'"

•

eelula nerviOH neurotransm,-.o, dlula diana

e8lula diana

.

Principlos generaJes de la scnalizaci6n celuJar

773

Figura 15-4 Conlraste entre las seftallzaci6n endocrina y 10 slnaptlca. 1...15 cclulas endocrinas y las celulas nerviosas actuan conjuntamente ooordinando las diversas aClividades de los miles de miUones de cclulas de un animal sUI>erior.las celulas endocrinas segregan a la circulacion muchos lipos diferenlcs de hormonas. para seiializar relulas diana especfficas. Las <:elulas diana tienen receplOrf$ que se unen especfficamente a las hormonas, de forma que tiellen que ~alrapar~ delliquido extracelular las honnonas adecuadas. En la sefializaci6n sinaptica. por el contrario, la especificidad reside en los contactos entre las prolongaciones nerviosas y las «Iulas nerviosas detenninadas que seiializan: habitualmente salo la celula diana que se halla en contacto sinaptico con la celula nerviosa esta expuesta al neurotransmisor liberado por eltermlnal nervioso (a pesar de que algunos neurotransmisores actuan de una manera paracrina como mediadores locales que InOuyen sobre muchas celulas diana en una ciena area). Mientras que diferentes celulas endocrinas han de utilizar diferentes hormonas para conseguir comunicarse especificamente con sus celulas diana, muchas celulas nerviosas pueden ulilizar el mismo neurotransmisor y, a pesar de ello, comunicarse tambien de una fonna espedfica.

proceso de seftallzad6n sinliptica se trata en detalle en el Capitulo II, por 10 que no sera considerado aqui. Las otras relulas senal especializadas que conuolan el comportamiento del organismo como un todo son las <:Bulas endocrinas. Segregan sus moleculas se"al, denominadas honnonas, en el torrente sangufneo (de un animal) 0 en la savia (de una planta), los cuales transportan la senal hasta las relulas diana djstribuidas ampliamente por todo el cuerpo (Figura 15-3Q. En la Figura 15-4 se contrastan los diferentcs sistemas a traVe; de los cuales las celuJas endocrinas y las relulas nerviosas coordinan el componamiento celuJar en los animales. Como la senalizaci6n endocrina depende de la difusi6n y del flujo sangufneo, es relativamente lenta. las celulas nerviosas, por el contrario, pueden aicanzar una velocidad y una precisi6n mucho mas elevadas. Pueden cransmilir informaci6n a grandes distandas mediante impulsos electricos que transport'lln la seflal a 10 largo de las prolongaciones nerviosas, a velocidades de hasta 100 metros por segundo. Una vez liberado por un tenninal nervioso, un neurotransmisor difunde no m<1s de 100 nm de la celula diana, un proceso que dura menos de un milisegundo. Qua diferenda entre la transmisi6n endocrina y la sin:'iplica es que, mientras que las horrnonas se diluyen enormemenle en la sangre cirCIIlante y en ellfquido intersticial, por 10 que han de poder actuar a conccntraciones muy bajas (dpicamente <10-8 MJ, los neurotransmisores se diluyen mucho menos, pudicndo Ilcgar a alcanzar concentraciones locales alias. Por ejemplo, la concentraci6n del neurotransmisor acetilcolina en la hcndidura sin:'iptica de una uni6n ncuromuscularacliva es de alrededor de 5 x IO-l M. Por 10 taniO, en la senalizaci6n simtptica los receptores de los neurotransmisores tienen una aOnidad relalivamente baja para sus ligandos, 10 cua! significa que el ncurotransmisor puede disodarse rapidamenle del receptor, con 10 que acaba la rcspuesla. (Los neurotransmisores son r:'ipidameme retirados de la hendldura sinaptica, tanto par enzimas hidrolfticas especfficas como por protefnas de membrana que transportan especfficameme el neurot.ransmisor, bombeandolo de nuevo hacia el terminal nervioso 0 hacia las celulas g1iales vednas.)

lA) SEI'lALlZACION ENOOCRINA

vllrilll

celulllt endocrinlls

cireulaci6r> sangulnell

villi.. ~ulll&

•

di,ln,l

lBI SEftALlZActON SINAPTICA varias neuronlls

varin dluln dillnll

La seiializaci6n autocrina puede coordinar decisiones

de grupos de cf!lulas idf!nticas3 Todas las fonnas de senalizaci6n que hemos descrito penniten a un tipo celula.r inDui.r sobre OlTO tipo celuJa.r. Sin emba.rgo, mediante el mismo mecanismo las celulas pueden enviar senales a otras celulas del ntismo tipo, de 10 que se deduce que pueden enviarse incluso senales a eUas mismas. En una seflalizaci6n de cste tipo, denominada aUlocrina, una celula segrega moleculas senal que pueden 774

CapftuJo 15: Transmisi6n de seftales entrecBulas

.

Figura 15-5 5ei'ializacI6n 8ulocrina. Un grupo de celulas id~nticas produce concentrnciones de moll!cula gei'ial m1s elevadas que una dlula sola.

UNA SOLA CfLULA SENAL RECIBE UNA SENAL AUTOCRINA MAs DEBIL

EN UN GRUPO DE CELULAS SEIiiAL IDENTICAS. CADA CELULA RECIBE UNA SENAL AUTOCRINA MAYOR

unirse a receptorcs de la propia c~lula. Durante el desarrollo, por ejemplo, cuando una c~lula ha sido dirigida a una etapa determinada de diferenciaci6n, puede 00menzar a segregar seilales aulocrinas que refuercen esta decisi6n de desarrollo. La seilalizaci6n autocrina es mAs efectiva cuando se lleva a cabo simultaneamente por varias c~lulas vecinas del mismo tipo. por 10 que puede utilizarse para estimular a grupos de c~lulas id~nticas para que tomen las mismas decisiones de desarrollo (Figura 15-5). Asf, se cree que la seilalizaci6n autocrina constituye un posible mecanismo sobre el que se basa el Mefecto comunitario" observado en las primeras etapas del desarrollo, segun el cual un grupo de c~lulas id~micas puede responder a seflaJes que inducen diferenciaci6n mientras que una c~lula aislada no puede hacerlo. Pero, la senalizaci6n autocrina no se produce s610 durante el desarrollo. Los elcosanoldes son mol~culas senal que a menudo actuan de una forma autocrina en los mamfferos maduros. Estos derivados de acidos grasos est.m sinletizados por celuJas de lodos los tejidos de mam(fero. $e sintetizan continuamente en la membrana plasmatica y se Iiberan al exterior celular, donde son rapidamente degradados por enzimas del medio extracelular. Sintetizados a partir de precursores (principalmente de dcido araqlliddnico) liberados a partir de los fosfolfpidos de la membrana celular mediante la aed6n de fosfolipasas (Figura 15-6). tienen una gran variedad de aetividades biol6gicas; por ejemplo influyen sabre la eOnlracd6n del museulo liso y la agregaci6n de las plaquetas y participan en las respues-

losfollpido d& membr.n&

'j-o-IH,

;vv-v-v-v=vv~-o-tH 'r -{}-A--G--' x ~

I

I

CH2

losfoliplISli

okido .r.,qu,dOnico t20 e8rbonot) en conforln8C06n .xtendid8

kido .rllCfutdOnico en conform.ciOn plegllde

Figura 15-6 Lasfnteslsdeun eicosanolde. Los eicosanoides son continuamente sintelizados en las membranas. a panir de cadenas de tlcidos grasos de 20 carbonos que cOlllCngan. al menos, tres dobles enlaces. como se muestra en (Al p.1ra el caso de la sfnlesis de proslaglandina PGEz, EJ subfndice se refiere a los dos dobles enlaces carbono-carbono siluados filera del anillo de PGEr Enslen cuatm da.ses principales de cicosanoides -las prosrnglandinas. las prostaddinas, los rromboxnllOS y los !eucornetl05- y (odas eRas cstAn sintetizadas a panirdel
~OOH

j

ETAPA DEPENDIENTE

DE LA ETAPA' OXIDATIVA'

CICLOQXIGENASA

I

o

~COOH OH

OH

(AI

Principios generales de la seiiali.7..acl6n celular

pro~l.ncIjnllS.

ETAPA OEPENOlE DE LA Uf>OXIGENASA

~ucotrlerlOS

prostKielinM.

,.,

tromoourlOS

775

tas inflamatorias y febriles. Cuando las c~lulas se activan por dano tisulnr 0 por a1gun tipo de senales qufmicas, se incrementa la velocidad de sfntesis de ccosanoides; el incremento resultante de los niveles locales de eicosanoides influye tanto sobre las c~lulas que los sintetizan como sobre sus vecinas inmediatas. Figura 15·7 SenaJizacl6n a traves de

Las uniones comunicantes permiten que la informaci6n de

sefializaci6n sea compartida por las celulas vecinas

4

Qtra via para coordinar las actividades de las c~luJas vecinas consisle en las unlo· nes comunlcantes 0 de tJpo gap. Se trata de uniones especializadas reluJa-c~lula que pueden fonnarse entre membranas plasm~ticassiruadas en eslrecho conlac10. y que conectan directamcnle los citoplasmas de las c~lulas que unen, a trav~ de esuechos canales Uenos de agua (v~ase Figura 19-15). Los canales penniten el inlercambio de pequeflas molecuJas sefial intraceluJares (mediadores imrace/flUlres). como el Ca20 y el AMP cfclico. pero no el de macromoleculas como protefnas y ~eidos nucleieos. Asf pues, las relulas eonectadas por uniones de lipo gap pueden comunicarse entre eUas directamente. sin tener la difieultad de la barrera que supone la presencia de las membranas plasm~licas (Figura 15-7). Como se diseule en el Capftulo 19, el patr6n de distribuci6n de las conexiones eomunicantes en un tejido puede ponerse de manifieslO lanto electrieamente, con electrodos intraeelulares, como visualmente. {ras la microinyecci6n de colorantes solubles en agua. Esludios de esle tipo indican que las e~lulas de un embri6n en desarrollo forman y deshacen uniones comunicantes siguiendo patrones espedfieos y muy interesantes. 10 eual sugiere que eslas uniones juegan un importante papel en los procesos de sefializaci6n que tienen lugar entre eslas e~luJas. Puede sospecharse que, como en el caso de la sefializaci6n autoerina deserita con anlerioridad. las uniones eomunicantes eolaboran en la coord inaci6n del eomponamiento de las e~lulas vecinas de tipo simiJar. Sin embargo, no sabemos qu~ pequenas mol~cll.las en particular son importantes transportadores de senales a lraves de las uniones comunieantes; lampoeo se ha definido con precisi6n eu~1 es la funci6n precisa de la comunicaci6n a lTav~ de las uniones de lipo gap en el desarrollo animal.

Cada celula esta programada para responder a combinaciones espedficas de moMculas sefial5 dada de un organismo pluricelular est~ expuesta a lllllehas diferentcs de su entomo. Est'as senales pucden ser solllbles, estar unidas a In mnlriz cxtracclular 0 estar unidas a la superlide de las celulas vecinas. y pueden aCluur ell varios millones de combinaciones posibles. La celula respondera a esln seleetividad de babel, de acuerdo con su car~eter especffico adquirido mediante In progresiva especializaci6n eelular, en el curso del desarrollo. Asf pues. una c~lula puede estar programada para responder a un conjumo de sel'lnles, diferenci~ndose, a otro conjullio de senales. proliferando. y a un tercer grupo de scnales. desarrollando algunas funeiones especializndas. La mayorfa de las relulas de los animales superiores, sin embargo, eSlan programadas para depender de un grupo espedfieo de senales simplemente para sobrevivir: euando son deprivadas de las sefiales adecuadas (por ejemplo. en una plaea de eultivo), las e~lulas inieian un programa suicida y se aUlodestruyen -un proceso denominado nlllerte cell/tar programada. que se discule mas extensamenle en el Capitulo 21 (Figura 15-8). Diferentes lipos de celulas requieren diferenles eonjuntos de sefiales de supervivencia, y par ello su loealizaci6n esta reslringida a diferenles ambiemes en el cuerpo. Debido a que generalmente las moleculas senal aenian en eombinaciones de elias. un animal puede eontrolar el eomportamiento de sus celulas de una manera altamente especffiea, utilizando una diversidad limitada de tales moleeulas: dent os de moleculas senal pueden utilizarse en millones de eombinaeiones dUerentes. Cualquier

c~lula

-quiz~s denlOS- senales

776

CaprtuJo 15: Transmisi6n de senates entre c~luJas

unlones comunlcantes. las celulas

que esuin conectadas por uniones comunicanles comparten las pequenas moleculas, incluidas las pequenas moleculas senal intracelulares, por 10 que pueden responder a senaJes extracelulares de una forma coordinada.

'

~

_ MUERTE CELULAR _

~

PROGRAMADA

A" \!) -

B_

~. ~

SOBREVIVE

C/

A" @ -

B_


PROLIFERA

1 '\, D

Diferentes celulas pueden responder de forma diferente ala misma senal qufmica6 La manera espedfica en que una clHula reacciona con su enloma, varfa, en primer lugar, de acuerdo con el conjunto de prorefnas receploras que posee la celula y a traves de las que detect a un canjunlo particular de todas las seflales que Ie

son asequibles y, en segundo lugar, de acuerdo con la maquinaria intracelular a (raves de la eual la celula integra e interpreta la informaci6n que recibe. ASI, a menudo una misma mohkula senal tiene efectos diferentes sobre cclulas diana diferentes. Por ejemplo. el neurotransmisor acetilcolina estimula la cancentraci6n de las celulas del mtisculo esqueletico pem disminuye la frecuencia y la fuerza de contracci6n de las celulas museulares del eoraz6n. Ello es debido a que las protefnas receptoras de acetilcolina de las celulas musculares esquelt'hicas son diferentes de las de las fibras musculares del coraz6n. Sin embargo. no siempre son las diferencias entre los receptores 10 que explica las diferencias de ereelOS. En muchas casas la misma molecula sefial se une a protefnas receptoras identicas y produce respueslas rnuy diferentes en diferentes tipos de celulas diana, 10 cual reOeja diferencias en la maquinaria enzima:tica a la que estan acoplados los receptores (Figura 15-9).

FIgura 15-8 sef'iallzacl6n comblnatorla. Cada tipo de celuJa presenta un conjunto de receptores que Ie pcmlile responder a illl conjunto correspondiente de rnoleculas setial producidas por otras celulas. Varias de estas moloculas seiial actuan de fomm combinada, regulando el cornportarniento de la ct'Huia Como se muestra aqui, muchas celulas rcquieren mJ1ltiples sefiales (jlechas verdes) para sobreviviry sefiates adicionales (jlecllas rojas) para proliferar; si se depriva a las celulas de ladas esas sefiales, inician un programa de muerte celular. (A) fibre muscular esquelf!itica

Bcetilcoline

!

• •

CONTRACCION

(8) fibre muscular cardiaca

.-

La concentraci6n de una molecula puede ajustarse nipidamente s610 si la vida media de la molecula es corta6 Es natlUal' pensar ell los sistemas de sefializaci6n en terminos de los cam bios que se producen cuando se libera una sefial. Pero tam bien resulta importante considerar que ocurre cuando se elimina una sefial. Durante el desarrollo a menuda sefiales transilorias producen efeclOs duraderos: pueden desencadenar un cambia que persiste indefinidamente, a traves de mecanismos de memoria celular como los discutidos en los Capflulos 9 y 21. Sin embargo, en la mayorfa de los casos, especialmente en los tejidos adullos, la respuesta se desvanece cuando cesa una sefial. La sefial actda sabre un sistema de moleeulas que estan en conti-

RELAJACION

(C) cf!ilule SecrBtora

-

..

. '....

.' .'

SECRECION

Figura 15-9 Una mlsma moh~culasenalplIede Indllclr respuestas dlferentes en celulas diana diIerentes. En algunos casos, ello es debido a que la molecula senal se une a proteinas receptoras diferenres, tal como se iJustra ell CAl y (B). En atros casas. la maleeula seiial se une a proreinas receptoras identicas pero estus aetivan respuestas diferentes en celulas diferentes. lal como se iJustra en (B) y (e). En todos los casos lIlostrados aquila molCcula sefial es la acetilco/ina (D).

Principios generales de la sefiallzaci6n celular

10) acetilcoline

o

CH J

H3C-C" -O-CH1-CH2-r-CHJ I

CH,

777

I"~:::::::::::::=-

200 ml'

_-----1

"

min

40 min

8

6

lOmin

10 min

, 40 min 2

11:'=:::::::.-------

~-----'m'n o

, ,

6

8

"

minutos despuft de qlHl I. vetoc:~ de &lotes;. hay. disminuido en un factor de 10

o

,

200 min

6 8 minutos despu6s (Ie que I, yetocidad de

2

"

.lolasis hay• • umtHltMio en un factor de 10

tAl

lSI

nuo recambio, de forma que cuando 1a senal cesa el reemplazamicnto de las moh~culas viejas por mole:culas nuevas borra las trazas de su acci6n. De ello se deduce que la velocidad de la reacci6n para eliminar los efeclos de 13 sefial de· pende de la velocidad del recambio de las moleculas a las que afeCla 13 seiial. Puede no resu.ltar Ian obvio que esla velocidad de recambio tam bien determine la prontirud de la respuesI3 cuando la sefial se activa. Consirleremos por ejemplo dos moleculas intracelulares X e Y, y que ambas se mantienen normal mente a una concentraci6n de 1000 moleculas por eelula. La moleeula X tiene una velocidad de reeambio baja; es sintetizada y degradada a una velocidad de 10 mol6eulas por segundo, de forma que eada moleeula tiene una vida media de 100 segundos. A su vez, la moleeula Y se recamhia 10 veees mas rapidarnente; es sintetizada y degradada a una velocidad de 100 moleeulas por segundo, de forma que eada moleeula tiene una vida media de 10 segundos. Si una sef'ial que acWa sobre la celula incrementa 10 veees las velocidades de sfntesis tanlo de X como de Ysin alterar las vidas medias, al final del primer segundo la coneenlraci6n de Ysc habra incrementado unas 900 mol6clIias en cada celula (10 x 100 - 100) mientras que la concentraci6n de X s610 se habra incrementado 90 mol6culas por celuta. De hecho, despues de que Sll veloeidad de sfntesis haya aumentado 0 disminuido abruptamente, el tiempo nccesario para que una molecula Ilegue a medio camino entre su concentraci6n antigua y Sll nueva concentraci6n de equilibria es igual a su vida media --es decir. es igunl al liempo que serfa necesario para que su concentraci6n bajara a la mitad si se parara complelamenle su sfnlesis (Figura 15-lO). EI mismo principia se aplica tanlo a prmefnas como a pequcflas moleculas, y tanto a molcculas del espacio extraceluJar como imracelulares. Muchas protefnas imracelulares que son degradadas nipidnmente tienen vidas medias cortas; a1gunas de elias sobreviven menos de J0 minutos; en la mayona de los casas sc trata de protefnas euyo papel regulador es clave, y cuyas concenlraciones celulares est<'in reguladas rapidamente mediante eambios en la velocidad de su sfnlesis. De la misma forma, cualquier modificaci6n covalenle de una protefna, que tenga lugar como pane de un proceso de rapido de seflalizaci6n -hahitualmente la adici6n de un grupo fosfato a una cadena lateral de un aminoacido- ha de ser eliminada eonlinuamente a una gran velocidad para hacer posible tal senaliza778

Capitulo 15: Transmisi6n de sefiaJes entre dlulas

Figura 15-10 La Importancla de un recanlblo rlipldo.La figura mueslra predicciones de las velocidades relalivas de cambio de las concenlraciones inlracelulares de molt!culas que lienen diferentes velocidades de recambio, cuando sus velocidades de simesis disminuyen (A) o aumeman (B) repentinameme en un faclor de 10. En ambos casos la concemraci6n de las moleculas que normalmenle son degradadas rapidamenle en la celula (lineas rojas) cambia rapidamenle mienlJ"as que la concenlrad6n de las moleculas que nonnalmente son degradadas mas lenlamenle (lineas verdes) cambia proporcionalmeme mas despacio. Los numeros (en azuf) dellado derecho de las graficas son las vidas medias asumidas para cada una de las diferenles moleculas.

ci6n. Mas adelante discutimos en detalle algunos de estos procesos moleculares. para el caso de procesos de seflalizaci6n que trabajan via receplOres de superficie celular. Sin embargo, los principios se aplican de forma general. como i111Stran los siguientes ejcmplos.

EI gas 6xido nJtrieo actua como una sefial, uni~ndose directarnente a una enzima en el interior de la c~lula diana' A pesar de que 13 mayorfa de las senales extracelulares estan mediadas por moleculas hidrofllicas que se unen a rceeptores silUados en la superficie de 13 membrana de 13 celula diana. algunas moleculas senal son suficientemente hidrof6bicas y/o suficienlemente pequenas para alravesar facilmente la membrana de la celula diana; una vez en el interior. regulan directamcnte la actividad 0 la especificidad de una prolefna intracelular. Un e;emplo remarcable 10 constituye el gas 6x1do nIlrlco (NO). el cual recientemente ha sido reconocido como una molt~cu­ la senal en los venebrados. Por ejemplo. cuando la acetilcolina es liberada pOT nervios aut6nomos a las paredes de los vasos sangufneos, hace que las fibras musculares lisas se relajen. La acetilcolina acrua indirectamente induciendo a las ctHulas endoteliales a simetizar y Iiberar NO, el cual haec que las celulas musculares lisas se relajen. EI efecto de NO sobre los vasos sangufneos proporciona una explicaci6n del mecanismo de acci6n de la nitroglicerina. que ha sido utilizada durante mas de 100 arlOs para tratar pacientes con angina de pecho (dolor debido a un flujo sangllfneo inadecuado en el musculo cardfaco). La nitroglicerina es transformada en NO. que relaja los vasos sangufneos, reduciendo el trabajo del coraz6n y. en consecuencia, el requerimiento de oxfgene del musculo cardfaco. Tambien se produce NO como mediador local por macr6fagos y neutr6filos activados para colaborar en el proceso de eliminaci6n de microorganismos invasores. Ademas. se uliliza por muchos tipos de celulas nerviosas para sefiaJizar celulas vecinas: el NO liberado por nervios aut6nomos en el pene. por ejemplo. hace que se dilaten los vasos sangufneos locales que son responsables de la erecci6n. EI NO es sintetizado por la enzima NO sill1asa mediante la desaminaci6n del aminoacido arginina. Como difunde flicilmenre a trav~ de las membranas, el NO difunde fuera de la cl!lula que 10 sinletiza. y entra directamente en las cl!lulas vecinas. 5610 acroa Iocalmente debido a que en el espacio extracelular su vida media es muy cona -enlre 5 y 10 segundo5- transfonnlindose en nitratos y nilritos al combinarse con oxfgeno y agua. En muchas celulas diana, como las celulas cndoteliales, el NO reacciona un atomo de hierro del lugar activo de la enzima guallilaro cielasa, cstimulandola para que produzca el mediador intracelular GMP cfclico, del que hablaremos mds adelante. Los efectos del NO pueden ser rap ides, ocurriendo en cuesti6n de segundos, debido a que la velocidad de recambia del GMP ddico es alta: la rapida producci6n de GMP dc1ico a partir de GTP por la guanilato ciclasa esta compensada por la rapida degradaci6n a GMP por una fosfodiesterasa. Existen evidencias recientes de que el mon6xido de carOOtlO (CO) tambien se utiJiza como una senal intracelular. y de que puede aCllIar de la misma forma que el NO, estimulando la guanilato ciclasa. Los gases como el NO y el CO no son las I1nicas moleculas senal que pueden pasar directamente a naves de la membrana plasm:\tica de la celula diana. Tambien entran en la celula diana. de esta fonna, un grupo de hormonas no gaseosas, pequeiias e hidrof6bicas. y varios mediadores locales; sin embargo, en lugar de unirse directamente a enzimas. se linen a receptores intracelulares que reguIan direclamente In transcripci6n genica.

Las hormonas esteroideas, las hormonas tiroideas, los retinoides y la vitarnina D se unen a receptores intracelulares que son

protefnas reguladoras de genes aclivadas por ligando8 Las hormonas eSleroideas. las IlOrmOtlas tiroideas. los re/;tloides y la vitam ilia 0 son pequenas moll!culas hidrof6bicas, muy diferentes entre sf lanto en estrucluPrincipios generales de la seiializaci6n celular

779

OH

CHzOH

I

C-O HO

OH

/,-,,/,-,OH

HO COr1itol

HO

CH J 0

v ....../ ..........~,,~,l,o_

tirollina

ra qufmica (Figura 15-tl) como en funci6n. Sin embargo, IOOas elias actlian a traves de un mecanismo similar. Difunden directamemc a traves de la membrana plasmatica de las c~lulas diana y se unen a prot'cinas receploras intracelulares. La uni6n delligando aCliva los receptores, los cuales entonces regttlan directamente la transcripci6n de detcnninados genes. Estos receptores tienen eslnlCfUraS Telacionadas entre sf y conslituyen la superfamilla de receptores intracelulares (0 superfamWa de rea!ptores de IlOmlOlIllS esteroideas) (Figura 15-12). Todas las hormonas esteroldeas, incluyendo e1 cortisol, las hormonas sexuales. la vitamina D (en los venebradosl y la hormona de la muda ecdisona (en los inseclOS), estan sintelizadas a partir del colesterol. EI cortisol se produce en e1 c6rtex de las g1lindulas adrenales y afecta el metabolismo de muchos tipos celulares. Las hormonas esteroideas sexuaJes se sinletizan en los testfculos y en los ovarios y son responsables de las caraclerfsticas sexuales secundarias que distinguen los machos de las hembras. La vltamlna 0 se sintetiza en la piel en respuesla a la luz solar; despu~ de transformarse en una fonna aCliva en el rifl6n 0 en el hfgado, regula el melabolismo del Ca2., favoreciendo la caplaci6n de Cn2• en el inleslino y reduciendo su excreci6n por el rifi6n. Las honnonas t1roldeas, que son sinteli,,,adas a parlir del amineacido tirosina, incrementan el melabolis· me de una gran variedad de ('ipos celulares, mientras que los rednoldes, como el acido retinoico, que se sintetizan a partir de la vitamina A, jllegan un irnportantc papcl como mcdiadorcs locales durante el desarrollo de los vertcbrados. A pcsar de que todas eSlas mol~clJlas senal son rclativamente insolubles en agua, se baoompleio proteico inhibidOI

domlnlo de union

lugal de uniOn a la hormona COOH

N - - - - -......-·-'D_N_A __

domlnlo de aclillacion dale IrenseripeiOn

C

receptor de cortisol

N

_

C

receptor de eS1rOgllflo dominlo de uniOn{reQl6r'1 bllagrs alONA

N - - - - - -••- - - C receptor- de progesterona

hormone . . esleroidea • N_ C receptor de vilam,,,. D

luga. de uniOn a' DNA ."pUB.to N

_

C

receptor de harmon.. tlraide.. N

,AI 780

'B' Capftulo 15: Transmisl6n de sei'iales entre c~lulas

_

C

receptor de kkto ,etinc»eo

H,C

CH, kido ret;nc»eo

Flgural5-1t AlgunasmolNulas seftaJ que se unen a receptores lntraceJula.res. Notese que todas elias son pequei'ias e hidrof6bicas. Se muestra la forma activa, hidroxilada, de la vitamina D~.

Figura 15·12 La superfamilla de receptores lntracelulares. (Al Modelo de protefna receptora de hormonas esteroideas. En su estado inaclivo el receptor se halla unido a un complejo proteko inhibidor que contiene una protefna activada por estres calor(fko (heal shock protein) dcnominada l"sp90 (se discule en el Capffulo 5). La uni6n delligando al reccptor hace que la protefna inhibidora se disocie, de fonna que el receptor se activa exponiendo su lugar de uni6n al DNA. Elmodelo que se presenla en la figura se basa ell el receptor para el cortisol (glucoconicoides), pero lodos los receplores de la superfamilia lienen una esffUClura similar a esta. como se mueSfra en {B}, donde se han dibujado en IICrdC los cortos dominios de uni6n al DNA de cada receptor. Experimelllos de infercambio de dominios sugieren que en esfOS recepfores la mayorfa de los dominios de union a la hormona, de aetivadon de la transcripcKin yde union al DNA pUedcn aCfUar como m6dulos intercambiables. Se cree que fodos los receplores inuacelulares se unen aI DNA como homodimeros 0 como helerodfmeros.

cell solubles para su transporte par ellorrente sangufneo y Olros lIquidos eXlracelulares mediante su uni6n a protelnas transportadoras especfficas, de las que se disocian antes de entrar en la celula diana (vease Figura 15-2). Ademas de la diferencia fundamental en la manera en que seiializan a sus celulas diana, la mayorfa de las molecuJas insolubles en agua se diferencian de las solubles en agua en cuanlo al tiempo que se mantienen en el torrenle sangufneo y en los lejidos. La mayorfa de las hormonas solubles en agua se eliminan ylo degradan en cuesli6n de minutos despu~ de cntrar en la sangre y los mcdiadores locales y los neurOiransmisores son eliminados del espacio extraeelular induso mas rnpidamenle -en cuesti6n de segundos 0 de milisegundos. Las hormonas esteroideas, par el contrario, persislen en la sangre durante horas, y las hormonas tiroideas durante dlas. En consecuencia, las moleculas senal solubles en agua habitualmenle median respueslas de duraci6n carta mienlras que las insolubles en agua tienden a mediar respuestas mas duraderas. Tados los receptores intraceluJares para las hormonas esteroideas, para las hormonas tiroidcas. para los retinoides y para la vitamina 0, se unen a secuencias especfficas del DNA adyacentes a los genes que estan regulados por elligando correspondienle. AJgunos de elias, como los receplores de cortisol, se localizan principalmente en el citoplasma y s610 se unen al DNA despuCs de unirse al Iigando (vease Figura 15-12); otros, como los receptores de relinoides, se localizan principalmente en el nueleo y se unen al DNA incluso en ausencia de ligando. En cualquier caso, la uni6n delligando altern la conformaci6n de la proteina receptora, la cual entonees acliva (u ocasionalmente inhibella transcripci6n geniea. En muchos casos la respuesta tiene lugar en dos etapas: en primer Jugar la inducci6n directa de la transcripci6n de un pequeno numero de genes especfficos, en cuesti6n de 30 minutos, y que se canace como la respuesta primaria: los praducros de estos genes, a su vez. activan arras genes, produciendo una respuesta retardada, denominada resp"esta set:undaria. As!, un simple incremento hormonal puede generar un complejo cambia del patr6n de expresi6n genica (Figura 15-13). La respuesta a las hormonas tiroideas y esteroideas, a la vitamina 0 y a los retinoides, como en el caso de las respuestas a seiiales extracelulares en general, esta determinada tanto por la naluraleza de la celula diana como por la naluraleza de la molecula sei\al. A pesar de que diferentes lipos celulares (eogan receplares intraccllliares idenlicas, el conjunto de genes que regula el receptor es di· (A) RESPUESTA PRIMARIA TEMPRANA A LA HORMONA ESTEROlDEA

Figura 15-t3 Respuestaprimaria ternprana IA) y respuesta secundaria retardada CB) que resulta de la aet.lvad6n de receptores protelcos intracelulares. Se i1ustra la respuesla a una honnona esteroidea. pero est05 misrnos principi05 se pueden aplicar a tados los ligandos que activan alguno de los cornponentes de esla familia de protefnas receploras. AJgunas de las prolefnas de la respuesta pomaria activan a los genes de la respuesla secundaria. mientras que olras inactivan a los genes de la respuesla primaria. El nlimero real de genes implicados en las respuestas primaria y secundaria es mayor que el que se indica en eSle dibujo. Como era de esperar, las drogas que inhiben la sfntesis proteica suprimen la transcripci6n de los genes de la reSl'uesla secundaria pero no los de la respuesla primaria.

(6) RESPUESTA SECUNDARIA RETAROAOA A LA HORMONA ESTEROIDEA

hormona recaptor de hormona esteroldea esteroidlla

'-CAA A

~

prolllinas dela rll5pullsta SllCundaria

.\.:

1011 eomplejos tIormona esteroid".....eeeplor .cI;van 101I gen" de la r..pu_a prlmaroa

..,

:.

I I I I

DNA

I

~

DNA

I

-:-

inducciOn d11I,IIIM"" de '1(Jun.a,.proteln" difllrllnl" lin I. respull1iU prim.ri,

un.a protllln. dll. de .. rnpuuta

un. protein. de III rllpUlllla primaria .cIivalOll gene, dela rnpunla

J)f'ffillrl'

MCUndan.

r"puISI' primllfia

inaetjva 10, genes

Principios generales de la seftalizaci6n celular

781

ferente en cada caso. Ello es debido a que generalmeme a cada gen eucariota se Ie ha de unir mas de un lipo de protefna reguladora de genes. para aClivar su transcripci6n. Por ello, un receptor intrnceJular puede activar un gen wlo si exis· te In combinaci6n adecuada de otras prolefnas reguladoras de genes, y algunas de elias son especfficas del tipo celuJar. Asi, las honnonas liroideas, la vilamina o y cada una de las hormonas esleroideas y de relinoides inducen un conjunto caracterfsrico de respuestas en los animales, debido a que: (I) lmicamente ciertos tipos celulares tienen receptores para ello; y (2) cada uno de estos tipos cclularcs contienen una combinaci6n diferenle de otras protefnas reglliadoras de genes, que colaboran con el receptor activado innllyendo enla transcripci6n de conjunlOS especfficos de genes. En el Capftulo 9 se discutcn los dClalles molecularcs so· bre c6mo los receplores intracelulares YOWlS protcfnas reguladoras controlan la transcripci6n de genes de forma especffica.

Se canoeen tres c1ases de prolefnas reeeptoras de superficie celular: las asociadas a canales i6nicos, las asociadas a protefnas G y las asociadas a enzimas9 Las tecnicas de DNA recombinante han revolucionado el estudio de los recepto· res y de las proteinas intracelulares que panicipan en la sefializaci6n celular. Es· tas protefnas a menudo constiruyen menos del 0,01% de la masa proleica tOlal de una celuJa, por 10 que ha resultado cxtremadamente dirfcil purificarlas. EI clo· naje de las secuencias de DNA que codifican las prolefnas ha acelerado enorme· mente el proceso de caracterizad6n: la mayorta de las protefnas sef'lal discutidas en este capitulo se han caracterizado de esta forma. Una contriblld6n funda· mental de estos estlldios de donaje y de secuendaci6n de DNA ha consistido en revelar que la increfble diversidad de protefnas receptoras conoddas puede re· ducirse a un mlmero mucho menor de grandes familias. Los receptores intrace· lulares de los que acabamos de tratar consthuyen una de estas famiLias. Ahora consideraremos los grupos de familias que pueden identificarse como pertene· dentes a una gran c1ase de receptores de sei'ial: los receptores Iocalizados en la superficie de In celula. Todas las moleculas senal solubles en agua (incluyendo los neurolransmiso· res, las homlOnas protcicas y los factores de crecimiemol y algunas moleculas sei'ialliposolubles, se unen a receptores proteicos especificos situados en la superficie de las relulas diana que afectan. Estos receptores proteicos de superfide acttlan como transductores de sei'ial: llnen la molecula sei'ial (el ligando) con una alta afinidad. y transforman cste evento extracelular en una 0 mas sei'mles intracelulares, las cuates alteran el comportamiento de la celula diana. La mayorfa de los receptores de la superfide celular pertenecen a una de es· laS tres clases. que se definen en fundon del mecanismo de transducd6n que uti· Iizan. los receptores asoclados a canales, lambien conocidos como canales i6"i· cos regulados por tTammisor, panidpan prindpalmente en la rapida senalizad6n sim1ptica entre celulas excitables elecuicamente. Esle tipo de senalizaci6n esla mediada por un pequeno numero de neurotransmisores que abren 0 derran transitoriamente el canal i6nico aI que estan unidos, alterando asf brevemente la permeabilidad i6nica de la membrana plasmatica y. por 10 lanto. modificando la exdtabilidad de la celula postsinaptlca (Figura 15·14A). Estos receptores relado· nados con un canal pertenecen a una familia de protefnas transmembrana que la atraviesan varias veces (muJripasol y que son hom610gas entre sL En el Capftulo 11 se eSludian estos receplores, de forma que aquf no se tralaran en mayor pro· fundidad. Los receptores asoclados a protefnas G actuan indlrectamente regulando la activldad de Ulla enzima Iigada a la membrana plasmMica 0 un canal i6nico. separados del receptor. La interacci6n enlre el receptor y la protefna diana esta mcdiada por una tercera protefna. lIamada protei"a reglliadortl qlle line GTP (0 protei"a G) (Figura 15-148). La activaci6n de la protefna diana altera la coneen· trad6n de una 0 mas pequenas moleculas senal intracelulares (sl la protefna 782

Caprlulo 15: Transmisi6n de senalcs entre celulas

Figura t5-14 Lastresdasesde rec::eptores de superflcle. A pesar de que muchos receplores asociados II enzimas tiencn una actividad enzim;jlica intrinseca. como se muestra en {Cj, muchos otros aCllian sobre enzimas asociadas (no se muestra).

(AI RECEPTOR RELAC10NAOO CON CANALES 16NICOS

.>looe6

•• IB)

RECEPTOR RElAClONAOQ CON PROn:lNAS G

prot.lne G lIozime 0

proteine G ectivitda

uneli60ico

IC)

IInlime ect.vitda o un" iOnico

-'''~

RECEPTOR RElAClONAOO CON ENZlMAS

\

dominlo C8laUtico ina<:tlvo

dominio ciltalilico activo

diana es una enzima) 0 altera la permeabilidad de la membrana plasmatica (si la protefna diana es un canal i6nico). A su vez, los mensajeros intracelulares actuan alterando el comportamiento de otras protefnas diana de la celula. Todos los receptores rclacionados con protefnas G pertenecen a lIna gran sllperfamilia de protefnas horn6logas, que atraviesan siete veces la membrana Cuando son activados par su Uganda, los receptores asoclados a cnzlmas actuan directamcntc como enzimas 0 estan asociadas a enzimas (Figura 15-14C). La mayorfa de elias son prote(nas que atraviesan la membrana una sola vez y que tienen ellugar de uni6n alligando en el exterior de la celu!a y e!!ugar catalftico en el interior. Comparados can las otras dos c1ases, los receptores relacionados con enzimas son heterogeneos. a pesar de que la gran mayorfa de ellos son protefna quinasas 0 estan asociados con protefna quinasas, que fosforilan con juntos cspecflicos de protefnas en la celula diana.

Los receptores de superficie celular, una vez activados, desencadenan la adici6n de grupos fosfato a una red de prote(nas intraceluJares9 • 10 La mayorla de 10 que se tratarn en este capitulo a partir de aqui se refiere a c6mo trabajan los receptores relacionados con prol'efnas G y los receptores relacionados con enzimas. A menudo las senales recibidas en la superficie de la c.:HuJa por cstas dos c1ases de receptores son transmitidas hasta el nudeo, donde alteran la expresi6n de detenninados genes modificando asf el comportamiemo de la ~Iula. EI sistema de nansmisi6n de la sefial csta fonnado por elaborados conjuntos de proleinas seflal intracelularcs. La mayoria de cstas proteinas son: 0 bien protefnas que cuando lIega la sena1 se rosrorilan mediante protefna quinasas 0 bien protefnas que cuando !lega 1a senal sc linen a GTP. En ambos casas las prole{nas ganan uno

Principios generales de la sei'ializaci6n celuJar

783

ENTRADA DE LA SENAl

V

I

• ;-0

-v-( _\ ~. I

ENTRADA DE LA seNAL

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I

I

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SAUDA DE LA

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SAUDA DE LA SEI'ilAL

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(A) sePlALIZACtON MEDIANTE

V

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fOSFORILACION

PROn:INA QUE UNE Gn>

o m
Resumen Ctufa IIna de Ins relums de lin animal plllrkellllar estd "rogramadn dllrante el desarrollo para respontkr a lin conjllnlo espedfico de senates qlle adrian ell diversas comblnaclones reglllando el com,lOrramlento de la dlula y determi,uJlloo si la ci-

784

Caprtulo 15: Transmisi6n de seftales cntrcc~Hulas

Figura 15-15 Los dos me(:anlsmos prtnc:lpales de seftaUzacl6n Intracelular comparten ca.racter{nlcafl comunes. En ambos casos una prOlefna sei'ial es activada por la adici6n de un grupo fosfato, e inaclivada por la e1iminaci6n del grupo fosfato. En (A) el fosfato es af'iadido de forma covaJente a la protefna sef'ial, mediante una protefna quinasa; en (8) una proteina sef'ializadora es inducida a cambiar su GOP por un GTP. Para poner de manifiesto las simililUdes entre ambos me(:anismos, el ATP se muestra como APP® cl AOP como APP, el GTP comO GPP®y el GOP como GPP.

IAI

'81

I PROCESO DE PROOUCCION DE SENAl

PROCESO DE PRODUCtION DE sellilAL

'ilia debe v;v;r 0 morlr 0 Ii debe proliferar 0 penlUlnecer qu;namte. La ",ayorin de esttu senates median senalizaciones paracrinas en las que los mediadofU locales son rapldamente captados, destruidos 0 inmoviliuulos. de forma que Ilnlcamente pueden lU:tuar sabre las c11ulas vecintlS. Adem4s, uisu un control amfrallzado qlll! estd ejerddo tanto por la seilallzaci6n endocrina, en la qlll! las ',omlomu segregalias por las cil"las endocrlnas son transportadas por In Mngre hast" las dl"'as diana th todD et cuerpo, como por In seiializaci6n sinaptlen en In ell/II los lIeumtransmlsoru s~dos por las celulas nerv;osas actdan localmente sobre Ins ellulas postsinaptlMS con las que oontacmn sus axones. Ln seiiallur£i6n eelldar requiere tanto moleculas senal extracel"'ares como 1m oollJUllto oomplementario de prote/llas receplOTas en cadn cilula, ql,e In permlletl unirlns y responder a elias de fUm JOmul programada y caracterlstica. Algrmas pe_ qll.eiias molkulas hldro/6bicm, iI.eluyendo las hormonas esteroilleas y tirolliens y los retinoldes, tli/unden a trallh de la membrana plasmdtlca de la cilt1la diana y actlvan protelnas receptoras intracelulares, las cllales regulan tliredtlmente la transcripcMn de determlnados genes. Algunos gases en solucMII, oomo el dxillo III· trico y el mon6xllio de ctlrbollO, actllon como mediadores locales llifumliemlo a tra. ves lIB la membrana de It, cilula diana y activanda una enz.ima illtracelt11ar -ImbltIIalmente la gua,dlato ciclasa, que produce GMP cfcllco e" la cilu/a llilllUI. Slrr emlH1rgo, la mayorla lIB las molkulas senai extracellliares SO" hidroflilcas y s610 son CttJHu;es de aCt/wlr proteltulS receploras de la superjicle de la c~/ula diana; eslos receptores actlmn oomo trlUlsdllctores de senal, cOlwirtiemw el eoo",o de ImMIl extracelular e,r senales intracelull1res que alteran el oomportamlellto de la cilula diann.. Existell Ires /amllias prillcipales de receptores de slllJerficie celltlar, los comlJOmmtes de aula wu, de las cl"'les tran.sducen las se,1ales ex'racelulares de wla mallera difere",e. Los receptores asociadDs a canales 16nicos son canales 16"lcos reo gultulos por transmisor que se abren 0 se cierrall breoomellte 001110 respuesta a la unl6" de un neurolTansmisor. Los receptores asociadas a protelnas G act/van 0 in.actlvan /ndirectame1lte ellZimas unidns a membralla plasmdtlca 0 canales 16"icos, a travis de proteinas trim~ricas que ullell GTP (proteinas G). Los recelltores moeiadDs a ellZimas actrlon directamente como ellZimas 0 esttIn asoc/ados a elu.l· mas; IUlbU,,,,lmente las e,lZimas son proteina quinasas que fosforilrm proteinas determinadas de III cilula diana. A tram de cascadas de fosforilllciones de protei· n4S, muy bien reguladtu, oonjuntos elaborados de protein4S que ilrteractl1an entre ellas transportan la mayorla de las senales desde III superjide luuta el nricleo, alu-rando a.sl el patron de expresJ6n ginlar y, como oonsecuencia de ello, el comporta· mlento de la cilula. La interacd611 entre diferentes ca.sauJas permite a la dlula inkgrar la infonnaci611 que prolJielle de las mliltiples senales que recibe. PrincipiOS generales de la sefiaJizaci6n celular

Plgura 15-16 Integracl6n de seftales. En (Al las seoales A y B activan diferenles cascadas de fosforilaci6n de prolC{nas, cada una de las cuales produce la fosforilaci6n de la prolefna Y, pero en diferenles lugares de la prole{na. La prolefna Yse activa unicamenle cuando ambos lugares esljn fosforilados, por 10 que Iinicamenle es activa cuando las senales A y Bse hallan presentes simuhjneamente. En (B) las sefiales A y B producen la fosforilaci6n de dos prolefnas. a y b, las cuales entonces se unen entre sf dando lugar a una prote£na activa abo En ambos ejemplos las proteinas se fosforilan. Sin embargo, una forma equivalente de control puede ocurrir con el intercambio de GTP por GOP sobre una proteina que une GTP (~ase Figura 15-15).

785

Seiializaci6n via receptores de superficie celular asociados a protefnas G') Los receptores asociadas a protefnas G constituyen la mayor familia de receptares de 1a superficie celular. En malllfferos se han descrito mas de 100 miem· bros de esla familia. La mayorfa de elias han sido identificados mediante c!ollaje de llOmolog(a, en el que se utiliza 1a hibridaci6n a baja estringencia con sondas de eDNA preexiSlentes para detectar secuencias de DNA relacionadas (vease Fi-

gura 7-17). Olros micmhros de la famma se han encontrado mediante dOllnje de expresi6". utilizando sus propiedades de uni6n de ligandos 0 de aClivaci6n celular para identificarlos. Una forma de esta aproximaci6n consiSIC en capiar en moleculas de RNA una lihrerfa de moleculas de eDNA preparada a panir de celuJas 0 de Icjidos que expresan el receplor en cuesti6n, e inyeclarlas en oocitos de XenopllS. Los oocilos traducen las molec-uJas de RNA a prOleina. Estas proler· nas se insenan en la membrana plasmalica, donde pueden detectarse gracias a sus propiedades de uni6n de un ligando determinado 0 de activaci6n celular. Los receplores asociadas a proteinas G median las respueslas celulares de una enonne diversidad de moleculas senal, incluyendo hormonas, neurotrans· misores y mediadores locales. de estructura tan variada como 10 es su funci6n: la lista induye protefnas y pequenos pept.idos. aminoacidos y derivados de .kidos grasos. Un mismo ligando puede activar muchos miembros diferenles de la familia. Par ejemplo. la adrenalina puede activar por 10 menos 9 miembros diferentes de receptores asociados a prote(nas G, la acet.iJcolina a Somas y la serotonina por 10 menos a 15 de ellos. A pesar de la diversidad qurmica y funcional de las moleculas senal que se unen a ellos, todos los receplores asociados a proteina G de los que se conoce su secuencia de amino<1.cidos a partir de estudios de secuenciaci6n de DNA, lienen una estructura similar y eSlan, casi con loda seguridad, relacionados evoluliva· mente. Estan formados por una sola cadena polipeptidjca que atraviesa siele ve· ces, arriba y abajo, la bicapa Iipidica (Figura 15·17). Como discmiremos mas adelante, esta superfamilia de prolefnas receptoras Iransmembrana que atravie· san la membrana siete veces induye la rodopsina, la prole!na localizada en los ojos de los vertebrados y que es activada par la luz, aSI como los receplores olfativos de los vertebrados. En los organismos unicelulares (amblen se encuentran miembros de esta familia: un ejemplo de eUos son los receptores de levaduras que reconoccn los faCiO res de acoplarniento de las levaduras. Este motlvo estruclural tan anliguo tam bien 10 presenta la bacleriorrodopsin3, una bomba bacteriana de H' actlvada por la luz, que se discule en el Capitulo 10, a pesar de que, a diferencia de los miembros de la familia, la bacteriorrodopslna no cs lin receptor y no actlla a traves de ninguna proteina G. En Sll conjllnto, estos hechos sugieren que los receptores asociadas a proteinas G que median la sei'ialil..aci6n celula-celula en los organismos pluricelulares deben haber evolucionado a par· lir de receptores sensoriales de sus anlepasados uniceluJares. Los miembros de esta familia de receplorcs han conservado no s610 su secuencia de mninoacidos sino tambien su relaci6n funcional can llna proteina G a Iraves de la cllal transmilen al interior celular la senal que ha transportado un Ugando extracelular. En esta secci6n trataremos principalmenle de esta cadena de acontecimienlos que se inician can la activaci6n de las proleinas G.

Las prote(nas G trim~ricas transmiten la sefial intraceluJar desde los receptores asociados a prote(nas Gil, 12 las prolefnas trlmerlcas que unen GTP (proteinas G) que acoplan funcionalmente estos receplores a sus enzimas diana 0 a canales i6nicos en la membrana plasmalica son eSlructuralmente diferentes de las proteinas que unen GTP. de una sola cadena (denominadas prote(nas monomericas que unetl GTP 0 GTPasas mOllomericas). las cuales transmiten las senales intracelulares y regulan el trati· 786

Capftulo 15 : Transmlsi6n de sefiales entre ceJulas

Ftgura 15-17 D1bujo esquematico de un uecptor asoclado a protefnas G. Los receptores que unen Iigandos proleicos denen un gran dominio extracelular de uni6n fonnado por la parle de la cadena polipeptfdica que se mUC$tra en verde claro. Los receplores para Iigandos pequefios, como es la adrenalina, tienen dominios extracelulares pequenos y habitualmente ellugar de uni6n se halla incruslado en el plano de la membrana, fonnado por aminoacidos de vados de los segmentos transmernbrana. Las regiones de los dominios transrnembrana que son responsables prillcipales de ullirse a las protefnas G trimericas se mucstran en naranja, y los que se fosforilan durante la dcscnsibilizaci6n del receptor (10 cllal se discute mas adelante) se lTlueslran en rojo.

.

_.....

PflOCESQ DE cAMP

FlguralS-18 Losdosprocesos prlnclilales mediante los cuales 1a proleina G relacionada con los receplores de superficie de la ~Iula genera mensajeros inlracelulares. En ambos casas, la uni6n de un Iigando eXlTacelular altern la conformaci6n del dominio citoplasmatico del receptor, de forma que ahora puede unirse a una protefna G, la cual a su vez aCliva (0 inaclival una enzima de la membrana plasmatica. En el proceso del AMP cfclico (cAMP).la enzima produce AMP cfclico directamente. En el proceso del Cal. ,Ia enzima produce un mediador soluble (el inositol trisfosfaw, se discute mas adelante) que Iibcra Cal. desde el retfculo endoplasmlhico. Como otms pequcf'ibs mediadores intracelulares, tanto el AMP dclico como el Ca2. transmiten la sef'ial aClUando como ereclOres alostericos: se Wlen espedficamente a protefnas de la celula, alterando su conformaci6n y, por 10 tanlo. su aClividad.

PROCESO DE Cal.

co de vesfculas y muchas Olros procesos de las celulas eucariotas. Las GTPasas monomericas seran tratadas mas tarde en este y en DUOS capflUlos. Sin embargo, ambas c1ases de prolcfnas que unen GTP son GTPasas y aCllian como inlerruptores moleculares que pueden saltar entre dos estados: uno activo, cuando eSlan unidas a GTP, y otro inactivo, cuando estan unidas a GOP. En el contexto habitual. ~activo~ significa que la molecula actua como una senal desencadenando Olras procesos celuJares. Cuando un ligando eXlracelular se une a un receptor asociado a prolcfna G. el receptor cambia de canformaci6n modificando 1a prolefna G trimerica a la que esta asociado. hacienda que se desprenda del GOP y 10 reemplace por GTP. Este cambia revierte cuando la prOlcina G hidroljz.a el GTP que lIeva unido, transformandolo de nuevo en GOP. Pero mientras ello ocurre, la protefna (activa) ticne la oportunidad de difundir lejos del receptor y de Iransmilir su mensajc por la cclula, durante un perfodo de tiempo mas 0 menos prolongado. La lllayorfa de receptorcs asociados a protefnas G activan una cadena de acontecimientos que modifican la concentraci6n de una 0 mas moleculas senal intracelulares. A su vez, estas pequenas molecuJas, a menudo denominadas medladores Intracelulares (a l'ambien mellsajeros illtrace/llfares 0 segulldos mensajeros), trans£ieren la senal alterando el comportamienta de determinadas prolefnas de la celula. Dos de los mediadores intracelulares mas ampljameme utilizados son el AMP cicfico (cAMP) y el Ca2,: en la mayona de las celulas animales exiSlen direrentes mecanismos que modifican sus concentraciones y la mayana de los re ceptores asociadas a protefnas G regulan uno de los dos mediadores, como se indica en 1a Figura 15-18. 4

Algunos receptores incrementan los niveles intracelulares de AMP cfclico activando la adenil ciclasa a traves de una protefna G estimuladora (G s )13 EI AMP dcllco (Figura 15-19) fue identificado par primera vez en 1959 como un mediador intracelular de la acci6n hormonal. Ahora sabemos que actua como una Illolecula senal intracelular en todas las celulas procariot'as y animales en que se ha eSludiado. Para que el AMP cfclico aClue como un mediador intraceluSeftal.Izacl6n vfa receptores de superficlc celular asociadas a prole(nas G

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-0-'I

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FOSFATO

laT, su concenlraci6n (que normalmente es S 1O-7M) ha de poder variar. aumenlando 0 disminuyendo. en respuesta a sefiales extraceluJares: bajo la influencia de hormonas los niveles de AMP ciclico pueden variar hasta valores cinco veces superiores. en cUC5li6n de segundos. Como hemos explicado antes (vease Figura 15-10), una capacidad de respuesla como esta requiere que la rapida sfmesis de la moh~cula este compensada por una rapida degradaci6n 0 eliminaci6n de ella. EI AMP cicJico se sinlCtiza a panir de ATP mediante una enzima unida a membrana, la adenU c1clasa, y es rapida y continuamenle destruido mediante una 0 varias fosfodiesterasas de AMP deUco, que h..idrolizan el AMP cfclico hasta ade-

Figura 15-19 E1AMPcklko.se muesrra su f6rmula. un modelo espacial de varilla y un modelo de espacio !Ieno. (C. H, N, 0 Y P indican 410mos de carbono, hidr6geno, nitrdgeno, oxigeno y f6sfoTO, respeclivamente.)

nosina S'-monofosfalo (S'·AMP) (Figura 15-20).

Muchas moh~culas sel\~d cxtracelulares aetuan controlando los nivcles de AMPcfdico, alterando la aClividad de la adenil ciclasa (Figura 15-21) y no la aClividad de la fosfodiesterasa. De la misma fonna en que la misma honnona eSleroidea produce efectos diferenles en cclulas diana diferenles, dislintas cclulas diana responden de forma muy diferente a sefiales extraceluIares que alteran los nivcles intracelulares de AMP cfclico (rabla 15-1). Sin embargo, habinlalmente todos los ligandos que activan la adenil ciclasa en un detenninado ripe de cclllia diana causan siernpre el mismo efecto: por ejemplo, por 10 menos cualro horrnonas activan la adenil ciclasa en las c6111las deltejido adiposo y IOdas elias estirnul'ln la degradaci6n de triacilgliceridos (1a forma de almacenamiento de las grasas) baSla acidos grasos (vease Tabla 15-1). Los diferenles receptores para cstas hormonas activan un acervo cornun de moleculas de adenil ciclasa, a las que estan acopladas mediantc una protefna G trimerica. Como esta protcina participa en la aClivaci61l de la cnzima, se denomina proleina G esllmuladora (G. de "stimulating"l. Los individuos que son geneticamentc deficientes en G. prcsentan respucstas disminuidas a cicrtas hormonas y, par 10 tanto, t'ienen anomalfas metab6licas. anomalfas en el desarrollo de los huesos y retraso mental. Los receplores acoplados a la activaci6n de la adenil ciclasa mejor estudiados son los rec::eplores Il adrcnerglcos. los cuales median algunas de las acciones de la adre"afi"a y de la lIoradrellalitla (Figura 15-22 y vease la Tabla 15·1). Puede reconslruirse un sistema adenil ciclasa activable par adrenalina en vesfculas de fosfolipidos sinteticas, utilizando receptores 13-adrenergicos purilicados, G. y moleculas de adenil ciclasa, 10 cual indka que no se requiere ninguna otra protefna para eSle proceso de activaci6n. iDe que fonna la prolefna G. media este acoplamicnto? La respuesta depende de la estructura trimenca de la prolefna G, tal como disculiremos a cOnlinuaci6n.

Se cree que las prolemas G trim~ricas se desensamblan cuando son activadas ll . 12, 14 Una prolefna G est~ compueSla por tres cadenas polipeptidicas diferenles, denominadas a, ~ y y. La cadet/a a de las proleitlas G. (aJ se une e hidroliza GTP y 788

Capftulo 15: Transmisi6n de seiiaJes entre ~Iulas

000 I I I l)-P-O· P-O-P-Q-CH

I

I

0-

0-

I

1

0-

OH OH

;;~ AN~ O/~

\/H1~ , ' - 0 OH 0-

'oModleater8s/I de

MPclll

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-O-P-O-CH

I 0-

""..... ,

~:1!~

OH OH

Figura 15-20 SCntesis y degradacl6n del AMP cklko (cAMP). Una pirofosfatasa hace que la sinlesis de AMP cfclico sea un proceso irreversible, hidrolizando el pirofosfato ®-@que se libera en esta reaoci6n (no se muesrra).

•

COOH dominios C8tl11illCOS

Figura 15-21 La adenU c1cJasa. En los vertebrados.la enzima est;i farmada habitualmcnlc por unos 1100 residuos de aminoacido y se cree que Ilene dos grupos de seis segmenlos transmembrana que scpamn dos dominios cataJiticos citol)]asmaticos similares. En mamfferos cxisten como minima seis tipos de cstas farmas de udellil ciclasa (tipos I-VI). Todos elias cstlln estimulados porG•. aunque ellipo I, que se encuenlra prillcipalmentc en el cerebra, tamblen se estimula por complejos de en!' unidos a la praterna que une Cal., la calmodulina (de la que tralafernos mas adelanle).

aCliva la adenil ciclasa. La cadena 13 y la cadena rde las proteiTlns G. fannan un intima complejo (Pl) que ancla el complejo G. a la eara citoplasmatica de 1a membrana plasmatica al menos en pane mediante una cadena Iipidica (un grupo prenilo) que est~ anclado covalentemente a la subunidad y. En su forma inactiva, G. esta en forma de trlmero can una molecula de GOP unida a a.. Cuando G, es activada par la uni6n de un receptor activado par un Iigando, a, cambia su GOP par GTP. 5e cree que clio hace que se disocie de jly, permitiendo que a, se una a una l1lolecula de adenil ciclasa, a la que act iva a producir cAMP dclico. 5i las celulas son capaces de responder nipidamente a cambios en la COllcelltraci6n de una molecula senal cxtracelular, la activaci6n de la adcn..il ciclasa pucde ser revenida nipidamente en cuanlo el Iigando senal se disocia del receptor. Esta capacidad para responder rapidamcnte a cambios esta asegurada debido a que la vida media de la fonna activa de a. es corta: la aClhridad GTPasa de se eSlimula cuando se une a la adenil cidasa, de forma que el GTP unido a ella se hidroliza a GDP, generando a.y la adenil cidasa inacliva. Entonces, a. se vuelve a asociar con ~ydando lugar de nuevo a una molecula G, inactiva (Figura 15-23). La importancia de la actividad GTPasa en el proceso de fmalizaci6n de 13 respuesla puede ponerse de manifieslo en el tuba de ensayo. Si se loman celulas, se rompen, se abren y se exponen a un anaJogo del GTP (GTPyS) cuyo fosfalo terminal no es hidrolizable. la producci6n de AMP dc1ico tras cl tratamiento con

a.

a.

a.

Idrenalinl

Tabla 15-1 Algunas respueSlas ce1ulares Inducldas por hormonas a tra... ~s del AMP dclico Tejldo diana

Hormona

Glandula liroides hormona eslimuladora de la liroides (TSH) Coneza adrenal hormona adrenoconicotropa

Respuesta principal sintesis y secreci6n de hormonas tiroideas secreci6n de cortisol

Figura 15-22 La adrenalina. Esta hormona (tambll!n denominada epinefrina) se sintetiza a partir de lirosina y es segregada por ia gl4ndula adrenal cuando un mamlfero se estresa.

(ACTH)

Ovario Musculo 'iueso Coraron

hormona IUleinizante (LH) adrenalina paralhormona adrcnalina

Hrgado RiMn Tejido adiposo

glucag6n vasopresina adrenalina. ACTH, g1ucag6n. TSH

secreci6n de progesterona degradaci6n de gluc6geno resorci6n del hueso incremento de la frccucncia cardfaca y de la fuerza de contracci6n del coraz6n dcgradaci6n de gluc6geno resorci6n de agua degradaci6n de lriacilgliceridos

Sei'ializaci6n vfa receplores de superficie celuJar asociados a protemas G

789

protelne r8Ceptofe

,

protejna G,

adenil ciclasa

ligando sellal la uniOn delligando IIlte'lI La eoofOlmaciOn del receplor haciendo asequible un lugll' pII,e III uniOn de la proleina Go

I

ia difusl6n &f1 la bicapa pennlte .. asociaclOn de 10$ compleios Itgando-receplOf con protelnas G., disminuyendo mueho III .finidad de Go par GOP

el GOP se disocia, permitiendo que se u~ GTP; elto hace que Ia subunidad a se disocie del complejo G.. exponiendo su lugar de unIOn para la adenil ciclasa

la subunidad II sa una e la adenil clclasa, activ~ndola para producir muchas moleculas da cAMP: mientra8 tanto, 18 disociaci6n delligando hace que el fllCeptor recupere su conformacion origlnsl

la hidrolisis del GTP por la subunidad a hsce qOll Btlta subunidad fllCUpere su conformacion original, disocijndose de la ad&f1H cielan (que se vuelve InaCCiv.) y se rea$OCie con un complejo ~y fo,mando de nuevo un complejo Go

790

CapftuJo 15: Transmisidn de sefiaJes entre c€Iulas

Figura 15-23 Modelo actual que \lustra de que forma G. acopla la actlvacldn del receptor a la actlvacldn de la aden" c1c1asa. Mientras el ligando senal pennanece unido, el receptor proleico puede continuar activando moleculas de protefna G,. con 10 que se produce una amplificaci6n de la respuesta. Lo que es m;js importante, despues de que el ligando senal se haya disociado del receptor, la prOieina a. puede pennanecer activa y seguir estimulando una molecula de ciclasa durante muchos segundos, 10 cual proporciona una amplificaci6n todavfa mayor.

una hormona se prolonga enomlemente. Un fen6meno similar se observa en pacientes que sufien de cOlera, en los que 10'1 toxina bacteriana responsable de los s(ntomas de esta enfermedad inhibe el mecanismo de autoinaClivaci6n de 0:... La toxlna oolerica es una enzima que cataliza 10'1 transferencia de ADP ribosa desde NAO' imracelular a a.. La AOP ribosiJaci6n altera a. de fonna que pierde 10'1 capacidad de hidrolizar cl GTP que tienc unido. Las llloleculas dc adenil cielasa aClivadas por estas a. allcradas perlllanccen activas indefinidamente. La c[cvaci6n prolongada de [os nivelcs de AMP cfelico en las celulas cpitcliales lotestinales provoca un gran eOujo de Na' y de agua en el intestino, que es responsab[e de 10'1 sever;) diarrea caracteristica del c6lera.

Algunos receptores disminuyen los niveles de AMP ciclico inhibiendo la adenil ciclasa via una protefna G trimerica inhibidora (G j ) 11, 12,15 Una misma molecula selial puede incrementar 0 disminuir 10'1 concentraci6n in· tracelular de AMP delieo, cn funci6n de[ tipo de receptor 0'11 que se una. Cuando [a adrenalina, por ejemp[o, se une a un receptor p adrem!rgico, activa [a adenil cielasa mientras que cuando se une a un receptor 0.2 adrenergico inhibe a la enzirna. La diferencia entre ambos radka en 10'1 proteina G que acopla en cada casu estos receptores a 10'1 cielasa. Los receptores p-adrenergicos se acoplan funcionalmente a la adenil cielasa a traves de una proleina G. mientras que los receptores ll:z adrenergicos se acoplan a 10'1 misma enzima a traves de una proteina G Inhibldora (Gil. Una Gl puede contener el mismo complejo Prque lIna G. pero tiene una subunidad a. diferente (~). Cuando son activados, los receptores ~ adrenergicos se unen a 10'1 proteina Gl provocando que III se una a GTP y se disocie del complejo py. Se cree que tanto In 0.1 como el pycontribuycn a 10'1 inhibici6n de la adenil cielasa: III inhibe 1.1 adenil ciclasa, probablcmentc de forma dirccta mientras que fty puede inhibir [a sfntesis de AMP dclieo de dos maneras -direc· tamente, uniendose a 10'1 cielasa, e indirectamente uniendose a algllnas subuni· dades ~ libres de la misma celula, impidiendo aSI que activen moleculas de adenil ciclasa. Mas adelante veremos que Gj tambien actua abriendo canales de K' de 10'1 membrana plasmatica, y parece probable que esta funci6n sea mas importante que 10'1 inhibici6n de la adenil ciclasa. Mientras que 10'1 toxina colerica cataliza 10'1 ADP ribosilaci6n de 0:.. y de esta forma inactiva 10'1 actividad GTPasa de 0:., 10'1 toxina pertusica, sintctizada por 10'1 bacteria que causa la 109 fcrina, calaliza la ADP ribosilaci6n de 0.,. La AOP ribosi[ad6n de a, impide que el complejo G1 pueda intcraclunr con [os receplores, por [0 que permanece unido a GOP y pierde 10'1 capacidad de inhibir 10'1 adenil ciclasn ode abrir los canales de K'. Las protelnas G trimericas son molkulas genal extraordinariamente versatiles. En los ejemplos considerados anteriormente tanto 10'1 subllnidad a como el complejo py son componentes activos, pero en otros casas los receplores se haIlan acoplados a sus protel'nas diana unicamente a traves de 10'1 Iiberaci6n del complejo py. Ademas, los complejos Itt tam bien pueden actuar como reguladores condidonales de protefnas efectoras: por ejemplo pueden incrementar 10'1 activaci6n de algunas formas de adenil ciclasa, pero unieamemc si 10'1 ciclasa ha sido activada previamente por a,.

La protefna quinasa dependiente de AMP cklico
791

.... l

AMPclcliro

quinMIIA

in.acliva

.ubunKlad

.ubunKlad

reguladora

c.1l1litial inactiYa

+ complejo de AMP cidico Y de III.

subunidactn reguladoru

cos. A su vez, la fosrorilaci6n covalente de los residuos de aminoacido adccuados regula la actividad de la proteina. La quinasa A se encuentra en todas las celulas animales y se cree que es la responsable de todos los efectos del AMP ddico en la mayona de las celulas. (La unica funcion conocida diferente del AMP dclico en mam(feros consiste en reguJar una elase especial de canales ionicos en neuronas olfativas sensibles al olor.) Los substratos de la quinasa A son diferentes en diferentes lipos celuJares, 10 cual explica por qu~ los efectos del AMP ciclico varian en funcion de la c~lulas diana de que se lrale. En su eslado inactivo, la quinasa A es un complejo formado por dos subunidades catalflicas y dos subunidades reguJadoras que unen AMP delico. La union de AMP cfelico altera la conformacion de las subunidades reguladoras, haciendo que se disocien del complejo. Las subunidades catalilicas Iiberadas resultan activas para fosforilar especfficamenle delerminadas moltkulas proleicas (Figura 15-24). La fosforilaci6n de protelnas mediada por AMP cfclico rue demOSlrada por primera vez en estudios del metabolismo del glucogeno en c~lulas de musculo esqueletico. EI glucogeno constituye la principal reselVa de glucosa, y tanto su sfntesis como su degradaci6n en el musculo esqueletico eSlrtn reguladas par la adrenalina. Par ejemplo, cuando par cualquier causa un animal se halla asustado a en tension, su glandula sllprarrenal segrega adrenalina a la sangre, poniendo en estado de "alerta" a diversos tejidos del cuerpo. Entre Olros efectos, la adrenalina cirClllante induce a las cclllias lllllsculares a degradar su glucogeno hasta glucosa I-fosfato y a detener la srntesis de gluc6geno. La glucosa se ox.ida a traves de la glucolisis suminislrando ATP para la contracci6n muscular sostenida. De esta (orma, la adrenalina prepara a las celulas musculares para una aClividad intensa. La adrenalina se une a receptores ~ adrenergicos de la sllperficie de la celula muscular, incrementando los niveles citos6licos de AMP cfclico. A Sll vez, el AMP cfclico aCliva la quinasa A, la cllal fosforila Olras dos enzimas. La prjmera de elias, lafasfarilasa quillasa es la primera protelna quinasa que fue descubierta (1956) ya su vez, fosforila la enzima gfuc6gerlO fosforUasa, activandola para que libere residuos de glucosa a panir de la molecula de gluc6geno (Figura 15-25). La otra enzima que resulta fosforilada por la accion de la quinasa A es la gfuc6gello simasa. la cual cataliza el ultimo paso de la slnlesis de g1ucogeno a partir de g1ucosa. Mediante esla cascada de interacciones, un incremento de los Iliveles de AMP delico estimula la dcgradacion de glucogeno e inhibe su slnlesis. con 10 que aumenla al maximo la cantidad de g1ucosa disponible para la c~lula. En algunas c~lulas animales, un incremento de los niveles de AMP cfclico activa la transcripci6n de determinados genes. Por ejemplo, en las c~lulas que segregan la hormona somatosrarina, el AMP cfclico activa los genes que codifican esta hormona. La region reguladora del gen de la somatostatina contiene una cona secuencia de DNA. denominada elemenro respuesta ai AMP cfclico 792

Caprtulo 15: Transmisi6n de seiiales entre relulas

Figura 15-24 Acllvacl6n de la proterna qulnasa dcpendiente de AMP dcJlco (quinasa A). La uni6n de AMP cJclico a las subunidades reguladoras induce en elias un cambio de confonnaci6n que las hace disociarse del complejo, aClivando asrlas subunidades calalflicas. cada subunidad reguladora liene dos lugares de uni6n para AMP cfdico. y la liberaci6n de las subunidades calalflicas es un proceso cooperativo que requiere la uni6n de mas de dos mol&:ulas deAMP cfclico al temtmero. Esle hecho hace que la respucsta de la quinasa a los cambios en la concentraci6n de AMP cidico sea aguda, como discutimos mas tarde. En la mayorfa de las celulas de mamifero exU;len aI menos dos tipos de quinasas A:. la del tipo Ise halla fundamenlalmente en el cilosol mienlras que la de lipo n se halla unida a trav6 de su subunidad reguladora a la membrana plasma-liea. a la membrana nuclear y a los microlUbulos. En ambos casas. sin embargo, cuando las subunidades catalfticas son liberadas y aClivadas, pueden migrar al mideo (donde pueden fosforilar proleinas reguladoras de genes) mientras que las subunidades reguJadoras permanecen en el citoplasma. La estrucrura lridimensional del dominio proterna quinasa de la subunidad catalftica de la qUina&'1 Ase mueslra en la Figura 5-12.

Figura 15·25 Estlmulacl6ndela degradaci6n de gluc6geno por AMP cfclleo en eelulas de museulo esquelellco. La union de AMP cfcIieo a la quinasa Aact iva a esta enzima a fosforilar, y por tanto activar, a la fosforilasa quinasa, la cual, a su vez, fosforiia y activa la gluc6geno fosforilasa, la enzima que degrada el glucogeno. La quinasa Atambien incrementa, directa e indireetamente, la fosforilacion de la glucogeno sintasa inhibiendola, inactivando asf la sfntesis de gluc6geno (no se muestra).

I()$foriteilll

quina.. ,nae11ve

GLuc6GENO

GLUCOSA ,-FOSFATO

GLUCOLISIS

(eRE, de Cyclic AMP Hesponse Element), que tambicn se enCllentra en las regiones reguladoras de otros genes activados por el AMP cfclico. Esta secuencia es reconocida por una protefna especffica reguladora de genes denominada proteina de unl6n a CRE (eREB, de CRE-Binding). Cuando CREB es fosforilada por la qllinasa A sobre un residuo de serina, adquiere la capacidad de activar la transcripci6n de estos genes; la fosforilaci6n estimula la actividad transcripcional de CREB sin afectar sus propiedades de uni6n al DNA. 5i eSle residuo de serina se modifica por mutaci6n, CHEB resulra inactiva y ya no puede estimular la transcripci6n de ningun gen ell respuesta a un incremento de los niveles de AMP delico.

Diversas protefna serina/treonina fosfatasas revierten rapidamente los efectos de la quinasa A17 Normalmente es imponante que los cfettos del AMP cfclico sean transitorios, por 10 que es evidellle que las cclulas han de desfosforilar las protefnas que han sido fosforiladas por la quinasa A. En generalla desfosforilaci6n de las serinas y las treoninas fosforiladas eSla catalizada por cuatro grupos de fosfoproteina serina/treonlna fosfatasas -las prolefna fosfalasas I, llA, liB Y lie. Excepto para el caso de la protein a fosfatasa IIC (que es una fosfalasa poco imponante, no relacionada con las olras), las demas fosfatasas eSlan compueslas por una subunidad calalftica hom610ga que forma un complejo con una 0 mas subllnidades reglliadoras. La proce{lIa fosfarasa I juega un importanle papel en la respuesta al AMP cfclico, como veremos a continuaci6n. La prole£nafosfarasa IIA tiene una especificidad muy amplia y parece ser la principal fosfatasa responsable de reverlir muchas de las fosforilaciones catalizadas por serina/lreonina quinasas; juega un papel importante en la regulaci6n del cicio celular. La proteillafosfatasa liB, lambicn denominada calcineurilla, es activada por Ca2~ y es especialmente abundante en el cerebro. La actividad de cualquier proteina rcgulada por fosforilaci6n depende del balance en un instante dado entre las actividades de las quinasas que la fosforiIan y de las fosfatasas que constantemente la eSlan desfosforilando. La proteina fosfatasa I es responsable de la desfosforilaci6n de muchas de las protefnas que son fosforiladas por la quinasa A. Par ejemplo, inactiva la CREB eliminando su Sefializaci6n vfa receptores de superficie eelular asociados a protefnas G

793

fosfato activador, inactivando asf la respuesta Iranscripdonal causada por un incremento de los niveles de AMP dclico. En las celulas del musculo esqueletico, la prolefna fosfatasa I desfosforila cada una de las tres enzimas dave del metaboIismo del gluc6geno que, como hemos mendonado anles, resultan fosforiladas par la quinasa A en respuesta a la adrenalina, y hacen que la celula cambie de una situad6n de sfntesis de gluc6geno a oHa de degradaci6n. La prOlefna fosfatasa I tiende a contrarreslar cslas fosforilaciones, pero en las celulas musculares activadas por adrcnalina Sll aClividad eSla suprimida por otra enzit~la diana de la quinasa A, que es una protef"a j"lljbidom de fosfatasas espedfica. Cuando esta protefna inhibidora es fosforilada por la quinasa A, se une a la protefna fosfatasa I inactivandola (Figura 15-26). Activando la fosforilasa quinasa e inhibiendo simultaneamente la acci6n opuest'a de la proleina fosfatasa I, la quinasa A genera un cambio mucho mayor en el metabolismo del g1uc6geno del que podrfa obtener mediante su acci6n a traves de una sola de eslas enzimas. Habiendo discutido de que forma las proteinas G trimericas acoplan los receptores a la adenil ddasa allerando los niveles de AMP dclico en las celulas, ahora consideraremos de que forma las proleinas G acoplan los receptores a alra enzima crucial-Iafosfolipasa C. La aClivaci6n de eSla enzima conduce a un incremento de la concentraci6n de Ca 2• en el citosol, y el Cal. es utilizado, de una forma incluso mas general que el AMP ddico, como mediador intracelular.

Para utilizar el Ca2. como seiial intraceluJar, las cfHuJas han de mantener los niveles basales de Ca2+ muy bajoslll La concenlrad6n de Ca~' Iibre en el dlosol de cualquier celula es extremadamente baja ($ 10-7 M), mientras que Sll concentrad6n en el nuido eXlracelular (_10-3 Mf yen el reticulo endoplasmatico (ER) es alta. Asf pues. existe un ellorme gradiente de Ca2< que tiende a llevar Ca 2• hacia el dtosol, lanto a traves de la membrana plasmatica como a traves de la membrana de EH. Cuando una seflal abre transitoriamente los canales de Ca 2 • en alguna de eSlas dos membranas, el Ca 2• nuye precipitadamenle al citosol. incrementando dramalicamente la concentraci6n local de Caz. y activando mecanismos celulares sensibles a Caz'. Para que este mecanismo de seiiaHzaci6n sea funcional, es necesario que la concentrad6n de Cal. en el dlosol se manlenga baja, 10 cual se consigue de dife-

Plgura 15-26 Papel de lit protelna rosratasa I enla rcgulacl6n del metaboUsmo del gluc6gcno por el AMP dcllco. El AMP ddioo inhibe la protefna rosratasa I, que en caso contrario podrla oponerse a la reaoci6n de rosrorilaci6n estimulada por el MiP ddioo. E110 ocurre ya que la quinasa A rosrorila a la protefna inhibidora de la roSratasa, la cual entonces se une a 10 rosratasa I, inhibiendola.

• "'l - .---

LA UNION DE LA PROTEiNA lNHIB1DORA FOSfORILADA INHIBE LA PROTEINA FOSFATASA

794

Capitulo 15: Transmlsi6n de seiiales entre celulas

-

rentes fomlas. Todas las ccluJas eucariotas tienen en su membrana plasmc1lica una ATPasa que uliliza la energfa de la hidr6lisis del ATP para bombear Cal. ha· cia el exterior del chosol. Las celulas tales como las musculares y las nerviosas. que utilizan de forma intensa el sistema de sefializaci6n del Ca2., disponen en su membrana plasmc1tica de OlTa bomba de Ca2. adicional, que acopla el eflujo de Ca2. a un innujo de Na'_ Este intercambiador Ca2··Na· tiene una afinidad por el Ca2• relativamente baja. por 10 cual unicamente actua de forma eficiente cuando los niveles citoplasmc1ticos de Ca2. aumentan 10 veces por encima de sus valores normales. tal como ocurre despues de que una celula nerviosa 0 una celula muscular hayan sido estimlliadas repetidnmenle. En In membrana de ER exisle otra bomba que lambicn desempei'm un papel importanle en el manlenimienlo de una concenlTaci6n baja de Ca2' en cl cjtosol: esta ATPasa dependiente de Ca2• perrnite al ER capmr grandes canlidades de Cal. del citosol, en contra del gradieme de concenlraci6n y aunque los niveles de Ca2. en el cilosol sean bajos. HabituaJmeme, la concemraci6n de Ca2• libre en el citosol varia desde 10-7 M cuando la relula estc1 en reposo. hasta alrededor de 5 x lQ-6 M cuando esta aclivada por una senal exuacelular. Sin embargo, cuando la cclula estc1 danada y no puede extraer Cal. del citosol de forma eficiente. la concentraci6n de Ca2. puede aumentar de forma peligrosa (>I~ M). En estas circunstancias, comienza a actuar una bomba de Ca2. de baja actividad pero gran capacidad. siluada en la membrana interna de la mitocondria. y utiliza el gradiente elcctroqufmico generado a traves de esta membrana durante las etapas de transferencia de electrones de la fosforilaci6n oxidativa, para extraer Ca~' del cilosol importandolo a la milocondria. En la Figura 15-27 se resume este mecanismo.

El Ca2 • actua como un mensajero intracelular ubicuO l9 La primera evidencia dirccla de que el Ca2• actua como un mediador inlracelular proviene de un experimenlo reali7..ado en 1947, que demostr6 que la inyecci6n intracelular de una pequefia cantidad de Ca2. provoca la contracci6n de las fibras musculares esqueh~ticas. Rccienlemente se ha puesto c1aramenle de manifiesto que el Ca2. actua. como un mensajero intracelular en una amplia. gama. de respueslas celularcs. entre las que se pueden destacar la secreci6n y la proliferaATPasa dependieme de Cal. en la membrana del retlculo

Figura 15·27 Controles de la concentJ"ltcl6n c1tos6Uca de Ca Zo • EI dibujo muestra un esquema de los mecanism05 principales a lra\~ de 105 euales la etHula mantiene muy bajas las concentraciones de Cal. ell el cilosol, ell contra de elevadas eoneentraciones de Cal. en el fluido eXlrncclular. EI Cal' es bombcado aetivamellle des<1e el cilOSOI al exterior de la e~lula (Aj yal interior de Ell (B). Ademas, en la eelula existen varios tipos de Illoleeulas que unen Cal. Iibre. La milOeondria tambien puede bombear Cal. eXlrayendolo del citosol. pero 5610 10 haee de (omla eficlenle cuando los niveles de UtI. son cxtremadamente altos -habitualmente como resuhado de una a1teraci6n de la eelula.

mot6cuJal del ciloplasma que unen Cl l •

importatIOn ao;:tjva de Cal.

en la mitocondria

endoplalmiltico mllmbrana plnmMicll

transportto 0. inter~mbio de c. 20 impulpdo pol" Na'

retlculo elHk>plaamillico

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Seiializaci6n vfa receptores de superficle celular asociadas a protefnas G

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795

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t""'o,I.IO

ci6n celular. Sc han definido dos procesos en la sefializaci6n par Caz'. uno de eUos milizado principalmente por c~lulas con actividad eleclrica (excitables) yel arm uLilizado por casi lodas las celulas eucariolas. EI primero de eSlOS procesos ha sido panicularmenle bien eSludiado en las celuJas nerviosas, en las cuales la despolarizaci6n de la membrana plasmatica provoca un influjo de Caz, a1 inlerior del lenninal nervioso iniciandose la secreci6n de un neurotransmisor: el Ca~· entra a traves de canales regulados par voltaje que se abren cuando la membrana plasmatica dcllerminal nervioso se despolariza por un potencial de acd6n que IJcga hasta elterminal (vease Figura 11-34). En el segundo proceso. que es ubicuo, la uni6n de moleculas senal extracelulares a receplores de superficie celular provoca la liberaci6n de Caz, del ER; los acontccimielllOS que ocu· rren en la superficie celular esH1n acoplados a la apertura de los canales de Caz, del ER a traves de Oint molccula mensajera intracelular, el illositol trisfosfato (Figura 15-28), como discutiremos despues.

Algunos receptores relacionados con protefnas G aclivan el proceso de senalizaci6n de fosfoHpidos de inositol activando la fosfolipasa C-(320 En 1953 se sugiri6 por primera vez que los fosfolfpidos de inositol (fosfoillosftidos) desempeflan un cicrto papel en la transducci6n de la sci;al cxtracelular, cuando se descubri6 que algunas moleculas seflal extracelulares eSlimulan la in· corporaci6n de fosfato radiacljvo a fosfatidillnositol (PI, de phosphatidylinosj· tol), una c1ase minoritaria de fosfolfpidos de las membranas celuJares. Mas larde se descubri6 que eSla incorporaci6n se produce par la degradaci6n Yposlerior sfntesis de fosfolfpidos de inosilOI. Se encontr6 que los fosfolipidos de inositol mas imponantes en 101 lransducci6n de la senal son dos derivados fosforilados del PI, el PI-fosfato (PIP, de PI-phosphate y el PI-bisfosfalO (PIP]). Se cree que ambos compueslos se hallan localizados principalmente en 101 carOl imerna de la membrana plasmatica (Figura 15-29). A pesar de que en las membranas de las c~lulas animales el PIP! es menos abundante que el PI, es 101 hidr61isis de PIPzla que es realmenle imponame en el proceso de sefJ.alizaci6n. La cadena de acontecimientos que Ueva a la rotura dc PIP z• empieza con la uni6n de una molecula senal a un receptor unido a 101 protefna G de la membrana plasmatica. Se ha demoslrado que mas de 25 receptares de superficie diferen· les utilizan esta via de Iransducci6n; en la Tabla 15-2 se presentan varios cjcm· 796

CapfluJo 15: Transmisi6n de sefiales entre c€lulas

Figura 15·2.8 Dos procesos comunes Irllv& de los cuales el ea!' puede entrar en el cltosol en respuesta II seftaJes extracelulares. En (Al el Ca~' entra a un lenninaJ nervioso desde el lluido extracelular a lraves de canales de Caz. regulados por vohaje, cuando la membrana dellermjnal nervioso es despolarizada por un potencial de acci6n. En (B), la uni6n de una mol~ula senal extracelular a un reeeplOr de superficie celular genera inosilollrisfosfalo, el cual eSlimuia la Iiberaci6n de CaZ' desde el ER. II

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PI qulnna

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2

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Figura 15-29 Los fosfoUpldos de Inosllol (fosfolnosflidos). Los fosfoinosflidos (PIP y PIP1) se producen par fosforilaci6n del fosfalidilinosilol (PI). A pesar de que los Ires fosfol1pidos de inositol pueden degradarse en el proceso de respucsla a una set\al, 1a degradaci6n mlls critica es 18 de P1Pl' a pesar de que es el menos abundame, ya que constilUye menos del 10% dellotal de Upidos de inositol y menos dell'" deltolal de fosfolfpidos.

I

Pl41osf.lo (PIP)

PI A,5-bisfc.fato {PlP2J

plos de respueslas mediadas de esta forma. Los detalles del proceso de activaci6n no son tan bien conocidos como los del AMP cfclico, pero existen evidencias creciemes de que en la membrana plasm3.1ica actua el mismo lipo de mecanismo constituido por varias elapas. Un receptor aClivado cslimula a una protefna G denominada G", la cual, a su vez, aCliva unafosfoUpasa Cespecifica de fosfoillosiwles, denominada fosfollpasa C-p. En menos de un segundo, esta enzima degrada el PlP2 generando dos producloS: inosiwl trisfosfow y diad/gUarol (Figura 15-30). En este pUlltO, el proceso de setiaJizaci6n se bifurca en dos ramas. Ambas molcculas juegan papeles cruciaJes en la senalizaci6n celular, por 10 que las consideraremos par sepamdo.

EI inositollrisfosfato (JP3) acopla la activaci6n del receptor con la liberaci6n de Ca2 del ER 21 t-

Ellnositol trlsfosfalo (IPJ producido por la hidr6lisis de PlP2 es una pequena molCt:ula hidrosoluble que se libera de la membrana plasm(tticn y difunde nipidamente par todo el citosol. Alii, libera Ca 2• del ER unicndose a callales liberadores de or' semibles a IP3 de la membrana del ER. Los canales son estructural-

Tabla 15-2 Algunas respuestas celulares medladas por receptores unldos a protcfnas G, acoplados al proceso de seiializaci6n de los fosfolJpidos de inositol TeJldo diana

Molkula seiial

Respuesta principal

Hfgado

vasopresina

P~ncrcas

acelilcolina acetilcolina anUgeno trombina

degradaci6n del gluc6gcno secred6n de amilasa contracd6n secrcd6n de histamina agregaci6n

MUSCll]O lisa ~Iula cebada Plaquctas sangufneas

Senallzad6n vfa receptorcs de sllperficle celular asociadoS:1 prolcfnas G

797

de ..

QdenM cIII kidol ( I f ' " del extefior lipkIlc:.I de" membrana pl..rnMlu

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c:MIiInaI de 6cicSoIc ~ dIiIlllleriGl' de .. ~ IlpidiU de I. rMf1'Itlr-.

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ACTIVA LA PROTEfNA aUINASAC

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LIBERA Cll~' oeSOE EL RETlcULO ENOOPlAsMAnco

o~

inoIil:oll,4,s-trisfosfato CIP:II

mente simiJares a los canales de Iiberaci6n de Cal. (receptores de riatlQ(/itla) del reticulo sarcoplasmatico de las cl!lulas musculares. los cuales Jiberan el Cal. que desencadena el proceso de contraccion muscular (vease Figura 16-92). Ambos opos de canales estan reguJados por retroalimentaci6n positiva, ya que el Cal. Jiberado puede unirse a los canales incrementando aun mas la liberaci6n de Cal•. Ello hace que la liberaci6n de Cal. OCllrra de una manera repcntina. lipo ~todo 0 nada". En tlluchas cl!lulas inclllycndo las cl!lulas musculares. sc encuenlran ambos tipos de canales liberadores de Cal•. Para aeabar la respuesta inicial de Ca 2• aetoan dos mecanismos: (I) ellP3 es rapidamcnle desfosforilado (y asf illactivado) mediante fosfatasas especffieas, y (2) el Cal. que enlra ell el cHosol es rapidamente bombeado hacia el exterior, principal mente hacia el exterior de la celu.la. Sin embargo no todo el IP, es desfosforilado: algunas moteculas son fosforiladas hasta 1,3,4.S·tetraquisfosfato (IP 4J. el eual puede mediar respuestas lentas pero mAs prolongadas en la celula 0 facilitar la recuperaci6n de las reservas intraeeluJares de Cal. a panir del fluido extraeeluJar, La enzima que cataliza la producci6n de IP. se activa por un incremento de la collcentracion citosolica de Cal. inducida por Wv 10 cual constiluye una forma de relroaJimellfaci6n negativa de los niveles de lP3'

A menudo las oscilaciones de Ca2. prolongan la respuesta inicial de Ca2. inducida por IP,22 Cuando se ulilizan incUcadores Ouorescentes sensibles a Cal•• como la aecuorina a fura-2 (se discUie en el Capftulo 4) para estudiar las variaciones de los niveles citos61icos de Cal. en celuJas individuates en las que se ha aClivado el proceso de sCI1alizacion de fosfolfpidos de inositol, a menudo se observa que la senal inicial de Cal. se propaga como una ola a traves del cirosol desde una zona localizada 798

Cap(luJo 15: Transmisi6n de scnales enlre celulas

Figura 15-30 Hldrollsls de PI.P}. La hidr6lisis de PIP} produce dos mediadores intracelulares: el inositol trisfosftlto (lP). el cual difunde a lrares del cilosol y provoca la Iiberaci6n de Cal. desde el ER. yel diacilglicerol. que pennanece en la membrana ycolabora en 1a aClivaci6n de la enzima proleCna quinasa C (v~ase mts ade1ante). AI menos exislen tres clases de fosfolipasas C-fl, 1 Y&- y es la de c1ase pIa que se aetiva por re<:eplores unidos a protefna G. Mts adelanle veremos que la c1ase les activada por olra c1ase de receptores, denominados rereptores tirosirw quinasa. que aclivan el proceso de senalizaci6n de fosrolfpidos de inositol sin ninguna prole(na G intermediaria.

Figura 15·31 Induccl6n de osclladones de ea:' en una celula heptitlC8 por vasopreslna. La c~lula rue cargada con la proleina sensible a Caz'. aecuorina, y a cominuaci6n rue expuesta a concentraciones creciemes de vasopresina N6tese que la frecuencia de las espigas de caz. aumenta a medida que aumenta la concentraci6n de vasopresina, pero que la amplitud de las espigas no se ve afectada. (Adaplado de N.M. Woods, K.S.R. CUlhbenson y P.H. Cobbold, Nature 319:600·602, 1986.01966 Macmillan Magazines Ltd.)

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70

de la c~lula, Ademas, a menudo cl incremento transitorio inicial de la concenuaci6n de Cal. viene segujdo por series de "espigas~ de concenlTaci6n de Cal., cada una de las cuales tarda en producirse del orden de segundos 0 minutos; estas oscllaclones de Caz. puetlen persistir mlentras los receptores se mantengan activados en la superficie de la c~lula (Figura 15-31). EI mecanismo responsable de la propagaci6n de las olas de Cal> y de la generaci6n de las oscilaciones no es conocido con certeza, a pesar de que se han propuesto una gran cantidad de modelos para explicarlo. En la mayorfa de estos modelos tanto la propagaci6n como las oscilaciones dependen de una retroalimentaci6n positiva, en la que el Cal> activa su propia Iibcraci6n produciendo una espiga de Cal. del "Iodo 0 nada". Los modelos se diferencian eOlre sf principalmcnte en considerar si el Cal. actua directamente sobre los canales de Iiberaci6n de Cal. del ER estimulando su propia Iiberaci6n, 0 bien si actua indireclamente incrcmenlando la actividad de la fosfolipasa C, generando asf oleadas de 1P3 que, a su vez, inducirfan olcadas de Iiberaci6n de ealo. EI significado biol6gico de las oscilaciones de Cal. lambien es incierto. A menudo su frecuencia depende de las concentraci6n delligando sef'ial extracelular (Figura 15-31) y puede, en principio, traducirse a respuesta celular dependiente de frecuencia, En c~lulas de la hip6fisis secretoras de hormona, por ejemplo, la estimulaci6n par una molecula sefial extracclular induce espigas rcpetidas de Cal>, cada una de las cuales eSla asociada con un pulso de secreci6n de honnona. Se ha sugerido que este hecho puede maximizar la secreci6n impidiendo los efectos t6xicos de un incremento soslenido de la concentraci6n citos6lica de Ca2,.

El diacilglicerol activa la protefna quinasa C (quinasa C)23 AI mismo tiempo que ellP3 producido por la h.idrolisis del PIP2 incrementa la concentraci6n de Cal, en el cilOSOI. el otro producto de hidr6lisis -el dlacUglicerolejerce efectos baslanles diferentes. Tiene dos papeles funcionales potenciales. En primer lugar, puede ser posleriormente degradado, liberando acido araquid6nico que puede actuar como mensajero 0 ser utiJizado en la sfOlesis de eicosanoides (vease Figura 15-6); En segundo lugar, y mucho mcis imporrante, activa una protefna scrina/treonina quinasa que fosforila varias protefnas de la c~lula diana. Scl\aUzacl6n vfa receptores de superflcle celular asociados a prolefnas G

799

La enzima aClivada por el diacilglicerol se denomina prolcfna qulnasa C (qulnasa C 0 PKC de Protein Kinase C), debido a que es dependiente de Ca 2+. Se cree que el incremento inicial de la concentraci6n citos61ica de Ca2+ inducido por 1P3 altera la quinasa C, traslocAndola de la cara cilos61ica de la membrana plasmatica a la eara citoplasmalica. Se activa par la combinaci6n de Ca2+, diacilg1icerol y el fosfolfpido de membrana cargado negativamente, fosfatidilserina. De las ocho 0 mas isofarmas diferentcs de la quinasa C en mamfferos, al menos cualro son activadas por diacilglicerol. Como el diacilglicerol producido inicialmente par la rotura de PIPl es rapidamente metabolizado, no puede mantener la actividad de la quill3S3 C como seria necesario para oblener respuestas mantenidas como la proliferaci6n 0 la diferenciaci6n. La aClivaci6n prolongada de la quinasa C depellde de una segunda ola de producci6n de diacilglicerol catalizada por fosfolipasas que rompen el fosfolfpido principal de la membrana fosfalidilcolina. No se conoce c6mo resultan aClivadas estas fosfolipasas que acttinn retrasadas. Cuando la quinasa C es nctivnda fosforila residuos delerminados de serina 0 de treonina de protefnas diana, las cunles varfan en funci6n del tipo de celula de que se (rate. Las mayores concentraciones de quinasa C se han cncantrada en el cerebra, donde (entre atras cosas) fasforila canales i6nicas de las celulas nerviosas alteranda sus propiedades y, par 10 Ian to, variando la excitabilidad de las membrana plasmatica de las celulas Ilerviosas. En muchas celulas la activaci6n de la quinasa C incremenm la transcripci6n de delenninados genes. Se conocen par 10 menos dos procesos. Ell uno dc elias, la quinasa C aCliva una cascada de protefnas quinasa que conduce a la fosforilaci6n, yactivaci6n, de una prOleina reguladora de genes unida a DNA; en el otro proceso, la activaci6n de la quinasa C conduce ala fosforilaci6n de una proleina inhibidora, Iiberando asf una proteina ciloplasmalica reguladora de genes que puede migrar aI nucleo y cslimular la tTan.sc:ripci6n especifica de deterrninados genes (Figura 15-32).

OUlNASA C INACTIVA

OUINASA C ACTIVA

MEMBRANA PlAsMAnCA

•

NF-KB

c

1

N(JCLEO

:J

-..

SRF

"en

CITOSOL

Elk-l

5"

lugar de uniOn a NF-ICB

regiOn codif.c.nte

regi6n codif.c.nte

NO HA,VTRANSCRIPCI6N

OE lOS GENES 1 V 2

800

Cap((ulo 15: Transmisl6n de senales entre celulas

TRANSCRIPCION ACTIVAOA DE LOS GENES 1 V 2

Figura 15-32 Dos procesos lntracelulare5 mediante los cuales 18 quinasa. C activo puede actlvar la lrans4::rlpcl6n especffico de determlnados genes.. En uno

de eUos fjlechas rajas), la quinasa C activa una cascada de fosforilaciones que conduce a la fosforilaci6n de una protefna quinasa clave, denominada MAP qui/JaW (sc discute mas adelante), la cua!. a su vez, fosforita y act iva la protefna reguladora de genes Elk-I. Elk-l se halla unida a cortas secuencias de DNA (denominadas e/ememos de respllcsta sirka. SRE, de serum Response Elements) en asociaci6n con otra protefna de uni6n al DNA (denominada!actorde respuesta sirica, SRF, de serum Response FaclOr). En el 01rO proceso (flechas wrdes) la activaci6n de la quinasa C conduce a la fosforilaci6n de he+B.la cual libera la protefna reguiadora de genes NF-ICB de fomla que ahora puede migrar haSla el m'icleo y allf aetivar la transcripci6n de determinados genes.

mol6cula leflal extracelular fosfolipasa Cop activada

dlacilglicerol

PIP~

ESPAC10 EXTflACELULAR

;~~~ii;iEE~;~~;~~~~~~~;~==~~==I~;;=~"I~ it

mOWL

.eceptor ae:tlvado

..

,Pl prOle'na

~

esaSI N

PLASMAnCA MEM8RANA

mi.....tlz.do po. ...e.el d.lorbol

aetivada mimetil.cto por lonOlorol de lo

c.

USERA c.J+ OELREOcuLO

FOSFOftllA PROTEINAS CELULARES

ENOOf'\.ASMAnco

En In Figura 15-33 se muestra cada una de las dos ramas del proceso de seflalizaci6n de fosfolfpidos de inositol. Como se indica en la figura. cada rama del proceso puede ser mimetizada mediante la adici6n a celulas inlactas de agentes farmacol6gicos espccfficos . Los efectos de 1P3 plleden ser mimetizados utilizando un jOlloforo de CU". como el A23187 0 la ionomjcina, los cuales permhen que el Ca 2• entre al chosol desde ellfquido extracelular (se discute en el Capftulo II). Los efectos del diacilglicerol se pueden mimetizar por esteres de forOO/, productos vegemles que se unen a la quinasa C y la activan directamente. Utilizando estos reactivos, se ha podido demostrar que, a menudo, las dos ramas del proceso colaboran produciendo una respuesta celular complera. Por ejemplo, algunos tipos celulares pueden ser estimulados a proliferar en cultivo cuando son tratados con ion6foros de calcio y con un activador de la quinasa C. pero no si se tratan con uno solo de ambos reaclivos.

La calmoduHna cs un receptor intracelular de Ca2.. ubicu0 24 Habilllaimente la coneentraci6n de Ca 2 • libre en el citoplasmn cs s; 10-7 M Ygcncralmcnte no aumenla por encima de 6 x 10-6 M, incluso aunqlle In e~lllla este aetivada por un influjo de Ca 2•. Asf, eualquiera que sea la estructum de la celula que aetlie directamcnte como diana para la regulaci6n dependicnte de Ca 2• deben1 tener una const3nle de afinidad (K..l para el Ca2. de unos J06 litros/mol. Ademas. como la concentraci6n de Mgl' en el citosol es relalivamente constantc (alredcdor de 10-3 M), estos lugares de uni6n aJ Ca 2• deberAn presentar una sclectividad para el Cal< sobre cl Mgl' de un as 1000 veces como mfnimo. Se COIlOcen varias prOlcfnas que unen Ca 2 ', que cumplen estos requisitos. La primera prolefna de este tipo que se descubri6 es la tropotlitla C de las celulas del mlisculo esqueletico; en el Capftulo 16 se discUl'e el papel de eSla proteina en la contracci6n muscular. En todas las celulas animales y vegelales en que se ha estudiado. se ha encontrado otta prmeina que une Ca2', estrechamen· te relacionada con la troponina C, denominada calmodullna. Una celula animal tipica contiene mAs de 107 molecuJas de calmodulina, 10 cual significa aproximadamenle el 1% de la masa tOlal de prolefna de la celuJa. La calmodulina aetua como un receptor intracelular polivaJenle de Ca2. que media la mayorfa de los procesos regulados par Ca 2'. Se trata de una cadena polipeplfdica altamente conservada. de unos 150 residuos de aminmkido, con cuatro lugates de uni6n con una alta afinidad para el Ca 2'. Cuando une calcio, la calmodulina Sllfre un imponame cambio de confonnaci6n (Figura 15-34A). SCiia1iza<:l6n via receptores de superficie celular asocIadas a protelnas G

FIgura 15·]3 Lasdosramasdel proceso de los fosfolfpidos de inositol. EI receptor. una vez activado, se unea una proteina G trimenca especffica (G,,) haciendo que la subunidad a se disocie y active la fosfotipasa C-~.Ia cual rompe el PIPzgenerando IPJ y diacilglicerol. EI diacilglicerol (junto con el Ca2. que lIeva unido y can fosfalidilsenna -no se mueSlra en el dibujO). actlva la quinasa C. Tanto la fosfolipasa C-Ii como la quinasa C son enzimas solubles en agua que, al activarse. se lranstocan desde el citosol hasta la cara interna de la membrana plasm,hica. Los efeclos de IP) pueden seT mimelizados expenmentalmente en celulas intactas mediante el trat8mlcnto con ion6foros de Ca 2 • rnientras que los crectos del diacilglicerol pueden seT mimctizados mediante eltratamiento can estcTes de forbol, los cuales se unen a 1a quinasa C actiVlilldola.

801

.... Figura 15-34 Estructura del complejo

ca2 '-calmodullna, basada sobre

2 om

HDOC

1

NH,

{"

{Aj

La activaci6n a1osl~rica de la calmodulina por el Caz. es analoga a la aClivaci6n aloslerica de la quinasa A por el AM P cfcLico. con la diferencia de que el Ca~'-calmoduLina no tielle actividad enzimatica sino que actua unielldose a atras protefnas. En algunos casas, la calmodulina actlia como una sub· unidad reguladora permanente de un complejo enzimatico, perc en la mayorfa de los casas la uni6n del Ca 2• induce a la calmodulina a unirse a varias protefnas diana de In celula, alterando su actividad. Cuando el complejo Ca2'- calmodulin3 se une a su prolcfna diana puede suffir un cambia de conformaci6n posterior

complejo

mucha mas importanle (Figura 15-348), De entre las protefnas diana reguladas por el complejo Ca2·- calmodulina. va-

rias de eUas son enzimas 0 prmem8S de transporte a lra~ de la membrana_ En muchas celulas, por ejemplo, el complejo Cal'-calmodulina se une. activando, la Cal··ATPasa de la membrana plasm~tica, la cual bombea Cal. hacia el exterior de la celula. Asi, si la concenuaci6n de Cat. en el citosol aumenta, la bomba se aCli· va. 10 cual contribuye a que los niveles citos61icos de Cal. vuelvan a los valores normales. Sin embargo.la mayor parte de los erectos del complejo Ca2·- calmodu· lina son mas dircctos y estan mediados por prorefna quillasas depefldiemes de QT·-calmodulifla.

En las c~lu1as animales la mayor(a de acciones del Ca2+ se producen a trav~s de protefna quinasas dependienles de Ca2+-ca1modulina (quinasas CaM)2S La mayoria de los erectos de Ca2. en las celulas animales estan mediados por rosforilaciones de prolefnas catalizadas par una familia de proleCna quinasas dependlenles de Cal'-calmodulina (quinasas CaM). Estas quinasas fosforilan residuos de serina 0 de treonina de detenninadas protemas y, como en el caso del AMP delko, la respuesta de una celuJa djana a un incremento de la concentra· ci6n de Ca2, libre en el citosol depende del lipo de qujnasas CaM reguJadas de que disponga la celuJa. Las primeras quinasas CaM que se descubrieron -Ia qui· nasa de la cadena ligera de la miosilla, que acliva la contracci6n del musculo liso, y lafosforilasa quillasa, que acliva la degradaci6n del gluc6geno- presentan una especificidad de substrata muy aha. Mas recienlemenle, sin embargo, se han identificado a1gunas quinasas CaM con una especificidad mc1s amplia, y que parecen ser las responsables de mediar muchas de las acciones del Ca2. en las celulas animales. EI ejemplo mejor estudiado de una quinasa "multifuncionar Cd··calmodu· tina es la quinasa·CaM II, que se encuentra en todas las celulas animales pero 802

Capitulo 15 : Transmlsi6n de senales entre cBulas

estudlos de dlfracd6n de rayos X y de resonancla magn~tJca nuclear (NMR, de Nuclear Magnetic Resonance). (A) La molocula parKe una ~pesa de gimnasia-. con dos cabezas g10bulares conectadas mediante una larga h~lice f.( expuesta. Gada una de las dos cabezas tJene dos dominiosde unl6n al cal., cada uno de los cuales est:!. constituido por un lazo de 12 residuos de aminm'icidos cn el que algunas cadenas lalerales de :tcido asp:trtlco y de addo glulamlco forman enlaces i6n.icos con el Ca 2 '. Los dos lugares de uni6n al cal. del eXlremo carboxilo lenninal de la moltkula tienen una afinidad par el Cal. diu VKCS superior a \a del extrema amino terminal. En soluci6n la molkula e5 flexible, moslfando un abanioo de form as, desde formas eXlendidas (como la dc la figural hasta formas mas compactas. (D) Cambios eslructurales del complejo Ca l'-ca1modulina que ocurren cuando este se une a una prolefna dIana (en CSle ejemplo. un peplido que contiene un dominio de uni6n para Cal'-calmodulina de una prolerna quinasa dependiente de Cal._ calmodulina Iia quinasa de la cadena ligera de la miosina. lratada mas adelantel). N61ese que eI comple;o Cal'-calmodulina se dobla como una "navaja de bolsillo" abrazando al peptido. lA. basado en dalos de crislalograffa de rayos X de Y.S. Babu el at. Natllre315:37-40. 1985. C 1985 Macmillan Magazines Ltd.; B, basado en datos de crislalograffa de rayos X de W.E. QUiocho, Science 257; 1251- J 255, 1992, Yen dalos de NMR de M. lkura el al.. SciCllce 256;632-638, 1992. e the MAS.)

prolelnll fosfatasa

P,

dominio Inhibidor

INDEPENDIENTE DE Ca" (50-80% ACTIVO)

dominio CIlllllftieo

Ca" -i:llimoduline

lIutofoslorilKi60

COMPlETAMENTE ACllVO

especialmcntc cnriquecida en el sistema nervioso. Constimye hasta el 2% de la masa total de prolelna en algunas regiones del cerebro, a1tamenle concentradas en sinapsis. Por ejcmplo, cuando las ncuronas que utilizan catecolaminas (dopamina, noradrenalina 0 adrcnalina) como neurotransmisores) son activadas, el innujo de Ca 2• a traves de canales de Ca 2• regulados en sus membranas plasm:1li-

cas induce a la ccluta a scgregar su ncurotransmisor. £1 inllujo de Ca2. tambicn haec que la quinasa CaM II se fosforile, aClivandose, y activando a la firasi"a hidroxUasa, la cual es In enzimu rcguJadora de flujo de In sfntesis de calecolaminas. Dc eSla forma, cuando la celula se activa se estimliia lanlO la secreci6n como la s(ntesis del ncurotransmisor. L.'l qllinasa CaM II lienc una propicdad deslacable: pllede actuar como un dispositivo de memoria molecular, colocandose en un estado activo cuando es expuesla a Caz'-calmodulina y permaneciendo activa incluso despues de que la concentraci6n de Caz, haya bajado. Ello es debido a que la qllinasa se fosforila a ella misma (un proceso denominado awofosforilaci6r1), lal como fosforila a otras prolefnas celulares cuando es activada par Ca 2·-calmodulina. En su estado autofosforilado la enzirna permanece activa en ausencia de Ca~', prolongando asf la duraci6n de 1'1 aClividad de la quinasa despues de que acabe la senal inicial activadora de Ca~'; la aClividad se manliene hasla que las fosfalasas abaten la actividad autofosforilativa de la enzima, inhibi~ndola (Figura 15-35). Debido a estas propiedades, la aClivaci6n de la quinasa CaM II puede ser utilizada como una memoria lraza de un puJso de Ca~' anterior, y aJ parecer juega un imponante papel en algunos Lipos de memoria y de aprendizaje del sistema nervioso de los venebrados. Ratones mutantes que careeen de la subunidad especi"fica de cerebra que se i1ustra en la Figura 15-35 tienen defeetos especfficos en su capacidad de recordar la localizaci6n de un objeto -es deeir, de aprendizaje espacial.

Figura 15-35 Aclivacl6n de la qulnasa CaM II. La cnrima es un complejo prolcico de unas J2 subunidades. Las subunidades son de cuatro ripos hom610gos (a, It yy 6) que se expresan en diferell1es lipos celulares en proporciones diferenles. En la figura se presell1a unicamell1e la subunidad a (en gris), que se expresa 5610 en el cerebro. En ausencia de Calo-calmodulina la enzima es inaCliva como consecuencia de una inleracci6n entre el dominio inhibidor y del dominio catalflico. La uni6n de Calo-calmodulina altern la conformaci6n de la prolefna, permitiendo que el dominio catalftico fosforile el dominio inhibidor de subunidades vecinas del complejo asf como olms protefnas de Ja celula (no se muestrnn). La autofosforilaci6n del complejo enzimatico (por fosforilaci6n mutua de sus subunidades) prolonga la aClividad de la enzima de dos maneras: {II atrapa el complejo Ca~o-calmodulina unido. de forma que no se disocia del complejo enzimalico hasta que los niveles cito56licos de Cal' vuelven a los valores basales, unos 10 segundos despues (no se muestra); (2) conviene la enzima en una forma independiente de Calo ya que la qulnasa se mantiene activa incluso despues de que el complejo Calo-calmodlilina se disocie de eUa. La actividad continua hasta que el proceso de alltofosforilaci6n es cOll1rareslado par una protefna fosfallls3.

Los procesos de Ca Zo y de AM.P cfclico interaccionan entre sfl' Los procesos de senalizaci6n a traves de calcio y de AMP cfclico interaccionan en diversos niveles en la jerarqufa de control. En primer lugar, los niveles citos6Seftallzad6n via receplores de superficle celuJar asoclados a prolefnlll'i G

003

licos de Ca 2• y de AMP cfclico pueden influirse respectivamente. Por ejemplo. al· gunas formas de las enzimas pueden sintetizar y degradar AMP cfclico -Ia adcnil dclasa y la fosfodiesterasa respectivamente- estan reguladas por complejos Ca 2•. calmodulina. De forma inversa, la quinasa fir puede fosforilar algunos canales y bombas de Cal•. modificando su actividad; par ejemplo, la quinasa A fosforila cl receptor de IP3 dcl ER, 10 cual puede inhibir 0 activar la liberad6n de Cal. induci· da por 1P3, dependicndo del tipo celular. En segundo lugar. las enzimas regula· das directamente por Cal. y por AMP cfclico pueden influirse mutuamcnte. Por ejemplo, algunas quinasas CaM son fosforiladas por la quinasa A. En terccr lugar. estas enzimas pueden tener efectos interactivos sobre las mismas moleculas diana del metaboUsmo. Asf, frccuentemente la quinasa A y la quinasa CaM fosforiIan lugares diferemes de la misma prolefna 1a cual, por 10 tanto. csta regulada tanto por el AMP cfclico como por el Cal.; 1a prolefna reguladora del gen CREB, de la que hcmos lratado anteriormcllle (vease pag. 793), constiluye un ejemplo de ello. Como ejemplo de c6mo pueden interactuar el Cal. yal AMP cfclico, consideremos lafosforiiasn qllillasa del musculo esqueh~tico. cuyo papel ellia degra· daci6n de gluc6geno ya hemos explicado. Esta quinasa fosforila la g1uc6geno fosforilasa, la cual cataliza la degradaci6n del g1uc6geno (vease Figura 15-25). Se trata de una enzima formada por cuatro subunidades aunque tan s610 una de elias cataliza la reacci6n de fosforilaci6n: las otras tres son reguladoras y permiten que el complejo enzimMico sea acLivado por AMP cfclico y por Ca2•. Las euatro subunidades se designan como a, p. y y 5. La subunidad y es la que presema la actividad catalflica; la subunidad 5 es la calmodulina y es la principal responsable de la depcndencia de la enzima por el Ca2•. Las subunidades Cl y P son las dianas de la regulaci6n por el AMP cfclieo. siendo ambas fosforiladas por la quinasa A (Figura 15-36). La misma seiial de Ca2. que inicia la comracci6n muscular tambien asegura que exisla suficiente cantidad de glucosa que aporte la energfa necesaria para la contracci6n. EI gran innujo de Cal. al imerior del citosol (se discule en el Caphu10 16) altera 130 conformaci6n de la subunidad de calmodulina. de 130 fosforilasa quinasa, incrementando su actividad quinasa. con 10 que se incrementa la velacidad de degradaci6n de gluc6geno varios centenares de veces. Adcm
Algunas proteCnas G trim~ricas reguJan directamente canales i6nicos27 Las prolefnas G trimericas no actuan exclusivamenle regulando la aClividad de enzimas y alterando 1a concentraci6n de nucle6tidos cfclicos 0 de Cal> en el chosol. En algunos casos activan 0 inaclivan directamente canales i6nicos de 130 membrana plasmlitica de la celula diana, alterando asf su permeabilidad i6nica y. par 10 tanto, la excilabilidad de la membrana. Par ejemplo. la acetilcolina libe· rada par el nervio vago reduce tanto la frecuencia como la fuerza de la contmc· ci6n de la celula muscular del coraz6n. EI efecto esta mediado por una c1ase es· pecia! de receptores de acetilcolina que activan la proteina G inhibidora G,. de la que hemos tratado previal1lente. (Estos receptores. que pueden ser activados por el alcaloide de hongos muscarina. se denominan receplores nlllscarinicos de aati/colina para dislinguirlos de Olros receptores, muy diferentes a ~tos, deno· minados receplores nicotfllicos de aceti/colilla. que son receptores relacionados con canales i6nicos de las celulas del musculo esqueletico y de celulas nerviosas que pueden ser activadas por nicotina.) Una vez aetivada, la subunidad a de G1 804

CapftuJo 15 : Transmisi6n de senales entre celuJas

lugs.8ctivo

- -

subunidlld catalities

\ \ 1,/

lugllres foslorilsdos PO' quinllSll A

Figura 15·36 La fosforilasa qulnasa. Dibujo muy esquematico que muestra las cualrO subunidades de la enzima de muscuJo de mamffero. La subunidad., presenta la actividad catalitica de la enzima aCliva; las subunidadesa YJJ ylasubunidad 6 (la calmodulina) median la regulaci6n de la enzima por AMP c1c1ico y por ca 2 ., respectivamente. fJ complejo enzimatico final contiene cuatro copias de cada subunidad.

cilios modificsd~

neYrons olfst, ...s dluls de _ten dluls bessl I6mins bassI s)(6n

lA,

'81

no s610 inhibe la adeniJ ciclasa (como hemos descrito previamenle) sino que tambicn abre directamenle canaJes de K· de la membrana plasmMica de la cclula muscular. La apertura de eSIOS canales de K+ hace que la clHula sea mAs diffcil de despolarizar, 10 cual contribuye aI efecto inhibidor de la acetiJcolina sobre el coramn. Otras protefnas G trimericas regulan la actividad de canales i6nicos de una forma menos directa, bien regulando la fosforiJaci6n de canales (medianle, por ejemplo, la qui nasa A, la quinasa Cola quinasa CaM) 0 bien causando la producci6n 0 la destrucci6n de nucle6lidos cfclicos que aClivan 0 inactivan direclamenle canales i6nicos. EsIOS canales i6"icos regiliados por tlllcle6tidos juegan un papel crucial en los procesos de la visi6n y de la 0lfacci6n.

Figura 15-37 Rec::eptores de neuronas olfativas. (AJ Dibujo esquematico del epitelio olfativo de la nariz. EI receplOr olfutivo de las neuronas poseen cilios modificados que se proyectan desde la superfide del epitelio y contienen los rec::eptores olfalivos y la maquinaria para la transducd6n de la sei'ial. EI axOn. que se eXliende desde el extremo opuesto de la neurona receptora. conduce las senales eltktricas hasta el cerebra ruando la celula es aclivada por un odoranle. las celulas basales actuan como celulas madre. produciendo nuevas neuronas receptoras durante IOOa la vida. (8) EJeclronmicrografIa de barrido de dUos de la superficie de una neurona olfaliva. (8, de E.E. Morrison y R.M. COSlanw. /. Comp. Neurol. 297; 1-13. 19900Wiley-liss.lnc.)

La olfacci6n y la visi6n dependen de receptores asociados a protemas G y de canales i6nicos regulados par nucle6tidos C£c1icos28 Los humanos podcmos distinguir mas de 10 000 olores diferenies (orlorantes), los cuales son delcclados por neuronas con receplores olfalivos especializados en el reveslimiemo de la nariz. Estas celulas reconocen odoranles mediante receptores olfatlvos relacionados con lIna protefna G especffica, que se presenlan en la superficie de citios modificados que sobresalen de las celulas (Figura 1537). Muchos de estos receptores aClllan a traves de AMP cfclico; cuando son estimulados par la lIni6n del odorante, activan una prote(na G trimerica olfaliva espedfica (ClJI/J' la cual. a su vez, acHva la adenil ciclasa; el incremento resultante de los nivcles de AMP cfclico abre canales cationicos regllfados par AMP cfcfice, 10 cual permitc que se produzca un influjo de Na+ que despolariza la celula e inicia un impulso ncrvioso que viaja a 10 largo del ax6n, hasta el cerebro. Otros receptores olfativos aClllan a traves del proceso de fosfolfpidos de inositol y canales de Ca~+ regulados por 1P3 de la membrana plasmatica, pero respeclo a su mecanismo de transducci6n existe todavfa poca informaci6n. Se cree que exislen centenares de receplores olfativos diferentes; cada uno esla codificado por un gen diferente y reconoce odoranles diferentes, pero todos eUos pertenecen a la superfamilia de reeeplOres asociadas a proleinas G. A pesar de que sabemos que cada celula olfativa responde a un conjunto determinado de odorantes. no eSla e1aro si cada aHula contiene linicamente un lipo de receptor que reconoce loda la serie de odoranles a los que la celuJa es sensible 0 si cada celula comiene un juego de receplores, cada uno de los cuales es espec(fico de un solo odorante. los receplores relacionados con prolefnas G lambien me· dian a1gunas formas de delecci6n de sabor, pero respecto a ello se conace lada· via muy poca cosa. los canales i6nicos regulados por nuele6tidos cielicos tambien panicipan en la transducci6n de senales en la visi6n de los vertebrados, pero el nuele6tido crucial en esle caso es el GMP cfcllco (Figura 15-38) en lugar de ser el AMP deli· Senalizaci6n vfa receplores de superfide ceJular asociadas a protemas G

GUANINA

o

I

-o-p

I

o FOSFATO

Acun 15-38

EI GMP cfcUco.

805

co. Como el AMP cfclico, las concentraciones celulares de GMP cfclico eSlan controladas por una rapida velocidad de sfntesis (por la guallilaro cic/asa) y una rapida degradaci6n (por lafosfodiesterasa de GMPciC/ico). En la rransducci6n visual, la aclivaci6n de los receplOres esta producida por la luz. y conduce a una disminuci6n, en lugar de un incremento, de los niveles del nucleOtido cfclico. EI proceso se ha estudiado especial mente bien en el caso de la respuesta a la luz de los rotorreeepto.-es en ro.-rna de bast6n (baslones) de la retina de los venebrados. Los bastones son responsables de la visi6n monocromatica con luz tenue, mientras que los fotorreceptores ell forma de COIlO (co1/os) son responsables de la visi6n cromatica con luz brillante. Un fotorret:cptor en forma de bast6n es una celula ahamente especializada con un segmento exterior y otro interior, un cuerpo celular y una regi6n sinaptica a traves de la cual el bast6n pasa una selial qufmica a lIna eelula nerviosa retiniana, la cual transfiere la senaJ a 10 largo del proeeso visual (Figura 15-39), EI aparato fototransduelOr se haUa en el segmento exterior, que eontiene discos apilados, cada uno de los cuales esta formado por una especie de saco de membrana en la que se halIan embebidas las moleculas fotosensibles de rodopslna. La membrana plasmatiea que radea el segmento exterior contiene canales de Na· regulados por GMP delico. Estos canales de Na' se manrienen abiertos en la oscuridad mediante moleculas de GMP dclico unidas al canal. Parad6jicamente. la luz no causa una despolarizaci6n de la membrana plasmatica (que podrfa estimlliar la senalizaci6n sinaplical sino una hiperpolarizaci6n de la membrana plasnuhica (que inhibe la senal sinaptiea), porque la activaci6n de las moleculas de rodopsina por la luz en la membrana de los discos conduce a que los canales de Na· de la membrana cirCllndanle se cierrell (Figura 15-40). Como hemos indicado anteriormente, la rodopsina es una molecula transmembrana que atraviesa la membrana siete veces, hom610ga de onos miembros de la familia de receplores asociados a prote(nas G y. como sus primas, actlla a trav~s de una prolefna G trimerica. Sin embargo, la serial activadora extracelular no es una molecula sino un fot6n de luz. Cada moleeula de rodopsina contiene el crom6foro. II-cis retinal, unido covalentemente, el cual se isomeriza casi instantaneamente a todo-mms retinal cuando absorbe un solo fot6n. La isomeriza· ci6n altera la conformaci6n del retinal. induciendo un cambio de conformad6n mas lenlO en la prole(na {opsinal. Entonees, la proteina activada se une a la protefna G trimerica tra1lsducilla (G,l haciendo que la subunidad tl (~) se disode y active una fosfodleste.-asa de GMP delico, la cual hidroliza el GMP delico. de forma que los niveles de GMP cielico del citosol disminuyen. Como consecuencia de clio, el GMP cfelieo se disocia de los canales de Na· de la membrana plasmatica. permitiendo que se derrell. De esta forma la senal pasa de la membrana de los discos a la membrana plasmatica, y la senal luminosa se transforma en una seflal electrica. Los canales de Na' lambien son permeables aJ Ca2., de forma que cuando se cierran el influjo normal de calcio se inhibe, haciendo que la concentraci6n de Ca2> en el drosol disminuya: esta disminud6n estimula a la guaniJaro ciclasa, la cual sintetiza GMP delico recuperando los niveles y haciendo que la celula r{jpidamente recobre el estado en el que cstaba anles de que la luz la activara. La activaci6n de la guanilato ciclasa por la disminuci6n de los niveles de Cal. esta mediada por una proteina sensible al Cal. denominada recoverina la cual, contrariamente a la calmodulina. es inactiva cuando se halla llnida a Ca2' yac· tiva cuando esta Iibre de Ca z.; estimula In cielasa cuando los niveles de Caz, son bajos Iras In respuesta a la luz. Este mecanismo dependiente de Cal. es de imponancin crucial, en dos aspectos. En primer lugar. permite al fotorreceptor revenir rapidamente basta su est ado de reposo, (fpieo de In oscuridad, tras un nash de luz, haciendo posible que el fotorreceplor pueda ser sensible a la corta duraci6n del nash. En segundo lugar. contribuye a permitir que el fotorreceplor se adaple, disminuyendo la intensidad de la respuesta cuando se expone a la luz continuamente. Como expJicaremos mas adelantc, la adaptaci6n significa que la celula receptora puede actuar como un detector sensible a cambios de la 806

Capfmlo 15: Transmisi6n de senales entre celulas

segmento e>
.

...." membr.na fote,receptor.

membra...ll plll$mAlic.

segme... te i... terior

mJcleo

cuerpo li""ptieo

Figura 15·39 Dlbulo de una celula folorreceplora en basl6n. En cl segmenlO extcrior exiSlen lInos I()(X) discos: las membranas de cada disco no se haHan oonecladas a 1a membrana plasmd.tica.

1=1 Ie;:.

r=r = I ~..::.l. r=r r=r rgr I ... I

Mgmento el<"terlor

Mgmento interior

regiOO nuele.r

regiOO .injptica

C:.::. 0::'-:' radopsina inllCti...a

<::>

I.:::::.l..canales de Naabiertos

[ [ [

0::::>

-.

0::::. 0::::'

= = = =

radop"na llCtiva

CIOn' Ie. de N,cenada.

celull

hiperpol,riz8dl

alta V'IlIocidad de liber.ciOn de tr.nsmisor

M,ew

Figura 15-40 La respuesta a Ja luz de una dluJa fotolTeceptora en bast6n. Los fotones son absorbidos por las moleculas de rodopsina situadas en los discos del segmento exterior. Ello dctennina que los canales de Na' de la membrana pJasmatica se cierren. 10 cual hiperpolariza la membrana y reduce la velocidad de liberaci6n del neurotransmisor desde la regi6n sinaptica. Debido a que el neurotransmisor aett:ia inhibiendo muchas de las neuronas retinianas postsinapticas, la iluminaci6n Crena la inhibici6n y, de esla Conna, de hecho. las aCliva

bI)I veloci6ad de liberiICiOn de

t.ansmi_

IlUMINACION

inlensidad del eslImulo en un enormemenle ampljo abanico de niveles basaJes de estimulaci6n. En la Tabla 15-3 se recogen datos de las principales protefnas G traladas en eSle caphulo.

Las sena1es extracelulares son notablemente amplificadas mediante la ulHizaci6n de mensajeros intracelulares y de cascadas enzirnaticas 29 A pesar de diferencias en delalles moleculares, todos los sistemas sef'alizadores iniciados por rcceplores dependiclHes de protefnas G comparlCn cicnas caracterfslicas y est:in gobernados por principios generales similares. Todos ellos, por ejemplo, dependcn de complejas cascadas 0 inician cadenas de mensajcros intracelulares. A difcrencia de 10 que ocurre con siSlemas de sei'lalizaci6n m:is directos utilizados por los receptores intracelulares discutidos anles y por recepto· res relacionados can canales i6nicos, tratados en el Capftulo II, las cascadas cataHticas de mediadores intracelulares proporcionan numcrosas oportunida· des de amplificar y de regular las respuestas a sefiales extracelulares. En la cascada de la transducci6n visual que acabarnos de describir, por ejemplo, una sola molecula de rodopsina activada cataliza la activaci6n de dentos de mol6culas de transdudna a una vclocidad de unas 1000 molecuJas de lransducina por segundo. Cada molecula de transducina activada activa una molecula de fosfodieste· rasa de GMP cfclico, cada una de las cuales hidroliza unas 4000 moleculas de GMP dclico por segundo. Esta cascada catalitica se manlienc durante aproximadamente un segundo, produciendo la hidr61isis de mas de 10~ molecuJas de GMP dcLico par cada cuanto de luz absorbida. que derra lransiloriamente centenares de canales de Na' de la membrana plasmatica (Figura 15-41). De forma similar. cuando una molecuJa seflal extracelular se une a un receptor que indirectamcnte acliva la adenil cic1asa via proteina G•• cada protefna receptora puede activar muchas molecuJas de proteina G•• cada una de las cuales puede activar a una molecula de adenil cic1asa. Como cada molecula de G. pennanece aCliva durame algunos segundos antes de hidrolizar su GTP unido. Seiiallzacl6n via receptores de superflcle celular asociados a prolc(nas G

807

Tabla 15-3 Las prlnclpaJes faml1las de proteCnas G trimerlcas* Algunos mJembros Subunldades Famill. delafamllla

•

G, G. G,

II

G. G, (transductna)

III

G.

o,

... ..

. ..

.

Fundones aCliva adenil ciclasa; aCliva canales de Cal< activa adenil ciclasa en neuronas sensoriales aloUalo inhibe adenil ciclasa; activa canales de K' activa canales de K'; inactiva canales de ea:'; activa fosfolipasa C-~ activa fosfodiesterasa de GMP dclico en fotorreceptores en bast6n de venebrado acliva fosfolipasa C-~

Modlfkado por toxlna baeteriana col~rica

activa

col~rica

aCliva

penusica inhibe penusica inhibe colerica acliva y pertuslca inhibe no tiene efecto

• Las familias se determinan por Ia relacidn entre las secuencias de aminoaddos de las subunidades u. Onlcameme se preseman ejemplos seleccionados. En mamfferos se han descrito unas 20 subunidades a y at menos 4 subunidades ~ y 7 subunidades 'Y.

puede manlener activa a la ciclasa a la que se halla un ida durante algunos se· gundos, de forma que la ciclasa puede calalizar la conversi6n de un gran nlimero de moleculas de ATP a AMP cfclico (Figura J5-42). Un tipo de amplificaci6n como este se presenta en la rum de los fosfolfpidos de inosilOl. Como resultado de eUa, una senal extracelular a concentraci6n nanomolar no'" M) induce a menudo concentraciones micromolares (10-6 M) de un segundo mensajero intracelular como el AMP dclico 0 el Ca:', Estas moleculas acnian como efeclores aloslericos aClivando enzimas determinadas, por 10 que una unica mol~cula scf'lal eXlracelular puede provocar la alteraci6n de varios miles de mol~culas en la celula diana. Ademrts, carla una de las prorefnas reguladoras de la cadena de procesos que se han aClivado puedc ser una diana independienle de la regulaci6n. ral como ocurre por ejemplo en la cascada melab6lica que produce la degradaci6n del gluc6geno en las fibras del musculo esqueletico, ESlas cascadas rnelab6licas explosivas han de estar reguladas por rnecanismos muy eficlenlcs y scnsibles, Por consiguienle, no resulla sorprendenlc que las celulas presenlen l11ccanismos eficaces para la degradaci6n rtipida del AMP cfc1ico y para el amortiguamienlo y secuesrTO del Ca2 •• asf como para la inactivaci6n de las enzimas que responden y para las protefnas transponadoras, una vez se han activado. Todo esto es c1aramente esencial para parar la respuesla y para definir el estado eSlacionario a partir del cual la celula ha de responder. Como hemos visla anles (v~ase ptig. 777), en generalla respuesla a la eSlimulaci6n puede ser frenada rrtpidamente unicamente si los mecanismos lam bien son rrtpidos.

Las celulas pueden responder de forma subita a incrementos graduales de la concentraci6n de una serial extracelularo A1gunas respuesras celulares a Iigandos de sefializaci6n aumenlan gradualmen· te de fonna proporcional a la concentraci6n del ligando. La respuesla primaria a las hormonas esteroideas (vease Figura 15· I3) sigue a menudo esle paU'6n, posiblemenle porque cada receptor hormonal une una sola molecula de hormona, y cada secuencia de DNA de reconocimiento especifico de un gen que responde a las honnonas eSleroideas acrua de forma independienle. A medida 808

Capftulo 15 : Transmlsl6n de seiiales entre celulas

una molkula de rodoplina ablorbe un lolon

$I

aetivan 500 molllcul88 de trasdU<:lna

Ie aelrvlln 500 moltlculu de fOlfodltlltllr8$l1

....--J.c.......:..

U hidrolizoo 10~ mol6<;ulas de G~P cletico

II eitltan 250 Clln.~ de Nt'

""" imPide que entre 10' V101 iONl$ N,' ootren, t, Cl!itula pot" Hgundo, dunmta un perfodo de ·1 M9uodo

I Figura 15-41 Ampllflcacl6n de la cascada catalftlca tnduclda pot la Iuz, en bastones de vertebrados. Las flechas divergemes indican las etapas en las que se produce amplificad6n.

cada prolelrla receptora activada puede ectivar muchllll moloculas de p,otelmt Go. c.d. Url. de las AMPUFlCACION cu.I" libtrfB un••uburlidad a que puede llCliv" Url, molecul. de ~ aden,I ciclasa dur.nt. un periodo de titrmpo prolongado

I

I

c.d. molkul. de adenil ciel... aetiva
~

subunidad (I de I. protein. G. adenH

del.sa ltCliv.ct.

AMPlIFICACtON

I I I

j

••••

las molkul.s de cAMP llClivan I. qulnasa A

/ utle moIkule de qulne.. A puede fo.lorilar. .etiv.ndo muchll copi.s de I. emime X

c.da copl. de I. emlm. X produce much.s molkulas de produeto

Figura 15-42 Amplificaci6n en una cascada calalfllca Inducida por un Ugando. La primera elapa de amplificaci6n requiere que elligando senal permanczca unido al receptor el tiellll)O necesario para que el receptor active varias mol~culas G,; en muchos casas elligando se disociarn muy [emamente para que se produzca esta amplificacl6n.

protein. receptor,

moI«:ul. de li911000 ..f1.1 -

1,1 ....


I•••• III (

\

AMPlIFICACtON

I

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quh'l... A

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AMPUFICACION

I

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'" de receptor" llClivldos

.': :.::-. ::.::::';::'X: !pro
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que aumenta la concenlraci6n de la hormona, la concentraci6n de los com plejos hormona-receptor aumenta de forma proporcionai, y tambi~n awuenta proporcionalmente el numero de complejos unidos a secuencias especfficas de reconocimiento de los genes que responden: asf pues, la celula responde de una manera lineal. Sin embargo. otras respuestas a Iigandos de seflalizaci6n empiezan de manera mAs subita cuando aumenta la concentraci6n delligando. A1gunas de eUas pueden ocurrir incluso de una forma que casi es del "todo 0 nada~, siendo indeteetable por debajo de una concentraci6n umbral de Iigando y aumentando hasta un mAximo en wanto esta concentraci6n umbral se sobrepasa. Algunos factores de crecimiemo, por ejemplo, aetuan como senales de todo 0 nada indicando a las celulas que deben empezar a replicar su DNA como preludio de una divisi6n celular. leual puede ser la base molecular de una respuesta abrupta como esta, casi a modo de interruptor, ante una senal gradual? Un posible mecanismo para escalonar la respuesta consiste en que para que se produzca la respuesta haga faJta que a una macromolt:cuJa diana se Ie una una molt:cula 0 un complejo intracelular. Por ejemplo, en algunas respuestas inSenalizacl6n vfa receplores de superficie celular asoclados a proleinas G

FIgura 15-43 Respuesla que presentan las celulas del ovlduclo de gallina ante la estlmulaci6n por 18 hormona esteroldea estradiol. Una vez activados. los reccl>lores de estradiol activan la transcripci6n de varios genes direrentes. La grnfica muestra las curvas dosis·respuesta para dos de estos genes. que codifican las proteinas del huevo conalbumina uno y olJQtllbllmina el otro. La cinetica lineal de respuesla para la conalbumina indica que cada rnolfi'icula de receptor activado que se une al gen de la conalbumina incremellla la actividad del gen en la misma cantidad. Por el conlrnrio, el retraso seguido del abruplo incremento en la c1netica de respuesta para la ovoalbumina sugiere que para iniciar la transcripci6n de eSle gen se Ie han de unir simultltneamente mlts de un receptor activado (en eSle caso son 2 receplOres). (A.daptado de E.R. Mulvihill y R.D. Palmiter. I. Bioi. Chern. 252:2060-2068. 19n.) 809

'"

Figura 15-44 Cinetlcas de actlvacl6n en funcl6n de la concentraci6n de la moiecuia senal. Las curvas muestral1 c6mo se incremenla la pendiente de la respuesta a medlda que se incrementa el numero de moleculas de efector que se han de unir simultaneamenle para activar una macromolecula diana. Las curvas de la grMica son las que cabe esperar sl la activaci6n necesitara la uni6n simuhanea de 1. 2, 8016 molCculas de efector. respectivamente.

•o •

,

:0 80

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'1

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50

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•.~ ~

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•E

~

$ubunidades proteicas inactives

~ 20

•

'.5

o

ligando se/'lal '5·

2.0

concentraci6n relativa de molecules de ef&Ctor

ducidas par hormonas esteroideas parece que han de unirse simultaneamente mas de un complejo hormana-receplor a una secuencia de DNA espedfica de

reconocimiento para conseguir activar un gen determinado. Como resultado de ello, In activaci6n del gen empieza de forma mas abrupta que si fucra suficicnle la uni6n de un solo complejo para producir eSla aClivaci6n (Figura 15-43). Un mecanisme similar a este aetDa en las activaciones mediadas por la quinasa A y por la calmodulina. como hemos discutido antes. Por ejemplo, se han de unir dos 0 mas iones Ca2• para conseguir que la calmodulina adopte su conformaci6n activa; como resultado de ello, se produce lin incremento de dncuenta veccs en la activaci6n del proceso cuando la concentraci6n de Ca 2' tan s610 se incremen~ ta diez veces. Este tipo de respuestas son lanto mas abruptas cuanto mayor sea el nlimero de moltkulas que cooperan, de forma que si el mlmero es sufidentemente elevado se pueden conseguir respuestas cercanas al "todo 0 nada" (Figuras 15-44 y 15-45). Tambicn se consiguen respuestas subitas cuando un Ugando activa a una enzima y al mismo tiempo inhibe otra enzima que cataliza la reacd6n opuesta a la de la primera enzima. Ya hemos hablado de un ejemplo de este habitual sistema de regulad6n en la estimulaci6n de la degradaci6n del gluc6geno en las celulas del musculo esqueh~tico, en las cuales un incremento en la concentrad6n intracelular de AMP cfclico actjva la fosforilasa quinasa e inhibe la acci6n opuesta de la fosfoprotefna fosfatasa. ESle mecanismo puede producir respueslas muy abruptas, pero en todo caso ligeramente graduales de acuerdo can la variaci6n de la concentraci6n del Uganda senal. Sin embargo, existe otro mecanismo par el cual una celula puede responder de forma "todo 0 nada" de modo que en cuanto la senal sobrepasa un valor umbral se produce una respuesta rapida y maxima. Todas las respuestas "lodo a nada" de este tipo dependen generalmente de la retroalimentaci611 positiva. Por este mecanismo, las celulas nerviosas y musculares generan potellciales de acci611 siguiendo la ley del" todo a nada", en respuesta a neurotransmisores (se discute en el Capitulo II). La activaci6n de los receptores de acetilcolina en una uni6n neuromuscular, par ejemplo, abre los canales cati6nicos de la membrana plasmalica de la cclula muscular. Et resultado de ella es un inl1ujo neto de Na' que despolariza localmente la membrana plasmatica. Esto hace que los canales de Nat controlados por voltaje situados en esta regi6n de la membrana se abran, produciendo un nuevo influjo de Na', el cua! despolariza aun mas la 810

Capltul0 15: Transm.lsl6n de seftales entre c~lulas

compleios proteicos Ilctivos ensnmblados de forma cooperativ8

Figura 15-45 Un tJpo de mecanlsmo de senailzacl6n del que cabe esperar que presente una respuesta sublta. Aquf se requiere la uni6n de ocho moJeculas de un ligando senal sobre un complejo protcico para activarlo: In capacidad de las subunidades para ensamblarse formando el complejo activo depende del cambio alosterico de conformaci6n que sufre cada subunidad cuando se une a su ligando. La un16n de un ligando formando un complejo de este lipo es generalmenle un proceso cooperativo, que genera una respuesta escalonada cuando cambia la concentraci6n delligando, como se explica en el Capftulo 5. A bajas concetltraciones delligando, el numero de complejos activos se incrementara subitamente en proporci6n a la octava pOlencla de la concemraci6n delligando.

membrana por 10 que los canales de Na' todavfa se abren mM, elc. Si la despolarizaci6n inicial excede un cieno umbral, csta retroalimenlaci6n posiliva tiene un efcclo "explosivo", produciendo un potencial de acci6n que se propaga por toda In membrana del mllsculo. Como hemos disculido antes, tiene lugar un mecanismo de retroalimenmci6n positivo como cstc cuando cl Cah cs liberado del EH. o del redculo sarcoplasmarico a traves de canales de Ca2.; el Ca2. liberado puede unirse a los canales de Ca2. incrementando mas la liberaci6n de Cal', produciendo asf una espiga de Ca2. tipo "todo 0 nada".

rLn ,,,'m, ~ '"oct'_'

~--i

-, ",""m, /1 -

EI efecto de algunas sefiales puede ser recordado por la c~lula31

lugal do ----' u"i6" para el producto

Un mecanismo de aceleraci6n par relroalimentaci6n positiva puede cSlablecerse entre prolefnas senal que en lugar de ser canales i6nicos presenten actividad enzimatica. Supongamos por ejemplo que un Iigando senal determinado activa una enzima localizada a mitad de la cadena de acont'ecimienlos que transmiten la scflal, y que dos 0 mas moleculas del producto de esta reacci6n emimatica se unen a la enzima activandola atin mas (Figura 15-46). La consccuencia sera que en ausencia del Ugando se producira una velocidad muy pequena de sfntesis del producto enzimatico, y que eSla velocidad aumentara muy lentamente cuando aumente la concentraci6n delligando hasta que. a un determinado valor umbral de concentraci6n del Iigando, se formam suficiente canudad de producto para activar la emima, estableciendose entonces un sistema de autoaceleraci6n. Entonces, la concentraci6n del producto enzimatico aumentara stibitamenle hasta el nivcl mas alto posible. De eSla forma, la celula puede traducir una variaci6n gradual de la conccntraci6n de un lignndo senal en un cambio de tipo "interruptor" de los niveles de lin producto enzilm1.lico delerminado, gencrando una respuesla de tipo "todo 0 nada" en la celula. £Ste tipo de mecanismo tiene una imponante propiedad que 10 hace inutiIizable para detenninados prop6silos y tinicarnente titi! para otros. Si un sislerna como este ha side activado aumenlando la concentraci6n delligando senal por encima del umbral, generalmente permanecera activo cuando la seilal vuelva a descender por debajo del valor umbral: en lugar de reflejar fielmente los niveles reales de seflal en cada momento, este sistema de respllesta liene memoria. Va hemosdiscutido cl ejemplo de la CaM quinasa II, la cual es acuvada por Ca2'-calmodulina a autofosforilarse y a fosforilar otras protefnas. La autofosforilaci6n mantiene activa la quinasa cuando los niveles de Ca 2 • ya han vuelto a la normalidad y el complejo CaZ··calmoduJina sc ha disociado de la enzima (veasc Figura 15-35). Tambien puedc actuar un mecanisme de autoactivaci6n de memoria mas abajo en lin proceso de seflalizaci6n, a nivel de la transcripci6n gcnica. Por cjemplo, la senal que desencadena la determinaci6n de la fibra muscular activa una serie proteinas reguladoras de genes especfficos de celula muscular que estimulan lanlO la transcripci6n de eslos mismos genes como de otros genes que producen muchas otras protefnas de celula muscular (vease pag. 475).

d,l, '''2imil

lICtiva

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1

lug.r aetivo

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UNION DE DOS MO!.1:CUlAS DEL PROOUCTO DE LA

I

prodUC1o de

I. em,ma

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~

,,,zima muyaetN'

•

Figura 15·46 Un mecanlsmo de "retroalimentacl6n POSltlv8 acelcrante". La uni6n inicial del Ugando sefta! activa la enzima para generar un producto, el cual se une a la propia enzima, incrementado aun mas su actividad enzimatica.

Resumen Los receptores asociados con prote{nas G aetiwm a inactivan i"din!CIamente f!nzl· mas unidas a 10 membrana plasmtftic:a a c:anales 16nkos. a traves de prole{niI$ reguladoras G trimeriau (prote{nas GJ, que Sf! inaalvan a s{ munuu medUrnte 10 111dr61isis de.1 GTP que llevan unido. Alg.,nos receptores asocliliuu a prote{niI$ G ac:tivan 0 '"ac:tluan In amnii elelma, altermuio as{ In concentrac:i6" Illtracelllltlr del ",ediador Intracelultlr AMP dclico. Otros aetivan IIntl fosfolipllStI C espedf1a, de. fosfoUpidos de inositol (la fosfoliptUll C-llJ, 10 elltllll1drollzn elfos/atidilinosltol bis/osfato (PIPJ generando dos mediadores intracel"lores -el inositol Iris/as/ato (IPJ, qlle libera eaz- destk el ER itu:rementando as{ In concentracwn de eaz· ell el dtosol, y el diaci/gUcerol, q"e permnnece en In membralla plnsmdticn y aetiva In q"innsn C. Un Illcremento de /05 nlvela de AMP del/co 0 de or- afecta la dluln es·

Seiiallzacl6n vfa receptorcs de superncle celular asoclados a protefnas G

811

amullwdo {til/II/nasa A y In fill/mull Ct'M, respectivtltnenle. til qll/mull C, In qll/tuua A y In quilUlStI CaM los/orUn" pro/ell/as diana detem.ilwd/IS sobre res/duos de uri/,a y de treon/nn, alteramlo In m:l;vitl,1d de estm protelnas. Giuln tipo de ce-

lula tie"e oofljuntos caracterlstioos de prote£tlas diana que SOil regrdadas de esta forma. 10 Clud pennUi! a In dlllin presetrtar 511 ",spuesta prop/a y carac:terlstica a c:nmbios de los niveles ;ntroc:elulnres de AMP cfclico 0 de Cal' libre. A traves de las cascadns meditulas por el AMP cfclioo 0 por el Qr2', las rrsplfesUU a 1m senales utrac:elulnres pueden ser enornreme"te ampl iftcadns. Las diferellln resplle$las medilUiLu por estos receptores SOli rtfpidamf?nte fre,lndiu C1umdo elligmufo senal ttrtra€e/ulares elimilUldo. Ello es debldo a qlle las prote{IUlS G Sf! auto/lind/van Ilidrolwmdo eI GTP que ,levan IInido, diP, es rtfpidnmetlte

desfas/orllndo mediante una fosfatasn (olos/orllado por II1Il1 quimlSil), el diacilglicernl es rdpidnmelltedegradado, los mu;le6tidos dclioos SOil rdpidamellte Iridrolizados por Ima fosfodiesterasa. el GIr' es rdpidametlte bombeado lracia fllera del citosol y las profeflms SOtl rdpidameflfe desfosforiladas por protef"a fosfatasas. El oo"amlO y rdpido recambio de eslos mediadores i"'racelulares llace posibk que se prodllZCtlllll rtfpido incremellto de SIIS OOllcellfraciolles cuatulo Ins d''''as respOIIdell a smlales extracelulares. Atlemds, las dlulas pll.edell ,uilWlr la cooperatlvidad y la retrrxdlmelltaci611 positilla IJam IUlcer que 5"S respueslas seall mas $IIbitas.

Sefializaci6n via receptores de superficie celular asociados a enzimas Como los receptores asociados a proteinas G, los receptores asociados a enzimas son protemas transmembrana cuyo dominio de uni6n aI Iigando se halla sobre la superficie exterior de la membrana plasmoitica. En lugar de lener un dominio cilos6lico que se asocia a una protefna G trimerica, sus dominios citos6licos tienen una actividad enzimfitica asociada 0 estan asociados directamente a una enzima. Mientras que los receptores asociados a protefnas G atraviesan sieIe veces la membrana. habilualmenle cada subunidad de los receplores cataHticos la alraviesan una sola vez. Existen cinco c1ases conocidas de receptores asociadas a enzimas: (l) el receptor gllallilaro cielasa, que calalizan la producci6n de GMP cfclico en el citosol; (2) los receptores t;ros;na qllillasa, que fosforilan determinados residuos de tirosina de un pequeno grupo de prolefnas senal intracelulares: (3) los receptores asociados a tirosina qllillasas, que est an asociados a protefnas que tienen actividad lirosina quinasa; (4) los rcccptores tirosina fosfarasa, que eliminan grupos fosfato de residuos de tirosina de dClcrminadas protefnas scnal intracelulares, y (5) los recepcores seri"altreollifla q/linam, que fosforilan delerminados residuos serina 0 neon ina de algunas proleinas intracelulares. Empezaremos nueslra discusi6n con el recepwr guanilato ciclasa.

Los receptores guaniJato ciclasa generan GMP cfclico directamente3 1 Los peptidos lIatriurelicos alriales (ANP, de Atrial Natriuretic Pcplidcs) constituyen una familia de hormonas peptfdicas, muy relacionadas enlre sf, que son segregadas por celulas musculares del atrium del coraz6n cuando se incrementa la presi6n de la sangre. Los ANP eslimuJan el riMn para que segregue Na- y agua e inducen a las celulas musculares Iisas de las paredes de los vasos sanguineos a que se relajen. Ambos efectos tienden a disminuir la presi6n sangufnea. EI receptor de ANP que media estas respuestas se halla presente en las ce:lulas del rin6n y en las celulas de la musculatura lisa de los vasos sangldneos; se trata de una protefna que atraviesa una sola vez la membrana plasmatica, que tiene un lugar cXlracelular de uni6n a ANP y lin dominio intracclular con actividad guanilalO ciclasa. La uni6n de ANP activa la cic1asa para producir GM P cfclico, el cual, a su vez, sc une y acliva una proteina qllinusa depelldieme de GMP cfelico (qu;"asa G), la cual fosforila determinadas protefnas sobre residuos de serina 0 treo812

Capftulo 15 : Transmisi6n de senales entre ce:lulas

dominio semejente e una inmunoglobulina dominio rico en cistelnas _

._"'_""_"""_+_-I"_+__ ss

ss

"

+,~~~~membrana CITOSOL plasm8tica

dominio tirosina quinasa

Figura J 5-47 Scls subfarnUias de receptores lirosina quinasa. Solamenle se indican uno 0 dos miembros de cada subfamilia. N6tese que en algunas subfamilias el dominio tirosina quinasa se halla inrerrumpida por una "regi6n insertada en la quinasa". No se canace el significado funcional de los dominios ricos en cisterna y de los dominios semcjanrcs a una inmunoglobulina.

regi6n insertada en la quinasa

raceplor receptor de raceptor receptor de EGF de NGF insulina, de FGF reCeplOr raceplor receptor de VEGF de IGF·' de PDGF, receplor de M-CSF

nina. Asf, los receptores guanilalo c1c1asa utilizan el GMP cfclico como mediadar intracelular de la misma forma que algunos receplOres asociados con protefnas G utilizan el AMP cfclico, can la diferencia de que la uni6n entre el ligando y la actividad cidasa se produce directamente en Iligar de sHeeder vfa una prolefna G trimerica. A pesar de que conoeemos relativamente poeos reeeptores que pertenezcan a la familia guanilato ciclasa, muchos receptores conocidos perteneeen a la familia tirosina qllillasa, de la que trataremos a eontinuaci6n.

Los receptores para la mayorfa de los factores de crecimiento son protefnas transmembrana que presentan actividad protefna tirosina quinasa especffica 32 La primera protefna receptora que se reconoci6 que presentaba actividad protei~ na t1TOslna qulnasa especifica (en 1982) fue el receptor para el factor de crecimiemo epidermico (EGF, de Epidermal Growth Factor). EI EGF es una pequefia protefna {53 residuos de aminmicidal que estimula la proliferaci6n de las celulas epidermicas y de una gran variedad de otros tipos celulares. Su recep(Qr es una protefna transmembrana, que atraviesa la membrana una sola vez, de unos 1200 residuos de aminoacido y que presenta una larga zona extracelular glucosilada que se line a EGF. Cuando el EGF se une a esta porci6n, se aCliva un dominio intracelular con actividad tirosina quinasa. Una vez activado, el receptor transfiere un grupo fosfato del ATP a determinadas cadcnas laterales de tirosina, tanto de la propia protefna receptora como de otras protefnas celulares determinadas. Muchas alros receptores para facIO res de crecimienta y diferenciaci6n tambien SOil receptares tiroslna quinasa. Entre elias, cabe destacar los receplOres para el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF, de Platelet-Derived Growth Factor). para los factores de crecimiento de los fibroblastos (FGF, de Fibroblast Growth Factors), para cl factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF, de Hepatocyte Growth Factor), para elfactor de crecimiento-I para iflSlIli"a y compuestos andlogos (fGF-I, de Insulin, insuli"like Growth FacIOr-l), para el factor de crecimiento neuronal (NGF, de Nerve Growth FacIOr), para el factor de crecimiefllo vascular endotelial (VEGF, de Vascular Endothelial Growth Factor), y para elfactor estimllladorde laformaci61l de colonias de macr6fagos (M-CSF, de Macrophage Colony Stimulating Factor), todos los cuaJes son protefnas. Como se muestra en la Figura 15-47, la familia de receptores can actividad tirosina quinasa puede subdividirse en un determinado numero de subfamilias estructurales; en cada

Sciializacion via receptares de supcrflcie cclular asociadas a cnzimas

813

I

dlmero de PDGF

'om

1 lAl

IBI

caso los receplores se fosforilan a sf mismos para iniciar la cascada de senalizaci6n imraceJular. iDe que forma la uni6n de una protefna especffica del dominic extracelular de un receptor lirosina quinasa acHva el dominic catalitico que se halla siluado al DUO lado de la membrana plasmMica? Resulta diffcil de imaginar que un cambia de conformaci6n pueda propagarse a traves de la bicapa Iipfdica a traves de una helice (X sencilla que alraviesa la membrana. EI problema qued6 resuelto cuando se demostr6 que la uni6n de un ligando haee que el receptor de EGF forme dfmeros. 10 cual permite a los dos dominios citoplasmaticos fosforilarse uno aJ ouo sobre varios resldUQS lirosina. Esta fosforiJaci6n crnzada se denomina autofosforikJci6n porque se produce demro del receptor dimerico. En el caso de los receptores de PDGF elligando es un dimero que reacciona con dos receplOres a la vel. (Figura 15-48). E! EGF, par el contrario, es un mon6mero que al parecer induce un cambio de confonnaci6n en el dominio extracelular de su receptor, 10 cual induce la dirnerizaci6n del receptor. Se cree que la dimerizaci6n del receptor es un mecanismo general de la activaci6n de los receptores asociados a enzirna que tienen un unico dominio transmembrana. La dimerizaci6n del receptor puede utilizarse experirnentalmente para inactivar espec{ficamente detenninados receptores, en un intento de determinar su importancia en una respuesta celular particular. La estralegia supone In transfecci6n de c~lulas con un DNA que codifica una forma mutalHe de un receptor tirosina quinasa que dillleriza normalmente pero que tiene un dominio quinasa inactivo. Cuando se coexpresan a elevado nivel can receptores normales, los receptores mutantes acn.ian de L1na manera dominante llegatiua (v~ase Figura 744), inhabilitando los receptorcs normales al formar dfmeros inactivos con ellos. Los procesos de senalizaci6n desencadenados por los receptores de EGF, POGF Yde FGF sc han annlizado con gran detalle. En cada caso las tirosinas de autofosforilaci6n se lltilizan como lugarcs de uni6n, de aha afinidad, para protefnas senal intTUcelulares de In c~lula diana. Cada una de estas protefnns se line a diferentes lugares fosforilndos del receptor activado, reconociendo ademas de la fosfotirosina, dCl'Crminadas cnracterfsticas del entomo de la cadena polipeptfdica. Una vel. se han unido al receptor, muchas de estas protefnas resuhan fosforiladas sobre tirosinas, y asf son activadas. De esta forma se cree que la autorosforilaci6n en tirosinas actua como una especie de interruptor que desencadena el ensamblaje transitorio de un complejo senal intracelular. el cual libera la senal al interior de la cellila. Los receptores de insulina y de IGF-I acn1an de una fomla ligeramente dire· rente_ En primer lugar, dado que los receptores son tetrameros (vease Figura 15· 47), se cree que la uni6n delligando no induce una dimerizaci6n sino una interacei6n alost~rica entre las dos mitades del receptor. En segundo lugar, la uni6n de insulina hace que el receptor fosforile su dominio catalftico, el Cllal activa la capacidad de fosforilar otra protefna (denominada substrata- J del receptor de ins"lina 0 IRS·), de insIllin Receptor Substrate-i) sabre mliltiples tirosinas. Las fos· fotirosinas de IRS·) actuan como lugares de uni6n de alta afinidad para el aco· plamienro y aetivaci6n de proteinas senal intracelulares, muchas de las cuales tambi~n se unen directamenle a otros receptores tirosina quinasa acLivados. 814

CapftuJo 15: Transmlsl6n de sciiales entrecelulas

'_plor de PDGF

Figura 15-48 Factordecrecimiento derivado de las plaquetas (PDGF). (Al Estructul1l. dimerica de la protelna. con las regiones de uni6n al receptor sombreadas en amarillo. EJ dimero se mantiene por tres enlaces disulfuro (nose muestran). {B} Debido a que PDGF es un dimero con dos lugares de uni6n, puede unirse a dos receptores adyacentes, iniciando asi el proceso de senalizaci6n intracelular. EI factor de crecimiemo neuronal (NGF), como las demas protefnas de la familia de las mmrotrofinilS (discutida en el Capitulo 21). lambi~n actua como dimeros que entrecruzan sus tirosina quinasas.

membrana plasm!lica

receptor de PDGF

crrosoL

I

740 dominio 751 t,rosina quinua n1 dividido

..---J damioio SH2

dommio SH3

IAI

dominio de unl6n para la 101101lrosine

dominlo de uni6n para !a cadena lateral de un eminoacido

«I

lSI

Los residuos tirosina fosforilados son reconocidos por prote{nas con dominios 5H2" Se ha encontrado una colecci6n complct
Seilallzaci6n v(a receptores de sllperncie celu.lar asociadas a enz.lmas

Figura 15-49 Uni6n de prote(nas senallntracelulares que conlienen 51-12, a un receptor aclivado de POGF. (a) Dibujo esquemlilico de un receplor de PDGF moslrando cinco lugares de aUlofosrorilaci6n en tirosinas. Ires en la regi6n insenada en la quinasa y cinco en la cola carboxilo terminal: a estos lugares se unen las [res prolefnas senal que se indican a su izquierda. (Exislen Olms dos lugares de aUlofosrorilaci6n en timsinas del receptor, que no se indican en el dibujo, localizados enlre el dominic que mraviesa la membrana y el principio del dominio quinasa, que acnlan como lugares de union para tirosina quinasas no receploras semejantes a Src.) Los llllmeros de 111 derecha indican las posiciones de las tlrosinas en la cadena polipeptfdica. [SIOS lugares de union han side idcl1lificados utilizando la lecnologfa del DNA recombiname para mular determinadas prolefnas del receplor. la mUlacion de las lirosinas 1009 y 1021, por ejemplo, impide la uni6n y la aetivaci6n de PLC-y, de forma que la activaci6n del receplor no eslimula el proceso de senalizaci6n de fosfolfpidos dc inosilOl. Se indica la localizaci6n de los dominios SH2 (en mjo) y Sl-lJ (en azul) en las tres proleinas senal. (8) E$truClUra tridimensional de un dominio SH2, delerminada por crislalogralia de rayos X. En amarillo a la dere<:ha, se mueslra el bolsillo para la fosfolirosina y en amarillo a la izquierda se muestra un bolsillo de uni6n espedfica a una cadena lateral de un aminokldo. (Cl EI dominio SI12 es un m6dulo compacta
815

.

funci6n del dominio SH3 es menos clara, pero parece ser que se une a olras proteinas celulares. Los estudios sobre una c1ase de pequefias protefnas "adapladoras~que solamente constan de un dominio SH2 y ouo SH3 han permilido sugerir que el do· minio SH3 debe tener una funci6n de uni6n. Estas peque;;as prorefllas SH (ulap· 'adoras no presentan actividad calalftica intrinseca y actuan acoplando proteinas fosforiladas en tirosinas. como los receptores tirasina quinasa activados, con otras proleinas que no tienen dominios SH2 a SH3 propios. Una de eslas proteinas SH adapladoras. denominada Sem-5, fue descubierta a traves de estlldios geneticos en el gusano nem<1todo C elegans, como se discute en el Capitulo 21. Delenninadas mutaciones en el gen sem-5 bloquean el proceso de se· nalizaci6n que parte desde varios rcceptores tirosina quinasa y tiene profundos efCClOS sobre el desarrollo del gusano. Los procesos de senalizaci6n son bloquea· dos con la misma efectividad por mutaciones que afectan aI dominio SH2 0 a cualquiera de los dos dominios SH3 de la moIecula, 10 cual sugiere que ambos dominios SH3 son necesarios para unir un componente senal del proceso (vease Figura 15·53). De hecho, parece que en la mayona de las celulas animales se halIan presentes protefnas hom61ogas a Sem-5, y exislen evidencias lanto geneticas como bioqu(micas de que estas proteinas acoplan los receptores proterna quinasa activados con Has, la importante prote(na del proceso de senalizaci6n, sobre la que volveremos enseguida.

Las protemas Ras constituyen un eslab6n crucial en la cascada inlracelular de seiializaci6n aClivada por receplores prolefna quinasa34 Las procefnas Ras pertenecen a la gran superfamilia Ras de GTPasas monomeri· cas, que tambien contiene otms dos superfamilias: (1) las proleinas Rho y Rae, implicadas en la transmisi6n de senales desde receptores de la superficie celular hasta el citoesquelcto de actina (discutidas en el Capitulo L6), y (2) la familia Rab, implicada en la regulaci6n del trMico del transporte intracelular de vesiculas (disculidas en el Capftulo 13). Como casi todas estas proternas GTPasa monomericas, las proternas Has comienen un grupo fen ii, unido covalentemente, que participa en el anclaje de la prote(na a la membrana, en este case a la cara citoplasm
816

CapItulo 15: Transmisi6n de sei'iales entre celulas

INACTIVA

Pi

ACTIVA

tlvadoras de GTPasa (GAP, de GTPase-Activating Proteins) incremenran la velocidad de hidrolisis del GTP unido a Ras, de fonna que la inaclivan. EsIOS reguladores negalivos estan compensados por las prolefnas Ilberadoras de nuclootldOl de guanina (GNRP, de Guanine Nucleotide Releasing Proteins), las cuales estimulan el intercambio de los nuclootidos unidos cstimulando la perdida de GOP y la posterior captaci6n de GTP del citosal; asf, tienden a activar Ras (Figura 15-50). En principio, pucs.los receptorcs tirosina quinasa pueden activar Has activando una GNRP 0 inhibiendo una GAP. Los receptorcs tirosina quinasa activadas se unen a GAP directamente, como hemos dkho anles, y se unen a GNRP sOlo indirectamente. como discutiremos despues. Sin embargo, es la union indirecta a GNRP Ia que habitualmente es la rcsponsable de conducir a la protema Ras a su estado activo, unido a GTP. Las pmtemas Ras y las proteinas que reguJan la actividad de Ras han side rouy conservadas durante la evolucion; analisis geneticos realizados en Drosophila y en C ekgans han praporcionado los primeros indicios sabre cOmo los receptores tirosina quinasa activan Ras. Han sido particularmente infonnalivos los estudios sabre eI desarrollo de la celula fotorreceplora del ojo de Drosophila.

FlgUJ1l 15·50 Regulacl6n de la iK:llvldad Ras. Las proteCnas activadoras de GfPasa {GAP} inactivan Ras aI estimularlas a que hidrolizen el GTP que Uewn unido. Las proteJnas liberadoras de nucle6tid05 de guanina (GNRP) activan Ras aI estimularlas a que Iiberen el GOP que Devan unido; dado que la concentraci6n de GTP en el olosol es 10 veres mayor que la de GOP, Has lendni tendencia a unirGTP cuando se haya Iiberado desu GOP. En ctlulas de mamifero se han identificado hasla ahora dos GAP reguladoras de Ras (Ros GAP) -p J2(f'N' y nellrofibromillQ (denominada asf porque ests codificada por el gen que se halla mutado en la mayona de la enfermedad humana comunllamada neurofibromatosis, asociada can tumores de los nervios). A pcsar de que las dos Ras GAP se expresan de forma ubicua, parece que en los diferentes tipos celulares una de las dos domina al manlener la mayorfa de las prole{nas Ras (-95%) ensu estado inactivo, unido a GOP.

Una protel'na SH adaptadora acopla los receplores tirosina quinasa con Ras: evidencias que provienen del desarrollo del aja de Drosophila" EI ojo compucsto de Drosophila cstc1. formado por unas 800 unidades identi-

cas denominadas omalidios, cada una de las cuales CSlct farmada por 8 celulas (otorreceptoras (RI-RB) y 12 celulas accesorias (Figura IS-51). EI oia se desarrolla a partir de una lamina epiteliaJ simple. y las celuJas que forman cada omatidjo

son reclutadas desde tOOa la l:imina a traves de una secuencia fija mediante una serie de interacciones celuJa-c~Hu1a. Empezando con el desarrollo de R8, cada relula diferenciada induce a su celula vecina inmediata, hasta cste momento no comprometida, a adoptar un destine y a eosamblarse de una manera especi.al en eI desarrollo del omatidio (Figura IS-52). FJ desarrollo del (otorreceptor R7, necesario para la deteccion de la luz ultravioleta, ha sido estudiado m6s intensamente, empezando en 1976 con la descripcion de una mosca mutanle denominada sevenless (sev, de "sin el siete'") en la que el tlnico derecto observado es que R7 no se desarrolla. Estos mut'antes son f;\ciIcs de seleccionar sobre la base de su ceguera a la luz ultraviolela. EI gen sev fue aislado y se observ6 que codifica un receptor lirosina quinasa que se expresa en las relulas pTeCunlOras de R7. Posteriores anc1..Hsis gentilicos de mutantes en los que se halla bloqueado el desarrollo de R7 pero en los que la protefna R7 no estct afectada, lIevaron a la identificacion del gen bride-oJ-sevenless (boss, 0 Ncompafiero de sevenless"),
Figura 15-51 Electronmlcrografrade barrldo de un ojo compuesto de Drosophila. EI ojo esut rompueslO de uuas 800 unidades identicas (omalidiosl. cada una de las cuales ticne una lente independienle que enfoca la luz sabre las ocho dlulas fotorreccploras de Sll base. (Por cortesfa de Ernst Hafen.)

817

(0Boss es una proteina que alraviesa 7 veces la membrana. que exdusivamcmc se expresa en la superficie de la relula adyaceme R8, y que cuando se une a una Sev la aCliva induciendo a 1a celula precursora de R7 a diferenciarse en un fotorreceplar R7. La prOlcfna Sev lambicn se expresa en algunas otras celulas prccursoras del omalidio en desarrollo. perc ninguna de estas celulas emTan en conlacto con R8. poT 10 que la proteina Sev no es activada y las celulas no se diferencian a fOlorreceplores R7. A pesar de que puede sospecharse que los organismos pluriceluJares hacen un usa mllY extendido de ligandos seflal unidos a la superficie cellilar como Boss. tales moleculas han sido mllY dificiles de identifiear y caraeterizar mediamc tecnicas bioqufmicas (fpieas. La identificaci6n de Boss ilustra el poder de las aproximaciones geneticas. Ha resuhado ml1s diffcil identificar los componentes del proceso imracelular de sei\alizaci6n activado por $even la celula precursora de R7 que el receptor o su ligando, debido a que estos componentes son utilizados por celulas de una gran cantidad de 6rganos en desarrollo ademas del ojo, y las mUlaciones que inactivan el proceso son lel'ales. Sin embargo, algunas de eSlas mulaciones son lelales unicamenle cuando estlin afectadas ambas copias del gen, por 10 que pueden manlenerse en ani males heterozigotos que presentan una copia del gen mutanle y la otra normal. Aislando estos mutanles asi como utilizando otras esIralegias genelicas, se han podido idenlificar algunos genes que codifican prolefnas de senalizaci6n intracelular. Uno de ellos codifica la prolefna Ras. Mientras que las moS£as en las que ambas copias del gen ras estl1n inaclivadas por mutaci6n mueren, las que presentan unicamente una copia inaClivada sobreviyen aunque carecen de R7. COl1trariamenle, si uno de los genes ras se hace hiperaclivo medial1le mUlaci6n, R7 se desarrolla incluso en mUlanles en los que lanlO sevcomo boss son inaclivos. Asf pues, la aClivaci6n de Ras parece ser nece· saria y suficiente para inducir la diferenciaci6n de R7. Un segundo gen, eillama· do lIijo-de-sevellfess (50S, de "s0':l-of·sevenless~)codifica una prolefna Iiberadora de nucle61idos de guanina (GNRPj, que es necesaria para que el receptor tirosina quinasa Sev aClive a Ras. Un tercer gen codifica lIna proterna semejante a Sem·S denominada Drt (de downstream of receptor kinases, "mtis adelanle de los receplores qllinasa") que acopla el receptor Sev a la prote(na 50s; el dominic SH2 de Drk se une a Sev, activl1ndola, mientras que parece que los dos domini os SH3 se unen a Sos. Un cuarlo gcn codifica una prote(na activadora de GTPasa (GAP). Si estc gcn es inactivado, R7 se desarroHa incluso aunqlle sev haya sido inactivado, probablemente porque Ras es hiperaclivo cuando GAP no 10 inhibe (Figura 15-53). En este sistema de sei\alizaci6n, sin embargo, y en muchos atros sistemas estudiados, la activaci6n de Ras par receptores lirosina quinasa depende de la aClivaci6n de GNRP m
Ras activa una cascada de fosforilaciones serina/treonina que activa la MAP-quinasa36 Las fosrorilaciones en tirosina y la activaci6n de Ras, estimuladas por receplores quinasa de la superficie ciloplasml1lica de la membrana plasml1tica, tienen una vida muy cona: las rosrorilaciones son revertidas rl1pidamente por prolefna lirosina fosratasas especfficas (discutidas mas adelante), y Ras cuando estl1 activa se inactiva a sf misma hidrolizando el GTP que tiene unido, a GDP. Para poder esti818

Caprlulo 15: Transmisi6n de sefiales entre celulas

Figura 15-52 Ensamblaje de las celulas de un [otofTeceptor en un omatldlo en desarrollo de Drosoplrila. Dibujo esquematico del reclulamiento secuencial de fOlorreceplores, empezando con R8 y acabandocon R7. que es la ultima celula fOlorreceplora que se desarrolla.

~Iul.

R8

~\-......

.;.ITO.S.O.l__. ,

membr.nli pl..malica.

moSOl Uluu. R7

DB

SIGUE EL PROCESO OE SENALIZACl6N Inhlbi<:iOn de GAP

mular las celulas para proliferar 0 para diferenciarse, estos conos eventos seflal han de convenirse en eventos m:is duraderos que puedan manlener la seflal y lransmitirla hacia el nUcleo. EI sistema de transmisi6n esl<1 formado por multiples cascadas de fosforiJaci6n en serinasltreoriinas. que interactuan entre si, las cuales son procesos mas duraderos que las fosforilaciones en tirosinas. En estas cascadas participan muchas scrinaltreonina quinasas, pero una familia que contiene a1 menos cinco miembros parece desempeflar un papel especial mente importanle -las protema qulnasas actlvadas por mit6genos (MAP, de Mitogen Activated Proteins) (tambien denominadas quinasas regll/lUias por sena/es extra· celli/ares, IERK, de Extracellular Signal Regulaled Kinasesl). ESlas quinasas son activadas por una gran variedad de seoales inductoras de proliferaci6n y diferenciaci6n celular, algunas de las cuales acrivan receplOres Urosina quinasa mienlras que ouas activan receplores asociados con prolefnas G. Una caraClerfstica extraardinaria de las MAP-quinasas es que para que se produzca su activaci6n complela hace faha que se fosforilen sabre una treonina y sabre una tirosina que en la protcfna se hallan separadas par un solo aminoaddo. La prolefna quinasa que calaliza ambas fosforilacioncs se denomina MAP-qlli"asa·qui"asa. Los requerirnientos de fosforilaci6n sobre lirosina y treonina aseguran que MAP-quinasa se mantenga inactiva mienlras no se active es· pecfficamenle la MAP·quinasa-quinasa, cuyos unicos subslralos conocidos son las MAP-quinasas. A su vez, la MAP-quinasa-quinasa se activa por fosforilaci6n en serinas/treoninas calalizada por una MAP-quinasa-quinasa-qujnasa, que al parecer se activa por uni6n a Ras activa (Figura 15-54). Cuando MAP-quinasa se halla activada, transmite senales fosforiJando varias protefnas celulares. incluyendo olras proteina quinasas y prolefnas reguladoras de genes. A menudo, en cuesti6n de minutos despues de que la celuJa haya side estimulada por un factor de crecimiento, se activa la transcripci6n de un conjunlo de genes tempra1los i1lmediatos. Un complejo proleico que desempena un imponanle papel en esta activaci6n de la transcripci6n es el complejo disculido anteriormente fonnado por el factor de respuesta S4!rica (SRF. de Serum Response Factor) y Elk-I. EI complejo se halla unido constitutivamente a una secuencia detenninada de DNA (el elemento de respuesta serica) que se haIla en la regi6n reguladora de un gcn denominado [as y de Olros gcncs (vease Figura 15-32). Ademas. las MAP-quinasas pueden fosforilar la protcfna Jun, que se combina con la protefna recit1n formada Fos formando ulla prot'cfna aCliva reguladora de genes denominada AP·). Entonces, est'a prote(na AP·] activa otras geSeftallzacl6n via receplores de superflcle celular asoclados a cl17.lmas

Figura t5-53 Procesos de seftallzaclon celular tempranos en el desarrollo de R7. La aetivaci6n del receptor tirosina quinasa sev de la superficie de la c~lula precursora de R7 por la protefna Boss de la superficie de R8 estli acoplada con \a activacion de la protefna liberadora de nucl~tides de guanlna Sos. a traves de la pequena prOle£na adaptadora SH, Drk.. Drt reconoce una detenninada liresina autofosforilada de la prote{na Sev mediante un dominio SH2 e inleractua con 50s mediallle dos dominios SH3. 50s eSlimula la protefna inactiva Ras para e1iminare! GDP que tiene unido y as( II caplar GTP, 10 cua! aCliva a Ras para transmitir la seflal siguiendo el curso del proceso de seJializaciOn. (j\ pesar de que no se mues[ra aqur, Itas se halla unida a la cara c1tos6lica de 13 membrana plasmatica.l Se cree que Sev activa tambien inhibe GAP, la eua! podrra, casa de estar activa, contrarrestar 1a funci6n de 50s estimulando a Ras para hidrolizar el GTP que lIevara unido, inactivandose. Parece que el acoplamiento del receptor tirosina quinasa con Ras ocurre a traves del mismo mecanismo que en las c~lulas de mamffero.

819

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membrana plasmatica

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nes, aunque no se conoce con total exactitud emil es el papel que desempena en la proliferaci6n celular. La quinasa C tambi~n puede fosforilar 'un y, como se iluslra en la Figura 1554, puede activar la MAP-quinasa-quinasa-quinasa. de fonna que tanto lun como MAP-quinasa-quinasa-quinasa constiluyen ejemplos de punlos de integraci6n donde convergen varios procesos de senalizaci6n.

La actividad de los receptores asociados a tirosina quinasa depende de tirosina quinasas que no son receptores 37 Muchas de las prolefnas receptoras de la sllperficie celular que han sido aisladas y caracterizadas no encajan en ninguna de las familias principales de receptores que hemos descrito hasta aquf: no eslitin asociadas a canales i6nicos ni a proternas G, y carecen de dominio catalftico evidente. Este gran y helerogeneo surtido de receptores incluye receplores para la mayorfa de los mediadores locales (denominados citoquinas> que regulan la proliferaci6n y diCerenciaci6n en el sistema hematopoy~tico, asf como receptores para algunas hormonas (por ejemplo, hormona de crecimiento y prolactina) y los receptores especificos de antfgenos de los linfocitos T YB. Muchos de los receptores de esta categorfa trabajan a trav~s de tirosina quinasas asociadas que fosforilan varias protefnas diana cuando el receptor se une a su Ugando. La mayoria de las quinasas asociadas con estos receptores asoclados a tlreslna quinasa son miembros de la bien caraclerizada familia Src de protefna tirosina quinasas no receptoras mencionadas anteriormente, 0 de la recientemenle descrita familia Janus tambien de prote£na tirosina quinasas no receptoras. Se cree que estos receptores acruan casi de la misma forma que los receptores tirosina quinasa. exceptO en que su dominic quinasa esta codificado por otro gen y se halla asociado no covalentemente con la cadena polipeptfdica del receptor. Como los receptores tirosina quinasa, parece que a menudo en su activaci6n panicipa una dimerizaci6n del receptor inducida por elligando (Figura 15-55). 820

CapftuJo IS: Transmlsl6n de 5enaJes entre celulas

Figura 15-54 Cascada de fosforUaciones serinaltreonina actlvada por Ras y qulnasa C. En el proceso activado pot re<:eptores tirosina quinasa a traves de Ras, a menudo MAP-quinasa-quinasaquinasa es una serina treonina quinasa dcnominada RaJ, que al parccer se activa por la uni6n de una Ras activada. En el proceso activado por re<:eptores asociados a protcfnas G a trav~ de quinasa C, MAP-quinasaquinasa-quinasa puede ser tamo RaC como otra prote£na serina/treonina quinasa. En levaduras y en todos los animales en que se ha estudiado, se ha encomrado una cascada de fosforilaciones serinaJtreonina semejanle a ~ta. en Ia que participan protefnas relacionadas estructural y fundonalmente con es.tas. Estas cascadas de fosforilaci6n inlegran y amplifican senales que provienen de diferenles eslfmulos extracelulares. Los receptores tirosina quinasa tambi~n pueden aetivar un proceso de senalizaci6n mas dire<:tO hacia el nucleo mediante la fosforilaci6n dire<:ta de protcmas reguladoras de genes, que as£ se activan, que conticnen dominios 5H2.

En mam(feros existen al menos ocho miembros de la familia Src de prOlcfna tirosina quinasas no receptoras: Src. Yes. Fgr. Fyn. Lek. Lyn, Hcky Bfk. Contienen dominios SH2 y SH3 Ytodos eLlos se hallan localizados en la cara citoplasm
Algunos receptores son proteina tirosina fosfatasas 38 Como hemos mencionado previamente. los residuos de tirosina que son fosforilados por protefna tirosina qujnasas son nipidamente desfosforilados por protefna tlroslna fosfatasas. Desdc cl punto de vista·estructural. estas cnumas no est
1l-2. I..

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senallzaci6n via receptores de superficie celular asociados a enzimas

Figura 15-55 Estructunl trldlmensJonai de la hormona de c:rec:imienlo bumana unIda asu rec::eplor. La honnona (en rojo) se ha unido, entrecruzindolos, a dos receptores idmticos (uno se muestra en ~ y eJ olm co llZlll), formando un receptor homodfmero. {No podia preverse en absoluto que un Uganda monombioo como la hormona de crecinUento PuWel1l unir.:;e, entrecruz.t.odolos. a dos receptores. ya que eUo supone que los dos receptores tMnticos han de recooocer zonas diferenles de la hormonal Se aee que Ia dimerizaci6n inducida poria uni6n de un liganda une ~ dominios citoplasm'ticos de las dos pmteinas receptoras 1l1losmembrana de un solo paso. Ella, a su vez, aoova una tirosina quinasa no reccptora (no se muestral. Las estructuras mostradas aqui han sido delerminadas por estudios de cristalografia de rayos X de complejos form ados entre la hormona y los dominios extracclulares del receptor producidos por la tecnologfa del DNA recombinante. {De A.M. deVos, M. Ullrech YA.A. Kossiakoff. Science 255:306-312. 1992. C theAAAS.)

Figura 15-56 Ensaroblaje induddo por Ugando en un receptor 1L-2. Parece que Ia unt6n de baja afinidad de 1l...2 a la cadena a desencadena eJ ensamblaje del receptor bete~rico, de aha afinidad. eJ cual entonces se une. aooVllndola. a Ia tirosina quinasa Lck, interaccionando con ella a tra~ de Ia cola dtoplasmttica de Ia subunidad Jl..

821

bajo. Las prolefna tirosina fosfatasas no actuan simplemente revertiendo continuamente el efeclo de las prolema tirosina quinasas. sino que pueden estar re· guladas y desempei'lar funciones especfficas en la sefializaci6n celular. asf como en el control del cido celular (se discute en el Capftulo 17). Un imponante ejemplo de protefna tirosina fosfatasa regulada es la protefna CD45. que se encuentra sobre la superficie de los linfocilOs y juega un papel esencial en la activad6n tanto de los Unfodlos B como de los linfocilos T por antfgenos extraiios. CD4S es una g1ucoprolefna que alraviesa la membrana una sola vez, cuyo dominio tirosina fosfatasa se halla expuesto sobre la cara citoplasm~hica de la membrana plasmAtica. Cuando se aCliva por la reacci6n de un ami· cuerpo extracelular (Sll Iigando normal no es conoddo), su dominio catalftico se activa eliminando grupos fosfato de residuos de tirosina de determinadas protefnas diana de la celula. Se cree que una de estas protefnas es la lirosina quinasa Lck mencionada anteriomlente. Cuando es desfosforilada por CD45, Lck se activa fosforilando otras protefnas de la cclula.

La utilizaci6n de oncogenes que provocan cancer ha permitido

identificar muchos componentes del proceso de seiializaci6n de los receplores tirosina quinasa3!1 Normalmente. las celulas de los animales superiores se dividen unicamente cuando son estimuladas por faClOres de crecimienro, producidos por otras diu· las y que habitualmente actuan uniendose a receptores lirosina quinasa. Las celulas cancerosas proliferan excesivamente principalmente porque. como resullado de mutacioncs acumuladas, son capaces de dividirse sin ser estimuladas por otras celulas, por 10 que no se hallan sujetas aI control "social" normal de la proliferaci6n celular (se discute en el Capftulo 17). No cs sorprendente que muchas de estas mutaciones afeclen a genes que codifican protefnas que participan en los procesos de senalizaci6n utiJizados por los receptores tirosina quinasa. De hecho. muchos de los genes que codifican las protefnas sei'lal discutidas en esta secci6n, incluyendo Has. Src (y los orros miembros de la familia SrcJ. RaI. Fos y Jun. fueron identificadas por primera vez como fonnas mutantes en celulas cancerosas 0 en virus tumorales productores de cancer. Como se discure en el Capftulo 24, los genes mutantes se denominaron oncogenes antes de que se comprendiera su origen a partir de genes normales; par ella, a los genes normales habitualmente se les denomina proto-oncogerles. En principio podrfa esperarse que cualquier mutaci6n que provocara la producci6n de una protefna anormalmente activa de cualquier paso del proceso de seiializaci6n que va dcsde el factor de crecimienlo hasta cl n(ldeo pudiera producir cancer aI estimular a la celula a proliferar en ausencia de las sefiales extracelulares apropiadas. Las evidencias de que disponemos corroboran esta idea. EI oncogen sis, por ejemplo. codifica un fonna funcionalmente acuva de PDGF que se expresa de fonna inadecuada; las celulas que presentan el oncogen sis y tam· bien expresan receptores para PDGF. continuanlente se autoestimulan a proliferar. EI oncogen erbB codifica una fonna truncada del receptor de EGF que tiene un dominio intracelular tirosina quinasa que se halla activo continuamente; las celulas que expresan este oneogen se componan como si esluvieran estimuladas continuamente a proliferar por un (aclOr de crecimienlO. Las eelulas se comportan de una fonna similar a como 10 harfan si hubieran estado infectadas por un virus que transportara el oncogen v-src, que codifica una fonna conSlilutivamen Ie activa de la prolefna tirosina quinasa Src. 0 como si expresara un oncogen ras. que codifica una forma anormal de una protefna Ras que no puede inactivarse a sf misma ya que ha perdido la capacidad de hidrolizar GTP. De forma similar. las celulas proliferan de forma anonnal si expresan un oncogen que codifica una forma eonstitulivamente activa de una prolefna reguladora de un gen activado por (aelores de crecimiento, como lun 0 Fos. los estudios sobre oncogenes de este tipo no s610 han i1uminado los mecanismos moleculares que estan en la base del cancer, sino que tambien han descubierto muchas prolefnas

_____________________L 822

Capfrulo 15: Transmlsl6n de sei\a1es entre ee:lulas

desconocidas de los procesos de sefializaci6n aetivados por faetores de crecimiemo. Algunas honnonas que estimulan sus celulas diana a proliferar se unen a receptores asociados a protemas G en lugar de unirse a receptores tirosina quinasa. Por ejemplo, el factor liberador de hormona de crecimiento (GHF, de Growth Hormone Releasing Factor) estimula las celulas secretoras de hormona de crecimiento de la glandula hip6fisis a proliferar; GHF se line a los receplores de GHF que activan la adenil cicJasa a uaves de lIna protefna G estimlliadora G•. EI incremento resuhame de los niveles de AMP cfdico induce a las celulas de la hip6fisis a dividirse. Como era de esperar, las mutaciones del gen a, que inaetivan la actividad GTPasa de la subunidad a de G, (y por 10 tamo hacen que la proteina este aeliva de forma constitutiva) producen un oncogen que se halla frecuenlemente en los tumores humanos de hip6fisis.

Las protemas de la superfamilia TGF-13 activan receptores

que son protema serina/treonina quinasas 40 Los faclores-p Iransformantes del creclmlento (TGF-ll, de Transforming Growth Factors-In eonstituyen lIna familia de mediadores locales que regulan la proliferaci6n y otras funciones de la mayorfa de tipos celulares de los vertebrados. Los cinco miembros de la familia ffGF-pl aI PS) son protefnas de estrueturas y funciones similares. Sus efectos sobre las eelulas son variados. Dependiendo del lipo celular, pueden suprimir la proliferaci6n, estimular la sfntesis de matriz extracelular, estimular la formaci6n del hueso y atraer celulas por quimiolaxis. los TGF-p son simetizados como largos precursores y secre(ados como complejos inactivos que mas tarde son activados por procesamienlo proteolftico. Algunas orras protefnas senal extracelulares est
Recienremente se han donado y secuenciado los eDNA que codifican algunos receptores de miembros de esta superfamilia. Estos receptores son prote'nas que atraviesan una vez la membrana y con dominios serina/treonina quinasa sobre la cara citos6lica de la membrana plasmatica. Se (rata de los primeros receptores serlnaltreonlna quinasa que se han identificado. y todavi"a conoeemos muy poca cosa acerca de los procesos de sei'iaJizaci6n que ellos activan. Enla Figura 15-57 se resumen algunas de las protefna quinasas especfficas de tirosina 0 especfficas de serinaltreonina de que hemos tratado en este capr· tulo.

EI receptor transmembrana Notch media la inhibici6n lateral mediante un mecanismo desconocido 41 La clase de receptores de superficie celular asociados a enzimas es grande y variada. [ncluye, ademas de los que ya hemos considerado, las i1lregrirlas, que se unen a componentes de la matriz extracelular. Como se discute en el Cap{tulo 19, estas proternas transmembrana no s610 unen celulas a la matriz a traves de contactos focales sino que tambien generan sef\ales intracelulares en estos lugares de uni6n, probablemente desencadenando el ensamblaje de un complejo sef\a1 intracelular (vease Figura 17-42). EI mecanismo de sefializaci6n utilizado por algunas protefnas receptoras es todavia ran desconocido que resulta dificil clasificar tales receptores. Un ejemplo importante de ella 10 constituye la proteina de Drosophila Notch. Como se explica en el CapfruJo 21. esta protefna transmembrana que la atraviesa una sola vez juega un papel crucial en las interacciones celuJa-celula que controlan el deHcado patron de diversificaci6n celular durante el desarrollo de la mosca. Tfpi-

Senallzacl6n via receptores de superficle celular asociados a en7.lmas

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PRorefNA OUINASA.s ESPEclFICAS DE SERINA/TREONINA

camente, una cclula que carccc de Notch no responde a la inllibiciorllateral-senales inhibidoras que proviencn de sus vecinas inmediatas y que normal mente harfan que se diferenciara siguiendo un camino diferente a elias. En un embri6n normal de mosca, por cjemplo, un precursor de cclula nerviosa inhibc a sus ve· doas para impedir que lambicn se transformen en celulas nerviosas, por 10 que dichas cclulas sc transfonnan en cclulas epiteliaJes; en mutantes Notch esta inhibici6n no se produce y todas las cclulas se uansforman en celulas nerviosas. Como en el caso de la protefna Sev de la que hemos tratado anteriormente, Notch se activa al unirsc no a molcculas senal solublcs sino a protefnas que se presentan sobre la superfide de las c~lulas adyacentes. Aunque se conoce la secuenda de Notch y se han identificado algunas de las proteinas del proceso de seiializad6n, mediante an;1lisis gen~ticos, todavfa no csta claro de qu~ forma Notch transmite In senal al interior de la celula. OtTaS protefnas semejantes a Notch tambi~n desempef'ian papeles importantes en el desarroUo de los vertebrados, pero en estos casas, los mecanismos que partidpan en los procesos de senalizaci6n tambi~n resultan un mistcrio.

Resumen & conoan cinco da.ses th tw:f!ptort!:S asoclados a enzinuu: (I) reaptort!:S guanilalo ciclasa transmembrano, que generan GMP cklico directamenle; (2) tw:('pWtu tirosino fosfafQ.sQ, que eliminon fosfatos tk cadena.s Iaterales tk fosfotirosino th thter-

mirnulas protelnn.s; (3) tw:('ptOtu serinaltreonina quinasa transmembrana, que ai'iaihn un grupo fosfaw a t:4lUnas Iateraln de serino 0 th rreonina th protelna.s 824

Capitulo 15 : Transmisl6n de seiiaJes entre celulas

Figura 15·57 Algunas de las proteina qulnasas dlsc:utJdas en este capftulo. Se muestra el tamana y la localizaci6n de sus dominios eatalftieos (en verde oscuro). En eada easo el dominio eatalftieo cs de unos 250 residuos de aminodcidos de longitud. Todos estos dominios ticnen una seeuencia similar, 10 eual sugiere que todos eUos han evolueionado a partir de una quinasa primordial comun. N61ese que looas las tirosina quinasas mostradas se hallan unidas a la membrana plasrndtica, mientras que la mayoria de las serinaftreonina quinasas se hallan en el citosol.

ditmni (4) receplores tlrosl"n qlllmua. y (5) receptores fUocindos a tirositm q"l"n. sas. Los dos l1ft/mostipos de receptores SOil, con diferem:in, los mm Illlmerosos y al parecer actllm, de 'ma mnnera simiinr. Ilnbitualmente in ,,,,1611 del liga"do it,dlli;e la dfmerlzncf6" del receptor, locllnl activa in actlvidad tiroslna qllillllSa del propio receptor 0 de la etlZima tiroslna quillllSll asociadn al receptor. Utm ve.z: activadn, 1mb/nmimellte la actividad tirosinn quillllSn se alltofosforlin a sf mLsma sobre m,iItiples resid"os tirosilla, que elllonees lII:llitm como lugares de ,ml6111Jtlra 1111 reducldo ",imero de protef"as seilnl i"tracel"inres las c,mles. a travis de SItS tromi"ios 5HZ, se II"ell es"edflam,etlle a determimulos residuos fosfotirosilltJ. De estn fonna se netiva 'III complejo seilal ",ultiproteinn. a partir del alnlin seiial se transmUe al interlorcel11lnr. Liu proteb,as R4s achian como IInJones cnu:iales del sislema Intracel'Uar de trallsmisi6n de seilaln. Son GTPasas monomerials que actJian como llllerruplores molec'lfnres; son actilHUtiu par proteflllU que Jiberan nucle6tldos de gunniJ,a e innct'11HUtiu par GAP. C,umdo las proteflllU Ras son ac:tivadns. inidnll una ca.scada de fosforlllll:iol'es urlnnltreol,ina que convergen sobre MAP'quinasas, las cunles colnborm, ell In Iralumisi6n de In seRnI nl ndeleo. M,.chos de los genes que codiflca" prote{tUIS de las cascadas lntracel"lnres de seiialimd6n que SOli aetjvados par rec.eplores rirosina q,dlUUiU jt,eroll idenlificados conto oncogenes en dl"las callarosas 0 como virus tlmloraln, ya que su actiwu:wn inndecluula Itace que In dluln prallfere uaslvamente.

Adaptaci6n de las celulas diana Normalmenle. cuando las celulas y los organismos responden a algtin esdmulo. pueden detectar el mismo porcemaje de variaci6n de la senal en una gama muy ampLia de inlensidades del estfmulo. A nivel celular. esto requiere que las ~Iulas diana sufran un proceso de adaplaci6n 0 desensibilizaci6n. mediante el cual su respuesta va disminuyendo cuando se halla expuesla a un eSl£mulo durante un periodo prolongado de tiempo. De esta forma, la celula ajusla de forma reversible su sensibilidad al nivel del estfmulo. En el caso de 1..1 senalizaci6n qufmica. la desensibili...aci6n permite a la celula responder a cambios de la concenlraci6n de la molecula tigando (en lugar de responder a concentraciones absolums del lignndo) en un am plio margen de concenlraciones absolulas. El principio general es sencillo: la adapmci6n se consigue a lraves de una relroalimentaci6n negativa que nClua can un cierlo relraso. La relroalimentaci6n negativa significa que una respllesta fuerle modifica la maquinaria que produce dicha respllesta, de fonna que sc inhibe a sf misma: pero gracias al relraso, un cambio repentino del nivel de eSI(mliJo es capaz de producir lIna respuesta intensa durante un perfodo de tiempo corto, anles de que la retroalimentaci6n negativa tenga ticmpo de actuar. La adaptacidn a sefiales qufmicas puede producirse de diferemes formas. En algunos casas, se produce por la disminuci6n progresiva del numero de protefnas receptoras especfficas de superlicie. la cual normalrnente se produce en un intervalo de horas. En otros casos se produce por una n1pida inactivaci6n de eslos receplores. 10 cual se produce en cuesti6n de minutos. En otros casos es debida a cambios en las protefnas que partjcipan en la transducci6n de la sel\al tras 1a aClivaci6n de los receplores. los cuales se producen habitualmente a unas escalas de liempo inlermedias.

La adaptaci60 leota depende de la regulaci6n par disminuci6n del mirnero de receptores42 A menudo. despu~ de que una honnona 0 un factor de crecimiento se haya unido a su receptor de la superficie de las celulas diana. son ingeridos por la ceIula por endocilosis mediada por receplor y liberados a los endosomas (sc discuIe en el Capflulo 13). La mayoria de los receplores descargan su Ligando en el ambienle acido de los endosomas y sc reciclan de nuevo hacia la membrana. Adaptad6n de las cilulas diana

825

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Figura 15·58 Dos mecanlsmos de la r4plda descnslblllzaci6n del receptor J}2 adrenergko. Ambos dependen de la rosrorilaci6n del receplor. Tanto la fosrorilaci6n en (A) como la uni6n de arreslina en (BJ inhiben la capacidad del recepwr para interaclUar con G., disminuyendo as( la respuesla a la adrenalina.

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UN INCREMENTO DE LA

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181

mientras que el Iigando es transferido a los Iisosomas y es degradado. Este proccso, por 10 tanto, constituye el principal mecanismo de degractaci6n de muchas prolcfnas senal. A pesar de que muchas moltkuJas de receptor son recuperactas del endosoma y recicladas, una derta proporci6n de elias no se Iiberan de su Iigando y acaban en los lisosomas, daude son degradadas con el Iigando. Asr, cuando una celula es expuesta continuamente a elevadas concentraciones de un Iigando, el numero de receptores de su superficie va disminuyendo progresivamente. con una disminuci6n concomitante de la sensibilidad de la celula diana al Iigando. Mediante este tipo de mecanismos, conocido como regulacl6n por dismlnucl6n del ntimero de receptores (receptor down-regulation). las celulas pueden. lentamente (durante horas) ajustar su sensibilidad a la concenlTaci6n de un ligando eslimulador.

A menu do la adaptaci6n r~pida se produce por fosforiJaci6n de los receptores 43 Frecuentcmente en la adaptaci6n de Ja cclula diana participa, adcllH1s de la lenta regulaci6n por disminuci6n del nlimero de receptores. una rapida fosforilaci6n del receptor inducida por el Ugando. EI ejemplo mejor conocldo es el receptor ~2 adrenergico, que activa la adenil ciclasa a traves de las protelna G eSlimulado· ra G•. Cuando las celulas son expuestas a elevadas concentraciones de adrenaJi· na. pueden desensibilizarse en cuesti6n de minutos, a traves de dos procesos que dependen de la fosforilaci6n del receptor pz adrenergico. En uno de eUos. el incremento de los niveles de AMP cfclico causado por la llni6n de la adrenaJina activa la quinasa A. la CllaJ fosforila el receptor l3z sabre un residuo de serina. interfiriendo asf con la habilidad del receptor de activar G•. En el Otro proceso. el receptor pz una vez activado se conviene en substrato de otra protefna quinasa m~s especifica (denominada qlli"asa Ii adrenergl.'ca) que fosforila el extremo car· 001010 de la cola citoplasmatica del receptor activado. sabre multiples residuos de serina y treonina; esta cola fosforilada se une a una prote(na inhibidora deno· minada Ii arrestina (del ingles -arrest": parar). la CllaJ bloquea la capacidad del receptor para activar G. (Figura 15·58). En las celulas fotorreceptoras de los vertebrados. la rodopsina, que como hemos visto esta estructuralmente relaciona· da COil los receptores Ii adrenergicos. se inactiva mediante un mecanismo alta· mel1le rclacionado al descrito basado en la acci6n de la arreslina, despues de haber sido 3clivado par la acci6n de un fot6n. Eslas celulas lienen una capaci· 826

Caprtulo 15: Transmisi6n de scnalcs entTC celulas

r dad de adaptaci6n excepcionalmente rapida y sofisticada, en la que parlicipan, ademas del mecanismo basado en la arrestina, muchos otros; uno de ellos fue discutido anteriormente, en la pagina 806. B mecanismo de desensibilizaci6n del receptor pz adrenergico dependieme de la quinasa A actua cuando los niveles de AMP dclico aumentan en la celula. Asf, la activaci6n de cualquier tipo de receptor de la celula diana que active la adenil ciclasa puede desensibilizar el receptor pz -10 cual constituye un ejemplo de desemibilizaci6r1 Ilecer61oga, medianl'e el cual un ligando desensibiliza la celula diana a otro ligando. EI mecanismo dependiente de la P arrestina, por el contrario, unicamentc actua cuando los receptores P2 han side activados por la uni6n de un liganda -un ejemplo de deserlsibilizaci61l hom6loga. medianle el cual un ligando desensibiliza la celula diana unieamente a sf mismo.

Algunas formas de adaptaci6n son debidas a cam bios en el proceso de sefializaci6n44 A pesar de que 13 mayoria de los mecanismos oonocidos de adaptaci6n suponen

cambios en la protefna receplora, en principia la adaptaci6n puede producirse por modificaciones de cualquier componente del proceso de sefializaci6n. Se conocen varios casos en los que la adaptaci6n de la celula diana se produce por modificaci6n de una proterna G trimerica. Ello ocurre, por ejemplo, en la respuesta de las celulas de levadura a feromonas de apareamiento. Las alteraciones mas adelanle de la protefna G en el proceso de senalizaci6n lambicn pueden contribuir a la adaptaci6n de las celulas diana, como en el caso de los fOlorreceptores (vease pag. 806). En los aditios a la morfina, par ejemplo. las neuronas sensibles a los opia-ceos del cerebro se desensibilizan a la morfina, de forma que los adiClOS necesitan dosis de morfina muy superiores a las que requieren los individuos nomlales para elim..inar el dolor a para causar sensaci6n de euforia (Figura IS-59). Las cclulas adaptadas, sin embargo, tienen niveles normales de receptores de superficie celular funcionales contra la morlina (opiaceos). Los mecanismos de adaptaci6n se han cstudiada tanto en rata como en Iineas celuiares newales sensibles a la morfina, mantenidas en cultivo. Los receptores a la mortina de la superficie de estas celulas activan la proterna G inhibidora G" que inhibe la adenil ciclasa. causando asf una disminuci6n de los niveles intracelulares de AMP cfclico. Ello disminuye la actividad de la quinasaA y, por 10 tanto, la fosforilaci6n de varios tipos de canales i6nicos, 10 cual djsminuye la excitabiJidad electrica de las neuronas. Las celulas cultivadas mantenidas durante mucho tiempo en presencia de elevadas concenlraciones de morfina se adaptan mediante un incremento compensatorio de la expresi6n de los genes de quinasa A y de adcnil ciclasa, 10 cual hace que los niveles tanto de actividad adeniJ cic1asa como de AMP dcLico vuelvan a los valores normales aunque los receptores de la superficie celular esten ocupados por mortina. Sin embargo, como las celulas adaptadas tienen niveles incrementados de adenil ciclasa y de quinasa A, cuando se elimina la morfina se produce un marcado incremento de la actividad adenil ciclasa y de la aetividad quinasa A, que provoca que los niveles de AMP cfdico aumenten hasta aicanzar valores anormalmente elevados. Ello incrementa la excitabilidad de las neuronas y conduce a los smtomas extremadamente desagradables de la deprivaci6n, (ansiedad, sudoraci6n. temblores, alucinaciones, elc.) que experimentan los adietos a la morlina cuando tienen "el mono".

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Figura 15-59 Estnlctura de In morOna.tPor que algunas de nuestras celulas tienen receptores para una droga como la mOnilla. que proviene de las semillas de la adormidera? Duranle mucho liempo los fannac6logos han sospechado que la morfina puede mirnelizar alguna rnolecula sei\a1 intracelular que regule el humory la percepci6n del dolor. En 1975 se aislaron a panir de cerebro de cerdo dos pentapeptidos con actividad sernejante a la morfina denorninados encefallnas. y poco mas tarde a partir de hip6fisis y de otros tejidos se aislaron unos polipeptidos mas grandes con actividad semejante. denominados endorflnas. Todas cstas substanclas. denominadas opidceos end6genos, presenlan una secuencia cornun de cuatro aminoticidos y se unen at mismo tipo de receptorcs de la superficie celular at que se une la morfina (y otros narc6licos relacionados con eUa). A diferencia de la morfina. sin embargo. cstos compuestos son rapidamenle degradados tras ser segregados. de fonna que nunca se acumulan en cantidadcs suficientes como para inducir 111 tolCfancia que se observa en los adiclos a la momna.

La adaptaci6n desempeiia un papel crucial en la quimiotaxis bacteriana4:l Muchos de los mecanismos que participan en la senalizaci6n qufmiea entre ceIulas en los animales pluricelulares han evolucionado a panir de mecanismos utilizados por organismos unicelula.res para responder a cambios qufmicos de su entomo. De hecho. ambos tipos de organismos ulilizan algunos mediadores intracelulares comunes. Entre las reacciones de los organismos unjcelulares meAdaptaci6n de las dlulas diana

827

'''' jor estudiadas (rente a sei'iales extracelulares, se encuentran las respuestas qui~ miotticticas, en las cuales el movimicnto celular se dirige hacia 0 escapa de una fuente de algljn compuesto qufmico del media. Concluimos esle capflUJo con una descripci6n de 1a quimiotaxis bacteriana la eual, a traves de In pOlencia del amUisis genelico, nos proporciona una ilustraci6n clara y elegante del papel crucial que supone la adaptaci6n en respucsta a sefiales qu(micas. En el Capitulo 16 se discule la quimiotaxis de las celulas eucariotas. Las bacterias m6viles han de nadar hacia los IligaTes donde haya elevadas concentraciones de nutrientes (arrayellles), como los al.ucares, los aminoacidos y pequeflos ~ptidos, y aJejarse de (ugares donde haya elevadas concentraciones de produclos qufmicos nocivos (repelemes) (Figura 15-60l. Este componamiento quimiotlictico, relativamente simple pero c1aramente adaptativo, se ha estudiado especialmente en £ coli y en Salmonella typhinlllrillm. Aqu[ nos centraremos principalmeme en la quirniotaxis hacia los atrayentes: la quimlotaxis que huye de los repelentes se produce esencialmente por los mismos mecanismos, acruanda a la inversa. Las bacterias nadan gracias a los flagelos, que son completamente diferenres de los flagelos de las celulas eucariotas. Los flagelos baeterianos consisten en un cilindro helicoidal que contiene un solo tipo de subunidad proteica, lIamada jlagelina. Cada flagelo est
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Figura 15-60 Qulm:IotaxJ.s bactertana. las fOlografias muestran baeterias SaJmonelltl ryphimurlum atrafdas hacia un pequeno tubo capilar de vidrio que oontiene eI aminoacido senna (A) y repelidas por un tubo capilar que oontiene renol (8). las fotograrl3S fueron tomadas a los cinco minutos de haber introducido los tubas capilares en las placas de cultivo en que se encontraban las baeterias. Esla prueba del tubo capilar es un metodo senciUo para demostrar la exIstencla de quimiotaxis baeteriana (De B.A. Rubik y D.E. Kosbland, Prot;. NaIL Aeatl. ScL U~ 75:2820-2824, 1978.)

•

Figura 15·61 Dlbujo esquem:itlcodel mOlor del Oagelo baeteriano. EI nagelo eslt unido a un codo flexible. EI codo esla unido a varias protelnas ctrculares (mostradas en rajo) que Ie hallan integradas en las membranas interiory exterior (plasmatica). y giran con el nagelo aproximadamente a ISO revoluciones por segundo. se cree que 1a rotaci6n estt dirigida por un flulo de protones a traves de un anillo exterior de proternas (el estator). que tambi~n conliene las protelnas responsables de cambiar 13 direcci6n de giro. (Basado en datos deT. Kubori et al.,J. Mol. 8101. 226:433-446, 1992 y N.R.Francisel al.. Proc. Nml. Acad. Sci.

6308, 1992.)

828

Capftulo 15 : Transmisi6n de sei\a1es entre celu]as

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89:6304-

utiliza 13 energfa aJmacenada en el gradiente transmembrana de H' girnndo r.1pidamente y moviendo el Oagelo helicoidal (Figura 15-61). Debido a que los Oagelos de la superficie bacteriana tienen una "orientaci6n" intrinseca. diferentes direcciones de rotaci6n tienen efectos distinlOS so· bre el movimiento. La TOlaci6n en eI sentido opuesto a las agujas del reloj hace que los nagelos se unan fonnando un haz, con 10 que la bacteria nada de forma uniforme en una direcci6n. Pero la rotaci6n en el sentido de las agujas del reloj hace que los flagelos se separen unos de otros. con 10 que la bacteria se mueve de forma ca6tica sin avanzar (Figura 15-62). En ausencia de estimulos ambienta· les, Ia direcci6n de giro de los Oagelos se revierte cada poros segundos producieodo un patr6n caracterfstico de movimientos en eI que Ia nataci6n suave en Linea recta se halla intemunpida por cambios abruptos de direcci6n (Figura 15-

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63A).

Este patr6n normal de nataci6n de Ia bacteria se modifica por attayentes 0 por repelentes quimiot:k:ticos, los cuales se unen a protefnas receptoras especr· ficas afectando la frecuencia de cambios de direcci6n, incrementando 0 disminuyendo Ia duraci6n de los intervalos de tiempo entre los cambios sucesivos de direcci6n de giro de los Oagelos. Cuando las bacterias est:in nadando en una di· recci6n favorable (hacia concentraciones elevadas de un atrayente 0 huyendo de concenttaciones elevadas de un repclente), cambian de direcci6n menos fre· cuentemente que cuando est:in nadando en una direcci6n desfavorable (0 cuando no existe mngUn gradiente). Como los perfodos de nataci6n suave son mas largos cuando la bacteria se desplaza en una direcci6n favorable, graduatmenle progresarn en esta direcci6n -hacia un atrayente (Figura 15·638) 0 apart:indose de un repeleme. En su ambiente natural, una bacteria detecta un gradiente espacial de atrayentes 0 de repelenles en el medio, nadando a una velocidad constante y com· parando la concentraci6n de compueslOS quimicos en fonci6n del tiempo (no monitoriza los cambios de concentraci6n utilizando receptores separados en el espacio a 10 largo de su longitud; ello serfa extremadamente dificil dado el pequefifsimo lamafio de la bacteria). En ellaboralorio se pueden generar artificialmenle variacioncs de concent'raci6n en funci6n del tiempo, medianle la adici6n o la eliminaci6n de productos qufmicos del medjo de cuhivo. Cuando se afiade, de csta (onna, un atrayenle at medio, la bacteria, tal como era de espcrar, cesa de cambiar de direcci6n durante algunos segundos. Pero transcurrido esle tiempo, incluso aunque se mantenga la presencia de atrayente en el medio, la frecuencia de cambio de direcci6n de la bacteria se recupera hasla valores norma-

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Adaptad6n de las relulas diana

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Figura 15-62 Poskionesdeb fbpIoI: de £ coli durante .. nat-*Sn. Cuando los flageIos giran en sentido Opueslo al de las agujas del reloj W quedan unidos en un solo baz que aettia como helice, dando lugar a Wla nataci6n suave. Cuando los BageJos giran en el sentido de las agujas del rdoj (8) se separan entre sf, generando un movimiento ca6tico.

Figura 15-63 Camlnos recorridos por una bacleria al nadar. En ausendade seftales quimiotacticas (A), los perfodos de nataci6n suave se intemJmpen con breves movimientos ca6ticos que modifican al azar la direcci6n del desplazamiento. As! pues, la bacteria se desplaza en tres dimensiones de una forma ca6tica, con continuos cambios de direcci6n que alteman con periodos de nataci6n suave. En presencia de un atrayente quimiotktico (8), eI movimiento ca6tico queda parcialmente suprimido mH!ntras la bacteria se desplaza hacia una concentrad6n mas alta del alrayente. de modo que se va acercando gradualmente al atrayente -un desplazamiento aI aut sesgado.

181

829

Figura 15-64 Modelo de la eslructuca homodlmertca de la protefna re<:eptora qulmlotactlca del aspartalO. La estruclura tridimensional del dominio eXU"acelular ha sido oblenida por difracci6n de rayos X. Los dominios inlracelulares superenrollados son una predicci6n a partir del analisis de la sec:uencia de aminoAcidos. Contienen los lugares de rnetilaci6n (mostradoscomo pll11l0S negros), de los que hay cuatro en cada una de las dos cadenas polipeptidicas (los lugares de una de las cadenas estan fuera de visi6n en la figural. Se cree que la uni6n delligando. en el espacio periplasmlilico. induce un cambio de oonfonnaci6n en el receptor que se propaga por loda la membrana mediante un movimienlO de toda la moldcula sernejante al de una tijera. (Basado en M.V. Milburn et al .. SCience254:13421347, 1991 e 1991 the AMS: y I.B. Stock et al../. Bioi. Cllem. 267:19753-19756. 1992. publica ASBMB.)

les. La bacteria se mantiene en este estado adaptado mientras no se produzca ninguna dismjnuci6n 0 aumenlO de 101 concentraci6n de atrayente en el medio; la adici6n de mas atrayenle de nuevo suprimira durante unos segundos los cambios de direcci6n de 101 bacteria mienuas que 101 eliminaci6n de atrayente en el medio incrementara, tambien durante unos segundos, 101 rrecuencia de cambios de direcci6n. hasta que 101 bacteria se haya vueho a adaptar OIl nuevo nive!. La adaptaci6n constituye una pane crucial de 101 respuesta quimiotactica en tanto que permile a 101 bacteria responder a ca",bios de concenuaci6n en lugar de responder a niveles estacionarios de un atrayente. y responde a estos cambios en un extraordinariamente amplio rango de concentraciones del atrayente (en algunos casosdesde menos de 10-10 M hasta mas de 1()-3 M).

La Quimiotaxis bacteriana est(\ mediada por una familia de cuatro receptores transmembrana hom61ogos y por un sistema de fosforilaci6n que transmite la seiial46 EI desenmarai'iamiento de los mecanismos moleculares responsables de 101 quimiotaxis bacteriana hOI dependido fundamentalmente del aislamiemo yanaJisis de mutantes con comportamiento quimiot8ctico defectuoso. De esta forma, se ha demostrado que 101 quimiotaxis a varios compuestos depende de una pequena familia de prolefnas receptoras transmembrana relacionadas entre sf. que son responsables de la transmisi6n de seoales quimiotacticas a traves de 101 membrana plasmlitica. Estos receptores qulmlotacticos se melilan durante 101 adaptaci6n (vease mas adelante), por 10 que a menudo se les denomina praterlitiS de qllimiotaxis accptoras de melilos (MCP, de Methyl-Accepting Chemotaxis Proteins"). Como verernos, la actividad del receptor se estimula por un incremento de la concentraci6n de atrayente: un solo receptor se afecta par ambos [ipos de moleculas. can consecuencias opuestas. Existen cuatro tipos de receptores quimiot8cticos de membrana, cada uno de los cuales esta relacionado con 101 respuesta a un pequeno grupo de compuestOS qufmicos. Los receptores de tipo I Yde tipo 2 median 101 respuesta a 101 serina y OIl aspartato. respectivamente, uniendose a estos amino<1cidos directamente y transduciendo el evento uni6n en forma de seoal en el citosol. En la Figura 15-64 se presenta un modelo de 101 estructura de uno de eslOS receptores. Los receptores de tipo 3 y 4 median la respuesta a azucares y a dipeplidos, respectival11eme. de una manera ligeramente menos direcl'a (Figura 15-65). Estudios gemWcos indican que cuatro protefnas citoplasmthicas -CileA, CheW, CheY y Chez.- participan en el proceso de seflalizaci6n que acopla el receptor quimiotactico con el motor bacteriano. CheY actua en el final efector del proceso. controlando la direcci6n de giro del f1agelo. Cuando esta aClivada, se une aI motor haciendo que gire en el sentido de las agujas del reloj, 10 cual produce cambios de direcci6n del movimiento de 101 bacteria; los mutantes que carecen de esta protefna nadan de forma continua sin cambiar de direcci6n. CheA es una hislidina protefna quinasa. Cuando esta unida tanto OIl receptor quimio630

Capitulo 15 : Transmisi6n de senaJes entre c~lulas

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tactico como a CheW, y aClivada por elias. se autofosforila sabre un residua de histidina y casi inmediatamente transfiere el fosfato a un residuo de acido aspartieo de CheY. La fosforilaci6n de CheY act iva la protefna de manera que se une al motor llagelar y genera una rotaci6n en el sentido de las agujas del reloj, y cambios de direcci6n. CheZ rapidamenle inacliva a la CheY fosforilada. estimulando su desfosforilaci6n (Figura 15-66). La uni6n de un repelente a un receptor quimiOlactico incrementa la actividad del receptor, el cual, a su vez. incrementa la actividad de CheA y por 10 tanlo la fosforilaci6n de CheY, que genera cambios de direcci6n. Estas fosforilaciones se producen rnpidamente: el tiempo necesario para que se produzca la respuesla de cambios de direcci6n lras la adici6n de un repelente es de alrededor de 200 milisegundos. La uni6n de un atrayente tiene el efecto opuesto. Oisminuye la actividad del receptor, el cual disminllye la actividad de CheA, de forma que CheY permanecc desfosforilada, elmotor continuara girando en scntido contrario al de las agujas del reloj y la bacteria nadara de manera continua. La funci6n de CheY en la quimiotaxis bacteriana es anaJoga a la funci6n de las protefnas Ras en la senalizaci6n de las celulas animales. Como Ras, CheY acnla como un interruptor de encendido/apagado; se halla aCliva cuando esta fosforilada e inacliva cuando esta desrosforilada, tal como ocurre can Ras, que esla activa cuando tiene unido GTP e inactiva cuando tiene unido GDP. CheY se activa por CheA y se inactiva par CheZ. tal como Ras se aCliva por GNRP y se inactiva par GAP (vease Figura 15-50). En erector las estnlcluras tridimensionaJes de CheY y de Ras son similares.

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sel'lsl Intrllcelulares

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Figura 15-65 Dlferentes tlpos de receptores qulmlotactlcos. Los atrayentes qurmicos se unen a los rcceptores quimiot~cticos de la membrana plasmatica de tipo lode tipo 2 0 a proteinas receptoras espectficas del espacio periplasmalico (entre las membranas exterior e Interior de la bacteria), las cuales emonces se unen a receptores quimiotacticos de tipo 3 0 de lipo 4. La uni6n de un 3lrayente disminuye la actividad del receptorquimiotktico. inhibiendo In cascada de senallzaci6n intracclular yhaciendo que el motor deillagelo continue girando cn sentido opueSlO al de las agujas del reloj, suprimiendo pues los cambios de direcci6n del desplazamiento de la bacteria y generando un movimiemo suave y continuado. Los atra)'ente5 difunden en el espacio periplasmatico desde el exterior de la ctHula, a traves de grandes canales situados en In membrana exterior (no mostrados aquO.

En la quimiotaxis bacteriana, la metilaci6n del receptor es responsable de la adaptaci6n 46 En la quimiotaxis bacteriana la adaptaci6n resulta de la meliJaci6n covaJeme de las protefnas receptoras quimiotacticas. $i se bloquea el proceso de metiJaci6n mediante una mutaci6n, la adaptaci6n se inhibe marcadamente y la exposici6n de la bacteria mutante a un alrayente produce el cese de los cambios de direcci6n de su movimiento durant'e dias. en lugar de durante algunos segundos 0 un minuto. Asf pues, la activaci6n de los receptores quimiotactieos por un quimioAdaptacl6n de las c~luJas diana

831

Figura 15-66 Sistema de transfereocla de fosforilacieSo que l}Cnnlte a los receptores qulmlotlictloos oontrolar el motor del Oagelo. La uni6n de un repelente incremCl1la 18 actividad el receptor, el cual se une a CheW y a CheA, estimulando asf CheA a que se autofosforile. R<'ipidamente CheA Iransficre el grupo fosfato que tiene unido de forma covalente a traves de un enlace de alta energfa. directamente a CheY generando CheY-fosfato, cl cual se unc al motor del nagclo haciendolo girar en el sentido de las agujas del reloj,lo cual hace que la bacteria entre en un movimiento anarquico, coo constantes cambios de dirccci6n. La uni6n de un atrayente tiene los efectos contrarios. Dismlnuye la actividad del receptor con los que produce una dlsminuci6n del grado de fosforilaci6n de CheA y de CheY. 10 cual provoca que el motor nagelar gire en scntido opuesto aI de las agujas del reloj, y por 10 lanto la bacteria nade con un movimiento sua\'e y continuo. CheZ acelera la desfosforilacicSn de CheY-fosfato. antagonizando asf la acdeSn de OleY. Cada uno de estos inlennediarios fosforilados se desfosforila en cuesti6n de unos 10 segundos.locualIe pennite a la bacteria responder de una forma muy rnpida acambios de su entomo (vhse Figura 15-10).

atrayenle tiene dos consecuencias diferentes: (I) nipidamenle disminuye la actividad del receptor, disminuyendo la actividad de CheA y de CheY y haciendo que el motor flagelar continue rotando en sentido contrario aI de las agujas del reloj, 10 cual hace que cesen los cambios de direcci6n; (2) se produce una adaptaci6n ya que. mientras el arrayenle est<1. unida aI receptor. el receptor es metilado por una enzima del citoplasma, 10 cual revierte la activaci6n durante un perlodo de algunos minutos (Figura 15-67). La metilaci6n del receptor est:i catalizada por una enzima soluble (1a meliJ trans/erma> que actua sobre la protefna receptora. Se pueden lIegar a transferir ocho grupos metilo a cada receptor. por 10 que el grado de metilaci6n se incrementa a elevadas concentraciones del atrayente (cuando cada receptor est<1. unido alligando durante periodos de tiempo prolongados). Cuando el arrayente se elimina del medio. el receptor es desmetilado mediante una enzima desmetilan· te soluble (metil esterasa). A pesar de que el nivel de metilaci6n varfa durante 1a respuesta quimiot<1.ctica. permanece constante mientras la bacteria est:1 adapta· da, ya que se alcanza un balance exacto entre las velocidades de melilaci6n y de desmetilaci6n. La metil esterasa que elimina los grupos metilo de los reccptorcs quimiot<1.cticos tambi~n est:1 regulada mediante fosforilaci6n mcdiada por CheA, 10 eual proporciona otra forma de regulaci6n por retroalimentaci6n ncgativa que tambi~n contribuye al proceso de adaptaci6n. Probablcmcnte quedan Otms imcracciones y retroalimentaciones por descubrir en la quimiotaxis bacteriana. Sin embargo, ya se han identificado todos los genes y lodas las protefnas que participan ell este componamiento alta mente adaptativo. y en la mayorfa de los casos se conacen las secuencias de las protefnas, y estas proteinas se encuentran disponibles ell grandes cantidades. Por ello. parece que la quimiotaxis baeteriana ser<1. el primer sistema de sei'lalizaci6n Figura J 5-67 ActJvacieSn sec:uenclaJ y adapl&CleSn (vfa metllacl6n) de un receptor qulmlotlicUoo. N6tese que la actlvidad del receptor, y por 10 tanto la frecuencia de cambios de direcci6n de la bacteria, es la misma en el eSlado basal que en el estado de adaptaci6n. EI receptor se ha represemado con dos lugares de metilaci6n, para simplificar el dibujo; en realidad existen ocho lugares de metilaci6n en cada receptor. A medida que la concentraci6n del alrayente va aumentando. la fratti6n de tiempo durante la cual el receptor estci ocupado por elligando tambien aumenla. Aelevados niveles del alrayente pues, se produCLra un cambio de confonnaci6n del receptor mayor que a ba}os niveles de Ugando. empujando aun mas al receplor hacla su estado completamente aJlerado. Sin embargo, se produce un ligero grado de melilaci6n. de fonna que en cuesti6n de algunos minutos la a1teraci6n confonnacional del receptor se habrn revertido completamente y la actividad del receptor se Incrementar.l hasta su niveJ anterior. FJ receptor se ha adaptado. 832

Capftulo 15: Transmisi6n de seftaJes entre celulas

......

motor del giro en.1 senlido de las ~uj" del

'"'~ MOVlMIENTO ANAROUICO eON CONTINUOS CAMBIOS DE D1RECCION

luga. de uoi6n delligando lugar de I.. metilaci6n

~e~~~~~~oor -;/ II \ <' LA UNION DELAlMYENTE D1SMINUYE LAACTMDAO DEL RECEPTOR Y HACE ASEOUIBLES LOS LUGARES DE METlL.AOON ALA METlL TRANSfERASA

III \'

receptor menos activado


II

LOS lUGARES EXPI.£STOS HACE OI.JE LA ACJ1\IDIlD DEL RECEPTOR RECUf'ERE LOS NMlES ANTEAlORES

ceJular que serll comprendido compJetamente en terminos moleculares. Pero incJuso cuando se hayan definido lodas las mohkuJas y sus interacciones, resultarll todavia diffcil comprender de que forma actlian los procesos de sef\aJizaci6n de una red integrada, como discutiremos a continuaci6n.

Resumen Mediante la tulaptad6n a alias ooncentradones de un ligantJo senaI. tk unafonna rfllJersible y M"eruUente tll!l tlempo, las dlulas plUden ajustar su sensibilldad td nivel de estfmulo, respondientJo pun a cambios de la ooncentrad6n en un rango tunpllsimo, y no a ooncentradones absolutas de ligando. fA adaptad6n se plUde produclr de dJferflnta forrruu; (1) la un16n delligantJo punk indudr la inum411z.ad6n de los ret%ptores, algunos de los cuales serdn degradados en los Ilsosonuu -un prooeso denominado reguladdn por di.sminu.ddn tll!l ndmero de receptores (receptor oown·ngulatlon); (2) los ret%ptores activadDs plUMn ser innctivadDs de forma rfllJftrsibk skntJofosforlUulos 0 tmtiltJdos; (3) las protefnas G plU!llen $U inaaivadas de fornuJ reversible; y (4) las prott:fntu de etapDS m4s aoonuuilu del proc:ao til! seRaUzad6n prutkn ur reguladas por incrrtmnto (up-regulation) 0 por di.smi· nuci6n (oown-regulation). A nivel mol«::ulor, el ejemplo mejor cotuK:iQo de adapta~ ci6n tkRfl lugar en las qulmiotaxis baderlana, en ta cualla 1R4ltitaci6n reversible de prott:flUU clave en ta transdu.cci6n de la uiial. que se hallan en la 1R4lmbralUl plasmdtlea. "ermlle a la dlula nadar hacia los ambkntes 6ptimos.

La 16gica de la sefializaci6n intracelular: lecciones

de "redes neuronales" basadas en los ordenadores Cada una de las celulas de un organismo pluricelular estll bombardeada con se· f'iales qufmicas que han sido producidas por otras celulas -senales que regulan su metabolismo, senales que alteran 0 mantienen su estado de diferenciaci6n, sef'iales que determinan cullndo se han de dividir las celulas y senales que dictan cullndo la celula ha de vivir 0 morir. En general, estas sef'iales se unen a receplOres de la superficie extracelular, los cuales activan varios procesos intracelulares de sef'ializaci6n, de forma que las senales intracelulares generadas por rcceptores diferentes interactlian entre sf de maneras muy complejas. iDe que forma una celula integra toda esta informaci6n de modo que puede comportarse de la manera que es 6ptima para el organismo en su conjunto? La tarea de entender de que manera la celula controla su magia parece abrumado· ra. Incluso en el caso relativamente sencillo de la quimiotaxis bacteriana, en el que existen relativamente pocos componentes, y probablemente todos ellos conocidos, las complejidades de las integraciones es demasiado enorme para poderse visualizar fllcilmente y comprender completamente, por el momento. Todavia no podemos predecir real mente, por ejemplo, el comportamiento de un mutante bacteriano en el que se hayan a1terado los niveles de un receptor de membrana 0 de una proterna citoplasmlltica, especialmente si el estfmulo quimiotllctico induye m~s de un atrayente 0 repelente 0 si el estfOluJo cambia rnpidamente con el tiempo. ,De que forma podemos esperar, entonces, entender las redes mucho mAs complejas de senaJizaci6n intracelular de las ululas animales, en las que participan cientos de componentes, muchos de los cuales todavia no conoceOlOS? A medida que vamos disponiendo de mlis informaci6n, resuha Ollls eviden· Ie que las simuJaciones basadas en los ordenadores deben1n jugar un papel cada vez mAs importante en nuestros intentos de entender de que forma aetlian estos procesos de sef\a1izaci6n. Construyendo un modelo del proceso en un ordenador, se puede visualizar y manipular la red de componentes interactivos, de formas que son imposibles de estudiar en las celuJas. La

l6gica de la sel'loallzacl6n celular: lecclones de redes neuronales basadas en los ordenadores

833

Los analisis basados en el ordenador son titHes desde otro punto de vista -que no depende del conocimiento cuantitativo detallado de las reacciones que participan. Los procesos de sefializaci6n intracelular, vistos como un todo, forman una red altamente interconectada en la que las sefiales son procesadas a traves de multiples rutas paralelas que interactuan una con otra. Asf, uno puede aprender acerca del comportamiemo de las redes de sef'ializaci6n companindolas con otras redes altamente imerconectadas. Las redes basadas en el ordenadar, a menudo denominadas redes neuronales, se desarroUaron original mente para comprender de que forma las celulas nerviosas transmiten y procesan la in· formaci6n en el cerebro, pero existen propiedades que tambien son relevantes para la senalizaci6n intracelular.

Las redes neuronales basadas en el ordenador

pueden ser entrenadas47 Uno de los tipos mas sencillos de redes neuronales basadas en el ordenador esta. compuesto de tres niveles de 11llidades interconectadas -un niuef de entrada (i11' put), un niuel escondido y un niuel de salida (OIllPlllJ, Cada una de las muchas unidades de la red acnia como un modelo de celula nerviosa (neurona), cuya salida individual esta. controlada por ml.'!ltiples sefiales de entrada. Las conexiones entre las unidades son anaJogas a las sinapsis y tienen pesos de conexi6n modificables, que controlan la fuerza can la que una unidad influye en ona unidad. La actividad de la red como un todo depende tanto de los valores de estos pesos de conexi6n como de las reglas matemalieas mediante las cuales carla unidad suma sus sefiales de entrada para generar una seflal de salida. Un patr6n de seflales de entrada recibido por las unidades de entrada es transform ado segtin estos pesos y reglas en otros patrones diferentes de actividad en las unidades de salida, v{a conexiones a traves de las unidades escondidas (Figura 15·68). La caracterfsrica mas remarcable y mas utH de las redes neuronales basadas en el ordenador es que pueden ser entrenadas para reconocer patrones especfficos de sef'iales de entrada, y para responder a cada uno de ellos con un palr6n de actividad de salida determinado. EI entrenamiento se consigue confrontando la red con ejemplos de entrenamiento en forma de series de seflales de entrada acompaf'iadas de los correspondiemes patrones deseados de sef'iales de salida. Par ejempia, las entradas pueden ser series de letras presentadas en una orientaci6n determinada en la panralla, y la salida deseada puede ser simplemente la identificaci6n correcta de cada lena. La entrada tambien puede ser las secuencias de aminoacidos de varias cadenas polipeptfdicas y la salida los tipos de eSlTUcturas secundaTias que forma cada cadena polipeptfdica. Cualquiera que sea la tarea, cuando se ha presentado lin ejemplo concreto de entrenamiemo, la salida que propane la red se campara con la salida deseada y se asigna un valor de ~error" basado en 10 cerca que esten las sei'lales real y deseada. Tras procesar todos los ejemplos de la serie de entrenamiento, se calcllia una medida general de realizaci6n, que caracteriza 10 bien que ha trabajado la red en toda la serie de entrenamiento.

ENTRADA

NIVEL ESCONDIDO

SALIDA 834

CapCtulo 15: Transmisl6n de sefiales entre celulas

Figura 15-68 Una red neuronal senclUa. La aClividad de cada unidad neuronal (moslrada como clrculos) se determina par las unidades de entrada. Habitualmente la salida de cada unidad es una funci6nno lineal de las unidades de entrada. Cada una de las conexiones entre unidades tiene una fuel'7.a particular 0 "peso", que se indica par las diferencias de grosor de las flechas que las conectan.

La vemaja del entrenamicnto es que pueden call1biarse los valores de peso de la red, de forma que su realizaci6n lllejore en presentaciones posteriores de series de entrenamiento. Se han disefiado varios algoritmos de entrenamiento para realizar estos cambios de los pesos de las conexiones. Uno de los metodos oonceptualmente m~s sencillos, y quizas el mas relevante para la sefialjzaci6n celular (como se discute mots adelante), es aquel en el que los pesos de las conexiones se cambian al azar, y los cambios que producen una mejora de la realizaci6n de la red tienden a mantenerse. Sea cual fuere el algoritmo utilizado, el proceso de entrenamiento se repite una y otra vez hasta que la salida real de la red se asemeja a 1a salida deseada. Los pesos finales de la red no est~ predetenninados por el algorinno sino que emergen de una fonna aut6noma como resultado de la presentaci6n repetida de los ejemplos de entrenamiento. Cuando la red ha "aprendido" la tarea deseada, a menudo puede reconocer y dar la respuesta 00rrecta de patrones de entrada nuevos, que no formaron parte de los ejemplos de entrenamiento.

Las redes de seiializaci6n celular pueden observarse como redes neuron ales entrenadas por la evoluci6n 46 A pesar de que las redes neurales se utilizaron originalmente para eSludiar sistemas de neuronas interconectadas, no existe ninguna raz6n para que las unidades de estas redes tengan que represen£ar unicamente neuronas; por ejemplo pucden ser enzimas u otro tipo de moleculas senal intracelulares. Consideremos las protefna quinasas que panicipan en Ja sefializaci6n celular. Estas enzimas reciben sefiales de entrada (en forma de fosforilaciones 0 de sencillas uniones de protefnas) a panir de componentes de varios procesos intracelulares de sefializaci6n, y estas senales de entrada, colectivamente, regulan 1a aclividad catalitica de la quinasa. Asu vez, cada qui nasa genera una senal de salida (1a fosforilaci6n de otras proteinas) que regula la actividad de determinadas protel"nas diana, las coales pueden ser componemes mas alejados del propio proceso de senalizaci6n 0 procesos de sefializaci6n paralelos. En tenninos de una red, en este ejemplo las quinasas acnian exactamente como 10 hacen las neuronas: integran varias senales de entrada y responden con una senal de salida adecuada. AI menos en principio, puede entrenarse una red altamente interconectada de reacciones senal intracelulares para que reoonozcan ciertos patrones de senalcs de entrada y respondan con patrones de salida especfficos, de una fonna similar a como hemos descrito para las redes neuronales basadas en ordenador. En este esquema, el entrenamiento debi6 de ocurrir durante la cvoluci6n, mediante mutaci6n y selecci6n natural, de forma que mutaciones al azar en los genes que codifican protefnas senal ejercieron la misma funci6n que las variaciones al azar en los pesos de las conexiones introducidas por el ordenador. Una mutaci6n que camhie In actividad de una protefna quinasa senal, par ejemplo, puede incrementar el peso de una 0 m~s conexiones de la red, mientras que un cambio de la especificidad de uni6n de una protefna SH adaptadora puede afiadir nuevas conexiones. las mutaciones que mejoran la realizaci6n de una red de senalizaci6n, por ejemplo, al pennitirle reconocer una nueva oombinaci6n de factores de crecimiento 0 discriminar entre dos senales extrncelulares que previamente la c~lula era incapaz de dislinguir, pueden proporcionar al organismo una vemaja selectiva y por eUo, ser retenidas para ser mejoradas posteriormente. De esta for· rna, pudo evolucionar una red de sefializaci6n cada vez m~s compleja.

Las redes de sefializaci6n capacitan a las c~luJas para responder a complejos patrones de senales extracelulares47 • 49 Cuando se analizan las redes neuronales entrenadas para detennillar como reconocen complejos patrones de seliales de entrada, se enCllentra que las unidades individuales del nivel escondido (vease Figura 15-68) han 9uedado fuertemente La 16glca de 1a senalizacl6n cclular: lecclones de rcdcs ncuronales basadas en los ordenadores

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ENTRADA mol6c.uln de Ie metriI

factore. de l:reclmlento

SALIDA

interconectadas a conjunlos significativos de unidades del nivel de entrada, de fanna que las unidades escondidas pasan a representar caracterfsticas significativas del patron de entrada aplicado a 101 red. En una red entrenada para reconneer letras represenladas en cualquier orientad6n sabre 101 pantaJJa, por ejemplo, detenninadas unidades escondjdas pueden empezar para reconocer Iineas curvas 0 pares de I{neas en Angulo recto, mientras que en una red entrenada para pronundar palabras escrilas, delemlinadas unidades escondidas pueden representar so-nidos de vocales 0 de consonantes. De una fonna similar, moltkuJas determinadas de senalizaci6n intracelular de una c~Hulapueden haber evoludonado para reconneer combinadones delerminadas de senales extracelulares, contribuyendo asf a tradudr estas combinadones de sci'lales en una respuesla celular particular. Consideremos 101 hipotthica red moslrada en la Figura 15-69, que casi con IOOa seguridad es mucho mAs sencilla que cualquier red de sciializaei6n eneonlrada en una celuJa. Consta de seis tipos de rcceplores de superfieie que eslAn acoplados funcionalmente a Ires prolefna quinasas citos6licas. Cada uno de los rcceptores I, II YIII reconocen diferentes eomponentes dc la malra cxlraceluJar, mientras que cada uno de los reeeplores A, Bye reeonoeen diferenles faelores de crecimienlo. La quinasa 3 lrabaja en una elapa poslerior del proeeso que las quinasas 1 y 2 Yactua como salida de III red, qUi7As estimulando a 101 eelula a proliferar al fosforilar un canjunlo de prolefnas reguladoras de genes. Debido a las diferentes fuerl.aS de las conexiones de la red, algllnas de las euales son exdtadoras y olras inhibidoras, eada una de las Ires quinasas seran estimu.ladas de forma 6plima par diferentes combinaciones de scf'iales extraccllliares. La quinasa 1 es mas activa cuando 101 celu.la enellcntra los componcntes I y II de matriz y no encuenlra los componentes III, mientras que la quinasa 2 cs mAs aeUva cuando 101 eelula encuenlra factores de crccimicnto A, By C y no el eomponente HI de malriz. Los requerimientos para la aelividad 6plima de 101 quinasa 3 son mAs eomplejos, ya que es sensible OIl entomo extraeelular unicamenle a traves de las quinasas 1 y 2. Presentar;i mmma aClividad, y estimulara a 101 celuJa a proliferar, cuando las quinasas I y 2 sean aelivas simult:\neamenle -es decir, cuando la eelu.la haya encontrado los faclOres de crccimiento A, By C y las moItxuJas de matriz I y II, Yno la molecula de malnz III, 10 cual conslituye un patr6n sorprendentemente complejo si conside· ramos la senciUez de 101 red. De acuerdo con esle punto de vista, 101 quinasa 3 ha "aprendido" a 10 largo de la evoluci6n a asociar esla partieuJar combinaci6n de estimu.los extraeelu.larcs con 101 necesidad de la eelula para proliferar. De la misrna fonna a1gunas de las imponantes molecuJas sefial de una ce.luJa real han aprendido a reconocer y responder a combinaciones relevantes de caracterfsticas del enlomo celular. 836

Capitulo 15 : Transmlsi6n de sci\a.Ies entre c6u.1as

Figura 15·69 Una hlpoletlca red de seftallzacl6n senclUa. La red conSla de seis receptores y tres protefna quinasas cit0s6licas. Cada receptor activa (/lechas verdes) 0 inhibe (l(neas negras) la quinasa I, la quinasa 2 0 ambas, mediante un mecanismo no espedfico. Dado que las senales convergen en la quinasa 3 (1a quinasa de salida), esta red sect activa aI maximo tlnicamente cuando se presenten las combinaciones especfftcaS de estfmulos extracelulares. Apesar de que esta red es mocho mas sencilla que cualquiera de las que se halla en una dlula viva. puede rormar parte de un proceso de senalizaci6n nW complejo.

Las redes senal son robuslas Una imponante consecuencia de la arquitectura ahamcnte interconectada de una red neuronal es que. una vez ha sido entrenada para realizar una larea. su realizaci6n no es facilmeme destruida por la modiJicaci6n 0 la eliminaci6n de unidades de la red. Si una determinada unidad responde de forma 6ptima cuando recibe sefiales de entrada de otras seis unidades, tambien responder.1. aunque no tan bien. a tan s610 cinco de eslas senales. Si por ejemplo se introducen cambios al azar en el peso de las conexiones en una red neuronal entrenada para reconacer letras. la capacidad para realizar esta tarea no sc suprime. sino que unicameme se degrada Iigerameme. De una fonna similar. una respuesta celular que depende de procesos de sciializaci6n intracelular ahamente imerconectados no sera f.kilmente a1terada si se elimina 0 se cambia un solo elememo sei'ial de uno de estos procesos. Por eUo. no debemos sorprendernos demasiado de encontrar que una celula eucariota pueda actuar casi con normalidad aunque una protcfna quinasa haya sido inactivada por mutaci6n. incluso si esta proteina quinasa ha sido muy conservada durante la evoluci6n. Probablemente esta estabilidad de las redes de senalizaci6n es importante para celulas perfecta mente normales y para celula que no comienen numeros detenninados de forma precisa de protefnas inlracelulares; adem:is, las concentraciones de metabolitos importalltes pueden flucluar can cl estado melab6lico de la celula. EI extenso ennecruzamiento enne los procesos seiial en las celulas animales puede haber evolucionado. en parte, para permitir que los procesos funcionen normalmente en el seno de eSlas fluctuaciones. Las propiedades semejantes a las de redes neuronales de los sistemas altamente interconectados de prolefnas. puede ayudarnos a enlender otTOS aspectos de la biologfa celuJar. ademlis de la scnalizaci6n celular. Estas mismas consideraciones sc pueden aplicar. por ejemplo. a las complejas redes de protefnas que interaccionan entre sf. que forman el citoesqueleto, que es ellema del pr6ximo capftulo.

Resumen La construa:i6n tk motlelos en el onlenndor puet:le aYlUwnlos a iluminar los compfejos comportamientos de las cascada.s tk seiializaci611 que se encuelltrall en las dlIIlas. Ell particuwr, las rede.s IIeuronales basadas ell ef orde"ador tiefUm una serie tk propiedades que es pas/hle que las ret:ks tk seiiafizacidfl ftltracelular comparta". Tal como las relies IIeuro"ales pllet:um ser entrenadas para reslJOmler de jonlla adeCilada a detem.iruu/os patrolles de senales de elltrada, estas retks tk senalizacidfl, mediarde proct!sos darwilllallos de cambio aleatorio Y seleecid" p/~edell I.aber desarrollado la capacldLui de responder de jorma apropituw a com,,'ejas combinaeiolles de senales extraceluwres. Ln arql4itectllra altamerlte irderactllJ{I de las relies rJelll'O"ales esttf mimetluula por las redes de prote(nas senallrltrticellliares. Ambas retles puedell, en principia, aetllar como eleme"tos de reomocimie"to de patrolles, ttue re.spotullm de jomm dptima a combituu:wnes selecciomuJa.s de estfmulos de etltrada. Las retIes de este tipo tambU" son rewtivamellte re.sistellte.s a las fluctuacione.s de ja"do 0 a las alteraciolles, de JamUl que eliminarulo 11110 de SIlS comporumtes 110 u altere completamenre w red.

La loglca de la sei'iallzacion celular: lecclones de rLodes neuronales basadas en los ordcnadores

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841

Micrografia de Ouorescencla de la bacteria Listeria monocytogelles. La bacteria (en rajo) se desplaza induciendo la ronnaci6n de filamenlos de actina (en verde) en el citosol de las celulas huesped. Las regiones en las que se superpone la fluorescencia verde y 18 raja aparecen de color amarillo. (Por cortesfa de Tim Mitchison y Julie Theriot.)

.,

EI citoesqueleto

16

.-

• La IIatUraIea del dtoeequeleso • Pllaaaeatollntltl"llMlllb

•aIIoI, ceub IloIoI • tu.meo. . 4eec:dna

• Protdnalcle anI6n alaJM:dna

·S . . . . . .

La capacidad de las c~lulas eucariOias de adaptar una gran variedad de formas y lIevar a cabo movimientos direccionales y coordinados depende de una red muy compleja. de filamcnloS proteicos que se extienden a lfaves del citoplasma (Figura 16-1). Esta red recibe el nomhre de citoesqueleto, aunque. a difercncia del esqueleto 6500. es una CSlnlctura sumamente dinamica que se reorganiza cantinuamcnre mienlras la celula cambia de forma. se divide, y responde a su co-

loma. De hecho. el ciloesqueleto podrfa. lIamarse tambien "citomusculatura" ya que es el responsable directo de movirnientos tales como el deslizamienlo de las celulas sobre un substrata, la contracci6n muscular. y lodos los cambios de forlila que ocurrcn durallle el desarrollo embrionario de los vertebrados; tambicn proporciona la maquinaria para los movimientos inrracelulares. lales como el transporte de los organulos desde un lugar a otro del citoplasma y la segregaci6n de los cromosomas durante la mitosis. Las bacterias carecen, aparentemente, de cilocsquclcto. par 10 que podrfa haber sido un factor decisivo en la evoluci6n de las celulas cllcariotas. Las diversas actividudes del citocsqueleto dependen de tres tipos de filamentos proteicos -los jilamemos de actina. los microlllblllos y los j'ilamelltos i,,· termeciios. Cada tipo de filamento esta formado par una subunidad proteica distinta: actina para los filamentos de actina, tubulina para los micro1l1bulos, y una familia de protefnas fibrosas relacionadas, tales como vimentina 0 laminas. para los filamentos Intermedios. La actina y la tllbulina han sido altamente conservadas a 10 largo de la evoluci6n de los eucariotas; sus filamentos proteicos se unen a una gran variedad de protelnas accesorias. las cuak'S capacitan al mismo filamento para parlicipar en distintas funciones en regiones diferentes de la cclula. Empezaremos este capltuJO con una introducci6n sobre los lIes principales tipos de filamentos del citoesqueleto e ilustrando algunos de los principios generales que rigen su funcionamiento. Despues de clio, consideraremos cada tipo de ftIamento por separado: en primer lugar. los filamcntos intennedios. cuya estnlctura a modo de cuerda parece tener la funci6n reJativamente simple de proveer a las relulas de fueua me· canica; en segundo lugar, los microtubuJos. los cuales se consideran los organi· zadores primarios del citoesqueleto; y fmalmente. los filamentos de actina. que son esenciales para muchos de los movimientos celuJares. especialmente los que se \levan a cabo en la sllperficie celuJar.

Figura 16-1 EI citoesque!cto. Celula en cuJtivo Iijada y marcada con el azul de Coomassie. colorante espedfico de proternas. Podemos obselVar la gnm vanedad de estructuras nJamentosas que se exticnden a traves de In c~lula. (Por cortesfa de Colin Smith.)

843

La naturaleza del citoesqueleto Una cclula cucariota dispone de miles de miUones de molecuJas proteicas. las cuales constituyen ccrca del 60% de su peso seeD. Se cree que una celula individual de un vcrtebrado tiene aproximadamente 10 000 tipos de protcfnas distilllas, la mayorfa de las cuales se encuentran organizadas en el espacia. Enconlramas esla organi7..aci6n a distintos niveles. En todas las celulas, las prOlcfnas fomlan complejos funcionales. la mayorfa de los cuales eslAn farmadas QUizas

por 5 a 10 protefnas, aunquc otros complejos pueden ser Ian grandes 0 incluso mjs que los ribosomas. EI siguicnte nivel de organizaci6n induye la disposici6n de prOlcfnas locaJizadas funcionalmente en 1a misma membrana 0 en el mismo compartimienlo acuoso de un orgAnulo limilado por una membrana, como por ejemplo el mlcleo, las milocondrias 0 el complejo de Golgi. EJ choesqueleto es el encargado de crear y mantener un nivel de organizaci6n todavia m<1.s elevado. Conviene la relula viva en una cosa muy parecida a una ciudad, con servicios especializados concentrados en o1reas distintas pero tmalmenle inlerconectados mediante vias de comunicaci6n. En esta secci6n, revisaremos algunas de las esrrategias Msicas que capacitan aI citoesqueleto para controlar la localizaci6n de los complejos proteicos y los orgi1nulos asl como para crear las vias de comunicaci6n entre eUos.

EI citoplasma de una c~lula eucariota esta organizado espacialmente por los fiJamentos de actina, los microtubulos y los mamentos intermedios) iDe qu~ formas una c~lula eucariota, de diametro de 10 pm 0 m<1.s, puede estar espacialmente organizada por moleculas de proteina del citoesqueleto que son c1aramenre m<1.s pequeiias (unas 2000 veres m:is pequefias en dimensiones lineales)'? La respucsta radica en la poUmerizaci6n. En cada uno de los tres principales tipos de prolcfnns de ciloesqueleto, miles de moleculas proleicas identicas se ensamblan formando un filamento lineal, que puede ser 10 suficientemcnle largo como para ir de un lado de la celula hasta ellado opuesto. Estos filamentos conectan complejos proleicos y orgo1nulos de regiones distintas de la celula y aculan a modo de ranes para el transporte entre ellos. Ademas, forman el soporte mecanico, que es especial mente irnportante en las celulas animales, las cuales no disponen de rfgidas paredes celulares externas. EI citoesqueleto forma una arrnaz6n interno que mnntiene todo el volumen dtoplasmatico. de igual modo como el esqueleto formado por vigas contribuyc a mantener un edilicio. Resulta sencillo determinar c6rno aparecen los filamentos durallle la evoluci6n: cualquier protefna que disponga en su superficie de pares orientados de lugares de autouni6n complementarios puede formar un largo filamcnto helicoidal (vease pag. 131). Cada uno de los tres lipos principales de filamcntos proteicos que forman el citoesqueleto es un polimero helicoidal que tiene una disposici6n diferente en In celula y una funci6n distinta (Figura 16-2). Sin embargo, los tres tipos de filamentos, por sf mismos, no pueden ser responsables ni de la forma ni de la longitud de In celula. Sus funciones dependen de un gran sequito de protefnas accesorias que unen los filamentos a orros filamentos y a otros componentes celuJares. Las protefnas accesorias son esenciales para el control del ensamblaje de los fiJamentos proteicos en lugares particulares, y proporcio· nan los motores que, 0 bien mueven los orgi1nulos a 10 largo de los fLlamentos, 0 bien mueven los filamentos unos respecto a otros.

La dinamica de los microtubulos emana del centrosomaz Los microtubulos son cstructuras polares; un extrema (el extrema mas) es capat. de crecer a gran velocidad mientras que el otro extremo (el extrema menos) tiene tendencia a perder subunidades si no esta estabilizado. En la mayona de celulas, 844

Capftulo 16: EI c!taesqueleto

FILAMENTOS DE ACTINA

Lo. j,lamenlOJ de .cti"'a (Illmbi'n conocido. como microfilamenro.) JOn poUmaro. helicold,I", enro~dos de do. en dos, de la prolelna actin•. Aparecen como Ulructur8B f1eK'ble., con un di'metro deS a 9 nm. que "t'n organludn en una gran veriedad de hllCU. da ,edt. bldimen.ionale. y de gele. trldimen.ionale•. Aunque los filemenlos de actina e.I'n di.pe..os por el citopla.ma de ta celula, esl'n alta mente concenlrados en e4 c6na'l, juliO por debaio de la membrana plalm'liee.

25,m

2SIlm

MICROTUBULOS

LOI mJCrOlubulos.art cihnd,OII largos y hlHlCOS formadas por una protelna lubulina. Su dl'metro utemo" de 2S nm y JOn mucho m'l rigidOJ qlHllos fit.memos de actina. Los mjc,otubulos son largos y rectOI y lipic:emerlle dll9O(len de un eKlr8mO unido a un eenl,o organizedor de mic,otubulos IMTOC, de microtubule or98niz,ng eenlerl Ilemado unflOSOfmltel como puede ob$ervarse en Ie

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"',m FILAMENTOS INTEAMEDfOS " " " " " "

Los filemento. 'ntarmed,o. JOn estructurel parecidn • cuarde., de un dl'metro de aproKimadamente 10 ",m; esl'n form&dos por lal protel",el de los mamentOI intermedlol, qua conlliluyen una grim familia heterogl!inea de protelnas. Uno de 10. tiPOI de fila menlO. intermedias forma una red !lamada I"mlna nuclear que se localila debajo de la membrane nuclear interna. Otros filamentol intermediOI se extienden a 10 largo del ciloplasma proporclonl,.,do a las cl!ilula. relilteneia mec"nlca y ,oll""iendo la lanli6n mec"nice de los tejidos epitelialea medianle I, u,.,i6n de 10. citoplumas de lal cl!ilulas vecinas a trav'. de 111I unionas celular".

2Snm

25 11m

el extremo menos de los mierotubulos esta estabilizado mediante la uni6n a una estructura que recibc el nombre de centrosoma, y los extremos can crecimien· to rapido estan entonces libres para afiadir moUiculas de tubulina (Figura 16-3). EI centrosoma suele estar localizado cerca del nucleo, en la zona central de la celula. En un momento determinado, centenares de rnicrotubulos crecen a partir de un cemrosoma, a1argandose muchas mieras, con su ~extremo mas" dirigido hacia la periJeria celular. Cada uno de estos mieronibulos es una estructura di· narnica que tanto puede acortarse como a1argarse: despues de unos minutos de crecimiento durante los cuales se produce la adici6n de subunidades, su extremo mas puede sufrit una repentina transici6n que implica una perdida de tales subunidades, de forma que la longitud del microtubulo disminuye rapidamente y puede lIegar incluso a desaparecer. La red mierOlubular que emerge a partir del centrosoma esta enviando constantemente nuevas microtubulos que reemplazan a los viejos que se han despolimerizado (Figura 16·4). La naturaleza del citoesqueleto

Figura 16-2 LostrestJposde flIamentos protelcos que constlluyen el citoesqueleto. Se muesrra una elcctronmicrografia de cada tipo de filamento y Wl diagrama esquem~tico de como estan fomlados a panirde subunidades. Tambien puede observarse esquemaocamente la distribud6n de cada filamento en un tipo de relula epitelial Los colores utilizados paR cada opo de liIamento se utilizan tambien en el resto del capitulo. (las micrografias de los filamentos de actina. de los microl11bulos Yde los filamentos intennedios porconesia de Roger Craig. Richard Wade y Roy

Quinlan. respectivamente.) 845

Figura J 6-3 Un centrosoma con micronibulos adherldos. Como hemos indicado, el extremo menos, de crecimiento lento, de cada microlubulo se encuentra inmerso en la matriz del centrosoma (verde claro) que rodea a un par de estruclUras que reciben el nombre de centr(%s. Esla matriz colabora en la delerminaci6n del nlimero de microtubulos de una celula mediante la nucleaci6n del crecimiento de los microtubulos de nueva formaci6n.

+ +

La red microtubular puede encontrar el centro de la ccHula3 l.Qu~

es 10 que determina que las hileras de microtubulos lengan una posici6n delerminada en la celula? Experimentos en los cuales se utilizan ctHulas pigmentarias aisladas a pan.ir de las escamas de peces han proporcionado datos muy importanlcs: en la celula exiSlen grandes celulas a1argadas que contienen gr~nu­ los lIenos de pigmento. Los gninuJos, que pueden ser marr6n oscuro, amarilJos, rojos. 0 iridisccntes. dependiendo de la especie. estan unidos a los microtubulos y pueden agregarse en el centro de la retula 0 dispersarse a traves del ciroplasmao El movimienlO de los granuJos de pigmento se produce a 10 largo de los microtubulos y puede ser controlado por el pez; de esla forma pueden cambiar el color de su piel. En una celula pigmentaria mantenida en cultivo, el movimiento puede ser controlado convenientemente mediante la aplicaci6n de hormonas u olros reaclivos. que hacen variar las concentraciones de AMP ticHco del cilosol: un incremento de la concenlraci6n de AMP cfclico provoca la dispersi6n de los granulos. mientras que una disminuci6n implica una agregad6n de los mismos. Los granulos de pigmento pueden ser utilizados como marcadores de la disposi· ci6n de los micrOlubuJos en la celula (Figura 16-5). Si cortamos, con una aguja. una porci6n de una celuJa pigmenlaria. el frag· mento celular restanle puede sobrevivir durante largos perfodos de tiempo inc1uso aunque desaparezca su nueleo. Si realizamos la misma operaci6n cuando los granulos pigmentarios se encuenlran dispersos por el dloplasma. algunos de eSlos grnnulos qucdan auapados en el fragmento celuJar. Si, inmediatamente despues de la operaci6n inducimos una agregaci6n de los granulos de pigmenlo en eSle fragmento celular mediante lfalamienlos hormonales, estos se mueven hada ellugar donde se ha producido el corte. Pero si esta agregad6n se induce 4 horas despu~s de la operad6n, los granuJos en vez de 1110verse hada la zona donde se ha producido la lesi6n, se mueven exactamenle hada el centro del fragmento celular. Investigaciones posteriores mueSlran que cste cambio impll· ca una redistribuci6n importante de los microtubulos dentro del fragmento, de forma que ahara SlJ eXlremo menDs se encuentra en el centro del fragmento, como si eSluvieran en el centro de una celula inlacta. En efecto, el fragmento celular aislado se ha convertido en una minicelula respecto a la organizaci6n de sus microtubulos: los microtubulos se han reorganizado alrededor de un nuevo centro organizador de microtubulos (Figura 16-6).

• •

,

+ +

Figura 16-4 Cn:<::Imlentoy Dcortamlento de un hazde mkrotUbuJos. EI haz de microlubulos anclados en un centrosoma eSlli en cambio continuo, mientras los nuevas microlubulos crecen (flechaJ rojm) y los microlubulos antiguos se aconan (flecllas azules)•

• 646

CapftuJo 16: EJ citoesqueleto

dilminuci6n decAMP eumenta decAMP

OISPERSOS

IAI

AGREGAOOS

Figura 16·5 Q!lulas plgmenlarlas de peres. Eslas celulas gigantes. responsables de los cambios de colorad6n de algunas especies de peces. disponen de grandes granulos de pigmento (morr6n). los cuales pueden cambiar su locali7.aci6n en respuesta a estfmulos neuronales u hormonales. (A) Visl6n esquemalica de una celula pigmenlaria. que muestra la dispersi6n y la agregaci6n de los granulos de pigmento, que se produceR a 10 largo de los microtubulos. (8J Electronmicrograffa de barrido de una celuta pigmentaria despues de una breve exposici6n a un detergente. La membrana plasm<1.tlca y el contenldo soluble del cltoptasma han sido eliminados y pueden observarse los haces de microtubulos asf como los granulos de pigmento asociadas. {C y DJ Itm1genes cn campo claro de la misma celula en una escama de un pez cfelldo africano, que muestra sus granulos de pigmento dispersos par el ciloplasma 0 agregados en el centro de la celula. (El Una Imagen de inmunofluorescencla de otra celula del mlsmo ejemplar marcada con anticuerpos conlra tubullna, que muestra largos haces de microtubulos paralelos extendlendose a partir del centrosoma hacla la periferia celuJar. (B, de MA McNivcn and K.R. Porter, j. Cell BioI. 103: 1547-1555), 1986, reproducida con permiso de copyright de Thc Rockefeller University Press; C, D, YE, por'cortcsfa dc Leah Halmo,)

+

e.ntrosome con un per de e.nlrfolos

++ eortado~ pot equf

con une agujl

""'~~""O~

Figura 16-6 Un experlmento que muestra de que fonna un haz de mJcrotubuJos puede encontrar el cenlro de la «Iula. Despues de que el extremo de una relula pigmentaria de un pez se corte con una aguja. los microtl1bulos situados el fragmento celular aislado se reorientan, siluando SU extremo menos cereano al centro del fragmento.

Ol'{Jenlledor

de microtubule. lin cttn1riolol

frlgmento celul8t

-+ con mlCl'otubulos r80'V,niI8Oot:

celule meI,n6fore

La naturaJeza del cltoesqueleto

847

Este cxperimento tan sencillo sugiere que las hileras citoplasmaticas de microtublilos que emergen del centrosoma plleden actuar como un mecanismo de supervivencia que es capaz de encontrar el centro de la celula. Esta posibilidad es muy imponante puesto que implica que la red microtubular puede organjzar el interior de la celula. Pera esto 5610 es el punta de inkio; tal y como veremos m.is adelante en esta secci6n de introducci6n, una celula puede posicionar la red moviendo especificamente su centrosoma a un lugar desplazado del centro celular.

Determinadas protemas motoras utilizan la red microtubular como gufa para posicionar los orgarmJos rodeados de membrana· Como acabamos de ver en las cclulas pigmentarias de determinadas especies de peces, los filamentos del citoesquclcto pueden utilizarse no s610 como soporte esuuctural sino como IIneas de transportc. Si con el microscopio 6plico observamos una celula viva de un vertebrado, podemos contemplar su citoplasma en continuo movimiellto. Despues de unos minutos, las mitocondrias y otras organulos membranosos mas pequenos cambian sus posiciones mediante movimiemos saltatorios peri6dicos, mucho mas sostenidos y direccionados que el continuo y pequeno movimiento browniano, pravocado por el movimiento termico al azar. £stos y olras movimientos intracelulares en las celulas cucariotas son generados par prote(nas motoms, las cuales se unen a los microtubulos 0 a los fLIamentos de actina y utilizan la energfa producida a partir de ciclos repetidos de hidr61isis de ATP para moverse a 10 largo de estos filamentos (vease pag. 221). Actualmente han sido identificadas docenas de protefnas motoras distintas. Se diferencian en el tipo de filamento al cual se unen, en la direcci6n en la que se mueven a 10 largo de este filamento y en la "carga" que transponan. La primera protefna motora descubierta fue la miosina, una proteina que se desliza a 10 largo de los filamentos de actina y que es especial mente abundante en el musculo esqueletico donde constituye la parte mas importante del aparato contractil. POSleriormente se descubrieron otros tipos de miosinas en las celulas no musculares. Todas las miosinas tienen dominios motores semejanles (la parte de la protefna responsable del movimiento), pero presentan diferencias muy marcadas en los dominios a traves de los cuales la molecula de miosina se une a otros componentes de la celula. Las prOtefnas motoras que se mueven a 10 largo de los microtlibulos son distintas a las miosinas y pertenecen ados familias: las qllillesillas, que gcneralmente se mlleven hacia el extremo mas de los microrubulos (a partir del ccntrosoma), y las dille[/las, que se desplazan hacia el extremo menos (hacia cl centrosoma). AI igual que las miosinas, cada tipo de prote(na motora dependierue de microtubulos transpona una carga determinada con la cual se desplaza (Figura 16-7). Las proteinas mororas microrubulo-dependientes juegan un papel muy importante en el posicionamiento de los organuJos membranosos dentro de la celula eucariota. Los tubulos membranosos del retfculo endoplasm3.tico (ER), por ejemplo, eslan alineados can los microtubulos y se extienden casi hasta la periferia celuJar; el complejo de Golgi, en cambio, esta localizado cerca del centroso-

EXTREMO

EXTREMO

MENOS

MAs motor

adaplador OINE[NAS carga

848

Cap{tulo 16: EI citoesqueleto

Flgun t6-7 ProteJnas motorasque se mueven alo largo de los mlcroll1bulos. Las quinesinas se mueven hacia el extremo mas de los microlubulos, mientras que las dinefnas se mueven hacia el extremo menos. Como hemos indicado, pueden exiSlir diversas formas de ambas prOlefnas mOlOras microlubulares, y se cree que cada ulla de eUas transporltl un lipo distimo de carga.

L

IAI

rna. Cuando tralamas las celulas con una droga que despolimeriza los micrOl1j· bulos, ambos org:tnulos cambian su locaJizaci6n: el ER se colapsa hacia el centro de la celula, mientras que el complejo de Goigi se fragmema en mtihiples vesiculas de pequeno (amano que se dispersan por todD el ciloplasma. Cuando la droga es eliminada. los organulos recuperan su posicion iniciaJ, conducidos por

prolefnas mOlOras que se desplazan a 10 largo de los microtubulos nuevamente farmadas. Se cree que la posici6n de cada uno de estos organulos vicne delcrminada por una protefna receplora que se encuentra localizada en la superficie d· tos6lica de la membrana del orgemu.lo, 1a Cllal se une a una prolcfna mOlora mi-

crolubulo·dcpcndiente especffica -una quinesina para el ER y LIlla dineina para el complejo de Goigi (Figura 16-8).

EI c6rtex de actina puede generar y mantener la polaridad celuJarS En general, los microtl1bulos funcionan como entidades individuales, mientras que los filamentos de actina actl1an formando redes 0 haces. Los filarnentos de actina que descansan debajo de la membrana plasmatica, por cjemplo, eSlan asociados a una red de protefnas que se unen a la actina formando el cortex celuJar. Como discutiremos mas adelante, la red es ahamente dim1mica y funciona con diversos tipos de miosinas que controlan los movimientos de la sllperficie celular. La localizacion y orientaci6n de los filamentos de actina corticales esta controlada mediante lugares de nucleaci6n en la membrana plasmatica; dislinlas regiones de la membrana dirigen la formaci6n de diferentes estruCluras basadas en los filamenlOS de actina. Delerminadas senales extracelulares que afeclan a una parle de la superficie celular pueden provocar reeSlruCluraciones locales del c6rtex de aClina debajo de la zona correspondiente de la membrana pJasmtttica. De manera recfproca, la organizacion del c6rtex de actina puede tener una influencia delerminada en el comportamiento de la membrana plasmatica que esta por encima. Mecanismos basados en los nJamenlos de actina corticales, pueden, por ejemplo, empujar la membrana plasmtitica hacia fuera rormando largas y finas microespi"as 0 exlen50S lamelipodios, 0 pueden invaginar Ja membrana duranle la divisi6n celular (Figura 16-9). En casas extremos el c6rtex de actina puede inlegrar los movimienlos de una celula animal sobre su superficie complela y mantener la polaridad celular La naluraJeza del ciloesqueleto

Figura 16-8 DlstribuckSn de los orglinulos por los mkrotubulos. (A) Diagrama esquemalico de una celu/a que muestr.l.la disposici6n Ifpica de los microttibulos (t'erde). el relfcuJo endoplasmatico (azull. y el complejo de Golgi (amarillo). Se muestra el nucleo en marr6n y el centrosoma en IIf!rde claro. (B) celula marcada con anticuerposcontra el retfculo endoplasmalico (ptlnel SU1Jerior) 0 contra los microtubulos (ptlnef inferior). Las prOlefnas motoras empujan aJ reticulo cndoplasmlllico a 10 largo de los mkrotubulos, lirando de ellos desde su locaJizaci6n hacia la membrana nuclear. (Cl Celula marcada con amkuerpos contra el complejo de Golgi (panel superior) 0 contra los microtubulos (panel il/ferior). En este caso las prote!nas motoras muevell el complejo de Golgi hada su posici6n cerca del cemrosoma. (B. por cortesia de Mark Terasaki y Lan Bo Chen; C, por cortesfa de Viki Allan y Thomas Kreis.)

849

181

independientemente de la rcd microtubular. Esto ha sido i1ustrado mediante expcrimentos en los cuales se han utilizado celulas no pigmentadas de las escamas de los peces. Estas ct"Hulas epidermicas, conocidas como qllcrari/locifOS, migran

en cultivo rapidamentc y de una manera poco corriente, viajando a velocidades iguales 0 superiores a 30 }.Im/minuto. Inmunomarcajes utiliz.'mdo anticuerpos demucstran que los filamentos intermedios y los micron.ibulos se encuentran 5610 en la regi6n posterior alrededor del Ilucleo. mientras que el exuemo extendido de la celula es rico en filamentos de actina (Figura 16-10). Ademtls, las celulas traladas con una droga que despolimeriza los microtiibulos migran a la m.isrna velocidad que las no {ratadas, mientras que 13 migraci6n se detiene totalmente si las relulas son tratadas con agentes que interfieren con los filamentos de actina. Evidentemente. los filamentos de actina (actuando con otras protefnas) son capaces de provocar el movimienlo de los queratinocilos sobre una superficie y tambicn de mantener su morfologfa di(erenciaJ y su polaridad; los detalles del mecanismo implicado no estan aun tolalmente esclarecidos.

Figura 16-9 Amenudo los marnentos de actina conRguran la membrana plasm:hlca de las celulas anlmales. Tres ejemplos de cambios en la membrana plasmatica provocados por la red cortical de filamenlos de aClina. (A) Protrusiones delgadas y punliagudas como las microespinas se forman en la superficie de las dlulas por el ensamblaje de haces de flJamenlos de actina anclados en el c6rtexcelular. (8) Extensiones parecidas a sabanas,lIamadas lamelipodios, tambien se forman en la superficie. en este caso sostenidas por redes alargadas de filamentos de actina en vez de haees discretos. (e) lnvaginaciones de la superficie celular, iguales que las que se producen durante la divisi6n de la eelula, producidas por un haz eontrrtclil de filamentos de actina asociado con la protefna molora miosina.

Normalment.e los filamentos de actina y los microtubuJos actuan juntos polarizando Ja celuJa6 En una celula viva los tres tipos mayoritarios de filamentos del citoesqueleto est:in cOllectados los lInos con los Olros y sus fllnciones est:in coordinadas. La distribuci6n de los filamenlOs intermedios en una celula epitclial en cultivo, par

lei

850

Capftulo 16: EI cltoesquclcto

Figura 16-10 La epidermis de los peces esld formada por celulas mlgratorias. (Al Micrograffas 6!>ticas de un queratinocito en cultivo tomadas a illlervalos de 15 segundos. La eclula esta migrando aproximadamente a 15llm/segundo. (8) Queralinocito observado con el microscopio elccn6nico de barrido, que mUC$lra su extremo en avance ahameme extendido, ycon el cuerpo celular que comiene el nucleo cerca del extrema final de la celula (O) Oistribuci6n de los fLIamenloS del citaesquelelo en esle tipo inusual de ct!:lula. Los filamentos de actina (rojo) lIenan el margen enendido de la c~lula y son los responsables de su migraci6n. Los microrubulos (verde) y los filamentos inlermedios (a.wf) eSlan restringidos en la zona pr6xima al nucleo. (Micrografia por cortes(a de juliellee.)

IAI

•

5e".1 localizada

regi6n npeci81ized.l del C6r(8)<

Figura J 6-11 La polarlzacl6n de una celula T c1tot6xJca despues del reconoclmlento de una celuJa diana. (A) Cambios en el citoesqueJeto de una celula T cilOl6xica despues del contaclo con una ctlula diana. (8) Micrograffa de inmunofiuorescencia en que la celula T (arriba) y su celula diana (abajo)

han sido marcadas con un anticuerpo contra los mlcrolubulos. En la celula T el cemrosoma y los microlllbulos que irradian a partir de el est~n orienlados hacia el punto de centaClo entre ambas celulas. En 13 celula diana el haz de microtubulos no cstll polarizado. (B. reproducida de II. Geiger, D. Rosen, y G. Berke, I. Cell BioI. 95:137-143. 1982, reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller Universily Press.)

ejemplo. puede verse radicalmente aherada 5i tratamos las celulas con una droga que provoca una despolimerizaci6n de los microlubulos: los filamentos intermedios, que normal mente sc distribuyen a 10 largo del citoplasma, se agmpan en la regi6n cercana al nucleo. Existen diversas situadones en las cuales los microtubulos y los fiJamenros de actina acruan de una manera coordinada polarizando la celula entera. Discllliremos unicamenle un ejemplo: la muene de una celula diana mediarizada por los Iinfocilos T citot6xicos. Las celulas T cirot6xicas matan a olras celulas que lIevan amfgenos extranos en su superficie. Esto conslituye una parte importante de la respuesta inmune de los vertebrados a una infecci6n, como se discute en el Capftulo 23. Cllundo los receplOres en la sllperficie de la celula T reconocen un antfgena en la sllperficie de la c~lula diana, la senal de los receprores hacia el cdrtex subyacenre de la celula T altera el ciloesqueleto de diversas maneras. Primero, las proremas asociadas con los filamenros de actina en la celula T reorganizan la zona de conlacro entre las dos celulas. Entonces, el cenlrosoma se reorienta y se mueve junto a los microtubulos hacta la zona de contaclo entre la celula T y la celula diana (Figura 16-IIA). Los micron1bulos, colocan el complejo de Goigi correclamenle debajo de la zona de comacto, dirigiendo la maquinaria asesina -que esla asociada con una secreci6n del complejo de Golgi- hacia la celula diana. En esle ejemplo y en muchos orros, una ceJula se conviene en polarizada de la manera siguienle. Primero, la membrana plasmatica detecta a1guna diferencia en un lado de la celula y genera una senallransmembrana. EI c6rlex de actina se rcorganiza localmente debajo de la membrana afectada, con 10 cual el centrosorna se desplaza hacia esta zona de la celula, probablemelue con un movimiento de los micrOlubuJos. Entonces, el cemrosoma posiciona los sistemas endomembranosos de una manera polarizada. EI resuJlado final es Ulla celula con Ull foro direccional muy marcado (Figura 16-11 B).

Las funciones del citoesqueJeto son diffciles de estudiar Aunque las prindpales subunidades de los tres tipos de polfmeros del ciloesqllelelo, asf como los muchos ciemos de prolefnas que se asocian con ellos. han sido aislados y su secuencia de aminoacidos delerminada. ha sido diffcil establecer c6mo funcionan estas protefnas deniro de la c~luJa. Independientemente de la complejidad que implica la exlslencia de un m1mero enomle de prolefnas implicadas, la comprensi6n del citoesqueleto se ve dificuJtada por dos hechos princiLa naruraleza del ciloesquelelo

851

pales. Primcro, el fUllcionamienlo del ciloesqueleto depende de un ensamblaje complejo de protc{nas. que se unen ~n grupos cooperativos a los filamcntos del citoesqucleto. Es rehitivamente senc1no estudiar el cfecto sabre un liIamenlO de una unica prolc{na accesoria, pero es mucha mas complejo analizar los creclos

de un conjullto de muchas prolcfnas distintas. Este problema no se encuentra unicamente en el esturlio del citoesqueleto, pero aquf es mucha mas acusado. En segundo lugar, las funciones del ciloesqueleto son mucha mas diffcUes de analizar que las funciones de alros grandes grupos de complejos proteicos. EI proceso de sfnlesis del RNA y del DNA, por ejemplo, que inc1uye la rormaci6n de nuevos polfmeros unidos mediante enlaces covalentes, puede ser f<1cihnenle analizado jtJ vitro, en pane porque los productos de las reacciones jtJ vjtro se pueden medir de una manera facil y comparar con los productos correspondientes fabricados en la c~lula. EI ciloesquelelo, por el conlrario, ejerce fuerzas y provoca movimientos sin cambios qufmicos imponantes. EsIO hace que sea especialmente dificil esludiar la funci6n de un sislema citoesquel~lico reconS(ilUido in vitro a partir de los componentes purificados.

Resumen Una red de protefnns jilnmentostU conocidm con el nombre de citonqueleto organizan espadalmente el citoplasma de las dlulns eucariotas. Bta red esuf fonnadn por tres tipos de jilametltos prindpales: microtlib"ws. jilnme1ltos de acti,1a y jilamentos itltermediO$. Los microtlibulos SOli estnu;t14ras rigitlLu q,'e, getleralmellte. dispomm de un extremo unido al centrosoma y otro exrumo Ubre en el dtoplasnm En la mayorin de dlula$ los microtdbulos son estmcturas alIamente dlndmlca.s ql4e altenlatllKlmente CTeCen y se acortan mediante In alUci6n y In plrdlda de s"bunidatks de tllbulina_ Algunas protefn£u motoras se tksplazan en ambas dlrecclones a 10 Inrgo de los mlcrohibulos, tmnsportando orgdnulos membranosos especfJicos Ilaela sus localJuu;lones deternrinadns en In dluln. Losjilame,IlOS de actIna son tambii" eslrllctl4ras dl"dmlcas, pera 1l0nJudmetJte!onmm luu;es 0 redes y 110 flla.mentos simples. Ulla m/Hl llamada c6rtex se forma justo debajo de la membralla plasmdtlca a partir de los jilnmelltos de actilla y de tIIltI variedad i",portatlte de protefr,as que se Ime" a la actilla. Esta mpa rica en actilla colltrala la f01711(1 y los movlmlentos sl~perflclalesde In mayoria de las dlulas animales. Losjllamelllos 111termedlos son relatilKlmellte reslste,ttes, eslructuras a modo de cllerdns que proporclonat' ,wa esttdJllidtu/ ",ectfnlca a la dlulLu y tejidos. Los (res tlpos de jllame"tos esttf"l"terconectatlos y SIts /lmclones coordlnadns.

Filamentos intermedios' Los filamentos inlermedios son fibras proleicas resistentes y duraderas que se encuentran en el citoplasma de la mayorfa de las celuJas eucariOlas superiores. Reciben el nombre de "inlermedios~ porque en las micrograffas clectr6nicas Sll diametro aparenle (8-10 nm) se encuentra entre el de los finos filamentos de actina y el de los grllesos filamentos de miosina de las celulas musculares. donde se descubrieron por vez primera (su diametro es tambien intermedio entre el de los fLIamentos de actina y el de los microtubuJos). En la mayorfa de celulas animales. una exlensa red de filamentos intermedios rodea al nucleo y se extiende desde esta zona hacia la perireria celular. donde illleracciona con la membrana plasmalica (Figura 16-12). Ademas, UD armaz6n densamente lejido de fiJamentos intermedios -Ia lamina nucJear- se encuentra debajo de la envoilura del nudeo. los filamelllos intennedios son paniculannente abundallles en las celulas que estan sometidas a imponantes tensiones meeanicas. Son muy abundanles, por ejemplo, en los epilelios, donde ronnan pane de las uniones especializadas entre dos cellilas vecinas, a 10 largo de los axones de las celulas nerviosas. y en tOOos los tipos de celulas musculares. Cuando las celulas se tratan con soludo-

852

CapftuJo t6: El ciloesqueleto

2O,m

Figura 16-12 FUamenlos lntennedlos en el c1toplasma de una dHula de un telldo en cultJvo. Se marcaron celulas epi!eliales de rata canguro (celulas PtJ(2) en interfase, con anticuerpos contra uno de los tipas de filamentos inlennedios (llamados queratinasl Yse observaron al microscopio de fluorescencla. (por conesfa de Mary Osborn.)

dominlo cent••1en hlillce (l

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regiones que contienen I.. -MelWncl.. en httplld.- Ihepl.d repEl.tI)

nes salinas concentradas 0 bien con delergentes no i6nicos, los filamemos intermedios se conservan mientras que los elementos restames del citoesqueleto son solubilil.ados. De hecho. el termino "citoesqueleto" se utiliz6 original mente para describir a esle sistema fibroso tan estable e insoluble.

Los fLlamentos intermedios son polfmeros de protefuas fibrosas' A difcrencia de la actina y la tubulina, que son protefnas globulares, los tipos

principales de mon6meros proteicos de los filamentos intennedios son mohkulas fibrosas muy a1argadas que tienen una cabeza amino termjnal, una cola carboxilo lerminal, y un dominio cemral a modo de varilJa. Esle dominio central conSla de una regi6n extensa de heLice a que contiene largos landems repelidos de secuencias aminoacfdicas dislinlas, que redben el nombre de "repericiotles ellllepcada". Como disculimos en el Capitulo 3, esta secuencia de 7 aminoacidos permite la formaci6n de dfmeros enroUados entre dos helices Cl paralelas (vease Figura 3-48). Otros tipos de prolefnas a1argadas del citoesqueleto con eslruCluras dimericas enrolladas, como por ejemplo la tropomiosina y la cola de la miosina, conliencn largas tiras de repeliciones en heplada, como discutJremos m<1s adelantc. En la siguicnte elapa dcl cnsamblaje, dos de los dfmeros enrollados interaccionan anliparalelamente formando un leuamero (Figura 16-14). Se encuentran pequenas cantidades de letrameros solubles en las celulas, 10 cual sugiere que la subunidad lelram~rica constiluye la unidad fundamental para el ensamblaje de los lilamenlQS intermedios. La disposici6n antiparalela de los dfmeros implica que el telramero y, por consiguiente, el filamento que forma, cs una estructura no polarizada -eSIO es, es la misma estructura en ambos extremos y es sim~lrica en toda sulongiwd. Esto distingue los filamentos intermedios de los microttibulos y los filamentos de aClina, que son estructuras polarizadas, cuya funci6n depende de csta polaridad. La Clapa final del ensamblaje de los filamenlOS intennedios no esta atin completamente caracterizada, pero parece que los tet.r<1meros se afiaden al filamento inlennedio en crecimiento mediante una reacei6n de uni6n sencilla, alineandose a 10 largo del eje del filamento y uni~ndose siguiendo un patr6n helicoidal (v~ase Figura 16-14). EI dominio centra] a modo de varilla, cuya estructura es parecida en todos los tipos de filamemos intennedios. inlerviene en las interacciones lalerales que forma el filamemo ensamblado. Los dominios g10buJares de la cabeza y de la cola pueden variar significativamente tanto en ellamaflo como en la secuencia de aminoacidos. sin que eSlO afecle la eSlruClUra axial basica del ftJamento; a menudo se proyeclan desde la superficie del fiJamento e intervienen en las unio· nes con olroS componentes. Esle diseflo experimental implica la existencia de una sorprendente variedad de tamanos de las protefnas que los fonnan (desde 40000 a 200 000 daltons). En la mayorfa de celulas, casi todas las proteinas de los filamentos intenne· dios se encuenlran totalmeme polimerizadas, con muy pocas subunidades teFilamenlos intermedios

Flgun 16-13 Organizacl6ndelos dornini05 de los mon6meros protelcos de 105 filamentos lntermedJos. La mayorla de las prolelilas de los filamentos inlennedios disponen de una regi6n centJal similar que tiene generalmente unos 310 aminoacidos yque forma una larga helice a. Los dominios amino terminal y carboxilo terminal no presentan esta estructura en helice (l y son variables en cuanto a tamano y secuencia en los distintos lipos de filamentos intennedios.

853

eOOH

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~----. regi6n en h(,lice

0:

NH,

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tetr.l.imero de dos dime'os sobreenrollados

101

dOs tatrtomaros empaquelados conjuntamente

tramericas lib res. Sin embargo, una celula puede controlar el ensamblaje de sus filamenlos intermedios y decidir su cantidad, longifud y posici6n. Uno de los mecanismos de control 5e basa en la fosforilaci6n de residuos de serina en el dominic amino terminal de las protefnas de los filamentos intermedios. En un casa extrema, la fosforilaci6n de las subunidades proteicas que forman la lamina nuclear provoca un desensamblaje tolal de los filamentos durante la mitosis; cuando esta term ina, las serinas espedficas son desfosforiladas y se produce la formaci6n de /lOUO de la lamina nuclear (vease Figura 12-18). Los filamentos intermedios ciloplasmaticos pueden suffir tambien una reorganizaci6n radical durante la mitosis como respuesta a algun tipo de senal extracelular. Aunque es· los cambios suelen ir acompanados de un incremento en la fosforilaci6n de las subunidades. otros factores pueden intervenir tam bien en este proceso.

Las c~lulas epiteliales presentan una familia muy diversa de filamentos de queratina9 En las celulas de los vertebrados, los filamentos intermedios citoplasmaticos pueden agruparse en Ires clases: (1) filamentos de qlleratina, (2) filamelltos de vimentifla y fllamentos relacionados COil la vimentina y (3) nellrofilamemos, cada uno de los cllnles esta [armado por la polimerizaci6n de sus correspondicntes 854

Capitulo 16: El citoesqueleto

Figura 16-14 Modelohabltualde ensamblaJe de un fllamento Intennedlo. El mon6mero mostrado en (A) se empareja con un mon6mero identico a el, fonnalldo un dfmero (Bl. de fonna que la regi6n central--conservada- se alinea en paralclo y se cmpaqueta conjuntamet1le fommndo un sobreenroLlamiemo. Entonccs, dos dfmeros se alinean, lado contra lado, y fonnan un tetrarnem antiparalelo de cuatro cadenas polipeptfdicas (el. Dentm de cada tetnimero los dfmeros estan dlstanciados suficientemente uno can respccto a otto pcmtitiendo la asociaci6n can otro tetramero, como puede observarse en (D). En eJ filamento intennedio final de 19 nm los tetnimeros cstan unidos fonnando lUl haz helicoidal (E). Se muestra Wla elcctronmicrograffa del ftIamento final en elmargen superior izquierdo. (Diagrama basado en datos de Murray Stewart; nticrogrnffa por cortcs(a de Roy Quinlan.)

Tabla 16-1 Prlnclpales tlpos de protefnas de fLIamentos Intermedlos en las celulas '1105 vertebrados Tlpo de rnamento lntermedlo

Componente polJpeptfdlco (masa en dattons) Locallzacl6n celular

Laminas nucleares lamininas A, B, YC (65000- 75 000)

PrOlefnas vimentina (54 OOOJ relacionadas con la vimentina desmina (53 000) proleina glial acfdica fibrilar (SO 000) periferina (66 000) Queratinas

lipo I (~cidas) (40000- 70000) tipo II (neutrns/Msicas)

1

I~mina nuclear de las celuJas eucariotas muchas celulas de origen mesenquimlitico, a menudo expresada lransitoriamente durante el desarrollo muscuJo celuJas g1iales (aslrocitos y celulas de Schwann) neuronas

celuJas epileliales y sus derivados (I'. ej., el pelo y las Ulias)

(40000-70000)

Filamentos inlermedios neuronales

protefnas de los neurofiIamentos NF-L, NF-M yNF-H

neuronas

(60 000 - 130000J

subunidades proleicas (fabla 16-1). la familia mas diversa de subunidades proteicas la constituyen las queratlnas (tambien lIamadas citDqlleratinas), que forman mantentos dequeratlna, principalmeme en las celulas epiteliales. Hay mas de 20 tipos distinlOS de querntinas en los epitelios humanos. AI menos, Olras 8 queralillas, lIamadas qlleratinas dllras. son especfficas del pelo y de las unas. (Las queratinas de las c~lulas epiteliales. pelo, y uflas reciben lambiE!n elnombre de a-queralinas para distinguirlas de las p-queratinas, evolulivamente distintas, que se cncuenlran en las plumas de las aves y que presentan una CSlructura totahnentc distinta que no disclitiremos en eSle capftlllo). las querntinas se subdividen en dos tipos. si nos basamos en su secuencla de aminoacidos: qllcrati1ws del tipo , (acidas) y quemtinQs del tipo II (llelltraslbdsicas). Mediante expcrimentos de reensamblaje se ha encontrado que los hetcrodfmeros formados par queratinas del tipo I y dellipo 11 pueden formar n1amentos micntras que los homodfmeros no los forman, hecho que pcrmite cxplicar por quE! los filamell10s de queratina son siempre hereropolfmeros formados par la misma cantidad de polipE!ptidos de queratina del tipo I y del tipo II. Cualquier celula epilelial puede disponer de una gran varied ad de queratinas, tadas elias copolimerizando en un unico sistema filamentoso de queratina. Los epitelios mas simples, como los que encontramos en los embriones tempranos a en algunos tejidos adultos como por ejemplo el hfgado. disponen de un solo tipO de queratina del lipo I y uno solo lambicn de queratina del tipo II. Olros CpilClios, como el de la lengua, el de la vejiga. y el de las ghlndulas sudorlparas. conlienen 6 0 ml1s tipos de queratinas -cuya combinaci6n particular depende de la localizaci6n de la cE!lula dentro del 6rgano. Esta diversidad es aun mas pronunciada en la piel, donde en las celuJas de las dislintas capas de la epidermis se expresan mediante distintos tipos de queralinas (vease Figura 22·19). Existen tambicn queratinas que son caracterfSlicas de los epilelios en proLiferaci6n. Esta helerogeneidad de queratinas es muy util c1fnicamente: en el diagn6slico de los dnceres epiteliales (carcinomas), el tipo concreto de queratinas que se expresa pucde ser utilizado para detenninar el tejido epitelial a panir del cual se ha origillado el tumor, 10 cUai puede servir de ayuda en el momento de decidir el tipo de lralamiento que resultani mas efectivo. Filamentos Intermedios

855

Muchas eclulas no epiteliales presentan sus propios filamentos intermediT citoplasmaticos diferenciales 'o A diferencia dc las queratinas, la vimenrina y las prQce(nas relacionadascofl fa vimencina, pueden formar filamentos intennedios que son polrmeros de un linico tipo de cspecie prOlcica. La vimentina es la proterna de los fiJamentos inlermedios ciloplasm,Uicos mlls abundante y se encuentra en la mayorfa de celulas de origen mcso<Jermico, incJuyendo fibroblastos, ululas endotelialcs, y celulas sanguineas de la Ifnea blanca; ademas muchas celuJas expresan la vimenlina transitoriamcnle durante el desarrollo. La desmina se encuentra principalmente en las fibras muscularcs: se cncuenlra distribuida poc todo el citoplasma de las fibras musculares lisas, y se une a las miofibrillas adyacentes (haces ordcnados de actina y miosina filamentosas que discutiremos mas adelante) en las fibras del mlisculo esqueletico y cardfaco. La prote(na glial acidicafibrilarfonna los filamenms gliales en los astrocitos del sistema nervioso central yen algunas celulas de Schwann de los nelVios perifericos (Figura 16-15). Todas estas protefnas pueden polimeri7..ar correctamenle entre elias; en algunos lipos celulares adultos se han enconlrado copolfmeros fonnados por vimentina y por prolefnas relacionadas con la vimentina. Por el comrario, ninguna de estas proteinas copolimeriza con las queratinas: cuando queratinas y protefnas relacionadas can la vimentina se exprcsan en la misma celula, fonnan sislemas filamentosos independientes. Las celulas nerviosas disponen de una variedad liniea de filamentos intermedios, que se expresan en disuntas regiones del sistema nervioso central en es. (adios especfficos del desarrollo. Los neurofilamenros son los mlls abundantes; se extienden a 10 largo dcl ax6n y fonnan su componente ciloesqueletieo primario, especialmente en las celulas nerviosas maduras. En los mamfferos, se han descrito tres lipos de prole(nas de los neurofilamenros. Uamadas NF-L, NF-M Y NF-H, debido a diferencias en su peso molecular (L de bajo, ~Iow'", M de medio, "middle" y H de aha, ~high~, respeclivamente). Normalmenle los lfes tipos de protefnas se encuentran en cada neurofilameoto. NF-M y NF- H tienen largas colas carboxilo terminalcs; se cree que se proyectan desde el eje del neurofilamento y contribuyen a regular el espaciarniento lateral de los neurofilamelllos en el ax6n (Figura 16-16). Si marcamos lIna celliia en cultivo con un anticuerpo contra las protefnas de los filamenlos intermedios del ciloplasma, podremos obsclVar una rcd delicada de filamcntos fibrosos que envuelve el nucleo y se eXliende a traves del dtoplasma hasla la membrana plasm,Hica (vease Figura 16-12), En las celulas epi-

Figura 16-15 Mlcrograf(a de Inm unonuorescencla de flIamentos gllBles en astrocltos cultlvados. Los haces de filamentos intermedios (verde) se han marcado con anticuerpos contra la proteina glial acfdica fibrilar. Los nudeos se han marcado con un colorame azul de union al DNA. (par conesfa de Nancy L.. Kedersha.)

856

Capitulo 16: EI ciloesquelclo

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telinles, los filamentos de queralina eSlan unidos a las uniones celulares especializadas -los desmosol/las que unen celulas vccinas y los hemidesmosomas, que unen las celulas a In lamina basal (se disculcn en el Capftulo 19). Dado que en cada celula los filamentos de queratina estan conectados a traves de los desmosomas can las celulas vecinas, forman una red continua a lraves de todo el epitelio (Figura 16-17). De forma parecida, los filamentos de desmina se encuentran a menudo anclados en las uniones cclulares especializadas de las fl· bras musculares.

La lamina nuclear esta constituida por un tipo especial de protemas de filamentos intermedios: las lamininas ll La himlna nuclear es una red proteica que limita la superficie interna de la membrana nuclear interna en las celulas eucariotas (Figura 16-18). Presenta un grosor tfpico de 10-20 nm y estli interrumpida en la zona de los poros nucleares, permitiendo la libre entrada y salida de macromolttulas del nucleo. En los ma-

mfferos la lamina nuclear esta formada por las laminlnas. proteinas hom610gas a las de los filamenros inlermedios. de las cuales difieren' al menos en cuatro puntos: (I) el dominio central en forma de vnrilla es alga Ollis largo (vease Figura

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Figura 16-16 Electronmlcrogranas de dos tlpas de flIamentos Intermedlos en c~lulas del sistema nervtoso. (A) Imagen de neuTofilamentos preparados mediante congelacl6n Tapida y sublimaci6n profunda de un ax6n de una celula nerviosa, mostrando el extraordinario entrecruzamiento de los haces a traves de puentes de protefna -una configuraci6n que probablemenle proporciona una gran resistencia a la tensi6n en este largo aJM'!ndice celular. Las uniones cruzadas estan farmadas por largas extensiones no hdicoidaJes del extremo carboxilo tenninaJ de las protefnas lOis grandes del neurofilamento. (B) Imagen de filamentos g1iaJes en una cetula glial oblenida mediante congelaci6n n'ipida y sublimaci6n profunda ilustrando que eSIOS filamentos son lisos y tienen menos puentes cruzados. (C) Elcclromicrograf(a convcncionltl dc un corte de un ax6n que muCSlrll [ll distancia de separaci6n regular dc los ncurofilal11enlos, l11ucho l11ll.s abundanles que los microtubulos. (A y B, por cortesfa de Nobutaka I-Iirokawa; C. por cortesfa de John Hopkins.)

Figura 16-17 Losrnamentosde queratlna manllenen unldas las «Iulas, fonnando las capas celulares. MicrografIa de inmunoOuorescencia de una red de filamentos de queratina en una monocapa de celulas epiteliales en cultivo. Los filamelltos de cada celula estan conectados indirectamcnte con los de las cl!lulas vcclnas, a travl!s de los desl11osomas. (Porcortes(a de Michael K1ymkowslcy.l Fllamel1los intermed.los

857

complejo del paro nuclear

CITOSOL membrana nuclear

NUCLEO

181

lA)

Figura 16-18 La Iimlna nuclear. (A) Dibujo esquemAtico que mueslra la Mmina nuclear a tra~de un corte en la regi6n del poro nuclear. La lAmina estA asaciada con la cromatina y con la membrana nuclear lnlema. (8) E1ectronmicrografia de una porci6n de la lAmina nuclear de un oocito de rana preparado por lIofilizacl6n y sombreado metalico. La lAmina estA fannada por una red cuadrangular altamente organizada de fLIamentos intemledios, compuesta por lamininas nucleares (no siempre tan altamente organizada como aqui se presenta). (C) E1eclf(mmicrograHa de dfmeros aislados de laminlna, sombreados metdlicamente (marcadas como Ll. Presentan una fom\a general semejante a la miosina muscular (marcados como M), con una cola en fonna de vari1Ia y das cabezas g1obulares. Sin embargo, son mucha menores que las molecuJas de miasina. las cabezas globulares estAn farmadas por los dos largos dominios carboxilo terminales. (8 y C. por cortesfa de Ueli Aebil.

16-13). (2) Presentan una seftal de transpone hacia el n(ideo que las dirige desde el cilosol. donde son sintetizadas, hasla el nudeo. (3) Se ensamblan fonnando una red bidimensional parecida a lIna l
Los filamentos intermedios proporcionan estabilidad mecanica a las celulas animaJes t2 Cada dfa disponemos de mayor m1mero de evidencias de que la funci6n principal de los ftJamentos inlermedios es la de soponar la lensi6n mccanica. En la enfermedad gen~tica humana epidermolisis bullosa simple. las mutaciones en los genes de las queralinas que se expresan nonnalmente en la capa basal de la epidermis desorganizan la red de filamentos de citoqueratina en estas c~lulas. transform
Capftulo 16: EI dtDeSqueleto

celull bual dela epldermi•

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I'mlnl baul hemidumosomas

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tan fmgil que el individuo mutante puede morir por un trauma meclnico. Se cree que los filamenlos inlennedios citoplasmAlicos juegan un papel semejante en las celulas no epiteliales. La estruClura que presenlan los filamelllos imermedios es la ideal para desarrollar este tipo de funciones mecanicas. Las subunidades fibrosas se asocian de manera paralela formando haces superpuestos. 10 cual les permite resistir tensiones mecAnicas mucho mas intensas que las que resisten los microtlibulos o los filamentos de actina (Figura 16-20). En la pie!. los nJamenlos de queratina de las capas mas extemas de la epidermis se entrecmzan covalentemente entre Sl y con protemas asociadas. y a medida que las celulas de la capa exterior van muriendo. las queratinas entrecruzadas persisten como la pane principal de 1a capa protectora externa del animal. Las celuJas epileliales especializadas de lugares especfficos de la piel proporcionan variaciones regionales. y generan apcndices superficiales tales como los pelos y las uoas. Sin embargo, si la funci6n de los filamentos intermedios es simplementc la de resiSlir las tensiones mectinicas en las celulas y lejidos, tpor que existen tantos tipos de subunidades proteicas? Adem;1s, tcuAI es la funci6n de los dominios variables de la cabeza y de 13 cola de estas proteinas? En la actualidad estas preguntas no pueden COntestarse delaUadamente, pero est<1. claro que la manera en que los filamentos intemledios se unen a otros componentes de la celula varia de un lipo celular a otro. Los filamentos de desmina que unen entre sf los bordes de las miofibrillas en las celuJas del rnuscuJo esqueletico deben presentar lllgares de uni6n para proteinas especfficas asociadas a las miofibriJlas. Los neurofilamentos en los axones estan unidos entre Sl a lraves de sus dominios carboxilo terminales y forman un haz continuo de filamentos, a modo de cuerda de un metro 0 mas de longirud. A1gunas queratinas estAn especializadas en la forma-

Figura 16-20 Propledades meconlcas de los polfmeros de actina, tubullna yvlmentlna. Redes formadas por microtubuJos 0 filamentos de actina 0 filamenlos de vimentina. tOOas a In misma concentracion. fueron expuestas a una fuena en un viscometro. y se calcul6 el gmdo de lension resultante. Los resultados muestran que la red de microtubulos se defonna facilmente pero que cuando 13 tension sobrepasa el 50% de su longitud original (indicada mediante 1a estrella roja que estalln) se mmpen y empiezan a fluir sin Il"mite. Los filamenlOs de actina son mucho mas rlgidos. pem se rompen facilmente. Las redes de vimentin3. al contrario. se defonnan facilmente. pero a diferencla de los microtl1bulos, sopoflan tenslones y esfuer.ros muy grandes sin romperse. Los filarnentos de vtmentina son muy necesar[os para el manlenim[ento de la lntegridad celular. (Adaplado de P. !amlley et al.,). Cell BioI. 113:155-160. 1991. reprOOucldo con permiso de copyright de The Rockefeller Uni\'crsity Press.}

FiJamentos intermedlos

flgural6-J9 Aparid6ndeampoUasen Ia piel provocadas porun gen mutante dequeratbla. Un gen mutanteque codifica una quemtina truncada (sin dominios amino y carboxiJo tenninales) ha sido expres:ldo en un rnl6n trans~nico. La proteena defectuosase ensambla con las molecu!as de queratina nonnales ydesorganiza Ia red de filamentos de querntina en las capas celu!ares basales. Micrografias 6pticas de piel nonna! W y mutante (8) muestran que las ampoUas se producen a partir de la ruplum de las celulas enla capa basal de [a cpidennis l11ulante. EI d[bujo en (el de tres celulas de la capa basal de la epidermis mutantcobservadas mediante microscopla electronica muestra que las dlulas se rompcn entre eI nUcleoy los hemidesmosomas. que conectan los lilamelllos de queratina con la lamina basal subyacente. (De PA Coulombe, M.E. Hutton. R. Vassary E. Fuchs,). Cell BioL 115:1661·1674, 1991, rcproducido con penniso de copyright deThe Rockereller Univcrsity Press.)

luet't. deformldor. - - -

859

ci6n de la capa externa protectora de la piel, dura y resisteme. mientras que olras simplemente mantienen las tensiones que sufren los epiteJios en los cambios de forma que se producen durante la morfog~nesis. Estas funciones direrenciales han de ser desarrolladas por las regiones variables de las distilllas proteinas de los filamentos intermedios. que se proyectan desde la superficie del fLIamento y delerminan su capacidad de uni6n a OlrOS componentes de la c~lula. En este sentido. las regiones variables de las protefnas de los nJamentos intermedios realizan funciones parecidas a las de las protemas accesorias de los filamentos de actina y de los microtubuJos. La diferencia esuiba en que las regiones variables son parte integral de la subunidad del filarnento intermedio mientras que las otras constituyen una protefna independiente.

Resumen Los filA.menttu

intermeditu son fuert.es, poUmeros de polipiptidos fibrosos, a modo

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tk cuerda, que raisten tensiones y tksempeiUm un papel estructural meafnico en IA. dlula. Se conoce,. di.stintas formas especfficas de filA.mentos intern,edios que difieren en el tipo tk polipiptido que los forn,a.: entre las que se encuentran los filA.mentos tk qlleratinn tk las cillllas epiteliales, los neurofilLlmelitos de las cilulas rrerviosas, los filLlmentos gl/ales tk los astrocitos y las cillllas de Schwa"", los filA.nlt!l1tos tk desm"", tie las fibrtu musculnres, y losfilamentos de vimenti1Ul de los flbroblastos y de otros nlllchos tipos celulLlres. Las lnm",inas nucleares, qlle form"" lLll4minn fibrosa sllbyacente a In envoltura nuclear, SOil Ima familia diferenre de prote{nas tk los fllLlmetltos intermedios. Los mondmeros de los di.st",tos tipos de fllamelltos internledios tkmm secuellcitu de aminotfddos distintas y diJleren ell SIU pews molecrtlLlres. Sill embargo, to· dDs ellos preuntan un dominio celltral homd/ergo que, clUmdo dimerizn, fonna una estructura tk sobree"rollamiellto rigido. Esras subullidades dimericns se aso-

cia" unas con otras fonlla"do tetrtfmeros simetricos, ws c,udes se e'lSambln" ell haces SUperpllf!$toS formalldo el fllnmento intern,edio no polarizado. Los dominios fibrosos de Ins sub",Jidadesforman el eJe estructural de losfilnmentos illtennedios, mientras que los dominlos globllinres se proyectan hac/a el exterior. UnaflmcUm de estos domillios variables puede ser la de penllitir a cadn tipo de Jllamellto illtermedio la asociaci6" COli otms compo"e"tes especfflcos de la celllia y la de pos/c/o1Ulr estosfllamelltos ell elillgar adecuado dentm de la dlllla.

Microtubulos'3 Los microtubulos, como hemos vista, son polfmeros largos y rfgidos que se extienden a trav6s del citoplasma y dirigen la localizaci6n de los orgallulos delimitados de membrana y de Olros componentes celulares. En este apanado discutiremos el ensamblajc de cstas importantes estructuras a partir de mol6culas de tubulina y explicarcmos c6mo su polimerizaci6n y despolimerizaci6n cst;! COI1trolada por el nucleOtido GTP. A continuaci6n examinaremos c6mo algunos microtdbulos previamente scleccionados son estabilizados en 1a c~lula mediante su asociaci6n a protefnas accesorias espedficas. Finalmente, discutiremos la imponancia de los motores dcpendientes de microtubulos que transportan vesiculas membranosas y diversos complejos proteicos a 10 largo de los microllibulos.

Los microtubuJos son cilindros huecos formados por tubulina l4 Los mjcratubulos estan constituidos par moleculas de (ubullna, cada una de las cuales es un hctcrOOfmero ronnado por dos subunidades globulares ruertemente unidas entre sf. lIamadas a-lIIblllillil y p-tubulina. Aunque la tubulina eSla presente en casi tOOas las c~lulas eucariotas. la fuente mas abundante para los esrudios bioqufmicos es el cerebra de los venebrados. Los procedimiemos de extracci6n recuperan de un 10 a un 20% de la prolefna soluble total del cerebra 860

CapflUlo 16: EI cltoesqueleto

Figura 16·21 Mlcrotubulos. (A) Eieclronmicrograffa de un microtubulo vislO en secci6n lransversaJ, con su anillo de 13 subunidades, cada una de las cuales corresponde a una molocula de tubulina diferente (un helerodimero a/~). (8) Crioelectronmicrograffa de un microlubulo ensamblado in vitro. (C y OJ Oiagramas esquem4ticos de un microtiibulo, en los que se muestrn la fonna en que las moloculas de lubulina se empaquelan entre sf fonnando la pared cilfndrica. {C} mueslra las 13 molOCulas vistas en secci6n transversal. (D) muestra una visi6n lateral de una corta secci6n de un microlubulo, con las moleculas de tubulina alineadas fonnando largas hileras paralelas 0 protofi/amemos. cada uno de los 13 prolofilamenlos esta compueslo por series de moloculas de tubulina, cada una dc las cUlllcs es un hClerodfmero alit Un rnicrotubulo es unn eSlructura polar, ya que cada uno de sus extremos tlene una molecula de tubulina {IX 0 PI diferenle. (A, por cOrlesfa de Richard Unck; B, por cortesla de Richard Wade; 0, dibujado a partir de datos proporcionados por Joe Howard.)

(C)

18)

(OJ pl"OIofilamentos

en forma de tubulina, 10 cual reneja la elevada y poco usual densidad de microtlibulos que exisle en los apendices alargados de las ct:lulas nerviosas. Las molt:culas de tubulina, en sf mismas, son diversas. En los mamiJeros existen como mfnimo seis farmas de a-lubuJina y un mlmero parecido de formas de P-tubulina, cada una de las cuales esta codificada por un gen diSlinto. Las dislintas formas de tubulina son muy parecidas, y IOOas elias copolimerizan en ensayos in /litro, formando un mismo microtlibulo, aunque pueden encoolrarse en distintas regiones de la ct:lula y lIevar a cabo fundones sutilmentc distintas. Por ejemplo, en seis neuronas especializadas que preselllan sensibilidad por contacto del nemalOdo CaeflorlwlJditis elegans, los microtubulos estan formados par una forma espedfica de l3-tubulina; las mutaciones en el gen que codifica esta proteina implican la pt:rdida de la sensibilidad par contacto especffica, sin ningtin efecto aparellle en otms funciones celulares. Un microtubulo puede ser considerado como una cstrucrura cilindrica en la cuallos heterodfmeros de rubulina estan empaquetados a1rededor de un nucleo ceOlral, que aparece vado en las micrograffas electr6nicas. De una forma quiz.as mas detallada, uno puede observar c6mo esta estruClura se construye a partir de 13 prOloftlamentos lineales, cada uno de los cuales esta formado por subunidades a1temadas de a- y p-rubuJina, dispuestos paralelamente formando un cilindro (Figura 16-21). Dado que los 13 protonJamentos cstan alineados en paralelo con la misma polaridad, los microtublilos son estructuras polares, y es posible distinguir un extremo mas (de crecimiento rapido) y un extremo menos (de crecimiento leoto).

Los microtubuJos son estructuras muy hibiles, sensibles a drogas antirnit6ticas espedficas l5 Muchas de las disposiciones de los microtlibulos celulares son labiles y esta labilidad es imprescindible para que puedan desarroUar su funci6n. Uno de los ejemplos mas notables de este hecho es el huso mit6tico, que se forma desput!s del desensamblaje de los microtUbulos aI comienzo de la mitosis. EI huso mit6tj· co es la diana de una gran variedad de drogas antimil6licas especificas que actuan interfi.riendo en el recambio entre las subunidades de tubulina de los microtubulos y el aeervo de tubulina libre. Una de estas drogas es la colclticina (Figura 16·22), alcaloide que se extrae del azafran silvestre y que ha sido utilizada como planta medicinal para el tratamiento de la gota desde la ~poca de los antiguos egipcios. Cada l1lol~cllla de colchicina se une fuertemente a IIna moltkula de tllbulina e impide su polimerizaci6n, pero no puede 1I1lirsc a la tubulina una vez la tubuJina ha polimerizado formando un micro(UbuJo. La cxposici6n de una celu· la en divisi6n a la colchicina, a la colcemida, droga fntimamente rcladonada can eUa, produce una desaparici6n rapida del huso mit6tico, e indica que el equilibrio qufmico se mantiene mediante el recambio continuo de subunidades

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entre los microtubulos del huso m1l6tico y el acervo de lUbulina Iibre. Debido a que la inlerrupci6n temporal de los microtubulos del huso mit6tico pravoca preferentemenle la muerte de celulas que se dividen de fonna anonnal. las drogas antimit6ticas. como la vinblastina y la vincristina (cuyos efeclOS son pareci· dos a los de la colchicina), han side ampliamente utilizadas en el tratamienlo del cancer. La droga taxol (Figura 16·22), que se extrae de la coneza del tejo. liene un efecto opuesto. Se une fuenemente a los rnicrotubulos y los estabiliza; cuando se afiade a celulas. provoca que muchas de las moleculas de tubulina Iibre se ensamblen formando microtubulos_ La estabilizaci6n de los microtubulos con taxol detiene la mitosis de las ctHulas en divisi6n, 10 cual indica que durante la mitosis los microll1bulos deben ser capaces no 5610 de polimerizar sino tambien de despolimerizar. Eltaxol ha sido tambien ampliamente utilizado como droga an· ticancerosa.

El alargamiento de un microtubulo es un proceso rlipido, mientras que la nucleaci6n de un nuevo microtubulo es un proceso lento l6 La polimerizaci6n y despolimerizaci6n de los microttibulos es compleja e inler· viene en procesos interesanles con importames papeles biol6gicos. Una buena parte de los conocirnientos actuales ace rca del comportamiento dinamico de los microl'ubulos ha sido obtenida en estudios de polimerizaci6n ill vitro a partir de moleculas de tubulina purificadas. La tubulina pura polimeriza a 37°C en ellubo de ensayo, forlllando lllicrotubulos. siempre y cuando esten presentes tanto Mg2. como GTP. Si seguimos In polimerizaci6n ya sea lllidiendo la luz dispersada o a traves del microscopio, podremos observar una fase inicial (fase lag). despues de la cual los microtubulos se forman n'ipidamente hasta Ilegar a un /livel de polimerizaci6n determinado. La fase inicial se produce porque es mucho mas fadl anadir moleculas de tubulina a un microtubulo existente, proceso Uamado alargamiellto. que iniciar un nuevo microtubulo de flOVO. proceso Hamado fllI-

cfeaci61l.

Durante la fase de polimerizaci6n rapida, las concentraciones elevadas de rubulina libre provocan que la polimerizaci6n de los microtubulos sea mas nipi· da que la despolimcrizaci6n (vease mas adelamel. Sin embargo. cuando se ha lie· gada al nivel de polimerizaci6n mas elevado. no toda la tubulina habra polimerizado pueslO que las subunidades se estan disociando (despolimerizando) a partir de los extremos de los microlubulos y. aI mismo riempo, ai'ladiendose a elias. La velocidad de polimerizaci6n decae con el tiempo porque es proporcional a la concentraci6n de tubulina libre; la concentraci6n de rubulina Iibre en el nivel mas alto. en el cual las velocidades de poLimerizaci6n y despolimerizaci6n se en· cuenuan en equilibria. recibe el nombre de collcentraci6" crftica (Figura 16-23). AI iniciar este capitulo vimos que nonnalmente en una celula los microtubulos crecen a panir de un lugar especffico de nucleaci6n (generalmente el cen-

• 862

Caprtulo 16: El citoesqucleto

Flgul'll 16-22 Est.ructuras qufmkas de lacolchldna ydel taxol. La cokemida. una tercera droga, estoi fntimamente relacionada con la oolchicina y en ella el gropo que se muestra en amarillo esta substituido por un -eHl _ Se une a la tubulina. pero a diferenda de la colchicina. su uni6n es rticilmenle reversible.

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olig6meros tiempo a 37"C

trosorna); puesto que existe una barrera cinetica para la llucleaci6n en soluci6n, la polimerizaci6n de la tubulina se produce lmicamenle en eSle lugar. Como en el tubo de ensayo, no toda la tubulina de la celula se encuemra polimerizada. Una fibroblasto t{pico dispone aproximadameme de una concemraci6n de IUbulina 20 micromolar (2 mg/ml), de la cual un 50% esta en los microtubulos y el 50% restame se encuemra Iibre.

FIgura 16-23 Pollmerizacl6n de tubulin. pura. Una mezcla de IUbuiina, tamp6n y GTP se eoloca a 37"C en el tiempo cera. La eantidad de micmnJbulo polimerizado, medida mediante dispersi6n de luz, sigue una eurva sigmoidal. Duranle la fase inicial (fase lag) las moleculas individuales de tubulina se asocian fonnando agregados mClaestables, algunos de los euales continuan y nuclean microtubulos. La rase lag relleja una barrera cinctica para este proceso de nucleaci6n. Durante la fase n1pida de nlargamiento, Ins subunidadcs se anaden a los extremos libres de los microtubulos existentes. Durante la rase de meseta, la polimerizaci6n y la despolimerizaci6n estan en equilibrio ya que 1a eantidad de lubuHna Iibre ha IIcgado a1 punto en que se ha eonseguido la collcemraci6n cr(rica. Para simplificllr, las subunidades que se aftaden y que se pierdcll de Ull microtubulo se muestran siempre en el mismo extremo.

Los dos extremos de un microtubuJo son diferentes y crecen a velocidades diferentes l7 polaridad estructwal de un microtubu.lo, reflejo de la orientaci6n regular de las suhunidades de lubuJina, haee que los dos extremos del polfmero sean distimos, 10 cual tiene un efecto profunda en su velocidad de crecimienlo. Si se permite que moleculas de tubuJina purificada polimericen durante un cono pe-

La

•

I

.

microtubulo form.oo

Mlcrol1.1bulos

"~

Figura 16-24 E1cctronmlcrograffa que muestra la poUmcrlzacion prderenclal de tubullna ell los extremos "mu" de los mlcmtl1bulos. Un haz estable de microtubulos oblenido del nuclco de un cilia (se discute mas adelante) se ineuba con subunidades de tubulina en condiciones de polimerizaci6n. Los micronibulos crecen mas ral)idamcllte en el extrema "mas" del haz de micrOlubulos (extrema que se encuentra sobre el haz en esta figural. (Por conesfa de Gary Borisy.l

863

Figunr. 16-25 Polarldad de 105 mierotubulos puesta de man16.esto por el metodo de "de<:oracldn con ganchos". En esta electronmicrograffa IOdos los micron1bulos (vistos en secci6n transversal) tienen la ntisma orientaci6n. Los pequci'ios ganehos, rormados par la tubulina que se ha ai'iadido, se eurvan siguielldo el sentido de las agujas del reloj,lo eual indica que los mierotubulos se estAn observando desde el extremo -mlis~ hacia el extremo ~menos~. La polaridad de los microll1bulos tambien se puededetcrminar mediante Is decoracl6n con moleculas de dinefna {no se muestra aquO. (Por cortesfa de Ursula Euteneuer.)

rfodo de tiempo en los extremos de fragmemos de microtubulos estables y entonces se examina la mezcla aI microscopio electr6nico puede observarse que un extrema se a1arga aI menos a una velocidad rres veces superior a la del ouo (Figura 16-24). Por ello. el extrema de crecimiento r
0.2 11m

~1uI.

en interf...

Los centrosomas son ellugar primario de nucleaci6n de los microtubulos en las c~lulas animales l8 En el citoplasma de una celula interfasica podemos observar los microtubulos mediante tinci6n de la celula con anticuerpos anti-tubulina Ouorescentes, despues de que las celulas hayan sido fijadas. Se observa una elevada densidad de microtubulos alrededor del nueleo. desde donde irradian hacia la periferia celular. en forma de flnas hebras (Figura 16-27). EI origen de los microtubulos se puede observar elaramente si estos se despolimerizan primero can colcemida y luego se permite su repolimerlzaci6n despues dellavado de la droga. Los nuevos microtubulos crecen a partir del centrosoma y forman una estructura con apa· riencia de estrella Uamada lister y entonces se a1argan hacia la periferia celular hasta que se restablece su distribuci6n inicial (Figura 16-28). Si los microtubulos de celulas en cultivo se ~decoran" con ganchos de tubulina para determinar su polaridad. se observa que t'Odos rienen sus extremos ~mas~, alejado del centrosoma, 10 cual indica que est'e centro organizador dene la capacidad de nuelear la polimerizaci6n de los microtubulos can una polaridad especffica. En la mayorfa de c~lulas ani males el centrosoma es el centro organizador de microtubulos mas importante. Durante la interfase se localiza en la proximidad del nucleo, muy cercano a la superficie extema de Ja envoltura nuclear. Inmer· sas en el centrosoma se encuentran un par de estructuras cilJndricas, dispuestas en angulo recto una respecto a otTa. en un configuraci6n en forma de L Son los cenrrlolos. que discutiremos mas adelante. EI centrosoma se duplica y se d.ivide en dos partes iguales durante la interfase de manera que cada mitad contiene un

etllula elliada eilio/fl.gelo

~Iul. en divisi6n

eelul. nerviou

Flgun 16-26 Orle:nlacl6n de los mlcrolubulos en las celulas. Nonnalmenle los extremos ·menos~ de los micronibulos se hallan embebidos en un centro organizador de microu1bulos. mientras que los enremos ~m4s~ se hallan cerca de Is membrana plasmlitica.

864

CapftuJo 16: El c1toesquelelo

--~

•

polo del

"'W

Figura 16-27 Distribucl6n Inlerfulca de 10$ mlcmtdbulos en un ftbroblaslo en cultivo. Los microtubulos (en !Jerde) han sido marcados con un anticuerpo Contra la tubulina; el nucleo celular (en azul) se ha marcado con un colorante Ouorescenle que se une aJ DNA. (Por conesla de Nancy 1.. Kedersha.)

~

10um

par de centriolos duplicados. Estos dos cemrosomas hijos se dirigen hacia Jados opuestos del nucleo al empezar la mitosis. y forman los dos polos del huso mit6tieo (vease Figura 18-5). Durante la interfase y la melafase se distingue una regi6n de citoplasma

mucha mas ascura rodeando cada par de centrfolos; en las mejores electromnicrograffas se puede distinguir en eSla regi6n una red de pequei"las fibras (Figura 16·29A). Es el material pericentrlolar, 0 maIm del cenlrosoma, yes la regi6n del centrosoma que nuclea la polimerizaci6n de los microtubulos. La composici6n proteica de la matriz del centrosoma 5610 es parcialmente conodda, igual que el mecanisme a panir del cual se produce la nucleaci6n de los microtubulos. Sin embargo. sabemos que estli (armada por protefnas especfficas del cen· trosoma, incluyendo una forma minoritaria de la tubuLina, lIamada y-rubuli"a (Figura 16-298), que puede interactuar con el dimero a/p,-tubulina colaborando en la nucleaci6n de los microrubulos. No todos los centros organizadores de microhibulos comienen centriolos. En las celulas mit6ticas de plantas superiores, por ejemplo, los microtubulos terminan en regiones eleclrodensas pobremente definidas, completamente desprovistas de centrfolos. El huso mei6tieo de los OOcilOS de ral6n tampoco preseota centriolos, aunque estos aparecen mas tarde en el cmbri6n en desarrollo. En hongos y dialomeas el centro organizador de mierotubulos es una plaea lIa· mada corpusculo polar del huso, que se encuentra en la envoltura nuclear. A pc· sar de las diferencias morfol6gicas (Figura 16-30), lodos los centros organizada. res contienen una matriz que nuclea la polimerizaci6n de los microlubulos, y que normaJmente esla formada por y-tubuJina y otras prole(nas espedficas del centrosoma. Asf pues, parece que el mecanismo molecular de la nucleaci6n de los microhibulos se ha conservado notablemenre durante la evoluci6n.

Figura 16-28 Mlcrotlibul05crec:lendo a partir del centrosoma despu& de retlrar I. colcemlda. MicrografJas de inmunonuorescencia que mueslran la dlslribucl6n de los microtubulos en c(!lulas cuhlvadas. deleclados mediante tincl6n can anticuerpos contra tubulina. En (A) se muestra una eelula normal de un tejido en cultivo. Las celulas,que se muestran en (B) fueron tratadas con colcemida durante I hora para despolimerizar sus microttibulos, y posterlonnenle se penniti6 que se re<:uperaran: los microtubulos apare<:en en primer lugar en una estruClura en forma de estrella, y luego se aJargan hada la periferia de la celula. (A, por cortesfa de Eric Karsenti y Marc Kirschner; B. de M. Osborn y K. Weber, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 73:867-871, 1976.)

Mlcrotubulos

865

En las celuJas animales los microtubulos se despolimerizan

Figura 16·29 Lamatrlzdel centrosoma. (A) E1ectronmicrogmffa de un centrosoma en una preparaci6n pUrificada. La matriz envuelve un centrfolo en forma de barril yaparece como un material fibroso que contiene granulos finos. (8) Micrograffa 6ptica de una celula humana dividiendose en cultivo, tenida con un anlicuerpo contra la ~-tubulina (verde) y con un amicuerpo contra la y-tubulina (rajo), una prolcfna que se localiza en el centrosoma de las celulas de una gran variedad de organismos. La superposici6n del marcaje rojo y verde provoca que las regiones que contiencn la y-tubulina en los palos del huso sean amari11as. (A, cortesfa dc Stcphcn Fuller; B, conesfa de M. Katherine Jungy Berl R. Oaklcy.)

y repoUmerizan continuamente l9 En Ulla celula, como por ejemplo un fibroblasto en cultivo, se produce un recambio cominuo de la red de microlllbulos. La vida media de un microtUbulo individual es aproximadameme de 10 minutos, miemras que Ja vida media de una molecula de rubulina. desde su sfntesis hasta su degradaci6n protooJitica. es de mas de 20 horas. Asf pues cada molecuta de tubulina panidpa en la fonnaci6n y desmantelamiento de muchos microl1.:ibulos durante su perfodo de vida, proceso que puede ser csludiado mediante la observaci6n dirccta de celulas vivas. As! por ejemplo. a una celula podemos inyectarle tubulina que ha side unida covalentemente a un colorante nuorescenle y seguir. utilizando un microscopia de fluorescenda, el componamienro de los microtubulos que incorporan la tubulina marcada. Ahernauvameme. en algunas celulas muy eXlcndidas los microtubulos pueden observarse directamente. sin neccsidad de ningt.in tipo de marcaje. lllmzando la microscopia de Contraste interferendal-diferencial video amplificada (vease Figura 4-12). Cuando se sigue el componamiento de los mi· crotubulos mediante a1guno de estos metodos. se observa un fen6meno impor· lante. Los microtubulos individllales crecen hacia la periferia celular a una velocidad constante durante un deno perfodo de tiempo y entonces de repente se

Figura 16·30 Un centro organlzador de mlcroll1bulos en una ce:lula de un hongo. Electronmicrograffa del corpusculo polar del huso en la levadura. (Conesfa de John Kilmanin.)

866

Capftllio 16: EI citoesquc]cto

l

FIgura 16-31 DIn3micadetos mlcroldbub en una c6uJa viva. Se ha inyectado tubulina a un 6broblasto, que ha sido ligada cova!entemente a

7

rodamina, de manera que aproximadiUnetlte una subunidad de tubulina de cada 10 de la relu1a esta marcada con eI coknante nuorescente. Se observa entonces la nuorescencia en un extremo de Ja celula mediante lUl sistema de imagen electr6nica extrenUldnmente sensible. Debajo de las micrograffas se muestr..lIl tr.tzos que pemlilen vcr los microtubulos seleccionados mas detalladamente. Podemos observar. por ejcmplo, oomo eI microtlibulo I crece primero y luego se aeona rnpidamente, mientras que eI microtlibulo4 crece continuamente. (De P.l. 5ammak yG.c. Borisy,Nature332:724-736, 1988. 0 1988 Maanil1an Journals Ltd)

...... --

-----------.. ------------------

acortan rapidamellle hacia el celllrosama. Pueden acartarse parcial mente y enlanCes continuar el crecimienta, a desaparecer por completo, siendo substilUi£los por un microtubulo distinto (Figura 16-30. Estas nuetuaciones de tamana pueden abarcar algunos micr6melros de langirud e incluyen la palimerizaci6n y despues la despolimerizaci6n de miles de subunidades de tubulina. Cuando se han estudiado en un tubo de ensayo microlubulos purincados, se han podido observar transiciones entre perfodos prolongados de polimerizaci6n y despolimerizaci6n (Figura 16-32). ESle comportamiento,lIamado iIJeslabiUdad dimfmica, juega un papel muy importante en el posicionamiento de los microtuhulos enla celula, tal como discutiremos mas adelante.

La hidr6lisis de GTP puede explicar la inestabilidad de los microtubulos individuaJes20

din~mica

InestabUidad dlnamlca de los microtubulos necesita un aporte de energfa para equilibrar el balance qu(mico entre la polimerizaci6n y la despolimcriza· ci6n --energ(a que proviene de la hidr6lisis de GTP. EI GTP se une ala subunidad f}-tubulina de la mol&:ula de tubulina heterodimerica y. cuando la mol&:ula de lubulina se incorpora aI extremo de un microtUbulo, esla mol&:ula de GTP es hidrolizada a GOP. (La subunidad (l·lubutina tambicn transporta GTP, pero no puede ser inlercambiado por GTP Iibre y no es hidrolizado, por 10 eual puede considerarse como una pane fija de la estructura proleica de la rubulina.) Se ha estudiado el papel de la hidr61isis del GTP en la polimerizaci6n de los micron.ibulos, utilizando amUogos no hidrolizables del GTP. Las mol&:ulas de tuhulina que conticnen estos analogos 110 hidrolizablcs de GTP forman microlli.bulos normahnente, 10 cual indica que la uni6n del nucle61ido es necesaria para la polimerizaci6n del microtlibulo, pero Sll hidr6lisis no 10 es. Sin embargo, eslOS microlubulos son anormalmente estables y no se despolimerizan igual que los micrOlubulos nonnales cuando la concentraci6n de lubulina en el lluido que los rodea es menor 0 cuando se tratan con eolchicina. As( pues. apareOlemeOle el papel nonnal de la hidr6Hsis del GTP es el de permiLir la despolimerizaci6n de los microtubulos dcbiJitando las uniones entre las suhunidades de rubulina. La

Microlubulos

-

-

-

-

Slim

extrema menos

extremo

"".

FIgura 16-32 lalnestabilidaddlnMtIca del ttedmlento de 'os microliibulos.

AUClUaCiones de 13 k>ngitud de un microtUbtdo en una soIuci6n de rubulina pura observadas mediante microsoopia de campo oscuro vfdeo-amplilicada. Se recogieron imagcnes del mismo microtubulo a intervaJosde 10 2 minutos y se presentaron siguiendo una secuenda ordelmda en la panTalla del monilor.lm dos extremos del microtllbulo estuvicron sometidos a dclos de acortamiento y alargamiento. de fonna independiclIle, siendo el extremo ~mas~ el que experi. ment6las mayores DUCluaciones. (De T. Horio YIi. Hotani. Natllre 321:6()5.607, 1986.0 1986 Macmillan Journals Ltd)

867

Se cree que la inestabWdad dimimica es una consecuencia de la hidr61isis retrasada del GTP despues del ensamblaje de la rubulina. Cuando un microtUbulo crece rnpidamente, la incorporaci6n de moJeculas de tubulina en el extrema del poHmero es mas rnpida que la velocidad de hidr6lisis del GTP que transportan. Esto impLica la formaci6n de un "casquete" de GTP en el extremo del micronibulo y. puestO que las mohkulas de rubulina que contienen GTP se unen unas a otras con mayor afinidad que las que contienen GOP, el casquete de GTP estimula at microtubulo a continuar su crecimiento. Por el contrario, cuando un microtUbulo ha perdido su casquete de GTP -por ejemplo, si la velocidad de polimerizaci6n baja lentamente- empezara a acortarse y luego tendera a seguir acorterndose. En la Figura 16-33 se muestra un modelo esquemiitico de los cambios estructurales que acompanan a la inestabiLidad diniimica. Algunos principios generales que pueden apLicarse tanto a los filamentos de actina como a los microtubulos se discuten en el Panel 16-1, piiginas 882-883. Las celulas pueden modjficar la inestabilidad diniimica de sus microtubulos para prop6sitos especfficos. En cada fase M del cicio celular. por ejemplo, la rapidez con la que los microttibulos se forman y se rompen se ve incrementada, de forma que los cromosomas pueden ser fiicilmente capturados por los microtubulos en crecimiento y el huso mit6tico se forma con una gran rapidez (discutido en el Capitulo 18). Contrariamente, cuando un celula se diferencia y adopta una morfologfa definida, la inestabilidad dinamica de sus microtubulos se suprime mediante protefnas que se unen a los microtubulos y los estabilizan. impidiendo su despolimerizaci6n. La capacidad de estabilizar a los microtubulos en una configuraci6n particular proporciona un mecanisme muy imponante mediante el cualla celula puede organizar su citoplasma,

La inestabilidad dimimica de los microtubulos proporciona un principio organizador para la morfogenesis celular2 1 En las celulas animales los microtubulos citoplasmaticos tienden a irradiar en todas direcciones a partir del centrosoma, donde estern anclados sus extremos "menos", No obstante, la mayona de las celulas animales estan polarizadas, y el

,dlmero de tubotin. GTP

desestabllb:a los mictotdbulos. 8 amUisis del crecimienlo y aconamiento de los microlubulos in mlro sugiere eI siguiente modelo para la inestabilidad dimimica. (AJ La adicidn de los heterodimeros de tubulina transponando GTP a un extrernO del pl'Q(ofllamento pro\"oca 50 crecimiento en una conformaci6n lineal, 10 cual favorece eI empaquelamienlo en la pared cilindrica del micron1buJo. es door, 10 convieneen eslabiJizado. La hidr6lisis del GTP despues del ensamblaje cambia la conformaci6n de las subunidades yel protofllamento tiende a dcfonnarse en un fonna cuJVada que es menos capaz de empaquetarse en la pared del microtubulo. (B) En un microtubulo intacto, los protofilamentos fonnados par subunldades que contienen GOP son forades a adopt31 una confonnaci6n lineal mediante los muchas enlaces Iaterales de la pared del micronibulo, especialmente en eI casquele eslable de subunidades que conlienen GTP. La perdida del casquete de GTP pennile que los prolofilamentos queconlienen GOP se relajen y adoplen su confonnaci6n curvada. Esto conduce a trna disrupci6n progresiva del

rnicronibulo Yal desensamblaje final de los protofilamenlQS, fonnando dfmeros

de IUbulina Iibres.

•

Inlerc.mbl~

cuquete deGTP

r

•

(

I

protom.mento recto

FIgura 16-33 La hklr6lIsls del GTP

despues de la pollmertzad6n

III hidroll,i, ~I GTP CIImbi.l. conformKlon de I. lIUbonldlld y debllit. el enlilCII en el pollmero

I region meno. prolofilllmenio curvlldo

I

deIpolimerizKiOn

I

nc.b'e~I

mlcrOlubulo q~eontiene

_do tubulin. Unidolll GOP

, rlelmblo GOP-GTP

~J 'AI

:......--..868

Capllulo 16: El citoesquelelo

CRECIMIENTO

ACORTAMtENTO

'81

ii

L

ellnlrosomll

prOllllns qUlI forms un U5qUlIll1

FIKura 16-34 LaeslabUlzacldn selec:tlva de los mlcroltibuJolJ puede

IA' .......- -

ensamblaje y desensamblaje de las moleculas de tubuJina estan controlados espacialmente de manera que predomina la extensi6n de los microtubulos hacia regiones especfficas de la celula. Se desconoce como se consigue esta distribuci6n, pero se cree que los mecanismos dependen de la inestabilidad dinamica de los micronlbulos. Hemos visto como ill vitro los micron1bulos individuales ticnden a existir en uno de los dos estados posibles -de crecimiento regular 0 n\pido, y de desensamblaje "catastr6fico"- y que los microtubulos en las celulas lambien existen en una de estas dos formas. La inestabilidad inherente de los microtubulos contribuye a explicar c6mo pueden ser inducidos a crecer en direcciones especfficas de la celula -par ejemplo, hacia el borde frontal de avance de la celula que se arrastra. La red de microtubulos que irradia a partir del centrosoma esta cambiando continuamente ya que crecen nuevas nticrotubulos y reemplazan a otros que se estan despolimerizando. Un microtubulo que crece desde un centrosoma puede ser estabiLizado si su extremo "mas" es estabilizado, 0 si se forma un casquete. de manera que se impida su despolimerizaci6n. Si es recubierto por una estructura de una regi6n particular de la celula, se establecera un punto de uni6n relativamente estable entre esta estructura y el centrosoma. Asf pues, los microtubulos originados en el centro organizador pueden estabilizarse selectivamente por diferentes fen6menos en cualquier lugar de la celula. Se cree que la polaridad celular esta determinada de esta manera, por medio de estructuras 0 factores desconocidos localizados en regiones particulares del c6rtex celular que "capturan" los extremos mas de los microtubulos (Figura 16-34). Tal como discutiremos a continuaci6n, en muchas celulas la estabilizaci6n inidal de los extremos mas de los microtubulos se consolida. produciendose una polarizaci6n mas permanenle de la misma.

polartzar una aHula. Un micronJbulo acabado de rormar 5610 persistinl. si sus dos extrem05 estan protegidos de la despolimerizaci6n. En las ctHulas, 105 extremos men05 de 105 miCfOnJbulos generalmente estan protegidos por los centros organizadores, a partir de 105 cuales crecen. los extremos mas son inicialmente Iibres pero pueden ser estabilizados por otras proternas. Aqul por ejemplo en (A) se representa una relula no polarizada con nuevos microttibulos creciendo y rompi~ndose en lodas direcciones. Los haces de microtubulos encuenlran entonces estructuras hipoU!llcas en una regi6n espedfica del c6rtex celular que pueden unir (eslabilizar) los eXlremos mlls de los microtubulos (8l. La estabilizaci6n selectiva de eslos microtubulos, que sucede a1 encontrar estas estructuras, componara una redistribuci6n rapida de los haces de mlcrotubulos yconveI"tirn a la c~lula en una rorma polarizada {C y DJ.

Los microtubulos sufren una lenta "maduraci6n" como resultado de modificaciones post-traduccionaJes de sus subunidades de tubulina 22 Las subunidades de tubuJina pueden ser modificadas covalentemente despues de su polimerizaci6n. Dos de estas modificaciones son especialmeme interesantes puesto que proporcionan una forma de reloj molecular, que puede usarse para expLicar cuanto tiempo ha transcurrido desde que un microtubulo determinado ha polimerizado. Estas modificaciones son la acetilaci6n de la a-tubulina en un residuo determinado de Iisina y la eliminad6n de un residua de tirosina del extremo carboxilo terminal de la a-rubulina. Ambas, acetilacion y destirosilIadon, son reacciones enzimaticas lentas que tienen lugar 5610 en los microtubulos y no se producen sobre moleculas de rubulina Iibres; ademas, su acci6n revierte rnpidamente cuando la molecula de rubulina se despolimeriza. Asf pues, cuanto mas tiempo haga que un microtubulo particular ha polimerizado. mayor sera el porcentaje de sus subunidades que estan acetiladas y destirosinadas. Las modificaciones tardan diversas horas en ptoducirse, de forma que en los fibtoblastos, donde los microtubulos se recambian rapidamenle, relativamente pocos de ellos est<\n modificados. Al contrario, en los axones de las celulas nerviosas, la mayorfa de los microtubulos son estables par 10 que muchos de ellos se hallan modificados. Mlcroltibulos

869

La acelilaci6n y 1a destirosinaci6n pueden ser delectadas mediante anticuerpos especfficos, y proporcionan un indicio util de la estabilidad de los microtubulos en aquellas c~lulas en que es diffcil estudiar direclumente la din~mi­ ca de los microtubulos. Se desconoce aun el papel de estas modificaciones, pera se cree que proporcionan lugares de uni6n para prateinas especfficas asociadas a microtubulos que podrian estabUizar los microltibulos maduros.

Las proteinas asociadas a microtubulos (MAP) se unen a los microtubulos y modifican sus propiedades23 Mien(Tas la modificaci6n posHraduccional de la tubulina marca ciertos microtubulos como "maduros" y puede aumentar su eslabilidad, las modificaciones m~s exlendidas y vers:1tiles de los microtubulos son las conferidas por la uni6n de orras proleillas. Estas prolelitas asociadas a los microllibulos (MAP, de Microtubule-Associated Proteins), actuan tanlo estabilizando los microtubulos contra el desensamblaje como mediando su interacci6n con OITOS componentes celulares. Como cabrfa esperar de la diversidad de funciones de los microtubulos, hay muchos tipos de MAP; algunas de elias eSI~n ampliamenre dislribuidas en la mayorfa de c~lulas, mientras que otras se encuentran Ian 0010 en algunos tipos celulares espccfficos. Los dos principales tipos de MAP se pueden aislar a panir de cerebro, asociadas a microlubulos: las prote{llas HMW (proleinas de aho peso molecular, de High Molecular Weight), que lienen pesos moleculares de 200 000 a 300 000 dallons 0 mas; y las proleinas tau, de pesos moleculares entre 55 000 Y 62 000 dallons. Ambos tipos de protefnas tienen dos dominjos, y 0010 uno de elias se une a los microlubulos; se cree que el otro dominio permile a los miCTOtubulos unirse a ouos componentes celulares (Figura L6-35). Pueslo que este dominio de uni6n a los microrobulos se une simull~neamentea varias mollkulas de tubulina no polimerizada, estas MAP aceleran ill virro el proceso de nucleaci6n durante la polimerizaci6n de la lubulina. Mucho mas importante es el hecho que estas MAP inhibcn la disociaci6n de la lubulina de los extremos de los microltibulos, por 10 cual eSlas protefnas los csl'abiliZ3Jl una vez formados. Anticuerpos contra la MAP-2 y cOnlra lau muesrran que ambas proteinas se unen a 10 largo de tada la extensi6n de los microlubulos cilOplasmMicos. Se han aislado muchas alras MAP. A1gunas actuan como componcntes estruclurales y proporcionan uniones permanentes con otTOS componenles ccllllares, incluyendo otras partes del ciloesqueleto. Dims son rnOlores microtubulares. y utilizan la energfa que proporciona la hidr6lisis del ATP para desplazarsc n 10 largo de los microtubulos, tal y como disculiremos m~s adelanle.

Las MAP colaboran en la generaci6n de regiones citoplasmliticas funcionalmente distintas 2• Muchas tipos celulares eSlabilizan especfficamenle los microrubulos en regianes espccializadas del ciloplasma. Un ejemplo especialmente bien eSlUdiado cs

",,~....-,micr01Ubulo

MAP-2

25flm

10llnm

870

CapfluJo 16: EI citoesqucLeto

lSI

Figura 16·35 Una protefna asociada a 105 microtubulo$. (A) E1eclronmicrografia que muestra los brazos laterales dismbuidos unifomlcmente a 10 largo de un microtubulo, y formados par una gran protefna asociada a los microtubulos (denominada MAP-2) aislada a panir del cerebro de los venebrados. Porciones de la proterna se proyectan hacia el exterior del microtubulo, como se muestra esquematicamente en IS). (MicrografJa electr6nica por conesfa de William Voter y Harold Erickson.)

el de las celulas nerviosas, que disponen de dos tipos de apendices -axollcsy delldritas. Los axones, llniformes en cuanto a su diametro y que pueden tener varios cenlfmelros de longitud, son los responsables de la propagaci6n de las sei'iales clectricas a partir del soma cclular, mientras que las dendritas, que se distribuyen radialmenle a partir del soma celuJar y que raramentc sobrepasan los 500 pm de longilud, son las responsables de recibir la informaci6n electrica de otras neuronas y retransmitirla al soma celular. La mayorfa de celulas nerviosas disponcn de varias dendritas pero tienen solamenre un unico ax6n (vease Figura 11-20). Ambos, axones y dendritas, estan formados por microlubulos, aunque can disposiciones distinras. En los axones, los microtubuJos son muy largos y lodos estc1n orientados con su extremo "mas~ aJejado del cuerpo celular. En las dendritas, los microtubulos son mas cortos y su polaridad es mixla: algunos de los extremos ~mas" se alejan del cuerpo celuJar, mienrras que ouos dirigen su extrema ~mas" hacia eSle cuerpo celular. Cuando se estudia la distribuci6n de las MAP en neuronas cultivadas mediante anlicuerpos especfficos, se observa c6mo ciertas formas de la protefna lau se encuentran solamente en los axones; par otro lado, la MAP-2 se encuentTa 0010 en las dendrilas y en el soma celuJar y esto1 totalmente ausente en los axones (Figura 16-36). Axones y dendritas se diferencian tambien en OIrOS aspectos: por ejemplo, en las dendritas y en el soma cclular, pero no en los axones, se encuentran las molecuIas de mRNA. los ribosomas y algunos tipos de canales i6nicos mientras que ciertos tipos de molecuJas implicadas en la adhesi6n celular y los canales de sodio implicados en la generaci6n de potenciales de acci6n estan localizados selectivamente en los axones. De est'e modo tanto el citoplasma como la membrana plasmatica de las celulas nerviosas se dividen en comparrimiemos axonales y dendriticos. Estos compartimienlOS en una celuJa individual se diferencian de los compartimienros delimitados por membrana, tales como el relfculo endoplasmatico 0 las mitocondrias, en que no estan separados los unos de los otros por membranas; de hecho, la diferencia radica en la organizaci6n estructural y en los tipos de prote(nas que se encuenlran presentes. La formaci6n de los axones y de las dendritas durante la diferenciaci6n de las celulas nerviosas se discute en el Capftulo 21. Aunque todavfa no conocemos c6mo se compartimentan el ciloplasma y la membrana plasmatica de una celula nerviosa, las MAP podrfan ser esenciales en este proceso. Cuando se inhibe la producci6n de la prolefna lau en nellronas cultivadas mediante tratamiento con oligonucle61idos antisenlido especfficos, se suprime la formaci6n de los axones mientras que no se ve afectada la de las dendritas. Contrariarnente, cuando celulas no neuronales son manipuladas geneticamenle de manera que se cxpresa cn elias la prolcfna tau (que normal mente se expresa solamentc en las celulas ncrviosas), forman largos apendices parecidos a los axones, que est~n formados por haces de microt(lbulos dispuestos con sus extremos "mas" parlicndo hacia fuera del cuerpo celular, al igual que en las celuJas nerviosas. Debido a que diferentes componenles de la celula se desplazan en distintas dirccciones a 10 largo de los microWbulos, se puede postular que una difercncia inicial en la polaridad de los micron:i.bulos esta generada por la distribuci6n diferencial de las MAP. que comportaro1una diferencia posterior entre axones y dendritas. Las vesfculas secretoras, por ejemplo, se desplazan hacia el extremo mas de los micrOlubulos y son lransportadas desdc el ax6n hasta los terminales nerviosos donde desarrollan su funci6n; contrariamenlc, si los ribosomas y los mRNA se desplazan hacia el extremo menos de los microtubulos, podrian ser exc1uidos de los axones.

Figura 16-36 UneJemplodela compartlmentackSn dtoplasmthlta de una c8ula nervtosa. Esla

micrograffa muestra la distribucion de la prolefna lau (!Jerde) yde la MAP-2 (namnja) en una neurona de hipocampo, en cuhivo. Mientras que tau se encuenlra con6nada a1 axon, MAP-2 se encuemra localizada en el soma celular y en las dendritas. EI anlicuerpo que se ha utilizado para detectar lau se une dnicamenle a tau desfosforilada, que se encuentra en el ax6n; olros datos muestran que lau fosforiJada lambien puede encontrarse en las dendritas. (Por conesfa de James W. Mandell y Gary A. Banker.)

La quinesina y la dinefna dirigen el movimiento de los organuJos a 10 largo de los micron:ibuJos2S A menudo ocurre que la aparici6n de una nueva tecnica experimemal ha comportado avances muy importantes en la biologfa celuJar. Con la microscopia 61'lica vfdeo-amplificada se ha mejorado la capacidad de observaci6n de objctos Microtubulos

871

eXlrllmo ml!is

'AI

quinllllinll

utrllmo meno,

dlnelnll

debUes y diminutos, 10 cual ha conduddo al descubrimicnto de los motares de los microtubulos responsables del transporte de los organulos. Cuando fue posible visualizar los rnicrotubulos simples en Ull espedmen no fijado, los investigadores pudieron seguir el movimiento de los organulos y atras part feu las a 10 largo de los microtubulos in vitro. AJternativamente, pudieron observar y medir el deslizamiemo de microrubulos individuales sobre superficies de cristal recubiertas con extractos celulares. Estos estudios in vitro sirvieron para idenoficar y aislar dos opos de protefnas motoras dependientes de microtubulos -las quinesinas y las dillelnas cilopJasmdticas. las dlnemas ciloplasmlhlcas eSlan implicadas en el transporte de los organulos y en la mitosis y estan muy fntimamente relacionadas con la dineltlQ ciliar, prote(na motora de los cilios y flagelos (se djscute mas adelante). las qulneslnas son mucho mas diversas que las dinefnas; algunos miembros de esta familia estan implicados en el transporte de los organuJos en la mitosis y en la meiosis y en el transporte de las vesiculas sinapticas a 10 largo de los axones. Tanto las dinefnas citoplasmaocas como las quinesinas esth fonnadas por dos cadenas pesadas y algunas cadenas ligeras. Cada cadena pesada contiene una cabeza globular muy conservada de uni6n al ATP y una cola formada por dominios a modo de varillas. Las dos cabezas globuJares son motores ATPasa que se unen a los micrott1bulos, mientras que las colas generalmente se unen a compo· nel1les celulares espedficos, detcrminando asf la carga que cada protein a transporta (Figura 16-37).

Pigura 16-37 Protefnas motorasde los mlcrotdbulos. Las quinesinas y las dinc[nas cilOI)lasmaticas son protc(nas motoras dc los microtubulos que general mente se desplazan en direcciones opuestas a 10 largo de un microtubulo (Al. Estas protefnas (aquJ dibujadas a escala) son complejos compuestos por dos cadenas pesadas id~nticas y algunas cadenas Iigeras mas pequenas. Cada cadena pesada forma una cabeza globular que une la protefna a los microtubulos de fonna dependieme deATP. (8 yC) Electronmicrograffas de grabado por congelacl6n de una molOCuJa de quinesina (B1 y de una molecula de dinefna citoplasmatica (C). Mientras la quinesina y la dinefna citoplasmatica tienen dos cabezas. la dinefna ciliar (D) tiene Ires. (vease Figura 16-44). (Las micrograffas elCClr6nicas de grabado por congeJacion fueron preparadas por John Heuser.)

La velocidad y la direcci6n de desplazamiento a 10 largo

de los microtubulos son espedficos del dominio globular de las protefnas motoras 26 La mayorfa de protefnas motoras conoddas se mueven unicamente en una di-

recci6n a 10 largo de los microtubulos -hada su extremo mas 0 hacia su extremo menos. Esta direccionalidad se puede analizar in vitro si se permite que bolas de poliestireno recubiertas con protefnas motoras se desplacen a 10 largo de microtubulos polimerizados en centrosomas. Los microtlibulos asf dispuestos l.ienen su extremo mas dirigido hacia al exterior y es fadl determinar la direcci6n del movimiento con un microscopio 6ptico. Miemras que las bolas de poliestireno que han side recubiertas con extractos crudos de citoplasma se mueven en ambas direcciones, las que han sido recubiertas con quinesina aislada de axones se mueven unicamente hacia el extremo mas de los microtubulos. AJ contrario, boIitas recubiertas con dineinas citoplasmaticas se mueven hacia los extremos menos de los microtubulos, embebidos en el centrosoma. Estudios con axones nerviosos intactos han confirmado los resultados obtenidos en los experimentos in /litro: la quinesina conduce, principalmente, el movimiento de los organulos hacia el exterior del soma celular, mientras que la dinefna citoplasmatica conduce el movimiento de los organulos desde los cxtre872

Capftulo 16: EI dloesquelclo

L

Figura 16-38 Transporte vellcular en dos dlrecc::lones. La quinesina y la dinefna citoplasmatica transportan su carga en direcciones Opueslas a 10 largo de los micrott:ibulos, Ial y como se mueslra en un fibroblaslo tAl yen el ax6n de una neurooa (8).

181

• vesicula; con di.-r..... unid• • vesieul. con quin"in. unid" _

miCfotubulo

mos del terminal nervioso hacia el soma celular (Figura 16-38). La dinema ciloplasmatica se sinteliza, igual que el resto de protefnas, en el soma celular nervio· so, y entonces debe ser transportada en un estado no funcional hacia el terminal nervioso antes de que em piece Sll funci6n transportando orgl'inulos de regreso al cuerpo celular. Sorprendememente no toctas las quinesinas desplazan los organulos hacia el eXlTemo mas de los microulbulos. Por ejemplo en Drosophila, una quinesina lIamada Ned, que es necesaria para la meiosis nonnal. se diferencia de la quinesina axonal tanto en la direcci6n como en la velocidad a la que se desplaza a 10 largo de los microrubulos: mienlnlS que la quinesina axonal se dirige hacia el ex· tremo m<1s a una velocidad aproximada de 2 p.m/segundo, la protema Ned 10 haee hacia el extremo menos a 0, I }lm/segundo. aproximadamente. Se deseonoce el mecanismo mediante el cual estas protefnas convienen la energfa de la hidr6lisis del ATP en movimiento vectorial. Seran necesarios estudios estructluales mas detallados para determinar c6mo las cabezas g10bulares tan fntimamente relacionadas de estas proteinas pueden desplazarse en direcciones opuestas a 10 largo de los microtubulos y quizts estO apone algtln conocimienlo sobre el proceso de transducci6n de energia.

Resumen Los mlcrotlibulos SO" poUmeros rlglOOs de moleculas de tubullna. El ensamblnje se produce mediante In adleMII al extrema libre de los mlcrotlibulos de moleculas de t"bulina que contienen GTP y ql4e dis/Jane" de "" extrema fet extrema "miSs") qlfe crece mds rdpidnmenre que el otro extremo fel "meJlOs"). Despuls del ensamblaje se produce In hldrolisis del GTP y debillta los enlaces que malltlemm unldos a tos mlcrohlbulos. Los mlcrohlbulos de creelmlento lento son muy Inestables y estan sujetos a un desensamblnje Mtastrojlcoi pueden estabitlzarse dentro de In cilula si Ul asoclan con otras estructuras {Ille rec"bren sus dO$ extremos. Un centros organiza· dores de microt,ibulos, tates como los centrosomas, protegen lO$ extremO$ menos y continllamente n1u:lean mrevos microtlibulos, que crecen en rodas direcciones. 5i un nrtcroh1bulo enCirentTa Ilna esrnu::tum que estabillza su extremo "nu&" libn, sem Ulh!ctivanrente retenido, mtentms que otro microtdbl4lo Ul despolinrerizaNf.. Se cree que este proceso selectivo detemlina In posid6n tk 10$ haus tk microhiblllos dentro tk In cilula. Las subll"idades tk hlbllUna tk los microtdbuios que han sldo Ull«tivanrente estabillzada.s Ul modlfican mediante acetilad6n y destirosinaci6n. Se cree que estas alteradones marean a tO$ microtdblllos como "maduros" y proporcionan lugares tk u1lt6n pam las prote{"as espedjlc:as de ,,,,16n a los microtlibu/os (MAP), 10 C1ud tambiln estabillza al microtdbulo [rente al desensamblaje. Las prote{nas motoms mlcrotllbldares constlhlyen una clase Importante de AtAP que IItfllzan In energla de In llidrolisis del ATP para desplaznrse unidirea:lotlalme"te a 10 largo de los mt· crotlibldos, lIevatlOO una Mrga espec{jlM. En gelleral, las dlnefnas desplnzan su Mlcrotdbulos

873

carga lutcia los extremos menos de los microhib"'os, mielltras qlle In nutyorla de las qllinesinas 10 Imam luu:ia los extremos nufs. Estas prote(lIlu motoros SOli Ins respcmsables de In organiznci6n espacial y del movimiellto dirigido de los 01"86"11los del citoplasnm.

Cilios y centrfolos27 El batido de los cilios es una de las formas del movimiento celular mas estudiadas. Los cUios son evaginaciones delgadas, a modo de pelos, de unos 0,25 Jlm de diametro, con un haz de microtlibulos en su interior; sobresalen desde la superficie de muchos tipos celulares y se encuentran en la mayorfa de especies an.i~ males, muchos prolOzoos, y algtUlas plantas inferiores. Su principal funci6n estriba en desplazar fluidos sabre la supcrficic de la cclula 0 en propllisar a lIna celula aislada a trav~s de un lfquido. Los protozoos. por ejemplo, ulilizan los cilias tanto para capturar panfculas alimenticias como para la locomoci6n. En las c~lulas epiteliales del tracto respiratorio humano, grandes cantidades de cilios (l0'/cm 2 o mas) trasladan hacia la boca capas de mucus que contienen partfculas atrapadas de polvo 0 celulas muenas. En la boca son enguUidas y eUminadas. Los cilios participan en el proceso de trasladar los oocitos a 10 largo del oviducto. Una eslructura relaclonada, el flagelo, propulsa el espermatozoide humano.

Los cilios se mueven por el batido de un axonema -un complejo haz de microtubuJos27 Los campos de cilios se inclinan siguiendo ondas coordinadas, unidireccionales (Figura 16-39). EI movimiento de cada cilio es semejame al de un latigo: un gol-

pe activo hacia adelante, durante el cual el cilio esta totalmente extendido y es capaz de ejercer una fuerza maxima sobre el liquido circundame, seguido de una rase de recupcraci6n, duranle la cual el cilio recupera su posici6n original gracias a un movimiento de desenroUamiento que minimiza la resislencia viscosa (Figura 16-40A). Los tielos de los cilios adyacenles son casi sincr6nkos, aunque no los son totalmente. Este sincronismo da lugar a unos patrones parecidos a olas, que se pueden observar al microscopio 6ptico. EI linico Oagelo de los espermatozoides y de muchos prolozoos es muy parecido a los dlios en cuanto a su ultraestructura interna, pero normalmente los nagelos son mucho mas largos que los cilios. Los flagelos no presentan un movimiento parecido al de un laligo, sino que generalmente propagan ondas casi sinusoidales (Figura 16-408). Sin embargo, la base molecular de su movimienlo es

figura 16-39 ClUos. Electronmicrograffa de barrido de un Mea ciliar del inlestino de un gusano marino. (De ).S. Mellor y 1.5. Hyams. Micron 9:91-94, 1978.01978, wn aulorizaci6n de Pergamon Press Ltd.)

874

Capftulo 16: EI citoesqueleto

Figura 1&.40 Conlrasteenlre los movlmlentosde baddo de uncilio yde un Ragelo. (Al EI batido de Ull cilio de una c~lula epitelial del tracto respiratorio humano parece una brazada de un nadador. EI golpe de una brtlUllh1 (esladios I y 2), durante el cual el fluido es empujado sabre la superficie de la CIBula, va seguido de un lento mOlJimiemo de recllperacion (estadios 3. 4 Y5). Tfpicamente. cada cicio tarda entre 0.1 yO.2 segundos y genera una fuerza perpendicular at eje del axonema. Para efectos comparativos en (8) se muestra el movimiento ondulante del f1agelo de un espermatozoide de un tunicado. La ~Iula se fotografi6 sabre una peUcula en movimiento con una iluminaci6n estrob0sc6pica de 400 destellos por segundo. N6tese que las ondas de amplilUd constante se desplazan desde la base del nagelo hasta su punta. Entonces. la ~Iula es eOlpujada directamente desde su axonema. un efeclo muy diferente del que produce un cilio. (8. por conesfa de C.,. Brokaw.)

2

la misma que la de los cilios. Los llagelos de las bacterias, sin embargo, (descrilOS en el Capitulo 15) son completamenle diferentes a los cilios y a los flagelos de las celulas eucariotas. EI movimienlo de un cilia 0 de un llagelo eSla prodllcido par la llexi6n de su eje, llamado axonema. EI axonema est<1 formado tOlahncntc por micrOltiblilos y por sus prolefnas asociadas. Los microtubulos est<1n modilicados y se hallao dispuestos siguiendo un patr6n cuyo aspecto curiosa y caracterfstico rue una de las m<1s nOlables revelaciones de los inkios de la microscopia electr6nica: nueve dobletes de microtubulos especiales estan dispuestos en cfrculo aJrededor de un par de micronlbulos sencillos (Figura 16-41). Esta disposici6n de "9 + 2" es caracterfstica de casi {odas las formas de ciLios y de flagelos eucario{as, desde los protozoos hasta los que exislen en los humanos. Los microtubulos se extienden inintemJmpidameOle en toda la longilud de' axonema. que suele ser de 10 p.m, aunque en algunas celulas puede alcanzar los 200 pm. Gada miembro del par de microtubulos sencillos (el par cemral) es un microtubulo completo pero cada uno de los dobletes eXleriores esta compueslo por un microtUbulo completo y un microtubulo parcial fusionados, de lal forma que ambos comparten una pared coml1.n. En secciones transversales, cada mi·

•

5

IA)

IBI

braw elrterior de dinern. sspina radial valns intarior par cenlral de microtlibtllotl --.--....;:: Mncillotl

braw Interior de dinefn.l

IB'

,AtutM.no

Bt\ibulo,

doblets elllerno de microtubulo

FlKura 16-41 La dlsposlcl6n de los mlcrotubuJos en un cillo 0 en un Dagelo. Electronmicrograffa que muestra una secci6n transversal del flagelo de un alga verde (CIIlamydomollas) en la que se puede observar la disposici6n caraclerfSlica de "9 + 2~ de los microtUbulos. (B) Diagrama de las parIes. Las diversas proyecciones de los microtubulos los Olantienen unidos y se producen a inlcrvalos regulares a 10 largo del ax-onema. (A, por cortesfa de Lewis Tuney.) (A)

•

Clllos y centrfolos

875

Figura 16-42 Mkrotubulo desUzAndose en un axonema. ElectronmicrografTa de un axonema aislado (a panir de un cilio de Tetrahymena) que ha side brevemente expueslo a la enzima proteolftica lripsina para romper las uniones proteicas que normalmente lo mantienen unldo. Tras el tratamiento con ATP, los dislintos dobletes de microtUbulos se deslizan unos respeclo a los otros, tal y como se mueslra esquematicamenle en la Figwa 16-43A. Como hay nueve dobletes de microlubuJos en el axonema, la eslructura original puede alargarse hasla nueve vecessu longitud inicial. (De F.D. Warner y D. R. Mitchell, ,. Cell Bioi. 89:35-44, 1981. Reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

crotubula aparece farmada por un anillo de 13 subunidades, mientras que ellu· bulo incompleto de los dobletes exteriares esta formado s610 por 1I subunida·

des. La dinetna dirige el movimiento de los cilios y de los flagelos 28 los microttibulos del axonema estan asociados a numerosas proteinas, que se encuentran en posiciones regulares a 10 largo de los microtubulos. Algunas sirven como puntas de uni6n que mantienen juntos los haces de microtubulos. Otras generan fuerzas que dirigen el movimiento de nexi6n, mientras que olras forman un sistema de transmisi6n aClivado mecanicamente que controla el rnavimiento, produciendo la forma de onda deseada. La mas importanle de estas prolefnas accesorias es la dlnema cUlar, cuyas cabezas interaccionan con los microtlibulos adyacenlcs y generan una fuerza de deslizamienlo entre microlubulos. A causa de las multiples uniones que mantienen unidos los dobleles de microttibulos adyacenles, 10 que serfa un movimiento deslizante entre microtubulos Iibres (Figura 16-42) se convierte en un movimiento de flex:i6n en el cilio (Figura 16-43). Como la dinefna citoplasmatica, la dinefna ciJiar liene un dominio mOlor que hidroliza ATP para desplazarse a 10 largo del microtubulo hacia su extrema menos, y una cola que transporta la carga, la coal en este caso es un microtubulo adyacente. La dinefna ciliar es considerablemente mas larga que la dinefna choplasm.1lica, tanto en la medida de sus cabezas pesadas como en el numero y complejidad de sus cadenas polipeptfdicas. En los flagelos del alga verde unicelular Chlamydomonas, par ejemplo, la dinefna esta formada por 2 a 3 cadenas pesadas (hay multiples formas de dinefna en los flagelos) y 10 a m<1s polip~pti· dos mas pequefios (Figura 16·44). Podemos observar c6mo In cola de la dinefna ciliar se une s610 al tubulo A y no allubulo B, que {iene una estructura Iigera· mente distinta. Esta asimetrfa, resultado de la disposici6n de las moleculas de dinefna, es necesaria para prevenir una lucha de "eslirar la cuerda" sin semido

(A.) OE.SPU~S DE LA PAOTEOUSIS:

OESf'lAZAMIENTO TELEscOf'M:o

doblelU librel

1101 puel'llel cnlz.dos

101 doblelel ledesliz.1'I

Ie h.1'I eHmil'lado medi.l'Ite proteolisill

876

Capftulo 16: EI cltoesqueleto

(BI ESTRUCTURA INTACTA: FLEXION

dobtetes Ul'lidol de UI'I cilio medlel'lte puentes CfUZedos:

el desliz.mlenlo de 101 dobletel prOYOCll I. ftexiOl'I de I.

estructur.

I

FIgura 16-43 Flexl6n de un axonema. (A) 5i las prOlefnas que mantienen unidos los dobletes son eliminadas medianle proleolisis, el des1izamiento de los dobleles de microlubulos enemos, unos respecto a los ouos, provoca el a1argamienlO del axonema. (8) Si los dobleles se encuentran unidos entre sf, el axonema se nexlona.

IAI

Figura 16-44 La dlne(na clllar. La dine(na ciliar es un gran complejo proleico (cerca de 2 milJones de daltons) compuesto por entre 9 y 12 cadenas polipepddicas, la mayor de las cuales tlene unos 512 000 daltons. (Al Se cree que las cadenas pesadas constituyen la mayor parte de \a cabeza globular y de los dominlos del tallo, y muchas de las cadenas mas pequenas se encuentran agrupadas alrededor de la base del tallo. La base de la moMcula se une fuertemente a un mlcrotubulo A, a traves de una reaccion dependiente deATP, mientras que las cabezas globulares mayores tienen un lugar de union dependienle de ATP para un microtubulo B (vease Figura 16-41). Cuando las cabezas hidrolizan el ATP que tienen unido. se desplazan hacia el eXlremo menos de eSle segundo microtubulo, produciendo asf una fuerza de deslizamiento entre los dobletes de microttlbulos adyacentes de un cilio 0 de un Ilagelo (vease Figura 16-43). Aqu( se ilustra la forma de tres cabezas de Ja dinefna dJiar, farmada por tres cadenas pesadas. (B) Electronmicrograffa de un cilio sometido a criofraclUra, mostrando los brazos de dineina proyectjndose a inlervalos regulares a partir de Jos dobletes de microtubulos. (B, por conesfa de John Heuser.)

"om

entre microtubulos vecinos, 10 eual posiblemente explicarfa por que cada uno de los nueve microttibulos externos es un doblete A-B.

Cilios y flagelos crecen a partir de corpusculos basales que estan muy intimamente relacionados con los centrfolos29

,

5i los dos flagelos del alga verde Chlamydomonas se separan de la celu!a, vuelven a formarse n1pidamente por elongaci6n a partir de uoas estructuras llamadas corplisclilos basales. Los corptisculos basales poscen la misma estructura que los centriolos que encontramos inmersos en el centro de los centrosomas animales. De hecho, en algunos organismos, corpdsculos basales y centrfolos parecen tener funciones intercambiables: durante carla una de las mitosis en ClIlamydomonas, por ejemplo, los flagelos son reabsorbidos y los corpusculos basales se mueven hacia el interior de la celula y se convierten en los generadores de los polos del huso rnit6tico. 'Centrfolos y corpusculos basales son estructuras cilfndricas de aproximadamente 0,2 11m de ancho y 0,4 11m de longitud. La pared del centrfolo esta formada por nueve grupos de (res microtubu]os, distribuidos en Iripletes. Cada triplete esta indinado hacia el eje central, como las aletas de una turbina (Figura 16-45). Los tripletes adyacentes estan unidos a intervalos a 10 largo de su longitud. En electronmicrograffas se pueden observar finos radios proteicos irradiando desde un nudeo central hasta cada triplete y dando lugar a un patr6n semejante a una rueda de carro (vease Figura l6-45A).

f

100nm

Figura 16·45 Corpusculos basales. (A) Electronmicrograffa de una seccion transversal a traves de tres centrioles del cortex de illl protozoo. (Bl Diagrama de un corpusculo basal viste lateralmente. Cada corpusculo basal constituye la pordon inferior de un axenema ciliar, y esta farmado por nueve tripleles de micronlbulos. cada uno de los cuates tiene un micronlbulo completo (el tubulo A) fusienado can dos microtubulos Incompletos (los tubulos B YC). Otras protefnas {marcada en rojo en (Bli forman puentes que mantienen unida la disposidon dlfndrica de microtubulos. La estructura del centrfolo es esencialmeme la misma. (A, porcones(a de D.T. Woodrowy R.W. Unck.)

Cllios y centriolos

IBI

877

\vI Duranle la formaci6n 0 regeneraci6n del eiJio. carla doblclc de micrOlubulos del axonema creee a parti.r de dos de los micronibulos deltriplete del corpusculo

basal, de manera que se preserva la simctrfa nonagonal de los microllibulos del axonema ciliar. Los eSludios autorradiograficos sugieren que la incorporaci6n de tubulina y de alras protefnas del axonema tiene lugar en la punta distal de 1a

estructura, en el extrema mas de los microtubulos. Se desconocc c6mo se forma el par central de micrOluhulos aislados del axonema, ya que en el ccOlTralo yen los corplisculos basales no existe ningun par central. Se desconoce c6mo se dctcrmina la longilud de los ciHos y de los flagelos. La longitud es constanle para uoas c~lllias detcrminadas. y no est
la disponibilidad de componentes a par la ci.lu~tica del alargamienta. $i separamos uno de los dos Oagelos de CII/amydomollas. par ejemplo. el flagelo restante empieza a reabsorberse mientras que. simultaneamente. el flagelo perdido se regenera. Una vez el f1agelo que se reabsorbe alcanza la misma longitud que el f1agelo que se regenera. los dos crecen juntos hasta conseguir la longirud final caracterCSlica. Este experimemo sugiere que la longitud flagelar esta constante· mente comrolada de la misma forma (Figura 16-46).

Los centrfolos suelen aparecer por duplicaci6n de los centrfolos preexislenles30 EI incremento continuo de la masa celular a 10 largo de todo el cicio celular animal presenta dos acontecimientos discretos de duplicaci6n: la replicaci6n del DNA y la duplicaci6n del centrosoma. que normalmeme tiene un par de centrfolos en su interior. Los dos cemrlolos del par estan dispueslOs perpendicularmen+ te UIlO respceto aI otro (Figura 16-47). En los fibroblastos en cultivo la duplicaci6n del centrfolo empieza casi al mismo tiempo que empicza la sfmesis de DNA: primcro se separan los dos miembros de un par y entOllces se forma un centriolo hijo perpendicular a cada ccntrfolo original (v~ase Figura 18-4). Un centriolo inmaduro rnuestra una disposici6n en simetrfa nonagonal de rnicrotu-

tOllm

Figura 16-46 La longtcud del flBgelo escli eOIlCrollldn medJnnte UII proceso nellvo. (Al Cuanda se separa ffslcamente uno de los flagelos (aspa azlll), empieza a crecer mediante polimerlzacl6n a part.ir del corpusculo basal (rojo). AI mismo tiempo. el nagelo restanle empieza a reabsorberse. CUlIndo ambos miden la mitad de su longilud original. empiezan a crecer juntos. EI crecimienlO se deliene cuando ambos ftagelos han conseguido la longitud final. cuidadosamente especificada. (8) FOlografia en color del alga Chlamydomonas. donde el color anaralljado e$ el resuhado de la aU(Qfluorescencia de la c1orofila y el l!E'rde proviene de la uni6n de un anticuerpo f1uorescente cOlllra una protelna de la membrana plasmlilica. (8. por cortesfa de Robert A. Bloodgood.)

Figura 16-47 EleclJ'Onmlcrografla moslrando un par de cenlriolos reden repUcados. Un cenlrfolo de cada par ha sido corrado lransversa!menle y el OUO conado en senlido 10ngilUdinal.lo cua! indica que los dos miembros de cada par estan colocados formando un Angulo reclO. (De M. McGill. D.P. Highfield. T.M. Monahan. and B.R. BrinkJey. J. Ultraslruct. Res. 57:43-53. 1976.)

878

ClIpftulo 16: EI citocsquelcto

"--------' 20 11m

IAI

PARAMECIUM ALTERADO

181

Figura 16-48 Herenela co~lcal del patr6n en un protozoo cUiado. (I.) Electronmicrografia de barrido de un Paramecium, que nada mediante el batido sincronico de sus cilios. (Bl Dibujo csquclmhico de las hileras de citios de la superficie de un Paramecium nonnal y de un Paramecium en el que se han invertido a1gunas hileras de cilios. con 10 cual baten en direcclones opuestas. Estos patrones alterados se propagan indefinidamcnte mientras el Paramecium se divida, aunque 13 informaci6n a nivcl de DNA no haya cambiado. tA. por cortesla de Sidney Tamm.)

bulos sencilfos; probablememe carla microtubulo acrua como plantilla para el ensamblaje de los tripletes de microuJhulos lipicos de los centriolos maduros. Los dos centrfolos que forman un par no son id~nticos: el centriolo hijo no soJamente liene una orientaci6n distinta sino que tambi~n se diferencia en detalles concretos de su motfologfa y de Sli flUlci6n. En muchos lipos celularcs de los vert'chrados, por ejemplo. uno de los dos centriolos se dlstingue por su capacidad para nuclear el Uamado cilio primario-cilio aislado inm6vil cuya funci6n es desconocida. Estas diferencias padres/rujos lambi~n se presentan en los corpusculos basales. 10 eual puede conducir a las asimetrfas del ciloesquelclo. En los protozoos ciliados. la replicaci6n de los corpusculos basales esta coordinada con In divisi6n celular y se cree Que la eSlcreoespecificidad del proceso de duplicaci6n puede ser imporlanle para manlener la orientaci6n del cilio en la superficie celular. Esto fue c1aramente demostrado en un experimento c1asico Ilevado a cabo durante los afios 1960 en Paramecium, protozoo cuya superficie esta cubierta por hileras de cilios m6viles. Normalmente, todas las hileras estan alineadas con la ndsma polaridad a traves de la replicaci6n coordinada de los corpusculos basales. los cuales producen corpusculos basales hijos con la misma orientaci6n relativa respecto a la superficie celuJar. Los haces de citios que crecen a panir de los corpusculos basales proporcionan a la celula la capacidad para nadar con una gran eficiencia. Mediante experimenlos de microinyecci6n, es posible aherar este patr6n y producir hileras de ciIios invertidos que baten en diret:cioncs opuestas a las de sus vecinos (Figura 16-48). Una vez establecidas, estas alteraclones pasan de padres a hijos en el Para· mecium durante mas de 100 generaciones. Este tipo de herencia no tiene nada que ver con el DNA: las celulas modificadas hcredan un palT6n particular de hileras de cilios gracias a la replicaci6n cstereoespecffica de sus corpusculos basales.

Resumen El tlXonema del cillo y del Jlogelo em:arlota cont/ene "n lInz cilflldrlco de ""eve dobletes de microtliblllo.s perljirlco.s. Entre los dobletes de microtlibllios adyaeentes se extienden braz.o.s latera/es de lline{na que IlidroliulII ATP y gelleran luena de deslizamiento entre /o.s dobletes. Diversn.s prote{nas aa:esorias mantierlen unMo el atlilio de dobktes de mlcrotlibllim y conmerte,. la ftrena tk deslizamiento en I", mom· m/ento inclinadD que genera el hatido de los ci/im. Ln comple)a e:stnu:tura del axonema ciliar sefomm por II" alltoensambla]ede sus componentes proteicos y estd--Hudeatla por ,m centriolo (coTplisculo basal), que sirve de plmltilla para el patm" carac.erlstico de 9 • 2 microtdbulos quelontUIn el ",ideo del tlXotlema. Los eentriolos se dllpl/call mediante 1m proceso altamente COlltroladO en el cual el celltriolo I.tjo se nuc/en a partir de IU' centrlolo plulre que se e"cue"trll a Sll lado y crece lJer· pelld/culannellie a it. Ln replicaci6" orlentada tk los coTplucuios basales comporta un patr6" Ileredable de hatMo de los cilios en la sllperficie deproroUJOS dlindos.. Clllos y centriolos

879

molkul8 de ect.in8

Filamentos de actina"

I eJltremo menos

Todas las especies eucariolas contienen actina. Esta protefna del citoesqueleto es la prolcfna mas abundamc en muchas c~lulas eucariotas, ya menudo conSlituye el 5% 0 mas de la protefna celuJar tOlal. Las fibras del musculo esquel~tico de los venebrados son la fueote mas COffiiln de actina para los experimcnlos que se realizan in vitro, puestQ que la actina constituye el 20% de su masa. Si se trata polva seea de musculo con una soluci6n salina filly diluida. los filamentos de octina se disocian en sus subunidades de actina. Cada mol~cu)a de actina es un Unico polipeplido de 375 aminoacidos de longitud y esta asociada fiUy fntima· mente con una mol6cula de ATP. En las relulas los filamenlos de actina pueden formar estructuras eslables y estructuras l
1

Los filamentos de actina son delgados y tlexibles32 En las elcctronmicrograffas los OIamentos de actina aparecen como hebras de 8 nm de diametro. Estan formados por una apretada helice de mon6meros de actina oriemados uniformemente (tambien conocida como actina globular. 0 acri· na G) (Figura 16-49). AI iguaJ que los microtUbuJos, un filamento de actina es una estructura polar. con dos extremos estructuraJmente distinlos -un extrema ~menos~. relativamente inerte y de crecimiento lento y un extrema ~mas~. de crecimiento rapido. A causa de la apariencla de flecha del complejo formado entre los filamentos de actina y la protema motora miosina, que describiremos mas adelante, el extremo menos se canace tambh~n como el extrema en punta y el extrema mas como extremo ancho 0 barbado. La estructura tridimensional de la molecula de actina ha sido anaJizada mediante an:i1isis de difracci6n de rayos X, y esta informaci6n ha sido utilizada para deducir la estructura de un filamen· to de actina a nivel de sus aminoacidos individuaJes (Figura 16·50). Algunos eucariotas inferiores, como las levaduras, tjenen un unico gen para la actina, que codifica una unica protefna. Sin embargo, lodes los eucariotas superiores tienen algunas isoformas codificadas por una familia de genes de actina. AI menos hay scis tipes distintos de aClina en los tejidos de los mamfferos; se agrupan en tres c1ases, dependiendo de su punto isoeUjctrico. Las alfa actinas se encuentran en diversos tipos de mtlsculo, mientras que las beta y las gamma son los conslituyenlcs principales de las cclulas no musculares. Aunquc las distinlas formas de actina presentan sutiles diferencias en sus propicdades, las secuencias de aminoacidos han sido altamente conservadas duranle la evoluci6n, y todas se ensamblan en filamentos que son esencialmente idcnticos en la mayorfa de estudios Ilevados a cabo in vitro. La longilud tOlal de fOdos los fiJamentos de actina de una c~lula es al menos 30 veces mayor que la longitud total de los microtubulos. 10 cual refleja una diferencia fundamental en la manera como estos poL£meros del ciloesqueleto estan organizados y funcionan en la c~lula. Los fdamenlos de actina son mas delgados y mAs flexibles, y normaJmenle mas cortos. que los microttibuJos. Veremos que rara· mente los filamentos de actina se encuentran aislados en la celula. sino que gene· ralmente forman agregados y haces. con puentes entrecruzados. que son mucho mas fuenes que los filamenlos individuaJes.

La actina y la tubulina polimerizan por mecanismos parecidos" La polimerizaci6n de la actina pura i" vitro necesita ATP y tambicn cationes mo· novaJentes y divalenres, que normalmente son el K· y el Mgz·. La reacci6n puede 880

Capftulo 16: EI clloesqueJelo

eJltremo m_

18' Flgurtl16.49 FUamentosdeactina. E1cclronmicrograffa de fLIamenlos de actina oontrnstados negativamenle. {A}

(B) Disposici6n helicoidal de las

actina en un filamento. por conesfa de Roger Craig.)

mol~culas de

(A.

txf.emo mtl108

~:t'" .~

c.:.-:' ,.' ...

J..

• extrtma m'l

la,

IAI

estudiarse mediante la observaci6n del cambio de luz emitida desde una sonda f]uorescenle que ha side covalenlemenle unida a la actina 0 medianle el seguimienlo del gran incremenlo de viscosidad provocado por la polimerizaci6n. Cuando se ai'Jade K- y Mt· a la actina monomerica en presencia de ATP, se produce una rase lema (lag), mienlras se nudean 105 nuevos filamentos, y luego una rase de polimerizaci6n rnpida, mienlras 105 conos filamentos se a1argan. La fase lag que encontramos en 1a polimerizaci6n de la actina pura es debida a la rrusma barrera cinetica para la nucleaci6n que discutimos para la polimerizaci6n de la tubulina (vease Figura 16-23). Para la actina, la velocidad de nucleaci6n es proporcional al cuba de la concenlraci6n de actina, 10 cual sugiere que la estructura de nucleaci6n para la polimerizaci6n espomanea de la actina pura es un trimero de moleculas de actina. AJ contrario, la velocidad con la cual un filamento se alarga es proporcional, igual que para los microtUbulos. a la concentraci6n de la suhunidad libre indicando que el filamento se a1arga mediante adici6n de moleculas de actina, de una en una. La velocidad de polimerizaci6n es distinta en los dos extremos del filamento de actina, y esta diferencia es mucho mayor que en los microt(lbulos: el extrema ~masH 0 "barbado", la actina polimeriza unas 10 veces mas rapidamente que el extrema ~menos" 0 "puntiagudo La concentracion crfrica para la polimerizaci6n de la actina -esto es, la concenlraci6n del mon6mero de actina Iibre en la cualla proporci6n de actina polimerizada detiene su incremento- esta a1rededor de 02 micromolar (a1rededor de 8 pg/ml). Esta concentraci6n es mucho mas bajlque la concentraci6n de actina no polimerizada de la celula. por 10 que la celula ha desarrollado mecanismos especiales para impedir que la mayona de esta actina monomerica se ensamble formando filamentos. tal y como discutiremos mas adelante. Rapidamente despu~ de la polimerizaci6n, el fosfato terminal del ATP unido a la molecuJa de actina es hidrolizado, quedando un ADP atrapado en el polfmero. La h..idr61isis del ATP durante la polimerizaci6n de la actina es anAloga a la hidr61isis del GTP que acompal'ia el ensamblaje de los microtubulos, pero en el caso de la actina podemos comprender los cambios confonnacionales implicados puesto que conocemos la estructura tridimensional de la protefna. La molecula de actina {iene forma de almeja y el ATP se hall a situado en la charnela situada entre las dos mitades; como la concha de una almeja, puede abrirse y cerrarse. Cuando la actina polimeriza, la concha esta total mente cerrada par inH

•

Fllamentos de actina

,e,

(OJ ul.tmo m"

Figura 16-50 Estructura de Ja acUna. Estructura tridimensional de la molocula de actina. deducida mediante amUisis de difracci6n de rayos X. Una molerola aislada de ATP (amarillo) est! estreehamente unida en una ftsura entre los dos dominlos de la protefna. (B) Dibujo esquemlillco de una molecula de actina que pone de maniOesto sus dos dominies y el lugar de uni6n al ATP que se encuentra entre ellos. (el Dibujo esquemlitico del filamento de aClina que muestra romo las mol~culas de actina interacluan unas con otras formando el polfmero helicoidal. Advi~rtase que de la misma manera que las moleculas de actinn se cnsamblan en el polfmero. hldrolizan sus moleculas de ATP estrechamente unidas (vtlase Figura 16-51). (0) Eslructura de la molecula de actina basada en la Imagen de un filamento obtenida mediante microscopia electr6nica. Cada bola del modele representa a un aminolicido; los que Interactuan con la miosina {se discute m!s adelantel se han marcado en verde. La diferencia emre los extremos m!s y menos es aparenle. (A. adaplado de W. Kabsch et at.. Natun347:37·44, 1990. C 1990 Macmillan Magazines Ltd.: B, de K.C. Holmes et 81.. Nature 347:44-49, 1990.0 Macmillan Magazines Ltd.) (A)

881

VELOCIOAOES OE CRECIMIENTO Y OE ACORTAMIENTO

NUClEACION Un pollmero helicoidal esl6 eslabilizado mediante multiples COnlaetos enlre subunidades adyacenles. Para Ie actina, dos malkulss de actina se unen mediante enlaces relativamente debiles, pero Ie uni6n de un tercer mon6mero

Un pollmero lineal de molecules de proteins. como por ejemplo un memento de actina 0 un

de actina formando un Ifimera proporciona una mayor estabilidad al conjunlO.

•

microtubulo, se ensambla (polimerizsl V se dltS&nsambta IdespoHmeriZl) mediante Ie adici6n y Ie p'rdidll de subunidades de los

extremas del filemento. La velocidad de edici6n de mon6meros viano dada por Ie constanta

"on.

l

cuvas uoidedes son de M-I 5eg-I. La velocidad de perdida viena dada por Ie constanta '0" (uoidedes de 58g-'), subunidad

•

+

mon6mero

pollmero

(con n subunldadell

l

dimero

La adici6n posterior puede tener luger sobre este trlmaro, qua enlonces actua como luger de nucleeci6n pare Ie polimerizaci6n. Ellugar de nucleaci6n de la tubulina es mucho mils grande y tiene una estructura mas compleia (posiblemente un anillo de 130 mas moleculas), pero el principio es at mismo. EI ensamblaje dellugar de nucteaci6n es relalivamenle lento, 10 cuel explica la fase inicial lenta (lase lag) producida durante la polimerizaci6n. La fese lenta puede ser reducida 0 eliminada del todo si se ai\aden lugares de nucleaci6n prefebricados, lales como fragmentos de micrOlubulos 0 fifamentos de actina previamente polimerizados. •

CIIIIJ '-11'"

-=oIl]

POLIMERACION EN FUNCION OEL TIEMPO EI ensamblaje de una protelna en un largo pollmero helicoidal, (p. ej., un fitemento del ciloesquelelo 0 un f1agelo bacterianol mueSlren eSla curva dependiente del tiempo: FASE DE eOUILIBflIO

liempo_

La fue inicial lenta lfase lag) as debida a ta barrera cimhica para la nucleacion. La fase de crecimiento se produce mientras los monomeros se ai'laden a los

extremos eKpueslos del pollmero en crecimiento. La fase de equilibrio se conslgue cuendo el crecimiento del pollmero debido a la edici6n de mon6meros eSlii precisamenle en equilibrio con elacortamienlo del polfmero debido a la perdida de monomeros.

EXTREMO MAs Y EXTREMO MENOS Los dos eJctremos de un filemento de actina 0 de un microtubulo polimeriz8n e vefocidades distintas. EI elCtremo de creeimienlo rapido sa llama eKtremo mils, y et de credmiento lento sa llama eKtremo menos. La diferencia de velocidad de credmiento de embos extremos se debe a cambios conformacionales de cada subunldad cuando sa incorpora al pollmero. SUbunidad.

libre

--.

UNTO

RAPlOOI

sobunidad en

el poHmero

Este cambio conformacional afecta a la velocidad a la cuallas subunidades se anaden a los dos eKtremOI. Aunque kon y Ieofl tendran valores distinlOS para el extremo menos del pollmero, la relaci6n kon/k",,-y, por taniO, Ce- debe ser igual en ambos eKtremos, Ello es debido a que cuando se pierde una subunidad en uno de los eJctremos sa rompan eKactamente el mismo numero de interacciones entre subunidades, y el estado final de la

882

I

Pmell6-1 PoUmerizad6n de la actina y la lubullna.

subunidad despues de Ie disociacl6n es identico. Asl pUBS, la toG de la subunidad perdida, que delermina la constante de equilibrio para su asociaci6n al extremo (vease Table 3-3, piigine 1011, es idenlica en ambos eKtremos; sl el eJctremo mils creee cuatro vecos mas nipidamenle que el extremo menos, tambiem debe disociarse cuatro voces mils rilpidamenle. Por lanlo, para ICI ;> Ce ambos eKtremos creeen; para ICI < Ce , ambos eKtremos decrecen.

INTERCAMBIO ROTATORIO ITREADMILUNGI Una consecuencia de Ie hidroli,i, del nucleotido qua Kompana 18 formaci6n de un polimero 8S al cambW de 18 concentraci6n critica en los dos extremos del pollmero. Debido a que IPoff V kTon se refteren a raacciones diferentes, Ie relacion IP""iTon no liene por que ser neeesanamente Ie misma en los dos extremos del poUmero, de forma que: c~

(extrema menDs) > Cc (extrema mlisl

Asumiendo que ambos extremas del pollmero S8 hallan asequibles, Ie polimerizaci6n proceden§ hasle que Ie concentracion del rnon6mero libra supere al valor de Cc para 81 extrema mas, perc este por debaje de Ce para 81 extremo menos. En este eSlado estacionario. las subunidades se ensamblaran 81 extrema mas V S8 desensamblarlin del eletrema menos a velocidades identicas. EI polimero manlendra una longitud constante, aunque uista un flujo neto de subunidades a traves del pollmero que se conoee como intercambio rotatorio (treadmiUing).

HIDR6uSIS DE NUCLE6TIDOS Cada moh~cula de actina transporta una mohlcula de ATP fuertemente un ida, la cual, en cuanto se produce el cambio de conformacion que acompana al ensamblaje de subunidades formando el poUmero, es hidrolizada hasta una molecula de ADP. De manera similar, cada molecula de tubulina transporta una molecule de GTP fuertemente unida, que se conviene en una molecula de GDP cuando la molecula 58 ensambla en el pollmero. - - - - _ ---~--- {T.ATPoGTPI ____ ___ ~ (O.AQf'oGDf>l mon6mero librll

.ubun~ Mill

poIlmero

LalNESTABIUDAD OINAMICA vel INTEACAMBIQ AOTATOAIO son dos comportamientos observados en los pollmeros del citoesqueleto. Ambos procesos estan asociados a la hidrolisis de nucle6tidos trifosfato. Se cree que la inestabilidad dinamica predomina en los microtubulos mientres que el intercambio rotatorio podria predominar en los filamentos de actina

La hidr6lisis del nucleotido unido reduce la afinidad de union de cada subunidad respeclo a la subunidad vecina, haciendola mas Mellmente disociable de cada uno de los extremos del memento lvease Figura 16-33 para elillble mecanismo). Es habilual que la forma se aflada al mamento V que 18 forma 0 se disgregue del filamento. Consideremos solo los acontecimientos del extremo m
o

0 000 000 000

'- If'o.

.'-=-..

CD

Como antes, el pollmero cre<:era hasta que ICI • Ce. Por motivos didlieticos, podemos considerar que If'on V kToff son insignirlcantes, de forma que podemos decir que el crecimienlo del polimero cese cuando

o

,.

C

If'o. .,~

CASQUETES DE ATP Y DE GTP La velocidad de adicion de subunidades a un filamento de actina 0 a un microtubulo en crecimienlO puede ser mas rapida que la velocidad a la cual sa hidroliza al nucleotido que lIevan unido. En estas condiciones, las subllnidades de los extremos del tilamento forman un casquete de subunidades que tienen unido el nucleosido Irilosfato -un casquete de ATP en el filemenlo de actina V un casquele de GTP en el microtUbulo.

Es un estado estaelonario V no un equilibrio va que el ATP 0 el GTP hidrolizados pueden ser reemplazados por una reaccion intercambiadore de nucle6tidos sobre Ie subunidad libre

ro;::-r;::-o-r.::O-=T"'T-=t""J• o 0 0 T

(m _ .).

INESTABIUDAD DINAMICA

casquete de ATP/GTP

los microtubulos se despolimerizan unas 100 veees mas rapidamenle del extremo que conliene lubulina GOP que del que conliene tubulina GTP. Un casquete de GTP favore<:e 01 crecimiento,l>ero si sa pierde, entonces sa produce la despolimerizael6n.

,....,

casquete de GTP

..•

co .--co CO

-"

-... • CAECIMIENTO . . .

• •

CO

ACORTAMIENTO

~

co

Los microtubulos individuales pueden alternar periodos de crecimiento lento V de desensamblClje rapido, fen6meno lIamado inestabilidad dinamica.

883

Figura 16-51 La trampa de ADP en un flIamento de aCIlna. Una lI1ol&ula de actina liene una estructuta que esta reladonada con la de la ubicua enztma hexoquinasa (v~ase Figura 5-2), can dos dominios que forman una bisagra alrededor dellugarde uni6n a1ATP. EI ATP es hidrolizado a ADP inmediatamente despu61 de que la mol~cula se ha incorporado a un filamento de actina. Para que el ADP sea reemplazado por un ATP, la bisagra deberfa abrirse, pero en el filamento de actina los dos dominios de cada molkula de actina estan unidos entre sf por interacciones con las subunidades vecinas, de manera que la bisagra se mantiene cerrada yactua de trampa para el ADP, hasta que el filamento se despolimeriz.a.

teracciones entre aminoacidos de las dos valvas de la aimeja y la zona posterior de la siguieme subunidad en el polimero. Se cree que la hidr6lisis del ATP se desencadena por el cierre de la concha miemras cada moll!cula de actina se incorpora aI filamento, y deja e) ADP alrapado dentro (Figura 16-51).

El comportamiento dimimico de los filamentos de actina requiere la hidr6lisis del ATF En la polimerizaci6n de la aClina, la hidr6lisis del ATP juega un papel parecido aI de la hidr61isis del GTP en la polimerizaci6n de la tubulina, como explicamos en el Panel 16-1 (pags. 882-883). Para formar el nJamento no es necesaria la hidr61isis del ATP: de hecho. debilila los enlaces del poJimero y de esla forma facilila la despolimerizaci6n. Sin embargo. existen diferencias importantes en los comportamiemos del nucle6tido que esla unido a las subunidades de eslOS dos polfmeros. Una diferencia especialmeme interesame es que el recambio ATP-ADP (la SUbSliluci6n del ADP unido por ATP) es relativameme lenta para la actina Iibre (del o~den de minutos). mientras que el recambio GTP-GDP es muy nlpido para la tubulina libre (del orden de segundos); asf pues, cuando las moltkulas de actina son Iiberadas por el desensamblaje de un filamenlo, tardan mucho liempo en poder a volver a ser reutilizadas en el ensamblaje de un filamento. En principio, eSla propiedad de la actina permhe a la celula mantener una elevada concemraci6n cilOs6lica de moltkulas de actina no polimerizadas en rorma ADP-actina; ademas, el mon6mero ADP-actina puede ser estabilizado en la celula mediante su uni6n a Olra protefna. 10 cua! podrfa proporcionar una manera para regular la polimerizaci6n de la aClina. EI erecto que la hidr6lisis del ATP tiene sobre la actina es suti!. y qucdan muchas pregumas sin responder sobre las consecuencias precisas de tiene este proceso para la c~lula. Los l1lamentos de aClina, a diferencia de los rnicroll.'ibulos, no parecen mOSlrar una inestabilidad dimimica dn1stica ill vitro. De hecho, pueden intervenir en un comportamiento dinamico interesante denominado illtercambio roUltorio (treadmilling), que se produce cuando se afiaden continuamente mole· culas de aClina al extrema mas del filamento y se pierden continuamente por el extremo menos, sin que haya un cambio neta de Jongitud en el filamemo (vease Panel 16-1. pags..882-883). EI intercambio rotalorio, a! igual que la ineslabUidad din:lln.ica, es un comportamiemo de no equilibrio que requiere un apone de energfa, el cual proviene de la hidr61isis de ATP que acompana a la polimeriza· ci6n. Se cree que este fen6meno contribuye a! recambio rapido de subunidades de filamentos de actina que se produce en la celula. Es remarcable que tanlo la actina como la tubulina esten implkadas en la hidr6lisis de nude6sidos trifosfato por la misma raz6n basica -para poder. una vez polimerizadas. despolimerizarse facilmeme. Actina y tubulina no estan absolutamente relacionadas en cuanto a su secuencia de aminoacidos: la aClina esta relacionada relalivameme. en cuanto a estnJctura, a la enzima glucolftica hexoquinasa. mientras que la lubulina esta dislantemente relacionada con una gran familia de GTPasas que induye la proteina G helerotrimerica y GTPasas monomericas como la proterna Ras. (Ambos tipos de estructura se discuten con detalle en el Capftulo 5.) La evoluci6n convergente de la capacidad de hidr6lisis 884

Capftulo 16: El c1loesqueleto

I

OESPOUM}RIZACtON

tt

\

POUMER1ZAC16N

( ~

de un nucle6tido en la actina y en la tubulina demuestra 10 importante que resuha la funci6n de los microtubulos y de los fLIamentos de actina: el ensamblaje y desensamblaje dim1.m.icos de estos poUrneros del citoesqueleto en los que la hidr6lisis hace posible que se encuentren en el coraz6n de la organizaci6n citoplasm~tica.

Las funciones de los filamentos de actina son inhibidas por drogas estabilizadoras y desestabilizadoras del polfmero35 Las drogas que estabilizan

0 desestabilizan los nJamentos de actina constituyen herramientas imponantes para investigar el comportamiento din~mico de estos filamentos en las celulas. Las citocalasillas son productos sintetizados par hongas, que impiden la polimerizad6n de la actina ya que se unen al extremo m~s de los filamentos de actina. Las!aloidillas son toxinas aisladas del hongo Amanilao que se unen muy fuertemente a los lados de los filamentos de actina y los estabilizan. impidiendo su despolimerizaci6n. (Un remedio contra el veneno del hongo Amanita es comer una gran cantidad de carne cruda: la elevada cantidad de filamentos de actina del tejido muscular se une a la faloidina y reduce su toxiddad.) Ambas drogas provocan cambios dram~ticos en el ciloesqueleto de acti· na. Anterionnente vimos. aI referimos a los microtubulos. que tanto las drogas desestabilizadoras del polfmero. por ejemplo la colchidna. como las drogas que los estabilizan, por ejemplo el laxol, son t6xicas para las celulas. La mismo sucede con las drogas que afectan la estabilidad de los filamentos de actina, 10 cual indica que la funci6n de los filamentos de actina tambilin depende de un equilibrio dinAmico entre el filamento y el mon6mero de actina. La dtocalasina es de gran utilidad para el estudio del movimiento celular. En particular. el borde frontal de avance de una clilula en movimiento contiene filamentos de actina que continuamente polimerizan y son muy sensibles a la dtocalasina. En la mayorfa de celulas en movimiento la citoca.lasina provoca la retracd6n de este borde fromal de avancc. Sin embargo. si la membrana plasmi1tica de este borde esto1. fuenemente unida aI substrata, la citoca.lasina provoca la retracci6n de los filamentos de actina pero deja la membrana pegada al substrato

FIgun.16-52 Elerectodela c1tocalaslna sobre el borde frontal del cono en credmlento de una ~ula nervlon en cultJvo. Observacl6n de un cono vivo en crecimiento mediante microscopia de contraste interfcrenclaJ de Nomarsky antes (A) y despu~s (8) del tratamiento con cilocalasina. La celula en {BJ ha sido marcada despues con faloidina Iigada a rodamina para revelar los filamenlOS de actina (C). Puede observarse c6mo la regi6n deuas del borde fronlal de avance del conn en crecimiento tralado con c1toc:alasina esui desprovista de filamenlos de actina. La estructura qulmica de la citocalasina B se muestra en (D). (A, B, YC, por cortesla de Paul Forscher.)

(Figura 16-52). La faloidina tambien se utiliza ampliamente, como derivado Duorescenle, para marcar los filamemos de actina de celulas fijadas, y tiene tambien un efecto profunda en las celulas vivas. Si se microinyecta faloidina a un fibroblaslo vivo, por ejemplo, los mon6meros de actina polimerizan formando fJJamentos situados a1 azar en el citoplasma, 10 cual provoca una contracci6n brusca que destruye la celula.

La moIecula de actina se une a pequefias protemas que ayudan a controlar su polimerizaci6n36 En un fibroblasto, aproximadamente el 50% de la actina se encuemra en forma de filamemos, mientras que el 50% restante esU. monomerizada. En una gran FUamentos de actina

885

Figura 16-53 Dos mec::anJsmos poslbles mediante los cuales una proteCna de unl6n al mon6mero de actina puede Inhlblr la pollmerlzacl6n de la actina. Se cree que 13 timosina inhibe la polimcriz.aci6n de la aedna mediante uno de estos dos mecanismos.

la prote(nll sa une y mllntiene la actina en III forme cia unl6n al AOP

lugar de uniOn al filamento de actinll

PUEOE POUMERlZAR

proteiOll cubriendo el tugar de uniOn ala actina

NO PUEOE POUMERlZAR

variedad de lipos celulares la concentraci6n del mon6mero es Ilpicameme de 50-200 micromolar (2-8 mg/m1). Esta concemraci6n es sorprendentemenle elevada dada la baja concentraci6n crftica de actina pura (menDs de I micromOo lar), y reneja la presencia de prolefnas especiales que se unen a la molecula de actina e inhiben su uni6n en los extremos de los filamemos de actina_ La mas abundante de estas prote{nas de uni6n aI mon6mero de actina en muchos lipos celuJares es la limoslna, una pequefla protelna poco corntin, de un peso molecular de aproximadameme SOOO daltons. En las celulas en que ha sido cuidadosamente estudiada (las plaquet'as sangulneas y los neuu6ftJos), se encuentra a una concentraci6n que es suficiente para secuestrar tOOa la actina monomerica. Se desconoce c6mo esta protelna inhibe la poLiIJ.1erizaci6n de la actina: pOOrfa bloquear estericameme la polimerizaci6n cubriendo el lugar donde un mon6mem se une al DUO, 0 podrfa secuestrar el ADP urudo a la actina impidiendo el recambio ADP-ATP, con 10 cualla molecula de actina no podria polimerizar (Figura 16-53). Otra protefna de uni6n al mon6mero de actina es la pronUna, que se encuenua en lodas las celulas y se cree que conLrola la polimerizaci6n de la actina como respuesta a est(mulos exLraceluJares. La proftJina, que en muchas celulas esto1 asociada a la membrana plasmatica, acetera el recambio de ATP por ADP cuando se une a la actina monomerica y se cree que facilita la polimerizaci6n regulada de actina duranle el movimiento cetuJar, aunque esto es lema de controversia. Un mutante de levadura deficiente en profilina tiene un deficit de filameows de actina, to cual apoya el papel de esta motecuta en la eSlimulaci6n de ta polimerizaci6n de ta actina.

Figura 16-54 FlIarnentos de actina en el borde frontal de avance de un Rbroblasto en cultlvo. (A) Eleclronmierograffa del extremo delantero de avance de una celula en cullivo, tralada con un detergente no i6nico para eliminar la membrana I'lasmatica y la mayorfa de las I'rotefnas solubles. N6tese la !rama orientada de los fiJamentos de actina que se presenta en ellamelipodio. en cl que se haUa inerustada la microespina. En (BJ se presenta una visi6n esquema/iea de los ftIamentos de actina de un lame1ipodio. (A, de J.Y. Small,). Cell BioI. 91:695-705, 1981. Reproducido con permiso de copyright de TIle Rockefeller University Press.)

lugarM cle nueleaci6n cle actina unida. a membrana (elClrema. mjs cle los filamenla. de eelinal

elClremo menos de Ia. filllmenla. de eelinll

~ oontlldO ett,.;:ho

lSI

886

Capftulo 16: EI cltoesqueleto

I

con el A1bstr.lo

- substrato

Adem<1s de la timosina y de la proftlina, las celulas disponen de otras muchas protefnas capaces de unirse a los mon6meros de actina, y algllnas de estas protefnas, como el factor despo/imeriUldor de fa aClina (ADF, de Actin-Depolymerizing Factor), illhibe el ensamblaje de los filamentos de actina. Evidentemente las celulas disponen de una gran variedad de mecanismos. cuyos detalJes no comprendemos todavfa, mediante los cuales la celula controla el ensamblaje de los filamentos de actina s610, cuando y d6nde es necesario.

Muchas celulas emilen, desde su borde frontal de avance, microespinas y lamelipodios dimimicos que contienen actina" Las expansiones superficiales dimimicas que contienen filamentos de actina son una caracterfstica comun de las celulas animales, especial mente cllando las cl!lulas estan migrando 0 cambiando de ronna. Las voluminosas cl!lulas vivas de Amoeba proteus, por ejemplo, producen pselld6podos -extensiones COrlas y gruesas del c6r1ex de actina- can los coales se mueven sobre las superficies. En los tejidos de los venebrados, muchas relulas tambil!n son capaces de desplazarse sobre una superficie, especialmente cuando se cultivan. EI borde fromal de avance de un fibroblasto que se arraslra extiende regularmente delgadas protuberancias laminates conocidas como lameUpodios, que poseen una densa red de filamentos de actina. Muchas cl!lulas emiten tambien protrusiones delg:ldas y rfgidas lIamadas mkroespinas. de aproximadamente 0,1 pm de diametTO y entre 5 y to pm de largo y que conuenen un haz laxo de aproximadamente 20 filamentos de actina orientado con su extremos mas hacia el exterior (vl!ase Figura 169). EI extremo en crecimiento (nucleo de crecimiento) de un ax6n nervioso extiende microespinas incluso mas largas, lIamadas jiJopodios. que pueden tener hasta 50 pm de largo. Un lamelipodio puede ser considerado como una versi6n bidimensional de una microespina; de hecho, a menudo este borde de la cl!lula esta delimitado par corlaS microespinas. Cuando una celula en movimiento es fijada y contrastada cuidadosamente para ser examillada aI microscopio electr6nico, se observa c6mo los filamentos de actina de los lamelipodios parecer estar mas organizados que en Otras regiones de la corteza celular. Muchos de los filamentos se proyectan hacia el exterior siguiendo una disposici6n ordenada, con sus extremos Mm<1s~ insertados en el borde frontal de avance de la membrana plasm<1tica (Figura 16-54). Los lamelipodios se comportan como una unidad estructural; si se pierde su adhesi6n al substrato, normalmenle se retraen r:jpidamente hacia atras y se enrollan de nuevo sobre la c61ula como un "rizo" (Figura 16-55).

Figura 16-55 Lamellpodlosy mlcroeslJlnas del borde frontal de

avance de un nbroblasto humano en cuhlvo que esta mJgrando. La necha indica la direcci6n del desplazamiento de la celula. A medida que la celula va avanzando, los lamelipodios y las microespinas pierden su uni6n a Ja placa de Cullivo y se enrollan sobre la superficie dorsal-un mo\li.mienlo conocido como rizado (ruffling). (Por conesfa de Julian Hearn.)

Filamentos de actina

887

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101

Tanto los lamelipodios como las microespinas son estructuras m6viles que pueden formarse y retraerse a una gran velocidad. Tal como discutiremos mas adelante, se cree que estas microespinas y lamelipodios SOil generados por 1a polimerizaci6n de la actina local en la membrana plasmatica y que eSla actina puede rl1pidamente empujar 1a membrana plasmatica hacia adelante sin rasgarla.

El borde frontal de avance de las celulas m6viles nuclea la polimerizaci6n de la actina38 Cuando se estudia el comportamiemo de los filamentos de actina en el borde frontal de avance, marcando una pequefia parte de la actina y siguiencto su movimiento, puede verse c6mo 1a actina se mueve continuamente de regreso hacia el cuerpo celular a una velocidad de aproximadamente I J.lm/minuto, 10 que sugiere que esta actina esta continua mente polimerizando cerca del borde frontal de avance y continuamente despolimerizandose en lugares mas internos (Figura 16·56). Se cree que este comportamiento altamente dinamico de los filamentos de actina en el borde frontal de avance es crucial para procesos tales como la 10comoci6n celular y la quimiotaxis. La impresi6n general es que el borde frontal de avance se impulsa a sf mismo hacia delante empujando los filamentos de ac· tina hacia atras. Parece que el borde frontal de avance de una celula organiza los filamentos de actina al igual que un centrosoma organiza los microtl1bulos, pero con una diferencia crucial: no nuclea unicamente el crecimiento de nuevos filamentos sino que tambien parece ser el lugar en que los mon6meros se van anadiendo, permitiendo el alargamiento de los filamenlos. Esta funci6n puede demostrarse si lisamos Iigeramente un fibroblasto y entonces ai\adimos mon6meros de actio na unidos a rodamina, los cuales se ha visto que polimerizan preferentemente en ellimite del borde frontal de avance (Figura 16·57). Ademas, si se marcan los

888

Capitulo J 6: EI citoesqueleto

Figura 16·56 Dlnamica de un filamento de actina en ellamellpodlo de un Dbroblasto en cultivo. Las mol~culas de actina marcadas con el coloranle fluorescente rodamina fueron microinyectadas en una c~lu1a, donde fueron incorporadas a los filamentos de actina. Utilizando un rayo !liser se produce una pequena mancha (por eliminaci6n del marcaje Iluorescenle) sobre los mamenlos de actina en el extrema anterior de la celuta. Enlonces la c~lula se fotograffa a intervalos de tiempo utilizando un microscopio Iluorescente equipado con un intensificador de imagenes. EI rapido movimiento hacia atras de la mancha sugiere que las moJecuias de actina poHmerizan continuamente en el extremo del borde frontal de avance y se despolimerizan en su base. (Par cortesfa de Y.L. Wang.) Figura 16·57 £1 extremo del borde frontal de avance nudea fIIamenlos de actina. Fibroblaslos en cultivo se permeabilizaron ligeramente con un detergenle no i6nico y entonces se incubaron con moleculas de actina marcadas con rodamina (rojo). Al cabo de 5 minutos se fijaron las c~lulas y se marcaron can faloidina marcada con Iluorescefna (verde). (A) Todos los mamenlos de actina, la mayorfa de ellos formados antes de la lisis, se marcan en verde. (B) La localizaci6n de los ftIamentos de actina nuevamente formados (rojo) polimerizados a partir de la actina marcada con rodamina ai\adida pennite observar que el borde fronlal de avance es ellugar predominate de nucleaci6n de ftIamentos de actina en 1a c~lu1a. (De M.H. Symons yT.J. Mitchison,j. cell Bioi. 114:503·513, 1991, reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

polimerizaci6n de Ia actin. lin eI borde

modelo del inllllcambio rolatorio

..

lronl~'~'de:';'~'~::rr.ifT,.,..,

largos filamentos dll actina $e d~pollmeliz.n en III pane lIaser. dellamelipodio

•

los filamento' de aClina 511 nuclean en

el borde Iront81 de avence

modelo de liberllCi6n de III nucleaclOn

•

III

Figura 16-58 Dos modelos que podrfan expUc::ar el OuJo retnSgrado de actina en un lameUpodlo. Las fl«1uu azules indican la direcci6n del movimiemo de la aHula. Aunque aqui se muestran las diferencias entre los dos modelos, ambos procesos pueden darse simult!neamenle en la c~lula. (Adaptado de JA Theriot yT.I. Milchison, Nafllre352:126·131, 1991 . Rcproducldo can el permiso de Nature. e 1991 Macmillan Magazines Ltd.)

Ia red de filemenlos de actina liberados en borde Iron... de Bvllnee SIll des.pl.~ h«1a Ia pane poslefio1' del IamehpodlO

ftIamentos de actina para pader observar su polaridad, se encuentra que en cada nJamento de actina, el extrema mlts de n1pido crecimienlo se encuentra unida a la membrana en el borde frontal de avance. Hay aun Jnuchas cuestiones sin respuesta acerca del mecanismo mediante el eual el borde frontal de avance nudea la polimerizaci6n de los filamcntos de actina. lEI borde frontal de avance se une aI extrema mas del filameolo que tlUclea, 0 nuclea lIll nuevo filamento y nipidamente se Iibera de cl? A causa del movimiento reu6grado de la actina (vease Figura 16-56), algtill modelo postula que, para que el borde frontal de avance se agarre a los extremos de los fLIamento de actina se necesitarfa que los fLIamentos dellamelipodio estuvieran en continuo intercambio rotatorio mediante la inserci6n de mon6meros de actina en los lugares donde los filamentos estAn unidos a la membrana. En un modele a1ternativa, los filamenlos de actina individuales serfan Iiberados en cuanlo se formamn y se desplazarian alejAndose de la membrana (seguramente como una red de puentes cruzados) (Figura 16-58). EI rapido ensamblaje de los filamentos de actina en cl borde frontal de avance de una celula en movimiento implica la liberaci6n de los mon6meros de actina de las protefnas de uni6n al mon6mero, que normnhnente impiden In polimcrizaci6n de los filamcntos de actina. Discutiremos mas adelante c6mo las sei'iales del ambiente celular extcrno pueden regular esta liberaci6n y permitir la polimerizaci6n de los mon6meros de actina en el extremo del borde fronlal de avance.

AJgunas bacterias pat6genas utilizan la actina para moverse dentro y entre las c~lu1as39 Listeria mOllocytogenes, una bacteria que provoca una fonna aguda de envenenamiento a1imentario, ha proporcionado datos inesperados acerca delmecan..ismo mediante el cualla celula controla la polimerizaci6n local de la actina. Esta bacteria pat6gena penetra por fagocitosis en la celula; entonces secreta enzimas que rompen la membrana del fagosoma y se Iibera en el citosol de la c6111la hllcsped. Una vez en el citosol, no sola mente crece y se divide, sino que se desplaza hacia las ccJulas adyacentcs movilizando el sistema de motilidad basado en los filamentos de actina de la celula huesped. Mediante la nucleaci6n de los filamentos de actina en una regi6n de su superficie, una bacteria individual se desplaza por el citosol a una velocidad de 10 pm por minuto 0 mas, dejando lras ella una cola de filamentos de actina. Cliando oolisiona can la membrana plasmatica de la celula huesped, se desplaza hacia el exterior induciendo la fonnaFilamenlOS de actina

889

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ci6n de una larga y fina microespina, en cuyo extrema se situa la bacteria. A me· nuda esta proyecci6n es engullida por una celula vecina, con 10 cualla bacteria

puede cntrar en su citoplasma sin exponerse al ambienle eXlracelular dande podrfa ser reconocida por anlicuerpos producidos por el organismo huesped (Figura 16-59). Este lipo de movimie!HQ sugiere que la bacteria puede estar usanda la actina para impulsarsc, de 1a misma forma en que la membrana plasmatica de una celula eucariota la miliza para impulsarse durante la formaci6n de una microespina normal 0 un lamelipodio. Si marcamos con fluorescencia los filamentos de actina de la cola que deja atras la bacteria Listeria cuando migra par el citosol y los observamos con el microscopio de fluorescencia, podremos observar que son estacionarios. Los filamentos se forman en la parte trasera de la bacteria y se quedan atras como la cola de un cohew mientras la bacteria avanza, despolimerizandose de nuevo at cabo de aproximadamente un minuto 0 en cuanro encuenrran factores despolimerizantes en el citosol. EI ensamblaje se induce par una protefna cspecffica de la superficie de la bacteria que actua indirectamente secuestrando las protefnas de la celuJa huesped, incluida la profilina. Si el movimiento inducido por la bacteria pudiera ser reproducido en un extracto libre de celulas concentrado, se podrfan conocer los detalles del mecanismo a partir de estudios bioqufmicos. Estos detalles ayudarfan a comprender c6mo se producen la nucleaci6n de la actina y la polimerizaci6n en las microespinas y lamelipodios de una celula normal, no infectada, y c6mo estos procesos capacitan a la celula para avanzar.

La polimerizaci6n de la actina en el c6rtex celular esta controlada por receptores de la superficie celularo La producci6n de movimiento es poco uti! a menos que este de acuerdo directa y adecuadamente con el ambiente. Como hemos discutido anteriormente, la red

890

Capftulo 16: EI citoesqueleto

L---' lOlJm

Figura 16-59 Movimlento basado en la actina de una bacteria dentro y entre celulas de mamffero. (AJ La bacteria Listeria mOflocytogenes viaja de una celula a otra induciendo el ensarnblaje de filarnentos de lIctina en cl dtosol de la c~lula hu~sped. (B) Micrografia de fluorescencia de la bacteria desplazandose en el interior de una c~lula que ha sido marcada para poder observar tanto a la bacteria como a los filamentos de actina. N6tese la cola, parecida a un cornela, de los n1amentos de actina (lierde) detras de cada bacteria en movimiento (raja). Las rcgiones en las que arnbas fluorescencias se superponen, se observan en amarillo. (B, par corlesfa de Tim Milchison y JulieTheriot.)

cortical dimtmica de filamentos de actina se ordena de nuevo n1pidamente como respuesta a sefiales que vienen del exterior de la celula y que inciden sobre la membrana plasmatica. Por 10 tanto, el citoesquelelo de actina puede ser considerado como una parte de los sistemas de transducci6n de sefiales celular, dis· cutidos en el Capftulo 15: cuando se afladen determinados factores de crecimien to al medio de cultivo de celulas quiescentes, por ejemplo, inmediatamente se forman lamelipodios que contienen actina y se mueven sobre la superficie celular. La respuesla del c6rtex de actina a las seiiales externas que Uevan informaci6n espacial puede ser altamente locaHzada. Anteriormente consideramos un ejemplo wando discutimos la polarizaci6n de una celula T citot6xica inducida por el contacto con su celula diana, a la que seguidamente matara (vease Figura 16-11). En las celulas animales capacitadas para la quimiotaxis tambien se produce una polarizaci6n del c6rtex de actina inducida par una seiial, que se define como un movimiento en una direcci6n controlado par un gradiente de una substancia qufmica difusible al que la celula es sensible. Un ejemplo muy bien estudiado es el movimiento quimiotactico de ciertas celulas de la serie blanca (neutr6jifos) hacia la fuente de infecci6n bacteriana. Los neutr6filos lienen protefnas receptoras en su superficie que les permiten detectar muy bajas concentraciones de peptidos N-formilados derivados de protefnas bacterianas (s610 los procariotas empiezan la sfntesis proteka con una N-formil-metioninal. Los neutr6fi1os pueden ser guiados hacia sus dianas con s610 una diferencia de concentraci6n de un 1% de estos peptidos difundibles, entre un lado de la celuJa y el otro. Otro ejemplo de quimiotaxis es el proporcionado por el moho del cieno, Dictyostelium discoideum. Estos eucariotas viven en el suelo de los bosques como celulas m6viles indepcndientcs Jlamadas amoebae (amebas). Se alirnentan de bacterias y de levaduras y, en condiciones 6ptimas, se dividen cada pocas horas. Cuando su suministro alimentario se agOla, la ameba interrumpe su divisi6n y se agrupa formando estrucluras minuscuJas (1-2 mm), plurkelulares, parecidas a gusanos, que se arrastran como babosas y dejan rastros de cieno detras de elias (Figura 16-60). Mientras la babosa migra, las celulas comienzan a diferenciarse e inician un proceso que finaliza con la producci6n de una estructura muy pequefla parecida a una plant a que consiste en un tallo y un werpo fmctifero unas 30 horas despues de haberse iniciado la agregaci6n (Figura 16-61). El cuerpo fructi"fero contiene un numero muy grande de esporas, que pueden sobrevivir largos perfodos de liempo en condiciones ambientales exlremadamente hostiles. 5610 cuando las condiciones son favorables, las esporas germinan y producen las amebas Iibres que empiezan el cicio de nuevo. Las amebas Dictyostelium se agregan mediante quimiotaxis migrando hacia una fuente de AMP delko, secretada por las amebas hambrientas. AI igual que los neutr6fi1os, las amebas reorientan su borde frontal de avance para migrar hacia el gradiente quimioatrayente superficial. Y cuando se exponen a una fuente local de AMP dclico que sale de una micropipela, las amebas extienden apcndices que contienen actina, directamente hacia la pipeta (Figura 16-62). Este experimento demuestra que la quimiotaxis eucariota implica la detecci6n directamente de un gradiente espacial de una cOllcentraci6n de atrayente, a diferencia de la quimiOlaxis bacteriana, que utiliza una variaci6n de la concemraci6n dependiente del tiempo para delectar los gradienles, como discutimos en el Capftulo IS. La reacci6n del citoesqueleto de Dictyostelium al AMP cfclico puede examinarse mediante lisados de estas celulas poco despues de su estimulaci6n con una soluci6n rica en AMP cfclico. Como se muestra en la Figura 16-63, a los 5-10 segundos de afiadir el AMP cfclico se produce una estallido dramatico de polimerizaci6n de aClina, que corresponde al tiempo necesario para la extensi6n de la celula en el substrato. Entre los 20 y 40 segl.lndos despues del pulso de AMP d· elico, la actina se despolimeriza y la celula se redondea. Entonces se produce un estallido de polimerizaci6n de actina mas prolongado, en forma de un reclutarniento en el citoesqueleto de protefnas de I.Ini6n a la actina a partir de acervos Filamentos de actina

Figura 16-60 Mlcrograffa 6ptlca de una babosa del moho del chmo DiclyOstelium dlscoideum mlgrando. (Por cortesfa de David Francis.)

Figura 16-61 Mlcrogra!Ca 6ptlca del cuerpo fructffero de Dictyostelium discoldeu",. (Por cortes(a de John

Bonner.) 891

solubles; durante esle ultimo per{odo las celuJas Que responden al AMP cfclico empiezan a formar lamelipodios y otras expansiones ricas en actina.

Figura !E)-52 RespUe1lla qulmlol4cllca de la ameba Dlctyosteli"", discoideum. La ameba tiene receptores para el AMP ddico en su membrana plasmatica, que la capacitan para arrastrarse hacia una fuente extracelular de AMP ddico. En este experimento se libera AMP dclico desde la punta de una micropipeta, que puede verse en la pane inferior de las micrografias: la respuesta que se muestra se produce en menQS de un minuto. (Por conesia de Gunther Gerisch.)

Protefnas G heterotrimericas y pequeiias GTPasas transmiten sefiales desde Ja superficie celuJar aJ c6rtex de actina 41 iDe que forma la uni6n del AMP cfclico a su receptor desencadena la polimerizuci6n masiva de actina en la ameba de Dicryostelill/lI? Se sabe que el receptor

act iva una protefna G heterotrimcrica. EI citoplasma contiene una reserva de mon6meros de actina, los cuales, tal y como vimos anteriormente, estan estabilizados media.llle prmefnas de uni6n al mon6mero de aClina. La estimulaci6n de la polimerizaci6n de la aClina supone Que eSlaS moh~culas de actina lienen Que eslar disponibles para polimerizar y tambien sera necesario superar la barrera cinctiea para la nucleaci6n. La protefna de uni6n aI mon6mero de actina, profilina. se llne estrechamente a los fosfolfpidos de inositol de la membrana plasmatiea, que generan senales intracelulares como respuesta a ligandos extracelulares (vease Figura 15-30). De acuerdo con una hip6tesis, la activaci6n de esta via de seftal (que se produce a traves de una protefna G heterotrimerica) podria liberar la profilina de la membrana plasmarica y dejarla libre en el citosol. La profilina puede calalizar el recambio ATP-ADP de la aecina in vitro, asf Que cuando es Iiberada desde la membrana plasmatica puedc, rapidamente, convertir la actina inactiva un ida a ADP en actina aCliva unida a ATP, induciendo la formaci6n local de fLIamentos de actina. Las protefnas G lambicn estan implieadas en los procesos de senalizaci6n que act ivan el c6rtex de actina durante la respuesta quimiot<1ctica de los neutr6-

FIgura 16-63 Ek'ClodelAMPdclico sobrc el c6rttlX de Dctina de la ameba DietyosteUilm tliscoldeum. La grMica (linea verde) muestra las canlidade1l relalivas de actina filamentosa asociada con el ciloesqueleto a distintos tiempos de la adici6n repentina de AMP cfclioo.

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892

Caprtulo 16: EI cilocsquclcto

30

60 90 tiempo de .dlciOn de cAMP (segl

mos y en la activaci6n de las plaquems sangufneas. Disponemos de datos evidentes de que dos peqllenas GTPasas relacionadas con la protefna Ras conocidas como Rho y Rae, intervienen en este proceso; se ha vista que estas protcfnas tienen diversos efectos sobre el citaesqueleto de actina en los fibroblastos. La microinyecci6n de la protefna Rac en celuJas en cultivo provoca, al cabo de 5 minutos, un incremento dranl
Los mecanismos de polarizaci6n celular pueden sec analizados en las c~luJas de levadura42 Se han oblcnido indicacioncs adicionales sabre c6mo las celulas pueden orientar las actividadcs de su citocsquelelo, a panir del esludio del componamiento de las celulas dc levadura. La facilidad de realizar un amilisis genetico en las Ievaduras ha proporcionado una fuenle imponante de informaci6n fundamental acerca de los mecanismos biol6gicos comuncs a todas las celulas eucariotas. Concretamenle, eSludios acerca de las imeracciones entre levaduras durante el apareamienlo han iniciado la idemificaci6n de mecanismos medianle los cuales las celulas eucariotas se convierten en estruclUras polarizadas. En la levadura de gemaci6n StlccllQromyces cerelJisiae. celuJas con dos tipos de apareamiento dislinlos, a y a, secretan hormonas conocidas como faclor a y factor a. respectivamente. ESlas hormonas actuan a Iraves de su uni6n a receplores de la superficie celuJar que pertenecen a la gran familia de receptores relacionados con proterna G, discutidos en el Capftulo 15. Una consecuencia de la uni6n del factor a a su receptor en una celula a es la conversi6n de la celula en una c~llIla polarizada que adopta una forma conocida como "shmoo" (Figura 16-64). Si exisle un gradiellle de factor n, el extremo de "shmoo" se dirige hacia la zona donde se cncuentra la concenlraci6n m1\s elevada de eSla molecula. Durallle est a polarizaci6n la levadura sufre reorganizacioncs del citoesqucleto que son paralclas a las que aparecen en las cclulas ani males cuando se convicrten en polarizadas. Los filamentos de aClina se congregan en la punta del borde "shmoo", desde dondc se cree que dirigen la secreci6n local de componentes de la pared celular -dirigicndo posiblemente el transporle de vesfculas porladoras de eSlos componentes hacia el borde de ~shmoo". AI mismo Iiempo, el centro organi7.ador de micrOlubulos [en este caso, e! corpllsculo pofardel 1111.50 (spindle pole body)], veasc Figura 17-24) se desplaza hacia ellado del nucleo que estl1 muy relacionado con el borde de "shmoo", y los microtubulos se extienden

Fllamenlos de actina

Flgunll6-64 Polarizacl6n morfol6glca de las celulas de levadura. Nonnalmente las celulas de SacclJaromJces cereuisiae son esfericas (Al, pero pueden convertirse en polarizadas cuando se tratan can un factor de apareamiento (B). Las celulas polarizadas se Uaman ·shmoos·, debido al famasa personaje de c6mic de AI Capp (C). (A YB, cor1esfa de Michael Snyder; C. C 1948Capp Enterprises, Inc., reservados todos los derechos.) 893

desde allf hacia el borde de la celula. Mediante la observaci6n de celulas mutantes que no forman shmoo durante el apareamiento, se han identificado muchos de los genes implicados en la polarizaci6n de las levaduras. Parece que a1gunas de las prote{nas que codifican estes genes estarfan impl..icadas en la polarizaci6n en las celulas animales.

Resumen La actilUl es UIUI protelna tkl ci'oesqueleto altamente oonservada qlle se enClUntra

oonanmu:iona elevadas en casi todo.s las cilulas eutxlriotas. La actina purlJ1eada se encuentra en forma th mOMmero en soludonn th bala fuen:a iOnica y al aiindir una sal que oontenga ATP se ensambla espontdneamente formando J1lamentor tk actina. Al /gual qlU! la tubulina, la polimerlzati6n tk la actina es un pnr ceso dJlUimko que u encuentra regulado por la hidrdlisis ih un nucle6tido al que au1a molkula esuf estr«hmnente unida (elATP en este casol. En las cilulas, apnr .dnuulamente la mUad th la actina se encuentra enforma monom/rica gracitu a su unldn II ihterminadtu prote{ruu ih balo peso mol«ular como la timor/na. En el c6rtu ih 1m cilulas animales, las molkulas de actina polimerlzan 1 despolimerlII

zan continuamente generando protrusiones en la superjicie ulular tales como los lamelipodios 1 las mU:r'oespinas. La palimeriz,aci6n puede ser regula.da par una1es utracelulans que u unen a reuptons th la superficie ulular 1 que actllan II travis tk prote{mu G heterotrlmiricas1ih pequeiias GTPasas oomo Rac 1 Rho.

Proteinas de uni6n a la actina" La actina esui implicada en un abanico notablemente amplio de estructuras, desde extensiones rfgidas y relalivamente permanentes de la superficie celular hasta redes tridimensionales dinamicas en el borde frontal de avance de una ceIula que esta migrando. En cada celula viva coexisten estructuras muy distintas, basadas en la actina. En cada caso la estructura fundamental del fLIamenlo de actina es la misma. Lo que varia es la longitud de estos filamentos, su estabilidad y el numero y la geometrfa de sus uniones (tanto las uniones de unos filamentos con otros como las uniones con otros componentes celulares). Esms propiedades dependcn, a su vez, de una gran grupo de protemas de unl6n a la actina, que se unen a la actina y modulan sus propiedades y sus funciones. En eslc apartado describimos algunas de las protefnas de uni6n a la actina m
Un citoesqueleto unido de manera sencilla a la membrana proporciona soporte mecamco a la membrana pJasmatica de los eritrocitos44 Como se expLic6 en el Cap{tulo 10, las proleinas espectrlna y anquirlna fueron descubiertas como componentes importantes del citoesqueleto que se haUa asociado a la membrana de los gl6bulos rojos sanguineos (erilrocitos). Estas celulas excepcionales han perdido el micleo y los companimentos membranosos iOlernos de taJ manera que 1a unica membrana de la celula es la membrana plasmtitica. Esta membrana est:t soslenida por una red bidimensional de tetrnmeros de espectrina conect'ados par sus extremos por filamentos muy cortos de actina. La espectcina est:t un ida a la cola citoplasmatica de una protefna tcansportadora transmembrana muy abundante (banda 3) a traves de puentes de anquirina (vea· se Figura 10·26). En la superficie de muchas celulas de venebrados se encuen894

Capftulo 16: EI cltoesqueleto

tran parienlcs muy pr6ximos de la espenrina (tam bien lIamada lodrina) y de la anquirina. Asf, la disposici6n detallada de las protefnas cn la cortcza del eritroci10 tambien proporciona un modelo simplificado de la red del citoesquelcto basado en actina que sostienc la membrana plasmatica en todas las demas celulas an..imalcs. Los filamcntos de actina en el c6rtex del eritrocito son muy conos, y tan 5610 acruan como elcmentos de entrecruzamiento entre los tetrameros de espectrina. AI contrario, en el c6rtex de una c~lula mas tfpica, son mucho mas largos y asf se proyectan hacia el citoplasma, donde forman la base de una red tridimensional de filamentos de actina. No esta nada claro si las mol~culas parecidas a la anquirina servirfan de anclaje a la membrana plasmalica para esta disposici6n cortical mas lfpica, aunque se cree que en aJgunas c~luJas epiteJiaies la ATPasa de Na'-Ko transmembrana (discutida en el Capitulo II) unirfa csta red cortical de actina a la membrana plasmatica a uaves de este tipo de protefnas. Generalmente la red cortical de fLIamentos de actina determina la forma y las propiedades mednicas de la membrana plasmatica. Muchos tipos de uniones n membrana necesitan de los filamentos de actina para lIevar a cabo sus diversas fundones en el c6rtex; el acoplamiento a proteinas transmembrana a trav~s de In anquirina es linicamente uno de eUos. Existen otros tipos de uniones mas dimimicas, pero tan 5610 empiezan a ser ca.raeterizadas las protefnas que los median.

Protemas de entreeruzamiento con diferentes propiedades organizan ensamblajes particulares de actinao En las c~lulas animales los fLIamentos de actina corticales estan organizados en tres tipos generales de disposiciones (Figura 16-65). En haas parale/os, tal como se eneuentran en las microespinas y en los filopodios: los fLIamentos estan orientndos con la misma polaridad y estan espaciados muy regularmente (separados 10-20 nm). En haces conlrdcti/es, encontrados en las fibras de estres y en el anillo contractil que divide la celula en dos durante la mitosis: los filamentos se cncuentran orientados con polaridades opuestas, mucho mas espadados (separados 30-60 nm) y presentan la prote{na motora miosina-II (se discute mas adelante). En las rtules parecidas a geles del c6rtex celular: los filamcntos esta.n dispuestos de forma relativamente mas relajada, en disposiciones abicrtas con interconexioncs orlogonales. lC6mo se generan Yse manticncn cstas diferentes disposicioncs del mismo filamento de actina en una misma celula? Aunque no

Figura 16·65 Trestlposde dlsposlclones cortlcales de los flIamentos de actlna. Se muestra una celula arrastrtindose, con tees areas ampliadas para evidcnciar la disposici6n de los filamentos de actina dibujados a escala. Las puntas de Ilecha apuntan hacia el extremo m4s de los (iJamentos.

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conozcamos lotalmenle la respuesta, las prote{nas de enrrecruzamietlto de losfi· lametltos deacri"a tienen c1aramente una gran importancia. Las protefnas de enlrecruzamiento pueden dividirse en dos c1ases -proref· "as que forman haces y prorefnas que forman geles- de acuerdo con su efeclo ;n vitro sabre los filamentos de actina puros. Las prol'einas que forman haces en· lrecruzan los filamentos de actina en disposiciones paralelas y san imponantes en la formaci6n tanto de las fntimas disposiciones paralelas como de los haces contrcktiles mas espaciados descrilos anleriormente. AI contrario, las prolefnas que fomlan geles enlrecruzan los filamentos de actina en intersecciones en dia· gonal, creando los geles laxos. LafimbriIJQ y la a·acrin;t1Q son prolefnas fonnadoras de haces ampliamente distribuidas. La nmbrlna se encuentra en los haces de filamentos paralelos del borde frontal de las celuJas, particularmente en las microespinas y en los filopo· dios, y se cree que es la responsable de la asociaci6n intima de [as filamentos de aClina en estas disposiciones. La segunda prOlefna formadora de haces, la a-ac· tinina, se concenlra en las fibras de estrcs, donde se cree que es la responsable, en parte, de los entrecruzamienlos relajados de los filamentos de actina en estos haces contr<1ctiles; tambicn interviene en el anclaje de los extremos de las libras de est'rcs en los contactosfocales. Tal y como explicaremos mas adelante, la mio· sina es la protcfna mot ora en las I1bras de cst res y en at'ras disposiciones con· tractiles y es la responsable de su conlraClibilidad. Parccc que el fntima em pol· quelamiento de los fil3menlas de actina causado por 13 fimbrina cxcluye a In miosina, mientras que el empaquetamiento relajado provocado por la o:·actini· na permitirfa la entrada dc las moleculas de miosina; de todas formas, cl diferente espaciamiento provoca que cada lIna de las dos proteinas formadoras de haces excluya a la atra (Figura 16·66). La mamlna es una proteina formadora de geles ampliamente distribuida. Aunque no se encuentra ni en las fibras de estres ni en el borde delantero, se en· cuenua enriquecida en el c6rtex. La filamina es un homodfmero que permilc la formaci6n de redes laxas y a1tamente viscosas aI unir dos filamentos de actina y entrecruzarlos uno can otro (Figura 16-67). Es una proleina abundante en mu·

Figura 16·67 La mamlna entrecruza los mamentos de actina formando una red tridimensional con las propledades ffslcas de un gel. Cada homodfmero de filamina tiene cerca de 160 nrn de longitud cuando esta IOlaimente extendido y (onna una uni6n Uexible con un angulo elevado entre dos liIamento, de actina adyacentes. La filamina puede consuluir un I'lL de la prolelna 10tai de la cBula. Hay una molecula de filamina por cada 50 mon6meros de actina.

896

CapCluJo 16: EI cltoesqueleto

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Figura 16-66 La fonnacl6n de dos lipos de haces de marnentos de actina. (AI La a-aetinina, que es un homodfmero, entrecruza los liIamentos de aClina en haees laxos. que penniten a la proleina motom miosina-II (no se muestra) panicipar en el ensamblaje. La fimbrina entrecruza los liIamenlos de actina en haees apretados, que excluyen a eSla protefna. La fimbrina y la a·aclinina tienden a excluirse la una a la olra a causa del espaciado de los diCerenles haces de filamenlos de actina que forman. (B) E1ectronmicrogmffa de l1lol&:ulas de a·actinina purificadas. (B. por eortesfa de John Heuser.)

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Las protefnas de uni6n a la actina con propiedades diferentes estan construidas a partir de m6dulos semejantes45 La fimbrina, la a-actinina, la filamina y la espectrina preseOlan todas ellas dos dominios de uni6n al filameOlo de actina, con 10 cual no es de extraftar que cada una necesite entrecruzar dos filamentos. Sorprendenremente, la estmctUTa de los dominios de uni6n a la actina de estas protefnas es parecida. En estas cuatro protefnas, la longitud y la flexibilidad de las secuencias espaciadoras que separan los dos lugares de uni6n a la actina son distintas, y cstas diferencias determinan las propiedades diferenciales de los cuatro entrecruzamientos. Evidentemente, estas protefnas han derivado a partir de una protefna de uni6n a la actina ancestral comun mediante la adici6n de secuencias espaciadoras distintas (Figura 16-68).

La gelsolina, cuando se activa por Ca2+ I fragmenta

los filamentos de actina 46 Cuando se cali en tan a 37°C en presencia de ATP extractos preparados a partir de alguno de entre muchos tipos celulares, forman un gel. Aunque esta gelificacion depende tanto de los filament os de actina como de una prote(na de entrecruzamiento como la filamina, el gel presenta un comportamiento mas complejo que las mezclas simples de filament as de actina y de filamina. Por ejemplo, si se incrementa la concemraci6n de Ca 2 • por encima de 10-7 M, el gel semis6lido de actina empieza a \icuar -proceso conocido como sofaciOn. AI microscopio se puede observar que algunas regiones del gel solante presentan vigorosas corrientes locales. Asf pues, es evidente que, ademas de la actina y de la filamina, en el extracto celular han de existir otros componentes responsables de este comportamienlo. Es probable que estos componentes esten implicados en las corrientes citopfasnuiticas observadas en algunas celulas grandes, en las que se requieren vigorosos movimientos de flujo para mantener una distribuci6n delerminada de metabolitos y de otTOS componentes citoplasmaticos. AI parecer estos movimientos estan asociados a un cambio local repentino del citoplasma desde una consistencia gelificada a un eslado mas fluido. A partir de extractos se han aislado algl.lnas proteinas celulares que cuando se afiaden a lin gel de filamentos de actina y mamina provocan que, en presencia de Ca 2 ', el gel cambie a un estado mas fluido. La mejor caracterizada de estas prateinas es la gelsollna, que, cuando se activa por la unj6n a1 Ca 2., separa los filamentos de actina y forma un casquete en el extrema mas del filamento que ahara esta asequible, deshaciendo asi la red entrecruzada de filamentos de actina. En la corteza de muchos tipos de celulas de los vertebrados se han encontrado proteinas similares a esta; estas prote(nas fragmentadoras se activan por concentradones de Ca2• (aproximadameme 10-6 M) que se alcanzan s610 temporalmente en el dtosol. Protefnas de unl6n a la actina

Figura 16-68 Estmcturas moduJares de cuatro prote(nas de unl6n a la actina. Cada una de las protefnas mostrada dene dos lugares de uni6n a la actina (en raja) que est~n relacionados entre sf en cuanto a su secuencia. La fimbrina tiene dos lugares de uni6n a la actina, adyacentes, de forma que une sus dos filamentos de actina muy juntos (14 nm de separaci6n), alineados con la misma polaridad (vease Figura 16·66). Los dos ll.lgares de uni6n a la actina de la moltkl.lla de n·actinina estan m~s separados, conectados por un espaciador flexible de 30 nm de longitud, con 10 cual forman haces de l1Iamentos de actina con una mayor separaci6n entre los filamentos (40 nm de separaci6n). La filamina tienc dos lugares de uni6n a la actina que est~n muy scparados, con una uni6n en forma de Ventre ellos, y asf entrecruza filamentos de actina formando una red con los filamentos orientados casi en ~ngulo recto el uno respecto aI otTO (vease Figura 16-67). La espectrina es un letr~meTO de dos subunidades 0: y dos subUllidades ll, y el tetramero tiene dos lugares de uni6n a la actina separados unos 200 nm. Las regiones espaciadoras de estas protefnas se construyen de mallera modular a partir de unidades de repetici6n que incluyen zonas en helice n (verde claro), zonas de lamina II (verde oscuro), y dominios de uni6n al Cal' (ovalos azules).

897

Una de las funciones que se postula para esras protefnas fragmentadoras es la de ayudar a la relajaci6n 0 licuaci6n local del c6rtex celular. permiriendo que se produzcan procesos de fusi6n de membrana. Por ejemplo, cuando una celula fagochica sanguinea engulle a un microorganismo, el fagosoma que se forma esr~ inicialmente cubierto, par ellado citoplasmatico. por una gruesa red de 61amentos de actina originados a partir del c6rtex.. Para que este fagosoma pueda fusionarse can los lisosomas, estos flIamentos de actina han de despolimerizarse para permitir el contacto intimo entre las membranas del fagosoma y la dellisosoma. Esta desaparici6n de la actina puede prevenirse reduciendo artificialmenre la conccntraci6n del ion Caz', a traves de la acci6n de la gelsolina (0 de una prorefna similar). Se cree que la gelsolina rambien es necesaria para que la celula se arrasrre a 10 largo de un subsuaro. aunque se desconoce su papel exacto en esre proceso. Una mezcla de filamenros de actina purificada, filamina, y gelsolina es capaz de experimentar transiciones de gel a sol dependientes de Caz" pero no puede contraerse ni presentar los movimienlos de f1ujo que presentan los geles crudos ricos en actina obtenidos a partir de la celula. Estas actividades requieren la presencia dc olro tipo de protcfna dc uni6n a la actina -In prolcfna mOlora miosinn. Si la miosina se elimina selectivamcme de los gcles crudos ricos en actina, desaparecen compleramente las contracciones y las corrientcs, 10 cual sugiere que In fuerza que provoca las corrientes citoplasmaticas esta generada por una interacci6n entre la actina y la miosina.

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En las celulas eucariotas se han encontrado multiples lipos de miosina47 La cinematograffa a intervalos de tiempo revela que el c6rtex de las ~Iulas est
Capitulo 16: EI cltoesquelcto

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Figura 16-69 Mlosln.-II. (A) Una molecula de miosina estaoompuesta por dos cadenas pesadas (cada una de las cuales tiene alredOOor de 2000 residuos de aminoacido de longitud) y CU.1tra caden.1sligeras. Las cadenas Iigeras son dedos lipos (unas conlienen alrOOedor de 190 residuos de aminoacidos y las otras alredOOor de 170). En cad.1 cabeza de miosina se haUa presenle una molecula decada tipo (vease Figura 5-23). La dimerizaci6n se produce cuando las dos helices Cl se enroscan la una alrOOOOor de 1.1 otm formando un sobreenrolJamienlo en helice Cl mediado por la asociaci6n de .1minoacidos hidrof6bicos scparados rcgularmcntc. La disposici6n en sobrccnrollamicnlo produce en so1uci6n una extensa cuerda; esla parte de la molecula se denomina el dominio de cuerda, 0 cola. Eslc til>O de estruclura se encucntra en olras proternas del clloesquelclo y les perrnitc fornHlr una cstruclura eXlendida. (B) Las dos cabeza globularcs y la cola pueden observarse c1aramente en electronmlcrograffas de molcculas de rnloslna sombreadas con platino. (B. por conesfa de David ShoHon.)

cede durante la contracci6n muscular. La miosina es relalivamente abundante en el c6rtex celular: en los fibroblastos, por ejemplo. existe una molecuJa de miosina-II pm cada 100 moleculas de acLina. En el anillo contractillos filamenlOS de miosina son los responsables del movimienlO de la membrana en el surco ccntral durante la divisi6n celular. como discutimos en el Capflulo 18. Se cree que estos filamentos gencran tensi6n en las fibras de estr~ y tambien mucha lcnsi6n conical que componarfa el tensamiento de la superficie celular. Su papel en la contracci6n muscular se describe a1 final de cSle capitulo. Ademas de la miosina-II. que generalmente es la miosina mas abundanle de la celula, las celulas no musculares disponen de diversas miosinas mas pequei'las, la mejor caracterizada de las cuales es la lIamada mloslna-I (Figura 16-70). Se cree que la mjosina-I es m:1s parecida a la original, a una miosina mas primitiva a panir de la cual habria evoludonado la miosina-II. Una linica celula puede disponer de multiples miosinas mas pequeiias, cada una de las cuales esta codificada par un gen distinlo y tam bien lleva a cabo una fund6n diferente; la celula del moho del dena Dicryostefium, por ejemplo. tiene al men as nueve de elias. La caracterfstica mas comun de todas las miosinas es la de presenmr un dominio motor muy conservado; el resto de dominios varfan de una miosina a otra y delerminan el papel especffico de la molecula en ta celula. Ademas. las colas de miosina pueden presentar un lugar de uni6n a la membrana y/o un lugar de uni6n a un segLUldo filamento de acLina independientemente del dominio de cabeza. Dependiendo de su cola. una molecula de miosina puede mover una vesfcuJa a 10 largo de un fiJamemo de actina. unir un nJamenlo de actina a la membrana plasmMica. o hacer que dos fiJamenlos de actina queden fntimamenle alineados y entonces se deslicen uno con respecto al Olro (Figura 16-71). Todas las miosinas conocidas hidrolizan ATP para deslizarse a 10 largo de los filamemos de actina desde el extremo menos hacia el extremo mas. Dada la imponancia de las protefnas motoras que se desplazan en direcciones opuestas

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500 emino'cldOs

Protefnas de uni6n a la actina

Figura 16-70 Dos mJembros de la ramUia de las miosinas. A la izquierda, se muestran la miosina-I y la miosinaII, dibujadas a escala, yalineadas respeclo a sus lugares de unilSn al ATP y a la aClina, altamente conservados. Las formas relativas de las prole{IlIlS completas se muestran 3 13 derecha.

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Figura 16-71 Poslbles funclones de In mlO5ln8-1 yla O1loslna-11 en una celula eucarlo{a {fplca. Las colas cortas de una moMcula de miosina-I contienen lugares que unen los filamentos de aClina a la membrana. Esto pennile a1 dominio de cabeza desplazarse de un filamenlo de actina a otro (II. desplazaruna vesfcula a \0 largo de un ftIamento de actina 12l 0 desplazar un filamento de actina hacia la membrana respecto a OIrO filamento de actina (4). Adem4s, los pequenos ensamblajes allliparalelos de las moleculns de miosina pueden deslizar unos filamentos de actina sobre los olros, COil 10 cual median contraccioncs locales en un haz de filamentos de actina (3). En todos los casos el gn1l>O de cnbcza "camina" hacia el exlremo mas del filamenlo de actina con el que contacta.

a 10 largo de los micronlbulos (vease Figura 16-37), no serfa sorprcndente descubrir un tipo adicional de prolefnas rnOioras que se desplazaraJl hacia el extrema menos de los filamentos de actina.

En celulas no muscuJares pueden formarse trans ito riamente ensamblajes semejantes a los musculares48 En las celulas eucariotas superiores se fannan transitoriamenlc haces comractiles organizados de filamentos de actina y de fLiamentos de miosina para realizar una funci6n especffica y luego se deshacen. Mlis destacado aun, la divisi6n eelular en las celulas animales es posible gracias a un baz a modo de cintu.r6n de mamentos de actina y de miosina, conocido como el anilIo ConlrticlU. Esle anillo aparece justa debajo de la membrana plasm;itica durante la fase M del cicio de divisi6n celuJar; las fuerzas generadas por este anillo constrincn la mitad de la cclula conduciendo a la eventual separaci6n de las dos celulas hijas mediante un proceso conocido como citocinesis (Figura 16-72). EI anillo contn1ctil se forma al iniciarsc la divisi6n celular a partir de actina, miosina y otras protefnas. Este proceso puede scguirse mediante la tinci6n con anticuerpos nuorescentes antimiosina de las celulas en divisi6n. Por ejemplo, en los huevos del erizo de mar que est<1n pr6ximos a dividirse, las moleculas de miosina est<1n al principio distribuidas uniformemenle por debajo de la membrana plasnuhica y Illego, a medida que se forma el anillo contr<1ctiJ, se desplazan a la regi6n ecuatorial de la celula. Una vez se ha completado la divisi6n celuJar, las moleculas de miosina se dispersan de nuevo. Se desconoce c6mo se controla este proceso, pero parece que estarfa implicado el cali6n Caz- ya que la fosforilaci6n de la miosina-II es dependicnte dc Caz- y tanto el Caz- como la fosforiJaci6n incrcmentan la interacci6n de la miosina con la actina 10 cual compona la formad6n de filamentos bipolarescor1os (Figura 16-73). Otro ejemplo de haces contr<1ctiles t'cmporales de filament os de actina y de miosina son las fibras de cstres, que son componentes mayoritarios del dtoesqueleto de los fibroblastos en cultivo (Figura 16-72). Aunque mucho m<1s pcquenas y menos organizadas, las fibras de estres presentan un deno parecido con Figura 16-72 Haces contricliles parecldos aI del musculo en celulas no musculares. Cada hazcontienc fllamentos de miosina-II adem
900

Capftulo 16: EI citoesqueleto

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Figura 16-73 EnsambloJe controlado de la mloslna·lI, fonnando fllamentos. (A) La fosforilaci6n controlada de una de las dos cadenas ligeras tielleal menos dos efe<:los ill vitro: provoca un cambia en Ja conformaci6n de [a cabeza de miosina, exponicndo su lugaf de uni6n a la actina. y libcra la cola de miosina de la "zona pegajosa" de la cabeza de rniosina. pcrmiticndo asf a 1<1 molccula de miosina cnsamhlarsc fOTmando cortos filamCll(OS bipolares. La enzima responsablc de esta fosforilaci6n (\a quinasa de la cadena Iigera de la miosina) se describe en relaci6n con el rnuscuJo lisa ("ease Figura 16·9B). tal Tinci6n negativa de filarnCnlOS cortos de miosina-I] que han sido inducidos a ensarnblarse I>or fosforilaci6n de sus cadCIlBs Iigeras. (Por cortesfa de John Kendrick-Jones.)

las minusculas miofibril/as del nUlsculo (discUlido mas adelante) en cuanto a su estructura y a su funci6n. Por uno de sus extremos se insenan en la membrana plasmatica, mediante unas uniones especiales Uamadas co"taclos [cJCales. lugar donde la cara extema de la celula esta intimamente unida a la matriz extracelular (Figura 16-74); por el otro extrema se insertan en un segundo contacto focal 0 en una red de filamentos intermedios que rodea el nucleo celular. Las fibras de estres se fonnan en respuesta a la tensi6n generada a traves de la celula y se desensamblan durante la mitosis cuando la celula se redondea y pierde sus uniones al substrato. Tambien desaparecen rapidamente si se libera la tensi6n mediame un rayo laser, separando siibitamente un extrema de la libra del contacto focal. Se cree que las fibras de tensi6n de los fibroblasros tisulares se contmen permitiendo a las celulas ejercer tcnsi6n sobre la matriz de colageno que las rodea -un proceso esencial en la curaci6n de las heridas y en la morfogenesis (vease Figura 19-48). En los epitelios. los haces de filarnentos de actina que se exticnden desde el citoplasrna de una celula hasta el citoplasma de la celula vecina a traves de las llniones celLllares pueden aparcccr y desaparecer de una manera sernejante; es105 haces de filament os, ligados de extremo a extrema a \raves de las uniones celuln-celuln, pueden formar cables y generar tensi6n a 10 largo de [(neas de est res particulares en las laminas mullicelulares.

Prote(nas de llni6n a la actina

Flgurn 16-74 Relacl6nentrelos conlaclOS focales y las obras de estrb en 8broblastos en cultlvo. Los contactos focales puede observarse de fonna 6plima en celulas "h'as mediame microscopio de comraSle inlerdiferencial (A). En esla l~nica, la luz se reOeja a panir de la superficie inferior de una celula unida a un soporle de vidrio, y los comaclos focalC5 aparecen como manchas negras. (8) La tinci6n de In misma celula (tras su fijaci6n) con anlicuerpos anti-actina muestra (!ue la mayorfa de los haces de filamentos de actina de la celuln (0 fibras de estres) acaban en 0 cerca de un contaclo focal. (Por cortesfa de Grenham Ireland.)

901

No IOdos los ensamblajes conlr
Los contactos focales perrniten que los filamentos de actina se extiendan hacia el substralo49 Para exten~erse sabre la matriz extracelular 0 sabre la superfidc de atm celula, una fibra de estres ha de eslar firmemente unida a un lugar adccuado de la membrana plasmatica. Los anclajes entre los filamentos de actina del interior de la celula y la matriz extraceluJar exterior estan mediad os por protefnas transmembrana unidas a glucoprotefnas de la membrana plasmatica. Los anclajes mejor caracterizados son los que forman los fibroblastos en cultivo. Cuando los fibroblastos crecen en una placa de cuhivo, la mayoria de su sllperficie esta separada del substrata por un espacio de mas de 50 nm; pero en las zonas de los contaclOS rocales (plaeas de adllesion), este espacio se reduce a enlre 10 y IS nm. En eslas zonas la membrana plasmallca esta unida a componcntes de la matriz exuacclular que se han adsorbido en la placa de cuhivo. Mediante lind6n con anlicuerpos anti-actina, puede observarse c6mo estas regiones son los lugares donde los extremos de las fibras de est res se unen a la membrana plasmatica (vease Figura 16~74). Las principales prOleinas de uni6n transmembrana de los contaClOS focales penenecen a la familia de las illlegrillas. cuyo dominio extemo se une a un componente de la matriz extracelular mientras que el dominio citoplasmAtico se une a los filamenlos de actina de las fibras de estres. La union es indirecta y eSla mediada por multiples proteillasde a"ciaje (Figura 16-75). EI dominic citoplasmatico de la integrina se une a una protefna Hamada talilla. que a su vez se une a la lJincl/lilla, pralefoa que se encuentra lambien en otras uniones que contienen filamcntos de actina, como par cjcmplo las un/Diles ad/,erentes (disculido en el Capitulo 19). La vinculina se une a la Q-aclinina que tambicn esta unida a un filamento de actina. Aunque la ropotog(a exact'a de las intcracciones proteicas ell los contac(os focales no esta establecida, en la Figura 16-75B se mllestra una posible disposici6n de rodas estas proternas. Ademas de su papel como andas para la celula, los contactos focales pueden tambien transmitir seiiales desde la matriz hasta el citoesquclelO. A1gunas proterna quinasas. incluyendo la tirasina quinasa codificada por cl gen src. se 10calizan en los contactos focales, y existen indidos de que su actividad cambia con el tipo de substrato sobre el cualla celula descansa. Estas quinasas pueden fosforilar diversas proteinas diana. incluyendo algunos componentes del dtoesqueleto. y asf regular la supervivenda, el crecimiento. la morfologfa, el movimienlO, y la diferenciaci6n de las celulas como respuesta a 1a matriz extracelular de su enlomo.

Los microvilli ilustran de qu~ forma los haces de filamentos entrecruzados de actina pueden estabilizar zonas locales de la membrana plasmcitica SO Los microvilli son eXlensiones digitiformes que se encuenlran en la superficie de muchas celulas animales. Son especial mente abundantes en las celulas epiteHales que para funcionar de una mallcra eficienle han de prcsclllar una gran 902

Caprtulo 16: EI citoesquclcto

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181

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~-==~--1=~""';'''' UNION DE LA c£lULA A UNA

MATRIl EXTRACELUlAR

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Flgun 16-75 Modelo que expllca de

CITOSQl

MATRlZ EXTRACELULAR

area superficial. Por ejemplo. una sola celuJa epitelial del intestino delgado humana tiene varios miles de microvilli en su superficie apical. Carla uno de elias liene aproximadamcntc 0,08 pm de ancho y I pm de largo, de ronna que la superficie de absorci6n de la celula es 20 veces mayor de 10 que serfa sin los microvilli. La membrana plasma-Liea que recubre estos microvilli esta allamente especializada. y contiene una gruesa cubierta extracelular de polisacaridos y de enzimas digestivas. EI citoesquelelo de los microvilli ha sido estudiado con dela-

que fonna lu Inlegrinas de la membrana plasmatJca conectan los flIamentos de actina lnlracelulares con la malrlz extracelular en los contactos focales. La formaci6n de un cOlllacto focal tiene lugar cuando In uni6n de glucoprolefnas de la malriz (Iales como la fibronectina) de la superficie eluerior de la c~Hula hace que las molkulas de integrina se agreguen en ellugar de contaeto, tal como se ilustra esquemalicamente en (A). En (8) se muestra una posible disposici6n de las prolefnas de uni6n intracelular que median la uniOn entre una integrina y un fLIamento de actina.

lie -labor que no ha side dificil ya que se trata de una estructura a1tamente especializada, com parada con las regioncs menos especiaHzadas del c6rtex celular. La zona central de cada mkrovillus intestinal contiene un haz rfgido de entre 20 y 30 filamentos paralelos de actina que se extiende desde la punta del microvillus hasta eJ interior de la corteza celuJar. Todos los filamentos de actina del haz estan orientados de forma que sus extremos mas apuntan hacia fuera del cuerpo celular y se mantienen unidos a intervalos regulares mediante prote(nas formadoras de haces de actina. Aunque la fimbrina, la prolefna formadora de haces de actina en las microespinas y los filopodios, interviene en la formaci6n de los filameotos de actina en los microvim, 13 protema formadora de haces de actina mas importante es 13 vllJina, que se encuentra unicamente en los microvilli (Figura 16-76). La viUina, igual que la fimbrina, entrecruza filamentos de actina en haces paralelos, perc tiene una secuencia de uni6n a la actina difcrente. Cuando se introduce villina en un cultivo de fibroblastos, los cuales normalmente no presenIan villina y s610 tienen unos cuantos microvilli pequei'los, los microvilli cxistentes se convierten en microvilli alargados y estabilizados e incluso se puede inducir la aparici6n de nuevos microvilJi. Estos datos sugieren que la villina es principalmente la responsable de la formaci6n de los largos microvilli de las ceo lulas epiteliales. Protemas de un..l6n a la actina

903

Figura 16·76 Un microvillus. Un haz de fiJamentos de actina paralelos. que se mantienen mediallle las protefnas formadoras de haces de actina -viUina y fimbrina- forman la parte central de un microvillus. Los brazos laterales (formados de miosina-i y la protefna de uni6n al Cal', calmodulina) conectan los lados del haz de fiJamentos de actina a la membrana plasmatica contigua. Los extremos mas de los fiJamentos de actina se hallan en el extrema del microvillus, donde estan inmersos en una sustancia amorfa, muy electrodensa, de composici6n desconocida.

regi6n amorfa tenida denSllmente

axtremos mb de los filamentos de actina

membrana plasmlltica

La parte inferior del haz de filarnentos de actina del microvillus esta anclada en

la corteza especializada de la regi6n apical de la celula epitelial intestinal, Esta corteza, conocida como la red temJi"al, contiene una densa trama de moleculas de especttina que cubre una capa de filamentos intermedios (Figura 16-77). Se cree que la especttina da rigidez y estabilidad al c6rtex, manleniendo los haces de actina en una proyecci6n en cingula recto hacia la superficie apical de la celula. EI haz de filarnentos de actina esta unido a la membrana plasmatica del microvillus mediante puentes laterales que pueden ser observados mediante electronmicrograffas. Los puentes estan farmados par una forma de la miosina-I que tiene algunas calmodulinas unidas en la regi6n de su cola (discutido en el Capitulo IS), La miosina esta orientada de forma que su cola esta inmersa en la membrana y su cabeza, unida a un ATP activo, contacra con los filamentos de aClina. ResuIta un mistetio par que una prote'na motora es utilizada para unir los filamentos de actina a la membrana de los microvilli. 5i la miosina-l de la membrana de los microvilli fuera m6vil, deberfa desplazarse hacia el extrema mas del filamenta de actina en la puma del microvillus. Esto ha conducido a especular que posiblemente la miosina-I ayudaria a transportar membrana desde el extremo de los microvilli hacia su regi6n central, fonnando vesiculas en su extremo que sedan entollces liberadas en el lumen del intestino, donde las enzimas digestivas que transportan continuan su acci6n.

"'' '11--

brllZos lateralos lmiosina-I y calmodulina)

entrecruzllmillntos Ivillinll, fimbrinal

El comportamiento de la corteza celular depende de un equilibrio de interacciones cooperativas y competitivas entre una gran colecci6n de protefnas de uni6n a la actina Los ejemplos precedentes muest.ran que un mismo filamento de actina puede unirse a diferentes tipos de protefnas de uni6n a la actina, localizadas en distinpuentes de espectrina

membrana plllsmatiCIl

,,'

terminal

0,2

904

~m

Capft!-,Io i6: EI ciloesqueleto

Figura 16-77 Electronmlcrograffa por congelacltin de una c~iuia epltellal intestinal, en ia quese muestraia red terminal par debajo de la membrana plasmatlca apical. Los haces de l1Iamentos de actina que forman el mlcleo del microvillus se extienden entre la red terminal. dande se unen conjuntamente mediante un grupo complejo de protefnas del citoesqueleto. que induyen la espectrina y la miosina-ll. Por debajo de la red terminal se encuentra una capa de ftlamentos intermedios. (De N. Hirokawa y J,E. Heuser,]. Cell Bioi. 91:399-409, 1981. Reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

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lormeeion de h_s de lropomlosinll

las regiones del c6rtex, y que estas protefnas puedcn ser segregadas en zonas distintas de la celu.la. lQue impide que las distintas colet::ciones de protemas se

mezclen en el citoplasma? Parece probable que sean importanles las imeracciones cooperativas y compclilivas entre eslas proteinas. Por ejemplo, un tipo de prolefnas de uni6n a la actina que aun no hemos discutido se une a 10 largo de los filamentos de actina. El ejemplo mas extendido de esta c1ase son las tropomloslnas, que son protefnas rfgidas en forma de varilla, denominadas as! por sus similitudes con la miosina-II en cuanto a su patr6n de difracci6n de rayos X. AI igual que la cola de la miosina-II, la tropomiosina es un dfmero con dos cadenas en helice 0: identicas que se enrollan una sabre la Olra formando un sabreenrollamiento. AI unirse a 10 largo del filamento de actina, 10 estabilizan y Ie dan consistencia. Tambien inhiben la uni6n de la filamina a los filamentos de actina, 10 cual explica probablemente por que la tropimiosina y la filamina estan distribuidas de forma diferenciaJ en la celula. Por el contJario, la uni6n de la tropomiosina al filamento de actina incremente la uni6n de la miosina-II-al filamento -un ejemplo de interacci6n cooperaliva (Figura 16-78). As! ahora podemos empezar a comprender c6mo las fibras de estres y las redes corticalcs de filamentos de actina pueden eoexistir en un mismo cilOplasma. En un lado de la celula -quizas nucleados en las adhesiones faeales que se forman por la influencia de la protcfna Rho aetivada- la tropomiosina, la miosinaII, y la o:-actinina se asocian con los filamenlos de actina e impiden la uni6n de la filamina: entonces, la actividad contractil de la miosinn-Il favoreee eambios en la organizaci6n que componan la producci6n de las fibras de estres. En otro lugar de In celula los fLIamentos de aClina, deficientes en tropomiosina, se unen ala filamina, y producen una red laxa que proporciona un bajo numero de lugares donde la a-aclinina puede unirse ados filamentos a la vez, con 10 cual queda excluida; la inclinaci6n de los filamentos en una red laxa tambien puede impedir la uni6n de la tropomiosina, que prefiere los filamentos rfgidos: Aunque esta explicaci6n es parciaJmente especulativa, puede iJustrar la via b~ica por la eual una combinaci6n de imeracciones cooperativas y competitivas puede producir disposiciones de los filamentos de actina espacialmente diferenciadas en un mismo citoplasma. Se desconoce c6mo se establecen estas diferencias locales postulndas que inician la formaci6n de estos ensamblajes. Tambien se desconoce cuantos tipos distintos de disposiciones de los filamentos de actina pueden coexist.ir en una celula -hay ciertamente algunos mtis de los dos que hemos mencionado. En la Figura 16-79 se resumen algunas de las protefnas de uni6n a la actina discutidas en esta secci6n. PrOlefnas de uni6n a la actina·

fil&mentos COf1tr6c1iles

de actina

Figura 16-78 Algunos eJemplos de Interacclones competltJv8s y cooperatlvll5 entre proternas de unltSn 8)8 actina. La punla de necha en el extremo de cada filamento indica el extremo menos. Tanto la tropomiosina como la filamina se unen ruertemente a los filamenlOS de actina, pero su uni6n es competitiva. Debido a que la tropomiosina se une a los filamentos de actina de fonna cooperativa, tanlo la uopomiosina como la filamina predominan sabre largas 7.(}nas de la red de filamentos de actina. Qlras protefnas de uni6n a la actina, como la a-actinina y la miosina, senin exclufdas de sus lugares especfficos par interacciones compctitivas. Asi, por ejetlll)lo, la a·'IClinina se une in vitro a todo 10 largo de los filamentos pUrificados de actina pero en la celu[a, debido a [a compelCncia con Olras prolefnas, solalllente se une de forma muy debit a los filamentos de actina, en los que esui confinada a lugares cercanos a los extremos llllis. Allemativarnente, la uni6n puede verse reforzada a 1m\'6 de uniones cooperativas; asf, la tropollliosina incrementa la uni6n de la rntosina a los filamenlOS de aClina. Se cree que las mt1ltiples interacciones que se producen entre los diferenles lipos de prOlefnas de uni6n a actina son los responsables de la compleja variedad de redes de aClina encontradas en tadas las celulas eucariotas (vease Figura 16-79 para las c1aves de los sfmbolos).

905

FUNCIDN DE LA PROTEINA

EJEMPLO DE PROTEINA

FORMAS. TAMAN OS Y MASAS MOLECULARES COMPARATIVAS so om

Forma tilementos

fortaleee los fitementos

actina

Ui

lropomiosina

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370 x 43

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INTERACCIDN ESOUEMATICA CON LA ACTINA elltremo menos

elttremo

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2x:!5kD

fimbrina

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• • 2X1ookO

Genera haces de

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mementos Entrecrul8 los filamentos formando un gel

mamma

Fragment. filamentos

gelsolin.

Hace deslizlr los

miosina-U

filamantas

Desptaz8 vesiculas por encime de los mementos

miasine-I

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plasmlllica

Secuestra mon6meros de actina

Iimosina

•

SltD

La migraci6n de las c~lulas animates comporta tres subprocesos distintos dependientes de aClina51 Los movimlentos de deslizamiento de las celulas animales son de muy diffcil ex·

plicaci6n a nivel molecular. Diferentes partes de la cclula cambian a la vez, y adenu1s no hay un {mica org<1nulo locomotor f<1cilmente idelllilicable (analogo al tlagelo, por cjemplo). Aunquc In act'ina es la base de la migraci6n cclular animal, pucde sufrir diferentcs tipos de modificaciones micntras la celula migra, ensambl<1ndosc en forma de lamelipodios 0 microespinas, asociandose con los contactos focales, formando las fibras de estres y otras muchas estructuras. Un informe completo tendr(a que dar una explicaci6n molecular a estas transformacioncs, explicar c6mo estan coordinadas en el tiempo y en el espacio y tambien informar de parametros bioqufmicos importantes tales como el desarrollo de la tensi6n cortical y la formaci6n de fucrtcs uniones entre la ctHuJa y el subslfalo. Hay, a grandes rasgos, tres procesos distintos que pueden identificarse en los movimientos deslizantes de las celulas animales: la prolT/tsidn, en que los lamelipodios y las microespinas (0 filopodios) se extienden desde la parte anterior de la relula; la adllesidn, en que el citoesqueleto de actina conecta con el substrato; y la traccidn, en que el cuerpo celular se mueve bacia adelante. La protrusi6n es una funci6n del borde frontal de avance de la c~lula. Los lamelipodios y las microespinas (0 fLIopodios) ricos en actina se extienden hacia adelante sobre el substrata, proceso que va acompanado de la polimerizaci6n de la actina, descrita anteriormente. Parece probable que la protrusi6n sea conducida por la polimerizaci6n de la actina en el borde frontal (Figura 16-58), pero ello aun es discutido. Los mot'Ores proteicos del tipo miosina-I se adhieren a la membrana plasmatica y podrfan conducir a la celula hacia adelante moviendose activamente a 10 largo de los filamentos de actina. Aun existe otra posibilidad, 906

Caprtulo 16: EI c1toesqueleto

Figura 16-79 AJgunosdelostres tipos de protdnas que se unen a la act.lna hallados en la mayoria de c~lulas de los vertebrados. La actina se rnueslra en rojo, mientras que las IHOtcfnas de uni6n a la actina se rnueslran en verde. EI peso molecular de cada prole(na se da en quilodaltons (kD).

cOrtex de 8ClINl

cL~

....bstnlIO

::-: *

polimeriuci6n de 18 mjs r----::;ii'~'~"~.:.:ro~m~"!!;60~.~'~."~.~":"---, i 18actina en los extremol ~

.. •

8lCtien.18melipodiO

movimienlO de la actin, no polimeritada

retr,imienlO (~

•

eontaeto. focales

Figura 16-80 Modeloqueexpllca cOmo las fuenas ~neradas en el

c6rtex rico en actina podrfan desplazar la clIula hacla adelante. La exlensi6n dependienle de actina y la fijad6n de un lamelipodio en eI borde fronlal de avance estirarlan cl c6rtex de actina. La lensi6n corlical dirigirfa el cuerpo de In celula hacia adelanle disipando pane de la tension. Se fonnan nuevos COnlaClos focales y los viejos se desensamblan mientras la dlula se mueve hacia adelanle. Esle mismo cicio se repeliria una y alTa Vel., desplazando la celula bacia adelante de una forma gradual. Se muestra en raja la actina conical polimerizada nuevamente.

que ha side sugerida a panir del movimienlo de amebas gigantes. y es que las prolrusiones aparezcan en el frenle celular mediante la presi6n hidrostalica generada por la contracci6n del c6nex celular. La adhesi6n aI substrato de los fiJamentos de aClina conicales se ha discUlido anteriormente cuando se describfan los contaclos focales. aunque hay eslructuras de adhesi6n especializadas presentes en los fibroblaslos en cultivo que estan asociadas a los extremos de las fibras de est res. Rapidamente las celulas m6viles -como las amebas Dictyostefiwll y los gl6bulos blancos- realizan mas contacloS difusos con el subslrato. Se cree que a eslOS contactos pueden aplicarse principios similares: receptores lransmcmbrana de protemas de la mauiz extraceluJar unen la membrana plasmMica con el substrato. y los filamenlos de actina del ciloplasma interactuan con los dominios citoplasmaticos de eslos receplores a lraves de las prolefnas de uni6n a la actina. Se desconocen aun algunos de los delalles de eslas interacciones tan imponantes, pero esra claro que los contaclOS celulares con el substralo deben estar formandose y rompiendose continuamenle mientras la celula se mueve. La lraeci6n es quizas la parte mas enigmatica del movimienlO eelular. En muchos casas se cree que la fuerza para la locomoci6n eelular se genera cerca del extremo anterior de la celula y que el !lucleo y el volumen citoplasmatieo son arrastrados pasivanlenle en este movimienlo. Se puede observar esta fuerza generadora de distinlas formas. EI exlremo anlerior de una celula puede conlraerse activamente iguaJ que una Jibra muscular y entonces lirar de la pane Irasera de la c~lula. Desde OlrO punto de vista, la polimerizaci6n de los filamentos de aclina en el borde frontal de avance de la celuJa extiende lambicn el c6nex de actina hacia adelante, y la pane rrasera de la eelula es enlonees arraSlrada hacia adelante par la fuerza cOlllractil resuhanle de la tensi6n cortical (Figura 16-80).

El mecanisme de la locomoci6n celular puede ser diseccionado geneticamente52 Una de las vfas mas poderosas para analizar el mecanismo de procesos celulares complejos es examinar el efeclo de las mutaciones que resuJtan de supresiones. sobreexpresiones. 0 modificaciones de proteillas espedficas. En el caso del movimienro de las celulas animales. las eelulas ameboides del moho del cieno Dicryoslelium son particularmente adecuadas para los an.1Hsis geneticos. ESlas celulas tienen una fonna y una manera de desplazarse que esl~ fmimameme relacionada con la de las celuJas de los organismos superiores. Ademas son haploides y, por Prolefnas de uni6n a la actina

907

tanto, son facilmente manipulables mediante melOdos de genetica inversa. Par tanto, en esta5 cclulas ha sido posible suprimir un numero importante de protefnas de uni6n a 10 actina y exominar su efeclo sabre la locomoci6n celular. Par ejemplo, el papel de la miosina-II ha sido comprobado geneticmneme mediante dos mctodos. En uno, se ha substituido el gen de la miosina-II par una forma defect iva de este gen, mediante recombinaci6n hom610ga (vcase Figura 747l, componando la aparici6n de un mutante sin miosina-II. La segunda estrategia es la de utilizar RNA antisentido (vcase Figura 7-43) para inactivar el mRNA de la miosina-II, 10 cuaJ tiene esencialmente el mismo efecto Que la estrategia anterior. En un Dictyosteliwn normal Que se desliza, la miosina-II esla concentrada cerca de la pane trasera de la cclula mientras que la miosina-I se concentra en el extremo anterior (Figura 16-8 J). En los mutanles, la miosina-I no ha cambiado pero no exiSle la miosina-II. Es de destacar que las celulas de Dicl)'osleliwn sin miosina-II pueden desplazarse todavfa sabre el substrato y responder quimiotacticameme a una fueme de AMP dclico, aunque ambos procesos estan algo allerados. Por tamo, la miosinaII no es absalutamente imprescindible para la locomoci6n celular. La actividad protrusiva del extremo anterior de tales mutantes es bastante nonnal, pero el movimiento del cuerpo celular hacia adelante no es tan nonnal, 10 cual sugiere que la miosina-II puede jugar un papel en la generaci6n de la tracci6n. De todas formas, la miosina-I y la polimerizaci6n de la actina pueden conducir la celula hacia adelante a una velocidad razonable sin la ayuda de la miosina-II. Como era de esperar, las cclula mUlantes son incapaces de formar el allillo contnktil despllcs de la mitosis y entonces se forma una celula gigante mllJtinucleada. Estas cclulas se dividen final mente miJizando la locomoci6n celular Que las rompe en dos partes. Es interesante especular que eSla citocinesis dependiente del movimienfo puede representar un mecanismo de divisi6n celular primitivo y que la miosina-II podrfa haber evolucionado a partir de la miosina-I mediante selecci6n natural, formando un aparato citocinetico mas eficicntc.

Resumen Las nuUt/ples formas y variadas flUlf;;ones de ill actina e" las cilllias eflcarlotas dependen de un repertorio versdtll tie proleillas tie uniOn a ia actbw fi"e etltrecrlluUI los jilamenlos tie actilla forma lido geles lnxos, los IItle,l et' forma tie hf'US rlgltlos, ios mIllieret' a III membrtllla plasmtftica, 0 los tlespltlZllt' a ill fuerza ,mo respecto lli otro. Por ejemplo, If' trotJomlosltw se 'IIIe a 10 largo de los jilflltwt'tos de lletlllll, cOlwlrtle"tlolos et' estmetllras mas rlgldas y alterat'do Sll ajillidatllwcla otras "rotelmlS. Lt, jilamlm, elltrecruz.a los jilamelltos de aetilla formmula geles Iluos. La jimbrilla y III a-actltlilliaformall luu:es dejilamentos de actirla IJllmlelos. La gelsolilla media IlIW fragmelltaci6" liepelldienle de or' tie ios fiillmelltos tie tU:thra, 10 que "rovoea ill solac1611 lie los geles tie aetl"a. Diversas fOnJUU tie miosilla 1IIi1iz.a1l ill ellergla tie In Itidr6llsls del ATP IX'ra tlesplazarse a 10 largo de ios jiinmelltos de actitla, IratlSportalldo orgtfrudos rotleculos tie membrana tie "'Ill regi611 (, otm tie la ciiula 0 desplazamlo jilamelltos de actilla adyacentes, ,wo cot,tra otro. Se cree que colecciolles tie proteillas de 1111;611 a In actiJut actdat, coopemtlvmllet'te genemlldo movlm;ettlOS de In s"IJerjicie celt~lnr, ;t,cluyendo In citocinesls, in fngocitosls y la 10comocidn cellilar. fstos mOIl;m;enlos son tliflciles de analizar a causa de los mileI,OS rompo"enles implicatlos ell ellos, pero aproxilluu;;olles gellitiCtlS, ell las clwles Sf! lIan mlllado los genes qlle cotI;fu:ml protefllas de I1II16n a la actina especlficas, pueden mastror la fimci6n illdillidual de las prolelnas en aula proceso.

El musculo 53 Muchas de las proteinas que se asodan a los filamentos de actina en las celulas eucariotilS fueron descubiertas por primera vez en el musculo. La comracd6n muscular es el movimiento m:is familiar y mejor conocido de todos los tipos de 908

Capftulo 16: EJ citoesqueleto

Flgun. 16-81 La locaJizacl6n de la mloslna-I yde la miosina-U en una ameba desJizante nonnal de Dictyostelium. se han marcado las dos fonnas de la miosina con anticuerpos especfficos. cada uno acoplado a un marcador l1uorescente distinto. y se han obserwdo con el microscopio de l1uorescencia. La miosina-Il (roja) se presenta a una elevada acumulaci6n en el cOrtex posterior, miemras que la nUosina·1 (verde) esta principalmeme restringida al extremo anterior. Tambil!n puede verse algo de miosina en vesfculas endociticas dentro del citoplasma. (Por conesia de Yoshio Fukui.)

Figura 16-82 ~ulas del mlisculo esquelilko (tambll!:n denominadas flbnlS muscuJares). tAl En un individuo humano adulto, estas enomu~ cl!:lulas plurinucleadaslienen lfpicamenle 50 ~m de dillmelro y pueden Uegar a tener algunos centlmetros de longitud. (B) MicrograrIa Ouorescente que muestra la localizaci6n periferica del nucleo en el musculo de la rata {azul}. (B, por cortesfa de Nancy L Kedersha.)

movimiento de que son capaces los all.imales. En los vertebrados. por ejemplo, cl correr, el andar, el nadar y el volar son dependientes de la capacidad del n/liscuia esqlletetico de contraerse rapidamente en su andamiajc dc hueso, mienrras que los movimientos involuntarios tales como ellatido del coraz6n y el pcristal. lismo del intestino, depcnden de la contracci6n del muscuJo cardfaco y del nHiscillo liso, respectivamenlc. Figura 16-83 MloObrl1las del mlisculo esquelhko. W E1cetronmicrograffa a oojos aumentos de una secci6n longitudinal de una libra muscular esqueiCtica de correjo, mostrando el pat16n rt.'gUlarde bandas transversales. L1 relula contiene numerosas miolibriUas a1ineadas en paralelo (vease Figura 16-82). (B) Detalle de la libra muscuJaresqueletica de W. mostrando portiones de
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E.I musculo

909

Figura 16-S4 Elec:tronmicrografia de una seccl6n transversal del mt1sculo de vuelo de un insecto. Los mamentos de aClina y de miosina esl~n dispuestos siguiendo una regularidad crislalina. A diferencia de 10 que ocurre en los vertebrados, los flIamentos gruesos son hueeos, lal como se observa en la ampliaci6n de la derec:ha. En la Figura 16-86 se muestra una secci6n longitudinal del musculo. La geometrfa de la trama hexagonal es ligeramente diferente en el mlisculo de los vertebrados. (De J. Auber, j. de Microsc. 8:197-232,1969.)

Aunque el musculo es el ejemplo lllejor comprendido del movimiento basado en la actina, fue desarrollado relativamente tarde en la evoluci6n y esta altamente especializado si 10 comparamos en las diversas celulas animales. En particular, las unidades contractiles de las celulas museulares. basndas en la actina y en la miosina, las miofibrilias. no son labiles como las estructuras basadas en la actina y en la miosina de las celuJas no muscuJares.

Las miofibrillas estan formadas por ensamblajes repetitivos de filamentos gruesos y delgadosS4 Las esbeltas fibras muscu/ares dcl musculo esquele:tico son enormes celulas individuaJes (ormadas duranle el desarrollo embrionario. resultantes de la fusi6n de celulas individuales (discutido en el Capitulo 22). EI nucleo de las celuJas integrantes permanece en esta gran celula y se dispone justo debajo de la mem· brana plaslll3tica. Pem la mayor parte del citoplasma (unas dos terceras partes de su Illasa) esta fonnado por mloDbrillas, que son los elemenlos cOnlractiles de la celula muscular. Las miofibrillas son estructuras cilfndricas de I a 2 pm de diamelro, que a menudo son tan largos como la celula muscular (Figura I6-82l. Cada miofibrilla esta formada por una cadena de minlisculas llnidades contractiles, 0 sarc6mcl:Os, cada uno de ellos de unas 2,2 pm de longitud, qlle confieren a la miofibrilla de los venebrados su apariencia estriada. A gran allmento, en cada sarc6mero puede verse una serie de anchas bandas claras y OSCllras; cada sarc6mero esta separado del siguiente por una Hnea eleclrodensa. situada en el centro de cada banda clara, denominada linea Z 0 discoZ (Figura 16-83). Cada sarc6mero contiene un ensamblaje de filamentos parcialmeme superpuestos y paralelos. Los fi/amentos de/gat/os estan form ados por actina con protefnas asociadas que estan unidas a los discos Z en uno de los extremos del sarc6mero. Se extienden hacia el inlerior del sarc6mero. donde se superponen can los filamentos grueso. que son polfmeros de isofonnas de la miosina-II espedficas del musculo (Figura 16-83C). Cuando se observa aJ microscopio electr6nico un cone transversal de esla regi6n de superposici6n, se puede ver que los filamenlOS gruesos se hallan dispueslos siguiendo una (rama hexagonal regular. con los filamenlos delgados dispueslos regularmente entre elias (Figura 16-84).

La contracci6n se produce por el deslizamiento de los filamentos de miosina y de actina entre sf El acortamienlO del sarc6rnero se produce por el deslizamiento de los filarnentos de miosina sobre los de actina, sill que se produzca ninglin cambio en la lon910

Capftulo 16: Elclloesqueleto

filIomenlO delgado

fitameNo grl,lClSO

Agura 16-85 Modelode deslizamlento de los filamentos de Is contracclcSn muscular. los filamentos de actina y de miosina se deslizan unos sobre Oiros, sin que se reduzca su longitud.

gitud de cada tipo de filamento (Figura I6-85). Este modelo de deslizamiellfo de

los filamelltos, propucsto por primera vez en 1954, fue crucial para entender el mecanisme de la contracci6n muscular. En las micrograffas electr6nicas a gran aumento se puede observar la base ultraestructural de la interacci6n generadora de la fuerza. Se puede observar c6mo los filamentos de miosina presentan nUlllcrosos brazos laterales diminutos. 0 puentes crIlzndos. que atraviesan la separaci6n de unos 13 nm. entrando en contaclo con los filamenlos de actina adyacentes (Figura 16-86). Es· tos puentes cruzados son las cabezas de la miosina-II, y cuando el musculo se contrae. los filament os de actina y de miosina se empujan los unos a los otros mediante la acci6n dclica de los puentes cruzados. a modo de baterfas de diminutos remos. Como ya hcmos mencionado anteriormente. la cabeza globular. 0 dominio motor, de la mohkula de miosina-II se line a los filamentos de actina e hidroliza ATP. las cabezas de miosina·1J aisladas. que pueden prepararse mediante digest.i6n con papaina, retienen tanto la actividad ATPasa como las propiedades de uni6n al filamento de actina y pueden utilizarse para analizar la interacci6n entre la aclina y la miosina. Cada molecula de actina de un filamento es capaz de unir una cabeza de miosina-II formando un complejo que permite ver la polaridad estructural del filamento de actina. Mediante tinciones negativas. eslOS complejos se pueden observar al microscopio electr6nico y tienen una forma regular y caracteristica: cada cabeza de miosina forma una proyecci6n lateral y la imagen superpucsta de muchas de estas proyecciones torna la apariencia de unas cabezas de flecha a 10 largo de los filamentos de actina. EI extrema plIIltiagudo creado por estas fie-

Figura 16·86 EJectronmicrografiade una secclcSn longiludlnal del mdsculo de vuelo de un Insecta. Esta seccl6n ultralina mueslra c1aramenle la allemanda entre los liIamentos de aClina y de miosina, asf como los puentes que los unen. Veasl'! que el musculo de vucJo de un insecto ticnCII un elevado grado de superposid6n inusual entre los dos tipos de liIamentos. (Por conesla de Mary C. Reed)'.)

"-------' 100nm

EI muscuJo

911

extremo menos

extremo

m~s

extrema menos

extremo menos

181

extrema

m~s

Figura 16-87 Filamentos de actina "decorados" con cabezas alsladas de mloslna. (A) Enla electronmicrograffa la disposici6n helicoidal de las cabezas de miosina unidas, incJinadas siguiendo una sola direcci6n, confiere al conjunto una apariencia de puntas de necha y pone de manifiesto la polaridad del filamento de actina. El extremo de la punta corresponde al extrema mellOS, mielllras que eJ extremo ancho corresponde aJ extrema mas. (8) Reconstrucci6n tridimensional a partir de las micrograffas eJectr6nictls, de un filamenlO de actina decorado de una manera parecida. La regi6n que se muestra corresponde al area marcada en (A). El filamento de actina se rnuestra en raja, las cabezas de miosina son amarillas, las cadenas ligeras de miosina son grises, yla posici6n de 1.1 tropomiosina se muestra en morada. (A, por cortesfa de Roger Craig; B. por cortesla de Hon Milligan.)

100 nm

chas de miosina corresponde aI extrema "menos", de crecimiento lento, del filamen to de actina descrito anteriormente (vease pag. 880). EI otro, el extrema barbada, corresponde al extremo "mas", de crecimiento nip ida (Figura 16-87). Como se muesrra en la Figura 16-88, las cabezas de miosina se orientan en direcciones opuestas a cada lad a de la zona central desnuda del filamento de cabelas de miosina

500nm

161

Figura 16-88 EI flIamento grueso de mloslna. (A) Eleclronmicrografia de un fiJamento grueso de miosina·ll aislado de un ml1sculo de rana. N6tese la zona central desnuda. (8) Diagrama esquemarico, no dibujado a escala. Las molcculas de miosina·1J se agregan conjuntamente a trav(!s de sus colas, de forma que sus cabeza.s se proyectan hacia el exterior. La zona desnuda del centro del filamenlO esta formada ellleramellle por colas de miosina-II. (C) Pequefta secci6n de un filamento de miosina-ll, reCOllstruido a panir de electronmicrografias. Se ha dibujado en lIerde una moJecula individual de miosina. (A, por cortesfa de Murray Stewart; C. basado en R.A. Crowther, R. Padron, y R. Craig,}. Mol. Bioi. 184:429-439, 1985.)

912

Capftulo 16: El cltoesqueleto

·1

I'

los filemenlOl grue_ (l., mioline invierten lU poIeride
••

/\

extremo mal de los lilementos de actina sabre el extrema del disco Z

extremo meno, de lilamentol de actina

miosina·11. Dado que las cabezas deben imeracruar con los filamemos de aClina en la regi6n de solapamiento, los filamentos de actina han de tener polaridades opuestas a cada lado del saroomero. Esto ha side demostrado utilizando cabezas de miosina para "decorar"los ftlamemos de actina unidos a discos Z aislados. Se encontr6 que tOOas las pumas de necha de la miosina apuntaban en direcci6n opuesta a las bandas Z ntientras que los extremos menos apuntaban hacia los fl· lamentos de miosina (Figura 16-89).

disco Z

Flgura 16-89 Acada ladodela linea media de un san:6mero los rnamentos de mloslna y de actina se solapan con la m1sma polaridad relallva.

Las cabezas de miosina "caminan" hacia el extrema lnenos de los ftIamentos de actina S5 La contracci6n muscular est
913

Figura 16·90 Modelo espaclai de la cabeza de la mloslna muscular. EI modelo esta orientado de manera que la superficie de uni6n a la actina se encuentra en la esquina derecha de la parte inferior. Los tres dominios de la cadena pesada de la miosina se han marcado en verde, rojo yazlll, respectivamente, mientras que las dos cadenas ligeras se han rnarcado en amarillo y morado. (De J. Raymelll et aI., Science, 261:50-58, 1993. © 1993 theAMS.l

filamento de actina axtremo manos

UNI6N

cabeza da mlosina

filamer-to grueso de miosins

UNI6N-AI inic;arsa al cicio que sa mueSlra en la figura, una cabaza de miosina, sin ningun nucle6tido unldo, se une fuartemente s un filamento de actina en u"a configuraci6n de rigor (asf lIemada porque es la responsabla del rigor mortis, la rigidez de la muertel. En un musculo an contracci6n aCliva esta astado es da corta duraci6n y finaliza rapidamente medianta la uni6n da una mollk:ula da ATP.

LlSERACI6N-Una molilcula de ATP sa una an al Burco da la "partetrasara" da la cabaza las decir, an la parte mas alejada dal filamento da actina) a inmediatamanta provoca un cambio ligero en la conformaci6n de los dominios, qua libara ellugar da uni6n a la actina (vease Figura 16·901. Esto reduca la afinidad da la cabeza por la actina y Ie permite desplazarse a 10 largo del filamento. lEI espacio aqul dibujado entre la caban y la actina enfatiza asta cambio, aunque an la raalidad probablamente se mantiena muy cerca de la actina.)

HIDR6L1SIS MO\llMIENTo--El surco se cierra como la concha de una almeja alrededor da la mollk:ula da ATP, induciando un gran cambio morfol6gico que provocs el desplszamianlo de la cabeza a 10 largo del filamento a una distencia de unos 5 nm. Sa prod"ca la hidr61isis del ATP, pero al ADP y al P; producldos sa mantisnan fntimamente unidos a la protelna. MOVIMIENTO

GENERACI6N DE LA FUERZA-ls uni6n debil da la cabazs da mioslna a un n"avo lugar en el filamanto de ectina provoca la liberaci6n del fosfato inorganico producido por Ie hidr61isis dal ATP, con 10 cual se refuerza la "ni6n de Is cabeza con la actina. Esta liberaci6n proporciona al golpe da potarn:is --ill cambio da forms genersdo por la fuarza duranta al c"al la cabeza recupera su conformaci6n original. Duranta al golpa da potancia, la cabaza pia,da el ADP "nido y sa inicia un nuavo cicio.

.

UNI6N-AI final del cicio, la cabaza de miosina se ancuentra da nuevo intimamenta unida al filamanto da actina an la configuraci6n da ,igor. N6tasa qua la csbaza s.e ha daaplszado hsc;a "ns nueva posici6n en al filsmento de actina.

,, , ,,

,

,

914

CapItulo 16: El c1toesqueleto

Figura 16-91 EI cicio de camblos por los cuates una molecula de mloslna "camlna" a 10 largo de un n1amenlo de actina. (Basado en I. Rayment et al" Science261:50-58, 1993.@ 1993 the AAAS.)

1

La contracci6n muscular se inicia por un aumento repentino de la concentraci6n de Ca2 + citos6lico56 La fuerza que genera la interacci6n molecuJar que acabamos de describir s610

tiene lugar cuando una senal procedente del nervio motor pasa al nnisculo esqueleuco. La senal procedente del nervio dispara un potencial de acci6n en la membrana plasmatica de la celula muscuJar, y esta excitaci6n electrica se transmite nipidamente a traves de una serie de pliegues membranosos, los Tllbulos trtHlsversales, 0 tUblllos T, que son invaginaciones de la membrana plasmatica de la fibra muscular que penelran hacia el interior de la celula. A continuaci6n, la senal se transfiere, de alguna manera, aI reticula endoplasmalico, una capa adyacente de vesfculas aplanadas y anastomosadas que rodea cada miofibrilla como una funda (Figura 16-92A). En la regi6n de uni6n, grandes callales de liberaci(m de eaz· se extienden como pilares desde la membrana del retlculo endoplasmatico cOntactando can la mcmbrana del tubulo T del otro lade (Figura l6-92C). Cuando diversas protefnas sensibles al voltaje en la membrana del tubulo T se activan por el incremento del potenCial de acci6n, descncadena la apertura de alguno de los canales de Iiberaci6n de calcio, probablcrnentc mediante un acoplamicnto mecanico directo. Enlances, las iones Ca2 ' se escapan del ret(cuJo endaplaslmitico (donde se almacenan en grandes cantidades) al lugar de la uni6n, provocando que se abran mas canales de liberaci6n de calcio, con 10 cual se amplifica la respuesta. EI flujo de iones Ca~· en direcci6n al cilosol, inicia la contracci6n de cada una de las miofibrillas. La senal se transmite desde la membrana plasmatica de la fibra muscular hasta cada sarc6mero, en cuesti6n de miUsegundos (vfa los tubulos T y el reticula endoplasmoiticoJ, por 10 que tOOas las miofibrillas se conlraen simuJtaneamente. El incrememo de la concentraci6n de Ca~- es lransilorio, ya que el Ca2* es rapidamente bombeado de nuevo hacia el retfculo endoplasmatico medianle una ATPasa dependieme de Ca2., presente en cantidades abundanles en la membrana de este reticulo sarcoplasmatico (discutido en el Capftulo II). Tfpicamente, la concentraci6n de Ca" citos6lico se restablece hasta sus niveles de reposo, en unos 30 miJisegundos, 10 coal provoca la relajaci6n de las miofibrillas.

miolibrill8 _ _

~

Figura 16-92 LostubulosTyel retfculo sarcoplasm:itlco. (A) Dibujo esquelluhico de los dos sistemas de membrana que transmiten 10 selial de contracci6n desde la membrana plasmatica de la fibra muscular a todas las miofibril1as de la celula. (B) Electronmicrografia que ilustra dOs tubulos T. N6tese la posici6n de los grandes canales liberadores de Cal. en la membrana del reticulo sarcoplasmatico: parecen ·pies" de Conna cuadrangular que estan conectados a la membrana del tubulo T adyacenle. (el Diagrama esquem41ico que muestra romo puede abrirse un canalliberador de Ca~' de la membrana del reticulo sarcoplasm4tico mediante una protefna lransmembrana sensible al voltaje localizada en la membrana del tubulo T adyacenle. (8, por corlesfa de Clara Franzini.Annslrong.l

4-<

C8nllle8Iibllrlldores de Ca" tubulos Irllnsverulel IT) formadO$ II pllnir de invIIginllCione8 de III membrana pilltm.liticll

O.SlIm

(AI

crrOSOL membrllnll del retlculo SIIrcopllltmjlico

(Cl

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o

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cansles liberlldores de ClI~' 0 0 0 0 0 0 0 0000

EI 1l1lisculo

915

actina

,

compltljo de troponine

tropomiosine

el movimiento de Ie lropomiosil'l8 mediado por el Ca 2, deja expuesto ellugar de unl6n a la miosina

bloqueo del luger de unl6n de Ie miosina a lit actina por la tropomiosina

, C

-C." 'AI

10 nm

'81

La troponina y la tropomiosina median la regulaci6n de la contracci6n del musculo esqueletico por el Ca 2 + S7 La dependencia respeClO al Cal' de la contracci6n muscular de los venebrados, y por consiguieme su dependencia respecto a las 6rdenes motoras cransmitidas a traves de los nemos, es debida exclusivamente a un grupo de protefnas accesorias especializadas. estrechameme asociadas con los ftlamenlOs de actina. 5i en un tubo de ensayo se mezcla miosina con filamentos de actina purificada, la ATPasa de la miosina se activa tanto si existe Cal. en el medio como si no; por otro lado, en una miofibrilla normal, en la que los filamenlos de actina estan asociados a proleinas accesorias, la activaci6n de la ATPasa de la miosina es dependieme de Ca 2•• Una de estas prOlefnas accesorias es una forma muscular de la tropomio· sina,la molecula en forma de varilla que hemos introducido ameriormente y que se une al surco de la helice de actina (vease Figura 16-78). La otra prolefna accesoria principal implicada en la regulaci6n del mllsculo esqueletico de los vertebrados por el Cal. es la troponilla, un complejo de tres polipeptidos -troponinas T, I, YC (llamadas asf por sus actividades de uni6n a la Tropomiosina, actividad Inhibidora, y de uni6n aI Calcio, respectivameme). EI complejo de la troponina tiene forma alargada, con las subunidades C e I formando una regi6n de cabeza globular y la subunidad T formando una cola larga. La cola de (roponina Tse une ala tropomiosina y, al parecer, es la responsable de situar el complejo sobre el fl· lamento delgado (Figura 16-93A). La troponina I se une a la actina, y cuando se afiade a la troponina T y a la cropomiosina, el complejo inhibe la interacci6n entre la actina y la miosina. inciuso en presencia de Ca 2'. La posterior adici6n de troponilla C completa el complejo y 10 hace sensible al Ca 2•• Cada molecula de croponina C une hasla cuatro moleculas de Ca 2.; con el Ca l + unido se suprime la inhibici6n de la uni6n de la miosina ,a la actina producida par los otros componentes de la troponina. La troponina C esta estTechamente relacionada con la calmodulina, la cual media respuestas sei'ializadas par Cal. en todas las celulas, inciuyendo la activaci6n de la miosina del Iln1sculo Iiso. Por 1o tanto, la troponina C puede ser considerada como una forma especializada de calmodulina que ha desarrollado de forma permanente un lugar de uni6n ala troponina I y T, asegurando asf que la miofibrilla responda de manera extremadllmente rapida a un incremento en la concentraci6n de Ca 2•• En un filamento ,de actina existe una sola mo1ecula del complejo de troponina por cada siete mon6meros de actina (vease Figura 16-93A). Estudios estructurales sugieren que en un musculo en reposo la uni6n de la troponina I a la actina desplaza las moleculas de tropomiosina a una posici6n que en un musculo en contracci6n activa esta ocupada por las cabezas de miosina, inhibiendo asf la interacci6n entre la actina y la miosina. Cuando los niveles de Ca 2+ aumentan, la troponina C provoca que la troponina I se libere de la actina, permitiendo a las moleculas de tropomiosina desplazarse liberamente de tal manera que las cabezas de miosina puedan unirse al filamento de actina (Figura 16·938).

Otras protefnas accesorias mantienen la arquitectura de la miofihrilla y Ie proporcionan su elasticidad 58 La notable velocidad y pOlencia de la conlracci6n muscular depende de que los

filamentos de actina y de miosina de cada miofibrilla esten dispuestos uno res916

CapItulo 16: EI citoesqueleto

"Mr

Figura 16·93 1:1 control de la contraccl6n del rntisculo esqueletlco por 10 troponlna. (A) Filamento delgado que rnuestra la posici6n de la tropomiosina y de la troponina a 10 largo del filamento de actina. Cada molecula de tropomiosina liene siete regiones de secuencias hom610gas, espaciadas regul:umente. Se cree que cada una de estas secuencias se une a un rnon6mero de actina, tal como se mueSlra en el dibujo. (B) Un filamento delgado que ilustra c6mo la uni6n del Ca 2 • a la troponina se cree que libera eJ bloqueo de la interacci6n de la cabeza de la miosina con la actina. (A. adaptada de G.N. Phillips, J.P. Fillers, y C. Cohen,;. Mol. Bioi. 192: 111-13\, 1986.)

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pecto aJ ouo a una distancia 6ptima y en una alineaci6n correcta. La organizaci6n exacta de la miofibrilla se mantiene gracias a n1<1s de una docena de protefnas estructurales: el orden en que se ensamblan y los controles sabre el proceso son temas imponantes de la investigaci6n contemporanea. Los fdamentos de actina estan anclados par sus extremos mas en el disco Z. donde se mantienen mediante proteinas que forman una trama cuadrangular. Una de las protefnas mas importantes de esta regi6n es la (l-actinina, prOieina que enfrecruza. la actina, que hemos discutido anteriomlente y que es abundante en la mayoria de celuJas animales. Se concentra en Ja regi6n del disco Z de la miolibriUa (Figura 16-94). Los filamentos de miosina estan tambi~n mantenidos mediante una trama reguJar-en este caso, hexagonal- a traves de protefnas asociadas que se unen en la zona media, a 10 largo de los filamemos gruesos bipolares. Las celulas del musculo esqueletico contienen dos protefnas extraordinariamente abundantes, Ilamadas titim' y "eblllilla, que forman una red de fibras asociada con los filamentos de actina y de miosina. La titina, que tiene un peso molecular de 3 x 10', es el polipeptido mas grande descrito hasta ahora. Las moIlkulas de titina, a modo de cuerdas, se extienden desde los filamentos gruesos del disco Z; se cree que aett1an a modo de mueUes manteniendo los filamentos de miosina centrados en el sarc6mero (Figura 16-95). AI contrario, la nebulina, que tambien es muy grande. est'a imimamente asociada con los delgados filamentos de actina, y esta formada casi enteramente en una secuencia repetida de 35 aminoacidos que se unen a la actina. EI numero de estos motivos, y por tanto la longitud total de la molecula de tubulina, es el necesario para extenderse desde un extremo del filamentos de actina hasta el otro. De este modo, la nebulilla podrfa actuar como una "regia molecular" para regular el ellsamblaje de actina y la longitud de los filamentos de actina durante el desarrollo del musculo (vease Figura 3-52). Las miofibrillas se unen unas a las otras, lade a lado, mediante un sistema de filamentos intermedios de desmina. y tada esta disposici6n se ancla entonces en la membrana plasmatica de la celula muscular mediante diversas prote{nas, incluyendo una proteina de uni6n a la aClina aJargada y flexible, Hamada distro/i"a. Esta proteina, que se encuentra ausente en aquellos pacientes con distrofia muscular, tienen un enorme parecido conla espectrina, y puede unir proteinas especfficas de la membrana muscular a los filamelltos de actina de la miofibrilla.

La misma maquinaria contnictil, en una forma modificada, se encuentra en el musculo cardlaco y en el musculo liS059 Hasta ahora s610 hemos explicado uno de los tres tipos prindpales de musculo presentes en los vertebrados -ell1l1lswlo esquetetico. Los otros tipos son ell1l1lsCillo del corazt)1l (0 fllllSClIlo cardfaco), que se contrae unos 3 mil millones de veces en el curso de una vida humana de duraci6n media, yel rmisculo /iso, que produce las contracciones lentas y prolongadas tfpicas de 6rganos tales como el intestino. Los tres tipos de fibras musculares, conjuntamente con otro tipo de celulas conuactiles conocidas como c:illllas mioepite/iales (vease Figura 22-36EJ.

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Figura 16·94 Localizacl6o de la a-acllnioa en el mUscuJo. Imagen de inmunoOuorescencia confocal que muestra un grupo de miofibrillas de celuJas del ml1sculo cardiaco cultivadas. La actina se ha marcado en rojo con faloidina unida a rodamina. y la (l-actinina se ha marcado en I'f?rde. con un anticuerpo ligado a nuorescefna, pero como la actina y la (l-actinina se colocalizan ell el disco Z, esta regi6n aparece realmcnte COIllO amarilla. (Dc M.H. Lu et al.. J. Cell Bioi. 117:1017-1022. 1992. can cl penniso de copyright de The Rockdeller University Press.)

Flguntlfi..95 IAcaIWd6ndelatitinay de Ia nebullna en lU1 sarc6mcI'O dd mWicWo esque&etico. cada moI6:u1a gigante de titina se extiende desde eI disco Z hasta la Ifnea M -una diSlancia superior a I jJlll. Una pane de cada mol&:ula de titilla estl\ fntimamente asociada con las mol6culas de miosina de los nJamelltos gruesos: el rcslO de la molecula cs elastico ycambia de Jongitud mientras el m(lSCu!.o se comrne y se relaja. Carla moWlcuia de nebulina se extiende desde ei disco Z a 10 largo de Ia Jongitud de illl lilamento de actina delgado Ypodrfa detenninar la Iongitud de ~e. diKQl

diKOl

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miolin, jfitllmento grueto)

nebulinll

EI musculo

917

disco intereeler

dlUlA 1

disco Z

disco Z

disco intereala. mitocondria

dlUlA2

se contraen mediante un mecanismo de deslizamiento de filamentos de actina y filamentos de miosina. Al igual que el mLisculo esquel~lico, el musculo del coraz6n es eslriado, reflejando una organizaci6n de filamentos de actina y de miosina muy similar. Tambi~n es estimulado a contraerse mediante un mecanismo parecido: un potencial de acci6n de los tubulos T dispara de alguna manera la liberaci6n de Ca 2• del retfculo sarcoplasmatico, 10 cual activa la contracci6n por medio de un complejo troponina-tTOpomjosina. No obstante, las c~lulas musculares del coraz6n no son plurinucleadas, y estan unidas por sus extremos mediante unas eslructu~ ras especiales Ilamadas discos imerca/ares (Figura 16-96). Los discos intercalares realizan al menos tres funciones. (I) Unen una relula a la siguiente por medio de desmosomas (discutido en el Capitulo 19). (2) Coneclan los filamentos delgados de las miofibrillas de las c~luJas adyacentes (realizando una funci6n analoga a la que desempeftan los discos Z en el interior de las c~lulas). (3) Presentan uniones de tipo gap que permiten la transmisi6n rapida del potencial de acci6n desde una c~lula a la siguiente, sincronizando las contracciones de las c~lulas musculares cardlacas. EI tipo de musculo mas "primitivo", en el sentido de ser mas parecido a las c~lulas no musculares, no presenta eslriaciones por 10 que se Ie denomina mus~ culo lisa. Forma la porci6n contractU del est6mago, del intestino y del utero, las paredes de las arterias, los conductos de las glanduJas secretoras y muchas otras regiones en las que es necesaria una contracci6n lenta y sostcnida. Esta formado por capas de c~lulas alargadas y fusiformes, cada una de las ClIales presenta un solo m1c1eo. Las c~lulas contienen filamentos de miosina y de actina, pero estos filament os no estan dispuestos siguiendo la distribuci6n altamente ordenada del musculo esquel~tico y del musculo cardfaco, y no forman miofibrillas. Por el comrario, los filamenlos forman un aparato contractil dispuesto de forma mas Jaxa, que se halla alineado, aproximadamente, con el eje largo de la c~lula pera que esta anclado oblicuamenle a la membrana plasmatica en uniones discoida· les que agrupan conjuntos de c~lulas. Aunque el aparato contractil del musculo Iiso no se contrae tan rapidamente como las miofibriUas del muscuJo estriado, tiene la vemaja de permitir un mayor grade de acortamiento, y por 10 tanto, puede producir grandes movimientos a pesar de que no disponga del sistema de palancas que proporciona el anclaje a los huesos. Actualmeme se conace muy poco todavfa acerca de la organizaci6n de los filamemos de actina y de los de miosma que hacen esto posible; en la Figura 16-97 se presenta un posible modelo al respecto.

En muchas celulas, la activaci6n de la miosina depende de la fosforilaci6n de la cadena ligera de la miosina60 Los mecanismos contr~ctiJes altamente especializados que acabamos de describir en fibras rnusculares evolucionaron a partir de unos simples mecanismos de 918

CapUulo 16: Elcltoesqueleto

Figura 16·96 Estrucluradelml1sculo cardCaco. Diagrama esquematico del ml1sculo cardfaco que muestra dos celulas unidas. extremo con extremo. mediante uniones especializadas conocidas como discos intercalares. Los filamentos de actina de los sarc6meros de celulas adyacentes se insenan en el dense material asociado con la membrana plasmatica de la regiOn de cada disco intercalar. como sl se lratara de discos Z. Asr. las mlolibrillas conlinl1an a trav~ del n.:ideo. sin tener en cuenta los !fmites celulares.

I

que~.,..c::::::;;;;;;>:::~~;:~:;;2""~"::>-c contle'len fibras de soporte que lilamentos

fil)r'1 cOnl.ktiles conlie'len aetin& V mio.ina

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inte.medios

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membrana pl,.m6tial d.nsamente teflidos

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• gencraci6n de fuerza que se encuentran en tadas las c~lulas eucariotas. No es sorprendente que la miosina-II de las celulas no musculares se parezca a la miosina-IJ de las celulas muscularcs lisas. el tipo menos cspecializado de museulo. Como en el ml1sculo esquehhico y en el cardfaco, la contracci6n en las celutas musculares Usas se dispara por un incremento del Ca 2• citos6lico; perc, al ccotrario que en el mecanismo del musculo esqueltHico y del card[aco, la contracci6n se inicia principalmenle por la fosforilaci6n de una de las dos cadenas ligeras de 1a miosina-II, 1a cual a su vez controla la inleracci6n de la miosina con la actina. Un mecanismo parecido regula 1a actividad de la miosina-II no muscular. Las dos cadenas Iigeras de cada cabeza de la molt'!cula de miosina-n (vt'!ase Figura 5-23) son diferentes, y 5610 una de eUas es fosforilada durante la contracci6n no muscularydurante la contracci6n del musculo lisa. Cuando esta cadena ligera se fosforila, la cabeza de miosina interactua con un filamento de actina por 10 que se genera la contracci6n; cuando la cadena se desfosforila, la cabeza de mosina tiende a disociarse de la actina y se vuelve inactiva. La fosforilaci6n estli catalizada por la enzima quinasa de la cadena ligera de In miosina, cuya uni6n requiere la uni6n de un complejo Ca2·- calmodulina. Como resultado de eUo, la contracci6n estli controlada por los niveles de Ca2. citos6licos, tal como ocurre en el musculo esquelt'!tico y en el musculo cardfaco (Figura 16-98). La fosforiJaci6n de la cadena tigera puede tener influencia sobre el estado de agregaci6n de las moleculas de miosina-II en la ct'!lula, mencionado anteriormente en relaci6n can 1a motilidad de las ct'!lulas no musculares (vt'!ase Figura 16-73). La fosforilaci6n de la miosina-JI se produce de una manera relativamente lenta, de modo que a menudo la contracci6n mmma se alcanza aproximadamente lin segundo despues del estfmulo (respecto a los pocos milisegundos necesarios para el casu de la ct'!luJa del musculo estriado). Sin embargo, en las ct'!lulas musculares lisas y en las no-musculares, la aclivaci6n rlipida de la canuacci6n no es imponante: en estas ct'!lulas las miosinas-II hidrolizan ATP apro-

ealmoclulina

quinn.. de I. eaden. liger. de 1. mlosina

miosin. con I. e.eden.a Ioger.

:;.1

PROTE/HAS INACT1VAS

PAOTEfNAS ACTIVADAS

Elmusculo

Figura 16-97 Modelo del aparato eontrlictil de una e~lula del ml1sculo Uso. SegUn esla hip6lesis, haees de fiJamentos eonlrtietiles que conlienen aClina y miosina (raja) se hallan anclados par un extremo a los cuerpos densos de la membrana plasmatica. y par el otto extremo, atravesando los ·cuerpos densos· citoplasmaticos, se hallan unidos a haces no contrtictiles de fiJamenlos inlermedios (azul). Los haees eontrtictiles de actina-mioslna se hallan orientados de forma oblieua al eje longitudinal de la clHula (el eual, generalmenle, es mucho mas largo de 10 que aquf se mueSlra), de forma que su contracci6n acorta notablemente la cclula. En la figura se presentan unJcamente unos cuantos de los haces existcntes.

FIgura 16-98 ReguJacl6n de la contraccl6n del ml1sculo llso par eI Cal>. La contracci6n se activa con la presencia de Caz', par la quinasa de Ja cadena ligera de la miosina, que calaliza la fosforilaci6n de un lugar particular en uno de los dos lipas de cadenas ligeras de la miosina. Las mo1ecuJas de miosina no muscular esuln reguJadas por el mismo mecanismo (vease Figura 16-73).

919

ximadamente 10 veces mas lentamente que Ja miosina del musculo esquel~tico, 10 cual produce un cicio de uni6n lento que supone que estas c~lulas s610 pueden conuaerse lentamente.

Resumen La oo"tracci6" ,muclliar se produce ",edla"te el desliznmlenlo de los jilamelllos de aclina respeclo los de ",Ioslna. La reglones de In cabeza de las molklllas de mloslna, que se proyeclan desde los fllnmelllos de ",iosina. hllcian lin cklo COndllcido porel ATP en qlle se "nell a losfllamenlos de aclina adyacellles, y se prodllce 1111 cambio co"jormaciomd qlle e",pll}a elflla",ellto de ",los/"a CQlltra el/llamell10 de act;'la, y elllom:es se separan. Di,lersas protelllas accesorias especlflcasjacilllall este cicio ell el ",dscllio y ",alltlene" los filamelllos de actina y de mlosilla en dlsllOslclones sllperp,.estas y paralelas COli la orlentac/6" correcla para que Sf! produua el desliznmle,Jto. Orras dos protelnas aa::ewrlas -troponlna y tropomlosina- permiten que la contrncci6n del rrllUc:r.do esquelitioo y del mWeldo cardlaco esti rtgI,lnda por el or', En lasflbrasdel nll!u;1I10 lIso,yen In mayorla dedlulas no mwclllnres, In actina y la miosbUl prodllam In contracd6" ch IIIUl JomUl similar a la del nll!u;lllo nqllelitico y rordlaco, Sin embargo, 'as lI1lidades oolltrtfctlles SOli mds peqllenas y menDs orgatlizadas en eslas ct"dasj tanto Sll ac:fiuidad como Sll estado ch ensambla}e estd" controlndos por ,ma josjorl'ad6" de In cade"a lIgera de In "'losina lkpelldie"te de or'.

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923

Gelulas del ~pice de una raIz de una planta, en diferentes estadios del cicio celular. (Por cones!a de John McLeish.)

EI cicIo de division celular

17 ----,.. .....-..-.-

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• Conuoleldeladlrl.... ceIuIIr J

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Las ceJulas se reproducen duplicando su contenido y luego dividiendose en dos. EI cicio de divisl6n es el media fundamental a traves del cual todos los seres vivos se propagan. En especies unicelulares como las bacterias y levaduras. cada divisi6n de la celuJa produce un nuevo organismo. En especies pluricelulares se requieren muchas secuencias de divisiones celulares para crear un nuevo individuo; la divisi6n celuJar tambien es necesaria en el cuerpa adullo para reemplazar las celulas perdidas por desgaste, deterioro 0 por muerte celular programada. Asi, un humano aduho debe producir muchas millones de nuevas celulas cada segundo simplemente para mantener el status quo y, si la divisi6n celular se detiene -a causa por ejemplo de una dosis clevada de radiaci6n ionizante- el individuo morin!. en pocos dias. Los detalles de la divisi6n celular pueden variar, pero existen algunos reque· rimientos universales. Lo primero y principal para que se produzcan un par de celulas hijas geneticamente idemicas es que el DNA se replique exactamente y que los cromosomas replicados se segreguen en dos celulas distinlas (Figura 171). EI cicio celular comprende. como minimo, el conjunto de procesos que una celula debe Ilevar a cabo para cumplir estas funciones. La gran mayorfa de las celulas tam bien doblan su masa y duplican todos sus organulos citoplasm:iticos en cada cicio celular. De este modo. durante el cicio celular un conjunto complejo de procesos citoplasm:iticos y nucleares tienen que coordinarse unos con otras. EI problema central es explicar c6mo se consigue esta coordinaci6n. Nuestro conocimiento de la celula ha avanzado muchfsimo en los u!timos anos. En el pasado se estudiaba el cicio celular obselVando los pasos de la segregaci6n cromos6mica con un microscopio 6ptico y siguiendo la replicaci6n del DNA mediante la medici6n de precursores radiactivos incorporados aI DNA. EI centro de atenci6n, por 10 tanto, eran los cromosomas, y parecfan existir grandes diferencias entre los ciclos celulares de dislintos organismos y tipos de celulas. Experi· mentos recientes han aportado perspectivas nuevas y mas sencillas, revelando un sistema de control del cicIo ceJuJar que coordina el ciclo en su totalidad. Las pro· tefnas de este sistema de comrol aparecieron par primera vez hace mas de mil milIones de afios y se han conselVado tan bien durante su evoluci6n que muchas de elias funcionan perfectamente cuando se transfieren de una celula humana a una celula de levadura. Par 10 tanto podemos estudiar el sistema de control en una gran variedad de organismos eucariotas y utilizar los descubrimienlos de lodos elias para dar una visi6n unificada de c6mo las celulas crecen y se dividcn. ESle capftulo trata de c6mo se coordinan y controlan (mos can OITOS los procesos del cicio celular. Otros capftulos explican detalladamente estos mismos

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_ Dt~ON CELULAR

/ 0 N CELULAR C'CLO SEGREGACI CROM05QMICA

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REPLICACION

I ~MOSOMICA

Figura 17·1 Elcldodedlvlsl6n celular.

925

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e-~-~-~-8-t}~ INTERFASE

replicKl6n del DNA

procesos pero por separado: Los Capftulos 6 y 8 tratan del mecanismo de replicacion del DNA, y el Capitulo 18 describe el aparato citoesqueh~ticoque segrega los cromosomas y divide la celula en dos. AquI, tras describir brevemente las etapas del cicio celular, tratamos los experimentos efectuados en embriones tempranos de animales y de levaduras que han proporcionado los mayores avances sobre el sistema de control bl1sico. Luego consideramos como actuan las senales extracelulares sobre el sistema de control regulando la divisi6n celular en los organismos pluricelulares.

La estrategia general del cicio celular La duraci6n del cicio celular cambia mucho de un tipo de celula a otro. Los embriones de mosca tienen los ciclos celulares mas conos que se conocen. cada uno solamente dura 8 minutos, mientras que el cicio celular de las celulas del hfgado de un mamffero puede durar m<1s de un ano. Sin embargo, comenzamos nuestro tratado con un ejemplo mas tfpico y describimos la secuencia de procesos en una celula de mamffero que se divide bastante mas deprisa, can una duraci6n del cicio de unas 24 horas. El cicio celular se divide tradicionalmente en varias fases distintas, de las cuales la mas imponante es la mHosls. el proceso de divisi6n nuclear, que nos conclucira hasta el mismo momento de la divisi6n celular. Tal como se trata detalladamente en el CapItulo 18, durante la mitosis la envoltura del nucleo se descompone, los contenidos del nucleo se condensan formando cromosomas visibles, y los microtubulos se reorganizan formando elll11so mirorico que finalmente separara los cromosomas. Mientras liene lugar el proceso de la mitosis, la celula parece detenerse brevemenre en un estado lIamado merafase, en el cuallos cromosomas, ya duplicados, se alinean en el huso mit6rico, preparados para la segregaci6n. La separaci6n de los cromosomas duplicados senala el inicio de la allafuse, durante la cual los cromosomas se trasladan a los polos del huso, donde se descondensan y fonnan un nuevo mlcleo. Entonees la celula se divide por el centro en dos mediante un proceso Uamado citoclnesls, que tradicionalmente se considera el fin de la fase mit6tica, 0 rase M, del cicio celular (vease Figura 17-2). En la mayorra de las celulas, toda la fase M 5610 dura una hora aproximadamente, 10 cual es 5610 una pequena fracci6n de la duraci6n total del cicio. EI penode que lranscurre entre una fase M y la fase siguienre es mucho mas largo y se conoce como la lnterfase. AI microscopio parece, enganosal1lente. como un interludio lranquilo durante el cualla celula aumenta de tamano. Pero ol'ras teen i926

Caprtulo 17: EI cicio de divlsl6n celular

Figura 17-2 Las etapas de 1a dlvlsl6n celularvistas aI mlcroscopio. Normalmente, los procesos facilmente visibles de divisi6n nuclear (mitosis) y fisi6n cclular (citocinesis). que juntos forman la lIamada fase M. ocupan una fracci6n pequefla del cicio celular lotal. La otra parle del cicio, mucho mas larga, se conoce con el nombre de imer/au. En la fase Mdurante la translcl6n de Ia metafase a la anafase tiene lugar un cambio brusco en el estado bioqufmico de la celula: una celula puede detenerse enla melafase anles del punto de transici6n, pero una vez ha sobrepasado este punlo.la celula continuad sin detenerse hasla el fin de 13 milosis y a traves de la citocinesls a 13 interfase.

Figura 17-3 Las cualrO rases 5uceslvas del cklo de una cBula eucariota lCplca. Duranle la interfase la celula crcce continuamente; duraJlle la rase M se divide. La replicaci6n del DNA se produce unieamente durante la parte de la interrase conoclda como la fase S. La raseG, es un intervalo de liempo entre la rase M y la rase S; Gz es el intervalo entre la rase S y la rase M.

cas demuesrran que en realidad la imerfase es un perfodo muy activo para la celula en divisi6n, durante el cual tienen lugar, siguiendo una secuencia muy ordenada, complicados procesos de preparaci6n para la divisi6n celular. Panicularmente, en el transcurso de la interfase riene lugar la replicaci6n del DNA en el nudeo.

La replicaci6n del DNA nuclear ocune durante una rase

espeC£fica de la interfase: la fase 8 1 La replicaci6n del DNA nuclear s610 suele ocupar una parte de la interfase llamada rase S del cicio celular (5 =sfntesis). El intervalo entre la consumaci6n de la mitosis y el comienzo de la sfntesis del DNA se llama la rase G. (G ="gap~, intervalo, lapso) y el intervalo entre el final de la sfntesis del DNA y el principio de la mitosis se denomina rase Gz. G l YGz proporcionan un tiempo adicional para el crecimiento: si la interfase s610 durara 10 necesario para que se produjera la replicaci6n del DNA, la c~lula no rendrfa tiempo suficiente para duplicar su masa antes de dividirse. Durante G. la c~lu1a supervisa su entomo y su propio tamalto y, cuando lIega el momento, da un paso decisivo que Ie conducirA a la replicaci6n del DNA y a la consumaci6n del cido de divisi6n celular. La fase Gz proporciona un lapse de seguridad, que permite a la c~lula asegurarse de que la replicaci6n del DNA se ha complerado, antes de lanzarse a la mitosis. Gl' 5, Gz Y M son las subdivisiones tradicionales del cicio celular tfpico (Figura \7-3). Veremos que la mayorfa de los ciclos celulares, aunque no {odos, se ajustan a este esquema tfpico. Debido a que las c~lulas necesitan un ciecto tiempo para crecer antes de separarse, normalmente el cicio celular tfpico es bastante largo -por ejemplo, 12 horas 0 mAs para tejidos de crecimiento rApido en mamffero. Aunque la duraci6n de las fases del cicio son variables dentro de unos m:irgenes, en la mayorfa de los casos estudiados la variaci6n mas grande ocurre durante G1• Las celulas en G1 pueden, si no han iniciado la replicaci6n del DNA, detencr su progresi6n en el ciclo y entrar en un estado de reposo especial, a menudo lIamado GD (G cero), donde pueden permanecer durante dfas, semanas 0 incluso afios antes de volver a proliferar. La estrategia general del cicio celular

927

Figura 17-4 £1 cicio celular lfplco comparado con el cicio celular del embri6n temprano. En el cicio del embri6n temprano no ocurre crecimiento. por 10 que cada una de las dos celulas hijas produclo de cada divisi6n liene un tamaiio de la mitad del de Ia celula progenitora. La durad6n del cicio es exrremadamenle cona, las fases M y S se aheman sin que tengan lugar las fases G. y Gz-

cicio calular normal

• ciclo c.lular delembriOn temprano

Los ciclos de divisi6n mas breves de todos en eucariOlas -m:is breves incluso que los de muchas bacterias- son los ciclos celli/ares de embriOlles tempranos que tienen lugar en algunos embriones allimales poco despues de la feculldaci6n, y que sirven para subdividir una celula huevo giganle en muchas celulas mas pequenas, Ian rapidamente como sea posible. En estos ciclos no hay crecimiento, las fases G 1 y G2 se acortan drasticamente, y el periodo entre una divisi6n y la siguicnte oscila entre 8 y 60 minutos, de los cunles la milad se dedican a la fase S y la otra mitad a la fase M (Figura 17·4). Mas adelante trataremos sobre estos ci· clas de embriones tempranos. tC6mo podemos saber en que fase del cicio se encuentra una celula? Las celulas en fase S son reconocibles si les suministramos moleculas marcadas de timidina -un compuesto que las celulas utilizan exclusivamente para la sfntesis del DNA. Lns marca puede ser radiacliva, normalmente en la forma de tim..idina-1H, 0 qufmica. generalmente en forma de bromodeoxiuridina (BrdU). un anaIogo artificial de la timidina. Los mkleos celulares que han incorporado dichos compuestos se reconocen mediante aUlorradiograffa (Figura 17-5) 0 anadiendo anticuerpos anti-BrdU. respectivamente. Generalmeme, en una poblaci6n de relulas en crecimiento que esten proliferando rapida pera asincr6nicamente. cerca del 30% de elias se encuentra en a1gu.n momenta de la fase S y. por 10 tanIo, quedan1n marcadas por \01 breve pulso del precursor del DNA Partiendo de la fracci6n de celulas que queden marcadas (el ["dice de 11Jarcaje). se puede calcular la duraci6n de la fase S como una fracci6n del cicio completo. 19ualmeme. partiendo de la fracci6n de celulas detccladas en mitosis (el [ndice mitotico). se puede calcular la duraci6n de la fase M como una fracci6n del cicio completo. En resumen. anadiendo un pulso de timidina-1H 0 BrdU y permiliendo continuar a las celulas dcnlro del cicio durante periodos de tiempo determinados, podemos eSlablecer curtmo tarda una celula en fase S en pragresar por G2 hasta la fase M, a traves de la fase M hasta G1 y, final mente a traves de G1 hasta volver a la fase S. A1ternativamente, se puedc establecer en que fase del cicio eSla una celula midiendo SIJ contenido de DNA, que se dobla durante la fase S. Esta operaci6n

20 \.lm

928

=

Cap(lulo 17: EI cicio de dlvisl6n celular

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Figura 17·5 Man:aJe de las celulas en fase S por 81110rmdlograffa. Ellejido ha sido expueslo duranle un perfodo corto de liempo a limidina-1H. La presencia de granos de plata (prmrO$ rlegros) en la emulsi6n fOlogrMica sobre el mkleo indica que la celula ha incorporado timidina-'H al DNA del n(ideo, y que esto ocurri6 en la fase S, en a1gtin momento durante el perfodO de marcaje. En esta preparaci6n del epilelio sensorial del ofdo inlerno. la presencia de una celula en fase S evidencia la proliferaci6n de celulas que tiene lugar como respuesta al dano sufrido. (Cortesfa de Mark Warchol y Jeffrey Cor.\'in.)

I --,l.

Figura 17·6 Amfllsls del conlenldos de DNA can un dtotluorimetro de fluJo separador. EI grMko muestra los resultados caracterfslicos obtenidos sobre una poblaci6n celular en crecimiento cuanda se determina eJ contenido de DNA de sus ceJuJas. En este caso el citofluorfmetro de flujo separador (vease Figura 4-31) no se uliliza para c1asificar las celulas sino s610 para reali7.ar mediciones de elias. Las ceJulas se tinen con un caloranle que se hace fluoresceme cuando se une al DNA, por 10 tanlo la cantidad de fluorescencia es direclamente proporcional a la cantidad de DNA en cada celula. Las celulas se repanen en tres calegorfas: aquel1as que lienen todo su DNA sin replicar de nuevo (una unidad arbitraria) y, por 10 tanto, estan en rase G1, aquellas que Ilenen todo su DNA replicado por completo (dos unidades arbitrarias), y por 10 tanto est"n en rase G2 0 fase M, yaquel1as que tienen una cantidad intermedia de DNA, por 10 que estan en fase S. En el caso que se ilustra, la distribuci6n de celulas indica que el mlmero de celulas en G t es mayor que el de celulas en G 2 + M, 10 cual implica que en este caso la poblaci6n es mayor en G, que en G, + M.

se ve facilitada en gran manera con la utilizaci6n de un citofl"orfmetro de flujo separador (Figura 17·6), el cual permit.e analizar grandes canlidades de celulas automaticamente. Se puede ir mas alia y establecer la duraci6n de Gl' y de las Cases S y G~ + M estudiando una poblaci6n seleccionada de celulas por estar todas en una misma Case y, utilizando las mediciones de conlenido de DNA, para seguir el proceso posterior de estas celulas a 10 largo del cicio.

celulas an lase G,

celuills en lase Gzy fase M

o

, cllntidlld rellltivlI de DNA PO' celula (unidades arbitrariasl

Paralelamente al crecimiento continuo de la celula, durante el cicio celular se producen una serie de procesos discretos 2 En condiciones que favorezcan el crecimiento, eltotal de protefna contenido en una celula normal aumenta mas 0 menos continuamente durante el cicio. De la misma forma, la sintesis del RNA contimIa a una frecuencia regular, exceplo durante la Case M, cuando los cromosomas esran aparentememe demasiado condensados para permitir su Iranscripci6n. Si se analiza el patr6n de sfntesis de las proteinas individuales, se ve que la gran mayorfa de elias se sintetizan durante todo el cicio. Por 10 tanto, el crecimiento de la mayorfa de los componentes de la celula es un proceso tranquilo ycontinuo, s610 interrumpido brevemente por la Case M, cuando elmlc1eo y la celula se dividen en dos. La sfntesis del DNA y los pasos visibles de la mitosis no son, sin embargo, los unicos procesos discontinuos que tienen lugar, [renle a este crecimiemo continuo generalizado. EI centrosoma, por ejemplo. ha de ser duplicado durante la preparaci6n de la mitosis, de Corma que pueda Cormar los dos polos del huso mit6tico (vease Figura 17-2). La producci6n de unas cuantas -aunque muy pocas- protefnas clave para el proceso, se acelera enormemenle en una fase determinada del cicio. Por ejemplo las histonas, que se requieren para la formaci6n de cromatina, se forman a una velocidad mllY alta s610 durante la fase S, y 10 mismo ocurre con algllnas enzimas que sintetizan los desoxirribonucle6tidos y replican el DNA. La activaci6n e inhibici6n de la expresi6n de genes y el comienzo y la detenci6n de procesos tales como la sfntesis del DNA y la mitosis son las consecllencias evidentes de una serie de transiciones repenlinas en el control del cicio cellllar, mucho mas diffciles de observar, CllyOS principios disclltimos a cOlllinuaci6n.

Un sistema de control central desencadena los procesos esenciales del cicio celular 3 En 10 que refiere a su control, el cicio celular actua como una lavadora automa:tica. Las Cunciones de una lavadora automlitica son introducir aglla y detergente, lavar la ropa, aclararla y centrifllgarla hasta secarla. Los procesos basicos del cicio de una lavadora son analogos a los procesos esenciales de: replicaci6n del La estrategia general del cicio celuJar

929

MAQUlNAR1A De l..,A MITOf;1S· v6:fffie CaUltl,l1018

[

t

pl,lellte en marcha dela mSQl,linaria de la mitosis

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progresion a travlls de Is trsnsicion de la metafs$(l a la anafase

Figura 17-7 EI control del cicio celular. Los procesos basicos tales como la replicaci6n del DNA. la mitosis y la citocinesis, se pOllen en marcha mediante un sistema de control central del cicio celular. Si efectuamos una analogfa con una lavadora automatica, el sistema de control se eqllipararfa a un indicador que gira en la direcci6n de las agujas del rcloj, desencadenando los procesos basicos cuando alcanza puntas detenninados del dial exterior.

pl,lesta en marcha de Ie maql,linaria da la ,eplic.ciOn

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DNA, mitosis etc., del cicio celular (Figura 17-7). En ambos casas un controlador central inicia cada proceso en el momento oportuno, siguiendo una secuencia especffica. Aunque el controlador podrfa en principio actuar como un simple reloj que asignara un tiempo fijo a cada proceso, tanto en la lavadora automatica como en el cicio celular, normalmente el propio controlador esta regulado por retroalimentaci6n, en ciertos momentos cr(ticos del cicio, par los procesos que se estan efectuando. Dentro de la lavadora, unos sensores miden el nivel del agua, y envfan senales de retorno al cOnlrolador para evitar que el siguiente proceso comience antes de que el anterior haya terminado. Sin esta retroalimenta· ci6n el retraso 0 la interrupci6n en cualquiera de estos procesos podrfa provocar un desastre. La distinci6n entre el sistema de control y la maquinaria que lIeva a cabo los procesos basicos del cicio celular no fue admitida mayoritariamente hasta hace poco. Por el contrario, se crefa que cada uno de los procesos principales podfa, de alguna manera, desencadenar por sf mismo el siguiente proceso, como en una cadena de fichas de domin6 cayendose (Figura 17-8). EI punto de inflexi6n en nuestro conocimienlo vino con la identificaci6n de los componentes fundamentales del sistema de control central del cicio celular y el reconocimiento de que eran distinlOS de las moleculas que efecl1Ian los procesos basicos de la replicaci6n del DNA, la segregaci6n cromos6mica, elC. EI sistema de control del cicio celular es un dispositivo bioqufmico que actua cfciicamente, compuesto por un conjunto de prolefnas interactivas que inducen y coordinan los procesos stlbordi"ados basicos que duplican y dividen los cOnlenidos de la celula (subordinados en este contexto simplemente significa

IAI

930

Figura 17-8 Dosconcepclones altematlvas del control del cicio de control celular. Las [icllas verdes represeman los procesos basicos del cicio celular, tales como la replicaci6n del DNA, la condensaci6n cromos6mica. la formaci6n del huso. etc. En (A) la ejecuci6n de un proceso desencadena In del siguiente. como en una cadena de fichas de domin6 que se van cayendo. En (B) los procesos no se acoplan directamente sino que se suceden consecutivamente debido a un mecanisme de control que funciona independientemente. El mecanismo mostrado en (B) corresponde mejor al cicio celular real, en el que un mecanismo de control cfclico. que denominaremos el sistema de control del cicio cellllar, pone en marcha los procesos slIbordinados del cicio.

Capftulo 17 : EI clelo de dlvlsl6n celular ---------~

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tEN lodo el DNA (epl;~dol tEl f.wreble

ntomo?

tEST'n Icxto.lo. CfOtnOl(l
81l ,I husol

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PUNTa DE CONTROL DE LA METN'ASE

Figura 17-9 Puntosdeconlroly entradas de Informacl6n reguladora aJ sistema de control del cicio celuJar. La rcuoalimenlad6n de los procesos subordinados y las seiiales del enlorno pueden impedir que el sislema de cOlllrol pase par deflos puntos de conuol especfficos. Los pUnlOS de control mas imponantes esl
PUNTO DE CONTROl. 61 ~.CiMIl ~

grande?

(h favorable el entomol

que dichos procesos Deupan una posicion inferior en la jerarqufa del connol del cicio celular). Durante el cicio celular trpico. el sistema de comrol esta regulado por unos factores de relraso que pueden parar el cicio en unos plmtos de control

delerminados. En elias. las senales de retroalimemaci6n que contienen informacion sabre los procesos subordinados pueden retrasar el avance del propia sistema de control, evilando que este desencadene el proceso siguiente sin que el anterior haya terminado. Los faelaTes de reteaso tambit:!n son importantes en otro aspecto: sirven para Que el sistema de control celular est~ regulado par senales de su enlomo. Normalmcnle estas senales de control ambiental actlIan en uno a dos de los PUniOS de control crucialcs del sistema de control del cicio -uno en GI' justa antes de entrar en fase S; y el otro en G2 , al comenzar la mitosis. En cl!lulas eucariotas mds dcsarrolladas las senales que retrasan el cicio acostumbran a actuar en punta de control de G1• Este punto de control se llama Inicio en las levaduras, y en las cl!lulas de mamffero simplemente 10 llamaremos punto de control Gl (Figura 17-9). 5i las circunstancias impiden la divisi6n celular. serd en estc punta del cicio donde muchas cl!lulas se detendnin. En una cl!lula de cicio cOIHinllo, el punto de control G1 es aquel en el cual el sistema de conlIol de la celula pondrd en marcha un proceso que inicia la fase S, y el punto de control G 2 aquel que pone en marcha un proceso que darA comienw a la fase M.

EI control del cicio celular es un mecanismo basado en una prote(na quinasa3 Por razones hisl6ricas la mayorfa de 10 que sabemos sobre el mecanismo del sistema de control proviene de estudios sobre el PUniO de cOnlrol G2 al comienw de la mitosis. En nuestra descripci6n inicial de este sistema de cOnlrol, consecuentemente, nos centramos en los mecanismos que conducen a la cl!lula una vez pasado el punta de control Gz dentro de la fase M. Parece probable que un mecanismo similar a ~te actue en el punta de control Gl' aunque los componentes precisos sean diferentes. La estralegla

generaJ del cicio celular

931

EI sistema de control del cicio celular se basa en dos familias clave de proteinas. La primera es la familia de las protefna qulnasas dependientes de c1clina (Cdk, de Cyclin-Dependem protein Kinases), las cuales inducen ios procesos subordinados fosforilando protefnas seleccionadas sobre serinas y treoninas. La segunda es una familia de protefnas activadoras especializadas, las ciC/illDs, que se unen a las moleculas Cdk y controlan su capacidad para fosforilar protefnas diana adecuadas (Figura 17- J0). EI ensamblaje cfdico de compuestos de ciclina y Cdk, su activaci6n, y desensambJaje, son los procesos centrales que dirigen el cicio celulaT. Las ciclinas se lIaman asi porque sufren un cicio de simesis y degradaci6n en cada cicio de divisi6n de la celula. Hay dos c1ases principales de ciclinas: las ciclinas mlt6t1cas, las cuales se linen a las molt~culas de Cdk durante G2 y son necesarias para entrar en la mitosis, y las cicUnas G]! las cuales se unen a moll~cu­ las Cdk durante G1 y son necesarias para entrar en la fase S (Figura I7-Il). En las celulas de levadura, que han jugado un papel fundamental en la investigaci6n del cicio celular. el mismo miembro de la familia Cdk proporciona la actividad quinasa en ambos pulllOS de control: en celulas de mamffero hay al menos dos protefnas Cdk diferentes, una para cada pun to de control. En resumen, los procesos que Bevan a la celula a la mitosis son los siguiemes: la ciclina mit6rica se acumula gradual mente durante Gl y se une al Cdk formando un compuesto conocido como factor promOTOr de la fase M (MPF, de M-Phasepromoting Factor). Este compuesto inicialmente permanece inactivo, pero a traves de la acci6n de otras enzimas que 10 fosforilan y desfosforilan, se convierte en un factor activo. La activaci6n final del MPF es casi explosiva, probablemente debido a un mecanismo de rerroalimentaci6n positiva por el cual el MPF activo incrementa la acci6n de las enzimas que 10 activan: de este modo la concentnrci6n de MPF activo aumema a ritmo acelerado hasta que se Uega a la cxplosi6n cru· cial, despues de la cual un nujo de MPF activos desencadena una serie de sucesos que impulsan a la celula hacia la mitosis. EI MPF tambien se desactiva de repeme por la degradaci6n de ia ciclina mit6rica en la melafase-anafase que sucede a continuaci6n, permitiendo a la celula salir de la milOsis. Cada paso de la activaci6n 0 des,activaci6n de Cdk marca una transici6n del ciclo celular y probablemente tiene algun crecto sobre el propio sistema de con-

pone efl mall:haelme<:afll.model.mlto.lt

t

faetor promotor de la fa5' M I

ciclina mitotica

,

ciclina G,

I

I, qulnat8 empieza, ae!uar poM ""

932

I'f\¥'Cl'Ia .. ~nlsm.o de repllcaciOn elM DNA

Capftulo 17 : El cicio de divisi6n ceJular

ciclina qu;n8Sa d,pendiente (Cdk)

Figura 17·10 Doscomponentes fundarnentaJes del sistema de control del cicio celular. Un complejo de ciclina y Cdk actua como una protefna quinasa para desencadenar los procesos subordinados. Sin la ciclina. la Cdk es inactiva.

Figura 17-11 EI coraz6n del sistema de control del cicio celuJar. Se cree que Cdk se asocia sucesivamellle a diferentes ciclinas desencadenando los distintos procesos subordinados del cicio. La aclividad de Cdk se termina con la degradaci6n de la ciclina.

Irol celular. iniciando reacciones que finalmente 10 conducimn a poner en mar· cha el proceso subordinado siguiente. EI mecanisme que actua en el punto de control G. es mucho menos conocido. pera se cree que 10 hace de manera simi· lar: del mismo modo que el ensamblaje del MPF desencadena final mente los procesos de la milosis. el ensamblaje de un compueslo parecido conSlimido por prolefna edk y ciclina G l conducirfa a la celula mib allot del punto de control G l , desencadenando los procesos que nos Ilevaran a la replicaci6n del DNA. Los procesos subordinados inducidos por la activaci6n de Cdk en los puntos de control G. y G2 son complelamenle diferenles, aunque en la levadura la misma protefna sirva para ambos procesos. Por 10 tanto se cree que las prolefnas que en cada caso se fosforilan, y son aetivadas por la proleina Cdk. dependen del componente de cidina del complejo. Ahora volvamos a las evidencias en las que se basa esla visi6n del cicio celular.

Resumen En cada cicio dedivisMn m dlula tieneqlle replicarsil DNA. La mayorla de lascillllas tamble" aumentan y dllpllClIll totio su conUmldo. Durante la fase M los eramosomas repllcados se segregm. (por mitosis) ell ",ideos separ(l{los y In dillm se divide e,. dos (por citoc;',esis). La otm parte del cicio conocida por if.terfase es mucllO mas mrga. Este perlodo de crecimie,rto coIIUmlO comprende m fase S. en la cual tiene lugar m repllcaci6n del DNA, ydos l(lpsos de tiempo. lasfases G, y G. elltre mfase S y m fase M. La secuencia de procesos del cicio celumr esttf regllimla por un sistema de control del cicio celultJr que cicllCilmenle pondrti en marclw los procesos bdsicos de Ia reprot/uaMn celular, IDles comO In replicaci6n del DNA Y Ia segregaci6" eramo· s6mica. En el coramn del sistema encontramos un conjunto de complU!$tos protei. cos fOrmatkJ btfsicamente por tfus clases tk componentes: subunldades de prote{na q,dnasas (lmmadas prolefnas Cdk) y unas prote(nas activadoras llnnuuJas cidinns.. EI cicio celumr nonnal esld regulado al menos por dos compuestos proteioos -uno un punto tk control al final tk In fau G poco antes tk lafaR 50 y otro al final tk In " faR Gt poco antes tk la fase M. Estos complejos proteicos eJercen III colltrol a traves de sus actillidades quinasa, que u acliwJII y desaaivan de repente en plmros concretos del cif:lo.

EI cicio celular de los embriones tempranos y la funci6n del MPF' En un cieJo caracterfstico la c~llIla pasa, antes de poder dividirse, por un perfodo de ctecimiento con el objetivo de duplicar todo su DNA Ylodos los componen· tes de su citoplasma. Esto supone liempo -un perfodo variable de tiempo si el emomo es variable. As! pues el cicio celular tfpico se prolonga, y se requieren mecanismos de control que garanlicen que todos los pteparativos indispensa· bles previos a la divisi6n se hayan completado en la secuencia correcla. Los embriones temptanos de muchos animaJes experimentan ciclos de divi· si6n celular que son atfpicos: lienen lugar sin crecimiento y se suceden a una ve· locidad extraordinaria y sin la mayorfa de controles y revisiones habituales. Es· t05 ciclo! celuJares de embriones lempranos nos muestran oomo trabaja el sistema de control celular, desnudo y sirnplificado hasta los mfnimos necesarios para conseguir el requerimiemo mas fundamental -Ia duplicaci6n del genoma y su segregaci6n en dos celulas hijas. Aunque estos ciclos celulares son excepcionales. i1uminan los meeanismos del cicio de divisi6n en tOOas las relulas eucariOlas. En esta secci6n vetemos c6mo estudios de ciclos de embriones lempranos de la rana Xenoplls nos Uevan a la identificaci6n del MPF como componente central del sistema de control celular; tralaremos edmo el sistema de control simplificado efectua sus ciclos repetidos de aClivaci6n y desaclivaci6n del MPF y tambien veremos c6mo cada uno de estos ciclos del sistema de control conduce precisamente a una ronda de teplicaci6n y segregaci6n cromos6mica. EI cicio cclular de los embrlones lempranos y la funci6n del MPF

933

EI crecimiento del oocito de Xenopus esta equilibrado por la divisi6n del huevo s EI huevo de Xenopus, como el de muchas otras especies, es una celula esferica gigante (Figura 17-12), de un poco mas de un milimetro de di~metro. Por 10 tanto su citoplasma es 100 000 veces mayor que el de una celuJa de tamano media· no, pero contiene un tinico ntideo. EI citoplasma se lIena de maleriales de reser· va que necesitani para la formaci6n del renacuajo. Estos materiales se han acumuJado durante un largo perfodo de crecimiento del huevo inmaduro, conocido como oociro, mientras esta en el ovario de la madre. De esla manera el embri6n temprano se ve relevado de la necesidad de encontrar aIimento y puede desarrollarse rapidamenre en un organismo vivo independiente capaz de arreg1arselas solo (Figura 17-13). Para preparase para su fusi6n con un espennatozoide, el OOCilo en crecimiento se ha embarcado tambien en un proceso de meiosis, al final del eual ver<1 reducido su mlmero de cromosomas a la mitad de 10 normal. La redueci6n se consigue a traves de una sola elapa de replicaci6n del DNA seguida de dos divisiones celulares especiales en las que no hay m<1s replicaciones del DNA (tal como se explica en el Capftulo 20). EI crecimient'O del oocito se produce a 10 largo de un amplio perfodo. durante el cualla progresi6n mei6tica se deliene en un estadio Jlamado uadicionalmente profase mei6tica, perc mejor descrito como rase G2 del primer cicio de divisi6n mei6tica: este PUnlO de detenci6n, justa antes de enuar en la fase M, corresponde al PUnlO de control G2 del cicio celular caraclerfstico. Para que se produzca un huevo madura, diversas honnonas acrnan en eJ oocilO, desbloqueando la delenci6n de G z y provocando que el oocita progrese a traves de la meiosis hasla que lIegue a detenerse en OtTO PWlIO no habitual de parada, en la fase M de su segunda divisi6n mei6tica (Figura 17·14). En eSle es· tado el huevo desciende por el oviducto, es fecundado y pueslO. La fecundaci6n desencadena una serie sorprendente de divisiones celulares en las cuales la relula gigante se divide, sin crecer, generando un embri6n que consiste en miles de celullis m<1s pequelias (vease Figura 17-13). En este proceso prtkticamente las unicas macromoleculas sintelizadas son de DNA -necesarias para producir los miles de nucleos- junto con una pequefla eanlidad de prolefna. Despues de la primera divisi6n, que dura unes 90 minutos, las II divisiones siguiemes se suceden, mas 0 menos sincr6nicamente, a intervalos de 30 minutos, produciendose aIrededor de 4096 (2 12) eelulas en unas 7 horas. Cada cicio eonsta de aproximadamente 15 minutos de rase M y 15 minutos de interfase ocupada principalmente par la sfntesis de DNA. No sc han deteetado fases G] 0 G2•

.1 ooelto crec••in dividirM (meA.)

mallcha p:1lida cen:a del apice nos indica la eoloeaci6n del m'ieleo, el eua! ha desplazado el pigmenlo pardo de la eapa de la superficie del citoplasma del huevo y euya envolturn se ha rolO durante el proeeso de maduraci6n del huevo. {CoTlesfa de Tony Mills.)

Flgun.17.13 FJcredrnlen.todeioodtoy Iassegmentadonesen un huew de XDuJPIU. El oocito aece durante muchos meses en eI ovano de una rana hembra, sin dMdirse. y finalmente madura en forma de huC\'O. En Ia fccundaci6n, eI hUC\'O se divide muy rnpidamentc..-inicialmenle a una veklcidacl de un cielo de divisi6n cada 30 minutos- formando un renacuajo pluricelular en uno 0 dos
-([J)_~J rlln, lIdultl!l

CapftuJo 17 : El cicio de divlsi6n eelular

17·12 Unhuevomadurode

• 1hullYO fecund.do .. divide.in creclml.nto (hor,s)

e-~0-0-@-~-0-CD

934

Figura

Xenopus IISlo para la fecundacl6n. La

ooeilo

MADURACION

lIuevo

IveSIC~~;~~~;;ol) -r

"(!jUCleo

embri6n

MEIOSIS I OFECUNDACIONnc!JUcleo diploide DIVISION

®

oocito parado en lase G2 de la meiosis I

ACTIVACION

corpuscuio rase M de polar ooeito la meiosis I parado en lase M de la meiosis II

I

---

®

corpusculo polar

huevo feeundado en interfase

Un regulador citoplasmatico, el MPF, controla la entrada en la mitosis6, 7

I

I

Dos experimenlOs cruciales establecieron la existencia de un mecanismo de control citoplasm
INYECCION DE CITOPLASMA DE UNA CI!:LULA EN FASE M

\

IAI

lIusa f6cilmente detectable en Ie superfieie de la eelula

EL OOCITOES CONDUCIDO HASTA LA FASE M

INYECCION DE CITOPLASMA DE UNA CI!:LULA EN INTERFASE

Figura 17-14 Maduracl6n y

actlvacl6n del huevo de Xenopus. Las actuaci6n de diversas hormonas sobre el oocito wando este ha completado su crecirniento, 10 conducen de su eSlado de reposo en G2 a la fase Mde meiosis: cornpleta su primera divisi6n mei6tica y se queda en reposo en la metafase de su segunda divisi6n mei6tica. Ahora, en este nuevo estado, se denomina IlUelio maduro, y es puesto. Las dos divisiones mei6ticas se suceden una a olra r{ipidamente, sin que intervenga la fase S; los cromosomas continuan condensados a 10 largo de todo eSte perfodo. La fecundaci6n saca al huevo del reposo de la metafase, de rnanera que este completa su segunda divisi6n mei6tica y entra en la interfase de su primer cicio celular embrionario. Cada ulla de las dos divisiones mei6ticas genera Ull celula grande ~un futuro huevo- y una celula pequena, Hamada corpusculo polar, que finalmente degenera.

Figura 17-15 EnsayodeMPF

medlanle Inyeccl6n en un oocllo de Xenopus. EI MPF puede ser detectado

\

porque conduce al oocito hasta la fase M. EI gran micleo (o vesfcula germinal) del oocito se rompe cuando se forma el huso mit6tico.

181

EI cicio celular de los embrlones lempranos y la funcl6n del MPF

fLOOCITO PERMANECE EN FASE Gl

935

ctilul. m1161ic.

dlul. en fu. G 1

inducci6n de .. coodenuci6n de cromosom.. de un. ceful. en f.M Gl

ctilula miI61;c,

dlula an fase S

inducci6n de 1. coodenlllci6n de

cromosoma& de un. celul. en f'M S

cromOlomu humano. en metafne

cromosomn humano. en metafllle

Figura 17·16 Resultados oblenldosal fuslonar una cclula de mam{fero en mitosis con unacelula de marnffero en Interfase. Las ceJulas son inducidas a fusionarse, anadicndo al medio de cuhivo un agcnte apropiado (vease ptlg. 170). El ndelco en In!crfase es conducido directamente hasta el cSlado dc mitosis, con cromosomas condcnsados, independiemememe de su eSlado de replicaci6n. Las fOlograflas mueslran fusiones de relulas humanas con ctHulas de marsupiales (celulas PtK) en inlerfase. En (A) 1a celula P1K eslaba ell fase G1: consecuentemente sus cromosomas, condensados prematuramente, todavfa son cromatidas. En (8) 1a celula P1K estaba en rase S y su cromalina adopta un aspeclo ~plumulado~. En (ella cclula PtK estaba en rase G: y ahara las cromatidas, aunque rouy largas en comparaci6n con los cromosomas metar
Las oscilaciones de la actividad MPF controlan el cicio de divisi6n celular8 Los huevos y oocitos de Xe,lOpus suministtan una gran Fuente de materiallanlO para purificar el MPF como para comprobar su actividad. Una vez purificado, se descubri6 que el MPF era una protefna quinasa que fosforila protefnas sabre 936

CapUulo 17: EI cicio de divisi6n celular

dlul. mit6tic.

Clilula en fase G l

induoci6n de la c:ondens.IlciOn de cromo.om.. de una c6!ul. en f _ G:

cromOlomll1 hum.nos en metafeae

residuos de serina y treonina y que esta compuesta de dos unidades basicas -una quinasa dependienre de ciclina (Cdk) denominada Cdc2 y una ciclina mit6tica (Figura 17·17). Sin embargo. incluso antes de ser purificado y caraterizado bioquimicamente fue posible demostrar el papel decisivo que desempena el MPr en el cicio celular. Experimentos utilizando el ensayo del oocito can muestras de citoplasma de ciclos celulares de embriones tempranos. asf como de oocitos maduros y de huevos. muestran que la actividad del MPF es alta durante toda la mitosis y baja durante la interfase. alcanzando un maximo cada 30 minutos en un huevo en divisi6n. Es mas. sabemos que la actividad del MPF es un rasgo universal del cicio celular eucariota: en tOOas las especies, desde las levaduras a los mamfferos. las celulas que estan en mitosis contienen actividad MPF que puede ser detectada can un ensayo de inoculaci6n de oocitos. Rapidamente se estableci6 que los increment'Os de actividad MPF que se producen cada 30 minutos provocando la escisi6n del embri6n de Xetlopus, se generan debido a un oscilador citoplasmalico que actua incluso en ausencia de un nucleo. Comprill1iendo un huevo activado antes de que haya completado su primera divisi6n. se puede separar en dos partes-una con un nudeo y 1a otra sin nucleo. Como era de esperar. la parte con nucleo sigue la programaci6n normal de rapidas divisiones. Sorprendentemente. la parte sin nucleo tambien experimenta una serie de oscilaciones, en forma de cidos repetidos de contracciones yendurecimientos de la corteza citoplasmalica. Estos espasmos recurrcntcs ocurren en sincronfa casi perfecta can las divisiones par escisi6n de la mitad del huevo con nudeo (Figura 17-18). Un huevo de eslrella de mar cuyo nucleo ha sido extrafdo, mdavfa va mas alia: en el caso de que retenga un cel1lrosoma, se escindira repetidamente formando celulas cada vez mas pequeflas, tOOas elias sin mideo. Si tomamos muestras de citoplasma a diferentes tiempos, de la celula de Xenopus sin nucleo y se ensayan par inyecci6n en oocitos, se puede demostrar que las oscilaciones visibles reflejan oscilaciones de la actividad MPF. Evidentemente en estas celulas gigantes las oscilacioncs que dirigen los cidos de divisi6n se producen de forma independiente a cualquier scf'ial que pueda emitir la rclati· vamelUe pequefla cantidad de DNA que normal mente se halla presente en la celula. Luego veremos que no ocurre 10 mismo en los cidos celulares lipicos, en los que actuan estrictos mecanismos de control asegurando que la replicaci6n cromos6mica y la divisi6n celular se acoplen correctameme.

ciclina mltOI;C8 qUIMSB

dependianla o.cielirlll Cdc2

,

Flgura17-17 Lasdossubunldades e1uvedel MPF. La subunidad Cdk se llama Cde2 debido al gen de la levadura de fisi6n que 10 codifica.

La acumuJaci6n y Ja destrucci6n de ciclina cont.rola

la activaci6n y la inactivaci6n de MPF9 Aunque los cidos de divisi6n en el elllbri6n en escisi6n pueden tener lugar en ausencia de DNA. no pueden ocurrir en ausencia de sfmesis de protefnas: si bloqueamos la sfntesis de protefnas aI inicio de la interfasc evitamos tanto la activaci6n del MPF como la mitosis siguiente. La explicaci6n de esta observaci6n qued6 clara can la identificaci6n de la c1cUna.

tiempo

I'" t. lecundeeiOn _

EI cicio celular de los embriones tempranos y la funci6n del MPF

Figura 17-18 UnhuevudeXenopwsc divide en dos partes-una ron ndeleo y la otn sin ~1. Se tensa un cabello humano alrededor del huevo para partirlo ell dos. La mitlld que conticnc eI nudeo continua dividiendose; la otra mitad, sin nudeo. no se divide. Las instantdneas cinematognificas, sin embargo, muestran que la pane sin nudeo cambia de tamallo peri6dicamenle mediante cambios en In dureza de su coneza celular, oscilando en clara s[ncron(a can las divisiones de la mitad dcl huevo que tlene mldeo. (De K. Ham, P. Tydeman y M. Kirschner. Proc. Nail. Acad. Sci. USA 77:462-466. 1980.)

937

--

-c,,....

MPF ...

ciclinl

cielina A cielina B riborll1c1a6tido

reduclasa

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_*''l'

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$e estudi6 In sfntesis de protefnas en huevos fecundados de erizos de mar (cuyo cicio celular es similar al de los embriones de Xenopus) fecundando un conjunto de huevos en agua de mar que comenla un aminoacido radiactivo (metionina·35SJ, eXlrayendo mueSlras peri6dicamente, y corriendolas sabre un gel. Una vez separadas en el gel, se podian detectar las protefnas reden sinteti· zadas gracias a su radiactividad. Estos experimentos revelaron que mientras que la mayor!a de 1a prolcfnas se acumulan continuamente despues de la fecundaci6n, un tipo de protefnas sigue un patr6n peri6dico: se acumulan de manera continua duranre cada interfase hasta la transici6n de la metafase-anafase, yenronces se destruyen de repente (Figura 17-19). Esta secuencia de procesos ha motivado que a dichas prolefnas se les denomine ciclinas y ha conducido a la hip6tesis de que para activar el MPF una 0 mas ciclinas tienen que alcanzar un umbral de concentraci6n, y que la destrucci6n de la ciclina eSla acoplada a la inactivaci6n del MPF y la salida de la celula de la milosis. EI desarrollo de extract os libres de celulas que siguen el cicio celular in vitro fue crucial para dilucidar el papel de la ciclina. Estos extractos se prepararon centrifugando huevos de rana para romperlos y asf abrirlos y poder recoger su citoplasma. EI nucleo de un espermalOzoide afiadido a dicho extracto de citoplasma puede hincharse, replicar su DNA y experimentar In mitosis tal como harfa en un huevo fecundado: de este modo nos sirven de indicadores de la fase del cicio celular en la que se encuentra el extracto (Figura 17-20). Si emonces se deslruye todo el mRNA existente en el extracto, el cicio celular se detiene en la interfase, tal como ocurre cuando se inhibe la sfntesis de protefnas en un embri6n.

citoplasma de hllevos de rans sctivados

nucleo del espermatozoide de rans

~-~ ~I

cicio celllier libre de c6lllles; dllrsci6n entre 40 y 60 minlltosl

938

Capftulo 17 : EI cicio de divisi6n celular

Flgura17-19 lncrementoy decremento de los nlveles de clclina y de MPF durante el cicio celular de embriones lempranos. Las mediciones de ciclina se han hecho principalmente en huevos de invertebrados marinos, dande la ciclina representa e15% de la protefna sintetizada durante un breve pulse con aminOlkidos radiactivos. Los geles de la parte inferior del grafico muestran las cantidades de dos variedades, A y B, de ciclina marcada en diferentes estadios del cicio de un huevo de almeja. La lfnea inferior de los geles muestra la sintesis de una enzima conslitutiva, como una estandar de referencia. (Adaptado de T. Hunt, F.e. Luca y J.Y. Ruderman,). Cell Bioi. 116:707-724,1992.)

FIgura 17-20 Ciclos en un sistema lIbre de Cl!lulas. Se fracciona un gran 11l1mero de huevos de rana activados, mediante una cenlrifugaci6n suave, la cual tambien separa el ciloplasma de otros cornponellles. Se recoge e[ citoplasma no diluido y se Ie ai'13de un nudeo de espermatozoide yATP. EI nucleo del espermatozoide se descondensa y experimenta ciclos repetidos de mitosis y replicaci6n del DNA. 10 cual indica que en eSle extracto citoplasmMico libre de celulas actua el sistema de control celular.

Hay que destacar que basta con aiiadir mRNA de delina purificado para restablecer la capaddad del extracto para aClivar el MPF e indudr la mitosis, 10 cual indica que la faha de sfntesis de delina en el extracto vadado de mRNA es sufidente para detener el delo. La hip6tesis mas simple serfa que nonnalmellle, en cuanto la concentrad6n de cielina alcanza el umbral necesario, se desencadena la activad6n del MPF. En realidad, tal como ya se ha dicho, el momento de activad6n del MPF no se regula exelusivamente mediante la delina sin6 que depende tambien de la regulaci6n de la subunidad de Cdk del MPF por parte de o!ras protefnas. EsIOS otros comroles son diffciles de investigar en el embri6n de Xenopus, pero pueden ser descifrados mediante los conocimicmos de la genetica de las levaduras, tal como trataremos mas adelante.

La degradaci6n de la cicLina desencadena la salida de la mitosis lO La destrucci6n de la delina es tan importame para la salida de la milosis como su sfntesis 10 es para entrar en ella. NormaJmente la delina se deslruye de repente por proteolisis en la transid6n metafase-anafase. Esle proceso necesita una secuencia senal en la cadena polipeptfdica de cielina que dirige a la molkula a su degradaci6n (proporcionando un lugar para la uni6n de la ubiquitina -vease pag. 232), y depende de la activaci6n del MPF. La funci6n de la degradaci6n de la ciclina ha sido eSlUdiada construyendo una forma truncada de delina que es capaz de estimuJar la activaci6n del MPF pero que no puede ser degradada porque carece de la secuencia senal adecuada. Si se 31iade mRNA de la delina indestructible a un ex:lracto del cielo celular de rana, el extracto entra ell mitosis pero no puede salir de ella. Asf pues, la activaci6n de MPF que induce la mitosis necesita la sfntesis de la delina, y la inactivaci6n del MPF que nos conduce a la pr6xima interfase necesita la degradaci6n de la ciclina. La ciclina es un componente esencial de MPF y se encuentra en todas las celulas eucariot'as. Tal como mendomibamos anteriormente, hay muchas variedades de delina. fabricadas por una familia de genes relacionados. La cielina mit6tica mas grande se conoce como ciclina B. Los delos celulares tipicos tambien dependen de otras cidinas diferemes: las ciclinas G paniculannente. parecen " dcsempefiar un papel central en la activad6n de la proleina quinasa que saca a las celuJas de Gl y las conduce de lIeno a la repLicad6n del DNA. Las principales evidencias de que disponemos sabre estos hechos tambien provienen de estudios geneticos de levaduras y se trataran mas adelante.

El MPF puede actuar como autocatalftico, estimulando su propia activaci6n 6 Ex:perimentos efectuados en oocitos de Xenopus sugieren una ex:plieaci6n para una caraelerfSlica mas del MPF -esta vez sobre su repemina activaci6n todo 0 nada en el comienzo de la milosis. Si se inyecta una pequena cantidad de MPF activo a un oocito en reposo. el oocito genera mas MPF activo, 10 cual implica que la producci6n de MPF activo es un proceso autocatalftico. En resumen el sistema de control del delo eeluJar actua de la siguiente fonna: la gradual acumulad6n de cielina actua como una mecha retardada, la cual finaJmente provocani la ex:plosi6n aUlocatalftica de la actividad del MPF que pondra en marcha los primeros procesos de la mitosis que iniciamn la destrucci6n de cielina. Con la destrucci6n de la cielina termina la actividad MPP, y empieza un nuevo proceso de acumulaci6n de cielina.

EI MPF activo induce los procesos subordinados de la mitosis ll EI MPF tiene que cousar muchos cambios radieales dentro de la celu.la para conducirlo a la mitosis. Los cromosomas han de condensarse. la envohura del nueleo ha de romperse y el ciloesqueleto ha de reorganizarse fonnando un huso mit6tico. EL MPF induce todos estos procesos bAsicos mediante su activiFJ cicio celular de los embriones tempranos y la funci6n del MPF

939

dad protelna quinasa. Produce directamente algunos cambios mediante la fosforilaci6n de algunos elementos esenciales de la arquitcctura celular. Otros procesos pueden inducirse indirectamente -por ejemplo, mediante fosforilaciones que act ivan otras protelna quinasas que actuan en cascada alterando considerablemente el estado celular. La rotora del nucleo requiere la desorganizaci6n de la lamina nuclear-Ia cubierta de filamentos potimerizados de laminina (tratad" en el Capftulo 12). EI MPF cataJiza cSle proceso directamente, forzando a las moleculas de laminina a descnsamblarsc al fosforilarlas en residuos clave de scrina (vease Figura 12-18). En celulas que contengan lamininas mulantes, obtenidas mediante ingenierfa genetica, en las que no existen lugares para la fosforilaci6n del MPF, la lamina nuclear es incapaz de desmantelarse durante la mitosis. aunque la envoltura del mkleo se rompa en vesfculas y otros pracesos de la mitosis acurran casi con nonnalidad. OlTa de las moleculas que puede Cosforilar directamente el MPF es la histona HI, la cual interviene en el empaquetamiento del DNA en los nucleosomas. Es posible, perc no esta probado, que la fosforilaci6n ayude a la inducci6n de la condensaci6n cromos6mica. El MPF cambia el comportamiento de los microtubulos en mitosis fosforilando las protefnas asociadas a los microrubulos. Durante la interfase el centrosoma nuclea largos microtubulos que se extienden por todo el dtoplasma. En la mitosis esta fonnad6n citoplasm.\tica de microtubulos se desmonta y los centrosomas nuclean un gran numero de microtubulos mas pequenos y menos estables, los cuales interactuan unos con ouos fonnando el huso mit6tico (tratado en el CapItulo 18). Esta transformaci6n reneja un cambia quimico en el centrosoma. en los microtubulos a en ambos a la vez, y esta transfonnaci6n puede ser reprodudda iI/ ";fro aiiadiendo MPF a un sistema de libre de celulas que contenga centrosomas, tubulina y Olros componentes del ciloplasma en intcrfase. Los dos componentes de MPF -Ia cicUna mit6tica y la quinasa Cdc2- pueden enc.ontrarse fuenemente wlidos a los centrosomas de la ct:!lula viva: se cree que la dclina mit6tica reconoce los componentcs del centrosoma y auae la quinasa Cdc2. Aunque los procesos no se conacen con detalle, esta claro que el MPF induce directa 0 indirectamente las fosforilaciones de muchas proteinas. Para salir de la mitosis las celulas tienen que invertir estas fosforilaciones; se ha dcmostrado en moscas y levaduras de fisi6n que las mUlaciones que inactivan la proteina fosfatasa I -una de las mayores fosfatasas de uso general en la celula- evitara 0 retrasara en gran manera los procesos subordinados que normalmenle siguen a la inactivaci6n del MPF, tales como la reconstmcci6n de la envoltura nuclear.

EI sistema de control del cicio celular permite tiempo suficiente para que se produzca una ronda de replicaci6n del DNA en cada interfase lZ Hasta ahora hemos visto de manera resumida c6mo se activan e inactivan peri6dicamente los componentes del sistema de control celular. haciendo que la celula entre y salga de la mitosis, y c6mo los componentes activados desencadenan los procesos subordinados. Sin embargo los procesos subordinados requieren un intervalo de tiempo para producirse. iC6mo asegura el sistema de control que existe tiempo sufidente para que cada uno de estes procesos se neven a cabo completamenle. antes de poner en marcha el siguiente proceso? EI mas crftico de los procesos a los que hay que concederles un tiempo adecuado para que se produzcan. es la replicaci6n del DNA. $i el sistema de control activa la puesta en marcha de la rase M antes de que la replicaci6n del DNA se complete. la celula entra en una mitosis suidda, con sus cromosomas 5610 parcialmente replicados. Luego veremos que en los ciclos celulares tipicos la sefial de retroalimentaci6n de un DNA replicado de fonna incompleta detiene la progresi6n del sistema de control. prolegiendo a la celuJa de este tipo de un desastre de eSle tipo. 940

Capftulo 17 : EI cicio de divlsi6n celular

Durante los primeros ciclos embrionarios del desarrollo de una rana, sin embargo, estas seilales de retroalimentaci6n no existen. En eSle caso cl tiempo necesario para que se produzca cada proceso subordinado es predccible e invariable, gracias a las reservas nutritivas del huevo y aI enlomo prolegido del cmbri6n; por 10 lamo es suficiente que el sistema de control programe atravesar el ciclo a una velocidad adecuada, con descansos adecuados programados entre la puesta en marcha de un proceso y del siguiente. La DNA polimerasa y otros componentes necesarios para la replicaci6n del DNA estan permanentemente a punto y pueden complelar una ronda de replicaci6n del DNA antes de que el sistema de control pueda completar su ciclo. De hecho, el sistema de control en el embri6n temprano no es consciente de la progresi6n del proceso de replicaci6n del DNA, de forma que si la replicaci6n del DNA se detiene artificialmente mediante un inhjbidor de la sfntesis del DNA, la celula entta en una milosis desastrosa. Pareee que durante las primeras escisiones del embri6n la cantidad de DNA es sencillamente demasiado escasa en relaci6n con la cantidad de citoplasrna para que las senales dependientes del DNA puedan afeetar el sistema de control. En los 12 primeros ciclos de divisi6n. mientras el huevo se subdivide y se forman nuevos micleos. la proporci6n entre el DNA nuclear y el citoplasma aumema por un factor superior a 4000, y hacia el final de este perfOOo los controles de retroalimentaci6n del ciclo celular tfpico empiezan a actuar.

Un bloqueo de la re-replicaci6n asegura que ningl.in segmento de DNA se replique m:is de una vez en cada cicio celular 1 Es neeesario otro tipo de control para solucionar un problema complementario: al igual que es esencial que en cada ciclo celular se replique todo el DNA celular, es igualmente imponante que ningtin DNA celular se replique mas de una vez. La celula no sol~ciona este problema mediante la regulaci6n de la retroalimentaci6n del sistema f,te control del cicio celular sino mediante un dispositivo aUIOIimilanle denno del propio proceso de replicaci6n del DNA: como se Irata en el Capitulo 8, en cuanta se ha replicado. cada segmento de cramatina queda modificado de alguna forma tal que irnpide que se vuelva a replicar duranle el cicio celular actual. Aunque la naturaleza de este bloqueo de las re-repllcacloncs todavia es desconocida, cxiste una evidcncia clara de su existencia, y parece fundamenlal para el funcionamiemo del cicio celular en todos los eucariolas. Experimcmos realizados en cultivos de celulas de mamffero que eSl
El paso por la mitosis hace desaparecer el bloqueo a las re-replicaciones l3 EI bloqueo a las re·replicaciones tiene que desapareeer en algtin momento entre el final de G2 y el comienzo de la siguiente fase 5. para que se pueda inidar el pr6ximo cicio de replicaciones del DNA No se conoce de forma preeisa ni cuando ni wmo se elimina el bloqueo pero, a1 menos en el ciclo celular de embriones EI cicio celular de los embrlones tempnmos y la funci6n del MPF

941

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G, lnmedletamente In I... S; el nucleo eo I... 5 contll'll:" ~ r.pie.ci6n del DNA

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IMl proglllmll temponl

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tempranos. esle cambia parece depender del desmantelamiento de la envoltura del mideo, en la mitosis. Los experimentos que 10 demuestran tambien iluslran edma el sistema de control del cicio celular conduce los cromosomas a traves de cielos de replicaci6n y segregaci6n, en estricla a1temancia. Como hemos discutido previa mente, el sistema de control del cicio celular de embriones Icmpranos puede aClllar en extractos de hucvo de rana lib res de celula, donde pucde detenerse en la intcrfase al bloquear III sfntesis de protefnas o conducirse hasta la fase M, afiadiendo MPF. Un nucleo de espermatozoide anaelido a un extracto detenido en la interfase sufrini exactamente una ronda de replicaciones del DNA y se detendni. Esto es asi no porque haya habido algUn cambio en el extracto (el cualtodavfa puede provocar la replicaci6n de olro n(icleo, anadido posterionnente) sino porque se ha producido un bloqueo de re-replicaciones en el n(icleo del espennatozoide. Si se afiade MPF aI extracto, el n(icleo se desmonta y cuando se recompone (tras la inactivaci6n del MPF), solamente experimenrarn una ronda adicional de replicaciones del DNA y se detendm de nuevo. De este modo cada incremento de actividad MPF concede al n(icleo una licencia para experimentar una ronda de replicaci6n. Aunque la naturaleza de esta licencia no se conoce, existen pruebas que sugieren que depende de un factor citoplasm
942

Capitulo 17: EI cicio de divisl6n celular

Flgura17·21 E1bloqueodelasrerepUcaclones: evidenclas a partir de

experlmentos de fusl6n c:eluiar con ctHuias de mamffero cultlvadas. Los resullados mueslran que los ciloplasmas en fase 5 contienen faclores que haecn que los nudeos en G1 entren directamente en proceso de sfntesis del DNA (A); sin embargo, los nudeos en Gl , que ya ha replicado su DNA. son refractarios a dichos faetores (B). NOlese (jue la fusiOn de lJlll! cl!lula en G2 con una celula en G1 no haee (jue el nudeo G 1 lnlcie la sfntesis de su DNA (C); por 10 lanto, los factores cilOplasm:hlcos parala replicatiOn del DNA que estaban presentes en 1a ctHula en rase 5 desaparecen coando la eellila se traslada de la rase 5 a la rase Ga.

Para avanzar en la explicaci6n sabre el sistema de control celular, y para ver de qu~ forma las celuJas coordinan procesos mas complejos del cicio celu.lar tfpico, (enemas que pasar desde los embriones tempranos de rana a las levaduras, en las que se puede tratar el problema desde el punta de vista gen~tico.

Resumen Los embriones temprarws de mucluu espedes an/mares uperimelltan dclos ululares exupdonalnumte rtfpldos, a travis de los crudes el gran huevo se subdiuith en mucluu dlulas nuts pequeilas, sin aumentar de tamnilo. £Stos dclos celillares de embrlo"es tempra"os, en los cludes las fases S y M se alterna" y se sru:ede" rtfpida",ellte S;1l que se produzcan fases G, y G, nos muestran como aenia el sistemn de colltrol del cicio celulnr ell su forma nuis simple. E1 componente fimdnmentnl del sistema de co"trol del cicio ululnr es una promCna qubrnsa, flamalln MPF. cuya actfIIUCi6", mediante"n exploslvo proceso autocataUtico, CO,ulllce a In dl,,1n a In mitosis; la inactivacion de MPP pentlite a la dl,,1n salir de In mitosis y replicar su DNA El MPP se activa e ;'Iactiva clcllcamente en los clclos embrlonarlos tempranos int/epelUliellleme"te del 1I/1cloo. Co,tsla de dos sllbllllJlIndes prlncJ,mles -"na qulnasa depemlle"te de clclina, rnmomhuula Cdc2, y clclina. Cdc2 tiene que asociarse con cIeli"a ,Jara adqll.iriractillidnd MPP. La deslrucciotl de In cicll,,,, Illactiva el MPP etl eE plmto de salida de la mitosis, y Ja acllllll4lncJ6n de ciclilla acalKuln de silltetlzar permite In reactivaclon de MPP ell el cicio s;guiente. En estos embr;olles tempranos, eE tiempo necesarlo pllra reactlvar el MPF es suficienle pllra pemlillr wla linJca ronda de replicadon del DNA Tras ser replkado. sobre aula segmellto de DNA actUn 1m mealllismo de bloqlU!o de re-replicnclones. el cllal solanrellte se eli",ina cuando In dll,ln atraviesa In mitosis. De estafonna, el sistema de co"trol celulnr dirige rolUlas alternas de repllcndon del DNA yde segregacion cromosdm;ca.

Las levaduras y la genetica molecular del sistema de control del cicio celular14 Las levaduras son hongos unicelulares -un grupo amplio y hClerogeneo de orga-

nismos eucarioras. Son ideales para el estudio gen~tico de la biologfa celular de los eucariotas porque se reproducen casi tan rapidamcmc como las bacterias y tienen un genoma cuya tamano es menor de 1/100 parte que el de un mamifero. Las levaduras y las ranas presentan ventajas complemcmarias para el estudio del cicio celular pero lambien desventajas. Las levaduras son muy adecuadas para In identificaci6n, el clonaje, y In caracterizaci6n de genes que control an el cicio cclular, pero son demasiado pequciias para parler efectuar microinyecciones, y sus cidos celulares son mlts complejos y todavfa no pueden ser reproducidos en sistemas lib res de celulas in vitro. De todas formas eSlOS dos organismos, muy diferentes entre sf, utilizan maquinarias del cicio celulares basicamente similares y. conjumamente, nos han permitido diseccionar los distmtos componeoles del sistema del control celular. Las dos especies que trataremos son la levadura de gemacl6n Saccharomyces cerelluiae, utiJizada par cerveceros y panaderos, y la levadura de flsi6n Sel,;zosacclJaromyces pombe, CllYO segundo nombre se debe a la cerveza africana en cuya fabricaci6n se usa. Aunque los linajes evolutivos que conducen a las levaduras de gemaci6n y las levaduras de fisi6n divergieron hace muchos ciemos de miles de anos. ambos organismos tienen ciclos celulares parecidos. Amhas levaduras pueden proliferar tanto en estado diploide como haploide: las celulas diploides pueden experimentar meiosis formando celu.las haploides. como una allernativa a la divisi6n habitual (v~ase Capftulo 20); las c~lulas haploides, como una ahernativa a la divisi6n, pueden conjugarse unas con olras formando relulas diploides (Figura 17-22). La fase haploide facUita el aislamiemo y el esludio de mUlaciones que inactivan un gen, sin la complicaci6n de tener una segunda copia de dicho gen en la c~lula. En ambas especies de levadura, la nutrici6n y el Las levaduras y la genetlca molecular del sistema de control del cicio celular

943

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ClelO VITAL DE LAS LEVADURAS DE GEMACION

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ClelO VITAL Of LAS LEVADURAS DE FISIQN

sexo juegan partes importantes en el control del cicio de divisi6n cclular, por 10 que estos organismos pueden ser utilizados para investigar In generalidactes de la regulaci6n del cicio de divisi6n por parte de factores ambientales y de las interacciones celula·celula.

El crecimiento celular requiere una interfase prolongada can puntas de control del cicio celular 3 , 15 EI cicio celular de la levadura es mas complejo que el del embri6n temprano de rana porque una levadura, como la inmensa mayorfa de las celulas, tiene que crecer antes de dividirse. Como una celuJa necesita mas tiempo para duplicar el total de su masa que para replicar su DNA y segregar sus cromosomas, el cicio celular de celulas en crecimiento consla de inlerludios G 1 Y Gz -G 1 entre el final de la rase Myel comienzo de la sfntesis del DNA, y Gz entre el final de la sfntesis del DNA y el comienzo de la fase M. Tanto G] como Gz permiten la exis(encia de controles que acoplen la duraci6n del cicio celular al ritmo de crecimiento celular. Para manlener constante el tamano de la celula, la duraci6n del cicio celular tiene que encajar perfectamente can el tiempo que necesita la celula para doblar su tamano. Si eltiempo del cicio es mas corto que elliempo que necesita la celula para doblar su tamano, las celulas seran mas pequenas en cada nueva generaci6n; y a la inversa, si el tiempo del cicio celular es mas largo que el tiempo que necesita la celula para doblar su lamai'io, las celulas seran mas grandes en cada generaci6n. Debido a que el ritmo de crecimiento de una celula esta a la merced del entorno, y varian1 segtin el suministro de alimentos y OlrOS factores, necesariamente la duraci6n del cicio celular sera ajustable (Figura 17-23). Para conseguir esta coordinaci6n, el control del cicio celular tiene puntos de control de tamaTla especfficos en los cuales el sistema de control se detiene y espera hasta que la celula ha alcanzado su tamano crftico. Estos puntos de control tienen lugar tanto en Gl' permitiendo al sistema detenerse antes de una nueva ronda de replicaci6n del DNA, como en Gz' permitiendo la detenci6n del sistema antes de que se desencadene la mitosis. Aunque ambos puntos de control actuan en todas las celulas, el punta de control G1 es mas importante en algunas celulas y el punta de control Gz en 944

Capftulo 17: EI cicio de divlsl6n celular

Figura 17-22 Ciclos vitales de una levadura de gemacl6n (Saccharomyces cerevisiae) yde una levadura de flsl6n proporci6n del cicio vital destinada a los estados diploide y haploide yarra con las especies y depende del entorno. Cuando en el medio hay mucho alimento, las variedades salvajes normales de la levadura de gemaci6n proliferan como celulas di!>loides, y la duraci6n de su cicio celular es aproximadamente de 2 horas. Si se colocan en situaci6n de ayuno, entran en meiosis y forman esporas haploides, las cuales germinan cuando las condiciones rnejoran y forman celulas haploides que pueden proliferar 0 fusionarse sexualmente (conjugarse) en fase G] formando celulas diploides, dependiendo del enlorno y de Q[ros factores. Las levaduras de fisi6n, pOT el contrario, normalmente proliferan como celulas haploides, y en condiciones de ayuno se fusionan formando celulas diploides que atraviesan nipidamente la meiosis y la esporulaci6n y regeneran celulas haploides. Las cepas de levaduras de gemaci6n mas utilizadas en ellaboratorio son celulas mutantes que puedell proliferar, igual (lue las levaduras de fisi6n, como celulas haploides.

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(AI SIN CONTROL NUTRICIONAL DEL CICLO CELULAR

(B) CON CONTROL NUTRICIONAL DEL CICLO CELULAR

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2

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reducei6n de .. nutriei6n

•

5 6 7 unid&des de tiempo _

o

2

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redooci6n de .. nutriei6n

alms, dependiendo de d6nde se apliquen el control de tamano a la mayorfa de los controles ambientales. Asf pues en la levadura de gemaci6n el punta de control GI' Hamada Inicio, es el punta de conlrol de lamano m
Las levaduras de fisi6n y de gemaci6n cambian de forma a medida que van progresando a 10 largo del cicio celular l4 Aunque las levaduras son modelos .Hiles para el estudio del cicio celular tfpico. sus ciclos difieren en algunos aspectos de los de una celula animal a vegetal. Como lados los hongos, mantienen su nucleo celular intacto a 10 largo de la mitosis: se forma un huse mil6lico dentro del nuclec, y despu~s de que la segregaci6n cromos6mica se ha complet'ado. el nucleo se divide por la milad. Adem
•

5 6 7 unid&des de liempo _

Plgura 17·23 Control dellamafto celular mediante el control del cicio

celular. Los diagramas muestron la relaci6n entre el rilmo de crecimiento de In celula, el tama/10 ceJular y el cicio de divisi6n celuJar, en un orgrlllismo de vida Iibre como la levadura. (AJ Si la divisi6n celular continuara a un mismo rilmo cuando las cetulas eSI
Las mUlaciones del cicio de divisi6n celular delienen el cicio en punlos espedficos; las mutaciones wee permiten al cicio saltarse un punto de conlrol de lamaiio l6 Los fundamentos de nuestro conocimiento actual sabre el cido celular de las levaduras provieneu de un esludio sislelm\tico de las mutaciones en los genes que codifican componenles de la maquinana del cicio celular. Para identificar los genes que conlrolan direetamenle el cicio celular. la investigaci6n se centr6 en dos fenotipos mutanles. En el pnmero de elias, tadas las cclulas mutantes se detenfan en el mismo punta del cicio celular. Los genes de eslas celulas mutanles se Uaman genes cdc (de Cell-Division Cycle. cicio de divisi6n celular); nonnalmente cada cdc mutante es deficienle en la fabricaci6n de un produclo necesario para que la relula supere el punlo especifico del cicio en el eual se detieL1en las celulas mmanles. La segunda dase de mutaci6n es la que Hamamos wee (~pequef1o" en escoccs), deb ida a que la divisi6n de dichas cclulas mut'antes da lugar a celulas de un tamano mtis pequeno de 10 normal. Se espera que las cclulas mutantes wee sean deficientes en un prodllcto que normalmente inhibe el paso par un punta de control de tamano. Las levaduras y la genelica molecular del sistema de conlrol del cicio celular

945

• LEVADURA DE FISION

/Schlzoucclll"omYCII pombeJ

( £3)(~I@)

(0 )

PUNTO DE CONTROL DE LA ENTRADA MITOTICA

PUNTO DE CONTROL DE INICIO

@ G,

t PUNTO DE CONTROL DE INICIO

PUNTO DE CONTROL DE LA ENTRADA MITOTICA

AI no poder complelar un cicio de divisi6n celular las celulas mutantes no pueden propagarse, las celulas mutantes cdc s610 pueden ser seleccionadas y conservadas si su fenolipo es condicionaf, es decir, solamenle si el producto genico no funciona solamente en algunas condiciones especificas. La mayorfa de las celulas mutantes condicionales son mutalltes sensibles a fa temperatura en las cuales la proteina mutante no funciona a altas temperaluras perc a bajas temperaturas funciona 10 suficientemenle bien para permitir que se produzca el cicio celular. Una linaje de celulas mutantes cdc sensibles a la temperatura puede hacerse crecer a baja temperatura (condici6n permisiva) y entonces puede subirse la temperattua (colldicio" restrietiva) para desactivar la funci6n del gen afectado. Todas las celulas seguiran su cicio hasta que alcancen el punta en el que la nmci6n del gen mUlante se haec necesaria para continuar progresando, punto en el que todas las celulas se delendran (Figura 17-25). En las levaduras de gemaci6n una detenci6n uniforme del cicio celular de este tipo se puede deteclar simplemente ahservanda las celulas; la presencia a ausencia de una yema y su lamana proporcionan una facH indicaci6n del punto del cicio en el que se encuemran bloqueadas las celulas mutantes. En las levaduras de fisi6n se necesitan unos estudios mas laboriosos para identjficar el proceso del cicio celular que ha fallado. Actualmente se conocen cerca de 70 genes del cicio de divisi6n celular, muchos de los coales se han clonado y secucnciado. Varias de elias codilican protei-

detencl6n debida a la elevada temperatura

I poblllci6n dll celulas escogidll al aZlIr antes de Que se eleve la tempe,aturll

detenci6n debida a la elevlld... tempereturll

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946

CapftuJo 17 : EI cicio de divisi6n celular

Figura 17-24 Comparacl6n entre los ciclos celulares de una levadura de flslon y una levadura de gemacion. La lelladura defisiDn rnostrada en el panel superior tiene el cicio celular normal eucariota con fasesG" S, G~ YM. Adiferencia de 10 que ocurre en las cclulas eucariolas superiores, sin embargo, la envoltura nuclear de las celulas de levadura no se desmonta: los microtubulos del huso mit6tico se fomlatl dentro del nuclen y se adhieren a los corplLsculos po/ares dellulSo (!Jerde oscuro) en su periferia. La celula se divide formando una tabicaci6n (conocida como la placa celular) y dividiendose en dos. La lelladura de gemacioll tiene fases G1 y S normales. No obstante. muy temprano en el cicio, durante la fase S, se empieza a fonnar un huso rormado I)or rnicrotubulos: de este modo parece no haber una fase S normal. A direrencia de la levadura de flsi6n, la cclula se divide mediante yemas. Como en las levaduras de flsi6n. pero a diferencia de las cclulas eucariotas mas desarrolladas. la envoltura nuclear permancce mtacta durante la mitosis. Los cromosomas mit6ticos condensados (mja) son faciles de vcr en la levadura de fisi6n, pero m
cdC2"

cltluls normsl

nas ya conocidas que participan en los procesos subordinados del cicio celular, tales como las DNA polimerasas que inlervienen en 1a formaci6n de los precur· sores de la sfntesis del DNA, que son necesarios para el paso a trav~ de la fase S. Sin embargo, un numero substancial de genes cdc y un gen wee clave, codifican componentes y reguladores del propio sistema de control del cicio celuJar.

Las subunidades del MPF en las levaduras son hom6logas a las del MPF en animales l7 Tal como mencionabamos anleriormenle, el PUnlO de control de lamafto mas illlponanle en el cicio de S. pombees el PUnlO de control de emrada en la mj{osis, si· lUado al final de~. En este pumo es donde nonnalmenle se detiene el sistema de comrol de la levadura de fisi6n, cuando la celuJa es mas pequefia de 10 convenien· Ie, para conceder liempo para el crecimiemo: una vez pasado este pUnlO de con· {folia celula se ve abocada a la mitosis. As' pues, estudios de la levadura de fisi6n nos proporcionan una ruta natural para la identificaci6n de los genes que codifi· can los componentes del sistema de control celular que conducen la celula a la mitosis, asf como de los reguJadores que acnIan en el sistema en cstc punto. EI momento de enlrada en In mitosis tambicn es el punto en el que se act iva el MPF en los ciclos celulares de los embriones tempranos de Xenopus, y ahora veremos que los esludios gencticos sobre la levadura de fisi6n convergen con los esludios bioqufmicos sobre Xenopus y nos penniten identiticar el gen que codifica la subunidad de Cdk del MPF y c1arificar el mecanismo de activaci6n del MPF. El hom610go de la subunidad protefna quinasa del MPF en la levadura de 6si6n esta codificado por un gen lIamado ctk2.. Estudios del cicio celular de un mUlante de esta levadura revelaron que el producto genico de edel resulta ser un componente decisivo y fundamenlal para conducir la ccluJa a la mitosis: si es defectuoso, la mitosis no tiene lugar: si se libera del control normal, la mitosis ocurre prematuramente. Los tests geneticos identificaron tres genes mas, wee!, elic2S, y cdcl3, cuyos productos regulan el funcionamiento del producto genico clic2 (Figura 17-26). Como discutimos a continuaci6n, la caracterizaci6n de estos productos genicos reguladores nos ha Ilevado al conocimiento actual sobre la regulaci6n del MPF. El descubrimiento de la relaci6n entre MPF y el produclo genico cdel se produjo gracias aI c10naje de cdc2. Existe una estrategia, sencilla y poderosa, para clonar el gen normal correspondieme a cualquier gen cdc mutante. CeluJas mutantes, incapaces de dividirse a elevadas lemperaturas (la condici6n de res· tricci6n), son transfectadas con ptasmidos que contiencn fragmemos de DNA, al azar, ete celulns normates. Ocasionalmente, algunas cclulas mutantes redbinin un fragmcnto de DNA que contendra una copia del gcn aie normal que falta en el mutante, y estas escasas celulas podran dividirse bajo las condiciones de restricci6n. Dc la progenie de eSfas celulas se puede recuperar el DNA del plasmido y obtener el gell cdc. Dicho gen puede ser secuendado y caracterizado y se pueden generar anticuerpos contra su producto genico. La secuenciaci6n ha revelado que el gen cdc2 de la levadura de fisi6n coditica una prolefna quinasa. Los anlicuerpos contra esta quinasa reconocen la subunidad quinasa dependiente de ciclina purificada a panir de MPF de una rana. La secuenciaci6n posterior del gen demostr6 que la protefna Cdel3 de la levaduLas levaduras y la genetiea molecuJar del

sistema de control del cicio celular

Flgun 17-26 Comparad6n del cicio de divlsl6n celular de a1gunas levaduras de nsl6n mUlantes con una celuJa normal. En el mutante cde2-, con un fenotipo recesi\'O, el gen cde2 cSla inaclivado de forma que la c~lula no puede superar el punto de conlTol de la entrada mh6tica, por 10 (!ue continua creclendo y su 13mal'lo final es enormc. lnversamente, el rnUlante cde2 dom;"alll~, cde2°, en ei que el prodUCIO del gen ale2 es hiperaClivo, tiene un fenolipo Uft: sobrepasa el punto de control prematuramcnte y su lamano celular es anormalmcmc pequeno. EI mutante cdc25 aetua como el mutame ale2-, y el mUlallle weel como un mutante cde2 D:cdC25 y weel afectan la activaci6n de la quinasa codificada par OOc2. (Folograrras cortesfa de Sergio Moreno.)

947

ra de fisi6n es hom610ga a la cielina mit6tica (cielina B) de ani males. La similitud fundamenlal entre las levaduras y los vertebrados se puso de manifieslo de una forma lodavfa m~s dram~tica mediante un tercer hecho: cuando se lransfectaron cl!lulas mutantes de Jevadura deficientes en cdc'!. con pJ:1smidos que contenfan fragmentos de DNA humano, algunas de ellas fueron capaces de dividirse normalmente. Una vez e1onado y secuendado, se comprob6 que el fragmento de estas celulas contenia un gen humano hom610go at gen cdc'!. de las levaduras de fisi6n. A partir de estas y de otras evidencias resulta elaro que la entrada en la milosis tanto de levaduras como de vertebrados esta dirigida esencialmente por la misma quinasa y que, para que adquiera actividad MPF, eSta quinasa ha de formar un complejo con delina. Por razones hist6ricas la subunidad quinasa dependiente de delina de MPF se denomina Cdc2 tanto en las levaduras de fisi6n como en las cl!lulas ani males.

La actividad del MPF esta regulada por fosforilaci6n y desfosforilaci6nl8, 19 Vol vamos a las proteinas reguladoras identificadas mediante muwcioncs cdc y wee y examinemos c6mo controlan la activaci6n y la inacrivaci6n del MPF. Ant'eriormente vimos que la cielina, aunque necesaria. no es suficiente para activar la Cdc2; sin embargo, una vez adherida a la ciclina B durante la interfase, Cdc2 se convierte en substrato para dos proteinas quinasa. La primera quinasa es la protefna Weel, la cual fosforila un residuo tirosina cerca del lugar catalftico de Cdc2, bloqueando su actividad quinasa e impidiendo que acrne prematuramenle como MPF. La segunda quinasa, lIamada MOl5 (identificada en la rana), fosforila un residuo treonina en alra regi6n de la molh:ula de Cdc2. Esta fosforilaci6n finalmente activani el MPF, pero mientras el residuo tirosina tambil!n este fosforilado, el complejo de d· dina Cdc2 scrn inactive. Tanto en ranas como en levaduras es la supresi6n de la tirosina fosfato inhibidora 10 que finalmente activa el MPF. En las levaduras de fisi6n dicha supresi6n esta calaliza por la proteina Cdc25, que es una protefna fosfarasa (Figura 17·27). En la Figura 5-16 sc presentan las series de cambios canfarmacionales en la prateina Cdc2 que acomp....nan este mecanisma de aClivaci6n. Probablemente, el equilibrio de la actividad de Weel y de Cdc25 es tal que al principia s610 se crea una pequena cantidad de MPF aClivo. Pero se cree que este MPF activo estimula la activaci6n de mas MPF, probablemente a traves de la actividad de la fosfatasa Cdc25. y In inhibici6n de la actividad de la quinasa Wee I ,ode ambas cosas a la vez, creanda un efecto de retroalimentaci6n posit iva. Asf, durante la fase Gzla ciclina se acumula de forma gradual, que pravoea un Icnto incremento de la actividad MPF hasta que, finalmente, se praduzca una explosi6n autocata.lftica. AI supcrar el umbral crftieo, los niveles de actividad MPF conduciran irreversiblementc a la celula hacia la mitosis.

EI mecanismo de activaci6n del MPF controla el tamano de las levadueas de fisi6n ls, 18, 19,20,21 Aunque la informaci6n anterior sobre la activaei6n del MPF parece ser vaJida para todos los eucariotas, existen variantes. Por ejemplo, en algunos organismos

MPf inkt'vo

.. quinasa lICtivadora

qulnua Inhibldora

948

Capftulo 17: El cicio de divlsl6n celular

MPf inllCtivo

Figura 17·27 Genesis de la actlvldad MPF, A medida que el nivel de cidina va aumentando gradualmente. Cdc2 se va asociando con la cielina; esto permite que Cdc2 sea fosforilada tanto por una quinasa activadora en lin lugaf de "activaci6n" como par la
•

',,,,~

MPf activo

el rilmo de activaci6n del MPF puede depender principalmente del rilmo de acumulaci6n de la ciclina, mientras que en otros puede depender de la actividad Cdc25. Ademas en diferentes organismos y en distintas c1ases de c~lulas denlro de un mismo organismo. el mecanismo de aClivaci6n del MPF es aprovechado con fines reguladores diferentes. En el embri6n temprano sirve sencillamente para establecer el tiempo entre una mitosis y la siguiente. En las levaduras de fisi6n, por el contrario, relraSa el final de la fase 5 y el comienzo de la mitosis. y concede una oportunidad al control de tamano celular. Todavia no se conoce con exactilud c6mo aCnla el mecanismo de control de lamano en las levaduras de fisi6n. peru podemos hacemos una idea general de c6mo podria funcionar. La activaci6n del MPF se controla equilibrando su inhibici6n mediante la proleina Wee! y su activaci6n mediante la proleina Cdc25, adcmas de Olros posibles reguladores. Las concentraciones y las actividades de eSlas mol~culas se alleraran de manera diferente a medida que la celuJa vaya creciendo. Si, por ejemplo, la prolefna Weel se diluyera en relaci6n con la prOleina Cdc25 como consecuencia del crecimiento de la cclula, dicho crecimiento inclinarfa el equilibrio en favor de la activaci6n del MPF, y un crecimiento superior a un tamai\o crHico dcscncadenarfa la explosi6n autocatalftica del MPF. Que el tamano celular sea Ull regulador crucial en activaci6n del MPF (como en las levaduras de fisi6nl 0 no (como en casi todas las dern<1.s cclulasl no depende del modo basico de aCluaci6n del mecanismo de activaci6n sino de los delalles cuantitativos de dicho mecanismo y de los reguJadores que 10 afeclen. Aunque existen pruebas de la existencia de control del ramano en muchas otras c1ases de c~lulas. el mecanismo parece incluso m<1.s oscuro que en las levaduras de fisi6n. Una pista posible vendrfa de las comparaci6n entre c~lulas que difieren en el grado de ploidfa (es decir, en el numero de copias del genoma que contienen) pero que en cambia tienen similitudes bioqufmicas y genel:icas (vease Figura 17-49). Parece una regia general que el tamano celular es de alguna manera proporcional a la ploidfa. 10 cual sugiere, a su vez, que el mecanismo de control depende de algtin tipo de litulaci6n -directa 0 indirecta- de la canlidad de un componenle citos6lico frente a la cantidad de DNA.

Para la mayorfa de las c~lulas el punto de control principal del cicio celular se encuentra en el Inicio de Gt" 15 Para las levaduras de gemaci6n y para los ciclos de divisi6n caracleristicos de la mayorfa de las celulas de los eucariOlas pluricelulares mas estudiadas, el pun to de control principal donde se detiene el cicio celular para conceder el tiempo Ilccesario para el crecimiento, no es G2 , como en las levadllr3S de fisi6n, sino al final de G1• Este punto de control de G se Hama Inlcio, Normalmente, si la celuJa de levadura de gemaci6n puede superar dicho Inicio, tambiell superara el punlo de control de entrada a la mitosis una vez ha completado la fase S. Asf pues. para la levadura de gemaci6n, como para la mayorfa de las c~lulas ani males , el punto de control G[ es el punta de no retorno mas alia del cualla celula complelar.:\ el cicio incluso aunque las condiciones cambien. Estudios gen~t..icos de la levadura de gemaci6n han demostrado que el paso por este punto, como el paso par el punto de control G2• depende de la acHvidad de una protefna quinasa dependiente de ciclina. j

La prote(na Cdc2 se asocia con la ciclina G1 para conducir a la c~luJa mas alili dellnido l •• 18,Z2 Para una colonia de c~lulas, el crecer libremente no es suficie11le para superar el Inido: es fundamental superar este punto en el momento adecuado, En las levaduras de gemaci6n son necesarias al menos tres condiciones para que ello ocurra -ellamai"io de la c~lula, la disponibilidad de aHmento, y las demandas sexuales. Si la c~lula es demasiado pequena, el sisl'ema de control se deliene para proporcionar liempo para el crecimiento. Si la celllia esla en condiciones de ayuno, el sisteLas levaduras y la genl!lica molecular del sistema de control del cicio celular

949

rna de control tam bien sc detiene, retrasando el intento de la celllia de duplicarse. Cuando a la celula se Ie requiere que se aparee, un factor peptfdico de apareamiento secretado por una cEHula veeina detiene el cielo celular en G1 Y prepara la celula para la fllsi6n con una parcja haploide (vease Figura 17·22). De este modo, tamano, alimelllo y sexo regulan de forma tripanita que la celula se aproximarse aI Inicio (Figura 17-28). Mutaciones que afeetan la respucsta de las levaduras de gemaci6n a estas innuendas han identificado los componentes del COlllrol del dclo cclular que dirigen el progreso desde G 1 hasta S. La busqueda de genes cdc en la levadura de gemad6n revel6 algunos genes que la celula necesita para superar el Inkio. Una celula mUlante deficieme en cualquiera de eSlo genes se detendr~ en G, aunque sea suficientemente grande para superar ellnicio. Uno de los genes cdc idenrificados de esta forma, Uamado CDC28 en las levaduras de gemaci6n. result6 ser hom61ogo aI gen alc2 de las levaduras de fisi6n: ambos genes tienen secuencias similares y son intercambiables funcionalmente. Este descubrimiento puso de manifiesto el vinculo remarcable entre ellnicio (el punto de control predominanre en la levadura de gemaci6n) y la entrada mit6tica eel punto de control predominame en la levadura de fisi6n). Ahora sabemos que los cielos celulares de ambos tipos de levadura incluyen los tipos de punto de conuol. y que en ambos tipos de levadura el producto del mismo gen sirve lanto para conducir a la celula a la mitosis y superar el Inicio como para inkiar la replicaci6n del DNA. En este capftulo. para clarificar y enfatizar su papel universal, a este gen 10 denominaremos gen cdc2. sin tener en cuenta la especie de la que estemos tratando. La proteina Cdc2 liene distintas aClividades en los dos puntos de control y se asocia con diferentes tipos de ciclina. En G2• como se ha visto, se asoda con cielina mit6tica formando el MPF; en G1 se asocia con ciclina G, formando un complejo al que nos referiremos como qulnasa de Inlelo. Probablemente la quinasa de Inido y el M PF fosforilan diferemes series de proteinas diana, las fosforiIan distilllamente. 0 ambas cosas a la vez. Por 10 tanto, parece que la especificidad de Cdc2 depende de la clase de cielina con la que se asocia (Figura 17-29). La clase de proteinas cielina G1 fue descubiena en las levaduras de gemaci6n mediante estudios sobre celulas mutanles que superaron ellnicio prematuramenle a bajo condidones en las cuales las celulas no mutallles no 10 habrfan hecho. Los tres genes identificados mediante estas mutaciones resultaron codificar protefnas lcjanamente relacionadas con las ciclinas mit6ticas. Esto hizo que a estas protcfnas sc las denominara "ciclinas G1~ Y de inmediato Se sugiri6 que pod fan desempcf'lar un papel activo en el [nicio. amUogo al que desempenaban In cicHnn mit6tica en el punto de control G 2 (Figura 17-30). Se podrfa probar que los fcnotipos mutantes son resultado de un exceso de aclividad de la ciclina G1• Sorprendentemenre, sin embargo, la deleci61l de uno solo de estos genes de cielina G1 no tiene ningtin efecto pnlctico; las cclulns s610 se detienen en GI' incapaces de superar ellnicio, si los tres genes c1esaparecen simult~neamellte. I>or 10 tanto parece que en una cetuln de levadura corriente por 10 menos existen tres clases de ciclinas Gl' que la celllia requiere su aClUaci6n para superar el Inido, y que son, aI menos hasta cierto pun to. fundonal-

.. ..

Cd02

~

fador promolOf de ,. I... M (MPF) lA)

950

..../>$1 ••10$ que 1M!

q ... iMAde

..... />$".10$ qu. 1M!

fO$for,lan an ,.

Inil;o

Iosfo,ilan .n III Initio

mitoSl'

Capftulo 17 : EI cicio de divisi6n eelular

)B)

Figura 17-28 Las Ires opclones de que dJspone una d1uJa haploide de levadura de flsi6n cuando sc acerca aJ Inklo. N6tese que una a!:lula diploide. en lugar de aparearse, lendrfa la ol>cion de entrar en la meiosis y fonnar esporas.

Figura 17-29 Comparacl6n entre la qulnasa de Inlclo yel MPF. Ambos disl>onen de Cde2. pero se asocian con direrentes lipos de ciclina. 910 sugiere que la ciclina detennina la especificidad de substrato de la quinasa Cde2. lanto porque se une a los substratos (como se muestra) como porque conduce a la quinasa a su localizaci6n adecuada en la a!:lula (no se muestra).

ciclin.

#,,~-y~:,\. quin... de Iniclo

Figura 17·30 EI cicio de Cdc2 en levaduras. Cdc2 esl3 presenre de ronna pennanenle. pero cambia su estado de asociaci6n con la ciclina. 10 cual define las rases del cicio de divisi6n de la celula.

lector promotor de I. f.MI M

!,~~~-t~ mente intercambiables de fonna que la celula puede seguir adelante si uno 0 dos de los lres genes se han perdido. Se cree que en un cicio habitual las tres ciclinas Gl colaboran asegurando que las celulas sobrepasen el fnicio de una manera rapida. decisiva e irreversi· ble, mediante una aClivaci6n explosiva de la quinasa de Inicio analoga a la actio vaci6n explosiva del MPF al comienzo de la mitosis. Aunque lOdavfa quedan muchas lagunas en el conocimiento de eslOS procesos. de nuevo parece que el mecanisme depcnde de una relroalimentaci6n positiva. aunque por un proceso dislinto: cuando la quinasa Cdc2 se une a una de las ciclinas G] forma un complejo activo que induce la transcripci6n de genes que codilican las otras dos cidinas Gl.las cuales. a su vez. se unen a Cdc2 e incrementan su producci6n hasta que se alcanza el umbral del complejo activo. Cuando la celula ya ha pasado porellnicio. las ciclinas Gl' como las ciclinas G2 en la mitosis. desapare<:en de la celula y. por 10 que se sabe hasta ahora. no desempenan ningtln otro papel hasta la fase G] del siguieme cicio.

Las ciclinas G1 median muchos de los con troles

que actuan en ellnicio,s.22.Z3

El sistema de control del cicio celular de las levaduras de gemaci6n esta regulado ampliamenle en el Inicio. mediante frenos y aceleradores que conlrolan la producci6n de las diversas cic1inas G]. Las celulas de levadura de gemaci6n regulan su tamano. haciendo que la adquisici6n de una ta.lla determinada sea la condici6n indispensable para superar el [nido -una estrategia que probablemente utilizan tambien La mayorfa de las demAs celulas. Asf pues, las celulas que comienzan Gl cuando son anormalmente pequenas ulilizaran un tiempo extra para cre<:er antes de superar el Inicio. miemras que las celulas anonnalmenle grandes al comenzar G, superaran el Inicio antes de 10 habitual. Va hemos discutido de que forma el tamano celular puede conuolar el paso de la celula a traves del punta de control G2 en las levaduras de fisi6n, modificando las concentradones relalivas 0 las actividades de las moIeculas reguJadoras. Principios similares podrfan aplicarse al mecanismo a traves del cual tamano de la celula regula el paso a traves del Inicio. Los mecanismos a lraves de los cuales los (actores ambientales rcgulan el paso por ellnicio se comprendcn algo mejor. Una deliciencia de alimento reduce la velocidad de sfntesis de ciclinas respecto a la de su degradaci6n, por 10 que reduce la concentraci6n de cicLinas en la celula. Como consecuencia de ella. la celula podrfa no a1canzar el umbral de concentraci6n de ciclinas G] necesario para desencadenar la explosi6n de qujnasa de lnicio. Tambi~n se cree que las feromonas de apareamiento bloquean el paso por el Inicio aI hacer disminuir los Las levaduras y la genetica molecular del sistema de control del cicio celular

951

niveles de ciclinas Gl' pero en este caso esto se consigue haciendo que las ciclinas G1 se mantengan inactivas y degradadas.

La quinasa de Inicio pone en marcha ]a fabricaci6n de los componentes necesarios para la replicaci6n del DNA2,2~ La actividad de la quinasa de Inicio tiene que inducir directa 0 indireclamente la

replicaci6n cromos6mica, taJ como la actividad del MPF tiene que inducir alII· nal de G2 la mitosis. La replicaci6n cromos6mica requiere un equipamiento complejo --enzimas tales como la DNA polimerasa, la ligasa, y la wpoisomerasa, asf como enzimas necesarias para la sfntesis de nucle6tidos, protefnas estructu· rales como las hislOnas, y factores de iniciaci6n que actuan en los ongenes de la replicaci6n iniciando la sfntesis del DNA (se discute en el Capftulo 6). los genes de al menos algunas de estas prorefnas se transcriben dclicamente durante cada fase S, y existen evidencias circunstanciales de que su transcripci6n est;1 activada por la quinasa de Inicio. Exceptuando las histonas, parece que la mayona de estas proteinas subsisten (aJ menos en las levaduras) a traves de todo el cicio. Sin embargo no est;1 claro si la quinasa de Inicio pone en marcha la fase S mediante la fosforilaci6n de componentes reguJadores permitiendo la actividad de la rna· quinaria de replicaci6n que ya esta presente, 0 desencadena la fase S mediante la fabricaci6n de los elementos de la maquinaria que se habfan perdido. En los ciclos celulares de embriones tempranos la situaci6n es mucho mas simple. EI embri6n dispone de abundantes reservas de transcritos de RNA derivados de la madre, y coda el aparato para la replicaci6n cromos6mica permanece disponible a 10 largo de todo el cicio incluyendo. al parecer, la quinasa de Inicio. El paso a traves de la fase M, eliminando el bloqueo de re-replicaciones, es suficiente para pennitir una nueva replicaci6n del DNA.

Los controles par retroalimentaci6n aseguran que las celulas completen un proceso de cicio celuJar antes de comenzar el siguiente3. 2S Cada una de las acciones principales del sistema de control del dclo celular -la activad6n del MPF al inicio de la mitosis, su inactivaci6n en la transici6n de la anafase a la mctafase, la activad6n de la quinasa de Inido en el [nida- desencadenan un complejo proceso subordinado que rcquiere un cicno intcrvalo de liempo para completarse. Si el sistema de control inida la siguieme acci6n sin que cada uno de estes proceses subordinados se haya completado. es probable que las consecuencias sean fatales 0 mutagenicas para la celula. Asi, si se cenduce a la celula a la mitosis antes de que haya terminado la replicaci6n de su DNA, transmitini a sus celulas hijas una serie de cromosomas rolOS e incompletos; si progresa hasta la anafase y comienza a dividirse en dos antes de que todos sus cromosomas esten alineados en el huso mit6tico, los cromosomas no qllcdar~ll repartidos por igual en las celulas hijas. En la mayoria de las celuJas lales desastres se evitan medianle controles de rerroalimentaci6n que actuan en cicnos puntos de control detenicndo el sistema de control celular hasta que el proceso requerido se haya completado. EI control par retroalimentaci6n mejor estudiado cs el que retrasa la mitosis hasla que se completa la replicaci6n del DNA. El fen6meno cs fadl de poner de manificsto en celulas de mamifero que tcngan ciclos celulares tfpicos. Si mientras estas celulas cst~n en fase S se tratan con un inhibidor de la sfntesis del DNA, como la ajidicolinQ (que inhibe especificamente la DNA polimerasa) 0 como la hidroxiurea (que bloquea la sfntesis de los desoxirribonuc1e6tidos), la celula se detiene en rase S y no progresa hacia la mitosis hasta que el inhibidor sea suprimido y se complete la replicaci6n del DNA. No obstante, si las celulas en las cuales se inhibe la sfntesis del DNA reciben cafelna junto con el inhibidor, las celuJas progresan de fonna suicida hacia 1a mitosis con su DNA repticado de 952

Cap!tulo 17: El cicio de divisi6n celular

control

.. cafelna

.. hidroxiu'ee

.. hidroxiurea .. cafelna

~+ ~ ~ ~+ ~MITOSISNORMAL ~ ~ [j.C:::::::~~ ~. @ ~• MITOSIS NORMAL

OETENCION EN LA FASE S

MITOSIS SUICIDA

Figura 17-31 EI DNA repllcado de forma incompieta bioquea ei comlenzo de la mitosis. En los experimenlos esquematizados aqu( se tralaron celulas de mamffero en cultivo con cafefna yean hidroxiurea. por separado 0 conjuntamente. La hidroxiurea bloquea la sfntesis del DNA. deteniendo las celulas en la fase S y relTasando la mitosis. Pero si ademas de hidroxiurea se afiade cafefna, el mecanisnto de retraso falla y las celulas entran en la mitosis siguiendo con su cicio Ifpico pero can un DNA replicado incompletamente.

manera incompleta. Ante la ausencia de un inhibidor del DNA la carcloa no causa ningtin dafia: el sistema de control continua siguiendo el programa dpieo, 10 eual permite a las celulas finalizar la replicaci6n del DNA antes de que la mitosis comience (Figura 17-31). Por 10 tanto parece que las celulas poscen un mecanismo de control por retroalimentaci6n que se inaCliva (de manera descooocida) con la cafefna. El control de retroalimemaci6n aertla como un mecanisrna de seguridad. En circunstancias normales el dispositivQ de seguridad no sera necesario ya que el DNA Helle tiempo suficiente para replicarse completamente antes de que se inicie la mitosis. Es mas, como mencionabamos anle· riormente, en los primeros ciclos celulares del emhri6n de una rana no existe tal dispositivo de seguridad, y la inhihici6n de la replicaci6n del DNA no relrasa la entrada en la mitosis.

El DNA dafiado genera una sefiaJ que retrasa la mitosis25,26 Ademas, actuan Olras senales de relroalimentaci6n reprimiendo el sistema de control celular basta que se hayan satisfecho algunas condiciones particulares. Tal como hemos mencionado anleriormente, los cromosomas que no estan adheridos al huso mit6tico generan una senal de retroalimentaci6n que bloquea la inactivaci6n del MPF (se discute en el Capitulo IS). Otro control por retroalimenlaci6n bien caracterizado actua en el punto de control de la enlrada mit6tica evitando que las celuJas cuyo DNA esta danado entren en la mitosis anles de que dicha alteraci6n este reparada. Normalmente la respuesta al DNA daflado se estudia con lesiones de DNA inducidas experimentalmente, como las infringidas par rayos X. Se han aislado muchas mutaciones debidas a radiaciones (md) en la levadura de gemaci6n, y al menos una, Hamada rad9, codifica un componenle fundamental del mecanismo de control de retroalimentaci6n. Las celulas mutantes que carecen de rad9 poseen la maquinaria de reparaci6n del DNA pero no pueden retrasar G~ tras ser irradiadas. Como consecuencia de ello, progresan hacia la mitosis con los cromosomas dafladosj no es sorprendente, por 10 lanto, que mueran debido a unas dosis de radiaci6n a las que las celulas normales sobrevivfan. En la Tabla 17-1 se resumen varios de estos genes cuyas funciones estan implicadas en la regulaci6n del ciclo celular de las levaduras. En las celulas de los mamiferos actua un dispositivo de seguridad adicionaJ reprimiendo la entrada en la fase S cuando el DNA esta dai'lado. EI mecanismo parece depender de una protefna Hamada p53, que se acumula en la celula como respuesta a las alteraciones del DNA y detiene al sistema de control del cicio celular en G 1 . Las mutaciones del gen p53 juegan un papel crucial en la genesis de una amplia proporci6n de los can ceres humanos, aparentemente incapacitando el control por retroalimentaci6n y, por 10 tanto. aumentando la frecuencia de alteraciones geneticas promOloras de cancer, como discutimos en el Capitulo 24. Las levaduras y la gcnetica molecular del sistema de control del cicio celu1ar

953

Tabla 17-1 Algunos genes del cicio de dlvisl6n celuJar de las levaduras y sus funclones Nombre del gen en levaduras degemacl6n

Nombrc del gcn en Icvaduras densl6n Producto g~nlco

Fenotlpo del mutantc que ha perdido la funcl6n del gen

CDC2

pol3

pam en la fase S

CDC9

cdcl7

CDC2.

cdc2

prote[na serinal treonina quinasa

SWIG

cdclO

ClNI,2,3

1

protefna reguladora de genes necesaria para la lranscripci6n de las c1c1inas Gl ciclinas Gl

CLB 1,2.3,4

cdc I3

ciclinas mit6ticas

WEEi

""'I

prOlefna tirosina quinasa

cdc25

protefna timsina fosfatasa protefna de funci6n desconocida

RAD9

?

DIS2 SI

dis2

subtmidad catalitica de la DNA polimerasa Ii DNA ligasa

protefna fosfatasa I

paro en G: con DNA replicado de forma imperfecta pam en ellnicio 0 en el puntc de control de la entrada a la mitosis (G 2) no entra en la fase S

paro en el Inkio (si los tres genes son inactivos) paro en el punto decontrol de entrada a la mitosis (G:J paso prematuro por el punto de control de la entrada a la mitosis (G 2). y por eUo tamano pequeno pam en el punto de control de entrada a la mitosis (G:l no se retrasa la mitosis cuando el DNA est
La labia 5610 mueslra una peqllefta seleccl6n de genes cdc y de genes relacionados que han side idemificados. La termlnologfa es confusa. En cada especie de levadllra, los genes cdc se numeran por orden de descubrimlento --cDCl. CJX:2. CDC3, . .. en levaduras de gemaci6n; cdc!. cdc2, cdc3 .. .. en levaduras de fisi6n. Por 10 tamo las secuencias numl!ricas no se correslmnden, de manera que el eqllivalente al gen cdc2 de la levadura de fisi6n 5e llama CDC28 en la levadura de gemaci6n (ambos genes codificAn la quinasa dependiente de ciclina del slslema de control del cicio celular). Para empeorar las cosas aun mas. no ell:iste ningUn convenio que regule e61no se llaman los hom610g05 de estos genes en olros organismos.

Generalrnente los controles por retroalimentaci6n en el cicio celular depend en de sefiales inhibidoras27 Un argumenlo general nos sugiere por que los con troles por retroalimentaci6n como los que hemos mencionado se basan en una senal negauva que dctienc cl sistema de control del cicio celular, en vez de basarse en una sefial posit iva que haga progresar al sistema de control hacia adelanle cuando el proceso subordinado sc haya completado. Consideremos, por ejemplo, la observaci6n de la adhesi6n de los cromosomas al huso mit6tico. Una celula necesita ser capaz de detectar la adhesi6n del ultimo cromosoma a los microtubuJos del huso: si la celula comienza la anafase y empieza a segregar sus cromosomas en las celuJas hijas antes de que esto haya sucedido, una celula hija recibir~ una dotaci6n incomplera de cromosomas mientras que la otra c~lula hija recibirti un exceso de cromosomas. En una celula can muchos cromosomas, si cada uno de ellos emria una sei'tal positiva al siste· rna de control una vez se ha adherido, cuando 10 hiciera el tiltimo cromosorna su senal seria diffcil de detecrar porque s610 supondria una pequeiia fracci6n de 954

CapftuJo 17 : EI cicio de divlsl6n celular

G,

_....,.,,"'0. . ,. t d. Inll;lo ,ctivad&

-

ImtlO P8f, active. ",o~ .. -r~"P"'~'6n.,.,.. InltCt;lIlIda MPF

MPF .inactivlldo _

clilul. de

DNA

DNA fllplTcado

cl!llula de

DNA

eromosoma

lamafia menor

altllrado

de forma

lamltl'lo menor

alt'fado

81 minima

(p53)

incomplet.

81 minima

(rad9)

separado del huso

cambia de la intensidad total de la senal de "ponerse en marcha". Por Dtra parte, 51 cada cromosoma no adherido al huso env(a una sefial negativa que inhiba el progreso del sistema de control del cicio celular, la adhesi6n del ultimo cromosoma sera f
Figura 17-32 Resumen de los controles de retroallmenlacl6n, tamano y dano en el cicio celular. Las barras rojas en forma de T representan los puntos de control en la progresi6n del sistema de control del ciclo celular, que provienen de procesos intraceluJares que son incomplelos o alterados.

Reswnen Las levaduras SOli UIl modelo de orgallismo gelleticumellte prtfctko para el eshufio de los cic/os celtdares tfpicos en los cludes la celula crece y se divide. £11 las celulas llOrmales el cicio de divisioll corre paralelo al crecimietlto de la celula, de forma que se matltenga 1m lanultlo medio tipico, medlallte controles que actdan ell dos puntos del cicio celular de control de tamaiio -1lI1O en G, llamado inicio (mas Importante ell las levaduras de gemac/on y en celulas de aninudes superiores), y el otro en G2 l/amado el punto de control de la elltroda mltolica (mas importallte ell las levadll.ras de jisitm). 5i la celula todavia 110 Ita alcanzado su tamano crltico, el sistema de cOlltrol del cicio celular se detietJe en estos pmllos. Los genes que codifican los componentes del sistema de control del cicio celular pueden ser idetJlifu:ados mediante nlll.tm:iones que deliellell a la celtda en un plmto especifico del cicIo 0 Ie penniten proseguir mas aiM del punto de cOlltrol y dividirse dando ltl.gar a celulas de tamanos anormalmellte reducidos. U/JO de estos genes, idelltificado ell Ia Ievadura de jisiOlI como cdc2, codifica una proteilulltomologa y jlmcionalmellte intercambiable COli Ia subunidad de MPF quillasa depettdiellte de cklilUl de los vertebrados. DicllO gen juega un papel central a 10 iargo del cicio celulnr de In levadura: ell Gz se asoeia con la c/clina milolicafonttatJdo el MPF y cotJdltclendo a la celuln mas aiM del control de entrada a la mitosis; en G I se asoeia con In ciclilUl G I formamW la quillasa de Illicio y cottduc/endo a la celula a pasar ellnicio. 5e cree que coda UIUl de estas aclivacione5 {Iuinasa se producen mediante un mecanismo de explosiOn autocalalftico qll.e implica otras compottelltes regrdadores, IIaciemW que el sistema de cOlltrol del ciclo celu/ar respollda a mlUtiples cOlltroles. Estos COIItroles illcluyen seiiales por retroalimelltaciOlI de DNA replicado de forma deficiente o daiiado que impediran que se supere el siguiellte plmto de colltrollJasta que se complete In replicac/oll 0 se repaTe el dano.

Controles de la divisi6n celular en los animales pluricelulares En los organismos unicelulares, en los cuales cada divisi6n celular genera un nuevo individuo, la selecci6n natural favorece a las celulas que crecen y se dividen mas rapidarnente ya las que sobreviven mas tiempo. Su proliferaci6n s610 Controles de la divisi6n celular en los anlmales pluricelulares

955

se ve frenada por la disponibilidad de alimento y por las demandas ocasionales del sexo. Por el conuario, en las especies pluriceluJares la seJecci6n natural no actua en cada celula sino en el conjunto del organismo. Para producir y mantener la intrincada organizaci6n del cuerpo los componellles celulares tienen que estar sometidos a comroles estrictos que Iimjten su proliferaci6n. La mayor par· te del tiempo, la mayona de las celulas de un aduJto no estan creciendo ni divi· diendose, sino que se encuentran en estado de reposo, lIevando acabo su funci6n especializada mientras se encuentran fuera del cicio de divisi6n. Debido a que los alimentos son abundantes en los tejidos corporales, las celulas tienen que frenar su proliferaci6n en condiciones en las coales las levaduras 0 las bac(erias se lanzarfan a proliferar. tA que se debe est a diferencia? Veremos que para las celulas de un animal pluricelular la abundancia de alimento no es suficieme para poner en marcha la divisi6n; una celula necesita recibir senales positivas especfficas de ouas celulas. Muchas de estas seflales SOil [acroTes de crecimiemo proteicos que se unen a receptores complementarios de la membrana plasm
EI sistema de control del cicio celular es m;\s elaborado que el de las levaduras28 Todos los genes del cicio celular que hemos vista en las levaduras, incluyendo cdc2, las ciclinas, cdc25, y weel. lambicn aparecen en las cclulas de mamffero. Se ha demostrado que todos elias actuan de forma similar a sus equivalentes de las levaduras, hasta el punto de que una levadura mutanle ala cual Ie falte Sll copia de gen funcional puede salvarse can la transferencia de un gen de mamffero. Como apumabamos antes, esto ha proporcionado un camino eficiente para el c10naje de genes del cicio celular de los mamJferos. Sin embargo, el sistema de control relular de la mayoria de los organismos pluricelulares es mucho mas complejo que el de las levaduras. Aparentemenle la duplieaci6n y divergeneia de genes ha generado multiples variantes de los genes fundamemales del cicio celular y estas variantes. que cocxisten en una misma ~Iula. se especializan en funciones ligeramente diferentes. De este modo, mientras que en las levaduras un gen de quinasa dependiente de ciclina es suficiente para lodos los pasos del cicio celular, las celulas humanas necesitan al menos dos a probablemcme mas de ellos. Se sabe que dos de estas proteinas --edc2 y un gen relacionado Uamado cdk2- estan presentes en la rana Xenopus y tambien en Drosophila; ambos codifican quinasas euya aClivaci6n depende de su uni6n a ciclbms. Como en las levaduras, los animales superiores tambicn tienen multiples ciclinas: se han encontrado al menos seis tipos diferentes de ciclina, lIamadas ciclina A. B. C. D. E, YF; algunas de elias son familias de molcculas estrechamente relacionadas entre si. La inducci6n de la mitosis en las cclulas de los vertebrados depende de una protefna Cdc2 complejada con ciclina 8; existen evidencias de 956

Capitulo 17: EI cicio de divisi6n celolar

Cdo'

f!.

Figura t7·33 Lasciclinasyla proterna Cdk en un cicio celular nonnal de vertebrados. Los venebrados Iienen muchos genes cidina y muchos genes edk distintO$. Sus produclOs acuJan en varias combinaciones de ciclina/Cdk en diferentes esladios del cicio. EI diagrama, que es especulativo, muestra algunas de estas cidinas. Las fundones de la Cdk2 y de la dclina A, en particular. son aun inciertas.

que la proteina Cdk2 complejada con la ciclina E pueden inducir la superaci6n del punto de control Gl (el equivalente a1 Inicio en los vertebrados), y que la cidina A complejada con la protc(na Cdk2 puccle ser neccsaria para aClivar la maquinaria de replicaci6n del DNA (Figura 17-33). Parece, por 10 tanto, que en los mamfferos diferentes protefnas Cdk cfecluan vadas fundones que en las levaduras son llevadas a cabo por una (mica protefna. En celulas que pascen cidos regulaTes, 1a concentraci6n de la mayo ria de las cidioas que toman pane en ellos sube y baja en direrentes momentos del cicio celular, mientras que las conccntraciones de las quinasas dependicmcs de cielina se mantienen aproximadamente conSlanles, como ocurre en las levaduras. ACllJalmente todavia no se conacen en detalle las funciones precisas de la mayoria de las protefnas del sistema de control del cicio celular de las celulas de los mamfferos.

La regulaci6n del crecimiento y de la proliferaci6n de las c~lulas de mamffero se estudia normalmente en Ifneas celulares cuJtivadas29 La observaci6n detallada de las c~luJas de mamifero en un animal imaclO no es facilmente accesible. Por eUo, la mayorfa de los estudios realizados sabre la proIiferaci6n de c~luJas de mamifero utilizan ..elulas que se hacen crecer en cultivo (Figura 17·34). Sin embargo. esto produce una complicaci6n adicional. Si las celulas de los tejidos nonnales de mamffero se cultivan en condiciones eSlandar, normal mente s610 poctran propagarse hast a un numero determinado de ciclos de divisi6n -aproximadamenle 50 para las celulas normales del cuerpo humano, por ejemplo; despues, las divisiones cesan y la celula final mente muere; este proceso recibe el nombre de senescencia celldar, de la cuallIataremos mas adelantc. Pero durante la proliferaci6n de algunas celulas culLivadas, especialmeme de roedores, a1gunas celulas escapan de la senescencia y se dividen indefinidameme como lEneas celli/ares. Aunque dichas celulas parecen normales en muchos aspeclos, su inmortalidad reneja la presencia de una 0 mas mUlaciones que han alterado sus propiedades de proliferaci6n. De todas form as, a pesar de sus ligeras anomalias, las lineas celulares se usan habitualmente en los esrudios sobre el cicio celuJar -yen tOOa la biologfa celular en general- porque aportan una fuenle i1imitada de celuJas estandarizadas y geneticamente homogcneas.

Los factores de crecimiento estimulan la proliferaci6n de celulas de mam£fero 30 AI principio las celulas de mamffero se cultivaron en coagulos sanguineos, y durante muchas decadas todos los esfuerzos dedicados a la definicion de los requerimientos minimos para la praliferaci6n de las celulas fueron vanos; inclusa en un media que contuviera los nutrientes tfpicos definidos qufmicamente, inControles de la divisi6n celuJar en los anhnales pluricelulares

'10' 11m

Figura 17-34 EJectronmk':rog:raf(a de barrldo de d!:lulas de mamffero proll£erando en cultlvo. Las c~lulas son fibroblaslOs de rala. (Cortes!a de Gucllter Albrecht-Buehler.) 957

c1uyendo glucosa. aminoacidos y vilaminas. las celuJas 5610 crccfan si al medio se Ie af'ladfa suero, ellfquido que queda despues de que la sangre se haya coagulado. AI igual que las levaduras cuando se quedan sin nutriemes. las celuJas de mamffero sin suero dejan de crecer y quedan delenidas, normaJmeme entre la mitosis y la fase S. en un eSlado de reposo Uamado Gq- Finalmeme se demostr6 que los componentes fundamenlales aportados por el suero son unas protelnas muy espedficas Ilamadas factores de creclmiento, la mayorfa de las cuaJes se necesitan 5610 en proporciones muy pequefias (del orden de 10-' a 10- 11 M). Uno de los primeros de estos faclores en ser identificados fue el factor de credmlento derivadode las plaquetas, 0 PDGF (de Platelel-Derived Growth Faclor) y es caraeterfstico de muchos atros descubienos despues. EI camino hacia su aislamienlo empez6 observando que los fibroblastos cultivados proliferan si se les suministraba suero pem no si se les suministraba plasma -ellfquido preparado mediante la extracci6n de las celulas de la sangre sin permilir que se produzca la coagulaci6n. Cuando la sangre se coagula, las plaquetas incorporadas aJ coagu10 se ponen en marcha liberando los contenidos de sus vesiculas secretoras (Figura 17-35). La capacidad superior del suero para facilitar la proliferaci6n sugiere que las plaquelas contienen uno 0 mas factores de crecimiento. Esta hip6tesis se confirm6 Illoslrando que los exlractos de plaquela pueden utilizarse en lugar del sucro para la proliferaci6n de fibroblaslOS. Se demOSlr6 que el factor crucial de crccimicnto es una protefna, que posteriormente fue purificada y Ilamada PDGF. Probablemente en el cuerpo la prolefna PDGF liberada de coagulos sanguineos juega un papel importanle en la estimulaci6n de la divisi6n celuJar (yen otros procesos) durante la curaci6n de las heridas. EI POCF solamente es I de las aproximadamente 50 prole£nas que acnian como factores de crecimiento. Para cada c1ase de factor de crecimienlO existe un receptor 0 un conjunlo de receptores especificos, cada uno de los cuales aJgunas celulas presentan en su superficie y otras no. las celuJas responden a un faClor de crecimiento 5610 si disponen de la proleina recept'Ora apropiada (se trata en el Capllulo 15). Ademas de las prole[nas, otras moleculas pueden actuar como faclores de crecimienlo; un ejemplo de elias son las honnonas esleroideas, que aCluan sobre prolemas receptoras intracelulares. Los faclores de crecimiento se pueden dividir en clases de especificidad amplia 0 reducida. Los factores de especificidad amplios, como el POCF y el faclor de crecimiento epidirmico (EGF, de Epidennal Growth Factor) aClllan sobre muchas c1ases de celulas. Asr, el PDGF acu:ia sobre una amplia variedad de celulas diana, entre las cuales se inc1uyen libroblastos, libras musculares lisas, y celulas neurogliales. mientras que el EGF no s610 actua sobre celulas epidermicas sino tam bien sobre muchos otros lipos de celulas, tanto epiteliales como no epileliales. En el Olro extrema encontramos los factores de especialidad reducida como la eritropoyetilla, que solamenle induce proliferaci6n de precursores celulares de los g16bulos rajos. Debido a que estos faclmes se presentan en pequeflas call1idades, son dif[ciles de aislar; sin embargo. una vez que el DNA que cadilica un faclor de crecimiento ha sido identificado y c1onado. puede utilizarse para idenlificar y aislar a una familia entera de genes relacionados con el que corlifican olros miembros de la misma familia de faclores de crecimiento. Un ejemplo es la familia defaclores de crecimiento de flbroblaslos (FGF, de Fibroblast Growth Faclor) que inc1uye al menos siete miembros. Hoy en dra, cuando se afsla un nuevo factor de crecimiento mediante un ensayo bial6gica, frecuentemente se eocuentra que es idenlico a esta emparenlado muy de cerca, a otto facior de crecimiento ya conocido. En los animales iotaclas la proliferaci6n de la mayorfa de las celulas depende de una combinaciotl especffica de faclores de crecimiento. mas que de un solo factor. De eSle modo un nDmero pequeno de faclores de crecimiento puc· den servir, en combinaciones diferenlcs, para regular seleclivamente la proliferaci6n de cada una de las djferentes c1ases de celulas de un animal superior. Aunque algunos factores estan presentes en la circulaci6n, la mayorfa de ellos se originan en celulas vecinas de la celula afectada y acn.'ian de mediadores 958

Capftulo 17: EI cicio dedlvlsl6n celuJar

micrOlllbulo

Figura 17·35 Una plaqueta. Las plaquclas son celulas en miniatura. sin nuelen. que cireulan por la sangre facilitando la coagulaci6n sangu{nea en los lugares daflados. Tambien liberan varios [aclores que eslimu1an la curaci6n de las heridas. La plaquela del diagrama esla abierta por la milad pari mostrar las vesfculas secretoras que contiene; a1gunas de eUas contienen el factor de crccimiento derivado de las plaquetas (PDGF).

Tabla 17-2 Algunos faclores de credmlento protelcos y sus funclones

Faclor

Miembros de la familia relaclonados

Especificidad ampliao Umllada Actlvldades representallvas

Factor de crecimienlO derivado de las p1aquet3S (PDGF) -tressublipos Faclor de credmiemo faClor de crecimiento de transformaci6n a ('fGF· a); cpidemlico (EGF) protefna Lin·3 (en C. elegafls) Faclor de crecimicnto factor de credmiento semejame a In insulina II (IGF·[I); insulina semejante a la insulina I (IGF·I) Faclor de credmienlO acLivinas; prolefnas morfogenicas de transformaci6n II de hueso (BMP); prolema (TGF-lll -mulliples decapenlaplegica (en DrosolJlIila); subtipos proteina Vgl (en Xenopus) Faclor de crecimicnlO de los fibroblastos (FGF)-muhiples sublipos Intcrlcuquina-2 (IL·2l Factor de crccimicnto neuronal (NGF)

factor neurotr6lico derivado del cerebro (BDNF); neurolrofina-3 (NT-3); neurolrofina·4 (NT·4j

Erilropoyetina Imerleuquina-3 ((L·3l

factores estimuladores de colonias hematopoyeticas (CSF) -mLiltiples tipos

ampUa

eslimula la proliferaci6n de celulas dellejido conjlllllivo y de algunas celulas neurogliales

eSlimula la proliferad6n de muchos tipos cclulares; actua como senal induclora durante el desarrollo crnbrionario amplia estimula la supervivenda celular; estimula el mClabolismo celular; colabora can OlIOS faclores de crecimiento estimulando la proliferaci6n celular amplia potcncla 0 inhibe la respucsta de la mayona de las celulas a ouos factores de crecimienlO. depcndiendo dellipo cclular; regula la diferendaci6n de algunos lipos celulares: acrua como selial induetora durante el desarrollo embrionario amplia estimula la proLiferad6n de muchos tipos celulares; inhibe la diferendaci6n de varios tipos de celulas madre; aClua como senal induclora durante el desarrollo del embri6n limilada estimula la proliferaci6n de los linfodtos T activados limilada estirnula la supervivenda y los procesos de prolongaci6n de las ramificaciones nerviosas de algunas c1ases especfficas de neuronas limitada estimula la proliferaci6n, la diferenciad6n y la sllpervivenda de prccursores de los gl6bulos rojos de la sangre limilada estimula la proliferaci6n y la supervivencia de varios lipos prccursores celulares sanguineos amplia

locales. Ademas de los factores de crecimiemo que estimuJan la divisi6n celular, existen fact ores, como algunos miembros de la familia defacrores decreci",iel1fo lie rrarlsformaci6/l hera rTGF·P) (de Transforming Growth ractors), que cn algunas celulas cstimulan la proHferaci6n celular y cn alras 13 inhiben. La mayorfa de facto res de crecimieilt'O efecluan llluchas otras actiones ademas de la regulaci6n del crecimiemo y la divisi6n celular; pueden comrolar In prolifernci6n, la super· vivencia. la migraci6n 0 el funcionamiemo de las Cellilas, dependiendo de las circunstancias. En la Tabla 17·2 aparece una muestra de los muchos factores de crecimien· to tratados en esle Iibro.

EI crecimiento celular y la divisi6n celular pueden ser regulados independientementeJ l Una funci6n imponanle de los (actores de crecimiento consiste en la regulaci6n de la sfntesis de protefnas y, par consiguiente, del rilmo 01 que las celulos crecell. La mayoria de los factores que estimuJan la proliferaci6n celular talllbit~n esli· mulan su crecimiClllo, pero la carrespondencia no es siempre exacta. Algunos faetores haran ereeer a celulas de una dena clase pero no las Uevaran mas alia del punta de control G 1 de su cicio, mientras que Olros factores las llevaran mas alia del punto de conlrol G 1 pero no las haran creecr. Parece ser que en mamffe· ros no es tan estricta la regia que relaciona el tamalio de la celula can su divisi6n. como 10 es en las levaduras. Controles de la divlsl6n celular en los anJrnaJes pluricelularcs

959

Los facto res de crecimiento que acluan independientemenre sabre el crecimienta y la praliferaci6n celulares son importantes para el animal completo. Las diferentes cclulas especializadas tienen proporciones entre citoplasma y DNA enormemente variadas, y algunas celulas en Gil' como las neuronas, pueden hacerse muy grandes si haberse dividido nunca (Figura 17-36). Variaciones de tamano celular como estas se controlan en parte mediante mecanismos intracelulares que dependen del cicio celular. Por ejemplo, el crecim-iento de ciertos tipos de neuronas depende del/actor de crec;m;ento neuronal (NGF, de Nerve Growth Factor) secretado por el conjunto de cclulas que estlin en contacto can la neuro· na: cuanlo mayor sea la cantidad de NGF a la que la neurona tiene acceso, mayor sem su tamalio.

Las c~luJas pueden retrasar su divisi6n entrando en un estado especializado de no-crecimiento 32 Si privamos de suero a las cclulas que estlin proliferando en un cuJtivo, detendran su crecimiento pero continuanin progresando en el cicio celular hasta que hayan alcanzado la fase G•. Alllegar a esta pane del cicio, se detienen en un estado de no·crecimiento, especializado -el estado de reposo Go ("'G cero") al que nos habfamos rererido anterionnente. E1 estado Go es diferente a todos los demlis estados de la proliferaci6n que la cc:lula experimema a 10 largo del cicio. La velocidad de sfnlesis de protefnas, por ejemplo, se reduce drlisticamente. a menudo hasta el 20% del valor que preseman cclulas que estan proliferando. Asf pues, la ausencia de ractores de crecim..ienro apropiados !leva a las celulas a una especie de suelio del cicio celular, en el cual el sistema de control del cicio celular es incapaz de progresar mAs alia del punto de control G t • Si privamos a una ccluJa de sus nutrientes, como los am-inoacidos. tambicn se detendra su crecimiento y se bloqueara el paso mAs aUa del punta de control GI' pero desde el puntO de vista de la cclula esta desnutrici6n es una experiencia muy diferente a la de no recibir las senales de avanzar par el cicio de los factores de ,
CapUulo 17: EJ cicio de divisi6n ceJular

neurone

• linfacito

Figura 17-36 Comparaci6n entre el tamano de un IInfoclto yel de una ncurona de mamlfero (extralda de la retina). Ambas celulas contienen la misma cantidad de DNA. Una neurona se haee progresivamente mas grande durante su desarrollo, mientras permanece en estado Go. Durante este perfodo la proporei6n entre la eamidad de citoplasma yde DNA aumenta enormememe {por un factor mayor a lOS para algunas neuronas}. (Neurona de B.B. Boycott en Essays on the nervous system IR. Bellairs y E.G. Cray, eds.l. OXford. U.K.; Clarendon Press, 1974.)

migrecl6n de 1., dlules epitellellls desde .u neeimlento en III fonda de Ie cript8 heste su desprendimillnlO en 10 ella de I, vello.ided (dureci6n del ,rlln.ito: de J e 5 diu)

LUMEN OElINTESTINO

vlIUosid.d (.in divili6n celul.r)

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hor.s'

F1gurnI7-37 D1visl6nymlgraciOn celular en el epltello de revestlmlento tJcllntestJno delgado de un ratOn. Tada la actividad de divisiOn celular se concentra en la parte inferior de los plicgues epileliales de fonna IUbular, conocida como aipta. La generaciOn de ctHulas nuevas se desplazan hacia arriba formando el epilelio que cubre las vellosidades, donde lrabajan en la digesliOn y absorciOn de los alimentos desde ellumen inles.inal. La mayorfa de las celulas epiteliales tienen una vida muy cona desprendiendose de la punta de la vellosidad cinco dias despues de su ascensiOn desde la cripta. Sin embargo. un aoillo de aproximadamenle 2{l celulas -inmortalcs- de divisiOn lenta {en rojol continua andado cerea de la base de cada cripta. Cada una de eslas eelulas madre se dividir4 formando dos celulas hijas. Par u~nnino media. una ~Iula hija pennanece en dicho lugar como una ~Iula madre indiferenciada mienuas que la oua acostumbra a migrar hada arriba diferenciandose y formando parte de la vellosidad epitclial. (Adaptado de C.S. Ponen, R. Schofield y L.G. Lajtha. Biochim. Biop/IYs. Acta 560:281-299, 1979.)

transcurre entre una divisi6n y la siguiente. Ahora debemos cenirarnos en la prueba experimental que identific6 el punto de control G, como un punto especifico del cicio asf como considerar 10 que significa la entrada en Go en t~rminos moleculares.

La ausencia de suero evita el paso por el punto de control G.32,33 Las celulas en cultivo pueden ser observadas al microscopio por cinematograf(a a intervalos de tiempo. De esta forma resulta facil determinar el tiempo que cada c~lula necesita entre una divisi6n y la siguiente. 5i se ha filmado al menos lodo un cicio celular del cultivo anles de aplicar un tratamienlo experimental, tam· bien es posible establecer elliempo transcurrido desde la ultima mitosis de cada c~lula en el momenta del tratamiento. Asf pues se pueden eSlUdiar los efeclOs de diferentes manipulaciones con condicionantes externos sobre difercntcs cstadios del cicio de divisi6n. Estos eSludios se han realizado principalmentc con fibroblaslOs. Con un cxperimento sencillo de este lipo fue suficiente para demostrar que la privaci6n de suero (y por 10 tanto de factores de crccimiemo) durante al menos 1 hora ticne unas consecuencias dramaticas para las c~lulas. Todas las c~lulas a las que se les retir6 el suero antes de transcurridas 3,5 horas dcspu~s de haber pasado la mitosis. necesitan 8 horas extra para alcanzar la mitosis despues de que se les anada suero nuevamente al medio. Por eJ contrario, las c~lulas de mas de 3,5 horas no mostraron ningt.in retraso y continuaron con el cicio normal (Figura 17-38). Esle componamiento sima el punta de control G l unas 3,5 horas despu~s de la mitosis, en el caso de la linea celular escogida. Mas allll de este punto, las e~luJas entran de fonna irrevocable en la replicaci6n de su DNA y completan eJ cicio de divisi6n normal, pero las c~lulas que se hallan entre la mi· tosis y el punto de control se detienen en el punto de control si echan en faha los faetores de crccimiemo adecuados. El retraso extra que transcurre anles de que estas c~lulas efcctuen la mitosis despu~ de que se les haya suministrado suero Controles de la dMslOn celular en 105 anlmales pluricelulares

961

IllKura 17-98 Efec:to de una breve depnvacl6n de suero en varlos momentos del cicio celular. Si deprivamos de suero los fibroblastos durante I hora mientras se encuentran en el inlervalo comprendido elllre la mitosis y el punto de control Gl (barm amarilla) dichas celulas se retrasan cerea de 8 homs en su lfayec:to hacia la mitosis siguiente; las celulas que sufren una dcprivaci6n similar despu6l del punto de control Gl (barra verde oscuro) no sufren tal retraso (aunque se puedan relfasar en el cicio siguiente).

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nuevamente sugiere que una privaci6n de J hora de suero entre las 0 y las 3,5 horas las coloca en un estado allerado -Go- del que necesilan 8 horas para saJir. EI erecto de la deprivaci6n de suero es deprimir la sintesis de prote'na y el crecimiento celular y se puede simular median Ie pequenas dosis de inhibidores de la s[ntesis de prOlefna, tales como la cicloheximida. Los experimenlos utilizando tanto la deprivaci6n de suero como la ciclohexhnida han demostrado que deprimiendo brevemente la s[ntesis de prolefna al final de G2 lambicn se puede inducir la entrada en Go' pero en este caso las celulas primero pasan por la mitosis y luego se delienen en Go cuando alcanzan el punto de control Gl • Por otra pane, las ctHulas a las que se depriva brevemente de suero durante la fase S 0 al comienzo de G2 prosiguen a traves del punto de control G1 con poco 0 ningUn retraso, probablemente porque ya eslan a mas de 8 horas del punlo de control. Por 10 tanto, los mecanismos que responden tan dramalicamenle a una breve deprivaci6n de suero deben de tener las siguientes propiedades: es impresclndible haber pasado el pUntO de control G1 pero sin haber entrado en la milosis, y aunque se pueden inhibir riipidamente, se necesitan del orden de 8 horas para regenerarse tras la nueva adici6n de factores de crecimienlo 0 desinhibici6n de la s[nlesis de prote[nas.

EI sistema de control del cicio celular puede desensamblarse n'ipidamente pero s610 puede ensamblarse de nuevo lentamenteS4 .iQue relaci6n lienen estos fen6menos con el comporlamienlo del sistema de control del cicio celular? Una inlerpretaci6n simple seria que cuando se relira el suero algunos COO1ponentes maleculares del sistema de control del cicio cellilar desaparecen rapidamenle -en una hora- pero necesitan un per[odo mucho mas largo -8 horas- para reaparecer cuando se restaura el suero. La desaparici6n y reaparici6n pucdcn oeurrir en cualquier momenta del cicio de divisi6n, pero unicamente es cn el pun 10 de control G] donde se necesita dicha componente molccular. Una especulaci6n obvia es que el componente crflico sea la propia protcrna Cdk y que las celulas de mamffero necesiten esta protefna para superar cl punto de control Gl' al igual que las celulas de levadura necesitan la protefna Cdc2 para superar el Inicio. De hecho, si comparamos las celulas quiescemes ~ con eelulas efectuando el cicio de divisi6n, encontramos que las celulas en Go tienen can· tidades muy bajas lanto de pratefna Cdk (0 al menas de una 0 mas clases diSlinras de protefna Cdk) y de todas las ciclinas Gl' aunque la presencia de prote[nas Cdk y de algona de las ciclinas G1 (ciclinas C y D) tiene un nivel prActicamenle constante a 10 largo duranle lodas las fases del cicio. Por 10 tanto, las cclulas Go no solamente delienen su conlrol del cicio celular, sin6 que 10 desmantelan. Cuando se suministra suero a las celulas en Goo se produce un retraso de varias horas hasta que las concentraciones de Cdk y ciclinas G1 alcanzan de nuevo los niveles norrnales del cicio: este retraso se corresponde con el que expcrimentan las celuJas antes de reincorporarse al cicio. Si la privaci6n de suero detiene la proliferaci6n celuJar desensamblando rlipidamenle el sistema de control del cicio mas que deteniendolo, no es sorprendente que cuando el entomo sea favorable de nuevo, las celulas necesiten un cierto tiempo para reensamblar lentamente el sistema de control antes de reincorporarse ycontinuar el cicio de nuevo. 962

Capftulo 17: EI cido de divisi6n ceJular

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Ya hemos visto c6mo responde el sistema de control del cicio celular a los factores de crecimiento; a continuaci6n estudiaremos c6mo los factores de credmiento y otras influencias ajustan el comportamicnlo de proliferaci6n de las ctHulas en los tejidos, de forma que se manlenga la forma y la funci6n del cuerpo.

Las celulas vecinas cornpiten por los factores de ~recimjento35 La proliferaci6n de celulas en el cuerpo tiene que estar regulada de forma que se

mantenga el numero de celulas y su organizaci6n espacial. ESla regulaci6n depende de inleracciones de unas celulas con otras y con la matriz extracelular. Consideremos por ejemplo una lamina epitelial de un mamffero aduho. A med.ida que las celulas van muriendo tienen que producirse celulas nuevas para ocupar su lugar. La proliferaci6n celular tiene que estar controlada de forma precisa para equilibrar la perdida de celulas, de forma que el epitelio ni crezca ni decrezca. Las nuevas celulas han de cncajar perfectamente en la estruclura., de fonna que no se desorganice la arquitectura del epitelio. De hecho, en la mayorfa de los epitelios s610 se dividen las cclulas que continuan en contacto con la lamina basal subyacente. Las cclulas situadas sobre la lamina basal son sensibles al menos ados tipos de sel'ales que rigen su disposici6n a dividirse: un lipo de senal es la que transporta informaci6n refcrenle a. la densidad de poblaci6n local de la celula, y el otro (ipo de senal es el que reneja las adhesiones a Olras celulas y a la lamina basal. Ambos tipos de control se pueden comprobar y analizar en Jas condiciones simplificadas de un cullivo celuJar, aunque la mayorfa de los estudios se han efectuado con fibroblastos y no esla claro c6mo se relacionan estos descubrimientos con conjuntos de celulas organizadas como las epilcliales 0 las de un 6rgano tridimensional. 5i colocamos celulas disociadas sabre una placa en presencia de suero, se adheriran a la superlicie, se extendenin, y se dividinin hasta que se fonne un mOIlDCapa c01Ij1ueme en la cual cada ceJula se adherini a la placa y contaet.ani con las celulas vecinas a todo su alrededor. En este punlO las celuJas normales, a diferencia de las ceJulas cancerosas (MuansfonnadasM), dejan de dividirse-un fen6meno conocido como ill!Iibicioll de la division cellllar depelldiente de la dellsidad. 5i una monocapa de esle tipo se "rasga" con una aguja de forma que se genera una franja libre de celulas sabre la placa, las celulas de los bordes ocuparan el espacio vado y se dividiran (Figura 17·39). Este fen6meno se describi6 inicialmente en terminos de "inhibici6n por contaclo~ de la divisi6n cellllar, pero probablemente es enganoso que el unico responsable del fen6meno sea la interacci6n celuia-celllia. La densidad de la poblaci6n celular a la que se deliene la proliferaci6n celular en la monocapa confluente se incrementa al aumentar la cOllcelllraci6n de los factores de crecimiento en el medio. Al hacer circular un flujo de medio fresco sobre la capa confluente de fibroblaslos se reduce la Bmilaci6n de la difusi6n para el aporle de factores de crecimiento, e induce a las celulas que est
u~

las ~luJIt. de los rnJrgenes .. elltienden y .. Itpllt~n, Itumentltndo Ia veb::idad de

.lntnil de

proteJ~•

Figura 17·39 Regulad6ndela dlvisl6n eelu!ar de una monocapa eelu!ar rasgada. Habilualmente, las celulas situadas en la superficie de una placa de cuJlivo proliferan hasta que se IOcan unas con alIas, formando una monocapa confluente. E.I diagrama mueSlra 10 que ocurre sl se rasga la monocapa eliminando una hilera de celulas. Las ceJulas que qucdan en los mll.rgencs de la zona vacfa de la "herida" se apJanan y empiezan a crec:er y a dividirse, hasla que la "herida" esta ·curada". Cuando la monocapa vuelve a ser connuenle, la proliferaci6n celular cesa casi oomplelamenle. capa conftuentll de celuln rliCOftStruidlt I"I'llldiltnte divisOOn ee1uler

e$~~ COlllrolcs de la divisl6n celular en los anlmales pluricelulares

963

eeluln prolilerlndo

monOClpa confluente: II. <:61ul•• no prolileran mil.

medlO nueyo .plieldo, llayll. dIIln dluln

reflejar, al menos en parle, la capacidad de una celula para reducir localmente la concentraci6n de factores de crecimiento en el medio, privando asf a las ctHulas vecinas de ellos. caJculos basados en las concemraciones conocidas de faClores de crecimiento en el suero y la velocidad a la que las celulas eliminan los faciores del medio de cuhivo apoyan esta hip6tesis. Por ejemplo, el PDGF nonnalmente se halla en el medio a un concentraci6n de 10 10 M (aproximadamenle una molecula por cada esfera de 3 !-lm de diametro de medio). Un fibroblasto tiene cerca de 10$ receptores de PDGF, cada uno con una afinidad muy alta por el faclor de crecimienlO. Par 10 lanlO cada celula liene receplores suficientes para unir todas las moleculas de PDGF que se hallan en una esfera de diametro -ISO pm. Asi pues es obvio que las celulas vecinas compilen por cantidades diminutas de factores de crecimienlO. Esle Lipo de competencia podrfa ser Ian imponanle para las celulas de los tejidos como para las celulas en cultivo, impidiendo que proliferen mas alia de una cierta densidad de poblaci6n, la cual esta delerminada por la cantidad de factor de crecimiento asequible. .

Las celuJas animales normales en cuJtivo necesitan anclarse para superar ellnicio 36 La compelencia por los faetores de crecimiento no es el (inico factor que altera el ritmo de la divisi6n celular en un eultivo de eelulas. La forma de una ClHuia mientras esta se eXliendc y se arrastra sobre el substrata para ocupar el espacio vada lambien afccta notable mente su eapacidad para dividirse. Cuando se cultivan fibroblastos normales 0 cclulas epiteliales en suspensi6n, sin cOnlaeto alguno con superficies s6lidas, casi nunca se dividen -un fen6meno eonocido como depelldellcia de allcfaje de la divisi6n celular. La reloci6n entre la propogaci6n de las cclulas y su prolifcraci6n se puede demostrar cultivando cellilas en substratos de grosorcs variables 0 pcrmitiendo que las cclulas sc estublczcan en una superficie no pcgajosa dondc se han pueslo previamcnlc pcqucnos parches pegajosos sobre los que se puede adherir una sola celula pero sin que pueda extcndersc mas alia del parche. La frecuencia con la que la celula sc divide aumenta a medida que la cclula se extiende. Quizas ocurre que las celulas mas extendidas al tener una superficie mayor, pueden caplurar mas moleculas de faclores de crecimiento y conseguir cantidades de nulrienles mayores. Sin embargo, algunas Iineas celulares de fibroblastos son practicamellle incapaces de proliferar en suspensi6n pero se dividen rapidameme si consiguen un punto de anclaje en alguna superficie formando un eomaclO [ocol. Ello ocurre incluso si ellugar de adhesi6n es un parche pequeno en el cualla celula no dispone de espacio suficiente para extenderse (Figura 17-41). Los contaCIOS focaJes son lugares de anclaje para los filamentos de actina intracelulares y para las moleculas de la matriz extracelular; estas y Olras observaciones nos indican insistenlemente que el conlrol de la divisi6n celular esta de alguna fonna acoplado con la organizaci6n del citoesqueleto 0 depende de senales intracelulares generadas en los lugares de adhesi6n, 0 de ambas casas (Figura 17·42). De hecho, en algunos Lipos celulares algunas moleculas de la matriz extracelular especificas. tales

964

Capftulo 17: El cicio de divlsl6n celuJar

el "ujo de media estimul. I. prolifllf"aCi6n celul.,

Flgun 17-40 Consecuenclasdela

presencia de un medio nuevo sobre la monocapa conDuenle celular. Las celulas de una monocapa confluente no se dividen (se indican en gris). Las et!lulas (en verde) vuelven a dividirse si se las expone diret:tameme a un medio fresco. Aparenlemenle, la monocapa confluenle ha dejado de dividirse porque en el medio cercano a las et!lulas ha disminuido la ooncentrad6n de raclOres de crecimienlO, por los cuales compilen las celulas.

c;olocad. tobre un perc"Idh'll~ pequ.f\o

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como lalamlnlna a la nbronectina, pueden actuar como factores de creclmien· to. Las c61ulas basales de 18 epidermis de la piel proporclonan un ejemplo que se trata en el CapCrulo 22. Como para ouos controles de la proliferacl6n celular, el control del anclaje aeroa en el punto de control Gl : las «Iulas necesitan el anciaje para superar este punta pero no para completar cl resto del cicio. De hecho, mientras progresan por la fase M normalmcnte aDojan sus uniones y se redondean. Este cicio de un16n y posterior desunl6 probablemente permite a las c~lulas reorganizar sus contactOlJ can otras ct!lulas y con la matrix extracelular, as! como acomodar las c61ulas hila. producldas por la dlvisi6n celular y despul!s unirlas fuertemente al teJldo o.ntes que se les permira inlciar el pr6ximo cicio de divisi6n. Aunque ol mecanlsmo de dependencia del anelaJe es poco conocldo yalgunos do 101 detalJes del fen6meno que acabamos de describir pueden ser peculiarldodes de 108 nbroblastos en cullivo, es bastante probable que las seflales Intra· celularoll acneradas en los shlos de adhesl6n jueguen un papel importante en el sistema de control del cicio celular en muchas e1ases diferentes de cl!lulas.

Controles de la dlvisl6n celular en los an1maJes pluriceluJares

Figura 17-41 Ladfvt&l6ncelular depende de la forma de la c~lula yde IU andaJe. En el experlmento que.e muestra aquf, la5 c~lulas.e mamlenen en suspensl6n 0 se permlte que se IIjen sobre parches de un material adherente (paladio) 0 50bre un substrato no adherenl6; el dlAmetro del porche, que es variable. determina el 'rca sobre la que Ie puede extender la c~lula y la probabllldad de que Ie dlvlda. AI medlo de cultivo Ie Ie l"lde timJdlna·'H YIe realiza una autOrradlografia para deacubrlr el porcenta}e de «lulu que han entrado en rase S. W Lu cBolas de Ia Irnea celular 3D raramente Ie dMden cuando se mantienen, redondeadu, en suspensi6n. pero la adherencla I un parche, aunque sea tan pequeno que no pennita que Ia cSuIa 56 extienda, las capacita para que lie divldan mu rrecuentemente. (8, C) Eloctronmicrograffas de barrido que muestran una c~luIa extendida sobre un parche grande comparado con una ulula colocada sobre un parche pequeno. (Micrograffas de C. O'Neill, P. Jordan y G. Ireland. Cell 44:489·496, 1986. oCeu Press.)

t-1guna 17-42 Contactosfocalesromo fugues de emIs16n de sefiaIell IntraceluJares. Esta micrograffa fiuorescente muestrn un fibroblasto en cullivo sobre un substrata recubieno oon fibroncctina, mol6cula de Ia matriz extraeeI.u1ar. Los filamentos de aetlnase han marcado de manera que emiten fluorescencia verde, mientras que las protefnas que contienen fosfotirosina se han marcado oon un anticuerpo que emite fluoresccncia roja. Donde los dos oolores se superponen, eloolor resultante es amarillo. los filament05 de actina tcnninan en los contaetos focaJes. en los que Ia ct!luIa se adhiere aI substrato. lAs prolefnas que oontienen fosfotirosina tambim sc concentran en estos lugares. Se ace que esto re6eja la aetuaci6n de un mecanIsmo de sefuIles Intraeelulares de tirosina quinasa activado mediante las proteinas tJanSmembrana integrinas que se unen a Ia fibronectina extraeeIuIar y (indirectamente) a los filamentos de actina intrncelulares (~P4 1011). Se ace que las sei'laJes generadas en estos lugare:s de adhesi6n facilitan Ia <eguloci6o de Ia _ '"'''''', tanto en fibroblastos como en c:eh.tlas eplteliale:s. (Cortesfa de KeIth Burridge.)

965

Estudios en c~lulas cancerosas revelan la existencia de genes irnplicados en el control de la proUferaci6n celular37 tOe qu~ forma las difcrcntes influencias extemas que hemos examinado afectan el interior de la cclula regl,llando la proliferaci6n celular? Cancretamente, tc6mo influye la adhesi6n de un factor de crecimiento a los receptores de la superficie celuJar en el funcionamiento del sistema de control del cicio cclular? Mucha de 10 que sabemos sabre este aspecto proviene del estudio de c~lulas cancerosas, en las cuales el control de la proliferaci6n celular se ha rota. Estas c~lulas son mutanles, y debido a que proliferan excesivamente y producen rumores, atraen nuestra atenci6n sobre sus genes mutanles_ Como discutimos en el Capitulo 24, el anaJisis de las alleraciones gen~licas en ccluJas cancerosas ha revelado un gran nu.mero de genes que codifican prolefnas implicadas en el control de la proliferaci6n celular. Dichos genes se podrfan clasificar inadecuadamente como genes de proliferaci61l y genes de alltiproliferaci6". EI producto de los primeros facilita el incremento del crecimiento celular y el ensamblaje de la maquinaria de control del cicio celular y conduce a la c~­ lula mlls allll del punlo de control G l ; el producto de los segundos facilila la aplicaci6n de frenos que delendn\n todo el sistema de control celular y provocan1n su desmantelamiento. Si una mutaci6n en un gen de prolireraci6n causa la sobreexpresi6n a la hiperaclividad de su producto, tendremos como resuhado una proliferaci6n celular excesiva caraclerfsLica del cancer. En eSlos casos se clasifica el gen mulante como un oncog~n (es decir un gen que provoca c
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RESULTADO PROUFERAOON ctLUlAR NOAMAL

966

PRQUFERAoON CELULAA EXCESlVA

Caprtulo 17 : El cicio de dJvisi6n celular

PROUFERAaON ctLlJLAA EXCESIVA

Figura t7·43 Genessupresoresde tumores respecto a proto-oncogenes. El producto de un gen supresor de turnores inhibe el ensamblaje y la activacion del sistema de control del cicio celular, el producto de un protooncogl!n hace todo 10 contrario. La proliferaci6n incontrolada puede resultar de mutaciones que inactiven ambas capias del gen supresor de tumores 0 que provoquen una fuene sobreaclivaci6n de una copia del prolo-oncogl!n.

Los facto res de crecimiento desencadenan cascadas de sefiales intraceluJares30,38 EI primer paso en la acci6n de un faelor de erecimiento proteico es su uni6n a un receptor transmcmbrana de la superficie de la celula diana. Enlonces la porei6n intracelular del receplor calaliza la produeci6n de moleculas que actllan como sefiales intracelulares. transmiriendo el eSlfmulo a orras moleeulas. Los detalles de los pasos iniciales de varias de estas cascadas de seflalizaci6n han side estudiados a fondo para el caso de diferentes lipos de receptores (se deseriben en el Capitulo 15). La complejidad del sistema aparece porque generalmente las eascadas no son simples cadenas lineales de transmisi6n sino que se ramifiean aetivando mllchos componenles interactivos que actuan en paralelo, formando una red de sel1a1es altamenle lntereoneetada. Vimos en el Caprtulo 15 que los reeeplores de los factores de erecimienlo activan cascadas de fosforiJaci6n intracelular que provocan cambios en la expresi6n de los genes. Los genes inducidos por los faetores de crecimiento son de dos c1ases; los genes de respuesta rtiplda inducidos dentro de los 15 minulos siguientes a la actuaci6n del factor de crecimiento y sin que se necesaria la sfntesis de protcinas, y los genes de respuesta relardada, que no se indueen hasIa al menos una hora despues de la actuaci6n del faclar de erecimiento y de forma dependiente de la sfntesis de prOlefnas. Parece que los genes de respuesta retardada se inducen a causa de los produclos de los genes de respuesta rapida, varios de los euales se sabe que son protefnas reguladoras de genes (Figura 17-44). Ambas c1ases de genes son silenciosos y no se Iral1scriben en las cl!lulas en Go pero se indueen a elevados niveles cuando se aii.aden faetores de erecimiento al media. Si entonees se manliene la exposici6n a los faetores de erecimienlO, el nivel de expresi6n de los genes cae gradualmente -para algunos genes aparcntemente hasta cero y para orros hasla un nuevo valor estable diferenle de cera. Por 10 lanto el producto de la segunda c1ase de eSlos genes se halla presente a unos niveles bajos pero constantes en las celulas de cicio normal (Figura 17-45). Asf pues la uanscripci6n de estos genes indica la presencia de faetores de crecimiento en el medio, y un elevado nivel de expresi6n indica una subida repentina de la eoncenlraci6n de factores de crecimicmo. Las sei'lales que recibimos por nuestros sentidos (el olfala, por ejemplo) se componan de una forma parecida. Los genes de respuesla rnpida mejor estudiados son los proto-oncogenes mye, [os y jun. Los tres genes codifican protefnas reguladoras de genes que acluan como homo- 0 helerodfmeros (se discuten en el Capitulo 9). Si en ciertos tipos eelulares estos genes se sobreexpresan 0 hiperactivan por efecto de mutaciones, todos elias pueden provocar una proliferaci6n incontrolada. Ex.islen evidencias que sugieren que partieularmente myc podrfa tener un papel cr(tieo en cl control normal de la proliferaci6n celular. Las eelu.las en las que se impide espedficamenlc la expresi6n de myc no se dividen incluso en presencia de factores de crecimienlo. En cambio, las celulas en las que se acliva especiahncnte

factor de crecimiento

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CfTOSOl

primefll quina.. activ/ldll

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Flgun 17-44 Ruta nonnal queslguen las sel\ales estlmuladoras de la

proUferad6n uluJar provocadas por un (aelor de eredmlento. Este diagrama muesua algunas de las etapas princlpales. Omile las eUlpas intermedlas del sislema de liberaci6n. Las rulas de las sef'iales intracelulares se uatan en el Capitulo 15. 1'Igunl17-45 LarespuestadeMycaun fiIdordeaednUento. Myc es eI producIo de un gen nl)Cde respuesta r.ipida. gr.ifiw muestra bscanDos de ronrentrad6n de 13 pmteina M~ U'aS un inaernentorepentinode13a.mcentrad6n de faaorde crednrienlO hada un ntJlM) estado esracionario, Ioque pltMX
a

factor de crlCimiento .usente

IMvcl

liempo (h)

o

8

• Controles de la dlvlsi6n celular en los animales pluricelulares

salida de In oaula de Go YSU prolifuraci6n. Los cambios en Ia concentraci6n de Myc reflcjan cambios en Ia transeripci6n del gen n!}\::, estimul.1dos mediante la cxposici6n de 13 celula aI factor de crecimiento. La propia protefna Myc inhibe 13 transcripci6n demyc, ysecreequesu retroalimentaei6n negama expIica porque eI niveI de Myc disminuyedesde 5U \'aIOr maximo iniciaI hasta un valor mas bajo pero estabIe.

967

la expresl6n de myc Independlentemente de facto res de erecimiento. no pueden entrar en Go' Ysl estlin en Go cuando se les proporeiona la proteina Myc. abandonarlln Go y empezarw a dividirse incluso en ausencia de factores de crecimiento -un comportamiento que final mente las Uevarll a la muerte celular programada.

Las ciclinas y la Cdk son inducidas por factores de crecimiento teas un largo retraso 34 Los genes de respuesta retardada no empiezan a transcribirse hasta bastante despu~s de la adlci6n de un factor de crecimlento, y su transcripci6n requiere la presencia de productos de genes de respuesta ntpida como myc. Entre los productos de los genes de respuesta retardada se cuentan algunos de los componentes hlisicos del propio sistema de control del cicio celular, incluyendo las proteinas Cdk y varias ciclinas, de las cuales se sospecha que desde el momento de su expresi6n estlin implicadas junto con las prote(nas Cdk en la conducci6n de las celulas mas alJA del punto de control Gl' en la iniciaci6n de la fase S, 0 en ambos procesos. Asf pues podemos trazar de forma tentativa una cadena de efectos estimuladores que nos conducirlln desde la uni6n de un factor de crecimiento hasta el iniclo de la replicaci6n del DNA. Se cree que estas seiiales estimuladoras actuan 8uperando dispositivos inhihidores especfficos que reprimen la proliferaci6n en ausencla de sei\ales positivas. Los mecanismos inhibidores son protefnas coditicadas por los genes de antiproliferaci6n de los que hemos tratado, y que se descuhrieron como genes supresores de tumores en clinceres humanos. El gen de antiproliferaci6n mejor conocido es el gen retinoblastoma.

La protema retinoblastoma actua manteniendo la proliferaci6n bajo controp9 EI gen rellnoblastoma (Rb) fue fnicialmente identificado a trav~s de estudios sobre una predisposici6n hereditaria para un clincer poco conocido, que se produce en los ojos de algunos nii\os (se discute en el Capftulo 24). La perdida de las dos copias de este gen conduce a una proUferaci6n celular excesiva en la retina inmadura, 10 cual sugiere que normalmente el producto del gen ayuda a mantener controlada la proliferaci6n celular. La c1onaci6n del gen retinoblastoma posibilita explorar c6mo ejerce este efecto el producto de gen. La proteina Rb en una molecula ahundantes en el nueleo de celulas de rna· mifero. Se une a muchas otras proteinas, ineluyendo algunas importantes protef· nas reguladoras de genes, pero su eapacidad de uni6n depende de su estado de fosforilaci6n. Cuando Rh se desfosforila, se une a un conjumo de protefnas reguladoras que favorecen ia proliferaci6n celular, manteniendolas secuestradas y fuera de acci6n; la fosforilaci6n de Rb faeilita la liberaci6n de estas proteinas. permitiendo que actt.1en (Figura 17-46). En ee;lulas normales Rb estll siempre presente. independientemente de si las celulas estlln en Go 0 progresando en el Acluacl6ndela protema rednoblastoma (Rb). La

Figura l7-46

. . .":ternaRb

('~JK';.'

~"

..,"" ",",.do," de genal inactiva

gen diana

968

Capitulo 17: El cicio de dlvtsl6n celular

prolerna Rb

®~ f~sforilede

~eCl;va

proterna r&guledora de gonal ectiva tranacrlpci6n genetlca geo diana

protefna Rb desfosforUada se une a protefnas reguladoras de genes que estimulan la transcrlpci6n de determinados genes (tales como mye) necesarios para la prollferaci6n celular, y los mantiene inactivos. Cuando estli fosforilada, Rb se separa de dichas protefnas estimuladoras, permltiendo que activen la proliferaci6n.

Rb in'ctlv,

Rb ae;tiv,

Figura 17-47 Camblosen 10 fosforllacl6n de Rb en una celula que progresa a traves del cicio. Rb se desfosforila cuando la celula sale de la mitosis y se refosforila al final de G[. cllando la aHllla se prepara para superarellnicio.

cicio, aunque su estado de fosforilaci6n es variable. La celula en Go cOlltiene poco fosfato y parece impedir la transcripci6n de genes como los Y "'}'C. que son necesarios para la proliferaci6n. Estos genes se transcriben a un rilmo elevado en celulas mutantes que no tienen una copia funcional del gen Rb y a un ritmo mucho mas bajo cuando a estas mismas celulas se les anade. mediante transfecci6n. una copia funcional del gen Rb. Los factores de crecimiento anulan la inhibici6n ejercida por Rb haciendo que la proteina se fosforile en multiples serinas y treoninas. Ahora las celulas empezaran a expresar la proteina Cdk, superanin el punto de control G l • y comenzaran a sintetizar DNA. En las celulas proliferantes el grade de fosforilaci6n de la prOle(na Rb aumenta y disminuye en cada cicio: aumenta al linal de Gl' cominua allo en S y Gz y disminuye hasta un estado de desfosforilaci6n cuando la celula esta en mitosis (Figura 17-47). Itl vitro la protefna Rb es un buen substrato para la fosforilaci6n mediante prOleina quinasas de la familia Cdk. 10 cual sugiere un posible camino en el cual el estado de fosforilaci6n de Rb podrfa relacionarse estrechamente con el estado del sistema de control del cicio celular. Se cree que la protefna Rb desfosforilada (activa) acrua en G l como pane del mecanismo de freno que inhibe el paso mas alia dellnicio; tambien podrfa permitir a la celula la entrada en Go mediante la interrupci6n de la producci6n de componemes fundamcntales del sistema de control del cicio cellliar --como hacen otras protefnas- cuando el ambiente se vuelve hostil para la proliferaci6n. Pero en la mayorfa de las celllias la situaci6n se complica por la presencia de mas de una protefna similar aRb, y parece que mucho tipos cellliares tienen un componamiento normal incluso en ausencia de la propia protefna Rb. eEl rat6n transgenico al que Ie falta el gen Rb progresa de fomla casi normal a traves de la primera mitad de su desarrollo embrionario, pero entonces rnuere, mostrando defectos solamente en algunos tejidos determinados,) Mejorar nueSlro conodrniento sobre los genes de antiproliferaci6n tales como Rb es una tarea importante, ya que delidencias en estos genes juegan un papel cnlcial en una gran cantidad de canceres hU1ll3nos.

La probabilidad de enlrar en Go aumenta con el numero

de divisiones celuJares: la senescencia celular 40 La proliferaci6n celular de un animal superior no se regula sencillamcnte me· dian Ie el entorno de 13 celula sino que depende de la historia de la c~lula a largo plaza de una mancra compleja: cada lipo celular diferenciado. en cada estadio de desarrollo animal obedece a unas leyes Iigeramente distintas. 10 cual reneja diferencias en su maquinaria de control interno. Quiza el ejemplo mas simple pero tambien el mas misterioso de los efectos a largo plaza sabre la divisi6n celular es el fen6meno de la senescencla celular. La mayorfa de las celulas del cuerpo de un marnifero 0 de un pajaro muestran una gran relicencia a continuar prolirerando indefinidameme. incluso aunque se las ali mente cuidadosamente ill virro. Esto las distingue de las c~lulas de la linea germinal y de Ifneas celulares establecidas en cultivo. las cuales se cree que han sufrido un cambio genl!tico que las hace "inmonalcs", Por ejemplo. los fibroblastos extrafdos de un feto humano nonnallinicamente duplicarnn su po-

Controles de la divisi6n celular en los animales pluricelulares

•

969

progenitor del cIon A

,

------ -- -- --

, / clliulas "'" --.jew hermanas

no se duplican

ocho

1._- ---

duplicaciones

01234567;108

numero de dupl,caciones de clliulas hermanas

omh

I t': __.11_.:.1_

L 8.

01234567;108

numera de duplicaciones de clltulas hermann

blaci6n unas cincuenta veces si las cuitivamos en un medio estandar de crecimiento. Hacia el final de este periodo, la proliferaci6n se ralentiza y finalmente se deliene. y las celulas entran en un eSlado Go del que nunca se recuperaran. Celulas similares extrafdas de un aduho de cuarenta ai'ios dejan de dividirse tras aproximadamente cuarenra duplicaciones. mientras que las celulas de un aduito de ochenta arios se detienen tras treinta duplicaciones. Los fibroblastos de animales con una esperanza de vida mas corta dejan de dividirse en culrivo teas un mlmero mas reducido de ciclos de divisi6n. Este fen6meno se ha denominado senescencia celular debido a la correspondencia con el envejecimiento del cuerpo. Su relaci6n con la edad del organismo. sin embargo, no esta clara. La senescencia celular sorprende por vadas razones y ni su funci6n, si es que tiene alguna, ni su mecanismo. estan claros. Se han propuesto muchas teorfas para explicar este fen6meno. AJgunas sugieren, poc ejemplo, que es el resultado de una acumulaci6n de mutaciones aleatorias nocivas que reflejan s' 1.11"mente la imprecisi6n del mecanismo de reproducci6n celular; otras sl.: ~Iere I que es el resultado de un mecanismo que se ha desarrollado para protegernos del cancer mediante la limitaci6n del crecimiento de tumores. Sin embalgo !>,~ sabe que para algunas clases de celulas la velocidad de aparici6n de la senesccncia depende estrechamente de la concentraci6n de factores de crecimiento {' lei medio. Aparentemente el proceso refleja cambios del potencial de prolifera<. \n que pueden ser regulados por el enlomo de la celula. Una caracteristica habitual del desarrollo embrionario son las coetas secuei' cias de divisiones celulares que terminan en diferenciaci6n, pero es diffcil de imaginar c6mo una celula puede calcular a largo plaza de forma precisa el numero de sus ciclos de divisi6n y detenerse al acabar el ciclo numero 50. De hecho. aunque la senescencia ocurre en un momento predecible para una poblaci6n celular determinada, no esta programada estrictamente a nivel de las c6111.las individuales. En un clan de fibroblastos normales aparentemente identicos que se estudie en condiciones de cultivo estandar, algunas celulas se dividen muchas veces y otras. en cambia, s610 unas cuantas. Parece que cada una de las celulas deja de dividirse como resultado de una transici6n a1eatoria. Las probabilidades de que esta transici6n ocurra aumentan con cada generaci6n celular sucesiva hasta que no quedan celulas proliferantes en la poblaci6n (Figura 17-48). Una posible interpretaci6n de este fen6meno radica en el comportamiento de los te16meros -las secuencias de DNA repetitivo especiales necesarias en los extremos de los cromosomas. Como tratamos en el Capftulo 8, cuando una celula se divide. est as secuencias no se replican de la misma forma que cl resto del genoma sino que son sintetizadas mediante una enzima, la telomerasa. que actua can menos precisi6n, creando una variaci6n aleatoria en el numero de repeticiones de la secuencia telomerica del DNA. La senescencia celular esta muy reladonada can la reducci6n progresiva del numero de estas repeticiones, 10 cual 970

Cap(tulo 17: EI cicio de divisi6n celular

Plgura 17·48 Evldenclade la varlacl6n celuJar respecto a la herencla de la capacldad de dlvisl6n. Las celulas de un cion varian en el mimero de divisiones celulares que experimenta cada una de elias. Aqul. se han estudiado varios pares de celulas hermanas del mismo don, y los hislogramas muestran el mlmero de celulas que se dividen un determinado numero de veces. Si una celula hermana no se divide nl una sola vez. a la otm hermana Ie ocurre 10 mismo 0 se divide muy pocas veces (a fa izquierda); y si una se duplica ocho veces 0 mas la Olra hace 10 mismo (a fa derecIJa). Esto muestra que existen caracteristicas hereditarias entre las celulas del mismo cion respecto al numero de ciclos de divisi6n que son capaces de realizar. No obstante. los disdnlOS estados hereditarios no son perfectamente estables; as! pues algunas veces celulas hermanas se comportan de manera distinta. Estudios posteriores muestran que a medida que la poblaci6n celular envejece. las celulas sufren transiciones casuales hacia estadios en los que la capacidad de divisi6n es mas reducida. (Datos de j.R. Smith y R.G. Whitney. Sciellce207:82·84. 1980.)

10

",m[

11

HAPLOIDE cromosomas

OIPLOIDE

PENTAPLOIOE

22 cromosomps

55 cromo$Omn

Figura 17·49 Dlbujos de secclones representatlvas de tubulos de rli'i6n de larvas de salamandra de dlferente grado de ploldfa. Las salamandras pentaploides ticnen celulas que son mas grandes que las de las salamandras haploides, pero los animales y sus 6rganos individuales ticnen el mismo tamano porque cada tejida dcl animal pentaploide tiene menos celulas. Esto indica que el numero de celulas sc re~:ula mediante un mecanismo que se basa en el tamafio y en la dislancia en vez de en el numero de divisiones celulares 0 cn la cantidad de cclulas. (Segtin G. Fankhauser. en Analysis of Development IB.H. Willer, P.A. Weiss, y V. Hamburger. eds.l, pp.126-150. Philadelphia: Sanders, 1955.)

sugiere que la senescencia puede estar provocada por la incapacidad de mantener la longitud de los tel6meros, quizas porque las celulas somaticas (en contraste con las celulas de la Ifnea germinal) son deficientes en telomerasa.

El cuerpo se genera y se mantiene mediante complicados patrones reguladores de la divisi6n celular 41 Mientras que la vida puede terminar mediante un proceso de senescencia for· tuito, comienza con una serie de ciclos de divisi6n regulados segun unas leyes precisas y complicadas. Esto ocurre asf en todos los organismos pluncelulares pero esta i1ustrado de una forma mas lIamativa en un gusano nematodo, CaerlorhaHditis elegans. EI huevo fecundado de C. elegom se divide produciendo un adulto con exactamente 959 celulas somaticas nucleadas, cada una de las cuales esta generada mediante Sll propia secuencia de divisiones celulares caracterfstica y absolutamente predecible. En general estos fen6menos no son simplemente una cuesti6n de lIevar el recuento de las divisiones celulares segun un patr6n temporal. Por ejemplo, salamandras de distinta ploidfa rienen el mismo tamano pero diferente numero de cclulas; cada una de las celulas de un animal penta· ploide tiene un volumen cinco veces mayor que las de un animal haploide, y en cada 6rgano los animales penraploides s6lo han generado una quinta parte de las celulas de sus parientes haploides, de manera que los 6rganos son aproximadamente del mismo tamano en las dos c1ases de animales (Figuras 17-49 y 17-50). Evidentemellle, en este caso Cy de hecho en la mayorfa de los otros casos) el tamano de lo.\> 6rganos no se regula mediante el recuento de celulas 0 de ciclos celulares sino mediante algt'in mecanismo que en realidad calcula distancias. Tales mecanismos requieren controles posicionales complejos en los cuales los facto res de crecimiento pl/eden jllgar un papel importante. Tal como veremos en el Capftulo 21, se empiezan a caracterizar algunos de los genes que rigen los programas de proliferaci6n en el cmbri6n. En el embri6n temprano de Drosophila empieza a ser posible explicar los patrones de la divisi6n celular segun las aClividades de componentes identificados del sistema de control del cicio ceJu-

Figura 17·50 Mlcrograffas que comparan las celulas de los cerebros de salamandras haploldes y tetraploldes. (A) 5ecci6n transversal del cerebro de lIna salamandra haploide. (B) Secci6n transversal correspondiente a la parte posterior del cerebro de una salamandra telraploide mostra.l1do que una reducida cantidad de celulas es compensada por un mayor tamafio celular. (De G. Frankhauser, 1m. Rev. Cirol.I:165-193. 1952.)

Controles de la divisi6n celular en los anlmales pluricelulares

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lar. Sin embargo. los bi610gos que estudian el desarrollo todavfa est1\n lejos de saber con delal1e de qll~ forma las quinasas dependientcs de ciclina. las ciclinas, los factores de crecimiento, los contaclos celulares, los genes de proliferaci6n y amiprolifcraci6n -todos los tornillos y las tuercas del control de la divisi6n celular de los que hemos tralado haSla aqui- Irabajan juntos l1evando a cabo los complejos programas de la divisi6n celular en desarrollo. Asf pues, haSI8 ahora nuestro conocimiento de la compleja red de com roles que rigen la divisi6n celular en la sociedad de celulas que forman un cuerpo adulto es 5610 fTagmemario. Por ejemplo, cuando se cura una herida en la piel de un venebrado, cerca de una docena de tipos cclulares -desde fibroblaSIOS a celulas de Schwann- Lienen que regenerarse en cantidades y posiciones adecuadas para reconslruir el lejido perdido. Eslas cuesliones sobre la divisi6n celuJar en . los lejidos, que se tratar.1 en profundidad en el Capitulo 22, son bAsicas para el conocimienlo del clincer, en el que los comroles sociales funcionan mal, y en muchfsimas olras enfermedades. En el centro mismo de la cuesti6n lenemos la funci6n del propio cicio celular --el mecanismo de reproducci6n celular del que depende cualquier forma de vida. Los descubrimientos procedenlcs de los estudios en ranas y levaduras ya estlin empezando a aportar nuevas solucioncs a problemas urgentes del ser humano.

Resumen Las dlultu de los an/males plurkelulares, como porejemplo los num.lferos, pare-

am teller bdsicamellte el m/smo sistema de control del cicio cellliar que presenum ltu levad"ras, cm. el principal p'l1Ito deco"trol en G/. Sin embargo, a difere"cia de ltu levad"ras, nOnltalmente rerrasan s" proliferaci6n a menos qlle reclban seffales especfjiau de otras dlulas para llel-'arla a cabo. Si a " ••a dlllla Ilormal de mamifero ell c,dtivo se Ie pril.'LI de estas senales, se detelldrd ell ,ma varitUlte qulescellte del estado G, ell la que no Ilay crecimiellto algullo -dellominatln Go- en la que se inactiva la producci6n de componentes del sistema de control del cicio ceiular y de mudlas otras protelllas. Los [tJCIOreS proleicos de crecimiellto ejercen infl"e"cias extracelillares importat.tes sobre la prollferaci6n celll.lnr. Dici.os factores esttfll preselltes a co,.ctmtraciotles mllY bajas y parece qlle la compelellela porellos lim/ta III dellsidad de la !Joblaci6" cellliar. Ademds del reqllerlmietlto de factores de crecimie/.to especlficos, la mayor/a de las cilulas tielle,l que estar ar.cladas a Uti substrato !tara potier dlvidirse. Los factores de crecimietlto regular, iii proliferaci61l celldar a traves de Wltl comtJlejtJ retl t/e cascadas de senales intraceiulnres, que jlllaimelite regrdall la trallscritJcl611 de genes y el ensamblnje y In activaci6n del sistema de COJltrol (tel cicio ce/ulnr. Se lum iclemiflcatlo /tIUC/IOS de los componelltes proteicos de estas llias se,laliuuloras med/allte el est"dio de d/ulas callcerosas, en las cllales se I,an tJrodllCido mutllciones qlle liar, ac:rivado genes CllyO prodllCto estitmda In prollferaci6n (proto-oncogenes) 0 que lum ;,ltIctivadO genes CllYO prodliCto tlonnalmellte relrasa In prolifertu:i611 (genes sllpresores de "",lOres). Entre los prolo-oncogenes exlstell algumu proleinas reglllndoras de gelles, como Myc, que ell algllnos tipos cellliares SOli IIecesarlas y slljic/elltes ,tara itldllclr la proliferad6n cellllnr. Cm'lrarlamellte, existell gelles sllpresores de t,m,ores, como Rb, fllYOs prodllCtOS bloqlleLIlI In prollfertu:/61l ,mie"dose y U!C1li?$lrtllldo proteltUJS reguladoras de gelles. Aparte de estos oontroles a corIo pIaz.o de la proliferaci6n ceiulnr de los orgallismos pillricelulnres, se produce" colltroles a largo plaza, como SOli los responsables de la progresiva dismi,wel6" del potetlc/al de proliferaci6" a meditln qll-e ltu dlllias etlvejece" 0 los oompUcados progmmas de divis/6n celll.lar "ec:esarlos dllrallte el desarroUo del embri6n. Por allora, n"eslro OOllocimlenlo sobre eslos oontroles es bastante limltado.

972

Caprtulo 17 : EI cicio de dlvls16n celular

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Capitulo 17 : PJ cicio de dlvj~16n celular

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Los mecanismos de la division celular

18

-

•_

.

doconjDnlo dora.....

-CItodRIIiI

En este capftulo vcremOlii los mccnnlsmos de los aconlcclmllmtus de III fUlIe M (0 divisl6n celular) del cicio cclular. Esto rase. que incluye los dirercntes esladlos de 18 divisl6n nuclear (mitosis) y de la dlvisl6n ciloplasltu1tlca (t.'icocillesis). es In cui· minacl6n del cicio celulaf. En un perfodo rcladvamente breve. los contcnlc.los de la cl!lula madre, que se han duplicado mediante las actividades bloslntl!tlcas de la interfase precedenlc, se segregan en dos cl!lulas hijas (Figura lB· I). A nlvel molecular In M se Inlela mediurut: unn cascada de fosforlloclones de protefnas dcscncadenadu por II' aClivncl6n de In prate(nu quinasa MPF que induce la mitosis, y se termina mcdiullw Ius dcsfosforllndutlcs que slKucn a la Inaclivacl6n de MPF II trav~s de In proteolisis de sus subunidndt.l!l dc c1dina (traladas en el Capftulo 17), Las desfosforiluciolle5 de protc{na que ocurren durante 18 fase M son las causantes de la mayorfl1 de camblos morfol6glco8 que acompanan a la mitosis: los cromosomas 5e condet\Snn. la envollura nuclcar se rompe. el retfculo endoplasml1Uco y el complejo de Golgi sc fragmcllI8n.lu c4!lula afloJa sus adheslones a otras c4!lulas y a In matrlz extrucclular, y cl cilocsqtu:leto se transforma facllItando In compllcuda organlzacl6n de movll11lcntos que segrcgarlin los cromosol11as y In divisl611 celulur. DebJdo 1I que lu fase M ctllllleva una reorganlzaci6n complclu del hllerlor celular, se cree que el mimcro de prolefnas que se fosforllan es muy amplio, y que prrtcllcnmenle ladas las wiles de In ~Iula quedan ftfecmdas de alguna mallCW.

rase

celulll.n lntorfull cllopluma

nueleo

.........

oromoo6mloo

1I... SI

@ I

MITOSIS

I•••••

prol,.., promlll.I..., mlll.f...,

,n,I'MI,

Mlm,..

Visi6n de conjunto de la fase M' Salvo pequenns vnrlucloncs, los procesos que Iienon lugur ell In rase M !'lIfa dividlr una c~lula tlll dos slguen Jn mlsma seclIcncla ell tudos Jos cucnrlotu8. Olrlgldas par 10 reorganlzacl6n del choesquclcto, las cclulas acoplltn, utJli1.un y desmantan los mecanismos necesarios IJUra separnr las series dc cromosomas dupUcadoll ydividlr el cltoplasmn en dos mllades.

Figura 18-1 I... fate M del cicio celll!..r. La (MIl M ernplew aJ nOli] de la (ast! G. y nnldl1.n oj comcn1.ar la pr6:dma {n~G,.lndu)'elOll dncCl eslndlM de la dlvlllido nuclear (OlJlml.!l). )' 18 dlvlsl6n dlClphumftit:a (cilOclnC!lls).

Tres caracterfsticas son excluslvas de la rase M: la condensacl6n cromos6mlc8, el huso mH6t1co y elaniUo contrtlcllI La prlmern milnifoSlucl6n aprcclllbic dc III fuse M os lit progrcslva compucluci6n de lit dlspersa cromatina inlcrftl.sica, fonnando lInos cromosomns en formn de hila. Esl8 condensacl6n crom086mlca es necesarla pora In scgregad6n organl· !ada de cromosom8s ell d05 ~lublS hljas que lendr4 lugar a comlnuacl611, y sc

977

Figura 18-2 EI cltoesqueleto en fase M. £1 huso mit6tico seensambla y scgrega los cromosomas. EI anillo contnictiJ se cnsambla mas larde y divide la celula en dos.

PROGRESION A TRAVESDE

LAFASE M mlcrOlljbulos del huso m'lOt'co

lilamentos de actina del anillo conti 'ehl

ve acompanada por la exlensa fosforilaci6n de moleculas de hislona HI (hasla seis fosfatos por molecula). Se cree que la fosforilaci6n de la hislona HI. en el comienzo de la fase M. contribuye a la condensaci6n cromos6mica. ya que su concentraci6n es de aproximadamente una molecula par nucleosoma y se sabe que participa en la condensaci6n de los cromosomas. La condensaci6n cromos6mica es el preludio de dos procesos mec:!.nicamente distintos: (I) mitosis -Ia segregaci6n de cromosomas y la formaci6n de dos nucleos en lugar de uno-- y (2) citocinesis -Ia divisi6n de la lotalidad de la celula en dos. Estos procesos se efeetuan por dos estructuras citoesqueleticas diferentes que aparecen fugazmente durant~ la fase M. La primera en formarse es un huso mlt611co bipolar. compuesto por microtubulos y por sus proteina asociadas. EI huso mit61ico alinea los cromosomas replicados en un plano que secciona la celula en dos; entonces cada cromosoma se sepam en dos cromosomas hijos. que son desplazados hacia los polos opuestos del mismo huso. La segunda estructura citoesqueletica necesaria en la fase M de las celulas animales es el anillo contniclll de filamentos de aclina y de miosina II, que se forma Iigeramente m:l.s tarde juslo debajo de la membrana plasm:!.tica, en un plano perpendicuJar al eje del huso (Figura 18-2); al mismo tiempo que se contrae el anillo se contrae In membrana hacia denlro dividiendo la celula en dos. asegurando asf que cada c~lula hija reciba no Ian s610 un serie completa de cromosomas sino tambicn la milad de los consliluyentes citoplasmaticos de la celula madre. Las dos estructuras ciloesqueleticas conrienen diferentes series de prolefnas y. en algunas celulas especializadas, se pueden formar de manera independiente. No obstante, su forlllaci6n normalmenle est:!. eS(fechamente coordinada de forma que la divisi6n citoplasnu1.tica (cilocinesisl tiene lugar justo despues del final de la divisi6n nuclear (mitosis). En la cclulas vegetales ocurre la misma secuencia, aungue sus paredes rfgidas rcqllieren un mecanismo diferenle para la citocincsis, tal como veremos mas adelante. La descripci6n de la fase M que acabamos de hacer s610 cs aplicable a las cclulas ellcariOlas. Las cclulas bacterianas no contienen filamentos de actina ni microtubulos. NormalmenlC poseen un solo cromosoma, cuyas capias replicadas se segregan en las cclulas hijas, sin ninguna condensaci6n especial, mediante un mecanismo que implica la adherencia del cromosoma a la membrana plasmlhica de la bacteria. Probablemente la necesidad de unos mecanismos mit6ticos complejos surge sola mente con la evoluci6n de celulas que contienen gra.lldes cantidades de DNA cmpaquetado en un numero de cromosomas variable. La funci6n primordial de lales mecanismos es repanir los cromosomas replicados de forma precisa entre las dos cclulas hijas: en las celulas de levadura, en las que se ha determinado con exactitud. se produce un error en la segrega· ci6n cromos6mica tan s610 cada ]Os divisiones celulares.

La divisi6n celular depende de la duplicaci6n del centrosoma2 Como se vio en el Capitulo 16 en la mayorfa de celulas 3.nimales el centrosoma es el principal refllro orgalJiUJdor de microtubulos (MTOC. de MicrOlubule Orga.lliz.ing Center). una nube de material pericemriolar poco definido (la mfltriz del centrosoma) asociado con un par de centriolos (Figura 18-3). Durante la interfase la matriz del centrosoma nuclea una serie de microtubulos citoplasmatieos. que se proyeclan hacia el exterior en direcci6n al perfmerro celular con 978

Capftulo 18: Los mecanlsmos de la divisi6n celular

Figura 18-3 Uncentrosoma Electronmicrografia de una secci6n gruesa de centrosoma de una c8ula de mamffero en culdvo. (Conesfa de P. Witt yG. Borisy.)

sus extremos "menDs" adheridos al centrosoma. Antes de que la ceJula eucariota se divida, su centrosoma ha de duplicarse para que cada una de sus dos celulas hijas tenga uno. De hecho, Jos centrosomas duplicados SOil necesarios para crear las dos celulas hijas, ya que los centrosomas forman los dos extremos del huso mil6tico. Los centrosomas de la mayorfa de las especies animales comparten una caracterfstica estructural notoria y distintiva: un par de centriolos (tratados en el Capitulo 16). Los centrfolos, sin embargo. que se asocian can la matriz del centrosoma, no son necesarios para la nucleaci6n de los microtubulos: los centrosomas vegetales no tienen centriolos; los centriolos tambien faltan durante las primeras divisiones del huevo de rat6n; adem
I

-profas&

Vision de conjunlo de la rase M

profll&e tempr'l'lll

Figura 18·4 La repllcaclon de los centr(olos. La pareja de centrlolos se asocia a la matriz del cemrosoma (en verde). En un cierto punto de la fase G1 los dos centriolos se separan unos cuantos micr6metros. Durante la fase S. cercil de la base de cada centrfolo empieza a crecer un centrfolo hijo, en angulo recto respecto a el. EI eSlirarniento del centrfolo hijo acostumbra a complelarse a 10 largo de la fase G1• Los dos pares de centrfolos permanecen juntos, en un complejo centros6mieo unieo, hasta el eomienzo de la fase M. cuando el cemrosoma se parte en dos y las dos mitades empiezan a separarse. La estructura del centrfolo es ilustrada en la Figuras 16·45 y 16-47. Figura 18-5 EI cicio del centrosoma de una ceJula animal. E[ centrosoma de una celula en interfase se duplica forrnando los dos palos del huso mit6tico. En la mayorfa de las celulas animaJes el par de centrosomas (ilustrado aquf como un par de Imrms verde QSCllro) se asocin con la rnatriz del centrosoma (verde clnro) que nuclea los microtubulos. (En este diagrama el volumen de 13 matriz del eentrosoma esta exagerado para facilitar Sll identilkaci6n; en la Figura 18-4 se [lustra una representaci6n mas exacta.) La duplicaci6n del cemrfolo empieza en G[ y se completu en Gz (vease Figura 18-4).lnicialmente, los dos pares de centrfolos y [a matriz de centrosoma asociada permanecen juntos como un complejo unico. En los inicios de la fase M este complejo se separa en dos y cada centrosoma nuclea una formaci6n de microtubulos radiales, lIamada lister. los dos asteres, que inicialmente permanecen uno al lado del otro eerca de la envoltura nuclear. se separan. AI final de la profase el haz de microtubulos po/ares que interactuan preferentemente entre los dos ilsteres, se alarga mientras los dos centros se separan siguiendo caminos opuestos a 10 largo de la parte exterior delnucleo. De esta forma se forma n\pidamente el huso mit6tico. En la metafase [a envoltura nuclear se rornpe, permitiendo que los microtubulos del huso interactuen con [os cromosomas; en la citocinesis la envoltura nuclear se forma de nuevo ulrededor de los dos conjuntos de cromosomas segregados. excluyendo los centrosomas.

979

organizador de microlubulos distimo que nuclea una formaci6n de mlcrottibu·

Figura 18-6 Organluu:lon cItQpla.m'tlca mediante 108 cenlroaoma, y lUI "teres. Sl Ie I"yetta afldlcolJna en lin embrion 1~lIlprallO de Drosoplli/a para bloquear III divisl6n Iluclear, los centrosoma. y 101 Iblcres que Iluc.iean Ie separan del mic1eo en esla dlula slneldal y mlgrll.n hilda 18 ,ullerllcle eelul8r, En el polo posterior. dondc normalmcnte se fonnanla. ·dlulas· germlnaJes, los broles de la membrana se organltAn graclos a los ~ntrosomas desplazadol, oblcnlendo como resultado la formadOn de las -dlula.· germlnaJes lin mldeo. (A) Esquema i1ustratlvo del proceso de yemal que provoca el ;uler. (8·01 MlcrografJaa fluorescentes de ·~Iulas· gcrmlnales sin nUcleo: (H) Ilncl6n para Vf!fel DNA, m08trando que no hay ",Ideo; (C) tinci6n con un antlcuerpo para 1M cenlr06Omas: (D) tlnci6n para mostrlI loa mlcrottlbulolllUOClados con 105 cenlrosomas. (B·D, cortes{a de Jordan

los radiaJes lIamada aster. Los dos asteres se desplv..an a caras opucslas del mi-

Raff.)

'A'

los y alros componentes del centrosoma se duplican pero pennanecen jUllIos como un unico complejo en una eara del nucleo. Al Iniciarse la mitosis, esle complejo se divide en dos y cada pareja de centriolos forma pane de un centro cleo formando los dos extremos de huso mit6tlco. Mientras nnali1.8 la mhosl!! y

la envoltura nuclear se reconslituye alrededor de los cromosomas scpamdos. cada celula hija recibc un centrosoma (el antiguo polo del huso) con sus emmasomas asociadas (Figura J 8-5). EI cicio del cemrosoma puede actuar con un grade de Indcpendl'ncia sorprelldente de los atros procesos del cicio celular. As! pues, sl sc eXlroc nsicamenIe el nucleo de un huevo de erizo de mar, 0 sl se bloquea In s(ntesls de DNA me·

dianle afidicolinn, que inhibe la sintesis de DNA, los clclos de duplicacl6n y divisi6n del centrosoma proceden casi con normalidad, prlmero produclcndo dos centrosomas, luego cllatro, despues ocho, etc. En embrioncs tcmpran08 de Drosopllila tratados dc forma paredda con afidlcollna, loti centrosomas prollfe· rantes del interior del embri6n se disocian de su m1c1co bloqupndo y tiC despla· zan a traves del citoplasma hacia la membrana plasmrttlca; cunndo nlcllllzan cstn membrana. mediante sus asteres, plleden madlfienr In formu de la momhra· na y de SLi eorteza subyacente, generanda celulas que conlimum ccnlrosomn/l pero sin nllcleo (Figura 18·6). Los huevos en divisi6n, COil tHIS rescrv1l8 de componentes celllinres que los liberan de la dependencia de 10 Irollserillcl6n gl!nlca, tienen un comportamiento marcadamente excepcional; en olms c61uJas el cicio del centrosoma depende de la presencia de un 1ll1cleo celular funcional. 8sM claro, sin embargo, que el cicio de divisi6n de la celula en su g10balidad depenclc de --0 al menos est<\ organizado en parte por- el aster microtubular, el cual It Stl vez esta organizado por el ceillrosoma. Los centrosomas, y los centriolos que normalmente se hallan asociados u ellos han dejado perplejos y han obsesionado a los bi61ogos celulares durante mas de cien anos. iDe qut:! estan hechos, c6mo se replican, y c6mo se origina· ron durante el curso de la evoluci6n? Estas cuesriones basicas contimlan sin respuesla.

Tradicionalmente la rase M se divide en seis estadios La estrategia de la divisi6n celular es extraordinariamente constante entre los organismos eucariotas. Los cinco primeros estadios de 1a rase M constituyen la mitosis (definida inicialmente como el perfodo durante el cuallos cromosomas se hallan condensados de manera visible); el sexto cstadio, que se solapa con el fi· 980

Capftulo 18 : Los mecanismos de 1a division celular

CtTOCINESIS

MITOSIS

G,

G,

o

"

"

tiiempo fminutot)

60

80

Figura 18· 7 Cronologfa normal de la mitosis y la cUodnesls de una dlula de marnffero. Los periodos varian de unas doses de c~lulas a olras. y son mucho mas cortos en los ciclos celulares embrionarios. N6tese que la citocinesis empieza ames de la finalizaci6n de la mitosis. EJ comienzo de la profase (y por tanto de loda la fase M) se define como el punto del cicio celular en que los cromosomas oondensados son visibles por primera vez.-segun un criterio arbilrario, ya que In oondensaci6n de cromosomas parece incrcmentarse oontinuamcnte durante cl final de Gl • EI comienzo de la prornelafase se define como el momento en que la envoltura nuclear se rompe.

Figura 18-8 EI CUJ'50 de la mllosls en una cilula de mamlfero liplea. En eSlas micrografias de celulas ell cuhim de pulm6n de nit6n, se han visualizado los microtubulos'mediante inmunoOuorescencia indirecta, mientras que In cromatina se line con un colorante azul fluorescente. Durante la illter/ase el centrosomn, compuesto por una matriz. asociada COil un par de centriolos, forma el foco necesario para las series de microtubulos de la illterfase. En la fJro!ase remprana el unico centrosoma conliene dos pares de centrlolos (no visibles); en la pro/ase tard(a el centrosoma se divide y los dos
981

PROFASE

-;;0---",-7 l;;

citoplasmll--------1'membrana plosmlltica

centrosomas separados Que formerlln los polos del huso

nucleolo en dispersi6n -(--"""17';~

centr6mero con clnetocoros unidos envoltura nuclear - - -....."':::-~

inlacta

::::::",,';:;'

cromosoma en condensacl6n con dos crometidas urlides

81 centr6mero

LA EN\lOlTURA NUClEAfl SE ROM

2 PROMETAFASE membrana plasmlitlca

-----,.,r

Io'i\-_-\-__ cromosoma colocado 81 azar en movimiento

-:---=~""""~=co

cinetoc6ricos

PROFASE

Tel como se va 81 microscopio, Ie transici6n de la fase G2 II 18 fase M del cicio celular no es un proceso estrictamente definido. La cromatina, Que en la interfase se halla difusa, se condensa lentamante formando cromosomas bien definidos, cuyo numero exacto es caracterlstico de la especie en cuesti6n. Cada cromosoma se ha duplicado durante la fase S precedente y ahora consta de dos cromatidas hermanas, cada una de las cuales contiene una secuencia de DNA especffica conocida como un centromero, necesaria para la correcta segregacion del cromosoma. Hacia 81 final de la profase los microtubulos citoplasm
~~,------'''--_POlosdel huso

microtubulO polar ---1L_-,l~'-1.'J

cinetocoros microtubulo$

,

activo

~:~~""'~~~~~~~~)

mlcrotubulos 8strales

de 18 If--_f-~~vesiculas anvaltura nuclear

~---:;7'~--- polos del huso

LOS CROMOSOMAS Sf DESP!.AZAN LA AMTAFAI

3 METAFASE ~

- - ' ' ' ' , - - - polos del huso

~::::IC'=='- envoltura veslc<.llas de la nuclear

2 PROMETAFASE La prometafase se inicia bruscamenfe con la desintegracion de la envoltura nuclear, que se rompe odginando vesIculas de membrana indiferenciables de las vesicules del retfculo endoplasmatico. Estas vesiculas permanecerl!n visibles alrededor del huso durante la mitosis. Los microtubulos del huso, Que hasta este momento se hallaban fuera del nudeo, pueden entrar en la region nuclear. En cada centromero maduran complejos proteicos especializados, lIamados cinetoeoros, y se unan a algunos da los microtubulos del huso, queentonces recibiran el nombre de microtubulos cinefoeCricos. Los microtubulos remanenfes del huso se lIaman microtubulos po/ares, mientras que los que son exteriores al huso se lIaman microtubulos astra/as. Los microtubulos cinetoc6ricos ejercen tensi6n sobrelos cromosomas, los cuales, por tanto, se ven sometidos a movimientos agitados.

cromosomas alineados en Is plsca metaflisic".,--_\-_-al1f~~\~~~~~ a medio camino de los palos r-r-~L-t-- microtubulo cinetoc6rico microtubulo polsr palos del huso

LOS CINETOCOROS HERMANOS SE SEPAAAN RfP£NTlNAMENTE AL INlelO DE tAANAFASE

982

Panel18·1 Los seis e8ladlos de la dJvtsl6n celular.

3 METAFASE Finalmentelos microtubulos cinetocoricos aliMan los cromosomas en un plano situado a medio camino de los pol os del huso. Cada cromosoma se mantiene en tension en esta placa mefafasica por los cinetocoros apareados y por sus microtubulos asociados. los cuales estan unidos a los pol os opuestos del huso.

4 ANAFASE

4 ANAFASE Impulsed. por una Beflat a.paclfica, Ie anafase empie%8 brU8Camente coando tos

los microtubulos Cjnetoc6r.''''=T~t"'':z~TlI

llcortllll a medldl'l que Iii crom8l1da Icromosoma' "arrllSlr-.da haei.

clnetocoroa epareados de cada eromO.Offia .8 aeparan. permitiendo que cada cromatida (ahara denominada cromosoma) Ma arrastrada lentament. hacia un po+o del huso. Todos los cromosomas que 58 acaban de _pen_ Ie de.p1azan a 18 misma velocidad. que es de aproximadamente 1 IJm por minula. Se pueden distinguir dos categorlas de movimiento. Durante Ie enefese A, los microtubulOI cinetoc6ricolle &Cortan a madida que loa cromolOmas sa aproximan a 101 polos. Durante la anafaS6 B, 101 microtubulol polares Ie alargan y los dos poIos del huso Ie separan. NOt"malmente Ia anafase tOlo dura unos minutos.

Sf!

"-

0o

microtubulo

- \. .--..~~

cinetoc6rico acoru~ndose

microtubulo astrlll

I

5 TElOFASE

5 TElOFASE tlOl1'lOlOm. . en

descondenuciOn

.en microtUbuIos cine1oc6ric:01c

micrOlubulos polar"

-"'----+---; \\

_-I-__ recomposiclon de III 8l'lyoltur. nuclear

En la telofase (rslos, finllos cromosom81 hi)oi saparados lIegen a los pokJs y 101 microtubulol cinetoc6ricos desaparecen. Los microtubulos polares Ie al8rgan aun mas y Ie vuelvs a formar una envottura nuclear. La cromatina condensada Ie expands de nuevo, los nuclltolos -que hablan desaparecido en la profa&&- empiezan a reaparecer; la mitosis ha lIegado 8 IU fin.

.Irededor de etta u~.

EL IlMCO DE LA SEGMlNT DMI)( LA Cf:lUlA EN .DOSiii::_~"

6 CITOCINESIS 6 CITOCINESIS

1i'I:T-- -.woItur. ' ' IC.....

-

eomp/oeh que rode. kNu~Ml

cverpo medio: ,egtOn dellOlllpamllinlo de

--

mic.OIubulos

testos eomprimidos de lot mlerotuburo.

.........

_ _ lormae:i6n del

coniunto de microtubukM interl6sioeos nucleaUo. III centrc.om8

pot

EI choprasma sa divide mediante un proceso conoctdo como ugmenlsci6n, que por 10 9tlneral 8fflpteza en atgtin momento de la anafase. Elte ejemplo i1ustra cOmo OCUfre alte proceso en celulal animales. La membrana de la zona central de la celula, perpeodicular al eje del hulO y situada en medio de los dol nuclllQl hijos, 56 desplaza hada danlro originaodo al surco de segmenlscion qua gradualmente sa vuetve mal profundo, haste que entra en contaeto con los estrechos restos del huso mit6tico que quedan entre los dos nUcIeos. Este estrecho puente, 0 CUfKPO rrNIdkJ, puede persistir durante un cierto ttempo antes de estrechlH"H aun mas y lIeger a romparle por cada extremo. produeiendo ali dol c'lul81 hilas completel y sepafedas.

983

(AJ

0 minutes

tEl 83 m;nutOI

(B) 1S minutes

te) 17 minutes

tD) 54 minutos

IF} 124 m;nutOI

IG) 169 minutes

{HI 199 m;nutOI

nal de la mitosis, es la citocinesis. Estos seis estadios forman una secuencia dinarnica cuya complejidad y belleza son diffciles de apreciar en descripciones escritas 0 a partir de un conjunto de fotograffas estaticas. La descripci6n de la divisi6n celular se basa en observaciones de dos fuenles: el eSludio de animales vivos mediante el uso del microscopio 6ptico (a menudo combinado can la microcinematografl'a) y el estudio de celulas fijadas y Ienidas ranto con el microscopio 6ptico como can el electr6nico. En el Panel 18-1 se resumen brevemente los diferenles estadios de la divisi6n celular. Los cinco estadios de la mitosis -profase. prometafase, metafase. anafase y telafase- tienen lugar en un orden secuencial eSlriCto, mientIas que la cilocinesis empieza durante la anafase y continua hasta el fin de la fase M (Figura l6-7). En las Figuras 16-6 y 16-9 se muest'fall micrograffas 6pticas de divisiones ceJulares de una celula animallfpica y de lIna celula vegetallipica, respeclivamente. ExiSlen incontables varianles de lodos los estadios de la divisi6n celular. mostrados esquemalicamen Ie en el Panel 18-1. tanto en el reino animal como en el vegetal. Mencionaremas algunas de elias despues de que hayamos visto mas de cerca los mecanismos generales de la divisi6n celular.

Los org~nulos citoplasm~ticos grandes se fragmentan durante la fase M asegurando que se heredan correctamente3 Los procesos de la divisi6n celular denen que asegurar que cada celula hija hereda todos los componenles celulares fundamentales. Como vimos en el Capitulo 12. los organuJos como las milocondrias y los c1oroplastos. por ejemplo, no pueden ensamblarse espomaneamente a partir de sus componemes individuales; 5610 pueden fonnarse mediante el crecimiento y la fisi6n del organulo correspondientc preexislente, de forma que la celula hija no podra conlener ninguno a menos que haya heredado uno a mas de elias. De la misma forma, no es posible hacer nuevas copias del complejo de Golgi y del reticulo endoplasmalico sin la presencia previa de a1 menos parle de la eSlruclura correspondieme. lC6mo se segregan los difereoles organulos adheridos a la membrana cuando una celuJa eucariola superior

984

Capftulo 18: Los mecanlsmos de la divlsi6n celular

Agun 18-9 EI proceso de la mJtosls en una «:Bula vegetal tfplca. Eslas rnkrografias de una cl!!lula viva de Jlaemam/lils (Iirio) fueron IOmadas a los tiempos indkados. ulilizando mieroseopia de contraste de fases lnterdiferencial. Habitualmente estas clilulas presentan cromosomas grandes. de manera que son faciles de ver. AI nivel microsc6pico moslrado aquf, las principales fases de la divisi6n celular haee mas de 100 anos que se eonoeen. (Aj Pro/ase: los cromosomas estan condensados y son c1aramente visibles en el nucleo celttlar. (B) y (C) Promera/ase: la envoltura nuclear se ha 1010 y los cromosomas estan interactuando can mlcrorubulos que emergen de los dos palos del huso. Las plantas no tienen eentriolos, pero los polos de sus husos contienen protc(llas relaclonadas con las que se encuentran en la matriz centrosOmica de las cl!!lulas animales. N6tese que entre los CSladios ilustrados por (8) y (C) sOIa han lranscurrido 2 minutos. (D) Merajase: los cromosomas se han alineado en la plaea melafasica con sus clnelOcoros siluados a medio camino enlre los dos polos del huso. (E) Alla/ase: los cromosomas se han separado en sus cromatidas hennanas.las cualcs se desplazan hacia palos opueslOs. (F) Tefojase: los cromosomas se deseondensan formando los dos nuc1cos que mas tllrde seran visibles lindicados con N en {G)I. (G) y (H) Citocillesis: se muestran dos estadios sucesivos en la fonnaci6n del plnno celt/far. el cual aparece como una Hllea cuya direcci6n de crecimiellio se indica con nechas ell (H). (Corlesra de Andrew Bajer.)

se ctivide? LoS orgallulos que se presenten en grandes cantidades se heredaran con seguridad si, como media, su numero se duplica en cada generaci6n celuJar. Qtros organulos, tales como el complejo de Golgi y el retfculo endoplaslllatico (ER), se fraccionan durante la mitosis ell un conjumo de fragmenlos y de vesfculas mas pcquenos, probablemente porque en esta fomla altamente vesiculada se pueden distribuir de manera mas equitativa cuando la celuJa se divida. Parece que las vesfculas del ER se asocian con los microttibulos del huso mil6tico. 10 que puede ayudar a diSlribuirlos equitativameme emre las dos celulas hijas.

Resumen Los procesos de In dillisi6n celllmr (m fase 111 del cicio celll.mr) co,ulste" ell diuislo· lies nucieares (mitosls) segll.idtu de diulsiones eitopmsnrdticas (eitoeinesu). La dil';· sMn IIuciear se efecllUl nredi""te UII limo nritotico compue$to por nricrorubuios, que sepnrnn los cromosomns, mielltras que m divisi611 eitoplasmdricn se efectda medIante lin ",11110 comnfcril compuesto porjimmelltos de netilUl. fA m/tosu se or· ganlza ft"uMnlfmtalmente nrediante el dsrer microlllblllar que se forma alredeiWr de cada uno de los dos centTosonuu producldos par dupllcadon de amtrosoma. La dupliau:i6n del amtrosonra comle,ua durante las lases S y Gz del dcio celular, y en el inicio de Ia fase !of los centrosomas duplicados se separ",' y .Ie desplaum IltIcia caras opuestns del mideo, formando los dos paws delilluo mil6tico. Los grandes orgdnllios membranosos, tales como el complejo de Golgi Y el retfado endoplasmdtico, .Ie rompen en nflu:llOs/rngnumtos nufs pequenos durante In fase M. 10 que aseK1,ra su distrlbud611 equUatiua entre las dl"las hijas durante la cUoci"esu.

Mitosis' La segregaci6n del cromosoma se lJeva a cabo mediame una ma
Figura 18-10 Lastresclasesde mlcrolubulos de un huso mlt6tJco completwnenle formado. (A) Imagen confocal del huso mil6tico en In lIleiafase de un embri6n de Drosoplu'la, con sus microll.ibulos marcados can fJuorescencia. (B) Diagrarna esquematico que identifica las tres clases de microtUbulos del huso. En realidad, los cromosomas son mucho mas grandes de 10 que aquf se muestra, ya cada cinetocoro se unen muchos microtubulos, CA, cortes(a de William Theurkauf,)

ci"etocoro

/

microtubukN

u1'....

mlcrotubukN cinetoc6riDol

mlCrOlubuloi poIMeI

181

MilOSis

985

gando a los polos y se [iberan de los microtubulos del huso; final mente, en torno a ellos se reconstruye la envoltura nuclear. EI ensamblaje del huso, la captura de cromosomas y su alineaci6n en la placa metafasica, y el posterior alargamienlO del huso con el desplazamiento de los cromosomas a los polos, dependen crfticamente de una serie de procesos que ocmren en 0 cerca de los extremos de los microtubulos: los micronjhulos no son tan s610 ellugar donde se [ocaliza el ensamblaje y desensamblaje de los microtubulos sino tambien donde se produce la fuerza. Veremos que se pueden distinguir tres tipos de microtubulos del huso: los microtubuJos polares, que se solapan en la lfnea media del huso y son los responsables de empujar a los po[os del huso causando su separaci6n; los mlcrotubuJos cinetoc6ricos, que se adhieren al cillelOcoro especializado que forma el centr6mero de cada cromosoma duplicado y conduce los cromosomas en el huso; y los microtubulos aslrales, que parten en todas direcciones desde los cemrosomas y se cree que contribuyen a generar las fuerzas que separan [os polos y los situan en relaci6n al resto de la celula (Figura 18-10). EI comportamienlO de cada una de estas clases de microtuhulos es distinlO debido a las diferentes estructuras con las que entran en contacto sus extremos y, por tanto, a los diferentes procesos que alli tienen lugar.

La formaci6n del huso mit6tico en una celula en fase M se acompafia de cambios sorprendentes en las propiedades dimimicas de los microtubulos 5 EI cOlljunto de microtllbulos imerftisicos que parten del centrosoma en todas direcciones se halla en un estado de inestabilidad dimimica, en la que los microlubulos se polimerizan y despolimerizan sin cesar y continuamente se nuclean nuevos micronjbulos para equilibrar las perdidas de los que desaparecen por completo mediante la despo[imerizaci6n (se trala en el Capitulo 16). Durante la profase tardia el ritmo de eslos procesos cambia dramMicamente. La vida media de un microtubulo carrienle decrece aproximadamente veinte veces (de 5 minutos a tan s610 15 segundos) (Figura 18-11), y se cree que esto refleja un aumento brusco de la probabiJidad de que un microtubulo tfpico en crecimiento se convierta en un microtubulo que se encoge, debido a alguna variaci6n en su extremo "mas" (vease pag. 868). Al mismo tiempo se produce un gran aumento del numero de microtubulos que parten del centrosoma, aparenlememe debido a una alteraci6n del propio centrosoma. acelerando el ritmo al que se nuclean microtubulos nuevos: se puede demostrar mediante un cultivo in virro que los centrosomas profasicos preseman un incremento notable en su capacidad para nuclear el crecimienlO de microtUbulos. Estos dos cambios son suficientes para explicar por que el inicio de la fase M se caracteriza par una rapida transici6n desde unos cuantos microtubulos largos que se extienden desde el centrosoma a la pcriferia celular (la formaci6n de microtubulos interfasicos) basta una gran cantidad de peqllenos microtubulos que rodean cada cenlrosoma (los microtubulos aSlrales). En algunas celulas tambien puede actuar un tercer mecanismo: la descomposici6n de los microtubulos inlerfasicos puede ser acelerada por unas protefnas que los dividen. La base molecular de estos cambios en la dimimica de los microtubulos es incierta, pero parece probable que implique la fosforilaci6n por MPF de una 0 mas protefnas que interactuan con los microtubulos. Los microtubulos que crecen y se encogen rapidamente emanan en lodas direcciones a partir [os centrosomas profasicos. Subformuciones de estos microtubulos astrales se estabilizan sclectivamenle de diferentes modos, formando asf un huso mit6tico organizado.

Las interacciones entre microtubulos orientados en direcciones opuestas conducen el ensamblaje del huso 6 Durante la profase, mientras la envoltura nuclear eSla todavia intacta. parece que algunos de los microtubu[os que se salen de cada centrosorna entran en 986

Capftulo 18: Los mccanismos de la divisi6n celular

METAfASE

tin" 5 mlnulo&

" 5 liempo (minulos)

F1b'llra 18-11 En la fase MIas microu:ibulos son mucho mas dlnamlcos, par Mrmlno media, que en In Interfase. Se inyecta tubulina. unida de forma covalente a un colorante []uorescente, a c~lulas de mamffero mantenidas en cultivo. Despues de que la tubulina fluorescente se incorpore a los microttlbulos eelulares, se blanquea toda la fluorescencia de una pequefia regi6n mediante un rayo laser intenso. Se esrudia la recuperaci6n de la fluoreseencia cilia regi6n blanqueada de mieroltlbulos en funci6n del tiempo. la eual se produce par recambio por mierottlbulos form ados por tubulina fluorescente no blanqueada procedente de la soluci6n. Se cree que eltiempo necesario para que se produzca e150% de la reeuperaci6n de ia l1uorescencia (t,,,) es igual al tiempo necesario para que la mitad de los microttlbulos de la regi6n se despolimericen y se vuelvan a formar. (Hesultados de \Y.M. Saxton et al.,). Cell Bioi. 99:2175-2187.1984, permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

Pigura 18-12 Modelo de c6mo se podrfa formar un huso ml16lico bipolar mediante la estoblllzacl6n treleclJva de microtl1bulos que Interactl1an eOlre sf. Los nuevos microtUbulos crecen hacia afuera. en direccioncs alealorias. a partir de dos cenlrosomas cercanos. Se hallan anclados a los cenlrosomas porsus exlremos ~menos~. Sus extremos -mas- son ~dinamicamente inestables~ y pueden pasar de repente de un crecimiento uniforme (flOC/las rojas oriemadas al exterior) a un acortamiento rnpido f/lechas rojas orientadas 1uKia el imerior) durante el cual, a menudo, se despolimeriza lodo el microilibuio. Si dos microtubulos de centrosomas opuestos inleracluan en una zona de solapamiento, las proteinas asociadas a los micrOlubulos entrecruzan los microtubulos [pumos negros), cubriendo sus extremos -masy eSlabiliztindolos, con 10 que disrninuye la probabilidad de que despolimericen. Existen pruebas de que las proteinas enllecruzadoras son molkulas motoras de microtubulosorienladas hacia el extremo ·mas~. que lienden a conducir los microlubulos en direcci6n de separar los polos del huso.

cOlllacto con microtubulos de polaridad opuesta que crecen desde el olro centrosoma (Figura 18-12). Se cree que en la regi6n en que estos microtubulos se solapan, a medio camino entre los dos centrosomas, se forman enlaces cruzados que estabilizaran los extremos de estos microtzibu/os polares impidiendo asf su desensamblaje, uniendo entre sf los dos conjuntos de orientaci6n opuesta y constituyendo el armaz6n hAsico del huso bipolar caracterlstico. Se cree que las protemas que establecen enlaces cruzados con los microtubulos polares son moleculas motoras de micro111hulos orientadas hacia el polo positivo, que no 5610 estabiljzan el huso bipolar sino que tambien actuan empujando los microtubulos antiparalelos en una direcci6n que tiende a separar entre sf los dos polos. Asf pues, aunque los microtubulos palares estan estabilizados frente a un desensamblaje catastr6fico, no son estaticos; veremos mas tarde que, incillSO en el hllso metafAsico (Figura 18-13), que da la apariencia de estabilidad, los microtubulos polares experimentan contmuamente la adici6n nera de mon6meros en sus extremos ~mas" y la perdida nera en sus extremos "menos~ en los polos. Probablemenle los microtubulos palares separan los centrosomas mienlras se forma el huso durante la profase. Mas tarde dirigiran el a1argamiento del huso en la anafase. No obstante, durante los estadios intermedios del alargamiento mit6tico del hllSO, este se mallliene comrolado; mientras que los micrOlubulos polares emplljan, manleniendo [os polos del huso separados, los microlllbulos cineloc6ricos que unen los palos del huso a los cromosomas, est iran conlrarreslando la fuerza de los microtuhulos polares. tal como veremos ahora.

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I

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microtubulos astral"

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microlubulos cenlrOMlma pol.res (polo del hUMlJ

Flxura t8-1S Huso mlt6lico. Huso melafl'isico aislado, visualizado COil Ires lecnicas de microscopia 6ptica: (A) microscopia de COntraSle de rases interferencial, (B) microscopia de COnlraSle de rases, y (e) microscopia de luz polariz.ada. (Conesfa de E.D. Salmon y R.R. Segall.J.Cell Bioi. 86:355-365, 1980, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

Mitosis

987

Flgu.ra 18-14 Elcentromero. E1eclronmicrograffa de barrido de un cromosoma mil6lioo humano. cOllSlituido por dos crom
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c'omoaom.

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met.fil.ico

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regiOn del centrOmero del cromosoma

cinelOCO'O

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microtubulo, cinetoc6rlco.

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Los cromosomas replicados se unen a los microtubulos por sus cinetocoros7 AI inicio de 1a fase M cada cromosoma csta replicado y se compone de dos cromatidas IIermanus a todo 10 largo, can una constricci6n en una unica regi6n Hamada el centromero, donde la cromatina parccc est'ar especialmcntc condensada (Figura 18·14). Durante la profase lardfa en cada cemr6mero se cnsamblan compleJos de protefoas especiallzados conocidos como clnelocoros, de forma que los dos dnetocoros de cada cromosoma (uno en cada crom.1lida hermana), se hallan dis· puestos en direcdones opueslaS. A traves de sus cinetocoros los cromosomas reo plicados se uniran a un subgrupo distinlo de microtubulos del huso mit6tico (Figura 18-15). Estos mJcrolubuios clnelororicos se utili.zar.1n finalmenle. en la anafase, para arrastrar las dos cromatidas hermanas hacia los polos opuestos del huso. Pero antes de esl'e estadio, mientrns las crornatidas hermanas todavfa estan unidas, ya exisle una tensi6n generada en los micronibulos cinetoc6ricos, separando los cromosomas y acercando los polos del huso. En la mayona de organismos el cinetocoro es un gran complejo multiproleico que sc puede observar al microscopio eleclr6nico como lIna estruC(Ufa multilaminar en fomla de plaea (Figura 18-16). Veremos que no se tram simplemcnte de una localizaci6n pasiva de anclaje para los microlubulos, sino que jllcga un papcl central en el control dcl ensamblajc ydesensamblaje de los microtubulos cinemc6ricos, generando tensi6n en eUos y, finalmenlc, dirigicndo el movimiento cromos6mico.

dtrecct6n del rnovimienlO doe La cromiltlda

micrOlubulO' Incluldo. en el cinetocoro

F1gun. 18-15 Mic:rotubuJ05 dnet0c6r1oos. Dibujo esquematioo de un cromosoma metafasico que mueslra sus dos croml'itidas hermanas unidas a microtlibulos cinetoc6ricos. Cada cinelocoro forma una placa en la superficie del CClllr6mero. Los extremos "mAs" de los microtlibulos se unen a los cinClOCoros {no se muestra).

FlguralS·16 ElcinelOcoro. (A) Un crOlTIosoma melafAsico tenido can un nuorocromo de uni6n aI DNA. (B) Un cromosoma metafAsico tenido con anticuerpos humanos que reaccionan con prote{nas especfficas del cinetocoro, mostrando la presencia de dos cinellxoros. cada uno de eUos asociado a una cromatida. (0 Electronmicrografia de una crom
988

Capflulo 18: Los mecanismos de la divisi6n celular

micrOl\ib!.Jlo a III ml.mll escala

elemento con_rvado I

elemenlO ric:o en AT II lIIememo l;Onaervado III

ATAAGTCACATGAT

TGATTTCCGAA

TAncAGTGTACTA

ACTAAAGGCTT

DNA

Figura 18-17 5ec::uencla de DNAde un centr6mero caraclerfstico de la levadura Saccharomyces cerrviJiae. La secuencia de DNA mostrada es suficiente para originar una segregaci6n cromos6mica complela: aClua ensamblando las protefnas del dnetocoro que atraen a un microlubulo (en verde) aI dnetocoro.

MERO DE lEVADURA nm de DNA de forrT18 B

~40

En los cromosomas de la levadura los complejos proteicos cinetoc6ricos se ensamblan siguiendo secuencias especfficas de DNA centromerico 6 La informaci6n que determina la consnucci6n de un cinetocoro en una localizaci6n especifica de un cromosoma se halla en la secuencia de DNA del eentr6mero. En las levaduras de fisi6n el DNA centromt!rieo puede ser idemifieado mediante su efeero en la propagaci6n de plasmidos que 10 contienen: un plttsmido que comenga DNA cenuomt!rieo se puede heredar de forma eSlable en la mitosis y la meiosis, como si fuera un cromosoma, miemras que un plasmido que carezca de dicho DN~ (y eslt~ preseme en bajas camidades) se segregara en las c~lulas hijas de forma irregular y se perdem. al cabo de unas cuantas divisiones celulares. (En el Capitulo 7 vimos c6mo se ha utilizado esta propiedad de los centr6meros en la construcci6n de vectores para DNA c1onado.) Experimentos gen~ticos moleculares mueSlran que cada uno de los 17 cromosomas de la levadura S. cerelJisiae conliene una secuencia cemromerica dislinla de una longitud de unos 110 pares de bases (Figura 18-17). Aunque cada secuencia es unica, todas contienen regiones hom61ogas sustanciales y pueden ser invertidas 0 intercambiadas de cromosoma a cromosoma sin perder su funci6n. Se han identificado algunas de las protelnas que forman el cinetocoro de la levadura par su capacidad de unirse al DNA centromerico. EI elemento III del centr6mero de levadura (vt!ase Figura 18-17). par ejemplo, se une a un complejo de tres protefnas. Se cree que este complejo proteico inicia In formaci6n de un cinetocoro sencilla que se une al extrema de lU1 5610 microtubulo. Una de las protefnas purificadas que unen cenu6meros es un motor de microtubulos dirigida hacia el cxtrcmo "menos", 10 Cllal parece suficiente para propulsar el cinelocoro de la tevadura a 10 largo de su microtubulo adherido hacia el polo mit6(ico. Otras protef-

Mitosis

Figura 18-18 T1ncl6n Inrnunonuorescente de c1netocoros en celulas en cultlvo_ Las ~Iulas de marsupial (~Iulas PtK) mO$tradas en (A) y (8) comienen relativamente pocos cromosomas y se encuentran en rase G1 en (AJ, donde existe un cinetocoro lenido por cada cromosoma, y en rase G2 en (8), donde exislcn dos cinelocoros lefJidos por cada cromosoma. Los anticuerpos uliiil.3dos para marear los dnelOcoros son los mismos que los utilil.3dos ell la Figura 18-168. En (C) se muestra un tipo diferellle de ctHula, que se encuentra en metafase; los dnclOcoros se han letiido con amicuerpos que rcaccionan con Ulla proleCna del cinelocoro, y el DNA se ha tef'lido con un colorante raja. (Cortesfa de B.R. Brinkleyy D. He.)

989

centrosome en el polo deilluso

nas se unen a otras secuencias del centr6mero y estabilizan su interacci6n con el microttibulo. Los centr6meros de mamffero se componen de distintas'secuencias de DNA mucho mas largas y forman dnetocoros mucho mas grandes que llegan a unir 30 040 micronlbulos. Se cree que la mayor parte de la secuenda repetitiva (el DNA salelite) de los centr6meros de mamffero es imprescindible para la organizaci6n especial de cromatina en el centr6mero. Pero parece ser que existen secuencias de DNA, comprendidas en eSle DNA estrllctural, que unen complejos proteicos parecidos a los de los centr6meros de las levaduras. EI hecho de que los enfermos que padecen ciertos tipos de escleroderma (una enfennedad de causa desconodda que se asocia con Wla fibrosis progresiva del tejido conjuntivo de la piel y de otros 6rganosl produzcan anticuerpos que reaccionan especfficamente con los cinetocoros, ha facilitado el estudio de las protefnas de cinelocoro de mamffero. Si utilizamos estos anticuerpos para marcar celulas en divisi6n mediante inmunofluorescencia. se observa un patr6n de puntos fluorescentes en el que cada punto indica la posici6n de Wl cinetocoro. Sorprendentemente, si se marcan celulas que no estan en divisi6n se obtiene Wl patr6n similar, de forma que el numero de pWltos por celula se corresponde con el numero de cromosomas, 10 cual sugiere que los precursores de cinelocoros se unen a cada centr6mero incluso en e[ nucleo interfasico (Figura 18-18). Los aUloanticuerpos de la escleroderma tambien penniten el clonaje de los genes que codifican muchas de las proteinas asociadas con los cinetocoros de mamffero, de manera que ahora estas protefnas pueden fabricarse en grandes cantidades mediante las tecnologfas del DNA recombinante. Asf pues empiezan a caracterizarse las interacciones de unas proteinas con otras, con el DNA y con los microttibulos.

Los cinetocoros capturan los microttibulos nucleados en los polos del hus0 9 Durante la profase. mjentras se forman los microtubuJos polares y se alarga el huso, encolllramos muchos microrubulos todavfa en crecimiento y que se retraen r:ipidamente desde el centrosoma de cada polo, con sus eXlfemos "mas" explocando al azar toda la celula. La profase termina y comienza la prometafase cuando la rapida fosforilaci6n de la lamina nuclear desencadena la descomposici6n de la envoltura nuclear y los microu1bulos consiguen acceder a los cromosomas. Mediante un procedimiento que se puede comparar al de un pescador lanzando el sedal, un microtl1bulo ala caza pasa a menudo 10 suficientemente cerca de un cinetocoro como para capturar el cromosoma. En las celulas de trit6n. en las cuales se puede observar la captura inicial, primero se observa c6mo el cinetocoro se adhiere al costado del microt(lbulo y entonces se desliza con rapidez a 10 largo del mismo !lacia el polo del huso (Figura 18-19). Prohablemente 1'1 adhesi6n lateral 'II microtubulo y el deslizamiento posterior hacia el polo son debidas a la actuaci6n de 1'1 dinefna (tramda en el Capftulo 16), una protefna motor de microtl1bulos orientada hacia el extremo ~menos", que se puede localizar en el cinetocoro mediante el marcaje con anlicuerpos anlidinefna. 990

Capflulo 18 : Los mecanJsmos de la division celular

Figura 18-19 Capturadecinetocoros por los m1crotubulos. El cinetocoro se une a Ull costado del microtubulo en crecimiento yse desliza a 10 largo del mismo hacia el[>olo del huso. En las figuras de la izquierda lajlecha roja seii.ala la direcci6n en que crece el microrubuJo, mientras que lafleclw gris seflala la direcci6n de deslizamiento del cromosoma. En la figura de la derecha se presenla una reconstrucci6n tridimensional por ordenador de un cromosoma de trit6n en prometafase, a partir de varias secciones finas. Este cromosoma (azul) no ha hecho mas que iniciar su desplazamiento hacia eJ [)olo del huso tras la uni6n de su cinetocoro (Ilaranja) a un microtubulo (blanco). (De C.L Rieder yS.P. Alexander. J. Cell 8iol. 110:81-95,1990, con permiso de copyright de The Rockefeller Universiry Press.)

Figura 18·20 Experimento que demuestnl que los mlcrotubulos c1net0c6rlcos metafulcos afiaden subunldades por su extremo "mu" unldo al c1netocoro. En este experimento se inyecl6 lubulina mareada con f1uorescencia a una cl!lula viva. en la que aeab6 incorpornndose a los microtubulos del huso (!Jerde). Entonces se inlrodujo lubulina mareada con rodamina a una cl!lula en metafase, en la que se incorporo a unos microlubulos cineloc6rlcos, concretamenle en el extremo "mas· (naranja) por el que se unen al dnetocoro. Tambil!n se observa una cierta incorporad6n en e1 centrosoma. (umesia de G. Borlsy.)

eada cinetocoro captura cada vez mas microlubulos, a medida que se desliza hacia el polo del huso, donde la densidad de microtubulos es mas alta. Durante este proceso las interacciones iniciales de los microtubulos que se produdan en los costados se convierten en interacciones en los extremos. con el cinetocoro adherido al polo ~mas~ de cada microlubulo. Finalmente, el cinelOcoro contrario, situado en la otra cromatida hermana, sem capturado por el extremo Iibre de un microtubulo procedente del polo contrario del huso, colocando a las cromatidas para su segregaci6n y tensando el sistema de microtubulos cinel0c6ricos. Dichas tensiones se deben a las propiedades especiales de los acoplamientos entre microtuhulos y cinetocoros, que veremos a continuaci6n.

Los extremos "mas" de los microtubuJos cinetoc6ricos pueden anadir y perder subunidades de tubulina mientras estan adheridos al cinetocoro lO Como los microujbulos polares, que despues de eSlablecer los conexiones emzadas en el ecuador del huso continuan anadiendo subunidades a llllO de sus extremos y perdiendo[as en el Olro, los microtubulos cinetoc6ricos tambien mantienen un eslado de Ilujo dinamico. Si se inyecta tubulina marcada qufmicamente en celulas mit6ticas durante la metafase, se observa que se incorpora continuamcnte a dichos micronjhulos cerca de su punto de uni6n al cinctocoro (Figura 18-20). VerCIllOS brevemelllc que durante la anafasc ocurrc la rcacci6n inversa, y que se pierden moleculas de tubulina de estos microtubulos cineloc6ricos a medida quc se desplaza hacia el polo del huso. Este hecho hace necesario que tanto la adici6n como la perdida de Illol&ulas de tubulina se produ7.ca mientras el cineiocoro conserva una uni6n Illecanica firme can los microtubulos. Dicha uni6n continuara siempre bajo presi6n, tanto si las moleculas de tubulina se anaden como si se pierden. Asf pues, parece que el cinelocoro acnia como un collar corredizo, que mantiene una asociaci6n lateral con las sllhllnidades de tubulina polimerizada cerca del extremo del microtubulo mienlras permite la adici6n 0 la perdida de moleculas de tubulina en dicho extrema (vease Figura 18-28, mas adelante). Cuando se afladen molecuJas de tubulina, el collar se mantiene en el extrema del microtubulo desliZ<1ndose hacia auas; si se pierden dichas moloculas el collar se mantiene en el extremo desplazandose hacia adelante.

Los polos del huso repelen los cromosomas ll Mientras que los microtuhulos cinetoc6ncos tienden a empujar a los cromosomas hacia el polo, alIa fuerza mas misteriosa actua en direcci6n COnlrana, rechazando cualquier objeto grande que se acerque demasiado a los polos. Esto se Mitosis

991

Figura 18-23 El comportamlento dlmimlco de los mlcroll1bulos en el huso melafaslco se esludla mediante la fOloactlvacl6n de la nuorescencla. A un huso melafasico formado in vitro a partir de un extracto de huevos de Xenopus, se Ie incorporan tres marcadores t1uorescentes: rubuJina marcada con rodamina (raja) para marcar todos los micronjbulos, un colorante azul que se une a DNA y marca los cromosomas, y una rubulina marcada con t1uorescencia empaquetada, que tambien se incorpora a IOdos los microtubulos pero que permanece invisible (porque no es t1uorescentel hasla que se activa con luz ultravioleta, En (Al se obselVa la distribuci6n de los cromosomas yde los microu.lbulos en el huso. En (B) se utiliza un haz de luz uhravioleta para visualizar la rubulina t1uorescente empaquetada, localizada principalmente en la banda izquierda de la placa melafasica. Durante los minutos siguientes (tras 11/2 minutos en C, y tras 2 1/2 minutos en OJ se obselV8 c6mo la sefial de la tubulina t1uorescente desempaquetada se desplaza hacia el polo Izquierdo del huso, 10 cua! indica que la tubulina se desplaza continuamente hacia el polo aunque el huso (visible en rojo gracias a la tubulina marcada con rodamina t1uorescentej permanezca inalterado durante largos per(odos. La sefial de la fluorescencia empaquetada tambicn disminuye de intensidad, 10 cual indica que los microtubulos individuales se despolimerizan yse substituyen sin parar. (De K.E. Sawin yT.J. Mitchison,j. Cell 8101.112:941-954,1991, permiso de copyright de The Rockefeller UniversityPress.j

que empezaran en la anafase. Todos los microtubulos del huso, pese a su aparente estabilidad, estan intercambiando continuamente subunidades con el acervo de tubulina soluble libre: un tratamiento can colchicina, que bloquea el ensamblaje de la tubulina en los microWbulos, provoca que todo el huso se descomponga rapidamente. EI comportamiento dinamico de los microtubulos polares y cinetoc6ricos se ha estudiado directamente permitiendo que los microttibulos incor· poren tubulina que se ha conjugado covalentemente a fluorescefna "empaquetada" fotoactivable (vease pag. 197). 5i dichos micrOtubulos del huso metafasico se marcan can una franja f]uorescente (mediante su exposici6n a rayos l;iser), se observa que los microttibulos marcados se desplazan continuamente hacia el polo (Figura 18-23). Este experimento demuestra que lamo en los microttibulos pol ares como en los cinelOc6ricos las suhunidades de tubulina se desplazan continuamente hacia los palos -un proceso que conocemos como intercambio rotatorio (Figura 18-24, y vease pag. 884). Las marcas se hacen mas dehiles con el liempo, 10 cual indica que muchos microtuhulos individuales se despolimerizan madlo huao

••

microtubulo clnatoc6rlco mlcrotubulo polar microtubulo astral

cromosoma

'------" los microtubulos sa dawnumbilln an )0' polos

994

clnatocoro los microtubulos polimarililln aqui

Capftulo 18: Los mecanismos de la divisi6n celular

(£luuuEl elttremo "mhO extremo "menos" del microtubulo del mlcrotubulo

Figura 18-24 Dlagrama slmpUncado del huso mlt6tlco en 1a metafase. EI huso esta formado por dos medios husos (verdey naranja). cada uno de los cuales esta compuesto por microtubulos polares. microtubulos cinetoc6ricos y microtubulos astrales. La polaridad de los microtubulos se indica mediante las puntas de las t1echas, que sef'ialan hacia el extremo ~mas". Los microtubulos polares que parten de palos opuestos del huso se solapan en una regi6n (sombreada ell gris), en la que las protefnas asociadas a micronibulos pueden entrecruzarse con ellos. N6tese la colocaci6n antiparalela de los microtubulos en la zona de solapamiento.

METAFASE

soS1rac:c16n en e' polo

ANAFASE

uni~

adici6n en e' einelocolo ..

m~

~

SUStl.eei6n lenl, "pida suslraoxi6n en ,I polo en el cinetocoro .ubunldade. . . ... .... r ~~ ~,

.... IlIn.iOn 1 •• 1

..

J

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J ' . I 11 . . .

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. . ten,i6n •

'A'

I I 1 .ll011UU1HI

el microtubulo cinet0c6rlco mantiene una longitud constanta

'91

el miclotubulo clnet0c6rico sa acorta debido a la despolimerllllcion an ambol extremo,

por completo y son reemplazados. Debido a que los microtubulos polares y cinetoc6ricos del huso metafasico mantienen el mismo tamano. riene que exisrir un equilibrio perfecto entre la aponaci6n de subunidades de tubulina en los polos ~ mas" en el ecuador del huso y la p~rdida de subunidades de tubulina en los extremos -menos~ unidos a los polos (Figura 18-25A). EI desplazamiemo continuo de las subunidades de tubulina hacia los polos del huso metafasico tiene profundas implicaciones en la construcci6n del huso. Se cree que muchos de los enlaces existentes entre los microtubulos polares del huso, y entre los microtubuJos y otras estructuras tales como los cinet'Ocoros y los centrosomas, son producidos por proteinas motoras de microtubulos. Debido a que las prOlefnas motoras se asocian y disocian del microtubulo continuamellle miemras avanzan por su cicio catalftico, su disefio es ideal para continuar unidas sobre microttlbulos cuyas subunidades no dejan de desplazarse. Pueden mamener una tensi6n incluso si el microlubuJo se esla alargando, mediaote la adici6n de subunidades, e igualmeme pueden malllener una compresi6n cuando el micronlbulo se encoge debido a la perdida de subunidades.

Las cromlitidas hermanas se separan repentinamente en la anafase l5 Como vimos en el CapftuJo 17, la anafase se desencadena debido a la degradaci6n de la ciclina y la consiguienle inaClivaci6n del MPF. Ello conduce bruscamenle a la divisi6n sincr6nica de cada cromosoma en sus cromdlidas hermanas,

F1sura 18-25 Comportamlenlo de 105 mJcrOlubuios cinet0c6rieos en la metaCase yen la anatase. (A) Durante la metafase, se aliaden subunidades al extrema ·mAs- del microtubulo, en el cineiocoro, y se eliminan del extrema -menos·, en el polo del huso. As! se produce un flujo conSlante de subunidades de tubulina hacia el polo, al mismo liempo que los microtubulos manlienen una longitud oonstante y permanecen bajo lensi6n. (B) En la anafase la eromalida se libera de la uni6n de su eromalida hermana en la plaea melafasica y el cinelocoro se desplaza rapidamenle microtubulo arriba, desplazando en su camino subunidades de su extrema "mll.s". Por 10 !:lnto, In cromll.tida un ida es transporlada n:lcia el polo del huso. Parle del mov1miento de la cromll.tlda se debe :lla ~rdida simultll.nea de subunidades del extrema -menos· de los mierotubulos en el polo.

Figura J8·26 Separacl6n de las cromtitJdas en la anatase. Durante la translc16n de lit metafase (A) a 13 anafase (8), los microl\lbulos del huso separan las eromatidas hermanas -como se observa en estas c~lulas de endospcrma de HaemantJlIIs (Iir1o) teflldas con amicuerpos contra tubulina marcados can oro. (Corlesla deAndrew Bajer.)

'A' Mitosis

995

cada una de elias con un cinelOcoro. La separaci6n de las crom~hidas hermanas las Iibera de la fijaci6n que las mantiene en la placa metafasica, y los cinetocoros pueden empezar a desplazarse hacia el polo del huso al que se adheriran mediante sus micronibulos cinet0c6ricos (Figura .18-258). Se cree que las cromatidas se mantienen unidas a 10 largo de sulongitud mediante proternas cromos6micas que se aheran bruscamente de alguna manera al comienzo de la anafase, pennitiendo que las cromatidas se separen e inicien su trayeeto hacia los polos (Figura 18-26).

La anafase se retrasa hasta que los todos los cromosomas se posicionan en la placa metafasica l6 La metafase ocupa una parte importame del perfodo mit6tico (vease Figura 18-7), en parte porque las celulas se detienen en ella hasta que todos sus cromosomas se aHnean de forma adeeuada en la placa metafasica. Si et huso mit6tico esta descnsamblado dcbido a lin tratamiento con colchicina, las cetulas se detienen en ta rnclafase durante horas 0 dras. (Este metodo de detenci6n del cielo celular se utiliza normal mente para recogcr grandcs cantidades de cctulas en mitosis, 10 cual pcrmitc analizar sus cromosomas condensados.) Micntras el huso se halle desensamblado debido a este tratamiento, tambh~n se bloquca la inactivaci6n del MPP, que habitualmente senaliza la transici6n de la mctafase a la anafase. Pareee que cualquier cinetocoro que no este unido a los microtubulos genera una senal difusible que de alguna manera estabi.liza el MPF, 10 cual normalmente garantiza que todos los cromosomas esten alineados antes de que se aUlorice la progresi6n a la anafase. Por 10 tanto se espera que aI desmontar el huso mediante drogas se provoque una senal fuerte que prolongue la metafase de manera notable.

Dos procesos diferentes separan las cromatidas en la anafase l7 Cuando cada cromosoma se ha dividido como respuesta a la puesta en marcha de la anafase. sus dos cromatidas se desplazan a polos opuestos del huso, donde se ensamblan denno del nueleo de una nueva celula. Su desplazamiento es con+ secuencia de dos procesos independientes relacionados con el huso. El primero. aI que se denomina anafase A, consiste en el desplazamiento de las cromatidas hacia et polo. acompanado del acorlamiento de los microtubutos cinCloc6ricos (vease Figura 18-258). EI segundo, at que se denomina anafase D, consiste en la separaci6n de los polos, acompai'lado de la elongaci6n de los rnicrotubulos polares (Figum 18-27). Anteriormente estos dos procesos se distingufan mediante sus distilltas sensibilidades a los tratamientos can drogas, pero ahora esta elaro que se deben a mecanismos distintos. Las contribuciones relativas de la anafase A y la anafase B a la separaci6n final de los cromosomas yarra considerablemente segUn el organislno. En las celulas de mamffero la anafase B comienza poco despuCs de que las cromatidas hayan iniciado su viaje hacia los polos y se detiene cuando el huso tiene un ta+ mano de cerca 1,5-2 veees su longitud metafa-sica. En otras c~lulas. tales como las levaduras y algunos protoZOQs, predomina la anafase 8 y el huso se alarga hasta 15 veees su longitud metafasica.

El desensamblaje de los microrubulos cinetoc6ricos se produce durante la anafase A18 Una fuerza sorprendentemente potente actua sobre los cromosomas mientras se desplazan desde la placa metafasica hasta el polo del huso. Mediciones efeeruadas calculando la desviaci6n de ullas agujas de cristal delgadas dan unas estimas de 10-5 dinas por cromosoma, una fuerza 10 000 veces mayor de la que necesitan los cromosomas para desptazarse a su velocidad habitual por el citoplasma. Obviamente, se necesitan unos motores mllY poderosos para des996

Capftulo 18: Los mecanlsmos de la dlvlsi6n celu.lar

ANAFA$E A

=

==

<:=

=" KOl'1amienlO de IlK mierOlubulos;

despl81amiento de IllS cromatidu hKia 10$ polos; fu.erz's genenodes en IlK C'ne10c0ros

ANAFASE B

une fueRe deslizente (11 se genera enlre los miemtubulos pol'res dill polos opuestos. empuj&ndoIos y separandolos; una fuerza dill ItracciOn (21 actue directamente en los poIos. separandolos

crecimiento dIIIl microtUbulo los exlremos -mas- dill IlK mierOlubulos poI_,"

IIIfl

plazar a los cromosomas, y la velocidad de desplazamienlo de los cromosomas debe de estar limitada por algo mc1s que por la viscosidad. Como hemos discutido anleriormente, los mismos motores pueden generar la tensi6n sobre los cromosomas en la placa metafc1sic8. Mienlras cada cromosoma se desplaza hacia el polo, sus micronibulos cinetoc6rieos se dcspolimerizan, de modo que en la telofase casi ya han desaparecido. L.1 perdida de subunidades se puede determinar marcando los microrubulos cinetoc6ricos mediallle subunidades de (UbuHna fluorescente y rayos laser, como hemos descrita antes. En experimentos de este tipo se puede observar que los mierotubulos cinctoc6rieos se despolimerizan por ambos extremos durante la anafase, y que la mayor parte de la despolimerizaci6n se produce en los cinetoeoros, donde se habfan polimerizado previamente. En una eelula de trit6n en eultivo, por ejemplo, el rnovimienlo en la anafase A sucede a una vclocidad de 2 mieras por minuto, 10 que cqllivale a una despolimerizaci6n de mierotubulos de 50 subllnidades par segundo. E16O-80% de esta despolimerizaci6n tiene lugar en los cinelocoros, y el resto en los polos, a la misma veloddad que observamos en la anafase (vease Figura 18-25). EI hecho de que el dnet'Ocoro cs ellugar principal de despolimerizaci6n de microtubulos sugiere que al mismo tiempo cs cill!o gar principal donde se genera la fuerza que desplaza los cromosomas. Sin embargo, el mecanismo por el que se desplaza el dnetocoro, y por 10 tanto cl cromosoma, hacia cl polo del huso durante la anfase A, es desconocido. En la Figura 18-28 se muestran esquem<1ticamente dos modelos posibles. En el primero, una prmefna motor de microtilbulos orientada hacia el extremo "menos" en el cinetocoro hidroliza ATP para desplazarse a 10 largo de su microtubu10 unido, y a medida que queda al descubierlO, el extremo "mc1s" del microtubu10 se va despolimerizancto. En el segundo modelo de despolimerizaci6n de microlubulos el cillelOcoro se desplaza pasivamente ya que el cinetQCoro permanece unido al extremo del microtubulo mienuas este se despolimeriza. EI reciente descubrimiento de prolefnas motoras orientadas hacia el polo negativo ha provocada una corriente de opini6n en favor del primer modelo. aunque es muy probable que la despolimerizaci6n contribuya al desplazamiento, quiza ac· lUando como un "director" que limita la velocidad de migraci6n hacia los polos. Mitosis

Figura 18·27 Losdosprocesosque separan las cromlhidas hennanas en la Wlafase. En la anafase A las cromdtidas son arraslradas hacia

polos opuestos por fuerzas asociadas al acortamiemo de sus micTOlllbulos cinetoc6ricos. Se Clee que la fuerza que conduce este movimiento se genera prindpalmente en el cinetocoro. En la anafase 8 los dos polos del huso se separan. Parece ser que las fuerzas que conducen la anafase B son similares a las que provocaJlla divisi6n yseparaci6n del centrosoma en los dos polos del huso en la profase (vease Figura 18-5). ExIsten evidencias de que dos fuerzas diferenles son las responsables de la anafase B; por un lado la elongaci6n y el deslizamienlo de los micronibulos polaTes, uno sobre otro, separa los dos polos; por OtTO lado, unas fuerzas eXleriores ejercidas por los microtubulos aSlrales en cada polo del huso atraen los polos hacia la superficie celular, a1ejandolos el uno delouo.

997

direcci6n del desplnamiento de 101 cromosomas

direcci6n del desplazamiento de 101 cromosomas

protelna con ails afinidad por la Illbulina polimerizsda

cinetocoro cromosoma IA) el despl&umiento de tos cromosom&5

Impulsado por el AlP CQnlrola el dll5ensamblaje de los mlcrotubulol

181 el dllensamblaje de /01 rf\lcrotubulot impulse el despluemiento de 10$ cromOlOmn

Figura L8·28 Dos modelos a1ternatlvos de c6mo ei c1netocoro puede generar una fuerza hacla los polos sobre su cromosoma, durante la anafase. (A) Las protefnas motoras de microtubulos forman parte del cinetocoro y utilizan la energla de la hidr61isis del ATP para arrastrar el cromosoma a 10 largo de los microtubulos a los que dicho cromosoma esta unido. (B) El desplazamiento de los cromosomas esta dirigido por el dcsensamblaje de los microtdbulos: cuando las subunidades de tubulina se dlsocian, el cinctocoro ha de deslizarse hacia el polo para mantenerse unido a las paredes del microtubulo.

Dos fuerzas distintas podrfan contribuir a la anafase 8 19 La anafase B aumenta la distancia entre los dos polos del huso, a diferencia de la anafase A, y se acornpan a de la elol1gaci6n de microtubulos. Se cree que el mis· mo mecanismo que separa los centrosomas en la prometafase controla los mo· vimientos en la anafase B. Mientras los dos polos se separan, los microtubulos polares se alargan, parece que por polimerizaci6n en sus extremos distales 0 ex· tremos "mas". Tanto la magnitud de la separaci6n del polo del huso en la anafase como el grade de superposici6n de los micrott1bulos polares en la zona media. varian de forma considerable de unas especies a otras. En muchas diatomeas, que se ca· racterizan porque en elias la mitosis ocurre dentro de la envoltura nuclear, las zonas de sllperposici6n de microtllbllios son especialmente prominentes (Figu· ra 18·29). ESIUdios de reconstmcci6n de la arquitectura tridimensional del huso completo de una diatomea a partir de centenares de secciones finas seriadas examinadas al microscopio electr6nico ffillestran que los microtubulos polares de cada medio huso se superponen en una regi6n central cerca del ecuador del huso y que los micrott1bulos de polaridad opuesta se distribuyen ordenadamen· te dejando espacios entre ellos. Segun parece durante la anafase estos dos gru·

pOlo

regi6n centrel de microtubulol solapedos

polo

17:::"'''

998

Capftulo 18: Los mecanismos de la divisi6n celular

mlcrotubulos poleres del huso

Figura 18·29 Desllzamlento de microtubulos solapados en la anafase. Electronmicrograffas que muestran el alargamienlo y la reducci6n del grado de solapamiento de los microtubulos polares durante la mitosis en una diatomea. (A) Metafase. (B) Anafase tardla. (Cortesia de Jeremy D. Pickett-Heaps.)

regl6n reduclde de solepamiento 211 m de los microtubulos r-----l

... +

=

Figura 18-30 Modelo probable de acluacl6n de las protdnas moloras de

+

+

+

+

+ +

- -

+

+

+ +

+

+

+

IAI lOS POlOS DEL HUSO SON EMPUJAOOS PARA SEPARAflSE

cortez. celuln

+

+

+

--------+

+

mlcrotubl05 en la anafase. En (A) las protclnas motoras dirigidas al extremo ·'md.s", de la familia de las quinesinas de emrecruzamiento contiguo. enlrecruzan microtl1bulos polares amiparalelos y hacen deslizar estos mic:rotl1bulos unos respecto a o!rOs. emplljando la separaci6n de los dos palos del huso. Lasfleclws 'legras indican la dirccci6n de deslizamicnlO de los mic:ronibulos. (8) Protefnas motoras de mic:rolubulos del extremo ·menos· se unen a la coneza celulary a los mic:rolubulos aslrales que apunlan al exterior del huso yatraen los palos del huso a1ejl'lndolos entre sf.

+-----~ ~---+ +---_/ + (Bl

~ ~

+

lOS POlOS DEL HUSO SON ESTIRAOOS DESDE EL EXTERIOR

~ -------v

pas de micrOlubulos palares antiparalelos se deslizan y separan uno de otm en la regi6n de superposici6n. Los movimientos de la anafase tambi~n se pueden estudjar en c~lulas lisadas de diatomea. En este modele el prominenle huso mit6tico es Iibremente accesi· ble a las macromoleculas, de forma que se pueden estudiar los efectos de varias sondas macromoleculares (incluyendo anticuerpos espedficos). EI movimiento de la anafase A en las diatomeas se puede bloquear mediante un anlkuerpo que reconoce las protefnas motoms de microtubulos de la familia quinesina, 10 cual sugiere que los movimientos pueden estar dirigidos por una protefna motor de esta familia. Parece que csta prOlefna mOlor se localiza en la zona de superposici6n. don de puede separar los medias husos (Figura IB-30Al. Se cree que los microtubulos astrales, que se alargan en todas direcciones durante la anafase. juegao un papel adicional en los movimientos de la anafase B. Tanto en los hongos como en los animales. cortando el centro del huso no se bloquea la separaci6n de los polos del huso, sino que de hecho la acelera. Esto sugiere que los microtubulos astrales que apuntan hacia fuera del huso generan una fuerza que arrastra los polos participando en su separaci6n durante la ana· fase B, posiblemente inleractuando junto can prolefnas motoras orientadas al extrema ~menos" que se hallan unidas a la corteza celular 0 a otras estrllcluras ciloplasmttticas (Figura 18-30B). De acuerdo con esla suposici6n. la inyecci6n de anlkuerpos contra la dinefna, una prolefna mOlor dirigida hacia el extremo ~menos~, provoca el colapso del huso de celulas en cultivo. Parece que esta fuerza de arrastre tambi~n acttia duranle el ensamblaje del huso en la profase, y que unas fuerzas similares a el!a gufan la dislrihuci6n especffica de los husos, previa a las escisiones celulares asimetricas. como vercmos mas adclante.

En la telofase se recompone la envoltura nuclear alrededor de los grupos de cromosomas zo AI final de la anafase los cromosomas se han separado en dos gropes iguales. uno en cada polo del huso. En la telofase, el esladio final de la mjtosis, se recomMllosls

999

pone una envoltura nuclear alrededor de cada grupo de cromosomas. formando los dos m,icleos hijos de la mterfase. Hay que considerar al menos tres partes del complejo de la envoltura nuclear (discutido en el Capitulo 12) durante su desaparici6n y recomposici6n en la mitosis: (I) las membrrlflas nucleares exterior e itllerior. que son continuas con el retfculo endoplasmaticO; (2) la ldmina nuclear subyacellte (una FIlla red de fila· mentos intermedios en forma de hoja formada a partir de laminas nucleares). que interactua con la membrana nuclear interior. la cromatina, y los poros nu· c1eares; y (3) los poros "ucleares formados por grandes complejos prot'eieos. En la profase la fosforilaci6n de las laminas nucleares tiene lugar en varias localizaciones distintas de cada cadena polipeptidica, provocando su desensamblaje. y par 10 tanto In rotura de la lamina nuclear. En consecucncia. quiu\s como respuesta a una senal diferente, las mcmbranas de la envollllra nuclear se disgregas en pequenas vesfculas de membrana. La repentina transici6n desde la metafase a la anafase inicia la desfosforilaci6n de las muchas prote(nas que se fosforilaron en la profase: aunque las fosfatasas pertinemes pennanecen activas durante la mitosis, no pueden actuar sin oposici6n hasta que se desactiva el MPF. Poco despues de esto, en la telofase.las vesfculas de la membrana nudear se asocian con la superficie de cromosomas individualizados y se fusionan entre Sl. recomponiendo las membranas nucleares, envolviendo parciallllente grupos de cromosomas, antes de coalescer y recomponer la envoltura nuclear cOlllpleta (vease Figura 12·18). Durante este proceso los poros nucleares se desensamblan y las laminas desfosforiladas se rcasocian forlllando la lamina nuclear; una de las protefnas de la lamina (lamina B) permanece a 10 largo de toda la mitosis con los fragmemos de la membrana nuclear y es posible que participc en la reconstrucci6n del nucleo. Tras la nueva construcci6n del nucleo. los poros bombean proteinas nucleares hacia el interior del nucleo, los cromosomas se descondensan, y se reanuda la sfnresis del RNA, todo 10 cual provoca la reaparici6n de los nucleolos. Se cree que la descondcnsaci6n de la cromatina puede ser provocoda en parte, por la desfosforilaci6n de las mol~culas de la hist'ona H I. En extractos crudos de huevos de Xenopus se produce tanto el cnsamblaje como el desensamblaje nuclear siempre y cuando estos extractos provengan de celulas que se encuentrcn en el estadio apropiado del cicio celular (celulas mitlilieas para el desensamblaje y celulas interfasieas para el ensamblaje). En estos extraclOs el proceso completo que implica la lamina. los polos nucleares, y las membranas nucleares parece progresar con normalidad en respuesla a ciclos de fosforilaci6n y desfosforilaci6n. Sistemas lit vitro de este tipo proporcionan un sistema de ensayo para la idemificaci6n y la purificad6n de protefnas que catalizan el ensamblaje y el desensamblaje de la envolwra nuclear en la celula, incluyendo las prolefnas (como el MPF) que regulan dichos procesos. Mientras que para ensamblar un n(icleo hay que suministrar DNA a estos extractos, se formar;1 una envoltura nudear completa alrededor de moleculas de DNA purificado procedentes de pntcticamente cualquier organismo, incluyendo virus bacterianos. Por 10 tanto. mientras que las protefnas que se unen al DNA han estar implicadas en este proceso. es poco probable que durante el reensamblaje nuclear se produzca un reconocirniento de secuendas especfficas de DNA. Sorprendenrerneme.la rotura de la envoltura nuclear no es un requerimien· to para la mitosis. De hecho, verernos a conrinuaci6n que en los eucariotas infe· riores la envohura nuclear no se desensambla durante la mitosis. $e dice que el huso de estos organismos es abierto en lugar de cerrado.

Resumen La mitosis comiellza con 1a profase. que se mallifiesla metUante 1m l1,cremellto etl

In. [osforUacMn th prole{nas especiflcas, y S6 desencadena por 1a ael/vldtul de IUla proteina qll/nasa inductora th la mitosis, MPF. Una OOtlSeClleneM de esla[osfor/IaeMil es Ima estnKtllra microtlllmIar extraord/"ariamenle ditufmim, IUlClooda 611

1000

Capftulo 18: Los mecanlsmosde la divlsi6n eelular

los Cfmtrosomas d/lpllcadas que forman los polos tk 111150. Un sllbconjlltlto de los mlcrohibulos de em/" eentrosoma se estabiliul, parece ser que establecielldo IlIZOs enundos con mlerotdbu/os tkl centrosonm contrario, forma lido los mlerotdbulos polares, los ellales se suvo"e que SOli responsables de la separae1611 de los polos. Tras I" rotum de la ellvollum nuclear ellla prometafase, los einelocoros de eromo· sotmlS emmen$ndos pueden caphlrar y estabilizar Olms subfonllneiones de mierot,ibulos de los mucilOS que cream collstanlelllente ell cada polo del '''ISO. Los eineto· coros de polos 0l}/leslo del IlIlSo tiran en direcc;otJes contrarlas de los dos cinetocoros de cada eromosoma d"pUcado, eremulo una tensl6" qlle esUlbilizn la IIIli6" de los cilletocoros. Fuerzas equiUbradas sobre los citJetocoros Ulmbiin lIe,mll a los cromosomas nl «I",dor dellulSO, fonnando la plaea metaft&ia1. Las Sl4blll,ldades de tubulina de los microtlibulos delllllSO suIre" collti""OS despllWlmletltos desde el ecuador IJaCM los polos dellulSO. En la anafase, las cromdtidas I,en/lm,as se separall una de In aIm de repente y SO" atraldn.s lIacia polos opuestos (el mavimielllo de In almfau A). Miel,tms, los dos poios dellulSO se uparan (el mouimiel,ro de la aJJafau B). E" la telo/nse, el estadioji'JaI de In mitosis, se reco,urn,ye In el'voltuTa 'lIIclear ell la sllperficie de cada Kmpo de crrJmosomas uparados al desfosforllnrse las prote{nas qlle sefosforllaroll al comiellZO de Infme M.

Citocinesis Zl Du.rame la cltoclnesls el ciroplasma se divide mediante un proceso denominado segmetltaci6". Aunque nonnalmeme la divisi6n nucleary la divisi6n ciloplasmalica estan relacionadas. son acontecimienlos que se pueden separar; en algunas circunstancias normales la divisi6n celular no va seguida de la citocinesis. POT ejemplo el embri6n temprano de Drosopllila experimenta 13 procesos de divi· si6n celular sin que se produzca njnguna divisi6n citoplasmauca, formandose una sola c~lula grande que conuene 6000 nucleos dispuestos como una mono· capa cerca de 13 superficie. Posteriormeme se generan celulas mononudeadas por segmenlaci6n cilOplasmatica alrededor de todos estos nudeos (vease Figura 21·51). No obstante en una celu!a normal cada mitosis viene acompanada de una cilOcinesis, que comienza en la anafase, continua en la telofase. y alcanza su culminaci6n al comenza.r la interfase siguiente.

EI huso mit6tico determina ellugar de fa segmentaci6n del citoplasma durante la citocinesis22 Normalmente el huso mit6tico determina d6nde y cuando OCllrre la segmcntaci6n. En las celulas animales la primera muestra visible de segmentaci6n es la formaci6n de un estrangulamiento y un Sllrco de la membrana plasmatica durante la anafase (Figura 18·31). La formaci6n del surco ocurre invariablemente

Figura 18·31 Electronmicrografias de barrldo de la segmentacl6n lemprana de un huevo de nma. EI surco de la membrana celular se forma por la actividad de un anilJo colltmelil siluado debajo de ella. EI SUITO de segmentaci6n en esta celula giganle y esferica es extraordinariamente obvio y bien definido. {Allmagen a poco aumento de la superficie del huC\'O. (8) Superficie del sureo a mayor aumento. (De H.W. Beamsy R.G. Kessel, Am. Sci. 64:279·290, 1976.

Reproducido con penniso de American Scientist, revista de Sigma Xi.) Citodnesis

1001

cromosomas

clliula huevo en divisi6n

ambos nucleos ant ran en mitosis

~_, bOlita dEl vidrio_~_~

una bolita de vidrio presionada sobre la clliula desplaza el huso

el surco ae forma s610 en un lado de la cl!ilula, produciendo un huevo binucleado

la segmenlaci6n ocurre entre centro somas unidos por hUlos mlt6ticoB y entre los dos centroBomas qUEl simplamente son adyacentas, formandose custro clilulas hlJas

en el plano de la placa metafa.sica, en angulo recto con el eje mayor del huso mit6tico. Esto asegura que el surco de segmentaci6n pasa entre los dos grupos de cromatidas, 'I de esta manera las dos celulas hijas reciban copias identicas del material genelico. Si mediante micromanipulaci6n se cambia el huso precisamente en la anafase temprana, el surco incipiente desaparece 'I se desarrolla otro surco de acuerdo con la nueva localizad6n del huso. Ingeniosos experimentos efectuados con huevos fecundados de erizo de mar demuestran que el surco de segmentad6n se forma a medio camino entre los asteres que parten de los dos cemrosomas incluso aunque ambos centrosomas no esten concctados mediante el huso mit6tico (Figura 18-32). Asf pues, 10 que sei'ializa a la corteza para que inide el surco de segmentad6n no son los cromosomas sino los asteres microtubulares, Mas tarde, cuando el proceso de formaci6n del surco ya esta bien encarrilado, se produce la segmentaci6n aunque el huso 'I los asleres sean alterados por succi6n 0 se destruyen con eolchicina. No conocemos el mecanisme mediante el eual un par de microtubulos indican la localizad6n de la segmentad6n en la eortcza, pero sin dllda constituye un ejemplo clasico de comunicad6n entre los microtubulos 'I los sistemas de filamentos de actina del dtoesqueleto. Una hip6tesis serfa que las dos formaciones de microtuhulos astrales conectan con la corteza cclular 'I establecen la futura localizaci6n de la segmentaci6n, posiblemente mediante el desplazamiento de filamentos de actina. Tambien podrfa ocurrir que la coneza percibiese un gradiente de Ca 2<, que se establece mediante de vesfculas secuestradoras de Ca 2< que sabemos que existen en los polos de huso. Cualquiera que sea la sei'ial esta claro que la corteza esta preparada para detectarla y amplificarla. Toda la corteza se encuentra bajo tensi6n (vease Figura 16-80), 'I si la tensi6n aumenta localmente en la localizaci6n del inido del SUTCO 0 decrece en los polos, los filamentos de actina se alineanin localmente 'I atraeran nuevos filamentos, junto con miosina-II, procedentes de la corteza circundante. Asf pues, el surco puede ser un sistema de autoamplificaci6n, que se autoorganiza sobre la base de una s\llil indicaci6n inicial.

EI huso se reposiciona especfficamente creando divisiones celuJares asimetricas 23 La mayorfa de celulas se divide de forma simetrica. EI surco de segmentaci6n se forma alrededor del ecuador de la celula madre, de modo que las dos cellilas hijas resultantes son del mismo tamano y tienen propiedades similares. Tal simetrfa en la segmentaci6n es el resultado de una colocaci6n previa del huso, el cual Hende a centrarse en el citoplasma, de forma que el eje del huso quede alineado a 10

1002

Capftulo 18: Los mecanlsmos de la divisi6n celular

Figura 18-32 Experlmento que mUCfitra la InOuencia de la poslcl6n de los asleres mlcrolubulares en el poslclonamlenlo del plano de segmenlacl6n. Si se empuja el huso mit6tico de una etHula de forma mecaniea hacia un lado de la celula, la membrana del sureo resultanl. incomplma, ya que no se producini en la cara opuesta de la celula. Las segmentaciones siguiemes se produciran no s610 en la relaci6n eonvencional respecto a cada uno de los husos mit6ticos (f1ecllas amarillasl sino tam bien entre los dos asteres adyacentes que no estan unidos por un huso mit6tico (pera que en esta celula anormal com parten el mismo citoplasma) (f1ecllas rajas). AI parecer, el haz contractil de filamentos de actina que produce el surco de segmentaci6n siempre se fonna en la regi6n intermedia entre los dos asteres, 10 eual implica que los dos asteres modifican de alguna manera la regi6n adyaeente a la eorteza celular.

flgun18-33 Rotacl6n del hmo. (A) Diagrama que muestl1l. un mecanismo que posiblemente subyace a la rOlaci6n conlrolada del huso. La franja raja representa una regi6n especiaJizadn de la corteza hacia la que los microtubulos astrales empujan un polo del huso. (8) Micrograffas 6plicas que mueslran la rolaci6n programada exa<:la del huso mil6tico de un gusano nematodo C elegam en el estadio de dos celulas. prepanindose para la segmentaci6n que producira cualro cclulas siguiendo un patr6n especffico. EI liuso de la celula de la derecha gira casi 90" en el senlido de las agujas del reloj. (Cortesla de Tony Hyman y John While.)

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d,l.. prOle/n.as molor.. de microtubulos oliel'lladas 'leXI~

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largo de 1m eje detcnninado de la celula. Se cree que dicha posici6n se establece mediante fuerzas de atracci6n sabre los microtubulos astrales. ejercidas par proteLnas motor citoplasmaticas dirigidas aI extrema menos (vease Figura 18-30B). Sin embargo. existen muchas situaciones durante el desarrollo embrionario en las que las celuJas se dividen asimetricamente. En estos casos el surco crca dos celulas de direrenle tamano y destinadas a desarrollarse par eaminos divergenies. A menudo las divisioncs de eSIC lipo se definen espaciahnente de forma exacta. Par ejemplo, pueden guardar lIlla relaci6n precisa con la superficie de una lamina epilclial 0 segregar regiones del ciloplasma que contengan lin conjUnio de organulos distimo. La colocaci6n asim~t:rica del huso mit6rico anlicipa siempre la posici6n asim~trica del surco. EI huso gira de forma controlada adoplando una posici6n adecuada dentro de la celuJa y orientando asf el plano de la divisi6n. Parece probable que estos movimientos del huso se dirijan mediante cambios programados en rcgiones locaJizadas de la eorteza eelular y que entonees In coneza desplace los palos del huso a lTav6; de sus microtubulos astraJes (Figura 18-33). Parece que en las c~lulas polarizadas e[ centrosoma se posiciona mediante un mecanismo similar a este (v~ase pag. 848). La divisi6n celular asim~trica es especialmente imponante en las celulas ve· getales, debido a que estas relulas no pueden desplazarse tras la divisi6n: por 10 laOlO la morfologfa de los tejidos viene determinada por los pianos de divisi6n celular. Las plantas utilizan un mecanismo distinto para establecer su plano de segmentaei6n, que veremos mas adelante.

La actina y la miasina generan las fuerzas necesarias

para la segmentaci6n 24 La segmentaci6n se consigue mediante 1a contracci6n de un fino anillo compucsto principaJmente por una formaci6n superpucsta de marnentos de actina y Citoclnesis

1003

(A)

.nillo tonlrKtii fDl'mado po< lil,mento. de actina y miolilUl

de nIamentos bipo\ares de miosina-II. Este anillo contniclil define el surca de segmemaci6n. Consiste en rtJamenlos orientados en circunferencia, unidos a la eara citoplasm~tica de la membrana plasmatica mediante prOicinas de anclaje no caracterizadas (Figura 18-34). EI anillo conlrncti! se ensambla en la anafase temprana. Una vez ensamblado, desarroUa una fuerza suficienlemente grande como para doblar una delgada aguja de vidrio insertada en la celula. Existen evi-

dencias convinccntes de que 10 que genera esta fuerza es el deslizamiento de los filamentos de actina y de miosina del aniUo contractil, de una forma muy similar a como se produce en un muscuJo. POT ejemplo, en celuJas mit6licas Iisadas. 1a segmenlaci6n se detiene cuando se afiaden subfragmenlos de miosina inaClivada que bloquea los lugares de actina que normalmente se unen a la miosina. De forma parecida, una inyecci6n de anticuerpos antimiosina en huevos de erizo de mar fecundados provoca la relajaci6n del surco de segmentaci6n sin que ella afecle In divisi6n nuclear. En cada pun to de su circunferencia el anillo COnlraclil conliene un haz de lInos 20 filnmentos de actina. Durante una divisi6n celular normal eJ aniJlo 110 se va haciendo mas grueso a medida que el surco se invagina, 10 cual sugiere que se produce una pthdida continua de filamentos, reduciendose asf el volumen del anillo. Asf plies, como otras estructuras citoesqueleticas y a diferencia del musculo esqueletico, el Sllrco es dim1mico. EI anillo contractil se eJimina por complcto al terminar la segmentaci6n, cuando la membrana plasnH\tica del smco de segmcntaci6n se estrecha formal)do el cuerpo medio. que pcrmanece como un puente entre las dos celulas hijas. EI cllerpo medio contiene los restos de los dos conjllntos de microtubulos polares, que se haUan fuertemellle empaquetados par material denso de la matriz (Figura 18-35). EI proceso de citocinesis requiere la reorganizad6n completa de los filamentos de actina y miosina en la corteza para conseguir que se produzca cl ensamblaje del aniUo contractil Durante la fase M se yen afectadas otras fundones de la coneza, especialmente la adhesi6n celular. Por ejemplo. celulas cultivadas de tejidos que durante la interfase se mantienen adheridas a un substrato debido a fuertes contactos con moleculas extracelulares de la matriz. at enttar en la fase M se redondean; mas adelante. todavia en la citocinesis. las celulas se apianan de nuevo. Se cree que durante la fase Mias actividades de las prolefnas de adhesi6n ttansmembrana. como las integrinas (se discute en el Capfmlo 19), se encuentran de a1guna forma somelidas a retroinhibid6n, 0 bien que se madifican las protefnas de adhesi6n que unen estas proteinas con los mamentos de actina de la concza. Como OCUITe con Olras manifestaciones de la fase M, es probable que estos cambios esten mediados por la fosforilaci6n de protefnas. 1004

Capflulo 18: Los meeanismos de la divisi6n celuJar

Figura 18-34 E1anUlocontnk:til. (A) Esquema de un surco de

segmentaci6n de una celula en divisi6n. (B) Elcctronmicrograffa del borde que crece hacia el interior de un surco de segmentaci6n de una clilula animal en divisi6n. (el Una ameba del moho en la que se ha tei'lido la actina (de raja) y la miosina-II (de verde). La miosina lenida en el anillo contractU enmascara de a1guna manera la actina que tambilin esta presente. (B, de H.W. Beams y R.G. Kessel, Am. Sci. 64:279290, 1976, reproducida con autorjzaci6n de American Scielltisr, revista de Sigma Xi: C. cortesia de Yoshio FukuL)

-

Figura 18-35 Cltodnesls. E1ectronmicrografia de barrido de una celula animal en cultivo durante su proceso de division; el cuerpo media todavfa une las dos celulas hijas. (B) Electronmicrograffa del cucrpo media de una celula animal en division. La segmentaci6n es casi completa. pero las dos diu/as hijas permanecen unidas a esta del gada franja de citoplasma. (A. cortesfa de Guenter Albrecht-Buehler; B. cortesfa de I.M. Mullins.) (A)

'8'

malerlal deoso de Iii mllml

membr.n. pillsm'tiu

En casas especiales, determinados componentes celulares se pueden segregar a una sola celuJa hija Z5 Mientras que la mayorfa de divisiones celuJares producen dos c~lulas hijas parecidas, a1gunas divisiones producen celulas hijas manifiestamente desiguales. Este fen6meno se da principalmcmc en las primeras segmentaciones en las que un hucvo fecundado grande se subdivide en celulas mas pequcf\as destinadas a formar diferentes partes del cuerpa. Ya hemos vista que la colocaci6n asimctrica del huso durante la divisi6n cclular puede producir dos cclllias de lamana desigual. pero la genesis de celulas hijas bioqufmicamcmc difercntes es un problema dislinlo. El componamiento de una fonnaci6n caracterlstica de granulos en el huevo de un gllsano nemalOdo C. elegans proporciona un extraordinario ejemplo de este proceso. Estos ~granulos-P" se distribuyell de modo uniforme par todo el citoplasma de un huevo no fecundado, pera se desplazan hacia el extremo posterior de la celula justo antes de la primera segmcntaci6n y consccuentemente son heredados I1nicamente por una de las dos celulas hijas. La misma c1ase de proceso de segregaci6n se repite en varias divisiones celulares posteriores, de forma que, al final, los granulos se encuentran solamente en las relulas germinales primordiales, a partir de las cuales se producen los huevos y los espennatozoides (Figura 18-36). Es posible que los granulos jueguen pane imponante en el control de los destinos particulares de estas celuJas. Los granulos-P se desplazan al extremo posterior de cada celula incluso en las celulas mutantes en las que el huso rnit6tico se descoloca y se Ie localiza en angulos rectos respecto a su posici6n norrnal. Ademas, la segregaci6n de granulos se bloquea mediante la droga citocalasina D, que inhibe la polimerizaci6n de los filamentos de actina, pera no mediante la colchicina, 10 cual sugiere que el des-

Citoclnesls

1005

..,

I , Itnterio.

posterior

plazamiento arientado de los gn1nulos-P depende de los filamcnlQS de actina pero no de los microtubulos. Aunque la scgregaci6n desigual de estos componentes parece basarse en alguna propiedad asimclrica del ciloesquelclo basado en aclina, el mecanismo molecular que genera su desplazamicnto orientado to· davia es desconocido.

En las c~luJas de las plantas superiores, la citocinesis ocurre mediante un mecanismo especialZ6 La mayorfa de las celulas de plantas superiores estan encerradas en una pared celular rfgida, yen esras celulas el mecanismo de la citocinesis es distinto a1 de las celulas animales que acabamos de describir. En vez de pinzar las dos ceJulas hijas mediante un aoiUa contractil en la superficie celular. el ciloplasma de la celula vegetal se parte por la constnlcci6n de una nueva pared celular en el interior de la celula (Figura 18-37). Esta panici6n determina de forma precisa la ubicaci6n de las dos celulas hijas respeclo a las celulas vecinas. De aquf se deduce que los pianos de la divisi6n celular, jUlllo con los de crecimiemo celular, determinanla forma de la plama. La nueva pared transversal, 0 plaea eelular, empieza a ensamblarse en un plano situado entre los dos nLideos hijos y en asociaci6n can los microtubulos polares del huso, que forman una estructura ciHndrica llamada fragmoplaslo. EI fragmoplasto, que corresponde a los microtuhulos del cuerpo media de las celulas animales, contiene dos conjuntos de microtuhulos que sc entrelazan en sus extremos ~mas~ en crecimiento (Figura 18-38). Los microtuhulos lien en sus extremos "mas" englobados en un disco electrondenso del plano ecualorial. Tal como se resume en la Figura 18-39. parece que pequefias vesfculas rodeadas de membrana. principalmeme derivadas del complejo de Golgi y repletas de precursores de la pared celular, COlllactan con los microrubulos en cada cara del fragmoplaslO y se dejan transponar por elias hasta a1canzar la regi6n ecuatorial. Alii se fusionan entre sf (ormando una estructura discoidal rodeada de membrana. la placn cellliar precoz. Las moleculas de polisacarido liberadas por estas vesfculas se ensamblan en la placa celular precoz (ormando la matriz de la pared celular primaria. Este disco (iene ahora que expandirse latcralmcnte hasta a1canzar la pared celular progenitora. Para que esto sea posiblc. los microtubulos del fragmoplasto temprano se rcorganizan sin parar en la peri feria de la placa celular precOl. donde atraen mas vesfculas que se fusionan en el ecuador extendiendo el borde de la placa. Esle proceso se repite hasta que la placa celular en crecimiento a1canza la membrana plasmatica de la celula progenitora. La membrana plasmalica y la membrana que envuelve la placa celular se fusionan, sepamndo las dos nuevas celulas hijas por completo (vease Figura 18·37). Los fila-

1006

Capftulo 18: Los mecanlsmos de la divlsl6n celular

20 >1m

Figura 18-36 Segregacl6n aslmetrlca. Estas micrograffas muestran la segregaci6n asimctrica controlada de un componente citoplasmatico a una celula hija que ocurre en IOOas las primeras divisiones de un huevo fecundado del nemalOOo C elegans. En la parte superior de la figura se presenlan celulas vislas con microscopfa de contrasle de fase interferencial y tefiidas con un ftuorocromo azul especffico para DNA; en la parle inferior de la figura se observan las mismas celulas pero lef'iidas con un amicuerpo conlra granuIOS-P. Eslos gmnulos {O,5-1 ~m de diamcuo}. de acci6n desconocida. se diSlribuyen al azar por el cilOplasma del huevo no fccundado. (Conesla de Susan Strome.)

I j

mentos de actina tambien abundan en el fragmoplasto, alineados con los mieronjbulos, pero su papel Cuncional en la formaci6n de la placa celular es poco claro. Algo mas tarde, las microfibrillas de celuJosa se extienden dentro de la placa celular, completando la nueva pared celular.

Una red de citoesqueleto determina el plano de divisi6n de las celulas vegetales27 Nonnalmente, el huso mit6lico en sf mismo no es suficiente para determinar la posici6n y el tamano exacto de la placa celular. La localizaci6n de la furura placa de uni6n can la pared de la celula madre parece decidirse en alglin momenta de G2, antes del comienzo de la mitosis. Asf, el primer signo visible de que un c~Hula vegetal superior ha iniciade su divisi6n en un plano determinado se aprecia justo despues de que desaparezca [a red de microtubu[os interfasicos de la ceneza, durante 1a preparaci6n de la mitosis. En este momento, aparece un franja de microtubulos en circunferencia que forma una anille alrededor de tada la celula, justo por debajo de la membrana plasmatica. Debido a que aparece antes del comienzo de la profase, esta fonnaci6n de microtubulos recibe el nombre de franja preprofase (vease Figura 18-39). La franja se estrecha a medida que la cclula progresa hacia la profase, y desaparece antes de alcanzar la metafase, cuando en los alrededores ya se ha detcrminado de algun modo el plano de di·

Figura 18·37 Mlcrognlffas6ptlcas secuenclales de una cilula vegetal en dlvlsl6n. E1liempo transcurrido en minulos se indica en la esquina inferior dereeh!l de cada fOlograffa. las vesfculas que se aHnean formando In plaea eelular pueden observarse Iras 42 minulOs. Entonees la placa se exliende por sus hordes hasla que aleanza la pared de la eelula madre y se fusiona con ella. (Conesfa de Peter Hepler.)

Figura l8·38 Mlcrografia 6ptlca de la c1loclnesls de una c::elula vegetal durante la telofase. la placa celular temprana (entre las dOl jlechns) se est4 fonnando en un plano perpendicular al plano de la pagina dellibro. las dos fonnaciones de mierorubulos que comribuyen al fragmoplasto se linen utilizando anlicuerpos contra tubulina marcados con oro, mientras que el DNA de las dos formaciones de cromosomas hijos se titlen con un colorante f1uorescente. (Cortesra de Andrew Bajer.)

Citodnesls

1007

complejo de Goigi

I pIIrltd celular materna En algun punlo de Gl 10. micrOlubuloa cortit.'le. se reeomponen formando la franja que rodea la ~'ula, juato por debajo de la membrana plasm.tit.'. Esta Iranja preprof6,ica de micrOlUbulos sa estrecha gradualmenle V predice con exaetitud dOnde.e unir. la nueva pIIred celular con la pared celular materna cuando la clWula sa div,Oa.

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vesicul.. clerivadaS del Golgi

citOClnes,">-

I I ,

lranja preprof•• ica

do_m_"'_~_'_b_"_~_'_~, En la telofase el fragmoplasto est. f ~ por dos juegos de mietotubulot palares. Las veskul.. derivada. del GoIgi que transportan precuraorn de pared celular .soo::iada$ eon micro!ubulos H 8CUmulan en Ia fe916n ecuaton.l y so fusiorlan fonnat'ldo Ia plae. celular tempr.na.

restot cIe microtubulo. polarn del huso

_

Los microtubulot c1e1 fr.gmoplasto .. forman de nUllVo en la perileria de la plat.' ee1ular temprana. En asta fe9i6n Ie reclutan nuevas vesiculas deriv.d.. del Golgi, V as lusionan sl borde de la plae. celulsr, extendi6ndola hacia III exterior.

placa celular temprana

microtllbuloa del fragmoplaslo

G, La membrana de la placa celular an crecimiento se fusiona con la membrana plallm.tica de la c'lula madre, completando la nueva pared celular. En cada UM de las dOl c'lulas hii" Ie relltahlece la formacion cortical de microtubulol Interfhlco•.

formaclon cortlt.'1 de micrOlubulos interf••ico.

plasmodesfl'lOt

lAl

Figura 18~39 Caracterisllcas princlpales de la mitosis y de Ja dloclnesls en una d!lula vegetal superior, (A) Diagramas que muestrnn celulas vegetales en Gz' lclofasc, cilocinesis, y G. temprana, resaltando los cambios dimtmicos que se producen en 13 dislribuci6n de los microtubulos a 10 largo del cicio celular. (B) MicrograrIas de inmunonuorescencia de ceJuias de la punta de las rakes de cebolla, moslrando la rranja preprorasica de microllJbulos en Gz y el rragmoplasto en cilocinesis. Los micron1bulos se lifien de IIt!rd~, y los cromosomas de QZlIl. (8, conesfa de Kim Findlay.)

1008

Capftulo 18: Los mecanismos de la divisi6n celular

'"

visi6n: cuando se forme la nueva placa celular, durante la citocincsis, crccen\ par los bordes hasta fusionarse con la pared de la celula progenitora, precisamente en la zona que anleriormenle ocupaba la franja preprofase (veasc Figura 18-39). Aunque tras la desaparici6n de la franja preprofase se dcsplace el contenido celular mediante cenlrifugaci6n, la placa celular en crecimiento tendera a encontrar su camino de vuelta al plano definjdo por la anterior franja preprofase. Ahora sabemos que la franja preprofase contiene numerosos filamentos de actina ademas de microtubulos. La presencia de fLIamentos de actina no se limi[a a la corteza celuJar; en relulas vacuoLizadas tambien forman un cstructura discoidal radial de fLIanlentos, que cruza la relula y se conecta al nudeo central en divisi6n, sujet<1ndolo. Despues de la despolimerizaci6n de los microtubulos de la franja preprofase, los filamentos radiales de actina pennanecen, y proporcionan una "memoria~ a la placa de divisi6n predetenninada Durante la cirocinesis, a medida que el fragmoplasto crece hacia el exterior, como los anillos circulares de agua en un estanque, los bordes de la placa celular en crecimiento conectan con la localizaci6n de la franja preprofase mediante filamentos de actina. Por 10 tantO,la actina parece tener una funci6n importante en la divisi6n de las celulas con pared aunque la contracci6n no juegue en eUas un papel importante. La actina tambien est<1 implicada en la fonnaci6n del septum en las relulas de hongos, 10 cual sugiere que puede colaborar en la conducci6n de la citocinesis en tOOas las a!lulas eucariotas.

La elaborada rase M de los organismos superiores evolucion6

gradualmente a partir de organismos procariotas de fisi6n 28 En las celulas procariotas la divisi6n del DNA y del citoplasma estan acopladas de manera muy directa. Cuando el DNA se replica, las dos capias del cromosoma se cncuentran unidas a regiones muyespecializadas de la membrana plasmatica, las coales se separan graduahnente por el crccimicnto hacia adentro de la membrana existente entre elJas. La fisi6n se produce entre los dos lugares de uni6n, de manera que cada celula hija adquiere un cromosoma (Figura 18-40). Con la evoluci6n de los eucariotas, el genoma increment6 su complejidad y los crOlllOsomas aumentaron de numero y de tamano. Aparentemente en eslOS organismos fue necesario un mecanismo mas elaborado para repartir los cromosomas entre las celli las hijas. Esta claro que el aparato mit6tico no pudo haber evolucionado de repente. En muchos eucariotas primitivos, como el dinoflagelado Cryplltllecodi"illm collnii, la mitosis todavla depende de un mecanismo de uni6n a la membrana, aunque en este caso la membrana nuclear asume la flmci6n que en los procariotas desempena la membrana plasm<1tica. La situaci6n intermedia de esta gran alga unicelular tambien se reOeja en la bioqufmica de sus cromosomas que, como los de los procariotas, lienen una cantidad de protefna asociada relalivamente escasa. La membrana nuclear de C. cohn;i permanece intacta durante la mitosis, y los microtubulos del huso permanecen completamente fuera del nUcleo. La envohura nuclear se frunce en una serie de canales paralelos par los lugares en que los microlUbulos del huso ejercen presi6n (vease Figura 18-40). Los cromosomas se unen a la membrana interna de la envohura nuclear, en los lugares opuestos a estos canales. y su separaci6n esta totalmente mediada en el interior de esta membrana nuclear acanalada. Asi", el "huso~ extranuclear se utiIiza meramente para ordenar la membrana nuclear y por 10 tanto define el pIano de divisi6n. En esta especie, parece que los cinetocoros se integran en la membrana nuclear, por 10 que pueden haber evolucionado a partir de alg(in componente de la membrana. EI origen evolutivo de los micro£ubulos todavia constiluye un miSlerio. Son importantes para la segregaci6n cromos6mica inc1uso en los eucariotas mas primitivos, pero tambien estan presentes en axonemas flagelares (vease pl1g. 875). 1.0 que esta [odavia por descubrir es si primero foe el flagelo 0 el huso. Citocinesis

1009

eromosoma

+---1J membrana plasmlilica

BACTERIAS los cromosomas hijos unidos a la membrana plasmlitica se separan mediante el crecimiento hacia el interior de la membrana plasmlitica situada entre ellos

QINOFLAGELAOOS CARACTERISTICOS varios haces de microtubulos paBan a traves de tune las da la anvoltura nuclear 'ntaeta, estableciando la polaridad de la divisi6n; los cromosomaa sa saparan an asociaci6n con la membrana nuclaar interna sin unirse a los haces de microtubulos

cromosomas

envoltura nuclear intacta

HIPERMASTIGINOS Y ALGUNOS DINOFLAGELAOOS POCO COMUNES se forma un huso central unico entre los centr(olos, en un tunel a traves de la envoltura nuclear ,ntaeta; los cromosomas est.lin unidos a la membrana nuclear por sus cinetocoros e interaccionan indirectamente con el huso a t.aves de sus mierotubulos cinetoc6ricos

microtubulos pol ares

m,crotubulos cinetoc6ricos

LEVAOURAS Y DIATOMEAS la envoltura rllJclear permanece Imacta; an el interior del nucleo se forman microtubulos polares del huso y se asoclan con la envoltura nuclear; un unieo microtubulo cinetoc6rico une eada cromOlloma a uno de los polos

·'wmicrotubulos

<::::r=

T

ANIMALES el huso empie~a a formarsa fuera del nucleo; durante la prometafase la envoltura nuclear se rompa permitiendo It los cromosomas que capturen los mlcrotubulos dill hUlIO, que ahora se convertirlin en mierotubuios clnetoc6ricos

fragmentos de envoltura nuclear

En los liipermastigillos, en los que la envoltura nuclear pennanece tambien intacta a 10 largo de la mitosis, se observa una huso algo mas avanzado, aunque aun extranuclear. Estos grandes prolozoos del intestino de los insectos proporcionan un ejemplo particularmente claro de la independencia entre la elongaci6n del huso y los movimientos de los cromosomas que separan las cromatidas, ya que los cinetocoros hermanos se separan par el crecimiento de la envohura nuclear (a 1a que estan adheridos) antes de adherirse al huso. 8610 cuando los cinelOcoros estan cerca de los palos del huso, adquieren la fibras cinetoc6ricas necesarias para unirse a1 huso. Puesto que las fibras del huso estan separadas de los cromosomas por la envoltLUa nuclear, dichas fibras, que se forman en el ex· terior del nucleo, se han de unir de alguna manera a los cromosomas a traves de las membranas nucleares. Tras producirse esta uni6n, los cinetocoros se desplazan de forma convencionaJ (vease Figura 18-40). 1010

Capftulo 18: Los mecanismos de la divisi6n celular

Fignra 18-40 Dlstlntos mecanlsmos de divlsl6n de los cromosomas utiiizados por diferentes organ.lsmos.

Algunos de estos Illccanislllos podrfan haber side estadios intermedios en la evoluci6n del huso mit6tico de organismos superiores. En lodes los ejemplos wle se nmestra la regi6n nuclear central. salvo cn el de bacteria.

Un estadio m:is avanzado en la evoluci6n de los mecanismos mit6ticos podrfa estar representado por los organismos que forman el huso dentro de un !lUcleo intacto. Tanto en las levaduras como en las diatomeas el huso se une a los cromosol1las por sus cinetocoros y los cromosomas se segregan de modo muy parecido al descrito para las relulas de mamffero -salvo que todo el proceso ocurre dentro de los Ifmites de la envoltura nuclear (vease Figura 18-40). Se cree que la mitosis "abicrla" en organismos superiores y la mitosis "cerrada" de levaduras y diatomeas evolucionaron de manera separada a partir de un anlepasado comun parecido al huso del hipermastigino modemo. En este moment'o no existe ninguna explicaci6n convinccnte de por que animales y plantas superiores han desarroUado un aparato mit6tico que requiere la disoluci6n controlada y reversible de la envoltura nuclear.

Resumen lA divisi6" celldar lem,;na 0011 Ia divisi6" thl conlenido ciloplasnJdlico medianle el prouso denomilUUlo cilocinesis. y con Ia tksrotuhnsad6n de los cromosomm, con to cual Ie rei"ida Ia s(",esis th RNA. Parece serque Ia citoeim!sls esld dirigida mediante Iuu:es orgmliuulos th jilamenlos th actina ell dlulm eumriotm tall di· versos como las th animates, vegelates y hongos. En las alulas aninudes el huso mi· 16tico delermlrUJ d6nde y cudndo ocurre Ia cilocinesis; el anillo co,,'mctil de adina y ",iosino forma 1m p,umle a medio camino entre los asteres th los polos del h.l.SO. Mienlras que Ia nUiyoria de las dlulas u dividen sinrelricamenle, ell algunos ca.sos el/uuo Ie caloea thlomla especial generando una divisi611 cetular asimitriM: por ejemplo UIILl alula thlemrinada u puede div/dir ell llna alilia petlileila y una grande, 0 un componenle citoplasnuftico tklenninada puede desplazarse a 1m £.[". mmo de Ia alula antes de Ia aloeinesis de nwdo qlle wlo ua "eredatlo por "no de las dl"las hijm, que de Dlmfanna hubieran sido idintkas. En las dlt4las vegetales SllperiOres In citoelnesis tiene lugar mediante un mecanismo especial: el citoplasma Ie divide mediallle Ia conslrucci6n th uno nueva pared eelular, In placa celull'r, en el interior de la dlt41a. La colacacidn de la. placa celular Ie deterndlla Mglln la 0010caeldn th Ia Irallja melillasien de mlcrotlibulos y jilamettlOS de (KIllin. En alglmos protoroos y Iwngos Ia orgattLureldn de Ia mitosis dijiere de la de "'dmales y plall· 1m, 10 cUDI silgiere ttl posibte y camplkalla evollU:i6n tht proceso de divis/6n celular de las dlt4las ellcariatas.

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r

Las celulas en su contexto social

U Qlt••

Un embri6n de ral6n de 15 diasde

geslaci6n.

Secci6n transversaJ del tallo de la planta £on flores Arabidopsis. Utilizando sondas fluorescenles para la celulosa (azul) y para 13 pectina (verde). se pone de manifiesto la distribuci6n relativa de estos dos polisadridos propios de la pared celular 0 de 13 malriz enracelular. (Por cor1esfa de Paul Unstead.)

19

Adhesion celular, uniones celulares y matriz extracelular

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En la mayoria de los organismos pluricclulares, las celulas se organizan en conjllnlOS cooperativos denominados lejidos. que, a su vez. se asocian (annanda grandes unidades funcionales denominadas 6rganos. Las celulas contactan, generajmente, con una compleja red de macromolecuJas secreladas, denominada matriz exrraceII/lar. Ilsla panicipa en el mantenimienlo de la estructura tisular y en los animales posee una organizaci6n reticular mediante la ellal las celuJas puedcn migrar e interaccionar. En muchas casos las cl:lulas inregrantes de un lejido tambien se mandenen en 5U lugar por media de adhesiones imercelulares. En vertebrados los tejidos principales son el nervioSQ, el muscular, el sanguflleo, ellin[oide, el epilelial y el conjlUuivo. EI tejido conjuntivo y el epitelial represelUan los dos eXlremos en los que el papel estructural que juega la matriz y las adhesiones intercelulares son radicalmente diferentes (Figura 19·1). En el teo lido conjuntivo (CapilUJo 22)la matriz extracelular es muy abundante, mientras que las celulas estan poco representadas. La matriz es rica en poJ(meros, principalmente colagenas, siendo la responsable principal de la respuesta a las tensiones a las que esta sujeto el tejido. Las celulas, que se encuemran unidas a diferentcs componentes de la matriz, pueden ejercer sobre esta diversas fuerzas, miclll'ras que la contribuci6n de las lllliones intercelulares es escaS3. Por el contrario, en los lcJidos epicellaJes las celulas se encuentran estrechamenle unidas formando laminas (denominadas epilelios). La matriz extracelular es escasa y

lUZ INTESTINAL

I'mina de cjlulas 1tp'lel,.les

celula epilelial

Plgura 19-) Esquema

""do[

conjunl;YO mutculo !Iso

fib"'[

ci.cula.os fibras[ longitudinalos lejido[ ooniunllvo

[

16mina de ,,'lulu epilelialllS

cliluia mesolillial

slmpliAcado de un corte transversa.! de la pared Inlestinal. £Ste 6rgano alargado, en forma de Iubo, est' constiruido por tejido epitelial (rojo), lejido conjunlivo (verde) y tejido muscular (amarillo). Cada lejido es un conjunlo organizado de celulas que se manlienen unidas entre sf mediante unlanes celula·celula, celuln-matriz extracelular 0 por ambas. 1017

esta conslituida principalmente por una delgada capa denominada Ittmi"a basal, que est~ en la base de las celulas, las cuales ocupan la mayor parte del volumen. Es en ~Slas donde reside, sabre todo, la oposici6n a las tensiones, mediante filamemos intracelulares de caracter proteico (componentes del citoesqueleto) que se entrecruzan en el ciloplasma de la celula epitelial, transmitiendo la lensi6n de una c~lula a otta; los filamentos se andan directa 0 indirectament'e a proteinas transmembrana de la membrana plasm,Hica, en regiones donde se localizan uniones especializadas can otras c~lulas, 0 con la lamina basal. Las capas de c~lulas epilcliales tapizan IOOas las cavidades y superficies libres del organismo y, mediante sus uniones especializadas, dotan a aqu~Uas de propiedades de barrera que reslringen el movimiento del agua, solutos y celulas entre los diversos compartimienlos del organismo. Como se i1ustra en la Figura 19-1, los epitelios se situan sabre soportes de lejido conjuntivo, el cual puede constituir un nexo con otros tejidos (muscular, por ejemplo), los cuales no presentan, necesariamente, una organizaci6n epitelial 0 conjuntiva. En este capitulo lralaremOS inkialmenle de la estructura y organizaci6n de las uniones c~lula-c~lula y c~lula-malriz (en conjunlo denominadas uniones celulares). A continuaci6n eSllldiaremos c6mo las c~lulas ani males se reconocen entre sf e inician la formaci6n de uniones celulares en los procesos de reconocimicnto celuJar formando tejidos y 6rganos. Finalmente trataremos de la estructura y organizaci6n dc la matriz extracelular animal y de la pared celular en plantas.

Uniones celulares' Aunque las unlones celuJares son especialmente abundantes e importantes en el t'ejido epilelial, tambien se localizan en regiones de contaclO celula-celula y celula-malriz de todos los tejidos. La mayona de estas uniones tienen un tamano que se encuentran por debajo de la resoluci6n que proporciona el microscopio 6ptico, por 10 que deben ser visualizadas mediante la microscopia electr6nica. bien sea convencional bien con la tecnica de la criofTaclura. Ambas muestran que las regiones de las membranas plasmaticas que interaccionan (y, a menudo, cl ciloplasma subyacente y el espacio intercelular) son altamente especializadas. las uniones celulares pueden clasificarse en tres grupos funcionales: (I) uniones de oclusl6n, que implican un seUado entre las celulas epileliales, el cual impide ellTllsiego, incluso de pequenas moll!culas, entre las dos superficies del epitelio; (2) unlones de andale, las coales linen, mecanicamente, las cl!lulas (y sus citoesqueletos) a sus vecinas 0 a la malriz extracelular; y (3) unlones de comunlcacl6n que, mediante el paso de sei'iales qufmicas 0 ell!clricas emre las cl!lulas adyacentes, permiten su interacci6n.

°

Tabla 19-1 Claslflcacl6n funclonal de las umones celulares

I. Unloncs de oclusi6n (uniones eSlancas) 2. Uniones de anclaje a. regiones de anclaje de los filamentos de actina (uniones adherentcs) i. c~luJa-c~lula (por ejemplo. bandas de adhesi6n) ii. celula-malriz (por ejemplo, contactos focalesl iii. septadas (5610 en invenebrados) b. regiones de anclaje de los filamentos intennedios i.~lula·~lula (desmosomas) ii. celula-matriz (hemidesmosomas) 3. Unlones de comunicaci6n a. uniones de tipo gap b. sinapsis electricas c. plasmodesmos (exclusivamelue en vertebrados)

1018

Capitulo 19 :Adhesi6n cclular, uniones celulares y matriz extracelular

En la Tabla 19·\ se relacionan los principales tipos de uniones intercelulares. Trataremos cada una de elias a excepci6n de las sinapsis qllfmicas. las cuales estan conslituidas exclusivamente por celulas nerviosas, que scran tratadas especfficamcnte en los Capftulos II Y15.

Las uniones estancas forman una barrera de permeabilidad selectiva a traves de los epitelios 2 A pesar de las grandes diferencias estructurales y bioquLmicas entre los diferen· tes tipos de epitelios. lodos tienen. como minima. una importante funci6n en comun: constituyen barreras selectivas de penneabilidad. separando nuidos de diferente composici6n. Las unJones eslancas juegan un importante doble papel en el mantenimienlO de esta funci6n de barrera selecliva; un buen ejemplo ilus· trativo es el epitelio intestinal de los mamfferos. Las celulas epiteliales que tapizan intemamente el inleslinO delgado man· tienen la mayor parte del contenido intestinal en la cavidad interna (Iuz intesti· nOlI}. Sin embargo, simultaneamente. bombean nutrientes de manera selectiva a traves del epitelio hacia el plasma del tejido conjuntivo subyacente {vease Figura 19·1}, el cual cs drenado hacia los capilares sangufneos. Este rrallsporle rrmlSCelillar depende de dos grupos de protemas transportadoras localizadas en la membrana plasmatica: uno en el domillio apical (Ia regi6n membranosa en con· tacto con la luz inlcstinal) que bombea nutrienles hacia el interior de la celula epitelial; otro. situado en el domj"io basolateral (basal y lateral) que transporta las mismas moleculas mediante difusi6n faciJitada hacia el plasma situado en la otra earn membranosa. EI mantenimiento de la unidireccionalidad de este transporte implica la imposibiJidad de migraci6n recfproca de los transponadores entre uno y otro dominio de la membrana. Ademas. los espacios intcrcelulares existentes entre las celulas han de estar sellados para impedir la difusi6n pOl· siva hacia la luz intestinal de los nutrientes (Figura 19-2).

BAJA

membrllnlll m'llt.. de 1•• 1:8'ul.. .dYlI(:entet

p'..

npllcio

lnterte!ulll'

_,-._1

trImsponlldOf" plIsivo de

.'~

SUperflCle bllsolIIter.1

, """" '---...

I

SANGRE

Uniones celulares

BAJA

Figura 19·2 Papel de las unlones eslancas en ellJ"ansporte transcelular. En las celulas epiteliales dellnleslino delgado, [as prote(nas lransl>ortadoras se hallan confinadas en difcrcntcs regiones de la membrana plasrm'ltica. Esta regionalizad6n permile una transferencia veclorial de nulrienles desde la luz intestinal !lasta la sangre a traves de la lamina epitelial. La figma mueslra el transporte activo de la glucosa !lacia el interior de la celula. mediante un mecanismo de simporte de glucosa impulsado por Na·. situado en la membrana apical. y posterior difusi6n de la glucosa !latia el espado extracelular por un mecanismo de difusi6n facililada mediado por transportadores de glucosa situados en la membrana basolateral. Se supone que las uniones estancas confinan las protefnas de transporte en sus dominios de membrana apropiados. aernando como barreras en el seno de la bicapa lipfdica de la membrana plasmtitica; estas uniones tambien bloquean la dirusi6n de g1ucosa desde la earn basal del epilelio hacia la luz intestinal..

1019

molkulll

t'lIzadora

union estllncs

,

c61ul1l

IAI

Se cree que son las uniones estancas los elementos bloqueantes de ambos tipos de difusi6n. En primer lugar, actdan como barreras contra la Iibre difusi6n de las prote(nas de membrana entre los dominios apical y basolateral de la membrana (vease Figura 19-2). Sin embargo, se observa este tipo de difusi6n cuando las uniones estancas se desorganizan al eliminar el Ca 2• del medio extracelular, el cual es necesario para mantener la integridad de dichas uniones. En segundo lugar, constituyen un sistema de sellado entre las celulas vecinas, de tal manera que las moleculas hidrosolubles no pueden difundir entre las celulas: cuando se inyecta un marcador electrodenso de bajo peso molecular en el espacio adyacente

Figura 19·3 Las unlones estancas permlten a las l8.minas celulares actuar como barreras en la difuslon de solutos. (A) Dibujo esquematico dande se muestra c6mo una pequena moleeula trazadora extracelular depositada en una de las caras de un epitelio no puede pasar a traves de las uniones estancas, las cuales sellan las cclulas adyacentes. (B) Imagelles de microscopia electr6nica de celulas cpiteliales en las que se ha depositado en el exterior de la celula. ya sea en la cara apical (a la izquierda) 0 bien en la eara basolateral (a la derecha) una pequena molecula tcazadora eleclrodensa; en ambos casas el trazador se detiene en la union estanca. (B, cortesia de Daniel Friend.)

Figura 19·4 Estructura de una union estanca locallzoda entre celulas epltellales dellntestlno delgado. Las uniones estancas se muestran esquematizadas en (A) y obscrvadas mediante criofraetura en (B) 0 mediante microscopia electr6nica convencional en (C). N61ese que las cclulas eSlan orlentadas con la regi6n apical hacia la parte inferior. En (B), el plano de micrograffa es paralelo al plano de la membrana, y la uni6n eSlanca aparece como una banda de lIebras de sellado anaslomosadas que rodean cada celula en la lamina. Las hebras de sellado se observan como crestas farmadas par partfculas intramembrana, situadas en la cara citoplasmatica de la fractuca (cara P) 0 sus depresiones complementarias en la cara externa de la fractma (cara E) (vcase Figura 19-5). En (C) las uniones se observaJl como series de conexiones focales entre las hemimembranas extemas de las dos membraJlas plasmaticas que interactuan, correspondiendo cada conexi6n a una hebra de sellado, observadas en secci6n traJlsversal. (8 y C, de N.B. Gilula, en Cell Communication (R.P. Cox, cd), pags. 1-29. New Vorlc Wiley. 1974. Reimpresi6n can penniso de John Wiley & SOilS, Inc.]

1020

CapftuJo 19 : Adhesi6n celuiar, uniones celulares y matriz extracelular

)

l

membranas plasmdticas interactuantes

I

espaclo intercelular

0,6 11m

1

hebras de partlculas de las uniones estancas

,

mitad citoplasmdtica de la bicapa lipidica clliula 1

a una de las caras del epitelio, este marcador no puede atravesar las uniones estancas (Figura 19-3). Aunque todas las uniones estancas son impenneables al paso de macromoleculas, su permeabilidad respecto a moleculas de pequeno tamafia varia mucho en los diversos epitelios. Par ejemplo, las uniones estancas que se encuentran en el epitelio que tapiza el intestino delgado son 10 000 veces mas permeables a iones inorganicos tales como el Nat que las que tapizan la veji· ga urinaTia. Las celulas epileliaJes pueden modificar transitoriamente sus uniones estancas permitiendo un aumento del Oujo de solutos y de agua a traves de las aberturas de las barreras de uni6n. Esta vfa (denominada transporte paracelular) es especiaJmente importante en la absorci6n de aminoacidos y monosacaridos hacia el lumen del intestino (donde su concentraci6n es a veces suficientemente alta para impulsar el transporte pasivo en la misma adecuadaJ. La estructura molecular de las uniones estancas no es conocida, aunque la criofraclUra revela que eSlan compuestas por una red filiforme y anastomosada que rodea en su totalidad la zona apical de cada celula epitelial (Figura 19-4A y B). A nivel de la microscopia electr6nica de rransmisi6n, las uniones se resuelven en una serie de conexiones pumuales entre las hemimembranas eXlernas de las dos cclulas adyacentes (Figura 19-4C). La capacidad de las uniones para restringir el paso de iones a traves de los espacios inlerceJuJares se incrementa logarftmicamenle con eJ nlimero de estmcturas ftliformes de la red, efeclo que se esperarfa si cada una actuara como una barrera independiente. Se cree que eSlos elementos filiformes estan compuestos por largas hiJeras de prOle(nas transmembrana espe· cfficas, situadas en cada una de las membranas plasma:ticas implicadas, las cuaJes se unen entre sf directamente oc1uyendo el espacio intercelular (Figura 19-5).

Las uniones de anclaje conectan el citoesqueleto entre c~lulas o entre la c~lula y la matriz extracelular Las unlones de anclaje estan ampliamenle distribuidas en los tejidos animaJes. Capacilan a delerminados gnlpOS celulares, como par ejemplo los epilelios, para constituirse como unidades estructuraJes resistentes, conectando los elementos citoesqueleticos de una celula a los esqueletos de sus vecinas, 0 a la matriz extracelular (Figura 19-6). Son especialmente abundantes en los tejidos que esHin sometidos a tensiones mecanicas, como son los casas del mlisculo cardiaUniones celulares

Figura J 9-5 Modelo actual de unI6n estanca. Se postula que las hebras de sel1ado que mantienen unidas las membranas plasmAticas estan constjtuidas por hebras continuas de prolefnas transmembrana, las cuales establecen conlacto a traves de espacio interceJular, dando Jugar a su sellado. En el esquema, se ha separado la mitad ciloplasmatica de una de las membranlls con el objelo de exponer las hebras proteicas. Se han caracterizado dos proteinas perifericas asociadas a la cara citoplasmatica de las uniones estancas, pero la supuesta protefna transmembrana no ha sido identificada todavfa. En microscopia electr6nica de criofraclurlllas protefnas de la uni6n estanca permanecerian con la mitad citoplasmatica (cara P) de Ja bicapa Iipldica para dar el patr6n de partfculas intramembrana observado en la Figura 19-4B, en lugar de permanecer en la otra mitad como se muestra aquf.

filamentos del citoesqueleto

uniones de anclaje matriz extracelular

Figura 19·6 Unlones de anclaje en un tejido eplteLial. Representaci6n muy esquematica de c6mo las uniones de ancJaje unen los filamenlos del ciloesqueielo entre una celula y OITa y entre una celula yla matriz extraceJuJar. 1021

Figura 19·7 Organizacl6ndeuna unl6n de andale. Representaci6n muy esquemlilica que mueslra las dos c1ases de prolefnas que consliluyen una uni6n de andaje: protefnas de adhesi6n intraeelular y g.Iucoprolefnas lransmembrana de uni6n.

fillImenlO. del cilOll"lUeleto

cELULA2

prOle,nn flImeIITIbrana de uniOn e~io

eXlfllCelulllr

\

mlllrlz eJllrllCelulllr

co y la epidermis. Se localizan bajo dos formas estmctural y funcionalmente diferemes: (I) uniones adllerentes. (2) desmosomas y (3) hemidesmosomas. Las uniones adhcrentes son regiones de conexi6n entre fibras de actina, mientras que los desmosomas y los hemidesmosomas 10 son entre filamentos intermedios (v~aseTabla 19-1, pag. 1018). Antes de entrar en la discusi6n de los diferentes tipos de uniones de anclaje, es interesante considerar brevemente los principios generales de su organizaci6n. Como queda i1ustrado en la Figura 19-7, estas uniones estan compuestas por dos c1ases de protefnas: (I) protefnas de adhesion intracelular, que forman una placn en la cara citoplasmatica y conectan el complejo de uni6n a filamenlos de actina 0 a filamentos intermedios; y (2) g/ucoprolefnas transmembrana de unio/l, cuyos dominios citoplasmaticos se unen a una 0 mas protefnas de adhesi6n intracelular, mientras que sus dominios extracelulares interaccionan con la matriz extracelular 0 con los dominios extracelulares de glucoprotefnas transmembrana de uni6n de otra c~lula. Mucho menos se sabe acerea de las ulliones septadas, las cuales son exclusivas de invertebrados. Probablememe deberian c1asificarse como uniones adhe· remes, ya que aeilian como lugares de conexi6n de los filamelllos de actina, pero hay indicios de que en algunos casos pueden actuar como barreras permeables.

Las uniones adherentes conectan haces de fibras de actina entre celuJas 0 entre la celula y la matriz extracelular' Las unlones adherentes Intercelulares aparecen bajo diferentes formas. En la mayorfa de los tejidos no epiteliales, se detectan como reducidas regiones de adhesi6n con formas puntuales a zigzagueanles, que cOllectan las fibras de actina situadas en los citoplasmas apicnles de c~lulas adyacentes. En los epilelios forman una banda de adhesl6n continua (0 zonula adhere1ls), situada alrededor de cada eelula epitelial, cerca de la membrana luminal y por debajo de las uniones estancas. En las c~lulas epiteliales adyacentes, las bandas de adhesi6n se encuentran en aposici6n. permaneciendo unidas ambas membranas por meca· nismos dependiemes de Ca2., Parece que las g1ucoprotefnas Iransmembrana de uni6n, que median dicha uni6n, penenecen a una familia de moleculas de adhesi6n intereelular dependientes de Ca2., denominadas cadl,erinas, las cuales tralaremos mas adelante. Las bandas de adhesi6n se denominan, en algunas ocasiones, desmosomas en banda, aunque el t~nnino pllede inducir a errores, ya que las bandas de adhesi6n son qufmieamenle muy diferentcs de los verdaderos desmosomas. 1022

Cap(lulo 19: Adhesi6n celuJar, unloncs celulares y malrlz exlracelular

microvilli que ae proyectan a partir de la luperflCie apical

mementOI de loCI;na en el inlerior del m!erovillul

11t--I--i-BII-- uni6n esta~

//

banda de adhuiOn

hal de filamentos: deloClina

cadherinas

membrllrlllS

--:::::""'t- laterales plaam't;cas

-Jl__

•_....,,_...I\--........

""'~L

Figura 19-8 Bandas de adhesl6n entre dlulas epltelJaies dellntestJno delgado. £Sla banda de adhesi6n rodea cada una de las relulas inleracluanles. Su caraclerfslica principal es la de conslimir un aniUo conlrictil de filamentos de actina. situado en la cara ciloplasmlitica de la regi6n membranosa implicada en \a unitSn. Los filamentos de actina se unen de ctHula a relula mediante protefnas de uni6n transmembrana (cadherinas), cuyos dominios cxlracelulares se unen al dominio extracelular de una mol~ula de cadherino id~ntica en la ct'!lula adyacenle (vt'!ase Figura 19·7).

de laa c61ullls eplteliales adyllcentes luperficie basal

En cnda celula puede observarse un haz de fibras de actina, conlractil, que se cncucnlra adyacente a la banda de adhesi6n, que corre paralclo a la membrana plasm~lica. a la cual est~ conectado mediante un complejo de protefnas de uni6n que cOnlienen n·, ~- y .,-calenina (se estudia m~s adclante), vincuUna, n·acri"illa y plaroglobilla. Los haces de actina se encuenlran interconectados a Iraves de las cadherinas y protefnas de uni6n, fonnando una extensa red transcelular (Figura 19-8). Se cree que la contracci6n de esta red, que depende de protefnas motoras de tipo miosina, puede ser la mediadora de un proceso fundamental en la morfogenesis animal: el pleganliento de los epitelios constituycndo tubos anat6micos y otras cstrucluras correlacionadas (Figura 19-9). Las u"lones adherentes ~Iula·malrlz conectan las c~lulas y sus haces de actina a la malriz extracelular. Asf, por ejcmplo, fibroblaSlOs cultivados sobre subslralos artificiales que contiencn illolcculas de la malriz eXlracclular se adI'mina de dlulas epiteliales

lilamentos: de aetin& asociados a In bandlll de adhesion

INVAGINACION DE LA LAMINA EPlTEUAl CAUSAOA POA El ESTAECHAMIENTO, A NlveL DE LAS 8ANOAS DE ADHESION, DE LAS cELULAS SITUAOAS EN DETEAMINADAS AEGIONES DEL EPlTEUO

SEPARA(;ION DEL CONOUCTO EPlTEUAl DE LA L..4.MINA ORIGINAL

Figura 19-9 Invaglnacl6n de una Ilimlna epltellal que dalugara un conduclo. Se supone que la contracci6n orientada de fLIamenlos de actina siluados a 10 largo de las bandas de adhesi6n provoca el estrcchamiento de las zonas apicales de las celulas epileliales, 10 cual es imponanle para el enrollamienlo de la llimina epitelial, fonnlindose un conducto (a pesar de que parcce que los reordenamientos celulares lambien juegan un papel imponante). Un ejemplo de ello es la fonnaci6n del tubo neural en los primeros esladios embrionarios de venebrados (estudiado en el Capitulo 21).

conducto epilellal

Unioncs cclulares

1023

hieren estrechamente al substrata mediante regiones especializadas de la membrana plasm,ilica denominadas contactos focales 0 pfacas de ad/lesion, coincidiendo con las zonas term in ales de los haces de actina. En los tejidos las cclulas generalmcnte establecen contactos focales con la matriz extracelular amUogos a estos. Las glucoprotefnas transmembrana de uni6n que median estas adhesiones y que conectan los haces de fibras de aclina a la malriz extracelular en estas placas penenecen a una gran famUia de receptores celula-matriz denominadas illtegriIJas, las cuales estudiaremos mlis adelante. EI dominio extraceluJar de la integrina se une a un componente proteico de la matriz extracelular, mienlras que su dominio intracelular se une indirectamente a haces de filamentos de actina a traves de una via compleja de protefnas de uni6n, que incluyen la taliTla, la a.-actin ina y la vinculina (Figura 19-10). Las unlones septadas se encuentran en tejidos de invenebrados. Comparten muchas caracterfsticas con las bandas de adhesi6n, con las cuales a veccs coexisten: (I) forman una banda conlinua alrededor de los moirgenes de las celulas epileliales, (2) se cree que ayudan a mantener juntas las celulas y (3) acnian como lugares de anclaje para los filamentos de aclina. Presentan una morfologfa sumamente especffica, ya que las membranas plasmalicas que interaccionan estan unidas par protefnas de uni6n mal caracterizadas que se disponen en filas paralelas con una regular periodicidad (Figura 19-11).

Los desmosomas conectan filamentos intermedios entre c~luJas; los hemidesmosomas los unen a la lamina basal" Los desmosomas y Ilcmidesmosomas acman como remaches repartiendo las fuerzas de tensi6n 0 de cizaLia a 10 largo del epilelio y del tejido conjuntivo subyacente. Los desmosomas son contactos intercelulares pumiformes que mantienen unidas las celulas (Figura 19-12A). En el interior de las celulas actuan como lugares de anclaje para los filamentos intermedios en forma de cuerda, los cuales forman una red estructural en el citoplasma proporcionando una ciena rigidez (Figura 19-128). Mediante eSlas uniones los filamentos intermedios de las ct!lulas adyacentes eSI
1024

Capftulo 19 : Adhesi6n celular, unlones celulares y maim extracelular

Figura 19-10 Locallzacl6nde v1ncullna en un contaclo focal. En estas micrografias de inmunofluorescencia. se observan c~lulas en cultivo con un doble marcaje con anticuerpos conlra aClina (verde) y contra vinculina (rojo). Observese que la vinculina se localiza en los contaclOS focales, donde los grupos de filarnentos de actina conectan con la membrana plasmatica. (De B. Geiger, E. Schmid, y W. Franke, DijJeremiatioll 23: 189-205. 1983.)

Figura 19-11 Unl6n septada. Electronmicrografia de una uni6n scptada entre dos celulas epitcliales de un rnolu5Co. Las membranas plasrnaticas que interaccionan. observadas en secci6n transversal. est:\n conectadas por filas paralelas de protefnas de uni6n. Las filas. siguiendo una cierla periodicidad. se observan como harms densas0 septos. IDe N.B. Gilula. en cell Communication (R.P. Cox. ed.), PI'. 1-29. New York: Wiley. 1974. Reimpresi6n con el permiso de John Wiley & Sons, Inc.l

c.dherine

placa citoplllsm6'k:a

• ....;:::~. con.tituida por protein•• de uni6n

flleffiento. de que.atiOll anctlldoa

en Ie place citopla.m6tlce

V

membranu pla.m6tices Que inler8C1uan

IAI

'---' 0,1 11m

181

'---' 0,1 11m

ICI

Figura 19·12 Desmosomas. (A) EleclIonmicrograffa de tres desmosomas entre dos celulas epiteliales en el imestino de rara. (8) Eleclronmicrograffa de un desmosoma entre dos cl!lulas epidermicas de un Idldo en desarrollo, moslrando c1aramente su uni6n a filamentos inlermedios. (C) Dibujo esquemalico de un desmosoma. Sobre la superficie dtoplasmatica de cada membrana plasrni'itica que interaclua se sittia una placa densa compuesla pot un conjunlo de proteinas de adhesi6n intracelular (incluyendo placoglobinas y desmoplaquinas). Cada placa se encuentra asociada con una densa red de filamentos de queratina, que estan unidas a 1a superficie de la placa. Algunas g1ucoprotefnas transmembrana de uni6n, que pertenecen la familia de las cadherinas y que actuan como mol~las de adhesi6n inlercelular. se unen a las placas e interaceionan fuertemente mediante sus domlnios enracelulares. manteniendo, unidaslas c~lulas medianle un mecanismo dependienle de Ca z-. IA. de N.B. Gilula. en Cell Communication (R.P. Cox. ed). pp. 1-29. New York: Wiley. 1974. Reimpresi6n con el penniso de lohn WIley & Sons, Inc.; B, de D.E. Kelly, I. Cell BioI. 28:51-59, 1966. con permiso de copyright de The Rockefeller University Press./

propias protefnas del tipo de las cadherinas desmosomales; eSIOS anlicuerpos se linen a desmosomas desorganizados entre las celulas epileliales (queratinocitos) callsando la relajaci6n de la estructura epitelial, 10 cual induce la formaci6n de abundantcs ampollas debido a la fuga del fluido tisular. La constataci6n de la espccificidad de estos anticllerpos par la epidermis sugierc que los desmosomas prcscnles en otros lejidos pueden ser bioqufmicamente difercntes. Los hcmldcsmasomas, semcjantes morfol6gicamentc a los desmosomas, difieren de estos tanto a nivel fllncional como bioqufmico. En lugar de unir las memhranas de las celulas adyacentes. unen el dominio basal de las celulas y la Idmilla basal -un (ipo espedalizado de la malriz extracelular que se encuentra en la interfase entre el epitelio y el tejida conjuntivo subyacente. Sin embargo, mien[ras que los filamenlOS de queratina asociados a los desmosomas es(ablecen conlaclOS lateraJes con las placas desmos6micas (vease Figura 19-12C). la mayana de los filamentos relacionados con los hemidesmosomas se anclan por una de sus regiones lenninales (Figura 19-13). En los contaclOS focales las protefnas de uni6n transmembrana de los hemidesmosomas no pertenecen a la familia de las cadherinas del grupo de proteinas de adhesi6n celular ulilizada para

Figura 19-13 D1strlbucl6n de desmosomas y hemldesmosomas en las celulas epltellales del intestlno delgado. las redes de filamcntos de queratina de dos cl!lulas adyaccnles estan conecladas indircclamente a traves de los desmosomas, mientras que los hemidesmosomas pcrmilcn su conexi6n COil la lamina basal.

Unlones cclulures

filementos de queretine

desmo.ome

hemid••mosom.

1025

Tabla 19-2 Unlones de andale PTQlefna de unl6n transmembrana

Unl6n

Ugando cxtracelular

Uni6n lntracelular al citoesqueleto

AJgunas protefnas deunl6n eXlracelular

Adherente lcelulacelula)

cadherina (cadherina E)

cadherina en celulas adyacentes

filamentos de actina

Desmosoma

cadherina (desmogleinas y desmocolinas) inlegrina

cadherina en celulas adyacentes prolefnas de matriz extraceluJar protefnas de matriz extracelular (lamina basal)

filamentos intermedios

cateninas. vinculina, a-actin ina placoglobina desmoplaquinas, placoglobina

filamentos de actina

talina. vinculina. a-actinina

filamenlOS intermedios

prolefna semejanle a la desmoplaquina

Adherente (celulamatriz) Hemidesmo- inlegrina ",rna (aJ!•. vease pag. 1069)

los desmosomas sino a la familia de integrinas de receptores de malriz extracelular. Las protefnas de uni6n intracelulares en los hemidesmosomas tambien son diferentes a las de los desmosomas. Asf. aunque la terminologfa para las disumas uniones de anclaje es confusa, los principios moleculares (en vertebrados por 10 menos) es sencilla (Tabla 192). Las integrinas en la membrana plasmatica se unen a moleculas de la matriz extracelular, las cadherinas en la membrana plasmatica se unen a cadherinas de la membrana de la celula adyacente. En ambos casos exisle un acoplamiento de los tilamentos del citoesqueleto. los cuales pueden ser de actina 0 filamenlOS intermedios dependiendo del lipo de prOleina de uni6n utilizada. Ademas en todas estas c1ases de uniones de anclaje la adhesi6n depende de cationes divalentes extracelulares. aunquc el significado de esta dependencia se desconoce.

Las uniones de tipo gap permiten el paso directo de pequei'ias mol~culas entre c~lulas5 Las unlones de tipo gap constiluyen, quizas, las uniones celulares mas intrigantes. Mllestran una amplia distribllci6n, siendo muy numerosas en la mayorfa de los l'cjidos de la pnictica lotalidad de las especies animales. A nivel de electronmicroscopia convencional se observan como regiones en las que las membranas de dos cclulas adyaceilles se encuentran separadas par un espacio uniforme de unos 2-4 nm de amplillld. Las uniones de tipo gap median la cOlllunicaci6n inlercelular al pcrmiur el paso de iones inorganicos y otras pequenas 1ll0lccll..Ias hid.rosolubles entre los respectivos citoplasmas. acoplando las cclulas tanto electrica como melab6licamente. Este aeop/amiel/to eellliar tiene importantes implicaciones hlllcionales, la muchas de las cuales unicamente empezamos a comprender. £Ste lipo de comunicaci6n interceluJar fue demostrado inicialmellle por melodos fisiol6gicos en 1958, aunque fueron necesarios diez afios para demostrar la correlaci6n enue ese acoplamiento fisiol6gico y la presencia de uniones de tipo gap observadas medjante el microscopio electr6nico. La evidencia inicial sabre el acoplamiento celu.lar proviene de los estudios electrofisiol6gicos sobre pares de celu.las nerviosas conectadas y localizadas en el sistema nervioso del cangrejo. Aplicando un gradiente de voltaje a traveS de las regiones de uni6n e insertando electrodos de regislro en cada una de las celulas inleraCluantes, se observ6 un inesperado nujo elktrico. indicando que los iones inorganicos {por1026

Capftulo 19: Adhesl6n celular, uniones celulares y matrizextracelular

tadores del potencial elect rico en los tejidos vivos) podian circular Iibremenle entre las celulas. Experimemos posteriores demostraron que pequeflas mohku· las de colorantes nuorescentes lambien pod fan pasar de una celula a otra ad~ yacenle sin pasar por el espacio inlercelular, a condici6n de que sus pesos moleculares no sobrepasaran los 1000 dahons (Figura 19-14). Eslos resultados sugiercn que esos tuneles inlercelulares presenlan un diametro funcional de alrededor de 1,5 nm, 10 cual implica que las celulas acopladas com parten las moleculas pequeflas (como los iones inorganicos, azucares, aminoacidos, nucle6lidos y vitaminas) pero no las macromoleculas (prolefnas, acidos nucleicos asf como polisacaridos). La evidencia de que las uniones de tipo gap median el acoplamiento eleclrico y qufmico enlre celulas que se hallan en conracto puede constatarse a partir de diversas fuenles. Exisle una correlaci6n entre la presencia de estructuras de esle lipo de uni6n y la demostraci6n de acoplamiento, medianle criterios qufmicas 0 electricos. Inversamenre, lal acoplamiemo no se ha demostrado entre celulas de vertebrados que no presentan uniones de tipo gap. Por otra parte, el acoplamiento electrico y el paso de coloranles puede ser bloqueado si se inyecIan anticuerpos contra la protefna principal de las uniones de tipo gap. Mas recientementc, la utilizaci6n de melodos moleculares ha proporcionado pruebas direclas: cuando esta protefna es reconstituida en bicapas lipfdicas sinteticas 0 cuando el mRNA que codifica esta pratefna es inyeclado en oocitos de rana 0 en una Ifnea celular deflciente en uniones de tipo gap puede dcmostrarse eleclrofl~ siol6gicamente la aparici6n de canales con propiedades tfpicas de las uniones de tipo gap.

o

Figura 19-14 Detemlinacl6n del tamano del canal de una uni6n de tipo gap. Cuando se inyectan moleculas de diversos tamaf\os en una de las dos cfHulas unidas entre sf mediante una uni6n de lipo gap, las moleculas mas pcqueiias de unos 1000 daltons Imeden pasar a la celula adyacente, pero no las moleculas de tamano mayor.

Los conexones de las umones de tipo gap estan compuestos par seis subunidades6 Las uniones de tipo gap estan organizadas en base a protefnas lransmembrana, que forman estructuras denominadas conex.ones. Cuando los conexones de las membranas plasnuhicas de dos celulas adyacentes estan alineados, forman un canal acuoso continuo que canecla ambos citoplasmas (Figura 19-15). Los conexones enlran en conlacto de lal manera que las membranas plasmalicas implicadas se encuentran separadas por una "hendidura" -de aquf cl nombre de uniones de tipo gap 0 de hendidura-Io cual aumenta la diferencia con las uniones estancas, ya que en eSlas las membranas eSlan unidas mas cstrechamente (comparense Piguras 19-5 y 19-15). Mediante la tecnica de criofractura, cada conex6n es observado como una partfcula intramembranosa y cada uni6n de tipo gap puede contener un grupo de mas de varios centenares de conexones (Figura 19-16). Un conex6n esta compuesto por un anillo de seis subunidades prOleicas identicas denominadas conexinas, cada una de las cuales contiene cuatro helices a que atraviesan la membrana. Las seis conexinas forman un canal mayor y mas permeable que el de cinco subunidades de las barreras de neurotransmiso~ res de canales de iones 0 que el de cuatra subunidades (0 dominios) de la barrera voltaica de los canales cali6nicos, que ya han sido ualados en el Capftulo II (vease Figura 11-33). En los diferentes tejidos las uniones de tipo gap pueden tener algunas propiedades diferentes. La permeabilidad de sus canales individuales puede variar; por ejemplo se sabe que actualmente existen duerencias apreciables entre las conexinas que forman las uniones. En ratas, par ejemplo, se conocen par 10 menos 1 t conexinas difercnles, cada una codificada por un gen separado y distinto, aunque a veces su dislribuci6n tisular csta solapada. Algunos lipos celulares expresan mas de un tipo de conexina, perc no esta claro si las diferentes protefnas de conexina se unen alguna vez denlrO del mismo conex6n. A pesar de las diferencias enlre los diferentes iSOlipos de conexina, Sll estruClura basica y funcional se ha conservado muy bien a 10 largo de la evoluci6n. As., al menos en cultivos celulares, una celula que exprese un tipo de conexina puede a menudo formar Uniones cclularcs

membrana8 plaam
espacio de 2-4 nm

Figura 19-15 Modelo de unl6n de tJpo gap. EI esquema mueSlra las membranas plasmaticas de dos celulas adyacentes. Las bicapas lipfdicas (raja) SOil atravesadas por complejos proteicos, denominados conexofles (verde), cada uno de los cua1esse supone formado por seis subunidades proteicas identicas (denominadas COfl€xinas). Dos conexones unidos a traves del cspacio intercelular dan lugar a la formaci6n de un canal acuoso continuo enue ambas celulas.

1027

Figura 19·16 Unionesdetlpogap visualizadas por mlcroscopla electr6nlca. Secci6n ultrafiml (A) y replica de criofraclUra (B) de dos uniones de tipo gap, una grande y otra pequei'ia, localizadas en fibroblastos en cultivo. En (B) cada uni6n es observada como un agregado de partfculas intramembranosas homogeneas, asociadas exclusivamellle a la cara citoplasmatica de la fmctura (cam Pl. Cada partfcula intramembranosa corresponde a un conex6n de los esquematizados en la Figura 19-15. [De N.B. CHula, en Cell Communication (R.P. Cox, ed.) pp. 1-29. New York: Wiley, 1974. Reimpresi6n con permiso de John Wiley & Sons, Inc.]

una uni6n del tipo gap funcional con una celula que exprese una conexina diferente, induso aunque las dos celulas sean de vertebrados distinlOS.

La mayor parte de las celulas embrionarias estan acopladas entre sf durante las primeras etapas del desarrollo mediante uniones de tipo gap7 En rejidos que conrienen celulas excilables electricamente, el acoplamiento ceJular mediante uniones de tipo gap tiene una funci6n obvia. Por ejemplo, el acoplamiento electrico entre celulas nerviosas permite el desplazamiento rapido de los potenciales de acci6n de una celula a otra sin el retraso que represcnta la sinapsis qufmica; ello es especial mente ventajoso en situaciones en que la veloddad y la fiabilidad son crudales, como en algunas respuestas de escape que presentan peces e insectos. De manera similar, en vertebrados superiores el acoplamienlo eh~ctrico sincroniza las contracdones de las celulas musculares cardfacas, 0 las de las celulas musculares lisas responsables del movimienlo perishUtico del inlestino. No resulta tan obvia la presencia de uniones de tipo gap en tejidos que no presentan actividad eh~ctrica. En principio en estos tejidos el compartir los pequenos iones y metabolitos proporciona un mecanismo para coordinar las actividades de las celulas y para suavizar las tluctuadones al azar de una celula a otra. Por ejemplo, aJguna de las actividades de las celulas epiteliales, como el movimiento cHiar, pueden estar coordinadas mediante este tipo de uni6n. De manera mas general, puesto que los mensajeros intracelulares tales como el AMP cfclico y el Ca 2• pueden pasar a traves de las uniones de tipo gap, las respuestas de las celulas acopladas frente a las sefializaci6n extracelular pueden propagarse y coordinarse de esta manera. EI acoplamiento celular mediante estas uniones desempena un papel imporlante en el transcurso de la embriogenesis. A partir de los estadios embrionarios inidales de los vertebrados (el estadio de 8 celulns en el cnso de embriones de rat6n), la mayor parte de las celulas esn\n acopladas electricamente. Sin embargo, generaJmente cuando grupos especificos de celulas embrionarias empiezan a desarroUan sus caracter(sticas especfficas y empiezan a diferenciarse, se desacoplan del tejido drcundante. As!. por ejemplo, cuando se cierra el tubo neural (vease Figura 19-9) sus celulas se desacoplan del ectodermo ext.erno. 1028

Capftulo 19: Adhesion celuJar, unlanes celulares y matriz extracelular

Mientras tanto, el conjunto de celulas de cada grupo permanecen acopladas y asC preselHan un comportamiento cooperativo y siguen de manera coordinada una misma via de desarrollo. Es posible que en los embriones el acoplamiento celular constituya una via de senalizaci6n celular a larga distancia denno de un epilelio en desarroUo. Por ejemplo, una pequei'la mol~cula puede pasar. a trav~ de las uniones de tipo gap. desde una regi6n tisular donde su concentraci6n se mantiene alta hasta otra regi6n donde su concentraci6n es mas baja, crelindose asf un gradiente de concentraci6n unifonne. EI valor que alcanza localmente la concentraci6n puede proporcionar a las celulas una "infonnaci6n posicional" para el control de su diferenciaci6n, en funci6n de su localizaci6n en el conjunto embrionario (se estudia en el Capirulo 21). Sin embargo. se desconoce si las uniones de tipo gap presentan una funci6n acorde con la hip6tesis expuesta.

La permeabilidad de las uniones de tipo gap esta regulada8 Como los canales i6nicos convencionales, los canales de las uniones de tipo gap no pcrmanecen abiertos continuarnente sino que alternan entre estados abierlos y cerrados. Adetmis. la permeabilidad de las uniollcs de tipo gap puede ser disminuida de manera nipida (en cuesti6n de segundosJ y rcvcrsiblemente, mediante manipulaciones experimentales que irnpliquen un descenso del pH 0 un incremento de la concentraci6n del Cal> Iibre citoplasm<'iticos. Estas observaciones indican que los canales de las uniones de tipo gap constituyen estrucruras din~micas que. al igual que los canales i6nicos convencionales. son regulables: pueden sufrir un cambio conformacional reversible que cierre el canal en respuesta a cambios en la c~lula. Un modelo interesante de tipo de cambio conformacional se muestra en la Figura 19-17. Se desconoce el papel fJsiol6gico del efceto del pH sabre la penneabilidad de las uniones de tipo gap. Sin embargo existe un casu en cl que parcee claro el control ejercido por el Cal-. Cuando una celula es danada. su membrana plasmMica se hace permeable. Asr, iones tales como el Cal< y el Na' ennan en la celula. micntras que otros metabolitos vaHosos salen de la aHula. Si la relula afectada continua estando acoplada a otras celulas adyacentes no dafiadas. estas pueden sufrir severos cambios funcionales. Sin embargo, la entrada de Cal< en la celula daf'iada provoca inmediatamente el cierre de los canales de las uniones de tipo gap, aislando eficazmentc a la celula y previnjendo. de este modo, la propagaci6n de la anomalfa funcional. En la Figura 19-18 se resumen los diversos tipos de uniones celulares presentes en las celulas epitelialcs. En 1a zona mas apical, sus posiciones relativas son las mismas en casi todos los tipos de epitelio: las unioncs estancas se sinian en las rcgiones mas extremas, seguidas de las bandas de adhesi6n y finalrnente de un grupo de desmosomas; el conjunto as! formado se denomina compLejo de uniOn. Las uniones de tipo gap y oLros desmosomas presentan una distribuci6n menos regular.

,tta coneenlraci6n de C,n 0 pH bajo

Unlones celulares

baja concentraei6n de Ca 2+ a pH alto

Figura 19-17 Modelo expllcatlvo de cdmo los canales de las unlones de tipo gap pueden cerrarse en respuesla a un aumento del cr- 0 un descenso del pH del c1tosol. Una pequena rolaci6n de cada subunidad cierra el canal. B modelo se basa en un anaJisis de micrografias oblenidas con el microscopio elecrr6nico a panir de tejidos congelados rapidameme. en los cuaJes la estruetura de los canales de uni6n de tipo gap supuestamente en estado abieno eran comparados con su estructura en un estado de cierre inducido por Cal-. Es factible que un mccanismo similar a kte aelue en la apertura y cierre de los canales i6nicos explicados en el Capitulo I J. (Seg(in P.N.T. Unwin y P.O. Ennis, Natllre 307:609-613, 1984.)

1029

Agura 19-18 Resumen de los disl1nlOS t1pos de unlones celuJares hallados en el epltelio de c~luJas anlmales. Esle CS(luema eslrt basado en las celulas epiteliales del intestino delgado.

microvilli

'ilamenlOs de qUerallnl_--::::
1.I1mina basal

En los vegetales, los plasmodesmas realizan muchas de las Cundones de las uniones de tipo gap9 Los lejidos vegelales se organizan bajo principios diferenles que los de los animales. Esto se debe a que las celulas vegelales estoin atrapadas dentro de paredes ce//llares rfgidas, constiluidas par una malnz extracelular rica en celulosa, como examinaremos mois adelanle. EI sistema de paredes celulares elimina la necesidad de uniones adherenles para manlener las rellilas en Sll lugar, pera persisle la neccsidad de una comunicaci6n illlcrcctular dirccta. As!, en contraste con las celulas animales, las vegctalcs licnen s610 una c1ase de uniones inlercelulares, los plasmodesmQs, que, como las uniones de lipo gap, coneclan dircctamenle el ciloplasma de las celulas adyacentes. Sin embargo, en los vegetales la pared celular que existe entre un par de reIulas adyacentes tipicas tiene por 10 menos 0,1 IJ.m de espesor, de modo que se requiere una estructura muy diferente a las uniones de tipo gap para mediar 13 comunicaci6n entre elias. Los plasmodesmas soludonan el problema. Can pocas excepdones espedalizadas, cada celula de una planta superior est<\ coneclada a su vecina mediante plasmodesmas, los cuales fonnan unos finos canales ci· toplasm<1ticos a traves de las paredes cclulares. Como se muestra en la Figura 19-19A, la membrana plasmoitica de una celula continua con la de la vecina a retlculo endoplasmelico liso desmotubulo

citoplasma

__ lemina

\1!:~

media

membrenl

l00nm

~smjjicll que

rrmlll III pla~. conectando entre iii de» ottul.. advKefllllS (A)

1030

'81

Capitulo J 9 : Adhesi6n celular, uniones celulares y matriz extraceluJar

Figura 19-19 Plasmodesmos. (A) Los cannlcs citoplasm:hicos de los plasmodesmas 3Lraviesan la pared celular vegelal y conectan entre sf Lodas las celulas del vegelal. (8) cada plasmodesmo est:i recubierto por la membrana plasm:ilica comun a dos celulas conccladas. Normalmente lamblen comicne una fina estructura lObular, el desmOlubulo, derivado del redculo endoplasm:ilico Iiso.

traves de los plasmodesmos. y los citoplasmas de las dos celulas se conectan por un canal m
retleulo endoplasm'tico

0,1

~m

• PO''''

celular

~

(B)

desmOlubulo

membra,.. plasm'tial

Resumen Ln mayorln de las cilulas se unen a orras cilulas 0 a In matm extraallllnr mediante Imos puntos espeda11zndos de Cfmlncto denomiluul.os ImiolU!$ celulares. fslas ",dones se organium en tn!S cliues funciolUlks: "niones de ocllul6n, "niOlln de anclaJe y Ilniones de comunlcad6n. lLrs IInlones estalll:as esuf" consriruldas fundamentalmente par /lnlones de oc/wi6n qlrejuegan IlR papel imporlante en el mantenimiento de las difenmdas de ronamrracl6n de peqlwiins molklltas l,idr6fllas a traves de los epltelios, mediante (I) sellndo la$ membrmuu plasmtfticas de las dlillas tldya-

centes, creando mm lmrrera conlilllm de impenlleabilldlul 0 semlpermeabilldad a travis del epltello y (2) actualldo como lmrreras en Ia bicapa lipidica, restring/endo III d/fwi61l de las prole{mu lratuporllUloras e"tre los domin/os apical y basolateral de Ia membrtllUl ell cada cilula epitelial. Los principales tipas de ,mio,res de atu::llIje e" lejidos de vertebrados SOIl las uniones adJrenmtes, los desIlWSO'1IIIS y los lremidesmosonuu. las "niones adlummtes colteetan Iuu:es de fllamentos de adllUl, ntlentms que los desmosonuu y los hemidesmosonuu wren filllnumtos Intermed/os. lns un10lles sepuulas tamhiin IJCh1nn como lugares de un/6n de los filamentos de aetilUJ, pero siSlo en tejidos de illvertebrados. Las Uniolles de tlpo gap son un/olles de comunicaci6" compuestas par agmptlciolies de canales proleicos, que permlt,m el paso del interior de una cilula a otra direclanumle, de nrolklllas de 1m peso moleculllr inferior a 1000 daltOtu. Ltu dlulas collecladns par eslas ,miotres comparlell nuu:hos iOlles itlOrgtflticos as{ como olras lItolk,,/as pequeiias, par to que estdll acopladas qufmica y eIectricamellte. Las "It/olles de tlpo gap SOlt imporlanles e" la coord/tlacl61l de las actividades de las clllllas elklrlcanrellle actill{U, y Sf! cree que desempellatl 1m papel de coombtacl6n similar ell otros grt41JOS celu14res. Los plasmodesmos SO" las "nleas ""iOlles bllerce/"lnres presentes ell los f.'egetales; acII,an como las UII/Olles de tipo gap, U1mque Sll estructura es compktamente dist/llla.

rl

U

UnionesceluJares

Figura 19-20 Plasmodesm05vlsl05aJ mlcroscoplo elect.nSnlco. (Al Secci6n longitudinal de un plasmodesmo de un helecho acuatiro. La membrana plasmtilica delimita el para y es continua ron la de la celula adyacente. Tambi~n puede observarse el retfculo endoplnsm(itlco y su asociacl6n con el desmOliibulo central. (B) Un plasmodesmo similar en seccl6n transversal. (Cortesfa de R. Overall.)

1031

---

Adhesi6n intercelular lO Para formar una uni6n de ancJaje, las c~luJas han de haberse adherido una a Qua. Poslcriormente. alrededor de las moleculas que median direClamente la adhesi6n se ha de formar un aparalO citoesquel~tico. EI resuhado es una eSlructura bien definida -un desmosoma, un hemidesmosoma 0 una uni6n adherente o septada- f
Existen dos vias fundamentales mediante las cuales las celuJas animales se unen para formar tejidos l' Muehos de los tcjidos simples, incluyendo la mayor pane de los epitclios, provienen de celulas precursoras euya progenie no puede migrar indcpcndientcmenle aJ estar ancladas a la matriz extraeelular ylo a Olras celulas (Figura 19-21). Sin embargo, a medida que las celulas se van acumulando no permanccen juntas de forma pasiva, amomonadas desordenadamenle, sino que, como veremos, la arquitectura del tejido se manliene de forma activa por adhesiones selcctivas que producen las dlulas y que van modificando progresivamenlc. De cSle modo, si se mezclan artificialmenlc el!luJas de diferentes tejidos embrionarios, las celulas se c1asificaran espontaneamente restableciendo una organizaci6n mas normal. Estas adhesiones selectivas son incluso mas esenciaJes para el desarrollo de los tejidos que lienen unos orfgenes mas complejos en los que participa la migra· ci6n celular en la que una poblaci6n celular invade a otra y se une a eUa y en los que quizas tambil!n participan O{Tas celulas migralorias. formando finalmente una estruClUra ordenada. Por ejemplo, en los embriones de venebrados aJgunas celu1as de la cresta neural (epiteliaJ). se separan del tubulo ephelial neural con el que inicialmente estaban relacionadas. y migran a traves de vias especlficas hacia otras muchas regiones. Posteriormente se unen a otras celulas organizandose y diferenciandose en diversos tejidos, incluyendo el sistema nervioso periferico (Figu1032

Capflulo 19: Adhesi6n celuJar, uniones eelulares y malriz extracelular

I c61uhllundlldorll lin III "mina basal

W I

01l'ill

uni6n

~intllrclllulBr

~ I

lAmina basal lAmina de celulll& eplteliales

FIsw'a 19·21 EI mecanJsmo mas simple medJante el cuallas d1ulas Ie unen enlre sf fonnando un telldo. La progenie de celulas fundadoras es rclenida en cl tcjido epilelial mediante la lamina basaJ y mecanismos de adhesi6n imercelular. incluyendo la formaci6n de uniones intercelulares.

FlgUTIl 19·22 EJemplo de un mecanlsmo mas complejo pOT el que IllS c~lulas se unen entre sf formando un telldo. Celulas de la cresta neural se segregan del epitelio que forma la superficie superior deltubo neural y migran formando diversos Lipos celulares y tejidos en 1000 el embri6n. Aquf se muCSlran uniendose y diferenciandose, formando dos grupos de c~lulas nerviosas en el sislema ncrvioso periferico. Tales grupos de cehllas ncrviosas se dcnominan 8anglios. En eI ganglio. otras celulas de la cresla neural se diferencian constiluyendo celulas de sapone (celulas sal~lite) que rodcnn la ncurona. Aunque no se mueSlra, las celulns de In cresln neural prolifcran rapidamcnle n In vez que migran.

ra 19-22). Esle lipo de proceso requiere. en primer lugar. de algljn mecanismo que dirija las ~Iulas hasla su deslino final, como la secreci6n de una molecula soluble que alraiga a las celulas que migran (por qllimio/axis) 0 extendiendo moleculas adhesivas en la matriz e.xtracelular 0 sobre la superficie de determinadas ~Iulas. guiando las celulas migradoras a 10 largo de vias definidas (mediante orientaci611 de ula). Cuando una ct~:Iula migraloria alcanza su destino, puede reconocer OlTOS tipos celulares apropiados y asociarse con ellos formando un lejido.

celulu de la / Cfella neural

',,00 I

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MIGRACION CfLUlAR SEGUIOADE AGREGACI6N

Las celuJas de vertebrados disociadas pueden reagregarse en tejidos organizados mediante mecanismos de adhesi6n selectiva celula-celuJa l2 A diferenda de los tejidos adultos de vertebrados. diffciles de disociar, los lejidos

embrionarios son fticiles de disociar mediante tratamiento con bajas concenlraciones de enzimas proteollticas. tales como la tripsina. combinando en ocasiones este tratamiento con el secueslro del Caz, y de Mg'!' extracelulares median Ie un quelante cati6n-divalente (como el EDTA). Estos re<Jctivos desorganizan las interacciones proteic<Js <muchas de las cuales son dependienles de calioncs di· valentes) que mantienen unidas las celulas. Es destacable que a mcnudo estos disociados celulares se reasocian ill vitro formando eSlrucluras que se asemejan aI lejido original. Tales caracterfsticas sugieren que la estruc(ura lisular no es propiamcnte un producto esttilico sino que se mantiene ac(ivamente y se estahiliza por un sistema de alinidades entre las propias celulas 0 entre cstas y la malriz extracelular. Por 10 talllo. el esludio de la reagregaci6n en cultivo de cellilas disodadas puede proporcionar una base para el estudio del papel que juega la adhesi6n de las celulas con otras celulas 0 con la matriz en la conslituci6n y el mantenimiento de la organizad6n de los lejidos en el organislllo. Las cxperiencias rcalizadas en cultivos cclulares de cclulas de la epidermis proporcionan un ejemplo mllY instruclivo aI respeclo. L..1S cclulas epidermicas, conocidas como qlleratinocitos. se adhieren fllerlemenle unas a OITllS formando una capa pluriestTlllificada que se apoya sobre lIna lamina basal. Los queratinocitos del estralo basal de la epidermis son relativamente indiferenciados, proliferan de forma continua y su progenie accede a los estratos supcriores, cesando la divisi6n celular y diferenciandose tolalmenle (vease Figura 22-21). Sabre un substrato adecuado, los qucratinocitos djsociados mantenidos en cultivo tam· bien proliferan y se difercncian. Si la concentrad6n de Ca2. en el medio de cultivo se mantiene en un nivel bajo. los sislemas de adhesi6n celular dependiellles de Caz, no son operalivos por 10 que las celulas crecen en forma de monocapa en la que se mezclan las celulas en proliferaci6n y las diferenciadas. $i se aumenta la concentrad6n de Caz" la organizaci6n espacial de las relulas se transforma inmediatamente: la monocapa se conviene en un epitelio pluriestraLificado en el que las ctHuJas en proliferaci6n forman una capa basal que se adhiere aI subslra· to. mientras que las celulas en diferenciad6n son segregadas hada las capas su· periores. como se observa en la piel. Esle resultado sugiere que el ordenamjen(o eSlralificado normal de los queratinocitos en funci6n de su estado de diferenciad6n se mantiene por mecanismos de adhesi6n intercelular dependienles de Caz'. Uno de eslos mecanlsmos implica la panicipaci6n de receptores de la matriz exlracelular del tipo de la integrinas. que estudiaremos mtis adelanle; estos Adhesi6n lntcrcelular

dlula sal"lit,

gllnglio. perifericos

1033

c~lulas

embrionarias de retina dlsociadas

••••••• ••••••

-

•• / \

00

000

o

c~lulll8

celulas embrionaries de hfgado disociadas

..••••• : ... • ••• / \ tt 00

000

o

celulas pequei'lo hllp6ticas de retina agregado de marcadas marcadas c~lulas de retina radiactivamente radiactivamente ' - - - - - " ' _ L-,-.-:-...J '----- ----l

pequei'lo agregado de celulas de hfgado '----TT~...J

w o

0

MEZCLA DE C~LULAS MARCADAS RADIACTIVAMENTE Y AGREGADQS CELULARES

receptores no se cncuentran en las celulas epidermicas diferenciadas pero sf en las celulas basales, las cuales utilizan las integrinas para adherirse a la lamina basal. Dtro de los mecanismos implica la presencia de moleculas de adhesi6n celular del tipo de las cadherinas, que tam bien veremos mas adelante. Un ejemplo todavfa mas lIamativo del mismo fen6meno se observa cuando celulas disociadas de dos 6rganos embrionarios de vertebrados, tales como el hfgada y la retina, se mezclan formando artificialmente un agregado: los agregados mixtos, se segregan paulatinamente en funci6n del tejido (6rgano) de origen. Del mismo modo, las celulas disociadas se unen con mayor facilidad a los agregados de sus propios tejidos que a los de otro origen (Figura 19-23). Namralmente han de existir sistemas de reconocimiento intercelular responsables de que las celulas del mismo tejido diferenciado se adhieran preferentemente entre elias; estas preferencias de adhesi6n probablemente son importanles en la eslabilizaci6n de la arquirectura tisular. lCual es la base molecular de esra adhesi6n intercelular selectiva en los ver· lebrados? En la mayorfa de animales pluricelulares actuan dos tipos distintos de molecuJas de adhesi6n interceluJar (CAM, de Cell-Cell Adhesion Molecules), uno de ellos dependiente de Ca 2• y otro independienle de Ca 2., que parecen ser los principales responsables de la adhesi6n intercelular especffica de lejido observada en estadios embrionarios lempranos. Ambas clases de moleculas de adhesi6n fueron identificadas inicialmente generando anlicuerpos contra moleculas de superficie y luego estudiando la capacidad de estos anticuerpos para inhibir la adhesi6n celular en el tubo de ensayo. Los anticuerpos poco comunes que inhibfan la adhesi6n celular fueron utilizados luego para caracterizary aislar las mohkulas de adhesi6n reconocidas por los anticuerpos. 1034

Capftulo 19: Adhesi6n cclular, uniones celulares y matriz extraceluJar

Figura 19-23 Adhesion espedflca de 6rgano de celulas d1sociadas de embriones de vertebrados delemlinada mediante un ensayo radlactivo de agregacl6n celular. La velocidad de adhesi6n celular pucdc ser medida determinando el ntmlero de cl!lulas marcadas radiactivamente que se han unido a los agrcgados celulares a 10 largo deltiempo. La velocidai:l de adhesion es mayor enlre cl!lulas del misrno tipo. En una modificacion habitual de cste ensayo, las celulas marcadas con un Ugando fluorescentc 0 radiaclivo se unen a tina monocapa de celulas en cultivo.

Las cadherinas median la uni6n celula-celula dependiente de Caz. en los vertebrados' 3 Como hemos indicado aJ tratar de las uniones intercelulares. las cadherinas son las responsables de la adhesi6n celular dependiente de Ca2. en los tejidos de vcr· tebrados. Las Ires primeras cadherinas que se descubrieron se denominaron Ie· niendo en cuenm los principales lejidos en los que se enconlraron: asf la cadhe· rina Ese halla en muchos lipos de celulas epiteliales. la cadllerina N en celuJas ncrviosas, musculares y del cristaJino; y finaJmente. la cndlrerina P se localiza en celulas placcntarias y cpidennicas. Todas esras moltkulas pueden ser detectadas de manera lransiloria en OlrOS tejidos duranle su desarrollo. Ademas. continuamente se eslan descubriendo nuevos tipos de cadherinas; aClualmenle se conocen por 10 menos una docena de elias. Parece que practicamente todas las celulas de vertehrados expresan L1na 0 mtis cadherinas, cada una de las cuales esHi codificada por un gen distinto, siendo In expresi6n de cada grupo concrelo una caraclerfsticas del tipo celular. Experimentos in vitro e ill villO han demoslrado que las cadherillas son las principaJes moleculas de adhesi6n que manlienen las ~Iulas unidas entre sf durante los primeros estadios embrionarios. In vitro la liberaci6n de Caz. extraceluJar 0 el lratamiento con anticuerpos anli-cadherina desmontan el tejido, y si la adhesi6n mediada por la cadherina pennanece intacta, los anticuerpos contra otras moJeculas de adhesi6n no tienen efeclo: ill VillO, las mutaciones que inaclivan la funci6n de las cadherinas provocan un fracaso en el desarrollo del embri6n. La mayor parte de las cadherinas son glucoprolefnas con un solo dominic lransmembrana, conslituidas por unos 700-750 residuos de aminoacido. La vo· luminosa fracci6n extracelular de la cadena polipeptfdica esut nonnaJmente piegada en 5 dominios. cada uno de los cuales contiene alrededor de 100 residuos de aminoacidos; 4 de eslos dominios son hom610gos entre sf y probablememe conlienen lugares de uni6n al Caz. (Figura 19-24). En ausencia de Ca 2 'Ias cadhe· rinas surren un imponantc cambio conformacional, como resultado del cual son degradadas ntpidamente por enzimas proleolfticas. EI significado biol6gico de la notable dependencia de la funci6n proteica de la cadherina respecto aI Ca 2• se desconoce. La cadherlna E (tanlbien denominada uuomorlllina) es la cadherina mejor caracrerizada. Ya la enconlramos al estudiar las uniones celulares puesto que habituaJmente se concentra en las bcmdas de adllesioll de los tejidos epiteliales maduros donde conecl'a los filamentos de actina de los citoesquelelos conicales de las celulas adyacemes mllntenicndolas unidas. Tambien es la primera cadherina que se expresa durante el desarrollo de los mamfferos. COtllribuyendo a la cOrrlpacraciotl. un importante cambio morfol6gico que Liene lugar en el estadio celular de 8 celuJas del desarrollo embrionario del ral6n. Duranle la compactaci6n. las celulas lodavfa unidas de manera muy laxa, denominadas blasl6meros, se van agregando de fonna muy compacla uniendose mediante uniones inlercelulares. Los anticuerpos dirigidos contra la cadherina E bloquean la compactaci6n blastomerica mientras que los anticuerpos contra Olras moleculas de la superficie celular no la bloquean. Parece probable que las cadherinas lambicn jueguen un importante papel en los Wlimos esladios del desarroUo de los vertebrados, ya que su presencia 0 ausencia estan correlacionadas con los principales procesos morfogeneticos implicados en la segregaci6n tisular. As£ por ejemplo. ulla vez formado el tubo neu· ral e independi2.ado del ccloderma. las celuJas del neuroepilelio en desarroUo pierden la cadherina E y expresan por el contrario la cadherina N. mientras que las ~Iulas de la capa cctodermica continuan expresando la cadherina E (Figura 19-25). Adem
100m

FIgura 19-24 D1bujoesquemlhlcode wla tfplca mol&:u1a de clldherlna. La

regi6n eXlraceluiar de la protefna presenta cinco dominios hom6logos. Ires de los cuales contienen lugares de uni6n paraelQr·. Secreequeel

dominio extrareIular rna<; lejano a la membrana media la adhesi6n lntercelular; 13 secuencia Iiis-Ala-Vai presenle en este dominio parece estar impJicada en eSfa uni6n ya que los I~Plidos que Ilenen esta secuencia inhiben la adhesi6n mediada por la cadherina La regi6n ciloplasmatica interacn1a con el ciloesquelclo de actina por medio de varias proletnas de uni6n inuaceluJar. que incluyen tres proteinas del tipo de las caleninas. La (l·calenina 1.'Sla eslructuralmente relacionada con la vinculina. X rcpresenta las prolefmls de uni6n no caracterizadas implicadas en el acoplamienlo de las cadherinas a los r.Jamentos de actina.

1035

de un mismo estrato celular presentan patrones distintos de expresi6n de cadherinas cuando se separan unos de otros, 10 cual sugiere que los cambios en la expresi6n de la ca.dherina estan implicados en los procesos de separaci6n celulares.

Las cadherinas median la adhesi6n celuJa-celuJa a traves de un mecanismo homofflico '-4 i.De que manera las moleculas de adhesi6n intercelular, tales como las cadherinas, median la uni6n celular? En la Figura 19~26 se i1ustran tres posibilidades: (I) las moleculas de una celula pueden unirse a otras moleculas del mismo tipo de celulas adyacemes (las uniones en este caso se denomjnan homofllicns); (2) las moleculas de una celula pueden unirse a moleculas de diferenle lipo de celuJas adyacentes (en este caso las uniones se denominan heterofllicas); y (3) los receptares de superficie celular de celulas adyacenles pueden eslar unidos entre sf a traves de moleculas secretadas de enlace l]lultivalente. Estos tres mecanismos se han enconlrado en ani males. Sin embargo, las cadherinas normalmente utilizan un mecanismo homofilico. Esto se ha demostrado utilizando una Ifllea celular dc fibroblastos dellominada cell/fas L, que no expresan cadhcrina y que no se linen unas a otras celulas. Cuando las cclulas L se transfectan can DNA que codifica cadherina E, se adhieren entre sf por meca.nismos dependienle de Ca 2., y esta adhesi6n se inhibe por anticuerpos contra cadherina E. Como las celulas transfectadas no se unen a las celulas L no transfecladas, la cadherina E puede unir dos celulas enne sf pero mediante la interacci6n de moleculas de cadherina E de ambas celulas_ Si se mezclan celuJas L que expresan ca.dherinas dislintas, las celulas se scparan y se agregan por separado, 10 cual indica. que las cadhcrinas se unen preferentemente a las de su mismo tipo. Una segregaci6n similar a esta ocurre si las celulas L expresan cantidades distintas de la misma cadherina. Por 10 tanto, pareee probable que las diferencias tanto cuaLitativas como cuantitativas en la expresi6n de las cadherinas deben jugar un papel crucial en la fonnaci6n de los tejidosi seguramente las diferencias en las cadherinas tambien explican la mayor!a de los experimemos cl:isicos de adhesi6n especffica tanto en 618anos como en tejidos in vitro. Muchas cadherinas, tales como las E, las N, y las P, actuan como protefnas de uni6n transmembrana mediando las interacciones entre los filamentos de actina del citoesqueleto de las eelulas que estan unidas. Son. como hemos visto, las protefnas de adhesi6n en torno a las cuales se eonstruyen las uniones adhercntes iniereellilares. Un dominio citoplasmatico altamenle conservado de estas cadherinas interactua con el c6rwx de actina por medio de tres protefnas de uni6n intracelular denominadas cateninus (vease Figura 19-24). Esta interacci6n es necesaria para que se produzca. adhesi6n intercelular: las moleculas de cadherina E que eareeen de dominio citoplasmatieo son inca paces de mantener unidas las eelulas. Las cadherinas que se 10caJizan en los desmosomas no interactuan con flIamentos de actina sino con fiJamentos intermedios; su dominio citoplasmatico es distinto y se unen a grupos distintos de prote!nas de uni6n, las cuales a su vez se unen a filamentos intermedios. Las cadherinas no son las unieas protefnas que median la adhesi6n mlereelular dependiente de Cal,: algullas integrinas tambien pueden unir celulas entre

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Figura 19-25 Distribucl6n de las cadherlnas E y N durante el desarrollo del sistema nervloso. Inmunofluorescenda de una secd6n transversal de un embri6n de polio mostrando el tubo neural en desarrollo marcado con anticuerpos COnlra la cadherina E (Ao) contr.lla cadherina N (B). Observese que las celuJas del ectodemlO dorsal 5610 expresan la cadherina E mientras que las relulas dellUbo neuralla han perdido, y han 'adquirido la cadherina N. (Cortesra de Kohel Hana y Masatoshl Takelchi.)

Flsu,. 19-26 Tees mecanismos

UNION HOMOFILICA

1036

UNION HETEROfILlCA

UNION A TRAVES DE UNA MOLECULA DE UNION EXTRACELULAR

Capftulo 19 : Adhesi6n cclular, unlones celulares y matrlz extracelular

mediante los cuaJes las mol&:ulas de supcrfkle celular pueden medlar la adhesl6n Lnlercelular. Aunque IOdos eslOS mecanismos pueden actuar en animales, el que depende de una mol&:uJa de uni6n eXtr.lcelular parece ser el menos cornun.

sf mediante interacciones heterofflicas con ot'faS protefnas de superficie celular, si bien la mayorfa de las integrinas median la uni6n de las celulas a la matriz extracelular, como estudiaremos nuis adelante. Ademas, una familia de prolefnas de uni6n a carbohidratos de superficie celular (las lecrinas) denominadas selcct1nas actuan en un gran numero de adhesiones intercelulares transitorias en la circulaci6n sangufnea, permitiendo por ejemplo a los gl6bulos blancos unirse transitoriamente a las celulas endoteliales de vasos sangufneos pequefios yasf migrar desde la sangre hacia tejidos y zonas inllamadas. Las selectinas conlienen un gran dominio de la lectina allamente conservado que en presencia de Ca 2• se une a un oligosacarido especffico de otra celula -otro ejemplo de adhesi6n intercelular heterofllica (vease Figura 10-42). Como en el Capftulo 10 ya se trata de las selectinas, no se consideraran aquf en mayor profundidad. Mas adelante discutiremos c6mo las celulas pueden regular la actividad adhesiva de sus integrinas. De una forma similar parece probable que por 10 menos algunas celulas pueden regular la actividad adhesiva de sus cadherinas, aunque se conoce mucho menos acerca de la regulaci6n de las cadherinas que acerca de la regulaci6n de las integrinas. Esta regulaci6n puede ser imponanle para los reordenamientos celulares que suceden en los epitelios cuando estas celulas cambian de forma y se organizan durante el desarrollo animal.

La adhesi6n intercelular independiente de CaZ+ esta mediada principalmente par unas protefnas pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas '5 Las moleculas responsables de la adhesi6n celula·celula independiente de Ca 2 • pertenecen principalmenre a la anligua y gran superfamilia de las inmunoglobulinas (lg), denominadas asf porque poseen uno 0 mas dominios de tipo Ig que son caracterfsticos de las moleculas de anticuerpo (se discute en el Capftulo 23). EI ejemplo mejor estudiado es la molecula de adhesl6n de las celulas neuraJes (N-CAM de Neural Cell Adhesion Molecule), la cual se expresa en varios tipos celulares incluyendo much as celulas nerviosas. Es la mas comun de las adhesiones intercelulares independientes de Ca 2 • en los vertebrados y, como las cadherinas, parece que une a las celulas entre sf mediante una inleracci6n homofllica (entre mollkulas N-CAM de celulas adyacentes). Sin embargo algunas protefnas de adhesi6n intercelular semejantes a las Ig utilizan un mecanismo heterofOico; algunas de elias, denominadas moleClilas de adhesi6n intercelular (lCAM), se expresan en celulas endoteliales aClivadas y se unen a las integrinas en la superficie de los gl6bulos blancos, colaborando asf en alfapar a las celulas sangufneas en los lugares de inflamaci6n. Existen por 10 menos 20 fonnas de N-CAM. A diferencia de las cadherinas, cada una de las cuales esta codificada por un gen diferente, los distintos mRNA que codifican las N-CAM provienen de la expresi6n alternativa de un transcrito de RNA codificado por un solo gen. En todas las formas de N-CAM el gran dominio extracelular de la cadena polipeptidica esta plegada en 5 dominios hom610gos a los de las inmunoglobulinas. La mayor.a de las N-CAM son prolefnas transmembrana de un solo paso, con dominios intracelulares de lamafio variable que parecen estar implicados en la sei'lalizaci6n celular 0 en la uni6n al citoesqueleto. Exisle una forma de N·CAM que no atraviesa la bicapa lipidica y que se une a la membrana plasmlilica mediante un enlace covalente al glucasilfosfatidilinositol (GPO, mientras que otras formas son secretadas y pueden ser incorporadas a la matriz extracelular (Figura 19-27). La glucosilaci6n de las N-CAM proporcionan mas diferencias: algunas form as lienen una gran cantidad de acido sialico (en la inusual forma de varias cadenas, cada una de las cuales contiene cientos de residuos repetidos de acido sialico) mientras que otras contienen una cantidad mucho menor. En virtud de su carga negativa, las largas cadenas de acido sialico impiden la adhesi6n celular, modificando de ese modo la funci6n adhesiva de las N-CAM. En efecto, es posible que en algunos casos las N-CAM que estan fuertemente cargadas con acido sialico puedan Adhcsl6n intercelular

10nm

Figura 19-27 D1bujoesquematico mostrando cuatro ronnas de N-CAM. En cada caso, la regi6n extracelular de cada cadena poHpeplfdica esta plegada en cinco dominios semejantes a los de las inmunoglobulinas (y uno 0 dos mas dominios denominados fibronectina de tipo II se repiten por causas que adararemos mas adelante). Los enlaces disulfuro (mostrados en raja) conectan las tenninaciones de cada bude. formando cada uno de los dominios semejantes a 19. 1037

impedir la adhesi6n mas que provocarla. Por ejemplo, en algunas neuronas la presencia de estas cadenas de licido polisialico fomentan el crccimiento de unas prolongaciones, probablemente facilitando que las puntas de estas prolongaciones se a1ejcn de las c~lulas que van encontrando y can las que podrfan entrar en contaclo. Existen evidencias subslanciales de que las N-CAM y sus respectivos hom6logos semejantes a Ig juegan un papel imponante en el desarrollo de los vertebrados. Cuando se utilizan anticuerpos contra cualquiera de las N-CAM 0 contra Olms mol&:olas de adhesi6n inlercelular neural de Lipo Ig denominadas Ll, y se inyeclan a 10 largo de la zona de crecimiento desde la retina hacia el cerebro, se altera el patron normal de crecimicnlo de las prolongaciones nerviosas. Cuando se uLilizan en cultivos celulares eSlos anticuerpos inhiben la lendencia de las prolongaciones en desarrollo de las c~lulas nerviosas a adherirse entre sf formando haces (fasdculos). AI igual que las cadherinas N, las N-CAM se expresan en grandes cantidades en las c~lulas dellubo neural en desarrollo; pero cuando las c~lulas de la cresta neural se disocian del tubo neural e inician la migraci6n, pierden las N-CAM recxprestindolas de nuevo cuando se agrcgan formando un ganglio nervioso (vease Figura 19·22). Como en el caso de las cadherinas, las NCAM se expresan tambien rransitoriamente durante eSladios crfticos del desarrollo de muchos tejidos no neuronalcs. A pcsar de que las cadherinas y los miembros de la familia de las Ig se expresan a menudo en las mismas relulas, las adhesiones mediadas por las cadherinas son mucho mas fuertes y casi con loda seguridad son las principales responsables de manlener la uni6n entre relulas, la segregaci6n de colectivos celulares en lejidos individuales y mantener la integridad del tejido. Parece que las N-CAM y olros miembros de la familia de las Ig contribuyen mas a la regulaci6n fina de las interacciones adhesivas durante el desarrollo y la regcneraci6n. Asr, la inyecci6n de mRNA que codifica cadherina N a huevos de rana fecundado provoca una sobrexpresi6n de cadherina N en lugares donde normalmente no sc expresa y conduce a una enorme disrupci6n de la estructura normal dellejido. Par el contrario. el mismo experimento realizado con mRNA que codifica N-CAM provoca una menor a1teraci6n en el desarrollo, a pesar de que parece que las N-CAM se sobrexpresan en muchas localizaciones anormales. La prueba mas crhica para conocer el papel de una prolefna en un proceso biol6gico concreto no consisle en sobrexpresarla sino en suprimir su producci6n modificando el gen correspondiente. Aunque aClualmente esto puede realizarse en algunos venebrados, es mas facil hacerlo en invertebrados manipulables geneticamente, tales como Drosophila 0 el nem
Muchos tipos de mol~ulas de superficie celular actuan paraJelamente mediando la adhesi6n selectiva c~lula-c~lula y c~lula-matrizI6 Todos los estudios realizados nivel de biologfa celular. bioqufmico y morfol6gico indican que cada celula utiliza diversos mecanismos moleculares para adherirse 1038

Capftulo 19 :Adhesion celular, uniones cclulares y malriz extracelular

Figura 19-28 Resumen de los meca.nismos de adheskSn, lanto los

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MECANISMOS DE' ACHE

lanto a olras celulas como a la maIm exlracelular. Algunos de eSlos mecanismos implican uniones celulares bien eslructuradas, mientras que otros no (Figura 19-28). Asr, de la misma manera que cada celula de un animal pluricelular conliene un conjunto de reeeptores de superficie que Ie penni ten responder espeerficamente a un conjunlo complemenlario de senales qufmicas solubles tales como hormonas y factores de creeimiemo, esta misma celula integrada en un tejido t'ambien puede disponer de una combinaci6n (0 concentraci6n) particular de receptores de superficie celuJar (moleculas de adhesi6n celularl que la capacitan para unirse de manera caracterfstica a olras celulas y ala matriz extracelular. Asimismo, de la misma fonna en que los receptores para senates qu[micas solubles generan senates intracelulares que alteran el componamiento de las celulas, tambien pueden allerarse las molecuJas de adhesi6n celular. a pesar de que en este caso los meeanismos de sefializaci6n son menos conocidos. Adiferencia de los receptores para senates qufmicas solubles, que se unen a sus ligandos especfficos con una alta afinidad, los receplores que se unen a las moleculas de la superficie celular 0 a componenles de la matriz eXlracelular 10 hacen generalmente con una baja afinidad. En consecuencia, eSlos receptores consiguen incrementar enormemente la fuerza de uni6n mediante la uni6n simuh<1nea de un gran numero de receptores a sus ligandos situados en oua celula 0 en la matriz adyacente. A este principio se Ie podrfa denominar Mprincipio del Velcro Hemos visto, sin embargo, que la interacci6n de los dominios de uni6n extracelulares de eslas moleculas de superficie celular no es suficiente para asegurar la adhesi6n celular: por 10 menos en el case de las cadherinas. y como veremos en el de las integrinas, las moleculas de adhesi6n tambien han de unirse (vfa acoplarniento proleico) aJ ciloesqueleto cortical del interior de la celula. Parece que el cilocsqueleto faciJila y estabiliza la agrupaci6n lateral de las moleculas de adhesi6n, facilitando la uni6n de multiples puntos, 10 cual tam·

que tmpUcan comple}os de unJ6n como los que no, mecUante los cuales las <:6u1as Ie adh.Ieren una a olnls y a la matrhexlJ'acelular.los mecanismos de uni6n se muestran en cclulas epitcliales, mientras que los que no lmplican uni6n, se muestran en cclulas no epiteliales. Una interacci6n adhesiva se define como aqueUa que mediante microscopia electronics convencional y/o criofractura puede ser observada como una regi6n de contaeto especiaJizada. Ob~rvese que las integrinas y las cadherinas estan implicadas tanto en interacciones de uni6n como en interacdones de no-uni6n cclulacclula (cadherinas) y cclula-matriz (integrinas). Generalmente las cadherinas median interacciones de tipo homomico, mientras que las integrinas median interacciones de tipo heteromico (ve85e Figura 19-26). Tanto las cadherinas como las integrinas aetuan como elementos de uni6n transmembrana, y su funci6n depende de caliones divaJentes extracelulares; por esta raz6n, la mayorfa de contactos ci'!lula-celula y cClula-matriz son dependientes de cationes dlvalentes. Las selectinas e inlegrinas tambien pueden aClUar como moleculas de adhesi6n heteromica celula-dlula: las selectinas se onen a carbohidratos, mientras que las integrinas unidas a celulas se unen a miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Las inlegrinas y los proteoglucanos integraJes de membrana que median la adhesl6n mediante complejos que no son de uni6n a la matriz extracelular senin explicados m<1s adelante.

M

•

AdhesiOn Intercelular

1039

SIN UNIONAl CITOESOUElETO

NO AFECTA A LACElULA

CON UNIONAl crrOESOUELETO

ADHESION CElULAR

Figura 19-29 Importancla del c1loesqueleto en la adhesl6n celular. Esle dibujo i1ustra la rawn par la cual las mollkulas de adhesi6n celular han de unirse al citoesquelelo para poder mediar una fuerte adhesi6n celulacelula 0 celula-matriz. En realidad, muchas de las prolefnas de adhesi6n pueden ser expulsadas de la celula junlo con fragmentos de membrana adheridos. ylos agujeros dejados en la membrana se vuel\'en a cerrar al inSlante.

bien es necesario para permitir que la celula adherida ejerza tracd6n sobre la celula 0 la matrtz adyacenles (0 viceversal (Figura 19-29l. Asf pues. es la suma de los opos espedficos de moleculas de adhesi6n interceluJar y de receptores de matriz presenles en las dos c~lulas.la concentrad6n de estas mol&ulas, las uniones dloesqueleucas y la distribud6n sobre la superfide celuJar, 10 que delermina la aflnidad 10lal con 13 que dos celuJas se uniran entre elias 0 con la malrtz.

Los contactos no adhesivos pueden ser los iniciadores de fen6menos de adhesi6n intercelular especfficos de tejido que posteriormente son orientados y estabilizados par contactos de uni6n l6 iCuc1! de los diversos tipos de uniones intercelulares que se han discutido en este capftulo. si es que puede atribuirse a alguno de elIos, esta implicado en la migraci6n y el reconocimielltO celulares que tienen lugar durante los procesos de formaci6n de tejidos y 6rgallos1 Una de las estrategias utilizadas para responder a eSla pregunta es la observaci6n mediante el microscopio electr6nico de los conlaCIOS establecidos entre celulas adyacenles cuando esnin migrando unas sabre otras en embrlones en desarrollo 0 en tejidos adultos en proceso de reparaci6n despues de una agresi6n mec<1nica. Estos estudios muestran que, a excepci6n de la reorganizaci6n celular dentro de un epitelio, eslos contactos generalmente no implican la formaci6n de uniones intercelulares organizadas. Por el contra rio, las memhranas plasm,hicas que interactuan, a menudo se situan muy pr6ximas y siguen trayecms paralelos dejando un espacio de tan s610 10-20 nm entre elias. Como varias protefnas transmembrana conocidas sobresalen de la membrana plasmlitica m.1s de 10-20 nm, dos protefnas de la superficie celular pueden interactuar entre sf a traves de esle espacio de 10-20 nm mediando la adhesi6n entre las celuJas. Este lipo de contaclo no incluido en los tipos de uni6n celular. puede ser 6ptimo para la locomoci6n celular -suflcientemente (uertes para soportar la tracci6n pero no 10 bastanle como para inmoviJizar la celuJa. Entre las celuJas embrionarias en migraci6n generalmente no se observan cOnt'aclos de uni6n (uniones adherentes. desmosomas. hemidesmosomas y. en insectos, urtiones sepladasl. por 10 que la fonnaci6n de tales uniones puede conSlituir un mecanismo importanle para inmovilizar las celulas en un lejido organizado cuando se ha formado. Ademas. se cree que la formaci6n de uniones interceluJares en el epilelio es necesaria para conseguir fuena mecanica y para ayudar a polarizar y orientar las celuJas constituyentes. Una hip6lesis razonable se basa en que las protefnas de adhesi6n no relacionadas con la uni6n celular iniciarfan la agregaci6n especffica en los tejidos, la cual seria entonces orientada 1040

Capflulo 19 :Adhesi6n celular. unlones celulares y matriz extracelular

.

y estabilizada median Ie el conjunto de uniones intercelulares. Muchas de las proleinas transmembrana implicadas pueden difundir en el plano de la membrana plasm~hica, por 10 que pueden acumularse en los lugares de contacto celula-cclula 0 cclula-matriz y par tanto ser utilizadas como adhesiones de uni6n 0 no de uni6n. Se ha dcmoslrado que eSIO sucede para el caso de algunas inlcgrinas y cadherinas, las cuales pueden intervenir en la adhesi6n celular inicial. para posleriormente pasar a ser parle integral de las uniones celulares. Se esla caracterizando un numero cada vez mayor de amicuerpos monoclonales y de fragmentos peptfdicos. cada uno de los cuales bloquea un solo tipo de moleculas de adhesi6n inlercelular a de receplOres de matriz -y a medida que los genes que codifican eslas proleinas de superficie celular empiecen a eSlar disponibles para la manipulaci6n en cultivos celulares yen animales de experimentaci6n- sera posible inactivar los diversos Iipos de prote(nas de adhesi6n intercelular y los receplores de matriz, individualmente y en diferenles combinaciones, para descifrar las bases de reconocimienlo y de uni6n que panicipan en la monogenesis de tejidos complejos.

Resumen Las dluIns disociadm a partir de diverun tejidos embrlotUJrlos de vertebrados

~

reasocian preferentemente con dildas del mismo orlge" tislllnr CIt/milo ~ cult/,x", conjlmtamente. En los vertebmdos estos sistemas de recotrocimiento especfficos de tejido estdtr medlados prltrdpalmente por ,mafamilia de prote£nas de ad/resl6" Intercellliar depe,ulletrtes de Ca" de'lOminadas cadllerltras, qlle mmlrie"e" Ins dllllas "nidas por Ima illteracci6n homo/Uiea entre prote£nas tmnsmembra"a de tipo c:adlleritra, de dlldas adyaamtes. Para nrallte"er Ins dlulas 'midas, Ins cadl,erl,1lU llan de estnr IlnldLu al citoesqueleto cortical. La mayoria de las dlllias animates lamblin presentan sistemas de OO/,esi6" interc:elldar i"depemlie"tes de Ca" que principalme'lle perleneam a la SIII1erfamilia de Ins I,mllmoglobldinas, incluye"do molkllias de adl,esi6" de dlllias nervioSlU como las N·CAM. Un solo tipo c:ellliar pllede utiliznr mdltiples meamismos molecllinres para atillerlrse a otras d/ulas (y ala matru f!Xtrac:eI,darj, por 10 que la especific:idad de la adl,esM" intercelular observada e" el desarrollo embrlotwrio Ira de ser el resllitado de la illlegmc:i6" de unrios sistemas de adhesl6" di/erentes, algunos de los c,udes estd" asociados con uniom~s eel,dares eSIJeclalizntIns, mientras que ell olros no 10 esld".

La matriz extracelular de los animales 17 Los tejidos no est;ill formados unicamente par celulas. Una buena pane de su volumcn 10 constilllye el espacio extracelll[ar, el cual esta ocupado por una intrincada red macromolecular que constituyen la matriz extracelular (Figura 1930). La malriz estti compuesla por polisacaridos y prolefnas muy divcrsos, secrelados localmenre y ensamblados en una red compleja en intima asociaci6n con la superficie celular. Si la discusi6n de las uniones celulares la hemos reaUzado fundamentalmente en el contexto de los tejidos epiteliales, la correspondienle 3 la matriz sc ccntrarti en el tejido conjunlivo (Figura 19-31). En este lejido. la matriz es mas abundanlc que las c~lulas, rodeandolas complelamente y determinando las propiedades ffsicas dcl lejido. Los Icjidos conjunlivos constituyen el esqueleto arquilecl6nico del cuerpo de los vencbrados. pero su canlidad presente en los diferentes 6rganos varia considerablemente: desde la piel y el hue· so, en los que son los componentes mayorilarios, hasta el cerebra y 13 medula espinal, en los que unicamente son constituyentes minorilarios. Las variaciones en cuanto a la panicipaci6n relaliva de los diferentes tipos de macromoleculas de la matriz asf como los patranes de organlzaci6n de estas macromoleculas en la matriz extracelular dan lugar a una sorprendente diversi· dad de (ormas, cada una de las cuales esta altameme adaplada a los requeri· mientos funcionales de cada lejido en particular. La matriz puede calcificarse. La

maIm extracelular de los anlmaJes

Flgora 19-30 ee:lulas rodeadas por espaclos lIenos de matrlz

exlracelular. las celulas panlculares moslradas en esla electronmicrografia

a bajo aumeDlO penenecen aI esbozo de una extremidad de polio. Las

celulas aun no presentan sus

caraeteristicas especializadas. (Cortes{a de Cheryll Tickle.)

1041

libras de col'genll

l

,8~

Figura 19-31 TejidoconJuntivo subyacentc a un epltello celuJar. Esui constituldo en su mayor pane por una matriz extracelular que es secretada por los fibroblastos.

o

....__ - ribra elistice

celul. ceb&dll glucosam,nogluc.na.. proleogJuc.no. V glucoproteinas

~

2

J

formando cstructuras duras como en el hueso y el diente, ser transparente como en el caso de la c6rnea 0 adoptar formas semejantes a tensorcs, las cualcs dan a los lendoncs su enorme resiSlcncia a la Iracci6n. En la interfasc cntre un epilclio y un tcjido conjunlivo, la matriz forma una lamina basal. cstructura eXlremada· mente delgada pero que al parecer juega un importante papel en el control del componamiento celular. Aunque en esta secci6n nos centraremos en la matriz cxtracelular de los venebrados. OIrOS organismos fabrican una gran call1idad de materiales relacionados. unicos e imeresames. como las paredes celulares de las bacterias, las cutfculas de los gusanos e inseetos. las conchas de los moluscos y. como discutiremos mAs adelallle. las paredes celulares de los vegetales_ Hasta haec poco se ha considerado que la matriz eXlracelular de los venebrados actuaba principalmeme como un andamio relaLivamente inerte que estabilizaba la estructura fisica de los tejidos. Sin embargo ahara se sabe que la maniz desempefia un papel mucho m~s activo y complejo en 18 regulaci6n del componamiento de las c~lulas que entran en contacto con ella -afectando a su desarrollo. su migraci6n, su proliferaci6n, su fonna y su funci6n. La matriz ex· tracelular presenta una oompleja composici6n molecular que corresponde a estas funciones. Aunque nuestro conocimiento de su organizaci6n todavfa es hagmemario, recientemente 1a caraclerizaci6n de sus componentes principales ha progrcsado rapidamente.

La malriz extracelular esta producida y orientada por las celulas que engloba '7 Las macromoltkulas que conslituyen la matriz extracelular proceden, fonda· mcntalmente, de Wla secreci6n celular de caracter local. Como discutiremos mas adelanle. estas c~lulas tambi~n conlribuyen a modelar la matriz ya que la orientaci6n de su citoesqueleto innuira en la oriemaci6n de la matriz que estas produzcan. En la mayor parte de los diferellles tipos de tejido conjuntivo, estas macromol~cuJas son secretadas fundamental mente por los fibroblastos (Figura 19-32). Sin embargo en algunos lejidos conjuntivos especializados tales como el cartfJago y el hueso, son secretudos por celulas relacionadas con los fibroblastos. que reciben denominaciones especfficas, como colldroblaslos en el caso del car· tfJago y osteoblasros en el hueso. Las dos c1ases principales de macromoleculas que confonnan la matriz son (I) cadenas de polisacaridos del tipo de los glucosamilloglllamos (GAG). los cuales normalmente se hallan unidos a protelnas mediante enlaces covalentes en forma de proteoglucollos. y (2) prolefnas fibrosas. penenecientes ados tipos funcionales: las de caracterfsLicas fundamenlaLmente estructurales (por ejemplo. co/dgena y elasti1la) y las adhesivas (por ejemplo. ft· brOflecti1la y lamillilla). M~s adclante vcremos (en la Figura 19-57) que los componentes de ambas c1ases presentan una gran diversidad de formas y tamaiJ.os. Las moleculas de glucosaminoglucanos y de proteoglucanos forman una ~subs1042

,J

Capftulo 19 : Adhesl6n cclular, unlones celularcs y malrlz CXlracclular

"------' 10~m

Figura 19-32 Electronmicrograffade barrldo de nbroblastos en el tejldo conJuntivo. EI tejido oorresponde a cOrnea de rata. La matriz extracelular que rodea los fibroblastos se compone mayoritarlamente de fibrillas de co!-'gcna (no hay fibras eMsticas en la c6rnea). Las g1ucoprotemas, g1ucosaminoglucanos y protcoglucanos. que nonnalmente forman un gel hidratado que ocupa los inter5ticios de la red fibrosa. son digerldos mediante tratamientos enzim-'ticos y con -'cidos. (De T. Nishida et aI. Invest. Oplltllalmol. Vis. Sci. 29:1887-1890. 1988.)

disacarido repetido

o . . OH o , CH,

HO

o

OH

__ O.-.l:>~'-O

Figura 19-33 Secuencia repetlda de dlsacllrldos de la cadena de un g1ucosamlnoglucano {GAG) de tipo dermatlin sulfato. Estas cadenas est~n constituidas tipicamente por enue 70 y 200 residuos de azucar. Existe una gran densidad de cargas negativas a 10 largo de la cadena debido a la presencia de grupos sulfato y carboxilo.

NH

I

c-o I

CH,

o

o kido iduronioo

o N-acelilgillIKtDSllmine4-suHeto

tancia fundamental", altamente hidratada, que presenta propiedades de gel y en la que est4n embebidas las protefnas fibrosas. EI gel de polisacarido opone rcsistencia a las fuerzas de compresi6n de la matriz, mientras que las fibras de col4gena oponen resistencia a la tracci6n. La fase acuosa del gel de polisac;1rido permite la difusi6n de metabolitos, nutrientes y hormonas entre la sangre y las celulas que conforman los lejidos; las fibras de col;1gena refuerzan y colaboran en la organizaci6n de la matriz. mientras que las de elastina Ie confieren elasticidad. Las protefnas adhesivas son intenned.iarias en el anclaje de las celulas a la matriz: por ejemplo, la fibronectina panicipa en la adhesi6n de fibroblastos y de otras celulas relacionadas a la matriz en el tejido conjuntivo, mientras que la lamin ina favorece la uni6n de las celuJas epiteliales a la lamina basal.

Las cadenas de glucosaminoglucano (GAG) ocupan grandes volumenes, formando geles hidratados' 8 Los glucosaminogJuc8nos (GAG) estan formados por largas cadenas no ramificadas de polisacAridos, compuestas a su vez por unidades repetidas de disac4ridos. Se denominan GAG debido a que en dichos disacaridos, uno de los rcsiduos es siempre un aminoazucar (N-acelilglucosamina 0 N-acetilgalactosamina). En la mayorfa de los casos este aminoazucar se encucnlra sulfatado, siendo el segundo residuo lin ~cido ur6nico (glucur6nico 0 id1lT6nico). Dehido a la presencia de grupos slIlfato 0 carhoxHo en la Illayorfa de los residuos gillcidicos de los glucosaminoglucanos, eslos presentan una gran carga negaliva (Figura 19-33). En funci6n de dichos reSlOs glucfdicos, el tipo de enlace entre elias y el numero y localizaci6n cle los grupos sulfato, se pueden distinguir cuatro grupos prindpales de GAG: (I) dcido hia/tlr6nico, (2) condroirfll sit/faro y dermatfln sulfato, (3)

•

protelna globular IPm 50 000)

colagene (Pm 290 000)

heparfln slI/faro y Ileparilla, (4) qlleratan su/fato.

Las cadenas de polisacaridos no presentan la flexibilidad sufidenle como para plegarse en estructuras globulares y compactas, que, tfpicamente, forman las eadenas polipeptfdicas. Adem<1s, son altamente hidrofilicas. Asf pues, los GAG lienden a adoptar conformaciones muy eXlendidas, oeupando un enorme volumen en relad6n a su masa (Figura 19-34) y formando geles incluso a concentraciones muy bajas. Su alta densidad de earga negativa es la causa de la captad6n de numerosos cationes. tales como el Na-, que debido a su actividad osm6tica, conducen a la aeumulaci6n de grandes volumenes de agua enla matriz. Ello da lugar a una presi6n de hinchamiento 0 turgenda que capadla a la matriz para oponerse a las fuerzas de compresi6n (en contraste can las fibras de colage· na, que se oponen a las fuerzas de tracd6n). Par ejemplo, la matriz canilaginosa que reviste la articulaci6n de la rodilla puede soportar presiones de dentos de atm6sferas gracias a este mecanismo. La cantidad de GAG del tejido conjuntivo no representa, en general, m<1s del 10% en peso del total de las proteinas fibrosas. Sin embargo, debido a que forman geles hidratados y porosos, las cadenas de gJucosaminoglueanos ocupan la La matriz extracelular de los anlmales

kido hieluronico IPm 8" 1lf} I

I

JOOom

FIgura 19-34 D1menslones y vohlmenes relativos ocupados por varias macromolkulas. EI esquema muesua varias protefnas, un grAnulo de g1uc6geno. y una molkula hkJratada de acido hialumnico.

1043

disaelirido rSPfltido

/

CH

CH J

I

C)

Ho~H' ~o ~L ~o o 0

.'

NH

I

c=o

(I H,

01'

0

0

0

g;iQj

8

0

0

HO

.

lieido glueur6nieo

O CH

I

HO

OH

Z

OH N·aeetilglucosamina

practica totalidad del espacio extracelular, constjtuyendo un soporte mecanico para los tejidos y facililando, al mismo tiempo, la difusi6n de moleculas hidrosolubles y la migraci6n celular. La importancia de los GAG se iluslra en enfermedad genetica humana poco habitual en la cual se produce una severa deficiencia de la sfntesis de disacaridos del tipo de los dermatan sulfatos mostrados en la Figura 19-33. Los individuos afectados son enanos, presentan una apariencia de envejecimiento prematuro y tienen defectos generalizados en la piel, articuladones, musculatura y huesos. Sin embargo hay que resaltar que en invertebrados y en vegelales a menudo existe orro tipo de polisacaridos que son los principales constituyentes de la estructura de la matriz extracelular. Asf, en plantas superiores -como veremos mas adelante-- existen cadenas de celulosa (poliglucosa) que estan densamente empaqueladas en formaciones crisralinas a modo de cintas, constituyendo el componente microfibrilar de la pared celular. En insectos, crustaceos y otros artr6podos, la quitina (poli-N-acetilglucosamina) constituye el principal componente del citoesqueleto. La celulosa y la quitina son los biopolimeros mas abundantes de la tierra.

Parece que el acido hialur6nico facilita la migraci6n celular durante la morfogenesis y la reparaci6n de los tejidos 19 El aeldo hlalur6nico (tamhien denominado hialuronato 0 hialuronallo) es el GAG de estIuctura molecular mas sencilla. Consta de una secuencia repetida de hasta 25 000 unidades de disacaridos no sulfatados (Figura 19-35). Se encuentra en proporciones variables en todos los tejidos y fluidos de los animales adult os, siendo especialmenre abundante en las fases embrionarias iniciales. Su simplicidad induce a considerarlo como una forma inicial en la evoluci6n de los GAG, allnqlle su estructura no es la Ifpica de la mayorfa de los GAG. Todos los demas grupos 0) contienen azucares sulfatados, (2) tienden a presenlar ciertos disacaridos diferentes dispuestos en secuencias mas complejas, (3) presentan numerosas cadenas cortas, de menos de 300 residuos gluddicos, y (4) estan unidos covalentemente a prolefnas que forman proteoglucanos. Ademas, mientras que los otros GAG son sintetizados dentro de la celula y liberados por exocitosis, el acido hialur6nico es alargado desde la superficie celular medianle un complejo enzimalico integrado en la membrana plasmatica. Se cree que el acido hialur6nico actua ofreciendo resistencia a las fuerzas compresivas en los tejidos y articulaciones. Tambien tiene una funci6n importame durante el desarrollo emhrionario como "rellenador" de espacio, pudiendo ser utilizado para forzar un cambia en la forma de una estmctura. De manera semejante a la espuma de estireno, el acido hialur6nico puede ser produddo de fonna n1pida y barata: aI hidratarse, una pequefla cantidad se expande y ocupa un gran volumen (vease Figma 19·34). Por ejemplo, el acido hialur6nico sintetiwdo a partir de la cara basal de un epitelio en lamina a menudo se utiliza para crear un espacio libre de celulas dentro del cual las celuJas pueden migrar; esto tiene lugar durante la formaci6n del coraz6n, la c6rnea y algunos otros 6rganos. 1044

Capftulo 19: Adhesi6n cellllar, unlones celulares y matriz extracelular

Figura 19-35 5ecuencla repellda de disacarldos en ell'icldo hlalur6nlco, un GAG relativamenle simple. Estit constituido par una larga cadena de unos 25 000 residuos de azucar. Observese la ausencia de gmpos sulfato.

'/ c-o I

H-C-CH-O

I

H-N

'

'----------------',,'------:---,-----' tetr~ridode

~oleina

uniOn

GAG

cenlral

Cuanclo finaliza la migraci6n celular, el cxceso de adelo hialur6nico es degradado mediante la enzima liiafuronidasa. EI adelo hialur6nico se sintetiza tamhien en

grandes cantidades durante la cicatrizaci6n de las heridas, y tamhien es un constituycnte importante de los fluidos articulares, donde actua como Ull lubrificante. Muchas de las funciones del adelo hialur6nico dependen de proteinas y proleoglucanos que se unen a el especfficameme. a1gunas de las cuales ronnan parte de la marnz exlracelular mienlras que atras son componenles integrales de la superficie celular. Se ha demostrado que algunas de cSlas moltkulas (a ve· ces reJacionadas con las llialadllerinas) presentan dominios hom61ogos de uni6n al adelo hialur6nico Que conrienen un gropo caracterfstico de residuos de aminoacidos cargados posilivamente.

Figura 19·36 Unl6n entre una cadena de GAG y su prote{na central en una molkula de proteogJucano. En primer lugar se cstablece un enlace especifico entre un tetrasaclrido y un residuo de serina. En la mayoria de los casos no esta claro c6mo se selecciona el residuo de serina, pero parece que es mas imponante la conformaci6n local de la proteina que una determlnada secuencia de aminoacidos. El resto de la cadena de GAG, constituida principalmeme par la repetici6n de un disacando, se sinteliza a continuaci6n. ai'ladiendose residuo a residuo. En los cOlldroit{1I sul/alDs, el disacarido esta compuesto I)or acido o-glucur6nico y N-acetil-DgalaclOsamina: ell los lleptm.1/l slIlfatos es o-glucosarnina (0 acido L·idur6nicol y N-acetil-D-glucosamlna; en el quermall slIlfma es D-galaclosa y N·acetil-o.g!ucosamina.

Los proteoglucanos estan compuestos por cadenas de GAG unidas covaJentemente a una prote(na central 20 Excepluando el acido hialur6nico, los demas GAG se encuentran unidos covalenlemenle a una prote(na, consliluyendo los proteoglucanos, los cuales son sinleliz..1.dos par la mayorfa de celulas animales. Como en el casu de casi tOOas las glucoprolefnas, la cadena polipepddica de los protcoglucanos proteina cenfral (core protein) es sintetlzada par ribosomas unidos a membrana, acumulandose en el imerior del rClfculo endoplasmatico rugosa. La uni6n de las cadenas de polisaearido a la proterna ccmral tiene lugar, funclamentalrnente, en el complejo dc Golgi: inicialmente se une un letrasacdrido de uniOll espedfico a un resto de serina de la prolefna central, cl cual aetua como un cebador del crecimiento de la cadena de polisac<1rido; posteriormente se ai'iade, en un s610 paso, un residuo glucidico mediante g1ucosiluansferasas especfficas (Figura 19-36). Mientras pennanece en el complejo de Golgi, se modifican covalentemente sus residuos mediante una serie de reacciones de sulfataci6n que tienen lugar de manera secuencial y coordinada, as! como mediante diversas reacciones de epimerizaci6n. La epimerizaci6n altera la configuraci6n de los substiluyenres alrededor de determinados <1tomos de carbono de la molecula g1ucfdica; la sulfataci6n incrementa mucho la carga negativa de los proteogiucanos. En general, los proteoglucanos se diferencian facilmellle de otras g1ucoprotefnas por la naturaleza, canlidad y organizaci6n de sus cadenas laterales de giucidos: por definici6n, por 10 menos una de las cadenas sencillas de azucares de un prolcoglucano ha de ser un GAG. Las g1ucoprotefnas contienen entre un 1% y un 60% en peso de carbohidralos, fonnando numerosas cadenas de oligosacaridos relativamente conas y ramificadas. Normalmellle la prole(na central de los protcoglucanos es una g1ucoprolema, pero puede contener hasla un 95% en peso de carbohidratos, generalmente en fonna de Wla larga cadena de GAG no ramificada, de unos 80 residuos g1ucfdicos de media. Asf pues, los prmeoglucanos pueden seT

°

La matrlz extracelularde los anll11ales

1045

AGRECANO

DECORINA

(Pm ~ JlIl 10')

tPm ~ 400001

RIBONUClEA$A lPm - 15000)

cedene lelerel de proteine

\~"''''

oligoJedf;oo cone Yfllmir~..............

I

cadena polipepticlice

GAG

lOOnm

mucho mas largos que las g1ucoprotefnas. Por ejemplo, el agrec;a1lO, componente principal del canflago, tiene una masa de alrededor de 3 x 1()6 dahons; est<1 compuesto por mas de 100 cadenas de GAG, aproximadameme una por cada 20 resi· duos de aminoacidos. Sin embargo, muchos proteoglucanos son mucho mas pequenos, leniendo tan s610 de I a 10 cadenas de GAG; la decQr;lIa, por ejemplo, es secrelada por los fibroblastos y tiene una sola cadena de GAG (Figura 19·37).· En principio, los proteoglucanos tienen lIna helerogeneidad potencial casi ilimitacla. La protefna cenlral ticne un peso molecular que oscila entre los 10 000 Y mas de 600 000 daltons y tanto el numero como el tipo de cadenas de GAG que se unen a ella es variable. Ademas el patr6n repetitivo basica de los disacaridos en cada GAG puede ser modificado por un pau6n complejo de grupos sulfalo. La helerogeneidad de estos GAG dificuha la identificaci6n y c1asificaci6n de los proteoglucanos en funci6n de sus azucares. Las secuencias de muchas protemas centrales han sido delerminadas mediante lecnicas de DNA recombinante, observa-ndose que son extremadamente diversas. Aunque Ian 5610 han sido identi· ficadas unas cuantas familias, existe una caracteristica estruclural poco comun que dislingue c1aramente la prolefna central del proteoglucano de otras proteinas, y muchas de elias tienen uno 0 mas dominios que son hom610gos a los enconlrados en otras prole(nas de la matriz eXllacelular 0 de la membrana plasmaliea. Asf, es mejor considerar a los proleoglucanos como un grupo diverso de glucoproteinas altamente g1ucosiladas cuyas funciones dependen lanto por su prOlefna central como por sus cadenas de GAG.

Las cadenas de proteoglucanos pueden regular las actividades de mol~culas secretadas de sefializaci6n 21 Dada la helerogeneidad estrUClUral de los proleoglucanos, parece improbable que su funci6n en la matriz extracelular se vea Iimitada a generar lin espacio hidratado alrededor y enlle las celulas. Por ejemplo, sus cadenas de GAG pueden formar geles de poro y densidad de carga variables. que pueden aClllar como criba selccliva para regular el trMico de moleculas y de celulas en funci6n de su tamailo. su carga 0 ambas casas a la vez. Existen evidencias de que el proleoglucano del tipo heparnn sulfato denominado perleamo tiene esta funci6n en la lcim.ina basal del glomerulo del riMn, la cual fihra las moleculas que pasan a la orina desde la corriente sanguinea (se mscute mtis adelante). Se cree que los proteoglucanos participan fundamenlalmcnle en la seflalizaci6n qufmica enlle las celulas. in vitro se unen a diversas moleculas seoal tales como faclores de crecimienlo proleicos, 10 cual ha permilido suponerque algo parecido puede ocurrir en los tejidos. Tales uniones pueden aumentar 0 disminuir la actividad de eslos faerores. Por ejemplo. el factor de credmiemo fibrobJdstico (FGF, de Fibroblasl Growth Factor), que estimula la proliferaci6n de varios tipos celulares, se une a las cadenas de heparan sulfato de proleoglucanos lanto in vitro como en los propios lejidos. Para algunas celulas esta uni6n parece ser un paso obligado para que el FGF active su receptor de superficie celular (una tirosina quinasa transmembrana, estudiada en el Capftulo 15). En la mayorfa de los casos las moleculas senal se linen a las cadenas de los GAG de los prOleog]ucanos, pero esto no 1046

Capftulo 19 : Adhesi6n celular, unlones celulares y matrlz extracelular

Figura 19-37 EJemplosde proteoglucanos pequenos (decortna) y grandes (agrecano) de III. matrlz eXlracelular. Sc han comparado con una glucoprolefna lipica de secrecl6n (la ribonucleasa B pancre<'ilica). Todos eSl<'in dibujados a escala. La prote(na celHral del agrecano y de la decorina liene cadenas de oligosacaridos y cadenas de GAG, pem no se represcnlan en la figura. EI agrecano esta constilUido tfpicameme por unas 100 cadenas de condroimfn sulfato y unas 30 cadenas de queratan sulfato unidas a una protelna central rica en serina de aproximadamente 3000 aminoacidos.l.a decorina ·decora~ la superficie de las fibrillas de colagena, de ahf su nombre.

siempre sucede asf: la ubicua proteCna reguladora del creeimienlO, el factor de crecim;etllO transfomlante P(7'(;F-P de Transfonning Growth Factor). se une a la proteCna central de varios proteoglucanos de la matriz, incluyendo la deeorina; esta uni6n a la deeorina inhibe la actividad del TGF-p. Los prOleoglucanos tambien se unen y regulan las actividades de otros tipos de protefnas de secreci6n. tales como enzimas proteoUticas (proteasas) e inhibidores de las proteasas. La uni6n a un proteoglucano podrfa controlar la actividad de una proteina de alguna de las siguienles maneras: (I) podrfa inmowizar la prolerna cerca dellugar donde esta se produce. restringiendo asf el alcance de su acci6n; (2) podrla bloquear estericamente la actividad de la protema; (3) podria proporcionar una reserva de proteCna para su Iiberaci6n posterior; (4) podrfa proleger a las protemas de degradaciones proteoliticas. prolongando de este modo su acci6n, y (5) podrfa alterar 0 concentrar la protema para hacer m
Las cadenas de GAG pueden estar altamente organizadas en la matriz extracelular2o• 22 Los GAG y los proteoglucanos se asocian formando enormes complejos polimericos en la matm extracelular. Por ejemplo, las moleculas de agrecatlo, el principal proleoglucano del cartilago, que se muestra en la Figura 19-37. se unen con el
Figura 19-]8 Agregado de agrecanos en el cartOago fetal bovino. (A) E1ectronmicrograffa de un agregado de agrecanos sombreado con platino. Pueden observarse tambien muchas molecuJas libres. (H) Dibujo esquemlitico del agregado de agrcanos gigante mostrado en (A). EsM constiluido por unos 100 mon6meros de agrecano (cada uno de los cuales es como el mOSlrado en la Figura 19-37) unidos de forma no covalcntc a una cadena senciJIa de
1-1 11m ----j

Ilgreglldo. de Il{JfecanoS

_I.

de kido hilllurOnieo

queralilin

.ullato

-:t!;>''--- eondroitln ",llato

IBl

La matrlz extracclu1ar de los an.lma.les

1047

Figura 19-39 ElectronmlcrografCa en la que se observan proteoglucanos de la matriz extracelular de un cartOago de rala. EI tejido rue congelado

fibrilla de col&geoa

0.5 11m

i6nicas u osm6licas. pueden alterar drasticamente SU canfarmaci6n. Asf pues. para poderlas visualizar ill uivo se han lenida que utilizar metados especiales (Figura 19-39).

Los proteoglucanos de superficie celular acruan como correceptores No lodos las prOlcoglucanas son camponentes secretados de la matriz ext raceluJar. Algunos de elias, tales como la serglicillQ. son constituyentes de )05 gninulos de secreci6n. donde intervienen en el empaquetamiento y acumulaci6n de moltkulas de secreci6n. Otros son componentes integrales de las membranas plasmoiticas y tienen su protel'na central insenada a traves de la bicapa lipfdica. a unida a eSla mediante un anclaje de glucosilfosfalidiJinosilol (GPI. de g1y_ casylphosphatidylinositol). Entre los proteoglucanos mejor caracterizados de membrana plasnuitica se encuentran los siTidecollos. los cuales poscen una protefna central que atraviesa la membrana. EI dominio extracelular de este proteoglucano transmembrana tiene un numero variable de cadenas GAG de condroitfn sulfato y heparan sulfata, mientras que su dominio intracelular se cree que interaclua con la actina del citoesquelelo en el c6rtcx celular. Los sindecanos se encuentran en la superficie de tnllchos tipos celulares, incluyendo los fibroblaslos y las celulas epilcliales. donde actuan junto can las integrinas como recepcores para la colagena. la fibronectina. y otras protefnas de la matriz a las cuales se unen. Como ya hemos mencionado anteriormellle, las sindecanos tam bien se unen al faclor dc crecimiento del fibrablaSIO (FCF) presennindola a protefnas receptoras de FCF de In misma celula. De un modo parecido. otro proteoglucano de membrana plasmatica, denominado betaglicallo. se une al factor de crecimienta transformante P {TCF-Pl presentlindolo a sus receptores especfficos. Asf pues, las proleoglucanos de membrana plasmalica actuan como correceptores quc colaboran can prolefnas receptoras de sllperficie celular convcncionales. tanto en la llni6n celular a la matriz extracelular camo iniciando la respuesta de las celulas a algunos factores de crecimiento. Los proteoglucanos descrilOS en eSle capflulo estAn resumidos en la Tabla 19-3.

Las cohigenas son las prote{nas mas abundantes de la matriz extracelular23 Las cohigenas constiluyen una gran familia de protefnas fibrosas que se encuen·

uan en lodos los animales pluricelulares. Son secretadas por las c~luJas dellejido conjuntivo y por otros tipos celuJares. Son los componentes m~s abundanles de la piel y de los huesos. par 10 que son las protefnas mas abundantes en mamfferos. constituyenda el 25% de la masa total de protefna en eSlos animales. EI 1048


rapidamenle a -196"C yfijado y conlraslado en eslas condiciones (metodo denominado de congelacionsllbstirucion), evitando asf el colapso de las cadenas de GAG. Las moleculas de prolcoglucanos pueden obselVarse como una fina red filamentosa que comiene una fibrilla de colagena. las rcgiones mas contrastadas corresponden a las prolefnas cenuales, mienlras que las que mueslran una menor intensidad corresponden a las cadenas de glucosaminoglucanos. (Reproducido de E.B. Hunziker y R.K. Schenk,!. Cell BioI. 98: 2n-282, 1984. con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

Tabla 19-3 Algunos proteoglucanos comunes Peso molecular aproximado ,"po de de la proceCoa cadenasGAG Protcoglucano central Agrec3no

210000

Numero decadenas

GAG

l.Dca.llzad6n

Funclones soporte mecAnico: fonna grandes agregados con el. Acido hialur6nico se tine a TGF-~

oondroitln sulfato + kerau1n sulfato condroitln sulfatol dermatAn sulfato condroilin sulfatol dermatAn sulfalo

-130

cartilago

heparnn sulfato

2-15

superficie celular y matriz amplia distribuci6n en tejidos conjuntivos lAmina basal

Betaglicano

36000

Decorina

40000

Perlecano

600000

Serglicina

20000

condroitfn sulfalOl dermat'an sulfato

10-15

Sindecano I

32 000

condroitfn sulfato + heparan sulfato

1-3

vesfculas de secreci6n en gl6bulos blancos superficie de fibroblaslOs y de celulas epiteliales

se une a fibrillas de colAgena de lipo I Ya TGF-~ eSlruclural y filtrante en la lAmina basal ayuda al empaqllelamiento y almaccnamicnto de moll~cllias de secrcci6n adhesi6n celular; se une a FGF

rasgo mas caracterfstico de las mol~ulas de coJagena es su longitud. rigidez y estructura helicoidal de tres hebras. en la cual tres cadenas polipeptfdicas de colagena. denominadas cadcJlos a. se enrollan sobre sf mismas formando una superh~lice semejante a un rodillo. Las colagenas son muy ricas en prolina y giicina, las cuales son importantes en la formaci6n de la ht!lice de tres hebras. Debido a su anillo, la prolina estabiliza la conformaci6n helicoidal en cada una de las cadenas a, mientras que la glicina se encuentra espaciada regulannente, cada Ires residuos de aminoacido, a 10 largo de la regi6n central de las cadenas a. AI ser el aminoacido mas pequeno (5610 tiene un atomo de hidr6geno como cadena lateral). la glicina favorece el denso empaquetamiento de las tres cadenas helicoidales a fonnando la superlumce de colagena (Figura 19-40). Hasta el momento, se han identificado alrededor de Ullas 25 cadenas a distimas de colagena, cada una de las cuales esta codificada por un gcn diferente. En los diferellles tejidos se expresan divcrsas combinaciones de estos genes. Aunque, en principio, se pueden formar mas de 10 000 lipos de moleculas de colagena de triple helice a partir de las aproximadamentc 25 cadcnas ex, s610 se han identificado 15 tipos de moltkulas de colagena. Los principales tipos de colagena encontrados en el tejido conjuntivo son los tipos I, II, III, Vy Xl, siendo el tipo I el principal de la piel y huesos, y con diferencia el mas abundante. Constituyen las cohigenas nbrllares y presenlan una eSlructura fibrosa que hemos descrilo

Figura 19-40 EsU'uctura tiplc::a de una molocula de colagena. (Al Modelo de

una regi6n de una cadena (l de oolAgena en la que cada aminoacido esla represemado por una esfera. La cadena contiene alrededor de 1000 residuos de aminoAcido, CSlando eslructurada como una helice lev6gira de tres resktuos de aminoacido por vueha, de los que ellercero es una glicina. Por 10 tanlo cada cadena (l esta oonstituida por secuencias Gly-X-Y, donde X e Y pueden ser cualquier aminoAcido (aunque habilualmente X es una prolina e Yuna hidroxiprolina). {BI Modelo de una zona de la molecula de colagena en la que las Ires cadenas (l, eada una de elias representada en un color distinto, eslan enrolladas entre sf dando lugar a una triple helice. La glicina es el unico aminoo.cido pequeno que puede ocupar el eje de 13 triple helice. 5610 se mueslra una pequefia regi6n de la molecula; la molecula entera tiene unos 300 nm de longitud. (Esquema realizado a partir del modelo propuesto par B.1.. Trus.) La matrlz extracelular de los anlmales

1049

Figura 19·41 E1eclrOnmkrognffa de flbroblastos rodeados por nbrlUas de colagena en el teJldo conjuntlvo de la plei de un embrl6n de polio. Las fibrillas, organizadas ell haces orlentados perpendicularmente, son sintelizadas por los fibroblaslos. Estas dlulas contienen un reticula endoplasmstico abundante donde se sintetizan prote{nas de secreci6n tales como la colagcna. (De C. Ploetz, E.I. Zycband, and 0.13. Birk,J. Struct. BioI. 106:73-81,1991.)

como la molecula tfpica de colagena. Una vez secretados al espacio extracelular, estos tipos molcculares se organizan en unos polfmeros ordenados denominados jibriflas de coltfgena, deJgados (entre 10 y 300 nm de diametro), de varios dentos de micr6metros de longilud en lejidos maduros, y bien visibles aJ microscopio electr6nico (Figura 19-41 y vease Figura 19·39j. Las fibriJIas de colage· na se agregan habitualmente formando haces, las cuales puedcn observarse al microscopio electr6nico como fibras de coltfgefla de varios micr6metros de diameno. Los tipos LX YXli son las denominadas coldgellas asociadas a fibrillas, ya que decoran la superfide de las fibrillas de colagena; se cree que unen a las fibrilias entre sf y a otros componentes de la matriz extracelular. Los lipos IV Y VII son las collfgellas formadoras de redes. las moleculas de tipo IV sc unen en una espccie de lamina 0 red que constituye la mayor parle de la lamina basal madura, mientras que las mol&:ulas del tipo VII fonnan dfmeros que se ensamblan fonnando estructuras especializadas denominadas fibras de anclaje, las cuales ayudan a unir la lamina basal del epileHo pluriestratificado aJ tejido conjuntivo subyaccntc y por esta raz6n son especial mente abundanles en la piel. Los tipos de colagena descritos se sislematiz<"lll en la Tabla 19-4. Tabla 19-4 Algunos tipos de colagena y sus propiedades F6nnula molecular

F6nnula polbnerlz.ada

[al (I)Iza.2(I)

fibrilla

hueso, picl, tend6n.ligamentos, c6mea, 6rganos inlernos (suponc el 90% de la colagena del cuerpo)

II

[al(lI)J3

fibrilla

cartllago, disco intervertebral. notocorda, humor vftreo del ojo

III

lal(lll)b

fibrilla

piel,

Tlpo FORMADORAS DE FlBRJUAS (FIBRlIARES)

ASOCIADAS A FIBRJUAS

FORMADQRAS DEREDES

Dlstrlbucl6n en teJldos

vasos sangll[neos, 6rganos inlemos

V

[a I (V) ba.2 (V)

fibrilla (con tipo I)

como para el tipo I

XI

al (Xl)a.2(Xlja3(XJ)

fibrilla (con tipo II)

como para el tipo II

IX

al (LX)a2(IX)a3(lX)

asociaci6n lateral

cartllago

XII

[al(XIIJ!3 con algunas ljbrillas de tipo I

asociaci6n lateral

tend6n, ligamenlos, algunos olms tejidos

IV

lal (IV) 12a.2(TV)

red laminar

lamina basal

VII

[al (VI1))3

fibrillas de anclaje

epitelio escamoso estratificado inferior

NOlese que los tipos I, IV, Vy Xl eslin compueslOs de 2 0 3 tipos de cadenas a, mienuas que los t1pos II, III, VII YXlI esltn compuestos l1nicamente de un solo l.ipo de cadena 0. cada uno. Solamente se mueslIan 9 lipos de oolagenas. pero hasta ahora se han deflnido unos 15 tipos de col
1050

Capftulo 19 : Adhesl6n celular, unJones celulares y matrlz extracelular

La mayorfa de las protefnas que comienen un patr6n repetitivo de aminoacidos han evolucionado por duplicaciones de secuencias de DNA. Las colagenas fibrilares se oribrinan, aparentemente, de esta manera. Los genes que codifican las cadenas a de la mayorfa de estas colagenas son muy largos (por encima de las 44 kilobases de lonbritud) y conLienen unos 50 exones. La mayorfa de los exo· nes tienen 54 nucle6tidos, 0 multiplos de 54, 10 cual sugiere que estas colo'igenas se originan por duplicaciones multiples de un gen inicial que contenfa 54 nu· c1e6tidos y que codificaba exactamente repeticiones de seis Gly·X·Y (vease Figura 19-40).

Los moleculas de coJagena son secretadas con unas extensiones no helicoidales en cada una de las regiones terminalesZ3·2-4 Cada una de las cadenas polipeptfdicas de colagena es sintetizada por los ribosomas unidos a membrana e incorporada a la luz del retfculo endoplasmatico (ER) como grandes precursores, denominados procadenas a. Estos prccursores no s610 poseen en la regi6n amino teoninal el peptido sei'Jai necesario para transportar el polipeptido naciente a traves de la membrana del ER, sino que tambicn presentan otros aminoacidos suplementarios, denominados proplpti· dos, situados en las regiones amino y carboxilo terminales. En la luz del ER determinados residuos de prolina y lisina son hidroxilados para fonnar hidroxiprolina e hidroxilisina respecLivamente, y algunos de los residuos de hidroxilisina son g1ucosilados. A continuaci6n cada procadena ( l se combina con otras dos mediante enlaces de hidr6geno, fonnando la molecula helicoidal de triple hebra, denominada procoldgena. Las foonas secretadas de colagenas fibrilares (pero no los otros tipos de colagena), son convertidas en el espacio extracelular en moMculas decoidgena mediante la Iiberaci6n de los propeptidos (vease Figura 19·43). Los residuos de hidroxilisina e llidroxiprolina (Figura 19-42) raramente se encuentran en otras prolefnas, aunque la hidroxiprolina es abundante en algunas protefnas que se encuentran en la pared celular de vegctales. Parece que en la col<1gena los grupos hidroxilo de estos aminoacidos forman enlaces de hidr6geno entre las cadenas colaborando en la estabilizaci6n de la helice de triple he· bra. As! por ejcmplo, las condiciones que inhiben la hidroxilaci6n de la prolina, tal como una deficlencia de <1cido asc6rbico (vitamina C), tienen graves consecuendas. En el escorbuto, una enfermedad causada por una deficienda de vimmina C en la dieta que era frecuente en marineros hasla el siglo pasado. las procadenas a defcctuosas no pueden formar la triple h~lice, siendo degradadas denlro de la celula. En consecuencia, debido a la perdida progresiva del coh1gena normal preexistcnte en la matriz, los vasos sangufneos adquieren una extremada fragilidad y los dientes van perdiendo su fijad6n. Ello implica que en estos tejidos la degradaci6n y renovaci6n de la colagena son rclativumente rapidas. Sin embargo, en muchos otros tCjidos aduhos, se cree que el rccambio de la co· lagena (asf como el de otras macromoleculas de la matriz extracclular) es muy lento: en el tejido 6seo, por poner un caso extremo, las moleculas de colagena pueden persistir hasta 10 ai'Jos antes de que sean degradadas y reemplazadus. Por el contrario, la mayorfa de las protefnas celulares tienen vidas medias del orden de horas 0 dfas.

de su secreci6n, las mol~culas fibrilares de procolagena son degradadas hasta mol~culas de coJagena, las cuales se organizan en fibrillasZ3. 2-4, 25 Oespu~s

I

Despues de su secrcci6n, los propeptidos de las moleculas de procol<1gena fibri· lar son degradados mediante enzimas proteolfticas especfficas en el exterior celular. Ello convierte las moleculas de procolagena en moleculas de col<1gena. las cuales se asocian en el espacio extracelular formando fibrilJas de oohfgena mucho mayores. Los propeptidos presentan, como mfnimo, dos funciones: (I) din· gen la fonnaci6n intracelular de la triple hebra de las moleculas de colagena; y La matriz extracelular de los animaJes

H

0

I II ····N-C-C···· I I H

o I c···

CH 2

I

CH,

I

H-C-oH

I

CH,

~H0 ,

hidroxili,ma en una proteina

I / N-C

I

\

CH 2

"CH

CH 2

/

I OH

hidroxip.oIina en una proleina

Figura 19·42 Reskluosde hldroxUlslna e hJdroxlprolina. EsIOS

aminoo.cidos modificados son abundantes en la colagena; son sintelizados par enzimas que actl1an despu6 de que la lisina y la prolina se ha)'an incorporado a las moleculas de procolagena.

1051

2. HIDRDXILACIQN DE OETERMINADOS RESIDUOS DE

PRDLINA Y

/ O~

HIN ~~~y.J~~~~Y'~:w.

I.

L1SINA

3. GLUCOSILACION DE OETERMINADOS RESIDUOS DE HIDROXIUSINA '

""

•

HIN~COOH

I'"

pro~ptido

3 procadenas a

,

""

fibra de cohlgena

4. AUTDENSAMBLAJE DE LAS

TRES CADENAS PRO a.

O'5-3}m E51111111111111i1i;IU"

;;""~'"""~

~

OH Oli 00

9. AGREGACIQN DE LAS FIBRllLAS DE COLAGENA DANDO LUGAR A UNA

5. FQRMACION DE LA TRIPLE H~L1CE DE PROCOLAGENA

FIBRA

compartimk!nto ERiGolg!

vlIsK:ula de secreccl6n

membrana plssmatlc8

6.SECflEC1QN

~

7. ESCISIQN DE LOS 00 HOHoti PROP~PTlDOS malkuls

de cohigena

(2) debido a que s6lo son eliminados despues de su secreci6n, previellcn la formaci6n intraceluJar de las grandes fibriUas de coi<~gena, 10 cual serfa calaslr6fico para la celula. EI proceso de formaci6n de fibrillas esta dirigido en parte por la tendencia que presentan las moltkulas de colagena a autoensamblarse, ya que son mas de 1000 veces menos solubles que las moleculas de procolagena. Las fibrillas empiezan a formarse cerca de la superficie celular, a menu do en invaginaciones de la membrana plasmatica formadas por la fusi6n en tandem de vesiculas secreloras con la superficie celular. Por 10 tanto, el citoesqueleto de las regiones mas externas puede influir en los lugares, velocidades y orientaci6n del ensamblaje fibrilar. En la Figura 19-43 se resumen los diversos pasos de la sfntesis y ensamblaje de las fibrillas de colagena. Dado el gran numero de pasos enzimaticos implicados en la formaci6n de la fibrilla de colagena, no es sorprendente que hayan muchas enfermedades geneticas que afecten la formaci6n de la fibrilla. MUlaciones que afectan a la cohigena de lipo I causan la osteogenesis imperfecra, caracterizada par una debilidad 6sea que facilmente conduce a su fractura. Las mutaciones que afectan a la colagena de tipo II causan condrodispfasias, que se caracterizadas por un cartllago anormat que conduce a deformidades en huesos y articulaciones. Las mutaciones que afectan a la colagena de tipo III causan el sfndrome de Ehlers-Danlos, que se caracleriza par la fragilidad en la piel y vasos sangu(neos y por articulaciones hiperm6viles. Al microscopio electr6nico, las fibrillas de colagena presentan eSlrias transversales caracterfsticas cada 67 mn, que reflejan el empaquetamiento escalonado y peri6dico de moleculas de cohigena individuales en la fibrilla (Figura 1944). Despues de formarse en el espacio extracelular, las fibril1as se refuerzan mediante la formaci6n de enlaces covalentes cruzados entre residuos de Iisina de las moleculas de colagena constituyentes (Figura 19-45). Los tipos de enlaces 1052

r

10-300 8. AUTOENSAMBLAJE nm DE LA FIBRILLA

Capftulo 19: Adhesi6n celular, uniones celulares yroatriz extracelu1ar

1- _. fibrilla de cohlgena

Figura 19-43 Procesos Intra y extracelulares ImpUcados en la fommcl6n de una fibrilla de co18gena. Observese que las fibrillas de colagena se ensamblan en el espacio extracelular contenido en una gran invaginaci6n de la membrana plasmMica. Se muestra el posterior ensamblaje en grandes fibras de colagena, las cualcs son visualizadas en el microscopio 6ptico, a modo de ejemplo de c6mo las fibrillas de colagella pueden formar estruclUras ordenadas en el cspacio extracelular. No se muestran los puentes cruzados que estabilizan los agregados cxtracelulares.

IAI

oonl'8S1ado d6bil de una region sin 8$PD!:io*

molkuls de colagenll

n

Figura 19-44 EI Solapamiento de las molhulas de cohigena da lugar al patron estrlado observado en DbrlUas contrastadas negativamente. (A) Debido a que el ageme conlraslante wlo ocupa los espacios existenles entre las moleculas, ~tos se observarnn como bandas oscuras. En la parte inferior de 1a figura se muestra una elcctronmicrograffa de una fibrilla cantrastada negativamente (B). EI solapamienlo de las moleculas de caMgella palencia la fuena de tensiOn del agregado. (B, conesla de Roberl Home.)

IBI

covalenles implicados s610 sc han encontrado en el colagena y la elaslina. Si las uniones cruzadas se inhibcn. la (uena de tensi6n de las fibrillas disminuye drasticamenle; los tejidos de cola-gena se vuelven fragiJes. y estrucluras tales como la piel, los tendones y los vasos sangufneos tienden a desgarrarse. La extensi6n y el lipo de uniones cruzadas varia de un tejido a ouo: por ejemplo, 1a colagena tiene muchas uniones cruzadas en el Icnd6n de Aquiles. donde la fuena tensora es crucial.

Las colagenas asociadas a fibrillas organizan estas fibrillas 26 A difercncia de los GAG, los cunlcs resistcn fuerzas de compresi6n, las fibrillas de

colagena forman estructuras que resislcn fuerzas de tracci6n. Las fibrillas pueden prcsentar un diametro muy variable y eSlan organizadas de distintas maneras en los djferenles lejidos. Par ejemplo, en la piel de los mamfferos estan organiz..1das espacialmente a modo de un cesto de mimbre, 10 que permite la oposici6n a las tracciones ejercidas desde mUltiples djrecciones. En los lendones estin organizadas en haees paralelos alineados a 10 largo del eje principal de tensi6n. Por ultimo, en el tejido 6seo adulto y en la c6rnea se disponen en laminas delgadas y superpueslas, de forma que las fibriJlas de cada lamina diseurren paralclamenle una a otra, pero forman un lingula recto con las de las capas adyacentes. Esta misma organizaci6n se observa en 101 piel del renaeuajo, la eual siNe como ejemplo de esle lipo de disposici6n (Figura 19-46). enl_. intramo!CK:ul.res

La matrlz extracelular de los ani males

Figura 19-45 Enlaces covalentes intra e Intennolcculares en las fibrlJlas de colagena formadas entre cadenas lalerales de Uslna mocURcadas. Los enlaces se fannan siguiendo una sene de pasos. En primer lugar. algunos residuos de Iisina y de hidroxilisina son desaminados por la enzima exlracelular !isH oxidasa, que da lugar a grupos aldehido allameme reaclivos. Estos grupas reaccionan esponlaneameme fonnando enlaces covalemes entre sf 0 con OltoS residuos de Iisina 0 hidroxilisina. La mayana de los puemes se fonnan entre los carlos segmentos no helicoidales de los extremos de la rnol~lIla de colagena.

1053

Las propias c~luJas del t'ejido conjuntivo determinan el tamano y la organizaci6n de las fibrillas de colagena. Las celulas pueden expresar uno 0 mas de los genes que codirican los diferentes tipos moleculares de procolagena fibrilar. Pero incluso fibrillas compueslas por IIna misma mezcla de mol~culas de col
Las c~lulas participan de la organizaci6n de las fibras de col
Figura 19-46 E1ectronmlcrograffa corre.pondlente II una seccl6n traMVersai de plel de renacuaJo. Obslrvese el ordenamiemo mullilaminar de las fibrillas de coljjgena, en el que las sucesivas capas de fibrillas estan orientadas en angulas rectos. Dicho ordenamiento se encuentra tambicn en et hueso maduro y en la c6rnea. (Cortesfa de Jerome Gross.)

te, Figura 19·47 Colagena deilipo IX. (A) Dibujo esquemlillco de la uni6n de moleculas de colligena de tipo IX unidas, siguiendo un patron peri6dico, a la superficie de una fibrilla comeniendo coljjgena de tipo II. (B) Elecuonmicrograffaoblenida mediante sombreado por rotacl6n de una fibrilla que comiene cotrtgena de tipo [I recublerta por moll!culas de coll\gena de tipo IX obtenidas de carlflago; (Cj mo1l!cula individual de colll.gena de tipo IX. (B Y C, de L Vaughan et aI.,J. cell Bioi. 106:991-997, 1988, reproducido con permiso de copyright por The Rockefeller University Press.)

1054

Capitulo 19: Adhesl6n celular, unlones celuJares y matrlz extracelular

Agura 19-48 Fonnad6n de la matrlz

extracelular par las cetulas. Micrograffa de la regi6n sitllada entre dos fragmentos del coraz6n embrionario de pallo (rico tanto en libroblastos como en fibras musculares) que han crecido en cliltivo sobre un gel de co18gena durante ruatro dias. Entre los explamcs se ha fonnado una densa lamina de fibras alineadas de colagena, probablememe como resuhado de la fuerz.a de lracci6n ejcrcida por los fibroblastos sobre la cohlgcna. (De D. Stopack y A.K.l-larris, Del). BioI. 90:383-396, 1962.)

lulares. Cuando los fibroblastos son eultivados en una plaea en la que existe una matriz gelifieada de fibrillas de eolagena distrihuidas tmalmente al azar, las celulas tiran de la matriz, ejerciendo traeci6n sobre la eol:igena situado a su aJrededor. 10 eual haee que el gel se eontraiga hasla a1canzar un volumen que es una pequena fraeci6n de su volumen inicial; mediante estrategias similares, un grupo de fibroblastos puede rodearse de una capsula de fibras de colagena, densameme empaqueladas y orientadas siguiendo una circunferencia. Cuando dos pequenos fragmentos de tejido embrionario que contienen fibroblastos se eoloean separados sobre un gel de colagena, la coh~gena tiemle a organizarse formando una estrecha banda de fibras alineadas que coneClan ambos explantes (Figura 19-48). Posteriormente, los fibrohlaslos migran a partir de dichos explantes siguiendo estas fibras de colagena. En eonsecuencia. los fibroblastos ejercen una lnfluencia sobre la a1ineaci6n de las fibras de colagena y, reciprocamcnte, estas afectan la distribuci6n de los fibroblastos. Probablememe los fibroblastos juegan un papel similar a eSle en la generaci6n de un ordenamiento, de largo alcanee, sobre la malriz extracelular del organisll1o -por ejemplo, facilitando la formaci6n de tendones y Iigamentos, 0 tambien las densas y resistellles laminas de tejido eonjllntivo que encapsulan y linen la mayorfa de 6rganos.

La elastina confiere a los tejidos su elasticidad 28 Muchos tejidos de vertebrados, como la riel. los vasos sangufneos y los pulmones, han de ser elasticos y resistentes a la tensi6n para ser funcionales. Una red de tibras clasticas en la matriz extracelular de estos lejidos les confiere la capacidad de rc<:obrar su eonformaci6n inicial despues de lIna deformaei6n transitoria. Las fibras elastieas son par 10 menos cinco veces mas extensibles que una banda de goma con la misma area de seeci6n transversal. Intercaladas con las fibras elasticas. se encuentran largas tibras de eolagena. inelasticas. que limitan la capacidad de extensi6n, evitando el desgarro tisular. EI componente principal de las tibras elaslicas es la elastina. una protefna muy hidrof6bica. de unos 750 residuos de aminoacidos de longitud, y que, como la colagena, es extraordinariamente rica en proUna y g1icina, pero a diferencia de ella no estti glueosilada y presenta un bajo contenido en hidroxiprolina y carece de hidroxilisina. Las llloleculas de elastina son secretadas al espacio extraeellllar y se ensamblan formando fibras elasticas pr6ximas a In membrana plasmatica. generalmente en zonas invaginadas de la superficie eelular. Despues de la seere· ci6n, las moleculas de elastina fonnan numerosos puentes cruzados, dando luLa matm extracelular de los animales

1055

Figura 19-49 Red de nbras ehbtlcas. Elcctronmicrograffas a bajo aumento quc muestran un segmento de la aorta de perro (A), y a mayor aumento, la densa red de fibras ehisticas orientadas en otra capa del mismovaso sangu(neo (B). EI resto de componcntes han side digeridos por medio de enzimas y icido i6mlico. (De K.S. I-Iaas. S.I. Phillips. A.}. ComerOla, y I.W. While,Anal. Roc. 230:86-96, 1991.)

gar a una extensa red de filamenlos y laminas (Figura 19-49). Oichos puentes se fonnan enlTe residuos de lisina, mediante el mismo mecanismo que por el que se fonnan en las mol~ulas de eol;~gena_ La elastina esta conslituida en su mayor parte por dos Iipos de segmenlos conos que se a1ternan a 10 largo de la cadena polipeplidiea -segmenlos hidrof6· bieos que son los responsables de las propiedades elaslicas de la mol~ula. y segmentos de helice (l ricos en a1anina y lisina que fonnan puenle cruzados en· tre mol~culas adyacenles. Cada segmenlO esta codificado por un ex6n diferenle. Sin embargo lodavfa se discule la conformaci6n de las mol~cuJas de elaslina en las fibras elasticas y c611l0 la estructura de estas fibras justinca sus propiedades elasticas. Desde un punto de vista, la cadena polipeplidica de elastina, como las cadenas polilll~ricas en lIna goma comenle, adoptan una confonnaci6n de "espiral al azar", y es esla estruclura la que permite a la red eSlirarse y COlllraerse como una banda ela,Slica (Figura 19-50). Las fibras elo1sticas no s610 eslan compuestas por elastina. EI mkleo de la elastina esto1 cubierro por una envollura de microfibrilJas, cada una de las cuales Iiene un di<1melro de llllOS 10 nm. Las fibras elaslicas siempre contienen microfi· brillas, pero las microfibrillas tambien pueden encontrarse en matrices extracelulares que no conlienen elastina. Las microl'ibriUas estan conSlituidas por varias glucoprotefnas dislintas. incluyendo la glucoproteina fibrilina, que parece jugar un papel esencial en el mantenimienlO de la integridad de las fibras elasticas. AIfibra elhtica

EXTENSION

I

R'lAJRC'ON

mol6cu1ll de elastin.

'.;~:~. 1056

Capitulo 19 : Adhesi6n celuJar, uniones celulares y matriz extracelular

Figura 19-50 Esliramlento de una red de mohk:ulas deelastlna. Las moleculas de elastina estan unidas cntre sf mcdiante enlaces covalentcs (indicados en raja) dando lugar a una red entrecruzada. EI modele muestra c6mo cada molecula de elaSlina puede expandlrse y contraerse como una espiral aI azar, de modo que el conjunto de la red tambien puede hacerlo, como una goma elastica.

r

l

gunas mutaciones del gen de 1a fibriJina dan lugar aI sindrome de Marfall, una enfermedad genetica humana relativamente comun que afecla a los tejidos conjuntivos ricos en fibras elasticas; en los individuos afectados de forma mas severa, la aorta (cuyas paredes son ficas en elastina -vease Figura 19-49) es propensa al desgarro. Se cree que las microfibrillas juegan un importante papel en el ensamblaje de las fibras elasticas. Aparecen antes que la elastina durante el desarroUo de los tejidos y parece que constituyen un andamio sobre cl ella] son depositadas las moltkulas de elastina secretadas. Cuando la elastina es deposilada, las micro· fibrillas empiezan a desplazarse hacia la periferia de la tibra en crecimiento.

La fibronectina es una protefna extracelular adhesiva que contribuye a la adhesi6n de la celula a la matriz 29 La matriz cxtracelular contiene varias proteinas adhesiuas diferentes de la colagena que tfpicamente prcsentan varios dominios, cada uno de los cuales tiene lugares de uni6n especfficos para otras macromoleculas de la matriz y para receptores de la superficie celular. De esta forma estas protefnas facilitan tanto la organizaci6n de la malfiz como el anclaje de las celulas a la matriz. La primera de elias en ser bien caracterizada fue la fibronectlna, una voluminosa glucoprotefna presente en todos los vertebrados. La fibronectina es un dfmero compuesto par dos subunidades muy largas unidas mediante un par de enlaces disulfuro situados cerca del extrema carboxilo terminal. Cada subunidad esta plegada en una serie de dominios semejantes a un rodillo, funcionalmente distintos. separados por regiones flexibles de la cadena polipeptfdica (Figura 19-51A y B). A su vez, estos dominios estan compuestos por unos m6dulos mas pequefios, cada uno de los cuales se repite en serie, y esta codificado por un ex6n independiente, 10 que sugiere que el gen de la fibronectina, como los genes de la colagena. se producen por duplicaciones multiples de exones. EI principal tipo de m6dulo, denominado repetlci6n de fibroneclina tipo III, tiene unos 90 residuos de aminml:cido de longitud yse repile al menos 15 veces en cada subunidad (Figura 19SIC). Esto tam bien se ha encontrado en otras prOlefnas de matriz, asf como en algunas protefnas plasmaticas y citoplasmaticas. Una manera de analizar una protefna compleja multifuncional como la fibronectina es cortar la molecula en sus diferentes dominios y determinar su funci6n. Para ello, la prorcfna foe tratada con bajas concentraciones de una enzima proteolftica, que corta la cadena polipeptfdica en las regiones de conexi6n entre

Figura 19-51 Estnlclura de un dimcro de fibronectina. Como se mucsrra esquematicamente en (A), las dos cadenas polipeptidicas son similares pero no id~nticas (estan sintetizadas par el mismo gen pero son el resultado de ulla maduraci6n diferencial de mRNA), y estan unidas por puentes disulfuro cerca del extrema carboxilo. Cada cadena tiene por 10 menos 2500 residuos de aminoacido y esta plegada en cinco 0 seis dominios en forma de varilla concclados mediante segmentos polipeptidicos Ilexibles. Cada dominio se espedaliza enla uni6n a una molecula determinada 0 a una celula, como se indica en Ires de los dominios. Para simplificar no se muestran todos los lugares de uni6n (por ejemplo, exislen otros lugares de uni6n a la celula). (8) E1ectronmicrograffa de moJeculas sombreadas con platino; las jlecllas seftalan el extremo carboxilo. (C) Estructura lridimensional, delerminada par resonancia magn~tica nuclear, de una sccuencia repetida de fibronectina de lipo Ill. Es el principal tipo de m6dulo de repetici6n de fibronectina, y tambien ha sido encontrado en muchas otms protefnas. La secuencia Arg-GlyAsp (RGD) llluestra la regi6n aislada del mayor lugar de uni6n a la celuJa (indicado en azul en IAIl que describimos en ellexto. (B, de I. Engel el al.,}. Mol. Biol.lSO:97-120, 1981.

Academic Press Inc. lLondon] LId.; C, adaptado de A.1.. Main, T.S. Harvey, M. Baron,]. Boyd e 1.0. Campbell, Cell 71:671-678, 1992. © Cell Press.)

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La matriz extracelular de los animales

1057

los dominios alargados pero deja estos dominios intactos, de modo que puedc eSlUdiarse la capacidad de uni6n de cada dominio. De esta forma se dcmostr6 que un dominio se unfa a la colagena, otro a receptores especfficos de superficie de varios tipos celulares y asf sucesivamente (vease Figura 19-51). Cuando se ha aislado un dominio responsable de la uni6n a celulas, por ejemplo, su secuencia de aminolicidos puedc scr dctcrminada y plledcn prepararsc peptidos corrcspondientes a diferentes segmentos del dominio. Estos peptidos fueron utilizados para localizar las regiones responsabJes de la uni6n celular. y luego identificar una secuencia tripeptfdica especffica (Arg-Gly-Asp. 0 RGD). que fue encontrada en una de las repeticiones de tipO JJJ (vease Figura 19-5JC) como una carncterfstica basica dellugar de uni6n. Induso peptidos muy cortos que conlienen esta secuencla RGD compiten con la fibronectina por ellugar de uni6n de las celulas. inhibiendo su adhesi6n a la fibronectina de la matriz. $i estOS peptidos se inmovilizan sobre una superficie s6lida, las celulas se adhieren a ella. La sccuencia RGD no esta reslringida a la fibronectina. De hecho su presencia es habitual en diversas prote{nas extrncelulares de adhesi6n. siendo reconocida por varios miembros de receptores de superfieie de la familia de las integrinas que unen dichas prOlefnas (se estudia mas adelante). Sin embargo. cada receptor reconoce su propio grupo reducido de moleculas de la matriz. 10 eual indica que la fuerte uni6n at receptor requiere algo mas que la secueneia RGD.

Las diversas formas de fibronectina son producto de una maduraci6n aJternativa del RNA29,3Q La fibronectina puede presentar diversas fonnas (isofomlas), incluyendo lam-

bien la denominadafibronectilla pJasmtitica, la cual es soluble y circllia por 5<1ngre y por otros nuidos del organismo, donde se cree que incrementa la coagulaci6n de la sangre, la cicatrizaci6n de las heridas y la fagocilosis. EI resto de formas se organizan en la superficie celular deposi[andose en la matriz ext race· lular como filamemos de fibro1lectillQ muy insolubles. En esms formas de la matriz y de superficie celular, los dimeros de fibronectina se unen a otros mediallle enlaces disulfuro complemelllarios; a diferencia de las moleculas de colagena fibrilar, las cuales en soluci6n se autoensamblan generando fibrillas, las mohku· las de fibronectina se unen en filamentos s610 en la superficie de dertas celulas, 10 que sugiere que son protefnas complementarias necesarias para la formaci6n de filamentos. Todas las formas de fibronectina estan codificadas por un solo gen de unos 50 kilobases de longitlld y que conliene alrededor de 50 exones de tamano similar. La transcripci6n produce una unica molecula de RNA, la cllal puede recombinarse ahern at iva mente por (res regiones, dependiendo del (ipo cclular y del eSladio de desarrollo de que se Hate. En humanos se producen alrededor de 20 RNA mensajeros distillloS, cada uno de los cuales codifica alguna subunidad de fibronectina distillla. Par ejemplo, la fibronectina plasmatica, que es secretada principalmenle por las c~lulas hepaticas, carece de dos repeticiones deltipo III que se encuemran en formas de fibronectina asociadas a ceJulas y malfiz. En algunos casos la maduraci6n alternativa af'iade 0 suprime un lugar de uni6n celular especffico de un tipo de relula: uno de estos lugares es utilizado por los Iinfocitos para adherirse ala fibroncctina. Probablemente la maduraci6n alternativa permite a la celula sintetizar el tipo de fibronectina que sea mas apropiada para las necesidades del tejido, EI modelo de recombinaci6n de RNA para la fibronectina en el estadio embriona· rio temprano es diferente del observado despues del desarrollo; pero si la piel del adulto se lesiona, el modelo de recombinaci6n del RNA para la fibronectina en la base de la herida cambia de nuevo al modelo observado en las primeras etapas del desarrollo. Estas observaciones indican que las fonnas de fibronectina producidas en el eSladio embrionario temprano y en heridas cicatrizallles son apropiadas sobre todo para promover las migraciones celulares y la proliferaci6n requerida para el desarrollo dellejido y su reparaci6n. 1058

Capftulo 19: Adhcsi6n celuJar, uniones celulares y matriz extracelular

La importancia crucial de la fibroncctina en el desarrollo animal ha sido de· moslrada de manera espectacular a partir de experimenlos de inaclivaci6n geni· ca (knockout). Porejemplo. ralones en los que ambas copias del gen que codifica la fibronectina estan inactivadas por mutaci6n. mueren en los primeros estadios de la embriogenesis. EI rat6n mUlante tiene mwtiples derectos morlol6gicos, entre los que se induyen anomaJfas en la rormaci6n de la notocorda. somitos. coraz6n. vasos sanguineos, luba neural y membranas extraembrionales.

Las glucoprotemas de la matriz ayudan a delerminar las vfas de migraci6n celular31 La fibronectina no 5610 jucga un papel importanle en la adhesi6n celular a la

matriz. sino que tambien actuan como guIa de las migraciones celuJares en los embriones de verlebrados. Por ejemplo, se han encontrado grandes acumulos de fibronectina en la vfa seguida por celulas mesodermicas en migraci6n durante la fase de gastrula en anfibios (estudiada en el Cap(tulo 21). La migraci6n de estas celulas puede inhibirse, durante el desarrollo embrionario del anfibio, mediante la inyecci6n de diversos ligandos que alteren la capacidad de las celulas a unirse a la fibronectina: tanto anricuerpos contra la fibronecrina como peptidos que contengan el tripeplido de uni6n celular RGD pero que carezcan de los dominios de uni6n a la matriz de la fibronectina y anlicuerpos contra las integrinas que acruan como receptores para la fibronectina en lodas est'as celulas, inhjben la migraci6n. Probablemente la fibroneclina estimula la migraci6n celular fadli· tando la uni6n de las celulas a la matriz. EI efccto debe de eSlar finamente equiJibrado de manera que las celulas en migraci6n se adhieran a la matriz, pero no permanezcan inmoviLizadas sobre ella. Se cree que muchos tipos de moleculas adhesivas de la matriz juegan un papel como guias de los desplazamiemos celulares morfogeneticos. y continuameme se van descubriendo otros nuevos tipos. Por ejemplo, la tenascina es un gran complejo g1ucoproteico de seis cadenas polipeptidicas similares 0 identicas unidas mediante enlaces disulfuro que irradian desd.e un centro como los radios de una rueda (vease Figura 19·57). Como en la fibronectina, cada una de las ca· denas polipeptfdicas esta compuesta por varios ripos de secuencias de aminoacidos cortas que estan repetidas muchas veces; una repetici6n de fibronectina del tipo III, por ejemplo. se repite ocho 0 mas veces en cada cadena. Cada cadena polipeptidica se pliega en un numero de dominios funcionales distimos, uno de los cualcs se une a proteoglucanos transmembrana del tipo sindecanos, miemras que otro sc une a la fibroneclina. La tenascina presenta una distribuci6n mucho mlis rcstrictiva que la fibronectina y cs mucho mlis abundante en la matriz extracelular de tcjidos embrionarios. A diferencia de la fibronectina, puede eslimular 0 inhibir la adhesi6n celular, dependiendo del tipo celular; se cree que las funciones adhesivas y antiadhcsivas estan mediadas por diferenles dominios proteicos. Exisren evidencias crecicnles de que tambicn las intcracciones an· tiadhesivas, como las adhesivas. juegan un importante papel como guias de las migraciones celulares. como veremos en el Capfrulo 21.

Las mol~ulas de cohigena de tipo IV se ensamblan formando una red laminar que facUila la formaci6n de la lamina basal 32 Hasta ahora. nuestro estudio acerca de la matriz extracelular se ha centrado en las estructuras que ocupan el espacio inlerceluJar. Pero en ciertos lugares. espe· cialmenle en la cercania de los epitelios.la marriz extracelular puede organizar· se como una delgada lamina resislente -Ia Mmina basal. La construcci6n de la lamina basal depende de algunos tipos especializados de moleculas de la matriz extracelular. incluyendo una variedad especializada de colagenas, de las que nos ocuparemos ahora. Las molecuJas de cohigena dc t1po IV poseen una eSlnlclura mas flexible que las colagenas fibrilares: su helice de tres hebras esta intcrrumpida en 26 reo La

matrlz cxtraceluJar de los anlmales

1059

170 nm / ' " ~-- dominio glob"lar C-terminal mon6meros

~- extremo N-Ierminal

)

y

dominios de triple h'lice

TRAV~S

I

ASOCIACI6N RAplDA "CABEZA·CABEZA" A DE LOS DOMINIOS GLDBULARES C·TERMINALES

Figura 19-52 UIp6teslssobrec6mose ensamblan las moleculas de cohigena de tipo IV formaJldo una red multllaminar. El modelo se basa en las electronmicrograffas obtenidas mediante sombreado por rolaci6n del ensamblaje de eSlas moleculas ill vitro. (Basado en P.O. Yurchenco, E.C. Tsilibary. A.S. Charonis y H. Furthmayr, I. Histocllem. Cytocllem. 34:93-102,1986.)

I

ASOCIACIONES LATERALES MEDIANTE LOS DOMINIOS DE TRIPLE H~LlCE QUE FORMAN REDES LAMINARES

los extremos N-Ierminales se proyeclan por encima y por debajo del plano de la red laminar

red laminar

Jig

ASOCIACIONES COVALENTES LEt-HAS A TRAV~S DE LAS COLAS N·TERMINALES. QUE FORMAN UN CONJUNTO OE REDES LAMINARES ESTRATIFICAOAS

I

giones. 10 cual permite plegamientos multiples. De manera semejante a las colagenas asociadas a fibrillas. una vez secretadas no se fraccionan sino que conservan las regiones terminales que impiden el empaquetamiento longitudinal de las fibrillas. Por el contrario, interactuan a traves de sus dominios terminales no fraccionados lUliendose fuera de la celula formando una red flexible de tipo laminar y multicapa. Estudios realizados con el microscopio electr6nico de prepa· raciones de ensamblajes de molcculas de colagena de tipo IV, sugieren que estas moleculas se asocian par su extrema carboxilo terminal formando dfmeros, los cuales luego daran lugar a una extensa trama a traves de asociaciones amino terminales con otras tres moleculas y con asociaciones laterales posteriores que se presentan en la Figura 19-52. Estas asociaciones se estabilizan mediante la formaci6n de enlaces disulfuro y orras uniones cruzadas covalentes entre las moleculas de colagena. La red result ante forma un andamio insoluble al cual se unen otros componentes de la lamina basal a traves de asociaciones especfficas con moleculas de colagena de tipo TV.

La himina basal esta compuesta fundamentalmente por colagena de tipo IV, proteoglucanos de tipo hepanin sulfato, laminina y entactina33 Las hunlnas basales estan constituidas por una matriz extracelular especializada que se organiza en capas delgadas (40-120 nm de grosor) y flexibles que subyacen a las superficies y conduclos epiteliales; tambien rodean las fibras musculares y las celulas de Schwann (las cuales se siluan alrededor de los axones 1060

Capftulo 19: Adhesi6n celular, uniones celulares y maim extracelular

r f

MOSCULO Ii!lminll bll5l1l

LAMINA EPITELlAl.1

GLOMERULO RENAL

lejido oonjuntivo

""'l'I"''l'II"II''''LU.Z •• ..•l~ • membrllna pillsmi!ltica dela fibra muscular

dlula endotelial

SANGRE

."""". ~~ . ORINA

lejido conjuntivo Ii!lmina basal

cl6lula ep,lellal

li!lm;na !)tsal

perifericos de las neuronas formando la envoltura de mielina). De esla manera las laminas basales conslituyen el elemento separador enlre estas relulas 0 enlre laminas celulares y el tejido conjuntivo adyaceme. En Olras localizaciones. lales como el glomerulo renal y los alveolos pulmonares, las laminas basales se situan entre dos capas celularcs diferentcs, y acruan de filrro ahamente selectivo (Figura 19-53). Sin embargo, las laminas basales tienen otras funciones que las simplemellle estruClurales 0 filtranles. Pueden deterrninar la polaridad celular. inOuenciar el melabolismo celular, organizar las proleinas de las membranas plasmaticas adyacentcs, inducir la diferenciaci6n celular y actuar como ~aulOpislas~ especfficas para la migraci6n celular. La lamina basal es sintetizada fundamentalmente por las celulas que se apoyan en ella (Figura 19-54). Como se observa al microseopio electr6nico despues de realizar una fijaci6n y contrastado convencionales, la mayorfa de las laminas basales constan de dos capas diferentes: una que muestra una baja eleclrodensidad (lamina flicida 0 rara), y que se eneuentra adyaeente al dominio basal de la membrana plasmalica de las celulas que se apoyan en ella -tfpicamente las celulas epiteliales- y otra que muestra una mayor opacidad electr6nica (ldmina dellSll) juslo por debajo de aquella. En algunos casas puede exislir una lercera eapa, rica en fibrillas de colagena (la ldmilla fibrorreticular), que concela la lamina basal con el lejido conjuntivo subyaeenle. AJgunos bi610gos cellilares utilizan ellermino membrana basal, para describir la eSlruelura de las lres membranas, que habilualmenle es sllficientemente gruesa para ser visla medianle el microscopio 6plico; olros bi61ogos celuJares ulilizan los terminos lamina basal y membrana basal, de forma indiferente. En la lamina basal de algunos cpilclios pluriestfillificados, tales como el epitelio escamoso plurieslralificado que conSlituye la epidermis de In piel, la lamina densa esta adosada al tejido conjuntivo

Figura 19-53 Tres modelos de organlzacl6n de las himinas basales {Utleas amarillas). Rodean ciertas cl!lulas (como las fibras musculares), se hallan en la regi6n basal de los epitelios, y se interponen entre dos eapas cpiteliales (Ial como sueede cn el gloml!rulo renal). Observese que en eSla Ultima estruelUra ttistol6gica ambas capas epileliales presentan espacios entre cUas de tal manera que la lamina basal consthuye una barrera pemlcable, la eual es delcrminame en el paso de las molecolas de la orina a la sangre.

Figura 19-54 Eleclronmicrogra£(a de barrldo de una lamina basal de la c6rnea de un embrl6n de polio. Alguml de las cl!lulas epiteliales (E) han sido extrafdas, dejando al descubierto asf la superficie superior de la lamina basal (BL). La red de fibrillas de colagena (C) del tejido conjuntivo subyacente interactua con la superficie inferior de la lamina. (Conesfa de Raben Trelstad.)

, , Bl

c

10"m

La malriz exlracelular de los animates

1061

subyacente mediante unasfibril1as de anc1aje constituidas por molCculas de colagena de lipo VII. En un tipo de enfermedad, que es devastadora para la piel, 0 no existen cstas conexiones 0 estan destruidas, y la epidermis y su htmina basal se separan del lejido conjuntivo subyacente. Aunque su composici6n exacta varia de un tejido a otro c incluso de una reo gi6n a otra en la misma lamina, la mayona de laminas basales maduras contie· nen colagena de tipo IV (vease Figura 19-52), muchos proteoglucanos del tipo heparcin sulfato denominados perleamos y glucoproteinas como la lamjnina y la enlaetina. La laminina es una de las primeras proteinas de matriz extracelular sinlclizadas durante el desarrollo embrionario; y en las primeras etapas del desarrollo,la lamina basal tiene poca 0 incluso nada de colagena de lipo IVy consta principalmenle de una red de laminina. La laminina es un gran complejo flexible (de unos 850 000 daltons) formado por tres largas cadenas polipeptfdicas, displlcslas en forma de cruz y llnidas mediante enlaces disulfuro (Figura 19-55). Como muchas ouas prot'einas dc la malriz extraceluJar, tambien presenta varios dominios funcionales: uno de uni6n a la colagena de tipo IV, otro al heparan sulrala, otro a la entactina, y dos a mAs a los receplores de la laminina situados en la sllperficie celular. Como la colagena de lipo IV, las moleClllas de laminina pllcdcn alllocnsambiarse ill vitro formando una lamina, en gran parte a traves de inleracciol1es entre los extremos de los brazos de laminina. Cada molecula de enraclilla, que posee fonna de pesa de gimnasia, se une a cada molccula de laminioa en ellugar donde los brazos cortos se entrccruzan can los largos. La entactina tambien se une a la colagcna de tipo IV, par 10 que se cree que actua como un puente adicional enue la colagena de tipo IVy la red de lamin ina de la lamina basal (Figura 19·56). En la Figura 19-57 se comparan las fonnas y tamai'Jos de a1gunas molecuJas de la matriz ex:lracelular estudiadas en este capiluJo.

Las laminas basales realizan diversas y complejas funciones 34 En el glomerulo renal, una lamina basal extraordinariamente gruesa, acnla como un filtro molecular, reguJando el paso de macromo1eculas de la sangre a la orina (vease Figura 19·53). Aparentemenle, los proteoglucanos dellipo heparcin sulfato

dominio. (I-helicoidal", .uperenrolledos

"" Flgun 19·55 Estructura de la laminina. Dibujo esquem!tico de la molecuJa de laminina representado en W. y eloctJonmicrografIas de molkulas de laminina sombreadas can platino representadas en (8). La glucoprotema multidominio est! ronnada por tres polipeptidos lA, BI Y~), que mediante enlaces disulruro dan lugar a una estructura asimeuica en ronna de cruz.. Cada una de las cadenas polipepddicas esta constiluida por m!s de 1500 residuos de aminoacido. Se han idenlificado tres lipos de cadenas A, Ires lipos de cadenas B,. y dos tipos de cadenas B2• las cuaJes pueden asociarse ronnando 18 isorormas direrenles de laminina. Algunas de estas isorormas presentan una diSIribuci6n tisular caraclerfstica. Exislen tambien varias isorormas de col!gena de lipo IV oon distribuciones lisulares especfficas. Asl pues. la llimina basal es qufmicamente diversa, 10 cual no es sorprendente en vista de su diversidad funcional. [B. de j. Engel et a1.,j.Mol.Biol. 150:97-120, 1981. o Academic Press Inc. (London) Lld.j 1062

CapftuJo 19: Adhesi6n celular, uniones celularcs y matrlz CXlracciular

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0' son fundamentales para Hevar a caho esta funci6n, ya que cuando las cadenas de GAG son degradadas mediante enzimas especfficas, desaparecen las propie· dades filtrantes de la lamina basal. La lamina basal t'amhien puede acluar como

FIgura 19-56 Modelo actual de la "Iructura molecular de una himlna basal. La lamina basa1 W esta fonnada por inlemociones espedficas entre las protefnas deoolagena de tipo IV.la lamlnina y la entaetina y el protcoglucano perlecano (B). En (B) las Oechas concetan moleculas que pueden unirse directamente unas con otms. (Basado en P.O. Yurchenco y J.C. Schillny. FASEBj. 4:1577-1590,1990.)

lIna barrera selectiva para el desplazamiento de las celulas. Asf, por ejempJo, la lamina sabre la que se apoya un epitelio irnpide que los fibroblaslOs del cejido conjunlivD establezcan cantaCla con las celulas epiteliales. Sin embargo, no es obsukulo para el paso de celulas tales como macr6fagos. Iinraeilos 0 procesos nerviosos. La lamina basal conslituye un clemento importante para la regeneraci6n de tejidos daftados. Cuando ello sucede en tcjidos como el muscular, el nervioso 0 el epilelial, la lamina basal se mamiene, proporcionando un enlramado a Irav~s del cual las c~lulas regcneradas pueden migrar, 10 cual pennilc una reconslntcci6n de la arquilectura del lejido original. En algunos casas, como en la piel 0 la c6rnea, la lamina basal se allera por ejemplo por la adici6n de fibronectina, la cual facilita la migraci6n celular necesaria para la reparaci6n deheridas. Un ejemplo de la importancia de la lamina basal en la regeneraci6n tisular 10 proporciona el estudio de la ullioll neuromuscular. mediame la cuallas neu· ronas lransmiten su eSI(mulo a las fibras musculares esquel~licas. En la zona de COnlaCIQ neuromuscular,las terminaciones nelViosas de la neurona mOlora forman una si"apsis con la c~lula muscular. La lamina basal que rodea a la celula muscular separa el nervio de la membrana plasmatica de la celula muscular en la sinapsis. La regi6n sinaptica de la lamina basal es caraclerfstica desde el punto de vista qufmico: por ejemplo, se han encontrado isoformas caracteristicas de

La

malriz ex.lracelular de los anlmalcs

1063

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fibronectina 'cidO hialur6nico

col'gena fibrilar \

~Iaminina

III

dacorina

:::::::::

perlecano

col'gana de tipo IV

100 nm

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Capitulo 19: Adhcsi6n celular, unlones celulares y matriz extracclular

Figura 19-57 Esquema comparatlvo de las fonnas y tamafios de a1gunas de las prlnclpales macromolecuJas de la matrlz extraceluJar. La proterna eSI
,

Figura 19-58 Experlmentos de regeneracl6n que Indican el cafacter especial de la himina basal de uni6n

11

en una uni6n neuromuscular.

I

estructura residual

.41 ~

cliluia muscular cortada para

qua degenera

::;:,'.m~

.

I nervio cortado / ::""....- _ \un,6n .

-

FIBRA NERVIOSA REGENEAADA

i}-\ 01 nervio

regene'8do

Ii ~ de I'mlna bani . uni6n

yuelve ellugar de uni6n original

neuromuscular

nuevas 'lICeptores do acetilcolina

sa concentran en MUSCULO Y NERVIO DEGENERADOS

FIBRA MUSCULAR

REGENERADA

ellugar de uni6n original

Cuando el nervio se regenera y el museulo no 10 haee, despues de que ambos han sido danados (parte slIperiorde la figura).la lamina de uni6n dirige el nervio en regeneraci6n hacia ellugar de la sinapsis original. Cuando se regenera el musculo pero no el nervio (parte inferior de la figural, la Illmina de uni6n provoca una nueva sfntesis de receptores de acetilcolina que se acumulan en el lugarsinllptico original {el musculo se regenera a partir de las celulas satelite localizadas enli"e la lamina basal yla cclula muscular original-no representada, pero vease pllg. 1262}. Estos experimclltos mueSli"an que la lamina basal unida controla la localizaci6n de otros componentes de la sinapsis -en ambos lados de la lamina.

de la epidermis subyacente. Sorprendentemente, 5610 estan afectadas las migradanes a 10 largo del eje dorsoventral del embri6n; las migracioncs a 10 largo del eje anteroposterior de la misma lamina basal se producen con normalidad. Estos hallazgos, asf como los referenles a regeneraci6n de la uni6n neuromuscular en la rana, sugieren que aun nos queda mucho por conoeer sobre las especializaciones funcionales de la lamina basal.

La degradaci6n de los componentes de la matriz extracelular

esta estrechamente controlada35 La reguJaci6n del recambio de las macromoleculas de la matriz extracelular es

important(sima para diversos procesos biol6gicos. Par ejemplo, existe una degradaci6n nipida cuando el utero involuciona despues de un parto, 0 cuando la cola del renacuajo se reabsorbe durante la melamorfosis. Una degradaci6n mas localizada de los componentes de la matriz es necesaria cuando las celulas migran a traves de la lamina basal, 10 que sucede, par ejemplo, cuando los gl6bulos bJancos migran a traves de la lamina basal vascular en respuesta a una infecci6n o a una herida, 0 cuando las celulas cancerosas migran desde su Jugar de origen hacia 6rganos distantes a traves del torrente sanguineo 0 de conductos linfaticos, en un proceso conocido como metastasis. Incluso la matriz extracelular de animales adultos, aparentemente estatica, esta sometida a un lemo recambio continuo debido a la degradaci6n y ala resfntesis. En cada uno de estos casos los componentes de la rnatriz son degradados por enzimas proteo]flicas extraceluJares que son secretadas localmente por las cclulas. Muchas de eslas proteasas perteneccn a una de las dos clases generales: algunas son metaloproteasas, cuya actividad dependc de su uni6n a Ca 2+ 0 a Zn 2+, mientras que otras son serina proteasas, las cualcs tienen un residuo senna muy reactivo en su centro activo. Ambas, metaloproleasas y scrina proteasas, cooperan en la degradaci6n de protefnas de la matriz tales como col
1065

f

Una imponante serina proteasa. implicada en la degradaci6n de la malriz es el aetivador del plasmin6geno de tipo uroquinasa (U-PA, de Urokinase-type Plasminogen ActivalOr). Acttia como desencadenante especffica en una cascada proteolflica: su diana inmediata es el pfasmin6gello. un precursor inactivo muy abundante en la sangre y que se acumula en los lugares de reestructuraci6n del tejido tales como heridas, tumores y lugares inflamados. U-PA degrada un unico enlace del plasmin6geno £lando lugar a la proteasa activa pfasmina. A diferencia de U-PA, la plasmina tiene una amplia especificidad, degradando una gran variedad de protefnas, incluyendo la fibrina (un componente de los co
Resumen Las dill/as del tejido oolljulltilJO se enCllentrml inclilidas en IIna oompleja matriz

extrac:elllmr, la ellal no solamellte ,me las dlillas elltre sf, sillo qlle tamblen illflilye

(B) cl!IlulBS COrl receplores de proteasll bloquelldos

IA) cl!Ilulas COrl receptores de proteBS8 fUrlciorl81es

/

receptores U-PA

" IV protease activlIlU-PAI CRECIMIENTO TUMORAL Y METASTASIS

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protease irlactive IU-PA muterltel CRECIMIENTO TUMORAL SIN METAsTASIS

Capftulo 19: Adhesi6n celular, uniones celulares y matriz extracelular

Figura 19·59 Importancladela proteasa unlda a un receptor de superflcle celular. (A) Sfntesis y secreci6n de V-PA, una serina proteasa que se une a protefnas rcceptoras V-PA de superficie celular en celulas cancerosas de pr6stata humana. En (8) las mismas celulas han sido transfectadas con DNA que sobrexpresa una forma inactiva de UPA, la cual se ulle a receptores de V-PA impidiendo que la proteasa activa se una a la superficie celular, Ambos tipos de celulas secretan V-PA activa, crecen r
ell $11 desarrollo, Sll polarillad y Sll comportamiento. La matrlz colltiene diuersas protel"asfornUldoras tk fibms i"terMladas en el illlerior de lUI gelhidratado compllesto por una retl de g/ucosamillglucallOs (GAG). Los GAG collstituyen 1m grupo 1Ieterogelleo tk largas cadenas de polisaafridos cargados "egativame"te, los clmles (e:cceptlumOO el addo I,lal","611lco) se unell covalentemente a IUIll protel"a damlo lugar a mollcilliu de proleogillcanos. £Stos proteoglucanos ocupan 1m gran I.IOlllnren y forma" geles IIitlratados ell el espado e:ctraalular. Tanrbiin se enClUmlran proteoglucanos en la sIIperjicie cellliar dollde desempenan ftmciones como COrreceplores faciUtlmdo 1a Imi6n de las dlulas a 1a matriz y respondienOO afadores de CTW:imienIO. Las protelnas formadoms de fibms plleden dillidine en dos gmlldes grupos ftmcimlilles: 1I11as ftuulamelllaimellle eslnlcturales (coldgenas y elasti"a) y otras ftmdamentalmente adllesivas (como la fibronectina y la lam/nina). Las coltfgenas fibrilares (tipos 1, 11, 111, Vy Xl) Sotl alargadas, semejantes a rodillos, y sus mo!klllas Ilellcoidaies de triple Ilebra se agregan fOrnlalldo largas fibrillas en el espacio extraceflllar; a Sll 1Ie% estas fibrillas 'JIU~den e'lSamblarse fonnalldo estmcturas 00rimlas altamente ordelladas. Las molkldas tk coldgena asociadas a fibras, tales oomo los tipos IX Y XlI, decorall la s/lperjicie tk las ftbras de coltfgella e IlIftuyen ell las IlIterm::ci01les de lasftbras entre sly con otros comp01lelltes de la matrh. Las moIIclllas de coldgena de tlpo IV se orgalliultl en IIJIa red lam"U1r que es IIJI componente crucial de todas las ltfm"U1S basales maduras, las cliaies tambihl contiellen liu protelnas laminit.a y entacti"a y ei proteoglucanos del tlpo lk los Ilepam" sldfatos, el perleamo. Las ",olleulas de elastina fomlan 'fila exttmsa red de ftbras y ltfmlnns, enlazndas por puentes cnwulos, que tlene" la capacidad de estiramie"to J' retraccl6n. propordonando eliutlcldad a la matriz. La jlbronectina y la lamin/,UI SOil buenos ejemplos tk grandes glucoprotelnas adllesivas de 'a matrlz. fomlatILls par mlHtiples OOm",;os; la primera de elIas esttf ampliamellte distribllida ell elteJido conjlUltivo, mientras que la segmlda se iocalizaftmdamelltalmente en la lamilla basal. Medumte Sll$ IIl1,ltiples domillios de mli611, estns proteillas fadlitaJI ia adllesi61l cellliar y colaooraJJ ejicazme"te ellia orgaJlizaci61l de la matriz extracell/lar.

Receptores de la matriz extracelular en celulas animates: las integrinas Para entender c6mo interacciona la matriz extracelular can las cclulas, es necesario idenlificar tanto las moh~Clllas de la superficie celular (los receptores de La matriz) que se unen a los diversos componentes de la matriz, como a los propios componentes de la matriz extracelular. Debido a las mliltiples interacciones que se producen entre las macromoteclilas de la matriz en el espacio extracelular. el eSlablecimiento de un limite enlte los componentes de la membrana plasmMica y la malriz eXltacelular conslitllye un ejetcicio semantico. Sin embargo. la wli6n ultima a la celula requiere de una proteina lransmembrana que una la malriz al citoesqueleto cortical de las cClulas. Va hemos visto que algunos proteoglucanas con ptoteinas centrales transmembrana actuan como correceplores para los componemes de la malriz. pera los principales receptotes en las celulas animales pata la mayorfa de proleinas de la matriz extracelulat, incluyendo la colcigena. la fibronectina y la laminina. son las integrinas. una gran familia de ptoteinas de uni6n. transmembrana y hom6logas. Las integrinas difieren de los receplares de harmonas de la superficie celular y de atras moleculas senal solubles en que se unen a sus Iigandas can una reo lativamente baja afinidad (K. = 1(16 - log liltos/mal) y en que habitualmente se presentan a concentraciones a nivel de la superficie celular entre 10 y 100 veces mayores. ESla situaci6n tiene senlido ya que la uni6n simuhanea pero debil a un gran mimero de moleculas de la matriz permile a las cclulas explorar su media sin dejar de unirse a el. 5i la uni6n fuera demasiado fuerte, las cclulas probablemente podrfan llegar a pcgarse irreversiblemente a la matriz sin porler Receptores de la malrlz eXlracelular en c~lulas animales: las Integrlnas

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desplazarse -un problema que no se presenla si la uni6n depende de m(lltiples adhesianes dcbiles. J:.ste es un ejemplo del "principio Velcro" comentado anteriormente.

union e Ie m&lriz

Las integrinas son heterodfmeros transmembrana36 Las integrinas son receplores de crucial importancia debido a que consutuyen los mecanismos principales de que disponen las celuJas para uni.rse a la matriz extracelular y responder a ella. Est<1n constituidas por dos subull.idades glucoproteicas transmembrana unidas entre sf no covalentemente, denominadas (l y I}; ambas contribuyen a la uni6n de las celulas a las protefnas de la matriz (Figura 19-60). Parece que algunas integrinas se unen Unicamente a un tipo de macromoleeula de la matriz, como la fibronectina 0 la laminina, mientras que otras se unen a m<1s de una: por ejemplo, una integrina que est<1 presente en fibrpblaslOS se une a col<\gena, fibronectina y lam.inina. Una subfamilia de integrinas reconoce la secuencia RGD presenle en estas y en otras protefnas de la malriz, m.ient.ras que oITas reconocen otras secuencias 0 dominios. Una misma moleeu· la de inlegrina localizada en diferenles tipos celuJares puede presentar diferenles afinidades por el ligando, por 10 que puede especularse que detenn.inados factores adicionales pueden interactuar con las inlegrinas modulando su actividad. La uni6n de las integrinas a sus ligandos depende de cationes bivalentes extracelulares (Ca 2- 0 Mg2', dependiendo de la integrinal, 10 cual refleja la presencia de tres 0 cuatro dominios de uni6n a cationes divalentes en la gran regi6n exuacelular de la cadena a. Esta propiedad puede utilizarse para purifica.r integrinas: las protefnas de membrana plasm<1tica solubles en detergente se hacen pasar a traves de una columna de afinidad que contiene una protefna de la matriz extracelular 0 un ~ptido con la secuencia RGD, y las integrinas que se han unida son luego eluidas de la columna mediante lavado con una soluci6n Iibre de caliones divalentes. EI tipo de cationes divalentes puede influir tanto la afinidad como la especificidad de la uni6n de una integrina a sus ligandos, aunque, como en el caso de las cadherinas, lodavia no conocemos el significado fisiol6gico de la regulad6n de este cati6n. Muchas prolefnas de la malTiz de verlebrados son reconocidas por varias inlegrinas: pOT ejemplo, par 10 menos 8 integrinas se unen a la fibronectina, y un mfnima de 5 a la laminina. Se han definido alrededor de 20 heterodfmeros de inIcgrina, constituidos por 9 tipos de subunidades ~ y 14 tipos de subunidades n, y otros se eSI:1n caracterizando. Su divcrsidad se incrementada par la maduraci6n alternativa de algunos RNA de imegrinas. Las cadenas ~I' que forman dfmeros con al menos 9 cadcnas a dislinlas, se han localizado en casi todas las cclllias de verlebrados; por cjempl0, o.s~1 es un receptor de la fibronectina y ~131 es un receplar para la laminina en muchos tipos celulares. En cambia, las cadenas 131, que forman dfmcros con 3 lipos de cadenas n, se expresan exclusivamentc en la superficie de los leucocitos y juegan un papel esenc.ial permitiendo a estas c~lu­ las combatir las infecciones. Una de estas integrinas 132 (aJ!1l es la denominada LFA-J (de Lynfocite Function Associated, asociada a la funci6n linfocitaria); otra (al-t132) es la denominado Mac-J debido a que se encontr6 fundamenlalmcnle en macr6fagos. Las integrinas dellipo 132 median principal mente la uni6n entre~· lulas y no entre las ciilulas y la mat.riz, uniendose a Iigandos especfficos de otra celula, como las ~Iulas endoteliales de los vasos sangumeos; los ligandos, a veces denominados CQlltrarreceplOres, son miembros de la superfamUia de inmunoglobuLinas de moleeulas de adhesi6n celular, estudiadas ameriormente. Las integrinas 1}2' por ejemplo. penniten a los g16buJos blancos unirse fmnemente y atravesar el revestimiento endotelial de los vasos sangufneos en los lligares de infecci6n. Los humanos que padecen la enfennedad geniilica denominada deficietlcia dealJ1Iesi{m leucocitaria no pueden simetizar la subunidad ~; como cansecuencia de ella, sus gl6bulos blancos son deficientes en rodos los receptores del grupo 1}2' ysufren repetidas infecciones bacterianas. Las inlegrinas del tipo I}, 1068

Cap((ulo 19: Adhesl6n celular, uniones celulares y matm e.xtracelular

figura 19-60 EstruCluraen subWlldades de WI receptor matrlzde superfide celular de tJpo Integrina. las electronmicrografTas de receptores aislados sugieren que la molecula tiene una morfologfa aproximadamente como la mostrada en el esquema, con un extrema globular que se proyecta m:\s de 20 nm sobre la bicapa lipfdica. Al unirse a una protefna de la matriz en cl exterior celular y al dtoesqueleto de actina (mediante las protefnas de anclaje latina yn-actinina) en el interior de la celula, la protefna actua como un elemento de uni6n lmnsmembrnna. Tanto las eadcnas n como las ~ estan glucosiladas (no se mUI.."Strn enla figura), y se linen entre sf mediante enlaces no covalenles. En el receptor de la libronectina rcprescntado, la cadena n es sintclizada inicialmente como una sola cadcna polipeplfdica de unos 140 000 daltons, la eual es posterionnenle cscindida en una pequena regi6n Iransmembrana y un gran rraglllento exlracelular.los cuales pemlanecen unidos entre sf mediante un enlace disulfuro; este fragmenlo extracelular esla plegado en eualro dominios de uni6n a cationes divalentes. la regi6n extracelular de Ia cadena p comiene una regi6n rica en cistefna que se repite, estableciendo puentes disulfuro inlracalenarios: la cadena p tiene una masa de unos 100 000 daltons.

han sido 10calizadas en diversas c~lulas, entre elias las plaquetas sangufneas, y se unen a varias protefnas de la malriz incluyendo el fibrin6geno; las plaqucta'. interactuan can el fibrin6geno durante la coagulaci6n de la sangre y los indivlduos que presentan la enfermetlad de Glanzmwm, deficientes gen~licamenle en integrinas deltipo ~3' sangran facilmente. En Drosopllila se han descrito dos integrinas que companen una subunidad ~ cornun. 5i ambas copias del gen que codifica esta subunidad 13 estan mutadas, las moscas mueren en el estado larvario; se desarrollan con nonnalidad hasta que ernpiezan las primeras contracciones musculares, momenta en que los rnusculos se desinsertan de sus lugares de uni6n a la matrix extracelular.

Las integrinas pueden interaccionar con el citoesquelelo para unir las c~lulas a la matriz extracelular31 Las inlegrinas aCluan como acopladores lransmembrana (0 ~integradores~) mediando las interacciones entre el citoesqueleto y la matriz extracelular que son necesarias para que las c~lulas se adhieran a la matriz. La mayorfa de las integrinas se asocian a haces de filamenlos de actina. (La integnna localizada en hemidesmosomas -<xJ'4- es una excepci6n ya que se asocia a fLIamentos intermedios.) Tras la uni6n de una integrina tfpica a su Iigando de la matriz, 1a cola citoplasmatico de la cadena 13 se une a la latina y ala a-actinlna. iniciando el ensamblaje de un complejo de protefnas de uni6n intracelulares que unen la integrina a los filamentos de actina en el c6nex celular; se cree que asf es como se forman los contaclOS focales entre las c~lulas y la matriz extracelular, como discutimos anteriormente. 5i el domjnio citoplasmatico de la cadena Pse suprime mediante la utilizaci6n de t~nicas de DNA recombinante. las integrinas mutanles permanecen unidas a sus Iigandos pero ya no establecen fuenes adhcsiones celulares 0 grupos de eontaetos focaJes. Asf pues, parece que las integrinas interaccionan con el citaesqueleto para que las e~luJas se unan a la matriz, de la misma forma en que las cadherinas deben interaetuar con el citoesqueleto para manlener unidas las c~lulas entre sf. Como discutimos anteriormente, parcce que la uni6n Iransmembrana con el citoesqueleto es un requislto general imporlante para las unianes celula-malriz y c~lula-c~lula: sin tales anclajes internos, el lugar de uni6n esta. predispuesto a ser eliminado de la c~lula (vease Figura 1929). Las llniones al citoesqueleto tambi~n pueden agrupar las integrinas, dando lugar a una importante agregaci6n de elementos de uni6n celular (otra vez el principio Velcro). Como cstudiaremos a continuaci6n, las interacciones que median las integrinas entre la matriz extraeelular y el citoesqueleto actuan en ambas direcciones y desempei\an lln importante papel en la orientaci6n tanto de las cclulas como de la matriz en un tejido.

Las integrinas permiten al citoesqueleto y a la matriz extracelular comunicarse a trav~s de la membrana plasm
Receptores de la matriz extracelularen c€Iulas animaJes: las inlegrinas

1069

Figura 19·61 AIlneaclc'in de los mamenl0S de Rbronectlna extraceluJar con los haces de mamentos de actJna. La fibronectina de dos fibroblastos de rata manlenidos en cuJtivo se observa mediante la utilizaci6n de anticuerpos unidos a 101 rodamina CAl. mienlras que 101 aClina se visualizada mediante anticuerpos espec{ficos unidos a la fluoresce!na (B). (De R.O. Hynes y A.T. Desiree, Cell 15:875-886, 1978.0 Cell Press.)

Esta interacci6n entre la malriz extracelular y el citoesqueleto es redproca en tanto que los filamentos de actina pueden influir 101 orientaci6n de las moltkulas de fibronectina secretadas. Por ejemplo, los filamentos de fibronectina extraceIulares se organizan sobre 0 cerca de 101 superficie de fibroblastos en cultivo alindndose con las fibras de estres intracelulares adyacentes (Figura 19·61). Si estas celulas son tratadas can una droga como 101 citocalasina. que desorganiza los filamentos de actina, los filamentos de fibronectina se disocian de 101 superficie celular (exactamente como 10 hacen durante 101 mitosis cuando las celulas se redondean). Estas interacciones recfprocas entre 101 fibronectina eXlracelular y los filamentos de actina intracelulares a traves de 101 membrana plasmAtica est<\n mediadas fundamentalmente par las integrinas. El citoesqueleto de las celulas puede ejercer fuerzas que orienlan las macro· moleculas de 101 matriz y estas, a su vez, pueden organizar el ciloesqueleto de las celulas que contactan con elias. por 10 que 101 matriz puede propagarse, en principio, de una celula a otra (Figura 19·62), creando estructuras orientadas a gran escala, como vimos anteriormente (vease pag. 1055). Las inlegrinas actuan como adapladores en eSlos procesos de orclenamiento, mediando las interacciones enlre las celulas y 101 malriz que las rodea.

I.

o.ientKiOl;l..9ue present. el citoesqueleto

en I. ~lul'l!J induce I. orientllCiOn del conjunlo molee\ll•• MeJeteodo que constituye I. m"fi~ elrtrll(:elul.r de las inmediacionas

Las c~lulas pueden regular la actividad de sus integrinas39 Mienlras que las integrinas de muchas celulas est3n constanlemenle en un eSlado compelente-adhesivo, las integrinas de las celulas sangufneas lienen que ser activadas antes de que puedan mediar 101 adhesi6n celular. Tales adhesiones reguladas permiten probablememe a las celulas sangufneas circular libremente hasta que son aclivadas por un estfmulo adecuado; debido a que las integrinas no necesitan ser sintetizadas de 1I0VO, 101 respuesta puede ser rApida. Por ejempia, las plaquetas pueden set activadas mediante el contacto con un vaso sanguineo danado 0 por alguna de las mollkulas de sefializaci6n SOlllbles. EI estfmulo activa vias de seiializaci6n intracelular, las cuales a Sll vez act ivan de forma rnpida y permanente una integrina Pl en 101 membrana de 101 plaqueta. aherando su conformaci6n de manera que ahora su dominic extracelular puede unirse 011 Figura 19·62 De que fonnala matm extracelular puede propagar de una celula aotra un orden dentro de un lejldo. Para simplilicar, la figura representa un esquema hlpOletico en el cual una celula influye enla orienlaci6n de las ct'ilulas veclnas. Sin embargo, es mas probable que lodas las celulas puedan afe<:lar la orienlaci6n de las demas.

1070

Capflulo 19: Adhesi6n celular, uniOIlCS celulares y ,"alriz cxtracelular

I. m.t.i! of~tadAeslablececonlaeto con las ctlulas!,!lY IJ). induciendo, a.u ~z. la orientllciOn cte lot citoesqueletos


la. ~lutas Y lIllCretan Yorientan 10. elementos de la maIn! m~s pro"im., propag.ndo asll. orientaei6n a In cliluln@v®

..-

ligando pere Ie integrina

sel'lal aclivadora

l

~

----r. . ACTIVACION CELULAA

IAI REGULACION DEL

ACTIVACION DE LA INTEGRINA

integrina Ilelivade

" -\ J seNllluci6n iotraeeluillt Iiln cas<:ada

LUGAR DE UNION

A LA MATRIZ

mlltriz llxtracelular LAS INTEGRINAS SE DlsaclAN DEL CORTEX DE ACTINA

~

YSE DISPERSAJ 191

• ~•

REGULACION DE LAUNIONAL

CITOESQUELETO integrinas Ilgruplldas

L•

.~

citollsquelato de actina

en un cOfltacto focal

fibrin6geno, prote(na coagulante de 1a sangre, con una gran afinidad, estimulando as! la agregaci6n plaquetaria y la formaci6n del coagulo sangufneo (Figura 19-63A), De un modo parecido, la debil uni6n de los linfocitos T fanto a su aot(gena especffico situado en la superficie de una celula presentadora de antfgenos como a una celula infectada por un virus (se explica en el Capitulo 23), desencadena sef'iales intracelulares en las celulas T, las cuales conducen a una n1pida activaci6n uansitoria de una integrina (LFA-l) en las celulas T. La integrina activada permite a los linfocitos T adherirse fuertemente a la celula diana, de modo que permanecen en contacto can ella el tiempo suficiente para ser estimulados; la integrina vuelve luego a su estado inactivo para permitir que los linfocitos T se liberen. La mayorfa de los mecanismos mediante los cuales algunas sefiales intracelulares activan los lugares de uni6n de una integrina en una celula sangu(nea son desconocidos. Otros fen6menos intracelulares pueden inactivar las integrinas. Por ejemplo, la fosforilaci6n de un residuo de serina en el extremo citoplasmatico de una integrina del tipo ~l durante la mitosis de celulas en cultivo debilita la capacidad de uni6n de la integrina a la fibronectina, 10 cual puede explicar por que estas celulas se redondean y se liberan del substrato durante la mitosis. De manera semejante, en algunas celulas cancerosas la fosforilaci6n de un residuo de tirosina en el extremo citoplasmatico de una integrina unida a la fibronectina, disminuye la capacidad de la integrina para unirse a la lalina, 10 cual parece que contribuye a la relativamente baja adhesi6n de estas celulas a la fibroneclina (Figura 19-638).

Figura 19-63 Las celuias pueden regular ia actlvldad de sus lntegrlnas. En (Alia activaci6n celular induce un cambia dellugar de union extraceJular de la inlegrina, de modo que ahara puede mediar la adhesion celular. En (8) la fosforilaci6n de la tirosina del extremo citoplasmatico de las integrinas disminuye Stl capacidad de union al citoesqueleto de actina. Debido a que las inlegrinas han de unirse al citoesqueleto para poder mediar una fuerte adhesi6n de la celula a la malriz, In fosforilacion provoca (lue las integrinns relajen Stl union con la matriz extracelular.

Las integrinas pueden activar cascadas de senalizaci6n intracelular40 Las macromoleculas de la matriz extracelular presentan notables efectos sobre la conducta de las celulas en cultivo, afectando a su forma, su polaridad, su movimiento, su metabolismo, su desarrollo y otras funciones especfficas. Muchos de estos efectos implican cambios en la expresi6n genica, y casi todos son llevados a cabo por las integrinas. Ya explicamos que las inlegrinas actdan como acoReceptores de la matriz ex:tracelular en celulas animales: las integrlnas

1071

Tabla 19·5 Famlllas de mol&ulas de adhesl6n celular AJgunos mlembros Dependenda de Homofllica 0 Ca 2 +0 de Mg2+ heteromica dela famlUa

Asociaciones con el cltoesquelelo

Asociaciones de unlones ceiuiares

filamentos de actina (vfa cateninas) liIamentos intennedios (vfa desmoplaquinas, placoglobinas y otras protefnas) desconocida

bandas de adhesi6n

ADHESION Cl!LUlA-Cl!LUlA

Cadherinas

Miembros de la familia de las Ig Selectinas (cl!:lulas de la sangre + dlulas endOleliaies exdusivamente) integrinas de las ~Iulas sangufneas

eadherinas E, N, P

,r

homofflica

eadherinas desmosomales

"

homof11ica

N-CAM, LI

no

Selectina P

,r

homomlcao heteromica heteromica

desmosomas

no

desconocida

no

I"""'"

P'g.537)

"

heteromica

mamentos de actina

no

muehos lipos

,r

heterofflica

contactos focales

",b.

,r

sindecanos

no

heterof.flica heterofflica

filamentos de actina (vfa talina, vineulina y otras protefnas) rilamentos intennedios liIamentos de actina

LFA·l (a~bz), Mac-l (aMb:l

ADHESION Cl!LUlA-MATRiZ

Integrinas

Proteoglucanos transmembrana

pladores transmembrana eonectando las moleculas de la matriz extracelular a los filament'os de actina del c6nex celular y que de este modo regulan la forma, la orientaci6n y el movimienlO eelulares. Sin embargo existen evidencias erecientes de que la agrupaci6n de integrinas en los lugares de contacto con la malriz (0 con olras cl!:lulasl puede lambil!:n aclivar algunas vfas de seflalizaci6n intracelu· lar, incluyendo la vfa de fosfolfpidos de inositol; ademas, algunas protefnas intracelulares, incluyendo una tirosina quinasa localizada en los contactos foeales, son fosforiladas en residuos de lirosina. Aunque se desconocen los mecanismos moleculares, cs posible que las agrupaciones de integrinas generen seflales intracelulares que inicien el ensamblaje de un complejo de seflalizaci6n en la cara citoplasmMica de la membrana plasmMica, como hacen las tirosina qllinasas Ii· gadas a receptores de factorcs de crecimiento (se explica en el capftulo 15). Fre· cuentemcntc la senalizaci6n mediante integrinas y receplorcs de factores de crecimicnlO cs nccesaria para una respuesla celular 6ptima: por cjcmplo, muchas cellilas en clillivo no proliferan en respuesta a factores de crecimienlo a menos que las celulas se unan a lraves de inlegrinas a las moleculas de la malriz. eXlracelular. E.I reto est<1 en determinar c6mo interactuan estas cascadas de se· nalizaci6n influyendo a conductas celulares complejas tales como la expresi6n genica y la proliferaci6n celuJar. En la Tabla 19-5 se resumen las moleculas de adhesi6n celular explicadas en este capftuio.

Resumen Las inlegrlnas son los r«eplores prlncipaks que utiliznn las dlll.las animnles para uniru a la. malrlz ulraawlnr. Son helerodimeros que acnlan como tu»plndores transmembrana mediando inlertKdones bidirecdonales entre In n,atrlz atraalll.1072

CapftuJo i9: Adhesl6n celuJar, uniones celuJares y matriz extracelular

hemidesmosomas

no

lnr y el citoesqlleleto th actina. Tambli" aclilan como transduclores th senaies, activando varias vras de senalizad6n Intracelular clUlIIdo son activadtlS mediante la 11.11/611 a la matriz. Una eelula puede regular la actividnd ad/lesiva th SIIS imegrinas mediallle la alteraci611 de Sits lugares de 1I.I"6n 0 $U ",li611 afilamentos de actina.

La pared celular de los vegetales

•

La pared eelular es una malriz extraeelular eompleja que rodea las celulas vegetales. Pue la gruesa pared eelular del eoreho, visible can un microscopio mdimentario. la que en 1663 permiti6 a Robert Hooke distinguir can claridad las celulas y darles despues dieho nombre. Las paredes de las celulas vegelales eolindanles, unidas entre sf formando la planla (Figura 19-64), son generalmenIe gruesas, fuerles, y, 10 mas importante de todo, mas rfgidas que la matriz eelular sintetizada por las celulas animales. Durante la evoluci6n de estas paredes relativamente rfgidas, que pueden lener muehos mier6metros de grosor, las eelulas vegetales primitivas perdieron la eapacidad para desplazarse y adoptaron un estilo de vida sedenlario que ha persistido en lodas las plan las hasla nuestros dias.

La composici6n de la pared celular depende del tipo celular41 En una planta pluricelular, la mayorfa de eelulas se produeen en regiones denominadas merislemos, como se vera en el Capitulo 21. Estas nuevas eelulas generalmente son pequeflas en eomparaei6n can su tamana final, y para poder ereeer posteriormente, sus paredes, denominadas paredes celularcs prlmarlas,

Figura 19-64 Paredes celulares vegetales. (Al E1ectronmicrograffa de una punta de rafz de un junco, mostrando un modelo organizado de celulas que resulta de una secuencia ordenada de divisiones celulares en celulas can paredes celulares rigidas. (B) Secci6n de una pared celular Ifpica separalldo dos celulas vegetales adyacentes. Las dos bandas transversales oscuras se corresponden can los plasmodesmos que atraviesan la pared. (A, cortes(a de Brian Gunning; B, cortes(a de Jeremy Burgess.)

La

pared celular de los vegctales

1073

son delgadas y semirrfgidas. Cuando se deticne el crecimiento y la pared ya no se ha de expandir mas. la pared primaria simplemente se conserva o. mas frecuentemente, se sinteti7..
Las fuerzas de tensi6n de las paredes celulares permiten a las

celulas vegetales desarrollar una presi6n de turgencia 42 EJ medio aClIoso extracelular de una celula vegetal esta constituido por el f111ido contenido en las paredes que rodean la celula. Aunque el f1uido de la pared celular de la planta contiene mas solutos que el agua del media externo de la planta (el suela, par ejemplol, es hipot6nico respecto al interior celular. Este desequilibrio osm6tico es la causa de que la celuJa desarroUe una gran presi6n hidrostdtica intema, 0 presl6n de turgeneta, que empuja hacia la pared celular, exactamente como la cc1mara de una rucda empuja contra la cubiena. La presi6n de turgencia aumenta justo en el punto donde la celula eSla en equilibrio osm6tico, impidiendo la entrada neta de agua a pesar del desequilibrio salino (vease Panel II-I, pag. 552). Esta presi6n es vital para las plantas debido a que es la principal fuerza impulsora de la expansi6n de la celula durante el crecimiento, y propordona la mayor parte de la rigidez mecanica. caracterfstica de los tejidos vegctales vivos. Comparcnsc. por ejemplo, las hojas marchitas de una plallla deshidratada can las hojas turgentes de una planta hidratada correctamente. Es In fuerza mecanica de la pared celular la que permite a las celulas vegetales mantener csta presi6n interna.

La pared celular est<1 constituida por microfibrillas de celulosa entretejidas con una red de polisacaridos y proteinas 43 La fuerza de tensi6n de la pared celular primaria la proporciona la celulosa. Una

molecula de celulosa se com pone dc una cadena lineal de por 10 menos 500 residuos de glucosa unidos entre sf covalememente formando una estructura a modo de cinta, la cual se estabiJiza por enlaces de hidr6geno dentro de la cadena. Ademl1s, se forman enlaces de hidr6geno entre molecuJas adyacelltes de celulosa que hacen que estas moleculas se unan fuenemente unas con Olras formando series paralclas superpuestas, constiruyendo un haz de 60 a 70 cadenas de celulosa. de forma que cada una de eUas tiene la misma polaridad. Estos agregados crislalinos sumamente ordenados, de muchos micr6metros de I~i­ tud, son las denominadas mlcrofibrWas de celulosa Diferentes grupos de microfibrillas estan ordenados en capas 0 laminas. separadas unas de otras por unos 20-40 nm y conectadas por largas molecuJas de hemiceflliosa, que se unen por enlaces de hidr6geno a la superficie de las microfibrillas. La pared celular 1074

Capitulo 19 :Adhesi6n ceJular. uniones celulares y matriz extracelular

pBred celular primllfill

Figura 19-65 Modeloaes<:aladeuna porcl6n de pared celular primaria que mueslra las dos mayo.-es Tedes de poUsacirtdos. Las capas de microfibrillas de celu10sa ordenadas ortogona.lmente (verde) (orman una red mediante enlaces de hidr6geno con moleculas de hemicelulosa (rojo). Esta red es paralela a la red de polisacaridos de tipo pectina (azul).la red de celulosa y de hemicelulosa absorbe fucrzas de traccion, mientras que la red de pectina resiste Itl compresion. La celulosa, la hemicelulosa y 13 pectina se presenlan a panes iguales en la pared celular primaria. La himina media es rica en pectina y cementa las celulas adyacentes.

primaria est;j constilllida por varias de dichas l;jminas dispuestas en una red Inultilaminar (Figura 19-65). Las hemlcelulosas son un grupo heterogeneo de polisacaridos ramificados que se unen fuertemente entre sf y ala superficie de cada microfibrilla de celulosa, facilitando la union de las microfibrillas formando lIna red compleja. Sus funciones son analogas a las de las colagenas asociadas a fibrillas que hemos estudiado anleriormenle. ExiSlen muchos lipos de hemicelulosas, pero lodas elias presentan una larga eslruetura lineal central compuesra por un solo lipo de azucar, del cua! sobresalen canas cadenas de Olros gJucidos. La composicion de azucares de ambas eSlructuras varia en funcion de la especie vegetal y de su estadio de desarrollo. siendo los glUcidos de la estruClura central los que forman enlaces de hidrogeno can las microfibrillas de celulosa. Coexist..iendo con esta red de microfibrillas de celulosa y hemicelulosas existe otra red de polisac:iridos entrelazados constituida par pectillas (vease Figura 19-65). Las pectinas constituyen un grupo heterogeneo de polisacaridos ramificados que contienen numerosos residuos de acido galactur6nico, cargados ncgat iva mente. A causa de su carga negaliva, las peclinas estan muy hidraladas y asociadas a cationes, y se asemejan a los glucosaminglucanas de las celulas animales dcbido a la gran cantidad de espacio que acupan. Cuando se aflade Ca 2• a una soluci6n de molecuJas de pectina. produce enJaces cruzados enlre elias que dan lugar a un gel semirrigido (es 10 que sucede cuando se anade pectina a un zuma de (rula para obtener jalea). Ciertas pectinas son especialmente abundantes en la ldmina media, region central especializada de 1a pared que une las pa· redes de las relulas vecinas; se supone que tales puentes de Caz. conlribuyen a mantener unidos entre s( los componentes de la pared celular. Si son tratados con un agente quelante del Caz•• lodos los lejidos vegel'ales se disocian en sus componentes celulares. Las uniones covalentes tambicn intervienen en la uni6n de los diferentes componentes de la pared celular vegelal, pero se canace muy poco acerca de su naturaJeza. Adem;js de las dos redes constituidas por polisacaridos, que eSlan pre&llllies en tadas las paredes celulares primarias de las plantas, exisle una conlribu~n variable de prolefnas estruclurales. Una c1ase de estas prolefnas canliene grandes cantidades de hidroxiprotina. como la colagena. Se cree que estas prolefnas refuerzan la pared y que son producidos en grandes cantidades como una respuesta local al ataque de microorganismos. Durante la diferenciaci6n las c~lulas La

pared celuJar de los vegetales

1075

Figura 19·66 Orlentaclondelas microflbrillas de celulosa en la pared celular prlmarla de una cBula de zanahoria en credmJento. Esta electronmicrografia de una replica sombreada de una pared celular congelada rapidamente y sublimada exlensivamellle muestra la disposition paralela de las mkrofibrillas de celulosa. orientadas perpendicularmente a1 eje de elongaci6n de la celula. Las microfibrillas estan unidas enlre sf y enlrclazadas formando un complejo andamiaje de moleculas de matriz (comparese con Figura 19·65). (Cortesia de Brian Wells y Keith Roberts.)

utiJizan prOlei'nas estruclurales para mOOificar delerminadas regiones de sus paredes, generando asf la eXlensa gama de paredes sccundarias especiaLizadas funcionalmente y que son caracterfsticas de los lipos celulares maduros (vease Panel I-I, pligs. 18-19). Para que una celula vegetal crezca 0 cambie de forma, la pared celular dene que ensancharse 0 deformarse, pero debido a su estructura cristalina, las microfibrillas de celuJosa individuales no pueden estirnrse. Estos estiramjemos 0 deformaciones de las paredes celulares deben implicar deslizamiento de unas microfibrillas sobe otras, la separaci6n de microfibriUas adyacenles, 0 ambas cosas ala vez. Como veremos a cominuaci6n, la direcci6n en la que se alargan las ceJulas en crecimienlo depende de la oriemaci6n de las microfibrillas de celulosa que se oponen a la deformaci6n de la pared primaria, la cual depende a su vez de la oricntaci6n de los micrOlublllos del c6nex celular sllbyaceme cuando se deposit6 la pared.

Los microtubulos orientan la deposici6n de la pared celular 44 La forma final de la celula vegctal 'cn crecimiento. y par 10 tanlo la forma final de

la planta, viene determinada por la expansi6n celular controlada. La expansi6n se produce cn respuesta a la presi6n de lUrgencia en una direcci6n que depende de la disposici6n de Las microfibriUas de celulosa en la pared. Por consiguiente, Las celuLas anticipan su morfologfa futura controlando la orientaci6n de las microfibrillas que se deposifan en la pared. A diferencia de muchas otras macromoleculas de la matriz. qt se sinteti7.an en el retlculo endoplasmlitico y en eL complejo de Golgi y son secreladas, ta celulosa, como el
Capflulo 19 : Adhesl6n cclular, uniones celulares y matriz extracelular

pr• ...on de

. • ..• . ..turgel'lClii

IN

'" Figura 19-67 La orlentadon de las mlcronbrillas de celulosa de la pared eelular Innuye en la direcdon en la que las eelulas Ie alargan. Las celulas en (A) y (B) parten con una forma idelllica (representada aqui como cubos) pero con diferente orielllacion de las microfibrillas de celulosa de sus paredes. Aunque la presion de turgencia es uniforme en lodas las direcciones. la debilidad de la pared celular provoca que cada celula se elongue en una direccion perpendicular a la orientacion de las microfibrillas. las cuaJes tienen una gran fuerza de tension. La fonna final de un orgnno 0 de un brote viene determinada par la direccion enla que sc expanden las cclulas.

(8)

(A)

gua en la cara externa. La mayor parte de miCfofibriLias de las cclulas en crecimiento se disponen de manera perpendicular al eje de elongaci6n celular (Figura 19-66); aunque 1a orientaci6n de las microfibrillas de las l<1minas extemas puede ser diferente. 10 que InOuye de forma predominante en la dirccci6n de 13 expansi6n celular es la orientaci6n de las laminas internas (Figura 19-67), Una pista importante para comprender e6ma se produce esta orientaci6n fue el descuhrimiemo de que la mayona de los mkrotubulos citoplasmo1ticos del c6rtex de In celula vegetal se disponen con la misma orientaci6n que las microlibrillas de celulosa que sc van depositauda en aquella regi6n. Estos micrOluhulos corticales conslituyen 10 que se denomina la red cortical, situdndose muy pr6ximos a la cara citoplasmMica de la membrana plasmatica y unidos a ella par protefnas mal caracterizadas (Figura 19-68). En muchas tipas y formas de c~llIlas vegemles se observa una orientaci6n congmente de la red cortical de microtubulos (en cl interior de la membrana plasmatica) y las microfibrillas de ccllliosa (en la cara extcrna de esta membrana), y se presenla durante la deposici6n tanto de la pared celular primaria como de la secundaria. $i la totalidad del sistema de microtUbulos conicales se desensambla mediante el tratamiento de un tejido vegetal con una droga despolimerizadora de microlllbulos, las consecuencias en la posterior deposici6n de celulosa no son tan c1aras como podrfa esperarse. EI tratamiento con la droga no afecta la producci6n de nuevas microfibrillas de celulosa, y en algunos casos las celulas pueden cominuar depositando nuevas m..icrofibrWas siguiendo la oricnlaci6n preexistentc. Sin embargo, cualquiera de los cambios que normalmentc se producman en el patr6n de dep6sito de microfibrWas entre las laminas consecutivas esta bloqllcado invariablemente. Aparcntcmente la oriemaci6n de las microfibrillas preexistentes puede~opagarse incluso en allsencia de microulbulos, pero cualquier cambio en la deJJ(m'ci6n de las microfibrillas de celulosa requjere que exislan microtubulos intactos para determjnar la nueva orientaci6n. Estas observaciones son coherentes con el siguiente modelo. Se cree que los complejos que sintetizan la celulasa de la membrana plasmatica generan y van segregando las molkulas de celulosa. Probablement'e a medida que se sintetizan las molkulas de celulosa y se autoensamblan formando las microfibriUas, el La pared celular de los vegctales

Figura 19-68 Red cortical de mlcrotubulos en una celula vegetal. (A) Secci6n de una celula de rafz de

heno mOSlrando un ordenamiento c:ortic:a1 de los microtubulos que se encuenlran debajo de la membrana plasmdlica. Estos mic:rotubulos estdn orientados perpendicularmenle al eJe longitudinal de la ctHula. (8) celula alslnda de In punta de la raiz de una ceboUa. {Cl La misma celula teiUda par inrnunolluorescencia que mueSlra el ordenamiento cortical transversal de los microrubulos. (A, conesfa de Brian Gunning; By C. cortesfa de Kim Goodbody.l

1077

eJltremos distales de microfibril!es de celulose en Ie pered prll8Jlistente

/\ membrene pl.sm't~

./'

CrTOSOL a.1llm

mi(:tQtubulo lIdtlerido e III membrena plnrnjla

extremo distal de cada microfibriJIa forma enlaces cruzados con la capa anterior del material de la pared. Sin embargo, durante el crecimiento los exuemos proximales de los complejos sintetizadores podrian tener que desplazarse a 10 largo de la membrana en la djrecci6n de sfntesis. Puesto que las microfibriJIas de celulosa en crecimienlo son muy rfgidas. cada capa de microfibrillas tenderfa a desplazarse por la membrana en la misma orientaci6n que la capa anterior, yel siguienle complejo de celulosa sintasa 10 haria a 10 largo de la trayectoria de las m..icrofibriUas preexislcntes. Sin embargo, los microttibulos pueden cambiar esta d..irecci6n predetenninada en la que se desplazan los complejos simasa: pueden crear barreras en la membrana plasmMica que actlien como las orillas de un canal constrinendo el desplazamiento de los complejos sintasa a ejes paralelos (Figura 19-69). Desde este punta de viSla la sfntcsis de cclulosa puede tener lugar can independencia de los microtlibulos pcro est~ determinada espacialmente cuando los microtlibulos corticales esu\n presentes ya que defmen los dominios de membrana dentro de los cuales el complcjo enzim~tico pucde moverse. Las celulas vegetales cambian su direcci6n de elongaci6n y, por Ian to, Sll fllturo plano de crecimiento y divisi6n mediante un repentina cambia en la orientaci6n de su red cortical de microtlibulos. Puesto que las celulas vegelales no pueden desplazarse (est<\n aprisionadas por sus paredes), la morfologfa de un vegetal pluricel\llar depende del control de la orientaci6n de estos microtubulos durante su desarrollo. Na se sabe c6mo se regula la organizaci6n de estos microlubulos, si bien se ha demostrado que pueden reorientarse n1pidamente en respuesla a estfmulos exuacelulares, incluyendo los factores de crecimienlO vegetales de bajo peso molecular tales como el etileno y el deMo giberelico.

Figura 19·69 Modelo sobre como la orlentacl6n cortical de los microtubul05 puede determlnar la orlentacl6n de las mlcroftbriUas de celulosa que se deposltan. Los grandes complejos celulosa sinlasa son prolcfnas inlcgrales de membrana que continuamente simelizan microfibriUas de celulosa en la cara eXlema de la membrana plasmlilica. Los extrcmos distales de las rfgidas microfibrillas se integran en la textura de la pared, micntras que su elongacl6n. en los extremos proximales, empuja el complejo slntasa a 10 largo del plano de la membrana Debido a que la red conical de los microtubulos estli proxima a 1a membrana plasmlitica, eonfinando los complejos a sureos membranosos definidos, la orientaci6n del microttibulo determina el eje a 10 largo del cual se depositan las microfibrillas.

Resumen Las dlllw uegetaks estdn rodeadas por una rlgidn matriz extracelular, en forma de llna pared celulilr. quees iii responsable de iii mayorlo de las caraeterlsticas tlpicas del tipo de IIldn uegetnl. La pared celular estd oonstituidn par resistentes micro--

ftbrlilas de celulosa induidns en una malrlz altamente entre<:ruzadn de polLuu:drldos (prlncipalmente pectinaJ y hemialuiosa) y glllOOprolelnas. Una ordelU1C16n oortical de microtlibldos PIU'de determinar la orienUU:i6n de las microJibrllku de celuiosa qlll' U depositnn, las etudes, a su ~ detennlnan iii manera en qlU las c:elulas Sl' expanden y por oonsiguienll' la forma Jinal de las cilulas., asl como sus patrones de dillisl6n c:elular. 1078

Capftulo 19: Adhesi6n celular. uniones celulares y matm extraCl'lular

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Electronmicrograffa de barrido de espemlalOwides sobre la superficie de un 6vulo de erizo de mar. (Por corles{a de Brian Dale.)

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Celulas germinales y fecundacion

20

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•Pen'''''''''

Para la reproducci6n no es imprescindible el sexo. los organismos uniceluJares puetlcn reproducirse mediante una simple divisi6n mit6tica. La mayorfa de las plantas se propagan vegct3tivamente mediante la rormaci6n de agregados pluri-

celuJares que, poslcriormente, se separaran de la planta madre. De manera semejanlC en el reino animal una Hydra pluricelular puede producir descendien· tes por gemaci6n (Figura 20-I). las ant~monas y los gusanos marinas pueden

dividirse en dos rnitades, regenerando carla una de las zonas de la mitad que les falta. Asf mismo, existen especies de laganos represenradas exclusivamente por hembras, las cuaJes se reproducen sin apareamienro. Aunque esta reproducci6n asexual es simple y directa. da lugar a una descendencia que es geneticamente id~nl.ica al organismo patemo. En cambio, la reproducel6n sexual irnpLica la mezcla de los genomas procedcnles de dos individuos distintos, para producir descendientes que suelen diferenciarse geneticamenle entre Sl Ylambien de sus dos progenitores. Parece pues que la reproducci6n sexual ha de presentar grandes ventajas, dado que ha sido adoplada por la gran mayoria de las plan las y de los animales. Muchos procariotas y eucariotas unicelulares incluso, han desarrollado la capaGi.d.ad de reproducirse sexual mente. ESle capftulo esta dedicado a la rnaquinaria cellJrM...de la reproducci6n sexual. Antes de estudiar con detalle e6mo aetlin esta maquinaria, nos detendremos a considerar por que existe y que bcncficios aporia.

Las venta~s del sexo EI cicio de la reproducci6n sexual supone una altemancia de generaciones de celulas haploides -cada una de las cuales contiene una dotaci6n senciUa de cromosomas- con generaciones de celulas dlploides --cada una de las cuales contiene una dOlaci6n doble de cromosomas. La mezcla de los genomas se consigue por medio de la fusi6n de dos celulas haploides fonnando una ceJuJa dipJoide. Posterionnente, cuando un descendiente de la celuJa diploide se divide por medio del proceso de meiosis (Figura 20-2) se generan nuevas celulas haploides. Durante la meiosis y antes de que los cromosomas sean reparlidos en conjuntos haploides, los cromosomas de la dOlaci6n diploide intercambian DNA mediante cl proceso de recombinaci6" gd'l;ea. De esla manera, cada celuJa de la nueva gencraci6n haploide recibe una dOlaci6n genica diferenle, de manera que cada cromosoma presenla unos genes que provienen de una eelula de la generaci6n haploide anlerior y otros de otra. Asi, a traves de ciclos de haploid fa, fusi6n ceJu-

Figura 20-1 FOlograffa de una Hydra en la que R estan rormando dos nuevos organlsmos por gemacl6n (jled,as). Los descendientes. genelicamentc identicos al padre. se separamn de el y vivinin indcpendicnlemcmc. (Por conesfa de Amala Hombruch.)

1083

lar, diploidfa y meiosis desaparecen las antiguas combinaciones de genes y se crean otras combinaciones nuevas.

En los animales pluricelulares J la fase diploide es compleja y larga mientras que la haploide es sencilla y corta Las cclulas proliferan median Ie divisiones mit6ticas. En la mayorfa de los organismos que se reproducen sexualmente, la proliferaci6n tiene Jugar durante la fase diploide. Algunos organismos primitivos, como derlos tipos de levaduras, son excepcionales en el sentido de que son las cclulas haploides las que prollferan mit6ticamente mientras que las celulas diploides, una vez formadas, entran directamente en meiosis. En las plantas ocurre un caso menos extremo, ya que presentan divisiones mir6ticas tanto en la fase haplo~de como en la diploide. Sin embargo, en las plantas mas primitivas la fase haploide es muy breve y sencilla, mientras que la diploide ocupa un largo perfodo de desarrollo y proliferaci6n. Casi lodos los animales pluricelulares, incluidos los vertebrados, se encuentran duranle la practica tOlalidad del cicio vital en un estadio diploide: las cclulas haploides tiene una corta exislencia, no se dividen y eSlan altamente especializa· das para realizar la fusi6n sexual (Figura 20-3). Las eelulas haploides que estan especializadas para la fusi6n sexual reciben el nombre de gametos. Tfpicamente se forman dos tipos de gametos: uno es grande e inm6vil y se denomina oocito (0 huevo) y el otro es pequeno y m6vil y se denomina espermacozoide (Figura 20-4). Durante la fase diploide que sigue a la fusi6n de los gametos, las celulas proliferan y se diversifican formando un organismo pluricelular complejo. En la mayorfa de los animales se puede estableeer una distinci6n uti! entre las celulas de la linea germinal, de la que derivara la siguiente generaci6n de gametos, y las ceLulas somatlcas, que forman el reSIO del organismo y lllueren sin dejar progenie. En cierto sentido, las eelulas somMicas unicamente existen para ayudar a las celulas de la Ifnea germinal (celulas gennlnalesl a sobrevivir y propagarse.

organismos diploides

organismos tlaploides

/ APAREAMIENTO

e 6\1ulo tlaploide

Cil

espermatozoide tlaploide

zigoto diploide

MEIOSIS

F£CUNOACION

6)

clilulas tlaploides

e e e e

zigoto diploide

j

MITOSIS

organismos tlaploides organismos diploides

EUCARIOTAS SUPERIORES

1084

CIERTOS EUCARIOTAS INFERIORES

Capftulo 20: Celulas germinales y fecundaci6n

LAS C~LULAS HAPLOIDES SE FUSIONAN FORMANOQ UNA CELULA DIPLOIDE

LA C~lULA DIPLOIDE SE DIVIDE FORMANOQ CELULAS HAPLOIDES

Figura 20-2 Cicio vilal sexual. Implica una ahernancia de generaciones de celulas haploides y diploides.

Figura 20-3 Celu1as hapioides y dlpioides en el cicio vilal de eucarlOlas superlores y algunos eucarlolas inrerlores. Las celulas de los organismos eucariotas superiores proliferan durante la fase diploide, fonnando un organismo pluricelular; s610 los gamelos son haploides. En algunos eucariotas illferiores, en cambio, Jas celulas haploides prolireran, y Ja unica ceiula dipJoide es el zigota. Que existe transitoriamente despues del apareamiento. Las ceJuJas haploides se han dibujado en raja y las diploides en aztll.

Figura 20-4 Ekc::tronmlcrograffa de barrido de un ooclto de mmeja con numerosos espcrmatozaldes dJspuestos en su supcrflde. A pe5ar de que se han unido a16vu1o muchas espennatozoides. I1nicameme uno de elias 10 fCClindanl., como disclilimos mas adel31ue. {Par cortes(a de David Epel.l

La reproducci6n sexual confiere una ventaja competitiva

a los organismos que se encuentran en un ambiente que cambia de forma i.mprevisible l

I

La maquinaria de la reproducci6n sexual cs elaborada, y los recursos que se dedican a ella son importantes. tPOT que aparcci6 y que bcneficios reporta? Me· djante la recombinaci6n genclica los individuos sexuados engcndran una descendencia imprevisiblemenlc desiguaJ. cuyas genotipos lienen. por razones de azar, lantas probabiJidades de representar un cambia para mejorar como para cmpeorar. Por 10 tanIO, ipOT que deberian tener los individuos sexuados una ventaja compcliliva [rente a los individuos que se reproducen de una manera fiable. a traves de un proceso asexual? Este problema deja aun perplejos a los genetistas, pero 1a conc!usi6n general parece ser que la redislribuci6n de los genes a lfaves de la reproducci6n sexual ayuda a la especie a sobrevivir en un ambiente que sufre aJteraciones imprevisibles. Si un progenitor produce nUlllerosos dcscendientes. con una gran variedad de combinaciones genicas, existen m~s probabilidades de que como minimo uno de sus descendiellles tenga el conjunto de caracterfsticas necesarias para sobrevivir. Se han propueslO attas muchas ideas para explicar las velllajas compet'ilivas de la reproducci6n sexual. Una de cllas sugiere c6mo pudo suceder una de las primeras etapas en la cvoluci6n del sexo. L..1 evoluci6n depende en gran manera de la compelencia enlre individuos que son portadores de alelos, 0 varianles. al· tcmativos producidos por mutaci6n de determinados genes. Supongamos que dos individuos de una poblaci6n sufren mUlaciones beneficiosas que afectan a diferentes foci gem!ticosy, par consiguicnte, ados funciones dislintas. En una es· pecic estrictamente asexual, cada uno de estos individuos dant lugar a un clon de descendienles mutanles. y los dos clones competir~n hasta que uno triunfe sobre el Olro: una de las dos mutaciones beneficiosas se difundim a traves de la poblaci6n mientras que la alIa, a la larga, se perderfi.. Supongamos ahora que uno de los mutantes originales posce una particularidad adicional. delerminada geneticamente, que 10 capacita para incorporar ocasionalmente genes dc alras celulas. Durante el pedodo competilivo. la adquisici6n de genes de una celula del clan competidor implica. probablemente. la producci6n de una celula portadora de ambas Illutaciones beneficiosas. Tal celula lendrA una probabilidad mayor de exilO que las otras, y dicllO exilo asegurara la propagaci6n del rasgo que la Las ventajas del sexo

1085

eapacita para ineorporar genes de otras eelulas. De esta forma, esla rudimenlaria eapacidad sexual puede haber sido favore<:ida por la selecci6n nalUral. Cualquiera que scan los orfgenes del sexo, es notable que la pn\clica totalidad de los organismos complejos actuales hayan evolueionado a traves de generaciones de reproducci6n sexual y no de reprodueci6n asexual. La mayorfa de los organismos asexuados, aunque son abundantes, han permanecido sencillos y primilivos. Vamos a examinar ahora con detalle los mecanismos celulares del scxo. empezando con los procesos de la meiosis, en la que se produce la re<:ombinaci6n genetica y las celulas diploides de la linea germinal se dividen produciendo gametos haploides. Oespues consideraremos los gametos en sf mismos y. finalmente, el proceso de la[ecllndacioll, en el eual los gametos se fusionan formando un nuevo organismo diploide.

Resumen La reproducd6n sex,ud implica IIna alternallcia dclica de estados dip/olde y haploide: 1m dlulm diploides se dividen mediallte la meiosisfornumdo dlillm haploides y 1m dlllliu Imploilks procelkntes de dos itrdividuos 51! fluionnll de dos en dos forn'aluW nllelHU db,1m dip/oides. En e/ proceso, los genon,," se meu:lall y recomblnnn produciendD lmlividuos qlle poseen nll€lHU dotaciolles de genes. Ln mayor parte lkl cicio vital de Ltu plantas y ck los aninmw SIlverlOres tra"scllrre en In fase diploide, sielldo la fase haploide muy coria. La reprod,ux16n sexual se 1m visto favorec:/da por la evolllcl6" debldo a que la rer:omblnnd6n gell/fica al azar aume,,fa la probabilldnd de prodllcir, como m{nimo, aiglUlOs tlesamdlentes que puedan sobrevivir en.", ambie"recu}'t1 varlabilldnd es imprevisible.

Meiosis' La eomprensi6n de que las celulas gemlinales son haploides y, por eonsiguieme. se tienen que producir mediante un lipo espe<:ial de divisi6n celular, se obtuvo como resultado de una observaci6n, la cual tambien fue una de las primeras en sugerir que los cromosomas son los portadores de la infonnaci6n genetica. En 1883 se descubri6 que mientras que el huevo fecundado de un determinado gusana canliene cuatro eromosomas, los nucleos del oocico y del espermacozoide s610 conticncn dos cromosomas. La teorfa cromos6mica podrfa expJicar, por tanto, la vieja paradoja de que a rnenudo las COnlribuciones materna y paterna al canicier de la pro~ie parecen iguales, a pesar de la enorme diferencia de 13· mafio entre el oocira y el espermatazoide (vease Figura 20-4). EI hallazgo implicaba tam bien que las celulas germinales se han de formar a traves de un tipo especial de divisi6n nuclear, mediame el eual la dOlaci6n eromos6mica queda dividida exactamente por la milad. Este tipo de divisi6n se denomina meiosis. euya raiz griega significa disminud6n. (No exislc conexi6n con el termino "mitosis", el eual proviene del vocablo griego mifOS, cuyo significado es hilo, que hace referencia a que euando los cromosomas se condensan duranle la divisi6n nuclear -proceso que liene lugar tanlo en las divisiones mil6ticas como en las mei6licas- se parecen a un hila.) EI eomportamiento de los cromosomas duranle la meiosis se presenl6 mucho mas complejo de 10 que se esperaba. Par ello no fue hasla el inicio de la decada de 1930, y como resuhado de eoncienzudos esludios cilol6gicos y geneticos, que pudieron eslablecerse las prineipales caraelerfsticas de la meiosis.

La meiosis implica dos divisiones nucleares en lugar de una sola Exeeptuando los cromosomas que delerminan el sexo (cromosomas sexllales), eada nueleo diploide contiene dos versiones muy semejantes de cada uno de los Otros eromosomas (los awosomas), una de los cuales proviene del padre y la otta de la 1086

Capftulo 20 : C~lulas gcrminaJes y fecundaci6n

madre. Ambas versioncs se dcnominan hom61ogas, y en la mayorfa de las ~lulas existen de forma complctamente separada, como cromosomas indcpcndientcs. Cuando cada cromosoma se duplica mediante la replicaci6n del DNA, inicial· mente las copias gcmelas de los cromosomas complctamente replicados pennanecen estrechamente asociadas. y se denominan cromlitldas hermanas. En una divisi6n mit6tica (descril3 en el Capitulo 18), las cromatidas hennanas se alinean sabre el huso dirigiendo sus fibras dnet0c6ricas hacia polos opueslOS. Cuando las cromatidas hemlanas se han separaclo una de la otra, en 13 anafase, se denomi· nan cromosomas. De esla manera las celulas hijas farmadas por mitosis hcredan una copia de cada cromosoma paterno y otra de carla cromosoma materna. Por el contrario. un gametQ haploide. producido por divisiones de una cIBula diploide durante la meiosis, ha de contener la mitad del mlmero original de cromosomas -un solo miembro de cada uno de los pares de cromosomas hom610gos- de fonna que el gameto dispone de la copia paterna 0 de 13 copia la malema de cada gen, pero no de ambas. Este requerimiento implica una nueva exigencia de la maquinaria de la divisi6n celular; el mecanismo que se ha desarrollado para conseguir que se produzca esta dislribuci6n adicional requiere que los cromosomas hom610gos se rcconozcan entre si y se apareen fisicamente antes de ali nearse sobre el huso. Este apareamiento de las copias de cada cromosoma paterno y materno es especifico de la meiosis. Mas adelante discutiremos de quI! fonna cada cromosoma rcconoce a otro de fonna corrccta. Dado un mecanismo para el apareamiento de los cromosomas hom61ogos maternos y paternos y su posterior separaci6n sobre el huso, las cl!lulas podrfan. en principio, producir la meiosis mediante la simple modificaci6n de un solo cicio mjt6tico celular en el que la duplicaci6n cromos6mica (fase S) se omitiera: si los cromosomas hom61ogos no duplicados se aparearan antes de la fase M, la divisi6n celular resultante podrfa producir directamente dos cl!lulas haploides. Sin embargo, por razones que desconocemos el proceso mei6tico actual es ml1s complejo. Antes de que los cromosomas hom61ogos se apareen, cada uno de ellos se replica produciendo dos cromMidas hermanas. como si se Iralara de una divisi6n mit6tica. Las caracterfsticas tfpicas de la meiosis s610 se hacen evidentes despul!s de la replicaci6n del DNA. En lugar de separarse, las cromaridas hermanas se comportan como una unidad, como si la duplicaci6n cromos6mica no hubiera tenido lugar: cada uno de los cromosomas hom610gos duplicados se empareja con su cornpaiiero, formando una estructura denominada bjlJ(lleme. que contiene cuatro crom<1tidas. Las estructuras bivalentes se alinean sobre el huso y, enla anafasc, los dos hom61ogos duplicados (cada LillO de ellos formado par dos cromaridas hermanas) se separan, desplaz<1ndose hacia palos opucstos. A consecuencia d4lue las crom<1lidas hermanas se comporlan como una unidad. cuando la ccruia mei6tica se divide cada ccluJa hija recibe dos copias de uno de los dos hom610gos. Por 10 tanto, las dos progenies de csta divisi6n (c1lvlsl6n I de la meiosis) conticnen una cantidad doble de DNA, pero difieren de las cclulas diploides normales en dos aspeclOs: (I) cada una de las dos copias de DNA de cada cromosoma deriva de uno de los dos cromosomas hom610gos presentes en la celula original (excepto que se haya producido rccombinaci6n genctical. y (2) estas dos copias se heredan como cromatidas hermanas estrechamente asociadas, como si fueran un unico cromosoma (vl!ase Figura 20-5). Ahora, se puede producir la fomlaci6n de los verdaderos nucleos de los gamelOS de manera bastante sencilla, a traves de una segunda divisi6n celular. la dlvisi6n II de la meiosis, sin que se produzca otra replicaci6n del DNA. Los cromosomas se alinean sobre un segundo huso y las croml1t.idas hermanas se separan como en una mitosis nonnal produciendo celulas con un contenido haploide de DNA. Asf pues. la meiosis consta de dos divisiones celulares sucesivas que se producen tras una sola fase de replicaci6n de DNA, por 10 que a panir de cada cclula que sufre la meiosis se producen cuatro cl!lulas haploides. En la Figura 206 se comparan la meiosis y la mitosis. A veces el proceso mei61ico se desarrolJa de manera anonnal y los hom610gos no se separan -fen6meno conocido como no-dlsyuncl6n. En este caso, alMeiosis

homologo paterno homologo materno • REPUCACION DEL DNA

....._'APAAEAMIENTO DE CROMDSOMAS _~,.HOMOlOGOS

I

lOS PARES HOM6LOGOS DE

CROMOSOMAS OUPlICADOS SE AlINEAN SOBRE El

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Figura 20-5 AcontecimJentos que se producen durante la primera dlvlsl6n celular de Ja meiosis. Para mayor claridad tinicamente se muestTa un par de cromosomas hom6logos. £1 apareamiento de cromosomas hom610gos (simplemente ~hom6Iogos~) es tfpico de la meiosis. Cada cromosoma se ha duplicado y se halla unido a su cromatida hennana anles de que se produzca el emparejamiemo. Como se mueslra mediante la rormaci6n de los cromosomas parte de los cuales son rajas y parte son negros. el apareamiento de los cromosomas durante la meiosis produce entrreruzarnienro (recombinad6n g~nica) entre cromosomas hom610g0s. como se explica en el textD.

1087

MEIOSIS

DIVISION CElULAA NORMAL hom61<>go

paterno hom61ogo

mltema

I

REPUCACION DEL DNA

REPUCACION DEL DNA

I

~AJlEAM"NTO I

DE CflOMOSOMAS

tliiiiif\MOLOGOS

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PARES HOMOlQGOS DE CROMOSOMAS DUPUCADOS /!!l"-'Sf AUNEAN SOME El HUSO

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lOS CROMOSOMAS DUPUCAOOS SEAUNEAN INDMDUAlMENTE SOBRE El HUSO

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gunas de las celulas haploides produddas carecen de algun cromosoma, miel1(ras que ouas poscen mas de una copia. Tales gametos forman embriones anormales, la mayorfa de los cuales mueren. Sin embargo, algunos de ellos sobrevi· ven: par ejemplo, el s(lldrome de Down en humanos est8 causado par una copia eXIra del cromosoma 21 a causa de la no-disyunci6n durante las divisiones mei6ticas I a II.

La redistribuci6n g~nica aumenta debido at entrecruzamiento entre las crornatidas hom61ogas no hermanas3 A menos de que se trate de gametos identicos, los descendientes de los mismos padres nunca son genelicamente iguales. Ello es debido a que, mucho antes de que se fusionen los dos gametos, se producen dos tipos de redistribuciones genicas durante la meiosis. 1088

Capftulo 20 : a:lulas germinales y fecundaci6n

DIVISION CElULAR

Figura 20-6 Comparacl6n entre las divlslones mit6tlcB y mel6lica. Como en la figura anterior, tiniLamente se muestra un par de cromosomas hom6logos. En la meiosis, tras la replicaci6n del DNA. se requieren dos dMsiones nucleares (y celulares) para producir los gamelos haploides. Por 10 lanto, cada celula diploide que entra en una meiosis da lugar a cualrO celuJas haploides mienlras que cada celula diploide que se divide por milosis produce dos celulas diploides.

Figura 20-7 Dos conlrlbuclones prlnclpales 8 18 redlstrlbucldn del material producen durante la meiosis. (Al La distribuci6n independiente de los hom61ogos palerno y materno duranle la primera divisi6n mei6tica produce 2- gamelOs haploides diferenles para un organismo con n cromosomas. Aquf n "" 3, por 10 que exislen 8 gametos diferentes posibles. (B) EI entrecruzamienlO durante la prorase meidtica I intercambia segmentos de cromosomas hom610g0s, rediSlribuyendo los genes de los cromosomas. Debido a las muchas diferencias en la secuencia de DNA que siempre exislen en cualquier par de hom6logos, ambos mecanismos incrementan la variabilidad genMica de los organismos que se reproducen sexualmente.

g~nJco que se

Un tipo de redisuibuci6n es una consecuencia de la distribuci6n al azar entre las celulas hijas de los dislintos hom610gos patemos y matemos, durante la divisi6n mei6rica I, a consecuencia de la cual cada gameto adquiere una dotaci6n diferente de los cromosomas matemos y patemos. 5610 debido a este proceso, un [ndividuo puede, en principio, producir 20 gametos geneticamente diferemes, donde n es el numero hoploide de cromosomas (Figura 20-7A). As!, en los humanos. cada individuo pllede producir par 10 menos 223 =8,4 x lOs gametos geneticamente diferentes. Sin embargo, el mlmero real de varianles es mucho mas elevado debido a un segundo tipo de distribuci6n, denominada entrecntzamlento cromos6m1co, que tiene lugar durante la meiosis. Se produce durante la larga fase de la divisi6n mei6tica (, en el cual se intercambian fragmentos de cromosomas hom610gos. En cada par de cromosomas humanos se producen por tennino media entre dos y tres entrceruzamientos durante csta fase. Este proceso mezcla el conienido genelico de cada uno de los cromosomas de los gametos, tal como se indica en la Figura 20-76. EI entrceruzamiento cromos6mico supone la rotura de la doble hclice de DNA de una cromatida materna y de una cromatida paterna hom61oga, de forma que se intercambian fragmentos entre dos crom.1tidas no hermanas de una fonna recfproca mediante un proceso conocido como recombinacldn genica general. Los detaUes moleculares de este proceso se estudian en el Capitulo 6. Las consecuencias de cada proceso de recombinaci6n pucden ser observadas citol6gicameme en las ultimas etapas de la divisi6n mei6tica i, cuando los dos cromosomas estan altamente condensados. En esta etapa, las cromatidas her· manas estan estrechamente colocadas una junto a otra a 10 largo de toda su longitud. Los dos hom610gos duplicados (materno y paterno) permanecen conceta· dos ffsicamente por unos puntos determinados. Cada uno de estos puntos, Uamado qulasma, corresponde a un entrecruzamiento entre dos cromatidas no hermanas (Figura 20·8). En esta elapa de la meiosis. cada par de hom610gos duplicados, 0 bivalellte, esta unido como minima por un quiasma. Muchos bivalentes contienen mas de un quiasma, 10 cua! indica que se pueden producir mUltiples entrecruzamientos entre los homdlogos.

El apareamiento mei6tico cromos6mico culmina con la formaci6n del complejo sinapton~mico4

trlS parIS de cromosomas hom61ogos

DlSTRIBUCION INLPENDIENTE DE lOS CROMOSOMAS MATERNOS Y PATERNOS HOMOlOGOS DURANTE LA DlVrtON MEIOnCA.

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ENTRECRUZAMIENTO DURANTE LA PROFASE t

DE LA MEIOSIS

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Durante la primera profase mei6tica ocurren complejos cambios morfol6gicos en los cromosomas cuando se aparean (sinapsis) y cuando empiezan a separarse quitsm.

Agura 20·8 Cromosomas homdlogos apareados dunmte 18 translcldn hada la melafase de la dlvlsldn meldtlca I. Con anterioridad, duranle la profase. se ha producido un unico enlrecruzamiento que da lugar a un quiasma. Ob~rvese que las cuairo cromll.tidas eslll.n dispUCSl8S en dos pares de cromll.tidas hermanas y que las dos cromll.lidas de cada par eSIll.n eSlrechamenle alineadas por su eje longitudinal y unidas por los centr6meros. Por ello, la unidad de cualro crornl'itidas recibe el nornbre de bivaleme.

Meiosis

crom'tidaa hermanas

1089

EPTOTENO cromatidas hermann poternas

cromatidas hermanas matarnas

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T1EMPO

(desinapsisJ, durante In primera profase mei6lica. Tradicionalmente esta profase esta dividida en cinco elapas secuenciales -leptoteno. zigoteno, paqllitello. dip/atena y diacinesis- definidas por estos cambios morfol6gicos. EI acontecimiento mas notable es el inicio de la sinapsis cromos6mi~a Intima en el zlgoteno, cuando entre los dos grupos de croma:tjdas hcrmanas de cada bivalente se empieza a desarrollar una estructura compleja, denominada complejo sillaptom?mico. Se dice que el paqulteno empieza en cuanto la sinapsis se completa, y generalmente persiste duranle dias, hasla que empieza la desinapsis en la fase de dlploceno, momento en que se observan por primera vez los quiasmas (Figura 20-9). La recombinaci6n genica requiere una estrecha aposici6n entre los cromosomas recombinantes. EI complejo slnaptonemlco. que se forma inmediatamente antes del paquiteno y desaparece inmediatamellle despucs, mantiene los cromosomas hom610gos unidos y estrechamente alineados formando un bivalente; se ha sugerido que juega un papel importante en el proceso de recombinaci6n. EI complejo sinaptonemico esta formado por un largo nucleo proteico, en forma de escalera, en cuyos lados opuestos se hallan los do's hom61ogos formando un largo par cromos6mico lineal. Las cromalidas hermanas de cada hom61ogo se mantienen cstrechamente empaquetadas entre sf, y su DNA se extiende desde el mismo lado de la escalera proleica, formando una serie de bucles (Figura 20-1 0). No se sabe por que se alinean las zonas hom610gas de los cromosomas. Es poco probable que se produzca una conexi6n continua a 10 laIgo de los cromosomas que interactl1an, ya que la cromatina de un hom610go esta clara mente separada de la de su compafiero en el complejo sinaptoncmico. Se ha propueslo que la interacci6n inicial entre cromosomas hom610gos esta mediada por interacciones de pares de bases complementarias del DNA en regiones discretas a 10 largo de cada cromosoma, Este reconocimiento puede ocurrir durante el zigoteno 0 incluso antes, cuando los cromosomas todavfa no estan muy condensados: tIas la condensaci6n de los cromosomas, la formaci6n del complejo sinaptonemico debe empaquetar entre sf las zonas remanentes de los cromosomas.

Se cree que los n6dulos de recombinaci6n median los intercarnbios de cromatidas5 Aunque el complejo sinaptonemico proporciona la trama estructural necesaria para los acontecimientos de la recombinaci6n, probablemente no es el mecanismo a traves del cual ambos cromosomas se mantienen unidos. Se cree que el proceso activo de recombinaci6n se halla mediado por unos grandes n6dulos de recombinacl6n, que son grandes ensamblajes que contienen protefnas, de un diametro de unos 90 nm, (Como referencia, una gran molecula pIoteica globular de un peso molecular de 400 000 daltons tiene un diametro de aproximadamente 10 nm.) Los n6dulos de recombinaci6n se hallan situados a intervalos en el complejo sinaptonemico, dispuestos como pelotas de balollcesto sobre una es1090

Capflulo 20: Ce:luJas germlnalcs yfecundacl6n

• Figura 20-9 Curso temporal de la slnapsls y de la deslnapsls cromosomIca durante la profase melotlca I. Tan s610 se muestra un bivalente. El estadio de paquitello se define como el perfodo durante el que existe un complejo sinaptonemico completamente formado. En los gametos de los animales hembra el posterior estadio de dip/orello es un perfodo enormemente largo de crecimiento celular, duranle el cuallos cromosomas se hallan descondensados y transcribiendo muy aclivamente. Ella acaba con la diacinesis -el estado de transici6n a la metafase- en el cuallos cromosomas se vuelvcn a condensar y cesa la transcripci6n. En los gametos macho el diploteno y la diacinesis son breves y menos diferenciados.

calera, entre las dos crornMidas hermanas (vease Figura 20-10). Se cree que marcan la localizaci6n de una gran "maquinaria de recombinaci6n" multienzimatica que une entre si regiones del DNA de las cromatidas materna y paterna a traves del complejo sinapton~mico de 100 nm de anchura. La evidencia de que el n6dulo de recombinaci6n presenta esla funci6n es indirecla: (I) el numero tOlal de n6dulos es aproximadameme igual al numero de quiasmas observados posleriormeme en la profase. (2) Los n6dulos estan dislribuidos a 10 largo del complejo slnaptonemico como 10 estan los fen6menos de enlrecruzamiento. Por ejemplo. como ocurre con los fen6mcnos de entrecruzamienlo, los n6dulos se haLian ausenles de las regiones del complejo sinaptonemico que mantienen unida la helerocromatina. Ademas, medidas geneticas y citol6gicas indican que la presencia de un fen6meno de entrecruzamiclHo impide que ocurra Olro fen6meno de cnlrecruzamienlo en cualquier lugar pr6ximo del cromosoma; de forma analoga, general mente los n6dulos no se producen muy pr6ximos unos de OlroS. (3) Algunas mutaciones de Drosophila causan una distribuci6n anormal de los fen6mcnos de entrecruzamicnto a 10 largo de los cromosomas. asf como una Intensa disminuci6n de la frecucncia de recombinaci6n. En estos mUlantes se enCUCnlran menos n6dulos de rccombinaci6n, can una altcraci6n paralela a la dc la distrihuci6n del entrecruzamiemo. Esta correlaci6n sugiere claramenle que la localizaci6n de cada fen6rneno de entrecruzamicnto vicne dcterminada por un n6dulo de recombinaci6n. (4) $e cree que la recombinaci6n genica implica una slntesis de una cantidad limitada de DNA en cl punto de cada entrecruzamienlo (se discute en el C3prtulo 6). La aUlorradiogratia mediante el microscopio electr6nico muestra c6mo los precursores radiactivos de DNA se incorporan preferenlemente en el DNA paquilenico. en los n6dulos de recombinaci6n 0 cerca de eLios. Aproximadameme existen tantos n6dulos como fen6menos de recombina· ci6n, por 10 que parece que los n6duJos de recombinaci6n son extremadamente eficientes en provocar la recombinaci6n de las cromalidas de hom610gos opuestos. Sin embargo aun es muy poco 10 que se conoce acerca de su eslructura 0 de su mecanismo de acci6n.

ejes prOleicos (elemenlOS 1.ler.I..1

elememo central erometin. de cromlltin. de I•• clomalid.. In cromatld.. herman.. herm.n.. petern.. 1 V 2

mlltern.. 3 y 4

Flgura20-IO Complejo slnaptoncmlco lfpico en el que se mueSlran los elementos laterales y centrales_ Tambicn se mucstra lin n6dulo de rccombinaci6n. El esqucma s610 mllcs{ra IIna peqllcf'ia secci6n del largo complejo en forma de escalera. En organismos tan diversos como las levaduras y el hombre se forma lin complejo sinaptoncmico similar, {odavfa no sabemos nada respeclO a las molkulas proleicas que forman este complejo.

Los quiasmas desempefian un importante papel en Ja segregaci6n cromos6mica durante la meiosis Ademas de mediar la redistribuci6n gcnica. parece que el enlrecruzamiento cromos6mico es crucial en In muyorfa de los organismos para la correcta segregaci6n de los dos hom61ogos en los ndelcos hijos. Ello es debido a que cada quiasma gcnerado por un entrecruzamiento juega un papel nnalogo al del centr6mero en una divisi6n mil6tica, manteniendo los hom610gos materna y paterno unidos al huso hasta la anafase I. En algunos organismos mUlantes que presenran una baja frecuencia de enuecruzamientos mei6ticos. algunos cromosomas no presentan quiasmas. Estos pares no se segregan de manera normal y una aha proporci6n de los gamelos resultantes contienen un exceso 0 un defecto de cromosomas -10 cual constituye un ejemplo de no-disyunci6n. Existen, como minimo. dos diferencias fundamentales entre los procesos de separaci6n de los cromosomas en la divisi6n mei6tica I yen la mitosis (vease Figura 20-6). (I) A 10 largo de la mitosis (yen la divisi6n mei6tica 11. la cual se parece a una mitosis), las cromAlldas hermanas se malllienen unidas unicamente en el cenlr6mero: los cinetocoros (complejos proleicos asociados con los centr6meros; se tralan en el Capitulo 18) de cada cromatida herman3 presentan las fibras cinetoc6ricas dirigidas hacia direcciones opuestas, de fomla que duranle la anafase las cromatidas son estiradas hacia celulas hijas diferentes. En la metafase 1 de la meiosis. por el conlrario. los cinelocoros de ambas cromalidas hermanas parecen fusionados de manera que sus fibras presentan la misma orientaci6n y los brazos de las cromalidas hermanas se hallan estrechamenle unidos; ademas. los cromosomas hom610gos paterno y materno se mantienen unidos entre sf a traves del quiasma. (2) Durante la mitosis (y In divlsi6n mci6tica II) el desplazaMeiosis

1091

miento de las cromatidas hacia los palos esta mediado par un mecanismo que separa entre sf los dos cinetocoros hermanos (iniciandose la anafase), 10 cual permite a las cromatidas hermanas segregarse en celulas hijas diferentes. En la anafase I de la meiosis, sin embargo, eSle desplazamiento hacia los polos es1<1 iniciado par la ruptura de las fuerzas, poco conocidas, que han permitido mantenerse unidos entre sf los brazos de las crom:Hidas hermanas, asf como por la disoluci6n de los quiasmas que ullfan los cromosomas hom610gos paterno y materna; consecuentemente, las cromatidas hermanas permanccen emparejadas pero los hom610gos paterno y materna se segregan en celulas hijas diferentes. En la Figura 20-11 se iluslran los diferenles sistemas a traves de los que se separan los cromosomas en las divisiones mei6ticas I y II.

malllfasa mai6tical

lOS cinalocoros fusionados dalas cromlitidas harmana5 Ilctuan como una unidlld

LOS BRAZOS DE LAS CROMATIDAS HERMANAS SE SEPARAN

ana/asa mal6tical

BREVE INTERFASE A LA QUE SIGUE EL ESTABLECIMIENTQ DE CINETOCOROS INDIVIDUALES PARA CADA CRQMATIDA HERMANA

malafasa mei6ticall

fibras cineloc6ricas de las cromlitldas hermana5 orienladas en dlrecclones opuaslas SEPARACION SUBITA DE LOS CINETOCOROS HERMANOS

anafasa mlli6ticall

1092

Capftulo 20 : C(Hulas germinales y fecundaci6n

Figura 20- J J Comparaci6n de los mecanlsmos de alineamlento cromos6mico (en la metafase) y de separacl6n eromos6mlea (en la anafase) en las dlvlslones mel6tlcas J y II. Los meeanismos implieados en la divisi6n mei6tiea II son los mismos que oeunen en la mitosis (vease Capitulo 18).

EI apareamiento de los cromosomas sexuaJes asegura que tambi~n ellos se segreguen 6 Hemos explicado de que fonna los cromosomas hom610gos se aparean durante la divisi6n mei6tica I de forma que luego se segregan cuidadosamente entre las celulas hijas. Pero, i,que sucede con los cromosomas sexuaJes, que no son hom610gos en los machos de los mamiJeros? Las hembras tienen dos cromosomas X. que se aparean y se segregan de la misma fomla que los otros hom610gos, pero los machos Lienen un cromosoma X y un cromosoma Y. que han de aparcarse durante la primera metafase de la meiosis para que el espennatozoide contenga un cromosoma Y 0 un cromosoma X pero no ambos 0 ninguno de ellos. EI apareamiento necesario es posible gracias a una pequena regi6n de homologla entre los cromosomas X e Y, situada en uno de sus extremos. En esta zona ambos cromosomas se aparean y se entrecruzan durante la primera profase mei6tica. EI quiasma correspondiente a esta pequena recombinaci61l genetica es suficieme para mantener apareados los cromosomas X e Y en el huso. de manera que nonnalmente s610 se forman dos Lipos de espennatozoides: unos conteniendo un cromosoma Y. que darAn lugar a embriones masculinos. y olros con un cromosoma X. que originaran embriones femeninos.

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La divisi6n mei6tica II es semejante a la mitosis Cuando la larga profase I (que puede ocupar mas del 90% de la meiosis) ha concluido, dos divisiones celulares sucesivas. sin que exista ningtin perfodo de sfntcsis de DNA. concluyen la meiosis (vease Figura 20-6). Todo el cicio celular mei6tico, que eoncluye con una divisi6n mei6tica inicial de la celuJa, se denomina division mei6tica J, y es con diferencia mas compleja y dura mucho mas tiempo que el segundo cicio de divisi6n mei6tica, denominado division meiotica JJ (Figura 20·12). Incluso la replicaci6n preparatoria del DNA durame el primer cicio celular tiende a ser mucho mas larga que una fase S nonnal, y las celulas tienden a mamenerse durante dias. meses 0 incluso anos en la primera profase mei6tica, dependiendo de las especies y de cuando se fonne el gamelo. (Aunque uadicionalmente se ha denominado profase, esta prolongada fase de la divisi6n mei6tica I es semejante a In fase G2 de una divisi6n celular nonnaJ en la que la envohurn nuclear permal1ece intacta y tan 5610 desaparece cuando se inicia la fonnaci6n de las fibras del huso en la profase I, dando paso a la metafase I.) DeSPlleS de finalizada la divisi6n mei6tica I, las membranas nucleares se forman de nuevo aJrededor de los dos micleos hijos, iniciandose una breve interfase. Durante eSle perfodo, los cromosomas pueden descondensarse un poco. pero normahnente se condensan de nuevo y empieza la profase II. Durante este intelValo no se produce sfnlesis de DNA, por 10 que en algunos organismos pare· ce que los cromosomas pasan casi directamente de una fase de divisi6n a la si· guiente. En todos los organismos la profase II es breve: la envoltura nuclear se rompe cuando se forma el nuevo huso, tras 10 cual se suceden n1pidamenle la metafase L1, la anafase 11 y la telofase II. Como en la mitosis, en cada cromatida hermana se fomla un grupo de fibras cinetoc6ricas que se extiendcn en direeciones opuestas a parlir del cenu6mero. Ademas. las dos cromatidas hermanas se mantienen unidas en la placa metafasica hasta que se liberan por la brusca separaci6n de sus cinetocoros durante 1a anafase (vease Figura 20-11 l. ASI, Y a diferencia de la divisi6n I, In divisi6n II se parece mucho a una mitosis. La unica difereneia imponante estriba en que en ella existe una sola copia de cada cromosoma. y no dos. Una vez formadas las envolturas nucleares alrededor de los cuatro nucleos haploides producidos durante la telofase II. la meiosis ha terminado (vease Figura 20-6). Los principios de la meiosis son los mismos en plantas yen animales. y en machos y en hembras. Sin embargo, la producci6n de game· tos supone algo mas que la meiosis. y los procesos Ilecesarios para ello sf son claramente diferentes para el oocito y el espennatozoide. Como veremos, al final de la meiosis un oocito de vertebrado ya esta completamente maduro (yen alguMeiosis

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fiNilizaci6n de la diviei6n

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5 DIPLOTENO DIACINESIS finaliZllCl6n de Ie divisi6n } mei6tice I.,. tOOl la divisl6n mei61ica It

'91 Plgura20--12 ComparackSndelos tJempos necesarl05 para cada una de lasetapas de Ja meiosis. Se indican los

tiempos aproximados para un mamlfero macho (raI6n) y para el tejido androg~nico de una planta (Iirio). Los tiempos difieren para los gamelos masculino y femenino (espermatozoide y oocilo) de una misma especie. asf como para los mismos gametos de especies diferenles. Por ejemplo, en un hombre la meiosis dura 24 dras, en comparad6n con los 12 del rat6n. Sin embargo, en IOOos los casas 13 profase mei6tica I es TMs larga que eI resto de las etapas mei6licas juntas. 1093

nos casos induso fecundado), mienlras que al final de la meiosis un espemlato zoide no ha hecho m:1s que empezar su diferenciaci6n.

4

Resumen Los oocitos Y los f?SpI!mmtozoides se fom.m. de In misllm .mUlero. a troves de In

meiosis. E" este proceso, dos divisio"es celulnres slIcesivas, posteriores a 1m cicio de repUcaci6" de DNA. dan tugar a clmtro dhdas Imploides a INlTtir de lflUl soln dlula diploide. UI meiosis esM domiruutn por la "rofllSe de In di"isi611 mei6tica 1, que pue· de OClIlJlrr el 90% 0 "uts del ,Jerlodo mei6tico lOlaL Ell cluu"lo empiew eSla proflISe, cllda cromosoma esM formmlo por dos cromdtidas IlemlallllS eSlrnelmmenle .mitias elltre sf. Duranle esla prolollgada profllSe i, Cllalldo los cromosomas IIOm61ogos se alinMII ciddadosamellle, OCIUTell fell6mellos de e"trecnl.Zllmielllo cromos6mico. Se cree qlle cadn fe,,6merlO de enlrecnl.ZllmlenlO esld mediado por ,m grail "tid,do de recombi"aci611 y da tllgar a In formaci611 de 1111 quiasma. que persisle IIasta In lIIUlflUe 1. Ell In primera dil/isM" celular mei6l1ca. ,m miembro de catla parcnmlos6miCO, compllesto fIIin por cromdtidas IIem.alllu Imidas, se distribuye a aula dtuln 'lila. LlIero se prodlla 111m uglllula dil/lsi6" alular, sin replicaci611 del DNA, Y cadn cromdtida IIemllllla se ~ luu:ia wm cllula haploide distillta.

Oocitos En lodos los embrioncs de vertebrados, durante las etapas iniciales del desarro· 110, determinadas cclulas se diferencian como progenitoras de los gametos. Estas c~lulas germlnales prlmordlales migran hacia las g6nadas en desarrollo, denominadas crestas gelliwles, que forman los ovarios en las hcmbras y los teslfculos en los machos. Tras un per(odo de proliferaci6n mil6lica, estas celulas sufren una meiosis y se diferencian en gamelos maduros -oocitos 0 espermatozoides. Despues, tras el apareamiento y la fusi6n de un oocito y de un espermalozoide. se inicia la embrioge:nesis. con la posterior producci6n en el embri6n de nuevas celulas primordiales, iniciAndose nuevamenle el cicio.

EI oocito es la unica c~lula de un animal superior que es capaz de desarrollarse produciendo un nuevo individuo

ooeito

hUlTI3r'1O

Los 6vulos son las celulas animales mas nOiables, por 10 menos en un aspecto: una vez activados, pucden dar lugar a un nuevo individuo complelo en tan s610 cuesli6n de dfas 0 semanas. Ninguna otra celula de un animal superior posee esta capaddad. En general la aClivaci6n es una consccucnda de la[ocwulaci61l-la fusi6n de un espermalOzoide con un oocito. Sin embargo, estrictamente el espennatozpide no es necesario para ello. Un oociLo puede ser activado anificialmente mediante procedimientos quimicos no especificos 0 mediante tratamientos fisicos; por ejemplo. un OOCiLO de rana puede ser activado pinchandolo con una aguja. Verdaderamenle algunos organismos. entre los que se encuenlran incluso vertebrados. como algunos laganos. se reproducen nonnalmenle a lraves de oocitos que son activados en ausencia de espennatozoides-lo cual se denomina partenogblesls. A pesar de que un huevo da lugar a lodos los opos celulares del organismo adullO (es decir. es ,olipo,ente). en si mismo es una relula altamente especializada. equipada unicameme para la sola funci6n de generar un nuevo individuo. Vamos a considerar ahora brevemente alguna de sus caracterfsticas especiales. antes de discUlirc6mo se desarrolla hasta el momenlO en el que es apto para la fec\mdaci6n. oocilo de gallina

Un ooello esta altamente especializado para su desarrollo independiente, presentando grandes reservas nutritivas y una compleja eubierta protectora1 Los oocitos de la mayorfa de los animales son clHulas gigantes. con una gran cantidad de reservas de lodos los materiales necesarios para que el desarrollo 1094

Capitulo 20 : Ululas germinales y fecundaci6n

DOCilo de rana

Flgura20-13 Tamaf\oreaJdetres 6vulos. £1 humane tiene un diamelro deO.1 mm.

inicial del embri6n consiga a1canzar el estadio de un nuevo indjviduo capaz de a1imentarse por sf mismo. Antes de a1canzar este punto, la c~lula gigante se djvide en muchfsimas c~lulas menores, sin que se produzca crecimiento neto. Los mamfferos son una excepci6n de este principio, ya que el embri6n puede iniciar antes su crecimiento tomando nUlrientes de la madre; por eUo, un oocilo de mamffero, a pesar de ser una c~lula grande, no 10 tiene que ser tanlo como por ejemplo el de una rana 0 de un ave. Tfpicamente, los oocitos tienen una forma esferica u ovoide, de un diAmetro de unos 100 j.1m en hurnanos y en erizos de mar Oos cuales comen larvas diminutas), de 1 a 2 mm en anfibios y peces, y de muchos centfmelros en aves y reptiles (Figura 20-13). Una relula somalica tipica, por cl contrario, tiene un diametro de s610 unos 10-20 pm (Figura 20· I 4) . EI ciloplasma del oocilo conliene reservas nutritivas en fonna de vitelo, que es rico en Ifpidos, protemas y polisacaridos y que habitual men Ie se haUa en estructuras discretas denominadas plaquelas lJitelirlas. En algunas especies cada plaquet'a vitelina esta rodeada por una membrana mientras que en otras no 10 esla. En los 6vu1os que dan1n lugar a grandes animales que se desarrollan fuera de la madre, el vitelo puede representar mas del 95% del volumen celular mientras que en los mamfferos, cuyos cmbriones son alimcntados par la madre, constituye mucho menos, si es que existe. Las cublertas oocltarlas constituyen otra peculiaridad de los oocitos. Son una especializaci6n de la matriz extracelular y estan (ormadas fundamentalmente por gJucoprotefnas, a1gunas de las cuales estan segregadas por el OOcilO y Olras por c~lulas acompafiantes. En muchas especies la cubicrta principal es una capa adyacente a la membrana plasmatica del oocito; en los oocilos de los no mamfferos, tales como los eriws de mar 0 los pollos, se denominan cubiertas lJileli"as mientras que en los oocitos de los mamfferos constituyen la zona pelli.cida (Figura 20-15). Esta capa protege al oocito de agresiones mecanicas, yen algunos casas actua como una barrera especffica de especie para los espennatozoides, admiticndo unicamente los de la misma especie 0 de especies estrechamente relacionadas (se discute mas adelantc). A mcnudo, los oocitos de los no mamHeros presentan otras capas exteriores que envuelven la cubierta vitelina, segregadas por c~lulas acompafiantes 0 foliculares. Por ejemplo, cuando los 6vulos de rana pasan desde el ovario al oviducto (el conducto que los conduce hada el exterior), se rodean de varias capas adicionales de consiSlenda gelatinosa segregadas por las reluJas epiteJiales que reviSlen el oviducto. AnaJogamente, In "clara" (albumina) y la cascara de los huevos de gallina se anaden (despues de la fecundaci6n) a medida que los huevos pasan por el oviducto. La cubierta vitelina de los 6vulos de los insectos eSI
•

celula som'l;ca I[pic.

00010 humano 0 de erizo de m.r

• oocilo tfpico de rana 0 de pez

lmm.1000llm

Figura 20-14 Tamafio relallvo de

varlos 6vulos. Se comparan con una celula somatica tipiea.

Los oocitos se desarroUan por etapas8 Un ooclto es un 6vulo en desarrollo; su diferenciaci6n en un 6vu1o maduro (u OlJllm) supone series de cambios que se producen en momentos que estcin coor-

Figura 20·15 lazona pehiclca. (A) Electronmicrograffa de barrido de un 6vulo de hAmster, mostrando la zona pelucica. En (8), 1a zona (a la que est;jn unidos muchos espenmuozoides) se ha separado para poner de manifiesto la membrana plasmtttica subyacente del6vulo, que contiene numerosos microvilli. (De D.M. Phillips, J. Ultras/ruet. Res. 72: 1-12, 1980.)

Oocltos

'81

'----J 20 11m

1095

Flgum 20-16 litapas de la oogenesis. CELULAS GERMINALES PRlMORDIALES

, ENTRAN EN LA GONADA

I

@

"oo;;;;O;.;O;;N;;";..._..I._.....:......:....I

LAS OOGONIAS. DIPLOIDES. SE DIVIDEN REPETIDAMENTE POR MITOSIS EN EL OVARIO

@ I

cubiertll delooclto

OOCITO PflIMARIO LA DIVISION MEIOTICA I aUEDA DETENIDA EN LA PROFASE. MIENTRAS CRECE EL OOCITO PRIMARIO

~

DESARROLLO POSTERIOR DEL OOCITO PRIMARIO

gninuloB cort;c\lles

MADURACION DEL OOCITO PRIMARIO: FINALIZACION DE l:A DIVISION MEIQTICA I

primer cuerPQ PQllIr

OOCITO SECUNDARIQ

DIVISION II DE LA MEIOSIS

segundo cuerpo PQlar

OOCITO MADURO

dinados can las etapas de la meiosis mediante las que las celulas germinales atraviesan sus dos divisiones finales, altamente especializadas. Los oocitos han desarrollado mecanismos especiales para detener el prcceso de la meiosis: permanecen suspendidos en la etapa de profase I durante largos perfodos de tiempo mientras el oocito aurnenta de tamano y, en muchos casos, vuelven a detenerse en la metafase " esperando la fecundaci6n. Los detalles del desarrollo del oocito (oogenesis) varfan segt1n la especie. perc las etapas generales son similares, como se muestra en la Figura 20-16. Las celulas germinales primordiales migran hacia la g6nada en formaci6n. convirtiendose en oogonias, las cuales proliferan mediante cidos de divisi6n celular

1096

Capftulo 20 : Celulas germinaJes y fecundacl6n

Las oogollias se desarrollan a partir de las celulas germinales primordiales que al principia de la embriogenesis migran hacia la g6nada en desarrollo. Tras un cierto numero de divisiones mit6ticas. las oogonias empiezan la divisi6n mei6tica I recibiendo entonces el nombre de oocitas primarios. En los mamfferos. los OOcilOS primarios se fonnan muy temprano (entre los 3 y los 8 meses de gestaci6n en el embri6n humano) y permanecen en la profase de la divisi6n mei6tica I hasta que la hembra es sexualmente madura. En este momento y de forma peri6dica un pequeno numero de oocitos madura bajo la influencia hormonal, completando la divisi6n mei6tica 1y constituyendose en oocitos seculldarias los cuales, finalmente, pasan par la divisi6n mei6tica 11 y se convierten en 6vulos maduros (OllQ). £1 momenta en el que el oocito es liberado por el ovario y es fecundado vana de una especie a otra. En la mayona de los vertebrados la maduraci6n de los oocitos se encuentra detenida en la metafase de la meiosis II, yel oocito secundario s610 completa la meiosis II tras la fecundaci6n. Finalmente, todos los cuerpos polares degeneran. En la mayona de los animates el oocito en desarrollo se halla rodeado por celulas accesorias especializadas que ayudan a aislarlo y a nutrirlo (no se muestran).

ordinaria durante un perlodo anterior a su diferenciaci6n en OOC;IOS primarios. En este estadio se inida la primera divisi6n mei6tica: el DNA se replica de manera que cada cromosoma esta compuesto por dos cromatidas, los cromosomas hom61ogos se emparejan a 10 largo de sus ejes longitudinales, y tienen lugar entrecruzamientos entre sus cromatidas. Posteriormente la celuJa pennanece detenida en la profase de la divisi6n I de la meiosis (en un estado equivalente al que hemos sei'lalado antes, de la fase G 2 del cicio de divisi6n ordinaria) durante un perfodo de tiempo que varfa, desde algunos dias hasta varios arlDs, segun las espedes. Durante este largo perfodo (0, en algunos casas. en el inido de la madurez sexual), los oocitos primarios sintetizan la cubiena y los granulos corticales y en el caso de los grandes oacitos de los no mamfferos, acumulan ribosomas, vitela, gluc6geno, Ifpidos y el mRNA que poslerionnente djrigini la sfntesis de las prote(nas necesarias para el credmiento embrionario inidal y para la puesta en marcha del program a de desarrollo. En muchos OOcilOS las imensas actividades biosinteticas se renejan en la estructuta de los cromosomas, los cuales se descondensan y forman bucles laterales adquiriendo un aspecto "plumulado", que indica que estan en activa sfntesis de RNA (se discute en el Capftulo 8). L.a fase siguiente del desarrollo de los oocilos se denomina mlldllraci6" 00ciraria y general mente no tiene lugar haSla la madurez sexual, cuando es estimulada por honnonas. Bajo esta influencia hormonalla celula recupera su progresi6n a traves de la divisi6n [ de la meiosis: los cromosomas vuelven a condensarse, la envoltura nuclear se fragmenta (lo cual se toma como punto de inicio de la maduraci6n) y en la anafase J los cromosomas hom610gos replicados se segregan, dando lugar ados nucleos hijos cada uno de los cuales conliene la mil'ad del numero inicial de cromosomas. AI finalizar la divisi6n I, el dtoplasma se divide asimetricamente produciendo dos celulas muy diferenles en tamailO: una de elias es un pequeno corpllsculo polar, y la olra es un gran oocito secundarlo, el precursor del 6vulo En eSla etapa, cada cromosoma todavfa esta compuesto par dos cromatidas hermanas. Estas cromatidas no se separan hasta la divisi6n II de la meiosis, cuando se distribuyen en dos celulas mediante un proceso que es identico a la mitosis, tal como hemos descrito anteriormente. Desputis de eSla separaci6n final de los cromosomas. en la anafase II, eJ citoplasma del gran oocito secundario se divide nuevamente de forma asimctrica produciendo un 6vuJo maduro (u ovum) y un segundo pequeno corpuscuJo polar, cada uno de los cuales contiene una dotaci6n haploide de cromosomas (vease Figura 20-16). Debido a estas dos divisiones asimetricas del ciloplasma, los 6vulos conservan su gran tamano a pesar de sufrir dos divisiones mei6licas. Ambos corpusculos polares son pequeflos y general mente degeneran. En la mayorfa de los vertebrados la madurad6n oocitaria sigue hasta la mclafase de la meiosis II, momento en cl que se detiene hasta la fccundaci6n. En la oocltacl6n el oocito secundario detenido es liberado del ovario y, si tiene lugar la fecundaci6n, el oocito es estimulado a complclar la meiosis y trans[onnarse en 6vulo.

Los oocitos crecen hasta alcanzar su gran tamaiio por medio de mecanismos especiales8,9 Una celuJa somoitica de un dioimetro de 10 a 20 )un necesita, en general, 24 horas para duplicar su masa como preparaci6n para su divisi6n celular. A eSla veloddad de biosintesis esta misma celula necesilar(a mucho tiempo para alcanzar la masa miles de veces superior de un oodto de mam'fero, de un dioimetro de 100 IJ.m, 0 la masa lOS veces superior de un oocito de insecto, de un dioimetro de 1000 IJ.m. Sin embargo, algunos insectos 5610 viven unos cuantos dfas y consiguen producir 6vulos de di;imetros que superan incluso las 1000 !lm. Es evidente, pues, que los oocitos han de disponer de mecanismos especiales para alcanzar su gran tamano. Una estrategia sencilla para crecer rapidamente consiste en disponer de copias extra de genes. Asf, e! oocito retrasa el final de su primera divisi6n mei6tica Oocltos

1097

mientras crece, manteniendo un duplicado del conjulllo diploide de CTOmosomas. De esta forma contiene doble cantidad de DNA para sintetizar RNA en comparaci6n con lIna celula sOIlHhica en fase G1 del ciclo celular. Algunos oocitos tam bien alcanzan grandes lamanos acumulando DNA extra: producen nu· merosas copias extra de algunos genes. En el Capftulo 8 hemos senalado que las celulas sOlllaticas de la mayorfa de los organismos necesilan emre 100 y SOO co· pias de los genes que codifican los RNA ribos6mioos para producir suficieme camidad de ribosomas para la sfnlesis proteica. Los OOcilOS necesilan un nlimero incluso mayor de ribosomas para atender la slmesis proteica en los momentos iniciales de la embriogenesis. por 10 que en los oocitos de muchos animales los genes que codifican los RNA ribos6micos son amplificados especfficamente; algunos oocilos de anfibios. por ejemplo, contienen entre 1 y 2 millones de copias de dichos genes. Para su crecimiento. los OOCilOS pueden depender lambien de las actividades simelicas de otras celulas. EJ vitelo por ejemplo. un conslituyente fundamental de los grandes oocitos. se simeliza habitualmente fuera del ovario y el oocito 10 impona. En aves, anfibios e insectos, las proteinas del vitelo son producidas por las celulas del hrgado (0 sus equivalentes). que secretan eslas protefnas a la sangre. En los ovarios los oocitos importan las protefnas vitelfnicas del medio extracelular mediante un proceso de endocitosis mediada por receptor (vease Figura 13-28). EI sopone nutritivo puede provenir lambicn de ccluJas foliculares del ovario. Existen dos tipas celulares accesorios que preseman eslas caracterfs· tieas. En algunos invenebrados algunas de las celulas progenie de la oogonia no se transforman en oocitos sino en c~lulas nodrlza. Habirualrnente eslas celulas esl.!n conecladas al oocito medianle puentes citoplasm.!licos a traves de los cua· les las macromoleculas pueden pasar directamente a1 citoplasma del OOcilO (Fi· gura 20-17). Las ctHulas nodriza de los oodros de los inscclos sintelizan muchos

celula nodrlza

pUllnla citoplasmiltico

Figura 20-17 CB Wall nodriza y

dlulas folJculares asociadas en un ooclto de Drosoplrila. las celulas nodriza y cl oocilo provienen de una oogonia comun. cada una de las cuales genera un oocitoy 15 celulas nodliza (de las cuales en esla figura unicamente se observan n. Eslas ct'!lulas permanecen unidas a Ira\"6 de puentes citoplasmll.ticos que se han producido por la divisi6n celular Incompleta_ Las ct'!lulas foliculares se desarrollan independienlemenle a partir de ct'!luJas del mesodenno.

Illmln~ ba5~1

cltopluma dalooclto

zona pelUcida

--"'~

10 11m

celulal fOlicularn so 11m

Figura 20-18 Electronmlcrografia de oocilos prlmulos en desarroUo en el ovarlo de conejo. (A) Esladio inicial del desarrollo del oocito primario. No se han desarrollado lodavfa ni la zona pelUcica ni los grll.nulos corticales, y el oocito se encuentra rodeado por una monocapa de ct'!lulas foliculares aplanadas. (B) Un oocito primario mll.s maduro. moslrado a una ampliaci6n seis veces menor porque es mucho mayor que el oocito de {A}. Esle oocilO ha adquirido una fina zona peillcida y esill. rodeado de diversas capas de celulas foliculares y de una Ill.mina basal, que afslan el oocilo de otras celulas del ovario. EJ oocito primario junlo con sus ct'!lulas follculares c1rcundanles recibe el nombre defulfculo primnrio. Las dlulas foliculares estll.n conectadas entre siy con el oocilo medlanle uniones de lipo gap. (CopyrighI1979. Urban 8< SChwarz.enberg. Baltimore-Munich. Reproducido con penniso de The Cellular Basis of Mammalian Reproduction. editado par Jonathan Van Blerkom y Pietro Mona. Todos los derKhos reservados.) 1098

Capftulo 20 : cetulas gerrrtinales y fecundaci6n

de los prodUCloS -ribosomas, mRNA, protefnas y otros compuestos- que los oocitos de los mamfferos han de producir por sf mismos. EI olro tipo de c~lulas accesorias del ovario que colaboran en la nutrici6n de los oocitos en desarrollo son celulas somaticas denominadas relulas foliculares, que se encuentran lanto en invertebrados como en vertebrados. $e disponen como si se tratara de una capa epiteljal alrededor del oocito (Figura 20-18 y v~asc la Figura 20-17), al que esHin unjdas liIl.icamenle a traves de uniones de lipo ~gap". las cuales penniten el intercambio de pequeiias moleculas. pero no de macromol~culas. Eslas relulas no pueden proporcionar al DOcilO macromoleculas ya formadas a traves de eslas uniones de comunicaci6n. pero pueden colaborar en el suministro de precursores, de menor tamano. a partir de los cuales est:m formadas las macromoleculas. Ademas, frecuentemenle las celuJas foliculares secretan macromoleculas que contribuyen a la Fonnaci6n de las cubiertas oocitarias. son importadas por el oocilo mediante endocilosis a aCluan como rceeplores de superficie celular del oocito controlando el patr6n espacial y las simetrias axiales del huevo (se discute en el Capitulo 21).

Resumen Los oocitos se desarrolInrr por etapas a partir de cilulas germlrrales que lIIigm" err

In g6'Ullta en ntadlos "my tempmmn del desarrollo, tmnsfomuS,ulose en oogo"ias. Trtu la prolifertu:16" 1IIi16tica, las oogorrias se trm,sfannan en oocltos primarios que ;n;c;mlla dlvisl6n mel6tica I, y.le pamn e" la profau dumllte tUtu 0 anos, dependlendo de ltu espedes. Durtulle este periodo de paro de ta profau I, los oocltos primarlos crea.", sintetlum llna cl,bierta yacllnmInn ribosomtu, ",RNA y prote(rras, a me'lIIdo lItlllUUldo In aYllda de otms cellllas, como las cebllas aa:esorliU qlle los rodet",. E" el proceso de madllrtu:l6" los oocitos primarlos completa,,'a dllJisl6" lIIeMtlea I fomumtlo 1m peqlleno corp,iscilio polar y ,m grml oocito sec,,,,dario, el ellal progresa lutsta la metafase de In dlvis;6" meMtlea 11. En esta etapa, e,l nmellas especies el DOCilo se para luula qlll~ es estimulado par In!ecumlaci6", completalldo la meiosis e illicialulo el desarrollo embrlol6gico.

Espermatozoides En la mayorfa de especies s610 exist'en dos tipos de gametos. y son radical mente diferentes entre sf. EI OOcilO cs una de las celulas mayores del organismo mientras que el esperrnalozolde suele ser la mas pequena. EI 6vulo y el cspermatozoide estan optimizados en scntidos diferentes para In propagaci6n de los genes que transportan. EI 6vulo es lIna celula inm6vil y ayuda a la supervivencia de los genes maternos proporcionando grandes reselVas de materiales crudos para el crecimiento y desarrollo, asf como proporcionando una cubierta protectora elicaz. EI espermatozoide. por el conl.rario, esta optimizado para la propagaci6n de los genes palernos utilizando las reservas maternas: habilualmenle es aItamentc m6vil y aerodimtmico para conseguir velocidad y eficiencia en la larea de la fecundaci6n. La compelcncia entre los espermatozoides es feroz. y la gran mayorfa de ellos sucumbe en Sll misi6n: de los mi.les de miJIones de espermatozoidcs que son Iiberados durante la vida reproduclora de un hombre. muy pocos de ellos conseguiran fecundar un 6vulo.

Los espermatozoides estan aJtamente adaptados para depositar su DNA en un oocito lO Los espennatozoidcs lfpicos son celulas ~desguarnecidas". equipadas con un pOlente flagelo que los propulsa a lraves de un medio acuoso. pero carccen de organulos cilop\asm
1099

trategicamente en ellugar donde pueden alimentar el tlagelo con mayor eficiencia. EI espermatozoide suele estar formado por dos regiones morfol6gica y funcionalmente diferentes, rodeadas por una misma membrana plasmatica: la cola, que impulsa al espermatozoide hacia el oocito y Ie ayuda a penetrar a traves de la envoltura del oocito, y la cabeza, que conliene un nucleo haploide condensado (Figura 20-19). El DNA del nucleo esta densa y extremadamente empaquetado, de modo que su volumen esta reducido al minimo para el lransporte. Los cromosomas de los espermatozoides de muchas especies carecen de las histonas que presentan las celulas somaticas y estan empaquetados con protefnas de elevada carga positiva denominadas protamillas. En la cabeza de la mayorfa de espermatozoides, en estrecha aposici6n con el extremo anterior de la envoltura nuclear, se encuentra una vesicula sccrelOra especializada, denominada vesicula acros6mica (Figura 20-19). Esta vesfcula contiene enzimas hidrolfticas que ayudan al espermatozoide a alravesar la envoltura extema del 6vulo. Cuando un espermalozoide entra en contaclo tCOn un OOciIO, el contenido de la vesicula se libera por exocitosis -Ia denom~da reacd6n acros6mica; en algunos espermalozoides esta reacci6n tambien expone 0 Iibera unas protefnas especfficas que colaboran en la uni6n del espermatozoide a la envoltura del OOcilO. La cola m6vil de un espermatozoide es un largo llagelo cuyo axonema central sale de un corpusculo basal situado inmediatamente detras del nucleo. Como ya hemos descrito en el Capftulo 16, el axonema esta formado por dos microtubulos centrales simples rodeados por nueve dobletes de microtubulos dispueslos ordenadamente. EI flagelo de algunos espermatozoides (incluido el de los mamfferos) se diferencia de los otros Oagelos en que la ordenaci6n habitual de 9 + 2 del axonema esta rodeada ademas por nueve fibras demas externas compueslas principalmente por quilina (Figura 20-20). Estas densas fibras son rfgidas y no contractiles, y no se sabe que papel desempei\an en el movimiento activo del flagelo, que eSla provocado por el deslizamiento de los dobletes adyacentes de micrOlubulos. EI movimiento flagelar esta impulsado par la protefna motora dinefna, que utiliza la energfa de hidr6lisis del ATP para hacer deslizar los microlubulos unos respecto a otros, como se discute en el Capftulo 16; el ATP esta generado por mitocondrias altamente especializadas, situadas en la parte anterior de la cola del espermatozoide (denominada la porci6n media), donde se necesita el ATP (veanse Figuras 20-19 y 20-20).

vesIcula acros6mica nucleo

mitocOf'ldrla

membrana plasmiltica cola

flagelo

10 11m

Figura 20-19 Un espennatozolde humano. Se muestra una secci6n longitudinal.

En muchas especies de mamiferos los espermatozoides se producen de manera continual I En los mamiferos existen diferencias importantes en el modo en que se producen los oocilOS (oogenesis) y tam bien en el sistema en el que se producen los espermatozoides (cspermalogenesis). Va hemos dcscrito que en la mujer, por ejemplo, la oogonia pralifera unicamente ell el feto, entra en meiosis despues del pano y se para en forma de oocitos en la primera profase mei6lica, que puede mantenerse durante mas de 50 aftos. Los OOcilOS maduran a partir de esta dotaci6n eSlrictamente limitada y ovulan a inlcrvalos, generalmente uno cada vez, desde el momcnta de la pubertad. En cl hombre, en cambio, la meiosis y la espermatogencsis no empieza en los tesllculos hasta la pubenad y desde entonces se produce de manera cominua en la pared epitelial de unos tubos muy largos, Figura 20-20 Dibujo de la porcl6n media de un espermatozoide humano vlsto en una seccl6n transversal al microscopio electr6nico. EI nudeo del f1agelo esta farmado por un axoncma rodeado por nueve fibras densas. El axonema csta formado por dos microlubulos scncillos rodeados par nueve microlubulos dobles. La mitocondria (moslrada en uerde) esta bien situada para proporcionar el ATP necesario para el movirnienlo flagelar; su estruclura espiral, poco habitual (vease Figura 20-19), resulla de la fusion de mitocondrias individuales durante la diferenciacion de la espermatida. 1100

Capftulo 20 : O~lulas gcrminales y fccundaci6n

microtubulos del S)(onema

membrsn8 plasmlitic8 fibras densas exteriores a.Sllm

1

crUll"" GERMINAL PftIMOftOlAl

I ENTRA EN LA GONAOA,

I ,-_.':>SI'E_RMATOGON;;;IA_ _

LA ESPERMA,TOGONlA OIPlOIOE SE OIVlDE POR MITOSIS DENTRO DEL TESTlcUlO

Figura 20-21 Las dlversas elapu de la espermatogenesis. Las espemwtogonias se desarrollan a partir de las celulas germinales primordiales que migran hacia los tesdculos durante las primeras fases de la embriogenesis.. Cuando el animal a1canza la madurez sexual, la espennatogonla empieza a proliferar rapidamenle, generando a1guna progenie que retiene 13 capaeidad de continuar dlvidicndose indefinidamente (como celulas madre de espermatogonlas) y Olra progenie (espermatogonla en maduraei6n) que dcspues de un nl1mero limitado de eidos de dlvisl6n normal inieian la meiosis hacia espemmtocit()$ primari()$.l1stos conllnuan a traves de la divisi6n mei6tica I hasta transformarse en espemwtocitas secundarios. DespuCs de completar la divisi6n mei6tica II, estOS espermalocilOS producen espemuftidas haploldes que se diferencian pasando a espermatOZ/Jides maduros. La espermalog~nesis se difereneia de la oogenesis (Figura 20·16) en varios aspectos: {Il a partir de 13 pubertad, continuamente exlsten nuevas celulas que inieian la meiosis, (2) cada celula que empicza la meiosis da lugar a cualro gamelos maduros, y 110 a uno $610, y (3) los espermatowldcs maduros se fom131l par un proceso elaborado de diferenciaci6n celular que empieza despuCs de que se complete la meiosis..

E$PERMATOCITO PRIMAR10

DIVISION MEIOTICA I

I ,

ESPERMATOCITO ",seCUNOARIO

ESPERMAnDAS

OlF£RENClACION

ESf'£RMATOZOIDES MADURQS

densamenle enroUados, que reciben cl nombre de tlibulos seminiferos. Las celulas germinales inmaduras, denominadas espermatogotlias, estan situadas alredeclor del borde eXiemo de estos tubas, junto a la lAmina basal, donde proliferan continuamente por ciclos de divisi6n celular ordinaria. Algunas de las celulas hijas dejan de proliferar y se diferencian a espermmocitos primarios. Estas celulas cntran en la primera profase mei6tica, en la que se emparejan con cromosomas hom6logos participando en el entrecruzamiento, y dcspucs contimian con la diEspermatozoides

HOI

dlula de Senoli

esperm810g0nia MITOSIS

espermatocilO primario

DIVISION MEIOTICA I

200 11m

ii~~~~~~

espermaloeilo MCundario

DIVISION MEIOTICA "

:-:,-;:1-- nperm40lida an dilerencillciOn

celula dB Senoli

• Il~mirla basal que rodea 01 lubulo somlrllforo

dlulas de Leydig

~ L"-;..LL

IAI

visi6n I de la meiosis produciendo dos espermatociros secufldarios. cada uno de los cuales contiene 22 cromosomas autos6micos duplicados y un cromosoma X o Y dupLicado. Los dos espermalocilos secundarios progresan a lraves de la divisi6n mei61ica II produdendo cuatro espermdlidas, cada una de las cuales licne un numero haploide de cromosomas simples. A continuaci6n, estas espermatidas haploides sufren la diferendad6n morfol6gica a espennatozoides (Figura 20·21). que escapan a la (uz del tubulo seminiJero (Figura 20-22). Seguidamcnlc los espermatozoides pasan aJ epitlftlimo, un lubo enrollado situado sobre los lestfculos, donde son aJmacenados y sufren la maduracl6n final. Un rasgo fascinante de la espermatogenesis es que las celulas germinales masculinas en desarrollo no complelan la divisi6n dloplasnl
Capftulo 20: celulas germinales y recundaci6n

'r__t-aspermalozoida --'

en ellumen

181

f1gura20-ZZ Dlbujomuysimplifk:adode una secd6n lJ1lnSV'er'Slll de un tubulo semlnlTero de un testkulo de mamlTero.

Tados las rases de la espermal~nesis mostradas tienen lugar mienlrns los gamelos en desarroUo estan en fntima asociacl6n con las celulns de Sertoli, que son grandes eelulas que se extiendcn dcsde la lamina basal hasta ellumen delltjbulo seminffero; son amilogas a las celulas foliculares del ovano. La espermat~nesis depende de la lestOSterona secretada por las aHulnsde Le)dig, Iocalizadas entre los tlibulos seminffcros. (B) Las espennatogonias en divisi6n se encuentran a 10 largo de la lamina basal. A1gunas de eslas celulas dejan de dividirse y enlran en meiosis convini~ndose en espennalocilos primarios. Poslerionnenle los espermalozoides son liberados allumen. En el hombre, para que un espermatocilO complete la meiosis y se transforme en espennallda lranscurren 24 dins y otms 5 scmanas para que se desarrolle hasHl espenllutozoide. Los espem\3tozoides suCren una maduraci6n posleriory se vuelven m6viles en eI epidfdimo: 5610 enlonees son espermalozoides completamcnle maduros. (A)

® MITOSIS

esperm;ltogoni;l

I I I

esperm;ltogonias

~ esperlTl;ltoeitos ~primafios DIVISI6N MEI6nCAI

~J. espermat~i'oS •

DIVISI6N MEI6TICA II

•

se<:ondaroos

puentes cltoplasmatlcos

Figura 20·23 Puentes dloplasmatlros entre los espermatozoldes en desarroUo y sus precursores. La progenie en maduraci6n de una mism3 eSl'ermatogonia I'enllanece c:onectada entre sf por media de puentes citoplasm:hicos, duranle su direrenciaci6n hasla espermatozoides maduTO$. Para mayor simplicidad 5610 se muestran dos espematogonias unidas que inician la meiosis. produciendo ocho espermatidas haploides que se manlienen conectadas. En realidad, el ntlmero de celulas unidas que pasan por las dos divisiones mei6licas y que se direrencian juntas. es mucho mayor del que se muestra aquf.

espermatidas en difelenc;acion

cuerpos residulles

espellTl;llozoid.. madurOli

Resumen Nonrrnlmente, 1m upenrrntozoide es Ima «lula pequeRa, compacta y altamellte especialiuJda para In tarea defecundar 1m 6vuw. Mielltras que en mlidlOS organumas I.embra el ctmjunto total de DOCitos Sf! produce allies del parto, en los ",adIOs las nuevas «ltllas germinales ,mtran en meiosis colltillllimiente a partir del inldo de 10 madllrez sexual, y cadi, espermatocito primario prodllC£ Cll/lIra espenllatowides ",adllras. La diferendaci611 de los espemwtozoides oCllrre (lespllis (Ie la meiosis, ClI.atu/o los tIIicleos so,. Imploides. Si" embargo las espermatogolll(L$ y los espermatocilos ell mculuraci6" 110 rompleta" In citocillesis, par 10 qlle la progenie de 11IM espenrlQtogoJlia Sf! desarrolln ell forma de 1m gran sincilio. £Sto pernlite que In diferendaci6J1 ute dirigida par los prodllctos de ambos genes patemos.

Fecundaci6n 12 Una vez liberados, lanto el OOcilO como el espermalozoide est:1n deslinados a morir en cuesli6r. de horas a menos que se encuenlren y se fusionen entre sf en el proceso de fecundacl6n. A lraves de la fecundael6n, el ooello y el espermaloFecundacl6n

1103

zoide se salvan: el oocito se acliva iniciando su programa de desarrollo, y los nucleos de los dos gametos se fusionan fonnando el genoma de un nuevo organis· mo. EI mecanismo de la fecundacion ha sido ampLiamente estudiado en Lnverte· brados marinos, especialmeme en el erizo de mar. En eslOS organismos la fecundacion QCurre en el agua del mar, donde se Liberan grandes cantidades de espennatozoides y de ovulos. Esta [ec""dacio" exlema es mas facil de eswdiar que la [ecwulacio" intema de los mamfferos, la cual acurre en el conducto reproductor de las hembras despues del apareamiento. Sin embargo, a finales de los anos 1950 result6 posible fecundar ovulos de mamifero (ffiM concretamente, oacitos secundarios -vease Figura 20-16) ;11 vilro, abriendo la via de amilisis de los procesos celuJares y molecuJares que se producen en la fecundaci6n de los mamfferos. EI progreso en el conodmiento de la fecundacion de los mamfferos ha producido beneficios medicos substan· dales: oocitos de mamiferos fecundados i" vitro pueden desarrollarse en el inte· rior de individuos normales cuando son trasplantados al interior del utero. De eSla forma ha sido posible que muchas mujeres que eran esteriles gestaran un nino normal. Ahara centraremos muestra atencion sobre la fecundacion en rnamfferos.

EI contaclo con la cubierta pelucida estimula al espermatozoide a sufrir la reacci6n acros6mica 13 De los 300 millones de espermalozoides humanos eyacuJados duranle un coiro,

unicamente 200 alcanzaran el lugar de la fecundacion en el oviduclo. Una vez alii, el espermatozoide ha de migrar a traves de la capa de relulas foliculares que rodean el ovulo y entonces unirse y atravesar la envoltura del ovulo -Ia zolla pel/kida. Finalmente ha de fusionarse con la membrana plasmatica delovulo. Para ser competentes en el cumplimienlo de estas tareas, nonnalmente los espennatozoides eyacuJados de mamfferos han de ser modificados por secreciones del traClQ reproductor de las hembras, un proceso denominado capacilacl6n, que en humanos requiere entre 5 y 6 horas. Parece que la capacitacion supone tanto una alteracion de la composition de !ipidos y g1ucoprotefnas de la membrana plasmatica del espennatozoide como un incremento de su metabolismo y movi· Iidad; el mecanismo de este praceso lodavia es poco claro. Cuando un espennatozoide capacilado ha atravesado la capa de celulas foliculares, se une a la zona peluclda (vease Figura 20-15). Habitualmente la zona pelucida actua como una barrera de fecundadon entre especies. de forma que a menudo al eliminarla tambien se elimina la barrera. Par ejemplo, un esperma(Qzoide humano fecundani oocitos de hamster si se les ha eliminado previamente la zona pelueida mediante cnzimas cspedfieas; no es sorprendellte que tales hfbridos no lleguen a desarrollarse. Sin embargo, los OOcilOS de hjmster liberados de la zona pelucida se utilizan para estudiar la capacidad de fecundaci6n de espermalozoides humanos ill vitro (Figura 20-24). La zona pelucida de los oacitos de mamifero esta compuesta I1nicameme par Ires g1ucoproternas. Dos de elias, ZP2 y ZP3, se ensamblan formando fLIamenlOS, mientras que la otra, ZPI, enlrecruza los filamentos fonnando una red tridimensional. ZP3 actua como receptor del espennatozoide: las union espedfica de especie de los espermatozoides a la zona pelucida esta mcdiada por una molecula (que puede ser la enzima galactosiltrans[erasa) de la superficie de la cabeza del espennatozoide, que se une a o-oligosacAridos a ZP3 de la zona pe. lucida. Una vez unido, el espermatozoide es inducido a produdr la reaccion acros6mica mediante la eual el contenido del acrosoma se Iibera por exocitosis (Figura 20-25). AI menos en el rat6n, ZP3 es la que dispara esla reaccion acrosomjca, activando un complejo mecanisme seflalizador intracelular que induce un influjo de Ca~' en el cilosol del espermalozoide que probablemenle es el responsable de iniciar la exocitosis. La reaction acrosomica libera prOleasas y hialuronidasa, que son esenciales para la penetraci6n del espermatozoide a traves de la zona pell1dda, y expone 1104

Capitulo 20: Cclulas germlnales y fecundaclon

FIgura zo...24 EIec::tronmJcrograffa de barrldo de un espennatozolde humano entrando en contacto con un ovulo de hl1mster. La zona pehkica del oocilo ha sido eliminada, quedando al descubierto la membrana plasmi1tica. que contiene numerosos microvilli. La habilidad de un espermatozoide deterrninado para penetrar en un oocito de hamster se utili7.3 como ensayo de feniJidad: una penelracl6n de mas del 10-25% de los oocltos se considera un valor nonnal. (por corlesra de David M. Phillips.)

CD ESPERMATOZOIDE UNION DEL A LA ZONA PELUCIDA

CD

Figura 20-25 La reaccl6n acros6mlca que oeune cuando un espermatozolde de mamffero fecunda un oocito. Se cree que en el rat6n una sola protefna de ia zona peh.1cida, ia ZP3, es [a responsable tanto de la llni6n del espermatozoide como de la indlleci6n de la reacci6n acros6mica. Obstkvese c6mo un espermalozoide de mamffero interacciona langencialmeme can ia membrana plasmlhica del oocito, de modo que [a fusi6n se produce mas en ellado que en la puma de [a eabeza del espermalozoide. En los ratones, [a zona peh.1dea es de 711m de di<1metro y el espermalozoide [a emza a una velocidad de aproximadamente 111m/min.

----------

REACCION ACROSOMICA

vllslcula acros6mica

mllmbrllna plasmliticB dill

DOCila

zona

~_

pelucidB

•

nUclIlO d.1 oocito

/

FUSION DE LAS MEMBRANAS PLASMATICAS

/

otras protefnas de la superficie del espermatozoide que se unen a ZP2, 10 cual contribuye a mantener el espermatozoide fuertemente unido a la zona mientras la esta perforando. Ademas, la reacci6n acros6mica expone una protefna de la membrana plasmalica del espermalOzoide que media la uni6n y la fusi6n de esta membrana con la del oocito, como veremos a continuaci6n.

La reacci6n cortical del oocito contribuye a asegurar que sea fecundado por un solo espermatozoide l4 A pesar de que a un mismo oocito se Ie pueden unir muchos espermatozoides, normal mente s610 uno de eUos se fusiona con la membrana plasmalica del 6vu10 e inocula su nueleo en el citoplasma del oocito. Si se fusiona mas de un espermatozoide -situaci6n que recibe el nombre de poliespermia- se forman husos mit6ticos adicionales que producen una segregaci6n anormal de los cramosomas durante la segmentaci6n; se producen celulas no diploides y rapidamente se detiene el desarrollo. Dos mecanismos son los responsables de conseguir que cada oocito sea fecundado par un solo espermatozoide. Parece que una rapida despolarizaci6n de la membrana del oocilO, causada por la fusi6n del primer espennatozoide, impide que otras espermatozoides se fusionen, actuando as! como un rapido bloqueo primario de poliespermia. Sin embargo, el potencial de membrana recupera su valor normal muy poco despues de la fecundaci6n, de forma que es necesario un segundo mecanismo que asegure un bloqueo secundario de poliespermia a largo plazo. ESle mecanismo eSla constituido por la reaccl6n cortical del6vulo. Cuando el espennatozoide se fusiona con la membrana plasmatica del6vulo, activa la via de sei'ializaci6n celular de fosfolfpidos de inositol (discutido en e1 Capftulo 15) en el 6vulo. Esta activaci6n, a su vez, genera un incremento local de la concentraci6n citos6lica de Ca2., que como una onda se esparce por toda la celula. Parece que el incremento del Ca2. citos6lico activa el oocito e inicia la reacci6n cortical, en la que los granulos corticales liberan su contenido mediante exocitosis. Fecundacl6n

1105

espermelozoide unldo

ell,bohidrlllO

-'"

~~J zone pehicide

~'---- membrene ple"mlltiee delooeito ->----grjnuIO c:ortlC81 que eontiene eNime, hidroUticll,

REACCION CORTICAL tEXOCITOSISI

'.~~t--- eontenido del grjnulo 111

BLoaUEO DE LA POUESPERMlA

cortlC8l, ye secretedo

• ~'--_ _ Hgundo espermetoloide

Si se incrementa artificialmcnle la concentraci6n citos61ica de Ca~' -directamcnle mediante una inyecci6n de Ca 2 • 0 indireclamente utilizando un ion6foro de Ca 2• (se discute en cl Capftulo 11)- los 6vulos de lodos los animales estudiados hasta ahara, incluidos los mam(feros, se aClivan. Par el cootrano, impidiendo que los niveles de Ca2. se incrementen mediante la inyecci6n de un quelante de Ca2. como el EGTA, se inhibc In activaci6n del oocito en respuesta a la fecundaci6n. Las enzi· mas Iiberadas por la reacci6n cortical cambian la estructura de la zona pelucida, la cual se "endurece", de forma que el espermawzoide ya no puede unirse a ella, constituyendo un bloqueo secundario tardio de poUespermia. EnLre los cambios que Henen lugnr en la zona, hay que destacar la degradaci6n proteolftica de ZP2 y la hidr6lisis de grupos de azucares sobre ZP3 (Figura 20-26).

Una proterna de fusi6n transmembrana de la membrana plasmcitica del espermatozoide cataJiza la fusi6n espermatozoide·oocito '5 Cuanda el espemlatozoide ha peneuado en la cubierta extracelular del oocito, interaclua con su membrana plasmatica enne las puntas de los microvilli de la superficie del oocito (vease Figura 20-24). Entollees, los microvilli vecinos se 1106

Capltulo 20 : ~luJas genninales y fecundaci6n

Figura 20-26 DlbuJo esqueml1tlco que lIustracdmosecree que la reaccldn cortical de un dvulo de ratdn 1m plde que ottos espennalozoldes enlren en eldvulo. EI contenido de los granulos conicales, una vez Iiberado, eliminan los carbohidratos de ZP3 de fonna que ya no puede unirse a la membrana plasmatica del espermatozoide, y fracdona pardalmente ZP2 enduredendo la mna peh1cida. En conjunto, estos dos cambios proporcionan un bloqueo a la poliespermia.

alargan rapidameme y se agnlpan alrededor del espermatozoide asegurando que quede unido fuerlemente. de forma que pueda fusionarse con el oocito. Tras la fusi6n. todo el espermatozoide es transferido al OOciIO. empezando por 1a cabeza, a medida que los microvilli son reabsorbidos. En hamsteres parece que una sola proterna transmembrana denominada PH-3D, que queda expuesta so· brc la supcrficie del espcrmatozoide durante la reacci6n acros6mica, media tanto la uni6n del espermatozoide a la membrana plasm~itica del 6vulo como la fusi6n de ambas membranas plasmaticas. La prote{na esta compuesta por dos subunidades transmembrana glucosiJadas denominadas a y Ii. que se mantienen unidas entre sf mediante uniones no covalentes (Figura 20-27). El dominio extracelular de la subunidad a contiene una regi6n hidrof6bica de unos 20 residuos de aminoacidos, que se parece a la regi6n fusogenica de protefnas viricas de fusi6n, que median la fusi6n de los virus revestidos con las celulas con las que interacttian (se discute en el Capitulo 13). Durante mucho tiempo se ha sospechado que las fusiones inter e intracelulares de membrana que se producen en las celulas eucariotas estan catalizadas par protefnas de fusi6n parecidas a las que se presentan en las cubiertas de los virus: PH-30 es la primera de estas protefnas que se conoce con detalle. EI dominio amino terminal extracelular de la subunidad Pde PH-30 se parece a un dominio de algunas protefnas que se unen a las jlliegrilws, los receptores de superficie celular que pcrmitcn a las celulas animales adhcrirse a la matriz extracelular (sc discute en el Cnphulo 19). Estas y otras evidencins indirectas sugieren que la subunidad 13 de PH-30 se une a una integrina de la membrana plasmalica del6vulo, contribuyendo asf a que el espermalozoide se adhiera a la superficie del oocito, preparandose para la fusi6n. A medida que se va conociendo mejor la biolog{a celular de la fecundaci6n de los mamfferos y se van definiendo las molecuJas que panicipan en las dife-rentes elapas del proceso. va siendo posible disei'iar nuevas estrategias de contracepci6n. Por ejemplo. una aproximaci6n que se est! cstudiado consiste en inmunizar machos 0 hembras con moleculas necesarias para la reproducci6n. esperando que los anticuerpos producidos inhiban las aClividades de eSlas moleculas. Ademas de las difercntes hormonas y receptores hormonales que participan en la reproducci6n. ZP3 y PH-30 pueden ser moleculas diana adccuadas para esta esrrategia. Una aproximaci6n ahernaliva podrfa consistir en administrar oligosacaridos 0 peptidos correspondiemes a Iigandos, como es el caso del dominio de uni6n a integrinas de PH-30, que acnlen en la fecundaci6n. PequeFias moleculas de este tipo pueden bloquear la fecundaci6n compitiendo con el Ugando normal.

NH,

po.ibl'dom,n;o d'llnl(ln I Int'9rina

Flgun 20-27 La protema PH-30 de la membrana del espennatozolde de hlimster. Las subunidades a y It ambas g1ucosiladas (no se muestra), se hallan asociadas entre sf de manera no covalente. La similitud de la secuencia de aminoacidos en la misma zona de ambas subunidades, semejante a EGF. sugiere su evoluci6n a panlr de una protefna progenltora cornun.

£1 espermatozoide proporciona un centrfolo al zigoto l6 Una vcz fecundado, el 6vulo se denomina zlgoco. Sin embargo, la fecundaci6n no se complcta hasla que los dos nlicleos haploides (L1amados promic/eos) se fusionan y combinan sus cromosomas formando un solo nucleo diploide. En ooci109 fecundados de mamfferos ambos pronuc!eos no se fusionan directamente como ocurre en muchas otras espccies: se acercan uno a OlTO pero permanecen indepcndiemes hasta que la mcmbrana de cada uno de ellos se rompe en preparaci6n para la primera divisi6n mei6tica (Figura 20-28). En la mayorfa de animales, incluido el hombre. el espcrmatozoide contribuye at zigoto con algo mas que con su DNA: tambien aporta un centrfolo. El cenlnolo del espcrmatozoide emra en el oocito con el nticleo y la cola del espennalozoidc. y en algunas especies se replica y colabora en la organizaci6n del ensamblaje del primer huso mit6tico en el zigoto (vease Figura 20-28). Ello explica por que a veces aparecen husos muJripolares 0 extramil6ticos en casos de poliespermia, en que varios espcrmatozoi· des aportan centriolos al oocilo. La fecundaci6n marca el principio de uno de los fen6menos m
1107

nucleo haploide deloocito

......

CITOSOL

cromosomas

OOS

material pericentr:;'.".'••" . . . .

micleo haploide delespermatozoide

NUCLEOS DIPLOIDES

LASENVOLTURAS NUCLEARES SE INTERDIGITAN, LOS CROMOSOMAS SE HAN DUPLlCAOO

REPLICACI6N DE LOS CENTRIOLOS, LA ENVOLTURA NUCLEAR SE ROMPE

LOS CROMOSOMAS DEL OOCITO Y DEL ESPERMATOZOIDE SE ALiNEAN SOBRE UN SOLO HUSO METAFAslCO

Figura 20-28 Union de los pronucleos del espemmto:rolde y del oocllo tras la fecundacl6n en mamlferos. Los pronucleos migran hacia el centro del oocito. Cuando se encuentran, sus envohuras nucleares se interdigitan. Los centriolos se replican, las envolturas nucleares se rompen y los cromosomas de ambos gametos se integran en un huso milotico comun, que media la primera division del zigoto. (Adaptado a panir de dibujos sobre eleclronmicrograffas proporcionadas por Daniel SztlllosL)

Resumen En los mamiferos in fecWUUKidll empieza ClUltuto la cabeza de lin espemultozoide se mle, de una m/mera especifica de la especie, a la zolla peMcitUl que rodea el 6uu10. Esto induce mill reacci611 acros6mica en el espermatozoide, el clUlllibera el contetJido de Sll ves{cula acros6mica, incluyemw enzimas que ayudan a que el espermalozoide digiera la zona peldcida ell Sll camino lIasta la membrana plasmatica deloocilo, para potierftui01,arse co,. ellll. LajuSi611 esttf catalizada por IIlIa proteina transmembrana localizada en III membrana plasmtftica del espermatozoide. Este proceso activa el oocito para qlle produzca III reacci6n cortical, mediante la Clul1los granulos cortlcales llberall Sil contellido, illclJl.ye"do eluimas que alteran in zona peldcitUl previniendo asi III jusi6n tk otros espermatozoides. HI desarrollo del zigoto empiezn tkspuis de que los prolllwIeos Imploides tkl espenllatozoide y tkl 6uulo se Imyan puesto ell cOlltacto, meulallllo sus cromosomas IltISta formar un solo Illwleo diploide.

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Mecanismos celulares del desarrollo

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Un animal 0 una planta pluricelulares son un cion orrlenarlo de celulas que conlienen cl mismo genoma pero que preseman especializaciones distintas. La esIructllra final puede seT enarmemenle compleja pero se genera por un limitarlo repertorio de actividades celulares. las celulas crecen. se dividen y mueren. Forman uniones mecAnicas y generan fuerzas para sus desplazamiemos y movimien lOS. Se diferencian mediante la expresi6n 0 inhibici6n de determinados grupos de prOleinas. Producen senales moleculares que afectan a las celulas vedoas y a su vez responden a senates que las celulas vecinas les envian. El genarna, repetido de fonna identica en looas las celulas, define las reglas seglil1 las cuales las diferenles aetividades celulares posibles entraran en juego. Mediante eSle proceso, en cada c~lula se esrablecen las directrices que conduciran el complicado proceso del desarrollo pluricelular por el que se genera un organismo adulto a partir de un huevo fecundado. En este capitulo, en lugar de eSllldiar un organismo en detalle, ilusLTaremos los principios generales del desarrollo mediante referencias a las especies que mejor illlstren cada principio. Primero veremos c6mo los movimielllos y las divisiones eelulares dan forma aI embri6n animal y e6mo se establecen las diferencias entre e~lulas scgu.n lin patr60 espaeial. Despues eoosideraremos c6mo actua la mcmoria cclular para perpetllar dicho patr6n espacial de diferenciaei6n y permite el almacenaje de nuevos detalles a medida que crece el animal. En la parte central del capflulo examinarcmos los mecanismos geneticos fundamentales de control, tomando como ejemplo el nematodo Caellorllabdiris elegalls y la mosca Drosophila melallogasler. Veremos c6mo la genetica molecular ha revelado similitudes notables en el desarrollo de las mas diversos grupos de ani males. Debido a que las lombrices y las moscas son primos nueSLTos, 10 que aprendamos a partir de ellos nos proporciona una informaci6n crucial sobre el desarrollo de los mam[feros. las dos ultimas partes de este capftulo se pueden leer como m6dulos separados: revisamos el desarrollo de plantas con flores y nos preguntamos hasta que punta siguen los mismos principios que rigen el desarrollo animal, y luego revisamos los mecanismos especiales mediante los cuales el sistema nervioso desarrolla su exrraordinaria red.

Movimientos morfogenicosylafonna del mapa corporall Empezaremos considcrando c6mo se forma la cstructura geometrica de un embri6n temprano de vertebrado. Nos centraremos en el desplazamiento de las ceo

•

1111

lulas hacia sus posiciones correctas. En los apartados siguientes consideraremos la adopci6n por parte de las celulas de los caracteres diferenciados correctos. Tradicionalmente se distinguen tres fases en el desarrollo de un vertebrado -y por supuesto de muchas otras c1ases de animales. Durante la primera fase el huevo fecundado se segmenla y forma muchas celulas mas pequenas, las cuales se organizan formando un epitelio y realizan una compleja serie de desplazamientos, Uamados gaslTulaci6n y neurulaci6n, que determinan el mapa basico del cuerpo -una cavidad intestinal y un tubo neural rudimentarios. Durante la segunda fase se forman los rudimenlos de los diversos 6rganos del cuerpo, tales como las extremidades, los ojos, el corazdn, etc.- proceso denominado organogenesis. En la tercera fase las pequenas estructuras que se han generado de esta forma crecen hasta alcanzar su tamano adulto. Estas fases no estan c1aramente delimitadas en el tiempo sino que se solapan. La rana Xenopus laevis (Figura 21I) nos servini para seguir el desarrollo de un huevo fecundado hasta el inicio de la organogenesis. AI igual que en otros anfibios, todo el proceso a partir de la fecundaci6n ocurre fuera de la madre, y el embri6n en desarrollo es resistente y Mcil de manipular para la experimentaci6n.

La polaridad del embri6n de anfibio depende de la polaridad del huevo 2 EI huevo de Xenopus es una celula grande, aproximadamente de un miHmetro de dicimetro, rodeada por una capsula 0 cubierta extracelular gelatinosa. La mayor parte del volumen celular esta ocupado por plaquetas vitelinas, que son agregados iipoproteicos rodeados por una membrana. EI vitelo esta concentrado en el extremo inferior del huevo, denominado polo vegetallvo; el extremo superior se denomina polo animal Las regiones animal y vegetativa contienen conjuntos distintos de moleculas de mRNA, diferentes cantidades de vitelo y de alros componenles celulares, y tienen destinos diferentes. En J(neas generales, el extremo vegetativo del huevo esta destinado a la formaci6n de tejidos internos (particularmente el tubo digestivo). mientras que el extremo animal dara lugar a los tejidos extemos (por ejemplo la piel). La fecundaci6n inicia una compleja serie de desplazamientos que finalmente doblaran la regi6n vegelativa hacia el interior, formaran el intestino, y a 10 largo del proceso estableceran los lres ejes del cuerpo: el anteroposterior, desde la cabeza a la cola; el dorsoventral, de la espal.da al vientre; y el mediolateral, desde e\ plano media a derecha e izquierda. La asimetrfa animal-vegetativa de un huevo no fecundado define solamente uno de los dos ejes finales del cuerpo -e\ anteroposterior- pem la fecundaci6n desencadena una distorsi6n del contenido del huevo creando una asimetrfa adicional que delermina una diferencia dorsoventral: el c6rtex citoplasmatico del huevo, exterior, rico en actina, gira bruscamente respecto al centro del huevo, de ral modo que el polo animal del c6rtex se indina Iigeramente hacia la futura cara ventral (Figura 21-2). La direcci6n del giro viene determinada por el punto de entrada del espermatozoide -quiza por efeclo del centrosoma que el espermato-

""., f~""d'd'O ~I

1 mm

112 hora. 1 c61ula

4 horas, 64 c61ulas

"""'"

•

6 horas, 10000 c6lulas

g''''"'' • 10 horas, 30 000 c61ulas

"~"'"'"

~ "

,

"

,'.

19 horn, ao 000 c61ulas

32 horas, 170000 c6lulas renacualo autosuficiente, 110 horas, 10" c61ulas

FIgura 21-1 Stoopsis del desarrollo del huevo deXenop"s faeuLs desde el huevo reelen fecundado hastael renacuajo

autosuflclenle. La fotograffa superior muestTa la raoa aduJta. Las rases del desarrollo se han dihujado vistas de lado, salvo en eJ casu del embri6n de 10 horas y del embri6n de 19 horas, que se han dibujado desde abajo ydesde arriba respectivamente. Salvo los adultos, lodos las fases se muestran a la misma escala. (Fotografla por cOrlesla de Jonathan Slack: dibujossegt1n P.O. Nieuwkoop yl. Faber. Normal table of Xenopus laevis [Daudin]. Amsterdam: North-Holland, 1956,)

1112

Capftulo 21 : Mecanlsmos celulares del desarrollo

POLO ANIMAL

Ir,n}e; gns efeet&nt,

o

o R 5

c6rtex

A

membf.n. plasm'tic.

L

vitelo central

POLO VEGETATIVO

zoide introduce en el 6vulo. En muchas especies de anfibios aparece una banda de pigmcntaci6n clara, lIamada media luna gris, opuesta al punto de entrada del

espennatozoide. que es debida a que los gnmulos de pigmento se desplazan a causa del giro. En los alrededores de la media luna gris el c6rtex del hemisferio vegetativo se yuxtapone con la regi6n central del citoplasma del hemisferio animal, creando una regi6n especial, crucial para la organizaci6n del eje dorsoventral del cuerpo, tal como veremos mas adelante. EI punto de entrada del espermalozoide corresponde, mAs 0 menos, con el futuro vientre; el lado opuesto farmaTA las estructuras de la espalda y el dorso, incluida la meduJa espinal. Los lratamientos que bloquean la rotaci6n permiten que 1a segmentaci6n del huevo se produzca con normalidad pero se forma un emhri6n con un intestino central y sin asimetrfa dorsoventral.

La segmentaci6n produce muchas c~lulas

a partir de una c~lula iniciaP La rotaci6n conical se completa aproximadamente una hora despues de la fecundaci6n y dispone la escena para la segmenraci6", en la euaJ una unica y gran c~lula huevo se subdivide repetidamente por mitosis, dando lugar a muchas e~­ lulas mcis pequenas, 0 blast6meros, sin que se produZC3 cambio en la masa tOlal (Figura 21-3). Para sobrevivir, el embri6n ha de aJcanzar rcipidameme un estado en el que pueda empezar a aJimentarse, nadar y escaparse de los depredadores; estas primeras divisiones eelulares son extraordinariamente rcipidas, can un cicio de aproximadamente 30 minutos. Pareee que la elevada velocidad de replicaci6n del DNA y de la mitosis imposibilita que se produzca transcripci6n g6nica (aunque se produce s(ntesis de protcfnas), de forma que la segmemaci6n del

FIgura 21-2 Primer desplazamlento morfogb1Jco despues de la fecundackSn de un huevo de rana. EI c6rtex del huevo (una capa de escasas micras de profundidadJ gila aproximadamente 30'" en relad6n al centro del huevo. en una direcciOn delenninada porellugar de entrada del espermatozoide. En las especies que presentan pib'111entaci6n en eI polo animal. la rotaci6n genera una fmnja gris creclente (media luna gris) opucsta aI punlO de entrada del espermntozoide. Figura 21-3 Elapas de segmentackSn enXmoplls.los dibujos muestran una serie de visiones laterales. Las fotografias esllin lomadas desde arriba. Las escisiones subdividen ntpklamenle eI huevo en muchas ceJuias m4s pequenas. La divisiOn celu1ar es sincronizada durante las 12 primeras escisiones, aunque las divisiones son asimt!lricas, de fonna que eI ntimero de ct!lulas vegetativas inferiores. cargndas de vitel0. es menory son mlis grnndes. Las asimetrlas del huevo y los patrones de segmenlaciOn varian de unas especies animales a otras. En los mamlferos. cuyos 6vulos pequeiios y simt!lricos contienen poco vitelo, las tres primeras escisiones dividen la ct!lula en ocho blasl6meros j~nticos. En el otro extremo.lenemos como ejemplo eI huevo cargado de vilelo de las a\'CS. cuya segmenlaciOn no se completa en el vilelo. permaneciendo lodes los micleos adheridos al polo animal; emonces el embriOn se desarroUa a panirde un grupo de ct!lu1as sittladas encima del vitelo. (Fotograflas conesla de Jonathan Slack.)

1--1 mm-l

J)

-CC))-~-

1 hor., 1 eelul.

hueYO fecundado

3 t>orn. 8 dluln

fase de 2 ClIluln

I... de 4 • 8 ClIlules

Movimienlos morfog~nlcos y la fanna del mapa corporal

4 /lorel, 64 dlul..

I... de 16 Clilul..

btAstule

1113

embri6n depende casi lotahnente de la reservas de RNA, de protefnas y de Olros materiales acull1ulados en el huevo mientras se desarroll6 como oocito en el interior de la madre. La unica biosfntesis crucial necesaria es la de DNA, y la extraordinariamente rapida replicaci6n de DNA es posible gracias a la presencia de un numero elevadfsimo de orfgenes de replicaci6n, mllY cercanos enlre sf en el DNA cromos6mieo. Tras aproximadameme 12 ciclos de segmentaci6n (7 horas), la velocidad de la divisi6n celular baja bruscamente y comienza la transcripci6n del genoma del embri6n. Parece que este cambio, denominado la trans;c;6n de la media bldstllla, se inicia debido a que se alcanza una proporci6n critiea entre DNA y cilOplasrna: la transici6n puede verse acelerada 0 retrasada si aumentamos 0 reducimos artificialmente la cantidad de DNA presente en el huevo.

La bhistula es una cavidad rodeada por un epitelio" Desde el inicio, las ceilulas del embri6n no se unen entre sf 5610 mecanicamente, sino que tambi~n eSlan acopladas por medio de uniones de tipo gap a trav~s de las que pueden pasar iones y pequefias moleculas, transportando mensajes que pueden panicipar en la coordinaci6n del componamiento celular. Mientras tanta, en las regiones mas extemas del embri6n existen uniones estancas entre biast6meros que generan una soldadura que arsla el interior del embri6n del medio extemo. Aproximadamente en la fase de 16 c~lulas se empieza a bombear Na' a trav~ de las membranas celulares hacia los espacios intercelulares del interiar del embri6n, y el agua sigue al Na' como resuhado del gradiente de presi6n osm6tiea que se produce. Los espacios intercelulares del interior del embri6n se agrandan fonnanda una sola cavidad, el blastoc:ele, y ahara el embri6n se denamina bhistula (Figura 21-4). Las c~lulas que forman la superficie exterior de la blastula se organizan en una capa epitelial, que sera decisiva en la coordinaci6n de su comportamiento posterior.

La gastrulaci6n transforma una esfera hueca de celulas en una estructura triestratificada con un intestino prirnitivo 5 , 6 Cuando las c~lulas de la blaslula han quedado ordenadas formando la capa epitelial, pueden iniciarse los dcsplazarnientos coordinados de la gastrulacl6n. Este espectacular proceso transforma la simple esfera hueca de celulas en una estructura pluriestratilicada, con un tubo digestivo central y una simelrfa bilateral: como consecuencia de una complicada invaginaci6n, muchas de las celulas situadas en la peri feria del huevo se desplazan al interior del mismo. EI desarrollo posterior depende de las interacciones entre las tres capas de c~lulas, interna, externa, y media que se han generado de est a forma La gastrulaci6n -formaci6n de un tubo digestivo mediante In irwaginaci6n de celulas situadas en el exteriar, hacia el interior del embri6n temprano- cs un paso fundamental en el desarrollo de practicamente todas los grupas animales. EI embri6n transparentc de erizo de mar proporciona uno de los ejemplos mas daros e i1ustrativos de estc proceso. La Figura 21-5 muestra la secuencia de

unlOnesla~

uniOrl de lipo g.p

1114

Capftula 21 : Mecanlsmos celulares del desarrolla

Figura 21-4 La bhistula. En esta fase las celulas forman un epltelio que envuclvc una cavidad lIena de Ouido, el blastocele. I.as celulas se asodan el~tric8mente mediante uniones de tipo gap y las uniones estancas cercanas a la superficie extema crean una soldadura que afsla el interior del embri6n del medio memo. Obser\'ese como en Xenopus la pared del blastocele liene varias celulas de grosor y que 5610 las celulas mas eJ:lemas se encuentran fuenemente unktas fonnando un epiteUo.

polO anim.1

blnlocele

ailula.

mesenqu;maIOia.

prima,i.. en Clilulas mesenquim.tou.

pr;mar;as

mignICi6n polo Y8gf!t.tivo

lei

101

181

filopodio.

futuro elqlHllelo

lEi

IF)

101

Figura 21-5 La gastrulaclon en el erlzo de mar. EI puntc de partida de la gastrulaci6n del erizo de mar es una simple blastula: una capa de cerca de 1000 cl:lulas que envuelve una cavidad esfl!rica. (A) Una electronmicrograffa de barrido muestra el plegamicnto inlerior inicial del epitelio en el polo vegetativo. (B) Un primer grupo de cl!lulas delmescnquima se liberan del epitelio en el polo vegetativo de la blastula. (el Estas cl!lulas se arrastran por la cara interior de la I>ared de la blasmla. (0) Mientras. en el polo vegetativo, el epitelio conliml.a invaginandose. (E y F) El epitelio continuasu invaginaci6n y se extiende formando untubo illlestinallargo: las cl!lula que se invaginan cambian activamenle su empaquetamiento sin alterar demasiado su forma celular normal. convirtiendo asf su formaci6n inicial de cupula aplanada en un tuba digestivo largo y estrecho. Este tipo de movimiento de tejidos, en el que una capa de cl!lulas se a1arga en una dirccci6n al mismo tiempo que se acorta en la otra, es una de las causas principales del remodelaje durante el desarrollo animal y se denomina exrensi6n conl.lt!rgeme. AI mismo tiempo, a1gunas cl!lulas de la capa epitelial que se invagina proycctan filopodies hacia el interior de la cavidad del blasl(K;ele; diches filopodios entran en COnlacto con las paredes de la cavidad, se adhieren a ella, y se cantmen, contribuyendo asf a dirigir el desplazamiento invaginante. (G) EI extremo del tuba digestivo entra en cantaeto con la pared de la blastula en la localizaci6n donde aparecerli la futura boca. Aquf se fusionarli el epitelio formando un agujero. CA, de R.D. Burke, R.L. Myers, T.L. Sexton, yc. Jackson, Dev.BioL 146:542-557, 1991; B·G segUn L. WolperyT. Gustafson, Endeavollr26:85-90, 1967.)

aconlccimientos, comenzando a partir de una senciUa bh1sluJa hucca. Esquematicamente. las celuJas situadas en el polo vegetativo se invaginan, formando un tubo que finalmente entrara en conlacto con el epiteJio cerca del polo opuesto del embri6n. fonnando la boca. Mientras Ian 10, en determinados pun los salen celulas del epileJio invaginado y se desplazan por el interior de la cavidad del cuerpo formando el lejido conjuntivo embrionario, 0 mest!"qllima. En la estructura triestratificada (ormada por la gastrulaci6n, la lAmina interna, el tubo digestivo primitivo. cs el e"dodermo; la lamina externa, es decir el epitelio que ha permanecido extcrno, es el ecrodermo; y entre ambos esta el mesodermo, la capa mas laxa de lejido formada por celulas mcsenquimalosas. ESlas son las lres hojas gennlnalcs iniciales caracterfslicas de los animales superiores. La organizaci6n del embri6n en estas tres capas se corresponde, a grandes rasgos, con la organizaci6n del adulto -inlestino en el inlerior, epidermis en el exlerior, y lejido conjumivo y. musculo entre ambos. Globalmenle se puede decir que estas tres capas de lejidos adultos derivan respeclivamente del endodenno, del ectodermo y del mesodermo, aunque exislen excepcioncs. EI proccso de la gastrulaci6n es mas complejo en el huevo de Xenopus que en el de erizo de mar. Sin embargo, cs imponante conocer sus principios basicos ya que los ejes fundamentalcs del cuerpo de un venebrado se generan por los desplazamientos de la gaslrulaci6n. Los detalles de est'e proceso se describen en la Figura 21-6. Ellejido situado junto a la media luna gris, a un lado del polo vegetativo. juega un papel fundamental. Aquf la gastrulaci6n comienza con una pequefta invaginaci6n que se eXliende gradualmente formando el blaslopora -una linea de penetraci6n que finalmente se curva rodcando cl polo vegetativo. EI lugar donde comienza la invaginaci6n define el labia dorsal del blasloporo; CSIC tcjido juega un papel importanle en las complejas series de movimientos que se producen a continuaci6n y a partir de el se produciran las estrucluras Movimlentos morfogenicos y la forma del mapa corporal

1115

PQLOANIMAL

linea media dorul

,, ,,,

,, ,, tabla dOfHI del b1..toporo

'11/,

'~~~~v,

tapOn vitelino

POLOVEGETATIVO

im6genes eJlterioles ~

cavidad

ectodermo neural

........

tptaca neuraU

intestinal

b1a5locele oblit...clo

_ _do

-labia del blastopore

vitelo

'mm

""

secdones lransYef'U1es

dorsales del eje principal del cuerpo. Como ocune en el erizo de mar. el resultado final del proceso completo es una estructura triestratificada: un capa de ectodermo extern a, un tubo interno de endodermo formando el rudimento del intestino, y entre ellos un capa de mesodermo. De nuevo. la boca se desarrolla como un orificio formado en un punto anterior en el que el endodenno y el ec· todermo entran en comacto directo sin intervenci6n del mesodermo. La transformaci6n que se ha producido durante la gastrulaci6n se puede resumir dibujando sobre la superficie del embri6n, al inicio de la gastrulaci6n. un mapa de deslillQ que indique las regiones destinadas a formar especfficamente cada una de las panes del cuerpo del adulto; en la Figura 21-68 se muestra uno de eslos mapas.

Los movimientos de gastrulaci6n se organizan alrededor dellabio dorsal del blastoporo< 7 EJ labio dorsal del blastoporo desempena una funci6n central no 5610 en el sentido geometrico. sino tambien como fuente de control. Si se secciona el labio dorsal de un blastoporo de un embri6n nonnal al comienzo de la gastrulaci6n y dicho labio se injerta en otro embri6n en posici6n diferente, el embri6n receptor

1116

'6'

Figura 21-6 La gastruJacl6n en Xenopus.. CA) Las im~genes exteriores (arriba) muestran el embri6n como un objelO semitransparente, la visi6n es lateral; las secciones transversales (abajo) est~n extraidas del plano medio (el plano en el que se cruzan las Ifncas dorsales y ventrales). Las diTecciones del movimiento celular se indican mediante flechns rojm. La gastrulaci6n se inicia cuando aparece una cona invaginaci6n. el primer signo del futuro blastoporo. en el exterior de la bl~stula. La invaginaci6n se extiende gradualmente, CllJ'VlIndose alrededor de la bltislula hasta que cierra el cfrculo envolviendo un grupo de celulas con abundante vilelo (que finalmente quedartin encerradas en el inlestino y ser.in digeridas). Mienlras eslO ocurre, varias capas de celulas se repliegan alrededor dellabio del blasloporo yse desplazan hacla el interior del embri6n. AI mismo liempo el epilelio externo de la rcgi6n del polo animal se extiende ocupando el lugar de la capas celulares que se han replegado. Finalmente, el epilelio del hemisfcrio animal se extiende de esta fonna cuhrlendo la superficle exlerna del emhri6n en su tOlalidad. y a medida que se complela la gastrulaci6n. el circulo del blastoporo se contrae quedando reducido pr~cticamente a un punlO. (8) Mapa del destino de las diferentes zonas del embri6n temprano de Xe,lOpUJ (visto lateralmente) al inidar la gaslrulaci6n. que muestra los orfgenes de las celulas que formaran las tres capas germinales como resultado de los movimientos en la gaslrulad6n. Las distintas partes del mesodermo (placa lateral. somitas y nOlocorda) derivan de celulas situadas mtis profundamente en la franja rayada. de cuyo epitelio se segregarAn posteriormente; las otras celulas, incluidas las 111M superfidales de la franja rayada. dar6n lugar al ectodermo (azul y rajo. en la parte superior) 0 al endoderll1O (mnarillo. pane inferior). En resumen, las primeras celulas que se IJliegan hada el inlerior de huevo, es dedr que inlJOl'lcio/lulI. efectuanll1ovimienlOS en el interior del embri6n formando las estructuras endodermicas y mesodermlcas mas anteriores, mientras que las ultimas celulas en illvolucionar forman las estructuras mas posteriores. (Segllll R.E. Keller,}. Exp. Zool. 216:81- 10 I. 1981.)

CapCtulo 21: Mec:anJsmos celulaTes del desarrollo

~"-'~ E"='~ el labio do....l de un bl.stoporo del d&dor " inje." el'l un luger ,norma''''' 81 receptor

localizacian de invaginaei6n

~.

.~ .

."

.

.

el embfi6<'l doble H detanollf, eon easi I. totalidad de tejidos originariot del receptOf

inicia la gastrulaci6n tanto en su propia labia dorsal como en ellugar del injeno (Figura 21-7). Los movimientos de gastrnlaci6n del segundo punlo conllevan la formaci6n de un segundo conjumo completo de estructuras corporales. de for-

rna que se ohtiene un emhri6n doble (gemelos siameses). Realizando injertos de este lipo entre especies que teogan c~lulas de pigmemaci6n diferente, de manera pueda distinguirse ellejido receptor del lejido implamado. se ha podido demostrar que ellabio del blastoporo injertado alrae epitelio receptor hacia su propia sistema de endodenno invaginado y de mesodermo. Evidenlemente ellabio dorsal del blastoporo proporciona algona seilal (0 sei'iales) que coordinan los movimienros de Ja gastrulaci6n y, direcfa 0 indirectamenle, el patron de especializaci6n de los tejidos de su alrededor. Debido a este papel crucial en la organizaci6n de la conslrucci6n del eje principal del cuerpo, ellabio dorsal del blastoporo es conocido como el Orgmlizador (u Orga· nizador deSpemann, su codescubridor). Es el mas antiguo y famoso ejemplo de un centro embriollario de senales -una funci6n que trataremos m:i\s adelanle cuando consideremos c6mo se conlrola la diversificaci6n celular.

Flgura21-7 PapelddOrganlzador.

Diagrama de un experimento que mueslrn romo ellabio dorsal de un blasloporo IQrganizador de Spemann) inicia y controla los movlmientos de la gastrulaci6n y romo, en consecuencia, sl se trasplanta organiza la fonnaci6n de un segundo conjunto de estructuras corporales. La fotografia muestra un renacuajo de axolole bict'!falo y con dos colas resultado de dicho injerto; en Xenopus se obtienen resultados muy similares a 6ae. (folografia cortesfa de Jonathan Slack.1

Cambios activos del empaquetamiento celular suministran una fuerza conductora para la gastruJaci6n l ,6,8 La gastrulaci6n comienza con cambios en la forma de las celulas siwadas en el blaslOporo. En los anlibios estas celulas reciben el nombre de celuJas en boteUa: (ienen cuerpos anchos y cuellos estrechos que les sirven para anclarse a la Sllperficie del epitclio (Figura 21 -8), Y pueden contribuir a curvar el epitelio y pie-

garlo hacia el interior, produciendo la muesca inicial observada desde el exterior. Cuando se ha formado este primer pliegue, las celulas pueden cominuar desplazandose al interior de la capa formando el tuba digestivo y el mesodermo. Como en el erizo de mar, parece que el desplazamiento sea guiado par una combinaci6n de mecanlsmos, aunque eJ principal de ellos es el re-empaquetamiento de celuJas. especialrncnte eJ de las celulas situadas en la parte dorsal de la zona marginal junto allabio blastoporo (vease Figura 21-8). En este punta se produce la extensl6n convergente. Pequefios fragmentos de tejido de la zona marginal

~~

rica en fibronectina

c----

1 epilelio del polo Inimll

en expansion

2 celulu mesod'rmiea. que migran sabre If, eapa de fibronectina

3 celulf,. en bolenl que

avudln I curvlr elepilelio en invaginaeiOn

4 lona marginal que experiment. If,

I.bio dortaJ del b1estopofO

Movlrnientos morfogenicos y la forma del mapa corporal

eJdensiOn eonvergenle

Flgura21-S Los movlmienlos celulares de la gastrulaci6n. Embri6n de Xellopus en gastrulaci6n seccionado en el mismo plano que en la Figura 21-6: se indican los cuatro tipos principales de movimienlOS implicados en la gastrulaci6n. EI epitelio del polo animal se expande mediante la reorganizaci6n celular, hacit'!ndose mas fino a medida que se ensancha. La migraci6n de las celulas mesodt'!rmicas por encima de 13 matriz de fibronectina

revisliendo ellec::ho del blaslocele puede contribuir aI estiramienlo de los lejidos invaginados. Sin embargo, la fuerza principal en la conducci6n de la gastrulaci6n en Xenopus es la extensi6n com'ergente de la zona marginal. (SegUn R.E. Keller. j. Exp. ZooL 216:81-101,1981.)

1117

-

EXTENSION

1

~~A

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t-

-

~~~~ ~

EXTEiSION

IAI

I

linea media dorsal

IB!

los lamelipodios intentan situarse sobre las superficies de las celulas veclnss. tlrando de eltas hscia el interior tal como indican las flechas

dorsal aislados en cultivo se estrechan y se a1argan espontaneamente gracias a una reorganizaci6n celular, tal como harfan en el embri6n durante el proceso de convergencia hacia la Ifnea media dorsal, doblandose hacia dentro alrededor del labia blastop6rico, y alargandose hasta formar el eje principal del cuerpo. En la Figura 21-9 se presenta una visi6n caracterlstica de los mecanismos que acompafian la extensi6n convergence.

Las tres capas germinales formadas por la gastrulaci6n tienen destinos distintos9 , 10, 11, 12 EI endodermo forma un tubo, el primordio del tracto digestivo, desde la boca hasta el ano. No s610 da lugar a la faringe, al es6fago, aI est6mago y a los intestinos, sino lambien a muchas glandulas asociadas. Por ejemplo, las glandulas sa!ivales, el hfgado, el pancreas. la traquea y los pulmones, se desarrollan a partir de las paredes del tracto digestivo inicial y crecen hasta convertirse en sistemas de tubos ramificados que se abren aI tubo digestivo 0 la faringe. EI endodermo forma los componentes epiteliales de estas estructuras -el revestimiento del intestino y las celulas secretoras del pancreas, por ejemplo- mientras que los elementos musculares y fibrosos que acWan de soporte derivan del mesodenno. La diferenciaci6n del mesodermo esta guiada por el Organizador en ellabio dorsal del blastoporo. que parece ser una fuenle de moleculas seoal que regulan las alternativas entre los posibles destinos mesodermicos. A su vez, las seiiales procedentes de los distimos grupos de celulas especializadas controlan el patr6n basico de especializaciones del endodermo y del ectodermo e inician la formaci6n del sistema nervioso, como veremos mas adelante. Tras la gastrulaci6n, la capa mesodermica del embri6n queda fragmentada en zonas diferentes silUadas a derecha e izquierda del cuerpo. Una espcciaJizaci6n muy precoz del mesodermo, conocida como nOlocorda, define el eje central del cuerpo y efectua la separaci6n. Se trata de una delgada varilla de celulas, de aproximadamente 80 flm de diametro, con ectodermo por encima de ella, endodermo por debajo y rnesoderrno a cada lado (vease Figura 21-12). Tambien deriva de las celulas del Organizador. AI pasar a1rededor dellabio dorsal del blastoporo y desplazarse hacia el interior del emhri6n. eslas celulas forman una columna de tejido que se alarga espectacularmente par extensi6n convergente. Las celulas de la notocorda tambien se hinchan debido a las vacuolas, de modo que la varilla se alarga todavia mas estirando el embri6n. En los cordados mas primitivos, que no tienen vertebras, la notocorda se conserva como substituto primitivo de la columna vertebral. En los verlebrados actda de centro alrededor del Cllal se agrllpan las celulas mesodermicas formando las vertebras. Asi la notocarda es el precursor de la columna vertebral, tanlo en sentido evolutivo como en el de desarrollo. En general, el mesodermo da lugar a los tejidos conjunlivos del cuerpo -primero a una red tridimensionallaxa de celulas conocida como mesenquina (vea1118

Capftulo 21 : Mecanismos celulares del desarroUo

Flgura21.g Laextenslon convergente y su base celular. (A) Patr6n de la extensi6n convergente en la zona marginal de la gastrula. tal como se apreda desde la cara dorsal. Las jledms azilles indican la convergencia hacia la !fnea media dorsal, las jlecllas rajas indican la extensi6n del eje anteroposterior. Este esquema es demasiado simple para ilustrar el movimienw de involud6n que se produce paralelamente a este, por el cuallas cclulas se pliegan hacia el interior del embri6n. (B) Esquema del componamiento celular que sirve de base a la extension convergente. Las cclulas se agrupan y forman lamelipodios, mediante los cuales intentan silUarse encima de las celuJas vednas. La alinead6n de los movimientos lamelipodiales a 10 largo del eje cornlin causa la extensi6n convergenle. ProbabJemente, es un proceso cooperativo. debido a que las celulas ya aJineadas ejercen fuerzas sabre sus vecinas para que se aJineen como eHas. (8. seglln j. Shih YR. Keller, Development 116:901-914,1992.)

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IMAGENES EXTERIORES

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00" se Figura 19-30) y finalmente al tejido cartilaginoso, al t'ejido 6seo y al tejido fibroso, inc!uida 1a dermis (capa inlerna de la piel). Los tubulos del sistema urogenital tambien se forman a partir de el, asf como el sistema vascular, incillidos el coraz6n, los vasos sangufneos y las celulas de la sangre. Estos tejidos mesodermicos especializados derivan de celulas situadas a diferentes distancias del labio dorsal del blastoporo, de forma que la notocorda tiene el origen m
Rgura21-10 FonnackSndeltubo neural en Xenopus. Las imd.genes exteriores son de la cam dorsal. Las

secciones transversales estd.n cortadas por donde indica la linea disoontlnua. (SegUn T.E. Schroeder, J. Embryol. Exp. MorphoLl3:427. 462,1970.0 Company or BiologiS15 Ltd)

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Flgura2!-I! Curvalura de un eplteUo dcblda u carnblos en la fonnacelulllr medlados por mk:rotUbuJos y manlentos de actina. A partir de observaciones de Ia

neurulaci6n de salamandras y trilones, en los que el epilelio dene 5610 una capa de celulas de grosor. Amedida que los extremos apicaJes de la celllla se eslrechan, su superficies membrnnosas superiores se arrugan 1119

cresta neural somlto

notocorda _ _ _ _-\-_ cavidad dlgastiva

FIgura 21-12 SKcl6n transversaJ (esquematlea) del troneo de un embri6n de anOblo despues de cerrar su tubo neural. (SegUl1 T. Mohun, R. Tilly. R. Mohun y I.M. Slack, Ce1l22:9-15, 1980. Cl Cell Press.)

yema de la cola placa mesodllrmica lateral

caooza

endodermo y vitelo ojo

ectodarmo (epidermis!

germinales producen las celulas de las tres capas concentricas correspondientes del cuerpo adulto. Los 6rganos sensoriales, por los que la luz, los sonidos, los olores, etc., inciden sabre el sistema nervioso, tambien son de origen ectodermico: algunos derivan dellUbo neural, otros de la cresta neural, y otros de la capa externa del ectodermo (vease Figura 21-102). Por ejemplo, la retina se origina como una expansi6n del encefalo y por 10 tanto deriva de celulas del tubo neural, mientras que las celulas olfativas de la nariz se diferencian directamente a partir del epitelio ectodermico que reviste la cavidad nasal.

El mesodermo situado a cada lado del eje del cuerpo se fragmenta en somitos, de los que derivan las ctHulas musculares 19 A cada lado del recien formado tuba neural se encuentra una extensa eapa de mesodermo (Figura 21-12). A partir de la regi6n dorsal de este mesodermo -mas gruesa y medial- se forman los tejidos musculares y esqueleticos del eje central del cuerpo. Inicialmente consiste en un una lamina gruesa y continua de tejido. situada a eada lado del cuerpo. Pronto esta lamina se rompe en bloques separados, 0 somltos, que forman las series repetitivas de vertebras y mliseulos segmentados (Figura 21-13). Los somitos se forman uno tras otro, sucesivamente, empezando par la eabeza y acabando por la cola (Figura 21-13). La segmentaci6n acarrea cambios entre las conexiones de las celulas mesodermicas. EI mecanismo que controla los surcos que separan un somito de su vecino, segUn un patr6n regular, continua siendo un misterio (aunque se sabe que el proeeso ffsico de farmaei6n de somitos viene prefigurado por un patr6n de segmentaci6n de la expresi6n de ciertos genes). Cada somita se corresponde con una unidad en la secuencia final de elementos aniculados. La masa de somitos forma los musculos esqueleticos del

IAI

1120

(B~

mesodermo pre-somito

Capltulo 21 : Mecanismos eelulares del desarrollo

somito maduro

FIgura 21·13 Formacl6n de somltos en Xenopus, (Al Fotograffas de embriones en tres fases consecutivas, tomadas lateralmente y mareadas con anticuerpos especffieos anti-celulas museu lares mostrando la formaci6n de somitos. (B) Diagramas explieativos. En el esquema superior de muestra una visi6n lateral del embri6n; la lInea intermitente sei'iala el plano en el que se ha efectuado la secci6n horizontal que se muestra justo debajo. EI diagrama inferior es un esquema aumentado de las eelulas mesodermicas ell pleno proceso de reagrupaci6n formando los somitos. En Xenopus. inicialmente las futuras celulas de los somitos estan orientadas en angulo recto respecto a los ejes del cuerpo y entonees rotan en grupos durante la formaci6n de los somitos. La parte principal de eada somito formara tejido muscular y se llama miotomo; la parte intema situada frente a la notocorda es el origen de las vertebras y costil1as y se denomina esclerotomo; la mas exterior, es decir la parte dorsal (en los vertebrados superiores, aunque no en Jvmoplls), contribuira a la formaci6n de la dermis (el tejido conjuntivo de la piel) y se denomina derma/omo.

Figura ZI-14 (izquierda) ClaslRcacieSn. Las celulas procedentes de diferenles partes del embri6n temprano de anfibio se dasificaran segUn sus orfgenes. En este experimento dasico primero se desagregan la celulas mesodermicas, las celulas de la placa neural y las celulas epidermicas, y luego se dejan reagrupar en una mez.cla aleatoria. Se dasifican dando lugar a una formaci6n con reminiscenclas de un embri6n Ilpico, con un "mbo neural" interno, una epidermis enema, y un mesodenno enlee ambos. (Modificado de P.L Townes y I. Hohfreter. J. Exp. ZOO,. 128:53-120.1955.)

I

Figura ZI-IS (derecha) CadherlnBs en el embrl6n temprano. lluSIraci6n de la variaci6n de los patrones de expresl6n de tres cadherinas en eSladios sucesivos de los cmbrlones tempranos de polio 0 rat6n, observados mediante seedones transversales efectuadas en el tubo neural y los somitos en desarrollo. Las celulas que expresan el mismo tipo de cadherinas permanecen unidas entre sf y tienden a segregarse de las olras celulas. As! pues, el patr6n de cadherinas contribuye a la regulad6n del patreSn de desplazamiemos morfogenicos implicados en la formad6n del tubo neural, de la notocorda, de los somitos, de la cresta neural y de los esclerotomos. (SegUn M. Takeichi. TrendJ Genet. 8:213-217, 1987.)

IICtQdermo (plllCa neurel}

mesodermo

erMla neural

tubo nllurel

epidenTli.

~

eomlto

notocorda

lIIdtfotomo

nAve

segmenlo, mientras que un subconjunto de sus celuJas forma los lejidos corrcspondienles a las vertebras y OlroS lejidos conjuntivos como la dermis. Los somitos lambien son el origen de casi todas las celulas del musculo esqueletico en el resto del cuerpo: estas celulas derivan de precursores que abandonan los somitos antes de diferenciarse de forma manifiesta.

lipo de eedherin••

••••• E

N

E.N

E.P

N.P

Los patrones cambiantes de moleculas de adhesi6n celular regulan los movimientos morfogenicosl 4 Los movimientos de los rejidos en el embri6n van acompai'lados de cambios en los caracteres qufmicos de las celulas. Par ejemplo, una celula puede alrerar su forma 0 su movimiento mediante la activacion de la produccion de una proteina citoesqueletica. Carnbiando el conjunto de molecuJas de adhesi6n que presenta en su superftcie puede romper adherencias ameriores y establecer orras nuevas. Las celulas de una regi6n detenninada pueden desarrollar propiedades en su superftcie que causaran su adhesi6n emre elias y su segregaci6n de un gropo de celulas veeinas cuya superftcie es qufmicamente distinta. Experimentos dasicos en embriones tempranos de anfibios demuesrran que los efectos la adhesi6n selectiva celula-celuJa pueden ser tan fuertes que producen una reconstrucci6n aproximada de la estructura nonnal incluso despues de que las celulas hayan sido disociadas artificialmente y mezcladas aI azar (Figura 21·14). Como se expone en el Capftulo 19, estudios reaUzados en embriones de polio y de raton sugieren que este componamienro depende, aI menos en pane, de una familia de glucoprorefnas hom610gas de adhesi6n celulacelula dependiemes de Caz. -las cadllerj1las. Eslas y otras mol&:ulas de adhesi6n celula-celula independienles de Cal. tal como las moleculas N-CAM, se expresan de forma distinta en los difcrentes tejidos del embri6n temprano; anticuerMovlmlentos morfogenlcos y 1a forma del mapa corporal

1121

pas dirigidos contra elias interfieren con la adhesi6n selectiva normal enlre cclulas de tipo similar. Los cam bios de los patrones de expresi6n de la diferenles cadherinas se corresponden estrechamcnte con los cambios de los patrones de asociaci6n celolar que se producen durante la gastrulaci6n, la neurulaci6n y la formaci6n de somitos (Figura 21-15); el patr6n de cadherinas puede regular y conducir parcialmente las transfonnaciones del emhri6n temprano. Particularmente, parece que las cadherinas juegan un papel central en el control de la formaci6n y disoluci6n de capas epiteLiales y agrupaciones de celulas. Las cadherinas no s610 unen celulas entre sf, sino que tambien proporcionan un anclaje para los fUamentos intracelulares de actina en las 10ca1izaciones de adhesi6n celula·celuJa (vease Caprtulo 19): de esta fonna ayudan a regular el pan6n de fuerzas y desplazamientos que se producen en el tejido en desarrollo de acuerdo con el pan6n de adhesiones. Aparte de unirse unas con otras, las cl!HuJas pueden adherirse a componentes de la matriz extracelular como la fibronectina y la laminina. Estas adhesiones se producen gracias a las j"tegri"as las cuales, como las cadherinas, acnian de conectores transmembrana conectando los lugares de adhesi6n del exterior de la celula con los filamentos de actina del interior. Las interacciones entre la celula y la malriz son importantes para los desplazamiemos de ciertas c1ases de celulas que se suehan de sus celulas vecinas y migran en el embri6n, avanzando lentamente por los espacios libres entre las relulas. Invasiones como estas, que veremas a cominuaci6n, hacen que la mayorfa de los tejidos del cuerpo aduho de un vertebrado esten constituidos por combinaciones de celulas derivadas de zonas del embri6n temprano muydistantes entre sf.

UluJas migratorias invaden los tejidos del embri6n de forma estrictamente controlada ll , 15, 16 Hasta este momento hemos establecido dos c1ases de celulas migralorias -las de la cresta neural y las que abandonan los somitos formando los musculos esqueleticos. Otro grupo importanle de celulas migratorias son las precursoras de las celulas de la sangre, de las celulas germinales y de los diferentes grupos de neuronas peneneciel1leS al sistema nervioso central. Estas migraciones celulares pueden establecerse marcando las celulas aJ comienzo de su (rayecto, con coJorantes no t6xicos, 0 incluso mejor con lin marcador heredable geneticamente. La mayor parte de nuestro conocimiento proviene de CSllldios mediante injerto de ceJulas de embriones de codorniz en embriones de polio. Allnqlle la codorniz es parecida aJ polio en muchos aspectos, sus celllias se pueden dislinguir. en cortes histol6gicos, gracias a una gran masa de heterocrornatina, intcnsamente lefiida, que se enCllentra asociada aJ nucleolo. Mediante este marcador nucleolar podemos identificar Jas ceJulas injertadas que han emigrado abandonando la localizaci6n donde flleron implantad as. Por ejemplo, si se substituye un tejido somitico de codorniz antes de que aparezcan las yemas de sus extremidades, par un tejido somflico de un embri6n de polio muy temprano, todas las celulas musculares de las extremidades que se desarrollen seran originarias de codorniz (Figura 21-16). Evidentemente las fUluras celulas musculares migran desde los somilos hacia la regi6n de la fmura ala y permanecen alii, mezcladas de forma discreta can las celulas de los tejidos conectivos de las yemas de las extremidades. hasta el momento oportuno para su diferenciaci6n. Flgura21-16 Origen mlgratorio de las Dbms musculares de las extremldades. Si se SUbslilu}'en las ct'!lulas de los somilOS de la eXlremidad de un embri6n de polio por ct'!lulas de somitos de codomiz a los dos dfas de incubaci6n y luego se secciona el ala del polio una semana mM larde, se pucde ver c6mo la fibras musculares del ala del polio derivan de las ctlulas de somilOS de codomiz injenadas. 1122

Capitulo 21 : Mecanlsmos celulares del desarrollo

EMBRI6N DE COOORNIZ

'\

Itxlrecci6n de .0milO$en EMBRI6N DE POllO desarrollo de Ie regiOn donde SIt deserrollllrllie yeme del elll It inj8rlO en el embri6n de polio

I.e elll en deurrOl1o

seceiOn qutl mues1re Ie di.UibuciOn de e61olll' de codomil. en el .Nebrazo

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.iluacian original de la clliulas de la creala n,ural

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De una forma parecida se puede seguir la dispersi6n de celulas procedentes de la cresta neural. Estas celulas migran a traves del embri6n por \'fas especfficas (Figura 21-17) y se establecen en locatizaciones determinadas de forma exacta. Mientras una celula que migra se desplaza a [raves del embri6n, va repet ida mente extendiendo proyecciones que Ie permiten conocer su entomo illmedia to (Figura 21-18) mediante sutiles indicios a los que es especialmente sensible gracias a su especffico surtido de protefnas receptOras de superficie. En el interior de la celuJa, estas proteina receptoras estan cOllectadas con el citoesqueleto. responsable del desplazamiento celular. Algunos componentes de la matriz extracelular, como la fibronectina, proporcionan lugares de adhesi6n que facilitan el avance de la celula: otros, como el proteoglucano condroitfn sulfato, inhiben el desplazamiemo y repelell la inmigraci6n. De la misma forma, las celulas no migralOrias situadas a 10 largo de los caminos de migraci6n pueden tener superficies receptoras 0 repelemes, 0 incluso pueden extender filopodios que entren en comacto con la celula migratoria, afectando so comportamiento. EI tira y al10ja incesante entre las tentativas opueslas de adhesi6n, conduce a las celulas a desplazarse en la direcci6n mas favorable hasta que la celula encuentra una localizaci6n en la que puede establecer una adhesi6n duradera. Oiros facto res tambicn pueden jugar un papel imponante, como son la quimioraxis y las interaccioncs entre las celulas migratorias. Otro media para controlar la distrihuci6n de celulas migratorias es la regulaci6n de Sll supcrvivencia y proliferaci6n. Parece que tanto las celulas germinales como las precursoras de cclulas sangufneas y las celulas pigmentarias derivadas de la cresta neural, est:in gobcrnadas en este aspecto por el mismo mecanismo btisicQ de control. Tal mecanismo implica a un receptor transmembrana pertenecientc a la membrana de la celulas migratorias, denominado protefna Kit, ya

Movimlentos morfogenicos y 1a fonna del mapa corporal

Flgura21-17 PrlndpaJesvfasde mlgrad6n celuJar de la cresta neuraJ. lJustrad6n que muestra un esquema de una secci6n transversal de un embri6n de polio en la parte media de su cuerpo. Las celulas que inidan su camino juslo debajo del ectodermo formar~n celulas pigmemarias de la piel; las celulas que tomen el camino profundo via somitas fomlarnn los ganglios sensoriales. los ganglios simp~licos y partes de las ghtndulas adrenales. Las ghtndulas digeslivas. de la pared del imestino. se forman con celulas procedentes de la cresla neural que migranl.n a 10 largo del cuervo. y dar.tn origen lanto a la regi6n del cuello como a ta region sacra. (Vease tambien Figura 19-22.)

Flgura21-18 Migrad6ndediulasde la cresta neural. Esta serie de fotograHas de un embri6n vivo de pez cebra, observadas mediante contraste de fases interferencial, muestran una ctllula de la cresta neural emitiendo prolongaciones de tanteo en varias direcciones antes de tamar la direcci6n ventral correcta (parte baja de la cuarta fOlograffal. Las fotograffas se tomaron a intervalos de cinco minutos. aproximadamente. (Cortesla de Suresh Jesuthasan.)

1123

Flgura21-19 Consecuenclasde mulacloneli en el gen kit. Tanto la nina como el rat6n son heterocigotos dcbido a una mUlaci6n que conlleva la ~rdida de funciones que los deja can wlo la mitad de la canlidad normal de produclo del gen kit. En ambos casos 1a pigmenlaci6n es deficieme debida a que las c~lulas pigmenlarias dependen del produclo de kil como receplor para un faclor de supervivencia. (Cortes(a de R.A.Fleischman. de Proc. Nail. Acad. Sci. USA 88:J08B5· 10889,1991. 0 1991 Macmillan Magazines Ltd.)

un ligando. denominado factor Steel. fabricado por las celulas del rejido a traves del cuallas celulas migran y/o en el que llegan a establecerse. Individuos con mutaciones en los genes de cualquiera de estas protefnas tienen deficiencias en su pigmentaci6n, en el suministro de celulas sangufneas y en la producc.i6n de celulas germinales (Figura 21-19). Parece que el factor Steel en una forma ligada a la membrana es necesario para activar correctamente la protefna Kil y capacitar todos eslos tipos de celulas para sobrevivir y proliferar.

EI plano estructuraJ del cuerpo de los vertebrados se forma primero en miniatura y despues se mantiene a medida que el embri6n crece' Normalmente. en el momento que se forman los somitos el embri6n mide unos cuanlOS milfmetros y consla de alrededor de 1()5 celulas. Aunque hasla ahara nos hemos referido principalmente a Xenopus, su escala y forma generales son muy parecidas a la de un pez, una salamandra, un polio. 0 un ser humano (vease Figura 1-36). Posleriormenle eSlas especies de embri6n crecerillt y alcanzaran lamafios y formas muy diferenles, pero de momento se puede observar que comparten el mapa estruetural basieo del cuerpo de los vertebrados. EI sistema nervioso central esta representado por cllubo neural, con lin engrosamienlo en un extremo para el eneefalo; lin tubo de cndodermo representa cl tubo digestivo y sus derivados; los somitos representan los scgmcntos dcllronco; el mcsodermo mas periferico no segment ado represenla los olms tejidos conjuntivos, incJuido el siSlema vascular; y el eetodermo, la epidermis de la pie!. Durante el crecimlento posterior lodos estos componentes aumentanin de tammio, mulliplicandose por un factor de cien veees 0 mas en longitud. y de un mill6n 0 mas respeclo a su volumen y numero de eelulas. No obstante se conservara la misma organizaci6n basica del euerpo.

Resumen Los huevos de la mayoria de los orgmlismos son d""'as gr-andes, qlle oontienen reseroas de n"trienles y olros oomponentes espedfirodos por el ge1lo",a malemo. Ell los anfibios, el primer desplllUlmlento de importanda tras mfecllndaei6n es IIna rotaei611 del c6rtex dellllleuo en remd6n a Sit ndeleo. La asimetria producida por esla rolaei6n,jrmto oon la aslmetria original debida a iii distrlbuei6n de contenidos del hIJeuo antes de la fecruulad6n, defllle los fuh'ros ejes anteroposterior y dorsoventral del euerpo. Dura"te liu posleriores dlvislones de segmentacl6n el huevo se sl,bdivide en d/IJtas nllfe/lo m6.J pequeiias, Sill que DCurra erecimlento a/guno. Pronto se desarrollard 11M cavidad etl el interior del embri6n, mietltras se organizan liu dluliu de su alrededorfomurndo una capa epileliaL Entonas se invagina parte del epilello, Iratuformmulo el embri6n en 11M estmeturo trlestratljlro-

1124

Caprtulo 2 J : Mecanlsmos celulares del desarroUo

da, jonnadn por un tubo intemo epileUai de eOOodemlO, 111111 capa epileUai exter· na de ectodemlO, y"nn capa intennedla de dl"las mesodinniC4S qlle Sf! IlIIn sepa· rtUW de hi capa epitelhll original. Durante este procew de gaslmIm:i6n las dllllas epileliala cambian aetlvamenfe SII empaquetamienlo eelldar, Io clUlI parece ql~e proporclonn unnfilerm mayor que COOOllCe los despIaz.amlenfOs. El endodermo revestird ailnlestlno y sus tkrlvados, el ectodemlO jomlllrd hi epitknnis y el sislema nervioso, y el mesodermo los mlUculos, los lejidos conjlUlti· vos, el sislema cardiovascuhlr y el tracto urogenitaL £1 desarrollo de lodas estas es· tmcturas depeOOe de las intertuXiones entre las Ires capas germinales y Implica despIaz.amie"tos cel"inres posteriores. Por ejemplo, el mesodernlo dorsal ind,," al ectodernJO sllpraym:e"le n ellgrosarse, ellrolhlrse y separarse, jornumdo el who y In cresta Ileural. j,lStO err medio del mesodernlO dorsal II"a varilla de dlulas eSlJeciallzadtu, deno",i"ada "otocorda, se alargarajornlatldo el eje celltral del embr16n. Las anchas ld",iIUU de mesodernJo qlle esla" a cada lado de hi 'IOtocOrda se segmenUm jornlando los somltos, de los cllales derivamn las vertebras y los mdsc.dos eslJIleliticos. En varias lugares, alK'"uu dlllias migratorias, como las dlulas de hi cresla neural, 51! Ubemn de $lIS vednos orlginnles y migran a traves del embrl6n para colonlzar nuevas regionu. Molkldm de adhesl6n dluhl-ciluu.. como las cadherinas y las lntegrinas, ayudan a guhlr las mlgradones y a controhlr in colJe· si61l celular selectiva en el epit.eUo.

I.

Diversificaci6n celular en el embri6n animal temprano'" Un huevo fecundado puede convertirse en una margarita 0 en un roble, en un erizo de mar 0 en un ser hurnano. £1 resultado final esta delerminado por el ge· noma: la secuencia lineal de los nucle6tidos A, G, C YT del DNA del organismo tiene que dirigir la producci6n de una variedad de lipos de celulares qufmica· mellle distilllos dispuestos segUn un patr6n espacial muy exacto. La biologfa del desarrollo intenta explicar c6mo ocurre esto. Cualquier discusi6n del problema, en este y en siguientes apanados. se basa en un hecho fundamental: todas las c~luJas del cuerpo heredan el mismo genoma del huevo. No impona 10 diferen· tes que puedan parecer las celulas -en musculos, huesos, 0 nervios, en ralces, ta· lIos u hojas- todas contienen el mismo conjumo de instrucciones geneticas. Una de las primeras y mas contundentes demostraciones de este principio proviene de expecimentos de trasplante de nlicleos utilizando huevos de anfibio (Figura 21-20). Un huevo normal de anfibio es tan grande que utilizando una pipeta fina de cristal se pllede inyecmr en el interior del huevo un micleo extrafdo de otra celula. Antes se ha destruido el micleo del huevo receptor mediante irra· diaci6n u1travioleta. EI desarrollo del huevo se aCliva con pinchazos producidos por la pipeta fina usada para inyectar el nucleo. De este modo se puede compro· bar si el nucleo de una celula somatica diferenciada contiene un genoma completo equivalente aI de un huevo fecundado tfpico y si es igual de vAlido para el desarrollo. La respuesta es afmnativa: se puede producir un renacuajo completo a panir de un huevo al que se Ie ha substituido el mkleo por el de un queratinocito de la piel 0 por el de un nucleo de un g16bulo rojo de la sangre. Debemos admilir que estos experimemos tambien presenlan Jimitaciones. 5610 han tenido eXilO con nucleos de un grupo Iimitado de tipos de celulas diferenciadas y s610 en algunas especies. Pero actualmente existe un conjunto contundeme de evi· dencias que apuntan a esta misma conclusi6n. Con s610 unas cuantas excepcio· l1es (vease Figura 23·37), el genoma permanece intacto durante el desarrollo. Los genes se plledell activar 0 permanecer inactivos. las celulas del cuerpo se di· ferencian no porque comengan genes diferentes sino porque expresan genes distimos. En el Capftulo 9 examinamos los mecanismos imracelulares que reguIan la expresi6n genica. En el presente capitulo hemos de considerar c6mo se onginan las diferencias entre las celulas y c6mo se coordinan espacial y tempo· Diversificaci6n celular en el embri6n animal temprano

1125

..

desln.ux:i6n del n.:.cleo con ladiaci6n

celulu de la pie! piKe de cuhivo

81'1

UV

m)cleo en una pipeta

\

""" 0 /'

,

inyeclado en el nuevo

,

,,,

• blastula normal

~.. reneeuajo

ralmente dentro de un organismo pluricelular. En este apartado veremos c6mo se coordinan los primeros pasos de la diversificaci6n celular en los embriones tempranos, tomando como ejemplo ranas y ratones.

Las diferencias iniciales entre los blast6meros de Xenopus surgen a partir de la segregaci6n espacial de delenninantes en el huev0 2 • 17. 19 En la mayorfa de especies de plantas y animales el huevo es en sf mismo qufmicamente asimetrico, concentrando algunos componenles en regiones determinadas del citoplasma 0 de la membrana. Como resuJtado de ella, desde el inicio ya exislen diferencias entre las celulas que se forman en la segmentaci6n porque reciben porciones distintas de material debido a su localizaci6n asimetrica. La importancia de tales dererminanles localizados del huevo Yarra de unas especies a otras. Tedricamente siempre se ha distinguido entre dos tipos de desarrollo opuestos: en el desarrollo en mosaico, delerminames localizados del huevo disei\an por completo el futuro patr6n del cuerpo, de forma que las inleracciones celula-c~lula posteriores no denen ninguna consecuencia; en el desarrollo regu{ador, los determinantes Iocalizados del huevo no cuenlan para nada. de forma que el patr6n corporal se genera 10latmente gracias a las inleracciones clHulacelula. En realidad, la posici6n de la mayorfa de las plantas y animates esta entre ambos extremos. PO[ 10 que se sabe hasla el momenta, no exisle ninguno desarrollo que sea comptetamente en mosaico -las interacciones reguladoras siempre juegan un papel importante; como veremos mas adelame, los huevos de mamUero parecen ser completameme reguladores. Xenopus representa un caso intermedio caracterfstico. 1126

Capftulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 21-20 Trasplantcnuclear. Esquema de UII experimento que demueslra que el nuden de una celula diferenciada de la piel de una rana adulla collliene todo el material genelico necesario para conlrOlar la fomlaci6n de un renacuajo complelO. la flecha disconlinua de la parte inferior de la figurn indica que para conceder aI genoma trasplanlado el tiempo suficienlc para que se adapte a un entomo embrionario se requiere un paso mots de lransferencia en el que se extrae uno de los nuclens del embri6n lemprano cuando comienza su desarrollo y se repone en un segundo huevo anucleado. (Modificado de I.B. Gurdon. Gene expression During Cell Differentiation. Oxford, UK: Oxford University Press, 1973.)

entomo experimental d&l tejido
$

4

&

tejido del polo vegetativo

en un flmbrlan normal

cultlvedo de forma aislada

cultivado en comblnaclon con tejido del polo vegetativo

tejido llCIodermico

5610 leiido llCIodllrmico

principalmenle lejido mes0d6,mlco

y un poco de leiido

Flgura21-21 Inducclon mesodi;mtlca en Xenoplu. Las relulas del polo animal de la blaslula, que nonnalmenle 5610 forman el ectodermo. formamn tejidos mesodl!:rmicos si se cultivan conjunlamente con celulas del polo vegclali\"O. En un desarrollo nomlal, probablemente una interaccion indUCliva de este tipo sucede durallle una fase mas temprana; cuando se cult iva de forma aislada, la regi6n ecuatorial de la blastula es capaz de formar lejidos mesodennicos.

m~rmico

det:lino del tefldo del polo .nir'nIol

Las asimetrfas del huevo de Xenopus se manifieslan de varias fonnas ~n la locaJizaci6n excemrica del ntideo. en la distribuci6n del vilelo y los granulos de pigmemo, en el cilOesqueleto y, quizas la mas significaliva, en la distribuci6n de unos mRNA dcterminados. Las asimetrfas del huevo dotan a los blasl6rneros lempranos con caraCleres diferentes segun sean ani males a vegetativas, dorsales o venlrales. Tanto la alteraci6n artificial de la disposici6n de los blast6meros tempranos como la aplicaci6n de lratamientos como la cemrifugaci6n a la radiaci6n ultravioleta que desplazan los conlenidos del huevo antes de su segmentaci6n e impiden que ocurra la rotaci6n cortical que en condiciones normales sigue a la recundaci6n provocan dr.'isticas penurbaciones en el mapa embrionario del cuerpo.

Interacciones inductivas generan nuevos tipos de celulas en un patr6n cada vez mas detallado zo las direrencias iniciales enue los blast6meros rempranos s610 determinan las

bases del patr6n del embri6n. Para generar todos los tipos celulares, los blast6meros han de inleractuar unos con olroS. Si colocamos el embri6n temprano de Xenoplls en un media desprovisto de Ca 2• y Mg2., los blaSl6meros perdenl.n Sll cohesi6n, y pod ran separarse y desarrollarse por separado; unas van a desarroliar las caracterfsticas propias del ectodermo, mientras que otras desarrollaran las caracterfsticas propias del endodermo; pera ninguno de eLios activara la ex· presi6n de los genes caracterfsticos del mesodenno, como por ejemplo el gen de actina espedfico del musculo. Pero si las celulas del polo animal de la blastula se colocan cerca del las celulas vegetativas, algunas de las celulas del polo animal cambian Sll via de desarrollo ectcxiermiea por la via mesodermica (Figura 21·21).

o

o

I.

'--1 . .,--~ C el Induclde por BIPllrtirdeA

Figura 21·22 Modelaje mediante Inducdones secuenclales. Series de interaccioncs induClivas pueden generar muchos lipos de celulas partiendo de unas pocas.

OvEson inducidas por C IIplIrtirdeAyB

o

DiversIBcacl6n celular en el embri6n animal temprano

1127

A

-

A

DV oogenesis

fecundacion y rotaclon

cortical

DV dorselizaci6n del mesodermo debido II una sellal prOClldenle del Qrgllnizador

inducci6n del Organizlldor y del

mesodermo por senllies de las celulas vegetlltivllS

EI cambia de via de las celulas debido a la influencia de un gmpo adyacente de celulas se denomina induccl6n. En el transcurso de un desarrollo normal, las inducciones interactivas pueden ocurrir entre celuJas que eran adyacentes desde el inicio del proceso -por ejemplo en la inducci6n mesodermica- 0 entre celulas cuya proximidad se debe a movimientos morfogenicos como 1a gastrnlaci6n. Mediante una serie de inducciones conseclltivas se pueden generar much os tipas de celulas distintos derivados de interacciones entre unos cuanlos tipos ceo lulares (Figura 21-22). Tal como hemos destacado, las asimelrfas del huevo de Xenopus determinan no s610 el eje animal como el vegetativo del cuerpo, y en consecuencia la divisi6n del embri6n en ectodermo, mesodermo y endodermo, sino tambien los ejes dorsoventral y anteroposterior. Parece de nuevo que en la organizaci6n del eje dorsoventral acrua un mecanismo inductivo. Experimenlos de injerto indican que lodos los blast6meros vegetativos pueden inducir mesodenno pero que no todos 10 hacen de la misma forma: los blast6meros vegelativos dorsales son unicos en tanlo que inducen a las celulas situadas encima de eUos a asimilar los caracteres especiales del Organizador de Spemann. Como vimos anteriormente, a su vez el Organizador produce una sei'ial que induce a su alrededor la formaci6n de un conjunto de especializaciones del mesodermo. Posteriormente, el pa-

mRNA inyeCledo en un blestomero vegetativo ventral

Flgura21.23 Modelodetressei'iales para la Induccl6n mesodcnnJca en el embrl6n temprano de Xenopus. Parece que se necesitan al menos tres senales. actuando de la forma indicada, para explicar los resultados de los experimentos sobre injertos. De hecho cada una de las ~senales" podrfa ser producto de una compleja combinaci6n de molcculas senal. (Segun 1. Slack, From Egg to Embryo, 2nd ed. Cambridge, UK; Cambridge University Press, 1991.)

activine

FGF

noggin

bloqueo de la rlH:epciOn de sanales

bloQueo de la rlH:epcion de se"'ales

hibridaciOn in situ

laltan los tejidos ventral y posterior

expre8ado en la regiOn del Organizador; Is proteins puada dorsalizar el mesodermo vantral

.~ment81

induccion de un segundo aqui la existencia de un segundo ele corporsl

Organi~ador, de

no hay inducciOn de mellOdermo, la gastrulation fracasa

Figura 21-24 Algunas molecuJas sei'iallmpllcadas en la Induccl6n mesodcnnlca de Xenopus, Se presenla el resultado de un experimenlo representativo para cada una de las cuatra clases de factores. Aunque las cuatro c1ases de factores pueden tener efectos considerables en la inducci6n del mesodenno, sus papeles exactos respecto al modelo de tres senales ilustrado en la Figura 21-23 todavfa no se conoce con certeza. Las familias de factores Wnt, aClivina y FGF (faclor de crecimiento de los fibroblastos, de Fibroblast Growth Factor) son muy conocidas en Olros contextos como moleculas senal celuia-celuJa; la activina (como Vgl -vease Figura 21-25) pertenece a la superfamilia de factores de crecimiento TGF-It La recepci6n de senates de activina 0 de FGF se puede bloquear lnyectando mRNA que codifica una forma defectuosa del receptor proteico correspondiente, a la que Ie falta el dominio intracelular e interfiere con la funci6n del receptor normal. (Fotografia de S. Sokol y aI., Cell 67:74 1-752, 1991.© Cell Press; A. Hemmati-Brivanlou y D.A. Melton, Nature359:609-614, 1992. © 1992 MacmiUan MagaZines Ltd.; E. Amaya, T.I. Musci, y M.W. Kirschner, Cell 66:257270,1991.«:> CeU Press; y W.e. Smith y R.M. Harland, Cell 70:829-840, 1992.© Cell Press.)

1128

Capftulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

j

(AI

181

huevo "0 fecu"dado reci~" puesto

mRNA de Vg1 concentrlldo e" c6rteK vegelativo

huevo lecundlldo

la rotaci6n corticaillctiva III proteina Vgl en III regi6n dorsal vegetativa

bltostula tempra"a

III protei"a Vgl activlld8 induce el Orga"lzador

Figura Z1-25 Locallzaci6n de Vgl y su supuesto papellnduclor en el embrl6n de Xellopus. (A) Hibridaci6n ;11 situ, mostrando su localizaci6n en la regi6n vegetativa cortical del oocito (el futuro huevo). (B) Diagramas que Hustran una hip61esis de c6mo acWa Vgl. EI mRNA del Vgl se sinletiza en el oocito y queda localizado, mediante mecanismos desconocidos, en las regiones corticales vegetativas de la celula. Igual que otros miembros de la superfamilia TGF-~, la forma activa de la protefna Vgl es un fragmento segmet1tado del precursor de longitud com!)leta. EI control del paso de activaci6n de la segmentaci6n es desconocida. Si se inyecla mRNA que codifica Vgl de tamalia normal en un embri6n temprano, se produce muy poco del fragmento activo y no se observa efecto alguno en el modelaje del embri6n. Pero si se modifica el mRNA para que codifique un precursor que ya esta segmentado para producir cl fragmento activo de Vgl, las consecuencias son dramaticas: se puede inducir un eje corporal complew, de un modo que sugiere que el fragmento de Vgl esta imitando la senal que normal mente procede de los blast6meros dorsales vegetativos yque induce el desarroUo del Organizador. SegUn otra propuesta, Vgl aclua como esta senal durante el desarrollo normal, y la producci6n de fragmento activo de VgI se localiza en los blast6meros dorsales vegetativos mediante un proceso que conSla de dos fases. Primero, el mRNA es liberado en el extremo vegetativo del huevo; entonces In rotaci6n cortical que sigue a la rotaci6n crea las condiciones especiales en la parte dorsal del c6rtex vegetativo, de forma que el precursor de protefnas se segmenta produciendo el fragmento activo. Entonces este se libera de los blast6meros dorsales vegetativos induciendo la formaci6n de un Organizador. (A, cortesfa de Douglas Melton.)

tr6n creado en el mesodermo inducira panones de especializaci6n local en el ectodermo yen el endodermo con los que entra en contacto. Asf pues parece que existen al menos tres sefiales inductivas que ucnian en los primeros estadios del desarrollo de Xenopus, euyos orfgenes son: los blast6meros vegetativos ventrales, los blast6meros vegetativos dorsales y el Organizadar (Figura 21-23). iQue son estas senales desde el punto de vista qufmico? Parece que estan implicados miembros de aI menos euatro familias de protefnas senal seeretadas. Aunque sus papeles exactos en el desarroUo dpieo no estan nada ciaros, se cree que ya estan todas presentes en el embri6n temprano de Xenopus, y todas eUas producen efectos inductores dram
Un sencillo gradiente de morf6geno puede organizar

un complejo patr6n de respuestas celulares21 Existen muehas maneras por las cuales las senales que pasan de una parte a otra del embri6n pueden eontrolar el patr6n de formaci6n (Figura 21-26). E10rganiDiversificaci6n celular en el embrl6n animal temprano

1129

,

G]) ,

0000000••0000000

8888888::8888~88

0000000••0000000 0 ••••••••••••••0

A

00 IA) sei'lales

o••••••••••••••@ 0 ••••••••••••••0 0 ••••••••••••••0 (B) s8l'iales intercelulere5 de largo elcence

intracelulares

zador constituye WI ejemplo de una estrategia de un inleres particular: un pequeno trozo de lejido de una regi6n determinada adquiere un canicler especial y se convierte en la fuenle de una senal que se introduce en los tejidos vecinos y controla su comportamiento. Por ejemplo, la senal podrfa tomar la forma de una moltkula difusible secrerada por centro emisor de senales. Supongamos que tal substantia se degrada lentamente a medida que difunde a traves del tejido circundante. La concentraci6n sera constante yalta cerca de la fuente y disminuini gradualmente al alejarse de ella, estableciendose un gradiente de concentraci6n (Figura 21-27). Las clHulas que se encuentren a distancias distintas de la fuente estaran expuestas a distintas concentradones y por tanto se volvenin diferentes. Una su~tanda como esta, cuya concentraci6n es "Iefda" por las celuJas para descubrir su posici6n relativa respecto a una derta seoal 0 baliza, se denomina morf6geno. Se cree que los gradientes de morf6geno constiluyen una via comtin de suministro de informad6n posidonaJ a las celulas 0 de comrol de su patr6n de diferenciad6n, a pesar de que en muy pocos casos se ha identificado el morf6geno qu{micamente. iC6mo responden las eelulas a un gradiente de morf6geno? La concentraci6n del morf6geno difusible debe presentar un gradiente muy suave, y sin embargo muchas de las especiallzaciones imporrantes del desarrollo son diseretas: por ejemplo, no existen series graduaJes de tipos cclulares aduJtas intermedias entre cartilago y mliseulo, 0 entre hueso y nervio. Te6rieamente, en una poblaci6n inicialmente uniforme pueden apareeer diferendas mareadas a traves de un umbraf de respuesta a una seoaJ cuya variaci6n de eoncentraei6n es muy suave. Si existe una retroalimentaci6n posiliva en cada eelula que responde que amplifiea el efecto de Wl pequeno incremento de la sefta!, celu]as expuestas a intensidades s610 ligeramente distintas de la senal pueden verse abocadas a vias de desarrollo completamen~e distintas, en funci6n de si la concentraci6n a la que esuin expuestas es superior 0 inferior a un umbral detenninado. Si existen varios umbrales de respuesta a una senal, un solo morf6geno puede controlar el patr6n de varias opciones celulares difetentes. POt ejemplo, se ha demostrado que cllando las celulas procedentes del polo animal de un embri6n temprano de Xenopus son expuestas a la molecula senal activina (vease Figura 21-24), se desartollan como epidermis si la concentraci6n es baja, en mlisculo si es un poco mas elevada y en notocorda si es un poco mas alta. Sin embargo, la funci6n normal de la activina

Figura 21·27 Gradlente de morfogeno. Si una substancia es producida por una fuente puntual y a medida que difunde a partir de esta fuente se va degradando, se produce un gradiente de concentraci6n CU}'O maximo se encontrani en la fuente. La substancia puede actuarcomo morf6geno, cuya concentraci6n local contro[anl. e[ comportamiento de las celulas segun su distancia respecto a [a fuente.

1130

Capftulo ZI : Mecanismos celulares del desarroUo

I

•••• •••• ••••

[

(q senales Intercelulares de corto alcance

Figura 21·26 Tres tlposde senates para tres estilos de fonnaclon de patrones. (A) Las senales intracelulares pueden organizar [os determinantes citoplasmaticos dentro del huevo, que heredaran los distintos blast6meros cuando el huevo se divida. (B) Senales difusibles de largo alcance procedentes de un centro senal pueden dirigir el patron global de especializacion celular en el tejido envolvente. (e) [nteracciones de Carla alcance. celula-celula, pueden crear un mosaico de celulas mimiscuJas que se encuentrall ell diferentes estados; a menudo juegan un papel crucial en la toma final de decisiones sobre la diferenciaci6n en tejidos complejos como la retina y oteos epiteJios sensoriales.

-:--x

- - - distancia de la fuente -

X

en el embri6n de Xenopus intacto es incierta, y la naturaleza de las senales producidas par el Organizador de Spemann todavfa no es conocida.

Las celulas pueden reaccionar de fonna distinta a una senal segtin el momento en que la reciban: funci6n de un reloj intracelular 22 Generalmente, a medida que se produce el desarrollo, las celulas embrionarias cambian su cankter a pesar de que su entorno permanezca inalterado. Si extraemos celula del polo animal de una bltl.swla de Xenopus y las mantenemos aisladas in vitro, se diferenciar
c(ilule jovlln

c(ilule villja

I

f5} la celula .. difllfllncie como A

la celula Ie difllfllncia como B

Figura 21-28 La lnDuencla temporal. Una seflal invariable acuja sabre celulas similares pero de edades diferentes. 10 cual puede cvocar respueslas diferentes. lDs patrones espaciales pueden producirse de esla forma, penniliendo que una senal invariable acnle en momentos distintos sobre diferenles miembros de una formaci6n de celulas iniciaJmeme similares.

En los mamfferos, el protegido entomo uterino permite un tipo extraordinario de desarroUo tempran09 • 2J EI embri6n de mamffero aClua de forma distinta del de otros animales en muchos aspectos. AI desarrollarse en el enlomo protegido del utero, no tiene la misma necesidad que los embriones de la mayoria de las demas especies de completar rapidamente los estadios iniciales del desarrollo. Ademas, el desarrollo de una placenta proporciona pronto a1imenlO procedenle de la madre, por 10 que el huevo no necesita tener grandes reservas de aLimentos basicos como el vitelo. EI huevo de rat6n tiene un diametro aproximado de tan 5610 80 J.l-m, por 10 que su volumen es 2Q1X) veces menor que el de un huevo de un anfibio coml1n. Sus divisiones de segmenraci6n no se producen mas r<1.pidamenre que las divisiones de muchas c~lulas somtl.licas ordinarias, y la uanscripci6n genetica ya se inicia en el estadio de 2 celulas. Ademas, mienuas que las etapas mas avanzadas del desarrollo de los mamfferos son fundamenlalmente similares a los de otros verDiversificacl6n celular en el cmbri6n animal temprano

1131

huevo fecul'IO/loo

de raton

rona pelUclda

_

2 dlulu de

l'hd(a.

morula de Bcelulalde - - - -

2'12 dill

compact.ciOn

seccion del blastocillO de 4di••

pronUdeos mlltefll(l y paterno

tebrados como Xenopus, los mamfferos empiezan por dar un gran rodeo en su desarrollo. formando un conjunto de complicadas estruc(Uras -principalmeme el saco amni6tico y la placema- que envuelven y protegen al embri6n y que proporcionan las condiciones id6neas para imercambiar metabolitos con la madre. Estas estructuras, como el Testa del cuerpo. derivan del huevo fecundado pero se denominan extraembrionan"as debido a que se eJiminan en el pano y no (annan parte del animal adulto. En la Figura 21-29 se resumen los esladios tempranos del desarrollo del rat60. Inicialmente el huevo esta rodeado poT una cubierta celular lranspareme. la ZOllO peflicida. Tras la fecundaci6n. el hllevo se segmenta dentro de la cubierta fonnando un grupo celular con forma de mora denominado mijrllia. En algtin momento entre los esladios de 8 celulas y de 16 celuJas. la supcrficic dc la m6ru1a se alisa y adquiere una apariencia casi esferica a medida que las cellilas modifican sus uniones y el grupo se welve mas compacta (Figura 21-30), y las cellilas situadas en el exterior de la esfera se unen entre sf mediante unioncs hermetiCas, aislando el interior de la m6rula del medio externo. Poco despucs, los espatios intercelulares internos se ensanchan dando lugar a una cavidad central que se Ilenara de fluido -el blastocele. En este estadio la m6nlla ya se ha convertido en un bla.'itocislo. Las celulas del blastocisto forman una lamina esferica que envuclve cl blastocele, en la que se destaca un polo debido a una mayor acumuJaci6n de Cellilas. Como se obscrva en la Figura 21-29, la capa celular externa es el

1132

16ciilulll

de 3 dillS

Capftulo 21 : Mecanlsmos celulares del desarrollo

Figura 21-29 Las prlmeras elapas del desarroUo del ra'60. (FolOgrafias por conesfa de Patricia Calarco. de G. Mallin, Sciellce209:768-n6.1980. Copyriglu 1980 the MAS.)

Flgura21-30 Electronmlcrograffa de barrldo de un embrl6n temprano de rat6n. Se ha extrafdo la zona pell1c1da. (A) Fase de dos celulas. (5) Fase de cuatro c~lulas (adenub de los cuatro blast6meros se observa un cuerpo polar). (el M6rula de acho a diedseis celulas -se produce la compactaci6n. (Cortesfa de Patricia Calarco y C.J. Epstein, Dell. Bioi. 32:208-213, 1973.)

trofoectodermo; el grupo de celulas situadas en el interior deltrofoecloderrno, en el polo mas grueso, Se denomina masa celular interna. De la masa celular interna deriva todo el embri6n. EI trofoectodermo es el precursor de la placenta y es el primer componente que aparece del futuro sistema de estructuras extraembrionarias. Cuando 1'1 zona pehicida se Ita formado. las relulas dcllrofoectodermo emran en comac[Q con la pared del Litero, de forma que el embri6n queda implamado. Mientras talllo, la masa celular interna crece y empieza a difercneiarse. Parte de ella da lugar a estructuras extraembrionarias. como el saco vitelino, y el resto panieipa en la formaei6n del embri6n mediante procesos de gastruJaci6n, neuruJaei6n, etc., que son muy parecidos a los de olros vertebrados, a pesar de que notables distorsiones geometricas dificuhen nuestra percepci6n de eUas.

Todas las celulas del embri6n animal temprano tienen el mismo potencial de desarroUo 24 Hasta que lIegan al eSladio de 8 celulas, las celulas del embri6n temprano de mamifero conservan su capacidad de desarrollarse en cualquier pane del embri6n adulto. Si el embri6n temprano se paniera en dos, se producirian un par de gemelos idcnticos -una unica celula produciria dos individuos totalmeme normales. De forma parecida, si una de las dos celulas de un embri6n de rat6n biceluJar se destruyen mediante pinchazos con una aguja, y se coloca el Mmedio embri6n~ resuJtame en un utero de una madre adoptiva para que se desarrolle, en muchos casos nacera un rat6n completamente normal. Inversamente, dos embriones de rat6n de ocho cclulas cada uno sc pueden combinar formando una m6ruJa gigante. la cual se desarrollaria formando un rat6n de tamano normal (Figura 21-31). Tales criaturas, producto de agregados de ccluJas geneticamente diferentes, se denominan quimeras. Las quimeras tam bien pueden generarse illyectando celulas de un embri6n temprano de un genotipo en el interior de un blastoeisto de otro genotipo. Las celulas inyectadas se incorporan a la masa celular interna del blastoeisto receptor desarrollandose un animal quimcrico. Es incJuso posible conseguir una quimera inyeclando de esta forma una sola cclula; de eSla forma se puede estudiar la capaeidad de desarrollo de una celula aislada. Una de las conclusiones mas imporlantes derivadas de estos estudios cs que inicialmentc las cclulas de un embri6n temprano de mamffero (hasta que alcanzan el estadio de 8 cclulas) son identicas y no ticnen restringida ningun3 de SllS capacidades: todas elias son tolipQtemes. Aparentemente los determinantcs localizados no juegan ninglin papel en el hl/evo de rnamffcro, y el patr6n de diversificaci6n celular del embri6n se genera posteriormente, y de forma completa, mediante las interacciones de unas celulas can atras y con SU entorno.

IImbriOn dll rllOn en II embriOn de fll0n en III flSIl de 8 dlull5, cuyos fase de 8 dluln, cuyos plldrll1l son bllncos pldres son n&gros

III lonll pelucida de Cllda huevo III .riminil mediante un trIItamienlo con prolea".

los embrlOOeS l1li coIocan junlO' y all fusionan ineuWndolol iI 37"

el desarrol+o de los embriooea fuston.doa continu. in haSUIlillilM de blaSlOClllo

"'fro

.1 blulocillo III transfie... a un filUm

pseudolecundado que aetua como nod,lza

la crla de rat6n tiene cuatro padres (adlmh de la nodriza)

Figura 21-31 ProcedJmlento para generar un ral6" qulmt:rlco. Se combinan dos tipos de m6ruJas de gCl1otipo diferente.

Las celuJas madre embrionarias de los mamfferos muestran c6mo senaJes procedentes del entorno pueden controlar el ritrno y la via de desarroIJo 2S EI desarrollo temprano de los mamiferos esta altamente regufado. El futuro de cada celula se determina a traves de interacciones con sus vecinas. Los experimentos con ratones que acabamos de describir 10 iJustran perfectamentc. Las relulas de un medio-embri6n 0 de un embri6n quimerico doble lienen que ajusI'ar su componamiento para poder generar un animal completamente normal en cuanto a su patr6n y a su tamano. Sin embargo, cuando las eircunstancias de desarrollo son mucho m~s anormales, las celulas embrionarias pueden quedar totalmente fuera de connol. De eSle fen6meno hemos de aprender varias leceiones imponanles. Si se inyecla un embri6n temprano normal de ral6n en el riii6n 0 en el testfculo de un adulto. el embri6n queda rapidamente desorganizado y desaparecen los con troles normales de la proUferaci6n celular. EI resultado dc ello es un groDlverslflcacl6n celuJar en el embri6n animal temprano

1133

testo crecimiento denominado teratoma, cuya composici6n es una masa desorganizada de cl:!lulas que contienen muchas variedades de tejidos diferenciados -piel, hueso, epitclio glandular, etc.- mezclados con c~lulas madre indiferenciadas que continuan dividi~ndose y generan todavfa m~s tejidos difercnciados. Teratomas de propiedades parecidas a ~tas tambi~n pueden aparecer espontl1neamente en las g6nadas a partir de c~lulas germinales como resuJtado de varios accidentes del desarrollo. Es posible derivar cl1nceres transplantables a partir de los teratomas. Tales teratocarcinomas crecen1n iJimitadamente hasta que maten a su hu~ped. Se pueden conservar indefinidamente implantando de forma seriada muestras de las c~)ulas tumorales de un hu~ped a olm y se observa que los teratocarcinomas siempre conLienen algunas celulas mat/res indiferenciadas, juntO con una gran variedad de tipos de relulas diferenciadas producto de las celulas madre. las celulas madre de los teratocarcinomas tambien pueden mantenerse en cultiva como Ifneas celulares permanentes. Podrfa pensarse que las celulas madre de los teratocarcinomas, como otros tipos de cAncer, se originan por mutaciones de genes responsables de los controles normales del componamiemo celular (Capitulo 24). Sin embargo, las observaciones siguientes sugieren que no es ke el caso. Se pueden obtener cetulas madre con propiedades muy parecidas a ~Ias colocando la masa celutar intema normal en un cultiva y dispersando las relulas al inicio de su proliferaci6n. Una vez dispersadas, si las mantenemos en condiciones id6neas en el cultiva, algunas de estas ceIulas continuaran dividiendose indefinidamente sin a1terar su caraclerfsticas. las Ifneas de ctlulas madre embrionarias (£S, de Embrionic Stem) son similares a las Ifneas celulares derivadas de teratocarcinoma, pero se pueden generar a partir de embriQnes nonnales con una frecuencia tan alta que es poco probable que sean prodUCIO de mutaciones. Por el contrario, parece que aI separar las c~lulas de sus vecinas nonnales y colocarlas en un medio de cultivo adecuado, el curso nonnal de su programa de cambios temporales de caracteres celulares se detiene. 10 cual permite que las ceJulas continuen dividiendose indefinidamente sin diferenciarse. Parece que la presencia en el medio de un factor de crecimiento proteico denominado factor inllibidor de leucemia (UF, de Leukemia Inhibitory Factor), es crucial para la detenci6n del programa de desarrollo. Con un coctel un poco m~s complejo de factores de crecimicnlo podriamos inducir el mismo tipo de comportamjento en c~lulas gerrninales embrionarias en cultivo. EI estadio en el que se detienen las ES. los teratocarcinomas, 0 las c~lulas madre derivadas de cellilas germinales parece ser equivaiente al de las c~lulas de la masa celular interna normal. Ello puede ponerse de manifiesto tamando las c~lulas de una placa de cultivo e inyect
Caprtolo 21 : Mecanlsmos celolares del desarrollo

-.

ulul., ES derivadas d. una CeplI pigmentllde dll retan

t1'. blastocisto recllptor dll una ctlpll elbine dll reton

grupo de eelul., ES on un. mlcropipete

e~lulllS ES inyect.das lin ellnterlor da la eavidad dill blutocisto

I.s elilul.. inyectadll .e incorporen e Ie men celuler interna del bl..tociSlO hu6sped

I

el b1estocISlo", desarroUe.n una nOOlite. formeodo un raton quiml!irico ~oo

Figura 21-32 Produccl6n de un rat6n qulm~rlco con c8ulas ES 0 cBulas madre de tcntocardnoma. EI experimento demuestra que las celulas madre pueden combinarse can las c~lulas de un blaslOClsto normal formando un rat6n quimerico sana.

Resumen En el tralUcurso del desarrollo embrlonarlo a partir de 1411 huellO fecuttdndo se generan m.u:hos tipos de cilulas. Los genomas de In dlulas diferencUulas son idinticos: 10 que las dlstillglu es el patr611 de expresi611 de sus genes. Generalmente. algl'nos de las diferelldas elltre las cil"las del embri6n temprano dellell s" orlgen en una distribud6n desigiUJI de los detennillantes l«nllzados clloplasm4tlros del I",eva allies de su segnunuu:i6n, pera In mayoria de elias surgen nufs tarde a partir de diferellCUu localluulas ell el etltomo de las dlulas del embrl6n. Por ejemplo, en el embri6n temprano de Xenopus, las dill/as allimales y vegelativas heredan determillantes citoplasmdticos distitltos dellmellO, y lluga alg"'uu de las cilulas al/lmales reciben Ima h.flllellcia de las c~lulas vegetativas qlle las ;'Jdllce a desarroilnrse como mesooenno en vez de ectodermo. Esta indlu:cl6tl mesodirmlca parece estar medlada porfamillas defactores prolelcos de credmlento que tambiin colltribuyen a regular ei crecimlet.to y In diferenclnd6n del orgtJnumo adJdto. Los huellOs dB mamlfero son e.u:epdonales dado q"e son f!$ellClalmente slm~· trlcos. AI(. inldalmente rodLu las cilulas dB un embrl6n temprano de mamlfero son 19uaIa y solnmente se diferencian a travis dB In interacci6n de unos con otras. Mediallte interacciones dlula-cilula, las cilulas de dDs embriones tempraJJos de rat6n ajustan su fUturo y colnboran foTttUJndo un .;nico rat6n q.l/m~rico. Cilulas de un embrl6n temprano de raMn. ale]adas de las 'nfluelldas tfp/cas de sus vecinas, pueden proliferar dB forma inadecluula dnndo lugar a teratocarcinomas, de los clUJles se pueden obtener cilulas madre embrlonarlas. Sin embargo, estas cilulas recllperan UII comportaltliellto normal CUQndo se implanlatl en 1m embri6tl temprano nonnal, y sus descem/ienles se diferetlclnn seglin su enlortlO y pueden col/lribuir a lafontlacl6n de utI mli",al quim~rlco'IOrmal.

Memoria celular, determinaci6n celular y el concepto de valores posicionales las c~lulas no s610 han de ser diferentes, sino Que han de pemu:mecer diferenciadas tras la desaparici6n de las influencias originales responsables de la diversificaci6n celular. A pesar del continuo recambio y resfntesis de practicamente to· dos los componentes celulares, en el adulto muchos tipos de c~lulas lienen caracterfsticas distintivas que se mantienen estables y heredables, incluso cllando el entomo cambia. Asf, cuando una celuJa pigmenraria se divide, sus hijas contintian siendo celuJas pigmentarias; cuando un queratinocito de la piel se divide, sus hijas conthll.ian siendo queratinocitos; y, aunque un fibroblast'O puede convertirse en otro tipo de c~lula perteneciente a un [ejido conjuntivo, como una c~lula cartilaginosa, nunca se convertirfa en una neurona 0 en una c~lula del hfgado; y as! sucesivamenle. las diferencias entre tipos celulares se deben, en ultimo l~rmino, a las distinlas inOuencias a Que han sido someddas las relulas en el embri6n, pero dichas direrencias se mantienen debido a Que las c~lulas recuerdan de a1guna manera los efectos de pasadas influencias y los transmiten a sus descendientes. Como veremos en este apanado, la memoria celular -y los lipos de informaci6n celular, especialmente la posicional, Que las relulas conselVan como consecuencia- son elememos centrales de los mecanismos de 010delaje que hacen posible un organismo pluricelular complejo.

A menudo las c~lulas quedan determinadas para su futuro papel especiaJizado mucho antes de que se diferencien manifiestamente l5,26 La existencia de una memoria celular se hace patente en la persistencia yeslabilidad de los estados diferenciados de las c~lulas del cuerpo adulto (v~ase Capftu1022). Pero habilualmeme, el caracter final de una c~lula ha sido decidido a lrav~s de una secuencia compleja de inOuencias que afectaron a sus progenitoras

Memoria celular, determJnaci6n celuJar y el ooncepto de mores posldonales

1135

durante el desarrollo y este cankter puede haber side establecido y fijado mucho antes de que se manifieste la diferenciaci6n. Por ejemplo, a traves de varias series de decisiones lomadas antes, durante y justo despues de la gaslrulaci6n, algunas celulas de los somilOs de un venebrado se especializan, en un estadio muy temprano, como precursoras de las celulas del musculo esquelctico; enlonces migran desde los somitos a otras regiones, eJ1{re elias a las regiones donde se formamn las extremidades (vease Figura 21-]6). Estos precursores de celulas musculares eareeen de las grandes eantidades de proteinas commcti!es especia)jzadas que se eneuemran en las celulas musculares maduras; de hecho, superficiaJmente se pareeen mucho a las otras celulas del rudjmemo de las extremidades. Pero despues de varios dras empiezan a fabriear grandes eantidades de las proternas trpicas del musculo, mientras que las otras celulas de las extremidades, con las que esl
EI momenta de la determinaci6n eelular puede ponerse de manifiesto por medio de experimentos de trasplante 27 Para comprobar si una celula 0 un grupo de celulas esta delerminado, se ha de demostrar que eSlas celulas tienen un caracter distintivo que se mantiene incluso aunque las circunSlancias se alteren experimentalmente. La lecnica mas comtin consiste entrasplantar las celulas a un enlomo experimental (Figura 21-33). Un ejemplo sencillo de este lipo de experimento nos 10 proporcionan los estudios con embriones de anfibios. Como apuntabamos anteriormente, cs posible trazar el mapa futuro de la blastula 0 de una gastrula temprana, indicando que panes de la misma se desarrollaran, segtin su proceso normal, y en que se con-

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antes de manifestar I. difereneillCiOn

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CaprtuJo 21 : Mecanlsmos ceJulares del desarroUo

DeTERMINADO

venin\n. Por ejemplo, las c~lulas de una regi6n estan destinadas a convenirse en epidermis si su desarrollo sigue el curso normal, miemras que el destino de las de otras regioncs sera convertirse en cerebro. Para establecer cuando estos dos grupos de celulas quedan determi"ados para seguir sus vfas de diferenciaci6n particulares, se secciona un bloque de celulas de la futura regi6n epidermica y sc las situa en la futura regi6n cnccfaIica, y viceversa. 5i la celulas se trasplaman en el estadio de g
La determinaci6n y la diferenciaci6n celulares renejan

la expresi6n de genes reguJadores 28 Del fen6meno de determinaci6n celular surgen tres cuesliones moleculares: iQue molecula 0 molttulas definen el estado de determinaci6n de una celula; que mecanismo de memoria mantiene este estado; y romo se acoplan dererminaci6n y diferenciaci6n? En general, el car
1137

Figura 21-34 Clrcuho del control genlco para la detennlnacl6n de una libra muscular. En este diagrama simptificado s6Jo se muesU"an dos micmbros representativos de la familia de genes MyoD ~J propio myoD y el gen miogel/hlll. La activaci6n mutua y la auto-activaci6n de estos genes por parle de sus propios prodUCIOS crea una retroalimentaci6n positiva que conlleva la expresi6n auloperpctuante de los genes. Id es una protefna h~lice­ bucle·h~lice codificada por el gen inhibidor de fa uni6n a DNA; gracias a su dimerizaci6n con Olms proternas h~lice-bucle-h~lice, y parlicularmenle debido a su compctici6n con miembros de la familia MyoD para oblener compai\eros de dimerizaci6n adecuados. se cree que dificulta la expresi6n tardla de genes musculares espedficos. Sin embargo el sistema de control completo es mucho mas complicado de 10 que sugiere este diagrama.

miembros de la familia MyoD, a un estado ya diferenciado. en el cualla protefna activa toda la variedad de genes musculares especfficos (Figura 21-34).

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EI eslado de delerminaci6n puede eslar controlado por el ciloplasma 0 puede ser inlrmseco a los cromosomas29

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La memoria celular. tal como se manifiesta en el fen6meno de la determinaci6n, es uno de los principales problemas que desafian a la biologia molecular. En el

Capflulo 9 vimos algunos de los mecanismos moleculares a traves de los cuales algunos patrones de expresi6n genica pueden convertirse en autoperpetuantes. En el COntexto de la detenninaci6n celular pueden distinguirse ues grandes categorfas de memoria celular, que podrfan denominarse respectivamente: memoria citoplasmdtica, autocri"a y nuclear. El mecanismo que acabamos de apuntar sobre las proteinas miogenicas es un ejemplo de memoria cilOplasmatica. En estc caso los componentes codificados por el conjunto de genes activos estan presentes en el cilOplasma, y actt1an di.recta 0 indirectamente sobre el genoma manteniendo la expresi6n selectiva de este conjunto determinado de genes. Una consecuencia de este mecanismo es que si un nt1c1eo tornado de un tipo de celula dUerenciada se ioyecta en el citoplasma de otro tipo celular, deberfa de modHicar su pau6n de expreii6n genica para encajar con el caracter del citoplasma hu~ped. los experimentos de trasplante nuclear efectuados en huevos de anfibio que estudiamos ameriormenle proporcionan un ejemplo de esta dase de componamiento. EI mecanislllo de memoria aUloc.rina es una variance del mecanismo citoplasmatico. Tambien depende de la sfntesis de productos que estimulan su propia producci6n, pero con la caracterfstica especial de que estos productos se segregan al medio cxtracelular y acluan sobre el exterior de la celula para que la celula permanezca en el est ado 6ptimo para su producci6n. Este mecanismo tiene un efceto secllndario importante: debido a que las celulas vecinas com parten el mismo entorno cxtracelular, tenderan a actuar colectivamente, adoptando el mismo estacto porqlle eSlan expuestas a las substancias que elias mismas produ· cen, y par 10 lanto una celula individual trasplantada a un medio nuevo tendera a cambiar su caracter para ajllstarse al de las celulas que la rodean por lodos lados. Asf pues, un grupo celular puedc actua.r como determinado aunque una celula de este grupo aislada no 10 este. Parece que eS[QS "erectos comunitarios" de la determinaci6n celular son baslante corrientes y se han esrudiado con profundidad en el embri6n temprano de Xenopus. A diferencia de las rnemorias citoplasmatica y autocrina. la memoria nuclear depende de cambios autoperperuantes que son intrinsecos de los cromosomas --cambios que definen la selecci6n de genes que se cxpresan. sin a1terar la se· cuencia de DNA. La inactivaci6n del cromosoma X (vease ,mg. 476) Yla actividad heredable (vease pag. 481) son ejemplos c1aros de ello. La base de la memoria nuclear son las modificaciones heredadas en la cromatina 0 en el DNA; la memoria citoplasmatica, por el contrario. permite que dos genes identicos coexistan con diferentes estados en una unka celula, uno expresado y el otro inhibido, aunque ambos esten expuestos al mismo entomo intracelular. 113ft

Caprtulo 21: Mecanlsmos celulares del desarrollo

En los temas concernientes a la memoria celuJar nuestra ignorancia es profunda. todavfa, y en la mayorfa de los casos alin no podemos discemir si la memoria es citoplasmatica 0 nuclear.

Las c~luJas de los tejidos en desarroUo recuerdan sus valores posicionales30 En el embri6n animal las senales posicionales y las interacciones actuan a dislancias cortas, aproximadamente a un milfmetro 0 incluso menos, y estas influencias dejan su huella en el caracler celular a trav~s de la memoria celular. A medida que el cuerpo se va desarrollando, otras influencias mas avanzadas actuan sobre cada una de sus regiones, creando nuevas dlferencias dentro de cada c1ase de celulas y trazando niveles de detalle cada vez mas finos sobre cl mapa corporal basico original. Asf pues cuando las c~lulas quedan sometidas a un modo de diferenciad6n particular, normalmenle quedan especificndas regionalmente: adquieren marcas bioquimicas distintas de direcci6n, 0 valores posicion ales. que reflcjan su localizaci6n en el cuerpo. E1 valor posicional de una cclula guiarn su comportamiento en fases consecutivas del patr6n de formaci6n -Ia manera en que respondera a senales posicionales posteriores, las vfas de interacci6n con sus vecinas, y tOOa la variedad de modos de diferenciaci6n abienos a ella misma y a su progenie. Se dice que las influencins que controlan la elecci6n del valor posicional proporcionan a la celula la i"!ormaci6,, posiciollol. La existencia y la naturaleza de valores posicionales almacenados en la memoria se demuestra mediante experimelllos sobre injenos lIevados a cabo entre un muslo y un ala de polio, ambos en desarrollo. Tanto el muslo como el ala adullos tienen musculo, hueso, piel, etc., y pr;1cticamentc la misma proporci6n de tejidos diferenclados. La diferencia entre ambas extremidades no radica en la c1ase de tejidos. sino en su distribuci6n espacial. tC6mo se produce esta diferencia? A simple visla podria parecer mM simple explicar la diferencia en tenninos de la presencia de una distribuci6n espacial de senales distinta para las extremidades anterior y posterior. ambas en desarrollo, que ordenara directamenle a las cclulas que estado diferenciado deben adoptar. Un simple experimento utillzando injenos demuestra que esta visi6n es profundamenle err6nea. En el embri6n de polio, el ala y el muslo se originan casi simuJtaneamente en forma de pequeiias yemas con forma de lengua que se proyectan desde el costado (Figura 21-35). Al principio las celulas de los dos pares de yemas de las

Figura 21·35 Desarrollo de un embri6n de polio. (A) Un embrl6n de pallo despucs de tIes dras de incubaci6n, iluslrando las localizaeiones lniciaJes de las yemas tempranas de las extremidades. (B) Elcctronmicrografia de barrido que muestra una vista dorsal de la yema del ala y los somitos adyaeentes. un dia despues: la yema ha crecido eonvinicndose en una proyecci6n can fonna de lengua de aproximadamellle lmm de largo. I mm de aneho. y 0,5 mm de grosor. (A, segUn W.H. Freeman y B. Bracergirdle: An Atlas of Embriology. London: Heinemann, 1967; B, cortesia de Paul Martin.)

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Memoria celuJar, determinaci6n eelular y eJ eoncepto de vaJores posicionales

1139

Figura ZI -36 Futuro telldo del muslo lnjertado en el extremo de la yema de lin aJll forma dedos del pie. (Seglin I.W. Saunders et aI., Dell. Bioi. 1:Z81· 301,1959.) yern.

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mUll de tejlda mesodlirmico que hsbrill formsdO IllS estructurlls del muslo

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exnemidades aparecen similar y unifonnemente indiferenciadas (v~ase Figura 19-30). Entonces se puede seccionar una pequena cantidad de tejido no diferen· ciado de la base de la yema del muslo, procedente de la regi6n que normalmente darla lugar a parte de la cadera. e injenarse en la punta del extremo de la yema del ala. EI injeno no formarti la parte del ala oorrespondiente ni tampoco una pieza desplazada de tejido de la cadera, sino un dedo del pie (Figura 21·36). Este experimenlo demuestra que las celulas de las yemas del muslo temprano ya est;jn determinadas como muslo, aunque su detenninaci6n 5610 irnplica que fornlarnn parte de la extremidad posterior sin ooncretar la pane del muslo que formarAn: todavfa pueden reacciOllar ante inOuencias de la yema del ala, fonnando asf estruCluras adecuadas para el extremo de la extremidad mas que para 13. base. AI parecer, el sistema de senales que conuola las diferencias entre las partes de las extremidades es el mismo para el muslo y para el ala. La diferencia entre las dos extremidades deriva de una diferenciaci6n presente en los estados internos de sus celulas en el inicio del desarrollo de las extremidades. Aunque las celulas parecen iguales y estan destinadas a dar lugar a la misma variedad de tipos celulares diferenciados, son 110 equillolelltes, y presentan valores posicionales distintos. Asf pues la especializaci6n del componamiento de las celulas de las extremidades se desarrolla de forma combinada: primero, y seglln la informaci6n que reciban, formartin parte del ala 0 del muslo; luego senales presentes en el interior de la yema de la exlremidad especifican componentes mas detallados de valor posicional, indicando la colocaci6n exacta en la extremidad. Una de las revelaciones mas notables de la genetica molecular moderna ha sido que casi todos los animales parecen ulilizar los rnismos mecanismos moleculares alta.ll1ente conservados para retener los valores posicionales siluados a 10 largo dellodo el eje corporal (de la cabeza a la cola), y algunos de estos mismos produclos geneticos rambien pueden acluar especificando valores posicionales en la extremidades de los vertebrados. Tendremos que aplazar nuestras teodas sobre estos importallles controladores del patr6n corporal hasla que hayamos eSludiado la mosca del vinagre, Drosop/lila, cuyos mecanismos fueron los primeras en ser descubiertos y caracterizados.

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El patr6n de vaJores posicionales controla la proliferaci6n celular y se regula a lraves de intercaJaci6n 31 Un aspeCIO crucial del patr6n de fonnaci6n es la regulaci6n de la proliferaci6n celular, a lraveS de la cuallas diferentes partes del patr6n alcanzan sus taman os adecuados. Muy a menudo, t'anto el crecimiento como el palr6n de valores posicionales dependen de un eSlrecho acoplamiento de interacciones c~lula-celula continuas. Partiendo de estudios realizados sobre la regeneraci6n que ocurre en varios organismos cuando se yuxtaponen rragmentos de tejido con valores posi· cionales distintos y se concede el liempo necesario para que crezcan y se adaplen, se ha deducido una ley senciJIa, cuyos principios al parecer son bastante corrientes. Quiztis su ejemplo mas claro sean los estudios realizados sobre la pata de la cucaracha (Figura 21·37).

Figura ZI·37 La pata de la cucaracha. Mediante mudas sucesivas la cucaracha se hace cada Vel. mlis grande (por proliferaci6n celular), pero no cambia su eslructurn bo1sica. La pata se reviste de una culicula segregada por una capa epid~nnica y que es reemplazada en cada muda. EI pat.r6n de la cuticula refieja el pat.r6n de valores posicionales que subyacen a la capa cpid~nnica.

1140

CapftuJo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

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Figura 2J -38 Regencrncl6n Inlercalada. Si se injerlan regiones de la tibia de la cucaracha que no se corresponden, se inlercalani (medianle proliferaci6n celular) un Icjido nuevo (verde), para reUellar los vades en el pauul1 de valores posicionales (numerados de I a 10). En el caso de (A) la inlercalaci6n reslablece la pane ausenlc. En (B) la inlcrcalaci6n genera una lercera pane celllral de la tibia entre las dos paries

cenlrales ya presenles. Las quetas indican la polaridad del tcjido inlerca1ado. En ambos casos la continuidad se reslablece en el palr6n final de los valores posicionales.

Las cucarachas pertenecen a la c1ases de insectas que no presenlan una me· lamorfosis radical de la larva a1 adulto, sino una progresi6n gradual a trav~s de una serie de formas juveniles separadas por mudas, en las cuales se elimina la capa de cuticula vieja y se genera una nueva capa mayor. La cucaracha juvenil tiene extremidades bien diferenciadas, pero sus celulas diferenciadas -a diferel1cia de las extremidades humanas- todavia son capaces de responder a las inOuencias que COnLrolan el desarroUo del patr6n de la extremidad y pueden regenerar dicha extremidad si esta se ve perturbada. Asi pues, los mecanismos del sistema de patr6n de fonnaci6n se pueden poner a prueba mediante ope rationes realizadas bastante despues del perfodo de desarrollo embrionario. Si a una cllcaracha Ie ampUlamos dos patas por uno de sus segmenlos medios -es decir por la tibia- pero por distintos niveles, el fragmento distal de LIlla pata pucdc ser injerlado en el mui'i61l proximal del Olro, de modo que la pal a compuesta sane aun carccicndo de la parte central de la tibia. A pesar de clio, la pata que aparece Iras la muda parecc normal: la pane media del patr6n ha regenerado In partc que echaba en falta (Figura 21-38A). Mas sorprendentc es cl resultado de una variante de csta opcraci6n. Se corta 1a tibia de una de las Cllea· rachas cerca del extremo proximal y otra tibia de otra cllcaracha cerca del extre· mo distal. Antes injcrlamos las dos partes seccionadas mas peqllcnas de ambas patas, pero en esta variaci6n injertaremos el rragmento y el mlln6n mas grandes. EI result ado dc esle injerto sera una pata excesivamente grande cuyo fragmento central es el doble de 10 normal (Figura 21-38B). Dejamos que el animal efectue la muda. La pata resuhante, en lugar de tener un tamano mas 0 menos normal, todavia es mas larga porque se ha desarrollado una tercera parte central entre las dos que ya existfan. Tal como se ilustra en la Figura 21-388, las quetas de esla nueva regi6n apuntan en direcci6n contraria a las de las del reSIO de la tibia. Se pueden realizar muchas operaciones de este tipo, y lodas elias apunlan hacia la existencia en la epidennis del insecto de un sislema de valores posicionales que convierten en no equivalentes a las celulas situadas en posiciones distintas a 10 largo del eje de la extremidad, hecho que va parejo al control de la proliferaci6n celular. Es util describir eJ valor poslcional mediante una escala Memoria celular, delerminaci6n ceJular y el concepto de valores poslclonaJes

1141

numerica cuyo maximo se halla en un extrema del segmento de la extremidad y el minimo en el ouo extremo. En las operaciones descritas anteriormente, se unen celulas con valores posicionales muy diferentes. Como resuhado de ello obtendremos celulas nuevas producto de la proliferaci6n celular de las celulas vecinas al punto de injerto. Estas celulas nuevas adquieren valores posicionales interpolados entre los de los dos conjuntos cuya confrontaci6n provocamos (Figura 21-38). Este comportamiento se define como prlnclpio de intercalacl6n: la profiferaci61l ce{lIfar local estd prouocada por discolltinuidades ell los vafore:s posicio"ales, y las cilulas recibl [ormadas adoptan valores posicionales illtermedios para re:stablecer la colltinllidad del patr6,1. La proliferaci6n celular terminara 5610 cuando se hayan imercalado celulas Que hayan recuperado todos los valores posicionales perdidos inicialmente y hayan Quedado siruadas segtln el patr6n de separaci6n imercelular que les corresponde. Todo este proceso se denomina regeneracl6n por InlercoJacl6n. La ley de intercalaci6n, con el corolario de que la proliferaci6n celular contimia hasta que se consigue un cierto espaciamiento de los valores posicionales, es un principio organizador mllY potente en los sistemas en que actua. A partir de un patr6n mas 0 menos especificado y "en miniatura" -un gradiente de morf6geno, por ejemplo- puede causar la construcci6n de un patr6n completo y muy preciso de valares posicionales que regulani el crecimiento de todas las partes del patr6n hasta que adquieran su tamana normal: todo 10 que se necesita es que el patr6n inicial sea cualitativamente --es decir, topol6gicamente- correcto. Parece ser Que el mismo principio dirige muchos procesos de organogenesis y regeneraci6n celular en insectos y tambien en crustaceos y anfibios. Incluso en criaturas como los mamr(eros, cuyas estructuras perdidas no acostumbran a regenerarse en el aduho, el principia de la ley de inlercalaci6n puede contribuir a la regulaci6n del crecimienlo y del patr6n de rormaci6n durante el desarrollo embrionario. Desgraciadamente no se conacen los mecanismos moleculares que originan esta forma crucial de control de crecimienlO.

Resumen Las d/,l/as embrionnrias 110 s610 11m, de diferenciarse sillo qlfe didla diferenciad6n debe mantem!r"U tras la desaparld611 de las sennles que illiclaron la diversifi-

cacl611 ce'ular. Para que ello QCurm es necesarla la memoria cellt.lar, ya que pernlite que las dlldas queden determlr,adas particulannellte IHim desempennr 1111 papel especlaliuldo nlllcllO antes de qlfe se diferellcien abiertamellle. Los mecanismos de la memoria celular puetlen ser cltoplasmdticos, imlJlicando matec,l.1as del cltoplasma que achlardn retroacti"amente en su mi.cleo IHim mallteller su prop/a sbrteslsj tmtocrillOs, implicanda malkulas segregadas que act,iall retroactivameute ell Itl dlllla; a nllcleares, implicmula procesos de modificacl6ll de cromalina a DNA. E" alglU'os casas el estado de determillac1611 se lIa relaclollatlo con la upn,16,1 de plies regrdadores especlJ1cos, como los plies miogblicos para las cilulas "UUCf.lares. Los dlfenmletl ripos de dlllias de lUI embri611 se producetl segdtl Uti patr6n regular espaciaL Normalmellte, el orip" de la fomUld6t1 de este patron SOli las asimetrla.r en el huevo y contimm medimlte interaeeiones dlula-celula ell el embri6n. Las sennles espadales que coordinnn et patron defornlad6n s'mrlnLstran infonnaddn poskional a las dildos, y el almace'Ulje de ",Ia de estas jllfomlaciolles por parte de las dluias se dellomi"a oo/or posidonal. Porejemplo, las dlulas de un rudimellto temprano de fa extremidnd posterior 0 anterior de lin embri611 de vertebratkt adqu/eren IIt1.lores paslclonates diferentes, coIlIJirtiernto a 1M dllllas de las extremidades amerior y posterior 110 eqllioole"tes en su cardcter illtrl,Uero, muellO ames de que el patr6n dediferellclaci6n celultlrse 'Iaya determi"ado. Ell "",e110S allimales el patron de valores posicronnles se aropla estrecllamellte al contro' de proliferaci6n celular st?gllll 1m prim:ipio de intercalllCl6" "IIIY simple. SeglfJr este prillcipio, la discm'tltlllidad de oolores pasiciollales provoca "tla prolifemel6l1 cell/lar local, y las cellilas redell formadas ad0IJta" oolores posieiollates

1142

Capftulo 21 : Mecanlsmos celulares del desarrollo

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illtermedlos para restablecer la contfnllidrui del patron. Es muy probabhl que este mectmlsmo actlle en ef desarrollo embrlO1U'lrio tfpico corr;gfetllio b,atkc,ladolles en fa especiflcaclon IlIlclal de lnfomuu:l6n posu;;onaL

EI gusano nematodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamiento celular3Z En el caso de las c~lulas, como en el de los ordenadores, la memoria hace que complejos programas de comportamiento celular sean posibles; muchas c~lulas a la vez. lodas elias avanzando gracias a su complejo programa de desarrollo, pueden generar un cuerpo adulto muy complejo. Algunos de los pasos que la c~­ lula da en el transcurso de su desarrollo son aut6nomos, mienrras que orros se yen afectados por senales de otras c~lulas. Asi pues, las c~lulas del embn6n pueden compararse a un conjunto de pequeiios ordenadores, 0 QUl6maras, aetuando en paralelo e inlercambiando infonnaci6n unos con otros. Las leyes que deleoninan el comportamiento celular estan codificadas en los genes celulares. Cada celula contiene el mismo genoma y, por 10 tanto, su comportamiento sigue las mismas reglas, pero existe una gran variedad de estados celulares; las leyes dingen el desarrollo a 10 largo de vias a1temativas segUn una combinaci6n de la informaci6n que la celula ha conseguido retener en su memoria y las sel'a1es del enlomo que redbe. Los modelos por ordenador muestran que incluso un programa muy sencillo puede conducir a los individuos aut6matas (celulas) de un sistema como eSle a producir patrones sorprendememente complejos; la simple observaci6n del desarrollo normal del patr6n no basla para deducir las leyes que rigen el programa. EI reto, por 10 taniO, consisle en descifrar experimenlalmenle las leyes subyacentes al desarrollo celular y esclarecer c6mo los genes especifican eSlas leyes. EI gusano nemAtodo Caenorllabditis elegansofrece condiciones excepcionales para esle eSludio, y se ba convertido en uno de los pnncipales modelos de la gen~tica del desarrollo. Aquf, 10 ulilizamos para i1ustrar varios principios generales, pero reservamos el estudio m<1s delallado de la gen~tica del desarrollo del patr6n de formaci6n para el pr6ximo apartado. sabre Drosopllila, de la cual se ha conseguido una visi6n m<1s completa gracias a m<1s anos de investigaci6n y muchas mAs medios.

Caellorhabditi.s elegalls es anat6mica y geneticamente senciUo 33 Como animal aduho. C. e{egalls tiene una longitud aproximada de I mm y s610 consta de alrcdedar de 1000 celulas sornaticas y de entre 1000 y 2000 celulas germinales (exactamente 959 nt1cleas de c~lulas somaticas mas aproximadamente 2000 c~lulas germinales en un sexo; y exactamente 1031 nt1cleos de ce:lulas som~Hicas mas aproximadamente 1000 celulas germinales en el olro sexo) (Figura 21-39). Se ha reconstruido, ce:lula a ce:lula, la anatom(a del nematoda, mediante

>------------1.2mm

-<

DORSAL

ANTERIOR

intestlno

huevos

POSTERIOR

Figura 21-39 CaenorhabditiJ e/egtllls. Visi6n laleral de un ejemplar hermafrodita adulto. N6tese que el lejido lIamado hipodermis del nemlhodo corresponde a Ia epidermis de Olras animales. (De I.E. SulSlon y H.R. Horvitz. Dev. BioL 56:110-156. 1977.)

VENTRAl

EI gusano nem~todo: los genes controtadores del desarroUo y las teyes del comportamiento celular

1143

_

el estudio aI microscopio elecu6n.ico de secciones seriadas. EI mapa corporal de este nematodo sencillo es basicamente el mismo que el de In mayona de los ani· males superiores dado que consta de un cuerpo alargado can una simetrfa bila· teral rudimentaria, compue5to por los mismos tejidos basicos (nervio, musculo, inteSlino y piel) organizados segtin el mismo patr6n Msico (boca y encefalo en el extremo anterior, y ano en el posterior). La pared extema del coerpo esta compuesla de dos capas: la epidermis proleclora, 0 ~piel". y la capa muscular subyaccnlc. Un senciUo tubo de celulas endodermicas forma el intestino. Un segundo tubo, silUado entre el intestino y la pared del cuerpo, conslituye la g6nada; la composici6n de su pared es a base de celulas soma:ticas. can las celuJas gcrminales ell el interior de la misma. C. elegom tiene dos sexos -uno bcrmafrodita y otro masculino. EI hcrmafrodita podrfa describirse como una hembra que produce un numero reducido de espermalozoides: puede reproducirse tanto par aumfecundaci6n, sirviendose de sus propios espermalOzoides. como por fecundaci6n cruzada tras la transferencia de espermatozoides de un macho a lTaves de la c6pula. La autofecundaci6n tiende a producir una progenie homozig6tica, que facilita la utilizaci6n de C. eJegatlS como un organismo excepcionalmente adecuado para los estudios geneticos. La relativa sencillez de la anatomra de C. etegans qucda reflejada de la misma manera en la sencillez de su genoma. Se calcula que el animal tiene en sus pares hom610gos de cromosomas un total de 3000 genes "esenciales", (es decir, genes en los que las mUlaciones son letales 0 de consecuencias facilmellle deteclables en el fenotipo) y cuatro 0 cinco veces este mismo numero de genes no escnciales. EI genoma haploide consla de aproximadamelllc 1()8 pares de nu· c1e6tidos de DNA. 10 que represellla cerca de 20 veces mas que B. coli, aproximadamente igual que Drosophila, y 30 veces menos que los seres humanos. Actualmente, mediante mut'aciones se han ide11lificado mas de 900 genes esendates. Entre ellos existen genes que influyen en caracteristicas visibles como el tamano y el comportamiento del gusano, genes que codifican protefnas conocidas como la miosina y genes que contTOlan el curso del desarrollo. se han realizado mapas de casi todo el genoma mostrandolo como una gran serie de segmenlos solapados de DNA, represenlados por una biblioteca de clones gen6micos ordenados (vease pl1g. 339), Yse han iniciado esfuenos sistematicos para det'enninar la secuenda complela de DNA del organismo.

EI desarrollo del nematodo es practicamente invariable34

c. efegalls comienza a vivir como una sola ce:lula. El huevo fecllndado da lugar, par media de divisiones celulares repetidas, a 558 celuJas que forman un pequeno gusano en el interior de la cascara del hllevo. Una vez fuera del huevo, se producen mas divisiones que provocaran el crecimiemo y la maduraci6n sexual del gusano a medida que pasa por los coano estadios larvarios sucesivos separados por las correspondiemes mudas. Tras la ultima muda se a1canza el estado adul· to, y el gusano herrnafrodita inicia la producci6n de sus propios huevos. Todo el proceso de desarrollo, de huevo a huevo, dura solamente tres dias. Pueslo que el C. elegam es pequeno y transparente. se puede observar como sus celulas se dividen, migran, se diferencian y mueren en el embri6n, y se puede seguir ellinaje desde el huevo hasta el organismo adulto. Esta sencWa lecnica de observaci6n direcla ha servido para describir el comportamiento y ellinaje de todas las celulas desde el huevo hasta el animal aduJto. Esto ha hecho posible un anaJlsls de Ilnaje pormenorizado, que es mucho mas diffdl de realizar en animales de mayor tamaJ10, en los cuales cada una de las celulas ha de ser marcada en est adios tempranos para poder identificarla a eUa y a Sll progenie. Ademas, en animales mayo res los pormenores dellinaje celular prescntan muchas variadones aleatorias, incluso enlre especfmenes geneticamente identicos. Por el conlrario, en el nem.ilodo las eslructuras somaticas se desarrollan segUn un linaje celuJar invariable y predecible, y cada una de las muchas divisiones celulares se produce en el momento preciso. Esto significa que los precursores celula· 1144

CapftuJo 21 : Mecanlsmos celulares del desarrollo

HUEVO

o

I •~ .! •

® .~

.........

hlpodermil

mUSCUIalUI8

•

mUlleUlalur1l

=

ec:kniOn : : :

POSTERIOR

res sigucn el mismo patr6n de divisiones celuJares en cada individuo, y salvo contadas excepciones, se plIcde predecir el futuro de cada celula hija a partir de su posici6n en el Mbal geneal6gico (Figura 21-40).

La descripci6n complela del !innjc celular del C. elegans nos proporclona lIna respuesta inmediat3 a una pregunta fundamental. El nem<1lodo, igual que muchos animaJes, se forma a partir de un numero relativamentc clevado de celulas que se puedcn c1asificar en un numcro mucha mellor de [Ipos cclulares difercnclados. Dada la importancia de los antecedentes celulares. cabe la tenla· ci6n de suponer que facias las cclulas de un mismo 1ipo celular son desccndien· les de lIna unica "celula fundadora" que ha seguido una sola via de desarrollo. Sin embargo, el analisis dellinaje demuestra que general mente esto no es cierto, ni para nematodos ni para olros animales. As(, en C. efegans (salvo pocas excepciones como las celulas intestinales y las celulas de la !fnea germinal) cada c1ase de celulas diferenciadas -hipodermicas, neuron as, musculares, de la g6nada- derivan de varias celulas fundadoras que se originan en ramas separadas del Mbol geneal6gico (vease Figura 21-40). De eSle modo, celulas de caracler parecido no tienen por que ser parientes cercanos. Par el contrario (aunque raramente), celulas de caracler diSlinto pueden tener un parentesco muy pr6ximo en cuanto a linaje: por ejemplo, algunas de las neuronas de C. elega"s son hermanas de las Illusculares. Enlonces, el problema consiste en comprender las leyes que actuan en cada rama del arbol geneal6gico generando un conjunlo delerminado de tipos celuJares, cada uno de elias en un numero adecuado.

Flgura21-40 Arbolgeneal6g1codelas ctlulas que forman el inte5tino de C. elegans. EI huevo (arriba) se ha dibujado a la misma escala que el adulto (abajo). Observese que miemras que las celulas intestinales se forman a partir de un unieo clan (como haeen las eelulas germinales), las eclulas de la mayorfa de los demas tejidos no 10 haeen.

Los genes de control del desarrollo definen las leyes del cornportarniento celular que generan el mapa corporal 3S Para explicar c6mo el genoma.define las leyes del desarrollo, necesilamos poder identificar los genes que controlan las opciones de desarrollo de las ceJulas. Las EI gusano nemlitodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamlenlo eeluJar

1145

mutaciones en eslOs genes dificultaran el desarrollo, aunque las mutaciones no son las unicas que 10 hacen. Por ejemplo, algunas mutaciones interrumpen lOdos los linajes celulares y causan la muene premalura del embrion simplemenle porque destruyen los genes ~cons(itulivos~ que (oda celula necesila para sabrevivir y proliferar. Qlms rnutaciones afeclan genes que codifican protefnas que determinados tipos de celulas diferenciadas necesitan para poder realizar su funci6n especializada; el mapa corporal seni bcisicamente normal, pero algunos tipos celulares, aunque inidentificables. funcionanin mal. Par el contrario, mutaciones en genes especfficamenle implicados en el control de opciones de desarrollo trastoman el mapa corporal: nonnalmente dan lugar a tipos diferenciados de celulas nonnales dispueslas anormaLmenle 0 en cantidades anonnales como resultado de alteraciones especfficas en el arbol geneal6gico. Identificados de esla manera, los genes de conlrol del desarrollo, se pueden c1asificar segtin las partes del arbol geneal6gico afectadas y. por 10 tanto, si conocemos las leyes del componamiento celular que generan esta parte del arbol, los genes se pueden c1asificar segtin las leyes de las que son responsables. Para i1ustrar los principios del analisis genetico de un mecanismo de desarrollo, veremos un ejemplo de interacci6n celula-celula en el nematodo -la inducci6n de Ja vulva.

La inducci6n de la vulva depende de un amplio conjunto de genes controladores del desarrollo 36 La vuJva -el orificio por el que el gusano hermafrodita pone sus huevos- es una obenura ventral en la hipodermis (piel) fonnada por 22 celulas produclo de Hnajes especiales de tIes celulas precursoras de la hipodennis. Una unica celula de la gonada, que no se divide. denominada c:ilula de anclaje. adhiere, 0 "ancla~, la

=_::::::::=DESARROLLO NORMAl-DE LA VULVA

II I II

g6nadll celulll d' anclaje hlpoderml.

vulv. en deM'rol1o

-•

g6nade hipodermi.

reSlot de celuln muert.. de la g6nada

cl!ilula de [t::=~~~f- 'rlclale

ld:=:;!!::::J1 l......

1. vulva no H de8erroli.

lAl

1146

EUMINActON DE TOOAS lAS cElUlAS DE LA GONA[)A,. EXcePTO LA cElULA DE ANCIAJE

celule de .oclaje

Capitulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

vulva en c1eM'rollo

Flgura21.41 Induccl6n de 1& vulVL (Al Experimenlos que demueslran que para que se desarroUe la vulva es necesaria una influencia induCliva procedenle de la c~lula de andaje. (8) Visi6n amplificada de las cl!lulas de la hipodermis ventral adyacenle a la g6nada, en los alrededores de la celula de andaje. con un esb020 de los diagramas del tlrbol geneal6gico tfpico de su progenie en 13 parte inferior. Las seis c(!lu[as {y ninguna otra} son capaces de responder a [a influencia inductora de la vulva, pero normalmenle 5610 tres de eslas cl!luJas estlin expuestas a ella.

vulva en desarrollo a la g6nada subyacente (ellitero) originando un pasaje que los huevos atravesan\n para alcanzar el mundo exterior. Experimemos en los que se utilizan tccnicas de microcirugfa demuestran que la celula de anclaje es responsable de la inducci6n de las tres celulas hipodermicas mas cercanas para formar la vulva (Figura 21-41). Si destruimos la celula de anclaje con un rayo laser, estas cehtlas no dan lugar a la vulva sino que producen celuJas hipodermicas tfpicas. $i se altera la posici6n de la celula de anclaje en relaci6n a las c~Hulas hipodermicas, se varra la fUlura localizaci6n de la vuJva; las tres celulas que normal mente originan la vulva se encuentran flanqueadas por oLras tres celulas que tambicn son capaces de hacerlo si se exponen a las senaJes de la celuJa de anclaje. Asf pues, la celula de anclaje induce la diferenciaci6n celular en C elegans del mismo modo que los blast6meros del polo vegetativo inducen la diferenciaci6n mesodermica en el embri6n temprano de Xenopus. La unica celula necesaria para la inducci6n es la de anclaje: si destruimos todas las celuJas de la g6nada salvo la celula anclaje, la vulva se desarrollara con nonnaJidad. Para identificar los genes implicados en un momento detenninado del desarrollo, lenemos que buscar mutaciones que interrumpan el proceso, mediante el estudio de la progenie de una gran poblaci6n de animales que han sido expuestos a agemes mutantes. De este modo se encuentran mutames que tienen un renotipo "sin vulva~. en los que las celuJas hipodermicas se compartan como si no hubieran recibido la senal de la celula de anclaje. Otro gran grupo de mutanles tienen un fenotipo "muILivuJva", en el que las seis celuJas hipodermicas capaces de responder a la senal de la celuJa de anclaje se comportan como si todas elias hubietan recibido la senaJ. de modo que el gusano forma varias eSlructuras en fonna de vulva en vez de una sola. Entonces se estudian las mutaciones individuales que dan lugar a fenoLipos similares para vcr si los genes afectados son los mismos 0 si son distintos, taJ como se explica en el Panel 21-1, pags. 1148-1149. Una vez se ha identificado de esta fonna, un conjunto relevante de genes, pOt regia general todavfa podtemos descubrir mas componentes del sistema buscando mutaciones en olros genes que supriman los efectos nocivos de mUlaciones en algtin gen ya identificado. Dichas mutaciolles sllpresoras exrragellicas pueden ser raras y s610 son favorables a nivel genelico en organismos como C. eJegans en los que son faciles de encontrar; si se encuentran, sin embargo, a menudo identifican genes cuyo productos proteicos inieractUan directamente con los produclos del gen identificado previamellte (por ejemplo, se puede compensar la modificaci6n de la forma de una molecuJa proteica mediante una modificaci6n complementaria de la forma de su proteina compai\eral. Se han idenlificado mas de 30 genes ifnplicados en el control del desarrollo de la vulva.

Pruebas gen~ticas microquirurgicas revelan la 16gica del control del desarrollo; el clonaje y la secuenciaci6n de genes nos ayudan a descubrir su bioqufmica37 Nuestro cSludio se cenlrara ahara en tan s610 cinco de los genes controladores de la vulva, llamados li/l-3, let-23. sem-5. let-50 y lin-45. EI deterioro de la funci6n de cuaJquiera de ellos a causa de mutaciones conUeva la misma consecuencia -un fenoUpo sin vulva. Por el conlrario, un cambio genelico que provoque un exceso de cuaJquiera de estos produclos gerticos a una actividad excesiva 0 no regulada -en Olras paJabras, un incremento de funciones- puede producir 10 conlrario: un efecto mulLivuJva. POt 10 tanto, los cinco genes son imprescindibles para que se produzca la inducci6n de la vuJva. 10 cuaJ sugiere que facilmente todos ellos podrfan ser eslabones de una misma cadena de causas y efeclos; es decir, que los cinco genes podrfan penenecer a una unica secue"cia g~nica. Va se vio en el Capitulo 15 c6mo se definfa mediante analisis genelico el proceso de senaJizaci6n que controla la especializaci6n de un tipo celular particular del ojo de Drosophila. Para determinar el orden en que actlian los genes oontroladotes de la vulva. se ha utilizado un tipo de analisis parecido, como se explica en la Figura 21-42. De hecho, parece que los cinco genes estan situados en una linica EI gusano nem4lodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamJento uluJar

1147

GENES Y FENOTIPOS Gan:

unidad funcional de herencia, normalmente corresponde 81 segmenlo de DNA que codifiea una sola proteina. Genome: conjunto de genes de un organismo. locus: localizBci6n del gan en un genome

Tipo salvaje: 01 tipo mas habitual

alelos: formes alternatives del gan

Mutante: S9 diferencia del

tipo salvaje en un cambia' geneticD (una mutaci6n)

homozigoto AlA

C"; :""')

GENOTIPO:conJunto Bspedfico

de alelos que forman 91 genome de un individuo

homozigoto ala

heterozigoto alA

~

FENOTIPO; caraeteres visibles

de un individuo

91 alelo A es dominante (respecto a a); 01 alela a as recesivo {respecto a A)

En 01 ejemplo ilustrado (parte superior), 91 fenotipo de un heterozigoto as 91 mismo que 01 de uno de los homozigotos; en los casos en que es diferente de los dos, se dice que los dos alelos son co-dominantes.

un cromosoma en el inicio del cicio celular, en la fase G,; la barra representa una doble helice larga de DNA

CROMOSOMAS cenlf6mero brazo 'p' corto

EL CICLO HAPLOIDE-DIPLOIDE DE REPRODUCCION SEXUAL

brazo "q' largo un cromosoma al final del cicio celular, en metafase, formado por dos croml§tidas hermanas identicas (cada una de las cuales contiene una doble helice de DNA) unidas al centr6mero.

brazo 'p' corto

brazo 'q" largo

paterno 1

autosomas

;;\\ m",m03

H1/

paterno 3

~~;;l::1:

paterno 2

X

m""o02

Un conjunto tfpico de cromosomas diploides, tal como se ve en una aposici6n en metafase preparada rompiendo la celula en metafase V tinendo los cromosomas dispersos. En el ejemplo ilustrado esqueml§ticamente, aparecen tres pares de autosomas (cromosomas heredados simetricamente de ambos progenitores, excepto los asexualesf y dos cromosomas sexuales -uno X de la madre V otro Y del padre. La cantidad y los tipos de cromosomas sexuales varian de unos organismos a otros, al iguat que la cantidad de pares de autosomas.

FUSI6N SEXUAL (FECUNDACI6N)

~ . t zlgo 0

cromosoma

moterno cromosomo patorno

Para simplificar, el cicio se representa solamente para un cromosomafpar de cromosomas.

MEIOSIS Y RECOMBINACION GENICA Cuanto mayor sea la distancia antra los dos loci, mayor serclls posibilidad de recombinaci6n por entrecruzamiento en un punto entre ambos loci. 5i se recombinan una proporci6n x% de gametos, estarl§n separados por una distancia en el mapa genetico de x unidades da mapa (0 x centimorgans).

cromosoma materno A

B

cromosoma paterno

, diu Is germinal diploide genotipo

lJ48

Pinel21·1

AB 'b

Revisj6ndege~cld.sica.

gametos haploides (oocitos 0 espermatozoides)

TIPOS DE MUTACIONES

I

deleci6n; suprime un sagmenlo de un cromosoma

mutaci6n puntual: cambia de un unico lugsr del genoma correspond!ente a un par de nucle6tidos o una parte muy pequel'ia de un gen

• f" inversion: invierte un segmento de un cromosoma

nSi.

translocaci6n; secciona un segmanto de un cromosoma

V 10 une a otro cromosoma mUlaci6n letal: provoca la muerte premature de un

organismo en desarrollo. mutacion candidonal: produce un sfeelo fenotipico 5610

mutad6n de incremento de funeion: aumento de la aClividad del gen 0 eKpresion del gen en condiciones inadecuadas; normalmente estas mutaciones reciban el nombre de

bajo ciertas condiciones. denominedes condiciones

dominantes.

restrictivas; en olres condiciones -las condiciones pe,misiva~ esle efecto no S8 observe. Para una mutacion

mutacion dominante negativa: mutacion activa dominante que bloquea la actividad genica, provocando un fenotipo de perdida de funcion incluso en presencia de una copia normal del gen. EI fenomeno ocurre cuando el producto del gen mutante interfiere con el producto del gen normal. mutaci6n supresora: elimina el efecto fenotfpico de otra mutacion, y 81 individuo con ambas mutadones pareca normal. EI gen afectado por la primara mutad6n presenla an su interior una mutadon supresora Imrsgenics; un segundo gen presents una mutaci6n supresora 6ltfrageni(;s; a menudo 61 produeto de este segundo gen interactua dir8Ctsmenle con el producto del primer gen.

sensible 8 /8 temperatura, Ie condicion restrictive mlls cornuo es la temperature elt8 mientrss que Ie condicion permisiva as la temperatura baja.

mutaci6n de perdida de funci6n: reduce 0 elimina la eClivided del gen. Son las mutsciones mas Ilpiess. Normalmente las mutaciones de perdida de funei6n son recesives -generelmenle los orgenismos pueden 'undoner con normalidad mientras relengan al menos una copia normal del gen afectado. mutaci6n nula; elimina por complelo la actividad del gen.

(DOS GENES 0 UNO SOLO? Si dos mutaciones determinadas producan al mismo fenotipo, loomo podemos discernir si son mutedones del mismo gen7 Si las mulaciones son recesivas Iy Ie meyorle 10 sonl, podremos encontrar la respuesla merced a una prueba de complementaciOn.

COMPlEMENTA

ilQli GENE

madre homozigoto mutants

nwg~

__

plldra homoEigoto mutanta

el descendiente nlbrido presenta un fenotipo normal: contiena una copia normal de cada gen

En al tipo mas simple de pruebe de complementacion, un individuo nomozigolo para una mutacion se cruza con un individuo que es homozigoto para Ie Olra mutaciOn. EI fenotipo de su deacendienle responde Is pregunts.

...----r;N"'O~Ci'iOiiMP;;orl'EMiiiiEiiNTTJ."'C:;;I6 ..N;:'"- - - -... DQ$ MYIAQOf\IES INOEPENOIENTES£N EL..MlSMQ GiN

mlldre homozigoto mU!lInte

p.dre homozigoto mut.nt8

el descendiente nlbrido presents un fenOlipo mutsnte: no presents copias normalas del gan mUlado

1149

ACTlVIDADES DE LOS GENES la actividad da cada gen dapande de la aetivldad del gen precedente muteci6n de perdida de lunci6n en A V mutacion de incremento de luncion en B mutaclon de Incramento de lunci6n en A V mutacion do p6rdida do funcion en C

~'~'~i ~L.:::.../~

FENOTIPO

~ ~

~_'D' • D'_~D

t,po salvaje

Incremanto da luncion

perdida de funci6n

secuencia genetica: lin-3 ocupando la primera posici6n, seguido de let-23, yen este orden sem-5, let-60y finalmente lin-45. Asf pues, por ejemplo una mutaci6n de incremento de funci6n de lin-3 no tiene ningun efecto sobre el fenotipo de un animal que tambien contenga una rnutaci6n que conlleve la perdida de funci6n de let-23; la doble rnutante carece de vulva debido a que el componente que abre la secuencia no puede hacer nada si el componente siguiente sobre el que deberia actuar ha desaparecido. EI problema siguiente consiste en relacionar las actuaciones de los genes con celulas determinadas del embri6n. Por ejemplo, les necesario lin-3 en las celulas de andaje que producen la senal de inducci6n 0 en las celulas hipodermicas que responden a ella? La genetica molecular nos proporciona una facil respuesta para el caso de lin-3: el gen se ha donado y se ha demostrado su expresi6n en la celula de andaje y en ningtma otta parte de la zona circundante (Figura 21-43). Parece que los otros cuatro genes, por el contrario, actuan de un modo distinto en las celulas hipodermicas, y una mutaci6n de incremento de funci6n en uno de ellos puede causar un fenotipo muJtivulva incluso si se ha destruido la celula de anclaje. Para completar el panorama vamos a relatar el camino definido geneticamente para moltkulas proteicas y su bioquimica. Se han donado y secuenciado los cinco genes lin·3, ler-23, sem-5, let-60 y lin-45, y en cada caso la secuencia indica una posible funci6n: Un-3 codifica una prote(na similar a una molecula senal segregada muy conocida en los vertebrados -el factor de crecimiento epidermico (EGF); let-23 codifica un receptor de tirosina quinasa hom610ga a los miembros de la familia de receptores de EGF de vertebrados; como vimos en el CapftuJo 15, sem-5 codifica la protefna que contiene los dominios SH2 y SH3, presente en muchas proteinas que se unen directamente a dichos receptores y que acruan sobre otros componentes intraeelulares; y lel-60 y li,,-45 son hom6logos respeetivamente a los genes de vertebrados ras y raj, cuyos productos transmiten sei'lales de estos receptores al interior de la celula, como se vio en el Capftulo 15. Por 10 tanto, es posible que la proteina Lin-3 sea la molecuJa senal segregada por la celula de anclaje, que la protefna Let-23 sea el receptor transmembrana de las celulas hipodermicas a las que se adhiere, y que las protefnas Sem-5, Let-50 y Lin-45 sean coneetores de la via de sefiales imracelulares, a t.fa-

Figura 21-42 Los genes se pueden ordenar en unft seeuendft genlea mediante pruebas efectuadas con mutantes dobles. Se diee que un gen A se shua por encima de un gen Bsi su producw normalmente regula la aelividad de B (0 el producto de B) y por debajo si la reguiaci6n es al reves. Si al gen superior Ie basta con regular la actividad del gen inferior para afenar el fenotipo del gen inferior, diremos que ambos genes estlin ligados en una misma secuencia genica. En este caso, mutaciones de cualquier gen tendnl.n consecuencias similares en los fenotipos. Para descubrir el orden de los genes en una secuencia, utilizamos mutantes dobles para delerminar cu
Figura 21-43 Ex)>resI6n de lin-3en la celula de andale. Un embri6n de C. elegalls ha sido transfectado call un gen informador artificial que consiste ell la regi6n de control de lin-3 acoplada al gen que codifica la enzima ~-galactosidasa, euya presencia es f
Capftulo 21 : Meeanlsmos eelulares del desarrollo

Cl:lULA DE

CnULA

ANClAJE

HIPO~RMICA

t-

·o-,,~-_}

•

j\

Un·J

Lel-5O IRes)

(EGA

lln-45 (R.f!

Flgura21-44 Camlnoqueslguela Induccl6n de la vulva en C eleg(l1Is. Los diagramas muestran las funciones de los produclos genicos que se han identificado. Los nombres de las protcfnas homOlogas en los venebrados se indican enlre parenlesls.

yes de la cualla uni6n delligando con el receptor ejerce sus efeclOS finales sobre la expresi6n genica y la dererminaci6n celuJar (Figura 21-44). De hecho, el anAlisis genelico de esle sislema del gusano nemAtodo en desarrollo proporciona una de las visones mAs c1aras que lenemos sobre la organizaci6n de la vfa de senales que parece que se ha conservado en la mayona del reino animaL Como vimos en el Capflulo IS, un camino muy similar a esle aparece del anAlisis de sevenless mutanles de Drosop/lila (vease pAg. 817).

Mutaciones heterocr6nicas identifican los genes que especifican cambios en las Jeyes del comportamiento celular a medida que transcurre el tiempo38 TaJ como saben los programadores de ordenadores, pequeiios cambios en el programa pueden tener consecuencias drasticas en el resultado que se obtiene al ejecular dicho programa. De forma parecida, una mUlaci6n sobre un gen de control que aJtere una sola ley del componamienlO celular puede provocar un arbol geneal6gico tOlalmenle anormal. Las muraciones l1eterocr6nicas en C. eleguns constiluyen un buen ejemplo de esle fen6meno, ya que provocan un componamiento en cierlos conjulllos de celuJas que serra normal en otros eSladios del desarrollo. Por ejemplo, una celula hija puede comportarse igual que una celula madre 0 abuela mienlras que la celula descendiente de la hija puede comportarse de nuevo de la misma manera, etc., 10 cual haee que una parte del patr6n geneal6gico se repira indefinidamente. La Figura 21-45 tllllCSlra los diagramas de !inajc para una serie de mutaciones de un gcnllamado Iin-14, que ilustran eSle fen6meno: enlugar de progrcsar

tipo

mut.nte 1in-14

mut&nte IIn.14

selveie

d. Pllrdide d.

de ir\Cremento de

f"ncion

IUr\Ciotl

T

T

T primer "lido

larvlflo

cuano . .8do l.rY.rio

A

Figura 21-45 Mutaclones helerocrdnlcas del gen fill-14 de C. elegfllls. Solo se mueSlran las consecuencias en uno de los muchos tinaies afectados. La mutaci6n (receslva) de perdida de funci6n de UTI-14 prO\'oca la apariciOn prematura del patr6n de divlsi6n y diferenciaci6n celular caraClerfstico de la larva madura; la mutaci6n (dominante) de incremento de funciOn provoca el efeclo conlrario. La X indica una muene celular programada. Las Iineas wrdes representan las celulas que contienen proteina lin-14, las Ifneas rojas las que no. En un desarrollo Ifpico el inicio de la nutrici6n larvaria marca el initio de la desaparici6n de Un-14. (SegUn V. Ambros y I-t.R. Horvitz. Scienu 226:409-416, 1984. Cl theAAAS; y P.Arasu,

B. Wightman y G. Ruvirun, Growth Dell. Aging. 5:1825-1833, 1991.)

EI gusano nem:hodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comporcamlenlo celular

1151

mediante series normales de divisiones celulares caracterfsticas del primero, segundo, lercero y cuarto estados larvarios para detenerse tras el cuarto, muchas de las cclulas que presentan una mutaci6n de incremento de funci6n de Iin-14 repiten los patrones caracterfsticos del primer estado larvario, hasta un m:iximo de cinco cidos -0 mudas- y persisten en la fonnaci6n de un lipo de culfcula inmadura. Las mUlaciones que implican perdida de funci6n del gen li,,-14lienen un efecto inverso: hacen que las celulas adoplen precozmente eSlados aduhos, sa11~ndose los CSlados intermedios, de forma que el animal alcanza su estado fi· nal premalUramente con un numero anonnalmenre reducido de celulas. EI gen lin-J4 ha sido donado, y tambien se ha descubieno que la prolefna que codifica se concenlra en el nudeo celuJar. En un ejemplar normal, la proterna eSI~ presente en la mayorfa de las celuJas somaticas del embri6n lardro y en el primer eSladio larval temprano, perc en el segundo esladio larval su concen· traci6n disminuye hasta casi cero. las mutanles lin-J4 que entran precozmente en el estado aduho presentan un nivel de proteina Lin-14 reducido, mientras que las mulantes que continuan repiliendo los primeros cidos del primer esl'adio larvario presentan una expresi6n de la proteina Lin-14 durante un perfodo extraordinariamente largo (debido a una mUt'aci6n en la porci6n reguladora del gen). Asf el efecto de la protefna Lin-14 consiste en mantener las relulas en un eslado inmaduro, y su maduraci6n nonnal depende de su desaparici6n. Podemos suponer que este producl'O genico es solamente uno de los muchos cuyas concentraciones en las celulas provocan cambios en las reglas del componamiento celular a 10 largo del desarrollo.

EI lltempo" del desarrollo no esta contralado mediante el cicio de divisi6n celuJar 39 EI ejemplo que acabamos de ver nos conduce a un problema fundamental del desarrollo. EI genoma liene que definir un conjunto de reglas que dirijan lanto la divisi6n como la especializaci6n de la celuJa, y ambos procesos han de eslar coordinados. tC6mo se coordina la divisi6n celular duranle el desarrollo, y c6mo se coord ina a su vez con la especiaHzaci6n celular? Una sugerencia es que exiSlan cam bios de su estado interno que esperen el paso de la celula a traves del cicio de divisi6n: par decirlo de algl'm modo, la celula pasarfa a la fase siguiente como 10 hizo a traves de la mitosis. ESla idea parece tenradora, especialmeme cuando se describe el desarrollo en lerminos de diagramas de Iinaje, perc las pruebas van en contra de esta hip6!esis. A menu do las celulas de embriones en desarrollo continuan diferenciandose de forma casi normal incluso cuando sc imp ide artificialmente la divisi6n celular. Obviamente, tiene que haber anomaHas, aunque s610 sea porque una sola celula no dividi· da no pueda diferenciarse de dos formas a la vez. Pero parece que en la mayorfa de los casos que hemos estudiado las cUvisiones celulares no son las manecillas del reloj que eSlablecen el "tempo" del desarrollo, sino que la celula cambia su estado qufmico con el tiempo independientemente de la divisi6n celular, yeSle estado cambiante controla tanlo la decisi6n de dividirse como la decisi6n sobre c6mo y culindo especializarse.

Las c~lulas mueren ordenadamente como parte del programa de desarrollo·o Un C elegans hermafrodila genera 1030 nucleos de celuJas somaticas en el transcurso de su desarrollo, perc 131 de las celulas mueren. ESlas muerles celulares programadas ocurren segun un palr6n absolutamellle predecible, y sin causar problemas. Mienlras que las celuJas que mueren a causa de heridas 0 envenenamientos nonnalmenle se hinchan y explolan, vertiendo su contenido sabre sus vecinas, estas muenes de cclulas nonnales OCUITen mediante un proceso conocido como apoplosls, en el que el nucleo celular se condensa, la celula se seea y el cuerpo marchito es engullido y digerido rapidamellle por sus celulas vecinas 1152

Capftulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

(Figura 21·46). La muerte celular programada es una caract'erfstica tfpica del de· sarrollo animal y probablemente el destino de un porcentaje substancial de las celuJas producidas por la mayorfa de los animales. Debida a que la apoptosis ocurre nipidamente y sin dejar rastra, es f
• •I

II eelu!a Be suicidl

.~ I. t*!u!. muerta es

angl,lllid. PO' un.

I

celul. vea~·"~':""=~~..

• •

el cad'ver es digerido y no queda rastro de "

j

Flgura 21·46 l'o1uerte teluJar por apoptosls en C elega.ns. La muene depende de la expresi6n de los genes ced·3yced·4 en la ct'!lula que va a morit, mienlras que la expresi6n de olms genes en las celulas vecinas tonlrolan la absorci6n y la eliminaci6n de sus reslOS.

Resumen Caenorhabdltls elegans tlene dos caracterlstit:as q"e "acell de il ,m organlsmo atractlvo para lnvestlgar m base genitica del desarrollo: prlmera, IU andllsis gene. fleo es serlclllo porqlle III ttempo de generac16n es corto y s" gelloma pequeno; se· grmdn, el C',lrso nomral de '" desa"ollo es extraordillarlamente reproducible y .Ie Ira eshullado detalladamente, de mallera qlie ,ma celula de una posleMIl delern,l· nada del cuerpo tlene el mismo linaje en tados los individuos, y esle llnaje Ie conace a m perfecci6n. AllgrUlI que en olTos orgalllsmos, el desarrollo depende de lnterac· dones cilum-cil"m y de procesos a"t6nomos de cilulas. Por ejemplo, experlmentos de destmccMn celulilr demuestran que el desarrollo de m IfWva depenM de liRa se· ital de Induccl6n, y los genes necesarios para esta inducci6n se pueden identijlMr a travh de mutadones que lntermmpen el desarrollo de lit vulva. El andlisls molec'4· litr genetico "wemn las funciones lndlviduales de utos getJes y nurestran que algunos de eUos codijlMtJ componentes de 10 IfM de senaliuJd6n que wmbUn acllIa en los vertebrados. El andlisis de linn}e de mutantes conduce al de&cl,lbrlmiento de mucllos otms c14sel importantes de genes, lncluyendo genes cuyos prodllctos uta· blean de/anna temporal los camblos de las reglas del comportamlelJto cel'4litr d,,· rante el desatTOllo y genes que .remn responsables de lit muerte celulilr prograrnada -"nn caracterlst:ica invariable en el desarrollo de tados 10. anlmaln. E1 gusano nemlitodo: los genes oontroladores del desarroUo y las leyes del comportamiento «:Iular

1153

Drosophila y la genetica molecular del patr6n de formaci6n. I. Genesis del mapa corporal" La afirmaci6n basica de la gencrica clasica es que 1a estructura de un organismo

esta controlada por sus genes. Los mecanismos del control genetico de la estructura del cucrpo continuaron siendo un misterio durante casi lin siglo, y mucha tiempo despues de que se descubriera el papel del DNA en los procesos de la herencia. Desde haee pocos aiios se esta Uenando este vado de nuestro conodmicolo. En el apanacto anterior utilizamos el gusano nematodo para describir algunos de los principios mas imponantes segl1n los cuales los genes de control del desarrollo organizan los procesos del desarrollo. Pem la mosca Drosophila melanogaster (Figura 21-47) es el organismo que mas ha contribuido a la transformaci6n de nuestro conocimiento sobre el control que los genes ejercen sobre la formaci6n del mapa corporal. Tras decadas de estudios geneticos, culminados con investigaciones sistematicas a gran escala, se ha conseguido un amplio catalogo de genes de control del desarrollo de la mosca cuya funci6n especffica es definir el patr6n espacial de los tipos celulares y de las partes del Cllerpo. Ahora es posible no s610 identificar los genes basicos, sino tam bien observar c6mo trabajan: mediante una hibridaci6n ill situ utilizando sondas de DNA 0 de RNA se puede observar directamente c6mo se definen los estados intcrnos de las celulas del embri6n mediante la expresi6n de conjuntos de genes reguladores. Gracias al amilisis de mutantes, animales transgenicos y animales que constituyen una masa confusa de celuJas mutantes y no mutantes, se puede avanzar mas y descuhrir c6mo actua cada gen como una parte de un sistema que define la organizaci6n del cuerpo. Ademas, la mosca ha ahierto una puerta fundamental para conocer nuestro propio desarrollo, ya que los genes que controlan el patr6n del cllerpo de Drosophila tienen equivalentes muy cercanos en los animales superiares, incluidos nosotros mismos Nuestro tratado sobre la genetica del desarrollo de Drosophila esta dividido en dos apartados. EI primero trata los procesos del embri6n t.emprano y describe la creaci6n del mapa basico del cuerpo, con un rudimento de la cabeza en un extremo, y un rudimento posterior en el o(ro extrema y entre ambos una serie ordenada de segmentos -las unidades modulares basicas a partir de las cllales estan construidos todos los insectos. EI segundo apartado trata de procesos mas avanzados y habla del aparato genetico que data a las celuJas de valores posicionales que diferencian las celuJas de un segmento de las del siguientc; estos procesos aseguran que, por ejemplo, la cabeza desarrollara antenas y el t6rax desarrollara patas -y no al contra rio, como veremos que ocurre en algunas mutantes.

1154

Capftulo 21 : Mccanismos cclulares del desarrollo

I

I

Figura 21-47 Drosol,lllia

melanogas'er. Vista dorsal de una mosca adlilta nonnal. (A) Fotograffa. (B) Diblljo. [Fotograffa cortesla de E.B. Lewis.)

EI cuerpo del insecto se construye mediante la modulaci6n de un patr6n fundamental de unidades de repetici6n· I ,.2 El programa del desarrollo de Drosophila, desde el huevo hasla el adulto, est:i resumido en la Figura 21-48. EI perfodo de desarrollo embriol1ario comienza en la fecundaci6n y dura aproximadamente un dia, al fmal del cual el embri6n abandona la cascara del huevo y se convierte en laroa. Entonces la larva pasa por Ires esta· dios, 0 crisdlidas, separados par mudas en las cuales se deshace de su cuticula vie· ja y se reviSle de una nueva. Al final de la tercera crisalida se convierte en p"IXl. Dentro de la pupa se produce una remodelaci6n radical del cuerpo, y fUlalmcnte, unos nueve dfas despu~ de la fecundaci6n, emerge una mosca adulta, 0 imago. La mosca eSla formada por una cabeza, tres segmentos loracicos (numerados deTI a TI), y ocho 0 nueve segmenlos abdominales (numerados deAl a A9). Aunque cada segmento es diferenle de los demas, todos se conslruyen de acuerdo con un mapa parecido. Por ejemplo, del segmento TI salen un par de palas, de 1'2 un par de palas y un par de alas. y de 1'3 un par de patas y un par de balancines -pequei'ias prolubcrancias de gran importancia para el vuelo que han evolucionado a partir del segundo par de alas que poseian los insectos mas primitivos. La segmen· tact6n casi repetitiva se desarroUa durante las primeras horas tras la fecundaci6n, aunque es mas obvia en la larva, en la que los segmenlos se parecen mas a los del adulto. En el cmbri6n se puede observar que los rudimentos de la cabeza, 0 al menos las partes de la futura boca en el adulto, rambien eslall segmentados (Figura 21-49). No obstante en los dos extremos del animal encontramos estrueturas ler· minates muy especializadas que no estan derivadas de segmenlOS.

FECUNOACION

o dill

o

huevo

I I

DESAflROllQ EMBRIONARIO

1 dia

EClOslON

I

{{i /I"/i1iJ/

larva

tres llS1&dios larv.rios wpar&do$ por mudas

Sdin

I I

P\)PADON

,"po

I I

METAMOfIFOSIS

9dr..

2 horas

f-1mm-l

5-8 horn

Flgura21.48 Sinopsis del desarroUo de Drosoplrila desde el huevo hasta la mosca aduha.

10 horas

Flgura21-49 Los orfgenes de lossegmentos corporales de Drosophila durante eI desarrollo embrionario. Los embriones se presentan en vista lateral en los d.ibujos (A-C) y corresponden a las electronmicrograffas de barrido (D·F). (A Y D) A las 2 horas, el embri6n se encuenrra en el esladio de blastodermo sincititll (vease Figura 21-51) y no se aprei:ia segmentaci6n alguna. aunque se puede trazar el mapa de deslino mostrando las fUluras regiones segmenladas (roloreadas en A). (B Y E) A las 5-8 horas, el embri6n se encuenlra en el estadio de banda germinal extendida:. la gastrulaci6n ya ha tenido lugar, la segmenlaci6n ha comenzado a ser visible. y el eje segmentado del cuerpo ha aumenlado de longilud, curvlindose sobre sf mismo por el extremo de la cola de fonna que encaja denim de la cascara del huevo. (Cy F) A las 10 horas, el ejedel cuerpose ha contrafdo yse ha erguido de nuevo, ytodos los segmemos esl3n delinidos c1arameme. Las estrueturns de la cabeza, extemamente visibles en este estadio, se pLiegan posterionnente en el imerior de la larva, para emerger de nuevo cuando la larva experimente la pupaci6n transfonnandose en aduha. (D y Eo conesfa de Rudi Turner yAnlhony Mahowald; F, conesfa de Jane Petsehek..) Drosopllila I. Genesis del mapa corporaJ

1155

embri6n

/(( legmentol PARTES

pllfllegmento!

larva redl!in puestll

Ellugar donde se traza el Umite entre un segmento y el siguiente es en parte convencional. Cuando tratemos los patrones de la expresi6n genica veremos que es apropiado hablar en terminos de un total de 14 parasegmentos (numerados desde PI a P14) que son mitades de segmento fuera de registro con los segmentos tradicionales (Figura 21-50).

Drosophila inicia su desarrollo como un sincif:i o 41, 43 EI huevo de Drosophila tiene aproximadamente 400).Lm de largo y 160).Lm de diametro, y presenta una polaridad muy definida. AI igual que los huevos de otras insectos, empieza su desarrollo de una forma poco usual: varias series de divisiones nucleares sin que se produzca divisi6n celular, dan lugar a un sincitio. Las divisiones nucleares tempranas son sincr6nicas y extremadamente rapidas, producil~ndose aproximadamente cada 8 minutos. Las nueve primeras divisiones generan un conjunto de mlcleos, la mayorfa de los cuales migran desde el centro del huevo hacia la superficie, donde forman una monocapa denominada blastodermo sincitial. Despues de cuatro rondas mas de divisiones nucleares, la mem~ brana piasmatica crece hacia el interior, desde la superficie del huevo, envol~ viendo cada mlcleo, y por 10 tanto el blastodermo sincitial se convierte en un blastodermo celular compuesto por unas 6000 celulas separadas (Figura 21-51). Un pequeno subgrupo de nucleos situados en el extremo posterior del huevo es segregado a celulas unos cuamos ciclos antes; estas celulas polares son las celulas germinales primordiales que daran lugar a oocitos 0 espermatozoides. Como en el huevo de un anfibio en segmentaci6n, parece que los rapidos cic10s de replicaci6n de DNA dificultan la transcripci6n, de tal modo que hasta la fase de blastodermo celular el desarrollo depende mayoritariamente -aunque no exclusivamente- de las reservas maternas del mRNA y de las protefnas que se han acumulado en el huevo antes de la fecundaci6n. Tras la celularizaci6n, la divisi6n celular continua, siguiendo una ¥fa mas convencional, asincr6nicamente y a una velocidad mAs baja, y la velocidad de ttanscripci6n aumenta espectacularmente. EI blastodenno celular equivale a 1a blastula hueca de un anfibio 0 de un erizo de mar, incluso aunque su interior este Ileno de vitelo en lugar de ser una cavidad lIena de nuido. La gastrulaci6n se produce cuando finaliza la celularizaci6n, y aunque la geometrfa de este proceso es Oluy diferente de la del insecto, el resultado general es sumamente parecido. Las celulas endodennicas se desplazan hacia el interior mediante movimientos celulares coordinados, formando el intestino que se extiende a 10 largo del eje del embri6n. EI mesodermo que envuelve el ru1156

Capitulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 21-50 Segmentos de Drosopllila y sus correspondenclas con las reglones del blastodermo. Tengase en cuenta que los extremos del blaslOdermo se corresponden con estructuras no segmemadas que forman grandes zonas internas de la larva como, por ejemplo, los rudimemos segmentales de las zonas bucales del adulto. En Drosophila, la segmentaci6n puede describirse en t~rminos de segmentos 0 parasegmentos: la relaci6n se muestra en la parte inferior de la figura. Los parasegmentos normalmente corresponden a patrones mas sencillos de expresi6n g~nica. El ml.mero exacto de segmentos abdominales es discutible: ocho estan bien definidos, y es probable que eldSla un noveno.

huevo lecundlldo

_

CilllllllI polere. (celllie.

germinelH primo,diale'l los nUcI_ mig.an

muchas nUcleos

en un .incitio

hKI. I, perilerla V

IAI

H IImpl.l.n • forma.

los ';m;let celutar..

Figura 21·51 DesarroUo del huevo de Drosophila desde I. recundacl6n hula eI e5ladlo de bllUlodermo. (A) Diagramas esquem.1licos. (8) Vista de superficie y (C) fOlograrfas aJ microscopio 6pdco de secciones del nudeo blastod~nnicoduranle la mitosis en la transici6n desde el estadio slncllial aI blaslodl:!rmico. La actina esta leruda de !Jerde, la tubulina de norallja. lA, seglln HASchneiderman, en Insect De\,elopmenl!PA Lawrence, ed.l, pp. 3-34. Oxford, UK; Blackwell, 1976; Bye. cones!a de W. Therkauf.)

dimenlo del intestino ocupa el espacio entre este y la capa exterior envoivente de ectodenno. Si marcamos las celulas y las seguimos durante sus complejos movimienlOS de gastrulaci6n, podremos dibujar un mapa futuro de la monocapa de celulas siluada en la superficie del blastodermo (Figura 21-52). EI futuro mapa es especialmenle senciJIo en una secci6n transversal a travl!s de la milad del embri6n, con el fuiuro mesodermo situado venualmeme y el eclodermo a cada lado por encima de l!1. Como en un vertebrado, los cordones de las celulas nerviosas que corren a 10 largo del cuerpo derivan de parte del eClodermo: un subgrupo de cl!. luJas se separar:i1n en este eclodermo nellrogenico de sus vecinas. escaparan de la capa epilelial, y se desplazanin hacia el ifllerior del embri6n conviniendose en precursores de neuronas. Para el mesodermo, el ectodenno y el cord6n nervioso, se mantiene aproximadameme la posici6n de las celulas a 10 largo del eje anteroposlerior duranle la gastrulaci6n debido a que sus desptazamiemos se producell en el plano Ifansversal. Sin embargo. el inteslino se forma medianle 1a invaginaci6n de dos grupos de celu.las silUados en extremos opueslos del embri6n; ambas invaginaciones se encuentran en la mitad del embri6n y final mente forman un tubo intestinal continuo. A medida que la gastrulaci6n se completa, en la superficie del embri6n aparecen una sene de muescas y protuberancias que definiran la subdivisi6n del cuerpo en parasegmentos a 10 largo de su eje anteroposterior (vease Figura 2149). Pnlebas m:i1s sutiles demuestran que las caracterfsticas principales de este pat.r6n de segmentos ya estaban eSlablecidas en el estado de blaslodermo celular, antes del inicio de la gastrulaci6n.

ANTERIOR

POSTERIOR

DORSAL

iiiiiiiiiiiiii;;~.....,---- membrana

eKtreemb,io~"a

epidermis dorNJ lIiIIemlI nervioto y epiderm. venu.l

PlIrte post.rio, del condueto digestlvo

==-:VISTA LATERAl

Drosopllila I. ~nesls del mapa corporal

melOdermo PlIrte antario. del condueto digntivo

SECCION TRANSVERSAL

CENTRAL

'"

lei

Flgura21-SZ MapadedestInodeun embrl6n de Drosoplliltl en la rase de blastodermo celular. Vista lateral y en secci6n transversal del embri6n. ilustrando la relacl6n entre la subdivisi6n dorsoventral en los principales lejidos futuros y el patrOn anteroposterior de los futuros segmentos. Una linea gruesa limita la regl6n que formant estructuras segmentales. Durante la gastrulaci6n las ct!:lulas situadas a 10 largo de la !fnea media \"enlral se invaginan fonnando el mesodenno, mientras que las relulas destinadas a fonnar el intestino se invaginan cerea de los dos extremos del embri6n. As( pues, aunque los dos extremos del embri6n se encuentran situados en puntos OpueslOS y lejanos, companen funciones y destino. (SegUn V. Hanenstein, G.M. Technau y JA Campos·Onega, Wi/hem Roux'Arch. lNu. Bioi 194:213-216, 1985.)

1157

Dos sistemas ortogonales definen el mapa geometrico del embri6n44 Se necesitan dos coordenadas para definir cada una de las posiciones en el bias· todermo y, de forma correspondiente, se pueden distinguir dos conjumos de ge· nes de polarldad del huevo que actuan independientemente en el inicio del de· sarrollo definiendo 'Ios dos ejes principales del embri6n -el dorsoventral y el anteroposterior. Estos genes definen las coordinadas espaciales del embri6n es· tableciendo gradientes de morf6genos en el huevo. Los genes de polaridad del huevo se descubrieron tras investigaciones ex· haustivas en busca de mutantes que transtornasen la polaridad del huevo. De esta forma se descubrieron 12 genes polares dorsovemrales del IlUevo. Salvo uno de ellos, todos los demas tienen el mismo fenotipo mutante de perdida de fun· ci6n en el que el embri6n se dorsaliza -es decir, todas sus celulas taman un ca· racter dorsal, de modo que las estructuras ventrales no se forman. El gen restan· te tiene el fenotipo de perdida de funci6n contrario: el embri6n se ventraJiza. Veremos que tales genes son componentes de un sistema unico que establece el gradiente morfogenico en el embri6n temprano. Por el contrario, el conjunto de genes anteroposteriores puede subdividirse seglin sus fenotipos mutantes en tres subsistemas, responsables de la definici6n de partes diferentes del eje anteroposterior (Figura 21·53). EI grupo anterior (4 ANTERIOR

intestino y extremo de

POSTERIOR

TERMINAL

II caben partes de la caben t6rax

normal

bicold

nanos

............ ....

,.. ~"'" ...... ".~

1158

Capftulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

tOI"$O

,

-"

a

Figura 21·53 Dombdos de los sistemas de genes de polarldad del huevo: anterlores, postertores y terminales. Los diagramas muestran los destinos de diferentes regiones del huevolembrion temprano, ylas regiones que no pueden desarrollarse si los sistemas anterior, posterior 0 terminal SOil deficiemes, se Indican en blanco. Los diagramas centrales muestran esquematicamente la apariencia de la larva normal y de las larvas mutantes que carecen de un gen del sistema anterior (el bicoid, por ejemplo), del sistema posterior (el nanos, por ejemplo), 0 del sistema terminal (el torso. por ejemplo). Los diagramas inferiores muestran la apariencia de las larvas en que no funciona ninguno de los tres sistemas de genes 0 solo uno de ellos. Las letras que aparecen debajo de cada larva especlfican que sistemas permanecen inlactos (A P T para una larva normal, -p T para una larva que tiene deficlencias en su sistema anterior pero que conserva los sistemas posterior y tennlnal intactos, etc.). La inaClivaclon de un gen determinado provoca la perdida del conjunlo correspondiente de estructuras corporales; las partes del cuerpo que se forman son produclo de los sistemas de genes que permanecen funclonales. Observese que las larvas con un defecto en el sistema anterior !Odavia pueden formar estructuras terminales en su extrema anterior, pero son del tipo que normalmente encontramos en el extrema posterior del cuerpo mas que de la parte frontal la cabeza. (Ligeramente modificado a partir de D. St./ohnson y C. NllssleinVolhard, CeIl68:201-2l9, 1992. © Cell Press.)

genes) conlrola la parte anterior del eje. EI grupo posterior (J 1 genes) controla la parte post'erior del eje. Por ultimo, el grupo terminal (6 genes conoridos) controla los dos extremos del embri6n, que comprenden las estrUCluras terminales especializadas no segmentadas y panicularmente el par de regiones -una anterior y otra posterior- de las que se deriva el intestino. AJ igual que el sist'ema dorsoventral, cada uno de estos tres subsistemas establece un gradjente morfog~nico -uno en la mitad anterior del embri6n, Olro en la mitad posterior (aunque es disculible) y olro que actua simthricamente en ambos eX.lremos del embri6n. las mutaciones de ~rdida de funci6n que inactivan uno de estos subsistemas causan la ~rdida de la estructura anterior, posterior 0 terminal correspondiente. Las cuntra senales espaciales primnrias -anterior, posterior, terminal y ventral- organizan el modelaje del embri6n gracias al control que ejercen sabre la expresi6n de otro grupo de genes, que interpretan, pulen y almacenan la informad6n que suministran las senales primarias.

InOuencias procedentes de las celulas que envuelven el huevo marean el inicio del modelaje del embri6n44,45 los genes de polaridad del huevo son transcritos desde el genoma materno durante la oog~nesis, y sus productos actuan poco despu~s de la fecundaci6n, yen algunos casas inclusa antes de ella. Asf pues, el fenotipo del embri6n se determina a traves de los alelos presentes en la madre (yen sus oodtos) mAs que por 1a combinaci6n de genes mnternos y patemos que posee el propio embri6n. Los genes que acnian de esle modo se denomjnan genes de efeeto materno. Fueron descubienos al buscar los fenolipos mutantes adecuados de embriones producldos a partir de huevos pueslos por madres que parecfan nonnales pero que con· tenIan mutacioncs gen~licas que convertfan a sus huevos en anonnales (Figura 21-54). Normalmenle, In mUlaci6n de efceto materno es recesiva. y las madres que producen huevos defectivos son homozigotas para el gen mutante.

1'4A~'" I

mi.

14,·,10 J

m

m

'II citaplasm/l tod....I/l cantlene prodl)ctOI rn,Im m.ternole

~ esperm/ltozoide

ligato

•~~..

'J4~

I

I

-+

.

Flgura21-54 Herendadeuna mutacl6n receslva de decto materna. EI patron de herencia se inicia con unos abuelos heteroz.igotos (m/-+) para la mutacion (m) que es recesiva al gen normal (+). A la izquierdade cada animal se mue5tra su genotipo. EI color raja denota la presencia de un producto genico normal (+). EI producto genico acttia solo allniclarse el desarrollo, y la apariencia de una animal maduro refleja el conjunto de componcmes especificados maternos prescnles en cl hucvo. Notesc que el espermatozoide no comribuyc significativamente con estos produclos genicos en el huevo. El patrOn de herencia de una mUlaci6n de efecto materna dominante es dislinto pero podrfa generar unos efeclos fiUy parecidos.

~esperm/lIOloide

et ei'loplesm. V. no c:onlientl nil'logun produeto 0

Drosophila I. ~nesis del mapa corporal

1159

ctilula folicular

oocito

•••

I.. cetul.. folieul.res proporcionlln MII,Ie. Vllntnlles

I.. "lui., fOlicul.ru Pl'oporcionlln ser.-I.. termin'les

Cuando se ha identificado un gen, ya se puede investigar su campo de acci6n a trav~ de la creaci6n y el ano1lisis de mosaicos geneticos -moscas que contienen porciones donadas y marcadas de celulas en las que el gen que interesa esto1 ausente 0 roUlado. (Mo1s adelante explicaremos c6mo se efectua este sor· prendente truco de microcirugfa genetica.) Utilizando esle metodo se puede demostrar que la mayorfa de los genes de polaridad del huevo son imprescindibles para ellinaje del OCCiIO, mientras que en las celulas foliculares que envuelven al OOcilO en el ovario son suficientes unos cuanlos. Los genes requeridos en las ceIulas foliculares proporcionan influencias que actt1an en el exterior del huevo 10ca1izando las fuentes de los gradientes morfogenicos terminales y ventrales que se desarrollanin en el interior de las celulas (Figura 21-55). Ademo1s, los productos localizados suministrados al occito en crecimiento, par medio de las celulas nodriza gigantes a las que esto1 conectado por un extrema, definen la polaridad anteroposterior del huevo. Para observar c6mo se establecen los patrones en el inlerior del huevo, pri· mero nos centraremos en el sistema dorsoventral.

El eje dorsoventral se define en el interior del embri6n mediante una protema reguJadora de genes con un gradiente de concentraci6n intranuclear 44,45.46 La funci6n de las celulas foliculares en el escablecimiento del gradienle dorsoventral del huevo de Drosopllila consiste en suministrar una molccula selial 10calizada que se une a un receptor en el exterior del huevo y de eSle modo controla la diSIribuci6n de una prote(na reguladora de genes en el Interior del huevo. Esle sistema puede analizarse genetieamente a mediante un metodo muy parecido al lllilizado anterlonnente para analizar el sistema que Induce la vulva en el gusano nenul.todo. Siete de los genes del sistema dorsoventral parti· cipan en la producci6n de la sei'lal extracelular localizada; uno de ellos, denominado Toll, codifica el receptor transmembrana de la molecula sei'lal, y los productos de los otros tres actuan en el interior del embri6n, siempre desplles de Toll. EI ultimo gen del efecto materno de la via senal eodifiea una protefna regnladora de genes y se denomina dorsal. La molecuJa sei'lal extracelular fabricada por las celulas foticulares 5610 se genera de forma activa en la superficie ventral del huevo y forma un gradienle que se reneja en una activaci6n selectiva de la protefna Toll y final mente en un gradiente de concentraci6n de la protefna Dorsal en el n..:ideo del embri6n. La proterna dorsal penenece a la misma familia que la prolefna reguladora de genes de venebrados NF·"B (vease Figura 15-32) y podrfa actuar de modo similar a ella. En el huevo recien puesto tanto el mRNA dorsal (detectado mediante la hibridaci6n in situ) como la protefna que codifica (detectada can anticuer· pos). se distribuyen unifonnemente en el citoplasma. No obstante. tras la migraci6n del nueleo a 1a superficie del embri6n para fannar el blaslodenno.

1160

CapftuJa 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 21-55 Ooclta de Drosophila en su folfcuJo. EI OOciio deriva de una celula germinal que se divide cuatro veces dando lugar a una familia de 16 celulas que permanecen en comunicaci6n unas con Olms a traves de puentes citoplasm'hicos. Un miembro de la familia se conviene en occito, mientras que los otros se convienen en celulas nodriza, que generan muchos de los componentes necesarios para el oocito, yse los Iransfieren a lraWs de los puentes cltoplasm4ticos. Las celulas foliculares que envuelven parcialmente el huevo tienen un origen diferente: son la Fuente de las sei'iales vemrales y tenninales que polarizan al huC\·o.

Figura 21-56 EI gradJente de la protema Dorsal y IU Interpretacl6n. Gradlente de concentraci6n de la protefna Dorsal en el nucleo del blaslodermo, puesto de manifiesto mediante un anticuerpo. (B) Interpretaci6n del gradiente Dorsal por genes que demarcan los dislintos territorios dOTSO\'entrales; para simplificar 5610 se muestran dos genes representativos. Los procesos posteriores efectuarnn subdivisiones mils complejas de estos territorios. Panicularmente, el gen decapemopftgico (dpp) codifica un factor segregado que actua como morf6geno local controlando el modelaje detallado del ectodermo. (A, segUn S. Roth, D. Stein y C. NOsslein· Volhard, CLI159:1189-1202. 1989. o Cell Press.) (A)

IB)

eublen. vitelina leubiefU del huevol

dpp trllllllCrito

mesodermo 1 gr.cli.nt.lSe

prolelnll Ooru' IntTllnuclear

2 gene, zigoto regulados por III proteinll Dorsal

3 .. protelna OW wgregadll lorm. un gradi.nt. do....1 inductivo

'" territor1oS

dorsoventral.. especiflClldos

riene lugar una notable redistribuci6n de la protefna Dorsal: dorsalmente la prole(na permanece en el citoplasma pero ventralmente se concentra en el nuc!eo, y enne estos dos extremos existe un gradiente uniforme de localizaci6n nuclear (Figura 21-56). Parece ser que la distribuci6n de la prole(na Dorsal entre el nt'!cleo y el citoplasma estd controlada. at menos en parte, par el producto de un gen llamado cactus. La protefna Cactus es hom610ga a la protefna 1-Jc8 que inhi· be NF-KB en las celulas de los vertebrados impidiendo que migre aI interior del m1c1eo (vcase Figura 15-32). Andlogamente, se cree que la protefna Cactus se une a la protefna Dorsal, atrapdndola en el citoplasma; tam bien se supone que la protefna Toll transmite la seilal que pone en marcha la fosforilaci6n de la protefna Dorsal, provocando su disociaci6n de la protefna Cactus de forma que esta pueda entrar en el m1cleo. Va en el interior del m1cleo la prote(na Dorsal activa 0 desactiva, en funcl6n de su concentracl6n, la expresi6n de diferentes grupos de genes. De esta forma el gradiente de localizacl6n nuclear de la protefna crea una serie de territorios dorsoventrales -franjas distintivas de cclulas que aparecen a lodo 10 largo del embri6n. Por ejemplo. donde la concentraci6n de la protefna Dorsal es m<1s alta, un gen especffico del mesodenno, denominado rwist, activa su expresi6n principalmente en la zona ventral. En cambia, donde la concentraci6n de protefna Dorsal es mds baja, un gen decapemapUgico (dpp). puede activarse, especificando estructuras dorsales. En la regi6n intennedia, donde la concentraci6n de la protefna Dorsal es 10 bastante alta para reprimir a dpp pero demasiado baja para activar nvist, las c~lulas se especializan convini~ndose en ectodenno neurogcnico (vcase Figura 21-56). Los productos de los genes regulados directamente por la protefna Dorsal generan, a su vez. senates mds locales que defmen subctivisiones m<1s delicadas del eje dorsoventral. Paniculannente, dpp codifica una protefna segregada de la superfamilia TGF-~, que podrla fonnar un gradiente morfogcnico local en la regi6n dorsal del embri6n. La acci6n de esta protefna tiene reminiscencias de la acci6n de la activina, miembro tambicn de la familia TGF·~. en el desarrollo Drosoplriln I. ~nesls del mapa corporal

1161

SISTEMA DORSOVENTRAL

SISTEMA TERMINAL

SISTEMA ANTERIOR

SISTEMA POSTERIOR

J.."JC_._) ~__)<:__3 r9<:eptores transmembrane

r9<:eptores trensmembrene

mRNA loclllizado

determinen • ectodermo vs. meaodermo VI. endodermo; • estructuraa termlnelea

EI sistema posterior define las celulas germinales y tambien los segmentos corporales posteriores 47 En practicamente todos los animales estudiados, las cellilas germinales primordiales -los precursores de la pr6xima generaci6n de gametos- se distinguen de las celu/as somdricas -que fonnarAn el resto de los tejidos del cuerpo- en un esladio muy temprano del desarrollo (vease Figura 21-51). En muchas especies el huevo contiene componentes cilOplasmalicos localizados -visibles como grdllulos polares en C. efegans y Drosophila, 0 plasma germinal en Xenopus- segregados al interior de las celulas primordiales germinales durante la segmemaci6n del huevo y que probablemente incluyen 0 se asocian can determinantes del caracter de las celulas germinales. Generalmente estos componentes se concentran en el extremo posterior 0 vegetativo del huevo, y las celulas que los heredan migran de este punto para colonizar las g6nadas. Los genes de efecto materno de Drosophila necesarios para la formaci6n de las celulas germinales pueden ser identificados mediante el descubrimiento de los mutantes que producen hijos que carecen de celuJas germinales. Esta descendencia an6mala tambien carece de segmentos corporales posleriores, 10 que indica que estos genes penenecen at sistema posterior de genes de polaridad del huevo. Los productos de muchos de estos genes se localizan ell el polo posterior -entre ellos, probablemente, los determinantes del caracter de celula germinal. EI gradiente morfogenico que organiza los segmemos corporales posteriores depende Cap(tulo 21 : Mccanismos celulares del desarrollo

mRNA loclllizedo

delermlnen • ciiluln germinalas va. ciilul" somiiticas; • cebeza va. cola; • "gmanto, corporelll8

temprano de Xenopus. A partir de experimentos inyectando mRNA de dpp, se cree que las concentraciones mas altas de protefna Opp causan el desarrollo del tejido mas dorsal -Ia membrana extraembrionaria-, las concentraciones intermedias causan el desarrollo del ectodermo dorsal, y concentraciones muy bajas penni ten el desarrollo del ectodermo neurogenico. Como el sistema dorsoventral, el sistema terminal depende de un receptor transmembrana que detecta las sef'iales localizadas transmitidas por las celulas foliculares para generar gradientes de protefnas reguJadoras de genes en el interior del embri6n (Figura 21-57). Estos gradientes definen el endodermo del intestino y algunas estruc(Uras terminales, por 10 que pueden clasificarse, junto can el sistema dorsoventral, como parte del aparato que define las tres capas germinales del insecto. Por 10 tanto, los sistemas dorsoventral y terminal de la mosca que utilizan moleculas segregadas que actl1an como sefiales inductivas, son comparables a los mecanismos inductivos que determinan las capas germinales en el embri6n temprano de Xenopus. Por el contrario, los sistemas anterior y posterior de los genes de polaridad del huevo establecen gradientes que dependen de acumulaciones localizadas de mRNA especfficos en el interior del huevo (vease Figura 21-57). Estos gradientes controlan las diferencias entre la cabeza y la cola, y definen las series de segmentos corporales a 10 largo del eje cabeza-cola, como veremos de forma detallada en el sistema anterior. Primero nos detendremos brevemente en discutir la funci6n especffica del sistema posterior: la especializaci6n de las celulas germinales.

1162

•

Flgura21-57 Organizacl6n de los cuatro sistemas de gradlente de polaridad del huevo.

•

de los mecanismos que crean y localizan los determinantes celulares germina· les. Un gen fundamental de este sistema es oskar. Generalmente, la protefna y el mRNA de oskar se localizan en eJ polo posterior del nuevo. En su ausencia no se desarrolla ninguna celula germinal, y si anificialmente se desplaza el mRNA de oskar hacia el extremo anterior del huevo, las clSlulas germinales se forma· ran en aquella localizaci6n. Ademas, se puede demostrar que el mRNA 10caHzado de oskar controla la localizaci6n de otros componentes -productos de atros genes del grupo posterior implicados en el desarrollo de los segmentos corporales posteriores y de las celulas germinales. Mediante su localizaci6n en el polo posterior del nuevo, estos productos pueden quedar incorporados de forma espedfica a las celulas que aUf se formen, determinando su fururo como ceJulas germinales.

El mRNA localizado en el polo anterior codifica una protefua reguJadora de genes Que constituye el gradiente morfogenico anterior 44 ,48 Si se pincha cuidadosamente el huevo de Drosophila par su extrema anterior, permitiendo que salga de una pequef'ia cantidad del citoplasma mas anterior, eJ embri6n no podra desarroLiar los segmentos de la cabeza. Si se inyecta citoplas· rna perteneciente aI extremo posterior de otro huevo en 1'1 locaJizaci6n donde se ha perdido el citoplasma anterior, se desarrolla un segundo conjunto de seg· mentos abdominales, con la poJaridad invenida, en la mitad anterior del huevo receptor (Figura 21·58). Este experimento demuestra que el control del modelaje de los segmentos del eje anteroposterior se efectua por media de substancias 10· caJizadas en los extremos del huevo. Estas substancias se han identificado gra· cias a investigaciones geneticas, comenzando con la busqueda de mutaciones que imitcn las consecucncias de la piirdida de cimplasma anterior 0 posterior. De forma mas destacada, las madres que son homozigotos para una mutaci6n en el gen de la polaridad del huevo bicoid, producen embriones que carecen de las eslructuras de la cabeza y elt6rax, y cuyas eslructuras abdominales se extien· den sobre una fracci6n anormalmente larga del cuerpO. Sin embargo, tales em· briones mutalltes pueden salvarse de un desarrollo an6malo si en su extremo anterior se inyecta citoplasma procedente del extrema anterior de un huevo normal. Asf pues el gen bicoid normal es imprescindible para fabricar dena producto en el extremo anterior del huevo que pucde actuar como hlente emisora de influencias de largo alcance que controlan el palr6n del desarrollo de las wnas anteriores.

posterior

anteriof

-:-,f=)-'C) huevo fecundlldo fl()rmal

pinchazo para faeilil&r I. wilda de pane del cilopla.ma

inyGCCi6n, en el elctremo anlUfim del hullVQ h\Jllsped, del citopla.m. posterior de un huevo dador

el embrl6n 50 deurroll. hntl el e.tadio I.rverio

.r ;.,--

I

I , 1

~

\

y" 4

~ • •

lw ... '

llrva doble-po.terior

Drosophila I. Genesis del mapa corporal

Figura 21·58 Detennlnantes locallz.ados en los extremos del huevo de Droso"hfla controlilll su polarldad anteroposterior. Se extrae una pequena calltidad de citoplasma anterior del huevo y se reemplaza inyectando citoplasma posterior. La larva doble·posterior resultanle ifotogrofta de /a derecha) se compara con un control nonnal ifotogrofta de fa Uqllierda); la substituci611 del citoplasma en un extremo del huevo tiene consecuencias a largo plalO, ya que cOllvierte a todos los segmentos mas anteriores en un duplicado espe<:ular de los tres ultimos segmenlOS abdominales. Las larvas se muestran con i1uminaci6n de campo OSCUfO. (De H.G. FmhnhMer, R. Lehmann y C. Nusslein·Volhard, j. Embryo'. Exp. MorphoL 97

ISuppl/:I69·I79, 1986. con autorizaci6n de Company or Biologists Ltd.)

1163

GRADIENTE DE LA PROTE(NA BICOID

PATflON DE SEGMENTACION RESULTANTE

100

o copl.. ","len

0>----::-----.:.:....:

100

o o

50

100

dlst.ncl. deld, ,I 'K1r,mo .nterior de I. longitud del huevo)

(%

Figura 21-59 EI gradlente de la protefna 8lcold en el huevo de DrosoplllJa y IUS consecuenclas en el patr6n de segmentos. El gradlente se manifiesta por Iind6n con un anticuerpo contra la protefna Blcoid; el patr6n segmentado se manifiesla can un antlcuerpo contra el produclO de un gen de regia par, even-skipped (que veremos mas adelante). Se comparan embrlones que contienen cera, una y cualro capias respeclivamente del gen bicoid normal. Can la dosis cera de bicoid, no se forman segmentos can caracter anlerior; al aumentar la dosis g~nica se forman segmentas cada vez mas aleJados del extrema anterior del huevo, como serfa de esperar sl su posiclOn se determinara par media de la concenlraci6n local de la prote(na Bicoid. En las grancas se presentan las medidas de eSla concentraci6n, indicados par la intensldad de tind6n. A pesar de las diferencias de poslcl6n y de espaclamiento de los rudimentos segmentales en los embriones con una a cuatra dosis del gen, ambos embriones se convertirlin en larvas adullas de praporciones normales. Los mecanismos que probablemente son responsables de esta regulacl6n se expllcan en la pagina 1140. (Ligeramente adaptado de W. Driever y C. NUsslein-Volhard, GeIl54;83-1 04, 1988 . Cl Cell Press.)

La hibridad6n in situ demuestra que el mRNA de bicoid se sintetiza originalmente en el ovario par las ctHulas nodriza conectadas aJ oocito (v~ase Figura 21-55). A medida que el mRNA bicoid atraviesa los distintos puentes dtoplasmllticos en el interior del ooeito, queda anclado par su cola 3' no transerita a un componente del cltoplasma -probablemente una parte del citoesqueleto- en el extrema anterior del oocito. La transcripci6n del mRNA empieza cuando el hue'10 es puesfO, dando lugar a un gradiente de concentraci6n de la protefna Blcold. con el punta mlls alto del gradiente en el extrema anterior del embri6n. La concemraci6n del gradiente puede alterarse gen~ticamente mediante la construcci6n de mUiantes que eontengan capias mUltiples del gen bicoid normal: al aumentar la dosis genica en la madre. tambi~n )0 hace la concentraci6n de la protefna en el huevo. Los segmentos del embri6n resultante se desplazan de fonna correspondiente hacia el polo posterior, como harlan si 1a delerminaci6n

1164

CapftuJo 21 : Mecanlsmos celulares del desarrollo

•

GEN GAP /Kriippel}

GEN DE REGlA PAR (~.kippeod)

GEN DE POlAR1DAO Oe. SEGMENTa /gooseberry}

-----= ~­

-

de sus localizaciones fuera dcbida a las infonnaciones posicionales derivadas de la coneentraci6n local de prole(na Bicoid (Figura 21-59). Por 10 tanto, esta prolerna eneaja perfectamente con la definici6n de un morf6geno. Como la proteina Dorsal, la prole(na Bicoid se une al DNA y su funci6n es regular la expresi6n de airos genes.

FlgunZI-60 EJemplosdelos fenotlpos de mutaclones que afectan a Ires tlpos de genes de segmenlacl6n. En cada caso las areas sombreadas en verde sobre la larva normal {izquierdal eslan suprimidas en el mutante a estan substimidas por duplicadO$ especulares de regiones no afectadas. Convencionalmente, las mutaciones dominantes se escriben con letras en mayUscula y las mUlaciones recesivas en mimlscula. Varias de la mutaclones de modelaje de Drosophila se c1asifican como dominantes debido a que tJenen un efeclo apreciable en el fenotipo del helerozigoto, a pesar de que su caraclerfstica mas imponante. las consecuencias lelales, son receslv8S. es decir, s610 son apreciables en el homozigoto. (Modificado de C. NUsslein-Volhard y E. Wieschaus. Natllre 287;795-801, 1980, C 1980

Macmillan Magazines LId,)

Tres clases de genes de segmentaci6n subdividen el embri6n49 Los productos de los genes de polaridad del huevo proporcionan, pues, gradientes globales de seftales. Las influeneias que acman sabre el sistema anlerior derivan del mRNA bicoid localizado en el extremo anterior del huevo anles de la fecundaci6n, y toman la forma de un gradienle anteroposlerior de la proteina reguladora de genes Bicoid. EI gradienle dirige la creaci6n de una serie de segmentos corporales discrelos. Este proceso depende de la acumuJaci6n de genes de segmentaci6n, de los euales han sido caraclerizados cerC4l de 25. Cualquier mutaci6n en uno de eslos genes altera el numero de segmenlos 0 la organizaei6n interna basica del huevo sin que la polaridad global del huevo quede afectada. Los genes de segmenlaci6n actuan en estadios m~s avanzados que los genes de polaridad del huevo, cllando el embri6n transcribe Sll propio genoma en vez de depender del mRNA materno almaeenado. Debido a que son los transcritos de los genes embrionarios, y no los Iranseritos de los genes maternos, los que delerminan el fenotipo, eSIOS genes se c1asifiean como genes de efeeto zlgoto en vez de genes de efecto malerno. Los genes de segmentaci6n se c1asifican habitualmeme en Ires grupos segUn sus fenotipos mutanles y los esladios en los cuales aCllian (Figura 21-60). Primero encontramos un grupo de al menos seis genes gap, cuyos produclos marcan las subdivisiones mas basicas del embri6n. Las mutaciones en un gen gap eliminan un grupo 0 mas de segmentos adyacemes, y las mUlaciones de genes gap diferentes provocan varios defectos de solapamienlo parcial. Por ejemplo, en el gen mutante Kriippel, la larva carece de seis segmenlos, desde Tl a AS, ambos inclusive. Los siguiemes genes de segmcmaci6n en actuar son un conjunto de ocho genes de regla par. Las mutaciones de estos genes provocan una serie de supresiones que afeetan segmentos alternos. dejando aI embri6n can s610 la mitad de sus segmentos habituales. Mienlras que todos los genes mUlantes de regia par presenlan esta periodicidad de dos segmentos, difieren en la posici6n exacta de las supresiones relativas a los Ifmites segmemales 0 parasegmenlales. Par ejempia el mutante de regia par even-skipped, que se estudia en el Capftulo 9. careee de todos sus segmentos pares, micntras que el mlltante de regia par fllSIli tarazu Drosophila I. Genesis del mapa corporal

1165

(ftz) carece de (Odos sus parasegmentos impares, yel mutante de regia par hairy carece de una serie de regiones de amplitud similar pero con registro distinto a las unidades parasegmentales. Par (Ulima, existen al menos 10 genes de polaridad de segmento. Las mutaciones en estos genes producen larvas can un Illimero normal de segmentos pero una parte de cada segmemo esta suprimida y reemplazada por una imagen especular duplicada de todos 0 s610 parte del resto de los scgmentos. Par ejemplo, en el caso de los mulantes gooseberry, se reemplaza la milad posterior de cada segmento (es decir, la mitad anterior de cada parasegmento) can una imagen espeeular aproximada de la mitad anterior del segmento adyaeente (vease Figura 21-60). Luego estudiaremos, paralelamente al proceso de segmentaci6n, un grupo de genes mas evolucionados, los genes seleetores home6ticos, que definen y preservan las diferencias entre un parasegmento y el siguienle. Los fenotipos de varios mUlantes de segmenlaci6n sugieren que los genes de segmenlaci6n forman un sistema coordinado que subdivide progresivamente el embri6n en dominios eada vez mas pequeilos a 10 largo del eje anteroposterior, que se difereneian segun diferentes patrones de expresi6n geniea. ASI, otra vez la genetiea molecular proporciona las herramientas necesarias para investigar el funcionamiento de este sistema.

La expresi6n localizada de los genes de segmentaci6n esta reguJada par una jerarqufa de senates de posici6nso,51 Se han c1onado la mayoria de los genes de segmentaci6n, y la seeuenciaci6n de los eDNA revela que cerea de las tIes cuartas partes de ellos, inc1uyendo lodos los genes gap, eodifiean protefnas reguladoras de genes. Por 10 tanto, sus accienes sobre etro u otros genes pueden estudiarse comparando la expresi6n geniea en embriones normales y en embriones rnutantes. En efecto, se puede fotografiar la activaei6n y desactivaci6n de genes en patrones cambiantes utilizando las regiooes eo las [ los geoes 90 el qU9 se trBoscribeo embti60 temprano

."iii".'Ii'.b.i'.'.....

K."II'li"i'• •

•••

.

9

10

11

12

13

14

regiones dBfic;entes[ cuendo los genes 9s"n mutedos Kruppal

IAI

1166

Figura 21-61 Dominlos espaclales de los genes gap hllncldxlck y KrllppeL Ambos genes codifican protefnils reguladoras de genes de la etase de dedos de zinc. (Al Diagrama de los principales dominios anteriores de 11lIncilhack y Kriippe/ que ilustra el modo en que los defcctos provocados por una ausencia de producto funcional de Iwncllback 0 Kriippel se extienden por los alrededores de la regi6n enla que normal mente se hallan los transcritos genicos. (B) Distribuci6n normal de los transcritos de II/mellback y Kriippe/ observada tras una hibridad6n in situ en el estadio blaslOdermico. (C) Distribud6n tipica de la protefna Kriippel (en raja) y de la protefna Hunchback. (en verde) tal como se manifieslan con anticuerpos t1uorescentes. La regi6n de solapamienlo. en In que estan presentes ambas protefnas, aparece en amarillo; una tinci6n mas sensible revelarfa un solapamiento mas extenso. Las protefnas se distribuyen fuera de sus dominios respectivos de transcripci6n genica y es posible que acttien como morf6genos locales panidpando en la regulaci6n de In expresi6n de ouos genes (genes gap y genes de regia par incJuidos). (A. adaptado de M. Hlilskamp y D. Tautz, Bioessays 13:261-268.1991; B, cortesfa de Diethard Tautz; C. cortesfa de lim WjJJiams, Steve Paddock.. Sean Carroll, y Howard Hugues Medical Institute.)

Capitulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

IBI

lei

Kruppal

FIgura 21·62 Patron de exprftlcSn de

ftz. en el blastodermo de Drosophila. La hibridad6n in siw muestra que eI gen se transcribe siguiendo un patr6n de siete bandas que se corresponden al patr6n de defectos en los mutanles ftz. Las bandas de expresi6n deftz aparecen como manchas negras debido a los granos autorradiograficos de plaIa presentes en eSla secci6n longitudinal. (Cortesfa de Philip Ingham.)

sondas adecuadas para detectar los transcritos genicos. Analfzando por este metodo mutantes que carecen de un gen de segmentaci6n determinado, se puede empezar a deducir la 16gica del sistema de control genico. Ya hemos visto como la hibridaci6n ill situ de embriones normales ha ayudado a demostraT que los lranscritos de gen bicoid son la fuente de una sefiaJ posicional: los transcritos se localizan en un extrema del huevo, a pesar de que los efectas de una mutacl6n en el gen se extienden sabre gran parte del embri6n. De forma similar puede demostrarse que los genes gap generan a su vez (directa 0 indirectamente) senales posicionales que ayudan a controlar el patr6n del desarroUo en zonas vecinas que se extienden m<\s aU<\ de sus propios dominios de expresi6n. Por ejemplo.los mulantes defectuosos en los genes gap Kriippel 0 hlmellback presentan anomalias en la regi6n en que se detectan los transcritos genicos de un embri6n normal y tambien en varios segmentos mas alejados (Figura 21-61). Se cree que, al igual que la proteina Bicoid, las protemas reguladoras de genes codificadas par genes gap como Kriippel y hunchback, se distribuyen como morf6genos difusibles a partir de los lugares en que estos genes se transcriben. El nivel siguiente de modelaje espadal, mas delicado. 10 marcan los genes de regia par. Algunos de estos genes tambien pueden codificar protefnas que se distribuyen par difusi6n ejerciendo efectos sabre celulas vecinas allugar en que

fuente de .al'iele'

Figura 21-63 Dos eslJ"8teglas paR utiUzar los gradJentes de concentrad6n de senales paR espedncar un patnSn detaUado de ct:lula!l en direrentes estadJos. En W existe un solo gradiente de senal, y las «Iulas seleccionan sus estados respondiendo adecuadamente a pequeil.os cambios producidos en la concentraci6n de la sefial. En (B) el gradiente inidal de la seil.al controla el establedmiento de Ull pcqueno numcro de sefiales mas locales, las cuales conlrolaran el establccimiento de otms senales todav(a mas locales, y asf sucesivamenle. Debido a la multiplicidad de senales locales. las cclulas no tienen que responder de fonna muy precisa a una tiniea sel'lal para generar una disposici6n espacial correcta de eslados celulares. EI casu Bse corresponde de forma mucho mas estrecha con la eslralegia del embri6n real.

fuente de ..!Iales

gradienle de sel'iele,

'81 Drosopllila I. Genesis del mapa corporal

llItedo. celularlll

1167

se transcriben estos genes; en cambio, otros parecen afectar s6lo el desarrollo de las regiones en las que son transcritos. Por ejemplo, los transcritos del gen [tz normal ocurren en siete "bandas cebra" en forma de circunferencia, en el estadio de blastodenno (Figura 21-62), de aproximadameme cuatro celuJas de ancho cada una, pareciendose en amplitud y localizaci6n a la de los rudimentos de los parasegmenlos pares perdidos en un mutanteftz. En conjunto, lodas estas informaciones implican que los productos de los genes de polaridad del huevo proporcionan sei'lales posicionales globales que activan la expresi6n de genes gap concretos en regiones determinadas, yentonces los productos de los genes gap proporcionan un segundo nivel de seiiaies posicionales que actuan localmenle regulando detalles mas sutiles del modelaje afectando la expresi6n de otros genes, incluidos los genes de regia par. De este modo los gradientes globales producidos par los genes de polaridad del hllevo organizan la creaci6n de un patr6n detallado a traves de un proceso de subdivisiones secuenciales par medio de una jerarqufa de controles posicion ales. ~sta es una estrategia de confianza: debido a que las seiiales posicionales globales no tienen que definir detalles sutiles, los nucleos individuales que responden a di· chas sefiales no tienen por que reaccionar con una precisi6n absoluta a pequeiias diferencias de concentraci6n de seiial (Figura 21-63).

El producto de un gen de segmentaci6n controla la expresi6n de otto gen generando un patr6n detallado 41 ,SO,51.52 La jerarqufa de relaciones de control existentes entre los niveles consecutivos de

genes de segmentaci6n puede ponerse de manifiesto mediante la observaci6n del patr6n de expresi6n de un gen determinado cuando otro gen queda desactivado debido a una mutaci6n. Por ejemplo, en un embri6n mutante que carezca del produclo normal Kruppel, las bandas /tz no puede desarrollarse justamente en la regi6n del blastodermo que corresponde at defecto en el mutante KriippeJ. Asi pues, el producto de Kriippef reguJa, directa 0 indirectamente, la expresi6n del genftz. En cambio en un mutante/tz, la distribllci6n del producto del Kriippel normal no se ve alterada, 10 que indica que el producto deftz no regula la expresi6n del gen KrfippeJ. Tambien existen interacciones entre genes del mismo nivel de la jerarqufa reguladora. Por ejemplo, los genes gap Kriippef y hunchback se expresan en regiones adyacemes del blastodermo, existiendo un !fmite muy marcado entre el territorio anterior de hunchback y el territorio posterior de Kriippel (vease Figura 21-61). La represi6n del gen de expresi6n Kriippel por la proleina reguladora de genes Hunchback ayuda a establecer este Ifmite, asegurando una correlaci6n adecuada entre los dominios de expresi6n de ambos genes. Interacciones de este tipo contribuyen a dirigir el patr6n de expresi6n peri6dica de los genes de regia par, estableciendo un acuerdo de reproducci6n exacta de exclusiones y solapamientos mutuos que se repite de forma fidedigna en cada unidad de segmenlo doble l1el blastodermo de lodos los embriones normales (Figuras 21-64 y 21-65).

segmeotos parasegmentos

$JI

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1168

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genos do regia par

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"Jgende n I I I I I I I I I I I I I I U polaridad del " segmento

Capftulo 21 : Mecanlsmos celulares del desarrollo

Figura 21-64 C6mo definen los genes de regia par los segmentos del blastodenno de Drosophila. EI diagrama muestra el patr6n de transcripci6n de cuatro de los ocho genes de regia par conocidos, y de uno de los genes de polaridad del segmento, engrailed. Aunque individualmenle cada gen de regIa par s610 define una alteraci6n con una distancia de repetici6n de dos segmentos. el conjunto completo de genes de regIa par combinados, por medio de su patr6n de adyacencia y solapamiento. define potencialmente una subdivisi6n mucho mas compleja del blastodermo en bandas de s610 una celula de amplitud. al igual que las que expresa el gen engrailed. (Segun M. Akam, Developmem 101:1-22. 19B7, con aurorizaci6n de Company of Biologists Ltd.)

3'h horn despuft de I. fecundllci6n

Figura 21-65 Formacl6n de lu banduftzy eve en el blutodenno de Drosopldla. Tanto el genftz como el gen eve son de regia par. Sus patrones de expresi6n (coloreados en marr6n paraftz y gri5 para eve) primero se encuenlran difusos pero se definen rapidameme en bandas. (SegUn P.A. lawrence, The Making of a Fly. Oxford. UK: Blackwell, 1992.)

De este modo se distinguen, hasta el mas mlnimo detalle, bandas de celulas diferentes alrededor del blastodermo por medio de diferenles combinaciones de expresiones de genes de regia par -Ia anchura de una sola celula. que correspon· de aproximadamente a una cuarta parte de la anchura de un futuro segmento 0 un parasegmento. La totalidad de este detallado proceso de modelaje depende de las largas extensiones de secuencias de DNA que controlan la expresi6n de cada uno de los genes de segmentaci6n. Estas regiones reguladoras unen muchas copias de protefnas reguladoras de genes producidas por un subgrupo de otros genes de segmentaci6n, y el gen se activa 0 desaCliva segun la combinaci6n de protefnas que se consigue. En el Capftulo 9 (vease pdg. 456) nos centramos en un gen de segmentaci6n determinado y vimos c6mo la decisi6n de la transcripci6n 0 no transcripci6n de un gen se efectua en base a todas estas senales de entrada.

Los genes de polaridad del huevo gap y de regia par generan un patr6n transitorio que es recordado por otros genes41.50.52 Duranle las primeras horas siguienles a la fecundaci6n, 105 genes gap y los genes de regia par se activan uno tras Otro. Sus productos mRNA aparecen primero en patrones que s610 se aproximan a la imagen final; luego, at cabo de poco liempo -y mediante una serle de ajusles interactivos- la confusa distrlbuci6n inicial se resuelve por Sl misma dando lugar a un sistema regular bien definido de bandas (vease Figura 21-65). Pero este sistema es de por sf inestable y transitorio. A me· dida que el embri6n progresa a Iraves de la gastrulaci6n y las etapas posteriores. el patr6n regular de segmenlOS de los produclOs de los genes gap y de regia par se desintegra. Sin embargo, sus acciones han dejado un sella permanente en forma de conjunto de marcajes {valores posicionatesl sabre las celulas del blastodermo. ESlos marcajes posicionales se graban en la activaci6n continuada de algunos genes de polaridad de segmentos y de genes selectores home6ticos que mantienen la organizaci6n segmentada de la larva y el adulto.

Los genes de la polaridad de segmento marcan las subdivisiones b('isicas de cada parasegmento 53 Los genes de polarldad de segmento se expresan segUn un patron que se repile de un parasegmento al siguiente. £1 gen e1lgrai/ed proporciona un buen ejemplo de ello (Figura 21-66). Sus transcrllos de RNA estdn dispuestos en el blastodermo en una serie de 14 bandas. del lamalio de una celula, y que corresponden a las porciones mas anleriores de los fuluros parasegmenlos. Las bandas aparecen en una relaci6n eSlablecida con las bandas de expresi6n de los genes de regia par (vease Figura 21-64). Nuevamente el patr6n esla comrolado de un modo combinatOrio por los produclos del conjunlo de genes que Ie anlecede en la jerarqufa y se ve mejorado y delallado por media de inleracciones entre los propios genes de polaridad de segmento. A lrav~ de la expresi6n de dislinlOS segmenlos de genes de polaridad en varias bandas de celuJas, cada futuro parasegmenlo queda subdividido en el eSladio del blastodermo celuJar en al menos tres regiones dis· limas. Las diferencias qufmicas persistiran. mantenidas por la transcripd6n conlinuada de at menos algunos de los genes de polaridad del segmenlO, desDrosOfJllila I.

G~nesis del

mapa corporal

1169

Ic.m:bc,CI6C.Cd"."'"hC,:",:.:....::.:=-=--",-oo-,-m"

embri6n de 10 ho.as

"------' m l00lJ

pues de la desaparici6n de la mayor parte de los productos de los genes de regia par (vease Figura 21-66). Algunos de los genes de polaridad del segmento que se expresan de este modo -inc1uyendo, especialmente uno Uamado wingless- coditican protefnas secretadas que lambien actuan durante el desarroUo posterior como sefiales espaciales denlro del parasegmento regulando los detalles de su crecimiento y modelaje interno. Ademas de regular los genes de polaridad del segmenta, los produclns de los genes de regIa par colaboran con los produclns de los genes gap (y quizas con los genes de polaridad del huevol provocando la activaci6n localizada y precisa de un conjunlo de marcajes espaciales mas desarrollado -es decir, los genes selectores home6ticos, que dislinguinin un parasegmento de otTO de forma permanente. En el pr6ximo apartado examinaremos en detalle estos genes selectores y consideraremos su funci6n en la memoria celular.

Resumen fguaf que otros imectos DrosophUa se callStruye a partir de una serle de ullidades modulares repetidas denomilUultlS segmentas, con estn.cturas na segmemales especlalizadas en cada extrema del cuerpo. Cada subdivisMn lmporumte de ccu:m segmento se distingue por medio de la expresMn de una seleccMn de gelles de colltrol /mrticuiar que define Sll "direcci611 postal". El or/gen del patr6n estd en la simetrla dellmelJO: la informacw" posidonalla proporc/o1lan cuntro gradielltes establecidos por los productos de cuatro grllpos de genes de eJecto matenlO liammIas genes de polaridad dellmelJO. Los cuatro grllpoS de genes controlan CIUltro dlJerenciaclanes baslcas del mapa corporal de los animales: dorsal versus ventral, endodermo versus mesodermo y ectodermo, cilllIas germinales versus ciluIas samdticas. y cabeza versus cala. Los genes de polaridad delllllelJO actlian estableciemw distrlbudones eSClllonadas de IJrote{nas reguladores de genes en elllUelJO y el embrl6n temprano. pero los gradientes las estab/ecen de modo distinto las diferentes ejes del IlUevo. La polaridad dorsoventral se define mediant.e una sellalloClllizada procedente de las cillllasJaliclllares que rodean elllllelJO. La molicllla senal se line a los receptares trammlembrana presentes en la sllperjide ventral del hllelJO, la fJlle condudrd finalmente a ,ma concentrad6n Intranllc1ear escalonada de la prote{na Dorsal reguladora de genes, a 10 largo del eje dorsoventral del embrMtt temprano. La prote{na Dorsal regula la expresi6n de otras genes, Inc1uido dpp, cuyo prodllcto actlfa a Sll vez como gradiellte morfogenico definiendo subdivisiones mds slltlles del eie dorsoll,mtral, como Iwcen las senales lnductoras temprmlas que act"an en Xenopus. Ell el caso del grupo anterior de ge"es de polaridad dellmelJO, el gradiente slIrge a partir de WI dep6sito de mRNA prodllcto {lei gen blcold, localizado en el extremo anterior dei !melJO. Debido a que elllUelJO del lmecto se desarrolla inkialmettte 1170

CapfluJo 21 : Mecanlsmos celulares del desarrollo

Figura 21-66 Patron de expresl6n de engralled, un gen de polarldad de scgmenlo. Las fotografias i1ustran el pau6n de engrailed en un embri6n de 5 hOTas (en e1 estadio de banda germinal exlendida), un embri6n de 10 haras y un aduJto (al que se Ie han extrafdo las alas para este experimental. EI patr6n se haee visible gracias a un anticuerpo (marron) cantra la pratefna EngraiJcd (para embriones de 5 a 10 hams) 0 (para el adulto) mediante la construcci6n de un linaje de Drosophila que contiene secuencias de control del gen engrailed acopladas a la secuencia que codifica la enzima ~-galactosidasa, cuya presencia es fl1cilmente detectable por media de metodos histoqu{micos a traves del producto azul de la reaccJ6n que cataliza. N6tese que una vez estabJecido. el patr6n de engrailed se preserva durante todo ellfanscurso de la vida del animal. (Cones{a de Tom Kornberg y Cal)' Hama.}

como "n sincitio, la prote(fUl Bicold transcrUa a partir de este mRNA es capaz d£ difundir ei citosol a 10 largo de la longihut del embri6n, dirlgielUlo la orgmlizaci6n global de su mltLul anterior. La conamtraci6n del gradiente B/cold pOf.e en marc/.a la expresi6n ordenado tk los genes gap, genes tk regia par, genes de polaridad tiel segmento y genes sekctores home6ticos. Estos genes, a traves de un jerarqll(n de interacciones, qlledan expresados en algunas regiones del embrl6n y en atms no, subdlIJldlelUkJ el cuerpo de/onna progresiva en UfUl serle regular de IIl1itlLules U!plfmtales y subsegmentales.

Drosophila y la genetica molecular del patr6n de formaci6n. II. Genes selectores home6ticos y

modelaje de las partes del cuerpo4l,SO

Las primeras observaciones sobre el sistema de genes del patr6n de fonnaci6n se efecruaron hace mas de 70 anos, con el descubrimienlo del primer grupe de mutaciones en Drosophila que provocaban perturbaciones extranas en la organizaci6n de la mosca adulta. Por ejemplo, en la mutaci6n Ame'lIlapedia de la cabeza surgen patas en vez de antenas (Figura 21-67), mientras que en la mutaci6n bithorax, aparecen porciones de un par extra de alas donde normalmente deberfan surgir unos ap~ndices mucho mc1s pequenos denominados balancines. Estas mutaciones, lIamadas homedticas, transforman unas partes del cuerpo en estructuras adecuadas para Otms posiciones. Un grupo completo de genes selectores home6tlcos determina el cantcter anteroposterior de 105 segmenlos de la mosca. En este apartado seguimos el desarrollo de Drosophila a !raves de las ultimas etapas en la formaci6n de la mosca aduha. AI final de este apartado veremos que estos mismos genes (jenen un papel crucial en el modelaje del cuerpo de otros animales, incluso los seres humanos.

Los genes selectores home6ticos del complejo bithorax y del complejo Antennapedia definen las diferencias entre parasegmentos~'55 Los genes seleclores home6ticos que aquf nos interesan se encuentran todos ellos concemrados en una de las dos estrechas agrupaciones de genes, co nod· das como complejo blthorax y complejo Antennapedla. Cada complejo coni iene varies genes con funciones amilogas: los del complejo bithorax controlan las diferencias entre los segmentos IOracicos y abdominales del cucrpo, rnienlras que los del complejo Antennapedia controlan las diferencias entre los segmenlOS toracicos y los de la cabeza. En olros insectos los grupos de genes correspondientes se encuentran en un unico complejo, denominado complejo HOM; por 10 tanto se piensa que los complejos Anlennapedia y bithorax son las dos mitades de un unico complejo HOM que se djvidi6 en el curso de la evoluci6n de la mosca. Cada gen home6tico selector tiene un dominio de aClUaci6n propio, definido por la regi6n del cuerpo que queda afectada si se produce una mutaci6n en este gen. Generalmente, el dominio tiene unos lfmiles bien marcados despla· zados de los Ifmites de los segmenlOS convencionales aproximadamente medio segmento, 10 que indica que el dominio es un parasegmento 0 un bloque de pa· rasegmentos (v~ase Figura 21·50). Muchas de las mutaciones de los genes selectores home6ticos tienen un fenodpo lelal recesivo y s610 permiten que el embri6n sobreviva poco tiempo a su nacimiento. En consecuencia son las observaciones efectuadas en embriones y larvas muy tempranas las que nos proporcionan la visi6n mlis clara y en algunos aspectos mlis complela de la funci6n de los genes selectores home6ticos. Las larvas que son deficientes en todos los genes del complejo bithorax tienen una estructura especialmente simple: la cabeza y elt6rax son normales hasta el parasegmento P4, pero los 10 parasegmentos restantes se convierten en el Drosophila IJ. Genes selectores home6tiC05 y modelaje de las partes del cuerpo

Flgura21-67 Mutacl6n home6tlca. La mosca que aquf se presenta es una

mutanteAmennapedia. Sus antenas se convienen en estructuras de pata debido a una mutaci6n del gen Amennapedia que provoca su expresi6n en la cabeza. Compirese con la mosca nonnal que aparece en la Figura 21-47. (Conesfa de Matthew SCott.)

117.

Figura 21-68 Consecuenclas de la supresl6n de la mayoria de los genes del complejo blthorax. (Al Una larva norma! de Drosopllila observada con iluminaci6n de campo oscuro: (B) la larva mutante en la que se ha suprimido la mayoria del complejo bithorax. En el mutanle IOdos los parasegmentos posteriores a P5 tienen el aspecto de P5. (Conesfa de Gary Struh!: A, de Natllre 293:36·41. C 1981 Macmillan Journals Ltd.)

catacler P4. Las supresiones parciales del complejo bithorax provocan transfor· maciones que son menos generales (Figura 21-68). Estas observaciones, y descu· brimienlos anl1ogos en el complejo Antennapedia, i1ustran la mnci6n fundamental de los genes selectores home61icos respecto a la definici6n de las diferencias enrre los parasegmentos: cuando se pierden estos genes, los paraseg· mentos no se diferencian unos de OlIOS.

Los genes selectores home6ticos codifican un sistema de marcadores moleculares de direcci6n so,56 Como los genes de segmentaci6n, los genes selectores home6ticos se activan primero en el blastodermo. Desde que se clon6 el DNA completo de los complejos Antennapedia y bithorax, disponemos de sondas de DNA que permiten establecer el mapa del patr6n espacial de transcripci6n de cada uno de los genes selectores home6ticos, mediante hibridaci6n in siru. Las conclusiones obtenidas de estos estudios son sorprendentes: seglin una primera aproximaci6n, habitualmente cada gen home6tico selector se expresa en las regiones que se desarrollan con anomalfas, por ejemplo debido a una mala colocaci6n, si el gen est;\ ausente 0 mutado. De esta forma se puede considerar a los productos de los genes selectores como marcadores moleculares de direcci6n de las celulas de cada parasegmento. Si se cambian los marcadores de directi6n, el parasegmento se comporta como si estuviera colocado en otro lugar. Debido a que los genes de segmentati6n contribuyen al control de la activati6n de los genes selectores home6licos, el patr6n de expresi6n del gen home6tico selector se situa en el mismo regislro que los Hmites de los parasegmentos definidos par media de los productos de genes de regia par y de polaridad del segmento. De esta forma la combinad6n del producto de un gen home6tico selector (0 una suma de tales productosl con un conjuOlo de productos de genes de segmentati6n definini con precisi6n una sola directi6n, que unicamente toman1n las celulas de una subdivisi6n de un segmento. Aunque el patr6n de expresi6n de los genes selectores home6ticos sufre ajustes complejos a medida que avanza el desarrollo, est.os genes continuan jugando un papel crucial en el transcurso del desarrollo posterior de la mosca. De a1gt1n modo equipan a las celulas con una memoria de su valor positional.

Las regiones de control de los genes selectores home6ticos actuan como chips de memoria de infonnaci6n posiciona1$4,S7,58,59 Como se vio en el Capftulo 9, los productos de los genes seleclOres home6ticos son protemas reguladoras de genes, todos son hom610gos entre sf y lodos conlienen una seclle"cia IlOmeobox muy conservada que codifica un IJomeodomillio de uni6n a DNA (de una longitud de 60 aminoacidos) en las protemas correspondientes. Aunque muchos ouos genes tambien contienen un homeobox, el tipo de secuencia homeobox enoomrada en los genes selectores home6ticos es caracteristica. En los complejos de genes Antennapedia y bithorax existen ocho genes selectores home61icos (a los que, por convenio, nos referiremos colectivamente como complejo HOM). Sus secuencias codificames estan repanidas en medio de una camidad mucho mayor de DNA regu1ador -eerca de un total de 650 000 1172

Capftulo 21: Meean1smos celu1ares del desarrollo

IBI

L--J

100 11m

pa r8llellmentOl

'0'1'2' 3 '4' 5'6'7'8'9'10'11'12'13'14'

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8

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AbdomlnlllB

Figura 21·69 Comparacl6n de los patrones de expresl6n y las locallzaclones cromos6mJcas de los genes del complejo HOM. La secuencia de los genes en cada una de las dos subdivisiones del complejo cromos6mico se corresponde con la secuencia espacial en que se expresan los genes. Observese que la mayona de los genes se expresan a un elevado nivel a traves de uno de los parasegmentos (color oscuro) y a nivel menor en alguno de los parasegmentos adyacentes {color intermedio, cuando la presencia de los transcritos es necesaria en un fenotipo normal, color claro donde dicha presencia no 10 esl. En las regiones donde se solapan los dominios de expresi6n. nonnalmente el gen que detennina e) fenotipo local es el gen localmente activo m4s ~posterior".los diagramas en la parte baja de la figura representan los patrones de expresi6n g~nica de embriones en la fase de banda germinal extendida, aproximadamente 5 horas despues de la fecundaci6n.

-,-,----r---

pares de nude6tidos. ESle DNA induye locaJizaciones para In fusi6n de los pro· ductos de genes de polaridad del huevo y de genes de segmentaci6n --como hi· cOid, hunchback y even-skipped. EI DNA regulador del complejo HOM actua como un int~rprete de las muchas unidades de informaci6n posicional que Ie proporcionan todos eSlos faclores, y, como respuesfa ante ellos, decidira si se transcribe un grupo delenninado de genes selectores home6ticos 0 no. Sin em· bargo, lodavia exislen grandes inc6gnitas acerca del c6mo se organiza el sistema de control HOM y c6mo auua. Una caraclerfsLica notable es que la secuencia en la que los genes se ordenan a 10 largo del cromosoma tanto en el complejo Anrennapedia como en el bitho. rax, se corresponde casi exaclamente con el orden en que los genes se expresan a 10 largo del eje corporal (Figura 21·69). Es como si los genes fueran aClivados en serie por un proceso que se extiende cada vez mas lejos a 10 largo del cromosoma en proporci6n directa a un indicador intracelular de distancia, presente a 10 largo del eje corporal. No esta claro si estas 6rdenes son tan solo un accidenle evolulivo o si realmente reOejan la implicaci6n de algt1n mecanismo que se propaga a 10 largo del cromosoma, aunque luego veremos que esta es una caract'erfstica del complejo HOM aJtamente conservado en el CUI'SO de la evoluci6n. Drosophila II. Genes selectores homedticos y modelaje de las partes del cuerpo

1173

Existc un rompecabczas todavfa mas complejo. EI complejo HOM siIve para diferenciar cada parasegmento del siguiente, pero el mimero de genes selectores home6ticos es mas pequeno que el mimero de parasegmentos. Por ejemplo, el complejo bithorax contiene s610 tres genes, pero de el dependen las diferencias entre 10 parasegmentos (vease Figura 21-69). Ademas, existen much as mutaciones, que afectan a diferentes 10caJizaciones del complejo, y que alteran el caracler anteroposterior de tinicamente un solo parasegmento 0 incluso de parte de un parasegmento. La mayorfa de estas mutaciones se encuentran en regiotles de cotltrol no codificantes y que tambien estan ordenadas a 10 largo del cromosoma en una secuencia que imita haSla el mas mfnimo detaUe el orden anat6mico de las regiones que afectan. Esto sugiere que las diferencias entre las regiones del cuerpo no se definen tinicamente por la presencia de productos de varios genes selectores home6ticos, sino mas sutilmente por alguna c1ase de diferencia persistente en los estados de las regiones de control asociadas con los genes. Desde este pumo de vista, una regi6n de control no debe describirse como un simple interruptor sino como algo mas parecido a un microchip de ordenador: recibe emradas de infonnaci6n (en fonna de factores regu1adores y otras moleculas que se unen a el), produce una respuesta de salida (en fonna de 6rdenes de transcribir 0 no el gen home6tico selector), y puede almacenar un rastro de memoria (una unidad de infonnaci6n posicional) que afecta el modo en que las entradas de informaci6n calculan las salidas de informaci6n. De este modo el valor posicional de una celula no se reOejara necesariamente en un nivel fijo de expresi6n de los genes selectores home6ticos sino en un modo de control particular de este gen en respuesta a las condiciones cambiantes. De momento todo eSlO son especulaciones, cuya confinnaci6n pasa por tener respuesla a una lercera pregunta, tal vez la mas import3nte: .iQue mecanismo mantiene el rastro de memoria? Como vimos anteriormente (v~ase p<1.g. 1137) una posibiJidad es que el mecanismo irnplique una retroaLimentaci6n positiva, en la que el producto de un gen, una vez producido, estimule su propia transcripci6n. Parece que al menos algunos genes selectores home6ticos tienen esta propiedad. Par ejemplo, el gen Deformed (perteneciente at complejo Antennapedia) tiene muchas localizaciones de uni6n para la prolefna Deformed en su regi6n de control superior, yen a1gunas celulas estas localizaciones son suficienles para mantener la actividad de la protefna una vez esta se ha desencadenado. No obstante, estos efeclos autoestimuladores no son suficientes para mantener el rastro de memoria en la mayorfa de las celulas. Se ha descubierto que es ncccsario un conjunto adicional completo de genes, Uamado grupo Pofycomb, para mantener inactivos a los genes selectores home6ticos no expresados: si se inactiva cualquiera de los genes del grupo Polycomb mediante mutaciones, los genes selectores home6ticos se activan primero siguiendo un patr6n normal, pero luego se activa de forma indiscriminada por todo el embri6n (Figura 21- 70A). La protefna Polycomb esta unida a la cromatina de los genes que ella controla (Figura 21-708). Adcmas, parece ser que genes relacionados est<1.n implicados en otras regiones en el control de la estructura de cromatina, 10 cual sugiere que a1guna modificaci6n persistente de la cromatina del complejo de genes HOM podrfa ser la transmisora de la memoria de valor posicional.

La mosca aduJta se desarroUa a partir de un conjunto de discos

imaginales que contienen informaci6n posicional60 En Drosopllilo, el patr6n basico de expresi6n de los genes selectores home6ticos ya se establece en el embri6n y no 5610 determina la estructura de la larva, sino que todavia es capaz de determinar las estructuras de la mosca adulta. Para apreciar la funci6n complela de estos genes como portadores de memoria posi· cional, es necesario tener una idea aproximada de la curiosa via a traves de la que se desarroUa la mosca aduha, 0 imago. La mosca adulta se fonna mayoritariamente a partir de grupos de celulas, denominadas celulas imaginales, que permanecen en un rinc6n de cada seg1174

Capftulo 21 : Mecanlsmos ce1uJares del desarrollo

F1gun.21-70 Actuacl6n de genes del grupo Polycomb. (A) Fotografl'a de un embri6n mUlante que carece de un gen extra sa combs (esc) y que desciende de una madre que lambien careda de este gen. El gen pertcnece al grupo Polycomb. Pnicticamenle lodos los segmentOs se han transformado pareciendose al mas posterior de los segmentos abdominales (comparese con Figura 21-68). En el mulanle, el pant," de expresl6n de los genes selectores home6tioos, que inicialmente era casi normal, es inestable de una forma tal que pronlO lodos los genes situados a 10 largo del eje corporal Intercambianin posiciones. (B) Visualizaci6n del patr6n que nonnalmente rige la uni6n de la proteina Polycomb a los cromosomas gigantes de Drosophila por media de un amicuerpo comra Polycomb. La protelna se une al complejo Anlennapedia (ANT·C) y al complejo bithorax (BX-q asl como a 60 localizaciones mas.(A, segtin

mento de la larva, y que aparenlemenle no estan diferenciadas. EI origen de la mayorfa de las c~lulas imaginales del cuerpo adulto se encuentra en la epidermis embrionaria -el epitelio que envue)ve al cuerpo. Pennanecen conecladas a la epidermis de la larva, y su destino sent formar las eslrucluras epidermicas de la mosca aduha. Las celulas imaginales de la cabeza, el 16rax, y los genitales se organizan en discos imaglnales; otros grupos de cclllias imaginales constilllin'in el abdomen. Tambi~n exislen grupos de celulas imaginales en las visceras de la larva que damn lugar a los 6rganos internos de la mosca. Los discos imaginales han sido el principal objetivo de los estudios delallados en este ambito. Hay 19 discos imaginales, dispuestos en nueve pares siluados en sendos lados de 1a larva, mas Olro disco en la linea media (Figura 21-71). Los discos son bolsas de epitelio, con forma de g1obos deshinchados y aprelujados, que se evaginan (se despliegan desde e) interior hacia el exterior), se extienden y se diferencian durante

G. $truhl. Namre 293:36-41 , 1981. C 1981 Macmlllan Journals Ud; 8, cortes{a de B. Zlnk y R. Paro, de R. Paro, Trends Genet. 6:416-421, 1990.)

Flgura21-71 Losdiscoslmaglnales de la larva de Drosophila y lu estrucluras adultlU a que dan lugar. (SegUn I.W. Fristrom et aI., en Problems In Biology: RNA In Development IE.W. 1-lanley,ed.l, p. 382. Salt LakeCilY: University of Utah Press, 1969.)

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balancin

Drosophila II. Genes seleclores home6ticos y modelaje de las partes del cuerpo

1175

la metamorfosis. A partir de un par de djscos se desarrollan las anlenas y los ojos, de alTO las alas y parte del16rax, de otro el primer par de patas, y asf sucesi· vamente. Las c~luJas de un disco imaginal se parecen a las de Olro disco, y cuando se diferencian, dan Lugar a conjunlos de tipos celuJares especializados generalmenIe bastante similares. Pero experimenlos can injertos demueslfan que de hecho las c~lulas ya estan determinadas regionalmente y que son no equivalentes. Si se subslituye un disco im~ginal por otro en la larva y permitimos que ~ta atraviese la metamorfosis, veremos que el disco trasplantado se diferenciara de fonna aut6noma, y darc1lugar a la estru~tura que Ie corresponde segun su origen, inde· pendienlemente de su nueva locaJizaci6n. Esto implica que los discos imaginales eslan controlados por algun tipo de memoria de su posici6n original. Mediante un ingenioso procedimienlo de injertos que permite que los discos imaginales proliferen durante un largo perfodo antes de su diferenciaci6n, se puede demostrar que esta memoria celuJar se hereda de forma estable (con escasos errores) a traves de un nllmero indefinido de generaciones celulares (Figura21-72). Los genes selectores home6licos son componentes fundamentales de este mecanismo de memoria. Si se eliminan estos genes de cllalqllier disco imaginal en cualquier esladio del largo perfodo que conduce hasta la diferenciaci6n en la metamorfosis, las celuJas se diferencian1n dando lugar a estrucluras incorrectas, tal como harfan si pertenecieran a un segmenro distinto del cuerpo. Esto se puede demostrar gracias a la poderosfsima tecnica de recombimu;ion mitotica inducida por rayos X -de hecho, una especie de cirugfa genelica para celuJas individuales que posibilita la generaci6n de clones mutantes de un genotipo determinado en cualquier momenta del desarroUo, tal como veremos a continuaci6n.

Los genes selectores home6ticos son esenciales para la memoria de la informaci6n posicional de las ceIulas de los discos imaginales&1 Una breve exposici6n a la radiaci6n con rayos X puede provocar, como efecto secundario al dana causado en el DNA. un entrecruzamiento entre cromosomas hom610gos de una celuJa en divisi6n -normaLmente, clicho entrecruzamiento 0010 se producida en la meiosis. Como i1ustra la Figura 21-73, si la celula es heterozigota por un gen de la regi6n del entrecruzamienlO cromoOOmico, es posible que el re-

.. -

disco imaginal

I'NI

metamorfo.i'

parte del disco injertad, en Olra laNa ~rte del dilCO in;ert.oa en I.Clvidid .bdomlnal de Ie motu Iduh.

Ie. "Iruetur.. edulle. diferencien e pertir de eelull. de discos imaginel"

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Ie

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imllginal prolifertln .n II moKll lIduhe y Ie pueden tretpla.ntar de form. leria
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o 1176

Capftulo 21 : Mecanlsmos celulares del desarrollo

Ie

forman 1111 mi,mas

.rUCIurullduhes

que.n III c6lule$ origlnale. del disco

Flgura21.72 Experimentosque permlten comprobar el cstado de determlnacl6n de las celulas de los discos Imaglnales. EI metodo de ensayo consiste en implantar celulas en 13 larva que esta a punto de sufrir metamorfosis: las celulas se diferenciaran formando estmcturas adultas re<:onocibles que, sin embargo. se encucnlIan en el inlerior de la mosca tras la metamorfosis sin inlegrarse en ella. Las celulas del diseo se pueden examinar de inmediato 0 pueden implantarse en el abdomen de las moseas adullas, que serviran como camara de cultivo natural. Las condiciones hormonales de la mosca aduha permiten que los discos imaginales que hayan traspasado la metamorfosis continuen su proliferacidn duranle un tiempo indefinido. sin diferenciarse. antes de que se efectue el ensayo de la detemlinaci6n celuJar. En ambos casos. las c~lulas se suelen diferenciar formando las estructuras propias del disco del que derivan originalmenlc.

(Al MITOSIS NORMAL

IBI RECOMBINACI6N MIT6TlCA

[:

q~==~::=>-f- materno ~::::'--~"o-f-paterno

I

los cromosomas se replican y se recombinan

los cromosomas se replican

[IF:]

la clliula se diVid~

Ala clliula se divide

[:

~J I

~J[: ~J

[~J

sultado del proceso sea un par de celulas hijas homozigOlas: una recibini dos copias del alelo materno del gen y la Olra recibira dos capias del alelo paterno. La coincidencia del entrecruzamiento se puede detectar si el animal escogido lambien es heterozigoto para una mUlaci6n en un gen de marcaje -por ejemplo, un gen de pigmentaci6n- que se encuentre cerca del gen que nos interesa. de forma que ambos sufran juntos el entrecruzamientos. De esta manera, se pueden generar "a medida" clones de celulas mutantes homozigotas marcadas (Figura 21-74). Las consecucncias mas importantes de las Illutaciones en los genes selectores bome6ticos acostumbran a ser recesivas: s610 ell el organismo homozigoto

?

Figura 21-73 Comparacl6n de la recomblnacl6n mlt6t1ca (B) can ia mitosis normal {A). Los diagramas siguen el destino de un solo par de cromosomas homologos. uno procedente del padre (sombreado) y otro procedente de la madre (110 sombreado). Estos cromosomas contienen un locus para un gen de pigmentacion (u otro gen de marcaje) con un alelo Ade tipo salvaje (Ull pequeno wadmdo blallco en el cromosoma paterno) y till alelo a can mutaci6n recesiva (un pequeno cuadrado raja en el cromosoma materno) de modo que una celula homozigota AlA 0 heterozigota Ala tiene un aspecto nonllal (iluslrado en bla"co) y una celula homozigota ala presenta un aspecto alterado (ilustrado en "amnja). La recombinaci6n por intercambio de DNA entre cromosomas maternos y patemos puede dar lugar a un par de celulas hijas, una homozigotaAlA y conSei:uentemente de aspecto normal y la otraala y por 10 tanto visiblemenle diferente. La recombinacion mit6tica es un accidentc raro que ocurre sin la intervencion del aparato especializado que facilita la recombinacion durante la meiosis. Una breve exposicion a rayos Xprovoca una mayor frecuencia de recombinaciones.

los rayos X provocan la recombinaci6n mit6tica en una clliule en proliferaci6n de epitelio del disco imaginal

] ~I,-----'---~I ~ I ~[

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~r::--:-Y-=--':~~~~'-::--=Y-=-=="--:-'--=-Y-:--=Y-:-:-:-1'el epitelio del disco

/I~I!~A~~~~~~~~:,~I el epitelio del ala adultll presenta un cion de clliulas marcedas genllticamenle

Flgura21-74 LautJlIzacl6ndeia recomblnacl6n mlt6tica para gencrar un clan de celuJas mutantes marcadas gem'!tlcamente en el aia de Drosop1lila. Cuanto mas temprano sea el estadio en que ocurra la recombinacion. mayor sera el clan resultanle.

Drosophila II. Genes sclectores homOOlicos y modelaje de las partcs del cuerpo

1177

mutante es visible la transformaci6n home6tica. Si utilizamos la recombinaci6n mit6tica podremos generar un clon de celulas mutantes home6ticas homozigolas marcadas en un disco imaginal y eSludiar su comportamiento en un medio heterozigoto, con un fenotipo normal. EI descubrimiento es que las celulas marcadas, y s610 las marcadas, presentan la transformaci6n home6tica (siempre que eSlen situadas en el dominio de acci6n del gen home6tico selector); este hecho se produce tanto si la recombinaci6n se provoc6 en una fase temprana del desarrollo como en una fase tardra. Por ejemplo, lIna larva de 2 dlas helerozigota para una mutaci6n que elimina la funci6n del gen Ultrabitllorax (Ubx) (del complejo bithorax), puede ser tratada can radiaci6n par rayos X para producir los clones aislados de celulas homozigotos en sus discos imaginales que contienen gen Ubx no funcionaL Estos clones, si estan situados en el disco del balandn. daran lugar a parches de tejido del ala en el balancfn. Estas y otras observaciones indican que la memoria de informaci6n posicional de la celula depende de la actividad continuada de un gen home6tico selector comtln. Ademas, esta memoria se expresa de forma independiente en cada celula -cada celula mantiene su estado de forma independiente de las demas, dependiendo s610 de su propia historia y de su genoma, sin tener en cuenta a sus vecinas.

Los genes selectores home6ticos y los genes de polaridad del segmento definen los compartimientos del cuerpo53,62 Las diferencias recordadas definidas par los genes selectores home6ticos son discretas: existe una gran diferencia en la expresi6n genica en celulas situadas en parasegmentos adyacentes. Lo mismo ocurre con algunos de los genes de polaridad, como ellgrailed (vease Figura 21·66), cuyas diferencias en la expresi6n se corresponden con la gran diferencia existente entre celulas siluadas en la parle posterior del parasegmento y las situadas en la parle anterior. Asf pues, por medio de la expresi6n diferente de estos dos tipos de genes, el cuerpo se subdivide en una serie de regiones discretas que constan de celulas en diferentes estados de determinaci6n. En la frontera entre una regi6n y la siguiente parece que las celulas no pueden mezclarse, como si existiera lIna cohesi6n selectiva entre las celulas que contiencn el mismo marcaje de direcci6n molecular, que las mantuviera segregadas de las celulas con un marcaje diferente (Figura 21-75). De este modo, vena central del ala

compartimiento anterior

= don compartimiento posterior don en el ala

IAI

ala que presenta 108 compartimienlos posterior y anterior

Figura 21-75 CompartimlenlOS. (A) Las formas de los clones marcados del ala de Drosopllila revelan la existencia de Ifmites de compartiTniento. El borde de cada cion marcado, donde entra en contacto con ellfmite, es recto. [ncluso si un clon marcado ha sido alterado geneticamente de forma que erezca mas rapidamente que el reSlO del ala ypor 10 tanlO sea mas grande, este clon respelani dicho !fmite (Iiltimodibujo). Observese que ellfmite del eompartimiento no coincide con la vena que discurre por el centro del ala. (B) Patr6n de expresi6n del gen ellgrailed en el ala, puesto de manifiesto por la misma teen lea que en la Figura 21-66. Los I(miles del compartimiento coinciden con los !fmites de expresi6n del gen engrailed. (A. segtln F.B.C. Crick y P.A. Lawrence, Science 189:340-347,1975. ttl 1975 the AMS; B, cortesfa de Cory Hama y Tom Kornberg.)

1178

Capitulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

un don de crecimienlo rapido respela ellimite entre los compartimienlos posterior y anterior

500 lJm

par ejemplo, si mediante recombinaci6n mil6tica se genera en el ala un clan de marcadas gen~ticamente, aunque normales par todo 10 dem~s, se obselVa que el clon est'
La expresi6n localizada de proteinas espec(ficas reguladoras de genes antecede la producci6n de quetas sensitivas63 Las moscas lienen muchas quetas repartidas par todo su cucrpo -unas grandes y orras pequeflas. Las mayo res actuan de baJiza en la superficie de la mosca: son relativamcnte escasas, muy espaciadas entre sf y ocupan unas posiciones prcdecibles con cxactilud. Las pequenas estan mucho mas cerca unas de otras y eSI
.

Figura 21-76 Estructura bislca de una quela mecanosensorial. Diagrama que represenla las cuatro celulas de la queta.

1179

Figura 21-77 CtHuias madre scnsorlalcs del ala del disco imaginal. Las cclllias madrc scnsorialcs (aquf azuladas) se poncn dc manifiesto con facilidad cn csta muestra especial de Drosophila, que contiene un gen marcador artificiallaeZ que, par casualidad, se ha insertado en el cromosoma colindante a una regi6n de control, 10 cual provoca su expresi6n select iva en los genes sensoriales madre. Animales como este nos proporcionan una via de detecci6n y de eSludio de regiones de conlrol cspedficas del gcnoma-la llamada Uknica enhancer-lrap. actillaci61l-caza. La tinci6n IJlirpura nos muestra el patr6n de expresi6n del gen sellle; ello anlecede la producci6n de las celulas sensoriales madre y dcsaparece progresivamente a medida que las celulas se desarrollan. (Segun P. Cubas, I.-F. de Celis. S. Campu7..ano y J. Modolell, GenesDev. 5:996-1006.1991.)

Hay dos genes, denominados acllaere y scure. cruciales en el inicio de la formaci6n de quetas en el disco imaginal epitelial. Estos genes tienen funciones similares que a menudo se solapan, y codifican protcfnas rcguladoras de genes de la c1ase helice-bucle-helice estrechamente emparentadas enrre sf (eslUdiadas en el Capftulo 9). Ambos genes penenecen a un grupo de genes hom61ogos muy relacionados, todos del complejo achaete-scllre. La hibridaci6n in situ demuestra que la expresi6n de acllaere y scure se produce exactamente en las regiones en las que se formanin las quetas. Las mutaciones que eliminan la expresi6n de eslOS genes en algunas de sus localizaciones habituales bloquean el desarrollo de quetas precisamente en estas mismas zonas. Las mutaciones que provocan la expresi6n en localizaciones adicionales y extranas causan la aparici6n de quetas en estas regiones no habituales. Pera la expresi6n de los genes achaere y scttle es transitoria, y s610 una minori"a de las celulas que inicialmente los expresan se convertiran en celulas sensoriales madre; las demas se convertiran en celulas epidermicas ti"picas. El estado que se define mediante la expresi6n de achaete y scute se denomina proneuraf. Las celulas proneurales estan preparadas para tomar la vfa de diferenciaci6n neurosensorial, pera esto depende de interacciones competilivas entre elias. por 10 que no lodas 10 consigucn.

La inhibici6n lateral regula el patr6n detallado de tipos celulares diferenciados 63, 64 Las celulas proneurales, que expresan achaele, sCllte 0 ambos, estan situadas en gmpos en el disco imaginal epitelial-un pequeno gmpo de menos de 30 celulas si se trata de una queta grande, 0 un gmpo amplio y uniforme de centenares 0 miles de celulas si se Irata de una regi6n con quetas pequenas. En el primer caso s610 un miembro del gmpo de celulas se convierte en lIna celula madre sensorial; en el segundo 10 hacen muchas de las celulas distribuidas por la regi6n proneural. Las celulas sensoriales madre casi siempre est an separadas unas de otras por una camidad minima de celulas epidermicas. Experimemos con mosaicos geneticos demuestran que todas las celulas que toman la vfa de diferenciaci6n celular de las celulas sensoriales madre envfan una senal a sus vecinas para evilar que elias hagan 10 mismo; esto se denomina Inhlblci6n lateral (Figura 21-78). 5i mediante procedimienlOs genelicos impedimos a una ce-

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Capitulo 21 : Mecanismos cellllares del desarrollo

Figura 21 -76 Inhiblci6n lateral. Lnicialmente todas las c~lulas de la muestra SOil equivalentes; todas tienden a desarrolJarse como c~luJas sensoriales madre, y cada una envia una sefial illhibidora a sus vecinas para que no sigan esta via de diferenciaci6n. Ello genera una situaci6n altamente competitiva. En cuanto una c~lula loma venlaja enla competencia, esta ventaja se magnifica. CuanlC mas cerca esta la celula vencedora de diferenciarse como madre sensorial, mayor sera la inhibici6n que padeccn sus vecinas. y estas, por el contrario, a medida que pierden su capacidad para convertirse en una celula sensorial tambicn perdenin su capacidad de inhibir a otras celulas. Asf pues. la inhibici6n lateral conduce a las celulas adyacentes a destinos diferentcs; es decir todo 10 contraric del efecto comunitario tralado en la pag. 1136.

Figura 21-79 Consecucnclas de la Inactlvaclc'in de la Inhlblclc'in lateral. La rotograffa muestra pane deltorax de una mosca que contiene una Imrd6n mutante (generada por Ulla recombinad6n mit6tica inducida por rayos X) en la que el gen neurogenico Defra ha sido parcialmente inactivado. La reducci6n de la inhibicion lateral ha provocado que casi lodas las celulas de la pord6n mutante (en ef C('lItro de fa forografta) 5C desarrollen como celulas sensoriales madre, 10 que produce un gran exceso de quetas sensoriales en esta zona. Las zonas constiluidas por celulas mutantes que contengan mutaciones mlis extrcmas, con perdida compieta de la inhibid6n lateral, aparentemenle no rorman quetas, debido a que loda la progenie de celulas sensoriales madre se desarrollani como neuronas en lugar de diversificarse rorrnando tanto las neuronas como las panes extemas de la estructura de la queta. (Conesfa de Palricia Simpson.)

lula que se conviena en una celula sensorial madre, una de las celulas proneura- . les circundanres, liberada de la inhibici6n lateral, se convenir:i en celula madre en su lugar. Fue en estudios de embriones mutantes donde se identincaran por primera vez los genes responsables de la inhibici6n laleral. Va en el embri6n, tanto el complejo achaete-scute como los genes de la inhibici6n lateral, controlan el desarrollo del sistema nervioso central y periferico, justo del mismo modo en que luego controlaran el desarrollo de los 6rganos sensoriales del sistema nervioso periferico en los discos imaginales. En ambos casas, las mutaciones que elimjnan la inhibici6n lateral causan un efecto simple y sorprendcnlc: se producen grandes cantidades de celulas neuronales a expensas de celuJas epidermicas (figura 2 I-79). Generalmente se dcnomina a los genes segUn su fenotipo mutante; he aqui por que los genes responsables de la inhibici6n lateral reciben la confusa denominaci6n de genes neurogenlcos. Fonnan un sistema genelico de aI menos siete miembros. El gen neurogenico mas conocido se llama Norcll. Codifica una protefna transmembrana cuya posible funci6n es la de actuar como receptora de la sefial de inhibici6n lateral. Experimentos can mosaicos geneticos demuestran que las celulas que carecen de Norell no responden a la sei'ial y prosiguen la via de diferenciaci6n neuronal. Parece ser que otra protefna transmembrana relacionada codificada por el gen neurog~nico Delta es una protefna Uganda que se une a Notcll y 10 activa; aI parecer, \a inhibici6n laleral se transmitc par medio de contactos celula-celula. Por debajo de NOtell, actuan intraccllliarmente los produc· tos de otras genes neurogenicos que interpretan la senal y suprimen la diferen· ciaci6n nemal. Puede demostrarse que este mismo mecanismo de inhibici6n lateral de· pendiente de Notch actua por duplicado en la formaci6n de las quetas -primero, obligando a las vecinas de las celulas sensoriales madre a seguir una via de difcrenciaci6n distinta, conviniendose asf en celulas epidermicas, y segundo, haciendo que las cuatro nietas de la celula madre sigan vias de diferenciaci6n distintas dando lugar a los cuatro componentes de la queta. En ambos casos la via por defecto es la neural y la inhibici6n lateral proporciona una interacci6n compctitiva que obliga a que las celulas adyacentes se diferencien de maneras distintas. Este mismo conjunto de genes neurogenicos no 5610 media en la inhibici6n lateral tantas veces como sea necesario durante el desarrollo del sistema nervioso, sino que tambien es imprescindible durante el modelaje detalJado de muchos otros tejidos de la mosca. De hecho, la inhibici6n lateral es una estrategia crucial para el control de los patrones de diferenciaci6n pluricelulares de todo el mundo animal, y seguramenle lambien del mundo vegetal; los lipos de patrones de diferenciaci6n que puede generar son multiples, desde el eSloma de una hoja a los fOiorreceptores oculares. En los venebrados se han encontrado genes hom610gos de los genes neurogenicos, por 10 que es probable que conserven los mismos mecanismos moleculares, y que estos actuen al menos en algunos de DroSOlJ/iifllll. Genes sclcctores homc6ticos y modelaje de las partes del cuerpo

1181

f

estos casos. En la parte final de este apartado consideramos hasta que plmto Drosophila es un modelo universal para la genetica molecular del patr6n de for-

maci6n.

Los genes de control de desarrollo de Drosophila tienen hom6logos en los vertebrados65 La teorfa de la evoluci6n nos dice que todos los animales son primos nuestros. Es bastante facil apreciar parecidos familiares del ser humano can un rat6n, 0 incluso can un pez, y establecer homologfas entre panes de su cuerpo y del nuestro. Pero si nos comparamos can moscas 0 gusanos, de los cuales nos separamos hace aproximadamente 600 millones de arios, las correspondendas no estcin tan c1aras. Es derto que podemos reconocer algunos tipos celulares familiares -como neuronas, celulas musculares estriadas 0 espermatozoides. Con lUl grado de coinddenda menor se pueden apreciar similitudes en el plano corporal, con cl intestino en el centro y la cabeza en un extremo. iPero hasta d6nde llegan estas similitudes? Aunque los f6siles no han proporcionado ninguna respuesta clara aI respecto, la genetica molecular ha comenzado a hacerlo. Las comparaciones de secuendas genicas ponen de manifiesto que una proporci6n sorprendentemente amplia de los genes de un animal como la mosca tienen, de modo inconfundible, hom610gos en vertebrados, y viceversa. Tales analogfas han sido comprobadas para la mayorfa de los genes de control de desarrollo que hemos mencionado en el transcurso de este caprlulo. iPero se usan estos genes de control con las mismas combinaciones y para prop6sitos hom6logos, de forma que se conserva el mismo sistema genetico de control del desarrollo? AI comparar un ser humano COil una mosca, las diferendas que apreciaremos de entrada parecen fundamentales, tanto en el desarrollo como en la estructura final. Por ejemplo, los huevos de los vertebrados no atraviesan un estadio sincitial como hacen los insectos, y por 10 tanto su modelaje pluricelular inicial no puede controlarse par medio de gradientes morfogenicos como Bicoid de Drosophila, establecido mediante la difusi6n intracelular de una protefna a traves del citoplasma companido por muchos nucleos. Y todavia mas, coando nos fijamos en estadios un poco mas avanzados, encontramos un patr6n considerable de correspondencias anat6micas. Sin la ayuda de la genetica molecular nunca habrfamos podido discernir esta cuesti6n. La genetica molecular nos revela en animales muy diferentes la presencia de marcas posicionales senal parecidas que se expresadas en partes del cuerpo que de otra manera nunca podrfamos haber considerado que tuvieran nada en comun. EI complejo genico HOM ha side fundamental en la elaboraci6n de esta nueva visi6n sabre nuestra relaci6n con moscas y gusanos.

posterior

anterior

![

Ofd

Ho>
,•

HoxB IHox 21

•E •E

HoxC (Hox3l

HoxD IHox 41

1182

Capetulo 21 : Mecanismoscelulares del desarrollo

f Figura 21·80 ComparachSn cnlre el complcjo HOM de un Insecto y los

complcjos Hox de un mamffero. La Ifnea superior ilustra la distribuci6n de los genes de los complejos Anlennapedia y bithorax de Drosophila: a continuaci6n se muestran los genes correspondienles a los cuatro complejos Hox de un mamffero (ral6n 0 humano), tambien en su distrihuci6n cromos6mica. Los genes que presenlan un predominio anlerior en los dominios de expresi6n estan dispueslos en la parte izquierda, y los que presenlan un predominio posterior en los dominios de expresi6n cSlan disllUcstos en la parte derecha. Los cinco cornplcjos estan alineados de modo que los gcnes can secuencias mas parecidas estell en la misma columna. Se cree quc los complejos han sufrido la siguientc evoluci6n: primero, en aJgI1n ancestro comun a gusanos, moscas y vertehrados, un unico gen scIector home6tico primordial sufri6 una duplicaci6n repelida formando ulla serie de tandems de estos genes -un complejo HOM. En el sublinajc de Drosophila este complejo unico se dividi6 en dos cornplejos separados, Anlcnnapedia y bithorax, mientras que cn ellinaje que conduce a los mamlferos se replic6 repelidamcnlc dando lugar alos cualro complejos Hox. Asf pues, el gen labial (lab) de Drosopllila es idenlificable pOT media dc su subsecuencia como equivaJentc de Hoxa-I. Hoxb-l y Hoxd-l: el gen proboscipedia (pb) es el equivaJenle de ffoxa-2 y Hoxb-2: y asf sucesivamentc. Aparcntemente, el paralclismo no es perfecto debido a algunos genes individualcs se han duplicado y otros se han perdido tras la divergencia de los cromosomas. (Basado cn M.P. Scott. Ce1l71:551-553, 1992.

@Cell Press.)

Los mamfferos tienen cuatro complejos HOM hom6Ibgos 59,66 Debido a que el homeodominio de los genes selectores home6ticos ha side muy conservado durante la evoluci6n, ha sido relativamente flicU descubrir hom610gos de los genes de Drosopllila en otras c1ases de animales. l!stos se han encontrado en prlicticamente todos los tipos de criaturas -en Hydra, en nemlitodos y gusanos de tierra, en escarabajos, moluscos y erizos de mar, en pcces, en ranas, en plijaros y en mamfferos. Cabc destacarque en los casos en que se ha invcstigado adecuadamente, resulta que estos genes se agrupan en complejos parecidos al complejo HOM de los insectos. En el ral6n encontramos cuauo complejos de esle tipo -denominados complejos HoxA, HoxB, HoxC YHoxD- cada uno de los cuales se halla en un cromosoma distinto. Los genes individuales de cada complejo pueden reconocerse por sus secuendas homeobox, como hom610gos de miembros especfficos del conjunto de genes de DrosoplJila. AI parecer cada uno de los cuatro complejos Hox en los mamiferos es, sin entrar en detalles, el equivalente de un complejo HOM completo de insecto (es decir, un complejo Antennapedia mlis un complejo bithorax) (Figura 21-80). La distribuci6n de los genes en el interior de cada secuencia Hox es basicamente la misma que en el complejo HOM en los insectos, 10 cual sugiere que el origen de los Cllatro complejos vertebrados radica en las duplicaciones de un unico complejo primordial y que su disuibuci6n blisica se ha conservado. Cuando se examinan los patrones de expresi6n de genes Hox de los embriones de los vertebrados mediante hibridad6n in situ, resulta que los mjembros de cada complejo se expresan en series de la cabeza a la cola alia largo del eje corporal, como en el caso de Drosopllila (Figura 2181). EI patr6n es mas flidl de observar en el ruho neural. Salvo escasas excepciones, este orden anat6mico encaja con la distribuci6n cromos6mica de genes en cada complejo, y los genes correspondiemes en los cuatro complejos Hox lienen los dominios de expresi6n anteroposteriores practicamente id~nticos. Los dominios de expresi6n g~nica defmen un sistema detallado de correspondencias entre las regiones del cuerpo de los insectos y las regiones del cuerpo de los venebrados. Como muestra la Figura 21-82, los parasegmentos de la mosca se corresponden a series de segmentos de la parte anterior del embri6n de venebrados marcados de forma paredda. En el cerebro posterior esta serie de segmentos se denominan romb6meros. Los tejidos colaterales al cerebro posterior presenran la segmentaei6n en series de arcos branquiales, prominentes en todos los embriones de vertebrados -los preeursores del sistema de branquias de los peces y de las mandfbulas y las estrueturas del eueUo en los mamffcrosi eada par de romb6meros del cerebro posterior corresponde a un area branquial (vease Figura 21-82). En el cerebro posterior, igual que en Drosophila, [as luniles de los dominies de expresi6n de los genes Hex se a1inean con los Hmiles de los segmentos anm6micos. Yal igual que en los compartimientos de Drosopllila, las e~lulas de un romb6mero no se mezclan can las del romb6mero siguiente. Sin embargo, todavfa no estli claro hasta que punto se parecen los detalles de los mecanismos que establecen la segmemaci6n del cerebro posterior y del arco branquial de un vertebrado y los que generan los parasegmentos de un in-

VI,!I1 dor.al

vl.ta lateral

Drosopllila II. Genes selectores home6tJcos y modelaje de las partes del cuerpo

Figura 21 -81 Dominios de expresl6n de los genes HOI en un rat6n. las fOlograaas muestran en embriones enleros los dominios de expresi6n de genes del complejo HoxB (mancha awl). Los dominios de expresi6n se visualizan gracias a la hibridacidn {n situ 0, como en estos ejemplos, generando un rat6n tJan.nico que contiene la secuencia de control del gen Hox acoplada a la secuencia de la Il-galaclosidasa, cuya presencia se detecta por man:aje hisloquImico. Cada gen se expresa en una larga extensi6n de tejido con un Ifmile anlerior bien definido. Cuanto mas anterior sea la posici6n del gen en su complejo cromos6mico, mds anterior sen' ellfmite anat6mico de Sll expresi6n. De este modo, salvo pequerlas excepciones, los dominios anat6mlcos de genes sucesivos ronnan un conjunlo ordenado, distribuido seglln el orden de los genes en el complejo cromos6mico. (Conesfa de Robb Krumlauf.)

vl'ta dorul

vista lateral

1183

Figura 21-82 Correspondencias entre las reglones del cuerpo de un Insecto y las de un vertebrado, como definen los genes de expresl6n HOM y tlox. Representaci6n de Ull embri6n de Drosopllila en el estadio de banda germinal, con sus parasegmentos coloreados de acuerdo con los genes "IOM queexpresan. EI c6digo de coloreses el mismo que en la Figura 21-80. y tambitn es el mismo para el patr6n de expresi6n del gen HoxB dellubo neural de un embri6n de vcnebrado. Para simplificar, no se iluslra la expresi6n de los otros tejidos del venebrado. En las regiones en que los dominios de expresi6n de dos 0 mas genes HOM/Hox se solapan, la coloraci6n de los genes corresponde al mas ~posterior~ de los genes expresados, tanto en la mosca como en el venehrado. Los PUI1IOS que presenten la coincidencia de varios Irmites de expresi6n de genes distinlOS apareceran rayados. Obstrvese que de igual forma que los dominios de expresi6n de la mosca eslan relacionados con los parasegmenlOS. los dominios de expresi6n de los vertebrados eslan relacionados eon los romb6meros (segmentos del cerebra posterior). Cada par de romb6meros se asocia con un areo branquial {un rudimento branquiaJ modificado), aJ que U"ansmite inervaci6n. EI patron de expresi6n de los genes Hox en los areas branquiaJes (no esla i1ustrado) encaja con los romb6meros asociados.

seclO. Aunque. por ejemplo, los vertebrados presentan hom610gos de los genes engrailed y wingless, estos genes no se expresan de una forma segmemal repetitiva en el cerebro amcrior.

Los genes Hox definen los vaJores posicionales en los vertebrados tal como ocurre en los insectos67 A pesar de las incertidumbres que se plamean en los mecanismos de segmemaci6n, pocas dudas pucden existir sobre la condici6n hom61oga de nuestro eje de cabeza a la cola respeclo al de un inseclO y respecto a que esencialmente el mismo conjunto de genes marca los valores posicionales anleroposteriores de nuestras clHulas. AI parecer, los genes Hox no tienen tan s610 palrones de expresi6n similares a los genes del complejo del insecto, sino que tambien presentan (unciones reguladoras parccidas. Los vertebrados lienell cuatro c1ases de complejos de genes Hox que actuan mlls 0 menos en paralelo a 10 largo del eje corporal, donde en el insecto actua un solo complejo HOM. Por 10 tanto, no basta con eliminar 0 provocar la cxpresi6n deficiente de un gen Hox para conseguir que una regi6n experimenle una transformaci6n home6lica de consideraci6n y adopte el canicter de Olra. De todas farmas, gracias a In ingenierfa genetica se ha conseguido que un rat6n con alteraciones en un solo complejo de genes Hox presenle anoma!fas localizadas que se podrfan interpretar como transfonnaciones homc6ticas incompletas. Este hecho i1ustra una de las dificultades principales que presenta el unl:\lisis de la genetica de los sistemas de control del desarrollo de los vertebrados. EI genoma venebrado es muy grande. y debe su gran tamano fundamenlalmeme a las duplicaciones genicas que se han ido produciendo en el Cllrso de la evoluci6n. Asf, contiene muchas copias diferemes de genes que en moscas 0 nemo1lodos estan represelllados en solitario: los cuatro complejos Hox son un ejemplo lfpico de eUo. Las mllitipies versiones de un gen tienen funciones solapadas y parcial mente inlercambiables. y esta redundancia parcial hace muy diffcil identiflcar la funci6n bAsica de un gen en solilario, de la misma forma que resuJta di· ficil, poniendo 0 quitando un solo tomiUo, demostrar la funci6n de uno de los muchos tomillos que tiene una puena en sus bisagras. He aquf por que los datos aponados por modelos de organismos mas simples como Drosop1lila y Coenorhabdiriselegans son tan imponallles. Sin embargo ello no quiere decir que la importancia de un gen individual sea superflua en el conjullto de genes de un vertebrado; a medida que avanza la evoluci6n; los genes duplicados divergen y comienzan a adoptar funciones nue1184

Caprtulo 21: Mecanlsmos celulares del desarrollo

I

vas y cada ve~ mds espccializadas que los distinguen unos de orros. Los viejos componentes pueden adaprarse organizando el desarrollo de los nuevos tipos de estruClUras que se ailadirdn a las ya existentes. Las extremidades de los vertebrados superiores nos proporcionan un ejemplo muy interesante de todo clio.

Subconjuntos de los genes Hox se expresan distribuidos a 10 largo de los dos ejes ortogonales de las yemas de las extremidades de los vertebrados 68 En este mismo capfrulo ya hemos uriJizado las yemas de las extremidades del embri6n de polio para demostrar que las celuJas de regiones distintas se distill' guen unas de otras mediante una propiedad que denominamos valor posicional. Esra caracrerfslica de la memoria celular decide si las cstructuras que se fonna· ran semn de la para 0 del ala, del om6plaro 0 del antebrazo, del pulgar 0 del me· fUque. La genetica molecular ha revelado 10 que significa "valor posicional~ en tenninos moleculares de la yema de la extremidad. Va sabemos que a 10 largo del eje corporal, en moscas y vertebrados, los va· lares posicionales se definen mediante el estado de expresi6n de los genes HoxlHOM. La hihridaci6n in situ demuestra que esto es cieno para las yemas de las extremidades de un embri6n de rat6n y rambien de polio -aunque existe una pequena diferencia. En lugar de enconrrar que los cuatro complejos Hox se ex· presan de forma similar, mediante patrones solapantes, igual que en el cerebra posterior, se observa que un subconjunto de miembros del complejo HoxD se expresa en una serie de dominios distribuidos a 10 largo de un eje de la extremidad (probablemente el anteroposterior) y que un subconjunto de miembros del complejo HolCA se expresan en serie a 10 largo de un eje distinto (probablemente el proximodisral) (Figura 21-83). Para comprobar si estos genes realmente controlan el modelaje de la extremidad, se ha uriJizado un retrovirus como vector de expresi6n en el embri6n de polio para introducir un gen Hox particular dentro de las celulas de la yema de la extremidad, forzando la expresi6n del gen en una

ANTERIOR

"

--r----cerebro antorior

=l-+----m9dula esplnal

::IG......-

vema de I' e:dramidad anterior

Figura 21-83 Patrones de expresl6n de los genes Hox de las yemas de las extremldades de los vertebrados. (A) Diagrama esquemalico del patr6n de expresi6n de los miembros expresados en la parte posterior del complejo Hoxde un embrl6n de t2 lh dras. (B) Comparaci6n entre los patrones de expresi6n de los genes de polio HoxD (ChoxDj Y HoxA (ChoxA) en In yemn de la extremidad anterior de un embri6n de polio de 4 dfas. En el polio y en el rat6n, los genes HoxD defincn el patr6n de los dominios antero-posteriores; los genes HoxA dcfincn cl patrOn proximodistal. lA, scgun D. Duboule, BioEsStlys 14:375384. 1992.@lCSU Press; B, segun Y. Yokouchi, 1-1. Sasaki, YA. Kuroiwa. Nature 353:443-445.1991. C 1991 Macmillan Magazines LId.)

1=11!~1='i1l-----lom;tO$

vema de La elrtremidad posterior

prOllim.,

~islal 5'

POSTERIOR

to,

Drosopllila U. Genes selectores home6ticos y modelaje de las partes del cuerpo

anterior

I

posterior

1185

localizaci6n inadecuada. Si se fuerza a las celulas pertenecientes a la regi6n en In que se desarrollar;1 el primer dedo del pie a que exprescn el gen Hox caractcrfstico del segundo dedo (fJoxd·/ 1), su comportamiento se vera alterada. y en 1a 10ca1izaci6n del primer dedo se desarrolla un duplicado del segundo dedo. Evi· dentcmente, cuanda el vertebrado desarrolla las extremidades, cambin a los diferentes conjuillos de genes Hox de formas distintas para comro!ar el modelaje del embri6n y lambi~n del principal eje corporal. Ahora, el problema central de la embriologia de los vertebrados es descuhrir c6mo se rCglJlan los genes Hox. Varias estudios senalan que el acido retinoico puede controlar la expresi6n de los genes Hox en las yemas de las extremidades y a 10 largo del eje principal del cuerpo, pero la forma en que se cjerce tal control yel papel que juega en el desarrollo nonnal son, aun, pregunlas sin respuesla. En esle momenro los genes HOM/Hox conslituyen el ejemplo mtls eSpe<:ta· cular de conservaci6n de mecanismos de conrrol del desarrollo. Pero el camino iniciado con las homologfas genelicas descubiertas mediante las secuencias ge· neiica durante los uhimos anos nos concede esperanzas para pensar que pronto podremos conSlatar muchas coincidencias mas. y no menos imponanles, en cl desarrollo de vertebrados e invenebrados. Los estudios gen~licos lradicionales Ymoleculares de organismos pequei'ios como moscas y gusanos, mtls accesibles, nos dan las pautas para aclarar los mislerios del desarrollo de todo el mundo animal. Pero. i.Y si vamos un poco mtls lejos y afirmamos que lambien nos abren las puertas del desarrollo vegetal? 0, i.es que el desarrollo de las plantas aCHJa segtin un conjunto de principios y meca· nismos complelamcnte dislintos? Con esla pregunta abordamos el siguienlc apartado.

l

•

Resumen Los genes selectores llOme6ticos deflnen las diferencias entre los segmelltos del cuero po desde In cabezn I,asla la cola: propordonan a las dbdas una memoria de Sll 11(1. lor poslclonal. Mlliaciones en estos genes pUedell cotJlJertir 1m segmenlo corporal al cardcler de otro, Yla sllpresi611 ell masa de eslos get,es causa larvas 'file tlet,e" tOilos los segmelllos co'1JQrtdes igrlales. Se observall lrallsfornlaciOl,es parecidas ell las estnlctllras exlenuu del cuerpo de In mosca adulla, derilmtlns de los discos Imagilla· les de la larua. ExperimetllOs COli tras/}lantes demuestrall que las cihdas (Ie los discos tletle" memoria a iargo pltuo de SIts Imlores posiciollales, y esta memoria depellde (Ie la presellcla contill'lada de genes seleclores IlOme6ticos. Todos los getleS selectores llOmeotioos codiflam prote(nas que ullell DNA, y 10· tins colltlellell Sei:llellclas Ilomeobox muy bien conservadas. En el getlOma se agrll· pan en dos conj"nlos que podrftm ser /Jarles separadas de wllinico conjwrto de ge· lies am:estrtd denomhuulo complejo HOM. La distrlblfdoll cromosomica de estos gelles ell Calla parte del complejo em:aja con In distrlbllcion espadal de s.tS domi· nios de expresi61l ell el cllerpo. El m«anlsmo molecular del fe1lomeno tie la memo· ria es desco'lOcldo, pero se cree que tlepellde de cambios autoperpetllUntes en el esIndo de las regim.es de colltrol tiel complejo HOM. Ln expres16n conj,,,,ta de los patrolle5 de.'os gelles HOM y de los genes tie IJOlarlilad del segmento, Srlbdivlde el cllerpo en compartimienlos, cllYas dl,dns no se meulnll. Los procesos posteriores genera" un patron de diferendaclon cellliar de· tallado en el interior lie aula compartimiento. Ln illilibici6n lateral, mediada por los llamados genes ne'lrogenlcos, jllega lin papel amtral en el esladio jinal de di· versiflcaci61l cellliar. Detennina que dlulas que se I,alla" en co"taclo unas con oITas se diferellclen de formas dlstinlas, 10 CIIaI ayuda a organiurr la «eaelon de conjllntos de cilulas con especlnUzaciones minri.sculas que colltribu/rtfn a In formacion de quelas sensoriales. Grall parte de los genes de oolltrol del desarrollo identiflcados en moscas y gil· sallOS Henlm llOm610g0s en otTas clnses de atrimales, illcb4idos los vertebrado.s. En algrmos casos se I,a demostrado qlle los genes correspm,dientes Henen pmclollf!$ ell el desarrollo, 10 cual impllca qlle los metxmismos fimdamelltales del desarrollo

1186

Caprtulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

•

a1limal5e IIall conservado im;lllso cllando el aspecto excerllo del cllerpo I,a el10/llcionmlo IJasca ser comple'amen'e difere",e. Al parecer, iJrdcricamellte todos los animales contlenell COmlJlejos de genes 110M, de orgallizaci6n parecida a los de los insec'os: los mamiferos presentan cuatro complejos, denominados complejos Hox, y se cree que SIIS prodllCtOS de/itlen los l1alores posiciollales que con'rolan el patrO/I anteroposterior de ZOllas de la regia" del cerebro all'erior y del 'ronco. Los camplejos Hox ta",b/~n I,an adqldrido n"evas /I",ciones como especiflctulores de informacilm pos/c/ollal ell partes del cuerpo de los ver'ebrados elJOlllc/onadas mas reclenteme",e, como son 'as extremldtuks.

El desarrollo vegetal 6' Las plantas y los animales est~n separados aproximadamenle por mil millones de ai'los de historia evolutiva. Ambos han desarrollado su organizaci6n pluricelular de forma independienle pero a panir del mismo conjunlo de herramielllas -el conjullto de genes heredados de su antepasado eucariota unicelular comlin. La mayorfa de diferencias entre sus estrategias de desarrollo provienen de dos panicularidades b~sicas de las plantas. La primera es que las plan las consigucn su energfa de la Illz solar, no ingiriendo otros organismos. Esta caracterfslica define un plan corporal distinto. Y1a segunda, que sus ctHulas esl~n encerradas en paredes celulares semirrfgidas que las mantienen en grupos compactos, evilando que se desplacen como hacen las celuJas ani males. Esta segunda caracter[stica delermina un conjunlo distinto de movimientos que definen la forma del cuerpo, y unos mecanismos de desarrollo distintos que puedan hacer frente a un entomo variable. EI desarrollo animal eSla muy prolegido frente a los cambios del eniomo, y el embri6n genera la misma estructura corporal definida genelicamenle sin que esta se yea afectada por condicionantes enemos. EI desarrollo de la mayorfa de las plantas, en cambio, esta inOuido dramaticamente por el enlorno: debido a que no pueden desplazarse a su entomo adecuado, las plantas se adaplan al media que les corresponde alterando el curso de su desarrollo. Su estrategia es oportunisla. Un 6rgano delerminado -es decir una hoja, ulla Oor 0 una raizpuede ser generado a parlir de un hllevo fecundado mediante difcrcntes v(as, segtin las informaciones del entorno. Una hoja de begonia plantada en el suelo puede desarrollar una rarz; la ralz puede dar un brote; el brole. si recibe la Iliz suficiente, puede desarrollar hojas y Oores. Normalmente, la planta adulta esta compuesta por muchas copias de un pequef'io conjunto de m6dulos estandar, tal como se i1ustra en la Figura 21-84. Las posiciones y momentos en que se generan estos m6dulos eSlan mllY inflllidos por el entorno, provocando variaciones en la estructura de toda la planla. Las opciones entre los m6dulos alternativos y su organizaci6n en toda la planta depende de informaciones del enlorno y de sei'iales hormonales de largo alcance, que en el control dcl desarrollo animal juegan un papel mucho menos importantc. Aunque el desarrollo global de una planta -Ia fonna de sus rafces y ramas, el nlimero de sus hojas a Oores- puede ser altamente variable, su organizaci6n detaUada a pequena escala no 10 es. Una hoja, una flor 0 incluso un embri6n vegetal temprano, lienen una estructura tan precisa como cllalquier 6rgano de un animal. La organizaci6n interna del m6dulo vegetal presellIa esencialmente los

meristemo apical

Figura 2t-84 Elemplo slmple de la construcclon modular de las planlas. cada m6dulo (coloreados en diferentes tonos de verde) consta de un lallo, una hoja y una yema que conliene un centro de crecimiento polencial, 0 meristemo. La rema se fonna en el nudo, punta de nacimiento de la rama, donde la ho;a diverge del tallo. Los mtXIulos derivan secuencialrnenle de la aC1h'idad continua de los rneristemos apicales. EI desarrollo vegetal

1187

mismos problemas en el control genetico de su patr6n de formaci6n que los del desarrollo animal. y se solucionan de formas anaIogas. En este apartado nos centraremos en los mecanismos celulares de desarrollo de la plantas can flares. Examinaremos tantos sus diferencias como sus similitudes con los animalcs.

EI desarrollo embrionario empieza con el establecimiento del eje rafz-brote y se detiene en el interior de la semilla 70 A pesar de la asombrosa variedad de las plantas con Oores. su origen es relativamente recientc. Los ejcmplares f6siles mas tempranos son de hace 125 miLIones de anos, frente a los 350 millones de anos de f6siles de animales vertebrados. Este hecho contribuye a expLicar por que algunos aspectos de su forma y desarrollo son extraordinariamente constantes. La estrategia basica de su reproducci6n sexual esta resumida esquematicamente en el Panel 21-2, pagina 1189. EI huevo fecundado, 0 zigato, de una planta superior empiez.a dividiendose asimetricamente. estableciendo la polaridad del futuro embri6n. Un prodUCIO de esta divisi6n es una celula pequei'la con un citoplasma denso, que se transfonnara en el embri6n propiameme dicho. EI otro producto es una celula grande y vacuola· da, que se divide de nuevo y forma una estructura Hamada el suspensor, que en algunos aspectos es comparable aI cord6n umbilical de los mamfferos. EI suspensor mantiene unido el embri6n al lejido nutritivo adyacente y proporciona una vfa para el flujo de nUlrientes. Durante el siguiente estadio del desarrollo, la celula embrionaria diploide prolifera fonnando una bola de celulas que adquiere rapidamente una eslructura polarizada. Comprende dos grupos clave de celulas proliferativas -uno en el extremo del suspensor del embri6n que generara una raiz en un extrema y otro en el polo opuesto que generara un brote (Figura 21-85). EI eje principal rafz· brOle establecido de este modo es anAlogo aI eje cabeza-cola de un animal. AJ mismo tiempo empieza a ser posible distinguir las futuras celulas epidermicas. que fom131l la capa mas externa del embri6n, las futuras celulas de tejido bdsico. que ocupan la mayorfa del interior del embri6n, y las futuras d/ulas de tejido vascular, que forman el nucleo central del embri6n. Estos tres conjuntos de celulas pueden comparase a las tres capas germinales de un embri6n animal. Un poco mas tarde durante el desarrollo, el rudimento del brote empieza a producir las hojas embrionarias de la semilla, 0 cotiledolJes -uno en el caso de los monocotiled6neas y dos en el caso de las dicotiled6neas. Normalmente, el desarrollo

Flgura21-85 Dosestadlosdela embrlog~lIeslsde la planta Arab/elapsEs tlralfnna. (Segt'in G.

embrlon globular eotll&don

primordlo del bro"

primordiG de la raiz

tAl

1188

(8'

Caprtulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

JUrgens, U. Mayer, R.A. Torres-Ruil., T. Berlelh. y S. MiseTa, DevelQpmelll ISlIppl./ 1:27-38, 1991.)

LA FLOR las floras, que contienen las dlulas reproductoras de las plantas Petalo: diSlintas eSlrUCluras en forma de hoja, generalmente superiores, surgen a panir de los meristemos apicales de brotes coloreadas con lonos brillantes. que aCluan de sistema polinizador, vegetales (veanse Flguras 21·84 y 21-88), Culminan su creeimiento por ejemplo atrayendo insectos. a panir de-este meristemo, Factores medioambientales, como Estembre: Organo que contiene celulas que el ritmo circadieno 0 Ie temperatura, activan el cambio de sufren meiosis V forman granos haploides estigma desarrollo vegetal floreL Asl pues las dlulas de j)'Olen, cade uno de los cuales contiene germinales apareeen en eltranscurso del I estilo dos celulas espermatic8s masculinas. desarrollo da la plante, y 10 hacen a panir grana Cuando trensferimos el polen a un de las dlules somaticas. y no a panir de estigme, germina, y el tubo pollnico de polen una linea celular germinal como los animales. conduce los dos espermatolOides e6lulas inmOviles al ovado. espermAlicas >---- 0,5 mm ~ Plstilo: Organo que condene uno 0 nUcleo mas ovarios, cede uno de los cuales del tubo contiene Ovulos. Cede Ovulo es polinico huesped de dlulas que atraviesen la maiosis, formando un saco embrionario que contiene la dlula huevo femenina lcosfera). En la feeundeciOn. une celula espermatica se fusiona con la relula huevo construvendo el futuro embriOn diploide, mientras que Ie otra 58 fusiona con des nucleos del S8CO embrionario cOflstituvendo al tejido triploide endospermico. Sepalos: eslruetures an forma de hoja que forman un revestimienlo protector durante el desarrollo floral temprano.

p6Ulo-

piltilo

v-m- lernprene

.. n~

La estructura de la flO!" as variada y caracterfstka de cada

espeeie; comprende cualro formaciones de estructuras concentricas que padrlan considerarse hojas modiflCadas.

LASEMILLA Una samilla consta de un embri6n quiesceote. reservas nlllritivas y la envoltura. AI final de su desarrollo eI contenido de agua puede

haber descendido desde un 90 a un 5%. Est' protegida por un truto Cuyos tejides son de origen matemo.

• la oostera fecundada del interior del saco embrionario creee formando un embri6n, sirviendose de los nutrientes transponados desde el endospermo por medio del suspensor, Una serie compleja de divisiones celulares, ilustrada aqul por una hierba pequefla llamada zurr6n de pastor, origina un embri6n con un meristemo apical da la ralz, un maristemo apical del brote, y una lmonocotiledOneas) 0 dos (dicotiledOneasl hojas 0 cotiledones. El desarrollo sa detiane en este estadlo, y al saco embrlonario, que contiena el embri6n, se conviene ahora en una semlUa preparada para su dispersl6n y capal de sobrevivir en circunstancias adversas.

Para qua un embriOn continue su desarrollo es neeesario qua su semilla germine, un proceso que depende de factores internos lestado qulescente) y de factores medioambienlales, como el agua, la temperatura y el oxlgeno. las reservas nUlritivas para la fase temprana de la germinaciOn pueden sar tanlO el endospermo (maid como los cotil8dones 19uisentes y judlas). Habitualmente, primero emerga la raiz primaria de la samille, para assgurar al suministro da egue necesario para Ie pl8ntula desde al comlenzo. EI cotiledon(as) pueda(nl apar8C9r por encima del sualo, como en la judia de jardin mOSlrada aqul, 0 continuar debajo del suelo, como en los gulsantas. En ambos cases los cotiledones acaber'n por extinguirse. . Ahora el meristemo apical puede mostrer su capacidad para el crecimianto continuo, produciando al petrOn tipice de nudes. internudos y vames ('lease Figure 21-841.

germinaci6n de

una judla da Jardin

Panel21·2 Caractedstlcas generales del desarrollo temprano de las plantas con Dores.

1189

se detiene poco despues de este estadio, y el embri6n queda empaquetado en una semiffa, especializada para la dispersi6n y para la supervivencia en condiciones adversas. EI embri6n en la semilla se estabiliza por deshidralaci6n, y puede permanecer latente durante un perfodo de tiempo muy largo -incluso centenares de all0S. Cuando se rehidratan, las semillas germinan y continua el desarrollo embrionario.

Los m6dulos repetitivos de una planta son generados secuencialmente por los meristemos71 Sin entrar en detalles, el embri6n de un insecta 0 de una animal vertebrado es un modelo rudimentario a pequena escala del organismo madura, y los detalles de la eslructura del cuerpo se completan progresivamente a medida que este aumenta de tamano. EI embri6n de la planta crece hasta convertirse en adulto de manera bastante diferente: las partes de la planta adulta se generan secuen· cialmente par medio de grupos de celulas que proliferan estableciendo las estructuras perifericas de la planta. Estos gmpos de celulas, todos importantes. se denominan meristemos aplcaJes (vease Figura 21-84). Cada meristemo esta formado por una poblaci6n de cclulas madre autorrenovables. A medida que estas celulas se van dividiendo, producen una progenie que emergera desde la regi6n meristem
brole de meristemo apical (escondido~

La forma de cada nueva estructura depende de la orientaci6n de la divisi6n celular y de la expansi6n 72 Las celulas vegetales, encerradas en el interior de sus paredes celulares, no pueden arrastrarse y tampoco pueden cambiar su posici6n a medida que crece la planta, pero pueden dividirse, y pueden hincharse, estirarse y curvarse. Por 10 tanto, la morfogenesis de una planta en desarrollo depende de una serie ordenada de divisiones seguidas de una expansi6n celular orientada de forma muy precisa. La mayorfa de las celulas producidas en el extremo del merislemo de la raiz, por ejemplo, pasan por tres fases distintas de desarrollo -Ia divisi6n, el crecimiento (elongaci6nl y la diferenciaci6n. Estas tres fases, que se solapan en el espacio y en el tiempo, dan lugar a la arquitectura caracleristica del extremo de la raiz. Allnque a menudo el proceso de diferenciaci6n celular empieza mientras la cclula todavia esta creciendo, es relalivamente facil distinguir en el extrema de una raiz una zona de divisi6n ceiular, una zona de elongaci6n celular orientada (que afecta el crecimiento longitudinal de 1a ralz) y una zona de diferenciaci6n celular (Figura 21-87). EI plano exacto en el que las celulas se dividen es crucial para la morfogenesis de la planta, debido a que afecta la direcci6n de la elongaci6n de la plama, y los cambios en el plano de divisi6n estan a menudo asociados con procesos 1190

Capitulo 21 : Mecanismos celuJares del desarrollo

meristemo apical de la ralz

Flgura2J-86 Unaphtntulade Arabitlopsis. Los objetos marrones situados a la derecha de la joven pJantula son las dos milades de la envolrura de la semilla dcsechada. (Corlcsfa de Catherine Duckett.)

ciHndro vascular que conliene llilema V el floem. en dlIurrolio

Figura 21-87 Extremo de una raiz en credmlento. (A) Organizaci6n de los 2 mm finales del extremo de una rall. Se indican las zonas aproximadas en las que es posible encontrar c~lulas que se dividen, se a1argan y se direrencian. (B) Meristemo apical y la cofia radicular del extremo 0 de una rafz de mm. presentando las series ordenadas de las celulas producidas. (B, segUn P.H. Raven, R.F. Evert y S.E. Eichhorn. Biology or Plants, 4th ed. New York: Worth, 1986.)

palos radiculares tortela lIPidefmill ZONAOE ELONGACION DE LA Cl:LULA

ZONAD<

[

DMSION DE LA cELULA

'8'

""

"--'

100",m

morfogenicos, como 1a producci6n de primordios foliares 0 de petalos (Figura 21-88). Los mecanismos intracelulares especiales que controlan el plano de la divisi6n celuJar se lratan en el Capitulo 18. En la fase de expansi6n controlada que generalmenle sigue a la divisi6n celular, las celulas hijas pueden a menudo aumentar su volumen cincuenta veces o mtis. ESla expansi6n eSlti conducida por una lurgencia de base osm61ica que presiona las paredes celulares de la planta hacia el exterior, y su direcci6n eSld determinada par la orientaci6n de los fibrillas de celulosa de 1a pared celular que conducen la expansi6n a 10 largo de un unico eje (vease Figura 19·68). A su vez, la orientaci6n de la celulosa eSlei aparentemente eontrolada por la orientaci6n de formaciones de microtubulos situ ados justa por debajo de la membrana plasmeitiea, [as cuales pareeen gular la deposici6n de eelulosa (vista en el Capftulo 19). Estas oricnlaciones pueden ser modifieadas can rapidez mediante rcguladares del erecimiento de la p[anta. como el catena y el dcida giber/mea (Figura 21-89), pero los mecanismos moleeulares subyaeentes a estas dram.Weas redistribuciones del eiloesqueleto son desconoeidos.

divilli6n dlv;lIl6n anticlinal pericJlnal laumentOll en di6rnetro V jrea IItlpel'fielall

diviaiOn tr.nlverlllli !aumento en Iongitudl

'AI EJ desarrollo vegetal

'8'

Figura 21-88 Relacl6n entre el plano de dlvlsl6n, 10 expansl6n celular y 10

morfogenesls. (A) Los tres pIanos de divisi6n celu1ar que presenta un 6rgallo vegetal tfpico. Las variaciones en la proporci6n de cada uno de ellos. combinadas con una expansi6n celular orienlada. pueden ser las responsables de los patrones moriogenicos que actuan en las plantas. (B) Secci6n longitudinal de Wl yema floral joven de una vincapervinca (hierba doncella). Las pequenas cUpulas de celulas dCSlinadas a convertirse en las direrenles panes de la flor son producto de una combinaci6n de los nuevas pianos de dMsiones celu1ares y de expansi6n celular orienlada detenninadas por refuerzos anulares de celulosa en la pared celular. (SegUn N.H. Bake, Am.]. Bot. 36;535-547, 1949.)

1191

Cada m6dulo de la plant'a crece a partir de un conjunto rnicrosc6pico de primordios de un meristemo 73 Los meristemos apicales son autoperpetuantes: continuan sus funcioncs indefinidamente mientras la planta sobreviva, y son responsables del continuo crecimiento y desarrollo de la planla. Pero los meristemos apicales tambh~n dan lugar a un segundo lipo de crecimiento, cuyo desarrollo esta altamente limitado y culmina can la formaci6n de estructuras como una hoja 0 una flor, de tamai'lo y forma determinada y con una esperanza de vida corrao Asf pues, a medida que el brote se va alargando, su meristemo apical deja detras de el una secuencia ordenada de midas donde han crecido hojas, e intertludos (segmentos del brole). De esta forma la actividad continua del merislemo produce una cantidad de m6dulos similares, cuyo numero no para de aumentar; cada uno de estos m6dulos esta formado por un brote, una hoja y una yema (vease Figura 21-84). Los m6dulos se conectan unos con olros mediante lejido de soporte y de transporte, y los sucesivos m6dulos estan situados unos respecto a otros, de forma precisa, dando lugar a una estmctura de formas repetidas. Esle modo de desarrollo interactivo es caraclerfstico de las plantas y se observa en muchas otras estructuras a pane del sistema tallo-hoja (Figura 21·90). Aunque el m6dulo final es grande, su organizaci6n, como la de un embri6n animal, esta mapada primero a escala microsc6pica. En el apice del brole, en un espacio de un milfmetro 0 incluso menor, se encuentra una cupula central, pequena y baja, rodeada por un conjunto de protuberancias de distinlOS tamafJ.os (Figura 21-91). La cupuJa central es el meristemo apical; cada una de las protuberancias que la rodean es un primordio foliar. Esta pequei'la regi6n, por 10 lan10, contiene los mdimentos ya diferenciados de varios m6dulos completos. Mediante un prograrna muy preciso de proliferaci6n celular y expansi6n celular, cada primordio foliar y sus celulas adyacenles crecen formando una hoja. un nudo y un entrenudo. Mientras, el meristemo apical da lugar a un nuevo primordio foliar, generando cada vez mas m6dulos, en Wla sucesi6n potencialmente infinita. La organizaci6n en serie de los m6dulos de la plama eSla controlada, de este modo, par procesos del apice del brote. Las sefiales locales dentro de una pequefia regi6n determinan el palr6n del primordio -Ia posici6n de un mdimento foliar en relaci6n can el siguiente, el espacio existenle entre ambos mdimentos y su localizaci6n en relaci6n aI meriSlemo apical.

IAI

IBI

ICI

IDI

Figura 21-89 Los diferentes efectos de dos reguladores del crecimJento vegetal, el gas etlJeno y ei addu g1bereUco. Estos reguladores ejercen efeclos n'ipidos y de consecuencias opuestas sobre la orientaci6n de los microtiibulos corticales de las celulas de broles j6venes de guisantes. (B) Celula tfpica de una planla tratada con elileno, sus microlubulos presentan una orientaci6n longitudinal. (Cl Celula tfpica de lIna planla tratada con <'icido giberelico. sus microtllbuJos presentan una orientaci6n transversal. Se depositan microfibrillas de celulosa paralelas a los microrubuios. Debido a su influencia sobre la orientaci6n de la expansi6n celular, ei acido giberelico y el etileno favorecen el crecimiento en direcciones contrarias: las plalltulas tratadas con etilello desarrolla.ll brotes bajos y gruesos (A), mientras que las plantulas que reciben tratamiento con acido gibereiico desarrollan brotes altos y deJgados (D).

Figura21.90 EI modelajerepetltlvo de las plantas. Una colocaci6n carreela de los rn6dulos sucesivos de un unico meristemo apical produce estas complicadas aunque regulaTes fOTmas en las hojas (A), flores (BJ y frulos (C). CA, segtill John Sibthorp, Flora Graeca. London: RTaylor, 18061840; B. segun Pierre Joseph Redoute,

IAI

Les Uiliacees. Paris: chez J'Auteur,

18)

___

1192

1a07; C, segl1n Christopher Jacob Tcew, Uitgezochte planten. Amsterdam: Jan Christiaall Sepp, 1771-cortesfa todos ellos de John Innes Foundation.)

(Cl

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C.pllu'o 21 ,M,c.ol,mo, c,lul.,., del de,mollo

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100 l'm

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3OO,m

No se conoce pnklicamente nada sobre los mecanismos que median los procesos centrales del modelaje en el reino vegetal. Todas las estrategias que he· mos tralado sobre el modelaje de la formaci6n de los ani males -como las basa· das en morf6genos locales, los mecanisll10s del reloj cclular y la inhibici6n late· ral- lambicn podrfan darse en el reino vegetal. No obstante, estudios detallados del destino y ellinaje de las celulas en el ~pice del brOle y en el ~pice de la rafz eSlan empezando a aponar parte de esta informad6n basica esendal, yempiezan a ser identificados algunos de los genes fundamentales del control del desarrollo. La protefna reguladora de genes codificada por el gen Knotted, por ejemplo. se expresa en la parte central del meristemo; una sobreexprcsi6n de esta protefna en una planta de tabaco provoca que las celulas foliares acluen como merislemo, gcnerando nuevas 6rganos a partir de la propia hoja.

Figura2t-91 Aplcedelbroredeuna planta Joven de tabaco. (A) E1ectronmicrografia de barrido que mueslra el :'pice del brOle con dos primordios foliates emergiendo secuencialmenle. visibles aqur como dos prolUberancias lalerales a cada lado de la cllpula del meristemo apical. (8) Secci6n fina de un :'pice similar mostrando que eI primordio foliar m(is joven surge de un gmpo reducido de celulas (aproximadamente 100) de las euatra 0 cinco capas m:'s exteriores. (e) Diagrama muy esquematieo que muestra que la apariencia secuencial del primordio foliar tiene lugar sobre una distaneia reducida y en una fase muy temprona del desarrollo del brole. Finalmente el credmiento del cipice formarci internudos que distribuircin ordenadamente las hojas a 10 largo del Iallo (vease Figura 21·84). (A YB. segUn R.S. Poethig e I.M. Sussex, Pfatlta 165:158·169.1985.)

SefiaJes hormonales de largo aJcance coordinan los procesos del desarrollo en partes distantes de la planta 74 Para que un tallo se ramifique. han de generarse nuevos meristemos. y es mediallle el control de estos procesos que el entomo ejerce una pane hnponante de su influenda sobre la forma de la planta. En eada nudo. en su ~ngulo agudo, o lui/a. enne la rama foliar y el tallo, se fonna una yema. Esta yema conticne un nida de celulas, derivado del meristemo apical, que ha conservado un caracter meristemtitico (y que expresa Knotted). Dichas celulas han canservado su capaddad para transformarse en el meriSlemo apical de una nueva rama. perc tam· bien tienen la alternativa de pennanecer en cslado latenle. El modelaje de la ramifiead6n de la planta csta regulado por esta opci6n, en cuya elecd6n panicipa el entomo. Partes distantes de la planta que reciben influencias de entornos distintos reaccionan frente a ellos individualmente mediante cambios en su desa· rroUo. Sin embargo. la planta debe de continuar actuando al unfsono. Esto exige que las opciones del desarrollo y los procesos de una parte de la planta afecten a las opciones del desarrollo del resta del organislllo. Es precise que existan sena· les de largo alcanee que den lugar a tal eoordinad6n. Como saben los jardineros, par ejemplo, cortando el extrema de una rama se puede esrimular su erecimiento lateral: exnayendo el meristemo apical desaparece lambien una inhibici6n que afecta a los merislemos axilares en eSlado lalente. permitiendoles que fonnen nuevos apices. En este caso la senal de largo alcance procedenle del meristemo apical, 0 al menos un componente fundamental del sistema de senal, ha sido identificada. Es una aluilla, un miembro de EI desarrollo vegetal

1193

uno de las cinco c1ases conocidas de reguladores del creclmlento vegetal (denominados algunas veces Ilormonas vegetales), los cuaJes ejercen poderosas influencias sobre el desarrollo vegetal. Las otras cuatro c1ases conocidas son las gtberelinas, las c1toqulnJnas, el 4c1do absddlco y el gas etileno. Tal como se muestra en la Figura 21-92, todas elias son pequenas moleculas que atraviesan f4cilmente las paredes celulares. Todas estan sintetizadas por la mayorfa de las celuJas vegetales y pueden tanto aClUar localmente como ser transportadas inOuyendo a distancia en olras cliluJas diana. La auxina, por ejemplo, se transporta de una clilula a otra a la velocidad aproximada de un centimetro par hora desde el extrema de un brote hacia su base. Cada factor regulador de crecimiento dene mUltiples efectos, que est4n modulados por OIrOS reguladores del crecimiento y por senales procedentes del entomo y del estatus nutritivo. Asf pues, la auxina sola puede estimular la formaci6n de la raiz, pero conjuntamente can la giberelina puede estimular la prolongaci6n del tallo, can la ciloquinina puede suprimir el crecimiento lateral del brote, y con el etileno puede estimuJar el crecimiento lateral de la rafz. Los receptores que reconocen estos reguladores del crecimiento empiezan a ser caracterizados, y los mecanismos de sus actuaciones contimlan siendo un misterio.

H

H

"c-c

/

"

H/

H

etileno

~CH'COOH I

H kido lndol-)'acetico

(1M. "indo'--)'ecetic lIcid~' [una aUJUNlI

Arabidopsis se utiliza como organismo modelo para la gen~tica molecular de.las plant'as75 La investigaci6n sistem4tica en busca de mutaciones que afecten el modelaje del embri6n vegetal ha facilitado que se empiecen a identificar los genes que dirigen el desarrollo vegetal y que se empiece a djlucidar su funcionamiento. Este enfo· que precisa de una planta que sea, como Drosopllila a CaenorhabcJitis elegatls. pequena, de reproducci6n rtipida. y apropiada para los estudios genliticos. EI papel de "planta modelo" recay6 en un pequeno vegetal, el berro comun de pared Arabidopsl$ tl,alinlJa (Figura 21·93). ya que se pueden hacer creeer un gran numero de indivlduos en el interior de un tuba de ensayo y produeir millares de brotes por planta at cabo de 8 a 10 semanas. Arabidopsis tambicn presenta la ventaja para el ammsis molecular de tener el genoma vegetal m4s pequeno eonoeido (7 x 107 pares de nucle6tidos), comparable al de la levadura (2 x 107 pares de nucle6tidos), C. elegam (I()8 pares de nucle6tidos) y Drosophila (10 6 pares de nucle6tidos). $e han lIevado a cabo eultivos eelulares y se han establecido mctodos de transformaci6n geniea, se ha aislado un gran nL1mero de mutantes de interes y ahara disponemos de una notable eoleeci6n de clones de DNA gen6mieo. Arabidopsis presenta, al igual que C. elegans, una ventaja importante sabre Drosopllila para los estudios genctieos: como muchas otras plantas can flor, se puede reprodueir como hermafrodita debido a que una sola flor produce tanto las celulas huevo como el polen que las puede fecundar. Por 10 tanto. euando una flor que es heterozigota debido a una mutaci6n letal reeesiva se autofeeunda, una cuarta parte de sus semillas presentara el fenotipo embrionario homozigoto (Figura 21-94). Mediante la utiliwci6n de mut4genos para generar deeenas de miUares de plantas mutantes, e inspeceionando de este modo su progenie. se ha identificado hasta el momenta un total de 50 genes distintos que controlan la formaci6n de los patrones embrionarios de Arabidopsis. Como en Drosophila, los genes del mode· laje pueden agruparse segtin sus fenotipos mutantes homozigotos (Figura 21-95). Vnos son necesarios para la formaci6n de la raIz de la semilla, otros para eltallo de la semilla y otros para el 4piee de la semWa con sus cotillidones. OtTO ripo de genes es necesario para la formaci6n de los tees (ejidos b
1194

Capflulo 21 : MecanJsmos celulares del desarrollo

lMliNl [una citoqulnlnel

o HO

/ ' - 1 / ' - / " - / " , OH

kido giber'lico IGA3, ~glbberellic

ecid~'

[une giberelinel

Figura 21-92 Reguladores del crcdmlento vegetal. F6rmula de una moll!cula representativa de cada uno de los cinco grupos de moleculas reguladoras narurales del credmiento vegetal.

Flgura21.93 Arubldopsu thnlltma. Esla pequei'la planta pertenece a la familia de la moslaza (0 crudfera). Es una hierba que carece de valor econ6rnico pero de gran valor para esludios genclicos del desarrollo vegelal. (Cortesfa de Chris Sommerville).

para los animales. Tal como veremos ahara, 10 mismo puede dedrse de los procesos posleriores del desarrollo por los que se genera una Oar.

Los genes selectores home6ticos definen las partes de una flor 76 Los meristemos tienen que elegir entre alras opciones de desarroUo ademas de elegir entre permanecer en estado latenle a iniciar el crecimiento; dichas apdanes tambi~n se ven inlluidas frecuenlemenle por el eniomo. La decisi6n mas importante es la de fonnar una nor (Figura 21-96). EI cambio que se produce a partir del desarrollo meristematico hacia la formaci6n de la flor esta desencadenado, normalmente, par la Iliz. Mediante unos mecanismos poco conocidos basados en la absord6n de la IlIz por medio de lInas prolefnas especfficas denominadas filOcromos, las cclulas del meristemo son capaces de modificar su paa6n de expresi6n genica en respuesta a un cambia en la longitud del dfa, y de esta forma, de experimentar el cambio de estado que marca el inicio el desarrollo de la nor. A traves de este cambio de su estado, el meristemo apical abandona sus opciones de continuar el credmiento vegetativo y apuesta su futuro en la producd6n de gametos. Sus cclulas se embarcan en un estriclo programa de crecimiento y diferenciad6n fin ita: por media de

Mmilla

pl'nlula

m~'"

1-

M(lor de ee!ula. mUlanln d&l

me,iltamo

vai,... de _ina. procedentn de:

sector mutanta

5eCIor no mutanl.

generaclon F1

I 0 .•

25'" +/..

\ gllnllraci6n F2

EI desarrollo vegelal

L--> 15mm

Flgura21-94 Producd6nde mulantes de Arobidopsls. Una semil1a, que conliene un embri6n pluricelular, se lrala con un mUlageno qufmico y se deja que se convierla en una plama. En condiciones IlQnnales, esta plama scra un mosaico de clones de cclulas portadoras de varias rnutacioncs inducidas. Norrnalmctlte. cada flor producida por eSla planta cSlar;1 compuesta por c~lulas que penenezcan al mismo cion, todas eUas p<madoras de la misma mUlaci6n, m, en fonna helerozigola (m/+). La aUIofecundaci6n de Dores individuales a naves de su propio polen gene~ vainas de semillas, cada una de las euales comendni una familia de embriones la milad de los cuales, per tcrmino medio, semn heterozigolos (m/+), tula cuana pane seran homozigotos mutantes (mlm), y una cuana parte seran homozigotos de lipo salvaje (+f+).

1195

IAI

una modificaci6n de los mecanismos ordinarios que generan las hojas. se fannan sigujendo un orden muy preciso una serle de apices especializados

0

verticilos

-habilualmenle primero los sepalo$, luego los petalos, mAs adelantc los estam· bres portadores de las anlcras que contienen el polen, y finalmCnlC los piSlilos que conLienen lasdos celulas huevo (vease Panel 21-2, pag. 1189). AI final de este proceso ha desaparecido el meristemo, pero entre su progenje ha producido reJulas germinales. Las series de hojns modilicadas que forman una nor pueden comparase con las series de segmentOs corporales que forman una mosca. En las plantas, igual que en las moscas, se pueden encontrar mutaciones home6ticas que conviertcn una parte del patr6n al caracter de Olra parte. Los fenotipos mutanl.es puedcn agmparse en Ires clases (Figura 21-97) en las que se modifican conjumos de 6rganos diferenles pero solapados. ESla primera clase, i1uslrada por la mUlante apetala2 de Arahidops;s, lienen los dos verlicilos externos lransformados: los sepalos est<1n transformados en pisliJos y los petalos en estambres. EI segundo tipo, ilustrado por apetala3, liene los dos verticilos medio transformados: los petalos estan converlidos en sepalos y los eslambres en pistilos. EI tercer tipo, ilustrado par ag(II1JQIIs. tlene sus dos verticilos cenlrales Iransforlllados, con una

Figura 21-95 PIMtulas mutantesde Ambidopsls. Comparaci6n enlre una pllinlula nonnal W y cualrO tipos de mutante$ (H·E) que carecen de alguna parte distinta del patr6n apicobasal; (B) presema estruclUras que carecen de su a~ndice, (e) presema apendice y rafz pem carece deltallo que las une, (O) carece de ra£z, y (E) ronna los tejidos del tallo pem presema carencias en ambos eXlremos. las pllinlUlas han side uansparenladas para moslcar los tejidos vasculares de su interior (puntas clams). (SegUn U. Mayer et 31., Nalllre 353;402-407, 1991. 01991 Macmillan Magazines Ud.)

Figura 21-96 Estructura de la nor de Ambidopsis. (A) FOlograffa. {Ill Dibujos. (e, Imagen esquemtllica de una secci6n transversal. EI plano btlsico, iluSlrado en (C), es comun a la mayorfa de las plantas dicotiled6neas can flares.

pistilo estamb,e 1>611110

IAI

1196

lBI

Capflulo 21 : Mecanismos celulares del desarroUo

Ie,

(A)

Figura 21-97 Flores deArabJdopsis que presentan mutadones home6tk:a5. (A) En agamous, 105 eSlambres se convienen en petalos y los pistilos en el merislemo noral; {Ol en apetala3, los pelalos se convienen en sepalos y 105 CSlambres en pislilos: (Cl en apelala2, los sepalos se conviertell en pistilos y los pClalos en estambres. Qtro gen, pistil/ma, presenla un fcnotipo mutanle parecido a In aperalas. de este modo es posible idcntificar las Ires c1ases funcionales de genes seleclores home6ticos. (0) En una mUlante triple que carezca de las tres funciones, todos los 6rganos de la nor se convierten en hojas. (A-C, cortesfa de Leslie Sicburth: D, cortesfa de Mark Running.)

Ie)

consecuencia mas drAstica: los estambres estan convertidos en pClaJOS. la flor

carcee de pistilos y en su lugar las cclulas cenuaJes se campanan como un me· risterna floral, eJ cual empieza de nuevo todo el proceso del desarrollo, generando otro conjunlo an6malo de sepalos y pl!talos que anida denlco del primer meristerno y. polcncialmenlc, otro canjunlo anidado dentro del segundo meristemo, y asf indefinidamentc. Estos fenotipos identifican tres c1ases de ge-

nes selectorcs home6ticos, los cualcs, al igual que los genes selectores home6ticos de Drosop"aa, codifican protcfnas reguladoras de genes. Estas protefnas definen las difcrcncias del cstado celular que O!.organ a las difcrentes partes de una flor normal sus distintos caracteres. La hibridaci6n ill sitll confirma que los genes se expresan segun los patrones previstos de acuerdo con esta interpretaci6n (Figura 21-98). En una mutante triple en la cuallas tres funciones genicas estan ausentes. se obtiene en lugar de una flor una sucesi6n infinita de hojas anidadas de forma compacta. Par 10 tanto las hojas representan un Mestado bttsico~ en el cual no se expresa ninguno de estos genes selectores home6ticos, mientras que los otros tipos de 6rganos son el resultado de la expresi6n de genes en combinaciones diferentes. Con la boca de drag6n Alltirrhillllm majlls se han lIevado a cabo estudios similares a estc y se ha identificado un conjunto parccido de fenotipos y genes. La secuenciaci6n de genes revela que, a pesar de la larga distancia en 13 evoluci6n existente entre Amirrllinum y Arabidopsis, los fellotipos home6ticos correspondientes surgen a panir de mutaciones en genes hom610gos: las plantas, como los animales, han conservado sus sistemas de genes sclectores home6ticos. Otra vez, el conjunlo de estos genes parece haber surgido por duplicaci6n genica: varios de elias, necesarios en los diferenles 6rganos de la flor, tienen secuencias c1aramente hom610gas. No son de la c1ase homeobox pera eslttn relacionados con olra familia de prote{nas reguladoras de genes (la denominada familia MADS) presenle en levaduras y venebrados. £1 desarrollo vegetal

1197

,r vertieilo2 ""alo (ab)

vertieilo 3 eMambra (be) • gen a laper.I.Z)

~ilo.

axpretedo en el meristemo

pialilo (el

• gen b (apetlr/.t3) axpr..edo en el men.ttmo

'"' gen c (agoamouII exprelsdo en el meri.ttmo

flornormal

mll(i'lemo floral

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...rtieilo3 pistilole) vartieilo 1 "palo (a)

vartiello. pillilo (e;)

meristemo floral ml/Ulnle

'"

fIor mulanle

Las investigaciones sobre la genl!tica molecular del desarrollo vegetal acaban de comenzar. Par el momenta, no se canace casi nada, por ejemplo acerca de los sistemas geneticos responsables de la comunicaci6n local celula-celula ni sabre la sefializaci6n pasicional en la formaci6n del palr6n vegetal. Sin embar· go, ya est3. claro que plantas yanimales, a pesar de sus diferencias. han encontrado de forma independiente soluciones muy similares a muchos de los proble· mas fundamentales del desarrollo pluricelular.

Resumen El daarrollo tk una planta conflores, igual queel de un animal, empieza ron In divisi6n de un hueoo fecundodD fomullulo un embri6n ron una organiztu:i6n polarizada.: la parte apical del embri6n forma primero el brote, Ia parte basal (Ia ralz) y la parte media (el lallo). Primero la divisi6n celular se da a 10 largo de tado el cuer· po del embri6n. No obstante, a medidn que el embri6n crea, In adicron de nuewu celulas queda restrlngida a regiones pequenas denominadas meristemos. Los me· ristemos apicales, sltuados en el extremo del brote y en el de In raiz, persisten duo rante toda In vida de In planta, concedlindole In capacldad de crecer secuencial· mente aiiadiendo ",MWU parUs del cuerpo a su perlferin. lIabitualrrumte, el brole genera series repetltlwu de m6dulos, cadn uno de los eludes consta de un segmento tk tallo, una hoja y una yema axilar. Una yema a:cilar es un nueoo meristemo en potenckl, capaz de dar lugar a un rama lateral; el entorno puede rontrolar el dna· rrollo tk In planta regulando la aaivaci6n de sus yemas. lAs sennles del entorno 1198

Capftulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 21·98 ExpresJ6n de los genes selectores home6t1cos en la Oorde Ambidopsh. IA) Dlagrama de los patrones nonnales de expresi6n de los tres genes cuyos fenotipos mutantes se ilustran en la Figura 21-97. Los tres genes rodifican protefnas reguladoras de genes. EI sombreado de color en la nor nos indica los 6rganos que desarrolla cada verticilo del meristemo, 10 cual no implica que los genes selectores home6ticos esu!n aun activos en este estadio. (B) Patroncs de una mulante en la que el gen apetalaJ es defectuoso. Debido a que el caracter de los 6rga.nos de cada verticilo se define por el conjunlo de genes selectores home6ticos que expresan, los eslambres y los ~talos se convierten en ~palos y pistilos. Las consecuencias de carencias de un gen de dase a. como apetala2. son un poco mas complejas: la ausencia de un producto gl!:nico de c1ase a pennile que el gen de c1ase c se exprese tanto en el exterior como en el interior de ambos vertic\los, haciendo que estos vertic\los eXlcriores se desarrollcn como pistilos y estambres, respectivamenle. La deficiencia de genes de c1ase c impide que la regi6n central sufra la diferenciaci6n tenninal como pistilo. de fonna que continua su crecimiento como meristemo generando cada ve.z mas sepaJos y petalos.

-

1I)l6n Idei<M' ITWtIOl de 1 mm II m'sde lmm de longitudl

-

,A!~ 1l:L"'::c.-,~ dendrillli /lIClben I.. sel\alel de errtrlldll de I.. sinapsil

aoma celullr

'--'

lallamal terminllel de 101 l)loneS establecen -,,".:i'~ linapliliobre lis dlulas diana

25 11m

Flgura21-99 NeuronaHplcadeun verlebrado. las flechas sei'lalan las direcciones en que se transmilen las senales. La neurona representada pcnenece a la retina de un mono. Las neuronas mas largas y grandes de un humano liene una extensi6n de cerea de I mill6n de ~m y su ax6n un diametro de 15 J.lm. (llustraci6n de la neurona de B.B. Boycott en Essays on the Nervous System IR. Bellairs y E.G. Gray, eds.). Oxford, UK: Clarendon Press, 1974.)

tambien p"eden pTOlJOClIr que el merntemo apical vase de formar IlOjns a fornwr flores. Senales de largo aleance mediadas par J'OfflIOlias vegetares COOrdillaJl los procesos de este desarrollo que fienell '''garen partes disftJIltes de la planta. Sin embargo, la organLtacldn illuma de cadn m6dulo de In planta estA COlltrolatta par mecanismas de fornuu:idn de patrones nmy estrlefas, andlogos a los que controlnn el desarrollo animal. Estas mecallismos ac:tdnll en las proximidndes del mernlerno apical, dom/e las posieiolles relativas de los rlUU"umtos foJinres y otros OrgallOS esrAli inicialmenle mapados a eseala mic:rosc:6pic:a. E:l patron de IIOjas modific:adas -sipalos, pilnlos, estambres y pistilos- de IIIIi1 /lor se establecen de forma similar. La base gelletica del patron defomuu:iOn de las plantas pltede alliIlLtarse del mismo modo queel de los allimales. La pequeiia IIierba Arabidopsls lhallana es muy utilLtadn como "planta mode/o" ell lales estudios. Los genes que col/troltUl la orgtlllizac:ion del embriOlI, alllilogos a los gelles de polaritlad de/ Jwevo y los genes de segmentllc:loll de Drosophila, puedtm ser Jdentificados. La sec:lleneia de las partes ell ,ma flor estA colltroladn por genes $i!lectores JlOmeOlicos estrec:llilmellte alIAfogos (aunqlle no IlOmologos) II los de los animales.

EI desarrollo neural 77 Las celuJas nerviosas, 0 neuronas, son unas de las m<\s antiguas de lodos los Iipos de celulas animales especializadas, y son tan imporlantes para las medusas y ant~monas marinas como para los gusanos. las moscas a los humanos. Su estructura es distinta a la de cualquier otro tipo de celula: los problemas que plantea el desarrollo del sistema nervioso no estan presentes en otros lejidos. Por en· cima de todo, 10 que sorprende m<1s de una neurona es su forma enormemente extendida, farmada par un largo ax6n y dendritas que cOllectan con olras celli' las por medio de las slnapsls (Figura 21-99). El principal desaffo del desarrollo neural consiste en explicar c6mo crecell los axones y las dendrilas, c6mo en· cuentran sus compaiieros adecuados. y c6mo establecen sinapsis seleclivas can elias generando una red funcional (Figura 21·1 OO). Muchos de los componentes caracterislicos del sistema nervioso -los diver· 50S tipos de neuronas, celuJas sensoriales y musculares- se originan en lugares del embri6n muy direrenles e inicialmenle eslern desconectados entre sf. Asi

Figura 21-1 00 La complejo orgnnlzoci6n de las conexlones de las cl!lulns nerviosas. Este dibujo scmicsquematico i1ustra una secci6n transversal de una pcquenn parte del cerebro de mamifero -el bulbo olfativo de un perro, imprcgnado con In lecnica de Goigi. Las manchas ncgras son neuronas: las Ifneas dilgadas son axones y dendritas, mediante las cuales se inlerconCClan varios eonjuntos de neuronas siguiendo reglas muy precisas. (Segl1n C. Golgi. Ril'. sper.frelliat. Reggia.-Emilia 1:405·425, 1875: repro
El desarrollo neural

1199

cre<:imiento de eltones VdentritllS

r,finemiento de In coneltiones sin'ptius

• --•

pues, durante la primera fase del desarrollo neural (Figura 21-101), se desarrolIan las diferentes partes del sistema neural, segUn sus programas locaJes, que actuan de acuerdo a los principios de diversificaci6n celular comunes a otros lejidos del cuerpo que ya hemos visto. La fase siguieme implica un tipo de monogenesis exclusiva del sistema nervioso: se establece, a 10 largo de rUlas especfficas, un conjunto provisional pero ordenado de conexiones entre las diferentes partes del sistema nervioso, mediante el crecimiemo de axones y dendritas. gracias al cual pueden empezar a interactuar. En la tercera y ultima fase, que se prolongar:1 en la vida adulta, las conex..iones se ajustan y perfeccionan a traves interacciones entre los diferentes componentes, mediante un mecanismo que dependc de las sef'lalcs clectricas que transmiten y reciben.

Las reservas de neuronas generadas en el inicio del desarrollo neural no se reemplazanin posteriormente78 En lodos los animates, el sistema nervioso se desarrolla a partir del ectodcrmo. Como hemos vista en este capftulo, en los vertebrados, ell los cuales nos ccntraremos, el sistema nervioso deriva principalmcntc dc dos gnlpos de celulas -las celulas del woo lIeural (una invaginaci6n del ectodermo) y las celulas de In cresra nel/ral (una poblaci6n de celulas que se liberan del ectodermo neuronal y mi· gran hacia otras regiones del embri6n). El tubo neural forma el sislema nervioso central (Ia medula espinal y el cerebra, incluyendo la retina del ojo), micntras que la cresla neural da lugar a la mayorfa de las neuronas y a las celulas de sosten del sistema nervioso periferico (Figura 21·102).

Flgura21-IOI Laslresfasesdel desarroUo neural.

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creste naural

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Flgun 21-102 Dlagrama de un embrl6n tempnrno de polio 12 lh dfas), que muestra los orlgenes del sistema nervioso. EI tubo neural (en wrde claro) ya esta cerrado, salvo en el extremo de su cola. y yare imemamenle bajo el ectodenno. al que pertenecfa originalmente (vease Figura 21-10). La cresla neural (en rojo) yace dorsalmenle bajo el eclodermo, denrro 0 encima del tuba neural. Ademas, los placodos (en lJerde DSCUro). engrosamientos de la superficle del ecuxienno de la cabeza, dan JUgal a algunas celulas lransduetoras sensoriales y neuronas de esta regi6n. incluyendo las de la nariz y del aida. Las celulas de la retina del ojo. por el comrario, t.ienen su origen en el tuba neural.

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Capftulo 21 : Mecanismos celulares del desarroUo

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Flgura21.I03 Fonnacl6ndellubo neural. E1eclronmicrografia de barrido que muestra una secci6n transversal del tronco de un embri6n de polio de dos dfas de edad. E1lubo neural est;i a punto de cerrarse y separarse del eclodermo; en este estadio conSla (en el polio) de un epilelio de un grosor de una sola aHula. (Cortesfa de Jean Paul Revel).

Ellubo neural. que Irataremos mas profimdamente. consta inicialmente de un epitelio de una sola capa (Figura 21-103) que genera tanto las neuronas como las celulas de sosten. denominadas gJiales, es decir las celulas del sistema nervioso central. Durante el proceso se transfonnan formando una estructura m:is gruesa y compleja can muchas capas de celuJas de distintos tipos. Debido a que las neuronas ya diferenciadas no se dividen, se puede asignar un ~nacimiento~ a cada lIna de elias. definido como el momento en que ocurre la mitosis final que generan\ la neurona a partir de una celula precursora de Ileuronas en divisi6n. Tanto en los vertebrados superiores como en los inverlebrados. todos los nacimientos de las neuronas de un tipo determinado generalmente ocurrcn en el Iranscurso de un per(odo eSlrictamente limitado. tras el eualno se producir:in m:is neuronas de eSle tipo. Cada regi6n del tuba neural cn desarrollo ticnc Sll propio programa de divisiones celulares, y las ncuronas can momentos distintos de nacimientos normalmente tendr:in fundones distintas. Las cclulas neuralcs madre no acoslUmbran a persistir una vez completada la producci6n de cclulas nerviosas, por 10 que las poblaciones de celulas nerviosas sola mente se podn'ln regular disminuyendo de numero, mediante la muerte ceJular, como veremos ml'is adelante.

EI momento y ellugar de nacimiento de una neurona determinanin sus conexiones79 Antes de emitir al exterior Sll ax6n y sus dendritas, la neurona inmadura 0 su precursora acostumbran a migrar desde su Jugar de nacimiento y se establecen en alguna otra loealizaci6n. Las celulas gliales muy a menudo proportionan una via para la migraci6n en el sistema nervioso central. Por ejemplo. el tubo neural de un embri6n de un vertebrado contiene un annamn de celulas gliales radiales. Cada una de estas celulas se extiende desde el interior del tubo hacia su superficie exterior, una distancia que en la coneza cerebral del cerebra en desarrollo de un primate puedc !Iegar a representar hasta 2 em. Las futuras neuronas atraviesan sus tlltimas divisiones celulares eerea del lumen del tubo neural y enronees se trasladan hacia el exterior arrastraudose sobre las celulas g1iales (Figura21-104). El desarrollo neural

1201

[ Flgura2l-l04 Migracl6nde neuronas Inmaduras a 10 largo de las celulas g11a1es radlales. Los diagramas sc basan en reconstrucciones declUadas a partir de 1a corteza cerebral de un mono (parte dellUbo neural). Las neuronas nacen cerca de la superficie luminal interna dellUbo neural y migran hacia el exterior. Las celulas gliales radiales pueden considerarse como las celulas supervivienlcs del epitelio columnar original del tuba neural, sorprendentemente estiradas como el grosor de la pared del tubo. (SCgUn

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Sucesivas cohortes de celuJas migrantes, nacidas en momentos distintos, se establecen en posiciones distintas. Por ejemplo, en la corteza cerebral, las neuronas estan dispuestas en capas segun su momenta de nacimiento, como resultado de una migraci6n en la que las celulas nacidas mas tarde adelantan a las que nacieron antes. Gracias al trasplanle de celulas entre embriones j6venes yembriones maduros se puede demosirar que las diferentes opciones de futuro ya estaban tomadas antes de iniciar la migraci6n; reflejan diferencias entre los carneteres intrfnsecos de las celulas producidas en momentos distinloS -difercnclas que influin1n tambien en las conexiones sinapticas que se forman\n posterior· mente. De eSle modo, en la corteza cerebrallas celuJas nacidas primero (capas inlernas) enviaran sus axones hacia el exterior de la corteza, mientras que las celulas nacidas mas tarde (capas extemas) enviaran sus axones hacia las regiones del interior de la corteza. La relaci6n enlre el momento del nacimiento y las conexiones de los axones se manliene incluso en ratones mutantes cuyas migraciones son anormales e invierten las posiciones finales de las celulas naeidas prime· TO can las que 10 haecn posteriormente, 10 que confirma que las conexiones reflejan el carncler intrfnseco de las ncuronas, mas que su localizaei6n final (Figura 21·105). No menos importante que el momenta de nacimiento dc una neUTOna es el lugar en que 10 haec. Las celuJas de diferentes regiones del tuba neural tienen valores posicionales diSlintos que controlan las conexiones que formaran. Estas diferencias dependienles de la posici6n son apreciables tanto en el patr6n de expresi6n de los genes HOI, que ya hemos visto, como en un gran grupo de alTOS genes que codifican protel'nas reguladoras de genes y otras mohkulas reguladoras. Se conacen muy pocos de los mecanismos que generan las diferencias mo· leculares entre la futuras neuronas, pero los que se conacen parecen ser muy parecidos a los mecanismos del pan6n de fonnaci6n que vimos anteriormente. Sin embargo, la cuesti6n que hemns de afrontar ahora es otra: iC6mo actuan las 1202

Capflulo 21 : Meca.nJsmos celulares del desarroUo

CORTEZA DE RATON

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REELER

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Flgura21-I05 Comparacl6nentrela dlsposlcl6n de capas de neuronas de la corteza de ratones nonnales y' reeler. En el mutante reeler una anoma]{a en la migraci6n celular provoca una inversi6n aproximada de la relaci6n habilUal entre el momento del nacimiento neuronal y la posici6n de las neuronas. Sin embargo las neuronas emplazadas de fonna incorrecla se diferencian y realizan las conexiones adecuadas scgt'in el momento de su nacimiento.

oaeidas, equipadas con sus marcadores especfficos.

para establecer un patr6n de conexiones bien ordenado?

Cada ax6n 0 dendrita se extiende gracias a un cono de crecimiento situado en su extremo17• 1lll Por regia general. los axones y las dendrilas.empiezan a desarrollarse a panir del cuerpo de la ctHula nerviosa poco despu~ de que el soma celuJar haya alcanzado su localizaci6n final. La secuencia de los procesos que se producen se observ6 originalmenle sabre tejido embrionario inlaclo medianle el melOdo de impregnaci6n de Golgi (vease Figura 21-106). Esta tecnica. y orros melOdos que se desarrollaron posterionneme. han revelado un engrosamiento irregular y erizado en el extremo de cada prolongaci6n en desarroUo de la celuJa nerviosa. Parece ser que esta estructura. que se denomina cono de creclmlenlo, se arrastra a traves del tejido de su a1rcdcdor. EsIo incluye la maquinaria que produce el movimienlo y el mecanismo que dirige el extremo de cada prolongaci6n por el camino adecuado. La mayor parte de los conocimientos de que disponemos sobre las propiedades de los canas de crecimiento procede de estudios realizados en cultivos tisulares y celulares. Es posible observar c6mo una neurona empieza a extender sus prolongaciones: primero son todas iguales, hasta que uno de los conos de crecimiento acelera su prolongaci6n bruscamente, identific~ndose esta prolongaci6n can el ax6n y presentando el conjunto de protefnas especfficas del ax6n \

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El desarrollo neural

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F1gura21.106 Losconosde crecimlento de la medula esplnal en desarrollo de un embrl6n de polio de 3 dfas. EI dibujo muestra una secci6n transversal imprcgnada con la lecnica Goigi. Aparentemente la mayorfa de las neuronas dene inicialmente una unica prolongaci6n alargada: el futuro ax6n. Los COIlOS de crecimiento de las interneuronas permanecen dentro de la mMula espinal, los de las motoneuronas salen de ella (emprendiendo su camino hacia los muscu!os) y los de las neuronas sensoriales crcecn hacia interior de III medula espinal desde el exterior (donde se hallan sus cuerpos celulares). Muchas de las celulas de las regiones mas centra1es de la medula espinal embrionaria aun estan proHrerando y no han empezado a diferenciarse como neuronas 0 celulas g1iales. (De S. Ram6n y Cajal, Hislologfa del sistema nervioso del hombre y los venebrados. Paris: Maloine, 1909-1911; reeditado, Madrid: C.S.I.c., 1972.)

1203

dendrila

IIOma celular

axon

cono da c.ecimiento

IAI

10"m

(Figura 21-107). EI contraste entre el ax6n y las dendritas. establecido en este estadio, provocarli que ambos tipos de prolongaciones crezcan hacia direcciones distintas, siguicndo caminos difcrentes, y asf desempenando funciones distintas en In formaci6n de las sinapsis. La distinci6n entre el ax6n y In dendrita no es a menudo flieU de observar en una neurona aislada en un euilivo, y es eonveniente referirse a ambos tipos de prolongaciones como: lIeuritas. EI cono de crecimicnto silliado en el eXlremo de una neurita de crecimiento rnpido tipico, avanza a una vclocidad de 1 mm par dfa. La nClirita consta de una extensi6n ancha y aplanada como la palma de una mano, can numerosas y largas microespillas 0 jilopodios que se eXlieoden como dedos a partir de ella (Figura 21-108). Estos nJopodios pcrmanecen en continua aClividad: unos se relraen hacia el conn de crecimienlo mientras que olros se a1argan, ondulandose y adhiriendose al substralo. Las "membranas~ 0 "velos" exislenles entre los filopodios (onnan lamelipodios. con una membrana fruncida. Todas eslas caracterfsticas. at iguat que la configuraci6n intema del citoesqueleto, sugieren que el conn de crecimienlo avanza arraSlrandose de un modo muy parecido al del borde anteribr de una celula como WI nelltr6nJo 0 un fibmblaslO, como vimos en el Capitulo 16. EI cono de crecimiento explora con sus filopodios y lamelipodios las regiones del medio situadas en posiciones mas avanzadas, en todas direcciones. Si eSlas prottlberancias enlmn en contaclo con una superficie poco favorable. se relraen; si entran en conlaclO con una superficie mas favorable, se mantienen eSliradas, orientando la extensi6n de todo el cono en esa direcci6n. De esta forma el conn de crecimiento se pllcdc glliar medianle sutiles variaciones de las propiedades de superficie del substrata sabre el que se desplaza.

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Flgura21·t07 Formad6ndeaxones ydendrltas en cuhlvo. Se ha aislado una neurona joven del cerebro de un mamrfero y se ha colocado en un cullivo para su desarrollo. donde emilint prolongaciones. Una de C5tas prolongaciones, el futuro ax6n, ha empezado a crecer mas Iipidamente que las Olras (las fulUras dendrilas) y se ha bifurcado. tAl Fotograffa en conlrasle de fases; (8) patron de imprcgnaci6n con faloidina nuorescente, que se une a los filamentos de actina. La actina se concenlra en los extremos de las prolongaciones de los conos de crecimicnto, que son muy activos extendiendose y en otras actividades de los lamelipodios. (Cortes{a de Kimberly Goslin, seglin Z.W. Hall, An Introduction 10 Molecular Neurobiology. Sunderland, MA: Sinauer, 1992.)

Flgura2t.l08 Conosdecreclmlento neurnl. (Al E1eclronmicrografra de barrido de los canas de crecimicnto prcscnles en el extrema de una neurita emil ida por una neurona simplilica en cultivo. En eSle caso. un eono de crecimienlO se ha divido en dos. Observense los numerosos filopodios y el aspecto tenso de la neurlta, debido a la tensi6n generada por el movimiento hacia adelante de los conos de crecimiento. que a menudo son los unicos puntos de adhesi6n finne al substrato. (8) E1ectronmicrograffa de barrido del cono de crecimiemo de una neurona sensorial in vivo, arraslmndose por la superficie imema de la epidennis de un renacuajo de Xenoplls. (A. de D. Bray, en CeU Behaviour IR. Bellairs. A. Curtis. y G. Dllnn. cds.l. Cambridge. UK: Cambridge University Press. 1982; D, deA. Roberts, Brai/l Res. 118:526-530, 1976.)

1204

Capftulo 21 : Mecanlsmos celulares del desarrollo

EI cono de crecimiento conduce in vivo a la neurita en desarrollo a traves de una via definida con precisi6n 81 -34 En general en los animales vivos los conos de crecimiento se desplazan hacia sus destinos a 10 largo de rutas establecidas, sirviendose de nlliltiples seiiales para encontrar su camino. Muy a menudo toman rutas que ya han sido ulilizadas anteriormcntc por otras neuritas. siguiendolas mediante gufas de contaCla. Como consecuencia de ello, las fibras nerviosas de un animal adullo suelen eSlar agrupadas formando haces compactos y paralelos (denominadosfasciculos 0 tractos fibrosos). Es probable que el avance de los canas de crecimiemo a 10 largo de los axones eSte mediado por moleculas de adhesi6n celula-celula homofllicas -glucoprolefnas de membrana que capacitan a las relulas que las expresan para adherirse a otras celulas que lambien las expresen. Como vimos en el Capilulo 19, dos de las dases mas importames de eSlas moleculas son las que pertenecen a la superfamilia de las innllmoglobulinas, como N-CAM, y a la familia de las ClUU,erillas dependientes de Ca2', como la cadherina N. Genera.lmente exislen miembros de ambas familias en las superficies de los conos de crecimiemo. de los axones y de muchos otros tipos celulares sabre los que se arraSlran los conos de crecimienlo. induyendo las celulas gliales del sistema nerviosa cemral y las celulas musculares de la periferia del cuerpo. Los conos de crecimiento tambien migran sabre componentes de la matriz extracelular, especia.lmeme la laminina. ala cual se adhieren mediante receptores de la matriz de la superficie celular de la familia de las itllegrillas (lratados en el Capitulo 19). En algunos casas se puede demostrar la importancia de lIna molecula de adhesi6n cclula-celula 0 celula-matriz simplemente bloqueando su funci6n con un anticuerpo y observando los traslOrnos causados sabrc el crecimiento del ax6n. Sin embargo. por regia general un cono de crecimienlo utiliza varios sistemas de adhcsi6n en sus migraciones. y si uLilizamos anlicuerpos COntra uno solo de ellos, los cfetloS seran mfnimos; 5610 cuando se aplican mulLiples anticuerpOS. de modo que se bloqueen lodos a la vez. se retrasa seriamente el viaje del cono de crecimienlo. En principio, diferenlcs combinaciones de moreculas dc adhesi6n proporcionan una gran variedad de propiedades de superficie de los canas de crecimiento y una sutil y compleja selecci6n de vias de aClIcrdo con las combinaciones dc moleculas presentes en las superficies de las celulas quc sc cncuenIran a 10 largo de la ruta. Todavia desconocemos hasta que punta son sufi dentes las diferentes combinaciones de prolefnas de adhesi6n como N-CAM, cadherina N e integrinas en la membrana del cono de crecimiento para explicar par que algunos callos de crecimiento escogcn una ruta mientras otras escogen otra, 0 por que un conjunto de axones. cuando han Ilegado a su regi6n diana, SOil capaces de generar formaciones ordenadas de sinapsis. Segurameme las molcculas de adhesi6n no son las unicas influencias que participan en estos pracesos. Los COlllaClOS que un cono de crecimiento establcce can las superficies celulares y can la matriz pue· den dar lugar a seftales intracelulares que, par ejemplo, pueden inhibir activamente cualquier avancc. Substancias difundidas a traves del medio eXlracellilar tambien pueden dar lugar a gradientes que proporcionen lin gufa. Por ejemplo, en la medula espinal en desarrollo existe un grupo de neuronas cuyos axones se desplazan ventralmente. hacia la placa bdsica del tuba neural, cruzando. par esta ruta. hacia el Olro lado del tuba. Si colocamos eSlas neuronas en cuJtivo cerca de un explanle de la placa basica. sus axones orientaran de nuevo su crecimiento hacia cl, 10 cual implica que las celuJas especializadas de la placa blisica secrelan moleculas que Lienen un efecto de guIa quimiolactica.

Los tejidos diana Liberan factores neurotr6ficos que conlrOlan el crecimienlo y la supervivencia de las celulas nerviosas SZ,8$ La mayorfa de los tipos de neuronas del sistema nervioso cenlral y periferico de

los venebrados se prodllcen en cantidades excesivas: un 50% 0 inclusa mi1s de esEl desarrollo neural

1205

las neuronas manran poco despues de alcanzar su destino, aunquc su aspcclO sea pcrfcctamcnte normal y saludable hasla el momemo de su muertc. Por ejcmplo, aproximadamente la mitad de todas las motoncuronas que envfan axones hacia el musculo esqucletico mueren pocos dfas despues de entrar en con{'acto con sus celulas muscuJares diana. La muerte a gran escala de neuronas podrfa renejar el rcsultado de una competencia. Cada tipo de celula diana Iibera una ca.ntidad limitada de faclor neurotr6fico especffico, que necesit31l para sobrevivir las neuronas que inervar~n esta diana: aparentemente las neuronas compilen para conseguir esle factor. y las que no consiguen una cantidad suficiente mueren por muerte celular programada. Este proceso aparentemente inuti. properciona una media simple y clegame para ajustar el numero de neuronas de cada tipo al numero de reJulas diana que inervan. EI primer factor neurotr6fico que se identific6. y con direrencia el mejor caracterizado. se conoce simplemente como factor de creclmlento ncrvloso, 0 NGF (de Nerve Growth Factor). Fue descubierto accidentalmente en el lranscurso de unos experimentos en los que se trasplantaron tejidos extranos y tumores a embriones de polio. Los trasplantes de un tumor concreto quedaron excepcional y densamente inervados y provocaron un engrosamiento sorprendenle en algunos gropes de las neuronas perifericas en las proximidades del injerto. $610 se vieron afcctadas dos c1ases de neuron as: las 'lellronas se1lSoriafes y I ~uronas simpdticos (una Sublipo de neuronas perifericas que controlan la .
Gapftulo 21 : Mecanismos celulares del desarroUo

Figura 21·110 Conexlones entreel ojo yel cerebro de un renncunjo de Xenol1w. En este espkimen se ha inyectado una molecula lraUidora en el interior de un oJo (objeto oscuro situado en la iu/llierda), ila sido asimilada por las neuronas presentes, y lransponada a 10 largo de sus axones. 10 cual

pone de manifiesto las rulas que loman hacia el tectum 6plico en el cerebro. (Cones(a de leremy Taylor.)

regulaci6n de las diferentes partes del sistema nervioso de los vertebrados. Se unen a una familia complementaria de protemas receptoras lransmembrana (denominadas asf debido a un proto-oncogen lIamado trk que codifica una de eUas); eslas prOlefnas pertenecen a la cJase de receplOteS tirosina quinasa vistos en el Capitulo 15. Se espera que los factores neurotr6ficos sean titiles en el tratamiemo de las enfermedades neurol6gicas, como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de las motoneuronas (la enfermedad de Lou Gehrig), en las que las neuronas degeneran y mueren inadecuadamente. Ahora volvamos aI problema del modelaje espacial de las conexiones nerviosas.

Los valores posicionales de las neuronas guian la formaci6n de mapas neuronaJes ordenados: doctrina de la especi6cidad neuronal86 NormaJmente las aponaciones de informaci6n procedentes de 6rganos sensoriales trazall mapas 0 se proyectall de forma ordenada sobre las regiones sensoriales del sistema nervioso central, y las salidas de informad6n de las regiones motoras del sistema nervioso central se trazan de manera ordenada sobre los mtisculos. Asf pues, celulas nerviosas similares pen:enecientes a regiones distintas de la retina de un vertebrado emiten sus axones estableciendo sinapsis con neuronas de regiones correspondientes distintas del tectum apnco del cerebro intermedio (Figura 21-110); de la misma forma, motoneuronas similares entre sf de distintas localizadones de la meduJa espinal emiten sus axones hacia diferentes musculos. En principio, los conos de crecimiemo se podrfan canalizar hacia sus varios destinos simple mente como consecuencia directa de los puntos de partida, como los conductores de una autopista multivfa en la que estuviera prohibido cambiar de carril. Esta posibiHdad fue comprobada en el sistema visual mediante un famoso cxpcrimento en los arlOS cuarenta. Si seccionamos cl nervio 6plico de una rana, este se regen era. Los axon'es de la retina creeen hacia el interior del tectum 6ptico, restituyendo la visi6n normal. Si, ademas, en el mismo momenta en que se secciona el nervio se haee girar cl ojo, de forma que las celulas originalmente ventrales de la retina queden en la posici6n de celulas dorsales de la retina, lodavfa se restituirfa la visi6n, pero con una carencia nomble: el animal se comporta como si percibiera el mundo al reves. Las celulas retinales mal emplazadas estableccn concx.iones apropiadas de acuerdo con su posici6n origillal, no con sus posici6n reales (Figura 21-] 11). Evidenlemente las celulas est:1n dotadas de valores posicionales que comienen una memoria de su posici6n original, de modo que las celulas de localizaciones opuestas en la retina son intrfnsecamcnte diferentes. Igual que oeurre en la coneza de un rat6n reeler (vease Figura 21105), es el caracter intrfnseco, y no la posici6n, el que elige In localizaci6n diana. Tal no equivalencia entre neuronas se denomina especlficldad neuronal.

Los axones de lados opuestos de la retina responden de forma distinta al gradiente de las mol&uJas repelentes del tectum87 Una vez han a1canzado el tectum, los axones retinales tienen que escoger, seglin su carncter individual, que regi6n deltecturn inervarAn. Por ejemplo, los axones de la retina nasal se proyectan hacia el tectum posterior, y los de la retina ternporaJ (ellado mas alejado de la nariz) se proyectan hada el tectum anterior. Esta opci6n se controla mediante diferencias del Catacter intrinseco de las celulas de EI desarrollo neural

1207

tectum denK;ho

tectum izquillfdo

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t.. neuron.. de clldll retinll IImitlln lUI IIlConel hacl' el tectum opunto, eltlbl&elendo un mapa orden ado (A-a. V-v, etc.)

lllI secciona et nervio 6ptico denK;ho Y $II hace girer el ojo der&eho; 101 elttremO$ $lIC(:lonadol de 101 1Il<0nei de Ie retina degeneran

diferentes partes del tectum. Asf pues, el mapa neuronal depende de la correspondencia elllre los dos sistemas de marcadores posicionales, uno situado en la retina y el otro en el tectum. Experimentos in vitro con tejidos de embri6n de polio aportan alguna luz sobre la naturaleza de los marcadores del tectum y la forma en que los axones retinales responden ante eUos. Se colocan rragmentos de retina en un cultivo, permiti~ndoles que emitan axones sobre el substrato que estc1 revestido de vesfculas de membrana preparadas a partir de celulas tectales (Figura 21·112). EI revestimicnto estc1 dispuesto en bandas, de forma que se alternan bandas de membrana del tectum anterior con bandas de membrana del tectum posterior. En funci6n de los detalles de la preparaci6n, los axones de la retina nasal pueden no presentar preferencia alguna y crecer indiscriminadamente 0 presentar una preferencia. la adecuada, por la membrana del tectum posterior. Los axones procedentes de la retina temporal crecen de forma consistente 5610 a 10 largo de bandas de la membrana del tectum anterior, en concordancia con su destino habitual. Sorprendemcmente. esto no ocurre porque la membrana del tectum anterior sea particularmente adhesiva 0 atractiva, sino porque la membrana del tectum postcrior es especialmentc repelente: los filopadias que la mcan se colapsan y sc retraen. De hecho, si se hace gOlear sabre cUos una suspensi6n de membrana del tectum posterior, los conos de crecimiento de los axones tcmporales (pero no los nasalesl se colapsan y retroceden. En cl caso de una preparaci6n de membranas del tectum anterior, no se produce colapso alguno. Los efectos peculiares de la membrana del tectum posterior sabre la ct'Hulas de la retina temporal se deben a una g1ucoprotefna inhihidora especffica que estc1 distribuida en gradiente desde la parte posterior hasta la parte anterior del tectum. En otras partes del sistema nervioso se puede demostrar que otras mo-

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lemporal

1208

Cap(tulo 21 : Mecanlsmos celulares del desarrollo

nestl

lei neuronal de cada parte de la retina. II pelllr de ellar Oelplllllldlli. regeneran lUI conelClonel con III milma parte del tectum lila que alIa ban CQn&etedll$ IIntss

Flgura21.ttt Regeneracl6ndelas conexlones entre el ojo y el cerebro de un anflblo despu& de la rotacl6n de un 010. Los axones de cada pane de la relina girada se regeneran y vuelven a conectar con la pane del tectum adecuada a sus posiciones originales en los cuerpos retinalcs. De este modo. por ejemplo,la IlIZ que cae sabre la parte ventral de la retina girada es percibida como si ca)"era sabre la parte dorsal, yel animal percibe el rnundo al rem; si colocamos alimemo por encima de l!:I, el animal se agacha"', elc. Rgura21-112 La selecllvidad de los axones de la retina en creclmlento sobre las membranas del teclum. EI subslrato del cultivo ha sido revestido can bandas allcrnasde membrana preparadas lanto a partir del tectum posterior (P) como del tectum anterior (A): las bandas del tectum anterior son vlsibles gracias ala lmpregnaci6n can marcadores nuorescentes en las bandas vcnicales de ambos lados de la pelfcula. Los axones de la neuronas procedcntes de la milad lemporal de la retina (en crecimiento desde la izquierda) slguen las bandas de membrana del tectum anterior pero evitan las membranas del tectum posterior, mientras que los axones de la mltad nasal de la retina (en crecimiento desde Ia derocha) hacen 10 contrario. Asf pues el tectum anlerior diriere dellectum posterior y la retina nasal de la lemporal, y las direrencias gu{an el crecimlento selectivo de los axones. EsIOS experimentos se han efectuado con cl!:lulas procedentes de un embri6n de polio. (De Y. von Boxberg, S. Diess y U. Scharwz, Neuron 10:345-357,1993.)

leculas de superficic t1enen funciones amflogas a las de los repelellles de los conos de crecimiento. Estos sistemas basicos de marcadores son adecuados para definir la orielllaciOIl anteroposterior en el mapa del tectum 6ptico de la rana. Sin embargo, para trazar el mapa completo con precisi6n son necesarios otros mecanismos complctamente distintos.

Los patrones difusos de las conexiones sinapticas se definen mediante la eliminaci6n de la sinapsis dependiente de actividad 88• 89 En un animal nonnal cl mapa retinotectal es inicialmente confuso e impreciso. Estudios en mnas y peces demuestran que el ax6n primero se prolonga de forma proFusa en el tectum estableciendo multitud de sinapsis distribuidas a todo 10 largo de una ancha area del tectum que se solapa can los territorios inervados por otras axones. Estos territorios se ordenan posterionnente a traves de la eliminaci6n de sinapsis y los retrocesos de las prolongaciones de los axones. Este perfeccionamiento del mapa mediante la eliminaci6n de sinapsis esta regido por dos reglas de competici6n que. actuando juntas, crean un orden espacial: (I) los axones procedentes de regiones distantes de la retina, que tienden a excitarse en momentos altemos. compilen por dominar el territorio tectal disponible, pero (2) los axones de Iocalizaciones vecinas a la retina. que tienden a excitarse al mismo tiempo, inervan territorios vecinos del tectum porque colaboran para mantener sus sinapsis con celulas tectales compartidas (Figura 21-113). EI mecanismo subyacente a ambas reglas depende de la actividad electrica y de la seflalizaci6n procedentes de sinapsis ya establecidas. Si se bloquean todas las acciones porenclales por medio de una toxina que se une los canales Na' reguJados por voltaje, la ellminaci6n de sinapsis se inhibe y el mapa continua conFuso. EI fen6meno de la ellmlnacl6n de sinapsls dependlenfe de acllvldad se produce en practicamente todas las partes en desarroUo del sistema nervioso de un venebrado. Primero. se establecen muchas sinapsis y se distribuyen sobre una regi6n diana muy amplia; luego el sistema de conexiones se reduce a traVes de procesos competitivos que dependen de la actividad electrica y las scflales 51napticas. EI proceso de eliminaci6n de sinapsis no tiene nada que vcr con la ellminaci6n del exccso de oeuronas a traves de la muerte celular. ya que ticne lugar despues de que el perfodo la muerte neuronal normal haya finalizado. Los mecanismos celulares de la eliminaci6n de sinapsis comienzan a ser comprendidos gracias a experimenros efectuados sobre la inerv
Figura 21-113 El mapa retJnotectal!le acaba de perflJar mediante la eUmlnad6n de ,"Inapsls. Inicialmente el mapa es confuso porque cada ax6n de 13 retina se ramifica inervando amplias zonas de uoa ancha regi6n de tectum. solapando las regiones inervadas por ouos axones retinales. EI mapa se acaba de perfilar mediante la e1irninaci6n de sinapsis. En los lugares en que los axones de partes distantes de la retina eslablecen sinapsis en la misma oHula teclal. se produce una compelencia, y las conexiones eSlablecidas por uno de los axones desaparecen. Pero los axones procedenles de celulas que sean vecinas a In retina cooperan, manteniendo sus sinapsis sobre celulas del tectum compartidas. As! l>Ues, cada ax6n retinal termina inervando un territorio tectal reducido, adyacente y en parte superpuesto al territorio inervado por axones procedentes de localizaciones vecinas a la retina.

neurona8 lectele8 neuronn de la relina

aKon81 de 1. relina

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MAPA INIOAl CONFUSO: CONEXIONES OIFUSAS

E1 desarrollo neuronal

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MAPA FINAl PERFllADO: CONEXIONES OlFUSAS EUMINAOAS

1209

r'llturo"a

FIBRA MUSCULAR ESTIMULADA REPETIDAMENTE MIENTRAS LA NEURONA PERMANECE EN REPOSO

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fibril muscular"

LA SINAPSIS SE DEBILITA

LA SINAPSIS PERMANECE FUERTE

culo esqueletico en embriones de vertebrados, donde habitual mente cada celula muscular recibe sinapsis de varias neuronas distintas, aunque al final s610 sea una la que inervara. Para el anatisis in vitro de este mecanismo se utilizan cocultivos de motoneuronas y celulas musculares. Se puede identificar una celula muscular inervada por una I1nica neurona y entonces excitar directamente la celula muscular mediante un goteo constante de acetilcolina mediante una microaguja cercana de su superficie. Asf, la sinapsis establecida por la neurona sobre' la fibra muscular estani permanentemente debilitada, a menos que se estimule electricamente a la neurona de modo que se active en sincronfa con el goteo de acetilcolina sobre la fibra muscular; en este caso la sinapsis permanece en buenas condiciones (Figura 21-114). EI debilitamiento, 0 represi61l, de la sinapsis refleja un cambio en la zona presimiptica, que provoca que el extrema del ax6n Iibere menos neurotransmisor cuando la neurona se activa. Es faeil de demostrar que la represi6n sinaptica depende de la entrada de Ca 2+ en el ml1sculo a traves de los canales cati6nicos asociados con los receptores de aceti1colina. De algl1n modo, un incremento brusco de la concentraci6n intracelular de Ca 2+ hace que las celula postsinaptica rechacen los terminales ax6nicos que esrablecen sinapsis sobre su superficie en las inmediaciones, perc los tenninales ax6nicos que acaban de ser activados son inmunes a este rechazo. Estos y OlroS resultados sugieren una interpretaei6n seneilla de las reglas de competencia que rigen la eliminaci6n sinaptica en el sistema retinotectal. Los axones de regiones distantes de la retina no se activan al mismo tiempo y par tanto compiten entre sf. Cuando un ax6n se activa, la(s) sinapsis establecida(s) par otro ax6n sobre una celula diana tectal compartida se debilita(n) hasta el punto en que uno solo de los axones quedara al mando de la celula. Por el conaario, los axones de celulas vecinas de la retina tienden a activarse sincr6nicamente, y por 10 tanto no compilen entre sf sino que mantienen las sinapsis de las celulas tectales compartidas, creando un mapa preciso y ordenado en que las celulas de la vecindad de la retina se proyectan hacia localizaciones cercanas del tectum (vease Figura 21-113).

La experiencia moldea el patr6n de conexiones sinapticas del cerebro89 ,90 Este mismo "principio de activaci6n" que se aplica a las sinapsis y la actividad neuronal conlribuye a organizar nuestro desarrollo cerebral en funei6n de la ex+ periencia. En el cerebro de un mamffero, los axones que transmiten las entradas de informaci6n procedentes de ambos ojos se juntan en la regi6n de la corteza cerebral, donde constituyen dos mapas superpuestos del campo visual externo, un mapa percibido por el ojo derecho y el otro por el Izquierdo. La organizaci6n y el desarrollo de las proyecciones corticales procedentes de ambos ojos han

1210

Capftulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 21-114 EIlminacl6n de las slnapsls y su dependencla del patron de excitacl6n. En el experimento que aqufilustramos esquematicamente, se ha penllitido que una neurona y una fibra muscular procedcntes de un embri6n de pallo establezcan una sinapsis ill vitro. Entonces se procede a la estimulaci6n de la fibra muscular mediante la apticaci6n de galas de acetilcolina (imitando la estimulaci6n neural): esta tecnica se aplica lanto sola como en sincronfa can la excitaci6n electrica de la neurona. Los resullados ilustran un principio general: cada excitati6n de una celula diana liende a causar el rechazo de las sinapsis cuyo ax6n terminal presinaptico ha permallecido inactivo, ya mantener las sinapsis cuyo ax6n ha estado activo en este momento.

I

sido estudiadas en profundidad. tanto mediallle investigaciones anal6micas como mediante pruebas fisiol6gicas en las que se estudia qu~ tipos de estimulos visuales excitan celulas detenninadas conicales. Esms estudios revelan una sensibilidad extraordinaria respecto a la experiencia en edades lempranas: si, durante un perlodo crftico. se cubre un ojo privandole de estimulos visuales. el ojo tapado pierde sus conexiones simipticas con la corteza y queda pr;ictica e irreversiblemcnte ciego. Dc acuerdo con el principio de activaci6n, ha tenido lugar una competencia en la que las sinapsis de la cortcza visual establccidas por axones inactivos se eliminan, mientras que las sinapsis est'ablecidas por axones activos se consolidan. De este modo ellerrhorio conical se asigna a axones portadores de infonnaci6n y no se desperdicia con los axones que carecen de ella. Pero el principio de activaci6n tambi~n actua de formas mucho mas sutiJes eslableciendo las conexiones nerviosas que pennhen ver. Por ejemplo, la capacidad de ver en profundidad -visi6n en eslereo- depende de la presencia en la corteza visual de celulas receploras de entradas de infonnaci6n procedentes de ambos ojos. transmidendo informaci6n acerca de la misma regi6n del campo visual. pero desde Angulos Iigeramente distintos. Las celulas de conducci6n binocular nos permitcn comparar la visi6n que obtenemos a traves del ojo derecho can la que obtenemos del izquierdo, de modo que seamos capaces de derivar informa· ci6n sobre las distancias en relaci6n a objetos situados a nuestro alrededor. Sin embargo. si se impide que ambos ojos observen la misma escena al mismo dempo durante un perfodo cntico -por ejemplo. cubriendo primero un ojo y luego el otro en dfas altemos 0 simplemente como consecuencia de un estrabismo infantil- prncticamente no se conservarAn c~lulas de convecci6n binocular en la corteza y la capacidad de ver en est~reo sem. casi irrecuperable. Evidentemente. seglin el principio de activaci6n, las entradas de informaci6n procedemes de cada ojo recibidas por una neurona de conducci6n binocuJar 5610 se mantienen si las dos entradas de informaci6n se activan sincr6nicamente can frecuencia. como ocurre cuando los dos ojos observan juntos una misma escena. Ya vimos en el Capftulo 15 que los cambios sin;ipticos que subyacen a la memoria en muchas panes de cerebro giran en torno al comportamiento de un tipo panicular de receptor para e) neurotransmisor glutamato -el receptor NMDA EI f1ujo de Cal. hacia el interior de la celula postsin;iptica. a traves de canales abiertos por este receptor. desencadena cambios duraderos en la fuena de las sinapsis de esta celula. tal como ocurre con la entrada de Cal. en una celula muscular vfa los canales de receptores de acetilcolina, que durante el desarrollo afecta las sinapsis establecidas pOT las motoneuronas. Los cambios inducidos por el mecanisTllo dependiente de NMDA en el cerebro adlllto obedecen a principios rnllY pr6ximos al principio de activaci611 del desarrollo. De hecho, el perfeccionamiento y el remodelaje de las conexiones sin;ipticas que acabamos de describir en los sistemas visuales en desarrollo de mamlferos y anfibios puede bloquearse gracias a un inhibidor del receptor NMDA. En consecuencia. tanto la memoria como los ajusles en el desarrollo pueden depender de los mismos mecanismos fundamentales. La ba~ molecular del mecanismo gracias al cualla experiencia moldea nuestros cerebros es uno de los mayores desaffos que el sistema nervioso presenta a la biologfa celular.

Resumen Ell desarrollo del sistema neroloso consta de Ires fans: primero, se generall las eil,,las neroiosas par medio de divis/ones «Iultlres; luego. CUtlndo IIan deJado de divldine, las t:ilullls emilen lU'ones y dendrltas eslablecienn{J sinapsis con cilulns tileJtulas. entablalUllJ nsf comllnicaciones; par ultimo, el sisfema de oomunicaciones sinApticas se perfecdona y remtKlela ugdn el patr6n de tlcrluidaLi elktrlca th la red neuronaL ws lU'O"es y Ills dendritas cream mediante oonos de credmiento qru existen en sus extremos, siguiendo viM espedficas trtuadas par orras cilullls y par la ma1m errracellllar sltuados a 10 largo del trayecto. WS oonos de crecimiento estif" guiados

EI desarrollo neural

1211

par diversas clases de moMClllas de ad/Jesion as{ como por sefiales intracelulares y factores que illllibell y repelell el crecimiellto de los conos. Qmos de creclmiellto procethmtes de IWllrollas distintas, /10 eqllivalelltes, respondell de modo desiK',al a estas senates, y de esta forma se establece el mapa neuronal -proyecdones ordemulas de formaciones de neuro,uu, ,ma ellcima lie otra. Cualltw los conos de crecimienlo Imn alcallzado sus dumas, se produam dos tipas de ajustes btfsicos. Primero, ,,,,,C#Jas de las nellrollas que ineroan muerell como cOIlSecuencia de 111m competellcia par fac. tores de supervivellcia como el NGF (factor de crecimiemo nervioso) secrelados par el tejldo duma. La muerte celular ajilSta ia cantidad de ;'Ieroacion al tamafio de la diallQ. Segundo, las sinapsis individuales retrocedell de alK'mas localizaclones y se refuerum ell otras, gellerando 1m patrOIi de COllexiones ordellado con mayor precision. Este proceso depende de la actividad electrica: las sinapsis mas activas se refuerzall, y lIeuronas distintas qlle colltactall COli In misma celilia diana acostllmbrtm a mantener SItS sinalJsis en la dialla compartida solo si ambas se activm! siucrOnicamente COli frecuencia. De este modo la estructllra del cerebro puede aj!lStarse rejlejalldo las cOllex/ones entre sucesos del mlmdo exterior. Los mecallismos moleculares qlle sllbyacell a estos mecanismos puedell ser similares a los responsables de laformacion de recuerdos en UI vida adulta.

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1217

Consccuencias del recambio tisular, vistas en una secci6n histol6gica de un hueso compacto. Los pequei\os segmentos negros a1argados son los espacios ocupados por cellilas maduras del hlleso (osteocitos) incluidas en la matriz del hlleso. las bandns a1ternantes brillantes y oscuras son capas de la matriz que comienen colagena orientada (visibles con In ayudn de luz polarizada). El patr6n proviene del proceso de continua erosi6n y reconstrucci6n, segt1n el cual el hueso antiguo es destruido por los osteoclastos (celulas semejantes a macr6fagos) y se deposita hueso nuevo, en capas, por los osteoblastos (precursores de los osteocitos).

.

Celulas diferenciadas , y conservaClon de los tejidos

En el transcurso de unos cuanlOS dias 0 semanas, un unico 6vulo fecundado da lugar a un complejo organismo pluricelular farmada por celulas diferenciadas dispuestas seglm un patr6n preciso. Por regia general, el patr6n del cuerpo de un animal se establece a pequefia escala y luego crece. Durante el desarrollo embrionario, los diferentes tipos celulares quedan determinados carla uno en su 1ugar apropiado. En el perfocto posterior de crecimienlo, las ccluJas proliferan, pera salvo algunas excepciones. sus caraclerfsticas especfficas permanecen mas o menos fijas. El organismo puede continuar creciendo durante tada 1a vida, como sucede en la mayorfa de crust,kens y de peces, 0 puede dejar de creeer aI alcanzar un cierto tamana, como sucede en las aves y en los mamfferos. Pero in· c1uso cuando se detiene el crecimiento, en muchas especies la proliferaci6n ce· lular continua. Asf, el organismo adulto de un vertebrado puede equipararse a un ecosistema estable en el que una generaci6n de individuos (celulas en este caso) sucede a la anterior sin que se allere la organizaci6n del sistema en su con· junto. Todavfa se desconoce de que forma se aJcanza el equilibria exacto enlre proliferaci6n y muerte celular. En este cap(tulo se discllie c6mo nacen, viven y mueren las celulas en los te· jidos y de que forma se mantiene la organizaci6n de dichos tejidos. Nos cenlra· remos en los vertebrados sllperiores y al considerar el problema del manteni· mien to y de la renovaci6n de los tejidos, vamos a intentar i1ustrar un poco la notable variedad de estructuras, funciones e hislorias vitales que se encuentran entre sus tipos celulares especializados.

Mantenimiento del estado diferenciado' Los tejidos del cuerpo se diferencian notablemente en muchos aspectos, pere 10· dos elias tienen ciertas necesidades basicas, satisfechas por 10 general, por distin· tos lipos celulares, tal como se ilustra para la piel en la Figura 22·1. Todos eUos necesitan una fuerza mecanica, que en muchas ocasiones esta preporcionada por un trama de sosten formada por 1a matriz extracelular, segregada principal· mente por los fibroblastos. Por otre lado, lodos los tejidos necesitan un aporte sangufneo para recibir nutrientes y eliminar produclos residuales, y por ello es· tan surcados por vasos sanguIneos Iimitados por celulas endoteliales. De forma amllaga, la mayorfa de los tejidos estan inervados y poseen axanes de celulas nero viosas, junto con las celulas de Schwaml que los redean. Con frecuencia tambien existen macr6fagos que eliminan las celulas muertas y la matriz superOua, asf 1219

IAI

rlorvios sllnsoriales va50

ssnguinllD

O,5mm

\

ctllwla pigmentllrill

~~r:g~~a

(melanocilol ctilule con funci6n macrofSogice Ictllule dlllorlgerhansl

mestOCito

fibroblasto

macr6fago

j

~

\

fibre 1l11istic8 IlnfDello

c'lula andalelial de un capile.

como linfocilOs y atras leucocitos que cambaten las infecciones. Pueden existir me/anocitos que proporcionan una pigmentaci6n protectora 0 decorativa. La mayarra de estos tipos celulares, auxiliares de la funci6n especffica del tejido, se ori· ginan fuera de el e invaden el tejido en el transcurso del desarrollo (celulas endotcliales, a~:ones de celulas neJViosas, celulas de Schwann y melanodtos ) 0 de forma continua durante tada la vida (macr6fagos y atras gl6bulos blancos). Estc complejo sistema de sosten es necesario para mantener las principales celulas especializadas del tejido: las celulas contractiles del musculo, las celulas secretoras de las g1andulas 0 las celuJas hematopoyeticas de la medula 6sea, por ejemplo. Por ello, casi todos los tejidos son una compleja combinaci6n de muchos tipos celulares que deben continuar siendo diferentes unos de otms y al mismo tiempo coexistir en un mismo ambiente. Por otro lado, la organizaci6n del conjunto debe preservarse a pesar de que en la mayorfa de tcjidos las celulas mueren continuamente y tienen que ser reemplazadas. EI manlenimienlo 0 conservaci6n de la forma y de la funci6n del tejido es en gran parte posibte gracias a dos propiedades fundamentales de las celulas. Gracias a la memoria celular (vease el Capftulo 21) las celulas diferenciadas mantienen de forma aut6noma su caracter distinto y 10 transmiten a su progenie. AI mismo tiempo cada tipo de celula especializada detecta cantinuamente las caracter(slicas de su entorna y regula su praliferaci6n y sus propiedades en funci6n de las circunstancias; de hecho, la elevada supervivencia de la mayor parte de celulas depende de las senales de otras celulas. Los mecanismos celuJares responsables de la memoria celular se han discutido en el Capitulo 9, mientras que las formas de respuesta de las celulas a las senales ambientales se consideran en el Capitulo 15. En esta secci6n preIiminar sabre el campartamiento de las celulas en los tejidos hacemos una breve revisi6n de ciertas evidencias sabre la estabilidad y la heredabilidad del estado diferenciado y consideramos hasta que punta este estado puede ser modificada mediante influencias ambientales. 1220

Capftulo 22 : Cclulas diferenciadas y conservaci6n de los tejidos

FIgura 22-1 Plel de mam(fero. (Al Esquemas que muestran la arquitectura celular de la piel gruesa. (Bl FotograHa de una secci6n transversal de la plama del pie humano, tenida con hematoxilinaeosina. La piel puede considerarse como un gran 6rgano constituido por dos tipos principales de tejidos: tejido epitelial (Ia epidermis) en la parte extema y tejido conjuntivo, que constituye la capa de la dermis (a partir de la cual se (abrica la piel) y la capa mas profunda de tejido adiposo: la hipodermis. Cada tejido se halla constituido par varios upos celulares. La dermis y la hipodermis se hallan altamente irrigadas por vasos sangufneos y nervios. Algunas fibras nerviosas penetran incluso en la epidermis.

Figura 22-2 DesarroUo del ofo de los vertebrados. La retina se desarrol1a a panir de la vesicula 6pficn, una evaginad6n epitelial de la regi6n del cerebro anterior del tubo neural. (A) E1 epitelio neural entra en contacto con el ectodermo que recubre el exterior de la cabeza. (B) £.ste conlaClO induce la invaginaci6n del ectodermo para formar una lente. AI mismo licmpo, la porci6n externa de lu vesicula 6plica se invagina, rcduciE!ndose la luz vesicular a una interfuse 0 entre dos capas que constiluyen una estruc(ura en forma de copa. (C) La capa de la copa 6ptiea adosada al criSlalino se diferencia en la retina neural, que contiene las cl!:lulas (otOrreceptoras y las neuronas que lransmiten los esdmulos visuales al cerebro (~ase Figura 22-6). La olra eapa se diferencia en el epitelio pigmentario de la retina. Sus celulas se hallan provislas de numerosos gmnulos de melanina y el conjunto forma una ~mara oscura para el sislema fOlorreceptOr (que sirve para reducir la cantidad de luz renejada, de forma similar a una cubierta de pintllJa negra en el interior de una cllmara fotogrMica).

La mayoria de las c~lulas diferenciadas recuerdan su caracter esencial incluso en un nuevo entorno 2 Diversos experimenlos sobre cultivos celulares demuestran que a pesar de que las celulas se separen de su entomo habilual, tanto las propias ~Iulas como su progenic manticnen intacta su programaci6n original. Consideremos, par ejemplo, las celulas epitcliales que forman la capa pigmetltada de la retina {Figura 22-2}. Debido a que dichas celulas manifieslan su caracter especializado produciendo unos granulos de melanina de color pardo OSCUlO, resuha facil estudiar su grado de diferenciaci6n. Cuando estas celulas de la retina de embri6n de polio se aislan y se maRlienen en cultivo, proliferan fonnando clones. Celulas aisladas tomadas de eSlos clones dan lugar a subclones de celulas epileliales pigmentadas similares. De eSla forma se puede mantener el eslado diferenciado a 10 largo de mas de 50 generaciones ceJuJares. Sin embargo, el comportamiento de las celulns no es indcpendienle de su entomo. En ciertos medios de cultivo 0 en condiciones de hacinamiemo eXllemo las celuJas quizas puedan sobrevivir, pero no simetizan pigmento, 0 l11uy poco. Pero incluso si no pueden expresar su caraclcr diferenciado, las celulas permanecen defermi"adlll como celulas pigmentarias: cuando se las expone a condiciones de cultivo mas favorables, empiezan nuevarnente a sintetizar pigmenta. Exisle una 0 dos excepciones conocidas a esta regia. En algunas especies de vertcbrados, bajo determinadas condiciones, las celulas pigmentarias de la retina se trallsdi!ere"cian en c~llllas del cristalino 0 en celulas de la retina neural, pero no se ha encontrado ninguna manipulaci6n de dichas condiciones que pueda ser la causa de eSle tipo de djferenciaci6n, en Jugar de diferenciarse por ejemplo en celulas sangufneas, celulas hepaticas 0 en celulas cardiacas. De forma parecida, la mayorfa de los tipos celulares especializados, incluyendo las celuJas sanguineas, las celulas hepaticas y las celulas cardfacas, mantienen en cuitivo su CaraCler esencial. En cl organismo, al igual que en los cultivos, la mayor parte de las ceJulas diferenciadas se comportan como si su caracter basico estuviera dcterminado de forma irreversible por Sll proceso de desarrollo. Las clHuJas epidcrmicas, por ejemplo, permanecen como tales en la mayor parte de ambientes distintos. Si se prepara una suspensi6n de celulas epidermicas a partir de la piel de la cola de rala y se inyecla bajo la capsula del riri6n, las celulas crecen formando quistes conSlituidos por una autentica epidermis, similar a la de la superficie corporal.

""

tejido eonjuntivo

proteoc4ifelo lepitelio del tuba neural) 11,11 dele vellcule 6plice

-:;;~

'" cope oplice

lei epitelie pigmen.... rio dele reline epitelio neural de Ie ."ine

El estado diferenciado se puede modular por el entorno celular l ,3 Aunquc no se producen transformaciones radicales, las caracterfsticas de muchas cclulas difercnciadas pueden eslar fuertemente influidas por el entorno. Los posibles reajusles pueden c1asificarsc cn su mayorfa como mo
1221

estado diferenciado, es decir, cambios reversibles entre fenotipos celuJares estrechamente relacionados. Las celulas hep~ticas, por ejemplo, ajustan su sintesis de enzimas especfficas (mediante cambios en los niveles de mRNA) en funci6n de las concentraciones ambientales de la honnona esteroidea hidrocortisona, y la producci6n de protefnas de la leche por las celulas de la glAndula mamaria puede ponerse en marcha 0 detenerse en funci6n de los cambios de la matriz extracelular. Los fibroblastos y otras celulas armes -Ia familia de cilulas del rejido conjuntjlJO- son un caso especial. Estas relulas son extraordinariamente adaptables y pueden presentar varias interconversiones: los fibroblastos, por ejemplo, pueden transfonnarse, aparentemente de forma reversible, en condrocitos. Estas transformaciones tienen su importancia en la reparaci6n de heridas y fracturas 6seas asf como en otros procesos patol6gicos. Se discutirAn mc1s adelante, en este capitulo. Sin embargo, estas conversiones de un tipo celular diferenciado en otro suelen darse de forma muy restringida: la c~lula transformada continua perteneciendo a la familia de celulas del tejido conjuntivo. En muchas tejidos adultos normales tienen lugar importantes, aunque restringidos, cambios del estado difcrenciado, en los que las celulas recien diferenciadas se generan a partir de ctUulas madre -precursoras que no manifiestan el caracter maduro diferenciado pero se especializan en dividirse y producir una progenie que sf 10 manifestar~t Distintos tipos de celulas madre quedan determinadas para la producci6n de distintos tipos de relulas diferenciadas y no son intercambiables. Sin embargo, la mayorfa de los tejidos adultos estAn (ormados por un mimero diferente de J(neas celulares determinadas de forma irreversible. El numero y las relaciones espaciales de estos componentes deben mantenerse funcionalmente por mecanismos Que no requieran Que un tipo de celula diferenciada se transforme en otro, sino Que dependan de complejas interacciones entre distintos tipos celulares.

Resumen mnyorla de las cilulas dlferencltuUu de Ws ujidfJs adultos mnntlenen $U espedaliztu:16n, induso cuando se trasllukJn a un amblente nuel/O. Generalmente Ws esrados de diferencitu;16n son estables y no intercambiables, pem algunas cilulas espedallztulas, incluso, pueden alterar algunas de sus propiedades en respmsta a detennlnados requerimientos amblenwles. Ademds, en muchos tejidos adultos se generan de fonna continua nueuas cilulas diferendadas a partir de cilulas madre que se m,«estTan indiferendadas. Las trans/onnaciones celulares mds relevantes ilenen lugar en la familia de cilulas del tejido conjuntivo que inclllYt! a los /ibmblastos y los condrocitos.

La

Tejidos con celulas permanentes' No todas las poblaciones celulares del cuerpo est<'in sujetas a renovaci6n. Algunos tipos celulares se han generado en cantidad suficiente en el embri6n y se conservan durante toda la vida adulta; parece Que nunca se dividen y, si son destmidos, no se pueden reemplazar. Casi todas las celulas nerviosas son pennanentes en este sentido. Tarnbien 10 son otros tipos de celulas, como --en los rnamfferos- las fibras muscu1ares del coraz6n, las celulas ciliadas del conducto auditivo extemo (Figura 22-3) y las celulas del cristalino del ojo. Aunque todas estas c~lulas tienen una vida extremadamente larga y viven necesariamente en medios protegidos, son diferentes en otros aspectos y resulta diffcil encontrar una raz6n general para Que tengan que ser permanentes e irremplazables. Para las celulas del musculo cardiaco y las celulas ciliadas del conducto auditivo resulta absolutamente diffcil encontrar una raz6n. En el caso de las celulas nerviosas parece probable Que un recambio celular masivo en el adullO resultase desventajoso en Ifncas generales, ya que en el adulto serra diffcil restablecer el complejo y precise patr6n de conexiones nerviosas que se ha 1222

Capftulo 22 : C~lulas dlferencladas y conservacl6n de los tejldos

cl!ilules de lI(lSlen

c6lulas ciliadas elllernas

membraM IIIC10rial

.....:Jo=:::::::~ ntereodllos cl!ilulas ciliadas inlemas

membrana basel

fibrilS nervlosas

'A'

conslituido durante el desarroUo en condiciones muy diversas. Ademas, proba+ blemeOle cuaJquier memoria registrada en fonna de Iigeras modificaciones de la estruclUra 0 de las interconexiones de las distimas celulas nerviosas se perdcrfa. La permanencia de las celulas del cristalino parece ser simplemente una consecuencia inevitable del mecanismos a traves del que se ha formado ellcjido.

Las celulas del centro del cristalino del ojo de un adulto son residuos del embri6n5 Muy pocas estructuras del cuerpo de un adulto estan formadas por las mismas mollkulas que fueron produeidas en el embri6n. EI erlslalino del ojo es una de las pocas estructuras euyas celulas no 5610 se han conservado, sino que mantic· nen su cOlllenido. EI cristaJino se forma a panir del eClodermo, en ellugar en que las vesfculas 6ptieas en desarrollo enmm en eantacto con el: en este punto el ectodermo se engruesa. se invagina y. finalmente se estrangula y separa en forma de la ves(cufa del cristalino (Figura 22-2). EI cristalino se origina par 10 tanlo como una capa de eelulas, formada a partir de un epitelio, de un grosor de una sola celula y que se dispone rodeando una cavidad central. Pronto, las cclulas de la parte posterior de la vesicula del eristalino (orienladas hacia la retina), sufren Ulla notable transformaci6n. Dichas celulas sintetizan y se Henan de cristalinas, las prote{nas caracterfsticas del cristalino. Durante el proeeso se alargan enormemente diferenciandose a /ibras del cristaJillo (Figura 22·4). Con el tiempo, sus micleos se desinlegran y cesa la sfntesis proteica. De esta manera, la parte del epitelio de la vesfcula del cristalino dirigida hacia la retina se expande formando un grueso cuerpo refraetario, constituido por largas y numerosas celulas sin vida, Intima· mente unidas entre sf (Figura 22-5). La cavidad central de la vesfcula se oblitera yen la regi6n frontal del epiteUo de la vesicula del cristalino -Ia parte dirigida hacia el exterior- permanece formada por una tina capa de celulas cuboidales. EI crecimiento del cristalino depende de la proliferaci6n de las relulas frontales, que empuja a algunas de las celulas de est'a regi6n alredcdor del borde del crista· lino, hacia la parte posterior (veanse Figuras 22·4 y 22·5A). A medida que las ceo lulas se desplazan hacia atras, dejan de dividirse, aumCnl'an su velocidad de sfntesis de cristalinas y se diferencian en tibras cristalinas. Las tibras adicionales del cristalino eontinuan formAndose de esta manera durante toda la vida, aunque a una velocidad decrcciente. Los tipos de cristalinas de las primeras generaciones de tibras del cristalino son diferentes de los de las generaciones posteriores, del mismo modo que las Tejldos con ~luJas pennanentes

Figura 22·3 ~Iulas clUadas del ofdo. Esquema de la secti6n transversal del aparato audilivo (6rgano de Coni) en el ofdo intcrno de un mamlfcro, dondc se obselVan las celulas ciliadas auditivas sltuadas en una compleja eSlructura de celulas de 50sten y rodeadas por una masa de matriz extracelular (denominada membrana leclorial). (8) Electronmicrograffa de barrido en la que se observa 1a superficie apical de algunas relula ciliadas del oklo, con su caracterfstlca ordenaci6n en hileras de los microvilli gigantes (denominados estereocilios). las celulas ciliadas auditivas actuan como transmisores, generando una sena! electrica como respuesta a las vibntciones sonoras que l1egan a! 6rgano de Corti yprovocan la inclinatiOn de los estereociJios. En los mamfferos, las celulas ciliadas audilivas que se producen en el embri6n poseen un l1nico ciclo vilal: si se destruyen por una enferrnedad 0 por ruido excesivamente fuerle, no se regeneran y se produce sordcrn pennanente. (B, de R.G. Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs; AText-Alias of Scanning Electron Microscopy. San Francisco: Freeman, 1979. Copyright C 1979W.H. Freeman and Company.) (A)

.223

hemoglobinas de los erilrocitos fetales son distimas de las de los erilrocilos adultos. Sin embargo, los eritrocitos se renuevan pero las fibras envejecidas del cristalino no 10 hacen. Por ello, en el centro del crislalino aduho se enCUentfan fibras que fueron producidas enla fase embrionaria y que todavfa presentan los tipos de cristalinas caractcrfslicas de este perfodo temprano. Las diferencias de rndice de rcfracci6n, entre los tipos embrionarios precoces de cristalinas y las producidas mas tarde ayudan a evitar aJ CriSlalinO del aja las aberraciones 6pti· cas que existen en las lemes simples construidas con un medio homogeneo como es el vidrio.

vesicula embrionarla del crhllalino

dlulas del epltelio anterior del erialalina

"· 0

··· .....

G ,

La mayoria de las celuJas permanentes renuevan sus

componentes: las celulas (otorreceptoras de la retina6 Exislen pocas celulas tan inmutables como las fibras del crisraHno. Por regia general. incluso aqueUas celulas que persisten durante tada la vida sin dividirse sufren una renovaci6n de sus constituyentes. Asr, las celu)as del musculo cardfaco y las celulas nerviosas, aunque no se dividen, son metab6licamente activas y capaces no s610 de sintetizar RNA y protefnas, sino tarnbien de alterar su tamaf'lo y su estruclUra durante la vida adulta. Las celulas del rnUsculo cardfaco. por ejemplo. renuevan cada una 0 dos semanas su contenido de moleculas proteicas y tienden a ajustar el equilibrio entre sfntesis y degradaci6n de prolefnas as[ como a aumelltar de tamaf'io a medida que la carga del coraz6n aumenta -por ejemplo debido a un incremento sostenido de la presi6n sangu[nea. Las celulas nerviosas lambicn renuevan su contenido proteico de fonna continua; adem3S, muchas celulas ner· viosas pueden regenerar axones y dendritas que hayan perdido. EI proceso de renovaci6n de los constituyellles celuJares queda ilustrado de manera particulannente clara en las celulas nerviosas altamente especializ.adas que fonnan los focorrecepcores de la retina. La retina neural (vease Figura 22·2) consta de varias capas de celulas organizadas de una forma aparentcmente complicada. Las neuronas que transmilen las senales visuales al cerebro (denominadas celulas ganglio"ares de fa retina) estan situadas mas cefca del mundo exterior. de modo que la IlIz. focalizada por el crislalino. debe pasar a traves de

fibre del cristalino

reet6n fotmllda centra del cri$t11llna aduho. farmada par las fibras prim.,ias dttI

cristlliino originllldu en al embri6n; los nUcleos ya no IOn visibles

FIgura 22-4 DesarroUo del CrlslallnO del 0)0 hwnano. La proliferaci6n 5610

se presenta en las celulas del epilelio anterior del eristalino, que se desplazan hacia In regi6n posterior y se diferencian en fibras del cristalino.

_ _f-ePitelio anterior del cristat1no

r

n"cleos celulares • -

---i-cfibraS del ctistalino

Figura 22·5 Estnlctura del cristallno maduro. {AI Mierografia 6ptica de una

lAl

1224

l'mi~ ~I

(despte:nd;o.)

100 11m

parte del elislalino donde.se observa la uni6n entre la fina capa del epitelio antelior que rubre la parte frontal del eristalino y las fibrns diferenciadas de la parte posterior. (B) Electronmicrograffa de barrido de una regi6n del eristalina. Las fibras del cristalino se hallan densamente apiladas. como tablones en un almacl!!n de madera. Cada fibra es una I1nica cBuia muerta yalargada que puede alcanzar hasta 12 mm de kmgitud. (A, porconesfa de Peter Gould; D, de R.G. Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A Text·Atlas of Scanning Electron Microscopy. San Francisco: Freeman, 1979. Copyright 01979 \V.H. Freeman and CompanY.1

Capftulo 22: ee:Julas dUerenciadas y conservacl6n de los tejidos

elias para alcanzar las c~lulas fotorreceptoras. Los fotorreceplOres, que se c1asifican en conos 0 bastones segUn su forma, se disponen con sus extremos fOlorreceptores, 0 segmeruos extemos, parcialmeme hundidos en eJ epiteJio pigmentario (Figura 22-6). Los conos y bastones presentan diferenles complejos proteicos fotosensibles con pigmento visual: los bastones son especial mente sensibles a niveles bajos de luz, mienlras que los conos (de los que existen tres tipos distintos, cada uno con respuestas espectrales diferentes) detectan el color y los detalies mtis finos. Parece que el segmento externo de un fotorreceptor es un cilio modificado con una ordenaci6n caracterfstica de microulhulos similar a la de los cilios en la zona donde dicho segmento extemo se une al resto de la c~lula (Figura 22-7). EI resto del segmento extemo esra casi completamente ocupado por un denso apilamiento de membranas en el que se haUan los complejos fotosensibles; la luz absorhida en dicha zona produce una respuesta el~c(rica, tal como se disculi6 en el Capftulo 15. En el extremo opuesto las c~lulas fOlOrreceptoras fonnan sinapsis con las intemeuronas retinianas, que propagan la sei'l.a1 hasta las celulas gangJionares de la retina (vease Figura 22-6). Los fotorreceptores son celulas permanentes incapaces de dividirse. Pero las molecuJas proteicas fOlOsensibles no son permanentes. Existe una renova· ci6n continua, que se puede po"er de manifiesto mediante la inyecci6n de ami-

----r-::"'-""llf:o-::~~''''':r''ll(.,:::_',,..,::''''\ • •

06lulQ epitellale. pigmenlad..

,,~

fotorrllCep!or _ _- basion lolorrllCeptor

Figura ZZ-6 Esquema de I. estructura de la redna. La estimulad6n de los fotorreceptores por Ia luz se transmite por las intemeuronas hada las celulas ganglionares, que envfan la selia! al cerebro. Los espacios entre las neuronas y los fotorreceptores en la retina neuronal se hallan ocupados por una poblaci6n de celulas especializadas de $Osten, que no aparecen en la figura. (Modificado de I.E. Dowling y B.B. Boycott, Proc. R. Soc. Wild. (Bioi.) 166:80-111,1966.)

06lula ganglionar - - (neuronal

t t t t luz tncidenlll

Tejidos con dlulas pennanentes

1225

dilCOt de membr.n. lotorreceptor.

tegmento extemo

membr'M pl..m4itic.

cillo de eo....xi6n

Hgmento 'nt.rna

uerpo .Inliptlco

IAI

noaddos radiactivos, los cuales se incorporan a dichas moleculas. En los basto· nes, (aunque curiosamente no los conos) esta renovaci6n se organiza en una sew cuencia ordenada de producci6n, que puede ser analizada siguiendo el trayecto en el interior de la celulas de una serie de moleculas proteicas marcadas radiac· livamente despues de un breve pulso de aminaacida radiactiva (Figura 22·8). Las prolefnas marcadas radiactivamente pueden detectarse gradualmente en su desplazamiento desde el complejo de Golgi en el segmento interno de 18 celula hasta la base de la pila de membranas que ocupa el segmento externo. Desde aUf se desplazan gradualmente hada el extrema opuesta a medida que se incorpora material nuevo en la base de la pila. Finalmente (en la rata, despues de unos 10 dfas) una vez a1canzado el extremo del segmento extemo, las protefnas mareadas y las membranas a las que se han ineorporado, son fagocitadas (absorbidas y digeridas) por las relulas del epitelio pigmentario.

Resumen Aigmuu cllulas de los mamlferos -Incluyendo las cilulas nervlosas, las cilulas del mUsculo cardfaco, las cilllias receptoras sensoriales de luz y sonldo y las fibras del cristalino- "enlsten a 10 largo tk toda la vida sin dividirR y sin ser substitul1226

Capftulo 22 : ~luJas direrenciadas y conservaci6n de los tejldos

Figura 22·7 Esquema de un bastcSn fotorreceptor. (A) Esquema. Realmente exislen unos 1000 discos fOlorreceptores en el segmento enerno. (8) Eleclronmicrograffa de parle de un fOlorreceplor de lipo cono, mostrando la base del segmenlO exlerno y el cilio modificado que 10 conecla al segmento intemo. (A, de 1.1.. Lentz, Cell Fine Siructure. Philadelphia: Saunders, 1971; B, de M.J. Hogan, Alvarado, y'.E. Weddell, Histology oflhe Human Eye: An Alias and Textbook. Philadelphia: Saunders, 1971.)

'A.

Figura 22-8 Renovacl6n de la prolefna de membrana en un bUldn. se administra un pulso de leudna 'H y medianle autorradiograffa se sigue su paso a trav~ de la celula. Los P14ntos rojos indican zonas de radiactividad. El melodo revela t1n.icamenle la leudna que se ha incorporado a las prolefnas; el resto se elimina medianle lavado durante la preparad6n deltcjido. La leudna incorporada se observa primero concentrada cerCII del complejo de Golgi (1), y desde alH pasa a la base del segmento externo a un disco recien sintelizado de membrana fOlorreceplora (2). Los nuevos discos se forman a una ve:locidad de Ires 0 cualro por hora (en un mamrfero), desplazando a los discos viejos hada el epitelio pigmentado (3-5).

c"ul. epitel,al plgmentllda

2

3

•

5

lias. En las fibras maduras del crlstaUno, las ndcleos cetllfares hall tkgenerado y In s{"tesls proteica se Iia detenida de modo qlle in parte central del crlstaUno adllltO estd formada par prote{nas cristalinas producidas durante la vida embria"arla. E'i in mayor parte del nsto de cilulas permanentes, la actluidad de bios{ntesis conrlnUn y existe IIna renOUlJciOn oo,tslante lie oomponentes celulnns. En los bastones retinianos, por ejemplo, se sinterizan ""euas c:apas de memhrantJ fotorreceptora cerea del nrlcleo, qlle se desplazan oollstal,temente lfacia el exterior, hasta qlle son absorbidas y digeridas par las cilulas del epiteliD pigmenUJrlo.

Renovaci6n por bipartici6n simple' La mayona de poblaciones celulares diferenciadas de un verlebrado no son per-

manentes: las celulas mueren continuamenle y son reemplazadas. En el adulto, las nuevas celulas diferenciadas pucden generarse de dos maneras dislintas: (I) pueden fonnarse mediante la bipartici6n simple de las celulas diferenciadas existentes, que se dividen dando pares de celulas hijas del mismo tipo, 0 (2) pueden formarse, lal como se explicar
Las fundones del hfgado como interfase entre el tracto digestivo y la sangre7 • 8 La digesti6n es un proceso complejo. Las celulas que reviSlen el Iraclo digestivo segregan a la luz intestinal diversas substancias, como i1cido c1orhCdrico yenzi-

Renovad6n por bipartid6n simple

1227

Figura 22-9 A1gunas de las ctHuias eSIJeClllilzadas que se cneuentran en el revestJmlento epltellaJ del lnlesllno. A menudo las posiciones vecinas en 18 capa epilelial estan ocupadas par el:!lulas de tipos distinlos (vl:!ase Figura 22-168). (SegUn T.L Lenz, Cell Fine Structure. PhiJadelphja: Saunders. 1971.)

I. c4ilull zim6gafl. del est6m~ Mgtegtl pepsin6geoo

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II celull cllicifOtme dal intastino delglldo segregll mucus

II celull con tibele en cepi1lo dellntellino delgldo (entetoeito) Ibtotbe nuttientea

mas digestivas. para hidrolizar las moleculas de los alimentos hasta nutrientes senciUos. Las celulas absorben estos numentes desde la luz intestinal y luego los liberan a la sangre para que puedan ser utiJizados por las restantes celulas del cuerpo. Tadas estas actividades est~n reguladas de acuerdo con la composici6n del atimento digerido y can los niveles circuJanles de melabolilOS. EI complejo conjunto de funciones se reaJiza mediante una distribuci6n del trabajo: algunas de las celulas est~n especializadas en la secreci6n de ~cido c1orhfdrico. Olras en Ja secreci6n de enzimas. Olras en la absorci6n de numentes. otras en la praduc· ci6n de honnonas peptidicas que. como la gastrina. reguJan las aClividades di· gestivas y melab6licas, etc. (Figura 22·9). Algunos de eslOS lipos celulares se halIan situados en la pared intestinal; otros se hallan agrupados en grandes g1lindulas que se comunican en el intestino y que en el embri6n se forman a par· tir del epit'elio intestinal. 1228

Capftulo 22: UluJas dlferenciadas yoonservaci6n de los tejidos

fibtobl..to

----If"!

hllPfltocJto

---+....

"nulolde

--,J

cl!llule endotelllli

{., Flgura22.IO La eslnlctura del hfgado. (A) Elecuonmicrograrfa de barrido de un fragmenlo de hfgado moslrando capas irregulares de hepalocitos y numerosos pequenos capilares. 0 sinusoides, por donde c1rcula la sangre. Los conductos mayores son vasos que dislribuyen y recogen la sangre que fluye a tra,"6 de los sinusoides. (8) Eslructulll microse6pica del hfgado (muy esquematizada). Los hepatocitos est!n separados de la corriente sangulnea por una Unica capa de cl!lulas endoteliales con cl!lulas intercaiadas de cankler macrof!gico. las r:tluUu de Kl4plfer. pequenos poros en la capa endolelial penniten el inlercambio de mol~ulasy de pequenas panlculas enlre los hepalOCitos y la corriente sangu(nea prolegiendo a los hepatocitos de los embates que les ocasionarfa el contaClo directo con las cl!lulas sanguineas en circulaci6n. Ademas de inlercambiar materiaJes con la sangre. los hepatocilos forman un sistema de diminutos canaUculos biliares en los que segregan la bilis, que pasa linalmente aJ intestino a Irav6 de los conduClos biliares. La eslructura real es menos regular que la que sugiere este esquema. {A, de R.G. Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A Texl-Atlas of Scanning Electron Microscopy. San Francisco: Freeman, 1979. Copyright C 1979 \V.H. Freeman and Company.,

EI hfgado es la mayor de cSlas gl:jndulas. En el embri6n. se desarrolla como una rcgi6n en la que discurre una vena principal junto a la pared del tuba intesLinal primitivo, de forma que en el 6rgano aduho mantiene una relaci6n extraordinariamente imerrelacionada con la sangre. Las celulas del hfgado que derivan del primitivo epitelio intestinal-los hepatocllos- est:jn dispueslos en Ilileras radiales orientadas hacia unos espacios lIenos de sangre denominados sillusoides (Figura 22·IOA). La sangre est~ separada de la superficie de los hepatocitos par una unica capa de celulas endoteliales aplanadas que reviste los lados de cada hilera de hepatocilos (Figura 22-IOB). Esta estructurn faciLita la funci6n principal del hfgado. que se basa en el intercambio de metaboLitos entre los hepatocitos y la sangre. £) hfgado es ellugar principal en el que los nutrientes que se han absorbido del intestino y luego se han transferido a la sangre son procesados para su utili· zaci6n por las otras celuJas del cuerpo; la mayor pane del apone sanguineo que recibe proviene directamente deltrncto intestinal (por la vfa de la vena pona). Los hepatocitos son responsables de la sfntesis. degradaci6n y almacenamiento de un gran numero de substancias que juegan un papel fundamental en el melabolismo de todos los carbohidratos y Ifpidos del cuerpo; a su vez segregan la mayorfa de las protefnas que se encuentran en el plasma sangufneo. AI mismo tiempo. los hepatocitos permanecen conectados a In luz inlestinal mediante un sistema de conductos diminutos (0 cana/{clllos) y conductos mayores (vease PiRenovacl6n por bipartki6n simple

1229

gura 22-IOB) a traves de los cuales el hfgado segrega haeia cl intestino un agente emulsionante. la bifi.s, que intcrviene en la absorci6n de las grasas. A difereneia de 10 que sueedc con el resto del tracto digestivo, parece que en la poblaci6n de hepatoeitos existe muy poea disuibuei6n de funeiones: cada hcpatoeito parecc capaz de reaHz.ar la misma amplia gama de funeiones metab6licas y sccretoras. Los hcpatoeitos tienen un estiJo de vida diferente del de las eelulas que re· visten la luz del intestino. Estas ultimas. expuestas al comenido abrasivo y corrosivo del intestino. no pueden vivir largo tiempo por 10 que han de ser rnpidameme reemplazadas mediante una aportaci6n continua de nuevas eeluJas. Los hepatocitos. alejados del contaeto directo del contenido intestinal, viven mucho mlls tiempo y se renuevan a una veloeidad baja. pero oontrolada exactamente.

La p~rdida de c~lulas hepaticas estimuJa la proliferaci6n

de celulas hepcilicas9 Incluso en los tejidos que presentan una renovaei6n lenta de las celulas, un pequeno pero persistente desequilibrio entre la velocidad de producci6n y la velocidad de perdida de eelulas conducirfa al desastre. Si cada semana se dividieran un 2% de las celulas hepAticas de un ser humano y s610 sc perdieran un I % de elias el hfgado crecerfa hasta sobrepasar. en 8 ailOS, el peso de todo el resto del euerpo. As! pues, ha de existir algtin mecanismo homeostatico que aoople la velocidad de proliferaei6n celuJar y/o la velocidad de muerte celular para mantener el tamano fijado para cada 6rgano. La prueba directa de la existeneia de un control homeostlltico de la proliferad6n de las celulas hepllticas surge de experimentos en los que se extirpan quinirgicamcnte importantes cantidades de hepatodtos 0 se destruyen intencionadamente por medio de tetracloruro de carbono. AI cabo de un dIa, apraximadamente. de efecluar cualquiera de estas lesiones, se observa un aumento brusco de la divisi6n celular entre los hepatodtos supervivientes, de forma que rapidamente se substituye el tejido perdido. Por ejemplo, si se extirpan los dos tercios del hfgada de una rata, a panir del terdo restante se puede regcnerar en unas das semanas un hfgada de tanlaflo casi normal. En casas de este Upo se puede demostrar la existencia de una seflal en la circulaci6n para la regeneraci6n hepatica: si se conectan quin'irgicanlente las circulaciones de dos ratas y se extirpan dos tercios del hrgado de una de elias, en el hfgado no mutilado de la otra rata, se induce la milosis. Una de las senales responsables del incremcnto de la proliferad6n celular se ha idcntificado como una pTOlcfna denominada factor de crecimiCllto de hepmociros. Estimula la divisi6n de los hepatocitos Cll cultivo y su concentraci6n en la circulaci6n sangufnea aumenla brllscamente (pOT mecanismos poco conoddos) como respuesta a la lesi6n del hfgado. EI misrna factor afecta a diversos tipos celulares en forma distinta y sc conoce tambien como factor de dispersion, debido a que transforma algunos tipos de celulas epi· teliales en celulas m6viles que llegan a disgregarse unas de olTas y se desplazan. Se desconoce por que estimula el crecimiento del hfgado de forma especffica despues de una lesi6n hepAtica. EI equilibria entre proliferaci6n y destrucci6n celular en cl hfgado adulto (como en OtTOS 6rganosl no depende unicamente de la regulaci6n de la proliferaci6n celuJar: parece ser que intervienen con troles de supervivenda celular. Por ejemplo, si se trata una rata adulta con la d.roga fenobarbital, se estimula a los hepatocitos a dividirse. provocando un ensanchamiento del hfgado. Cuando se imerrumpe el tratamiento con fenobarbital aumenta oonsiderablemcnte 1a muerte celular de los hepatocitos hasta que el hfgado recupera su tamano original, generalmenle al cabo de una semana poco mas a menos. Se desconoce cu~1 es el mecanismo de este tipo de control de supervivencia celular. aunque se ha sugerido que los hepatocitas, al igual que 1a mayona de celulas de los vertebrados. dependen para su supervivencia de senales emitidas por OLras celulas y que el nivel normal de dichas senales puede mantener solamente un numero delerminado de hepalocilos. Si el numero de hepatocitos supera esta cantidad (como

1230

CapfluJo 22: Celulas dJfercnciadas y oonservaci6n de los tejidos

resullado de un Iralamienlo con fenobarbilal, por ejemplol la muerte celular se incrementani aUlomaticamenle para volver a rebajar el numero de celulas. Todavfa se desconoce de que forma se manlienen los niveles de los factores de supervivencia.

La regeneraci6n requiere el crecimiento coordinado

de los constituyentes de los tejidos lO Como ocurre en los demas 6rganos, el hfgado es una combinaci6n de lipos celulares. Ademas de los hepalocilos y de las celllias endoteliales que revislen sus sinllsoides, en el hfgado exiSlen macr6fagos especializados (celli/as de KupJ!er), que engloban a las pardculas que circllian por la corriente sanguinea y fagocilan los eritrocilos viejos, y un reducido nLimero de fibroblastos, que proporcionan una len lie trama de soslen de tejido conjunlivo (vease Figura 22-108). Todos es· lOS tipos celulares son capaces de dividirse. Para que se produzca una regeneraci6n 6ptima, su proliferaci6n ha de eslar coordinada de forma adecuada. La imporlancia de la regeneraci6n equilibrada de los diferenles tipos celulares se demlleslra precisamenle cuando se presema una siluaci6n de desequilibrio. Si los hepatocitos, por ejemplo, se intoxican repetidamente con tetracloruro de carbono 0 con alcohol, a intelValos Ian frecuenles que no plledan recuperarse por complelO entre los ataques, los fibroblastos aprovechan la siluaci6n yel hfgado queda obslruido de forma irreversible por tejido conjunlivo, dejando poco espacio para que los hepatocitos crezcan incluso despues de la desaparici6n de los agentes t6xicos. Esla afecci6n denominada cirrosis es frecuente en los a1coh6licos cr6nicos. De forma similar, a menudo la regeneraci6n del mLisculo esqueletico a1tamente lesionado se ve seriamente obstaculizada por un crecimienlo demasiado rapido de su tejido conjunlivo, de modo que el tejido cicatricial subsliluye a las fibras musculares contn'icliles. Sin embargo, para que se Ileguen a producir eslOS desequilibrios es necesario que se produzca una alleraci6n imporlante del tejido; en circunSlancias normales de renovaci6n, actLian unos mecanismos todavfa mllY poco conocidos que regulan la proliferaci6n y la supelVivencia celular a la vez que aseguran la permanencia de una proporci6n adecuada de los diSlintos tipos celulares.

Las celulas endoteliales revisten todos los vasos sanguineos l1 En conlraposici6n con los ejemplos anteriores de comportanuento mal coordinado de los fibroblastos, las celuJas endoleUales que constiluyen el reveslimien10 de los vasos sangufneos tienen una notable capacidad para adaptar su l1Iime-

Figura 22-11 Corte transversal de una arteria de pequeno calibre. CAl Esquema de un fragmento de la pared. Las celulas endoteliales, aunque poco conspicuas, son el componente fundamental de la pared. Comp4rese con el capilarde la Figura 22-12. (B) Electronmicrografia de barrido de una secci6n transversal de una arteriola (arteria muy pequefia), mostrando el revestimiento interno de celulas endoteliales y la capa circundante de musculo Iiso y de tejido conjuntivo co14geno, Una ligera contracci6n del musculo liso ha hecho que el revestimiento endotelial del vaso quedara plegado. A causa de la fijaci6n, el revestimienlo endolelial se ha arrugado separ4ndose de la pared muscular y dejando un pequef'io espacio entre ambos. (B, de R.G, Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A Text-Atlas of Scanning E]ectron Microscopy. San Francisco: Freeman, i979, Copyright © 1979 W.H. Freeman and Company,)

reveslimienlo endOleliel

musculo liso

colAgene

I:b.o"'~'1--- tejido con]untivo laxo musculo lisa llimine elAstica (Ii bras de elastinal fevestimiento endoteliel

'A, Renovaci6n por bipartlci6n simple

''I 1231

Figura 22-12 Electronmlcrograffa de

un fino capllar, enseccl6n nucleo de la c'lula andotalial +O""'-'---'-'--c:

I~mina

basal

luz del capllar

vesfculas transcit6sicas

ro y su disposici6n a las exigeneias locales. Casi todos los tejidos dependen del suministro de sangre, y el aporte sangufneo depende de las eelulas endoteliales. Estas e~lulas crealllm sistema de soslen vital adaptable. propagandose hasla las mas ree6nditas regiones del cuerpo. 5i las eelulas endoleliales no se extendieran y remodelaran la red de los vasos sangufneos. el crecimiento y la reparaci6n de los lejidos resultarfa imposible. Los vasos sanguineos de mayor calibre son las arterias y las venas, que poseen una gruesa y resistente pared de tejido conjuntivo y de musculatura lisa (Figura 22-IIA). La pared interna esta revestida par una unica eapa, extraordinariamen· te fina, de celulas endoteliales separadas de las capas externas por una lamina basal. La cantidad de lejido conjuntivo y de musculatura lisa de la pared del vaso varfa segun su diametro y funci6n, aunque el revestimiento epitelial siempre se halla presente (Figura 22-11 B). En las ramas mas finas del arbol vascular -los capHares y los sinusoides-las paredes eSlan formadas exclusivamente por una sola capa de celulas endoteliales y por una lamina basal (Figura 22-12). De esta forma, las celulas endoteliales revisten todo el sistema vascular, desde el coraz6n hasta los mas finos capilares. y conrrolan el paso de materiales -asf como el transito de gl6bulos blancos- hacia el interior y el exterior de la corriente sangu(nea. El estudio embrionario revela ademas que las arterias y las venas se desarrollan a partir de pequefios·vasos sencillos formados unicamente por celulas endoteliales y por una lamina basal: ellejido conjulltivo y la mUSCulatura lisa se forman mas adelante. cuando se necesitan, bajo la influencia de sefiales producidas por las celulas endoteliales.

Las nuevas celulas endoteliales se generan por bipartici6n simple de celulas endoteliales ya existentes lZ En todo el sistema vascular del adulto, las celulas endoteliales conservan la capacidad de divisi6n celular y de movimiento. 5i, por ejemplo, se destruye una regi6n de la pared de la aorta y se disgregan las celulas endoteliales, las celulas endoteliales mas pr6ximas proliferan y migran hacia dicha zona recubriendo la 1232

Capltulo 22: Celulas diferencladas y conservaci6n de los tejidos

transversal. La pared esta farmada por una unica celula endotelial, rodeada par una lamina basal. Observense las pequei'las vesfculas "transdt6sicas" que segun una teor(a posibilitan el transpone hada dentro y hada fuera en estos tipos de capilares: los materiaJes solubles son absarbidos par las vesfculas mediante endocilosis en la superfide luminal de la celula y expulsados par exodtosis en la superficie extema, 0 viceversa. (De R.P. Bolender,]. cell BioI. 61:269-287. 1974. Reproduddo con penniso de copyright de the Rockefeller University Press.)

•

• superficie expuesta. Las celulas endoteliales reci!'!:n fonnadas consiguen recubrir incluso la superficie inrema de los tubos de plastico que se utilizan en cirugfa para reemplazar las zonas destruidas de los vasos sanguineos. La proliferaci6n de las ce:lulas endoteliales se puede demostrar utilizando timidina 3H para marcar las celulas que estan sintetizando DNA. En los vasos normales la proporci6n de celulas endotcliales que queda marcada es especialmente elevada en las zonas de ramiJicaci6n de las anerias, donde la turbulencia y el desgastc consiguiente de las celuJas endotcliales parece estimular la proliferaci6n celular. Sin embargo, las celulas endoteliales se regeneran generalmente con bastante lentitud, con unas vidas medias de meses 0 incluso afios. Las celulas endoteliales no 5610 repara.l1 el reveslimiento de los vasos sangufneos existenles sino que tambien generan nuevos vasos sangufneos. Deben hacerlo en los tejidos embrionarios para adaptarse al crecimiento, en los tejidos adultos para resistir los ciclos recurrentes de remodelaci6n y reconSIrucci6n y en los lejidos adultos lesionados para soportar el proceso de reparaci6n.

Los capilares se forman mediante proliferaci6n IJ•• of Los vasos siempre se originan como capilares que surgen de pequeiios vasos ya existentes. Este proceso de angiogenesis se produce como respuesla a senales especfficas. Se pllede obselVar claramente en los conejos, practicando un pequei'lo agujero en la oreja y fijando fragmentos de cubreobjetos de vidrio a ambos lados, generando una fina camara de paredes lransparenles hada la que pueden crecer las celulas que rodean la herida. La angiogenesis tambien se puede observar en estructuras de par sf lransparentes, como la c6rnea del ojo. Los productos irritantes aplicados a la c6mea inducen el crecimiento de nuevas va50S sangu(neos, a partir del borde de tejido que rodea la c6mea, el cual se halla fiUy vascularizado, alcanzando el centro de la romea que 110mlalmente no pre· senla vascularizaci6n. Asf, la c6mea queda vasclliarizada a traves de una inva· si6n de celulas endoteliales en el grucso tcjido colageno de In c6rnea. ObselVaciones de este Ii po revelan que las celulas endoteliales que formar:i1n un nuevo capilar crecen desde la pared de un capilar 0 pequena venula emiliendo largas expansiones 0 pseud6podos (Figura 22-13). Inidalmente, las celulas forman un brote macizo que luego se vada hasta fonnar un IUbo. Esle proceso continua hasla que el brote encuentra olro capilar, con el que se conecta, permitiendo asf la circulaci6n de la sangre. Experimentos sobre cultivos demuestran tlue celulas endoteliales colocadas en un medio que contenga los factores de crecimiento adecuados forman espantaneamcnte lubas capilares incluso si se hallan aisJadas de Olros tipos de celulas. BI primer signo de la formaci6n del capilar en cultivo es la aparici6n en una celula de una vacuola alargada que al principio esta rodeada por el cilOplasma (Figura 22-14A). Las celuJas conliguas desarrollan vacuolas similares y, al final, disLribuyen sus vacuolas de tal modo que las vacuolas quedan ordenadas de forma continua de una c~lula a

glObulo rojo

ctilul8 er'ldOlellel

Figura Z2-13 Angiogenesis. Un nuevo

capilar sangufneo se forma como un brote a partir de una cl!lula endoteliaJ de la pared de un pequeno vasa ya existente. £Sle esquema se basa en las observaciones realizadas en las cl!lulas de la cola transparenle de un renacuajo vivo. (SegUn c.c. Speidel. A.m. J.Arnu. 5Z: 1·79, 1933.)

lUI del c8pll.r

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Renovaci6n por blpartid6n simple

se lorman v!KuoIas en 1111 «Ilul"

conlivuaI

1111 vacuol.. S8 unen generllndo II Iuz del capilllr en Cf&clmiento:

81 proc8lO IB repitlll Ie ctllula .ndoleli.1 5e divide

medide que til nuevo

capilar .. elerg.

1233

otra, formando un capilar (Figura 22-14B). El proceso esta estrechamente relacionado con la naturaleza de la matriz extracelular en el entomo de las celulas: la formaci6n de los capilares es activada por los componentes de la lamina basal, como la laminina, que puede ser segregada por las celulas endoteliales. Los capilares que se desarrollan en un cultivo puro de celulas endoteliales no contienen sangre y no circula nada por su inlerior, [0 cual indica que no son necesarios ni el flujo ni la presi6n sangufneos para la formaci6n de una red capilar.

La angiogenesis esta controlada por factores de crecimiento

liberados por los tejidos pr6ximosl 4 En los animales vivos las celulas endoteliales forman nuevos capiJares en donde 5011 necesarios. Es bien conocido que cuando las celulas, en los tejidos, quedan privadas de oxfgeno, liberan factores angiogenicos que inducen el crecimienlo capilar. Probablemente por este motivo, casi todas [as celulas de los vertebrados se situan a menos de 50 pm de un capiJar. De forma similar, despues de producirse una herida, en la proximidad del tejido lesionado se estimula un desencadenamiento del crecimiento de nuevos capilares (Figura 22-15). Substancias irritantes locales 0 infecciones tambien pueden producir una proliferaci6n de nuevos capiJares, la mayorfa de los cuales entran en regresi6n y desaparecen cuando rentite la inflamaci6n. La angiogenesis tambien es imponante en el crecimiento tumoral. El crecimiento de un tumor s6lido se halla limitado por e[ flujo sangufneo: si no fuera invadido por capilares, un tumor dependerfa de la difusi6n de nutrientes procedentes de la periferia y no podrfa alcanzar mas que un diametro de unos cuantos miJfmetros. Para que se pueda producir un crecimiento mayor. el rumor ha de inducir la formaci6n de una red capilar que invada la masa tumoral. Un peque-

1234

Capltulo 22: C~lulas diferenciadas y conservaci6n de los teJidos

Figura 22-14 Fonnacl6n in vitro de un capllar. Las celuJas endoteliales en cultivo desarrollan vacuolas internas que se unen entre sf dando lugar a una red de tubos capilares. Las fotografias (A) y (B) muestran los estadios sucesivos del proceso: la flecha en (A) indica la formaci6n de una vacuola en una celula endotelial. Los cultivos se han realizado a partir de pequei'los agregados de dos a cuatro celulas procedentes de reducidos segmentos del capilaT. Estas celulas se establecen en una placa de cultivo recubierta de colagena y fonnan una pequei'la colonia aplanada que aumenta de lamano a medida que las celulas proliferan. La colonia se extiende por toda la placa y, al cabo de unos 20 dias, en las regiones centrales se fonnan tubos capilares. Una vez iniciada la formaci6n de los tubas, las ramificadones no tardan en aparecer y a los 5-10 dfas ya resulta visible una extensa red de tubas, tal como se observa en la Figura (B). (De J. Folkman y C. Haudenschild, Nature 288:551-556,1980. © Macmillan Journals Ltd.)

,

•

Figura 22-15 Fom18c16n de nuevos capllares como respuesta a una lesl6n. Electronmicrograffa de barrido de moldes del sistema de vasos sangufneos en el borde de In c6rnea, donde se observa la reacd6n a una Icsi6n. Los moldes se reaJlzan medianJe una inyecci6n de resina en el inJerior de los vasos, dejando que dichd resina polimerice; con ella se pone de manifiesto la fonna de la luz del capilar complementaria aJ comorno de las celulas. Sesenta horas despues de la lesi6n, numeroso capilares empiezan a brot~lr de nuevo hada el area lesionada, que se halla junto a la parte superior de la figura. EI crecimiento orienlado de los vasos refleja una respuesta quimiotactica de las celulas endoteliales a un factor angiogenico liberado en la zona de la herida. (Cortesfa de Petet C. Burger.)

lio fragmenlO de un tumor de este tipo implantado en la c6rnea provoca un ra· pido crecimiema de vasos sangufneos desde el borde vascularizado de la cornea hasta la zona del implame. y ia veloddad de crecimiemo del rumor aumentara bruscamente en el momemo en que los vasos lIeguen a eL En lodos estos casos las celulas endoteLiales invasoras han de responder a una selial producida por el tejido que necesita apone sangufneo. La respuesta de las celulas endoteliales consta por 10 menos de cuatra elementos. Primero. las celulas han abrirse paso a traves de la lamina basal que rodea a los vasos ya existemes; durante la angiogenesis las celulas endoleliales segregan proteasas. que les penniten la digesti6n de dislimos materiales a su paso por la lamina basal del capilar 0 venula originaria. Segundo. las celulas endoleliales han de desplazarse hada el origen de la serial. Tercero, tienen que proliferar. Cuano. lienen que for· mar conducios. En algunos casos, algunos de los componemes de esta respuesla compleja pueden conseguirse en ausenda de los restames. Sin embargo, tam· bien se han identificado factores de credmiento que pueden manifeslar conjuntamente los cuatro componentes de la respuesta angiogenica. EI mas importante de estos factores es una protefna conodda como factor de crecimielllo endote/ial vasClllar (VEGF, de Vascular Endothelial Growth Factor -reladonado en parte can el factor de crccimiento derivado de las plaquetas [PDGF, de Platelet-Derived Growth Factor)). ESle factor actua de forma selectiva en las celulas endoteliales eSlimulando la angiogenesis en circunstancias muy diferentes, y parcce ser el agente responsable de la elevada irrigaci6n sangufnea que presen· tan algunos tumores. Gtros factores de credmiento, incluyendo algunos miem· bros de la familia del factor de crecimiento de losfibrablastos. tambh~n eslimulan la angiogenesis pero aI mismo tiempo inDuyen en ouos tipos celulares pr6ximos a las ~1u1as endoleliales. Estos tipos de factores angiogenicos se Iiberan durante la reparaci6n , inOamad6n y crccimienlO de los tejidos; son fabricados por dislimos lipos celulares, incluidos los macr6fagos. los mastocitos y los adipocitos. Tambien se ha identificado un deno numero de inhibidores nonnales que pue· den bloquear la formaci6n de nuevas vasos sangufneos. Asf la angiogenesis. aI igual que el comrol de la proliferaci6n celu1ar en general, parece que es regulada por complejas combinaciones de senales, mas que por un solo tipo de sei\a1.

Resumen Ln mnyor{a de pobIaclones de cilillas diferencuulas de los vertebrndos estdn slljetas

a recambio por nwdlo de la nlllerte y la divlsi6n cebLinr, E" algzmos casos, como el de los Ilepatocitos del "(gallo, las cilillas completamellte dlfere"cladas slmplemente se dlvlden, prodllClendo c41lllas lIIJas del mlsmo tipo. Tanto la velocldad de prallferaci6" como la sllpervlvencia de los IIepatocitos estdn co"trolatias para mante"er el ",lmera total de c4llllas aproplado. 51 se destrllye Ima gra" parte del hfgado, los IIepatocitos restantes Incrementan Sll uelocldad de dlvls16n restmlrando diclla ~r· diM; sl se Incrementa transitorlamente la proliferad6" de los hepatoc/los median· te tratnmlento con drogas, el allmento del mimero de cilulas es lnmedlatamente compensallo por un allmento de la mll.erte "'ular, recllperd"dose el mlmero oormal de cllulas. Estos mecnnlsmos de control en lin tejido, "omralmente ma"tienen el mlmero de cllulas de cadn tlpo en un equIlibrio aprop/ado. 51" embargo, como respuesta a una leswn ocaslonal, la reparad6n puede dane de fonna deseqllilibra· do, oomo ocurre en leslones repetiLUu del h(gada en las que los ftbroblastos cream denuuJado rdpldamente en relad6n al creclmiento de los IIepatocltos, de fonna qlle los hepatocltos quedan substltuldos por tejido conJlmtlvo. Las cilulasendotellalesfonnan llna monocapa celularque reviste todin los 00' sos sangu{nem y regula los intercamblos entre la oorriente sa"gu(nea y los te]uws subyacentes. Los nuevos vasos sangu(neos Ie desarrollan a partir de las paredes de peqlleilos vasos ya exlste"tes, a lralJU del crecimiento de clllllas emlotellales que Henen la capacldad de fonnar capilares clUlndo crecen aisladas ell c"ltivo, En el orga"ismo, los tejidos an6.rlcos, leslonados 0 en creclmle"to, est/mula" la angiogenesis medla"te la libertu:i6" de ftu:tores de creelmiento angiog4nlcos. Dlchos ftu:to-

Renovacl6n por biparticl6n simple

1235

,

res atraen dlulas endQtelJales y las estimlllan para qlle segregu.en proteasas, proliJeren y formen nuevas capilares.

I

Renovaci6n por medio de celulas madre: la epidermis~' 15 Ahora pasamos de las poblaciones celulares que se renuevan por duplicaci6n simple a las que se renllevan mediante la intervenci6n de celulas madre (stem cells). Estas poblaciones varfan ampliamente. no s610 en cuanto al caracler celular y a la velocidad de renovaci6n, sino tambicn en cuanlo a la geomeul"a de la substitllci6n celular. En el revestimiento del intestino delgado, por ejemplo, las cclulas estan dispuestas en forma de epilelio monoestratificado. Este epitelio recubre la superficie de las vellosidades que se proyectan hacia la luz intestinal y reviste las criptas que descienden hasta ellejido conjunlivo subyacenle (Figura 22-16). Las celulas madre se encuentran en una posici6n resguardada, en el fondo de las criplas. Las celulas diferenciadas que se generan a panir de ellas se transportan hacia arriba por un movimiento de deslizamienlO en el plano de la capa epitelial, hasta que Ilegan a las superficies lib res de las vellosidades; en el extrema de las vellosidades las celulas mueren y son expulsadas a la luz intestinal. Otro ejemplo 10 enconlramos en el epitelio que forma la cubierta externa de la piel. denominada epidermis. La epidermis es un epitelio pluriestratificado y las celulas en diferenciaci6n se desplazan hacia el exterior desde su lugar de origen, ell direcci6n perpendicular al plano de la capa celular. En el caso de las celulas sangufneas, el patr6n espacial de prodllcci6n resulta ca6tico. Sin embargo antes de entrar en mas detalles hemos de detenernos a considerar que es una celula madre.

Figura 22-16 Renovaclon del revestlmlento dellntestlno. (Aj Esquema que muestra el modelo de renovaci6n y proliferaci6n celular de las eelulas madre en el epiteJio que forma el rcvestimicnto del intestino delgado. Las celulas diferenciadas que no se dividen en la base de las criptas poseen un cicio vital definido, que finaliza can la muerte celular programada y son reemplazadas eontinuamente por el Hnaje de eelulas madre. (B) Micrografla de una secci6n de una regi6n del revestimiento del intestino delgado, mostrando las vellosidades y las eriptas. Observese como las celulas ealiciformes, que segregan mucus (tei'iidas de rojo), estan entremezcladas eon las celulas absorbentes can ribete en cepillo (enterocitos) del epilelio de las vellosidades. Vease en la Figura 22·9 la ultraestruetura de dichas celulas.

LUZ INTESTINAL

migraci6n de las celulas epiteliales

~O:~~e~~:·~il~~:::{a:~

vellosidad (sin dlvisi6n celulerl

I

81

extremo de la vellosidad lei tiempo de transito es de 3 a 5 diasl

secci6n transversal de una vellosidad

celulas absorbentes can tibete en cepilio

celulas epiteliales cripta

vellosidadl-+-_-rl~

_

tejldo conjuntivo laxo

, , , . J

seccl6n transveraal de una ctipta

celulas caliciformas que segregan mucus

diferencladas que no se dividen

dlracci6n del movimiento celuler •

U

celulas que se dividen repidamente Wempo del cicio. " horaal

celulas madre que se dividen lentamente Itiempo del cicio 2: 24 horasl

lA'

1236

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Capftulo 22: Celulas diferencladas y conservad6n de los tejjdos

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clliula madre

Las celulas madre pueden dividirse sin limite y dar lugar a una progenie diferenciada 16 Las propiedades que definen a una celula madre son las siguientes: I. No est(\ 10lalmenle diferenciada (es ded.r, no se encuenlra al final del proceso de diferenciaci6nJ. 2. Se puede dividir sin Hmiles. por 10 menos durante el cicio vital del animal. 3. Cuando se divide. cada celula hija puede permanecer como celula madre. 0 puede iniciar una via que conduce irreversiblemenle hacia la diferenciaci6n terminal (Figura 22-17). Las celulas madre son necesarias siempre que se presenta la exigencia recurreme de reemplazar celu)as diferenciadas, las cuales no pueden dividirse por sf mismas. En diversos tejidos el estado terminal de diferenciaci6n celular es incompatible, por cuestiones obvias, can la divisi6n celular. EI nucleo ce)ular, por ejemplo, puede destruirse, como sucede en las capas mas eXlernas de la piel, 0 puede ser expulsado como ocurre en los eritrocitos de los mamfferos. Tambien es posible que el ciloplasma este sobrecargado de estructuras, como por ejemplo de miofibrillas en las fibras Illusculares estriadas, que dificulten la mitosis y la citocinesis. En otras celuJas diferenciadas de fonna tenninal, las propiedades qufmicas de la diferenciaci6n han de ser incompatibles can la divisi6n celular de algljn modo m~s suti!. En cualquiera de estos casos, la renovaci6n ha de depender de las cclulas madre. La misi6n de la celula madre no consisle en Ilegar a diferenciarse sino en producir cclulas que se diferencien. A consecuencia de ella las celulas madre tienen a menudo un aspecto poco conspicuo, par 10 que resuhan dificiles de identificar. Pero esto no quiere decir que lodas las celulas madre sean iguales. No estAn diferenciadas de forma terminal pero SI estAn determjnadas (vease pcig. 1136): la celula saMlile muscular, que origina el musculo esqueJetico; la celula madre epidcrmica, que origina las cclulas epidermicas queratinizadas; la espermatogonia, que origina el espermalozoide; la celula basal del epilelio olfauva, que origina las neuronas olfativas (Figura 22-18), etc. Las cclulas madre que dan lugar a un unica tipo de celula diferenciada reciben el nombre de wlipotellciales y las que dan lugar a muchos tipos celuJares reciben el nombre de pillripole"ciales. Los tejidos que se forman a partir de celulas madre plantean importantes cuestiones. Hemos de considerar que tipo de facto res determinan el que una celula madre se divida 0 permanezca quiescente, que es 10 que condiciona que una celula hija, una vez form ada, permanezca como celula madre 0 se diferencie y de que forma se regula el proceso una vez ha entrado en la via de la diferenciaci6n. Par otro lado, cabe considerar Cll3.ntas celulas mlleren y c6mo se controla la supcrvivcncia. Empezaremos nuestro estudio con la epidennis, que por su

I\\....-neurona 011.1.",.

Renavaclon por media de celulas madre: la epidennis

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• • c6ful. dilerMlC.ada de form. lermiMl

Figura 22-17 Deflnici6n de una ceuJa madre. Cada una de las celulas hijas procedentes de la division de una cl'!lula madre puede permanecer como cl'!luIa madre 0 iniciar el proceso hacia la direrenciacion lerminal.

Figura 22-18 Esquema de una seccl6n transversal del epltelio olratlvo. En este epitelio, especializado en la percepci6n de olores, se pueden dlstinguir tres tipos celulares: cl'!lulas de sosten, celulas basales y neuronas olfativas. Por autorradiograffa se demuestra que las celulas basaleS son las celulas madre de la producci6n de neuronas olfativas, las cuales, pues, constituyen una de las pocas excepciones a la regIa general de que las neuronas son celulas permanentes. Cada neurona olrativa sobrevive aproximadamente un mes (en los mamfreros) anles de ser subsliluida. De la cabeza globular de la neurona olfmiva se proycclan entre seis y ocho cilios modillcados.los cuales. segtln parece, conlienen los receptores olfativos. EI ax6n que se extiende desde el Olro extremo de la neurona, transmile el mensaje hasla el cerebro. Cada Vel. que una cl'!lula basal se diferencia y se conviene en una neurona olfaloria se ha de desarroUar un nuevo ax6n, que lendnl. que establecer las conexiones apropiadas.

1237

capa de escamas } - muenas queratlnizadas _ _ ClipS de cliliulas granulares

L J_

0--

capa de clliulas espino58s capa de cliluin baules Illmina basal

tejido conjuntlvo de Ie dermis

'A' seneilla organizaci6n espacial facilita el estudio de la historia natural de sus lulas madre y del destino de su progenie.

ce-

Las celulas madre epidermicas se encuentran en la capa basaJl7. 18 La capa epidermica de la piel y el revestimiento epitelial del tracto digestivo son los dos tejidos que sufren el COnlacto mas directo y perjudicial con el ambiente externD. En ambos casas, las celulas diferenciadas maduras desaparecen rapidamente en los lugares mas expuestos y son substituidas gracias a la proliferaci6n de celulas menos diferenciadas en nichos mas resguardados.

filementos _ _J!-";" de qUeratlfla dosmosoma que conacts dos celulas entre sf

condueto ablarto

100 I.lm

Figura 22·19 Sec<:l6n transversal de la epldennls de mamffero. (AJ Esquema. (B) MicrofolOgraffa de Wla secci6n transversal de la planta del pie (tinci6n de hematoxilina y Van Gieson). Las cell/las granulo.res entre las ctHuias espinosas y las escamas aplanadas se hallan en la pellllltima fase de queratinizaci6n: aparecen granuladas debido a que contienen unos agregados que se th'ien de oscuro, formados por un material denominado qlleratohialina, que al parecer participa en la compactaci6n imracelular y en el ensamblaje de la queratina. La queratohialina esta form ada basicamente por una protelna conocida como filo.grina. Ademas de las celulas destinadas a la queratinizaci6n, las capas profundas de la epidermis contienen un m.lmero reducido de celulas de caracter bastante diferente (no se observan aquO -como las celulas de LaligerlwfIS de cart'icter macrofagico, derivadas de la mcdula 6sea; los melallocitos, derlvados de la cresta neural y las cell/las de Merkel, que estan asociadas con terminaciones nerviosas de la epidermis. vease tambicn Figura 22-1.

f
1238

Capftulo 22: Cclulas diferencladas y conservacl6n de los tejidos

La epidermis es un epitelio pluriestratificado constituido mayoritariamente par qlleratinocitos (denominados asf debido a que su actividad caraclerfstica diferenciada es la sfnlesis de protefnas denommadas queratinllS que forman los fllamentos intermedios) (Figura 22-19). Estas c~lulas varran de aspecto de una capa a otra. Las que se hallan en la capa mas interna, adheridas a una lamina basal subyacente. se denomlnan cilulas basales y normalmente son 6slas las que presentan mayor numero de mitosis. Por encima de las celulas basales se hallan unas cuantas capas de grandes celulas espinosas (Figura 22-20), cuyos numero· sos desmosomas -zonas de anclaje de gruesos haces de marnentos de queratina- se visualizan aI microscopio 6ptico como finas espinas alred.edor de la superficie celular (de ahf su nombre). Por encima del estrato espinoso se extiende la capa granular (vease Figura 22-19). £Sta capa marca la frontera entre la zona profunda melab6licamente activa y la zona extema de la epidermis, constimida por c~lulas rnuertas cuyos org<1nulos intracelulares han desaparecido. £Stas c~­ lulas mas extemas se reducen a escamas repletas de queratina densamenle empaquetada. La membrana plasm.hica de las escamas y de las ~Iulas granulares mas extemas se halla reforzada por su cara choplasmatica por una capa fina (12 nm), resistente y entramada que contiene una protefna intracelular denominada inuolucrina. Normalmente las propias escamas se hallan tan comprimidas y son tan delgadas que sus Ifmiles se visualizan con dificullad aI microscopio 6ptico, aunque tralandolas con hidr6xido s6dico se hinchan Jigeramenle y con una linci6n adecuada se puede observar en las regiones mas finas de la piel una dlsposici6n ordenada de forma geometrica. Las escamas estan apiladas en ordenadas columnas hexagonales que se entrelazan en los bordes (Figura 22·21), de forma que una columna presenla una altura de 10-20 celulas y se apoya sabre una base de unas 10 celulas basales.

Las c~lu1as epidermicas en diferenciaci6n sintetizan una secuencia de queratinas diferentes a medida que maduran l8 Una vez descrita la imagen eSlatica, pasemos ahora a la imagen funcional. Mien[ras algunas celulas basales se dividen, incorporandose a la poblaci6n celular de la capa basal, Olras (sus hermanas 0 primas) salen de la capa celular basal yen-

tePll de c4lulu g••nul,.,.

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tePll de ~ul.. IIplllOlll' CIlp,ll de cjlul..

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b'NIIi

I"min. bop'

Flgura22.21 OrgllIlizacl6n en columnas de las escamas de 10 capa epldermlca de 18 plel. La estructura se visualiza hinchando las escamas queratinizadas con una soluci6n de hidr6xido s6dico. Esle lipa de organizaci6n en columnas 5610 se presenla en los lugares en los que la epidennis es mis Iina. Algunos estudios sugieren que cada una de dichas columnas es una "unidad proliferativa~, que corresponde a una l1nica celula madre de las 10·12 ct!:lulas basales en las que se apoya la columna.

_ --';1-_ Ieiido eonjunlivo del, derml.

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Renovacldn por medJo de ce:lulas madre: Ia epidermis

1239

tran en la capa de celulas espinosas, siendo este el primer paso de su movimiento ascendente. Cuando Began a la capa granular, las celu[as empiezan a perder sus m1eleos y organulos citoplasmaticos y se transforman en las celuJas escamosas queratinizadas de la capa c6rnea. FinaJmente, las celulas escamosas queratinizadas se descaman en [a superficie de la piel y son arrastradas. en forma de polvo, por el aire. EI perfodo que transcurre desde el momenta en que se forma una celula en la capa basal de la piel humana hasta el momenta en que se desprende de su superficie, oscila entre dos y cuatro semanas segtin la regi6n del cuerpo de que se trate. Las transformaciones moleculares que acompafian este proceso se pueden estudiar analizando cortes finos de epidermis paralelos a [a superficie a capas sucesivas de celulas obtenidas por sucesivas aplicaciones y desprendimientos de cinta adhesiva. Por ejemplo, las moltkulas de queralina, que se haHan en gran cantidad en todas las capas de la epidermis, se pueden extraer e identificar. Existen varios tipos de queratinas (estudiados en el Capitulo 16), codificadas por una amplia familia de genes hom610gos, cuya diversidad se ve incrementada progresivamente mediante la maduraci6n alternativa de los transcritos genicos. A medida que el nuevo queratinodto en la base de la columna se transforma en [a escaroa de [a parte superior (vease Figura 22-21) expresa una sucesi6n de distintas selecdones del conjunto de genes que codifican queratina. Durante este proceso otras protefnas caracterfsticas, como [a involucrina, tambien se sintetizan en funci6n de un programa coordinado de diferenciaci6n celular terminal.

celule medre inmortel

Las celulas madre epidermicas son un subconjlU1to de las celulas basales l9 Si cada fragmento de epidermis se mantiene indefinidamente mediante la proliferaci6n de sus celulas basales, entre dichas celuJas basales debe existir por [0 menos una celuJa cuya Ifnea de descendientes no ml/era durante el cielo vital del animaJ. A esta celuJa se Ie denomina celula madre inmortal (Figura 22-22). En principio, la divisi6n de una celula madre inmortal podrfa generar dos celulas hijas inidalmente similares, cuyos diferentes destinos pueden estar generados por diversas circunst'ancias. En el casa opuesto, la divisi6n de la celula madre puede ser siempre asimetrica: podrfa ocurrir que una, y s610 una, de [as celulas hijas heredara una caracterfstica especial indispensable para ser imnortal. mientras que la otra podrfa presentar algl1n tipo de alterad6n desde el momento de . su fonnaci6n, de tal modo que se verfa forzada a diferenciarse y, final mente, a morir. En este ultimo caso no podria haber nunca ningun incremento del numero de celulas madre inmortales existentes, 10 cual se contradice con los hechos. Si se destruye un fragmento de epidermis, la lesi6n se repara gracias a las celulas epidermicas sanas cercanas que migran y proliferan hasta cubrir el area afectada. En este proceso se establece un nuevo fragmento de epidermis renovado, [0 que impUca que las celulas madre inmortaJes adicionales se han generado para compensar la perdida. De este modo, el destino de las celulas hijas debe eSlar regulado al menos pardalmente par las circunstancias externas. Un posible factor determinante de este destino puede ser el contacto de las celuJas con la lamina basal 0 con ellejido conjuntivo expuesto en una lesi6n, con una perdida de dicho contacto se desencadena el proceso de la diferenciad6n terminal yel mantenimiento del concacto tiende a preservar el potenciaJ de la celula madre. Sin embargo, estudios in vitro han demostrado que este no es e[ unico delerminante del destino de la celuJa basaJ. Los queratinocitos basales pueden disociarse de la epidermis intacta y proliferar en una placa de cultivo, dando lugar a nuevas celulas basales y a celulas diferenciadas terminales. lneluso en una poblaci6n de queratinocitos basales cuitivados en que todos aparecen indiferenciados, existe una gran variabilidad en la capacidad de proliferaci6n. Cuando se aislan las celulas y se comprueba Sll capacidad para formar nuevas colonias, algunas carecen tota[mente de [a capaci1240

Capftulo 22: C~lulas diferencladas y conservacl6n de los lejldos

FIgura 22-22 Cclula madre lnmortal. Cada zona de epidermis con capacidad de renovacl6n debe cantener en cada generaci6n celular por 10 menos una cclula madre "inmortal~, cuyas descendientes todavfa se encontrardn presenles en aquella zona en un fulum lejano. Las flechas indican las lineas de descendencla. En el dibujo se muestra una cclula madre inmortal que ocupa la misma posicl6n en cada generacl6n celular. Se pueden formar otras celulas basales qu(micamente distintas. de tal forma que se vean obligadas a abandonar la capa basal ya diferenclarse; tambien pueden ser celulas madre. equivalenles a la celula madre inmortal en cuanla a su caracter y s610 mortales en el sentldo de que su descendencia sera desplazada posteriormente desde In capa basal ydesprendida en la superficie de la piel.

dad de dividirse, otras desarrollan unicamente unos cuantos ciclos de divisi6n y mas tarde se deticnen. y otras todavfa pueden dividirse 10 suficiente para formar nuevas colonias. Las celulas basales difieren tambien en la expresi6n de los receptores de la matriz eXlracelular de la familia de las integrinas (estudiados en el Capftulo 19): las celulas que po~een mayor numero de dichos receplores y mayor capacidad de uni6n a los componentes de la lamina basal son las que presentan un mayor potencial de proliferaci6n. Esto sugiere que no todas las relulas basales son similares in lJivo y que el mero contacto de dichas celulas con la lamina basal no es suficiente para mantenerlas como relulas madre. Mejor dicho. al parecer las celulas madre constituyen un pequeno subconjunto -alrededor de un IO%- de la poblaci6n de celulas basales que estan programadas para generar una ciena proporci6n dellinaje destinada a la diferenciaci6n terminal. inc!uso antes de haber abandon<\do la capa basal. De hecho. si se cultivan queratinocitos en un medio deficiente en Cal<. que pennite mantenerlos en monocapa y por tanto en una posici6n basal, algunos emprenden una dlferenciaci6n tenninal a pesa.r de su localizaci6n. como indica la sfntesis de involucrina; dichas celulas diferenciadas emergen de la capa basal en el momento en que se aumenta la concentraciOn de Caz>. No obstante, el contacto con la matriz extracelular ejerce una influencia critica en la selecci6n del destino de la celula. que evidentemente no esta programada de fonna rigida. Si se mantienen las celulas en suspensi6n, en lugar de poder dispersarse y adherirse al fondo de la placa de cullivo, tOOas elias cesan de dividi.rse y se diferencian. No obstante. algunas celulas no se diferenciarnn ni en suspensi6n. si el medio induye fibronectina (un componente minoritario de la lamina basal y un componente mayoritario de la mauiz extracelular que provoca la migraci6n de los queratinocitos durante la curaci6n de las heridas). Las celulas que manifiestan dicha respuesta a la fibroneclina son las que poseen las integrinas adecuadas. En condiciones nonnales. posiblemente la existencia de dichos receptores mantiene las celulas unidas a la lamina basal, conservando la posibilidad de pennanecer como celulas madre; la perdida 0 inactivaci6n de los receplores provoca la expulsi6n desde la capa basal, confmnando con ello la opci6n de la diferenciaci6n; la expulsi6n de la capa basal por otras causas que provocan la perdida de receptores obliga a la celula a diferenciarse de forma prematura.

La.proliferaci6n de las c~Hulas basales se regula en funci6n del grosor de la epidermis 20 Sea cual sea la influencia de la lamina basal, deben intervenir con troles adicionales para regular el indice de producci6n y el in dice de mantenimicnto de las celulas epidermicas. Por ejemplo, si se extirpan las capas externas de la epidermis, la velocidad de divisi6n de las celulas basales aumenta. Despues de una hipenrofia transitoria, se restablece el grosor nonnal y la velocidad de divisi6n de la capa basal disminuye hasta los valores normales. Es como si la extirpaci6n de las capas diferenciadas Iiberara a las celulas de la capa basal proliferativa de una influencia inhibidora y fueran sometidas de nuevo a esta inhibici6n en cuanto las capas externas recuperan su grosor habitual. Es bien conocido que los queratinocilos en CUllivo responden a una gran variedad de hormonas y factores de crecimiento, incluyendo el factor de creclrniemo epidermico (EGF. de Epidermal Growth Factor). pero los mecanismos moleculares que regulan su proliferaci6n en el organismo continuan siendo un problema tOdavfa sin resolver. de gran importancia c1fnica. las consecuencias de un control defectuoso de la proJiferaci6n celular basal se observan en la psoriasis. En este trastomo cut:ineo tan frecuente. la velocidad de proliferaci6n de las celulas basales esta muy aumentada -Ia epidennis se vuelve ml1s gruesa y las eelulas se expulsan de la superficie de la piel al cabo de una semana de haber surgido de la eapa basal, ant.es de haber tenido tiempo de queratini:r.a.rse por completo. Renovaeldn por medlo de ct:lulas madre: la epidennis

1241

hBmbra virgen leche expulsada en el condueto

compleio de Golgi c'lula mioepiteliel

hembra lactante

c'lula alveolar expensi6n de une celula mioepitellel

,

'AI

'81

,e,

Figura 22·23 La ghindula mamarla. (A) Esquema del erecimiento de los alveolos a partir de los conductos de la glandula mamaria durante el embarazo y la lactancia. Unieamente se muestra una pequena parte de la gl~ndula. La gl~lldula "en reposo" presenta una reducida eantidad de tejido glandular inaetivo. englobado ell una gran masa de tejido eonjulltivo de tipo adiposo. Durante el embarazo tiene lugar una intensa proliferaci6n de tejido glandular a expensas del tejido adiposo; las porciones seeretoras de la gl~ndula desarrol1an preferentemente alveolos. (B) Uno de los alveolos de la g1
Las c~luJas secretoras de la piel estlin agrupadas en gllindulas que tienen su propia cin~tica de poblaci6n 21 En ciertas regiones especiaJizadas de la superficie del cuerpo, a panir de la epidermis embrionaria se desarrollan, ademas de las celulas queratinizadas antes descritas, otros tipos de celulas. En particular, secreciones tales como el sudor, las lagrimas, la saliva y la leche se producen en celllias situadas en glandulas profundas, que se originan como invaginaciones de la epidermis pero que tienen patrones de renovaci6n distintos a los de las regiones qlleratinizadas. La glandula mamaria presenta un interes especial a causa del control hormonal de sus procesos de divisi6n y diferenciaci6n celular. La producci6n de leche debe empezar cuando ha nacido un bebe y debe terminar cuando este es destetado. Una glandula mamaria "en reposo" esta formada por un sistema raM mificado de condllctos excretores rodeados de tejido conjunlivo: estos conductos estan revestidos en sus porciones secretoras por una unica capa de celulas epiteliales relativamente inactivas, que actlian como celulas madre. Como primer paso hacia la producci6n de leche a gran escala, las hormonas que circulan 1242

Capftulo 22 : Celulas diferenciadas y conservaci6n de los leJldos

por la sangre durante cl embarazo hacen que las celulas de los cOllductos proliferell y que las porcioncs terminales de los conduclos crezcan y se ramifiquen, formando pequenas bolsas dilatadas 0 alveolos, que conlienen celulas secretoras (Figura 22-23). La secreci6n de leche se inicia s610 cuando, Uas cl nacimiento del bebe, estas celulas son estimuladas por distintas combinacioncs de hormonas circulanles en la madre. M
Resumen MuchO$ te}ido$, espedalmente los que denen un desgaste y una prolifemd6n rtfpl· dos -rales como el reuestimlento intestinal, Ia capa epitUrmica dB In piel y los te}l· dos hernnlopayiticos- se renuevan nU?diante dlulns nuulre. Las cllulas madre, par definicl6n, no esldl! lotalmente diferencladas y pos«n Ia capacldad de dil/ldine durante el cicio IIltnl del organismo produclendo unos Una}es celulares que se diferencian y OlrOS qlle contlnwm como cllulas moore. En Ia piel, las clluUu madre de la epidermis se encuentran en la capa basal, adheridtu a Ia lAmina basal. E1lbla}e celulnr procetknte de las dlulas nuulre se diferenc:ia til abmuhmar dlcha capa y. a medida que se ooplaza hacla el exterior, slntetiza una serie de tipas de queratina diferentes IUlSra qlle, fillalmente, sus nucleos degeneran producletldo una capa externa de c1lulas queratltllzadas m"ertas que condl!uamente se I/QII desprel.diendo de In superflcie de la piel. l1nicamellte una mftlinra parte de dlulas basales 5011 dIllias madre. £1 destl"o de las dl,,1as origi'Jadas a partir de wla d/uln madre estd controiado parcialme,.te por Interacclo1les COIlIa /dmina basal y en parle por otros factores mflY poco collocidos. &tos factores pasibUlIan que d"ratJte IllS procesos de reparacl6" seformell dos celllias madre a partir de Ilna de elias, Y reglllan la velocl· dnd de proUferac161l de las cillllas basaws segdn el grosor de In epidermis. Las gldlldulas collectadas a la epidermis, como las gldlld"las mlmrarias, poseen S/IS proplas cilfltas ",,,,Ire Y SIIS patrOlles de renovaci6" cellliar ctIracterlstlcos.

Renovaci6n por medio de celulas madre pluripotenciales: formaci6n de las celulas sangufneas22 • 23 La sangre presenta muchos tipos celulares can Cunciones muy diversas. que abarcan desde el transpone de oxfgeno hasta la producci6n de anticuerpos. A1gunas de estas funciones celuJares tienen lugar enteramente en el sistema vascuJar, mientras OUas utilizan dicho sistema vascular s610 como media de transpone y Uevan a cabo su funci6n en otro lugar. Sin embargo, lodas las celulas sanguJneas presenlan similitudes en su cicio vital. Todas eUas denen una vida de duraci6n Iimilada y todas se reproducen de forma continua a 10 largo de tOOa la vida del animal. La caraclerfstica m
Renovacl6n por media de cElulas madre pluripotenclales: fonnacl6n de las celuJas sangulneas

1243

Figura 22-24 ElectronmlcrograJfa de barrldo de clSlulas sangufneas de mamlfero en un vaso S8nguIneo de pequeno calibre. las cl'!lulas mayores, m~s esfl'!ricas y con una super6cie rugosa, son leucocitos; las ce:lulas menoreS,lisas yaplanadas, son eritrocilos. (De R.G. Kessel y R.H. Kardan, Tissues and Organs; A Text-Atlas orScannlng Electron Microscopy. San Francisco: Freeman, 1979. Copyright CI979 W.H. Freeman and Company.)

las ce:lulas sangufneas se pueden dasificar en rojas y blancas (Figura 22-24). Los g16buJos rojos, 0 eritrocllos, pennanecen en el imerior de los vasas sangu{neos y transportan O2 y CO~ unidos a la hemoglobina. Los g16buJos b1ancos, 0 leucocilos, combaten las infecciones y, en algunos casos, fagocitan y digieren substancias residuales. Para lIevar a cabo sus funciones, los leucocilos, a diferencia de los erirrocilOs, se han de abrir paso a rrave:s de las paredes de los vasos sanguineos de pequeno calibre y han de migrar hacia los rejidos. Ademas la sangre presenta una gran numero de plaqlletas, que no son ce:lulas complelas sino pequenos {ragmemos celulares disgregados 0 ~mjnicelulas" derivadas del cilOplasma cortical de grandes ce:lulas denominadas megacariocilos. las plaqueras se adhieren de forma espedfica a las celulas endoleliales que reviSlen los vasos sanguJneos lesionados, donde inrervienen en la reparaci6n de las roturas y brechas asf como en el proceso de la coagulaci6n sangufnea.

Existen tres tipos principales de gl6bulos blancos: los granulocitos, los monocitos y los linfocitos22.23 Todos los gl6bulos rajas son similares entre sf, como tambie:n los son las plaquetas; sin embargo existen varios tipos distintos de gl6bulos blancos. Tradicionalmente se agrllpan en tres grandes categorfas, denominadas granulocitos, monocilOS y linfocitos, en base a su aspecto al microscopio 6ptico. Todos los granuJodlos contienen numerasos lisosomas y vesfcllias secretoras (0 gn1nulos) y se subdividen en tres c1ases en funci6n de la morfologfa y de las propiedades lintoriales de estos organulos (Figura 22-25). las caracterfsticas tintoriales reflejan diferencias importantes en cuanto a sus propiedades qufmicas y a su funci6n: los Ilelltrofilos (tambh~n denominados lellcocitos pofimorfoll11cleares debido a su nueleo rnultilobulado) constituyen el ripo de granulocitos m
CapftuJo Z2: Cf:lulas diferenciadas yconservacl6n de los tejidos

linfocito -*nOfilo

mOl'\Oci1o

.....~~

neutrOfiIo

L..--J 20 11m

0160010 roja

Figura 22·25 Los g16bulo5 blancos de 10 sangre. (A-D) Eleclronmicrograffas en que se muestran respectivamente, un neutr6filo, un bas6filo, un eosin6mo y un monocilO. En la Figura 23-4 se han presenlado electronmicrografias de linfocilOs. Cada uno de los tipos celulares represemados aquf tiene una funci6n dislinta. que se reneja en los diferenles tipos de grnnulos de secreci6n y de lisosomas que contiene. Cada c~lula presenta un solo mlcleo, aunque presenta una forma 10buJada irregular. yen (B), (el y (D) las conexiones entre los 16bulos se hallan fuera del plano de la secci6n. (E) Micrograffa de un frotis sangufneo teftido con la tocnica de Romanowsky, que tine intensamente los g16bulos blancos. (A-D, conesfa de Dorothy Bainlon; E. conesfa de David Mason.)

somales. Los macr6fagos. sin embargo. son mucho mas grandes y presentan una vida mas larga que los neutr6fi1os. Son responsables de eliminar las celulas aile· radas. envejecidas y muenas de muchos tejidos y son los unicos capaces de ingerir grandes microorga.l1ismos. como los prolozooS. &islen dos tipos principales de HnfocJlos. ambos implicados en respuest'as inmu.l1es: los Iillfociros B fabrican anticucrpos, mientras que los finfocitos T matan celulas infcctadas por virus y regulan la actividad de otros gl6bulos blancos. Adcmas ex.islen celulas de caracter Iinfochario denominadas cell/las asesinas (celllias NK de Natural KiJler Cells) que destruyen cienos tipos de celulas tumorales yde celulas infectadas por virus. La producci6n de Jinfocitos es un lema especializado que sera discutido con detalle en el Capitulo 23. Ahara vamos a ccntrarnos principalmente en el proceso de fom13ci6n de los otros g16bulos blancos. tarnbien denominados. en conjunto. celulas mieloldes. En la Tabla 22- I se resumen los distintos tipos de celulas sanguineas y sus funciones. Renovaci6n por medio de c(!lulas madre pluripotenciales: formaci6n de las ct:!lulas sangu(neas

1245

1 Tabla 22-1 OOulas sangufneas

Tlpo celu1ar

Funclones prlnclpales

Concentraclones caraclerfsUcas en sangre humana (ctlulas/Utco) 5 X IOIZ

GI6bulos roJOS (erltrocitos)

GI6buJos blancos (Ieucocltos) Gramdocitos Neutrofilos (leucodtos fagocilan y desuuyen bacterias invasoras

5x 10'

polimorfonucleares)

Eosin6nJos

Bas6fi1os MOflocitos

Un/oci/os Cehllas B CelulasT Cilulas asesinas (oelllias NJO Plaquetas (fragmentos celulares procedentes de megacnrioc:iros de la

destroyeD par~sitos y modulan respuestas infiamatorias de tipo aJergico liberal\ histarnina y serotonina en elertas

rcaedones inmunitarias se conviertcn en macr6fagos en los teJidas, mediante fagocitosis y digesti611 de microorganismos invasores, cuerpos extral'os y ctHulas envejecidas rabrican anticuerpos malan celulas infectadas por virus y regulan la actividad de otros leucadlas malan c~lulas infectadas por virus y a1gunas

celulas tumorales inician el proceso de coagulaci6n

2 x lOS 4 X 101

4 x lOS

2 x 10'

I x 10' I x 10*

3 X 1011

m~ula6seal

EI cuerpo humano contiene a1rededor de 5 linos de sangre. que supone un ~ del peso del cuerpo. Los g16bulos rojos constilUyen a1rededor de un 45% de este volumen y los g16bulos blancos a1rededor de un 1%, el resto es el plasma Sllngu(neo Iiquido.

La producci6n de los distintos tipos de ctHulas sangumeas en la medula 6sea se halla controlada individualmente 22 ,24 La mayorfa de los g16buJos blancos no actuan en la sangre sino en Olros tejidos.

La sangre unicamente los transporta a los lugares donde se necesitan. Una infecci6n local 0 una herida en algt1n tejido rapidamente auae a los gl6bulos blancos hacia la regi6n afectada, como pane de una respuesta Inflamatoria que actua contra la infecci6n 0 reparando la herida. La respuesta inflamatoria es compleja y esta provocada por distintas molkulas sei\a1 producidas localmente por mastocitos. por tenninaciones nerviosas. por plaquetas y por gl6bulos blancos. asf como por la activaci6n del complemento (discutido en el CapftuJo 23). A1gunas de estas molkulas seoal actuan cerca de los capilares. provocando una dismi+ nuci6n de la adhesi6n entre las c~lulas endoteliales pero incrementando la ad+ herencia de la superficie de estas c~lulas aI paso de los g16bulos blancos. Asr, los g16bulos blancos quedan atrapados en la superficie interna del vasa como mari+ posas en un cazamariposas, de donde pueden escapar deslizAndose entre las celulas endoteliales y atravesando la lamina basal con la ayuda de las enzimas digestivas; la uni6n inicial a las celulas endoteliales se realiza mediante selecrinas (estudiadas en el Capitulo 10) y la uni6n mas fuene que necesitan las celuJas sangufneas para atravesar la pared de los vasos sangufneos se realiza mediante inregrinas (estudiadas en el Capftulo 19). Otras mol~cuJas actuao como agentes quimiotl1cticos para distintos tipos de gl6buJos blancos, provocando una polari-

1246

CapCtulo 22: Celulas diferencladas y conservaci6n de los telidos

Figura 22-26 Migracl6n de 101 g16buJos blaneos desde la elrcuJacl6n sangulnea durante la rapuesta lnOamatorla. La respuesta se inieia a Irav~ de diSlinlas moleculas senal producidas localmente por diversas eelulas (principalmente del tejido eonjunlivoJ 0 por aelivaci6n del eomplemenlo. Algunos de estos agente5 inlermediarios aetuan a nivel de las celulas capilares endoleliales, provocando la perdida de 5ll adhesi6n a las eelulas pr6ximas de rorma que los eapilares se vuelven mas permeables; la eslimulaci6n de las celulas endoleliales provoca la expresi6n de selecIinas -moleeulas de la superficie celular que reconocen carbohidralos especffieos localizados en la superficie de los leucocitos de la sangre y provocan su adhesi6n al endotelio. OlrOS ngelltes intermediarios aetuan como raelores quimiotll.cticos dirigiendo el avance de los lecucocitos que penetran entre las celulas endoleliales de los cal>Uares hada el tcjido circundante.

zaci6n en dichas relulas la cual las hace avanzar hacia el lugar de origen de la sustancia quimiotactica. EI resuhado de lodo eUo es que en el lejido afectado penetran un gran mimero de gJ6buJos blancos (Figura 22-26). Duas molOClilas sefial, producidas en el transcurso de la respuesta inflamatoria, pasan a 1a sangre y estimulan a la medula 6sea para que produz.ca mas leucocitos. libemndolos haeia la circuJaci6n sanguinea. La medula 6sea constiluye el objetivo principal de esta regulaci6n ya que, con excepci6n de los linfocitos y de algunos macrMagos, la mayorfa de los tipos de gJ6buios blancos en los mamfferos adullos se generan unicamente en la miiduJa 6sea. La regulaci6n tiende a ser especffica para cada lipo celular: algunas infecciones bacterianas, por ejemplo, provocan un aumento selectivo de neutr6ftJos, miemras que las infecciones por protozoos y por orras pan1.sitos provocan un incremento selectivo de eosin6filos. (Por este mOlivo se reaUzan rutinariamenle recuemos direrenciales de gl6bulos blancos para emitir el diagn6stico de infecciones y de otras enfermedades inflamatorias.l En otras circunslancias. se incrementa selectivamente la praducci6n de eriuocitos -por ejemplo, en individuos que viven en altitudes elevadas, donde el oxfgeno es mas escaso. Esta fonnaci6n de eeluJas sangurneas (hematopoyesis) implica necesariamenle la existencia de complejos controles, bajo los cuales la producci6n de cada ripo de ciilulas sangufneas se regula individualmente, de forma que pueden variar de acuerdo con las necesidades. EI comprender c6mo actlian dkhos contrales constituye un problema de gran importancia medica. y se han conseguido grandes progresos en este campo en los lillimos afms. En animales intactos, la hematopoyesis es mas diffcil de analizar que la renovaci6n celular de un lejido como la capa epidermica de la piel. En la epidermis existe una organizaci6n espacial regular que facilita el seguimiento del proceso de renovaci6n y la localizaci6n de las celuJas madre: sin embargo, en el casu de los tejidos hemalopoyiiticos esto no es as!. En cambio. las ciilulas hemalopoyetieas presentan un tipo de vida n6mada que las haee mas aeeesibies a otros tipos de estudios experimentales. Las celulas hematopoyeticas dispersas pueden transferirse facilmente, sin alteraciones, de un animal a otro; ademas. en estas ciilulas mantenidas en cultivo se puede observar y analizar la proliferaci6n y la diferenciaci6n de celuJas individuales y de su progenie. Par este motivo. se dispone de m~dalOS sobre las molecuJas que eontrolan la producci6n de ciilulas sangui'neas que sobre los mecanismos de conuol de producci6n celuJar a njvel de otros tejidos de mamiferos.

c81ule endOlllie'

gl6bulo blenco lin II Intllrior del capiler

I

EXPOSICION A LOS AGENTES INTERMEOIARIOS DE LA INfLAMACION UBERADOS POR EL TEJIDO LESIONADO

OUIMIOTAXIS HACIA LOS AGENTES RESPONSABLES DE LA A TRACOON UBERAOO5-POR EL TEJIDO LES10NAOO

I

glObulo, bl.nco, lin el tejido conJuntlvo

La medula 6sea contiene las celuJas madre hematopoyeticas22, 25 En la miidula 6sea se pueden distinguir los direrentes lipos de celulas sangl.lfneas y sus precursores inmediatos por su aspeCIO caracterfstico (Figura 22-27). Todas elias se hallan enuemezcladas unas con OUBS, as! como con los adipocitos y con otras etluJas del estroma (relulas conjuntivas) que fonnan una delieada red estructural de fibras de colagena y de otros componentes de la matm extracelular. AdeRenovacl6n por medJo de eelulas madre pluripotenclales: rormaci6n de las ce1ulas sangufneas

1247

neutrofito. inmedura.

precUBOfH

de

los erttrocila.

:~~"'.;f- megllCeriocilo inmaduro

181

eo.lnofilo inmlldufo

monoclto inmeduro

erilrocilO

linfocllo inmeduro

Figura 22·27 La meduJll 6sell. (A) Micrografia de una sccci6n tenida. Los amplios espacios vados corresponden a adipocilos, cuyo COlltenido en Ifpidos se ha disuelto en el uanscurso del procesado de la muestra. La ctHula gigante con nucleo lobulado es un megacariocito. (8) E1ecuonmicrografia a bajos aumentos. Esle tejido constituye la fuente principal de nuevas celulas sangufneas (exceptuando los linfocitos T, que se producen en el timo). Ob~rvese que las celulas sangufneas inmaduras de un tipo determinado tienden a agruparse en "grupos familiares (A, cortcs{a de David Mason; 8, de JAG. Rhodin, Histology: ATexi and Atlas. New York.: Oxford University Press, 1974.) R

•

Figura 22·28 los megacariocltos. (A) Esquema de un megacariocito situado entre distintas aHulas de la medula 6sea. Su enorme lamano es el resultado de la elevada poliploid£a desu nucleo. Un megacariocito produce alredOOor de 10000 plaquetas, las cuales se extienden mediante largas expansiones que se imroducen a traves de los poros de las paredes de los sinusoides adyacent'es. (B) Eleclronmlcrograffa de barrido del interior de un sinusoide en la rnedula 6sea, en la que se observan las expansiones de los megacariocitos. (B. de R.C, Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A TextAtlas of SCanning Eleclron Microscopy. San Francisco: Freeman, 1979. Copyright e 1979, W.H. Freeman and Company.)

prolongeelOn del megaceriocilo emitiendo p1aquel..

lUI del ';nullOide

'" Clliul •• lIllngulneu en form &CIon

IAI

1248

meg&alriocito

20 11m plequele.

181

Capftulo 22: Celulas diferendadas yconservacl6n de los leJldos

expefl.lones de! megacer,ocito

globul0 ro)o

I

,

mas.lodo el tejido conjulltivo esta. altamente irrigado porvasos sangufneos de paredes muy finas (denominados sillusoides sangullleos) al interior de los cuales van a parar las nuevas c~llIlas. Tambi~n se hallan presenles los megacarlocllos; eSlas celulas, a diferencia de Olras relulas sangufneas, pennanecen en la medula 6sea despues de haber madurado, 10 cual conslituye una de sus caracterfslkas mas remarcables; ademas son extraordinariamente grandes (con un diameuo de mas de 60 lJm) y presentan un ntldeo con elevada poliploidfa. Nomlalmente se hallan adosados junto a los sinusoides y extienden sus expansiones a traves de los poros del reveslimienlO endolelial de estos vasos; las plaquetas se fragmenlan a nivel de sus expansiones y son arrastradas por la sangre (Figura 22-28). Debido a la compleja ordenaci6n celular de la m&lula 6sea, resulta diffcil la idemificaci6n de las precursores inmediatos de las relulas maduras. Las celulas que se hallan en esladios lempranos del desarrollo. antes de que inicien ninglln tipo de diferenciaci6n, son muy similares en su aspecto y no exiSle ninguna caraaeristica visible que pennila reconocer las llitimas celulas madre constituidas. Para su identificaci6n y caracterizaci6n, se necesita una prueba funcional. que consisle en el marcaje de la progenie de cada celula. Como veremos. esto puede realizarse i" vitro simplemente examinando las colonias que producen las celulas previameme aisladas. EI sistema hematopoye..ico. sin embargo. puede ser manipulado de fonna que los clones celulares plledan reconocerse in vivo en el animal intacto. Si se expone un animal a una dosis elevada de rayos X, las c~lulas hematopoyl!ticas se destruyen yel animal muere a los pocos dfas como consecuencia de su incapacidad de producir nuevas celulas sangufneas. EI animal irradiado puede salvarse. sin embargo. mediante una transfusi6n de cl!lulas extrafdas de la mMula 6sea de un donante sana inmunol6gicamente compaHble. Evidentemente. entre estas relulas existen algunas (alrededor de I celula de cada 10000) que pueden colonizar el huesped irradiado y proporcionarle un nuevo tejido hemalopoyetico de forma pemlanente. Uno de los tejidos en el que se desarrollan las colonias es el baze. que en ratones nonnales constituye un area adicional muy importante de hematopoyesis. Cuando se examina el bazo de un rat6n irradiado al cabo de una 0 dos semanas despul!s de la uansfusi6n de celulas procedentes del donante sana. se observa un clerto nUrnero de n6dulos diferenciados en cada uno de los cuales se puede localizar una colonia de celuJas mieloides (Figura 22-29); algunas de las colonias que se presentan al cabo de dos semanas pueden contener mas de un miU6n de celulas. EI caracter discreto de los n6dulos sugiere que cada uno de ellos puede corresponder a un cion de celulas descendientcs de una linica celula inicial. de forma similar a como crece una colonia bacleriana ell una placa de cultivo; mediante marcadores gel1elicos puede demostrarsc que eSlo es 10 que sucede realmente. La celula fundadora de esre tipo de colonia se denomina celula formadora de colonias, 0 CFC (de Colony-Forming Cell), tambien conocida como 11l1idad formadora de colonias, CFU. Las celulas formadoras de colonias son heterog~­ neas. Ciertas colonias se hallan cons(ituidas por un s610 tipo de celula mieloidc. mientras que Olras se hallan constiluidas por diversos lipos. A1gunas cl!lulas forman grandes colonias mediante varios ciclos de divisi6n, miemras que otras se dividen con menor frecuencla y forman colonias mas reducidas. La mayoria de las colonias muercn despues de generar un numero restringido de celulas sanguineas diferenciadas. Sin embargo, un reducido numero de colonias son capa· ces de aliiorrenovarse produciendo, ademas de celulas sangufneas diferencla· das, mas relulas formadoras de colonias. Se asume que las celulas fundadoras de tales colonias capaces de autorrenovarse son las celulas madre hematopoyeticas que se presentan en la mMula 6sea lrasplantada.

I. irrediaci6n con revos X dellene I. producci6n de celules sengu(nee.; el rll16n morirl••1r'IO recibiere ningun

.""mltY""',,

~ I

INYECCION DE etlUlAS DE ME-OULA OSEA PROCEDENTES DE UN OONANTE SANa

at rel6n sobreviYe; 2 semanu

I

despues de II inoroleclOo, en II circulaciOn H pueden deteetllr

nurnerOlll' o6lul.. sengulnen senes

~ I

EL EXAMEN DEL BAZO REVELA LA PRESENOA DE NOOULOS NO HABITU....LES EN SU SUPERflClE

ced. n6dulo del balo eonliloe un clOf'l de dlul.. hem'lopoyihic.ss,

descendienle de una de I•• c"ules de Ie mtklula 6lee

Figura 22-29 £1 experirnenlo de

fonnacl6n de t:olonlas en el baw. EI baw de un animal intensamcnte irradiado queda sembrado con celulas de In medula 6sea procedentes de la trnnsfusi6n de un donante sano. Esle experimenlo. desarrollado en 1961. revolucion6 los estudios sobre la hemalopoyesis, al permilir por primera vez que celulas mieloides precursoras pudieran ser analizadas.

Las celulas madre pluripotenciales dan lugar a todos los tipos de ctHuias sangufneas26 Con frecuencia en una colonia del bazo originada a partir de una sola aHula madre se pueden encontrar juntos tados los tipes de celulas mieloides. Asf pues, fa celula Renovaci6n por medio de c8ulas madre pluripotenciales: fonnacl6n de las celu1as sangufneas

1249

madre hemalopoyetica es pfllripotellcial: puede dar lugar a muchos tipos celularcs. Las colonias del baw no parecen contener linfocitos, pero alros estudios demuestran que eSlas celulas se forman a partir de la misma ccluJa madre que origina 10das las demas cclulas mielaides. En la demoslraci6n de esta lcorfa se han utilizado marcadorcs geneticos que pemliten identificar los componenles de una colonia induso dcspucs de que se hayan Iibcrado a la circulad6n sangufnea. Para eUo se han utilizado algunos tipos de marcadores c1onales, pero la utilizad6n de ttll retrovirus (unlleclor retrov(r;co que contiene un gen marcador) disefiado para este fin ha permitido a1canzar plenamente este objetivo. Esle virus marcador. al igual que otros retrovirus, puede insertar su genoma en los cromosomas de la relula que infccla. aunque se hayan eliminado los genes que posibilitan la generaci6n de nuevas infecciones por partfculas vfricas. Asf pues. el marcador queda confinado enla progenie de las celulas infecmdas inicialmente. de fonna que la progenie de una de estas relulas se puede dislin!,ruir de la progenie de Olras celuJas ya que las zonas de inserd6n del virus en el cromosoma son distintas. Para analizaT los Iinajes hemampoycticos, las cclulas de la m&fula 6sea se infectan in lIitro con el vector retrovfrico e inmediatamente se transfieren a un receplor irradiado lelalmenle; entonces se pueden utilizar sondas de DNA para marcar la descendencia de relulas individuales infecmdas en los diferenles tejidos hematopoyeticos y Iinfoides del hllesped. Estos expcrimentos no s610 confinnan que todas las clases de celulas sanguineas -tanto mieloides como linfoides- denvan de una celula madre coml'm (Figura 22-30) sino que tambien pennilen seguir el pedigree de las celulas sanguineas durante largos intervalos de tiempo. Meses mas larde. cuando el sistema hematopoyetico ha tenido tiempo de estabiHzarse tOlaLmenle despues de la transfusi6n. praclicamellle lodas Las celulas sanguineas del rat6n huesped irradiado son descendiellles de un m1mero muy reducido -en algunos casas solamenle de una- de las ctHulas transfccladas iniciales. Una un..ica cclula madre pluripotencial pesee evidentemente la capacidad de generar un cion indefinidamente grande de progenie de cclulas, entre las cuales, presumiblemente, se originan nuevas cclulas madre can una capacidad similar, asf como celulas diferenciadas definilivamente.

El numero de c(ilulas sanguineas especializadas se amplifica por divisiones de cclulas progenitoras determinadas22,27 En cuanto una celula sc ha diferenciado en erilrocilo 0 granulocilo 0 en algun otro lipo de celula sangllfnca, parece que no exisle marcha atras: el estado de diferenciaci6n es irreversible. Asf pues, en alguna elapa de su desarrollo, algllna descendencia de una c~lula madre pi uri potencial ha de ser determinada de forma irreversible hacia una Ifnea particular de diferenciaci6n. Esto se observa claramenle a partir de una simple observaci6n microsc6pica de m~dllia 6sea en la que esta determinaci6n se produce mucho antes de la divisi6n final que da lugar ala celula madura diferenciada: se pueden reconocer cellilas prccursoras especializadas que todnvf
CapilUlo 22: Q'!lulas diferenciadas yconservaci6n de los tejidos

TIMO

i---------------------------------o----j

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,celula madre Iirlfoide7

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celula T

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eosirl6filo

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•

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rleutr6filo

osteoelasto

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- ~ m,,,6<,go

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CFC·E

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- - - - ploquetos

eritroeito

Figura 22·30 Esquema tentativo de 1a hematopoyesls. Normalmente la cclula madre pluripotencial se divide de tarde en tarde generando nuevas cclulas madre pluripotenciales (autorregeneradoras) cl1/ldas progellitoras determilladas (Iambien denominadas CFC, de Colony Forming Cells), que se hallan delerminadas de fonna irreversible para producir s610 unos cuantos lipos celulares de la sangre. Las celulas progeniloras son eSlimuladas a dividirse por faetores espeefficos de erecimienlo, pero estas eelulas van perdiendo progresivamenle su eapacidad de divisi6n y aeaban evolucionando a celulas sanguineas diferenciadas. que general mente s610 viven duranle unos euantos dfas 0 semanas. En mamfferos adultos todas estas eelulas se desarrollan principalmenle en la medula 6sea --exeepto los linfocitos T, que se originan en el rimo, y los maer6fagos y los oSleoc!astos, que se forman a partir de los monocitos en la mayorfa de los lejidos. La parte mas conflictiva del esquema reside en e1lugar que corresponde a los precursores de los Iinfocilos T y B. Asfmismo.las celulas madre pluripolenciales pueden dar lugar a varios tipos de celulas de otras tejidos no represenladas en este esquema, eomo las eelulas NK, los mastociloS y una gran variedad de tipos de celulas que presenlan los antigenos (se estudiaran en el Capflulo 23); sin embargo, las vias a traves de las cuales estas celulas se desarrollan son desconocidas.

°

Los factores que regulan la hematopoyesis pueden analizarse en cultivo 28 Las celu]as hematopoyctieas pueden sobrevivir. proliferar y diferenciarse en eulrivo si y s610 si se hallan provistas de faelores de ereeimienlO 0 aeompafladas de eelulas que produzean estos faelores; si se yen privadas de diehos faetores, las eelulas mueren. Por ejemplo. se puede conseguir que cclulas madre pluripotenciales proliferen durante largo tiempo cultivando celulas hematopoyetieas aisladas de la medula 6sea endma de una eapa de celulas del estroma de la medula 6sea, 10 eual posiblemenle mimeliza las condiciones de la propia mcdula 6sea; este tipo de eultivos puede generar lodos los tipos de cclulas mieloides. Por otro lado, eelulas hematopoyetieas aisladas'de la medula 6sea se pueden cultivar en una matriz semis6lida de agar diluido a de metilcelulosa, afladiendo artil1cial· mente al medio faclores derivados de otras eClulas. Debido a que las eelulas no pueden migrar en la matriz semis6lida, las eelulas deseendientes de eada eelula preeursora aislada permaneeen juntas en forma de colonias faciles de reconoRenovacl6n par medio de celulas madre pluripotenciales: formaci6n de las celulas sanguineas

1251

cer. Por ejemplo, se puede observar c6mo un progenitor neulr6filo determmado lIega a formar una colonia de cientos de neutr6fi1os. Este tipo de sistema de cultivo, desarroUado a mitad de la decada de 1960, constituye un sistema de anllisis de los factores que regulan la hematopoyesis y, por 10 tanto, permite purificarlos y esmdiar su actividad. Estas substancias se encuenlran en forma de glucoproteinas y generalmente se denominan c1topoyetlnas 0 factores estlmuJadores de colonJas, 0 CSF (de Colony-Stimulating Factors). Del creciente numero de CSF que se han definido y purificado, algunos circulan por la sangre y acruan como honnonas, mientras que otros actuan en la medula 6sea tantO como mediadores segregados locales como senales ligadas a la membrana que actuan medjante el contacto relula a cEBula. EI mas conocido de los CSF que actuan como una hormona es la gJucoprotefna erirropoyetina, que se fabrica en el riMn y regula la eritropoyesis (la formaci6n de los gl6bulos rojos).

eritroblaslO

r

La eritropoyesis depende de la hormona eritropoyetina29 EI erilrocito constituye, con diferencia, ellipo de celula m
Cap!tulo 22 : CeluJas dlferenciadas y conservaci6n de los tejldos

F

retieulocito

Figura 22-31 Esquema del desarrollo un g.i6bulo roJo (erltroblasto). Se muestra c6mo la celula expulsa el nucleo yse conviene en un eritrocito inmaduro (reticulocito), que mas tarde abandona la medula 6sea roja y pasa a la corrienle sangufnea. EI reliculocilo elimina sus mirocondrias y ribosomas un dla 0 dos anles de convenirse en un erilrocilo maduro. los clones de erirrodtOs se fomlan en la medula 6sea, en la superfide de un macr6fago, que fagocira ydigiere los nucleos desprendidos par los erirroblaSIOS.

ses de celulas sangufneas diferenciadas. Se diferencian de las CFC-E en su insensibilidad a la eritropoyetina, y en que su descendencia ha de lIevar a cabo 12 divisiones antes de convenirse en eritrocitos maduros (para 10 cua! ha de estar presente la eritropoyetina). Estas celulas tam bien difieren de las CFC-E en su tamana, de forma que amhas pueden separarse por sedimentaci6n. Asf pues, se cree que las BFC-E son un tipo de celulas progenitoras determinadas en la diferenciaci6n de los eritrocitos y que constituyen un antepasado temprano de las CFC- E (Figura 22-32).

c&lula madre • pluripotenclal

En la producci6n de los neutr6fi1os y de los macr6fagos influyen mtiltiples CSf28 , 3() Los dos tipos de celulas fagoc!ticas especializadas, los neutr6fi1os y los macr6fagas, se forman a panir de una celula progenitora comun denominada clHula progenitora de granulocUos y macr6fagos 0 GM (de Granulocyte/Macrophage Progenitor Cell). AI igual que otros granulocitos (eosin6filos y bas6fi1os), los neutr6filos circulan por la sangre unicamenle durante unas horas antes de migrar desde los capilares hacia los rejidos conjuntivos u otras areas espec!ficas, donde sobreviven durante unos cuantos dfas y luego mueren y son fagocitados por los macr6fagos. Los macr6fagos, por el contrario, pueden sobrevivir duranle meses o quiza incluso af'ios fuera de la corriente sangufnea, donde pueden ser aClivados por senales locales reiniciando su proliferaci6n. Hasta ahora se han definido hasla siete tipos distintos de CSF que estimulan la formaci6n de colonias de neulf6filos y de macr6fagos y se sabe que algunos 0 todos ellos actuan, en distintas comhinaciones, regulando la producci6n selectiva de eSlas celulas in vivo. Estos CSF son sintetizados por varios tipos celulares -incluyendo las celulas endoteliales, fibroblastos, macr6fagos y IinfocilOs- Ysu concenlraci6n en sangre aumenta rapidamente de fomla caracterfstica como respuesta a la infecci6n bacteriana de un tejido, aumentando asf el numero de celuJas fagoc!ticas liberadas desde la medula 6sea hacia la sangre circulante. IL-3 es uno de los factores menos espec!fico y actua tanto sobre celulas madre pluripotenciales como sobre la mayor parte de las celulas progeniwras determinadas, incluyendo las celulas progenitoras GM. Los Olros factores actuan de forma mas selectiva sobre las celulas progenitoras determinadas GM y su descendencia diferenciada (Tabla 22-2). aunque en muchos casos afectan lambien a otras linajes de la familia hematopoyetica.

2 11 eritrocitoa maduros

Figura 22-32 £1 desarrollo de los g16bulos rojos.!nterrelaciones entre las celulas BFC-E. las celulas CFC-E y el eritrocito maduro. Las celulas BFC-E y CFC-E son celulas progenitoras eritroldes detenninadas. Las BFC-E son sensibles a1 factor IL-3 pero no a la eritropoyetina, mientras que las CFC-E responden a la eritropoyetina. Las series de divisiones celulares que tienen lugar en eSle linaje bajo la influencia de la eritropoyetina dan un potente sistema de control de la producci6n de eritrocitos sin interferir en la producci6n de otros Iipos celulares.

Tabla zz-z Algunos facto res estlmulanles de colonlas (CSF) que InOuyen en la fonnacl6n de c~luias sangufneas Factor

Tamafio (en ratones)

C~luias diana

C~lulas productoras

Receplores

Eritropoyetina

51000daltons

CFC-E

celulas del riMn

Interleuquina 3

25000 daltons

celula madre pluripotencial, la Iinfocitos T, celulas mayor parte de celulas epidennicas progenitoras, muchas celulas diferenciadas de forma terminal Iinfocitos T, celulas celulas progenitoras GM y neutr6fi1os endoteliales, fibroblastos

familia de las cilOquinas familia de las cilOquinas

(IL-3)

Granulocito/ 23000 daltons macr6fago CSF (GM-CSF) Granulocito CSF 25 000 daltons (G-CSF)

Macr6fago CSF (M-CSF) Factor Steel (factor de celulas madre)

celulas progenitoras GM y neutr6fi1os 70000 daltons cl;'jlulas progenitoras GM y (dfmero) macr6fagos 40·50 000 dahons celula madre hematopoyetica (dfmero)

macr6fagos, fibroblastos

familia de las citoquinas fibroblastos, macr6fagos, familia de receplOres cl;'jlulas endoteliales tirosina quinasa celulas de estroma en familia de receplOres ml;'jdula 6sea y en muchas tirosina quinasa olras celulas

Renovacl6n par medio de celulas madre plurlpotenciaJes: fonnacl6n de las celulas sangufneas

I

familia de las citoquinas

1253

Figura 22-33 Reparto de subunJdades entre los receptores CSF. Los receptores It-3 humanos y los receplores GM-CSF poseen subunidades 0. distintas y subunidades II comunes. Sus ligandos se unen a las subunidades 0. con una baja afinidad. 10 cual desencadcna el ensamblaje de los hClerodfmcros que se unen aI ligando con alta afinidad.

aubunldad comun ~

aubunldad (J. del r_plof IL-J

.... bun;~(I;del receptor CM·CSf

\,~_ MI'l.1

Todos estos CSF, al igual que la eritropoyetina, son g1ucoprotefnas II .1.: aculan a bajas concenlradones (- 10-12 M) mediante su uni6n a receptores cspccfficos de superficie. como eslUdiamos en el Capitulo IS. Algunos de dichos receptores son tirosina quinasas transmembrana. Los restantes pertenecen a otra gran familia de receptorcs (denominada a veres la familia de receptores dtOll"i· nas), cuyos miembros se companen generalmente de dos 0 m
Caprtulo 22: Ctlulas diferencladas y conservacl6n de los tejidos

Las c~luJas madre hematopoy~ticasdependen del contacto con c~lulas que expresan el factor Steepn Los CSF que aCluan en c~lulas madre pluripotenciales son los menos conocidos. Tal como hemos ViSIO, IL-3 corresponderfa a eSle grupo. Otro faclor parecido de imponancia fundamental se ha esclarecido a partir de am1.lisis de ramncs mutanles que presentan una curiosa combinaci6n de defeelos: una reducci6n del numero de gl6bulos rojos (anemia). de relulas germinaJes (esterilidad) y de c~lu­ las pigmenlarias (manchas blancas en la piel). Tal como vimos en el Capitulo 21. este sfndrome se origina a partir de mutaciones en algunos de eslOS dos genes: uno, denominado c-tit, codiJica un receptor tirosina quinasa; el otro, denominado Steel. codifica su ligando. Todos los tipos celulares afectados por las mutaciones derivan de c~luJas preeursoras rn6vi1es, y aI parecer para que eslOS tipos celulares se produzcan en cantidades normales, dichas celuJas preeursoras deben expresar en cada caso el receptor (Kit) y proveerse delligando (Sleel) a partir de su enlomo. AI igual que IL-3, el factor Steel actua en algunos de los Iinajes de relulas sangufneas determinadas. incluyendo ellinaje eritroide, asf como en las relulas madre pluripotenciales, pero tiene un efecto reducido sobre sf mismo. Bl1sicamente potencia los efeetos de otros CSF incrementando notablemente el numero y tamano de IOdos los lipos de colonias de clones de c~lulas sangufneas en cuhivo. Tambien constituye un CSF poco corriente en ouo aspecto. Se cncuentra tanlO en la forma vesicular como en la forma segregada, generadas por rnadwaci6n altemaliva del mRNA, y parece que la forma vesicular es la ml1s importanle: los ralones mulantes que fabrican la fonna segregada del factor Steel pero no la fonna vesicular presentan deficiencias acusadas. E110 implica que la hematopoyesis normal requiera el contacto directo celula-celuJa entre la celula madre hematopoylhica y la celula del estroma que expresa el Steel y que unicamenle mediante este contacto el faclor Steellogra la activaci6n de la protefna receptora Kit de forma eficienle. Debemos considerar dicho factor Kit como un correceplor (como veremos en el Capitulo 23) que tiene que activarse simult<1.neamentc con los reeeptores para los factores tales como IL-3 para la estimulaci6n de la hematopoyesis. EsIO podrfa ayudar a explicar por que la hematopoyesis tiene lugar unicamente en cierlOS entornos especiales. como los que se hallan entre las celli las del estroma de la medllia 6sea, mientras que otros tejidos no manificstan la invasi6n y la colonizaci6n allnque siempre se encuentren algunas celulas hemalopoy~tieas en la circulaci6n sangufnea.

El comportarniento de una celula hematopoy~tica depende parcialrnente del azar 28 •32 Uegados a cstc punto vamos a cansiderar una cuesti6n fundamental. Los CSF sc han definido como facto res que estimulan la producci6n de eolanias de cclulas sangufneas difcrenciadas. Pero. ique efecto predso ejerce un CSF sobre una cclula hematopoy~tica individual? Un factor de este tipo podria controlar la velocidad de djvisi6n celular 0 el numero de cielos de divisi6n que la celula, progenilora presenta en ellranscurso de la diferenciaci6n, 0 podrfa actuar tempranamente innuyendo en su delenninaci6n; 0 podria actuar simplemente incrementando la probabiIidad de supervivencia celular (Figura 22-34). Mediante el seguirruento de un eultivo de c~luJas hematopoyeticas ha sido posible demostrar que un solo CSF. el GM-CSF, puede ejercer todos estos efeetos distintos. Sin embargo. todavfa no queda claro cu;1les son las actividades que ill vivo son mas imponantes. EI componamiento de las celulas madre pluripotenciaJes continua siendo especialmente diffcil de detenninar: estas celulas esenciales son escasas y se hallan muy dispersas -menos de I de cada 1000 relulas de la meduJa 6sea- y son extremadamente difTdies de identificar c1aramente. Adem<1.s, cstudios ill vitro indican que existe una elevado componente de azar en la forma de comportarse de la oHula hematopoyetica. EI CSF no dicta diRenovaci6n por medio de cl!lulas madre pluripotenciales: formad6n de las dlulas sangu(neas

1255

PARAMETROS CONTROLABLES 1. Frecllencia de divisi6n de Ie dlllie msdre

2. Probabilidlld de muerte de III celulll madre 3. Probabilidlld de que Is c6lule madre dascendiente se convierta an une c6luls progenitors rasponseble de Ie formeci6n de I.m tipo celuler determinado

4. Ourecl6n del cicio de divlsi6n de la c6lula progenitora determlnada

5. Probabllidad de muarte de la cjlule progenitora

6. Numero da divisiones de In cjlulas proganitoru determlnadas que se producen antes de III diferenciaci6n terminal

7. Cicio vital da les celule. difarencladllS celule SlIngulnee diferenciade terminal

rectamente 10 que debe hacer cada celula sino que actua regulando probabilidades. En cultivos de celulas hematopoyeticas, incluso cuando las celulas seleccionadas constituyen una poblaci6n 10 mas homogenea posible, se produce una marcada variabilidad en cuanto a ramafios y a menudo en cuanto a caracterfsticas de las colonias a que dan lugar. Dos celulas hermanas que se separen inmediatamente despues de una divisi6n y que se cultiven aparte bajo condiciones identicas, frecuentemente daran lugar a colonias que contengan distintos tipos de celulas sangufneas, 0 los mismos tipos pera en cantidades distintas. Asf pues parece que tanto en la programaci6n de la divisi6n celular como en el proceso de la detenninaci6n de una celula en una vfa particular de diferenciaci6n participan una serie de acontecimientos aleatorios a nivel individual, aunque el comportamiento de un sistema multicelular en su conjunto se regula de forma mas precisa.

La regulaci6n de la supervivencia celular es tan importante como la regulaci6n de la proliferaci6n celular 33 Aunque estas observaciones muesrran que los CSF no son estrictamente necesarios para ordenar a las celulas hematopoyeticas c6mo deben diferenciarse 0 cuantas veces tienen que dividirse, los CSF son necesarios para el mantenimien· to de las celulas vivas: el comportamiento defectuoso de las celulas en ausencia de los CSF es suicida. En principia, los CSF deberfan regular el m1mero de los distintos tipos de celulas sanguineas de forma completa mediante el control selectivo de la supelVivencia celular y existen evidencias de que el control selectivo de la supervivencia celular juega un papel fundamental en la regulaci6n normal del numera de celulas sangufneas y, ral como vimos anteriormente para los hepatocitos, tambien de muchos otros tipos celulares. AI parecer, en muchos rejidos las celulas estan programadas para destruirse a sf mismas si no reciben se· nales especfficas para su supervivencia. Ya hemos visto la imponancia y el mecanismo de la muerte celu/ar programada durante el desarrollo (vease pag. 1152); es un factor iguaJmente importante para el recambio y la renovaci6n de las poblaciones celulares en el individuo adulto (Figura 22-35). Los genes que la 1256

Capitulo 22: Celulas diferencladas y conservaci6n de los tejidos

FIgura 22-34 Algunos de los parametros que pueden regular la produccl6n de un tlpo determlnado de celu)as sangu(neas. Estudios ill vitro sugieten que los (aerotes estimuladotes de colonias (CSF) pueden afeetat lOdos estos aspectos de la hemalOpoyesis.

Figura 22-35 Muerte celular por apoptosls. La eleclTonmicrografia muestra una cl'!lula apopt6tlca de la glandula mamana. La muerte celular apopt6tica es un hecho nonnal en dicha glandula. eslabilizando la proliferaci6n de las celulas epiteliales mamanas que se da en cada cicio menstrual. Obsl'!rvese la desinlegrnci6n de la envohura nuclear y las zonas oscuras de la cromatina condensada. Puede compararse con una zona de una celula nonnal. visible a un lado de la figura. (ConesIa de David Ferguson.)

regttlan se han conservado durante la evoluci6n hasta el punto que al menos uno de dichos genes, denominado bcl·2, que codifica un inhibidor imracelular de la muerte celular programada en celulas de mamfferos. puede Uevar a cabo la misma funcidn en celulas de un gusano nematodo. Una £recuencia de muerte celular demasiado baja puede ser tan peligrosa para la salud de un organismo pluricelular como un exceso de proUferaci6n, y las mUlaciones que inhiben la muerte celular debido a una sobreexpresi6n del bcl-2 se hallan implicadas en el desarrollo del cAncer. lal como se vent en el Capitulo 24. £1 camidad de muerte celular programada en el sistema hemalOpoyetico de los vertebrados es enonne; par ejemplo, miles de millones de neulr6fi1os mueren de esta forma cada dfa en el hombre adullO. Aunque el mecanismo de la muerte celular programada cOl1limla siendo un misterio, generalmellle las c~lu­ las que muercn experimenlan una serie de cambios morfol6gicos caractcr{sticos denominados apoplQsls, durante los cuales la celula, incluido el mlc1eo, sc con· traen condensandose y con frecuencia se fragmentan. Por el connario, las celu· las que mueren accidentalmenle, como resultado de una lesi6n aguda, gencral· menle se hinchan y cstallan -un proceso denominado necrosis celu/ar. Miel1lras las c~lulas que mucrcn por necrosis liberan su contenido citos6lico al espacio extracelular y provocan una respuesta inflamatoria, las celulas que mueren por apoptosis desaparecen de una forma mas eOciente para el organismo: ntpida· mente son fagocitadas por los macr6fagos (u otras celulas vecinas) 10 cual no provoca la liberaci6n de componenles citos6licos nl respuesta inflamatoria. Una vez en el interior del macr6fago, la celula apopt6tica rapidamente se fragmenta y sus componentes basicos son reutilizados. Para activar este dispositivo, las celulas apopt6ticas cambian la cornposici6n qufmica de su superficie de forma que puedan ser reconocidas par los rnacr6fagos. £1 mecanismo de reconocimiento depende del t'ejido y del tipo de celula sangufnea. En algunos casos una lectina de la superficie del rnacr6fago parece que reconoce los grupos de azucares alterados de la superficie de la celula apopt6tica. En otros casos una integrina (como hemos viSIO en el Capftulo 19) de la superficie del rnacr6fago reconoce una protema de la matriz extracelular dene· minada trombospotlditla. que es segregada por el macr6fago y parece que actua como puente entre este y la celula apopt6tica; se desconoce el mecanismo por e) cualla trombospondina se une a la celula apopt6tica. En algl1n otro caso el rnacr6fago es capaz de reconocer la fosfatidilserina, un fosfolfpido cargado negatiRenavacl6n por media de cl'!lulas madre pluripotenclales: fannad6n de las ~Iulas sanguCneas

1257

vamenlc que normalmenlc ~e localiza en la subcapa citos61ica de la bicapa Iipfdica de la membrana plasm:1Lica (vl!ase Figura 10-11) pero aparcntcmcnte se resilua en la subcapa extracelular de las c~lulas sangufneas apopl6ticas. Indepcndienlemenle del sistema de reconocimienlo utilizado, los macr6ragos reaccionan frente a las c~lulas apoPl61icas de forma especifica: las engloban y las digieren, pero no segregan senales inductoras de inflamaci6n como ocurre cuando fagocilan y digieren c~lulas necr61icas. ~ta es la segunda raz6n por la que la necrosis celular se asocia con la inflamaci6n y la apoPl'Osis no. 5i bien los bi61ogos han centrado mucho mas la atenci6n en el control de la proliferaci6n celular que en el conlrol de la supervivencia, se observa c1aramente que ambos tipos de controles pueden servir para regular el mlmero de c~lulas. Ambos lipos de controles dependen de scnales especfficas producidas por OlTas c~lu­ las, que aseguran que una c~lula se divida unicamente cuando se necesitan mas c~­ lulas y que una c~lula sobrcviva 5610 cu:1ndo y d6nde se la necesita. EI desafio reside en pader definir todas las seflales que regtllan la supervivencia y la proli1eraci6n de cada lipo celular, para delerminar c6mo se controlan sus nivcles para equilibrar In proliferaci6n y la l1l11erte celular de acuerdo con las distintas necesidades del organismo, ycomprender c6mo una unica c~lula integra lodaS estas sefiales extracelularcs y decide si vivir 0 moTir ysi dividirsc 0 permanecer quiescellie.

Resumen Los principaleJ tipos tk dlllw slmgr,fneas proceden tk unn dluln madre pluripotenda/OOtmUL En el individllo tululto las ci/ulas madre se localium ,trind,NUmente en la midllla 6sea, dotuh nonllnlmenle se dividen, tk tank en tank. prodlldendo 111M cilulas madre (autorregenemtltes) y l/(lrias cilulas pragen/toms tktemli1UUlas que plleden dar lllgar a uno 0 WlriOS tipos tk cilula.s sangJ4f~ Las cilllla.s progenitoms tktermi1UUlas se dividen profusamente bajo la inJlI~ncin tk varias moUcula.s proteiau senal (tknomi1UUlas ftu:lore$ estimuladores tk ooloniar 0 CSF) Y posteriormente se di[erenelan en cillllas snngJ4fneas adultas, que genemlmetlte ml~ren al cabo tk ""OS aumtos dfas 0 semanas. Los estlUUos sabre la hemntopoye:sls han progresndo etlOmleme"te gracias a experimelltos bt vitro, ell los ellala las cil"lils nuulre o las cilulils progetlitoms impllaulasfornulII oolonias tk tipo d6111co aurlldo se adtivan en IUta mlltrlz semis61ltln. fllJllnje tk cillllils nuulre parece ejerur SII se1ecci611 entre vias tk desarrollo lIltematlVll$ tk unn fornUl parelalmente easluri. 1A muerte cellllnr, oontroltula por In dlsptmibilidtul tie los CSF. tnmblen juega 1m papel[mulamelltal ell In regultlCion tkl tUlmero de dlllias SlllIgu{IIMS di!eretu:itulas; tlepe/ute tk ia actil1{ld6" de Ittl slI/cidio imracellflnr IJrogrnmtulo y es ca/JaZ tie oofllribuir a In regJ1lncion del mimero tk dlllias en tIIll.e/lOs otros tejidos y ell otras grllfJOS deallimales.

Genesis, modulaci6n y regeneraci6n del musculo esqueletico 34 EIIl!rmino "musculo~ se aplica a un gran numero de lipos celulares. lodos ellos especializados en la contraccion, pero distintos en ouos aspeclos. Como se dijo en el Caprtulo 16. el sistema conlr:1clil compueslO por actina y mloslna es una caraclerfstica b:1sica de las cclulas ani males en general, aunque las c~lulas de tipo muscular han desarrollado este sistema hasta un grado elevado: los mamiferos poscen cuatro categorfas pTincipales de celulas especializadas en la conIracci6n: c~lulas del lIuiscu/o esqlleletioo. celuJas museulares del CQra.zan (0 cardiacas). fibras musculares lism y cclulas mioepiteliales (Figura 22·36). EsIOS tipos de c~lulas se diferencian en cuanlo a funci6n. estructura y desarrollo. Aunque todas elias generan fuerzas de contracci6n mediante sislemas organizados de fi· lamenlOS de actina y de miosina, las mol~culas de aClina y de miosina uliJizadas son algo distintas en cuanlo a Sll secuencia de aminoacidos, tienen una dislribuci6n espacial distinta y el conlrol de la contracci6n se produce a traves de su asociaci6n con dis(intos conjulllos de prote(nas. 1258

Caprtulo 22: Cl!lulas diferencladas y conservaci6n de los lcjldos

,

Las celulas del mdsculo esqueletJco. cuyo aparalo contractil se discute en decaJle en el Capitulo 16, son las responsables de praclicamente todos los movimientos que estan bajo control volunlario. Estas celulas pueden ser muy largas (203 em de largo y 100 Jlm de diametro en un humane aduho) por 10 que a menudo se les denomina fibras muscu/ares. Cada una de elias es un sindlio que contiene varios micleos en un dtoplasma comUn. Los otros lipos de relulas musculares SOil mas convcncionales, y tiellen un solo nucleo. Las c~lulas musculares cardfacas se parcccll a las celulas llluscularcs csqueleticas Cll que sus liIamenlos de actina y miosina cstan alineados de Ulla forma lllUy ordenada, formando series de unidades contracliles denominadas sarcomeros, de forma que las c61ulas tienen una aparienda eSlriada. Las ululas del mtbculo Uso redben este nombre porque, conuariameme, no tienen aspecto estriado. Las fundones del musculo lisa son muy variadas y abarcan desde la propulsi6n del alimento a 10 largo del tracro digestivo hasla la erecd6n de los pelos como respuesta aI frfo a at miedo. Las celulas mloepltellales tambicn carecen de eSlrfas pero, a diferenda de los dcmas tipos de fibras musculares, se hallan en los cpitelios y derivan del eClodermo. Forman el ml1sculo dilalador del iris y tambicn actuan expulsando la saliva, el sudor y la leche de las glandulas correspondienles (vease Figura 22-36E). Las cuatra categorfas principales de fibras musculares se pueden dividir en varios subtipos, cada uno de los cuales tiene sus rasgos caracterfsticos. IAI

celule de musculo 'iao

Figura 22-36 Las cuatro c1ases de celulas musculares de un mamffero. {A} Esquemas {a escalal. (D·EI Electronmicrografias de barrido. en las que aparecen (B) musculo esquel~tico del cuello de h;imster, {C} musculo cardiaco de rata, (D) musculo lisa de la vejiga urinarla de cobaya y (E) c~lulas mioepitelialcs en un a1vl!olo secrelor de una glAndula mamaria de rala laclante. Las flechas en (CI senalan los discos intercalares -uniones enlre los eXlremos de las cl!lulas musculares del coraz6n; las cl!lulas de la musculatura esquel~tica de los grandes musculos unen un extremo con olro de fonna similar. Observese que el musculo liso se ha prescntado en esta figura a menos aumentos que los restantes. (B, por cortes(a de Junzo Desakl; C, de T. Fujiwara, en Cardiac Muscle en Handbook of Microscopic Anatomy IE-D. Canal ed.l. Berlin: Springer Verlag. 1986; D, por cortesia de Saloshi Nakasiro; E. de T. Nagato, Y. Yoshida. A. Yoshida, e Y. Uehara, Cell Qlld Tissue Res.209:HO.1980.)

celule de museulo esquelt!lieo

celules de musculo cardlaeo

'------'

'---'

10 11m

10 11m

ct!lula mloepileliel c81ule NICIlllore

"".".• lEi

Genesis, modulaci6n y regcneraci6n del rnusculo csqueletico

L--J

10lJm

1259

,J

,

••

Los mecanismos de la contracci6n muscular se han vista en el Capftulo 16; en este capftuJo vamos a considerar c6mo se genera y se mantiene el rejido muscular. Nos centraremos en la celula del musculo esqueletico, que presenta un modele especial de desarrollo y tam bien una notable capacidad para moduJar su caracter diferenciado. asf como una estralegia especial de regeneraci6n.

Las nuevas celulas del musculo esqueIetico se forman por fusi6n de los mioblastos2, 35 En el capitulo anterior describfan10s c6mo ciertas celulas, originadas a partir de los somitos de un embri6n de venebrado en un esradio muy lemprano, quedan delerminadas como miob/astos (es decir, precursoras de las celulas del musculo esqueletico) y migran hacia el tejido conjuntivo embrionario adyacente 0 mesenquima. Tal como se trat6 en el Capitulo 9, parece que la detenninaci6n de conslituir un mioblasto (y tambien la de constituir un fibroblasto) depende de la activaci6n de uno 0 mas genes miogenicos, que codifican protefnas reguJadoras de genes, de la familia helice-budehelice. Despues de un petiodo de proliferaci6n, los mioblaslos se fusionan entre si formando celulas del musculo esquelelico plurinucleadas (Figura 22-37). AI fusionarse surren un marcado cambio de fenolipo que depende de la aetivaci6n coordinada de un conjunto de genes especfficos de la celula muscular. Una vez se ha producido la fusi6n, los nucleos ya no replican mas su DNA. La fusi6n implica molecuJas de adhesi6n celula-celula que intervienen en el reconocimiento entre los mioblastos. Mioblastos que se han mantenido en proliferaci6n en un cultivo celular durante dos ai'ios todavia conservan la capacidad de diferenciarse y de fusionarse formando fibras lllusculares en respuesta a un cambio adecuado de las condiciones de cultivo. Parece que la presencia en el medio del factor de crecimiemo de jibrobfaslOs (FGF, de Fibroblast Growth Factor) es esencial para mantener la proliferaci6n de los mioblaslos e impedir su diferenciaci6n: si se elimina el FGF, las celuJas detienen fltpidamenre sus procesos de divisi6n, se fusionan y se diferencian. Sin embargo, el sistema de controles es complejo. Por ejemplo, para diferenciarse los mioblaslos deben adherirse a la malriz extracelular. Por otro lado, el proceso de fusi6n es cooperativo: los mioblastos que se fusionan segregan factores que incitan a OtIOS mioblastos a fusionarse. En el animal intacto los mioblastos y las fibras muscuJares se soslienen en las mallas de una red de tejido conjuntivo formada por los fibroblastos. Esta red coord ina el desarrollo muscular y controla la ordenaci6n y la orientaci6n de las fibras musculares. 1260

Capftulo 22 : Celulas diferenciadas y conservaci6n de los lejidos

Figura 22-37 Fusl6n de mloblastos en cultivo. Micrograffas de contraste de rases de mioblastos en cullivo. en las que se observa c6mo las celulas van proliferando, se alinean y luego se fusionan formando celulas musculares plurinudeadas. A mayores aumentos ee) se observan las estriaciones Iransversales que empiezan a visualizarse al desarrollarse el aparato contnktll (fIeeIJa raja), aSl como las acumulaciones de numerosos nudeos dentro de una rnisma celula (flee/las verdes). (Cortesla de Rosalind Zalin.)

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Las fibras musculares pueden modular sus propiedades mediante cambios de las protefnas isoformas que poseen 36 Generalmente cuaodo una ctHula de musculo esqueletico se ha farmada, se mantiene durante todo el cicio vital del animal. Drnante este perfocto, crece, madura y modula sus caracterfsticas segun los requerimientos funcionales. EI genorna contiene multiples capias variantes de los genes que codifican 1a mayoela de las protefnas caracterfslicas de la celula muscular esqueletica, y ademas los transcritos de RNA de estos genes pueden madurar de distintas farmas. Como resultado de ello, para los componentes del aparato contnictil se pueden produde numerosas variantes proleicas Us%rmas}, A medida que la celula va madurando, se van produciendo distintas selecciones de isoformas proteicas, adapladas a las sucesivas demandas de velocidad, fuerza y resistencia en el feto, en el recil~n nacido y en el aduho. En el mlisculo de lU1 individuo adulto, se pueden encontrar adosados distintos tipos de fibras musculares esqueleticas, cada uno de ellos con un conjunto distintos de pratefnas isoformas y con distintas propiedades funcionales (Figura 22-38).

Figura 22-38 Flbras musculares rlipldas y lentas. Dos cortes consecutivos de WI mismo fragmemo de musculo de poUo se han telUdo con dos amicuerpos fluorescentes, cada uno espec(fico para wta isofonna distinra de la miasina [I. En (A) celulas especializadas en la producci6n de contracciones rrtpidas se liT1en con anticuerpos contra miosina ~rrtpida"; en (B) las celulas especializadas en la producci6n de contracciones 1entas y sostenidas se tinen con anticuerpos contra miosina ~Ienta~. Las celulas de conlracci6n nipida se conocen como fibras musculares blancas, debido a su conlenido relalivamente bajo en una protefna de color rajo que une oxfgena. la mioglobina; las celulas musculares 1enlas se denominanjibras mllsclliares rajas debido a su mayor contenido en dicha pratelna. Las celulas pueden ajustar su caracter lenlo 0 nipido mediante cambios de la expresi6n genica segt1n el tipo de eSlfmu10 nerviaso que reciben. (De G. Gauthier et al.,]. Cell Bioi. 92:471-484, 1962. COil penniso de copyright de The Rockefeller University Press.)

En el adulto persisten algunos mioblastos como celulas madre quiescentes37 Un mllsculo pllede crecer de tres maneras: sus fibras musculares diferenciadas pueden aumentar en nllmero, en longilud 0 en grosor. Debido a que las fibras musculares esqueleticas no pueden dividirse, la mayor parte de elias se fonnan por fusi6n de mioblastos. EI numero fibras musculares esqueleticas plurinuclea~ das que tiene un adulto se alcanza en una elapa lemprana -en la especie huma~ na antes del nacimiento. El enorme incremento posterior del volumen muscular se produce por aumento del volumen de las celulas. El crecimiento en longitud depende de la incorporaci6n de mas mioblastos a una celula plllrinucleada ya formada, principal mente por fusi6n a nivel de los extremos, con 10 cual se incrementa el nllmero de nucleos de cada celula. En contraposici6n. el crecimiento en grasor, tal como ocurre en los rnllsculos de los levantadores de pesas, depende de un incremento del volumen muscular y del numero de las miofibrillas contractiles que contiene cada fibra muscular mas que de variaciones del numero de las fibras musculares 0 de sus micleos. En el adulto, sin embargo, persiste lin pequeno numero de mioblaslos en forma de celulas inactivas, peqllenas y aplanadas, en estrecho contacto con la

Figura 22·39 AUlorradlografla de una sola cclula muscular plurlnucieada con cclulas satcllte asociadas. La fibra se ha aislado a partir de una rala adulta yse ha transferido a un medio de cultivo que contenfa timidina)H y un eXlraclo de un musculo lesionado, que estimula la divisi6n de las celu1as sateille. Las celulas satelite en divisi6n (flee/las) aparecen marcadas radiactivamente (los granos de plata se visualizan como puntos negros); los nucieos de la celula muscular no tienen posibilidad de proliferar y permanecen sin marcar. (De R. Bischoff, Dev. BiaL 115: 140-147, 1966.)

Genesis, modulacl6n y regeneraci6n del musculo esqucletico

20 11m

1261

celula muscular madura y localizados a nivel de la lamina basal. Si se lesiona el mt1sculo 0 se trata artificialmente con FGF, estas denominadas celll1as satefile se act ivan y proJi[cran (Figura 22-39) y su descendencia puede fusionarse formando nuevas fibras muscularcs. Las celuJas satelite constituyen las celulas madre de la musculatura esqueh~tica de un adulto, que normal mente se mantienen en reserva en un estado quiescente pero que son utilizables cuando se requiere una alltorrenovaci6n de celulas diferenciadas de forma terminal. Aunque este mecanismo de reparaci6n muscular funciona bien en animales pequef'ios como el rat6n, es menos eficiente en el hombre. Par ejemplo, en la distrofia muscular, las fibras musclilares esqueleticas diferenciadas mlleren debido a un defecto genetico en la protefna del citoesqueleto disrrofina (vease pag. 917). Como resliitado de ella, las celulas satelile proUferan formando nuevas ft· bras musculares; pero dicha respuesla regenerativa no consigue ajllstarse a la lesi6n y las ftbras musculares quedan finalmente reemplazadas por tejido conjunrivo, bloqueando cllalquier posibilidad posterior de regeneraci6n.

Resumen Las c~lulll$ del mdsculo esquetetico cOnstitll.yell ulla de las prillcipaies categorfll$ celulares de los vertebrados especiallzadas en la contraecion; SOil responsables del lIIovimiento voluntario. Gada dilda del llllisculo esquetet/co es utI slncit/o y sedesarrolla por lafusiOlI de mioblll$tos. Los mioblastos SOli estimulados para proU/erar porfactores de crecimiellto, como el FGP, pero IUla vez se lIan fusiOfJado, ya "0 pueden volver a dividirse. Gelleralmellte la fiuMII de los mioblastos se halla acoplada con el programa de la diferenciaci6n ck la fibra muscular, en la clull varios genes qu~ codifican las protefllas especiflcas del ll11uculo actwlII de forma coordlnada. En el mlisculo del individuo adulto persistell algunos mloblastos (en estado qu;escellte) como cilulas satilite; wando se lesiona UII mlisculo, estas cilulas se reactivan, proliferalldo y!usiolltf"dose, y reemplaumdo las fibras musculares perdidas.

Los fibroblastos y sus transformaciones: la familia de las celulas del tejido conjuntivo38 En el individuo adullo, la mayor parte de las celulas diferenciadas pucden agruparse en familias cuyos miembros se haHan estrechamente relacionados entre sf en funci6n de su origen y de sus caracterfst'icas. Un ejemplo imponante 10 cons· tituye la familia de las celulas del telldo conjunlivo, cuyos componentes no s610 estan relacionados sino que lambien son interconvertibles en un alto grado. ESla familia incluyefibroblastos, cotldrocitos y osteociros, cellilas todas elias espedalicet"la oslta losteoblastolosteoclto)

celula cartilaginosa Figura 22·40 La familIa de celulas del lcondrocitol fibroblasto

•

/ cellile del mU!lClilo liso cellile adipose (adipocito)

1262

Capftulo 22 : Celulas diferenciadas y conscrvaci6n de los tcjidos

leJldo conJuntlvo. Las flechas seIialan las interconversiones que posiblemente tienen lugar entre las celulas de la familia del tejido cOlljumivo. Para mayor simplicidad, el fibroblasto aparece como un tipo celular I1nico, 8unque de hecho se desconoce cuantos tipos de fibroblastos existen y si la diferenciaci6n potencial de los distintos tipos puede restringirse de formas distintas.

Figura 22-4. EI f1broblasto. W Micrograffa en eOnlrnste de rases de un fibroblaslo en cultivo. (B) Esquemas de una e~lula viva similar a un fibroblaslO, de la eola Iransparenle de un renaeuajo. en el que aparecen los ellmbios dc forma y de posici6n cn dfas sucesivos. Obs~rvese que los fibroblastos en eultivo se aplanan pero que en [as tejidos puedcn prescntar morfologfas mlts eomplcjas, formando diferenles expansiones. (A, por cortesfa de Daniel Zieha; B, dibuJado a partir de E. Clark, Am. j. Ana'. 13:351379,1912.)

zadas en la secreci6n de la colagena de la malriz extr~celular y que en con junto son las responsables del soporte arquitecl6nico del cuerpo, asf como los adipocilOs y las fibras museu/ares /isas, que parecen tener un origen comun con las anteriores. En la Figura 22-40 se i1ustran estos tipos celuJares y las inlerconversiones que tienen lugar enue ellos. Las celuJas del tejido conjuntivo juegan un papel fundamental en el soslen y en la reparaci6n de la mayor parle de los lejidos y 6rganos; la adaptabilidad de su cankler diferenciado conslituye uno de los aspectos m<1s importantes de las respueslas frente a dislinlOS tipos de lesiones.

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Los fibroblastos cambian sus caracterfsticas en respuesta a seiiales de la matriz extracelular"'39 Los fibroblastos son las relulas menos especializadas de la familia del lejido conjunlivo. Se haHan dispersas en el tejido conjuntivo de todo el cuerpo, donde segregan una matriz extracelular blanda rica en colagena de tipo lode tipo III, tal como vimos en el Capitulo 19. Cuando se lesiona un lejido, los fibroblastos migran hacia la herida, proliferan y producen grandes canlidades de colagena, la cual contribuye al aislamiento y reparaci6n de los tejidos danados. Su capacidad para desplazarse en el momenta de una lesi6n, junto can el sistema de vida solitario que presentan, podria explicar par que los fibroblastos son las celulas que crecen'mAs fAcilmenle en cultivo -una caracterfSlica que las ha hecho el clemento fundamental en los estudios de biologfa celular (Figura 22-41). Tal como se indica en la Figura 22-40, parece que los fibroblaslos son las celulas mas versatiles del lejido conjumivo, ya que poscen una notable capacidad para diferenciarse en alTOS miembros de la misma familia. Sin embargo, existen algunos pumos oscuros acerca de dichas interconversiones. Exisle una evidencia clara de que los fibroblaslos de distintas partes del cuerpo son intr[nsecamenle distintos y esta tOlalmente comprobado que lodos los fibroblaslos de una rcgi6n determinada son equivalentes. Ante la falta de evidencias que prueben 10 conlrario, 10 mas senciUo es suponer que efcctivamenle son equivalentes, aUIlque es igualmente posible que ellejido conjunlivo pueda contener una mezcla de Iinajes procedenles de fibroblastos distinlOS, algunos de ellos capaces de transformarse en condrocilos, ouos en adipocilOS, etc., en lugar de que un solo tipo de fibroblasto posea mulliples capacidades de desarrollo. Es posible tambien que puedan coexislir los fibroblastos ~maduros" incapaces de transformarse junto con fibroblastos "inmaduros" (freeuentemente denominados cellllas mesenquimdticas), los cuales pucden dar lugar a lIna gran variedad de tipos celulares maduros. A pesar de estas indelenninaciones, a partir de estudios realizados tanto in vivo como in virro, exisle una evidencia clara de que las reJulas del tejido conjumivo pucden sumr cambios radicales de sus caracterfsticas. En este sentido, si sc obliene una preparaci6n de matriz 6sea mediame raspado del hueso hasla obtener un polvo fino, se elimina por disoluci6n el componenle mineral duro y se implanla en la capa dermica de la piel, algunas de las celulas (posiblememe fibroblaslos de la dermis) se transforman en celulas eartilaginosas y, algo mAs tarde, otras 10 haeen en celuJas 6seas, de tal forma que constituyen una pequena proluberancia de hueso que se completa con una cavidad medular. Esl'e tipo de experimemos sugiere que los componemes de la matriz extracelular pueden inLos fibroblastos y sus (ransformaciones: la familia de las eelulas del (elldo conjunUvo

dIll 2

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fluir notablemcnte en la diferenciaci6n celular del lejido conjuntivo. Veremos mas adelante que transformaciones celulares muy similares a ~slas son importantes en la reparaci6n espontanea de fracluras 6seas. De hecho, se ha detect'ado que la matriz 6sea contiene en su inlerior concentraciones elevadas de algunos faclores de crecimiemo que pueden afectar el comporramiento de las c~lulas del tejido conjunlivo, incluyendo, en particular, el faclor P de lransformaci6n del crecimienlO TGF-p (de Transforming Growth Faclor Pl, y un conjunto de diversas protefflas mor[ogefleticas del/lUeso (8MP, de Bone Morphogenelic Proleins) que penenecen a la superfamiJia TGF-ll Estos faclores ~onsti(Uyen potentes reguladores del crecimiento. diferenciaci6n y sintesis de la matriz par c~­ lulas del tejido conjuntivo, ejerciendo distintas aCclones que dependen del tipo de celula diana y de la combinaci6n con otros faclores y componenles de la matriz que se hallan presentes. Cuando se inycctan en un organismo vivo. pueden inducir formaci6n de canOago, de hueso 0 de matriz fibrosa, segtln la zona y las circunstancias de la inyccci6n.

La mattiz extracelular puede inOuir en la diferenciaci6n de las c~ulas del

tejido conjuntivo, afectando a su adhesi6n y a su forma 40

La matriz extracelular puede lnfluir en el eslado de diferenciaci6n de las celulas del tejido conjuntivo, mediallle efcctos ffsicos 0 quimicos. Esto se ha demostrado en estudjos realizados sobre cultivos de celulas canilaginosas 0 cm,drocitos. Bajo condiciones de cultivo apropiadas, estas celulas proliferan y manlienen su canlcter diferenciado, manteniendo durante muchas generaciones la sflllesis de grandes cantidades de una matriz cartilaginosa notablemente caraclerfstica, que las rodea por completo. Sin embargo, bajo condiciones en las que las celulas se mantienen a una densidad relativamenle baja y permanecen en forma de monocapa en la placa de cultivo, tiene lugar una transformaci6n. Las celulas pierden la forma redondeada dpica de los condrocitos, se aplanan contra el substralO y dejan de fabricar matriz canilaginosa. Concretamente dejan de producir colagena de tipo II -Ia caracterfSlica del cartilago- y en su lugar empiezan a producir colagena de tipo I -Ia caracterfstica de los fibroblastos. Al cabo de un mes de cultivo, casi tadas las c~lulas han modificado la expresi6n genica de la colll.gena y presentan aspecto de fibroblastos. Probablemente los cambios bioqufmlcos deben de producirse de forma brusca, ya que s610 unas cuantas celulas fabrican slmultaneamente ambos tipos de coltigena. Algunas Hneas de evidencia sugieren que los cambios bioqufmicos esttin inducidos, al menos en parte, par cambios producidos en la forma y en la adhesi6n celular. Por ejemplo, las c~lulas del canflago que han realizado la transici6n al caracler fibrobltistico pueden irse separando poco a poco de la placa de cullivo y transferirse a una placa de agar. AI formar el dep6sito de gel a su alrededor, el agar mantiene las celulas en suspensi6n sin ninglln tipo de adhesi6n al substrato, vi~ndose obligadas a adoptar una forma redondeada. En eSlas condiciones, las c~lulas revierten inmedialamente al caracler de condrodtos y empiezan a fabricar de nuevo colagena de lipo II. La fonna y la adhesi6n de la c~lula puede controlar la expresi6n genica mediante seliales intracelulares generadas en for· rna de contaCIOS focales, lal como vimos en el Capitulo 16. Para la mayorfa de tipos celulares y especialmente para las celulas del tejido conjuntivo, las posibilidades de anclaje y adhesi6n dependen de la malriz circundante. que generalmenle esta elaborada por las propias ululas. De esle modo una celula puede crear un entorno que posleriormente actua sobre sf misma reforzando el estado diferenciado. Ademas, la matriz extracelular que segrega una celula forma pane tanto de su propio entorno como del de las celulas vecinas, 10 cual provoca un mismo tipo de diferenciaci6n en estas celulas pr6ximas. Por ejemplo, se puede observar que un grupo de condrocitos que constituyen un n6dulo de cartflago se expande, tanto en el organismo en desarrollo como en una placa de cultivo. debido a la conversi6n en condrocitos de los fibroblastos vecinos. 1264

Capftulo 22: Gelulas diferencladas y conservaci6n de los tejidos

nucleo

gotes lipfdices celule precursore similer e un fibroblesto

edipocito

Figura 22·42 Desarrollo de un adipocllo. Unacelula precursora similar a un fibroblasto se conviene en una celula adiposa madura mediante acumulaci6n y coalescencia de gotas lipfdicas. EI proceso es, por 10 menos parcialmente. reversible. tal como indican las flechas. Las clBulas en los estadios temprano e intennedio pueden dividirse, perc la celula adiposa madura ya no puede hacerlo.

Distintas moleeulas seftal aetnan de forma seeuencial regulando la produeci6n de adipocitos 41 Se cree que las cl!ilulas adlposas 0 adlpocltos tambil!in se originan a partir de celulas similares a los fibroblastos, tanto en condiciones normales de desarroUo de los mamfferos como en circunstancias patol6gicas -por ejemplo, en la distrofia muscular, en la que las flbras musculares mueren y gradualmente son reemplazadas por tejido adiposo. La diferenciaci6n de la celula adiposa se inicia con la producci6n de enzimas especfficas, seguida de una acumulaci6n de gotas lipfdicas que posteriormente se fusionan y ensanchan hasta que toda la celula queda enormemente dilatada, de forma que tan s610 queda un fino cord6n de citoplasrna alrededor de la masa lipfdica (Figura 22-42). EI proceso puede estudiarse en cultivo (utilizando lineas celuJares de fibro· blastos como las celulas 3T3 de rat6n). de forma que se pueden analizar los factores que influyen en ellos. En un principio se obsetv6 que el desarrollo de celu· las adiposas en cultivo requerfa la presencia de suero bovino fetal, un aditivo corriente para los medios de cultivo. £1 factor crucial del suero que desencadena la diferenciaci6n celular Cue posteriormente identificado como hormona del ere· cimiento -una protefna que normalmente segrega a la cireulaci6n sangufnea la hip6flsis. Se ha demostrado que la hormona del crecimiento estimula la diferenciaci6n tanto del condrocito como de la cl!ilula adiposa, y que actua de esta forma tanto in vivo como in vitro. Sin embargo la hormona de crecimiento no es la unica molecula senal segregada que regula el desarrollo de la celula adiposa. Los precursores celulares de los adipocitos que se han estimulado mediante la hor· mona de crecimiento se vuelven sensibles a IGF-I (de InsuJinlike Growth Factor· 1), el cual estimula la proliferaci6n de los adipocitos en diferenciaci6n. La diferenciaci6n de las celulas adiposas. al igual que la de los condrocitos, tambien esta influida por factores que afectan a la forma y al anclaje celulares. La diferenciaci6n de las celulas 3T3 a cl!ilulas adiposas, por ejemplo, queda iobibida si las ceiulas se dejan expandir sobre una plaea de eultivo recubierta con flbronectina, a la que se adhieren fuertemente. Sin embargo, esta inhibici6n revierte mediante el tratamiento con el farmaco chocalasina, que disgrega los filamentos de actina y provoca que las celulas se dispongan en la periferia. Todos estos experimemos con celulas del tejido conjuntivo i1ustran un con· cepto recurrente: la diferenciaci6n viene regulada por una combinaci6n de sei\ales solubles y de contactos con la matriz extracelular. Los efectos de eada uno de estos faetores dependen de las caraeterfstieas de la eelula afeetada 10 cual, a su vez, depende de la historia del desarroUo de la celula.

El hueso se remodela continuamente por medio de las celulas que 10 constituyen 4Z EI hueso eonstituye una modalidad muy densa y especializada del tejido con· juntivo. Como el hormig6n armado, Ia matriz 6sea esta formada principalmente por una mezcla de fibras resiSlentes (fibrillas de colagena de tipo I), que resisten las fuerzas de presi6n, y de partfculas s6lidas (fosfato eaJcico y crist ales de hidroLos fibroblastos y sus transformaciones: la famIlIa de las celulas del tejldo conJuntivo

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xiapatita), que resisten la compresi6n. EI volumen ocupado por 101 colagena es practicameme igual que el que ocupa el fosfalo calcico. En el hueso adullo las fl· brillas de colagena se ordenan en capas regulares en forma estratificada, de lOll manera que las fibrilJas de cada capa se disponen paralelas entre sc. pero per· pendiculares respcclo a las fibriJIas de las capas contiguas. A pesar de proporcionar esla gran rigidez el hueso no es, aunque parezca 10 contrario, un lejido inmutable y permanente. Atravesando su dura malriz extracelular se hallan conducios y cavidades ocupados por celulas vivas, que alennzan alrededor de un 15% del peso del bueso compaclo. Estas celulas se hallan impUcadas en un incesante proceso de remodelaje: un tipo de celulas destruye 101 matriz 6sea envejecida mientras que otras ceJulas depositan matriz 6sea nueva. Este mecanismo posibilita una continua renovaci6n y substituci6n de 101 marriz en el interior del hueso. El hueso unicamente puede erecer por aposici6n, es decir, mediante el dep6silo de matriz adicional y de celulas sobre las superficies Iibrcs dellejido duro. En el embri6n, cste proceso debe producirse de forma coordinada con el crecimiento de los demas tejidos, de modo que el patr6n corporal pueda aumentar de escaIa sin que se a1teren radicaJrnente sus proporciones. Para 101 mayor parte del esquelelo y en panicular para los huesos largos de las extremidades y del tronco, el crecimiento coordinado se consigue mediante una compleja estralegia. En el embri6n se forma primero un conjunto de diminutos "modelos a esca101" de los huesos, a base de canOago. Cada modele a escala crcce. y a medida que se forma mas cartOago, el cartOago viejo se substiruye par hueso. EI creci· miento y 101 erosi6n del caru1ago y el dep6siro de hueso duranle el desarrollo esIan coordinados de una forma tan ingeniosa que el hueso adulto, aunque pueda lener medio metro de largo, tiene casi la misma fonna que el modelo eartiJagi· noso inicial, que unicamente medra unos cuantos milfmetros.

Los osteoblastos segregan matriz 6sea, mientras que los osteoclastos la erosionan40,4Z,43 EI cartOago es un tejido senciJIo, constituido par un unito ripo de celulas -los condrocitos- inmersos en una malriz mas 0 menos uniforme. Esta matriz canilaginosa es deformable, y el tejido crece por expansi6n a medida que los condrocitos se dividen y segregan nueva matriz (Figura 22-43). EI hueso es un tejido mas complejo. La matriz 6sea esta segregada por los oSleobJastos, que se hallan en 101 periferia de la matriz exislente y deposilan nuevas capas de hueso sobre elias. Algunos osteoblaSlos permanecen libres en la periferia, mienlras que otros quedan gradllalmenle englobados en su propia secreci6n. Este material recien fabricado (formado principalmente par colagena de tipo I) recibe cl nombre de osteoide. Se transform a rapidamente en marriz 6sea dura, mediante el dep6sito de cristales de fosfato cli-Idco en su interior. Una vez aprisionada en la matriz dura, la celula original formadora de hueso, lJamada ahora ostcoclto, ya no riene oponunidad de dividirse, aunque continua segregando a su alrededor, en pequef'ias cantidades, mas cantidad de malriz. EI oSlcocito, al igual que el condrocilo, ocupa una pcquefia cavidad 0 laguna en 101 matriz, pero a diferencia del condrocito no eSlli aislado de los otros osteocilOS. Desde cada laguna parten unos diminutos conductos 0 ca"alfcillos, que a1bergan las prolongaciones cehlFigura 22·43 Cr-eclmienlo del cartflago. E1lejido se expande a medida que los condrocilos se dividen y producen mas cantidad de malriz. La malriz recien sinletizada. con la que se rodea cada ~luJa. esla sombreada en verdeoscuro. EJ cartflago tambien puede crecer incorporando fibroblastos del tejida periferico y conviniendolos en condrocitos.

1266

Capflulo 22: ~luJas diferenciadas y conservaci6n de los tejidos

c6lula osteog'nlca Iprecursora del osteoblnlol oSleob!UIO

Figura 22-44 Dep6sito de matrlz 6sca por los osteoblastos. Los osteoblaslos que revisten la superfide del hueso segregan la mauiz organica del hueso· (osteoide) y se lransforman en osleodtos al quedar englobados por esla matriz. La matriz se cakilica poco despuM de haber sido deposilada. Parece que los propios oSleoblaslos derivan de las celulas madre oSleogenicas que se hallan eslrechamente reladonadas con los fibroblastos.

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olleoide lmalrir Osea no calciftcada)

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malr;lOsee calciflc.da prolongaciOn celul.r en el _ eondueto calcOfolo OSleocilO - - - -

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lares del oSleocilo que reside en elias, permitiendole fonnar uniones de comuni· cames con los osteocilos adyacentes (Figura 22-44). Aunque los osteocilos no segregan ni erosionan cantidades apreciables de maLriz por sf mismos, es probable que desempenen un papel importame en el control de las actividades de las celulas que sf 10 hacen. La matriz 6sea es generada por los osteoblastos, y se erosiona por los osteoc1astos (Figura 22-45). Estas grandes celulas plurinucleadas se originan, al igual que los macr6fagos, a partir de clHulas madre hematopoyeticas de la medula 6sea. Las celulas precursoras se liberan como monocilos hacia la corrienle san.gufnea y se agrupan en las
maim: 6Ma

ribeta eslriado del osleoelnlo

Figura 22-45 Se£c16n transversal de un oslcoclasto. Esta celula gigante rnultinucleada erosiona la matriz 6sea. EI ~ribete estriado" es una zona de secreci6n de acidos (que disuelven los minerales del hueso) y de hidrolasas (que digieren los componentes organicos de la matriz). Los osteoclastos varian en cuanto a forma, son m6viJes, y a menudo fonnan prolongaciones que reabsorben el hueso en distintas zonas. Se originan a partir de los monodtos y se pueden considerar macr6fagos especializados. (De R. V. Krstit: Ultraslructure of the Mammalian cell An Alias. Berlin: Springer, 1979.)

10..,m

Los fibroblastos y su.s lransfonnaciones: la familia de las ~luJas deltejido conjuntJvo

1267

Figura 22·46 EI remode1ado del hueso compacto. Los osleoclaslos, ost&oblasto que actuan juntos como un pequeno quiescents (celula grupo, excavan un tunel a naves del 6sea limitante) ............ hueso viejo, avanzando a una velocidad de aproximadamente 50 Ilm vaso sangu(neo pequei'lo calibre , aI dfa. Los osteoblastos peneuan nas celula endotelial ellos en elltlnel. revisten sus paredes y hUlIso r"Iuevo empiezan a fonnar hueso nuevo matriz 6see nueva depositando matriz a una velocidad de todav!a no calcificada libroblasto - - 1-2 Ilm al dfa. AI mismo tiempo. un hueso viejo capilar crece a 10 largo del centro del I(mel. Finalmente. el tunel quedani osteocito - - tejido conjuntivo laxo \leno de capas concentricas de hueso formado de nuevo, unicamenle con un estrecho conduclo central. Cada uno capllnr creclendo de estos conduclos, ademas de dentro del t~nel ostsobluto a punto de depositar hueso constituir una vfa de acceso para los lormado de nUllvo IIxcavando osteoclastos y los osteoblastos osteocluto que lIer"lara el t~r"Iel un t~nel a travils d e l . . excevado hueso viejo conliene uno 0 mJis vasos sangufneos que transportan los nutrientes que las ctHulas 6seas necesitan para sobrevivir. 100 11m De esta manera cada ano se substituye un 5-10% del hueso de un mamffero adulto sano. (Segtln Z.F.G. Jaworski, B. estos osteoblastos depositan capas concentricas de hueso reden formado, que Duck y G. Sekaly,'. Anal. 133.397-405,

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gradualmente lleoa la cavidad, dejando l1nicameOle un esuecho canal que rodea al nuevo vaso sangufneo. Muchos de los osteoblastos quedan atrapados en la matriz 6sea y sobreviveo en los anillos concentricos que forman los osteocitos. AI mismo tiempo que algunos de los tuneles se llenan de hueso, otros quedan perforados par los osteoclastos, que de este modo se abreo paso a traves de sistemas coocentricos mas antiguos. Las consecuencias de este remodelaje constante se ponen claramente de manifiesto en los bonitos patrones estratificados de la matriz que se observan en el hueso compacto (Figura 22-47). Todavfa existen muchos problemas no resueltos en coanto a estos procesos. Por ejemplo, los huesos presentan una marcada capacidad de adaptaci6n frente ala carga que deben soportar, debido al remodelaje de su estruchira, 10 cual implica que el dep6sito y la erosi6n de la matriz estan de alguna fonna controlados por un desgaste mecanico local. No se conocen los mecanismos que determinan

conducto antiguo condueto nuevo laguna 6sea

1268

.Capftulo 22 : Celulas diferenc1adas y conservaci6n de los tejidos

1981.)

Figura 22-47 Seccl6n transversal de una regl6n compacta externa de un hueso largo. La micrograffa muestra los Ifmites de los tuneles fonnados por los osteoclastos y posteriormente re\lenados por los oSleoblaslOs durante perfodos sucesivos de remodelaje del hueso. La secci6n se ha preparado mediante la Mcnica de desgasle. La matriz dura ha quedado consetvada, pero no as! las celuJas. Sin embargo, las lagunas y los conductos calc6foros que habran estado ocupados por los osteocitos son c\aramenle visibles. Los anillos concentricos claros y oscuros en altemancia corresponden a una orientaci6n alternante de las fibras de co1<~gena en las sucesivas capas de la matriz 6sea depositada por los osteoblastos que en vida revestfan la pared del conducto. (Este modeJo se revela aquf observando la muestra entre filtros polaroid parcialmente cerrados.) Obsetvese c6mo el sistema mJis viejo de capas concentricas de hueso de la parte inferior derecha se ha corlado parcialmente y se ha reemplazado por sistemas mas nuevos.

I

que 1a matriz sea depositada por los osteoblastos 0 bien sea erosionada por los osteodastos localizados en una determinada superficie 6sea, aunque probablemente jueguen un papel importante los faetaTes de credmiento sintelizados por las celulas 6seas, aprisionados en 1a matriz y Iiberados, posiblemente, cuando 1a matriz se degrada 0 se desgasta de lIna forma adecuada.

Durante el desarrollo, los osteoclastos erosionan el cartGago y se abren paso en el hueso 44 La substituci6n del cartilago por hueso en el lTanscurso del desarrollo parece que depende tambit~n de las actividades de los osteoclastos. A medida que el carulago madura, en algunas regiones sus celuJas se ensanchan enormemente a expensas de 1a matriz que las rodea, y 1a propia matriz se va mineraJizando, al igual que el hueso, por dep6sito de cristales de fosfato calcico. Los condrocitos hinchados mueren, dejando grandes cavidades vacfas. Los osteoclastos y los vasos sangufneos invaden las cavidades y erosionan la matriz cartilaginosa residual, miemras que los osteoblastos siguen su recorrido empezando a depositar matriz 6sea. EI unico residuo de cartilago que permanece en el hueso adulto es una fina capa que fonna una cubierta lisa en la sllperficie de los huesos a nivel de las articulaciones 6seas (Figura 22·48). Sin embargo, en el tejido conjumivo que rodea el hueso persisten algunas celulas capaces de formar mas canOago. Si el hueso se rompe, las celulas pr6ximas a la fractura Uevan a cabo la reparaci6n mediante una rudimemaria pero efectiva recapitulaci6n del proceso embrionario original, depositando primero canilago para Ilenar la rotwa y substituyendo luego ese canilago par hueso.

Agura 22·48 DesarroUo de un hueso largo. Los huesos largos. como el femur a el hl1mero, se desarroUan a panir de un modelo canilaginoso en miniatura fJ cartilago no calcificado se ha dibujado en verde, el cannago calcificado en negro. el hueso en mam:'ln y los vasos sangufneos en roja. E] cartfiago no se lransforma en hueso, sino que gradualmente se subsliluye por eSle debido a la acci6n de los condroclaSIOs y de los osteoblastos, que invaden e[ cartilago en asociaci6n con los vasos sangufneos. Los osteoclaslos erosionan el cannago y la malriz 6sea, ntientras que los osteoblaslos segregan malriz 6sea. fJ proceso de osificaci6n empieza en el embri6n y no tennina hasla el final de la pubenad. fJ hueso resultanle consiste en un cilindro vado de paredes gruesas conslituldas por hueso compaclO que limllan una cavidad central ocupada por la medula 6sea. Tengase en cuenta que no lodos los huesos se desarrollan de esta manera. Los IllIesos membra/losos del cn\neo, por ejemplo, no se forman a partir de un modelo cartilaglnoso sino directamenle como placas Oseas. (Adaplado de D.W. Fawcett, A TeXibookofHislOlogy, I lIh ed. Philadelphia: Saunders, 1986.)

La estructura del cuerpo estii estabilizada mediante su armaz6n de tejido conjuntivo y mediante la cohesi6n selectiva de las c~lulas45 Un hueso, al igual que un organismo completo, es un sistema dinamico que mantiene su estructura mediante un equilibrio entre actividades opuestas de numerosas celulas especializadas. Cualquier sistema dinamieo plantea un problema de estabilidad, 10 eual hace que nos planteemos una cuesti6n de tlpo general sobre el mantenimiento de la estructura del cuerpo. Hemos visto que las celulas de tejidos distintos mamienen su estado direrenciado, se producen nuevas celulas de fanna conuolada reemplazado a las que se han perdido y se renueva y remodela la matriz exuacelular. Pero, l.por que los diferentes Upos de Los fibroblaslos ysus transronnaciones: la familia de las cElulas del tejido conJuntivo

1269

ELHUESO

SEROMPE

la eompresi6n en eSlI zona favorece

en"lI zona favoreee la

el depOsito de hueso

erosiOn del hueso

la perdida de eompresiOn

EL HUESO SE DESPlAZADE SU POSIcION

CORRECTA

c~lulas no van quedando paulalinamente desordenados y desplazados? tPor qu~ loda la estructura no cede, se deforma 0 cambia sus proporciones cuando las zonas viejas son substituidas por zonas nuevas? HaSla cierto punlo, evidentemente, el cuerpo cede y se dcforma con el paso del tiempo -esto forma parte del cnvejecimiento. Pero tiene lugar de forma muy lenla. EI esqueleto, a pesar de su constante remodeJaci6n, proporciona un armaz6n rfgido cuyas dimensiones cambian muy poco. Ello se debe en parte a que las regiones de un hueso se renuevan no todas a la vez sino poco a poco, al igual que un edificio cuyos ladriUos se substituyeran uno a uno. Junto a un tipo de renovaci6n tan conservador actuan mecanismos homeostaticos activos. Por eUo pequenas desviaciones de un hueso respecto a su forma normal constituyen patrones de desgaste a1terados que regulan la remodelaci6n del hueso de tal forma que el hueso Uega a recuperar su forma normal (Figura 22-49). EI crecimiento y renovaci6n de muchas de las partes blandas del cuerpo estan controlados lambi~n homeoslciticamenle, de modo que cada componente se adapta a su nicho. La epidermis se extiende manleniendo cubierta la superficie corporal, y si se lesiona, las celulas crecen cubriendo la lesi6n y detienen su migraci6n cuando han cumpLido esla misi6n; ellejido conjuntivo crece JUSlO 10 necesario para Ilenar el vacfo creado por una herida; elc. Sin embargo se necesita algo mAs. Los diversos tipos de celulas diferenciadas se deben manlener no 5610 en las cantidades relativas correctas. La renovaci6n tisular impLka necesariament'e movimientos celulares. Estos movimienlos han de eSlar limitados de alguna manera; las c~lulas han de estar somelidas a reslriccioncs lerritoriales. Estas restricciones son de diversos lipos. Por ejemplo, a men lido las glandulas y otros grupos celulares especializados se hallan contenidos dentIo de capsulas resistenles de tejido conjllnt'ivo. Muchos tipos de c~lulas rnucren si se encuentran fucra de su emorno normal, privadas de unos factores de crecimiento especfficos de los que depende su supervivencia. Posiblemente la estrategia mAs imponante para manlener las diferentes c~lulas en su lugar sea la eSlrategia de la adhesi6n inlercelular selecliva: celulas del mismo tipo tienden a uniTse unas con Olras, ya sea en masas s6Udas, como el musculo Liso, 0 en capas epiteliales, tales como el revestimiento del intestino. Tal como se describi6 en Capitulo 19, este mecanismo posibilila, por ejemplo, que celulas epid~rmicas disociadas se reagrupen espontoineamenle formando un epitetio correctamente ordenado. En un sentido mas amplio, las capas de celulas epitetiales sirven para dividir el organismo en diferentes comparumientos, manleniendo asf las distintas celulas debidamente separadas y confmadas a sus lerritorios correspondientes. Los controles y equilibrios que preservan la estructura del cuerpo y la organizaci6n celular {rente a continuos procesos de recambio y de renovaci6n son sumamente intrincados y sUliles. La importancia de dichos controles queda ciaramenle en evidencia cuando fallan, tal como veremos al tratar el lema del cancer en el ultimo capItulo de este Iibro.

1270

Capftulo 22 : Ct'!lulas dlrerencladas y conservacl6n de los tejidos

Figura 22-49 Remodelado de un hueso largo de la plerna desput'!s de una fractura, reparada fuera de 5U posicion correcta. La deformaci6n que se origina en el hueso recientemente reparado 10 somete a tensiones an6malas. Donde las fuerzas de compresi6n se han incrementado, el nivel de dep6sito de hueso aumenla respecto aI nivei de erosion; en la zona donde las fuerzas disminuyen, el nivel de depOsito disminuye en relacion aI nivel de erosion. De esla manera el hueso se remodela gradualmenle hasla recuperar su forma normal.

HcsumCII

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127.

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1277

Pequefta c~lula T citol6xica prepar:tndose para malar una gran cclula tumoral. (De D. zagury, J. Bernard, N. Thierness, M. Feldman yG. Berke, Bur. j. (mlnl/nol. 5:818-822, 1975.)

EI sistema inmunitario

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Nueslro sistema inmunitario nos salva de una ffiuerte segura por infecci6n. Un vertebrado que nazca con un sistema inmunitario gravemente defectuoso morifa pronto, a menos que se adaplen medidas extraordinarias para aislarlo de un ejercito de agentes infecciosos -bacterias, virus, hongos y atros parasitos. rodos los vertebrados tienen un sistema inmunitario, mientras que los invertebrados presentan sistemas de defensa mas primitivos, que a menudo se hasan principalmente en celuJas fagocfticas. Estas celulas (principal mente macr6fagos y neutr6filos) desempenan tambien un papel importante en la defensa de los vertehrados contra la infecci6n, aunque 5610 constituyen una parte de una estrate· gia de defensa mucho mas compleja y sofisticada. La inmuflologfa, el estudio del sistema inmunitario, naci6 a partir de la observaci6n habitual de que las personas que se recuperan de ciertas infecciones son ~inmunes" a la enfermedad a partir de entonces; es decir, rara vez sufren de nuevo la misma enfennedad. La inmunidad es a1tamente especffica: un individuo que se recupera del sarampi6n queda prategida contra el virus del sarampi6n, perc no contra otros virus comunes como el de las paperas 0 el de la varicela. Esta especificidad es una caracterfstica fundamental de la respuesta inmunitaria. Muchas de las respuestas del sistema inmunitario inician la destrucci6n y eliminaci6n de los organismos invasores y de todas las moleculas t6xicas producidas por ellos. Estas reacciones inmunitarias san destructivas, par 10 que es imporfame que unicamente se produzcan contra moleculas que son extrai'i.as al organismo huesped y no frente a moleculas del propio huesped. Esta capacidad de distinguir entre moleculas extraiias y moleculas propias es otro rasgo fundamental del sistema inmunitario. En ocasiones el sistema inmunitario no distingue de una fonna adecuada y reacciona de forma destructiva contra las propias moleculas del huesped; estas enfermedades autoinmunitarias pueden ser fatales. El sistema inmunitario evolucion6 en el sentido de proteger a los vertebrados contra la infecci6n por parte de microorganismos y parasitos mayores, pero Ia mayor parte de 10 que sabemos sobre la inmunidad procede de estudios sabre las respueslas inmunitarias en los animales de laboratorio ante inyecciones de substancias no infecciosas, tales como protefnas y polisacaridos extranos. Casi cualquier macromolecula, siempre que sea extrafia al receptor, puede inducir una respuesta innnmitaria; las substancias capaces de desencadenar una respuesta inmunitaria reciben el nombre de ant/gena (generador de anticuerpo). Es imponante subrayar que el sistema inmunitario puede distinguir antfgenos muy similares entre sf -por ejemplo, dos protefnas que se diferencien en un solo aminoacido, 0 dos is6meros 6pticos de la misma molecula.

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1279

Exislen dos c1ases principales de respuestas inmunitarias:{l) respuestas por anticuerpos y (2) respuestas inmunitarias mediadas par celulas. Las respuestas por antlcuerpos implican la producci6n de anticuerpos, que son prole{nas que reciben el nombre de ;m1HlIIogloblllinas. Los antieuerpos circulan por la sangre y penetran en otros nuidos corporales donde se unen espec{ficamente al antfgeno eXlrano que los ha inducido. La uni6n del anticuerpo inactiva a virus y toxinas bacterianas (como la del uhanos 0 la botulfnica) bloqueando su capacidad de unirse a los receptores de las relulas del huesped. La uni6n de los anticuerpos lambien marca a los nl.icroorganismos invasores para su destrucci6n, facilitando su ingesti6n por una celula fagocftica a mediante la activaci6n de un sistema de protefnas sangufneas, denominadas coleclivamente complemento, que destruir<1 a los invasores. La respuesta mediada por cilulas, la segunda c1ase de respuestas inmunitarias, implica la producci6n de celulas especializadas que reaccionan can los antfgenos extrai'ios situados sabre la superficie de otras celulas del huesped. La celula reactiva, por ejemplo, puede matar a las celulas del huesped infcctadas por virus, que presenten antfgenos vfricos en su superficie, eliminando asf la celula infectada antes de que el virus se haya replicado. En otros casos, la celula reacliva segrega senales qufmicas que activan a los macr6fagos para que destruyan a los mieroorganismos invasores. EI principal reto de la inmunologfa ha sido entender c6mo el sistema inmunilario reconoce especmcamente y reacciona de forma agresiva frente a un mimero casi i1imitado de macromoleculas extranas distintas, evitando al mismo tiempo reaccionar con las decenas de miles de macromoleculas propias diferentes producidas par las celuJas del huesped_ Empezaremos nuestra discusi6n sobre el sistema inmunjtario considerando las celuJas que son las responsables principales de los dos tipos de inmunidad. A continuaci6n consideraremos las caraclerfsticas estruclUrales y funcionales de los anticuerpos que posibilitan a las celulas reconocer y destruir los antfgenos extracelulares. Despues de discutir c6mo se genera 13 diversidad de los anticuerpos, consideraremos las c:lTacterfslieas especiales de las respuestas inrnunilarias mediadas por celulas, que son cruciales en la defensa contra los mkroorganismos intracelulares.

Base celular de la inmunidad El sistema inmunitario humano esta compuesto por billones de linfocitos 1 Las c~llIlas responsables de la especificidad inmunitaria pertenecen a una clase de gl6bulos blancos conocido como Ilnfocitos. Se encuentran en grandes cantidades en la sangre, en la linfa (elUquido incoloro de los vasos linf<1ticos que conectan los n6dulos linfMicos del cuerpo) yen 6rganos Ilnfoldes especializados como el limo, los n6dulos Iinf
Capftulo 23 : EI sistema inmunitario

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&deno;de

timo

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Figura 23-1 Los 6rganos IInfoldes humanos. Los linfocitos se desarrollan en ellimo y en la medula 6sea {en amarillo}. los cuales se denominan por este motivo 6rganos lin/oides primarios (0 centrales). Los linfocitos reci~n fonnados migran desde eSIOS 6rganos primarios hacia los 6rgallos linJoides secundarios (0 peri/iricos) (en azu/). donde pueden reaccionar con el antfgeno. En el dibujo 5610 se mueSlran algunos de los 6rganos linfoides secundarios: por ejemplo. muchas Iinfocitas se encuentran en la piel y en los pulmones.

linfocitos se encontraban entre las cclulas de los vertebrados menos conocidas; ahara se encuenlran entre las celulas que cooacemos mejor.

I...os linfocitos B producen las respuestas humorales con anticuerpos; los linfocitos T producen las respuestas mediadas par celulas2 Durante los ai'IOS 1960 se descubri6 que los dos tipos principales de respuestas inmunitarias estan mediadas por dos c1ases diferentes de Iinfocilos: las celulas T que se originan en c1 timo y son responsables de la inmunidad mcdiada por celutas, y las celuJas 8, que en los adultos se originan en la medula 6sea y en el feto en el hfgado, que producen los anlicuerpos. Esta dicotomfa del sistema Iinfoide

fue demostrada inicialmenlc en animates con inmunodeficiencias inducidas experimelltalmente. Se encontr6 que la extirpaci6n del limo a un animal rceicn naeida perjudica de forma pronuneiada las respuestas mcdiadas por celulas pcro cjerce rnllcho menos efecta sobre las respuestas con alllicuerpos. En las aves tambien fue posible demostrar el efccto cOlllrario debido a que las cclulas B se desarrollan cn Ull 6rgano linfoide discreto asociado al intestino, In bolsa de Fabricio, que es exclusivo de las aves. La extirpaei6n de la bolsa de Fabrieio en el

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animal normal

animal irradiado

AESPUESTA - - - INMUNITARIA RECUPERADA

""."O

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Figura 23-2 EI experimento chislco que demuestra que los Unfocltos son los responsables del reconoclmlento y de la respuesla anle los anHgenos extraiios. Una caracterfstica illlporiame de lodos estos experimentos de uansferencia de celulas es que las c~llI.Jas se lransfieren entre anirnales de la misma cepa cOllsallgllfllea. Los miembros de una cepa consangu(nea son gcncticamcnte idcnticos. 5i se transfieren los Iinrocitos a un animal gcncticamente difcrente que ha sido irradiado. CSIOS Iinfocitos reaccionan contra los antlgenos ~exlrai'ios" del hu~sped y Jluedcn malar al animal.

ReSPUESTA INMUNrTARIA NORMAl

el enimel ifrediedo fecibe Iinfoeitos da un animal normal

__ _ _ _ NO SE PRODUCE RESPUESTA INMUNrTARIA

CONTROL

Base celularde la inmunldad

NO SE PRODUCE RESPUESTA INMUNrTARIA

EXPfRIMENTO

1281

momento de la eclosi6n disminuye la capacidad del ave para produeir anticuerpos pero ejerce muy poco efecto sobre la inmunidad mediada por celulas. Por otra parte, estudios realizados con ninos reeien naeidos can una inmunidad deficiente demostraron que algunos de estos niOos no podian producir anticuerpos pero tenian una inmunidad mediada por celulas normal, mientras que otros presentaban la deficiencia 0pllesta; ademas, los que tenfan una deficiencia selectiva en el tipo de respuestas mediadas por celulas, casi siempre presentaban anomalfas en el timo. Uno de los rasgos mas sorprendemes de estos estudios sabre ani males inmunodeficientes estribaba en que los individuos deficientes en celulas T (porque su timo habfa sido extirpado 0 era anormal) no s610 eran incapaces de producir respuestas inmunitarias mediadas por celulas sino que ademas presentaban unas respuestas de anticuerpos algo deficientes. Ahora sabemos cual es la explicaci6n. Existen dos tipos principales de celulas T -celulas T colaboradoras y celulas T citot6xicas. Las celulas T colaboradoras intensifican las respuestas de ouos gl6bulos blancos, y algunas de dichas celulas T colaboran can las celulas B en la producci6n de las respuestas por anticuerpos. Las celulas T citot6xicas, por el contrario, destruyen las celulas infectadas; debido a que se hal1an directamente implicadas en la defensa contra la infecci6n, a diferencia de las celllias T colaboradoras, las celulas T citot6xicas (jumo can las celulas B) en ocasiones se denominan celulas efectoras.

Los linfocitos se desarrollan en los 6rganos linfoides primarios y reaccionan con los antfgenos extranos en los 6rganos linfoides secundarios3 Los linfocitos se desarrol1an a partir de celulas madre hematopoyeticas pluripotendales, que dan lugar a todas las celulas sangufneas, incluidos los eritrocitos, los leucocitos y las plaquetas. Estas celulas madre, que han sido estudiadas en el Capitulo 22, estan localizadas primariamente en los tejidos hematopoyeticos --el hfgada en fetos y la medula 6sea en adultos. Las celulas T se desarrollan en el timo a panir de!Celulas precursoras procedentes de los tejidos hematopoyeticos. par via sangufnea. En los mamfferos las celulas B se desarrol1an a partir de celulas madre en los propios tejidos hematopoyeticos; sin embargo, en las aves las celulas B se desarrollan en la bolsa de Fabricio a partir de celulas precursoras que han migrado hasta allf a partir de los tejidos hematopoyeticos, a traves de la sangre. EI timo, los tejidos hematopoyeticos y la bolsa de Fabricio se conocen como 6rganos 110-

lejido hemetopoy"-ico

timo

c~lula

T

linfocito del timo cdlulas madre hematopoydticn

RESPUESTA DE ANTI CUERPOS

clliula B

""''-t-Iinfocito de la bolsa bolsa de Fabricio lunicamente aves)

1282

RESPUESTA INMUNITARIA MEDIADAPOR Cl!LULAS

Cap{tulo 23: EI sistema Inmunllario

Figura 23-3 EI desarrollo de las celulas T y B. Los 6rganos linfoides primarios, donde se desarrollan los linfodtos a partir de celulas precursoras, eslan reseJiados en los recuadros amarillos.

foldes (centrales) primarlos, debido a que son centros donde se desarrollan los Iinfocitos a partir de las celuJas precursoras (Figura 23-1). Tal como veremos mas adelante, la mayorfa de los Iinfocilos mueren poco despues de haberse formado en un 6rgano Iinfoide primario. GUos, sin embargo, maduran y migran vfa sangufnea hada los 6rganos llruoldes (perlfericos) Sttun· darlos -principalmente. los n6dulos Iinfaticos. el bazo y los n6dulos Iinfaticos asociadas al epitelio del tracto gastrointestinal. traclo respiratorio y la piel (vease Figura Z3-1). En estos 6rganos linfoides secundarios es principalmente donde las celulas T y las celulas B reaccionan con los antfgenos extrai\os (Figura 23-3). EI gruesa de la migraci6n de los Iinfocitos desde el timo y la bolsa de Fabricia se produce en las primeras elapas del desarrollo. por 10 que la extirpaci6n de estos 6rganos en los animales adultos tiene relativamente poco efecto sabre las respueslas inmunitarias: esta es la raz6n de que su papel en la inmunidad tardara tanto tiempo en ser descubierto. Par el comrario, la medula 6sea de los mamfferos continua generando grandes cantidades de nuevas celulas 8 (-s x !OJ/dia en un rat6n) durante toda la vida. Figura 23-4 EleclronmJcrogra((as de IInfocltos en reposo y actlvados. El linfocito en reposo en (A) puede ser una c~lula T 0 una c~lula B pues resulta dif(cil dislinguirlas morfol6gicamente hasta que hayan side activadas. La celula B aClivada (una c~lula plasml'ilica) en (B) estl'i repleta de un exlenso relfculo endoplasml'itico (ER) rugoso, que se halla distendido. con molkulas de anlicuerpo. La c~lula T aetivada en (C) presenta relativamenle poco ER rugoso pero esla lIena de ribosomas libres. Ob~rvese que las Ires celulas se mueSlran al mismo aumenlo. (A. por conesfa de Dorothy Zucker-Franklin: B, por cones[a de Carlo Grossi; A y B. de D. Zucker~FrankJin et aI., Alias of Blood Cells: Function and Palhology, 2nd ed. Milan. ItaJia: Edi. Ermes. 1988: C. por cortesfa de Siefanello de Pettis.)

Los marcadores de superficie celular permiten distinguir y separar las celulas T de las celulas 8 2 • 4 Las celulas T y las celulas B s610 san morfol6gicanlenle diferenciables despues de haber sido estimuladas por un antfgeno. Las celulas T y B no estimuladas ("en reposo~l tienen un aspecto muy similar. ineluso al microscopio electr6nico: ambas son pequei\as. s610 alga mayores que los eritrocitos, y tienen un nueleo volumi· nosa (Figura 23-4A). Ambas se activan par amfgenos. pasando entonces a proliferar y a diferenciarse. Las relulas 8 activadas se convierten en relulas secretoras de anticuerpos, las mAs maduras de las cuales son las celllias pfasmdricas, que presentan un reticula endoplasmatico rugosa bien desarrollado (Figura 23-48). En cambia, las celulas T aetivadas presentan muy poco relkulo endoplasmatico y no segregan anticuerpos. aunque segregan una gran variedad de mediadores dena· minados Iinfoquinas. inlcrlcllquinas 0 citoquinas (Figura 23-4C). Ambos tipos de linfociloS. T y 8. se preseman en todos los 6rganos Iinfoides secundarios, por 10 que ha side necesario encontrar sistemas para distinguir y separar ambos lipos celulares y sus numerosos subtipos. con el fin de estudiar sus propiedades individuales. Afortunadamente. exislen numerosas diferencias en las g1ucoprote(nas de la membrana plasmatica de los diferentes lipos de linfocilos que se pueden utilizar como marcadores distintivos. Por ejemplo, los an-

IAI

~t ... la

T 0 B en reposo lCI

~lula

T 'C1iva

(Bl eelula B aCliva (eelula plasml\lieal

Base celular de la inmunjdad

1283

<:elule precursor.

diatinto. clone. de <:etulaa B en reposo t... l,genllS)

i)

/1\ •• ••• ••

PROLIFERACION Y OlVERSIFlCACl6N DEL lINAJE CELULAR

UNION OELANTIGENOA UN CLON

ESPECIFICO

PROUFERACl6N [EXPANSION CLONAl) Y MAouRACl6N

cj.ulas B secralOlU de ."I!euerpos oe un aoIoclan

licuerpos que reaccionan con la protef"a Thy-l,la cual se encuentra en las ct!:lu· las T del ratdn pero no en las B, son ampliamente utilizados para eliminar 0 purificar ct!:lulas T de una poblaci6n mixta de linfocitos. Asf mismo, los anticuerpos contra las proreflJas CD4 y COB, que veremos mas adelanle. se utilizan muy a menudo para distinguir y separar ct!:lulas T colaboradoras de ct!:lulas T citot6xi· cas, respectivamente, tanto en el rat6n como en el hombre.

EI sistema inmunitario actua mediante la selecci6n donal s El rasgo mas notable del sistema inmunitario estriba en que puede responder a millones de antrgenos extrai'los diferentes de una manera altamente espccffica -por ejemplo, mediante la producci6n de anticuerpos que reaccionan espec£f1camcntc con cl anHgeno que ha inducido su formaci6n.le6mo pucde el sistema inmunilario producir semejante diversidad de anticuerpos especfficos? La respuesta empcz6 a dilucidarse en los ai'los 1950 con la tcorfa de la seleccl6n clonal. Segun dicha leorfa cada animal genera primero aleatoriamcnte L1na gran variedad de linfocilOs y posleriormente se seleccionan especfficamente las ct!:lulas que reaccionan contra los anlrgcnos extraf'ios quc el animal ba ido encontr<Jndo. La tcorfa de la selecci6n clonal se basa en la idea de que durante el desarrollo. cada Iinfocilo queda destinado a reaccionar con un antfgeno concreto, antes de habersido cxpuesto a este antIgeno. Una celula expresa este destino en forma de unas protefnas receptoras de la superficie celular que se adaptan espec£ficamenIe al antigeno. La uni6n del antfgeno a los receptores activa la celula haciendo que prolifere y madure. Por consiguiente, un antfgeno extTano cstimula selectivamente a aquellas ct!:lulas que expresan unos receptores complementarios y especfficos del antfgeno y que par consiguiente ya estan destinadas a responder ante el antfgeno. Esto es 10 que hace que las respuestas inmunilarias sean especfficas del antfgeno. EI termino "clonal" de "Ia selecci6n clonal" deriva del postulado de que el sistema inmunitario esta compueslO por millones de familias diferentes, 0 clOlles de ct!:lulll$. cada uno de los cuales conSla de celulas T 0 Bdescendientes de un ancestro comlin. Cada ct!:lula ancestral ya esla deslinada a producir un tipo de proteina receplora determinada. especffica del antfgeno, y todas las celulas de cada cion tienen la misma especificidad anligenica (Figura 23-5). Asf, segt.in la tcorfa de la selecci6n clonal. el sistcma inmunitario aetua segt.in el principio de ~Io ya confeccionado~ y no de "10 hecho a medida~. 1284

Capflulo 23: EI sistema inmunilario

FIgura 23-5 La leorfa de la selet:c16n clonal. Un antfgeno activa unicamente aquellos clones de linfodtos que ya estll.n destinados a responder ante el. Una ce:lula deslinada a responder ante un amfgeno concreto expresa receptores de superfide celular que reconocen especfficamente al antfgeno y lodas las ctHulas del cion expresan el mismo receptor. Se cree que el sistema inmunitario consta de mi110nes de clones diferentes de linfocitos, demos de los cuales pueden ser activados par un andgeno panicular (vtase mas adelante). Aunque 5610 se muestran las celulas B, las celulas T aCluan de fonna similar.

Figura Z3.fi Dos lipos de experimenlos que apoyan la teoria de selecd6n clonal. Para wla mayor

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EXPERIMENTO 1

Iiniocilol de r.t6n normal

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simplicidad. los receptores de la superficie celular se han dibujado Linicamellle en los linfocilOS que eSIl1n destinados a responder al amfgeno A: de hecho. sin embargo. lodos las c~lulas T y B licnen receplores especfficos para el antfgcno en su superficie. Los e:xperimenlos se han realizado principalmente can celulas B, puesto que las ctHuias T reconocen un anlfgeno 5610 cuando ~sle se ha unido a la superl1cie de una celula hu~sped, como veremos mas adelante.

In celulu con rec:eplores per' elant!geno A .null.n

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Existen muchas pruebas que apoyan los principios de la teona de selecci6n clonal. Por ejemplo. cuando los Iinfocitos de un animal que no ha sido inmunizado sc incuban en un (ubo de ensayo con un amigeno cualquiera de una serie de anlfgenos marcados radiactivarnente -por ejemplo A, B, C YD- 5610 una proporci6n muy reducida de los Iinfocitos «0,01%) se unen a carla uno de los antfgenos, 10 coal sugiere que 5610 unas euantas celuJas pueden responder a A, B, C 0 D. Ello se confinna hacienda que el antfgeno A sea tan altamente radiaCliva que cualquier celuJa que se una a ~I quede irradiada lelalmente; la poblaei6n restame de linrocitos ya no es capal. de producir respuesta inmunitaria ante A, aunque todavia puede responder a los antfgenos B, CoD. EI mismo erecto se puede conseguir con una columna de afinidad de cuentas de vidrio recubiertas can el antf· gena A y hacienda pasar luego los linrocitos a traves de la columna. las celulas can receptores para A quedan relenidas en la columna mientras que las otras celulas la atraviesan; por ello, las eelulas que salen de la columna ya no plleden responder ante A, pera responden normalmente a atros antfgcnos (Figura 23-6). Estos dos experimentos indican primero que los linrocitos esnin destinados a responder a un antigeno delerminado antes de haber estado expuestos a el, y segundo. que los IinrociloS lienen receptores en su superficie que unen especffieamente el antIgeno. Par consiguieme quedan confinnadas dos de las predicciones principales de la teorfa de la selecci6n clonal. Aunque la mayorfa de experi· mentos de este tipo se han realizado en celulas By en respuestas de amicuerpos. otros experimcntos indican que las rcspuestas mediadas par celulas T tambien se dcsarrollan por la selccci6n clonal. En la aetualidad sabemos que los receptores espedficos de antfgcnos tanto para las celulas T como para las celuJas B se hallan codificados par genes que se ensamblan a partir de series de segmemos genicos mediante una tinica rorma de Base celular de la Inmunidad

1285

recombinaci6n genlHica que tiene lugar en una elapa lemprana del desarroUo celular, antes de encontrarse con el antigeno. Veremos m<1s adelante c6mo el proceso de ensamblaje genera la enorme diversidad de receptores que capacita al sistema inmunitario para responder pr<1cticamente a una diversidad iJimitada de antfgenos. NO,

La mayorfa de antfgenos estimulan muchos clones diferentes de linfocitos6 La mayorfa de macromolkulas. incluidas practicamente todas las proteinas y gran pane de los polisacaridos. pueden actuar como antfgenos. Las zonas de un antfgeno que se combinan con ellugar de uni6n para los antfgenos de una molecuJa de anticuerpo 0 can el receptor de un Iinfocito, reciben el nombre de determJnantes antlgenlcos (0 ep{topos). La mayorfa de antfgenos {ienen varios determinantes antigenicos diferentes que estimulan la producci6n de anticuerpos o la rcspuesta de celulas T. Algunos determinantes son mas antigenicos que otros. de modo que la reacci6n que provocan puede dominar la respuesta general; se dice que tales determinantes son imnWlOdomillames. Como eabria esperar de un sistema que aetlie por selecci6n clonal. generalmente cada determinante antig~nico activara muchos clones. cada uno de los cuales produce un lugar de uni6n al ant{geno con una aflnidad caracterfstica para el dcterminante. Por ejemplo, incluso una estructura relativamente simple como el grupo dinirrofenol (DNP). que se muestra en la Figura 23-7, puede ser ~mirada" de muchas maneras distintas. Asi, cuando esta acoplado a una proteina, suele estimular la producci6n de cientos de especies diferentes de anlicuerpos anti-DNP, cada una de elias producida por un don de relulas B diferente. Tales respuestas se denominan policlonales. Cuando 5610 responden unos cuantos dones. se dice que la respuesta es oligoclonal; y cuando tOOa la respuesta esta prOOucida por un solo don de celulas BoT, se habla de respuesta monoclonal. Las respuestas a la mayona de amfgenos son polidonales. Incluso los antigenos que activan muchos clones s610 estimulan una fracci6n muy reducida de la poblaci6n Iinfocitaria total. Para asegurar que estos pocos linfocitos sean expuestos al antfgeno, los antigenos son recogidos por celulas presemadoras de antfge1lo especializadas en los 6rganos linfoides secundarios, a traves de los cuales circulan continuamente linfocitos T y B. Los amfgenos que entran a traves del intestino son atrapados par los tejidos linfoides asociados al intestino; los que penetran a traves de la piela el uacto respiratorio son retenidos local mente y/o transportados vfa Iinfatica hasta los n6dulos linfaticos locales; y los que emran en In sangre son filtrados en el bazo.

La mayorfa de los linfocitos recirculan continuamente7 La mayona de las celulas T y 8 recirculan cominuameme entre la sangre y los 6rganos Iinfoides secundarios. En un n6duJo Iinfatico, par ejemplo, los linfocitos abandonan la circulaci6n pasando con dificuhad entre celulas endoteliales espe· cializadas; uas fLItrarse a tra~s del n6duJo se acumuJan en pequeflos vasos linraticos que abandonan el n6dulo y conectan con O((OS vasos Iinfaticos, que a su vez atraviesan otros n6dulos linfatieos situados mas lejos. Circulando a traves de vasos cada vez mayores, los linfocitos entran finalmente en el vaso Iinratico principal (el condllcto torddcol. que los devuelve a la circuJaci6n sangufnea. Esta recirculaci6n continua no 5610 asegura que los linfocitos apropiados entren en contacto con el antigeno sino que tambi~n asegura que los Iinfocitos apropiados se encuemren entre sf: veremos que las interacciones entre Iinrocitos detenninados constituyen una pane crucial de la mayona de las respuestas inmunitarias. La recirculaci6n de Iinfocitos depende de interacciones espedficas entre la superficie celular dellinrocilO y la superficie de c~luJas endoteliales especializa· das que recubren el interior de pequeflas venas en los 6rganos linfoides secundarios; dcbido al extraordinario tamano de sus celulas endoteliales, dichas venas

1286 l

Capftulo 23: EI sistema Inmunltarlo

grupo dinitrofeo,t fONPj

e-.quelMo del polip6p1ido

Flguna 23-7 EI grnpo dJnJlrofenol

(DNP). Aunqlle es demasiado reduddo para indudr una respuesla inmunitaria pOT sf mismo, cuando se acopla en forma covalente a una lislna de In cadena lateral de una protefna, tal como se illistra aquf. el DNP estirnula la production de muchas espedes diferentes de anlicuerpos, que se unen especfficamente a dicho grupo.

Figura 23-8 DlbuJo muy Ilmpllfkado

~rKOrtex

(princ::I~Jmenle r~~_

ulul.. n

'eno marginal &enOl medula.el

""'"- VIlIO linUltlco

eferente

vena

3mm

se denominan lH!nulas posrcapilares de endorelio grande (Figura 23-8). Muchos tipos celulares de la sangre entran en contacto con dichas celulas endoteliales grandes, pero 5610 los linfocitos se adhieren y migran entonces fuera de la corrieme sangufnea. Distintas subpoblaciones de linfocitos migran a traves de distimos tejidos Jinfoides: por ejemplo, mientras que la mayorfa de linfocitos rnigran hacia los n6dulos linf~ticos, algunos migran preferentemenle hacia las placas de Peyer en el intestino delgado y constituyen, efectivamente, un subsislema intestinal especffico de linfocitos especializados en la respuesta frente a antfgenos que penetran en el cuerpo desde el intestino. Dichas migraciones estan dirigidas por los diferentes receptores buscadores en los Iinfocitos y por los Iigandos de
de un n6dulo Unr'tleo humano. Las c~lulas B estAn localizados primariamenle en el c6rtu, donde est~n agrupadas en estructuras lIamadasfollculos linfoides. Las reJulas T sc encuentran mayoritariamente en el parac6rrex... Ambos tipos de IinfodlOS penetran en el n6dulo linfAlico procedentes de la sangre, pasando por unas pequenas venas denominadas lIl1llulas postcapllares de elldotelio 8ra/lde y migrall despu~s hada sus areas respectivas. Finalmente tanto las c~lulas T como las Bmigran a los senos medulares y abandonan el n6duJo pasando por el vaso Iinf4dco eferente. Este vaso desemboca en la corriente sangu£nea. pennitiendo que los linfocitos empiecen OlrO dclo de circulad6n a trav~ de un 6rgano linfoide secundario. los antfgenos extral'tos que enlran en el n6dulo linfatico son expueSIOS en la superfide de celulas preselltadams de ant/gellO

especializadas: un tipo de estas c~lulas (celulas de/ldrlticas con interdigitaciolles) presenta los

antfgenos a las c~lulas Ten el4rea paracortical; se cree que otro lipo de relulas (celulas tkndrlticas folicularesl est1n implicadas en la activad6n de las c~lulas Bde memoria (sc discutir.i mas adelanteJ en el centro activado (denominado un centro genninativoJ de los foUculos Iinfoides.

1287

.

--

• •• • • • • • oUlL'

-.-.0

ADHESION FUERTE V MIGRACION nt!'1lrln.·oapendlenle

vl!nula

postcapllar

linfoeito

c61ula de Itndotel;o al\o de 18 v6nuIB

poslcapilar

•••••••• •

Figura 23-9 Migracl6n de un Ilnfocllo desde la corrlente sangulnea hacla un n6dulo IInflilico. Un linfocito circulante se adhiere debilmente a la superficie de las c~luJas espedaJizadas de endotelio alto. Dicha adhesi6n inicial. mediada por la selectina E de la superficie del linfocito. es Ian debiJ que provoca que el1infocito se desplace a 10 largo de la superficie de las celulas endOlCliales. Ellinfocito activa nipidamente un sistema de adhesi6n mas fuerte. mediado por una integrina. que permite a la celula detenerse en su desplazamiento y migrar hacia fuera de la venula entre las celulas endoteliales.

La memoria inmunol6gica se debe a la expansi6n clonal

ya la maduraci6n de los linfocitos8 Como el sistema nervioso, el sistema inmunitario liene 1a capacidad de recordar. Por ella, tras eslar expuestos a delenninados virus desarrollamos una inmunidad para tada la vida frente a muchas enfermedades vfricas comunes, 10 ella] constituye In inmunizaci6n. Este mismo fen6meno se puede poner facilmcnte de manifiesto en animales experimentales. 51 a un animal se Ie inocula el ant(ge· no A, su respuesta inmunilaria (ya sea por anticuerpos 0 mediada por celulas) aparecera al cabo de un perfodo de retraso de varios dias, aumentando de manera nipida y exponencial para luego volver a disminuir, aunque de forma mas gradual. ~ste es el curso caraclerfstico de una respuesta inmunitarla primaria, que se produce en la primera exposici6n de un animal a un antfgeno. Si se dejan transcurrir algunas semanas 0 meses, 0 incluso ai'ios, y de nuevo se inyecla al animal el antfgeno A, se producira una respuesta lnmunltarla secundarla, muy distinta de la respuesta primaria: el perfodo de retraso es mas breve y la respuesta es mayor y su duraci6n mas prolongada. Estas diferencias indican que el animal ha ~recordado" su primera exposici6n aI antfgeno A. Si aI animal se Ie administra un antigeno distinto (por ejemplo el antfgeno B), en lugar de una segunda inyecci6n de antfgeno A, tfpicamenle la respuesta sera de tipo primario y no secundario; por consiguiente, la respuesta secundaria retleja una memoria tomunol6gica especffica del anrfgeno A (Figura 23·10). La leoria de la selecci6n clonal proporciq,na una trama conceptual uti! para comprender la base celular de la memoria inmunol6gica. En un animal adulto, las celulas T y B de los 6rganos linfoides secundarios son una mezcla de celulas

WIIlnqnflrmtnfIltQllnl'nJlfo...nm 1

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primera inyeccl6n delllntlgeno A

1288

Capftulo 23: EI sistema inmunltario

20

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tiempo Idfas)

sllgunda inyecci6n delllntfgeno A y primera inyecei6n del antlgeno B

Figura 23-10 Respueslas prlmarla y secundarla de anllcuerpos. La respuesta secundaria es mas rapida e intensa que la respuesta primaria yes especlfica para A, 10 cllaJ indica que el sistema inOlunitario ha "recordado" especfficamente eJ haberse encontrado anteriormente con el amfgeno A. Si se miden las respueslas mediadas por celulas T y no las respuestas de anticuerpos de celulas B, se obtienen pruebas de memoria inmunol6gica del mismo tipo.

Figura 23-11 Modelo de los rundamentos celulares de la memoria lnmunltarla. Cuando las cl!lulas T 0 B vfrgenes son estimuladas par su antIgeno especffico. pronferan 'I maduran; a1gunas se activan dando lugar a una respuesta, mientras que otras se transforman en celulas de memoria. Durante una expasici6n posterior aI mismo antIgeno, las ~Iulas de memoria responden mb nlpidamente que las celulas vfrgenes: proliferan 'I se desarroUan dando lugar a celulas activadas y a Ollis celulas de memoria. En el modelo que se presenta aqu{, cada celula virgen Individual puede desarroUarse ya sea en celula de memoria 0 en celula activada, dependiendo de las condiciones. En un modelo altemativo (que no se muestra en la figural las ceJulas vfrgenes que maduran a celulas de memoria son dlferentes de las que maduran en cl!lulas activadas. Se desconoce culil de estos modelos es el correcto. que se hallan por 10 menos en tres fases discretas de maduraci6n. que se pueden denominar celulas lIfrgefies (0 "f1ai'vecells"), celli/as CO" memoria y celulasacrivadas. Cuando las celulas virgencs se encuentran con un antfgcno por primera VCZ, algunas de elias se estimlilan para multiplicarse y se transforman en cl!luJas actlvadas -es decir, en c~llllas dedicadas activamente a producir una respuesta (las cl!lulas activadas T realizan respuestas mediadas par celulas, mientras que las cl!lulas activadas B secretan anticuerpo). Duas cl!lulas vfrgenes se estimulan para multiplicarse y difeIenciarse en cl!lulas de memoria -es decir, en celulas que no producen respuesta pero que facilmente se inducen a uansfonnarse en celulas activadas, ante un encuentro posterior con el mismo antlgeno (Figura 23·11). Mientras que las celuJas vfrgenes y las celulas de memoria pueden vivir durante meses 0 incluso afJos, las celuJas efectoras mueren por muene celular programada en unos cuantOS dlas. Las celulas de memoria responden mucho mas rapidameme al antigeno que las celulas virgenes. Veremos mas adelante que una de las razones que explica esta capacidad de respuesta incrementada de las celuJas B de memoria es que sus receptores presentan una mayor afinidad por el antlgeno. Par el contrario, las celuJas de memoria T parecen responder al antlgeno mas rnpidamente que las celulas vfrgenes T no debido a la presencia de receptores de alIa afinidad para el antfgeno, sino porque que se adhiercn de forma mas fuene a otras celulas y traducen las sefiales extracelulares de fonna mAs eficiente. Segun este esquema, la memo· ria inmunol6gica se genera durante la respuesta primaria, en parte porque la pro· liferaci6n de la celuJa virgen. de$&ncadenada por el antfgeno, genera muchas celulas de memoria -proceso conocido como expansion cJol1al- y en parte porque las celt/las vfrgenes se diferencian en celulas de memoria que son capaces de res· ponder mas facilmente aJ arllfgeno que lila celula virgen. Los antfgenos pueden persistir en los tejidos Llnfoides durante largo tiempo consoLUyendo una respues· fa primaria y se cree que una estimulaci6n continua mediante un antfgeno conoibuye at mantenimiento de dicha mcmoria a largo plaza.

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primef1l ."posiciOn .1 .nllgeno

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I

celul.. de memori.

I

aegunda exposiciOn e' entlgeno

0'-0--

QHJ> 00 c6lulat de m.mori.

La falta de respuesta ante los antfgenos propios es debida

a una tolerancia inmunol6gica adquirida9 tPor que es capaz en sistema inmunitario de diferenciar entre las moleculas exua· fias y las moleculas propias? Una posibilidad estriba en que el animal hereda unos genes que codifican los receptores para los antfgenos extraftos pero no para los antIgcnos propios, de modo que su sistema inmunol6gico este constituido geneticamente para responder unicamente a los antfgenos extranos. Tambien es posible que el sistema inmunitario sea, de forma inherente, capaz de responder tanto a los antfgenos extrai'ios como a los propios, pero que durante el desarrollo "aprenda~ a no responder a los antfgenos propios. Se ha demostrado que esta segunda explicaci6n es la correcta. La primera prueba de clio fuc una observaci6n rcaJizada en 1945. Normalmente, cuando s~ trasplantan tejidos de un individuo a otro, se reconocen como extrai'ios por el sistema inmunitario y son destruidos. Pem se observ6

IUJ

Bus".lu'" d.1a 'nmunldad

_

1289

que los mellizos dizig6ticos de b6vidos, que se desarrollan a partir de dos 6vu1os fecundados y que por 10 tanto no son id~nticos, intercambiaban c~lulas sangufneas i/1 lUero como resultado de la fusi6n espontanea de sus placentas; se demostr6 que estos mellizos acept'aban mutuameme los injertos cUl.meos. Mas tarde, estos hechos se reprodujeron experimentalmente en pollos, permitiendo la fusi6n de los vasos sanguIneos de dos embriones distintos; tambi~n se realizaron en ratones, introduciendo en un neonato de rat6n relulas del bazo de una cepa distinta, donde sobrevivfan durante la mayor parte de la vida del receptor. En ambos ca$OS, cuando los animales maduraron, los injertos procedemes del animal unido 0 del animal donante fueron aceptados {Figura 23-12}, mientras que los injenos de un ~tercero" fueron rechazados. Asf, la presencia continua de antigenos no propios iniciada allies de que e) sistema inmunitario haya madurado, conduce a una ausencia permanente de respuesta ante los antfgenos no propios determinados. El estado resultante de la ausencia inducida de respuesta inmunol6gica a delerminados antfgenos recibe el nombre de tolernncla lnmunol6gica adquirlda. Existen c1aras evidencias de que la ausencia de respuesta del sistema inmunilario de un animal frente a sus propias macromoleculas (toleratl(;;a ;11111"'1016gica tlatural) se adquiere de la misma forma y, por 10 tanto, no es in nata. Por ejemplo, los ratones normales no pueden producir una respuesta inmunitaria contra su propia protelna del complemento CS, pero un rat6n mutante que carezca del gen que codifica C5 (siendo por otto lado geneticamente identico en todo 10 demas a un rat6n normal) puede producir respuesta inmunitaria (rente a esta proteina. EI mantenimiento de la autotolerancia requiere la presencia constallle de autoantfgenos. Si un animal elimina un antigeno como el CS recupera la capacidad de respuesta a dicho antlgeno en unos cualllos dias 0 semanas. As!, es evidente que cl sistema inmunitario es geneticamente capaz de responder a 10 propio pero aprende a no hacerlo. EI proceso de aprendizaje que posibilita la autotolerancia puede implicar tanto la eliminaci6n de Iinfochos aUiorreactivos (deleci611 clonal) como la inactivaci6n funcional de las celulas pero manteniendolas vivas (allergia clotlal). Como veremos mas adelante, muchos Iinfocitos autorreactivos se eliminan 0 inactivan cuando encucntran por primera vez un antfgeno en los 6rganos Hnfoi· des primarios. AI parecer, los linfocitos (armadas nuevamente en dichos 6rga· nos no se activan por unl6n al antfgeno aunque son eliminados 0 inactivados por dicho ant!geno. Alguna vez la tolcrancia ante los antfgenos propios desaparece, haciendo que las celulas T 0 B (0 ambasl reaccionen contra los antfgenos de sus propios t'ejidos. La miastellia gravis es un ejemplo de estas enfermedades autolnmunltarlas. Los individuos afectados producen anticuerpos contra los receptores de acetilcolina de sus propias c~lulas del ml1sculo esqueletico; los anticuerpos intcrfiercn en el funcionamiento normal de los receptores, de modo que estos padentes se debilitan y pueden morir por incapacidad para respirar. Flgura23·12 Tolerancla InmunoI6g1ca. EI injerto cUlaneo que mueSlra esta fOlograffa, uasplantado de un rat6n pardo adullo a un rat6n blanco adulto, ha sobrevlvido durante muchas semanas unicamente porque el segundo animal fue convertido en inmunol6gicamenle lolerante gracias a la inyecci6n de cl!:lulas del ral6n pardo desde el momento del nacimienlO. (por cortesfa de leslie Brenl, de l. Roin, Essential Immunology, Gill ed. Oxford, U.K.:

Blackwell5clentific, 1988.)

1290

Capitulo 23: EI slSlema inmunltario

Resumen £1 dstema inmunitarlo evoludon6 en el sentido de de/elmer II los vertebrados de in infecci6t1. EJut rompuesto por mlllones de clones de U,,/ocitos. Los linfocitos de eada dOli compartell U" receptor deterntinado de la slIperjic:le celrdar que les permite Imirse a un "tktermlnant.e antigen/co" com::reto, consLstenle en una disposid6n especffica de atomos de IlIIa ZOllO de La molkula. ulsten dos clases de lin/oci. los: las c1lulas B, que .Ie forman en la medula 6sea y produam atlticuerpos., y las dlldas T, que sefomum ell el rimo y desarrollan respuestas lnmunitarias mediadm pordlulas.

•

Dllrante ltu prlmeras lases tkl lksarrolw de los lin/ocltos, m.u:hos linfocilos que reaa:ionnrlnn contra detennJnnnles llntigenic:os de macromolkulas propins son elimbuulos 0 jrnu:tivados; II ronsec:lumcin de ella, IIomlalmellte el sistema j,,munitarlo reaccionn 5610 amtra UlII(gf!IIOS extranos. Ln ,mi6" de ,m antfgeno utratlo a un ""[ocUo inicia ,ura respuesla por parte de la dlula que ayuda a e1iminar el m,Ngeno. Como parte de esta respuesla, algrmos lillfocitos proUferan y mMurm, a dlulas de memoria, que son capaces de responder mas rapidameme que las ciluins virgenes frente al alltigello. Asi, in proxima IIt'Z fl"e aparezca el mismo m,llge"o in respuesta imnullitarla sera mas rapida e inte/lsa.

Propiedades funcionales de los anticuerpos'O

,

I

Los venebrados mueren rapidamente a causa de una infeccion si no son capaces de producir anticuerpos. Los anticuerpos nos defienden de la infeecion mediante la inactivacion de los virus y de las toxinas bacterianas, asf como mediante el reelutamiento del sistema del complemento y de varios tipos de g16bulos blancos de la sangre que matan a los microorganismos extracelulares y a parasitos mas grandes. Los anticuerpos, sintetizados exclusivamente por las celulas B, son producidos en millones de fonnas. cada una de las cuales tiene una secuencia de amjnoacidos y un lugar de uni6n al antigeno diferentes. Conocidos coleetivamente como [nmunoglobullnas (abreviado. Ig), se encuentran entre los componentes proteicos mas abundantes de la sangre, conslituyendo aproximadamente un 20% en peso del total de prme(nas plasmalicas. En esta secci6n describiremos las cinco c1ases de anticuerpos que se encuentran en los venebrados superiores, cada una de las ClIales media una respuesta biol6gica caracteristica tras su uni6n al antfgeno.

Los receptores de las celulas Bespedficos para los antfgenos son moleculas de anticuerpoll Como predice la teor(a de la selecci6n clonal, todas las moll!culas de anticuerpo producidas por cada cl!luJa 8 tienen el mismo lugar de uni6n para el antigeno. Los primeros anlicuerpos producidos por una celula 8 recil!n fonnada DO se se· cretan, sino que quedan insertados en la membrana plasmatica. donde acn1an como receptores para el antfgeno. Cada celula B tiene aproximadamenre UP moll!culas de anticuerpo en su membrana plasmtitica. Cada una de dichas moll!culas de anticuerpo se halla asociada de fonna no covalente con una serie constante de cadenas polipeptfdicas transmembrana implicadas en transmim senales al interior de la cl!lula cuando el lugar de urti6n extracelular para el antigeno se halla ocupado por un antfgeno. Dichos polipeptidos constantes tienen la finaJidad de acoplar los reeeptores de los antlgenos de las celulas 8 a uno 0 mAs miembros de la familia Src de proteinas mosina quinasas (incluyendo la Lyn quinasa). de forma que cuando se une un antfgeno se activa una cascada de fosforilaciones (vease Figura 23-548). Cada cl!lula 8 produce una sola clase de anticuerpo. con un unico Jugar de uni6n al ant(geno. Cuando una cl!lula virgen 0 una celula 8 con memoria es activada por un antfgeno (con la ayuda de las celulas T colaboradorasl. prolifera y Propledades funcionales de los anticuerpos

1291

madura conviniendose en una celula secretora de anticuerpos. Las celulas activadas producen y segregan grandes camidades de amicuerpos solubles (en vez de llnidos a membrana), con un lugar de uni6n para el amfgeno igual al de los anticuerpos de la superficie celular que inicialmente habian servido de receptores para el antigeno (Figura 23-13). Las celulas B activadas pueden empezar a secretar amicuerpos mientras todavfa son Iinfocitos pequefios, pero la fase final de su proceso de maduraci6n es una gran celula plasmatica (vease Figura 23-4B) que secreta anticuerpos a gran velocidad, del orden de unas 2000 moleculas por segundo. Parece que las ccllllas pJasmaticas han dedicado una parte tan grande de su maquinaria de sfntesis de protefnas a la producci6n de anticuerpos que son incapaces de crecer y dividirse, muriendo la mayorfa de eUas al cabo de varios dfas.

PROLIFERACION y MADURACION

r-T-T--1

Las c~lulas B pueden ser estimuladas a segregar anticuerpos en una placa de cultivo 12 Dos adelantos realizados en los a1'lOs 1960 revolucionaron la investigaci6n sobre las celulas B. EI primero fue el desarrollo de la prueha de la plaea hemolitiea, que hizo posible identificar y contar cellilas B activadas secretoras de anticuerpos contra un antfgeno especffico. En la forma mas sencilla de esta prueha, se toman linfocitos (generalmente del hazo) de animales que se habfan inmunizado contra eritrocitos de oveja (SRBC, de Sheep Red Blood Cells). Luego, estos Iinfocitos se incluyeron en agar, junto con un exceso de SRBC, de modo que la placa contenfa un "cesped" de SRBC inmovilizados y algunos Iinfocitos. En estas condiciones las celulas son incapaces de moverse, pero cualquier anticuerpo anti-SRBC que sea secretado por una eelula 8 difundira hacia el exterior y recubrira los $RBC de las proximidades de la eelula secretora. Una vez recubiertos de anticllerpo, los $RBC se pueden matar anadiendo complemento. De esta manera, la presencia de cada celula secretora de anticuerpo viene indicada por la presencia de un punto claro, a placa, en la capa opaca de SRBC. Esta misma prueba se puede utilizar para contar las celulas que producen anticuerpos contra otros antfgenos, tales como protefnas y polisacaridos, acoplando qufmicamente estos amfgenos a la superficie de Jos SRBC. EI segundo avance imponante foe la demostraci6n de que las celulas B pueden ser inducidas a segregar anticuerpos exponiendolas al antfgeno en un ensayo en tubo 0 en la plnca de cultivo. don de las interacciones celulares se plleden manipular y el emorno se puede controJar. Esto condujo al descubrimiento de que la mayorfa de antfgenos necesitan, para estimular a las celulas B virgenes a secretar anticuerpos, tamo los celulas T colaboradoras como las celulas presenradoras deanrfgeno especializadas, tal como veremos mas adelante.

anti cuerpos sogregados

Figura 23-13 Activacl6n de una wlula B. Cuando se activan celulas B en repose mediante un antfgeno para que proliferen y maduren a celulas secretoras de anticuerpos, producen y segregan anticuerpos con un unico tipo de lugar de uni6n, que es el mismo que en los anticuerpos unidos a membrana actuaba como receptor

del antfgello.

Los anticuerpos tienen dos lugares id~nticos de uni6n a1 antigeno l3 Las moleclilas mas sencillas de anticuerpo tienen forma de Y con dos lugares identicos de unl6n al andgeno, uno en cada punta de los dos brazos de la Y (Figura 23-14). Como tienen dos lugares de uni6n al antfgena, se dice que son bi· valenles. Cuando las moleclilas de antfgeno tienen tres 0 mas determinantes antigenicos, las moleclilas de anticuerpo bivalentes pucden establecer enlaces .cruzados entre moltkulas de antfgeno, formando amplias rcdes (Figura 23-15), que pueden ser fagocitadas y degradadas rapidamente par los macr6fagos. La eficiencia de la uni6n del antfgeno y la formaci6n de enlaces cruzados se ve altamente incrementada par la presencia en los anticuerpos de una regiOn bisagra flexible, que permite variar la distancia entre los dos lugares de uni6n a1 antfgena (Figura 23-16). EI efecto protector de los anticuerpos no se debe simplemente a su capacidad para unir el antfgeno. Tambien panicipan en diversas actividades mediadas por el pie de la molecuJa en forma de Y. Esta parte de la molecula determina 10 que Ie sucedera al antfgeno despues de unirse al anticuerpo. Veremos que anti1292

Capftulo 23 : EI sistema Inmunltarlo

Figura 23- J 4 Representael6n seneUla de una moleeula de antJeuerpo. Observese que los dos lugares de uniOn al antfgeno son identicos.

cuerpos con lugares de uni6n al anl1geno iguales pueden tener uno cualquiera de los diferentes tipos de pie, cada uno de los cuales confiere al anticuerpo propiedades funcionales distintas, como por ejemplo la capacidad de aClivar el complemento 0 de unirse a c~lulas fagocfticas.

Una moltkula de anticuerpo esta compuesta por dos cadenas ligeras if;lenticas y dos cadenas pesadas identicas 's La unidad estructural basica de una mollXula de ant.icuerpo consta de cuatro cadenas polipeptfdicas, dos cadenas Ugems (L) id~nticas (cada una de elias de unos 220 amino"cidos) y dos cadenas pesadas (1-1) (de "heavy") identicas (generalmente de unos 440 amino;1cidos). Las cuatro cadenas se mantienen unidas emre sf gracias a una combinaci6n de uniones no covalentes y covalentes (enlaces disu.lfuro). La molecula est;1 compuesta por dos mirades identicas, con ellugar de uni6n al antfgeno igual, y normal mente tanto la cadena ligera como la ca· dena pesada cooperan enue sf fonnando la superficie de uni6n al antfgeno (Figura 23-17). Las enzimas proteolfticas papaina y pepsina rompen las moleculas de anticuerpo en difercntes fragmentos caracterfsticos. La papa(t10 produce dos (ragmentos Fab (de Fragment Antigen Binding) idenlicos, cada uno de los cuales presenta un lugar de uni6n al antfgeno, y un fragmenlo Fc (!lamada asf porque crislaliza can facilidad). En cambio, la pepsitlo produce un (ragmento F(ab')z lIamado asf porque consta de dos fragmentos F(ab') unidos covalentemente (cada uno de ellos alga mayor que un fragmento Fab); el resto de la mollkula se degrada en fragmentos menores (Figura 23-18). Los (ragmentos F(ab')z son bivalenles, par 10 que todavfa pueden, a diferencia de los fragmenlos Fab monovalentes, formarenlaces cruzados con los antigenos, y precipitar. Ninguno de estos fmgmentos conscrva las otras propiedades biol6gicas de las moltkuJas de anticuerpo intactas debido a que carecen de la regi6n del pie (Fe) ell la que se basan eslas propiedades.

Flgura23-15 Interac:donesantfgenoanticuerpo. Debido que los anlicuerpos tlenen doslugares Id~nticos de uni6n aI anlfgeno, pueden fonnar enlaces cruzados enlre anlfgenos. EI tiro de complejo antfgeno-anticuerpo que fonnan depende delnumero de delerminanles anlig~nioos del anligeno. Aqui se mueslra la uni6n de una sola especie de anticuerpo (un anticuerpo monoclonal) a un anlfgeno que presenla una, dos 0 Ires capias de un mismo lipo de delcrminanle al1tig~nico. Los antfgenos con dos dclcrminantcs antigenicos pueden formar pequcnos complejos cfclicos 0 cadcnas lineales con eI anlicucrpo, mienteas que los antigenos con IreS 0 m4s detenninanles antigt!:nicos pueden fonnar grandcs redes tridimensionales que precipilan rtpidamenle en la soluci6n. La mayorfa de antfgcnos poSt.-en muchosdelemllnantes antig~nicos distintos (vease Figura 2325A) y los dislintos anticucrpos que reconocen estos delenninanles diferentes pueden rooperar fonnando enlaces cruzados con eI anlIgeno (no se mueslra en Ia figural.

delerminanl. .nlig6<'lico antig.no

regi6n bisagra de la molkula de anlicYerpo

Existen cinco clases diferentes de cadenas pesadas, cada una de las cuales tiene propiedades biol6gicas distintas lO, 14 En los venehrados superiores existen cinco clases diferemes de anticuerpos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, cada una de las cuales Hene su propia c1ase de cadena pesada n, 0, E, YY11, rcspectivamente; las moleculas de 19A. tienen cadenas n, las rnoleculas de IgG rienen cadenas y, etc. Adcrnas, exislen vadas subclases de inmunoglobuJinas IgG e IgA; por ejemplo; en humanos exislen cuatro subclases de IgG (lgGl, IgG2, IgG3 e IgG4) constituidas respectivamente por las cadenas pe· Propiedades funcionaJes de los anticuerpos

FJgura23·16 laregi6nblsagrade una molecula de antlcuerpo, Debido a su nexibilid3d, In regi6n blsagra aumenla 13 eficlencia de la uni6n del anffgeno y de la formaci6n de enJaces cruzados.

1293

Figura 23-17 lIustradon esquematlca de una mol6::ula tIplca de antlcuerpo. Esta compuesta por dos cadenas pesadas identicas y dos cadenas ligeras identicas. Observese que los centros de union al antlgeno estan formados por un cOn;J.plejo de las regiones amino terminales de ambas cadenas ligeras y pesadas, pero que la region de la cola y las regiones en bisagra estan formadas unicamente par cadenas pesadas.

cadena ligera

eOOH

Hooe

Hooe

eOOH

sadas "1'1' "1'2' "1'3 Y"1'., Las diferentes cadenas pesadas imparten una conformaci6n distintiva a las regiones de bisagra y de pie de los amicuerpos y confieren a cada c1ase y subclase unas propiedades caracterfsticas. La IgM, cuya cadena pesada es siempre 11, es la primera c1ase de amicuerpo que producen las celulas B en desarrollo, aunque posteriormente muchas celulas B pasan a producir ouas c1ases de anticuerpo (como veremos mas adelante), Inicialmeme el precursor inmediato de una celula B, denominado celula pre-B, s610 fabrica cadenas 11, las cuales se asocian can cadenas de polipepridos no li-

Figura 23·18 Fragmentos de antlcuerpo Fab y F(ab')z' Estos fragmentos se producen cuando las moleculas de anticuerpo son degradadas can las enzimas proteolfticas papafna y pepsina, respectivamente. paPS;nll

peplIina

I

s-s

lugllrell de uniOn

A 1..1

+

lugere5 de uniOn

-5-5

tJ

dos frllgmentos Fab

+

~

un frllgmento

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•• ••••

\~_s -s-s/+ ·t...

F,

1294

~

CapItulo 23 : El sistema inmunitario

I

un Irllgmento F(sb'h

I

subfragmentos de Fc

cad..,. liger.

Figura 23-19 Una molecula pentamerica de IgM. Las cinco subunidades estill unidas entre sf por enlaces disulfuro. Una I1nica cadena J, que presenta una estructura similar a la de un unico dominio de Ig (se estudia mAs adelanle), estli unida por enlaces disulfuro eRne dos cadenas pesadas~. La cadena J es necesaria para el proceso de polimerizacl6n. La adicl6n de cada una de las cutllro subunidades sucesivas de 13 cadena IgM rcquiere una cadena J, que se desprendc, excepto la ultima, que queda retenida.

_ _ enl_ dilulluro region R: de un

b.eteri. flil'Cvbl.ru de

geras (con frecuencia denominadas substituyentes de las cadenas ligerasl y si· tuadas en la membrana plasmarica. En cuanto incrementa la sfnlesis de las cadenas ligeras. ~slas se combinan con las cadenas ~, desplazando las cadenas ligeras Subslituyemes, fonnando una mol~cuJa de IgM de cuatro cadenas (con dos cadenas I.l y dos cadenas Iigeras). que se insertan en la membrana plasmatica. Ahora la c~lula tiene receplores en su superficie a los que puede unirse el an· dgena; en este momento la cl!lula redbe el nombre de alum B virge". Muchas cl!lulas 8 vfrgenes empiezan tambi~n a producir mol«ulas IgD de superficie celular. con el mismo lugar de uni6n a andgeno que las moleculas IgM. La IgM no es 5610 la primera c1ase de anticuerpo en aparecer en la superficie celular de las cl!lulas B en desarrollo. sino que tambi~n es la c1ase principal de Ig secretada a la sangre en las primeras fases de una respuesta primaria de anticuerpos. La forma de IgM de secred6n se compone de cinco unidades de cualro cadenas, teniendo asf un total de diez lugares de uni6n para el anlfgeno. Cada pentamero contiene una copia de olra cadena polipeptfdica denominada cadena J (de "joining"). Las celulas secretoras de IgM producen la cadena J y la inserIan covalememente entre dos regiones adyacemes del pie (Fe) (Figura 23-19). La un.i6n del antlgena a las regiones Fab de la IgM pentamerica secrelada induce a las regiones Fe a unirse. y por tanto a activar al primer componente del sistema del compleme"to. Tal como veremos mas adelante. cuando el antigeno se encuentra en la superficie de un microorganismo invasor, la activaci6n resultante del sist'ema del complememo inicia un ataque bioqufmico que mala al microorganismo. A diferencia de las IgM. las moleculas de IgO raramente son secretadas par una cl!lula B activa; sus funciones -ademas de las que presentan como receptores para el antfgeno- son desconocidas. La dase principal de inmunoglobulinas que se hallan en la sangre es la de las IgG, que sc producen en grandes cantidades durante las respueslas inmunitarias sccllndarias. Ademas de activar el sistema del complemento, la regi6n Fe de una molecula de IgG se une a receptores especfficos de macr6fagos y de neutr6filos. ESlas celulas fagodticas. en gran parte mediante eSIOS receptores Fe, se unen, ingieren y destruyen a los microorganismos infectanles que han side recubiertos POt anticuerpos IgG producidos en tespuesta a la infecci6n (Figura 2320). Algunos tipos de gl6bulos blancos que exptesan receptores Fe pueden tam· bien matar celulas eucariotas extnuias tecubiertas de IgG, sin fagocitarlas. Propiedades funclonales de los antJcuerpos

anticuerpo~OG /uerpo IgG recaptor Fe

/

mXlolaoo 0 neulrQfilo

1

FAGOCITOSIS

Figura 23-20 Fagocltosls aellvado por antlcuerpo. Una bacteria cubierla por anticuerpos IgG es fagodulda eficazmcnte por un mact6fago 0 un neutr6filo, 105 cuales tienen receptores de superficie capaces de unlrse 3 la regi6n Pc de las mole<:ulas de IgG. La uni6n de esta bacteria recubierta de anticucrpos a eslOS receptores Fc del macrofago activa el proceso de fagocitosis. 1295

Las mol~culas de IgG son los unicos anticuerpos que pllcdcn pasar de la madre al fela a Irav~s de la placenta. Las celulas de la placenta que se hallan en contacto con la sangre materna tienen receptores Fc que unen mol~culas de IgG y median su paso hacia el fem. En primer lugar. los anticuerpos son captados de la sangre materna mediante una endocitosis mediada por rcceptor, y luego son transportados a traves de la celula en el interior de vcsfculas y son liberados por exocitosis a la sangre fetal (proceso denominado rranscitosis. lal como se describe en el Capitulo 13). Dlras c1ases de anticuerpos no se unen a estos receplores por 10 que no pueden alravesar la placenta. La IgG tambien se segrega en la Ieche malerna y es captada por el recien nacido desde el intestino hacia la sangre. La IgA es la principal c1ase de amicuerpos que se hallan presentes en las secreciones (saliva, I<'i:grimas.leche y secreciones respiratorias e intcstinales) (Figura 23-21). Se transporta a traves de las celuJas de un epitelio de secreci6n desde el medio extracelular hasta el material de secreci6n por otTO lipo de receptor Fe que es el unico de los epilelios de secreci6n (Figura 23-22). La regi6n Fe de las moleculas de IgE se une con una elevada afinidad (K,. .. 10 10 litTOs/mol ) a otra c1ase de receptores Fe. Estos receptores se localizan en la superfieie de los mastociros de los tejidos y de los bas6filos de la sangre; a su Vel, las moleculas de IgE unidas a elias aetuan como receptores para el antfgeno. La uni6n del antfgeno desencadena la secreci6n por pane de las celulas de una serie de aminas biol6gicamemc activas, particularmente "istamina (Figura 23-23). Eslas aminas causan una dilataci6n y un aumento de la permeabilidad de los vasos sanguineos siendo en gran parte las responsables de las manifestaciones cUnicas de reacciones atergicas como la fiebre del heno, el asma y la urticaria. En circunstancias normales, los cambios que sulren los vasos sanguineos estan pensados para ayudar a las gl6bulos blancos de la sangre, a los anticuerpos y a los componentes del complemento a penetrar en los lugares de inflamaci6n. Los mastocitos tambien segregan ractores que auaen y activan a una c1ase especial de gl6bulos blancos denominados eosin6jilos, los cuales pueden malar varios tipos de parasitos, especialmemc si los parasitos se hallan recubiertos de anticuerpos IgE olgA. En la Tabla 23-1 se resumen las propiedadcs de los dislintos tipos de anI icuerpos en el hombre.

Los anticuerpos pueden tener cadenas Iigeras K 0 A, pero no de ambos tipos

clOdenlOS peUdUll

componente

Meretor

lugares de uniOn 101antigeno

FIgura 23-21 Dlagrama altamenle esquemlillco de una molkula dJmerica de IgA, la cuaJ se presenla en las secreclones. Ademas de los dos mon6meros de IgA, existe una unica cadena J y una cadena polipeptfdica aditional denominada romptmente secretor, el cuaJ parece que prolege las mol&ula de IgA de la digesti6n por las enzimas proteoliticas de las secreciones.

Ademas de las cinco c1ases de cadcnas pesadas, los vertcbrados supcriores ticnen dos tipos de cadenas Iigeras. '" y 1." que pueden estar asociadas con cual-

flUlDO EXTflACELULAA

CElULA EPlTElIAl

LUMEN

dimero IgA ---..:

, I

TRANSOTOSIS ~Fc:untdo

• membrana

---'"2r

Figura 23-22 Mecanlsmo de lransporte de una mohkula dlmerlca de IgA a traves de una celula eplleilal. La molCcula de IgA, asf como la cadena J que contiene el dfmero, se une a un receptor Fc Iransmembrana espe<:iaJizado de la superficie no luminal de la celula epiteliaJ secretora. Los complejos receplOr·lgA son ingeridos por endocitosis mediada por receplor. lransporlados a traves del ciloplasma de la celula epilelial en vesiculas, y secretados en el lumen del lado opuesto de la celula por exocitosis. Cuando queda expUeslO en ellumen, la pane del receptor Fc. que est! unido aI dimero de IgA (el component#! secretor). se escinde de su cola transmembrana. Iiberando asf el anticueTpO. tal como se muestra en la Figura 23·21.

1296

Caphulo 23: El sistema Inmunitario

vesicula secretora que contiene histamina

.:..... ' . ..... ',,,.,",;

antfgeno

>-'.,1"1

'"

.. receptor Fc

~~~::':~.::;~~r

especlfieo de IgE

lA IgE SE UNE A RECEPTORES Fe

"~,.:t:;;;; )::< ELANTfGENO

MULTIVALENTE FORMA ENlACES CRUZADOS ENTRE MOLECUlAS DE IgE ADYACENTES

"f)..

quiera de las cadenas pesadas. Una determinada molecula de anticuerpo contiene siempre cadenas ligeras identicas y cadenas pesadas identicas; por consiguiente. sus dos lugares de uni6n al antigeno siempre son identicos. Esta simetrfa es crucial para la funci6n de formaci6n de enlaces cruzados que tienen los anticuerpos secretados. Por consiguiente. una motecula de IgG puede tener cadenas Iigeras K 0 A pero no ambas a la vez. Por el momento no se han identifica· do diferencias en la funci6n biol6gica de estos dos tipos de cadenas Iigeras.

La intensidad de una interacci6n antigeno·anticuerpo depende tanto del mlmero de lugares de uni6n ocupados como de la afmidad de cada lugar de uni6n 10 • 15 La uni6n de un antfgeno a un amicuerpo, al igual que la uni6n de un substrato a una enzima. es reversible. Esta mediada por la suma de numerosas fuerzas nocovalentes. cada una de las cuales es relativanlente debil: enlaces hidrof6bicos. fuerzas de van der Waals, interacciones i6nicas, etc. Estas fuerzas debiles s610 son eficaces cuando la motecula de antfgeno esta 10 bastante cerca para permitir que alguno de sus atomos puedan encajar en los huecos complementarios existentes en la superficie del anticuerpo. Las regiones complementarias de una unidad de anticuerpo de cuatro cadenas son sus dos lugares identicos de uni6n aI antfgeno, mientras que la regi6n correspondiente del antigeno es un determiname antigenico (Figura 23-24). La mayorfa de las macromoleculas antigenicas presentan muchos determinantes antigenicos diferentes; si dos 0 mas de ellos son identicos (como sucede en un polimero con estructura repetitiva), se dice que el amfgeno es multivalente (Figura 23-25).

'

LlBERACIQN DE '. HISTAMINA PaR EXOCITOSIS

Figura 23-23 Funcl6n de las IgE en la secrecl6n de histamina par los mastocltos. Un mastocito (0 W1 bas6fi1o) se Wle a las molCculas de IgE despues

de

que hayan sida scgregadas por las cl!luJas B activadas; los anticuerpos 19E solubles

se unen a las protem8s receptoras Fc de la superficie celular del maslocilo que reconoce especlficamente la regi6n Fe de estos anticuerpos. Las molCculas 19E adquiridas pasivamente por el mastocito sirven como receptores de superficie celular para el antfgeno. Asi, a diferehcia de las cl!lulas B. cada maslodto (y bas6fi1ol presenta un conjuolo de anticuerpos de superficie celularcon una gran variedad de centros de uni6n aI antigeno. Cuando una molOCula de ant/geno se une a estos anticuerpos 19E unidas a membrana fonnando enlaces cruzados con los de las c~ulas cercanas, activa al mastocito a que Ilbere histamina por exocitosis. UNION DE ALTA UNION DE BAJA AFINIDAO AFINIDAD determinante entigenico lugar da unl6n el entigeno de 18 mohleula de antieuerpo

Tabla 23-} Propledades de las c1ases principales de antlcuerpos humanos Clase de antlcuerpo Propicdades Cadenas pesadas Cadenas ligeras Numero de unidades de cuatro cadenas Porcentaje respecto al total de Ig en sangre Activa el complemento Atraviesa la placenta Se une a macr6fagos y neutr6filos Se une a mastocitos y bas6fi1os

IgM

IgO

IgG

IgA

"

0

KOA

KOA

y KOA

KOA

5

I

I

102

IgE

•

cedene ligera

cedena pesada

FIgura23·24 Uni6n del antigeRa aI antJcuerpo. Un detenninante antigenico de una macromolOCula interacciona con

el lugar de uni6n del antfgeno de dos

molecuJas distintas de anticuerpo, una de alta afinidad y otra de baja afmidad. EI

10

++++

Propledades funcionales de los anlicuerpos

<1

75

15


++ + + +

detenninante antigenico se mantiene en el lugar de wti6n gracias a la acci6n de varias fuerzas debiles, no covalentes yen ellugar de mayor adaptaci6n al antfgeno posce una gran afinidad. ObselVese que nonnalmente tantO las cadenas pesadas como las ligeras de la molecuJade anticuerpo contribuyen allugar de uni6n al antfgeno.

1297

La reacci6n reversible de uni6n entre un antfgeno can un unico determinante antig~nico (indicado par Ag) y un anticuerpo can un unico lugar de uni6n aI antfgeno (indicado par Ab) se puede expresar de la siguiente manera:

Ag+Ab

~

AgAb

EI punlo de equilibria depende de las concemraciones de Ag y de Ab y de la imensidad de su interacci6n. Evidentemente. a medida que aumente la concentraci6n de Ag mayor serll In fracci6n de Ab que se asociara con el. Generalmente, la fuerza de In imeracci6n se expresa como la constante de aflnJdad (K.J (vease Figura 3-9), donde

multiplel determinen"l antigenicol dif"entes

IAl

_ IAgAbl K'-IAgiIAbl (los corchetes indican la concentraci6n de cada componente en el equilibrio). La constante de afinidad. denominada a veces constanle de asociaci6n, se puede delerminar midiendo la concentraci6n de Ag Iibre necesaria para ocupar la milad de los lugares de uni6n aI antfgeno del anticuerpo. Cuando estAn ocupados la mitad de estos lugares, IAgAbl =lAb) y K. =IJIAg]. Por 10 tanto el valor inverso de esta concentraci6n de antfgeno que produce la mitad de la uni6n mAxima es igual a la constante de afinidad del anticuerpo por el antfgeno. Los valores habiluales osciJan desde cifras tan bajas como 5 x 1()4 hasla cifras tan altas como 1011 IhrosJmol. La constante de afmidad para la cual una molecula de inmunoglobulina deja de ser considerada como anticuerpo para un delerminado antfgeno, es algo arbitraria, pero es poco probable que un anticuerpo con una K. inferior a I~ sea biol6gicameme eficaz; ademlls. es poco probable que las celulas 8 Que posean receptores de baja afmidad por un antigeno sean activadas por dicho antfgeno. La aflnidad de un anticuerpo para un antfgeno determinante reneja la fuerza de la uni6n de una sola copia de un delerminante amigenico a un solo lugar de uni6n del anlJgeno, yes independiente del numero de lugares de uni6n. Sin embargo, cuando un antfgeno que transpona muhiples copias de un mismo detenninante antigenico se combina con un anticuerpo multivalenle, la fuerza de dicha uni6n se incremema nOlablemente debido a Que para que el antfgeno y el anticuerpo puedan disociarse, se han de romper simuh<1neamente lodas las uniones anlfgcno-anticuerpo. As!, una molecula caracterfstica de IgG puede unirse a un antfgcno Illultivalenle con una fuerza de por 10 menos 50-100 veces mayor si en lugar de participar un s610 lugar de uni6n panicipan todos los lugares de uni6n al antfgeno. La fuerza total de la uni6n de un anlicuerpo llluilivalente a un ant(geno multivalente se designa como la avidez de la interacci6n. Si la afinidad de los lugares de uni6n de una molecula de IgG y de IgM cs In misma, la molecula de IgM (con 10 lugares de uni6n) tendra LIlla avidez muy superior par un anlfgeno multivalenle que una molecula de IgG (que liene dos lugares). Esta diferencia de avidez, a menudo de 10· veces 0 m<1s, es importante debido a que generalmente los anticuerpos producidos en las primeras fases de una respuesla inmunitaria tienen afinidades muy inferiores a las que mueslran los producidos mas tarde. (EI aumento de la afinidad media de los anticuerpos producidos despu~ de un tiempo de la inmunizaci6n, denominado maduraci6n de la afi,,;dad, se eSludiarll mlls adelante.) Debido a su elevada avidez 10lal, las IgM -Ia principal c1ase de Ig producida en las primeras fases de las respueslas inmunilarias- pueden actuar de fonna eficaz a pesar de Que cada uno de sus lugares de uni6n presente una afinidad baja.

La utilizaci6n del complemento por los anticuerpos contribuye ala lucha contra las infecciones bacterianas l6 EI complemento, denominado asf porque complementa y amplifica la acci6n de los anticuerpos, es una de las fannas principales a traves de la cuallos anlicuerpos defienden a los venebrados contra la mayona de las infecciones bacterianas. 1298

Capftulo 23: EI sistema inmunitario

multiples detlllm'linantlll ant.ig8n.icos idenliootl

(un anllgeno multivelente'

181

Figun 23-25 Molkulas con

mt1ltlples detennJnantes antJgl!:nicos. W Una protefna globular con varios determinantes antigl!:nicos diferenles. Generalmente distintas regiones de una cadena polipeptfdica pueden quedar juntas en la estruClUra plegada, formando cada uno de los determinantes antigenicos de la superficie de la prote[na. (B) Una eslruclUra poliml!:rica con muchos determianlcs anligenicos idtnricos; una molecula de esle tipo recibe el nombre de anrlgeno multivalente.

Los individuos que presentan alguna deficiencia en uno de los componentes centrales del complemento (denominado C3) eslan su;elos a repelidas infecciones baclcrianas, como si Fueran individuos deficientes en anticucrpos. EI sistema de complemento consl'a aproximadamcnt.e de 20 protefnas solubles que principal mente se producen en el hfgado y circulan por la sangre y por el fluido extracelular. La mayona de elias son inactivas a menos que se activen a traves de una respuesla inmunilaria, 0 de forma mas direcla por un microorganismo invasor. La ultima consecuencia de la aClivaci6n del complemento es el ensamblaje de los denominados componenres tardfos del comp/emento que forman grandes complejos proteicos, denominados comp/ejos de mal/ue de membrana, que producen perforaciones en la membrana de un microorganismo y pueden llegar a deslruirlo. Una de las funciones principales del complemento es atacar 1a membrana de las celuJas microbianas, par 10 que su aClivaci6n se concentra sobre 1a membrana celuJar microbiana, activada por los anticuerpos que estan unidos aI microorganismo 0 par los polisacaridos de la cubierta microbiana; ambos activan los componemes tempranos del compfememo. Existen dos gropos de componentcs tempranos, que pertenecen ados vfas diferentes de aClivaci6n del complemento, la via chislca y la via alternatlva. Los componenles tempranos de ambas vias actuan localmente activando C3, el componente mas importante del complemento, cuya fragmentaci6n provoca no 5610 el ensamblaje de los complejos de ataque de membrana sino rambien la selecci6n de dislintos tipos de g16buJos blancos (Figura 23-26). Los componentes tempranos y C3 son proenzimas que se activan secuencialmenlc par escisi6n protcolftica limitada: la escisi6n de cada proenzima de la secuencia, activa el componente que genera una serina proteasa que escinde la siguienle proenzima de la secuencia, y asf sucesivameme. Como que cada enzirna activada escinde varias moleculas de la siguiente proenzima de la cadena, la activaci6n de los componentes tempranos constituye una cascada proteo/[tica amplificada. As( cada molecula activada aI inicio de la secuencia provoca la producci6n de varios componentes activos, incluyendo muchos complejos de ataque de membrana. Muchas de eSlas escisiones tiberan un pequeno fragmento peplfdico, y de eSlc modo se expone en el (ragmento mayor un lugar de uni6n a membrana, el cual se une eslrechamente a la membrana de la celula diana y ayuda a llevar a cabo la siguiente rcacci6n de la secucncia, provocando temporalmenle la formaci6n de complejos de alaque de membrana. Esta forma de activaci6n del uniOn del anlicuerpo

pohslldirido microbieno

)

•

C' C2

VA

"""CA

o

C4

viA ALTERNAT!VA

ESCIS ON Of C3

. . . . SELECCl6N DE ~ lAS dLUlAS INFLAMATORIAS

RECUSRIMIENTO . . . DELOS ~ MICROORGANISMOS E INOUCCION DE LA FAGOCITOSIS

,

Figura 23-26 Fases princlpale1l de la actlvacl6n del complemento por las vias cl3ska y altematJva. En ambas vfas, nonnalmemc las reacciones de la aClivaci6n del complemento lienen lugar sobre la superficie del microorganismo invasor, como par ejemplo una bacteria. CI-C9 Ylos factores By 0 son los componentes reactivos del sistema de complemento; ouos tipos de componentes (no se muestran en la figural regulan el sistema. Los compommres tempranos estlin sei\alados dentro de lasfleclias grises, mientras que los componentes rardtos se hallan dentro de lijfledla marron.

I ,

'USOS '

"j;El\AAlf , I '

Propiedades runcionales de los anticuerpos

1299

C"J C" Clr

complejo Cl

complemento esta confinada principalmcnrc a la zona de la 5uperficie celular donde ha comenzado. EI fragmento mayor de C3 se denomina C3b. e.ste se une de forma covalente a la superficie de una celula diana. Una vez allf no 5610 aetda como una prO£casa que cataliza las etapas siguientes de la cascada del complemenlo sino que tambien es reconocido por protefnas receptoras espedficas de

Figura 23-27 La compleJa estructura de C I. La uni6n de dos 0 mas mol&:ulas de IgG {o una mol&:ula penlamerica de IgM; no se muestral a la supcrficie de un microorganismo capacita a sus regiones Fe para unirse aI primer componente de la via c1Asica, CI, que es un gran complejo integrado por tres subcomponentes-<:Iq, Clry Cis. Cuando Clq se une a los complejos antfgeno-anticuerpo, activa a Cl r, que adquiere actividad proteolftica, rompiendoCls e iniciando asf la cascada proteolitica. O~rveseque Clq esta integrado por seis subunidades identicas, cada una de eUas con una cabeza globular (que 10 une al amicuerpo) yuna cola similar a la colagena.

los macr6fagos y de los neutr6fi1os que incrementan la capacidad de diehas cetuJas para fagodfar la ceJula diana. EI fragmemo mas pequeno de C3 (denominado aa) actua independicmcmeme como una sefial difusible que provoca

una respuesta inflamatoria, estimulando a los gl6bulos blancos de la sangre a migrar hacia el foco de la infecci6n. Generalmente 1a \'fa c11sica se aCliva por agregados de amicuerpos IgG 0 IgM unidos a los amfgenos de la superficie de un microorganismo. La primera etapa de esta via queda ilustrada en la Figura 23-27. Por el comrario, la via alternativa se activa mediante los polisac<1ridos de la cubierta celuJar de los microorganismos, incluso en ausencia de anticuerpos, aunque la activaci6n de la via c1<1sica tambien activa la via a1ternativa mediante una retroalimentaci6n positiva. Por consiguiente, la via alternativa proporciona una primera I(nea de defensa contra la infecci6n, antes de que la respuesta inmunitaria pueda ponerse en marcha, y una vez la respuest'a inmunol6gica ha empezado tambien amplifica los efectos de la via cl<1sica. Las moleculas de membrana C3b inmoviiizadas, producidas tanto por la via c1<1sica como par la aIternativa desencadenan una cascada posterior de reacdones que provocan el ensamblaje de los. compleJos de ataque de membrana a partir de los Ultimos componentes (Figura 23-28). Dichos complejos se forman en la membrana cerca dellugar de activaci6n de C3; en las electronmicrograffas tenidas negativamente lienen un aspecto caracterfstico. En estas micrograffas se

•• 1300

Capftulo 23 : EI sistema Inmunilarlo

Figura 23-28 EnsamblaJe de los componenlcs tantfos del complemenlo, fonnando el complejo de ataque de membrana. Cuando se produce C3b tanto por la via c1asica como por la vfa a1temaliva, queda inmovilizado sobre la membrana, donde provoca la escisi6n de una prolCfna del complemento denominada C5 produdendo CSa (no se muestra en la figural y C5b. CSb permanece unido de forma laxa a C3b (no se muestra en la figural y se ensambla rapidamente con C6 y C7 formando C567, que se une emonces firmemente a la membrana via C7, tal como se jlUSlra en la figura. Este complejo anade una molecula de C8 formando C5678. La uni6n de una mol&:ula de C9 a C5678 induce un cambio conformacional en C9 que expone una regi6n hidrof6bica. insen4ndose en Ia bicapa lipfdica de 18 cl!lula diana. proxima a ca. Esto inicia una reacci6n en cadena en la que C9 a1terado se une a una segunda moll!cula de C9, la cual sufre un cambio de conformaci6n y se insena en la bicapa: a su vez, esta moll!cula puede unir Olra mol&:ula de C9, etc. De eSla manera par cada mol&:ula de C9 se forma un gran canal transmembrana.

puede observar c6mo forman poros acuosos a trav~s de la membrana (Figura 2329). Por esta raron, y debido a que perturban la estructura de la bicapa Iipfdica en sus proximidades, hacen agujeros en la membrana. Las moleculas pequenas

salen 0 entran de la celula a travl!s de estos compleJos mientras que las macromollk-ulas permanecen en el interior, de forma que se interrumpe el mecanismo normal de la celula para controlar el balance de agua. Por consiguiente, el agua penctfa en el interior de las celulas por 6smosis, causando su hinchamiemo yexplosi6n. EI proceso es tan eficiente que un pequeno numero de complejos de alaque de membrana (quizas uno s610) puede matar un gl6bulo rojo. Incluso un virus con cubiena, que no prescnta un gradiente de presi6n osm6tica grande a traves de su membrana y no es susceptible por tanto a esta !isis osm6tica. pllede ser destruido por estos complcjos, posiblemente debido a que estos complejos de ataque desorganizan la membrana vfdca. Las propiedades destructoras autoampLificantes de la cascada del complemento hacen necesario que los componentes clave activados sean rapidamente inactivados despue. de haber side generados, para evitar que el ataque se extienda a las celulas del huesped que se hallen en las proximidades. La desactivaci6n se consigue por 10 menos de dos maneras. En primer lugar, en la sangre existen unas protefnas inhibidoras especfficas que finalizan la cascada, bien fijando 0 bien escindiendo ciertos componentes cuando se han activado par escisi6n proteolftica. En segundo lugar, muchos de los componentes activados de la cascada son inestables; a menos que se unan inmediatamente a un componente apropiado de la cadena 0 a una membrana pr6xima, son inactivados n\pidamente.

(AI

(8'

'--' 10nm

Figura Z3-29 E1ectronmlcrograffas de leslones de la membrana plasrnthlca de un g1dbulo rolo, obtenldo.s con tlnddn negatlvu. La

eSla vista de [rente miemrasque en (B) eSlct visla de lado. como si fuera un canal lesion en (A)

transmembrana. E.l colorante negativo lIella el canal. por 10 que aparece de

color negro. (De R. Dounnashkin. Immunology35:205-212. 1978.)

Resumen Una molk.4ul de antlcuerpo dpica es una prote{na ell fomla de Y COli dos Illgares ldinticos de ulI1611 al alldge,1O e'l los extremos de los brazos de la Y (las regiolles Fab) y dlversos lilgares de "'I16n pam los componelltes del complemellto y/o pam varlos rea!ptores de sliperftcie "'ular, en el pie de In Y (regi6n Fc). Los anticllerpos dejientkn a los vertebrados de la Infea:i6n, inactluando ulnu y tadnas ba€terlmuu y redutamlo complemellto y diversas dlulas para ,natar e i"gerir a los microorganismos ;'llJasore$. (;ada clon de dlulas B produce molkulas de allticuerpo CO" UII ,,,,lco tipo de lugar de un16n al m,dgello. I"ldabnellte, las moliculas Sf! InserUlII ell 111 membmna plasmdtlca, donde acnian como receptores para el ant(gello. La ""i6" del andgeno a dlcllos receptores activa tktermlnadas c$lulas B (lIabltllalme"te con la aYIIda de las celulas T colaboradorasJ para nlldtipUcarse y madurar, conuirt;elldose ell cel"las con memorIa 0 ell celulas secretoras de mlticueryJO, las Cllales secretan autlcuerpos CIlYO lugarde 1U.16n al mlt{gello es 19ual al ql4e tell{a" los allticuerpos IUddos a 111 membmlla tk las c$/ulas B. (;ada molecllia tk antkllerpo constn de dos cade,uu pesadas Wlltlcas y dos cadenas llgeras idb.ticas. Tfpicamente. los Illgares de 1",16n al mldgeno estdn formados por parte de ambos tipos de auhmas, peuuJas y lIgeras. Existerr dnco dnses de anticuerpos (lgA. IgD, IgE, IgG e IgM). cada .4110 de los c,lnles tielle IUla cluuma pesada caracterlstica (a, 6, A. 'Y Y ...., respecrioomen.te). Las cade,uu pesadns tambierlforman In regi6" Fcdel mlNcuerpo, la c'UJI detemlina a qui prote{lIas Sf! IInlrtf el allticllerpo Y. por consiguie"te, males seran las propledades bioi6gicas de cada clase de anticuerpo. Cualqlliem de los dos tjpos de cade"a ligem (K 0 A) pUMe asodarse con cIUJlq,.ier clase de cadena pesada. Sh. embargo, parece que el tlpo de cadella ligera "0 tie"e Influencia sobre las propiedades del alltlcuerpo. Bl sistema del complemento c:oopera CO" los alltic"erpos defendle"do a los vertebrados de las h.fecdones. Los compo"eutes tempratlOs SOli proe"zimas qlle drwIan par la sallgre y se activa'4 seclle"dalmeute e" win serie amplificada de reaceio"es proteolftlcas Umitadas. EI compo"ente "Ids importante del c:ompleme"to es III prote{na C3 que se activa por escis16" proteolftlca y Sf! IlIIe a la membrana de una dlllla microbia'liJ, dontk colabora en la Inidaci6" del ensamblaJe local de los comporrenres tardfos del compleme'lto y en la inducei6n de lafagocitosis de In dlu-

Propiedades runclonales de los anUcuerpos

1301

Ia microblana. Los componentes tardfos constituyell gratutes complejos de alaqlle de membrana en Ia membrana de Ia cilula microbialla y de este modo deslmyell el microorgalllsmo invasor.

La estructura fma de los anticuerpos Existen lamas fonnas diferemes de anticuerpos, que cada uno de ellos constituye una mfnima fracci6n de las moJ~culas de Ig de la sangre de un individuo no inmunizado. Este hecho coloc6 a los bioqufmicos heme a un dificil problema, t.i.nico en qufmica de protefnas: c6mo obtener suficienle cantidad de cada una de las molttulas de amicuerpo para determinar su secuencia de aminoacidos y su estruclUra tridimensional. EI problema se resolvi6 gracias al descubrimiento de que las c~lulas de un tipo de cAncer, conocido como mieloma mtUtlple (dado que se desarrollan multiples tumores en la medula 6sea, 0 tejidos mieloides), secretan a la sangre del paciente grandes camidades de una unica especie de anticuerpo. EI amicuerpo es homog~neo, a monoclonal, ya que el cancer suele empezar con el crecimien10 incontrolado de una sola c~luJa , y en el mieloma multiple esta eelula es una eeluJa plasmarica secretora de amicuerpos. El anticuerpo, que se acumul'1 en la sangre, recibe eJ nombre de prolema del mleloma. La estructura detaUada de los anticuerpos rue establecida inicialmente con el estudio de las prOlefnas de mieloma presentes en la orina y en la sangre de estos pacientes, 0 de ratones a los que se les habfa inducido experimentaLmeme un rumor similar aI del mieloma mUltiple. Posteriormeme ha side posible conseguir c~lulas B secretoras de amicuerpo inmortales, al fusionarlas can c~lulas de mieloma no secretoras de anticuerpo. Los hibridomas resultantes proporcionan una fuente rapida de amicuerpos monoclonales. que pueden ser pro.du(jdos en cantidades ilimitadas contra cualqujer antfgeno deseado, tal como se via en el Capfrulo 4. En la actualidad pueden producirse cantidades iLimiladas de amicuerpos homog~neos mediante la tecnologfa del DNA recombinanle.

Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas presentan regiones constantes y regiones variableslO, 13 La comparaci6n de las secuencias de amin0<1cidos de distimas prote(nas de mie-

lorna revel6 un rasgo notable de impartantes implicaciones gen~licas. Tanto las cadenas pesadas como las cadenas Iigeras tienen una secuencia variable en su extrema amino terminal y una secuencia constante en su extremo carboxilo terminal. Por ejemplo, al comparar las secuencias de amin0l1cidos de mucbas cadenas I( diferenles de micloma se observa que las mitadcs carboxilo terminales 0 son iguales 0 s610 mueSlran pequenas diferencias, mientras que las milades amino terminales son completamente diferenles. Por consiguiente, las cadenas ligeras tienen una regi6n conslanle de aproximadamente 110 aminoacidas de longitud y una regi6n variable del mismo tamano. La regi6n variable de las cadenas pe· sadas (en su extremo amino terminal) tambien tiene unos 110 aminoacidos de longitud, mientras que la regi6n constante tiene unos 330 0 440 aminoacidos, dependiendo de la c1ase de inmunoglobulina de que se trate (Figura 23-30).

CADENA UGERA

l'1IlOn nliable

1302

Caprtulo 23: EI sistema inmunitario

legion eon~nle nipo

II;

0 lipo:U

Figura Z3-30 Zonas variables y conslantes de las cadenas de Inmunoglobullna. Las cadenas Iigeras y las cadenas pesadas de una mol&:u1a de Ig Ijenen distintas regiones conStantes y variables.

,eglo".. hipetVeriebl8ll de Ie cadena ptIs.eda

regiOn verieble de I. eedene ligere

Figura 23-31 Reglones hlpervarlables del antlcuerpo. Dibujo a1tamenle esquem;ttico que i1ustra c6mo las Ires regiones hipervariables de cada cadena Iigera y pesada [onnan, en conjunlo, ellugar de uni6n al antfgeno de una moltkula de anticuerpo. A veres a las regiones hipervarlables se les denomina regiones determinanres de fa complementariedad. La

estructura tridimensional real de un lugar de uni6n al antfgeno se muestra en la Figura 23-35.

Los extremos amino terminales de las cadenas Iigeras y de las cadenas pesadas son los que se unen entre sf fonnando el lugar de uni6n aI antfgeno (vease Figura 23-17), y la variabilidad de sus secuencias de amino<1cidos constilUye la base estructural de la diversidad de estos lugares de uni6n. La existencia de las regiones variable y constante en las mol6:ulas de anticuerpo planlea importantes cuestiones geneticas que consideraremos m<1s adelante. Antes de que fuera posible investigar directamente estas cuestiones geneticas, los eSlUdios estruclUrales de las protefnas de mieloma revelaron otros rasgos impartantes de la estructura de los anticuerpos.

Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas contienen tres regiones hipervariables cada una, que en conjunto forman ellugar de uni6n al antfgeno l7 EI estudio detallado de las secuencias de aminoc1cidos de una gran diversidad de cadenas Ig muestra que la variabilidad de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas esta restringida en su mayor pane a tres pequenas reglones hipervariables de cada cadena. Las reslanles zonas de la regi6n variable, conocidas como regiOIl€S de armaz6Il, son relalivamente constantes. EsIOS haUazgos condujeron a la predicci6n de que el lugar de uni6n al antigeno esla fonnado por tan s610 los 5 a 10 aminoc1cidos de cada regi6n hipervariable (Figura 23-31). Dicha predicci6n se confirm6 mc1s tarde gracias a estudios mediante difracci6n de rayos Xde las moleculas de anticllerpo (vease mas adelanle). En relacl6n can el tamano dellugar de uni6n al antfgeno de una moltkula de anticuerpo, generalmente el detemlinante antigenico que es reconocido de fonna especffica por un anticuerpo es comparativamenle mc1s pequeno: por ejemplo puede ser de menos de unos 25 residuos de aminoc1cido de una protefna globular de superfi· cie (vease Figura 23-35) y puede lIegar a ser tan pequeno como un grupo dininofenol (vease Figura 23-7).

Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas estan plegadas en dominios repetitivos simiJareslO. 18 Tanto las cadenas Iigeras como las cadenas pes<1das estc1n formadas por segmemos repetitivas -cada uno de ellos de una longitud de unos J 10 aminoacidos y con enlaces disulfuro entre cistefnas de la misma cadena- que se pliegan independientemente formando unidades funcionales compactas, 0 domlnios. Como mllestra la Figura 23-32, una cadena ligera consta de un dominio variable (VJ y otro constante {CJ, en cambio la mayorfa de las cadenas pesadas constan de un dominic variable (VH) y nes dominios constanles (CIII, ~2 YCH3). (ranto las cadenas IJ como las cadenas £ tienen un dominic variable y cuatro constantes.) Los dominios variables son los responsables de 1a uni6n al antfgeno, miemras que La estructura fina de los anlicuerpos

1303

los dominios constantes de las cadenas pesadas (excepto el Cui) forman la regi6n Fe, la cual determina las demas propiedades biol6gicas del anticuerpo. La similitud existente entre los diferentes dominios sugiere que probablemente las cadenas de Ig surgieron durante la evoluci6n gracias a una serie de duplicaciones genicas, empezando con un gen primordial que codificaba un dominio de 110 aminoacidos de funci6n desconocida. Esta hip6tesis se ve con firmada por el descubrimiento de que cada dominio de la regi6n constante de una cadena pesada esta codificado por una secuencia codificadora aislada (ex6n) (Figura 23-33),

FIgura 23-32 Domlnlos de la lnmunoglobullna. Las cadcnas ligeras y las cadenas pesadas de una mol!kuJa de Ig estan plegadas en dominios repetilivos, que son parecidos entre sf. Las zonas variables (en azu{) de Jas cadenas ligeras y de las cadenas pesadas (V l y VH) forman los lugares de uni6n al antfgeno, mientras que los dominos constantes de las cadenas pesadas (principalmente C1I 2 y CJl3j determinan las otras propiedades biol6gicas de la moMcula. Las cadenas pesadas de los anticuerpos IgM e IgE tienel un domino constante adicional (C Jl 4j. Las interacciones hidrof6bicas entre los dominios de cadenas Ig adyacentes juegan un papel importante en mantener juntas las cadenas en la moh~cuJa de Ig: par ejemplo, CL se une a Cu I YJos dominios CII 3 se unen entre sf.

Estudios por difracci6n de rayos X han revelado la estructura tridimensional de los dominios de las Ig y de sus lugares de uni6n aI antfgeno l9 Aunque se conozca la secuencia completa de aminoacidos de una gran protefna, no es posible todavfa deducir su estructura tridimensional; generalmente hay que realizar estudios por difracci6n de rayos X sobre protefnas cristalizadas. $e han cristalizado varios fragmemos tanto de protefna de mieloma como de anticuerpos, asf como de una molecula intacta de IgG, y los estudios sobre su estructura por rayos X han confirmado las predicciones de los inmunoqufmicos, Lo

secuel1cias codificantes

bisagra il1t.6n

il1t.611

I t====::JI.=:II••• ClEI• • • • TRANSCRIPCION

5'

J'

:JI• • •

I I lllllliii••••••••

MADURACION DEL RNA POR CORTE Y EMPALME mRNA

c~

CHJ

TRADUCCION

CH1 H2N -

blseg'lI

CH2

CHJ

::JI• •

ragi611 constllnta de III cadel1l1 pasadll

1304

Capftulo 23: EI sistema inmunitario

COOH

RNA

Figura 23·33 Organizacl6n de las secuenclas de DNA que codiflcan la regl6n constanle de una cadena pesada de Ig. Las secuencias codificanles (exonesj de cada dominio y de la regi6n bisagra esul.n separadas por secuencias no codificantes (imrones). Las secuenclas intr6nicas se eJiminan mediante Ja maduraci6n de Jos transcritos primarios de RNA, que da lugar aI mRNA. Se cree que la presencia de intrones en la secuencia de DNA puede haber facilitado las duplicaciones accidentaJes de segmentos de DNA que, en el transcurso de la evoluci6n, han dado lugar a los genes de los anticucrpos (se discute en el Capitulo 8). Las secuencias de DNA y de RNA que codifican la regi6n variable de la cadena pesada no se muestran en la figura.

dominio Vl

dominioVH

~,'O"

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luger de uni6n et enllgeno

dominio C l

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lugar de un06n 81

entlgeno

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cedenas pesada,

c.; •••••

cadenalligaras .-

1

----.

t

COOH

•

Figura 23-34 La estruclura plegada de una molkula de antlcuerpo IgG, basada en estudJos de crislalograffa por rayos X. (A) Cada residuo de amlno!cldo de la prote£na se ha dibujado como una pequena es(era. Una de lascadenas pesadasse ha dibujado en azul claro y la Olra en azul OSCllro, con los dominios de las cadenas ligeras en amarillo. TOOas las molEkulas de anticuerpo eSlan glucosiladas: la cadena de ollgosacaridos unida a la regi6n CIl2 estrt representada en rajo. (B) Conliguracl6n de 1a cadena polipcptfdica de una cadcna Iigera. Las regiones varible y conslanle eSlrtn formadas por dos himinas f' -una con treS hebras (verde) y alra con cualro (amarillo). Las laminas eslan unidas per un cnlace disulfuro (negro). Tcxlas las regiones hipervariables (raja) (orman bucles en el extremo distal del domlnlo variable, donde fonnan el lugar de unl6n al antfgeno, (A, segtin EW. Silverton, M.A. Navia y D.R, Davies, Proc. Natl. Acad. SCi. USA 75:5140,1977; S, segl1n M. SChiffer,

R.L. Girling, K.R. Ely YA.S.

L-_--,-----,---_--,----:-:--,---_---J"L_--,-----,---

'8'

dominio veriebl. fVd

=-_---J

Edmundson, Biochemistry 12:4620,1973. Copyrigtlll973 American Chemical Society.)

dominio constant.ICd

que todavfa es mlis imponanle, eslOS estudios han revelado la forma en que estlin construidos miJIones de lugares diferentes de uni6n al antfgeno, siguiendo un patr6n estructural comlin. Tal como se ilustra en la Figura 23-34, cada dominio de las Ig lienen esuucturas tridimcnsionales muy similares, basadas en 10 que ahora se denomina el plcgamiento de las inmulloglobulinas. A grandes rasgos, cada dominio es un cilindro (de 4 x 2,5 x 2,5 nm) compuesto par un "bocadillo" de dos capas proteicas extendidas: una capa conticne tres hebras de cadena poLipeptfdica mientras que la otra contiene cuatro hebras. Ell cada capa las hebras adyacentes son antiparalelas y forman una lamina j3,. Las dos capas son mas 0 menos paralelas y estan conectadas entre sf por un unico enlace disulfuro intracalenario. Veremos mas adelante que muchas otras protefnas de la superficie de los linfocitos y de otras celulas, muchas de las cuales acnian como mollkuJas de adhesi6n celulacelula (estudiadas en el Capitulo 19) contienen dominios similares y por tanto son miembros de un amplio nlimero de proteinas de la super/amilia de las inmUlloglobulillas.

Los dominios variables de las moleculas de Ig preseman la caracterfstica propia de tener su conjunto particular de tres regiones hipervariables, que se disponen en (res bl/des IiiperllOriables (vease Figura 23-348). Tal como se habia predicho, los bucles hipervariables de los dominios variables Jigero y pesado eslan agrupados formando un lugar de uni6n al antfgeno. Un principia importante que se deduce de estos esludios es que la regi6n variable de una lllolecula de anticuerpo consta de una estructura rfgida allamente conservada, con unos budes hipervariables unidos entre sf en uno de los exuemos. Por consiguiente, es posible generar una enonne diversidad de lugares de uni6n at antfgeno camLa estructura fina de los antlcuerpos

1305

Figura 23-35 Estructura tridimensional de un complejo antfgeno-antlcuerpo, determlnada por anlillsls de dlfracci6n de rayos X. EI antfgeno proleico, que es la enz.ima lisozima. se mueslra en verde. Ellugar de uni6n al antfgeno del fragmenlo Fab del anticuerpo esla formado por la cadena Iigera (en amarillo) y la cadena pesada (en azul). Unos 20 residuos de aminoacido dellugar de uni6n estan en conlaCIO con un numero similar de residuos de la superficie de la lisozima. En (B) se han separado el antfgeno y el anlicuerpo para mostrar sus superficies de contaeto complementarias. La porci6n de antfgeno protuberante de 13 superficie complementaria (en rajo) es un residuo de glulamina En (0 las mol~ulas separadas han sufrido una rotaci6n de unos 90 grados alrededor del eje venicaJ (AI para mOSlrar las superficies que interacluan; las cadenas laterales de aminoacidos que interactuan se mueslran en roja, con la glulamina protuberante en rosa. En ouas mol~ulasde anlicuerpo que han side esludiadas de esla forma, ellugar de uni6n al anlfgeno (para un delerminanle antigenico pequeno) esla formado por una hendidura mucho mas profunda. (De A. Amit, R. Mariuzza, S. Phillips, y R. Poljak. Science 233:747-753, 1986. Copyright 1986 por MAS.)

biando s610 la longitud y la secuencia de aminoiicidos de los bucles hipervariables, sin alterar la eSlruclura tridimensional global necesaria para la funci6n del anticuerpo. EI amUisis por rayos X de criSlales de fragmentos de anticuerpo unidos a un antfgeno 0 a un detenninanle anligenico ha revelado con exactitud de que forma cooperan, en delerminados casos, los bucles hipervariables de los dominios variables ligero y pesado entre sf fonnando la superficie de uni6n al antfgeno (Figura 23-35). Las dimensiones y la fonna de cada lugar diferenle varian scgUn la conformaci6n de la cadena polipePlfdica de los bucles hipervariables la cuaJ, a su vez, viene detenninada por la secuencia de aminoiicidos de las cadenas la1306

Caprtulo 23: £1 sistema lnmunitario

terales de los bucles. La forma de los lugares de uni6n varfan mucho dependiendo del anticuerpo -desde hendiduras, hasla surcos que se adapmn a las superficies ondulantes, e incluso protuberancias. Los ligandos mAs pequefios tienden a unirse a depresiones poco profundas. mientras que los mas grandes lienden a unirse a superficies mlls accidentadas. Ademas.los lugares de uni6n pueden alterar su forma para que la uni6n con el antfgeno pueda encontrar mejor alligando. Asf pues, en la aClualidad los principios generales de la estructura de los anticuerpos estan claros.

Resumen Cada InmunoglobuUna Ugem y pesada COIl$(Q de una regi6n variable de unos liD ruiduos de am/nodddos en su utnmo amino terminnl y de una rt'gi6n coll$lante. que en la eadenn Ugem es del mLsmo tamano que In regl6n variable y en In eadenn pesnda. es tn!s 0 CUl.IITO r.oecr.J mayor. Cada ctulena. estdfornuula por dominios ITpetitiuos, pkgados de forma similar. una eadena ligem lUmen una regMn variable (VJ y una regi6n constante (CJ. mienmu que las eadenas pesmlas Henen llna regi6n va~ riable rvlfJ y hU 0 cuatro regiones constilntl'S (CIf). La varinci6n de la secuencla de amlnodcldos en las reglones variables de las cadenas ligeras y pesmlas estd rutrlnglda fulUlnmentalmente a varlas pequenas regiones hipervarlnbles; forman bueles que sobresnlen de In superflcle y sejuntan fomumdo ellugar de uni6n al allUgeno.

La generaci6n de la diversidad de los anticuerpos Se eslima que el hombre puede producir por 10 menos lOIS moltkulas de anli-

cuerpo diferenles -su repertorio preinmutlitario de atlticuerpos incluso en ausen~ cia de estimulaci6n por antfgenos. Los lugares de uni6n al antfgeno de muchos anticuerpos pueden presentar reacci6n cruzada con varios delerminantes antig~nicos relacionados entre sf pero diferentes. y por 10 que parece el repertorio preinmunhario es 10 suficientemente amplio como para asegurar que siempre haya un lugar de uni6n a antfgeno que encaje can un determinanle anlig~nico potencial cualquiera, aunque esla uni6n sea de baja afinidad. Los anlicuerpos son protefnas. y las protefnas estlln codificadas por genes. Por consiguiente, la diversidad de los anticuerpos plantea un problema genclico panicular: !c6mo puede un animal producir mas anticuerpos que genes hay en su genoma? (Se cree que el genorna humano, por ejemplo, contiene men os de 1()5 genes.) ESle problema no es tan formidable como podrfa parecer a primera vista. Dcbido a que las regioncs variables de las cadenas ligeras y pesadas contribuyen al lugar de uni6n al antfgeno, un animal con 1000 genes que codifiquen cadenas ligeras y 1000 genes que codifiquen cadenas pesadas poddan combinar sus producloS de 1000 x 1000 maneras diferentes formando l()li lugares de uni6n dislintos (asumicndo que cualquier cadena ligera puede combinarse con cualquier cadena pesada formando un lugar de uni6n al antfgeno). Sin embargo. el sistema inmunilario de los mamfferos ha desarrollado mecanismos genclicos unicos que 10 capacitan para generar un numero casi iJimitado de cadenas Iigeras y de cadenas pesadas diferentes de una forma ahamente econ6mica, fusionando segmentos g~"icos separados anles de que sean transcritos. Las aves y los peces utilizan esualegias muy diferemes para diversificar los anticuerpos. pero centraremos nuestra discusi6n en los mecanismos que milizan los mamfferos.

Durante el desarroUo de las celulas B, los genes de los anticuerpos se ensamblan a partir de segmentos g~nicos aislados20 La primera evidencia directa de que el DNA se reordena durante el desarrollo de las c~lulas B procede de experimemos realizados en 1976. en los cuales se compar6 el DNA de embriones tempranos de rat6n que no producen anlicuerpos. can el DNA de una linea celular de mieloma de rat6n que sf los produce. los experimenLa generacl6n de la dlversldad de los antieuerpos

1307

c61ula de mieloma de rat6n que prodUCll cadenn Iigetas especlficaa

Figura 23-36 Experlmento que demostro dlrec::tamente III reordenllcl6n del DNA durante el dcsarroUo de III cBula B. Las dos sondas radiactivas utilizadas eran especfficas de las secuencias de DNA oodificantes de la regi6n Cy de la regi6n V de la cadena ligera del mieloma.

c61ula de embri6n de rat6n rIO productor. de 19

EXTRACCION DEL DNA Y DIGESTION CON ENZlMAS DE RESTRICCION

J

•

SEPARAClON DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCION DEL DNA MEDIANTE El£CTROFQRESIS SECUENCIAS CODtFICANTES

DE

lAS REGlONES V Y C, V1SUAUZADAS

MEDIANTE HtBRtDACION CON SONDAS DE DNA RAOIACTlVAS

-"

codlf"lClInt.

de I, regi6n C lasleCuencillll codifica,ntea de

Ia. regionet V V C nan.n HoCUlll1Ci, codiflC8nte

IregmentOt: dife"n'"

de Ia regi6n V

IDS mostraron que las secuencias codifieantes esped6cas de la regi6n variable (V) y de la regi6n eonstanle (C) ulilizadas por las eelulas del nueloma estaban presenles en el mismo fragmenlo de restrieci6n de DNA en las eelulas de mieloma pero no en dos fragmemos de reslrieci6n distimos de los embriones, 10 eual dcmostraha que las seeuencias de DNA que eodifiean Wla molecula de anticuerpo se rcardenan en alguna rase de la difcrenciaci6n de las celulas B (Figura 23-36), Actualmenle se sabe que ex.iste un acelVO diferenle de segmentos genlcas para cada uno de los tipos de cadcnas de Ig -eadenas Iigeras K, cadenas ligeras /.. y cadenas pesadas -a partir del eual se sintetiza una unica cadena polipeplfdica, Cada acelVD se haHa en un cromosoma diferente y normal mente cOlllienc un gran numero de segmelllos genicos eodificanles de la regi6n V de una cadena de Ig y un menor numcro de scgmentos genicos codifieantes de la regi6n C. Durante el desarrollo de la eelula B, para eada una de las dos cadcnas de Ig a sintetiur se ensambla una secucncia codificante eompleta par recombinaci6n cspedfica de lugar (se eSlUdia en cl Capflolo 6), juntando la secuencia eodificantc de la regi6n V con la seeuencia codificante de la regi6n C. Adem<1s de reunir los segmentos genicos individuaJes del gen que eodifica un anticuerpo, estas reordenaciones lambien activan la transcripci6n a panir del gen promotor mediante eambios en las posiciones relativas de las seeuencias aetivadoras y silenciadoras que aetuan sabre el promotor. Asr, una cadena eompleta de Ig s610 puede sintetizarse despues de que Itaya oeurrido una reordenaci6n genica. Como veremos, el proeeso de reuni6n de los segmentos genicos contribuye a la diversidad de los lugares de uni6n al antfgeno de varias maneras.

Cada regi6n Vesta codificada por mas de un segmento g~nico21 Cuando se analizaron las secuencias de DNA gen6mico que codifican las regiones Vy C, se encontr6 que la regi6n C cst:i codificada por un solo segmento g~1308

Capitulo 23: £1 sistema Inmunitario

•

I

regiones del DNA que se ven

&

unt,

I

5'. DNA de la linea germinal

v,

v,

3

c

v"

V3

Jl J2 J3 J4 REOADENACIQN DEL DNA DURANTE LA

DIFERENCIACIQN DE LA C~LULA B

S'

3'

DNA de Ie clilulo B :''"'''''

''' VI

V2

''''

0

..:

l TAANSCRIP~'ON C

V3

J3 J4

5' transcrito de RNA

3'

'!!!'l''''"''''!!' V3 c

-1

J3 J4 MADURAC'ON DEL RNA

5' J' mRNA_ V3 J3 C

TRADUCCION

NH2 eaOH cadena ligore V3 J3 C

nleo Cdc una cadena Ig, mienlras que cada una de las regiones Vestan codifica· das por uno 0 dos segmentos genicos. Cada una de las regiones V de una cadena Iigera esta codificada por una secuencia de DNA ensamblada a partir de dos fragmentos genicos -un segmenlO gcnico V largo y un scgmento de uni6n corto, o segmento genical (no confundir con 1a protefna cadenai. vease Figura 23-19), codificado en otro lugar del genoma. La Figura 23-37 i1ustra los mecanismos geneticos que participan en la producci6n de un polipeptido de una cadena ligera intacta a partir de segmentos genicos V, J y C separados. Cada regi6n V de una cadena pesada esta codificada par una secuencia de DNA ensamblada a partir de tres segmentos genicos -un segmento V, un segmenlO J y un segmenlo de diversidad 0 segmento genico D. La Figura 23-38 muestra la organizaci6n de los segmentos genicos implicados en la producci6n de cadenas pesadas. EI elevado nlImero de segmentos genicos V, J y D heredados que son disponibles para la codificaci6n de las cadenas de Ig contribuye substancialmente par sf mismo a la diversidad de los anticuerpos, pero la uni6n combinatoria de estos segmentos (denominada diversificacl6n combinatorla) aumenta ampliamente eSla contribuci6n. Por ejemplo, cuaiquiera de los aproximadamente 300 segmentos V del acervo de segmemos genicos de la cadena ligera IC que exiscen en el rat6n, puede unirse a cualquiera de los 4 segmentos J (vease Figura 23-37), de forma que a partir de este acervo se pueden formar aJ menos 1200 (300 x 4) regiones V diferentes de cadena IC. De forma similar, cuaiquiera de los aproxirnadamente

VI

5'

V2

/lJVII"C:=::::~ ~ ~ ~JII'DJI'l::Ii""ic:i"'.l::lIlC,.iilc..iiJIlCuii::1iI

La generacl6n de la diversldad de los anticuerpos

3'

Figura 23·37 Proceso de unl6n V-I que partldpaen la producd6n de una eadeM Ugera K en el ral6n. En el DNA dela "lfnea germinal" (en la que los genes de las inmunoglobulinas no se expresan y por consiguiente no se reordenan), el grupa de los cuatro segmentos genlcosJ eSIi1 separado del segmento genico C par un cono intr6n, y separado de los aproximadamente 300 segmentos genicos V, porvarios pares de nucle6tidos. Durante el desarrollo de la ceJula B, el segmento genico Velegido (\13 en este caso) se desplaza quedando exactamente junto a uno de los segmemos genlcosl U3 en este caso). EI gen I "extra" Ui{) y la secuencia intr6nica se transcriben Gunto con los segmentos gcnicos unidos \13, J3 y q y luego son eliminados durante la maduraci6n del RNA, generando moleculas de mRNA en las cuales las secuencias \I3,J3 y Cson contiguas. Luego, estos rnRNA se traducen a cadenas Iigeras 1(. Un segmenlo genkoJ codifiea unos 15 aminolicidos del extremo carboxilo tenninal de la regi6n V, y la wli6n de los segmentos V-J coincide con la lereera regi6n hipervariable de la cadena ligera. Figura 23·38 El conjunlo desegmenlos genlcos de la cadena pesada en el rat6n. secree queel rat6n contiene entre lOOy 1000 segmenlos V, al menos 12 segmentos D, 4 segmentosJyun grupo ordenado de segmenlos C, cada uno de de los cuales codifica una c1ase diferente de cadenas pesadas. El segmento D codifica los aminolicidos de la lercera regi6n hipervariable de la regi6n V, que fonna pane del segmento /. La figura no ha sido dibujada a escala. Por ejemplo, los segmentos genicos Jl y Cg se hallan separados por unos 200 000 pares de nucle6tidos. Ademlis se han omitido muchos detalles: por ejemplo, existen cuatra segmentos genicos Cy (C 1 ~, ~ y~; cada segmento gllnico "Cestli compueslo por mUltiples exones (vease Figura 23-33); y los segmentos gcnicos v,/estan agrupados en el cromosoma en conjuntos de familias h0111610gas. Los mecanismos geneticos implicados en la producci6n de una cadena pesada son los mismos que los que se muestran en la Figura 23-37 para las cadenas ligeras, con la excepci6n de que en este caso se necesitan dos erapas en la reordenaci6n del DNA en lugar de una: primero, un segmento D se une a un segtnenlO J, y luego un segmento Vse Wle a los segmentos DJ reordenados.

1309

500 segmenlOS V del acervo de la cadena pesada que exislen en el rat6n puede unirse a cualquiera de los 4 segmentos J y a cualquiera de los, al menos, 12 segmentos D, para codificar como mfnimo 24 000 (500 x 4 x 12) regiones Vdiferenles de cadena pesada. llstas son s610 estimaciones aproximadas ya que no se conoce el mlmero exaCIO de segmentos g~nicos V que existen en estos acervos. La diversificaci6n combinaloria resuJlante del ensamblaje, en diferenles combinaciones, de los segmentos g~nicos v, J y D heredados, que acabamos de ver, conslituye un imp0rlanle mecanismo de diversificaci6n de los lugares de uni6n al antigeno de los anticuerpos. Se estima que unicamente mediante este mecanismo. un ral6n podrfa producir aI menos 1000 regiones V L diferentes y del orden de 25 000 regiones V H diferentes. Estas regiones podr{an luego combinarse entre sf pro
La uni6n imprecisa de los segmentos genicos aumenta la diversidad de las regiones VZI,ZZ Todavfa no se conace con detalle el mecanismo por el cual segmemos g~nicos que pueden estar a1ejados entre sf cientos de miles de bases de nucledtidos, se unen formando una secuencia codificante funcional de la regi6n VL 0 VH • Cada segmento g~nico eSI.1 nanqueado por secuencias de DNA conservadas, que supuestamente actuan como centros de reconocimiento para un sistema de recombinaci6n especffica de lugar, de forma que se asegura que 5610 se recombinen los segmentos g~nicos adecuados. Asf, por ejemplo, un segmenlo Vsiempre se unira a un segmento I 0 D Yno a otro segrnento V. Parece que dos genes estrechamenle Iigados, denominados rag-l y rag-2 (de Recombination Activating Genes, genes aClivadores de recombinaci6n) codifican las proteinas especfficas de los Iinfocitos del sistema de recombillaci6n V(DJ}. Asf, si se transfecta un £ibroblasto con ambos lipos de genes, se puede conseguir experimentalmente una reordenaci6n de segmentos genicos Ig introducidos, 10 suficiente para que la c~­ lula B se desarrolle normahnente. Ademas, los ratones transg~nicos que son deficientes en ambos genes son incapaces de iniciar reordenaciones V(D)J y en consecllcncia no poseen ni c~lulas B ni celulas T funcionales. (las c~lulas T utilizan una reordenaci6n similar para ensamblar los genes que codifican sus receplores espccfficos de antfgenos.l En In mayorfa de los casos de recombinaci6n especffica de lugar, la uni6n del DNA es prccisa, pero durante la uni6n dc los segmentos g~nicos dcl amicuerpo (y del receplor de la celula n, a menudo se pierde lin mlmero variable de nucle6tidos de los extremos de los segmentos de recombinaci6n y. en el caso de la cadena pesada, se puedcn insertar uno 0 mas nucle6tidos, clegidos de forma alealoria. Esla p~rdida y ganancia de nucle6tidos en los sitios dc uni6n Idenominada diversIOcacl6n de empaJme (junctional diversification)l aumenta enormemente la diversidad de las secuencias codificantes de la regi6n Vcreadas por recombinaci6n. especfficamente en la tercera regi6n hipervariable. En este caso. el incremento de la diversificaci6n cuesra un precio ya que, en muchas acasiones, producira un corrimiento de la pauta de lectura de forma que se producira un gen no funcional; habitualmente, en el desarrollo de las c~lulas B se producen uniones "improductivas" de eSle tipo.

La hipermutaci6n somoitica dirigida por el antfgeno acaba de afinar las respuestas de anticuerpos23 Tal como vimos anteriormente, a medida que va transcurriendo el tiempo tras la inmunizaci6n se produce un aumento progresivo de la afinidad de los anlicuerpos producidos contra el antfgeno inmunizante. ESle fen6meno. que se conace 1310

Capftulo 23 : EI sistema inmunltarlo

•

,

i

como maduracl6n de la aflnldad, es unico para los anticuerpos (no ocurre en los receptores de las ct'!lulas n y se debe a la acumulaci6n de mutaciones puntuaJes especfficas en las secuencias codificantes de la region V, tanto de las cadenas pe. sadas como de las Ijgeras. Dichas mUlaeiones tienen lugar despues de ensamblarse las regiones codjficantcs, una vez que las celulas 8 han side estimuJadas por el andgeno y pOT las celulas T coJaboradoras para generar oHuJas con memoria en el centro activado (Iambicn denominado centro germinalJ de un foUeu10 linfoide. en un 6rgana Hnfoide secundario (vease Figura 23-8). Las mutaciones puntuales tienen lugar a una velocidad de alrededor de una mutaci6n por se· cuencia de regi6n V codificante en cada generacion celular, que es aproximada-

mente un mli6n de veces mayor Que la velocidad de mutaci6n esponlttnea en otros genes; por eso, el proceso se denomina hJpennutacl6n som'tlca. No se conoce el mecanismo Que posibiJita Que los cambios de nucle6tidos puedan di· rigirse aI DNA de una parle especificada de forma precisa del genoma. Dnicamente una pequena pane de estas mutaciones pUnluales se reflejarAn en los receptores de antfgeno, los cuales presentarlin un incremento de 1a afinidad para el antfgeno. Sin embargo, el bajo numero de c~lulas B que expresen eslOS receplores de alta afinidad serlin estimuladas preferentemente por el antfgeno para sobrevivir y proliferar, mientras que las restantes c~lulas B sufrirl1n muene celular programada. Asf, como resultado de cidos repelidos de hipennutaci6n soml1tica y selecci6n de antfgenos dirigidos, en el transcurso de una respuesta inmunitaria se producen anticuerpos de elevada y creciente afinidad, 10 cual proporciona una protecci6n progresivamente mejor contra los antigenos agresores.

CELULA PAO-B

:= mlllerne

La uni6n de los segmentos g~nicos de los anticuerpos estc1 J

J

regulada asegurando que las c~lulas B sean monoespecfficas

La generacl6n de

la dlversldad de los anticuerpos

,

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I

cELULA PRE-S

24

Tal como predice la teoria de la selecci6n clonal, las c~lulas B son monoespedji· em. 0 sea, lodos los anticuerpos que produce una c~lula B poseen lugares de uni6n at aOlfgeno iguales. Esto garantiza que los lugares de uni6n al antfgeno de a1gunas mol~cuJas de anticuerpo sean id~nticos y, por taOlo, Que los anti· cuerpos segregados puedan formar grandes redes de antfgenos entrecruzados, que de esle modo provocan la eliminaci6n del aOlfgeno (v~ase Figura 23-15). EsIO tambi~n asegura que una c~lula activada segregue anticuerpos con una especificidad similar a la de los anticuerpos unidos a la membrana de las c~lulas B que se habfan est'imulado inicialmente. La necesidad de monoespecificidad significa que debe existir a1gu.n mecanismo que asegure que, cuando los genes de las Ig se activan dmante el desarrollo de una ctHula B, cada una de dichas celulas B prodllzca lin s610 tipo de regi6n Vt Yun 5610 tipo de regi6n VII" Las celulas B, como otras c~lulas somaticas, son diploides, par 10 que cada celula tiene seis acervos de segmentos genicos coditicantes de anticuerpos: dos acervos de genes de cadena pesada (uno de cada pro· genitor) y cuafrO acervos de cadena Iigera (uno Ie y otro Ade cada progenitor). Si las reordenaciones del DNA ocurren independientemente en cada uno de los acervos de cadena pesada y de cadena tigera; una sola celula podrfa produdr hasta acho anticuerpos difercntes, cada uno de los cuales tendrfa un lugar disdnto de uni6n al antigeno. Sin embargo, cada celula Bs610 utiliza dos de los seis acervos de segmentos genicos: uno de los cuatro acervos de genes de cadena Iigera y uno de los dos acervos de genes de cadena pesada. As!, cada celula B debe escoger, no s610 entre los acervos de cadena Iigera, "y A, sino lambien entre sus acervos materna y palerno de genes de cadena Iigera y de cadena pesada (Figura 23-39). Esle ripo de elecci6n, se denomina exclusl6n atellea y parece que linicamenle ocurre en los genes codificantes de anticuerpos (y los de receptores de relulas n. Para otras protefnas codificadas par genes alllos6micos [excepto para las que son codificadas por genes sujelos a actividad heredable (genomic impriming) estudiados en el Capflulo 9J, parece que tanto los genes maternos como los pat'ernos de una c~lula se expresan casi por igual.

plIIlerne

,

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conjunlo genico

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conjunlo genico

de clldenll pesada de cadena t1gera selecclonado CElULA B seleoclon.do

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Figura 23-39 DesarroUo de una

c;t:lula B. Este esquema muestra las selectiones secuenciales de la activati6n de los genes de Ig que deben realizar las celulas Bpara producir anticuerpos can un solo lipo de lugar de uni6n aI antfgeno. Se cree que la selecci6n entre los conjuntos de segmentos genicos materna y paterno ha de ser aI azar.

1311

Todavia no conocemos el mecanismo de exclusi6n alelica y la elecci6n del lipo de cadena Hgera, K 0 A, que se produce durante el desarroUo de las celula B. Una posibilidad reside en que laS'celulas B son monoespecfficas, slmplemente debido a que la probabilidad de que una serie de reordenaciones se den en mas de un conjunto de genes para cada cadena Ig es muy baja. Sin embargo, este no constituye el unico mecanismo, como resulta evidenle de algunos tipos de regu!acidn por relroalimentacidlJ negativa del sistema de recombinaci6n V(DlJ, por el que una reordenaci6n funcional en un conjunto de segmenlos genicos suprime las reordenaciones en los conjuntos restantes que codifican el mismo tipo de cadena polipeptfdica. Por ejemplo, en los clones de celulas B aislados a partir de ratones transgenicos que expresan una reordenaci6n del gen de la cadena J.I, la reordenaci6n de los genes end6genos de la cadena pesada generalmenle queda suprimida unicamente si la cadena J.I codificada por el transgen se inserta en la membrana plasmatica. Se han obtenido resultados similares a estos para las cadenas ligeras. Par consiguiente parece que para que actue la retroalimentaci6n negativa, el producto de un ensamblaje de genes de cadena pesada 0 ligera debe expresarse en la superficie celular, 10 cuaI indica que en la regulaci6n del proceso participan seiiales extracelulares. El ensamblaje de las secuencias codificames de la regi6n Vde una celula Ben desarrollo tiene lugar en una secuencia ordenada. can un solo segmemo cada vez, generalmente empezando can el acervo de la cadena pesada. En este conjunto, los segmentos D se unen primero a los segmentos /H en ambos cromosomas patemos. Despues se reaLiza la uni6n de VH a D1H en uno de estos cromosomas. Si esta reordenaci6n produce un gen funcional, la producci6n resultante de cadenas Jl completas (que siempre son las primeras cadenas pesadas que se producen) conduce a su expresi6n en la superficie celular asociada a una cadena Ligera substituycnte. Estos receptores de la superficie celular posibilitan que la celula B reciba sciialcs de las celulas cercanas (denominadas cf!lulas del eSlroma) y dichas seiiales suprimen ouas reordenacioncs de los segmentos genicos codificantes de la regi6n VIi' de forma que puede incrementar la velocidad de las reordenaciones de Vt • En ratones, por 10 menos, la reordenaci6n de Vt generalrnente ocurre primero en un acervo de segmentos genicos K, y s610 sl faUa esta reordena· ci6n, se reordena el otro acervo Ie 0 los acervos A. 5i en a1giin momento la uni6n en fase" Vt a 1t conduce a la producci6n de cadenas ligeras, estas se combinan can las cadenas J.I preexistentes formando moleculas de anticuerpo [gM, las cuales se insertan en la membrana plasmatica. Los receptores IgM de la superficie celular pennilen a las celulas B recien farmadas recibir seiiales extracelulares que suprimen posteriores recombinaciones V(DJ/ par inactivaci6n de la expresi6n de los genes rag-J y rag-2. 5i lIna celula B en desarrollo no consigue ensamblar la secuencia codificante funcional, tanlo de la regi6n funcional VII como de la regi6n nmcional VL, es incapaz de produdr moleculas de anticuerpo, y muere. No se han encontrado c1iferencias bial6gicas entre las cadenas Iigeras Ie y A, pero el hecho de tener dos acervos distintos de segmentos genicos codificantes de cadenas ligeras supone una ventaja obvia: aumenta las probabilidades de que una celula pre·B que ha cnsamblado can exito una secuencia codificanle de la regi6n VH continue con exito con el ensamblaje de una secuencia codilicante de la rcgi6n Vl • convirtiendose en una celula B. N

Cuando las cl!luJas B son estimuJadas por un antfgeno, pasan de la producci6n de anticuerpo Hgado a la membrana ala producci6n de la forma segregada del mismo anticuerpo25 De los mecanismos geneticos que determinan el lugar de uni6n aI antfgeno de un alllicuerpo, pasemos ahora a los mecanismos que detemlinan sus propiedades biol6gicas -los responsables de la forma de la regi6n constanle de la cadena pesada que sera sintetizada. La elecci6n de los segmelllos genicos paniculares que codifican ellugar de uni6n aJ antfgeno es irreversible duranle loda la vida de una celula B y de su progenie, pero el tipo de regi6n ~ producida cambia du1312

Capftulo 23: E1 sislema inmunitario

J

rante el desarrollo de una c~lula B. Los cambios son de dos tipos: cambia de una forma Iigada a membrana a una fanna secretada de la misma regi6n Cw Ycarnbios en la clase de regi6n G.t producida. Todas las clases de anticuerpos pueden producirse tanlo en (onna ligada a membrana como en forma soluble y secretada. La forma ligada a membrana ac· Ilia como un receptor para el anlfgeno en la superficie de la c~lula B, mientras que la forma soluble se produce 5610 despues de que la c~lula haya sido estimulada por un antfgeno para convertirse en c~lula secretora de anticuerpos. La unica diferencia entre ambas fonnas reside en el extremo carboxilo terminal de la cadena pesada: las cadenas pesadas de las mol4kulas de anlicuerpo Ig ligadas a membrana, por ejemplo, tienen un extremo carboxilo hidrof6bico que las ancia en la bicapa Iipidica de la membrana plasmalica de la c~lula B mientras que las mol~culas de Ig secretadas tienen un extreme carboxilo hidrofilico que les permile escapar de la c~lula. EI paso al caracter de producci6n de moJeculas de Ig tiene lugar debido a que la activaci6n de las celulas B por el amfgeno (y por las ceJulas T colaboradorasl induce un cambio en la fenna en que se procesan los transcritos de RNA de Ig en el nlieleo (vease Figura 9·78).

Las c~lulas Bpueden cambiar la clase de anticuerpo que producenz6 Durante el desarrollo, muchas de las celulas B pasan de producir una determi· nada c1ase de anticuerpo a producir ona -proceso denominado camblo de clase. Todas las celulas B empiezan su vida de sfmesis de anLicuerpos produciendo moleculas de IgM, que insertan en la membrana plasmatica donde actuaran de receptores para el antfgeno. Antes de interacdonar con el antigeno, muchas c~lulas B cambian y producen moleeulas tanto de IgM como de IgD, las cuales actuaran como receptores de antigeno ligados a membrana. Tras la estimulaci6n por el antigeno, algunas de estas celulas se activan y secretan anticuerpos IgM, que son los dominantes en la respuesta primaria de anLicuerpos. Otras ceJulas estimuJadas por el antfgeno cambian y producen anticuerpos IgG, IgE olgA; las celuJas con memoria expresan una de estas tres c1ases de moleeu· las en su superficie, mientras que las celulas B aetivadas, las segregan. las mole· culas de IgG, IgE e 19A reciben colectivamente eJ nombre de elases secundarias de anticuerpo debido a que se cree que linicamenle se producen despues de la estimulaci6n por el ant(geno y porque domi.nan en las respuestas secundarias de anticucrpos. Como hemos visto, cada una de estas diferentes c1ases de anticuerpes se especializan en el ataquc contra microorganismos mediante diferentes procesos y en lugares dislintos. Ceme la c1ase de un anticuerpe viene determinada por la rcgi6n constante de su cadena pesada, el heche de que las celulas B pllcdan cambiar la clase de anticuerpo que producen sin alterar el lugar de uni6n al antfgeno implica que una misma secuencia codilicante de la regi6n VII (que especifica la zona de la ca· dena pesada que se une al antfgenol puede asociarse secuencialmente con diferentes segmentos genicos Cw Ello supone imponantes implicaciones fundonales. Significa que en un animal un Jugar de uni6n al anlfgeno particular, seleccionado por antfgeflos ambientales. puede dislribuirse entre las diferentes clases dc inmunoglobuJinas, adquiriendo de esta manera las propiedades biol6gieas propias de cada c1ase. EI cambio de c1ase sucede mediante dos mecanismos moleculares diferentes. Parece que cuando las c~lulas Bvfrgenes pasan de producir unicamente IgM Iigada a membrana a producir simult:!.neamenle IgM e IgO Ligadas a membrana, el cambio es debido a un cambio en eJ procesamiento del RNA. las celulas producen grandes transcritos primarios de RNA que contienen la secuencia codificante ensamblada de la regi6n VII junto con las secuencias c,. y C~ entonces se producen moJeculas de IgM e IgO por maduraci6n diferencial de estos transcri· tos de RNA (Figura 23-40). Por el contrario, la maduraci6n final a celula B activada que segrega una de las clases secundarias de anticuerpos est:!. acompanada por un cambia irrevcrsiLa generacl6n de la dlversldad de los antlcuerpos

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005 TIPQS DE MAeURACION DEL RNA

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A

V3 Q; ~mRNA~ D4 J4 D4 J4

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TRADUCCION

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V3 Q;

D4 J4

D4 J4

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IgO

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clIden1l6

Figura 23--40 Sfnlesls sirnuJt'nea de IgM YIgD. las celulas Bque producen simuluineamente moleculas de IgM y de IgO ligadas a la membrana plasmatica.las cuales tienen los mismos lugares de uni6n aI antfgeno, producen lranscritos largos que contienen las dos secuencias y Ct. Estos transcritos maduran de dos maneras diferenles produciendo moleculas de mRNA que tienen la misma secuencia codificante de 13 regi6n VII (V3D414) unida a una secuencia C~ 0 a una secuencia C,.

c..

1313

VDJ enlambl'do

VOJ

5'

"

DNA

DELECION DE DNA POft MADURACl6N

POR COflTE Y EMPALME DEL DNA CERCA DE LAS SECUENCIAS DE

CAMBIO

VDJ

TRANSCRIPCION, PROCESAMIENTO

DEL RNA Y TRAQUCCION

Ca

" DNA

VDJ Ca

"

ble a nivel de DNA -un proceso denominado recombinaci6n del cambio de cI~ (class switch recombination). Ella supone la delecci6n de rodos los segmentos g~­ nicos CH que se hallan en direcci6n 5' (si se considera la direcci6n sobre la hehra codificante) del segmenro genico CH particular que la ceJula estc1 destinada a expresar (Figura 23-41). La evidencia de que esta etapa del cambia de c1ase implica la delecci6n del DNA precede de experimentos realizados en reluJas de mieloma: celulas de mieloma secretoras de IgG carecen del DNA codificante de las regiones <;. y c;. mientras que las que secretan IgA carecen del DNA codificante de todas las demcts dases de regiones C de la cadena pesada.

Resumen Los anricuerpos se prod'lcen a partir de tres aurvos de segmelltos gi,licos d/fere". tes que codlflcan respectlvame"te las cadenas ligeras k, las cadenas IIgerm "Y las cadenas pesatlil3. En cada acervo, los segmentos que cod/flcan 1m dlsllntlU zonas de liI3 regiones variables de las cadenlU ligeras y pesadas se "nen metllmlte reCOntblnaci6n especfJ1ca de '''gar durante la dlferenclaci6n de la celula 8. Los acerllOs de In Cluhma tigera co"tiene" Imo 0 nuts segme"tos ginlcos constantes {C} y gnltJOS de segmelltos variables (V) y de segmentos de mlio" m. El acervo ge,lico de las cadenas pesadas conllene .m grlllo de segme"tos gen/cos C y grupos de segmelltos V, de dl· vers/dad (D) y J. Para produ.clr mla molu"'a de antiCllerpo, ,m segmento gen/co V L se recombl"a co', 1m segmento gen/co JL produclemio Win secltellc/a de DNA codlfl· cante de la regiO" Vde la cadena ligera; lin segmellto gelllco VII se recomblna COli 1111 segmento D y mlo I n prodllc/endo 1111 secuencia de DNA codlflcante de la regi6n V de In cadtma pesada. Cada 11110 de los segmentos gell/cos ensambllllb:1s se cotrallscribe con la secllellcia aprop/tula de la regio" C, dmrdo I"gar a "na lUolecula de mRNA qlle cod/flea la calhmn pali,Jeptltlica campleM. Comb/llamw de dlversas maneras los segmentos gellicos heredados que cod/flean las reglones VL y V,,, los uertebrados puede prodllcir miln de cadenas ligeras d/ferentn y miles de cadelUu pesadas diferentes. Debido a que ellugar de IIni611 al antfgeno seforma donde seJuntan V,y VJI en el ant/cuerpo final, las code,tas ligeras y pesndas pueden asoe/ar$#! fornlnlldo anticuerpos con millolln de '''gares d/ferentes de I",16n al antlge'JO. Esta cifra se tie enonnemenle ineremelltadn por la pirdidn Y In ganancla de nll£lootidos en ellugar de ,,"16n de los segmelltos gen/oos, asl como par liI3 mutacumes som.dtlcas, qlle OCItrrell can una frecueneia muy elevada en el ensamblaje de secmmclas codiflcantes de reglones Vdespuhde la esl/mulacion porel antfgeno. Todas las dlllw 8 producen /niclalmente antkuerpos IgM. Alga nuts tarde pa_ san a producir antk"erpos de arras ewes pero COli el mlsmo lugnr de ,mion al an· tlgeno que tenlall los mltlcllf!:rpoS IgM originales. Este cambio de clase pem.ite q"e los mismos 'ugares de ,,"16n al antlgeno se distribuyan e"tn anticuerpos CO" propledades blol6gicas d/ferenles.. 1314

Cap(lulo 23: EI sislema lnmunltario

e,

_lgM

G

IgA

Flgura23.41 Unejemplodela reordenad6n del DNA que 5ucede en 1a recombinad6n de cambio de clue. Cuando una cc'!lula 8 que produce anticuerpls IgM a partir de una secuencia de DNA ensamblada VOl es eslimulada por el antigeno para madurar a una celula secretora de anticuerpls IgA. suprime el DNA entre la secuencia VOiy el segmemo gc'!nico Co. Las secuencias de DNA especfficas (SOCl4enclas decambio, que en la figura aparecen como esferas negras) se localizan en direcci6n 5' de cada segemento g~nico CH (excepto CJ. se recombinan enU'e sf suprimiendo el DNA intermedio. Se cree que el tipo de recombinaci6n de cambio de c1ase estl1 mediado por una recombinasa de cambia, que se dirige a las secuencias apropiadas de cambio cuando c'!stas se vuelven accesibles bajo la influencia de senales extracelulares (\infoquinas) segregadas por las celulas T colaboradoras, como veremos ml1s adelante.

•

Los receptores de las celulas T y sus subclases

,

Las diversas respuestas de las celuJas T reciben el nombre colectivo de reacciones inmunitarias mediadas por dIu/as. AI igual que las respuestas por amicuer· pos, son altamente especfficas para el antfgeno y son importantes para 1a defensa de los vertebrados comra 1a infecci6n. Sin embargo, las cclulas T se diferencian de las cclulas B en varias aspectos importantes. Primero. actuan unicamente en un radio iimitado, interactuando directamenre con atras celulas del cuerpo, a las que destruyen 0 sefialan de algun modo (nos referiremos a dichas celulas como cefulas diana); las celulas B, par el contrario segregan anticuerpos que pueden actuar a distancia. Segundo, las celulas T se especializan en el reconocimiento de un antigeno extraflo unicamente cuando este se localiza en la superficie de una celula diana. Por este motivo la forma de un antigeno reconocido por las celulas T es distinta del que reconocen las celulas B: mientras que las celulas B reconocen un antfgeno intacto, las celulas T reconocen fragmentos peptfdicos de proteinas antigenicas que han sido parcialmente degradadas en el interior de la celula diana y luego transportadas y expuestas sobre la superficie celular. De este modo las celulas T son capaces de detectar la presencia de microorganismos que proliferan en el interior de las celulas, asf como de detectar antfgenos extracelulares que han sido ingeridos por las celulas. Existen dos c1ases principales de celulas T -celulas T citot6x:icas y celulas T colaboradoras. Las dlulas T citot6xicas destruyen directamente las cclulas que han sido infectadas por un virus 0 algun ono microorganismo intracelular. Las c!flulas T colaboradoras, por el contrario, contribuyen a estimular las respuestas de otras cclulas: par ejemplo, colaboran activando macr6fagos y celulas B.

Los receptores de la c~lula T son heterodimeros similares a los anticuerpos27 Debido a que las respuestas de las cclulas T dependen del contacto directo con un cclula diana, los receptores del antigeno producidos por las cclulas T, a diferencia de los anticuerpos producidos por las cclulas n, existen unicamente en la forma ligada a membrana y no son segregados. Por este motivo, result6 diffdl aislar los receptores de las celulas T, y no fue hasta 1983 que se identificaron bioqufmicamente por primera vez. Tanto en cclulas T colaboradoras como en cclulas T citot6x:icas los receptores est
eade"a 0.

cada",

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Flgura23.42 Un receptor helcrodimero de una relula T. EI receptor esta compuesto por una cadena poLipeptfdica a y una p. Cada cadena tiene aproximadamente 280 residuos de aminoacido de longitud y posce una porci6n extracelular que esta plegada en dos dominios con aspecto de 19 -uno variable (V) yel OleO constante (C). Se cree que el sitio de uni6n aI antfgeno formado por un dominio V" YOleO V~ (sombreados en aZIll) es similar en dimensiones y geometrfa g10bales allugar de uni6n al amfgeno de una mohkula de anticuerpo. Sin embargo, a diferencia de los anticuerpos, que presentan dos lugares de uni6n al antJgeno, los receptores de la celula T presentan uno s610 lugar dc uni6n. EI heterodfmero alp mostrado esta asociado de forma no covalente con un gran conjunto de protefnas invariables (no se muestran) que colaboran con la celula T activada cualldo los receptores de la celula T se unen al antfgeno. Una celula T tfpica tiene alrededor de 20 000 complejos receptores de estc tipo en su superficie.

1315

Dichas ct!ilulas surgen temprano en el desarrollo y se localizan principalmente en 105 epitelios (por ejemplo, en la piel y en el imestino). donde proporcionan una primera linea de defensa comra los microorganismos que intentan penetrar en dichas capas celulares. Como ocurre en el caso de los receplores de antfgeno en las celulas B, los receptores de las celuJas T se halla estrechamente asociados a la membrana plasmatica por un numero invariable de proteinas, que se hallan implicadas en la transmisi6n de la seflal desde un receptor activado por el antfgeno al interior de la celula. Mas tarde estuwaremos con mas detalle estas protefnas.

Las diferentes respuestas de las celuJas T estan mediadas por distintas clases de celuJas TZ8 Las dos c1ases principales de c~lulas T poseen funciones muy diferentes. Las celulas T cltot6x1cas destruyen c~lulas que hospedan microorganismos nocivos, mientras que las c~lulas T colaboradoras contribuyen a aclivar las respuestas de Olros g16bulos blancos, principalmenle por la secreci6n de diversos mediadores locales, denominados en conjunto lin/oquinas, interleuqllinas 0 ciroquinas. Asf las c~llIJas T citot6xicas proporcionan protecci6n contra microorganismos pat6gel1OS, como virus y algunas bacterias intracelulares, que se multiplican en el citoplasma de la celula huesped, donde quedan resguardadas del ataque de los anlicuerpos. La fonna m<1s eficienle de prevenir que lales microorganismos invadan dichas celulas es destruyendo las celulas infectadas antes de que puedan proliferar los microorganismos. Por el comrario, las celulas T colaboradoras son cruciales en la estimulaci6n de respuestas freme a los microorganismos extracelulares y a sus productos t6xicos. Exislen dos tipos de celuJas T colaboradoras: las cefillas Tnl, que activan a los macr6fagos para que deslruyan los microorga· nismos que han ingerido, y las celllias T~. que eslimulan la proliferaci6n y la se· creci6n de anticuerpos de las celulas B. Tanto las celulas T citot6xicas como las celulas T colaboradoras reconocen aI antfgeno en forma de fragmenlos peptfdicos que se generan a partir de la degradaci6n de proteinas antigenicas extranas en el interior de la celula diana, y ambos lipos, por lamo, dependen de la presencia de protefnas especiales de la c~:!Iula diana que se unan a dichos fragmenlos. rranspoOllndolos hasta la superficie celular, donde los presentan a las celulas T. Estas protefnas especiales se denominan moMclllas MHCdebido a que est;1n codificadas por un complejo de genes denominado el complejo principal de llistocompatibilidud (MHC, de Major Histocompatibility Complex). Existen dos clases distintas de moleculas MHC que son estructural y funcionalmente diSlinlas: las moleclllas MHC de clase I, que presentan peptidos extrai'los a las celulas citot6xicas y las molkllias MHC de clase II que presentan peptidos extrai\os a las celulas colaboradoras. Antes de examinar los diferentes mecanismos con que se procesan las protefnas anligenicas para exhibirlas a los dos tipos de celulas T. debemos eslUdiar de forma mas precisa las propias moleculas MHC, que juegan un papel muy importame en la inmunidad par ct!ilulas T.

Resumen Existen por 10 menos dos subclases fi"u:ionalnumle distinlas de cilillas T: cilulas T clIOt6xicas, que destruyen cilulas infectadLu, especialmenle las que son lnfeeuulas por lUI vIrus, y cilulas T colilboradoras, que contrlbuyen a aetiIHJr tanto a las ellulas B productoras de antlcuerpo$ como a los nuu:r6fagos que Ingleren y destruyen los mlcroorgallismos ;nvasores. Ambos tipos de celulas T expresan receptores similares a los mltlcuerpos ell Sll superftcle cellllilr, que estan rodiftaulos por genes en,snmblados a partir de segme"tos I¢IIIcos ""ilt;ples durallte el desnrrolw de fa dIllla Tell el timo. Estos rec:eptores rec:cmocen frngmentos de prote(lIIU extraitas qlle se ex/llbell en la superflcie de las celllias 'III/sped asocIadas COli las molklllas MHC.

1316

Caprtulo 23: EI sistema Inmunltarlo

Las moleculas MHC y la presentaci6n del antigeno a las celulas T29 Las moleculas MHC se reconocieron mucha antes de que se entendiese cual era su funci6n normal. Inicialmente se crey6 que eran los antfgenos diana principales en las reacciones de trasplante. Generalmente cuando se intercambian injenos de 6rganos entre individuos aduhos de la misma especie (alo;lljerros) 0 de

especies diferentes (xenoinjerros), estes injertos son rechazados. En los arms 1950, experimenros realizados con injertos de piel entre diferentes cepas de ral6n demostraron que el recllQZO del ;lIjerto es una respuesta inmunitaria frente a andgenos extraiios de la superficie de las celulas injenadas. M<1s tarde se demostr6 que estas reacciones est<1n mediadas principalmente por celulas T y que estan dirigidas contra versiones geneLicamente "extranas" de las g1ucoprOleinas de la superficie celular denominadas moteculas de Itistocompatibilidad ("histo" significa tejido). Con diferencia, las mas imponantes de eslas melecuJas son las de la familia de protefnas codificadas por el grupo de genes del complejo principal de hlstocompatlblUdad (MHC). Las moleculas MHC se expresan en todas las celulas de los vertebrados supcriores. Su existencia sc demostr6 por primera vez en ratones, recibiendo el nombre de am(genos H-2 (ant(genos de histocompatibilidad-2). En humanos, estas moleculas se denominan ant/genos HLA (de Human-Leucocyre-Associated antigens) debido a que se describieron por primera vez en leucocitos. Tres propiedades nOlables de las moleculas MHC confundieron a los inmun610gos durante mucho tiempo. En primer lugar, las mollkuJas MHC son, con mucha diferencia, los antfgenos diana preferidos de las reacciones de transplante mediadas por celulas T. En segundo lugar, una Cracci6n extraordinariamenle grande de celulas T son capaces de reconocer las moleculas MHC extraflas: mientras que, por ejemplo, menos de un 0,001 % de las celulas T de un individuo responden frente a un antfgeno virico tfpico, mas del 0,1% de elias responden hellle a un antfgeno MHC extrano. En lercer lugar. muchos de los loci que codifican las moleculas MHC son los mas polim(jrficos que se conocen en venebrados superieres; es decir, en una especie existe un numero extraordinariamenle grande de alelos (fonnas allemativas de un mismo gen) en cada locus (a menudo mas de 100), cada uno de los cuales se presenta en una frecuencia relativamente alta en la poblaci6n. Por esla raron, y debido a que cada individuo tiene cinco 0 mas loci codificadores de moleeulas MHC (vease mas adelante), es raro que dos individuos posean conjumos identicos de prOlefnas MHC, 10 cual hace muy diffci! el emparejamiento de un donante y un receptor para el trasplante de 6rganos en humanos (exceplo en el caso de gemelos geneticameme identicos). Un vertebrado no necesita protegerse de la invasi6n de celulas extrafias de vertebrados; por 10 tanio, eSla aparente obsesi6n de sus celulas T par las moleeulas MHC extranas y el acusado polimorfismo de eslas moleculas constitula un gran rompecabezas para los inmun610gos. Este rompecabezas s610 se resolvi6 tras el descubrimiento de que las mollkulas MHC acttian concentrando las celulas T sobre las celulas del huesped que presentan antfgenos extralios en su superficie y que las celulas T responden a las moleculas MHC extrai'las de la misma forma que a las moleculas MHC propias que poseen antfgenos extraf'tos unidos a elias.

Existen dos clases principales de moleculas MHC 29 Las pretefnas MHC de c1ase I y de c1ase II presentan estructuras muy simiJares. Ambas son heterodimeros transmembrana cuyos dominies extracelulares amino terminales se unen a1 antigeno para la presentaci6n a las ct!lulas T. Cada gen MHC de c1ase I codifica una cadena polipeptfdica Iransmembrana (denominada a), la mayor parte de la cual se pliega en lTes dominios extracelulares globulares (al' ~ y <X:J). Todas las cadenas a esntn asociadas de forma no covalente a una pequeii.a protefna extracelular no glucosilada d,enominada ~2-mi-

Las mol~culas MHC y la presenlacl6n del antfgeno a las celulas T

1317

cadena

cadene

Ct

~

II

NH,

, - ::las

microglobullna

.

1

"

ESPACIO EXTAACELULAR

HOOC

-+..-.---

ClTOSOL

(AI PROTEINA MHC DE CLASE I

(8) PAOTEfNA MHC DE CLASE II

croglobuUna, que no atraviesa la membrana y esta codificada por un gen que no pertenece al grupo de genes MHC (Figura 23-43A). La ~2-microglobulina y el do-

minio (X3' que son los mas pr6ximos a la membrana, son hom610gos a un domi+ nio de inmunoglobulina Ig. Los dos dominios amino terminates de la cadena a, que son los mas alejados de la membrana, se unen al antfgeno y contienen los aminoacidos polim6rficos (variables) que son reconocidos par las celuJas T en las reacciones de trasplante. Al igual que las moleculas MHC de c1ase 1, las moleculas MHC de c1ase II son heterodfmeros con dos dominios conservados, similares a Ig, que se hallan pr6ximos a la membrana. Sin embargo, en estas moleculas ambas cadenas (o: y ~) estan codificadas por MHC, y ambas atraviesan la membrana (Figura 23-438). La presencia de dominios parecidos a las Ig en las proteinas de clase I y de clase II sugiere que las moleculas MHC y los anticuerpos poseen una historia evolutiva comun. En la Figura 23+44 se muestran las localizaciones de los genes que codifican las protefnas MHC de clase I y de clase II en ratones y en el hombre.

Figura 23-43 Protefnas MHC de c1ase I y de c1ase II. (A) La cadena a de la molecula de c1ase I presenta [res dominios extmcelulares {II' a. Ya l , codificados por exones diferentes. Eslli asociada de forma no covalente con una cadena polipepddica menor. 1l2-microglobulina, que no estll codificada por el MHC. EI dominio ~ y la Il,-microglobulina son similares a los de una inmunoglobulina. Mientras que la 1l2-microglobulina es invariable, la cadena (X es eXlremadamente polim6rfica, principalmente en sus dominios a l Y a•. (B) En las moJeculas MHC de c1ase II, ambas cadcnas son polim6rficas (la ~ mlls que la a), principlameme en los dominios a l Y Ill: los dominios ex. y 112 son similares a los de una inmwlOglobulina. Asf, existen notables similitudes entre las protefnas MHC de c1ase I Y las de c1ase II. En ambas, los dos dominios mlls externos (sombreados en azul) interaccionan entre sf formando un surco que une eI antfgeno extrafio Y 10 presenta a las celulas T. Todas las cadenas estan glucosiladas con cxcepci6n de la ~.-microglobulina (no se muestra en el esquema).

Figura 23-44 Los complejos g~nJcos H-2 y Hl.A. Este dibujo esquematico complejo H-2 cromosome 17 de rat6n

H 2K

=== ill

P !

H-2A

H-2E

H·2D H·2L

C~l!~!~;!~';dim1f::'==:::i.P:.~~.[].~,=====5J""l::]II!Ii:===

/

'

"'

a

centr6mero

=== II

\

HLA· DP

HLA· DO

HLAOR

HLA-8 HLA-C

cromosoma 6 humane

complejo HLA

1318

HLA-A

C~I==riiU'"1!~'~!~.',Il.!ati'~,!~'TIilrj1=!!~,~n~'TI"=' ]lI!Ii11!!11:':"TI'I"~'JlJIIii=

Capitulo 23: EI sistema inmunitarlo

mueslra la localizaci6n de los loci que codifican las subunidades transmembrana de las protefnas MHC de clase I (ell verde claro) y de c1ase II (en verde oscuro). Existen tres tipos de protefnas de c1ase [ (H-2K, H-2D Y H-2Len el rat6n y HIA-A, HIA-B Y HIA-C en humanos). En el ral6n existen dos tipos de loci MHC de c1ase II (H-2A Y H·2l:.) Ymlls de Ires lipos en humanos de los que s610 se muestran Ires (HLA-DP, HI.A-DQy fiLA-DR). Cada locus de c1ase II codifica al menos una cadena a y al menos una cadena I}. pero algunos codifican mlls de una cadena ex 0 I} (no se mueSlra en la figural.

I

j

~ptido.n.1

sUleo de union

1

lllenilgeno

«,

«,

punta de rotur. par. I, plpernll ~.microglobulin8

eaOH

ESPACIO

IBJ VISTA SUPERIOR

EXTRACELULAR

memb<1lrl8 plasmitica

Figura 23·45 (A) EslruClun de una prolema MHC de dase I humana delenninada por anlOlsl.'l de dlfraccl6n de rayos Xde enstales de la parte extrltcelular de la molOCu.la. La pane exlracelular de la protelna se escindi6 del segmemo transmembrana con la enzima pmleolftica papalna anles de la cristalizaci6n. Los dos dominios mAs proximos a la membrana plasmAtica (Os Y ~2·microglobulina) son similares a un dominio de inmunoglobulina dpico (vl!ase Figura 23-348), mientras que los dos dominios mas a1ejados de la membrana (a l Y0.:) son moy similares entre sf, y junlOs fonnan un surco de uni6n al ~plido en la pane superior de la mol~cula.

CITOSOL

se cree que las moloculas MHC de clase II lienen una

estructura nmy similar. (B) Visto desde arriba, el surco de uni6n al anlfgeno contiene los pequenos ¢plidos que copurilicaban can la protefna MHC. &ta es la parte de ta motecula MHC que interacciona can cl receptor de la ctHula T. (De I'.J. Bjorkman, M.A. Saper. B. Samraoui. W.S. Bennett. J.L Stromingery D.C. \Viley. Na/llre329:506(A~

VISTA DE PERFIL

512.1987.)

Estudios poc difracci6n de cayos X revelan ellugar de uni6n aI ant(geno de las prote(nas MHC as( como el p~ptido de uni6n 30 Cualquier individuo posee unicamente un reducido numero de lipos de moltkulas MHC, que han de ser capaces conjuntamente de presentar a las celulas T fragmemos de peptidos de praclicamente cualquier prOlefna eruana. Asf cada molecula MHC tiene la capacidad de unirse a un gran numero de peptidos diferentes. La base esttuetural de dicha versatilidad surge de los anaIisis por cristalograna de rayos X de moleculas MHC. Como se mueslIa en la Figura 23·45A. una proterna MHC de c1ase I presenta un unico lugar de uni6n al peptido. locaJizado en un extremo de la molecula. Este lugar eonsiste en un profundo sureo eOlre dos largas helices a derivadas de los dominios (Xl Y lXz' casi identieos entre sf; la base del sureo esta formada por ocho hebras p derivadas de los mismos dominios. EI sureo es suficientemente grande como para alojar un peptido de unos 10 residuos de aminoacidos. En reaIidad, cuando se analiz6 una protefna MHC de c1ase I mediante cristalograffa por rayos X. se encontr6 que este sureo eontenfa una zona de baja densidad. que Las moleculas MHC y la presentacl6n del anugeno a las cclulas T

1319

Figura 23-46 I1ustracl6n muy esquematka de un peptIdo en el surcode unl6n de una molkula MHC de c1ase I. Desde esta perspectiva el esqueleto peptrdico se muestra como una serle de bolas rojas, cada una de las cuales representa uno de los nueve residuos de arnlno<'icido. Los esqueletos de los Mresiduos de anclaje" en los exlremos del peplido se unen a los pliegues conservados de los bordes del SUTCO.

I ,

posiblemente correspondfa aI peptido de uni6n que habfa cocristalizado con la protefna MHC (Figura 23-458). Este descubrimiento implieaba que este surco era el lugar de uni6n al amfgeno y sugeria que una vez que el peptido se une a este lugar, se disocia muy lentameme. Esta conclusi6n se apoya en la observaci6n de que celulas expuest'as durame un corto perfodo de tiempo a fragmentos de una protc(na vfrica puedcn conservar durante algunos dfas su propiedad de ser dianas para las celulas T citot6xicas especfficas. Sin embargo, en soluciones acidificadas, los peptidos de uni6n puedcn ser eluidos a partir de moleculas MHC de c1ase I aisladas, y efectivamente se ha encontrado que poseen una longitud de 8 a 10 residuos de aminoacidos. Casi todos los aminoacidos polim6rfieos de la protefna MHC (los que varian entre fonnas a1elicas de este tipo de molecula) se localizan en el int'erior del surco, donde se supone que unen el antigeno, 0 en los hordes del surco, donde serian accesibles para el reconocimiento por el receptor de la eelula T. Se han encontrado distintos peptidos que se unen al surco de una protefna MHC de clase I mediante una combinaci6n de contactos variables e invariables. En cada caso se cOllsidera el peptido como una cadena extendida de 8 a 10 aminoacidos, con el eje peptfdico invariable de aminoacidos terminales en cada extremo del sureo (Figura 23-46). Otras regiones del peptido se unen a ~bolsas especificas" formadas por porciones polim6rficas de la protefna MHC, mientras que las eadenas laterales de algunos residuos se dirigen al exterior, en una posici6n que sea reconocida por los receptores de las celulas T citot6xicas. Debido a que las holsas eonservadas en los extremos del surco de uni6n reconocen caracteristicas del esqueleto peptidico que son comunes a muchos peptidos pero no a las cadenas laterales de los aminoacidos, que varian, una unica prote(na MHC de c1ase [ puede unirse a una amplia variedad de peptidos de secuencias diferentes. A su vez la distinta especificidad de las bolsas a 10 largo del surco asegura que cada forma alelica de molecula MHC se una y presente SU propio y caracteristico con junto de peptidos. Asf, los numerosos tipos de moleculas MHC de c1ase 1 de un individuo pueden presentar un am plio rango de protefnas extrai'ias a las celulas T citOl6xicas, pero en cada individuo 10 hacen de maneras muy parecidas. Las moleculas MHC de c1ase II poseen una estructura tridimensional rouy parecida a la de las moleculas de dase I, pero su surco de uni6n aJ antigeno a10ja peptidos mucho mas largos y heterogeneos, alcanzando un tamano de 15 a 24 residuos de aminoacidos. Asf, aunque un individuo produce probablementc me1320

Caprtulo 23: EI sistema inmunJlario

CELULA T CITaTQXICA

cELULA T COLABORADORA

Figura 23·47 Las ct'!lulas T cltot6xJcas y colaboradoras re<:onocen dlstlntas moleculas MHC. Las celulas T

recaptor de la celula T flllgmenio de 'a protaina

protelna MHC da _ _....:

el..a'

..,.:..w:.::...

~...~. .

protelna MHCda -_-C ela.. "

fragmento da la plotelna elCtl.fla

nos de 20 tipos de molkulas de c1ase II, cada una de las cuales presenta un unico lugar de uni6n al antfgena, parece que en conjunta estas moleculas consiguen unir y presentar una variedad aparentemente ilimitada de peptidos extra· nas a las celulas T colaboradaras, que juegan un papel crucial en casi tadas las respuestas inmunitarias.

Las mol~culas MHC de clase I y de clase II tienen funciones distintas 29

cilot6xicas reconocen los amfgenos videos extrai'los en asociaci6n con las prolefnas MHC de dase I en la superficie de cualquier celula del huesped. mientras que las c~lulas T colaboradoras reconocen a los antfgenos eXlrai'los en asociaci6n eon las prolefnas de dase II en la superficie de una c~lula presentadora de antfgeno, como un macr6fago 0 una celula 8. EJ antfgeno extraJio unido a una molecula MHC de dase I se sinletiza en la celula diana, mienuas que el antfgeno extrai'lo unido a una mol&:ula MHC de dase II se ha caplado por endocilOsis y se ha procesado anles de ser presenlado en la superficie celular (no se muestra en la figural. En las reacciones de lrasplante, las c~lulas colaboradoras lambien reaccionan contra las g1ucoprolernas de dase II eXlranas, y las celulas citol6x:icas reaccionan contra las g1ueoprolefnas de dase I extra"as.

las maleculas MHC de c1ase I se expresan pnicticamente en lodas las celuJas nucleadas, posiblcmente debida a que las ceJulas T citol6xicas deben ser capa· ces de concentrarse en cualquier celula del cuerpo que haya sido infectada por un microorganismo intracelular, como un virus. Por el contraria, las 11101&:ulas MHC de c1ase If se hallan normalmente reslringidas a celuJas especializadas, como las celulas B, macr6fagos y otras celulas presentadoras de antfgcnos. que extraen los andgel10s dellfquido extracelular e interactuan con las celulas Teo· laboradoras (Figura 23-47). En la Tabla 23-2 se resumen las caractedsticas principales de las dos clases de protefnas MHC.

TabJa23·2 Propledades de las moleculas MHC de cJase I y II Clasel Loci genetlcos

Clase II

H·2K, H·2D, H-2L en el rat6n; agrupaciones H-2A YH-2Een el HLA-A, HLA-B, HLA·C rat6n; DP, DQ, DR Yalgunas

en el hombre Estructura de la cadena D1strlbucl6n celular

Inlemenen en la presenlacl6n del antfgena a Origen de los fragmentos peptldlcos Domlnlos pollmdrOcos

olras en el hombre cadena a + p~-microglobulina cadena a + cadena P la mayorfa de celulas nucleadas

celulas T cit0l6xicas

celulas presentadoras de andgeno (incluyendo celulas BJ, celulas epileliales del limo y algunas otras celulas T colaboradoras

prolefnas praducidas en el citosol

prolei'nas extracelulares y de membrana plasmlilica, endociladas

a+a,

oJ + ~l

Las moleculas MHC y la presentaci6n del antfgeno a las celulas T

1321

Un aspecto importante es que las celulas T cilOt6xicas concentran su a1aque en las celulas que proollcen antlgenos exrraflos, mientras que las celulas T colaboradoras concentran su colaboraci6n en celulas que extraen los anHgenos extranos del Hquido extracelular. £1 primer tipo de celula diana cOllstituye una amenaza, perc el segundo tipo es esencial para la defensa inmunitaria del organismo. £1 sistema inmunitario debe ser capaz de deshacerse de los ant{genos extranos extracelulares, de numerosas baclerias que se multiplican fuera de las celulas, y de a1gllnas toxinas prcleicas segregadas, como la toxina lel~nica y la loxina botlllfnica. que pueden ser letales. Las celulas T colaboradoras contribuyen a eliminar estos pat6genos ya sea colaborando con las celulas T para la producci6n de ant.icuerpos contra los microorganismos 0 bien contra sus toxinas, activando a los macr6fagos para que destruyan los microorganismos ingeridos. Para garantizar la direcci6n correcta de las funciones citotoxica y colaboradora, cada uno de los dos tipos principales de celuJas T, adem~s del receptor del antfgeno que reconoce un complejo peptfdico-MHC, lambicn expresa un COrTereptor que reconoce una parte no polimorfica de la c1ase apropiada de molccula MHC, tal como veremos a continuaci6n.

[

r

las prote{nas C04 y COB acttian como correceplores de uni6n a MHC en las c~lulas T colaboradoras y cilo16xicas, respectivarnente3 1 Generalmente la afinidad de los receptores de la celula T para los complejos peptidicos MHC de la celuJa diana es demasiado baja para inducir una interacci6n funcional entre las dos celulas. Son necesa.rios los receplores acresorios para contribuir a estabilizar dkha interaccion aumentando la fuerza tOlal de la adhesion intercelular; cuando estos receptores lambien ejercen un papel direclo en la activacion de la cclula T gcnerando sus propias senales intracelulares, se denominan COrTeceptores. A diferencia de los receplOres de la ccluJa T 0 de las moIccuJas MHC, los receptores accesorios no se unen al antfgeno y son invariables y no polim6rficos. Los mj,s import'antes y mejor conocidos de los correceptores de las cclulas T son las prolefnas CD4 y CD8, que son protefnas transmembrana de paso (mico con dominios elCtracelulares similares a las Ig. AI igual que los receptores de la celula T, reconocen a las protefnas MHC, pero, a diferencia de los receptores de cclulas T, se unen a las zonas no variables de la protefna, lejos del surco de union al peptido. CD4 sc expresa en las celulas T colaboradoras y se une a las moleculas MHC de clase II, micntras que COB se expresa en las celulas T citot6xicas y sc line a las moleculas MHC de dase I (Figura 23-48). Asf CD4 YCD8 contribuyen al reconocimiento de la c~lula T. contribuyendo a que la celula se concentre en un tipo concreto de moleculas MHC, y en un tipo concreto de celulas diana. La cola citoplasmlitica de est'as prote[nas transmembrana se haHa asociada con lin miembro de la familia de protelnas quinasa Src espedficas de tirosina, denominada protefna Uk, la cual fosforila varias protefnas celulares en los residuos de tirosina y de est'e modo participa en la aClivaci6n de la celula T. Las protefnas CD4 y COB no solo se requieren para aumenlar la fuerza de adhesion intercelular y para conuibuir a activar la celula T, sino que tambicn son necesarias para el desarrollo de la celula T: si se inaclivan los genes que codifican CD4 0 COB en raton mediante recombinacion genetica vectorial. no se desarroLian ni las celulas T colaboradoras ni las celulas T citot6xicas. Ironicamenle, CD4 tambien funciona como receptor para el virus del SIDA (HIV), permitiendo que el virus infecte a las celulas T colaboradoras.

Resumen Las molkuUu Mile de dase I y de clase /I son las prote(nas mb poUm6rjicas qll-e se

conoan -a decir, nllresfran IIna gran variabilidad ge"iticn th: lin llllliuiduo a otTo- y juegan ,m papel cn,clal en fa presentaci6n de proteln/U m,tigitlicas extrana.s a las ciluUu T dtotd.ricas y a las cilulas T cofaboradoras, respecriuamente.

1322

Capftulo 23: EI slSlema Inmunitario

ploteln. MHC de clne I

receptor de celule T

protelna CD4

c6lula prnentadora de anllgeno

proteina MHC de cla$ll II

Figura 23-48 Los corre<:eplores CD4 y COO de la superflde de las c~luJa5 T.

Observese que estas proteinas se unen ala regi6n invariable de la mol~ula MHC que ha unido lacelula T receptora. de forma que se manlienen adosados a los receptores de la celula T durante el proceso de aetivaci6n celular. Los anlicuerpos contra CD4 y CDS son ampliamenle Ulilizados para distinguir entre celulas T colaboradoras y celulas T citot6Jticas.

r

Mlentras que las lJIolkll.las de la clase I se expresall ell casi totlas las dlulas tie los vertebmdos, las l1Iolkulas tIe In clase II ql'eOOll restrillgidas a .wos euantos tipos eelldares qlU! interactlum COil las cillllas T oolaboradoras, oomo son los lilJfocitos B y los macr6fagos. Ambas elases tie molkulas MIlC poseell OOmillios similares a 19 Y un linlco smro de 111116" al pepfldo. que IUle petllrenosfragmelitOs de piptioos derivados de prote(nas extraiias. Cada mollel,la MHC puede Imir IUla earaeterlsticn y grail cnntidad de oolljuntos de peptidos, qfle 51! producen Illtrace/l,inrnumte por degradaci6n proteico.. Despf4a de 5U fonnaci6n en el interior de in ci"4la diana. los compleJos plptidos-MHC SOli transportados a la superfleie cel.dar dOllde SOli reconoc/dos por los N!Ceptores de in cilula T. Ademas de sus reaptores espedficos de ant(geno que recDlJocell los complejos lIfHC-piptido de in silperflele de las cilll.las dm.. na, las dlulas T expreulII los co"~plOres eD4 0 COB, q.re reamocen regumes 110 polim6rflcas de las molk••tas MIlC en las ci/fltas tliana: las cilutas ooinboradoras expresan CD4, qu~ recolloce las molkulas MIlC eIase lI, ",ielltrfU las dlllias T cUot6xlClU expresan CD8 que N!COlloce las molkulas MIlC de clase J.

Las celulas T citot6xicas Como estudiamos anteriormente. las celulas T citol6xicas nos defienden contra microorganismos como los virus que crecen en el interior de las celu[as, lejos del alcance de los anticuerpos. Las celulas T citot6xicas. a diferencia de los anticuerpas, pueden reconocer eslas celulas infectadas debido a que las moleculas MHC de c1ase I envian continuamenle fragmemos de las proteinas microbianas a la superficie celular. donde pueden ser detectadas por las celulas T. En esta secci6n esludiaremos c6mo se generan dichos fragmentos y se reparten enlre las moleculas MHC de c1ase I, y consideraremos c6mo las celulas T citot6xicas destruyen las celulas diana infccladas.

Las c~lulas T citot6xicas reconocen fragmentos de prote(nas vfricas en la superficie de ceJuJas infectadas por virus32 La primera prueba clara de que las moleculas MHC presentan los amfgenos ex· tranos a las celulas T surgi6 de un experimemo con relulas T citot6xicas realizado en 1974. que demoslr6 que las celulas T citot6xicas de rat6n infectadas por un virus podrfan destmir celulas cultivadas infeCladas con el mismo virus, s610 si dichas celulas expresaban alguna de las molecuJas MHC de la misma c1ase I de rat6n infectado (Figura 23-49). Estc cxpcrimento demOSlr6 que las celulas T de cualquier individuo s610 reconocera un antfgeno determinado cuando dicho anIfgeno se halle asociado a las formas alelicas de llloicculas MHC expresadas par ese mismo individuo, un fen6mcno conocido como restriccidfl MHC. Sin embargo. 110 fue hasta 10 anos despues. que se descubri6 la naturaleza quimka de los anligenos viricos reconocidos por las celulas T citot6xicas. En los experimenlos

las cilulas T malan , las cilula. dilln,

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fibroblastot e-delrat6nde laC8P8X ~Iula~ T infeclaoos con e'IOI6xICllS el virus A ,n,did.. , fibroblastot del de laeap,y infe<:taclot con til yi.u. A •

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Las celulas T citot6xicas

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Figura 23-49 EI experimento dulco que demuestTa que las ~lulll5 T citot6xleas re<:onoc:en el antfgeno vieiro y alglin aspec:to de la superflcle de la cliuJa diana huesped. Ratones de la ccpa Xse infectan con el virus A. M cabo de siete dias, los bazos de estos ratones contienen celulas T dtot6xicas capaces de destntir fibroblastos en cuhi\'o de la cepa Xinfectados por el virus. Tal como se esperaba. estas celulas T cilot6xicas unicamente destruyen los fibroblastos infectados por el virus A, pero no por otm virus B; asI pues, las cl:!Iulas T citot6xicas son especfficas del virus. Sin embargo eslas mismas cclulas son incapaces de destruir fibroblaslOs de ratones de Ja cepa Yinfectados con el mismo vims A. 10 cuallndica que las cclulas T cilot6xJcas no solamente reconocen [os virus sino lambien a1guna djferencia genetica entre ambos lipos de fibroblastos. Gracias a la utilizaci6n de cepas especiales de ratones (conocidas como ceptJ5 congenilQS) que 0 bien son geneticamente identicas excepto para los alelos de sus loci MHC de c1ase I a son geneticamente diferentes excepto para dimos a1eJos lie encontro que Ia destrucci6n de celulas diana infectadas requiere que dichas celulas expresen al menos uno de los a1elos MHC de la misma dase expresados por el ral6n infectado inicialmente. EsIO indicaba que las protefnas MHC de c1ase I son necesarias para presentar los antfgenos vfricos unidos a supcrficie a las ceJulas T citot6xicas.

1323

con celulas infectadas por el virus de la gripe se encontr6 de forma inesperada que algunas celulas T citot6xicas reconocfan especfficamente protefnas internas del virus que en la partfcula del virus intacta no debfan ser accesibles. La prueba siguiente sugerfa que las celulas T estaban reconociendo fragmenros degradados de las protefnas internas del virus. Debido a que la celula T puede reconocer mi· m.isculas cantidades de antfgeno (s610 unos cuantos centenares de moleculas), unicamente una pequena fracci6n de los fragmentos generados a partir de las protefnas vfricas Ilegan a alcanzar la superficie celular, donde atraen y son ataca· das por las celula T citol6xicas. Sin embargo, el misterio no ha sido desvelado to· davfa. Se sabe que casi todas las protemas de una celula se degradan continuamente (Capftulo 5), por 10 que no resulta diffcil comprender que en una celula infectada se producen fragmentos peptfdicos de protefnas vfricas intemas. AI igual que otras protefnas celuJares, las prote[nas viricas son sintetizadas por los ribosomas cilos6licos y. como se expUc6 en el Capftulo 12, se requieren mecanismos especiales para que estas proleinas dejen el citosol, alravesando una membrana, hacia el interior de algun otro compartimienlo. Generalmente las proteinas deslinadas a la superficie celular empiezan su trayecto pasando desde el citosol hacia la luz del reticulo endoplasmAtico (ER) (Figura 23-50). EI rompe· cabezas de c6mo los fragmentos de las protefnas vfricas alcanzan la superficie celular se solucion6 con el descubrimiento de un sistema de transpone remarcable que poseen las celulas de los venebrados para transportar dichos peptidos desde el chosol hasta la 1m del ER. Una vez en el interior del reticulo, los pepli· dos pueden unirse a las moleculas MHC que se encuentran allf y de este modo pueden ser transportados con elias hacia la superficie celular.

Los transportadores ABC codificados par MHC transfieren [ragmentos peptfdicos desde el chosol hasta la luz del ER33 Como se sef'lal6 en el Capftulo 5, en el citosolla degradaci6n proteoHtica se Ileva a cabo principalmente por un mecanisme dependienle de ATP y de ubiquitina que actua en los proteosomas, los cuales constituyen grandes complejos de enzimas proleoHticas construidas a panir de subunidades proteicas muy distintas. Aunque probablemente todos los proteosomas se encuentran capacitados para generar fragmentos peplfdicos que se unirAn a las moleculas MHC de c1ase I, se cree que algunos de ellos estAn especializados en este objetivQ debido a que contienen dos subunidades que estcin codificadas por genes localizados en la reo gi6n cromos6mica MHC. El mecanismo mediante el cuallos peptidos se transportan desde el citosol hasta la luz del ER se descubri6 a lrav~s de observaciones en celulas mUiantes en las que las moleculas MHC de clase I no se expresan en la superficie celular sino que se degradan en el interior del ER. Los genes mutantes de dichas celulas proporcionaron las subunidades para codificar una protefna pertcnecientc a la fa· milia de los trallsportadores ABC, que esludiamos en el Capftulo II. Esta proter· na transponadora se localiza en la membrana del ER y uliliza la energfa de hidr6lisis del ATP para bombear peptidos desde el cilosol hacia la luz del ER. Los genes que codifican estas dos subunidades estAn en la regi6n cromos6mica MHC, y si algunos de estos genes es inactivado por una mutaci6n, las cl:luJas son incapaces de sumjnistrar peptidos a las moteculas MHC de c1ase I. EI hecho de Que en cstas celulas mulantes las moleculas MHC de c1ase I sean degradadas en el ER sugiere Que normalmenle para que las moleculas MHC se plieguen y/o en· samblen de forma apropiada. han de unirse a peptidos. En celulas no infectadas por virus los fragmemos peptfdicos provienen de las protefnas citos61icas y nuc1ean~ normales Que son degradadas en el proceso de reciclaje normal de prOternas; dichos ~ptidos se transponan a la superficie celular por moleculas MHC pero no son antigenlcos debido a que las celulas T cilot6lCicas Que deberian reo conocerlos han sido eliminadas 0 inactivadas durante el desarrollo de la celula T, (al como veremos mas adelanle. En la Figura 23-51 se muestra un esquema 1324

Caphulo 23: El sistema bununltario

fragmento peptldieo

retlculo endoplesm6tico

cadena polipeplldica MHC
Flgww 23·50 EI problema del ~t1do transportador. iCOmo pasan los fragmentos peptfdicos fabricados en el citosol hacia la luz del ER, donde se rabrican las mol~ulas MHC de clase I? Se requiere un proceso especial de lransporte.

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general de c6mo se procesan las proteinas viricas para su presentaci6n a las

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Iulas T citOl6xicas.

Cuando se activan las ce;lulas T par un antfgeno, segregan varias molecuJas seflatizadoras. incluido el interfer6n.'Y, que intensifica notablemenle las respuestas antivfricas. EI inlerfer6n·yinduce la expresi6n de muchos genes de la regi6n cromos6mica MHC, incluyendo los que codifican las protefnas MHC de c1ase I (y de c1ase 11), las dos subunidades de los proteosomas, y las dos subuni· dades de la bomba peptfdica localizada en el ER. Asf, toda la maquinarla que se requiere para la presentaci6n del antfgeno virico a las celulas T citol6xicas entra en acci6n de forma coordinada medianle el interfer6n-y, creando una retroalimentaci6n posiliva que amplifica la respuesra inmunilaria y culmina can la muerte de la c~lula infectada.

Las ctHulas T citot6xicas inducen a las celulas diana infectadas a destruirse a sf mismas34 Cuando una c~lula citot6x.ica ha reconocido un p~ptido vfrico unido a una molecula MHC de c1ase I en la superficie de una celula diana, su trabajo consiste en destruir a la celula antes de que el virus que da lugar al peptido pueda producir nuevas parllculas vfricas que puedan salir de la celula infectada. Si se marca una celula T citot6xica con anticuerpos anti-rubulina, en el momenlo de destruir su celu]a diana, se observa que su centrosoma se orienta hacia el punto de contacto con la celula diana (Figura 23-52). Por otro lado, el marcaje con anticuerpos muestra que en el c6rlex de la celula T en ellugar de cOntaCIO se concentra talina, una protefna que contribuye a unir los receptores de la superficie celular con los filamentos corticales de actina. Se cree que la agregaci6n de receptores de la celula en ellugar de contacto conduce a una alteraci6n local, dependiente de laLina, de los fLIamentos de actina del c6rtex celular; entonces, un mecanismo dependiente de microtubulos desplaza el cemrosoma y el complejo de Goigi asociado hacia ellugar de eontaclO, enfocando la maquinaria de destrucci6n sobre la celula diana. Se ha observado una polarizaci6n similar del citoesquelelo euan· do una relula T colaboradora interactlia funcionalmente con una eelula diana. El mecanismo por el cuallas cetulas T citot6xicas destroyen sus eelulas diana no se conoce con certeza. AJ parecer, utilizan como mfnimo dos estrategias. I...as celulas T c1tot6xlcas

DEL PrPTooAlA CADENA 0-

ESTABlUlA EL ENSAMBlAJE DE LA

Figura 23·5 I Procesamiento de una prolelna vUica para presentarla a las clJwa! T cltol6xlcas. Una cl!lula T citol6xica destruir~ a una celula inrectada por un virus cuando reconozca rragmenlos de una prOlelna extrai'la unida a moIl!culas MHC de c1ase I en la superficie de la cl!lula lnrectada. Aunque no lodos los virus entran en la eelula por la vfa que utiliza este virus de RNA recubieno. los rragmentos de las proteinas vfrieas Internas siempre slguen la via represenlada en la figura. Uniearnente se degrada una pequei'la proporei6n de prote(nas vfrlcas sintetizadas en el chosol, pero es una eantidad suflclente para atraer y surrir el ataque de una celula T citot6x.iea.

1325

,

que al parecer acttian induciendo a la celula diana a lIevar a cabo ia muerte cellttar programada (tambien denominada apopwsis, vease pag. 1257). En una de es· tas estrategias, la uni6n a una celula diana estimula en dichas celulas T citot6xicas la liberaci6n de lIna protefna formadora de poros denominada perforina que es hom610ga aI componente C9 del complemento y polimeriza en la celula diana de la membrana plasmatica formando cadenas transmembrana. La perfo· rina se almacena en vesfcuJas secretoras y se libera par exocitosis en el punlo de contacto con la celula diana. Las vesiculas secretoras tambien contienen serina proteasas y olras protefnas, que se cree que juegan algun papel en la destrucci6n de la celula diana, quizas entrando a la celula diana por los canales de perforina y induciendo la muerte celular programada. Por el contrario, la segunda estrategia implica la activaci6n de un receptor de la ceJula T citot6xica en la superficie de la ceJula diana, 10 cual seflaliza la celula diana para lIevar a cabo la muerte ceo lular program ada.

Resumen Las cilulas T eitotaxicas destruyen directamelEte las dlulas dialEa infectadns ql~e exponen fragmentos de prote{nas mierobianas en SII superficie. Algm,as de las prote{nas microbimlas que se sintetizan en el eltosol de la ceb~la diana SOli degradadas par los proteosomns, y algunos de los fragmelltos peptldicos resultantes SOli bombeados por un transportador ABC haeia ellumen del ER, domle se unell a las molkulas MHC de elase 1. A colltillltRei6l1, los eomplejos peptfdlcos-MHC SOil transportados a la superficie de la eelula dialEa, do,ute SOli reeollocidos por cilulas T eitoltMieas. Se cree que dic1uu cehdas destmyen las eel"las d;(ma ;'lfectadns indueie,ulolas a lievara cabo la nmerle celular programada.

Celulas T colaboradoras y activaci6n de las celulas ]'3' A diferencia de las celuJas T citot6xicas, las c~luJas T colaborndoras no aetuan directamente destruyendo eclulas infectadas 0 eliminando microorganismos, sino estimulando a los macr6fagos para que resuhen mas efectivos en la destrucci6n de los pat6genos, y colaborando con otras tipos de linfocitos en su respuesta frente al antfgeno. La importancia decisiva de las celulas T coJaboradoras 1326

Caprtulo 23 : EI sistema lnmunltario

Figura 23-52 c.Hulas T cltot6xJcas durante el proceso de destruccl6n de ctHulas diana en cuJt1vo. Las celulas se observan por microscopia electr6nica en (1\) y (B) Ypor mieroscopia de inmunolluorescencia tras la tinci6n con anticuerpos anti-tubulilla en (Cl. Las celulas T citot6xicas se obtuvieron de ratones inmunizados con las celulas diana, que son celulas tumorales eXlranas. En (A) y (el se muestran celulas T unUindose a la ceiuJa diana y en (B) despues de haber destmido la celula diana. AI contrario de 10 que ocune en una plaea de cultivo, en un animalla cclula diana destruida deberia ser fagodlada por las celulas vednas en lugar de desintegrarse de la forma que aquf se indica. Obsfhvese que en la celuJa T, el centrosorna y los microtubulos que irradian de el esuln orientados hada el punlo de contacto con In celula diana (C). (1\ YB, de D. Z3!,'ury. J. Bernard. N. Thiemess, M. Feldman y G. Berke. Ellr. /. Immunoi. 5:818-822,1975: C, reproducido de B. Geiger, D. Rosen y G. Berke,/. Cel/. BioI. 95:137-143. 1982, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

en la inmunidad se ha puesto c1aramente de manifiesto de una forma dramatica por la devastadora epidemia del sfndrome de jnmllllodeficiencia adquirida (SlDA). La enfermedad esta causada por un retrovirus 1virus de la inmunodeficiencia humana, HIV, de Human Immunodeficiency Virus) que reduce el mimero de celulas T colaboradoras por un mecanismo desconocido, danando asi el sistema inmunitario y haciendo aI pacieme susceptible de con traer una infec· ci6n por microorganismos que normalmente no son peligrosos. Como resultado 'de ello, la mayorfa de los paciemes de SIDA mueren a causa de una infecci6n al cabo de varios aflos del inicio de los sfntomas. En esta secci6n estudiamos c6mo las moleculas MHC de c1ase II de las celulas presentadoras de antfgeno adquieren fragmentos peptfdicos de las protefnas captadas par endocitosis y los presentan a las celulas T colaboradoras. Mas tarde discutimos la multiplicidad de senales que se requiere para activar las celulas T colaboradoras y c6mo dichas celulas, una vez activadas, contribuyen a activar a las celulas B y a los macr6fagos.

Las c~lulas T colaboradoras reconocen fragmentos de protefnas antigt';nicas extrafias endocitadas, asociadas con prote(nas MHC de clase 1136 Antes de que las cclulas T colaboradoras puedan ayudar a otros Iinfocitos en la rcspuesta contra el anllgeno, primero han de activarse a sf mismas. Esta activaci6n tiene lugar cuando las celulas T colaboradoras reconocen un antigeno unido a prolefnas MHC de c1ase (( en la superficie de diu/as presentadoras de antfgeno especializadas, que se encuentran en muchos tejidos. Estudjaremos estas celulas con detalle mas adelante. Como en el caso de los antfgenos vfricos presemados a las celulas T citot6xicas. los antigenos presentados a las celulas T colaboradoras por las celulas presentadoras de amfgeno son fragmentos de degradaci6n de In protefna extraiia, que se unen a las moleculas MHC de c1ase (( exactamente de In misma manera que los peptidos derivados de virus se unen a las moleculas MHC de c1ase I. Pero tanlo el origen de los fragmentos peptfdicos presentados como la \'fa que siguen para encontrar las moleculas MHC. son diferentes de 10 que sucede con los fragmentos peplfdicos presentados por las moleculas MHC de c1ase I a las celulas T citot6xicas. En lugar de oblenerse a partir de protefnas extranas sinletizadas en el interior de la celula diana, los peptidos presemados a las celulas T colaboradoras se oblienen a partir de microorganismos extracelulares 0 de sus productos. que han sido ingeridos por las celulas presentadoras de antfgeno y degradados en el entorno addico de los endosomas. Estos peptidos no tienen que ser bombeados a traves de la membrana porque no se originan en el chosol; se han generado en un companimienw que es lopol6gicamente equivalente al espacio extracelular. NUllca penetran en la luz del ER, donde se sintetizan y ensamblan las moleculas MHC de c1ase IJ, sino que se unen a los heterodimeros de c1ase II pre-ensambla· dos en un compartimiento cndos6mico lardlo. Una vez se ha unido el ~ptido. la molecula MHC de c1ase (( a1lera su conformaci6n atrapando al pepLido en el surco de uni6n para su presemaci6n a la superficie de las celulas T colaboradoras. Para que la presentaci6n de pepLidos derivados de las prolefnas extrailas extracelulares sea efectiva, las moleculas MHC de c1ase (( recien sintetizadas no han de unirse prematurarnenle con peptidos derivados de prolefnas sintetizadas de forma end6gena en ellumen del ER. Para que no se produzca esta uni6n prematura, un poli~ptido no polim6rfico. denominado la cadena invariable. aetua por 10 menos de dos form as. Primero se asocia con heterodImeros MHC de c1ase II reci~n sinletizados en el ER de tal forma que impide que se unan a otros pepti· dos en la luz del ER. Segundo, dirige a las moleculas MHC de c1ase II desde la red trailS del Goigi al compartimiento endosomal, donde la cadena invariable se libera por proteolisis, permitiendo a las moleculas MHC de c1ase II unirse a los fragmentos peptfdicos derivados de las proteinas captadas por endocitosis (Figura 23·53). De este modo las diferencias funcionales entre las moleculas MHC C~lulas

T colaboradoras y actlvacl6n de las c~luJas T

1327

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prasentadora de antlgeno

c~ll,lla

endosoma temprano

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antlgeno protelco plegado

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PARA SU IlECONOC1MlENTO: POR UNA cElULA T COlABORADO~RA""..._ ... -_. -

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de clase I y de clase II se mantienen: las primeras presentan moleculas que proceden del citosol, las segundas presenlan moleculas que proceden del espacio extracelular. Muchas de las moleculas MHC de clase I y de clase II de la sllperficie cellliar de una celula diana poseen peptidos derivados de las propias protefnas en el surco de uni6n -para las moleculas de clase 1, fragmentos de protefnas citos6licas y nucleares degradadas y para las moleculas de clase II, fragmenlos degradados de membrana y protefnas sericas que pasan a traves del sistema endosoma-lisoso· rna. S610 una pequefia fracci6n de las rnoleculas MHC de clase II de la superficie de lIna celula presentadora de ant(geno estan1n llnidas a peptidos. Sin embargo, esto es suficiente para iniciar una respuesta inmunitaria, debido a que s610 lUlOS cuantos centenares de dichas moleculas son suficienres para activar una celula T colaboradora, como unos cuantos centenares de complejos peptfdicos MHC de clase I de una celula diana son suficientes para activar de una celula T citot6xica.

Las c~lulas T colaboradoras se activan por las c~luJas presentadoras de antigeno 37 AJ igual que para que una celula B pueda proliferar y diferenciarse en una celula secretora de anticuerpo y plleda funcionar, primero ha de ser acrivada, una celula T ha de ser acrivada para proliferar y diferenciarse antes de que pueda destruir a una celula diana infectada 0 colaborar con un macr6fago 0 con una celula B. Generahnente la activaci6n inicial de una celula T tiene lugar cuando reconoce a un peptido extrano unido a una Il10lecula MHC de la superfide celular de una celula diana apropiada. Para una celula T colaboradora la diana adecuada es una celuJa presentadora de antigeno. Las celulas presentadoras de antigeno derivan de la medula 6sea y comprenden un grupo heterogeneo de celulas, en el que se incluyen celulas dendrfticas con imerdigiraciones en los 6rganos linfoides, celulas de LallgerfJans en la piel, asf como las celulas 8 y los macr6fagos que a continuaci6n seran las diana de la colaboraci6n de las celulas T. Junto con las celulas epiteliales del timo. que tienen un papel especial en el desarrollo de la celula T (se esrudiara mas adelantel, y las celulas activadas de algunos mamfferos, estas celulas presentadoras de antfgeno especializadas son los tinicos tipos celulares que normalmente expresan las moleculas MHC de clase II (vease Tabla 23·2). Ademas de las moleculas MHC 1328

Capftulo 23: EI sistema Inmunltarlo

Figura 23·53 Procesamlento de un ant/geno protelco extracelular para su presentacl6n a una celula T colaboradora. Una visi6n actual de c6mo se forman los complejos peptido-MHC de cJase II en los endosomas y se Jiberan a la superficie de una Cf.!Jula presentadora de antfgeno.

•

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de c1ase II, las celulas presentadoras de antfgeno tambien expresan una segunda molecula de superflcle celular, lIamada B7. que juega un papel crucial participando en la activaci6n de las celulas T, tal como veremos mas adeJante.

EI receptor de una c~lula T forma parte de un gran complejo de sefializaci6n en la membrana plasm:itica311 La activaci6n de una c~Hula T citot6xica 0 colahoradora constituye un complicado proceso que todavia no se comprende del todo. EI heterodfmero receptor de la celu)a T reconoce peptidos extranos unidos a mollkulas MHC de la superficie de la celula diana. Como en el caso de las celulas B, el receptor se encuentra 350ciado a un conjunlo de cadenas polipeptidicas rransmembrana invariables (denominado el complejo CD3) que transduce el proceso de uni6n extracelular a senales de activaci6n inlracelular. Se cree que el complejo CD3 activa uno 0 mas miembros de la familia Src tirosina quinasas, incluyendo la proteina Fyn, que fosforilan varias protefnas celulares, incluidos los componentes del propio CD3 y la enzima fosfolipasa C-l, la cual activa la vfa de senalizaci6n de fosfoHpidos de inositol descrita en el Cap!tulo 15. En la Figura 23-54 se comparan los receplores de las c~lulas T y B Ysus cadenas polipeptfdicas asociadas. La activaci6n de las c~lulas T no se produce Unicamente por la acci6n de los receptores de la c~lulas T y el complejo CD3. Tambi~n juegan papeles imponantes una diversidad de correceptores. Va hemos visto los correceptores CD4 y CDa y lambi~n se han definido sus asociados lck quinasa y algunos OllOS. En el proceso de activaci6n de la c~lula T parece que dichos receptores y correceptores, asf como sus asociados, las tirosina quinasas simUares a Src, se ensamblan formando un gran complejo de senalizaci6n en la membrana plasmatica de la c~lula T. Sin embargo, incluso este gran complejo de sefializaci6n es insuficiente para activar par sf mismo a la c~lula T colaboradora: se requiere otta vfa de senalizaci6n independiente.

Para activar la celula T colaboradora se requieren dos sefiales simult aneas!t9 Para activar la ct'!lula T colaboradora, una ct'!lula presentadora de antfgeno ha de proporcionar como minima dos sef'tales. Ya hemos vista la sef1ali: la suministra un p~plido eXlrafto unido a una mol~cula MHC de clase 11 de la superficie de la c~­ luIa presentadora. que activa el complejo receptor de la celula T ilustrado cn la Figura 23-54A. Dependiendo dellipo de celuIa T colaboradora (como veremos mas adelante), 1a seflal 2 la suminislra tanto una senal qufmica segregada. como la 111terleuqlllna-i (lL-i), 0 bien la molecula senalizadora B7 unida a la membrana plasmatica de la superficle de la celula presentadora de antigeno. B7 es reconocida por una prole!na correceptora denominada C02a, que se encuentra en la superficie de la celula T colaboradora y es miembro de la superfamilia de Ig. Si las celulas T colaboradoras reciben ambos tipos de senales, Sf activan para proliferar y segregar una gran variedad de imerleuqllinas. Por el contrario, si reciben la senal I sin la sef'al2, se alterao de tal forma que ya 00 pueden ser activadas aunque recibao ambas se-

(A) complejo receptor de II dlull T ,eceplor de II cl!ilule T ~""-...

CITOSOL

protlrne 'yo

(8) complejo reclptor dill celule B

,

receptor de II cl!ilull 8 (Ig)

Figura 23-54 Comparacl6n entre los receptores del antfgeno de c~luJas T y

los de dluJas 8. En ambos casos los receplores (negro) se asoclan con cadenas polipeptfdicas transmembrana invariables (verde) que aCluan como transduetores de sei'lal. Las cadenas invariables asociadas con el receptor de la d!lula T forman el complejo CD3, mientras que los que se asoclan con el receptor de la c~lula Bse denominan Ig-a, Ig-p e Ig-y. En ambos casos por 10 menos una de las cadenas invariables se une a una tirosina quinasa similar a Src (roja). Todas las cadenas que se muestran, exceP(O las cadenas CD3-~ y las quinasas similares a Src. presentan dominios extracelulares similares a Ig y, por lanto, son miembros de la superfamilia Ig. CClulas T colaboradoras y activacl6n de las c~lulas T

ClTOSOL

1329

ACTIVAC1CN

SENALCD

cl!ilulas presentadoras de arlligeno

INACTIVACICN

Figura 23·55 Se requleren dos senales para la actlvaci6n de la celula T colaboradora. La sefial 2 puede ser proporclonada tanto pOT una sefial segregada, como la interleuquina.l OL-l} a par una protelna unida a membrana de la superficie de la celula presentadora de antlgeno, como la prote(na 87. La senal I sin la sef\al 2 puede inactivar In celula T. Las proteinas accesorias asociadas can el receptor de In celula T (ilustrado en la Figura 23-54A) que se requieren para generar dicha senall no se muestran en la figura.

flales (Figura 23-55). Se ha sugerido que este puede ser el mecanismo por el que las celulas T se welven tolerantes, tal como estudiaremos mas tarde. Cuando lUla celula T colaboradora 0 citot6xica ha sido eSlimulada por un anligeno, son necesarias otras prolefnas accesorias de su superiicie para aumenlar la fuerza de uni6n de la celula Tala celula diana. Por ejemplo, en el Capftulo 19 vimos que la eSlimulaci6n de una celula T activa a la protefna LFA-l asociadn a la ftmci611 lin/acUaria, un miembro de la familia de las protefnas de adhesi6n celular de las integrinas, de forma que LFA-I puede unirse a su Iigando de la celula diana; elligando se denomina molecula 1 de adhesi6" inrercelular (TCAM-T, de Intercellular Adhesion Molecule) y constituye un miemhro de la superfamilia de las Ig. En la Tabla 23-3 se resumen algunos de los correceplores y Olras protefnas accesorias de la superficie de las celulas T.

1

Tabla 23-3 Algunas protefnas accesarlas de la superflcie de las celulas T Peso molecular Protefna- aproxlmado

SuperfamUia

Se expresa en

Uganda en la celula diana

cadena "y = 25 000 cadena oS = 20 000 cadena E = 20 000 cadena ~ = 16 000 55000

[g [g [g [g

celulas T colaboradoras

MHC de clase II

COB

70 000 lhomodfmero o heterodimero)

[g

celulas T citot6xicas

MHC de c1ase [

C028

80 000 (hornodfmero)

[g

B7

LFA·I

cadena a l = 190 000 cadena b 2 = 95000

muchas celulns T citot6xicas y colaboradoras la mayoria de leucocitos, incluyendo las celulas T

CD3

CD4

)

integrina

Funciones ayuda a transmitir la seflal entre el complejo MHC-antfgeno unido a los receptores de la celula T

todas las celulas T

lCAM·1

estimula la uni6n entre las celulas presentadoras de antfgeno y las celulas 8; sei'laliza las celulas T favorece la adhesi6n entre las celulas diana infectadas; sei'laliza las celulas T proporciona la sefial2 a algunas celulas T estimula la adhesi6n celula-celula

• CD significa agrllpaciones de diferenciaci6n (de cl1l5ler of dijfereflfiatioll), ya que cada una de [as protefnas CD fue dcfinida originalmente como un "andgeno de diferenciaci6n" de celula T reconocida por multiples anticuerpos monoclonales. Su identificaci6n fue posible gracias a estudios de colaboracl6n a gran escala mediante los cuales se gencraron, en muchos laboratorios, cientos de estos anticuerpos, fueron com· parados entre sf y se enconlTo que consislfan en relativamente pocos grupos (0 "agrupacioncs"), cada uno de los cuales reconocfa una unicn proteina de In superficie celular.

1330

Capftulo 23: El sistema inmunitario

Las c~lulas T colaboradoras, una vez activadas, se estimulan a sf mismas y a otras c~lulas T para proliferar mediante la secreci6n de interleuquina-2 40 La acci6n comhinada de las sei\ales I y 2 provoca la proliferaci6n de las celulas T eolaboradoras mediante un curioso mecanismo indirecto. Dicho mecanismo provoca en las celulas T la eSlimuJaci6n de su propia proliferaci6n por secreci6n simuJt:1nea de un factor de crecimiento denominado interleuqulna·2 (lL·2) y la sfntesis de receptores de superficie celuJar que se unen a el. La uni6n de IL-2 a estos receptores estimuJa la proliferaci6n de la eelula T. Mediante este mecanismo Qlltocrino, las eelulas T colaboradoras pueden continuar proliferando tras haber dejado la superficie de la eelula presentadora de antfgeno (Figura 23-56). La relula T colaboradora tarnbien puede estimular la proliferaci6n de cuaJquier otra eelula T, incluyendo las celuJas T citot6xicas, que primero haya sido induci· da a expresar reeeptores de IL-2. Sin embargo, debido a que la expresi6n de reo ceptores de IL-2 es estrictamente dependiente de la estimulaci6n por antigeno, IL·2 5610 provoca la proliferaci6n de aquellas celulas T que han reaecionado con su antigeno especffico. Cuando se descuhrieron los requerimientos necesarios para la proliferaci6n de las celulas T, fue posible producir Ifneas de diu/as T especfficas de antfgeno que proliferan indefinidamente en eultivo, mediante la administraci6n de IL·2 y la estimulaci6n peri6dica con antigeno para mantener la expresi6n de recepto· res de IL·2. Entonces se pueden aislar celuJas de estos cultivos y generar clones de celulas T. Estos clones han tenido una importancia critica en el estudio de las celuJas T. 'unto con los hibridomas de diu/as T (que son amUogos a los hibridomas de celuJas B secretoras de anticuerpos monoclonales mencionados ante· riormente y que se producen por fusi6n de celulas T especfficas de un antfgeno con una eelula T de una Unea tumoral), los clones de eelulas T posibilitan el aislamiento de los reeeptores de eeluJas T y de sus genes. Tambien han sido ampliamenle ulilizados para estudiar los mecanismos de aetivaci6n de las eelulas T y del papel de las eelulas T colaboradoras en la estimulaci6n de las respuestas de otras celulas, como las celulas B y los macr6fagos.

Para responder ante un antfgeno, la mayorfa de las c~lulas 8 necesitan la participaci6n de las c~lulas T colaboradoras41 El papel de las celulas T colaboradoras en las respuestas de anticuerpos de las celulas B se c1cscubri6 por primera vez a mediados de los arios 1960, a partir de experimentos en los que a ratones irradiados se les inyeetaban celulas del limo 0 de la mhdula 6sea con un antigeno. Los ratones que habian recibido s610 celulas de medula 6sca 0 celulas de time eran incapaces de producir anticuerpos; pero si se inyectaba lIna mezcla de celulas de timo y de medula 6sea, proclucfan grandes cantidades de anticuerpos. Mas tarde se mostr6 que el timo suministra e~lu-

celul. pru.nlador. ell antlgeno

:

IL·2

se_@

... ...... receptor ell IL·2

\

/ )

ACTIVACION

---- -- --- --

PROUFERAClON

IragmenlO .nligllOO

(tel

06tul. T eol.bofldor. ~

.......

--ee1ula T

lCIivada

Qlulas T colaboradoras y activaci6n de las celulas T

Figura 23-56 Estimulacl6n de la prollferacl6n de la celula Tpor IL-2. Las senales 1y 2 activan a la celula T oolaboradora para producir receplOres de IL·2 y segregar lL-2. La uni6n de IL·2 a sus receptores estimula el crecimiento yla dlvisi6n de la celula. Cuando se elimina el antlgeno. la celula Tdetiene temporaJmenle la producci6n de IL-2 yde receptores de IL·2. de tal manera que se detiene su proliferaci6n. Veremos mas adelante que algunas ct!:lulas T colaboradoras no producen IL-2: su proliferaci6n, aI igual que la de las celulas T cilOt6xicas. se cslimula por IL-2 fabricada par las celulas Tcolaboradoras cercanas. 1331

las T. mientras que la medula 6sca suministra celulas B. EI uso de un marcador espec!fico para distinguir entre las celulas T y las celulas B inyectadas mostr6 que las celulas secretoras de anticuerpos eran s610 las celulas B. 10 cllaillev6 a la conclusi6n de que las celulas T deb!an colaborar con las celulas B en la respuesta frenle al antfgeno. Sin embargo, exiSlen algunos antigenos. entre los que se cuentan muchos polisacaridos bacterianos. que plleden estimuJar la proliferaci6n y diferenciaci6n en celulas secrelOras de anticuerpos sin la ayuda de las celulas T. Con frecuencia estos a"t(gellos i"depelldieme5 de celillas T son grandes polfmeros con delerminanles antigenicos identicos repelidos (vease Figura 23-258); su uni6n a multiples puntos de las molttulas de anticuerpo unidas a la membrana, que en las celulas B actuan como receptores para los antfgenos. puede generar una sefial suficientemente inlensa para activar directamente las celulas 8; sin embargo. 5610 algunas celulas B pueden activarse de esta forma. Debido a que eSlos amfgenos no activan a las celulas T colaboradoras. tampoco inducen las celulas B de memoria ni provocan el cambio de c1ase de los anticuerpos (ambos proce50S requieren la colaboraci6n de las celulas n, por 10 que provocan principalmente la producci6n de anticuerpos IgM de baja afinidad.

!

La activaci6n de las c~lulas B por c~lulas T colaboradoras se produce tanto por senales unidas a la membrana como por senales segregadas42 Mientras que las celuJas presemadoras de antfgeno. como las celulas dendrldcas y los macr6fagos. son omn!voras e ingieren y presenlan antfgenos inespecfficamente. generalmente una celula B s610 presenta un antigeno. que reconoce especlficameme. En una respuesta prirnaria de anticuerpos las celulas T colaboradoras normalmente se activan por un.i6n a un antfgeno extrai\o ligado a una protefna MHC de c1ase II de la superficie de una celula presenladora de antfgeno de tipo omnfvoro -como la celula dendrftica con imerdigiradones en un 6rgano Iinfoide secundario. Una vez activada, la celula T colaboradora puede colaborar en la activaci6n de una celula B que expone especificamente en su superficie el mismo complejo de antfgeno extrano y prote!nas MHC de c1ase II. La exposici6n del antfgeno en la superficie de la celula B refleja la selectividad con que capta las moleculas extrafias del Hquido eXlracelular. Dichas moleculas se selecciOllan por su ulli6n a los anlicuerpos Iigados a membrana especfficos (receptores antigen icos) de la superficie de la celula B y se ingieren por endocitosis medlada por receptores; mAs tarde son degradados y reciclados hacia la superficie celular en forma de peptidos unidos a protefnas MHC de c1ase II. As!. la c~lula T colaborndora activa las celulas qlle producen anticuerpos Iigados a membrana que reconocen especfficamente a.I antfgeno que ha activado inicialmente a la celula T. En las respuestas secundarias de amicuerpos, las propias celulas B de memoria pueden aCluar como celulas presentadoras de antfgeno y activar a las celulas T colaboradoras, de forma que sigan siendo las siguientes dianas de las celulas T colaboradoras. Las acciones mutuas de refuerzo entre las celulas T y las celulas B provocan una respuest'a inmunitaria que es a la vez intensa y altamente selectiva. Cllando una celllia T colaboradora se ha activado y ha entrado en comaclo con una celula B. dicho contacto inicia una reordenaci6n del citoplasma de la celula colaboradora que orienta el centrosoma y el complejo de Goigi hacia la celula B. tal como se describi6 para una celula T citot6xica al cOntactar can su celula diana (vease Figura 23-52). Sin embargo, se cree que en este caso la orientaci6n capacila a la celula T colaboradora a dirigir las moleculas seflalizadoras unidas a membrana y segregadas hacia la superficie de la celuJa B. La molecula senalizadora unida a membrana es una prolefna transmembrana de la superfide celular denominada Ugando CD40, que se expresa en la superficie de las celulas T colaboradoras aClivadas, pero no en reposo. Se reorganiza mediante la protefna transmembrana CD40 de la superficie de la celula B. Para que las celulas T colahoradoras activen las celulas B para proliferar y madurar a celulas de 1332

CapftuIo 23: EJ sistema InmunJtarlo

)

i

,

~

ioterleuquinlls

SeNAL

'I J

Interleuquinas

;g~::

~

\"

senates requerldas para actlvar la celula B y la celuJa T colaboradora. Observese que la senal 2 puede proporcionarla tanto una molecula SENALG) senalizadora segregada (una antigone interleuquina) como una interaccion \' pro~eico en forma de cantaclo intercelular.

® """''""!-r CD

C028

Figura 23-57 Comparacl6n entre las

CELULA B '

CELULA T COLABORADORA

nallVO

d""m;""",~

de C040 ~f-;-L Bntigllnico de

celula presentadora de antlgono

Ie c61ula B

detarminanta antigl!Hlico de Ie celulll T

celula T colaboradora

(0 celulll 8)

memoria y secretoras de anticuerpos se requiere la interacci6n entre elligando CD40 y CD40. Esta interacci6n es cr(tiea para la colaboraci6n de la celuJa T: aquellos individuas que pierden el Ugando CD40 debido a una mutaci6n en el gen que codifica la prote(na, unicameme pueden producir anticuerpos IgM y son inrnunodeficientes agudos: son susceptibles de contraer las mismas infecciones que afectan a los pacientes de SIDA, en los que las celulas T colaboradoras han sido destruidas. Las senales segregadas por las celulas T proporcionan una colaboraci6n adidonal activando a las celulas B para proliferar y madurar y, en algunos casos, cambiando la clase de anticuerpo que producen. La interleuquina·4 (lL-4) constituye este tipo de senal. Estimula la proliferaci6n y la maduraci6n de las celulas B y estimula el cambio a la producci6n de anticuerpos igE e IgGl: si en un ral6n se inactiva el gen IL-4 mediante recombinaci6n genetica vectorial, el rat6n es incapaz de producir IgE y fabrica muy poca IgGI. As£, la mayorfa de celulas B, a1 igual que las celulas T, requieren multiples senales de aClivaci6n, una de elias proporcionada por la uni6n del antfgeno a las moieculas Ig unidas a membrana y las otras proporcionadas par las celulas T colaboradoras; como ocurre en el caso de las celulas T, si una celula B recibe solamente la primera senal, puede ser inactivada funcionalmente. En la Figura 23-57 se comparan las senales que se requieren para la activaci6n de las celulas T colaboradoras y las celulas B.

Algunas celulas T colaboradoras activan las celulas T citot6xicas y los macr6fagos mediante la secreci6n de interleuquinas43 Existen par 10 menos dos subclases funcionalmente disrintas de celulas T colaboradoras, que pueden distinguirse por las interleuquinas que segregan. Las ceIwas Till segregan IL-2 e interfer6n-y, y estan irnplicadas principalmente en la colahoraci6n con las celulas T cilot6xicas y los macr6fagos. Las celulas TII 2 segregan IL-4 e IL-5 y estan implicadas en la colaborad6n can las celulas Bylas eosin6fi.los. Vimos anteriormente que la IL·2 segregada par las celulas T colabaradoras activadas puede estimular a las celulas T citot6xicas activadas (asf como a atras celulas T colaboradoras) a proliferar. Las celulas T estimuladas tambien segregan atras inlerleuquinas, como el illterferon-y, que comribuye a la activaci6n de las celulas T citot6xicas para que destruyan celulas infectadas diana y aumenta la eficiencia de los macr6fagos para la fagocitosis y para la destrucci6n de los microorganismos invasores. La capacidad de las celulas T de atraer y activar macr6fagas es especialmente importanle en la defensa de infecciones par Cclulas T colaboradoras y activaci6n de las cclulas T

1333

TablaZ3-4 Propledades de algunas InterleuqulnasInterleuqulna

Peso

(IL)

molecular aproxlmado

IL-I

15000

lL-2

15000

IL-3

25000

IL-4

20000

IL-S

20000

IL-6

25000

Intcrferon-'Y

2S 000 (dfmero)

Fuente

Diana

Accl6n

c~lulas presentadoras de antfgeno algunas c~lulas T colaboradoras algunas c~lulas T colaboradoras algunas celulas T colaboradoras las mismas c~luJas T colaborodoras que produccn IL-4 algunos celulas T colaboradoras y macr6fagos las mismas celulas T colaboradoras que producen IL-2

celulas T colaboradoras

ayuda en la aclivaci6n

IOOas las c~lulas T y aClivadas varias c~lu1as hemalo-

estimula la proliferaci6n

c~lulas 8

I

eSlimula la proliferaci6n

poy~t.icas

celulas B celulas 8, eosin6fi1os

celuJas Boctivados, celulas T celulas B, macr6fagos, celulas endOleliales

estimula la proliferaci6n, maduraci6n y c1asificaci6n en IgE e IgGl estimula la proliferaci6n y maduraci6n

eSlimula la maduraci6n de las celulas Ba e~lulas secrelOras de Ig; eolabora en la activaci6n de las c(Hulas T activa divcrsos genes MHC y macr6fagos

• Las inter!euqldnas son peplidos y prOle[nas secrelados que principalmente median inleracciones locales entre celulas blancas de la sangre (leucocilos) pero que no unen anllgeno; las que son secreladas por IinfocilOS lambitlin se denominan finfoquinas. Se conoce Ia secuencia de amino4cidos de lodas las protemas listadas. Las fuenles, c(lilulas diana y las funciones lis{adas son las mlls relevantes para el sistema inmunilario. pero la mayorla de las inlerleuquinas Iienen muchas mlls fuentes, dianas yacciones de las que se mueslran aquc.lt;te es el caso de IL-t e IL-6, que lambren son produddas por dlulas no sanguineas yaclllan sobre muchos tipos de c(lilulas diana diferenlcs de las c8ulas sangurneu; porconslguiente se denominan con mlls exaClitud. ciroquinas.

microorganismos que pueden sobrevivir a la simple fagocitosis por macr6fagos no activados. La rnberculosis es una de eslas infecciones. La secreci6n de interleuquinas desencadenada por el antfgeno es el fundamento de la conocida prueba epid~rmica de la tuberculina. $i se inyccta tuberculina (un eXlraclo de la bacteria causante de la tuberculosis) en la piel de individuos que han sido inmunizados contra la tuberculosis 0 han sufrido la enfermedad, (y por consiguiente poseen las celulas T de memoria apropiadas) se produce en la piel una respuesta inmunitaria caracterfstica. $e inicia en el sitio de la inyecci6n par la secreci6n de il1tcrleuquinas por las celulas T colaboradoras de memoria, que reaccionan a la luberculina. Las interleuqulnas atraen a los macr6fagos (y a los linfocitos) hacia cl lugar de la adminisrraci6n, causando de este modo la hinchaz6n caraeterfstica de una reacci6n posiliva a la luberculina. Otro importante efecto del interfer6n-y es la inducci6n de la expresi6n de las gJucoprOlefnas MHC de dase II en la superficie de algunas c~luJas (como las celulas endoteliales) que normalmenle no las expresan. EsIO capacila a eslas ce· lulas para la presentaci6n del antfgeno a las celulas T colaboradoras. Tal como se vio anlerionnente, el inlerfer6n-y tambien incrementa la eficiencia can que las celulas diana presentan el peplido vfrico asociado con moleculas MHC de clase I para que sean reconocidas por las celulas T citot6xicas. En la Tabla 23-4 aparecen aJgunas de las interleuquinas segregadas por las celulas T colaboradoras, 0 por las celulas presentadoras de antfgeno.

Resumen lAs cibllas T oolaboradoras acUvan a las cilulas 8 y a los macro/agos, DicluLs cilu-

las son actilllUias a su vez cualUlo reootlocen fragmentos peptfdicos derilllUlos de prote{nas extraiias extracelulares que las cilulas especlaliuulas presenUUloras 1334

Cllpftulo 23 : EI sistcma inmunltllrlo

\

\

r

\

de antfgeno 1Ian captado por e,ulocIIOSis. Las profefnns lngerldas se lkgrada'l en los endosomns y algllnos de los fmgmentos peptfdiOO$ re$ldtnntes se Jlnen a Ins molieulas MHe de clase II,fonnanOO complejos que son tmll$portndos a Ia superfick cellllar, OOnde las cilldas T colaboradoras los nconocen. fA aetivad6n de las cilulas T colaboradoras requkn! por los menos dos senalu: In senall Ia sumlnistran el complejo peptfdlco MJlc. mlentras qlle las sdal21a propordona tanto in protelna 87 de Ia sllperjicie de las dlula presentadorn del antfgeno como una seilal segrega· tin por dicllll cil"la. Una vez actit-'adas. las cilulas T colaboradoras esfinlllian Sll propia proliferac16t1 mediallte Ia secrec16n de interleuqllltla.2 y aetlfltln SIU clildas diana mediante "ua combinac16n de nroMculas ",tidas a membrana y moliculas seilal segregadas.

Selecci6n del repertorio de celulas T Las celulas T se desarrollan en ellimo. De fonna notable, mas del 95% de las celulas que se fabrican mueren antes de ser capaces de madurar y migrar hacia los 6rganos linfoides perifericos. Esle excedente es debido sobre todo a los estrictos procesos de selecci6n que actuan durante el desarrollo de las celulas T asegurando que unicamente sobrevivan aquellas celulas que tengan receptores potencialmente funcionales. En esla secci6n vamos a esludiar los procesos de selecci6n positiva y negativa que colaboran en la configuraci6n del repertorio de las celulas T. Ello nos conducira a considerar par que los individuos difieren geneticamente en su respuesta inmunitaria y por que las moltkulas MHC que presenta el antfgeno a las cellllas T presentan una variabilidad genetica tan acusada.

Las celuJas T que reconocen peptidos asociados a las rnoleculas MHC propias son seleccionadas positivamente durante su desarrollo en el tirno 44 Hemos visto anteriormente que las celulas T reconocen el antfgeno en asociaci6n con las propias moleculas MHC pero no asociadas con moleculas MHC ex· tranas, es decir, que presentan la restricci61l MHC Dicha reslricci6n refleja un praceso de seleccl6n posltlva durante el desarrollo del timo, par 10 cuallas celulas inmaduras que sean capaces del reconocimiento de peptidos extranos presemados por las rnolecuJas MHC propias son seleccionadas para sobrevivir, mienlras que las reSlanles, que no podrfan ser utilizadas por el organismo, mueren. Esta restricci6n MHC es una propiedad adquirida del sistema inmunitario que se pone de rnanifiesto cuando las celulas T se desarrollan en el timo. Par ejemplo, si lln timo de la cepa Y es transplant ado a un rat6n de la cepa X que ha sido irradiado para eliminar todas sus celulas T maduras y al que despues se Ie ha transplantado mCdula 6sea fresca para proveerlo de celulas nuevas, estas celulas T de la cepa X se desarrollan en ellimo de la cepa Y. En la mayorfa de experimentos de este lipo, las celulas T maduras de la cepa X producidas reconacen antfgenos extrafios asociados con g1ucoprotefnas MHC de la cepa Y pero no con protefnas MHC de la cepa X, 10 que sugiere que el limo dicla la especificidad de la restricci6n MHC. Dado que las celulas T se desarrollan en el limo, se seleccionan las que puedan reconocer anlfgenos en asociaci6n con los lipos de moleculas MHC expresadas. y sobreviven y proliferan. Experimentos similares demuestran que las celulas epilelioides del timo son las responsables del proceso de selecci6n positiva. La v(a mas directa para cl estudio del proceso de selecci6n es el seguimiento del destino de un conjunto de celulas T de especificid3d conocida. Esto puede realizarse utilizando ratones transgenicos que expresan lin par especffico de genes de receplores de celuJa T, a y~, derivados de lin cion de celulas T de especilicidades MHC y antigenica conacidas. Como en el caso de los genes para inmu· noglobulinas en las celulas B, la expresi6n de lransgenes de receptores de celulas T reordenados inhibe la reordenaci61J de genes de receptores de relulas Selecci6n del repertorio de celulas T

1335

T end6genos, asegurando la exclusi6n alelica, de forma que en estos ratones transgenicos una gran proporci6n de las cE'Hulas T expresa unicamente el receptor Iransgenico. Asf, puede ser faciJmente controlado el desljno de las celulas T con una especificidad conocida. Este lipo de experimentos demueslran que las celuJas T Iransgenicas maduran y se reparten en los tejidos Iinfoides perifcricos Ian s610 si el rat6n transgenico tambicn expresa la misma fonna ah~lica de la molecula MHC Ial como es reconocida por el receptor de la celulas T transgenica; si el rat6n no expresa la molecula MHC apropiada. las celulas T transgenicas mue· ren en el timo. Asf, Ial como sugieren los experimentos de transplante de limo. la supervivencia y maduraci6n de una celula T depende de la pugna entre su receptor y las moleculas MHC expresadas en el limo. Fonnando parte de este proceso de selecci6n positivo. las celuJas T citol6xicas se seleccionan en funci6n del reeonocimiento de moleculas MHC de cJase I mientras que las celulas T colaboradoras se seleecionan en funci6n del reconocimiento de las moleculas MHC de cJase II. De eSla forma, ratones obtenidos por ingenieria genctica que carecen de molecuJas MHC de c1ase I de la superficie celular pierden especfficamente celulas T citot6xicas, mientras que ratones que carecen de molecuJas MHC de c1ase II carecen especfficamente de celulas T colaboradoras. La selecci6n positiva deja todavfa por resolver un gran problema. Si las celulas T en desarrollo con receptores que reconocen peptidos propios asociados con moleculas MHC propias maduraran en el limo y migraran hacia los tejidos Iinfoides perirericos. deberian causar estragos. Para evitar este desastre se requiere un segundo proceso de selecci6tl tlegariva en el limo.

Las celulas T en desarrollo que reaccionan fuertemente con los peptidos propios unjdos a moleculas MHC propias son eliminadas en el tim O
1336

CapftuJo 23: EI sistema inmunitarlo

•

1'10 h.y IXpr..i6n deTCR

TCR qUi 1'10 ~nMHC

propi. 10 MHC propl. + p6ptido propio)

er

UfRTe POA DEFECTO

1

~

T~ oon totrt. r.conocimiento de MHC propi. to MHC propl. + pj:ptiOo proPell

TCR con f'IICOI'IOcimiento d'bIl de MHC propi. to MHC propl. +~opropio)

~

MUfRTEPOR DeFlCTO

1 @

@

diLlI. muert.

Figura 23-58 Seleccl6n posillva y negativa en el limo. 5610 se selecclonan para sobre\'ivir. madurnr y mlgrar hacia los organos linfoides perifericos aqueUas celulas que lienen receplores que reconocen pt:ptidos exlrallos asociados a molkulas ~U1C propias; IOOas las celulas restanles experimentan la muene «Iular programada. En el transcurso del proceso de la selecci6n positiva. las celulas T colaboradoras ITH) Ylas celulas T c1tot6xicas ITcl divergen por un mecanismo desconocido. de tal forma que las celulas colaboradoms expresan el correceptor CD4 pero no el CD8 y reconocen pt:ptidos extrallos asociados a mollkulas MHC de clase II, mientras que las celulas T citot6xlcas expresan CD8 pero no CD4 y reconocen peptidos extrallos asoclados a moleculas MC de clase [ (no se mueSlran en la figural.

haci. los 6rg.~ linfoides perif"~

linfoides perifericos de ralOnes hembra se encuentran grandes cantidades de relulas T maduras que expresan el receptor rransg~nico, pero se encuentran muy pocas en los ratones macho. en los que las c~lulas mueren en el timo antes de rener oportunidad de madurar. AI igual que la selecciOn positiva. la selecciOn negaliva requiere Ja interacciOn de un receptor de celula T y un correcepror CD4 0 CD8 con una moJecula MHC apropiada. Sin embargo. a diferencia de Ja selecciOn positiva que riene lugar principalmenre en la superficie de las celulas epiteliales del limo. la selecciOn negativa se produce principal mente en la superfide de otras celulas, como las c~lulas dendrfLicas 0 los macr6fagos. que se forman en la medula 6sea y migran hacia el timo. AI igual que las celulas epiteiiales. poscen en Sll superficie tanto molecllias MHC de c1ase I como de c1ase II. Los mecanismos respollsables de la selecciOn positiva y Ilcgativa de las cellllas T en el timo se desconocen, pero en ambos casas se cree que se halla implicada la muerte celular programada (estudiada ell los Cap(tulos 21 y 22). Parece que durante la selecci6n positiva las celulas epileliales del limo proporcionan senales de supervivencia para unirse debilmente a las celulas T. evitando la autodestrucd6n de las celulas T. En la selecci6n negativa, por el conuano. las celulas derivadas de las celulas derivadas de la mtXlula Osea senalizan la uniOn fuerte de las celulas T para deSlruirse a sf mismas (Figura 23-58). La supresi6n en el timo de celulas T autorreactivas no puede eliminar lodas las celulas T potencialmente autorreaclivas, ya que algunas moleculas propias no se hallan presentes en el rimo. Probablemente algunas de las celulas T con receptores que reconocen este tipo de moleculas propias son eliminadas despues de abandonar el timo. pero las orras pueden ser funcionalmente inactivadas mediante un proceso denominado anergia clonal (para distinguirlo de la deleci6n clonal. en el que mueren las celulas autorreaclivas; vease pag. 1290). Aunque el mecanismo molecuJar de anergia clonal es incierto. se ha postulado que las celulas T reconocen peptidos propios unidos a moleculas MHC de la superficie de celulas de t'ejidos que son incapaces de proporcionar la senal 2; como se vera mas adelante. la senal I sin la senal 2 puede inactivar una celuJa T sin destruirla. Sclecci6n del repertorio de celulns T

1337

AJgunas formas aIeHcas de moltkulas MHC no son efectivas en la presentaci6n de antfgenos especfficos a las c~lulas T: genes de la respuesta inmunitaria {lr)46 A diJerencia de los genes MHC de c1ase I, que se reconocieron por primera vez por su efecto en el rechazo de injenos. los genes MHC de c1ase II se identificaron por primera vez por su efecto en las respuesras inmunitarias dependientes de celulas T a antfgenos solubles especfficos. Cuando se inmunizan varios animales con un antfgeno sencillo, algunos de ellos producen energicas respuestas dependientes de celulas T mientras que olros no responden en absoluto. Estudios geneticos indicaron que la capacidad de responder al antfgeno eslaba controlada por un unico gen. denominado gen de respuesla Inmunltarla (lr) (de Immune Response); a menudo. las respuestas a diferentes antfgenos eSlahan controladas por /r diferentes. Los genes Ir que controlan la respuesta de las ccHulas T colaboradoras frente a un amfgeno mapan uno u otro de los loci MHC de clase II mientras que los que controlan la respuesla de las celulas T citot6xicas frente a un antfgeno mapan uno u otro de los loci MHC de c1ase 1. Estas observaciones resuhaban extremadamenle incornprensibles, perc una vez reconocido que las prolc(nas MHC juegan un papel crucial en In uBi6n y presentaci6n del antfgeno a las celulas T. pod dan explicarse f<1cilmcntc: un individuo que no responde a un antfgcno sencillo (normal mente un antigeno con un solo delerminante antigenico) posiblemente carece de una molecula MHC que pueda unirse a el, presentando de forma efecriva el determinante antigenico a una celula T apropiada. Esta explicaci6n se basa en estudios realizados ill uitro que mOStraron que las moleculas MHC de c1ase II purificadas procedentes de un animal que responde innumoldgicamentc al amigcllo pueden unir el peptido relacionado. mienrras que las procedemes de un animal que 110 responde. no pueden hacerlo. Sin embargo. en algunos casas parece que el responsable de la falta de respuesta genetica a antigenos especificos es otro mecanismo. Es probable que algunas combinaciones de molttulas MHC propias con peptidos extranos se pa~ rezcan a algunas combinaciones de molttulas MHC y peptidos propios. Debido a que las celulas T colaboradoras que reaccionan frente a eSlas comhinaciones son eliminadas por selecci6n negativa durante su desarrollo en el timo, un animal puede ser gencticamente incapaz de responder a estos pcptidos extraiios.

El papel de las protefnas MHC en la presentaci6n del antfgeno a las c~lulas T proporciona una explicaci6n de las reacciones de trasplante y del polimorfismo MHC 47 El papel de las protefnas MHC en 13 uni6n y presentaci6n de ant(genos extraf'ios a las celulas T proporciona una explicaci6n de por que llluch3S celulas T responden frente a moleculas MHC extranas. rechazando per consiguicnle injenos de 6rganos extranos. Posiblemente. proteinas MHC extranas con un peptido end6geno en su surco de uni6n al peptido constituyen complejos que pueden parecerse a molttulas MHC propias que forman complejos con pcplidos eXlrai'los. Por ejemplo. algunos clones de cclul3s T citot6xicas que reaccionan frente a un antfgeno vinco en asociaci6n con una molecula MHC de c1ase I propia. tambicn reaccionan (rente a una molttula MHC de dase I extrafia en ausencia del antigeno vinco (Figura 23-59). La funci6n de las protefnas MHC presentadoras de antigeno puede explicar tambicn el am plio polimorfismo de estas moJcculas. En la lucha evolutiva entre los microorganismos pat6genos y el sislema inmunitario de los venebrados, los microorganismos tender~n a cambiar sus anrigenos para evilar la asociaci6n a las molttulas MHC. Cuando uno de ellos 10 logre. sem capaz de cxtenderse por una poblaci6n como una epidemia. En estas circunstancias, cl escaso numero de individuos que produzcan una molecula MHC nueva que pueda asociarse con un am(geno del microorganismo aherado tendn1 una gran velltaja selectiva. 1338

Capitulo 23: EI sistema Inmunltarlo

,

Figura 23-59 Mlmelismo de una molecula MI-ICextrafia. Una molCcula MI·IC extrana can un peptido cnd6geno unido al surco de uni6n puede parecerse a una molecula MI-IC propia con un peptido eXlrai'io (como un peptido vinco) unido a ella. Se cree que esta seria la explicaci6n de por que tamas de nuestrns celulas T pueden activarse mediante mol&ulas MHC exlraftas en las reacciones de lfasplante. mol6cula MHC propia

~.

J

mol6cula MHC eXl.afl.

AdemAs, los individuos con dos alelos diferentes para cada molecula MHC (hcterozigOlOS) tendran mayores posibilidades de resislir la infecci6n que los individuos que tengan los dos a1elos identicos en cualquier locus MHC dado, y poseeran una mayor capacidad para presentar antfgenos procedentes de una amplia gama de pat6genos. As!, la selecci6n tendem a promocionar y mantener una gran diversidad de moleculas MHC en la poblaci6n. Esta hip6tesis de que las enfermedades infecciosas han proporcionado la fuerza conductora para el polimorfismo MHC ha sido consolidada recientemente por las observaciones sabre individuos de Africa occidental que poseen un alelo espedfico de MHC y presentan una susceptibmdad reducida frente a una forma severa de malaria: mientras que el alelo raramente se encuentra en OlTas regiones, se encuentra en un 25% de la poblaci6n de Arrica occidental, donde dicha fonna de malaria es generalizada. Si una mayor diversidad de MHC significa una mayor resistencia a la infccci6n, tpor que poseemos tan pocos loci que codifican estas moleculas, y por que no hemos desarroUado esuategias para incrementar su diversidad -mediante maduraci6n allernaliva de RNA, por ejemplo, 0 mediaJ1le mecanismos de recombinaci6n genetica encaminados a diversificar los anticuerpos? Posiblemente, sea debido a que cada vez que una nueva molecula MHC se ai'lade al repertorio, las celulas T que reconocen pcptidos propios asociados con una nueva molecula de MHC debcn eliminarse para mantener la aUlowlerancia. La eliminaci6n de dichas celli las T deberfa eontrarrestar la ventaja de afiadir la nueva molecula MHC. Asf, el nlimero de moleclilas MHC que expresamos puede representar un equilibrio entre las vcntajas de presentar una gran diversidad de peptidos extrai'los a las cell/las T y las desvcnlajas de restringir el eonjunlo de eelulas T.

Las moleculas de reconocimiento inmunitario pertenecen a una antigua superfamilia 48

•

I

La mayorfa de las prolcfnas que median el reconocimienlo celula-celula 0 el reconocimiento de antfgenos en el sistema inmunilario conticnen elementos estructuraJes relacionados, 10 eual sugiere que los genes que las codifican poseen una historia evolutiva com un. Incluidos en esta superfamilia Ig se encuenlTan los allticuerfJOs. los receplOres de las cilulas T, las prote(nas MHC, los correccptores CD4, COB y CD28, la mayorfa de las cadenas polipeptfdicas invariables asociadas con los receptores de celuJas 8 y T, Ylos varios receplores Fcde linfocilOs y de OlTOS gl6bulos blancos -todos ellos comienen uno 0 mas dominios de inmunogiobuJina 0 con aspecto de inmunoglobulina (unidades de 110molog(a Ig). En reaLidad, un 40% de los aproximadamente ISO poLipeptidos que han sido caracterizados de la superficie de Los gl6bulos blancos pertenecen a esta superfamilia. Cada uno de estos dominios con aspeclO de inmunoglobulina consta de unos 70-110 aminoacidos de longilud y parcce que se pliega segun una eslruclUra caracterfstica con aspecto de "bocadino~ fonnada por dos laminas ~ antiparalelas, estabilizadas nonnalmente por un enlace disulfuro eonservado. Muchas de estas

Seleccl6n del reperrorlo de celulas T

1339

: • enlace dilulfl1ro

Thy-'

,euptor Fe

ploterna MHC de el.....

prot,in. MHC d, eillse II

receplorde celuh. T

inmunoglobuline

genIl:rados por reagrupamieflto de segmenlOS g6nicos

CD<

CIl8

complejo CDJ

mol~culas son dfmeros u olig6meros mayores en los cuales los dominios con aspecto de inmulloglobu.lina de una cadena interaccionan con las de la OlIa (Figura 23-60). Normalmente. la mayorfa de los aminoacidos de cada dominio COil aspecto de inmulloglobuJina estdn codificados por un ex6n, y parece probable que la familia supergeniea entera evolucionara a partir de un gen eodifieante de un unko dominio con aspeeto de inmunoglobulina -similar al que codifica la P2-mleroglobulina (vease Figura 23-45AJ 0 la protefna Thy-! (v~ase Figura 23-60J- que puedcn huber panicipado en la mediaci6n de las ilHeracciones c~lula·eel\lla. Existen evidencias que demuestran que este gen primordial surgi6 antes de que los vertebrados divergieran de sus antepasados invertebrados, haee unos 400 millones de anos. Probablemente los miembros de la nueva familia surgieron por duplicaci6n de genes y de exones; sueesos de duplicaci6n similares a estos dieron lugar probablcmenle a los segmentos genicos muhiples codificantes de los antieuerpos y de los receptores de las celulas T.

Resumen El (X1II}IIIIIO de ululas T se manticmen principalmente por lura combinacl6" de procesos de selea::i6n positiva y negatilKl que aetlkln en el ti"w durante el desarrollo tie las dlulas T. Dicl,os PrrJUSOS aseguran que s610 sobrev;lJtlll y mad"rell las dlulas T con receptores potellcialme"te utiles mie"tras que las otras sujre" 10 mllerle ceilllor programada: las ulllias T qlle sean capaces de recouoeer piptidos extraiios que forman complejos COli molkulas MHC proplas son selea::ioruliuu positilmmetlte. mielltras qlle las dluUu T que reaccio"atl fuertemetlte corr piplidos propios q"e fomum complejos CO" molkulas MHC propias SOil eliminada.s. lA mayoria de leu prote{neu implicadas etl el reamocimiento imerall"lar yen el reCimocimietllO IIlrtiginico en el sistema inmunitarlo, inclll.yfmdo los atrticuer1340

Capflulo 23: £I sistema lnmunitario

Figura 23·60 Algunas de las protefna5 de membrana pertenec:lentes a la superfamllla de las lnmunoglobullnas. Los dominios de la inmunoglobulina se mueslran en color gris y los dominios de uni6n a1 antfgeno en azul. La superfamilia de las inmunoglobulinas tambien induye muchas protefnas de superficie celular implicadas en las interacciones celula· celula fuera del sistema inmunilario, tales como la molecula de adhesi6n celular neural (N-CAM) estudiada en el Capftulo 19 y los receptores para diferentes factores de crec:imiento estudiados en los Caprtulos 15y 17 (no se muestran en la figural.

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Cancer ....... I '11.J.UU"• . . . . , Iii"'•

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En los parses pr6speros del mundo, aproxirnadamente una de cada cinco personas morir<1. de cancer; sin embargo, ~sta no es la raz6n por la que Ie dedicamos un capitulo de este libra aJ lema del cancer. Las enfermedades cardfacas causan mas muenes y en todo el mundo otros problemas sanitarios. como la malnurnci6n y las infecciones parasilarias. son mas graves. Sin embargo, en el comexto de la biologia celular, el cancer delle una irnportancia tinica, ya que 1a familia de enfennedades agrupadas bajo ese titulo refieja alteraciones de las pautas de componamiento mas fundamentales de las celulas en un organismo pluricelular. Para comprender el cancer y para idear procedimienlos racionales para tcatarlo, debemos comprender tanto los procesos intemos de las celulas como sus interacciones sociales en los lejidos del cuerpo. Asf, el esfuerw dedicado a la invesligaci6n del cancer no s610 ha beneficiado al propio lratamiento del cancer sino tambien un area mas amplia del conocimiento medico. Va hemos comentado muchos de los aspectos relacionados can la investigaci6n del cancer en los capftulos ameriores. En este capftulo de conclusi6n examinaremos la enfermedad en sf misma. En la primera secci6n consideraremos la naturaleza del cancer y la hiSlOria natural de la enfermcdad desde cl punta de vista celular; en la segunda sccci6n nos centraremos en su base molecular.

EI cancer como un proceso de microevoluci6n I El cuerpo de un animal puede contemplarse como una sociedad 0 ecosistema cuyos miembros son celulas, que se reproducen por divisi6n celular y que estan organizadas en conjuntos de celulas que colaboran enU'e sf, 0 tejidos. En nuestra observaci6n anterior sobre el mantenimiemo de los tejidos (en el Capflulo 22). nuestros puntos de interes eran similares a los del ec610go: nacimientos celulares, muertes, habitalS, Iimitaciones territoriales, el manlenimiento del tamano de las poblaciones y cosas por el estilo. El Unico t6pico ecol6gico manifiestamente ausente era el de )a selecci6n natural: no comentamos nada sobre competencia 0 mutaci6n entre celulas somaticas. La raz6n es que, en 10 que a eUo respecta, un cuerpo sano es una sociedad muy particular, en la que el autosacri· f1eio, mas que )a competencia, es la nonna: todos los linajes de celulas somaticas estan condenados a morir, sin dejar progen..ie pero dedican su existencia a sustemar las celulas genninales, que son las tlnicas que tienen la oportun..idad de sohrcvivir. No se trata de ningt1n misterio, porque el cuerpo es un clan, y el genoma de las celulas somdticas es el mismo que el de las celulas germinales; por 1345

lanto, con su autosacrificio par el bien de las celulas germinales, las celulas somaticas ayudan a propagar copias de sus propios genes. En contraste par consiguienlc con las celulas de vida indepcndiente como las bact'erias, que compilen para sobrevivir. las relulas de un organismo pluricelular estan comprometidas a colaborar. Cualquier mUlaci6n que origine un componamicnto no altruista de miembros individuales de la cooperativa arriesgam. el futuro de la totalidad de la empresa. Por tanto. la mutaci6n, la competencia. y la selecci6n natural actuando denlro de la poblaci6n de celulas somaticas son los ingredientes bAsicos del cancer: una enfennedad en la que las celulas mutadas incUviduaJmenre empiezan a prosperar a cxpensas de sus vecinas. pero que finaJmente destroyen toda la sociedad celuJar. y mueren. En esta secci6n comentaremos el desarroUo del cancer como un proceso de microevoluci6n que se produce en una escaJa temporal de meses 0 arias en una poblaci6n de celulas del cuerpo. pero que depende de los mismos principios de mutaci6n y selecci6n narural que gobiernan la evoluci6n a largo plazo de todos [os organismos vivos.

Los canceres difieren en funci6n del tipo celular del que derivan 2 Las celu[as cancerosas est3n definidas por dos propiedades hereditarias: elias y su progenie (I) se reproducen a pesar de las restricciones normales y (2) invaden y colonizan territorios normalmente reservados para otras relulas. La combinaci6n de CStas caracteristicas es 10 que hace a los canceres especiaJmente peligro· 50S. Una ctHula anonnal aislada que no prolifere mas que sus vecinas nonnaJes. no produce ningtin dana signHicativo. sean cuales sean las otras propiedades desagradables que pueda lener; pero si su proliferaci6n esla fuera de control, producira un lumor 0 neopfnsmn -una masa de celuJas anormales creciendo inexorablemente. Sin embargo. si las celulas neoplasicas permanecen agrupadas en una masa Unica, se cUce que el tumor es benigno y generalmente puede conseguirse una curaci6n comple!a extrayendo la masa quinirgicameme. Un tumor se considera canceroso s610 si es maligno, es decir. si sus celulas lienen la capacidad de invadir el tejido circundante. La capacidad invasora implica, generalmen Ie. la habilidad de Iiberarse. entrar en el torrenle sangufneo 0 en los vasos linfaticos, y formar tumores secundarios 0 metastasis en otros lugares del cuerpo (Figura 24-1). Cuanlo mas ampliamente produzca melastasis un cancer. mas diffcH resultara de erradicar. Los can ceres se c1asifican de acuerdo con el tejido y con eJ tipo ce[ular a partir de los que se originan. Los canceres procedentes de celulas cpitelia[es se denolllinan carcinomas; los que proceden de tejido conjuntivo 0 de ceJulas muscuJares se dcnominan sarcomas. Entre los c<1nceres que no encajan en ninguna de luOOIO. glandularal

norm,ln

1_" If,nlyerun

neopI,bicol

tejido coniuntiYO fibroso dallumor

benigno

ADENOMA (BENIGNO)

1346

Callftulo 24 : Cancer

malignos tfpicamente producen metastasis, haciendo que el cancer sea diffcil de erradicar. EI dlbujo muestra las localizaciones mas frecuentes de metastasis en la meduJa 6sea procedentes de un carcinoma de pr6stata. (De Union Intemalionale Conue Ie Cancer, TNMAtlas: illUStrated Guide to the Classification of Malignam Tumors, 2nd ed. Berlin; Springer-Verlag. 1986.)

Figura 24-2 Contraste entre un

cloplYl, de lubulos glandulafll'

Figura 24·1 MeUistasls. Los mmores

lubulO' gl,ndularel normaln

tubulos: glandulaflll Inya.llfOl canceroso.

ADENOCARCINOMA (MALIGNO)

tumor glandular benJgno (adenoma) y una tumor glandular mallgno (adenocardnoma). Estos tumores pueden tener muchas formas; el diagrama i1ustra esquemalicamente los lipos que pueden encontrarse en la mama.

Tabla 24-1 Incfdencfa de clincer y mortaUdad por clincer en £.stados Unidos, 1993 Tlpo de cancer

N. O de casos nuevos cada ano

Numero total de canceres 1170000 Canceres de epilelios: carcinomas 992700 Cavidad orat y faringe 29800 Organos digeslivos (tolal) 236900 Colon y recto 152000 Pancreas 27700 Esl6mago 24000 Hfgado y sistema biHar 15800 Sistema respiratorio (total) 187100 Pulm6n 170000 Mama 183 000 Piel (IOlal) (>700 000)' Melanoma maligno 32000 Traclo reproductor (total) 244400 Pr6stala 165000 Ovario 22000 Cuello ulerino 13500 Otero (endometrio) 31000 Organas urinarios (lotal) 79500 Vejiga 52300 CAnceres de los sistemas hematopoyetico e inmunitario: leucemias y linfomas 93000 CAnceres del sistema nervioso central y del ojo: gliomas, retinoblastoma, etc. 18250 Canceres de tejidos conjuntivos, musculos y vasculatura: sarcomas 8000 Todos los demlis cAnceres + lugares no eSj:lecificados 57050

(85%) (3%) (20%)

(13%)

N. o de muertes cada ana 528300 417175

noo 120325

(1%)

57000 25000 13600 12600

(16%) (15%) 06%)

154200 149000 46300

(2%)

(2%)

(79%) 0%) (23%) (11%) (5%)

(3%) (2%)

59950

(29%) (28%) (9%) (2%) (1%) (11%)

35000

(7%)

13300 4400 5700

(3%) (1%)

20800 9900

(4%) (2%)

(8%)

50000

(9%)

(2%)

12350

(2%)

(1 %)

4150

(I %)

(5%)

43425

(8%)

(3%) (21%) (14%) (2%) (1%) (3%) (7%) (4%)

9100 6800

(1%)

• Los clnceres de piel que no son melanomas no se han incluido en el numero 10Ial de dnceres, ya que la mayona de eUes se curan ficilmente y muchas de elias no se registran En el mundo enlero, los cinco lipos ~ frecuenles de clncer son los de pulm6n. csl6mago. mama, colon/recto y cuello ulerino, y el numero IOlal de casas nuevos de dincer cada ano sobrepasa los 6 millones. Ob~rvese que 5610 aproximadamenle 1a rnitad de la genic que desarrolIa un cancer mucre por esla causa. (Dalos para EEUU de American Cancer Society. Cancer Facls and Flgwes, 1993.)

estas dos amplias calegorias se encuemran las diversas foonas de leucemIa, derivadas de celulas hematopoy~ticas,y los canceres derivados de c~lulas del sistema nervioso. La Tabla 24·) enumera los tipos de cancer mas frceuentes en Estados Unidos, indicando su incidencia y la frecuencia de muertes que producen. Cada una de las grandes calegorfas tiene muchas subdivisiones de acuerdo con el tipo celular de que se tratc, la localiwci6n ell cl cucrpo y la estructura del tumor; mllchos de los !lombres utilizados estan fijados par tradki6n sin quc tengan ninguna base racional medema. Paralelamente a la serie dc nombres para lumores malignos, existe una serie de nambres relacionados para tumares benignos: un adenoma, por ejemplo, es un tumor epilelial benigna can una organizaci6n glandular, siendo eltipo de tumor maligno correspondiente un adellocarcilloma (Figura 24-2); un oolldroma y un oo"drosarooma son, respectivamente, tumores de canflago benigno y maligno. Aproximadamente el 90% de los canceres humanos son carcinomas. quizas porque la mayor pane de la proliferaci6n celuJar del cuerpo se producc en los epitelios. a quiuis porque los tejidos epileliales eSlan expuestos mas frecuentemente a las diversas foonas de Icsi6n ffsica y qu(mica que favorecen el desarrollo del cancer. EI Clincer como un proceso de microevoluci6n

1347

Cada cancer tiene caracteristicas que reflejan su origen. As!, por ejemplo, las celulas de un carcinoma de celulas basales epidennico, derivadas de una estirpe de celulas queratinocfticas de la pie!, generalmente continuaran sintetizando filamentos intermedios de citoqueratina, mientras que las celulas de un melanoma, derivadas de una celula pigmentaria de la piel, a menudo (aunque no siempre) continuaran produciendo granulos de pigmento. Los canceres que se originan a partir de diferentes tipos celulares son, en general, enfermedades muy distintas. EI carcinoma de celulas basales, por ejemplo, s610 es invasive de forma local y raramente fonna metastasis, mientras que el melanoma es mucho mas maligno y rapidamente produce un IlI.lmero de metastasis mucho mayor (comportamiento que recuerda las tendencias migratorias de los precursores de las celulas pigmentarias normales durante el desarrollo, discutido en el Capitulo 21). Generalmente, el carcinoma de celulas basales puede eliminarse facilmente mediante cirugfa, consiguiendose la curaci6n completa; sin embargo, una vez que el melanoma maligno ya ha formado metastasis, resulta normalmente imposible de exrirpar, por 10 que resulta fatal.

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I, poblacl6n de clilulu tumorales se duplica

La mayona de canceres derivan de una sola celula anormaP Incluso cuando el cancer ha producido metastasis, normalmente puede determinarse su origen como un unico tumor primario que procede de un 6rgano determinado y probablemente derivado por divisi6n celular de una sola celula que ha sufrido alglin cambia hereditario que Ie permite crecer mas que a sus vecinas. Pero cuando se detecta por primera vez un tumor dpico, ya tiene miles de millones de celulas (Figura 24-3), a menudo induye muchas celulas normales -por ejemplo fibroblastos en el tejido conjuntivo de sosten que esta asociado al carcinoma. tQue evidencia tenemos de que las celulas cancerosas sean, en efecto, un cion descendiente de una unica celula anormal? Una manera de demostrarlo consiste en el analisis del DNA de las celulas. En casi todos los pacientes con leucemia mie16gena cr6nica, por ejemplo, los g16bulos blancos leucemicos se distinguen de las celulas nonnales par una anormalidad cromos6mica especffica (el llamado cromosoma Filadelfia, originado, como se muestra en la Figura 24-4, por una translocaci6n entre los brazos largos

Figura 24-3 Creclmlento de un tumor humano tfplco como el tumor de mama. E1 di
Figura 24-4 Translocacl6n entre los cromosomas 9 y 22 responsable de la leucemia miel6gena cr6nlca. EI menor de los dos cromosomas anonnales resultantes se denomina cromosoma Filadelfia, nombre de la ciudad donde la anomalia se registr6 por primera vez.

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22

'q' (Ph')

1348

Capitulo 24: Cancer

de los cromosomas 9 y 22). Cuando el DNA dellugar de la translocaci6n es clonado y secuenciado, se obselVa que ellugar de ruptura y de reuni6n de los fragmentos translocados es identico en todas las celulas leucemicas de un mismo paciente, pero que difiere ligeramente (en varios cientos a miles de pares de bases) de un paciente a otro, como cabrfa esperar si cada caso de leucemia surgiese a partir de un accidente unico que se produjera en una sola celula. Posteriormente veremos c6mo las translocaciones Filadelfia conducen a leucemia por una inactivaci6n inadecuada de un determinado gen. Otro modo de demostrar que un cancer tiene un origen monoclonal consiste en utUizar el fen6meno de la inactivaci6n del cromosoma X. Una mujer normal es una mezcla al azar, 0 un mosaico, de dos clases de celulas -las que tienen inactivado el cromosoma X paterno y las que tienen inactivado el cromosoma X materno (se comenta en el Capftulo 9). La inactivaci6n de uno de los cromosomas X ocurre aI azar en cada celula en una fase temprana del desarrollo embrionario, pero una vez se ha producido, la elecci6n es irreversible; por 10 tanto cuando la celula se divide pasa a su descendencia su estado de inactivaci6n del cromosoma X. Por 10 tanto, el estado de inactivaci6n del cromosoma X-materno a paterno- puede utilizarse como un marcador hereditario para deducir ellinaje de las celulas del cuerpo. En la gran mayorfa de los tumores que se han analizado -tanto benignos como maligno5- se ha encontrado que todas las celulas tumorales tenfan inactivado el mismo cromosoma X, 10 cual sugiere que estas celulas derivan de una sola celula alterada (Figura 24-5).

Probablemente la mayorfa de canceres se inician pOT un cambio en la secuencia de DNA de una celula4 Si bien es cierto que una sola celula anormal genera un tumor, esta celula ha de transferir su anormalidad a su progenie: la anomalfa ha de ser hereditaria. Un primer problema para comprender un cancer es descubrir si la anomalfa hereditaria es debida a un cambio genetico -es decir, una alteraci6n en la secuencia de DNA de la celula- 0 a un cambio epigenetico -es decir, un cambio en la pauta de expresi6n genica sin que exista ningun cambio en la secuencia de DNA. Los cam bios epigeneticos heredables reflejan una memoria celular y constituyen una caracter(stica muy conocida del desarrollo normal, como se manifiesta en la estabilidad del estado diferenciado de las celulas y en fen6menos tales como la inactivaci6n del cromosoma X; a priori no existe ninguna raz6n obvia por la que estos cambios no puedan estar implicados en el desarrollo de procesos cancerfgenos. En algun caso -como en un tipo de cancer raro y extraordinario, el teratocarcinoma (vease Capftulo 21)- existen evidencias de que su odgen es epigenetico. Sin embargo, existen buenas razones para pensar que la mayorfa de los canceres se inician debido a un cambio genetico. Asf, a menudo puede obselVarse que las celulas de un determinado tjpo de cancer comparten una misma anormalidad en su secuencia de DNA, como se ha comentado para la leucemia miel6gena cr6nica; en la segunda parte de este capftulo se comentaran muchos orros ejemptos de ello. Una evidencia de que el cambio genetico puede ser una causa de cancer proviene del estudio de agentes que se sabe que conducen a la enfermedad. La correlaci6n entre carcinogenesIs (la generaci6n de cancer) y mutagenesis (Ia producci6n de una cambio en la secuencia del DNA) esta clara para tres c1ases de agentes: los cancerCgenos quCmicos (que habitualmente causan simples cambios locales en la secuencia de nucle6tidos), las radiaciones ionizantes, como los rayos X (que tipicarnente causan roturas de cromosomas y translocaciones) y los virus (que introducen en las celulas DNA ajeno). El papel de los virus en el cancer se comentara posteriormente; ahora pasaremos a comentar los cancerfgenos qufmicos. En general, no puede responsabilizarse completamente a un unico suceso 0 a una causa unica, de la aparici6n de un cancer dado: como veremos, par regia general los canceres son el resultado de que en una celula se produzcan de forma aleatoria varios accidentes independientes, cuyos efectos son acumulativos. El d.ncer como un proceso de mlcroevoluci6n

Figura 24-5 Evidencia que demuestra el orlgen monoclonal de los cltnceres, a partir del anlUlsls de mosalcos de lnactlvacl6n del cromosoma X. Como resultado de un proceso al azar, que se produce en una fase temprana del embri6n, pnkticamente todos los tejidos nonnales del cuerpo de una mujer son una mezcla de celulas que presentan diferente heredabilidad del cromosoma Xinactivado (indicada aquf par la mezcla de celulas rajas y celulas grises en el tejido norma]). Sin embargo, cualldo se determina la expresi6n de Ull gen marcador ligado a Xen las celulas de un cancer, generalmente se obtiene que todas elias tienen el mismo cromosoma X inactivado. Esto implica que todas ellas derivan de una unica celula cancerosa inicial.

1349

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0

0

o

0

0

0

OH oxidesas esociadas con 81 citocromo P·4SO OCH,

0

0 N OCH, H,N

N

0

N DNA

AFLATOXINA

AFLATOXINA-2,3-EPOXIDO

AGENTE CANCERfGENO UNIDO A GUANINA EN EL DNA

Sin embargo. se conaeeo algunos agentes extraordinariamente cancerfgenos que aumentan la probabilidad de los sucesos crfticos hasta el punto de que, dada una dosis 10 suficientemente alta de dicho compuesto, se haee practicamente inevitable que al menos una celula del cuerpo se convierta en cancerosa. EI compuesto 2-naflilamina. utilizado en la industria qu(mica a principlos de siglo, es un ejemplo oalorio de ello: en una fabrica briHinica, lodos los hnmhres contratados para destilarlo Cy que, por \0 tanto, estuvieron sometidos a una exposici6n prolongada) desarrollaron con el tiempo cancer de vejiga. Muchas compuestos qufmicos bastante dispares tam bien se han mostrado cancerfgenos cuando son ingeridos por animales experimentales 0 son aplicados repetidamente sobre su piel. Algunos de estos agenles cancerfgenos acn1an directamenle sobre las celulas diana; muchos olros actuan s610 despues de haber sido modil:icados a una forma mas reactiva a Iraves de un proceso metab6li· co --especialmenle por una serie de enzimas intracelulares conocidas como las citocromo P-450 oxidasas, que normalrnente ayudan a convertir las toxinas ingeridas y los materiales Iiposolubles ajenos en compuestos menos daflinos y faciles de excretar, pero que can ciertas subslancias fracasan en esta tarea can virtiendolas, par el contrario, en cancerfgenos direclos (Figura 24-6). Aunque los agentes cancerfgenos qufmicos conocidos son rnuy diversos, la mayoria de eUos tienen al menos una propiedad en corn un: producen mutaciones. En un ensayo clasico utilizado para poner de manifieslo la capacidad ffiulagenica, el agente cancerfgeno se rnezcla con un extracto activador preparado a partir de celulas de hfgado de rata (para mimetizar el procesamienlo bioqufmico que se produce en un animal intacto) y se ai'iade a un cultivo de baclerias especialmente disefiado para el ensayo; a continuaci6n se determina la frecuencia de mutaci6n resultante de las bacrerias (Figura 24-7). Muchos de los compuestos que segun este ensayo se c1asifican como mutagenicos tambien producen muraciones ylo aberraciones cromos6micas cuando se ensayan en celulas de mamiferos. Cuando los resultados sobre capacidad mutagenica obtenidos a partir de diversas fuentes se combinan y se analizan, se encuentra que la mayorfa de los agentes cancerfgenos son mUlagenos. Sin embargo, existe una minor(a significativa de agentes carcin6genos que no aparentan ser mutagenicos. Posteriormente se comentani c6mo las substancias no mutagenicas pueden estirnular el desarrollo de un cancer afectando el comportarniento de celulas mutantes preexistentes. Pero en primer lugar hemos de considerar con que frecuencia es probable que surjan estas celulas mutantes en el curso normal de los acontecimientos.

Una sola mutaci6n no es suficiente para causar cancerl,S En un cuerpo humano se producen en el curso de una vida normal aproximadamente 10 16 divisiones celulares; en un rat6n, debido a su menor mimero de celulas y a su cicio vital mas corto, el numero de divisiones es aproximadamente de 10 12 • !neluso en un entomo que este Iibre de mutagenos, las mutaciones se pro· 1350

Capftulo 24: Cancer

Figura 24·6 Actlvacl6n metab6l1ca de un agente cancerfgeno. Muchos agcnlCS canccrfgenos quimicos han de ser activados par una transformacion melab6lica antes de que puedan reaccionar con el DNA y causar mUlaciones. El compueslo que se presenta aqui es la aflmoxina 81, una 100dna de un moho (Aspergillusflavus oryzael que crece sabre el grano y los cacahuetes cuando se almacenan en condiciones humedas en areas tropicales. Parece que esta substancia contribuye al desarrollo de cancer de hfgado en los tropicos y se asocia a mutaciones especfficas del gen p53 (comenlado mas adelan{c en eSle capltuJo).

, NO MUTAGENO

cultivo de SII/mana/la dependiente de histidine

alttraeto de hlgado homogeneizlldo

MEZCLA' EXTENo,,!i·;,WX(i.;::: Y

EN UN MEDIQ DE AGAR SIN HISTIDINA

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INCUBAR 2 OIAS

A 37°C

compuesto ensayado,

potenc'lIlmenle mut~geno

duciran espontaneamCnlC con una frecuencia estimada de aproximadamentc 10-" mutaciones por gen y por divisi6n celular -un valor que depende de limita· danes fundamentales en la precisi6n de la replicaci6n y de la reparaci6n del

DNA. Por 10 tanto, en eJ curso de la vida de cualquier ser humane es probable que en carla gen se haya producido una mutaci6n en unas 10 10 ocasiones difereotes, y en un rat6n en \lnas 106 ocasiones. Entre las celulas mutantes resultan· tes cabe esperar que muchas de elias presenten alteraciones en genes relaciona· dos con la regulaci6n de la divisi6n celular y que, por 10 tanto, desobedezcan las restricciones normales sobre la proliferaci6n celular. Desde este punto de vista, el problema no es por que se produce el cancer, si no par que se produce con tan poca frecuencia. Evidentemente, una unica mutaci6n no es suficiente para convertir una celula sana tfpica en una celula cancerosa que prolifere sin restricciones, porque de ser asf no serfamos organismos viables. Diversas Ifneas de evidencia indican que en realidad la genesis de un cancer requiere que se produzcan en la misma celula varios accidentes independientes y raros. Una indicaci6n de este tipo proviene de eSludios epidemiol6gicos sabre la incidencia de cancer en funci6n de la edad. Si fuera suficiente una sola mUlaci6n que se produjera con una probabilidad fija por afio, la probabiJidad de desarrollar cancer en cualquier ano dado deberfa ser independienle de la edad. Sin embargo, en la mayorfa de tipos de cancer la incidencia se incrementa abruptamenle can la edad -tfpicamente como elevada a la tercera, a la cuarta 0 a la quinta pOlencia (Figura 24-8). A partir de estas estadfsticas se ha estimado que se requieren entre tres y siete sucesos indepenmentes al azar, cada uno de ellos de baja probabilidad, para que una celula normal se transforme en cancerosa; los numeros mas bajos corresponden a leucemias y los mas altos a carcinomas. Ahora que se han identificado mutaciones especfficas responsables del desarrollo de cancer, ha sido posible probar en ratones transgenicos los efeclos de estos genes mutantes; como veremos posteriormente, los resultados proporcionan evidencias adicionales y mas directas de la hip6tesis de que una unica mutaci6n es insuficiente para producir un cancer. La hip6tesis rambien esta corroborada por muchos estudios anteriores del fen6meno de la progresl6n tumoral segun la cual un desorden inicialmenle benigno del comportamiento celular evoluciona gradualmente hasla un cancer en pleno desarrollo. Por otra parte, estas observaciones sobre c6mo evolucionan los tumores, proporcionan ideas sobre la naturaleza de los multiples camhios que deben suceder para que una EI cancer como un proceso de microevoluci6n

MUTAGENO

<·5;11"it7'· .. '" ".' .

CONTAR LAS COLONIAS DE BACTERIAS INDEPENDIENTES DE HISTIDINA

Flgura24-7 EnsayodeAmespara detcl'ffilnar la capacldad mutagenlca, EI ensayo utiliza una cepa de la bacleria Salmonella que necesita hislidina en el medio a causa de un defecto en un gen necesario para la sfntesis de histidina. Los ffiUll'igenos pueden producir OlrO cambio en este gen que revierta el defecto, generl'indose una bacteria que no necesite histidina. Para aumentar la sensibilidad del ensayo, la bacleria tam bien tiene un defecto en su mecanismo de reparaci6n del DNA, 10 cualla hace especlalmente susceptible a agentes que daiiell el DNA. La mayorfa de compuestos que son mutagenicos por ensayos como eS{e tambien son cancerfgenos, y viceversa.

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normal se transforme en cancerosa y sabre los factores que controlan su

producci6n.

Los canceres evolucionan mediante etapas lentas a partir de celulas alteradas benignas l ,S,6 Para los canceres que tienen una causa externa identificable, casi siempre existe un largo intervalo entre e1 (\os) suceso(s) causa\(es) y el inicio de la enfermedad: la incidencia de cancer de pulm6n no empieza a aumentar abruptamente hasta despues de 10 0 20 af'ios de fumar con intensidad; la incidencia de leucemias en Hiroshima y Nagasaki no aument6 marcadamente hasta unos 5 aflos despues de la explosi6n de las bombas at6micas, y no alcanz6 su maximo hast a transcurridos 8 afios; generalmente. los trabajadores industriales expuestos a agentes cancerigenos qu!micos durante un per!odo Iimitado de tiempo no desarrollan los canceres caracterfsticos de su ocupaci6n hasta 10,200 incluso mas afios despues de la exposici6n (Figura 24-9); etc. Durante este largo perfodo de incubaci6n, las presuntas celulas cancerosas experimentan cambios sucesivos. La leucemia miel6gena cr6nica, mencionada anteriormente, proporciona un ejemplo claro y simple aI respeclo. Esta enfermedad empieza como un desorden caraClerizado por una.sobreproducci6n no lelal de gl6bulos blancos y continua asf du-

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1352

Caprtulo 24 : Cancer

Figura 24-8 Incldencla de cancer en funcl6n de la edad. EI m1mero de nuevos casos de cancer de colon diagnosticados en mUjeres en Inglaterra y Gales en un ano se expresa en funci6n de la edad de diagn6stico y en relaci6n aJ numero total de individuos en cada grupo de edad; los mismos datos se presentan en una escala lineal ordinaria en (A) yen una escala logarftmica en (B). La Incidencia de cAncer aumenta abruptamente en funci6n de la edad, en este ejemplo aproximadamente elevada a la quinta potencia lesto es, la pendiente de la recta log-log en (B) es aproximadamente 5). Si una sola mutaci6n fuese sufidente para desencadenar el cancer, yesta mutaci6n tuviera la mlsma probabiLidad de ocurrlr en cualquler momento, la incidencia deberfa ser independlente de la edad (es decir, la pendiente de la grMica deberfa ser 0). Ello sugiere que una ctHula debe acumular los efectos disruptivos de aproximadamenle seis acddentes independientes antes de que orlglne un cancer de este tipo; la frecuencia de cada uno de eSlos acontecimientos es un factor Hmilante en la incidencia del cancer. (Datos de C. Muir er aI., Cancer Incidence in Five Continents, Vol. V. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 1987.)

Figura 24-9 Retraso de la aparlcl6n de cWtcer tras la exposlcl6n a un agenle cancerfgeno. La grMlca muestra el retraso hasta que se produce la aparlci6n del cancer de vejiga en una serle de 78 hombres que habfan estado expuestos al cancerigeno 2-naftllamina; se agrupan segl1n la duraci6n de su exposlci6n. (Modificado de J. Cairns, Cancer: Science and Society. San Francisco: W.H. Freeman, 1978. Segun M.H.C. Williams, en Cancer, Vol. III (R.W. Raven, ed.). London: Butterfield, 1958.)

•

rante vadas afios hasta que se convierle en una enfermedad de progresi6n mucho mas ntpida que generalmente finaliza, a los pocos meses, con la muerte. En la fase cr6nica temprana, las celulas leucemicas del cuerpo se distinguen simplemente porque presentan la translocaci6n de cromosomas mencionada anteriormente. En la siguiente fase aguda de la enfermedad, el sistema hematopoyetieo queda invadido par celulas que no s610 mueslran esta anormalidad cromos6mic'a sino tambien otras vadas. Parece como si las celulas del clan mutante inicial hubiesen sufrido mas mutaciones que las hicieran proliferar m<1s r<1pidamente (a dividirse mas veces antes de diferenciarse), de forma que llegan a exceder numericamente a las hematopoyeticas normales e incluso a sus primas que unieamente tenian el desorden primario. Parece que los carcinomas y otros tumores s6lidos evolucionan de un modo similar a este. En humanos, muchos de estos c<1nceres no se diagnostican hasta un estadio relativamente tardio, sin embargo en algunos casos es posible observar las primeras etapas del desarrollo de la enfennedad. AI final de este capftulo discutiremos otro ejemplo --el c<1ncer colon-rectal. Los c<1nceres de la cervix uterina (el cuello del utero) proporcionan otro ejemplo al respecto. Estos canceres derivan del epitelio cervical multilaminar, que tiene una organizaci6n similar a la de la epidermis de la piel (comentado en el Capitulo 22). Nonnalmente la proliferaci6n se produce s610 en la capa basal, generando celulas que entonces se desplazan hacia la superficie exterior, diferenciandose a 10 largo de este desplazamiento en celulas aplanadas ricas en queratina, que no se dividen y que finalmente se descaman de 1a superficie (Figura 24-lOA y E). Sin embargo, cuando se

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(8) dlsplasla

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IEl normal

EI cancer como un proceso de mlcroevolucl6n

(C) carcinoma In situ

(0) carcinoma maligno

Figura 24-1 0 Etapas de progresldn en el desarrollo de cancer enel epltello del cuello uterlno. (A-D) Diagramas esquematicos. En la displasia, las celulas mas superficiales lodavfa muestran algunos signos de diferenciaci6n. aunque es incompleta: se observan celulas en proliferati6n anormalmente alejadas de la capa basaL En el carcinoma in sim, las celulas de todas las capas estan proliferando y aparentemente estan indiferenciadas. La verdadera malignidad empieza cuando las celulas cruzan la lamina basal y empiezan a invadir el tejido conjuntivo subyacente. Pueden transcurrir varios anos desde los primeros signos de displasia hasta el initio del cancer c1aramente maligno. (El FOlograffa de una secci6n de un epitelio cervical nonnal. (Fl Fotograffa de una secci6n de una carcinoma cervical que empieza a ser invasive: laflecha apunla a las celulas que eSlan en el proceso de paso desde el epitelio al tejido conjunlivo inferior. (E y F, cortesfa de Andrew Hanby.)

1353

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10 11m

(8)

ICI

examinan muchas muestras de este epilelio, obtenidas de diferentes mujeres, no es raro encontrar placas de dlsplasla, en las que las celulas en divisi6n no estan confinadas en la capa basal, y ademas se presenta algtin desorden en el proceso de diferenciaci6n (Figura 24-108). Las celulas se descaman de la superficie en estadios anormalmenle tempranos de diferenciaci6n, y la presencia de la displasia puede detectarse raspando una muestra de celulas de la superficie y observandoJas al microscopic (tecnica de "frotis de Papanicolaou" -Figura 24-1l). A menudo las placas displ
Capftulo 24 : Cancer

Figura 24-11 FOlograflas de celulas recogldas par raspado de la superficle del cuello uterino (tecnlca de Papanicolaou 0 "Pap smear"). (A) Nannal: las celuJas son grandes y bien diferellciadas, can nudeas muy candensados. (B) Displasia; las celulas eslan en vaTias eta pas de diferenciaci6n, algunas de ellas baslante inmaduras. (C) Carcinoma invasivo; todas las celulas aparecen indiferenciadas, can escasa citaplasma y nudeo relativamente grande; entre las restos acompanantes hay algunos gl6bulos blancos. (Cortesfa de Winifred Gray.)

pan1meuos principales: (I) la velocidad de n1utaci6u, es decir, la probabilidad por gen y por unidad de tiempo de que cualquier miembro dado de la poblaci6n sufra un cambio gem1tico; (2) el mimero de iTldividllos de In pobfaci6T1" (3) la ve· locidad de reproducci6T1, es decir, el promedio del numero de generaciones pro· ducidas por unidad de tiempo; y (4) la vemaja selectiva de que disponen los individuos mutantes con ~xito, es decir. el cociente entre el mimero de celulas hijas sobrevivientes y fertiles par unidad de tiempo que producen cstas celulas mlltantes respecto al numero de celulas sobrevivientes y fCrtiles prodllcidas par las celulas no mutantes. Los estudios experimentales sobre la induccion del cancer en animales ilustran estos principios sobre evoluci6n.

El desarrollo de un cancer puede estar estimulado por factores que no alteran la secuencia de DNA de las celulas6,8 Las etapas por las que progresa una lesi6n inicialmente benigna hasta transformase en un cancer se pueden observar mas facilmente en la piel. Por ejemplo, pueden producirse canceres de piel en ratones aplicando repetidamente sobre la piel un carcin6geno qllfmico mutagenico, como el benzola)pireno (un constituyente del alquitn1n y del humo del tabaco), a el compuesto relacionado, dime· tilbenzo[a)amraceno (DMBA). Sin embargo, generalmente una sola aplicaci6n del ageme cancerfgeno no produce por si sola ninglin tumor 0 ninguna otra anormalidad permanente. A pesar de ello. esta substancia causa alteraciones genElUcaS latentes, 10 cual se pucde detectar a traves de una mayor incidencia de cancer cuanda las celulas eslan expuestas ya sea a tratarnientos pasteriores con la misma substantia 0 a otro tipo de agresiones. bastanle distinlas. Un carcin6· geno que siembra la semilla del cancer de esta forma se dice que acnia como un inicla~or tumoral. EI solo hecho de herir la piel que ha sido expuesla una sola vez a uno de estos iniciadores pllede suponer que se desarrollen canceres a partir de algunas de las celulas del borde de la !lerida. A1ternalivamente, la exposlci6n repctida durante un perfodo de meses a cierlas substanclas conocidas como promotores (umorales. que en sf mismos no son mutagenicos, pueden producir cancer selectivamente en una piel que previamente ha sido expuesta a un iniciador tumoral. Los promotores tumorales mas ampliamente estudiados son los ~steres defarOOI como el acetato de tetradecanoilforbol (TPA, de TetradecanoylPhorbol Acetate), de los que hemos tratado en otTO contexto como activa· dores arlificiales de la protefna qllinasa C {yen consecuencia como agentes que aClivan parlC de la via de seflalizaci6n intracelular dcl fosfatidilinositol, cornelltado cn el Capitulo 15. Estas subslancias causan canccr con una frccllencia alta tan s610 si se aplican despues de lin tratamiento con un iniciador mutagenico (Figura 24·12).

cANCER

CANCER

---------------il

NO CANCER

cANCER

liempo_

EI cancer como un pTOCeso de mlcroevolucl6n

Figura Z4·IZ Algunos programas poslbles de ~posicl6n a un Inlclador tumoral (mutag~nlco) ya un promotor tumoral (no mutag~nico) y sus consecuenclas. Tan S(jlo aparece cancer si la exposici6n al promotor sigue a la exposici6n del iniciador, y S(jl0 si la intensidad de la expositi6n aI promotor excede un cierto umbra!. Tambi~n puede producirse dncer como resultado de la exposici6n repetida solamente al iniciador.

1355

l

Inlclador tumoral

ctilule normel

promotor tumoral o producc16n de una herida

muteci6n creede en un gen de prolifereci6n eilenciollo

La mayorfa de canceres se producen por combinaciones evitabIes de causas ambientales9 Generalmente, el desarrollo de un cancer comprende muchas etapas, cada una de las cuales esta gobernada por multiples factores: algunos de ellos son dependientes de la constituci6n genetica de los individuos, otros son dependientes de su entomo y de Sil modo de vida. Por 10 tanto, cambiando nuestro medio ambiente 0 nuestros habitos podemos, en principio, ser capaces de reducir notaCapitulo 24 : Cl1ncer

,

el promotor 0 Ie heride inducen Ie elCprell16n gtinlca

Como cabe esperarse de un dana genetico, los cambios OCllltOS producidos por un iniciador tumoral son irreversibles: asf, se pueden poner de manifiesto mediante tratamiento con un promotor tumoral incluso despues de un largo intervalo de tiempo. Aparentemente, et efecto inmediato del promotor es estimular la divisi6n celular (0 hacer que las celulas que normatmente seguirfan una diferenciaci6n terminal continuen dividiendose); la exposici6n previa al iniciador provoca el crecimiento de una gran cantidad de pequeiios tumores benignos parecidos a verrugas, denominados papilomas. Cuanto mayor es la dosis previa del iniciador mayor es el numero de papilomas inducidoi parece que cada papiloma (al menos para dosis bajas del iniciador) consiste en un unico cion de celulas descendiente de una celula mutante producida por el iniciador. Probablemente tanto la herida como la aplicaci6n del promotor actuan induciendo la expresi6n de algunos de los genes que directa 0 indirectamente afectan ala proliferaci6n celular. Estos genes pueden permanecer quiescentes en el epitelio en reposo, de manera que cualquier mutaci6n que se haya producido en respuesta al iniciador pasa inadvertidai al inducir la expresi6n genica, el promotor 0 el estfmulo de la herida pueden poner de manifiesto las mutaciones y permitirles empezar a innuir en la proliferaci6n celular (Figura 24-13). Un papiloma tfpico puede contener aproximadamente lOs celulas. $i se interrumpe la exposici6n al promotor tumoral casi todos los papilomas entran en regresi6n y la piel recupera una apariencia pnicticamente normal -como cabrfa esperar a partir de la hip6tesis illlstrada en la Figura 24-13. Sin embargo, en tinos cuantos tipos de papilomas se producen cambios adicionales que permiten que el crecimiento continue de forma incontrolada. incluso despues de que se haya retirado el promotor. Estos cambios parecen originarse de vez en cuando en celulas de papiloma individuales, con una frecuencia aproximadamente igual a la esperada para las mutaciones espomaneas. De esta forma, una pequena proporci6n de los papilomas progresan hasta convertirse en canceres. Asi, aparentemente el promotor tumoral favorece el desarrollo del cancer, al menos en este sistema, expandiendo la poblaci6n de celulas que llevan una mutaci6n inicial: cuantas mas celulas haya, y mas veces se dividan, mayor sera la probabilidad de que al menos una de elIas sufra oITa mutaci6n que la adelante un paso en el camino hacia la malignidad. Aunque los canceres que se producen naturalmente no surgen necesariamente a traves de la secuencia espedfica de distintos pasos de iniciaci6n y promoci6n que acabamos de describir, su evoluci6n puede estar gobernada por principios similares a estos. Estos canceres naturales tam bien evolucionaran a una velocidad que depende de la frecuencia de mutaciones y de factores que afecten la supervivencia, la proliferaci6n y la expansi6n de ciertos tipos de celulas mutantes, despues de que dichas celulas hayan aparecido.

1356

EXPANSION ANORMAL DEL CLON MUTANTE

Figura 24-l3 Una hlp6tesls

propuesta para expllcar el efecto de 108 promotores tumorales sobre el desarroUo de lumores. Un iniciador causa la mutaci6n en un gen que normalmente no se expresa en celulas en reposo. El promotor activa el gen mUlado y, provocando la divisi6n celular, aumenta el mimero de celulas que contienen la mutaci6n. Altemativamente. el gen mutante

puede expresarse de fonna constitutiva pero no tener efecto hasta que el promotor active otros genes necesarios para la proliferaci6n celular.

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Tabla 24·2 Varlacr6n entre parses en la lncldencla de algunos cMceres eomunes Lugar de orlgen del cancer Poblael6n de alta Incldencla Locallz.acl6n Pulm6n Mama Prostata Cuello del utero Est6mago Hfgado Colon Melanoma Nasofarfngeo Es6fago Vejiga Otero DYario Recto Laringe PtIlereas Labio RiMn Cavidad Oral Leucemia Testfeulo

Poblacl6n de bala Incldencla

lncldencla* Locallzaci6n

EEUU (Nueva Orleans, negros) Hawaii (hawaianos) EEUU (Atlanta, negros) Brasil (Recife) JapeSn (Nagasaki) China (Shangai) EEUU (Connecticut, blancos) Australia (Queensland) Hong Kong Francia (Calvados) Suiza (BasHea) EEUU (San Francisco Bay Area, blancos) Nueva Zelanda (Islenos polinesios) Israel (europeos y naeidos en EEUU) Brasil (Sao Paulo) EEUU (Los Angeles, eoreanos) Canad.1 (Newfoundland) Canad.1 (NWT y Vulcon) Francia (Bas-Rhin) Canad.1 (Ontario) Suiza (Vaud urbano)

Incidenela·

110 India (Madrns) 9. Israel (no judfos) 91 China (fianjfn)

5,8 14,0 1.3 83 Israel (no judfos) 3,0 82 Kuwait (kuwaitfes) 3,7 34 Canad.1 (Nueva Escocla) 0,7 34 India (Madras) 1.8 31 JapeSn (Osaka) 0,2 30 Reino Unido (Sudoeste) 0,3 30 Rumania (Ouj urbano) 1,1 28 India (Nagpur) 1.7 26 India (Nagpur) 1.2 26 Kuwall (kuwaitfes)

3,3

Kuwait (kuwaitfes)

3,0

23

JapeSn (Miyagi rural) India (poana) Jap6n (Osaka) India (Poona) 14 India (poona) 12 India (Nagpur) 10 China (fianirn)

18 16 15 15

2,1 1,5 0,1 0,7 0,4 2,2 0,6

'Ineldencta:: mlmero de casos nuevos por ano por cada 100 000 personas, aJustado para una distribucldn de edades estandarizada (para eliminar efectos debidos meramente a la dislribu· cidn de la edad de la pobladdnl. Los valores de c
blemenlc nueSlra posibilidad de desarrollar casi cualquier tipo dado de c
1357

Figura 24·14 Efectos del parto sobre el riesgo de padecer elineer de mama. La probabilidad relativa de desarrollar cancer de mama en algun momenta de la vida de una mujeresta representada en funci6n de la eclad a la que dio a luz su primer hljo. La grafica mueslra el valor de la probabilidlld respeclO a la de las mujeres sin hijos. Cuanto mayor es la espera anles de dar a luz el primer hijo, mayor es la probabilidad de cancer de mama. 10 cual sugiere que la exposici6n a cierlas combinaciones de homlOnas sexuales puede eslimular el desarrollo de Clincer. A partir de estudios de laboralorio se dispone de dena evidencia de que la primera geslaci6n completa puede producir un cambio epigenelico permanenle en las celulas de la mama. alterando su respuesla poslerior a las hormonas. Muchos olms faelores -por ejemplo, el contenido en grasa de la dieta- eslan lambien ahameme correlacionados con el clncer de mama. y algunas mujeres son porladoras de genes que aumentan el riesgo a la enfermedad. (De ,. cairns, Cancer: Science and Society. San Francisco: \V.H. Freeman, 1978. Conforme a B. MacMahon, P. Cole y J. Brown, /. NatL CAncer l11SI. 50:21-42, 1973.)

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La busqueda de curaciones para el cancer es dura pero no irnposible 1o La dificultad de curar un cancer es como la de librarse de las malas hierbas. Las celuJas cancerosas pueden ser extirpadas quinirgicamente 0 destruidas con agentes t6xicos 0 con radiaci6n, pero es diffcil erradicarlas todas y eada una de elias. La ci.rugia raramcnte puede descubrir todas las metl1stasis, y los tratamientos que matan a las cl!lulas cancerosas generalmentc tambil!n son t6xicos para las cl!luJas normales. Ademl1s. con que queden unas cuantas ccHulas cancerosas, pueden proliferar y producir un resurgimiento de la enfermedad; a diferencia de las cl!lulas normales, pueden desarrolla.r resistencia a los t6xicos ulilizados en su contra. A pesar de todo ello, la perspectiva no es desesperada. A despecho de las dificultades, se han desarrollado curas efectivas milizando drogas anticancerosas (solas 0 en combinaci6n con otros tratamientos) contra algunos cAnceres que anteriormente eran muy lelales (especialmenlc el linfoma de Hodgkin, el cAncer de teslfculo, el coriocarcinoma, algunas leucemias y algunos onos tipos de cAncer de la infancia). Ademl1s, pa.ra el caso de algunos de los canceres ml1s comunes, una cirugfa apropiada 0 una radioterapia local permilen la recupera-

1358

Capftulo 24 : Gincer

mujMe!. sin hljos

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dares tumorales mutagl!nicos, provocando directamente un cambio genl!tico; otros probablememe acttlen como promolores tuInorales, ayudando a aumentar la poblaci6n de cl!lulas obligadas a progresar, a traves de sucesivas mutaciones, hasta conseguir un cAncer en pleno desarrollo. Probablemente tanto los agentes cancerigenos del humo del tabaca como la aflatoxina producida en los cacahuetes tropicales (vl!ase Figura 24-6), pertenecen fundamentalmenle a la primera categoria, miemras que las hormonas reproduclOras que circulan en el cuerpo de una mujer durante diferenles etapas de su vida podrlan pertenecer a la segunda categorla. La imporlancia de estas honnonas queda establecida en la esuecha correlaci6n exiSleOle eOlre el historial reproductor de la mujer y el riesgo a desarrollar cl1ncer de mama; probablemente estas hormonas afectan la incidencia de c~ncer a trav~s de su inOuencia sobre la proliferaci6n celular en la mama (Figura 24-14). Es posible que algunos otros factores tambil!n actuen por otros canlinos -por ejcmplo, eausando cambios epigen~ticos heredables. Evidentemenlc, no es necesario comprender c6mo actuan los agentes causantes de cancer para poder identificarlos y aprender c6mo evitarlos. En eSle sentido, la epidemiologfa sobre el c<\ncer ha tenido exilos nOlables y en el futuro probablemente tendra muchos ml1s; simplemente mencionando el riesgo de fumar, en Aml!rica del Norte y en Europa ha eontribuido a reducir el mlmcro total de muerles par cancer del orden del 30%. La prevenci6n del cancer no cs s610 mejor que su curaci6n sino que, dado nuestro estado aClual de conocimiento, lambien parece que pllede lIevarse a cabo mas facilrnente.

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25

35

.o.d. t. que III mujer liene su prime< hijo

ci6n de una gran proporci6n de pacientes si la enfermedad se diagnoslica en una elapa razonablemente temprana. En algunos casos, tratamientos efeclivos, esl<1n basados en el entendimienlO de las causas de un tipo espeC(fico de c<1ncer. Por ejemplo, los estr6genos parecen actuar como promotores naturales del cancer de mama (Figura 24-14), y el tratamiento con un antagonista de eslr6genos, como el farmaco tamoxifeno, es efectivo en la mayorfa de pacienles de c<1ncer de mama, evitando 0 relardando la recurrencia de la enfermedad. Incluso cuando la curaci6n parece eSlar fuera de nuestro alcance, se dispone de tratamientos que prolongan la vida 0 al menos alivian la dolencia. Una gran parte de la investigaci6n c1fnica sobre el cancer se centra en el problema de c6mo matar selectivamente las celulas cancerosas. En su mayoda, los melodos actuales aprovechan diferencias relalivamcnte sutiles existentes enlre las celulas normales y las neoplasicas con respeclo a su velocidad de proUferaci6n, a su melabolismo y a la sensibilidad a la radiaci6n; eSlos melodos denen efectos 16xicos locales desagradables. Algunos tipos de celulas cancerosas son especialmenle vuJnerables al ataque selectivo porque dependen de hormonas espec[ficas 0 porque sus superficies denen caracterfsticas qufmicas no usuales que pueden ser reeonocidas por anticuerpos. Sin embargo, en general el progreso en el dificil problema de la selectividad amicancerosa ha side lento -una cuesli6n de ensayo y error con una dosis igual de adivinaci6n y de cAlculo racional. En la bl1squeda de metodos mejores para controlar la supervivencia, la proIiferaci6n y la expansi6n de las celulas cancerosas. es importanle examinar m<1s delalladamente las estrategias mediante las que eSlas celulas prosperan y se multiplican.

EI crecimiento canceroso depende a menudo de des6rdenes de la diferenciaci6n celular ll Hasla ahora hemos deslacado que las celulas cancerosas desafian los comroles nonnales de la divisi6n celular: esla es su propiedad sobresaliente. De todos modos para que un tumor crezca sin Itmites han de cumplirse otros requisitos. Por ejemplo, las celulas del tumor han de estimular el desarrollo de Yasos sangufneos que les proporcionaran los nUlrientes y el oxfgeno necesarios para crecer, como se comenla en el Capitulo 22. Sin embargo, muchos tejidos esl<1n organizados de tal mancra que induso un aumento incontrolado en la frecuencia de divisiones celulares no producir<1 par s{ mismo un tumor de crecimiento cons· tame. EI ejemplo del cuello uterlno, comentado anter;ormente, iluslra eSle pun· to. Como ocurre con la epidermis de la piel y de muchos otros epitelios, el epitelio del cuello uterino normalmcnte se renueva continuamente descamando en su superficie externa las celulas diferenciadas de forma terminal y generando ce· lulas que las reemplazan a partir de las celu.las madre en la l;imina basal. En pro· medio, cada divisi6n normal de una celula madre genera una celula madre hija y una celula que esl<1 condenada a la direrenciaci6n lerminal ya la suspensi6n de la divisi6n celular. Si la celuJa madre simplememe se dividiera m
1359

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(81 LA ceLULA MADRE FRACASA EN LA

PROouco6N DE UNA SOlA a:LULA aUE NO SEA CElULA MAOOE EN CADA

DMSl6N Y POR ELLO PRQUFEAAN tAl RUTA NORMAl

FORMANOO UN TUMOR

Por ejemplo, parece que varias Cannas de leucemia surgen por una disfunci6n del programa normal de diferenciaci6n, de tal forma que un progenitor determinado de un ripo panicular de celuJa sangu(nea continua dividi~ndose indefinidamente en )ugar de diCerenciarse terminalmente en 1a forma normal, despues de un numera estrictamente limitado de ciclos de divisi6n (se (rata en el Capftu10 22). En general, las mutaciones 0 los cambios epigeneticos que bloquean In maduraci6n nOfmal de las celulas hacia un estado terminal diferenciado en el que no se dividen que alteran el programa natural de muerte celular, deben jugar un papel esendal en muchos tipos de cancer. Por 10 tanto, existen algunas expectativas de que en el uatamiento del ec1neer las drogas que estimulan la diferenciaci6n celular puedan convertirse en una a1temativa 0 un eomplemento uti! a las drogas que simplememe matan las c~lulas en divisi6n.

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Para formar metdstasis, las c~lulas cancerosas han de ser capaces de cruzar la Idmina basa(lz Lo que haee al el1neer diffcil de erradicar. quirurgicamente 0 por irradiaci6n 10· ealizada, es su habUldad para formar metc1stasis. Para diseminarse ampliamente por el euerpo, las e~lulas de un tumor s61ido tipieo han de ser capaces de dismi· nuir su adhesi6n a sus vecinas originales, escapar del tejido de origen, atravesar otros tejidos hasta lIegar a un vaso sangufneo 0 linfc1tico. cruzar la llimina basal yel reveslimiento endotelial del vaso para eotrar a la circulaci6n, salir de la cir· culaci6n en olra parte del euerpo y sobrevivir y proliferar en el nuevo entomo en el que se encuentren (Figura 24·16). Cada uno de estos pasos requiere diSlintas propiedades. Por ejemplo. en una gran variedad de carcinomas estudiados la disminuci6n de la adhesi6n a las c~lulas vecinas en un epitelio depende de la p~rdida de expresi6n de cadllerina E, una molecula de adhesi6n entre relulas del epitelio. mientras que la habilidad en atravesar tejidos parece depender de la producci6n de enzimas proteolfticas que permitan degradar la matriz extra· celular. Los ultimes pasos son probablemente los mc1s diffciles: muchos tumo· res liberan a la circulaci6n un numero bastante grande de c~lulas. pero s610 una pequena proporci6n de elias consiguen fundar colomas de metc1stasis. Algunos tipos de ct1lulas nonnales -especialmente los g16bulos blancos- ya tienen algunas e tOOas las prepiedades necesarias para diseminarse a trav~s del cuerpo, pero probablemente. para muchos cAnceres la habilidad para formar 1360

Capftulo 24: CMcer

(el lAS etlulAS HIJAS NO se OIFERENCIAN NORMAlMENTE V POR EllO PfI0UFERAN FORMANDO UN TUMOR

Figura Z4~ I 5 Control nonnal y altcrado de la produccl6n de dlulaJ a partir de cBulas madre. (A) Estralegia normal para producir nuevas cf!lulas difcrcnciadas. (B y q Dos Iipos de alleraciones que pueden producir la prolireraci6n desenrrenada caraClerfslica del cancer. N61ese que una \'eloddad excesiva de divisi6n eelular de las celulas madre no tendrfa este efeeto por sf sola. ya que eada dlvisl6n celular produce una sola ef!lula madre.

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metAstasis requiere mutaciones adicionales 0 cambios epigeni:ticos. Se cree que estas transronnaciones, como atras implicadas en el desarroUo del cancer, ocurrco al azar en la poblaci6n tumoral inicial: 5610 aquellas pocas ct':lulas que adquieran las propiedades necesarias para formar metastasis y Ileguen par casualidad a un enloma adecuado sen1n capaces de fundar turnOfes secundarios. De acuerdo con este concepto de evoluci6n a traves de variaci6n al azar y selecci6n

natural, se observa que las cclu.las de un mismo tumor son hcterogeneas en cuanlo a su capacidad de formar metastasis (Figura 24·17). A la larga. la compresi6n de los mecanismos moleculares de la formaci6n de metl1stasis deberia permitir el disei\o de tratamientos para bloQuearla. Se han hecho algunos progresos en esle sentido. Por ejemplo, se ha demostrado Que para Que las c~lulas tumor"ales crucen una lAmina basal deben tener receptores de laminina Que penni Ian a las c~lulas adherirse a la l
Las mut'aciones que aumentan la frecuencia de mutaci6n aceleran el desarrollo del cancer l • 13

prolif.r. form.ndo m.I'SUI.1I an hlgado

Flgura24.16 Etapasenelprocesode met'stasls. Este ejemplo lIustra la expansl6n de un tumor desde un 6rgano como el pulm6n 0 la vejiga hasta el hfgado. Las oolulas tumorales pueden entrar dlrectamente al torrente drculatorio cruzando la pared de un vaso sangufneo -c;:omo aqui se esquematiza- o. quilAs m4s frecuenlemente, cruzando la pared de un vasa Iinf4tico. Finalmente los vasos linf4ticos descargan su contenido (Iinfa) en eltorrenle circuJatorio pero a menudo las c~lulas tumorales que han entrado en un vaso linf4tico querlan atrapadas en n6dulos linf4ticos. produclendo met4stasls en estos n6dulos lJnf4tlcos. Dlversos estudios en animales demuestran que de cada mil c~lulas tumorales malignas que entran en eltorrente dreulatorio, genera1mente sobrevive una que produce un tumor en otro sltio del cuerpo.

Como hernos remarcado, la incidencia de turnores y su velocidad de progresi6n de benignos a malignos dependen de la frecuencia de mutaci6n. La velocidad de £1 CMcer como un proceso de mlcroevolucl6n

1361

~~- celulas de melanome meligno

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I OESPU~S

Figura 24-17 Experimento demostratlvo de que exJsten dlferenclas heredables c10nalmente entre las celulas de un unlco tumor con respeclo a su habllldad para rormar metastasis. Se subclonan celuJas derivadas de una sola Ifnea celuJar cancerosa, y se estudi311 alfcuotas estAndar de cada subcl6n mediante inyecci6n en eltorrenle circuJatorio de ratones huesped. Los subclones difieren marcadamente en el mimero de metAstasis que producen por rat6n.

nlimero medio de tumores de mllthtllsi. por rat6n

mutaci6n puede ser alta tanto debido a la presencia de mutagenos en el entomo como debido a defectos intracelulares en la maquinaria que gobierna la replicaci6n, la recombinaci6n y la reparaci6n del DNA. Por ejemplo, las personas que padecen xeroderma pigmentosllm, un trastorno genetico poco frecuente, tienen un defecto en el sistema de enzimas necesarias para reparar el tipo de alleraci6n en el DNA que se produce por irradiaci6n con luz ultravioleta; en consecuencia, la mas Iigera exposici6n de la piel a la luz del sol provocara canceres de piel. Una predisposici6n mas general al cancer se observa en el relativarnente cornun s£ndrome HNPCC. como veremos en la pagina 1383, en el s£ndrome de Bloom, la anemia de Paneoni y la ataxia telangiectasia. En estes raros trastomos genetieos, la anomalfa se hereda a traves de la Ifnea germinal y por tanto esta presente en todas las celulas del cuerpo. Sin embargo, pueden aparecer defectes geneticos del metabolismo del DNA, similares a estos, a traves de mutaciones originadas en celulas somaticas. De hecho, mutaciones que provocan un aumento en la velocidad de mutaci6n parecen ser un factor importante en el desarrollo de muchas canceres. Algunas de estas rnutaciones facilitan pequefias cam bios locales en la secuencia de DNA. Otros, paniculannente comunes, facilitan alteraciones imporrames del genoma. A menudo, las celulas cancerosas muestran una variahilidad anormal en el tamafio y en la forma de sus nudeos asf como en el numero y estructura de sus cromosomas; de hecho, la morfologfa anormal del nudeo es una de las caracterfstieas clave utilizadas por los pat61ogos para diagnosticar un cancer (Figura 2419). Cuando se hacen crecer celulas cancerosas en cultivo, a menudo se observa que tienen un cariotipo extraordinariamente inestable: los genes aparecen amplificados 0 mutilados y los cromosomas se pierden, se duplican 0 se translocan con una frecuencia mucho mayor que en las celulas norm ales en cultivo. Esta variabilidad cramos6miea sugiere que las celulas sufren algun error heredable en la maquinaria 0 control de la replicaci6n, reparaci6n, recombinaci6n 0 segregaci6n de los cromosomas. Este defecto, producido par una mutaci6n somatica. podrfa ser el responsable del aumento en la probabilidad de aparici6n de mutadones posteriores en otras clases de genes, y por 10 tanto proporciona una via fliciJ hacia la acumulaci6n de mutaciones multiples necesarias para el comportamiento canceroso. Estudios de gcnetiea molecular han revelado un mecanismo que explica esta desestabilizaci6n del cariotipo de las celulas cancerosas, como se vera en la ultima parte del capftulo cuando se discute el papel de una protefna conocida como prote£na p53. Figura 24-18 Tres etapas del proceso de cruce de una lamina basal, una tarea que las celuJas tumorales Invaslvas han de ser capaces de reallzar. A1gunas de las evidencias experimenlaJes de este mecanismo se presentan en la Figura 19-59.

1362

Capftulo 24: Cancer

UNION A LAMININA

cohlgenll de tipo IV en III

I~mina

DIGESTION DE LA LAMINA BASAL POR COLAGENASA DE TIPO IV

MOTllIOAO

basal

Figura 24·19 VariabUidad ytamano anormales del nudeo de una cBuia cancerosa. La fOlOgrafia mueslra una secd6n del epilelio de mama de una pacienle con carcinoma de Pager, en el cualla epidermis esta invadida par c~lulas cancerosas originadas en la mama. Las dlulas cancerosas pueden ser diferenciadas de las normales por su nucloo anormalmenle grande y polimorfo; lambicn por el borde de espacio clMo que rodea a cada una de eUas. (Corlesfa de Andrew Hanby.)

El incremento de la capacidad de mutar de las celulas cancerosas confiere a estas celulas una cierta capacidad de evadirse de la destrucci6n producida por drogas anticancerosaslO, 14 Cualquieta que sea el otigen de la mutabilidad anormalmenle alta de las celulas cancerosas, casi todas las pohlaciones de celulas Illmorales malignas son hererogeneas en muchos aspectos y son capaces de evolucionat a una vclocidad alarmante cuando se somelen a nuevas presiones de selecci6n. ESlo agrava las dificllitades de 13 terapia conlra el c<1ncer. Para matar la mayoria de las celulas neoplasicas en un paciente con c
1363

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'A'

que es mas facil malar, por irradiaci6n 0 por exposici6n a drogas especfficas que intcrficren con el metabolismo del DNA, a las cclulas de muchas tumares que a las cclulas normales. A medida que vamos aprendiendo ace rca de los mecanis-

mos moleculares de la replicaci6n, recombinaci6n y reparaci6n del DNA, empiez3 a set posible diseflar ensayos para delerminar con precisi6n los defeclos en estas funciones en casas individuales de cancer. como muestra la ultima secci6n de este capitulo. Utilizando esle tipo de informaci6n deberfamos estar mas

capacitados para matar las celulas delincuentes mediante drogas disenadas de tal forma que aprovechen sus dehilidades paniculares.

Resumen Ltu dlulas cancerosas, par defitdcl6n, prollferan tksaftando los c:ontroles normales (es deck, son neoplAsica.sJ y son capaces th invadir y colonlz.ar los tejidos que las

rodean (es decir, son nlllllgnas). Origimm tumores secundarios 0 metdstasls, por 10 q"e resllIla muy diflcil ermdlcarhu quirurgicamente. Se cree que la mayorla th cdnceres se originan a partir th una unlea dluia que ha experimentado una mutaci6n somatlca, pero para que ia progente de esta celuia se trans/omle en eancerosa ha tk slI/rir mlfs cambios, los cltales probablemente reqllieren varlas mutadones adiclollales. Estefen6meno de progresMn h,moral, que generalmente dura muchos anos, refteja la evoluci6n par mutacMn y selecci6n natural entre las ci!bdm somaticas; la velocidad de esle proceso esM acelerada par age,des nmtagenlcos (Inlciadores tumorales) asi como por clertos agentes no mUlagenlcos (promotores tumorales) que afeclan a la expresi6n genlca, estlmulan ia prolijeraci6n aluiar y aIleran el equilibria oco16gico de dlulas mutalltes y no mutantes. Asl, en el desarrollo de un edncer dado contrlbuyen muchos factores; algunos de estos factores SOli caracterlsticos del entorno que se podrinll evIlar, por 10 que, en principia, una gran proporci611 de edm:eres se pUedell prevenlr. En ia investigaci611 sobre el edncer, se han dedicado muellos esfllenos a la bl1squeda de fOrm4S pam cumr la enfennedad exterminando las dlulas cam:erosas sin afectar a sus vecinas nomudes. UM aproximaci6n racional a este problema requiere conOCf!r las propiedades especiales de las celuhu eancerosas que les pennIlen euoludonar, multiplkarse y expandirse. Asi, a melll,do parea que ia proll[eracMn de las dlulas neoplifsicas estd asociada a un bWqlreo de la dijerenciaci6n, por 10 que la progenie de UM «lula madre puede continuar dividiendose en lugar de entrar en un eslado terminal de no divisi6n; en principia, ia prallferacf6n puede[renarse estimllillndo la di[erenciaci6n celuiar. Para que las dlulas fumorales se transfonnen en mallgnas "11'1 de ser capaces de Crllznr ill I6mina basal; Sf! pueden diseiiar anticuerpos que interflerml con esta capacidad, de lonna que obstaclllicen la [0rma.ci6n de meuulasLs. A menuero se observa que las dlulas can1364

Capftulo 24: C4nccr

Figura 24·20 Los camblos cromos6mlcos en las celulas cancerosas reflejan 10 ampUflcoci6n genlco. En eSlos ejemplos los numeros de coplas de un proto-oncogen myc han sido amplificados. Los cromosomas estll.n marcados en rojo Ouorescenle, mienrras que las copias multiples del gen mycse han localizado mediante una hibridaci6n in siru utilizando una sonda man:ada con nuorescencia amarilla. W Cariotipo de una celula en la cual las copias del gen myc eSlan presenles como cromosomas dobles diminutos (manchas amariflas pareadas). (8) Cariotipo de una celula en la cual aparecen copias multiples del gen myc en una regi6n marcada homogeneamenle (amarillo) inlerpolada en uno de los cromosomas normales. (Normalmente se yen copias unicas de genes myc como minusculas maflchas amarillas en oU'os lugares del genoma.) En celulas cancerosas que lienen otros genes amplificados se yen eSlructuras similares a estas. (Cortesfa de Denise Sheer.)

cerosas pre5ellran linn c:apaciclad de mllrar anormalmellre elevada,' #!Sro aceJem 10 elJOluci6n del complejo grupo de propiedndes que SOli necesarias para 10 llooplasia yin malignidad y ayudo a Ins dlulns c:allurosas a desarrollar resistencia a Ins drogas allricallcerosas. At mismo tiempo, sin embargo, los defectos en el metabolismo chi DNA que SOli 10 cmua de e5ra capacidml de murar pluden lutar que las cilulns ca1lCerosas sean #!Specialmenre lIulnerables a un ataqlle terapiutico diseiindo de forma adecuada.

Genetica molecular del cancer 15 EI cancer es el resultado de una serie de accidentes geneticos al azar sujetos a selecci6n natural, por 10 que no es probable que se produzcan dos casos de cancer geneticamente idemicos, incluso aunque sean de la mjsma enfermedad. No obstante, en todos los canceres cabe esperar que participe una a1teraci6n de las restricciones normales sobre proliferaci6n celular; para cada tipo celular existe un mimero finito de mecanismos par los que se puede producir esta alterad6n. De hecho, parece que en el cancer los respansables de la mayor parte de la desregulaci6n de la divisi6n celular son algunos cambios en un gropo relativamente pequeno de genes. La identificaci6n y caracterizaci6n de muchos de estos genes ha sido uno de los grandes triunfos de la biologfa molecular. La proliferaci6n celular puede estaJ regulada directamente a trav~s del mecanismo que determina si una celuJa pasa el punto de restricci6n 0 ~inicio" del cicio de divisi6n celular, como se indica en el Capftulo 17,0 indirectamente -por ejemplo, a Iraves de la regulati6n del mecanismo que somete la celula a diferendati6n terminal a a muerte celular programada. En cualquier caso, los genes reguladores normales pueden clasificarse, de forma laxa, en aquellos cuyos productos ayudan a estimuJar la proliferaci6n celular y aquellos cuyos productos ayudan a inhibirla. Por 10 tanto existen dos caminos de mutaci6n hacia la proLiferaci6n celular incontrolada y la invasividad que son caracteristicas del cl1ncer. EI primero consiste en conseguir que un gen esrimulador se vuelva hiperactivo: este tipo de mutaci6n tiene un efecto dominante --es suficiente can que el cambia afecte a una de las dos capias del gen en la c~luJa; el gen alterado se denomina un oocageo (siendo el alelo normal un proto-oncogen; del griego ankos, tumor). EI segundo consiste en inactivar un gen inhibidor. este ripe de mutaci6n tiene un efecto recesivo -para que la celula quede Iibre de la inhibici6n es nece· sario que las dos copias del gen en la celula esten inactivadas 0 delecionadas; al gen perdido se Ie llama, en espera de un nombre mejor, un gcn suprcsor de tu· mores. Los genes mutados con efectos dominantes --es decir los oncogenes- pueden identificarse dhectamente tomando DNA procedente de celulas tumorales y buscando fragmentos que cuando se introducen en celulas normales les hagan comportarse como celulas tumorales. A finales de los alios 1970 se disenaron tknicas que permitieron alcanzar este prop6sito; se desarrollaron despues de estucUos mas tempranos de procesos similares que ocurren de forma natural, cuando los virus trasladan su material genetico desde una celula a otra. Este trabajo facilit6 el camino hacia el descubrimiento masivo de oncogenes y proto-oncogenes. En esta secci6n (rataremos de los oncogenes y de los supresores de tumores. Concluimos presemando el esrudio de una variedad comtin de cancer, en el que los pasos de la progresi6n tumoral pueden relacionarse con una serie de mUla· dones identilicadas.

Los retrovirus pueden actuar como vectores para los oncogenes que modifican el comportamiento celularl6, 11, 18 Los virus juegan un papel remarcable en la investigaci6n de las causas del can· cer humano. A pesar de que los virus no desempeflan ningtin papel irnportame en la mayor[a de canceres humanos, son una de las causas predominanres de Genetica molecular del cancer

1365

Tabla 24·3 Algunos camblos que normalmente se observan cuando un cultlvo celular es transformado por un virus tumoral I. AnormaJidades relaclonadas con la membrana plasmatica

A. AClivaci6n del transpone de melabolilos B. Abultamienlo excesivo de la membrana plasmalica C. Aumento de movilidad de las prolefnas de la membrana plasmalica Z. Anormalidades de adherencla

A.

Disminuci6n de la adhesi6n a superficies; (>Or 10 laJUO son capaces de manlener una morfologfa redondeada B. Incapacidad de los filamenlos de actina de organizarse en fibras de estres C. Disminuci6n de la red enema de fibronectina D. Incremento de la producc:i6n de activador de plasmin6geno, causando un incremento de la proteolisis extracelular

3. AnormaUdades de crecimiento y dlvisi6n A. Crecimiento hasla una densidad celular extraordinariamente aha B. Disminuci6n del requerimiento de faetares de crecimiento C. Disminuci6n de la dependencia de anclaje (pueden crecer incluso sin uni6n a una supcrficie rfgida) D. ~Inmonalidad~ {pueden continuarcrecienda inde6nidamente} E. Pueden causar tumores cuanda son inyectadas a animales susceplibles

cancer en algunas especies ani males; el anAiisis de los virus animales de tumorales han proporcionado una de las claves del conocimiemo del mecanismo general del cancer. EI primer virus tumoral animal fue descubierto hace mAs de BO anos en poUas que eSIti.n sujetas a infecciones que generan tumores en ellejido conjuntivo, o sarcomas. EI agente infeccioso hie caracterizado como un virus -el vims del sarcoma de ROIlS, que ahora sabemos que es un virus de RNA. Como los otros virus de RNA tumorales descubienos, hasta ahora, es un relrovirus. Cuando infecta a una ctHula, su RNA es copiado a DNA mediante lIna transcripci6n inversa y cl DNA se inserta en el genoma huesped, donde puede persistir y heredarse en las gencraciones de celulas sucesivas. En la Figura 6-82 se presenta el cicio viml de un retrovirus y se muestra c6mo su genoma sufre una transcripci61l illversa, se integra en el DNA huesped y c6mo sale y entra de la celula huesped. Pero, ide que forma una infecci6n vfrica genera tumores? L1 sollld6n a este problema, como para Olros muchos casos de biologfa celular, depende del desarrollo de un ensayo adecuado por el cual pueda determinarse la capacidad de generar tumores de distintas ccpas de virus. EI ensayo, ampliamente lltilizado, consist'e simplcmentc ell la proliferad6n de fibroblastos sobre una placa de cultivo. $i se anade al media de cultivo un virus tumoral activo, en pocos dfas aparecen pequei\as colonias de celulas transfonnadas que proliferan anormalmenIe. Cada una de estas colonias es un cion que deriva de una unica celula que ha sido infCCl'ada por el virus y ha incorporado de manera eslable el material genetico del virus. Una vez liberadas de los controles sociales de divisi6n, las celulas transformadas crecen mlls que las normales en la placa de cuhivo, como ocurre en el cuerpo, y por 10 tanto generalmente son faciJes de selecciollar. Las c~lulas transformadas, normalmente. presentan un complejo sindrome de anormalidades (se resumen en la Tabla 24-3). Por ejemplo, tienden a perder la inhibici6n de la divisi6n celuJar dependjente de la densidad celular (vease Figura 17-39) y se apiJan en capas a medida que proliferan (Figura 24-21). Ademas, a menudo erecen independientes de anclaje y son capaces de dividirse incluso cuando se mantienen en suspensi6n; presentan una forma a1terada y se adhieren escasamenle aI substrata y a otras celulas. manteniendo una apariencia redondeada que recuerda a la de una celula normal en mitosis; pueden ser capaces de proli1366

Capftulo 24 : C4ncer

monotllpa de Cl!ilulas normala.

-

Inhibld,ls por eonlllctO

medio de ctecimiento

Figura 24·21 Perdlda de Inhlblcl6n por contaclo. Habitualmente las celulas cancerosas, a diferenda de la mayoria de las celulas normales, cuando ya han formado una capa connuente contimian creciendo y se apilan unas sobre Olras.

mullieapade ee1ulas CIlncefOSll'S no lnhibidn

placa de plbllco de ctJllivo de leiido

ferar incluso en ausencia de factores de crecimiento; son inmonales y en cultivo no alcanzan la etapa de senescencia; cuando son inyecladas de nuevo en una animal huesped adecuado, pueden generar tumores. Este componamienlo desrcgulado de las celulas transformadas puede deberse a un oncogen transpormdo por el virus pero que no es necesario para la supervivencia 0 la reproducci6n del propio virus. Esto fue demostrado por primera vez gracias al descubrimiento de un mUlante de los virus del sarcoma de Rous que se multiplica de forma normal pero que no LIansforma la celulas huesped. La perdida de capacidad transformadora corresponde a la perdida 0 inactivaci6n de un gen, que recibi6 el nombre de src (Figura 24-22). Este gen espedfico del virus del sarcoma de Rous es responsable de la transformaci6n celular i" vitro y de la fonnaci6n de tumores ill vivo, pem es una carga innecesaria desde el punto de vista de la propagaci6n del propio virus.

Los retrovirus recogen oncogenes por accidente l6, 17, 19 Si el gen src es perjudicial para el animal e innecesario para el virus, tpor que e5tj prescnte y de d6nde procede? Cuando una copia del gen src marcado Tadiactivameme es utilizada como sonda para 10ca1izar secuencias emparemadas mediante hibridaci6n DNA-DNA, se encuentra que el genoma de las celulas normales de venebrados contiene secuencias muy similares, pero no idemieas, al gen src de virus del sarcoma de Rous. Esle equivalenle del gen src \'frieo (v-src) que se encuentra en celulas normales se denomina c·src (0 simplcmenle src). Es el prolo-oocogen que corresponde a1 oncogen v-src. Eviclentemente, el gen cs tomado accidentalmentc por el retrovirus del genoma de una celula huesped

Genetica molecular del cd-ncer

Figura 24-22 Transfomlacl6n celular por el virus del sarcoma de ROllS. Las imligenes de microscopia electr6nica de barrido muestran c~lulas en cultivo infectadas con una forma del virus del sarcoma de Rous, portador de una mUlaci6n sensible a la lemperatura en el gen responsable de la transformaci6n (el oncogen v-src). (A) Las ~lulas eslAn transformadas y a baja temperatura (34"C) tienen una forma redondeada anormal, a la cual el prodUCIO del oncogen es funcional. (BJ Debido a un incremento de la lemperatura (39"C) aparece el produclO del oncogen y las celulas se adhieren fucrtemente a la superficie de cultivo y recobran su aparienda aplanada. (Cortesla de G. Steven Martin.)

1367

virus de Ie leucemie murin8 [j----------repeliciones lerminelos - - - - - - - - - ,

cepC~~~;.':::'I.~.~";.;";';";.;'~;;";.;.;";.;";';";~;;;;~~~:~~:~';';:' ~t gag

env

pol

virus dol sarcoma de Rous

DNA de 18 celu!a huesped 5'

exon

intton

region que codific8 el dominio de 18 quinese

,: '• •[';::;:';;!I~,~,jl~,~.~;:] •.:;:,].I[;'~';;H~d;:].Il:,di• •;.;;.'iG~;";;;~j;:]'C::;

~

_________p_'_'_to-onc0gen c-src de polio

." oncogen

181

3'

Tabla 24-4 Oncogenes que se Identlncaron a traves de su presencia en retrovirus transfonnantes Oneo-

Orlgen del virus

Tumor lnducldo por el virus

prolefna (Iirosina) quinasa

ral6n gato

leucemia de las celulas pre-B sarcoma

erb-B

protefna (Iirosina) quinasa: receplor del factor de ereeimiento epidennieo (EGF)

polio

eritroleucemia; fibrosarcoma

f" fm,

protefna (tirosina) quinasa

gaw/pollo sarcoma

proterna (tirosina) quinasa: receptor del factor estimulador de colonias de macr6fagos (M-CSF)

galO

sarcoma

los productos se asocian formando la protefna reguladora del gen AP-l

rat6n pollo

osteosarcoma fibrosarcoma

kit

protefna (tirosinal quinasa: receptor del factor Steel

gato

sarcoma

mf

protefna (serina/treonina) quinasa activada por Ras

polloI rat6n

sarcoma

my'

protefna reguladora de gen de la familia HLH

polio

sarcoma; mielociloma; carcinoma

H-ras

protefna que une GTP

rata

sarcoma; eritroleucemia

K-ras

proteina que une GTP

rata

sarcoma; eritroleucemia

"I

protefna reguJadora de gen relacionada con NFJdJ

pavo

reticuloendoteliosis

sis

factor de crecimiento derivado de plaquetas, cadena B

mono

sarcoma

'"

prolefna (tirosina) quinasa

polio

sarcoma

g,n

FUJlcl6n del proto-oReogen

obi

fo, jun

)

1368

Capftulo 24 : Cancer

Figura 24-23 Eslruetura del virus del sarcoma de Rous. (Al Organizaci6n del genoma vfrico comparada con la de un retrovirus m;1s tfpico (virus de la leucemia murina). EI virus del sarcoma de Rous es diferente de la mayorfa de los retrovirus que transportan oncogenes en que esre ha retenido los tres genes vfricos completos necesarios para el cicio vital ordinario del vfricos: gag (que produce una poliprotefna que se fragmema generando las prolefnas de la capsidel, pol (que produce la transcriptasa inversa y una enzima implicada en integrar el cromosoma vfrico en el genoma del huespedl y env (que produce la glucoprotefna de la cubierta). En Olros retrovirus oncogenicos. uno 0 varios de estos genes vfricos se han perdido total 0 parcialmente debido al intercambio con la adquisici6n del oncogen transformante y. por 10 tanto. s610 se pueden generar partfculas infecciosas del virus transformante en una cl!lula que sea infectada simulraneamente con un virus altxiliar, no defe<:luoso y no transfonnante, que suministre las funciones perdidas. (A menudo el oncogen transformante se fusiona a un fragmento residual de gag, conduciendo a la producci6n de una proterna hfbrida oncogl!nica que contienen parte de la secuencia de Gag.) (B) Interrelaci6n entre el oncogl!n v-sre y el proto-oncogen celular c-sre del que se ha derivado. Los intrones presentes en c-sre han sido suprimidos (por llladuraci6n por corte y empalmel de v-src; ademas, v-src contiene mutaciones que alteran la secuencia de aminoacidos de la protefna v-src, hacil!ndola hiperacliva y desregwada como protefna tirosina quinasa especifica. EI virus del sarcoma de Rous ha sido escogido (por los investigadores sobre cancer) por su capacidad para transformar celulas en celulas neopMsicas, 10 cual realiza con una velocidad y eficiencia poco habltuales.

1

anterior y sufre la mutaci6n durante el proceso (Figura 24-23). El resuhado es un gen cuya funci6n esta penurbada y conduce a un cancer, por 10 que tanto el gen como el virus que 10 transpona Ilaman la atenci6n del cientifico. En efecto, el retrovirus ha donado en nuestro beneficio. De esta forma se han identificado un gran nLimero de oncogenes en otros retrovirus (Tabla 24-4). Cada uno de ellos nos ba condllcido al descubrimiento del proto-oncogen correspondieme que se presenta en la celula normal.

Un retrovirus puede transformar una celula huesped insertando su DNA en un lugar pr6ximo a un proto-oncogen del huesped 20 Existen dos caminos por los cuales un proto-oncogen puede pasar a oncogen una vez incorporado en un retrovirus: la secuencia del gen puede ser alterada 0 truncada de forma que codifique una protefna con una actividad anonnal, 0 el gen puede quedar bajo el control de promotores y activadores potentes del genoma del virus, generandose producto en exceso a en circunstancias inapropiadas. Los retrovirus tambien pueden ejercer efectos oncogenicos similares por otro camino. Las copias en DNA del RNA del virus pueden ser simplemente insenadas en el genoma de la celula huesped en zonas cercanas a proto-oncogenes 0 induso en los propios proto-oncogenes. La disrupci6n genetica resultante se denomina mutacl6n par Insercl6n, y el genoma alterado 10 hereda toda la progenie de la celula huesped originaria. Las inserciones mas 0 menos al azar de las capias en DNA del RNA vfrico en el DNA de la celula huesped ocurren como parte del cielo vital normal de retrovirus y. al menos en un caso bien documentado, la inserci6n en cualquier lugar de una zona de 10 000 pares de nuele6tidos de un proto-oncogen puede causar una activaci6n anormal de este gen. La mUlagencsis por inserci6n proporciona un sistema importante para identificar proto-oncogenes, que pueden ser localizados par su proximidad al DNA del virus insertado. A menudo los proto-oncogenes identificados de este modo resultan ser los mismos que los descubiertos por el otro camino -como bom610gos de los oncogenes que los retrovirus transportan de una celula a otrapero tambien se ban descubierto otros nuevas proto-oncogenes (Tabla 24-5). Un ejcmplo de ellos es el gen Wnt-J, activado par mutagenesis par inserci6n en canceres de mama de ratones infeclados con el virus de tumor mamario (Figura 24-24). Este gen resulta ser estrechamente hom610go aI gen willgless de Drosophila, que participa en la comllnicaci6n celula-celula que regula los detalles del patr6n corporal de la mosca, como se comenta en el Capftulo 21.

Diferentes investigaciones sobre la base genetica del cancer convergen sobre disfunciones de un mismo pequeno grupo de proto-oncogenes I7, 21 Mientras que algunos autores siguieron la lfnea de investigaci6n que conduda desde los retrovirus hasta los oncogenes, otros escogieron una aproximaci6n mas directa y buscaron secuencias de DNA en celulas cancerosas humanas que pudieran provocar proliferaci6n incontrolada al ser introducidas en celulas no cancerosas. El ensayo se realiz6 en cullivo de celulas, uliJizando como buesped no canceroso una Ifnea particular de celulas 3T3 derivadas de rat6n -eelulas NIH 3T3- Ytransfectandolas can DNA obtenido de celulas tumorales humanas. Los

I Ij 5' 5000 pares de nucle6tidos

jI

III

Tabla 24-5 Algunos oncogenes que no se identiflearon por su presencia en retrovirus transformantes Sislemas de deteccl6n

Oncogenes

Mutaci6n por W1lt-l (i1lt-ll'[gf-3 inserci6n (i1lt-2), Notch-} (im-3).lek

Amplificaci6n L-myc. N-myc Transfecci6n nell, N-ras, trk, ret Translocaci6n bcl-2, RARa

Figura 24-24 MUlagenesls por Inserci6n. En eSle ejemplo el proceso aCliva un gen llamado Wm-l (anteriomlCnte se lJamaba jilt-I) que produce cancer de mama en ratones infectados con el virus de tumor mamario de rat6n (MMTV. de Mouse MammaryTumor Virus). Lasflechas indican los lugares de inlegraci6n de MM1V observados en 19 turnores aislados diferentes. Observese que las inserciones pueden activar la trancripci6n del gen Wnt-l desde lugares que estan alejados a mas de 10 000 pares de nucle6lidos a uno u otro lado del gen. Este efecto se atribuye a una secuencia de DNA que es un potellle activador y que esta presellle en las repeticiones terminales del genoma de MMTV.

gen Wnt-l

v ,:::{>

jj 3'

w

eJ
Gcnetica molecular del cancer

1369

hallazgos fueron dramaticos: se'detectaron oncogenes en muchas Ifneas de C~lll­ las canccrosas humanas y en varios casos estos oncogenes resultaron ser alelos mutanlCS de algunos de los mismos proto-oncogenes que habfan side identificados con la estrategia retrovfrica 0 de genes relacionados muy estrechamente con ellos. Por ejcmplo, se encontr6 que uno de cada cuatro tumores humanos contenia un miembro mutado de la familia de los genes ras, que habian side descubiertos como oncogenes transponados por retrovirus que causan sarcomas en rat as. Asf, dos lineas independientes de investigaci6n convergieron en los mismos genes. Otro enfoque que tambien condujo a algunos de estos mismos proto·oncogenes se basa en el estudjo del cariotipo de las celulas tumorales. Como se men· cion6 anteriormente, en casi todos los paciemes con leucemia miel6gena cr6ni· ca, las celulas leucemicas muestran la misma translocaci6n de cromosomas, entre los cromosomas 9 y 22; de modo similar, en ellinfoma de Burkiu existe reo gularmente una translocaci6n entre el cromosoma 8 y uno de los tres cromoso· mas que contienen los genes que codifican las moleculas de anticuerpo. En ambos tipos de cancer se encontr6 que el punto de ruptura de la translocaci6n, lugar donde parte de un cromosoma esta unido a otro, coincidfa exactamente con la localizaci6n de un prom-oncogen ya conocido a partir de estudios rctrovfricos -abl en la leucemia miel6gena cr6ruca, myc en ellinfoma de Burkill. De forma similar, se sabe que algunas translocaciones anaJogas entre cromosomas estan asociadas con algunos olros tipos de cancer. A partir de estudios de secuenciaci6n de DNA parece que en algunos casas la translocaci6n transforma un prolo-oncogen en un oncogen al fusionar el prolo-oncog~n con Oiro gen de manera que se produzca una protefna alterada (Figura 24-25); en otros casos, la translocaci6n lraslada un proto·oncogen a un entorno cromos6mico inapropiado que acLiva su transcripci6n de forma que la protefna normal se produce en cantidades excesivas.

Un proto·oncog~npuede ser convertido en oncog~nico de muchas maneras l7,ZZ Hasta ahora se han descubierto unos 60 prolo-oncogenes (las Tablas 24-4 y 24·5 muestran una pequena selecci6n de elias); cada uno de estos proto-oncogenes se puede transformar en un oncogen que juega un papel dominanle en canceres de una c1ase u Olra. Muchos de eSlos genes han sido encontrados repelidamente en diferenles fonnas mutanles y en vadas formas difcrentes de cancer, 10 cual sugiere que posiblcmente la mayor(a de los proto-oncogenes de marnfferos ya estan idenlificados.

gen beren III cromOlome 22

glln Ilblen III cromosome 9

"IIII!!IlI!!!lIll!!!lIllll"

5'1IIi!I

~nto dll rupture

""

/

_--,.

,.

~unlo do rupture

TRANSlOCA06N Ph'

..... I

,

..

gen fusionado

bcr/~bI

I

TRANSCfUPCION 5·

I

,!]· poli A

mRNA fusion..,., bcr/.bI

I TRAOUCOON

I protein. de fusiOn 8er/Abl

1370

Capftulo 24: Qincer

Figura 24-25 Conversion del protoollcogl'!n ubi en un oneagen, en paclelltes con leucemia mle16gena craDlea. La translocaci6n cromos6mica responsable une el gen Ixr del cromosoma 22 COil el gen ubi del cromosoma 9. generando asf un cromosoma Philadelphia (vease Figura 24·4). La proteina de fusion resultante tiene el extrema amino terminal de la pratefna Ber unido al extrema carboxilo terminal de la proteina tirosina quinasa Abl: por 10 lanto, el dominio quinasa Abl probablemenle resuha activo de una forma no apropiada. produciendo una proliferaci6n excesiva de un cion de celuJas hematopoyeticas en la m&l.ula

.....

r8CllplOI de PDGF receplol de EGf terbB] leceplol de M-CSf l'lm]

plOleinas Rat IH·rnl tN-Ills] tk-l.sl

•

PDGF [.isl plOlelna quinasa SIC

[.rel

llictolu de crK:imienlo

, r-.oeplores de ~oru de ClKimienlo que actulln vfa pIOteOnN: eon lldividlld tilosina quinasa

..... [hlosl

,

ploteinas de uni6n a GTP

,'

plOI:efnN eon aetMdad

tif05iM quinMIP nociIIdn II

membr.-..leitouque6e(o

ree.plOI de hornlOflll tiroidea [erbAl

,-

prOlelnll clloplasm'lk:as tirollna QlIiMH •• pecilk:..

rl<:.p1or•• d. 11<:10r•• de crl<:imiento d. tlpo ellerolde

prot.lnll Hrillaltreonina qlllnllla

Pero, ,qu~ funciones realizan eSlos genes en una c~luJa sana para que las mUladones que se producen en ellos sean tan peligrosas? La mayorfa de prolooncogenes codifican componenles de mecanismos que regtdan el comportamiento social de las c~lulas en el cuerpo -en particular los mecanismos mediante los que seiiales de c~lulas vecinas empujan a la celuJa a dividirse, a diferendarse 0 a morir. De hecho, muchos de los componentes de las vias de sef\alizaci6n celular se identificaron a trav~s de la busqueda de oncogenes, y de hecho una Usta completa de producms de prom-oncogenes induye ejemplos de prncticamente todos los tipos de moh~culas que panicipan en la sefializaci6n celular -proteinas secreladas, receptores transmembrana, proteinas de uni6n a GTP, prole£na quinasas, prolefnas de regu1aci6n genica, etc, como resume la Figura 24-26 y se trala en delalle en el Capftulo l5. Todas estas mollkulas nonnalmente realizan su fund6n en complejas cadenas de transmisi6n de seftales de producci6n de mas c~lulas, cuando estas se necesilan. Sin embargo, pueden aiterarse debido a mutaciones y transmitir seftales incluso cuando no son necesarias mas celulas. EI proto-oncogen erbB, por ejemplo, codifica el receptor dcl factor de credmiento epidennico (EGF); cuando el factor EGF se une al dominio extracelular del receptor, el dominio intracelular genera una serial de estimulaci6n en el interior de la celula. Una mUlaci6n en c-erbB puede convenirlo en un oncog~n pOl eliminaci6n del dominio extracelular de uni6n a EGF de tal modo que la selial de estimulaci6n intracelular se produce consrantemenle, incluso en ausencia de EGF. De un modo similar una mutaci6n puntual en un lugar apropiado del gen ras puede generar una proteina Ras incapaz de hidrolizar el GTP que lIeva unido, persistiendo anormalmente en su eslado activado y transmitiendo as! una sellal intraceluJar de proliferaci6n incluso cuando no deberia. Exislen innumerables ejemplos de este tipo. Los tipos bcisicos de acddent'e genetico que conviert'en a una proto-oncogen en un oncogen se resumen en la Figura 24·27. EI gen puede ser aherado por una mutad6n puntual, una deleci6n, a trav~ de una tra.nslocaci6n cromos6mica, 0 por inserci6n de un elemento genetico m6w, como un DNA retrovfrico. EI cambio puede darse en la zona de oodificaci6n de la prorefna, de tal forma que se genera un producto hiperactivo. 0 puede ocurrir en zonas de control adyacentes. de forma que el gen simplemente se sobrexpresa. A1ternativamente el gcn tambien puede sobrexpresarse debido a una elevada amplificaci6n del numero de copias a Iraves de crrores en el proceso de replicaci6n cromos6mica (el Gen~rica

EO' M-CSf

molecular del cl1ncer

Figura 24-26 Activldades y locallzaclones celulares de 105 prodUCIOS de las prindpales clues de proto-oncogenes. Entre corchete5 se Indican aJgunos de los prolooncogenes mots representativos de

cada dase.

1371

[ OELEClOf\I 0 MUTACI6N PUNTUAt. EN LA SECUENOA COOlfICANTE

DNA--il• • •-

RNA RNA

.1ntetilade en

prolein. nOflTlllt produclda en c:antldadM superiores

centidade. normales

.1111 normales

protelna hiperactiv.

I. ceraoni. de 110 lICtiv.oor potenle hac. que I, pro"ln. normal Be .Inlalice en Clntidfldes .upenor" a In norm.l~tI

mecanismo sera comentado posteriormente -vease Figura 24-34). Cada gen en particular y cada respuesta a carcin6genos particulares prcscnta tipos caractcrfsticos de anomaHas. Par ejemplo, el 90% de tumores de piel provQcados en ralanes por el iniciador tumoral dimclilbenzo[a]antraceno (DMBA) tienen un cambia de una A por una T exaclamcnte en el mismo lugar que un gen ras mutado; probablemcmc de ladas las mutaciones causadas por DMBA, 0010 1a que se produce en este lugar aCliva de forma eficiente las celulas de la piel para fonnar un tumor. Por otro lado, frecuenlememe se sobrexpresan 0 amplifican algunos miembros de la familia del gen myc. La proteina Myc normalmente acrua en el nucleo como sellal de proliferaci6n celular, como se comenta en el Capitulo 17; camidades excesivas de Myc provocan la entrada de la celula en el cicio de divisi6n celular en circunsrancias en las que una celula nonnal se detendrfa.

Las acciones de los oncogenes pueden ensayarse individualmente o combinadas entre sf en ratones transgenicos Z3 EI concepto de un oncogen es parad6jico. Como se ha argumentado ampliamenle en la primera parte de estc capitulo. una sola mutaci6n no es suficiente para producir un cancer. Sin embargo, se define a un oncogen como un gen de actuaci6n dominante, y Hpicamente se ensaya por su capacidad para causar, por sf mismo. transformaci6n ncopl<1.sica de celulas en cultivo. ESla contradicci6n aparenle refleja el ahismo entre los modelos simplificados de cAncer estudiados m
eapftulo 24: Clincer

Ie fusiOn e un gen que" transcribe activemenle hace que Ie protelne de fUlion Ie lintetice en cMtid.des supeliores e las normelel; tembi.n puede ocurrir que I. proteIn. de fUlion sea hipereetiv.

Plgur1l24-27 Trcs caminos por los que un prolo,ollcogen puede ser trllDsformlldo en oncogen. Un cuarto mecanismo (no se mucstra en In figural implica In recombinacion entre el DNA retrovirico y un proto-oncogen (vease Figura 24-24). EsIO tiene efectos similares a los de un reordenamienlO del cromosoma, poniendo aI prolOoncogen bajo el control de un aClivador virico y/o fusionandolo a un gen vinco que se transcribe activamente.

t

•

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ratones transgenicos que llevan el oncogen en lodas sus c~lulas. £1 oncogen introducido de esta forma puede expresarse en muchos tejidos 0 5610 en unos cuanlos lejidos especiales, de acuerdo con la especificidad tisular del promotor asociado. Tfpicamente, en rat ones dotados mediante este sistema con un oncogen myc 0 ras, algunos de los tejidos que expresan el oocogen crecen exageradamente; con el paso del tiempo, de vez en cuando algunas celulas sufrell cambios adicionales y dan lugar a cdnceres. Sin embargo, la gran mayorla de las celulas que expresan el oncogen myc 0 ras en el rat6n transgenico no originan cAnceres, 10 cual demuestra que el oncogen por sf solo no es suficienle para causar una transformaci6n neopl
La perdida de una copia de un gen supresor de tumores puede generar una predisposici6n hereditaria al cancer24 • 25 Dada una celuJa cancerosa, es mas diffcillocalizar la ausencia de un gen normal que descubrir la presencia anormal de Olro gen: no puede lomarse el DNA y reaIizarse un ensayo de transformaci6n para identificar a1go que simplememe no eSla. Los conocimienlos sobre los genes supresores de lumores han sido mucho m
!

t

o o

100

200

edad en die,

Pllunl24·28 Colaboracl6n entre oncogenes en nlones Inlnsgen1C05. Las grnficas muestran la incidencia de tumores en Ires ripos de ratones lransgenicos. uno portador de un oncogen myc, Olro del oneogen feu, y un lercero portador de ambos oncogenes. Para estos experimenlos se oonstruyeron dos Iineas de ratones transgenicos. Una de elias lleva insertada una copia de un oncogen creado fusionando el prOlo-oneogen myceon elpromolorfeSllmuiador del virus del tumor mamario de ra{6n (que asf produce la sobreexpresi6n de myc en delerminados tejidos como la glandula mamaria). La Olra !fnea!leva insenada una copia del oncogcn v-Hreu bajo control del mismo promotorfeslimulador. Los ralOnes de ambas cepas desarrollan tumores mucho mJl.s frecuentemcntc de 10 normal, a menudo en la glJl.ndula mamaria 0 en las glJl.ndulas salivales. Por cruzamiento de las dos cepas se obtuvieron ratones que contenian ambos oncogenes a la vez. Estos hfbridos des,1rrollan tUffiores con mucha ma~'Or frecuencia lodavfa, muy superior a la suma de las frecuencias para los dos oncogenes por separado. Sin embargo, los tumores se producen 5610 despu~ de un lapso de tiempo, y 5610 en una pequefia proporci6n de las cclulas de los tejidos donde se expresan ambos genes: aparememenle. para que se desarrolle un proceso canceroso es necesario que, ademJl.s de la presencia de los dos oncogenes, ocurran algunos cambios accidentales adicionales. (SegUn E. Sinn, et aI., Cell 49:465-475, 1987.1!:l Cell Press.)

1373

La dificuhad estriba en que la perdida de un solo gen supresor de t'Ulllores -incluso la perdida de ambas copias del gen- nonnalmente no es suficienle por sf misma para causar clneer; eslo haee diffciJ incriminar mutaciones especfficas. Hemos visto que al intentar localizar oncogenes nos enCOl1lramos con el mismo problema, y que puede solucionarse mediante ensayos en los que se utiJizan Ifneas celulares que normalmente son faciles de transformar con un unico gen mutado. Sin embargo, en el estudio de genes supresores de tumores la clave provino de un tipo de clncer humano poco comun, el retinoblastoma, que aparece a partir de celulas del cuerpo que estm rransformadas por un numero extraordinariamente pequeno de muraciones. EI retinoblastoma aparece en la infancia; los tumores se desarrollan en celulas precursoras neuronales en la retina inmadura. Aproximadamente uno de cada 20 000 ninos se encuentra afectado. Ensten dos formas de la enfermedad, una hereditaria y otra no hereditaria. En la forma hereditaria aparecen mt1ltiples tumores, normalmente de forma independieme, afectando ambos ojos; en la no hereditaria 5610 queda afectado un ojo y por un solo tumor. En algunos enfermas afectados de retinoblastoma hereditario se ha observado un cariotipo visiblemente anormal. con una deleci6n en una banda especffica del cromosoma 13; deleciones de este mismo locus tambien se han encontrado en celulas tumorales de pacientes con la forma no hered.itaria de la enfermedad. Esto sugiere que el cancer podria estar causado no por la adqu..isici6n de un oncogen sino por la perdida de un gen supresor de tumores. Concretamente. si todas la celulas de los pacientes con la enfermedad hereditaria carecen de una de las dos copias de un gen supresor de tumores, estas celuJas estantn predispuestas a transformarse en cancerosas: una sola mutaci6n somAtica que elimine la copia correcta del gen que se conserva en una celula del mW6n 0 mas de celuJas que crecen en la retina, sem suficieme para iniciar un cancer. EI gen cuya perdida parece ser crftica para el desarrollo del cancer se denomina el gen retinoblastoma, 0 gen Rb. En ninos sin la predisposici6n hereditaria, el retinoblastoma es muy poco frecuenle porque requiere de la coincidencia de dos mulaciones som
RETINOBLASTOMA HEREDITARIO

I

l

Figura 24-29 Mecanismos genetJcos deJ retJnoblasloma. En la fonna hereditaria, IOOas las ~Iulas del cuerpo carecen de una de las dos copias Funcionales normales de un gen supresor de lumores, y en aquellas cl!:lulas en las que la otra copia se pierde 0 se inactiva debido a una mutaci6n som:\tica, se producen tumores. En la fonna no hereditaria, todas las cl!:lulas contienen inicialmente dos copias Funclonales del gen, y eltumor surge porque se picrden 0 inactivan ambas copias a Irav~s de la coincidencia de dos mutaciones somaticas en una cl!:lula.

RETINOBLASTOMA NO HEREDITARIO

glln Rb mutente heredado

CJD / I \ "'" CJDCJDCIDCJD

OCAl,onelmente une <»lule inllcli"'lI uno de .u. doll genet Rb correcto.

\

OCllI'onlllmente un~ celula lnectlva III .... niell copia correctll del 9"n Rb

plolifelaci6n eelullil exeesivll que <Sa lugar 1I un letinobll.ltome

COpi~d'

III Hgunda Rb M inactivlI lin III misma c81ule muy

raf'llmenle ploliferaciOn celul.t exeesiv. que dll lugllr 1I un rMinoblllltom.

RESULTADO: SIN lUMOfl

1374

CapfluJo 24: CAncer

RESUlTADO: MAYM PARTE DE lOS INDfYCUOS QUE PRESENTAN El GeN HI; OESAAROLLAN ~

\

RESUtTAOQ: sOlo UNA DE CADA 30 000 PfRSClfrtAS NORMAlES OESAAROUA lUMOR"",_ _

cELULA SANA CON UNA SOLA COPIA NORMAL DEL GEN Rb

mulllCiOn en ellocue Rb en ttl cromotOma malerno

FORMAS POSIBLES DE EUMINA06N DEL GEN Rb NORMAl

ein d.euniOn (p6rdida de cromotoma,

.In de.uniOn y

reeombineelOn milOlie,

convenliOn g.niea

delec:iOn

mulKlOn puntual

duptieKlOn

no cancerosas son defectuosas en una sola de las copias del gen, mientras que las cancerosas son defectuosas en ambas copias. En contraste, en paciemes que padecen la fonna no hereditaria de la enfennedad, las c~lulas no cancerosas no muestran ningtin defecto en rtinguna de las copias de Rb, mientras que las cancerosas sf son defectuosas de ambas copias. Muchas combinaciones diferentes de accidentes geneticos pueden eli mi· nar 0 inutilizar ambas copias de un gen. La primera copia podria, por ejemplo, perderse en una deleci6n a gran escala del cromosoma 0 inactivarse por una mutaci6n puntual; la segunda copia podrfa perderse de una manera similar 0 por recombinaci6n mit6tica (se explica en la Figura 21-73) 0 por conversi6n g~­ nica (vease Figura 6-66). EI abanico de posibWdades esta resumido en la Figura 24·30. Puede verse que la mayorfa de estas posibilidades son tales que la segunda copia del gen, y nonnalmente tambien las regiones flanqueantes en el cro· mosoma, son delecionadas totalmenle 0 reemplazadas por una copia de Ja regi6n correspondiente del primer cromosoma en defecto; en orras palabras, se pierde la combinaci6n heterozigota nonnal de los alelos materno y paterno de los genes en esta regi6n cromos6mica. De hecho, cuando se analizan las celulas tumorales de muchos pacientes de retinoblastoma distintos, se observa una perdlda de heterozJgosls en la regi6n del gen Rb en aproximadamente-el 70% de los casos. Como vercmos mas adelante, la perdida de heterozigosis en las celulas de un tumor sienta las bases de un melOdo general por el ella] pueden ser identifi· cados y clonados los genes supresores de tumores.

Figura Z4·30 Sels camlnos por los cuales se puede perder I. copl. correcta conservada de un gen 5upresor de tumores. Una relula defeetuosa en una sola de sus dos copias de un gen supresor de tumores se compona como una relula normal sana; los diagramas muestran c6mo podrfa perderse la funci6n de 1a olra copia del gen, hach~ndose asl propicia a desarrollar cancer. Para analizar el DNA del tumor se pueden utilizar sondas de DNA donado en conjunci6n con la determinnci6n de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricci6n (ve:ase Capflulo 7); asf se puede descubrir qu~ tipo de suceso ha ocurrido en un pacienle dado. N6tese que la mayorfa de los me«:anismos dan lugar a una reJula que care«:e totalmente ya sea de la copia materna 0 de la paterna de un gen supresor de rumores, junto con regiones cromos6micas adyacenles. Esto se refleja en una perdida de heterozigosis en las zonas vecinns al defecto gcne:tico. La perdida de heterozigosls en un lugar espedfico del genoma es una caracterfslica distintiva de un clincer dependienle de la pe:rdida de funci6n de un gen supreser de tumores. (SegUn W.K. Cavenee et aI., Nature 305: 779-784, 1983. C 1983 Macmillan Magazines Ud.)

La p~rdida del gen supresor de tumores de retinoblastoma

interviene en muchos canceres distintos2S,26 Dada la secuencia del gen Rb, es posible detenninar su presencia en celulas de tumores distinlos de los tumores del retinoblastoma. Parece que es frecuente que el gen este inaetivado en varios tipos comunes de clincer, como los carcinomas de pulm6n, de mama y de vejiga. EsIOS cAnceres mAs comunes se generan par una serie mas compleja de cambios geneticos que los del retinoblastoma y aparecen mas tarde en la vida y en otros tejidos del cuerpo. Pero en {odos ellos parece que la perdida de Rb es un paso importame en la progresi6n hacia la rnaIignidad. As!, aunque el retinoblastoma es poco comun, los cAnceres en los que estA implicado el gen Rb no 10 son. Como se comenta en el Capftulo 17, Rb se expresa normalmente en casi 10' das las celulas del cuerpo, y parece que su producto actua como uno de los principales frenos del progreso a lraves del cicio de divisi6n celular. La acci6n de freno nonnalmenle est<\ reguJada por fosforilaci6n. La prolefna Rb puede hallarse fosforilada y no fosforilada en cada cicio de divisi6n celuJar, y en celuJas que se ha retirado del cicio se mantiene desfosforilada. Mienrras esta desfosforilada, Rb Gene:tica molecular del c4ncer

1375

Tabla 24·6 Virus asociados con clinceres humanos VI,",

Tumores asociados

Areas de alta Incldencia

verrugas (benignas) carcinoma de cuello ulerino

mundial mundial

cancer de hfgado (carcinoma hepatocelular)

Sudesle de Asia; Africa tropical

linfoma de Burkin (cancer de los Iinfocitos B)

Oeste de Africa; Nueva Guinea Papua Sur de China; Groenlandia (esquimales)

Virus de DNA

Familia de los papovavirus Virus de los papilomas (muchas cepas distinlas) Familia de los hepadnavirus Virus de la hepatitis B Familia de los herpesvirus Virus de Epstein-Barr

carcinoma de nasofaringe

Virus de RNA

Familia de los retrovirus Jap6n (Kyushu); Virus tipo I de 101 leucemia leucemia de las celulas T de celulas T (HTLV-I) de adultos/linfoma Amillas Virus de 101 inmunodcficiencia sarcoma de Kaposi [cancer de Africa Centr"l humana (HIV-1, el virus las celulas endoteliales de del SlDA) los capilares sangufncos 0 linf<1licos (?1I Para todos los virus indicados, el numero de personas infocladas es mucha mayor que el mlmero de personas que desarrollan cl1ncer: los virus han de aetuar en conjunci6n con otros factores. Adem4s. probablemente algunos de los virus contribuyen a la formacl6n de un cl1ncer 5610 de forma indirecta: por ejemplo, el HIV·I, destruyendo las defenSll$ inmunes mediadas por c~lu· las, puede pennitir que las c~lulas endoteliales transformadas por alg\ln otro ~nte no sean destruidas por el sislema lnmunitario sino que medren como un tumor.

se une fuenemenle a cienas prolefnas reguladoras de genes y as( evila que actuen en el nudeo favoreciendo 101 replicaci6n del DNA. La pcrdida del gen deja a 101 celula libre de esta restricci6n. La interpretaci6n molecular de la aClllaci6n de Hb permite avanzar o(ro paso en la comprensi6n del cancer, ya que aporta luz sobre otra fomla por la que se puede desencadenar el cancer -por virus de DNA. Antes de explicar c6mo oeurre, hemos de detenernos y examinar el papel que tienen los virus en la causalidad del cancer humano.

Los virus de DNA tumoraJes activan la maquinaria de replicaci6n del DNA de la c~lula como parte de su estrategia para sobrevivir l6 Se cree que aproximadameme un 15% de los caneeres humanos en todo el mundo se desarroUan por mecanismos en que panicipan virus. Como muestra 101 Tabla 24-6, en hmnanos los principales eulpables no son los retrovirus sino los virus de DNA. La evidencia de su participaci6n proviene, en parte, de la detecci6n de virus en pacientcs de cancer y en parte de 101 epidemiotogfa. EI cancer de hfgado. por ejemplo, cs comun en algunas partes del mundo (Africa y sudcste de Asia) donde las infccciones vfricas de hepatitis B son comunes; en estas regiones el cancer de hfgado se da casi exclusivamente en personas que muestran signos de infecci6n cr6nica de hepatitis B. EI papel preciso de un virus asociado aI cAncer es, a menudo, difieil de descifrar porque existe un desfase de muchos anos desde 101 infecci6n viriea inicial 1376

CapftuJo 24: CAncer

1

hasta el desarrollo del cancer. Ademas, el virus s610 es responsable de una de las etapas en la progresi6n hacia el cancer; tambien participan otros faclores amhientales y accidentes geneticos. Parece que en algunos callceres los virus ejercen acciones promotoras direClaSj por ejemplo, es posible que el virus de la hepatitis B favorezca el desarrolJo del cancer de hfgado al causar un dano que provoca la divisi6n celular en el hfgado. Sin embargo, en algunos ouos canceres humanos los virus contribuyen directamente a causar una transformaci6n neoplasica de las celulas que infectan. Estudios en cultivos celulares in vitro muestran c6mo puede ocurrir esto. Si una celula Hene que ser transformada de forma eSlable por un virus, ha de establecerse una asociaci6n parasitaria estable: el virus no ha de matar la celuJa, y la celuJa ha de retener los genes vfricos de una generaci6n a otra -normalmente integrando estos genes en uno 0 mas de sus propios cromosomas, y aveces manteniendolos como un plasmido extracromos6mico que se replica al mismo tiempo que los cromosomas. Esto vale tanto para virus de DNA como para retrovirus, pero las dos clases de virus difieren fundamentahnente en la naturaleza de los genes viricos que causan la transformaci6n neoplasica. Como se explica en el Capitulo 6, normalmente un virus de DNA lumoral en eSlado natural se propaga por un proceso que no depende de la generaci6n de cancer. Por ejemplo, un virus SV40 (Figura 24-31) produce una protefna virica que activa rapidamente la maquinaria de replicaci6n del DNA de la celula huesped. Entonces el virus utiliza las protefnas del huesped para replicar y transcrihir su propio genoma; la infecci6n continua hasta que el huesped muere, Iiberando una gran cantidad de nuevas pankuJas viricas infecciosas. Menos frecuentemente, sin embargo, el DNA vfrico no se replica sino que se incorpora de forma estahle en el cromosoma de la celula huesped. Si el gen ¥frico que activa la maquinaria de replicaci6n de la celula huesped se transcribe, este gen puede actuar como un oncogen, causando una transformaci6n cancerosa. A diferencia de los oncogenes retrovfricos comentados anteriormente, este oncogen es una parte esenciaJ del genoma vfdco y no tiene un hom610.go en la celula huesped normal.

Los virus de DNA tumorales activan la maquinaria de replicaci6n de la celula bloqueando la acci6n de los genes clave supresores de tumores l6,27 Los virus de DNA son un grupo diverso, pero en general, los principios que acabamos de describir son vaJidos para la mayoria de los virus de DNA que estan

protelnas v{ricas requeridas para la replicaci6n conlrolada del virus

cromosoma hu6sped

•

INTEGRACIQN ACCIDENTAL OE UN FRAGMENTO DE DNA VfRICO EN EL CROMOSOMA HUl!:SPED

producci6n desequilibrsdll de las protelnas vlricas de replicacion

gen integrado codificante de una protelna virica de replicaclon

cromosoma del papilomavirus

CRECIMIENTO BENIGNO 0 VERRUGA

Gen(!tica molecular del cancer

TUMOR MALIGNO

Figura 24-31 EI vlrns SV40. La estructura de la capside de este virus de DNA que infecta monos, ampliamente estudiado, ha sido determinada par difracci6n de rayos x. (Cortesfa de Roben Granl, Slephen Crainicy James M. Hogle.)

Figura 24·32 Mecanlsmo por el cual clenos papllomavlrus se cree que desencadenan el cl1ncer del cuello de dtero. Los papilomavirus tienen cromosomas de DNA circulares de doble cadena de aproximadamente 8000 pares de nucle6tidos. En una verruga u otra infecci6n benigna, estos cromosomas se manlienen, de forma estable, en las celulas basales del epitelio, como plasmidos cuya replicaci6n esta controlada para mantenerse en el mismo estadio que los cromosomas de la celula huesped (lUjuierda). Accidentes poco frecuentes pueden causar la integraci6n de un fragmento del plasmido en el cromosoma del huesped, alterando el entomo de los genes vfricos y desorganizando el control de su expresi6n. La producci6n descontrolada consiguiente de protefnas de replicaci6n vfricas-en particular los produclos de los genes vfricos E6 y E7- tiende a condllcir a la celllla huesped a la fase 5, facilitando de este modo la genesis de un cancer (derecha).

1377

A'

Ie prOle'ne Rb secuestte Ie proteroe vl,ice secueslre Rbv pS3

pro,""K'60

fllCto, de p,olife'lICi6n celule, ineetivo II)rOleine reguledora

"'-'

DNA

fllClor de p,oIiferllCi6n celule, IICt.ivo

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\\. I ,

lreneeripclOn

~"ifIIIII(,- g6na

."

~III.""

,

p5J.rove eI frena de Ngunded de Ie proIiferllCi6n celllllr PROUfERAOON CELUlAR BLOOUEADA

PROLIFERACION CnUlAR ACTIVADA PM El DNA DEL VIRUS

implicados en la genesis de ccinceres, Los papilomallirus, por ejemplo, son la causa de la verrugas en los seres humanos y tambien estan impJicados en carcinomas del cuello urermo. Son parientes lejanos de la familia de poliomaflirus que incluye a SV40, y el cancer que causan en humanos requiere que algunos genes de replicaci6n del virus se inregren en el cromosoma huesped, como se iJusIra en la Figura 24-32. Como ocurre can SV40, los papilomavirus lienen que ser capaces de controlar la maquinaria de slntesis de DNA de la celula huesped, y los genes vlricos que rienen cSla funci6n pueden acluar como oncogenes. Se denominan genes £6 y £7 del papilomavirus, y sus producloS proleicos son funcionalmenle cquivalenres a una proteina de doblc funci6n denominada amlgeno T grande, codificada por el correspondiente oncogen vfrico del genoma de SV40, EI mecanismo de acci6n es aparenlemente simple: eslas proteinas vfricas se unen a los productos proteicos de dos genes clave supresores de rumores de la celula huesped dejandolos fuera de acci6n y permiliendo por 10 tanto a la celula replicar su DNA y dividirse (Figura 24-33). Una de estas proreinas del huesped es Rb: uniendose a elia, la protelna vlrica (E7 0 T grande) evita que se una a sus Iigandos nonnales de la celula. EI otro gen supresor de tumares que las protei'nas viricas inactivan se denomina p53 (por su masa molecular de 53 kilodaltons). Como Rb participa en el desarrollo de muchos tipos de ca.nceres, no s610 de los que son dependientes de virus.

Mutaciones en el gen p53 inhabilitan el frena de emergencia de la proliferaci6n celuJar y conducen a una inestabilidad genetica 13, 14,28 Las personas que heredan de sus padres una sola copia funcional del gen p53, como aquellas que heredan una sola copia funcional de Rb, est:1n predispuestas a padecer cancer. Son propensas a desarrollar varios tumores independientes en una amplia variedad de tejidos a una edad relativamente temprana -tlpicamente de aduhos j6venes. Esta predisposici6n familiar se denomina sfndrome de LiFraumeni; como el retinoblastoma, es poco corrienle. Las celulas tumorales de pacienres de U-Fraumeni tienen defectuosas ambas copias de p53, mientras que las celulas no tumorales s610 tienen defectuosa una de elias. Estas caracteristicas son tfpicas de un gen supresor de tumores y. confirmando esta funci6n de p53, se sabc que aumentando artificialmenle en cuhivos celulares ordinarios los niveles de la protefna p53 normal, se detiene la proJiferaci6n de las celulas. La protefna p53 se une al DNA y ejerce su efcclo, al menos en parte, induciendo la transcripci6n de otro gen regulador. EJ producto de esle gen, una proteina de 21 kilodallons, se une a complejos de ciclina G1 con proteina Cdk2, la cual normalmenle conduce la celula mas allci del punto de control G1 del cicio celular. como se comenta en el Capitulo 17. La protefna de 21 kilodaltons bloquea la actividad quinasa de estos complejos, evitando asi la progresi6n de la celula en la fase S y la replicaci6n de su DNA. A diferencia de 10 que ocurre con Rb, en condiciones normales en la mayorfa de la cclulas del cuerpo se encuelllra muy poca cantidad de prolefna p53. De 1378

Capftulo 24 : C
Figura 24-33 ActJvacl6n de la proltreracl6n celular por el vlru.s tumoral de DNA SV40. SV40 uliliza una sola protefna de doble funcion, denominada antfgeno T grande. que secuestra tanto a Rb como a p53; otros virus lumorales de DNA relacionados utilizan dos prolefnas vfricas individuales (E6 y E7 en el caso de papilomavirus) para el mismo prop6siIO.

•

hecho p53 no es necesaria para el desarrollo normal: ratones lransgenicos en los que se han inaclivado ambas capias del gen apareeen nonnales en todos los aspectos exeepto en uno -nonnalmenle desarrollan atneer a la edad de 3 meses. Eslas observaciones sugieren que p53 podria realizar una funci6n necesaria 5610 oeasionahnenle 0 en cireunSlancias especiales. Evidencias eomplemenlarias apoyan esta idea. Cuando se exponen eelulas normales a luz ultraviolela 0 radiaci6n gamma, reaccionan aumentando la eoneentraci6n de protefna p53 (reduciendo In velocidad, normalmente n1pida, de degradaci6n de In moI6cula). EI alto nivel de p53 resllilante bloquea la proliferaci6n eelular: las ctllulas no pucden progresar en la fase S del cicio celular y se relTasan en la fase G1 0 mueren por apoplosis. Las celulas que eareeen del gen p53 no muestran esla respuesta: contimian dividiendose. precipitcindose en la replicaci6n del DNA sin delenerse en la reparaci6n de roturas ni de otras lesiones causadas por la radiaci6n daf\ina. Como resuhado de ello, mueren. 0 10 que es pear. sobreviven y proliferan pero con un genoma en mal eslado. Asf una conseeuencia habitual es que los eromosomas se fragmenlen y se reunan, generando un cariotipo allameme inestable. Esto puede conducir a duplicaciones genicas y. en los siguiemes cidos de divisi6n celular, a amplifieaeiones genieas como las descritas anteriormente para mdrl y myc en celulas tumorales (Figura 24-34). Parcee, por 10 lanlo, que la funci6n normal -0 como minima una funci6n nonnal- de p53 es eapacilar a las celulas para reparar con exilo el DNA daiiado. Es posible que p53 pueda actuar lam bien como freno de la proliferaci6n celular en OlTas circunstancias de estres. De hecho. muchas eelulas cancerosas contienen grandes cantidades de p53 (de mutante inactiva); 10 cual sugiere que los otTOS accidentes genelicos que generan el cancer SOil suficientes para estimular a p53 para que entre en juego. La perdida 0 inaClivaci6n de p53 puede ser. por 10 tanIo, doblemente peligrosa en relaci6n con el cjncer -primero, debido a la eliminaci6n de un bloqueo bacia la proliferaci6n de las celulas que ban sufrido mulaciones carcinogenicas, y segundo por permilir otras mUlaciones carcinogenicas que se generartin cllando estas celulas se dividan. Las mlltaciones en el gen p53 son las lesiones mas comunes en el cancer humano: esta prescnle en mas del 50% de los casos de esta enfermedad.

Los canceres colon-reclales se desarroUan lentamente, a de una sucesi6n de cambios estructurales visibles Z9.30

trav~s

En la primera parle de eSle capitulo hemos visto que la mayor parte de canceres se desarrollan lenlamente a partir de una sola celula alterada, progresando desde lumores benignos a maJignos por la aCllmulaci6n de media docena de accidenles genelicos independientcs. En la segunda parte del capftulo hemos disculido algunos de eSlos accidenles en terminos moleculares. Ahora consideraremos de que fomla encajan los principios generales y los fragmemos de la explicaci6n ge-

lelOmero

24·201.

fibril del hUIlO milOlico

centrOmero

fragmento de cromosoma

;""'dO

-genA ro!ura en una hebra lel6mero

lL

,

Figura 24-34 Mec:anlsmo por el cual la repllcacl6n del DNA dll.nado puede conduclr a anomalfas cromosOmlcas y ampllflcacldn genlca. El esquema muestra un de los diversos mecanismos posibles. EI proceso empieza con el dano accidenlal del DNA en una ct'!hlla que carece de prolefna p53 funcional. En lugar de detenerse en el punta de control dependiente de p53 de 120 fase G1 del cicio de divisi6n celular, como haria una celula normal con el DNA dafiado hasta que Sll DNA estuviera reparado, la celula dcfcctiva en 1'53 elma en la fase S con las consecuencias que se muestran. Cuando se ha generado un cromosoma que contiene una duplicacidn y carece de tel6mero, rondas de replicaci6n repetidas, fusi6n de cromalidas, y WIllms desiguales pueden incrementar todavfa mas el numero de copias de la regi6n duplicada. Por 10 taniO, la selecci6n a favor de las cellilas can un mlmero incremcntado de capias de un gen en la regidn afectada del cromosoma dara lugar a mutanles en las cuales el gen se amplifica hasta un elevado mimero de copias. Las coplas mUltiples pueden ser visibles finalmente como una regi6n leilida homogeneamente en el cromosoma, 0 pueden -tanlO a Iraves de un aCOnlccimienlo de recombinati6n como mediante una rotura no rcparada de una hchra de DNA- deledonarse de SII locus original y aparccer como cromosomas dobles diminutos individuales (vt'!ase Figura

2

.. Clilula enlra en I, fase 5 y replICa IU ONA a peNr de que Ie 1010.. de Ie hebra no ha ,ido r8j:Ulrad.

Gent'!tica molecular del c4ncer

3

una c61ula hij. hereda eI coomosom. que ce.«:e de lelomero

•

.. c6+ula entra enlafaseSy .eplica IU DNA

~

elllremos de

fel c,omatida. hermann que celecen de lelomeros 58 fu.lonan

•las crom'tidu • hermanal fusioneda. .. np.e..n en la mitosi. gene..ndo un nuevo punlo de rOlura

, una ""uta hila hereda un coomolOme con gene. dupllcedol perc que lambillln caracen de lelome,o

1379

L

F1gum 24-35 Seccl6n tmnsversal de un p611po adenomatoso del colon. El p6lipo sobresale en ellumen del COIOll. EI resto de la pared del colon esta cubierta COil epitelio de colon nonnal, formando glanduJas tipicas cortas; en el p6Jipo el epile!io aparece a1go anormal, formando glandulas mas largas. (Cortesfa de Anne CampbeU.l

•

,

,

, , mm

nerica, proporcionando una relaci6n coherente del desarrollo de uno de los canceres humanos mas comunes. Como ejemplo tomamos el cancer colon-rectal, porque en esre caso los pasos de 1a progresi6n tumoral se han podido seguir in UillO, a traves de una serie de cambios estructurales que pueden seT relatados como acontecimientos moleculares especfficos. Los canceres colon-rectales se generan en el epitelio Iindante del colon y del recto (el tramo final del intestinal. Son comunes, ya que actualmente causan unas 50 000 muertes cada ano en los Estados Unidos y representan elll% del lOtal de muertes por cancer. Como la mayoda de canceres, normalmente no son diagnosticados hasta una edad tardfa (el 90% despues de los 55 aoos). Sin embargo, un examen rurinario en aduhos normales mediante un colonoscopio (un aparato de libra 6ptica que permite observar el interior del colon y del recto) a menu do revela un tumor benigno del epitelio intestinal. de pequenas dimensiones, 0 adenoma, que forma una masa protuberante del tejido denominada p6lipo (Figura 24-35). Se cree que estos p6lipos adenomatosos son los precursores de una gran proporci6n de los canceres colon-rectales. Debido a que normalmente la progresi6n de la enfermedad es fiUy lenta, existe un perfodo dpico de 10-35 afios en el cual el tumor de crecimjento lento ya es detectable pero aun no se ha convertido en maligno. Par ello, cuando la gente se somete a un reconocimiento mediante colonoscopio, hacia los 50 afios, y se extraen los p6lipos -el procedimiento quin.irgico es rapido y sencillo- la incidencia de cancer colonrectal disminuye mucho -de acuerdo con algunos estudios, menos de la cuarta parte de 10 que ocurrirfa en caso contrario. EI cancer de colon proporciona un ejemplo claro del fen6meno de la progresi6n tumoral descrito previamente. En los p6lipos menores de I cm de diametro, las celulas y los detalles locales de su disposici6n en el epitelio aparecen casi normales. Cuanto mayor es el p6lipo, mayor es la probabilidad de que contenga celulas con apariencia anormalmente indiferenciada y formando estructuras organizadas de forma anormal. En algunos casos en un mismo p6lipo pueden distinguirse dos 0 mas sectores y las celulas de un sector parecen relativamente normales mientras que las del otro parecen realmente cancerosas, como si hubieran aparecido como un subclon mutante del colon original de ceo lulas adenomatosas. En estadios posteriores de la enfermedad, las celulas tomorales resuhan invasivas, primero se separan de la lamina basal epitelial, luego se extienden por la capa muscular que rodea el intestino y finalmenle forman metastasis hacia los n6dulos linfaticos, el hfgado, el pulm6n y otras tejidos. 1380

Capftulo 24 : CMcer

,

,

,

Las mutaciones que conducen a] cancer colon-rectal pueden ser identificadas examinando las c~luJas cancerosas y estudiando las familias propensas a desarroUar cancero2!l,31 l.Cuales son las mutaciones que se acumulan con el tiempo para producir esle lipo de cancer? Una aproximacidn para responder a esta pregunta consiste en utilizar sondas de DNA de prOIO-oncogenes conocidos y de genes supresores de tumores para determinar si alguno de ellos han sufrido una mutaci6n. Par este media se ha visto que el 75% de canceres colon-rect'ales dellen mumciones de inactivaci6n en el gcn supresor de tumores p53; el 50% Henen mutaciones puntuales en el prolo-oncogen ras (normal mente una mutaci6n especffica de activaci6n, en el cod6n 12 del gen K-ras); un pequeno porcemaje tienen amplificado el numero de copias del proto-oncogen myc; y otro pequeno porcemaje Hene mutaciones en olros proto-oncogenes conocidos (vease Tabla 24-n. Qua aproximaci6n consiste en localizar el defecto genetico en aquellas familias poco frecuenles que muestran una predisposici6n heredilaria al cancer colon-rectal. El principal de estos sfndromes de docer hereditario es la coodici6n conocida como poliposis coli adellomatosa familiar (APe, de Adenomalous Polyposis Co(j), en la cual a 10 largo del colon se desarrollan demos de miles de p6lipos. Aparecen en una fase lemprana de la edad adulta, y si no son extirpados, es casi inevitable que uno 0 mas de elias progrese hasla convenirse en maligno; desde la primera detecci6n de p61ipos hasta el diagn6stico de cancer transcurren unos doce arios. Un indicio de la enfermedad puede ser una deleci6n 0 una inaclivaci6n de un gen especffico -el gen APe situado en el brazo largo del cromosoma 5. Los individuos que padecen el sfndrome APe lienen mutaciones inactivadoras 0 deleciones del gen APe en todas las celulas del cuerpo. De los pacientes de cancer colon-rectal que no padecen el smdrome APC, mas del 65% tienen mutaciones similares en las celulas cancerosas pero no en los otms tejidos_ Por 10 tanio, de manera similar a 10 que hemos comentado para el retinoblastoma, las mutaciones de APe han sido identificadas como uno de los ingredientes centrales del cAncer colon-rectal. La funci6n normal de la protefna APe no se conoce, pero se ha viSIO que se une a calenina 13 (vease Caprtulo 19), 10 cual sugiere que podria estar implicada eD a1gUn mecanismo de control relacionado con los lugares de anclaje del citoesqueleto a las uniones celula-celula.

Tabla 24-7 Algunas anomalfas genctlcas detectadas en cclulas de cancer colon-reclal Geo

Cromosoma

K-ras fleu

Tumorescon mUladones (%) Clase

\2

-SO

17

1/1)'1:

8

2 2

APe

5

>70

\8

>70

17

>70

2

-15

(poliposis coli adeflomatosa)

DeC (delecioflado e" carcinoma deCO/Oil) p53

HNPCC (cancer colOfl-reclal "eredilario "0 polipoide)

oncogen oncogen oncogen supresorde nunores supresorde nunores supresorde tumares supresorde nunores

Fuenle: Modiflcadode J.L Marx,Sclenu260:751-752, 1992.

Genetica molecuJar del cancer

\381

Deleciones geneticas en las celulas cancerosas colon-reclales revelan lugares de perdida de genes supresores de tumores 29,32 Olro enfoque en la investigaci6n ha conducido lambien al descubrimiento de otros genes supresores de tumores. Como hemos indicado anleriormente, la perdjda de ambas capias de un gcn supresor de tumores a menudo comporta una perdida de heterozigosis en la regi6n cromos6mica en la que reside el gen: enlugar de distintas variames malerna y paterna s610 enSle una versi6n de la secuencia cromos6mica y algunas veces ninguna. Como en las poblaciones humanas existe una gran variabilidad genelica, en muchos individuos es posible encontrar varias diferencias de secuencia entre las capias materna y paterna de cualquier cromosoma dado y disei'tar sondas genelicas que delecten eslas direrencias. Usando estas sondas se puede analizar sistematicamcnte el genoma de celulas de un tumor y buscar la perdida de helerozigosis que es delectable en las celulas norm ales del individuo. Si la perdida de heterozigosis se delecla repeddamente en el mismo lugar cromos6mico en muchos tumores derivados de rnanera independienle, disponemos de un indicio muy fuerte de que est'e lugar normalmente hospeda un gen supresor de tumores cuya perdida es un instrumenlO para generar turnores. Un am1.lisis sistematico de este lipo en un gran numero de ca.nceres colonreclalcs revela distintos lugares en los que la perdida de heterozigosis es tan eomun que sugiere la presencia de un gen supresor de tumorcs. EI lugar del gen APe esla entre ellos, al igual que el gen p53; olro lugar que muestra perdida de heterozigosis en mas del 70% de tumores esta ocupado par un gen Uamado DeC (delecionado en carcinoma de colon). Este gen, que rue descubierto a {raves de esle sistema de analisis, codifica la que parece ser una prolefna transmembrana cuyo dominio eXlracelular es similar al de la molecula de adhesi6n celular N-CA.M, 10 cual sugiere que podrfa eSlar implicada en la adhesi6n celula-celula o celula-marriz 0 en la recepci6n de sei'iaJes desde el entorno celular. La Tabla 24-7 proporciona un resumen de los principales prolo-oncogenes y genes supresores de lumores implicados en el c;incer colon-rectal.

Las elapas de la progresi6n lumoral pueden correlacionarse con delerminadas mUlaciones~·33 lEn que secuencia oeurren estas mutaciones y c6mo contribuye eada una de ellas al eomportamiento desordenado de la eelula cancerosa? Las mutaciones que inactivan el gen APe pareeen ser la primeras, 0 al menos, eorresponden a una etapa muy remprana. Pueden ser ya deteeladas en pequenos p6lipos benignos con la misma freeuencia elevada que en los tumores malignos de mayor lamano. Sll efeeto parece ser simple mente el de incrementar la velocidad de proliferaci6n de la eelula en relaci6n a la velocidad de perdida de eelulas, sin afeetar la forma en que las eelulas se diferencian 0 los detalles del palr6n histol6gico que forman. Las mutaciones que ncUvan el oneogen ras oeurren un poco mas tarde; son raras en los p6lipos pequei'ios pero son comunes en los mayores que muestran distorsiones en la diferenciaci6n celular y en el palf6n histol6gico. Cuando se haeen crecer en cultivo estas celulas malignas del carcinoma colonreclal que eonlienen eslas mulaciones de ras. muestran las caraclerfsticas comunes de eelulas transfonnadas, como la habilidad de proliferar sin anclaje al substrato; si su gen ras aetivado es eliminado las celulas revierten a no lransformadas y rcducen su velocidad de proliferaci6n. Las mutaciones en DeC y en p53 se produeen mas larde. Son raras en p61i~ pos perc comunes en tumores malignos que se desarrollan de ellos. La perdida de p53 parece liberar a las celuJas mutanles de sus ultimas inhibicionesi si se transfecla p53 normal en las celulas de carcinoma colon-rectal. se suprime su proliferaci6n. De acuerdo can una tearfa, las muraciones oneogenicas de ras. como el dana genetico inducido por radiaci6n, activan un frena de emergencia de la proliferaci6n que dependc de la protefna p53: para que las eelulas puedan 1382

CapftuJo 24: Cancer

'"

5q

epilelio normal

18q

17p

ptkdlda

activaci6n

~rdidll

perdida

APC

K-rtls

DeC

p53

-L

L L L m''"r otras

epilelio

ltdenoma

hiperprol1ferativo

temprano

ltdenoma

intermedio

_

crecer hasta un cancer totalmente establecido ha de ocurrir que este frena sea inutilizado por una mutaci6n en p53. Parece que la perdida de la funci6n p53 permite a las celulas no 5610 dividirse sino lambien acumular mas mutaciones a una velocidad rapida. progresando a lraves del cicio celular cuando no eSlan prepararlas para hacerlo. Debido a que eslas mutaciones posleriores oeurren nipidamentc. probablementc no son acontecimienlOS limitantes en la incidencia del cancer (vease Figura 24-8), pero deben tener consecuencias funcionales. Por este camino se llega finalmente al tumor maligno, can diversas y variadas aberraciones geneticas y su habilidad para sobrevivir adaptandose frente aI ataque lerapeutico (Figura 24~36). A pesar de que las mutaciones en APG, ras, DCCy p53 pueden ser pasos limitantes cruciales en una gran proporci6n de canceres colon-rectales, eSlas mutaciones no siempre ocurren en la misma secuencia, y no son la I1nica TUta de la enfermedad. Por ejemplo, en aproximadamente un 15% de los casos parece que el desarrollo del cancer colon-rectal se desencadena desde el principio mediante otro tipo de mutaci6n que aumenta la mutabilidad de la ctHuJa disminuyendo la fidelidad de replicaci6n de delerminadas clases de secuencias de DNA repetitivo (como repeticiones de dinucle6tidos del tipo CACACA...) que estan distribuidas a 10 largo del genoma. Individuos que heredan esta mutaci6n que promociona las mutaciones tienden a desarrollar canceres colon-rectales (y de otros tipos) en una edad temprana; esta condici6n se conoce como cancer colOr/-rectal hereditaria,1O poUpoide 0 HNPCC (de Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer). El gen HNPCC tiene una historia de evoluci6n muy antigua: existe un gen hom610go al humano en bacterias y levaduras denominado mutS que es necesario para reparar regiones del DNA donde se producen desapaIeamientos de la secuencia de nucle6tidos de las dos cadenas de la doble Mlice (vease Figura 6-50). Esta claro que estos mecanismos de reparaci6n son de una importancia fundamental en todos los organismos vivos. Las celulas tumorales con mutaciones HNPCC normalmente no muestran la enorme inestahilidad cromos6mica asociada a las mutaciones p53: han encontrado otIa ruta mas sUli! hacia la acumuJaci6n rapida de las mutaciones requeridas para el cancer. Glros tipos de canceres que han sido analizados geneticamente muestran a menudo una variedad de lesiones genelicas y de diferencias entre un caso y otro de la enfermedad, incluso mas amplias que las descrilas aqui. Par ejemplo, en la forma de cancer de pulm6n conocida como cancer de las celulas pequeilas del puJm6n, se encuentran mutaciones no s610 en ras, p53 y APC sino tam bien en Rb. en miembros de la familia myc (en la forma de amplificaci6n del numero de copias del gen myel. y en al menos otros cinco proto-oncogenes conocidos y genes supresores de tumor. En pacientes distintos se han encontrado combinaciones diferentes de mutaciones. que corresponden a canceres que reaccionan de forma distinta al tratarniento.

eoonom. _ tardio

carcinoma _

mel'Slasis

Figura 24-36 Secuencla tfplca de los camhlos genetloos que marcan el desarrollo de un carcinoma colonre<:tal. N6tese que generalmellte la perdida deAPC, DeC 0 p53 requiere dos mutaciones para que se eliminen ambas copias del gen. De este modo, los camhios mostrados aquf correspondcll a un tOial de siete mutaciones. (SegUn E.R. Fearon y B. Vogelstein, Cell 61:759-767, 1990.)

Carla caso de cancer se caracteriza por su propia sucesi6n de lesiones geneticas Todo el progreso medico depende de un diagn6stico acertado. Si no se puede identificar correctamente una enfermedad, no se pueden descubrir sus causas, Genetica molecular del clincer

1383

r

predecir su rcsuhado. selcccionar un tratamiento adecuado para un paciente dado, 0 realizar prucbas en una poblaci6n de pacientes para juzgar si un trammiento propuesto es efectivo. Como acabamos de ver, la calificaci6n tradicional de canceres es simplista: una sola de la categorias convencionales aparece como una colecci6n de traSlornos heterog~neos despues de un escrulinio detenido. con algunos aconlecimientos en comun pero cada uno caracterizado por su propia sucesi6n de traSlornos gen~ticos (Figura 24-37). La biologfa molecular eSla empezando a proporcionar herramientas para detenninar con precisi6n que genes son amplificados. cuales eslan delecionados. y cuales estAn mutados en las celulas tumorales de un paciente dado. Esla informaci6n podrfa ser Ian importanle para el tratamiento y prevenci6n del cancer como 10 es la identifieacl6n de microorganismos en pacientes con enfennedades infecciosas. El descubrimiento de oncogenes y. mas recientemenre. de genes supresores de tumores ha mareado el fin de una era de tanleo en la oscuridad de los indicios de las bases bioqufmicas del clncer. Ha sido a1entador enconrrar que, despu6> de todo, existen algunos principios generales y que las distintas fonnas de cancer companen algunas anomalfas geneticas clave. De todos modos aun estamos lejos de en tender completamente los canceres humanos comunes. Canocemos las secuencias de DNA de muchos oncogenes y proto-oncogenes y de diversos genes supresores de tumores cruciales. pero 5610 conocemos las funciones fisiol6gicas de algunos de eUos. Para poder disenar tratamientos racionalcs yeficaces necesitamos conocer mejor wmo interaccionan estas y otras mol&ulas para gobernar el componamiento de las celula individuales. hemos de entender mejor la sociologfa de las celulas en los tejidos y hemos de comprender mejor la poblaci6n gen~tica de la celula que gobiema la genesis de las celuJas eancerosas a traves de la mutaci6n y de la selecci6n nalural Retroccdiendo en la historia de la biologia celuJar. podemos sentimos optimistas. EI desco de entender que es 10 que guia la investigaci6n basica revelara seguramente nuevos eaminos hacia nueslTaS metas humanitarias, no 5610 en relaci6n at cancer sino lambi~n en ltreas mas amplias que apenas podemos prever.

)

TUMOR 1

TUMOR 2

Figura 24-37 Cada tumor generalmente contendni un 'uego de leslones genl!:ticas dlsUntas. En esle diagrama esquemAtico, W. X, yyz denOlan alleraciones en genes supresores de tumor u oncogenes al1n no descubienos. Los tumores que aparecen en distinlos lejidos son. generalmenle. mlls diferentes en sus anomalras genl!:ticas que los tumore5 de ongen similar.

,

Resumen Dos clases tk genes son crltlcos en I" gitlesis del cancer -gelles sIIpresores de tllmo-

res y proto-oncogenes. Las nmtaciolles de perdida defuncMII ell gelles sllpresores de tll.mores relevml tllas dlllias Ire las in/libiclones qM normalmente mmltie,re" c(mtroUuio Sll mfmero; liu mlltaclolles de ganancla de fu"ci6" ell proto-oncogelles estimlllan a las dlulas a incremelltar Sll mfmero cluuulo 110 deberfatl/Jacerlo. Estas rill/mas mlltaciolles tienell 1m efecto tiominante, y los gelles mutados, conocldos como otlcogenes, pfleden ideutiftcarse por SII lulbilidad en trtmsformar el comportamiento de las dlt,las en las cuales son illtroducldos. MucilOs oncogetles lIa" sldo Iocallzados por Sll prese"cla en retrovirus transformantes, los cunles plreden tomar estas versiolles modlflcadas y peligrosas de genes en unns dltdas IlIIispell e itrtrodllcirlos e" otras cilillas IlIIuped. U,m grm. proporci6n de proto-ot,cogeues codlftcml com'lOlUmtes de las rutas por las clUlles IiIS seRtlles externns estimulan a las cilllins a divldirse. Normalmente las m"tadones en gelles supresores de tJJmores SOli receshl{U e" Sll efecto sobre '''Ill cebda indivldllal: no se produce perdida del control Ilasta que ambtu copias del ge'l se Imllan inactivadas. Sin embargo, las personas qlle I,eredall lllUl copla defectuoSll y otm flmdotlal del gen estan a meruufo ft.erum,ente predls· puntas al ctfncer, 16 que IIna sola mutad6n sonuftica es suftciente. j,mto con la mutad6n Ilerednda, para ge"erar una dlula que carez.ca totalmente de la ftmcMJl del gen sllpresor de 'umores. Los cam:eres que se dan de este modo ell !amllins son raros, pero proporclomm UII medio para ldentlJkar gelles supresores de t"mores cuya perdida es caraderlstica e" m,u;hos canceres comunes. Los "irw de DNA como fNJpilOnuUlirus y SV40 PUedeli promover el tkSllrroilo del Mllcer ucllestrando los productos de relies Sllpresores de t,mlOres -e'l particrdar de la protefna RetiJ'oblastoma, que regula In progrrsMn en el ddo cellllar ell circ:unstancins 'IOrnwles, y de

1384

Capflulo 24: D1ncer

,

la protelna p53, que se cree que aetila comQ freno de emergencia en La diuisidn eel",lar de celulas que tum SllfrltW un Mno genetico. Las etapas de La progresi6n tIImoral plI«letl correfm;ionarse con ntlltaelones que actilJQn Otrcoge"es espedjicos e intu:tilJQn genes SIIPresOres de tumores. La plrdida de La funel6n de p53, por e]emplo, es lin acontecimiento tardio comdn y puede ser el respottsable de La inestablllMd genetica de nrllcllOs cdnceres eslableddos que forman metdstasls. Combintu:iones diferenles de mlllaeiones se han errcotltrado etl diferetltes formas de cdncer e inelluo err pacietttes que nornlalnrerrte suIretl la mis· ma fonn" de In enfermedad. De lodos mados, repetiMmetlte se encllentran tIIUellOS de los mismos tipos de lesiolles getleNcas, 10 cual lug/ere qlle 1610 exlste un mInrero limitado de clUniJlos por los cllales ,."estras defeusas contra el callcer ,meeietl ser sllperadas.

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