Техника изготовления микротомных и давленых препаратов: Практическое пособие к большому практикуму по цитологической и эмбриологической микротехнике. Часть 1

М и ни сте р ство о б р а зо ва ни я РФ В о р о не ж ски й г о суда р стве нны й уни ве р си те т Би о ло г о -по чве нны й фа культе т К а фе др а г е не ти ки , се ле кци и и те о р и и эво лю ци и

П р акти ч е ско е п о со би е кбо льш о м у п р акти кум у п о ци то ло ги ч е ско й и эм бр и о ло ги ч е ско й м и кр о те хни ке

Ча сть 1. Те хни ка и зг о то вле ни я ми кр о то мны х и да вле ны х пр е па р а то в (для студе нто в IV кур са дне вно г о о тде ле ни я )

Со ста ви те ли : М .Н . Н а за р о ва И.А. Га вр и ло в Н .А. Ба г р янска я

В о р о не ж 2002

2

П Р ЕДИСЛОВ ИЕ Да нны й р а зде л б о льш о г о пр а кти кума по ци то ло г и че ско й и эмб р и о ло г и че ско й ми кр о те хни ке по свящ а е тся о сно вны м ме то да м пр и г о то вле ни я ми кр о пр е па р а то в для це ле й по сле дую щ е г о и х и зуче ни я в све то во м ми кр о ско пе . О н о сущ е ствляе тся в VII се ме стр е в о б ъе ме 75 ча со в. Н а сто ящ е е по со б и е со зда но на о сно ве и спо льзо ва ни я уче б но й и на учно й ли те р а тур ы ве дущ и х учр е ж де ни й на ш е й стр а ны , а та кж е мно г о ле тне г о о пы та р а б о ты со тр удни ко в ка фе др ы г е не ти ки , се ле кци и и те о р и и эво лю ци и . О но мо ж е тб ы ть и спо льзо ва но студе нто м-б и о ло г о м пр и са мо сто яте льно й р а б о те в о б ла сти ци то ло г и и , эмб р и о ло г и и , г е не ти ки и се ле кци и . П р е дла г а е мы е ме то ди ки и зуче ни я р а сти те льны х тка не й по зво ляю тс те ми и ли и ны ми мо ди фи ка ци ями по луча ть по сто янны е и ли вр е ме нны е ми кр о пр е па р а ты пр а кти че ски для лю б о й г р уппы вы сш и х р а сте ни й . Сло ж не е о б сто и тде ло с ж и во тны ми . В связи с и х не ср а вне нно б о льш е й сло ж но стью в мо р фо -а на то ми че ско м пла не пр е дло ж и ть ка кую -ли б о е ди ную ме то ди ку и зуче ни я, пр и г о дную для все х и ли хо тя б ы для б о льш и нства г р упп ж и во тны х, за тр удни те льно . В ме сте с те м вр е мя, о тве де нно е на б о льш о й пр а кти кум, по зво ляе то зна ко ми ться с не ко то р ы ми ср а вни те льно пр о сты ми спо со б а ми ми кр о ско пи че ско г о и зуче ни я ж и во тны х о б ъе кто в. Та к, для а на ли за мо р фо ло г и и о р г а ни змо в, г е не ти ки и фе не ти ки по пуляци й ча сто и спо льзуе тся ме то ди ка пр и г о то вле ни я то та льны х пр е па р а то в. В это м случа е о р г а ни зм це ли ко м по ме щ а е тся по д по кр о вно е сте кло , что це ле со о б р а зно пр и и зуче ни и б о льш и нства г р упп ме лки х б е спо зво но чны х ж и во тны х, та ки х, ка к, на пр и ме р , пло ски е че р ви , р а ко о б р а зны е , па уко о б р а зны е , на се ко мы е . П р и г о дна эта ме то ди ка и для пр е па р и р о ва ни я о тде льны х ча сте й те ла ср а вни те льно кр упны хж и во тны х. Для и зуче ни я функци о на льно й мо р фо ло г и и хр о мо со м студе нты о сва и ва ю т ме то д и зг о то вле ни я пр е па р а то в по ли те нны х хр о мо со м и з слю нны х ж е ле з ли чи но к Drosophila melanogaster (ме то ди ку пр и г о то вле ни я пр е па р а то в по ли те нны х хр о мо со м хи р о но муса студе нты о сва и ва ю тна ма ло м пр а кти куме ). В ве дени е . Заняти е 1. Общ е е знако м ство с п о сле до вате льным и этап ам и о бр або тки и ссле дуе м о го м ате р и ала п р и и зго то вле ни и м и кр о то м ных и давле ных п р е п ар ато в М и кр о пр е па р а ты мо г утб ы ть то та льны ми , да вле ны ми , пр е дста вле нны ми в ви де ма зка , а та кж е ср е за р а зли чны х тка не й и кле то к. Ц и то ло г и че ски е и ли эмб р и о ло г и че ски е пр е па р а ты б ы ва ю твр е ме нны ми и ли по сто янны ми . В р е ме нны е пр е па р а ты тр е б ую т и х не ме дле нно г о и зуче ни я, по сто янны е - мо г утхр а ни ться дли те льно е вр е мя.

3

Н а по сто янны х и вр е ме нны х пр е па р а та х мо ж но и зуча ть ка р и о ти п, ми то з, ме й о з, дво й но е о пло до тво р е ни е , р а зви ти е за р о ды ш а , эндо спе р ма и т.д. О б р а б о тке ма те р и а ла и и зг о то вле ни ю и з не г о пр е па р а та до лж е н пр е дш е ство ва ть пр е два р и те льны й пр о смо тр по д ми кр о ско по м ж и во г о ма те р и а ла . Та ко й пр о смо тр пр о и зво дятдля вы явле ни я нуж но й ста ди и р а зви ти я, для пр а ви льно г о вы б о р а фи кси р ую щ е й ж и дко сти , а та кж е для уста но вле ни я ха р а кте р а тка не й , и з ко то р ы х по стр о е н то ти ли и но й о р г а н, по ско льку мяг ки е и р ы хлы е тка ни фи кси р ую тся о дни ми , а тве р ды е и пло тны е - др уг и ми ж и дко стями . Ф и кси р о ва нны й и за ко нсе р ви р о ва нны й ма те р и а л мо ж е т со хр а няться не о пр е де ле нно до лг о е вр е мя и все г да до ступе н для и ссле до ва ни я. О б р а б о тка фи кси р ую щ и ми ж и дко стями де ла е т б о ле е о тче тли вы ми то нки е стр уктур ы тка не й и кле то к, а по сле дую щ е е упло тне ни е ма те р и а ла по зво ляе тпо луча ть то нки е ср е зы . П р е ж де че м пр и ступи ть к фи кса ци и , не о б хо ди мо пр а ви льно о сущ е стви ть по дб о р ма те р и а ла . П о дбо р о бъе кто в дляи ссле до вани я Для ци то ло г и че ски х и эмб р и о ло г и че ски х и ссле до ва ни й ва ж но о пр е де ли ть, ка ки е о р г а ны и тка ни р а сте ни я не о б хо ди мы для р а б о ты . П р и и зуче ни и ми то за и спо льзую тме р и сте му мо ло ды х ко р не й , ко нусы на р а ста ни я сте б ле й , мо ло ды е ли стья. Для и зуче ни я ме й о за и по дсче та чи сла хр о мо со м во вр е мя де ле ни я ма те р и нски х кле то к ми кр о спо р и спо льзую т у зла ко вы х р а сте ни й мо ло ды е ко ло сья, у др уг и х р а сте ни й не б о льш и е б уто ны , и но г да мо ло ды е пы льни ки . О пло до тво р е ни е и р а зли чны е эта пы эмб р и о г е не за на б лю да ю т в о пы ле нны х цве тка х че р е з о пр е де ле нны е пр о ме ж утки вр е ме ни по сле на не се ни я пы льцы на р ы льце . П о дго то вка м ате р и ала кфи ксаци и О т по дг о то вки ма те р и а ла в фи кса ци и во мно г о м за ви си т до сто ве р но сть экспе р и ме нта . Что б ы на б лю да ть де ле ни е кле то к в ко нчи ка х мо ло ды х ко р не й , ва ж но о б е спе чи ть со о тве тствую щ ую те мпе р а тур у во здуха , вла ж но сть ср е ды , то е сть не о б хо ди мо со зда ть о пти ма льны е усло ви я для р о ста и р а зви ти я р а сте ни я. П р и по дг о то вке ко р не й к фи кса ци и сле дуе т о б р а щ а ть вни ма ни е на и х дли ну. Э то ва ж но пр и о пр е де ле ни и вр е ме ни на ступле ни я пе р вы х ми то зо в. У р а зны х ви до в пе р вы е ми то зы у пр о р о сш и х се мян на б лю да ю тся в ко р нях не о ди на ко во й дли ны [1]. П о ско льку чи сло де лящ и хся кле то к в р а зно е вр е мя суто к не о ди на ко во , фи кса ци ю ма те р и а ла нуж но пр о во ди ть в р а зно е вр е мя суто к и ли за р а не е о пр е де ли ть вр е мя и х ма кси ма льно г о де ле ни я. К о р ни для и ссле до ва ни я мо г утб ы ть по луче ны о тсе мян и ли р а сте ни й ,

4

вы р а щ и ва е мы х в ва зо на х. В не ко то р ы х случа ях пр о во ди тся фи кса ци я ко р не й , р а стущ и х в по ле . Для и зуче ни я ми то зо в и ка р и о ти па в ла б о р а то р ны х усло ви ях се ме на пр о р а щ и ва ю т в ча ш ка х П е тр и на вла ж но й фи льтр о ва льно й б ума г е в те р мо ста те пр и те мпе р а тур е 23-25°С. Дли на ко р е ш ко в пр и фи кса ци и до лж на б ы ть 8-20 мм, в за ви си мо сти о то б ъе кта . Че м кр упне е се ме на , те м б о льш е до лж на б ы ть и хдли на . Е сли р а сте ни я вы р а щ и ва ю тся в по ле вы х усло ви ях, то и х не о б хо ди мо за р а не е по дг о то ви ть: по ли ть, удо б р и ть, по др ы хли ть по чву. П о дг о то вле нны е р а сте ни я по дка пы ва ю т с о дно й сто р о ны и о б мы ва ю т о б на ж е нны е ко р ни . Ф и кси р ую тко нчи ки мо ло ды х ко р не й , ж е ла те льно , в утр е нни е ча сы . К р о ме то г о , для о пр е де ле ни я чи се л хр о мо со м мо ж но г о то ви ть пр е па р а ты и з мо ло ды х ли стье в и сте б ле во й ме р и сте мы [1]. Для и зуче ни я ме й о за пр и ми кр о спо р о г е не зе фи кси р ую тб уто ны о пр е де ле нно г о р а зме р а . П р е два р и те льно б е р ут се р и ю б уто но в, на чи на я о т са мы х ма ле ньки х, и по сле до ва те льно а на ли зи р ую т со сто яни е пы льни ко в, по ка не б уде то б на р уж е на нуж на я ста ди я. П р е до бр або тка м ате р и ала п е р е дфи ксаци е й В те х случа ях, ко г да тр удно по дсчи та ть хр о мо со мы и з-за и хб о льш о й дли ны и ли скуче нно сти , ко р ни пе р е д фи кса ци е й о б р а б а ты ва ю тспе ци а льны ми р е а кти ва ми , ко то р ы е ли б о р а зг о няю тхр о мо со мы , ли б о и х уко р а чи ва ю т. Э то зна чи те льно о б ле г ча е тпо дсче тхр о мо со м и и зуче ни е и х мо р фо ло г и и . Н а и б о ле е ча сто для пр е до б р а б о тки и спо льзую тся сле дую щ и е ве щ е ства : ко лхи ци н, па р а ди хло р б е нзо л, мо но б р о мна фта ли н, 8-о кси хи но ли н и др . К о лхиц ин - о б ъе кты по две р г а ю то б р а б о тке в во дны х р а ство р а х ко лхи ци на с ко нце нтр а ци е й 0,2-0,5% в те че ни е 1-2 ча со в пр и ко мна тно й те мпе р а тур е . П а р а дихло р бен зо л - пр е до б р а б о тку пр о во дят в на сы щ е нно м во дно м р а ство р е пр и те мпе р а тур е 12-16°С в те че ни е 2,5-3 ча со в. П а р а ди хло р б е нзо л пло хо р а ство р яе тся в во де , по это му р а ство р не о б хо ди мо пе р и о ди че ски взб а лты ва ть в за кр ы то й по суде (5-10 г па р а ди хло р б е нзо ла р а ство р яю т в 500 мл во ды и вы де р ж и ва ю тб уты ль в те че ни е но чи в те р мо ста те пр и те мпе р а тур е о ко ло 60°С). 8-о ксихин о лин - о б ъе кты по две р г а ю т о б р а б о тке в 0,002-мо ляр но м р а ство р е 8-о кси хи но ли на (0,058г в 200 мл во ды ) в те че ни е 3-х ча со в пр и те мпе р а тур е 12-16°С. М о ж но пр о во ди ть пр е до б р а б о тку хо ло до м. О б ъе кты (о тр е за нны е ко р ни и ли ли стья) по ме щ а ю тв со суды с пр е два р и те льно о хла ж де нно й во до й и вы де р ж и ва ю т в хо ло ди льни ке пр и те мпе р а тур е 0-2°С в те че ни е 24 ча со в.

5

В р яде случа е в пр и ме няе тся о дно вр е ме нна я и по сле до ва те льна я мно ж е стве нна я пр е до б р а б о тка [2]. П о сле пр е до б р а б о тки о б ъе кты тщ а те льно пр о мы ва ю т. П р и м е ч ани е . В не ко то р ы х случа ях пр и дли те льно й пр е до б р а б о тке 8-о кси хи но ли но м, мо но б р о мна фта ли но м на б лю да е тся фр а г ме нта ци я хр о мо со м. Э то г о мо ж но и зб е ж а ть, со кр а щ а я вр е мя пр е б ы ва ни я о б ъе кта в пр е до б р а б а ты ва ю щ е м р а ство р е . За да ни е . 1. Де та льно о зна ко ми ться с по дг о то вко й ма те р и а ла к фи кса ци и . 2. П р и г о то ви ть по суду, пр е дме тны е и по кр о вны е сте кла , р е а кти вы , не о б хо ди мы е для р а б о ты (см. пр и ло ж е ни е ). I. Ф ИКСАЦИЯ Заняти е 2.Т и п ы фи ксато р о в, и х со став, м е хани зм действи я и и сп о льзо вани е Ф и кса ци я - это о б р а б о тка ма те р и а ла , пр и ко то р о м б ы стр о пр е р ы ва ю тся ж и зне нны е пр о це ссы в о б ъе кте и со хр а няю тся по во змо ж но сти не и зме нны ми то нки е стр уктур ы кле то к и тка не й . В р е зульта те фи кса ци и кле то чны е ко лло и ды , спо со б ны е на б уха ть и и зме нять сво ю фо р му, пр е вр а щ а ю тся в сто й ки е не эла сти чны е г е ли . О сно вна я це ль фи кса ци и - со хр а ни ть о б ъе кт в та ко м со сто яни и , ка ко е о н и ме е т в ж и во м о р г а не . Изме не ни я, вы зва нны е фи кса ци е й , не о б р а ти мы . Ф и кса то р до лж е н о ка зы ва ть: 1) све р ты ва ю щ е е де й стви е , то е сть вы зы ва ть ко а г уляци ю со де р ж и мо г о кле тки ; 2) упло тняю щ е е де й стви е , а и ме нно за кр е пи ть тка нь, пе р е ве сти ко мпо не нты кле то к в не р а ство р и мо е со сто яни е , что б ы стр уктур а кле то к ста ла усто й чи во й для да льне й ш е й о б р а б о тки ; 5) хи ми че ско е во зде й стви е (что б ы о б ъе кт мо г во спр и ни ма ть кр а ску), а та кж е пр о и зво ди ть о пти че скую ди ффе р е нци р о вку со де р ж и мо г о . К ла ссиф ика ц ия ф икса т о р о в Иде а льны х фи кса то р о в - та ки х, ко то р ы е б ы в то чно сти со хр а няли ми кр о ско пи че ски е стр уктур ы взяты х для фи кса ци и тка не й , не сущ е ствуе т. О ди н и то тж е фи кса то р не о ди на ко во хо р о ш о фи кси р уе тр а зли чны е тка ни , по -р а зно му вы являе тр а зли чи е и х стр уктур . П о это му фи кса то р вы б и р а ю тс уче то м о со б е нно сте й ма те р и а ла , взято г о для ми кр о ско пи че ско г о и ссле до ва ни я. Кр о ме то г о , спо со б фи кса ци и зна чи те льно о г р а ни чи ва е т во змо ж но сть пр и ме не ни я те х и ли и ны х ме то до в о кр а ски пр и да льне й ш е й о б р а б о тке ма те р и а ла . В за ви си мо сти о т ха р а кте р а де й стви я фи кса то р ы де лят на сле дую щ и е г р уппы :

6

фи кси р ую щ и е ядр о , и ли яде р ны е фи кса то р ы (фи кса то р ы Н а ва ш и на , М о ди ле вско г о , К а р нуа , Я ко вле ва и др .); II. фи кси р ую щ и е ци то пла зму (фи кса то р ы Ф ле мми нг а , Ге р ма на и др .); III. фи кси р ую щ и е ми то хо ндр и и и пла сти ды (фи кса то р ы Л е ви тско г о , Ре г о , сме сь Га мма лунда и др .); IV. фи кса то р ы для ци то хи ми че ски х и ссле до ва ни й (фи кса то р ы Бр о дско г о - Ф СТ; Би р х-Ги р ш фе льда , К а р нуа и др .). П р и ци то ло г и че ски х и эмб р и о ло г и че ски х и ссле до ва ни ях ча щ е все г о и спо льзую тяде р ны е фи кса то р ы . В со ста в яде р ны х фи кса то р о в мо г утвхо ди ть ле дяна я уксусна я ки сло та , фо р ма ли н, хло р о фо р м, о сми е ва я ки сло та , спи р ти др . О б ы чно фи кса то р пр е дста вляе т сме сь не ско льки х р е а кти во в. О ди н р е а кти в р е дко и спо льзуе тся для фи кса ци и всле дстви е о дно сто р о нне г о де й стви я. В за ви си мо сти о тр а ство р и те ля фи кса то р ы де лятна I) во дны е (на пр и ме р , фи кса то р ы Н а ва ш и на и М о ди ле вско г о ), II) спи р то вы е (на пр и ме р , р а ство р К а р нуа и Че мб е р ле на ). В о дны е фи кса то р ы ме дле нно пр о ни ка ю тв кле тки р а сте ни й , по это му в ни х ма те р и а л вы де р ж и ва ю то т24 ча со в до не ско льки х суто к. В спи р то вы х - ма те р и а л фи кси р уе тся б ы стр е е , по это му вр е мя и х во зде й стви я мо ж е т со ста влять о т30 ми нутдо 12 ча со в в за ви си мо сти о тр а зме р о в ма те р и а ла . Ф и кса ци я спи р то вы ми фи кса то р а ми б о ле е г р уб а я, по это му для не б о льш и х не ж ны х о б ъе кто в пр е дпо чти те льне е во дны е фи кса то р ы . Для кр упны х о б ъе кто в во дны е фи кса то р ы не пр и г о дны , та к ка к пло хо пр о ни ка ю тв ни х. I.

Со ст а вн а ибо лее р а спр о ст р а н ен н ых ф икса т о р о в: 1. Ф и кса то р Н а ва ш и на (10:4:1): 10 ча сте й 1% р а ство р а хр о мо во й ки сло ты , 4 ча сти 16% р а ство р а фо р ма ли на (и ли 40% р а ство р а о тпр о да ж но г о ), 1 ча сть ле дяно й уксусно й ки сло ты . Сме ш и ва ть р а ство р ы мо ж но то лько не по ср е дстве нно пе р е д фи кса ци е й , та к ка к фи кси р ую щ а я сме сь б ы стр о по р ти тся (фо р ма ли н о ки сляе тся хр о мо во й ки сло то й ). Ф и кса то р Н а ва ш и на де й ствуе то че нь мяг ко , хо р о ш о со хр а няе т стр уктур у хр о мо со м, пр о до лж и те льно сть фи кса ци и - 24 ча са в те мно те . 2. Ф и кса то р М о ди ле вско г о (9:2:2:2): 9 ча сте й 1% р а ство р а хр о мо во й ки сло ты , 2 ча сти 16% р а ство р а фо р ма ли на , 2 ча сти 5% р а ство р а двухр о мо во ки сло г о ка ли я, 2 ча сти 5% р а ство р а уксусно й ки сло ты . П о де й стви ю на ма те р и а лсхо де н с фи кса то р о м Н а ва ш и на . В р е мя фи кса ци и 24 ча са . 3. Ф и кса то р К а р нуа (6:3:1): 6 ча сте й 100% и ли 96% эти ло во г о спи р та , 3 ча сти хло р о фо р ма , 1 ча сть ле дяно й уксусно й ки сло ты . П р о до лж и те льно сть фи кса ци и о т 2 до 12 ча со в. П р и г о то вле нны й фи кса то р мо ж но хр а ни ть до о дно й не де ли , но лучш е г о то ви ть пе р е д упо тр е б ле ни е м.

7

4. "У ксусны й а лко г о ль" (3:1): 3 ча сти 100% и ли 96% эти ло во г о спи р та , 1 ча сть ле дяно й уксусно й ки сло ты . П р о до лж и те льно сть фи кса ци и о т2 до 12 ча со в. 5. Ф и кса то р Че мб е р ле на (90:5:5) и ли (18:1:1): 90 ча сте й 50-70% эти ло во г о спи р та , 5 ча сте й 40% фо р ма ли на (пр о да ж но г о ), 5 ча сте й ле дяно й уксусно й ки сло ты . П р о до лж и те льно сть фи кса ци и 12-16 ча со в, но пр и не о б хо ди мо сти в это м фи кса то р е ма те р и а л мо ж но хр а ни ть б о ле е пр о до лж и те льно е вр е мя. П о ха р а кте р у де й стви я фи кса то р Че мб е р ле на за ни ма е т пр о ме ж уто чно е по ло ж е ни е в ср а вне ни и с фи кса то р а ми К а р нуа и Н а ва ш и на . 6. Ф и кса то р Н ью ко ме р а (6:3:1:1:1): 6 ча сте й и зо пр о пи ло во г о спи р та , 3 ча сти пр о пи о но во й ки сло ты 1 ча сть пе тр о ле й но г о эфи р а , 1 ча сть а це то на , 1 ча сть ди о кса на . М а те р и а л в фи кса то р е вы де р ж и ва ю тв те че ни е 24 ча со в пр и ко мна тно й те мпе р а тур е , за те м за ли ва ю т све ж и м р а ство р о м фи кса то р а и хр а нятв хо ло ди льни ке . Ф и кса то р да е то че нь хо р о ш и е р е зульта ты , о со б е нно пр и фи кса ци и ме й о за , е г о мо ж но г о то ви ть за р а не е . О дна ко сле дуе т по мни ть, что ди о кса н и пр о пи о но ва я ки сло та - си льны е яды , р а б о та ть с эти м фи кса то р о м мо ж но то лько в р е зи но вы х пе р ча тка х и по д тяг о й . П е р е д и ссле до ва ни е м о б ъе кты тр и ж ды пр о мы ва ю тв 96% спи р те . П р а вила ф икса ц ии 1. В ы б о р фи кса то р а до лж е н о тве ча ть це лям и ссле до ва ни я и за ви се ть о т о б ъе кта . 2. О б ъе м фи кси р ую щ е й ж и дко сти до лж е н в не ско лько р а з (о б ы чно не ме не е , че м в 50 р а з) пр е вы ш а ть о б ъе м фи кси р уе мо г о ма те р и а ла . Для фи кса ци и ко р не й удо б но и спо льзо ва ть пло ско до нны е пр о б и р ки ди а ме тр о м 1,5-2 см и по ле зны м о б ъе мо м не ме не е 7-10 мл. 3. Ф и кси р о ва ть со ве р ш е нно све ж и й ма те р и а л лучш е на ме сте е г о пр о и зр а ста ни я. Е сли это по ка ко й -ли б о пр и чи не не во змо ж но сде ла ть, то ма те р и а л со б и р а ю т б о льш и ми ча стями . Н а пр и ме р , в ви де ве то к с б уто на ми и ди цве тка ми . П р и ве зе нны й ма те р и а л на не ко то р о е вр е мя по ме щ а ю т в во ду, что б ы все ча сти р а сте ни я пр и няли но р ма льны й ви д; ли ш ь по сле это г о пр и ступа ю тк е г о о б р а б о тке . 4. К о р е ш ки б р а ть то лько пр ямы е , дли но й 7-8 мм. П р и фи кса ци и эмб р и о ло г и че ско г о ма те р и а ла уда ляю тне нуж ны е ча сти (ле пе стки , ча ш е ли сти ки , цве то но ж ки и др .). 5. Для лучш е г о и р а вно ме р но г о пр о пи ты ва ни я ма те р и а ла фи кса то р о м ста р а ю тся б р а ть не б о льш и е кусо чки тка ни . Кр упны е о б ъе кты пе р е д фи кса ци е й р а зр е за ю тна не ско лько ча сте й (на пр и ме р , ко р зи нки сло ж но цве тны х). Буто ны фи кси р ую т це ли ко м, а ко ло сья ж е ла те льно пр е два р и те льно р а зо б р а ть на ко ло ски . Е сли пр о ни кно ве ни е фи кса то р а б уде тне по лны м, то та ко й ма те р и а л в да льне й ш е м да ст не пр а ви льную ка р ти ну и пр и ве де т к не пр а ви льны м вы во да м.

8

6. Для лучш е г о пр о ни кно ве ни я фи кса то р а в тка ни по ступа ю т сле дую щ и м о б р а зо м: а ) на дно со суда , в ко то р о м пр о во ди тся фи кса ци я, по ме щ а ю ткусо чки ва ты с те м, что б ы фи кси р уе мы й ма те р и а л не пр и ле г а л не по ср е дстве нно ко дну со суда ; б ) е сли кусо чки не о пуска ю тся на дно , а пла ва ю т по по ве р хно сти ж и дко сти , это зна чи т, что пр о ни кно ве ни ю фи кса то р а ме ш а е тво здух, на хо дящ и й ся в р а сти те льны х тка нях. Н а и б о ле е пр о сто мо ж но уда ли ть во здух эне р г и чны м и пр о до лж и те льны м встр яхи ва ни е м склянки с фи кси р ую щ е й ж и дко стью и по ме щ е нно й в не е тка нью и ли на кр ы ва ни е м о б ъе кта кусо чко м ва ты , ко то р ы й , на мо ка я в ж и дко сти , увле ка е те г о на дно со суда . 7. В р е мя фи кса ци и в те че ни е суто к сле дуе то пр е де лять для ка ж до г о ко нкр е тно г о случа я. Ко р ни фи кси р ую т в те ча сы , ко г да на б лю да е тся ма кси ма льно е чи сло ми то зо в. П р и и зуче ни и пр о це сса о пло до тво р е ни я и р а зви ти я за р о ды ш а эмб р и о ло г и че ски е о б ъе кты фи кси р ую тче р е з о пр е де ле нны е пр о ме ж утки вр е ме ни по сле на не се ни я пы льцы на р ы льца . 8. Сле дуе т со б лю да ть вр е мя, р е ко ме ндуе мо е для фи кса ци и . Дли те льно е пр е б ы ва ни е ма те р и а ла в б о льш и нстве фи кса то р о в зна чи те льно ухудш а е т р е зульта ты по сле дую щ е й о б р а б о тки . 9. Ф и кси р ую щ и е р а ство р ы сле дуе тг о то ви ть не по ср е дстве нно пе р е д упо тр е б ле ни е м. П о вто р но е и спо льзо ва ни е фи кса то р а , уж е б ы вш е г о в упо тр е б ле ни и , не ж е ла те льно . За да ни е . 1. П р и г о то ви ть фи кса то р ы Н а ва ш и на и К а р нуа . 2. За фи кси р о ва ть ко р ни пр о р о сш и х се мян и г е не р а ти вны е по чки . II. П Р ОМ Ы В КА, ОБ ЕЗВ 0Ж ИВ АН ИЕ И Х РАН ЕН ИЕ ЗАФ ИКСИР ОВ АН Н ОГ О М АТ ЕРИАЛА Заняти е 3. П р о м ывка м ате р и ала о тфи ксато р а и е го о бе зво ж и вани е П о сле фи кса ци и ма те р и а л не о б хо ди мо тщ а те льно пр о мы ть для уда ле ни я о ста тко в фи кси р ую щ е г о ве щ е ства и ли пр о дукто в и х р а зло ж е ни я. Е сли во вр е мя это г о не сде ла ть, то мо г ут пр о и зо й ти не ж е ла те льны е и зме не ни я тка не й (чр е зме р но е упло тне ни е , и ли хр упко сть, и ли , на о б о р о т, ма це р а ци я). П р и и спо льзо ва ни и во дны х и ли спи р то вы х фи кса то р о в пр о мы вку ве дутне о ди на ко во . П р о мы вка ве де тся спи р то м в то м случа е , е сли и спо льзо ва лся спи р то во й фи кса то р , и во до й - пр и пр и ме не ни и во дно г о фи кса то р а . Дли те льно сть пр о мы вки за ви си то тпло тно сти и р а зме р о в фи кси р уе мо г о ма те р и а ла , о на пр о до лж а е тся о тI ча са до суто к. П о сле спи р то вы х фи кса то р о в ма те р и а л р е ко ме ндуе тся пр о мы ва ть тр и р а за по 1-2 ча са в 80% спи р те до по лно г о и сче зно ве ни я за па ха уксус-

9

но й ки сло ты . П р а кти че ски это мо ж но о сущ е стви ть сле дую щ и м о б р а зо м. Бю кс с ма те р и а ло м на кр ы ва ю ткусо чко м ма р ли и о сто р о ж но сли ва ю т фи кса то р , не до пуска я по дсы ха ни я ма те р и а ла . За те м на ли ва ю т пе р вую по р ци ю 80% спи р та , а спустя ука за нно е вр е мя – вто р ую и тр е тью . П р о мы ты й ма те р и а л мо ж но о ста ви ть на хр а не ни е в 80 и ли 70% спи р те . Е сли ж е ма те р и а л по сле пр о мы вки ср а зу по две р г а е тся да льне й ш е й о б р а б о тке , то е г о лучш е пр о мы ва ть не 80%, а 96% спи р то м, это уско р яе т пр о це сс о б е зво ж и ва ни я. Спи р тна ли ва ю тс та ки м р а сче то м, что б ы ур о ве нь б ы л на 1-2 см вы ш е о б ъе кта . П о сле и спо льзо ва ни я во дны х фи кса то р о в ма те р и а л пр о мы ва ю т в пр о то чно й во де в те че ни е 1-24 ча со в. П р о до лж и те льно сть пр о мы вки за ви си т о т те мпе р а тур ы . Н а пр и ме р , пр о мы вка ко р е ш ко в, за фи кси р о ва нны х сме сью Н а ва ш и на , в ле тне е вр е мя со ста вляе т1-2 ча са , а зи мо й 3-4 ча са . П р о мы вку фи кси р о ва нно г о ма те р и а ла удо б но пр о во ди ть и ли в ма р ле вы х ме ш о чка х, и ли ци ли ндр а х, за тянуты х се тко й [З]. Е сли о тсутствуе т во змо ж но сть пр о во ди ть пр о мы вку в пр о то чно й во де , то это мо ж но сде ла ть и в б ю кса х. В это м случа е ко р ни пр о мы ва ю тв 3-5 сме на х во до пр о во дно й во ды , вы де р ж и ва я в ка ж до й и з ни х 10-15 ми нут(ко р ни не о б хо ди мо пе р и о ди че ски встр яхи ва ть). За те м и х пр о мы ва ю т в ди сти лли р о ва нно й во де . П о сле о ко нча ни я пр о мы вки ма те р и а ла в во де е г о не о б хо ди мо ча сти чно о б е зво ди ть в эти ло во м спи р те . Что б ы и зб е ж а ть смо р щ и ва ни я ма те р и а ла , о б е зво ж и ва ни е пр о во дят по сте пе нно , и спо льзуя для это г о се р и ю спи р то в во зр а ста ю щ е й ко нце нтр а ци и (20,40,60 и 80%). Их пр и ли ва ю т в б ю кс и в ка ж до м и з ни х ма те р и а л вы де р ж и ва ю тпо 30 ми нут. В 80% спи р те ма те р и а лмо ж но хр а ни ть дли те льно е вр е мя. Спи р тс за да нно й ко нце нтр а ци е й мо ж но пр и г о то ви ть путе м р а зб а вле ни я 96%-но г о спи р та ди сти лли р о ва нно й во до й и ли и з двух спи р то в с р а зли чно й ко нце нтр а ци е й . К р о ме это г о , мо ж но во спо льзо ва ться спе ци а льно й та б ли це й , со ста вле нно й М .С. Н а ва ш и ны м (1936),(см. пр и ло ж е ни е ). За да ни е . 1. П р и г о то ви ть спи р ты за да нно й ко нце нтр а ци и (20%, 40%, 60%, 80%, 90%, 96% (1,П ), 100% (1,П ). 2. П р о ве сти пр о мы вку и о б е зво ж и ва ни е за фи кси р о ва нно г о ма те р и а ла по схе ме (см. пр и ло ж е ни е ). III. Т ЕХ Н ИКАИЗГ ОТ ОВ ЛЕН ИЯ П ОСТ ОЯН Н Ы Х М ИКР ОТ ОМ Н Ы Х П Р ЕП АР АТ ОВ Заняти е 4. П р о п и тывани е м ате р и ала р аство р и те ле м п ар афи на и п ар афи но м Те хни ка пр и г о то вле ни я о кр а ш е нны х ми кр о то мны х пр е па р а то в для р а сте ни й вве де на В .И. Бе ляе вы м. П р о це сс и зг о то вле ни я по сто янны х ми кр о то мны х пр е па р а то в и з р а сти те льно г о ма те р и а ла со сто и т и з р яда дли -

10

те льны х и до ста то чно сло ж ны х пр о ме ж уто чны х эта по в о б р а б о тки ма те р и а ла . П р и это м г ла вно й за да че й являе тся по луче ни е то нки х о кр а ш е нны х ср е зо в. Для по луче ни я ср е зо в на ми кр о то ме и ссле дуе мы й ма те р и а л не о б хо ди мо пр о пи та ть па р а фи но м, по сле это г о ма те р и а л ста но ви тся пла сти чны м. П о ско льку па р а фи н не р а ство р яе тся ни в во де , ни в спи р те , то хр а нящ и й ся в 80% спи р те ма те р и а л не о б хо ди мо по лно стью о б е зво ди ть. О б е зво ж и ва ни е пр о и зво ди тся в се р и и спи р то в во зр а ста ю щ е й ко нце нтр а ци и . За те м спи р т, на хо дящ и й ся в ма те р и а ле , за ме няю тр а ство р и те ле м па р а фи на , ко то р ы й в да льне й ш е м за ме щ а е тся чи сты м па р а фи но м. П о сле до ва те льна я пр о це дур а о б е зво ж и ва ни я, пр о пи ты ва ни я р а ство р и те лями па р а фи на и са ми м па р а фи но м но си тна зва ни е "пр о во дки ". П о лн о е о безво ж ива н ие ма т ер иа ла О ттщ а те льно г о о б е зво ж и ва ни я ма те р и а ла за ви си тка че ство пр е па р а та : не до ста то чно о б е зво ж е нны й о б ъе кт б уде т пло хо пр о пи ты ва ться па р а фи но м, та к ка к во да с па р а фи но м не сме ш и ва е тся и и з ср е за пр и р е зке б удут вы кр а ш и ва ться уча стки не пр о пи та нно й тка ни . Сли ш ко м дли те льно е о б е зво ж и ва ни е то ж е вр е дно , та к ка к пр и это м пр о и схо ди тси льно е упло тне ни е тка ни , что та кж е б уде тза тр уднять е е пр о пи ты ва ни е па р а фи но м. Для р а зны х тка не й и для кусо чко в р а зно й ве ли чи ны ср о ки пр о во дки мо г утзна чи те льно о тли ча ться. Е сли не тво змо ж но сти за фи кси р о ва ть и пр о ве сти по пр о во дке ма те р и а л за о ди н де нь, мо ж но р а стянуть это тпр о це сс, о ста ви в ма те р и а л в на и б о ле е б е звр е дны х для о б ъе кта ср е да х до сле дую щ е г о дня. Та ко й ср е до й мо ж е тб ы ть 70% эти ло вы й спи р т(в не м мо ж но ма те р и а л хр а ни ть не де лями ). М е не е б ла г о пр и ятно о ста вле ни е о б ъе кто в в 96% и ли 100% спи р те . Н е льзя о ста влять ма те р и а л в то луо ле и ли сме си то луо ла со спи р то м, та к ка к эти ср е ды си льно вы суш и ва ю ттка ни , де ла ю ти х хр упки ми , пло хо р е ж ущ и ми ся. М о ж но ма те р и а л о ста влять в па р а фи но во й ка ш е на 12-18 ча со в, но пр и это м р е ко ме ндуе тся вы нуть б ю кс и з те р мо ста та . Для уда ле ни я и з ма те р и а ла о ста тко в во ды е г о вы де р ж и ва ю т в двух сме на х 96% спи р та и двух сме на х 100% (а б со лю тно г о спи р та ). В ка ж до м и з ни х ма те р и а л вы де р ж и ва ю т по 1-2 ча са . О пе р а ци и по о б е зво ж и ва ни ю пр о и зво дят сле дую щ и м о б р а зо м. Из б ю кса (пе ни ци лли но во г о пузы р ька ) 80% спи р т(че р е з ма р лю ) сли ва ю тв со суд с 80% спи р то м. В за ме н пр и ли ва ю т96% спи р тI и II, а за те м две сме ны 100% эти ло во г о спи р та (а б со лю тно г о ). В ка ж до м и з ни х ма те р и а л вы де р ж и ва е тся 1-2 ча са . М е то ди ку пр и г о то вле ни я а б со лю тно г о спи р та см. в пр и ло ж е ни и . П р о пит ыва н ие ма т ер иа ла р а ст во р ит елем па р а ф ин а (пр о меж ут о чн о йж идко ст ью ) ипа р а ф ин о м П о сле о б е зво ж и ва ни я ма те р и а ла в 100% спи р те е г о пе р е во дят в та к на зы ва е мую пр о ме ж уто чную ж и дко сть - р а ство р и те ль па р а фи на , по ско льку спи р тс па р а фи но м не сме ш и ва е тся. Ра ство р и те ль па р а фи на до лж е н

11

хо р о ш о сме ш и ва ться со спи р то м и о дно вр е ме нно р а ство р ять па р а фи н пр и те мпе р а тур е е г о пла вле ни я. Для ме лки х о б ъе кто в (ко р е ш ки и б уто ны ) хо р о ш и м р а ство р и те ле м являе тся хло р о фо р м, а для кр упны х - б е нзо л и кси ло л. О б ъясняе тся это те м, что по сле дни е и спа р яю тся ме не е б ы стр о , че м хло р о фо р м, а по то му пр о пи ты ва ни е па р а фи но м и де туспе ш не е . О б е зво ж е нны й в спи р те ма те р и а л пе р е во дятв р а ство р и те ль па р а фи на не ср а зу, а по сте пе нно . Для это г о а б со лю тны й спи р т П за ме няю т на 25% р а ство р хло р о фо р ма (кси ло ла , б е нзо ла ) в а б со лю тно м спи р те - I ча сть хло р о фо р ма + 3 ча сти а б со лю тно г о спи р та , за те м сле дуе т50% хло р о фо р м -I ча сть хло р о фо р ма + I ча сть а б со лю тно г о спи р та . Э то тр а ство р за ме няе тся 75% р а ство р о м хло р о фо р ма - 3 ча сти хло р о фо р ма + I ча сть а б со лю тно г о спи р та и , на ко не ц, чи сты й хло р о фо р м (кси ло л, то луо л) - 2 сме ны . В ка ж до й и з эти х сме се й ма те р и а л вы де р ж и ва ю то ко ло о дно г о -двух ча со в. У р о ве нь ж и дко сти до лж е н б ы ть на 3-4 мм вы ш е ма те р и а ла . Хо р о ш о о б е зво ж е нны й и пр о пи та нны й пр о ме ж уто чно й ж и дко стью ма те р и а л до лж е н б ы ть пр о зр а чны м. П о сле это г о в б ю ксы с ма те р и а ло м, на хо дящ е мся в хло р о фо р ме П , до б а вляю тме лко на р е за нны й па р а фи н и ли на ли ва ю тр а спла вле нны е па р а фи н в о б ъе ме , пр и ме р но р а вно м о б ъе му хло р о фо р ма . Н а по ве р хно сти хло р о фо р ма во зни ка е т то лсты й сло й за сты вш е г о па р а фи на , ко то р ы й пр е до твр а щ а е т б ы стр о е и спа р е ни е р а ство р и те ля па р а фи на . В за кр ы ты х б ю кса х ма те р и а л вы де р ж и ва ю тсутки . За те м сни ма ю ткр ы ш ку и ста вятб ю ксы в те р мо ста т(+56-57°С) до по лно г о и спа р е ни я р а ство р и те ля па р а фи на . Е г о по лно е и спа р е ни е уста на вли ва ю тпо о тсутстви ю за па ха , а пр и и спо льзо ва ни и хло р о фо р ма и по о тсутстви ю сла дко ва то г о пр и вкуса . Е сли по пр о ш е стви и 3-х суто к за па х р а ство р и те ля пр о па л, то па р а фи н сле дуе тсли ть и за ли ть ма те р и а л чи сты м р а спла вле нны м па р а фи но м. Тр е б о ва ни я, пр е дъявляе мы е к па р а фи ну, см. в пр и ло ж е ни и . За да ни е .

1. П р о фи льтр о ва ть па р а фи н. 2. П о сле до ва те льно пе р е не сти о б е зво ж е нны й ма те р и а л в сме си а б со лю тно г о спи р та с р а ство р и те ле м (1,II,III), а за те м в чи сты й р а ство р и те ль (1,П ). До б а ви ть па р а фи н в р а ство р и те ль и по ста ви ть ма те р и а л в те р мо ста т с те мпе р а тур о й 56-570С до по лно г о пр о пи ты ва ни я па р а фи но м.

Заняти е 5. Зали вка м ате р и ала в п ар афи н и п р и го то вле ни е п ар афи но вых бло ко в П о сле по лно г о пр о пи ты ва ни я о б ъе кто в па р а фи но м со де р ж и мо е б ю кса пе р е но сятв спе ци а льно и зг о то вле нны е б ума ж ны е ко р о б о чки (и х и зг о то вле ни е см. в пр и ло ж е ни и , за няти е 5). П о ка па р а фи н не за сты л, пр о г р е ты м ш па те ле м и ли пр е па р о ва льно й и г ло й ма те р и а л р а скла ды ва ю тв ко р о -

12

б о чки на не ко то р о м р а ссто яни и др уг о т др уг а та к, что б ы и з за сты вш е г о па р а фи на ле г ко мо ж но б ы ло б ы вы р е за ть ска льпе ле м о б ъе ктс до ста то чны м ко ли че ство м па р а фи на во кр уг не г о . Н а по ве р хно сть за сты вш е г о па р а фи на о сто р о ж но кла дут эти ке тку, на дпи сью вве р х. Ко р о б о чки по ме щ а ю тна по ве р хно сть хо ло дно й во ды , на ли то й в ш и р о кую ча ш ку. П о сле о хла ж де ни я па р а фи н вме сте с о б ъе кто м пр и ни ма е тфо р му ко р о б о чки , в ко то р ую е г о за ли ли ("па р а фи но вы й пр яни к"). «П р яни ки » и звле ка ю ти з ко р о б о че к и хр а нят, о б е р е г а я о тпы ли . П р иго т о влен ие па р а ф ин о вых бло ко в П р и ступа я к р е зке на ми кр о то ме , о б ъе ктсле дуе тпр и кр е пи ть к де р е вянно му б ло ку (куб и ку). Их г о то вяти з др е ве си ны р а зны х по р о д де р е вье в, р а зме р о м 1,5х2х2,5 и ли 3х3х5 см и пе р е д упо тр е б ле ни е м пр о пи сы ва ю т р а спла вле нны м па р а фи но м. П р и кр упны х эмб р и о ло г и че ски х о б ъе кта х мо ж но и з "пр яни ко в" на г р е ты м ска льпе ле м а ккур а тно вы р е за ть кусо чки па р а фи на с за клю че нны ми в ни х о б ъе кта ми . Их пр и кр е пляю тна р а б о чую по ве р хно сть куб и ка , пр е два р и те льно на ка па в на не е сло й р а спла вле нно г о па р а фи на , вы со то й 2-4 мм. К по луче нно му па р а фи но во му во звы ш е ни ю на г р е ты м ле зви е м б е зо па сно й б р и твы пр и кр е пляю тпа р а фи но вы й б ло к, пло тно пр и ж и ма я е г о . П о сле это г о б ло к о хла ди ть в во де , а за те м ле зви е м б р и твы ср е за ть ли ш ни й па р а фи н, пр и да ва я б ло ку фо р му па р а лле ле пи пе да с г р а нями , па р а лле льны ми г р а ням б ло ко де р ж а те ля. П р и ме лки х ци то ло г и че ски х и эмб р и о ло г и че ски х о б ъе кта х (ко р ни , пы льни ки и др .) це ле со о б р а зне е и спо льзо ва ть ме то д "за ка пы ва ни я" (по С.Г. Н а ва ш и ну), см. пр и ло ж е ни е , за няти е 5. За да ни е . 1. Изг о то ви ть б ума ж ны е ко р о б о чки (см. пр и ло ж е ни е , за няти е 5) и па р а фи но вы е «пр яни ки ». 2. П р и г о то ви ть па р а фи но вы е б ло ки двумя спо со б а ми . Заняти е 6. У стр о йство и п р и нци п ы р або ты м и кр о то м о в П р и б о р , пр и по мо щ и ко то р о г о по луча ю т о че нь то нки е (о т 2 до 30 мкм) ср е зы тка не й р а сти те льны х и ли ж и во тны х о р г а ни змо в для и зуче ни я и х по д ми кр о ско по м, на зы ва ю тми кр о то мо м. Сущ е ствуе т2 о сно вны х ти па ми кр о то ма : р о та ци о нны й и са нны й (и ли са ла зо чно г о ти па ) (см. та б л.). У р о та ци о нно г о ми кр о то ма в дви ж е ни е пр и во ди тся сто ли к, а но ж пр и кр е пле н не по дви ж но . У ми кр о то ма са ла зо чно г о ти па сто ли к пр и кр е пляе тся не по дви ж но , в дви ж е ни е пр и во ди тся но ж . У ми кр о то мо в все х ти по в сто ли к со е ди няе тся с ми кр о ме тр и че ски м ви нто м та ки м о б р а зо м, что с ка ж ды м дви ж е ни е м но ж по дни ма е мся на за да нную вы со ту, что по зво ляе тпо луча ть ср е зы о пр е де ле нно й то лщ и ны .

13

За да ни е . 1. Изучи ть стр о е ни е и о со б е нно сти р а б о ты р о та ци о нно г о и са нно г о ми кр о то мо в. О зна ко ми ться с по р ядко м р а б о ты на са нно м ми кр о то ме (см. пр и ло ж е ни е , за няти е 6). 2. П р и г о то ви ть б е ло к для на кле и ва ни я ср е зо в (см, пр и ло ж е ни е , за няти е 6). Заняти е 7-8. П о луч е ни е м и кр о то м ных п ар афи но вых ср е зо в П р и и зг о то вле ни и ср е зо в сле дуе т пр и де р ж и ва ться сле дую щ и х пр а ви лр а б о ты . 1. М и кр о то м до лж е н по сто янно сма зы ва ться, со де р ж а ться в чи сто те . 2. Для по луче ни я р о вны х ср е зо в тр е б уе тся и ме ть о стр о на то че нны й и вы пр а вле нны й ми кр о то мны й но ж , о б р а щ а ться с ко то р ы м не о б хо ди мо о сто р о ж но . Е г о де р ж а тв чи сто те , пр о ти р а я чи сто й тр япо чко й , смо че нно й кси ло ло м, и не пр и ка са ясь па льца ми к по ве р хно сти но ж а . 3. В а ж но , что б ы во вр е мя р а б о ты на ми кр о то ме все ви нты , укр е пляю щ и е б р и тву и о б ъе кт, б ы ли хо р о ш о за кр е пле ны и по до б р а н пр а ви льны й уг о л на кло на но ж а к о б ъе кту. Е сли но ж пло хо за кр е пле н, ср е зы мо г утпо луча ться р а зно й то лщ и ны . П р и на ли чи и за зуб р и н на по ве р хно сти но ж а ср е зы б удути сца р а па нны ми , ча сто р а сщ е пляю щ и ми ся по хо ду е г о дви ж е ни я. 4. Н о ж сле дуе тза кр е пи ть на "са ла зка х" ми кр о то ма в то м по ло ж е ни и , что б ы фа се тка ле зви я б ы ла па р а лле льна г р а ням па р а фи но во г о б ло ка и пе р пе нди куляр на к на пр а вле ни ю дви ж е ни я но ж а . 5. Н а кло н но ж а уста но ви ть та к, что б ы но ж не ско б ли л б ло к (уста но вле н сли ш ко м кр уто ) и не вы кр а ш и ва л пе р е дни й кр а й б ло ка (уста но вле н сли ш ко м по ло г о ). Н а кло н но ж а о б ы чно со ста вляе т3-5° (и но г да до сти г а е т15°). Н а кло н но ж а вы б и р а ю т, пр о и зво дя пр о б ны е ср е зы то лщ и но й 7-10 мкм, а за те м пе р е хо дя к нуж но й то лщ и не ср е зо в (см. р и с. пр и ло ж е ни я). 6. То лщ и на ср е зо в за ви си то тце ле й и ссле до ва ни й . Для и зуче ни я де ле ни я кле то к – о т8 до 10 мкм, а пр и эмб р и о ло г и че ски х и ссле до ва ни ях - о т10 до 20 мкм. 7. Ср е зы и зг о то вляю т сле дую щ и м о б р а зо м: пр и за дне м по ло ж е ни и но ж а пе р е ме щ а ю т ми кр о ме тр и че ски й ви нт о б ъе кто де р ж а те ля, а сле до ва те льно , и б ло к с ма те р и а ло м, на то лщ и ну ср е за , а за те м са ла зки , с за кр е пле нны м на ни х но ж о м, сдви г а ю тпо на пр а вле ни ю к се б е , и но ж де ла е тср е з уста но вле нно й то лщ и ны . О то дви нув са ла зки с но ж о м на за д, вно вь по да ю т о б ъе ктна о пр е де ле нную то лщ и ну, сно ва пе р е дви г а ю тса ла зки с но ж о м к се б е и де ла ю тно вы й ср е з, ко то р ы й пе р е ме сти тпе р вы й ср е з на но ж е и со е ди ни тся с ни м в ле нту. 8. Тве р до сть па р а фи на , в ко то р ы й за ли т о б ъе кт, си льно ме няе тся в за ви си мо сти о т те мпе р а тур ы . П р и те мпе р а тур е б о ле е 20-22°С па р а фи но вы е ср е зы на чи на ю тсли па ться, и пр и хо ди тся б ло ки пе р е д р е зко й по ме щ а ть в хо ло ди льни к и ли о пуска ть в хо ло дную во ду. В хо ло дно м по ме щ е ни и , на пр о ти в, ср е зы кр о ш а тся, е ди но й ле нты и з ср е зо в не по луча е тся. В это м

14

случа е к ми кр о то му пр и б ли ж а ю т на сто льную ла мпу. При пр и г о то вле ни и ср е зо в не о б хо ди мо сле ди ть за пр а ви льно стью по да чи : пе р е ме щ а ть но ж и ли б ло к нуж но с о дно й и то й ж е ско р о стью и о ди на ко вы м на ж и мо м па р уко ятку. 9. Ср е зы , со е ди не нны е в ле нту, сни ма ю тс но ж а мяг ко й ки сто чко й и укла ды ва ю тв ко р о б ку с че р но й б ума г о й и ли ср а зу на пр е дме тно е сте кло . О не уда ча х пр и и зг о то вле ни и ср е зо в на ми кр о то ме и и х устр а не ни и см. в пр и ло ж е ни и , за няти е 7. Техн ика н а клейкипа р а ф ин о вых ср езо в П о луче нны е ми кр о то мны е ср е зы до лж ны б ы ть на кле е ны на а б со лю тно чи сты е пр е дме тны е сте кла . П о дг о то вку и вы б о р пр е дме тны х и по кр о вны х сте ко л см. в пр и ло ж е ни и , за няти е 1. Из со суда с ди сти лли р о ва нно й во до й пи нце то м вы ни ма ю т чи сто е пр е дме тно е сте кло , де р ж а е г о па льца ми за кр а я, вы ти р а ю тчи сто й тр япо чко й с ни ж не й сто р о ны и кла дутна сто л. Н а кле и ва ть ср е з мо ж но р а зны ми спо со б а ми . Н е пло хи е р е зульта ты да е т и спо льзо ва ни е о б ы чно й ди сти лли р о ва нно й во ды , но пр и это м пр е дме тны е сте кла до лж ны б ы ть а б со лю тно чи сты ми . Н а пр е дме тно е сте кло и з ка пе льни цы на но сятне ско лько ка пе ль ди сти лли р о ва нно й во ды , на по ве р хно сть ко то р о й с по мо щ ью ки сто чки по ме щ а е тся ле нта и з ср е зо в. Ко ли че ство ср е зо в в ка ж до м кусо чке о пр е де ляю т, и схо дя на р а зме р о в по кр о вно г о сте кла . Н а кле и ва ть ле нту со ср е за ми сле дуе твсе г да то й сто р о но й к сте клу, ко то р о й о на ле ж и тна б р и тве . Э та ни ж няя сто р о на па р а фи но во й ле нты г ла дка я и б ле стящ а я, а ве р хняя сто р о на ле нты ма то ва я. За те м па р а фи но вы е ср е зы не о б хо ди мо р а спр а ви ть путе м по до г р е ва и х на д пла ме не м г о р е лки и ли по ме щ е ни е м и х на те р мо сто ли к. П р и это м нуж но сле ди ть, что б ы со сте ко л не и спа р яла сь во да . В а ж но р а спр а ви ть ср е зы , но не льзя до пуска ть р а спла вле ни я па р а фи на . Е сли па р а фи н хо тя б ы не мно г о р а спла ви лся и вно вь за сты л, то тка ни о ка ж утся де фо р ми р о ва нны ми . Ра зме сти в на сте кле ср е зы , не о б хо ди мо о тсо са ть фи льтр о ва льно й б ума г о й о ста тки во ды , по сле то г о ка к ср е зы о сты нут(и на че о ни пр и кле ятся к б ума г е ). За те м сте кла пе р е но сятв те р мо ста т, что б ы ср е зы хо р о ш о пр и со хли (t 37-40°С). Е сли суш и ть пр и ко мна тно й те мпе р а тур е , то о ни мо г уто тста ть о тсте кла , та к ка к в это м случа е мо г утво зни кнуть щ е ли ме ж ду хо ло дны м па р а фи но м и сте кло м. Е сли ме ж ду сте кло м и ср е за ми и ме е тся во здух, то та ки е ср е зы о ткле ятся, ка к то лько о ка ж утся в ж и дко сти . Е сли ср е зы пло хо пр и ста ю тк сте клу, и х на кле и ва ю тспе ци а льно пр и г о то вле нны м б е лко м (см. пр и ло ж е ни е ). За да ни е . П о лучи ть ср е зы пр и по мо щ и ми кр о то ма и о вла де ть те хни ко й и х на кле и ва ни я на пр е дме тны е сте кла .

15

Заняти е 9-10. У дале ни е п ар афи на и о кр аш и вани е ср е зо в Для вы явле ни я о тде льны х ко мпо не нто в кле тки ср е зы не о б хо ди мо о кр а си ть. Для это г о и з ср е за уда ляе тся па р а фи н, ко то р ы й пр е пятствуе то кр а ске . Тка нь по сле это г о пр о пи ты ва е тся во до й и о кр а ш и ва е тся во дны ми кр а си те лями . Для ка ж до г о о б ъе кта вы б и р а ю т сво й ме то д о кр а ски в за ви си мо сти о тце ли и ссле до ва ни я и фи кса то р а . Ра зли чны е стр уктур ы в кле тке не о ди на ко во во спр и ни ма ю т и уде р ж и ва ю т кр а си те ли . К р а си те ли по пр о и схо ж де ни ю де лят на 3 г р уппы : р а сти те льны е (г е ма то кси ли н, о р се и н), ж и во тны е (ка р ми н) и си нте ти че ски е о р г а ни че ски е (а ни ли но вы е и др .). Си нте ти че ски е кр а си те ли пр е дста вляю тсо б о й со ле о б р а зны е со е ди не ни я и в сво ю о че р е дь р а зде ляю тся на о сно вны е кр а си те ли (с о кр а ш е нны м ка ти о но м и б е сцве тны м а ни о но м), ки слы е (с о кр а ш е нны м а ни о но м и б е сцве тны м ка ти о но м) и не й тр а льны е (с о кр а ш е нны е ка ти о но м и а ни о но м). П о ха р а кте р у де й стви я кр а си те ли р а зде ляю т на 2 г р уппы : 1) ци то пла зма ти че ски е - в о сно вно м ки слы е кр а си те ли (эо зи н и др .) и 2) яде р ны е г ла вны м о б р а зо м, о сно вны е (ме ти ле но вы й си ни й ), а та кж е г е ма то кси ли н и ка р ми н. Спо со б ы о кр а ш и ва ни я мо г ут б ы ть пр о г р е сси вны ми и р е г р е сси вны ми . П р и пр о г р е сси вно й о кр а ске ср е зы по ме щ а ю тв сла б ы й р а ство р кр а си те ля. О кр а ш и ва ни е дли тся не ско лько ми нут, по ка не о б хо ди мы е стр уктур ы в кле тке не ста нутче тко ви ди мы ми на пр е па р а те . Бо ле е упо тр е б и те льно й являе тся р е г р е сси вна я о кр а ска . В это м случа е ср е з за ве до мо пе р е кр а ш и ва ю тко нце нтр и р о ва нны м р а ство р о м кр а си те ля. Изб ы то к кр а ски уда ляю тпуте м о тмы ва ни я е г о со о тве тствую щ и м р а ство р и те ле м (спи р т чи сты й и ли по дки сле нны й , ли б о во дны й р а ство р ква сцо в). Э то т пр о це сс на зы ва ю т ди ффе р е нци р о вко й , ве дуте г о по д ми кр о ско по м, и спо льзуя для это г о о б ъе кти вы с не б о льш и м уве ли че ни е м. Ино г да пе р е д о кр а ско й ср е зо в пр и б е г а ю тк пр е два р и те льно му пр о тр а вли ва ни ю . Н а и б о ле е р а спр о стр а не нны м спо со б о м, да ю щ и м на де ж ны е р е зульта ты , являе тся о кр а ш и ва ни е ср е зо в г е ма то кси ли но м по Ге й де нг а й ну. Ге ма то кси ли н г о то вяти з экстр а кта ка мпе ш е во г о де р е ва . Са м г е ма то кси ли н не являе тся кр а си те ле м, но , о ки сляясь, о н пе р е хо ди тв г е ма те и н и , со е ди няясь с пр о тр а во й , о б р а зуе т со ле о б р а зно е со е ди не ни е (ла ки ). Для пр о тр а вы и спо льзую тсо ли а лю ми ни я, ж е ле за , хр о ма , мо ли б де на , ва на ди я. Уско р ен н ый спо со б пр иго т о влен ия кр а сит еля 1 г р а мм г е ма то кси ли на р а ство р яю тв 100 мл ди сти лли р о ва нно й во ды в ко лб е пр и ки пяче ни и на во дяно й б а не в те че ни е 30-60 ми нут. П о сле это г о р а ство р фи льтр ую тне ско лько р а з (2-3), по сле о сты ва ни я до б а вляю ткр и ста лли к ти мо ла , что б ы не р а зви ва ли сь ми кр о о р г а ни змы . Ра ство р г е ма то кси ли на до лж е н и ме ть кр а сно -б ур ы й и ли че р ны й цве т. П е р е д упо тр е б ле ни е м кр а си те ль р а зво дятвдво е ди сти лли р о ва нно й во до й .

16

П о следо ва т ельн о ст ьр а бо т ы (пр о ц едур а о бр а бо т кима т ер иа ла ) 1. П р е дме тны е сте кла по ме сти ть в кси ло л I для уда ле ни я па р а фи на . Дли те льно сть пр е б ы ва ни я в кси ло ле не ме не е 20-30 ми н. 2.П е р е не сти сте кла со ср е за ми в све ж и й кси ло л II на 5-10 ми н. 3.О б мы ть ка ж до е сте кло 96% спи р то м и з ка пе льни цы и по ме сти ть в 96% спи р т на 10-30 ми н. 4. П р о мы ть сте кла со ср е за ми в тр е х сме на х ди сти лли р о ва нно й во ды по 5-10 ми нут. Сте кла не до лж ны и ме ть ж и р ны х сле до в и б ы ть мутны ми . 5.П о ме сти ть сте кла со ср е за ми в 4% во дны й р а ство р ж е ле зо а ммо ни й ны х ква сцо в для пр о тр а вли ва ни я ли б о на 4-6 ча со в, ли б о уско р е нны м спо со б о м в те р мо ста т(t 45-56°С) на 30-40 ми н. 6.Тщ а те льно пр о мы ть сте кла в ди сти лли р о ва нно й во де в те че ни е 5-10 ми нут. Е сли ква сцы б удутза не се ны в г е ма то кси ли н, о н ста не тко р и чне ва ты м и мутны м, б уде тпло хо кр а си ть. 7. П о ме сти ть пр е па р а ты (сте кла со ср е за ми в р а ство р г е ма то кси ли на на 10-12 ча со в, в случа е и спо льзо ва ни я уско р е нно г о спо со б а , о кр а ш и ва ни е ве дутв те че ни е 30-40 ми н. в те р мо ста те (t 45-56°С). 8. П р о мы ть сте кла со ср е за ми сна ча ла в во до пр о во дно й , а за те м в ди сти лли р о ва нно й во де в те че ни е 1015 ми нут. 9. Ди ффе р е нци р о вку ср е зо в ве сти в 2% р а ство р е ж е ле зо а ммо ни й ны х ква сцо в по д ко нтр о ле м ми кр о ско па (хр о мо со мы до лж ны и ме ть те мно -си ни й цве т) до нуж но й и нте нси вно сти о кр а ски , пр о мы ть ср е зы пр о то чно й во до й (15-60 ми н.). Для эмб р и о ло г и че ски х пр е па р а то в мо ж е т и спо льзо ва ться по сле дую щ а я по дкр а ска эо зи но м [1, 3] и ли а лци а но вы м си ни м [9]. 10. О б е зво ди ть ср е зы спи р та ми . Для это г о о б мы ть сте кла со ср е за ми 96% спи р то м и з ка пе льни цы и по ме сти ть в со суд с 96% спи р то м на 10-15 ми нут. За те м о б мы ть сте кла со ср е за ми 100% спи р то м и з ка пе льни цы и по ме сти ть в со суд со 100% спи р то м на 10-15 ми нут. 11. П о ме сти ть сте кла со ср е за ми в сме сь 100% спи р та и кси ло ла на 3-5 ми н. (1:1). 12. О б мы ть кси ло ло м и по ме сти ть в кси ло л I и II по 5 ми нутв ка ж до м. 13. За клю чи ть ср е зы в ка на дски й б а льза м. Для это г о пр е па р а ты и з кси ло ла вы нуть пи нце то м, ни ж ню ю по ве р хно сть пр о те р е ть фи льтр о ва льно й б ума г о й и по ло ж и ть на р о вную по ве р хно сть, по кр ы тую б е ло й б ума г о й . Н е до пуска я и спа р е ни я кси ло ла с по ве р хно сти пр е па р а та , сте клянно й па ло чко й на не сти 1-2 ка пли б а льза ма и б ы стр о по кр ы ть по кр о вны м сте кло м. Че р е з 1-2 дня б а льза м за сты ва е т. Ба льза м пр е дста вляе тсо б о й р а ство р е нную в кси ло ле смо лу не ко то р ы х ви до в пи хты . П р а ви льно пр и г о то вле нны й б а льза м до лж е н и ме ть ко нси сте нци ю ж и дко г о ме да . За да ни е . 1. П р о ве сти де па р а фи ни р о ва ни е пр е па р а то в и и х пр о тр а вли ва ни е (мо ж но о ста ви ть на но чь в по дки сле нно й во де ). 2. О кр а си ть пр е па р а ты , о тди ффе р е нци р о ва ть, о б е зво ди ть и за клю чи ть в ка на дски й б а льза м.

17

IV. Т ЕХ Н ИКАИЗГ ОТ ОВ ЛЕН ИЯ ДАВ ЛЕН Ы Х П РЕП АР АТ ОВ Заняти е 11. М аце р аци яо бъе кто в, и х о кр аш и вани е и м о нти р о вани е давле ных п р е п ар ато в П р и пр о ве де ни и ма ссо вы х ци то ло г и че ски х а на ли зо в для и зуче ни я ми то ти че ско й а кти вно сти кле то к в ко р нях, мо ло ды х ли стьях, ко нуса х на р а ста ни я сте б ле й , ка р и о ти па , о со б е нно сте й пр о те ка ни я ме й о за пр и ми кр о спо р о г е не зе це ле со о б р а зно и спо льзо ва ть ме то д да вле ны х пр е па р а то в. Их и зг о то вле ни е не тр е б уе тсло ж но й пр о це дур ы о б е зво ж и ва ни я, за клю че ни я в пр о ме ж уто чную ж и дко сть, в па р а фи н и по луче ни я ми кр о то мны хср е зо в. Для фи кса ци и ма те р и а ла в о сно вно м и спо льзую тспи р то вы е фи кса то р ы (см. за няти е 2). П о сле пр о мы ва ни я в ди сти лли р о ва нно й во де е г о пе р е во дят в ма це р и р ую щ и е ж и дко сти , спо со б ствую щ и е р а ство р е ни ю кле то чны х сте но к и р а зъе ди не ни ю кле то к. М а це р а ци я пр о во ди тся не ско льки ми спо со б а ми . Бо льш и нство и з ни х о сно ва но на о б р а б о тке тка не й си льны ми ки сло та ми , г и др о ли зую щ и ми ср е ди нны е пла сти нки , со е ди няю щ и е кле тки . М о ж но и спо льзо ва ть та кж е пр е па р а ты фе р ме нто в - пе кти на зы , ко то р ы е де й ствую тб о ле е мяг ко и не пр и во дятк по вр е ж де ни ю и ли р а зр уш е ни ю ко мпо не нто в кле то к. О пи са ни е р а зны х спо со б о в ма це р а ци и см. в пр и ло ж е ни и , за няти е 11. Окр аш и вани е и м о нти р о вани е вр е м е нных п р е п ар ато в Для о кр а ш и ва ни я пр е па р а то в да вле но й тка ни в ка че стве кр а си те ле й в о сно вно м и спо льзую т г е ма то кси ли н, ка р ми н, о р се и н, фукси нсе р ни стую ки сло ту (р е а кти в Ш и ффа по Ф е льг е ну). Окр аш и вани е п р е п ар ато в аце то -ж е ле зо -ге м ато кси ли но м Для пр и г о то вле ни я кр а си те ля 4 г г е ма то кси ли на и 1 г ж е ле зо а ммо ни й ны х ква сцо в, тщ а те льно р а зме льче нны х в ступке , р а ство р и ть в 100 мл 45% уксусно й ки сло ты . Ра ство р вы де р ж а ть в те р мо ста те пр и те мпе р а тур е 36°С в те че ни е 7 суто к пр и о б яза те льно м взб а лты ва ни и . Э то не о б хо ди мо для «со зр е ва ни я» кр а си те ля. Све ж е пр и г о то вле нны й р а ство р не пр о являе ткр а сящ е й спо со б но сти . О на по являе тся ли ш ь по сле е г о «со зр е ва ни я», ко то р о е вы р а ж а е тся в о ки сле ни и г е ма то кси ли на в г е ма те и н (С16Н 14О 6∗3Н 20 → С16Н 12О 6). О б р а зо ва ни е г е ма те и но во г о ла ка пр о и схо ди т по д вли яни е м та ки х эле ктр о ли то в, ка к ж е ле зны е и ли ка ли й ны е ква сцы . П о сле фи льтр а ци и кр а си те ль г о то в к упо тр е б ле ни ю и хр а ни тся в хо ло ди льни ке . П р о до лж и те льно сть о кр а ш и ва ни я г е ма то кси ли но м у р а зны х о б ъе кто в со ста вляе т о т не ско льки х ча со в до двух суто к пр и ко мна тно й те мпе р а тур е в б ю кса х, за кр ы ты х кр ы ш ка ми . За те м ма те р и а л пр о мы ва ю тв ди сти лли р о ва нно й во де и по ме щ а ю тна пр е дме тно е сте кло в ка плю сме си

18

45% уксусно й ки сло ты и 80% хло р а лг и др а та . Э та сме сь спо со б ствуе то дно вр е ме нно й ма це р а ци и и ди ффе р е нци а ци и о б ъе кта . В не й де р ж а тма те р и а л о т6 до 20 ми н. За те м е г о пе р е но сятна др уг о е пр е дме тно е сте кло в све ж ую ка плю то й ж е сме си , на кр ы ва ю тпо кр о вны м сте кло м и р а зда вли ва ю т. Для это г о че р е з по ло ску фи льтр о ва льно й б ума г и ле г ки м на да вли ва ни е м р учко й пр е па р о ва льно й и г лы р а спр е де ли ть кле тки в о ди н сло й . За те м на по кр о вно е сте кло на да вли ва ю т б о льш и м па льце м р уки , эти м о б е спе чи ва е тся р а спо ло ж е ни е хр о мо со м в о дно й пло ско сти . Окр аш и вани е п р е п ар ато в аце то кар м и но м О б ы чно и спо льзую т2-4% р а ство р ка р ми на в 45% уксусно й ки сло те . О н о дно вр е ме нно фи кси р уе т кле тки и о кр а ш и ва е т ядр а . Для пр и г о то вле ни я р а ство р а в ко лб у с 2-4 г р а мма ми ка р ми на (по р о ш ка ) пр и ли ва ю т55 мл ди сти лли р о ва нно й во ды и 45 мл уксусно й ки сло ты . Ра ство р е ни е ве дутна во дяно й б а не в вы тяж но м ш ка фу. К о лб у за кр ы ва ю тпр о б ко й со вста вле нны м в не е о б р а тны м хо ло ди льни ко м и ли сте клянно й во р о нко й с за кр ы то й тр уб ко й . К р а си те ль ки пятятв б о льш и нстве случа е в 30-60 ми н. Ино г да ки пяче ни е уве ли чи ва ю т до 3-4 ча с. и ли г о то вят е г о в те че ни е не ско льки х дне й . В это м случа е ка р ми н де р ж а тна ме дле нно м о г не , ста р а ясь не ки пяти ть, пе р е д за ки па ни е м во дяную б а ню вы клю ча ю т. П о сле р а ство р е ни я ка р ми на р а ство р о тста и ва е тся в те че ни е суто к, за те м е г о фи льтр ую т. П о сле это г о те мно -кр а сны й р а ство р ка р ми на по ме щ а ю т и склянку с пр и те р то й кр ы ш ко й и хр а нятв хо ло ди льни ке не о г р а ни че нно до лг о е вр е мя. Для р а б о ты ка р ми н удо б но на ли ва ть в на б о льш и е ка пе льни цы . Аце то ка р ми н б ы стр е е и и нте нси вне е о кр а ш и ва е т, е сли к не му не мно г о до б а ви ть уксусно ки сло г о ж е ле за (1-2 ка пли на 100 мл кр а си те ля), и ли ж е до фи льтр о ва ни я в о хла ж де нны й р а ство р кла дут ж е ле зную скр е пку и ли ма ле ньки й г во здь, а на сле дую щ и й де нь р а ство р фи льтр ую т. Изб ы тка ж е ле за сле дуе ти зб е г а ть, та к ка к о но вы зы ва е тпо те мне ни е все й ци то пла змы . О кр а ш и ва ни е удо б но пр о во ди ть в фа р фо р о вы х ти г лях. О тмы ты й о тфи кса то р а о б ъе ктза ли ва ю та це то ка р ми но м и вы де р ж и ва ю тв не м о тпо луча са до не ско льки х ча со в. Е сли ма це р а ци я пр е два р и те льно не пр о во ди ла сь, то ма те р и а л мо ж но о ста ви ть на но чь. П о сле это г о ти г е ль о сто р о ж но по до г р е ва ю т, не до во дя кр а си те ль до ки пе ни я. Че р е з 15 ми н. е щ е р а з по вто р яю тпо до г р е в. За те м о б ъе ктпе р е но сятна пр е дме тно е сте кло в ка плю 45% уксусно й ки сло ты и ли хло р а лг и др а та (е г о г о то вят, р а ство р яя 5г хло р а лг и др а та в 2 мл. ди сти лли р о ва нно й во ды ), на кр ы ва ю т по ло ско й фи льтр о ва льно й б ума г и и г о то вятда вле ны й пр е па р а тта кж е , ка к б ы ло о пи са но вы ш е . В то м случа е , е сли пр и и спо льзо ва ни и это г о ме то да хр о мо со мы о кр а ш и ва ю тся пло хо , то пе р е д о кр а ш и ва ни е м нуж но пр и ме ни ть пр о тр а вли ва ни е . Для это г о о б ъе кт по ме щ а ю т на 5-10 ми н. в 2-4% во дны й р а ство р ж е ле зо а ммо ни й ны хква сцо в, за те м пр о мы ва ю ти о кр а ш и ва ю т.

19

Окр аш и вани е о р се и но м К р а си те ль г о то ви тся на уксусно й ки сло те (а це то о р се и н) и ли на пр о пи о но во й (пр о пи о но о р се и н). В пр о пи о но во й ки сло те о н лучш е р а ство р яе тся. Для пр и г о то вле ни я 1% р а ство р а о р се и на б е р ут45 ми л ле дяно й уксусно й (и ли пр о пи о но во й ) ки сло ты , на г р е ва ю тв ко лб е до ки пе ни я, всы па ю т1 г о р се и на и да ю то сты ть. За те м пр и б а вляю т55 мл ди сти лли р о ва нно й во ды , тщ а те льно взб а лты ва ю ти фи льтр ую т. О кр а ш и ва ни е и мо нти р о ва ни е пр е па р а то в пр и и спо льзо ва ни и это г о кр а си те ля пр о и зво ди тся та к ж е , ка к и пр и и спо льзо ва ни и а це то ка р ми на . О дна ко пр и пе р е во де вр е ме нны х пр е па р а то в в по сто янны е и х о кр а ска со хр а няе тся до льш е , че м пр и о кр а ске а це то ка р ми но м. За да ни е . 1. П р о ве сти ма це р а ци ю тка не й со ляно й и уксусно й ки сло та ми . 2. О кр а си ть ма те р и а л а це то -ж е ле зо -г е ма то кси ли но м, а це то ка р ми но м и о р се и но м. П р и г о то ви ть да вле ны е пр е па р а ты . Заняти е 12. П е р е во двр е м е нных п р е п ар ато в в п о сто янные 1. П р и пр и г о то вле ни и по сто янны х пр е па р а то в на пр е дме тно е сте кло сле дуе т на не сти ж и дко сть Го й е р а . В е е со ста в вхо дят50 мл во ды , 30 г г умми а р а б и ка , 16 мл г ли це р и на , 200 г хло р а лг и др а та . П р и о тсутстви и г умми а р а б и ка е г о мо ж но за ме ни ть ка ме дью ви ш ни . П р о суш е нную ка ме дь тщ а те льно р а сти р а ю тв ступке , за ли ва ю тди сти лли р о ва нно й во до й на 30 ми н., за те м ки пятятна во дяно й б а не 5 ми нут. П о сле до б а вле ни я в не е г ли це р и на и хло р а лг и др а та сме сь фи льтр ую тне ско лько р а з че р е з б а ти ст, за те м е е по ме щ а ю тв те мны й пло тно за кр ы ва ю щ и й ся со суд и хр а нятв хо ло ди льни ке . 2. П р и пе р е во де вр е ме нны х пр е па р а то в в по сто янны е не о б хо ди мо уда ли ть по кр о вно е сте кло , пр о ве сти пр е па р а тче р е з се р и ю спи р то в и за клю чи ть в ка на дски й б а льза м. У да ли ть по кр о вно е сте кло мо ж но двумя спо со б а ми . 1. П р е дме тно е сте кло по ме щ а е тся на со ве р ш е нно р о вную по ве р хно сть сухо г о льда и ли на сто ли к за мо р а ж и ва ю щ е г о ми кр о то ма , и ли на пло ски й ко не ц а лю ми ни е во г о сте р ж ня, вста вле нно г о в со суд с ж и дки м а зо то м. П р е па р а тза мо р а ж и ва ю т о т 30 до 90 се кунд. За те м ска льпе ле м и ли ле зви е м б р и твы сни ма ю т по кр о вно е сте кло . 2. П р и де р ж и ва я сте кло , о сто р о ж но сни ма ю тпа р а фи н, ко то р ы м сте кло б ы ло о ка й мле но . За те м пр е па р а ткла дутна спи чки в ча ш ку П е тр и по кр о вны м сте кло м вни з. В ча ш ку П е тр и пр е два р и те льно на ли ва ю т 10% уксусную ки сло ту. П о кр о вно е сте кло о тде ляе тся о тпр е дме тно г о че р е з 10-15 ми н., но в не ко то р ы хслуча ях мо ж е тде р ж а ться до суто к.

20

О б ъе кт и ссле до ва ни я, о ста вш и й ся на пр е дме тно м сте кле , до лж е н б ы ть о б е зво ж е н и за клю че н в ка на дски й б а льза м. Для это г о пр е дме тно е сте кло пе р е но сят:1)в сме сь 96% спи р та и 45% уксусно й ки сло ты в о тно ш е ни и 1:1 на 5-10 ми н.; 2)спи р т96% I – 3 ми н.; 3)спи р т96% II - 1-2 ми н.; 4)спи р т 100% 1 -3 ми н.; 5)спи р т 100% II – 3 ми н; 6)сме сь то луо л:спи р т100% (1:1) - 5 ми н.; 7)то луо л I – 3 ми н.; 8)то луо л II – 3 ми н. За те м на пр е па р а тна но си тся чи сты й то луо л, ка па е тся ка на дски й б а льза м и пр е па р а тпо кр ы ва е тся чи сты м по кр о вны м сте кло м. За да ни е . 1. О зна ко ми ться со спо со б а ми пе р е во да вр е ме нны х пр е па р а то в в по сто янны е . 2. О сущ е стви ть пе р е во д вр е ме нны х пр е па р а то в в по сто янны е с по мо щ ью уксусно й ки сло ты . Заняти е 13. П р и го то вле ни е то тальных м и кр о п р е п ар ато в дляи зуч е ни я фе не ти ки п о п уляци й насе ко м ых (на п р и м е р е п р е дстави те ле й гр уп п ы Coccinea – Ко кци ды) Выбо р о бъект о вдля пр епа р ир о ва н ия В уче б ны х це лях на б о льш о м пр а кти куме сле дуе ти спо льзо ва ть на и б о ле е до ступны е в пр и р о де и на и б о ле е кр упны е по р а зме р а м ви ды ко кци д. Н а пр и ме р , в се р е ди не ма я в пр и р о де ле г ко со б р а ть о па сно г о вр е ди те ля др е ве сны х р а сте ни й – а кци е вую ло ж но щ и то вку-Partenolecanium corni (Bouche), о б р а зую щ ую пло тны е ко ло ни и на р а зли чны х пло до вы х де р е вьях. В это ж е вр е мя на ве твях б е р е з, яб ло нь, кле но в ве сьма о б ы че н кр упны й мучни сты й че р ве ц – Phenacoccus aceris (Sign.). В те че ни е все г о ле та на ве твях и ли стьях кр а пи вы встр е ча ю тся ко ло ни и кр а пи вно й о р те зи и – Orthezia urticae L., а в и ю ле на ко р нях ка чи ма и не ко то р ы х др уг и х мно г о ле тни х тр а вяни сты х р а сте ни й мо ж но со б р а ть о че нь кр упны х са мо к по льско й ко ш е ни ли (Porphyrophora polonica). Изо б р а ж е ни я вне ш не г о ви да и со ве ты по сб о р у эти х и др уг и х ви до в ко кци д мо ж но на й ти в б р о ш ю р е Н .С. Бо р хсе ни уса [7]. Со б стве нно ме то ди ка и зг о то вле ни я пр е па р а то в р а зб и ва е тся на сле дую щ и е эта пы [8]: 1. Ф и ксаци я. Ф и кси р ую тсо б р а нны х ж и вы х на се ко мы х в эти ло во м спи р те , о б ы чно 75-80 % ко нце нтр а ци и . Для ци то г е не ти че ски х и ссле до ва ни й на се ко мы х сле дуе т фи кси р о ва ть в а це то эта но ле (1:3) и ли в р а ство р е с б о ле е «мяг ки м» со че та ни е м 1:1. 2. П р е двар и те льно е п р е п ар и р о вани е . П о д б и но куляр о м на те ле на се ко мо г о де ла ю тна др е з на о дно й и з б о ко вы х сто р о н. Для это г о и спо льзую тза то че нны е энто мо ло г и че ски е и г лы и ли спе ци а льны е ле зви я. 3. П р о све тле ни е . Н а се ко мы х по ме щ а ю т в ти г е ль с 8-10 % р а ство р о м NaOH и ли KOH на вр е мя до 8 ча со в, в за ви си мо сти о т сте пе ни скле р о ти за ци и по кр о во в. За те м на г р е ва ю тв это м ж е р а ство р е на во дяно й

21

б а не в ср е дне м о ко ло 30 ми нут. В ко не чно м сче те , хи ти но вы е по кр о вы до лж ны ста ть пр о зр а чны ми . 4. П р е п ар и р о вани е . М а те р и а л пе р е но сят в ди сти лли р о ва ную во ду, на ли тую в сте кло с лунко й и ли спе ци а льную со ло нку, и по д б и но куляр о м уда ляю тче р е з р а не е сде ла нны й на др е з все внутр е нно сти . Для это г о и спо льзую т кр ю чки и пе тли , сде ла нны е и з то нки х энто мо ло г и че ски х и г л и ли ми нуци й . 5. П р о м ывка в ди сти лли р о ванно й во де. П р и не о б хо ди мо сти на это м эта пе ма те р и а л мо ж но о ста ви ть на вр е мя до не ско льки хсуто к. 6. Окр аска. В р е мя о кр а ски на пр ямую за ви си т о т сте пе ни скле р о ти за ци и по кр о во в. Си льно скле р о ти зи р о ва нны х на се ко мы х о кр а ш и ва ю т 10-20 ми нут, сла б о скле р о ти зи р о ва нны х – не ско лько ча со в и ли да ж е суто к. Для о кр а ски хи ти но вы х по кр о во в о б ы чно и спо льзую ткр а си те ли на о сно ве фукси на . Для пр и г о то вле ни я дво й но г о кр а си те ля сме ш и ва ю т 10 мл 2% р а ство р а р о зо во г о ли г ни на и 5 мл р а ство р а ки сло г о фукси на . Э ту сме сь р а зво дятв 100 мл ж и дко сти Э сси г а и в та ко м ви де хр а нят. Для пр и г о то вле ни я р а б о че г о р а ство р а 1-2 ка пли пр и г о то вле нно г о ма тр и чно г о р а ство р а до б а вляю тк 3 мл ж и дко сти Э сси г а . Со ста в ж и дко сти Э сси г а (Essig aphid fluid): мо ло чна я ки сло та (85%) – 20 ча сте й ; р а ство р фе но ла (1г р а мм на 15 мл во ды ) – 2 ча сти ; ле дяна я уксусна я ки сло та – 4 ча сти ; ди сти лли р о ва нна я во да – 1 ча сть. 7. П р о м ывка в эти ло во м сп и р те (96 %). В ы нуты х и з кр а си те ля на се ко мы х пр о мы ва ю т в спи р те , ко нтр о ли р уя по д б и но куляр о м сте пе нь о кр а ски . Н е о б хо ди мо до б и ться, что б ы ж е ле зы , ш и пы , во ло ски и т.д. на те ле б ы ли пр о кр а ш е ны г о р а здо и нте нси вне е , не ж е ли са м хи ти но вы й по кр о в. 8. П р о во дка. М а те р и а л по ме щ а ю тв г во зди чно е ма сло , в ко то р о м вы де р ж и ва ю т ми ни мум 30 ми нут и ли , в случа е не о б хо ди мо сти , хр а нят дли те льно е вр е мя. Да нны й эта п не о б хо ди м для то г о , что б ы пр е о до ле ть не сме ш и ва е мо сть спи р та и ка на дско г о б а льза ма . Для это й ж е це ли , пр и о тсутстви и г во зди чно г о ма сла мо ж но и спо льзо ва ть кси ло л, то луо л и ли о б ы чны й р а ство р и те ль для ла ка . 9. Зали вка в канадски й бальзам . Н а се ко мы х пе р е но сят на пр е дме тно е сте кло , р а спр а вляю т, уда ляю т и зли ш ки ма сла , ка па ю т ка плю б а льза ма и по кр ы ва ю тпо кр о вны м сте кло м. Для и зуче ни я ци то г е не ти че ски х о со б е нно сте й ко кци д, та к ж е ка к и мно г и х др уг и х на се ко мы х, в ка че стве и схо дно г о ма те р и а ла и спо льзую т све ж е о тло ж е нны е яй ца . Э то связа но с те м, что на на ча льны х ста ди ях др о б ле ни я яй це кле тки , пр и ме р но на ста ди и 8 б ла сто ме р о в, кле тки и хр о мо со мы в ни х со хр а няю то тно си те льно кр упны е р а зме р ы и по это му б о ле е удо б ны для и зуче ни я. О дно и ли не ско лько яи ц по ме щ а ю т на чи сто е пр е дме тно е сте кло в ка плю 45% уксусно й ки сло ты и ли в ка плю на сы щ е нно г о р а ство р а ка р ми на

22

в 45% уксусно й ки сло ты . Да ле е с по мо щ ью то нки х и г л (ми нуци й ) уда ляю т о б о ло чку яй ца – хо р и о н. П о сле это г о ка плю на кр ы ва ю т по кр о вны м сте кло м и сле г ка на да вли ва ю т. П р и г о то вле нны й та ки м о б р а зо м вр е ме нны й ми кр о пр е па р а ти зуча ю тна фа зо во -ко нтр а стно м ми кр о ско пе и ли на о б ы чно м ми кр о ско пе с о пущ е нны м вни з ко нде нсо р о м. В р е ме нны е пр е па р а ты , со де р ж а щ и е кле тки с хо р о ш о р а спо ло ж е нны ми хр о мо со ма ми , по две р г а ю т да льне й ш е й о б р а б о тке с и спо льзо ва ни е м ме то ди ки сухо г о льда и р а зли чны х спо со б о в о кр а ски . О б щ е пр и нята я ны не ме то ди ка р а б о ты с хр о мо со ма ми ко кци д о тр а ж е на , на пр и ме р , в не да вне й р а б о те Lyn G. Cook (Cook, 2000). За да ни е . 1. П р о ве сти по сле до ва те льную о б р а б о тку ма те р и а ла и и зг о то ви ть пр е па р а ты . 2. П р и ма ло м и б о льш о м уве ли че ни и ми кр о ско па о зна ко ми ться с мо р фо ло г и е й ко кци д. О б р а ти ть вни ма ни е на р а зли чны е ти пы во ско о тде ляю щ и х ж е ле з. Заняти е 14. П р и го то вле ни е аце то кар м и но вых п р е п ар ато в дляи зуч е ни яп о ли те нных хр о м о со м и зслю нных ж е ле здвукр ылых (на п р и м е р е ли ч и но кDrosophila melanogaster) Для пр и г о то вле ни я пр е па р а та с хр о мо со ма ми др о зо фи лы б е р ут ли чи нку на по здне й ста ди и р а зви ти я (че ты р е хдне вную ), ко г да о на ста ла по дви ж но й , но е щ е не о кукли ла сь. Та кую ли чи нку на но чь мо ж но о ста ви ть в по ме щ е ни и пр и те мпе р а тур е о ко ло 10 г р а дусо в, что о б ле г ча е тпо то м о тде ле ни е ж е ле з. П о сле до ва те льно сть р а б о ты сле дую щ а я [5]. 1. Л и чи нку по ме щ а ю т на пр е дме тно е сте кло в ка плю фи зи о ло г и че ско г о р а ство р а (со де р ж и т0,73% NaCl). 2. П р е дме тно е сте кло вме сте с о б ъе кто м уста на вли ва ю т на сто ли к б и но куляр а . 3. Бе р ут в ка ж дую р уку по пр е па р о ва льно й и г ле . Иг ло й , на хо дящ е й ся в ле во й р уке , си льно пр и ж и ма ю тк сте клу р о то вую ча сть ли чи нки . В то р о й р уко й , на хо дящ е й ся в пр а во й р уке , да вятпла ш мя на се р е ди ну те ла и о ттяг и ва ю тза дни й ко не ц ли чи нки . П о сле р а зде ле ни я те ла на две ча сти не о б хо ди мо на й ти слю нны е ж е ле зы , со сто ящ и е и з пр о зр а чны х кле то к, внутр и ко то р ы х пр о сма тр и ва ю тся ядр а с ле нто ви дны ми о б р а зо ва ни ями – хр о мо со ма ми . 4. Слю нны е ж е ле зы с по мо щ ью пр е па р о ва льно й и г лы пе р е но сятна ча со во е сте кло с а це то ка р ми но м. Для лучш е г о о кр а ш и ва ни я ча со во е сте кло на кр ы ва ю т др уг и м сте кло м и по ме щ а ю т в те р мо ста т пр и те мпе р а тур е 370С на 20-30 ми нут. 5. Н а пр е дме тно е сте кло в ка плю с 45 % р а ство р о м уксусно й ки сло ты пе р е но сятж е ле зу и з а це то ка р ми на . За кр ы ва ю тпо кр о вны м сте кло м и г о то вятда вле ны й пр е па р а т. В р е ме нны й пр е па р а тмо ж но о ка нто ва ть р а с-

23

пла вле нны м па р а фи но м, кле е м и ли пе р е ве сти в по сто янны й , и спо льзуя сухо й ле д. За да ни е . 1. О зна ко ми ться со схе ма ти чны м и зо б р а ж е ни е м внутр е нне г о стр о е ни я ли чи нки др о зо фи лы . 2. В ы чле ни ть слю нны е ж е ле зы , о кр а си ть и х в р а ство р е а це то ка р ми на и пр и г о то ви ть да вле ны е пр е па р а ты . 3. За р и со ва ть хр о мо со мны й ко мпле кс эндо ми то ти че ско г о ядр а , и спо льзуя о б ъе кти в Х 40. О б р а ти ть вни ма ни е на на ли чи е хр о мо це нтр а , мо р фо ло г и ю хр о мо со м: ме ж ди ско вы е пр о стр а нства , стр о г о упо р ядо че нно е и спе ци фи чно е р а спо ло ж е ни е ди ско в по дли не хр о мо со мы . Л ИТЕ РАТУ РА 1. П а уш е ва Е .П . П р а кти кум по ци то ло г и и р а сте ни й / Е .П . П а уш е ва . - М .: П р о ми зда т, 1988. - 270 с. 2. Ге не ти че ски е ме то ды в се ле кци и р а сте ни й / П о д р е д. Н .В . Тур б и на М .: К о ло с,1974. - 207 с. 3. П р о зи на М .И. Бо та ни че ска я ми кр о те хни ка / М .И. П р о зи на . - М .: В ы сш а я ш ко ла , 1960. - 205 с. 4. Ю р це в В .Н . М е то ди че ско е р уко во дство к ла б о р а то р но -пр а кти че ски м за няти ям по ци то ло г и че ско й и эмб р и о ло г и че ско й ми кр о те хни ке / В .Н . Ю р це в, В .А. П уха льски й . - М .: Изд-во М о ск. ун-та , 1968. – 113 с. 5. Го сти мски й С.А. П р а кти кум по ци то г е не ти ке / Го сти мски й С.А., Дьяко ва М .И., Ива но вска я Е .И., М о на хо ва М .А. - М .: Изд-во М о ск. ун-та , 1974. – 172 с. 6. М а лы й пр а кти кум по ци то ло г и и / П о д. р е д. Ю .С. Че нцо ва . – М .: Издво М о ск. ун-та , 1977. – 288 с. 7. Бо р хсе ни ус Н .С. Сб о р и и зуче ни е че р ве цо в и щ и то во к / Н .С. Бо р хсе ни ус. - М .-Л .: Изд-во АН СССР, 1950. - 31 с. 8. К о за р ж е вска я Э .Ф . М е то ди ка пр и г о то вле ни я пр е па р а то в ко кци д для це ле й и х о пр е де ле ни я / Э .Ф . К о за р ж е вска я // Э нто мо ло г и че ско е о б о зр е ни е . - 1968. - № 1. - С. 248-253. 9. Ж и нки на Н .А. К ме то ди ке о кр а ски эмб р и о ло г и че ски х пр е па р а то в / Н .А. Ж и нки на , О .Н . В о р о но ва // Бо та ни че ски й ж ур на л. - 2000. – Т. 85, № 6. - С. 168-171. 10. Cook L. G. Extraordinary and extensive karyotypic variation: A 48-fold range in chromosome number in gall-inducing scale insect Apiomorpha (Himiptera: Coccoidea: Eriococcidae) / L. G. Cook // Genome. – 2000. – V. 43. - P. 255-263. Со ста ви те ли : Н а за р о ва М а р г а р и та Н и ко ла е вна Га вр и ло в Илья Але кса ндр о ви ч Ба г р янска я Н а та лья Але ксе е вна Ре да кто р Ти хо ми р о ва О .А.