Mikrobiologia ogólna

Mikrobiologia ogólna Wydanie drugie poprawione

Hans G. Schlegel tłumaczenie zbiorowe pod redakcją naukową Zdzisława Markiewicza

WYDAWNICTWO NAUKOWE PWN WARSZAWA 2 0 0 3

Dane oryginału

Allgemeine Mikrobiologie Hans G. Schlegel 7. uberarbeitete Auflage unter Mitarbeit von Christiane Zaborosch © 1976, 1992 Georg Thieme Verlag, Stuttgart

Z wydania niemieckiego tłumaczyli Jadwiga Baj (rozdz. 1-3, 17), Alicja Borowska (rozdz. 5), Zdzisław Markiewicz (rozdz. 7-14), Janusz Popowski (rozdz. 4, 6), Krystyna I. Wolska (przedmowy, rozdz. 15, 16)

Okładkę i strony tytułowe projektował Edwin Radzikowski-Kokosiński Redaktor Krystyna Mostowik Redaktor techniczny Jolanta Cibor

Copyright © for the Polish edition by Wydawnictwo Naukowe PWN SA Warszawa 1996, 2000

ISBN 83-01-13999-4 Wydawnictwo Naukowe PWN SA 00-251 Warszawa, ul. Miodowa 10 tel. (O-prefiks-22) 69-54-321 faks (O-prefiks-22) 69-54-031 e-mail: [email protected] http://www.pwn.pl Wydawnictwo Naukowe PWN SA Wydanie drugie poprawione (drugi dodruk) Arkuszy drukarskich 46,0 Druk ukończono w lutym 2003 r. Druk i oprawa: Rzeszowskie Zakłady Graficzne SA Miłocin 181 k/Rzeszowa, 36-062 Zaczernie

PRZEDMOWA DO WYDANIA POLSKIEGO

W roku 1975 nakładem PWRiL ukazało się polskie wydanie przekładu drugiego wydania niemieckiego Mikrobiologii ogólnej Hansa G. Schlegela. Książka wówczas stanowiła wartościową pozycję w polskiej literaturze mikrobiologicznej, służąc kilku pokoleniom studentów. Od tamtego czasu mikrobiologia dokonała olbrzymich postępów i wyrosły z niej tak ważne kierunki badań, jak biologia molekularna i biotechnologia. Książka H. Schlegela doczekała się siedmiu wydań, ulegając modyfikacji wraz z nowymi osiągnięciami mikrobiologii. Została też przełożona na kilka języków, w tym na angielski, hiszpański i rosyjski. Obecnie trafia do rąk polskiego czytelnika przekład siódmego wydania niemieckiego, napisanego przez Hansa Schlegela przy współudziale Christiane Zaborosch. Mikrobiologia ogólna znakomicie wypełnia pustkę w polskim piśmiennictwie, w którym jedyną pozycją w ostatnich latach było nowe wydanie Życia bakterii Prof. Kunickiego-Goldfingera. Te dwa wydane przez PWN podręczniki doskonale się uzupełniają. Książka Schlegela zawiera bardzo wiele szczegółowych informacji i drobiazgowe opisy przebiegu szlaków metabolicznych i uczestniczących w nich enzymów, w tym również nietypowych procesów metabolicznych u archeonów. Obejmuje też rozdziały poświęcone roli mikroorganizmów w procesach biotechnologicznych, degradacji przez drobnoustroje wielu naturalnych substancji występujących w przyrodzie, zmienności genetycznej, regulacji metabolizmu i miejscu bakterii w świecie ożywionym. Dwa osobne rozdziały poświęcone są wirusom i grzybom.

5

Przekładu podjął się zespół obecnych lub byłych pracowników Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego. Pozwoliło to na łatwiejsze porozumiewanie się tłumaczom poszczególnych rozdziałów w celu uzgodnienia właściwej terminologii itp. Niemniej, w tym miejscu gorące podziękowania należą się Pani redaktor Krystynie Mostowik z PWN, za ogromny trud włożony w ujednolicenie tekstu. Jeśli uważny czytelnik nadal dostrzega pewne niedociągnięcia, to wynikają one z niejednorodności tekstu poszczególnych rozdziałów dostarczonego do redakcji. Jest to nie do uniknięcia przy tłumaczeniu przez zespół. Niemniej, do rąk polskiego studenta czy młodego pracownika naukowego trafia bardzo ważny podręcznik, który przez przynajmniej kilka lat powinien oddawać cenne usługi w kształceniu polskich mikrobiologów. Zdzisław Markiewicz

W obecnym wydaniu dokonano pewnych zmian mających na celu uwzględnienie współczesnych poglądów na systematykę, wyróżniających trzy tzw. domeny organizmów żywych - Bacteria, Archaea i Eukarya. Tak więc w całym tekście stosowana wcześniej nazwa archebakterie została zastąpiona określeniem archeony. Ponieważ zmiany w klasyfikacji organizmów nie objęły niższych taksonów systematycznych, nazwy wielu archeonów nadal kojarzą się z bakteriami, np. Methanobacterium wolfei, co czasem może być mylące.

PRZEDMOWA DO WYDANIA SIÓDMEGO

Przez ostatnie 25 lat książka ta spełniała dwa zadania: dawała przegląd wiedzy mikrobiologicznej oddzielając ją od innych dziedzin biologii i stanowiła próbę pogodzenia ogromnej ilości materiału z jego szczegółowym opisem. Jestem przekonany, że główne zadanie podręcznika polega na prezentacji istotnych wiadomości, z jednoczesnym odrzuceniem ich nadmiaru jako zbędnego balastu nie przyczyniającego się do nabycia podstawowej wiedzy. Starałem się również nie ulegać obecnym modom, pamiętając że „rodzące owoce gałęzie wyrastają często ze skromnego pączka". W ten sposób objętość tej nowej edycji podręcznika jest utrzymana w rozsądnych granicach. Zwiększona liczba stron wynika głównie z korekty materiału; postęp we wszystkich gałęziach mikrobiologii wpłynął na konieczność licznych uzupełnień, pewnych skrótów i poprawek niektórych rozdziałów, łącznie z dodaniem nowych ilustracji i zmianami starych wykresów. Zostały rozciągnięte i pogłębione dwa wątki mogące potencjalnie wpłynąć na wybór mikrobiologii jako przedmiotu studiów. Dotyczą one ewolucji prokariotów i ekologii mikroorganizmów. Porównanie sekwencji nukleotydowej rybosomowego RNA niewątpliwie stało się ogromnie przydatne do badań ewolucyjnych i pozwoliło na poznanie prokariotycznego drzewa filogenetycznego zgodnego z większością badań biochemicznych. Z kolei, odkrycie nowych gatunków bakterii i nowych szlaków metabolicznych wraz z mechanizmami ich regulacji ułatwia badanie ekologii mikroorganizmów, a niedawno uzmysłowiona konieczność lepszego 7

poznania wzajemnych związków w biosferze, co jest również warunkiem jej skutecznej ochrony, bardzo podkreśla zwiększające się znaczenie tych badań. Ponownie dziękuję kolegom i studentom za owocne uwagi krytyczne. Szczególnie pomocni, oprócz osób wymienionych w przedmowie do wydania pierwszego, byli: Barbel Friedrich, Margot Kogut, Jan R. Andreesen i Botho Bowien. Pani B. Friedrich podjęła się rewizji rozdziału 15 „Stałość, zmienność, rekombinacja i przekazywanie cech genetycznych", który zawiera wiele nowych informacji. Wdzięczny jestem pani Christiane Zaborosch za cenną pracę edytorską. Książka obejmuje nowe diagramy, ilustracje i tabele, za które, jak również za chętną i wyrozumiałą współpracę dziękuję panu Gunterowi Boschowi. Wyrazy uznania, wyrażone wydawnictwu Georg Thieme już w 1968 roku, powtarzam teraz bez zastrzeżeń i w całej rozciągłości. Na koniec, moja rodzina, moja żona i dzieci musiały się nauczyć życia z Mikrobiologią i zawsze wykazywały zrozumienie dla tego priorytetu. I za to składam im serdeczne podziękowania. Hans Gunter Schlegel Getynga, lipiec 1991

PRZEDMOWA DO WYDANIA PIERWSZEGO

Mikrobiologia zajmuje się głównie bakteriami, grzybami i wirusami, które dzięki różnorodności swej budowy i czynności wykraczają znacznie poza obręb tradycyjnej botaniki. Prowadzone w ostatnich latach badania nad mikroorganizmami przyczyniły się w ogromnej mierze do rozwiązania zasadniczych problemów ogólnobiologicznych. Ze względu na łatwość izolowania, szybki rozwój, duże zdolności adaptacyjne i wiele innych właściwości mikroorganizmy stały się uprzywilejowanym obiektem badań biochemicznych i genetycznych. Studiujący mikrobiologię mają do dyspozycji znakomite podręczniki wymienione w spisie literatury, np. „General Microbiology" Staniera i in., „Das Leben der Bakterien" Thimanna lub „Microbiology" Daviesa i in. Odczuwało się brak zwięzłego i krótkiego przeglądu zawierającego niezbędne, podstawowe wiadomości z zakresu mikrobiologii ogólnej, przydatne nie tylko dla mikrobiologów, lecz również dla studentów botaniki, zoologii, farmacji, rolnictwa, medycyny, fizyki i chemii. Niniejsza książka ma służyć właśnie temu kręgowi czytelników. Dając ogólny przegląd aktualnej wiedzy z zakresu mikrobiologii, ma ona jednocześnie dostarczyć dokładnych informacji i wzbudzić zainteresowanie tą dziedziną wiedzy. Zawiera ona również wiadomości z biologii, które w krótkim zarysie można znaleźć w podręcznikach botaniki i zoologii wydanych w tej samej serii. Powinna także zainteresować czytelnika pokrewnymi dziedzinami nauki, a przede wszystkim biochemią ogólną. Dlatego podano w niej tylko w zarysie podstawowe reakcje chemiczne zachodzące 9

w procesach przemiany materii, dokładniej przedstawiając jedynie zasadnicze reakcje przemian charakterystycznych dla mikroorganizmów. Niektóre rozdziały potraktowano obszerniej, zwracając uwagę głównie na fizjologię bakterii. Wydaje się, że udało się dzięki temu uwypuklić powiązania mikrobiologii z innymi dziedzinami nauk przyrodniczych. Poznanie współzależności zjawisk na poziomie molekularnym wyjaśnia podstawowe zjawiska biofizyczne. Różnorodność form życia można bowiem sprowadzić do ograniczonej liczby podstawowych struktur i procesów, od których z kolei zależy odpowiedni plan budowy i przemiany materii organizmów żywych. Tak więc wnikanie „w głąb" zjawisk poszerza horyzonty naszej wiedzy. Chciałbym złożyć szczególnie serdeczne podziękowanie za wszechstronną pomoc, uwagi i wskazówki współpracownikom: D. Clausowi, U. Eberhardtowi, G. Gottschalkowi i N. Pfennigowi. Dużą pomoc w pracy okazała mi także dr K. Schmidt. Bez jej współpracy przy projektowaniu rysunków i opracowywaniu tekstu, przygotowanie maszynopisu byłoby niemożliwe. Panu L. Schnellbacherowi dziękuję za staranne i czytelne rysunki, a pani M. Welskop za przepisywanie manuskryptu i wykonanie skorowidza. Wdzięczny jestem także Kolegom, którzy użyczyli mi nie publikowanych zdjęć lub dostarczyli znakomicie wykonane odbitki zdjęć już publikowanych. Wydawnictwu należą się szczególne podziękowania za ich staranne reprodukcje w podręczniku. Szczególne uznanie należy wyrazić wydawnictwu Georg Thieme, które podjęło się wydania serii bardzo cennych i dobrze opracowanych podręczników z różnych dziedzin nauk biologicznych. H. G. Schlegel Getynga, listopad 1968

PISOWNIA I SKRÓTY

Autor podręcznika zakłada, że — zgodnie z przyjętym zwyczajem — pisownia terminów technicznych powinna zależeć od autora i wydawcy. W związku z tym ustanawia następujące reguły. Skróty nazw rodzajowych mikroorganizmów należy stosować rzadko i tylko tam, gdzie nie istnieje możliwość nieporozumień. Podobnie, należy unikać skrótów nazw związków chemicznych. Mimo to, niekiedy skróty są stosowane, szczególnie na schematach szlaków metabolicznych. W celu ułatwienia śledzenia tekstu mikrobiologom bez przygotowania biochemicznego postanowiono utrzymać konwencjonalne użycie pewnych terminów uznane obecnie za nieprawidłowe. Szczególnie nie oznaczano ładunku nukleotydów nikotynowo-adeninowych (NAD zamiast NAD+). Podobnie, wzory kwasów organicznych i estrów fosforanowych są przedstawione w postaci niezdysocjowanej, choć dotyczą soli np. mleczanów, pirogronianów, bursztynianów.

11

CZĘSTO STOSOWANE SKRÓTY 1. Aminokwasy Ala — alanina Arg — arginina Asn (Asp-NH2) — asparagina Asp — kwas asparaginowy Cys — cysteina Dab (A2bu) — kwas diaminomasłowy Dpm (A2pm) — kwas diaminopimelinowy Gin (Glu-NH2) — glutamina Glu — kwas glutaminowy Gly — glicyna His — histydyna

Ile — izoleucyna Leu — leucyna Lys — lizyna Met — metionina Phe — fenyloalanina Pro — prolina Ser — seryna Thr — treonina Trp — tryptofan Tyr — tyrozyna Val — walina

2. Nukleozydofosforany AMP, ADP, ATP — adenozynomono(di, tri)fosforan CMP, CDP, CTP — cytydynomono(di, tri)fosforan GMP, GDP, GTP — guanozynomono(di, tri)fosforan IMP, IDP, ITP — inozynomono(di, tri)fosforan TMP, TDP, TTP — tymidynomono(di, tri)fosforan UMP, UDP, UTP — urydynomono(di, tri)fosforan NuMP, NuDP, NuTP — nukleozydomono(di, tri)fosforan 3. Inne skróty (kolejność alfabetyczna) CoA — koenzym A Cyt — cytochrom DH — dehydrogenaza DNA — kwas deoksyrybonukleinowy EDTA — etylenodiaminotetraoctan FAD — dinukleotyd flawinoadeninowy FBP — fruktozo-1,6-bisfosforan FMN — mononukleotyd flawinowy F-6-P — fruktozo-6-fosforan G-6-P — glukozo-6-fosforan GAP — aldehyd 3-fosfoglicerynowy Gal-6-P — galaktozo-6-fosforan Glc — glukoza GlcN — glukozamina GlcNAc — N-acetyloglukozamina GSH — glutation (forma zredukowana) KDPG — kwas 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonowy Μ — molarność (stężenie) mol — mole (ilość) MurNAc — kwas N-acetylomuraminowy NAD(P) — dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (fosforan)

12

NAD(P)H 2 — zredukowany dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (fosforan) PEP — fosfoenolopirogronian 3-PG — kwas 3-fosfoglicerynowy 6-PG — kwas 6-fosfoglukonowy PHB — kwas poli-β-hydroksymasłowy Pnieorg (Pi) — ortofosforan - -PO3H2 — fosfoketolaza PP n i e o r g (PPi) — pirofosforan R-5-P — rybozo-5-fosforan Ru-5-P — rybulozo-5-fosforan RuBP — rybulozo-l,5-bisfosforan RNA — kwas rybonukleinowy Shu-7-P — sedoheptulozo-7-fosforan ShuBP — sedoheptulozo-l,7-bisfosforan TA — transaldolaza TCA — cykl kwasów trikarboksylowych TK — transketolaza TPP — fosforan tiaminy UQ — ubichinon Xu-5-P — ksylulozo-5-fosforan

SPIS TREŚCI

PRZEDMOWA DO WYDANIA POLSKIEGO PRZEDMOWA DO WYDANIA SIÓDMEGO PRZEDMOWA DO WYDANIA PIERWSZEGO PISOWNIA I SKRÓTY SKRÓTY CZĘSTO UŻYWANE 1. MIEJSCE MIKROORGANIZMÓW W PRZYRODZIE 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6.

Trzy królestwa: zwierzęta, rośliny i Protista Prokaryota i Eukaryota Ewolucja organizmów Udział mikroorganizmów w obiegu podstawowych pierwiastków w przyrodzie Mikroorganizmy w służbie człowieka Właściwości ogólne mikroorganizmów

2. KOMÓRKA I JEJ BUDOWA 2.1. 2.2.

Komórka eukariotyczna (eucyt) Komórka prokariotyczna (protocyt) 2.2.1. Bakteryjny nukleoid Cytoplazma, białka i rybosomy 2.2.2. Błony 2.2.3. Ściana komórkowa 2.2.4. Otoczki i śluzy 2.2.5. Rzęski i ruch 2.2.6. Materiały zapasowe i inne inkluzje komórkowe 2.2.7. Endospory i inne formy przetrwalne 2.2.8. 2.2.9. Barwniki bakterii i grzybów

5 7 9 11 12 19 19 21 23 25 31 33 36 37 42 45 57 64 71 83 87 95 102 108

13

3.

GRUPY ORGANIZMÓW PROKARIOTYCZNYCH 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8. 3.9. 3.10. 3.11. 3.12. 3.13. 3.14. 3.15. 3.16. 3.17. 3.18. 3.19. 3.20. 3.21.

4.

14

113 120 123 124 125 126 128 130 134 136 140 140 141 144 146 150 155 158 160 162 163 171

4.1. 4.2.

173 181 184 187 192 198

Wirusy Wirusy bakteryjne (bakteriofagi) 4.2.1. Namnażanie się fagów wirulentnych — cykl lityczny 4.2.2. Rozwój fagów łagodnych — lizogenia Rola wirusów i plazmidów w powstawaniu nowotworów Ważne wirusowe patogeny człowieka

GRZYBY (MYCOTA) 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6.

6.

113

WIRUSY: WYSTĘPOWANIE I BUDOWA

4.3. 4.4. 5.

Wstęp Grupy prokariotów Gramdodatnie ziarniaki Gramujemne ziarniaki Gramdodatnie pałeczki nie tworzące endospor Bakterie maczugowate Prątki Promieniowce sensu stricto Laseczki i ziarniaki tworzące endospory Bakterie z grupy Pseudomonas i inne pałeczki gramujemne Gramujemne pałeczki względnie beztlenowe Gramujemne bakterie beztlenowe Archeony Wygięte pałeczki: śrubowce i przecinkowce Krętki Bakterie o ruchu ślizgowym Bakterie tworzące wyrostki, wypustki i pączkujące Bezwzględne pasożyty komórkowe Mikoplazmy Beztlenowe bakterie fototroficzne Tlenowe bakterie fototroficzne: sinice

Acrasiomycetes (akrazjowce) Myxomycetes (śluzowce) Phycomycetes (grzyby niższe) Ascomycetes (workowce) Basidiomycetes (podstawczaki) Deuteromycetes = Fungi imperfecti (grzyby konidialne)

201 205 208 209 214 221 224

WZROST MIKROORGANIZMÓW

225

6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5.

225 228 236 238 243 244

Odżywianie się mikroorganizmów Podłoża bakteriologiczne (pożywki) i warunki wzrostu Typy odżywiania Metody hodowli selektywnych (wybiórczych) Fizjologia wzrostu 6.5.1. Metody określania liczby i masy bakterii

6.6.

6.5.2. Wzrost logarytmiczny i czas generacji 6.5.3. Wzrost bakterii w hodowlach okresowych 6.5.4. Parametry krzywej wzrostu 6.5.5. Wzrost bakterii w hodowlach ciągłych 6.5.6. Synchronizacja podziałów komórkowych Zahamowanie wzrostu i zamieranie 6.6.1. Metody sterylizacji 6.6.2. Procedury konserwujące

246 249 253 255 259 260 264 270

7. PODSTAWOWE MECHANIZMY METABOLIZMU I PRZEMIAN ENERGETYCZNYCH 7.1. Rozważania ogólne 7.2. Szlaki degradacji glukozy 7.2.1. Szlak fruktozo-1,6-bisfosforanowy (glikoliza) 7.2.2. Cykl pentozofosforanowy 7.2.3. Szlak 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonianowy 7.2.4. Utlenianie pirogronianu 7.3. Cykl kwasów trikarboksylowych 7.4. Łańcuch oddechowy i fosforylacja na poziomie transportu elektronów 7.5. Cykle pomocnicze i glukoneogeneza 7.6. Biosynteza niektórych niskocząsteczkowych składników 7.7. Pobieranie substancji przez komórkę

273 274 286 287 289 291 293 295 297 314 320 324

8.

332

WAŻNIEJSZE PROCESY FERMENTACYJNE 8.1. 8.2. 8.3. 8.4. 8.5. 8.6. 8.7.

9.

Fermentacje alkoholowe u drożdży i bakterii 337 Fermentacja mlekowa i Lactobacteriaceae............... ...................................... 344 Fermentacja propionowa i bakterie propionowe 353 Fermentacja mrówkowa i Enterobacteriaceae 356 Fermentacja masłowo-butanolowa i klostridia 366 Fermentacja homooctowa: dwutlenek węgla jako akceptor wodoru . . 376 Produkty naturalne podlegające i nie podlegające fermentacji 378

TRANSPORT ELEKTRONÓW W WARUNKACH BEZTLENOWYCH . . 9.1. Oddychanie azotanowe: denitryfikacja i amonifikacja azotanów .... 9.1.1. Oddychanie azotanowe: denitryfikacja 9.1.2. Oddychanie azotanowe: amonifikacja azotanu 9.2. Tworzenie siarkowodoru podczas redukcji siarczanu 9.3. Redukcja siarki do siarkowodoru 9.4. Tworzenie metanu przez redukcję węglanu 9.5. Tworzenie octanu przez redukcję węglanu 9.6. Tworzenie bursztynianu przez redukcję fumaranu 9.7. Redukcja żelaza(III) do żelaza(II)

380 382 383 385 387 394 395 402 403 404

10. UTLENIANIE CZĘŚCIOWE I BIOTECHNOLOGIA Z WYKORZYSTANIEM DROBNOUSTROJÓW 10.1. Produkcja kwasu octowego i bakterie octowe 10.2. Wytwarzanie innych kwasów organicznych przez grzyby

406 407 410

15

10.2.1. Fizjologia i biotechnologia 10.2.2. Chemia tworzenia kwasów przez grzyby 10.3. Produkcja aminokwasów 10.4. Przemiana substancji organicznych przez drobnoustroje 10.5. Produkcja antybiotyków 10.5.1. Organizmy i odkrycia 10.5.2. Antybiotyki ważne w lecznictwie 10.5.3. Mikotoksyny 10.6. Witaminy 10.7. Egzopolisacharydy 10.8. Enzymy 10.9. Biomasa

410 414 416 417 419 420 424 428 429 430 431 433

11. NIEORGANICZNE DONORY WODORU: TLENOWE BAKTERIE CHEMOLITOTROFICZNE 11.1. Utlenianie amonu i azotynu: nitryfikacja 11.2. Utlenianie zredukowanych związków siarki 11.3. Utlenianie żelaza(II) 11.4. Utlenianie wodoru cząsteczkowego 11.5. Wiązanie dwutlenku węgla

435 436 441 444 446 450

12. BAKTERIE FOTOTROFICZNE I FOTOSYNTEZA

456

12.1. Purpurowe bakterie siarkowe, purpurowe bakterie bezsiarkowe i zielone bakterie siarkowe 12.1.1. Pigmenty aparatu fotosyntetycznego 12.1.2. Metabolizm 12.1.3. Występowanie bakterii fototroficznych 12.2. Podstawowe procesy w fotosyntezie 12.2.1. Fotosynteza anoksygenowa 12.2.2. Fotosynteza oksygenowa 12.2.3. Podsumowanie 12.3. Wykorzystywanie energii świetlnej przez archeony z rodzaju Halobacterium

457 466 470 473 475 478 481 486 487

13. WIĄZANIE AZOTU CZĄSTECZKOWEGO 13.1. Wiązanie azotu przez bakterie symbiotyczne 13.1.1. Brodawki korzeniowe roślin motylkowych 13.1.2. Brodawki korzeniowe roślin niemotylkowych 13.1.3. Symbioza z sinicami wiążącymi azot 13.2. Wiązanie azotu przez bakterie wolno żyjące i sinice 13.3. Biochemia wiązania azotu

488 489 489 493 493 494 496

14. ROZKŁAD SUBSTANCJI NATURALNYCH

500

14.1. Celuloza 14.2. Ksylan 14.3. Skrobia i inne glukany 14.4. Fruktany

16

502 508 509 513

14.5. 14.6. 14.7. 14.8. 14.9. 14.10. 14.11.

Mannan Pektyny Agar Chityna Lignina Powstawanie humusu Węglowodory 14.11.1. Metan 14.11.2. Etan, propan i butan 14.11.3. Alkany długołańcuchowe 14.11.4. Węglowodory aromatyczne 14.12. Białka

513 514 515 516 517 520 522 523 526 526 528 535

15. STAŁOŚĆ, ZMIENNOŚĆ, REKOMBINACJA I PRZEKAZYWANIE INFORMACJI GENETYCZNEJ 15.1. Pochodzenie mutacji 15.1.1. Nieukierunkowany charakter mutacji 15.1.2. Mutacje i ich częstość 15.1.3. Typy mutacji 15.1.4. Czynniki mutagenne i ich działanie 15.1.5. Wyrażanie się i selekcja poszczególnych fenotypów mutantów 15.1.6. Naprawa DNA 15.1.7. Test na aktywność mutagenną 15.2. Przekazywanie cech i rekombinacja genetyczna 15.2.1. Rekombinacja genetyczna 15.2.2. Transformacja 15.2.3. Transdukcja 15.2.4. Koniugacja 15.3. Plazmidy 15.3.1. Plazmidy i ich właściwości 15.3.2. Biologiczne znaczenie plazmidów 15.4. Restrykcja i modyfikacja DNA 15.5. Metody klonowania molekularnego

541 542 542 544 546 547 552 557 559 560 561 565 568 570 577 577 582 586 589

16. REGULACJA METABOLIZMU 16.1. Regulacja syntezy enzymów 16.1.1. Indukcja 16.1.2. Represja 16.1.3. Mechanizm regulacji 16.2. Regulacja przez zmianę katalitycznej aktywności enzymów 16.2.1. Mechanizmy regulacji 16.2.2. Przykłady sposobów regulacji 16.3. Mutanty z zaburzeniami w regulacji

599 601 602 605 609 615 616 621 629

17. MIKROORGANIZMY I ŚRODOWISKO

633

17.1.

Ekologia mikroorganizmów

634

17

17.2.

17.3. 17.4.

17.1.1. Wstęp 17.1.2. Ekosystemy wodne Symbiotyczne stosunki między mikroorganizmami 17.2.1. Symbioza mutualistyczna 17.2.2. Symbioza antagonistyczna Mikroorganizmy a ewolucja Ziemi Ewolucja mikroorganizmów

634 638 646 647 654 656 658

BIBLIOGRAFIA

666

SŁOWNICZEK

673

INDEKS

681

MIEJSCE MIKROORGANIZMÓW W PRZYRODZIE

1.1. Trzy królestwa: zwierzęta, rośliny i Protista Aż do zeszłego wieku żywe organizmy były klasyfikowane jako rośliny bądź zwierzęta na podstawie oczywistych różnic w ich budowie. Różnice te można było tłumaczyć odmiennością sposobów odżywiania. Zwierzęta (heterotrofy) odżywiają się gotowymi substancjami organicznymi, które wewnątrz ich ciała, w przewodzie pokarmowym, zostają rozdrobnione, strawione i wchłonięte. Przewód pokarmowy powstaje w czasie rozwoju embrionalnego w wyniku wpuklenia blastuli. W rozwoju ewolucyjnym zwierząt doszło więc do wytworzenia dużych, wewnętrznych powierzchni resorbujących. Według takiej zasady zbudowane są zwierzęta poczynając od jamochłonów (np. stułbia spośród Hydrozoa), aż do wyższych kręgowców. Rośliny (autotrofy) charakteryzuje całkowicie odmienny sposób odżywiania i inny plan budowy. Syntetyzują one ze związków nieorganicznych substancje potrzebne do budowy organizmu i wykorzystują światło słoneczne jako źródło energii. Aktywne w fotosyntezie komórki i tkanki, zawierające barwniki absorbujące światło (chlorofile i karotenoidy), są rozmieszczone na dużej powierzchni obwodowych warstw organizmu roślinnego. Inne ogólne różnice między roślinami i zwierzętami dotyczą obecności ścian komórkowych, zdolności do aktywnego poruszania się i zmiany pozycji w środowisku oraz zdolności do syntetyzowania różnych substancji. 19

20

Tak więc, dopóki niewiele wiedziano o mikroorganizmach, łatwo było wytyczyć ostrą granicę między królestwami roślin i zwierząt. Nawet grzyby miały tak wiele wspólnych cech z roślinami wyższymi, że można je było zaliczyć do królestwa roślin, mimo ich heterotroficznego sposobu odżywiania. Znacznie trudniej było rozstrzygnąć, do którego królestwa zaliczyć bakterie, śluzowce i inne organizmy jednokomórkowe. Wyodrębniono je więc jako trzecie królestwo, któremu nadano nazwę Protista. Haeckel (1866) zaliczył wszystkie organizmy do trzech królestw: roślin, zwierząt i Protista. Opierając się na ewolucyjnej teorii Karola Darwina (1859), Haeckel powiązał znane wówczas rodzaje i gatunki roślin oraz zwierząt z punktu widzenia ich możliwego rozwoju ewolucyjnego. Na opracowanym przez siebie drzewie filogenetycznym (ryc. 1.1) próbował wykazać, jak współczesne organizmy mogły wyewoluować ze wspólnego pnia — „radix communis organismorum". Wydaje się jednak, że Haeckel nie miał zbyt jasnego poglądu na królestwo Protista. Królestwo Protista grupuje te organizmy, które wyróżniają się spośród roślin i zwierząt brakiem morfologicznej specjalizacji, większość z nich są to bowiem organizmy jednokomórkowe. Na podstawie budowy komórki można podzielić Protista na dwie wyraźnie zróżnicowane grupy. Wyższe Protista pod względem budowy komórki przypominają komórki roślin i zwierząt — należą do Eukaryota. Grupa ta zawiera glony, grzyby i pierwotniaki. Niższe Protista obejmują bakterie (w tym sinice) i archeony — należą one do Prokaryota, a budowa ich komórek znacznie różni się od budowy komórek innych organizmów. Termin mikroorganizmy jest związany z niewielkimi rozmiarami wymienionych powyżej organizmów i odpowiada terminowi Protista. Wirusy to niekomórkowe cząstki, różniące się od wszystkich żywych organizmów brakiem zdolności do samoodtworzenia się i mogące namnażać się tylko w żywych komórkach.

1.2. Prokaryota i Eukaryota Podstawową, zdolną do życia, fizyczną jednostką żywych organizmów jest komórka. Jej istotne składniki są takie same we wszystkich organizmach; DNA, RNA, białka, lipidy i fosfolipidy są podstawowymi składnikami wszystkich komórek. Jednak szczegółowe badania składu i ultrastruktury różnych typów komórek wykazały znaczące różnice między bakteriami z jednej strony, a zwierzętami i roślinami (łącznie z ich

21

najmniejszymi przedstawicielami) z drugiej. Różnice te były tak znaczące, że obie te grupy rozdzielono i nazwano odpowiednio — Prokaryota i Eukaryota. Wśród Prokaryota należy doszukiwać się reliktów z najwcześniejszego okresu ewolucji biologicznej, brak jednak form pośrednich, wskazujących, że bezpośrednio z nich rozwinęły się Eukaryota, co stanowi największą nieciągłość w ewolucji żywych organizmów. Podział żywych organizmów na wymienione trzy główne grupy i różnice między królestwami Prokaryota i Eukaryota są pokazane schematycznie na rycinie 1.2. Eukariota mają jądro (gr. karyon), które zawiera większą część genomu umieszczonego w zespole chromosomów. Chromosomy są replikowane w procesie zwanym mitozą. W chromosomach DNA jest połączony z zasadowymi białkami zwanymi histonami. W komórce eukariotycznej znajdują się też organelle, takie jak mitochondria i (w roślinach) chloroplasty, które zawierają małą część genomu w formie koliście zamkniętych cząsteczek DNA. Rybosomy eukariotyczne są stosunkowo duże (80S). Prokariota nie mają wyodrębnionego jądra otoczonego błoną. DNA występuje w cytoplazmie jako koliście zamknięta cząsteczka. Ten pojedynczy chromosom zawiera wszystkie informacje niezbędne do odtworzenia komórki. Ponadto w komórce może występować 22

jedna lub więcej małych, kolistych cząsteczek DNA, zwanych plazmidami; te jednak nie są niezbędne. Komórka prokariotyczna nie zawiera wydzielonych organelli błonowych. Każdy podział wnętrza komórki na przedziały (kompartmentacja) jest mniej wyraźny niż u eukariotów. Rybosomy prokariotyczne są stosunkowo małe (70S). Właściwości prokariotycznych rybosomów i enzymów biorących udział w syntezie białek, jak i budowa ścian bakteryjnych, są podstawą selektywnego działania szeregu antybiotyków. Dalsze różnice zostaną omówione w rozdziale 2. Prokariota są stosunkowo słabo zróżnicowane morfologicznie. Można wyróżnić jedynie kilka podstawowych kształtów, będących pochodnymi kuli i prostych bądź zakrzywionych cylindrów. Małemu zróżnicowaniu kształtów towarzyszy zadziwiająca różnorodność i zmienność właściwości metabolicznych. Podczas gdy wszystkie rośliny i zwierzęta potrzebują tlenu, istnieją grupy prokariotów, które mogą żyć beztlenowo (w braku O2) i potrafią uzyskiwać energię potrzebną do wzrostu w drodze fermentacji lub oddychania beztlenowego. Inne grupy są zdolne do wykorzystania energii słonecznej i mogą syntetyzować swoją materię komórkową bądź ze związków organicznych, bądź z dwutlenku węgla. Pewne grupy bakterii mogą otrzymywać energię z utleniania związków nieorganiczych lub metali. Szeroko jest rozpowszechniona wśród bakterii zdolność wiązania azotu atmosferycznego. Ta fizjologiczna różnorodność i plastyczność, zdolność do szybkiego wzrostu i syntezy, a także prosta budowa komórki i nieskomplikowana struktura jej materiału genetycznego spowodowały, że prokariota od ponad trzydziestu lat są ulubionym obiektem badań biologii ogólnej. Fakt ten, a także brak miejsca uzasadniają, dlaczego książka ta będzie zajmować się głównie biologią bakterii.

1.3. Ewolucja organizmów Tak długo, jak niewiele wiedziano o zróżnicowaniu bakterii i praktycznie nic o molekularnej strukturze ich składników, bezcelowe wydawało się rozpowszechnianie rozważań Haeckla na temat prokariotów. Ewolucja mikroorganizmów przez długi czas była przedmiotem spekulacji i kontrowersji. Dopiero gdy C. Woese wyizolował i zsekwencjonował rybosomowy RNA dużej liczby bakterii, można było wyrysować ich drzewo filogenetyczne. Dzięki zbadaniu stopnia pokrewieństwa sekwencji zasad

23

z różnych bakterii stwierdzono, że wszystkie prokariota mogły powstać ze wspólnego przodka (czasem określanego jako progenota) i że rozdzieliły się bardzo wcześnie na dwie duże grupy: Archaea i Bacteria (rozdz. 3 i 17.4). Obecnie można określić czas, kiedy zaszły pewne wydarzenia z bardzo wczesnego okresu ewolucji biologicznej, które doprowadziły do powstania poszczególnych grup bakterii z progenoty. Bardzo wcześnie musiało dojść do rozwoju podstawowych szlaków metabolicznych. Można to wywnioskować ze stosunku 13 C/ 12 C w związkach organicznych (C o r g ), które zostały złożone w osadach ponad 3,8 miliarda lat temu. Skład izotopowy tych związków organicznych (znanych też jako kerogen) jest taki sam jak współczesnych bakterii autotroficznych i roślin. Można więc wywnioskować, że C org osadzony we wczesnej erze archaicznej musi pochodzić z bakterii autotroficznych. Na podstawie danych izotopowych nie można

24

jednak określić, czy tymi wczesnymi producentami biomasy były bakterie fototroficzne, czy też beztlenowo oddychające bakterie metanowe (rozdz. 9.4). Stromatolity, biogenne skały osadowe, zawierają najstarsze ślady aktywności biologicznej w historii Ziemi. Ich powstanie musi być związane z obecnością organizmów autotroficznych. Fotosyntetyczne sinice istniały już około 2,9 miliarda lat temu. Ich działalność dała początek ewolucji tlenu. Jednak ten wczesny tlen był wychwytywany przez zredukowane związki żelaza, które tym samym utleniały się do nierozpuszczalnych tlenków żelaza. Te z kolei odkładały się wokół brzegów oceanów jako tzw. wstęgowe rudy żelaza (ang. banded iron formations, w skrócie — BIFs) (ryc. 1.3). Uważa się, że żyjące wtedy prokariota były potomstwem najstarszych organizmów i że ogólny metabolizm komórkowy rozwinął się na poziomie prokariotycznym. Ewolucja organizmów eukariotycznych mogła zajść dopiero wówczas, gdy dzięki sinicom powstała stabilna atmosfera zawierająca tlen.

1.4. Udział mikroorganizmów w obiegu podstawowych pierwiastków w przyrodzie Żywe organizmy można podzielić na trzy grupy na podstawie roli, jaką pełnią w gospodarce przyrody. Rośliny wykorzystują energię słoneczną do wytwarzania materii organicznej z dwutlenku węgla. Nazywane są one producentami. Zwierzęta zaś są konsumentami; wykorzystują większą część pierwotnej biomasy do syntezy substancji budujących ich własne ciała. Ostatecznie zarówno rośliny, jak i zwierzęta podlegają procesom degradacji, w których materia organiczna zostaje z powrotem przekształcona w związki nieorganiczne. Głównymi uczestnikami tego procesu, zwanego mineralizacją, są bakterie i grzyby. Działają one jako czynniki degradacyjne w gospodarce przyrody. Biopierwiastki podlegają więc procesom cyklicznym. Przedstawiamy tu krótko obieg węgla, azotu, fosforu i siarki. Obieg węgla. Udział mikroorganizmów w obiegu węgla to najważniejsza rola, jaką odgrywają one w podtrzymywaniu życia na Ziemi. Dokonują one mineralizacji związków organicznych węgla wytwarzanych w czasie fotosyntezy i tym samym utrzymują równowagę w obiegu tego pierwiastka

25

(rye. 1.4). Powietrze atmosferyczne zawiera niewiele ponad 0,03% dwutlenku węgła (12 μmol/l). Aktywność fotosyntetyczna roślin zielonych jest tak wielka, że cały dwutlenek węgla zawarty w powietrzu zostałby wyczerpany w ciągu 20 lat. Jest to dość krótki okres w skali życia ludzkiego; szacuje się, że źródła energii i węgla na Ziemi powinny wystarczyć na następne 1000-3000 lat. Zapas dwutlenku węgla znajdujący się w samych oceanach starczyłby na 2000 lat. Gdyby niższe zwierzęta i mikroorganizmy stale nie uzupełniały rezerw CO2 przez mineralizację związków organicznych, rośliny zielone 26

musiałyby wkrótce zaprzestać jego wiązania. Tak więc bakterie i grzyby w glebie odgrywają nie mniej ważną rolę w gospodarowaniu materią na Ziemi, niż rośliny zielone. Wzajemna zależność wszystkich form życia na naszej planecie jest najlepiej widoczna właśnie w obiegu węgla. Szczególną właściwością procesu mineralizacji jest to, że mała część zmineralizowanego węgla (1-1,5%) dociera do atmosfery nie w postaci dwutlenku węgla, lecz jako metan. Gaz ten jest wytwarzany z materii organicznej w środowiskach, w których brakuje tlenu atmosferycznego (tundra, pola ryżowe, żwacz przeżuwaczy). Może on być utleniany przez rodniki OH z atmosfery, do tlenku węgla (CO), a potem do CO 2 . Wytwarzanie metanu, jak i innych gazów śladowych (H 2 , CO, N 2 O, NO 2 ), jest spowodowane głównie przez bakterie i archeony. Na pierwszy rzut oka wydaje się, że oceany stanowią ogromny rezerwuar dwutlenku węgla. Jednak należy wziąć pod uwagę, że szybkość wymiany między dwutlenkiem węgla atmosferycznym i zawartym w morzu — z którego ponad 90% istnieje jako HCO 3 - — jest bardzo mała. W ciągu roku zaledwie jedna dziesiąta CO 2 z powietrza jest wymieniana z dwutlenkiem węgla z morza. Ponadto w takiej wymianie gazowej bierze udział jedynie bardzo płytka warstwa powierzchniowa. Duże ilości CO 2 obecnego w głębszych warstwach docierają do powierzchni tylko w kilku miejscach, gdzie występują prądy wstępujące (Afryka Zachodnia, Chile). Wzbogacają one atmosferę w CO 2 (do 0,05%). W ostatnich latach stwierdzono jednak, że zawartość CO 2 w atmosferze stale rośnie, co jest spowodowane głównie spalaniem ropy naftowej i węgla. W 1976 roku zużycie ropy naftowej na całej ziemi wyniosło 3,2 χ 109 ton, z czego większość została spalona. Wzrost ilości CO 2 atmosferycznego wynika też prawdopodobnie z obniżenia wiązania CO, w procesie fotosyntezy, a także z degradacji gleby. Należy jednak podkreślić, że oceany stanowią potężny system buforujący, który reguluje zawartość CO 2 w atmosferze.

W biochemicznych procesach fotosyntetycznego wiązania CO2 przez rośliny powstają przede wszystkim cukry i związki pokrewne. Większość dwutlenku węgla związanego w postaci wielocukrów gromadzi się przejściowo w drzewach i trawach. Prawie 60% CO2 związanego przez rośliny lądowe wchodzi w skład drewna. Drewno składa się w 75% z polisacharydów (celuloza, hemiceluloza, skrobia, pektyny i arabinogalaktan) i tylko nieco powyżej 20% — z ligniny i lignanów, natomiast zawartość białka jest bardzo mała (1%). W trawach i innych roślinach zielnych zawartość wielocukrów jest nawet większa. Fakt, że polisacharydy są głównym produktem asymilacji roślin, wskazuje na znaczenie cukrów jako substancji odżywczych dla wszystkich organizmów, które zależą od organicznych składników pokarmowych. Glukoza i inne cukry w formie polimerów stanowią więc nie tylko główną masę substancji organicznej ulegającej procesowi mineralizacji w przyrodzie, ale także, jako monomery, stanowią główne składniki odżywcze dla większości mikroorganizmów heterotroficznych. 27

Obieg azotu. Głównym związkiem w obiegu azotu jest amoniak (ryc. 1.5). Jest to produkt końcowy degradacji białek i aminokwasów, które trafiają do ziemi w postaci martwych zwierząt i szczątków roślinnych. W dobrze przewietrzanych glebach amoniak podlega nitryfikacji. Bakterie z rodzaju Nitrosomonas i Nitrobacter utleniają amoniak do azotynów i azotanów. Zarówno amoniak, jak i azotany mogą być wykorzystane i przyswojone przez rośliny jako źródło azotu. W warunkach beztlenowych w obecności azotanu zachodzi denitryfikacja. Pewne bakterie mogą wykorzystywać azotany jako akceptory wodoru, a więc mogą oddychać wykorzystując NO3- zamiast O2 („oddychanie azotanowe"). Denitryfikacja powoduje straty azotu w glebie. Inne bakterie są zdolne do wiązania wolnego azotu. Niektóre bakterie wiążące wolny azot są organizmami wolnożyjącymi w glebie, podczas gdy inne żyją w symbiozie z roślinami wyższymi. Tak więc w obiegu azotu uczestniczą, obok zwierząt i roślin, przede wszystkim bakterie. Obieg fosforu. Fosfor występuje w biosferze prawie wyłącznie w postaci fosforanów. W żywych organizmach kwas fosforowy jest włączany jako

28

ester fosforanowy. Estry te po śmierci organizmu są łatwo hydrolizowane, co prowadzi do uwolnienia jonów fosforanowych. Rośliny asymilują fosfor z gleby w postaci jonów kwasu fosforowego (H3PO4). Stężenie tych jonów jest często bardzo małe. Ograniczenie wzrostu organizmów jest przede wszystkim spowodowane akumulacją nierozpuszczalnych związków fosforanowych, takich jak apatyt, lub kompleksów metali ciężkich, nie zaś całkowitym brakiem fosforu w glebie. Rezerwy fosforanów są duże i jest nieprawdopodobne, by w najbliższej przyszłości miały ograniczyć produkcję rolniczą; jednak fosforany muszą być przeprowadzone do form rozpuszczalnych. Fosforany z nawozów często dostają się do potoków i jezior. Ponieważ stężenie żelaza, wapnia i aluminium w takich wodach jest raczej małe, fosforany pozostają w formie rozpuszczalnej, co prowadzi do eutrofizacji tych wód, a zwłaszcza sprzyja rozwojowi sinic wiążących azot. W glebach natomiast, fosforany są często szybko wytrącane w postaci nierozpuszczalnych soli.

29

Obieg siarki. Siarka występuje w żywych komórkach głównie w postaci grup sulfhydrylowych w aminokwasach zawierających siarkę (metionina, cysteina, homocysteina). Stanowi ona około 1% suchej masy. Grupy sulfhydrylowe są odłączane przez desulfurazy w czasie beztlenowej degradacji materii organicznej; tworzenie siarkowodoru w czasie beztlenowej mineralizacji jest określane jako desulfurylacja. Większa część siarkowodoru występującego w przyrodzie jest jednak wytwarzana w czasie dysymilacyjnej redukcji siarczanów przez bakterie redukujące siarczany (ryc. 9.4). Beztlenowe bakterie fototroficzne (Chromatiaceae: rozdz. 12) mogą utleniać siarkowodór, wytworzony w beztlenowych osadach dennych, do elementarnej siarki i siarczanów. Jeśli siarkowodór dotrze do miejsc zawierających tlen, może zostać utleniony do siarczanów, bądź abiotycznie, bądź przez tlenowe bakterie siarkowe (rozdz. 12.1, 12.1.2). Siarka, niezbędna roślinom i mikroorganizmom do syntezy aminokwasów siarkowych, jest otrzymywana w wyniku asymilacyjnej redukcji siarczanów. Zwierzęta natomiast są uzależnione od pobierania związków zawierających zredukowaną siarkę w pożywieniu (ryc. 1.6). Ograniczenia produkcji biomasy przez źródła fosforu i azotu. Czynnikami, które ograniczają wzrost roślin, a więc i produkcję biomasy, są fosfor i azot. Limitują one wzrost zarówno na lądzie, jak i w morzach. Znane są dokładne dane liczbowe określające te zależności w środowiskach morskich. Tabela 1.1 pokazuje, ile biomasy (wyrażonej w gramach suchej masy) można otrzymać z pierwiastków występujących w 1 m3 wody

30

morskiej: 28 g węgla może dać 60-100 g biomasy; 0,3 g azotu może dać 6 g, a 0,03 g fosforu — tylko 5 g. Wyliczenia te wskazują, że produkcja biomasy jest ostatecznie ograniczana przez fosforany. W wodzie morskiej więc nawet organizmy wiążące wolny azot, jak np. sinice, nie mają przewagi selekcyjnej.

1.5. Mikroorganizmy w służbie człowieka Laik ocenia praktyczne znaczenie mikroorganizmów przede wszystkim na podstawie szkód, jakie wyrządzają one człowiekowi, zwierzętom i roślinom. Tymi chorobotwórczymi lub inaczej patogennymi mikroorganizmami zajmuje się mikrobiologia lekarska, weterynaryjna i fitopatologia. Szkodliwe działanie mikroorganizmów ujawnia się także w wielu dziedzinach gospodarki człowieka i w przyrodzie, przede wszystkim jednak spełniają one pożyteczną rolę. Już od dawna stosuje się je w gospodarstwie domowym i w przemyśle, gdzie są nie do zastąpienia. Ich zastosowania rozciągają się od przetwórstwa podstawowych produktów rolniczych do katalizy skomplikowanych reakcji chemicznych. Klasyczne procesy mikrobiologiczne. Wykorzystywanie od najdawniejszych czasów drożdży do produkcji wina i piwa oraz wypieku chleba, bakterii mlekowych w przetwórstwie mlecznym oraz bakterii kwasu octowego do wytwarzania octu świadczy o tym, że mikroorganizmy są najdawniej udomowionymi organizmami. W Japonii i Indonezji ziarna soi są preparowane przy użyciu grzybów pleśniowych, drożdży i bakterii mlekowych. Jednak, z wyjątkiem produkcji alkoholu, dopiero od około sześćdziesięciu lat mikroorganizmy są stosowane na skalę przemysłową. W czasie pierwszej wojny światowej odpowiednio kierowaną fermentację drożdży wykorzystywano do produkcji glicerolu. Za pomocą bakterii mlekowych i grzyba Aspergillus niger uzyskuje się odpowiednio, kwas mlekowy i kwas cytrynowy, znajdujące zastosowanie w przemyśle spożywczym. Z tanich odpadków zawierających węglowodany można uzyskać aceton, butanol, 2-propanol, butanediol i inne podstawowe związki chemiczne w procesach fermentacji przeprowadzanych przez bakterie z rodzaju Clostridium i Bacillus. Wytwarzanie antybiotyków. Odkrycie antybiotyków zapoczątkowało nowy okres w terapii medycznej i przemyśle farmaceutycznym. Penicylina i inne antybiotyki wytwarzane przez grzyby, promieniowce i inne bakterie 31

stały się najpotężniejszym narzędziem w walce z infekcjami bakteryjnymi. Poszukiwania nowych antybiotyków wciąż trwają i przynoszą pozytywne wyniki. Niewykluczone, że za pomocą antybiotyków możliwe również będzie, na razie teoretycznie, zwalczanie chorób wirusowych i nowotworów wywoływanych przez wirusy onkogenne. Nowe procesy mikrobiologiczne. Do klasycznych, wymienionych powyżej fermentacji, dochodzą nowsze reakcje i procesy mikrobiologiczne. Z grzybów można otrzymać karotenoidy i steroidy. Od czasu wykrycia, że Corynebacterium glutamicum w obecności cukru i soli amonowych wytwarza znaczne ilości kwasu glutaminowego, uzyskano różne mutanty tego gatunku i tak ulepszono procesy mikrobiologiczne, że można na skalę przemysłową otrzymywać różne aminokwasy, nukleotydy i inne związki. Mikroorganizmy mogą być też wykorzystywane do katalizy pewnych wieloetapowych reakcji syntezy, gdyż działają one bardziej swoiście i wydajnie, niż to się dzieje w procesach chemicznych. Enzymy otrzymywane z mikroorganizmów stosuje się w przemyśle, np. amylazę do hydrolizy skrobi, proteinazy do wyprawiania skór, pektynazy do klarowania soków owocowych itp. Monopolistyczna pozycja mikroorganizmów. Należy podkreślić, że pewne surowce występujące w przyrodzie w dużych ilościach, takie jak ropa naftowa, gaz ziemny lub celuloza, mogą być wykorzystane wyłącznie przez mikroorganizmy, które przekształcają je bądź we własną biomasę, bądź w produkty pośrednie wydzielane przez komórki. Mikroorganizmy mają więc monopol na „uszlachetnianie" ropy naftowej, gazu ziemnego i węgla. Wykorzystywanie metod mikrobiologicznych do tego celu dopiero się jednak zaczyna. Inżynieria genetyczna. Wyjaśnienie mechanizmów przekazywania genów u bakterii i udziału w tym procesie elementów pozachromosomowych otworzyło możliwość przekazywania obcego DNA do bakterii. Dzięki inżynierii genetycznej można włączyć małe kawałki nośnika informacji genetycznej np. z człowieka do bakterii, która może następnie syntetyzować białka kodowane przez obcy DNA. W ten sposób wykorzystując bakterie można by wytwarzać hormony, antygeny, przeciwciała i inne białka. Poza tym, dzięki inżynierii genetycznej można wprowadzić do roślin użytkowych pewne cechy, jak oporność, np. na owady (stonka ziemniaczana)

32

lub zakażenia grzybicze. Próbuje się też przenieść do roślin wyższych zdolność do wiązania azotu atmosferycznego. Wreszcie inżynieria genetyczna pozwala na wytwarzanie sond DNA, które mogą być wykorzystane do rozpoznawania uszkodzonych odcinków DNA i RNA. Tak więc inżynieria genetyczna, z bakteriami jako narzędziem, otwiera nową erę ewolucji biologicznej. Zastosowania w naukach podstawowych. Trudno byłoby nawet wyliczyć wszystkie procesy i produkty stosowane w mikrobiologii przemysłowej i dociekać, jakie są możliwości ich dalszego wykorzystania. Powiązania między badaniami podstawowymi i ich zastosowaniem są bardzo ścisłe w mikrobiologii, jak i w innych naukach: „II n'y a pas des sciences appliquees... mais ii y a des applications de la science" (Pasteur) *.

1.6. Właściwości ogólne mikroorganizmów Cechą charakterystyczną mikroorganizmów, jak sama nazwa wskazuje, są ich mikroskopijne rozmiary. Cecha ta zdecydowała nie tylko o wyodrębnieniu tej grupy z królestwa roślin i zwierząt, ale też o specyficzności ich budowy, aktywności, różnorodności i zmienności ich metabolizmu, rozmieszczeniu ekologicznym oraz metodach badania. Jednostki miary i stosunki powierzchnia-objętośc. Średnica większości bakterii nie przekracza zwykle jednej tysięcznej milimetra; dlatego dla mikrobiologów jednostką miary jest mikrometr (mikron); 1 μm= 10 - 3 mm. Wymiary odnoszące się do ultrastruktury podaje się w nanometrach: 1 nm= 10 - 3 μm = 10 -6 mm. Wymiary małych sinic, drożdży i pierwotniaków zwykle nie przekraczają 10 μm. U mikroorganizmów stosunek powierzchni do 3 objętości jest bardzo duży (podział sześcianu o objętości 1 cm na sześciany o objętości 3 1 μm daje 1012 takich sześcianów, a suma ich powierzchni jest 10000 razy większa niż powierzchnia sześcianu wyjściowego). Objętość komórki bakteryjnej wynosi średnio 1 μm3.

Duża wartość stosunku powierzchni komórki bakteryjnej do jej objętości pozwala na rozległe oddziaływania ze środowiskiem i jest przyczyną wyjątkowej intensywności metabolizmu niektórych bakterii. „Reguła powierzchni" Rubnera (1893) mówi, że przemiana kaloryczna zwierząt w spoczynku nie jest proporcjonalna do ich masy, lecz do ich powierzchni. Jeśli regułę tę zastosujemy do tkanek i małych komórek, to

należałoby oczekiwać, że szybkość ich metabolizmu będzie ogromna. W tabeli 1.2 pokazano oczekiwane zależności między szybkością metabolizmu a wielkością tkanek i komórek, mierzone ilością zużytego tlenu. Podobne zależności widać dla szybkości wzrostu mikroorganizmów. Czytelnikowi zainteresowanemu problemem wyżywienia wciąż wzrastającej populacji ludzi może wyda się ciekawy fakt, że krowa ważąca 500 kg wytwarza w ciągu doby 0,5 kg białka, podczas gdy 500 kg drożdży w tym samym czasie produkuje 50000 kg białka. Różnorodność metaboliczna. Rośliny wyższe i zwierzęta mają raczej ustabilizowany system enzymatyczny; może on wprawdzie ulegać zmianom w czasie rozwoju osobniczego, ale pod wpływem środowiska zmienia się tylko nieznacznie. Plastyczność metaboliczna mikroorganizmów jest natomiast znacznie większa. Duża zdolność adaptacyjna bakterii jest koniecznością wynikającą z ich małych rozmiarów: komórka ziarniaka może pomieścić tylko kilkaset tysięcy cząsteczek białka. Brak w niej miejsca na enzymy, które nie są w danym momencie wykorzystywane. Pewne enzymy kataboliczne są więc wytwarzane tylko wtedy, gdy obecny jest w środowisku odpowiedni substrat. W pewnych warunkach enzymy indukowane mogą stanowić do 10% zawartości białka w komórce. Mechanizmy regulacyjne odgrywają więc znacznie większą rolę w komórkach bakteryjnych i łatwiej jest je badać niż w innych organizmach.

34

Rozprzestrzenienie mikroorganizmów. Małe rozmiary mikroorganizmów mają też znaczenie ekologiczne. Zasięg roślin i zwierząt był ograniczony do jednego z kontynentów, dopóki człowiek nie przyczynił się do ich rozprzestrzenienia. Bakterie i sinice występują natomiast wszędzie. Można je znaleźć na obszarach polarnych, w wodach i wysokich warstwach atmosfery. Rozmieszczenie gatunków jest w tych wszystkich środowiskach mniej więcej takie samo jak w glebie. Ze względu na mały ciężar, mikroorganizmy mogą być łatwo przenoszone przez prądy powietrzne. W warunkach naturalnych żadne środowisko nie jest więc wolne od drobnoustrojów. Wykorzystuje się to przy izolacji poszczególnych bakterii stosując hodowle wzbogacające. Zwykle już w 1 g gleby ogrodowej można znaleźć bakterie, które zdolne są do rozkładu każdego naturalnego substratu. Mikroorganizmy są wszędzie, a o tym, jaka ich grupa rozwinie się w danym środowisku, decydują jego cechy. Stosując warunki selekcyjne i hodowle wzbogacające można wyizolować z małej próbki gleby, mułu czy jakiegokolwiek innego materiału naturalnego większość znanych mikroorganizmów i otrzymać je w postaci czystej kultury. Badania ilościowe i postęp w badaniach genetycznych. Metody hodowania mikroorganizmów w laboratoriach rozwinęły się w dziewiętnastym wieku dzięki O. Brefeldowi oraz R. Kochowi i jego uczniom. Wprowadzenie klarownych pożywek zestalonych żelatyną lub agarem umożliwiło izolację pojedynczych komórek, obserwację ich wzrostu w kolonie i otrzymanie czystych kultur. Standaryzacja techniki przygotowywania podłoży i ich sterylizacji spowodowała szybki rozwój mikrobiologii lekarskiej. Chociaż już Koch opisał niektóre ilościowe metody badań, to ich znaczenie ujawniło się szczególnie wyraźnie dopiero w ciągu ostatnich pięćdziesięciu lat. Małe rozmiary mikroorganizmów pozwalają na badanie populacji 108-1010 komórek znajdujących się w jednej probówce lub na jednej płytce Petriego, co umożliwia badanie tak rzadkich zjawisk jak mutacje i przenoszenie cech genetycznych przy zastosowaniu prostej aparatury, nie wymagającej wiele miejsca. Ogromny postęp badań biochemicznych i genetycznych wynika więc, przynajmniej częściowo, z łatwości, z jaką można badać bakterie.

KOMÓRKA I JEJ BUDOWA

Do niedawna nasza wiedza o szczegółowej strukturze komórki zależała całkowicie od bezpośredniej obserwacji w mikroskopie świetlnym. Udoskonalenie budowy mikroskopów i techniki mikroskopowania umożliwiło postęp w badaniach nad mikromorfologią komórki i jej składników. Rozwój mikroskopii świetlnej, zastosowanie promieni ultrafioletowych i wprowadzenie mikroskopii elektronowej ogromnie powiększyło granice rozdzielczości. Zastosowanie ciemnego pola i kontrastu fazowego w mikroskopii bardzo ułatwiło obserwację żywych komórek. Badania mikroskopowe, szczególnie przy użyciu mikroskopu elektronowego, mimo trudnych metod preparowania materiału biologicznego, są do dziś powszechnie stosowane. Mogą one zostać uzupełnione mniej bezpośrednimi metodami fizycznymi i chemicznymi, które umożliwiają izolację i poznanie właściwości składników komórkowych na poziomie molekularnym. Różnicowe wirowanie homogenatów komórkowych pozwoliło na wyizolowanie i zbadanie pod względem biochemicznym frakcji komórkowych i organelli, a połączenie metod optycznych i biochemicznych umożliwiło szybkie i coraz bardziej szczegółowe wyjaśnienie ich funkcji i struktury. Dzięki tego typu badaniom stwierdzono, że w budowie komórki eukariotycznej i prokariotycznej występują znaczne różnice. Wszystkie komórki składają się z cytoplazmy i materiału jądrowego. Są one na zewnątrz otoczone błoną cytoplazmatyczną. Taki protoplast może być otoczony ścianą komórkową, która pełni przede wszystkim funkcje mechaniczne, jak to jest u roślin i większości bakterii.

36

Poniżej został zamieszczony krótki opis podstawowych właściwości komórek eukariotycznych (eucytów) i komórek prokariotycznych (protocytów). Jako przykład eucytu przedstawiono zarodkową komórkę roślinną (ryc. 2.1).

2.1. Komórka eukariotyczna (eucyt) Jądro. Budowa jądra i sposób jego podziału to podstawowe i najłatwiej dostrzegalne cechy pozwalające odróżnić komórkę eukariotyczna od prokariotycznej (ryc. 2.2). Jądro będące w interfazie otacza błona jądrowa zbudowana z dwuwarstwowej błony lipidowej, w której występują pory. Na DNA jądrowy (genom) składa się pewna liczba podjednostek zwanych chromosomami, które stają się widoczne wyłącznie w czasie podziału jądra. Podział jądra następuje w procesie mitozy (ryc. 2.2). Mitoza ma dwa zadania: 1) dokładną replikację materiału genetycznego, który staje się widoczny w czasie rozdziału zduplikowanych chromosomów, i 2) równe rozdzielenie kompletu chromosomów do jąder potomnych. Nie udało się jeszcze w pełni wyjaśnić, jak dochodzi do podwojenia liczby chromosomów, chociaż proces replikacji DNA u organizmów prokariotycznych został dość dobrze poznany. Podział chromosomów i ich rozdział 37

znane są od dawna; można je obserwować w mikroskopie optycznym. Chociaż w mikroskopie świetlnym jądro interfazowe nie wykazuje żadnego zróżnicowania strukturalnego, to w czasie podziału zawarte w nim chromosomy ulegają skróceniu i stają się widoczne. Ustawiają się one w jednej płaszczyźnie równikowej, przy czym pary zduplikowanych chromosomów — równolegle do siebie. Następnie, dzięki kurczeniu się włókienek wrzeciona kariokinetycznego, zduplikowane pary chromosomów zostają rozdzielone. W końcu, wrzeciono zanika, chromosomy stają się niewidoczne, a jądra potomne znów otaczają się błoną jądrową. U wszystkich wyższych roślin i zwierząt w czasie rozmnażania płciowego dochodzi do rearanżacji jądrowych. Gamety (komórki rozrodcze) i ich jądra podczas zapłodnienia zlewają się, dając zygotę. Jądra

38

męskie i żeńskie wnoszą taką samą liczbę chromosomów (n). Jądro zygoty ma więc dwa zestawy chromosomów (i genomów) (2n). Tak więc gamety są haploidalne (mają jeden komplet chromosomów), a wszystkie komórki somatyczne są diploidalne (mają dwa komplety). W procesie rozmnażania płciowego musi nastąpić redukcja normalnej liczby chromosomów (2n) do połowy (n). Proces prowadzący do redukcji liczby chromosomów nazywa się mejozą lub podziałem redukcyjnym (ryc. 2.3). Mejoza jest podstawowym procesem u wszystkich organizmów rozmnażających się płciowo. Spełnia ona dwa zadania: prowadzi do rekombinacji ojcowskich i matczynych materiałów genetycznych oraz do redukcji liczby chromosomów. Mejozę rozpoczyna ułożenie się chromosomów w pary. Każdy chromosom łączy się z homologicznym chromosomem drugiego rodzica. W tej fazie może nastąpić ich pękanie i wymiana odcinków między chromosomami homologicznymi na skutek crossing-over. Po parowaniu następuje dwukrotne rozdzielenie (tworzenie wrzeciona) sparowanych i podzielonych chromosomów. W wyniku tego powstają komórki z haploidalnymi jądrami. W czasie mejozy zachodzi więc nie tylko przemieszanie zestawu chromosomów pochodzących z gamety męskiej i żeńskiej, ale i możliwość wymiany odcinków między chromosomami homologicznymi. Oba te procesy prowadzą do rekombinacji materiału genetycznego. U wielu roślin niższych, włącznie z glonami, i u pierwotniaków mejoza zachodzi natychmiast po wytworzeniu zygoty, a więc powstałe organizmy są haploidami. U roślin z przemianą pokoleń, takich jak mchy i paprotniki, pokolenia haploidalne i diploidalne występują na przemian. Chromosomy eukariotyczne składają się z łańcuchów DNA połączonych z licznymi białkami, z których część to białka zasadowe, zwane histonami. Histony i DNA są połączone w wysoce uporządkowany sposób, tworząc nukleosomy, które są uważane za podjednostki chromosomów. W jądrze na matrycy chromosomowego DNA syntetyzowany jest mRNA, który jest następnie transportowany do cytoplazmy przez pory w błonie jądrowej. W czasie interfazy w środku jądra widać jąderko. Zawiera ono informację dla rybosomowego RNA (rRNA) i prawdopodobnie również dla transportującego RNA (tRNA). Zarówno rRNA, jak i tRNA są syntetyzowane w jąderku i następnie przenoszone do cytoplazmy. Komórki embrionalne i komórki jajowe zawierają liczne jąderka.

39

W jądrze eukariotycznym jest zawarta najważniejsza dla komórki część informacji genetycznej. Pewną część informacji koduje też DNA znajdujący się w mitochondriach i chloroplastach. Cytoplazma. Protoplast jest otoczony błoną cytoplazmatyczną. Cytoplazmę eucytu charakteryzuje podział na liczne wydzielone przedziały (kompartmentacja), dzięki wpukleniom błony cytoplazmatycznej oraz tworzeniu pęcherzyków i cystern. Eukariotyczna cytoplazma zawiera dodatkowo mitochondria i (u roślin) chloroplasty, które są otoczone błonami. Błona cytoplazmatyczną przechodzi w postaci retikulum endoplazmatycznego do wnętrza komórki. Część retikulum tworzy również błonę jądrową, która otacza jądro. Liczne pory w błonie jądrowej umożliwiają przejście kwasów nukleinowych, białek i metabolitów między jądrem i cytoplazmą. Część błon retikulum endoplazmatycznego jest pokryta rybosomami. Jest to tzw. retikulum endoplazmatyczne szorstkie. Rybosomy są miejscem syntezy białek. Zarówno rybosomy przyłączone do retikulum endoplazmatycznego, jak i występujące swobodnie w cytoplazmie eucytu są typu 80S. Komórki zwierzęce są zaopatrzone w specjalne organelle o budowie błonowej, zwane aparatem Golgiego. Podobne organelle w komórkach roślinnych zwane są diktiosomami. Składają się one ze stosów spłaszczonych pęcherzyków, tzw. cystern. Zarówno aparat Golgiego, jak i diktiosomy pełnią ważną funkcję wydzielniczą. Wydzielają one głównie enzymy, które są syntetyzowane i magazynowane w cysternach. Taki pęcherzyk może się oderwać, przesunąć ku błonie cytoplazmatycznej i po połączeniu z nią opróżnić swoją zawartość na zewnątrz komórki. Proces ten zwany jest egzocytozą. Mitochondria i chloroplasty. Eucyt zawiera poza tym dwa rodzaje organelli o budowie błonowej: mitochondria i chloroplasty. W mitochondriach zachodzi proces oddychania. Są one tworami o zmiennych kształtach, bogatymi w lipidy. Składają się z dwóch błon — zewnętrznej i silnie pofałdowanej wewnętrznej (fałdy te zwane są grzebieniami). Błona wewnętrzna zawiera składniki łańcucha przenoszenia elektronów i syntazę ATP. Komórki glonów i roślin zielonych oprócz mitochondriów zawierają chloroplasty. W błonie wewnętrznej chloroplastów (tylakoidy) występują barwniki fotosyntetyczne i składniki systemu przenoszenia elektronów związanego z fotosyntezą.

40

Endocytoza. Inną cechą charakterystyczną eucytów jest zdolność do pobierania ze środowiska pokarmów zarówno w postaci płynnej, jak i stałej. Pobieranie cząstek stałych, np. przez przez leukocyty we krwi lub przez ameby, zwane jest fagocytozą. Pobieranie płynów to pinocytoza. Pobieranie obu rodzajów materiału zewnątrzkomórkowego zwane jest natomiast endocytozą. Zdolność organizmów eukariotycznych do pobierania cząstek stałych, w tym żywych komórek, ma fundamentalne znaczenie biologiczne, bowiem endocytoza może stać u podłoża pochodzenia endosymbiozy. Zwykle cząstka stała pobrana przez amebę w drodze fagocytozy zostaje przez nią całkowicie strawiona i przyswojona. Jednak w pewnych wypadkach taka endocytoza mogłaby prowadzić do wewnątrzkomórkowej symbiozy. Najlepiej znanym przykładem tego typu symbiozy są brodawki roślin motylkowych i bakterie z rodzaju Rhizobium (rozdz. 13). Tego typu endosymbioza jest szeroko rozpowszechniona wśród organizmów eukariotycznych (rozdz. 17.2.1). Zdolność komórek eukariotycznych do endocytozy przemawia za słusznością hipotezy o endosymbiotycznym pochodzeniu mitochondriów i chloroplastów. Prokariota nie są zdolne do endocytozy. Hipoteza o endosymbiotycznym pochodzeniu chloroplastów i mitochondriów. Organelle komórek eukariotycznych mają wiele ważnych cech komórek prokariotycznych. Zawierają koliście zamknięty DNA, rybosomy typu 70S, a w ich błonie występują składniki łańcucha przenoszenia elektronów (flawoproteiny, chinony, białka żelazo-siarkowe oraz cytochromy), które biorą udział w przekształcaniu energii w procesie oddychania i fotosyntezy. Hipoteza endosymbiotyczna zakłada, że mitochondria powstały z bezbarwnych bakterii tlenowych, a chloroplasty — z sinic, które wniknęły do prymitywnych komórek eukariotycznych. Następnie musiało dojść do silnej specjalizacji, przy czym organelle przejęły wytwarzanie ATP. Błona otaczająca eukariotyczny protoplast nie zawiera składników łańcucha przenoszenia elektronów. Z drugiej strony, wewnątrzkomórkowe organelle nie są autonomiczne, chociaż posiadają własny DNA. Znaczna część informacji niezbędnej do syntezy ich białek jest umiejscowiona w jądrze komórki. Dobrym przykładem jest tu kluczowy enzym w autotroficznym wiązaniu CO2 przez rośliny zielone — karboksylaza rybulozo-bisfosforanowa. Składa się ona z ośmiu podjednostek większych i z ośmiu mniejszych. Informacja na temat większych podjednostek jest zakodowana w DNA chloroplastów, natomiast 41

informacja o mniejszych — w DNA jądrowym. Organelle te nie są więc zdolne do namnażania się poza eucytem, toteż hipotezy o endosymbiotycznym pochodzeniu organelli nie można ani w pełni udowodnić, ani odrzucić. Organelle ruchu. Wici lub rzęski organizmów eukariotycznych mają jednakową budowę u glonów, pierwotniaków, a także w komórkach nabłonków urzęsionych i w plemnikach. W przekroju poprzecznym widać dziewięć peryferycznych fibryli podwójnych i dwie pojedyncze fibryle centralne (wzór: 9 + 2). Są one otoczone błoną cytoplazmatyczną. Wić jest zakotwiczona w zewnętrznej warstwie cytoplazmy, w ciałku bazalnym lub blefaroplaście, ten zaś powstaje z samoreplikującej się organelli — centrioli.

2.2. Komórka prokariotyczna (protocyt) W rozdziale tym zostaną szczegółowo opisane struktura i funkcje komórek prokariotycznych. Zanim jednak do tego dojdzie, należy wpierw podkreślić najważniejsze cechy różniące komórki prokariotyczne od eukariotycznych. Jak już wspomniano, komórki prokariotyczne są raczej małe. Większość z nich ma kształt cylindra o średnicy nie przekraczającej 1 μm i długości do 5 μm. Wiele bakterii z rodzaju Pseudomonas ma średnicę 0,4-0,7 μm i długość 2-3 μm, zaś średnica ziarniaków wynosi tylko 0,5 μm. Wśród bakterii niewiele jest dużych form. Do takich należą Chwmatium okenii,

42

Thiospirillum jenense, Achromatium itp. Te ogromne mikroorganizmy zwykle rosną powoli. Występowanie wewnętrznych przedziałów w komórce prokariotycznej jest znacznie mniej zaznaczone niż w eucytach (ryc. 2.4). Nie ma tu organelli podobnych do mitochondriów i chloroplastów, a DNA nie jest otoczony błoną jądrową. Obszar jądrowy, widoczny na ultracienkich skrawkach w mikroskopie elektronowym jako sieć bardzo cienkich nitek, graniczy bezpośrednio z cytoplazmą, która zawiera znaczne ilości rybosomów (ryc. 2.5). Błona cytoplazmatyczna wielu bakterii wpukla się do środka cytoplazmy (błona wewnątrzcytoplazmatyczna). U Prokaryota jest miejscem, w którym powstaje energia w procesie oddychania i fotosyntezy. Analogiczne funkcje u Eukaryota pełnią błony mitochondriów i chloroplastów.

Rybosomy prokariotyczne są mniejsze niż cytoplazmatyczne rybosomy eukariotyczne; mają stałą sedymentacji 70S. Cała informacja genetyczna protocytu jest zawarta w chromosomie bakteryjnym składającym się z jednej cząsteczki DNA. We wszystkich zbadanych dotychczas bakteriach cząsteczka ta, o długości 0,25 do 3 mm, jest koliście zamknięta. Nie ma tu histonów. U wielu bakterii stwierdzono

43

też występowanie DNA pozachromosomowego. Są to, w większości przypadków, małe, koliście zamknięte cząsteczki zwane plazmidami. Znaleziono również plazmidy liniowe. Informacje zakodowane na plazmidach nie wydają się niezbędne dla danego organizmu. Bakterie zwykle rozmnażają się przez podział poprzeczny. W komórce, po osiągnięciu przez nią odpowiednich rozmiarów, pojawia się przegroda, poczynając od obwodu komórki w stronę jej wnętrza. Komórki potomne mogą się rozdzielić. Jednak u wielu bakterii w określonych warunkach środowiskowych komórki po podziale pozostają połączone w charakterystycznych układach. Na przykład u bakterii kulistych, w zależności od płaszczyzny i liczby podziałów, można wyróżnić dwoinki (diplococcus), paciorki (Streptococcus), pakiety (Sαrcina) i grona (gronkowce). Bakterie cylindryczne również mogą występować w parach lub łańcuchach. Nieliczne organizmy prokariotyczne rozmnażają się przez pączkowanie lub wypustki cytoplazmatyczne. Podział komórki jest poprzedzony replikacją, czyli podwojeniem chromosomu bakteryjnego. Faza diploidalna jest więc ograniczona do bardzo krótkiego okresu w cyklu podziałowym komórki. Prokaryota są organizmami haploidalnymi. Komórki prokariotyczne, z bardzo nielicznymi wyjątkami, jak np. Mycoplasma sp., są pokryte ścianą komórkową. Zawiera ona szkielet zbudowany z peptydoglikanu (zwanego też mureiną), który jest heteropolimerem charakterystycznym dla organizmów prokariotycznych. Nie znajduje się go u Eukaryota. Wiele bakterii jest zdolnych do ruchu — mogą pływać lub poruszać się ruchem ślizgowym. Organem ruchu bakterii pływających są rzęski. Mają one znacznie prostszą budowę niż wici eukariotyczne i są zbudowane z jednego rodzaju włókna. Bakterie, poza nielicznymi wyjątkami, mają kształt kulisty, cylindryczny bądź wygiętego cylindra. Wyróżnia się więc wśród nich ziarniaki oraz proste i wygięte pałeczki (ryc. 2.6). Postać prostych pałeczek mają

44

np. przedstawiciele rodzajów Pseudomonas i Bacillus. Wygięte pałeczki określa się mianem przecinkowców (rodzaj Vibrio), a pałeczki śrubowate skręcone — mianem krętków i śrubowców. Kształty niektórych bakterii odbiegają od wyżej wymienionych. Komórki maczugowate, wykazujące tendencję do zmiany kształtów, spotyka się u rodzaju Corynebacterium i innych bakterii maczugowatych. U wielu gatunków z rodzaju Mycobacterium komórki tworzą rozgałęzienia. Promieniowce zaś, podobnie jak grzyby, tworzą „grzybnię", której nitki są jednak znacznie cieńsze. Ich średnica nie przekracza 1 μm, podczas gdy u grzybów wynosi ona ponad 5 μm. Skład komórki. Mokrą masę organizmów jednokomórkowych można określić po odwirowaniu ich z podłoża i przemyciu. Odwirowana masa zawiera 70-86% wody. Sucha masa stanowi więc 15-30% mokrej masy. Bakterie posiadające duże ilości materiałów zapasowych (lipidy, wielocukry, polifosforany lub siarka) mają większą zawartość procentową suchej masy. Na suchą masę bakterii składają się głównie polimery, w tym białka stanowią 50%, ściana komórkowa 10-20%, RNA 10-20%, DNA 3-4% i lipidy około 10%. Procentowa zawartość biopierwiastków wchodzących w skład bakterii wynosi: węgiel — 50%, tlen — 20, azot — 14, wodór — 8, fosfor — 3, siarka — 1, potas — 1, wapń — 0,5, magnez — 0,4, żelazo — 0,2%.

2.2.1. Bakteryjny nukleoid Małe rozmiary bakterii i obecność dwóch typów kwasów nukleinowych znacznie utrudniły badanie cytochemiczne bakteryjnego materiału jądrowego. Stosując klasyczne metody cytologiczne, dzięki rozwojowi techniki ultracienkich skrawków w połączeniu z mikroskopią elektronową, wykazano, że bakterie zawierają DNA, który nie jest rozproszony w cytoplazmie, lecz jest umiejscowiony w określonych rejonach i dzieli się przed każdym podziałem komórki. Struktura materiału jądrowego została wyjaśniona dzięki zastosowaniu mikroskopii elektronowej do badania ultracienkich skrawków komórek bakteryjnych. Dla optymalnego uwidocznienia ultrastruktury rejonu jądrowego ważne jest odpowiednie utrwalenie preparatu (przez zastosowanie czterotlenku osmu, octanu uranylu lub kwasu fosforowolframowego). Na ultracienkich skrawkach rejon jądra widać jako przejrzystą

45

strefę, wyraźnie odcinającą się od elektronogęstej cytoplazmy z silnie kontrastujacymi rybosomami. Przy dobrym utrwaleniu preparatu chromosom jest widoczny jako wysoce uporządkowane ciało włókniste. Na rycinie 2.7B przedstawiono schemat uporządkowanego chromosomu bakteryjnego. Autoradiografia. Cairns jako pierwszy wykazał, że materiał jądrowy bakterii składa się z DNA, który u Escherichia coli tworzy pojedynczą, koliście zamkniętą cząsteczkę o długości 1 mm. DNA jest jedynym składnikiem komórki zawierającym tyminę. Cairns hodował bakterie w obecności tymidyny znakowanej trytem. Tak wyznakowane komórki poddawał lizie na filtrze membranowym z udziałem lizozymu bądź siarczanu laurylu. Uwolniony materiał jądrowy można było uwidocznić za pomocą autoradiografii. Takie autoradiogramy (ryc. 2.8) dowodzą przekonująco, że bakteryjny DNA występuje w postaci kolistej, zamkniętej nici. Nić ta odpowiada grupie sprzężeń w sensie genetycznym, jest więc nazywana bakteryjnym chromosomem. Autoradiogramy pokazują też, w jaki sposób może przebiegać podział takiego chromosomu. Na rycinie 2.9 pokazano DNA bakteriofaga, przygotowany inną metodą. 46

Struktura DNA. Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) jest makrocząsteczką. Stosując kwaśną hydrolizę można go rozłożyć na trzy składniki występujące w równych ilościach molarnych: deoksyrybozę, kwas fosforowy i zasady. Cząsteczka DNA zawiera cztery różne zasady — dwie puryny (adeninę i guanine) i dwie pirymidyny (cytozynę i tyminę).

47

Jeśli DNA trawi się nukleazami (DNazą I z trzustki lub diesterazą z jadu węża), to zostają uwolnione nukleotydy 3' bądź 5'. Kwasy nukleinowe składają się z długich łańcuchów takich deoksynukleotydów, z występującą na przemian pentozą i kwasem fosforowym oraz zasadą (jedną z czterech) przyłączoną do każdej cząsteczki cukru. Łańcuch nukleotydów charakteryzuje się polarnością, tzn. na jednym końcu ma grupę fosforanową w pozycji 5', a na drugim końcu wolną grupę hydroksylową w pozycji 3'. Już w 1950 r. Chargaff zaobserwował występowanie pewnych prawidłowości w budowie kwasów nukleinowych. Adenina i tymina oraz guanina i cytozyna występują w jednakowych ilościach (A = T, G = C). Suma zasad purynowych jest równa sumie zasad pirymidynowych. Stosunek

dla różnych gatunków może się znacznie wahać, jednak

dla danego gatunku jest on stały. Ułożenie składników DNA, a więc jego struktura drugorzędowa, została wyjaśniona za pomocą analizy rentgenowskiej. Jeśli rozciągnąć DNA do postaci nici, obracając go w monochromatycznym świetle rentgenowskim, a następnie utrwalić na kliszy odbite światło, to otrzyma się diagram struktury rentgenowskiej. Diagramy DNA różnego pochodzenia (nasienie, grasica, bakterie, bakteriofagi) były prawie identyczne. Wilkins wykorzystując diagramy rozproszonych promieni rentgenowskich wykazał, że pierścienie purynowe i pirymidynowe ułożone są pod kątem prostym w stosunku do głównej osi łańcucha polinukleotydowego. Łańcuch DNA jest śrubowo (helikalnie) skręcony wokół osi głównej, ze skokiem 3,4 nm. Jego gęstość wskazywała na występowanie więcej niż jednego łańcucha.

Na podstawie przedstawionych wyników Watson i Crick (1953) opracowali znakomitą teorię budowy DNA. Według modelu Watsona— -Cricka dwa łańcuchy polinukleotydowe są śrubowo skręcone wokół tej samej osi, tworząc podwójną helisę. Oba łańcuchy połączone są za pomocą mostków wodorowych występujących między skierowanymi do wewnątrz zasadami (ryc. 2.10). Tworzenie wiązań wodorowych jest przestrzennie możliwe jedynie między adeniną i tyminą oraz między guaniną i cytozyną. Na jeden skręt helisy przypada około 10 zasad. Sekwencje zasad na obu łańcuchach są więc komplementarne, a łańcuchy mają przeciwną polarność (wiązanie 5'—>3', 3'—>5')· Długość konturowa DNA Escherichia coli jest równa 1,4 mm. Względna masa cząsteczkowa dwuniciowego DNA o długości 1 μm (3000 par zasad, czyli 3 tys. p.z.) wynosi około 2 x l 0 6 , 48

tak więc względna masa cząsteczkowa chromosomu E. coli osiąga 2,9 xl0 9 . Mostki wodorowe wiążą adeninę z tyminą i guanine z cytozyną z różną siłą. Wiązania te są przeważnie natury elektrostytycznej. Są one utworzone przez grupy —OH i —NH2. Tlen i azot są pierwiastkami silnie elektroujemnymi; powodują odpychanie elektronów, co nadaje dodatni ładunek przyłączonym do nich atomom wodoru. Naładowane dodatnio atomy wodoru są przyciągane przez inne elektroujemne grupy mające wolne pary elektronów i mogą tworzyć mostki wodorowe. Siłę wiązania mostka wodorowego można określić kwasowością atomów Η i zasadowością atomu akceptora. Mostki wodorowe są silniejsze niż międzycząsteczkowe siły van der Waalsa. Energia wiązania wodorowego dochodzi do 38 kJ (9 kcal)/mol. Przeciętnie energia ta nie jest większa aniżeli energia kinetyczna drgań cieplnych w temperaturze 37°C. Jak widać na rycinie 2.10, między guaniną i cytozyną występują trzy takie wiązania, a między tyminą i adeniną — dwa. Mała energia tych wiązań powoduje, że podwyższenie temperatury, niewielka zmiana stężenia magnezu lub dodatek mocznika mogą doprowadzić do znacznych zmian, a nawet do ich zerwania. Podwyższenie temperatury powoduje rozerwanie mostków wodorowych i rozwinięcie łańcuchów

49

polinukleotydowych. Zniszczenie struktury drugorzędowej wiąże się ze zwiększeniem absorpcji światła o długości fali 259 nm (efekt hiperchromowy). Temperaturę, w której osiąga się połowę maksymalnego przyrostu ekstynkcji, określa się jako wartość Tm. Temperatura, w której zachodzi takie uszkodzenie, jest tym wyższa, im DNA zawiera więcej guaniny i cytozyny połączonych potrójnymi mostkami wodorowymi. Dzięki wyznaczeniu temperatury (Tm — tzw. punkt topnienia), w której dochodzi do denaturacji wyizolowanego i odpowiednio oczyszczonego DNA, można określić względną zawartość cytozyny i guaniny (rye. 2.11B). Zawartość GC oznacza stosunek liczby moli guaniny i cytozyny do całkowitej liczby moli guaniny, cytozyny, adeniny i tyminy w DNA (w procentach).

Bakterie różnią się w znacznym stopniu zawartością GC. Wartości te wahają się od 30%, dla niektórych gronkowców i bakterii z grupy Cytophaga, do około 70% u pewnych przedstawicieli rodzaju Micrococcus i bakterii śluzowych. Zawartość GC jest gatunkowo swoista i wykorzystuje się ją jako cechę taksonomiczną. Replikacja DNA. DNA zawiera informację genetyczną komórki. Jego replikacja i rozdział, które zawsze poprzedzają podział komórki, muszą prowadzić do powstania dwóch identycznych chromosomów. Mogłoby się wydawać, że podwojenie DNA, czyli jego replikacja, jest bardzo prostym sposobem. Oba łańcuchy muszą się rozdzielić, tak aby podjednostki nukleotydowe z komplementarnymi zasadami mogły się ułożyć na każdym

50

z pojedynczych łańcuchów i zostać połączone. Trudno byłoby wyobrazić sobie, jak dochodzi do rozdzielenia łańcuchów DNA. Zgodnie z diagramami struktury rentgenowskiej, DNA jest podwójną helisą plektonemiczną, a nie paranemiczną (ryc. 2.11 A). Aby wyjaśnić, w jaki sposób przebiega rozwinięcie łańcuchów, Delbriick i Stent w 1957 r. wysunęli trzy hipotetycznie możliwe sposoby replikacji DNA (ryc. 2.12): 1. Replikacja konserwatywna (zachowawcza): rozwinięcie nie następuje; rodzicielska helisa służy jako matryca do syntezy nowej helisy. Helisa potomna zostaje zbudowana z całkowicie nowego materiału, a rodzicielska pozostaje zachowana. 2. Replikacja dyspersyjna: w czasie replikacji rodzicielska helisa rozpada się w połowie każdego skrętu na wiele fragmentów; na tych fragmentach zachodzi synteza nowych odcinków, które łączą się krzyżowo. Każdy łańcuch polinukleotydowy składa się więc z odcinków starego i nowego materiału. 3. Replikacja semikonserwatywna: podwójna helisa zostaje rozwinięta i każda z nici polinukleotydowych służy jako matryca do syntezy nowej nici komplementarnej. Nowa helisa jest więc hybrydem składającym się z jednej nici już wcześniej istniejącej i jednej nowo zsyntetyzowanej.

W celu stwierdzenia, który z wymienionych mechanizmów jest prawdziwy, Meselson i Stahl znakowali DNA ciężkimi izotopami, a następnie rozdzielali go w gradiencie gęstości (ryc.2.13). Gradient gęstości CsCl można uzyskać przez wielogodzinne wirowanie 6 Μ roztworu CsCl z przyspieszeniem dośrodkowym 100000 g (dzięki ustaleniu się równowagi między dyfuzją i siłą ciążenia). Jeśli roztwór zawiera DNA, to DNA skupia się w miejscu, gdzie

51

gęstość gradientu odpowiada jego gęstości. Jeśli DNA został otrzymany z bakterii hodowanych w obecności 1 5 NH 4 Cl, to jest on o 0,8% cięższy od normalnego 14 N-DNA, tworzy więc odrębne pasmo w gradiencie CsCl. Escherichia coli była hodowana przez wiele pokoleń na pożywce z 15N jako jedynym źródłem azotu; jej DNA zawierał więc wyłącznie 1 5 N. Następnie do hodowli dodano w nadmiarze 1 4 N. Pobrano próby przed i po dodaniu I 4 N, wyizolowano z nich DNA i zbadano jego rozdział w gradiencie CsCl. Gdy bakterie hodowano z 1 4 N przez okres odpowiadający czasowi podwojenia, to cały DNA stał się „półciężki" (DNA hybrydowy). Zawartość tego półciężkiego DNA była stała przez wiele pokoleń, podczas gdy ilość DNA lekkiego wzrastała. W celu udowodnienia, że półciężki DNA rzeczywiście składa się z jednej nici 14N i jednej 1 5 N, półciężki DNA poddano „stopieniu" (podgrzano do temp. 100°C) i gwałtownie ochłodzono. W gradiencie DNA pojawiły się dwa pasma odpowiadające jednoniciowemu DNA zawierającemu 14N bądź 1 5 N.

Wyniki tych doświadczeń nie są zgodne ani z pierwszą, ani z drugą teorią; potwierdzają natomiast semikonserwatywny mechanizm replikacji. W czasie replikacji obie nici podwójnej helisy rozwijają się i rozdzielają. Każda z nich służy jako matryca do syntezy nici komplementarnej. W syntezie tej biorą udział polimerazy DNA. Funkcja tych enzymów jest prosta; łączą one ze sobą nowe nukleotydy występujące we właściwej pozycji wskutek zjawiska parowania zasad i syntetyzują w ten 52

sposób nową nić polinukleotydową. Biochemiczne podstawy działania polimerazy DNA przedstawiono na rycinie 2.14. Zainteresowanych tym problemem odsyłamy do podręczników biologii molekularnej.

Syntezę jednej z nowych nici polinukleotydowych można więc łatwo wytłumaczyć: polimeraza DNA łączy nukleotydy w ciągłą nić działając w kierunku 5'—>3'. Synteza drugiej nici powinna postępować w przeciwnym kierunku, tzn. 3'—>5', ponieważ nici podwójnej helisy mają przeciwną polarność. Na rycinie 2.15 przedstawiono mechanizm nieciągłej syntezy drugiej nici zaproponowany na podstawie danych doświadczalnych. Najpierw powstają tylko krótkie odcinki DNA (o długości około 1000 nukleotydów), zwane fragmentami Okazaki. Ich syntezę zapoczątkowuje wytworzenie krótkiego odcinka RNA, który służy jako starter (primer). Do niego zostaje dołączony przez polimerazę DNA III odcinek DNA o długości 1000-2000 nukleotydów. Następnie primer RNA zostaje wycięty, a powstającą lukę wypełnia polimeraza DNA I. Powstający produkt jest łączony z syntetyzowaną nicią DNA przez ligazę. Ten nieciągły mechanizm syntezy nici polinukleotydowej tłumaczy możliwość replikacji drugiej nici również w kierunku 5'—>3'.

53

Na rycinie 2.16 pokazano sposób replikacji chromosomu bakteryjnego i podziału komórki, z założeniem, że replikacja jest jednokierunkowa. Synteza obu nowych nici nie zachodzi jednak jednokierunkowo, lecz może postępować z punktu początkowego w obu kierunkach na jednej lub na obu niciach. Taki dwukierunkowy mechanizm wymaga istnienia dwóch widełek replikacyjnych na każdej cząsteczce. Synteza dwóch nowych pojedynczych nici zachodzi w dwóch rozgałęzieniach widełek replikacyjnych utworzonych przez rozwijającą się podwójną helisę. Podwojenie chromosomu E. coli trwa około 40 min, ale w dogodnych warunkach komórki dzielą się co 20 minut. Okazało się, że chromosomy

54

potomne mogą zacząć nowy cykl replikacji, zanim zakończył się poprzedni, co wyjaśnia to zjawisko. Znanych jest znacznie więcej szczegółów o mechanizmie replikacji niż można tu zamieścić. Istnieją np. znaczne różnice w replikacji DNA chromosomowego, plazmidowego i fagowego. Aby pogłębić wiadomości, należy sięgnąć do podręczników biologii molekularnej. Wielkość genomów i ich liczba. Wielkość bakteryjnego chromosomu może wynosić u różnych gatunków od 0,6 x l 0 6 do 13xl0 6 par zasad (p.z.). Większość bakteryjnych chromosomów ma rozmiar podobny do 6 chromosomu E. coli, tzn. około 4,6 x 10 p. z. Również liczba genomów na komórkę jest różna u różnych gatunków, ale zależy także od warunków hodowli. Escherichia coli rosnąca w hodowli laboratoryjnej ma 2 do 4 genomów na komórkę, Azotobacter chroococcum — 20 do 40, a Desulfovibrio gigas — 10 do 15. (Dla porównania chromosomy 6 6 Eukaryota mają: Neurospora crassa 19xl0 ; Aspergillus niger 40xl0 ; 9 9 człowiek 2,9 x 10 i Zea mays 7 x 10 p.z.). Hybrydyzacja DNA-DNA: homologie sekwencji między DNA różnych gatunków. Jak już było powiedziane wcześniej, ogrzanie wyizolowanego DNA powoduje rozdzielenie obu nici polinukleotydowych wskutek zniszczenia mostków wodorowych. Taką denaturację DNA można odwrócić przez powolne schłodzenie, które pozwala na ponowne parowanie i reasocjację odcinków komplementarnych. Reasocjacja może też zajść, kiedy miesza się krótkie odcinki zdenaturowanego DNA pochodzącego z różnych, choć spokrewnionych bakterii, ogrzewa powyżej temperatury 55

topnienia i wolno chłodzi. Dwuniciowe cząsteczki DNA utworzone z pojedynczych nici pochodzących od różnych organizmów zwane są cząsteczkami heterodupleksowymi. Aby prześledzić tworzenie cząsteczek heterodupleksowych, należy oznakować DNA jednego z gatunków ciężkim bądź radioaktywnym izotopem. Jeżeli hoduje się bakterie w ciężkiej wodzie (D,O), to ich ciężki DNA pozwoli śledzić tworzenie heterodupleksu, gdy zastosuje się wirowanie w gradiencie sacharozy. W taki sam sposób Meselson i Stahl wykazali istnienie hybrydowego [14N] i [15N] DNA. W celu otrzymania znakowanego DNA organizmu można też hodować go w podłożu zawierającym 14C lub 32 P. Długie kawałki zdenaturowanego DNA (z hodowli nieznakowanej A) są mieszane z krótkimi odcinkami zdenaturowanego DNA (ze znakowanej 14C hodowli B) i powoli chłodzone. Mieszanina jest następnie filtrowana przez membranę, przez którą przechodzą odcinki krótkie, a zatrzymywane są na niej jedynie długie cząsteczki heterodupleksowe. Radioaktywność DNA zatrzymanego na filtrze jest tym większa, im więcej radioaktywnych odcinków (B) związało się z odcinkami (A), a więc jest ona proporcjonalna do homologii sekwencji zasad między DNA bakterii A i B. Ta metoda reasocjacji dwóch rodzajów DNA pozwala na określenie stopnia homologii sekwencji między DNA pochodzącymi z różnych organizmów. Doświadczenie kontrolne, w którym DNA znakowany i nieznakowany pochodzi z tego samego szczepu bakteryjnego, daje nam stopień renaturacji określony jako 100. Stopień reasocjacji cząsteczek DNA tego szczepu z DNA innych szczepów można wyrazić jako procent całkowitej homologii. Opracowano i stosuje się różne metody określenia stopnia homologii DNA; wszystkie z metod opierają się na zasadzie tworzenia heterodupleksów między dwiema próbkami DNA, z których jedna jest odpowiednio znakowana.

Homologia sekwencji DNA, tzn. podobieństwo sekwencji cząsteczek DNA z różnych bakterii, jest największa w ściśle spokrewnionych szczepach. Określenie homologii jest bardzo pomocne do porównywania oraz badania rodzajów i gatunków spokrewnionych. Rzadko występuje wystarczająco duża homologia między niespokrewnionymi gatunkami, aby doszło do wytworzenia heterodupleksów. Jednoniciowy DNA może też łączyć się z komplementarnym RNA, a powyższe metody mogą też być wykorzystane do zbadania homologii zasad między DNA i RNA. Plazmidy. Wiele bakterii oprócz DNA chromosomowego posiada dwuniciowy, koliście zamknięty DNA pozachromosomowy. Takie autonomicznie replikujące się cząsteczki DNA nazywa się plazmidami. W bakteriach znaleziono też plazmidy liniowe.

56

2.2.2. Cytoplazma, białka i rybosomy Cytoplazmę oddziela od ściany komórkowej błona cytoplazmatyczna. W cytoplazmie znajdują się różne inkluzje (pęcherzyki, grana), jak również materiał jądrowy. Dzięki rozwojowi mikroskopii elektronowej i technik biochemicznych stwierdzono, że cytoplazma nie jest homogennym roztworem białek. Składa się ona z cytoplazmy podstawowej, w której występują różne struktury błonowe i wpuklenia oraz rybosomy. Bakteryjną cytoplazmę można rozdzielić, przez wielogodzinne wirowanie przy 100 000 g, na frakcję „rozpuszczalną", która głównie zawiera rozpuszczalne enzymy i RNA, oraz na frakcję „cząstkową", która składa się przede wszystkim z rybosomów i materiału błonowego. Enzymy rozpuszczalne katalizują różne reakcje rozkładu i syntezy. Rozpuszczalne kwasy rybonukleinowe (messenger [m]RNA i transfer ft] RNA) oraz rybosomy biorą udział w syntezie białek. Białka. Białka składają się z aminokwasów, które łączą się ze sobą w określonej kolejności wiązaniami peptydowymi w łańcuch polipeptydowy. Łańcuchy polipeptydowe wykazują ściśle określone ułożenie przestrzenne (konformację), które jest stabilizowane przez dodatkowe wiązania zarówno typu kowalencyjnego, jak i niekowalencyjnego (ryc. 2.17). W zależności od typów występujących wiązań wyróżnia się rozmaite stopnie uorganizowania struktury. Pierwszorzędowa struktura białka jest określona liczbą i sekwencją połączonych kowalencyjnie aminokwasów. Struktura drugorzędowa może powstać, gdy w łańcuchu polipeptydowym grupy karboksylowe i aminowe są połączone mostkami wodorowymi, co może spowodować powstanie struktury helisy a lub struktury β. Dalsze oddziaływania między różnymi bocznymi grupami polipeptydu wpływają na charakterystyczne, stabilne ułożenie przestrzenne cząsteczki, zwane strukturą trzeciorzędową. Powstaje ona w wyniku działania wiązań wodorowych, jonowych, apolarnych (hydrofobowych). Ponadto mogą występować kowalencyjne wiązania poprzeczne między różnymi częściami łańcucha, takie jak wiązania dwusiarczkowe wytworzone przez utlenienie grup —SH. W końcu, wskutek oddziaływania między cząsteczkami różnych łańcuchów polipeptydowych, może dojść do ich agregacji. Występowanie w białku określonej liczby łańcuchów polipeptydowych (podjednostek) określa się jako strukturę czwartorzę-

57

dową. W warunkach fizjologicznych białka znajdują się w fazie wodnej, następują więc wzajemne oddziaływania między nimi i dipolami wody. Grupy polarne białek są uwodnione. Czynniki zmieniające ładunek białka (stężenie jonów H+, Ca2+, Mg2+, K+ itp.) wpływają na stopień ich uwodnienia, a tym samym na ich konformację. Rybosomy. Rybosomy są miejscem syntezy białek. W mikroskopie elektronowym rybosomy bakterii są widoczne jako cząstki o wymiarach 16x18 nm. Znajduje się w nich około 80-85% bakteryjnego RNA. Nienaruszone rybosomy bakteryjne osiadają w ultrawirówce przy szybkości sedymentacyjnej równej 70 jednostkom Svedberga. Określane są więc one jako rybosomy 70S. Eukariotyczne rybosomy cytoplazmatyczne są, z nielicznymi wyjątkami, nieco większe i zwane są rybosomami 80S. Rybosomy składają się z dwóch podjednostek; u bakterii są to podjednostki 30S i 50S, które łącząc się dają rybosom 70S (ryc. 2.18). Ze względu na wielkość i niektóre inne cechy, rybosomy bakteryjne są podobne do rybosomów występujących w mitochondriach i chloroplastach. Komórki bakteryjne zawierają około 5000-50000 rybosomów; ich liczba jest tym większa, im szybszy jest wzrost komórki. W mikroskopie elektronowym, na ultracienkich skrawkach komórek, w których zachodzi 58

aktywna synteza białek, widać regularne łańcuchy rybosomów. Łańcuchy te wydają się nawleczone na nici mRNA, jak perły w naszyjniku. Zwane są one polirybosomami bądź polisomami. Różnice między rybosomami bakteryjnymi (70S) i eukariotycznymi (80S) mają ogromne znaczenie w skutecznym leczeniu infekcji. Niektóre antybiotyki hamują bowiem syntezę białek przeprowadzaną na rybosomach 70S, nie wpływając na działanie rybosomów 80S. Skład RNA. RNA różni się od DNA zarówno składem budujących go podjednostek, jak i strukturą drugorzędową. Szkielet nici polinukleotydowej zbudowany jest z rybozy i fosforanu. Jako zasady występują adenina, guanina i cytozyna oraz uracyl zamiast tyminy. Poza tym RNA może zawierać inne zasady, rzadziej spotykane (pseudouracyl). Komórkowy RNA jest przeważnie jednoniciowy; parowanie zasad zwykle występuje tylko na pewnych jego odcinkach. Transkrypcja DNA. Informacja zawarta w sekwencji DNA nie jest przenoszona z DNA na białko bezpośrednio. Pośrednikiem tego procesu jest RNA. To przeniesienie informacji z DNA na RNA nazywa się 59

transkrypcją. Powstająca cząsteczka RNA to informacyjny RNA, czyli messenger RNA (w skrócie mRNA). Jest on jednoniciowy. Synteza RNA zachodzi wyłącznie na jednej nici DNA — nici kodującej, poczynając od końca 3'; mRNA jest więc komplementarny w stosunku do nici kodującej. W wyniku transkrypcji zostaje skopiowana sekwencja zasad występująca wyłącznie w DNA. Enzym syntetyzujący mRNA jest stosunkowo dużym białkiem, składającym się z kilku podjednostek. U E. coli polimeraza RNA jest złożona z dwóch podjednostek a, jednej β i jednej β' (w skrócie α2ββ'). Ponadto do rozpoczęcia syntezy RNA potrzebna jest jeszcze jedna podjednostka. Jest to czynnik sigma (σ), niezbędny do inicjacji transkrypcji. Czynnik sigma bierze udział w rozpoznaniu promotora, czyli sekwencji startowej na transkrybowanym DNA. Potem czynnik ten jest już zbędny. W czasie transkrypcji podwójna helisa DNA musi ulec rozwinięciu. Proces transkrypcji pokazany jest na rycinie 2.19A. Synteza RNA zostaje zakończona, gdy polimeraza dotrze do pewnej sekwencji DNA zwanej terminatorem. Transkrypcja jest to przepisanie sekwencji zasad z DNA na RNA, natomiast przetłumaczenie sekwencji zasad w RNA na sekwencję aminokwasów w białku nazywamy translacją.

Kod genetyczny. Każdy gen jest to określona sekwencja DNA. Specyficzna informacja genu tkwi w sekwencji zasad w tym DNA. Szyfr kodujący informację w DNA zawiera cztery znaki, tj. zasady: adeninę (A), guaninę (G), tyminę (T) i cytozynę (C). W mRNA tyminę zastępuje uracyl. Podstawą specyficzności białek enzymatycznych, których synteza jest zapisana w genach, jest sekwencja aminokwasów w łańcuchach polipeptydowych. Sekwencja aminokwasów determinuje budowę przestrzenną białka, czyli jego konformację (budowa drugo-, trzecio- i czwartorzędowa). Przekaz informacji od zapisu nukleotydowego do aminokwasów odbywa się za pomocą kodu. Sekwencja trzech nukleotydów, zwana

60

61

trypletem lub kodonem, określa aminokwas, a sekwencja trypletów w kwasie nukleinowym określa sekwencję aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Oznacza to, że łańcuch polipeptydowy jest odzwierciedleniem kwasu nukleinowego. Ułożenie zasad w kwasach nukleinowych w trypletach pozwala na 64 kombinacje (tab. 2.1). Gdyby tylko jeden tryplet kodował każdy z 20 aminokwasów, to 44 możliwe kombinacje pozostałyby nie wykorzystane (zbędne). Stwierdzono jednak, że wiele aminokwasów jest kodowanych przez dwa lub więcej trypletów. Trójki są odczytywane w kolejności 1, 2, 3; 1, 2, 3..., poczynając od początku mRNA. Niektóre trójki mają specjalne znaczenie: AUG koduje metioninę i służy jako kodon startowy. Trójki UAA, UAG i UGA to kodony

62

„nonsensowne" lub inaczej kodony stop (nie kodują aminokwasów). Sygnalizują one koniec translacji jakiegoś kawałka mRNA. Synteza białek: translacja mRNA. Aminokwasy są włączane do łańcucha polipeptydowego w kolejności określonej sekwencją trójek w mRNA. W procesie tym bierze udział mRNA, transportujący RNA (tRNA), rybosomy, różne enzymy, ATP i inne czynniki. W pierwszym etapie aminokwasy są aktywowane przez ATP, w wyniku czego powstaje aminoacylo-AMP. aminokwas + ATP -> aminoacylo-AMP + PPnieorg. Reszta aminoacylowa zostaje następnie przeniesiona z AMP na końcowy nukleotyd tRNA. Aktywacja i połączenie aminokwasu z właściwym tRNA są przeprowadzane przez enzym — właściwą syntetazę aminoacylo-tRNA, która rozpoznaje zarówno aminokwas, jak i odpowiadający mu tRNA. Każdemu aminokwasowi odpowiada swoista syntetaza aminoacylo-tRNA. Jak już wspomniano, niektórym aminokwasom odpowiada więcej kodonów (mówi się, że kod genetyczny jest zdegenerowany); odpowiada im też większa liczba tRNA. Odpowiednia syntetaza może też przyłączyć więcej rodzajów tRNA. Każdy tRNA zawiera region, zwany antykodonem, który jest komplementarny do właściwego trypletu (kodonu) mRNA. Przyłączenie aminokwasów zachodzi na rybosomach (ryc. 2.19A i B), które przesuwają się wzdłuż mRNA poczynając od jego końca 5'-OH. Aminokwasy zostają poprzez tRNA ułożone w odpowiedniej kolejności i połączone wiązaniem peptydowym, wytworzonym między grupą aminową jednego aminokwasu a grupą karboksylową aminokwasu poprzedzającego. Oczywiście sekwencja aminokwasów i charakter ich łańcuchów bocznych (grupy hydrofobowe i hydrofilowe) prowadzą do zwijania się i skręcania łańcuchów polipeptydowych, dzięki czemu mają one określone właściwości i pełnią odpowiednie funkcje. Do danego mRNA może przyłączyć się kilka rybosomów, tak że mRNA równocześnie stanowi matrycę do syntezy kilku polipeptydów. Taki kompleks złożony z mRNA i rybosomów nazywa się polisomem. Sekwencja nukleotydów w DNA stanowi więc kod, który za pośrednictwem mRNA określa budowę białek. Przepływ informacji z DNA poprzez mRNA do białek nazwano „głównym dogmatem" biologii

63

molekularnej. W ten sposób przekazywana jest informacja we wszystkich organizmach, które zawierają DNA jako materiał genetyczny (schemat na s. 60), a więc u eukariotów, prokariotów i DNA wirusów. U niektórych RNA wirusów RNA jest replikowany bezpośrednio. Pewne RNA wirusy replikują swój RNA bezpośrednio. Jednak u niektórych wirusów onkogennych (nowotworowych) proces ten jest poprzedzony syntezą DNA kierowaną przez RNA, gdzie RNA stanowi matrycę dla DNA. Informacja zawarta w RNA jest więc przekazywana na DNA (przy udziale odwrotnej transkryptazy) w procesie postępującym w odwrotnym kierunku niż transkrypcja (p. schemat na s. 60). Enzym ten można wyizolować z komórek nowotworowych powstałych pod działaniem RNA wirusów. Znalazł on zastosowanie w biologii molekularnej (rozdz. 15.5). Jeżeli izolowanym nośnikiem informacji jest nie DNA, lecz odpowiadający mu mRNA, to przed włączeniem do plazmidu należy przetranskrybować go na DNA. Przy użyciu odwrotnej transkryptazy można więc zsyntetyzować in vitro żądany DNA.

Transkrypcja i translacja są procesami wrażliwymi na działanie licznych antybiotyków (patrz rozdz. 6.6) odznaczających się dużą swoistością. Tak więc, na przykład, kwas nalidyksowy i nowobiocyna hamują rozwinięcie DNA przy replikacji i transkrypcji. Ryfampicyna natomiast hamuje prokariotyczną polimerazę RNA. Synteza białek, a w szczególności etap translacji, jest u prokariotów hamowany przez streptomycynę, neomycynę, erytromycynę, tetracykliny i chloramfenikol, natomiast u eukariotów — przez cykloheksimid i toksynę błoniczą. Wyjaśnienie procesów molekularnych zachodzących w czasie biosyntezy białek było w dużym stopniu możliwe dzięki badaniom nad mechanizmem działania antybiotyków.

2.2.3. Błony Błona cytoplazmatyczna. Na zdjęciach z mikroskopu elektronowego ultracienkich skrawków bakterii utrwalonych w czterotlenku osmu widać błonę cytoplazmatyczną złożoną z kilku warstw: dwóch osmofilowych (a więc ciemnych), każda o grubości 2-3 nm, które otaczają warstwę jaśniejszą (osmofobową), o grubości 4-5 nm. Budowa błon cytoplazmatycznych u bakterii, zwierząt i roślin jest bardzo podobna, wydaje się więc uzasadnione nazywanie ich błonami elementarnymi („unit membrane").

64

Stosując szok osmotyczny, można odzielić błonę cytoplazmatyczną od protoplastu uzyskanego po zadziałaniu lizozymem. Jest ona bogata w lipidy, a szczególnie w fosfolipidy (tab. 2.2). Z 8-15% lipidów zawartych w suchej masie komórki w błonie cytoplazmatycznej jest ich aż 70-90%.

Błona cytoplazmatyczna składa się z podwójnej warstwy lipidowej. Hydrofobowe końce fosfolipidów i triglicerydów skierowane są do środka, a hydrofilowe „główki" na zewnątrz. Błona jest stabilizowana przez hydrofobowe siły występujące między kwasami tłuszczowymi lipidów i przez siły elektrostatyczne między hydrofilowymi główkami. W tę podwójną warstwę są włączone białka, stanowiące jej integralną część (białka integralne). Są one zanurzone w warstwie lipidowej, jedne tylko częściowo, inne zaś przechodzą przez całą grubość błony. Białka peryferyczne są natomiast przyłączone do jej części wewnętrznej bądź zewnętrznej (ryc. 2. 20). Ponadto niektóre błony są, jak się wydaje, pokryte na jednej lub na obu powierzchniach siecią wydłużonych białek. Uważa się, że błona jest bardzo miękka, odkształcalna, prawie płynna. Wyizolowane błony mają tendencję do zwijania się i tworzenia zamkniętych pęcherzyków. Błona cytoplazmatyczna odgrywa znaczącą rolę w metabolizmie. Stanowi ona barierę osmotyczną komórki i kontroluje wnikanie substancji do komórki oraz ich usuwanie. Jest też miejscem aktywnego transportu i występowania systemu permeaz swoistych dla różnych substratów. Ciągła podwójna fosfolipidowa warstwa błony cytoplazmatycznej pozwala 65

66

w różnym stopniu na przechodzenie przez nią określonych substancji. Przedstawione na rycinie. 2.21 szybkości dyfuzji pokazują, że substancje hydrofobowe przechodzą łatwiej, podczas gdy jony właściwie wcale nie dyfundują. Transport substancji do i z komórki zachodzi poprzez integralne białka błony, które są swoiste dla jednego lub dla grupy pokrewnych substratów. Enzymy biorące udział w przenoszeniu elektronów i w fosforylacji oksydatywnej, które u eukariotów są umiejscowione w błonie mitochondrialnej, u bakterii znajdują się w błonie cytoplazmatycznej lub są z nią związane. Tak więc cytochromy, białka żelazo-siarkowe i inne składniki łańcucha przenoszenia elektronów są znajdowane wyłącznie w błonie cytoplazmatycznej. Szczegółowe badania lokalizacji poszczególnych składników błony dowiodły, że ma ona strukturę asymetryczną. Tak więc np., niektóre cytochromy i inne białka związane z transportem elektronów znajdują się na powierzchni zewnętrznej, a syntaza ATP na powierzchni wewnętrznej błony (rozdz. 7.4). Również inne procesy biosyntetyczne, w tym synteza komponentów ściany komórkowej i otoczek, wydzielanie egzoenzymów, zachodzą prawdopodobnie w błonie komórkowej. Wydaje się, że centrum replikacji DNA znajduje się też w błonie. W błonie są także zakotwiczone rzęski. Błony wewnątrzcytoplazmatyczne i lamelle. U niektórych bakterii błona otacza cytoplazmę nie tworząc żadnych inwaginacji ani fałd. U innych jest wpuklona i może tworzyć różne struktury błonowe. W komórkach pewnych bakterii zaobserwowano twory zwane mezosomami. Najprawdopodobniej są to jednak artefakty związane z preparatyką. U bakterii z rodzaju Nitrobacter, Nitrosomonas i Nitrosococcus występują pakiety lamelli, utworzone z równolegle ułożonych płaskich pęcherzyków. Niektóre z tych pęcherzyków są połączone z błoną plazmatyczną (ryc. 2.22 i ryc. 2.24). Szczególnie bogate w wewnętrzne błony cytoplazmatyczne są fototroficzne bakterie purpurowe. Na ultracienkich skrawkach te wewnątrzcytoplazmatyczne systemy błon są widoczne jako struktury rurkowate, blaszkowate i pęcherzykowate. U Rhodospirillum rubrum i rodzaju Chromatium światło komórki wydaje się prawie całkowicie wypełnione przez gęsto ułożone kuliste pęcherzyki (ryc. 2.23). Pęcherzyki te powstają przez wpuklenie błony cytoplazmatycznej i jej cylindryczne rozdęcie.

67

68

69

W równomiernych odstępach rurki te zaciskają się, przez co powstają odcięte od siebie, ale nie rozdzielone pęcherzyki. Dopiero po pęknięciu i homogenizacji komórki, struktury te zostają rozdzielone. Uwolnione pęcherzyki zwane są chromatoforami. U innych bakterii purpurowych pęcherzyki są silnie spłaszczone i tworzą uporządkowany stos, który przez analogię do układów spotykanych w chloroplastach roślin zielonych nazywa się stosem tylakoidalnym. Błony fotosyntetyzujące zbudowane są podobnie jak inne błony cytoplazmatyczne i mają zbliżony skład (tab. 2.2). Są one nośnikami 70

barwników absorbujących światło (bakteriochlorofile i karotenoidy) oraz składników fotosyntetycznego systemu transportu elektronów i układu fosforylacyjnego.

2.2.4. Ściana komórkowa Ściana komórkowa bakterii nie jest sztywna jak stalowa kula, lecz raczej elastyczna jak skórzane pokrycie piłki futbolowej. Podobnie jak napompowana dętka piłki ciśnie na jej skórzaną powłokę, tak protoplast napiera na ścianę komórkową nadając jej określoną sztywność. Ciśnienie wewnętrzne, czyli turgor, jest uwarunkowane siłami osmotycznymi. Błona cytoplazmatyczna stanowi aktywną barierę osmotyczną; jest ona półprzepuszczalna i kontroluje pobieranie do komórki oraz wydalanie z niej substancji rozpuszczalnych. W przeciwieństwie do tego ściana komórkowa jest całkowicie przepuszczalna dla soli i licznych innych substancji drobnocząsteczkowych. Plazmoliza. W normalnych warunkach stężenie osmotycznie czynnych soli i cukrów jest wyższe wewnątrz komórki niż na zewnątrz. Ciśnienie osmotyczne w komórce odpowiada 10-20% roztworowi sacharozy. Komórka pobiera tyle wody, na ile pozwala jej ściana komórkowa. Jeśli np. przez dodanie cukru bądź mocznika podwyższymy ciśnienie osmotyczne środowiska, w którym znajduje się komórka, to traci ona wodę, wskutek czego protoplast „marszczy się", a błona cytoplazmatyczna zaczyna odstawać od ściany komórkowej. Proces ten, przebiegający w środowisku hipertonicznym, nazywa się plazmoliza. Pomarszczenie protoplastu dużych komórek bakteryjnych pozwala wykazać, że błonę komórkową otacza ściana komórkowa. Błonę cytoplazmatyczną i ścianę komórki można wybarwić rozpuszczalnym w wodzie, zasadowym barwnikiem — błękitem Wiktorii. Barwienie metodą Grama. Ściana komórkowa decyduje o wyniku barwienia bakterii metodą wprowadzoną przez Grama (1884). Właściwość trwałego zabarwiania się na kolor fioletowy lub jej brak jest ważną cechą taksonomiczną, z którą związane są też inne właściwości bakterii. Metoda Grama polega na zabarwieniu utrwalonych komórek zasadowym barwnikiem — fioletem krystalicznym. Następnie działa się roztworem jodu. Jod tworzy z fioletem krystalicznym kompleks, który jest nierozpuszczalny

71

w wodzie i słabo rozpuszczalny w alkoholu oraz acetonie. Następnie komórki „różnicuje" się działając na nie alkoholem: komórki gramdodatnie zatrzymują kompleks barwnika z jodem, podczas gdy gramujemne zostają odbarwione przez alkohol. Aby je uwidocznić, stosuje się barwnik kontrastowy, np. fuksynę. Jeśli po wybarwieniu metodą Grama komórek gramdodatnich podziałamy na nie lizozymem, to protoplast pozostanie zabarwiony na fioletowo, ale odbarwi się pod wpływem alkoholu. Kiełkujące przetrwalniki Bacillus subtilis i pierwsze pokolenie po kiełkowaniu przetrwalników barwią się gramujemnie, dopiero potem stają się gramdodatnie. Obserwacje te sugerują, że barwny kompleks znajduje się w protoplascie, ale to ściana komórkowa bakterii gramdodatnich uniemożliwia ekstrakcję barwnika przez alkohol. Podstawowy szkielet ściany komórkowej. Do zrozumienia budowy ściany komórkowej bakterii może być pomocne rozważenie jej podobieństwa z innymi szkieletowymi strukturami zbudowanymi z polimerów β-D-glukozy, a więc celulozy i chityny. Celuloza jest podstawowym składnikiem ściany komórkowej wyższych i niższych roślin, glonów i lęgniowców (Oomycetes). W ścianie komórkowej bakterii celuloza zwykle nie występuje, lecz u Sarcina ventriculi jest ona czynnikiem zespalającym komórki w duże pakiety. Acetobacter aceti subsp. xylinum wydziela do środowiska celulozę w postaci delikatnych włókienek, które nadają skórzastą zwartość strukturze otaczającej komórkę zwanej „mycoderma aceti".

Chityna tworzy szkielet stawonogów i innych grup zwierząt. Jest ona również podstawowym składnikiem ściany komórkowej wielu grup grzybów (podstawczaki, workowce, sprzężniaki). Podstawową podjednostką chityny jest .N-acetyloglukozoamina. Cząsteczki .N-acetyloglukozoaminy w chitynie łączą się wiązaniem l,4-β-glikozydowym, podobnie jak cząsteczki glukozy w celulozie. 72

Szkielet ściany komórki bakteryjnej składa się również z dość jednolitego polimeru — peptydoglikanu zwanego mureiną. Ta makrocząsteczka jest heteropolimerem złożonym z łańcuchów, w których występują na przemian cząsteczki N-acetyloglukozoaminy (GlcNAc) i kwasu N-acetylomuraminowego (MurNAc), połączone wiązaniami β-1,4-glikozydowymi. Te heteropolimeryczne, proste, nierozgałęzione łańcuchy stanowią trzon mureiny. Podjednostki kwasu muraminowego mają przyłączony do reszty mleczanowej, za pomocą wiązania peptydowego, krótki peptyd. Typowe aminokwasy występujące w tych peptydach to L-alanina, kwas D-glutaminowy, kwas mezo-diaminopimelinowy (A2pm) lub L-lizyna oraz D-alanina. Aminokwasy diaminowe, a więc kwas m- (bądź LL-) diaminopimelinowy i L-lizyna odgrywają ważną rolę w powstawaniu usieciowanej struktury mureiny, ponieważ ich obie grupy aminowe mogą brać udział w tworzeniu wiązań peptydowych, a tym samym mogą łączyć ze sobą dwa heteropolimeryczne łańcuchy (ryc. 2.25). Na miejscu kwasu diaminopimelinowego lub lizyny może występować ornityna bądź kwas diaminomasłowy. Dzięki wiązaniom peptydowym między bocznymi peptydami, heteropolimeryczne łańcuchy tworzą olbrzymią cząsteczkę podobną do woreczka i zwaną właśnie woreczkiem (sacculus) mureinowym. Klasyczny model, który przedstawia heteropolimeryczne łańcuchy jako koliście zamknięte nici opasujące bakterie o kształcie cylindrycznym jak obręcz beczkę, nie jest chyba prawdziwy. Długość łańcuchów heteropolimerów stanowi bowiem jedną dziesiątą obwodu bakterii. Należy więc przyjąć, że łańcuchy złożone z 50-500 disacharydów (GlcNAc + MurNAc) są połączone peptydami i tworzą mniej regularną sieć, niż pierwotnie przypuszczano. Przestrzeń przylegająca bezpośrednio do błony cytoplazmatycznej, zwana przestrzenią peryplazmatyczną, ma konsystencję żelu. Należy podkreślić, że w ścianie komórkowej bakterii występują 73

związki, jakich nie spotyka się u roślin i zwierząt. Dotyczy to N-acetyloglukozoaminy i kwasu N-acetylomuraminowego, naprzemiennie występujących, oraz szeregu aminokwasów nie występujących w białkach, np. kwasu m-diaminopimelinowego (A2pm) i D-formy — alaniny oraz kwasu glutaminowego. Te szczególne składniki ściany bakterii stanowią ich „piętę Achillesową", wykorzystywaną w terapii medycznej. Składniki, struktura i biosynteza ściany komórkowej różnią się zasadniczo u bakterii oraz zwierząt i roślin. Stosowane w lecznictwie środki terapeutyczne, działające swoiście na ścianę komórkową bakterii i jej syntezę, muszą być jednocześnie nieszkodliwe dla poddanego leczeniu organizmu wyższego.

74

Obecność warstwy peptydoglikanu w ścianie komórkowej jest cechą charakterystyczną większości bakterii. Istnieją oczywiście nieliczne wyjątki. Peptydoglikan nie występuje natomiast u żadnego z archeonów. Woreczek mureinowy pełni funkcję szkieletu podporowego ściany komórkowej i jest poprzeplatany bądź otoczony innymi substancjami. Bakterie gramdodatnie różnią się od bakterii gramujemnych zarówno budową tego szkieletu, jak i występowaniem dodatkowych substancji w ścianie. Ściana komórkowa bakterii gramdodatnich. U bakterii gramdodatnich mureina stanowi 30-70% suchej masy ściany komórkowej i składa się z około 40 warstw. W wielu przypadkach zamiast kwasu m-diaminopimelinowego występuje kwas LL-diaminopimelinowy lub L-lizyna. U Staphylococcus aureus boczne łańcuchy tetrapeptydów kwasu muraminowego są połączone mostkami peptydowymi (mostek pentaglicynowy); aminokwasy występujące w mostkach mogą być różne w zależności od bakterii. Specyficzne dla gatunku cechy budowy szkieletu podporowego mogą mieć znaczenie taksonomiczne. Polisacharydy występujące w ścianie komórkowej bakterii gramdodatnich są z nią związane kowalencyjnie. Zawartość białek jest nieznaczna. Charakterystyczna jest obecność kwasów tejchojowych; są to łańcuchy złożone z 8-50 cząsteczek glicerolu lub rybitolu połączonych mostkami fosfoestrowymi. Niektóre kwasy zawierają erytrytol lub mannitol. Kwasy tejchojowe mogą być przyłączone do mureiny poprzez fosforany wiązaniem przypominającym wiązanie amidowe. Ściana komórkowa bakterii gramujemnych. U bakterii gramujemnych sieć mureiny jest jednowarstwowa (ryc. 2.25) i stanowi mniej niż 10% suchej masy ściany komórkowej (u Escherichia coli B). Mureina nie zawiera lizyny, lecz kwas m-diaminopimelinowy i nie występują w niej mostki międzypeptydowe. Budowa woreczków mureinowych, jak się wydaje, jest podobna u wszystkich zbadanych do tej pory bakterii gramujemnych. Oprócz części szkieletowej w skład ściany wchodzą duże ilości lipoprotein, lipopolisacharydów i innych lipidów, które są przyłączone do zewnętrznej powierzchni mureiny. Niektóre z nich są związane kowalencyjnie. Łącznie stanowią one 80% suchej masy ściany komórkowej. Wydaje się, że do zachowania stabilności warstwy lipopolisacha2+ rydowej potrzebne są jony Ca . U wielu bakterii gramujemnych warstwa mureinowa staje się dostępna dla lizozymu, enzymu degradującego

75

mureinę, dopiero gdy jony Ca2+ zostaną usunięte przez działanie EDTA. Ten czynnik chelatujący uwalnia część lipopolisacharydu. U bakterii gramujemnych nie wykryto kwasów tejchojowych. Działanie lizozymu i penicyliny. Do wyjaśnienia budowy ściany komórkowej i mureiny przyczyniły się znacznie badania nad działaniem lizozymu i penicyliny na bakterie. Lizozym, odkryty przez Aleksandra Fleminga (1922), jest enzymem bakteriobójczym występującym w łzach, śluzie jamy nosowej i białku jaja. Został on też wyizolowany z bakterii {Escherichia coli, Streptomyces) i bakteriofagów. Po zadziałaniu lizozymem na zawiesinę bakterii gramdodatnich widać szybkie jej przejaśnienie. Komórki Micrococcus luteus (lysodeikticus) ulegają lizie już przy stężeniu lizozymu 1 μg/ml, natomiast Bacillus megaterium — dopiero przy stężeniu 50 μg/ml. Wiele bakterii gramujemnych ulega lizie jedynie w obecności czynników chelatujących, takich jak EDTA. Lizozym rozszczepia w mureinie wiązania glikozydowe między atomem C-l kwasu N-acetylomuraminowego a atomem C-4 N-acetyloglukozaminy i rozkłada ją do disacharydów GlcNAc-MurNAc (ryc. 2.25). Lizozym jest więc (N-acetylo)-muramidaza. W izotonicznym dla protoplastu roztworze sacharozy (0,1-0,2 M) nie dochodzi do lizy komórek bakteryjnych. W takich warunkach pod wpływem działania lizozymu tworzą się kuliste protoplasty, bardzo wrażliwe na ciśnienie osmotyczne (ryc. 2.26). W środowisku izotonicznym i hipertonicznym są one stabilne, natomiast w podłożu hipotonicznym protoplasty pękają i pozostają po nich jedynie resztki błony cytoplazmatycznej (ang. „ghosts"). Protoplastami należy nazywać tylko takie kuliste komórki, które nie zawierają pozostałości ściany komórkowej,

76

a więc ani kwasu muraminowego, ani kwasu diaminopimelinowego, który nie występuje w białkach. Rozpuszczenie ściany komórkowej nie zakłóca procesów metabolicznych. Protoplasty oddychają tak jak komórki nienaruszone, tworzą spory, jeśli proces sporulacji już wcześniej został rozpoczęty, jednak nie adsorbują się na nich fagi. Oprócz lizozymu istnieje wiele enzymów, które degradują mureinę. Muroendopeptydazy, występujące głównie u bakterii, specyficznie rozszczepiają wiązania peptydowe biorące udział w usieciowaniu mureiny. Jedna z endopeptydaz wyizolowanych z E. coli rozszczepia wiązanie między D-alaniną a kwasem m-diaminopimelinowym (zaznaczone na ryc. 2.25). Inne enzymy rozszczepiają inne wiązania. Penicylina niszczy głównie bakterie gramdodatnie (gronkowce i pneumokoki), ale działa też na wiele komórek gramujemnych (gonokoki, meningokoki, Enterobacteriaceae). Penicylina działa bakteriobójczo na komórki rosnące; komórki nie rosnące, będące w stanie spoczynku, nie są na nią wrażliwe. Najbardziej rzucająca się w oczy zmiana, obserwowana w czasie działania penicyliny na wrażliwe bakterie, to tworzenie przez nie tzw. form L. Powstają one wskutek nadmiernego wydłużenia i pogrubienia komórek oraz wielokrotnego zwiększenia ich objętości w porównaniu z komórką wyjściową (rozdz. 3.19). Te olbrzymie komórki rosną przez pewien czas na podłożach agarowych. W pożywce hipotonicznej penicylina powoduje pękanie rosnących komórek. W pożywce izotonicznej lub hipertonicznej formy cylindryczne zmieniają się w twory kuliste (ryc. 2.27), zwane formami L lub sferoplastami. Te ostatnie różnią się od protoplastów obecnością resztek ściany komórkowej (można wykazać obecność kwasu muraminowego i diaminopimelinowego). Penicylina działa więc na syntezę ściany komórkowej.

77

Biosynteza ściany komórkowej. Biosynteza i łączenie podjednostek budulcowych peptydoglikanu przebiega w trzech etapach (ryc. 2.28). Pierwsza faza biosyntezy zachodzi w cytoplazmie. Tu powstaje muramoilopentapeptyd. Synteza zaczyna się od fosforanu l-N-acetyloglukozoaminy. W następujących po sobie kolejnych reakcjach enzymatycznych zostaje do niego przyłączony mleczan przez wiązanie eterowe, a następnie do mleczanu pięć aminokwasów. W tym czasie rosnąca cząsteczka pozostaje przyłączona do UDP, który służy jako nośnik. Druga faza obejmuje połączenie muramoilopentapeptydu z N-acetyloglukozoaminą i (w przypadku Staphylococcus aureus) przyłączenie pięciu reszt glicynowych. Zachodzi

78

to w błonie cytoplazmatycznej i jest zapoczątkowane przez przeprowadzenie cząsteczki z formy hydrofilowej do lipofilowej poprzez wymianę nośnika UDP na fosforan izoprenoidu C55 (fosforan undekaprenylu), zwany baktoprenolem. Umożliwia to również transport gotowych podjednostek przez błonę cytoplazmatyczną. W trzeciej fazie zachodzi włączenie prekursorów do już istniejącego peptydoglikanu i tworzenie poprzecznych wiązań peptydowych poprzez reakcje transpeptydacji. W reakcji tej dochodzi do rozszczepienia wiązania między dwiema D-alaninami pentapeptydu prekursora, a uwolniona grupa karboksylowa przedostatniej D-alaniny zostaje połączona z grupą aminową lizyny w sąsiednim oligopeptydzie. Zostaje więc uwolniona jedna reszta D-alaniny. W tym czasie zostaje też uwolniona cząsteczka baktoprenolu w formie pirofosforanu, która po usunięciu jednej grupy fosforanowej ponownie wchodzi w cykl biosyntetyczny. Lipidowy baktoprenol służy również jako nośnik innych polimerów pozacytoplazmatycznych, takich jak polisacharydy, lipopolisacharydy i celuloza. Penicylina nie działa na syntezę podjednostek budulcowych mureiny ani na reakcje transglikozylacji, w wyniku których wydłuża się łańcuch cukrowy, ale hamuje transpeptydację, a więc tworzenie wiązań poprzecznych. Pod wpływem penicyliny różne szczepy bakteryjne wydzielają do podłoża nie tylko UDP-muramoilopentapeptyd, ale też nieusieciowane łańcuchy peptydoglikanu. Pochodne penicyliny, a także cefalosporyny, rystocetyny, wankomycyna, bacytracyna i cykloseryna hamują również syntezę mureiny, co może prowadzić do powstania sferoplastów. Mogą one też powstawać pod wpływem glicyny i D-aminokwasów, a także w wyniku „lizy beztlenowej". Osłony bakterii gramujemnych. U bakterii gramujemnych pojedyncza lub, co najwyżej, podwójna warstwa mureiny jest otoczona strukturą zwaną błoną zewnętrzną. Na ultracienkch skrawkach jest ona podobna do błony cytoplazmatycznej. Błona zewnętrzna ma złożoną budowę i w jej skład wchodzą białka, fosfolipidy i lipopolisacharydy (ryc. 2.29). Do warstwy mureiny, poprzez kwas diaminopimelinowy, są przyłączone kowalencyjnie lipoproteiny. Lipofilowe końce lipoprotein są skierowane na zewnątrz mureiny i zakotwiczone (poprzez wiązania hydrofobowe) w podwójnej warstwie lipofilowej. Ta podwójna warstwa zawiera fosfolipidy i hydrofobowe końce lipopolisacharydów. Hydrofilowe końce lipopolisacharydów są skierowane na zewnątrz komórki. 79

Lipopolisacharydy są endotoksynami bakterii gramujemnych. Lipopolisacharydy (LPS) mają duże znaczenie w diagnostyce bakteriologicznej i epidemiologii. Różne szczepy Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae i inne mikroorganizmy odpowiedzialne za infekcje jelitowe różnicuje się dzięki O-swoistemu bocznemu łańcuchowi lipopolisacharydów występujących w ich błonie zewnętrznej. Metody immunologicze pozwalają wykryć nawet niewielkie różnice w budowie tej warstwy. Dzięki zastosowaniu metod serologicznych zidentyfikowano ponad 1000 gatunków i szczepów rodzaju Salmonella, a różnice zostały potwierdzone analizą chemiczną (Westphal). W obrębie rodzaju Salmonella istnieją nawet odmiany lokalne, które można rozpoznać dzięki ich właściwościom

80

immunochemicznym. Pozwala to określić miejsce, gdzie zakaził się pacjent lub zlokalizować źródło epidemii. Można określić np. czy pacjent nabawił się biegunki w danym mieście południowoamerykańskim, czy dalekowschodnim. Wiele szczepów bakteryjnych świeżo wyizolowanych ze środowiska bądź od pacjenta rośnie na podłożu agarowym w formie gładkich, błyszczących kolonii (formy S, ang. smooth). Powierzchnia ich komórek zatrzymuje dużo wody wskutek obecności O-swoistych wielocukrów. Formy S mogą spontanicznie przechodzić w formy R (ang. rough, szorstki), tworzące kolonie płaskie i szorstkie (ryc. 2.30). Te łańcuchy

polisacharydowe dają bakteriom najwidoczniej jakieś korzyści selekcyjne, bowiem w organizmie zwierzęcym są one bardzo odporne na fagocytozę, a więc są wirulentne. Jedynie wytworzenie przeciwciał przez gospodarza i ich połączenie z łańcuchami polisacharydowymi czyni bakterie wrażliwymi na fagocytozę. Wielka różnorodność O-swoistych polisacharydów wśród bakterii patogennych może być wynikiem ciągłej selekcji nowych typów antygenów O (mutantów). Daje to korzyść selekcyjną bakteriom, gdyż gospodarz nie jest w stanie wytworzyć jednocześnie przeciwciał przeciwko setkom antygenów. Lipopolisachacharydy są najbardziej efektywnymi endotoksynami bakterii, wywołującymi gorączkę i biegunkę. 81

Lipopolisacharydy Salmonella typhimurium i innych Enterobacteriaceae zostały bardzo dokładnie zbadane. Mają one trzy główne składniki: lipid A, rdzeń R i O-swoiste łańcuchy cukrowe (ryc. 2.29). Lipid A składa się z disacharydu glukozoaminy, którego grupy hydroksylowe zostały zestryfikowane kwasami tłuszczowymi: C12, C 14 i C 1 6 ; ta część ma charakter hydrofobowy. Za nią występuje część rdzeniowa R, zbudowana z trzech reszt kwasu 2-keto-3-deoksyoktonowego (KDO), które mogą być podstawione fosfoetanoloaminą), następnie dwie cząsteczki heptozy oraz zewnętrzna część rdzenia. Ten ostatni składa się z rozgałęzionych łańcuchów zbudowanych z glukozy, galaktozy i N-acetyloglukozoaminy. Taką podstawową, zunifikowaną strukturę odnajduje się we wszystkich gatunkach Salmonella. W mutantach R trisacharyd KDO stanowi zewnętrzną granicę komórki; nie udało się wyizolować mutantów pozbawionych KDO, są one niezdolne do życia. Łańcuchy cukrowe O-swoiste są przyłączone do rdzenia. Składają się one z długich łańcuchów powtarzających się oligosacharydów, których sekwencja i skład są swoiste dla szczepu. Mogą zawierać galaktozę, mannozę, ramnozę, abekwozę, fukozę, kolitozę i inne cukry, które różnią się w zależności od szczepu. Redukujące końce C-l cukrów są skierowane do wewnątrz. Te zewnętrzne, szczepowo swoiste łańcuchy polisacharydowe, to somatyczne antygeny O, które umożliwiają identyfikację szczepu metodami immunologicznymi (rozdz. 2.2.6).

Funkcje błony zewnętrznej. Błona zewnętrzna bakterii gramujemnych pełni nie tylko rolę mechaniczną, ale ma też ważne znaczenie fizjologiczne. Dwuwarstwowa błona lipidowa składa się z lipidu A (będącego częścią lipopolisacharydu) i fosfolipidów oraz z białek przechodzących przez całą jej grubość. Te transbłonowe białka, zwane porynami, tworzą w lipofilowej błonie kanały wypełnione wodą. Istnieją różne rodzaje poryn. Pozwalają one na wniknięcie do komórki niskocząsteczkowych substancji hydrofilowych o względnym ciężarze około 6000. Przestrzeń peryplazmatyczna. U wielu bakterii przestrzeń występująca między błoną zewnętrzną i warstwą peptydoglikanu, zwana przestrzenią peryplazmatyczną, zawiera znaczną ilość enzymów. Są to np. enzymy biorące udział w rozkładzie substratów (metanol, glukoza) i wykorzystywaniu związków nieorganicznych (SO 4 2 - , NO 3 - ). Niektóre z tych enzymów istnieją w stanie wolnym w roztworze, inne są zakotwiczone w błonie cytoplazmatycznej. Znajdują się tu również enzymy rozkładające białka, polisacharydy, kwasy nukleinowe i inne biopolimery, a także białka wiążące, które działają jako receptory w chemotaksji i transporcie pewnych substratów. Jest prawdopodobne, że stężenie białek w przestrzeni peryplazmatycznej jest zbliżone do stężenia białek w protoplaście.

82

2.2.5. Otoczki i śluzy Zewnętrzną warstwę ścian komórkowych wielu bakterii pokrywają mniej lub bardziej grube warstwy substancji zawierających dużo wody: są to otoczki i śluzy. Nie są one niezbędne do życia, jednak ich obecność sprawia, że niektóre bakterie patogenne są odporne na fagocytozę, co zwiększa ich zjadliwość. Otoczki. Obecność otoczek łatwo można wykazać w mikroskopie świetlnym, stosując barwniki, które nie przechodzą przez materiał otoczkowy, a więc nigrozynę, czerwień Kongo lub tusz chiński. Jeśli zastosujemy tę technikę, zwaną barwieniem negatywnym, widzimy jasne otoczki na ciemnym tle (ryc. 2.31; 2.32). Cieńsze otoczki pneumokoków można uwidocznić przez dodanie homologicznej surowicy, co prowadzi do nagromadzenia na nich białek przeciwciał. Powoduje to, że komórki wyglądają jak spęczniałe (reakcja Neufelda). Większość otoczek składa się z polisacharydów (u Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Xanthomonas sp., maczugowców), które oprócz glukozy zawierają: aminocukry, ramnozę, kwasy 2-keto-3-deoksygalaktonowe, różne kwasy uronowe

83

i kwasy organiczne, takie jak kwas pirogronowy czy kwas octowy. Otoczki niektórych gatunków Bacillus (Β. anthracis, Β. subtilis) składają się z polipeptydów, a szczególnie z kwasu poliglutaminowego. Śluzy. Liczne substancje otoczkowe są wydzielane do środowiska w postaci śluzu. Przez wytrząsanie zawiesiny komórek lub jej homogenizację można oddzielić otoczki od powierzchni komórek i w postaci śluzu wyekstrahować je z pożywki. Wiele mikroorganizmów wytwarza dużo śluzu w podłożu zawierającym sacharozę. Znanym przykładem jest występująca w cukrowniach heterofermentatywna bakteria kwasu mlekowego, Leuconostoc mesenteroides, która w krótkim czasie zamienia roztwory cukru trzcinowego w ciągliwą, kleistą, masę śluzową złożoną z dekstranów. Przemiana ta zachodzi pozakomórkowo i jest katalizowana przez pozakomórkową heksozylotransferazę — sacharazę dekstranową. Dekstran jest polisacharydem, w którym cząsteczki α-D-glukozy są połączone w pozycjach 1,6 (α-l,6-glukan). Równoległe łańcuchy są powiązane w sieć. Dekstran jest substancją stosowaną w lecznictwie zamiast plazmy krwi. Zwiększa on lepkość roztworów wodnych i jest podstawowym składnikiem żeli dekstranowych (sefadeksów). Streptokoki odpowiedzialne za próchnicę zębów, m.in. Streptococcus salivarius i S. mutans, wydzielają inną heksozylotransferazę, która przekształca sacharozę w polifruktozę (lewan). Polisacharyd ten przyczepia się do 84

powierzchni zębów. Na nim właśnie gromadzą się kwaśne produkty fermentacji przeprowadzanej przez streptokoki, a szczególnie kwas mlekowy. Pochewki. Niektóre bakterie nitkowate tworzą rurkowate osłonki, opisywane jako pochewki (Sphaemtilus natans, Leptothrix ochracea). Pochewki te składają się z heteropolisacharydu zawierającego glukozę, kwas glukuronowy, galaktozę i fukozę. Wydzielanie śluzu w określonym miejscu w formie wypustki umożliwia pewnym bakteriom nieznaczną zmianę położenia (Gallionellaferruginea). Śluzy mogą też utrzymywać pojedyncze komórki w zespołach {Zooglea ramigera, ryc. 2.33) i powodować powstawanie kożuchów (Bacteriogloea). Komórki Acetobacter aceti subsp. xylinum wydzielają celulozę, która zespala je tworząc skórzastą błonę („mycoderma aceti"). Komórki Sarcina ventriculi (ryc. 2.34) i Lampropedia hyalina wy-

85

dzielają celulozę, która łączy je w regularne agregaty. Celuloza spełnia tu rolę substancji cementującej i różni się od otoczek strukturalnie oraz funkcjonalnie. Utrata zdolności do wytwarzania celulozy, np. w wyniku mutacji, nie wpływa na wzrost tych mikroorganizmów. Biosynteza. Wszystkie polisacharydy umiejscowione na zewnątrz komórki zwane są egzopolisacharydami. Otoczki i śluzy różnicuje się zgodnie z ich właściwościami fizycznymi. Egzopolisacharydy ściśle związane z powierzchnią komórki nazywa się otoczkami, natomiast związane w sposób luźny bądź występujące w podłożu — śluzami. Biosyntezę egzopolisacharydów charakteryzują dwa wspólne mechanizmy: 1) dekstrany i lewany są tworzone przez enzymy zewnątrzkomórkowe z disacharydów; 2) skład większości egzopolisacharydów jest niezależny od substratów komórkowych. Droga ich biosyntezy jest podobna do biosyntezy mureiny i lipopolisacharydów. We wszystkich trzech procesach uczestniczy trifosforan urydyny (UTP) i lipid — difosforan undekaprenylu. Cukry, aktywowane przez przyłączenie UDP, zostają przyczepione do nośnika lipidowego, następnie przyłączone do gatunkowo swoistej podjednostki budulcowej homo- lub heteropolimeru i przeniesione z protoplastu do zewnętrznych warstw ściany komórkowej, gdzie zostają włączone do wielkocząsteczkowych egzopolisacharydów. 86

2.2.6. Rzęski i ruch Bakterie mogą się poruszać różnymi sposobami. Ruch u większości aktywnie pływających bakterii jest wywołany rotacją rzęsek. Ruch bez rzęsek występuje u bakterii przemieszczających się ruchem ślizgowym (w tym u bakterii śluzowych, sinic i kilku innych grup), a także u krętków. Mechanizm tego sposobu poruszania się zostanie przedstawiony w rozdziałach opisujących wymienione grupy bakterii. Ułożenie rzęsek. Sposób ułożenia rzęsek u ruchliwych bakterii jest ich cechą charakterystyczną i dlatego ma wartość taksonomiczną. U bakterii o kształcie cylindra rzęski mogą być osadzone biegunowo (polarnie) lub bocznie (lateralnie) (ryc. 2.35). Wśród bakterii urzęsionych jednobiegu-

87

nowo (monopolarnie) niektóre mają jedną, ale za to szczególnie grubą rzęskę (urzęsienie monotrychalne — np. Vibrio metschnikovii, ryc. 2.36; Caulobacter sp.). Rzęska u licznych mono- i bipolarnie (dwubiegunowo) urzęsionych bakterii, pozornie wyglądająca i funkcjonująca jako pojedyncza, stanowi w rzeczywistości pęczek złożony z 2 do 50 rzęsek (urzęsienie politrychalne). Monopolarne urzęsienie politrychalne nazywa się urzęsieniem lofotrychalnym (Pseudomonas, Chromatium), bipolarne — urzęsieniem amfitrychalnym (Spirillum). Bakterie z rodzaju Selenomonas mają pęczek rzęsek osadzony bocznie (lateralnie) (ryc. 2.37B). U bakterii urzęsionych perytrychalnie (Enterobacteriaceae, Bacillaceae i innych) rzęski są osadzone wzdłuż komórki lub na całej jej powierzchni (ryc. 2.37A). Identyfikacja rzęsek. Rzęski lub pęczki rzęsek można rozpoznać u niektórych bakterii w zwykłym mikroskopie świetlnym lub z kontrastem fazowym, np. u Chromatium okenii, Bdellovibrio, Thiospirillum (ryc. 2.38). 88

89

U wielu innych bakterii rzęski i ich ruchy można wykazać jedynie w ciemnym polu {Pseudomonas, Spirillum). Na ogól rzęski najłatwiej jest uwidocznić stosując specjalne barwniki albo napylenie metalem bądź też w mikroskopie elektronowym (ryc. 2.39). Działanie rzęsek. W większości przypadków urzęsienia biegunowego rzęska działa jak śruba okrętowa, która jak gdyby przeciska bakterię przez środowisko. Rzęska składa się ze spiralnie zwiniętych włókien, które są kierowane przez „rotacyjny motor" znajdujący się w miejscu zakotwiczenia rzęski w błonie cytoplazmatycznej i obracają się wokół osi fikcyjnej spirali. Ruch ten może być wykonywany przez pojedynczą rzęskę lub przez pęczek rzęsek. Rzęski obracają się ze względnie dużymi częstot-

90

liwościami, w przypadku bakterii spiralnych około 3000 obrotów na minutę, tzn. podobnie do szybkości silnika elektrycznego średniego rozmiaru. Ciało bakterii obraca się przy tym w kierunku odwrotnym do ruchu rzęsek, lecz 3 razy wolniej. Rzęski mogą zmienić kierunek ruchu albo spontanicznie, albo w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne (ryc. 2.35). U niektórych bakterii o urzęsieniu polarnym zmiana orientacji ruchu rzęsek powoduje poruszanie się komórki w przeciwną stronę. U np. Chromatium okenii, pod wpływem bodźca świetlnego, zmiana kierunku rotacji pęczka rzęsek powoduje zmianę kierunku ruchu; działają one wówczas jako rzęski ciągnące. Szybkość ruchu wstecznego stanowi tylko 1/4 szybkości ruchu do przodu i prowadzi do „koziołkowania". U Thiospirillum jenense, olbrzymiej, spiralnej bakterii fototroficznej o urzęsieniu jednobiegunowym, pęczek rzęsek przy ruchu wstecznym nie jest skierowany do przodu, lecz rozciąga się nad powierzchnią komórki jak parasolka odwrócona przez wiatr. Podobnie wygląda to u bakterii spiralnych o urzęsieniu amfitrychalnym. Perytrychalnie ułożone rzęski u Escherichia coli działają jak dobrze skoordynowana wiązka helikalna i przepychają komórkę przez podłoże. Zmiana kierunku rotacji rzęski powoduje „koziołkowanie". Prawdopodobnie rzęski ułożone perytrychalnie nie mogą ciągnąć komórki. Urzęsione bakterie mogą poruszać się bardzo szybko. Bacillus megaterium osiąga prędkość 1,6 mm/min, a Vibrio cholerae 12 mm/min. Zatem w ciągu minuty pokonują odległość 300-3000 razy większą niż długość ich ciała. Ultrastruktura rzęsek. Rzęski składają się z helikalnie zwiniętych łańcuchów białkowych. Różne bakterie mają rzęski o różnej średnicy (12-18 nm), długości (do 20 μmι ) oraz długości skoku helisy. Parametry te są swoiste dla szczepu, chociaż nieliczne bakterie mogą mieć kilka typów rzęsek. Włókienka rzęsek są złożone z podjednostek zbudowanych z jednego typu białka — flagelliny, o względnie małym ciężarze cząsteczkowym. Podjednostki te ułożone są spiralnie wokół osiowego cylindra (podobnie do wirusa mozaiki tytoniu; rozdz. 4.1). Tak więc struktura rzęsek jest określona przez właściwości podjednostek białkowych. Rzęski składają się z trzech części: opisanego powyżej włókna, ciała podstawowego oraz z haka, który łączy obie te części. Za pomocą haka 91

rzęska jest zakotwiczona w błonie i ścianie komórkowej (ryc. 2.40). U bakterii gramujemnych ciało podstawowe jest zbudowane z dwóch par pierścieni, przez które przechodzi centralny rdzeń. Zewnętrzna para (pierścienie L i P) leży w płaszczyźnie zewnętrznej i wewnętrznej warstwy ściany komórkowej, a para wewnętrzna (pierścienie S i M) — na poziomie zewnętrznej warstwy błony cytoplazmatycznej. To, że bakterie gramdodatnie nie mają zewnętrznej pary pierścieni, świadczy, że jedynie pierścienie wewnętrzne są niezbędne do ruchu rzęsek. Uważa się, że być może pierścień Μ działa jako napęd, a pierścień S jako przypora na wewnętrznej powierzchni peptydoglikanu. Mechanizm działania motoru rotacyjnego rzęski na poziomie molekularnym nie jest jeszcze znany. Antygeny O i H. Proteus vulgaris rozprzestrzenia się często w postaci cienkiej, szarej błony na całej powierzchni agaru. Wynika to z dużej ruchliwości tej bakterii. Komórki rozprzestrzeniają się jakby niesione podmuchem (niem. Hauch) i stąd nazwa formy H. Niektóre szczepy nie mają tej właściwości (niem. „ohne Hauch" — i stąd nazwa formy O). Są to szczepy nieruchliwe, pozbawione rzęsek. Na takich obserwacjach oparte są niektóre pojęcia serodiagnostyki bakteryjnej. Stąd też antygeny zawarte na powierzchni bądź wewnątrz komórki (somatyczne) określa się jako antygeny O, natomiast antygeny rzęskowe — jako antygeny H. Fimbrie i pilusy. Powierzchnia niektórych bakterii pokryta jest pewną ilością (od 10 do kilku tysięcy) długich, cienkich i prostych nici, o średnicy 3-25 nm i długości do 12 μm. Określa się je mianem fimbrii lub pilusów. Występują one zarówno u gatunków urzęsionych, jak i nieurzęsionych. Należy odróżnić pilusy typu I od pilusów płciowych typu F. Obecność tych ostatnich stwierdzono w komórkach dawców 92

Escherichia coli K12, a więc w szczepach zawierających czynnik płciowy F (szczepy F+ i Hfr). Pilusy F występują w komórce tylko pojedynczo lub po dwa. Są to puste rurki białkowe o długości 0,5 do 10 μm. Chemotaksja. Swobodnie poruszające się bakterie są również zdolne do wykonywania ruchów ukierunkowanych — taksji. W zależności od czynnika środowiskowego wyzwalającego ruch mówi się o chemotaksji, aerotaksji, fototaksji lub magnetotaksji. Gdy ruchliwe bakterie reagują na sygnały chemiczne, to gromadzą się w pewnym miejscu bądź uciekają z innego. Takie zachowanie w odpowiedzi na bodziec chemiczny zwane jest chemotaksja. Przyciąganie bakterii przez bodźce chemiczne zachodzi następująco (ryc. 2.41). Bakterie o urzęsieniu perytrychalnym poruszają się na dwa sposoby: pływają prosto i koziołkują. Koziołkowanie zatrzymuje ruch po linii prostej i powoduje zmianę kierunku ruchu. Jeżeli umieścimy bakterię w gradiencie stężenia jakiegoś atraktanta, to ruch prostoliniowy będzie trwał wiele sekund, jeśli zachodzi w kierunku optymalnego stężenia atraktanta; jeśli w przeciwnym, to zostanie zatrzymany po kilku sekundach. Koziołkowanie prowadzi do zupełnie przypadkowego wyboru nowego kierunku pływania. Ruch prostoliniowy, którego długość trwania zależy od kierunku, powoduje zgromadzenie bakterii w miejscu, gdzie stężenie substratu jest optymalne. Za odbiór bodźców i odpowiedź na nie są odpowiedzialne swoiste chemoreceptory. W niektórych przypadkach są one niezależne od zdolności

93

bakterii do asymilacji substratu. Tak więc pewne mutanty wykazują nie zmienione reakcje chemotaktyczne na określone składniki odżywcze, chociaż utraciły zdolność do ich wykorzystania. Aerotaksja. Na podstawie ruchów aerotaktycznych oraz skupiania się komórek w określonych odległościach od brzegów szkiełka nakrywkowego można u bakterii ruchliwych scharakteryzować typ przemiany materii w zależności od ich stosunku do tlenu. W zawiesinie bakterii znajdujących się między szkiełkiem podstawowym a nakrywkowym organizmy aerofilne skupiają się przy brzegach szkiełka nakrywkowego lub w pobliżu pęcherzyków powietrza. Wykazują tym samym, że wymagają warunków tlenowych, a potrzebną im energię czerpią z procesów oddychania tlenowego (ryc. 2.42). Bakterie ściśle beztlenowe skupiają się na środku.

w strefę zaciemnioną rzęski zmieniają kierunek obrotów i bakterie wracają do strefy oświetlonej. Zmiana kierunku następuje tak szybko, że reakcja ta została opisana pod nazwą „reakcji przestraszenia" (fobotaksja). Wystarczy nawet niewielka różnica w oświetleniu, aby ją wywołać. Małe komórki Chromatium skupiają się w oświetlonym polu, które zawiera zaledwie 0,7% więcej światła aniżeli otoczenie. Ich wrażliwość na kontrasty świetlne jest więc zbliżona do wrażliwości oka ludzkiego (0,4%). Magnetotaksja. Ostatnio stwierdzono, że wiele bakterii (pałeczki, krętki i ziarniaki) wyizolowanych z wierzchnich warstw osadów w stawach, a także w morzach, orientuje się w polu magnetycznym i pływa wzdłuż linii sił pola. Zawierają one niezwykłe ilości żelaza. (0,4% suchej masy) w postaci ferromagnetycznego tlenku żelaza (magnetytu), tworzącego magnetosomy, które są umieszczone blisko miejsca zakotwiczenia rzęsek. Bakterie wyizolowane na półkuli północnej dążą w kierunku północnego bieguna magnetycznego; linie pola są skierowane ku dołowi pod kątem około 70°. Magnetotaktyczne właściwości pozwalają więc bakteriom migrować ku dołowi, w stronę ubogich w tlen bądź pozbawionych tlenu osadów dennych. Bakterie magnetotaktyczne są beztlenowcami lub mikroaerofilami, ich zachowanie znajduje więc wytłumaczenie ekologiczne. Przeniesienie tych mikroorganizmów na półkulę południową powoduje ich śmierć. Tylko nieliczne, „przeciwnie namagnesowane bakterie", mogą rosnąć i mnożyć się. Wydaje się, że kierunek namagnesowania nie jest kodowany genetycznie.

2.2.7. Materiały zapasowe i inne inkluzje komórkowe Liczne mikroorganizmy, w określonych warunkach środowiska, odkładają wewnątrz komórki substancje, które można uważać za materiały zapasowe. Są to wielocukry, tłuszcze, polifosforany i siarka. Materiały te są gromadzone, gdy w podłożu znajdują się składniki potrzebne do ich syntezy, ale gdy jednocześnie wzrost jest ograniczany lub zatrzymany wskutek braku jakiegoś składnika pokarmowego bądź obecności jakiegoś czynnika hamującego. Wspomniane materiały zapasowe znajdują się w komórce w postaci osmotycznie nieczynnej i są nierozpuszczalne w wodzie. W warunkach sprzyjających wzrostowi substancje zapasowe są w razie potrzeby ponownie włączane w metabolizm komórki. Zapasowe polisacharydy, obojętne lipidy i kwas poli-β-hydroksymasłowy mogą być dla komórki źródłem

95

węgla oraz energii, co przy braku odpowiedniego źródła energii w środowisku może przedłużyć czas życia bakterii albo np. u bakterii przetrwalnikujących — umożliwić tworzenie przetrwalników. Polifosforany mogą stanowić zapasy fosforanów, a siarka może być donorem elektronów. Polisacharydy. Węglowodany zapasowe występujące w komórkach mikroorganizmów nie są jeszcze dokładnie zbadane pod względem chemicznym. U niektórych mikroorganizmów można rozpoznać polisacharyd na podstawie reakcji barwnej z płynem Lugola. Skrobia daje w tej reakcji zabarwienie niebieskie, a glikogen brunatne. W przeciwieństwie do polisacharydów występujących w ścianie komórkowej, wielocukry zapasowe są zbudowane wyłącznie z reszt α-D-glukozy, której cząsteczki są połączone wiązaniami α-glikozydowymi w pozycji 1,4 i tworzą łańcuchy z licznymi rozgałęzieniami (ryc. 14.3).

Wiązania α-glikozydowe powodują, że łańcuchy glukozy nie są proste, lecz spiralnie skręcone. Skrobia magazynowana w postaci ziaren w komórkach roślinnych składa się z amylozy i amylopektyny. Amyloza stanowi 20-30% i daje z jodem reakcję barwną (niebieskie zabarwienie) wskutek odkładania się jodu w spiralnych skrętach łańcuchów glukozy. Substancję podobną do skrobi, występującą u bakterii z rodzaju Clostridium, opisano pod nazwą „granulozy". Komórki Clostridium butyricum wypełnione są małymi ziarnistościami tej substancji, jedynie biegun, gdzie tworzy się przetrwalnik, jest ich pozbawiony. Skrobię zawiera też Acetobacter pasteurianus i wiele gatunków Neisseria. Glikogen, znany też jako „skrobia zwierzęca", jest podobny do amylopektyny, ale jeszcze bardziej rozgałęziony (wiązania w pozycji 1,6). Wydaje się, że występuje on u bakterii częściej niż skrobia. Glikogen spotyka się u drożdży i innych grzybów, a także u laseczek {Bacillus polymyxa), Salmonella, Escherichia coli (ryc. 2.43) i innych Enterobacteriaceae, u Micrococcus luteus i przedstawicieli rodzaju Arthrobacter. 96

Substancje tłuszczowe. Wewnątrzkomórkowe ziarna i kropelki tłuszczu występują u mikroorganizmów bardzo często. Można je rozpoznać w mikroskopie optycznym dzięki silnemu załamywaniu światła, a także wybarwić je barwnikami lipofilowymi (sudan III lub czerń sudanowa B).

U bardzo wielu bakterii „sudanofilne" ziarnistości składają się z kwasu poli-β-hydroksymasłowego (ang. poly-hydroxy-butyrate — PHB), poliestru rozpuszczalnego w chloroformie, lecz nierozpuszczalnego w eterze, zbudowanego z łańcuchów zawierających około 60 reszt kwasu β-hydroksymasłowego. Może on stanowić aż 90% suchej masy komórki. Kwas ten jest gromadzony przez wiele bakterii tlenowych (ryc. 2.44), przez sinice i beztlenowe bakterie fototroficzne (ryc.2.45A). Bakterie względnie i ściśle tlenowe gromadzą go, gdy komórki są pozbawione tlenu i muszą przeprowadzać fermentację. PHB można więc uważać za wewnątrzkomórkowy, polimeryczny produkt fermentacji. W warunkach tlenowych PHB może zostać wykorzystany jako źródło węgla i energii w metabolizmie oksydacyjnym. Niektóre bakterie mogą, oprócz PHB, wytwarzać i inne kopolimery. Jeśli np. dostarczyć im jako substrat kwas propionowy lub β-hydroksywalerianowy, to tworzone są polimery składające się z kwasu β-hydroksymasłowego i β-hydroksywalerianowego. Mogą też występować inne 97

kwasy gamma-hydroksytłuszczowe, a także długołańcuchowe hydroksykwasy (C8, C 10 , C 12 ); te wszystkie materiały zapasowe często określa się jako polihydroksykwasy tłuszczowe lub hydroksypolialkany (PHA). PHA mają 98

właściwości termoplastyczne, można by więc stosować je jako nowy rodzaj mas plastycznych, tym przewyższających polipropylen i polietylen tym, że są biodegradowalne. Tłuszcze obojętne (trójglicerydy) są magazynowane głównie w wodniczkach u drożdży i innych grzybów. Pod względem strukturalnym przypominają one tłuszcze występujące u organizmów wyższych. U drożdży (Candida, Rhodotorula) mogą stanowić aż 80% suchej masy. Prątki, nokardie i promieniowce gromadzą w wodniczkach lub też wydzielają do środowiska inne substancje tłuszczopodobne. Prątki mogą zawierać do 40% wosków (estry długołańcuchowych kwasów tłuszczowych i alkoholi). Tłuszcze zapasowe można izolować bezpośrednio z komórki, a ich zawartość w komórce zależy od warunków pokarmowych (wysoki stosunek C/N). Zawartość innych frakcji lipidowych jest natomiast tylko w nieznacznym stopniu zależna od warunków środowiska. Lipidy te są uwalniane dopiero po hydrolizie białek i polisacharydów; są składnikami lipoprotein (w błonie cytoplazmatycznej i innych błonach) oraz lipopolisacharydów. Polifosforany. Wiele bakterii i zielenic gromadzi w komórkach kwas fosforowy pod postacią ziaren polifosforanów. Ze względu na to, że po raz pierwszy ziarna takie opisano u Spirillum volutans nazywa się je ziarnami „wolutyny", a z powodu charakterystycznej zmiany zabarwienia (metachromatyczność), jakiej ulegają one pod wpływem pewnych barwników (błękit metylenowy, błękit toluidyny), określa się je również jako ziarnistości „metachromatyczne". Składają się one głównie z długołańcuchowych polifosforanów typu soli Grahama; wykrywane często podczas analiz metafosforany pierścieniowe są prawdopodobnie artefaktami pochodzącymi z rozkładu polifosforanów. Ziarna wolutyny są magazynem fosforanów, z których komórka korzysta przy ich braku w podłożu, i dzięki nim może podzielić się kilkakrotnie.

99

Siarka. Bakterie utleniające siarczki do siarczanów przejściowo gromadzą w komórkach siarkę w postaci kuleczek silnie załamujących światło. Zarówno siarka magazynowana w komórce, jak i ta wydzielana na zewnątrz, jest początkowo w formie ciekłej i stopniowo krystalizuje w odmianę ortorombową. Ilość nagromadzonej siarki zależy od stężenia siarkowodoru w środowisku; przy braku siarkowodoru nagromadzona siarka zostaje utleniona do siarczanu. Dla bakterii tlenowych utleniających siarkowodór siarka może być źródłem energii {Beggiatoa, Thiothrix, Achromatiwn, Thiovulum, ryc. 2.46), a dla beztlenowych, fototroficznych bakterii purpurowych jest donorem elektronów (Chromatiuni). Uważa się, że inkluzje siarki znajdujące się w komórkach sinic i Sphaerotilus natans mogą być produktami detoksykacji siarkowodoru, obecnego często w miejscach występowania tych mikroorganizmów.

Inne inkluzje komórkowe. W komórkach Bacillus thuringiensis i gatunków pokrewnych (B. laterosporus, B. medusa) do przetrwalników przylegają inkluzje w postaci kryształków (ryc. 3.9). Te parasporowe „kryształy" są zbudowane z białka. Gdy białko zostanie rozpuszczone w sokach

100

jelitowych wrażliwych owadów (gąsienice motyli), to uwolniona toksyna niszczy nabłonek ich jelita, co prowadzi do śmierci gąsienic. Odpowiednie preparaty z tych laseczek, szkodliwe dla określonych grup owadów, stosuje się jako skuteczne pestycydy biologiczne. Wakuole gazowe. Wiele bakterii wodnych, szczególnie gatunki fototroficzne, ale też gatunki nie zawierające barwników {Pelonema, Peloploca) i gatunki halobakterii (Halobacterium halobium) oraz nieliczne klostridia mają wakuole gazowe. Wakuole te umożliwiają komórkom zmianę gęstości i unoszenie się w wodzie. Zdolność do unoszenia się w wodzie dzięki wakuolom gazowym pozwala niektórym bakteriom nie posiadającym rzęsek (umożliwiających aktywne poruszanie się) na pozostawanie w określonej warstwie wody, gdzie warunki bytowania są dla nich optymalne. Beztlenowe fototrofy, w tym bakterie purpurowe (Lamprocystis, Amoebobacter, Thiodictyon) i zielone (Pelodictyoń), rosną w strefie beztlenowej (hipolimnion) tuż poniżej termokliny (ryc. 17.2). Ich gęstość pławna umożliwia im unoszenie się w zimnej (ciężkiej) warstwie wody hipolimnionu, ale nie pozwala na uniesienie się do cieplejszej warstwy leżącej powyżej. Tlenowe fototrofy, sinice (Oscillatoria agardhii, Aphanizomenon flos-aquae, Microcystis aeruginosa) rozwijają się powyżej termokliny. Unoszenie się tych organizmów jest, jak się wydaje, regulowane przez fotosyntezę, turgor komórkowy oraz ilość i wielkość wakuol gazowych. Każda wakuola gazowa składa się z kilku lub wielu pęcherzyków gazowych o kształcie wrzecionowatym (stożkowato zakończone cylindry). Ich ściany, o grubości jedynie 2 nm, nie mają typowej budowy błonowej, lecz składają się z czystych białek o układzie listkowym. Na mikrofotografiach elektronowych, w części cylindrycznej pęcherzyków widać jakby układ żeber, ułożonych jak obręcze na beczce. Białko ściany składa się podjednostek o względnym ciężarze cząsteczkowym 14xl03. Białka są tak ułożone, że ich powierzchnia hydrofobowa skierowana jest do środka pęcherzyka, a powierzchnia hydrofilowa na zewnątrz. W komórce pęcherzyki gazowe ułożone są równolegle do siebie. Utworzone z nich wakuole wyglądają w mikroskopie świetlnym jak puste przestrzenie, silnie załamujące światło. Karboksysomy. Niektóre bakterie autotroficzne mają karboksysomy. Są to twory o kształcie wielościanów i wielkości zbliżonej do główki bakteriofagów. Zawierają one enzym — karboksylazę rybulozo-l,5-bisfosforanową. Karboksysomy znaleziono u Nitrosomonas, Thiobacillus i u wielu sinic. 101

Ziarna cyjanoficyny. Wśród prokariotów tylko sinice mogą magazynować związany azot. Mają one ziarna cyjanoficyny, które składają się ze specyficznych polipeptydów (rozdz. 3.2.1).

2.2.8. Endospory i inne formy przetrwalne Zdolność do wytwarzania endospor (przetrwalników) ma tylko mała grupa bakterii. Szczególne znaczenie endospor wynika z ich wyjątkowej ciepłooporności. Podczas gdy wszystkie inne bakterie i komórki wegetatywne form prztrwalnikujących giną po 10-minutowym ogrzewaniu w temp. 80°C (pasteryzacja), to endospory wytrzymują znacznie dłuższe ogrzewanie, niektóre nawet wielogodzinne gotowanie. W celu zniszczenia endospor stosuje się pracochłonną i kosztowną technikę sterylizacji (wyjaławiania). Z drugiej strony, ciepłooporność endospor można wykorzystać do selektywnego izolowania bakterii przetrwalnikujących. Ogrzewanie próbek gleby czy innego materiału przez 10 min w temp. 80 do 100°C powoduje śmierć wszystkich komórek wegetatywnych; tylko ciepłooporne endospory zachowują żywotność i mogą kiełkować po wysianiu ich na odpowiednie podłoże. Klasyfikacja bakterii przetrwalnikujących. Wszystkie bakterie przetrwalnikujące, z jednym wyjątkiem, mają kształt cylindryczny i są gramdodatnie. Większość z nich to bakterie ruchliwe o urzęsieniu perytrychalnym. Gatunki z rodzaju Bacillus są bezwzględnymi lub względnymi tlenowcami. Przetrwalnikujące beztlenowce należą do rodzajów Clostridium i Desulfotomaculum. Klostridia uzyskują energię w procesie fermentacji, a Desulfotomaculum dzięki oddychaniu beztlenowemu, z siarczanem jako ostatecznym akceptorem elektronów. Sporolactobacillus należy do grupy bakterii mlekowych. Sporosarcina ma wprawdzie komórki kuliste, ale na podstawie jej cech fizjologicznych można by ją zaliczyć do rodzaju Bacillus. Bakterie przetrwalnikujące mają bardzo małą zawartość GC, a klostridia, u których zawartość GC wynosi 20-27%, najmniejszą ze wszystkich prokariotów. Wykrywanie endospor. Endospory w mikroskopie optycznym można łatwo rozpoznać dzięki temu, że silnie załamują światło, podobnie jak odwodnione białka. Wskazuje to, że zawierają one dużą ilość materiału bogatego w białko, skondensowanego w małej objętości. W sporze 102

zawarta jest bowiem prawie cala sucha masa komórki macierzystej, chociaż jej objętość jest dziesięć razy mniejsza. W przypadku wątpliwości, czy mamy do czynienia z endosporami, należy zastosować odpowiednią metodę barwienia. Jeśli utrwalony preparat bakterii zabarwimy na gorąco fuksyną karbolową, to endospory przyjmą ten barwnik i nie odbarwią się po przemyciu etanolem, ani 1M kwasem octowym, odbarwią się natomiast komórki wegetatywne. Tworzenie endospor. Endospory powstają wewnątrz komórki bakteryjnej, a proces ich tworzenia rozpoczyna się od nagromadzenia substancji białkowej, czemu towarzyszy wzrost współczynnika załamania światła. Zachodzące przy tym przemiany metaboliczne odbywają się kosztem materiałów zapasowych (kwasu poli-β-hydroksymasłowego u tlenowców i polisacharydów u beztlenowców). W ciągu pierwszych pięciu godzin sporulacji większość białek komórki macierzystej ulega rozkładowi. Wytwarzany jest kwas dipikolinowy (kwas pirydyno-2,6-dikarboksylowy), związek swoisty tylko dla endospor, nie występujący w komórkach wegetatywnych. W czasie syntezy kwasu dipikolinowego gromadzone są wybiórczo jony wapnia; w dojrzałych sporach dipikolinian chelatuje wapń i może stanowić do 10-15% suchej masy spory. Kwas dipikolinowy jest umiejscowiony w protoplastach endospor i tylko w nich występuje (ryc. 2.47 i 2.48).

103

Sporulacja jest jednym z najbardziej złożonych procesów różnicowania u bakterii. Zaczyna się specyficznym, nierównym podziałem komórki (ryc. 2.47). Na skutek przewężenia błony cytoplazmatycznej następuje oddzielenie części protoplastu od komórki macierzystej. Ten protoplast spory zawiera część materiału genetycznego, a mianowicie jeden genom. Między obu protoplastami nie dochodzi jednak do utworzenia ściany komórkowej, jak dzieje się to w czasie normalnego podziału komórki. Protoplast endospory zostaje stopniowo otaczany przez błonę cytoplazmatyczną komórki macierzystej. W wyniku tego protoplast spory jest już otoczony dwiema błonami cytoplazmatycznymi, które biorą udział w syntezie ściany przetrwalnika. Błona protoplastu spory syntetyzuje na zewnątrz ścianę komórkową przyszłej kiełkującej komórki, a błona pochodząca 104

z komórki macierzystej syntetyzuje do wewnątrz korteks. Korteks składa się z wielu warstw peptydoglikanu, który różni się, na przykład, od mureiny komórek wegetatywnych stopniem usieciowania. Zewnętrzna osłona spory jest tworzona przez komórkę macierzystą i składa się głównie z polipeptydów. U nielicznych bakterii (np. Bacillus cereus) komórka macierzysta tworzy jeszcze jedną, dodatkową, luźną osłonę polipeptydową — egzosporium. Osłony, z powodu wielowarstwowej budowy, mogą stanowić do 50% objętości bądź też suchej masy dojrzałej endospory. Inicjacja sporulacji. W cyklu życiowym laseczek nie zawsze wytwarzają się endospory. W dogodnych warunkach pokarmowych wegetatywne komórki laseczek mogą przez czas nie ograniczony rozmnażać się przez podział. Dopiero brak substancji odżywczych lub nagromadzenie produktów przemiany materii prowadzi do tworzenia się spor. Przetrwalniki powstają więc tylko w pewnych określonych warunkach sprzyjających temu procesowi, z tym że wysuszenie nie powoduje powstawania endospor. Jeżeli komórki wegetatywne zostaną przeniesione do wody destylowanej, to następuje „sporulacja endotroficzna", tzn. wytwarzanie spor kosztem wewnątrzkomórkowych materiałów zapasowych. Proces tworzenia endospor jest więc zapoczątkowany brakiem odpowiednich substratów w środowisku. Indukcja sporulacji zachodzi w ciągu kilku godzin. Jeżeli do zawiesiny komórek Bacillus cereus var. mycoides w ciągu pierwszych 5 godzin po przeniesieniu ich do wody dodamy glukozę, to nie dochodzi do wytwarzania endospor, a więc dodana glukoza hamuje sporulację. Jeśli jednak glukozę dodamy po okresie dłuższym niż 6 godzin, to nie zahamuje ona procesu wytwarzania przetrwalników. Indukcja (derepresja) sporulacji jest nieodwracalna i około 90% komórek wytworzy endospory między dziesiątą a trzynastą godziną po przeniesieniu do wody. Sporulacja jest zatem regulowana przez czynniki środowiskowe. Liczbę komórek sporulujących można zwiększyć przez dodanie soli magnezu do podłoża. Zdolność do tworzenia spor może być stopniowo tracona przez ciągłe pasażowanie komórek wegetatywnych. Zawiesiny szczepów zdolnych do tworzenia spor zawierają zarówno komórki wegetatywne, jak i spory (w odpowiednich warunkach). Aby więc utrzymać lub nawet zwiększyć zdolność hodowli do sporulacji, poddaje się ją krótkiemu ogrzaniu w temperaturze bliskiej 100°C. 105

Właściwości dojrzałych endospor. Endospory zostają uwolnione po autolizie komórki wegetatywnej. Dojrzałe endospory nie wykazują dostrzegalnego metabolizmu i są bardzo odporne na ogrzewanie, promieniowanie i czynniki chemiczne. Ich ciepłooporność wynika z małej zawartości wody. Spory Bacillus megaterium zawierają np. 15% wody, a więc w przybliżeniu tyle co wełna lub sucha kazeina. Bardzo odporne na wysoką temperaturę są też zliofilizowane komórki wegetatywne, a ciepłooporność endospor wydaje się proporcjonalna do zawartości w nich kwasu dipikolinowego. Większa odporność przetrwalników niż komórek wegetatywnych na promieniowanie jest w przybliżeniu proporcjonalna do liczby mostków dwusiarczkowych w zewnętrznych warstwach białkowych. Osłony endospor zawierają głównie białko bogate w cysteinę, podobne do keratyny. Odporność chemiczna spor wynika z nieprzepuszczalności ich osłon dla wielu związków chemicznych. Kiełkowanie endospor. Większość spor na odpowiednich podłożach może wykiełkować. Zdolność tę można zwiększyć przez właściwe przechowywanie i traktowanie, np. krótkie ogrzanie. Najlepszym postępowaniem stymulującym kiełkowanie endospor Bacillus subtilis jest pięciominutowe ogrzewanie w wodzie o temperaturze 60°C, po siedmiodniowym okresie spoczynku. Inne spory mogą być „aktywowane" przez ogrzewanie we wrzącej wodzie przez 10 minut. Szok cieplny musi być zastosowany tuż przed umieszczeniem spor w podłożu, na którym będą kiełkowały, gdyż wydaje się, że procesy aktywacji są odwracalne. Kiełkowanie endospor jest poprzedzone pobieranien przez nie wody i pęcznieniem. W pewnych przypadkach proces ten jest zależny od obecności glukozy, aminokwasów, nukleozydów lub innych substancji. W czasie kiełkowania zachodzą głębokie zmiany fizjologiczne: wzrasta gwałtownie intensywność oddychania i aktywność enzymatyczna, wy-

106

dzielane są aminokwasy, kwas dipikolinowy i peptydy; utrata suchej masy spory wynosi 25-30%. Podczas kiełkowania spora traci ciepłooporność. Kiełkująca komórka wydostaje się z niej biegunowo lub bocznie, drążąc albo rozrywając jej osłony (ryc. 2.49). Jest ona otoczona bardzo cienką i być może niekompletną ścianą komórkową, co ułatwia pobieranie DNA (patrz: transformacja). Okres przeżywania endospor. W postaci endospor bakterie mogą przetrwać w stanie uśpienia metabolicznego długi okres. W glebie przylegającej do roślin przechowywanych w herbarium Kew Gardens (Anglia) i pozostającej przez 200-320 lat w stanie wysuszonym wykazano obecność nielicznych, zdolnych do życia endospor B. subtilis i B. licheniformis. W próbkach 50-100-letnich stwierdzono również obecność B. coagulans i B. circulans. Na podstawie podobnych badań wykazano, że w ciągu 50 lat przechowyania suchych prób gleby 90% endospor utraciło żywotność. Jednak nawet po upływie 1000 lat w 1 tonie suchej gleby można jeszcze znaleźć zdolne do życia spory. Wiele bakterii przez długi czas zachowuje żywotność w stanie wysuszonym. W celu przechowywania bakterii, komórki wegetatywne poddaje się zamrożeniu, a następnie wysuszeniu przez sublimację (liofilizacja) i trzyma w temperaturze pokojowej lub niższej, w próżni. Becquerel obliczył, że w temperaturach bliskich zera absolutnego mikroorganizmy mogłyby przetrwać miliony lat. Ekstrapolacja krótkotrwałych doświadczeń z ciekłym azotem zdaje się potwierdzać słuszność tych obliczeń. Bakterie źle znoszące liofilizację można przechowywać przez całe lata w temperaturze ciekłego azotu.

Inne formy przetrwalne (cysty, egzospory, miksospory). Endospory wykazują największą, ze wszystkich form przetrwalnych wytwarzanych przez bakterie, odporność na ciepło, wysychanie, promieniowanie i czynniki chemiczne. Nieliczne bakterie posiadają jednak innego rodzaju formy przetrwalne: cysty i egzospory. Istnienie egzospor stwierdzono jedynie u bakterii wykorzystującej metan, Methylosinus trichosporium. Egzospory tworzone w wyniku pączkowania komórki wegetatywnej mają takie same właściwości jak endospory rodzaju Bacillus. Niektóre bakterie tworzą okrągłe, grubościenne komórki zwane cystami. Powstają one, gdy zostaną wyczerpane składniki odżywcze. W cystę zostaje przekształcona cała cylindryczna komórka wegetatywna, a nie tylko jej część, jak przy 107

tworzeniu endospor. Cysty gatunków należących do rodzaju Azotobacter i Methylocystis są odporne na wysychanie, mechaniczne naprężenia i promieniowanie, ale nie na ciepło. Podobna przemiana cylindrycznych komórek wegetatywnych rodzaju Myxococcus i Sporocytophaga zachodzi przy tworzeniu miksospor. Komórki rodzaju Arthrobacter (A. globiformis) są pleomorficzne. W obecności dużej ilości substratów tworzą komórki cylindryczne; gdy substraty zostają wyczerpane, komórki stają się kokoidalne. Arthrobacter należy do tych bakterii, które mogą przetrwać pewien okres w stanie wysuszenia, np. w wyschniętej glebie. Nieznane jest jednak u tego rodzaju żadne zróżnicowanie strukturalne.

2.2.9. Barwniki bakterii i grzybów Kolonie wielu bakterii i grzybów mają zróżnicowane zabarwienie, które zawdzięczają barwnikom wydzielanym do środowiska lub też zawartym w ich komórkach. Zdolność do wytwarzania barwników jest uwarunkowana genetycznie, a więc stanowi cechę diagnostyczną. Formy barwne są łatwiejsze do rozpoznania i identyfikowania. Wiele barwników to pochodne takich związków, jak: karotenoidy, fenazyny, pirole, azochinony, antocyjany i inne (ryc. 2.50). Ochrona przed światłem i promieniowaniem UV. Na złożonej pożywce agarowej rozlanej na płytki Petriego, wystawionej przez pewien czas na działanie zanieczyszczonego powietrza (tzw. „wysiew z powietrza"), często pojawiają się kolonie barwne. Przeważają zwykle barwy: żółta, pomarańczowa i czerwona, pochodzące od karotenoidów. Kolonie takie tworzą najczęściej bakterie należące do rodzajów Micrococcus, Corynebacterium, Mycobacterium i Nocardia oraz drożdże Rhodotorula. Występowanie barwników w komórkach mikroorganizmów pochodzących z powietrza jest uzasadnione; chronią one bowiem te organizmy przed działaniem promieni światła widzialnego i bliskiego ultrafioletu. W środowiskach, w których występują te bakterie (kurz, słoma), postacie bezbarwne wystawione na działanie światła giną znacznie szybciej niż te, które mają barwniki. Działanie ochronne pigmentów przed uszkodzeniami natury fotodynamicznej udało się wykazać na przykładzie pewnej halofilnej bakterii o barwie pomarańczowej, zawierającej barwniki karotenoidowe, 108

i jej bezbarwnego mutanta. Przy słabym oświetleniu obie formy rozwijały się jednakowo dobrze, natomiast jaskrawe światło słoneczne hamowało rozwój bezbarwnego mutanta, nie wywierając wpływu na barwny szczep dziki. Działanie bakteriobójcze światła obserwowano tylko w obecności 109

tlenu, a więc było spowodowane fotooksydacją. W fotooksydacji niektóre barwniki komórkowe (flawiny, cytochromy) spełniają rolę katalizatorów (związki fotosensytyzujące). Karotenoidy zlokalizowane w błonie cytoplazmatycznej chronią wrażliwe okolice komórki przed fotooksydacją. Fotouczulenie (fotosensytyzacja). W obecności światła można zwiększyć wrażliwość bakterii na tlen przez wybarwienie przyżyciowe, np. błękitem metylenowym, eozyną lub oranżem akrydyny. Wybarwione komórki są szybciej inaktywowane przez światło widzialne niż nie wybarwione komórki kontrolne. Cząsteczki barwnika absorbują światło i mogą przenieść jego energię na cząsteczkę tlenu, która przechodzi z normalnego stanu podstawowego (tryplet) do singletowego stanu wzbudzonego. Tlen w stanie singletowym może powodować reakcje utleniania, które nie zachodzą w przypadku normalnego O2 (w szczególności cykloaddycji). Takie fotouczulenie wykorzystuje się do niszczenia bakterii patogennych w ogrodach zoologicznych i fermach zwierząt futerkowych dodając błękit metylenowy lub inne barwniki do wody pitnej. Fotouczulone bakterie zostają zabite przez normalne światło dzienne. Synteza karotenoidów. Czerwone karotenoidy (z 12-13 podwójnymi wiązaniami i grupami metoksy i okso) są odpowiedzialne za ciemnoczerwone zabarwienie bakterii purpurowych. W bakteriach tych karotenoidy działają nie tylko jako czynniki ochronne, ale absorbują światło do reakcji fotosyntetycznych i uczestniczą w odbieraniu światła przy fototaksji. Karotenoidy wraz z bakteriochlorofilami znajdują się w błonach biorących udział w fotosyntezie (tylakoidy, chromatofory). U wielu bakterii synteza tych barwników jest zależna od światła, podobnie jak wytwarzanie fotosyntetycznych pigmentów u roślin wyższych. A więc prątki, w tym patogenny prątek gruźlicy (Mycobacterium tuberculosis), jak również bakterie, które pojawiają się na wędlinach i serach, wytwarzają karotenoidy tylko na świetle. W pewnych przypadkach pigmentacja zależy też od składu podłoża i temperatury. Pulcherymina. Kolor wielu czerwonych drożdży (Rhodotorula, Sporobolomyces salmonicolor) jest zależny głównie od obecności karotenoidów, natomiast Candida pulcherrima wytwarza barwnik pulcheryminę, który należy do innej klasy związków. Candida pulcherrima, podobnie jak Candida reukaufii, można wyizolować z kwiatów zawierających nektar, 110

pewnych owoców oraz z przewodu pokarmowego pszczół. Na podłożach zawierających żelazo gatunek ten tworzy ciemnoczerwone kolonie. Czerwony barwnik pirazynowy zawiera kompleksowo związane żelazo i jest nierozpuszczalny w wodzie oraz rozpuszczalnikach organicznych. Prodigiozyna. Na pożywkach zawierających węglowodany często rozwija się bakteria, którą dawniej zwano „bakterią krwawiącej hostii" — Bacterium prodigiosum, a obecnie znana jest jako Serratia marcescens. Ciemnoczerwona barwa kolonii tych bakterii lub ich zawiesiny pochodzi od barwnika — prodigiozyny. W podstawowym szkielecie barwnika występują trzy pierścienie pirolowe. Barwnik ten jest też wytwarzany przez niektóre promieniowce. Indygoina. Ten niebieski, nierozpuszczalny w wodzie barwnik należy do grupy związków zwanych azochinonami (diazodifenochinony). Jest wydzielany do podłoża przez różne bakterie (Pseudomonas indigofera, Corynebacterium insidiosum, Arthrobacter atrocyaneus, Arthrobacter polychromogenes). Wiolaceina. Z wilgotnej gleby, w której umieszczono ziarna ryżu, można łatwo wyizolować Chromobacterium violaceum. Kolonie tej bakterii rozpoznaje się po błękitnofioletowym zabarwieniu spowodowanym obecnością nierozpuszczalnego w wodzie purpurowego barwnika — wiolaceiny. Wiolaceina jest pochodną indolu, powstającą w wyniku utlenienia tryptofanu. Barwniki fenazynowe. Wiele barwników wydzielanych przez bakterie wodne należy do grupy fenazyn. Wśród nich najbardziej znana jest piocyjanina, wytwarzana przez Pseudomonas aeruginosa (dawniej P. pyocyanea). Różne szczepy i gatunki z rodzaju Pseudomonas wydzielają także kwas fenazyno-1-karboksylowy, oksychlororafinę i jodyninę, przy czym związki te mogą być wydzielane razem lub każdy oddzielnie. Żółtozielone barwniki fluoryzujące. Żółtozielone barwniki fluroryzujące bakterii z grupy Pseudomonas, wykazujące wyraźną fluorescencję w świetle ultrafioletowym lub w świetle świetlówki, działają jako siderofory. Są one wytwarzane i wydzielane do podłoża, gdy brakuje w nim żelaza. Biorą udział w wiązaniu i transporcie żelaza do komórki (rozdz. 7). 111

Żółtozielone fluoryzujące siderofory Pseudomonas putida i P. aeruginosa to piowerdyny (= pseudobaktyny). Są to chromopeptydy zbudowane z łańcucha peptydowego złożonego z 6-10 aminokwasów i chromoforu, którym jest diaminodihydroksychinolina. Wtórne metabolity. Barwniki wytwarzane przez mikroorganizmy są wtórnymi metabolitami (rozdz. 10.4), tzn. nie należą one do związków, które występują we wszystkich organizmach. Widać jasno z ich struktury, że pochodzą one z normalnych metabolitów komórki bądź z jej podjednostek budulcowych. Niektóre barwniki mają aktywność antybiotyczną i wiele mikroorganizmów wytwarzających pigmenty wytwarza też antybiotyki. Z dużym prawdopodobieństwem można przyjąć, iż mikroorganizmy wytwarzające barwniki będą też wytwarzać antybiotyki i inne substancje czynne.

GRUPY ORGANIZMÓW PROKARIOTYCZNYCH

3.1. Wstęp Organizmy zaliczane dawniej do Schizophyta (rozprątki), obejmujące grupę Schizomycetes (bakterie w szerokim znaczeniu) i Schizophyceae (sinice), łączy się dzisiaj w grupę prokariota na podstawie takich cech, jak: pozbawiony błony nukleoid, słabo zaznaczony podział cytoplazmy na przedziały i ściana komórkowa zawierająca mureinę. Międzynarodowy Komitet Systematyki Bakteriologicznej ustalił Kod Bakteriologiczny do opisywania i nadawania nazw prokariotom i czuwa nad jego przestrzeganiem. Kod Bakteriologiczny odróżnia od Kodu Botanicznego zasada, że hodowla każdego nowo opisanego szczepu musi zostać złożona w znanej kolekcji szczepów, aby mogła służyć jako hodowla wzorcowa. Opis bakterii. Przy opisie bakterii należy podać ich cechy morfologiczne, a więc określić czy są to ziarniaki, pałeczki czy krętki, czy występują u nich otoczki, czy pojedyncze komórki łączą się w zespoły (łańcuszki, tetrady, pakiety), czy mają rzęski i jak są one rozmieszczone, czy tworzą endospory i jak się barwią metodą Grama. Opis taki uzupełnia się podaniem właściwości fizjologiczno-biochemicznych, jak: 1) wzrost komórek w warunkach tlenowych, beztlenowych lub jednych i drugich; 2) sposób uzyskiwania energii (oddychanie, fermentacja czy fotosynteza); 3) zależność wzrostu od temperatury i pH (z podaniem optimum i zakresu tolerancji); 4) wykorzystywane składniki pokarmowe; 5) siedlisko; 113

6) stosunki pasożytnicze lub symbiotyczne z innymi organizmami; 7) inkluzje komórkowe, zabarwienie i materiały otoczkowe; 8) skład ściany komórkowej (peptydoglikanu, lipopolisacharydów, kwasów tejchojowych); 9) właściwości serologiczne (antygeny powierzchniowe, białka homologiczne); 10) skład zasad w DNA (zawartość GC); 11) hybrydyzacja DNA-DNA, zdolność do transformacji międzygatunkowej; 12) sekwencja rRNA 16S lub 5S rRNA; 13) wrażliwość na antybiotyki. Nomenklatura. W systematyce bakterii obowiązuje, podobnie jak w systematyce zwierząt i roślin, nazewnictwo binominalne, tj. nazwa rodzajowa i gatunkowa. Obecnie, gdy szybko rośnie liczba nowych gatunków, zarzucono dawną zasadę, aby nazwy rodzajowe uwzględniały cechy morfologiczne, a gatunkowe — fizjologiczne. Beijerinck i Winogradski, obserwując różnorodność typów przemian materii, nadawali bakteriom nazwy rodzajowe nawiązujące do ekologii oraz cech fizjologicznych i biochemicznych. Tak więc na przykład właściwości fizjologiczne odzwierciedlają nazwy takich rodzajów jak Acetobacter, Nitrosomonas, Azotobacter, zabarwienie komórek — nazwy Chromobacterium, Rhodomicrobium, właściwości patogenne — Pneumococcus, Phytomonas, a swoiste składniki pokarmowe odzwierciedlają nazwy Haemophilus, Amylobacter. Obecnie nowe nazwy nadaje się według ściśle określonych zasad. Klasyfikacja. Klasyfikacja mikroorganizmów zaliczanych do prokariotów opiera się na względach praktycznych — mają one ułatwić rozpoznawanie już opisanych form. Pod pojęciem klasyfikacji rozumiemy uporządkowanie jednostek w grupy wyższego rzędu. Obejmują one wiele stopni. W mikrobiologii jednostką podstawową jest „szczep"; jest to czysta kultura wyizolowanej bakterii. Szczepy grupuje się w gatunki (species), gatunki w rodzaje (genus), rodzaje w rodziny (końcówka -aceae). Klasyfikacja opiera się na opisie odpowiednich cech poszczególnych szczepów i porównaniu właściwości różnych grup. Tworzeniem systemów klasyfikacji zajmuje się taksonomia. Wyróżnia się dwa rodzaje klasyfikacji: filogenetyczną, czyli „naturalną", i sztuczną. Nadrzędnym celem taksonomii bakterii jest połączenie spokrewnionych ze sobą form, tzn. tych, które mają wspólnych przodków, i uporządkowanie ich w jedno wspólne drzewo filogenetyczne bakterii. Cel ten może być osiągnięty na podstawie pewnych właściwości biochemicznych, takich jak sekwencja aminokwasów w enzymach speł114

niających podobne funkcje, sekwencja zasad w składnikach komórek odznaczających się konserwatywną budową, takich jak rybosomowe kwasy nukleinowe. Klasyfikacja sztuczna. Klasyfikacja sztuczna nie jest tak dociekliwa jak klasyfikacja filogenetyczna. Jej celem jest grupowanie organizmów zgodnie z ich podobieństwem, tak aby mogły być identyfikowane i oznaczane. W systemie sztucznym do oznaczania bakterii posługujemy się określonym kluczem. Najpełniejszym dziełem, w którym opisano bakterie, jest „Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (1974) oraz „Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (4 tomy wydane w latach 1984—1989), które zawierają nazwy, opisy cech morfologicznych, fizjologicznych, powołania na literaturę oraz klucze do oznaczania nowo izolowanych bakterii. Taksonomia numeryczna. Krokiem prowadzącym do bardziej obiektywnego, systematycznego uszeregowania bakterii było wprowadzenie taksonomii numerycznej. Opiera się ona na zasadzie Adansona, według której wszystkie uchwytne cechy organizmu są w klasyfikacji jednakowo ważne. W analizie numerycznej należy brać pod uwagę możliwie jak najwięcej cech. Cechy te należy tak ustawić, aby można je było wyrazić alternatywie — tak (+) lub nie ( —). Oceny odpowiednich kombinacji cech można dokonać za pomocą komputera, przy czym każdą cechę danego szczepu porównuje się z tą samą cechą wszystkich pozostałych szczepów. Podobieństwo między szczepami jest funkcją liczby podobnych cech w stosunku do całkowitej liczby badanych cech. Podobieństwo między parą szczepów jest więc wyrażone współczynnikiem podobieństwa (S), który jest zdefiniowany następująco:

gdzie a i d to sumy cech wspólnych dla szczepów A i Β (α — obie pozytywne, d — obie negatywne), b to suma cech, pod względem których A jest pozytywny, a Β negatywny, i wreszcie c jest sumą cech, pod względem których A jest negatywny, a Β jest pozytywny. Obliczenia dają wartości między 1 i 0; S=1 oznacza 100% podobieństwa, tzn. identyczność, a S < 0, 02 oznacza całkowity brak podobieństwa. Wartości są przedstawiane w postaci macierzy podobieństwa lub w postaci dendro115

gramu (podobnego do drzewa filogenetycznego). Taksonomia numeryczna nie ma jednak żadnego związku z filogenezą. Filogeneza bakterii. Analiza i porównanie konserwatywnych cech filogenetycznych umożliwiły C. Woesemu opracowanie drzewa filogenetycznego bakterii. Rybosomy, jako miejsca syntezy białek, występują we wszystkich komórkach. Funkcjonalnie muszą więc być silnie konserwatywne. Dotyczy to szczególnie rybosomowego RNA (rRNA), gdyż na sekwencję zasad w rRNA nie ma wpływu ani degeneracja kodu genetycznego, ani mutacje supresorowe. rRNA ma więc właściwe cechy, by mógł być ogólnie stosowanym markerem filogenetycznym. Do analizy izoluje się 16S rRNA ze wszystkich organizmów, które chce się porównać. RNA zostaje pocięty na fragmenty (oligonukleotydy) przy użyciu enzymów restrykcyjnych. Oligonukleotydy rozdziela się w drodze elektroforezy i określa się sekwencje występujących w nich zasad. Katalog sekwencji zasad charakterystycznych dla każdego organizmu można poddać analizie porównawczej za pomocą odpowiedniego programu komputerowego. W wyniku analizy można ujawnić istnienie silnie konserwowanych sekwencji, które są w dużym stopniu takie same u wszystkich bakterii. Z drugiej zaś strony występują pewne sekwencje, które różnią się nawet między rodzajami i gatunkami. Zidentyfikowano określone sekwencje, które są charakterystyczne dla danych grup organizmów. Dzięki tym analizom wyrysowano dendrogramy, które można traktować jako części drzewa filogenetycznego. Pozwoliły one na ujawnienie nieznanych dotąd powiązań między organizmami. Jednym z najbardziej frapujących wyników analizy sekwencji 16S rRNA było odkrycie, że istnieje większa homologia tej sekwencji między dwiema tak różnymi morfologicznie i fizjologicznie gatunkami jak Escherichia coli i pewna sinica, niż między E. coli i morfologicznie bardzo podobnym prokariotem z rodzaju Methanobacterium. Na tej podstawie uznano, że Methanobacterium musi wchodzić w skład całkowicie odrębnej, dużej grupy prokariotów. Przypuszcza się, że prokariota rozdzieliły się bardzo wcześnie na dwie duże grupy: Archaea (do których należy Methanobacterium) i wszystkie pozostałe bakterie oznaczone jako Bacteria. Uważa się, że najstarsze komórki — progenoty — są przodkami zarówno Archaea, jak i Bacteria. Jako trzecia grupa powstały Eukarya. Ich przodkowie również musieli bardzo wcześnie oddzielić się od wspólnego pnia (ryc. 3. 1). 116

117

Badania porównawcze typowych Bacteria pozwoliły na wyłonienie jedenastu dużych grup (ryc. 3. 2). Jedna z nich to beztlenowe fototroficzne bakterie purpurowe. Szczegółowe porównanie członków tej grupy bakterii gramujemnych z licznymi gramujemnymi bakteriami chemotroficznymi prowadzi do następnego zaskakującego wyniku: bakterie purpurowe można podzielić na cztery podgrupy, które oznaczono jako alfa, beta, gamma i delta. W skład każdej z nich (z wyjątkiem podgrupy delta) wchodzi kilku dobrze znanych przedstawicieli bakterii purpurowych oraz duża liczba niefotosyntetyzujących bakterii heterotroficznych bądź chemolitoautotroficznych (ryc. 3. 3). Filogenetycznie oznacza to, że w czasie ewolucji rozwinęły się przynajmniej cztery grupy bakterii purpurowych. Heterotroficzne bakterie oddychające tlenowo lub prowadzące fermentację, jak również chemolitoautotrofy i inne bakterie oddychające beztlenowo musiały rozwinąć się z przedstawicieli tych czterech

118

gałęzi wskutek utraty aparatu fotosyntetyzującego i na skutek metabolicznej specjalizacji. Te niefotosyntetyżujące bakterie filogenetycznie związane z bakteriami purpurowymi mają wspólną nazwę Proteobacteria. Można więc stwierdzić, że większość bakterii glebowych i wodnych, a także wiele bakterii patogennych pochodzi z grupy bakterii purpurowych. Jest zrozumiałe, że system taksonomiczny, oparty w dużym stopniu na cechach fenotypowych, takich jak — kształt, rzęski, barwliwość metodą Grama itp., niewiele ma wspólnego z systemem filogenetycznym. Tylko nieliczne grupy, które zaliczono do rodzin bądź wyższych jednostek wg klasycznych kryteriów taksonomicznych, wydają się spokrewnione filogenetycznie. Tak jest np. w przypadku bakterii redukujących siarczany, wliczanych do grupy delta, oraz w przypadku Enterobacteriaceae. W przeciwieństwie do tego, przedstawicieli bakterii z grupy Pseudomonas można znaleźć w podgrupach alfa, beta i gamma bakterii purpurowych. Wydaje się więc, że typ komórki reprezentowany przez rodzaj Pseudomonas powstał w wyniku rozwoju konwergencyjnego. Klasyfikacja filogenetyczna nie zastępuje jednak tradycyjnej taksonomii i nie czyni jej zbyteczną. Ta ostatnia odgrywa ważną rolę przy identyfikacji i opisywaniu bakterii de nονο. System filogenetyczny dostarcza więc wielu heurystycznych zasad przydatnych w badaniach ewolucyjnych, a także w mikrobiologii stosowanej. Różnorodność organizmów prokariotycznych. Następne rozdziały mają na celu pokazanie różnorodności prokariotów. Podejście jest tu podobne do tego, jakie przedstawiono w „Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (8. wydanie, 1974) i „Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (cztery tomy, 1984-1989). Wyniki nowych badań najprawdopodobniej spowodują konieczność wprowadzenia wielu modyfikacji i uzupełnień. Mikroskopowy obraz bakterii pozostanie jednak nie zmieniony, a stosunek bakterii do tlenu i zdolność do barwienia metodą Grama są stosunkowo łatwe do określenia. Bakterie zostały podzielone na grupy na podstawie: 1) kształtu — ziarniaki, pałeczki lub wygięte pałeczki (śrubowce i krętki); 2) zdolności do wzrostu tlenowego bądź beztlenowego; 3) wyniku barwienia metodą Grama. Te bakterie, których nie można było przypisać łatwo do żadnej z trzech głównych kategorii, zostały wymienione jako „duże grupy specjalne". W podrozdziałach 3. 2-3. 21 przedstawiono grupy bakterii w takiej 119

kolejności, w jakiej pojawiają się na liście. Niektóre z nich zostały omówione w tym rozdziale jedynie pobieżnie i czytelnik zostaje odesłany do rozdziałów, w których opisano je dokładniej, kładąc nacisk na ich właściwości fizjologiczne i biochemiczne. Jeśli jakaś grupa została w tym rozdziale opisana dokładnie, to nie jest już później omawiana. Przegląd prokariotów daje pewne wskazówki potrzebne do ich identyfikacji. Każdy biolog doświadczył prawdopodobnie tego, że dany klucz do oznaczania pozwolił mu zidentyfikować tylko te organizmy, które były mu znane. Do identyfikacji bakterii niezbędna jest więc pewna wiedza podstawowa; kiedy pałeczkę wyizolowaną z jogurtu zidentyfikujemy jako Methanobacterium, sceptycyzm będzie w pełni uzasadniony.

3. 2. Grupy prokariotów Przedstawiony poniżej podział prokariotów został ustalony na podstawie kształtu komórek (ziarniaki, pałeczki, krętki), barwienia metodą Grama i stosunku do tlenu (tlenowce i beztlenowce). 1. Ziarniaki (cocci), formy kuliste A) Ziarniaki gramdodatnie tlenowe Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus beztlenowe Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Sarcina B) Ziarniaki gramujemne tlenowe Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Paracoccus, Lampropedia beztlenowe Veillonella, Acidaminococcus, Megasphaera

2. Pałeczki (proste bakterie cylindryczne) A) Bakterie gramdodatnie tlenowe

Gramdodatnie, nie tworzące endospor Lactobacillus, Listeria, Erysipelothrix, Caryophanon

tlenowe

Maczugowce i promieniowce Corynebacterium, Arthrobacter, Brevibacterium,

120

Cellulomonas, Propionibacterium, Eubacterium, Bifidobacterium, Mycobacterium, Nocardia, Actinomyces, Frankia, Actinoplanes, Dermatophilus, Micromonospora, Microbispora, Streptomyces, Streptosporangium tlenowe beztlenowe

Pałeczki i ziarniaki tworzące endospory Bacillus, Sporolactobacillus, Sporosarcina, Thermoactinomyces Clostridium, Desulfotomaculum, Oscillospira

B) Bakterie gramujemne tlenowe

tlenowe

tlenowe względnie beztlenowe

ścisłe beztlenowce

Gramujemne, tlenowe pałeczki i ziarniaki Pseudomonas, Xanthomonas, Zoogloea, Gluconobacter, Acetobacter, Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia, Derxia, Rhizobium, Agrobacterium, Alcaligenes, Brucella, Legionella, Thermus Gramujemne, tlenowe bakterie chemolitotroficzne Nitrobacter, Nitrospina, Nitrococcus, Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus, Nitrosolobus, Thiobacillus, Thiobacterium, Thiovulum Bakterie pochewkowe Sphaerotilus, Leptothrix, Streptothrix, Crenothrix Gramujemne pałeczki względnie beztlenowe Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia, Erwinia, Yersinia, Vibrio, Aeromonas, Photobacterium Gramujemne bakterie beztlenowe Bacteroides, Fusobacterium, Leptotrichia, Fibrobacter

Archeony ścisłe Methanobacterium, Methanothermus, Methanosarcina, beztlenowce Methanothrix, Methanococcus tlenowe Halobacterium, Haloferax, Halococcus, Sulfolobus, Thermoplasma beztlenowe Thermoproteus, Pyrodictium, Desulfurococcus, Pyrococcus, Thermococcus, Thermodiscus 121

3. Wygięte pałeczki lub komórki giętkie Gramujemne bakterie wygięte i spiralne tlenowe

Spirillum, Aąuaspirillum, Azospirillum, Oceanospirillum, Helicobacter, Bdellovibrio, Microcyclus, Pelosigma Gramujemne, wygięte bakterie beztlenowe

beztlenowe

Desulfovibrio, Succinivibrio, Butyrivibrio, Selenomonas Krętki

tlenowe Spirochaeta, Cristispira, Treponema, Borrelia, Leptospira i beztlenowe 4. Inne duże grupy bakterii Bakterie śluzowe (zawsze gramujemne) Myxococcus, Archangium, Cystobacter, Melittangium, Stigmatella, Polyangium, Nannocystis, Chondromyces, Cytophaga, Sporocytophaga, Flexibacter, Herpetosiphon, Saprospira, Beggiatoa, Thiothrix, Thioploca, Achromatium, Leucothrix, Vitreoscilla, Simonsiella, Alysiella Bakterie pączkujące i tworzące wyrostki Hyphomicrobium, Hyphomonas, Caulobacter, Asticcacaulis, Planctomyces, Ancalomicrobium, Prosthecomicrobium, Blastobacter, Seliberia, Gallionella, Nevskia Bakterie bezwzględnie pasożytnicze: riketsje i chlamydie Rickettsia, Coxiella, Chlamydia Grupa Mycoplasma (Mollicutes) Mycoplasma, Acholeplasma, Spiroplasma, Metallogenium Beztlenowe bakterie fotosyntetyzujące Rhodospirillum, Rhodopseudomonas, Rhodobacter, Rhodomicrobium, Rhodocyclus, Rhodopila, Chromatium, Thiocystis, Thiosarcina, Thiocapsa, Thiospirillum, Thiopedia, Amoebobacter, Ectothiorhodospira, 122

Lamprocystis, Thiodictyon, Chlorobium, Prosthecochloris, Pelodictyon, Chloroherpeton, Chloroflexus, Chloronema, Oscillochloris Tlenowe bakterie fotosyntetyzujące: sinice Synechococcus, Gloeocapsa, Gloeothece, Gloeobacter, Pleurocapsa, Dermocarpa, Myxosarcina, Oscillatoria, Spirulina, Lyngbya, Phormidium, Plectonema, Anabaena, Nostoc, Calothrix, Fischerella

3. 3. Gramdodatnie ziarniaki W szerszym sensie gramdodatnie ziarniaki obejmują również kokoidalne formy bakterii mlekowych, takie jak Lactococcus, Leuconostoc i Pediococcus (patrz tab. 8. 2). Bakterie te uzyskują energię w reakcjach fermentacji, są mikroaerotolerancyjne i większość nie ma barwników hemowych. Oprócz nich należą tu tlenowe i względnie tlenowe rodzaje Streptococcus, Micrococcus i Staphylococcus oraz bezwzględnie beztlenowe rodzaje Sarcina, Peptococcus i Ruminococcus. Rodzaj Micrococcus zawiera też barwne bakterie, których żółte lub pomarańczowe kolonie odnajduje się w posiewach z powietrza (rozdz. 2. 2). Były one uprzednio zaliczane do rodzaju Sarcina, gdyż tworzą pakiety komórek lub tetrady; bakterie znane kiedyś jako Sarcina lutea, S. flava, S. aurantiaca, itd. są teraz klasyfikowane jako jeden gatunek — Micrococcus luteus. Gatunek ten obejmuje też Micococcus lysodeikticus, nazwany tak przez A. Fleminga ze względu na jego wrażliwość na lizozym. Gatunki należące do rodzaju Micrococcus są tlenowcami i cechuje je duża zawartość GC (66-72%). Nazwa rodzaju Staphylococcus wiąże się z obrazem komórek pod mikroskopem. Komórki wyglądają jak ułożone w grona (gr. staphyle — grono), co wynika z nieregularnych podziałów komórek w różnych płaszczyznach (ryc. 2. 6). Staphylococcus (gronkowiec) jest względnym beztlenowcem, w warunkach tlenowych wytwarza cytochromy i jest dość oporny na wysychanie. Staphylococcus aureus jest patogenem wytwarzającym toksyny i egzoenzymy (jest przyczyną powstawania ropni). Inne szczepy wywołują zatrucia pokarmowe, wydzielając enterotoksyny w czasie wzrostu na niewłaściwie przechowywanym jedzeniu. 123

Sarcina ventriculi (rozdz. 2. 2. 5; ryc. 2. 34), beztlenową bakterię mikroaerotolerancyjną, łatwo jest wyizolować z gleby, ale można ją też znaleźć w treści jelita ludzi cierpiących na schorzenia żołądka. Ma ona kilka niezwykłych cech. Jej duże komórki (średnica 4 μm) tworzą bardzo duże skupiska (ponad 64 komórki połączone celulozą). Rośnie w bardzo szerokim zakresie pH (pH 0, 9-9, 8) i może wytwarzać endospory.

3. 4. Gramujemne ziarniaki Do grupy tej zostały wliczone nieruchliwe ziarniaki gramujemne i krótkie pałeczki. Są tu tlenowce i beztlenowce, patogeny i bakterie glebowe oraz bakterie zasiedlające przewód pokarmowy i błony śluzowe różnych ssaków. Ziarniaki tlenowe. Rodzaj Neisseria jest oksydazododatni i należy do niego wiele patogenów ludzkich oraz zwierzęcych. Neisseria gonorrhoeae wywołuje rzeżączkę, chorobę weneryczną, która została w wielu krajach wypleniona dzięki wrażliwości tej bakterii na penicylinę (już 1 μg penicyliny/ml działa bakteriostatycznie). Neisseria gonorrhoeae trudno hoduje się w laboratorium; wymaga ona warunków tlenowych z 10% CO2, jest niezwykle wrażliwa na światło i wysychanie, co tłumaczy fakt, że do infekcji dochodzi jedynie w wyniku bezpośredniego kontaktu płciowego. Neisseria meningitidis zasiedla jamę nosowo-gardłową, ale może przedostać się do układu krwionośnego i spowodować zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Moraxella też jest oksydazododatnia i bardzo wrażliwa na penicylinę. Te owalne ziarniaki nie są zdolne do wykorzystywania węglowodanów. Acinetobacter jest oksydazoujemną bakterią glebową i wodną, którą łatwo otrzymać stosując hodowlę wzbogaconą, w podłożu o pH 5, 5-6, 0, zawierającym 0, 2% octanu. Zwykle nie wykorzystuje ona glukozy, dwucukrów i wielocukrów, ale poza tym jest podobna do rodzaju Pseudomonas pod względem różnorodności wykorzystywanych substratów. W gatunku Acinetobacter calcoaceticus markery genetyczne mogą być wymieniane w drodze transformacji. Z bakterią tą wiąże się nadzieje na usuwanie nadmiaru fosforanu ze ścieków, ponieważ ma ona zdolność do gromadzenia dużej ilości polifosforanów w komórkach. W diagnostyce różnicującej tę grupę bakterii stosuje się test na obecność oksydazy. Opiera się on na wytwarzaniu barwnego produktu z dimetylo-p-fenylodiaminy (N, N-dimetylo-l, 4-diaminobenzen) w obec124

ności rozpuszczalnego w wodzie cytochromu c. Na kolonie na płytce agarowej nanosi się kilka kropli odczynnika i obserwuje pojawienie się czerwonej barwy. Ziarniaki beztlenowe. Do najlepiej poznanych ziarniaków beztlenowych należą Veilonella alcalescens (uprzednio znana jako Micrococcus lactilyticus) i Megasphaera (uprzednio Peptostreptococcus) elsdenii. Oba gatunki są niezdolne do fermentowania węglowodanów. Veilonella alcalescens znajduje się w ślinie ludzi i zwierząt oraz w żwaczu przeżuwaczy. Fermentuje ona kwasy organiczne, szczególnie mlekowy, do kwasu propionowego, octowego, CO2 i H2 (rozdz. 8. 3). Megasphaera elsdenii fermentuje kwas glutaminowy i inne aminokwasy, wchodzi w skład normalnej flory jelitowej wielu zwierząt.

3. 5. Gramdodatnie pałeczki nie tworzące endospor Gramdodatnie, nie tworzące endospor pałeczki, które mogą rosnąć w obecności tlenu i w wyniku fermentacji węglowodanów (glukozy, laktozy) tworzą głównie kwas mlekowy, mają wspólną nazwę „bakterie mlekowe". Należą do nich rodzaje Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus i Bifidobacterium. Ten ostatni to jedna z niewielu bakterii wytwarzających kwas mlekowy będąca ścisłym beztlenowcem. Bakterie mlekowe są dokładniej opisane w rozdziale 8. 2. Wymieniamy tu również gramdodatnią tlenową pałeczkę, Listeria monocytogenes, którą niedawno wyizolowano z serów twarogowych. Bakteria ta może spowodować listeriozę u osób, które spożyją skażone sery. Na podstawie kształtu komórek oraz innych cech morfologicznych i fizjologicznych bakterie gramdodatnie można uporządkować w pewien szereg. Pałeczki kwasu mlekowego znajdują się na jego początku. Większość bakterii mlekowych to regularne pałeczki, a tendencja do tworzenia komórek maczugowatych i rozgałęzionych nie jest u nich zbyt silna. U bakterii o kształcie maczugowatym, do których należą Corynebacterium i Arthrobacter, ta morfologiczna zmienność staje się normą. Tendencja do tworzenia komórek rozgałęzionych jest silniejsza u prątków, jeszcze bardziej zaznacza się u nokardii, a najbardziej u promieniowców, które przejściowo tworzą „grzybnię". Wielu przedstawicieli powyższych grup można łatwo rozpoznać po

125

kształcie komórek, morfologii kolonii i właściwościach fizjologicznych. Inne można zidentyfikować wyłącznie na podstawie cech biochemicznych. Można tu też zaliczyć Caryophanon latum, bakterię nitkowatą o urzęsionych komórkach, łatwą do wyizolowania z krowiego nawozu. Te gramdodatnie, nitkowate pałeczki są niezwykle długie (3x15 μm) (ryc. 3. 4).

3. 6. Bakterie maczugowate Maczugowiec. Do rodzaju Corynebacterium (gr. coryne — maczuga, buława) zaliczono pierwotnie (1896) bakterie typu Corynebacterium diphtheriae. Wykazują one, oprócz zmienności kształtów, charakterystyczny sposób podziału — komórki potomne odchylają się od siebie na dwie strony pod pewnym kątem. Ich przylegające ściany komórkowe rozdzielają się z nierówną prędkością, tak że komórki wydają się odchylać w przeciwnym kierunku. Równocześnie duże komórki dzielą się na wiele krótkich pałeczek. Corynebacterium diphtheriae wywołuje błonicę. Pod względem fizjologicznym jest nietypowym przedstawicielem swojej grupy, gdyż może żyć jako mikroaerofil i beztlenowiec, podczas gdy większość maczugowców to tlenowce. Bakteria ta atakuje gardło oraz migdałki i wytwarza egzotoksynę, która krąży we krwi i atakuje mięsień serca, nerki i nerwy (porażenia pobłonicze). Egzotoksyna jest wytwarzana jedynie przez szczepy lizogenne fagiem β. Tak więc wytwarzanie toksyny 126

jest konsekwencją genetycznej zmiany bakterii spowodowanej przez faga, zwanej konwersją fagową. Drugim warunkiem koniecznym do wytworzenia toksyn jest występowanie żelaza w stężeniu mniejszym od optymalnego. Do rodzaju Corynebacterium należą jeszcze inne gatunki patogenne dla zwierząt oraz szeroko rozprzestrzenione bakterie wywołujące choroby roślin (C. michiganense, C. poinsettiae, C. fascians). Corynebacterium mediolaneum był pierwszym gatunkiem bakterii wykorzystanym do biologicznego przetwarzania steroidów (1938). Arthrobacter. Do rodzaju Arthrobacter zalicza się wiele maczugowatych bakterii licznie występujących w glebie. Charakteryzują się one silną tendencją zarówno do tworzenia rozgałęzień, jak i form ziarenkowatych. Niektóre formy są urzęsione i dzięki temu ruchliwe. Wszystkie gatunki są tlenowcami. Łatwo je izolować z suchej gleby, bowiem podobnie jak laseczki są w stanie przetrwać w suchej glebie kilka miesięcy, podczas gdy większość bakterii nie tworzących przetrwalników zamiera. Bakterie z rodzaju Arthrobacter są pleomorficzne (wielopostaciowe); w młodych hodowlach (zarówno na podłożach stałych, jak płynnych) wyrastają w postaci nieregularnych, długich pałeczek, a w starych — wyłącznie w postaci ziarniaków (ryc. 3. 5). Inna grupa bakterii maczugowatych z gleby to różne gatunki Cellulomonas wykorzystujące celulozę.

127

Bakterie zaliczane do rodzaju Arthrobacter zasiedlają różne środowiska. Można je uznać za przeważającego, pod względem ilościowym, przedstawiciela autochtonicznej mikroflory glebowej w glebach, w których zostały rozłożone łatwo przyswajalne substraty i gdzie próchnica stanowi główną frakcję materii organicznej. W warunkach niekorzystnych Arthrobacter rośnie powoli, tworząc formy kokoidalne. Można przypuszczać, że ziarniaki znajdowane w glebie przez Winogradskiego w większości przypadków były bakteriami z rodzaju Arthrobacter. Inne szczepy oraz gatunki występują na roślinach i w osadzie czynnym w oczyszczalniach ścieków. Inne rodzaje i gatunki. Liczne bakterie maczugowate wydzielają do podłoża kwas glutaminowy oraz inne aminokwasy (rozdz. 10. 2. 2) i z tego powodu mają zastosowanie w przemyśle. Inne typowe formy rosną na serach twarogowych, np. Brevibacterium linens, który ma umiarkowane właściwości proteolityczne, bierze udział w dojrzewaniu sera. Całkiem niedawno do grupy bakterii maczugowatych zaliczono też bakterie propionowe (rozdz. 8. 3). Pod względem morfologicznym i fizjologicznym bakterie maczugowate zajmują stanowisko pośrednie między bakteriami mlekowymi i prątkami. Wykazują one silniejszą tendencję do tworzenia rozgałęzień niż bakterie propionowe, ale słabszą niż prątki. W tym szeregu widać też przejście od metabolizmu beztlenowego w kierunku ściśle tlenowego. Mimo wielu wysiłków nie udało się jasno sprecyzować, które gatunki mają należeć do grupy bakterii maczugowatych. Do stworzenia nowej klasyfikacji tej niezwykle ważnej i ekologicznie zróżnicowanej grupy mikroorganizmów potrzebna jest znajomość zawartości GC. składu mureiny i innych właściwości oraz zastosowanie taksonomii numerycznej.

3. 7. Prątki Wszystkie prątki są tlenowcami. Pod względem kształtu tworzą formy pośrednie między maczugowcami i nokardiami. Nie tworzą „grzybni", lecz rosną w postaci komórek lekko rozgałęzionych, o nieregularnych kształtach. Są gramdodatnie i nieruchliwe. Od maczugowców różnią się kwasoopornością. W 1882 roku Ehrlich spostrzegł, że prątki gruźlicy 128

{Mycobacterium tuberculosis) zabarwione barwnikami anilinowymi nie odbarwiają się, gdy potraktuje się je kwasem. W metodzie Ziehl-Neelsena utrwalone rozmazy tych bakterii barwi się na gorąco fuksyną karbolową, płucze, a następnie działa na nie alkoholem z dodatkiem kwasu solnego. Prątki oraz bakterie z rodzaju Nocardia nie odbarwiają się po potraktowaniu kwasem, są kwasooporne. Niektóre prątki saprofityczne odbarwiają się pod wpływem alkoholu z dodatkiem kwasu solnego, ale nie odbarwia ich wodny roztwór kwasu solnego. Kwasooporność wynika z dużej zawartości kwasu mikolinowego w ścianie komórkowej. Związek ten powoduje, że ściana komórkowa jest woskowata i silnie hydrofobowa. Rodzaje Corynebacterium, Mycobacterium i Nocardia wykazują wiele podobieństw w budowie ściany komórkowej, ale także pewne różnice. Ich mureina przypomina mureinę bakterii gramujemnych, lecz jest do niej przyłączony arabinogalaktan — wielocukier składający się z arabinozy i galaktozy. Dołączone są do niego lipidy — kwasy mikolinowe. Są to rozgałęzione 3-hydroksykwasy (R1—CHOH—CHR2—COOH), podstawione w pozycji 2 i 3 łańcuchami alifatycznymi o różnej długości. U maczugowców mają 32-36 atomów węgla, u bakterii z rodzaju Nocardia — 45-58, a u prątków od 79 do 85. To właśnie te długołańcuchowe podstawniki alifatyczne czynią komórki kwasoopornymi. Mycobacterium tuberculosis, który jest patogenem wywołującym gruźlicę u ludzi, został opisany przez R. Kocha w 1882 roku. Infekcja płuc prowadzi do powstania w nich gruzełków, zniszczenia tkanek i dalszego rozszerzenia się jej w organizmie. Na gruźlicę zapadają przede wszystkim ludzie niedożywieni i osłabieni. Antybiotyki, takie jak penicylina i streptomycyna, oraz chemoterapeutyk — hydrazyd kwasu izonikotynowego (INH), prawie całkowicie wyeliminowały tę chorobę z krajów uprzemysłowionych. INH hamuje tworzenie kwasu mikolinowego i tym samym powoduje utratę kwasooporności; już w małych stężeniach zabija M. tuberculosis. W krajach tropikalnych miliony ludzi chorują na trąd. Przyczyną tej choroby jest M. leprae, który rosnąc w skórze powoduje powstawanie guzów i guzowatych zniekształceń, co prowadzi do zniszczenia tkanek twarzy i kończyn. Leczenie nie jest tak skuteczne jak terapia przeciwgruźlicza. Prątki występują też w glebie. Wiele z nich może rozwijać się na prostych podłożach mineralnych zawierających sole nieorganiczne i wzbogaconych ropą naftową, naftalenem lub innymi lotnymi węglowodorami. 129

Prątki glebowe rosną stosunkowo szybko i nie wymagają żadnych specjalnych dodatków, patogenne zaś rozwijają się powoli i wymagają złożonych pożywek.

3. 8. Promieniowce sensu stricto Promieniowce sensu stricto rozwijają się w postaci „grzybni". Zasiedlają one przede wszystkim gleby. Są gramdodatnie. Istnieje szereg form przejściowych między promieniowcami a bakteriami maczugowatymi i prątkami. Poza nielicznymi wyjątkami promieniowce są tlenowcami. Ich nazwa łacińska pochodzi od opisanego po raz pierwszy gatunku Actinomyces bovis, wywołującego u bydła aktynomikozę zwaną promienicą. Występujące w czasie choroby duże narośla w różnych tkankach i żuchwie zwierząt mają promienisty kształt. Promieniowce dobrze rosną na prostych pożywkach i łatwo je rozróżnić po sposobie wzrostu na i w agarze, po wytwarzaniu „grzybni" powietrznej, „grzybni" substratowej, spor i sporangiów (ryc. 3. 6 i 3. 7). Nokardie tworzą „grzybnię" substratową i powietrzną, która w starych koloniach rozpada się na pałeczkowate komórki. Nie wytwarzają one prawdziwych spor (ryc. 3. 6 i 3. 8). Natomiast u promieniowców z rodzaju Streptomyces, obejmującego bardzo wiele gatunków, „grzybnia" występuje stale. „Grzybnia" powietrzna jest silnie rozwinięta. Wyrastają z niej strzępki zwane sporoforami, na których tworzą się spory służące do rozprzestrzeniania się mikroorganizmu. Gatunki i szczepy rozróżnia się na podstawie typu wytwarzanych sporoforów (proste, faliste, spiralne, splątane, wrzecionowate itd. ), kształtu kolonii, jej zabarwienia, wielkości i zapachu. Charakterystyczny zapach świeżo przeoranej gleby na wiosnę pochodzi właśnie od promieniowców. Wywołuje go substancja zwana geosminą, którą można wyizolować ze Streptomyces griseus. Jest to l, 10-dimetylo-9-dekalol. Znajomość tej grupy bakterii jest dość duża ze względu na ich znaczenie przemysłowe w produkcji wielu skutecznych antybiotyków. Spośród setek wyizolowanych antybiotyków największe zastosowanie w lecznictwie mają streptomycyna (S. griseus), chloromycetyna (S. venezuelae), aureomycyna i tetracyklina (S. aureofaciens). 130

131

132

Liczne promieniowce są zdolne do rozkładu celulozy, chityny oraz innych trudno rozkładalnych, naturalnych substancji organicznych. Micromonospora, jeden z rodzajów rozkładających celulozę, jest rozpowszechniona w glebie i w gnijących osadach dennych. Kolonie tych bakterii są płaskie. Nie tworzą one „grzybni" powietrznej, a pojedyncze spory powstają na słabo rozgałęzionych końcach sporoforów. Rodzaj Microbispora jest podobnie zbudowany, lecz tworzy „grzybnię" powietrzną, a na końcach sporoforów powstają po dwie spory. Niektóre promieniowce (Actinoplanes, Streptosporangium, Ampullariella) tworzą spory nie na strzępkach powietrznych, lecz w sporangiach. Streptosporangium jest tlenowym promieniowcem rozkładającym celulozę. Na podłożach stałych wykształca najpierw „grzybnię" substratową, a dopiero później — powietrzną. Wierzchołki strzępek „grzybni" powietrznej nabrzmiewają i tworzą kuliste sporangia o średnicy 5-8 μm, a w okresie dojrzewania do 18 μm. Strzępka nośna wrasta do kulistej komórki końcowej, skręca się spiralnie i oddziela sporangiospory. U Streptosporangium spory są nieruchliwe. Promieniowce z rodzaju Actinoplanes rosną na szczątkach roślinnych. Tworzą urzęsione, ruchliwe spory w główkowatych sporangiach, z których uwalniają się po ich otwarciu. Innym promieniowcem wytwarzającym ruchliwe spory jest Dermatophilus congolensis. Wywołuje on dermatozę na grzbiecie owiec i koni. Na pożywkach stałych rośnie w postaci gładkich bądź szorstkich kolonii i wykształca gęstą „grzybnię" substratową. Strzępki dzielą się podłużnie i poprzecznie. Może w ten sposób powstać do 8 równoległych rzędów ziarniakowatych komórek, które uwalniają się ze strzępki po zgalaretowaceniu i rozpuszczeniu jej ścian. Spory poruszają się za pomocą rzęsek. Spory promieniowców zwykle nie są ciepłooporne, ale wytrzymują wysychanie. Jedyny promieniowiec, który tworzy spory odporne na wysoką temperaturę, to Thermoactinomyces vulgaris. Jest on termofilem i wchodzi w skład flory bakteryjnej wilgotnych stogów siana oraz stert odpadków organicznych, gdzie powstaje ciepło. Budową i zawartością kwasu dipikolinowego spory te przypominają endospory rodzajów Bacillus i Clostridium.

133

3. 9. Laseczki i ziarniaki tworzące endospory Zdolność tworzenia mniej lub bardziej ciepłoopornych endospor jest, poza nielicznymi wyjątkami, cechą występującą jedynie w grupie gramdodatnich laseczek, poruszających się za pomocą perytrychalnie ułożonych rzęsek. Tlenowe i względnie beztlenowe formy należą do rodzajów Bacillus, Sporolactobacillus i Sporosarcina, a beztlenowe — do rodzajów Clostridium i Desulfotomaculum. Wiele z tych bakterii jest dobrze znanych dzięki swoistym właściwościom biochemicznym. Zostaną tu opisani tylko niektórzy przedstawiciele dwóch obszernych rodzajów: Bacillus i Clostridium. Tlenowce tworzące spory. Tlenowe laseczki tworzące spory zasiedlają glebę. Liczne gatunki z rodzaju Bacillus tworzą łańcuszki. Ze względu na kształt endospor i komórek macierzystych (ryc. 3. 9) można je podzielić

na trzy grupy. (I) U większości laseczek owalne lub cylindryczne spory mają średnicę nie przekraczającą średnicy komórki macierzystej. (B. megaterium, B. cereus, B. subtilis, B. licheniformis, B. anthracis, B. thuringiensis). (II) Owalne endospory mają średnicę większą niż średnica komórek macierzystych, przez co w czasie sporulacji komórka macierzysta ulega rozszerzeniu (B. polymyxa, Β. macerans, Β. stearothermophilus, B. circulans). (III) Endospory są prawie okrągłe, a komórki macierzyste terminalnie rozszerzone (B. pasteurii). 134

I. Bacillus megaterium, o rozmiarach 2x5 μm, jest olbrzymem wśród bakterii. Nieco mniejsze są komórki B. cereus. Do tego gatunku zalicza się też odmianę zwaną „mycoides"', która na powierzchni agaru rośnie podobnie do grzyba (B. cereus var. mycoides). Istnieją prawo- i lewoskrętne szczepy tej bakterii; morfologia kolonii jest bardzo charakterystyczna (ryc. 3. 10). Z B. cereus jest blisko spokrewniony gatunek B. anthracis, wywołujący wąglik. Jest to bakteria nieurzęsiona, posiadająca otoczkę zawierającą kwas glutaminowy. Z B. cereus spokrewniony jest też gatunek patogenny dla owadów — B. thuringiensis. Bacillus subtilis, zwany laseczką sienną, ponieważ łatwo jest go wyizolować z siana, oraz B. licheniformis wytwarzają antybiotyki polipeptydowe. Ten ostatni gatunek może uzyskiwać energię nie tylko w procesie oddychania tlenowego, ale też w wyniku fermentacji i beztlenowego oddychania azotanowego. II. Bacillus polymyxa (dawniej B. asterosporus) zawdzięcza swoją nazwę obfitemu wydzielaniu śluzu (a dawniej — beczułkowatym endosporom, które w przekroju poprzecznym mają kształt gwiazdy). Podobnie jak Bacillus licheniformis wytwarza on 2, 3-butanodiol. Bacillus stearothermophilus jest organizmem zdecydowanie termofilnym (optymalna temperatura wzrostu 50-65 °C). III. Bacillus pasteurii jest klasycznym przykładem bakterii rozkładającej mocznik. Tworzy on konstytutywnie ureazę, hydrolizuje mocznik do CO2 i amoniaku i jest przystosowany do wzrostu w wysokich wartościach pH. Sporosarcina ureae jest do niego bardzo podobna pod względem fizjologicznym, chociaż morfologicznie przypomina bakterie z rodzaju

135

Sarcina. Sporosarcina ureae jest zaliczana do laseczek z powodu jej cech fizjologicznych, tzn. obecności ciepłoopornych spor zawierających kwas dipikolinowy i tlenowego metabolizmu. Beztlenowce tworzące spory. Beztlenowe laseczki tworzące endospory do wzrostu nie wymagają tlenu. Gatunki zaliczane do rodzaju Clostridium nie mają cytochromów ani katalazy. Liczne gatunki zawierają dużo enzymów flawinowych, które powodują, że w zetknięciu z tlenem atmosferycznym powstaje toksyczny dla komórek nadtlenek wodoru. Bakterie tworzące spory i redukujące siarczany, zaliczane dawniej do rodzaju Clostridium, umieszczono w nowym rodzaju Desulfotomaculum (nigrificans, orientis, ruminis), gdyż zawierają one pigmenty podobne do protohemu. U laseczek beztlenowych endospora jest zwykle znacznie szersza niż komórka wegetatywna, która w zależności od położenia endospory przybiera różne kształty. Klostridia przeprowadzają fermentację wielu różnych substratów, w tym wielocukrów, białek, aminokwasów i puryn (rozdz. 8. 5). W zależności od najchętniej fermentowanego substratu rozróżnia się klostridia sacharolityczne (np. Clostridium butyricum, C. acetobutylicum, C. cellulosae-dissolvens), peptolityczne (C. histolyticum, C. sporogenes, C. tetani, C. botulinum) i klostridia rozkładające kwas moczowy (C. acidi-urici). Produktami fermentacji są: kwas masłowy, butanol, aceton, izopropanol i, w wielu przypadkach, duże ilości gazu (H2, CO2). Clostridium pasteurianum i wiele innych klostridiów sacharolitycznych wiąże azot atmosferyczny. Clostridium aceticum przekształca fruktozę lub mieszaninę CO2 i H2 w octan. Można tu jeszcze wymienić Oscillatoria guillermondii. Jest to niezwykle duża (5x100 μm), beztlenowa bakteria zdolna do wykształcania spor. Jej komórki tworzą łańcuchy. Występuje ona w wyrostku robaczkowym świnek morskich, często można ją też znaleźć w żwaczu przeżuwaczy.

3. 10. Bakterie z grupy Pseudomonas i inne pałeczki gramujemne Do grupy Pseudomonas (ang. pseudomonads) zalicza się wszystkie biegunowo urzęsione, gramujemne pałeczki, a więc bakterie należące 136

często do rodzajów skrajnie różniących się pod względem fizjologicznym, takich jak np. Nitrosomonas, Methylomonas, Thiobacillus, a nawet fototroficzny Rhodopseudomonas. Nazwa tej grupy nie ma jednak żadnego znaczenia taksonomicznego, określa jedynie cechy morfologiczne tych bakterii. Do rodziny Pseudomonadaceae zalicza się gramujemne, biegunowo urzęsione, proste lub nieznacznie wygięte pałeczki, które nie tworzą endospor i rosną tlenowo. Energię uzyskują z oddychania tlenowego, a u niektórych gatunków również — beztlenowego (denitryfikacja — oddychanie azotanowe), ale nigdy w wyniku fermentacji. Pseudomonadaceae są chemoorganotrofami, a niektóre — względnymi chemolitotrofami. Rodzaj Pseudomonas stanowi prototyp tej rodziny, z jej cechami charakterystycznymi. Może on wykorzystywać bardzo różnorodne substraty organiczne, między innymi związki heterocykliczne i aromatyczne, które nie są rozkładane przez inne bakterie. Rozkład cukru następuje w cyklu Entnera—Doudoroffa (rozdz. 7. 2. 3). Niektóre gatunki z rodzaju Pseudomonas utleniają cukry niecałkowicie i wydzielają do środowiska kwasowe pochodne cukrów (kwas glukonowy, kwas 2-ketoglukonowy). Bakterie z grupy Pseudomonas, ze względu na małe wymagania, spotyka się wszędzie: występują w glebie, wodzie, ściekach i w powietrzu. Zwykle jako pierwsze zasiedlają nowe miejsce, jeżeli zawiera ono sole mineralne i kwasy organiczne bądź cukry. Często można je rozpoznać po tworzeniu rozpuszczalnych w wodzie barwników, tzn. błękitnozielonej piocyjaniny (pochodnej fenazyny) i żółtozielonych pigmentów fluoryzujących. Niektóre z wydzielanych barwników fluoryzujących działają jako siderofory (rozdz. 7. 7). Gatunki Pseudomonas. Pseudomonas aeruginosa (uprzednio P. pyocyanea) jest bakterią wodną, która może wywoływać takie infekcje oportunistyczne u człowieka jak zapalenie ucha środkowego, zakażenia przyranne występujące z charakterystyczną zieleniejąconiebieską ropą, a u pacjentów z ogólnym osłabieniem — nawet posocznicę. Pseudomonas fluorescens i P. putida to inne gatunki występujące w glebie i wodzie, które mogą utleniać różne związki organiczne. Wiele gatunków patogennych dla roślin połączono ostatnio w jeden gatunek P. syringae. U wodnej bakterii P. saccharophila zbadano przebieg rozkładu cukrów w cyklu Entnera-Doudoroffa.

137

Xanthomonas. Żółto ubarwione bakterie patogenne z rodziny Pseudomonadaceae połączono w rodzaj Xanthomonas. Żółty barwnik jest związkiem polienowym zawierającym brominę. Niektóre szczepy Xanthomonas campestris wydzielają egzopolisacharydy (ksantan), które są odporne na rozkład enzymatyczny. Polisacharydy te produkuje się na skalę przemysłową i wykorzystuje jako dodatki do zwiększenia lepkości roztworów wodnych (budynie, zupy dietetyczne, farby drukarskie). Inne gramujemne pałeczki tlenowe. Alcaligenes, Agrobacterium i Rhizobium, bakterie octowe — Acetobacter i Gluconobacter (rozdz. 10. 1) oraz wolnożyjące bakterie wiążące azot atmosferyczny — Azotobacter, Beijerinckia i Derxia (rozdz. 13. 2), to rodzaje metabolicznie przypominające bakterie z grupy Pseudomonas. Alcaligenes, Rhizobium, Agrobacterium. Rodzaje te obejmują bakterie, które sposobem uzyskiwania energii przypominają tlenowe bakterie z grupy Pseudomonas (oddychanie), ale nie mają urzęsienia biegunowego. Ich rzęski są rozmieszczone podbiegunowo lub perytrychalnie (wtedy są nieliczne — 2 do 6). W skład rodzaju Alcaligenes wchodzi względnie autotroficzna bakteria wodorowa A. eutrophus (rozdz. 11. 4). Rhizobium, żyjący w endosymbiozie z roślinami motylkowymi, charakteryzuje się zdolnością do wiązania azotu atmosferycznego (rozdz. 13. 1). Agrobacterium tumefaciens może wytwarzać rakowate narośla na korzeniach, liściach i łodygach roślin (rozdz. 4. 3; ryc. 4. 15). Bakterie chemolitotroficzne. Tlenowe chemolitotrofy (rozdz. l l ) charakteryzują się zdolnością do wykorzystywania nieorganicznych jonów lub związków jako donorów elektronów bądź protonów. Mogą one wykorzystać CO2 jako źródło węgla i wiążą go w cyklu rybulozobisfosforanowym. Większość z tych bakterii to względne autotrofy, mogą więc też wykorzystywać substraty organiczne. Bakterie autotroficzne reprezentują wiele rodzajów, w tym Pseudomonas, Alcaligenes, Aąuaspirillum, Xanthobacter, Mycobacterium, Bacillus i Nocardia. Bakterie pochewkowe. Najlepiej poznaną bakterią nitkowatą jest Sphaerotilus natans. Bakteria ta, zwana często „grzybem ściekowym", rozwija się w zanieczyszczonych płynących wodach, w ściekach z cukrowni, na tamach i biologicznych złożach zraszanych. Tworzy ona nici bądź 138

kłaczki, a na podłożach stałych — skórzaste naloty i powłoki. Bakterie te mogą w krótkim czasie całkowicie zaczopować rury, kanały odpływowe i rowy. Sphaerotilus natans jest jednokomórkową bakterią gramujemną, o politrychalnym urzęsieniu biegunowym. Można ją zaliczyć do grupy Pseudomonas. Rośnie w postaci charakterystycznych długich nici, złożonych z komórek połączonych łańcuchowo we wspólnej, cienkiej, rurkowatej pochewce (ryc. 3. 11). Pochewka zbudowana jest z heteropolisacharydu i można ją traktować jako otoczkę. Bakterie rozmnażają się wewnątrz pochewki w wyniku podziałów poprzecznych i mogą ją opuścić jako ruchliwe pojedyncze komórki. Na pożywkach agarowych tworzą dwa typy kolonii: szorstkie, złożone głównie z form nitkowatych, i gładkie, w których przeważają pojedyncze komórki. Rozmiar komórek, średnica tworzonych filamentów i inne cechy posłużyły do wyróżnienia w tym rodzaju kilku gatunków.

Szeroko rozpowszechnione w wodach zawierających żelazo w postaci Fe(OH)2, a więc w rowach, studniach, sączkach drenarskich i bagnach, tzw. bakterie „ochrowe", zaliczano dawniej do Leptothrix ochracea. Naturalne środowiska, w których występują, są ubogie w potrzebne im związki organiczne, lecz bogate w żelazo. Pochewki tych bakterii są wysycone i pokryte tlenkiem żelaza. Od czasów badań Winogradskiego (1888) sądzono, że są to bakterie autotroficzne utleniające żelazo. Obecnie na podstawie badań fizjologicznych i biochemicznych uważa się, że 139

Leptothrix ochracea i Cladothrix dichotoma, różniąca się od niej formą wzrostu to odmiany Sphaerotilus, mające jedynie inne miejsca występowania.

3. 11. Gramujemne pałeczki względnie beztlenowe Bakterie należące do tej grupy systematycznej charakteryzowane są przez ich produkty fermentacji. W warunkach beztlenowych uzyskują one energię w wyniku fermentacji, wydzielając różne kwasy organiczne, w tym kwas mrówkowy. Jest on charakterystycznym, choć nie głównym produktem fermentacji. Ponieważ przedstawiciele tej grupy, w tym Escherichia coli, Salmonella, Shigella, zasiedlają przewód pokarmowy (gr. enteron), to całą grupę nazwano Enterobacteriaceae. Jest ona opisana w rozdziale 8. 4.

3. 12. Gramujemne bakterie beztlenowe W ekosystemach beztlenowych są rozpowszechnione beztlenowe pałeczki i beztlenowe przecinkowce. Badanie tych mikroorganizmów jest utrudnione z powodu ich wrażliwości na tlen i wymogu dwutlenku węgla do wzrostu. Dopiero niedawno stwierdzono, że przeważają one ilościowo w przewodzie pokarmowym, żwaczu i osadach ściekowych. Pałeczki są bądź nieruchliwe, bądź poruszają się za pomocą rzęsek ułożonych perytrychalnie. Gatunki z rodzaju Bacteroides (B. fragilis, B. succinogenes) są dominującym składnikiem gramujemnej flory ludzkiego kału. Stanowią one do 30% jego masy: w 1 g mokrej masy kału znajduje się 10 1 0 bakterii 6 8 z rodzaju Bacteroides, 10 -10 bakterii z grupy coli i podobna liczba bakterii z rodzaju Streptococcus i Lactobacillus. Stosunek ilości ścisłych beztlenowców do względnych beztlenowców wynosi 40: 1. Bakterie z rodzaju Bacteroides mają metabolizm czysto fermentacyjny. Fermentują one glukozę z wytworzeniem bursztynianu, octanu, mrówczanu, mleczanu i innych kwasów. Nazwa rodzaju Fusobacterium pochodzi od wrzecionowatego kształtu tych długich pałeczek. Głównym, charakterystycznym dla nich produktem fermentacji jest kwas masłowy. Gatunki z tego rodzaju występują w jamie ustnej, przewodzie pokarmowym i kale. 140

Rodzaj Leptotrichia tworzy długie (do 200 μm), nieurzęsione nici. Leptotrichia buccalis występuje w jamie ustnej. Głównym produktem fermentacji glukozy u tych bakterii jest kwas DL-mlekowy. Bakterie o kształcie przecinkowatym są omówione w rozdziale 3. 14 {Selenomonas, Butyrivibrio, Succinivibrio) oraz w innych rozdziałach w powiązaniu z ich właściwościami ekologicznymi i metabolicznymi (Desulfovibrio: rozdz. 9. 2; Selenomonas: rozdz. 8. 3; Butyrivibrio\ rozdz. 8. 5).

3. 13. Archeony Archeony różnią się znacznie od bakterii. Występują one w specyficznych środowiskach, gdzie panują warunki ekstremalne, przypominające te, jakie istniały na Ziemi w najwcześniejszym okresie jej rozwoju, tzn. w erze archaicznej. W skład tej grupy wchodzą zarówno litoautotrofy, jak i heterotrofy, tlenowce, jak i beztlenowce. Mają one wiele wspólnych cech, które odróżniają je od bakterii. W obrębie grupy występują jednak różnice w kształcie i budowie komórek oraz w metabolizmie, podobnie jak u bakterii. Na podstawie obecnego stanu naszej wiedzy archeony można podzielić na trzy grupy: metanogeny, archeony halofilne i archeony termokwasolubne. Cechy wspólne. Wspólne cechy archeonów dotyczą ściany komórkowej, lipidów, aparatu transkrypcji i translacji, koenzymów i grup prostetycznych, mechanizmu autotroficznego wiązania CO2 i wykorzystywanego źródła energii. Opierając się na najnowszych badaniach, przedstawiamy tu ogólny przegląd archeonów, chociaż nasza wiedza na temat tej grupy ma wciąż jeszcze wiele luk. Ściana komórkowa archeonów nie zawiera peptydoglikanu, lecz w niektórych przypadkach — pseudomureinę, w innych białka lub polisacharydy. Tłumaczy to brak wrażliwości archeonów na takie antybiotyki jak penicylina i cefalosporyna oraz na D-cykloserynę, które działają na ścianę komórki bakteryjnej. Błona cytoplazmatyczna archeonów, zamiast estrów kwasów tłuszczowych z glicerolem, zawiera etery glicerolowe izoprenoidów alkilowych z resztami C20-fitanylowymi lub C40-bifitanylowymi. Występują

141

w niej też lipidy obojętne w postaci węglowodorów izoprenoidowych C 15 - C 16

Polimerazy RNA zależne od DNA różnią się tym od bakteryjnych, że składają się z więcej niż czterech podjednostek i są oporne na takie antybiotyki, jak ryfampicyna i streptolidygina. Sekwencja nukleotydowa rybosomowego 16S RNA i 5S RNA archeonów różni się znacząco od RNA bakteryjnych. Translacja u archeonów jest niewrażliwa na chloramfenikol. Hamuje ją toksyna błonicza, która nie działa na translację u bakterii, natomiast hamuje syntezę białek u eukariotów. Pewne grupy prostetyczne i koenzymy archeonów są podobne (choć nie identyczne) do bakteryjnych lub eukariotycznych. Niektóre z nich to: koenzym F 4 2 0 — pochodna 5-deazoryboflawiny, koenzym F 4 3 0 — czynnik niklo-tetrapirolowy, metanopteryna, koenzym Μ i inne. Składniki te odkryto w archeonach metanogennych (rozdz. 9. 4). Autotroficzne wiązanie CO2 nie zachodzi w cyklu rybulozobisfosforanowym. Metanogeny wiążą CO2 poprzez acetylokoenzym A (rozdz. 9. 4); ta droga asymilacji jest też wykorzystywana przez niektóre bakterie. W procesie przekształcania energii (regeneracja ATP) prawdopodobnie uczestniczy potencjał protonowy wykorzystywany przez syntazę ATP. Proces ten można uważać za rodzaj prymitywnego „oddychania beztlenowego". Akceptorami elektronów mogą być dwutlenek węgla, siarka i, tylko u nielicznych archeonów, tlen. Archeony metanogenne. U metanogenów można odnaleźć prawie wszystkie kształty występujące u bakterii: ziarniaki (Methanococcus vannielii); pałeczki (Methanobacterium formicicum); krótkie pałeczki (Methanobrevibacter ruminantium, M. arboriphilicus); śrubowce (Methanospirillum hungatei); pakiety ziarniaków (Methanosarcina barkeri); formy nitkowate (Methanothrix soehngenii), a nawet formy kwadratowe (Methanoplanus limicola). Są gatunki mezofilne i termofilne (Methanobacterium autotrop142

hicum, Methanothermus fervidus). Można wśród nich wyróżnić sześć rodzin, a liczba znanych gatunków i rodzajów wciąż rośnie. Zawartość GC wynosi między 27 a 61%. Ekologia i metabolizm archeonów metanogennych są omówione w rozdziale 9. 4. Archeony halofilne. Wśród rodzajów Halobacterium, Haloferax i Halococcus występują mikroorganizmy ekstremalnie halofilne. Są one tlenowcami i heterotrofami, można je znaleźć w salinach, gdzie odparowuje się wodę morską w celu odzyskania z niej soli. Przyrastająca masa tych archeonów zawierających karotenoidy (haloruberyna) zabarwia wodę na kolor ciemnoczerwony. Optymalny ich wzrost zachodzi w obecności 3, 5-5 Μ NaCl. Archeony te mają szczególną zdolność do wykorzystywania w swoim metabolizmie energii świetlnej (rozdz. 12. 3). Archeony termo-kwasolubne. Obecnie w skład tej niejednorodnej grupy wchodzą termofilne archeony, które nie są metanogenami i mają niewiele cech wspólnych. Są w tej grupie autotrofy i heterotrofy, archeony skrajnie kwasolubne i neutrofile, tlenowce i beztlenowce. Sulfolobus acidocaldarius żyje w kwaśnych, gorących źródłach i utlenia siarkę do siarczanów (rozdz. 11. 2). Archeonem szczególnego rodzaju jest Thermoplasma acidophilus. Nie ma ona ściany komórkowej, podobnie jak mikoplazmy, a rośnie optymalnie w temperaturze 59°C i pH 1-2. Jej zwykłym siedliskiem są samozagrzewające się hałdy węgla, ale można ją też znaleźć w gorących źródłach. Ma najmniejszy genom, jaki dotąd 9 znaleziono wśród prokariotów niepasożytniczych (lxl0 ). Rośnie heterotroficznie w warunkach tlenowych w obecności ekstraktu drożdżowego. Wymienionym wyżej gatunkom tlenowym można przeciwstawić grupę gatunków beztlenowych o wspólnej nazwie Thermoproteales. Izolowano je z gorących źródeł, wulkanów i z dna morskiego. Są ekstremalnymi termofilami, o optymalnych temperaturach wzrostu 85-105°C, a ich metabolizm określa się jako „oddychanie siarkowe" (rozdz. 9. 3). Oznacza to, że utleniają one wodór i redukują siarkę elementarną do siarkowodoru. Grupa ta zawiera względne autotrofy (Thermoproteus tenax), bezwzględne autotrofy (Thermoproteus neutrophilus, Pyrodictium occultum) i heterotrofy (Desulfurococcus, Thermococcus, Thermodiscus). Im bardziej zaawansowane są badania nad tą grupą archeonów, tym jaśniej widać, i to nie tylko na podstawie budowy komórki, że archeony i bakterie rozdzieliły się bardzo wcześnie w czasie ewolucji. Większość 143

archeonów to prawdopodobnie potomstwo tych pierwotnych bakterii, które „nauczyły się" wykorzystywać nieorganiczne donory wodoru (H2) i jego akceptory (CO2, siarka), dostępne w najwcześniejszej erze rozwoju życia. To prawdopodobnie one spowodowały nawarstwienie zredukowanego węgla w skałach osadowych 3 miliardy lat temu.

3. 14. Wygięte pałeczki: śrubowce i przecinkowce Śrubowce i przecinkowce to gramujemne bakterie wodne, poruszające się za pomocą rzęsek. Śrubowce. Charakteryzuje je śrubowaty kształt komórki i dwubiegunowe urzęsienie perytrychalne. Energię uzyskują w procesie oddychania. Istnieje kilka rodzajów tych bakterii. Rodzaj Spirillum ma tylko jeden gatunek, S. volutans. Jest to ogromny śrubowiec, znajdowany często w gnoju świń, znany z zawartości „wolutyny" (polifosforanów). W czystej kulturze można go hodować jedynie w warunkach obniżonej zawartości tlenu (około 5%), jest więc bakterią mikroaerotolerancyjną. Większość śrubowców należy do rodzaju Aquaspirillum (A. itersonii, A. serpens). Również bakterie z tego rodzaju są wrażliwe na ciśnienie cząstkowe tlenu, jakie występuje w powietrzu atmosferycznym. Przecinkowce. Przecinkowce są to względne beztlenowce, metabolicznie podobne do Enterobacteriaceae (fermentacja kwasów mieszanych). Najlepiej poznany jest Vibrio cholerne wywołujący cholerę, przenoszony przez wodę zanieczyszczoną ściekami. Występuje on w przewodzie pokarmowym i wytwarza enzymy atakujące nabłonek jelita oraz egzotoksynę, która powoduje znaczną utratę wody z tkanek, a tym samym odwodnienie organizmu. Bdellovibrio. Bdellovibrio bacteriovorus jest tlenowym mikroorganizmem pasożytującym na innych bakteriach. Są to niewielkie komórki, bardzo ruchliwe dzięki grubej rzęsce o średnicy 50 nm (ryc. 3. 12). Pływają one z szybkością 100 μm/s, a więc w ciągu sekundy przebywają odległość 70 razy większą niż długość ich ciała. Napotkawszy odpowiednią bakterię żywiciela pasożyt ten przywiera nieurzęsionym biegunem do jej ściany komórkowej (ryc. 3. 12) i obraca się wokół swej osi podłużnej. Wkrótce 144

145

potem zaatakowana komórka przekształca się w formę kulistą, podobną do sferoplastu. Bdellovibrio penetruje jej ścianę komórkową i umiejscawia się w przestrzeni peryplazmatycznej. Komórka Bdellovibrio rośnie i wydłuża się, aż do chwili, gdy zostaną wyczerpane związki pokarmowe ze stopniowo malejącego protoplastu żywiciela. Forma cylindryczna dzieli się wielokrotnie, dając komórki o jednakowych rozmiarach. W końcu ściana komórkowa gospodarza ulega lizie i do podłoża zostaje uwolnione potomstwo pasożyta gotowe do zaatakowania następnych bakterii. Postępujący atak pasożyta i liza komórek gospodarza uwidacznia się makroskopowo powstawaniem stref przejaśnień na płytce z gęsto posianą hodowlą (w formie tzw. murawy) lub, w przypadku hodowli płynnej, zmniejszeniem stopnia zmętnienia. W odróżnieniu od bakteriofagów, które namnażają się tylko w bakteriach rosnących, Bdellovibrio może też atakować i komórki nie rosnące. Szczepy Bdellovibrio izolowane z różnych gleb różnicuje się na podstawie powinowactwa do gospodarza. Powodują one lizę przede wszystkim bakterii gramujemnych, głównie z grupy Pseudomonas i bakterii jelitowych. Szczepy dzikie są bezwzględnymi pasożytami bakterii, natomiast niektóre mutanty są zdolne do wzrostu saprofitycznego poza komórką bakteryjną, na pożywkach złożonych. Uważa się, że pasożytniczy tryb życia Bdellovibrio jest przystosowaniem do środowiska o małym stężeniu substancji odżywczych. Przecinkowce ściśle beztlenowe. Druga grupa przecinkowców to bakterie ściśle beztlenowe: Desulfovibrio, Selenomonas, Butyrivibrio i Succinivibrio. Desulfovibrio przeprowadza dysymilacyjną redukcję siarczanów (rozdz. 9. 2). Selenomonas sputigena występuje w jamie ustnej ludzi, a S. ruminantium jest bakterią żwacza. Oba gatunki mają boczne urzęsienie i są zdolne do wzrostu w wyniku fermentacji węglowodanów z wytworzeniem kwasu propionowego i octowego.

3. 15. Krętki Krętki to grupa jednokomórkowych bakterii chemoheterotroficznych o bardzo charakterystycznym kształcie. Wyróżnia je spośród innych bakterii budowa komórki i sposób poruszania się. Mają one kształt spiralnie skręcony, podobnie jak śrubowce, lecz ich ciało jest niezwykle giętkie. Średnica komórek krętków jest niezmiernie mała (0, 1-0, 6 μm)

146

w stosunku do długości (5-500 μm). Przenikają więc one przez większość filtrów bakteriologicznych, które zwykle nie przepuszczają bakterii. Można zatem do ich selekcji zastosować filtrowanie jako metodę wzbogacania.

147

Z powodu niewielkiej średnicy trudno je dostrzec pod mikroskopem w jasnym polu, są jednak dobrze widoczne, jeśli zastosuje się kontrast fazowy lub ciemne pole. Budowa komórki. W komórkach krętków można rozróżnić trzy główne składniki: protoplast w kszałcie spiralnie skręconego cylindra, włókno osiowe i błonę zewnętrzną (ryc. 3. 13). Cylinder protoplazmy jest otoczony kompleksem błony cytoplazmatycznej ze ścianą. Zwinięte wokół niego fibryle zwane są fibrylami osiowymi. Razem tworzą one włókno osiowe. Jeden koniec każdej fibryli jest przyczepiony w pobliżu szczytu komórki, a drugi jest wolny. Liczba fibryli jest różna u poszczególnych gatunków i rodzajów: Treponema pallidum i Leptospira zwykle mają 4, Borrelia — do 18, a u Cristispira jest ich ponad 100. Na ogół na obu końcach komórki znajduje się taka sama liczba fibryli. Mogą one zachodzić na siebie w środkowej części komórki lub na całej jej długości. Zarówno ciało komórki, jak i fibryle okrywa błona zewnętrzna. Ruch. Chociaż krętki nie mają rzęsek, to potrafią pływać, a więc poruszać się bez kontaktu ze stałym podłożem lub ślizgać się na stałych powierzchniach. Ruch jest wywołany działaniem fibryli. Fibryle mają cechy wspólne z rzęskami: budowa białkowa (flagelina), helikalne ułożenie podjednostek budulcowych i sposób zakotwiczenia w ciele komórki. Uważa się, że rotacja lub kurczenie fibryli powoduje charakterystyczne dla krętków rodzaje ruchu, tj. ruch wężowaty, kręty i zginający. Rozprzestrzenienie, siedlisko i najważniejsi przedstawiciele. Wolnożyjące krętki można znaleźć w wielu środowiskach wodnych: w sadzawkach, jeziorach, a nawet w morzach. Inne gatunki należą do normalnej autochtonicznej mikroflory zwierząt. Występują w przewodzie pokarmowym ssaków, na powierzchni orzęsków, w jelitach termitów odżywiających się drewnem i karaluchów, w pręciku krystalicznym mięczaków, w żwaczu i w wielu innych siedliskach. Tylko nieliczne są patogenami wywołującymi takie choroby, jak: syfilis (kiłę), gorączkę powrotną i leptospirozę. Istnieje pięć rodzajów krętków: Spirochaeta, Cristispira, Treponema, Borrelia i Leptospira. 148

Gatunek Spirochaeta plicatilis występuje stale w wodach słodkich i słonych. Nigdy nie spotyka się go w osadach ściekowych, lecz zawsze w strefach mezosaprobowych wód, w stawach, bajorach i w mule, w którym masowo występują bakterie purpurowe. Mikroorganizm ten charakteryzuje się ciągłym ruchem bez odpoczynku. W hodowlach laboratoryjnych może przetrwać tylko krótki okres. Spirochaeta zuelzerae występuje w gnijących osadach różnych wód. Jest ścisłym beztlenowcem, rośnie na podłożach z glukozą i ekstraktem drożdżowym, może wykorzystywać różne cukry, a także skrobię. Optymalna temperatura do wzrostu wynosi 37-40°C. Bakteria ta przypomina Treponema pallidum zarówno wyglądem, jak i właściwościami antygenowymi; daje dodatnią reakcję wiązania dopełniacza z surowicą ludzi chorych na kiłę. Zarówno S. zuelzerae, jak i krętki żwacza fermentują, podobnie jak E. coli, glukozę do mleczanu, octanu, bursztynianu, CO2 i cząsteczkowego H2. Krętki z rodzaju Cristispira żyją w pręciku krystalicznym oraz przewodzie pokarmowym małży słodkowodnych i morskich (Anodonta, Pecten, Wenus i innych). Ich komórki mają skręty drobniejsze niż Spirochaeta plicatilis, a średnicę 0, 5-3 μπα. Na powierzchni cylindrycznej komórki znajduje się delikatna błona falująca, skręcająca się śrubowate wokół niej. Przebieg tej błony wskazuje na sposób ułożenia włókna osiowego. Składa się ona z ponad 100 pojedynczych fibryli. Do rodziny Treponemataceae należą najmniejsze formy krętków. Treponema pallidum jest sprawcą kiły, a T. pertenue wywołuje frambezję — tropikalną chorobę skóry. Liczne krętki są nieszkodliwymi komensalami jamy ustnej; T. macrodentium można łatwo wyizolować ze śliny lub z osadu na zębach. Do rodzaju Borrelia zalicza się beztlenowe krętki, łatwo barwiące się barwnikami anilinowymi. Są one pasożytami różnych stawonogów, a także mogą wywoływać choroby człowieka oraz innych kręgowców. Borrelia recurrentis wywołuje gorączkę powrotną. Ehrlich i Hata posłużyli się B. anserina w badaniach nad zastosowaniem preparatów arsenu w walce z kiłą. Osiągnęli swój cel wprowadzając salwarsan, syntetyczny terapeutyk, bardzo skuteczny w leczeniu tej choroby. Borrelia burgdorferi wywołuje boreliozę zwaną chorobą z Lyme. Jest ona roznoszona przez kleszcze, które rozprzestrzeniają się poprzez zwierzynę płową i ptaki. Infekcję można zwalczyć stosując antybiotyki. Do rodzaju Leptospira należą najmniejsze krętki tlenowe; ich średnica wynosi 0, 1-0, 25 μm, a długość 4-8 μm. Końce komórek są charakterys149

tycznie, haczykowato zagięte. Leptospira biflexa można wyizolować z wód słodkich, takich jak woda wodociągowa, stawy i kałuże. Rośnie ona na zwykłych pożywkach i jest tlenowcem. Spośród patogennych gatunków rodzaju Leptospira najlepiej poznano L. icterohaemorrhagiae wywołującą chorobę Weila, L. pomona wywołującą chorobę pasterzy świń i L. canicola, która powoduje żółtaczkę krwotoczną. Zarazki te dostają się do organizmu z wodą lub pokarmem, przenikają do krwi, nerek i wątroby powodując zaburzenia czynności tych narządów, krwotoki i żółtaczkę.

3. 16. Bakterie o ruchu ślizgowym Niewiele bakterii może się poruszać ruchem ślizgowym lub pełzającym. Połączono je w jedną grupę, którą można podzielić na następujące podgrupy: I. Bakterie zawierające wewnątrzkomórkową siarkę; niektóre z nich tworzą nici {Beggiatoa, Thiothrix), inne są jednokomórkowe (Achromatium). II. Bakterie nie zawierające siarki, występujące w postaci nici, takie jak Vitreoscilla, Leucothrix i Saprospira, oraz Simonsiella i Alysiella izolowane z jamy ustnej (ryc. 3. 14). III. Jednokomórkowe bakterie o kształcie pałeczek, włączając bakterie śluzowe, bakterie z grupy Cytophaga i z grupy Flexibacter. IV. Nitkowata bakteria pełzająca Chloroflexus — jest omówiona łącznie z beztlenowymi bakteriami fototroficznymi (rozdz. 12. 1). V. Sinice, jeśli w ogóle się poruszają, to tylko ruchem ślizgowym. Są opisane w rozdziale 3. 21. Ad I. Beggiatoa jest bezbarwną, nitkowatą bakterią siarkową. Składa się ona z nici o stałej grubości i jest zbudowana podobnie jak Oscillatoria. Niektóre gatunki można identyfikować właśnie na podstawie grubości nici (1, 5-35 μm). Komórki są zwykle wypełnione kropelkami siarki, co sprawia, że bezbarwne nici wydają się białe. Nici poruszają się ruchem ślizgowym. Beggiatoa jest organizmem tlenowym. Występuje masowo, tworząc naloty podobne do pajęczyny na czarnym mule dennym wolno płynących wód lub w morzach, gdzie woda zawierająca dużo siarkowodoru jest w kontakcie z tlenem atmosferycznym. Beggiatoa utlenia siarczki do siarczanów, a produktem pośrednim jest siarka elementarna, która może 150

151

Beggiatoa izolowane ze środowiska wymagają do wzrostu substancji organicznych. Bakterie z rodzaju Thiothrix nie poruszają się swobodnie. Nici, skupione w pęczki, mają podstawy silnie przyczepione do podłoża. Każda nić podzielona jest na podstawę i wierzchołek, ku któremu średnica nici zwęża się z 5 μm do 2 μm. Rozmnażanie zachodzi przez gonidia, które powstają w wyniku zaokrąglenia komórek wierzchołkowych. Gonidia poruszają się ruchem pełzającym po powierzchniach stałych. Zwykle większa liczba gonidiów skupia się i rozwijają się z nich nowe nici. Rodzaj Thiothrix jest znacznie bardziej rozprzestrzeniony niż rodzaj Beggiatoa; rozwija się przede wszystkim w wodach, gdzie zachodzi rozkład materii organicznej z wydzielaniem siarkowodoru. Ad II. Do rodzaju Vitreoscilla należą bezbarwne, tlenowe bakterie, tworzące długie nici, poruszające się ruchem pełzającym i rozmnażające się przez rozpad nici na fragmenty (ryc. 3. 14). Można je izolować z krowiego nawozu. Rodzaj Leucothrix rozwija się epifitycznie na morskich glonach i, biorąc pod uwagę sposób jego wzrostu, można

152

powiedzieć, że jest organotroficznym odpowiednikiem Thiothrix. Nici rosną w postaci pęczków i są przytwierdzone nasadą do podłoża stałego. Spiralnie skręcone sinice z rodzaju Spirulina przypominają podobnie ukształtowane bakterie siarkowe Thiospirillopsis floridana oraz organotroficzne bakterie z gatunku Saprospira grandis. Na rycinie 3. 15 przedstawiono schematycznie bakterie podobne morfologicznie, lecz prezentujące trzy typy metabolizmu (fototroficzne sinice, bezbarwne bakterie utleniające siarkowodór, bakterie utleniające związki organiczne), przy czym formy o podobnej budowie umieszczono obok siebie. Ad III. Bakterie śluzowe to ścisłe tlenowce chemoheterotroficzne, zdolne do ruchu pełzającego. Są mikroorganizmami glebowymi, które w środowis-

153

ku naturalnym tworzą ciała owocowe, zwykle bardzo małe (o średnicy poniżej 1mm). Można je znaleźć na rozkładających się szczątkach roślinnych, gnijącym drewnie, korze drzew i na odchodach zwierząt roślinożernych (mysich, zajęczych). Można je wyhodować z odchodów inkubowanych przez kilka tygodni z wilgotną glebą. Na podłożu stałym bakterie śluzowe rosną w postaci płaskich, rozległych kolonii. Gdy komórki wegetatywne w środku kolonii wytworzą agregaty, zaczynają się różnicować w ciała owocowe, które u różnych rodzajów i gatunków mają charakterystyczny kształt, rozmiar i ubarwienie (ryc. 3. 16, 3. 17). Komórki znajdujące się w ciele owocowym przechodzą w czasie dojrzewania w stan spoczynku, tzn. zostają przekształcone w miksospory. Miksospory są okrągłe (Myxococcus) lub pałeczkowate (ryc. 3. 16) i mogą być zamknięte w cystach. Gatunki bakteriolityczne i celulolityczne można rozróżnić po sposobie odżywiania. Większość bakterii śluzowych może powodować lizę innych bakterii przez wydzielane egzoenzymy. Gatunki celulolityczne zawiera wyłącznie rodzaj Polyangium. Do grupy Cytophaga należą rodzaje Cytophaga i Sporocytophaga,

154

które tlenowo rozkładają celulozę w glebie. Podobnie jak bakterie śluzowe, wykazują ruch pełzający, ale nie tworzą ciał owocowych. Kilka gatunków to względne beztlenowce, które fermentują glukozę z wytworzeniem kwasów organicznych. Wrzecionowate komórki wegetatywne Sporocytophaga mogą przekształcić się w, podobne do miksospor, kuliste formy spoczynkowe, okryte grubą błoną, zwane mikrocystami (ryc. 3. 18). Cytophaga i Sporocytophaga można łatwo wyizolować na celulozie (bibuła filtracyjna) (rozdz. 14. 1).

Do rodzaju Flexibacter należą bakterie wodne, o kształcie długich, bardzo giętkich nici nie podzielonych na komórki (ryc. 3. 18). W czasie długotrwałego hodowania nici te stają się krótsze i mogą rozpadać się, dając komórki ziarniakowate. Liczne bakterie z rodzaju Flexibacter zawierają karotenoidy, dzięki czemu są zabarwione na żółto, różowo bądź pomarańczowo. Obecnie do rodzaju Flexibacter zalicza się bakterię wywołującą u ryb chorobę columnaris (F. columnaris, uprzednio zwany Chondrococcus columnaris).

3. 17. Bakterie tworzące wyrostki, wypustki i pączkujące Do grupy tej należą mikroorganizmy znacznie różniące się od typowych bakterii, albo przez obecność wyrostków (łodyżek) bądź pączków, albo przez tworzenie pozakomórkowych wypustek śluzowych (ryc. 3. 19, 3. 20).

155

156

Bakterie tworzące wyrostki i pączkujące. Pączkowanie jest terminem oznaczającym sposób rozmnażania charakterystyczny dla drożdży. W przeciwieństwie do podziału poprzecznego, jest to podział nierówny, zachodzący w wyniku miejscowego wzrostu komórki. Komórka potomna (pączek) jest zwykle mniejsza niż macierzysta i osiąga normalne rozmiary dopiero po oddzieleniu się. Do grupy bakterii pączkujących należy wiele gatunków wodnych i glebowych. Denitryfikatora Hyphomicrobium vulgare można otrzymać w hodowlach wzbogacanych na podłożu zawierającym azotan i metanol. Występuje on w wodach stojących, w tym w łaźniach wodnych w laboratoriach. Tworzy pączki na końcach długich wyrostków cytoplazmatycznych. Inny mikroorganizm zamieszkujący podobne siedliska to bezsiarkowa bakteria purpurowa Rhodomicrobium vannielii. Zewnątrzkomórkowe wyrostki zwane są łodyżkami. Najlepiej poznano je w grupie bakterii, do której należy Caulobacter (Caulobacter vibrioides, Asticcacaulis), rosnących w postaci mat lub błon w łaźniach wodnych itp. Mają one charakterystyczny kształt i złożony cykl życiowy. Biegunowo urzęsione pałeczki przylegają do powierzchni stałych, w tym nawet do innych bakterii, urzęsionym końcem, który zamienia się następnie w łodyżkę; bakteria dzieli się, a komórka potomna tworzy na wolnym biegunie nową rzęskę. W wyniku szczegółowych badań skorupiaków, roślin wodnych i organizmów żyjących na powierzchni wody poznano dalsze bakterie o niezwykłych kształtach, takie jak np. Prosthecomicrobium, Ancalomicrobium i Pedomicrobium. Bakterie tworzące wypustki. Niektóre z bakterii szeroko rozpowszechnionych w przyrodzie są osiadłe dzięki wypustce składającej się ze śluzu. Na przykład Gallionella ferruginea, bakteria o kształcie fasoli, wydziela we wklęsłej części komórki pasmo śluzu wysyconego wodorotlenkiem żelazowym. Pod mikroskopem widać, że wypustka ta jest spiralnie skręcona. Gallionella jest najlepiej poznaną bakterią żelazową. Rośnie obficie, szczególnie wiosną, w wodach zawierających żelazo, takich jak strumienie, rury odpływowe itp. Nevskia ramosa była niejednokrotnie izolowana z kożuszka, jaki tworzy na powierzchni stawów, rowów bagiennych i w wodnych łaźniach laboratoryjnych. Charakterystyczne dla tej bakterii biegunowe wydzielanie śluzu zachodzi tylko w przypadku braku składników pokarmowych.

157

3. 18. Bezwzględne pasożyty komórkowe O tym, że wzrost i rozmnażanie niektórych bakterii są całkowicie uzależnione od innych żywych komórek, wspomniano już w rozdziale 3. 14, przy omawianiu Bdellovibrio bacteriovorus. Jest prawdopodobne, że bakterie, które występują jako endosymbionty owadów i orzęsków, są bezwzględnie związane ze swoimi gospodarzami. Przyczyną takiego pasożytnictwa komórkowego są zwykle degeneracyjne zmiany w metabolizmie. Najlepiej poznanymi bezwzględnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi są riketsje i chlamydie. Są one patogenami zwierząt i człowieka. Struktura ich ściany komórkowej jest taka jak u bakterii gramujemnych. Riketsje. Riketsje otrzymały swą nazwę od nazwiska H. T. Rickettsa, odkrywcy zarazka gorączki plamistej z Gór Skalistych. Mówi się też o tej grupie mikroorganizmów jako o grupie wywołującej „gorączki plamiste", ze względu na chorobę wywoływaną przez najlepiej poznaną riketsję — Rickettsia prowazekii. Naturalnym siedliskiem riketsji są stawonogi (kleszcze, wszy, roztocza, pchły), w których występują one jako nieszkodliwe pasożyty lub nawet symbionty. Po przeniesieniu przez ukłucie, zadrapania bądź inhalację, na inne zwierzęta lub człowieka, wywołują poważne objawy chorobowe. Chociaż rozmiary riketsji są tego samego rzędu wielkości co rozmiary wirusów ospy, to można je jednoznacznie odróżnić od wirusów. Zawierają one zarówno DNA, jak i RNA — w stosunku 1: 3, 5. Komórki otoczone są ścianą komórkową zawierającą kwas muraminowy i wrażliwą na lizozym. W obrazie cienkich skrawków oglądanych w mikroskopie elektronowym można wyróżnić region jądrowy i ścianę komórkową. Większości riketsji nie udało się wyhodować poza żywymi komórkami. Namnaża się je w zapłodnionych jajach kurzych lub w zwierzętach 9 laboratoryjnych; z jednego żółtka jaja kurzego można uzyskać 10 bakterii. W komórkach riketsji wykazano obecność enzymów metabolizmu pośredniego. W czasie przechowywania aktywność metaboliczna komórek spada; oddychanie wzmaga się po dodaniu ATP, kwasów organicznych i aminokwasów. Riketsje mają więc swój własny metabolizm, jednak wydaje się, że wskutek zmienionej przepuszczalności osłon komórkowych nie są w stanie kontrolować pobierania substancji i wydzielania metabolitów. 158

Najlepiej poznano grupę riketsji wywołujących gorączkę plamistą. Rickettsia prowazekii wywołuje epidemicznie dur osutkowy. Rezerwuarem zarazka jest człowiek. Zarazek jest przenoszony przez wszy (wesz głowową lub odzieżową), które w ciągu kilku dni giną pod wpływem pasożyta. Infekcja następuje przez odchody zakażonych wszy. Rickettsia typhi wywołuje endemiczny dur mysi o podobnym, lecz łagodniejszym przebiegu choroby. Nosicielem zarazka są szczury, które nie wykazują objawów choroby. Bakterie są przenoszone z jednego osobnika na drugiego, a niekiedy także na człowieka przez pchły szczurze. Podczas gdy wymienione riketsje są dość wrażliwe na ogrzewanie i wysychanie, Coxiella burnetii, wywołująca gorączkę Q, wytrzymuje działanie tych niekorzystnych warunków nawet poza żywicielem. Jest przenoszona przez kleszcze na owce, kozy, krowy. Do zakażenia człowieka może dojść nie tylko przez ukłucie kleszcza, lecz także za pośrednictwem wełny, sierści, zakażonej gleby i mleka. Pasteryzacja mleka (60°C, 30 min) nie niszczy komórek Coxiella. Chlamydie. Chlamydie są patogenami ludzi. Chlamydia trachomatis wywołuje jaglicę (trachomę), która zaczyna się od zapalenia spojówek i prowadzi do ślepoty, oraz chorobę weneryczną — ziarniaka wenerycznego pachwin. W obu przypadkach zakażenie następuje przez kontakt. Chlamydia psittaci wywołuje choroby ptasie, z których najlepiej poznana jest choroba papuzia, objawiająca się gorączką i zapaleniem płuc. Chlamydie są przenoszone głównie przez ptaki. Na podstawie cech biochemicznych chlamydie zalicza się do prokariotów (bakterie). Wcześniej uważano, że są one wirusami. Mikroorganizmy te zawierają RNA i DNA w proporcji charakterystycznej dla bakterii. Syntetyzują związki, których nie potrafią syntetyzować komórki eukariotyczne, takie jak kwas muraminowy, kwas diaminopimelinowy, D-alanina i kwas foliowy. Zgodna z tymi cechami jest ich wrażliwość na penicylinę i sulfonamidy. Ich genom jest bardzo mały (względna masa cząsteczkowa 0, 66x109) i odpowiada jedynie około jednej czwartej informacji genetycznej E. coli. Chlamydie rosną wyłącznie w żywych komórkach, można je hodować na jajach kurzych i w hodowlach tkankowych. Ich zależność od metabolizmu gospodarza wynika z braku własnego systemu wytwarzającego ATP. Są niezdolne do fosforylowania glukozy i metabolizowania jej. Z drugiej strony, niezwykle łatwo pobierają ATP i koenzym A. Można je zatem uważać za „pasożyty energetyczne". 159

Istnienie obligatoryjnych pasożytów wewnątrzkomórkowych jest wynikiem ewolucji zstępującej. Przystosowaniu się bowiem bakterii do komórek żywiciela towarzyszy utrata zdolności do syntezy różnych związków.

3. 19. Mikoplazmy Bakterie należące do grupy Mycoplasma (klasa Mollicutes) są najmniejszymi, samodzielnie replikującymi się organizmami prokariotycznym!. Nie mają one ściany komórkowej. Ponieważ ich protoplasty otoczone są jedynie błoną cytoplazmatyczną, są one osmotycznie niezwykle labilne. Rozmiar genomu różnych mikoplazm {Mycoplasma i Ureaplasma) odpowiada jedynie frakcji genomu E. coli. Ich chromosom, składający się z 500-900 tys. p. z, jest najmniejszym genomem prokariotycznym zdolnym do samodzielnej replikacji. Rząd Mycoplasmatales podniesiono więc do rangi specjalnej klasy bakterii — nazwanej Mollicutes (o miękkiej

160

skórze), aby zaznaczyć filogenetyczną odrębność tej grupy od innych bakterii. Pierwszy opisany przedstawiciel mikoplazm to zarazek wywołujący pleuropneumonię, czyli zapalenie płuc z wysiękiem opłucnej u bydła. Stąd pochodzi pierwotna nazwa tej grupy bakterii — PPLO (ang. pleuropneumonia like organisms). Na podłożu agarowym zawierającym surowicę krwi rozwijają się one w postaci małych kolonii, przypominających wyglądem sadzone jaja. Mikoplazmy wywołują różne choroby, mogą także zakażać hodowle tkankowe, ale występują też jako nieszkodliwe pasożyty. Kolonie mikoplazmy składają się z komórek i ich fragmentów o różnej wielkości, które można opisać jako ziarniaki, nici, płytki i rozetki. Bakterie te rozmnażają się przez podział poprzeczny, fragmentację nici i pierścieni na komórki ziarenkowate lub w sposób przypominający rodzaj pączkowania. W podłożach płynnych tworzą formy bardzo nieregularne, czasem rozgałęzione (ryc. 3. 21), które, podobnie jak wirusy, mogą przenikać przez filtry membranowe. Występowanie i gatunki. Przedstawiciele grupy Mycoplasma (rodzaje Mycoplasma, Acholeplasma i Spiroplasma) są bakteriami pasożytniczymi. Nie zabijają swoich gospodarzy, lecz wywołują najczęściej stan chronicznej infekcji; są więc pasożytami bardzo skutecznymi. U zwierząt mogą występować jako nieszkodliwe pasożyty nabłonka śluzowego układu oddechowego i rozrodczego (u ssaków i ptaków). Są pasożytami błon w tym sensie, że przylegają ściśle do komórek nabłonkowych. Nie wydzielają toksyn, ale z powodu ścisłego kontaktu pasożyta, który nie ma ściany komórkowej, z komórką gospodarza, nawet słabo toksyczne metabolity, takie jak jony amonowe lub nadtlenek wodoru, mogą działać toksycznie na komórki gospodarza. Pasożyty zwierząt należą do dwóch rodzajów. Bakterie z rodzaju Mycoplasma wymagają do wzrostu cholesterolu lub złożonych steroidów (tzn. podłoża zawierającego surowicę krwi). Dla tych, które nie wymagają cholesterolu lub podobnych związków, utworzono rodzaj Acholeplasma. U niektórych zwierząt infekcje mikoplazmami mogą być bezobjawowe, u innych zaś bakterie te wywołują stan zapalny dróg oddechowych, płuc lub wymion. Swoistość bakterii z rodzaju Mycoplasma w stosunku do gospodarza jest wyrażona w nazwie gatunkowej np. Mycoplasma canis, M. gallisepticum, M. hominis. Pewne mikoplazmy powodują żółknięcie roślin. Umiejscawiają się

161

one głównie w łyku układu przewodzącego. Z powodu morfologicznego podobieństwa do śrubowców (spirillum) zaliczono je do rodzaju Spiroplasma. Spiroplasma citri wywołuje żółknięcie drzew cytrusowych. Stwierdzono, że podobne bakterie występują też w innych roślinach (kukurydza, opuncje, ryż). Znaleziono je również w pszczołach i pasikonikach. Przypuszcza się, że owady są nie tylko nosicielami tych bakterii, ale także ich gospodarzami. Właściwości biochemiczne. Grupę Mycoplasma odróżniają od innych bakterii również pewne cechy biochemiczne, a nie tylko brak ściany komórkowej. Mikroorganizmy te rosną wyłącznie w podłożach izotonicznych bądź hipertonicznych (z sorbitolem lub sacharozą) i wymagają do wzrostu puryn, pirymidyn, a także lipidów i steroidów. Brak chinonów i cytochromów świadczy o ich bardzo skróconym łańcuchu oddechowym. Związek z formami L. Z populacji komórek Streptobacillus moniliformis wyizolowano w 1934 roku szczep rosnący w formie nieregularnych protoplastów. Komórki te nazwano formami L, od Instytutu Listera w Londynie, gdzie zostały wyizolowane. Nagie, zdolne do wzrostu protoplasty można też uzyskać hodując Salmonella, E. coli, Proteus, a także inne bakterie, na podłożu agarowym z surowicą i penicyliną (100 μg/ml). Formy te wytwarzają kolonie przypominające sadzone jajko, podobnie jak bakterie z rodzaju Mycoplasma. Wyizolowano dwa typy form L: labilne, które na pożywce bez penicyliny stają się ponownie normalnymi komórkami z kompletną ścianą komórkową, oraz formy stabilne, które nie tworzą ścian komórkowych, nawet po usunięciu penicyliny. Przyjmowano początkowo, że mikroorganizmy typu Mycoplasma powstały w wyniku zmutowania normalnych bakterii do stabilnych form L. Rozmiar genomu i zawartość GC mikoplazm zaprzecza jednak tej hipotezie i sugeruje, że stanowią one odrębną klasę bakterii.

3. 20. Beztlenowe bakterie fototroficzne Beztlenowe bakterie fototroficzne {Rhodospirillales) posiadają barwniki fotosyntetyczne i zależą od światła jako źródła energii. Na podstawie cech fizjologicznych wyróżniono cztery rodziny: purpurowe bakterie siarkowe 162

(Chromatiaceae), purpurowe bakterie bezsiarkowe (Rhodospirillaceae), zielone bakterie siarkowe (Chlorobiaceae) i grupę Chloroflexus {Chloroflexaceae). Stanowią one grupę filogenetyczną, która jest omówiona w powiązaniu z fotosyntezą w rozdziale 12.

3. 21. Tlenowe bakterie fototroficzne: sinice Już od dawna, ze względu na podział komórki, zaliczano sinice wraz z bakteriami do Schizophyta. Z powodu jednak cech fizjologicznych wspólnych z roślinami zielonymi włączano je do królestwa roślin jako glony niebieskozielone i traktowano zgodnie z zasadami taksonomicznymi stosowanymi przez botaników. Odkąd jednoznacznie rozróżnia się prokariota i eukariota, sinice zostały definitywnie włączone do bakterii. Sinice, podobnie jak glony i rośliny wyższe, mają chlorofil a i inne barwniki, a ich fotosyntezie towarzyszy wydzielanie tlenu. Dawniej zaliczano je więc do glonów i nazywano glonami niebieskozielonymi. Jednak już F. Cohn, na podstawie sposobu podziału komórki, wyodrębnił je w grupę Schizophyceae i wraz z Schizomycetes (dzisiejsze bakterie) zaliczył do Schizophyta. I rzeczywiście takie cechy jak budowa komórki, ściana komórkowa zawierająca mureinę, obecność rybosomów 70S i inne świadczą o tym, że sinice są gramujemnymi mikroorganizmami prokariotycznym!. Sinice to największa, najbardziej zróżnicowana i najbardziej rozpowszechniona grupa fotosyntetyzujących prokariotów. Dzięki zdolności do wzrostu w ekstremalnych siedliskach i wiązania azotu atmosferycznego odgrywają one bardzo ważną rolę w gospodarce przyrody. Niektóre sinice są ruchliwe. Ich ruchliwość nigdy nie jest jednak związana z rzęskami, lecz polega na ślizganiu się bądź pełzaniu po powierzchniach stałych. Ten typ ruchu jest też charakterystyczny dla niektórych innych grup bakterii. Morfologia i klasyfikacja. Wśród sinic występują zarówno formy jednokomórkowe, jak i wielokomórkowe. Można je podzielić na pięć grup ze względu na morfologię (ryc. 3. 22). Grupa 1. Jednokomórkowe pałeczki i ziarniaki zostały zebrane w grupę sinic chrookokalnych. Ich komórki występują pojedynczo lub łączą się w agregaty dzięki otoczkom bądź śluzowi. Dzielą się przez podział poprzeczny lub przez pączkowanie. W skład tej grupy wchodzą Synecho163

coccus (uprzednio Anacystis nidulans), Gleocapsa, Gloeothece i Gloeobacter violaceus. Grupa 2. W skład grupy sinic pleurokapsularnych wchodzą formy jednokomórkowe, ale tylko te, które mogą się rozmnażać przez podziały wielokrotne. W czasie tego procesu w dzielącej się komórce macierzystej powstaje wiele małych komórek, tzw. beocytów. Przedstawicielami tej grupy są Pleurocapsa, Dermocarpa i Myxosarcina. Opisane poniżej trzy grupy charakteryzują się tworzeniem nici złożonych z łańcuchów komórek, które wykazują ruch ślizgowy. Ich wzrost jest interkalarny, tzn. zachodzi przez podział komórek w obrębie nici. Rozmnażanie następuje też przez rozerwanie nici i tworzenie hormogoniów. Z tego powodu grupę sinic nitkowatych nazywano hormogonalnymi glonami niebieskozielonymi. Znane są trzy grupy sinic tworzących nici. 164

Grupa 3. Sinice nitkowate nie tworzące heterocyst. Nici składają się wyłącznie z komórek wegetatywnych. Typowe dla tej grupy są: Oscillatoria („glon drgający"), Spirulina, Lyngbya, Phormidium i Plectonema. Grupa 4. Nitkowate sinice tworzące heterocysty. Kiedy nici są hodowane bez azotu w formie związku dodanego do podłoża, niektóre komórki różnicują się i tworzą heterocysty. W pewnych wypadkach mogą pojawiać się akinety, grubościenne komórki spoczynkowe. W skład tej grupy wchodzą rodzaje Anabaena, Nostoc i Calotrix. Grupa 5. Nitkowate sinice tworzące heterocysty. Przedstawicieli tej grupy różni od grupy poprzedniej sposób podziału komórki w więcej niż jednej płaszczyźnie. Najlepiej poznanym rodzajem z tej grupy jest Fischerella. Ekologia. Sinice występują w jeziorach i innych wodach, w glebie i na polach ryżowych. Można je zobaczyć gołym okiem jako ciemnoniebieskie lub czarne naloty na skałach w strefie literalnej jezior i oceanów. Czarne linie zaznaczające poziom wody, jakie często widać na skałach wapiennych, to strefy wzrostu sinic chrookokalnych. W jeziorach eutroficznych występują nagłe zakwity sinic niebieskozielonych {Anabaena) lub zabarwionych na czerwono (Oscillatoria rubescens) (patrz rozdz. 17. 1). Zdolność wiązania azotu atmosferycznego powoduje, że sinice są organizmami pionierskimi w ubogich siedliskach, takich jak piaszczyste plaże i pustynne skały. Potrafią one znaleźć schronienie w zagłębieniach i szczelinach i są zdolne do wzrostu endolitycznego. Mogą też żyć w innych ekstremalnych warunkach. Niektóre sinice jednokomórkowe (Synechococcus lividus) tolerują niskie pH i mogą rosnąć w kwaśnych, gorących źródłach (pH 4, 0, 70°C). Inne gatunki sinic żyją w symbiozie: Nostoc rośnie w poroście Peltigera oraz w korzeniach Cycas i Gunnera, zaś Anabaena azollae — w przestworach międzykomórkowych wodnej paproci Azolla. Komórka: budowa i składniki. Komórki sinic są zbudowane bardzo podobnie do komórek bakterii gramujemnych (ryc. 2. 4). Protoplast jest otoczony ścianą komórkową, w której występuje warstwa mureiny pokryta błoną zewnętrzną, zawierającą lipopolisacharydy. Wiele sinic wydziela egzopolisacharydy tworząc rozpuszczalny śluz lub otoczki, które pokrywają poszczególne komórki bądź, w postaci pochewek, otaczają całe nici. Aparat fotosyntetyczny tworzą tylakoidy, które ułożone są albo równolegle do błony cytoplazmatycznej, albo występują w postaci 165

pofałdowanej na obrzeżach komórki (ryc. 3. 23). Błona tylakoidów zawiera chlorofil a, β-karoten i ketokarotenoidy, takie jak miksoksantofil, echineon i zeaksantyna, oraz składniki fotosyntetycznego systemu transportu elektronów. Cechą charakterystyczną tylakoidów sinic (i krasnorostów) jest obecność fikobilisomów, tj. krążkowatych struktur przyczepionych do zewnętrznej powierzchni tylakoidów. Składają się one z fikocyjaniny fikobiliprotein (75%), allofikocyjaniny (12%) i fikoerytryny oraz kilku bezbarwnych polipeptydów. Dwa ostatnie składniki stanowią około 12%. Fikobiliproteiny z kolei składają się z białek i ich grup prostetycznych — fikocyjanobiliny i fikoerytrobiliny. Działają one jako przekaźniki i oddają zaabsorbowaną energię głównie fotosystemowi II. Chlorofil a współdziała jedynie z fotosystemem I. Fikobilisomy mogą stanowić do 50% wszystkich białek komórkowych. Fikobiliny są bardzo podobne do barwników żółci. W czasie ich syntezy najpierw powstaje porfiryna; przy otwarciu jej pierścienia atomy węgla z grup metylenowych zostają uwolnione w formie tlenku węgla. 166

Synteza fikobilin jest jednym z niewielu procesów, podczas którego tworzy się tlenek węgla. Tylko jedna z sinic, Gloeobacter violaceus, nie posiada tylakoidów i fikobilisomów, ma chlorofil a umiejscowiony w błonie cytoplazmatycznej, a białka fikobilinowe są przyłączone, w postaci ciągłej warstwy, do wewnętrznej części błony cytoplazmatycznej. U wielu sinic barwa padającego światła wpływa na stosunek ilościowy barwników niebieskich i czerwonych. W świetle niebieskim i zielonym syntetyzowana jest głównie fikoerytryna, w świetle czerwonym przeważa fikocyjanina. Taka komplementarna „adaptacja chromatyczna" zapewnia skuteczne wykorzystanie światła w różnych siedliskach (np. w niebieskim świetle w głębokich wodach czy pod baldachimem liści). Inkluzje komórkowe. Wszystkie sinice mogą gromadzić ziarna glikogenu i polifosforanów, natomiast tylko kilka gatunków — kwas poli-β-hydroksymasłowy. Ziarna cyjanoficyny są materiałem zapasowym odnajdywanym tylko u sinic. Na podstawie dodatniej reakcji z barwnikami charakterystycznymi dla białek stwierdzono, że są one polipeptydami. Składają się z poliasparaginianu z argininą przyłączoną do każdej wolnej grupy karboksylowej, tak więc zawierają asparaginian i argininę w stosunku 1: 1. Polimer ten stanowi zapas azotu. Jego ilość maleje w czasie niedoboru azotu i rośnie po dodaniu źródła azotu. Jest on gromadzony głównie w heterocystach. Może być też jednak, choć w mniejszym stopniu, źródłem energii, gdyż w warunkach beztlenowych może służyć do regeneracji ATP przez rozkład do ornityny i karbamoilofosforanu. W komórkach wielu sinic znajdują się karboksysomy (rozdz. 2. 2. 7). Formy wodne sinic, występujące w wodach stratyfikowanych lub jako zakwity, są wyposażone w wakuole gazowe. Komórki wyspecjalizowane. Sinice są zdolne do tworzenia pewnej liczby wysoce wyspecjalizowanych komórek, które nie mają sobie podobnych w innych grupach bakterii. W mikroskopie świetlnym można zauważyć heterocysty dzięki ich grubej ścianie komórkowej, słabej pigmentacji i załamującym światło, polarnym ziarnistościom. Ich ultrastrukturę zbadano w mikroskopie elektronowym (ryc. 3. 24). Polarne ziarnistości to ziarna cyjanoficyny, a zwarte warstwy otaczające gramujemną ścianę komórkową składają się 167

z polisacharydów zbudowanych z glukozy, galaktozy, mannozy i ksylozy połączonych wiązaniami β-1, 3-glikozydowymi. Heterocysty są odporne na działanie lizozymu. Przez pory są one połączone w nici z sąsiadującymi z nimi komórkami wegetatywnymi. Heterocysty są miejscem wiązania azotu atmosferycznego w warunkach tlenowych. Powstają one, gdy brakuje azotu w formie związku chemicznego (NH4+ lub NO 3 - ). Różnicowaniu morfologicznemu heterocyst towarzyszą zmiany biochemiczne. Syntetyzowana jest nitrogenaza, a białka fikobilinowe ulegają degradacji, natomiast chlorofil a zostaje zachowany. Ponieważ w dojrzałych heterocystach nie ma białek fikobilinowych i funkcjonalnego fotosystemu II, nie mogą one wytwarzać tlenu. Obecny jest jedynie fotosystem I, który pozwala na prowadzenie cyklicznej fotofosforylacji i regeneracji ATP. Zmiany te stwarzają dogodne warunki do działania wrażliwej na tlen nitrogenazy. Komórki wegetatywne dostarczają heterocystom źródła węgla organicznego, a otrzymują od nich związany azot, głównie w formie glutaminy. Akinety to formy przetrwalne. Można je rozpoznać po rozmiarze, intensywnym zabarwieniu i grubych ścianach komórkowych, a więc podobnie jak heterocysty są to komórki zróżnicowane morfologicznie. W nici mogą być położone terminalnie (u Cylindrospermum) bądź między innymi komórkami (u Anabaena) (ryc. 3. 22). Hormogonia to krótkie odcinki nici utworzone wskutek rozerwania dłuższych filamentów. Ich tworzenie sprzyja rozprzestrzenianiu się sinic. 168

Powstawanie hormogoniów u Oscillatoria prowadzi do zniszczenia przynajmniej jednej komórki nici, jako że komórki są połączone wspólną warstwą peptydoglikanu, która nie jest podzielna. Zachodzi tu poprzeczny podział komórki. Beocyty to „małe komórki", czyli komórki reproduktywne sinic pleurokapsularnych. Powstają one wskutek wielokrotnych podziałów komórki macierzystej. Są otoczone wspólną ścianą, pozostałą po komórce macierzystej, i dodatkowo grubą warstwą włóknistego egzopolisacharydu. U Dermocarpa, na przykład, szybkie podziały poprzeczne prowadzą do wytworzenia od 4 do 1000 beocytów. Ruch ślizgowy. Wiele sinic cechuje się ruchliwością (np. te, które tworzą nici). Ruchliwe są też hormogonia i wiele beocytów. Jest to wyłącznie ruch pełzający, a więc odbywa się na stałym podłożu. Ruch zachodzi przez rotację nici wokół jej osi podłużnej, to wywołuje wrażenie kołysania lub drgania (stąd nazwa Oscillatoria). Gdy na powierzchnię Oscillatoria princeps naniesiono kropelkę barwnika, stwierdzono, że poruszając się wykreśla ona spiralę o skoku 60°. Badania ultrastrukturalne wykazały, że w jej ścianie komórkowej występują spiralnie ułożone fibryle o podobnym skoku. Sugeruje to, że ruch mógłby zachodzić przez falowe skręcanie fibryli. Kierunek ruchu jest odwracalny. Wiele sinic wykazuje fototaksję i gromadzi się w odpowiednio oświetlonych miejscach. Wiązanie azotu. Wszystkie sinice, które tworzą heterocysty, są zdolne do wiązania azotu atmosferycznego. Heterocysty są komórkami wyspecjalizowanymi pod względem morfologicznym i fizjologicznym do wiązania azotu (patrz powyżej — akapit dotyczący heterocyst). Wielkim zaskoczeniem było odkrycie, że informacja genetyczna dotycząca syntezy nitrogenazy (gen nif) jest nawet w komórkach pleurokapsularnych i w sinicach nie tworzących heterocyst (grupa Oscillatoria). Wydaje się, że w mikrooorganizmach tych wiązanie azotu jest zablokowane w normalnych warunkach wzrostu na świetle, gdyż enzym nitrogenaza jest niezwykle wrażliwy na tlen. Syntezę enzymu można jednak odblokować i wykazać jego obecność stosując odpowiednie warunki. Inkubacja komórek w warunkach beztlenowych na świetle, w obecności herbicydu DCMU (dichlorofenylometylomocznik), który hamuje fotosystem II, a tym samym powstawanie tlenu, prowadzi do wytworzenia nitrogenazy. Wyka-

169

zano w ten sposób, że ponad 50% wszystkich zbadanych szczepów jest zdolnych do wytwarzania nitrogenazy. Do wiązania azotu są też zdolne niektóre szczepy sinic chrookokalnych. Nie wiadomo, w jaki sposób ich nitrogenaza jest chroniona przed tlenem wytwarzanym w czasie fotosyntezy. Metabolizm beztlenowy. Wiele sinic występuje w wodach zawierających znaczne stężenia siarkowodoru (około 5 mmol/1). Badania nad Oscillatoria limnetica wykazały, że w obecności H2S fotosystem II jest nieaktywny i zachodzi fotosynteza beztlenowa, podobna do tej, jaka występuje u beztlenowych, purpurowych bakterii siarkowych: CO2 + 2H2S -> + H2O + 2S Zdolność wielu sinic do życia w warunkach beztlenowych ma prawdopodobnie znaczenie tylko w nielicznych siedliskach. Bezwzględna fotoautotrofia. Wiele sinic to bezwzględne fotoautotrofy, tj. mogą rosnąć wyłącznie w obecności światła. Tylko kilka szczepów może rosnąć chemoorganotroficznie w ciemności, utleniając cukry. W tych przypadkach szybkość wzrostu jest zawsze znacznie mniejsza niż w warunkach fotoautotroficznych. Bakterie prochloralne. Niedawno odkryto mikroorganizmy fototroficzne, które łączą cechy typowe dla prokariotów z pewnymi cechami zielenic. Z jednej strony mają one typową budowę prokariotyczną (gramujemna ściana komórkowa z peptydoglikanem, brak organelli i prawdziwego 9 jądra, rozmiar genomu 3, 6xl0 ), ale zawierają oprócz chlorofilu a, również chlorofil b, który był znajdowany dotychczas jedynie w zielenicach. Od sinic odróżnia je brak białek fikobilinowych, cyjanoficyny i kwasu poli-β-hydroksymasłowego. Dotychczas znaleziono dopiero dwie bakterie z tej grupy. Prochloron występuje jako egzosymbiont na różnych rodzajach żachw (zwierząt morskich, jednego z podtypów osłonic), ale trudno jest go wyhodować na podłożach syntetycznych. Prochlorothrix hollandica jest słodkowodną, wolno żyjącą bakterią nitkowatą, którą można hodować na podłożu mineralnym na świetle.

WIRUSY: WYSTĘPOWANIE I BUDOWA

Określenie „wirus" (trucizna) pierwotnie było używane w odniesieniu do pewnych patogennych czynników, o których wiedza była bardzo niewielka. Ostatecznie tym terminem objęto grupę chorobotwórczych czynników zdolnych do przechodzenia przez filtry bakteriologiczne (co zostało odkryte przez Iwanowskiego w 1892 r. ) i nazwanych wirusami przesączalnymi lub po prostu wirusami. Wirusy różnią się od mikroorganizmów następującymi właściwościami: 1. Zawierają one tylko jeden rodzaj kwasów nukleinowych — albo RNA, albo DNA. 2. Kwas nukleinowy jest niezbędny, choć niewystarczający do ich namnażania (reprodukcji). 3. Są one niezdolne do reprodukcji poza żywą komórką. Tak więc wirusy nie są niezależnymi organizmami, lecz potrzebują do namnażania żywych komórek. Reprodukcja zachodzi wewnątrz komórki gospodarza, ponieważ replikacja kwasu nukleinowego i synteza białkowego płaszcza wirusa jest uzależniona od tej komórki. Proces ten prowadzi zazwyczaj do śmierci komórki gospodarza. Wirus poza komórką nazywany jest cząstką wirusową lub wirionem. Cząstka wirusowa składa się z kwasu nukleinowego i białkowego płaszcza zwanego kapsydem. Jest więc ona nukleokapsydem. Obecność wirusów ujawnia się w wyniku ich rozwoju w organizmie gospodarza. Niszczą one grupy komórek, powodując uszkodzenie tkanki, powstanie nekrotycznych plam i litycznych łysinek (ryc. 4. 1). Naturalnymi gospodarzami wirusów są rośliny, zwierzęta i mikroorganizmy.

171

Wirusy roślinne. Wirusy roślinne uzyskują dostęp do swego gospodarza przez uszkodzenia powłoki, nie potrafią zaś aktywnie wnikać do tkanki. Ilościowe oznaczanie wirusów roślinnych opiera się na rozwoju plam nekrotycznych wokół sztucznie wytworzonych pierwotnych uszkodzeń. W warunkach naturalnych wirusy rozprzestrzeniają się w wyniku bezpośredniego kontaktu lub za pomocą tzw. wektorów (czyli innych organizmów), często wnikają do tkanki liściowej przez zranienia powstałe w wyniku otarcia. Pasożyt roślinny Cuscuta wnika do rośliny za pomocą haustorii, otwierając równocześnie bezpośrednie połączenie między gospodarzem i swoim układem przewodzącym, co tworzy drogę transportu dla wirusów. Wiele wirusów jest roznoszonych przez owady. W niektórych przypadkach wirus namnaża się w przewodzie pokarmowym owada (wirus persystentny) i do zainfekowania kolejnej rośliny może dojść dopiero po pewnym czasie inkubacji w jego wnętrzu. Wirusy nieprzewlekłe są wprowadzane bezpośrednio i biernie w wyniku nakłucia owadów. Wirusy powodują wiele chorób roślin. Duże znaczenie ekonomiczne ma wirus zarazy ziemniaczanej. Najintensywniej badanym i najlepiej poznanym wirusem roślinnym jest wirus mozaiki tytoniu (TMV — ang. 172

tabacco mosaic virus). Materiałem genetycznym większości wirusów roślinnych jest jednoniciowy RNA. Zwierzęce wirusy chorobotwórcze. Wirusy te wywołują wiele chorób ludzi i organizmów zwierzęcych. Można tu wymienić takie choroby, jak: ospa prawdziwa, ospa wietrzna, odra, wścieklizna, paraliż dziecięcy (polio), grypa, pospolite przeziębienie, choroba pyska i racic (u bydła) itd. Również te wirusy mogą być przenoszone przez bezpośredni kontakt lub za pośrednictwem owadów, ale właściwe wniknięcie do wnętrza komórki gospodarza następuje w wyniku fagocytozy lub pinocytozy. Laboratoryjne badania wirusów wymagają zastosowania zwierząt laboratoryjnych lub zapłodnionych kurzych jaj. Poza tym niektóre wirusy można hodować na kulturach tkankowych, które służą także do wykonywania oznaczeń ilościowych. Materiałem genetycznym wirusów zwierzęcych może być DNA lub RNA. Podczas gdy DNA występuje zazwyczaj w postaci dwuniciowej helisy, RNA może być jedno- lub dwuniciowy. Wirusy bakteryjne. Wirusy, których gospodarzem są komórki bakteryjne, nazywają się bakteriofagami lub krócej — fagami. Istnieje zaledwie kilka gatunków bakterii, dla których mimo intensywnych poszukiwań nie znaleziono żadnych wirusów. Obecność bakteriofagów uwidacznia się w postaci „łysinek" na tle ciągłej „murawy" bakteryjnego wzrostu na podłożu stałym. Rozmnażanie bakteriofagów w płynnej hodowli bakterii może doprowadzić w krótkim czasie do ich całkowitej lizy. Fagowy kwas nukleinowy występuje jako jedno- lub dwuniciowy DNA, albo jako jednolub dwuniciowy RNA. Fagi Escherichia coli stały się bakteriofagami modelowymi. Badania nad bakteriofagami, ich cyklem reprodukcyjnym przyczyniły się do uzyskania ważnych danych dotyczących przekazywania informacji genetycznej z komórki do komórki.

4. 1. Wirusy Budowa wirusów. Każda cząstka wirusowa — wirion składa się z kwasu nukleinowego (DNA lub RNA) pokrytego białkowym płaszczem zwanym kapsydem. Kwas nukleinowy wraz z kapsydem nazywa się nukleokapsydem i może być nagi albo pokryty osłonką (ryc. 4. 2 i 4. 3). Na przykład wirusy mozaiki tytoniu, adenowirusy i papillomawirusy są 173

nagimi nukleokapsydami. Do wirusów mających osłonkę należy wirus grypy i Herpesvirus. Kapsyd składa się z podjednostek zwanych kapsomerami. Kapsydy najczęściej są zbudowane symetrycznie; wyróżnia się wśród nich dwa rodzaje symetrii — helikalną i kubiczną (tab. 4. 1). Klasyfikacja wirusów. Wirusy są obdarzone wysoką swoistością w stosunku do gospodarza, a wewnątrz niego wykazują też swoistość tkankową i komórkową. Spośród patogennych wirusów zwierzęcych te na przykład, które rozwijają się w komórkach nerwowych, zwane są neurotropami, znalezione w limfocytach — łimfotropami, a te, które są wyspecjalizowane

174

175

w kierunku komórek błon śluzowych i komórek epitelialnych nazywane są wirusami miksotropowymi. Wirusy będące patogenami roślin wyższych są nazywane według nazwy ich gospodarza i efektu, jaki wywołują. Jak dotychczas, zbadano i wykryto bardzo niewiele wirusów atakujących glony, grzyby i pierwotniaki, dlatego też nie były podejmowane próby ich klasyfikowania. Bakteriofagi są nazywane od organizmu gospodarza, w którym po raz pierwszy zostały wykryte, a także otrzymują określoną literę i numer identyfikacyjny. Klasyfikacja zwierzęcych wirusów chorobotwórczych ogranicza się zazwyczaj do podania nazwy rodziny. Nazwy te pochodzą od objawów chorobowych (krosta, obrzęk, guz), od rodzaju i rozmiaru kwasów nukleinowych (piko-RNA) wirusów lub od mechanizmu replikacji tych kwasów (retrowirusy). Liczba znanych wirusów jest ogromna i w ramach tego skondensowanego przeglądu nie da się przedstawić oceny ich roli w patogenezie ani roli, jaką odegrały w badaniach, które wpłynęły na imponujący postęp w dziedzinie biologii molekularnej. Strukturalne formy wirusów. W następnych podrozdziałach są opisane cztery chorobotwórcze wirusy: dwa wiriony o symetrii helikalnej, z czego jeden nagi (wirus mozaiki tytoniu) i jeden z osłonką (wirus grypy), oraz dwa wiriony o symetrii kubicznej - jeden bez osłonki (wirusy wielościenne i Poliomyelitisvirus) i jeden z osłonką (Herpesvirus). Wirus mozaiki tytoniu (TMV). TMV jest modelowym przykładem wirionu o symetrii helikalnej. Można go łatwo otrzymać z wyciśniętego soku rośliny zainfekowanej tym wirusem. Jest on ukształtowany w postaci pręcika o średnicy 18 nm (ryc. 4. 4A). Pałeczkowaty nukleokapsyd składa się z około 2100 kapsomerów, które są ułożone helikalnie tworząc pusty cylinder. Każdy kapsomer jest łańcuchem polipeptydowym zbudowanym ze 158 aminokwasów o znanej sekwencji. RNA jest wciśnięty w ściankę cylindra pomiędzy kapsomerami, tak że nić RNA podąża za ich śrubowatym przebiegiem (ryc. 4. 4B). Wirus grypy Influenzavirus. Cząstki wirusa grypy mają średnicę 110 nm (ryc. 4. 5A). Nukleokapsyd, podobnie jak w TMV, ma budowę helikalną, choć nie tworzy formy pręcika, lecz jest wielokrotnie skręcony lub zwinięty (ryc. 4. 5B). Nukleokapsyd jest otoczony osłonką, będącą częścią błony komórki gospodarza, z której pochodzi wirion. Osłonka ma na zewnętrznej powierzchni kolce, służące do adsorpcji wirionu na powierz176

chni komórki gospodarza. Zawierają one mukoproteiny i enzym neuraminidazę. Enzym ten rozkłada jeden ze składników błony komórkowej gospodarza (kwas N-acetyloneuraminowy), a także upłynnia śluz pokrywający nabłonek jamy nosowo-gardłowej. Namnażanie się wirusa odbywa się wewnątrz komórek gospodarza, a uwalnianie wirionów zachodzi w wyniku pewnego rodzaju pączkowania. Obserwacja tego procesu prowadzi do wniosku, że osłonka cząstki wirusowej składa się z błony komórkowej gospodarza, choć zmodyfikowanej przez obecność białek kodowanych przez wirus (np. neuraminidaza). Wirus grypy występuje w licznych odmianach. To, jaka tkanka będzie stanowiła cel ataku, zależy od swoistości wirusa i od receptorowych właściwości

177

178

komórek gospodarza. Atak wirusa może doprowadzić do zahamowania metabolizmu komórkowego lub zniszczenia komórki. Wirus ma właściwości antygenowe i pobudza tworzenie przeciwciał przez organizm gospodarza. Szczepy wirusowe odpowiedzialne za wielkie epidemie grypy zostały scharakteryzowane pod względem wirulencji i patogenności. Wielościenne wirusy bez osłonki. Wiele wirusów o kształcie kulistym to właściwie wielościany. Najczęściej spotykaną formą jest ikosaedr (dwudziestościan) — bryła złożona z 20 równobocznych trójkątów i 12 wierzchołków (ryc. 4. 5C i 4. 6). Kapsyd takiego wirusa składa się z dwóch typów kapsomerów: w wierzchołkach znajdują się pięciokątne pentony złożone z 5 białkowych monomerów (protomerów), a boki i krawędzie są zajęte przez sześciokątne heksony złożone z 6 protomerów. Składanie kapsydu z kapsomerów zachodzi według praw krystalografii, zgodnie z którymi najmniejszy możliwy ikosaedralny kapsyd będzie się składał z 12 pentonów, następny o stopień większy — z 12 pentonów i 20 heksonów. Są wirusy, które mają 252, a nawet 812 kapsomerów. Według planu ikosaedru zbudowanych jest wiele wirusów, np. wirus porażenia dziecięcego (poliomyelitis), wirus choroby pyska i racic, adenowirusy, czy rakotwórczy wirus SV40 (ryc. 4. 5D).

179

Taka konstrukcja kapsydu złożonego z wielu identycznych podjednostek znajduje wyjaśnienie w fakcie, że kwasy nukleinowe wielu wirusów mają niewielki ciężar cząsteczkowy, to znaczy są stosunkowo krótkie. Dlatego też informacja w nich zawarta wystarcza tylko na kilka łańcuchów polipeptydowych, z których większość musi pełnić funkcje enzymatyczne niezbędne do replikacji wirusa w komórce gospodarza. Taki sposób budowania kapsydu z wielu identycznych podjednostek gwarantuje najwyższą efektywność przy minimalnym wydatkowaniu informacji genetycznej.

Wielościenne wirusy z osłonkami. Forma ikosaedru pokrytego osłonką została znaleziona w przypadku chorobotwórczych czynników wywołujących takie choroby, jak ospa wietrzna (varicella), półpasiec (herpes zoster) oraz pęcherzykowe zapalenie jamy ustnej. Dwudziestościenny kapsyd wirusów rodzaju Herpesvirus składa się ze 162 kapsomerów. Osłonka prawie na pewno pochodzi z wewnętrznej błony jądrowej. Wirusy te namnażają się wewnątrz jądra gospodarza. Kapsydy zostają pokryte wewnętrzną błoną jądrową, po czym wydobywają się z jądra przez wypączkowanie, a następnie są wyprowadzane na powierzchnię zewnętrzną z udziałem retikulum endoplazmatycznego. Ospa wietrzna jest lekką chorobą dziecięcą. Jej wirus zakaża górne drogi oddechowe, a następnie rozprzestrzenia się przez układ krążenia. Ostatecznie wirus zagnieżdża się w skórze, powodując powstawanie typowych płaskich pęcherzyków. Półpasiec występuje u osób częściowo uodpornionych i właściwie jest wynikiem reaktywacji wirusa ospy wietrznej. Tak więc przyczyną obu chorób jest ten sam wirus. Wirusy grupy ospy. Wirusy tej grupy są największymi spośród zwierzęcych wirusów patogennych. Ich budowa różni się zasadniczo od czterech opisanych powyżej typów. Zawierają one DNA, białka i lipidy. Dlatego też ich wiriony nazywa się złożonymi (tab. 4. 1). Cząstki wirusowe ospy prawdziwej variola) oraz krowianki (vaccinia) mają kształt zaokrąglonych kwadratów. Składają się one z ciałka wewnętrznego zawierającego dwuniciowy DNA, podwójną warstwę białkową, białkowe ciałka eliptyczne i błonę powierzchniową. Całość jest pokryta ściśle oplatającymi nićmi. Wirus jest bardzo odporny na odwodnienie, co decyduje o jego wysokiej infekcyjności. Ospa jest chorobą, na którą zapadają tylko naczelne (człowiek i małpy człekokształtne), natomiast bydło, króliki i owce są wrażliwe na wirusa krowianki. Oba wirusy, ospy i krowianki, mają wspólne antygeny. To właśnie jest powodem, że wirus krowianki może być użyty w szczepieniach ochronnych przeciwko ospie. Wirus ten, 180

izolowany z cieląt, wywołuje u człowieka tylko lekkie objawy chorobowe. Ten typ szczepienia (szczepienie aktywne) prowadzi do wytworzenia przeciwciał w surowicy, które uodporniają także przeciwko ospie prawdziwej (variola).

4. 2. Wirusy bakteryjne (bakteriofagi) Izolacja i oznaczanie. Bakteriofagi można łatwo wyizolować zawieszając w pożywce bakterie będące ich gospodarzami i wprowadzając próbkę materiału pochodzącego z miejsca naturalnego występowania tego szczepu bakterii. Jeżeli ta tzw. wzbogacająca hodowla będzie teraz inkubowana w warunkach sprzyjających rozwojowi badanych bakterii, również bakteriofagi obecne w próbce będą mogły ulegać szybkiemu namnożeniu. Wirus będzie się oczywiście namnażał tylko w żyjących komórkach. Przez odfiltrowanie lub odwirowanie bakterii, które nie uległy lizie, otrzymuje się supernatant — lizat, w którym z kolei można oznaczyć (zmianować) liczbę cząstek wirusowych. W tym celu wykorzystuje się zjawisko polegające na tym, że jeśli na stałe podłoże zostanie wysiana zawiesina bakterii wolna od wirusów, to po inkubacji w odpowiednich warunkach wytworzy ona ciągłą „murawę" bakteryjnego wzrostu, podczas gdy po wysianiu zawiesiny zawierającej policzalną liczbę cząstek wirusowych, w bakteryjnej murawie powstaną „łysinki". W każdym miejscu, gdzie została zdeponowana cząstka fagowa i gdzie zaatakowała ona komórkę bakteryjną, dochodzi do gwałtownej lizy coraz większej liczby przylegających komórek (atakowanej przez potomstwo pierwotnej cząstki fagowej), co prowadzi po pewnym czasie do powstania miejsc wolnych od bakterii, czyli „łysinek". Są one łatwo odróżnialne gołym okiem od tła, które stanowi ciągła warstwa bakteryjnego wzrostu, dzięki czemu można je łatwo policzyć (ryc. 4. 1C). Stosując odpowiednie metody można uzyskać szybkie namnożenie fagów w płynnych zawiesinach bakterii lub na podłożu stałym. Bakterie są usuwane za pomocą wirowania, a nieliczne pozostałe w supernatancie zostają zabite za pomocą chloroformu. W ten sposób otrzymuje się tzw. lizat fagowy zawierający 1010-1013 cząstek fagowych w mililitrze. Morfologia bakteriofagów. Kształt bakteriofagów został najlepiej określony dla fagów tzw. serii Τ pochodzących z Escherichia coli (kolifagi). 181

Kolifag T2 składa się z wielościennej główki o długości około 100 nm i ogonka o podobnej długości. Nazywa się go więc wirusem złożonym (ryc. 4. 9). Główka wirusa składa się z kapsomerów i zawiera DNA. Białko i DNA występują w główce w równych ilościach. Ogonek kolifaga T2 jest dość skomplikowaną strukturą i składa się z co najmniej trzech części. Wydrążony rdzeń jest otoczony kurczliwą pochewką, która na

182

183

swym zewnętrznym końcu ma płytkę podstawową zaopatrzoną w szponiaste włókna i haczyki adsorpcyjne swoiste wobec gospodarza. Preparaty spod mikroskopu elektronowego przygotowane techniką kontrastu negatywnego pokazują dwa możliwe stany. W jednym z nich główka mocno odcina się od tła, a pochewka pozostaje rozciągnięta. W drugim stanie główka jest słabo skontrastowana, a pochewka jest skurczona. Na rycinie 4. 7 wyjaśniono szczegóły tej obserwacji: A) przedstawia aktywnego faga zawierającego DNA, B) pokazuje faga po wstrzyknięciu DNA do bakterii. Wiele bakteriofagów ma mniej skomplikowane struktury. Na podstawie kształtu dojrzałych cząstek fagowych można wyróżnić kilka ich typów (ryc. 4. 8, 4. 9). Większość bakteriofagów zawiera dwuniciowy DNA, jednakże w ciągu kilku ostatnich lat odkryto także pewną liczbę fagów z DNA jednoniciowym oraz z jednoniciowym RNA. Fagi Q17 i Qβ (ryc. 4. 9E) zawierające RNA mają najmniejsze znane genomy: 3500-4500 nukleotydów.

4. 2. 1. Namnażanie się fagów wirulentnych — cykl lityczny Namnażanie się wirusów w komórkach gospodarza jest procesem bardzo złożonym. Przebieg poszczególnych etapów od momentu zaatakowania komórki gospodarza do uwolnienia dojrzałych cząstek fagowych był dokładnie analizowany dla bakteriofagów serii Τ (T2, T4, T6) na poziomie morfologicznym, genetycznym i molekularnym. W badaniach tych wykorzystano fakt, że fagowy DNA zawiera 5-hydroksymetylocytozynę zamiast cytozyny, co sprawia, że synteza fagowego DNA może być łatwo śledzona. Ponadto wyizolowano bakteriofagi-mutanty, których namnażanie było zablokowane na jednym z etapów lub, które były zdolne do powielania się tylko w określonych warunkach. Mutanty te umożliwiają śledzenie morfologicznego rozwoju fagów wewnątrz komórki gospodarza (morfopoeza) oraz ustalenie czasowej sekwencji syntezy fagowych podjednostek i ich zespalania. Podobnie jak inne wirusy, bakteriofagi są nieruchliwe. Kiedy zawiesina wolnych cząstek fagowych zostaje zmieszana z zawiesiną odpowiednich bakterii, przypadkowy kontakt prowadzi do przylgnięcia fagowej cząstki do powierzchni bakterii (adsorpcja), po czym następuje wstrzyknięcie fagowego DNA do wnętrza komórki. Ostatecznie, z chwilą zakończenia

184

okresu syntezy i dojrzewania fagów, następuje liza komórek gospodarza, a nowo utworzone cząstki fagowe zostają uwolnione do otaczającego środowiska (ryc. 4. 13). Adsorpcja. Nie każdy fag jest absorbowany przez każdą bakterię. Relacja gospodarz-fag jest oparta na swoistości zjawiska adsorpcji. Jest ona uwarunkowana obecnością odpowiednich receptorów w ścianie komórkowej bakterii. Dla niektórych fagów receptorami są fragmenty komponenty lipoproteinowej, dla innych natomiast znajdują się one w warstwie lipopolisacharydowej. Najbardziej prawdopodobną przyczyną oporności bakterii na fagi jest brak takich receptorów. Jeżeli fagi zostaną dodane w nadmiarze, dochodzi do masowej adsorpcji — aż do 200-300 fagów na komórkę gospodarza. Wewnątrzkomórkowy rozwój fagów. Fag bezpośrednio po adsorpcji wstrzykuje własny DNA do komórki gospodarza. W przypadku faga T2 wstrzyknięcie polega właściwie na zakotwiczeniu płytki podstawowej i skurczu pochewki, czego efektem jest przebicie się wydrążonego rdzenia do wnętrza komórki bakteryjnej. Doświadczenia z DNA znakowanym 3 2 P i białkami znakowanymi 35S wykazały, że do komórki gospodarza wnika wyłącznie kwas nukleinowy, natomiast białko pozostaje na zewnątrz. Białkowy płaszcz można oddzielić od komórki gospodarza, co pozostaje bez wpływu na rozmnażanie się faga. Podczas tzw. okresu latencji, który

185

u Escherichia coli trwa zazwyczaj około 25 min, nie można stwierdzić obecności fagów w sztucznie rozerwanych bakteriach. Wstrzyknięty fagowy DNA powoduje natychmiastowe, daleko idące zmiany w metabolizmie zakażonej komórki bakteryjnej (ryc. 4. 10). Zostaje gwałtownie zahamowana synteza bakteryjnego DNA. W ciągu kilku minut po iniekcji dochodzi także do wstrzymania syntezy bakteryjnego RNA i białek, ale całkowita zawartość białka nadal rośnie, a synteza DNA zostaje na nowo podjęta z większą nawet intensywnością. Najpierw DNA fagowy jest syntetyzowany kosztem degradowanego DNA bakteryjnego. Takie przekształcanie, a następnie syntezę fagowego DNA de nονο można śledzić mierząc zwiększanie się zawartości 5-hydroksymetylocytozyny, która jest właściwa dla niektórych fagów z grupy T. Enzymy potrzebne do tej syntezy DNA powstają wkrótce po wstrzyknięciu; są to tzw. białka wczesne. Białka późne, do których należą białka płaszcza i fagowe lizozymy lub endolizyny, są wytwarzane wyłącznie w drugiej połowie okresu latencji.

186

Ostateczne dojrzewanie polega na połączeniu fagowego DNA z białkami płaszcza, czego rezultatem jest dojrzała, zdolna do zakażania cząstka fagowa. Dojrzewanie fagów Τ jest skomplikowanym procesem, który zachodzi w kilku etapach. Najpierw syntetyzowany jest kapsyd wypełniony białkiem. Po degradacji białek w centralnej części kapsydu uformowana główka zostaje wypełniona DNA właściwym dla danego typu faga, a następnie zamknięta. W końcu następuje dołączenie składników ogonka. Kolejność tych procesów została ustalona na podstawie analizy warunkowo letalnych mutantów, które były zdolne do przeprowadzania syntezy w temperaturze 25°C, ale różne jej etapy były zablokowane w temperaturze 43 °C. Ostatecznie ściana komórkowa bakterii zostaje rozpuszczona przez fagowy lizozym i następuje uwolnienie cząstek fagowych. To nieomal wybuchowe rozerwanie ściany komórkowej można obserwować w mikroskopie do obserwacji w ciemnym polu. Długość trwania okresu latencji i wielkość plonu waha się w szerokich granicach i zależy od typu faga, od bakterii oraz podłoża (ryc. 4. 11). W przypadku niektórych bakterii, jak np. Haemophilus influenzae i Bacillus subtilis, okazało się możliwe zakażenie ich natywnym DNA, wyizolowanym z bakteriofagów. Taki proces, analogiczny do genetycznej transformacji, nazywamy transfekcją.

4. 2. 2. Rozwój fagów łagodnych — lizogenia Fagi dotychczas opisywane zawsze lizowały zainfekowaną bakterię, można je więc określić jako fagi zjadliwe (wirulentne). Niektóre bakteriofagi zakażają swego gospodarza, lecz nie namnażają się w nim i nie powodują jego lizy. Są to tzw. fagi łagodne, które replikują się synchronicznie z komórką gospodarza. Od czasu do czasu, w jednej na 102-105 takich lizogennych bakterii dochodzi do spontanicznego wznowienia niezależnego namnażania fagów, a następnie lizy. Aby dostarczyć dowodu wskazującego na uwolnienie się infekcyjnych cząstek fagowych, należy zastosować jako indykator inny szczep bakteryjny, dla którego fag ten jest zjadliwy. Po zmieszaniu lizogennych bakterii z pewnym nadmiarem wrażliwego szczepu indykatorowego i wysianiu mieszaniny na płytkach z agarem odżywczym, lizogenne komórki tworzą kolonie, jednakże co jakiś czas dochodzi do uwalniania cząstek fagowych. Natychmiast atakują one wrażliwe bakterie tworząc łysinki, w środku których pozostaje zachowane potomstwo lizogennych bakterii (ryc. 4. 12). 187

Bakterie lizogenne niosą potencjalną zdolność do produkcji fagów, choć nie można tego wykazać za pomocą metod serologicznych ani stwierdzić na podstawie cech morfologicznych. Te nieinfekcyjne fagi, przekazywane z komórki do komórki, zostały nazwane profagami. Profagi są dziedziczone w podobny sposób jak inne bakteryjne właściwości. To, że całe potomstwo lizogennej komórki jest również lizogenne, oznacza, że profag musi być replikowany równocześnie z chromosomem gospodarza (ryc. 4. 13). Lizogenne bakterie są uodpornione na tego właśnie faga, którego niosą w sobie jako profaga. Genetyczna zmiana spowodowana lizogenizacją została nazwana konwersją fagową lub konwersją lizogenną (jak np. u maczugowca błonicy, rozdz. 3. 6). Indukowana przez faga oporność nie jest wynikiem zahamowania adsorpcji faga (jak w przypadku oporności na fagi zjadliwe), ale jest powodowana przez cytoplazmatyczne białko represorowe, które hamuje reprodukcję faga wegetatywnego. Białko represorowe hamuje także powrotną przemianę profaga w faga wegetatywnego, jak również tworzenie wszystkich białek fagowych. Tak więc za wytworzenie stanu lizogenii jest odpowiedzialne białko represorowe. Lizogenne bakterie tylko wyjątkowo podlegają spontanicznej lizie bez udziału czynników zewnętrznych. Z drugiej strony wiadomo, że wiele

188

różnych czynników (UV, mitomycyna, czynniki alkilujące) może indukować wszystkie komórki zawierające profaga, powodując uwalnianie infekcyjnych cząstek fagowych. Sukces w przeprowadzeniu takiej indukcji zależy od genetycznych właściwości profaga, fizjologicznego stanu gospodarza i warunków hodowli. Indukcja polega na zniszczeniu lub 189

inaktywacji obecnych cząsteczek represora. Dla pewnych mutantów łagodnych bakteriofagów posiadających termolabilne represory wystarczy jedynie podwyższyć temperaturę do 44°C, aby zaindukować lizę bakterii. Wstawienie i wycięcie faga lambda. Badania nad fagiem lambda, który jest lizogenem dla Escherichia coli, rzuciły światło na sposób wiązania profaga z bakteryjnym chromosomem. Lizogenizacja przeprowadzana przez faga lambda została wykorzystana jako model do poznania rozwoju fagów łagodnych. Długość genomu faga stanowi około 2% długości chromosomu bakteryjnego. DNA w uwolnionym fagu ma postać liniowej, dwuniciowej cząsteczki (ryc. 4. 14), chociaż każda z dwu nici jest dłuższa od struktury dwuniciowej na przeciwległych jej końcach o 12 nukleotydów. Te dwa jednoniciowe końce są do siebie komplementarne; mogą ze sobą hybrydyzować przez sparowanie zasad i są określane jako „lepkie końce".

190

Podczas przetrzymywania in vitro tego rodzaju cząsteczek DNA w roztworze, komplementarność jednoniciowych końców prowadzi do powstania mieszaniny, w której liniowy i kolisty DNA pozostają w stanie równowagi. Podobne zjawisko zamykania pierścienia zachodzi, gdy fag lambda zakaża komórkę bakteryjną. Dwa wolne końce nici są ostatecznie wiązane z udziałem ligazy polinukleotydowej — bakteryjnego enzymu służącego do naprawy jednoniciowych pęknięć w dwuniciowym łańcuchu polinukleotydowym. A więc przejście liniowego fagowego DNA w zamkniętą formę kolistą zachodzi bez udziału enzymów fagowych. W lizogennej komórce profag jest mocno związany z chromosomem gospodarza i, w doświadczeniach z koniugacją bakterii, DNA profaga jest przenoszony z komórki dawcy do komórki biorcy wraz z chromosomem. Eksperymenty genetyczne wskazują, że DNA faga lambda musi być umieszczony w swoistym locus na chromosomie gospodarza między operonem galaktozy a regionem biotyny. Początkowo sądzono, że fagowy DNA jest po prostu przyczepiony w tym miejscu do chromosomu gospodarza, jednakże mapowanie markerów fagowych i eksperymenty rekombinacyjne wykazały, że w stanie lizogenii fagowy DNA nie jest po prostu doczepiony, lecz musi być wstawiony do chromosomu. Wszystko wskazuje na to, że wstawienie DNA fagowego do chromosomu przebiega przez następujące kolejne etapy: równoległe ułożenie, pękniecie i ponowne krzyżowe połączenie (ryc. 4. 14). Za przebieg tego procesu jest odpowiedzialny enzym zwany integrazą lambda. Może ona rozpoznawać dwie różne, niehomologiczne sekwencje DNA — jedną na DNA chromosomowym, a drugą na DNA fagowym. Doprowadza ona do równoległego ułożenia obu podwójnych nici. Zostają one przerwane, a następnie ponownie połączone na krzyż. Poszczególne etapy tej rekombinacji zlokalizowanej (ang. site specific) można prześledzić na rycinie 4. 14. Fagowy DNA wstanie zintegrowanym jest replikowany wraz z DNA bakteryjnym i podlega takiej samej regulacji jak replikacja chromosomu bakteryjnego. Informacja zawarta w zintegrowanym fagowym DNA nie ulega ekspresji. Jedynie przejście profaga do stanu wegetatywnego może przywrócić autonomię fagowego DNA i doprowadzić do namnożenia faga wewnątrz komórki. To „wycofanie" się faga może zajść spontanicznie lub może być indukowane (np. naświetlenie UV). Wycięcie fagowego DNA z DNA bakteryjnego przebiega najprawdopodobniej jako odwrócenie procesu wstawiania. Wycięcie faga jest zazwyczaj bardzo precyzyjne. Ponad 99% cząstek fagowych wytworzonych przez lizogenne komórki 191

jest identycznych z oryginalnym infekującym fagiem. Musi to oznaczać, że w czasie wycinania DNA fagowego rozerwanie następuje dokładnie w tych samych miejscach co przy wstawianiu. Tylko czasami (raz na 105) okazuje się, że wycięty fragment odbiega od normy (patrz: transdukcja). Gdy tylko profag powraca do stanu wegetatywnego przez wycięcie, odzyskuje on swoją autonomię i może się namnażać wewnątrz komórki bakteryjnej tak jak fag zjadliwy. Tak więc wycięcie prowadzi do lizy komórki gospodarza i uwolnienia fagów lambda do środowiska.

4. 3. Rola wirusów i plazmidów w powstawaniu nowotworów Różnego typu nowotwory (raki, guzy, narośla) mogą być powodowane wieloma czynnikami, ale zawsze jest to związane z DNA, dziedzicznym materiałem komórki. Niezależnie od tego, co zapoczątkowuje proces nowotworowy (onkogeneza), przebiegiem chorobliwej proliferacji komórek kieruje ostatecznie DNA świeżo powstałej komórki nowotworowej. Przekształcenie prawidłowej komórki w komórkę złośliwą zwane jest transformacją nowotworową i następuje wskutek przeniesienia lub reorientacji DNA. Czynnik, który pobudza namnażanie komórek, jest produktem genu. Mimo że w chwili obecnej brakuje ogólnej teorii onkogenezy, która uwzględniałaby wszystkie typy nowotworzenia, to badania nad nowotworami indukowanymi przez wirusy i plazmidy pozwoliły na sformułowanie kilku ogólnych wniosków. W następnych podrozdziałach rozważamy trzy przykłady powstawania nowotworów: 1) wytwarzanie nowotworów roślinnych, 2) wytwarzanie nowotworów zwierzęcych przez DNA wirusy, 3) wytwarzanie nowotworów zwierzęcych przez RNA wirusy (retrowirusy). Powstawanie nowotworów roślinnych. Nowotwory mogą się pojawiać na wielu gatunkach roślin. Są to tzw. raki roślinne, galasówki lub narośla. Rozrost tych tkanek hamuje przepływ substancji odżywczych w roślinie. W wielu przypadkach wzrost nowotworowy można zaindukować eksperymentalnie. Typowe nowotwory roślinne (ryc. 4. 15) są wytwarzane w wyniku zakażenia rośliny przez Agrobacterium tumefaciens, perytrychalnie urzęsioną, gramujemną bakterię przypominającą Rhizobium. Do zakażenia dochodzi wskutek wniknięcia bakterii przez uszkodzenia,

192

a następnie proliferację w przestrzeniach międzykomórkowych. Istnieją wirulentne (zjadliwe) i niewirulentne szczepy A. tumefaciens. Szczepy wirulentne zawierają duży plazmid o nazwie plazmid Ti (ang. tumor inducing). Właśnie ten DNA plazmidowy jest właściwym czynnikiem infekcyjnym. Penetruje on wnętrze komórki roślinnej, a następnie jest wcielany do jej genomu. Proces ten nazywa się transformacją nowotworową. Przenosząc do zdrowej tkanki wycinki transformowanych komórek wykazano, że po transformacji obecność bakterii nie jest już potrzebna do dalszego zakażania. Jedynie część plazmidowego DNA, a nie cały plazmid, jest włączana do DNA gospodarza. Część ta niesie genetyczną informację niezbędną do wytwarzania opin. Opiny są to związki pochodne argininy. Są one wytwarzane przez stransformowane komórki roślinne, które nie mogą ich wykorzystać. Związki te są natomiast metabolizowane przez A. tumefaciens. Tak więc Agrobacterium z pomocą plazmidu Ti zapewnia sobie wyłączny dostęp do produktów fotosyntezy gospodarza. Inne geny plazmidu Ti są odpowiedzialne za tworzenie auksyn i cytokinin, które pobudzają podział komórek roślinnych i tworzenie narośli. Naturalna zdolność plazmidu Ti polegająca na wnoszeniu heterogenicznego bakteryjnego DNA do komórki roślinnej otwiera możliwość zastosowania tego plazmidu jako wektora do wprowadzania obcego DNA do roślin. Z zastosowaniem techniki rekombinacji DNA (rozdz. 16) jest 193

możliwe wbudowanie obcego DNA do plazmidu Ti w miejsce genów odpowiedzialnych za zjadliwość. Po wniknięciu plazmidu do komórki może dojść do rekombinacji z genomem roślinnym, a następnie do ekspresji (fenotypowego wyrażenia) wprowadzonego DNA. W ten właśnie sposób wyprodukowano „rekombinacyjny" tytoń, który wytwarzał system lucyferazy i dzięki temu mógł świecić. Do innych roślin wprowadzono geny oporności na antybiotyki, herbicydy i szkodniki. Jak dotychczas, największe sukcesy we wprowadzaniu genów były notowane w obrębie rodziny Solanaceae (tytoń, ziemniak, Rauwolfia, Petunia, Datura i inne). Gwałtowny postęp badań w tej dziedzinie wskazuje na możliwość powodzenia technologii genowej także w zastosowaniu do roślin jednoliściennych. Czy zdolność wiązania azotu atmosferycznego zostanie pewnego dnia przeniesiona na inne rośliny hodowlane, zależy przede wszystkim od wyjątkowej wrażliwości na tlen kompleksu nitrogenazy. Powstawanie nowotworów zwierzęcych z udziałem wirusów DNA. Badania nad powstawaniem nowotworów u zwierząt były prowadzone głównie na hodowlach tkankowych. Kiedy komórki tkanek zwierzęcych, np. z organów pochodzących od chomika czy kury lub takie jak ludzkie fibroblasty, są wprowadzane do odpowiedniej pożywki, zaczynają się mnożyć i rosną na wewnętrznej powierzchni naczyń hodowlanych. Zazwyczaj wzrost ten trwa do momentu aż wszystkie komórki zetkną się ze sobą. Zachodzi wówczas zjawisko zwane inhibicją kontaktową, w wyniku którego powstaje tylko jednokomórkowa ciągła warstwa. Kiedy takie normalne komórki zostają zainfekowane wirusem nowotworowym, tracą zdolność do inhibicji kontaktowej i kontynuują namnażanie, tworząc kilka warstw. Ten wielowarstwowy wzrost obserwuje się tylko w kulturach komórek nowotworowych. Pojedyncze komórki można łatwo izolować i namnażać jako czyste linie komórkowe, tzn. klony transformantów nowotworowych. Taka niekontrolowana proliferacja komórek zachodząca w organizmie prowadzi do powstania nowotworu. Jeżeli organizm potrafi ograniczyć wzrost nowotworu i wytworzyć wokół niego rodzaj torbieli, powstaje nowotwór łagodny lub dobrotliwy. Jednakże jeśli komórki rosną bez zahamowań i dochodzi do inwazji w innych częściach ciała z wytworzeniem przerzutów, mówi się o nowotworze złośliwym lub raku. Przykładem wirusa powodującego powstawanie zwierzęcego nowotworu jest małpi wirus (Simianvirus) SV40, zawierający dwuniciowy DNA. Może on atakować wielu gospodarzy i wiele tkanek, co zresztą 194

sugeruje nazwa grupy, do której należy — Polyoma („oma" oznacza nowotwór). Wirus ten należy do najlepiej zbadanych wirusów onkogennych, także z punktu widzenia możliwości zastosowania go jako genetycznego wektora w manipulacjach genetycznych na komórkach zwierzęcych. SV40 jest prostym, nie pokrytym osłonką ikosaedrem (dwudziestościanem) złożonym z 72 kapsomerów i zawierającym jedną, kolistą cząsteczkę dwuniciowego DNA. Wirus może być przenoszony z takich gospodarzy jak chomik czy mysz do hodowli tkankowych, gdzie kontynuuje rozmnażanie. W niektórych liniach komórkowych (komórki permisywne) wirus ma charakter lityczny, a jego rozmnażanie prowadzi do śmierci komórki. W innych (komórki nie permisywne) wirus przechodzi w stan lizogenii i nie reprodukuje się. W rzadkich przypadkach (1 na 105) wirusowy DNA integruje na stałe do DNA komórki gospodarza. Genetycznie zmieniona komórka może ulec transformacji nowotworowej, co prowadzi do niekontrolowanego wzrostu i powstania nowotworu. Komórka po transformacji wytwarza białko (antygen T), które inicjuje replikację komórkowego DNA. Wstrzyknięcie zwierzętom takich transformowanych komórek powoduje gwałtowne formowanie nowotworu. Transformacja nowotworowa komórek przeprowadzana przez takie wirusy jak SV40 jest pod wieloma względami podobna do włączania faga lambda do genomu E. coli (przejście do stanu lizogenii). Jednakże wstawienie DNA SV40 może zachodzić w bardzo wielu miejscach DNA gospodarza. Istnieje jeszcze wiele innych mechanizmów powstawania nowotworów z udziałem wirusów DNA. Powstawanie nowotworów z udziałem retrowirusów. Wytwarzanie nowotworów u zwierząt może być wynikiem działania RNA wirusów (retrowirusów). Należą one do wirusów ikosaedralnych z osłonką. Mają one genom typu (+)RNA, który jest zbudowany z pojedynczej nici RNA. Przykładem onkogennej działalności RNA wirusów może być powstawanie mięsaka Rousa u kur lub leukemii u myszy. Nazwa „retrowirusy" nawiązuje do udziału odwrotnej transkryptazy (ang. reverse transcriptase) w ich namnażaniu (rozdz. 2. 2. 2). Powielanie tych wirusów nie może zachodzić przez prostą replikację RNA, lecz wymaga najpierw przekopiowania do DNA, a następnie jego integracji do genomu gospodarza. Jest to niezbędny etap w procesie rozmnażania wirusa, bowiem wirusowy DNA może ulegać transkrypcji tylko po wcieleniu do genomu gospodarza. Częstość takiej integracji jest bardzo wysoka, gdyż stanowi ona część 195

cyklu życiowego wirusa. Jest prawdopodobne, że może ona zachodzić w dowolnym miejscu DNA gospodarza. Replikacja nici (+) jednoniciowego RNA przebiega w następujących etapach (ryc. 4. 16): proces odwrotnej transkrypcji katalizowany przez wirusową odwrotną transkryptazę prowadzi do powstania komplementarnej nici DNA, która jest kopiowana przez komórkową polimerazę DNA, w wyniku czego powstaje liniowa, dwuniciowa cząsteczka DNA. Zostaje ona następnie zamknięta kowalencyjnym wiązaniem do formy kolistej — ccc (ang. covalently closed circle). Kolejnym etapem jest wcielenie do genomu gospodarza i transkrypcja wirusowego DNA do mRNA i RNA wirusowego. Wreszcie, zamknięcie w kapsydzie i otoczenie wirusowej cząstki osłonką podczas wypączkowywania z błony cytoplazmatycznej kończy cykl. Ten sposób roz196

mnażania wirusa nie ma charakteru litycznego i nie prowadzi do śmierci komórki. Zintegrowany DNA retrowirusa replikuje się wraz z DNA gospodarza (np. w mięsakach) i dlatego jest obecny we wszystkich komórkach tego nowotworu. Onkogeneza, tzn. powstawanie nowotworu, jest następstwem wyrażania się wirusowego genu src. Gen ten koduje kinazę, która fosforyluje białka. Podstawowa sekwencja wirusowego genu src jest podobna do sekwencji analogicznego genu komórek gospodarza, którego produkt pełni rolę w regulacji wzrostu prawidłowych komórek. Sugeruje to, że rakotwórczy gen retrowirusa jest pochodzenia komórkowego i że znajdował się on w tych zwierzętach, w których reterowirus zazwyczaj się rozmnaża. W jaki sposób można wyjaśnić patogenny efekt wirusowych genów rakotwórczych zwanych też onkogenami, jeśli są one jedynie kopiami prawidłowych genów komórkowych? Jedna z hipotez zakłada, że wirusowy onkogen różni się nieznacznie od swojego komórkowego prekursora i mimo że produkt takiego genu ma podobną aktywność enzymatyczną, może on wykazywać odmienny zakres działania. W odróżnieniu od tej hipotezy, zwanej hipotezą mutacyjną, istnieje hipoteza wielkości dawki. Zakłada ona, że wywoływanie raka przez retrowirusy następuje wyłącznie wskutek „przedawkowania" wirusowego białka, a nie jako rezultat jego swoistych właściwości. Teoria onkogenów ma obecnie zastosowanie do wszystkich nowotworów pochodzenia wirusowego: każdy onkogen rakotwórczego wirusa pochodzi z prawidłowego genu komórki zwierzęcej. Produkty tych genów są odpowiedzialne za regulację wzrostu i różnicowania komórek zwierzęcych. Wiroidy. Ostatnio wykazano, że czynnikiem etiologicznym kilku roślinnych chorób jest mała, „naga", pozbawiona białkowej otoczki cząsteczka RNA. Nazwano ją wiroidem. Wiroidy są koliście zamkniętymi, jednoniciowymi cząsteczkami RNA o długości łańcucha ok. 360 nukleotydów (tzn. o względnej masie cząsteczkowej 12xl04). Tak więc są one ok. 10 razy mniejsze niż infekcyjne RNA najmniejszych znanych do tej pory

197

wirusów RNA, a zatem i najmniejszym etiologicznym czynnikiem jakiejkolwiek choroby. Powodują one choroby ziemniaków, cytrusów, ogórków, chmielu, palm kokosowych i innych roślin. Priony*. Czynnik etiologiczny takich chorób jak zespół Creutzfeldta-Jacoba u człowieka i scrapie u owiec jest ciągle jeszcze mało znany. Jest to zapewne małe białko, pozbawione kwasów nukleinowych, zbudowane z ok. 250 aminokwasów. Uważa się, że białko to aktywizuje nieczynny gen gospodarza, którego produkt jest przyczyną choroby.

4. 4. Ważne wirusowe patogeny człowieka Pospolite przeziębienie i grypa należą do najpowszechniejszych chorób ludzkości. Są one powodowane przez RNA wirusy, które atakują najczęściej górne drogi oddechowe. Są one przenoszone między ludźmi drogą zakażenia kropelkowego. Objawy przeziębienia, takie jak katar, zapalenie błony śluzowej nosa i gardła, są wywoływane przez rinowirusy — małe wirusy zawierające jednoniciowy RNA i pozbawione osłonki (Picornaviridae i Coronaviridae). Namnażają się one w komórkach nabłonka, które są zabijane. Optymalna temperatura do ich replikacji to 33°C — taka jak temperatura jamy nosowo-gardłowej. Brak wytwarzania trwałej odporności przeciwko przeziębieniu wynika prawdopodobnie z obecności dużej liczby serotypów rinowirusów. Wirus grypy należy do grupy Orthomyxoviridae, RNA wirusów z osłonką. Choroba na początku przypomina pospolite przeziębienie, ale stan zapalny nie jest ograniczony do obszaru nosa i gardła. Wirus silnie * Ostatnie badania prowadzone głównie przez S. Prusinera, autora nazwy „prion", wykazały, że prionopodobne białka są wytwarzane przez wszystkie dotychczas zbadane organizmy zwierzęce i pełnią bliżej nieokreślone funkcje, lokalizując się w błonie cytoplazmatycznej komórek. Mutacja genu kodującego to białko może doprowadzić do zmiany jego konformacji, czego następstwem jest gromadzenie się tego białka we wnętrzu komórki. Dotyczy to głównie komórek nerwowych, a więc prowadzi do szybkiej degeneracji ośrodkowego układu nerwowego. Dodatkową właściwością prionu jest jego działanie autokatalityczne umożliwiające przekształcanie siostrzanych cząsteczek białka o nie zmienionej konformacji w białko patogenne. Właściwość ta powoduje, że prion nabiera charakteru zarazka i przeniesiony do innego organizmu wyzwala łańcuchową reakcję przemiany prionopodobnego białka nowego gospodarza w zabójczy prion wywołujący encefalopatię i śmierć organizmu (przyp. tłum. ).

198

oddziałuje także na płuca i wpływa negatywnie na ogólny stan zdrowia. Ponieważ jest on łatwo przenoszony, często dochodzi masowych zakażeń i epidemii grypy. Pandemia 1957 r. była wynikiem pojawienia się wysoce wirulentnego mutanta wirusowego, przeciwko któremu nikt nie miał wytworzonej odporności. Odporność na białka kapsydu i otoczki wirusa grypy może być utrzymywana przez kilka lat. Czasami jednak dochodzi do zakażenia jednej komórki kilkoma cząstkami wirusowymi, co prowadzi do wymiany i nowego ułożenia antygenów (antigenic shift), tak że wirus staje się oporny wobec istniejących już przeciwciał, czego następstwem jest jego niezahamowany rozwój w organizmie osobnika uprzednio odpornego. Poza wirusem grypy i wirusem pospolitego przeziębienia, jednym z najbardziej znanych wirusów jest wirus HIV (Human Immunodeficiency Virus), nie z powodu częstości występowania, ale ze względu na śmiertelność wywoływanej przez niego choroby AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome — zespół nabytego upośledzenia odporności). AIDS został rozpoznany jako choroba układu immunologicznego, ponieważ infekcji wirusa HIV towarzyszyły zakażenia tzw. mikroorganizmami oportunistycznymi. Zakażenia wywołane przez Pseudomonas aeruginosa, niektóre pierwotniaki, drożdże i inne grzyby, są bardzo rzadko spotykane u osób o prawidłowo funkcjonującym układzie immunologicznym. Zazwyczaj atakują one organizm osłabiony innymi chorobami lub kuracją i stają się patogenne, gdy zawodzi układ immunologiczny. HIV jest retrowirusem i dlatego jego replikacja zależy od włączenia jego genomu do genomu gospodarza (ryc. 4. 16). Jest wirusem limfotropowym i wybiórczo atakuje limfocyty T4. Limfocyty te właściwie nie wytwarzają przeciwciał, ale odgrywają zasadniczą rolę jako komórki pomocnicze w tworzeniu przeciwciał przez limfocyty B. U pacjentów chorych na AIDS właściwie nie występują limfocyty T4. W ten sposób wirus HIV likwiduje ważne ogniwo w łańcuchu wytwarzania przeciwciał, co sprawia, że organizm staje się podatny na wszystkie choroby zakaźne, a także na powstawanie nowotworów. Ogólnie rzecz biorąc, infekcje wirusowe są obecnie najczęściej występującymi chorobami zakaźnymi. Można to łatwo wytłumaczyć faktem, że bakterie posiadają wiele wrażliwych punktów, na które mogą działać czynniki terapeutyczne i hamować ich wzrost. Natomiast namnażanie wirusów jest nieodłącznie związane z podstawowym procesem metabolicznym komórki gospodarza — syntezą kwasów nukleinowych. 199

Dlatego też niezwykle trudne jest zahamowanie wewnątrzkomórkowego wzrostu wirusa bez poważnego naruszenia metabolizmu komórki gospodarza. Postęp terapii antywirusowych jest, jak dotychczas, stosunkowo nieznaczny i dlatego klasyczne domowe środki („Na zdrowie!") ciągle wydają się najlepsze na pospolite przeziębienie.

GRZYBY (MYCOTA)

Grzyby (gr. mykes, łac. fungus) są organizmami eukariotycznymi i podobnie jak rośliny mają ścianę komórkową, tłuszcze gromadzą w wakuolach, pod mikroskopem widoczny jest przepływ cytoplazmy i nie mają (prawie nigdy) stadiów uwicionych. Nie zawierają one jednak barwników fotosyntetyzujących i są chemoorganoheterotrofami. Są tlenowcami i zdobywają energię dzięki utlenianiu związków organicznych. W porównaniu z roślinami, które mają ciało zróżnicowane morfologicznie na łodygę, korzeń i liście, grzyby wykazują ograniczone zróżnicowanie morfologiczne i prawie brak zróżnicowania funkcjonalnego. Grzybnia wegetatywna. Grzybnia wegetatywna jest plechą (łac. thallus). Składa się ona ze strzępek o średnicy około 5 μm, wielokrotnie rozgałęzionych i wrastających w podłoże lub rozrastających się na jego

201

powierzchni. Strzępki mają ścianę komórkową i cytoplazmę z organellami komórkowymi. Strzępki mogą nie mieć przegród poprzecznych (grzyby niższe) lub są podzielone septami na komórki (grzyby wyższe). Jednakże, nawet w strzępkach septowanych cytoplazma poszczególnych komórek jest ciągła dzięki istnieniu centralnej pory w septach (ryc. 5. 1). Cała strzępkowa plecha grzyba jest nazywana grzybnią (mycelium). W pewnych stadiach, zwykle w okresie przejścia w fazę rozmnażania płciowego lub bezpłciowego, grzybnia tworzy skupienia przypominające tkankę nazywaną plektenchymą. Typową plektenchymą jest miąższ owocników pieczarki. U grzybów wyższych grzybnia może także formować grubsze sznury, tzw. ryzomorfy, które służą do transportu substancji odżywczych. Wzrost i rozmnażanie. Strzępki grzyba wydłużają się tylko w strefie wierzchołkowej (wzrost szczytowy). U większości grzybów każda część grzybni ma potencjalną możliwość rozwoju; mały fragment grzybni jest wystarczający jako inokulum do wytworzenia nowej plechy. Formy i mechanizmy związane z rozmnażaniem grzybów są jednak niezmiernie zróżnicowane i są one uznawane za podstawowe w klasyfikacji. Wyróżnia się dwa typy rozmnażania, określane jako płciowe i bezpłciowe. Większość grzybów rozmnaża się oboma sposobami. Bezpłciowo grzyby rozmnażają się głównie przez pączkowanie, fragmentację grzybni lub dzięki tworzeniu spor. Wytwarzanie spor jest najczęstszym i najbardziej zróżnicowanym sposobem reprodukcji. Konidia (zarodniki konidialne) są zwykle formowane z wierzchołkowych części strzępek powietrznych (np. u Penicillium, Aspergillus). Gdy zarodniki tworzą się wewnątrz sporangiów (tzn. zarodni), wówczas grzyby zalicza się do sporangiosporowych (np. Mucor, Rhizopus). U grzybów niższych zarodniki często są uwicione i nazywane wtedy zoosporami lub pływkami. Ich wić ma budowę typową dla wszystkich organizmów eukariotycznych; wyrasta ona z blefaroplastu i składa się z jedenastu równoległych włókien, z których dziewięć jest położonych peryferyjnie, a dwa — centralnie (9 + 2). Rozmnażanie bezpłciowe charakterystyczne dla drożdży to pączkowanie; na komórce macierzystej powstaje uwypuklenie, do którego przemieszcza się jądro potomne, potem tworzy się ściana poprzeczna, a „wypączkowana komórka" może się oddzielić od komórki macierzystej

202

(ryc. 5. 2). Rozmnażanie bezpłciowe może także następować przez fragmentację strzępki na pojedyncze komórki, nazywane także oidiami lub artrosporami (np. u Endomyces lactis). Niektóre grzyby tworzą także podobne, grubościenne komórki nazywane chlamydosporami. Są także drożdże (Schizosaccharomyces), które rozmnażają się przez podział jak bakterie. Rozmnażanie płciowe. W zasadzie jest to, podobnie jak u wszystkich eukariotów, połączenie, czyli koniugacja dwu jąder komórkowych. U grzybów łączenie się jąder może następować w różnym czasie od pierwszego zetknięcia się strzępek macierzystych. W procesie płciowym można zwykle wyróżnić trzy fazy. Najpierw następuje plazmogamia, a więc łączenie się dwu protoplastów. Powstająca komórka zawiera dwa jądra. Ta para jąder, czyli dikarion, nie musi się natychmiast połączyć, a może pozostawać w stadium dikariotycznym w czasie kolejnych podziałów komórki, oba jądra dzielą się równocześnie (podział koniugacyjny). Łączenie się dwu haploidalnych jąder (kariogamia) może następować później, często dopiero w formującym się owocniku grzyba, a powstające jądro diploidalne jest zygotą. Po kariogamii zachodzi mejoza, podział redukcyjny przywracający haploidalną liczbę chromosomów. Te trzy procesy, czy fazy: plazmogamia, kariogamia i mejoza mogą u niektórych grzybów następować niezwłocznie jeden po drugim, u innych zaś mogą one przebiegać w zupełnie różnych stadiach rozwojowych. U grzybów niższych proces płciowy jest zapoczątkowany przez tworzenie gamet — komórek płciowych. Gdy gamety formujące się w męskich i żeńskich gametangiach są morfologicznie nierozróżnialne, nazywamy je izogametami. Gamety często tworzą się wewnątrz gametangiów, które różnią się od siebie, wtedy męskie gametangium jest nazywane anteridium (plemnia), a żeńskie oogonium (lęgnia).

203

W zależności od sposobu przemieszczania się gamet i miejsca następowania plazmogamii mogą być wyróżniane poszczególne grupy grzybów. U grzybów niższych, zwłaszcza wodnych, obie gamety są uwiciowane (planogamety) i łączą się ze sobą poza gametangiami (tzn. po uwolnieniu się z gametangiów). U Oomycetes tylko gameta męska przemieszcza się do lęgni i zapładnia komórkę jajową. Zygomycetes charakteryzuje gametangiogamia, łączenie całych wielojądrowych gametangiów i formowanie zygoty (cenozygoty). Gdy męskie i żeńskie gametangia tworzą się na tej samej grzybni wegetatywnej (powstałej z jednego zarodnika), grzyb jest uznawany za homotalliczny, czyli hermafrodytyczny (monozoiczny). Grzyby heterotalliczne, czyli dizoiczne, mają plechy męskie lub żeńskie. Grzyby homotalliczne mogą być samozgodne płciowo (autogamiczne). Jednak u niektórych grzybów homotallicznych następuje samozapłodnienie z powodu działania fizjologicznego inhibitora, który jest odpowiedzialny za samoniezgodność (inkompatybilność). To sprawia, że np. u Neurospora, chociaż jest homotalliczna, przy zapładnianiu niezbędne jest połączenie (koniugacja) dwu różnych typów plech (+ i —); plechy należące do tego samego typu są niezgodne płciowo. Klasyfikacja. Klasyfikacja grzybów, podobnie jak bakterii, jest przeznaczona do praktycznego zastosowania, ale uwzględnia głównie powiązania filogenetyczne. Nazewnictwo jest binominalne, tzn. dwuczłonowe, a nazwa obejmuje nazwę rodzaju i epitet gatunkowy (np. Aspergillus niger). Gatunki grupuje się w rodzaje, rodzaje w rodziny (przyrostek -aceae), rodziny w rzędy (przyrostek -ales), a rzędy w klasy (przyrostek -mycetes). Gromada Mycota *, czyli grzyby i śluzorośla, obejmuje śluzowce (Myxomycetes), grzyby niższe ** (Phycomycetes) i grzyby wyższe (Eumycetes). Pogłębioną prezentację zagadnień dotyczących taksonomii, morfologii i fizjologii grzybów można znaleźć w licznych podręcznikach mikologicznych. W niniejszym opracowaniu mogą być omówieni tylko nieliczni przedstawiciele kilku grup, które zostały uznane za przykłady modelowe lub mające szczególne znaczenie praktyczne (tab. 5. 1).

204

5. 1. Acrasiomycetes (akrazjowce) Acrasiomycetes są nazywane śluzowcami komórkowymi, w odróżnieniu od śluzowców właściwych, które tworzą plazmodia. Inny termin, „ameby gromadne", pochodzi od osobliwego tworzenia szczególnych owocowań

205

przez dużą liczbę współpracujących indywidualnych komórek (ameb). Na rycinie 5. 3 przedstawiono kolejne etapy formowania owocowań przez Acrasiomycetes i Myxomycetes wskazujące na ich pozorne podobieństwo. Acrasiomycetes obejmują około 25 gatunków organizmów swobodnie żyjących w glebie. Najlepiej zbadanymi są Dictyostelium mucorioides i D. discoideum. Można je łatwo wyizolować z próchniczej gleby. W hodowlach czystych na podłożach zestalonych agarem lub na pożywkach płynnych ameby odżywiają się bakteriami; w warunkach eksperymentalnych są nimi zwykle Escherichia coli lub Enterobacter aerogenes. Cykl rozwojowy. Podstawową jednostką Acrasiomycetes są nagie, jednojądrowe i haploidalne ameby (ryc. 5. 3A). Na podłożach stałych poruszają się one za pomocą pseudopodiów, odżywiają się bateriami dzięki fagocytozie i rozmnażają się. W końcu, ameby przesuwają się do centrum agregacji (skupiania się) i formują zbiorowe plazmodium, które jest nazywane pseudoplazmodium w odróżnieniu od wielojądrowego, ale jednokomórkowego, prawdziwego plazmodium u Myxomycetes. Chociaż poszczególne ameby zachowują swoją indywidualność, pseudoplazmodium funkcjonuje jako jedność. Tworzy ono „stożek". Następnie z jego górnej części, osiowo różnicuje się owocowanie, sorokarp. Komórki ze szczytowej części tworzą trzonek (serofor) otoczony celulozową ścianą, a komórki z tylnej, czyli dolnej części, migrują na wierzchołek trzonka, gdzie formują kulistą część sorokarpu i przekształcają się w spory (zarodniki). Spory są incystowanymi (otoczonymi ścianą) amebami. W czasie kiełkowania spor, w celulozowej ścianie powstaje pora, przez którą uwalnia się ameba i rozpoczyna się nowy cykl. Faza odżywiania się (wegetatywna) jest wyraźnie oddzielona od fazy morfogenetycznej. Absorpcja substancji odżywczych kończy się na jakiś czas przed zapoczątkowaniem agregacji. Faza agregacji może być zahamowana na pewien okres przez powtórne dodanie bakterii stanowiących pożywienie. Cykl rozwojowy Acrasiales reprezentuje model tworzenia indywidualnego (jednostkowego) owocowania przez liczne niezależne komórki. Inicjacja agregacji i tworzenia owocowań przez tzw. wyższy rozkaz (lub „boga ameby") jest sterowana przez rozpuszczalną substancję, która została nazwana akrazyną. Wykazano, że u Dictyostelium discoideum jest ona identyczna z cAMP (cykliczny adenozyno-3', 5'-fosforan).

206

5. 2. Myxomycetes (śluzowce) Myxomycetes tworzą owocowania, które są bardzo podobne do tych, jakie formują myksobakterie i Acrasiomycetes, chociaż są one dużo mniejsze. Cykl rozwojowy śluzowców przedstawiono na rycinie 5. 3B. Myxomycetes żyją w wilgotnych miejscach na kłodach drzew, na opadłych liściach, na korze czy na drewnie budulcowym i na słupach ogrodzeniowych. Niekiedy ich jaskrawo zabarwione owocowania, około 0, 5-1 cm średnicy, są łatwo dostrzegalne. Młode zarodnie Lycogala epidendron, podobne do owocu wiśni, mają piękny szkarłatny kolor, natomiast mniejsze, pojedyncze owocowania Cribraria rufa to sporangia o oryginalnej i eleganckiej strukturze. Żółte plazmodia Fuligo septica wyglądają jak dłoniaste, piankowate naloty na pniakach drzew, w garbarniach i wielu innych siedliskach. Rozwój (ryc. 5. 3B). Spory uwolnione ze sporangiów (zarodni) kiełkują na wilgotnych podłożach i wytwarzają uwicione pływki lub myksameby. Odżywiają się one płynnymi substancjami lub, dzięki fagocytozie, bakteriami, drożdżami, zarodnikami grzybów itp. Pływki śluzowców po pewnym czasie tracą wici i przechodzą w stadium ameboidalne. Są to komórki jednojądrowe. Mogą one także łączyć się parami (plazmogamia i kariogamia) i stawać się zygotami. Te diploidalne ameby żyją w takiej postaci lub mogą łączyć się z innymi amebami i formują prawdziwe śluźnie, czyli plazmodia, które są wielojądrowe. W sprzyjających warunkach, zwłaszcza przy dostępie dużej ilości substancji odżywczych, zwiększa się liczba jąder w wyniku licznych podziałów mitotycznych. Plazmodia wykazują negatywną fototaksję (tzn. unikają światła) i odnajdują korzystne siedliska dzięki hydrotaksji i chemotaksji. Przemieszczanie plazmodium jest związane z obecnością w nim proteiny podobnej do miozyny Β (stwierdzona u Physarum polycephalum). Plazmodia dają początek owocowaniom, czyli sporangiom. Przejście do tej fazy jest związane z czynnikami fizjologicznymi, a zwłaszcza ze zmianą taksji. Plazmodia opuszczają dotychczasowe ciemne, wilgotne siedliska i przemieszczają się ku światłu. Cytologicznie stwierdzono występowanie podziału redukcyjnego (mejozy). Po nim rozpoczyna się formowanie sporangium o bardziej lub mniej skomplikowanej strukturze, okrytego ścianą. W sporangium (zarodni) powstają liczne, małe, jednojądrowe spory, osłonięte ścianą. Z pozostałych resztek cytoplazmy formują

208

się leżące między sporami sieci lub „nici", które są nazywane włośnią. Po dojrzeniu i pęknięciu ściany sporangium, zarodniki wydostają się na zewnątrz i rozprzestrzeniają się z powietrzem.

5. 3. Phycomycetes (grzyby niższe) Phycomycetes obejmują dużą grupę grzybów, które mają nieseptowane i wielojądrowe plechy, składające się z wielokrotnie rozgałęzionych strzępek. Taki typ plechy jest zaliczany do cenocytycznych. Większość grzybów niższych wytwarza zarodniki w sporangiach. Najbardziej prymitywne formy są przystosowane do środowiska wodnego i mają uwicione spory oraz gamety. Przy przejściu od form wodnych do bardziej zaawansowanych — ziemnowodnych i lądowych, stadia uwicione spotykane są coraz rzadziej. Chytridiomycetes. Chytridiomycetes są przeważnie grzybami wodnymi; nieliczne gatunki żyją w glebie. Są one mikroskopijnych rozmiarów, a ich ściana zawiera głównie chitynę. Wiele z nich pasożytuje na glonach planktonowych i na roślinach wodnych. Duże znaczenie ekonomiczne ma Synchytrium endobioticum, patogen roślin uprawnych oraz sprawca choroby ziemniaka. Rhizophydium pollinis poraża pyłek sosny i jest popularnym obiektem demonstracyjnym i dydaktycznym. Oomycetes. Oomycetes są wodnymi i lądowymi organizmami, rozmnażającymi się za pomocą dwuwiciowych pływek. Saprolegnia i Leptomitus bywają nazywane „pleśnią wodną" i żyją w wodach. Peronosporales przystosowały się do lądowego trybu życia. Są one obligatoryjnymi pasożytami, przez całe życie związanymi z roślinami wyższymi. Wytwarzają one także pływki (zoospory). Do najgroźniejszych patogenów roślin należą: Phytophthora infestans powodująca zarazę ziemniaczaną i Plasmopara viticola sprawca choroby nazywanej mączniakiem rzekomym winorośli. Saprolegnia jest szeroko rozprzestrzeniona, może być łatwo wyizolowana i hodowana. W tym celu należy zastosować metodę „przynęt", zgodnie z następującą procedurą: martwe muchy o rozpostartych skrzydłach i z odnóżami skierowanymi ku dołowi umieszcza się jako przynętę na powierzchni wody, w naczyniu wypełnionym wodą ze stawu. Po kilku 209

dniach można dostrzec, że dookoła muchy wyrastają strzępki, a na ich zakończeniach zarodnie. Tworzenie zoosporangiów i wypływanie z nich zoospor można prześledzić pod mikroskopem (ryc. 5. 4). Swoistą cechą Saprolegnia i grzybów z pokrewnych rodzajów jest występowanie diplanetyzmu — dwóch stadiów pływkowych następujących po sobie. Zoospory pierwotne uwalniane z zarodni podlegają incystacji i formują się cystospory. Z nich powstają pływki wtórne, które następnie są incystowane. Tylko cystospory mogą kiełkować rostkiem, z którego tworzy się strzępka. Rozmnażanie płciowe następuje po bezpośrednim zetknięciu się gametangiów, jakimi są lęgnia i plemnia. Większość Saprolegniaceae jest hermafrodytami, czyli organizmami homotallicznymi; koniugujące ze 210

sobą lęgnie i plemnie wyrastają na tej samej grzybni. Lęgnie (łac. oogonia) są kuliste, mają grubą ścianę i zawierają kilka komórek jajowych (oosfer). Plemnie są mniejsze, proste lub rozgałęzione, tworzą się na zakończeniach strzępek i rosną w kierunku lęgni. Z plemni wyrastają rurki koniugacyjne, które wrastają przez pory w ścianie do lęgni i docierają do oosfer. Jedno jądro przedostaje się (przez rurkę koniugacyjną) do każdej oosfery i łączy się z jej jądrem, tworząc diploidalne jądro zygotyczne. Po zapłodnieniu każda oosfera otacza się własną grubą ścianą i staje się oosporą. Po okresie spoczynkowym kiełkują one tzw. rostkiem i równocześnie następuje mejotyczny podział jąder. Cykl rozwojowy kończy się formowaniem nowych zoosporangiów. Zygomycetes. Nazwa Zygomycetes jest związana z typem rozmnażania płciowego, a zwłaszcza z wytwarzaniem zygospory. Cenozygota, czyli zygospora, powstaje w wyniku połączenia dwóch gametangiów (gametangiogamia), które łączą ze sobą dwie strzępki macierzyste jak most czy jarzmo (gr. zygos) (ryc. 5. 6). Zygomycetes są organizmami najbardziej zaawansowanymi w rozwoju spośród Phycomycetes i zaadaptowały się do życia na lądzie. Dzieli się je na trzy rzędy: Mucorales, Entomophthorales i Zoopagales; tylko pierwszy z nich będzie omówiony. Mucorales zasiedlają rozkładające się podłoża organiczne; niektóre są koprofitami, tzn. rozwijają się na nawozach zwierząt; nawóz koński lub wyciąg z niego mogą być substratami dogodnymi do badań. Grzyby, takie jak Mucor mucedo, Rhizopus nigricans (pospolity także na wyrobach piekarniczych), R. oryzae, R. arrhizus, R. rouxii, Phycomyces blakesleeanus, Choanephora cucurbitarum, Blakesleea itd., są dobrze znane nie tylko mikologom, ale ze względu na ich znaczenie przemysłowe także chemikom i biotechnologom. W warunkach beztlenowych grzyby na ogół rosną rzadko i przez krótki okres. Przy braku tlenu atmosferycznego mogą brać udział w procesie fermentacji wytwarzając kwas mlekowy lub etanol. W tym czasie przechodzą one na inny typ wzrostu. W warunkach beztlenowych np. Mucor racemosus wytwarza grzybnię pączkującą, a powstałe komórki rozmnażają się przez pączkowanie, podobnie jak drożdże. Mucorales rozprzestrzeniają się bardzo szybko, zarówno dzięki szybkiemu wzrostowi strzępek, jak i wytwarzaniu bardzo licznych sporangiospor. Niektóre z nich, np. Rhizopus nigricans (R. stolonifer), 211

wytwarzają strzępki rozłogowe, które mogą pokonać odległość kilku centymetrów. Rozmnażanie bezpłciowe następuje za pomocą sporangiów zawierających sporangiospory. Odgałęzienia pionowe wyrastają z obfitej, błyskawicznie rozrastającej się grzybni, a ich wierzchołki rozszerzają się kuliście i są oddzielane przez septę. W miarę powiększania się sporangium (zarodni) septa uwypukla się do jej wnętrza, powodując zagęszczanie się cytoplazmy w części peryferyjnej. Setki czy nawet tysiące znajdujących się w niej jąder są otaczane przez cytoplazmę i rozwijają się w sporangiospory. Niektóre Mucomles wytwarzają na odgałęzieniach trzonków sporangialnych małe sporangia, czyli sporangiole zawierające tylko jedną lub kilka spor.

Sporangium Pilobolus ma nieco inną postać (ryc. 5. 5). Trzonek sporangialny rozszerza się soczewkowato tuż pod sporangium, które osadzone jest jak czarna czapeczka na tym rozdętym wierzchołku. Intensywne pobieranie wody zwiększa ciśnienie w trzonku, w dojrzewającym sporangium i przenoszone jest na kolumellę. Powoduje to odstrzelenie zarodni na odległość do 2 m {Pilobolus ma nazwę polską zrywka). Zarodnie Pilobolus są odstrzeliwane nie tylko daleko, ale także w określonym kierunku. Trzonki sporangialne są dodatnio fototropiczne i rosną ze sporangium skierowanym ku źródłu światła. Pilobolus wytwarza sporangia tylko wtedy, gdy rośnie na podłożach nawozowych, zawierających niezbędny związek, jakim jest koprogen. Rozmnażanie płciowe i cykl rozwojowy mogą być przedstawione na przykładzie Rhizopus nigricans (ryc. 5. 6). Z zarodni uwalniane są wielojądrowe sporangiospory, które w sprzyjających warunkach kiełkują i rozwija się obficie rozgałęziona grzybnia powietrzna. Gdy odgałęzienie zetknie się z podłożem, tworzy się ryzoid przerastający substrat. Bezpo212

średnio ponad nim wyrasta jeden lub kilka sporangioforów (trzonków sporangialnych). Rozmnażanie płciowe R. nigricans może nastąpić tylko wtedy, gdy dwie fizjologicznie różne, zgodne płciowo (+ i —) grzybnie zetkną się ze sobą. Jak już wspomniano, kopulujące odgałęzienia wydłużają się w progametangia, w których skupia się cytoplazma z jądrami. Są one oddzielone od strzępek podstawowych przez tworzącą się septę. W strefie zetknięcia się gametangiów ściany komórkowe podlegają lizie i protoplasty łączą się ze sobą (gametangiogamia). Każde jądro (+) tworzy parę z jądrem ( —) i następuje kariogamia. W tej fazie cenozygota powiększa się i formuje grubościenną zygotę. Po okresie spoczynkowym zygospora pęka i kiełkuje w sporangium, a jądra podlegają mejozie. Dlatego grzybnia jest haploidalna. Niektóre Mucorales są homotalliczne i samopłodne.

213

5. 4. Ascomycetes (workowce) Ascomycetes łącznie z Basidiomycetes tworzą grupę grzybów właściwych (Eumycetes), czyli grzybów wyższych. Charakteryzują się grzybnią septowaną i wytwarzaniem konidiów (konidiospor). Nie formują one żadnych uwicionych komórek. Nazwa Ascomycetes jest związana z posiadaniem charakterystycznych dla tej grupy worków (łac. asci), w których formują się askospory. Wewnątrz worków odbywa się zarówno kariogamia, jak i mejoza. Stadium workowe jest końcową fazą rozmnażania płciowego i jest wiązane z wytwarzaniem owocników. Stadium to jest nazywane doskonałym lub głównym. Liczne workowce rozmnażają się bezpłciowo za pomocą konidiów. To dodatkowe stadium, w którym wytwarzane są zarodniki, jest określone jako niedoskonałe lub konidialne. U wielu grzybów znane jest tylko stadium związane z formowaniem konidiów i są to grzyby włączane do grupy Deuteromycetes (dawniej nazywane Fungi imperfecti). Cykl rozwojowy. Rostek kiełkujący z askospory rozwija się w grzybnię (ryc. 5. 7). Często wyrastają na niej konidiofory wytwarzające bardzo liczne konidia. One także mogą kiełkować i tworzyć grzybnię podobną do tej, która powstaje z askospor. Worki rozwijają się na tej samej grzybni co konidia, ale w późniejszym stadium. Faza płciowa rozpoczyna się uformowaniem askogonu (lęgni). Typowy askogon opatrzony jest włostkiem, przez który męskie jądra przemieszczają się z anterydium (plemni) do askogonu. Następuje plazmogamia i jądra ustawiają się parami, ale nie łączą się ze sobą. Na askogonie wyrastają strzępki workotwórcze, których komórki zawierają jedno jądro męskie oraz jedno żeńskie (strzępki dikariotyczne). Jądra te dzielą się synchronicznie. Łączenie się dikariontów jest skorelowane ze swoistym podziałem komórki i formowaniem haczyków. Wierzchołkowa część strzępki wygina się i tworzy haczyk; równocześnie para jąder dzieli się. Górna para jąder jest oddzielana przez septę od komórki podstawowej i od haczyka. Następnie haczyk łączy się z komórką podstawową, tworząc ponownie komórkę dwujądrową. Szczytowa komórka haczyka staje się workiem, w którym następuje łączenie się obu jąder. Wreszcie jądro w młodym worku dzieli się dwukrotnie, pierwszy podział jest mejotyczny. Wokół ośmiu siostrzanych jąder formują się askospory. Liczba podziałów jądra może być mniejsza (cztery askospory) lub bardzo duża (nawet 214

więcej niż 1000 spor w worku). Tak więc, zarówno askospory, jak i grzybnia są haploidalne. Owocniki. Poza nielicznymi wyjątkami, worki tworzą się w owocnikach. Stanowią one osłonę lub podkładkę, w których gametangia osiągają dojrzałość. Zwarta grzybnia nadaje owocnikom charakterystyczny kształt. Wyróżnia się trzy podstawowe postaci owocników (ryc. 5. 8): 1) całkowicie zamknięty, kulisty owocnik jest nazywany kleistotecjum i jest typowy dla Plectomycetes; 2) butelkowaty owocnik jest nazywany perytecjum i jest charakterystyczny dla Pyrenomycetes; 3) otwarty, miseczkowaty owocnik nazywa się apotecjum i jest typowy dla Discomycetes. Niektóre grzyby tworzą worki nagie, nie osłonięte ścianą komórkową (Protoascomycetes). Trufle (Tuberales) wytwarzają owocniki całkowicie kuliste, podziemne. 215

Drożdże. Drożdże, czyli grzyby pączkujące zalicza się do Protoascomycetes. Typowym dla nich sposobem rozmnażania bezpłciowego jest pączkowanie (ryc. 5. 2). Podział komórki przez rozszczepienie występuje bardzo rzadko. Wypączkowane komórki mogą pozostawać na komórkach macierzystych i mogą tworzyć pseudo- lub pączkującą grzybnię bądź wypączkowane komórki mogą się całkowicie oddzielać. Askospory są wytwarzane w nagich workach powstałych z zygoty lub z komórek wegetatywnych. Grzyby z rodziny Endomycetaceae, oprócz komórek pączkujących, wytwarzają grzybnię. Endomycopsis formuje w tym samym czasie strzępki, komórki pączkujące oraz worki z zarodnikami. Endomyces lactis (znany pod nazwą Geotrichum candidum lub Oospora lactis) wytwarza artrokonidia w wyniku fragmentacji strzępek. Saccharomycetaceae (drożdże właściwe) nie mają zdolności wytwarzania grzybni (ryc. 5. 9 oraz 5. 10). Drożdże piwowarskie i piekarniane są odmianami fizjologicznymi Saccharomyces cerevisiae. Haploidalne komórki wegetatywne mogą się ze sobą łączyć (kopulować). Po kariogamii może następować natychmiast mejoza i formują się cztery askospory. Jednakże diploidalne komórki są zdolne do wielokrotnego rozmnażania 216

217

przez pączkowanie, są one większe i bardziej aktywne fizjologicznie od komórek haploidalnych. Szczepy diploidalne, a nawet poliploidalne są najczęściej wykorzystywane w przemyśle. Saccharomyces cerevisiae stał się organizmem modelowym dla genetyków molekularnych badających Eucaryota dzięki temu, że posiada mały haploidalny genom (tylko trzykrotnie większy niż E. coli) i małą liczbę chromosomów (16 liniowych chromosomów po 200-2200 tys. p. z. ), a także dzięki krótkiemu czasowi podwojenia (90 min). Drożdże nie wytwarzające worków można uznać za bardziej zredukowane (tzn. mające skrócony cykl życiowy). Tylko niektóre mają rozgałęzioną grzybnię. Większość z nich rozmnaża się wyłącznie przez pączkowanie. Drożdże nie tworzące askospor zalicza się do rodzajów: Candida, Torulopsis, Cryptococcus, Rhodotorula, Pullularia i in. (ryc. 5. 11).

W warunkach naturalnych drożdże żyją we wszystkich siedliskach, gdzie są dostępne w postaci płynnej wydzieliny lub wydaliny zawierającej cukry łatwo podlegające fermentacji, np. w nektarze kwiatów, na owocach, na liściach. Pullularia pullulans (tzw. czarne drożdże) tworzy czarne naloty na liściach pokrytych spadzią. Plectomycetes. Plectomycetes są grzybami wytwarzającymi kleistotecja. Do tej grupy należą bardzo ważne rodzaje Aspergillus i Penicillium. Są to grzyby identyfikowane właśnie na podstawie ich stadiów konidialnych

218

(ryc. 5. 12). Są one omówione dalej w kontekście zagadnień fizjologicznych. Na ich obficie rozgałęzionych, wielojądrowych grzybniach wyrasta ogromna liczba konidioforów. Z komórki bazalnej wyrastają pionowo ku górze komórki podtrzymujące konidioforu, a na ich szczycie są odgałęzienia uwieńczone fialidami (komórki konidiotwórcze). U Aspergillus szczytowa komórka podtrzymująca konidioforu jest kuliście rozdęta i na jej powierzchni wyrastają fialidy. Na każdej fialidzie, w łańcuchu formowane są konidia przypominające sznury kulistych korali. Są one zabarwione (czarne, brązowe, ochrowe, zielone i inne) i nadają odpowiedni kolor kolonii grzybów. Liczne gatunki z rodzaju Aspergillus i Penicillium powodują rozkład podłoży organicznych, takich jak owoce, wyroby ze skóry i drewna itp. Penicillium roqueforti i P. camemberti (obecnie często zastępowane przez szybciej rosnące P. cascicolum) nadają specyficzny aromat serom „Roquefort" i „Camembert". Penicillium notatum i P. chrysogenum są dobrze znanymi grzybami wykorzystywanymi do uzyskiwania penicyliny. Pyrenomycetes. Pyrenomycetes są grzybami formującymi perytecja. Typowe perytecjum ma własną ścianę. Worki wyrastają w dolnej części butelkowatego owocnika i są przemieszane z parafizami (wstawkami płonnymi). Wnętrze szyjki owocnika wyścielone jest peryfizami (ryc. 5. 7 i 5. 8). Bardzo liczne grzyby patogeniczne zaliczane są do Pyrenomycetes. 219

Obejmują one pasożyty obligatoryjne, takie jak mączniaki prawdziwe (Erysiphe, Uncinula necator, Sphaerotheca mors-uvae itp. ), oraz saprofity, np. z rodzaju Chaetomium, czy znany obiekt badań genetycznych — Neurospora. Jednym z koprofitów jest np. Sordaria fimicola. Czarne owocniki grzybów z rodzajów Xylaria i Hypoxylon wyrastają na kłodach drzew. Nectria galligena i N. cinnabarina powodują tworzenie się rakowatych narośli na drzewach. Clavicepspurpurea jest sprawcą powstawania sporyszu na życie; inne gatunki Claviceps atakują różne trawy. Rozwój Pyrenomycetes. Cykl życiowy przedstawiciela Pyrenomycetes może być zilustrowany na przykładzie Claviceps purpurea (ryc. 5. 13). Askospory atakują znamiona słupków traw w okresie ich kwitnienia. Strzępki grzyba przerastają do zalążni i formują delikatną, białą grzybnię. Na pofałdowanej powierzchni zwartej grzybni na szczycie tworzą się konidiofory wytwarzające ogromną ilość małych, hialinowych konidiów. Konidia są pogrążone w słodkiej wydzielinie i są rozprzestrzeniane przez owady. Po pewnym czasie konidia przestają się tworzyć, a słupek trawy porażony przez grzyba przekształca się w czarnofioletowy, wygięty przetrwalnik (sklerocjum) nazywany także sporyszem. W czasie żniw przetrwalniki wypadają z kłosów i zimują w glebie. Po okresie zimowego spoczynku, wiosną, w odpowiedniej temperaturze i wilgotności, na przetrwalnikach wyrastają podkładki. W ich kuliście rozszerzonej, górnej

220

części tworzą się perytecja, a w nich worki z ośmioma nitkowatymi askosporami. Przetrwalniki zawierają wysoce aktywne alkaloidy (pochodne kwasu lizergowego, ergotoksyny i ergotaminę) wykorzystywane w farmakologii. Przetrwalniki mogą być uzyskiwane na większą skalę dzięki uprawom celowo infekowanych zbóż. Inne gatunki, np. Clavicepspaspali, mogą być także hodowane na podłożach płynnych. Discomycetes. Są to grzyby wytwarzające apotecja. Do grupy tej należą liczne grzyby ściśle związane z lasami, np. Peziza, Morchella, Helvella i Tuberales (trufle). Włączanych jest tu też wiele grzybów patogennych, z których należy wymienić: Monilina fructicola, Sclerotinia sclerotium, Rhytisma acerinum i Lephodermium. Apotecja są owocnikami miseczkowatymi, kieliszkowatymi lub buławkowatymi. Niektóre grzyby wyrastające w lasach tworzą owocniki jaskrawo zabarwione, np. czerwone, żółte lub pomarańczowe, ale bywają także czarne lub brązowe. Pyronema omphalodes (P. confluens), będąca obiektem doświadczalnym w badaniach ontogenezy worka, wyrasta na wypaleniskach i pożarzyskach.

5. 5. Basidiomycetes (podstawczaki) Basidiomycetes są uznawane za grupę grzybów najbardziej zaawansowaną rozwojowo. Wyróżniającym elementem Basidiomycetes jest bazydium (podstawka), komórka spełniająca podobną funkcję jak worek. Zwykle formują się na niej cztery bazydiospory. Są one haploidalne i na ogół jednojądrowe. Bazydiospory, podobnie jak askospory, są efektem plazmogamii, kariogamii i mejozy; dwa ostatnie procesy zachodzą, odpowiednio, w worku i w podstawce. Grzybnia Basidiomycetes składa się ze strzępek septowanych. Białe sznury grzybni, widoczne niekiedy gołym okiem w ściółce leśnej, uformowane są ze splotów strzępek otoczonych zwartą warstwą grubościennych strzępek i noszą nazwę ryzomorf. Cykl rozwojowy Hymenomycetes. Z kiełkujących bazydiospor rozwija się grzybnia pierwotna, septowana, złożona z jednojądrowych komórek. Grzybnia wtórna jest dikariotyczna, a powstaje po zetknięciu się ze sobą strzępek dwu zgodnych płciowo szczepów i połączeniu się ich jednojądrowych protoplastów (somatogamia). W każdej dzielącej się komórce jądra podlegają synchronicznemu podziałowi. U wielu Basidiomycetes 221

podział komórki i podział jąder są związane z formowaniem cylindrycznego, bocznego wyrostka nazywanego sprzążką (ryc. 5. 14). Dzięki temu, nowo powstała komórka zawiera po jednym jądrze z każdego jądra siostrzanego. Gdy komórka jest przygotowana do podziału, między dwoma jądrami, a i b, tworzy się sprzążka, a następnie wygina się ku tyłowi. Szczytowe jądro b przesuwa się do sprzążki i oba jądra dzielą się. W szczytowej części komórki znajdują się teraz siostrzane jądra a' i b', następnie są one oddzielane przez tworzącą się septę. W tym samym czasie sprzążka łączy się z komórką macierzystą i dzięki temu jądro b przesuwa się z powrotem do tylnej części komórki. Szczytowa komórka jest także oddzielana od sprzążki przez septę; obie komórki siostrzane, tzn. szczytowa i podszczytowa, zawierają po dwa jądra siostrzane. Grzybnia dikariotyczna może rosnąć i formować owocniki o określonym pokroju, które są dobrze znane jako grzyby kapeluszowe. Podstawki tworzą warstwę hymenium znajdującą się w określonych miejscach

222

owocnika. Składa się ona z podstawek i strzępek płonnych, parafiz oraz cystyd. Podstawki powstają z wydłużającej się komórki wierzchołkowej, w której następuje kariogamia. Zygotyczne jądro podlega mejozie i tworzą się cztery haploidalne jądra. Równocześnie formują się cztery sterygmy, a na nich bazydiospory, do których migrują jądra. Bazydiospory są aktywnie uwalniane z owocników. Bazydiospory w masie mają określone zabarwienie. Bywają zarodniki brązowe, czarne, purpurowe czy ochrowe i jest to istotna cecha diagnostyczna. Podobny proces rozwojowy, z niewielkimi modyfikacjami, występuje u pozostałych Homobasidiomycetes. Wytwarzają one podstawki tego samego typu. Hymenomycetes różnią się od Gasteromycets lokalizacją hymenium. U tych ostatnich, owocnik nie otwiera się, a warstwa hymenium jest osłonięta; bazydiospory są uwalniane z owocnika po jego rozpadzie lub przez otwór w okrywie owocnika (Lycoperdon, Bovista, Geastrum, Cyathus, Phallus). Grzyby takie jak Tremellales, Uredinales i Ustialginales są zaliczane do Heterobasidiomycetes. U przedstawicieli kilku grup probazydia są grubościenne i pełnią funkcje zarodników przetrwalnikowych. Niestety, nie możemy tu rozpatrywać wielu interesujących zagadnień, takich jak np. modyfikacje podstawki, adaptacje do warunków środowiskowych czy do cyklu rozwojowego gospodarza. Możemy jednak wspomnieć małą rodzinę Sporobolomycetaceae, obejmującą grzyby drożdżoidalne. Wytwarzają one konidia na krótkich wyrostkach, z których są aktywnie odrzucane i dlatego nazwano je balistosporami. Sporobolomyces salmonicolor rozmnaża się przez pączkowanie, podobnie jak drożdże. Jednak każda komórka może wytwarzać wyrostek przypominający sterygmę, na której formuje się nerkowaty zarodnik. Gdy zarodnik dojrzeje, na jego dolnym końcu tworzy się kropla wydzieliny i jest on odrzucany w powietrze na odległość 0, 1 mm (ryc. 5. 15). Sądzi się, że jest to powszechny sposób „odstrzeliwania" bazydiospor przez grzyby mające odsłonięte podstawki {Hymenomycetes).

223

5. 6. Deuteromycetes = Fungi imperfecti (grzyby konidialne) W tej klasie zgrupowano wszystkie grzyby, które nie mają stadiów płciowych, oraz te, u których stadia takie nie zostały jeszcze stwierdzone. Stadia konidialne tych grzybów są bardzo podobne do dobrze znanych u Ascomycetes. Dlatego można przypuszczać, iż Deuteromycetes reprezentują stadia konidialne Ascomycetes, których stadia workowe nie zostały jeszcze odkryte lub też utracone w toku ewolucji. Nawet jednak grzyby konidialne (Deuteromycetes) nie są całkowicie bezpłciowe. Wykazano, że występują u nich procesy paraseksualne, podobnie jak u Basidiomycetes i u niektórych Ascomycetes. Stwierdzono, iż w czasie tego procesu następuje plazmogamia, kariogamia i mejoza, ale nie odbywają się one w określonych miejscach w grzybni, ani nie są związane ze specjalnymi stadiami rozwojowymi (tzn. występują przypadkowo). Grzybnia wegetatywna jest zwykle homokariotyczna, tzn. zawiera jądra tylko jednego typu. Niekiedy łączenie się protoplastów grzybni zawierającej różne typy jąder daje początek grzybni heterokariotycznej. W rosnącej grzybni heterokariotycznej liczba jąder zwiększa się w wyniku mitozy. Może zachodzić także kariogamia i mejoza. Końcowym efektem procesu paraseksualnego jest rekombinacja materiału genetycznego, tak samo jak w procesie płciowym. Klasyfikacja grzybów konidialnych bazuje głównie na typach owocowań, konidiów i innych cechach morfologicznych, a służy jedynie praktycznym celom, jakimi są identyfikacja i przypisanie odpowiedniej nazwy.

WZROST MIKROORGANIZMÓW

6. 1. Odżywianie się mikroorganizmów Wzrost mikroorganizmów zależy od obecności wody. Są w niej rozpuszczone związki odżywcze, czyli substancje, z których mikroorganizmy czerpią energię i syntetyzują materiały wchodzące w skład komórki. Różne mikroorganizmy mają odmienne wymagania dotyczące zarówno składu podłoża, jak i innych warunków środowiskowych. Z tego względu zaprojektowano wiele rodzajów podłoży mikrobiologicznych o różnym składzie. Podstawowym wymogiem, jaki musi spełniać każde podłoże, jest to, aby dostarczało ono, w postaci przyswajalnych związków, wszystkich pierwiastków uczestniczących w tworzeniu masy komórkowej. Podstawowe wymagania odżywcze. Pierwiastki wchodzące w skład komórki można podzielić na dwie grupy, tj. makroelementy obecne we wszystkich organizmach: węgiel, tlen, wodór, azot, siarka, fosfor, potas, sód, wapń, magnez, żelazo (C, O, H, N, S, Ρ, Κ, Na, Ca, Mg, Fe), oraz mikroelementy lub pierwiastki śladowe, które nie są konieczne dla wszystkich organizmów, tj.: mangan, molibden, cynk, miedź, kobalt, nikiel, wanad, bor, chrom, selen, krzem, wolfram i inne. Metale ciężkie są przeważnie składową enzymów zaangażowanych w metabolizmie nieorganicznych pierwiastków lub związków, takich jak O 2 , N 2 , H 2 , S, SO 4 2- , SO32-, NO 3 - , NO2~, NH4+. Większość mikroelementów jest wymagana w ilościach śladowych (w stężeniach mikromolarnych) i zawarta jest 225

w postaci zanieczyszczeń w solach makroelementów. Mogą one także dostać się do podłoży mikrobiologicznych z zanieczyszczeń w szklanych naczyniach lub pyłkach kurzu. Z tych względów wykazanie zapotrzebowania na pierwiastki śladowe wymaga zastosowania specjalnego postępowania. Liczne metale ciężkie (Cu, Hg, Zn, Ni, Cd, Ag, Cr, Se) są toksyczne w ilościach milimolarnych. W większości przypadków pierwiastki wprowadza się do podłoży w postaci soli. Tabele 6. 1 i 6. 2 przedstawiają skład prostego podłoża syntetycznego oraz skład stężonego roztworu pierwiastków śladowych.

Źródła węgla i energii. Organizmy zdobywające energię w wyniku fotosyntezy lub przez utlenianie związków nieorganicznych mogą wykorzystywać dwutlenek węgla jako główne źródło węgla. Te autotroficzne

226

w stosunku do węgla organizmy są zdolne do redukcji CO2. Wszystkie inne organizmy cały węgiel zawarty w swoich komórkach uzyskują ze związków organicznych. Związki te służą na ogół zarówno jako źródło węgla, jak i źródło energii. Są one w części przyswajane tworząc masę komórkową, a częściowo utleniane dostarczając energii. Dominującymi pod względem ilościowym organicznymi związkami pokarmowymi w biosferze są wielocukry — celuloza i skrobia. Monomerem, podstawową cegiełką tych polimerów jest glukoza, która może być wykorzystywana przez większość mikroorganizmów. Praktycznie, wszystkie występujące w naturze związki organiczne mogą być rozkładane i wykorzystywane przez różne mikroorganizmy. Dodatkowe substancje odżywcze. Wiele organizmów wymaga do wzrostu, obok soli mineralnych, węgla i źródła energii, kilku dodatkowych substancji odżywczych zwanych czynnikami wzrostowymi lub uzupełnieniami. Substancje te wchodzą w skład komórek, ale nie wszystkie komórki mogą je syntetyzować z prostych podstawowych składników pokarmowych. Rozróżniamy trzy grupy czynników wzrostowych: aminokwasy, zasady purynowe i pirymidynowe oraz witaminy. Aminokwasy są składnikami białek, a puryny i pirymidyny — kwasów nukleinowych, dlatego też są one niezbędne w dużych ilościach. Witaminy natomiast są komponentami koenzymów lub grup prostetycznych enzymów, tzn. działają jako katalizatory i dlatego potrzebne są minimalne ich ilości (tab. 6. 3). Organizmy wymagające do wzrostu takich dodatkowych czynników nazywają się auksotrofami, w odróżnieniu od prototrofów, które nie są uzależnione od dodatkowych substancji odżywczych. Siarka i azot. Oba te pierwiastki występują w komórkach głównie w postaci związków zredukowanych, a mianowicie odpowiednio w formie grup sulfhydrylowych i aminowych. Większość organizmów może asymilować siarkę i azot w postaci związków utlenionych, a także redukować zarówno siarczany, jak i azotany. Najpospolitszym źródłem azotu dla mikroorganizmów są sole amonowe. Kilka organizmów prokariotycznych jest w stanie redukować azot cząsteczkowy (N2). Inne mikroorganizmy mogą wymagać źródła azotu w postaci aminokwasów, w których azot jest już obecny w formie organicznej. Podobnie, nie wszystkie organizmy mają zdolność do przeprowadzania redukcji siarczanów i niektóre z nich jako źródła siarki wymagają siarkowodoru lub cysteiny.

227

Tlen. Tlen w komórkach jest zawsze obecny w postaci wody. Może być także w postaci dwutlenku węgla i w licznych związkach organicznych. Wiele organizmów jest jednakże dodatkowo uzależnionych od tlenu cząsteczkowego (O2). Tlen przede wszystkim jest ostatecznym akceptorem elektronów w oddychaniu tlenowym, ulegając redukcji do wody. Właściwe włączanie cząsteczkowego tlenu do składników komórkowych następuje tylko wtedy, gdy jako źródło węgla wykorzystywany jest metan lub węglowodory długołańcuchowe czy aromatyczne. Pod względem stosunku do tlenu możemy wyróżnić trzy grupy mikroorganizmów: ścisłe tlenowce (obligatoryjne aeroby), mogące czerpać energię tylko w drodze oddychania tlenowego, ścisłe beztlenowce (obligatoryjne anaeroby), mogące rosnąć tylko pod nieobecność tlenu, który jest dla nich toksyczny, względne beztlenowce (fakultatywne anaeroby), rosnące zarówno w obecności tlenu, jak i bez niego. W tej ostatniej grupie można wyróżnić dwa typy reprezentowane np. przez: a) bakterie mlekowe, które mogą rosnąć w obecności tlenu, co oznacza że są aerotolerancyjne, ale nie mogą wykorzystywać tlenu, czerpiąc energię wyłącznie z fermentacji, oraz b) inne względnie tlenowe bakterie (Enterobacteriaceae) i wiele drożdży, które mogą czerpać energię z oddychania tlenowego albo z fermentacji, gdy brak jest tlenu. Wiele, jeśli nie większość, bakterii tlenowych należy do mikroaerofili, tzn. organizmów, które wymagają tlenu do zdobywania energii, lecz nie tolerują jego obecności przy takim ciśnieniu parcjalnym, jakie występuje w powietrzu (0, 2 bara). Dobrze znoszą tylko ciśnienie rzędu 0, 01-0, 03 bara.

6. 2. Podłoża bakteriologiczne (pożywki) i warunki wzrostu Liczne, niezbyt wymagające mikroorganizmy, jak na przykład niektóre bakterie z rzędu Pseudomonadales zamieszkujące glebę lub wodę, a także Escherichia coli, mogą dobrze rosnąć w płynnym podłożu o składzie podanym w tabeli 6. 1. Wiele mikroorganizmów wymaga czasem jakiegoś śladowego pierwiastka, witaminy lub innego dodatku. Kiedy podłoże jest wykonane wyłącznie z określonych związków chemicznych, jest ono nazywane podłożem syntetycznym lub zdefiniowanym. Dobrze jest poznać minimalne wymagania odżywcze każdego mikroorganizmu i za-

228

projektować podłoże minimalne zawierające tylko te komponenty, które są naprawdę niezbędne do wzrostu. Wymagające gatunki mogą potrzebować wielu dodatkowych związków. Tak więc np. podłoże minimalne dla Leuconostoc mesenteroides zawiera 40 składników. Podłoża złożone. W przypadku wielu bakterii o dużych wymaganiach odżywczych nie zostały w pełni poznane niezbędne uzupełnienia. Organizmy te są więc hodowane na podłożach zawierających ekstrakty drożdżowe, autolizaty drożdżowe, peptony lub ekstrakty mięsne. Dla pewnych grup mikroorganizmów stosuje się też takie dodatki jak ekstrakt słodowy, namok siana, sok śliwkowy, sok z marchwi, mleko kokosowe, a dla koprofilnych grzybów nawet wyciąg z końskiego nawozu. Bardzo często, także ze względów ekonomicznych, podłoża są przygotowywane nie z czystych związków chemicznych, lecz z takich złożonych preparatów jak melasa, syrop kukurydziany, ekstrakty sojowe i pszeniczne, które są tanimi półproduktami lub odpadami przemysłowymi. Podłoża stałe. Aby otrzymać podłoże stałe, do płynnej pożywki należy dodać jakiś czynnik zestalający, który nadaje jej galaretowatą konsystencję. Żelatyna, która była pierwszym czynnikiem zestalającym, jest obecnie mało używana, ponieważ ulega upłynnieniu w temperaturze 26-30°C, a także wiele mikroorganizmów może ją rozkładać. Prawie idealnym czynnikiem zestalającym jest agar wprowadzony do praktyki bakteriologicznej przez W. Hessego, jednego ze współpracowników Roberta Kocha. Jest to silnie rozgałęziony, złożony wielocukier otrzymywany z glonów. Dodaje się go do wodnych roztworów związków odżywczych w ilości 15-20 g/litr. Agar ulega upłynnieniu dopiero w temperaturze 100°C, lecz pozostaje płynny do temp. 45°C lub niższej. Bardzo niewiele bakterii jest zdolnych do jego rozkładania. Jeżeli wymagane jest podłoże stałe nie zawierające żadnych organicznych składników, wówczas jako czynnik zestalający stosuje się żel krzemionkowy. +

~

Stężenie jonów wodorowych. Jony H i OH są najbardziej ruchliwe ze wszystkich jonów i dlatego nawet małe zmiany ich stężenia wywołują znaczne efekty. A więc ustawienie początkowego optymalnego pH i jego utrzymanie w czasie prowadzenia hodowli jest niezwykle ważne. + ~ Większość organizmów rozwija się najlepiej, gdy jony H i OH znajdują się w przybliżeniu w równych stężeniach (pH7). Wiele bakterii woli jednakże wyższe wartości pH, to znaczy podłoże lekko alkaliczne. 229

Przykładem takich bakterii są bakterie nitryfikacyjne, promieniowce, bakterie brodawkowe czy rozkładające mocznik (ryc. 6. 1). Tylko nieliczne należą do kwasotolerancyjnych (bakterie mlekowe, Acetobacter, Sarcina ventriculi) lub kwasolubnych {Thiobacillus). Grzyby wolą niższe zakresy pH, a więc wprowadzenie próbek gleby do złożonych pożywek o różnych wartościach pH wywołuje dominujący rozwój grzybów przy pH 5 i bakterii w pH 8. Utrzymanie stałego pH podczas wzrostu hodowli jest szczególnie ważne dla tych mikroorganizmów, które produkują kwas, ale nie tolerują go w zbyt dużych stężeniach (bakterie mlekowe, Enterobacteriaceae i wiele spośród Pseudomonadales). Aby uniknąć samozatrucia kwasem kultur o długim czasie hodowli, podłoże musi być zbuforowane lub nie powinno zawierać substratów fermentacyjnych. Pewne właściwości buforujące, choć ograniczone do pH powyżej 7, 2, mają nieorganiczne fosforany. W przypadku intensywniejszej produkcji kwasów zalecane jest dodawanie węglanu wapnia albo, jeśli nierozpuszczalne składniki są niepożądane, kwaśnego węglanu sodu. Jednakże w tym ostatnim przypadku należy pamiętać, że jony dwuwęglanowe (HCO3-) są w równowadze z CO2 rozpuszczonym i CO2 obecnym w fazie gazowej (np. w powietrzu)

Zależność między pH, stężeniem kwaśnego węglanu sodu i parcjalnym ciśnieniem CO2 w atmosferze jest ujęta w równaniu Hendersona-Hasselbalcha pokazującym, że stężenie kwasu węglowego jest w równowadze z iloczynem ciśnienia parcjalnego CO2 i współczynnika rozpuszczalności a.

230

Bakterie nie są na ogół wrażliwe na niewielkie zmiany pH w zakresie 6-9. Jeżeli pH podłoża zmienia się gwałtownie, może dojść do przejściowej zmiany pH wewnątrzkomórkowego, ale zazwyczaj jest ono doprowadzane do właściwej wartości w ciągu 30 minut. Uszkodzenia wywoływane nieodpowiednim pH właściwie nie są wynikiem działalności samego jonu wodorowego lub wodorotlenowego. Powodują one jedynie zwiększenie ilości niezdysocjowanych cząsteczek słabego kwasu lub zasady, które łatwiej wnikają do komórki niż produkty ich dysocjacji. Niezdysocjowane kwasy są formą aktywniejszą fizjologicznie. Komórki tym szybciej pobierają dwuzasadowy kwas bursztynowy i trójzasadowy kwas cytrynowy, im niższe jest pH pożywki. Dwutlenek węgla. Podłoża dla bakterii autotroficznych asymilujących CO2 zawierają zazwyczaj kwaśny węglan sodu i są inkubowane w atmosferze CO2 w zamkniętym systemie. Można też przepuszczać przez pożywkę strumień powietrza lub strumień powietrza wzbogaconego CO2. We wszystkich przypadkach musi być brana pod uwagę zależność między pH, stężeniem kwaśnego węglanu i ciśnieniem parcjalnym CO2 w fazie gazowej. Jak się okazuje, nawet heterotroficzne organizmy, które wykorzystują węgiel organiczny, potrzebują CO2. Spośród pasożytniczych bakterii występujących we krwi, tkankach lub w przewodzie pokarmowym, jest wiele takich, które zaadaptowały się do większych stężeń CO2 w otaczającym je środowisku niż w powietrzu. Takie bakterie muszą być inkubowane w atmosferze gazowej zawierającej objętościowo 10% CO2. Poza tym należy pamiętać, że usunięcie CO2, np. przez absorpcję w KOH, hamuje wzrost prawie wszystkich bakterii (Wiązanie CO2, rozdz. 11. 5). Zawartość wody i ciśnienie osmotyczne. Mikroorganizmy w znacznym stopniu różnią się między sobą pod względem wymagań co do zawartości wody w środowisku. Aby możliwe było porównywanie substancji o stałej konsystencji i roztworów wodnych pod względem dostępności zawartej w nich wody, stosuje się takie parametry jak aktywność wodna (aw) lub wilgotność względna. Parametry te odnoszą się do fazy gazowej (pary), która pozostaje w równowadze z substancją stałą lub roztworem wodnym. 231

Podają one stosunek stężenia wody w formie gazowej nad badaną substancją do stężenia wody w formie gazowej nad czystą wodą w danej temperaturze. Mikroorganizmy mogą rosnąć w zakresie aktywności wodnej od 0, 998 do 0, 6. Najniższa aktywność wodna dopuszczająca wzrost była zanotowana dla osmotolerancyjnych drożdży Saccharomyces rouxii, które rosną w aw = 0, 6. Aspergillus glaucus i inne kropidlaki mogą rosnąć w aw = 0, 8, ale większość bakterii wymaga aktywności wodnej większej niż 0, 98. Jedynym wyjątkiem jest pewna halofilna bakteria wymagająca aw, =0, 75. Temperatura. Bakterie i archeony różnią się także pod względem wymagań w stosunku do temperatury potrzebnej do wzrostu (ryc. 6. 2). Większość bakterii glebowych i wodnych należy do mezofili, co znaczy, że maksymalna szybkość ich wzrostu przypada w zakresie temperatur 20-42°C. Organizmy termotolerancyjne mogą rosnąć w temperaturze do 50°C (Methylococcus capsulatus). Bakterie termofilne rosną najlepiej powyżej 40°C, a ich temperatura graniczna przebiega w rejonie 70°C (Bacillus stearothermophilus, Thermoactinomyces vulgaris). Termofile ekstremalne są to organizmy, których optimum wzrostu znajduje się powyżej 65°C {Thermus aquaticus, Sulfolobus), a niektóre z nich mogą rosnąć w temperaturze powyżej 70°C (kilka gatunków z rodzaju Clostridium i Bacillus), 80°C (Sulfolobus acidocaldarius) lub nawet przy 105°C (Pyrodictium occultum — ścisły beztlenowiec redukujący siarkę).

232

Prokariota rosnące między 80 a 100°C są nazywane hipertermofilami. Na drugim krańcu zakresu temperatur wzrostowych znajdują się psychrofile (lub kriofile). Dominują wśród nich pewne bakterie morskie (bakterie fotosyntetyzujące) i bakterie żelazowe (Gallionella), które osiągają maksymalną szybkość wzrostu w temperaturze poniżej 20°C. Nawietrzanie. Wszystkie mikroorganizmy, które są ścisłymi tlenowcami, potrzebują tlenu jako ostatecznego akceptora elektronów. Kiedy bakterie te rosną na powierzchni agaru lub w cienkich warstwach płynu w kontakcie z powietrzem, wówczas zaopatrzenie w tlen jest na ogół wystarczające. Jednakże wewnątrz bakteryjnej kolonii i bezpośrednio pod nią ciśnienie parcjalne tlenu może spadać do zera. Rycina 6. 3 przedstawia taką sytuację i wyjaśnia znane od dawna zjawisko polegające na tym, że np. względny beztlenowiec Escherichia coli, rosnąca na glukozie będącej substratem fermentacji, produkuje kwasy organiczne także w obecności tlenu atmosferycznego, przez co sama hamuje swój wzrost. W płynnych podłożach o większej głębokości bakterie mogą rosnąć tylko w powierzchniowej warstwie, ponieważ tlen jest w sposób ciągły zużywany, wskutek czego w głębszych warstwach powstają warunki beztlenowe. Jeżeli bakterie tlenowe mają rosnąć w całej objętości pożywki, należy zapewnić stały dopływ tlenu przez nawietrzanie. Mikroorganizmy mogą wykorzystywać tylko tlen rozpuszczony. Podczas gdy sole mineralne i organiczne składniki odżywcze można dostarczyć w stężeniach wystarczających do wzrostu

233

przez kilka godzin czy nawet dni, to bardzo mała rozpuszczalność tlenu w roztworach wodnych stanowi znaczne ograniczenie. Jeden litr wody będący w stanie równowagi z powietrzem pod ciśnieniem 1 atm w temperaturze 20°C zawiera 6, 2 ml lub 0, 28 milimola tlenu. Jest to ilość wystarczająca do utlenienia 0, 046 milimola lub 8, 3 mg glukozy (co stanowi ok. 1/1000 przeciętnej zawartości glukozy w 1 litrze podłoża). Tak więc tlen nie może być w pożywce zmagazynowany, lecz musi być dostarczany w sposób ciągły. Jednak większość mikroorganizmów jest zaadaptowana do bardzo małych stężeń rozpuszczonego tlenu, niemniej pewna minimalna wartość (krytyczne stężenie tlenu) musi być utrzymana do zapewnienia właściwego oddychania komórek. Szybkość rozpuszczania tlenu w płynie można zwiększyć zapewniając dużą powierzchnię kontaktu między fazą płynną a gazową i przez zwiększenie ciśnienia parcjalnego tlenu w fazie gazowej. Płynne kultury są zazwyczaj nawietrzane za pomocą powietrza lub mieszaniny gazów O2, CO2 i N2. W celu osiągnięcia dużej powierzchni nawietrzania wypróbowano wiele różnych sposobów: 1) hodowla w cienkiej warstwie, 2) mieszanie płynu przez wytrząsanie (wytrząsarka rotacyjna lub posuwisto-zwrotna), 3) rotacja ułożonych poziomo butelek wokół podłużnej osi, 4) wymuszone nawietrzanie słupa cieczy za pomocą powietrza przepusz-

234

czanego pod ciśnieniem przez dystrybutor gazowy (filtr ze spiekanego szkła, kolba Kluyvera), 5) perkolacja (ryc. 6. 4), 6) mechaniczne mieszanie. W płynnych hodowlach mikroorganizmów tlenowych często stosuje się kombinację wymuszonego nawietrzania przez filtry ze spiekanego szkła lub innego typu dystrybutory w połączeniu z mieszaniem mechanicznym. W niektórych fermentorach i urządzeniach typu „Waldhof' wykorzystuje się zawirowania płynu uzyskane pod działaniem bardzo szybkich mieszadeł. Na rycinie 6. 5 przedstawiono kilka naczyń hodowlanych tak zaprojektowanych, aby dawały maksymalną powierzchnię, i naczynia do hodowli tlenowców w głębszych warstwach. Należy pamiętać, że nawet w dobrze zaprojektowanym fermentorze czy w wodach naturalnych nasycenie tlenem nie zawsze jest równomierne. Na przykład kłaczkowanie bakterii może wytwarzać lokalne mikrośrodowiska o obniżonym ciśnieniu parcjalnym O 2 . Powstanie takich na wpół beztlenowych mikrośrodowisk może być stymulowane przez inne cząstki zawieszone w naturalnych wodach. Warunki te można symulować eksperymentalnie, dodając do bakteryjnej zawiesiny takie stałe cząstki jak glina, Chityna czy celuloza. 235

Bakterie rosnące po zaadsorbowaniu się na powierzchni tych cząstek cierpią na brak tlenu. Względne tlenowce, które wobec braku tlenu mogą przestawić się albo na fermentację (Escherichia coli), albo na oddychanie azotanowe (Pseudomonas denitrificans), są szczególnie dogodnym obiektem do zademonstrowania tego efektu. Hodowle beztlenowe. Wyeliminowanie tlenu ze środowiska hodowlanego jest podstawowym warunkiem uzyskania wzrostu ścisłych beztlenowców. Do osiągnięcia tego celu stosuje się różne techniki, jak np.: 1) pożywki odpowietrzone przez gotowanie i pozbawione pęcherzyków powietrza oraz umieszczone w szczelnie zamkniętych naczyniach, 2) beztlenowa gazowa atmosfera w eksykatorach i kloszach anaerobowych, 3) wykorzystanie związków absorbujących tlen (alkaliczny pirogallol, ditionian, chlorek miedziawy) i wiele innych. Dodatek do podłoża czynników redukujących (kwas askorbinowy, tioglikolan, cysteina, a także siarczyn, o ile jest tolerowany) może zmniejszać toksyczne działanie tlenu atmosferycznego lub całkiem mu zapobiegać. Nawet bakterie bardzo wrażliwe na tlen mogą być przenoszone przy swobodnym dostępie powietrza, jeśli przed kontaktem z tlenem będzie chronił pożywkę ciągły strumień wolnego od tlenu azotu przepuszczanego przez naczynie hodowlane (metoda Hungate'a). Innym rozwiązaniem jest zastosowanie komory do przeszczepień pozbawionej tlenu, wypełnionej azotem, argonem lub wodorem. Do podłoża można dodać rezorcynę jako wskaźnik warunków beztlenowych; w obecności tlenu jest ona niebieska, w warunkach beztlenowych — bezbarwna, a po ponownym utlenieniu czerwona. W tym celu może też służyć zlewka z alkalicznym roztworem błękitu metylenowego z glukozą wstawiona do klosza inkubacyjnego. W warunkach beztlenowych roztwór pozostanie bezbarwny.

6. 3. Typy odżywiania Terminy heterotrofizm i autotrofizm, które zostały wprowadzone w celu rozróżnienia sposobów odżywiania roślin i zwierząt, nie są wystarczające do scharakteryzowania znacznie większej różnorodności typów odżywiania wśród mikroorganizmów. Pełny opis sposobów odżywiania wymagał narodzenia się nowych terminów, takich jak źródło energii, donor wodoru czy źródło węgla.

236

Źródło energii. Biorąc pod uwagę mechanizm przemiany energii w jej biochemicznie użyteczną formę — ATP, organizmy można podzielić na dwa zasadnicze typy metaboliczne — fototrofy i chemotrofy. Organizmy, które potrafią wykorzystać promieniowanie elektromagnetyczne (światło) jako źródło energii do wzrostu, są nazywane fototrofami (organizmy fotosyntetyzujące). Składają się one z dwu dużych grup — beztlenowych bakterii fototroficznych, które nie uwalniają tlenu, i tlenowych fototrofów, jak sinice, glony i rośliny zielone, które w obecności światła wytwarzają tlen. Termin chemotrofy (lub organizmy chemosyntetyzujące) wskazuje, że energia jest uzyskiwana w drodze reakcji oksydo-redukcyjnej przeprowadzanej na substracie odżywczym, niezależnie od tego, czy biochemiczna forma tej energii powstała przez fermentację czy oddychanie tlenowe. Donory wodoru i źródła węgla. Wszystkie organizmy, które wykorzystują związki organiczne jako donory wodoru, są nazywane organotrofami. Termin ten jest antonimem pojęcia litotrof, które jest stosowane do określenia zdolności wykorzystania nieorganicznych donorów wodoru, takich jak NH 3 , H2S, S, CO, Fe2+ i inne. Pojęcia autotrof i heterotrof zostały zawężone w swoim znaczeniu i odnoszą się tylko do źródeł węgla komórkowego. Mikroorganizmy są autotrofami, jeżeli zasadniczą część swojego komórkowego węgla zdobywają przez asymilację dwutlenku węgla, natomiast są one zaliczane do heterotrofów, jeżeli węgiel zawarty w ich komórkach pochodzi z asymilacji związków organicznych. Ogólnie rzecz biorąc, klasyfikacja oparta na podstawowych procesach przemian energetycznych i uwzględniająca donory wodoru jest wystarczająca. Rośliny zielone, sinice i purpurowe bakterie siarkowe są fotolitotrofami, bakterie nitryfikujące są chemolitotrofami, a zwierzęta i większość pozostałych mikroorganizmów należy do chemoorganotrofów (źródło węgla komórkowego zaznacza się tylko w szczególnych przypadkach). Ponieważ u większości mikroorganizmów litotrofia związana jest z autotrofią, można także mówić o fotoautotrofach, chemoautotrofach i chemoheterotrofach.

237

6. 4. Metody hodowli selektywnych (wybiórczych) Nasza umiejętność rozróżniania mikroorganizmów jest oparta na dwóch typach postępowania. Niektóre mikroorganizmy można zróżnicować na podstawie charakterystyki ich kolonii, nagromadzania pewnych związków lub zmian w środowisku. Wiele z nich, wytwarzając widoczne dowody swojej obecności, nadaje się do bezpośredniej izolacji. Dla takich mikroorganizmów łatwo ustalić odpowiednie warunki i podłoża wzrostowe. Istnieje jednakże wiele innych typów mikroorganizmów, które można badać dopiero po zastosowaniu techniki wzbogacania hodowli opracowanej przez S. N. Winogradskiego i M. W. Beijerincka. Hodowla wzbogacająca *. Zasada metody i wykonanie jest bardzo proste. Warunki wzbogacania dla danej grupy organizmów są takie, aby dawały im możliwość skutecznego konkurowania i uzyskiwania przewagi. W tym celu można narzucić odpowiednie warunki przez dobór poszczególnych parametrów (źródło węgla, energii i azotu, gazową atmosferę, akceptory elektronów, temperatura, światło, pH itp. ). Po zaszczepieniu takiego podłoża mieszaną populacją mikroorganizmów, jak np. próbką gleby czy mułu, organizmy najlepiej przystosowane do tych szczególnych warunków, którym zostały poddane, będą rosły lepiej niż inne i uzyskają liczebną przewagę. Kolejne przeszczepienia do tego samego płynnego podłoża i w tych samych warunkach, a następnie wysianie na podłoże stałe o tym samym składzie prowadzą do takiego wzbogacenia poszukiwanego gatunku czy szczepu, że można go bez trudności wyizolować. Częste przeszczepianie w krótkich odstępach czasu na płynnej pożywce eliminuje wzrost towarzyszących organizmów, które mogłyby wykorzystywać produkty wydzielania, czy nawet produkty autolizy komórek pierwotnie wybranych do wzbogacenia. Odpowiednim materiałem wyjściowym, tzw. inokulum, są próbki z takich miejsc, gdzie mogła już zajść naturalna selekcja i wzbogacenie. Na przykład * W diagnostyce i mikrobiologii żywności częściej stosuje się termin „hodowla namnażająca", jeżeli wzrost mikroorganizmów przebiega w obecności czynnika faworyzującego określoną grupę mikroorganizmów. Jeśli natomiast stosowane podłoże daje zbliżone szanse wzrostu dla wszystkich wprowadzonych mikroorganizmów, jest to „hodowla przednamnażająca" (przyp. tłum. ).

238

bakterii wykorzystujących tlenek węgla szukamy w przewodach gazowniczych, bakterii zużywających hemoglobinę — w odpadach rzeźnych, a organizmów utleniających węglowodory — na polach naftowych i w rafineriach. Technika hodowli wzbogacających umożliwia izolację mikroorganizmów o dowolnej kombinacji wymagań odżywczych, pod warunkiem że pożądany typ rzeczywiście w naturze istnieje. Dla wielu wyspecjalizowanych mikroorganizmów warunki wzbogacania mogą być wysoce selektywne. Bezazotowe podłoże mineralne w obecności światła jest wyjątkowo wybiórcze dla sinic wiążących wolny azot (Cyanobacteria). Jeśli taka pożywka zostanie uzupełniona organicznym źródłem węgla i energii, a następnie inkubowana w ciemności w warunkach tlenowych, będzie w niej dominował Azotobacter, natomiast w warunkach beztlenowych — Clostridium. Istotne dla powodzenia procesu wzbogacania jest zaspokojenie tylko minimalnych wymagań odżywczych metabolicznego typu, który ma być wyodrębniony. Tak więc na przykład, jeśli poszukiwana bakteria ma utleniać metan lub wodór w obecności azotanu lub siarczanu jako akceptora wodoru, warunkiem absolutnie koniecznym jest wykluczenie tlenu ze środowiska, w przeciwnym razie przewagę uzyskają bakterie tlenowe zdolne do utleniania metanu i wodoru. Metody selekcji mogą także być oparte na oporności lub tolerancji mikroorganizmów w stosunku do kwasów, zasad, temperatury lub promieniowania. Dość często techniki selekcyjne stosują tzw. kontrselekcję (ang. counter selection) przez wprowadzenie do podłoża selektywnych inhibitorów. A więc np. podłoże zawierające azydek pozwala w warunkach tlenowych na wzrost bakterii kwasu mlekowego, podczas gdy wzrost innych tlenowców będzie zahamowany. Azydek, cyjanek i siarkowodór eliminują organizmy tlenowe, które w procesie oddychania wykorzystują cytochromy. Wybiórcze hamowanie ma też zastosowanie w diagnostyce lekarskiej do identyfikacji Corynebacterium diphtheriae (na podłożach zawierających telluryn) oraz patogenów z rodziny Enterobacteriaceae (na agarze z bizmutem). Technika kontrselekcji penicyliną zastosowana w celu wzbogacenia mutantów auksotroficznych Escherichia coli została opisana w rozdziale 15. 1. 5. Dodatek penicyliny do podłoża ma także zastosowanie do ograniczenia wzrostu bakterii gramdodatnich. Wzrost grzybów, drożdży, pierwotniaków i innych eukariotów może być zahamowany po dodaniu cykloheksamidu.

239

Niekiedy w materiale wyjściowym używanym do szczepienia można napotkać różne szczepy i warianty o podobnym typie metabolicznym i tylko nieznacznie różniące się optimum pH lub szybkością wzrostu. W tym przypadku, tylko najlepiej zaadaptowane lub najszybciej rosnące szczepy będą w przewadze i przerosną inne, uniemożliwiając ich izolację. W celu uzyskania największej możliwej liczby szczepów, które mogą rosnąć w danych warunkach selektywnych, należy zastosować metodę bezpośredniego wysiewu na płytki. Jeżeli odpowiednio rozcieńczone

240

inokulum zostanie rozprowadzone na powierzchni stałego, selektywnego podłoża agarowego, wówczas poszukiwane warianty metaboliczne pojawią się w postaci indywidualnych kolonii, a przy odpowiedniej odległości między koloniami nie dojdzie do współzawodnictwa o związki odżywcze. Dzięki temu wolniej rosnące szczepy nie zostaną zarośnięte przez rosnące szybciej i będzie można je wyizolować. Tabela 6. 4 przedstawia najważniejsze warunki selekcji dla przedstawicieli różnych typów metabolicznych. Podsumowuje ona dane dotyczące izolacji gatunków reprezentujących różne typy odżywiania. Czysta kultura. Czystą kulturę definiuje się jako potomstwo pojedynczej komórki (klon). Otrzymanie czystej kultury, wykazanie jej czystości ponad wszelką wątpliwość i przechowanie jej bez zakażeń jest jednym z najważniejszych zadań mikrobiologii. Izolację czystej kultury jakiegoś mikroorganizmu przeprowadza się, poza nielicznymi wyjątkami, na 241

podłożach stałych. Najpierw pojedyncza komórka musi zostać odseparowana od reszty populacji, tak aby kolonia, która powstanie z tej komórki, pozostawała z dala od innych kolonii i komórek. Bakterie tlenowe izoluje się metodą lanych płytek Kocha lub w mniej pracochłonny sposób — wykonanie posiewu redukcyjnego za pomocą platynowego oczka (zwanego też ezą) na powierzchni odpowiedniej płytki agarowej (ryc. 6. 6). Bakterie beztlenowe zawiesza się w upłynnionym podłożu agarowym o temperaturze 45°C i inkubuje się bez dostępu tlenu (ryc. 6. 7). Przez ostrożne pobranie pojedynczej kolonii, zawieszenie jej w odpowiednim roztworze i wielokrotne wysiewanie metodą redukcyjną na podłożu

242

agarozowym można zazwyczaj wyizolować czystą kulturę większości szczepów. Otrzymywanie czystej kultury można też przeprowadzić na podłożu płynnym, pod warunkiem że poszukiwany mikroorganizm dominuje ilościowo w wyjściowym materiale. W wyniku wykonania serii rozcieńczeń w płynnym podłożu można osiągnąć taki etap, że w ostatnim rozcieńczeniu będzie obecna tylko jedna komórka. Powstały z niej klon będzie czystą kulturą. Hodowla mieszana. Naturalne populacje zazwyczaj składają się z mieszaniny różnych mikroorganizmów. Spotykamy wśród nich dużą różnorodność wzajemnych relacji. Mamy więc do czynienia z konkurencją, jeśli organizmy współzawodniczą o jeden substrat, lub też z komensalizmem albo mutualizmem (rozdz. 17. 2). W badaniu tych zależności coraz szersze zastosowanie znajdują hodowle mieszane. W hodowlach okresowych, jak i w systemie hodowli ciągłej można stosować określone warunki, a także monitorować kolejność pojawiania się różnych mikroorganizmów i ich produktów metabolicznych. Dostarczają one dowodów na synergistyczne lub antagonistyczne zależności między tymi mikroorganizmami. Hodowlę mieszaną o pożądanym składzie można uzyskać przez zmieszanie próbek czystych kultur. Doświadczenia z mieszanymi hodowlami o zdefiniowanym składzie dają wgląd w złożone zależności między mikroorganizmami w ich naturalnym środowisku. W gospodarstwie domowym i przemyśle mają zastosowanie nie tylko czyste kultury, lecz także mieszane, zwane niekiedy naturalnymi czystymi kulturami. Przykładem może tu być zakwas piekarski, kefir, „grzybek herbaciany" i drożdże piekarniane. Mieszane hodowle odgrywają także dużą rolę w oczyszczaniu ścieków i zanieczyszczeń kanalizacyjnych, a szczególnie w degradacji ksenobiotyków w ściekach przemysłowych.

6. 5. Fizjologia wzrostu Wzrost może być rozważany określanej zazwyczaj liczbą komórek. Szybkość wzrostu lub ich masy w jednostce

jako powiększanie ilości żywej substancji żywych komórek lub całkowitą masą mierzy się zmianami liczby komórek czasu. W przypadku organizmów jed-

243

nokomórkowych wzrost polega przede wszystkim na zwiększaniu liczby komórek. Komórki bakteryjne rozmnażają się przez podział. Najpierw rozmiar komórki podwaja się, a następnie komórka dzieli się na dwie komórki potomne, które mają w przybliżeniu ten sam rozmiar co pierwotna komórka macierzysta. Czas niezbędny do podwojenia liczby komórek nazywa się czasem generacji, a czas potrzebny do podwojenia masy komórkowej określa się jako czas podwojenia. Oczywiście, w takich warunkach, kiedy masa komórkowa i liczba komórek podwajają się w tych samych przedziałach czasowych, czas generacji (g) i czas podwojenia (td) są sobie równe. Wartość odwrotna, czyli 1/g określa szybkość wzrostu (v) i ma miano h-1 (1/godz).

6. 5. 1. Metody określania liczby i masy bakterii Podczas wzrostu populacji w hodowli okresowej, np. zawiesiny bakterii w kolbie Erlenmeyera, nie zawsze istnieje stała i typowa zależność między powiększaniem się masy bakterii a liczbą ich komórek. Może się zdarzyć, że po zaszczepieniu pożywki pewne bakterie będą się dzieliły szybciej niż by to wynikało z przyrostu masy. Wówczas komórki będą się stawały mniejsze. W późniejszym stadium szybkość przyrostu masy może przewyższać szybkość zwiększania się liczby komórek, co prowadzi do powiększania ich rozmiarów. Z tego względu konieczne jest rozróżnienie między przyrostem masy a przyrostem liczby komórek. Z drugiej strony, jeśli mamy do czynienia z taką fazą wzrostu, o której wiadomo, że przyrost masy i liczby komórek jest jednakowy, nie ma potrzeby rozpatrywania tych dwóch parametrów oddzielnie. Mówi się wówczas o „wzroście zbalansowanym" i „komórkach standardowych". Można wtedy zamiast liczby komórek lub ich masy podać odpowiednią proporcjonalną do nich wielkość, jak np. wartość ekstynkcji (absorbancja, gęstość optyczna). Masę komórek w jednostce objętości (litr lub mililitr) nazywamy stężeniem czy gęstością komórek lub gęstością bakterii (g/l; g/ml). Określanie liczby bakterii. Niekoniecznie wszystkie komórki w populacji bakteryjnej są żywe. Tylko te komórki są uważane za żywe, które mogą rosnąć na powierzchni lub wewnątrz pożywki agarowej tworząc kolonie lub takie, które rosnąc w pożywce płynnej wytwarzają zawiesinę. Metoda przyżyciowego liczenia komórek polega na określeniu liczby

244

żywych komórek w danej populacji, podczas gdy „całkowita liczba komórek" obejmuje zarówno żywe, jak i te, których obecność wykrywa się innymi metodami, obejmującymi także komórki martwe lub uszkodzone. Całkowita liczba komórek. 1) Najpowszechniejszą metodą określania całkowitej liczby komórek jest liczenie, z użyciem mikroskopu, komórek zawieszonych w cienkiej warstwie w specjalnej komorze o znanej objętości (np. w komorze Neubauera, Thoma lub Petroff-Hauzera). Dla warstwy o grubości 0, 02 mm i powierzchni kwadratu o boku równym 0, 05 mm objętość komory wynosi 5 x 1 0 ~ 8 cm 3 , a zatem liczba komórek tam znalezionych musi być pomnożona przez 2 x 107 w celu otrzymania liczby komórek w mililitrze. 2) Liczenie względem znanej liczby małych cząstek, jak np. erytrocytów we krwi (w przybliżeniu 5 x 106/ml), jest jedną z najstarszych metod. 3) Elektroniczny aparat zwany licznikiem Coultera bardzo ułatwia określanie całkowitej liczby komórek. Wykorzystuje on spadek przewodnictwa roztworu elektrolitu podczas przechodzenia komórki bakterii (lub małej cząstki) przez wąski otwór. 4) Kiedy mamy do czynienia z liczbą komórek mniejszą niż 106/ml, można zastosować metodę filtracji membranowej. Znana objętość wody morskiej, stawowej lub pitnej jest przepuszczana przez filtr membranowy, który jest następnie suszony i barwiony. Filtr taki pod działaniem pewnych odczynników można uczynić przezroczystym, tak że nadaje się on do liczenia bakterii na jego powierzchni z użyciem mikroskopu. Liczba żywych komórek. Zazwyczaj wykorzystuje się liczenie kolonii wytworzonych przez żywe komórki w odpowiednich warunkach wzrostu. Według metody lanych płytek Kocha, odmierzoną objętość odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny hodowli miesza się z płynnym agarem odżywczym (o temperaturze 40-45°C), wylewa na płytkę Petriego i pozostawia do zastygnięcia. Zawiesina bakterii może też być rozprowadzona po powierzchni agaru za pomocą specjalnej sterylnej głaszczki. Inną możliwością jest umieszczenie komórek na filtrze membranowym, który następnie zostaje położony na agarze odżywczym lub kartoniku pokrytym pożywką. We wszystkich tych przypadkach liczy się kolonie, które wyrosły po inkubacji pożywki w odpowiednich warunkach. Zastosowanie metody lanych płytek Kocha, jak również innych metod pokrewnych, znajduje zastosowanie tylko w homogennych zawiesinach danego szczepu czy gatunku, a nie do liczenia indywidualnych komórek różnych gatunków w mieszanej populacji.

Oznaczanie masy bakterii. Wybór metody oznaczania masy bakterii zależy od sytuacji i celu jakiemu ma służyć to oznaczenie. Na przykład do określenia wydajności wzrostu stosuje się najczęściej badanie suchej lub mokrej masy. Aby jednak ocenić aktywność enzymatyczną i metaboliczną, właściwsze będzie oznaczanie zawartości białka lub azotu w danej zawiesinie bakterii. Bardzo często wybór metody jest podyktowany głównie szybkością wykonania i prostotą. Dlatego metody pośrednie, chociaż wymagają kalibracji, są chętniej stosowane niż bezpośrednie.

245

Metody bezpośrednie. 1) Oznaczanie mokrej masy po odwirowaniu. Po wysuszeniu odwirowanych komórek do stałej wagi można też określić suchą masę. Obie te procedury są obciążone poważnymi błędami systematycznymi. 2) Dokładniej można oznaczyć zawartość całkowitego azotu (mikrometodą Kjeldahla z mikrodyfuzją amoniaku) oraz zawartość węgla (wg Van Slyke-Folcha). 3) W oznaczeniach rutynowych z powodzeniem stosuje się ilościowe oznaczenie bakteryjnych białek. Szczególnie wygodne są reakcje oparte na pomiarach kolorymetrycznych, jak np. reakcja biuretowa i inne. Mikrometody oparte są na oznaczeniach reprezentatywnych składników białek, takich jak tyrozyna czy tryptofan w metodzie Lowry'ego lub Folina-Ciocalteu. Metody pośrednie. 1) Metody, które są oparte na pomiarze zmętnienia zawiesiny bakterii są bardzo dogodne do oznaczania masy bakterii. Zazwyczaj stopień zmętnienia zawiesiny bakteryjnej przedstawia się w postaci ekstynkcji (turbidometria), chociaż dla pewnych celów właściwszy bywa pomiar światła rozpraszanego (nefelometria). Zachowanie liniowości między tymi pomiarami a masą bakterii pozostaje tylko w wąskim zakresie gęstości komórek. Ponieważ rozpraszanie światła przez komórki zależy od ich wielkości, średnicy, kształtu, współczynnika refrakcji światła, a także składu i turgoru komórki, konieczne jest przeprowadzenie w każdych warunkach kalibracji pomiarów optycznych w stosunku do bardziej bezpośrednich parametrów (np. sucha masa, zawartość azotu lub węgla). 2) Właściwą miarą masy bakteryjnej mogą też być pewne funkcje fizjologiczne, które są bezpośrednio związane ze wzrostem zużycia tlenu, wytwarzaniem CO2, lub kwasu. Takie oznaczenia są użyteczne w tych przypadkach, w których inne metody zawodzą, np. kiedy mamy do czynienia z bardzo małą gęstością komórek. Pomiary aktywności metabolicznej można przeprowadzać z zastosowaniem różnych metod miareczkowych, manometrycznych, elektrochemicznych itd. Dla właściwej, a nie tylko względnej oceny masy bakterii, pomiary dokonywane tymi metodami również muszą być skorelowane z pomiarami bezpośrednimi (np. z wartością suchej masy).

6. 5. 2. Wzrost logarytmiczny i czas generacji Bakterie namnażają się przez podział, w wyniku którego powstają dwie komórki potomne. Dlatego też ich rozmnażanie odbywa się w postępie geometrycznym 2°-> 21 ->2 2 ->2 3 ... 2". Liczba komórek zwiększa się w każdym przedziale czasowym pewną ilość razy określoną przez stały czynnik. Ten typ wzrostu nazywamy wzrostem logarytmicznym *. Jeżeli przyjmiemy, że w jednostce objętości bakteryjnej hodowli okresowej * Z matematycznego punktu widzenia słuszniejsza jest nazwa stosowana w literaturze niemieckiej i anglosaskiej — wzrost wykładniczy, jednak w literaturze polskiej częściej używamy pojęcia „wzrost logarytmiczny", co podkreśla fakt, że w tej fazie wzrostu logarytm liczby bakterii jest proporcjonalny do czasu hodowli. Oba pojęcia są jednak równoważne (przyp. tłum. ).

246

znajduje się No komórek, możemy obliczyć, że po n podziałach będzie n tam Ν komórek, co będzie równe No · 2 . Po zlogarytmowaniu otrzymujemy log Ν = logN0 + nlog 2, a w przeliczeniu na liczbę podziałów:

Można też podać liczbę podziałów w ciągu godziny, co określa pojęcie szybkości podziałów (v):

Okres, w którym zachodzi jeden podział, nazywamy czasem generacji (g)

Tak więc, jeśli w jakiejś hodowli liczba bakterii w ciągu 10 godzin zwiększy się z 103 do 109 w jednostce objętości, to jej szybkość podziałów będzie równa

a wobec tego czas generacji będzie równy pół godziny. Wykreślenie funkcji zależności liczby komórek (na osi rzędnych) w stosunku do czasu (na osi odciętych) z zachowaniem na obu osiach skali arytmetycznej, daje w rezultacie krzywą o charakterze wykładniczym (ryc. 6. 8). Takie arytmetyczne przedstawienie krzywej wzrostu jest jednak niewygodne przy dużej liczbie podziałów, ponieważ tylko wczesne lub tylko późne podziały będą do odczytania (w zależności od wyboru zakresu). Z tego względu często stosuje się wykresy w skali półlogarytmicznej (ryc. 6. 8), to znaczy skala logarytmiczna dotyczy tylko jednej osi, osi rzędnych, na której przedstawiane są stężenia komórek. Taki sposób przedstawiania zapewnia, że wykładniczy wzrost bakterii jest uwidoczniony w postaci prostej linii, której nachylenie odpowiada szybkości podziałów — im większe nachylenie, tym większa szybkość podziałów. Ponieważ wzrost wykładniczy charakteryzuje się liniową

247

zależnością między czasem a logarytmem liczby komórek (lub masy), nazywa się go często wzrostem logarytmicznym. W badaniach kinetyki wzrostu bakterii nie rozpatruje się indywidualnych komórek, lecz cała rosnąca populacja jest traktowana jako autokatalitycznie namnażający się system. Obliczenia opiera się na masie bakterii (x) lub na wartościach ściśle do niej proporcjonalnych (np. ekstynkcja w określonych warunkach). Szybkość zmian wartości χ w każdym dowolnym przedziale czasu jest proporcjonalna do początkowej wartości x, a zatem podlega zasadom kinetyki reakcji pierwszego rzędu. Tak więc dla wzrostu logarytmicznego

gdzie μ jest swoistą szybkością wzrostu. Po scałkowaniu

a przy podwajaniu wartości χ

a zatem

248

stąd

Z tego widać, że swoista szybkości wzrostu jest odwrotnie proporcjonalna do czasu generacji lub czasu podwojenia, a więc szybkość podziałów będzie wyrażona równaniem

Oba parametry μ i ν są funkcją tego samego procesu, tzn. logarytmicznego (wykładniczego) wzrostu populacji bakterii

6. 5. 3. Wzrost bakterii w hodowlach okresowych Bakterie wprowadzone do płynnej pożywki, a następnie inkubowane w odpowiednich warunkach będą się dzieliły do momentu, gdy którykolwiek z niezbędnych składników zostanie wyczerpany i stanie się czynnikiem limitującym dalszy wzrost. Jeżeli w ciągu tego czasu nie będą dodawane żadne składniki odżywcze ani nie będą usuwane szkodliwe produkty metabolizmu, powstaje układ zamknięty, w którym wzrost mikroorganizmów nazywa się hodowlą okresową (lub statyczną) i podlega on takim samym prawom jak wzrost organizmu wielokomórkowego.

249

Hodowla okresowa zachowuje się jak wielokomórkowy organizm z genetycznie uwarunkowanymi ograniczeniami wzrostu. Wzrost hodowli bakteryjnej można zobrazować graficznie, przedstawiając wykres zależności logarytmu liczby komórek lub tylko liczby żywych komórek od czasu. Tego rodzaju typowa krzywa wzrostu (ryc. 6. 9) ma kształt sigmoidalny i dzieli się na pewną liczbę faz wzrostu zawsze możliwych do zidentyfikowania, choć niekiedy słabiej lub silniej wyrażonych, lub różniących się nieco czasem trwania. Są to: faza zastoju (lag faza), faza logarytmiczna lub wykładnicza, faza stacjonarna i faza zamierania. Wzrost na podłożach stałych przebiega zasadniczo w ten sam sposób, lecz osiągane są znacznie większe zagęszczenia komórek. Faza zastoju. Faza ta obejmuje okres od momentu zaszczepienia do momentu ustalenia maksymalnej szybkości podziałów. Czas trwania fazy zastoju zależy od „historii" hodowli użytej jako inokulum, jej wieku oraz składu i stopnia dopasowania nowej pożywki. Jeżeli inokulum pochodzi ze starej hodowli, np. z fazy stacjonarnej, komórki będą zmuszone do syntetyzowania RNA, rybosomów, enzymów i innych związków w celu zaadaptowania się do nowych warunków wzrostu. Jeżeli źródła węgla i energii w nowym podłożu różnią się od tych, które były w poprzednim, adaptacja do nowych warunków często jest związana z syntezą innych

250

enzymów, które nie były wymagane do wzrostu poprzedniej hodowli i dlatego nie były produkowane. Synteza tych enzymów jest indukowana obecnością nowych substratów. Dobrym przykładem takiego działania substratu na syntezę enzymów jest zjawisko zwane diauksją (ryc. 6. 10). Dwufazowy wzrost lub podwójny cykl wzrostu można obserwować w podłożach zawierających mieszaninę substratów. Na przykład Escherichia coli z mieszaniny sorbitolu i glukozy w pierwszym rzędzie zużywa tylko glukozę. Glukoza indukuje syntezę enzymów niezbędnych do jej wykorzystania i w tym samym czasie represjonuje syntezę enzymów, które są niezbędne do zużywania sorbitolu. Enzymy te zaczną być wytwarzane dopiero wtedy, gdy cała glukoza zostanie zmetabolizowana. Tak więc dwie fazy zastoju obserwowane w takiej hodowli będą właśnie wynikiem opisanego mechanizmu regulacyjnego. Zmiany w ilościowym składzie bakterii zachodzące podczas fazy zastoju są najlepiej widoczne na przykładzie RNA. Zawartość RNA zwiększa się 8-12 razy. Zmiana ta wskazuje na udział RNA i rybosomów w syntezie białek enzymatycznych. Faza logarytmiczna. Faza logarytmiczna (inaczej wykładnicza) charakteryzuje się stałym minimalnym czasem generacji. Czas generacji w tej fazie jest wielkością swoistą dla danego gatunku bakterii i warunków hodowli. Enterobacteriaceae dzielą się co 15-30 minut, Escherichia coli w 37°C — co 20 minut. Dla innych bakterii czas generacji może być dłuższy, np. dla wielu bakterii glebowych wynosi on 60-150 minut, zaś Nitrosomonas i Nitrobacter mają czas podwojenia około 5-10 godzin. U wielu bakterii wielkość komórki i zawartość białek podczas fazy logarytmicznej jest stała. O takiej hodowli mówi się, że zawiera ona „komórki standardowe". Kiedy zostanie to stwierdzone, a liczba komórek, sucha masa i białko rosną z tą samą szybkością, każdy z tych parametrów może być miarą szybkości wzrostu. Jednakże bardzo często komórki w hodowlach okresowych podlegają zmianom rozmiaru i/lub składu nawet podczas logarytmicznej fazy wzrostu, ponieważ podłoże także podlega ciągłym zmianom. Zmniejsza się stężenie substratu, rośnie zaś stężenie komórek i następuje gromadzenie końcowych produktów metabolizmu. Mimo wszystko podczas fazy logarytmicznej czas generacji pozostaje stosunkowo niezmienny i jest to faza najodpowiedniejsza do prowadzenia pomiarów szybkości wzrostu. Badanie wpływu czynników 251

środowiskowych (pH, temperatura, potencjał redoks, nawietrzanie), jak też wykorzystywanie różnych substratów przeprowadza się na podstawie pomiaru liczby komórek lub zmętnienia (ekstynkcja) podczas fazy wzrostu logarytmicznego. Faza stacjonarna. Faza ta rozpoczyna się w momencie, gdy komórki nie mogą się już reprodukować. Ponieważ szybkość wzrostu zależy, obok innych czynników, także od stężenia substratu, które maleje podczas hodowli, szybkość wzrostu hodowli zaczyna się zmniejszać nawet przed całkowitym wyczerpaniem substratu. Dlatego przejście od fazy logarytmicznej do stacjonarnej jest zazwyczaj stopniowe. Poza ograniczeniem ilości substratu, także inne czynniki, takie jak duża gęstość populacji, niskie ciśnienie parcjalne tlenu czy nagromadzenie toksycznych produktów metabolizmu, mogą prowadzić do spowolnienia szybkości wzrostu i zainicjowania fazy stacjonarnej. Podczas fazy stacjonarnej mogą być zużywane materiały zapasowe, ulega degradacji część rybosomów, ale enzymy są nadal syntetyzowane. Te różnorodne procesy zależą od natury czynnika ograniczającego wzrost. Tylko bardzo wrażliwe komórki zamierają natychmiast. Na ogół, jeśli energia niezbędna do podtrzymywania procesów komórkowych jest dostarczana dzięki wykorzystywaniu materiałów zapasowych lub białek, bakterie mogą pozostawać żywe przez stosunkowo długi okres. W wielu produkcyjnych procesach mikrobiologicznych nastawionych na wytwarzanie wtórnych metabolitów (np. produkcja penicyliny) faza stacjonarna jest główną fazą produkcyjną. Dlatego w biotechnologii rozróżnia się trofofazę, czyli fazę wzrostu, i idiofazę — fazę produkcji. Mimo że w idiofazie komórki już nie rosną, potrafią one wykorzystywać podawany substrat i włączać związki prekursorowe do produktu końcowego. Masa bakteryjna wytworzona w chwili osiągnięcia fazy stacjonarnej nazywa się wydajnością, plonem lub uzyskiem i zależy od rodzaju składników odżywczych pożywki oraz warunków hodowli. Faza zamierania. Faza zamierania i przyczyny śmierci bakterii w normalnym podłożu nie były badane zbyt intensywnie. Nieco bardziej oczywista jest sytuacja, kiedy w hodowli akumulowany jest kwas (Escherichia, Lactobacillus). Liczba żywych komórek może się zmniejszać w sposób wykładniczy. W niektórych przypadkach zachodzi liza komórek (autoliza) wskutek wydzielania enzymów komórkowych.

252

6. 5. 4. Parametry krzywej wzrostu Jeżeli wzrost hodowli okresowej jest badany za pomocą pomiarów suchej masy, warto ustalić trzy następujące parametry charakteryzujące ten wzrost: wydajność, szybkość wzrostu i czas trwania fazy zastoju (ryc. 6. 11). Wydajność. Wydajność jest różnicą między początkową a maksymalną masą bakteryjną: X = Xmax — Xo. Wartość ta jest wyrażana w gramach suchej masy. Szczególne znaczenie ma zależność między wydajnością a zużyciem substratu (X/S). Kiedy obie te wartości są wyrażane w jednostkach wagowych, ich stosunek nazywa się współczynnikiem wydajności lub wydajnością wzrostu i oznacza — Υ (ang. yield = wydajność). Często wydajność jest odnoszona także do stężenia substratu i wyrażana jest jako molarny współczynnik wydajności Ym (gramy komórek/mol substratu). Molarny współczynnik wydajności umożliwia też obliczenie ilości ATP otrzymywanego z danego źródła energii (substratu). Prowadzi to do określenia pojęcia energetycznego współczynnika wydajności (g komó-

253

rek/mol ATP), który można obliczyć znając drogę kataboliczną danego substratu i wynikający z niej zysk energetyczny. Dla beztlenowych hodowli Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae, których wzrost był limitowany dawkowaniem glukozy, energetyczne współczynniki wydajności Y ATP wynoszą odpowiednio 12, 4 g i 14 g masy komórkowej na mol ATP. W przypadku beztlenowych bakterii, które wytwarzają energię w drodze fermentacji, Y ATP jest przeważnie wielkością stałą. Znacznie wyższe wartości YATP dla jakiejś nieznanej bakterii sugerują istnienie dodatkowej energiotwórczej drogi metabolicznej. Wartości Y ATP były także wyznaczane dla bakterii hodowanych w warunkach tlenowych. Zależą one od warunków hodowli i rodzaju procesów syntetycznych, jakie muszą przeprowadzić, np. w zależności od tego, czy źródłem azotu do tych syntez będą jony amonowe, azotanowe czy azot cząsteczkowy. Wykładnicza szybkość wzrostu. Wykładnicza szybkość wzrostu jest miarą szybkości wzrostu komórek w fazie logarytmicznej. Oblicza się ją z gęstości bakterii x0 i xt odpowiednio w czasie t0 i czasie t, zgodnie z równaniem

gdzie log e = 0, 43429, a czas podwojenia wynosi

Faza zastoju (lag-faza). Faza zastoju, podobnie jak faza logarytmiczna, jest ważnym parametrem do oceny właściwości organizmu i optymalizacji podłoża. Czas trwania fazy zastoju T1 jest czasem obliczonym z różnicy między punktem czasowym tr, w którym hodowla osiąga pewną gęstość xr, a czasem tt, po którym hodowla osiągnęłaby tę samą gęstość, gdyby rosła wykładniczo od razu — od momentu zaszczepienia.

(znaczenie indeksów: l = lag-faza; r = wzrost rzeczywisty: i = wzrost idealny)

254

Ponieważ parametr T1 jest brany pod uwagę tylko wówczas, gdy porównuje się dwie hodowle o tej samej szybkości wzrostu logarytmicznego, długość fazy zastoju nie jest zwykle mierzona czasem absolutnym, lecz czasem fizjologicznym (czasem generacji g). Różnica między wzrostem obserwowanym — rzeczywistym a wzrostem idealnym może być wyrażona wielokrotnością czasów generacji i wynosi L=Tlv. Dlatego też wartość L określa, o ile czasów generacji hodowla rzeczywista jest opóźniona w stosunku do hodowli idealnej, która w całym swoim przebiegu rosłaby z szybkością wykładniczą. Wartości L służą do porównywania danych dotyczących wpływu na wzrost różnych składników odżywczych, inhibitorów i warunków środowiskowych.

6. 5. 5. Wzrost bakterii w hodowlach ciągłych W hodowli okresowej warunki hodowli podlegają ciągłej zmianie — gęstość bakterii wzrasta, a stężenie substratu maleje. Jednakże dla wielu badań fizjologicznych byłoby pożądane utrzymanie przez dłuższy czas takich warunków, w których utrzymywałoby się stałe stężenie substratu i innych parametrów hodowli, a komórki byłyby stale w fazie logarytmicznej. Pewnym przybliżeniem takiej sytuacji jest częste przenoszenie populacji komórek do świeżego podłoża. Jednakże cel ten można osiągnąć

255

prościej i pełniej przez ciągle dodawanie nowego podłoża do rosnącej populacji, z jednoczesnym odprowadzaniem tej samej objętości hodowli. Zasada ta leży u podstaw metody hodowli ciągłej prowadzonej w chemostacie lub turbidostacie. Hodowla w chemostacie. Chemostat (ryc. 6. 12) składa się z naczynia hodowlanego i zbiornika, który dostarcza świeże podłoże ze stałą szybkością. W celu osiągnięcia optymalnego zaopatrzenia w tlen i równomiernego rozprowadzania substancji odżywczych w naczyniu hodowlanym stosuje się wymuszone nawietrzanie i mechaniczne mieszanie hodowli bakteryjnej. Nowa pożywka jest ciągle, ze stałą szybkością dodawana do naczynia hodowlanego i z tą samą szybkością hodowla bakterii jest odprowadzana. Jeżeli objętość naczynia hodowlanego wynosi V litrów, a pożywka jest uzupełniana z szybkością f (1/godz. ), to szybkość rozcieńczania wynosi D = f/V, a więc D oznacza zmianę objętości na godzinę. Jeżeli bakterie początkowo obecne w naczyniu hodowlanym w ilości χ g/l okazałyby się niezdolne do wzrostu, byłyby one wymywane z naczynia hodowlanego z pewną szybkością wymywania:

Gęstość bakterii w hodowli zmniejszałaby się więc wykładniczo wg Dt wzoru χ = xoe . Wzrost bakterii w naczyniu jest także wykładniczy, a szybkość przyrostu określa zależność μx — dx/dt, tak że gęstość bakterii rośnie wykładniczo wg wzoru x=x0eμt. Szybkość zmian gęstości bakterii w hodowli jest więc wypadkową obu wyżej wspomnianych szybkości, tzn. dx/dt = μx —Dx. Jeżeli szybkość wzrostu μ i szybkość rozcieńcznia D są sobie równe, to ubytki wynikające z odprowadzania i przyrosty w wyniku wzrostu pozostaną w równowadze. Wówczas zmiany biomasy wyniosą zero, a gęstość bakterii χ pozostanie stała. W takiej sytuacji mówi się, że hodowla jest w stanie „równowagi", tzn. że wykładniczy przyrost masy komórek jest kompensowany innym procesem wykładniczym o przeciwnym znaku. Hodowla w chemostacie jest kontrolowana za pomocą stężenia substratu, tzn. stabilność układu opiera się na regulowaniu szybkości

256

wzrostu za pomocą określonego substratu (takiego jak donor wodoru lub źródło azotu, siarki czy fosforu). Jeżeli limitowanie substratu będzie zastosowane do utrzymania swoistej szybkości wzrostu na poziomie niższym niż maksymalna szybkość wzrostu μmax (możliwa dla tego substratu), to szybkość rozcieńczania D może się wahać w szerokim zakresie bez ryzyka usunięcia wszystkich bakterii, oczywiście pod warunkiem, że szybkość rozcieńczania nie przekroczy μ max . Zależność swoistej szybkości wzrostu μ od stężenia substratu cs przebiega zgodnie z krzywą nasycenia (ryc. 6. 13). Na ogół bakterie mogą rosnąć z maksymalną szybkością przy małym stężeniu substratu (np. 10 mg glukozy na litr pożywki): μ staje się proporcjonalne do stężenia substratu tylko przy bardzo małych wartościach stężenia. Ks jest stężeniem substratu, w którym μ osiąga połowę wartości maksymalnej (μ = 1/2 μ m a x ). Ks jest obok Υ (plon, wydajność) i μ m a x jednym z podstawowych parametrów wzrostu hodowli chemostatowych.

Na rycinie 6. 14 przedstawiono przebieg zmian gęstości bakterii, stężenia substratu, czasu podwojenia i plonu bakterii w zależności od szybkości rozcieńczania D. Kiedy szybkość rozcieńczania D zawiera się między zero a szybkością Dc, przy której następuje wypłukiwanie komórek, obserwujemy tylko minimalne różnice w gęstości bakterii. W tym zakresie bakterie reagują na zwiększanie szybkości rozcieńczania skracaniem czasu generacji (czyli zwiększaniem szybkości wzrostu). Zwiększanie szybkości rozcieńczania, podobnie jak zwiększanie szybkości dopływu pożywki wraz ze skracaniem czasu generacji, powoduje zwiększoną

257

produkcję bakterii. W momencie osiągnięcia Dm dochodzi ona do maksimum, a po przekroczeniu Dm — spada. Stężenie substratu w naczyniu hodowlanym, a stąd i w wycieku, jest bliskie zeru dla szerokiego zakresu szybkości rozcieńczania. Tylko wówczas, gdy szybkość rozcieńczania jest taka, że wywołuje maksymalną szybkość wzrostu, pewna ilość substratu pojawia się w wycieku, to znaczy ulega on wypłukiwaniu. Wraz z dalszym wzrostem szybkości rozcieńczania, stężenie substratu w wycieku staje się w końcu równe jego stężeniu w pożywce dopływającej. Utrzymanie stanu równowagi w chemostacie opiera się na kontrolowaniu swoistej szybkości wzrostu za pomocą stężenia substratu. Swoista szybkość wzrostu μ jest utrzymywana na niskim poziomie. Chemostat jest wówczas samoregulującym się systemem. Pozostaje tylko utrzymanie szybkości dopływu przez dłuższy okres na stałym poziomie. Wzrost w turbidostacie. Hodowle ciągłe w turbidostacie należy odróżniać od hodowli w chemostacie. Jak sugeruje nazwa, hodowla ta jest oparta na

258

utrzymaniu stałej gęstości bakterii, czyli stałego zmętnienia. Gęstość hodowli reguluje dopływ pożywki za pomocą zaworu. Naczynie hodowlane zawiera wszystkie składniki odżywcze w nadmiarze, a bakterie rosną z prawie maksymalną szybkością. Prowadzenie hodowli w turbidostacie jest technicznie bardziej skomplikowane i wymagające niż w przypadku chemostatu. Fundamentalne różnice. Istnieją zasadnicze różnice między wzrostem w klasycznej hodowli okresowej i wzrostem hodowli ciągłej w chemostacie. Różnice te należy jeszcze raz podkreślić: Hodowla okresowa musi być rozpatrywana jak układ zamknięty, w tym sensie jak organizm wielokomórkowy, którego rozwój składa się z fazy zastoju, fazy wzrostu logarytmicznego, fazy stacjonarnej i fazy zamierania (jak młodość, dojrzałość, starość i śmierć). Warunki takiej hodowli są inne w każdym momencie, a więc zastosowanie w niej automatyzacji jest prawie niemożliwe. Hodowla ciągła reprezentuje układ otwarty, który osiągnął stan równowagi. Czynnik czasu został w mniejszym lub większym stopniu wyeliminowany, a warunki środowiska dla hodowanych organizmów są stałe. System taki może być łatwo zautomatyzowany.

6. 5. 6. Synchronizacja podziałów komórkowych Do uzyskania populacji komórek dzielących się w tym samym momencie, czyli synchronicznie, konieczne jest przeprowadzenie badań zależności między procesami metabolicznymi a cyklem podziałowym. Fazową zgodność różnorodnych procesów w różnych komórkach można osiągnąć przez synchronizację hodowli. Można do tego doprowadzić kilkoma sposobami, np. przez zmianę temperatury, stymulację światłem, ograniczenie składników odżywczych lub wyselekcjonowanie komórek o jednakowych rozmiarach za pomocą filtrowania. Populacja komórek potraktowana jedną z powyższych technik będzie się dzieliła jednocześnie przez kilka podziałów, aby następnie powrócić do podziałów asynchronicznych, tak że sposób zwiększania liczby komórek zmieni się ze skokowego na ciągły.

259

6. 6. Zahamowanie wzrostu i zamieranie Istnieje spora liczba związków chemicznych spowalniających wzrost mikroorganizmów lub nawet powodujących całkowite jego zahamowanie. Jeżeli wzrost zostaje wstrzymany w obecności danej substancji, a następnie może być przywrócony z chwilą jej usunięcia, substancję taką nazywamy czynnikiem bakteriostatycznym, a cały efekt — działaniem bakteriostatycznym. Czynniki bakteriobójcze są to czynniki, które powodują śmierć komórek. Oba efekty są zależne od stężenia. Warto jednak zauważyć, że wśród bakterii są takie typy mikroorganizmów, które mogą tolerować związki ogólnie uznane za trucizny metaboliczne (H2S, CO, fenol itd. ), a nawet mogą wykorzystywać je jako źródła energii. Zakres i mechanizm działania większości czynników antybakteryjnych został już stosunkowo nieźle poznany. Uszkodzenie osłon komórkowych i innych struktur. Alkohol etylowy o dużym stężeniu (70%) powoduje koagulację białek i działa bakteriobójczo. Fenole, krezole, mydła neutralne i związki powierzchniowo czynne (detergenty) atakują osłony komórkowe i niszczą półprzepuszczalne właściwości błony cytoplazmatycznej. Błony biologiczne składają się głównie z lipidów i białek. Detergenty mają strukturę polarną i składają się z grup lipofilowych (długołańcuchowe lub aromatyczne węglowodory) oraz z grup hydrofilowych o charakterze jonowym. Gromadzą się one w błonach lipoproteinowych, które mają podobną polarną budowę, i zakłócają ich funkcjonowanie. Dzięki szerokiemu spektrum antybakteryjnego działania detergenty są używane powszechnie do dezynfekcji powierzchni, ubrań itp. Niektóre antybiotyki polipeptydowe (połimyksyna, kolistyna, bacytracyna, subtylina) i pewne czynniki bakteriobójcze pochodzenia roślinnego w sposobie działania przypominają detergenty. Uszkodzenia enzymów i ważnych procesów metabolicznych. Niektóre metale ciężkie (między innymi miedź, srebro, rtęć) nawet w bardzo małych stężeniach działają na enzymy silnie „zatruwająco" (działanie oligodynamiczne). W formie soli (HgCl2, CuCl, AgNO3) i związków organicznych (np. 4-hydroksybenzoesan rtęci) wiążą się one z grupami —SH enzymów i powodują zmiany w trzecio- i czwartorzędowej strukturze tych białek. Funkcjonalna grupa sulfhydrylowa koenzymu A może być zablokowana w ten właśnie sposób. Cyjanek jako trucizna oddechowa

260

wiąże się z organicznymi połączeniami żelaza i blokuje funkcje końcowego enzymu łańcucha oddychania tlenowego, to znaczy oksydazy cytochromowej. Tlenek węgla hamuje oddychanie poprzez konkurencję z tlenem cząsteczkowym na etapie oksydazy cytochromowej i działa jako inhibitor kompetycyjny. Antymycyna A hamuje transport elektronów w łańcuchu oddechowym blokując reduktazę cytochromu c. 2, 4-dinitrofenol powoduje rozprzęganie fosforylacji oksydatywnej w mitochondriach, a arsenian działa podobnie przy fosforylacji substratuwej. Fluorooctan blokuje cykl kwasów trikarboksylowych, ponieważ podobnie jak octan jest on najpierw aktywowany i przekształcany we fluorocytrynian (synteza letalna), który blokuje enzym akonitazę, uniemożliwiając dalszy metabolizm cytrynianu. Hamowanie kompetycyjne. Zahamowanie przemiany bursztynianu do fumaranu powodowane przez malonian może być uważane za modelowy przykład hamowania kompetycyjnego. Efekt ten jest wysoce swoisty i zachodzi nawet w małych stężeniach malonianu. Zwiększenie stężenia bursztynianu eliminuje częściowo lub całkowicie hamowanie dehydrogenazy bursztynianowej przez malonian. Inaczej przebiega hamowanie oddychania powodowane np. przez cyjanek, którego działanie nie zostaje zniesione przez zwiększenie stężenia substratu, powiedzmy parcjalnego ciśnienia tlenu. Uważa się, że przy hamowaniu dehydrogenazy bursztynianowej przez malonian, normalny substrat — bursztynian konkuruje o centrum aktywne enzymu ze swoim strukturalnym analogiem lub antymetabolitem — malonianem. Hamowanie kompetycyjne jest oparte na strukturalnym podobieństwie inhibitorów do normalnych składników komórki. Dlatego pobranie antymetabolitu do wnętrza komórki może

261

prowadzić do przeróżnych następstw, zwłaszcza w procesach biosyntetycznych (patrz niżej). Na przedstawionym wcześniej schemacie (s. 261) trzy metabolity: kwas bursztynowy, kwas para-aminobenzoesowy (PABA) i arginina są pokazane w parach z ich antymetabolitami — z kwasem malonowym, sulfanilamidem i kanawaniną. Zahamowanie syntezy składników komórkowych. Najlepiej poznanym przykładem zahamowania wzrostu wywołanego pobraniem strukturalnego analogu jednego ze składników komórkowych jest działanie pochodnych kwasu sulfanilowego. Przeciwbakteryjne działanie sulfonamidów zostało stwierdzone doświadczalnie przez Domagka, ale dopiero późniejsze badania wyjaśniły, że kluczem do zrozumienia mechanizmu tej reakcji jest strukturalne podobieństwo do PABA. Kwas para-aminobenzoesowy jest częścią koenzymu, mianowicie kwasu tetrahydrofoliowego. Większość bakterii potrafi go syntetyzować z prostych elementów. Kiedy jednak PABA lub sulfanilamid jest dodany do podłoża, zostaje on pobrany przez komórkę i włączony do kwasu foliowego; w przypadku sulfanilamidu rezultatem tej syntezy jest powstanie niefunkcjonalnego koenzymu, co ostatecznie prowadzi do zahamowania wzrostu. Takiemu wpływowi sulfanilamidu można przeciwdziałać zwiększając dawkę kwasu paraaminobenzoesowego, co świadczy o kompetycyjnym mechanizmie hamowania. U zwierząt kwas foliowy nie może być syntetyzowany ani de nονο, ani ze związków pośrednich i musi być dostarczony jako kompletny koenzym. Dlatego też sulfonamidy nie mogą być włączane do koenzymu i nie są szkodliwe. Selektywna toksyczność sulfonamidów i ich użyteczność jako czynników chemioterapeutycznych jest rezultatem wielkich syntetycznych zdolności bakterii i znacznie bardziej ograniczonych syntetycznych możliwości zwierząt. Zahamowanie dehydrogenazy bursztynianowej przez malonian i zahamowanie wzrostu przez pochodne kwasu sulfanilowego to przykłady antagonistycznych stosunków między normalnymi metabolitami komórki i związkami o podobnej strukturze. Ten antagonizm między metabolitem a antymetabolitem może działać na różnych poziomach. Antymetabolity mogą przeciwdziałać włączaniu prawidłowych metabolitów i w ten sposób hamują biosyntezę ważnych składników komórkowych albo też same mogą być włączane do złożonych związków wielkocząsteczkowych, w rezultacie czego dochodzi do utraty czy zmniejszenia aktywności enzymów lub kwasów nukleinowych. 262

Hamowanie syntezy białek przez antybiotyki. Synteza białek u organizmów prokariotycznych może być swoiście hamowana przez różne antybiotyki. Wpływają one najczęściej na funkcjonowanie rybosomów 70S. Streptomycyna i neomycyna hamują prawidłowe włączanie aminokwasów do łańcucha polipeptydowego. Erytromycyna hamuje funkcjonowanie podjednostki 50S. Tetracyklina hamuje wiązanie aminoacylo-tRNA z rybosomami. Chloramfenikol hamuje tworzenie wiązania peptydowego z udziałem peptydylotransferazy. Jest on stosowany w chemioterapii jako bardzo efektywny czynnik bakteriostatyczny, jak również jest nadzwyczaj użyteczny w badaniach biochemicznych jako wybiórczy inhibitor syntezy białek bez wpływania na inne metaboliczne aktywności. Naturalnie, wymienione wyżej antybiotyki mają podobny wpływ na rybosomy znajdujące się w mitochondriach i chloroplastach. Ponieważ jednak błony mitochondrialne są prawie całkowicie nieprzepuszczalne dla streptomycyny, antybiotyk ten nie ma takiego wpływu na organizmy eukariotyczne przy małych stężeniach, w których już działa na organizmy prokariotyczne. Podział organelli w organizmach eukariotycznych zostaje zahamowany dopiero w tysiąckrotnie większym stężeniu. Jeżeli streptomycyna o wysokim stężeniu zostanie użyta wobec rosnących organizmów eukariotycznych (drożdże, euglena, stożki wzrostu roślin wyższych), hamuje rozwój mitochondriów i chloroplastów, tak że komórki tkanki odznaczają się znacznie mniejszą zawartością tych organelli. Hamowanie syntezy kwasów nukleinowych przez antybiotyki. Synteza kwasów nukleinowych jest również hamowana przez sporą liczbę antybiotyków. Mitomycyna C selektywnie hamuje syntezę DNA bez naruszania syntezy RNA i białek. Przyjmuje się, iż działa ona w ten sposób, że wytwarza poprzeczne wiązania i pęknięcia nici w dwuniciowym DNA. Aktynomycyna D tworzy kompleks z dwuniciowym DNA reagując z guaniną, co blokuje syntezę wszystkich trzech typów RNA, ale nie wpływa na replikację DNA. Ryfampicyna działa na DNA-zależną polimerazę RNA, wskutek czego hamuje syntezę RNA. Zahamowanie syntezy ściany komórkowej. Hamowanie syntezy peptydoglikanu przez penicylinę, cefalosporynę i inne antybiotyki działające na ścianę było już omawiane w rozdziale 2. 2. 4.

263

Zamieranie i spadek liczby żywych komórek. Śmierć mikroorganizmów można zdefiniować jako nieodwracalną utratę zdolności do wzrostu i podziałów, co w praktyce wyraża się utratą możliwości tworzenia kolonii. Liczne uszkodzenia komórki prowadzące do śmierci mogą być jednak w pewnych warunkach naprawialne. Dobrze znane są reaktywacje po naświetleniu UV lub działaniu gorąca (rozdz. 15. 1. 4). Ilościowa ocena zamierania i spadku liczby żywych komórek u mikroorganizmów jest możliwa tylko w odniesieniu do populacji, a nie do indywidualnej komórki. W wielu przypadkach szybkość zmniejszania się liczby żywych komórek w dowolnym momencie jest proporcjonalna do liczby żywych komórek, a więc przebiega zgodnie z kinetyką reakcji pierwszego rzędu: Ν = Noe~kt (k = swoista szybkość zamierania). Prawo to stosuje się np. podczas sterylizacji metodą radiacyjną.

6. 6. 1. Metody sterylizacji Zabijanie mikroorganizmów, czyli nieodwracalnie pozbawiane ich zdolności do wzrostu, jest podstawową częścią metod mikrobiologicznych i konserwacji żywności, wymaga więc dokładnego omówienia. Sterylizacja albo wyjaławianie jest procesem polegającym na pozbawianiu dowolnego materiału wszystkich żywych organizmów oraz ich form przetrwalnych. Należy odróżniać sterylizację od częściowej sterylizacji (np. pasteryzacji) oraz konserwacji. Jeżeli sterylne podłoże lub takie, które ma być zaszczepione pewnym typem mikroorganizmów, zostanie zanieczyszczone innymi, nie dodanymi specjalnie drobnoustrojami, mówi się wówczas o zakażeniu lub kontaminacji. Takie pojęcia jak dezynfekcja (zabicie wszystkich patogennych mikroorganizmów), aseptyka, antyseptyka i infekcja są częściej używane w higienie niż w mikrobiologii. Mikroorganizmy różnią się wrażliwością na różne metody sterylizacji. Różnice te są związane z gatunkiem, lecz zależą także od zawartości wody, pH środowiska, wieku komórek, przetrwalników itp. Szybkość zamierania zależy więc od pewnej liczby czynników zarówno środowiskowych, jak i związanych z typem mikroorganizmu. Zamiast określenia szybkości zamierania stosuje się często określenie stopnia uśmiercenia danej populacji w danych warunkach, co wyraża się wartością D10, czyli czasem niezbędnym do zabicia 90% komórek, zwanym też czasem dziesięciokrotnej redukcji Z)10 (tab. 6. 5). Sterylizację lub częściową

264

sterylizację można przeprowadzić stosując „wilgotne gorąco", „suche gorąco", filtrację, promieniowanie lub metody chemiczne. „Wilgotne gorąco". Komórki wegetatywne większości bakterii i grzybów giną w temperaturze ok. 60°C w ciągu 5-10 minut, formy przetrwalne drożdży i grzybów dopiero powyżej 80°C, natomiast spory bakteryjne wymagają czasu ok. 15 minut w temperaturze 120°C. Czasy dziesięciokrotnej redukcji podane w tabeli 6. 5 pozwalają obliczyć niezbędny czas ekspozycji na wilgotne gorąco kilku wytwarzających spory, bardzo ciepłoopornych bakterii. Należy jednak pamiętać, że program sterylizacji zależy także od stopnia skażenia i że większa liczba termoopornych przetrwalników wymaga dłuższego czasu sterylizacji. Aby osiągnąć temperatury powyżej punktu wrzenia wody pod ciśnieniem atmosferycznym, musi być zastosowany autoklaw — pojemnik, który umożliwia ogrzewanie pod zwiększonym ciśnieniem.

Aktualna temperatura pary (wytwarzanej z wody) w autoklawie zależy od ciśnienia (ryc. 6. 15), ale temperatura przy danym ciśnieniu jest znacznie niższa, jeśli znajduje się w komorze jakakolwiek ilość powietrza. Ponieważ efektywność sterylizacji zależy od temperatury, a nie od ciśnienia, należy zapewnić usunięcie powietrza ze sterylizatora. Dokonuje się tego przez otwarcie zaworu podczas początkowego ogrzewania, tak aby usunąć powietrze wraz ze strumieniem pary, lub za pomocą pompy próżniowej. Siedzenie temperatury w autoklawie byłoby właściwsze niż śledzenie ciśnienia, lecz dzięki prostocie i ze względów bezpieczeństwa

265

bardziej popularne jest rejestrowanie ciśnienia. Niezbędny czas procesu sterylizacji zależy także od wielkości aparatu (pojemności cieplnej) i naczyń, które mają być sterylizowane (odpowiednie dane przytoczono w tab. 6. 6)

Podobny efekt można uzyskać stosując sterylizację etapową, czyli tyndalizację. Polega ona na ogrzewaniu podłoży i roztworów przez trzy kolejne dni w temperaturze 100°C przez 30 minut i pozostawianie ich w temperaturze pokojowej w okresach pomiędzy ogrzewaniami, tak aby mogło nastąpić kiełkowanie przetrwalników, a powstałe w ten sposób formy wegetatywne mogły być uśmiercone przy kolejnym podniesieniu temperatury do 100°C.

266

Do wielu celów może być wystarczające zniszczenie tylko wegetatywnych form mikroorganizmów (częściowa sterylizacja). Takim przykładem jest proces pasteryzacji, ogrzewanie w temperaturze 75-80°C przez 5-10 minut. Na przykład mleko jest zazwyczaj pasteryzowane i to nawet przez krótszy czas, aby nie zanikły jego wartości smakowe. Do pasteryzacji mleka stosuje się najczęściej dwie metody: krótkoczasową (20 s, 71, 5-74°C) i wysokotemperaturową (2-5 s, 85-87°C). Sterylizację mleka przeprowadza się metodą zwaną UHT (ultra high temperature). W metodzie tej przegrzana para jest wtryskiwana do mleka, wytwarzając temperaturę 135-15O°C, w której mleko pozostaje przez 1-2 s, a następnie jest rozpylane przez specjalną dyszę z jednoczesnym chłodzeniem, podczas którego zostaje usunięta woda wprowadzona przy wstrzyknięciu pary. Częściowa sterylizacja zachodzi również podczas konserwacji jagód i owoców pestkowych. Ogrzewanie słoja przeznaczonego do wekowania przez 20 min w temperaturze 80°C zabija wszystkie komórki wegetatywne i spory grzybów, chociaż przetrwalniki bakterii pozostają żywe. Jednakże niskie pH związane z kwasowością pewnych owoców hamuje ich kiełkowanie. Zakonserwowane owoce często utrzymują się przez lata mimo obecności bakteryjnych przetrwalników. Właściwie nie ma takich przetrwalników bakterii, które mogłyby kiełkować w pH poniżej 4, 5. Owoce i warzywa o mniejszej kwasowości (fasola, groszek, marchew, grzyby) także mogą być konserwowane przez pasteryzację, jeśli doda się do nich 1 czy 2 łyżki octu w celu zapewnienia wystarczająco niskiego pH. Truskawkowa pleśń Byssochlamys nivea często jest spotykana w pasteryzowanych truskawkach. Askospory tego grzyba wytrzymują temperaturę do 86°C. W tej temperaturze ich wskaźnik D10 wynosi 14 minut. „Suche gorąco". Zniszczenie bakteryjnych spor przez zastosowanie suchego gorąca wymaga wyższych temperatur i dłuższego czasu ekspozycji niż sterylizacja wilgotnym gorącem (tab. 6. 7). Przedmioty i produkty, które są stosunkowo niewrażliwe na wysokie temperatury, jak szklane naczynia, proszki, oleje itp., mogą być sterylizowane przez ogrzewanie w ciągu 2 godz. w temperaturze 160°C w suchym sterylizatorze lub w suszarce. Dla materiałów o dużej pojemności cieplnej lub właściwościach termoizolacyjnych należy uwzględnić czas konieczny do osiągnięcia temperatury sterylizacji. Zaleca się, aby zawsze obecny był wskaźnik sterylizacji lub próba kontrolna zawierająca glebę z przetrwalnikami.

267

Ogrzewanie w 180°C przez 30 min może być stosowane tylko wówczas, gdy sterylizowane materiały są odporne na tę temperaturę. Doświadczenie wykazuje, że w takich warunkach wszystkie przetrwalniki zostają zabite. Letalne działanie ciepła polega na koagulacji białek komórkowych. Filtrowanie. Roztwory zawierające związki wrażliwe na temperaturę (witaminy, niektóre aminokwasy, cukry i inne substraty) najwygodniej jest sterylizować przez filtrowanie. Do tego celu już w laboratorium Pasteura była używana nieglazurowana porcelana (świece Chamberlanda). Obecnie w wielu laboratoriach i do sterylizacji wody używa się filtrów z prasowanej ziemi okrzemkowej. Oprócz tego stosuje się też filtry ze spiekanego szkła i filtry membranowe. Filtry membranowe z nitrocelulozy i innych materiałów są wytwarzane o różnej średnicy porów, a więc za ich pomocą mogą być oddzielane mikroorganizmy o różnej wielkości i kształcie. Możliwość przyłączenia jednokierunkowych filtrów membranowych do strzykawki zapewnia szybką rutynową sterylizację roztworów, które nie przetrzymałyby sterylizacji cieplnej. Cząstki wirusowe mają, niestety, zdolność przechodzenia przez filtry membranowe. Należy zwrócić uwagę, że cukry takie jak glukoza i fruktoza w czasie autoklawowania czy nawet gotowania mogą ulegać hydrolizie i innym przekształceniom. Glukoza ma najwyższą stabilność w zakresie pH 3-5, w którym może być autoklawowana w wodnych roztworach. Jednakże w pH8 podczas 30-minutowego gotowania 40% glukozy przekształca się we fruktozę. Sole metali (Fe, Mn, Mo, itp. ) przyspieszają tę przemianę. Ponieważ fruktoza w tych warunkach jest następnie przekształcana w kwasy huminowe, pożywka poddana takim zabiegom brązowieje lub czernieje. Naświetlanie. Spośród wielu różnych rodzajów promieniowania (UV, promienie X i gamma) stosowanych niekiedy do całkowitej lub częściowej sterylizacji, największe zastosowanie w laboratorium ma promieniowanie ultrafioletowe (UV). Większość lamp UV wytwarza promieniowanie w zakresie długości fal ok. 260 nm wybiórczo absorbowane przez kwasy nukleinowe, skutkiem czego jest letalne działanie na bakterie poddane dłuższej ekspozycji (rozdz. 15. 1. 4 i ryc. 14. 3). Promieniowanie UV stosuje się do częściowej sterylizacji pomieszczeń, gdzie bakterie zabijane są szybko, lecz zarodniki grzybów, mniej wrażliwe na UV, giną znacznie wolniej.

268

Promieniowanie jonizujące. Promienie X, promieniowanie UV i promienie gamma (np. 60 Co) działają dzięki wytwarzaniu rodników hydroksylowych atakujących makrocząsteczki. Nawet bardzo małe dawki promieniowania okazują się wystarczające do zniszczenia komórek. Tłumaczy to fakt, że w większości komórek znajduje się tylko jedna kompletna kopia DNA, podczas gdy większość białek i polisacharydów występuje w wielu kopiach. Tak więc pojedynczy atak na cząsteczkę DNA prowadzi do śmierci komórki bez żadnych obserwowalnych zmian w innych cząsteczkach. Dlatego też promieniowanie jonizujące może mieć zastosowanie do sterylizacji żywności i innych stałych materiałów. Metody chemiczne. Stwierdzono, że sterylizacja za pomocą tlenku etylenu jest bardzo wygodna do sterylizacji żywności, lekarstw, instrumentów i aparatów. Tlenek etylenu zabija zarówno formy wegetatywne, jak i przetrwalniki, ale jest skuteczny tylko w obecności wody (co najmniej 5-15%). Jest on używany w mieszaninie z azotem lub dwutlenkiem węgla w postaci gazu zawierającego 2-50% tlenku etylenu.

Inny związek, β-propionolakton został wprowadzony do sterylizacji pożywek i termolabilnych materiałów. Jest on znacznie aktywniejszy niż tlenek etylenu, ale uważa się, że jest karcenogenny i wywołuje inne efekty uboczne. Jest on dodawany w końcowym stężeniu 0, 2% do pożywki, która jest następnie inkubowana 2 godz. w 37°C. Podczas przechowywania do następnego dnia propiolakton ulega całkowitej degradacji. Węglowodany pozostają nienaruszone. Napoje mogą być sterylizowane z użyciem dietylodiwęglanu (0, 003-0, 020%). Tradycyjne środki bakteriobójcze, takie jak woda bromowa (1%), sublimat, czyli HgCl2 (1% roztwór w alkoholu), azotan srebra (0, 5%) lub podchloryn wapnia stosuje się do zewnętrznej sterylizacji nasion, z których można wyhodować sterylne rośliny. Zabieg ten trwa 5-30 min, jednakże przed jego zastosowaniem należy doprowadzić powierzchnię nasion do pełnej zwilżalności. Można to osiągnąć przez ich wstępne przemywanie mydłem lub innymi środkami powierzchniowo czynnymi. 269

Aby umyć szklane naczynie i pozbawić je żywych mikroorganizmów, wystarczy zastosować odpowiedni detergent, np. SDS (sodowy dodecylosiarczan) rozpuszczony w gorącej wodzie, lub nawet zwykły domowy preparat do mycia naczyń. Resztki środków myjących muszą jednak być usunięte, w zależności od planowanego zastosowania szkła, przez wielokrotne płukanie w czystej, najlepiej destylowanej wodzie. 6. 6. 2. Procedury konserwujące Substancje organiczne ulegają biologicznej degradacji, jeśli nie zostaną zabezpieczone przed działalnością i namnażaniem się mikroorganizmów. Znane są liczne procedury służące do zabezpieczenia i zakonserwowania substancji pochodzenia organicznego. Do najważniejszych należą metody zabezpieczania żywności i środków spożywczych. Problemami tymi zajmuje się mikrobiologia żywności. Zepsucie żywności przeznaczonej do spożycia dla ludzi może następować nie tylko w wyniku degradacji prowadzonej przez mikroorganizmy, lecz także skażenia toksynami wytwarzanymi przez bakterie lub grzyby. Do najważniejszych „producentów" toksyn spotykanych w żywności należy Clostridium botulinum i kilka gatunków Staphylococcus. Pierwszy z nich produkuje śmiertelną egzotoksynę atakującą układ nerwowy — neurotoksynę. Gronkowce wytwarzają enterotoksynę odpowiedzialną za zatrucia pokarmowe i działającą głównie na przewód pokarmowy. Niektóre grzyby wytwarzają mikotoksyny, wśród których aflatoksyna produkowana przez Aspergillus flavus jest chyba najszerzej znana.

Procedury konserwujące mające na celu zabezpieczenie żywności przed zepsuciem wywołanym przez mikroorganizmy wykorzystują różne możliwości oparte na metodach fizycznych i chemicznych. Metody fizyczne. Sterylizacja cieplna została już omówiona powyżej. Żywność w metalowych puszkach jest zazwyczaj autoklawowana. Kwaśne soki owocowe są trwałe, nawet jeśli były pasteryzowane tylko tak, że komórki wegetatywne zostały zabite, a spory pozostały żywe, gdyż endospory bakterii nie mogą kiełkować w kwaśnym środowisku. Filtracja sterylizująca przez mikropory w krążkach prasowanego azbestu lub celulozy jest stosowana do jałowienia soków owocowych, wód mineralnych i leków. Wirowanie

270

i filtracja mają też zastosowanie do przerywania fermentacji wina na odpowiednim etapie, tak aby pozostawić pewien poziom cukru. Powszechnie stosowana starożytna metoda polegająca na suszeniu pewnych typów żywności opiera się na fakcie, że wzrost mikroorganizmów wymaga określonej zawartości wody (zazwyczaj powyżej 10%). Płatki owsiane, suszone owoce, siano i produkty silosowane zawdzięczają swoją trwałość stanowi wysuszenia, ale po wystawieniu na działanie wilgotnego powietrza i pochłonięciu wody są one natychmiast atakowane przez pleśnie i bakterie. Napromieniowywanie środków spożywczych ma jak dotychczas ograniczone zastosowanie. Promienie UV są stosowane głównie do sterylizacji powietrza i pomieszczeń w mleczarniach, chłodniach, dużych piekarniach i innych tego rodzaju zakładach. W niewielkim stopniu wykorzystuje się możliwość zastosowania promieniowania jonizującego do żywności. Nieszkodliwość naświetlania promieniami gamma została przetestowana i ustalona w kilku przypadkach. Są także dowody, że niewielkie dawki promieniowania potrzebne do sterylizacji nie wywołują znaczących zmian w sterylizowanych produktach. Bezpieczną metodą, coraz częściej stosowaną w gospodarstwach domowych i konkurującą z wekowaniem, jest przechowywanie w niskich temperaturach. Niskotemperaturowe zamrażarki i głęboko mrożące magazyny chłodnie utrzymują zamrożone produkty w temperaturze poniżej — 20°C. Przechowywanie żywności w tych temperaturach nie zmniejsza w poważniejszym stopniu ilości żywych mikroorganizmów ani nie niszczy ich toksyn, ale całkowicie hamuje wzrost bakterii. Nawet bakterie psychrofilne nie są w stanie rosnąć w temperaturze poniżej — 12°C. Metody chemiczne. Konserwowanie przez zakwaszenie opiera się na tym, że tylko kilka mikroorganizmów może rosnąć w niskim pH w warunkach beztlenowych. Do pozbycia się ich wystarcza zazwyczaj pasteryzacja, a termooporne spory nie mogą wykiełkować w pH poniżej 4. Naturalny sposób konserwowania przez zakwaszenie jest wykorzystywany w produkcji kiszonej kapusty i ogórków lub wędlin typu salami i serwolatka. W wielu przypadkach dodaje się kwasu octowego, mlekowego, cytrynowego czy winowego. Zakwaszone, ale nie pasteryzowane produkty ulegają jednak zepsuciu pod wpływem drożdży i innych grzybów w warunkach tlenowych. Do konserwacji mięsa i produktów rybnych stosuje się wędzenie. Proces ten polega na zmniejszeniu zawartości wody oraz nasyceniu produktów takimi substancjami zwalczającymi drobnoustroje, jak fenole, krezole, aldehydy, kwas octowy i mrówkowy. Solenie przeprowadza się przez zanurzenie konserwowanej żywności w 14-25% roztworze soli kuchennej. Zabieg ten prowadzi do zmniejszenia zawartości wody oraz zahamowania wzrostu mikroorganizmów powodujących psucie. W warunkach tych może się rozmnażać zaledwie kilka rodzajów halofilnych bakterii. Cukier w dużym stężeniu (50%) jest inhibitorem wzrostu. Tak więc zabezpieczenie dżemów, marmolad i syropów jest przede wszystkim wynikiem ich kwasowości i zawartości cukru.

271

Do zabezpieczenia przed psuciem niektórych produktów spożywczych konieczne są środki chemiczne. W winach tradycyjnie stosuje się dodatek siarczynu. Soki i wina można też konserwować dodatkiem dietylodiwęglanu. Inne metody zabezpieczania produktów spożywczych polegają na dodawaniu kwasu sorbowego, benzoesowego i mrówkowego. Powierzchnię owoców cytrusowych zabezpiecza się za pomocą difenylu lub o-fenylofenolanu. Wreszcie, w celu zahamowania wzrostu bakteryjnego były podejmowane próby zastosowania antybiotyków.

PODSTAWOWE MECHANIZMY METABOLIZMU I PRZEMIAN ENERGETYCZNYCH

Omawiając obieg węgla przeciwstawiono dwa procesy: fotosyntezę z towarzyszącym jej wiązaniem CO 2 i wydzielaniem tlenu oraz zużywanie tlenu z wyzwalaniem dwutlenku węgla w trakcie mineralizacji związków organicznych. W przypadku przekształceń masy obydwa procesy są komplementarne; najwyraźniej widać to w przejściu węgla z nieorganicznej formy gazowej do organicznej formy stałej lub nietrwałej i w odwrotnym procesie mineralizacji. Jednakże, jeśli obydwa procesy rozpatrywać z punktu widzenia przekształceń energetycznych, węgiel wydaje się mieć mniejsze znaczenie niż wodór. Już w roku 1848 J. R. Meyer wyraził to słowami: „Rośliny pobierają siłę, światło i wytwarzają siłę, potencjał chemiczny" (słowo siła użyte jest w znaczeniu energii). Energia świetlna słońca ulega w fotosyntezie przetworzeniu w energię chemiczną w drodze rozszczepienia wody do wodoru i tlenu, a następnie przeprowadzenia

273

powstałego wodoru w połączeniu z węglem (z dwutlenku węgla) do stanu metastabilnego (patrz schemat powyżej). Główna część wodoru jest przejściowo związana w postaci węglowodanów. Ta potencjalna różnica między wodorem a tlenem wytworzonym przez rośliny służy jako źródło energii dla wszystkich tlenowo oddychających organizmów organotroficznych. Organizmy te usuwają wodór z jego związków z węglem i utleniają go tlenem w reakcji biochemicznej wyzwalającej energię. Utlenianie wodoru przebiega w kilku etapach, co pozwala na przetworzenie wyzwalanej energii w energię chemiczną małymi porcjami. W skali globalnej układ „rośliny fototroficzne-organizmy organotroficzne" stanowi integralną część procesu przekształcania energii świetlnej w ciepło i powoduje wolniejszy przyrost entropii.

7.1. Rozważania ogólne Metabolizm i szlaki metaboliczne. Komórki wegetatywne są zależne od stałego źródła energii, nie tylko podczas wzrostu, lecz również w stanie spoczynku. Żywa komórka jest najwyżej uporządkowaną formą materii. Do utworzenia tego stanu uporządkowania i do jego utrzymania potrzebna jest energia. Energia wymagana do utrzymania życia i syntezy składników komórkowych uzyskiwana jest w drodze metabolizmu, tj. uporządkowanych przekształceń substancji w komórce. Źródłami energii są substancje odżywcze uzyskiwane ze środowiska. Ich przekształcanie wewnątrz komórki odbywa się w wielu następujących po sobie reakcjach enzymatycznych tworzących swoiste szlaki metaboliczne. Szlaki te mają dwojakie funkcje: zapewnienie prekursorów składników komórkowych oraz dostarczenie energii koniecznej do syntez i innych procesów. Przemianę substancji w komórce (metabolizm komórkowy), prowadzącą od prostych substancji odżywczych typu glukozy, długołańcuchowych kwasów tłuszczowych lub nawet związków aromatycznych do syntezy de nονο materiału komórkowego, można dla uproszczenia podzielić na trzy fazy. Substancje odżywcze są najpierw degradowane do mniejszych fragmentów (katabolizm), a następnie przeprowadzane w reakcjach metabolizmu pośredniego (amfibolizm) do różnych kwasów organicznych i estrów fosforanowych. Te niskocząsteczkowe związki są substratami, z których powstają podstawowe elementy składowe komórki, takie jak aminokwasy, zasady pirymidynowe i purynowe, fosfocukry, kwasy 274

organiczne. Związki te często są produktami końcowymi bardzo długich ciągów reakcji syntetycznych. Stanowią one materiał do syntezy polimerycznych makrocząsteczek (kwasy nukleinowe, białka, materiały zapasowe, składniki ściany komórkowej) tworzących komórkę. Powyższe dwie fazy biosyntezy materiału komórkowego — synteza elementów budulcowych i synteza z nich polimerów — określa się terminem metabolizmu syntezy lub anabolizmu (ryc. 7.1). Jedność w biochemii. Zasada „jedności w biochemii" jest jednym z nielicznych trwałych dogmatów tego wieku. Zakłada ona, że biochemia wszystkich żywych form na naszej planecie jest zasadniczo taka sama. Zasadę tę ilustruje jedność komórkowych składników, łącznie z ich rotacją optyczną; uniwersalność ATP jako podstawowego kwantu energii biologicznej; uniwersalność kodu genetycznego oraz uniwersalność szlaków degradacji cukrów i łańcucha oddechowego. Główne szlaki metaboliczne są również prawie identyczne u wszystkich żywych organizmów. Istnieje kilka grup bakterii, w których zasadnicze schematy uległy modyfikacji, powodując dominację kilku szlaków, a zanik lub uproszczenie

275

innych. Metaboliczne strategie drobnoustrojów można łatwo wyprowadzić ze wspólnego schematu. Można założyć, że szlaki metaboliczne, jakie powstały w trakcie ewolucji, oraz „maszyneria" biochemiczna typowa dla organizmów tlenowych rozwinęły się dość późno, po nastaniu warunków tlenowych. Obecnie trudno zdecydować, czy skrócone szlaki metaboliczne są cechami prymitywnymi, czy wynikiem utraty pewnych etapów przemian metabolicznych. Rozkład węglowodanów. Jak już wspomniano w omówieniu obiegu węgla, dominującymi pod względem ilościowym produktami fotosyntezy roślin są węglowodany. Związki te są również najbardziej powszechnymi substancjami odżywczymi dla większości drobnoustrojów. Z tego powodu dalsze rozważania będą dotyczyć przede wszystkim glukozy, jako substancji odżywczej i substratu w metabolizmie komórkowym. Udział innych naturalnych substancji wykorzystywanych w metabolizmie jako substancje odżywcze będzie omówiony w odpowiednim kontekście (rozdz. 14). Makrocząsteczki zwykle są degradowane na zewnątrz komórki przez egzoenzymy do mono- lub dimerycznych elementów budulcowych, które następnie są pobierane do wewnątrz komórki. Heksozy, po różnego typu reakcjach wstępnych, ulegają rozszczepieniu na dwie części. Powstałe produkty są następnie przekształcane do pirogronianu będącego głównym metabolitem pośrednim, od którego rozpoczyna się wiele syntez i dalszych reakcji katabolicznych. Pirogronian ulega dekarboksylacji do związku dwuwęglowego, który łączy się z odpowiednią cząsteczką akceptorową (szczawiooctanem), a następnie wchodzi do cyklu kwasów trikarboksylowych (TCA; zwanego również cyklem kwasu cytrynowego), gdzie w ciągu reakcji ulega utlenieniu do dwutlenku węgla. W cyklicznym procesie szczawiooctan zostaje odtworzony. Atomy wodoru (lub równoważniki redukujące) uzyskane w reakcjach odwodorowania zostają wprowadzone do łańcucha oddechowego, co pozwala na regenerację ATP (oksydatywna fosforylacja). W każdym obrocie cyklu z dwuwęglowego związku (acetylo-CoA) powstają 2 cząsteczki CO2 i cztery razy 2[H]. Ta seria reakcji wyrównuje bilans cyklu kwasów trikarboksylowych. Pośrednie związki w cyklu kwasów trikarboksylowych to kwasy organiczne odgrywające dużą rolę w procesach biosyntezy ( α-ketoglutaran,

276

bursztynian, szczawiooctan). Cykl kwasów trikarboksylowych funkcjonuje zatem nie tylko jako szlak całkowitego utlenienia substancji odżywczych, lecz również dostarcza materiałów dających początek syntezie składników komórki. Gdyby te związki pośrednie były w sposób ciągły wycofywane z cyklu, jego bieg szybko uległby zahamowaniu. Zapobiegają temu reakcje uzupełniające (anaplerotyczne), które wprowadzają do cyklu dodatkowe związki pośrednie wyrównujące straty powodowane procesami biosyntezy. Szlaki anaplerotyczne mają szczególnie istotne znaczenie dla organizmów rosnących z wykorzystaniem prostych związków węgla (związki C1 i C2) lub innych substratów degradowanych do tych prostych związków. Funkcja enzymów. Przemiany substancji chemicznych w komórce są przeprowadzane przez enzymy. Każde przekształcenie jednego metabolitu w drugi katalizują swoiste białka enzymatyczne. Do najważniejszych właściwości enzymu należą: rozpoznawanie swoistego metabolitu (substratu), jego aktywność katalityczna oraz potencjalna możliwość regulacji tej aktywności. Reakcje katalizowane przez enzymy są inicjowane wiązaniem się metabolitu (substratu enzymu) do białka enzymatycznego. Zazwyczaj dany enzym reaguje tylko z jednym metabolitem — swoim substratem — i katalizuje jego przekształcenie do drugiego metabolitu, aż do ustalenia się równowagi. Każdy enzym charakteryzuje się zatem swoistością substratową (ma do czynienia tylko z jednym metabolitem oraz produktem jego przekształcenia) i swoistością katalizowanej reakcji (katalizuje tylko jedną z możliwych reakcji przekształcenia danego metabolitu). Rozpoznawanie substratu przez enzym jest częścią procesu wiązania enzym-substrat. Substrat wiąże się do specyficznego miejsca enzymu, jego centrum katalitycznego. Enzym rozpoznaje steryczne i jonowe właściwości substratu. Połączenie między substratem a centrum katalitycznym enzymu można porównać do „klucza" i „zamka".

277

Białka enzymatyczne mają charakter biologicznych katalizatorów, obniżających energię aktywacji (reakcji). Chemiczne przekształcenie metabolitu przez enzym odbywa się w normalnym zakresie temperatur. Enzymy pozwalają na przebieg reakcji, które bez nich mogłoby przebiegać jedynie w wysokich temperaturach lub niefizjologicznych warunkach nie tolerowanych przez komórkę. Reakcja katalizowana przez enzym przebiega około dziesięć rzędów wielkości szybciej niż taka sama reakcja nieenzymatyczna. Zwiększenie szybkości 10'° razy skraca okres półtrwania z 300 lat do jednej sekundy. Bardzo ważną cechą enzymów, z której w pełni zdano sobie sprawę dopiero niedawno, jest ich podatność na regulację aktywności katalitycznej. Regulacja ich aktywności ułatwia zrozumienie współgrania procesów metabolicznych wewnątrz komórki. Aktywność przynajmniej niektórych enzymów, zwykle jednego w danym szlaku metabolicznym, może być regulowana. Enzymy te rozpoznają nie tylko substrat w centrum katalitycznym, lecz również produkt końcowy syntezy lub jakiś inny związek niskocząsteczkowy mający wpływ na aktywność enzymatyczną. Enzymy tego typu mają zatem drugą domenę wiązania, tzw. centrum regulacyjne. Wiązanie produktu lub innego metabolitu (efektora) jest rozpoznawane przez centrum katalityczne, które zmienia swoje właściwości katalityczne. Końcowe produkty w reakcjach syntezy są efektorami negatywnymi. Pozytywne efektory powodują natomiast wzrost aktywności. Stężenia metabolitów będących efektorami regulują zatem aktywność enzymu oraz szybkość katalizowanej reakcji. Ponieważ struktura efektora różni się od struktury substratu, obydwa związki różnią się też przestrzennie. W związku z tym wprowadzono nazwę efektorów allosterycznych, a regulatorowe miejsca ich wiązania zwane są centrami allosterycznymi.

Koenzymy i grupy prostetyczne. Białka enzymatyczne biorące udział w pobraniu lub przenoszeniu fragmentów substratu, np. wodoru, grup metylowych lub grup aminowych, wykorzystują niskocząsteczkowe związ278

ki zwane koenzymami oraz grupy prostetyczne (tab. 7.1; ryc. 7.2), które są mniej lub bardziej ściśle związane z enzymem. Substancje przyjmujące część substratu, podczas gdy same są związane z enzymem, to koenzymy (a właściwie kosubstraty). Jeśli niskocząsteczkowa substancja jest związana z enzymem i przekazuje np. grupę metylową nie oddysocjowując od niego, nazywana jest grupą prostetyczną danego enzymu. Koenzymy mają szczególne znaczenie, gdyż wiele organizmów nie syntetyzuje ich, lecz musi je otrzymać w formie witamin. Wiele bakterii mlekowych, glebowych i wodnych, jak również wiele innych organizmów jednokomórkowych wymaga którejś z witamin wymienionych w tabeli 6.3 lub jej prekursora jako czynnika wzrostowego. 279

280

Przekształcenia energii. Wspomniane wyżej szlaki metaboliczne (metabolizm heksoz, cykl kwasów trikarboksylowych oraz łańcuch oddechowy) powodują utlenienie cukru do dwutlenku węgla i wody. Energia wyzwalana w wyniku tych reakcji jest taka sama jak podczas całkowitego spalania cukru. Rozbicie utleniania glukozy na wiele reakcji katalizowanych enzymatycznie i teoretycznie całkowicie odwracalnych umożliwia przekształcenie części uwalnianej energii do formy wykorzystywanej w procesach biochemicznych z uniknięciem wysokich temperatur reakcji. Wiele procesów metabolicznych wyzwala jedynie małe ilości energii. Są one wykorzytywane przez komórkę jedynie dlatego, że równowaga reakcji jest przesunięta w stronę produktu. Metabolizmowi niektórych produktów pośrednich towarzyszy jednak uwolnienie większych ilości wolnej energii ( — ΔG = 40 — 60 kJ/mol lub 10—15 kcal/mol); energia ta zostaje zachowana w formie ATP w wyniku fosforylacji substratowej, stając się w ten sposób dostępna dla innych reakcji metabolicznych wymagających energii. Ten typ regeneracji ATP przebiega przy współudziale substratów (związków pośrednich) i enzymów. Główna część energii powstająca w wyniku utleniania substratów jest jednak przetwarzana do ATP w wyspecjalizowanym ciągu reakcji polegających na fosforylacji w trakcie przenoszenia elektronów w łańcuchu oddechowym. Metabolity. Nawet bardzo ogólna znajomość związków uczestniczących w metabolizmie komórkowym wskazuje, że wiele z tych substancji jest w formie ufosforylowanej, tj. w formie estrów kwasu fosforowego. Niefosforylowane związki pośrednie zawierają grupy karboksylowe lub ulegające jonizacji grupy zasadowe. Wynikałoby z tego, że enzymy reagują jedynie z metabolitami mającymi grupy zjonizowane lub z niosącymi ładunek. Cząsteczki lub grupy bez ładunku zawsze przyłączają się do koenzymów lub grup prostetycznych; niektóre tworzą zasady Schiffa z diaminowym aminokwasem — lizyną w centrum aktywnym enzymu. Jedynie początkowe i końcowe związki w szlakach metabolicznych nie są zjonizowane. Dotyczy to też wielu wyjściowych substratów i produktów końcowych (glukoza, fruktoza, etanol, octan, 2-propanol, glicerol i inne). Niezależnie od uogólnień, jakie się nasuwają, powstaje pytanie, czy występowanie zjonizowanych związków pośrednich jest związane z funkcjami enzymatycznymi, czy ze szczególnie skutecznymi mechanizmami zatrzymującymi metabolity wewnątrz komórki. 281

Odwodorowanie i nukleotydy pirydynowe. Utlenianie związków organicznych wiąże się z transferem elektronów od donora do akceptora. W biologicznym utlenieniu substratu zazwyczaj przeniesieniu dwóch elektronów towarzyszy równoczesne oderwanie od substratu dwóch protonów (H + ). Tego typu utlenienie substratu, formalnie równoznaczne z utratą dwóch atomów wodoru, zwane jest odwodorowaniem. Używa się wymiennie następujących terminów: donor wodoru i donor elektronu; akceptor wodoru i akceptor elektronu; utlenianie i odwodorowanie; redukcja i uwodorowanie. Enzymy usuwające atomy wodoru z substratu są to dehydrogenazy, a ich nazwy pochodzą od donora wodoru (dehydrogenaza mleczanowa, dehydrogenaza jabłczanowa itd.). Wiele dehydrogenaz przekazuje wodór do jednego z dwu koenzymów, dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NAD) lub jego fosforanu (NADP). Aktywną grupą obu koenzymów jest NH?

amid kwasu nikotynowego. Jeden atom wodoru wraz z parą elektronów przekazywany jest (w postaci jonu wodorkowego) od substratu do pierścienia pirydynowego, podczas gdy drugi wodór staje się protonem

282

w roztworze. Transfer wodoru jest procesem stereoswoistym; niektóre enzymy (dehydrogenaza alkoholowa, dehydrogenaza mleczanowa) przekazują go do jednej strony (strona A) pierścienia pirydynowego, podczas gdy inne dehydrogenazy (dehydrogenaza aldehydu fosfoglicerynowego) wykorzystują przeciwną (B) stronę pierścienia. W uproszczeniu, tego typu odwracalne odwodorowania zapisywane są również następująco: Zredukowane formy obydwu koenzymów, w przeciwieństwie do form utlenionych, wykazują maksimum absorpcji w spektrofotometrze przy długości fali 340 nm. Przy tej długości fali można zatem śledzić przebieg redukcji i utleniania koenzymów. Stanowi to podstawę dla wielu optycznych metod określania aktywności dehydrogenaz. Obydwa koenzymy swobodnie dysocjują, tzn. oddysocjowują od dehydrogenazy po połączeniu się z wodorem, który następnie przenoszą do akceptora, po połączeniu się z kolejną cząsteczką dehydrogenazy. Od funkcji „przenośników wodoru" pochodzi nazwa „metabolitów transportowych". NADH2 przenosi wodór przede wszystkim do prekursorów produktów fermentacyjnych lub wprowadza go bezpośrednio do łańcucha oddechowego, podczas gdy NADPH2 uczestniczy przede wszystkim w biosyntetycznych reakcjach redukcji. ATP i inne związki wysokoenergetyczne. Przebieg procesów komórkowych wymagających energii umożliwiony jest przez współudział

283

adenozynotrifosforanu (ATP), będącego chemiczną formą energii uzyskanej w fotosyntezie, oddychaniu lub fermentacji. ATP jest uniwersalnym przenośnikiem energii pomiędzy reakcjami wyzwalającymi i zużywającymi energię. Jest to jakby międzynarodowa waluta na rynku energetycznym komórki. ATP uczestniczy w tak odmiennych procesach, jak synteza elementów budulcowych i makrocząsteczek, regulacja osmotyczna i ruch komórkowy. Wiązania pirofosforanowe między grupami fosforowymi są „bogate w energię", charakteryzują się wysokim potencjałem transferu. Inaczej mówiąc, do ich wytworzenia potrzeba więcej energii aniżeli do wiązania normalnych połączeń estrowych i odwrotnie, ich rozszczepienie uwalnia dużą ilość energii (gdy czynnikiem hydrolizującym jest woda, ΔG'O = — 30 kJ), która może być zachowana w produktach reakcji (tab. 7.2).

ATP jako koenzym w aktywacji metabolitu. Wiele związków pośrednich wchodzi w różnego typu reakcje dopiero po ich aktywacji w wyniku przemieszczenia grup. Aktywacja ta następuje w jednym z trzech możliwych procesów rozszczepiania ATP. Cukry ulegają aktywacji po przeprowadzeniu w fosfocukry: glukoza + ATP -> glukozo-6-fosforan + ADP Rybozo-5-fosforan ulega aktywacji w wyniku przeniesienia reszty difosforanowej (grupy pirofosforanowej) rybozo-5-fosforan + ATP -> fosforybozylodifosforan + AMP

284

Niektóre kwasy organiczne, wszystkie aminokwasy i nieorganiczny siarczan są aktywowane w wyniku transferu grupy AMP, z równoczesną hydrolizą do difosforanu:

Reakcje mogą przebiegać aż do całkowitego przekształcenia substratu pod warunkiem hydrolizy difosforanu (przez pirofosfatazę). W ten sposób równowaga zostaje zachwiana. Powyższe uwagi powinny przekonać o uniwersalnym znaczeniu ATP i pomóc w zrozumieniu różnorodności metabolicznej wśród bakterii. Metaboliczne strategie różnych organizmów można bowiem rozpatrywać z punktu widzenia maksymalnej wydajności ATP uzyskiwanej z dostępnych substancji odżywczych w danych warunkach środowiska. Regeneracja ATP. ATP jest odtwarzany w trzech procesach: w fosforylacji fotosyntetycznej (rozdz. 12. 12.2.2), fosforylacji oksydatywnej lub w łańcuchu oddechowym (rozdz. 7.4) oraz fosforylacji na poziomie substratu (rozdz. 7.2.1). W pierwszych dwu procesach występuje wspólny etap tworzenia ATP przez syntazę ATP. Fosforylacja substratowa występuje w kilku reakcjach w metabolizmie pośrednim. Reakcje tworzenia ATP o najważniejszym znaczeniu w metabolizmie węglowodanów są katalizowane przez kinazę fosfoglicerynianową, kinazę pirogronianową i kinazę octanową. Podczas fermentacji cukrów przez bakterie i drożdże ATP powstaje wyłącznie przy udziale tych enzymów. W niemalże wszystkich procesach fosforylacji akceptorem fosforanu jest ADP. Najpierw zachodzi jednak przekształcenie adenozynomonofosforanu (AMP) do ADP. W reakcji tej uczestniczy ATP i enzym kinaza adenylanowa (AMP + ATP = 2 ADP). W następnych częściach tego rozdziału zostaną przedstawione cztery najważniejsze ciągi reakcji w katabolizmie glukozy: wstępne rozszczepienie do związków C 3 , utlenienie pirogronianu, cykl kwasów trikarboksylowych oraz łańcuch oddechowy i jego funkcje. Dla zrozumienia nietypowych procesów metabolicznych zostaną również omówione niektóre ważne szczegóły. Aby jednak głębiej zrozumieć metabolizm i biochemię drobnoustrojów, należy sięgnąć do podręcznika biochemii.

285

7.2. Szlaki degradacji glukozy Znanych jest kilka sposobów przekształcania glukozy do związków trójwęglowych (C3), w tym do pirogronianu, będącego jednym z najważniejszych związków pośrednich w metabolizmie. Najpowszechniejszy szlak metaboliczny przebiega przez fruktozo- 1,6-bisfosforan i zwany jest szlakiem FBF, glikolizą lub szlakiem Embdena-Meyerhofa-Parnasa od nazwisk jego odkrywców (ryc. 7.3). Inna sekwencja reakcji przeprowadzanych przez większość żywych organizmów łączona jest w cykl zwany oksydatywnym szlakiem pentozofosforanowym, szlakiem heksozomonofosforanowym lub szlakiem Warburga-Dickensa-Horeckera (ryc. 7.4). Odwrócony kierunek ciągu reakcji tworzy najważniejszą drogę regeneracji akceptorów CO2 w autotroficznym wiązaniu dwutlenku węgla. Szlak Entnera-Doudoroffa, znany również jako szlak KDFG od charakterystycznego związku pośredniego kwasu 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonowego, jak się wydaje, występuje jedynie u bakterii (ryc. 7.5). Inne spokrewnione mechanizmy degradacyjne mają bardziej specjalistyczny charakter.

Wewnątrz komórki glukoza najpierw ulega fosforylacji przy węglu C-6 przez heksokinazę. Donorem fosforanu w tej reakcji jest ATP. Glukozo-6-fosforan jest metabolicznie aktywną formą wewnątrzkomórkowej glukozy i punktem wyjścia wszystkich trzech wspomnianych wyżej mechanizmów degradacyjnych.

286

7.2.1. Szlak fruktozo-1,6-bisfosforanowy (glikoliza) W szlaku fruktozo-1,6-bisfosforanowym (ryc. 7.3) glukozo-6-fosforan jest przeprowadzany do formy rozszczepialnej, ulegając najpierw izomeryzacji przez izomerazę glukozo-6-P do fruktozo-6-fosforanu, a następnie fosforylacji przy C-l przez 6-fosfofruktokinazę i ATP. Powstały fruktozo-1,6-bisfosforan jest rozszczepiany przez aldolazę fruktozobisfosforanową do dwóch różnych cząsteczek triozofosforanu utrzymywanych w równowadze przez izomerazę triozofosforanową. Fosforan dihydroksyacetonu może ulec redukcji do glicerolofosforanu, a następnie hydrolizie przez glicerolu-1-fosfatazę do glicerolu i ortofosforanu. Jednakże, w normalnym przebiegu reakcji fosforan dihydroksyacetonu powstający w reakcji z udziałem aldolazy jest przekształcany do aldehydu 3-fosfoglicerynowego, który z kolei ulega utlenieniu. Ta ostatnia reakcja odwodorowania jest jednym z najważniejszych etapów w glikolizie, zarówno pod względem zysku energetycznego, jak i dla przebiegu innych reakcji prowadzących do powstania aldehydo-6—

287

-fosforanu. Część energii uzyskiwanej podczas utlenienia aldehydu 3-fosfoglicerynowego do 3-fosfoglicerynianu (ΔG0 = — 67 kJ) zostaje zachowana w postaci bogatego w energię wiązania fosforanowego. Grupa 288

aldehydowa zostaje najpierw dołączona do grupy SH dehydrogenazy aldehydu fosfoglicerynowego, a wodór przeniesiony na NAD. Powstający kompleks acylo-S-enzym jest bogatym w energię tioestrem. Poprzez wymianę grupy S-enzym na ortofosforan (fosforoliza) energia zostaje zachowana w postaci kwasu 1,3-bisfosfoglicerynowego, a właściwie w 1-fosforanie. Z kolei enzym kinaza fosfoglicerynianowa przekazuje ten bogaty w energię fosforan do ADP z wytworzeniem ATP i fosfoglicerynianu. Ponieważ bogaty w energię fosforan powstaje na substracie, ten typ fosforylacji nosi nazwę fosforylacji substratowej. Utlenienie aldehydu 3-fosfoglicerynowego zależy od obecności enzymu, ortofosforanu i ADP. Brak lub wyczerpanie się któregokolwiek z tych czynników powoduje przerwanie glikolizy. Fakt ten ma duże znaczenie dla regulacji katabolizmu glukozy (efekt Pasteura). 3-fosfoglicerynian zostaje przekształcony przez fosfogliceromutazę do 2-fosfoglicerynianu, a następnie do fosfoenolopirogronianu z udziałem enolazy. Bogata w energię grupa fosforanowa tego enolowego estru zostaje przeniesiona na ADP przez kinazę pirogronianową. Powstający w tej reakcji pirogronian jest prekursorem w wielu innych procesach katabolizmu, syntezy i przekształceń. Reakcje w szlaku fruktozo-1,6-bisfosforanowym są całkowicie odwracalne, z wyjątkiem trzech reakcji: heksokinazowej, 6-fosfofruktokinazowej i reakcji katalizowanej przez kinazę pirogronianową. Jeśli cały triozofosforan utworzony w wyniku rozszczepienia fruktozo-1,6-bisfosforanu zostaje przekształcony do pirogronianu, bilans netto degradacji glukozy w tym szlaku to 2 cząsteczki pirogronianu, 2 cząsteczki ATP (tj. 4 minus 2) oraz 2 cząsteczki NADH2. Dwie reakcje służące zachowaniu energii podczas przekształcania aldehydu 3-fosfoglicerynowego do pirogronianu są najważniejszymi reakcjami energetycznymi u organizmów beztlenowych. Wszystkie, z nielicznymi wyjątkami, drobnoustroje fermentujące węglowodany są całkowicie uzależnione od energii uzyskiwanej z utlenienia aldehydu 3-fosfoglicerynowego do pirogronianu.

7.2.2. Cykl pentozofosforanowy W cyklu pentozofosforanowym (ryc. 7.4), dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu odwodorowuje glukozo-6-fosforan do 6-fosfoglukonolaktonu, przekazując wodór na NADP. 6-fosfoglukonolakton ulega spontanicznej 289

lub enzymatycznej (glukonolaktonaza) hydrolizie do 6-fosfoglukonianu, który z kolei zostaje odwodorowany przez dehydrogenazę 6-fosfoglukonową do 3-keto-6-fosfoglukonianu. Dekarboksylacja tego ostatniego prowadzi do rybulozo-5-fosforanu, kończąc właściwy proces utleniania. Następujące reakcje można rozpatrywać jako proste przekształcenia pentozofosforanów do heksozofosforanów i odwrotnie. Połączenie tych reakcji z reakcjami wstępnego utleniania tworzy cykl metaboliczny. 290

Rybulozo-5-fosforan znajduje się w równowadze z rybozo-5-fosforanem i ksylulozo-5-fosforanem. Rybozofosforan jest ważnym elementem w syntezie nukleotydów i kwasów nukleinowych. Pentozofosforany mogą być przeprowadzone przez transketolazę i transaldolazę do dwóch reszt fruktozo-6-fosforanu i jednej cząsteczki aldehydu 3-fosfoglicerynowego. Cykl zamyka izomeryzacja fruktozo-6-fosforanu do glukozo-6-fosforanu i kondensacja dwu cząsteczek triozofosforanu do heksozofosforanu. Jeden obrót cyklu przeprowadza zatem trzy cząsteczki glukozo-6-fosforanu do dwóch cząsteczek fruktozo-6-fosforanu oraz jednej cząsteczki aldehydu 3-fosfoglicerynowego, dając trzy cząsteczki CO2 i trzy razy 2 NADPH2. Enzymy dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa i dehydrogenaza fosfoglukonianowa większości, jeśli nie wszystkich, bakterii mogą przenosić wodór od substratu na zarówno NAD, jak i NADP. Cykl pentozofosforanowy jest prawdopodobnie pomocniczym ciągiem reakcji, którego znaczenie polega na dostarczaniu niezbędnych prekursorów (pentozofosforanów, erytrozofosforanu, aldehydu 3-fosfoglicerynowego) oraz równoważników redukujących dla procesów syntezy. Pentozofosforan jako prekursor w syntezie nukleotydów i kwasów nukleinowych uzyskiwany jest zatem przez odwodorowanie i dekarboksylację glukozo-6-fosforanu oraz z fruktozo-6-fosforanu w reakcjach z udziałem transaldolazy i transketolazy. 7.2.3. Szlak 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonianowy

Glukozo-6-fosforan wstępnie ulega odwodorowaniu do 6-fosfoglukonianu, podobnie jak opisano dla szlaku pentozofosforanowego. Usunięcie wody z 6-fosfoglukonianu przez dehydrazę fosfoglukonianową prowadzi do 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonianu (ryc. 7.5), który jest z kolei rozszczepiany przez swoistą aldolazę do pirogronianu i aldehydu 3-fosfoglicerynowego. Ten ostatni związek jest utleniany w szlaku glikolitycznym do pirogronianu. Poszczególne szlaki degradacyjne znacznie różnią się od siebie wydajnością ATP, NADH2 i NADPH2. W szlaku fruktozobisfosforanowym na każdy mol glukozy przeprowadzonej do pirogronianu powstają 2 mole ATP i 2 mole NADH2, podczas gdy w szlaku 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonianowym jedynie po jednym molu ATP i NADPH2. Tworzenie jednego mola NADPH2 wydaje się zatem równoważne pod względem bilansu energetycznego z powstaniem jednego mola ATP + jednego mola 291

292

NADH2. Jest to zgodne z obserwacją, że przeniesienie wodoru przez transhydrogenazę z NADH2 do NADPH2 jest często reakcją zależną od energii, powodującą zużycie jednego mola ATP. Drobnoustroje znacznie się różnią stopniem wykorzystywania poszczególnych szlaków (tab. 7.3). Enzymy szlaku fruktozobisfosforanowego wydają się częścią podstawowego wyposażenia komórkowego, choć wiele bakterii wykorzystuje ten szlak jedynie w kierunku odwróconym (pokonując etapy nieodwracalne z udziałem innych enzymów). Szlak pentozofosforanowy również wydaje się mieć uniwersalne znaczenie. Szlak 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonianowy jest szeroko rozpowszechniony wśród bakterii, mając znaczenie przede wszystkim w wykorzystywaniu glukonianu. Tak więc, chociaż E. coli i gatunki z rodzaju Clostridium mogą wykorzystywać glukozę w szlaku fruktozobisfosforanowym, glukonian może wchodzić w ich metabolizm pośredni za pośrednictwem reakcji 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonianowej. Klostridia i niektóre bakterie rozkładają glukonian w różnych odmianach szlaku 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonianowego; glukonian jest najpierw przeprowadzany do 2-keto-3-deoksyglukonianu przez dehydratazę glukonianową, a następnie przy udziale ATP ulega fosforylacji przez kinazę ketodeoksyglukonianową. Wytworzony 2-keto-3-deoksyfosfoglukonian jest rozszczepiany przez aldolazę 2-keto-3-deoksyfosfoglukonianową.

7.2.4. Utlenianie pirogronianu Pirogronian zajmuje centralne miejsce w metabolizmie pośrednim, w którym jest przetwarzany do różnych produktów anabolicznych. U wielu organizmów pirogronian wytworzony w reakcjach katabolicznych jest przede wszystkim utleniany do acetylo-CoA. U bakterii główną rolę w tym procesie odgrywają trzy reakcje:

Reakcja 1) jest katalizowana przez wieloenzymatyczny kompleks dehydrogenazy pirogronianuwej. Enzym ten występuje u wszystkich organizmów i służy przede wszystkim tworzeniu acetylo-CoA na potrzeby cyklu kwasów trikarboksylowych. Proces ten jest opisany szczegółowo w pod293

W pierwszej z powyższych reakcji (El) pirogronian wiąże się w pozycji C-2 pierścienia tiazolowego (1) pirofosforanu tiaminy (TPP) z równoczesnym odszczepieniem CO2. Powstający hydroksyetylo-TPP (2) reaguje z kwasem liponowym (2) na E2, który ulega redukcji, a reszta acetylowa (4) zostaje związana z drugorzędową grupą SH. E2 dalej katalizuje transfer grupy acetylowej do CoA, pozostawiając kwas dihydroliponowy. Ten ostatni związek ulega ponownemu utlenieniu (przez E3), z równoczesną redukcją NAD (3).

Wieloenzymatyczny kompleks dehydrogenazy pirogronianowej nie występuje u bakterii ściśle beztlenowych.

7.3. Cykl kwasów trikarboksylowych Cykl kwasów trikarboksylowych służy utlenieniu dwuwęglowego octanu do dwutlenku węgla (ryc. 7.7). Trzy z uczestniczących w tym procesie dehydrogenaz przekazują oderwany wodór do NAD(P), podczas gdy dehydrogenaza bursztynianowa przekazuje go bezpośrednio na chinon. Wodór do łańcucha oddechowego wprowadzają zazwyczaj koenzymy. Na początku acetylo-CoA łączy się ze szczawiooctanem, dając cytrynian oraz wolny koenzym A. W reakcji tej uczestniczy syntaza cytrynianowa. Aczkolwiek cytrynian jest cząsteczką o symetrycznej budowie, metabolizowany jest w sposób asymetryczny. Akonitaza katalizuje wzajemne odwracalne przemiany trzech kwasów trikarboksylowych: Z kolei, dehydrogenaza izocytrynianowa katalizuje reakcję prowadzącą od izocytrynianu do α-ketoglutaranu. Białko to występuje w formach swoistych dla NAD i NADP. Szczawiobursztynian, będący związkiem pośrednim w reakcji, pozostaje związany z enzymem. Następny enzym, dehydrogenaza 2-ketoglutaranowa, katalizuje reakcję analogiczną do reakcji z dehydrogenazą pirogronianową; oprócz enzymu uczestniczą w niej 2+ pirofosforan tiaminy, kwas liponowy, koenzym A, NAD i Mg . Bur295

rozdziale 7.6. Reakcja 2) jest katalizowana przez oksydoreduktazę pirogronian: ferredoksyna. Enzym ten ma ważne znaczenie u wielu bakterii beztlenowych, np. u klostridiów. Reakcja 3) jest przeprowadzana przez liazę pirogronian:mrówczan. Enzym ten występuje u wielu beztlenowych bakterii wydzielających mrówczan (fermentacja mrówkowa, rozdz. 8.4), szczególnie u przedstawicieli Enterobacteriaceae, lecz jest również syntetyzowany przez organizmy fototroficzne. U drożdży oraz niektórych bakterii wydzielających etanol występuje czwarty enzym katalizujący utlenianie pirogronianu: 4) pirogronian -» aldehyd octowy + CO2 Enzym ten, dekarboksylaza pirogronianowa, rozszczepia pirogronian do aldehydu octowego i CO2. Aldehyd jest następnie utleniany do etanolu. Odwodorowanie pirogronianu przez dehydrogenazę pirogronianową. Pirogronian ulega przekształceniu do acetylo-CoA i CO2 przy współudziale wieloenzymatycznego kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej oraz kilku kofaktorów (ryc. 7.6).

294

296

sztynian następnie jest uwalniany z powstałego bursztynylo-CoA przez acetylazę-CoA lub w sprzężonej reakcji z fosforylacją ADP: bursztynylo-CoA + ADP + Ρnieorg. = bursztynian + CoA + ATP W kolejnej reakcji dehydrogenaza bursztynianowa utlenia bursztynian do fumaranu i przekazuje elektrony do ubichinonu i cytochromu b. Fumaraza (hydrataza fumaranowa) katalizuje hydroksylację fumaranu. Reakcja ta ma charakter stereoswoisty i prowadzi do wytworzenia 2-jabłczanu. Ten z kolei jest odwodorowany przez dehydrogenazę jabłczanową do szczawiooctanu, co prowadzi do odtworzenia akceptora octanu. Aż do reakcji tworzenia bursztynylo-CoA wszystkie reakcje cyklu kwasów trikarboksylowych są odwracalne. Metabolizm octanu w cyklu kwasów trikarboksylowych prowadzi do wytworzenia 2 cząsteczek CO2 i 8[H], z czego 6 na poziomie nukleotydów pirydynowych i 2 na poziomie flawoprotein. Ponadto powstaje jedno wiązanie bogate w energię (w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę 2-szczawioglutaranową). Cykl kwasów trikarboksylowych służy nie tylko ostatecznemu utlenieniu składników odżywczych, lecz również powstawaniu prekursorów dla biosyntez (α-ketoglutaran, szczawiooctan, bursztynian). Usunięcie tych związków pośrednich doprowadziłoby jednak do braku szczawioctanu jako akceptora octanu, a zatem do ustania przebiegu cyklu. Ich utrata w cyklu kwasów trikarboksylowych kompensowana jest zatem przez tzw. reakcje odtwarzające (uzupełniające) lub anaplerotyczne. Do najważniejszych mechanizmów odtwarzających, wprowadzających do cyklu kwasów trikarboksylowych czterowęglowe kwasy dikarboksylowe należą karboksylacja pirogronianu i fosfoenolopirogronianu (C3 + C1 -» C4). Reakcje te omówiono szczegółowo w części dotyczącej cykli pomocniczych (podrozdz. 7.5).

7.4. Łańcuch oddechowy i fosforylacja na poziomie transportu elektronów Podczas gdy większość organizmów beztlenowych odtwarza ATP wyłącznie na poziomie fosforylacji substratowej, organizmy oddychające tlenowo wykorzystują w tym celu znacznie skuteczniejszy mechanizm. Jest nim łańcuch oddechowy lub łańcuch transportu elektronów oraz enzym 297

syntaza ATP. Obydwa systemy znajdują się w błonie cytoplazmatycznej organizmów prokariotycznych oraz w wewnętrznej błonie mitochondrialnej u organizmów eukariotycznych. Równoważniki redukujące ([H] lub elektrony) oderwane od substratów wchodzą do łańcucha oddechowego wewnątrz błony i elektrony ostatecznie przenoszone są na tlen (lub inne końcowe akceptory). Reakcje w łańcuchu oddechowym można rozpatrywać jako ciąg biochemicznych utlenień i redukcji, który różni się energetycznie od chemicznego utlenienia wodoru tym, że znaczna część wolnej energii zostaje zachowana w formie ATP, tzn. w formie dostępnej dla procesów biochemicznych, a jedynie niewielka część rozproszą się w postaci ciepła. Mechanizmy fosforylacji na poziomie transportu elektronów. Równoważniki redukujące (protony i elektrony) pochodzące z substratów są transportowane do wewnętrznej błony mitochondrium lub do błony cytoplazmatycznej. Ich przejściu przez błonę towarzyszy wytworzenie gradientu elektrochemicznego z dodatnim potencjałem na zewnętrznej powierzchni błony i ujemnym potencjałem na powierzchni wewnętrznej (ryc. 7.8.). Gradient potencjałów jest funkcją odpowiedniego rozmieszczenia składników łańcucha oddechowego w błonie. Jedne składniki przekazują elektrony, a inne wodór. Układ składników przenoszących w błonie sprzyja pobieraniu protonów przy wewnętrznej powierzchni i uwalnianiu ich na zewnętrznej powierzchni w trakcie transportu elektronów od substratu do tlenu. Ten system transportu elektronów i protonów zwany jest łańcuchem oddechowym lub łańcuchem trans-

298

portu elektronów. Z powodu jego głównej funkcji czasem określany jest również nazwą pompy protonowej. Siła protonomotoryczna, lub gradient elektrochemiczny błony, jest siłą napędową generacji ATP (i procesów wymagających energii). W błonie znajduje się specjalny enzym — syntaza ATP, który syntetyzuje ATP z ADP i P nieorg - Białko to wystaje z wewnętrznej powierzchni błony. Protony podczas syntezy ATP wędrują z zewnętrznej powierzchni błony do strony wewnętrznej. Synteza ATP związana z transportem elektronów w błonie cytoplazmatycznej nosi nazwę łańcucha oddechowego lub fosforylacji oksydatywnej. Aby zrozumieć proces oddychania, należy znać: 1) składniki tworzące łańcuch oddechowy, 2) ich potencjały redoks oraz 3) ich rozmieszczenie w błonie. Błony jako miejsce, w którym odbywa się oddychanie. Składniki łańcucha oddechowego to białka enzymatyczne zawierające względnie mocno związane ugrupowania niskocząsteczkowe (grupy prostetyczne). Wcześniejszy wniosek O. Warburga, że oddychanie to kataliza żelaza na powierzchniach okazał się prawdziwy; enzymy łańcucha oddechowego są związane z błoną. U eukariotów znajdują się one w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, a u organizmów prokariotycznych rozmieszczone są w błonie cytoplazmatycznej. Rozmieszczenie składników łańcucha oddechowego w odpowiednich błonach organizmów proi eukariotycznych jest zadziwiająco podobne. Łańcuchy oddechowe Ałcaligenes eutrophus i Paracoccus denitrificans są prawie takie same jak w mitochondriach.

Składniki łańcucha oddechowego. Składniki łańcucha oddechowego rozmieszczone są w dwuwarstwowej lipidowej błonie cytoplazmatycznej. Należy do nich duża grupa enzymów przenoszących elektrony i wodór, koenzymy i grupy prostetyczne, kilka dehydrogenaz oraz systemów transportowych. Białka te można wyizolować z błony. Do najważniejszych składników uczestniczących w utlenianiu wodoru należą flawoproteiny, białka żelazo-siarkowe, chinony i cytochromy. Flawoproteiny to enzymy zawierające grupę prostetyczną w postaci FMN lub FAD. Przekazują one wodór. Aktywną grupą tych białek jest układ izoalloksazynowy (ryc. 7.9A), który działa na zasadzie odwracalnego systemu redoks. Centrum reaktywne zawiera dwa atomy azotu, z których każdy ma zdolność pobierania atomu wodoru. Uwodorowanie przebiega dwuetapowo poprzez semichinon. Zdolność pobierania albo jednego, albo dwóch atomów wodoru pozwala flawoproteinom pośredniczyć między dwoma typami procesów przenoszenia wodoru. Białka żelazo-siarkowe to systemy redoks obdarzone zdolnością 299

przenoszenia elektronów. Zawierają one atomy żelaza, które z jednej strony są związane z siarką aminokwasu cysteiny, a z drugiej z nieorganicznym siarczkiem (ryc. 7.9B). Ten ostatni w warunkach kwasowych jest łatwo uwalniany w postaci siarkowodoru. Reszty cysteiny są częścią łańcucha polipeptydowego, a centra Fe-S można uważać za grupy prostetyczne tego łańcucha. Centra [2Fe-2S] uczestniczące w łańcuchu oddechowym przenoszą tylko jeden elektron. Tego typu białka żelazo-siarkowe zawierające dwie labilne grupy żelaza i siarki występują w kilku kompleksach enzymatycznych łańcucha oddechowego. Około 80% całego żelaza w łańcuchu oddechowym znajduje się w białkach Fe-S. Jedynie 20% jest w cytochromach. Oprócz udziału w transporcie elektronów w błonie, białka Fe-S uczestniczą również w wiązaniu azotu, redukcji siarczynu, redukcji azotynu, w fotosyntezie, aktywacji i uwalnianiu

300

wodoru cząsteczkowego oraz w utlenianiu alkanów. Białka Fe-S charakteryzują się małą masą cząsteczkową oraz silnie ujemnym potencjałem redoks; ich wartości Eo' znajdują się w zakresie 0,2 do 0,6 V. Oprócz białek Fe-S o centrach [2Fe-2S] (w chloroplastach i u bakterii tlenowych) znane są białka z jednym centrum [4Fe-4S] (Clostridium, Chromatium) lub dwoma centrami [4Fe-4S] (Clostridium, Azotobacter). Nazwa niektórych białek żelazo-siarkowych pochodzi od ich funkcji lub występowania, np. ferredoksyna, putydoredoksyna, rubredoksyna lub adrenodoksyna.

Inny typ układu redoks w łańcuchu oddechowym jest reprezentowany przez chinony. Ubichinon (koenzym Q; ryc. 7.9C) występuje w błonie mitochondrium oraz u bakterii gramujemnych. Zarówno gramujemne jak i gramdodatnie bakterie zawierają naftochinon, a w chloroplastach obecny jest plastochinon. Chinony, szczególnie ubichinon, mają charakter lipofilny, w związku z czym występują w lipidowej fazie błony. Przenoszą one elektrony lub wodór dwuetapowo za pośrednictwem semichinonu. W porównaniu z innymi składnikami łańcucha oddechowego chinony występują w 10- do 15-krotnym nadmiarze. Służą one jako „pule" dla wodoru przenoszonego przez różne koenzymy i grupy prostetyczne łańcucha oddechowego; wodór ten jest następnie przekazywany do cytochromów. Cytochromy to układy redoks przenoszące elektrony; nie mają one zdolności przekazywania wodoru. Przyjmują one elektrony z puli chinonów, a równocześnie liczba protonów równoważna liczbie elektronów przechodzi do roztworu. Grupą prostetyczną cytochromów jest hem (ryc. 7.9D). Centralny atom żelaza pierścienia hemu uczestniczy w transporcie elektronów na skutek zmian wartościowości. Cytochromy są barwne i można je od siebie odróżnić na podstawie widm absorpcji oraz ich potencjałów redoks. Wyróżnia się cytochromy a, a3, b, c, o oraz kilka innych. W cytochromie c grupa hemu jest kowalencyjnie związana z resztami cysteiny w apoproteinie. W wyniku tego silnego związania cytochrom c jest rozpuszczalny w wodzie i daje się ekstrahować z błony wodnymi roztworami soli oraz buforami. Obecność cytrochromu c stwier301

dzono u prawie wszystkich organizmów posiadających łańcuch oddechowy. Występowanie innych cytochromów jest znacznie zróżnicowane. Cytochromy uczestniczą również w przenoszeniu elektronów na tlen. Oksydaza cytochromowa (cytochrom aa3) jest terminalną oksydazą, która reaguje z tlenem przekazując mu 4 elektrony:

Również szeroko rozpowszechniony wśród bakterii cytochrom o może wchodzić w reakcję z tlenem. Końcowe oksydazy w łańcuchu hamowane są przez cyjanek i tlenek węgla. Przez długi czas uważano, że cytochromy występują jedynie u organizmów tlenowych i fototrofów. Odkrycie cytochromu c3 u Desulfovibrio było więc zaskoczeniem. Jednak stwierdzenie, iż redukcja siarczanu przez bakterie redukujące siarczany wiąże się z fosforylacją oksydatywną w warunkach beztlenowych, pozwoliło zrozumieć, że formalnie rzecz biorąc, proces ten jest analogiczny do oddychania. Stosunkowo niedawno stwierdzono, że nawet aerotolerancyjne bakterie mlekowe Streptococcus lactis i Leuconostoc mesenteroides, jak również beztlenowiec Bifidobacterium, wytwarzają cytochrom, gdy hodować je w podłożu odżywczym zawierającym heminę lub krew. Cytochromy wykryto nawet w szczepach Selenemonas ruminantium, Veilonella alcalescens, Wolinella succinogenes, Clostridium formicoaceticum i C. thermoaceticum. Wydaje się zatem całkiem prawdopodobne, że i u innych ścisłych beztlenowców mogą występować cytochromy i skrócony łańcuch oddechowy.

Potencjał redoks. Transport wodoru i tlenu są procesami równoważnymi. Łańcuch oddechowy można rozpatrywać jako ciąg transportu elektronów, w którym składniki oscylują między stanem zredukowanym i utlenionym. Zachowują się zatem tak jak typowe katalizatory redoks. Można więc bezpośrednio zmierzyć (w przypadku cytochromów) lub pośrednio ustalić (dla NAD, FAD) ich potencjały redoks. Potencjał redoks jest miarą tendencji związku lub pierwiastka do oddawania elektronów i porównywany jest z potencjałem wodoru cząsteczkowego. Zgodnie z definicją półogniwo wodoru daje potencjał 0 (elektroda platynowa przy pH — 0 z H2 przy ciśnieniu atmosferycznym p =1,013 bara): Analogicznie jak potencjał pierwiastków, tak i potencjał oksydoredukcyjny można uporządkować w szereg. Dla połowicznej reakcji (jednakowy stopień utlenienia i redukcji) potencjał oksydoredukcyjny określa się jako Eo. W biochemii normalny potencjał E'o mierzy się przy pH 7,0. Dla tej wartości pH elektroda wodorowa wykazuje potencjał E'o równy —0,420 V.

302

a więc jest tym bardziej ujemny, im mniejszy jest stosunek substancji utlenionej do zredukowanej (ryc. 7.10B). Potencjał oksydoredukcyjny jest również miarą maksymalnej wydajności lub energii swobodnej ΔG0 określonej reakcji. Z różnicy potencjałów

303

oksydoredukcyjnych ΔE0 między dwoma reagującymi systemami można obliczyć energię swobodną przemiany ΔG0 według wzoru: Normalne potencjały Eo'składowych łańcucha oddechowego zawierają się w granicach od -0,32V dla układu NADH2/NAD, poprzez -0,08V dla flawoprotein (FADH2/FAD), -0,04V dla cytochromu b (Fe2+/Fe3+) do +0,81V dla Ο2-/1/2O2. Można również obliczyć normalne potencjały dla niektórych substratów: układ mleczan/pirogronian — 0,186V; jabłczan/szczawiooctan — 0,166V; bursztynian/fumaran — 0,03V. Dla reakcji gazu piorunującego, przy uwzględnieniu różnicy między normalnymi potencjałami H2 i O2 ( — 0,42 i +0,8IV = 1,23V) suma wolnej energii ΔG0' = —2x96,5x1,23= —237,4kJ/mol. Dla wodoru dostarczanego komórce na poziomie NADH2 różnica potencjału wynosi tylko (+0,81 V-[-0,32V])=1,13V i jest równoważna ΔG0'= -218kJ/mol. Podobnie z różnicy między potencjałami przenośników elektronów w łańcuchu oddechowym można obliczyć sumę energii swobodnej (tab. 7.4).

Uporządkowanie i funkcje układów redoks w łańcuchu oddechowym. Składniki łańcucha oddechowego można ustawić w pewien ciąg zależnie od ich potencjałów redoks, od NAD (ujemny potencjał) do oksydazy cytochromowej i tlenu (ryc. 7.11 A). Elektrony są przenoszone na tlen za pośrednictwem ciągu dużych kompleksów białkowych — reduktazy NADH-Q (zwanej również dehydrogenazą NADH), reduktazy cyto-

304

chromowej i oksydazy cytochromowej. Kompleksy te przekraczają szerokość błony cytoplazmatycznej utrzymując swoje grupy prostetyczne — flawiny, cytochromy, centra Fe-S — silnie związane i w określonej konfiguracji. Elektrony przekazywane są przez reduktazę NADH-Q za pośrednictwem zredukowanej formy ubichinonu (UQ-H2) do reduktazy cytochromowej. Białko to, zwane również kompleksem bcv składa się z cytochromu typu b, centrum Fe-S oraz cytochromu c,. UQ jest w dużym nadmiarze i przekazuje wodór wewnątrz dwuwarstwowej błony lipidowej. Cytochrom c jest peryferycznym białkiem błonowym. Oksydaza cytochromowa, przenosząca elektrony z cytochromu c na tlen, jest kompleksem białkowym zawierającym cytochrom a, cytochrom a3 oraz Cu. W łańcuchu oddechowym wodór będący substratem ulega zatem jonizacji; protony są usuwane przez kompleksy białkowe poza błonę, a elektrony — przekazywane na tlen. Kolejność układów redoks ustaloną na podstawie ich potencjałów redoks potwierdzono doświadczalnie w badaniach spektrofotometrycznych oraz z użyciem inhibitorów. Układ ten, który znajduje się w mitochondriach, rzadko występuje u tlenowych organizmów prokariotycznych. Kompleks bc1 jest odnajdywany w prawie wszystkich znanych łańcuchach oddechowych, lecz u niektórych bakterii występują rozgałęzione układy transportowe oraz wiele endooksydaz (ryc. 7.11B, C). Występują zatem cytochromy typu b zwane cytochromem o (oksydaza). Zajmują one miejsce kompleksu cytochrom aa3 i działają podobnie jak pompy protonowe. Inną alternatywną oksydazą jest cytochrom d. Rozgałęzienia mogą powstawać na poziomie puli chinonu lub kompleksu bc1 O tym, które odgałęzienie łańcucha oddechowego zostaje wytworzone, w dużej mierze decydują warunki środowiskowe, przede wszystkim ciśnienie parcjalne tlenu. Inhibitory łańcucha oddechowego. Łańcuch oddechowy jest hamowany lub blokowany przez różne trucizny komórkowe. Amytal, rotenon i piericydyna A hamują dehydrogenazę NADH. Antymycyna A blokuje transfer między cytochromami b i c. Cyjanek i tlenek węgla hamują jedynie oksydazę cytochromową; jon żelaza cytochromu c schowany jest tak głęboko wewnątrz cząsteczki białka, że nie reaguje z CN ~ ani CO. Swoiste działanie tych inhibitorów oraz opisane niżej zmiany w widmach absorpcji składników łańcucha oddechowego pozwoliły wyjaśnić funkcję łańcucha oddechowego.

306

Stosunek P/O i bilans energetyczny. Gdy przyjrzeć się potencjałom redoks (tab. 7.4), można zauważyć, że w łańcuchu oddechowym występują tylko trzy reakcje utlenienia dostarczające energii niezbędnej do syntezy wiązania wysokoenergetycznego. Tak więc w transferze 2[H] z NADH, do tlenu jedynie trzy przeniesienia elektronów sprzężone są z fosforylacją ADP do ATP, wobec czego najwyżej trzy cząsteczki fosforanu mogą być włączone do związków organicznych. Zależność ta nosi nazwę stosunku P/O (mol ATP/mol atomu tlenu). Gdy w mitochondriach zwierzęcych donorem wodoru dla NAD jest izocytrynian lub jabłczan, stosunek P/O wynosi 3. Dla bursztynianu stosunek ten wynosi tylko 2, gdyż wodór z bursztynianu wchodzi do łańcucha oddechowego na etapie flawoprotein. Stwierdzenie, że podczas transportu dwóch równoważników wodoru w łańcuchu oddechowym tworzą się trzy cząsteczki ATP pozwoliło na ustalenie bilansu energetycznego utlenienia glukozy. Zakładając, że jedna cząsteczka glukozy ulega całkowitej degradacji w szlakach fruktozobisfosforanowym i kwasów trikarboksylowych oraz, że cały wodór zostaje utleniony do wody, razem otrzymuje się: a) w cyklu fruktozobisfosforanowym: 2 NADH2; b) w odwodorowaniu pirogronianu: 2 NADH2; c) w cyklu kwasów trikarboksylowych: 2 x 3 NADH2 oraz 2 FADH2; łącznie więc 10 NADH2 oraz 2 FADH2. Przy stosunku P/O równym 3 (lub 2) zysk wynosi 10x3 + 2 x 2 = 34 cząsteczki ATP. Do tego należy doliczyć reszty ATP uzyskane w szlaku fruktozobisfosforanowym (2) oraz dwie reszty ATP wytworzone podczas utleniania α-ketoglutaranu, co łącznie daje 38 ATP. Wyliczenia te są prawdziwe dla mitochondriów i wielu bakterii. Jednakże w przypadku dużej liczby bakterii występują jedynie etapy fosforylacji związane z transferem wodoru z NADH2 na tlen, co powoduje, że stosunek P/O wynosi tylko 2. Tak jest w przypadku tlenowo rosnącej Escherichia coli; w wyniku tlenowego oddychania glukozowego powstaje jedynie 26 ATP. Fosforylacja w łańcuchu oddechowym. Tworzenie ATP w trakcie fosforylacji w łańcuchu oddechowym oraz w fosforylacji fotosyntetycznej zachodzi w błonach. Syntaza ATP, podobnie jak inne białka łańcucha oddechowego, jest składnikiem tych błon. Mechanizm sprzężenia procesów transferu wodoru i elektronów w łańcuchu oddechowym z powstawaniem ATP nie jest do końca znany. Wykazano jednak doświadczalnie, że 307

jedynie pęcherzyki lub inne całkowicie obłonione struktury posiadają zdolność wytwarzania ATP. Procesy transferu elektronów i wodoru są ściśle związane z translokacją protonów, co wydaje się niezbędnym warunkiem powstania ATP. Transport protonów. Gdy do beztlenowej zawiesiny mitochondriów lub bakterii wprowadzi się tlen, można stwierdzić spadek wartości pH podłoża. Na tej podstawie można wnioskować, że podczas oddychania

komórek bakteryjnych lub mitochondriów następuje wyrzucanie protonów do podłoża (ryc. 7.12A,B). W preparatach pęcherzyków, w których wewnętrzna powierzchnia błony bakteryjnej lub mitochondrialnej znajduje się na zewnątrz, zachodzi oddychanie charakteryzujące się odwróconym transportem protonów, powodując alkalizację podłoża (ryc. 7.12C). Przemieszczenie protonów powoduje powstanie gradientu elektrochemicznego. Wnętrze oddychającego mitochondrium lub bakterii jest alkaliczne

308

i elektroujemne względem otaczającego środowiska. Zarówno gradient pH, jak i gradient potencjału błonowego wywierają wpływ na powrotny ruch wyrzuconych protonów w kierunku wnętrza komórki. Na ten potencjał protonowy, zwany też siłą protonomotoryczną, składa się potencjał elektryczny błony (Δψ ) oraz różnica pH ( Δ H ) między wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnią błony:

gdzie Z=2,3Rt/F, tj. 59 mV w 25°C. Potencjał protonowy może zależeć wyłącznie od różnicy pH, wyłącznie od potencjału błonowego lub od obydwu tych czynników równocześnie. Dane eksperymentalne są zgodne z następującym obrazem: błona cytoplazmatyczna bakterii oraz wewnętrzna błona mitochondrium są nieprzepuszczalne dla jonów, w tym jonów H+ i OH- . Przewodnictwo elektryczne błony jest niskie. Budowa błony jest asymetryczna; chociaż podwójna warstwa lipidowa wydaje się symetryczna, rozmieszczenie funkcjonalnych białek błonowych (składniki łańcucha transportu elektronów, syntaza ATP, permeazy itp.) nadaje jednak błonie charakter asymetryczny. Przestrzenne rozmieszczenie cząsteczek enzymów powoduje ukierunkowaną wymianę substancji. Zgodnie z sugestią P. Mitchella, łańcuch oddechowy składa się z przenośników wodoru i elektronów, naprzemiennie ułożonych w błonie (ryc. 7.13). Utlenienie substratu pociąga za sobą zużycie 6 protonów po wewnętrznej stronie błony i ich uwolnienie po stronie zewnętrznej. Zakładając obecność trzech takich pętli, utlenienie NADH2 wiązałoby się z transportem 6 protonów na zewnątrz. Tego typu transport protonów napędzany oddychaniem wytwarza gradient elektrochemiczny między wewnętrzną a zewnętrzną powierzchnią błony, a potencjał protonowy jest siłą napędową fosforylacji, czyli regeneracji ATP. Biochemiczne zachowanie energii przez regenerację ATP jest zatem konsekwencją gradientu protonowego i towarzyszy mu wyrównywanie potencjału błonowego. Tak w skrócie wygląda teoria chemiosmotyczna. Regeneracja ATP z ADP i P nieorg . Synteza ATP z ADP i P n i e o r g jest katalizowana przez syntazę ATP. Enzym ten przetwarza energię z przepływu elektronów w wysokoenergetyczne wiązanie fosfoestrowe w ATP.

309

310

Enzym ten występuje we wszystkich błonach biorących udział w przetwarzaniu energii, mianowicie w błonach mitochondriów, chloroplastów oraz u bakterii. Jest to duże białko (względna masa cząsteczkowa 350xl0 3 ) o złożonej budowie. Składa się ono z główki utworzonej z pewnej liczby podjednostek, trzonu i podstawy. Ta ostatnia jest zakotwiczona w lipidowej części błony. Syntaza ATP usuwa cząsteczkę wody z ADP i fosforanu z wytworzeniem ATP. Nie wiadomo, w jaki sposób przepływ protonów lub gradient protonów przyczynia się do tej fosforylacji; jedna z możliwości zakłada powrotny przepływ protonów do wnętrza przez kanał lub por w cząsteczce enzymu, a uwalniana w tym procesie energia napędza reakcję fosforylacji. Syntaza ATP jest taka sama jak F1-ATPaza; obecność enzymu można wykazać w wyniku hydrolizy ATP wg reakcji ATP + H2O -> ADP + P nieorg + H - . Odwracalność reakcji katalizowanej przez syntazę ATP jest bardzo ważna dla komórki. Enzym ten uczestniczy, na przykład, w wytwarzaniu potencjału protonowego, wykorzystując ATP powstały w fosforylacji substratowej. Syntaza ATP pełni zatem rolę „pompy protonowej" lub „pompy elektrogennej". Odwracalność procesu zachodzącego we wnętrzu błony cytoplazmatycznej pozwala na wzajemne przekształcenia między potencjałem protonowym i ATP. Przekształcenia te mają istotne znaczenie dla sprzężonych procesów (transportu substratów, ruchu rzęsek i procesów biosyntezy), co ukazuje schemat:

Odwrócony transport elektronów. Szczególne problemy stoją przed bakteriami wykorzystującymi donory wodoru charakteryzujące się wyższymi potencjałami redoks niż nukleotydy pirydynowe. Zredukowane 311

nukleotydy pirydynowe są niezbędne w procesach syntezy, szczególnie w redukcji 3-fosfoglicerynianu podczas autotroficznego wiązania CO2. Nukleotydy te muszą więc ulegać redukcji nawet wtedy, gdy donorami wodoru są siarczki, tiosiarczan, siarka, azotyn lub Fe2+. Ponieważ bezpośrednia redukcja NAD przez wspomniane donory wodoru jest termodynamicznie niemożliwa, można przyjąć, że redukcja NAD w takim przypadku zachodzi w drodze zależnego od energii odwróconego transportu elektronów, napędzanego albo przez ATP, albo przez siłę protonomotoryczną oraz że odtworzenie ATP może zachodzić jedynie w końcowych etapach łańcucha oddechowego, tj. redukcji tlenu. Występowanie odwróconego transportu elektronów, połączonego z redukcją NAD, stwierdzono u Nitrobacter, Thiobacillus i Comamonas carboxydovorans. Toksyczny wpływ tlenu na tlenowce i beztlenowce. Tlen jest końcowym akceptorem elektronów w oddychaniu tlenowym i jest niezbędny dla wszystkich organizmów tlenowych. Toksyczność tlenu dla ścisłych tlenowców znana jest od czasów eksperymentów Pasteura nad fermentacją masłową u bakterii. Ze zdziwieniem jednak przyjęto fakt toksyczności tlenu wobec organizmów tlenowych i że większość tych organizmów ma enzymy chroniące przed toksycznymi produktami tlenu. W biologii wyróżnia się trzy rodzaje aktywacji tlenu, które można rozróżnić na podstawie liczby elektronów przekazanych na cząsteczkę tlenu: 1) O2 + 4e~ -» O2- + O22-

2) O2 + 2e~ -> O

3) O2 + l e - -> O2Reakcja 1) jest katalizowana przez oksydazę cytochromową, tj. końcowy enzym w łańcuchu transportu elektronów. Równocześnie prze2noszone są 4 elektrony, przyczyniając się do powstania dwóch jonów O . Każdy z tych jonów reaguje z dwoma protonami dając wodę. Oksydaza cytochromowa i kilka białek zawierających miedź (tyrozynaza, lakkaza) to jedyne enzymy katalizujące przeniesienie czterech elektronów na O2. Reakcja 2) jest charakterystyczna dla niektórych enzymów z grupą flawinową (oksydaza glukozowa, oksydaza aminokwasowa, oksydaza ksantynowa). Enzymy te równocześnie przenoszą dwa elektrony, redukując tlen do jonu ponadtlenkowego O 2 ~ , który następnie reaguje z protonami 312

dając ponadtlenek wodoru, H 2 O 2 . Nadtlenek ten jest toksyczny dla komórek, utleniając, na przykład, grupy SH. Działanie ochronne w tym względzie wykazują enzymy katalaza i peroksydaza:

Ponieważ flawoenzymy występują u wielu bakterii tlenowych i beztlenowych, zrozumiałe jest występowanie katalazy u większości tlenowców. Reakcja 3) katalizowana jest przez dużą liczbę oksydaz (oksydaza ksantynowa, oksydaza aldehydowa, oksydaza NADPH i inne). Przeniesieniu ulega tylko jeden elektron, z wytworzeniem jonu nadtlenkowego OJ. Aczkolwiek reakcja ta jest dla wspomnianych enzymów reakcją uboczną, rodnik ponadtlenkowy oraz produkt jego reakcji z H2O2 (O2- + H2O2 + Η + -» O2 + H2O + OH- ), rodnik hydroksylowy, są bardzo reaktywne i tworzą dalsze bardzo aktywne związki wewnątrz komórki. Przed działaniem rodników ponadtlenkowych chroni dysmutaza ponadtlenkowa.

Dysmutaza ponadtlenkowa razem z katalazą przeprowadza rodnik ponadtlenkowy do nieszkodliwego tlenu (stan podstawowy). Przyjmuje się, że jedynie te organizmy, które wytwarzają dysmutazę ponadtlenkową są zdolne do tolerowania tlenu. Enzym ten wykryto u wszystkich (prawie) dotychczas zbadanych bakterii aerotolerancyjnych. Jednakże, ponieważ ta dziedzina badań intensywnie się rozwija, należy na razie wstrzymać się od wszelkich innych uogólnień. Procesy transportu elektronów u bakterii beztlenowych. Organizmy chemoorganotroficzne w warunkach beztlenowych mogą odtwarzać energię biochemiczną (ATP) w drodze fermentacji oraz przez fosforylację w łańcuchu oddechowym w warunkach beztlenowych. Organizmy przeprowadzające fermentację wykorzystują jedynie ograniczoną liczbę reakcji prowadzących do odtworzenia ATP, zwanych fosforylacją substratową. Wiele bakterii przeprowadza fosforylację związaną z transportem elektronów nawet w warunkach beztlenowych, przenosząc elektrony pochodzące z substratu przez skrócony łańcuch transportu elektronów na

313

zewnętrzny (w podłożu odżywczym) lub wewnętrzny (powstający z degradacji substratu) akceptor elektronów. Do akceptorów tego typu należą jony azotanowe, siarczanowe, węglanowe i fumaranowe, jak również siarka. Na podstawie przeprowadzanych procesów bakterie klasyfikowane są do fizjologicznych grup bakterii redukujących azotan, bakterii denitryfikacyjnych, desulfurykacyjnych, metanogennych czy acetogennych i do bakterii redukujących siarkę. Wymienione grupy bakterii odgrywają ważną rolę w przyrodzie. Ponieważ fosforylację na poziomie transportu elektronów długo uważano za zasadniczy proces zdobywania energii, proces uzyskiwania energii w trakcie fosforylacji związanej z przenoszeniem elektronów w warunkach beztlenowych często nazywany jest „oddychaniem beztlenowym". Fosforylacja na poziomie transportu elektronów z fumaranem jako akceptorem elektronów nie jest ograniczona do bakterii, lecz występuje również u robaków i nawet ssaków. Na obecność tej reakcji, katalizowanej przez reduktazę fumaranową, wskazuje gromadzenie lub wydalanie bursztynianu.

7.5. Cykle pomocnicze i glukoneogeneza Odprowadzenie związków pośrednich z cyklu kwasów trikarboksylowych do reakcji biosyntezy stwarza konieczność ich odtworzenia. Dzieje się to w wyniku reakcji anaplerotycznych (uzupełniających), których zadaniem jest przede wszystkim odtworzenie szczawiooctanu, jako akceptora acetylo-CoA. Podczas wzrostu na pożywce z glukozą cukier ten może służyć jako prekursor do syntezy wszystkich elementów budulcowych zawierających glukozę, rybozę, deoksyrybozę i inne cukropochodne. W takim przypadku reakcje anaplerotyczne służą przede wszystkim uzupełnieniu cyklu kwasów trikarboksylowych. Podczas wzrostu w obecności laktozy, pirogronianu, octanu, glioksalanu i innych związków węglowych dla zapewnienia funkcjonowania cyklu kwasów trikarboksylowych oraz dostarczania produktów pośrednich do biosyntezy cukrowców (glukoneogeneza) niezbędne są dodatkowe szlaki metaboliczne. Glukoza jako substrat. Do najważniejszych reakcji anaplerotycznych służących uzupełnianiu cyklu kwasów trikarboksylowych, występujących 314

u zwierząt, roślin i drobnoustrojów, należy karboksylacja kwasów trójwęglowych (pirogronian, fosfoenolopirogronian) do szczawiooctanu (ryc. 7.14). W tkankach zwierzęcych (wątroba, nerki) oraz u niektórych przedstawicieli rodzaju Pseudomonas karboksylacja pirogronianu jest katalizowana przez karboksylazę pirogronianową: pirogronian + CO2 + ATP -» szczawiooctan + ADP + P nieorg . Najbardziej rozpowszechniona reakcja karboksylacji to przemiana fosfoenolopirogronianu katalizowana przez karboksylazę fosfoenolopirogronianową:

315

Mleczan, pirogronian i inne związki trójwęglowe jako substraty. Wzrost komórek na pirogronianie i pokrewnych związkach powoduje konieczność nie tylko uzupełnienia cyklu kwasów trikarboksylowych, lecz również syntezy glukozy i jej pochodnych. W syntezie cukrów (glukoneogenezie) uczestniczą te same związki pośrednie, co w glikolizie. Jednakże poszczególne reakcje kataboliczne przeprowadzane przez heksokinazę, 6-fosfofruktokinazę i kinazę pirogronianową są zastąpione przez reakcje enzymatyczne egzoergiczne w kierunku syntezy glukozy (ryc. 7.3). W tkankach zwierzęcych (wątroba, nerki) praktycznie nieodwracalna reakcja katalizowana przez kinazę pirogronianową jest zastąpiona przez karboksylację pirogronianu do szczawiooctanu, po której bezpośrednio następuje reakcja katalizowana przez karboksykinazę fosfoenolopirogronianową: szczawiooctan + GTP -> fosfoenolopirogronian + CO2 + GDP Proces syntezy fosfoenolopirogronianu z pirogronianu poprzez szczawiooctan zużywa dwa wiązania wysokoenergetyczne, jedno do karboksylacji pirogronianu i drugie do syntezy fosfoenolopirogronianu ze szczawiooctanu. Ostatnio stało się jasne, że odwrócona reakcja katalizowana przez karboksykinazę fosfoenolopirogronianową jest jedyną reakcją u ściśle beztlenowych bakterii (i robaków), w wyniku której ze związków trój węglowych powstaje szczawiooctan. W warunkach dużych stężeń dwutlenku węgla w środowisku reakcja przebiega głównie w kierunku tworzenia szczawiooctanu.

U Escherichia coli i niektórych innych bakterii pirogronian jest bezpośrednio fosforylowany przez syntetazę fosfoenolopirogronionową (ryc. 7.14).

Reakcja ta również zużywa dwa wiązania wysokoenergetyczne. Następująca po niej synteza szczawiooctanu jest katalizowana przez karboksylazę fosfoenolopirogronianową. U E. coli nie występuje karboksylaza pirogronianowa. Bakterie propionowe, Acetobacter aceti, Entamoeba histolytica i Fusobacterium symbiosus mają kolejny enzym tworzący fosfoenolopirogronian z pirogronianu, mianowicie dikinazę pirogronian: ortofosforan, który katalizuje odwracalną reakcję: 316

pirogronian + ATP + Pnieorg.-> fosfoenolopirogronian + AMP + PP nieorg . Należy zwrócić uwagę na to, że w tym przypadku bogate w energię wiązanie difosforanu zostaje zachowane. U roślin C4-dikarboksylowych (kukurydza i trzcina cukrowa) enzym ten jest odpowiedzialny również za syntezę fosfoenolopirogronianu, który następnie ulega przekształceniu do szczawiooctanu przez karboksylazę fosfoenolopirogronianową. Octan jako substrat. Drobnoustroje potrafią rosnąć wykorzystując octan oraz związki katabolizowane do octanu (kwasy tłuszczowe, węglowodory), które ulegają przemianom w cyklu glioksalowym (cykl Krebsa-Kornberga) (ryc. 7.15). Ten anaplerotyczny ciąg reakcji oparty jest na dwóch enzymach. Liaza izocytrynianowa rozszczepia izocytrynian do bursztynianu i glioksalanu:

Połączona aktywność liazy cytrynianowej i syntazy jabłczanowej prowadzi zatem do przekształcenia jednego mola izocytrynianu i jednego mola acetylo-CoA do dwóch moli czterowęglowych kwasów dikarboksylowych, które dalej mogą być przekształcone przez enzym jabłczanowy w pirogronian lub przez karboksykinazę fosfoenolopirogronianową do fosfoenolopirogronianu wykorzystywanego w glukoneogenezie. Z drugiej strony mogą one dostarczać szczawiooctanu do reakcji katalizowanej przez syntazę cytrynianową, a zatem prekursorów do reakcji biosyntezy. Cykl glioksalowy wydaje się mieć niewielkie znaczenie dla uzupełniania cyklu kwasów trikarboksylowych w trakcie metabolizmu glukozy, pirogronianu i innych związków trójwęglowych. Glioksalan jako substrat. Kiedy źródłem węgla jest glioksalan lub jego prekursory (glikolan, kwas moczowy), indukują one enzymy szlaku 317

D-glicerynianowego. Syntaza semialdehydu kwasu winowego (zwana również karboligazą glioksalanową) przekształca dwie cząsteczki glioksalanu w semialdehyd kwasu winowego z uwolnieniem dwóch reszt dwutlenku węgla. Z kolei swoista reduktaza przeprowadza aldehyd do D-glicerynianu, który ulega fosforylacji do 3-fosfoglicerynianu. Powstający acetylo-CoA wchodzi do cyklu kwasów trikarboksylowych, w którym jest utleniany (ryc. 7.16). Powstanie produktów pośrednich zapewnia aktywność syntazy jabłczanowej, która katalizuje

318

przekształcenie kolejnej cząsteczki glioksalanu oraz acetylo-CoA do jabłczanu. Podczas gdy enzymy głównych szlaków metabolicznych są zawsze obecne w rosnących komórkach, np. w obecności glukozy, te, które uczestniczą w cyklach pomocniczych, są indukowalne. W czasie wzrostu w obecności glukozy występują one w bardzo małych ilościach i trudno wykazać ich obecność. Mówi się wówczas o podstawowym poziomie aktywności enzymatycznej. Enzymy ulegają indukcji, gdy komórki przenieść do podłoża odżywczego z octanem lub glioksalanem jako jedynym źródłem węgla. Zawartość enzymów w pełni zaindukowanych komórkach może przekroczyć ich poziom podstawowy ponad stukrotnie. Mierząc poziom aktywności enzymu przed i po zmianie substratu można wykazać jego indukcję przez ten substrat. Tego typu wytwarzanie enzymu indukowane przez nowy substrat świadczy o jego roli w metabolizmie tego związku. Jednakże, ostateczny dowód można uzyskać stosując substrat znakowany izotopem i odzyskując znakowane atomy w pośrednich i końcowych produktach przemiany materii. Błędne jest przeświadczenie, że wszystkie enzymy uczestniczące w metabolizmie cukrów są stałą częścią składu enzymatycznego komórki, tj. są konstytutywne. Bakterie rosnące w obecności octanu wytwarzają np. tylko te enzymy, które potrzebne są w glukoneogenezie; w komórkach „octanowych" enzymy biorące udział w degradacji glukozy są prawie niewykrywalne. 319

Kiedy komórki mogą równocześnie korzystać z dwóch substratów, często zużywają tylko jeden z nich. Podczas wzrostu E. coli lub bakterii z grupy Pseudomonas w obecności glukozy i octanu najpierw zużywany jest pierwszy z tych związków. Enzymy uczestniczące w przekształceniach octanu nie są wytwarzane; ich indukcja nie zachodzi w obecności glukozy. Zjawisko to nosi nazwę katabolicznej represji enzymów uczestniczących w przemianach octanu. Regulacja syntezy enzymatycznej omówiona jest bardziej szczegółowo w rozdziale 16 — Regulacja metabolizmu.

7.6. Biosynteza niektórych niskocząsteczkowych składników Biosynteza aminokwasów. Większość drobnoustrojów, jak również rośliny, mają zdolność wytwarzania de ηονο wszystkich 20 aminokwasów potrzebnych do syntezy białek. Szkielety węglowe aminokwasów pochodzą z pośrednich związków w metabolizmie. Grupy aminowe wprowadzane są do nich w drodze bezpośredniej aminacji lub przez transaminację. Azot nieorganiczny wbudowywany jest do związków organicznych jedynie za pośrednictwem amoniaku. Asymilację azotanu, azotynu i azotu cząsteczkowego poprzedza ich redukcja do amoniaku, który następnie jest wbudowywany do związków organicznych (ryc. 7.17; (1),(2),(3)). Tylko nieliczne aminokwasy powstają w drodze bezpośredniej aminacji przez wolne jony amonowe. W pierwotnej asymilacji amonu uczestniczą dehydrogenaza L-glutaminianowa (6) i dehydrogenaza L-alaninowa (7). Enzymy te katalizują reduktywną aminację odpowiednich α-ketokwasów bez udziału ATP. W powstaniu glutaminy z glutaminianu bierze udział syntetaza glutaminowa (4). Enzym ten charakteryzuje się znacznie wyższym powinowactwem (niższym Km) do jonów amonowych niż wspomniane dehydrogenazy, jest zatem aktywny przy bardzo małych stężeniach NH42+. Synteza glutaminy wymaga ATP. Grupa amidowa może być przy udziale syntazy glutaminianowej przeniesiona na α-ketoglutaran (5). Ten system włączania azotu amonowego do związków organicznych wydaje się zawsze wykorzystywany przez bakterie i rośliny, gdy stężenie dostępnych jonów amonowych jest bardzo małe (poniżej 1 mmola/litr), a szczególnie podczas wiązania azotu. Większość z pozostałych aminokwasów otrzymuje grupę aminową przez transaminację z aminokwasu pierwotnego. Wśród wolnych amino-

320

kwasów w cytoplazmie dominuje kwas glutaminowy (ponad 50% puli aminokwasowej). Szlaki syntezy 20 aminokwasów u bakterii zostały bardzo dobrze zbadane. Rozpoczynają się one od prostych związków metabolizmu pośredniego (pirogronian, α-ketoglutaran, szczawiooctan lub fumaran, erytrozo-4-fosforan, rybozo-5-fosforan i ATP). W przypadku większości aminokwasów, wbudowanie grupy aminowej w drodze transaminacji jest ostatnim etapem szlaku biosyntetycznego. Niektóre aminokwasy powstają bez transaminacji, w wyniku przemian aminokwasów będących prekursorami. Na podstawie wspólnych szlaków biosyntetycznych aminokwasy można podzielić na kilka grup (ryc. 7.18). Na syntezę różnych aminokwasów składa się różna liczba etapów enzymatycznych. Należy zauważyć, że aminokwasy niezbędne dla ludzi u innych organizmów powstają w wyniku bardzo złożonych szlaków syntezy. Szybkość, z jaką zbadano te i inne szlaki biosyntetyczne, zawdzięczamy auksotroficznym mutantom bakterii i grzybów. U wielu mutantów auksotrofa jest wynikiem utraty zdolności wytwarzania enzymu uczestniczącego w biosyntezie i rosną one dopiero po dostarczeniu im produktu końcowego zablokowanego szlaku. Mutanty tego typu wykazują inną korzystną cechę: rosną nie tylko na końcowym produkcie zablokowanego szlaku, lecz również wykorzystują metabolity pośrednie pomiędzy zablokowanym etapem a produktem końcowym. Z drugiej strony, substrat 321

brakującego (lub nieaktywnego) enzymu często jest wydzielany, np. gdy brak enzymu b, może być wydzielany produkt B:

Niektóre mutanty mogą zatem „karmić" inne mutanty mające zablokowany inny etap tego samego szlaku syntezy; mutant z blokiem późniejszym (brak enzymu d) może dostarczać niezbędnego produktu pośredniego mutantowi z wcześniejszym blokiem (w enzymie b). W eksperymentach 322

polegających na żywieniu krzyżowym, mutanty w danym szlaku biosyntetycznym można ustawić w szereg, w którym jeden mutant dostarcza substancji odżywczych następnemu. W ten sposób, izolując wydzielane produkty pośrednie, oczyszczając enzymy uczestniczące w biosyntezie i stosując inne metody, prześledzono przebieg wielu szlaków biosyntetycznych. Biosynteza nukleotydów. Nukleotydy purynowe i pirymidynowe są podstawowymi jednostkami strukturalnymi kwasów nukleinowych; wchodzą one również w skład wielu koenzymów i uczestniczą w aktywacji i transferze grup aminowych, cukrów, składników osłon komórkowych oraz lipidów. Synteza nukleotydów purynowych przebiega na tej samej drodze, która rozdziela się dopiero od inozynomonofosforanu, prowadząc do adeniny i guaniny. Nukleotydy pirymidynowe również syntetyzowane są w pojedynczym szlaku, który rozgałęzia się na poziomie kwasu urydylowego. Część pentozowa nukleotydu pochodzi od rybozo-5-fosforanu, który może powstać albo oksydatywnie z glukozo-6-fosforanu przy współudziale szlaku pentozofosforanowego, albo nie-oksydatywnie z fruktozo-6-fosforanu i aldehydu fosfoglicerynowego w reakcji transaldolazotransketolazowej (rozdz. 7.2.2). Rybozo-5-fosforan jest wykorzystywany do syntezy nukleotydów purynowych i pirymidynowych w energetycznie bogatej formie fosforybozylodifosforanu. Redukcja rybozy do deoksyrybozy zachodzi na poziomie rybonukleotydu i może przebiegać różnymi drogami. Biosynteza lipidów. Tłuszcze i lipidy są ważnymi składnikami błony cytoplazmatycznej i osłon komórkowych, służą też jako substancje zapasowe. Wśród lipidów bakteryjnych dominują długołańcuchowe (C 14 -C 18 ) nasycone i jednonienasycone kwasy tłuszczowe; wielonienasyconych kwasów tłuszczowych i steroidów prawie się nie spotyka, a triglicerydy występują rzadko. Duże znaczenie mają lipidy złożone; składają się one z glicerolu, którego dwie grupy hydroksylowe są estrowane kwasami tłuszczowymi. Trzecia grupa hydroksylowa glicerolu jest estrowana fosforanem lub cukrem. Z kolei grupa fosforanowa związana jest z seryną, etanoloaminą lub glicerolem. Do tej grupy lipidów należą, występujące u wielu bakterii, fosfatydyloinozytol, fosfatydyloglicerol i fosfatydyloetanoloamina.

323

Biosynteza długołańcuchowych kwasów tłuszczowych polega na dołączaniu i redukcji grup octanowych. W celu przyśpieszenia reakcji grupa metylowa acetylo-CoA najpierw ulega karboksylacji w reakcji zależnej od biotyny do malonylo-CoA:

W kolejnych reakcjach kondensacji grupa karboksylowa zostaje ponownie uwolniona w postaci dwutlenku węgla. Syntezę kwasów tłuszczowych przeprowadza kompleks wielu enzymów, zgodnie z następującą reakcją:

7.7. Pobieranie substancji przez komórkę Zanim substancje odżywcze zostaną wykorzystane przez komórkę muszą najpierw przedostać się przez osłony komórkowe. Osłony te nie są dużą przeszkodą dla małych cząsteczek i jonów, lecz zatrzymują związki o względnej masie cząsteczkowej powyżej 600. O transporcie substancji odżywczych do komórki decyduje przede wszystkim błona cytoplazmatyczna. Transport substancji odżywczych przez błonę cytoplazmatyczną przeważnie jest swoisty; pobierane są jedynie te składniki, dla których istnieją systemy transportu (ryc. 2.21 oraz 7.19). Poza kilkoma wyjątkami, transport jest procesem swoistym, zależnym od permeaz i translokaz. Są to białka błonowe, a ich nazwy wskazują na właściwości enzymatyczne: mogą być indukowalne przez substrat, są substratowo swoiste i wytwarzane są jedynie w warunkach pozwalających na syntezę białka. Określenie „transport" w biologii komórki ma kilka całkiem różnych znaczeń. Rozpatrując jedynie te procesy, które odbywają się w błonie cytoplazmatycznej, możemy rozróżnić dwa rodzaje transportu: pierwotny i wtórny. Transport pierwotny obejmuje te procesy, które prowadzą do + + + przemieszczenia takich jonów, jak H , Na , czy K , a zatem powodują zmiany potencjału elektrochemicznego. Transport pierwotny jest napędzany przenoszeniem elektronów w oddychaniu lub fotosyntezie, pompami 324

jonowymi zależnymi od ATP (ATPazy) lub pompami jonowymi uruchamianymi w wyniku dekarboksylacji różnego typu metabolitów (szczawiooctan, metylomalonylo-CoA, glutakonylo-CoA). Termin transport wtórny określa wszystkie procesy powodujące pobieranie przez komórkę lub wypływanie z niej metabolitów i jonów.

325

Wszystkie opisane w tej części procesy napędzane potencjałem elektrochemicznym należą do transportu wtórnego. Można rozróżnić kilka typów mechanizmów pobierania substancji do komórki. Dwa z nich powodują jedynie transport substancji do komórki bez ich akumulacji wewnątrz niej. Z drugiej strony, szereg procesów tzw. transportu aktywnego prowadzi do wewnątrzkomórkowego nagromadzania się transportowanych związków (ryc. 7. 19, 7.20). Dyfuzja prosta (bierna). Termin ten określa nieswoistą penetrację substancji do komórki. Penetracja ta zależy od wielkości cząsteczki oraz jej lipofilności. Szybkość tego rodzaju transportu jest mała. Nigdy nie wykazano pobierania cukrów w drodze dyfuzji prostej. Z tej drogi korzysta woda oraz najprawdopodobniej niepolarne trucizny, inhibitory i inne substancje będące obce dla komórki. Dyfuzja ułatwiona. W dyfuzji ułatwionej dana substancja jest transportowana do komórki zgodnie z gradientem jej stężenia, tj. w kierunku wyrównania stężeń wewnątrz i na zewnątrz komórki. W procesie tym uczestniczy swoista pod względem substratu permeaza, a jego szybkość w szerokim zakresie wartości zależy od stężenia substratu w podłożu (ryc. 7.20). Dyfuzja ułatwiona jest niezależna od energii uzyskiwany z metabolizmu, a substancje nie mogą wnikać do komórki tą drogą wbrew gradientowi stężenia. Transport aktywny. W transporcie aktywnym i translokacji grupowej, tak jak w dyfuzji ułatwionej, uczestniczą białka swoiste pod względem substratu. Te rodzaje transportu różnią się jednak od dyfuzji ułatwionej tym, że wymagają nakładu energii. W obecności źródła energii pochodzącej z metabolizmu, substrat może akumulować się wewnątrz komórki wbrew gradientowi stężenia. Zasadnicza różnica między transportem aktywnym a translokacją grupową polega na charakterze produktu uwalnianego wewnątrz komórki. W transporcie aktywnym cząsteczka uwalniana w cytoplazmie jest taka sama jak na zewnątrz komórki. W translokacji grupowej cząsteczka w trakcie wchodzenia do komórki ulega modyfikacji, np. fosforylacji. Wszystkie przedstawione modele transportu aktywnego zakładają obecność w błonie cytoplazmatycznej swoistych białek transportowych. Białka te noszą nazwy wskazujące na ich przypuszczalne funkcje: permeazy, translokazy, białka translokujące lub przenośnikowe. Procesy

326

transportu rozróżniane są przede wszystkim na podstawie źródła potrzebnej energii: potencjału protonowego Δp (ryc. 7.21), ATP lub fosfoenolopirogronianu (ryc. 7.19 i 7.21). Transport wielu substancji, w tym jonów organicznych i nieorganicznych oraz cukrów, napędzany jest potencjałem protonowym Δρ (rozdz. 7.4). Komórka bakteryjna utrzymuje stały potencjał protonowy przez + ciągłe wypompowywanie na zewnątrz protonów i innych jonów (Na ). W błonie cytoplazmatycznej znajdują się swoiste białka transportowe. Każde z tych białek ma odrębne właściwości. Jedno z nich, na przykład, katalizuje równoczesne przeniesienie cząsteczki cukru (laktozy, melibiozy lub glukozy) oraz protonu w tym samym kierunku. Jest to symport dwóch (lub więcej) substancji. Inne białka transportowe katalizują równoczesne przeniesienie dwóch substancji w kierunkach 327

przeciwnych, np. protonu i innego jonu (Na+ lub kwasu organicznego). Proces ten nosi nazwę antyportu. Jony napędzające wnikanie cukrów do komórki to prawdopodobnie zawsze H+ lub Na+. Wydaje się, że u Prokaryota dominuje symport sprzęgnięty z H+, a u Eukaryota — symport sprzęgnięty z Na+. Obecność białek transportowych w komórce bakteryjnej wykazano: a) izolując i wbudowując oczyszczone białko przenośnikowe do protoplastów lub liposomów, b) otrzymując mutanty defektywne pozbawione danego białka oraz jego swoistej funkcji. Transport aktywny napędzany potencjałem protonowym prawdopodobnie jest najpowszechniejszym mechanizmem czynnego pobierania substratów metabolicznych. Założenie, że w transporcie jonów uczestniczą swoiste białka transportowe, zostało poparte obserwacjami dotyczącymi antybiotyków oraz syntetycznych substancji zwanych jonoforami. Jonofory są to substancje niskocząsteczkowe (500-2000) o hydrofobowej powierzchni i hydrofilowym wnętrzu. Dyfundują one do błony lipidowej na skutek hydrofobowości. Do najlepiej znanych antybiotyków będących jonoforami należy walinomycyna: dyfunduje ona do błony i tam katalizuje transport (uniport) K+, Cs + , Rb + lub NH4+. Działanie walinomycyny w obecności tych jonów w podłożu prowadzi zatem do wyrównania ładunków i załamania się potencjału protonowego. Inne jonofory tworzą kanały, przez które mogą przechodzić jony. Są również związki syntetyczne zwiększające przewodność protonową błony. Związki te, zwane rozprzęgaczami, odłączają syntezę ATP od transportu elektronów, ponieważ protony transportowane są do komórki bez udziału syntazy ATP. Badania dotyczące transportu przez błony dostarczyły ważnych danych potwierdzających teorię chemiosmotyczną przekształcenia energii.

Oprócz systemów transportu zależnych od potencjału protonowego istnieją inne, zależne od ATP. W systemach tych uczestniczą peryplazmatyczne białka wiążące (ryc. 2.29). Błona cytoplazmatyczna komórek zwierzęcych nie transportuje protonów i nie wytwarza gradientu pH. Potencjał błonowy prawdopodobnie powstaje przy udziale mechanizmów zależnych od ATP, takich jak pompa sodowo-potasowa, a powstający potencjał Na+ napędza symport Na+/substancja odżywcza. Translokacja grupowa. W translokacji grupowej transportowana cząsteczka jest chemicznie modyfikowana. Pobrany cukier, na przykład, dostarczany jest do wnętrza komórki w postaci fosfocukru. Glukoza, fruktoza, mannoza i inne węglowodany są pobierane za pośrednictwem systemu fosfotransferazowego zależnego od fosfoenolopirogronianu (PTS). W translokacji grupowej uczestniczą cztery enzymy (ryc. 7.22). Enzym II jest integralnym białkiem błony, który tworzy kanał i katalizuje fosforylację

328

cukru. Grupa fosforanowa nie pochodzi bezpośrednio od PEP, lecz zostaje najpierw przekazana przez enzym I do małego, termostabilnego białka, zwanego HPr. Ufosforylowana forma HPr (HPr ~ P) reaguje z enzymem III, peryferycznym białkiem błony, od którego enzym II odbiera grupę fosforanową i przenosi ją na cukier. Enzymy błonowe II i III są swoiste dla poszczególnych cukrów, podczas gdy enzym I i HPr uczestniczą we wszystkich procesach przenoszenia (translokacji) cukrów z udziałem PTS. W transporcie niektórych cukrów nie uczestniczy enzym III. Złożoność PTS wskazuje na to, że nie tylko uczestniczy on w transporcie cukrów, lecz może również mieć rolę regulatorową. Na przykład, cukry pobierane z udziałem PTS hamują pobieranie i równoczesne wykorzystanie innych cukrów (rozdz. 16.1.3. — represja kataboliczna). Wypływ substancji. O wydzielaniu substancji do podłoża wiadomo jeszcze mniej niż o mechanizmach pobierania. Prawdopodobnie odgrywają tu rolę zarówno procesy transportu, jak i niekontrolowana dyfuzja. Wydzielanie zachodzi w przypadku nadprodukcji i akumulowania substancji w dużych stężeniach wewnątrz komórki. Akumulacja taka może być skutkiem niepełnego utlenienia, wadliwej regulacji metabolizmu lub procesów fermentacji. Transport żelaza. Żelazo jest makroelementem pobieranym przez komórki drobnoustrojów z udziałem wyspecjalizowanych mechanizmów. W warunkach beztlenowych żelazo występuje w postaci jonu dwuwartościowego -1 (II), a jego stężenie osiąga wartość 10 mola/l, co nie ogranicza wzrostu. W warunkach tlenowych, przy pH 7,0 żelazo występuje w postaci praktycznie nierozpuszczalnego wodorotlenku żelaza(III); jego stężenie

329

nie przekracza 10 l8 mola/l. Nie jest więc dziwne, że drobnoustroje wydzielają substancje przeprowadzające żelazo w formę rozpuszczalną — powstałe kompleksy zawierające Fe3+ transportowane są do komórki. Substancje tego typu noszą nazwę sideroforów. Są one, prawie bez wyjątku, niskocząsteczkowymi substancjami (względna masa cząsteczkowa poniżej 1500) rozpuszczalnymi w wodzie, wiążącymi żelazo z bardzo wysoką swoistością i powinowactwem (stała stabilności 1030). Pod względem budowy chemicznej związki te zalicza się do związków fenolowych oraz hydroksamatów. Do pierwszej z tych grup należy enterobaktyna, mająca sześć fenolowych grup hydroksylowych. Związek ten wydzielają niektóre bakterie jelitowe. Forma enterobaktyny wolna od żelaza jest wydzielana do podłoża, gdzie wiąże się z żelazem. Komórka pobiera powstały kompleks ferrienterobaktyny. Wewnątrz komórki żelazo jest uwalniane przez enzymatyczną hydrolizę kompleksu (ryc. 7.23). Zielonożółte fluoryzujące pigmenty wydzielane przez Pseudomonas putida i P. aeruginosa również mają charakter sideroforów. Wiele grzybów wytwarza w tym samym celu ferrichromy; związki te należą do sideroforów hydroksamowych. Są to pierścieniowe heksapeptydy wiążące żelazo trójwartościowe za pośrednictwem trzech grup hydroksamowych. Związki te również są wydzielane do podłoża w formie wolnej od żelaza, a po połączeniu z nim pobierane są do komórki w postaci ferrichromów. Wewnątrz komórki żelazo jest redukowane do

330

Fe2+, do którego ferrichrom ma bardzo niskie powinowactwo. Podobne funkcje mają ferrioksamina (u promieniowców), mikobaktyna (w prądkach) oraz egzochelina (również u bakterii śluzowych). Drobnoustroje wytwarzają siderofory zazwyczaj tylko wtedy, gdy nikła dostępność żelaza, ogranicza wzrost. Wydzielanie jest wynikiem derepresji syntezy sideroforów. W obecności rozpuszczalnych, skompleksowanych form żelaza siderofory są syntetyzowane tylko w małych ilościach i pozostają wewnątrz osłon komórkowych, gdzie uczestniczą w transporcie żelaza do wnętrza komórki. W tym kontekście interesujące jest, że do naturalnych mechanizmów obronnych organizmów wyższych należą metody pozbawiające środowisko wolnego żelaza. Organizm wytwarza białka wiążące żelazo, które wiążą je tak ściśle, że staje się ono niedostępne dla drobnoustrojów, hamując zatem ich wzrost. Związki tego typu występują w białku jaja kurzego (konalbumina), w mleku, wydzielinach kanalika łzowego i gruczołów śliniankowych (laktotransferyna) oraz w surowicy krwi (serotransferyna). W związku z tym, bakterie wszczepione do jaja kurzego będą rosnąć tylko wtedy, jeśli równocześnie podamy żelazo w formie cytrynianu amonowo-żelazowego. Innymi słowy, żelazo odgrywa bardzo ważną rolę w walce między bakteriami i organizmami wyższymi. W walce tej zwycięża organizm wytwarzający substancję chelatującą, charakteryzującą się silniejszym powinowactwem do żelaza.

WAŻNIEJSZE PROCESY FERMENTACYJNE

Gdziekolwiek w przyrodzie znajdują się związki organiczne i równocześnie brak jest tlenu, tam jest duże prawdopodobieństwo wystąpienia drobnoustrojów fermentujących. Bakterie zdolne do fermentacji inicjują rozkład polimerów znajdujących się w warunkach niedostępnych dla tlenu. W środowiskach pozbawionych tlenu (anoksygenowych) szybko zaczynają dominować (o ile pozostałe warunki będą korzystne) bakterie fermentujące. Ilościowo dominującym biopolimerem fermentowanym w osadach jezior, stawów itp. jest celuloza. Większa część celulozy spożytej przez zwierzęta roślinożerne zostaje wydalona w nie zmienionej postaci. Jeśli celuloza ta znajdzie się następnie w strefie anoksygenowej, jest fermentowana przez

332

klostridia i inne ściśle beztlenowe organizmy. Powstające produkty fermentacji, jak alkohole, kwasy organiczne, dwutlenek węgla i wodór, stają się dostępne dla innych bakterii i archeonów. Te z kolei, w drodze swoistych fermentacji lub oddychania beztlenowego, mogą wytwarzać metan i, w obecności siarczanu, siarkowodór. Fermentacje te zatem zapoczątkowują beztlenowy łańcuch pokarmowy. W osadach na dnie słodkowodnych jezior oraz w żwaczu przeżuwaczy wodór i octan ulegają fermentacji do metanu, prowadzonej przez archeony metanogenne. W morskich ekosystemach anoksygenowych bakterie sulfidogenne (oddychanie siarkowe) przeprowadzają wodór i siarkę do siarkowodoru. Organizmy przeprowadzające od tysięcy lat procesy fermentacyjne wykorzystuje się do przetwarzania i przechowywania żywności. Znane przykłady to browarnictwo, produkcja wina, powstawanie kwasu mlekowego, jogurtu, kiszonej kapusty, kiszonki, sery i drożdże piekarniane. Wiele organizmów fermentujących to względne beztlenowce rosnące zarówno w obecności, jak i braku tlenu. Tlen nie odgrywa roli w procesach fermentacyjnych i stwierdzenie Louisa Pasteura „La fermentation c'est la vie sans l'air" nie podlega dyskusji w naukach podstawowych. Z drugiej strony, termin „fermentacja" w mikrobiologii przemysłowej (dziś często nazywanej biotechnologią) jest rozumiany nieco szerzej. Ponieważ urządzenia stosowane w hodowli na dużą skalę w warunkach tlenowych — do produkcji biomasy lub metabolitów — są takie same, jak w klasycznych fermentacjach beztlenowych, procesy te również noszą nazwę „fermentacji". Fermentacja. Fermentacja jest rozumiana jako proces metaboliczny służący odtworzeniu ATP, w którym produkty rozkładu substratów organicznych pełnią równocześnie rolę donorów i akceptorów wodoru. Reakcje prowadzące do fosforylacji ADP mają charakter utleniania. Utlenione związki węgla opuszczają komórkę w postaci dwutlenku węgla. Poszczególne etapy utleniania polegają na odwodorowaniu z równoczesnym przekazaniem wodoru do kofaktora typu NAD. Produkty pośrednie powstające na skutek degradacji substratu służą z kolei jako akceptory wodoru pochodzącego z NADH2. Zredukowane produkty utworzone w wyniku regeneracji NAD są wydzielane. Podczas fermentacji węglowodanów i niektórych innych związków powstają, pojedynczo bądź w różnych układach, następujące produkty: etanol, mleczan, maślan, bursztynian, kapronian, octan, n-butanol, 2,3-

333

-butanodiol, aceton, izopropanol, dwutlenek węgla i wodór cząsteczkowy. Poszczególne rodzaje fermentacji mają zazwyczaj nazwy pochodzące od dominującego, charakterystycznego produktu końcowego. Są więc fermentacje alkoholowe, mlekowe, propionowe, mrówkowe, masłowe i octowe. Odtworzenie ATP w drodze fermentacji. Podczas fermentacji glukozy przez drobnoustroje mogą powstać od jednej do czterech cząsteczek ATP:

Biorąc pod uwagę ogromną liczbę możliwych produktów fermentacji, wydaje się dziwne, że jedynie kilka reakcji uczestniczy w przetwarzaniu energii na poziomie fosforylacji substratu. Obecnie poznamy trzy najważniejsze:

Większość organizmów przeprowadzających fermentacje wykorzystuje jedynie reakcję (1), katalizowaną przez kinazę fosfoglicerynianową, i reakcję (2) przeprowadzaną przez kinazę pirogronianową, a niezbędnymi akceptorami wodoru są pirogronian oraz związki syntetyzowane z acetylokoenzymu A. Podczas fermentacji 1 mola glukozy powstaje jedynie 2 (do 4) moli ATP oraz następujące produkty: mleczan, etanol, aceton, maślan, n-butanol, izopropanol, 2,3-butanodiol, kapronian, octan, dwutlenek węgla i wodór cząsteczkowy. Wykorzystanie kinazy octanowej (reakcja 3) daje możliwość utworze334

nia dodatkowego ATP. Z acetylokoenzymu A, przy współudziale acetylotransferazy fosforanowej, powstaje acetylofosforan.

Acetylofosforan może również powstać z fosfocukrów (ksylulozo-5-fosforan, fruktozo-6-fosforan) w wyniku reakcji katalizowanych przez fosfoketolazę. To, czy bakteria może wykorzystać kinazę octanową, czy nie, najprawdopodobniej zależy od jej zdolności do wytwarzania wodoru cząsteczkowego. Komórki przeprowadzące fermentację nie muszą syntetyzować akceptorów wodoru dla równoważników redukujących (elektronów), gdyż są one przenoszone na protony i uwalniane w postaci wodoru cząsteczkowego. Aby zrozumieć te zależności, należy omówić mechanizmy umożliwiające uwalnianie H2. Bakterie beztlenowe mogą utleniać pirogronian do acetylo-CoA dwoma sposobami (patrz utlenianie pirogronianu, reakcje (2) i (3) w rozdz. 7.2.4). W reakcji typu „klostridium" katalizowanej przez oksydoreduktazę pirogronian:ferredoksyna redukcji ulega ferredoksyna. Jej potencjał redoks jest tak niski (E'o, —420 mV), że wodór może powstać na skutek aktywności specjalnej hydrogenazy, oksydoreduktazy ferredoksyna: H2:

W reakcji katalizowanej przez acetylotransferazę mrówczanową (typ enterobakteryjny) obok acetylokoenzymu A powstaje mrówczan, który następnie z udziałem liazy wodorowej ulega rozszczepieniu:

Obydwa mechanizmy uwalniania H2 przebiegają z wytworzeniem produktów pośrednich (FdH i mrówczan) charakteryzujących się bardzo niskimi potencjałami redoks, tak że równoważniki redukujące powstające w wyniku utleniania pirogronianu do acetylo-CoA mogą być uwalniane przez komórkę bez większego uszczerbku. Powyższe reakcje można porównać z zachodzącą u większości bakterii beztlenowych reakcją odwodorowania aldehydu 3-fosfoglicerynowego. Wodór związany w NADH2 jest przekazywany do akceptorów organicznych. Jednakże wiele bakterii ma zdolność uwalniania w postaci wodoru

335

również tych redukcyjnych równoważników. Zachodzi to z udziałem oksydoreduktazy przenoszącej wodór z NADH2 na ferredoksynę: NADH2 + 2Fd -» NAD + 2FdH Wodór jest uwalniany z FdH przez hydrogenazę. Ponieważ powyższa reakcja wiąże się ze zmianą w kierunku bardziej ujemnego potencjału redoks (od E'0, - 320 mV dla NADH2 do E'o, -420 mV dla ferredoksyny), równowaga reakcji nie sprzyja wydzielaniu wodoru. Przebiega ona jedynie pod warunkiem ciągłego jego usuwania. W związku z tym, organizmy, które mają potencjalną zdolność wytwarzania H2 z NADH2, mogą wykorzystywać ten mechanizm jedynie wtedy, gdy rosną razem z organizmami, które wykorzystują wodór cząsteczkowy. Zjawisko to spotykane jest w przyrodzie i nosi nazwę międzygatunkowego przekazu wodoru, jako szczególny przypadek symbiozy między drobnoustrojami. Bakterie, które uwalniają wodór w postaci H2 z NADH2 jak opisano wyżej, nie muszą wykorzystywać acetylo-CoA jako akceptora wodoru z NADH2. Mogą zatem przekształcać acetylo-CoA do acetylofosforanu i następnie uzyskiwać ATP w reakcji z udziałem kinazy octanowej. W ten sposób z fermentacji jednego mola glukozy mogą uzyskiwać do 4 moli ATP (Ruminococcus albus; podrozdz. 8.5), wydzielając octan jako produkt końcowy. Rola fermentacji w przyrodzie. Organizmy fermentujące odgrywają bardzo istotną rolę w cyklach metabolicznych w przyrodzie. Celuloza występująca w strefach beztlenowych osadów dennych ulega fermentacji do wspomnianych wyżej produktów końcowych, w których prawie zawsze obecny jest wodór. Wodór przeto jest w środku beztlenowego łańcucha pokarmowego, a głównymi produktami są metan i/lub siarkowodór:

W osadach wód słodkich oraz w żwaczu przeżuwaczy wodór ulega przekształceniu do metanu przez metanogenne archeony, a w beztlenowych ekosystemach morskich wodór i siarczan są przetwarzane w siarkowodór przez bakterie redukujące siarczan.

336

8.1. Fermentacje alkoholowe u drożdży i bakterii Fermentacja cukrów z wytworzeniem etanolu jest szeroko rozpowszechniona wśród drobnoustrojów. W warunkach beztlenowych nawet rośliny i wiele grzybów akumulują etanol. Głównym producentem etanolu są grzyby, szczególnie szczepy Saccharomyces cerevisiae. Drożdże, tak jak większość grzybów, oddychają tlenowo, ale w warunkach beztlenowych fermentują węglowodany do etanolu i dwutlenku węgla. Wiele beztlenowych lub względnie tlenowych bakterii również wytwarza etanol jako główny lub uboczny produkt fermentacji heksoz i pentoz.

Produkcja etanolu przez drożdże Drożdże są ulubionym obiektem badań nad podstawowymi szlakami metabolicznymi. Prowadzone przez nie przejście glukozy do etanolu zostało wykazane już w roku 1815 przez Gay-Lussaca:

Zwykła fermentacja glukozy przez drożdże. Drożdże {Saccharomyces cerevisiae) fermentują glukozę do etanolu i dwutlenku węgla w szlaku fruktozobisfosforanowym. Przejście pirogronianu w etanol jest procesem dwuetapowym. W pierwszym etapie dekarboksylaza pirogronianowa, przy współudziale pirofosforanu tiaminy, przeprowadza pirogronian do aldehydu octowego (1). Aldehyd octowy z kolei ulega redukcji do

337

Historia badań nad fermentacją u drożdży. Pominiemy w tym miejscu wczesne rozważania, czy wytwarzanie etanolu z cukru wymaga udziału żywych organizmów, czy jest wynikiem chemicznej katalizy. Kwestię tę ostatecznie rozstrzygnął Louis Pasteur, który wykazał również, że drożdże w warunkach tlenowych produkują dwudziestokrotnie więcej materiału komórkowego z danej ilości cukru niż w warunkach beztlenowych. Wykazanie, że w obecności tlenu proces fermentacji zostaje zahamowany, tzw. efekt Pasteura, stało się modelowym przykładem regulacji metabolicznej. W latach 1896-1897 Buchner i Hann zaobserwowali, że ekstrakt otrzymany po roztarciu krzemionką i piaskiem prasowanych drożdży browarniczych pienił się po dodaniu cukru. Był to w istocie pierwszy przykład złożonego procesu biochemicznego przebiegającego in vitro, to jest bez obecności całych komórek. Harden i Young (1906) odkryli, że fermentacja glukozy przez ekstrakt z drożdży wymaga obecności fosforu nieorganicznego, który jest wbudowywany do fruktozo-1,6-bisfosforanu. Ekstrakty z drożdży fermentują glukozę zgodnie z równaniem Hardena-Younga:

Równania Neuberga. Metody i odkrycia C. Neuberga mają doniosłe znaczenie historyczne i ogólne. Wykazał on, że drożdże mogą fermentować zarówno glukozę, jak i pirogronian. Tworzenie pośredniego produktu, aldehydu octowego, można wykazać w reakcji z wodorosiarczynem, który nie jest toksyczny dla drożdży. Po dodaniu wodorosiarczynu do drożdży fermentujących glukozę, aldehyd octowy ulega precypitacji: CH3—CHO + NaHSO3 -» CH3—CHOH—SO3Na W tych warunkach jako nowy produkt fermentacji powstaje glicerol, ze zmniejszoną równocześnie wydajnością etanolu i dwutlenku węgla. Fermentacja w obecności wodorosiarczynu została wykorzystana w przemyśle do produkcji glicerolu. Unieczynniany w ten sposób aldehyd octowy nie może funkcjonować jako akceptor wodoru. Miejsce aldehydu octowego, jako akceptora wodoru, zajmuje fosforan dihydroksyacetonu, który ulega redukcji do glicerolo-3-fosforanu, a następnie defosforylacji do glicerolu. Równanie tej fermentacji wygląda następująco: 338

glukoza + wodorosiarczyn -» -> glicerol + siarczyn aldehydu octowego + CO2 Tę zmodyfikowaną fermentację nazywamy drugą fermentacją Neuberga. Zasada wiązania metabolitu w szlaku znana jest jako dość powszechna w biochemii „metoda wychwytywania". Dodatek związków o typie zasadowym (NaHCO3, Na7HPO4) do ekstraktów drożdżowych przeprowadzających fermentację również prowadzi do powstania glicerolu, ponieważ aldehyd octowy ulega dysmutacji do etanolu i octanu, nie pełniąc zatem funkcji akceptora wodoru. Reakcja ta nosi nazwę trzeciego wzoru fermentacyjnego Neuberga: 2 glukoza + H2O -> etanol + octan + 2 glicerol + 2 CO2 Zwykła fermentacja przeprowadzana przez drożdże znana jest jako pierwsza fermentacja Neuberga. Przyjął on, że metyloglioksal (CH3—CO—CHO) powstający podczas nie biologicznego rozkładu glukozy jest również produktem pośrednim w fermentacji tego cukru. Stosunek drożdży do tlenu. Fermentacja glukozy przez drożdże jest procesem beztlenowym, lecz drożdże są organizmami tlenowymi. W braku tlenu drożdże energicznie fermentują, ale prawie nie rosną. Gdy w ich środowisku pojawi się tlen, intensywność fermentacji znacznie się obniża na rzecz oddychania. U niektórych drożdży silne nawietrzanie powoduje całkowity zanik fermentacji (efekt Pasteura). Pasteur odkrył to zjawisko ponad 100 lat temu w trakcie badań dotyczących fermentacji w produkcji wina. Zjawisko to nie jest jednak ograniczone do drożdży, lecz jest

339

charakterystyczne dla wszystkich komórek fakultatywnie tlenowych, łącznie z komórkami organizmów wyższych. Bilans katabolizmu glukozy w przykładowym eksperymencie z drożdżami przedstawiono w tabeli 8.1. Nawietrzanie podtrzymuje wzrost, równocześnie powodując zmniejszenie zużycia glukozy i produkcji etanolu oraz dwutlenku węgla. Obserwacja ta ma sens z energetycznego punktu widzenia i sugeruje istnienie nadzwyczaj wymyślnego mechanizmu regulacyjnego: w warunkach beztlenowych jeden mol glukozy daje jedynie 2 mole ATP, w porównaniu z 38 molami uzyskiwanymi z 1 mola glukozy w oddychaniu. Komórka zatem, regulując zużycie substratu, przystosowuje się do zysku energetycznego w obydwu warunkach. Trzecia kolumna w tabeli 8.1 pokazuje wyniki doświadczenia; w którym drożdże inkubowano w warunkach beztlenowych w obecności 0,4 mM 2,4-dinitrofenolu (DNP). DNP jest „rozprzęgaczem" fosforylacji w łańcuchu oddechowym; znosi on ścisły związek między transportem elektronów a oksydatywną fosforylacją i pozwala na przebieg oddychania bez kontroli ze strony fosforylacji. Ponieważ dodatek DNP praktycznie znosi fosforylację w łańcuchu oddechowym, wodory uzyskiwane w cyklu kwasów trikarboksylowych z punktu widzenia energetyki pozostają nie wykorzystane. Wykorzystany może być jedynie fosforan pochodzący z rozszczepiania bogatego w energię bursztynylo-CoA. Wynik tego eksperymentu, czyli wzrost zużycia glukozy do takiej jej ilości, która jest wykorzystywana w warunkach beztlenowych, jest zgodny z rozprzęgającą aktywnością DNP. Efekt Pasteura prawdopodobnie jest związany z kilkoma równoczesnymi mechanizmami regulacyjnymi. Jeden z nich działa na poziomie fosforylacji i jest tłumaczony współzawodniczeniem o ADP i P n i e o r g . Etap Tabela 8.1. Bilans zużycia glukozy w trakcie tlenowej i beztlenowej inkubacji drożdży (w 25 °C) w obecności 0,4 mM 2,4-dinitrofenolu (DNP)/1

340

odwodorowania w katabolizmie aldehydu fosfoglicerynowego wymaga fosforanu i ADP:

Rozkład substratu (glukozy) w szlaku fruktozobisfosforanowym zależny jest zatem od dostępności ADP i fosforanu. Bez nich nie zachodzi odwodorowanie aldehydu 3-fosfoglicerynowego. W warunkach tlenowych ADP i fosforan konieczne są do oksydatywnej fosforylacji, która również prowadzi do syntezy ATP. Wydaje się, że zużycie glukozy, jak również produkcja etanolu, ulega redukcji na skutek wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia ADP i Pnieorg.· Po rozprzęgnięciu fosforylacji w łańcuchu oddechowym przez DNP, zarówno ADP, jak i fosforan stają się dostępne dla procesu odwodorowania aldehydu 3-fosfoglicerynowego, a zużycie glukozy osiąga poziom jej wykorzystania w warunkach beztlenowych (tab. 8.1). Za efekt Pasteura jest odpowiedzialny również drugi mechanizm: allosteryczne hamowanie fosfofruktokinazy przez ATP. Do hamowania adenylanu powrócimy w podrozdziale dotyczącym fosfofruktokinazy i efektu Pasteura (16.2.2). Bilans fermentacji według Hardena i Younga. Glukoza metabolizowana jest przez ekstrakty z drożdży zgodnie z bilansem Hardena i Younga. Akumulacja fruktozo-1,6-bisfosforanu wynika z niewykorzystywania ATP w systemie bezkomórkowym (w przeciwieństwie do wymagających energii reakcji w układach żywych) i utrzymywania się nadmiaru tego związku. Ponieważ ekstrakt z drożdży nie zawiera aktywności fosfatazy, ADP musi powstawać przez fosforylację nadmiaru glukozy i/lub fruktozo-6-fosforanu. Wykorzystywanie drożdży. Drożdże wykorzystuje się do wielu celów. Od długiego czasu trwa selekcja gatunków, szczepów i odmian najbardziej odpowiednich do różnych celów. Drożdże słabo oddychające, a przede wszystkim fermentujące, tak zwane „drożdże denne", są używane do warzenia piwa. Drożdże stosowane w produkcji etanolu i wina, jak również drożdże piekarniane, to tzw. „drożdże fermentacji górnej". Drożdże piekarniane {Saccharomyces cerevisiae) są stosowane z po-

341

wodu wytwarzanego przez nie dwutlenku węgla, który spulchnia ciasto. Są to organizmy skutecznie przeprowadzające fermentację. Hoduje się je w dobrze nawietrzanych pojemnikach. Produktem ubocznym fermentacji jest etanol, lecz stosunek ilości drożdży do wytworzonego alkoholu można regulować przez zmianę nawietrzania i stężenia glukozy. W jednym ze stosowanych procesów cukier dostarczany jest w sposób ciągły, w tempie ograniczającym szybkość wzrostu. W ten sposób unika się pojawienia produktów fermentacji i cały cukier wykorzystywany jest do wzrostu. Dodatkowe substancje odżywcze potrzebne do wzrostu (np. źródła azotu) dostarczane są wraz z zacierem. Drożdże stosowane w browarnictwie to głównie drożdże „fermentacji dolnej" (np. do produkcji piwa typu „Pilsner") i rzadziej „górne" (do piwa typu „Ale", „Berliner"). W Europie centralnej piwo produkuje się przede wszystkim z jęczmienia; materiał początkowy wybiera się spośród, odmian jęczmienia o małej zawartości białka i dużej zawartości skrobi. Ponieważ drożdże nie mają amylaz i nie mogą fermentować skrobi, lecz tylko cukier, należy najpierw skrobię zawartą w jęczmieniu przeprowadzić w cukier. Wykorzystuje się w tym celu amylazę powstającą podczas kiełkowania ziaren. Ziarno jęczmienia moczy się powodując jego pęcznienie, a następnie kiełkowanie. Powstający słód jest suszony w temperaturze hamującej proces kiełkowania, ale nie inaktywującej enzymów. Słód jest następnie rozcierany i zawieszany w wodzie. Skrobia ulega hydrolizie do maltozy, dając brzeczkę. Po usunięciu plew dodaje się chmielu, po czym wywar jest gotowany, schładzany, a następnie, po dodaniu odpowiednich drożdży, poddawany fermentacji w specjalnych kadziach. Do produkcji alkoholu przemysłowego wykorzystuje się odpady powstające w produkcji cukru z trzciny cukrowej (melasa) lub ziemniaki. Duże ilości alkoholu otrzymuje się również z hydrolizy odpadów drzewnych lub z ługów siarczynowych w zakładach papierniczych. Spośród cukrów zawartych w drewnie jedynie heksozy ulegają fermentacji do etanolu; pentozy są wykorzystywane w innych procesach jako źródło węgla dla takich drożdży, jak Endomyces lactis i Torula, które następnie służą jako bogaty w białko dodatek do paszy dla bydła. Wiele win w Niemczech wytwarza się w wyniku spontanicznej fermentacji soku z winogron przeprowadzanej przez drożdże Kloeckera. Aby zapobiec niekontrolowanej fermentacji przez dzikie drożdże, dodaje się również czyste kultury drożdży lub mieszaniny Kloeckera i Saccharomyces z określonych winnic. Aromat i smak wina zależy jednak

342

bardziej od rodzaju winogron (np. Riesling, Sylvaner) oraz czynników klimatycznych i edaficznych (glebowych) podczas wzrostu roślin, niż od stosowanych drożdży. Wszystkie płyny powstające podczas fermentacji przeprowadzonej przez drożdże zawierają tzw. fuzle: propanol, 2-butanodiol, 2-metylopropanol, alkohol amylowy (pentanol), alkohol izoamylowy (3-metylobutanol). Są to produkty typowego metabolizmu fermentacyjnego u drożdży i nie powstają one wyłącznie w złożonych podłożach odżywczych zawierających aminokwasy. Główne składniki fuzli powstają jako uboczne produkty w trakcie przemian izoleucyny, leucyny i waliny. Produkcja etanolu przez bakterie

Wśród wszystkich zbadanych do tej pory bakterii jedynie Sarcina ventriculi wytwarza etanol w taki sam sposób jak drożdże (szlak fruktozobisfosforanowy i dekarboksylaza pirogronianowa). W Meksyku, z fermentującego soku agawy (Agave americana) wyizolowano pałeczkowatą, polarnie urzęsioną, ruchliwą bakterię wytwarzającą etanol. Bakteria ta, Zymomonas mobilis, rozkłada cukier w szlaku 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonianowym i z udziałem dekarboksylazy pirogronianowej rozszczepia pirogronian do aldehydu octowego i dwutlenku węgla. Aldehyd octowy następnie jest redukowany do etanolu. Jedynymi produktami fermentacji są etanol, dwutlenek węgla i niewielkie ilości kwasu mlekowego. Warto zwrócić uwagę na fakt, że

343

w skład etanolu wytwarzanego z soku agawy wchodzą atomy C-2, C-3, C-5 i C-6 glukozy, podczas gdy etanol produkowany przez drożdże zawiera atom węgla C-l, C-2, C-5 i C-6 (ryc. 8.1). Etanol występuje jako produkt uboczny fermentacji prowadzonych przez niektórych przedstawicieli Enterobacteriaceae oraz przez klostridia. Prekursor etanolu — aldehyd octowy — nie powstaje jednak w wyniku działania dekarboksylazy na pirogronian, lecz na skutek redukcji acetylo-CoA. Heterofermentujące bakterie mlekowe (np. Leuconostoc mesenteroides) wytwarzają alkohol w całkowicie odmienny sposób. Glukoza zostaje przekształcona do pentozofosforanu. Ksylulozo-5-fosforan ulega następnie degradacji przez fosfoketolazę: ksylulozo-5-fosforan + P nieorg . -> -> acetylofosforan + aldehyd 3-fosfoglicerynowy Powstający acetylofosforan jest redukowany do etanolu przez dehydrogenazę aldehydu octowego i dehydrogenazę alkoholową. Drugi produkt reakcji, aldehyd 3-fosfoglicerynowy, jest przekształcany do pirogronianu, a następnie redukowany do mleczanu.

8.2. Fermentacja mlekowa i Lactobacteriaceae Wszystkie bakterie mlekowe zostały przypisane do rodziny Lactobacteriaceae. Chociaż grupa ta obejmuje bakterie o odmiennej morfologii, tj. długie i krótkie laseczki oraz ziarniaki typu paciorkowcowego, jest ona bardzo dobrze scharakteryzowana pod względem fizjologii. Wszystkie bakterie z tej grupy są gramdodatnie, nie wytwarzają endospor (z wyjątkiem Sporolactobacillus inulinus) i w zdecydowanej większości są nieruchliwe. Są one zależne od węglowodanów jako źródła energii i wytwarzają kwas mlekowy. W przeciwieństwie do Enterobacteriaceae, które również wytwarzają kwas mlekowy, fermentują one obligatoryjnie. Lactobacteriaceae, a szczególnie paciorkowce, mimo iż nie zawierają hemin (cytochromy, katalaza), rosną w obecności powietrza lub tlenu. Są one tolerancyjnymi beztlenowcami; bakteria, która nie wytwarza katalazy, a rośnie w warunkach tlenowych, jest najprawdopodobniej bakterią mlekową.

344

Dodatkowe czynniki wzrostowe. Inną charakterystyczną cechą bakterii mlekowych są wymagania dotyczące czynników wzrostowych. Żadna bakteria z tej grupy nie rośnie w podłożu mineralnym zawierającym glukozę i sole amonowe. Większość z nich wymaga witamin (laktoflawiny, tiaminy, kwasu pantotenowego, kwasu nikotynowego, kwasu foliowego, biotyny), aminokwasów, puryn i pirymidyn. W związku z tym hoduje się je na podłożach wzbogaconych w stosunkowo duże ilości ekstraktu drożdżowego, koncentratu z pomidorów lub nawet krwi. Całkiem niedawno ze zdziwieniem stwierdzono, że niektóre bakterie mlekowe (jak również inne bakterie fermentujące) podczas wzrostu na podłożach z krwią tworzą cytochromy i mogą nawet być zdolne do fosforylacji w łańcuchu oddechowym. Bakterie mlekowe nie mają jednak zdolności syntezy porfiryn. Po dodaniu tych związków do podłoża niektóre z nich mogą syntetyzować odpowiednie barwniki zawierające hem. Lactobacteriaceae można zatem uważać za formy metabolicznie „ułomne", które zatraciły zdolność syntezy wielu metabolitów, prawdopodobnie w wyniku przystosowania do wzrostu w mleku oraz na innych podłożach bogatych w substancje odżywcze i czynniki wzrostowe. Z drugiej strony mają one zdolność, której brak większości innych bakterii — potrafią wykorzystywać laktozę. Zdolność tę wykazują również bakterie jelitowe {Enterobacteriaceae) typu coli. Laktoza praktycznie nie występuje w królestwie roślin. Jest ona wytwarzana przez ssaki, u których znajduje się w mleku. Wykorzystywanie laktozy przez drobnoustroje można więc rozpatrywać jako adaptację do warunków ekologicznych w układzie pokarmowym ssaków. Laktoza jest dwucukrem, który musi ulec hydrolizie przed wejściem w szlak kataboliczny heksoz:

Enzym β-galaktozydaza występuje jedynie u nielicznych bakterii. Galaktoza, będąca produktem hydrolizy po fosforylacji przez swoistą galaktokinazę, ulega izomeryzacji do glukozo-1-fosforanu. Galaktoza jest również, jako galaktolipid, składnikiem błony tylakoidu w chloroplastach. Z powodu dużych ilości wytwarzanego mleczanu, podłoża muszą być dobrze buforowane. Zwykle dodaje się węglanu wapnia. Wytwarzanie kwasu na agarze odżywczym z dodatkiem węglanu wapnia (agar kredowy) jest widoczne w postaci przejrzystych stref wokół kolonii.

345

Występowanie. Rozprzestrzenienie bakterii mlekowych w przyrodzie jest związane z ich dużym zapotrzebowaniem na substancje odżywcze i sposobem uzyskiwania energii (przez fermentację). Bardzo rzadko występują w glebie lub wodzie. Ich naturalnymi siedliskami są: a) mleko oraz miejsca, w których powstają produkty mleczne (Lactobacillus lactis, L. bulgaricus, L. helveticus, L. casei, L. fermentum, L. brevis, Lactococcus lactis, L. diacetilactis); b) zdrowe i gnijące rośliny {Lactobacillus plantarum, L. delbrueckii, L. fermentum, L. brevis, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides); c) układ pokarmowy oraz błony śluzowe ludzi i zwierząt {Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium, Enterococcus faecalis, Streptococcus salivarius, S. bovis, S. pyogenes, S. pneumoniae), Enterococcus faecalis wchodzi w skład mikroflory jelita człowieka, S. bovis występuje u przeżuwaczy, a wiele paciorkowców są to nieszkodliwe komensale występujące na błonach śluzowych w jamie ustnej oraz w drogach oddechowych, moczowych i narządach płciowych. Należą one do tzw. mikroflory skórnej. Ich obecność zapobiega kolonizacji skóry przez inne, czasem patogenne organizmy. Kiedy wzrost mikroflory skórnej jest zahamowany, np. w wyniku intensywnej terapii antybiotykowej, błony epitelialne często zostają zainfekowane takimi patogennymi dermatofitami jak Candida albicans. Niewskazane są zatem nadmiernie długotrwałe kąpiele z preparatami zawierającymi detergenty. Z powodu wytwarzania dużych ilości kwasu mlekowego i tolerancji na kwasowość środowiska, bakterie mlekowe w sprzyjających warunkach łatwo mogą się stać organizmami dominującymi. Można je w prosty sposób izolować stosując technikę kultur wzbogacających w odpowiednich warunkach eksperymentalnych. „Naturalne czyste kultury" występują w kwaśnym mleku, niektórych przetworach mlecznych, w kiszonej kapuście i innych produktach. Metabolizm węglowodanowy i produkty fermentacji. Zależnie od tego, czy Lactobacteriaceae fermentują glukozę wyłącznie do mleczanu, czy też do dodatkowych produktów, dzieli się je na homo- i heterofermentatywne (tab. 8.2). Ten stosowany już od wielu lat podział jest zgodny z zasadniczo odmiennymi szlakami katabolicznymi cukrów obu grup.

346

* W tabeli podano obecnie używane nazwy bakterii mlekowych. W tekście powszechnie są stosowane nazwy skrótowe.

Homofermentacja mlekowa. Bakterie mlekowe homofermentujące wytwarzają czysty lub prawie czysty (90%) mleczan. Metabolizm glukozy odbywa się w szlaku fruktozobisfosforanowym, gdyż bakterie te mają wszystkie potrzebne enzymy, łącznie z aldolazą, i wykorzystują wodór z odwodorowania aldehydu 3-fosforoglicerynowego (do 1,3-bisfosfoglicerynianu) w redukcji mleczanu. Stereoswoistość dehydrogenazy mle-

347

czanowej i obecność lub brak racemazy mleczanowej decyduje o powstaniu D(—)-, L(+)- lub DL-mleczanu. Jedynie niewielka część pirogronianu ulega dekarboksylacji z wytworzeniem octanu, etanolu, dwutlenku węgla i czasem acetoiny. Ilość produktów ubocznych zależy od dostępności tlenu. Heterofermentacja mlekowa. Heterofermentatywne bakterie mlekowe nie mają ważnych enzymów szlaku fruktozobisfosforanowego, tj. aldolazy i izomerazy triozofosforanowej. Początkowy rozkład glukozy zachodzi więc wyłącznie w szlaku pentozofosforanowym, tzn. przez glukozo-6-fosforan, 6-fosfoglukonian i rybulozo-5-fosforan (ryc. 7.4, 8.2). Ostatni z tych związków jest przekształcany przez epimerazę do ksylulozo-5-fosforanu, który z kolei w reakcji wymagającej pirofosforanu tiaminy jest rozszczepiany przez fosfoketolazę z wytworzeniem aldehydu 3-fosfoglicerynowego i acetylofosforanu:

Przemyte, nie rosnące komórki Leuconostoc mesenteroides fermentują glukozę nieomalże stechiometryczne, zgodnie z reakcją:

348

w której powstaje mleczan, etanol i dwutlenek węgla. Redukują one więc acetylofosforan poprzez acetylo-CoA i aldehyd octowy do etanolu (ryc. 8.2). Inne heterofermentatywne bakterie przeprowadzają acetylofosforan bądź częściowo, bądź całkowicie, do octanu, przekazując bogate w energię wiązanie na ATP i zyskując w ten sposób energię w postaci ATP. W tym przypadku nadmiar wodoru jest przekazywany na glukozę, z wytworzeniem

349

mannitolu. Fosforan aldehydu glicerynowego jest przekształcany do mleczanu poprzez pirogronian. Leuconostoc mesenteroides fermentuje rybozę do mleczanu i octanu. Heterofermentatywne bakterie fermentują fruktozę z wytworzeniem mleczanu, octanu, dwutlenku węgla i mannitolu: 3 fruktoza -> mleczan + octan + CO2 + 2 mannitol Fruktoza w tej reakcji służy jako akceptor nadmiaru równoważników redukujących: fruktoza + NADH2 -> mannitol + NAD Lactobacillus plantarum (synonimy: pentosus i arabinosus) przekształca glukozę homofermentatywnie, lecz rozszczepia pentozy z udziałem fosfoketolazy do mleczanu i octanu. Należy podkreślić, że nawet tak ściśle homofermentatywna bakteria jak Lactobacillus casei prowadzi homofermentację glukozy, lecz rybozę rozkłada heterofermentatywnie do octanu i mleczanu. Obecność rybozy wywołuje syntezę fosfoketolazy. Komórki hodowane w obecności rybozy, a następnie dokładnie przemyte, rozkładają glukozę w sposób heterofermentatywny. Fermentacja prowadzona przez Bifidobacterium. Nazwa heterofermentatywnej bakterii mlekowej Bifidobacterium bifidum pochodzi od kształtu komórek przypominającego literę V lub Y. Organizm ten jest dobrze znany, ponieważ dominuje w układzie pokarmowym niemowląt, szczególnie gdy są karmione piersią. Obecność tych bakterii związana jest z ich wysokim wymaganiem w stosunku do N-acetyloglukozoaminy, która występuje w mleku ludzkim, a nie ma jej w mleku krowim. Przedstawiciele rodzaju Bifidobacterium są ścisłymi beztlenowcami; nie są aerotolerancyjne i do wzrostu potrzebują atmosfery zawierającej 10% dwutlenku węgla. Od czasu stwierdzenia tych wymagań, dość niezwykłych jak na bakterię mlekową, wykryto Bifidobacterium we florze jelitowej osób dorosłych, w kilku innych siedliskach, a nawet w gnijącym błocie. Obecnie znanych jest kilka gatunków. Bifidobacterium fermentuje glukozę zgodnie z równaniem: 2C 6 H 1 2 O 6 -+2CH 3 —CHOH—COOH + 3CH3—COOH Fermentacja ta odbywa się w szlaku fosfoketolazowym. Organizm ten nie posiada ani aldolazy, ani dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, lecz 350

produkuje fosfoketolazy, które rozszczepiają fruktozo-6-fosforan i ksylulozo-3-fosforan, odpowiednio: do acetylofosforanu i erytrozo-4-fosforanu lub aldehydu 3-fosfoglicerynowego. Heksoza jest przekształcana według poniższego schematu:

Wykorzystanie bakterii mlekowych w przetwórstwie domowym i rolnym oraz w produkcji żywności. Gdy niejałowe roztwory zawierające cukry, złożone źródła węgla oraz dodatkowe czynniki wzrostowe pozostawić w warunkach beztlenowych (lub gdy roztwory są w naczyniach na tyle głębokich, że dolne warstwy są praktycznie pozbawione dostępu tlenu), szybko przerosną one bakteriami mlekowymi. Bakterie te obniżają pH środowiska do poniżej 5,0, hamując tym samym wzrost innych beztlenowców, gorzej znoszących warunki kwasowe. To, które bakterie mlekowe będą dominować, zależy od określonych warunków danego środowiska. Sterylizujący i konserwujący wpływ bakterii mlekowych, wynikający z wytwarzania przez nie kwasu, jest wykorzystywany w rolnictwie, mleczarstwie i w gospodarstwach domowych. Produkcja kiszonek. Bakterie mlekowe występujące na materiale roślinnym odgrywają dużą rolę w konserwowaniu pokarmu dla bydła. Liście buraka cukrowego, ziemniaka, kukurydzy, traw lub lucerny upakowywane są w silosach. W celu zwiększenia stosunku węgla do azotu dodaje się melasy, a czasami również kwasu mrówkowego lub innych kwasów organicznych, aby stworzyć warunki sprzyjające początkowemu wzrostowi bakterii mlekowych i paciorkowców tolerujących kwasowość. Działania takie prowadzą do kontrolowanej fermentacji mlekowej. Kapusta kiszona również powstaje w wyniku fermentacji mlekowej. W poszatkowanej kapuście, upakowanej z dodatkiem 2-3% NaCl w celu uzyskania warunków beztlenowych, zachodzi spontaniczna fermentacja

351

mlekowa prowadzona najpierw przez Leuconostoc, z wytworzeniem dwutlenku węgla, a później również przez Lactobacillus plantarum. Produkty mleczne. Bakterie mlekowe mają ogromne znaczenie w przemyśle mlecznym, gdzie wykorzystuje się je ze względu na zdolności zakwaszania i nadawania smaku. Materiałem wyjściowym zwykle jest sterylne lub częściowo sterylne mleko, lub śmietanka, do której dodaje się czyste kultury bakteryjne. Masło śmietankowe powstaje ze śmietanki zakwaszonej przez dodanie Lactococcus lactis, L. cremoris i Leuconostoccremoris i zyskuje szczególny smak w wyniku wytwarzania diacetylu (patrz podrozdz. 8.4). Kultury zawierające mezofilne lub termofilne bakterie Lactococcus lactis, czy Lactobacillus bulgaricus i S. thermophilus wykorzystuje się do koagulacji kazeiny w produkcji twarogu i np. niektórych typów serów niemieckich (Harzer, Mainzer). Do tych pierwszych należą Lactococcus lactis (subsp. lactis i cremoris), Lactococcus diacetilactis i Leuconostoc cremoris, a inkubacja odbywa się w temp. 20 do 30°C. Do bakterii termofilnych należą Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Lactobacillus delbrueckii (subsp. bulgaris lub lactis) i/lub Lactobacillus helveticus, dla których temperatura inkubacji zwykle jest w zakresie od 32 do 45°C. W produkcji serów twardych kazeina jest ścinana przez enzymy laboratoryjne; równocześnie przebiega jednak kwaszenie przez mezofilne kultury. W dojrzewaniu serów stosuje się różnego typu kultury bakteryjne, np. bakterie propionowe w serach typu szwajcarskiego, jak również w serach pleśniowych (sery typu Roquefort), oraz preparaty enzymatyczne. W produkcji różnego typu mleka zsiadłego stosuje się kultury starterowe zawierające bakterie wytwarzające kwasy i związki aromatyczne. Bardzo aromatyczną maślankę uzyskuje się z udziałem tych samych organizmów, które są stosowane w produkcji masła. Oprócz kwasu mlekowego zawiera ona kwas octowy, acetoinę i diacetyl. Jogurt składa się z pasteryzowanego, homogenizowanego mleka zaszczepionego Streptococcus thermophilus i Lactobacillus bulgaricus. Inkubacja trwa tylko 2-3 godzin w temp. 43-45°C. Nazwa biogurt odnosi się do mleka zakwaszonego z udziałem bakterii Lactobacillus acidophilus i Streptococcus thermophilus. Kefir to produkt mleczny zawierający kwasy i etanol. Mleko (krowie, owcze lub kozie) zaszczepia się „ziarnami kefirowymi", będącymi częściowo scharakteryzowanymi symbiotycznymi związkami

352

bakterii mlekowych, paciorkowców, Leuconostoc i drożdży. Zakwaszanie odbywa się w temperaturze 15-22°C i trwa 24-36 godzin. Kumys otrzymuje się z mleka oślego zaszczepionego kulturą zawierającą Lactobacillus bulgaricus oraz drożdże Torula. Czysty kwas mlekowy do celów przemysłowych oraz jako dodatek do produktów spożyczych również jest uzyskiwany w wyniku fermentacji. Mleko lub serwatkę zaszczepia się Lactobacillus casei i L. bulgaricus. W przypadku fermentacji glukozy lub maltozy stosuje się Lactobacillus delbrueckii, L. leishmanii lub Sporolactobacillus inulinus. W celu zapewnienia niezbędnych czynników odżywczych dodaje się melasy lub słodu. Zakwaszanie ciasta używanego do produkcji niektórych rodzajów chleba żytniego przeprowadza się przy pomocy bakterii mlekowych, przede wszystkim Lactobacillus plantarum i L. coryniformis, które hamują wytwarzanie CO2 przez drożdże. Kultury starterowe bakterii mlekowych i mikrokoków stosuje się też przy wyrobie niektórych rodzajów wędlin (salami, serwolatka). Obniżenie pH w wyniku wytworzenia kwasu mlekowego przez te bakterie przyczynia się do przedłużenia trwałości wędlin, których nie trzeba gotować.

8.3. Fermentacja propionowa i bakterie propionowe Występowanie, izolacja i klasyfikacja. Bakterie propionowe występują w żwaczu i jelicie przeżuwaczy (bydło, owce), gdzie odgrywają rolę w tworzeniu kwasów tłuszczowych, przede wszystkim kwasu propionowego i octowego w żwaczu. Są one odpowiedzialne za przekształcenie mleczanu, powstającego podczas różnorodnych fermentacji w żwaczu, do kwasu propionowego. Rzadko występują w mleku, nie są izolowane z gleby, ani z wody. Bakterie propionowe można wyizolować z hodowli wzbogacającej w warunkach beztlenowych, stosując podłoże zawierające kwas mlekowy i ekstrakt drożdżowy. Inokulum takiej hodowli stanowi kawałek sera typu ementaler. W serze tym bakterie propionowe odgrywają istotną rolę w procesach dojrzewania i wytwarzania smaku po koagulacji mleka we wczesnych etapach produkcji na skutek dodania reniny. Renina jest wodnym ekstraktem z żołądków cieląt i zawiera liczne żywe bakterie propionowe. Najlepiej znane gatunki to Propionibacterium freudenreichii i jego podgatunek shermanii oraz P. acidi-propionici (wcześniej znany

353

jako Ρ. pentosaceum). Inna bakteria propionowa, P. acnes, jest czynnikiem sprawczym trądziku, stanu zapalnego mieszków włosowych w skórze człowieka. Oprócz rodzaju Propypnibacterium, do bakterii wytwarzających kwas propionowy należą również Veilonella alcalescens (Micrococcus lactilyticus), Clostridium propionicum, Selenomonas i Micromonospora. Wiele innych bakterii wytwarza również mniejsze lub większe ilości propionianu, jako produktu końcowego fermentacji. Wzrost i metabolizm rodzaju Propionibacterium. Rodzaj Propionibacterium przypomina maczugowce (rozdz. 3). Gatunki należące do tego rodzaju to gramdodatnie, nieruchliwe laseczki, nie tworzące endospor. Bakterie propionowe nie rosną na podłożach stałych na powietrzu. Z powodu braku tolerancji na tlen atmosferyczny oraz zdolności do wzrostu i tworzenia ATP w wyniku beztlenowej fermentacji, przez długi czas uważano bakterie propionowe za obligatoryjnie fermentujące. Stwierdzono jednak, że zawierają one enzymy takie jak katalazy, a także cytochromy. W istocie, wszyscy dotychczas zbadani przedstawiciele rodzaju Propionibacterium rosną zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. W warunkach kontrolowanego nawietrzania wzrost jest nawet lepszy niż w warunkach beztlenowych. Jednakże podczas wzrostu w obecności powietrza szybkość dyfuzji tlenu z fazy gazowej do zawiesiny bakterii nie powinna przekraczać tempa oddychania; mierzalne ciśnienie parcjalne w hodowli jest toksyczne. Gatunki należące do Propionibacterium należy zatem uważać za mikroaerotolerancyjne. W warunkach tlenowych Propionibacterium przeprowadzają fermentację glukozy, sacharozy, laktozy i pentozy, jak również mleczanu, jabłczanu, glicerolu i wielu innych związków do kwasu propionowego. Katabolizm heksoz przebiega szlakiem fruktozobisfosforanowym. W roku 1936 Wood i Werkman, badając fermentację glicerolu prowadzoną przez Propionibacterium acidi-propionici, stwierdzili, że reakcji tej towarzyszyło wiązanie dwutlenku węgla. Związany CO2 odnajdywano w wydzielanym bursztynianie; zachodziła karboksylacja pirogronianu z wytworzeniem kwasu dikarboksylowego. Karboksylacja ta nosi nazwę reakcji Wooda i Werkmana. Nie jest ona ograniczona do bakterii propionowych, lecz występuje u zwierząt i roślin oraz wszystkich organizmów heterotroficznych. Przemiany te zostały omówione uprzednio (rozdz. 7.5).

354

Biochemia powstawania kwasu propionowego (szlak metylomalonylo-CoA). Tworzenie propionianu z mleczanu zachodzi zgodnie z równaniem:

Redukcja mleczanu lub pirogronianu do propionianu zachodzi w szlaku metylomalonylo-CoA, nazwanym tak z powodu charakterystycznego produktu pośredniego (ryc. 8.3). Pirogronian ulega dekarboksylacji do szczawiooctanu przy współudziale karboksylotransferazy metylomalonylo-CoA i kompleksu biotyny z dwutlenkiem węgla. Szczawiooctan z kolei jest redukowany poprzez jabłczan i fumaran do bursztynianu. Ostatni etap jest sprzężony z fosforylacją (patrz oddychanie fumaranowe, rozdz. 9.6). Bursztynian najpierw ulega acetylacji przez transferazę

355

CoA (transferaza CoA bursztynylo-CoA: propionian) do bursztynylo-CoA, który przy współudziale koenzymu B 12 (cyjanokobalamina) i mutazy metylomalonylo-CoA jest przekształcany do metylomalonylo-CoA. Oderwanie dwutlenku węgla od tego związku przez karboksylotransferazę metylomalonylo-CoA prowadzi do propionylo-CoA. Transferaza CoA odrywa CoA od propionylo-CoA, przekształcając go w propionian, a koenzym jest przekazywany do bursztynianu. Należy zauważyć, że w procesie wytwarzania propionianu dwie grupy (CO2 i CoA) są przekazywane z produktu do prekursora nie występując w formie wolnej. Inną ważną cechą tego szlaku jest obecność w nim trzech kofaktorów (biotyna, koenzym A i koenzym B12). Większość bakterii propionowych wytwarza kwas propionowy właśnie w tym szlaku, który występuje również u Veilonella alcalescens i Selenomonas ruminantium. Szlak metylomalonylo-CoA jest wykorzystywany również w kierunku odwrotnym, np. podczas metabolizmu izoleucyny, waliny oraz długołańcuchowych kwasów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów węgla. Kwasy tłuszczowe i izoleucyna przekształcają się do propionylo-CoA, który następnie ulega karboksylacji do metylomalonylo-CoA. Przekształcenie tego ostatniego związku do bursztynylo-CoA przez mutazę metylomalonylo-CoA jest zależne od obecności witaminy B12, zarówno w brodawkach korzeniowych, jak i w tkankach roślinnych. Szlak akryloilo-CoA. Clostridium propionicum, Bacteroides ruminicola i Megasphaera elsdenii wytwarzają kwas propionowy w znacznie prostszym szlaku, w którym produktem pośrednim jest pochodna kwasu akrylowego, tj. akryloilo-CoA.

8.4. Fermentacja mrówkowa i Enterobacteriaceae Pewne organizmy wytwarzające kwas podczas fermentacji zebrano w grupę charakteryzującą się wytwarzaniem swoistego produktu, który niekoniecznie musi być produktem głównym. Jest nim kwas mrówkowy. Końcowymi produktami fermentacji mogą być też inne kwasy. Ten typ fermentacji

356

zwany jest fermentacją mrówkową lub fermentacją kwasów mieszanych. Ponieważ niektórzy przedstawiciele wspomnianej grupy zamieszkują układ pokarmowy, zaklasyfikowano ją jako rodzinę Enterobacteriaceae. Rodzina ta charakteryzuje się następującymi cechami: są to gramujemne pałeczki, perytrychalnie urzęsione, ruchliwe i nie wytwarzające przetrwalników. Są fakultatywnymi tlenowcami, wytwarzają heminy (cytochromy i katalazę) i mogą uzyskiwać energię tlenowo (oddychanie) lub beztlenowo (fermentacja). Nie mają skomplikowanych wymagań odżywczych i potrafią rosnąć na prostych podłożach syntetycznych zawierających sole mineralne, węglowodan i sole amonowe. Wszyscy przedstawiciele tej rodziny fermentują glukozę z wytworzeniem kwasów. Znaczenie Enterobacteriaceae w problemach sanitarnych i higienie, jak również w badaniach eksperymentalnych, uzasadnia szczegółowy opis niektórych przedstawicieli tej rodziny. Ważne gatunki. Escherichia coli zamieszkuje jelita. Gatunek ten nie jest bynajmniej najliczniej reprezentowany, gdyż znacznie liczniejsi są przedstawiciele Bacteroides i Bifidobacterium. Escherichia coli potrafi jednak żyć poza układem pokarmowym i jej obecność można łatwo wykazać np. w wodzie. Gatunek ten zatem bardzo dobrze nadaje się do stwierdzenia zanieczyszczenia wody pitnej kałem. Proteus vulgaris również występuje w normalnej florze jelitowej, lecz równocześnie jest szeroko rozpowszechniony w glebie i wodach. Organizm ten ma tendencję do zmiany kształtu (stąd jego nazwa), jest bardzo ruchliwy i na płytkach agarowych wykazuje zdolność do tzw. wzrostu „rozpełzliwego" prowadzącego do szybkiego zarastania całej powierzchni. Gatunek Enterobacter aerogenes jest uważany za bliźniaczo podobny do Escherichia coli. Często występuje w glebie i jest określany jako typ coli. Jak sugeruje nazwa tego organizmu, wytwarza on duże ilości gazu. Różni się od E. coli jedynie kilkoma cechami biochemicznymi (tab. 8.3 i 8.4). Serratia marcescens (wcześniej Bacterium prodigiosium) można uważać za odmianę Enterobacter wytwarzającą pigment. Rodzaj Erwinia obejmuje gatunki patogenne dla roślin. Atakują one liście, łodygi i korzenie, powodując procesy gnilne wywoływane na skutek wydzielania pektynazy. Klebsiella pneumoniae różni się od Enterobacter jedynie obecnością grubszej otoczki oraz brakiem ruchu. Powoduje ona bardzo groźne (o wysokiej śmiertelności) zapalenie płuc.

357

Salmonella typhimurium jest najbardziej rozpowszechniona spośród bakterii powodujących nieżyt żołądka i jelit, czyli tzw. zatrucia pokarmowe. Efekt toksyczny jest spowodowany zapaleniem błon śluzowych na skutek uwalniania lipopolisacharydu; nie zachodzi inwazja układu krążenia. Salmonella typki jest czynnikiem sprawczym epidemicznego duru brzusznego. Shigella dysenteriae oraz szczepy pokrewne powodują czerwonkę i biegunkę. Vibrio cholerae powoduje cholerę, chorobę o charakterze epidemicznym. Bakteria ta nie należy do Enterobacteriaceae, ale przypomina tę grupę pod względem metabolizmu. Vibrio cholerae namnaża się w układzie pokarmowym. Przylega do nabłonka jelit, nie penetrując do wnętrza komórek. Enterotoksyna wytwarzana przez V. cholerae jest białkiem wiążącym się do swoistych receptorów na komórkach nabłonka i powodującym ucieczkę jonów sodu, dwuwęglanu i chloru do światła jelita. Yersinia pestis powoduje dżumę. Yersinia nie należy do rodziny Enterobacteriaceae, ale fakultatywnie beztlenowym typem wzrostu oraz sposobem fermentacji przypomina bakterie z tej rodziny. Naturalnym rezerwuarem tej bakterii są dziko żyjące gryzonie, głównie szczury. Bakterie są przenoszone na ludzi za pośrednictwem zakażonych pcheł lub innych zewnętrznych pasożytów i powodują dżumę gruczołową lub płucną. Infekcje szybko kończą się śmiercią z powodu nagłego tempa wzrostu bakterii w organizmie oraz intensywnego wytwarzania przez nie toksyn.

358

Analiza wody pitnej. Analiza wody pitnej polega w dużej mierze na wykazaniu obecności E. coli i zostanie opisana dość szczegółowo, jako przykład różnicowej diagnozy bakteriologicznej. Escherichia coli jest normalnym mieszkańcem jelita człowieka i jest zupełnie niegroźna. Jej obecność w wodzie nie stanowi zagrożenia, chociaż niektóre szczepy bywają enteropatogenne i powodują biegunki. Przewód pokarmowy człowieka zamieszkują jednak gatunki powodujące epidemie; mogą one być wydalone wraz z kałem (razem z E. coli) przez chorujących na daną chorobę, rekonwalescentów lub nosicieli, powodując zakażenie źródła wody. Mieszkaniec jelit — E. coli służy zatem jako wskaźnik zanieczyszczenia wody kałem, co pozwala na unikanie specjalnych procedur w przypadku różnych epidemii. Wykazanie obecności E. coli w próbkach wody dowodzi zakażenia wody bakteriami jelitowymi, w tym ewentualnie bakteriami chorobotwórczymi. Całkowita liczba bakterii w wodzie pitnej nie powinna przekraczać 100 komórek w 1 ml, a w 100 ml nie powinno się w ogóle stwierdzać E. coli. Escherichia coli dobrze rośnie w podłożu peptonowym z glukozą lub laktozą. Chcąc więc uzyskać warunki selektywne wykluczające wzrost jak największej liczby innych bakterii, stosuje się laktozę. Wykorzystanie laktozy wymaga zdolności hydrolizowania tego związku przez β-galaktozydazę. Bakterie typu coli oraz bakterie mlekowe produkują ten enzym, w przeciwieństwie do większości bakterii glebowych i wodnych. Pierwszą wskazówką obecności bakterii wytwarzających gaz jest jego pojawianie się w rurce fermentacyjnej (rurka Durhama) podczas inkubacji danej próbki w podłożu peptonowym zawierającym laktozę. Gdy osobno zaszczepić dwie probówki E. coli i Enterobacter aerogenes, różnice w wytwarzaniu gazu stają się widoczne po 24-godzinnej inkubacji w 37°C. Enterobacter aerogenes, zgodnie ze swoją nazwą, wytwarza dwa razy tyle gazu co E. coli. Poza tym, E. coli wytwarza wodór i dwutlenek węgla w stosunku 1:1, podczas gdy E. aerogenes wytwarza więcej CO2 niż wodoru. Niektóre bakterie mlekowe hydrolizują laktozę oraz wytwarzają gaz. W celu uniknięcia fałszywych wyników dodatnich, niezbędne są dalsze metody różnicowania. Po wysiewaniu hodowli na agar EMB (zaw. laktozę, pepton, eozynę i błękit metylenowy) pojawienie się ciemnobordowych kolonii o metalicznym połysku wskazuje na obecność E. coli. Enterobacter aerogenes wytwarza zaś śluzowate, różowe kolonie bez metalicznego połysku. Obydwa organizmy można odróżnić od siebie za pomocą pełnej analizy fermentacyjnej, lecz jest to metoda znacznie bardziej uciążliwa, choć niewątpliwie dokładniejsza. Rutynowa metoda rozróżniania obydwu gatunków (tab. 8.4) oparta jest na następujących cechach jakościowych: 1) wytwarzanie indolu z tryptofanu; 2) ilość kwasu wytwarzanego z cukru (próba z czerwienią metylową); 3) wytwarzanie acetoiny podczas fermentacji glukozy (reakcja Voges-Proskauera); i 4) zdolności do wzrostu na cytrynianie jako źródle węgla. Wyniki tych testów, określonych wspólną nazwą IMViC przedstawiono w tabeli 8.4. 1. Wytwarzane indolu. Wytwarzanie indolu z tryptofanu wykazuje się za pomocą odczynnika Ehrlicha (aldehyd p-dimetylobenzoesowy), dającego wiśniowoczerwoną barwę. 2. Test z czerwienią metylową. Produkcja kwasu powoduje zmianę barwy wskaźnika z czerwonej na żółtą (czerwona < pH 4,5 < żółta). 3. Wytwarzanie acetoiny (reakcja Voges-Proskauera). Acetoina, wytworzona w podłożu peptonowym z glukozą, w środowisku zasadowym (dodatek 1 ml 10% KOH do 5 ml podłoża) wchodzi w reakcję z kreatyniną w peptonie, tworząc czerwony barwnik. Czułość reakcji można zwiększyć przez dodatek kreatyniny i α-naftolu.

359

4. Wykorzystywanie cytrynianu. Wykorzystywanie cytrynianu w podłożu syntetycznym zawierającym cytrynian (jako jedyne źródło węgla) można wykazać śledząc wzrost zmętnienia podłoża oraz wzrost wartości pH (wskaźnikiem jest błękit bromotymolowy).

Produkty fermentacji i szlaki metaboliczne. Fermentacje prowadzone przez bakterie fakultatywnie tlenowe, w tym przez Enterobacteriaceae oraz wiele gatunków Bacillus, prowadzą do powstania dużej liczby związków, wśród których przeważają kwasy organiczne; najważniejszymi spośród produktów fermentacji są octan, mrówczan, bursztynian, mleczan, etanol, glicerol, acetoina, 2,3-butanodiol, dwutlenek węgla oraz wodór. Heksozy są metabolizowane głównie w szlaku fruktozobisfosforanowym oraz w niewielkim stopniu w szlaku pentozofosforanowym. Glukonian jest wykorzystywany w szlaku 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonianowym. W zależności od produktów końcowych wydzielanych w warunkach

360

tlenowych rozróżnia się dwa główne typy fermentacji: 1) typ E. coli, charakteryzujący się dominacją kwasów i brakiem wytwarzania butanodiolu, oraz 2) typ Enterobacter, w którym powstaje znacznie mniej kwasów niż butanodiolu. Wyniki przykładowej analizy fermentacyjnej przedstawiono w tabeli 8.5. Obydwa typy fermentacji różnią się przede wszystkim reakcjami zaczynającymi się od pirogronianu. Cechy charakterystyczne fermentacji typu E. coli. W fermentacji glukozy przez E. coli charakterystyczne są następujące reakcje: 1) przemiana pirogronianu do acetylo-CoA i mrówczanu; 2) rozszczepienie mrówczanu do dwutlenku węgla i wodoru; 3) redukcja acetylo-CoA do etanolu; 4) brak zdolności przekształcania pirogronianu do acetoiny i 2,3-butanodiolu. Rozszczepienie pirogronianu do acetylo-CoA i mrówczanu następuje jedynie w warunkach beztlenowych. Powodem jest bardzo wysoka wrażliwość na tlen enzymu liazy pirogronian:mrówczan (patrz utlenianie pirogronianu, rozdz. 7.2.4). Enzym jest utrzymywany w stanie zredukowanym przez flawodoksynę i do aktywacji wymaga S-adenozylo-α-metioniny. Większość szczepów E. coli oraz innych gatunków Enterobacteriaceae wytwarzających gaz rozszczepia mrówczan do dwutlenku węgla i wodoru.

Reakcja ta jest katalizowana przez układ enzymatyczny noszący nazwę liazy mrówczan: H2. Układ ten najprawdopodobniej łączy w sobie aktywności dehydrogenazy mrówczanowej (HCOOH + X -» CO2 + XH2) oraz hydrogenazy (XH2 -> X + H2). Escherichia coli wytwarza obydwa produkty gazowe (H2 i CO2) w prawie równych ilościach i stechiometryczny stosunek 1 :1 jest zgodny z wytwarzaniem obydwu gazów z rozszczepienia mrówczanu. Zmiana pH może jednakże wywołać zmianę stosunku ilościowego. Przedstawiciele Enterobacteriaceae wytwarzają etanol w wyniku redukcji acetylo-CoA; nie wytwarzają zaś dekarboksylazy pirogronianowej, która przeprowadzałaby dekarboksylację pirogronianu do aldehydu octowego. Część acetylo-CoA wydziela się w postaci octanu. Wiązanie bogate

361

w energię zostaje zachowane w wyniku reakcji katalizowanych przez acetylotransferazę fosforanową i kinazę octanową. Mleczan powstaje w wyniku redukcji pirogronianu. Bursztynian jest wytwarzany w procesie sprzężonym z fosforylacją w łańcuchu transportu elektronów, noszącym nazwę „oddychania fumaranowego" (rozdz. 9.6). W pierwszym etapie fosfoenolopirogronian ulega karboksylacji do szczawiooctanu, który z kolei poprzez jabłczan zostaje przekształcony do fumaranu. Związana z błoną cytoplazmatyczną reduktaza fumaranowa redukuje fumaran do bursztynianu, który następnie zostaje usunięty z komórki. Wydzielanie znacznych ilości bursztynianu (tab. 8.5), którego synteza łączy się z wiązaniem CO2, pozwala wytłumaczyć fakt, że E. coli może uzyskiwać z dwutlenku węgla do 20% węgla tworzącego komórkę. Charakterystyczne cechy fermentacji typu Enterobacter aerogenes. E. aerogenes wytwarza również pewne kwasy w sposób beztlenowy. Ilościowo przeważają jednak acetoina i 2,3-butanodiol. Acetoina powstaje z dwóch cząsteczek pirogronianu w procesie, w którym zachodzą dwie reakcje dekarboksylacji. Tworzenie neutralnego produktu fermentacji — butanodiolu wiąże się ze współzawodnictwem o pirogronian, prowadząc do zmniejszonej produkcji kwasu. Z drugiej strony, tworzenie butanodiolu wiąże się z dodatkowym uwalnianiem dwutlenku węgla. Ilość „dodatkowego" dwutlenku węgla jest stechiometrycznie związana z ilością utworzonego butanodiolu. W tabeli 8.5 pokazano, że część dwutlenku węgla pochodzi z rozszczepienia mrówczanu, lecz zdecydowana większość powstaje w procesie tworzenia butanodiolu. Nazwa Enterobacter aerogenes pochodzi właśnie od intensywnego wytwarzania gazu. Te różnice w produktach fermentacji w porównaniu z E. coli stanowią podstawę testu z czerwienią metylową oraz reakcji Voges-Proskauera na obecność acetoiny.

362

Wytwarzanie acetoiny przez Enterobacter zachodzi poprzez 2-acetylomleczan. Aktywowany aldehyd octowy (pirofosforan hydroksyetylotiaminy; ryc. 7.6) łączy się z pirogronianem w reakcji katalizowanej przez syntazę acetylomleczanową (enzym I) dając 2-acetylomleczan. Drugi enzym (II), dekarboksylaza 2-acetylomleczanowa w sposób stereoswoisty usuwa dwutlenek węgla z wytworzeniem acetoiny. 2,3-butanodiol powstaje na skutek redukcji acetoiny. Reakcja ta jest katalizowana przez dehydrogenazę butanodiolową:

Oprócz E. aerogenes również Bacillus subtilis, B. polymyxa, Serratia, Aeromonas hydrophila i niektóre inne bakterie wytwarzają butanodiol poprzez 2-acetylomleczan. Fermentacje butanodiolowe znalazły zastosowanie w procesach przemysłowych. Diacetyl, związek zbliżony do acetoiny, łatwo powstaje z acetoiny w wyniku utleniania na powietrzu. Wytwarzają go również niektóre bakterie mlekowe (Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis var. diacetylactis oraz w mniejszym stopniu Streptococcus salivarius subsp. thermophilus), które dodawane są do mleka w produkcji masła, jogurtu oraz podobnych produktów powstających z kwaśnego mleka, ponieważ diacetyl jest związkiem nadającym smak. Bakterie te wytwarzają diacetyl raczej nie poprzez 2-acetylomleczan, lecz z pirofosforanu tiaminy i acetylokoenzymu A. Bioluminescencja i bakterie świecące Bioluminescencja, czyli zdolność emitowania światła przez organizmy, jest szeroko rozpowszechniona. W Europie, w tym w Niemczech, najbardziej znanym przykładem jest świecący żuk Lampyris noctiluca, podczas gdy w Ameryce Północnej najczęściej występuje świetlik Photinus pyralis. Również niektóre chrząszcze, kraby, grzyby (Armillaria mellea, Panus stipticus), pierwotniaki (bruzdnice) oraz narządy niektórych ryb wydzielają światło. Bakterie świecące omówione w tej części są organizmami morskimi. Są one chemoorganotrofami i cechami morfologicznymi oraz fzjologicznymi przypominają bakterie jelitowe. (Czasami nazywa się je morskimi enterobakteriami). Niektóre z nich żyją jako symbionty w organach 363

świetlnych mątw i niektórych ryb głębinowych. Podczas gdy, z punktu widzenia przewagi selekcyjnej, zrozumiałe jest wytwarzanie luminescencji przez zwierzęta, to znaczenie bioluminescencji u organizmów jednokomórkowych jest nieznane. Bakterie świecące można łatwo wyizolować z wody morskiej i wód słonawych. Dobrze rosną na mięsie, również rybim, jako naturalnych podłożach wzbogacających, zwykle w niskiej temperaturze. Na powierzchni ciała morskiej ryby trzymanej w lodówce (4-6°C) i częściowo zanurzonej w roztworze soli wyrosną kolonie bakterii świecących — można je łatwo wyizolować i otrzymać czyste kultury. Bakterie te zwykle nie są gnilne; chociaż uwalniają aminy, nie produkują one substancji toksycznych. Można zacytować Roberta Boyle'a (1667) „niejeden kawałek mięsa jeszcze wieczorem świecił, zanim ugotowany następnego dnia stanowił apetyczny i smaczny posiłek". Wszystkie dotychczas wyizolowane bakterie świecące są gramujemnymi fakultatywnymi tlenowcami poruszającymi się za pomocą rzęsek. Na podstawie typu urzęsienia: polarnego lub perytrychalnego oraz liczby od 1 do 8 nagich rzęsek lub schowanych w pochewkach zalicza się je do rodzajów Photobacterium lub Vibrio. Do gatunków najlepiej znanych i zbadanych należą: Photobacterium phosphoreum, Vibrio fischeri, V. harveyi i V. logei. W warunkach beztlenowych większość bakterii świecących przeprowadza fermentację mrówkową lub kwasów mieszanych, podobnie jak bakterie jelitowe — z wytworzeniem mrówczanu, octanu, mleczanu, bursztynianu, alkoholu, dwutlenku węgla i acetoiny. Jak wiele innych morskich bakterii, są one halofilami i po przeniesieniu do roztworów hipotonicznych (np. woda destylowana) natychmiast ulegają lizie. Wzrost i bioluminescencja silnie zależą od składu podłoża. Luminescencja występuje jedynie w obecności tlenu. Od początku tego wieku bakterie świecące używane są jako bardzo czułe wskaźniki wydzielania tlenu podczas fotosyntezy przeprowadzanej przez krasnorosty i zielenice przy różnych długościach fal świetlnych. Proces luminescencji. Proces ten można rozpatrywać jako utlenianie na powietrzu, jakby rodzaj oddychania nie prowadzącego do wytworzenia ATP, ale do aktywacji związku pośredniego wydzielającego światło. Reakcję luminescencji opisano po raz pierwszy (Dubois w 1885 r.) w wyniku doświadczeń, w których użyto ekstraktów wodnych gorących

364

(lucyferyna) oraz zimnych (lucyferaza) z narządu świetlnego małża skałotocza Pholas dactylus:

Luminescencja u zwierząt. Substraty uczestniczące w bioluminescencji różnią się w zależności od układu lucyferyny. Proces ten zbadano najdokładniej dla amerykańskiego świetlika Photinus pyralis. Lucyferyna w tym układzie jest pochodną benzotiazolową. Lucyferaza (E) katalizuje przetworzenie, przy współudziale ATP, zredukowanej lucyferyny (LH2) do adenylanu, który po utlenieniu emituje światło.

Stechiometryczna zależność między ATP i intensywnością światła uczyniła z „luminescencji świetlikowej" ulubiony test na ilościowe wykazanie ATP. Luminescencja u bakterii również przebiega z udziałem kilku składników: zredukowanego FMN, tlenu oraz długołańcuchowego aldehydu (tetradekanalu). Lucyferaza jest monooksygenazą (rozdz. 14.11.1). Przebieg reakcji jest następujący: Utlenienie FMNH2 najprawdopodobniej prowadzi w pierwszym etapie do wzbudzonej cząsteczki FMN, tj. [FMNH 2 O]*, która powraca do stanu wyjściowego z równoczesnym wydzieleniem światła:

Lucyferaza bakteryjna jest dostępna w handlu. Używana jest w reakcji sprzężonej do określania niezmiernie małych ilości NAD(P)H. Autoindukcja luminescencji. Bakterię Vibrio fischeri można wyizolować zarówno z wody morskiej, jak i z organów świecących niektórych ryb morskich, w których bakteria ta jest endosymbiontem. Podczas gdy hodowle poniżej pewnej gęstości komórkowej wykazują jedynie słabą luminescencję, to w stężonych zawiesinach jest ona niezwykle intensywna. Zjawisko to jest wynikiem indukowalności luminescencji. Induktor zostaje wytworzony przez komórki podczas wzrostu. Autoinduktor ten jest 365

cząsteczką o małej masie cząsteczkowej i o znanej strukturze. Występuje on w prawie identycznych stężeniach w cytoplazmie i podłożu. Przy dużej gęstości komórek stężenie induktora również jest duże. Służy on jako chemiczny sygnał dla wyrażenia się genu luminescencji i syntezy lucyferazy. Dokładne zbadanie tego systemu regulacyjnego pozwoliło wyjaśnić, dlaczego bakterie świecące zwykle nie wykazują zjawiska świecenia w morzu, ale dają silną luminescencję w narządach świetlnych ryb, w których występują w stężeniu około 1010 komórek w mililitrze. Geny kodujące bioluminescencję można przenieść na hybrydowych plazmidach do innych bakterii, a nawet roślin, np. do tytoniu, w których ulegają wyrażeniu. System luminescencji jest również wykorzystywany jako marker i wskaźnik w genetyce rekombinacyjnej.

8.5. Fermentacja masłowo-butanolowa i klostridia Maślan, jak również butanol, aceton, 2-propanol i inne kwasy organiczne oraz alkohole są typowymi produktami fermentacji węglowodanów przez beztlenowe bakterie sporujące (klostridia). Grupa ta, razem z wyspecjalizowanymi bakteriami fermentującymi jedynie etanol, aminokwasy lub inne związki, będzie omówiona łącznie w kontekście produkcji maślanu. Cechy charakterystyczne. Rodzaj Clostridium należy do rodziny Bacillaceae. Bakterie te, podobnie jak inni przedstawiciele tej rodziny {Bacillus, Sporolactobacillus, Desulfotomaculum i Sporosarcina), są gramdodatnie. Klostridia są perytrychalnie urzęsione i charakteryzują się ogromną ruchliwością. Komórki wegetatywne mają kształt laseczek, ale często jest on zmienny i określony przez czynniki środowiskowe. Endospory są owalne lub kuliste, a ponieważ ich średnica zwykle jest większa niż średnica komórki wegetatywnej, komórka ulega deformacji (przyjmuje kształt maczugi). Endospory są oporne na ciepło. Pod względem fizjologii klostridia charakteryzują się intensywnym metabolizmem fermentacyjnym oraz wyróżniają się stosunkiem do tlenu. Rosną one tylko w warunkach beztlenowych, lecz reprezentują przekrój od ścisłych beztlenowców {Clostridium pasteurianum, C. kluyveri) do gatunków niemalże tolerancyjnych wobec tlenu (C. histolyticum, C. acetobutylicum) (tab. 8.6). Klostridia zazwyczaj nie zawierają pochodnych hemowych

366

(cytochromy, katalaza), lecz kilka gatunków potrafi wytwarzać cytochromy, jeśli w podłożu są odpowiednie prekursory. Klostridia gromadzą materiały zapasowe przeważnie w postaci wielocukrów podobnych do skrobi.

367

Optymalna temperatura wzrostu większości klostridiów znajduje się w zakresie 30-40°C. Oprócz tych mezofili występują też gatunki termofilne o optymalnej temperaturze wzrostu między 60 i 75°C {Clostridium thermoaceticum, C. thermohydrosulfuricum). Klostridia, tak jak inni przedstawiciele Bacillaceae, rosną wyłącznie w neutralnym lub alkalicznym pH. Ich niepożądany wzrost można zatem całkowicie zahamować przez obniżenie pH (kiszona kapusta, przetwory z owoców, salami itp.). Substraty wykorzystywane przez klostridia. Klostridia bardzo różnią się pod względem substancji, które mogą być przez nie wykorzystywane i fermentowane. Niektóre z nich potrafią wykorzystywać bardzo wiele substratów, podczas gdy inne są wysoce wyspecjalizowane i fermentują jedynie niektóre. Łącznie, jako grupa, klostridia wykorzystują szeroki zakres naturalnych substratów; metabolizują one wielocukry (skrobię, glikogen, celulozę, hemicelulozę i pektyny), kwasy nukleinowe, białka, aminokwasy, puryny i pirymidyny. Niektóre klostridia wymagają złożonego podłoża lub dodatku substancji odżywczych, inne nie. Jeszcze inne zaś wykorzystują azot cząsteczkowy jako jedyne źródło tego pierwiastka, wiążąc go z dużą szybkością (np. C. pasteurianum). Klostridia na podstawie wykorzystywanych przez nie substratów można podzielić na sacharolityczne, metabolizujące przede wszystkim wielocukry i cukry, oraz peptolityczne, metabolizujące białka, peptony i aminokwasy. Dodatkowo, klostridia dzieli się według ich właściwości fermentacyjnych oraz produktów fermentacji (tab. 8.6 i 8.7).

368

odtworzenia ATP, z powstaniem octanu (patrz część dotycząca powstawania ATP podczas fermentacji, na początku tego rozdziału). W czystej fermentacji masłowej wodór pochodzący z utlenienia pirogronianu zostaje uwolniony w formie gazowej. Kiedy glukoza ulega fermentacji do maślanu, dwutlenku węgla i H2, zgodnie z równaniem ustala się równowaga wodorowa i na każdy mol wykorzystanej glukozy przypadają 3 mole powstającego ATP. Butanol, maślan, aceton i 2-propanol są końcowymi produktami fermentacji glukozy przez Clostridium acetobutylicum (ryc. 8.5). Początkowo w fermentacji tej powstaje również maślan. Jednakże, wraz ze wzrostem kwasowości następuje indukcja różnych enzymów, m.in. dekarboksylazy acetooctanowej, uczestniczących w powstaniu acetonu i butanolu. Między powstawaniem acetonu i butanolu istnieje ścisły związek. Dekarboksylacja części acetooctanu przyczynia się do utraty potencjalnego akceptora wodoru, który mógłby pobrać dwa razy 2[H] w redukcji do maślanu. Wodór musi zatem zostać przekazany do innych

370

akceptorów, łącznie z już wytworzonym maślanem. Maślan, przed redukcją do butanolu, jest najpierw aktywowany w wyniku konwersji do butyrylo-CoA. Reakcje w konwersji maślanu i acetonu do butanolu przedstawiono na rycinie 8.4. Gdy fermentacja przebiega w warunkach alkalicznych (np. w obecności CaCO3; patrz tab. 8.8), C. acetobutylicum zachowuje się jak C. butyricum. Niektóre szczepy redukują aceton i wydzielają 2-propanol. Etanol powstaje w wyniku redukcji acetylo-CoA. Wodór cząsteczkowy może pochodzić z rozszczepienia pirogronianu lub z NADH2 podczas odowodorowania aldehydu 3-fosfoglicerynowego (patrz początek rozdziału). Im większe wydzielanie wodoru cząsteczkowego, tym mniejsze zapotrzebowanie na organiczne akceptory wodoru (acetylo-CoA), tak że bogate w energię wiązanie tioestrowe acetylo-Co może zostać zachowane w formie ATP. Zysk energetyczny z fermentacji glukozy przez C. butyricum może zatem przekroczyć 3 mole ATP, o ile zostanie uwolnione więcej niż 2 mole wodoru i wytworzy się odpowiednio mniej maślanu, a więcej octanu (patrz Ruminococcus w dalszej części tego rozdziału). Produkcja acetonu, 2-propanolu i butanolu ma duże znaczenie przemysłowe. Wymienione związki używane są jako rozpuszczalniki organiczne.

371

Wzbogacanie i izolacja. Ciepłooporność endospor wytwarzanych przez klostridia stwarza wygodny sposób uzyskiwania wzbogacających hodowli tych bakterii. Jest nim stosowanie pasteryzowanego inokulum. Zapewnienie ściśle beztlenowych warunków wyklucza również wszystkie organizmy tlenowe. Sacharolityczne klostridia, tak jak wiele innych bakterii metabolizujących wielocukry, często adsorbują się na powierzchni ziaren skrobi lub cząstek celulozy. Przemycie tego typu cząstek przed użyciem ich jako inokulum (np. zawartość żwacza) usuwa wiele bakterii, pozostawiając przyczepione klostridia. Biochemia fermentacji oraz jej produkty. Podczas fermentacji prowadzonych przez klostridia powstają różne ilości kwasów (maślan, octan, mleczan), alkoholi (butanol, etanol), aceton i gazy (dwutlenek węgla oraz wodór). Klostridia metabolizują glukozę w szlaku fruktozobisfosforanowym. Wodór powstający podczas odwodorowania aldehydu 3-fosfoglicerynowego zazwyczaj jest przenoszony na kwasy organiczne lub ketony, które powstają odpowiednio — z pirogronianu lub acetylo-CoA. Fermentacje glukozy przeprowadzane przez Clostridium acetobutyricum i C. acetobutylicum można rozpatrywać jako pierwowzory fermentacji wśród klostridiów. Produktami końcowymi są maślan, octan, butanol, etanol, aceton, 2-propanol, dwutlenek węgla i wodór. Wydajność uzyskiwania poszczególnych związków jest zróżnicowana i zależna od warunków. Maślan powstaje w wyniku kondensacji dwóch cząsteczek acetylo-CoA z wytworzeniem acetoacetylo-CoA. W reakcji tej uczestniczy enzym tiolaza. Acetoacetylo-CoA ulega następnie redukcji przez dehydrogenazę β-hydroksybutyrylową w obecności NADH2 do β-hydroksybutyrylo-CoA. Krotonaza następnie pozbawia ten związek wody, z wytworzeniem krotonylo-CoA, który ulega redukcji przez dehydrogenazę butyrylo-CoA — enzym należący do grupy flawin — do butyrylo-CoA (ryc. 8.4). Transferaza CoA może przenieść koenzym A na octan, a uwolniony maślan zostaje usunięty z komórki. Acetylo-CoA może być, przy udziale acetylotransferazy fosforanowej i kinazy octanowej, wykorzystany do

369

Fermentacja przeprowadzona przez klostridia była pierwszym mikrobiologicznym procesem przemysłowym wymagającym wykluczenia jakichkolwiek zanieczyszczeń. Fermentacja etanolu i octanu. W trakcie prowadzenia hodowli wzbogacającej dla Methanobacterium omelianskii w pożywce zawierającej jako substrat etanol wyizolowano beztlenową bakterię wytwarzającą spory i wymagającą octanu oprócz etanolu. Bakteria ta, Clostridium kluyveri, metabolizuje etanol i octan do maślanu, kapronianu i wodoru (ryc. 8.6). Octan służy jako dodatkowy akceptor wodoru, chociaż powstaje również podczas fermentacji. ATP ulega regeneracji jedynie w reakcji z udziałem kinazy octanowej.

372

Fermentacja mleczanu i octanu. Z hodowli wzbogacającej zawierającej jako substrat mleczan wyizolowano C. tyrobutyricum. Bakteria ta wymaga również octanu jako dodatkowego akceptora wodoru, gdy głównymi substratami są mleczan lub glicerol:

Fermentacja glukozy przez C. tyrobutyricum przebiega według schematu podobnego jak dla C. butyricum i nie wymaga dodatkowych akceptorów wodoru. Fermentacja kwasu glutaminowego. Istnieje wiele procesów fermentacyjnych, w których aminokwasy w warunkach beztlenowych przetwarzane są do kwasów tłuszczowych, dwutlenku węgla i amoniaku. W tym miejscu zostanie omówione jedynie przetwarzanie glutaminianu przez C. tetanomorphum. Fermentacja ta wzbudziła zainteresowanie, ponieważ jej zbadanie doprowadziło do odkrycia biochemicznej funkcji

373

witaminy B 12 . Clostridium tetanomorphum wyizolowano z hodowli wzbogaconej z histydyną jako substratem. Aminokwas ten ulegał przekształceniom poprzez glutaminian. Produktami fermentacji glutaminianu są maślan, octan, amoniak, dwutlenek węgla i wodór cząsteczkowy. Katabolizm glutaminianu wiąże się z ciągiem niezwykłych reakcji (ryc. 8.7). Zaczyna się on od rozszczepienia wiązania między atomami węgla 2 i 3 oraz połączenia atomów 3 i 4 z wytworzeniem rozgałęzionego aminokwasu kwasu metyloasparaginowego. Reakcja wymaga udziału witaminy B 12 jako koenzymu. Na tym etapie zachodzi deaminacja. Nienasycony kwas mezakonowy (metylofumaran) ulega hydroksylacji, a powstały 2-metylojabłczan ulega rozszczepieniu do octanu i pirogronianu. Octan zostaje usunięty, a pirogronian przetworzony do maślanu i CO2 w dobrze znanym szlaku. Fermentacja par aminokwasów — reakcja Sticklanda. Peptolityczne klostridia (tab. 8.6, podrozdział 8.5) hydrolizują białka i fermentują uwalniane aminokwasy. Jednakże, wiele aminokwasów nie ulega fermentacji pojedynczo. W 1934 r. Stickland stwierdził, że Clostridium sporogenes chętnie fermentuje mieszaninę alaniny i glicyny, lecz nie potrafi metabolizować poszczególnych aminokwasów. Zgodnie z następującą reakcją

Zysk energetyczny w sposób oczywisty pochodzi zatem ze sprzężonej reakcji oksydoredukcyjnej. Aminokwasy alanina, leucyna, izoleucyna, walina i metionina służą jako donory wodoru, zaś glicyna, prolina, arginina i tryptofan jako akceptory wodoru. Donorowy aminokwas ulega deaminacji do ketokwasu, który z kolei jest oksydatywnie dekarboksylowany do kwasu tłuszczowego. Etap ten wiąże się z fosforylacją, będąc zatem reakcją energotwórczą. Wodór, który początkowo jest przeniesiony na ferredoksynę, zostaje ponownie związany podczas reduktywnej deaminacji akceptorowego aminokwasu. Nie wszystkie aminokwasy wykorzystywane są przez peptolityczne klostridia.

374

Fermentacja masłowa i octowa przeprowadzane przez organizmy nie wytwarzające endospor. Pewne gatunki bakterii beztlenowych wykazują pokrewieństwo do klostridiów, wyrażone typem przeprowadzanej przez nie fermentacji. Nie wytwarzają one jednak endospor, a niektóre są nawet gramujemne. Większość z nieprzetrwalnikujących oraz wytwarzających maślan i octan organizmów wyizolowano ze żwacza, gdzie uczestniczą w degradacji skrobi, celulozy i innych węglowodanów. Ponieważ wytwarzają one duże ilości wodoru i CO2, sprzyjają tworzeniu metanu przez metanogeny. Jednym z głównych producentów wytwarzających maślan w żwaczu jest Butyrivibrio fibrisolvens. Inny mieszkaniec żwacza, Ruminococcus albus, jest ziarniakiem wykorzystującym celulozę, ksylan i wiele cukrów, produkując przy tym octan. Przekształca on jeden mol glukozy do 2 moli octanu oraz 4 moli wodoru i dwutlenku węgla, ale tylko wtedy, gdy zostaje utrzymane małe stężenie wodoru. Jest to możliwe w mieszanej hodowli z bakterią wykorzystującą wodór, np. Wolinella succinogenes (ryc. 8.8). Schemat pokazuje, iż w czystej fermentacji octowej w wyniku zużycia 1 mola glukozy mogą powstać 4 mole ATP. Tak wysoką wydajność odtwarzania ATP można założyć, gdy wszystkie równoważniki redukcyjne pochodzące z degradacji glukozy zostają uwolnione w formie wodoru (patrz powyższe rozważania dotyczące fermentacji octanu).

Klostridia jako organizmy patogenne wytwarzające toksyny. Niektóre peptolityczne klostridia to organizmy patogenne będące przyczyną zakażenia ran (zgorzel gazowa i tężec) oraz zatruć pokarmowych. Endospory 375

tych bakterii są szeroko rozpowszechnione w glebach. Kiedy spory Clostridium histolyticum i C. septicum dostaną się do rany, w której są warunki beztlenowe lub gdy obecność bakterii tlenowych zużywających tlen powoduje warunki beztlenowe, zaczynają one kiełkować, rozpoczynając proces wzrostu. Bakterie te wytwarzają proteazy trawiące kolagen i inne białka, powodując powstanie brzydko pachnących i często toksycznych produktów fermentacyjnych oraz gazu. Ten rodzaj zakażenia, jak również zgorzel gazową, w przeszłości można było ograniczyć jedynie amputacją chorej kończyny lub kończyn. Innym zakażeniem ran, będącym jeszcze obecnie groźną chorobą, jest tężec, wywoływany przez C. tetani. Podczas wzrostu bakteria ta wydziela bardzo silną toksynę atakującą układ nerwowy i powodującą sztywniejący paraliż mięśni (tężec). Najgroźniejszy rodzaj zatrucia pokarmowego, botulizm, powodowany jest przez C. botulinum, szeroko rozpowszechnioną bakterię, która rozwija się w źle wysterylizowanych produktach mięsnych, konserwowej fasoli itp. Nazwa bakterii pochodzi od jej obecności w kiełbasach (łac. botulus — kiełbasa). Wytwarza ona toksynę, która po zjedzeniu zakażonej żywności powoduje paraliż układu nerwowego i zgon na skutek paraliżu układu oddechowego. Toksyna A (jad kiełbasiany) wydzielana przez C. botulinum jest białkiem ciepłochwiejnym. Dawka powodująca 50% śmiertelność (LD50) wynosi 1 nanogram na kilogram masy ciała. Neurotoksyna ta jest zatem najskuteczniejszą trucizną ze wszystkich znanych. Toksyna ta jest inaktywowana przez gotowanie (15 min ).

8.6. Fermentacja homooctowa: dwutlenek węgla jako akceptor wodoru Niektóre klostridia (Clostridium formicoaceticum, C. thermoaceticum, C. acidiurici, C. cylindrosporum) przenoszą równoważniki wodoru uwolnione we wczesnych etapach utleniania substratu jedynie na dwutlenek węgla, z wytworzeniem octanu: Termofilna bakteria C. thermoaceticum oraz mezofilna C. formicoaceticum fermentują glukozę przede wszystkim do octanu. Metabolizują one heksozę w szlaku fruktozobisfosforanowym, wytwarzając prawie 3 mole octanu na

376

każdy mol wykorzystanej glukozy. By to osiągnąć, duża część dwutlenku węgla powstającego podczas dekarboksylacji pirogronianu musi być ponownie związana, by pełnić rolę akceptora wodoru. Tworzenie octanu z CO2 i równoważników redukujących (elektronów) otrzymanych we wstępnych reakcjach utleniania przebiega zgodnie ze schematem (na rycinie 8.9). Heksoza ulega przekształceniu do pirogronianu w szlaku fruktozobisfosforanowym (jak u większości klostridiów). W powstaniu octanu, CO2, FdH2 i ATP z pirogronianu uczestniczą następujące enzymy: oksydoreduktaza pirogronian: ferredoksyna (1), acylotransferaza fosforanowa (2) oraz kinaza octanowa (3) (ryc. 8.9). Dwutlenek węgla służy jako akceptor wodoru. Częściowo jest on redukowany przez dehydrogenazę mrówczanową (4) do mrówczanu, następnie do grupy metylowej trzeciej cząsteczki octanu, a częściowo przez dehydrogenazę CO (5) do tlenku węgla tworzącego grupę karboksylową octanu. Redukcja grupy formylowej do metylowej przebiega przy udziale koenzymu — kwasu tetrahyd-

377

rofoliowego (FH4). Grupa metylowa zostaje następnie przekazana do białka korynoidowego, gdzie ulega karboksylacji przez wbudowanie związanego CO. Przebieg omówionego reduktywnego mechanizmu syntezy acetylo-CoA z CO2 i równoważników wodoru, tzw. szlak acetylo-CoA, jest w zasadzie identyczny, jak szlak wykorzystywany przez metanogeny i bakterie acetogenne podczas oddychania beztlenowego (rozdz. 9.4, 9.5). Zarówno C. formicoaceticum, jak i C. thermoaceticum posiadają cytochrom b. Nadal nie wiadomo jednak, czy C. aceticum i inne klostridia uzyskują energię przez fosforylację w łańcuchu transportu elektronów (patrz rozdz. 9.5).

8.7. Produkty naturalne podlegające i nie podlegające fermentacji Większość naturalnych produktów zbudowanych z węgla, tlenu, wodoru i/lub azotu w warunkach beztlenowych ulega fermentacji. Fermentacja jest uwarunkowana możliwością częściowego utlenienia substratu w wyniku egzoergicznej wewnątrzcząsteczkowej reakcji rozszczepienia. Fermentowalne są zatem wielocukry, heksozy, pentozy, tetrozy i poliole, jak również kwasy organiczne (łącznie z kwasowymi pochodnymi cukrów, glukonianem, jabłczanem, szczawianem itp.), aminokwasy (z wyjątkiem aminokwasów aromatycznych, które podlegają fermentacji jedynie w szczególnych warunkach), puryny i pirymidyny. W przeciwieństwie do związków podlegających fermentacji, istnieją takie, które w warunkach beztlenowych nie ulegają biodegradacji. Należą do nich alifatyczne i aromatyczne węglowodory, steroidy, karotenoidy, terpeny, nasycone kwasy tłuszczowe oraz porfiryny. Aczkolwiek w warunkach tlenowych wymienione związki podlegają utlenieniu i degradacji, w warunkach beztlenowych są one bardzo stabilne. Stabilność ta wynika z tego, że: a) większość z tych związków są zbudowane wyłącznie z atomów węgla i wodoru, a wewnątrzcząsteczkowe rozszczepienie nie daje zysku energetycznego, b) Węglowodory nasycone i poliizoprenoidy ulegają utlenieniu wyłącznie przez tlen cząsteczkowy; pierwszy etap jest katalizowany przez oksygenazę. Ogromną trwałość węglowodorów w warunkach beztlenowych można wykazać w prostych doświadczeniach laboratoryjnych. Trwałość ta prawdopodobnie tłumaczy przetrwanie

378

Ryc. 8.10. Przegląd najważniejszych rodzajów fermentacji i ich produktów

węglowodorów w złożach ropy naftowej. Drobnoustroje, obecne w czasie, gdy powstawały złoża, prawdopodobnie nie miały zdolności fermentowania parafin i do dzisiaj tej zdolności nie nabyły. Wydaje się jednak możliwe u nich bardzo wolno przebiegające oddychanie beztlenowe z wykorzystaniem węglowodorów aromatycznych i alifatycznych.

TRANSPORT ELEKTRONÓW W WARUNKACH BEZTLENOWYCH

W osadach dennnych jezior i stawów, jak również w stale mokrej glebie, czyli w ekosystemach pozbawionych tlenu rozwijają się bakterie, które otrzymują energię do procesów metabolicznych drogą oddychania beztlenowego. Bakterie te wykorzystują związki i pozostałości wytworzone przez organizmy przeprowadzające procesy fermentacyjne. Są one na końcu beztlenowego łańcucha pokarmowego (rozdz. 8). Te beztlenowo oddychające organizmy wykorzystują jako akceptory wodoru azotan, siarczan, siarkę, węglan, żelazo(III) i wiele innych związków. Redukują one azotan do azotu cząsteczkowego i NO2, siarczan i siarkę elementarną do siarkowodoru, CO2 i węglany do kwasu octowego lub metanu oraz żelazo(III) do żelaza(II). Reakcje redukcji, krótki opis ich roli w metabolizmie oraz bakterie przeprowadzające te reakcje podano na rycinie 9.1. Przejście elektronów pochodzących z substratów organicznych do wyżej wymienionych nieorganicznych jonów i związków pozwala na fosforylację na poziomie transportu elektronów (fosforylacja oksydatywna) oraz odpowiedni zysk energetyczny. Zależności energetyczne zostały już omówione w rozdziale 7.4. Organizmy oddychające beztlenowo mają ogromne znaczenie dla poszczególnych cykli obiegu pierwiastków w przyrodzie oraz w utrzymaniu równowagi w biosferze. Wszystkie, bez wyjątku, należą do prokariotów. Oddychanie beztlenowe, bez wątpienia, należy do typów metabolizmu dominujących we wczesnej ewolucji organizmów i doprowadziło do akumulacji węgla organicznego w prastarych osadach. Produkty od-

380

381

dychania beztlenowego są bardzo charakterystyczne. Mogą to być pęcherzyki gazu (N2, NO2, CH4), który czasem jest palny (CH4), związki o charakterystycznym, nieprzyjemnym zapachu (H2S), czy też diamagnetyczny tlenek żelaza (Fe3O4) utworzony z niemagnetycznego żelaza w formie jonowej. Na koniec należy wspomnieć o dużym znaczeniu gospodarczym bakterii oddychających beztlenowo.

9.1. Oddychanie azotanowe: denitryfikacja i amonifikacja azotanów U bakterii mających zdolność oddychania azotanowego wodór, a ściślej elektrony, przekazywane są do azotanu, który ulega redukcji. W trakcie transportu elektronów powstaje energia. Proces ten znany jest jako oddychanie azotanowe lub dysymilacyjna redukcja azotanu. Ze względu na ekologię i rolę biochemiczną wyróżnia się dwa typy bakterii i dwa rodzaje metabolizmu. 1) Bakterie denitryfikacyjne to tlenowce, które nie rosną w warunkach beztlenowych pod nieobecność azotanu. W warunkach beztlenowych i w obecności azotanu, jako jedynego akceptora wodoru, związek ten ulega redukcji do gazowego podtlenku azotu (N2O) oraz azotu atmosferycznego, które następnie są uwalniane z komórki. Denitryfikacja jest więc przekształceniem azotu związanego (azotan) do wolnego N 2 . Denitryfikacja jest jedynym biologicznym procesem, w wyniku którego azot w związkach organicznych lub nieorganicznych może zostać uwolniony i ponownie włączony do obiegu. Do bakterii denitryfikacyjnych należą — by wymienić kilka najbardziej reprezentatywnych gatunków — Pseudomonas denitrificans, Paracoccus denitrificans, Thiobacillus denitrificans, Pseudomonas aeruginosa i Bacillus licheniformis. 2) Amonifikacja azotanów przeprowadzana jest przez kilka grup drobnoustrojów, przede wszystkim przez ważną grupę bakterii jelitowych (Escherichia coli, Enterobacter aerogenes). Są to fakultatywne beztlenowce zdolne do przeprowadzania fermentacji w warunkach beztlenowych. Jednakże w obecności azotanu wykorzystują go jako zewnątrzkomórkowy akceptor wodoru, który redukukowany jest do azotynu. Azotyn również ulega redukcji, lecz nie do azotu, ale w asymilacyjnym szlaku redukcji + azotanu do amoniaku (NH3) w formie amonu (NH4 ). Amonifikacja nie prowadzi zatem do uwolnienia azotu cząsteczkowego.

382

9.1.1. Oddychanie azotanowe: denitryfikacja Stechiometria przekształcenia azotanu do N2 przy udziale równoważników redukujących pochodzących ze związków organicznych lub wodoru wygląda następująco:

Każdy etap jest katalizowany przez swoisty enzym. Związana z błoną cytoplazmatyczną reduktaza azotanowa A zawiera molibden. Powstający azotyn jest redukowany przez inny związany z błoną cytoplazmatyczną enzym, reduktazę azotynową, do tlenku azotu (NO), który z kolei jest redukowany przez reduktazę NO do N2O, a następnie przez reduktazę N2O do azotu cząsteczkowego (N2). Zależnie od warunków środowiskowych, redukcja azotanu może albo przebiegać bez akumulacji związków pośrednich prowadząc wprost do uwalniania N2, lub też z akumulacją, a następnie wydzielaniem NO2, NO lub N2O. Azotyn, NO lub N2 są wydzielane, kiedy jest nadmiar azotanu i stężenie donorów wodom staje się czynnikiem ograniczającym. Tlenki azotu trafiają zatem do atmosfery nie tylko w wyniku niepełnego spalania węgla i ropy naftowej, lecz również jako produkt przemian biologicznych w glebie i osadach na dnie zbiorników wodnych. Wydaje się, że nie ma bakterii denitryfikacyjnych będących obligatoryjnymi beztlenowcami. Wszystkie mają pełny zestaw składników łańcucha oddechowego. Enzymy biorące udział w oddychaniu azotanowym są indukowane bądź derepresjonowane, w warunkach niedoboru lub braku tlenu (ryc. 9.2). W wielu przypadkach obecność azotanu jest konieczna do indukcji enzymów, ale w innych wystarczającym czynnikiem jest brak tlenu. Wiele bakterii denitryfikacyjnych rośnie wykorzystując nie tylko azotan, lecz również azotyn lub N2O jako akceptory wodoru. Wskazuje to na fakt, że nie tylko reduktaza azotanowa A, lecz również enzymy biorące udział w dysymilacyjnej redukcji azotynu, NO i N2O są sprzęgnięte z łańcuchem transportu elektronów.

383

Hodowle wzbogacające bakterii denitryfikacyjnych. Jeśli podłoże odżywcze zawierające różne donory wodoru, elementy budulcowe dla syntez komórkowych oraz azotan zaszczepić glebą lub błotem i hodować bez dostępu tlenu (tab. 6.4), mogą wyrosnąć w nim różne gatunki bakterii: a) w obecności śladowych ilości peptonu i etanolu lub propionianu: Pseudomonas aeruginosa; b) z glukozą: P. fluorescens; c) z winianem, bursztynianem lub jabłczanem: P. stutzeri; d) z kwasami organicznymi, alkoholem, ekstraktem mięsnym oraz dużym stężeniem azotanu (5-12% KNO3): Bacillus licheniformis; e) ze śladową ilością ekstraktu drożdżowego i wodorem cząsteczkowym jako donorem wodoru: Paracoccus denitrificans; f) z siarką lub tiosiarczanem: Thiobacillus denitrificans. Ponieważ niektóre bakterie denitryfikacyjne jako akceptor wodoru wykorzystują wyłącznie lub głównie wodór, lecz nie potrafią redukować go do amonu, niezbędny jest dodatek źródła azotu (pepton lub sól amonowa). Utrata azotu z gleby na skutek denitryfikacji. Lokalną oraz przejściową denitrifikację w glebach z pewnością można przypisać denitryfikacji bakteryjnej. Denitryfikacja jest powszechna w siedliskach pozbawionych tlenu i łatwo zachodzi w wodach stojących, szczególnie wtedy, gdy równocześnie stosowane są nawozy organiczne i azotany. Na przykład, nawożenie azotanowe na polach ryżowych może prowadzić do szkód spowodowanych akumulacją azotynu. Azotyn akumuluje się również w niedostatecznie nawietrzanych systemach odprowadzania wody, w której obecne są azotany, prowadząc do zanieczyszczenia wody pitnej. Zależność między utratą azotu a stopniem nawietrzenia gleby wynika z mechanizmu regulacji enzymów uczestniczących w redukcji azotanu; enzymy te 384

ulegają indukcji w obecności azotanu jedynie w warunkach beztlenowych (ryc. 9.2). Tlen hamuje tworzenie reduktazy azotanowej i reduktazy azotynowej. Jeśli enzymy zostaną zaindukowane, a następnie komórki przeniesione do warunków tlenowych, tlen będzie współzawodniczyć z azotanem o elektrony przenoszone w łańcuchu oddechowym i zahamuje aktywność układu redukującego azotan. Znaczenie denitryfikacji w przyrodzie. Denitryfikacja jest jedynym biologicznym procesem, w którym azot w formie związanej zostaje przeprowadzony do formy cząsteczkowej. W skali globalnej proces ten ma zasadnicze znaczenie dla utrzymania życia na Ziemi. W normalnie nawietrzanych glebach i wodach azotany są końcowym produktem mineralizacji. Ponieważ jony azotanowe są bardzo dobrze rozpuszczalne w wodzie, a słabo wiążą się do cząstek gleby, mogłyby być wymywane i akumulować się w oceanach. W ten sposób azot cząsteczkowy byłby w sposób ciągły tracony z atmosfery (w procesie wiązania azotu), co w końcu doprowadziłoby do zahamowania wzrostu roślin i produkcji wszelkiej biomasy na Ziemi.

9.1.2. Oddychanie azotanowe: amonifikacja azotanu Pewne fakultatywnie beztlenowe bakterie przeprowadzające fermentację w warunkach beztlenowych, np. Escherichia coli i Enterobacter aerogenes, uzyskują również energię wykorzystując obecność azotanu. Bakterie te mają zdolność przenoszenia elektronów oderwanych od substratu na azotan, z wytworzeniem azotynu. Reakcja ta jest katalizowana przez reduktazę azotanową A i jest sprzężona z fosforylacją oksydatywną, dając zysk w postaci energii.

Azotyn może się akumulować w podłożu, lecz nie zachodzi uwalnianie N2. Jednakże, azotan może ulec redukcji do amonu, który zostaje wydzielony. Proces ten nosi nazwę amonifikacji azotanu, a redukcja do amonu nie daje zysku energetycznego. Przypomina to proces fermentacji, w którym azotyn jest egzogennym akceptorem elektronów. Dla organizmu jest to korzystne, ponieważ podczas fermentacji glukozy część równoważ-

385

ników redukcyjnych jest wykorzystywana do redukcji azotanu, przyczyniając się tym samym do zwiększonego uwalniania octanu (patrz rozdz. 8, reakcja 3). Asymilacja azotanu. Oddychanie azotanowe (lub dysymilacyjną redukcję azotanu) można przeciwstawić asymilacji azotanu (lub asymilacyjnej redukcji azotanu). Poza amonem, azotan jest najpowszechniej występującym źródłem azotu dla roślin i bakterii. Większość bakterii wytwarza enzymy potrzebne do asymilacji azotanu. Ulegają one indukcji, zarówno w warunkach tlenowych, jak i betlenowych, gdy brak innego źródła azotu. Obecność amonu zwykle hamuje tworzenie enzymów biorących udział w asymilacyjnej redukcji azotanu. Proces asymilacyjnej redukcji prowadzi do powstania amonu i wymaga dużej siły redukującej: Azot ulega wbudowaniu do aminokwasów i innych związków zawierających azot w formie amonu. Ta redukcja azotanu przebiega poprzez kilka związków pośrednich, z których jedynie azotyn zostaje uwolniony, i jest katalizowana przez dwa enzymy.

Pierwszy etap przebiega przy współudziale cytoplazmatycznej reduktazy azotanowej B. Powstający azotyn jest redukowany do amonu przez kolejny enzym w cytoplazmie, reduktazę azotynową. Reakcja ta wymaga sześciu elektronów dostarczanych za pośrednictwem NAD(P)H2 (u bakterii i grzybów) lub ferredoksyny (u roślin i bakterii). Enzym ma złożoną budowę i oprócz centrum Fe-S zawiera również centrum żelazowo-hemowe (sirohem). Reakcja katalizowana przez reduktazę azotanową przypomina reakcje z udziałem nitrogenazy i reduktazy siarczynowej, gdyż wszystkie wspomniane enzymy przekazują sześć elektronów bez uwalniania jakichkolwiek produktów pośrednich. Tworzenie methemoglobiny jako konsekwencja akumulacji azotynów w wodzie pitnej i żywności. Picie wody bogatej w azotany (co często się zdarza w okresach suszy) oraz spożywanie pewnych warzyw (np.

386

nadmiernie nawożonego szpinaku) może prowadzić do choroby spowodowanej redukcją azotanu przez bakterie występujące w jelicie. Gdy azotyny dostają się do krwi, wchodzą w reakcję z hemoglobiną, utleniając Fe(II) do Fe(III). Powstały związek, methemoglobina, wiąże tlen w sposób nieodwracalny. Prowadzi to do sinicy, gdyż erytrocyty tracą tym samym zdolność przenoszenia tlenu. Choroba ta występuje jedynie u dzieci do szóstego miesiąca życia, u których bakterie redukujące azotan przechodzą nieuszkodzone przez żołądek, a następnie namnażają się w jelitach. U starszych dzieci oraz osób dorosłych bakterie redukujące azotan są zabijane przez silnie kwasowe soki żołądkowe, a jony azotanowe ulegają wchłonieniu zanim mogłyby ulec redukcji w sprzyjającym pH w dwunastnicy.

9.2. Tworzenie siarkowodoru podczas redukcji siarczanu Grupa bakterii redukujących siarczany (zwanych również bakteriami sulfidogennymi) charakteryzuje się zdolnością przekazywania wodoru do siarczanu, jako ostatecznego akceptora elektronów, redukując go do siarczku. Proces ten pozwala na transport elektronów przy współudziale cytochromu c, a zysk energetyczny w warunkach beztlenowych pochodzi z fosforylacji oksydatywnej.

Ponieważ powyższy typ redukcji siarczanu pod pewnymi względami przypomina oddychanie tlenowe, często nazywany jest oddychaniem siarczanowym lub dysymilacyjną redukcją siarczanu. Głównym produktem redukcji jest siarkowodór: Większość siarczków w przyrodzie powstaje zgodnie z powyższą reakcją. Bakterie redukujące siarczan, w przeciwieństwie do bakterii redukujących azotan, są obligatoryjnymi beztlenowcami ściśle uzależnionymi od warunków beztlenowych.

387

Pozycja taksonomiczna. Znanych jest kilka grup bakterii beztlenowych zdolnych do oddychania siarczanowego. Należą do nich zarówno urzęsione, jak i nieurzęsione bakterie (Desulfovibrio, Desulfobacterium, Desulfococcus, Desulfomonas, Desulfobacillus, Desulfosarcina, Thermosulfobacterium), gramujemne bakterie poruszające się ruchem ślizgowym (Desulfonema), gramdodatnie bakterie wytwarzające endospory (Desulfotomaculum) oraz archeony (Archaeoglobus). Donorami wodoru dla poszczególnych prokariotów mogą być bardzo różne związki niskocząsteczkowe: mleczan, octan, propionian, maślan, mrówczan, metanol, etanol, wyższe kwasy tłuszczowe, związki aromatyczne i wodór cząsteczkowy. Żaden pojedynczy gatunek nie ma zdolności wykorzystywania wszystkich wymienionych związków, a żaden związek nie jest wykorzytywany przez wszystkie organizmy. Grupa organizmów oddychających siarczanowo jest zatem bardzo zróżnicowana pod względem szlaków metabolicznych. Poniższe krótkie zestawienie charakteryzuje, bez wnikania w szczegóły, poszczególne podgrupy. 1. Grupa ta, odkryta prawie dwadzieścia lat temu, zawiera gatunki, które rosną w obecności kwasu mlekowego oraz innych kwasów i wykorzystują wodór cząsteczkowy. Przedstawiciele tej grupy utleniają donory wodoru jedynie częściowo i wydzielają octan. Należą tutaj gatunki Desulfovibrio i Desulfotomaculum. 2. Kilka lat temu wyizolowano gatunki wykorzystujące jako donory wodoru: octan, krótko- i długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, alkohole, związki aromatyczne i wodór cząsteczkowy. 3. Kilka gatunków rośnie autotroficznie, wykorzystując wodór cząsteczkowy i tiosiarczan. W skład tej grupy wchodzą szczepy Desulfovibrio, Desulfobacterium, Desulfococcus, Desulfobacter i Desulfotomaculum, jak również ekstremalnie termofilny archeon Archaeoglobus. 4. Niedawno odkryta bakteria, Desulfovibrio dismutans, przeprowadza niecodzienną reakcję dającą energię — dysmutację tiosiarczanu lub siarczynu do siarczanu i H2S. Niektóre szczepy rosną autotroficznie lub w obecności octanu, jako chemolitrotrofy. Ten typ metabolizmu można uważać za „fermentację nieorganiczną". Redukcja siarczanu. Prawie wszystkie bakterie, jak również grzyby i rośliny zielone, mogą wykorzystywać siarczan jako źródło siarki. W szlaku „asymilacyjnej redukcji siarczanu" wytwarza się siarczek

388

niezbędny do syntezy aminokwasów siarkowych. Pierwszy etap redukcji dysymilacyjnej i asymilacyjnej jest taki sam. Jednakże, o ile w redukcji dysymilacyjnej aktywowany siarczan ulega bezpośredniej redukcji, o tyle w procesie asymilacji następuje dodatkowa aktywacja. Komórka inicjuje redukcję siarczanu dość energochłonną aktywacją siarczanu przez ATP (ryc. 9.3); sulfurylaza ATP wymienia difosforan ATP na siarczan:

Adenozyno-5'-fosfosiarczan (APS) jest związkiem aktywnym. W szlaku asymilacyjnym APS jest fosforylowany przez kinazę APS i kolejny mol ATP do fosfoadenozyno-5-fosfosiarczanu (PAPS). Dopiero podwójnie aktywowany siarczan redukowany jest poprzez siarczyn do siarczku. W dysymilacyjnym szlaku redukcji APS jest redukowany przez reduktazę APS do AMP i siarczynu. 389

Redukcja siarczynu do siarczku ma odmienny przebieg u różnych bakterii. Reduktaza siarczynowa może redukować siarczyn bezpośrednio do siarczku z udziałem sześciu elektronów i bez powstawania jakichkolwiek produktów pośrednich. Ten typ redukcji, podobnie jak asymilacyjna redukcja siarczanu, najprawdopodobniej przebiega z udziałem związków żelazoporfirynowych (desulfowirydyna, desulforubidyna). W asymilacyjnej redukcji siarczyn jest redukowany w trzech kolejnych reakcjach, w których powstają wolne związki pośrednie (tritionian i tiosiarczan) (ryc. 9.3). Elektrony do redukcji siarczynu prawdopodobnie są dostarczane za pośrednictwem cytochromów (cytochrom b u niektórych bakterii, cytochrom c u innych). Fosforylacja na poziomie transportu elektronów. Założenie, że u bakterii redukujących siarczan fosforylacja zachodzi na poziomie transportu elektronów, oparte jest na tym, że w błonach cytoplazmatycznych (i na błonach) tych bakterii występują cytochromy i białka żelazo-siarkowe. Charakterystyczny jest też znaczny zysk energetyczny. Cytochrom c3 charakteryzuje się niezmiernie niskim potencjałem redoks (E'o , — 205 mV) w porównaniu z innymi cytochromami i znajduje się bądź na zewnętrznej powierzchni błony cytoplazmatycznej, bądź w przestrzeni peryplazmatycznej. Dotychczas zbadane rodzaje bakterii redukujących siarczan mają konstytutywną hydrogenazę biorącą udział w pobieraniu i aktywacji wodoru, jak również w jego uwalnianiu. Niektóre bakterie redukujące siarczan rosną w obecności wodoru i siarczanu, jako jedynego źródła energii. Zdolność redukowania siarczanu przy udziale cząsteczkowego wodoru z akumulacją dużych ilości H2S, ale bez wyraźnego wzrostu, jest cechą charakterystyczną większości bakterii redukujących siarczan. Transport elektronów z wodorem cząsteczkowym jako donorem i redukcja jednego mola siarczanu do siarczku jest najprawdopodobniej sprzężona z odtworzeniem 3 moli ATP, z których dwa są zużywane do aktywacji siarczanu. Autotroficzne asymilacja CO2. W ciągu ostatnich 40 lat autotroficznemu wzrostowi drobnoustrojów poświęcono bardzo wiele badań. Wyniki, choć wciąż niepełne, można już jednak jakoś uporządkować. Szlaki tego typu wiązania CO2 to reduktywny cykl acetylo-CoA lub reduktywny cykl kwasów trikarboksylowych (TCC), lecz nie cykl Calvina (rozdz. 11.5). 390

Utlenianie substratów organicznych. Najlepiej poznane bakterie redukujące siarczan, do których należy Desulfovibrio vulgaris, nie wykorzystują pełnego cyklu kwasów trikarboksylowych i wydzielają octan. Do gatunków wykorzystujących octan należą takie, które utleniają ten związek w oksydatywnym szlaku TCC {Desulfobacter postgatei) oraz inne, które utleniają go w oksydatywnym szlaku acetylo-CoA {Desulfobacterium, Desulfosarcina, Desulfococcus, Desulfotomaculum). Szczepy te do utleniania octanu wykorzystują zatem te same szlaki, które służą do reduktywnego wiązania CO 2 , tyle że w odwrotnym kierunku. Większość z ostatnio wyizolowanych bakterii wykorzystuje octan, długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, jak również związki aromatyczne. Asymilacja substratów organicznych. Energia metaboliczna uzyskana z fosforylacji na poziomie transportu elektronów pozwala na asymilację substratów organicznych (kwasy organiczne, aminokwasy i złożone mieszaniny). Niektóre szczepy syntetyzują składniki komórkowe z octanu i dwutlenku węgla, wykorzystując wodór cząsteczkowy jako donor wodoru. Tego typu asymilacja substancji organicznych podczas utleniania nieorganicznego donora wodoru nosi nazwę „chemolitoheterotrofii". Fermentacja bez siarczanu. Niektóre bakterie desulfurykacyjne w warunkach braku siarczanu metabolizmują mleczan lub pirogronian. Utlenianie pirogronianu zgodnie z równaniem:

Fermentacja mleczanu wskazuje na zdolności fermentacyjne bakterii desulfurykacyjnych. Wzbogacanie i izolacja. Podłoże dla hodowli wzbogaconej w bakterie redukujące siarczan powinno zawierać odpowiedni donor wodoru, łatwy do asymilacji substrat, sole mineralne i siarczan. Należy również zapewnić warunki beztlenowe oraz odpowiednio niski potencjał redoks (E'o = -200 mV) (ryc. 9.4).

391

Występowanie i rola bakterii desulfurykacyjnych w przyrodzie. Bakterie redukujące siarczany występują przede wszystkim w rozkładających się osadach oraz w „czarnym błocie", w którym zachodzi beztlenowa degradacja związków organicznych. Bakterie desulfurykacyjne są dobrze przystosowane do metabolizowania takich produktów niepełnej degradacji węglowodanów, tj. kwasy tłuszczowe, ketokwasy, alkohole, i wodoru z fermentacji. Siarkowodór występujący w przyrodzie można uznać za produkt końcowy oddychania siarczanowego. Zanieczyszczone wody 4 6 7 często zawierają 10 -10 , a czarne błoto 10 organizmów desulfurykacyjnych w jednym mililitrze. Większość spośród wykorzystywanych złóż siarki (m.in. w Teksasie, Luizjanie oraz Meksyku) nie jest pochodzenia wulkanicznego, lecz wytworzyły się na skutek powolnej akumulacji. Siarkowodór i siarka powstają również w procesie redukcji morskich osadów siarki przez

392

ścieki zawierające Desulfovibrio. Desulfovibrio pośrednio przyczynia się także do beztlenowej korozji żelaza. Tego typu korozja ma istotne znaczenie dla gospodarki. W wilgotnej atmosferze zachodzą następujące reakcje:

Żelazo zwykle zabezpieczone jest przed dalszą korozją przez błonkę z wodoru. W obecności siarczanu i bakterii desulfurykacyjnych zachodzi depolaryzacja na katodzie i żelazo ulega utlenieniu nawet w braku tlenu:

W ten sposób powstaje wiele uszkodzeń rurociągów. Zdolność bakterii redukujących siarczany do wykorzystywania kwasów organicznych, alkoholu i wodoru, w tym wodoru powstającego podczas polaryzacji żelaza, można wykorzystać przy zakładaniu hodowli wzbogacających (ryc. 9.4). Bakteria Desulfovibrio jest odpowiedzialna za dużą zawartość siarkowodoru na dnie (poniżej 200 m) Morza Czarnego i jego czarną barwę wynikającą z korozji żelaza. Aby zapobiec czernieniu powodowanemu 393

przez H2S, białej farby zawierającej metale ciężkie, gondole na Canale Grandę w Wenecji maluje się dodatkowo czarną farbą. Desulfotomaculum ruminis uczestniczy w tworzeniu H2S w żwaczu zwierząt przeżuwających (rozdz. 14.1).

9.3. Redukcja siarki do siarkowodoru Od dawna wiadomo, że siarka, po dodaniu „kwiatu siarczanego" do zawiesiny drożdży fermentujących cukier, „wchodzi w ciąg biologicznych reakcji redukcji" z wytworzeniem siarkowodoru. Jednakże dopiero ostatnio odkryto, że niektóre bakterie wykorzystują nieorganiczną siarkę jako akceptor wodoru podczas beztlenowego transportu elektronów. Siarka ulega redukcji do siarkowodoru w procesie zwanym oddychaniem siarkowym. Jedynym dotychczas dobrze poznanym organizmem tego typu jest Desulfuromonas acetoxidans. Jest to ruchliwa bakteria poruszająca się przy pomocy bocznie umieszczonej rzęski. Wyizolowano ją z wody morskiej metodą hodowli wzbogacającej w roztworze soli mineralnych uzupełnionym octanem i siarką elementarną. Desulfuromonas acetoxidans utlenia octan lub etanol do dwutlenku węgla. Odróżnia się od większości szczepów należących do rodzaju Desulfovibrio tym, że redukuje siarkę

394

oraz całkowicie utlenia substraty organiczne. Inne gatunki tego rodzaju redukują jedynie siarczan lub siarczyn, lecz nie siarkę, a utleniają np. etanol jedynie do octanu. Desulfuromonas acetoxidans zawiera cytochrom c7 o bardzo niskim potencjale redoks oraz białko 4Fe-4S. Wytwarza również enzymy cyklu kwasów trikarboksylowych. Organizm ten potrafi żyć w syntrofii z fototroficzną zieloną bakterią siarkową, która na świetle utlenia siarkowodór do siarki i wiąże dwutlenek węgla (ryc. 9.5). Redukcja siarki przez archeony. Niektóre ekstremalnie termofilne i hipertermofilne archeony, z których większość to organizmy kwasolubne oraz ściśle beztlenowe, należą do typu metabolicznego zdolnego do oddychania siarkowego. Wyizolowano je całkiem niedawno z gorących źródeł oraz stawów siarkowych. Pyrodictium (P. occultum, P. brockii) to ściśle beztlenowy archeon rosnący w temperaturach do 110°C. Rośnie autotroficznie, wykorzystując H2 jako donor wodoru oraz siarkę jako akceptor wodoru, chociaż w odpowiedmich warunkach zachowuje się jak miksotrof. Z drugiej strony, gatunki należące do Acidianus (A. brierleyi, A. ambivalens) są zadziwiająco wszechstronne. Rosną w warunkach beztlenowych, utleniając siarkę do siarczanu, ale również redukują siarkę do siarkowodoru, wykorzystując w tym procesie wodór cząsteczkowy jako donor wodoru. Przeprowadzają zatem beztlenowe oddychanie siarkowe.

9.4. Tworzenie metanu przez redukcję węglanu Metan wytwarza się podczas beztlenowego katabolizmu substratów organiczych. Ilości powstającego metanu są ogromne; ocenia się, że 1-1,5% węgla w atmosferze w postaci dwutlenku węgla powstającego w wyniku mineralizacji substancji organicznych trafia tam początkowo w formie metanu, który następnie ulega przekształceniu poprzez CO do CO 2 . W reakcji tej uczestniczą rodniki wodorotlenowe (OH). Do ekosystemów, w których powstaje najwięcej metanu, należą wielkie tundry oraz obszary bagienne, pola ryżowe, osady na dnie jezior i innych zbiorników wodnych, bagna, piaszczyste laguny, zbiorniki, w których 9 odbywa się rozkład ścieków, oraz żwacz ponad 10 przeżuwaczy zamieszkujących naszą planetę. W tych beztlenowych środowiskach substraty organiczne początkowo są fermentowane do octanu, dwutlenku węgla i wodoru cząsteczkowego (poprzez kilka etapów pośrednich). Z kolei te 395

produkty pierwotnej i wtórnej degradacji wykorzystywane są przez drobnoustroje produkujące metan (metanogeny). Około 70% wytworzonego metanu pochodzi z octanu, a około 30% z CO2 i H 2 . Pozycja taksonomiczna. * Klasyfikacja następujących bakterii metanogennych jest oparta na morfologii ich komórek: Methanobacterium (pałeczka), Methanococcus (ziarniak), Methanosarcina (podobny do pakietowca — Sarcina) i Methanospirillum (kształt spiralny). Metanogeny odróżniają się od bakterii nie tylko typem metabolizmu, lecz również pewnymi cechami strukturalnymi. Pozbawione są one typowego szkieletu z peptydoglikanu (mureiny). Methanococcus ma jedynie osłonę białkową, podczas gdy ściana komórkowa Methanosarcina barkeri składa się z wielocukru zbudowanego z kwasów uronowych, cukrów obojętnych oraz aminocukrów. Wzrost metanogenów nie jest hamowany przez penicylinę. Błona cytoplazmatyczna metanogenów zawiera lipidy złożone z eterów glicerolowych węglowodorów izoprenoidowych (patrz rozdz. 3.13). Rybosomy metanogenów mają wielkość zbliżoną do rybosomów eubakterii (rybosomy 70S), lecz sekwencja zasad w rybosomowym RNA, szczególnie w 16S rRNA, jest całkiem odmienna. Pod tym względem metanogeny różnią się bardziej od E. coli niż sinice. W dodatku, translacja na rybosomach nie jest wrażliwa na antybiotyki hamujące syntezę białka u bakterii. Na podstawie tych i innych różnic metanogeny zaliczono w obrębie prokariotów do archeonów (rozdz. 3.13). Fizjologia. Metanogeny są ścisłymi beztlenowcami; obecność powietrza jest dla nich letalna. Nie zawierają ani katalazy, ani dysmutazy ponadtlenkowej. Nadzwyczajna wrażliwość na tlen jest powodem ubóstwa wiedzy na temat ich biochemii, fizjologii i ekologii. W celu ich izolacji w warunkach wykluczających obecność tlenu stosuje się specjalną metodę, zwaną techniką Hungate'a. Większość metanogenów dotychczas wyizolowanych i utrzymywanych w czystych kulturach wykorzystuje wodór cząsteczkowy jako donor wodoru; niektóre korzystają również z mrówczanu, metanolu, octanu lub metyloaminy. W niektórych ekosystemach beztlenowych głównym substratem do produkcji metanu jest octan. Spektrum wykorzystywanych substancji jest bardzo wąskie.

396

Metanogeny są ostatnim ogniwem w beztlenowym łańcuchu pokarmowym (rozdz. 8), który rozpoczyna się od wielocukrów (celuloza, skrobia), białek oraz lipidów i w którym uczestniczą bakterie przeprowadzające fermentację: 1) bakterie fermentujące celulozę do bursztynianu, propionianu, maślanu, mleczanu, octanu, alkoholi, CO2 i H2, 2) bakterie acetogenne, które fermentują powyższe produkty do octanu, mrówczanu, CO2 i H2. Te ostatnie produkty są substratami dla metanogenów, które

występują w ścisłym związku z bakteriami wytwarzającymi wodór (ryc. 9.6). W mikrośrodowiskach wodór rzadko uwalniany jest w formie gazowej. Metanogeny asymilują wodór, który po wydzieleniu natychmiast ulega rozpuszczeniu w środowisku. Wiadomo, że wysokie ciśnienie parcjalne wodoru hamuje metabolizm i wzrost organizmów wytwarzających go. Oznacza to, że nie tylko metanogeny zależą od bakterii wytwarzających wodór, lecz również te ostatnie są zależne od swoich

397

partnerów wykorzystujących wodór. Jest to związek równoznaczny z symbiozą mutualną. Metanogeny mają zdolność aktywowania wodoru i sprzęgania jego utlenienia z redukcją dwutlenku węgla. Jako że wszystkie z nich syntetyzują składniki komórkowe, wykorzystując dwutlenek węgla jako jedyne źródło węgla, należy uważać je za chemoautrofy. Ponieważ dwutlenek węgla jest wykorzystywany również jako akceptor wodoru w procesie wytwarzania energii z równoczesnym powstaniem metanu, tworzenie tego gazu można zatem rozpatrywać jako formę oddychania węglanowego.

ΔG0 = -131 kJ/mol (-31,3 kcal/mol) Niektóre metanogeny przeprowadzają tlenek węgla do metanu. Produktami pośrednimi są dwutlenek węgla i wodór:

Biochemia tworzenia metanu i zysk energetyczny. Biochemiczne przekształcenia H2 i CO2 do metanu, zaś octanu do metanu i CO2 przebiegają z udziałem różnych enzymów i grup prostetycznych, których występowanie dotychczas stwierdzono jedynie u metanogenów; są to deazaryboflawinowa pochodna F 4 2 0 , metanopteryna, metanofuran, niklowo-tetrapyrolowy czynnik F 4 3 0 oraz koenzym Μ (sulfonian merkaptoetanu). Podstawowe struktury tych związków przedstawiono na rycinie 9.7. Prawdopodobne szlaki tworzenia metanu z octanu oraz z wodoru i dwutlenku węgla są przedstawione poniżej (s. 399). Jak dotychczas, bardzo mało wiadomo o enzymach uczestniczących w poszczególnych reakcjach, a mechanizmy odtwarzania ATP są również nie do końca

398

poznane. Jedynie ostatni etap powstawania metanu charakteryzuje się odpowiednim potencjałem termodynamicznym do regeneracji ATP. Doświadczenia przeprowadzone z archeonem Methanosarcina barkeri, który produkuje metan z metanolu i wodoru CH3OH + H2 -> CH4 + H2 dały jednoznaczne wyniki. Wprowadzenie obydwu substratów do zawiesiny bakterii prowadzi do wyrzucania protonów, tworzenia metanu oraz regeneracji ATP przez komórki. Opierając się na tych wynikach, można sądzić, że metanogeny regenerują ATP nie przez fosforylację substratu, lecz w warunkach beztlenowych przez fosforylację na poziomie transportu elektronów (oddychanie beztlenowe).

399

Ι

Zysk energetyczny jest ostatnim etapem tworzenia metanu, któremu najpierw towarzyszy wyrzucenie protonów z komórki. Reakcję tę katalizuje kompleks enzymatyczny metyloreduktazy metylokoenzymu M. Enzym ten zawiera, oprócz trzech podjednostek białkowych, czynnik niklo-tetrapirolowy F 4 3 0 będący grupą prostetyczną. Enzym redukuje metylo-CoM (CH3-S-C0M) do metanu przy pomocy HS-HTP jako donora wodoru. Równocześnie powstaje CoM-S-S-HTP, który następnie ulega reduktywnemu rozszczepieniu do CoM-SH i HS-HTP. Niezbędne równoważniki redukujące pochodzą z H2 aktywowanego przez hydrogenazę. Autotroficzne wiązanie dwutlenku węgla: reduktywny szlak acetylo-CoA. Autrotroficzne wiązanie CO2 przez metanogeny (podobnie jak

400

w przypadku bakterii redukujących siarczan (podrozdz. 9.2) oraz bakterii acetogennych (podrozdz. 9.5) przebiega bez udziału reakcji cyklu rybulozobisfosforanowego. Synteza materiału komórkowego z dwutlenku węgla przebiega raczej poprzez reduktywny szlak acetylo-CoA z udziałem pirogronianu. Reakcje odpowiedzialne za ten proces wykryto dzięki eksperymentom wykorzystującym związki radioaktywne oraz badaniom enzymatycznym z Methanobacterium thermoacetotwphicum; mechanizmy te są wciąż tematem wnikliwych badań. Dwutlenek węgla ulega redukcji do metanolu (w formie związanej). Druga cząsteczka CO2 jest redukowana do tlenku węgla przez dehydrogenazę tlenku węgla. Siła redukująca jest dostarczana w wyniku aktywacji H2 przez hydrogenazy i przekazywana przez enzymy, które reagują z czynnikiem F 4 2 0 lub NADP. W wyniku karbonylacji metylo-X powstaje acetylo-X, a reduktywna karboksylacja acetylo-CoA przez syntazę pirogronianową prowadzi do pirogronianu, z którego w dobrze znanych szlakach powstają materiały komórkowe.

Zastosowania. Zbiorniki do beztlenowego rozkładu substancji organicznych w ściekach są częścią systemu oczyszczania ścieków komunalnych. W krajach uprzemysłowionych procesy sedymentacji są wykorzystywane w stabilizacji osadów pierwotnych oraz osadów powstających podczas tlenowego oczyszczania ścieków. Metan wydzielający się w tym procesie jest częściowo wykorzystywany, a częściowo spalany. W rolnictwie fermentory „biogazowe" lub doły gnilne są stosowane do fermentacji odchodów zwierzęcych razem z odpadami zawierającymi celulozę. Procesy te są korzystne, gdyż z jednej strony azot zawarty w odchodach zostaje zachowany w gnijącym osadzie, a z drugiej strony, powstający biogaz (metan) może być wykorzystywany jako źródło energii do celów gospodarczych i rolniczych. 401

9.5. Tworzenie octanu przez redukcję węglanu W kilku środowiskach, w których powstaje metan, wytwarza się również octan. Bakterie najprawdopodobniej przyczyniają się do zakwaszania zbiorników w zakładach oczyszczania ścieków, metabolizując dwutlenek węgla i wodór cząsteczkowy zgodnie z następującą reakcją:

Stosując podłoże zawierające jedynie niezbędne sole nieorganiczne, witaminy oraz nawietrzanie CO2 i H2, z gnijących osadów dennych oraz słodkowodnych i morskich błot wyizolowano szereg organizmów rosnących autotroficznie w obecności H2 i CO2. Są to takie gramdodatnie bakterie, jak Clostridium aceticum, C. thermoaceticum oraz Acetobacterium woodii (rozdz. 8.6). Bakterie acetogenne należy rozpatrywać jako beztlenowe, utleniające wodór chemolitoautotrofy zdobywające energię w drodze „oddychania węglanowego". Syntetyzują one materiał komórkowy poprzez pirogronian i acetylo-CoA. Podczas asymilacyjnej syntezy octanu dwutlenek węgla ulega redukcji poprzez mrówczan do metylo-FH4. Koenzymem w tej reakcji jest tetrahydrofolian. Kolejne reakcje prawdopodobnie przypominają szlak syntezy octanu przeprowadzanej przez Methanobacterium thermoacetotrophicum. Reduktywna karboksylacja acetylo-CoA prowadzi do pirogronianu, z którego w znanych szlakach metabolicznych powstaje materiał komórkowy. Podczas wzrostu z wykorzystaniem dwutlenku węgla i wodoru organizmy oddychające węglanowo wydzielają duże ilości octanu. Synteza octanu prawdopodobnie odbywa się w szlaku asymilacyjnym i bogate w energię wiązanie acetylo-CoA jest wykorzystywane do odtwarzania ATP. Poszczególne reakcje oraz ich występowanie u różnych organizmów nie są do końca znane. Niektóre ekstremalnie termofilne i ściśle beztlenowe prokarioty, wyizolowane ostatnio z gorących źródeł, rosną w podłożu mineralnym w atmosferze czystego tlenku węgla. Jako jedyne produkty metaboliczne wytwarzają one wodór i dwutlenek węgla oraz przypuszczalnie syntetyzują materiał komórkowy w reduktywnym szlaku acetylo-CoA.

402

9.6. Tworzenie bursztynianu przez redukcję fumaranu Bursztynian wcześniej kilkakrotnie wymieniano jako produkt fermentacji. Nie wspomniano jednakże, że jego tworzenie może być sprzężone z fosforylacją w trakcie transportu elektronów. Bursztynian jest produktem redukcji fumaranu: 2 [H] + fumaran -> bursztynian Fumaran jest nie tylko akceptorem równoważników redukujących (NADH2) wytworzonych podczas wczesnych etapów katabolizmu heksozy. Charakteryzuje się on stosunkowo wysokim potencjałem redoks (E'o układu fumaran/bursztynian wynosi —30 mV). Może on zatem przyjmować elektrony dostarczane przez koenzymy przenoszące wodór, które przeszły przez część łańcucha transportowego. Redukcja fumaranu (przez odpowiedni przenośnik) pozwala na oksydatywną fosforylację. Ten system oddychania można zatem uważać za „oddychanie fumaranowe" (ryc. 9.8). W istocie „oddychanie fumaranowe" jest szeroko rozpowszechnione wśród chemoorganotroficznych bakterii beztlenowych. Dodatek fumaranu do podłoża wzrostowego powoduje szybszy wzrost oraz większą wydajność wielu bakterii. Wskazuje to na bardziej efektywne odtwarzanie ATP w obecności tego związku, co potwierdzono dla wielu bakterii jelitowych

403

(Escherichia, Proteus, Salmonella, Klebsiella) oraz Bacteroides, Propionibacterium i Vibrio succinogenes (patrz ryc. 8.8 dla R. albus). Chociaż fumaran może być stosowany egzogennie jako ostateczny akceptor elektronów w warunkach beztlenowych, to jest on również wytwarzany endogennie z węglowodanów i wielu innych substratów. Produktami pośrednimi są szczawiooctan i jabłczan (ryc. 7.14). Lokalizacja reduktazy fumaranowej w komórce jest zgodna z jej rolą w transporcie elektronów: enzym jest związany z osłonami. Redukcja fumaranu jest procesem zużywającym protony. Jeśli redukcja fumaranu jest sprzężona z wytwarzaniem potencjału protonów (dodatniego po zewnętrznej stronie błony), to enzym powinien znajdować się na wewnętrznej powierzchni błony. Tak zapewne jest. Wykazano, że redukcja jednego mola fumaranu jest związana z odtworzeniem około jednego mola ATP.

Można również przyjąć, że większość fermentacji, którym towarzyszy tworzenie bursztynianu, przebiega przy współudziale reduktazy fumaranowej, co daje dodatkowy zysk w postaci ATP. Jak wspomniano powyżej, reduktaza fumaranowa uczestniczy w wielu procesach fermentacyjnych, np. w tworzeniu bursztynianu przez E. coli oraz propionianu przez Propionibacterium. Jednakże oddychanie fumaranowe ma istotne znaczenie nie tylko u prokariotów. Wiele „robaków" (Ascaris lumbricoides, Fasciola hepatica, Trichuris vulpis, Arenicola marina) również potrafi żyć w wamnach beztlenowych. Organizmy te wydzielają bursztynian i propionian. Ten ostatni związek powstaje w szlaku metylomalonylo-CoA (ryc. 8.3). Wydaje się, że wytwarzanie bursztynianu i propionianu przez zwierzęta niższe odgrywa podobną rolę, jak fermentacja mlekowa w mięśniach ssaków. Zarówno te fermentacje, jak i „oddychanie fumaranowe" pozwalają na pewien zysk energetyczny nawet w ściśle beztlenowych warunkach, nadając organizmowi tolerancję na przejściowe okresy braku tlenu.

9.7. Redukcja żelaza(lll) do żelaza(ll) Mieszane kultury bakterii glebowych redukują żelazo(III) do jonów żelaza(II). Jeśli oprócz jonów żelaza(III) są również obecne jony azotanowe lub azotynowe, ulegają one redukcji do azotynu oraz azotu cząsteczkowego (denitryfikacja) zanim nastąpi redukcja jonów żelaza(III). Elektrony prawdopodobnie są przekazywane do żelaza(III) przez reduktazę azotanową A. Ponieważ redukcja azotanu jest sprzężona z fosforylacją oksydatywną, wydaje się, że redukcja żelaza(III) również pozwala na oddychanie beztlenowe. Potencjał redoks E'o + 770 mV dla pary 3+ 2+ Fe /Fe decyduje o tym, że reakcja taka jest termodynamicznie możliwa. 404

W istocie, niedawno odkryto bakterię przeprowadzającą dysymilacyjną redukcję żelaza. W braku tlenu bakteria ta, szczep GS-15 (Alteromonas), wykorzystuje octan jako źródło węgla i donor Η oraz Fe(III) jako akceptor H. Podczas redukcji żelaza(III) przez octan powstaje mieszanina Fe 2 + i Fe3 + , która ulega przekształceniu do Fe3O4 (magnetyt). Związek ten ma silne właściwości ferromagnetyczne, zatem produkty metaboliczne organizmów redukujących żelazo można wykryć za pomocą magnesu! Ponieważ tlenek żelaza(III) charakteryzuje się niezwykle małą rozpuszczalnością i musi być przeprowadzony do formy rozpuszczalnej przechodzącej do wnętrza komórki (prawdopodobnie za pomocą sideroforów), wzrost w tych warunkach jest bardzo wolny i słaby.

UTLENIANIE CZĘŚCIOWE I BIOTECHNOLOGIA Z WYKORZYSTANIEM DROBNOUSTROJÓW

Większość drobnoustrojów tlenowych w drodze metabolizmu oddechowego utlenia organiczne składniki odżywcze do dwutlenku węgla i wody. Ponieważ węgiel w dwutlenku węgla znajduje się w swojej najbardziej utlenionej formie, ten typ metabolizmu jest określany jako utlenianie całkowite. W przeciwieństwie do klasycznych fermentacji zachodzących w warunkach beztlenowych (patrz rozdz. 8), fermentacje przebiegające w obecności tlenu zwane są fermentacjami oksydatywnymi lub utlenianiem częściowym. Do produktów końcowych tych procesów należą m.in. kwas octowy, kwas glukonowy, ketokwasy, oksykwasy, kwas fumarowy, kwas cytrynowy, kwas glutaminowy, kwas mlekowy. W ostatnich 50 latach liczba produktów uzyskiwanych dzięki drobnoustrojom hodowanym w warunkach tlenowych znacznie się powiększyła. Rozdział ten zatem zajmuje się nie tylko „fermentacjami tlenowymi" sensu stricto, lecz również drobnoustrojami i procesami wykorzystywanymi w mikrobiologii przemysłowej, obecnie zwanej również biotechnologią. (Procesy opisane już w rozdz. 8 w tym miejscu pominięto.) Nowy termin biotechnologia ma też odmienne znaczenie. Drobnoustroje stosowane wcześniej w procesach przemysłowych były albo szczepami naturalnie występującymi, albo wyselekcjonowanymi w wyniku mutacji. Obecnie jednak są, a tym bardziej w przyszłości będą wykorzystywane drobnoustroje zmienione w wyniku stosowania nowych osiągnięć biochemii i biologii molekularnej. Metody technologii genowej (rozdz. 406

15.5 oraz 16) pozwalają na wytwarzanie przez drobnoustroje nowych metabolitów, produktów wtórnych oraz obcych białek (insulina, somatostatyna itp.).

10.1. Produkcja kwasu octowego i bakterie octowe Bakterie octowe mają wspólną cechę tworzenia kwasów w drodze częściowego utleniania cukrów lub alkoholi i przejściowego bądź ciągłego wydzielania tych kwasów do podłoża jako niewykorzystywane produkty końcowe. Do bakterii octowych należą słabo ruchliwe wkołorzęse (Acetobacter) lub biegunowo urzęsione (Gluconobacter, wcześniej Acetomonas) gramujemne pałeczki. Przypominają one bakterie z rodzaju Pseudomonas, lecz charakteryzują się dużą tolerancją na kwasowość, niską aktywnością peptolityczną, ograniczoną ruchliwością i brakiem pigmentów. Naturalnymi siedliskami bakterii octowych są rośliny. Bakterie te, razem z drożdżami, występują wszędzie, gdzie znajdują wydzieliny lub soki zawierające cukier. Na pytanie, czy dana bakteria należy do grupy peroxidans, która jedynie przejściowo akumuluje octan, czy do grupy suboxidans, która nie potrafi metabolizować go dalej, można odpowiedzieć drogą prostego eksperymentu. Organizm hoduje się na mętnym agarze kredowym (o mlecznym wyglądzie) zawierającym etanol, ekstrakt z drożdży i węglan wapnia. Wytwarzanie kwasu przez rosnące kolonie powoduje strefę przejaśnienia spowodowaną rozpuszczeniem węglanu wapnia. Podczas gdy strefa przejaśnienia powodowana przez bakterie grupy suboxidans jest trwała, to w przypadku szczepów peroxidans dalsze utlenianie octanu prowadzi do ponownego zmętnienia spowodowanego reprecypitacją węglanu wapnia. Do przedstawicieli grupy peroxidans należą Acetobacter aceti i A. pasteurianum. Gluconobacter oxydans jest prototypem grupy suboxidans. Organizmy te dzieli szeroki zakres typów pośrednich. Acetobacter xylinum, A. aceti i A. acidophilum utleniają octan bardzo wolno. Większość bakterii octowych wymaga złożonych podłoży odżywczych. Bakterie octowe utleniają alkohole pierwszorzędowe do odpowiadających im kwasów tłuszczowych:

407

Alkohole drugorzędowe są utleniane do ketonów:

Alkoholocukry są utleniane do aldoz lub ketoz. Na przykład, sorbitol jest przekształcany do sorbozy. Utlenianie to ma duże znaczenie praktyczne jako cząstkowa reakcja w preparatywnym szlaku od glukozy do kwasu askorbinowego. D-sorbitol jest otrzymywany w drodze elektrolitycznej redukcji glukozy, a Gluconobacter oxydans przekształca sorbitol w postaci 30% roztworu do sorbozy z wydajnością sięgającą 90%. W podobny sposób przebiega utlenianie glicerolu, tetritoli, pentitoli, heksitoli i heptitoli (np. utlenianie D-mannitolu do D-fruktozy).

Aldehydy, aldozy i ketozy są utleniane do odpowiednich kwasów, na przykład:

Poszczególne szczepy bakterii octowych różnią się zdolnością tworzenia 2- lub 5-ketoglukonianu. Gluconobacter melanogenum wytwarza 2,5-diketoglukonian poprzez 2-ketoglukonian. Związek ten, charakteryzujący się niestabilnością w pH 4,5, odpowiada za brunatną barwę kolonii G. melanogenum na agarze z glukozą.

408

Technologia produkcji octu. Produkcja octu z wina sprowadza się przede wszystkim do problemu technologii nawietrzania (rozdz. 6.2). Celem różnych procesów technologicznych jest zapewnienie ścisłego kontaktu bakterii i utlenianych płynów z tlenem atmosferycznym. Opierając się na technice nawietrzania, można wyróżnić trzy rodzaje procesów: tradycyjny proces powierzchniowy (metoda orleańska), metoda wiązana i fermentacja zanurzona. Metoda powierzchniowa jest metodą bardzo starą. Gdy pozostawi się wino w płaskim naczyniu lub kadzi fermentacyjnej i pozwoli na jego „zaszczepienie" przez muszkę owocową Drosophila, na powierzchni wytworzy się błonka zwana mycoderma aceti, składająca się z komórek Acetobacter xylinum unieruchomionych na włókienkach celulozy. Proces zakwaszania jest bardzo powolny, lecz może być stosowany w warunkach domowych. Termin „procedura wiązana" obejmuje te procesy, w których bakterie są „związane" z nośnikiem (wytłoczyny z winogron, łodygi winorośli) w naczyniach napowietrzanych przez wytrząsanie. W technice „szybkiego zakwaszania" płyn zawierający alkohol jest kilkakrotnie przeprowadzany przez naczynia wypełnione wiórami bukowymi. Kolumny takie, zawierające unieruchomione bakterie, nawietrza się od dołu. Proces ten ma tę przewagę nad innymi, że powstający ocet nadaje się do spożycia w gospodarstwach domowych bez dodatkowego filtrowania w celu usunięcia bakterii. Niektóre kolumny są w użyciu od ponad 50 lat i wciąż dają dobre wyniki. Opisane tradycyjne techniki są jednakże wypierane przez fermentacje zanurzone. Do tego celu stosuje się fermentory pozwalające na odpowiednie nawietrzanie oraz rozpraszanie ciepła. Biochemia tworzenia kwasu octowego. Acetobacter i Gluconobacter wytwarzają dehydrogenazę alkoholową, dehydrogenazę glukozową i inne dehydrogenazy poliolowe, które zawierają niedawno odkrytą grupę prostetyczną, metoksatynę. Enzymy te znajdują się na zewnętrznej powierzchni błony cytoplazmatycznej i katalizują utlenienie etanolu, glicerolu lub glukozy do odpowiednich kwasów (octowy, glicerynowy i glukuronowy). W reakcjach tych elektrony są wprowadzane do łańcucha transportu elektronów, a protony są wyrzucane do przestrzeni peryplazmatycznej. Do podłoża może dostawać się również metoksatyna i jest odnajdywana w occie. 409

10.2. Wytwarzanie innych kwasów organicznych przez grzyby Niektóre kwasy organiczne są wytwarzane na skalę przemysłową przez grzyby. Zalety stosowania grzybów w produkcji kwasu cytrynowego, itakonowego, glukonowego, jabłkowego i innych kwasów znane są od dawna. Należy do nich przede wszystkim łatwość oddzielania organizmów od płynu. Podczas gdy oddzielanie bakterii wymaga szybkoobrotowych wirówek i dużego nakładu energii, drożdże i inne grzyby usuwa się znacznie tańszymi metodami filtracyjnymi.

10.2.1. Fizjologia i biotechnologia Metabolizm grzybów jest ściśle tlenowy. Nie znaczy to, że grzyby nie potrafią rozkładać węglowodanów beztlenowo (fermentacje drożdżowe); w warunkach beztlenowych nie są jednakże zdolne do wzrostu przez dłuższy czas, a jedynymi produktami końcowymi są etanol i kwas mlekowy. Wszystkie pozostałe kwasy organiczne są wydzielane wyłącznie w warunkach tlenowych. W naturalnym środowisku drożdży, tzn. w glebie, nie zachodzi znaczniejsze wydzielanie produktu pośredniego. Drożdże w przypadku ograniczonego dostępu składników odżywczych uzyskują maksimum energii oraz materiał komórkowy przeprowadzając całkowite utlenienie i asymilację substratów. Wydzielanie wielu produktów metabolicznych w laboratorium lub w praktyce przemysłowej jest wynikiem nadmiaru węglowodanów oraz pewnej „dezorganizacji metabolizmu", która często jest potęgowana (celowo) przez brak pierwiastków śladowych w podłożu wzrostowym. Grzyby charakteryzują się „silnym systemem glikolitycznym". Związki pośrednie ulegają spiętrzeniu w „wąskich gardłach" w ciągach reakcji metabolizmu pośredniego, a następnie są wydzielane, bądź bezpośrednio, bądź po pewnym ich przekształceniu. J.W. Foster nazwał to zjawisko „metabolizmem nadmiaru". Większość „oksydatyw-

410

nych fermentacji" jest prawdopodobnie wynikiem błędnej regulacji metabolizmu. W wielu przypadkach wykluczenie pojedynczego pierwiastka ze wzrostowego podłoża grzyba indukuje akumulację jakiegoś produktu pośredniego. Wyraźny wpływ na tę akumulację wykazują: żelazo, mangan, miedź, magnez, potas i wapń (ryc. 10.1).

Ryc. 10.1. Zależność między ciężarem grzybni a ilością kwasu cytrynowego wytworzonego przez Aspergillus niger po 9 dniach hodowli. Pożywka podstawowa zawiera następujące składniki (w g/l): glukoza 140; azot 1,05; KH2PO4 2,5; MgSO4 · 7H,O 0,5; żelazo 0,01; cynk 0,0025; pH 3,8. (Wg: Shu P., Johnson M.J.: J. BacterioL, 1948, 56, 577)

Kwas mlekowy jest wydzielany przede wszystkim przez Mucorales (Rhizopus nodosus, R. oryzae, R. arrhizus, R. nigricans) oraz inne Phycomycetes (Allomyces, Saprolegnia, Blastocladiella). Przeciwnie niż u homofermentatywnych bakterii mlekowych, nigdy nie jest on jedynym produktem metabolicznym, lecz towarzyszą mu mniejsze ilości kwasu

411

fumarowego, bursztynowego, mrówkowego i octowego, jak również etanol. Maksymalną wydajność wytwarzania kwasu mlekowego grzyby osiągają jedynie w obecności tlenu. Ponieważ nie wymagają one złożonych podłoży odżywczych i mogą rosnąć z mocznikiem jako jedynym źródłem azotu, izolacja czystego kwasu mlekowego jest mniej kłopotliwa niż w przypadku fermentacji mlekowej przeprowadzanej przez bakterie mlekowe. Kwas fumarowy wytwarzają przedstawiciele kilku rodzajów należących do Mucorales (Mucor, Cunninghamella, Circinella, Rhizopus). Kwas glukonowy jest wytwarzany przez wiele kropidlaków i pędzlaków. Powstaje on w wyniku enzymatycznego utlenienia glukozy przez oksydazę glukozową wydzielaną do podłoża. Aspergillus niger może wykorzystywać roztwór zawierający 30-50% glukozy, wytwarzając z wysoką wydajnością glukonian. Warunkiem jest obecność węglanu wapnia, który neutralizuje kwasowy odczyn. Oksydaza glukozowa jest enzymem wykorzystującym FAD jako grupę prostetyczną. Podczas utleniania glukozy pierwotnym produktem utleniania jest β-D-glukono-delta-lakton, który albo spontanicznie, albo w wyniku działania kolejnego enzymu ulega hydratacji do glukonianu. Zredukowana oksydaza glukozowa przenosi wodór na tlen atmosferyczny z wytworzeniem nadtlenku wodoru, który jest rozkładany przez katalazę do wody i tlenu.

Kwas szczawiowy jest wydzielany przez wiele grzybów. Jego tworzeniu sprzyja zasadowy odczyn środowiska. Wytwarzanie kwasu cytrynowego przez grzyby zbadano bardzo szczegółowo, szczególnie jeśli chodzi o aspekty praktyczne i ekonomiczne. Po odkryciu przez C. Wehmera w 1893 r. kwasu cytrynowego w hodowlach Citromyces pfefferianus Currie (1917) stworzył podstawy przemysłowej produkcji kwasu cytrynowego. Stwierdził on mianowicie, że Aspergillus 412

niger bardzo dobrze rośnie w podłożu odżywczym o początkowym pH 2,5-3,5, równocześnie wydzielając duże ilości kwasu cytrynowego. Wzrost pH powoduje pojawienie się kwasu glukonowego i szczawiowego. Niskie początkowe pH ma ten korzystny wpływ, że praktycznie eleminuje możliwość zakażenia hodowli przez bakterie. Przez wiele lat kwas cytrynowy produkowano przemysłowo bez zwracania szczególnej uwagi na sterylność procesu. Aluminiowe koryta (2 x 2,5 x 0,153m) w komorach fermentacyjnych wypełniano do wysokości około 8 cm mieszaniną melasy, inokulowano i inkubowano 9-11 dni w temperaturze 30°C, uzyskując wysoką wydajność. Po usunięciu zużytego podłoża wprowadzano pod matę grzyba świeże podłoże i proces powtarzano. Kwas cytrynowy precypitowano węglanem wapnia z płynu hodowlanego, rekrystalizowano i uwalniano przez dodanie kwasu siarkowego. Obecnie w krajach uprzemysłowionych kwas cytrynowy jest produkowany wyłącznie metodą fermentacji zanurzonej, aseptycznie, w fermentorach o objętości 300-400 tysięcy litrów. Zamiast melasy stosuje się nie oczyszczony cukier lub hydrolizat skrobi.

Jako przykład optymalizacji podłoża odżywczego w celu zwiększenia produkcji mogą posłużyć dawne badania (ryc. 10.1). Produkcja kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger w sposób istotny zależy od składu podłoża. Staje się to oczywiste, gdy zmieni się tylko jeden składnik, zachowując pozostałe. Dodając do podłoża pozbawionego pierwiastków śladowych (przez precypitację wodorotlenkiem glinu) pojedyncze związki w określonym stężeniu, zaszczepiając i hodując przez 9 dni z wytrząsaniem, można określić masę mycelium, pozostałą zawartość cukru oraz stężenie kwasu cytrynowego. Na podstawie przykładowych wyników, przedstawionych na rycinie 10.1, można wyciągnąć wnioski: a) Azotan amonu i siarczan magnezu nie wpływają na wydajność cytrynianu, lecz jedynie na wzrost mycelium. b) Typowe „krzywe optimum" są charakterystyczne dla zależności między produkcją kwasu cytrynowego a stężeniem żelaza, cynku i fosforanu. Kiedy czynniki te występują w stężeniu pozwalającym jedynie na zbliżony do optymalnego wzrost, zwiększa się wydajność kwasu cytrynowego. Dalsze zmniejszanie stężenia powoduje jednakże ograniczenie wzrostu mycelium i zahamowanie produkcji kwasu cytrynowego, c) Szczególnie wysoką wydajność kwasu cytrynowego uzyskuje się, gdy dwa pierwiastki — żelazo i cynk występują w stężeniach ograniczających. Mangan ma silny wpływ 2+ hamujący; już 3 μg Mn w 1 litrze podłoża powodują znaczne obniżenie wydajności kwasu cytrynowego (dodatek 140 g czystego handlowego preparatu glukozy do jednego litra podłoża wzrostowego wzbogaca je w około 10 μg Mn2+.)

413

To, że brak żelaza powoduje zwiększone wydzielanie cytrynianu, prawdopodobnie wynika z roli tego pierwiastka jako kofaktora akonitazy. Miedź z kolei jest antagonistą żelaza. Obserwację tę wykorzystano do zwiększenia produkcji kwasu cytrynowego. Nawet w małych stężeniach żelaza w mieszanie melasy (około 10 mg/l) można uzyskać maksymalną wydajność dodając do podłoża nadmiar jonów miedzi (150 mg/l). Kwas itakonowy wytwarzają jedynie nieliczne szczepy Aspergillus itaconicus i A. terreus. Kwas ten wytwarzany jest w pH około 2,0.

10.2.2. Chemia tworzenia kwasów przez grzyby Nie ma wątpliwości, że w tworzeniu kwasów wydzielanych przez grzyby w trakcie metabolizowania glukozy uczestniczą enzymy cyklu kwasów trikarboksylowych. Można przyjąć, że jabłczan, fumaran, bursztynian i cytrynian są wytwarzane w reakcjach tego cyklu, ulegając bezpośrednio wydzieleniu (ryc. 10.2).

414

Produkcja kwasu itakonowego rozpoczyna się od kwasu cis-akonitowego. Podczas reakcji dekarboksylacji następuje migracja elektronów i przesunięcie podwójnego wiązania z pozycji 2-3 do 3-4:

Cykl kwasów trikarboksylowych pełni przede wszystkim funkcję kataboliczną. Może jednak być poza tym rozpatrywany jako cykl rozprowadzający prekursory dla ogromnej liczby elementów budulcowych potrzebnych komórce. Z drugiej strony, jeśli w jakimkolwiek miejscu w cyklu zostaną wycofane produkty pośrednie, funkcje uzupełniania szczawiooctanu lub bezpośredniego prekursora spełniają inne reakcje. Z dwu ciągów anaplerotycznych (uzupełniających) (przedstawionych na ryc. 7.7), tj. przekształcenia izocytrynianu poprzez glioksalan i acetylo-CoA do bursztynianu oraz karboksylacji pirogronianu do szczawiooctanu, ten ostatni ma większe znaczenie. Cykl glioksalowy służy przede wszystkim wykorzystaniu octanu, długołańcuchowych kwasów tłuszczowych i węglowodorów, jak również innych substratów ulegających degradacji poprzez acetylo-CoA. Synteza głównych enzymów cyklu glioksalowego (liazy izocytrynianowej i syntazy jabłczanowej) jest hamowana przez glukozę. Gdyby kwas cytrynowy był syntetyzowany wyłącznie z acetylo-CoA, z jednego mola glukozy powstałoby jedynie 0,66 mola cytrynianu; ze 100 g glukozy powstałoby 71,1 g cytrynianu. Jednakże czasem osiągana jest wydajność rzędu 75-78 g cytrynianu/100 g glukozy. Stwierdzono, że 14 przyczną tego jest wiązanie dużych ilości CO2. CO 2 dodany do hodowli jest odnajdywany w C-6 kwasu cytrynowego. Przemianę glukozy do kwasu cytrynowego można zatem przedstawić następująco:

415

10.3. Produkcja aminokwasów Odkrycie Corynebacterium glutamicum (Kinoshita, 1957) zapoczątkowało nową erę w rozwoju przemysłowo użytecznych procesów niepełnego utlenienia. Bakterię wydzielającą kwas L-glutaminowy wyizolowano posługując się prostą techniką „skriningu" (ang. screening), tzw. metodą bioautografii. W metodzie tej duża liczba bakterii glebowych przenoszona jest systemem replik (rozdz. 15.1.1) na różne podłoża odżywcze. Po okresie wzrostu bakterie zabija się promieniowaniem UV. Płytki z bakteriami zalewa się warstwą podłoża podstawowego zawierającego szczep bakteryjny wymagający kwasu glutaminowego. Po odpowiednim czasie inkubacji szczep wskaźnikowy pokazuje, które z pierwotnych kolonii wydzielały kwas glutaminowy. Kwas L-glutaminowy jest wytwarzany jedynie w warunkach ściśle beztlenowych. Inkubacja wyżej wspomnianego organizmu, przez 40 godzin w temperaturze 30°C, w fermentorze o objętości 50 m3 zawierającym roztwór odżywczy z mocznikiem jako jedynym źródłem azotu oraz 10% glukozy, spowodowała akumulację 50 g L-glutaminianu/l, czyli około 0,6 mola glutaminianu na mol glukozy.

Glukoza często ulega degradacji w szlaku fruktozobisfosforanowym, a następnie poprzez cytrynian i α-ketoglutaran do L-glutaminianu. Główną drogą powstawania szczawiooctanu jest raczej karboksylacja pirogronianu, tak jak w produkcji cytrynianu przez Aspergillus niger, a nie cykl 14 glioksalowy. CO2 dodany do podłoża jest odnajdywany prawie wyłącznie w grupie α-karboksylowej kwasu glutaminowego. Wydzielanie zależy od akumulacji α-ketoglutaranu na skutek braku dehydrogenazy α-ketoglutaranowej. Gdy brak jest amonu, wydziela się α-ketoglutaran. W przemysłowej produkcji glutaminianu od pewnego czasu zamiast glukozy stosuje się octan. Szczepy Corynebacterium glutamicum i Brevibacterium divaricatum wydzielające kwas glutaminowy wymagają biotyny, której stężenie jest

416

bardzo istotne dla akumulacji kwasu. Stężenie biotyny mniejsze od optymalnego (2,5 μg/l podłoża) powoduje zahamowanie wzrostu, podczas gdy większe wywołuje lepszy wzrost, ale zmniejsza wydajność kwasu glutaminowego (ryc. 10.3).

Mutanty auksotroficzne są stosowane w produkcji innych aminokwasów. W odpowiednich warunkach mutanty wymagające homoseryny mogą wydzielać 20 g lizyny na litr podłoża. Inne mutanty C. glutamicum, jak również bakterie jelitowe i szczepy Pseudomonas wytwarzają m.in. L-homoserynę, L-walinę, L-izoleucynę, L-tryptofan, L-tyrozynę. W Japonii rozwinięto procesy służące produkcji kwasu inozynowego i guanylowego. Te 5'-nukleotydy stosuje się jako przyprawy i środki poprawiające smak.

10.4. Przemiana substancji organicznych przez drobnoustroje Wysoka swoistość oraz wydajność utleniania przeprowadzanego przez bakterie octowe i związane z tym korzyści ekonomiczne, szczególnie w produkcji sorbozy, doprowadziły w ostatnich 50 latach do rozległych badań nad katalitycznymi właściwościami drobnoustrojów. Poszukiwano reakcji katalitycznych użytecznych w przekształcaniu naturalnych substratów do pożądanych produktów, jak również reakcji przebiegających z udziałem substancji obcych dla tych organizmów. Drobnoustroje przeprowadzają wysoce swoiste reakcje, w których wykorzystują różne

417

substancje; do reakcji tych należą utlenienie, uwodorowanie, hydroliza, estryfikacja, metylacja, dekarboksylacja, aminacja, deaminacja, dehydratacja i wiele innych. Zdolności te wykazują promieniowce i inne bakterie, jak również wyższe i niższe grzyby. Synteza steroidów przez drobnoustroje jest jednym z przykładów ogromnego sukcesu. Chemiczna synteza kortyzonu i hydrokortyzonu obejmuje ponad 30 etapów, przy słabej wydajności procesu. Stosując drobnoustroje ograniczono cały proces do 13 etapów. Jedną z najtrudniejszych reakcji w syntezie jest wprowadzenie grupy hydroksy- do pozycji ll szkieletu steroidu. Reakcję tę przeprowadzają grzyby niższe (Rhizopus arrhizus, Curvularia lunata, Cunninghamella blackesleeana) oraz Streptomyces fradiae. Konwersja związku S Reichsteina do hydrokortyzonu, będąca klasycznym przykładem specyficznej oksygenacji, wygląda następująco:

Oprócz tej oksygenacji wiele grzybów z pomocą stereoswoistych oksygenaz przeprowadza reakcję hydroksylacji przy prawie wszystkich atomach węgla cząsteczki steroidu. Inne reakcje enzymatyczne przeprowadzane przez drobnoustroje dotyczą odwodorowania grup hydroksyalhoholi, wprowadzania podwójnych wiązań, redukcji grup keto- i okso-, itp.

418

Synteza karbinolu fenyloacetylowego jest przykładem reakcji addycji. Związek ten jest ważnym pośrednikiem w syntezie efedryny. Aldehyd benzylowy dodany do fermentacyjnej hodowli drożdży najprawdopodobniej ulega acylacji, podobnie jak w tworzeniu acetoiny, przez przeniesienie „aktywnego aldehydu octowego" (ryc. 7.6, 2) na aldehyd benzylowy. Kolejne przekształcenia tak otrzymanego karbinolu fenyloacetylowego mają charakter czysto chemiczny.

Produkcja kwasu 6-aminopenicylanowego może służyć jako przykład swoiście ukierunkowanego enzymatycznego rozszczepienia substancji przy współudziale drobnoustrojów. Kilka gatunków grzybów i bakterii zawiera swoiste acylazy, które hydrolizują naturalne penicyliny do kwasu 6-aminopenicylanowego, będącego materiałem wyjściowym do produkcji półsyntetycznych penicylin.

10.5. Produkcja antybiotyków Wiele drobnoustrojów i roślin wydziela produkty nie związane z podstawowym metabolizmem tych organizmów. Produkty takie zwane są metabolitami wtórnymi. Bakterie i grzyby wytwarzają wiele tego rodzaju „wtórnych metabolitów". Dużo z tych substancji znalazło istotne za419

stosowania jako leki, dodatki pokarmowe czy czynniki stymulujące. W związku z tym wiele drobnoustrojów zyskało ogromne znaczenie ekonomiczne. Odkrycie penicyliny i innych antybiotyków dało początek nowej dziedziny mikrobiologii przemysłowej. Badania nad antybiotykami oraz rozwój ich półsyntetycznych pochodnych przyniósł wielkie korzyści w terapii medycznej. Praktycznie nie ma ograniczeń, jeśli chodzi o nowe odkrycia, modyfikacje i zastosowania wtórnych metabolitów. Dalsze możliwości w tej dziedzinie tkwią w selekcji mutantów z defektywnymi mechanizmami regulacji metabolicznej. 10.5.1. Organizmy i odkrycia

Symbiotyczne i antagonistyczne stosunki między drobnoustrojami znane są od XIX wieku. Punktem wyjścia do wyjaśnienia podstaw antybiozy było zaobserwowanie przez A. Fleminga (1928), że kolonia grzyba (Penicillium notatum) hamowała wzrost gronkowca. Związek wydzielany przez Penicillium i dyfundujący do agaru nazwano penicyliną. Od tamtego czasu otrzymano wiele związków o właściwościach antybiotyczych. Antybiotyki zdefiniowane są jako substancje pochodzenia biologicznego, które w małych stężeniach hamują wzrost drobnoustrojów. Rozróżnia się aktywność hamującą wzrost (efekt bakteriostatyczny i fungistatyczny) i aktywność „zabójczą" (efekt bakteriobójczy lub grzybobójczy), objawiającą się zmniejszeniem liczby żywych komórek. Drobnoustroje wytwarzające antybiotyki. Zdolność wytwarzania antybiotyków wykazują głównie grzyby należące do grupy Aspergillales, promieniowce i kilka innych bakterii. Spośród bakterii Streptomycetes zadziwiają chemiczną różnorodnością wytwarzanych antybiotyków. Do tej pory dobrze scharakteryzowano około 2000 antybiotyków, z których w lecznictwie stosuje się około 50. Całkowita liczba dotychczas opisanych antybiotyków jest znacznie większa, a są grupy drobnoustrojów, m.in. bakterie trudne do hodowania i niektóre niższe grzyby, których dotychczas nie zbadano pod kątem produkcji antybiotyków. Znaczenie antybiotyków dla organizmu produkującego. O znaczeniu antybiotyków dla organizmu producenta w jego środowisku glebowym w zasadzie prawie nic nie wiadomo. Antybiotyki zazwyczaj powstają w specjalnych szlakach syntetycznych będących częścią tzw. metabolizmu

420

wtórnego. Wtórne metabolity są produkowane w wyniku mechanizmów syntezy i przez enzymy nie będące niezbędne do wzrostu i podstawowych funkcji komórki. Stąd też wydawałoby się, że aparat genetyczny służący syntezie antybiotyków byłby czymś uciążliwym dla organizmu i zatem wyeliminowanym w trakcie ewolucji. Wychodząc z założenia, że jedynie korzystne cechy zostają zachowane, antybiotyki muszą w naturalnym środowisku ich producenta nadawać mu jakieś cechy korzystne, być może we współzawodnictwie o ograniczone substraty. Jednakże tego rodzaju stosunki antagonistyczne są prawie niemożliwe do wykazania w glebie, gdyż ilości wytwarzanych antybiotyków są bardzo niewielkie, a w wielu wypadkach hamują one nawet wzrost producenta. Stopniowo przyjmowany jest pogląd, że w trakcie ewolucji czasem zostaje zachowany jakiś bezużyteczny materiał genetyczny, nawet jeśli wydaje się utrapieniem dla danego organizmu w dostępnych warunkach eksperymentalnych. Być może przyroda jest nieco bardziej zachowawcza niż sądzono we wczesnym okresie biologii molekularnej. Obecnie antybiotyki i inne wtórne metabolity, których użyteczność dla organizmu producenta nie jest zrozumiała, zaliczane są do produktów „powstających na placu zabaw metabolizmu" lub uważane za „odpady metabolizmu". Produkty tego typu pokazują jednakże, iż nawet wtórny metabolizm bakterii, grzybów i roślin może być owocnym tematem badań w kierunku zrozumienia ewolucji drobnoustrojów. Wykazanie produkcji antybiotyku. Pierwsze antybiotyki wykryto w zasadzie przez przypadek, obserwując strefy zahamowania wzrostu organizmów będących w zasięgu ich działania. Tak więc na płytce z agarem odżywczym, gęsto posianym szczepem indykatorowym (wskaźnikowym), wzrost w pobliżu kolonii grzyba lub promieniowca ulega zahamowaniu.

421

Antybiotyk, dyfundując z organizmu producenta do agaru, powoduje pojawienie się strefy zahamowania gęstego wzrostu bakteryjnego szczepu wskaźnikowego (ryc. 10.4). Jako organizmy wskaźnikowe wykorzystuje się w badaniach reprezentatywne drobnoustroje. Jakościowo można wykazać produkcję antybiotyku przez dany organizm nanosząc go na środek odpowiedniej płytki agarowej, a następnie posiewając szczepy wskaźnikowe w postaci linii promieniście rozchodzących się od środka (ryc. 10.5). Określenie, po odpowiednim czasie inkubacji, linii zahamowania dla poszczególnych szczepów daje obraz zakresu aktywności danego antybiotyku. Antybiotyki wykazują charakterystyczne różnice skuteczności wobec gramdodatnich i gramujemnych bakterii, drożdży, dermatofitów i innych organizmów.

Większość antybiotyków odkryto w trakcie intensywnego „skriningu". Poszczególne etapy tej metody przedstawiono na rycinie 10.6. Ilościowe oznaczenia. Główne metody ilościowego określenia siły antybiotyku to dyfuzja na płytkach (ryc. 10.7) oraz mniej dokładna metoda seryjnych rozcieńczeń. W metodzie płytkowej wypełnia się szalki, do dokładnie odmierzonej wysokości, podłożem agarowym zawierającym organizm wskaźnikowy (inokulum). Po zastygnięciu agaru

422

roztwory badanego antybiotyku wprowadza się albo do studzienek wydrążonych w agarze, albo do metalowych cylinderków umieszczonych na jego powierzchni. W trzeciej metodzie stosuje się krążki bibuły nasączone roztworem antybiotyku. Jeśli wynik jest pozytywny, po odpowiednim czasie inkubacji pojawiają się strefy zahamowania wzrostu. Średnica strefy jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku. Ważne jest zapewnienie stałości wszystkich warunków, tj. składu podłoża, grubości warstwy agaru, stężenia organizmu wskaźnikowego w inokulum, czasu inkubacji i temperatury (ryc. 10.7).

W metodzie seryjnych rozcieńczeń badany antybiotyk rozcieńcza się w stosunku 1: 2 w zaszczepionym roztworze odżywczym. Po odpowiednim czasie inkubacji najmniejsze rozcieńczenie, które całkowicie zahamowało wzrost bakterii, określane jest jako „minimalne stężenie hamujące" antybiotyku = MIC (wobec konkretnego organizmu testowego). Znanych jest kilka metod określania synergistycznego lub antagonistycznego działania różnych substancji oraz badania ich skuteczności wobec innych organizmów (np. pierwotniaki, glony, robaki, komórki w hodowli tkankowej, wirusy).

10.5.2. Antybiotyki ważne w lecznictwie W tym miejscu zostaną omówione jedynie nieliczne pożyteczne antybiotyki. Naczelne miejsce nadal zajmuje penicylina (β-laktam) wytwarzana przez Penicillium notatum, P. chrysogenum i kilka innych grzybów, szczególnie od czasu pojawienia się penicylin półsyntetycznych. Te ostatnie uzyskuje się rozszczepiając cząsteczkę penicyliny acylazą i wprowadzając do powstałego kwasu 6-aminopenicylanowego jeden z licznych

424

łańcuchów bocznych (ryc. 10.8). Etap metabolizmu bakteryjnego hamowany przez penicylinę omówiono wcześniej (rozdz. 2.2.4). Penicylina jest w zasadzie nietoksyczna dla ludzi, z wyjątkiem małego odsetka osób, u których rozwijają się reakcje alergiczne. Wiele bakterii wytwarza enzym zwany penicylinazą (β-laktamaza), który rozszczepia pierścień β-aktamowy penicyliny czyniąc antybiotyk nieskutecznym. Wiele spośród półsyntetycznych penicylin wytwarzanych z kwasu 6-aminopenicylanowego jest niewrażliwych na działanie penicylinazy. W dodatku, są na tyle stabilne w środowisku kwasowym, że mogą być podawane doustnie. Cefalosporyny są wydzielane przez gatunki grzyba Cephalosporium. Cefalosporyna C zawiera pierścień β-laktamowy i wykazuje podobieństwo do penicyliny; jest zaliczana do grupy antybiotyków β-laktamowych (ryc. 10.9). Niektóre cefalosporyny półsyntetyczne są produkowane przez podstawienie kwasu 7-aminocefalosporanowego, uzyskanego z cefalosporyny, różnymi grupami bocznymi. Działanie półsyntetycznych cefalosporyn jest podobne do działania półsyntetycznych penicylin. Streptomycynę wyizolowano z podłoża hodowlanego Streptomyces griseus, lecz syntetyzują ją też inne gatunki Streptomyces. Cząsteczka składa się z trzech ugrupowań: N-metylo-L-2-glukozoaminy, metylopentozy 425

i pochodnej inozytolu zawierającej dwie reszty guanidylowe (ryc. 10.9). Streptomycyna jest skuteczna wobec wielu bakterii gramujemnych i kwasoopornych niewrażliwych na działanie penicyliny. Może ona jednak powodować u ludzi dość poważne skutki uboczne o charakterze alergii. Streptomycyna z powodzeniem jest stosowana również w praktyce weterynaryjnej i w chorobach roślin. Chloromycetynę (chloramfenikol) po raz pierwszy odkryto w hodowli Streptomyces venezuelae, lecz obecnie jest otrzymywana syntetycznie (ryc. 10.9). Jest to bardzo stabilny antybiotyk, skuteczny wobec wielu bakterii gramujemnych, krętków, riketsji, promieniowców i dużych wirusów. Tetracykliny są wydzielane przez różne promieniowce, także przez Streptomyces aureofaciens. Są one spokrewnione chemicznie i są pochodnymi szkieletu naftacenowego. Do najlepiej znanych należą chlorotetra-

426

cyklina (aureomycyna), oksytetracyklina (terramycyna) i tetracyklina. Charakteryzują się szerokim spektrum aktywności i są dobrze tolerowane przez ludzi. Pochodzenie antybiotyków makrolidowych (erytromycyna, karbomycyna A, pikromycyna itp.) jest zróżnicowane. Antybiotyki te mają stosunkowo dużą masę cząsteczkową, wynikającą z obecności wieloczłonowego pierścieniowego laktonowego. Pierwszym antybiotykiem wyizolowanym z hodowli promieniowców (w 1940 r.) była aktynomycyna. Jest to właściwie mieszanina kilku związków zawierających fenoksazonowy chromofor, lecz podstawionych różnymi łańcuchami polipeptydowymi (ryc. 10.9). Ostatnią grupę w tym krótkim omówieniu tworzą antybiotyki polipeptydowe (gramicydyna S, polimyksyny, bacytracyna, rystocetyna itp.). Polimyksyna Β składa się z pierścienia zbudowanego z siedmiu aminokwasów oraz łańcucha bocznego połączonego z pierścieniem wiązaniem peptydowym (ryc. 10.10). Antybiotyki polipeptydowe charakteryzują się dużym powinowactwem do błony cytoplazmatycznej, w związku z czym są toksyczne zarówno dla bakterii, jak i dla organizmów eukariotycznych. Cecha ta silnie ogranicza ich użyteczność. Niektóre z antybiotyków polipeptydowych, z powodu ich zdolności selektywnego transportu jonów przez błony biologiczne (rozdz. 7.7), znajdują zastosowanie w badaniach naukowych jako jonofory. Na przykład, walinomycyna ułatwia transport potasu przez błony. Antybiotyk ten jest zbudowany z dwunastoczłonowego pierścienia zawierającego walinę i 2-hydroksyizowalerianę. Jego struktura przestrzenna pozwala na umiejscowienie atomu potasu wewnątrz cząsteczki. Z powodu obecności waliny i izowaleriany kompleks walinomycy-

427

na-K+ charakteryzuje się lipofilnością i łatwo przechodzi przez błonę lipidową. Dodatek walinomycyny do zawiesiny komórek powoduje zatem utratę jonów potasu. W przemyśle farmaceutycznym stosującym nowoczesne technologie w produkcji antybiotyków nigdy nie używa się oryginalnych organizmów, lecz mutanty zapewniające znacznie większą wydajność procesu. Pleśń badana przez Fleminga dawała około 3 μg penicyliny w 1 ml hodowli, podczas gdy obecnie stosowane szczepy produkują jej co najmniej 2000 razy więcej. Tak wysoka wydajność jest wynikiem mutacji i selekcji bardziej aktywnych szczepów, lepszych podłoży hodowlanych oraz efektem badań w kierunku optymalizacji procesu produkcyjnego. W miarę poznawania szlaków produkcji wielu antybiotyków rozwijają się dalsze badania zmierzające do zwiększenia wydajności w wyniku izolacji i selekcji mutantów.

10.5.3. Mikotoksyny Mikotoksyny są wtórnymi metabolitami grzybów, trującymi dla ludzi i zwierząt. Znanym producentem mikotoksyn jest buławinka czerwona Claviceps purpurea (rozdz. 5.4). Wytwarza ona alkaloidy, pochodne kwasu lizergowego (ergotamina, ergotoksyna) o dużym znaczeniu w leczeniu schorzeń sercowo-naczyniowych i migren. Są one również używane jako środki halucynogenne. Podczas gdy wspomniane alkaloidy nadal są produkowane przez sztuczne zakażenie zboża buławinką, coraz większego znaczenia zaczynają nabierać hodowle innych szczepów, m.in. C. paspali. Wiele grzybów, łącznie z niektórymi podstawczakami oraz mniej znanymi przedstawicielami Myxomycetes, wytwarza bardzo silne toksyny oraz inne związki organiczne o często nieznanym składzie chemicznym, które mogą mieć inne interesujące właściwości. Do toksyn należą m.in. amanitatoksyna wytwarzana przez trujący grzyb Amanita phalloides oraz mikotropina i muskaryna (A. patherina, A. muscaria i Inocyte patouillardi). Badania nad wtórnymi metabolitami grzybów rozpoczęto dopiero niedawno. Ostatnio miksotoksyny stały się przedmiotem ogólnego zainteresowania, gdy na skutek zatrucia aflatoksyną wyginęły tysiące indyków. Aflatoksyny są pochodnymi kumaryny wytwarzanymi przez szczepy Aspergillus flavus, A. parasiticus i A. oryzae, jak również przez inne grzyby. Mogą się znajdować w różnych zapleśniałych produktach spożyw-

428

czych, jak orzeszki ziemne, zboże, nasiona roślin oleistych i karma zwierzęca. Związki te mają również charakter rakotwórczy.

10.6. Witaminy Witaminy obecnie powszechnie dodaje się do żywności i pokarmu, a zatem produkuje się je w ogromnych ilościach. Chociaż wiele witamin otrzymuje się w drodze syntezy chemicznej, to ryboflawinę, witaminę B 12 i witaminę C (kwas askorbinowy) nadal produkuje się przy współudziale drobnoustrojów. Ryboflawina jest wydzielana przez przedstawicieli Ascomycetes (Ashbya gossypi i Eremothecium ashbyii) oraz przez drożdże (Candida) i bakterie (Clostridium) w ilościach gramowych na litr podłoża. Niezbędna dla zwierząt witamina B12 jest syntetyzowana wyłącznie przez drobnoustroje. Zwierzęta muszą ją zdobywać z pokarmem lub jako witaminowe uzupełnienie diety. Witamina wytwarzana przez drobnoustroje (łącznie z E. coli) w jelicie nie jest wchłaniana przez zwierzę. Często spotykane pożeranie własnych odchodów przez gryzonie (koprofagia) można uważać za zachowanie adaptatywne w celu uzyskania witamin z treści jelita. Najbardziej przydatne w przemysłowej produkcji witaminy Β 12 są te bakterie, dla których ważną rolę w metabolizmie odgrywają korynoidy (bakterie propionowe, klostridia, promieniowce i bakterie metanogenne). Karotenoidy. Związki te są dodawane do karmy zwierzęcej i nadają żółtku jaj, nawet zimą, charakterystyczne zabarwienie. Są one izolowane z mycelium Zygomycetes (Blakesleea trispora i Choanephora circicans). Ich synteza chemiczna obecnie konkuruje z biotechnologią. Wcześniej wspomniano o wprowadzeniu w syntezie witaminy C etapu biokonwersji, tj. utlenienia sorbitolu do L-sorbozy (rozdz. 10.1). Obecnie w celu otrzymania szczepu Erwinia przeprowadzającego glukozę bezpośrednio do kwasu α-keto-L-gulonowego wykorzystuje się technologię 429

genową. W środowisku kwasowym związek ten przekształca się w kwas askorbinowy. Procedury, które rozwinęły się do masowej hodowli bakterii, drożdży i grzybów, coraz częściej znajdują zastosowanie w hodowli komórek roślinnych i zwierzęcych. Opracowano techniki pozwalające na wzrost izolowanych komórek roślinnych w fermentorach o objętości kilku tysięcy litrów. W warunkach tych komórki roślinne wytwarzają enzymy lub wtórne metabolity w stężeniach większych o rząd lub dwa niż w całych roślinach. Zadziwiające jest, że substancje produkowane nawet w bardzo małych ilościach przez całe rośliny mogą być akumulowane przez hodowle tkankowe komórek roślinnych. Należy się spodziewać, że w przyszłości będzie możliwa produkcja alkaloidów, glikozydów, steroidów, kwasów organicznych i innych wtórnych metabolitów z wykorzystaniem komórek roślinnych w hodowlach in vitro, szczególnie gdy będą też stosowane nowe techniki łączenia protoplastów oraz manipulacje genetyczne.

10.7. Egzopolisacharydy Śluzy roślinne od dawna stosuje się jako czynnik zagęszczający płyny. Obecnie stopniowo są one wypierane przez różnego typu egzopolisachąrydy pochodzenia bakteryjnego (rozdz. 2.2.5) (tab. 10.1). Jako dodatek w lodach, budyniach, kremach itp. oraz jako hydrofilową osłonę pozwalającą na zachowanie wilgoci w korzeniach stosuje się alginiany. Wielocukry pochodzące z morskich glonów zastępuje się produktami uzyskanymi z Azotobacter i Pseudomonas. Wiele zastosowań znajdują śluzy, zwane ksantanami, produkowane przez patogenną dla roślin bakterię Xanthomonas campestris. Są to polimery reszt glukozy połączonych 1,4-β-glikozydowo (jak w celulozie) z trójcukrowymi łańcuchami bocznymi. Ksantany stosuje się jako czynniki zagęszczające w przemyśle spożywczym, jako emulgatory w produkcji farb, w tym też drukarskich, oraz nawet przy usuwaniu rozlewisk ropy naftowej. Kurdlan, który nie jest rozkładany w przewodzie pokarmowym, wykorzystuje się w produkcji niskokalorycznych deserów i zup. O stosowaniu dekstranu jako substytutu plazmy krwi oraz surowca do produkcji materiałów chromatograficznych znanych pod nazwą Sefadeks (Sephadex) wspomniano już w rozdz. 2.2.

430

10.8. Enzymy Reninę, enzym ekstrahowany z tkanki wyścielającej żołądek cielęcy, tradycyjnie stosowano w produkcji twardych serów, a proteazy używane do garbowania skór izolowano z wysuszych psich odchodów. Procesy z wykorzystaniem drobnoustrojów znacznie usprawniły otrzymywanie enzymów tego typu i wydłużyły listę enzymów stosowanych w biotechnologii (tab. 10.2). Reninę z cieląt można więc zastąpić reniną wydzielaną przez Mucor rouxii i inne grzyby. Podobnie, degradacja skrobi do cukru w procesie produkcji alkoholu nie wymaga już dodatku sfermentowanego słodu, lecz przeprowadzana jest przez amylazy uzyskane z grzybów. Aby otrzymać fruktozę, która jest słodsza niż sacharoza lub glukoza, przeprowadza się skrobię, stosując α-amylazę i glukoamylazę, do glukozy, z której z wysoką wydajnością uzyskuje się fruktozę. W tej ostatniej 431

reakcji uczestniczy izomeraza glukozowa. Innym enzymem wykorzystywanym w degradacji skrobi do cukrów jest pullulanaza, która rozszczepia wiązania zarówno 1,4-α-glikozydowe, jak 1,6-α-glikozydowe. Różnego typu preparaty wspomnianych enzymów, łącznie z takimi, które charakteryzują się względną opornością na temperaturę, uzyskuje się ze szczepów Bacillus i Clostridium, promieniowców i bakterii mlekowych. Proteazy i lipazy dodaje się do proszków do prania. Innym celem jest użycie

432

celulazy syntetyzowanej przez drobnoustroje do przeprowadzania taniej celulozy zawartej w drewnie lub słomie do cukrów, wykorzystywanych następnie do produkcji alkoholu. Wszystkie wymienione powyżej enzymy to egzoenzymy — są wydzielane przez drobnoustroje i izolowane następnie z podłoża hodowlanego. Do enzymów izolowanych z różnego typu komórek, przede wszystkim bakteryjnych, i rozprowadzanych przez przemysł biochemiczny należą endonukleazy oraz inne enzymy stosowane w klonowaniu. Technologia genowa otworzyła nowe perspektywy wykorzystywania enzymów pochodzących z drobnoustrojów. W ostatnich latach, poza tradycyjnymi produktami otrzymywanymi w procesach wykorzystujących drobnoustroje, otrzymano pierwsze białka obcego pochodzenia. Molekularne techniki klonowania (rozdz. 15.3.6) umożliwiły włączenie obcego DNA do plazmidów, które metodą transformacji są następnie wprowadzane do bakterii (lub drożdży). Jeśli zachodzi dobra ekspresja tych obcych genów, bakterie lub drożdże syntetyzują obce białka. Przemysłowa produkcja substancji terapeutycznych oraz witamin, interferonu, insuliny, somatostatyny, urokinazy, białek wirusowych czy szczepionek jest już dobrze rozwinięta. Badania w kierunku otrzymania enzymów przeznaczonych do celów przemysłowych obejmują również wykorzystanie ich możliwości immobilizacji, tj. zdolności do wiązania się do celulozy, agarozy, alginianu, szklanych perełek lub ich włączania do kapsułek. Dzięki tego rodzaju metodom uzyskuje się znaczną stabilizację niektórych enzymów.

10.9. Biomasa Drobnoustroje namnaża się w ogromnych ilościach jako karmę (drożdże, bakterie, grzyby jadalne), inokula dla roślin (Rhizobium), czynniki spulchniające w piekarnictwie (drożdże piekarniane), inokula dla produktów mlecznych, w produkcji niektórych wędlin oraz do wielu innych celów. Hodowlę drożdży pokarmowych (Candida) na ściekach siarczynowych z przemysłu włókien sztucznych rozpoczęto już w latach trzydziestych. Po okresie produkcji białka drożdżowego w celach spożywczych dla ludzi w okresie ubóstwa — nawet w Europie Centralnej — w latach siedemdziesiątych wymyślono kilka procesów masowej produkcji białek z jednokomórkowców (ang. single cell protein). Do badanych substratów należą nafta i czyste węglowodory (Candida 433

lipolytica), wodór i dwutlenek węgla (Alcałigenes eutrophus), metanol (Methylomonas), etanol i pewne wartościowe związki organiczne będące odpadami w procesach syntez chemicznych. „Zielona rewolucja" oraz optymalizacja metod hodowli rolnej zahamowały jednak na jakiś czas badania w tym kierunku. Zainteresowanie biomasą wzrosło ponownie, gdy okazało się, że bakteryjny produkt zapasowy poli-β-hydroksymaślan (PHB) charakteryzuje się właściwościami termoplastycznymi (podobnie jak polipropylen i polietylen). Może on być obrabiany w formie arkuszy, włókien i takich przedmiotów, jak butelki lub kubki, a ponadto jest podatny na biologiczną degradację. Niektóre bakterie w odpowiednich warunkach i w obecności substratu cukrowego akumulują wewnątrzkomórkowo duże ilości PHB. W przypadku Alcałigenes eutrophus zawartość PHB może łatwo osiągać ponad 90% suchej masy tej bakterii. Dalsze badania w kierunku określenia warunków, w których oprócz PHB wytwarzany jest również kwas poli-β-hydroksywalerianowy i kwas poli-y-hydroksywalerianowy, jak też — przez inne bakterie — kwas poli-β-hydroksyoktanowy i inne kwasy polihydroksyalkanowe (PHA), spowodują, że produkcja tych przyjaznych dla środowiska homo- i heteropolimerów przy współudziale drobnoustrojów powinna mieć zapewnioną przyszłość.

NIEORGANICZNE DONORY WODORU: TLENOWE BAKTERIE CHEMOLITOTROFICZNE

Wiele grup bakterii wodnych i glebowych potrafi wykorzystywać nieorganiczne związki lub jony (amon, azotyn, siarczyn, tiosiarczan, siarczek i żelazo(II), jak również siarkę elementarną, wodór lub tlenek węgla jako donory elektronów lub wodoru, zyskując w wyniku ich utleniania energię i równoważniki redukujące dla procesów syntezy. Energia zazwyczaj jest uzyskiwana w wyniku oddychania z tlenem, jako ostatecznym akceptorem elektronów. Jedynie kilka „wyspecjalizowanych" bakterii z tej grupy rośnie wykorzystując azotan, azotyn lub podtlenek azotu jako akceptor

435

wodoru w oddychaniu beztlenowym. Ten typ życia, w którym związki nieorganiczne wykorzystywane są jako donory wodoru, nosi nazwę chemolitotrofii. Większość bakterii należących do tej grupy metabolicznej wykorzystuje do syntez komórkowych dwutlenek węgla jako jedyne lub główne źródło węgla. Są one zatem również autotrofami (chemolitoautotrofami). Wszystkie zbadane do tej pory bakterie chemolitotroficzne asymilują węgiel z dwutlenku węgla w cyklu rybulozobisfosforanowym. Mechanizm tego wiązania przedstawiono w dalszej części tego rozdziału. Pod tym względem niektóre bakterie chemolitoautotroficzne są obligatoryjne, inne zaś wykorzystują możliwość wzrostu jako chemoorganotrofy — są zatem fakultatywnie chemolitotroficzne. Wiele chemolitoautotrofów jest wysoce wyspecjalizowanych, mając monopol na niektóre siedliska. Utlenianie amonu, azotynu i nieorganicznych związków siarki w przyrodzie zależy przede wszystkim od aktywności bakterii nitryfikacyjnych i utleniających związki siarki.

11.1. Utlenianie amonu i azotynu: nitryfikacja W trakcie tlenowej lub beztlenowej degradacji związków azotowych azot jest uwalniany w formie amonu. Znane jest od dawna powstawanie saletry (azotanu potasu) podczas kompostowania nawozu zwierzęcego. W średniowieczu wykwity saletry na kamiennych ścianach kompostowni wykorzystywano do wyrobu prochu strzelniczego. Według starych zapisów, przygotowowywano złoża składające się z wapnia, gleby i azotowych substancji organicznych, które następnie zwilżano moczem i krwią oraz dobrze przewietrzano. Amoniak powstający podczas rozkładu związków organicznych przez bakterie dyfundował do gleby, gdzie ulegał utlenieniu do azotanu przez tlen atmosferyczny. Roztwór uzyskany po ługowaniu wierzchniej warstwy takiej gleby służył jako materiał wyjściowy do warzenia saletry. W przekształcaniu amonu do azotynu w glebie, czyli nitryfikacji, uczestniczą bakterie nitryfikacyjne. Dotychczas nie odkryto bakterii przeprowadzającej amon bezpośrednio do azotanu; w reakcji utleniania zawsze uczestniczą dwa rodzaje bakterii: utleniające amon wytwarzają azotyn, a utleniające azotyn produkują azotan. Do najlepiej poznanych należą Nitrosomonas europaea i Nitrobacter

436

winogradskyi (tab. 11.1). Z ostatnich badań wynika jednak, że głównymi organizmami utleniającymi amon w glebach są gatunki należące do rodzaju Nitrosolobus, a nie Nitrosomonas. Obydwa rodzaje są wyspecjalizowane w reakcjach przedstawionych w tabeli 11.1. Organizmy utleniające amon dostarczają substrat dla organizmów utleniających azotyn. Ponieważ duże stężenia amonu w glebach alkalicznych są toksyczne dla Nitrobacter, rodzaje Nitrosomonas i Nitrosolobus korzystnie zmieniają środowisko dla bakterii utleniających azotyn, gdyż wykorzystując amon równocześnie zwiększają kwasowość (wymieniając kation na anion). Nitryfikatory to gramujemne bakterie należące do rodziny Nitrobacteraceae. Nitrosomonas europaea jest owalną bakterią, mającą biegunowo umieszczone rzęski. W środowiskach morskich utlenianie amonu przeprowadza przede wszystkim Nitrosococcus oceanus (ryc. 2.22). Bakterie nitryfikacyjne można hodować w czystych roztworach soli, lecz rosną wtedy bardzo powoli, tj. ich czas generacji jest rzędu 10-20 godzin. Do tej pory bakterie nitryfikacyjne uważano za ściśle obligatoryjne chemolitoautotrofy nie wykorzystujące substancji organicznych wprowadzanych do podłoża. Najnowsze badania rzucają nowe światło na to zagadnienie, które wymaga dalszych wyjaśnień. Wykazano bowiem, że N. winogradskyi pobiera octan z podłoża, włączając go do materiału komórkowego, głównie do białka i poli-β-hydroksymaślanu. Szlak utleniania amonu. Utlenianie amonu przebiega prawdopodobnie przez następujące etapy pośrednie: Pierwszy etap jest endoergiczny i jest katalizowany przez monooksygenazę amonową; atom tlenu w NH2OH pochodzi z tlenu cząsteczkowego. Drugi 437

etap jest katalizowany przez oksydoreduktazę hydroksyloaminową. W utlenianiu azotynu elektrony są przenoszone na cytochrom a1 Jedynie etapy utlenienia od hydroksyloaminy do azotynu i od azotynu do azotanu dają wykorzystywalną energię. Rola nitryfikacji w glebach. Jony amonowe wyzwolone w trakcie mineralizacji związków azotowych w dobrze nawietrzanych glebach szybko ulegają utlenieniu. Zastąpienie kationu anionem prowadzi do zakwaszenia gleby i zwiększonej rozpuszczalności minerałów (potasu, wapnia, magnezu i fosforanów). Przez długi czas uważano mikroflorę nitryfikacyjną za ważny czynnik w żyzności gleby. Ostatnio jednak pogląd ten nieco się zmienił. Jony amonowe są silniej zatrzymywane w glebie niż azotan; adsorbują one do minerałów w glinie i silniej lub słabiej wiążą się do składników humusu. Azotan natomiast łatwo ulega wymyciu. W związku z tym w niektórych rejonach rolniczych podjęto próby zaprzestania nawożenia azotanowego, a nawet poszukiwania czynników swoiście hamujących wzrost bakterii nitryfikacyjnych. Czynniki takie (np. „N-serve" = Nitrapyrin = 2-chloro-6-(trichlorometylo)-pirydyna), jak się sądzi, mogłyby służyć w rolnictwie jako środki zachowujące azot w glebie. Z drugiej strony, wzrost i metabolizm autotroficznych bakterii nitryfikacyjnych charakteryzują się wąskim optimum pH między 7 a 8. Zakres pH dla całkowitej nitryfikacji amonu do azotanu jest zatem dość wąski, ponieważ wolny amoniak (w glebach alkalicznych) oraz kwas azotawy (w zakresie kwasowym) są toksyczne dla Nitrobacter. Stężenia wolnego NH3 i wolnego HNO2 są zależne od wartości pH. Bakterie nitryfikacyjne uczestniczą bezpośrednio w niszczeniu wapienia i cementu (np. w nawierzchniach dróg czy budynkach), gdyż utleniają amon z atmosfery lub odchody zwierzęce do kwasu azotowego. Grupa bakterii utleniających amon, niezależnie od znanych funkcji, ma duże znaczenie ekologiczne. Gleby potraktowane nawozami amonowymi uwalniają tlenki azotu (NO, NO2), szczególnie w warunkach braku tlenu (gleby mokre). Wykazano, że Nitrosomonas i Nitrosovibrio przeprowadzają oddychanie azotanowe (denitryfikację), a NO i NO2 powstają w wyniku redukcji azotynu pochodzącego z utleniania amoniaku (rozdz. 9.11). Organizmy utleniające amoniak utleniają również metan, metanol, tlenek węgla, etylen, propylen, cykloheksan, alkohol benzylowy i fenol.

438

Innymi słowy, charakteryzują się ogromnym potencjałem utleniającym. Należą one do autochtonicznej flory glebowej i prawdopodobnie uczestniczą w powolnym utlenianiu produktów pośrednich powstających podczas rozpadu związków organicznych. Zastanawiano się też, czy wykorzystujące metan bakterie metylotroficzne (rozdz. 14.11.1), które utleniają substrat początkowo przy udziale monooksygenazy, utleniają nie tylko metan, lecz również jony amonowe. Stwierdzono, że tak jest, chociaż bakterie metylotroficzne nie wykorzystują do wzrostu amoniaku jako substratu. Reakcja ta zaliczana jest do grupy nitryfikacji heterotroficznych. Nitryfikacja heterotroficzna. Pytanie, czy autotroficzne bakterie nitryfikacyjne zajmują monopolistyczną pozycję w przyrodzie, czy też bakterie heterotroficzne i grzyby odgrywają rolę w przekształcaniu jonów amonowych do azotanu, jest nadal otwarte. W czystych hodowlach jedynie szczepy Arthrobacter wytwarzają azotyn ze związków azotowych. Niektóre grzyby utleniają azot aminowy lub amon do azotanu. W przeciwieństwie do autotroficznej nitryfikacji, te heterotroficzne reakcje nie są sprzężone ze wzrostem i produkcją biomasy; są one raczej rodzajem dodatkowego utleniania amonu i związków organicznych. W dodatku, tempo heterotroficznej nitryfikacji jest wolniejsze od autotroficznej nitryfikacji o współczynnik rzędu 103-104. Heterotroficzne organizmy nitryfikacyjne nie stanowią więc żadnego zagrożenia dla monopolistycznej pozycji organizmów autotroficznych. Skromna nitryfikacja przeprowadzana przez heterotrofy tłumaczy jednak obecność nitryfikacji nawet w kwaśnych glebach (np. plantacje herbaty, lasy iglaste), w których autotroficzne bakterie nitryfikacyjne nie mają żadnych szans. Odwrócony transport elektronów i wydajność komórkowa. Utlenianie jonów amonowych, azotynu, związków siarki lub żelaza przez bakterie autotroficzne jest procesem mało korzystnym energetycznie. Substraty te bowiem charakteryzują się bardzo wysokim potencjałem redoks. Potencjał + ΕΌ dla NH 4/NH2OH wynosi +889 mV, dla NO3 /NO2 + 420 mV, dla 3+ 2+ NO2 /NH2OH + 66 mV, dla Fe /Fe +770 mV. Dla porównania, + potencjał dla NAD /NADH, wynosi —320 mV. Utlenianie tych substratów nie może zatem być bezpośrednio sprzężone z redukcją NAD+. Jednakże + zredukowany NAD jest niezbędny do redukcji CO2 w cyklu rybulozobisiosforanowym. Istnieją dowody na to, że elektrony pochodzące z utlenienia 439

substancji nieorganicznych wchodzą do łańcucha oddechowego na poziomie cytochromu a lub cytochromu c; zysk energetyczny jest zatem odpowiednio mały, gdyż może być wykorzystana tylko jedna fosforylacja (w łańcuchu oddechowym). Ponadto, część energii jest wykorzystywana na poziomie cytochromów do napędzania elektronów w kierunku przeciwnym do łańcucha oddechowego, gdzie uczestniczą w redukcji nukleotydów pirymidynowych. Wsteczny transport elektronów jest u tych bakterii niezbędnym mechanizmem uzyskiwania równoważników redukujących koniecznych do procesów syntezy (rozdz. 7.4). Bardzo niewielkiej ilości energii uzyskiwanej z utleniania wyżej wymienionych związków nieorganicznych towarzyszy bardzo mała wydajność komórkowa. Synteza jednego grama suchej masy komórkowej wymaga wykorzystania znacznie większych ilości substratu niż w przypadku innych organizmów (tab. 11.2). Niektóre z tych bakterii przeprowadzają również niesprzężone reakcje utlenienia, tzn. utleniają substraty bez równoczesnej syntezy materiału komórkowego (metabolizm „jałowy"). Nie dziwi zatem, że reakcje nitryfikacji w glebie i wodzie przeprowadzają stosunkowo niewielkie populacje bakterii. Tabela 11.2. Porównanie wydajności komórkowej w zależności od pierwotnego źródła energii przekształcanego przez różne mikroorganizmy autotroficzne i organotroficzne

440

11.2. Utlenianie zredukowanych związków siarki Zdolność uzyskiwania energii w drodze utleniania zredukowanych związków siarki ma grupa polarnie urzęsionych bakterii gramujemnych, należących do rodzaju Thiobacillus. Ostatnio wyizolowano również dwubiegunowo urzęsioną bakterię spiralną (Thiomicrospira) oraz nieruchliwego termofilnego archeona (Sulfolobus), charakteryzujące się podobnymi właściwościami (tab. 11.3). Większość spośród tiobakterii utlenia kilka związków siarki, wytwarzając siarczan jako związek końcowy.

Większość bakterii siarkowych (T. thiooxidans, Τ, thioparus, Τ. denitrificans) to obligatoryjne chemolitoautotrofy zależne od wiązania CO2. Inne, jako źródła energii i węgla wykorzystują również związki organiczne (T. novellus, Τ. intermedius). Thiobacillus thiooxidans wytwarza duże ilości kwasu siarkowego i wykazuje swoistą adaptację do wzrostu w warunkach niskiego pH; toleruje on 1N kwas siarkowy. Zakwaszanie może się odbywać różnymi drogami. W celu zmniejszenia alkalicznego odczynu gleb kredowych stosuje się wprowadzanie do nich siarki elementarnej. Kwas siarkowy

441

wytwarzany przez tiobakterie przeprowadza węglan wapnia w bardziej rozpuszczalny siarczan wapnia, który następnie łatwo ulega wypłukaniu. Podobnie można zwalczać nie tolerujący odczynu kwasowego mikroorganizm powodujący parcha ziemniaka. Podczas gdy wspomniane powyżej bakterie siarkowe żyją w warunkach tlenowych, T. denitrificans potrafi wykorzystywać azotan jako akceptor wodoru, oddychając zatem beztlenowo. Organizm ten denitryfikuje azotan, lecz nie przeprowadza asymilacyjnej redukcji do amonu; jest więc zależny od soli amonowych jako źródła azotu. Sulfolobus acidocaldarius i Caldariella acidophila należą do archeonów i żyją w ekosystemach ekstremalnych. Zamieszkują one gorące źródła, w których utleniają głównie siarkowodór pochodzenia wulkanicznego. Sulfolobus acidocaldarius jest termofilnym, fakultatywnie chemolitotroficznym archeonem utleniającym siarkę elementarną do kwasu siarkowego i wykazującym optymalny wzrost w pH 2-3 i temperaturze 70-75°C, chociaż toleruje temperaturę dochodzącą do 90°C. Reakcje w utlenianiu związków siarki. Ustalenie poszczególnych etapów utleniana siarki natrafiło na duże trudności spowodowane niebiologicznym, chociaż powolnym, utlenianiem siarkowodoru i siarki w roztworach wodnych. Schemat na rycinie 11.1 przedstawia najważniejsze reakcje katalizowane enzymatycznie. Żółta siarka (kwiat siarkowy) występuje w postaci ośmioczłonowego pierścienia (S8) o słabej rozpuszczalności w wodzie (0,176 mg siarki/l). Zakłada się, że elektrony uzyskiwane w wyniku utleniania siarczynu do siarczanu wnikają do łańcucha oddechowego na poziomie cytochromu c. Przynajmniej niektóre tiobakterie wykorzystują energię pochodzącą z utleniania siarczynu do siarczanu w drodze fosforylacji substratowej (ryc. 11.1; (5), 6).

Kierunek reakcji (1) i (2) jest przeciwny do reakcji uczestniczących w dysymilacyjnej redukcji siarczanu (ryc. 9.3).

442

Bakterie nitkowate oraz inne bakterie siarkowe. W osadach dennych bajor, dużych kałuż lub w wolno płynących wodach, w których powstaje siarkowodór, występują bezbarwne nitkowate bakterie siarkowe Beggiatoa, Thiothrix i Thioploca (ryc. 2.46) oraz duże, jednokomórkowe formy Achromatium oxaliferum i Thiovolum (ryc. 2.46). Winogradski wykorzystał Beggiatoa w badaniach, które doprowadziły do powstania koncepcji chemolitoautotrofii. Stwierdził on, że Beggiatoa utlenia wewnątrzkomórkowo siarkowodór do siarki i że przekształcenie siarkowodoru może prowadzić aż do powstania kwasu siarkowego. Równocześnie wykazał, że ten proces utleniania jest rodzajem oddychania, z którego komórki czerpią energię. Otrzymanie bakterii siarkowych w formie czystej kultury oraz zbadanie ich właściwości fizjologicznych i biochemicznych jest jednak bardzo trudne, ponieważ bakterie te wymagają zarówno siarkowodoru, jak i tlenu, lecz tolerują jedynie bardzo małe stężenia tego ostatniego. U Beggiatoa alba udało się wykryć obecność karboksylazy rybulozobisfosforanowej, co wskazuje na obecność autotroficznego szlaku wiązania dwutlenku węgla. Siarkowodór jako podstawa ekosystemu pozbawionego światła. Życie wszystkich wyższych organizmów heterotroficznych jest oparte na biomasie powstającej w drodze fotosyntezy. Kilka lat temu odkryto wyjątek od tej reguły. W pozbawionych światła głębiach oceanu, w miejscach, w których rozdzielają się kontynenty, z dna wydobywa się woda o temperaturze 350°C. Te gorące źródła zawierają wiele minerałów, jak również H2S. W miejscach, w których gorąca woda styka się z zimną, zawierającą tlen wodą oceanu, żyją bakterie zdolne do utleniania siarki 443

lub siarkowodoru. Są one pokarmem krabów i „robaków". Riftia pachyptila z grupy Pogonophora charakteryzuje się wysokim stopniem adaptacji do tego ekosystemu; nie ma on ani gęby, ani odbytu, lecz posiada narząd, zwany trofosomem, w którym żyją endosymbiotyczne bakterie utleniające siarkowodór. H2S i O2 docierają do tego organu wraz z krwią. Tak więc, w pobliżu gorących źródeł na dnie ocenu istnieje ekosystem oparty na produkcji biomasy nie w drodze fotosyntezy, lecz chemolitoautotrofii.

11.3. Utlenianie żelaza(ll) Bakteria żelazowa Thiobacillus ferrooxidans utlenia żelazo(II) do żelaza(III): 4Fe 2 + + 4H + + O2 -> 4Fe 3 + + 2H2O Bakteria ta, tolerując wartości pH 2,5, bardzo przypomina T. thiooxidans, lecz nie uzyskuje energii z utleniania zredukowanych związków siarki, ale również z utleniania jonów żelaza(II). Występuje ona w kwaśnych wodach kopalni rud żelaza, które zawierają siarczki metali oraz piryt (FeS2). Kwasolubne bakterie żelaziste mają zdolność wzrostu chemoautotroficznego. Niedawno odkryto termofilne szczepy bakterii siarkowych utleniających żelazo i siarkę, jak również szczepy termofilnego archeona Sulfolobus acidocaldarius utleniające żelazo(II). Z gleb zawierających antymon 3+ 5+ wyizolowano Stibiobacter senarmontii, która utlenia Sb do Sb . Ługowanie rud. Zdolność niektórych kwasolubnych, utleniających żelazo i siarkę bakterii do przeprowadzania rud siarczkowych w rozpuszczalne w wodzie siarczany metali ciężkich wykorzystuje się do ługowania ubogich rud oraz uzyskiwania miedzi, niklu, molibdenu i uranu. Ługowanie stosuje się na szeroką skalę w odzyskiwaniu rud z odpadów kopalnianych, może być także pożyteczne w kopalnictwie na dużych głębokościach. W najprostszym systemie woda wolno przecieka przez kolumny z pokruszonych skał zawierających piryt (FeS2) i inne siarczki metali, jak CuS, ZnS, NiS, MoS2, Sb2S3, CoS i PbS, następnie odprowadza się roztwory zawierające siarczany. W dalszym etapie metale są zatężane i wytrącane. Metale ciężkie są przeprowadzane do postaci roztworu

444

w wyniku kilku połączonych ze sobą procesów: bakteryjnego utleniania zredukowanych związków siarki (1) lub elementarnej siarki (2) do kwasu siarkowego oraz Fe2+ do Fe3+ (3), jak również chemicznego utleniania nierozpuszczalnych soli metali ciężkich do rozpuszczalnych siarczanów metali i siarki (4).

Bakterie dostarczają kwas siarkowy oraz przeprowadzają regenerację Fe3+; oba składniki są zużywane w trakcie solubilizacjii rudy. Są to Thiobacillus thiooxidans i T. ferrooxidans. Szczepy tych bakterii są nadzwyczaj tolerancyjne na występujące w ich środowisku stężenia Cu2+, Co2+, Zn2+, Ni 2+ i jonów innych metali ciężkich. W ługowaniu rud metali uczestniczą również szczepy Sulfolobus utleniające żelazo i siarkę. Inne bakterie żelazowe. Do najlepiej poznanych bakterii żelazowych należą Gallionella ferruginea (ryc. 3.19) oraz Leptothrix ochracea. Występują one w naciekach z tlenków żelaza w rurach odpływowych oraz w strumykach górskich. Jeszcze kilka lat temu nie było wiadomo, czy wykorzystują one energię dostępną w wyniku utleniania Fe2+ do Fe3+ i są zdolne do wzrostu autotroficznego. Dopiero niedawno wykazano w komórkach Gallionella karboksylazę rybulozobisfosforanową i obecnie bakteria ta zaliczana jest do grupy litoautotrofów. Oprócz żelaza, bakterie tej grupy utleniają również mangan. Pochew2+ 4+ kowa bakteria Leptothrix discophorus utlenia Mn do Mn , lecz nie wiadomo, czy energię uwalnianą podczas tej reakcji wykorzystuje w procesach metabolicznych. Autrotrofia obligatoryjna. Określenie autotrofia obligatoryjna odnosi się do krańcowej specjalizacji oraz adaptacji do oddychania z wykorzystaniem substratów nieorganicznych. W celu wyjaśnienia tego zjawiska wysunięto kilka hipotez. 1. Za punkt wyjścia można przyjąć złożenie, że cykl kwasów trikarboksylowych nie jest niezbędny do utleniania substratów nieorganicznych (przez analogię do metabolizmu fermentacyjnego). Równoważniki redukujące są uzyskiwane przecież w wyniku utlenienia substratu nieorganicznego i mogą wnikać do łańcucha oddechowego. Powinny być zachowane jedynie funkcje syntetyzujące cyklu kwasów trikarboksylowych (dostarczanie α-ketoglutaranu i bursztynianu), lecz nie wymaga to udziału dehydrogenazy α-ketoglutaranowej. Wykazano,

445

że wspomniany enzym w istocie u wielu obligatoryjnych autotrofów nie występuje. Nie można wykazać jego obecności nawet u różnych fakultatywnych autotrofów hodowanych z substratem nieorganicznym. Mutant fakultatywnegeo organizmu, który utracił zdolność wytwarzania dehydrogenazy α-ketoglutaranowej, powinien zatem zachowywać się podobnie jak obligatoryjny autotrof. 2. Ponieważ zarówno bakterie nitryfikacyjne, jak i utleniające siarkę i żelazo charakteryzują się „rozgałęzionym" łańcuchem oddechowym, wydaje się prawdopodobne, że u niektórych obligatoryjnych autotrofów w pierwszej części łańcucha oddechowego istnieje etap odwracalny, zapobiegający utlenianiu NADH2; łatwiej można sobie to wyobrazić, ponieważ część ta jest wykorzystywana jedynie do wstecznego transportu elektronów. Prawdopodobne zahamowanie tej odwracalności w drodze regulacji enzymatycznej prowadziłoby również do zachowania siły redukującej (NADH2) powstającej przy tak dużym wydatku energetycznym. Brak jednoznacznego wytłumaczenia zjawiska autotrofii obligatoryjnej. Nie można wykluczyć odmiennych dróg powstawania tego typu metabolizmu u różnych organizmów.

11.4. Utlenianie wodoru cząsteczkowego W trakcie beztlenowego rozkładu substancji w osadach dennych i beztlenowych mikrośrodowiskach glebowych wytwarza się wodór. Wiele bakterii potrafi go wykorzystywać. Duża część wodoru jest metabolizowana przez bakterie żyjące razem z wytwarzającymi wodór bakteriami fermentacyjnymi i utleniający H2 z równoczesną redukcją siarczanu do siarczynu lub dwutlenku węgla do metanu (rozdz. 9.4). Niektórzy przedstawiciele

446

wszystkich grup bakterii zdolnych do fosforylacji oksydatywnej w warunkach beztlenowych (oddychanie beztlenowe) jako donora wodoru wykorzystują również wodór cząsteczkowy (rozdz. 9). Wodór występuje również w dobrze nawietrzanych ekosystemach, np. w glebie, na której rosną rośliny motylkowate (soja, fasola). Powstaje on podczas reakcji z udziałem nitrogenazy i dyfunduje do środowiska z bakteroidów w brodawkach korzeniowych, z których wiele nie wytwarza żadnych hydrogenaz. Bakterie tlenowe utleniające wodór Bakterie utleniające wodór z wykorzystaniem tlenu jako ostatecznego akceptora elektronów są nazywane tlenowymi bakteriami utleniającymi wodór. Wszystkie z nich są zdolne do wiązania CO 2 , są zatem autotrofami. Z drugiej strony, wszystkie wykorzystują też równocześnie substraty organiczne. Bakterie utleniające wodór są więc fakultatywnymi chemolitoautotrofami. Niektóre bakterie utleniające wodór utleniają również tlenek węgla, wykorzystując go jako jedyny donor elektronów i jedyne źródło węgla. Izolacja i wzrost. Bakterie utleniające wodór rosną w roztworze zawierającym jedynie sole nieorganiczne, pod mieszaniną gazów w stosunku objętościowym 70% H2 + 20% O2 + 10% CO 2 . Gazy te są metabolizowane zgodnie z następującym równaniem: 6H 2 + 2O 2 + CO2 -> (CH 2 O)* + 5H2O Powyższe warunki pozwalają na łatwe uzyskanie hodowli wzbogacającej i wyizolowanie bakterii utleniających wodór z próbki gleby służącej za inokulum. Do bakterii tych należą najszybciej rosnące autotrofy, o czasie generacji około 3 godz., oraz pewne termofile o czasie generacji około jednej godziny. Niektóre szczepy rosną heterotroficznie jeszcze szybciej. W korzystnych warunkach z jednego litra podłoża można uzyskać wydajność komórkową rzędu 20 g suchej masy. Klasyfikacja. Bakterie tlenowe utleniające wodór stanowią bardzo zróżnicowaną grupę. Większość gatunków należy do gramujemnych * (CH 2 O) w przybliżeniu odzwierciedla stosunek ilościowy węgla, wodoru i tlenu w materiale komórkowym.

447

rodzajów Pseudomonas, Alcaligenes, Aquaspirillum, Paracoccus i Xanthobacter, część — do gramdodatnich rodzajów Nocardia, Mycobacterium i Bacillus (tab. 11.4). Niedawno odkryto zdolność wzrostu autotroficznego w warunkach tlenowych i w obecności wodoru również u przedstawicieli innych rodzajów (Rhizobium, Derxia). Obecność enzymów aktywujących wodór oraz zdolność wiązania CO2 jest więc szeroko rozpowszechniona wśród licznych grup taksonomicznych. Wykorzystywanie wodoru i przemiany energetyczne. Wodór włącza się do procesów metabolicznych za pośrednictwem hydrogenaz. U bakterii tlenowych utleniających wodór występują dwa rodzaje hydrogenaz: rozpuszczalna, cytoplazmatyczna hydrogenaza redukująca NAD (oksydoreduktaza H 2 : NAD) oraz hydrogenaza związana z błoną cytoplazmatyczną. Tylko nieliczne bakterie (Alcaligenes eutrophus, A. hydrogenophilus) posiadają obydwa enzymy. Nocardia zawiera jedynie enzym rozpuszczalny, podczas gdy większość innych bakterii tej grupy wytwarza tylko enzym związany z błoną. Obydwa enzymy katalizują wejście wodoru do łańcucha oddechowego. Proces wytwarzania ATP jest bardzo wydajny; składniki łańcucha oddechowego u Alcaligenes eutrophus i Paracoccus denitrificans są prawie takie same jak w mitochondriach. 448

Heterotroficzne i miksotroflczne typy odżywiania. Wiele bakterii wodorowych katabolizuje heksozy i glukonian w szlaku Entnera-Doudoroffa, utleniając substrat do CO2 i wody. Bakterie te zwykle wykorzystują również inne związki organiczne, w tym rozgałęzione kwasy tłuszczowe, związki aromatyczne i wielopierścieniowe, a nawet testosteron. Materiałami zapasowymi u tych bakterii są poli-β-hydroksymaślan oraz glikogen. Niektóre bakterie wodorowe w warunkach równoczesnej obecności substratów nieorganicznych (dwutlenek węgla i wodór) oraz organicznych wykazują miksotroficzny typ odżywiania. Oznacza to, że związki organiczne są wykorzystywane do budowy materiału komórkowego, podczas gdy energia do syntezy pochodzi z utleniania wodoru. W tych warunkach żaden ze związków organicznych nie musi być całkowicie utleniony. Zdolność do wzrostu miksotroficznego jest częsta u wielu fakultatywnych autotrofów, które zdobywają energię do reakcji syntezy w drodze utleniania różnych zredukowanych związków nieorganicznych (siarkowodór lub siarka, w przypadku bakterii siarkowych) lub w wyniku fotosyntezy (zielenice i rośliny wyższe). Regulacja wykorzystywania substratów. U niektórych bakterii utleniających wodór wykorzystywanie substratów jest bardzo ściśle regulowane. Na przykład, autotroficznie rosnące komórki Alcaligenes cutrophus nie zawierają enzymów do metabolizmu fruktozy. Gdy takie komórki zostaną wsiane do podłoża zawierającego fruktozę i będą hodowane w warunkach tlenowych, wytworzą one enzymy szlaku Entnera-Doudoroffa i będą rosnąć. Jednakże, jeśli inkubacja będzie się odbywać w mieszaninie gazów zawierającej 80% wodoru i 20% CO2, komórki nie będą syntetyzować wspomnianych enzymów i nie będą rosnąć. Najwyraźniej, wodór hamuje tworzenie enzymów potrzebnych do wykorzystywania fruktozy. Gdy do eksperymentów weźmie się komórki zawierające enzymy katabolizmu fruktozy oraz hydrogenazę i inkubuje się je w mieszaninie wodoru i tlenu, katabolizm fruktozy odbywa się, lecz jest to proces bardzo powolny, ponieważ jest hamowany przez obecność wodoru. Kluczową rolę w tych procesach odgrywa enzym dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa. Znaczne obniżenie tempa katabolizmu fruktozy in vivo (przez H2 + O2) jest wynikiem zahamowania aktywności powyższego enzymu przez NADH. W eksperymentach tych wykazano, że dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa jest enzymem regulatorowym szlaku Entnera-Doudoroffa, 449

podobnie jak fosfofruktokinaza w szlaku fruktozobisfosforanowym (patrz rozdz. 16.2.2). Bakterie wykorzystujące tlenek węgla (karboksydobakterie). Tlenek węgla występuje w przyrodzie zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Nie są znane biochemiczne reakcje jego powstawania, ani drobnoustroje przeprowadzające je. Wiadomo jednak, że kilka gatunków bakterii utlenia tlenek węgla do dwutlenku węgla. Zdolność wzrostu z wykorzystaniem tlenku węgla jako jedynego donora elektronów i jedynego źródła węgla nie jest jednak ograniczona do bakterii tlenowych. Pseudomonas carboxydovorans metabolizuje dwutlenek węgla zgodnie z następującą reakcją:

Asymilacja węgla odbywa się w drodze wiązania dwutlenku węgla w szlaku rybulozobisfosforanowym. Utlenianie CO jest katalizowane przez enzym zawierający molibden, a więc wzrost z wykorzystaniem CO wymaga obecności tego pierwiastka w śladowych ilościach, podczas gdy do wzrostu na substratach organicznych nie jest on potrzebny. Bakterie wykorzystujące tlenek węgla, zwane również karboksydobakteriami, mają hydrogenazę związaną z osłonami i rosną również jako bakterie wodorowe.

11.5. Wiązanie dwutlenku węgla Większość organizmów rosnących w obecności dwutlenku węgla, jako jedynym źródłem węgla, wiąże go w szlaku rybulozobisfosforanowym (cykl Calvina-Basshama). Do organizmów tych należą tlenowe bakterie chemolitoautotroficzne, prawie wszystkie bakterie fototroficzne, sinice i rośliny wyższe. Cykl ten nie uczestniczy w wiązaniu CO2 przez bakterie acetogenne i metanogeny, które z definicji również są chemolitoautotrofami. W cyklu rybulozobisfosforanowym uczestniczą dwa enzymy nie biorące udziału w żadnym innym szlaku metabolicznym. Są to fosforybulokinaza i karboksylaza rybulozobisfosforanowa. Drugi z tych enzymów jest najpowszechniejszym białkiem na naszej planecie. Cykl jest ciągiem redukcji, w których dwutlenek węgla ulega przekształceniu

450

do poziomu węglowodanów. Można w nim wyróżnić trzy stadia: 1) reakcję karboksylacji 2) redukcję i 3) regenerację cząsteczki akceptorowego CO2. Reakcja karboksylacji W trakcie wiązania dwutlenku węgla rybulozo-1,5-bisfosforan jest przekształcany przez karboksylazę rybulozobisfosloranową w dwie cząsteczki kwasu 3-fosfoglicerynowego.

karboksylaza rybulozobisfosforanowa

Enzym ten katalizuje również drugą reakcję. W braku dwutlenku węgla i w obecności tlenu przekształca on rybulozobisfosforan w fosfoglikolan i fosfoglicerynian w drodze oksygenacji (aktywność oksygenazowa). Reakcja ta uczestniczy w tworzeniu glikolanu przez bakterie autotroficzne i rośliny zielone, jest więc „oddychaniem świetlnym". Reakcja redukcji. Natychmiast po karboksylacji następuje redukcja grupy karboksylowej fosfoglicerynianu do grupy aldehydowej. Konwersja la zachodzi w wyniku reakcji znanych ze szlaku fruktozobisfosforanowego (rozdz. 7.2.1), tj. fosforylacji z ATP przez kinazę 3-fosfoglicerynianową oraz redukcji z NAD(P)H2 przez dehydrogenazę aldehydu 3-fosfoglicerynowego. Ta ostatnia reakcja jest swoista dla NAD u bakterii i dla ΝADP u roślin. Redukcja 3-fosfoglicerynianu jest etapem w procesie wiązania CO2 wymagającym nakładu energii oraz siły redukującej. Kolejne etapy nie są

451

istotne z punktu widzenia energetycznego i przebiegają przy mniej więcej stałym poziomie energetycznym. Regeneracja cząsteczki akceptora CO2. Izomeraza triozofosforanowa utrzymuje równowagę między aldehydem 3-fosfoglicerynowym a fosforanem dihydroksyacetonu, a obydwa triozofosforany są z kolei utrzymywane w równowadze z fruktozo-1,6-bisfosforanem przez aldolazę fruktozobisfosforanową. Fruktozobisfosforan ulega defosforylacji przez fruktozobisfosfatazę do fruktozo-6-fosforanu. Przekształcenie jednej cząsteczki fruktozo-6-fosforanu i trzech cząsteczek triozofosforanu do trzech cząsteczek rybulozo-5-fosforanu przebiega z udziałem niektórych enzymów znanych z oksydatywnego cyklu pentozofosforanowego oraz kilku innych enzymów. Ciąg reakcji inicjowany jest przez transketolazę (ryc. 11.2, prawa strona) która katalizuje transfer grupy glikolilowej z ketozomonofosforanu do aldozofosforanu. Aldehyd glikolowy, który pełni funkcję koenzymu, przejściowo ulega związaniu w postaci „aktywnego aldehydu" z difosforanem tiaminy (TPP). Tetrozofosforan (erytrozo-4-fosforan) powstający w reakcji z udziałem transketolazy przekształca się następnie do sedoheptulozo-l,7-bisfosforanu w reakcji z udziałem aldolazy z fosforanu dihydroksyacetonu. Związek ten

452

ulega potem defosforylacji w pozycji 1 do sedoheptulozo-7-fosforanu (Shu-7-P) przeprowadzanej przez fruktozobisfosfatazę. Ten etap hydrolizy jest nieodwracalny powodując nieodwracalność całego ciągu reakcji. Stwierdzono, że u roślin regeneracja rybulozo-5-fosforanu przebiega poprzez sedoheptulozo-l,7-bisfosforan (ryc. 11.2, lewa strona). Transketolaza przenosi grupę glikolilową z sedoheptulozo-7-fosforanu do aldehydu 3-fosfoglicerynowego, dając dwie cząsteczki pentozofosforanu — rybozo-5-fosforan i ksylulozo-5-fosforan, które są w równowadze z rybulozo-5-fosforanem (patrz ryc. 7.4, gdzie reakcje te przedstawiono dla oksydatywnego szlaku pentozofosforanowego). Ostatnią reakcją w cyklu rybulozobisIbsforanowym jest, przeprowadzana przez fosforybulokinazę, fosforylacja rybulozo-5-fosforanu do rybulozobisfosforanu przy współudziale ATP. Bilans cyklu rybulozobisfosforanowego. Synteza jednego mola heksozy z. 6 moli dwutlenku węgla wymaga sześciu obrotów cyklu. Bilans cyklu dla wiązania CO2 można zatem przedstawić następująco: 6CO 2 + 18 ATP + 12NAD(P)H2 -> F-6-P + 18 ADP + + 12NAD(P) + 17Pnieorg. Przedstawienie cyklu w formie zamkniętej nie powinno przesłonić faktu, że niektóre produkty pośrednie są ważnymi prekursorami do syntezy materiału komórkowego; 3-fosfoglicerynian prowadzi do pirogronianu i acetylo-CoA; erytrozo-4-fosforan prowadzi do syntezy aminokwasów aromatycznych; rybozo-5-fosforan jest prekursorem syntezy nukleotydów, a heksozofosforan — prekursorem dla różnych polimerów.

453

Regulacja aktywności niektórych spośród enzymów uczestniczących w cyklu zapewnia z jednej strony, że nie za dużo energii (ATP) ulega wycofaniu z metabolizmu komórkowego na skutek stosunkowo dużego zapotrzebowania energetycznego wiązania CO2, a z drugiej strony, że wycofanie produktów pośrednich uczestniczących w syntezie materiału komórkowego nie prowadzi do zahamowania przebiegu cyklu (patrz rozdz. 16.2.2). Inne szlaki autotroficznego wiązania dwutlenku węgla. Chociaż wiązanie dwutlenku węgla w szlaku rybulozobisfosforanowym jest najważniejszym w biosferze szlakiem syntezy substancji organicznych z CO2, nie jest on szlakiem jedynym (tab. 11.5). Beztlenowe bakterie autotroficzne asymilują CO2 dwoma odmiennymi mechanizmami. Metanogeny, bakterie acetogenne oraz redukujące siarczan, które mogą wykorzystywać wodór lub tlenek węgla jako donor wodoru, redukują CO2 w reduktywym szlaku acetylo-CoA, to jest do acetylo-CoA i pirogronianu (rozdz. 9.4). Pirogronian następnie wchodzi w główne szlaki syntezy dobrze znanymi reakcjami.

454

Zielona bakteria siarkowa (Chlorobium thiosulfatophilum) wiąże CO2 wyłącznie w reduktywnym cyklu kwasów trikarboksylowych (TCC). W cyklu tym CO2 jest wiązany w wyniku reduktywnej karboksylacji bursztynylo-CoA. Porównanie trzech wymienionych typów wiązania CO 2 pokazuje, że procesy beztlenowe są znacznie wydajniejsze niż proces tlenowy. Synteza jednego mola triozofosforanu z 3 moli ('(), w beztlenowym szlaku acetylo-CoA wymaga jedynie 3 moli ATP; w reduktywnym cyklu kwasów trikarboksylowych — około 5 moli ATP, a w szlaku rybulozobisfosforanowym 9 moli ATP.

Ogólne reakcje wiązania dwutlenku węgla. Wcześniej, przy różnych okazjach wspomniano, że organizmy heterotroficzne również wymagają dwutlenku węgla, który włączają do metabolizmu komórkowego. Rolę karboksylacji pirogronianu i fosfoenolopirogronianu w uzupełnianiu cyklu kwasów trikarboksylowych (reakcje anaplerotyczne) szczegółowo omówiono w podrozdziale 7.5. Poniższy schemat przedstawia metabolity pośrednie, które mogą włączać dwutlenek węgla. Poszczególne reakcje wiązania CO2 mają różne znaczenie u różnych organizmów. Niektóre z nich służą wyłącznie aktywacji metabolitów lub uzupełnianiu głównych szlaków metabolicznych. Zależne od ferredoksyny reakcje reduktywnej karboksylacji stwierdza się wyłącznie w przypadku niektórych bakterii beztlenowych i fototroficznych.

455

BAKTERIE FOTOTROFICZNE I FOTOSYNTEZA

Zdolność wykorzystywania światła jako źródła energii do wzrostu posiadają dwie grupy bakterii. Obydwie grupy zasadniczo różnią się między sobą. Jedna grupa to bakterie purpurowe i zielone, które można uważać za relikty z najwcześniejszego okresu w ewolucji fotosyntezy. Nie są one zdolne do wykorzystywania wody jako donora wodoru, tak jak robią to rośliny zielone, muszą zatem korzystać z bardziej zredukowanych donorów tego pierwiastka (H2S, H2 lub związki organiczne). W rezultacie, fotosynteza przebiega tu bez uwalniania tlenu. Jest to fotosynteza anoksygenowa. Bakterie te to typowo wodne organizmy, szeroko występujące w wodach słodkich i słonych. Są jednokomórkowcami o czerwonej, pomarańczowej lub zielonej barwie, zależnie od zawartości bakteriochlorofilu i karotenoidów. Druga grupa to sinice. Wykorzystują one wodę jako donor wodoru i wydzielają na świetle tlen. Przeprowadzają zatem fotosyntezę oksygenową. Ich układ barwników zawiera chlorofil a, karotenoidy i fikobiliny. Ponieważ przebieg fotosyntezy u sinic jest w zasadzie taki sam jak u roślin zielonych, zazwyczaj omawiano je razem z fotosyntetyzującymi eukariotami i nazywano niebieskozielonymi glonami. Ich budowa komórkowa jest jednak typowa dla prokariotów. Sinice zostały już przedstawione w rozdz. 3.21 i nie będą tutaj omawiane.

456

12.1. Purpurowe bakterie siarkowe, purpurowe bakterie bezsiarkowe i zielone bakterie siarkowe Bakterie przeprowadzające fotosyntezę anoksygenową podzielono na trzy duże grupy: purpurowe bakterie siarkowe, purpurowe bakterie bezsiarkowe i zielone bakterie siarkowe. Przedstawiciele tych trzech grup różnią się właściwościami cytologicznymi i fizjologicznymi, jak również pigmentacją (tab. 12.1; ryc. 12.1, 12.6 i 12.10). Wszystkich przedstawicieli bakterii purpurowych cechuje to samo umiejscowienie całego aparatu fotosyntetycznego (system zbierania światła lub anten zbiorczych i centrum reakcyjne) na błonach wewnątrzkomórkowych (tylakoidach), które są wpukleniami błony cytoplazmatycznej (ryc. 2.23 i 2.24). Ze względu na morfologię można wyróżnić tylakoidy pęcherzykowate, tubularne i lamelarne. Z nielicznymi wyjątkami, wszystkie bakterie tej grupy zawierają bakteriochlorofil a (Bchl a) i wszystkie wiążą dwutlenek węgla w cyklu rybulozobifosforanowym, wykorzystując związki organiczne jako donory wodoru i/lub źródło węgla. Do bakterii purpurowych należą dwie rodziny, różniące się zdolnością wykorzystywania związków siarki jako donora wodoru; są to purpurowe bakterie siarkowe lub Chromatiaceae (wcześniej Thiorhodaceae) i purpurowe bakterie bezsiarkowe lub Rhodospirillaceae (wcześniej Athiorhodaceae). Chromatiaceae. Większość purpurowych bakterii siarkowych można łatwo rozpoznać, gdyż ich komórki zawierają globule siarki silnie załamujące światło (ryc. 2.45, 12.2 i 12.3). Chromatium okenii (5 μm średnicy i 20 μm długości) i Thiospirillum jenense (3,5 μm średnicy i 50 μm długości) należą do olbrzymów wśród bakterii (ryc. 12.1, 12,2 i 12.3). Zawsze przyciągały uwagę specjalistów od mikroskopii i były często obiektem badań dotyczących ruchów rzęsek i reakcji chemotaktycznej. Chromatium warmingii można odróżnić od C. okenii biegunowym umiejscowieniem globulek siarki (ryc. 12.2). Większe chromatia mają kształt fasolowaty, podczas gdy mniejsze są krótkimi pałeczkami. Chromatium vinosum należy do tych ostatnich i był przedmiotem ważnych badań dotyczących fotosyntezy. Rodzaj Thiocystis (T. violacea, Τ. gelatinosa) charakteryzuje się ruchliwymi, kulistymi komórkami, podczas gdy komórki Thiocapsa roseopersicina i T. pfennigii są również kuliste, ale nieruchliwe. Kilka gatunków Chromatiaceae zawiera wakuole gazowe. Są to Lamprocystis roseopersicina o ruchliwych, kulistych komórkach,

457

459

460

Wszystkie bakterie należące do Chromatiaceae zawierają pęcherzykowate tylakoidy (chromatofory), które nieomalże wypełniają komórkę. Jedynymi znanymi wyjątkami są Ectothiorhodospira sp. i Thiocapsa pfennigii, które mają tylakoidy tubularne. Rhodospirillaceae. Znane obecnie purpurowe bakterie bezsiarkowe zalicza się do pięciu rodzajów w zależności od kształtu. Spiralne należą do rodzaju Rhodospirillum. Spośród nich R. rubrum, R. fulvum (ryc. 12.4), R. molischianum i R. photometricum wyróżniają się barwą i wielkością. Pałeczkowate gatunki należą do rodzajów Rhodopseudomonas (R. palustris, R. viridis, R. acidophila i R. sulfoviridis) i Rhodobacter (R. capsulatus, R. sphaeroides i R. sulfidophilus). Zakrzywione pałeczki nazwano Rhodocyclus (R. purpureus, R. gelatinosus i R. tenuis). Bakterie o kształcie zbliżonym do kulistego tworzą rodzaj Rhodopila, do którego należy tylko jeden gatunek R. globiformis. Bakterie purpurowe bezsiarkowe posiadają wszystkie znane struktury tylakoidalne. Dwa gatunki spośród tych bakterii, Rhodomicrobium vannielii i Rhodocyclus purpureus, wyróżniają się szczególnie. Rhodomicrobium vannielii (ryc. 12.5) rozmnaża się przez pączkowanie. Pączki pozostają połączone z komórką macierzystą przez łodyżki podobne do strzępek lub uwalniają

461

się w postaci perytrychalnie urzęsionych ruchliwych komórek. Rhodocyclus purpureus jest jedyną nieruchliwą formą należącą do tej rodziny. Jego komórki są półokrągłe. Błona fotosyntetyzująca najprawdopodobniej jest taka sama, jak błona cytoplazmatyczna, lecz jest silnie pofałdowana. Wzrost większości purpurowych bakterii bezsiarkowych jest hamowany przez siarkowodór, choć niektóre gatunki tolerują ten związek lub nawet wykorzystują go jako donor wodoru do wiązania dwutlenku węgla. Rhodopseudomonas sulfidophila i R. palustris mogą utleniać siarkowodór do siarczanu bez wytwarzania siarki jako produktu pośredniego. Zielone bakterie siarkowe Przedstawiciele zielonych bakterii siarkowych charakteryzują się tym, że w bezpośrednim sąsiedztwie błony cytoplazmatycznej mają organelle zawierające pigmenty (barwniki). Organelle te to tzw. chlorosomy, znane też jako pęcherzyki Chlorobium. Zawierają one bakteriochlorofil charakterystyczny dla tej grupy, tj. bakteriochlorofil c, d lub e (Bchl c, d, e), czyli pigment anten. Poza tym bakterie te zawierają również niewielkie ilości Bchl a, który jest bezpośrednio związany z fotosyntetycznym centrum reakcyjnym i znajduje się w błonie cytoplazmatycznej. Zielone bakterie siarkowe różnią się od bakterii purpurowych brakiem enzymu karboksylazy 462

rybulozobisfosforanowej, nie wiążą zatem dwutlenku węgla w cyklu rybulozobisfosforanowym. Skład 16S-RNA obydwu rodzin zielonych bakterii siarkowych — Chlorobiaceae i Chloroflexaceae świadczy o tym, że nie są one filogenetycznie spokrewnione. Występują między nimi także różnice w budowie ściany komórkowej: Chlorobiaceae są gramujemne, Chloroflexaceae — gramdodatnie. Chlorobiaceae. Zielone bakterie siarkowe (ryc. 12.6-12.9) obejmują szczepy o zielonym {Chlorobium vibrioforme, C. limicola) lub brązowym zabarwieniu {Chlorobium phaeobacteroides), tworzą skupiska przypominające gwiazdę {Prosthecochloris) lub sieć {Pelodictyon clathratiforme). Chlorochromatium aggregatum jest symbiotycznym związkiem (konsorcjum) dwóch gatunków bakterii: bezbarwnej chemoorganotroficznej pałeczki poruszającej się za pomocą długiej, biegunowej rzęski oraz

463

464

zielonych fototroficznych bakteryjnych ektosymbiontów pałeczki przyczepionych do powierzchni. Podobnie wygląda Pelochromatium roseum, lecz bakterie będące jej ektosymbiontami mają zabarwienie brązowe. Morska bakteria Chloroherpeton thalassium różni się od szczepów Chlorobium nitkowatą budową komórki i pełzakowatym ruchem. Chloroflexaceae. Fototroficzna zielona bakteria Chloroflexus, ze względu na kształt i rodzaj ruchu zalicza się do bakterii nitkowatych o ruchu ślizgowym. Zawiera jednak bakteriochlorofil c i a oraz chlorosomy podobne do chlorosomów gatunków Chlorobium. Z drugiej strony, Chloroflexus różni się od gatunków Chlorobium zdolnością do tlenowego, 465

heterotroficznego wzrostu na złożonych podłożach zarówno w ciemności, jak i na świetle. W przeciwieństwie do Chlorobiaceae, fotoautotroficzny wzrost z wykorzystaniem CO2 i H2S jest u tej bakterii prawie niedostrzegalny. Chloroflexus aurantiacus jest szeroko rozpowszechniony na całym świecie. Jest głównym składnikiem zielonych i pomarańczowych „mat" na dnie kanałów i w wyciekach z gorących źródeł. Heliobakterie. Heliobakterie są niedawno odkrytą i całkowicie odmienną grupą anoksygenowoych fototrofów. Do tej pory opisano tylko trzech przedstawicieli tej grupy. Są to: Heliobacterium, który jest bakterią poruszającą się ruchem ślizgowym, Heliospirillum — dużym, bardzo ruchliwym krętkiem i Heliobacillus — ruchliwą pałeczką. Zawierają one bakteriochlorofil g, który różni się nieznacznie od bakteriochlorofilu a (ryc. 12.11). Zasadniczą cechą różniącą te bakterie od wcześniej opisanych bakterii purpurowych, które są gramujemne, jest ich gramdodatni sposób barwienia oraz inne umiejscowienie na drzewie filogenetycznym. Są one odrębną grupą gramdodatnich bakterii bliskich rodzajowi Clostridium.

12.1.1. Pigmenty aparatu fotosyntetycznego Gęste zawiesiny fotosyntetyzujących bakterii wydają się zielone, niebieskozielone, purpurowe, fioletowe, czerwone, brunatne lub łosiosowe, zależnie od rodzaju barwników biorących udział w fotosyntezie. Różnice w zabarwieniu wynikają z rodzaju i składu ilościowego pigmentów. Skład ten można łatwo rozpoznać badając spektra absorpcji całych komórek (ryc. 12.10). Maksima absorpcji w zakresie niebieskim (<450 nm) i czerwonym, jak również w podczerwieni (650-1000 nm) są powodowane obecnością różnych rodzajów chlorofilu. Absorpcja w zakresie 400-550 nm wynika z zawartości karotenoidów, a w zakresie 550-650 nm u sinic — z obecności fikobilin. Poszczególne rodzaje chlorofilu różnią się głównie obecnością lub brakiem podwójnego wiązania między atomami węgla 3 i 4 oraz podstawnikami przy szkielecie pofirynowym (ryc. 12.11). Różnice te są odpowiedzialne za różne wartości maksimum absorpcji w bliskiej podczerwieni. Można je łatwo rozpoznać badając widma komórek i izolowanych błon fotosyntetyzujących, w których barwniki występują w swoistych kompleksach pigmentowo-białkowych (ryc. 12.10). Główne

466

467

maksimum absorpcji chlorofilu a u zielenic i sinic leży między 680 i 685 nm; bakteriochlorofilu c, d i e zielonych bakterii siarkowych oraz Chloroflexus — między 715 i 755 nm i bakteriochlorofilu a większości bakterii purpurowych — między 850 i 890 nm. Bakteriochlorofil b, znaleziony dotychczas jedynie u Rhodopseudomonas viridis, Ectothiorhodospira halochloris i Thiocapsa pfennigii, wykazuje absorpcję między 1020 i 1035 nm. Bakteriochlorofil a bakterii purpurowych występuje w czterech formach spektralnych: Β800, Β820, Β850 i Β870-890. Różnice w widmach absorpcji wynikają z rodzaju wiązań i pozycji chlorofilu 468

w kompleksach pigmentowo-białkowych aparatu fotosyntetycznego. Liczba pików, jak również ich wysokości różnią się w zależności od gatunku i dla wielu organizmów mogą się zmieniać zależnie od warunków hodowlanych. Chlorobiaceae, oprócz charakterystycznych składników chlorofilowych Bchl c lub Bchl e, zawierają również niewielką ilość Bchl a, wykazującego jeden pik przy 810 nm. W komórkach Chloroflexus widmo Bchl a wykazuje jednakże dwa wyraźne maksima, tj. przy 808 i 868 nm. Barwne karotenoidy są tak zwanymi pomocniczymi pigmentami organizmów fotosyntetyzujących. Absorbują one światło w zakresie 400-550 nm. U bakterii purpurowych są to głównie związki alifatyczne o długości łańcucha C40 (tetraterpenoidy) z trzeciorzędowymi grupami hydroksylowymi lub metoksylowymi (likopen, rodopina, spiryloksantyna i sferoiden). Obecność grupy okso lub aldehydowej może im nadać intensywną czerwoną barwę (sferoidenon, okenon, rodopinal). Znane są również karotenoidy o pierścieniach aromatycznych (arylokarotenoidy), będące pochodnymi γ- lub β- karotenu. Ich występowanie ograniczone jest do kilku rodzin (okenon występuje u kilku gatunków Chromatiaceae, chlorobakten jest typowym karotenoidem zielonych Chlorobiaceae, a izoreniraten — brunatnych Chlorobiaceae). Karotenoidy spełniają dwie funkcje. Są one aktywne w fotosyntezie i należą do barwników anten, które przekazują energię do chlorofilu, a także pełnią funkcje ochronne: chronią chlorofil przed uszkadzającym go fotoutlenieniem. Pozbawione karotenów niebieskozielone mutanty bakterii purpurowych rosną jedynie w przyćmionym świetle i giną w silnym oświetleniu. Różnice w widmach absorpcji sinic, zielenic, bakterii purpurowych i bakterii zielonych pozwalają wyciągnąć wniosek, że poszczególne grupy organizmów fototroficznych wykorzystują w fotosyntezie różne długości widma światła. Różnice te są związane z warunkami świetlnymi w naturalnych środowiskach tych organizmów i można je wykorzystać do selektywnej hodowli poszczególnych organizmów fototroficznych (ryc. 12.13). Rozmieszczenie pigmentów. Pigmenty bakterii purpurowych uczestniczące w fotosyntezie są związane z systemem błon wewnątrzkomórkowych (tylakoidów). Powstają one jako pęcherzykowate lub tubularne wpuklenia błony cytoplazmatycznej do wnętrza komórki, pozostając związane z błoną. Wewnątrzkomórkowe błony poszczególnych gatunków 469

mają różne formy. Mogą to być tubule, pęcherzyki czy też koncentrycznie lub cylindrycznie ułożone układy lamelli, zajmujące większą część wnętrza komórki (patrz ryc. 2.24). Błonowe fragmenty dające się wyizolować z rozbitych komórek metodą różnicowego wirowania zwane są chromatoforami. W komórkach zielonych bakterii siarkowych fotopigmenty są związane z dwiema odrębnymi strukturami komórkowymi: pigmenty anten znajdują się w chlorosomach, a pigmenty centrum reakcyjnego — w błonie cytoplazmatycznej (ryc. 12.9). Regulacja syntezy pigmentów i tylakoidów. Synteza fotopigmentów zależy od kilku różnych warunków środowiskowych: przede wszystkim od zakresu i natężenia oświetlenia, a u fakultatywnych tlenowców od obecności tlenu. W pośrednim zakresie naświetlenia zawartość pigmentu w komórkach wzrasta wraz ze zmniejszaniem się natężenia naświetlenia podczas wzrostu komórek. Na tworzenie barwnika wpływa również obecność tlenu; duże natężenie światła i tlen hamują tworzenie struktur błonowych zawierających pigmenty, hamując tym samym syntezę bakteriochlorofilu i karotenoidów. Zmiany liczby tubul lub pęcherzyków widocznych w mikroskopie są bezpośrednio związane ze zmianami w stężeniu fotopigmentów. Tlen wywiera dodatkowy wpływ hamujący na niektóre reakcje w syntezie bakteriochlorofilu. Największe stężenia fotopigmentów oraz zawierających je pęcherzyków i tubul stwierdza się w komórkach hodowanych w warunkach beztlenowych i przy małych natężeniach światła.

12.1.2. Metabolizm Metabolizm bakterii fototroficznych jest zagadnieniem bardzo złożonym. Wiele purpurowych bakterii bezsiarkowych oraz z grupy Chloroflexaceae może rosnąć beztlenowo na świetle oraz tlenowo w ciemności. Inne grupy to ścisłe beztlenowce i obligatoryjne fototrofy. Wiele bakterii fototroficznych wykorzystuje wodór, inne jako donor wodoru zużywają siarkowodór lub siarkę. Zachodzi u nich zarówno wiązanie dwutlenku węgla, jak i asymilacja substratów organicznych. Niewielką ilość energii uzyskują nawet przez fermentację w warunkach beztlenowych i w ciemności, chociaż nie służy ona podtrzymywaniu wzrostu komórki. Fizjologia bakterii fototroficznych stawia je więc wśród najbardziej wszechstronnych organizmów.

470

Wiązanie dwutlenku węgla. Prawie wszystkie zbadane do tej pory bakterie fotosyntetyzujące wiążą dwutlenek węgla w szlaku rybulozobisfosforanowym. Do redukcji 3-fosfoglicerynianu wykorzystują one jednak głównie NADH2, a nie NADPH2 tak jak rośliny. Poza tym, asymilacja węgla przebiega przy współudziale reakcji karboksylacji zależnych od ferredoksyny lub NAD(P). Wiązanie CO 2 może albo całkowicie podtrzymywać wzrost autotroficzny, albo służyć zapewnieniu równowagi redoks w obecności silnie zredukowanych związków organicznych. Chlorobium wiąże CO2 w reduktywnym cyklu kwasów trikarboksylowych. Donory wodoru. Beztlenowe fototrofy są zależne od zewnętrznego donora wodoru. Wykorzystują one wodór cząsteczkowy, siarkowodór, siarkę elementarną, tiosiarczan, kwasy organiczne, alkohole, cukry i nawet niektóre związki aromatyczne. Wodór jest wykorzystywany przez bardzo wiele, ale nie przez wszystkie bakterie fototroficzne. Małe chromatia, gatunki należące do Rhodobacter (np. R. capsulatus), rodospirilla i chlorobia mogą rosnąć na świetle mając do dyspozycji jedynie H2 i CO 2 . Wydajność kwantowa w tym przypadku jest prawie taka sama, jak w fotosyntezie oksygenowej. Dla Rhodopseudomonas acidophila oraz dla sinicy Anabaena cylindrica wydajność kwantową określono na 8 moli kwantów na mol związanego dwutlenku węgla. Purpurowe bakterie bezsiarkowe i zielone siarkowe, jak również niektóre purpurowe bakterie siarkowe utleniają siarkowodór do siarczanu. Większość purpurowych bakterii siarkowych w trakcie tego procesu przejściowo akumuluje siarkę wewnątrz komórki. Zdolność do szybkiego utleniania siarkowodoru na świetle, z jednoczesnym wewnątrzkomórkowym gromadzeniem siarki, może tłumaczyć ilościową dominację dużych chromatiów w bajorkach i kałużach; wewnątrzkomórkowa siarka służy tym mikroorganizmom jako zapas równoważników redukujących, co pozwala na wiązanie CO2 na świetle nawet w warunkach braku zewnątrzkomórkowych donorów wodoru. W procesie wykorzystywania tiosiarczanu można wyróżnić siarkę sulfanową i sulfonową; gromadzona jest jedynie siarka sulfanowa, podczas gdy siarka sulfonowa natychmiast pojawia się w podłożu wzrostowym w postaci siarczanu. Niektóre chlorobia utleniają siarkowodór jedynie do siarki, która następnie jest wydalana. Bakterie te rosną szczególnie dobrze w obecności Desulfuromonas acetoxidans, gdyż bakteria ta w oddychaniu beztlenowym redukuje siarkę do siarkowodoru, 471

równocześnie utleniając etanol do octanu. Współbytowanie Chlorobium i Desulfuromonas jest modelowym przykładem funkcjonalnego związku — syntropii pomiędzy dwoma drobnoustrojami (patrz rozdz. 9.3). Metabolizm ciemny. Wiele purpurowych bakterii bezsiarkowych oraz Chloroflexus rośnie beztlenowo w ciemności, zużywając substraty organiczne. Musi zatem przebiegać u nich m.in. cykl kwasów trikarboksylowych, który również uczestniczy w tlenowym metabolizmie na świetle. Wykorzystywanie wielu różnych kwasów organicznych i cukrów przez niektóre Chromatiaceae i Rhodospirillaceae prowadzi do wniosku, że podstawowy metabolizm bakterii fototroficznych, choć może różnić się w szczegółach, zasadniczo przebiega znanymi szlakami (fruktozobisfosforanu, Entnera-Doudoroffa, cyklu kwasów trikarboksylowych itp.) Uzyskanie niewielkiego zysku energetycznego jest również możliwe w ciemności i warunkach beztlenowych. Nie ma w tym niczego dziwnego, gdyż bakterie fototroficzne muszą przetrwać noc! Reakcje fermentacji mogą przebiegać z wykorzystaniem materiałów zapasowych, jako donorów wodoru, i siarki — jako akceptora wodoru. Stwierdzono, że produktami końcowymi tego beztlenowego metabolizmu są dwutlenek węgla, octan, propionian i siarkowodór. Jednakże w ciemności i warunkach beztlenowych nie zachodzi wzrost tych organizmów. Fotoprodukcja wodoru. W warunkach obecności odpowiednich organicznych lub nieorganicznych donorów wodoru niektórzy przedstawiciele Rhodospirillaceae i Chlorobiaceae mogą na świetle wytwarzać wodór cząsteczkowy. Tworzenie H2 zależy od stosunku węgla do azotu w podłożu i jest hamowane przez wolne jony amonowe. Również N2 hamuje w sposób odwracalny tworzenie H2. Fotoprodukcja wodoru została przypisana drugorzędnej funkcji nitrogenazy, to jest jej zdolności redukowania nie tylko N2, ale również protonów, czego wynikiem jest uwalnianie H2. Nadmiar energii i siły redukującej prowadzi zatem do wydzielenia wodoru. Wiązanie azotu. Ogromna większość dotychczas poznanych bakterii fotroficznych ma zdolność wiązania azotu. Zazwyczaj rosną one jednak wtedy wolniej niż w obecności jonów amonowych.

472

Materiały zapasowe. U bakterii fototroficznych występują typowe materiały zapasowe, takie jak poli-β-hydroksymaślan, wielocukry i polifosforany. W pewnych warunkach wodniczki Chromatiaceae mogą zawierać wtręty siarki w formie ortorombowej.

12.1.3. Występowanie bakterii fototroficznych Występowanie. Siedliska bakterii fototroficznych znajdują się w strefach beztlenowych wielu wód: w płytkich stawach, wodach wolno płynących, jeziorach i zatokach morskich. Purpurowe bakterie siarkowe na powierzchni błota i gnijących szczątków roślinnych tworzą często naloty o barwie od łososiowej do purpurowej. Niekiedy grubość warstwy na powierzchni czarnego błota może sięgać 10 cm. Tego rodzaju „zakwity" w stawach są powodowane głównie przez ogromne Chromatiaceae (Chromatium okenii, C. warmingii, C. weissei, Thiospirillum jenense). W mniejszym stopniu przyczyniają się do tego również mniejsze chromatia i Chlorobiaceae. Bakterie purpurowe silnie namnażają się także w płytkich stawach o powierzchni pokrytej rzęsą (Lemna) lub liśćmi lilii wodnej. Ten

473

biologiczny filtr najwidoczniej nie pochłania składowych widma, które są absorbowane przez bakteriochlorofil i ciemnoczerwone karotenoidy. Dlatego też pod osłoną Lemna rozwijają się anoksygenowe fotobakterie, ale nie występują tam sinice i zielenice (ryc. 12.12). Niektóre gatunki w swoim naturalnym środowisku występują w postaci nieomalże czystych kultur. Zawsze można spotkać przedstawicieli Rhodospirillaceae, lecz rzadko występują gromadnie. Purpurowe bakterie siarkowe okresowo występują również w dużych ilościach w beztlenowych strefach jezior poniżej chemokliny (ryc. 7.2). W warstwie tej mają one dostęp do siarkowodoru, dwutlenku węgla i wielu związków organicznych. Chociaż podczerwień widma słonecznego nie sięga głębokości 10-30 m, to w warstwie tej zachodzi maksymalny rozkład energii widma w zakresie od niebieskiego do niebieskozielonego (450-500 nm). Ten zakres widma jest absorbowany przez karotenoidy. Tłumaczy to stosunkowo dużą zawartość karotenoidów u bakterii purpurowych, których barwa w istocie od tych związków zależy. Karotenoidy (tak jak fikoerytryny krasnorostów i sinic) umożliwiają bakteriom purpurowym fotometabolizm na większych głębokościach. Z tego samego powodu na wspomianych głębokościach przeważają bogate w karotenoidy brązowo zabarwione gatunki zielonych bakterii siarkowych {Chlorobium phaeobacteroides, C. phaeovibrioides, Pelochromatium). Hodowle wzbogacające. Na podstawie powyżej opisanych obserwacji, tj. rozwijania się purpurowych bakterii siarkowych w płytkich stawach i pod osłoną rzęsy, oparte są metody wzbogacania hodowli w bakterie fototroficzne. Selektywne warunki hodowlane dla zielonych bakterii siarkowych, jak również dla bakterii purpurowych zawierających Bchl a i Bchl b można uzyskać stosując filtry pochłaniające światło w zakresie promieniowania krótkiego, a przepuszczające promieniowanie podczerwone. Poza tym, to czy Rhodospirillaceae, Chromatiaceae lub Chlorobiaceae będą dominować w tego typu hodowli wzbogacającej zależy od dostępności donora wodoru oraz stężenia siarkowodoru (kolumna Winogradskiego, ryc. 12.13). Jeśli wypełnioną wodą kolumnę (zawierającą białko, glebę i piasek) zaszczepi się próbką pochodzącą z naturalnego środowiska, to wyrosną na świetle purpurowe bakterie siarkowe. Dodatek siarczanu wapnia zapewni ciągły dostęp siarkowodoru (z redukcji siarczanu), który zahamuje wzrost purpurowych bakterii bezsiarkowych, stwarzając warunki

474

dominacji bakterii siarkowych. W podłożu syntetycznym zawierającym witaminę B 1 2 można osiągnąć wzbogacenie w wiele różnych gatunków bakterii, zmieniając stężenie siarkowodoru i soli oraz stosując odpowiednie pH, temperaturę i natężenie światła. Charakter donora wodoru oraz obecność niektórych witamin (biotyny, kwasu aminobenzoesowego, tiaminy i kwasu nikotynowego) również silnie wpływają na selektywne wzbogacenie w poszczególne gatunki purpurowych bakterii bezsiarkowych.

12.2. Podstawowe procesy w fotosyntezie Fotosyntezę można określić jako odbywające się wewnątrz komórek organizmów fototroficznych przekształcenie energii świetlnej w energię biochemiczną (ATP) oraz siłę redukującą (NAD(P)H2), które są wykorzystywane w biosyntezie materiału komórkowego. Podstawowymi procesami fotosyntezy są fotofosforylacja oraz fotosyntetyczna redukcja nukleotydu pirydynowego.

475

Wiedza ta jest wynikiem eksperymentów porównawczych między fotosyntezą bakteryjną i fotosyntezą u roślin wyższych oraz interpretacji otrzymanych wyników. Winogradski (1888) na podstawie badań nad bakteriami siarkowymi stwierdził, że asymilacja dwutlenku węgla nie jest obligatoryjnie związana z obecnością energii świetlnej. Engelman (1883-1888) na podstawie eksperymentów, w których badał reakcje na bodźce, określił bakterie purpurowe jako fototroficzne. Buder (1919) wykazał, że bakterie purpurowe tworzą odmienny typ metaboliczny: purpurowe bakterie siarkowe i bezsiarkowe na świetle asymilują, odpowiednio: dwutlenek węgla oraz substancje organiczne. Ten typ fotosyntezy odbiega jednak zasadniczo od fotosyntezy roślin wyższych. Po pierwsze, nie wykorzystuje wody jako donora wodoru dla fotosyntezy, nie powstaje zatem wolny tlen. Po drugie, zużywa siarkowodór lub substancje organiczne jako donory wodoru (czego nie potrafią rośliny zielone). W wyniku dalszych badań nad bakteriami purpurowymi (van Niel w 1931) wyprowadzono następujące równania:

Gdy pierwsze z tych równań porównano z równaniem fotosyntezy roślin zielonych, stwierdzono uderzające podobieństwo:

Wynikało z nich, że w fotosyntezie bakteryjnej siarkowodór odgrywa taką rolę, jak woda w fotosyntezie roślin wyższych. Uogólnione równanie fotosyntezy, zgodne z tym podobieństwem

doprowadziło do hipotezy, że każdy rodzaj fotosyntezy opiera się na tym samym procesie podstawowym, a różnią się jedynie donory wodoru (woda, siarkowodór lub związek organiczny). Podstawowy proces fotosyntezy rozpatrywano zatem jako fotolityczne rozszczepienie wody (fotoliza) (H 2 O + hv—> [H] + [OH]) na część redukującą i część utleniającą. Według tego schematu bakterie są uzależnione od zewnętrznego źródła wodoru — H 2 A, służącego redukcji składnika utleniającego do wody, podczas gdy rośliny wyższe wykształciły

476

zdolność uwalniania tlenu ze składnika utleniającego (4[OH] -» 2H 2 O + O 2 ). Chociaż w końcu koncepcję fotolizy wody jako podstawowego procesu w fotosyntezie musiano porzucić, zasada napędzanego światłem transportu równoważników redukujących utrzymała się w obecnym ujęciu teorii przepływu elektronów w fotosyntezie.

Produktami fotosyntezy są ATP i równoważniki redukujące. Ich obecność można wykazać w nienaruszonych komórkach oraz w chloroplastach (izolowanych z roślin wyższych), jak również w zawiesinach fotosyntetycznych pęcherzyków błonowych (chromatoforów) z bakterii purpurowych. Wiązanie CO2 nie jest ściśle związane z reakcjami świetlnymi i może się odbywać w postaci reakcji „ciemnej" niezależnej od struktur zawierających barwniki, pod warunkiem dostępności ATP i NAD(P)H2. Obydwa procesy są rozdzielone również przestrzennie: fotosynteza odbywa się w błonach, podczas gdy wiązanie CO2 zachodzi w cytoplazmie, w tzw. stromie chloroplastów. Jak już wspomniano, oksygenowa fotosynteza roślin zielonych i sinic różni się od anoksygenowej fotosyntezy fototroficznych bakterii beztlenowych rodzajem wykorzystywanych donorów wodoru. Do wykorzystania wody jako donora wodoru niezbędne są dwie następujące po sobie fotoreakcje, podczas gdy do wykorzystania donorów wodoru o bardziej ujemnym potencjale oksydoredukcyjnym niż woda wystarczy jedna taka reakcja. Fotoreakcje. Podstawowymi procesami w fotosyntezie są fotoreakcje. Te oksydoredukcyjne reakcje odbywają się w fotochemicznych centrach reakcyjnych składających się z kilku komponentów, z których najważniejszymi są pierwotny donor elektronów (P)(specjalny kompleks chlorofilowo-białkowy) oraz pierwotny akceptor elektronów (X). Obydwa są układami redoks. System donora (P/P+) ma zawsze potencjał dodatni, ~ a układ akceptora (X/X ) ujemny. Udział energii prowadzi do przepływu elektronu.

Fotochemiczne centrum reakcyjne, w którym „P" jest w formie utlenionej, a „X" — zredukowanej, przedstawiono na schemacie. Fotoreakcja

477

powoduje powoduje ubytek elektronu na donorze; ubytek ten musi zostać uzupełniony. Zależnie od pochodzenia uzupełniających elektronów można rozróżnić otwarty łańcuch i cykliczny przepływ elektronów. W otwartym łańcuchu elektrony są dostarczane przez zewnętrzny donor; w przypadku pierwszej fotoreakcji łańcuch transportu elektronów łączy dwa fotosystemy, w drugiej zaś donorem elektronów jest H2O. W cyklicznym przepływie elektronów elektrony wracają od zredukowanego akceptora (X) do utlenionego donora. Podczas gdy otwarty łańcuch przepływu elektronów powoduje zarówno redukcję NADP, jak i protonów przez błonę, w cyklicznym przepływie elektronów zachodzi jedynie przemieszczenie ładunku.

12.2.1. Fotosynteza anoksygenowa Fotosyntetyczny transport elektronów u fototroficznych bakterii beztlenowych różni się pod kilkoma względami od opisanego powyżej. W fotosyntezie anoksygenowej bierze udział pojedyncza reakcja świetlna, która napędza cykliczny transport elektronów. Elektrony wycofane z cyklu do redukcji NAD nie zostają odtworzone przez rozszczepienie wody. Fotosynteza jest zatem zależna od obecności w podłożu zredukowanych substancji i przebiega bez wydzielania tlenu. Chociaż przebieg właściwej reakcji świetlnej jest analogiczny do takiej reakcji u roślin, to prawdopodobnie prowadzi ona jedynie do powstania siły protonomotorycznej, a zatem do wytworzenia energii (ATP), lecz nie do redukcji NAD. Nie ma transportu elektronów na drodze „otwartego łańcucha" (od donora do nukleotydu pirydynowego); NADH2 tworzy się najprawdopodniej w ciemnej reakcji przebiegającej z udziałem wstecznego transportu elektronów wymagającego nakładu energii. Różnice między poszczególnymi grupami bakteryjnych fototrofów, związane ze składem pigmentów oraz mechanizmami fotosyntetycznymi, są o wiele większe niż między poszczególnymi grupami roślin. W poniższych rozważaniach bakterie zielone zostaną pominięte.

478

Fotoreakcja u bakterii purpurowych. Barwniki i składowe systemu transportu elektronów bakterii purpurowych są umieszczone w błonach. Kompleks pigmentów fotochemicznego centrum reakcyjnego (CR) można oddzielić od pigmentów anten. Energia absorbowana przez pigmenty anten (bakteriochlorofile i karotenoidy) jest przekazywana do centrum reakcyjnego. Izolowane centra składają się z kompleksu białkowego zawierającego Bchl a, bakteriofeofitynę, karotenoid, ubichinon i białka żelazo-siarkowe. Barwnik centrum reakcyjnego nazwano Ρ 870 od maksymalnie absorbowanej długości fali. CR wyizolowano z komórek Rhodopseudomonas viridis, a następnie uzyskano w formie krystalicznej. Analiza strukturalna z zastosowaniem promieniowania rentgenowskiego pozwoliła na określenie grup prostetycznych wewnątrz łańcuchów polipeptydowych. Po R. viridis, który zawiera Bchl b, podobną analizę przeprowadzono dla CR z Rhodopseudomonas sphaeroides, którego pigmentem fotosyntetycznym jest Bchl a. Przepływ elektronów w CR przedstawiono schematycznie na rycinie 12.14 na przykładzie CR u R. sphaeroides zawierającym Bchl a. Wewnątrz CR jako pierwotny donor elektronów funkcjonuje tzw. „specjalna para" bakteriochlorofilu a (na schemacie oznaczona Ρ 870). Elektron trafia następnie do pojedynczej cząsteczki Bchl a, potem do bakterio-

479

feofityny (BPhe a jest to cząsteczka Bchl a pozbawiona magnezu) i w końcu do ubichinonu. Ubichinon znajduje się w bezpośrednim sąsiedztwie BPhe a, a jego boczne łańcuchy izoprenoidowe są w ścisłym z nim kontakcie. W pobliżu ubichinonu znajduje się również centrum Fe-S. Elektrony są przenoszone z ubichinonu poprzez kompleks cyt bc1 i cyt c2 z powrotem do „specjalnej pary" Ρ 870 (ryc. 12.14 i 12.15). Elektrony do redukcji NAD najprawdopodobniej pochodzą z cyklicznego szlaku przepływu i są przekazywane do NAD z udziałem wstecznego transportu wymagającego nakładu energii. Aby uzupełnić ubytek elektronów w cyklu, bakterie purpurowe muszą wykorzystywać zewnętrzne donory elektronów: siarkowodór i siarkę lub w przypadku purpurowych bakterii siarkowych — również tiosiarczan. Obie grupy bakterii purpurowych wykorzystują w tym celu również związki organiczne (jabłczan, bursztynian i inne) oraz wodór.

Doświadczalnie wykazano, że napędzany fotosyntezą transport elektronów u bakterii purpurowych prowadzi do wytworzenia gradientu protonów. Nienaruszone komórki reagują na światło wyrzucaniem protonów (zakwaszeniem środowiska). Naświetlenie zawiesiny fotosyntetyzu480

jących pęcherzyków błonowych (chromatoforów) powoduje transport protonów do ich wnętrza. Wynika z tego, że polarność pęcherzyków i błon tylakoidów jest taka sama, jak w przypadku pęcherzyków mitochondrialnych. Można wytłumaczyć to tym, że wymienione rodzaje pęcherzyków powstały na skutek wpuklenia się do środka błony cytoplazmatycznej lub wewnętrznych błon chloroplastów. Aczkolwiek do tej pory nie zlokalizowano poszczególnych składników błon, można przypuszczać, że struktury transportujące wodór i elektrony są tak ułożone w błonach beztlenowych bakterii fototroficznych, by sprzyjało to przemieszczaniu protonów. W pęcherzykach błonowych elektrony są przekazywane na zewnątrz, a protony transportowane do wnętrza. Fotoreakcja u Chlorobiaceae. Przebieg fotoreakcji u bakterii zielonych nie jest do końca poznany. Potencjał pierwotnego akceptora w reakcji świetlnej najprawdopodobniej wynosi około —500 mV (w porównaniu z — 100 mV u bakterii purpurowych). Przy tak silnym ujemnym potencjale elektrony z pierwotnego akceptora mogą być bezpośrednio wykorzystane do redukcji ferredoksyny i nukleotydów pirydynowych (ryc. 12.15). Chlorobiaceae są według wszelkich oznak niezależne od napędzanego energią wstecznego transportu elektronów i właśnie ta cecha stanowi o zdecydowanej odmienności ich fotosyntezy w porównaniu z bakteriami purpurowymi. Wydajność fotoreakcji u Chlorobiaceae byłaby zatem taka sama jak w pierwszej fotoreakcji u sinic. Z ewolucyjnego punktu widzenia fotosynteza u Chlorobiaceae stanowiłaby ogniwo pośrednie między fotosyntezą u bakterii purpurowych a fotosyntezą u sinic i roślin wyższych.

12.2.2. Fotosynteza oksygenowa Podstawowe procesy fotosyntezy odbywają się w tylakoidach. Są to spłaszczone, całkowicie zamknięte pęcherzyki błonowe występujące w komórkach sinic oraz w chloroplastach zielenic i roślin wyższych. Błona tylakoidu i pigmenty anten. Błony tylakoidowe w chloroplastach zawierają chlorofil (Chl) a i Chl b, karotenoidy, przenośniki elektronów oraz enzymy. Większość cząsteczek chlorofilu (99,5%) oraz pomocniczych barwników (karotenoidy, fikobiliny) uczestniczy w absorpcji światła i przekazie energii. Tworzą one system barwników anten. Jedynie bardzo niewielka frakcja chlorofilu a odgrywa rolę fotochemicznego

481

centrum reakcyjnego, w którym odbywa się właściwa fotochemiczna reakcja oksydoredukcyjna. Pigmenty anten zbierają światło (energię) i przekazują ją chlorofilowi centrum reakcyjnego (karotenoid -» karotenoid*; chlorofil + karotenoid* -» chlorofil* + karotenoid). Karotenoidy mają również funkcje ochronne. W ostrym świetle słonecznym spełniają rolę bufora: przeprowadzają one nadmiar światła w ciepło, które ulegając rozproszeniu chroni chlorofil przed szkodliwym fotoutlenianiem. System barwników anten oraz fotochemiczne centrum reakcyjne tworzą podstawową jednostkę fotosyntetyczną. Dwie fotoreakcje w dwóch systemach pigmentów. W fotosyntezie oksygenowej występują szeregowo dwa systemy pigmentów (ryc. 12.16). Pigment reagujący na fale dłuższe ( l < 7 3 0 nm) znany jest jako fotosystem I (PS I), a pigment wrażliwy na fale krótsze ( l < 7 0 0 nm) zwany jest

482

fotosystemem II (PS II). Fotochemiczne centrum reakcyjne systemu I zawiera Chl a1 (P 700), który jest pierwszym donorem elektronów w pierwszych fotoreakcjach. Chl a1 jest aktywowany przez energię świetlną absorbowaną przez pigmenty anten systemu I. Aktywacja ta powoduje, związane z funkcją elektronu, utlenienie Chl αI do Chl aI+. Inaczej mówiąc, emisja elektronu przez centrum reakcyjne powoduje jego deficyt. Deficyt ten jest natychmiast wyrównywany przez inny elektron, dostarczany za pośrednictwem łańcucha transportu elektronów. Akceptorem elektronu emitowanego przez Chl αI jest prawdopodobnie białko żelazo-siarkowe („X") o potencjale redoks poniżej —420 mV, prawdopodobnie — 530 mV. Akceptor przekazuje elektron do ferredoksyny, a siła redukująca ze zredukowanej w ten sposób ferredoksyny przechodzi do NADP lub innego akceptora. Alternatywnie, elektron może przejść z „X" w cyklicznym szlaku poprzez plastochinon, cytochrom i plastocyjaninę z powrotem do chlorofilu aI+ centrum reakcyjnego, uzupełniając tym samym pierwotny deficyt. Centrum reakcyjne fotosystemu II zawiera Chl aII (P 680), który jest pierwotnym donorem elektronów w drugiej fotoreakcji. Chl au ulega wzbudzeniu przez energię absorbowaną przez pigmenty anten fotosystemu II. Aktywacja Chl au powoduje emisję elektronu, który zostaje przyjęty przez swoistą cząsteczkę plastochinonu (X 320), ulegającą redukcji do semichinonu. Przekazany elektron jest słabo redukujący (E o ~ 0 mV). Donorem elektronu dla fotosystemu II jest woda. Deficyt elektronu w Chl aII jest uzupełniany przez elektron uwolniony z wody + ~ podczas tworzenia tlenu cząsteczkowego (2H2O -» O2 + 4H + 4e ). Rozszczepienie wody przebiega przy współudziale manganu. Obydwa fotosystemy pigmentów są połączone łańcuchem transportu elektronów i współpracują ze sobą. Istotnym ogniwem łączącym fotosystemy jest plastochinon. Występuje on w dużym nadmiarze i pełni rolę rezerwuaru elektronów, podobnie jak ubichinon w łańcuchu oddechowym. Plastochinon przyjmuje elektrony od X 320 i ulega następnie utlenieniu przez fotosystem I. Po przejściu przez przenośniki oksydoredukcyjne — cytochrom f (związany z błoną cytochrom typu c) i plastocyjaninę (rozpuszczalne białko zawierające miedź) elektrony plastochinonu uzupeł+. niają deficyt w Chl aII Plastochinonowy rezerwuar ma ważną cechę odbierania, a następnie rozprowadzania elektronów z różnych źródeł; przechodzi przez niego co najmniej dziesięć różnych łańcuchów transportu elektronów.

483

Główne szlaki transportu elektronów w podstawowych procesach fotosyntetycznych przedstawiono na rycinie 12.16. Dobrze znany schemat przepływu elektronów, w kształcie położonej litery „Z", powstał w wyniku badań wykorzystujących spektrofotometrię, sztuczne donory i akceptory elektronów oraz swoiste inhibitory. Bierze on pod uwagę potencjały redoks poszczególnych pigmentów i czynników przenoszących elektrony, jak również kolejność ich utleniania i redukcji. Nie daje on jednak żadnych informacji dotyczących umiejscowienia tych czynników w błonie. Rozmieszczenie pigmentów i przenośników elektronów w błonie. Informacje dotyczące dokładnego rozmieszczenia poszczególnych pigmentów i związków transportujących elektrony uzyskano stosując test czynnościowy z tylakoidami w obecności przeciwciał lub sztucznego lipofilnego czy hydrofilnego systemu redoks (ryc. 12.17). Przeciwciała

484

skierowane przeciw poszczególnym składowym fotosyntetycznego układu transportu elektronów nie przechodzą przez błonę, reagują zatem jedynie ze składnikami będącymi po zewnętrznej stronie błony tylakoidu. Przykładowo, przeciwciała przeciw ferredoksynie i reduktazie ferredoksyna: NADP hamują aktywność fotosystemu I, wskazując na umiejscowienie tych białek na zewnętrznej powierzchni błony tylakoidu. Donor elektronów, z kolei, znajduje się na powierzchni wewnętrznej. Wektorowy transport elektronów i tworzenie gradientu protonów. Sugerowane rozmieszczenie poszczególnych składowych fotosyntetycznego systemu transportu elektronów jest zgodny z obserwacjami i pomiarami uzyskanymi w badaniach fizjologicznych. Naświetlenie zawiesiny naruszonych chloroplastów lub tylakoidów prowadzi do wzrostu pH środowiska zewnętrznego. Po przerwaniu naświetlenia pH ponownie spada. Naświetlenie powoduje zatem transport protonów do tylakoidów (ryc. 12.17, 12.18). Mówiąc inaczej, energia świetlna może być wykorzystana do ustanowienia gradientu protonów poprzez błonę tylakoidu. Już dużo wcześniej wykazano, że zawiesiny tylakoidów mogą syntetyzować ATP w ciemności, pod warunkiem podwyższenia pH środowiska z 4 do 8. Tego typu eksperymenty stworzyły podstawy chemiosmotycznej teorii konwersji energii. Szczegółowe badania wykazały, że transport jednego elektronu w obydwu reakcjach świetlnych powodował transport dwóch protonów do wnętrza tylakoidu. Można zatem założyć, że obydwie fotoreakcje, łącznie z łańcuchem transportu elektronów, powodują ukierunkowany przepływ elektronów z wody po wewnętrznej stronie błony tylakoidu do NADP po jej zewnętrznej stronie. Fotoreakcje prowadzą zatem do redukcji NAD i polaryzacji błony. Innymi słowy, reakcje świetlne mają charakter pompy protonowej napędzanej światłem (ładunek dodatni wewnątrz tylakoidu) i prowadzą do wytworzenia gradientu protonów. Potencjał protonowy powoduje powstanie ATP; łączy on

485

fotosyntetyczny transport elektronów z fosforylacją w taki sam sposób, w jaki transport elektronów w oddychaniu jest związany z fosforylacją.

12.2.3. Podsumowanie Fotosynteza przetwarza światło w energię chemiczną. Pierwotne działanie światła polega na transferze elektronów w fotochemicznych centrach reakcyjnych od donora do akceptora, przeciwnie do gradientu termodynamicznego. Przynajmniej niektóre z tych elektronów powracają do centrum reakcyjnego poprzez łańcuch transportu elektronów. Na skutek odpowiedniego rozmieszczenia składowych tego łańcucha w błonie prowadzi to do translokacji protonów i powstania gradientu protonów przez błonę. Aparat fotosyntetyczny można więc uważać przede wszystkim za „napędzaną światłem pompę protonową". Potencjał protonowy jest niezbędny do przekształcenia energii w drodze fosforylacji. Regeneracja ATP odbywa się w procesie podobnym do tego, jaki zachodzi w błonach bakterii oddychających i w mitochondriach. Jeśli chodzi o zamianę energii świetlnej w energię wykorzystywaną w procesach biochemicznych (ATP), to w zasadzie nie ma większych różnic między fotosyntezą bakterii fototroficznych i roślin zielonych. U bakterii purpurowych fotosynteza wydaje się ledwo wystarczać do pokrycia ilości wykorzystanej energii. Fotosynteza u sinic i roślin zielonych pod względem ewolucyjnym jest procesem bardziej rozwiniętym; ciąg dwóch kolejnych reakcji świetlnych umożliwia aktywację elektronów w pierwszej reakcji do poziomu wystarczającego do redukcji ferredoksyny i NADP. Druga reakcja świetlna pozwala następnie na wykorzystanie wody jako źródła elektronów. Poza uzyskiwaniem energii, układ ten umożliwia również redukcję NADP i wydzielanie tlenu. Proces fotosyntezy jest najpowszechniejszą reakcją chemiczną na Ziemi. Nie tylko umożliwia ona ciągłą syntezę de ηονο materii organicznej, lecz jest również źródłem energii w postaci węgla, ropy naftowej i gazu ziemnego. Wysiłek i wydatki związane z próbami wyjaśnienia tajemnicy fotosyntezy wydają się zatem całkowicie uzasadnione. Opisany powyżej model fotosyntezy oprócz eksperymentalnie udowodnionych faktów zawiera kilka hipotez wymagających jeszcze udowodnienia.

486

12.3. Wykorzystywanie energii świetlnej przez archeony z rodzaju Halobacterium Gatunki zaliczane do rodzaju Halobacterium (H. halobium, H. cutirubrum) pod względem fizjologii tworzą bardzo wyspecjalizowaną grupę. Występują one w bardzo stężonych lub wręcz nasyconych roztworach soli, jak np. wielkie słone jeziora w stanie Utah (USA), lub w solankach, w których odparowuje się wodę morską w celu uzyskania soli. Organizmy te są doskonale przystosowane do ekstremalnych warunków, ponieważ stężenie soli w komórkach jest zbliżone do jej stężenia w środowisku. Wykazują one optymalny wzrost w stężeniu NaCl 3,5-5,0 mol/l. Enzymy izolowane z ich komórek do aktywności i stabilizacji również wymagają stężeń soli często sięgających 2 mol/l. Ta grupa prokariotów należy do archeonów (rozdz. 3.13). Ruchliwe, pałeczkowate komórki H. halobium z powodu zawartości karotenoidów są zabarwione na czerwono, pomarańczowo lub żółto. Ich błona cytoplazmatyczna ma ciemnoczerwone plamki o średnicy około 0,5 μm, zajmujące około połowy całej powierzchni komórki (ryc. 12.19). Te barwne plamki stanowią tzw. błonę purpurową. Ich zabarwienie wynika z obecności bakteriorodopsyny, która przypomina rodopsynę w komórkach wzrokowych zwierząt. Pigment ten podczas naświetlenia komórki wytwarza gradient protonów między wewnętrzną i zewnętrzna powierzchnią błony. Błona purpurowa pełni zatem funkcję „napędzanej światłem pompy protonowej" tworzącej elektrochemiczny potencjał błonowy. Powstaniu potencjału może towarzyszyć generacja ATP. Błona purpurowa prowadzi więc swoisty rodzaj fotofosforylacji. Uzyskiwana w ten sposób na świetle energia uzupełnia energię otrzymywaną z tlenowego utleniania substratów.

487

WIĄZANIE AZOTU CZĄSTECZKOWEGO

Prokariota są jedynymi organizmami zdolnymi do wykorzystywania azotu z atmosfery i wiązania azotu cząsteczkowego. Jako organizmy żyjące samodzielnie lub w symbiozie z roślinami wyższymi przeprowadzają one reakcje wbudowania N2 do związków organicznych, które bezpośrednio lub poprzez substancje roślinne trafiają do zapasów białka w glebie. Symbiotyczne wiązanie azotu przez rośliny motylkowe może osiągać wydajność 100 do 300 kg N/ha/rok. Ocenia się, że organizmy wolnożyjące dostarczają od 1 do 3 kg N/ha/rok (patrz „Obieg azotu" w rozdz. 1). W dodatku, znaczne ilości związanego azotu mogą trafiać do gleby na skutek wytrącania. Zależnie od stopnia zanieczyszczenia atmosfery ilości te sięgają od 3 do 30 kg N/ha/rok. Wyliczono, że globalne wiązanie azotu 6 6 w roku 1974 było rzędu 175 x 10 ton, z czego 90 x 10 trafiło do gleb uprawnych. W procesie Habera-Boscha zostało związane 40 x 106 ton azotu, z czego większa jego część w wyniku symbiozy z bakteriami z rodzaju Rhizobium. Biologiczne wiązanie azotu jest procesem reduktywnym. Kompleks nitrogenazy przekazuje łącznie 6[H] do N2 oraz uwalnia 2[H] w postaci wodoru cząsteczkowego. Pierwszym zidentyfikowanym produktem tej reakcji enzymatycznej jest amoniak:

488

Diimid i hydrazyna są jedynie przykładem możliwych produktów pośrednich związanych z układem enzymów. Wszystkie dotychczas wyizolowane kompleksy enzymatyczne nitrogenazy są bardzo do siebie podobne. Wyróżniającą je cechą jest niezwykła wrażliwość na tlen in situ i in vitro. Cechę tę należy brać pod uwagę zarówno we wszelkich badaniach, jak i stawiając hipotezy.

13.1. Wiązanie azotu przez bakterie symbiotyczne Z powodu wysokiej wydajności symbiotycznego wiązania azotu, na proces ten zwrócono uwagę już dawno temu i wykorzystano w rolnictwie stosując płodozmian. Rośliny motylkowe zaorywano w glebie, by wzbogacić ją w azot organiczny. Pierwszych dowodów na wzbogacanie w azot przez uprawy roślin strączkowych i motylkowych dostarczył Boussingault. Na rolę brodawek roślin motylkowych w wiązaniu azotu zwrócili uwagę Hellriegel i Wilfarth (1886-1888). Rośliny strączkowe rosną bez zewnętrznego źródła azotu jedynie wówczas, gdy ich korzenie mają brodawki; brodawki te powstają na skutek zakażenia włosków korzeniowych przez bakterie glebowe (ryc. 13.1).

13.1.1. Brodawki korzeniowe roślin motylkowych Bakterie odpowiedzialne za tworzenie brodawek korzeniowych u roślin motylkowych należą do rodzaju Rhizobium. Występują one w glebie jako wolno żyjące, ściśle tlenowe, gramujemne pałeczki wykorzystujące do wzrostu związki organiczne. Niektóre szczepy (Bradyrhizobium) są zdolne do wzrostu autotroficznego wykorzystując H2. Na podstawie swoistości gospodarza oraz charakteru wzrostu można wyróżnić trzy podgrupy (tab. 13.1), którym nadano nazwy rodzajowe. Do grupy Rhizobium zalicza się najszybciej rosnące bakterie brodawkowe wielu pospolitych roślin hodowlanych. Grupa Bradyrhizobium japonicum obejmuje rosnące bardzo wolno symbionty soi. Do trzeciej grupy należy Azorhizobium caulinodans, bakteria wytwarzająca brodawki łodygowe. Prawie wszystkie rośliny motylkowe mogą wytwarzać brodawki przy współudziale ryzobiów, a dany gatunek Rhizobium zwykle może wchodzić w układ symbiotyczny z różnymi roślinami motylkowymi.

489

490

Etapy tworzenia się brodawki korzeniowej. Bakterie wnikają z gleby do młodych włosków korzeniowych. Rośliny motylkowe zawierają lektyny. Są to glikoproteiny, które wiążą się ze swoistymi wielocukrami. Lektyny występują powszechnie w przyrodzie i prawdopodobnie spełniają szerokie funkcje rozpoznawcze. Interakcje między lektynami na zewnętrznej powierzchni włosków korzeniowych i wielocukrami na zewnątrz ściany komórkowej ryzobiów zbadano u R. trifolii zakażającego koniczynę białą. Wiązanie następuje jedynie między zgodnymi partnerami; nie każdy gatunek Rhizobium może się wiązać z jakąkolwiek rośliną motylkową i odwrotnie. Jeśli połączenie jest możliwe, czubek włoska zagina się i penetrujące bakterie wyrastają w postaci tzw. nici zakaźnej otoczonej komórkami korzenia. Wyrastając w kierunku podstawy (do góry) zakażają one kolejne komórki epidermalne korzenia. Zwykłe komórki diploidalne ulegają zniszczeniu, lecz ryzobia namnażają się w często obecnych komórkach tetraploidalnych. Po wytworzeniu hormonów wzrostowych komórki epidermalne korzenia namnażają się. W wyniku rozrostu tkanki, wywołanego przez ryzobia oraz promotory wzrostu, najprawdopodobniej cytokiny, powstaje brodawka. Szybko rosnące bakterie przekształcają się w zdeformowane komórki, zwane bakteroidami, o objętości do dziesięciokrotnie większej niż ryzobium. Bakteroidy, żyjąc w cytoplazmie komórek roślinnych pojedynczo lub w grupach, otaczają się błoną perybakteroidalną. Tkanka zawierająca bakteroidy jest czerwona, ponieważ zawiera barwnik leghemoglobinę. W miarę starzenia się brodawki następuje degradacja leghemoglobiny do zielonych barwników żółciowych (biliwerdyn) i brodawka również przyjmuje zieloną barwę. Po śmierci brodawki

491

zostają uwolnione ryzobia, wciąż licznie występujące w stacjonarnej fazie wzrostu. Mogą się one namnażać wykorzystując jako substraty produkty rozpadu brodawki. Funkcje bakteroidów i leghemoglobiny. Bakteroidy wiążą azot. W fazie wiązania azotu komórka roślinna dostarcza im kwasów C4-dikarboksylowych (np. malonian, bursztynian, fumaran). W przeciwieństwie do wolno żyjących ryzobiów, bakteroidy nie potrafią wykorzystywać cukrów. Wydzielają one jony amonowe, które prawdopodobnie są wbudowywane do związków roślinnych przy współudziale syntetazy glutaminowej, obecnej w otaczającej je komórce roślinnej (rozdz. 7.6.). Zależność między rośliną i Rhizobium jest zatem rzeczywistą symbiozą mutualną. Ta wzajemna zależność obojga partnerów jest jeszcze bardziej wyrazista w roli leghemoglobiny w wiązaniu azotu. Powstawanie leghemoglobiny jest swoistym wynikiem symbiozy. Grupa prostetyczna — protohem jest syntetyzowana przez bakteroidy, podczas gdy synteza części białkowej przebiega w komórkach roślinnych. Leghemoglobina przypomina mioglobinę. Występuje ona w brodawkach przede wszystkim w formie zawierającej żelazo(II) i wykazuje bardzo wysokie powinowactwo do tlenu. Barwnik ten występuje w cytoplazmie komórki roślinnej, a nie w przestrzeni perybakteroidalnej. Przypuszcza się, że leghemoglobina ułatwia transport tlenu przez komórki roślinne do bakteroidów, zwiększając jego szybkość. Jej właściwości zapewniają bakteroidom wystarczająco dużo tlenu do pokrycia zapotrzebowania energetycznego bez wytworzenia nadmiernego ciśnienia parcjalnego O2, które hamowałoby wiązanie azotu. Wydaje się, że obecność leghemoglobiny w pełni chroni enzymy uczestniczące w wiązaniu azotu (rozdz. 13.3) przed uszkodzeniem przez tlen. Ryzobia są jedynymi bakteriami wiążącymi azot, których nie wszystkie szczepy mają enzym hydrogenazę, stanowiącą również ochronę przed tlenem. Wydaje się niemożliwe, aby ryzobia wolno żyjące w glebie mogły wiązać azot. Podczas wzrostu na płytkach z podłożem odżywczym obecność nitrogenazy wykazano jedynie u kilku szczepów Rhizobium. Tworzenie nitrogenazy zależy od ciśnienia parcjalnego tlenu wewnątrz kolonii. Brodawki łodygowe. U niektórych roślin motylkowych brodawki występują na łodygach. Zawierają one szczepy należące do rodzaju oznaczonego jako Azorhizobium caulinodans. Rośliny te, jak na przykład Sesbania 492

rostrata, żyją w Afryce tropikalnej i w Indiach. Brodawki występują na zagłębionych w glebie łodygach, jak i powyżej poziomu gleby. Wiedza na temat symbiozy bakterii z łodygami jest stosunkowo niewielka. Należy się spodziewać, że te sposoby wiązania azotu będą mniej wrażliwe na tlen niż pozostałe.

13.1.2. Brodawki korzeniowe roślin niemotylkowych Niektóre dwuliścienne rośliny wyższe nie należące do Leguminosae również mają brodawki korzeniowe zdolne do wiązania azotu. I w tych przypadkach wiązanie azotu jest wynikiem symbiozy z prokariotami. Endosymbiontami są najczęściej promieniowce i przedstawiciele rodzaju Frankia. Gospodarzami promieniowców są drzewa, krzewy i rośliny zielne. Występują one szeroko, często jako rośliny pionierskie w środowiskach ubogich w azot. Wydajność niektórych z nich sięga 150-300 kg N/ha/rok i odgrywa znaczącą rolę w gospodarce. Do roślin najefektywniej wiążących azot należą: Casuarina equisetifolia, Alnus, Hippophae i Ceanothus. Nieco gorzej wiążą azot Myrica, Dryas, Elaeagnus i Shepherdia. Brodawki korzeniowe roślin drzewiastych mogą osiągać wielkość piłki tenisowej. Składają się z gęsto upakowanych, podobnych do koralowców, rozgałęzionych korzeni, które przestały rosnąć. U Casuarina brodawki składają się z luźnej wiązki pogrubionych mniejszych korzeni, wykazujących ujemny geotropizm. Jedynie zewnętrzne komórki parenchymatyczne są zainfekowane symbiontem. Infekcja korzeni zachodzi z gleby, poprzez włoski korzeniowe, jak u Leguminosae. Do brodawek Leguminosae zbliża je też obecność leghemoglobiny. Ostatnio, szczep Rhizobium zidentyfikowano jako endosymbionta w niemotylkowej roślinie Parasponia parviflora. Szczep ten przeniesiono do roślin fasoli, a powstałe brodawki czynnie wiązały azot.

13.1.3. Symbioza z sinicami wiążącymi azot Jako organizmy partnerskie w symbiozie z organizmami wyższymi występują również sinice. U paprotki wodnej Azolla, rosnącej na powierzchni stojących tropikalnych wód, sinice występują w przestrzeniach tkankowych w liściach. Symbiontem paprotki jest Anabaena azollae. Podczas gdy wolno żyjące komórki Anabaena zawierają niewiele (5%) 493

heterocyst, u symbionta ich ilość wzrasta do 15-20%. Może to wskazywać na efektywne wiązanie azotu. Pomiary aktywności nitrogenazy potwierdzają to przypuszczenie. Azolla rośnie na zatopionych polach ryżowych i przy odpowiednich metodach uprawy może całkowicie zaspokajać zapotrzebowanie pola na azot. Wydajność wiązania azotu w wyniku symbiozy między Azolla i Anabaena wynosi około 300 kg N/ha/rok. Podobna symbioza istnieje między przylaszczkami (Blasia pusilla, Anthoceros punctatus, Peltigera) i Nostoc. U tropikalnego krzewu Gunnera macrophylla, w specjalnych gruczołach u nasady liści występuje Nostoc punctiforme. Ten gatunek Nostoc również wytwarza heterocysty i nitrogenazę.

13.2. Wiązanie azotu przez bakterie wolno żyjące i sinice Zdolność wiązania azotu jest dość szeroko rozpowszechniona wśród bakterii wodnych i glebowych. Prawie w każdej grupie fizjologicznej można znaleźć kilku przedstawicieli wiążących azot, z mniejszą lub większą wydajnością. Większość przedstawicieli należących do dużych grup fototroficznych prokariotów — purpurowych bakterii siarkowych, purpurowych bakterii bezsiarkowych i sinic — posiada zdolność wiązania azotu. Do najważniejszych bakterii autotroficznych wiążących azot należą: Xanthobacter autotrophicus, Alcaligenes latus i Derxia gummosa, a wśród fakultatywnych beztlenowców — Klebsiella pneumoniae i Bacillus polymyxa. Wśród obligatoryjnych beztlenowców zdolność wiązania azotu wykazują klostridia, metanogeny i bakterie sulfidogenne. Ze zdziwieniem stwierdzono, że metanogenne archeony też są zdolne do wiązania N 2 . Wprowadzenie technik izotopowych (identyfikacja 15N) oraz chromatografii gazowej, która pozwala na szybkie wykazanie obecności etylenu wytwarzanego z acetylenu przez organizmy wiążące azot, pozwoliło na zbadanie dużej liczby gatunków. Jednakże, ostatecznego dowodu na wiązanie azotu dostarczają badania wzrostu. Wydaje się, że większość bakterii może posiadać informację genetyczną pozwalającą na wiązanie azotu, lecz geny te nie są wyrażane w warunkach środowiska, do których organizmy zaadaptowały się. Podczas gdy większość tlenowych bakterii wiążących azot przeprowadza tę reakcję jedynie w warunkach zmniejszonego parcjalnego ciśnienia tlenu, grupa Azotobacter w pełni przystosowała się do tlenu 494

atmosferycznego. Azotobacter chroococcum, A. vinelandii, Beijerinckia indica, Derxia gummosa i Azomonas agilis należą do bakterii, które można łatwo wyizolować zaszczepiając podłoża odżywcze pozbawione związanych form azotu wodą lub glebą, a następnie inkubując je w warunkach tlenowych. Liczebność A. chroococcum jest o wiele większa w glebach ubogich w azot niż w glebach dobrze nawożonych, bogatych w azot. Ryzosfera niektórych roślin zawiera skupiska bakterii wiążących azot, takich jak Azotobacter paspali na powierzchni korzenia trawy piaskowej Paspalum notatum, czy Azospirillum lipoferum w ryzosferze Digitaria decumbens. Ponieważ każdy z partnerów w takim związku odnosi korzyści, można go uznać za symbiozę. Wiązanie azotu przez wolno żyjące sinice jest procesem wyjątkowej wagi, szczególnie na polach ryżowych (30-50 kg N/ha/rok). Zdolność wiązania azotu została wykazana w czystych hodowlach u przynajmniej 40 gatunków sinic. Sinice należą do pionierskich gatunków w kolonizacji ubogich gleb (na przykład gleb wulkanicznych) i występują w ekstremalnych siedliskach, takich jak Antarktyda — w temperaturach bliskich zera, czy gorące źródła. Rosną samotnie lub w symbiotycznych związkach z grzybami, znanych jako porosty, w wodach śródlądowych oraz w niektórych częściach oceanów. Coroczne okresowe namnażanie się sinic 495

prowadzi do zakwitów wód. Dotychczas nie udało się ustalić, jaką część biomasy w oceanach stanowią sinice oraz ile azotu trafia do wód dzięki ich aktywności. Pierwiastki śladowe niezbędne do wiązaniu azotu. Do wiązania azotu potrzebne są dwa pierwiastki, molibden i nikiel. Molibden jest konieczny do wiązania azotu i redukcji azotanu. Zawierają go główne enzymy obydwu procesów. Nikiel jest natomiast składnikiem hydrogenazy. To, iż wszystkie bakterie wiążące azot (z wyjątkiem nielicznych ryzobiów) zawierają hydrogenazę powoduje, że nikiel jest dla tych organizmów pierwiastkiem niezbędnym. Rolę molibdenu, jako istotnego składnika w wiązaniu azotu, wykrył około 50 lat temu H. Bortels. W kilku przypadkach molibden może być zastąpiony przez wanad. Badania genetyczne wykazały, że Azotobacter vinelandii i Xanthobacter autotrophicum mają dwie grupy genów, z których jedna koduje nitrogenazę zawierającą molibden, druga — nitrogenazę zawierającą wanad. Z kolei okazało się, że oba te pierwiastki nie są niezbędne. Azotobacter vinelandii po delecji obydwu genów nadal wiąże azot. Wytwarza się wówczas zwykła nitrogenaza żelazo-siarkowa.

13.3. Biochemia wiązania azotu Wiązanie azotu przebiega przy współudziale układu enzymatycznego, zwanego kompleksem nitrogenazy, który składa się z nitrogenazy i reduktazy nitrogenazowej (ryc. 13.2). Obydwa te, połączone ze sobą składniki, znajdują się w cytoplazmie i są nadzwyczaj wrażliwe na tlen. Z tego powodu fakultatywne beztlenowce wiążą azot tylko w warunkach beztlenowych, sinice jedynie w heterocystach, a ryzobia wyłącznie w obecności leghemoglobiny. Obydwa składniki są białkami żelazo-siarkowymi. Nitrogenaza jest większym białkiem zbudowanym z czterech podjednostek (a2 i β2), z których każda zawiera jeden atom molibdenu. Białka te mają ujemny potencjał oksydo-redukcyjny. Elektrony przepływają poprzez ferredoksynę i flawodoksynę — w pierwszym etapie do reduktazy nitrogenazowej, a następnie, z równoczesnym zużyciem 16 moli ATP na + mol N 2 , do nitrogenazy. Równocześnie 2H ulegają redukcji do H 2 . Układ enzymatyczny może redukować nie tylko azot cząsteczkowy, lecz również acetylen, azydek, NO 2 , cyjanek, nitryl, izonitryl oraz protony.

496

Najprościej można wykazać aktywność nitrogenazy wykorzystując jej zdolności redukowania acetylenu do etylenu, którego obecność można następnie ilościowo określić za pomocą chromatografii gazowej. Wszystkie bakterie wiążące azot i układy symbiotyczne dotychczas zbadane mają zdolność redukowania acetylenu. Alternatywny kompleks nitrogenazy, zawierający wanad jako metal ciężki, przeprowdza redukcję acetylenu o krok dalej, do etanu. Pozwala to na odróżnienie obydwu systemów, nawet in vivo. Energia — w formie ATP — wymagana do wiązania azotu może pochodzić z fermentacji, oddychania lub fotosyntezy (ryc. 13.2). Potrzebne ilości siły redukującej i ATP są na tyle duże, że znajduje to odzwierciedlenie w wydajności wzrostu. Gdyby bakterie wiążące azot były hodowane z ograniczającą ilością cukru (lub innego substratu węglowego), to dodatek amoniaku pozwoliłby na uzyskanie większej wydajności komórkowej niż w wypadku wzrostu zależnego jedynie od wiązania azotu. Rola hydrogenazy. Odkrycie, że kompleksy nitrogenazy prawie wszystkich bakterii wytwarzają oprócz NH3 również wodór, początkowo wydawało się zaskakujące, tym bardziej że wskazywało to na marnotrawienie cennej siły redukującej. Jednakże stwierdzenie, że bakterie te posiadają również hydrogenazę związaną z błoną cytoplazmatyczną, wskazywało na ewentualną rolę ochronną wodoru, to jest mógłby on chronić wrażliwą na tlen nitrogenazę. Najprawdopodobniej wodór tworząc wodę redukuje tlen mogący się dostać do komórki w drodze dyfuzji (ryc. 13.3).

497

Bez hydrogenazy wodór nie może ulec aktywacji. Wykazanie obecności wodoru cząsteczkowego w atmosferze bezpośrednio nad polami koniczyny popiera tę sugestię. Wynika to z tego, że wiele ryzobiów, między innymi Rhizobium trifolii, nie zawiera hydrogenazy i nie może zatem aktywować H 2 , który jest uwalniany do komórki roślinnej, a z niej do atmosfery. Brak hydrogenazy u wielu ryzobiów można wytłumaczyć obecnością leghemoglobiny, która stanowi ochronę przed uszkodzeniem przez tlen. Nie ma zatem w tym przypadku presji selekcyjnej utrzymania drugiego mechanizmu ochronnego. Badania nad soją zaszczepioną (1) szczepem Bradyrhizobium japonicum wytwarzającym hydrogenazę i (2) mutantem tego samego szczepu nie produkującym tego enzymu wskazuje, że wewnątrzkomórkowe wykorzystywanie wodoru wytworzonego przez kompleks nitrogenazy prowadzi do zysku energetycznego i zwiększonej wydajności. Zwiększona wydajność energetyczna prawdopodobnie nie jest jeszcze głównym powodem jednoczesnej obecności nitrogenazy i hydrogenazy u wszystkich bakterii wiążących azot (z wyjątkiem ryzobiów). Głównym powodem jest rola ochronna hydrogenazy. Regulacja wiązania azotu. Wiele bakterii wytwarza nitrogenazę jedynie wtedy, gdy enzym ten jest niezbędny do wzrostu, to jest gdy nie ma odpowiedniego źródła związanego azotu. Synteza nitrogenazy zostaje zahamowana w obecności jonów amonowych. U niektórych organizmów jony amonowe hamują aktywność enzymu już wytworzonego. Enzym 498

syntetaza glutaminowa odgrywa prawdopodobnie istotną rolę w regulacji syntezy nitrogenazy (rozdz. 7.6). Syntetaza glutaminowa i syntaza glutaminianowa to dwa enzymy, które umożliwiają bakteriom włączanie jonów amonowych do związków organicznych, kiedy jony te występują w małym stężeniu. Układ ten ma małe powinowactwo do jonów amonowych, utrzymując ich stężenie wewnątrz komórki na niskim poziomie. Wzrost stężenia jonów amonowych w środowisku, a zatem i wewnątrz komórki, prowadzi do zahamowania tworzenia syntetazy glutaminowej i, w konsekwencji, do zatrzymania syntezy nitrogenazy. Transfer genetyczny genu nif. Zdolność wiązania azotu można przekazać z jednej bakterii do drugiej przez bezpośredni kontakt między komórkami. W ten sposób przekazano gen nif z Klebsiella pneumoniae do Escherichia coli. Występowanie tego genu na plazmidzie zrodziło nadzieje możliwości przekazania go do innych bakterii, a nawet do organizmów eukariotycznych. Ponieważ jednak wiązanie azotu wymaga, poza kompleksem nitrogenazy, również swoistego białka żelazo-siarkowego, jak też ochrony układu nitrogenazy przed tlenem, tego rodzaju badania nastręczają dużo problemów.

ROZKŁAD SUBSTANCJI NATURALNYCH

Chociaż od milionów lat rośliny zielone syntetyzują substancje organiczne z dwutlenku węgla, żadna z nich nie nagromadziła się w dużej ilości. Jedynie tam, gdzie nie dochodziło powietrze, niewielka ich część przetrwała w postaci silnie zredukowanych związków węglowych (węgiel, ropa naftowa, gaz ziemny). W warunkach tlenowych wszystkie związki utworzone w wyniku biosyntezy ulegają degradacji. Oznacza to, że dla każdego związku, bez względu na skomplikowanie budowy, znajdzie się przynajmniej jeden drobnoustrój zdolny do jego całkowitej lub częściowej degradacji. Powstałe produkty mogą być wykorzystywane przez inne organizmy. Drobnoustroje są zatem wszechstronnie, biochemicznie uzdolnione, co pozwala mówić o „zasadzie ich niezawodności". Ostatnio stało się konieczne pewne ograniczenie tej zasady. Niektóre syntetyczne substancje niskocząsteczkowe oraz materiały o wysokim stopniu polimeryzacji okazały się, po latach obserwacji i badań, oporne na atak ze strony bakterii. Znajomość drobnoustrojów atakujących, rozkładających i przekształcających poszczególne substancje naturalne wynika głównie z eksperymentów z hodowlami wzbogacającymi. Proste roztwory podstawowych składników odżywczych z badanym związkiem jako jedynym źródłem energii (i/lub węgla) pozwalają na wzrost jedynie organizmów o stosunkowo niewielkich wymaganiach odżywczych; w płynnych hodowlach wzbogacających zaczynają dominować organizmy rosnące najlepiej. Można zatem wątpić, czy organizmy te można uważać za typowych reprezentantów drobnoustrojów przeprowadzających badany proces degradacji w wa-

500

runkach naturalnych. Organizmy o odmiennych wymaganiach wzrostowych i właściwościach fizjologicznych mogą pozostać nierozpoznane. Nie tylko bakterie, lecz również drobnoustroje eukariotyczne oraz małe zwierzęta (robaki, mięczaki, owady) uczestniczą w rozkładzie substancji organicznych w glebie (ryc. 14.1). Jednym z celów ekologii drobnoustrojów jest zbadanie tlenowego łańcucha pokarmowego. Rozkład w warunkach beztlenowych i tlenowych. Duża część biomasy powstającej w wyniku fotosyntezy ulega mineralizacji w warunkach beztlenowych. Do ekosystemów beztlenowych, poza wspomnianymi osadami na dnie stojących wód, polami ryżowymi, bagnami i tundrą, można zaliczyć również gleby ze stojącą wodą, składy odpadów, silosy oraz układ pokarmowy zwierząt. Drobnoustroje uczestniczące w procesach beztlenowego rozkładu i wchodzące w skład beztlenowego łańcucha pokarmowego są dobrze zbadane (rozdz. 9.3). Interakcje między poszczególnymi organizmami obejmują symbiozę, syntrofię, międzygatunkowe przekazywanie wodoru i kometabolizm, a ogólny obraz tych zjawisk wydaje się dość dobrze poznany. Wynika to z tego, że w beztlenowych procesach metabolicznych biorą udział prawie wyłącznie bakterie i archeony. Z drugiej strony, główna część biomasy jest rozkładana tlenowo. Proces ten jest przeprowadzany przez organizmy prokariotyczne i eukariotyczne, z tym że dominują w nim te drugie, zarówno pod względem liczby organizmów, jak i ilości przetwarzanej biomasy. Przebieg tlenowego 501

rozkładu jest znacznie bardziej rozgałęziony niż w beztlenowym łańcuchu pokarmowym. Z tego powodu można w tym przypadku mówić nie o łańcuchu pokarmowym, lecz raczej o sieci pokarmowej. Wiele drobnych zwierząt, głównie takich jak robaki, mięczaki, owady i ich larwy, zajmuje znaczną część tej sieci. Z drugiej strony, nie należy zapominać o tym, że drobnoustroje odgrywają dużą rolę w trawieniu pokarmów i substancji odżywczych w układzie pokarmowym zwierząt, by tylko wspomnieć o rozkładzie takich substancji włóknistych, jak lignoceluloza i celuloza, które stanowią ponad połowę biomasy powstającej w wyniku fotosyntezy. Niestety, zarówno procesy, jak i organizmy występujące w jelitach zwierząt są stosunkowo słabo zbadane zarówno pod względem opisowym, jak i biochemii czy dynamiki populacyjnej. Jedynym chlubnym wyjątkiem jest jelito termita. Zwiększenie zainteresowania tlenowym rozkładem pierwotnej biomasy wydaje się zatem sprawą nader pilną.

14.1. Celuloza Celuloza stanowi podstawowy składnik materiału roślinnego i powstaje w większych ilościach niż jakakolwiek inna substancja. Mniej więcej połowa biomasy powstającej w fotosyntezie to celuloza. Resztki roślinne w glebie składają się (przeciętnie) w 45% do 90% (bawełna) z celulozy, która ma zatem — obok dwutlenku węgla — ważne znaczenie w obiegu węgla. Celuloza składa się z łańcuchów utworzonych z jednostek β-D-glukopiranozy połączonych wiązaniem 1,4-glikozydowym. Liczba reszt glukozy tworzących jedną cząsteczkę celulozy waha się od 3 500 u bakterii Acetobacter xylinum, 14 000 u roślin, do 25000 u zielenicy Valonia. Podstawową jednostką tworzącą celulozę nie jest jednak glukoza, lecz disacharyd celobioza. Celuloza ma charakter częściowo krystaliczny, to jest strefy krystaliczne przeplatają się w niej ze strefami amorficznymi. Strefy krystaliczne wykazują zdecydowany pleomorfizm; celuloza I (naturalna celuloza) i celuloza II (bawełna merceryzowana) różnią się ułożeniem łańcuchów glukozy w sieci krystalicznej. Duża wytrzymałość mechaniczna oraz nierozpuszczalność celulozy wynikają, na poziomie molekularnym, z obecności między- i wewnątrzcząsteczkowych mostków wodorowych. Te pierwsze łączą ze sobą pojedyncze łańcuchy. Pojedyncze łańcuchy są stabilizowane przez wewnątrzcząsteczkowe mostki wodorowe (dwa na każdą resztę glukozy). W ten sposób powstaje dwuwymiarowa sieć mostków. Silne związki między poszczególnymi poziomami sieci wynikają z sił Van der Waalsa (celuloza I) lub z mostków wodorowych (celuloza II), co prowadzi do powstania sieci trójwymiarowej.

502

Enzymatyczne rozszczepienie celulozy jest katalizowane przez celulazę. Badania przeprowadzone na grzybach wykazały, że system celulazy składa się z co najmniej trzech enzymów. 1. Endo-β-1,4-glukanazy atakują wiązania β-1,4 wewnątrz cząsteczki, wytwarzając długie łańcuchy o wolnych końcach. 2. Egzo-β-l,4-glukanazy odcinają disacharyd celobiozę od końców łańcuchów celulozy. 3. β-glukozydazy hydrolizują celobiozę do glukozy. Regulacja syntezy celulozy zachodzi albo przez kataboliczną represję, albo w drodze indukcji substratowej przez celobiozę, kiedy w sposób konstytutywny wytwarzana jest celulaza. Stężenia celobiozy powodujące indukcję lub represję różnią się u poszczególnych organizmów. Najogólniej, małe stężenia celobiozy mają aktywność indukującą, a duże hamującą. W dodatku, na poziomie enzymatycznym celobioza może również być kompetetycyjnym inhibitorem. Sama celuloza, będąc nierozpuszczalna w wodzie, nie wpływa bezpośrednio na syntezę i może oddziaływać na nią jedynie pośrednio przez celobiozę powstającą w wyniku degradacji łańcuchów. Tłumaczy to pozorne działanie indukujące krystalicznej celulozy. Degradacja w warunkach tlenowych. W dobrze nawietrzanych glebach celuloza jest rozkładana i wykorzystywana przez drobnoustroje tlenowe

503

(grzyby, miksobakterie i inne bakterie), a w warunkach beztlenowych — przez bakterie, kilka beztlenowych grzybów oraz pierwotniaki (tab. 14.1). Grzyby odgrywają znaczącą rolę w degradacji celulozy w warunkach tlenowych. Przeprowadzają one ten proces skuteczniej niż bakterie w kwaśnych glebach oraz tam, gdzie celuloza jest inkrustowana ligniną (drewno). Wyróżniają się tu gatunki z rodzajów Fusarium i Chaetomium. Inne gatunki celulolityczne to Aspergillus fumigatus i A. nidulans, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Trichoderma viride, Chaetomium globosum i Myrothecium verrucaria. Trzy ostatnie gatunki są używane do wykazywania aktywności celulolitycznej, np. do badania środków impregnacyjnych stosowanych na tkaninach i okrywach w celu zapobiegania szkodom ze strony drobnoustrojów celulolitycznych. Grzyby te wydzielają celulazy, które można wyizolować zarówno z grzybni, jak i podłoża hodowlanego. Cytophaga i Sporocytophaga to bakterie najłatwiejsze do wyizolowania spośród tlenowych bakterii celulolitycznych; osiąga się to stosując hodowle wzbogacające w płynnym podłożu. Niewiele wiadomo o wykorzystywaniu i wstępnej degradacji celulozy przez bakterie śluzowe, gdyż nigdy nie wykazano zewnątrzkomórkowej celulazy ani wstępnych produktów rozszczepienia celulozy. Komórki bakteryjne przytwierdzają się do włókna celulozy tak, że ich oś podłużna jest równoległa do osi włókna. Wydaje się, że hydrolizują celulozę tylko wtedy, gdy są z nią w bezpośrednim kontakcie i natychmiast wchłaniają produkty jej hydrolizy. Oprócz gatunków należących do Cytophaga zdolność wzrostu na celulozie wykazują również bakterie śluzowe wytwarzające ciała owocowe, należące do rodzajów Polyangium, Sorangium i Archangium. Zdolność wzrostu na celulozie jako substracie jest dość częsta u wielu tlenowych bakterii uważanych za „wszystkożerne". Niektóre z nich atakują celulozę jedynie wobec braku innych źródeł węgla. Niektóre bakterie przypominające Pseudomonas niegdyś zebrano w grupę Cellvibrio. Dopiero niedawno opisano gatunek Pseudomonas fluorescens var. cellulosa. Cellulomonas z kolei należałoby zaliczyć do bakterii z grupy maczugowców. Niewiele gatunków celulolitycznych opisano wśród promieniowców, są to: Micromonospora chalcea, Streptomyces cellulosae, S. sporangium. Degradacja w warunkach beztlenowych. W warunkach beztlenowych celulozę rozkładają bakterie mezofilne i termofilne oraz nieliczne grzyby i pierwotniaki. Termofilna bakteria Clostridium thermocellum rośnie na

504

prostym podłożu syntetycznym z celulozą lub celobiozą jako substratem oraz solami amonowymi jako jedynym źródłem azotu. Glukoza oraz wiele innych cukrów nie są przez nią metabolizowane. Degradację celulozy poprzedza wydzielanie żółtawej substancji przypominającej karotenoidy, co zaobserwowano również u innych bakterii celulolitycznych. Zwiększa to powinowactwo enzymu celulolitycznego do celulozy. Żółte zabarwienie celulozy jest dobrym wskaźnikiem rozpoczęcia hydrolizy. W przypadku C. thermocellum opisane powyżej wieloenzymatyczne kompleksy przyjmują postać tzw. celulosomów o masie cząsteczkowej rzędu kilku milionów. Produktami fermentacji celulozy są etanol, octan, mleczan, mrówczan, wodór cząsteczkowy i dwutlenek węgla. Na zewnątrz komórki celuloza prawdopodobnie jest przekształcana do glukozy. Podobne produkty powstają podczas fermentacji celulozy przez mezofilną bakterię Clostridium cellobioparum. Długie laseczki noszące nazwę Bacillus cellulosae-dissolvens, podobnie jak w przypadku Cytophaga, wydają się ściśle przylegać do włókien celulozy i nie wydzielają one celulazy do podłoża. Przekształcanie celulozy w żwaczu. W żwaczu celulozę rozkładają bakterie beztlenowe, grzyby i pierwotniaki. Głównymi źródłami węg-

505

lowodanów dla przeżuwaczy jest siano, słoma i trawa. Około 50% suchej trawy to fruktozany i ksylany, reszta węglowodanów jest w postaci celulozy. Ten ostatni składnik karmy byłby bezużyteczny dla przeżuwaczy, gdyby w trakcie ewolucji nie weszły one w symbiotyczny związek z drobnoustrojami, z których część ma zdolność degradacji celulozy (ryc. 14.2). Pierwsze dwa odcinki żołądka przeżuwacza, żwacz i czepiec, tworzą dużą komorę fermentacyjną o objętości od 100 do 250 litrów. Zapewnia ona idealne warunki do wzrostu licznych drobnoustrojów. Zwierzę zapewnia w tej symbiozie stalą temperaturę od 37°C do 39°C, ciągłą dostawę roztworu mineralnego dobrze zbuforowanego przez dwuwęglan i fosforan (pH 5,8 do 7,3) (około 100-200 litrów śliny na dobę), okresowe dostarczanie substratów odżywczych w postaci dobrze rozdrobnionego pokarmu zawierającego celulozę oraz mechaniczne mieszanie na skutek ruchów żwacza. Żwacz przypomina zatem system hodowli półciągłej.

Wśród drobnoustrojów w żwaczu dominują pierwotniaki i bakterie. W 1 ml treści żwacza znajduje się około 105 pierwotniaków, przede wszystkim orzęsków należących do rodzajów Diplodinium i Entodinium. Są one wysoce wyspecjalizowane i rzadko występują poza żwaczem. Stanowią one od 6 do 10% masy zawartości żwacza, a do części tej masy przyczyniają się wielocukry będące materiałami zapasowymi. Ich rola w żwaczu nie wydaje się niezbędna do życia organizmu gospodarza. Z punktu widzenia funkcji, najważniejszymi mieszkańcami żwacza są 11 bakterie. W 1 ml soku żwacza występuje do 10 komórek stanowiących 5 do 10% suchej masy jego zawartości. Bakterie swoiste dla żwacza są ścisłymi beztlenowcami. Bakterie przeprowadzają polimeryczne węglowodany w pokarmie do takich prostych związków, jak kwasy tłuszczowe i alkohole. Celuloza, skrobia, fruktozan i ksylan są katabolizowane przede wszystkim do kwasów tłuszczowych. Około 90% pobranej celulozy ulega rozkładowi. Powstają duże ilości kwasów — przede wszystkim octowy jako główny produkt (50-70%), propionowy 17-21%), masłowy (14-20%) oraz mniejsze ilości kwasu walerianowego i mrówkowego. Równocześnie dziennie powstaje około 900 1 gazu, który składa się w 65% z dwutlenku węgla, 27% metanu, 7% azotu, 0,18% wodoru oraz śladowych ilości siarkowodoru. Ponieważ bakterie celulolityczne, wyizolowane w ostatnich latach z treści żwacza, w warunkach laboratoryjnych wytwarzają te same kwasy w zbliżonych proporcjach, można sądzić, że kwasy powstające w żwaczu pochodzą z degradacji celulozy. Do organizmów rozkładających

506

celulozę w żwaczu należą: gramujemne ziarniaki Ruminococcus albus i R. flavefaciens, gramujemna, nieruchliwa pałeczka Fibrobacter succinogenes, która wytwarza głównie octan i bursztynian, Butyrivibrio fibrisolvens oraz Clostridium cellobioparum. Brak mleczanu w żwaczu jest przypisywany obecności Veilonella alcalescens (Micrococcus lactilyticus), która fermentuje mleczan do octanu, propionianu i dwutlenku węgla. Powstający w trakcie degradacji celulozy metan tworzy się z kwasów tłuszczowych oraz z wodoru cząsteczkowego i dwutlenku węgla (rozdz. 9.4). Siarkowodór w żwaczu powstaje na skutek redukcji siarczanu przez Desulfotomaculum ruminis. Selenomonas ruminantium (ryc. 2. 37B) fermentuje glukozę do mleczanu, octanu i propionianu. Spośród beztlenowych grzybów obecnych w żwaczu najlepiej jest zbadany Neocallimastix frontalis (Chytridriomycetes). Rozkłada on celulozę do glukozy, a następnie fermentuje glukozę do octanu, mrówczanu, etanolu, mleczanu, CO2 i H2. Pokarm przeżuwaczy w ich naturalnym środowisku na sawannach i stepach jest bardzo ubogi w azot i białko. Aby zapewnić syntezę białka przez organizmy symbiotyczne w żwaczu, przeżuwacze wykształciły odpowiedni cykl, tzw. żwaczowo-wątrobowy. Mocznik powstający w wątrobie, w celu uniknięcia zatrucia amoniakiem, tylko częściowo jest usuwany z moczem; część poprzez ścianę żwacza oraz z wydzielinami gruczołów śliniankowych trafia do przedżołądków, stając się tym samym dostępna dla syntezy białka przez mikroflorę żwacza (ryc. 14.2). Symbioza z drobnoustrojami zamieszkującymi żwacz czyni zwierzę niezależnym od źródła białka. Wielokrotnie powtarzane doświadczenia wykazały, że krowy mogą odżywiać się pokarmem bezbiałkowym.

Bakterie dwojako pomagają przeżuwaczom w procesach odżywiania: kwasy wytwarzane w trakcie katabolicznych przemian węglowodanów są w żwaczu resorbowane, a masa bakteryjna, przesuwająca się wraz z zawartością żwacza, jest trawiona w jelicie i wchłaniana. Bakterie ulegają lizie na skutek aktywności enzymu zwanego lizozymem, który jest wydzielany przez nabłonek żołądka. Ponieważ bakterie rosnące w żwaczu wykorzystują azot nieorganiczny, zapewniają one zwierzęciu znaczny poziom białka. Twardnienie tłuszczy. Roślinne kwasy tłuszczowe różnią się od tłuszczów zwierzęcych niskim stopniem nasycenia; zawierają one kwas olejowy, oleinowy, linolowy, linoleinowy i arachidowy oraz mają rzadszą konsystencję (niższy punkt topnienia). U zwierząt nie mających żwacza (świnie, gryzonie, gęsi) kwasy tłuszczowe pochodzenia roślinnego są pobierane

507

w jelitach i nie ulegając zmianie są wykorzystywane w tworzeniu tkanki tłuszczowej. Tłuszcz tych zwierząt ma zatem rzadką konsystencję. U przeżuwaczy roślinne kwasy tłuszczowe w żwaczu na skutek aktywności bakterii ulegają silnemu uwodorowaniu (nasyceniu), po czym kwasy nasycone są absorbowane z jelita i wbudowywane do tkanki tłuszczowej. Tłuszcz tych zwierząt (masło, łój) ma gęściejszą konsystencję. Ponieważ opisane przemiany przeprowadzają bakterie oraz biorąc pod uwagę, że 60 do 90% białka w mięsie wołowym jest również pochodzenia bakteryjnego, to zjedzenie befsztyka w ostatecznym rozrachunku odbywa się kosztem bakterii, a skonsumowanie kotleta schabowego kosztem roślin stanowiących karmę.

14.2. Ksylan Ksylan jest po celulozie drugim, pod względem ilości i powszechności występowania, węglowodanem w przyrodzie. Słoma i kora w 30% składają się z ksylanu; drewno drzew iglastych zawiera 7-12% ksylanu, a drzew liściastych 20-25%. Ksylan należy do grupy węglowodanów zwanych hemicelulozami. Pod względem struktury i podstawowych jednostek budulcowych różnią się one od celulozy. Są one jednak, przynajmniej częściowo, rozpuszczalne w wodzie lub ługach. Hemicelulozy są zbudowane z pentoz (ksyloza, arabinoza) lub heksoz (glukoza, mannoza, galaktoza) oraz z kwasów uronowych. U roślin pełnią one funkcje materiałów zapasowych oraz podporowych. Termin hemiceluloza obecnie wychodzi z użycia, gdyż dużą liczbę podobnych wielocukrów wykryto u grzybów i bakterii.

508

Łańcuch ksylanu składa się z cząsteczek β-D-ksylozy połączonych ze sobą wiązaniami 1,4-glikozydowymi. Można go przyrównać do celulozy, w której grupy CH2-OH zastąpiono wodorem, lecz charakteryzuje się mniejszym stopniem polimeryzacji (od 30 do 100 jednostek). Niektóre ksylany zawierają również arabinozę, glukozę, galaktozę i glukuronian. Mają zatem złożoną strukturę i w przeciwieństwie do celulozy są silnie rozgałęzione.

Wiele drobnoustrojów szybciej rozkłada ksylan niż celulozę. Liczne organizmy celulolityczne wytwarzają również ksylanazę. Nawet Sporocytophaga myxococcoides, która atakuje celulozę jedynie wtedy, gdy bezpośrednio styka się z jej włóknami, oraz Neocallimastix, wydzielają ksylanazę. To, które organizmy najpierw rozpoczną degradację ksylanu, zależy od czynników środowiskowych. W glebach kwaśnych dominują grzyby, a w alkalicznych i neutralnych dominują takie bakterie jak Sporocytophaga. Zdolność do wykorzystywania ksylanu jest bardzo powszechna wśród grzybów. Jest on doskonałym podłożem do hodowli pieczarek. Niektóre bakterie (Clostridium) wytwarzają ksylanazę w sposób konstytutywny, podczas gdy u innych enzym ten jest indukowany przez ksylan. Działanie wolnej ksylanazy powoduje powstanie ksylozy, ksylobiozy oraz związków o dłuższych łańcuchach. Enzym najprawdopodobniej atakuje cząsteczkę równocześnie w kilku miejscach.

14.3. Skrobia i inne glukany Skrobia jest głównym materiałem zapasowym roślin. Zwykle występuje w postaci kulistych, soczewkowatych lub jajowatych granul o wyraźnie warstwowej budowie. Skrobia roślinna składa się z glukanów — amylozy (15 do 27%) oraz amylopektyny. Amyloza jest rozpuszczalna bez pęcznienienia w gorącej wodzie i jest odpowiedzialna za typowe niebieskie zabarwienie w reakcji z jodyną. Zbudowana jest z helikalnie ułożonych, nierozgałęzionych łańcuchów reszt D-glukozy połączonych 1,4-α-glikozydowo. W jednym łańcuchu występuje 200-500 jednostek. Amylopektyna pęcznieje w wodzie, a przy podgrzewaniu tworzy klej skrobiowy. W reakcji z jodyną daje zabarwienie od purpurowego do brązowego. Również jest poli-l,4-α-D-glukozą, lecz, tak jak glikogen, ma rozgałęzienia w pozycjach 1,6 przy mniej więcej co 25 reszcie glukozy. Oprócz tego zawiera reszty fosforanowe, jak również jony wapnia i magnezu. Skrobia z różnych 509

źródeł różni się rodzajem rozgałęzień, liczbą jednostek w łańcuchu oraz właściwościami. Skrobię można przeprowadzić do glukozy w drodze kwaśnej hydrolizy lub enzymatycznie. Występują trzy rodzaje enzymatycznej degradacji glukanów: 1) fosforoliza, 2) hydroliza, 3) transglikozylacja. Fosforoliza. Przekształcenie skrobi, glikogenu i podobnych wielocukrów do glukozo-1-fosforanu jest katalizowane przez α-l,4-glukanofosforylazę (fosforylazy). Chociaż reakcja jest odwracalna, przebiega ona wewnątrzkomórkowo jedynie w katabolizmie wielocukrów i nie ma znaczenia dla syntez. Fosforylacja rozpoczyna się od wolnego nieredukującego końca łańcucha amylozy, z uwolnieniem kolejnych reszt glukozo-1-fosforanu. W przypadku amylopektyny fosforoliza zatrzymuje się przy rozgałęzieniach w pozycji 1,6 i postępuje dalej dopiero po rozszczepieniu tych ostatnich przez amylo-l,6,-glukozydazę. Fosforylazy odgrywają ważną rolę w aktywowaniu i wykorzystywaniu wewnątrzkomórkowych wielocukrów zapasowych (glukanów).

Hydroliza. Wielocukry wewnątrz komórki są rozszczepianie hydrolitycznie przez amylazy. α-Amylaza występuje u roślin, zwierząt i drobnoustrojów. Szybko upłynnia ona skrobię, równocześnie atakując wiele wiązań 1,4-glikozydowych, łącznie z wiązaniami w środku łańcucha (jest zatem nazywana również endoamylazą). Uwalnia ona maltozę, glukozę oraz oligomery zawierające od 3 do 7 reszt glukozy. Z powodu szybkiej degradacji struktury makrocząsteczkowej lepkość roztworu oraz jego zdolność wchodzenia w reakcję z jodyną również szybko maleją, z równoczesnym stopniowym pojawieniem się cukrów ulegających fermentacji (glukoza, maltoza, maltotrioza). W obecności enzymów odcinających rozgałęzienia, jak pullulanaza lub izoamylaza, zachodzi również degradacja dekstryn (ryc. 14.3). 510

β-amylazy występują przede wszystkim w roślinach (np. w jęczmieniu, pszenicy), lecz również w bakteriach. W przeciwieństwie do α-amylazy, przejawiają aktywność od wolnych nieredukujących końców makrocząsteczki. Ich działanie na skrobię prowadzi do szybkiej akumulacji cukrów z zachowaniem zdolności reagowania z jodem. Hydroliza zatrzymuje się w miejscach rozgałęzień, a pozostające reszty noszą nazwę granicznej β-dekstryny. Gdy miejsca rozgałęzień ulegną enzymatycznemu rozszczepieniu, następuje całkowite przekształcenie substratu do maltozy, która z kolei na zewnątrz komórki może być rozkładana przez maltazę. W obecności odpowiednich permeaz maltoza i inne oligomery są transportowane do wnętrza komórki i tam rozszczepiane fosforolitycznie.

Transglikozylacja. Schardinger odkrył w podłożach zawierających skrobię, w których hodowano Bacillus macerans, pewne związki o charakterze krystalicznym. Składają się one z pierścieniowo zamkniętych łańcuchów reszt glukozy połączonych wiązaniami α-l,4-glikozydowymi. Pierścienie tych α-, β- lub y-cyklodekstryn składają się z sześciu, siedmiu lub ośmiu reszt glukozy i powstają ze skrobi w wyniku działania transglikozylaz. Zarówno grzyby, jak i bakterie wytwarzają α-amylazy. Zdolność rozkładania skrobi przez zewnątrzkomórkowe enzymy amylolityczne jest wśród drobnoustrojów szeroko rozpowszechniona; trudno mówić o mikroflorze swoiście degradującej skrobię. Wiele grzybów glebowych wytwarza

511

duże ilości amylaz, a preparaty tych enzymów są produkowane na skalę przemysłową z wykorzystaniem Aspergillus oryzae, A. niger i A. wentii. Na przykład, Taka-amylaza i Taka-diastaza to przemysłowe, nie oczyszczone preparaty otrzymywane z hodowli A. oryzae, które hydrolizują skrobię do glukozy. Wśród bakterii do aktywnych producentów a-amylaz można zaliczyć niektóre gatunki z rodzaju Bacillus {Bacillus macerans, B. polymyxa, B. subtilis), kilku przedstawicieli rodzaju Pseudomonas oraz niektóre promieniowce. Enzymy wytwarzane przez B. stearothermophilus i B. licheniformis można przez krótki czas ogrzewać w 100°C bez utraty przez nie aktywności. Niektóre termofilne gatunki Clostridium, jak Clostridium thermosulfurogenes i C. thermohydrosulfuricum, również wydzielają ciepłostałe α-amylazy i pullulanazy. Ponieważ drożdże produkujące alkohol nie wydzielają α-amylaz, skrobia rozkładana jest do cukru przez dodatek amylaz zawartych w słodzie lub uzyskanych z Aspergillus oryzae. W warunkach beztlenowych, w glebach nasyconych wodą i świeżo wzbogaconych węglowodanami, skrobia jest rozkładana przede wszystkim przez sacharolityczne bakterie z rodzaju Clostridium. Ponieważ bakterie te wiążą azot cząsteczkowy, beztlenowy rozkład bogatego w wielocukry materiału roślinnego może prowadzić w glebie do nagromadzenia dużych ilości azotu. Inne glukany. Bakterie i grzyby zawierają wiele różnych glukanów, z których jedne mają funkcje strukturalne, a inne pełnią rolę materiałów zapasowych. Należą do nich między innymi liczne śluzy wydzielane przez drobnoustroje. Do najlepiej znanych należy dekstran. Jest on wytwarzany w dużych ilościach w podłożach zawierających sacharozę przez egzoenzym wydzielany np. przez Leuconostoc mesenteroides lub L. dextranicum (rozdz. 2.2.5). W szkielecie ściany komórkowej drożdży znajduje się β-1,6-glukan. Dokładna budowa tego nierozpuszczalnego polimeru, usieciowanego krótkimi odcinkami jednostek połączonych wiązaniami β-1,3, nie jest znana. Ściany komórkowe drożdży, jak wiele innych glukanów, są rozkładane przez soki trawienne ślimaków. Soki te zawierają mieszaninę ponad 30 enzymów, m.in. celulazę, mannazę, glukanazę, chitynazę i lipazę. Są one przydatne w otrzymywaniu protoplastów z komórek drożdży i innych grzybów, jak również z glonów.

Grzyb Aureobasidium (Pullularia) pullulans podczas wzrostu na podłożu zawierającym glukozę lub sacharozę wydziela pullulan. Glukan 512

ten składa się z jednostek maltotriozy połączonych wiązaniem 1,6-α-glikozydowym (poli-α-l,6-maltotrioza). Pullulan jest rozkładany przez pullulanazę.

14.4. Fruktany Rośliny z niektórych rodzin jako materiał zapasowy odkładają, oprócz skrobi (glukan), również fruktany (zwane też polifruktozanami). Podczas gdy inulina, fruktan wytwarzany przez rośliny złożone (bulwy dalii), pod względem ilościowym ma niewielkie znaczenie, fruktany typu flein warte są dalszych badań. W trawach pastwiskowych stanowią one od 12 do 15% suchej masy. Enzymy rozkładające te związki są wytwarzane przez Aspergillus niger oraz bakterie i wydają się szeroko rozpowszechnione. Fruktany (zwane również lewanami) występują też jako egzopolisacharydy (rozdz. 10.7) produkowane przez wiele bakterii w obecności sacharozy w podłożu. Proces powstawania lewanu jest analogiczny do syntezy dekstranu i jest katalizowany przez zewnątrzkomórkową sacharazę lewanową. η sacharoza -» lewan + η glukoza Enzymatyczna synteza lewanu ujawnia się w postaci małych kropelek lewanu w pobliżu kolonii rosnących na podłożu zawierającym sacharozę. Łatwo można zaobserwować je u szczepów Bacillus subtilis, B. cereus, Azotobacter chroococcum, wielu przedstawicieli fluoryzujących i fitopatogennych bakterii z rodzaju Pseudomonas oraz szczepów Enterobacter. Niektóre szczepy wykorzystują syntetyzowany przez siebie lewan, hydrolizując go, gdy w podłożu braknie sacharozy.

14.5. Mannan Mannan występuje w drewnie niektórych rodzajów roślin iglastych, gdzie stanowi do 11% suchej masy. W komórkach drożdży znajduje się on w postaci rozpuszczalnego wielocukru, który można ekstrahować wodnym roztworem ługu lub przez autoklawowanie Drożdże z gatunku Hansenula holstii podczas wzrostu w obecności glukozy wydzielają rozpuszczalny mannan w 20% zestryfikowany kwasem fosforowym.

513

14.6. Pektyny Pektyny występują w przestrzeniach międzykomórkowych w tkankach młodych roślin. Szczególnie są w nie bogate jagody i inne owoce. Nie mają one znaczenia ilościowego, lecz pełnią ważną rolę w stabilności rośliny. Są one składnikami blaszki środkowej występującej między ścianami komórkowymi sąsiadujących komórek. Pektyny są poligalakturonidami. Zbudowane są z nierozgałęzionych łańcuchów kwasu D-galakturonowego połączonego wiązaniami α-l,4-glikozydowymi. Grupy karboksylowe są całkowicie lub częściowo podstawione metanolem. Nierozpuszczalne pektyny są w dużym stopniu usieciowane. W degradacji pektyn przez drobnoustroje biorą udział enzymy pektynolityczne (esterazy i depolimerazy). Esterazy rozszczepiają wiązanie metyloestrowe, uwalniając metanol. Pozostające kwasy poligalakturonowe są hydrolizowane przez poligalakturonazy, z uwolnieniem monomerów i oligomerów kwasu D-galakturonowego. Te ostatnie, w postaci soli wapniowych, wykorzystuje się jako czynniki zestalające w przetworach owocowych.

Wiele spośród bakterii i grzybów może trawić pektyny. Patogenność niektórych drobnoustrojów wobec roślin (Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, F. lycopersici) opiera się na ich zdolności wydzielania enzymów rozpuszczających pektyny. Erwinia carotovora powoduje rozkład tkanek sałaty, marchwi, selera i innych roślin. Liczba organizmów glebowych zdolnych do degradacji pektyn jest ogromna (105 komórek/g gleby). Organizmy wytwarzające spory, jak Bacillus macerans i B. polymyxa, należą do najaktywniejszych. Pektyny rozkłada również wiele gatunków z rodzaju Pseudomonas (np. Pseudomonas fluorescens), bakterie żwacza, promieniowce, termofilne klostridia oraz bakterie mlekowe. Wśród grzybów należy wymienić Aspergillus niger, Penicillium italicum, Aureobasidium pullulans, Fusarium i Rhizoctonia solani. Organizmy degradujące pektyny mają duże znaczenie w roszeniu lnu i konopi. Proces ten polega na uwolnieniu wiązek włókien celulozowych od pozostałych tkanek roślinnych. Proces tlenowy przebiega przy udziale drożdży, a w procesie beztlenowym uczestniczą przede wszystkim bakterie. Do najważniejszych bakterii produkujących pektynazy należą Clostridium pectinovorum i C. felsineum. Do celów technicznych, np. do klarowania soków owocowych i wina, stosuje się głównie grzyby hodowane na podłożach zawierających pektyny.

514

14.7. Agar Agar jest mieszaniną agarozy i agaropektyny. Główny wielocukier składa się z D-galaktozy i 3,6-anhydrogalaktozy połączonych na przemian wiązaniami β-1,4 i β-1,3· Budowa agaropektyny jest bardziej złożona, gdyż zawiera ona D-galaktozę, 3,6-anhydrogalaktozę, kwasy uronowe odpowiadające tym cukrom oraz reszty siarczanowe. Większość krasnorostów zawiera agar, a przemysłowo otrzymuje się go z gatunków należących do rodzaju Gelidium.

Tylko nieliczne drobnoustroje rozkładają agar. Nieliczne gatunki hydrolizujące agar wyizolowano z wody morskiej i wodorostów. O rozkładaniu agaru świadczy zapadanie się kolonii na podłożu zestalonym tym związkiem (ryc. 14.4). Bakterie degradujące agar występują przede wszystkim w biotopach morskich. W strefie pływów występuje do 107 organizmów rozkładających agar w 1 g namułu, co stanowi około 2-4·% bakterii tlenowych występujących w tym środowisku. Bakterie rozkładające agar należą do rodzajów Cytophaga, Flavobacterium, Bacillus, Pseudomonas i Alcaligenes.

515

14.8. Chityna Chityna uważana jest za drugi po celulozie najpowszechniej występujący wielocukier na naszej planecie. Formalnie, chitynę można wyprowadzić z celulozy podstawiając grupę hydroksy przy drugim atomie węgla glukozy acetylowaną grupą aminową (rozdz. 2.2.4). Stabilność chityny wynika z wiązań wodorowych między N-acetylowymi grupami bocznymi. Chityna jest materiałem podtrzymującym w świecie zwierzęcym, gdzie tworzy szkielet zewnętrzny wielu bezkręgowców. W sposób ciągły jest syntetyzowana również w glebie przez grzyby, gdyż jest głównym składnikiem wielu workowców i podstawczaków.

Nic więc dziwnego, że bardzo wiele bakterii wodnych i glebowych wykorzystuje chitynę. Wśród 50 bakterii rozkładających chitynę, wyizolowanych z gleby uprawnej, znajdują się następujące rodzaje: Flavobacterium, Bacillus, Cytophaga, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia i Micromonospora. Do grzybów degradujących chitynę należą gatunki Aspergillus, Mucor i Mortierella. W jednym gramie gleby ornej znajduje się do 106 organizmów zdolnych do rozkładu chityny. Tak duża liczba tych drobnoustrojów w glebie świadczy o tym, że Chityna może być zawsze dostępnym substratem. Dodatek drobno sproszkowanej chityny do gleby powoduje przyśpieszony wzrost promieniowców. Dodatek do podłoża chityny jako jedynego źródła węgla i azotu tworzy zatem warunki do selekcji tych organizmów. W warunkach tlenowych Chityna jest rozkładana przez pewne wyspecjalizowane, bezwzględnie beztlenowe bakterie chitynolityczne. Warto byłoby poszerzyć wiadomości na temat degradacji chityny w układzie pokarmowym zwierząt morskich żywiących się krewetkami i krabami, jak również chityny w osadach. Chityna jest również rozkładana przez enzymy pozakomórkowe pochodzące z drobnoustrojów. Enzymy wydzielane przez Streptomyces griseus rozdzielono na chitynazę i chitobiazę. Degradacja chityny najprawdopodobniej polega na równoczesnym ataku chitynazy w wielu miejscach polimeru, co prowadzi do powstania małych ilości N-acetyloglukozoaminy oraz przede wszystkim chitobiozy i chitotriozy. Chitobiaza przeprowadza te ostatnie do monomerów. Drobnoustroje, np. Absidia coerula, rozkładają chitynę do chitozanu. Związek ten jest poliglukozoaminą i łatwo powstaje w drodze deacetylacji chityny. W dużych ilościach jest otrzymywany metodami biotechnologicznymi i znajduje zastosowanie jako klej, środek opatrunkowy, chelator oraz dodatek do gleby i pokarmu zwierzęcego.

516

14.9. Lignina Pod względem ilości lignina, po celulozie i hemicelulozie, jest najważniejszym składnikiem roślin. Zawartość ligniny w tkance drzewnej wynosi od 18 do 30% suchej masy. Lignina stanowi inkrustację tkanki roślinnej i znajduje się we wtórnych lamellach ściany komórkowej. Kompleks celulozy i ligniny zwany jest lignocelulozą. Lignina jest najwolniej degradowalnym składnikiem roślin. Stanowi zatem główne źródło wolno rozkładanych substancji organicznych w glebie, szczególnie kwasów huminowych. Pod względem chemicznym lignina nie jest jednorodna, lecz jest bardzo złożonym związkiem (ryc. 14.5). Złożoność ta nie wynika z dużej liczby różnych monomerów, ponieważ podstawowe jednostki są pochodnymi fenylopropanowymi, przede wszystkim alkoholu koniferylowego. Jest ona natomiast spowodowana dużą liczbą rozmaitych wiązań łączących ze sobą poszczególne monomery. Nieregularna struktura ligniny jest zgodna

517

z założeniem, że proces enzymatycznej syntezy ligniny ogranicza się do tworzenia rodników alkoholu koniferylowego. Rodniki te następnie łączą się spontanicznie ze sobą, a charakter i możliwości tych połączeń zależą od mezomerycznego stanu poszczególnych rodników.

Wyizolowano szereg dimerów i oligomerów alkoholu koniferylowego będących produktami pośrednimi w syntezie ligniny (ryc. 14.6). Podczas gdy lignina świerka złożona jest głównie z alkoholu koniferylowego, lignina drzew liściastych zawiera alkohol koniferylowy i alkohol sinapylowy. Z kolei ligina przedstawicieli Gramineae składa się z alkoholu kumarylowego. Różnice w składzie ligniny wyrażają się głównie zawartością grup metoksylowych: 20,5-21% w ligninie drewna drzew liściastych, 15-16% w przypadku świerka i 14-15% u przedstawicieli Gramineae. Fenylopropanowe jednostki budulcowe w ligninie są silnie usieciowane wiązaniami eterowymi i C—C (ryc. 14.5). Wiązania te są niezwykle oporne na działanie enzymów. U roślin lignina jest nieczynnym produktem końcowym metabolizmu; nie jest ona ponownie wykorzystywana w procesach metabolicznych i pełni jedynie funkcje strukturalne. Rozkładana jest wyłącznie przez drobnoustroje. W porównaniu z celulozą lub hemicelulozą rozkład ten zachodzi nadzwyczaj wolno. Proces degradacji ligniny przeprowadzają grzyby niszczące drewno, jak również bakterie i grzyby glebowe.

518

Rozkład ligniny. Niektóre grzyby rozkładają ligninę nawet w żywej roślinie. Wśród postawczaków niszczących drewno można wyróżnić dwie grupy. Pierwsza to grzyby, które wywołują brunatną zgniliznę zamieniając drewno w brunatonoczerwoną masę; degradują one przede wszystkim celulozowe i hemicelulozowe składniki drewna, pozostawiając nietknięte polimery fenylopropanowe. Druga grupa to grzyby powodujące białą zgniliznę drewna zmieniając je w białą masę. Atakują one głównie ligninę i przez dłuższy czas pozostawiają nietkniętą celulozę. Do grzybów atakujących przede wszystkim ligninę należą: Polystictus versicolor, Stereum hirsutum i Phanerochaete chrysosporium. Inne grzyby atakują równocześnie ligninę i celulozę (Pleurotus ostreatus, Ganoderma applanatum, Polyporus adustus, Armillaria mellea). Rozkład drewna przez czyste kultury grzybów postępuje tak wolno, że eksperymenty tego typu trwają miesiącami, a nawet latami. Stosując różne metody można wykazać rozkład ligniny przez przedstawicieli następujących rodzajów: Pholiota, Clitocybe, Lenzites, Panus, Poria i Trametes). Jednym z najaktywniejszych grzybów powodujących białą zgniliznę drewna, wykorzystywanym obecnie jako organizm modelowy w badaniach nad rozkładem ligniny przez grzyby, jest Phanerochaete chrysosporium. Rozkłada on ligninę wyłącznie w obecności tlenu i glukozy. W warunkach beztlenowych degradacja ligniny nie zachodzi. Lignina jest rozkładana przez kompleks enzymatyczny zwany niegdyś ligninazą. Na kompleks ten składają się dobrze zbadane peroksydazy, w tym dwie peroksydazy hemowe; peroksydaza ligninowa i peroksydaza zależna od manganu. Peroksydazy, aby były aktywne, wymagają H2O2 i katalizują oksydatywne rozszczepienie eterowych wiązań β-Ο-4 oraz wiązań C—C w ligninie. Nadtlenek wodoru prawdopodobnie pochodzi z utlenienia glukozy (pochodzącej z celulozy) przez oksydazę glukozową. Tworzeniu peroksydaz sprzyja ograniczenie azotu. Ten sposób regulacji syntezy peroksydazy sprzyja hipotezie, że rozkład ligniny nie ma celu uzyskiwania energii do metabolizmu, lecz jest ukierunkowany na uzyskiwanie składników drewna zawierających azot, które inaczej byłyby niedostępne. Badania nad wyizolowanymi peroksydazami wykazały, że proces degradacji rozpoczyna przeniesienie pojedynczego elektronu. Elektron ten tworzy względnie trwałe aromatyczne rodniki kationowe w szkielecie ligniny. Te z kolei mają charakter jednoelektronowych utleniaczy aktywnych w pewnej odległości od enzymu. Rodniki te powodują rozszczepienie 519

wiązań C—C oraz wiązań eterowych i rozpad szkieletu ligniny do niskocząsteczkowych związków fenolowych, które z kolei są utleniane przez oksydazy fenolowe. Zjawisko powstawania rodników pośrednich w trakcie działania oksydaz jest dobrze znane. Biorąc pod uwagę dużą liczbę związków fenolowych powstających podczas degradacji kompleksu ligniny, wątpliwe jest, by jej mechanizm był kiedykolwiek wyjaśniony do końca. Warto jednak prowadzić dalsze badania nad pośrednim powstawaniem rodników pełniących rolę w przenoszeniu elektronów katalizowanym przez oksygenazy. Nie ulega wątpliwości, że ligninę rozkładają nie tylko grzyby, lecz również bakterie. Rozkład ten jest jednak tak wolny, że nie ma on większego znaczenia w porównaniu z innymi procesami metabolicznymi. Ciągle poszukuje się drobnoustrojów degradujących ligninę lub przekształcających ją w sposób pozwalający na jej dalsze utlenienie przez inne mikroorganizmy.

14.10. Powstawanie humusu Rozkład większości martwych szczątków roślinnych i zwierzęcych zachodzi w glebie (ryc. 14.7). Łatwiej degradowalne substancje ulegają szybszemu i całkowitemu utlenieniu. Związki mniej podatne na degradację przez drobnoustroje długo pozostają w ziemi jako jej składniki organiczne. Organiczne składniki gleby to niecałkowicie rozłożone szczątki roślinne oraz humus. Nazwa humus odnosi się do bezpostaciowych, zazwyczaj ciemno zabarwionych substancji organicznych w glebie. Składają się na nie substancje rozkładane z trudnością przez drobnoustroje, głównie lignina, lecz również tłuszcze, woski, węglowodany i składniki białkowe. Są one przetworzone do trudnych do zdefiniowania polimerów. W tworzeniu humusu uczestniczą nie tylko bakterie i grzyby, lecz również pierwotniaki i robaki. Przekształceniu substancji roślinnych w humus towarzyszy wzbogacenie w azot. Podczas gdy stosunek węgla do azotu w szczątkach roślinnych jest około 40:1, to w humusie stosunek ten wynosi około 10:1. Duża część azotu znajduje się w związkach organicznych i w tej postaci nie jest dostępna dla roślin. Lignina jest szczególnie bogatym źródłem lignoprotein i heterocyklicznie związanego azotu. Humus znajduje się w ciągłym stanie równowagi — powstaje on cały czas, a równocześnie jego część

520

ulega całkowitemu utlenieniu. Zawartość humusu w glebie jest największa w warunkach sprzyjających jego powstaniu, niekorzystnych zaś dla jego degradacji. Przykładowo, niska zawartość humusu w glebach tropikalnych jest spowodowana szybkim rozkładem substancji organicznych przez małe organizmy, którym sprzyja tropikalny klimat. Czarna gleba stepów i prerii powstaje w rejonach, w których panują długie, chłodne zimy oraz suche lato. Ilość powstającego humusu zależy nie tylko od czynników klimatycznych i gleby, ale i od charakteru materiału roślinnego. Słoma z roślin zbożowych i roślin rosnących na prerii daje łatwo rozkładamy humus, podczas gdy humus powstający z drewna drzew leśnych, szczególnie z opadłych igieł drzew iglastych, jest bardzo oporny na degradację. W trakcie tworzenia humusu uwalnia się dużo grup karboksylowych. Jakość humusu oraz szybkość jego degradacji przez drobnoustroje zależy zatem od obecności lub braku kationów. W glebach ubogich w minerały oraz związki zasadowe (bielice, kwaśne gleby torfowe, lasy iglaste) gromadzą się brunatne kwasy huminowe. Przy dostatecznej ilości minerałów zasadowych tworzą się nasycone zasadami koloidy humusowe stanowiące tzw. kompleks sorpcyjny gleby. Organiczna część tego kompleksu spełnia rolę wielkocząsteczkowego naturalnego wymieniacza jonowego, utrzymującego równowagę korzystną dla organizmów glebowych, zwłaszcza dla roślin i drobnoustrojów. Wytwarzanie zasadowego humusu powoduje w następstwie intensywny rozwój organizmów glebowych. Strzępki grzybów i substancje śluzowe zespalają cząstki gleby, prowadząc do wytworzenia pożądanej gruzełkowatej jej struktury.

521

Podczas gdy silnie zmineralizowana gleba jest uboga w drobnoustroje, gleba bogata w humus zawiera mikroflorę składającą się z bardzo wielu gatunków. Mikroflora ta, która rozwija się bez dodatku substancji odżywczych do gleby, zwana jest autochtoniczną, w przeciwieństwie do drobnoustrojów zymogennych, które dominują po wprowadzeniu organicznych substancji odżywczych. Stabilizujący wpływ frakcji humusowej na dynamikę gleby wynika również z utrzymywania się złożonej mikroflory.

14.11. Węglowodory Nawet tak stabilne chemicznie substancje, jak parafiny, ropa naftowa i kauczuk są rozkładane przez drobnoustroje. Znaczną ich degradację ogranicza jedynie brak tlenu, jak w złożach ropy naftowej lub w żyłach węgla. Odpowiedź na pytania, czy ropa naftowa, która trafiła do wody lub gleby, jest utleniana biologicznie, czy istnieje mikroflora swoiście wykorzystująca węglowodory, czy obecność pewnej liczby drobnoustrojów utleniających węglowodory może wskazywać na istnienie złóż ropy naftowej lub gazu ziemnego, ma ogromne znaczenie praktyczne. Bakterie wykorzystujące węglowodory są szeroko rozpowszechnione. Można je wyizolować ze wszystkich gleb uprawnych, pastewnych i leśnych. Ponadto, zdolność wykorzystywania ropy naftowej jako źródła energii nie jest ograniczona do kilku wyspecjalizowanych drobnoustrojów; stwierdza się ją u wielu gatunków bakterii i grzybów. Obserwacje te są zgodne z nowymi danymi dotyczącymi składu bakterii, roślin i zwierząt. Węglowodory są obecne w wielu organizmach i w sposób ciągły są syntetyzowane przez bakterie i rośliny; należą do nich np. woskowate substancje pokrywające liście wielu roślin. Węglowodory należy zatem uważać nie za skamieniałe relikty pierwotnej produkcji roślinnej z czasów prehistorycznych, lecz również za wtórne metabolity nadal syntetyzowane w znacznych ilościach przez rośliny zielone.

Degradacja węglowodorów zwykle wymaga obecności tlenu. Dotyczy to zarówno węglowodorów alifatycznych — od gazowego metanu, poprzez etan i propan do stałych parafin, jak i węglowodorów aromatycznych — od benzenu i naftolu do antracenu i związków policyklicznych. Wszystkie wymienione substancje po wstępnych reakcjach utlenienia wchodzą w główne szlaki metaboliczne. Reakcje te polegają na wbudowaniu cząsteczki tlenu do związku organicznego. Etap ten zwany jest oksygenacją, a enzymy przeprowadzające go — oksygenazami. Kiedy

522

enzym wprowadza tylko jeden atom tlenu, zwany jest monooksygenazą, a gdy dwa atomy tlenu — dioksygenazą. Enzymy te zdecydowanie różnią się od oksydaz katalizujących przeniesienie atomów wodoru od donora do tlenu z jego redukcją do wody, gdyż nie wbudowują one nigdy tlenu do cząsteczek organicznych ani do materiału komórkowego.

14.11.1. Metan Metan wyróżnia się wśród wszystkich węglowodorów. Jest on wykorzystywany i utleniany przez bakterie, które nie degradują węglowodorów długołańcuchowych. Bakterie wykorzystujące metan należy uważać więc nie tyle za bakterie wykorzystujące węglowodory, ile za szczególnie wyspecjalizowaną grupę organizmów zużywających związki jednowęglowe. Należą one zatem do grupy organizmów metylotroficznych, to jest bakterii (i drożdży) wykorzystujących metanol, metylowane aminy, eter dimetylowy, formaldehyd i mrówczan. Podłoża zawierające metan jako jedyne źródło węgla i energii podtrzymują wzrost bakterii należących do kilku rodzajów: Methylomonas, Methylococcus, Methylosinus. Niektóre z nich rosną jedynie w obecności metanu, metanolu lub eteru dimetylowego jako substratu i nie potrafią wykorzystywać cukrów, kwasów organicznych ani innych alkoholi. Zysk energetyczny. Równoważniki redukujące potrzebne podczas uzyskiwania energii mogą pochodzić z utleniania metanu do metanolu, utleniania formaldehydu i mrówczanu do dwutlenku węgla. Utlenianie metanu do metanolu wiąże się z wbudowaniem tlenu cząsteczkowego do cząsteczki; reakcję tę katalizuje oksygenaza metanowa.

Synteza materiału komórkowego. Synteza materiału komórkowego zazwyczaj rozpoczyna się od formaldehydu, produktu pośredniego utleniania metanu. Przebiega ona kilkoma różnymi szlakami, z których najlepiej poznany jest cykl rybulozomonofosforanowy wiązania formaldehydu oraz szlak serynowy. W cyklu rybulozomonofosforanowym formaldehyd, utworzony jako związek pośredni w utlenianiu metanu,

523

ulega kondensacji aldolowej z rybulozo-5-fosforanem do arabino-3-heksulozo-6-fosforanu, który z kolei w reakcji izomeryzacji jest przekształcany do fruktozo-6-fosforanu (ryc. 14.8). Ten znów przechodzi w Pentozofosforan, podobnie jak w cyklu rybulozobisfosforanowym

524

wiązania dwutlenku węgla. Cykl ten, przedstawiony w lewej części ryciny 11.2 (rozdz. 11.5), przebiega bez udziału sedoheptulozo-1,7-bisfosfatazy. Przebieg szlaku serynowego (ryc. 14.9) zbadano na przykładzie Pseudomonas MA i Hyphomicrobium X. U innych drobnoustrojów być może występują modyfikacje tego szlaku. Akceptorem dla formaldehydu jest glicyna. U organizmów wykorzystujących ten szlak do asymilacji związków jednowęglowych powinny występować enzymy, jak reduktaza hydroksypirogronianowa, tiokinaza jabłczanowa, liaza maleilo-CoA oraz liaza izocytrynianowa. Drożdże wykorzystują jedynie metanol, a nie metan. U tych drożdży (Candida boidinii, Hansenula polymorpha) metanol jest wbudowywany do składników komórkowych również poprzez formaldehyd, ale inny jest Pentozofosforan, tj. ksylulozo-5-fosforan. W ksylulozo-5-fosforanowym cyklu wiązania formaldehydu, formaldehyd i ksylulozo-5-fosforan są przeprowadzane przez swoistą transketolazę do aldehydu fosfoglicerynowego i dihydroksyacetonu. Po fosforylacji dihydroksyacetonu przez tiokinazę obydwa produkty wchodzą w szlaki syntezy. Wykorzystywanie metanolu. Metanol jest wykorzystywany nie tylko przez bakterie metanotroficzne, lecz również przez wiele innych szczepów bakterii, np. Methylobacterium extorquens, Methylomonas clara, Xanthobacter autotrophicus, Paracoccus denitrificans, Hyphomicrobium czy Rhodococcus erythropolis, i niektóre drożdże, np. Hansenula polymorpha i Candida boidinii. Tak jak w przypadku metanotrofów, do bakterii wykorzystujących metanol należy wiele gatunków charakteryzujących się zróżnicowanymi możliwościami odżywczymi i metabolicznymi, jak również takie, które wykorzystują metanol obligatoryjnie. Niektóre bakterie rosną tak dobrze na metanolu, że wykorzystuje się je do produkcji biomasy na skalę techniczną — do produkcji tzw. białka z jednokomórkowców. Wykorzystanie metanolu przez bakterie zapoczątkowane jest przez dehydrogenazę metanolową. Enzym ten zawiera grupę prostetyczną w postaci metoksatyny (PPQ) (ryc. 7.2). PPQ jest składnikiem wielu dehydrogenaz alkoholowych i oksydaz aminokwasowych związanych z osłonami komórkowymi. Występuje również u organizmów eukariotycznych, z człowiekiem włącznie. 525

14.11.2. Etan, propan i butan W hodowlach wzbogacających, zawierających oprócz tlenu i dwutlenku węgla również czysty metan, głównym rozwijającym się organizmem jest Methylomonas methanica, podczas gdy w hodowlach z gazem ziemnym, zawierającym etan obok metanu, rozwijały się jedynie organizmy utleniające etan. Znacznie więcej jest bakterii utleniających etan niż tych, które utleniają metan. Większość spośród bakterii utleniających etan należy do rodzajów Mycobacterium, Flavobacterium i Nocardia. Niektóre bakterie wykorzystujące etan utleniają również wodór. Dodanie propanu do hodowli wzbogacających pozwala na wzrost jeszcze większej liczby gatunków bakterii. Wyizolowano również bakterie utleniające butan (Mycobacterium i Pseudomonas).

14.11.3. Alkany długołańcuchowe Długołańcuchowe węglowodory (alkany) są wykorzystywane przez liczne bakterie. Długość łańcucha ma tu zasadnicze znaczenie. Liczba gatunków wykorzystujących je oraz intensywność degradacji wzrasta wraz z długością łańcucha parafin. W degradacji uczestniczą mykobakterie, nokardie i korynebakterie. Chociaż wzrost bakterii z wykorzystaniem węglowodorów od dawna traktowano jako ciekawostkę, zainteresowanie bakteriami degradującymi węglowodory znacznie wzrosło w wyniku dwóch odkryć. W 1950 r. w Berlińskim Instytucie Technologii Fermentacyjnej z hodowli wzbogaconych we frakcje węglowodorów jako źródło energii wyizolowano dwa gatunki drożdży: Candida lipolytica i Candida tropicalis. Candida lipolytica wykorzystuje łańcuchy zbudowane z 15 atomów węgla oraz wszystkie wyższe homologi. W tym czasie stwierdzono również, że większość gatunków Candida utlenia węglowodory. Badania szczepów drożdży w różnych kolekcjach wykazały, że zdolność wykorzystywania węglowodorów jest wśród drożdży szeroko rozpowszechniona. Przemianie węglowodorów towarzyszy niezwykle wysoki współczynnik wydajności. Wartość Υ dla substratów węglowodanowych wynosi około 0,5, podczas gdy dla węglowodorów — od 0,7 do 1,0. Mechanizm. Wiele bakterii z rodzaju Pseudomonas utlenia węglowodany całkowicie, nie prowadząc do akumulacji produktów pośrednich. Jedynie Acinetobacter calcoaceticus gromadzi w komórce produkty utleniania,

526

a ich charakter zależy od wykorzystywanych substratów. Podczas wzrostu A. calcoaceticus w obecności heksadekanu można z filtratu podłoża hodowlanego wyizolować cetylopalmitynian, będący estrem kwasu palmitynowego i alhoholu cetylowego (heksadekanol). Obydwa związki powstają w wyniku utlenienia heksadekanu. Eksperyment przedstawiony schematycznie na rycinie 14.10 dostarcza dowodów, że degradacja parafin jest inicjowana przez utlenienie końcowego węgla. We wstępnym ataku na łańcuch węglowodorowy uczestniczy tlen. W warunkach braku tlenu cząsteczkowego utlenianie parafin nie zachodzi. Utlenianie jest katalizowane przez monooksygenazę (oksygenazę alkanową): parafina + O2 + NADH2 -> alkohol parafinowy + NAD + H2O Dalsze utlenianie parafin przebiega w wyniku dobrze znanej degradacji długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, to jest β-oksydacji (ryc. 14.11). Gdy bakterie z rodzaju Pseudomonas utleniające heptany hoduje się w warunkach obniżonego ciśnienia parcjalnego tlenu, w podłożu wzrostowym gromadzą się kwasy tłuszczowe C 3 , C5 i C 7 . Z kolei, gdy bakterie hodowane na heksanie inkubuje się z heptanem, następuje

527

akumulacja propionianu. Gromadzenie propionianu wynika prawdopodobnie z braku enzymów przekształcających propionian poprzez metylomalonylo-CoA w komórkach hodowanych na heksanie.

14.11.4. Węglowodory aromatyczne Rośliny produkują wiele związków organicznych zawierających pierścienie aromatyczne. Pod względem ilościowym dominuje lignina, która stanowi 20% (wagowych) drewna. Pierścień aromatyczny rozszczepia wiele gatunków bakterii i grzybów. Niektóre bakterie z rodzaju Pseudomonas rosną szybciej w obecności benzoesanu niż cukrów, jednakże warunkiem szybkiej degradacji związków aromatycznych jest obecność tlenu. Zajmiemy się tymi szlakami degradacji nieco dokładniej. Według nowych badań związki aromatyczne są również degradowane beztlenowo w szlaku, o którym jedynie wspomnimy w dalszej części tego podrozdziału. Przygotowanie do rozszczepienia pierścienia. Większość spośród związków aromatycznych występujących w przyrodzie początkowo ulega degradacji przez bakterie do jednego lub dwóch związków: katecholu i kwasu protokatechowego. Wiele pojedynczo lub podwójnie (1,2-di-) podstawionych pierścieni aromatycznych, np. w kwasie migdałowym,

528

fenyloalaninie, toluenie, benzoesanie, salicylanie, fenolu i benzenie jest degradowanych do katecholu. Do kwasu protokatechowego są przekształcane pierścienie aromatyczne podwójnie podstawione w pozycjach 1,3 i 1,4, jak również pierścienie podstawione wielokrotnie. We wszystkich przypadkach do pierścienia włączają się grupy hydroksylowe. Tlen jest pochodzenia cząsteczkowego. W przypadku aromatycznych związków niefenolowych struktura 1,3-dihydroksybenzenu, niezbędna do rozszczepienia pierścienia, powstaje na skutek podwójnej hydroksylacji.

Nie podstawiony pierścień benzenu ulega, na przykład, hydroksylacji przez dioksygenazę (podwójną hydrolazę) do cis-l,2-dihydro-l,2-dihydroksybenzenu, który następnie ulega odwodorowaniu (ponownej aromatyzacji) do pirokatechiny. Inaczej dzieje się w przypadku związków fenolowych, które są dalej hydroksylowane przez monooksygenazy. Jeden z atomów tlenu cząsteczkowego zostaje wbudowany, a drugi zredukowany do wody. Jako donory wodoru mogą służyć nukleotydy pirydynowe.

Rozszczepienie pierścienia aromatycznego często, lecz nie zawsze, jest poprzedzone usunięciem z niego podstawników. Grupy chlorowe, nitrowe i sulfonowe są zastępowane grupami hydroksylowymi. Alifatyczne łańcuchy boczne mogą być różnie modyfikowane i skracane lub pozostawać nietknięte. Rozszczepienie pierścienia. Pierścień rozszczepiają dioksygenazy. W trakcie tego procesu jest wbudowywany tlen cząsteczkowy. Pierścień zostaje rozerwany albo między dwiema sąsiadującymi grupami hydroksylowymi, albo między hydroksylowanym i sąsiadującym niehydroksylowanym 529

atomem węgla. Najlepiej zbadano enzymy wyizolowane z różnych gatunków Pseudomonas. Najważniejsze typy otwarcia pierścienia aromatycznego przedstawiono na rycinie 14.12. Rozszczepienie typu orto. Rozszczepienie pierścienia między dwoma sąsiadującymi hydroksylowanymi atomami węgla (rozszczepienie ortolub intradiolowe) prowadzi do powstania kwasów dikarboksylowych. Przypuszczalnie zachodzi pierwotne przyłączenie cząsteczki O2 do atomów węgla obok grupy hydroksylowej z wytworzeniem cyklicznego nadtlenku. Z kolei, wewnątrzcząsteczkowe przekształcenia prowadzą do zerwania wiązania C—C z wytworzeniem kwasu cis,cis-mukonowego. Katechol jest rozszczepiany przez ortopirokatechazę (dioksygenaza-1,2-katecholowa), a kwas protokatechowy przez dioksygenazę-3,4-protokatecholową. Produkty tych dwóch reakcji enzymatycznych, cis,cis-mukonian i 3-kar-

530

boksy-cis,cis-mukonian ulegają dalszemu metabolizmowi poprzez ten sam związek pośredni, kwas 3-ketoadypinowy. Związek ten jest aktywowany przez transferazę-CoA i zostaje rozszczepiony do bursztynylo-CoA i acetylo-CoA, które są włączane do szlaków metabolizmu pośredniego (ryc. 14.12). Rozszczepienie typu meta. Rozszczepienie pierścienia między hydroksylowanym i niehydroksylowanym atomem węgla (rozszczepienie typu meta lub ekstradiolowe) również jest katalizowane przez dioksygenazy. W wyniku reakcji powstają semialdehydy kwasu 2-hydroksymukonowego (ryc. 14.13), które następnie wchodzą w szlaki metabolizmu pośredniego

poprzez pirogronian, aldehyd octowy, szczawiooctan, fumaran i inne produkty pośrednie, zależnie od typu podstawienia powstałych kwasów alifatycznych. Badania wykazały, że szlaki kataboliczne związków aromatycznych znacznie różnią się zarówno sposobami rozszczepiania pierścienia, jak i reakcjami wstępnymi prowadzącymi do rozszczepienia pierścienia aromatycznego. W przypadku niektórych bakterii nawet faza wzrostu oraz warunki hodowli mogą decydować o tym, czy powstają enzymy katalizujące rozszczepienie typu orto, czy typu meta. U niektórych bakterii z rodzaju Pseudomonas związki aromatyczne katabolizowane poprzez katechol ulegają rozszczepieniu typu orto, podczas gdy katabolizowane poprzez kwas protokatechowy ulegają rozszczepieniu typu meta. 531

Szlaki konwergentne. Degradacja związków aromatycznych przebiega w wyniku dość dużej liczby reakcji. Szlaki te prowadzą do powstania katecholu lub kwasu protokatechowego (ryc. 14.14 oraz 14.15). Są one bardzo przydatne do wyjaśnienia regulacji konwergentnych szlaków katabolicznych (patrz rozdz. 16.1.1).

Naftalen, antracen i związki poliaromatyczne. Niektóre bakterie są zdolne do rozkładu związków policyklicznych, z których w tym miejscu omówione zostaną tylko naftalen, antracen i fenantren. Kiedy bakterie tego typu hodowane są w obecności jednego z wymienionych substratów, często w podłożu stwierdza się obecność salicylanu. Sugeruje to udział reakcji uczestniczących w degradacji związków monocyklicznych (ryc. 14.15). Na zakończenie tej części można stwierdzić, że naturalnie występujące węglowodory są przekształcane i częściowo lub całkowicie utleniane przez drobnoustroje. W odpowiednich warunkach bardzo powoli jest degradowany nawet asfalt, a w żyznych glebach utleniany jest także grafit. Zanieczyszczanie środowiska ropą naftową. W przypadku zanieczyszczenia gleby ropą naftową należy pamiętać o tym, że węglowodory w dobrze przewietrzanych glebach ulegają szybkiej i całkowitej degradacji. Jedynie wtedy, gdy zanieczyszczenia sięgają głęboko lub gdy występują warunki silnie ograniczonego dostępu tlenu, należy się liczyć z groźbą

532

utrwalenia danego stanu lub skażenia wody pitnej. Wylew ropy naftowej na morzu stanowi bezpośrednie zagrożenie dla morskiej flory i fauny, lecz i w tym przypadku jest ona degradowana przez bakterie. Mogą jednakże pozostawać długołańcuchowe alkany, poliaromatyczne węglowodory oraz mieszaniny asfaltopodobne, które przez długi czas opierają się biologicznej degradacji. Beztlenowy rozkład węglowodorów aromatycznych. We wstępnych etapach rozszczepienia pierścienia aromatycznego bierze udział tlen cząsteczkowy. Sądzono więc, że benzen, kwas benzoesowy, kwas 4-hydroksybenzoesowy i wiele innych związków musi być opornych na beztlenową degradację. Okazało się to jednak nieprawdziwe. Fenol, a także kwas benzoesowy, czy nawet alkohol benzylowy są atakowane również w warunkach beztlenowych. Warunkiem jest obecność takich akceptorów wodoru, jak azotan, siarczan, CO 2 , które pozwalają na oddychanie beztlenowe, lub dostęp światła. Stwierdzenie to wynika z badań z mieszanymi populacjami lub zdefiniowanymi kulturami mieszanymi, jak również z kilkoma ostatnio wyizolowanymi bakteriami. Z drugiej strony, wiedza dotycząca przemian enzymatycznych poszczególnych etapów degradacji jest szczątkowa bądź w ogóle nie istnieje. Już w 1932 r. Van Niel w swoich badaniach wyizolował Rhodopseudomonas

533

palustris z hodowli wzbogaconej w benzoesan i wystawionej na działanie światła. Od tego czasu stwierdzono, że we wczesnych etapach aktywacji benzoesanu uczestniczy koenzym-Α i powstaje związek pośredni benzylo-CoA, który ulega hydratacji do pochodnej cykloheksanu, a następnie degradacji z uwolnieniem acetylo-CoA. Beztlenowy rozkład podstawionego benzenu jest szlakiem reduktywnym. Wiele jeszcze jest do wyjaśnienia, zanim możliwości beztlenowego rozkładu węglowodorów aromatycznych zostaną w pełni poznane. Ksenobiotyki. Są to związki zsyntetyzowane chemicznie, na ogół nie występujące w przyrodzie. Wydaje się wątpliwe, aby istniały organizmy zdolne do ich rozkładu. Do ksenobiotyków należą fungicydy, herbicydy, pestycydy, nematocydy i wiele innych. Pod względem budowy najczęściej są to podstawione węglowodory, fenylowęglany i inne podobne związki. Niektóre z tych substancji, stosowane w dużych ilościach w uprawach, są bardzo oporne i rozkładają się niezwykle wolno lub wcale. Inne usuwane są z gleby, lecz nie są znane produkty ich rozkładu. Jeszcze inne rozkładają się bardzo szybko. Badania w tym kierunku pełne są niespodzianek. W niektórych słabo przepuszczalnych glebach pod budynkami przemysłowymi, takie rozpuszczalniki, jak chloroform, di-, tri- i polichloroetylen akumulują w ilościach pozwalających na ich wypompowanie. Gleba wymaga zaś oczyszczenia metodami chemicznymi, fizycznymi lub biotechnologicznymi. Ważne problemy tego rodzaju są przedmiotem badań mikrobiologicznych. Sztuczne włókna typu polietylen i polipropylen są niegroźne, ale praktycznie zupełnie niepodatne na biologiczną degradację. Podczas gdy substancje zmiękczające zawarte w tych włóknach stopniowo utleniają się, to szkielet polimeru pozostaje nienaruszony. Należy mieć nadzieję, że polimery te będą zastąpione przez takie biodegradowalne biopolimery, jak kwasy poli(hydroksy)tłuszczowe lub pochodne skrobi. Kometabolizm. Niektóre związki podlegają degradacji przez drobnoustroje jedynie wówczas, gdy występują razem z innymi substancjami. Tego typu degradacja jakiegoś związku, która sama nie podtrzymuje wzrostu komórki, ale przebiega w obecności innej degradowalnej substancji (kosubstratu), nosi nazwę kometabolizmu lub koutlenienia. Kometabolizm może być wykorzystywany, na przykład, do oczyszczania w tej samej oczyszczalni ścieków przemysłowych zawierających syntetyczne związki 534

oporne na degradację razem ze ściekami komunalnymi. Często mechanizm procesu jest nieznany. Naturalna odmiana tego typu przemian występuje w przypadku rozkładu ligniny przez Phanerochaete chrysosporium (rozdz. 14.9). Lignina występuje tu w związku z celulozą (lignoceluloza). Uwalnianiu glukozy towarzyszy powstanie nadtlenku wodoru oraz rodników hydroksylowych i nadtlenkowych potrzebnych do degradacji szkieletu ligniny. Inkubując ksenobiotyki razem ze substratami, które indukują syntezę monooksygenazy, można enzym ten wykorzystać do tworzenia rodników.

14.12. Białka Organizmy składają się przede wszystkim z białek. Dla większości żywych istot martwy organizm jest najlepszym substratem (pokarmem). Białka martwych organizmów są atakowane i rozkładane przez liczne grzyby i bakterie. Podobnie jak inne substancje wielkocząsteczkowe, białka najpierw są rozkładane przez enzymy pozakomórkowe do odpowiednich produktów degradacji. Proteazy wydzielane przez bakterie i grzyby hydrolizują białka do oligopeptydów i aminokwasów. Aktywność proteolityczna drobnoustrojów często jest określana na podłożach stałych zawierających żelatynę. Aktywność przejawia się w postaci przejrzystej strefy wokół kolonii, w której żelatyna nie jest wytrącana przez kwas (HC1). Oligopeptydy i aminokwasy są pobierane do komórki przez swoiste systemy transportowe, a peptydy są rozkładane przez wewnątrzkomórkowe proteazy. Aminokwasy są wbudowywane do białek komórkowych lub w drodze swoistych reakcji ulegają deaminacji i włączeniu do szlaków metabolizmu pośredniego, w którym są utleniane, służąc jako źródło energii (ryc. 14.16). Proteazy są enzymami, które rozszczepiają wiązania peptydowe. Istnieją proteazy zarówno zewnątrzkomórkowe, jak i wewnątrzkomórkowe. Te pierwsze uczestniczą w metabolizmie komórkowym, podczas gdy drugie biorą udział w zewnątrzkomórkowej degradacji białek. Z punktu widzenia swoistości rozróżnia się egzo- i endopeptydazy. Egzopeptydazy rozpoznają koniec karboksylowy lub aminowy łańcucha peptydowego. Endopeptydazy, zwane również proteinazami, rozszczepiają wiązania wewnątrz łańcucha polipeptydowego. Rozróżnia się przynajmniej cztery główne grupy proteinaz: serynowe, cysteinowe, asparaginowe i cynkowe.

535

Te wewnątrzkomórkowe enzymy charakteryzują się wysoką swoistością i pełnią ważne funkcje w regulacji metabolizmu komórkowego, na przykład odcinając sekwencje sygnalne białek lub wprowadzając cięcia w białkach enzymatycznych, powodując ich aktywację lub inaktywację. Częściowo strawione białka niegdyś zwano peptonami. Ten niewłaściwy termin obecnie stosuje się jedynie w odniesieniu do peptonów wchodzących w skład podłoży bakteriologicznych. Uzyskuje się je w wyniku trawienia białek pepsyną, która hydrolizuje tylko niektóre wiązania peptydowe. Pepton zawiera około 30% (wagowych) aminokwasów. Resztę stanowią di- i tripeptydy oraz rozpuszczalne w wodzie polipeptydy, które nie są wytrącane kwasami ani temperaturą. Często stosowany w laboratoriach mikrobiologicznych złożony „bulion odżywczy" o chemicznie nieokreślonym składzie jest mieszaniną peptonu, ekstraktu mięsnego i ekstraktu drożdżowego w stosunku 7 : 2 : 2 . Oprócz aminokwasów i oligopeptydów zawiera również różne cukry, kwasy organiczne witaminy i pierwiastki śladowe.

Zewnątrzkomórkowe proteazy wydzielane są do środowiska, gdzie przeprowadzają degradację białek. Niektóre z nich mają charakter toksyn i czynników wirulencji (np. subtylizyna, lizostafina, streptokinaza, elastaza, hemolizyna). Duże ilości proteaz wytwarza się przemysłowo i dodaje do detergentów lub wykorzystuje w obróbce skór i w wielu innych procesach. Termostabilne proteazy uzyskuje się z pomocą termofilnych bakterii (tab. 10.2). Zewnątrzkomórkowe proteazy wytwarzają liczne bakterie i grzyby. Rozkładowi białka w glebie towarzyszy powstanie amoniaku. Proces ten zwany jest mineralizacją azotu lub też amonifikacją. Białka rozkłada wiele grzybów i bakterii, w tym Bacillus cereus var. mycoides, Proteus vulgaris i inne bakterie z rodzaju Pseudomonas.

536

Pierwszą reakcją w degradacji aminokwasu jest dekarboksylacja lub deaminacja. Dekarboksylazy powstają przede wszystkim w środowisku kwaśnym. Produktami dekarboksylacji aminokwasów są dwutlenek węgla i aminy pierwszorzędowe (aminy biogenne). Do najlepiej znanych z tych zasad należą kadaweryna, putrescyna i agmatyna; powstają one odpowiednio z lizyny, ornityny i argininy. Te pierwszorzędowe aminy powstają podczas normalnych procesów trawiennych w jelicie oraz w trakcie innych procesów beztlenowego rozkładu substancji białkowych.

Pod pojęciem deaminacji rozumiemy uwolnienie amoniaku z aminokwasu. Zależnie od dalszego losu szkieletu węglowego można rozróżnić deaminację oksydacyjną, desaturacyjną i hydrolityczną. Deaminacja oksydacyjna jest najczęstszą formą degradacji aminokwasów. Kwas glutaminowy ulega oksydacyjnej deaminacji przez dehydrogenazę glutaminianową do α-ketoglutaranu. Reakcja ta jest odwracalna i należy do najważniejszych w metabolizmie aminokwasów. Równowaga reakcji jest przesunięta w stronę kwasu glutaminowego.

W procesie desaturacyjnej deaminacji kwasu asparaginowego powstaje kwas fumarowy:

537

Reakcja ta jest katalizowana przez aspartazę i również jest odwracalna. Hydroliza mocznika jest uważana za przykład deaminacji hydrolitycznej. Wiele bakterii ma zdolność wykorzystywania mocznika jako źródła azotu, a hydroliza tego związku jest katalizowana przez ureazę. H2N—CO—NH2 + H2O -»2NH3 + CO2 U większości bakterii jony amonowe hamują wytwarzanie ureazy. W ten sposób ilość wytworzonego amonu wydzielonego do podłoża jest utrzymywana na poziomie niezbędnym tylko do syntezy białka. U kilku bakterii zwanych „organizmami rozszczepiającymi mocznik" (Bacillus pasteurii, Sporosarcina ureae, Proteus vulgaris) ureaza wytwarzana jest konstytutywnie; jej powstawanie nie zależy od obecności mocznika i nie jest też hamowane przez jony amonowe. Bakterie te hydrolizują cały dostępny mocznik (np. w stajniach) do amoniaku, podwyższając przy tym pH do wartości 9-10, do jakiej są przystosowane. W trakcie transaminacji grupa aminowa aminokwasu jest przenoszona przez transaminazy na α-ketokwas.

Transaminacja służy zatem syntezie niektórych aminokwasów, niepodlegających aminacji przez jony amonowe, jak również katabolizmowi innych aminokwasów. W omówionych reakcjach dekarboksylacji i transaminacji bierze udział fosforan pirydoksalu (ryc. 14.17). Ten koenzym metabolizmu aminokwasów jest pochodną pirydoksalu, zwanego również witaminą B6. Grupą czynną fosforanu pirydoksalu jest grupa aldehydowa; w połączeniu z grupą aminową aminokwasu powstaje zasada Schiffa. W reakcji transaminacji grupa aminowa pozostaje związana z fosforanem pirydoksalu, a szkielet węglowy uwalniany jest w postaci «-ketokwasu. Fosforan pirydoksalu ulega regeneracji w reakcji z ketokwasem. W reakcji dekarboksylacji od zasady Schiffa jest odłączany dwutlenek węgla. Dalszy los szkieletu węglowego jest różny w różnych aminokwasach. Tylko niektóre produkty deaminacji są związkami pośrednimi w centralnych szlakach metabolicznych (pirogronian, α-ketoglutaran, szczawiooctan). Inne szkielety węglowe zostają włączone w pośrednią prze-

538

539

mianę materii poprzez specjalne cykle rozkładu. Przedstawienie wszystkich szlaków degradacji przekraczałoby ramy tego rozdziału. Reprezentatywnym przykładem jest degradacja leucyny, przedstawiona na rycinie 14.17. Uwagę zwraca występowanie 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-CoA; związek ten jest ważnym produktem pośrednim w syntezie steroidów i karotenoidów.

STAŁOŚĆ, ZMIENNOŚĆ, REKOMBINACJA I PRZEKAZYWANIE INFORMACJI GENETYCZNEJ

Każdy żywy organizm większością cech przypomina swoich przodków. Utrzymywanie swoistych właściwości, czyli stałość cech przez pokolenia, nazywamy dziedzicznością. Przekazywaniem cech oraz prawami dziedziczności zajmuje się genetyka. Każda cecha genetyczna może być przypisana genowi, który jest nośnikiem informacji. Już klasyczna genetyka zakładała, że geny są umiejscowione w jądrach organizmów eukariotycznych i postulowała liniowe ułożenie genów. Przez długi czas wiązano informację genetyczną z białkowym składnikiem nukleoplazmy. W końcu jednak, udane przekazanie informacji genetycznej (transformacja) przez DNA wskazało tę substancję jako nośnik właściwości dziedzicznych. Następnie wykazano, początkowo na przykładzie owadów, a później mikroorganizmów, że wyrażanie się informacji genetycznej zależy od aktywności enzymów. W mikroorganizmach enzymy znajdują odzwierciedlenie w określonych cechach biochemicznych. Według hipotezy „jeden gen, jeden enzym" pojedynczy gen niesie informację konieczną dla jednego swoistego enzymu; obecnie twierdzi się bardziej precyzyjnie, że każdy gen strukturalny koduje określony łańcuch polipeptydowy. Zmiany mutacyjne w obrębie genu lub nawet poza nim prowadzą do utraty enzymu lub do syntezy jego zmienionej formy, a w konsekwencji do widocznych zmian we właściwościach dziedzicznych. Gen można więc poznać przez jego mutacje. Termin mutacja został stworzony przez De Vriesa, który badając zmienność i dziedziczność wśród roślin wykrył nagłe, nieciągłe zmiany cech dziedzicznych. Beijerinck zastosował ten 541

termin do bakterii. Genetyka opiera się na badaniu różnic w cechach dziedzicznych, u podłoża których leżą alternatywne (alleliczne) formy genu. Studia genetyczne są więc badaniem mutantów. Naturalnie występujący szczep jest typem dzikim, a powstały w wyniku mutacji mutantem. Mikroorganizmy są niezwykle przydatnym materiałem do badań genetycznych, bowiem olbrzymia liczba osobników może żyć w ograniczonej przestrzeni (i w ograniczonym czasie). Włączenie mikroorganizmów do badań genetycznych wymagało jednak przezwyciężenia pewnych uprzedzeń.

15.1. Pochodzenie mutacji 15.1.1. Nieukierunkowany charakter mutacji Pogląd głoszący, że mikroorganizmy mogą mutować i zmieniać swe cechy dziedziczne, przez długi czas nie cieszył się poparciem. Przed wprowadzeniem technik czystych hodowli wielu mikrobiologów (Nageli, Zopf) sądziło, że bakterie odznaczają się zmiennością kształtów i właściwości fizjologicznych. Według jednego z poglądów, liczne, różnorodne typy bakterii istniejące w naturze reprezentują różne stadia cyklu życiowego niewielu gatunków (pleomorfizm). Jednak Cohn i Koch, opierając się na własnej, ulepszonej metodyce i doświadczeniu w pracy z czystymi hodowlami, stali się obrońcami przeciwnego poglądu, monomorfizmu, który głosił stałość cech morfologicznych i fizjologicznych i, co za tym idzie, ich przydatność do identyfikacji oraz klasyfikacji mikroorganizmów. Różnica między genotypem a fenotypem bakterii musiała być w końcu uznana (tak jak u innych organizmów). Genotyp określa genetyczny potencjał komórki, podczas gdy fenotyp opisuje jej aktualne obserwowane właściwości. Najłatwiej zauważalnymi zmianami bakterii są te, które powstają w obecności związków toksycznych. Początkowo przypuszczano, że komórki oporne na toksyny powstają w wyniku adaptacji bakterii do tych związków. Na pierwszy rzut oka wydaje się niełatwe odróżnienie adaptacji fenotypowej do zmian środowiska od zmian genotypowych, a jednak kryteria są proste: w przypadku adaptacji fenotypowej wszystkie komórki w hodowli przystosowują się, natomiast zmiany genotypowe zachodzą

542

tylko w kilku komórkach hodowli, które są następnie pozytywnie selekcjonowane przez środowisko ze względu na ich lepsze przystosowanie. W rezultacie, w obecności toksyn, komórki genotypowo oporne na nie przerastają hodowlę rodzicielską. Następny problem dotyczył przyczyny zmian genotypowych, co sprowadza się do odpowiedzi na pytanie, czy zmiany te są powodowane przez środowiskowy czynnik selekcyjny, a więc są ukierunkowane, czy też powstają przypadkowo, bez jakiegokolwiek wpływu środowiska. Należy nadmienić, że dla organizmów wyższych pogląd Darwina — nowe typy oraz gatunki powstają w wyniku przypadkowych mutacji i następnie selekcji najlepiej przystosowanych — był już powszechnie akceptowany i doprowadził do porzucenia teorii Lamarcka głoszącej dziedziczenie cech uzyskanych przez adaptację. W końcu jednak liczne, sławne teraz eksperymenty udowodniły przypadkowy i nieukierunkowany charakter również mutacji bakteryjnych. W rozdziale tym przedstawimy jeden z łatwych do powtórzenia, klasycznych eksperymentów demonstrujących zastosowanie metody replik. Selekcja mutantów pośrednią metodą replik. Eksperymenty Lederberga z 1952 r. dostarczyły niekwestionowanego dowodu na możliwość selekcji mutantów, przedstawiając jednocześnie po raz pierwszy metodę replik, która od tej chwili jest powszechnie stosowana. Sterylny kawałek welwetu o średnicy nieco mniejszej niż płytka Petriego przyciska się do płytki agarowej z wyrośniętymi koloniami. Włoski welwetu pobierają komórki bakteryjne pochodzące z każdej kolonii na płytce, a natychmiastowy odcisk na powierzchni drugiej, sterylnej płytki agarowej powoduje dokładne przeniesienie wzorca kolonii, które wyrosły na płytce oryginalnej. Na przykład, organizmy z płytki całkowicie pokrytej bakteriami wrażliwymi na faga (ryc. 15.1, płytka I) przeniesiono za pomocą welwetu na drugą — standardową płytkę agarową (II) oraz na płytkę z dużą ilością cząstek fagowych (III). Po inkubacji wszystkich płytek, kilka fagoopornych kolonii pojawiło się na płytce III. Następnie pobrano bakterie z miejsca standardowej płytki (II) — ściśle odpowiadającego miejscu wzrostu opornych kolonii na płytce fagowej (III), namnożono bakterie na pożywce płynnej bez faga i wysiano je na świeżą płytkę agarową nie zawierającą faga. Kolonie, które wyrosły po inkubacji, ponownie replikowano na normalną płytkę agarową (II) i na płytkę z fagiem (III). Powyższe postępowanie powtarzano kilkakrotnie, aż w końcu otrzymano całkowicie

543

fagooporną hodowlę, której przodkowie nigdy nie zetknęli się z fagiem. Opisany eksperyment dostarczył przekonującego dowodu na spontaniczne, bez udziału jakiegokolwiek czynnika selekcji, powstanie fagoopornych mutantów bakteryjnych. 15.1.2. Mutacje i ich częstość Mutacje spontaniczne. W populacji bakteryjnej powstaje pewna liczba mutacji nie mających określonej zewnętrznej przyczyny. Nazywamy je mutacjami spontanicznymi, a zmutowane komórki — mutantami spontanicznymi. Względna liczba mutantów w populacji komórek określa częstość występowania mutantów. Wielkość ta waha się w granicach 10 -4 do 10-11, zależnie od cechy, warunków środowiska, wieku hodowli i innych czynników. Prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji w przeliczeniu na jedną komórkę i jeden czas generacji nazywamy tempem

544

mutacji, które wyznacza się zazwyczaj dla komórek w wykładniczej fazie wzrostu hodowli w optymalnych warunkach. Tempo mutacji spontanicznych dla jednego genu jest rzędu 10 ~ 5 , a w przeliczeniu na jedną parę nukleotydów — 10 ~ 8 . Mutacje ciche. Na poziomie molekularnym każda dziedziczna, stabilnie utrzymująca się zmiana w DNA jest mutacją. Nie wszystkie mutacje wyrażają się fenotypowo, co wynika choćby z niejednoznaczności kodu genetycznego. Na przykład, zmiana trzeciej zasady w wielu kodonach trójkowych nie pociąga za sobą zmian fenotypowych (mutacje ciche). Czasami nawet zastąpienie pierwszej lub drugiej zasady trypletu nie musi mieć zauważalnych fenotypowych następstw. Wiadomo również, że zmiany poszczególnych aminokwasów mają bardzo zróżnicowany wpływ na strukturę białka wyższego rzędu (drugorzędową, trzeciorzędową). Zmiana kodonu AUC na GUC, na przykład, prowadzi do podstawienia izoleucyny waliną, a oba te aminokwasy są hydrofobowe, niepolarne i mają podobne właściwości. Przeciwnie, zmiana CUU na CCU, prowadząca do zamiany niepolarnej leucyny w polarną prolinę, powoduje ugięcie łańcucha polipeptydowego, co z kolei prowadzi do istotnych zmian struktury wyższego rzędu. Przykłady te dobrze ilustrują regułę — poszczególne mutacje w genie strukturalnym dla danego enzymu w różny sposób wpływają na jego aktywność; od ledwie zauważalnych zmian do całkowitej utraty jego aktywności. Mutacje powrotne albo rewersje. Wiele mutantów, choć nie wszystkie, może mutować wstecznie, z przywróceniem cech dzikiego rodzica. Odróżnia się dwa rodzaje mutacji powrotnych: 1) rewertanty (prawdziwe), gdy druga mutacja w tym samym genie odtwarza genotyp pierwotny, tj. genotyp typu dzikiego istniejący zanim zaszła pierwsza z mutacji, i 2) rewertanty funkcjonalne z zachowaną oryginalną mutacją, lecz fenotypowo dzikie w wyniku powstania drugiej mutacji w innym locus w obrębie tego samego lub nawet innego genu. Do grupy tej należą mutanty supresorowe, w których nowa mutacja hamuje w sposób pośredni początkowy defekt. U podstaw supresji może leżeć zmiana antykodonu w transportującym RNA (patrz rozdz. 2), co prowadzi do rozpoznania zmutowanego kodonu i wstawienia aminokwasu do łańcucha polipeptydowego. Mutanty supresorowe niejednokrotnie rosną wolniej niż prawdziwy typ dziki. Podstawą wolniejszego wzrostu jest zachodzące od czasu

545

do czasu włączenie złego aminokwasu wskutek możliwości wykorzystania kilku pokrewnych tRNA przez jeden aminokwas.

15.1.3. Typy mutacji Można odróżnić trzy typy mutacji, przyjmując jako kryterium powodowane przez nie zmiany molekularne. Są to: mutacje punktowe, delecje i insercje oraz mutacje prowadzące do zmian ramki odczytu. Mutacje punktowe. Mutacje te prowadzą do zmiany pojedynczych zasad. Zastąpienie jednej puryny (np. adeniny) inną puryną (np. guaniną) bądź jednej pirymidyny (np. tyminy) inną pirymidyną (np. cytozyną) nazywamy tranzycją. Zamianę puryny w pirymidynę lub odwrotnie określamy mianem transwersji. Ogólnie, mutacja punktowa prowadzi najczęściej do zmiany sensu kodonu (rozdz. 2), a w związku z tym do syntezy łańcucha polipeptydowego zawierającego zmieniony aminokwas. Czasami jednak podstawienie jednej zasady inną prowadzi do powstania nonsensownego terminującego kodonu, co pociąga za sobą przedwczesne zakończenie translacji, z wytworzeniem niekompletnego białka. Mutacje punktowe charakteryzują się dużą częstością rewersji. Delecje i insercje. Terminem delecji określamy utratę jednej lub większej liczby zasad w DNA. Delecja może obejmować nawet duże odcinki DNA, wielkości kilku genów. Z tego właśnie powodu efekt delecji nie może być zahamowany przez inną mutację. Dotyczy to też mutacji insercyjnych, prowadzących do wstawienia jednej lub większej liczby zasad w jeden lub więcej genów, czego wynikiem jest ich Inaktywacja. Mutacje zmieniające ramkę odczytu. Każdy gen wyraża się tylko w jednej ramce odczytu. W procesie translacji informacyjnego RNA (mRNA) rybosomy wiążą się do sekwencji złożonej z około 9 p.z. (Shine-Delgarno Box), która przylega do inicjującego kodonu AUG i jest komplementarna do końca 3' 16S rRNA. Następnie w kodonie inicjującym rozpoczyna się translacja wykorzystująca ciągłą, trójzasadową ramkę odczytu. Przyczyną mutacji zmieniających ramkę odczytu jest utrata lub wstawienie pojedynczej zasady, a więc mutacje te są swoistymi przykładami mutacji delecyjnych lub insercyjnych (ryc. 15.2). W rezultacie,

546

mutacje zniekształcające właściwą ramkę odczytu, zależnie od ich umiejscowienia, powodują wytworzenie niefunkcjonalnego białka lub białka o obniżonej aktywności. Polarność. Konsekwencją wytworzenia kodonu terminującego w wyniku mutacji punktowej, delecji lub insercji jest przedwczesna terminacja translacji, po czym następuje odłączenie rybosomów od mRNA. Zakończenie translacji danego genu ma wpływ na geny dalsze i prowadzi do powstania gradientu informacji nie podlegającej translacji lub odczytywanej bardzo słabo, zależnie od długości mRNA. To właśnie jest polarność. Przerwanie translacji w początkowej części genu (na końcu 5') daje większy efekt, a polarność jest silniej wyrażona niż w przypadku przerwania translacji w końcowej części genu (na końcu 3')·

15.1.4. Czynniki mutagenne i ich działanie Częstość mutacji można zwiększyć działając na komórki czynnikami mutagennymi (czynnikami indukującymi mutacje). W ten sposób powstają

547

mutacje indukowane, a takie mutanty nazywają się mutantami indukowanymi. Mutagenami mogą być czynniki chemiczne, fizyczne i biologiczne. Mechanizm ich działania zostanie wyjaśniony na wybranych przykładach w następnych paragrafach tego rozdziału (tab. 15. 1). Analogi zasad. Analogi zasad są antymetabolitami. Niektóre z nich do tego stopnia przypominają normalne puryny i pirymidyny, że mogą być pobierane przez komórkę i włączane do DNA, gdzie funkcjonują prawie

548

jak normalne zasady. Mają one jednak większą skłonność do tworzenia pary z błędnie dobranym partnerem podczas replikacji DNA. Bromouracyl (BU) i 2-aminopuryna stanowią dwa przykłady analogów zasad zdolnych do indukcji mutacji. Bromouracyl jest funkcjonalnym analogiem tyminy, a zastępując ją tworzy parę z adeniną. BU ulega tautomeryzacji do formy enolowej częściej niż tymina. Enolowa forma BU podczas replikacji tworzy parę z cytozyną i w ten sposób powoduje włączenie do DNA guaniny zamiast adeniny, prowadząc do zastąpienia pary AT parą GC. 2-aminopuryna jest włączana zamiast adeniny, a jej działanie przypomina działanie bromouracylu. Rodzaj zmian powodujący zastąpienie puryny inną puryną (A -> G) lub pirymidyny inną pirymidyną (C -> T) nazywamy tranzycją. Chemiczna modyfikacja zasad. Kilka czynników chemicznych indukujących mutacje działa przez chemiczną zmianę niektórych zasad, co prowadzi do pomyłek replikacyjnych. Przykładem związku mającego tę właściwość jest azotyn. Powoduje on deaminację adeniny, guaniny i cytozyny nie wywołując pęknięcia wiązań, ani innych zmian. Podstawienie grupy aminowej przez grupę hydroksylową zmienia adeninę w hipoksantynę, ta zaś tworzy parę z cytozyną, a nie z tyminą, co w rezultacie prowadzi do tranzycji AT -> GC. W wyniku deaminacji cytozyny powstaje uracyl, który tworzy parę z adeniną zamiast guaniny, to zaś powoduje tranzycję GC —> AT. W końcu zmiana guaniny w ksantynę nie powoduje mutacji, ponieważ ksantyna również tworzy parę z cytozyną. Hydroksyloamina reaguje głównie z cytozyną i zmienia ją w ten sposób, że zaczyna ona tworzyć parę z adeniną, powodując tranzycję CG -> TA. Związki alkilujące. Metylo- i etylometanosulfonian, dietylo- i dimetylosiarczan, iperyt oraz N-metylo-N-nitro-N-nitrozoguanidyna są przykładami najsilniej działających mutagenów. Etylometanosulfonian powoduje wybiórczo etylację atomu N-7 guaniny. Alkilowana guanina zostaje wycięta z nici DNA, w wyniku czego powstaje luka. W to opuszczone miejsce podczas następnej rundy replikacyjnej często jest wstawiana błędna zasada. Barwniki wstawiające się w DNA. Proflawina i inne barwniki akrydynowe charakteryzują się odmiennym mechanizmem działania. Cząsteczki akrydyn mają zdolność do wstawiania się między sąsiednie zasady

549

(interkalacja), zwiększając przez to odległość między nimi. Ta zmiana przestrzenna prowadzi do dwóch rodzajów pomyłek podczas replikacji i może powodować bądź utratę nukleotydu, bądź też wstawienie dodatkowej pary zasad. Poważną konsekwencją tego typu mutacji jest opisana uprzednio zmiana ramki odczytu (ryc. 15.2). Światło ultrafioletowe i promieniowanie jonizujące. Światło ultrafioletowe (UV), promieniowanie X i inne rodzaje promieniowania jonizującego działają na mikroorganizmy zarówno letalnie, jak i mutagennie. Mechanizm tego działania nie jest jeszcze w pełni poznany. Znaczna współzależność między widmem absorbowanym przez kwasy nukleinowe a widmem mającym efekt letalny i mutagenny sugeruje, że to właśnie kwas nukleinowy jest celem ataku przez UV. Bliski ultrafiolet, około 260 nm, jest najbardziej aktywny (ryc. 15.3). Toksyczne działania uboczne prawie nie występują. UV niszczy głównie zasady pirymidynowe. Dwie

550

tyminy sąsiadujące ze sobą zostają połączone wiązaniami kowalencyjnymi. Takie dimery tyminowe mogą następnie powodować błędy replikacyjne (ryc. 15.4). Transpozony. Mutageneza transpozonowa staje się obecnie techniką standardową w genetyce bakterii. Transpozony (elementy Tn) są stosunkowo krótkimi odcinkami dwunicowego DNA, zawierającymi więcej niż 2000 par zasad. Kodują one zazwyczaj cechę oporności na jeden lub więcej antybiotyków. Transpozony mają zdolność przemieszczania się lub skoku w obrębie genomu, a nawet między chromosomem bakteryjnym a plazmidem, mają również zdolność do wstawienia się w różne miejsca genomu (patrz podrozdz. 15.2.1 dotyczący rekombinacji genetycznej). Wstawienie transpozonu w gen strukturalny przerywa normalną sekwencję nukleotydów i sprawia, że gen nie może służyć jako nośnik informacji dla syntezy normalnego, funkcjonalnego polipeptydu. Jak widać, transpozony są głównie przyczyną powstawania mutantów insercyjnych. Transpozony nie mogą replikować się autonomicznie, a ich przeniesienie między komórkami wymaga nośnika (wektora). Plazmidy i bakteriofagi świetnie służą temu celowi. Tu należy wspomnieć, że bakteriofag

551

Mu (fag mutator), którego gospodarzem jest Escherichia coli, włącza się w liczne miejsca chromosomu bakteryjnego, indukując mutacje, tak jak to czynią transpozony. Fag Mu znany jest nawet pod nazwą „transpozonu olbrzyma" i może być użyty jako czynnik mutagenny różnych szczepów E. coli. Mutageneza ukierunkowana. Opisana powyżej mutageneza in vivo prowadzi do mutacji przypadkowych. Obecnie, dzięki metodom rekombinacji i sekwencjonowania DNA oraz syntezy oligonukleotydów, jest możliwa bezpośrednia indukcja mutacji in vitro (podrozdz. 15.5). Molekularny wynik zabiegu jest z góry zaplanowany i opiera się na tworzeniu delecji, insercji lub podstawień w określonych miejscach DNA (patrz podrozdz. 15.2). Zmutowany w ten sposób gen może być ponownie wprowadzony do komórki z użyciem wektora (plazmidu lub faga), stwarzając możliwość analizy następstw określonej mutacji. Materiały i metody stosowane w mutagenezie in vitro zostaną omówione w części dotyczącej technik klonowania molekularnego (podrozdz. 15.5).

15.1.5. Wyrażanie się i selekcja poszczególnych fenotypów mutantów Wyrażanie się mutacji. Wyrażenie się mutacji jest konsekwencją licznych następujących po sobie zdarzeń, które mogą zachodzić w trakcie kilku podziałów komórkowych, zależnie od komórki i rodzaju mutacji. Tak więc, w przypadku mutacji prowadzącej do „zyskania" jakiejś cechy, np. rewersji niwelującej konieczność zewnętrznego dostarczania aminokwasu (auksotrofizm) i przywracającej zdolność do jego syntezy (prototrofizm), zmiana genotypowa może znaleźć natychmiastowe odzwierciedlenie w fenotypie, jeśli zostaną spełnione określone warunki. Z drugiej strony, mutacja prowadząca do utraty jakiejś cechy, np. mutacja powodująca auksotrofizm, a więc brak zdolności do syntezy jakiegoś aminokwasu, może być wyrażona dopiero po upływie wielu generacji. U podstawy opóźnionego fenotypowego wyrażania się tego typu mutacji leży obecność i funkcjonowanie enzymu(ów) uprzednio istniejących w komórce, nawet gdy synteza nowych cząstek jest zahamowana. Zmutowana cecha może się ujawnić dopiero wówczas, gdy wewnątrzkomórkowa pula enzymu zostanie „rozcieńczona", co zachodzi w ciągu kilku podziałów komórkowych. Mutacje prowadzące do zyskania jakiejś cechy można również odróżnić od mutacji powodujących utratę cechy w komórkach zawierających kilka chromoso-

552

mów. Escherichia coli rosnąca intensywnie w podłożu bogatym zawiera zazwyczaj cztery chromosomy (rozdz. 2.2.1). Mutacja prowadząca do zyskania cechy jest zwykle dominująca i powoduje natychmiastowe wyrażenie się nowego fenotypu. Przeciwnie, mutacja pociągająca za sobą utratę cechy ma charakter recesywny w komórce zawierającej kilka chromosomów. W trakcie podziałów komórkowych chromosomy zostają rozdzielone między komórki potomne (segregacja chromosomów, ryc. 15.5). Defekt genetyczny może być wyrażony jedynie w komórce, której chromosom jest nośnikiem zmutowanego genu. Potomstwo takiej komórki stanowi klon genetyczny.

Selekcja mutantów. Mutanty oporne na antybiotyki, toksyny lub bakteriofagi mogą być łatwo zidentyfikowane (tab. 15.2). Obecność czynników selekcyjnych pozwala na przeżycie jedynie mutantów opornych, eliminując komórki dzikiego typu. Na podstawie zmian zabarwienia, formy kolonii lub innych cech fenotypowych uwidoczniających się na standardowych podłożach stałych, można odróżnić stosunkowo niewiele mutacji. Zmianę innych cech można zaobserwować po dodaniu do podłoża odpowiednich wskaźników lub barwników. Identyfikacja mutantów różniących się od swych rodziców zwiększonymi lub zmniejszonymi wymaganiami pokarmowymi wymaga porównania ich wzrostu na różnych podłożach. Na przykład, utrata zdolności do syntezy aminokwasu leucyny sprawia, że wzrost mutanta jest możliwy tylko na podłożu z leucyną. Taki typ mutanta (Leu ) nazywamy auksotrofem wymagającym leucyny (inne nazwy: mutant defektywny, mutant wadliwy). Typ dziki (Leu + ) nie

553

554

wymagający dodania leucyny do podłoża nazywa się prototrofem. Mutanty Leu mogą być odróżnione od komórek Leu+ obecnych w tej samej zawiesinie przez porównanie ich wzrostu na dwóch różnych podłożach. Standardowa technika pozwalająca na identyfikację mutantów auksotroficznych jest zilustrowana na rycinie 15.6. Wzbogacanie puli mutantów. Jak już stwierdzono w poprzedniej części tego rozdziału, tempo mutacji wielu cech jest raczej niskie i dla większości dotychczas badanych cech metabolicznych i fizjologicznych wielkość ta -5 -10 waha się w granicach od 10 do 10 . Częstość występowania mutacji 8 rzędu 10- wymagałaby przebadania 100 milionów komórek potomnych w celu znalezienia jednego mutanta. Nawet po zastosowaniu mutagenów zwiększających w sposób istotny zarówno tempo mutacji, jak i częstość ich występowania, wysiłek i czas poświęcony na ich zbadanie byłyby ogromne. Zabiegi zmierzające do zwiększenie puli mutantów stosowane przed ich selekcją czynią tę ostatnią znacznie łatwiejszą. Wzbogacenie mutantów auksotroficznych opiera się na poddaniu hodowli działaniu warunków uniemożliwiających wzrost mutantów i jednocześnie zabijających lub w inny sposób eliminujących rosnące komórki

555

dzikiego typu. Do tego selektywnego eliminowania stosuje się związki działające jedynie na rosnące komórki i pozostające bez wpływu na komórki w stadium spoczynku. Po usunięciu związku eliminującego i dodaniu wymaganego czynnika wzrostowego, żywe komórki auksotrofa mogą się namnożyć. Penicylina lub jej pochodna ampicylina są stosowane do wzbogacenia puli mutantów auksotroficznych E. coli. Antybiotyki te dodane do pożywki dla organizmu prototroficznego (to jest bez związku, którego wymaga do wzrostu auksotrof) zabijają komórki dzikiego typu, podczas gdy nie rosnące mutanty przeżywają (ryc. 15.7). Po indukcji mutantów i następującym po tym wzroście hodowli na pożywce pełnej, zawiesinę bakterii inkubuje się przez kilka godzin w roztworze zawierającym glukozę, lecz bez źródła azotu, w celu pozbawienia komórek rozpuszczalnych związków azotowych. Następnie dodaje się penicylinę, siarczan amonu i inkubuje przez dalsze 24 godziny. Prototroficzne komórki rodzicielskie zdolne do wzrostu w tych warunkach zostają zabite przez penicylinę, natomiast komórki auksotrofa nie mogą rosnąć w tych warunkach i,

556

w związku z tym, nie są podatne na działanie penicyliny. Inne antybiotyki (nowobiocyna, cykloseryna, kolistyna, kanamycyna) znajdują zastosowanie w przypadku bakterii opornych na penicylinę. Odmienne metody eliminowania rosnących komórek wykorzystują tzw. „letalną syntezę".

Wiele typów mutantów może być wzbogacanych i izolowanych wyżej opisanymi lub podobnymi metodami (ryc. 15.8). Należy tu wymienić

mutanty mające defekt transportu i katabolicznego rozkładu substratów, mutanty z zaburzonym metabolizmem pośrednim, mutanty temperaturowrażliwe (warunkowo letalne) itp. Techniki izolowania komórek z zaburzoną regulacją metabolizmu są opisane poniżej, a przegląd metod izolacji i selekcji niektórych typów mutantów, łącznie z kilkoma mutantami regulatorowymi, jest przedstawiony w tabeli 15.2.

15.1.6. Naprawa DNA DNA narażony jest ciągle na działanie komórkowych enzymów które mogą go uszkodzić (alkilacja, depurynacja, pęknięcie wiązań), oraz na wysoko- i niskoenergetyczne promieniowanie (światło, radioaktywne izotopy w skałach, budynkach, pokarmie). Życie rozwija się od przeszło miliardów lat w obecności tego promieniowania. Byłby więc wielce zadziwiający brak wykształcenia komórkowych mechanizmów naprawy. •..

557

Mechanizmy takie istnieją i są w większości przypadków indukowane. Organizmy, które zetknęły się z subletalną dawką czynników niszczących DNA, w konsekwencji stają się na nie bardziej oporne niż organizmy nigdy nie narażone na działanie tych czynników. W rozdziale tym opisano jedynie trzy z licznych znanych sposobów naprawy DNA. Naprawa zachodząca w obecności światła (fotoreaktywacja) i w ciemności. Odkrycie zdolności do naprawy przynajmniej części uszkodzeń DNA jest związane z działaniem promieni UV na bakterie. Po naświetleniu zawiesiny bakteryjnej dużą dawką UV i następnie inkubacji w ciemności, tylko mały odsetek komórek zachowuje zdolność do tworzenia kolonii. Przeciwnie, jeżeli bakterie po naświetleniu UV poddamy działaniu światła o dłuższych falach (320-384 nm), procent przeżywających komórek wzrasta o kilka rzędów wielkości. Ta fotoreaktywacja zachodzi z udziałem enzymu fotoliazy, który, czerpiąc energię ze światła o dłuższych falach, rozszczepia dimery tyminy na monomery (ryc. 15.4). W ten sposób następuje powrót do stanu wyjściowego, a naprawa jest bezbłędna. Drugi, równie bezbłędny sposób naprawy uszkodzeń powodowanych promieniowaniem nie wymaga światła. Ta ciemna reaktywacja polega na wycięciu uszkodzonego kawałka nici DNA (naprawa przez wycięcie) i zastąpieniu go nowymi nukleotydami. Proces ten jest katalizowany przez korekcyjną endonukleazę, która jest przykładem kompleksu enzymatycznego złożonego z produktów genów uvrA, Β i C. Skuteczność naprawy uszkodzeń radiacyjnych zależy od szczepu bakterii. Oporność niektórych bakterii, np. Deinococcus radiodurans, na promieniowanie jest związana z wysoce wydajnym systemem naprawy. Naprawa SOS. Silne uszkodzenie DNA przez duże dawki czynników mutagennych lub promieniowania, bądź też w wyniku zahamowania replikacji przez niektóre antybiotyki, jak nowobiocyna lub mitomycyna C, wyzwalają alarmową reakcję komórki, zwaną odpowiedzią SOS. Istotne zmiany komórkowe związane z tą odpowiedzią obejmują między innymi: namnożenie umiarkowanych fagów (podrozdz. 4.2.2), opóźnienie w podziale komórkowym, spadek intensywności procesów oddechowych, wzmożony rozpad białek i w końcu indukcję syntezy enzymów biorących udział w naprawie. Cały proces jest regulowany przez dwa białka: LexA i RecA. W warunkach normalnych, RecA bierze udział w genetycznej rekombinacji opisanej w dalszej części tego rozdziału (podrozdz. 15.2).

558

LexA natomiast jest białkiem wiążącym się z DNA (białkiem represorowym), które, łącząc się z regionem operatora, hamuje transkrypcję. LexA działa jako represor licznych funkcji komórkowych objętych odpowiedzią SOS indukowaną przez wzrost frakcji jednoniciowego DNA. LexA traci swą funkcję represora w wyniku proteolitycznego cięcia niszczącego jego zdolność do wiązania się z DNA. Proteoliza jest wspomagana przez białko RecA, które samo nie ma jednak zdolności proteolitycznych. Wyniki ostatnich badań wykazały, że naprawa SOS różni się od uprzednio opisanej naprawy konstytutywnej dużą ilością pomyłek i dlatego stanowi przykład naprawy błędnej. Ta błędna naprawa jest przyczyną wielu mutacji indukowanych przez UV. Powyższa informacja jest istotna dla chemoterapii nowotworów, ponieważ stosowane tu związki hamują replikację DNA, a w konsekwencji podział komórkowy, ale powodują zarazem znaczne uszkodzenia z uwagi na swój efekt mutagenny.

15.1.7. Test na aktywność mutagenną Prawie wszystkie związki działające na DNA, a zarazem rakotwórcze, są równocześnie mutagenami. W ciągu roku syntetyzuje się sztucznie około

559

500-1000 nowych substancji. Uprzednio stosunkowo trudno było zidentyfikować wśród nich związki rakotwórcze, gdyż wiarygodne oznaczenia wymagałyby praco- i czasochłonnych badań z użyciem zwierząt laboratoryjnych. Ames i współpracownicy opracowali bakteriologiczną metodę pozwalającą na wykrycie uszkodzeń DNA powodowanych przez daną substancję, co wskazuje na jej potencjalne właściwości rakotwórcze. Założenia testu przedstawiono na rycinie 15.9. Oryginalny test Amesa został zmodyfikowany w celu zwiększenia jego czułości i wiarygodności. Zaczęto stosować komórki niosące liczne mutacje, które sprawiają, że są one szczególnie wrażliwe na działanie mutagenów, czego powodem jest brak mechanizmów naprawy DNA, a więc możliwości usunięcia uszkodzenia. Zdolność badanej substancji do indukcji profaga w lizogennej bakterii również wskazuje na jej właściwości mutagenne. Metodę tę, pozwalającą ograniczyć eksperymenty na zwierzętach, stosuje się obecnie szeroko w świecie. Badanie to jest wiarygodne; na 100 związków ponad wszelką wątpliwość mutagennych, dla 84 potwierdzono pozytywny wynik w teście z zastosowaniem Salmonella typhimurium, a dla 91 — w teście z Escherichia coli.

15.2. Przekazywanie cech i rekombinacja genetyczna W organizmach eukariotycznych pojedyncze, kompletne zestawy genów spotykają się w zygocie powstałej w wyniku zapłodnienia. Diploidalna zygota przechodzi kilka podziałów mitotycznych, po czym może nastąpić zarówno rekombinacja genetyczna, jak i redukcja genów do pojedynczego zestawu (w wyniku mejozy). Utworzone tą drogą gamety są haploidalne. Nowe kombinacje genów powstają tu w wyniku rozmnażania płciowego, odmiennego od paraseksualnych procesów, do których należy rekombinacja cech u organizmów prokariotycznych. Bakterie są prawie zawsze haploidalne, a więc mają tylko jeden zestaw genów. Mogą one tworzyć zygoty, ale nigdy przez fuzję całych komórek. Zazwyczaj jedynie część materiału genetycznego komórki dawcy zostaje przeniesiona do komórki biorcy (akceptora), z wytworzeniem niepełnej zygoty (merozygoty). Chromosom biorcy i część chromosomu dawcy łączą się w parę i wymieniają między sobą odcinki. Następne podziały chromosomów i komórek prowadzą do powstania potomstwa zawierającego zrekombinowane chromosomy (ryc. 15.10).

560

Rozróżniamy trzy rodzaje przekazywania cech u bakterii: koniugację, transdukcję i transformację. W wyniku każdego z tych procesów DNA zostaje przeniesiony z komórki dawcy do biorcy. Te trzy procesy różnią się między sobą jedynie sposobem przeniesienia. Rekombinacja DNA w komórce biorcy następuje natychmiast po wejściu materiału genetycznego, a jej wynikiem jest włączenie DNA dawcy do DNA biorcy. Komórka, w której nastąpiła rekombinacja, nazywa się rekombinantem.

15.2.1. Rekombinacja genetyczna Zgodnie z obecnym stanem wiedzy, istnieją dwa różne mechanizmy, za pomocą których obcy DNA pobrany przez komórkę bakteryjną może zostać włączony do chromosomu lub plazmidu, są to: 1) rekombinacja ogólna lub homologiczna i 2) rekombinacja zależna od miejsca lub sekwencji, zwana również rekombinacją zlokalizowaną (np. integracja faga lambda). Rekombinacja ogólna proces, w którym obcy do DNA gospodarza sekwencji, pęknięcie i

lub homologiczna. Terminem tym określamy DNA znajdujący się w komórce zostaje włączony przez połączenie się w pary homologicznych krzyżową wymianę (crossing-over) (ryc. 15.10). 561

Warunkiem koniecznym tego procesu jest istnienie długiego obszaru homologii sekwencji w DNA dwóch partnerów. Wiadomo jednak, że niewielkie różnice sekwencji, na przykład powstałe w wyniku mutacji, bywają tolerowane. Homologiczna rekombinacja może więc zachodzić między DNA dzikiego typu i DNA mutanta. Rekombinację ogólną katalizuje co najmniej sześć enzymów mających również znaczenie w reperacji DNA (podrozdz. 15.1.6) i/albo w replikacji DNA (podrozdz. 2.2.1). Najważniejszym z nich jest RecA. Uproszczony schemat molekularnego mechanizmu rekombinacji przedstawiono na rycinie 15.10. Rekombinacja zależna od określonego miejsca lub sekwencji. Ten rodzaj rekombinacji, w przeciwieństwie do rekombinacji ogólnej, wymaga jedynie krótkiego odcinka homologii DNA koniecznej do rozpoznania się partnerów. Rekombinacja ta nie jest katalizowana przez białko RecA, lecz przez enzymy swoiste dla rekombinujących cząsteczek DNA. Jeśli sekwencja wymagana do rozpoznania znajduje się w dwóch partnerach, mamy do czynienia z „rekombinacją określoną przez dwa miejsca" (double site-specific). Przykładem tego typu rekombinacji jest integracja (włączenie) bakteriofaga lambda (ryc. 15.11) i plazmidu płciowego F (ryc. 15.18) do chromosomu E. coli. Obecność rozpoznawanej sekwencji tylko w jednej cząsteczce DNA prowadzi do rekombinacji „określonej przez jedno miejsce" (single site-specific), która jest związana z ruchomymi elementami genetycznymi (sekwencje insercyjne, transpozony, bakteriofag Mu) omówionymi w dalszych częściach. Jak wykazały doświadczenia genetyczne, przejście faga lambda w stadium profaga jest związane z jego integracją w określone miejsce chromosomu E. coli, między operonami gal i bio (ryc. 15.11). Insercja jest zapoczątkowana przez nici DNA będące w ścisłym kontakcie. Poprzednio

562

uważano, że kontakt ten wymagał długiej sekwencji homologicznej w obrębie kontaktujących się odcinków attP i attB, Teraz wiadomo, że homologiczne segmenty DNA są krótkie, obejmują jedynie 15 par zasad (p.z.) i służą jednocześnie jako sekwencje rozpoznawane przez integrazę. W regionie tym integraza działa podobnie do endonukleaz restrykcyjnych i przecina fagowy oraz bakteryjny dwuniciowy DNA. Prowadzi to do powstania dwóch przesuniętych końców, które po przekrzyżowaniu zostają ponownie połączone przez ligazę. Integracja faga jest procesem odwracalnym, wycięcie wymaga jednak dodatkowego udziału innego fagowego enzymu, produktu genu xis. Oba procesy, wbudowanie się faga i jego wycięcie, wymagają współdziałania białka gospodarza zwanego „integracyjnym czynnikiem gospodarza" (ang. integration host factor, IHF). Wzajemne oddziaływanie białka IHF, produktu genów himA i hip, z DNA jest bardzo dobrze poznane. Sekwencje insercyjne. Sekwencje insercyjne zwane elementami IS (ang. insertion sequences) należą do elementów genetycznych zdolnych do transpozycji. Mogą się one włączać w wiele miejsc genomu bakteryjnego bez spełnienia warunku homologii sekwencji. Zdolność ta warunkuje ich wielką ruchliwość. Sekwencje IS były odkryte wskutek ich zdolności do indukcji spontanicznych mutacji w E. coli powodowanych przerwaniem naturalnej sekwencji genów w wyniku insercji IS (podrozdz. 15.1.3). IS

563

są obecne w bakteryjnym chromosomie, plazmidach i fagach, jak również w komórkach organizmów eukariotycznych i w wirusach. Składają się one z 800-1400 p.z. i wydaje się, że kodują funkcje fenotypowe związane tylko z własną transpozycją. Na końcach elementów IS znajdują się istotne dla procesu transpozycji proste lub odwrócone „powtórzenia", którym to mianem określamy powtórzenia sekwencji komplementarnej w prostej lub odwróconej polarności. Transpozycja jest katalizowana przez transpozazę kodowaną przez element IS, rozpoznającą niektóre regiony dwuniciowego DNA (docelowego DNA) i końce elementu IS, a następnie przecinającą z przesunięciem obie nici DNA (ryc. 15.12). Elementy IS odnajdują i włączają się w przecięty DNA docelowy. Prowadzi to do podwojenia par nukleotydów w miejscu insercji. Przyjmuje się, że elementy IS spełniają ważną rolę w zmianie ułożenia i w rekombinacji genów. Transpozony. Transpozony (skrót Tn) są następnym przykładem ruchomych elementów genetycznych, a ich zdolność do transpozycji może być przyczyną mutacji. Czasami nazywamy je „skaczącymi genami". W przeciwieństwie do elementów IS, transpozony kodują łatwe do uchwycenia cechy fenotypowe, na przykład oporność na penicylinę, tetracyklinę, kanamycynę i oporność na metale ciężkie takie jak rtęć. Transpozonowe geny oporności są otoczone z dwóch stron dwoma elementami IS, których umiejscowienie można uwidocznić przez analizę zdjęć heterodupleksu wykonanych w mikroskopie elektronowym (ryc. 15.13). „Skok" lub

564

transpozycja transpozonu jest związana przeważnie z jego replikacją, co powoduje trwałą obecność tego elementu w oryginalnym miejscu połączenia. Jeden z modeli transpozycji zakłada, że podwojenie transpozonu łączy się z wytworzeniem kontaktu z docelowym DNA i z powstaniem przejściowej formy kointegratu oryginalnego nośnika transpozonu i nowego miejsca docelowego. To przejściowe połączenie rozpada się w wyniku działania enzymu zwanego resolwazą, a efektem końcowym procesu są dwie cząsteczki DNA, z których każda niesie kopię transpozonu. Bakteriofag Mu. Bakteriofag Mu, podobnie do elementów IS i transpozonów, ma zdolność do integracji przez transpozycję. Nazwa Mu jest skrótem słowa „mutator" i wskazuje na zdolność faga do indukcji mutacji w genomie gospodarza. Można go porównać do olbrzymiego transpozonu. Podobne właściwości mają retrowirusy zwierzęce (rozdz. 4.3). Transpozycja jest niezbędna w litycznym namnażaniu się faga, którego DNA nie może się replikować poza genomem bakteryjnym. Inwersja genu (odwrócenie jego orientacji, przyp, tłum.) jest inną ciekawą właściwością faga Mu. Proces ten, wykorzystujący umiejscowioną rekombinację, zwaną tu inaczej mechanizmem „flip—flop", prowadzi do zmiany ułożenia ściśle określonego odcinka DNA fagowego, zwanego segmentem G. Segment G koduje informację dla białka włókna ogonka. W jednej orientacji segmentu G +, tworzą się białka S i U, a fag może zakażać bakterię E. coli K12. W odwróconej orientacji G~ są transkrybowane geny S' i U', a proces transkrypcji rozpoczyna się z innego promotora i z komplementarnej nici DNA. Te inne białka ogonka powodują zmianę zakresu gospodarza i adsorpcję faga na komórkach E. coli C i innych bakterii jelitowych. Inwersja genów jest odpowiedzialna również za zmianę białek, składników rzęski Salmonella.

15.2.2. Transformacja Transformacją nazywamy przekazanie genów w formie rozpuszczalnego DNA wyekstrahowanego lub uwolnionego z komórki dawcy za pomocą innych metod. Ten sposób przekazania genów między bakteriami został wykryty jako pierwszy i historycznie ma największe znaczenie. Odkrycie DNA jako nośnika cech dziedzicznych. W 1928 r. Griffith opisał zmianę bezotoczkowego szczepu R Streptococcus pneumoniae

565

w szczep S posiadający otoczkę (ryc. 15.14). Wstrzyknął on myszom małą ilość niezjadliwych komórek R wraz z zabitymi termicznie komórkami S. Komórki R pochodziły od innego szczepu S (SII), którego otoczka dała się łatwo odróżnić za pomocą metod serologicznych od otoczki zabitego termicznie szczepu S (SIII). Po pewnym czasie można było izolować z myszy zjadliwe ziarniaki mające otoczki typu SIII. Wydawało się więc, że zabite komórki SIII przekazały cechę warunkującą tworzenie się otoczek do komórek R, które z kolei mogły przekazać ją potomstwu. W 1944 r. Avery, Macleod i McCarthy wykazali, że transformującym czynnikiem w opisanym doświadczeniu był DNA. Transformacja dostarczyła niezbitego w tamtym czasie dowodu wskazującego na lokalizację genetycznej informacji w DNA, nie zaś w białkach. Metody transformacji. Obecnie istnieje kilka metod doświadczalnych znajdujących zastosowanie w przekazaniu izolowanego DNA do bakterii: 1) wykorzystanie naturalnej zdolności (kompetencji) niektórych gatunków bakterii do pobierania obcego DNA; 2) indukcja kompetencji przez specjalne, przedtransformacyjne zabiegi; 3) protoplastyzacja komórek; 4) elektroporacja. 1) Naturalna zdolność bakterii do pobrania DNA, zwana kompetencją, została opisana u licznych rodzajów bakterii, jak: Acinetobacter, Azotobacter, Bacillus, Haemophilus, Mycobacterium, Neisseria, Pseudomonas, Streptococcus i Synechococcus. W ten sposób mogą być przekazane cechy prototrofizmu lub oporności na antybiotyki. Kompetencja zależy od stanu 566

fizjologicznego komórek i od fazy wzrostu. Zarówno moment rozwinięcia, jak i długość stanu kompetencji różnią się między gatunkami. Kompetentne komórki mają zmienione warstwy powierzchniowe, ściana komórkowa staje się porowata, aktywność zewnątrzkomórkowych enzymów zwiększa się i następuje synteza „czynnika kompetencji", który zostaje wydzielony do podłoża. Czynnik ten powoduje zmiany we właściwościach komórki charakterystyczne dla stanu kompetencji. Do transformacji potrzebne jest bardzo małe stężenie DNA, już 0,1 mikrograma na mililitr zawiesiny komórek wystarcza do transformowania biorcy — maksimum 5% populacji. Transformacyjny DNA musi być dwuniciowy, jego wielkość powinna przekraczać określone minimum, jest on również pocięty przez zewnątrzkomórkową nukleazę na fragmenty, których długość wynosi około 15 tys. par zasad. Podczas pobierania transformującego DNA jedna z jego nici zostaje strawiona, a więc tylko pojedyncza, pozostała nić wchodzi do wnętrza komórki. Jeśli warunek wystarczającej homologii sekwencji jest spełniony, DNA zostaje włączony do genomu biorcy, co zachodzi według mechanizmu rekombinacji ogólnej (patrz podrozdz. 15.2.1). 2) Indukcja kompetencji drogą specjalnych zabiegów laboratoryjnych jest stosowana z powodzeniem w przypadku komórek niezdolnych do naturalnej transformacji. Większość metod doświadczalnych polega na ściśle określonych zmianach warunków hodowli bakteryjnej. Tak więc, E. coli może być z powodzeniem transformowana z wydajnością 0,05 transformanta na jedną komórkę przeżywającą procedurę po potraktowaniu chlorkiem wapnia komórek przechowywanych w niskiej temperaturze. Metoda ta ma bardzo duże znaczenie, choćby z uwagi na powszechne zastosowanie E. coli w technikach klonowania molekularnego (podrozdz. 15.5). 3) Transformację protoplastów stosuje się głównie w bakteriach gramdodatnich, na przykład z rodzaju Bacillus lub Streptomyces. Pozbawione ściany komórkowej protoplasty tych organizmów, po potraktowaniu ich polietylenoglikolem, zdolne są do pobrania plazmidowego DNA (podrozdz. 15.3). Przeciwnie, bezpośrednia fuzja protoplastów jest niezbędna do przekazania chromosomowego DNA. Prowadzi to do połączenia części genomów obu komórek rodzicielskich, a następnie w odpowiednich warunkach doświadczalnych może zostać odtworzona komórka mutanta (rekombinanta) zdolna do życia. Rekombinanty, które powstały w wyniku fuzji i następnie homologicznej rekombinacji, mają cechy obu rodziców. 567

4) Trudności doświadczalne i niezadowalająca częstość transformacji innych organizmów z zastosowaniem wyżej wymienionych technik doprowadziły do wynalezienia nowej metody zwanej elektroporacją. Metodę tę, wpływającą na przepuszczalność błon biologicznych i prowadzącą do ich fuzji pod wpływem pola elektrycznego, po raz pierwszy zastosowano do komórek eukariotycznych, na przykład do hybrydyzacji komórek roślinnych. Okazało się, że te same, dostępne w sprzedaży przyrządy mogą być użyte do transformacji plazmidowym DNA wielu gatunków bakterii, zarówno gramdodatnich, jak i gramujemnych.

15.2.3. Transdukcja Przeniesienie DNA z komórki dawcy do biorcy przez bakteriofaga nazywamy transdukcją. Zazwyczaj zostaje przeniesiony tylko mały fragment DNA gospodarza (tj. dawcy). Rozróżniamy dwa rodzaje transdukcji: niespecyficzną (ogólną), gdy każdy segment DNA gospodarza może zostać przeniesiony, i specyficzną, ograniczoną do przekazania określonych segmentów DNA. W transdukcji ogólnej fragment DNA gospodarza zostaje włączony do cząsteczki wirusa albo jako odcinek dodatkowy, albo zastępując genom fagowy. W transdukcji specyficznej tylko niektóre geny fagowe są zastąpione przez geny gospodarza. W obu przypadkach fagi transdukujące są zazwyczaj poronne, na przykład często tracą zdolność do lizy komórek gospodarza. Przeniesienie cech genetycznych metodą transdukcji opisano dla wielu bakterii, włączając gatunki z rodzajów Salmonella, Escherichia, Shigella, Bacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Vibrio i Rhizobium. Nie wszystkie jednak fagi mają zdolność do transdukcji i nie każdą bakterię można transdukować. Transdukcja ogólna. Przeniesienie genów bakteryjnych za pośrednictwem faga zostało wykryte przez Lederberga i Zindera w 1951 roku. W podstawowym doświadczeniu (ryc. 15.15) szczep dawcy B+ zainfekowano umiarkowanym fagiem P22. Po lizie gospodarza oddzielono cząstki uwolnionego faga i dodano je do zawiesiny szczepu biorcy B~ różniącego się od szczepu B+ przynajmniej jedną cechą genetyczną. Rekombinanty, które wyrosły na selektywnej pożywce, zawierały marker genetyczny pochodzący ze szczepu dawcy B+. Na przekazanie DNA w drodze ogólnej transdukcji składa się szereg

568

skomplikowanych procesów. Podczas litycznego namnażania się faga w szczepie dawcy, fragmenty poszatkowanego DNA gospodarza mogą być przypadkowo włączone do główek fagowych w miejsce fagowego DNA. Lizaty fagowe składają się więc z mieszaniny fagów normalnych i defektywnych. Zakażenie biorcy przez normalną cząstkę fagową kończy się zazwyczaj jej lizą. Kilka komórek może jednak zostać zainfekowanych defektywnymi fagami transdukującymi, których DNA jest zdolny do rekombinacji z chromosomem biorcy. W wyniku wymiany homologicznych odcinków DNA następuje podstawienie uszkodzonego genu biorcy przez nienaruszony gen dawcy. Prawdopodobieństwo zajścia rekombinacji jednej określonej cechy 6 8 jest bardzo małe, rzędu od 10~ do 10~ na jedno zdarzenie transdukcyjne (tj. przez jedną cząstkę faga transdukującego). Wielkość DNA fagów transdukcji ogólnej, faga P22 i Pl, których gospodarzami są odpowiednio Salmonella typhimurium i Escherichia coli, wynosi około 1-2% wielkości chromosomu bakteryjnego; fakt ten tłumaczy przenoszenie przez te fagi podczas transdukcji jedynie genów sąsiadujących ze sobą. Fag PBS1 Bacillus subtilis jest wyjątkiem, może transdukcyjnie przenosić 8% genomu gospodarza. Transdukcja specyficzna. Fag λ jest najlepiej znanym przykładem faga transdukcji specyficznej. Lambda zazwyczaj przenosi określone geny należące do operonów gal (wykorzystanie galaktozy) i bio (synteza 569

biotyny). Przejście λ w stadium profaga wiąże się z integracją faga w określone miejsce chromosomu gospodarza, właśnie między genami gal a bio. W pewnych warunkach, np. po naświetleniu promieniami UV, czego wynikiem jest indukcja faga, zachodzi nieprecyzyjne wycięcie profaga z chromosomu. Fag może wówczas zostawić kawałek własnego DNA w chromosomie, włączyć natomiast fragment sąsiadującego DNA gospodarza, który może być następnie uwalniany z komórki wraz z DNA fagowym. Po infekcji takim transdukującym fagiem komórki biorcy z uszkodzonym genem, np. gal , nienaruszony gen wprowadzony drogą transdukcji może zamienić uszkodzony gen gospodarza. Wszystkie powstałe tą drogą rekombinanty są gal+. Podobnie są przekazywane geny przez faga j80 którego DNA włącza się w chromosom w pobliżu genów kodujących zdolność do biosyntezy tryptofanu. Fag j80 może więc przenosić geny trp. Przeniesienie genów metodą specyficznej transdukcji (w przeciwieństwie do transdukcji ogólnej) przeważnie jest związane z włączaniem się faga do chromosomu.

15.2.4. Koniugacja Przekazywanie materiału genetycznego z komórki do komórki w drodze ich bezpośredniego kontaktu nazywamy koniugacją. Już od dłuższego czasu przesłanki związane z morfologią komórek sugerowały możliwość łączenia się bakterii w pary. Ostatecznego dowodu na przeniesienie DNA przez bezpośredni kontakt komórek dostarczyło dopiero doświadczenie z zastosowaniem wielokrotnych mutantów jako partnerów koniugacyjnych. Ten decydujący eksperyment został wykonany w 1946 r. przez Lederberga i Tatuma, którzy zastosowali dwa szczepy E. coli, a każdy szczep był podwójnym auksotroficznym mutantem w dwóch różnych genach (ryc. 15.16). Jeden z tych podwójnych mutantów był auksotrofem względem cechy A i B, ale mógł syntetyzować aminokwasy C i D (A ~ B ~ C + D + ). Drugi mutant uzupełniał pierwszego (A + B + C ~ D ~ ) . Żaden z mutantów nie mógł rosnąć, ani wytwarzać kolonii na podłożu minimalnym (bez aminokwasów), natomiast mieszanina dwóch mutantów miała zdolność do tworzenia kolonii na tym minimalnym podłożu. Komórki pochodzące z tych kolonii syntetyzowały wszystkie cztery aminokwasy, a więc genetycznie były typu A + B + C + D + (tj. prototroficzne). Powstały one

570

z częstością 1 na 106 i z powodu obecności mieszanej informacji genetycznej pochodzącej od dwóch zmutowanych typów rodzicielskich zostały nazwane rekombinantami. Użycie wielokrotnych mutantów jako partnerów koniugacyjnych wyklucza możliwość powstania rewertantów. 14 Prawdopobieństwo jednoczesnej rewersji dwóch genów jest rzędu 10-16 do 10 na generację. Jednokierunkowe przekazywanie DNA od dawcy do biorcy. Doświadczenia podwójnego krzyżowania partnerów, z których tylko jeden był zawsze oporny na streptomycynę, pokazały, że materiał genetyczny przekazywany jest zawsze jednokierunkowo. Po koniugacji każda mieszanina bakteryjna została wysiana na agar ze streptomycyną. Rekombinanty powstały jedynie wtedy, gdy szczep biorcy był streptomycynooporny, a więc zdolny do przeżycia selekcji. Wrażliwość komórek dawcy na streptomycynę nie miała natomiast znaczenia dla powstania rekombinantów, przy założeniu, że informacja genetyczna została przekazana już wcześniej. Wyniki tego doświadczenia udowodniły jednokierunkowe przekazanie materiału genetycznego ze szczepu dawcy do biorcy, jak 571

również wykazały, że zarówno rekombinacja, jak i segregacja zachodzi w komórce biorcy. Czynnik F i stan Hfr. Badania procesu tworzenia się par koniugacyjnych udowodniły, że zdolność do pełnienia roli dawcy zależy od obecności ruchomej cząsteczki DNA, czynnika płciowego F (ang. fertility = płodność) w komórce. Czynnik F jest zamkniętą kolistą cząsteczką dwuniciowego DNA o wielkości 100 tys. p.z. i jako pozachromosomowy DNA zdolny do autonomicznej replikacji jest przykładem plazmidu. Zawiera on geny odpowiedzialne za proces koniugacji. Należą tu geny

572

kodujące specjalne struktury na powierzchni komórki, takie jak pilusy F (ryc. 15.17), które są niezbędne do koniugacji. Włosowate pilusy, w liczbie dwóch lub trzech na komórkę, ułatwiają kontakt między komórkami dawcy i biorcy, prowadząc do powstania tzw. „krzyżowych agregatów" co umożliwia jednoczesny kontakt dawcy z kilkoma biorcami. DNA czynnika F penetruje komórkę biorcy po częściowym złączeniu się komórek krzyżujących się partnerów. Tylko nieliczne bakterie w populacji F+ mogą przekazać chromosomowy DNA. Cechę tę mają komórki, w których nastąpiła integracja czynnika F do chromosomu (ryc. 15.18). Liczba rekombinantów po-

573

wstałych po koniugacji z tymi dawcami tysiąckrotnie przewyższa liczbę otrzymaną po koniugacji z komórkami F + . Takie komórki nazywamy Hfr (ang. high frequency of recombinants = wysoka częstość rekombinantów). W integracji czynnika F istotną rolę pełnią elementy IS ( patrz podrozdz. 15.2.1) występujące zarówno na plazmidach, jak i w chromosomie E. coli. Umiejscowione na plazmidzie elementy IS2 i IS3 mogą się włączać we wszystkie miejsca chromosomu E. coli, gdzie znajduje się kopia odpowiedniego elementu IS. Integracja zachodzi według mechanizmu homologicznej rekombinacji i jest odwracalna. Inny mechanizm, niezależny od białka RecA, oparty na transpozycji elementów IS, jest również wykorzystywany do połączenia czynnika F z chromosomem. Przeniesienie genów chromosomowych. Po zmieszaniu Hfr z nadmiarem komórek F~ praktycznie każda komórka Hfr może znaleźć partnera i zaangażować się w koniugację. W niezwykle odkrywczym eksperymencie przerywanej koniugacji próbki pobierano w różnych czasach koniugacji, a następnie bardzo silnie wytrząsano je w mikserze w celu rozerwania par koniugacyjnych. Bakterie wysiewano na odpowiednie podłoża stałe, izolowano rekombinanty, a następnie oceniano, które geny zostały przekazane z dawcy do biorcy. Taka analiza ujawniła, że czas przekazania genów jest różny i charakterystyczny dla każdego genu (ryc. 15.18). Czas przekazania genów zgadza się z kolejnością ich ułożenia na chromosomie, ustaloną w wyniku analizy genetycznej. Izolowane niezależnie od siebie szczepy Hfr mają dwie charakterystyczne właściwości. Każdy Hfr przekazuje geny do komórki biorcy z określonego punktu początkowego i w określonym kierunku, przy czym każdy szczep Hfr stanowi homogenną populację komórek z tym samym punktem początkowym i kierunkiem przekazywania. Przekazywaniu DNA towarzyszy jego replikacja rozpoczynająca się w miejscu insercji czynnika F, a koniec 5' nowo syntetyzowanej nici wchodzi jako pierwszy do komórki biorcy (ryc. 15.18). Rekombinacja DNA dwóch partnerów w komórce biorcy (rekombinacja homologiczna) zachodzi natychmiast po przekazaniu DNA z komórki dawcy. Mapa genetyczna. Opisana metoda przerywanej koniugacji, pozwalająca określić czas wejścia poszczególnych genów z komórki dawcy do biorcy, może znaleźć zastosowanie w konstrukcji mapy przedstawiającej wzajemne ułożenie genów na chromosomie (ryc. 15.19). Im dalej od punktu 574

575

początkowego znajduje się dany gen, tym później zostaje on przekazany i rzadziej wchodzi do biorcy w procesie nieprzerwanej koniugacji. Przekazywanie całego chromosomu E. coli trwa około 100 minut. Szybkość przekazywania pozostaje niezmienna w ciągu całego procesu, a więc czas wejścia poszczególnych genów do komórki biorcy zależy od odległości między nimi. Technika ta nie pozwala jednak określić okresów mniejszych niż 1 minuta. Bardziej szczegółowe mapowanie jest możliwe przez zastosowanie transdukcji. Na rycinie 15.19 przedstawiono bardzo uproszczoną mapę genetyczną. Od czasu jej konstrukcji została określona lokalizacja dalszych 1403 genów. Dostępne są również mapy genetyczne chromosomów Salmonella typhimurium, Streptomyces coelicolor, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa i innych bakterii. Rola czynnika F' w przekazywaniu genów. Wbudowanie się czynnika F w chromosom bakteryjny jest odwracalne. Czynnik F może zostać wycięty z chromosomu, co powoduje rewersję Hfr do F+ (ryc. 15.18). Częstość wycięcia jest zbliżona do częstości integracji, a proces przebiega, gdy miejsce wycięcia jest identyczne z miejscem wstawienia. W rzadkich przypadkach miejsca wycięcia i integracji nie pokrywają się, co prowadzi do przyłączenia fragmentu DNA gospodarza do uwolnionego czynnika F. Czynnik F z małym odcinkiem chromosomowego DNA to czynnik F'. Widoczne jest podobieństwo w sposobie powstawania F' i fagów transdukujących (patrz podrozdz. 15.2.3). Komórki zawierające czynnik F" to tzw. pierwotne komórki F'. DNA połączony z czynnikiem F' może być przeniesiony z dawcy F' do biorcy F~ z 100% częstością, tak jak czynnik F ze szczepu F+ do F . Ten sam ~ segment chromosomowego DNA byłby przeniesiony z Hfr do F z częstością wynoszącą jedynie 1%. Przeniesienie czynnika F' z pierwotnej komórki F' do następnej komórki F~ prowadzi do powstania wtórnej komórki F', w której fragment chromosomu bakteryjnego jest podwojony (diploidalny). Koniugacja w innych grupach bakterii. Koniugacyjne przekazywanie genów, po raz pierwszy opisane u E. coli, występuje powszechnie wśród Enterobacteriaceae. Procesy koniugacyjne zachodzą i były intensywnie badane w Streptomyces coelicolor, w gatunkach rodzaju Nocardia i Rhizobium, jak również w innych bakteryjnych gatunkach i rodzajach.

576

Wydaje się, że koniugacyjna wymiana genów i mobilizacja genów przez plazmidy są szeroko rozpowszechnione w królestwie Prokaryota.

15.3. Plazmidy Wiele bakterii może być nośnikami pozachromosomowych cząsteczek DNA — plazmidów. Te małe (w stosunku do chromosomu bakteryjnego), najczęściej koliste, kowalencyjnie zamknięte dwuniciowe cząsteczki DNA nie są istotne dla wzrostu bakterii w standardowych warunkach. Komórki „wyleczone" z plazmidu w wyniku naświetlenia promieniami UV albo działania mitomycyny lub barwników akrydynowych rosną bez zakłóceń w zwykłych pożywkach. Plazmidy nadają komórkom gospodarza cechy specyficzne. Niektóre z nich umożliwiają koniugację, a prototypem tych koniugacyjnych plazmidów jest czynnik F E. coli opisany już uprzednio. Plazmidy koniugacyjne rozprzestrzeniają się łatwiej niż inne, ponieważ proces ten może zachodzić również przez bezpośredni kontakt komórek. Plazmidy koniugacyjne zdolne są do przejściowego wbudowywania się w chromosom bakteryjny podobnie jak profagi, co jednocześnie powoduje czasową utratę autonomiczności. Plazmidy mogą mobilizować chromosom gospodarza i w ten sposób uczestniczyć w wymianie i rekombinacji materiału genetycznego w naturalnych warunkach. Użycie plazmidów jako wektorów dla obcego DNA w inżynierii genetycznej i w technologii genowej (podrozdz. 15.5) opiera się na metodach analogicznych do procesów zachodzących w naturze. Eukaryota również posiadają plazmidy, badania nad nimi nie są jednak zbyt zaawansowane.

15.3.1. Plazmidy i ich właściwości Obecność miejsca warunkującego początek replikacji (origin), analogicznego do znajdującego się w chromosomie, jest warunkiem koniecznym do istnienia plazmidu jako autonomicznej, pozachromosomowej cząsteczki (ryc. 15.20). Wielkość charakterystyczną dla danego plazmidu stanowi jego liczba kopii przypadająca na komórkę. Ogólna zasada mówi, że im plazmid jest większy, tym mniejsza jest liczba jego kopii. W replikacji biorą udział białka kodowane przez geny chromosomowe, natomiast plazmid koduje funkcje kontrolujące częstość inicjacji i rozdział kopii plazmidu między komórki potomne. Małe plazmidy charakteryzujące się

577

dużą liczbą kopii replikują się wielokrotnie w trakcie jednego cyklu życiowego komórki. Amplifikacja. Najlepiej poznanym plazmidem jest ColE1 (ryc. 15.20, patrz podrozdz. 15.3.2), mały plazmid o wielkości 6646 par zasad. Replikacja chromosomowego DNA kończy się zazwyczaj w ciągu jednej godziny po dodaniu chloramfenikolu, ale replikacja plazmidu (ColE1) trwa dalsze 12-15 godzin. Powoduje to wzrost liczby kopii z 15 do 120 na chromosom. Proces ten, nazywany amplifikacją plazmidowego DNA, dotyczy całej grupy plazmidów. Podczas gdy replikacja chromosomowego DNA wymaga ciągłej syntezy nowych białek, replikacja plazmidów zdolnych do amplifikacji wymaga jedynie białek trwałych, a więc mogących funkcjonować przez stosunkowo długi czas. Niezgodność. Wiele bakterii jest nośnikami kilku różnych plazmidów. Możliwość wspólnej egzystencji plazmidów w komórce jest uwarunkowana ich zgodnością. Dwa plazmidy spokrewnione ze sobą nie mogą koegzystować w jednej komórce, są one niezgodne. Przynależność do grup niezgodności (Inc, ang. incompatibility) jest cechą klasyfikacyjną plazmidów. Plazmidy z tej samej grupy niezgodności nie mogą współistnieć. Jak dotychczas, opisano 30 grup niezgodności plazmidów E. coli i 10 grup plazmidów Staphylococcus. Niezgodność kontrolują determinanty plazmidowe umiejscowione w regionie inc (ryc. 15.20). Wyrażanie się niezgodności jest związane z kontrolą replikacji plazmidów. Plazmidy niezgodne wzajemnie hamują swą replikację; zachodzi to według mechanizmu dość skomplikowanego i jeszcze nie w pełni poznanego.

578

Właściwości fizyczne. Z małymi wyjątkami, wielkość plazmidów jest mniejsza niż 1/10 wielkości chromosomu E. coli (tj. <450 tys. p.z.). Opisano występujące naturalnie plazmidy, których wielkość waha się w granicach 2-1200 tys. p.z. Plazmidowy DNA może być izolowany jako kowalencyjnie zamknięta, kolista (ccc, ang. covalently closed circular), dwuniciowa cząstka. Kolista podwójna helisa owija się jeszcze wokół siebie, przyjmując w rezultacie upakowany, superzwinięty kształt. Pęknięcie jednej z dwóch nici prowadzi do rozluźnienia tej upakowanej, drugorzędowej struktury i wytworzenie formy otwartego koła (oc, ang. open circular), różniącej się właściwościami od formy kowalencyjnie zamkniętej. Pęknięcie dwóch nici w tym samym miejscu zmienia plazmidowy DNA w formę liniową, która nie może być już odróżniona od innych cząstek liniowych, jakimi są fragmenty chromosomu powstałe po lizie komórki. Izolacja plazmidowego DNA opiera się na szczególnych fizycznych właściwościach kolistej, kowalencyjnie zamkniętej cząsteczki. DNA plazmidowy sedymentuje szybciej niż DNA liniowy podczas wirowania w ultrawirówce, ma również mniejsze powinowactwo niż chromosomowy DNA do barwników, takich jak bromek etydyny, które wstawiają się w DNA, a tym samym zmniejszają jego gęstość. Większa gęstość plazmidowego DNA sprawia, że po wirowaniu w gradiencie chlorku cezu tworzy on osobny prążek, ułożony w innej pozycji niż DNA chromosomowy, co ułatwia jego izolowanie. Cząsteczki plazmidów różniące się wielkością mogą być również oddzielone elektroforetycznie na żelach agarozowych. Migracja kwasów nukleinowych przez pory w żelu zależy od ciężaru cząsteczkowego i od struktury cząsteczki. Małe plazmidy przesuwają się szybciej niż liniowy DNA, ponieważ ich struktura jest bardziej zwarta. Odwrotnie, ruch dużych plazmidów jest wolniejszy. Porównanie szybkości migracji ze wzorcami o znanym ciężarze cząsteczkowym pozwala wyznaczyć wielkość plazmidu. Prążki DNA po wybarwieniu bromkiem etydyny stają się widoczne w świetle UV. Obserwacja plazmidów możliwa jest również w mikroskopie elektronowym. Technika ta pozwala na pomiar długości poszczególnych cząsteczek, a więc na dokładne oznaczenie wielkości plazmidu. Plazmidy koniugacyjne. W poprzedniej części rozdziału opisano czynnik płodności (F) E. coli. Stanowi on przykład plazmidu samoprzenoszącego się albo koniugacyjnego. Wszystkie znane plazmidy koniugacyjne mają geny tra (od ang. transfer) kodujące funkcje związane z koniugacją. Do

579

nich należy zdolność do syntezy pilusów płciowych warunkujących kontakt między koniugacyjnymi komórkami; w ten sposób geny tra uczestniczą w przenoszeniu plazmidów koniugacyjnych po zetknięciu się komórek. Geny tra kodują białka wymagane do stabilizacji koniugacyjnych partnerów, jak i do samego procesu przekazywania DNA i jego regulacji. Co więcej, są również niezbędne do wykluczenia z komórki innych plazmidów. Region tra czynnika F obejmuje około 30 tys. p.z. i 31 genów. Na koniugacyjne przekazanie DNA składa się kilka różnych etapów: 1) proces jest zapoczątkowany jednoniciowym pęknięciem w regionie stanowiącym początek koniugacyjnej replikacji (oriT). oriT to sekwencja składająca się z 373 p.z., która jest rozpoznawana przez swoiste białka wiążące się z DNA i która różni się od miejsca ori replikacji wegetatywnej (ryc. 15.20). 2) DNA zostaje następnie rozwinięty w kierunku 5' do 3', począwszy od oriT. Proces ten jest katalizowany przez dwa białka funkcjonujące w przekazywaniu DNA i wymaga hydrolizy ATP. 3) Wolny koniec 3' przechodzi do biorcy przez kanał łączący obie komórki. 4) Synteza nici komplementarnych zachodzi

580

równocześnie z przekazywaniem. W dawcy nić ta jest syntetyzowana nieustannie od końca 3' wg mechanizmu „toczącego się koła". Synteza drugiej nici w biorcy zachodzi nieciągle, z wykorzystaniem starterów RNA (ryc. 15.21). Plazmidy koniugacyjne występują w wielu gramujemnych bakteriach innych niż E. coli. Wykazano również ich obecność w rodzajach Bacillus, Clostridium, Nocardia, Staphylococcus, Enterococcus i Streptomyces. Jeden z typów koniugacyjnych Enterococcus faecalis, odznaczający się dużą częstością koniugacji, koduje feromony płciowe będące swoistym sygnałem koniugacyjnym. Sygnał ten powoduje syntezę „substancji agregacyjnej" w komórce dawcy. Związek ten, zwany adhezyną, łączy komórki dawcy i biorcy, prowadząc do zbijania się komórek obu typów. Plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy. Zakres gospodarzy dla większości plazmidów jest wąski, plazmidy te są zdolne do replikacji jedynie w blisko spokrewnionych gatunkach. Niektóre plazmidy mają jednak szerszy zakres gospodarzy. Na specjalną uwagę zasługują plazmidy bakterii gramujemnych: RP4 — koniugacyjny plazmid niosący geny oporności należący do grupy IncP1, i RSF1010 — niekoniugacyjny plazmid z grupy IncQ kodujący oporność na antybiotyki. Pierwszy z plazmidów decyduje o oporności na ampicylinę, kanamycynę i tetracyklinę oraz na metal ciężki — telur, drugi koduje oporność na streptomycynę i sulfonamidy. Istnieje tylko kilka gatunków bakterii, które nie mogą być gospodarzami tych plazmidów. Wiedza dotycząca plazmidów o szerokim zakresie gospodarzy w bakteriach gramdodatnich jest nikła. Koniugacyjne plazmidy izolowane z Enterococcus faecalis mogą się replikować w innych gatunkach Enterococcus oraz w biorcach z rodzaju Staphylococcus, Bacillus i Lactobacillus. Plazmid pC194 o wielkości 2,9 tys. p.z. izolowany ze Staphylococcus aureus ma szczególnie szeroki zakres gospodarzy, obejmujący zarówno bakterie gramdodatnie, np. Bacillus subtilis, jak i gramujemne, np. E. coli, a nawet organizmy eukariotyczne, jak Saccharomyces cerevisiae. Uwarunkowania cechy szerokiego zakresu gospodarzy nie są w pełni określone. Należy jednak podkreślić, że plazmidy te kodują kilka funkcji replikacyjnych, co uniezależnia ich replikację od gospodarza. Plazmidy o wąskim zakresie gospodarza albo wcale nie wymagają funkcji plazmidowych do replikacji, np. ColEl (ryc. 15.20), albo w inicjacji tego procesu bierze udział tylko pojedyncze białko kodowane przez plazmid. 581

Plazmidy koniugacyjne mogą również służyć jako plazmidy pomocnicze ułatwiające przekazanie plazmidu niekoniugacyjnego z dawcy do biorcy. Proces ten nazywa się „mobilizacją plazmidu" i może się opierać na dwóch molekularnych mechanizmach: 1) niekoniugacyjny plazmid mobilizacyjny jest przekazywany wspólnie z plazmidem koniugacyjnym, ale jako osobna cząsteczka; 2) przekazywanie jest uwarunkowane fizycznym połączeniem dwóch plazmidów, a więc ich uprzednią rekombinacją. Powstały tą drogą plazmid, tzw. kointegrat, wchodzi do komórki biorcy, w której następuje jego rozpad z odtworzeniem dwóch oryginalnych cząsteczek. Plazmid ColEl ulegający mobilizacji zawiera tzw. region mobilizacyjny (ryc. 15.20) kodujący trzy białka mobilizacyjne istotne dla przekazania plazmidu. Plazmidy liniowe. Plazmidy liniowe, których DNA nie jest kowalencyjnie zamknięty w formę kolistą, są rzadkością u Prokaryota. Jak dotychczas, zostały one znalezione jedynie w promieniowcach, paciorkowcach i szczepach Nocardia opaca*. Nieznany jest mechanizm ich ochrony przed atakiem egzonukleaz.

15.3.2. Biologiczne znaczenie plazmidów Plazmidy są szeroko rozpowszechnione wśród bakterii. Niejednokrotnie ich obecność można stwierdzić jedynie metodami fizycznymi, gdyż nie kodują one żadnych cech zmieniających fenotyp gospodarza. Nazywamy je wtedy kryptycznymi. Metody selekcji plazmidów, kodujących oprócz funkcji replikacyjnych inne możliwe do rozpoznania cechy fenotypowe, są różne i zależne od charakteru danej cechy. Plazmidy opornościowe. Pierwsze doniesienie o bakteriach opornych na kilka antybiotyków miało miejsce w Japonii w 1950 r. i dotyczyło bakterii wywołującej biegunkę, Shigella, izolowanej od pacjentów poddanych kuracji antybiotykowej. Zauważono, że bakterie te były oporne na kilka różnych antybiotyków i właściwość ta mogła być przeniesiona do innych bakterii, z E. coli włącznie, przez bezpośredni kontakt komórek. Teraz wiadomo, że plazmidy opornościowe (R, ang. resistance = oporność) * Ostatnio stwierdzono ich obecność u przedstawicieli kilku innych rodzajów bakterii, m.in. z rodzaju Borrelia (przyp. tłum.).

582

zawierają geny odpowiedzialne za oporność bakterii na sulfonamidy, streptomycynę, chloramfenikol, kanamycynę i tetracyklinę Niektóre plazmidy wnoszą oporność aż na osiem różnych antybiotyków. Inne są przyczyną oporności na toksyczne metale ciężkie, jak rtęć, nikiel, kobalt, kadm, rtęć, cynk, chrom, arsen, antymon, telur i srebro. Plazmidy opornościowe są zazwyczaj koniugacyjne lub zdolne do mobilizacji. Niektóre z nich mają szeroki zakres gospodarzy i mogą być przekazane między różnymi rodzajami bakterii, w czym leży przyczyna ich dużego rozprzestrzenienia. Przeniesieniu plazmidów opornościowych niejednokrotnie towarzyszy przeniesienie genów chromosomowych, które są niewątpliwie mobilizowane przez czynnik R. Mechanizmy plazmidowej i chromosomowej oporności bakterii na antybiotyki są różne. Oporność na streptomycynę jest tego przykładem. U podstawy oporności chromosomowej leży zmiana podjednostki 30S rybosomów, natomiast oporność plazmidowa jest związana z enzymatyczną adenylacją cząsteczki antybiotyku. W większości przypadków plazmidowa oporność na antybiotyki zależy od ich enzymatycznych modyfikacji: chloramfenikol jest acetylowany, kanamycyna i neomycyna są fosforylowane lub acetylowane, a penicylina — hydrolizowana przez penicylinazy. Powszechne stosowanie antybiotyków w lecznictwie, szczególnie w zamkniętym, doprowadziło do rozprzestrzenienia się plazmidów R wśród chorobotwórczych bakterii oraz do pozytywnej selekcji i namnożenia bakterii opornych na antybiotyki. Obecność licznych genów oporności w pojedynczym plazmidzie łatwo jest wytłumaczyć mając na względzie zarówno duże możliwości rekombinacji, jak i presję selekcyjną. Nie jest natomiast zrozumiała rola plazmidów opornościowch w leczeniu schorzeń przed erą antybiotykową. Plazmidy te były odnalezione w bakteriach izolowanych przed rokiem 1940, czyli przed wprowadzeniem antybiotyków do lecznictwa. Bakterie oporne na metale ciężkie mogą być izolowane z gleby lub z wód, które je zawierają w sposób naturalny lub są nimi zanieczyszczone. Bakterie oporne rzadko są izolowane z gleb nie zawierających metali. Genetyczna informacja kodująca oporność na metale ciężkie może być chromosomowa lub plazmidowa. Oporność ta może być oparta na aktywności ATPazy albo na transporcie (antyporcie) toksycznych jonów na zewnętrz komórki. Zależność rozprzestrzeniania się bakterii opornych na metale ciężkie od środowiska wskazuje na istotną rolę nacisku selekcyjnego w utrzymaniu genetycznej informacji w ekosystemie.

583

Plazmidy kodujące bakteriocyny. Wiele bakterii produkuje białka zdolne do zahamowania wzrostu organizmów pokrewnych lub nawet do zabicia ich. Związki te, bakteriocyny, których działanie jest gatunkowo specyficzne, są kodowane przez plazmidy. Bakteriocyny były izolowane z E. coli (kolicyny), Pseudomonas aeruginosa (piocyny), Bacillus megaterium (megacyny) i kilku innych bakterii. Czynniki zjadliwości lub chorobotwórczości. Organizm ludzki i zwierzęcy stwarza idealne warunki do wzrostu wielu mikroorganizmów z uwagi na wydzieliny mogące służyć jako naturalne pożywki i względnie trwałe warunki środowiskowe panujące w jego wnętrzu. Normalną florę skóry i przewodu pokarmowego stanowią miliardy bakterii. Wiele gatunków pełni użyteczną, niekiedy ważną rolę w zdrowym bytowaniu gospodarza. Rola innych jest niszcząca i wtedy nazywamy je patogenami. W trakcie ewolucji człowiek i zwierzęta wytworzyli wiele barier dających ochronę przeciwko inwazji i wzrostowi bakterii patogennych. Wymienić tu trzeba skórę, układ immunologiczny i składniki krwi. Z drugiej strony, organizmy patogenne stały się bardziej agresywne z powodu wytworzenia czynników zjadliwości lub chorobotwórczości. Wiele z tych czynników kodowanych jest przez plazmidy, a to pozachromosomowe umiejscowienie wpływa na ich szybkie rozprzestrzenianie się. Czynniki kolonizacji przyczyniają się do przebiegającego bez przeszkód zasiedlenia śluzowych powierzchni przewodu pokarmowego, a plazmidowe „inwazyny" pozwalają skutecznie przeniknąć komórki jego nabłonka przez ludzki szczep Shigella flexneri. Enterotoksyny tego organizmu, których działanie uwidocznia się w przewodzie pokarmowym i prowadzi do biegunki, są również kodowane przez plazmidy. W E. coli plazmidowa jest także lokalizacja genów determinujących wytwarzanie hemolizyn, które powodują lizę erytrocytów. Inwazja komórek i tkanek przez wiele bakterii jelitowych zależy od obecności jonów żelaza. Nie jest więc niespodzianką, że siderofory wiążące żelazo, takie jak aerobaktyna, są również kodowane przez plazmidy. Przykładem plazmidu wywołującego chorobę u roślin jest plazmid Agrobacterium tumefaciens zdolny do indukcji nowotworu, o którym wspomniano już poprzednio (rozdz. 4.3). Białka wywołujące efekt owadobójczy, zawarte w ciałach wtrętowych (inkluzyjnych) Bacillus thuringiensis (podrozdz. 2.2.7), są również kodowane przez duży (100 tys. p.z.) plazmid.

584

Plazmidy degradacyjne. Plazmidy mogą być nośnikami genów związanych z określonymi reakcjami chemicznymi. Czasami plazmidy kodują enzymy katalizujące rozkład substancji syntetyzowanych chemicznie i nie występujących naturalnie w biosferze (ksenobiotyków). Do tej grupy należy wiele aromatycznych i heterocyklicznych związków z podstawnikami halogenowymi, włączając herbicydy oraz związki grzybo- i owadobójcze, które mogą być rozkładane jedynie przez bakterie niosące degradacyjne plazmidy. Skrócony wykaz plazmidów degradacyjnych przedstawiono w tabeli 15.3. Inne plazmidy. Lista właściwości, które mogą być kodowane przez plazmidy, jest zbyt długa do prześledzenia. Wchodzą tu geny determinujące skomplikowane reakcje metaboliczne, np. wiązanie azotu, tworzenie brodawek, syntezę indolooctanu i diacetylu, transport cukrów i jonów metali (nikiel), syntezę dehydrogenazy i enzymów denitryfikacyjnych. Te „metaboliczne" plazmidy są często bardzo duże, wielkości 300-1200 tys. p.z., i z tego powodu są nazywane „megaplazmidami". Systemy restrykcji i modyfikacji chroniące bakterie (podrozdz. 15.4) przed inwazją obcego DNA mogą być również kodowane przez plazmidy. Zróżnicowana

585

lokalizacja tych genów, chromosomowa w jednych szczepach, a plazmidowa w innych, jest dość powszechną sytuacją. Dotyczy to zarówno różnych szczepów jednego gatunku, jak i różnych szczepów bakterii filogenetycznie spokrewnionych. Ta wzajemnie alternatywna lokalizacja (na chromosomach lub plazmidach) może wskazywać, że istnieje możliwość wymiany genów, a nawet całych ich grup między chromosomami a plazmidami i że plazmidy mogą odgrywać bardzo ważną rolę w ewolucji prokariotycznego genomu.

15.4. Restrykcja i modyfikacja DNA Możliwość wzrostu fagów na jednym ze szczepów E. coli i brak wzrostu na innych szczepach była pierwszą wskazówką istnienia systemu restrykcji i modyfikacji DNA. Stwierdzono, że restrykcja zależy od enzymów bakteryjnych, które mogą rozpoznawać i przecinać specyficzne miejsca w obcym DNA, natomiast DNA gospodarza jest chroniony przed restrykcją w wyniku jego enzymatycznej modyfikacji, która sprawia, że nie jest on rozpoznawany przez enzymy restrykcyjne. System restrykcji i modyfikacji jest szeroko rozpowszechniony wśród mikroorganizmów. Jego szczególna rola polega na wyznakowaniu i ochronie komórkowego DNA, a jednocześnie na niszczeniu i degradacji każdego obcego DNA znajdującego się w komórce. System składa się z dwóch aktywności enzymatycznych — endonukleazy i metylotransferazy, znajdujących się w jednym lub dwóch białkach. Obie aktywności wyrażają się w specyficznym miejscu DNA, czyli w sekwencji rozpoznawanej, choć ta określona sekwencja nukleotydów stanowi substrat dla wyłącznie jednego z dwóch enzymów. Komórkowy DNA jest modyfikowany chemicznie przez metylotransferazę metylującą adeninę w pozycji N-6 oraz cytozynę głównie w pozycji N-5, ale również w pozycji N-4. Modyfikacja zachodzi podczas replikacji, prowadzi do powstania dwuniciowego DNA metylowanego w jednej nici. W przypadku obcego DNA, endonukleaza restrykcyjna hydrolizuje wiązania fosfodiestrowe. Enzym ten jest aktywowany jedynie w obecności niemodyfikowanego DNA, który zarazem stanowi jego substrat. Endonukleazy restrykcyjne. Endonukleazy restrykcyjne są kodowane przez bakteriofagi, plazmidy oraz chromosomy bakteryjne. Rozróżniamy 586

kilka klas enzymów restrykcyjnych, z których wszystkie przecinają dwuniciowy DNA. Enzymy klasy 1 rozpoznają specyficzną sekwencję nukleotydową, ale przecinają DNA niespecyficznie i poza miejscem rozpoznawanym. Do klasy tej należą restrykcyjne endonukleazy bakteriofaga P1. Enzymy klasy 2 przecinają DNA w miejscu specyficznym, zlokalizowanym wewnątrz rozpoznawanej sekwencji. Prowadzi to do wytworzenia określonych fragmentów DNA. Endonukleazy restrykcyjne klasy 2 znajdują zastosowanie w klonowaniu molekularnym opisanym w następnym podrozdziale. W tabeli 15.4 przedstawiono kilka przykładów nukleaz restrykcyjnych klasy 2. Niektóre enzymy rozpoznają ciąg czterech zasad, inne rozpoznają sekwencję szóstkową. W przypadku sekwencji czwórkowej, cięcia cząsteczki DNA są częstsze, a powstające fragmenty mniejsze niż w przypadku sekwencji szóstkowej. Sekwencja rozpoznawana ma podwójną symetrię obrotową, której oś zaznaczona jest linią przerywaną w tabeli 15.4. Struktura taka nazywa się palindromem. Miejsca cięcia są zaznaczone strzałkami i albo pokrywają się, albo leżą na zewnątrz osi symetrii. Cięcie dwóch nici przesunięte względem siebie, jak w przypadku EcoEl, prowadzi do wytworzenia jednoniciowych końców obejmujących 4 zasady. Przecię-

587

cie DNA wzdłuż osi symetrii, np. przez HaeIII, prowadzi do powstania tzw. tępych końców. Jak dotąd, enzymy restrykcyjne wyizolowano z setek różnych mikroorganizmów i są one szeroko dostępne w handlu. Oznaczenie enzymów oparte jest na nazwie organizmu, z którego pochodzą (i to właśnie stanowi powód stosowania kursywy w druku). Mapy restrykcyjne. Różniące się wielkością fragmenty powstałe po trawieniu DNA enzymami restrykcyjnymi mogą być rozdzielone metodą elektroforezy (patrz podrozdz. 15.3). Na rycinie 15.22 przedstawiono

przykład takiego rozdziału. Szybkość przesuwania się fragmentów zależy od ich długości, małe fragmenty migrują szybciej niż duże. Wielkość odcinków DNA można oznaczyć przez porównanie ich pozycji z pozycją prążków DNA wzorcowego o znanej wielkości. Wzajemne ułożenie miejsc cięć restrykcyjnych można określić dopasowując zachodzące na siebie końce fragmentów powstałych w wyniku trawienia kilkoma enzymami. Jedynie endonukleazy, tnące stosunkowo rzadko, co w rezultacie daje długie odcinki DNA, nadają się do konstrukcji map genetycz-

588

nych. Natomiast enzymy restrykcyjne, które tną DNA często i na małe odcinki, znajdują zastosowanie w określaniu sekwencji nukleotydów (patrz podrozdz. 15.5).

15.5. Metody klonowania molekularnego Metody klonowania molekularnego rozwinęły się we wczesnych latach siedemdziesiątych. Oparte są na danych uzyskanych z podstawowych badań DNA, RNA i enzymów, głównie restrykcyjnych, jak również na informacjach dotyczących przekazywania genów przez plazmidy i wirusy. Przedstawione tu wiadomości wstępne dotyczące technologii otrzymywania zrekombinowanego DNA uzupełniają materiał zawarty w podrozdziałach 15.1-15.4. Trawienie i analiza restrykcyjna DNA. Po trawieniu endonukleazami restrykcyjnymi cząsteczka DNA może być rozdzielona na określone fragmenty, dzięki swym małym rozmiarom łatwe do manipulacji. Wzór restrykcyjny fragmentów otrzymanych po trawieniu endonukleazami plazmidowego DNA jest pokazany na rycinie 15.22. Odcinki DNA nie przekraczające 1000 p.z. mogą być rozdzielone na żelach akryloamidowych. Rozdział większych fragmentów wymaga żelów z większymi porami, np. żelów agarozowych. Szybkość przesuwania się fragmentów w obrębie określonego rzędu wielkości jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu ich rozmiarów określonego liczbą par zasad. Suma wielkości poszczególnych fragmentów odpowiada wielkości cząsteczki oryginalnej. Zastosowanie kilku enzymów restrykcyjnych i następnie dopasowanie zachodzących na siebie fragmentów pozwala na wyznaczenie pozycji poszczególnych miejsc restrykcyjnych oraz wykreślenie mapy restrykcyjnej danego segmentu DNA. Mapy całych chromosomów powinny być skonstruowane już niedługo dzięki zastosowaniu elektroforezy w pulsowym polu elektrycznym. Technika hybrydyzacji Southerna pozwala odnaleźć sekwencję komplementarną do określonego fragmentu DNA. Fragmenty DNA rozdzielone elektroforetycznie, a następnie zdenaturowane (jednoniciowe), przenosi się na błonę nitrocelulozową (ang. blotting). Fragmenty 32 te hybrydyzuje się z sondą DNA znakowaną izotopem P lub barwnikiem. Dwuniciowy hybryd DNA-DNA tworzy się jedynie między segmentami homologicznymi, co można uwidocznić za pomocą autoradiografii lub wykorzystując swoiste właściwości barwnika. 589

Wyznaczanie sekwencji nukleotydów. Dostępność fragmentów restrykcyjnych spowodowała przyspieszenie rozwoju stosunkowo prostych metod sekwencjonowania DNA. Znajomość sekwencji nukleotydów pozwala z kolei na wydedukowanie, na postawie pewnych znanych reguł, sekwencji zakodowanych aminokwasów. Są dwie metody sekwencjonowania DNA. 1. Chemiczne rozbicie cząsteczki (metoda Maxama-Gilberta). Zastosowanie odczynników chemicznych pozwala zmodyfikować cztery zasady

590

cząsteczki DNA uprzednio znakowanej 32P. Zasady można oddzielić od reszt cukrowych stosując specyficzne związki działające na guaninę, guaninę + adeninę, tyminę + cytozynę lub cytozynę (w próbach równoległych). Powstająca w ten sposób luka wyznacza określone miejsce przecięcia nici DNA. Przecięcie w tych miejscach prowadzi do powstania fragmentów różniących się wielkością, a więc dających się rozdzielić na żelach akryloamidowych. Porównanie wzoru prążków na autoradiogramach próbek traktowanych różnymi odczynnikami pozwala umiejscowić poszczególne zasady w cząsteczce DNA. (2.) Metoda dideoksy wg Sangera. Technika ta opiera się na zakończeniu replikacji DNA. Poczynając od primera, którym jest krótki, znakowany izotopowo fragment DNA (zazwyczaj oligonukleotyd dostępny w handlu), polimeraza DNA syntetyzuje nici komplementarne w czterech równoległych próbach reakcyjnych, wykorzystując jako substrat cztery deoksyrybonukleozydotrifosforany (dNTP). Do każdej próby reakcyjnej dodaje się jeden z czterech analogów zasad będących 2',3'-dideoksyrybonukleotydami (ddNTP). Włączenie takiego związku blokuje dalsze wydłużanie się łańcucha z powodu braku możliwości utworzenia wiązania fosfodiestrowego. W rezultacie, podobnie jak w poprzedniej metodzie, powstają fragmenty różniące się wielkością, a więc możliwe do rozdziału metodą elektroforezy. Porównanie pozycji prążków na czterech ścieżkach autoradiogramu pozwala odczytać sekwencję zasad (ryc. 15.23). Konstrukcja zrekombinowanej cząsteczki DNA. Metody klonowania molekularnego wykorzystują plazmidy lub wirusy jako nośniki (wektory) do wprowadzenia obcego, nawet eukariotycznego DNA do komórek bakteryjnych. Prokariotyczny DNA można klonować bezpośrednio, natomiast DNA eukariotyczny może być sklonowany tylko jako cDNA. cDNA zawiera jedynie sekwencje kodujące i jest otrzymywany metodą odwrotnej transkrypcji mRNA przeprowadzanej z użyciem odwrotnej transkryptazy. Obcy DNA wprowadzamy do komórek bakteryjnych najczęściej metodą transformacji. DNA może być również pobierany przez komórki zwierzęce i roślinne. Budowę cząsteczki zrekombinowanego DNA przedstawiono na rycinie 15.24. Zarówno DNA wektora, jak i obcy DNA zostają na początku przecięte przez swoistą endonukleazę, np. EcoRl, co prowadzi do utworzenia liniowych fragmentów z jednoniciowymi końcami, których sekwencje są wzajemnie komplementarne (lepkie końce). Po utworzeniu wiązań wodorowych między jednoniciowymi końcami, pęknięcia szkieletu 591

zostają ponownie połączone wiązaniami kowalencyjnymi przez ligazę polinukleotydów. Na tym kończy się konstrukcja cząsteczki zrekombinowanego DNA. Powstały produkt nazywa się hybrydowym DNA lub DNA chimerą. Wektory. Wektory stosowane do klonowania powinny spełniać dwa warunki: muszą zawierać tylko jedno miejsce cięcia przez endonukleazę użytą do klonowania, muszą również zapewniać selekcję zrekombinowanego DNA. Zdolność do wydajnej rekombinacji z obcym DNA jest również niezwykle pożądaną cechą, zwłaszcza dla wektorów stosowanych do konstrukcji bibliotek genowych. Mutanty faga λ świetnie nadają się do tego celu. Grupa wektorów, pochodnych tego faga, zwana kosmidami może połączyć się z fragmentami DNA o wielkości 35—40 tys. p.z. (ryc. 15.25). Kosmidy są to wektory skonstruowane metodami inżynierii genetycznej, w skład których wchodzi region replikacyjny (np. plazmidu pBR322), gen oporności na antybiotyki (np. oporność na tetracyklinę) 592

i jednoniciowe końce faga λ (tzw. miejsce cos). Końce cos są miejscami rozpoznawanymi przez ekstrakt komórkowy będący częścią składową zestawu do pakowania DNA w kapsydy faga λ. Zabieg klonowania rozpoczyna cięcie i ligacja obcego DNA z kosmidem. Tylko hybrydowe kosmidy zawierające fragment obcego DNA o długości 35-45 tys. p.z. mogą być przecięte w miejscach cos w trakcie następnego etapu, 593

obejmującego inkubację DNA in vitro z ekstraktem służącym do pakowania w kapsydy λ. Odcinki mniejsze nie mogą być zapakowane, a więc technikę tę stosuje się wybiórczo do klonowania długich fragmentów DNA (ryc. 15.25). Jako wektor może również służyć fag M13. Jest on przykładem faga nitkowatego, którego długość wynosi 9000 nm, a szerokość 9 nm. Fag ten penetruje komórkę przez pilus płciowy, a jego wewnątrzkomórkowe namnożenie nie pociąga za sobą śmierci komórki. Μ13 należy do fagów, których materiałem genetycznym jest jednoniciowy DNA. Po infekcji komórki, nić plus przekazana przez faga replikuje się, prowadząc do powstania przejściowej formy replikacyjnej (RF), złożonej z dwóch nici — plus i minus. Dwuniciowa forma replikacyjna zachowuje się jak plazmid, może być trawiona przez endonukleazy, jak również może rekombinować z obcym DNA. Po ligacji fragmentów obcego DNA w obu orientacjach i po replikacji faga można wyizolować jednoniciowe cząsteczki zawierające segmenty zrekombinowanego DNA w nici plus. Wektor Μ13 jest szczególnie przydatny do sekwencjonowania. Jednoniciowość DNA pozwala ominąć etap denaturacji, a klonowanie zawsze w tym samym miejscu umożliwia użycie uniwersalnego primera do inicjacji replikacji w metodzie Sangera. Selekcja zrekombinowanych klonów. Komórki niosące zrekombinowaną cząsteczkę DNA można izolować opierając się na fenotypowych cechach wektora lub na właściwościach sklonowanego genu. Insercja obcego DNA w gen kodujący oporność na antybiotyki umiejscowiony w wektorze pociąga za sobą inaktywację tego genu. W ten sposób można zinaktywować geny oporności na tetracyklinę lub ampicylinę w plazmidzie pBR322 (ryc. 15.25). Transformacja bakterii takim zrekombinowanym plazmidem nie powoduje oporności bakterii na jeden lub na dwa antybiotyki, w przeciwieństwie do transformacji wektorowym DNA. Odnalezienie określonego genu w bibliotekach genowych wymaga bardziej złożonych technik. Homologiczny fragment genu (sonda genetyczna) służy do odnalezienia właściwego genu w bibliotece, z zastosowaniem metody hybrydyzacji Southerna. Znajomość funkcji genu i dostępność mutantów umożliwiają genetyczną komplementację defektu przez zrekombinowany DNA. Na przykład, mutant nie syntetyzujący leucyny może, w wyniku wstawienia odpowiedniego genu dzikiego typu, uzyskać zdolność do wzrostu na podłożu minimalnym bez leucyny, a selekcja tego mutanta 594

nie stanowi żadnej trudności. Należy jednak pamiętać, że sklonowany DNA nie zawsze jest zdolny do kodowania funkcjonalnego produktu, szczególnie gdy bakteria, w której się znajduje (zazwyczaj E. coli), nie jest spokrewniona z organizmem dawcy. W przypadku braku metabolicznej aktywności produktu w biorcy, do identyfikacji genu stosuje się przeciwciała. Technika ta znajduje zastosowanie nawet dla pojedynczych kolonii. Wyrażanie się sklonowanego DNA. Ekspresja eukariotycznego cDNA w bakteriach jest możliwa jedynie wówczas, gdy zostanie on wstawiony w region wektora zapewniający silną ekspresję sklonowanego odcinka. Na przykład, rekombinacja cDNA kodującego insulinę z genem kodującym β-laktamazę lub β-galaktozydazę prowadzi do produkcji mieszanego polipeptydu zwanego „fuzją białkową". Wyrażanie się takiego produktu znajduje się pod kontrolą wybranego promotora bakteryjnego. Siła promotora i wydajność translacji określają szybkość tworzenia się produktu zrekombinowanego genu. Zazwyczaj pożądana jest duża jego ilość. Należy jednak pamiętać, że nadprodukcja białka ma niejednokrotnie toksyczne efekty uboczne dla organizmu. Białko produkowane w nadmiarze bywa również niestabilne. Z wyżej wymienionych powodów niekontrolowane (konstytutywne) wyrażanie się genów wcale nie stwarza sytuacji optymalnej. Skonstruowano więc specjalne wektory do klonowania, zawierające silne promotory podlegające regulacji, jak np. promotor pL bakteriofaga A, którego wyrażanie się można regulować przez zmiany temperatury. Represor blokujący promotor pL ulega inaktywacji w wyższych temperaturach. Hodowlę bakteryjną prowadzi się w niższych temperaturach, czyli w warunkach dogodnych do wzrostu komórek, natomiast produkcja obcego białka możliwa jest dopiero po podwyższeniu temperatury. Retrowirusy służą jako wektory do klonowania DNA w komórki zwierzęce. Promotor genu kodującego metalotioneinę pochodzący z mysich komórek pozwala na indukcję ekspresji tego białka przez dodanie kadmu. Bogata w reszty cysteinowe metalotioneina jest zdolna do wiązania metali ciężkich, a tym samym pełni funkcje ochronne. Zmodyfikowany plazmid Ti (rozdz. 4.3) służy do wprowadzania genów do komórek roślin dwuliściennych. Natomiast protoplasty komórek roślin dwu- i jednoliściennych mogą być transformowane metodą elektroporacji (podrozdz. 15.2.4). 595

Zastosowania. Możliwości ujawnione dzięki badaniom nad zrekombinowanym DNA znajdują zastosowanie w przemyśle biotechnologicznym. Celem biotechnologii jest wydajna i przeprowadzona na dużą skalę synteza produktów biologicznych odznaczających się wysokim stopniem czystości. Innym zastosowaniem, którego początek datuje się na lata siedemdziesiąte, jest produkcja białek mających znaczenie w terapeutyce. Do tej klasy należą proteohormony, jak insulina ludzka wytwarzana na dużą skalę przez bakterie lub drożdże, hormony wzrostowe, np. hormon folikularny, endorfiny działające przeciwbólowo i substancje antyrakowe, takie jak czynnik powodujący martwicę nowotworów, interleukiny oraz interferony. Tradycyjne metody produkcji szczepionek są kosztowne i wiążą się z ryzykiem. Technologia genowa upraszcza te metody i minimalizuje stopień ryzyka. Tak więc, produkcja niezwykle wydajnej szczepionki przeciwko zapaleniu wątroby typu Β była poprzedzona klonowaniem informacji kodującej białko osłon wirusowych w DNA bakteryjny. Szczepionki przeciwko opryszczce, wściekliźnie oraz chorobie pyska i racic otrzymano stosując podobne zabiegi. Obecnie przeprowadza się intensywne badania zmierzające do opracowania szczepionek przeciwko malarii i innym chorobom wywołanym przez pasożyty, przeciwko nowotworom i HIV. Technologia genowa jest również przydatna w produkcji związków rozpuszczających trombocyty, np. urokinazy i tkankowo specyficznego aktywatora plazminogenu, które są stosowane w leczeniu schorzeń naczyń wieńcowych. Komórki produkujące ludzkie przeciwciała monoklonalne mogą być otrzymane przez zastosowanie tzw. „techniki hybrydoma". Daje ona zarówno możliwość skutecznego zwalczania tych chorób zakaźnych, dla których nie ma skutecznych leków chemicznych ani antybiotyków, jak i eliminowania komórek nowotworowych i limfocytów Τ odpowiedzialnych za odrzucanie przeszczepów. Toczą się ożywione dyskusje nad możliwościami zastosowania technologii genowej u człowieka — do analizy genomu, terapii genowej komórek somatycznych i do manipulacji komórkami rozrodczymi. Stosowane dotychczas w rolnictwie tradycyjne metody krzyżowania roślin były ograniczone naturalnymi możliwościami genetycznymi krzyżowanych gatunków. Stosowanie zrekombinowanego DNA rozszerzyło i wzbogaciło zasięg zmienności genetycznej. Obecnie stało się możliwe przekroczenie bariery gatunku i wprowadzenie obcego materiału genetycz596

nego bez eksperymentów krzyżowania, trwających niekiedy dziesiątki lat. Głównym celem tych zabiegów jest uodpornienie roślin na trucizny, herbicydy, metale, itp., zwiększenie tolerancji roślin na złe warunki środowiska, takie jak odwodnienie, niska temperatura, duże stężenie soli, osiągnięcie wydajniejszego wykorzystania światła i azotu cząsteczkowego oraz badanie przydatności roślin do produkcji wtórnych metabolitów i półproduktów. Prowadzi się również badania nad zastosowaniem technologii genowej do ulepszania hodowli zwierząt domowych. Próby użycia mikroorganizmów do oczyszczania ścieków wód przemysłowych datują się już od ubiegłego stulecia. Opracowanie metod zastosowania mikroorganizmów do oczyszczania powietrza, ścieków komunalnych i przemysłowych, otrzymywania nowych źródeł energii oraz półproduktów stwarza szerokie pole badawcze dla technologów genetycznych. Istnieje możliwość wytwarzania mikroorganizmów o szczególnych, cennych cechach metabolicznych, co może wzbogacić ich dotychczasowe fizjologiczne możliwości. Problemy bezpieczeństwa. Nawet występujące naturalnie przekazywanie genów i rekombinacja DNA może prowadzić do stworzenia nowych kombinacji cech genetycznych, włączając kombinacje powstałe między pro- a eukariotami, jak to uwidocznia przykład plazmidu Ti indukującego nowotwory roślin (patrz rozdz. 4.3). Technologia genowa pozwala na, przebiegające na dużą skalę, łączenie in vitro materiału genetycznego niespokrewnionych organizmów. Ze względu na niemożność dokładnego przewidzenia właściwości powstającego produktu, technologia genowa wiąże się z potencjalnym ryzykiem. Problem bezpieczeństwa dyskutowany był po raz pierwszy na konferencji w Asilomar, której wynikiem było opracowanie zasad pracy w tej dziedzinie. Ten dobrowolny system ograniczeń przyjął podział eksperymentów w zależności od stopnia ich bezpieczeństwa i uściślił techniczne wymagania ich przeprowadzania. Laboratoria zajmujące się badaniami tego typu muszą posiadać odpowiednie wyposażenie i muszą być umieszczone w specjalnych rejestrach. W eksperymentach powinno się stosować określone „bezpieczne szczepy", niezdolne do życia w warunkach naturalnych. Wszystkie organizmy nosiciele zrekombinowanego DNA muszą być zabite przed usunięciem z laboratorium, w celu zapobiegnięcia ich dalszemu rozprzestrzenianiu się. Wprowadzenie do środowiska zmodyfikowanych genetycznie organizmów wymaga specjalnego pozwolenia. 597

Warunki bezpiecznej pracy z mikroorganizmami patogennymi były określone już dość dawno. Doświadczenie nabyte w ciągu około 20 lat rozwoju inżynierii genetycznej i technologii genowej pozwala twierdzić, że bakterie niosące zrekombinowany DNA nie stwarzają ryzyka większego niż wynikające z właściwości DNA dawcy, komórek biorcy i wektora do klonowania. Zgoda na kontrolę pracy in vitro ze zrekombinowanym DNA, jak dotąd dobrowolna, doczekała się podstaw prawnych w Niemczech w czerwcu 1990 roku.

REGULACJA METABOLIZMU

O regulacji metabolizmu i wzrostu przez czynniki środowiska wspominano często w poprzednich rozdziałach dotyczących przemiany materii mikroorganizmów. Obserwowane przez Pasteura hamowanie fermentacji drożdży przez tlen atmosferyczny jest często cytowanym i szeroko badanym przykładem regulacji. Wiadomo również, że niektóre enzymy metaboliczne wytwarzane są jedynie w obecności substratu. Bakterie denitryfikacyjne są zdolne do oddychania azotanowego w atmosferze beztlenowej; tlen hamuje zarówno syntezę, jak i funkcję systemu redukującego azotany. Zmiany pH w hodowlach bakterii jelitowych i beztlenowców z rodzaju Clostridium decydują o przebiegu fermentacji i tworzeniu określonych jej produktów. Tlen i światło wpływają na syntezę pigmentów w bakteriach fototroficznych. Te i wiele innych zmian środowiska łączy się z podstawowymi mechanizmami regulacyjnymi. Ogromna ilość procesów związanych z wewnątrzkomórkowymi syntezami i rozmnażaniem się bakterii wymaga sprawnej koordynacji. Każdy szlak metaboliczny obejmuje dużą liczbę reakcji enzymatycznych. Całość procesów metabolicznych dostarcza energii, materiałów budulcowych, związków wielkocząsteczkowych i służy namnażaniu się komórek. Sukces we współzawodnictwie wymagał ewolucyjnego powstania mechanizmów adaptacji do zmian środowiska, jak również zharmonizowania procesów metabolicznych. Temu celowi służą enzymy — ich synteza i funkcje. Regulacja procesów metabolicznych zachodzi na dwóch poziomach obejmujących zarówno kontrolę syntezy enzymów, jak i zmiany w ich 599

aktywności. Regulacja przez kontrolę syntezy enzymów jest związana z wieloma szlakami metabolicznymi. Produkcja enzymów należących do jednego szlaku podlega zazwyczaj wspólnemu mechanizmowi regulacji szybkości ich syntezy, zależnie od szybkości syntezy wszystkich białek komórkowych. Szybkość syntezy enzymów zależy od intensywności transkrypcji ich genów strukturalnych. Liczne enzymy są produkowane przez komórkę ciągle, a w związku z tym są w komórce zawsze, niezależnie od warunków środowiska. Stanowią one stałe składniki komórki, nazywają się enzymami konstytutywnymi, a kodujące je geny określamy mianem genów konstytutywnych. Synteza wielu innych katabolicznych enzymów jest regulowana w drodze indukcji. Regulację tę uważa się za niezwykle korzystną z punktu widzenia ekonomiki metabolizmu komórkowego. Enzymy konieczne do wykorzystania danej substancji pokarmowej oraz włączenia do metabolizmu pośredniego produktów powstałych w wyniku ich katabolicznej funkcji tworzą się wyłącznie wtedy, gdy substancja ta znajduje się w środowisku. Ujmując inaczej, synteza katabolicznych enzymów następuje dopiero wtedy, gdy jest na nie zapotrzebowanie.

Wytwarzanie licznych anabolicznych enzymów jest natomiast regulowane przez represję. Podobnie do sytuacji omówionej uprzednio, i tu prawa ekonomii wymagają, żeby enzymy szlaków biosyntetycznych nie były produkowane, gdy znajduje się w środowisku końcowy produkt ich działania. Nagromadzenie końcowego produktu reakcji prowadzi do represji, tj. do zmniejszenia szybkości syntezy wszystkich enzymów związanych z określonym szlakiem biosyntetycznym.

600

Enzymy biorące udział w syntezie materiału budulcowego są wytwarzane ciągle. Ich produkcja zaczyna być hamowana (reprymowana), gdy końcowy produkt reakcji jest w nadmiarze. Ten typ regulacji nazywamy represją przez produkt końcowy.

Regulacja na poziomie zmian aktywności dotyczy zazwyczaj enzymów podstawowych dla metabolizmu komórki. Aktywność kataboliczna określonego enzymu związanego ze swoistym szlakiem metabolicznym może podlegać zmianom: może się zwiększać (pod wpływem związku działającego pozytywnie = dodatniego efektora) lub zmniejszać (pod wpływem negatywnego efektora). Hamowanie przez końcowy produkt reakcji (hamowanie zwrotne) polega na hamowaniu przez produkt końcowy reakcji pierwszego z ciągu enzymów w szlaku metabolicznym. Dwa rodzaje regulacji, indukcja/represja oraz wahania aktywności enzymów, dają w rezultacie podobny efekt w sensie zmian wydajności szlaków metabolicznych. Wpływ indukcji i represji enzymów na metabolizm uwidacznia się wolno i możemy go porównać do „regulacji ogólnej". Zmiany aktywności podstawowych enzymów zachodzą natychmiast i mogą być uważne za typ „regulacji szczegółowej".

16. 1. Regulacja syntezy enzymów Wiele bakterii może wykorzystywać liczne związki pokarmowe. Wymaga to oczywiście syntezy enzymów koniecznych do ich metabolizmu, a w związku z tym obecności odpowiednich genów strukturalnych. Terminy: indukcja enzymu, enzym indukowany lub substrat indukujący (induktor) odnoszą się do sytuacji, gdy dany enzym kataboliczny (lub enzymy) tworzą się w odpowiedzi na obecność substratu w pożywce i przy braku innych (kompetycyjnych) substancji. Synteza większości enzymów katabolicznych podlega indukcji. Z drugiej strony, synteza enzymów związanych z metabolizmem syntetycznym, np. z syntezą pirymidyn, puryn i aminokwasów, jest 601

regulowana przez represję. W większości przypadków sygnałem powodującym represję jest końcowy produkt szlaku biosyntetycznego (represja przez produkt końcowy). Jednoczesna obecność dwóch katabolicznych substratów w pożywce prowadzi do preferencyjnego wykorzystania jednego z nich, zazwyczaj tego, który zapewnia lepszy wzrost. Wiąże się to z hamowaniem syntezy enzymów katabolicznych koniecznych do wykorzystania drugiego substratu; zjawisko nosi nazwę represji katabolicznej.

16. 1. 1. Indukcja Indukcja β-galaktozydazy. Najlepiej zbadany przykład indukcji enzymatycznej jest związany z wykorzystywaniem laktozy przez Escherichia coli (ryc. 16. 1). Laktoza to dwucukier, który musi ulec hydrolizie z amin wejdzie w szlak metaboliczny heksoz:

Aktywność β-galaktozydazy w komórkach typu dzikiego rosnących w pożywce z glukozą jest jedynie śladowa. W obecności laktozy lub innego galaktozydu poziom jej podnosi się 1000 razy i wtedy enzym ten może stanowić 3% wszystkich białek komórkowych. W normalnych warunkach enzym tworzy się tylko w obecności indukującego substratu, laktozy. Aby jednak ułatwić badania regulacji metabolizmu, stosuje się analog substratu, 2-propylo-β-tiogalaktozyd, który jest induktorem nie

602

wykorzystywanym przez komórkę jako substrat. Dodanie tiogalaktozydu prowadzi do tzw. „niepotrzebnej indukcji", w wyniku której wytworzony enzym nie może ani hydrolizować induktora, ani wykorzystywać go w jakikolwiek inny sposób. Indukcja jednoczesna i sekwencyjna. Indukcja enzymów związanych z katabolizmem substratu przebiegającym przez szereg związków pośrednich A, B, C itd.

może zachodzić zgodnie z jedną z kilku teoretycznych możliwości (ryc. 16. 2): 1) Synteza enzymów może przebiegać kolejno, gdy każdy następny enzym jest indukowany przez produkt poprzedniej reakcji. 2) Wszystkie enzymy biorące udział w danym szlaku metabolicznym mogą być syntetyzowane jednocześnie, tj. substrat A jest zdolny do indukcji wszystkich enzymów od a do e. 3) Enzymy związane z częścią kolejnych reakcji (a, b, c) są indukowane jednocześnie, a końcowy produkt ich działania (D) lub nawet inny, poprzedni produkt (C) indukuje syntezę następnych enzymów (d, e).

Główną zaletą jednoczesnej syntezy wszystkich enzymów biorących udział w katabolizmie jest stworzenie możliwości szybkiej odpowiedzi komórki na obecność substratu. Następujące po sobie zdarzenia indukcyjne wiążą się ze zmianą substratów indukujących, co wpływa na spowolnienie odpowiedzi; produkt pierwszej reakcji musi osiągnąć progowe stężenie

603

w komórce zanim stanie się zdolny do indukcji następnego enzymu. Natomiast w regulacji enzymów związanych z zachodzącymi na siebie szlakami metabolicznymi najbardziej właściwy wydaje się podział na regulowane w sposób skooordynowany grupy indukowane przez produkt grup poprzednich.

Sposoby regulacji zbieżnych (konwergencyjnych) szlaków metabolicznych były badane szczególnie dokładnie w przypadku rozkładu migdalanu, 4-hydroksybenzoesanu i tryptofanu u Pseudomonas putida, Acetinobacter calcoaceticus i Alcaligenes eutrophus. Sposoby te różnią się i zależą od gatunku. Indukcja przez produkt. Niektóre kataboliczne enzymy są indukowane przez produkty pierwszej, ewentualnie następnych reakcji danego szlaku. Można to zbadać na przykładzie rozkładu tryptofanu. Droga rozkładu tryptofanu prowadzi przez formylokinureinę, kinureinę i antranilan do katecholu, przy czym kinureina pełni rolę induktora. Ten rodzaj enzymatycznej indukcji wymaga wystarczająco wysokiego podstawowego poziomu enzymów zmieniających tryptofan w kinureinę, co zapewnia obecność przynajmniej śladów tego związku w komórce w obecności tryptofanu.

Indukcja rozkładu tryptofanu przez produkt reakcji jest przykładem mechanizmu chroniącego przed indukcją enzymów katabolicznych przez endogennie tworzony tryptofan zużywany do syntezy białek. W rezultacie tryptofan może być kabolizowany jedynie wówczas, gdy znajduje się w pożywce i jest pobierany w dużych ilościach przez komórkę.

604

16. 1. 2. Represja Represja przez produkt końcowy. Biosynteza argininy jest przykładem pokazującym mechanizm represji szlaku biosyntetycznego przez produkt końcowy i wpływ tego produktu na stężenie biosyntetycznych enzymów (ryc. 16. 3). Synteza argininy rozpoczyna się od glutaminianu (ryc. 7. 18)

i prowadzi przez ornitynę, cytrulinę oraz bursztynian argininy do argininy. Podczas wzrostu E. coli na podłożu minimalnym, enzym, karbamoilotransferaza ornitynowa (OCTaza) — przedstawiciel enzymów szlaku biosyntetycznego argininy, znajduje się w komórkach w „normalnym" stężeniu. Dodanie argininy (20 μg/ml) do podłoża prowadzi do natychmiastowego ustania (represji) syntezy OCTazy. Wzrost na pożywce z argininą powoduje wewnątrzkomórkowe rozcieńczenie enzymu, a jego swoista aktywność spada do bardzo niskich wartości. Ponowne pozbawienie komórek źródła argininy przez przemycie i następne zawieszenie w pożywce bez aminokwasu powoduje natychmiastową derepresję syntezy enzymu, którego stężenie wzrasta wielokrotnie (ryc. 16. 4). Po pewnym czasie, gdy aktywna synteza argininy doprowadzi do jej nagromadzenia się w komórkach,

605

swoista aktywność OCTazy zaczyna stopniowo opadać do poziomu „normalnego". Eksperymenty prowadzone w chemostacie z użyciem mutantów charakteryzujących się defektem jednego z enzymów szlaku biosyntezy argininy wykazały, że w tych warunkach stan derepresji utrzymuje się. W rezultacie, jeśli ilość argininy jest czynnikiem ograniczającym wzrost mutanta, swoista aktywność OCTazy 25-krotnie przewyższa poziom „normalny". Regulacja rozgałęzionych szlaków biosyntetycznych. Regulacja tworzenia się enzymów związanych z rozgałęzionymi szlakami biosyntetycznymi zachodzi w sposób skomplikowany. Przykładami takich szlaków są biosyntezy: aminokwasów aromatycznych, pochodnych asparaginianu i pochodnych pirogronianu (ryc. 7. 18). Poszczególne produkty końcowe hamują wyłącznie syntezę enzymów własnego szlaku. Natomiast enzymy funkcjonujące przed rozgałęzieniem są hamowane przez wszystkie produkty końcowe działające łącznie; zjawisko to nazywamy represją wielowartościową. Synteza enzymów ulega represji jedynie w obecności wszystkich

606

produktów końcowych w podłożu; dodanie tylko jednego z tych produktów nie ma żadnego znaczenia. Interesującym przykładem rozgałęzionego szlaku jest droga syntezy L-waliny, L-izoleucyny i L-leucyny. Cztery reakcje enzymatyczne prowadzące odpowiednio od pirogronianu do waliny lub od 2-ketomaślanu do izoleucyny. Co więcej, 2-ketoizowalerian (2-okso-3-metylomaślan) jest prekursorem waliny i substratem (miejscem rozgałęzienia reakcji) dla syntezy leucyny (ryc. 16. 5). Represja kataboliczna. Opisana wyżej represja przez produkt końcowy jest związana ze szlakami biosyntetycznymi, natomiast represja kataboliczna odnosi się do szlaków rozkładu substratów. Represja kataboliczna leży u podstaw znanego zjawiska diauksji (ryc. 6. 10). Dwa związki tworzące pary substratów: glukoza i sorbitol, glukoza i laktoza lub glukoza i octan nigdy nie są zużywane przez E. coli w tym samym czasie, lecz jeden po drugim. Glukoza jest metabolizowana jako pierwsza, jednocześnie hamując wytwarzanie enzymów niezbędnych do katabolizmu innych substratów (ryc. 16. 6). Z niezwykle skomplikowaną sytuacją mamy do czynienia, gdy są zużywane aminokwasy, które mogą służyć zarówno jako źródło węgla,

607

jak i azotu. Przypadek ten może być omówiony na przykładzie badania rozkładu histydyny przez Enterobacter aerogenes, opartego na pomiarze wewnątrzkomórkowego stężenia histydazy (tab. 16. 1). W obecności glukozy i soli amonowych nie wykrywa się w komórkach histydazy, nawet przy jednoczesnej obecności histydyny. Glukoza + jony amonowe prowadzą do całkowitej represji syntezy enzymu. Brak azotu amonowego w podłożu, sprawiający, że histydyna jest jedynym źródłem tego pierwiastka, obniża hamujący efekt glukozy. Przykład ten obrazuje, iż brak azotu może działać przeciwstawnie do represji katabolicznej wywie-

608

ranej przez glukozę. Synteza enzymów katabolicznych zależy więc nie tylko od obecności induktora i dostarczenia źródła energii, ale również od dostępności źródła azotu w podłożu. Regulacja stężenia enzymów należących do głównych szlaków metabolicznych. Enzymy wchodzące w skład szlaków amfibolicznych również podlegają genetycznej regulacji. Enzymy cyklu kwasów trikarboksylowych są obecne w komórce E. coli w wysokim stężeniu, jeśli wzrost zachodzi w warunkach tlenowych, zaś przy braku tlenu swoista aktywność enzymów obniża się dziesięcio-, dwudziestokrotnie, a jednego z nich, dehydrogenazy α-ketoglutaranowej — całkowicie. Niektóre z enzymów anaplerotycznych, jak syntaza jabłczanowa, liaza izocytrynianowa lub karboligaza glioksylanowa występują jedynie w komórkach, które potrzebują ich do metabolizmu właściwych substratów.

16. 1. 3. Mechanizm regulacji Teoretycznie, synteza enzymu może być regulowana na etapie transkrypcji lub translacji. Prokaryota preferują regulację transkrypcyjną i tak właśnie jest regulowana ekspresja większości genów kodujących łańcuchy polipeptydowe. Warunki środowiska i możliwości metaboliczne komórki określają, czy i z jaką częstością są transkrybowane geny strukturalne. Taki mechanizm regulacji wymaga przekazania określonych sygnałów z cytoplazmy komórki do DNA. Cząsteczki sygnalne, czyli cząsteczki efektora, są związkami o małej masie cząsteczkowej, takimi jak cukry lub ich pochodne, aminokwasy lub nukleotydy. Efektory nie mogą oddziaływać bezpośrednio z DNA, lecz wymagają udziału określonych białek regulatorowych. Efekt ich uwidacznia się dopiero po połączeniu z odpowiadającymi im białkami, co prowadzi do zmiany konformacji tych białek, wpływając na ich związanie z DNA. Białko regulatorowe zdolne do wiązania się z DNA w nieobecności efektora (induktora) nazywa się represorem, natomiast białko wiążące się z DNA jedynie po dodaniu efektora (korepresora) nazywamy aporepresorem. Białka regulatorowe nie wiążą się z DNA w obrębie genów strukturalnych, lecz w sekwencjach sąsiednich — promotorach i operatorach. Promotor, operator i gen(y) struktury wchodzą w skład operonu. Promotor to sekwencja zasad rozpoznawana przez DNA-zależną polimerazę RNA, w obrębie której leżą miejsca wiązania polimerazy RNA i startu 609

transkrypcji danego genu lub operonu. Wszystkie geny, nawet te, których transkrypcja nie podlega regulacji, są poprzedzone promotorami. Inicjacja transkrypcji w promotorach genów regulowanych jest modyfikowana przez wiązanie białek regulatorowych. Represor wiąże się z sekwencją operatora umiejscowioną między promotorem a genami struktury, co hamuje transkrypcję. Termin operon określa grupę genów spokrewnionych funkcjonalnie. Białka kodowane przez geny wchodzące w skład operonu są zazwyczaj enzymami katalizującymi kilka etapów jednego szlaku metabolicznego. W wyniku transkrypcji powstaje jedna (policistronowa) cząsteczka mRNA. Synteza białek regulatorowych jest uwarunkowana obecnością genów regulatorowych, których ekspresja jest zazwyczaj konstytutywna. Geny te mogą, choć nie muszą, znajdować się w sąsiedztwie operonu, którego ekspresję regulują. Jedynie kompletna cząsteczka polimerazy RNA (holoenzym) zdolna jest do właściwego rozpoznania promotorów. Polimeraza RNA składa się z podjednostek α, β, β' i σ. Polimeraza pozbawiona czynnika sigma (σ), który dość łatwo odłącza się od reszty enzymu, zachowuje aktywność katalityczną, ale traci zdolność do łączenia się z promotorem. Czynnik sigma niewątpliwie pełni istotną rolę w wiązaniu polimerazy do DNA. Zakończenie syntezy RNA na końcu operonu zależy od swoistej sekwencji zwanej terminatorem. Rola terminacyjnego czynnika rho (p) aktywnego w formie tetramerycznej w odłączeniu polimerazy RNA od DNA jest nadal niejasna. W przeciwieństwie do tRNA i rRNA, mRNA jest nietrwały; wiele rodzajów mRNA ma czas półtrwania wynoszący zaledwie 0, 5-5 minut. Wynika z tego, że stężenie określonego rodzaju mRNA w komórce zależy od wydajności jego transkrypcji, z kolei ilość mRNA determinuje ilość kodowanego przez nie białka. Można odróżnić operony indukowane i reprymowane. Kataboliczne operony laktozy, galaktozy i arabinozy są indukowane, tzn. maksymalną wydajność transkrypcji można osiągnąć po dodaniu do podłoża zewnętrznych efektorów (induktorów). Z drugiej strony, biosyntetyczne operony argininy, histydyny lub tryptofanu stanowią przykład operonów reprymowanych. Maksymalną wydajność transkrypcji obserwuje się w nieobecności efektora w podłożu. Jak już wspomniano, efektory te nazywają

610

611

się korepresorami, a regulatorowe białka, z którymi współpracują — aporepresorami. Synteza enzymów kodowanych przez operony reprymowane rozpoczyna się od ich derepresji. Indukcja operonu laktozy (kontrola negatywna). Operon laktozy (lac) E. coli składa się z promotora lac, operatora lac i genów strukturalnych trzech enzymów: β-galaktozydazy, permeazy β-galaktozydowej i transacetylazy tiogalaktozydowej (ryc. 16. 7). Operon ten był badany bardzo szczegółowo. Wyizolowano DNA i określono sekwencję regionu promotora-operatora. Został również wyizolowany i analizowany represor lac (białko regulatorowe). Operon lac podlega kontroli negatywnej; znaczy to, że białko regulatorowe (represor lac) pozostaje związane z operatorem, hamując transkrypcję operonu dopóki nie pojawi się induktor. Rolę zewnętrznego induktora pełni laktoza (α-D-galaktozylo-β-1, 4-D-glukoza). Permeaza β-galaktozydowa transportuje związek do komórki, gdzie zostaje on zamieniony w allolaktozę (α-D-galaktozylo-β -1, 6-D-glukozę), która funkcjonuje jako induktor wewnątrzkomórkowy. Zmiana laktozy w allolaktozę jest katalizowana przez β-galaktozydazę. Te dwa enzymy permeaza β-galaktozydowa i β-galaktozydaza w nieindukowanych komórkach są obecne w ilościach śladowych, tysiąckrotnie mniejszych niż po całkowitej indukcji. Związanie allolaktozy do represora lac powoduje jego zmiany konformacyjne, a przez to zmniejsza powinowactwo represora do sekwencji DNA operatora. Represor opuszcza operator, stwarzając warunki do rozpoczęcia transkrypcji. Operon laktozy podlega również drugiej, pozytywnej kontroli. Transkrypcja zachodzi jedynie wówczas, gdy białko regulatorowe zwane CRP lub CAP (angielskie skróty pochodzą od: cyclic AMP receptor protein = białko receptora dla cyklicznego AMP i catabolite activator protein = białko aktywatora katabolicznego i są synonimami). Związanie CRP do promotora warunkuje przyłączenie polimerazy RNA. Cykliczny AMP (cAMP) zwiększa powinowactwo CRP do promotora, w rezultacie CRP wiąże się z DNA jedynie w warunkach dużego komórkowego stężenia cAMP. Kataboliczna represja operonu laktozy. Jak już wspomniano poprzednio, jednoczesna obecność laktozy i glukozy w pożywce prowadzi do represji operonu lac E. coli (ryc. 16. 6 i 16. 7). Negatywny wpływ glukozy (wywołujący zjawisko diauksji) jest spowodowany małym wewnątrzkomórkowym stężeniem cAMP w obecności tego cukru. Kataboliczna

612

represja związana z obecnością glukozy (także fruktozy i glukozo-6-fosforanu) rozciąga się również na inne szlaki kataboliczne (arabinozy, galaktozy, sorbozy, glicerolu itp. ). Zmniejszenie stężenia cAMP ma związek z komórkowym umiejscowieniem enzymu syntetyzującego ten nukleotyd, tj. cyklazy adenylanowej, powodującej konwersję ATP do cAMP.

Cyklaza adenylanowa znajduje się w osłonach, a jej aktywność zwiększa się, gdy system transportu cukrów do wnętrza komórek, HPr, istnieje w formie ufosforylowanej. Transport cukrów przez system HPr jest związany z ich fosforylacją, co powoduje zużycie energii. Indukcja operonu arabinozy (kontrola pozytywna). Operon arabinozy (ara) E. coli oraz operony ramnozy i maltozy podlegają również kontroli pozytywnej. Operon ara składa się z genów strukturalnych ara A, ara Β i ara D, których produkty powodują konwersję L-arabinozy do D-ksylulozo-5-fosforanu. Induktorem operonu jest arabinoza. Tak jak wiele katabolicznych operonów, również ten podlega regulacji inicjacji transkrypcji przez białko cAMP-CRP. Operon zawiera dwa inne regulatorowe regiony: operator i inicjator. Białko regulatorowe kodowane przez gen ara C wiąże się z operatorem i działając jak represor prowadzi do zahamowania transkrypcji. Arabinoza zmienia białko represora w inicjator, który przez wiązanie się z promotorem powoduje inicjację transkrypcji. Operon ten podlega, jak widać, kontroli negatywnej i kontroli pozytywnej związanej z działaniem swoistego białka regulatorowego. Represja operonu tryptofanu przez produkt końcowy. Operon tryptofanu E. coli składa się z genów strukturalnych kodujących pięć enzymów powodujących przejście kwasu choryzmowego w tryptofan oraz z operatora i promotora znajdujących się na początku operonu. Znaczenie drugiego, mniej wydajnego promotora umiejscowionego w obrębie genów strukturalnych, można tu pominąć. Szczegółowe badania funkcjonowania operonu doprowadziły do wyjaśnienia jego regulacji, która świetnie pasuje do modelu funkcjonowania operonów reprymowalnych, sformułowanego przez Jacoba i Monoda w 1961 r. Gen regulatorowy trpR oddalony od operatora operonów reprymowalnych koduje białko efektora — aporepreso613

ra. Tryptofan funkcjonuje jako korepresor, ma duże powinowactwo do aporepresora i powoduje zmianę tego ostatniego w funkcjonalny represor zapobiegający transkrypcji. Zmniejszenie stężenia tryptofanu prowadzi do dysocjacji represora, uwolnienia operatora i do syntezy mRNA. Regulacja autogenna. Termin ten odnosi się do systemów, w których rolę białka regulatorowego pełni produkt genu umiejscowionego w obrębie regulowanego operonu. Białko to, kontrolując ekspresję operonu, jednocześnie reguluje swoją własną syntezę. Autoregulacja może być zarówno pozytywna, jak i negatywna. Najlepiej poznany system autoregulacji jest związany z wykorzystaniem histydyny przez Salmonella. Rozkład histydyny do glutaminianu i amoniaku jest katalizowany przez cztery enzymy, których geny strukturalne (geny hut) są umiejscowione blisko siebie. Ekspresja tych enzymów

614

znajduje się pod kontrolą represora, a gen kodujący represor jest umiejscowiony między genami strukturalnymi i stanowi część operonu. Operon hut jest indukowany przez pierwszy produkt tej drogi metabolicznej — urokainian (indukcja przez produkt). Indukcja operonu prowadzi więc nie tylko do syntezy enzymów rozkładających histydynę, ale również do akumulacji białka represora. Represor powoduje spadek transkrypcji operonu, włączając w to gen regulatorowy. Ta metoda kontroli syntezy enzymów jest bardzo efektywna, a systemy autoregulacyjne są szeroko rozpowszechnione wśród bakterii, eukariotów i bakteriofagów. Regulacja syntezy tRNA i rRNA. Synteza mRNA jest kontrolowana przez indukcję, represję i represję kataboliczną, natomiast regulacja syntez stabilnych RNA zachodzi w całkowicie inny sposób. Od dłuższego czasu wiadomo, że Escherichia coli, Salmonella typhimurium i Bacillus subtilis reagują gwałtownie na brak aminokwasu koniecznego do wzrostu. Następuje natychmiastowe ustanie syntezy nie tylko białek, lecz również RNA. To ścisłe (stringent) uzależnienie syntezy RNA od obecności aminokwasów wskazuje, że jego synteza jest warunkowna nie tylko dostępnością własnych składników budulcowych — nukleotydów. Izolacja jednostopniowych mutantów z rozluźnioną regulacją (relaxed), które mogą syntetyzować RNA nawet przy braku wymaganego aminokwasu, udowodniła, że z procesem tym jest związany przynajmniej jeden gen (relA). Brak aminokwasu prowadzi do nagromadzenia się nietypowych nukleotydów (ppGpp i pppGpp) w komórkach dzikiego typu; nie obserwuje się tego w komórkach mutanta. Przyjmuje się, że nukleotydy te dają sygnał do zaprzestania syntezy tRNA i rRNA.

16. 2. Regulacja przez zmianę katalitycznej aktywności enzymów W poprzednich rozdziałach przedstawiono możliwości, którymi dysponuje komórka, aby dostosować stężenie enzymów do potrzeb metabolizmu. Synteza enzymów de ηονο lub ich rozcieńczanie podczas wzrostu komórki prowadzi do stopniowej i powolnej adaptacji do zmian warunków środowiska. O wiele szybsza adaptacja do nagłych wahnięć warunków metabolicznych może być osiągnięta drogą modyfikacji katalitycznej aktywności enzymów. 615

16. 2. 1. Mechanizmy regulacji Szybkość reakcji katalizowanej przez enzym, opisana zazwyczaj jako ilość substratu ulegająca przemianie w określonej jednostce czasu (μmol substratu/min), zależy od powinowactwa enzymu do substratu (Km) i od maksymalnej szybkości (Vmax), jak również od stężeń enzymu (E), substratu (S) lub produktu (P). Km, tzw. stała Michaelisa-Menten, określa stężenie substratu, przy którym aktywność enzymu osiąga połowę maksymalnej szybkości (Vmax/2). Maksymalna szybkość enzymu jest uzyskiwana w warunkach nadmiaru substratu, gdy cały enzym jest nim „wysycony". Km i Vmax są kinetycznymi parametrami enzymu. Enzymy proste. Większość enzymów charakteryzuje hiperboliczna krzywa wysycenia substratem; szybkość reakcji enzymatycznej zależy jedynie od stężeń substatu oraz produktu i rośnie hiperbolicznie wraz ze wzrostem stężenia substratu. Zachowanie się enzymu podlega równaniu Michaelisa-Menten. Enzymy te nazywamy „hiperbolicznymi" lub prostymi (rys. 16. 9 A, krzywa czarna). Należy przyjąć, że szybkość przemiany substratu

616

zwiększa się wraz ze wzrostem jego stężenia. Wrażliwość enzymu na zmiany stężenia substratu opisuje krzywa nasycenia substratem. W obszarze maksymalnego nachylenia krzywej już bardzo małe wahania stężenia substratu powodują zmiany szybkości reakcji enzymatycznej. Nachylenie krzywej jest największe w małych stężeniach substratu, co widać na rycinie 16. 9A. Powyższe rozważania wykazują, że szybkość przemian metaboliczych w komórce zależy od stężenia metabolitów. Regułą jest, że metabolity są obecne w komórce w stężeniach poniżej wartości Km. Enzymy regulatorowe. Właściwości enzymów regulatorowych są o wiele bardziej złożone niż enzymów zwykłych. Dla większości z nich krzywe nasycenia substratem znacznie się różnią od hiperbolicznych i przyjmują często kształt sigmoidalny (ryc. 16. 9A, B). Krzywe sigmoidalne charakteryzują się znacznie bardziej stromym nachyleniem niż krzywe hiperboliczne. W obszarze nachylenia, średnio między 1/2 a 1 1/4 wartości Km, enzymy są niezwykle czułe i bardzo małe zmiany stężenia substratu wystarczają do spowodowania dużych zmian w szybkości reakcji. Sigmoidalny kształt krzywych oznacza, że enzym składa się z podjednostek, między którymi istnieje współdziałanie. Przyłączenie substratu do centrum katalitycznego jednej podjednostki wyraźnie zwiększa powinowactwo innych miejsc wiążących substrat w tej samej cząsteczce enzymu. Enzymy regulatorowe składają się zazwyczaj z dwóch lub więcej, a najczęściej z czterech podjednostek. Enzymy te mają obok centrum katalitycznego, które rozpoznaje i wiąże substrat, również inne miejsca przestrzennie swoiste, zwane centrami allosterycznymi. W centrach tych wiążą się efektory zmieniające powinowactwo enzymu do substratu. Mogą to być miejsca wiązania efektorów pozytywnych (aktywatorów) i efektorów negatywnych (inhibitorów). Efektory wywierają wpływ na kształt krzywych sigmoidalnych aktywności enzymatycznej (ryc. 16. 9B). Mówi się nie tylko o centrach allosterycznych, lecz także o: enzymach allosterycznych, hamowaniu allosterycznym i efektorach allosterycznych; używa się także naprzemiennie terminów: enzym allosteryczny, enzym regulatorowy, enzym sigmoidalny. Stopień współdziałania jest opisywany współczynnikiem Hilla lub współczynnikiem współdziałania n. Określa on liczbę wzajemnie zależnych miejsc wiązania, a raczej liczbę współdziałających podjednostek. Przy braku współdziałania η = 1. Dla enzymów allosterycznych, złożonych z czterech podjednostek, η leży w przedziale > 1 i < 4, zależnie od stopnia

617

pozytywnego współdziałania. Przy współdziałaniu negatywnym η < 1. Istnieją również systemy bardziej skomplikowane, których tu nie opisujemy.

Modele współdziałania. Współdziałanie między podjednostkami enzymu znajdujące odbicie w sigmoidalnym kształcie krzywych nasycenia substratem można wytłumaczyć opierając się na hipotezie: symetrycznym modelu Monoda, Wymana i Changeuxa oraz sekwencyjnym modelu Kushlanda. Oba modele są przedstawione schematycznie na rycinie 16. 10.

Każdy z modeli opiera się na założenu istnienia możliwości przyjmowania przez enzym różnych konformacji: formy aktywnej (duże pokrewieństwo do substratu) i formy nieaktywnej (małe powinowactwo do substratu). W danym momencie wzajemne powiązania między różnymi formami podjednostek zależą od obecności i stężenia ligandów (substratu, aktywatora i inhibitora). Modele różnią się sposobem, w jaki tłumaczą osiągnięcie zmian konformacyjnych. Zgodnie z modelem symetrycznym, enzym może przybierać tylko dwie alternatywne i znajdujące się w dynamicznej równowadze konformacje. Wszystkie podjednostki w cząsteczce enzymu mają taką samą konformację, nie ma stanów pośrednich, oligomery mogą być jedynie symetryczne (ryc. 16. 11). Stan równowagi jest opisany allosteryczną stałą L. W nieobecności ligandu, nieaktywny podstawowy stan Τ (ang. tense — napięty) przeważa nad stanem aktywnym R (ang. relaxed — rozluźniony). Ligandy mogą reagować jedynie z tymi cząsteczkami enzymu, które mają odpowiednią konformację: inhibitory — z cząsteczkami T, a substraty i aktywatory z cząsteczkami R. Związanie substratu utrwala 618

konformację R, a konieczność utrzymania równowagi powoduje zwiększenie konwersji stanu Τ w stan R. To z kolei umożliwia dalsze wiązanie substratu. Przypuszcza się, że przyłączenie substratu do kilku miejsc wiążących w każdej cząsteczce enzymu (tj. do różnych jego podjednostek) powoduje przejście równej ilości cząstek enzymu do stanu R, który umożliwia reagowanie z dalszymi cząsteczkami substratu. Innymi słowy, początkowe związanie nawet nielicznych cząsteczek substratu umożliwia następne związanie dużej jego ilości, co jest przykładem efektu współdziałania, prowadzącego do sigmoidalnej zależności szybkości reakcji od stężenia substratu. Efektory negatywne mają działanie dokładnie odwrotne. Model sekwencyjny zakłada, że enzym przybiera katalitycznie aktywną konformację jedynie z powodu swych oddziaływań z substratem (ryc. 16. 10). W enzymie złożonym z kilku podjednostek konformacyjna zmiana jednej z nich zaindukowana przez jej oddziaływanie z ligandem jest przenoszona kolejno na inne podjednostki, powodując, że coraz łatwiej wiążą one dalsze cząsteczki substratu. Model przyjmuje możliwość istnienia niesymetrycznych oligomerów (na ryc. 16. 10 — tetramerów), których podjednostki mają różną konformację. Obecność (związanie) aktywatorów ułatwia przejście do form aktywnych, natomiast obecność inhibitorów utrudnia ten proces. Enzymy allosteryczne i efektory. Regułą jest, że enzymy regulatorowe występują we wszystkich szlakach biosyntetycznych i w niektórych szlakach katabolicznych. W większości przypadków allosteryczne enzymy

619

regulatorowe działają na początku szlaku lub w jego szczególnie istotnym miejscu. Allosteryczne efektory, zazwyczaj związki drobnocząsteczkowe, są albo końcowymi produktami drogi biosyntetycznej, albo substancjami, których stężenie odzwierciedla stan metaboliczny komórki, takimi jak: ATP, ADP, AMP, acetylo-CoA, fosfoenolopirogronian, NADH2 itp. Zmiany w aktywności enzymu powodowane jego kowalencyjną modyfikacją. Z niektórymi enzymami związany jest jeszcze inny rodzaj mechanizmu regulacyjnego. Polega on na ich enzymatycznych modyfikacjach. Dotychczas opisano następujące modyfikacje: adenylację, fosforylację i acetylację. Skutek modyfikacji przejawia się natychmiast. Jako przykłady enzymów regulowanych przez enzymatyczną modyfikację można podać fosforylazę degradującą glikogen i syntetazę glikogenową u zwierząt. Aktywność syntetazy glutaminowej u Escherichia coli może być zmniejszona o 80-90% w ciągu kilku minut po dodaniu NH4+ do podłoża: synteza tego enzymu podlega również regulacji przez represję. Spadek aktywności jest spowodowany chemiczną modyfikacją przez adenylację aktywnej formy (syntetaza glutaminianowa a) do nieaktywnej syntetazy glutaminowej b (ryc. 16. 12). Obecność glutaminy w komórkach pobudza enzym adenylujący, podczas gdy α-ketoglutaran hamuje go. Po usunięciu jonów NH4+ z podłoża stężenie glutaminy spada do poziomu ograniczająα-ketoglutaran

620

cego wzrost, enzymy adenylujące tracą aktywność, a system deadenylacji, który usuwa grupy adenylowe (AMP), reaktywuje syntetazę glutaminową.

16. 2. 2. Przykłady sposobów regulacji Szlaki biosyntetyczne. Pierwszym enzymem w szlakach biosyntetycznych jest zazwyczaj enzym regulatorowy, który może być hamowany przez produkt końcowy (hamowanie zwrotne). Nagromadzenie lub nadprodukcja produktu końcowego w komórkach, w konsekwencji zahamowanie pierwszego enzymu w szlaku biosyntetycznym prowadzi do natychmiastowego wyłączenia całego szlaku. Jako przykład może służyć deaminaza treoninowa w biosyntetycznym szlaku prowadzącym od treoniny do izoleucyny.

Kontrolowane i niekontrolowane enzymy izofunkcyjne. Trzeba podkreślić, że nawet w tym samym organizmie nie każda deaminaza treoninowa jest hamowana przez izoleucynę. Podczas wzrostu E. coli w obecności tlenu w podłożu zawierającym glukozę i sole amonowe jest obecna tylko jedna forma deaminazy treoninowej. Udowodnienie, że enzym ten podlega hamowaniu allostrycznemu przez izoleucynę pozwoliło przypisać mu określone funkcje anaboliczne. Przeciwnie, gdy organizm rośnie w warunkach beztlenowych na podłożu zawierającym wiele aminokwasów (hydrolizat kazeiny, pepton), anaboliczna deaminaza treoninowa podlega represji, ale tworzy się izoenzym mający funkcję kataboliczną; izoenzym ten podlega jedynie regulacji allosterycznej przez AMP i ADP. Inny przykład opiera się na syntezie 2-acetylomleczanu przez Enterobacter aerogenes. Reakcja ta, katalizowana przez syntazę kwasu hydroksyoctowego, odgrywa rolę w beztlenowej fermentacji glukozy do acetoiny (katabolizm), jak również zapoczątkowuje syntezę waliny

621

(anabolizm). W ten sposób, 2-acetylomleczan jest produktem przejściowym rozgałęzionej drogi metabolicznej. Organizm ten jest zdolny do wytwarzania dwóch enzymów izofunkcyjnych. Jeden z nich tworzy się jedynie w warunkach obniżonego pH w trakcie procesu fermentacji, gdy acetoina jest wytwarzana jako neutralny jej produkt. Drugi enzym produkowany jest również w obojętnym i lekko zasadowym pH, optimum jego aktywności leży w zakresie wysokiego pH. Enzym ten jest hamowany allosterycznie przez walinę. Przykłady te obrazują sposób wzajemnego oddziaływania dwóch szlaków metabolicznych, możliwego dzięki obecności enzymów izofunkcyjnych, z których jeden podlega ścisłej regulacji, a drugi jest regulowany w inny sposób lub nie jest regulowany wcale. Rozgałęzione szlaki metaboliczne. Istnienie wspólnego pierwszego etapu (etapów) w szlakach biosyntetycznych dla dwóch lub większej liczby produktów stwarza szczególne problemy regulacyjne. Jeżeli, w hipotetycznej kolejności reakcji zmieniających związek A do E, G lub H, już pierwsza reakcja byłaby hamowana w warunkach nagromadzenia się tylko jednego z końcowych produktów reakcji (np. H), prowadziłoby to również do jednoczesnego spadku ilości produktów Ε i G. Z tą komplikacją, wynikającą z rozgałęzienia szlaków metabolicznych, poszczególne mikroorganizmy radzą sobie w różny sposób. Jak dotychczas, wykryto kilka strategii regulacji funkcji enzymów w rozchodzących się lub równoległych szlakach. 1) Pierwszy etap jest katalizowany przez kilka izoenzymów, z których każdy jest regulowany przez inny produkt. 2) Pierwszy etap jest katalizowany przez pojedynczy enzym, ale: a) enzym ten jest hamowany jedynie w przypadku, gdy wszystkie końcowe produkty są w nadmiarze (hamowanie wielowartościowe) lub b) każdy z produktów końcowych uczestniczy w równej części w inhibicji (hamowanie łączne), jednak całkowita inhibicja przewyższa sumę efektu hamującego poszczególnych produktów końcowych (hamowanie kooperatywne). Synteza aminokwasów, takich jak metionina, lizyna, treonina i izoleucyna (rodzina asparaginianu), jest zapoczątkowana przez enzymy

622

izofunkcyjne (ryc. 16. 13). Escherichia coli ma trzy równoległe kinazy asparaginianowe przeprowadzające reakcję: asparaginian + ATP -> kwas 4-fosfoasparaginowy + ADP Aktywności tych enzymów są regulowane przez różne produkty końcowe. Kinaza asparaginianowa I i dehydrogenaza homoserynowa są regulowane przez treoninę. Kinaza asparaginianowa II jest regulowana przez lizynę, a kinaza asparaginianowa III nie podlega kontroli allosterycznej. Regulacja kinaz asparaginianowych może zachodzić również według innego mechanizmu, zgodnie z którym pierwsze z enzymów każdego odgałęzienia szlaku metabolicznego podlegają inhibicji zwrotnej (ryc. 16. 13).

623

Podobne mechanizmy regulacji są wykorzystywane w syntezie aminokwasów aromatycznych (ryc. 7. 18). Synteza fenyloalaniny, tyrozyny, tryptofanu i 4-aminobenzoesanu rozpoczyna się konwersją erytrozo-4-fosforanu i fosfoenolopirogronianu do 3-deoksy-D-arabinoheptulozo-7-fosforanu (DHAP). Escherichia coli ma trzy syntazy DHAP. Jedna z nich jest hamowana przez tyrozynę, druga przez fenyloalaninę, a trzeci, mało aktywny enzym nie podlega inhibicji zwrotnej. W regulacji ma również znaczenie hamowanie zwrotne dalszych enzymów. Fosfofruktokinaza i efekt Pasteura. Efekt Pasteura i zahamowanie glikolizy przez oddychanie (tlenowe) zwykło się przekonująco tłumaczyć

624

przyjmując, że łańcuch oddechowy i fosforylacja substratowa współzawodniczą o fosforan i ADP (rozdz. 8. 1). Jednak, zgodnie z ostatnimi badaniami, kontrola metabolizmu heksozy w szlaku fruktozobisfosforanu opiera się na allosterycznej regulacji fosfofruktokinazy (ryc. 16. 14). Fosfofruktokinaza z drożdży piekarnianych podlega allosterycznemu zahamowaniu przez ATP. ATP sprawia, że krzywa nasycenia substratem staje się bardziej sigmoidalna. Na podkreślenie zasługuje zaskakujący fakt braku zdolności hamowania lub regulacji enzymu przez 5'-fosforany inozyny, guanozyny i cytydyny, mimo że związki te mogą służyć, podobnie jak ATP, jako dawcy grup fosforanowych. Świadczy to, że centrum allosteryczne charakteryzuje się wysoką swoistością dla ATP, swoistość katalicznego centrum jest natomiast niska. AMP może spełniać funkcję pozytywnego efektora i zapobiegać inhibicji przez ATP, natomiast inne mono- lub difosforany dają znikomy efekt. W komórkach E. coli rolę AMP, jako pozytywnego efektora przejmuje ADP. Fosfofruktokinaza jest również hamowana przez cytrynian; hamowanie to zwiększa ATP, a fruktozo-6-fosforan znosi je. Znajomość allosterycznych właściwości fosfofruktokinazy pozwoliła na postulowanie następującego modelu. Pozbawienie tlenu drożdży lub hodowli tkankowych normalnie rosnących w warunkach tlenowych prowadzi do zablokowania fosforylacji i spadku stężenia ATP w stosunku do AMP. Powoduje to wzrost aktywności enzymu (fosfofruktokinazy) i szybszy przepływ metabolitów w szlaku fruktozobisfosforanu. Pomiary wewnątrzkomórkowego stężenia glukozy, glukozo-6-fosforanu, fruktozo-6-fosforanu, fruktozo-1, 6-bisfosforanu i fosfotrioz przed i po zmianie warunków z tlenowych na beztlenowe potwierdziły istotność tego systemu regulacji. Stężenie glukozo-6-fosforanu i fruktozo-6-fosforanu wzrasta natychmiast po napowietrzaniu komórek, podczas gdy stężenie fruktozo-1, 6-bisfosforanu i fosfotrioz gwałtownie się zmniejsza. Fosfofruktokinaza działa więc jak zawór bezpieczeństwa kontrolowany przez adenylany i inne metabolity; kiedy zawór jest zamknięty, metabolity umiejscowione przed nim (powyżej) nagromadzają się, podczas gdy metabolity umiejscowione za nim są nadal metabolizowane, a więc stężenie ich się zmniejsza. Zahamowanie metabolizmu przez tlen jest więc zrozumiałe. Glukoneogeneza. ATP, ADP, AMP i acetylo-CoA biorą udział w regulacji kilku reakcji związanych z metabolizmem heksoz, z metabolizmem pośrednim i z syntezą produktów zapasowych. Regulacyjne działanie

625

fosfofruktokinazy niewątpliwie jest główną kontrolą przepływu metabolitów przez szlak fruktozobisfosforanu. Liczne bakterie mają dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, enzym kontrolujący katabolizm w szlaku 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonianu. Enzym ten jest w znacznym stopniu hamowany przez ATP i NADH2. Synteza glukozy z pirogronianu lub mleczanu (glukoneogeneza) staje się szczególnie istotna, gdy w braku innych węglowodanów związki te służą jako źródło węgla. Synteza przebiega przez reakcje stanowiące odwrotność szlaku fruktozobisfosforanu, z wyjątkiem trzech nieodwracalnych etapów (ryc. 16. 14). Reakcje te są katalizowane przez enzymy regulacyjne. W tkankach zwierzęcych szczawiooctan jest produktem pośrednim w reakcji syntezy fosfoenolopirogronianu z pirogronianu. Pierwszy etap, zależny od acetylo-CoA, jest katalizowany przez karboksylazę pirogronianową. Wydaje się, że acetylo-CoA służy jako związek wysycający wszystkie reakcje metaboliczne zużywające go, a przede wszystkim końcowe reakcje utleniania w cyklu kwasów trikarboksylowych (TCA). Ten kontrolny mechanizm pozwala na syntezę glukozy jedynie wobec nadmiaru acetylo-CoA, co z kolei gwarantuje działanie skierowane na zysk energetyczny. Co więcej, zależność tworzenia się szczawiooctanu (z pirogronianu) od acetylo-CoA ma również znaczenie dla wejścia tego związku w cykl kwasów trikarboksylowych. Druga nieodwracalna reakcja w katabolizmie glukozy jest ominięta w procesie glukoneogenezy dzięki działaniu fruktozo-1, 6-bisfosfatazy

AMP hamuje ten enzym, a tym samym staje się wskaźnikiem stopnia zaspokojenia potrzeb komórki na związki wysokoenergetyczne; nadmiar AMP oznacza zarazem niedomiar ATP zdolnego do podtrzymania reakcji zużywających energię. W warunkach tych glukoneogeneza powinna być zahamowana na korzyść katabolizmu glukozy dostarczającego energii. Cykl kwasów trikarboksylowych. W drożdżach, ATP znacznie zmniejsza powinowactwo syntazy cytrynianowej do acetylo-CoA. U E. coli i innych bakterii duże stężenie NADH, sygnalizuje wysycenie łańcucha oddechowego i konieczność zmniejszenia przepływu metabolitów w cyklu kwasów trikarboksylowych. NADH2 hamuje 3 enzymy, tj. dehydrogenazę 626

α-ketoglutaranową, syntazę cytrynianową i dehydrogenazę pirogronianową (ryc. 16. 14). Synteza tłuszczy zapasowych. Materiały zapasowe zaczynają się zazwyczaj gromadzić, gdy zarówno źródła węgla, jak i energii dostarczone są w nadmiarze, a jednocześnie wzrost jest zahamowany lub ograniczony przez brak azotu lub siarki. Sygnał do tworzenia tłuszczy (kwasów tłuszczowych) i polisacharydów pochodzi głównie od metabolitów wtórnych. W drożdżach reakcją ograniczającą syntezę kwasów tłuszczowych jest karboksylacja acetylo-CoA zachodząca z udziałem karboksylazy acetylo-CoA:

Enzym ten jest pierwszy w ciągu biosyntezy długołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Inne rodzaje syntez rozpoczynające się od acetylo-CoA (synteza karotenoidu, steroidu, cytrynianu i jabłczanu) nie wymagają aktywacji przez malonylo-CoA. Karboksylaza acetylo-CoA jest aktywowana przez cytrynian, a więc zwiększone stężenie cytrynianu w komórkach prowadzi, poprzez syntezę malonylo-CoA, do produkcji długołańcuchowych kwasów tłuszczowych i tłuszczy (triglicerydów). CoA-pochodne kwasu palmitynowego i innych kwasów tłuszczowych działają w kierunku przeciwnym i pełnią rolę efektorów negatywnych. Nagromadzenie się tych efektorów prowadzi do hamowania reakcji przez produkt końcowy. Synteza zapasowych wielocukrów. Związkiem wyjściowym do syntezy glikogenu i skrobi jest glukozo-1-fosforan, który po aktywacji przez nukleozydotrifosforan (NTP) zostaje włączony do łańcucha glukanu.

Synteza glikogenu w wątrobie wykorzystuje UDP-glukozę, natomiast synteza skrobi w roślinach zielonych i synteza glikogenu w niektórych bakteriach zużywa ADP-glukozę. System regulacyjny bakterii i roślin 627

różni się znacznie od działającego w komórkach wątroby, gdzie rolę enzymu regulacyjnego pełni tu pirofosforylaza. U E. coli, Arthrobacter, Rhodospirillum rubrum i w liściach szpinaku AMP i ADP hamuje, a prekursor (glukozo-1-fosforan) stymuluje enzym. Pirofosforylaza z E. coli jest aktywowana przez fruktozobisfosforan, aldehyd fosfoglicerynowy i fosfoenolopirogronian, aktywatorem enzymu u R. rubrum jest pirogronian, a w liściach szpinaku — 3-fosfoglicerynian, fosfoenolopirogronian i fruktozobisfosforan. Kontrola syntezy polisacharydów świadczy o tym, że różne systemy regulacyjne prowadzą do tego samego celu. Autotroficzne wiązanie dwutlenku węgla. Wiązanie dwutlenku węgla w cyklu rybulozo-l, 5-bisfosforanu jest jednym z najbardziej energochłonnych procesów w metabolizmie komórkowym. Logiczną tego konsekwencją jest istnienie mechanizmu kontrolnego, który sprawia, że cykl ten funkcjonuje z największą wydajnością tylko wtedy, gdy zapewniony jest dopływ energii niezbędnej do podtrzymania procesów komórkowych (syntezy mono- i polimerów, odnawiania enzymów itp. ). Ta globalna kontrola odbywa się za pośrednictwem fosforybulokinazy. Enzym ten jest hamowany przez AMP (a czasami przez ADP), natomiast NADH2 zwiększa jego aktywność. Potencjał energetyczny komórki. Cytowane wyżej przykłady potwierdzają znaczenie kontrolnej roli adenylanów w komórce. Adenylany przekazują sygnał wspólny dla procesów anabolicznych i katabolicznych oraz regulują szybkość reakcji dostarczających energii i szybkość biosyntez komórkowych. Wewnątrzkomórkowe stężenie ATP, AMP lub ADP, albo raczej ilościowe stosunki między nimi określają szybkość poszczególnych reakcji a, co za tym idzie, ogólne tempo przemian anabolicznych i katabolicznych. Poniższa formuła opisuje w sposób ilościowy ładunek energetyczny komórki (EC = energy charge):

Współczynnik 0, 5 jest przyjęty umownie, a jego wartość może się wahać między 0 i 1. Potencjał energetyczny określa, ile jest wysokoenergetycznych wiązań w stosunku do całkowitej ilości adenylanów. Wartość ta wynosi 1, gdy wszystkie adenylany są w formie ATP, i 0, gdy wszystkie są w formie AMP. Potencjał energetyczny komórek rosnących wykładniczo wynosi zwykle 0, 8.

628

Dostępne dane doświadczalne są zgodne z postulowanym hamującym lub aktywującym działaniem adenylanów na enzymy allosteryczne, co prowadzi do zharmonizowania wszystkich reakcji metabolicznych. W ten sposób, zwiększenie potencjału energetycznego komórki powoduje zmniejszenie aktywności enzymów katabolicznych, z jednoczesnym wzrostem aktywności enzymów biorących udział w reakcjach syntezy. Zmniejszenie zasobów energetycznych prowadzi do reakcji odwrotnej.

16. 3. Mutanty z zaburzeniami w regulacji Poznanie mechanizmów regulujących syntezę i aktywność enzymów zawdzięczamy w dużym stopniu mutantom z zaburzeniami w regulacji. Na przykład, izolowano i w dalszym ciągu izoluje się mutanty, które: 1) nie tworzą białka represora lub przeciwnie, syntetyzują go w znacznym nadmiarze; 2) są konstytutywne z powodu mutacji operatora przestającego wiązać represor; 3) nie są podatne na regulację allosteryczną, tzn. enzymy allosteryczne przestają rozpoznawać allosteryczne efektory. Poniżej opisano kilka podstawowych metod izolacji takich mutantów. Mutanty konstytutywnie wytwarzające enzymy kataboliczne. Frakcję mutantów syntetyzujących enzymy kataboliczne w sposób konstytutywny można wzbogacić przez częste zmiany substratu. Konstytutywna produkcja enzymów pozwalających wykorzystać substat A umożliwia komórkom osiągnięcie maksymalnej szybkości wzrostu natychmiast po zmianie substratu z Β na A. Komórki dzikiego typu, w których synteza enzymu jest indukowana, muszą uprzednio wytworzyć enzym pozwalający na wykorzystanie nowego substratu B, co powoduje ich przejście przez fazę zastoju. Po kilku generacjach hodowlę ponownie przenosi się do podłoża z substratem B, gdzie rośnie ona przez pewien czas, podczas którego enzym rozkładający substrat A zostaje rozcieńczony w komórkach tworzących go indukcyjnie. Po kilku takich pasażach, komórki tworzące konstytutywnie enzym rozkładający substrat A przerastają populację komórek dzikiego typu. W ten właśnie sposób izolowano mutanty konstytutywne w operonie laktozy. Inne metody selekcji są oparte na wykorzystaniu hamującego efektu analogów substratu na proces indukcji, czego przykładem jest działanie tiometylogalaktozydu na indukcję operonu galaktozy — gal w E. coli.

629

Mutanty konstytutywnie wytwarzające enzymy biosyntetyczne. Mutanty tworzące enzymy biosyntetyczne w sposób konstytutywny bądź też nie nie mające zdolności do kontroli biosyntez przez hamowanie zwrotne mogą być otrzymane za pomocą metody antymetabolitowej. Wiele antymetabolitów lub strukturalnych analogów (rozdz. 6. 6) produktów końcowych (aminokwasów, puryn, pirymidyn, itp. ) ma działanie bakteriostatyczne. Z jednej strony, struktura tych związków przypomina produkty, co jest podstawą hamowania przez nie syntezy normalnych metabolitów, a z drugiej strony, związki te mogą być włączane do białek i kwasów nukleinowych, a to, z kolei, powoduje unieczynnienie tych polimerów. W wyniku działania wspomnianych pseudoproduktów wzrost zostaje zahamowany. Jeżeli populacja dzikich komórek w liczbie 10 8 —10 10 zostanie wysiana na podłoże agarowe z antymetabolitem, wówczas jedynie kilka opornych mutantów może wytworzyć kolonie. Mutacje powodujące oporność na antymetabolity mogą być różnorodne. 1. Mutacje prowadzące do utraty wrażliwości na kontrolę allosteryczną. Powoduje to brak możliwości regulacji allosterycznego (pierwszego) enzymu przez normalny metabolit, co prowadzi do niekontrolowanej syntezy końcowego produktu tej drogi metabolicznej. 2. Mutacje powodujące ciągłą derepresję. U podstaw tych mutacji leży niekontrolowana produkcja enzymów biorących udział w biosyntezie określonego produktu końcowego. 3. Mutacje w centrach katalitycznych, aktywujących i powodujących przemiany metabolitu. Zwiększenie swoistości enzymu, z zachowaniem zdolności do wiązania metabolitu, powoduje utratę zdolności wiązania antymetabolitu, a to jest przyczyną braku jego bakteriostatycznego działania. 4. Mutacje wywołujące zaburzenia w transporcie mogą powodować brak transportu antymetabolitu do wnętrza komórki, a tym samym uniemożliwiają jego działanie. 5. Mutacje umożliwiające konstytutywny katabolizm, a w następstwie tego unieczynnienie antymetabolitu. Tylko pierwsze dwa z wymienionych typów mutacji są interesujące z punktu widzenia selekcji komórek z zaburzeniami regulacyjnymi. Derepresja enzymów biosyntetycznych i utrata możliwości hamowania allosterycznego prowadzi często do nadprodukcji i wydzielenia końcowego produktu biosyntezy. Nadprodukcja metabolitu przez komórki mutanta powoduje usunięcie antymetabolitu z miejsca jego działania w komórce, umożliwiając jej wzrost i tworzenie kolonii. Produkowany w nadmiarze metabolit zostaje wydzielony, dyfunduje w agarze i na obszarze objętym tą dyfuzją

630

może przeciwdziałać wpływowi antymetabolitu na komórki dzikiego typu, co stwarza im możliwość wzrostu i tworzenia maleńkich, satelitarnych kolonii. Pierścień wtórnych, satelitarnych kolonii wskazuje, że kolonie położone centralnie składają się z komórek mutanta, który wydziela metabolit (ryc. 16. 15), a więc odznacza się defektem regulacyjnym. Poznanie charakteru defektu prowadzącego do nagromadzenia i wydzielenia metabolitu wymaga dalszej analizy. Znaczna liczba mutantów z defektem regulacyjnym była izolowana metodą wykorzystującą antymetabolity. Porównanie różnych mutantów defektywnych w regulacji wykazało, że brak represji wywiera mniejszy efekt na poziom syntezy produktu końcowego niż zmiany wrażliwości na hamowanie allosteryczne. Mutant, który utracił wrażliwość na zahamowanie szlaku metabolicznego, gromadzi produkt końcowy wewnątrz komórki i często wydziela go na zewnątrz, nawet gdy represja pozostaje nie zmieniona. Przeciwnie, mutanty charakteryzujące się znaczną derepresją (mutanty konstytutywne) gromadzą i wydzielają metabolit jedynie w ograniczonym stopniu, jeżeli wrażliwość na hamowanie allosteryczne jest nie naruszona. Widać z tego, że represja jest istotna głównie dla ekonomicznej syntezy mRNA i białek, podczas gdy rzeczywista synteza metabolitu jest regulowana przede wszystkim przez hamowanie zwrotne. Mutanty ze zmienioną wrażliwością na efektory allosteryczne. Mutanty ze zmienioną wrażliwością enzymów allosterycznych na działanie efektorów były również izolowane z zastosowaniem metody opartej na innej zasadzie —jako rewertanty auksotrofów (metoda auksotroficzna). Sposób ten ilustruje następujący schemat postępowania. Po pierwsze, izoluje się mutanty auksotroficzne w stosunku do metabolitu, który, w tym wypadku, powinien być produktem wydzielanym na zewnątrz. Wśród tych auksotroficznych mutantów selekcjonuje się te, w których brak syntezy metabolitu jest powodowany defektem allosterycznego enzymu należącego 631

do danej drogi syntetycznej. Zaczynając od tych mutantów auksotroficznych izoluje się prototroficzne rewertanty, których wzrost nie zależy od dostarczenia produktu końcowego, ponieważ zdolne są do jego syntezy. Następnie, wśród rewertantów selekcjonuje się mutanty wydzielające produkt końcowy, opierając się na obserwacji wzrostu satelitarnego lub metodzie bioautografii opisanej w rozdziale 10. 2. 2. Można przyjąć, że pierwsza mutacja wyselekcjonowana w wyniku tej dwustopniowej procedury spowodowała utratę funkcjonalności katalitycznego centrum allosterycznego enzymu. Druga mutacja zmieniła konformację cząsteczki białka w sposób odbudowujący aktywność katalityczną, lecz niweczący wrażliwość allosteryczną. Do izolowania innych określonych klas mutantów może być konieczne zastosowanie kilku etapów selekcji podobnych do opisanych powyżej. Aspekty teoretyczne i zastosowania praktyczne. Selekcja mutantów jest ważna dla wyjaśnienia metabolizmu komórkowego i zidentyfikowania mechanizmów regulacyjnych. Ma ona również znaczenie praktyczne, wskazując najlepszy sposób selekcji mutantów produkujących wydajnie każdy związek, który może być wytworzony w procesach mikrobiologicznych.

MIKROORGANIZMY I ŚRODOWISKO

W poprzednich rozdziałach opisano właściwości biochemiczne i fizjologiczne mikroorganizmów, wspominając w wielu przypadkach o ich siedliskach. Na podstawie uzyskanych wiadomości można więc teraz zająć się omawianiem stosunków występujących między mikroorganizmami i ich środowiskiem. Na wstępie zostanie przedstawione słownictwo i podstawowe zagadnienia ekologii. Nauka ta bada zachowanie organizmów w ich naturalnych siedliskach i stosunki między organizmami, tj. wzajemne związki między organizmami a środowiskiem. 9 Najwcześniejsze ślady istnienia życia na Ziemi liczą 3 x 10 lat. Pozostawiły je mikroorganizmy, które jeszcze 0, 5 x 109 lat temu dominowały w biosferze naszej planety. Prokariota, stojące u początków życia i stanowiące źródło rozwoju różnorodności organizmów eukariotycznych, były obecne wszędzie. Oznacza to, że organizmy wyższe nigdy nie były same w czasie ewolucji; towarzyszyły im zawsze organizmy jednokomórkowe, z którymi musiały współzawodniczyć, albo które przynosiły im korzyści. Wśród organizmów wyższych dominowały te, które nie tylko wyszły zwycięsko ze współzawodnictwa z podobnymi sobie, ale były też w stanie obronić się przed mikroorganizmami oportunistycznymi. W wielu wypadkach w czasie ewolucji powstawały stosunki partnerskie — symbiozy mutualne. W drugiej części tego rozdziału zostaną omówione właśnie takie partnerskie stosunki występujące między mikroorganizmami a roślinami i zwierzętami. Mikroorganizmy istniały już wtedy, gdy powierzchnia Ziemi dopiero 633

przyjmowała swoją obecną formę. Były obecne, gdy kontynenty migrowały, gdy tworzone były osady o grubości 1000 m, gdy skorupa ziemska ulegała fałdowaniu i gdy powstawały złoża rud, węgla, ropy naftowej i gazu ziemnego. Mikroorganizmy brały nawet aktywny udział w niektórych z tych procesów. W trzeciej części tego rozdziału zostaną omówione niektóre zagadnienia geomikrobiologii. Ziemia była zamieszkiwana wyłącznie przez mikroorganizmy przez 80% czasu, jaki przypisuje się ewolucji biologicznej. Chociaż znaleziono jedynie nieliczne skamieliny mikroorganizmów, to porównawcze badania fizjologiczne i biochemiczne umożliwiają nam klasyfikację organizmów prokariotycznych na podstawie ich metabolizmu. W rozważaniach dotyczących ewolucji mikroorganizmów będziemy niestety musieli pogodzić się z występowaniem pewnych luk i spekulacji.

17. 1. Ekologia mikroorganizmów 17. 1. 1. Wstęp Wiele wysiłku włożono w izolację i opisanie poszczególnych mikroorganizmów. Badania czystych kultur są ważne dla oceny potencjalnych możliwości i funkcji indywidualnych gatunków w przyrodzie. Szczegółowe badania taksonomiczne, biochemiczne, fizjologiczne i genetyczne spowodowały jednak, że wielu naukowców straciło z oczu najważniejszy cel pracy naukowej, tzn. badanie zachowania mikroorganizmów w ich naturalnym środowisku. Ekologia bada zależności między organizmami i stosunki między organizmami a środowiskiem. Ekologia mikroorganizmów zajmuje się jedynie pewnym wycinkiem całego układu ekologicznego. Ekologia jest nauką bardzo złożoną, zajmują się nią więc różne dyscypliny biologii. Z tego powodu podstawowe słownictwo i koncepcje często nie są ujednolicone. W następnych podrozdziałach spróbujemy więc zdefiniować znaczenie terminów powszechnie stosowanych w ekologii drobnoustrojów. Ekosystem. Podstawową jednostką w ekologii jest ekosystem, zawierający zarówno składniki abiotyczne, jak i biotyczne. Elementem biotycznym jest zespół żywych organizmów, zwany biocenozą. W skład biocenozy 634

wchodzą populacje mikroorganizmów, a populacja składa się z klonów jednego lub kilku gatunków. Składnik abiotyczny ekosystemu to warunki chemiczne i fizyczne, w jakich żyją organizmy. Rozmiary ekosystemów mikrobiologicznych mogą się znacznie różnić. Ekosystemem może być staw, jezioro albo system korzeniowy rośliny. Ekosystemy mogą też być tak małe, jak np. jama ustna człowieka, żwacz krowy czy owcy, lub odcinek jelita. Z drugiej strony wszystkie żyjące organizmy na naszej planecie, stanowiące biosferę, można traktować jako jeden ogromny ekosystem. Często w związku z ekosystemami używa się terminu środowisko i w tym sensie dotyczy on składników biotycznych i abiotycznych, które stanowią bezpośrednie otoczenie danego organizmu. Siedlisko. W danym ekosystemie każdemu rodzajowi organizmu można przypisać jakieś siedlisko. Siedlisko ekologiczne to miejsce lub stanowisko, które dany organizm (pojedynczy osobnik bądź populacja) normalnie zamieszkuje. Tak więc każdemu organizmowi można przypisać przynajmniej jedno siedlisko, w którym normalnie można go znaleźć, gdzie rośnie i rozwija się, i skąd można go wyizolować. Siedliskami, by dać kilka przykładów, mogą być osady w jeziorach, żyzne gleby bogate w humus, jama nosowa lub przewód pokarmowy człowieka. Większość mikroorganizmów ma jedno siedlisko w danym ekosystemie, choć pewne z nich mogą zamieszkiwać różne siedliska, każde w innym ekosystemie. Bakterie z rodzaju Rhizobium, na przykład, rosną w glebie i na włośnikach korzeni roślin motylkowych; siedliskiem metanogenów mogą być osady w jeziorze, żwacz zwierzęcia lub zbiornik osadowy oczyszczalni ścieków. Można powiedzieć, że siedlisko określa ulicę i numer domu, gdzie żyje dany organizm, a niektóre organizmy mają kilka adresów. Nisza ekologiczna. W przeciwieństwie do siedliska, nisza ekologiczna nie odnosi się do aktualnego umiejscowienia organizmu, lecz do funkcjonowania gatunku lub populacji w zespole. Można powiedzieć, że nisza ekologiczna charakteryzuje zawód lub zajęcie danego gatunku. Każdy gatunek lub populacja pełni pewne funkcje, określone przez jego wymagania pokarmowe, właściwości kinetyczne, zdolności biochemiczne, cechy strukturalne i tolerancję w stosunku do warunków środowiska. Suma tych parametrów określa funkcję gatunku w danym ekosystemie. Jest dość powszechne, że rozprzestrzenienie gatunku lub populacji jest mniejsze niż

635

by to mogło wynikać z jego znanych właściwości. Innymi słowy, aktualne nisze ekologiczne danego gatunku są bardziej ograniczone, niż by to wynikało z jego możliwości. Dość często wtórne czynniki decydują, czy gatunek może rzeczywiście pełnić funkcję, do której ma potencjalne zdolności. Można to zilustrować następującym przykładem. Tylko te z bakterii celulolitycznych, które rozkładają celulozę beztlenowo i uzyskują energię w drodze fermentacji, mogą utrzymywać się i rozwijać w żwaczu. Ponadto muszą one tolerować panującą tam temperaturę, a także obecność kwasów tłuszczowych, enzymów, amoniaku, gazów i innych produktów. Tak więc, aby pełnić pewne funkcje w danym ekosystemie, mikroorganizmy muszą charakteryzować się wieloma określonymi cechami. Mieszkańcy ekosystemu. Zgodnie z koncepcją przedstawioną przez Winogradskiego w 1925 roku, mikroorganizmy znajdujące się w danym ekosystemie można podzielić na autochtoniczne i allochtoniczne. Mikroorganizmy autochtoniczne to te, które zawsze są obecne w danym ekosystemie (glebie, jelicie itp. ). Autochtoniczne bakterie glebowe występują w niej zawsze, niezależnie od dopływu dodatkowych składników odżywczych. Ich obecność jest związana z mniej lub bardziej ciągłą zawartością składników odżywczych typowych dla tego ekosystemu. Mikroorganizmy allochtoniczne (albo inaczej zymogenne) to te, które są zależne od chwilowego wzrostu stężenia pewnych składników odżywczych lub od obecności specyficznych składników. Zasadniczo są one obce dla ekosystemu, pojawiają się tylko chwilowo lub występują w formie spoczynkowej. Autochtoniczna flora danego ekosystemu często obejmuje organizmy ściśle wyspecjalizowane, takie jak nitryfikatory lub mikroorganizmy zamieszkujące gorące źródła, czy inne środowiska ekstremalne. W skład flory allochtonicznej natomiast wchodzą często występujące wszędzie bakterie wodne i glebowe. Liczebność i różnorodność mikroorganizmów w ekosystemie. W normalnych warunkach flora gleby i wód składa się z wielu gatunków. „Normalne" oznacza tu pH około obojętnego, duże stężenie składników pokarmowych i dużą zawartość wody. Wraz z odejściem od tej „normalności", tzn. gdy warunki chemiczne i fizyczne ekosystemu stają się

636

bardziej „ekstremalne", różnorodność gatunkowa zmiejsza się, ale liczba indywidualnych osobników danego gatunku może wzrastać. Ten rodzaj zależności między liczbą osobników i różnorodnością gatunków a „ekstremalnością" środowiska zaobserwowano w wielu ekosystemach: w gorących źródłach, słonych jeziorach, kwaśnych wodach kopalnianych, suchych glebach, jelitach. W takich ekosystemach dominują te organizmy, które są najlepiej zaadaptowane do swojego siedliska i zwykle nie mogą rosnąć w warunkach mniej ekstremalnych. Te wysoce wyspecjalizowane i zaadaptowane organizmy nazywa się ekstremalnymi termofilami, psychrofilami, halofilami, organizmami ekstremalnie kwasolubnymi itp. Niedobór substancji pokarmowych jest normalnym stanem w ekosystemach naturalnych. W przyrodzie mikroorganizmy żyjące w glebie i wodach mają stale do czynienia z niedoborem substancji pokarmowych. W ekosystemach wodnych stężenia składników odżywczych wynoszą często poniżej 10 μg/l. Dla większości mikroorganizmów „głód i ubóstwo" są więc normalną sytuacją życiową. Bardzo powolny wzrost lub występujące na przemian fazy szybkiego wzrostu i jego zahamowania to normalny sposób życia w przyrodzie. W wielu środowiskach czas generacji różnych bakterii może wynosić aż 100 do 200 dni. Nawet E. coli w okrężnicy człowieka ma czas generacji 20 godzin. Zwykle potencjalne zdolności mikroorganizmów bada się tylko w odniesieniu do optymalnych warunków i szybkości wzrostu. A więc zachowanie się organizmów w warunkach ostrego niedoboru składników pokarmowych jest wciąż jeszcze słabo zbadane. Skrajny niedobór składników pokarmowych stwarza warunki, które określa się wygodnym terminem „stres" lub „szok". Przez szok cieplny lub stres cieplny rozumie się reakcje komórek na podwyższenie temperatury; w przypadku E. coli np. z 30°C do 42°C. Prowadzi to do przejściowej syntezy bądź zwiększonej syntezy pewnej liczby nowych białek, do częściowej degradacji RNA i do wielu innych reakcji. Podobne objawy są indukowane przez stres związany z brakiem składników pokarmowych. Syntetyzowane są wtedy nowe enzymy kataboliczne, które mają wyższe powinowactwo do substratów niż enzymy produkowane w bogatych podłożach. Najważniejszą, z ekologicznego punktu widzenia, odpowiedzią na brak substancji odżywczych jest rozwój stanu zwiększonej odporności komórek na szok cieplny, stres osmotyczny lub na czynniki dezynfekcyjne. 637

17. 1. 2. Ekosystemy wodne Biosfera naszej planety zawiera dużą liczbę ekosystemów, w których mikroorganizmy odgrywają ważną rolę; niektóre z tych ekosystemów są zamieszkałe wyłącznie przez mikroorganizmy. Ponieważ niemożliwe jest wymienienie wszystkich ekosystemów, z konieczności musimy ograniczyć zakres ich omawiania. Gleba jest dobrym przykładem ekosystemu lądowego, a jeziora i oceany — ekosystemów wodnych. Badania żyznych gleb rolniczych są bardzo ciekawe, ale z powodu wielkiej heterogenności gleby nawet na bardzo małych obszarach, ekosystemy glebowe są niezwykle złożone. Nasz opis poświęcimy więc systemom wodnym, tym bardziej że duża część mikrobiologicznych przekształceń (w przyrodzie) zachodzi właśnie w wodzie. Oceany, jeziora, stawy i wody płynące są typowymi ekosystemami wodnymi. Oceany. Mikrobiologia morska, dział biologii morza, jest bardzo młodą dyscypliną nauki. Pierwotną produkcję w morzu przeprowadzają jednokomórkowe glony — fitoplankton. Łańcuch pokarmowy obejmuje bakterie, pierwotniaki, stawonogi i ryby. Chociaż oceany stanowią największy odbiornik i rezerwuar energii słonecznej, ich udział w produkcji żywności jest mały; tylko 5-10% całkowitej ilości białka wytwarzanego na Ziemi pochodzi z morza. W dodatku produktywność jest tu bardzo nierówno rozłożona. Ta nierównomierność produkcji pierwotnej i wtórnej może zostać zilustrowana danymi na temat produkcji ryb. Otwarte morza, stanowiące 90% powierzchni oceanów światowych, wytwarzają 0, 7% ryb; strefy przybrzeżne, stanowiące 9, 9% powierzchni oceanu — 54%, a obszary występowania prądów wstępujących, stanowiące tylko 0, 1%, dają aż 44% ryb. Ilość ryb jest oczywiście skorelowana z całkowitą biomasą, jaka jest wytwarzana w morzu. Ich rozmieszczenie wskazuje na ograniczenie produkcji pierwotnej przez dostępność składników odżywczych, głównie azotanów i fosforanów. Tak więc można powiedzieć, że wody wpadające do oceanu światowego, bogate w składniki odżywcze, nie powodują jego zanieczyszczenia, lecz raczej umożliwiają produkcję biomasy. Bez ciągłego dopływu składników odżywczych oceany nie mogłyby nam dostarczać żadnych plonów. Ciekawe przemiany mikrobiologiczne zachodzą na brzegu morza, przy ujściu rzek, na terenach żuławowych, słonych bagnach i w słonawych wodach stojących. Powszechna obecność siarczanów w wodzie morskiej powoduje, że w strefach beztlenowych bakterie redukujące siarczany

638

wytwarzają siarkowodór, co w efekcie wpływa na pozostałą florę bakteryjną. Badania bakterii halofilnych w strefach przybrzeżnych są prowadzone za mało intensywnie. Bakteriom morskim powinno się poświęcić więcej uwagi, i to nie tylko w celach poznawczych, ale też ze względów praktycznych. Obecnie wiele badań mikrobiologicznych jest poświęconych mikroflorze ścieków i degradacji bardzo opornych zanieczyszczeń wód. Trzeba jednak pamiętać, że ścieki są skażone nie tylko przez zanieczyszczenia organiczne, lecz zawierają też znaczne ilości soli, w tym siarczanów. Panują więc w nich warunki podobne do tych, jakie istnieją w ekosystemach morskich. Wyniki badań przemian mikrobiologicznych zachodzących w ekosystemach morskich mogą więc być pomocne i w tej dziedzinie. Pierwotna produkcja biomasy w głębokich wodach. Życie praktycznie wszystkich organizmów heterotroficznych zależy od biomasy wytworzonej przez rośliny fotosyntetyzujące. W porównaniu z nią biomasa wytworzona przez bakterie chemolitotroficzne jest ilościowo nieistotna. Wyjątkiem jest tu pierwotna produkcja biomasy w pozbawionych światła głębiach oceanu. W tych rejonach szelfu, gdzie kontynenty rozchodzą się, przez powstające pęknięcia dna morskiego wydostaje się na jego powierzchnię magma, a wpływa do nich woda morska. Woda ta wydostaje się ponownie na powierzchnię dna, wzbogacona o gazy (NH3, H2S, H2, CO2, CH4) i minerały (Ca2+, Fe2+, Mn2+, Cu2+) (ryc. 17. 1). Jony metali w kontakcie z wodą morską zawierającą tlen i siarczany tworzą precypitaty, tak więc w miejscu wypływu powstaje jakby pióropusz. Termin „dymiące kominy" (ang. black smokers) odnosi się do tych „źródeł", z których wypływa woda o temperaturze 350°C. Po zmieszaniu z wodą z dna morskiego wygląda ona jak czarny, gęsty dym. Obok gorących źródeł, z pęknięć w skale bazaltowej, mogą wypływać też ciepłe źródła, również bogate w rozpuszczone gazy. Rejony te znane są z obfitości małży, krabów i „robaków" żywiących się bakteriami, które występują tu w postaci zawiesiny lub porastają powierzchnie stałe. Dominują wśród nich bakterie utleniające siarkowodór. Endosymbioza między bakteriami utleniającymi siarkę i „robakami" została już opisana w rozdziale. 11. 2. Tak więc w głębiach, gdzie nie dociera światło, istnieją gorące źródła i ekosystemy, w których pierwotna biomasa jest wytwarzana chemolitotroficznie, a nie w drodze fotosyntezy (ryc. 17. 1).

639

Jeziora. Nauka o jeziorach i stawach (limnologia) umożliwia nam zrozumienie zachodzących w nich cykli i ich wzajemnych powiązań. Jeziora, stawy, baseny są zbiornikami wodnymi, co ułatwia ich opisywanie. Zawsze zawierają one strefy tlenowe i beztlenowe. Takie strefy można też znaleźć w glebie, ale ich bliskość względem siebie utrudnia badania. W jeziorach strefy te zajmują duże przestrzenie, a więc można je znacznie łatwiej badać. Wydaje się też, że wyniki badań limnologicznych można odnieść do gleb i ich zróżnicowania w skali mikro. Biologiczne procesy zachodzące w jeziorach i stawach zależą znacznie od fizycznego stanu wody. Woda ma największą gęstość w temp. 4°C. Jej temperatura zmienia się wraz ze wzrastającą głębokością i w związku

640

z tym obserwuje się mniej lub bardziej stabilną sezonową stratyfikację wody (ryc. 17. 2). Stratyfikację można znaleźć w dwóch typach jezior. Jeden z nich to jeziora słodkowodne w strefie umiarkowanej. Wiosną zimna woda jeziora zostaje podgrzana przez słońce. Warstwa powierzchniowa ogrzewa się najbardziej i zmniejsza się jej gęstość. Jest ona nazywana epilimnionem i unosi się nad warstwą zimniejszą zwaną hipolimnionem. Obie te warstwy rozdziela warstwa przejściowa zwana metalimnionem lub termokliną. Granice między warstwami mogą być bardzo ostre. W głębokich jeziorach warstwy te mogą przetrwać całe lato. Procesy kataboliczne zachodzące z wykorzystaniem tlenu w osadach czynią hipolimnion strefą beztlenową. Epilimnion natomiast, mieszany i poruszany przez wiatr, kontaktuje się z tlenem atmosferycznym, jest więc z zasady tlenowy. Stratyfikacja prowadzi zatem do powstania gradientu potencjału redoks i parametrów chemicznych. Z tego powodu termoklina zwana jest też chemokliną. Jesienią epilimnion się oziębia. Spadek jego temperatury poniżej temperatury hipolimnionu prowadzi do wymieszania się warstw, czemu sprzyjają też jesienne sztormy. To

641

jesienne zmieszanie wód kończy stratyfikację. Tak więc roczny cykl powoduje wypłynięcie głębokich wód na powierzchnię, gdzie mogą zostać wzbogacone w tlen. Ponadto bogate w składniki odżywcze głębokie wody zostają rozłożone bardziej równomiernie. Jeziora z takim pełnym cyklem cyrkulacji nazywamy holomiktycznymi. W czasie zimy może się rozwinąć odwrotna stratyfikacja. Głębsze wody mają temperaturę 4°C i mogą zostać pokryte warstwą zimniejszej wody (która ma mniejszą gęstość), a także lodem. Gdy wiosną temperatura wody na powierzchni podniesie się powyżej 4°C, stratyfikacja ta zniknie. Kiedy głębokie wody, bogate w składniki odżywcze, zostają wyniesione na powierzchnię, wywołują bujne namnożenie sinic i zielenic, tzw. zakwity glonów. Intensywność metabolizmu i produkcji biomasy zależy od trofii (stężenia pokarmów) wody. W wodach eutroficznych zachodzą poważne zmiany, takie jak opisano powyżej, natomiast w wodach oligotroficznych zmiany te są ledwo dostrzegalne. Od jezior holomiktycznych odróżnia się wody meromiktyczne i amiktyczne, w których mieszanie warstw wody jest niecałkowite lub w ogóle nie zachodzi, tak więc powstaje stabilny hipolimnion beztlenowy, występujący niezależnie od pór roku. Taka stała stratyfikacja występuje głównie w jeziorach tropikalnych, których wody powierzchniowe rzadko ochładzają się do temperatur niższych niż temperatury głębszych warstw. Jeziora meromiktyczne można też znaleźć w strefach umiarkowanych. Tam stabilność stratyfikacji jest głównie spowodowana dużymi stężeniami soli (fiordy) lub warunkami geograficznymi. Na przykładzie jezior holomiktycznych można prześledzić procesy biologiczne, które wywołują sezonową stratyfikację trwającą kilka miesięcy w ciągu lata. W epilimnionie, przez który przechodzi światło, fitoplankton (okrzemki, wiciowce, zielenice i sinice) wytwarza biomasę. Z reguły do jeziora dostaje się też dodatkowy materiał organiczny ze środowiska. Niektóre z tych substancji organicznych, w szczególności zawierające celulozę, mają tendencję do opadania na dno, gdzie są rozkładane. W czasie pierwszych, tlenowych etapów degradacji zostaje zużyty tlen. W wyniku dalszego rozkładu beztlenowego powstają produkty fermentacji i uwalniają się H2, H2S, CH4 i CO2. Ponieważ nie ma konwekcji, produkty te przechodzą z osadu do wody bardzo wolno. Tylko metan, główny produkt beztlenowego łańcucha pokarmowego w osadach dennych, uwalnia się w formie pęcherzyków gazu. W czasie wędrówki na powierzchnię 642

część metanu zostaje rozpuszczona w wodzie i może być wykorzystana przez tlenowe bakterie utleniające metan. Szybkie rozprzestrzenienie się metanu w wodzie i wzrost tych bakterii prowadzi do zużycia tlenu występującego w hipolimnionie, który przez to może się stać całkowicie beztlenowy. Gdy w hipolimnionie warunki stają się beztlenowe, zaczynają w nim zachodzić beztlenowe procesy mikrobiologiczne. Wykorzystywane są pierwotne produkty fermentacji z jednoczesną redukcją azotanów i siarczanów. Największa ilość siarkowodoru (w jeziorze) powstaje w wyniku redukcji siarczanów w masie wody (ryc. 17. 3). Hipolimnion i chemoklina to Eldorado bakterii beztlenowych. Jeżeli jest odpowiednie oświetlenie, to w obecności siarkowodoru poniżej chemokliny mogą rosnąć purpurowe bakterie siarkowe i zielone bakterie siarkowe, odpowiedzialne za pierwotną produkcję biomasy. W strefie tej można znaleźć bakterie z takich rodzajów, jak: Lamprocystis, Amoebobacter, Thiodictyon, Thiopedia, Pelodictyon i Ancalochloris, mające wakuole gazowe, a także z rodzajów Chromatium i Thiospirillum poruszające się przy pomocy rzęsek. Produkcja

643

biomasy przy udziale beztlenowej fotosyntezy jest znaczna; widać to po liczbie orzęsków, widłonogów i wioślarek, które żyją bezpośrednio pod chemokliną i odżywiają się bakteriami fototroficznymi. Siarczany, wytwarzane przez purpurowe bakterie siarkowe, są ponownie szybko redukowane do siarkowodoru przez bakterie redukujące siarczany, które mogą prawdopodobnie wykorzystać jako donory wodoru produkty wydalone przez mikroorganizmy fototroficzne. Metalimnion również charakteryzuje się znaczną aktywnością biologiczną. Rozwijają się tu niektóre sinice tolerujące siarkowodór i warunki beztlenowe; jedną z nich jest Oscillatoria limnetica. Ryciny 17. 2 i 17. 3 ilustrują opisane powyżej sytuacje. Jak widać, w jeziorze stratyfikowanym występują dwie warstwy wody, w których może zachodzić fotosyntetyczna produkcja pierwotna: fotosynteza tlenowa w warstwie bliskiej powierzchni epilimnionu i fotosynteza beztlenowa w górnej warstwie hipolimnionu. Wody płynące. W naturalnych, czystych strumieniach liczba jednokomórkowych organizmów jest często tak mała, że woda wydaje się krystalicznie czysta. Należy jednak pamiętać, że zawiesina zawierająca 106 bakterii/ml ludzkiemu oku wydaje się przejrzysta. Jeśli zanieczyszczenie jest niewielkie, to degradowalne substancje organiczne pochodzące z okolicznych osad ludzkich mogą zostać zmineralizowane na liczącym kilka kilometrów odcinku przebiegu strumienia bądź rzeki. Skład mikroflory i fauny strumienia jest dobrym wskaźnikiem stopnia jego zanieczyszczenia. Jeśli są w nim dafnie, to wodę można uważać za czystą. Obecność Sphaerotilus natans wskazuje na znaczne zanieczyszczenie organiczne, a zapach siarkowodoru jest dowodem na beztlenową redukcję siarczanów i powinien być sygnałem alarmowym. Ścieki i ich oczyszczanie. Urządzenia do oczyszczania ścieków działają na zasadzie przepływania wody, w której zanieczyszczenia organiczne są rozkładane przez grzyby i bakterie. Zanieczyszczenie ścieków może być różnego rodzaju, zależnie od tego, czy są to tylko ścieki z gospodarstw domowych, czy też ścieki z rzeźni, gnojowica lub ścieki przemysłowe. W wielu wypadkach w ściekach można znaleźć metale ciężkie i trudno rozkładalne związki organiczne. Oczyszczanie ścieków ma na celu usunięcie stałych i rozpuszczalnych, mineralnych i organicznych zanieczyszczeń przed wpuszczeniem wody do rzek i strumieni. Stosuje się

644

specjalne metody, aby zanieczyszczenia organiczne uległy mikrobiologicznej mineralizacji. Zawartość biologicznie degradowalnego materiału organicznego może być określona na podstawie biologicznego zapotrzebowania tlenu (BZT). Jest to ilość tlenu potrzebna do tlenowego rozkładu materiału organicznego. Tak więc BZT 5 oznacza ilość tlenu (w mg), jaką mikroflora zużywa w czasie 5 dni do utlenienia substancji organicznych. Chemiczne zapotrzebowanie tlenu (ChZT) jest to ilość tlenu zużytego do całkowitego chemicznego utlenienia materiału organicznego do CO2 i H2O. W oczyszczaniu ścieków stosuje się kilka procesów technicznych. Poszczególne działania opierają się na wspólnych zasadach i obejmują: 1) usunięcie łatwo sedymentujących cząstek stałych w płaskownikach i zbiornikach sedymentacyjnych; 2) mikrobiologiczne utlenienie rozpuszczalnego materiału organicznego przez osad czynny lub na złożu zraszanym; 3) beztlenową inkubację osadu ściekowego, otrzymanego w wyniku sedymentacji przed i po biologicznym oczyszczaniu; powstaje tu metan i łatwo sedymentujący osad. Osad ten po usunięciu wody można

645

kompostować i wykorzystać jako nawóz lub spalić go (ryc. 17. 4). Oczyszczona woda jest odprowadzona do rzek i strumieni bezpośrednio lub przez kanały odpływowe. Wciąż zawiera ona produkty zmineralizowane, azotany, fosforany, amoniak i inne jony, których dopływ może spowodować wzrost produkcji pierwotnej. Aby uniknąć takiej eutrofizacji, wylewa się ścieki na pola irygacyjne, wykorzystuje do użyźniania lasów lub poddaje dodatkowej obróbce mającej na celu usunięcie przez denitryfikację przynajmniej części azotu. Można ponadto zastosować chemiczną procedurę wytrącania fosforanów solami żelaza.

17. 2. Symbiotyczne stosunki między mikroorganizmami Mikroorganizmy mogą oddziaływać na siebie w różny sposób. W czasie ewolucji rozwinęły się wzajemne lub jednostronne zależności, które wykraczają poza interakcje w łańcuchu pokarmowym. Kiedy prokariota i wiele mikroorganizmów eukariotycznych osiągnęły obecny stan rozwoju, zaczynające się pojawiać formy wyższe stały się ich potencjalnymi siedliskami. Zwierzęta i rośliny rozwijały się w środowisku, w którym obecne były mikroorganizmy wykazujące praktycznie wszystkie typy metabolizmu prokariotycznego. Łatwo więc można zrozumieć, że między mikroorganizmami a zwierzętami lub roślinami rozwinęły się liczne stosunki partnerskie. Takie powiązania między różnymi rodzajami organizmów nazywa się symbiozą. Wyróżnia się kilka kategorii symbiozy w zależności od stopnia korzyści, jakie partnerzy uzyskują ze wzajemnego powiązania. Jeśli z takiego współżycia korzyści mają obaj partnerzy, to nazywa się je symbiozą mutualną (lub mutualizmem). Jeżeli jeden z partnerów ponosi szkody, współżycie nazywa się pasożytnictwem. Komensalizm to współżycie, w którym jeden partner ma jakąś korzyść, a drugi nie ponosi szkód. W wielu przypadkach partnerzy mogą współżyć nie wywierając na siebie znaczącego wpływu; zjawisko takie nazywa się neutralizmem. Między partnerami żyjącymi w asocjacji mogą też występować różne stosunki przestrzenne. Jeżeli jeden z partnerów znajduje się poza komórkami drugiego, to takie stosunki nazywa się ektosymbiozą, jeżeli zaś jeden partner występuje w komórkach drugiego — endosymbiozą. Większy z partnerów jest zwykle zwany gospodarzem. Korzyści, jakie jeden z partnerów lub obaj czerpią ze współżycia,

646

mogą być różnego rodzaju. Mogą to być korzyści pokarmowe, np. wiązanie azotu, rozkład celulozy, dostarczanie podstawowych składników pokarmowych bądź czynników dodatkowych. Mikroorganizmy pełnią też funkcje rozpoznawcze, jak to jest w przypadku symbiozy ryb i bakterii luminescencyjnych. Często też dzięki asocjacji gospodarz daje ochronę ekto- lub endosymbiontowi, chociaż czasem również gospodarz jest chroniony przed innymi mikroorganizmami pasożytniczymi bądź patogennymi (np. w przewodzie pokarmowym lub na skórze).

17. 2. 1. Symbioza mutualistyczna Między mikroorganizmami. Istnieje wiele przykładów wzajemnego żywienia, czyli syntrofii, między mikroorganizmami. Związek Desulfuromonas acetoxidans i Chlorobium jest typu syntroficznego, podobnie jak Desulfovibrio i Chromatium. W obu przypadkach pierwszy z organizmów dostarcza drugiemu donorów wodoru, a drugi dostarcza pierwszemu akceptorów wodoru (rozdz. 9. 3). Syntrofia może też polegać na dostarczaniu witamin i pewnych prekursorów. Wzrost zarówno grzyba Mucor ramannianus, jak i drożdży Rhodotorula rubra zależy od obecności witaminy B1 (tiaminy) w podłożu odżywczym. Pierwszy z organizmów może syntetyzować składnik pirymidynowy tej witaminy, ale nie syntetyzuje składnika tiazolowego; drożdże natomiast syntetyzują tiazol, ale nie pirymidynę. W czasie wspólnego wzrostu grzyb wydziela do podłoża

647

składnik pirymidynowy, a drożdże — tiazolowy. W ten sposób zapotrzebowania witaminowe obu partnerów zostają zaspokojone. Porosty są przykładem wysoko rozwiniętej ektosymbiozy między mikroorganizmami. W poroście grzyb i glon są tak ściśle powiązane, że stanowią jeden organizm wegetatywny (ryc. 17. 5). Obaj partnerzy mają korzyści z tej asocjacji. Kształt organizmu określa zawsze składnik grzybowy — mikobiont. Grzyb otrzymuje od glonu organiczne składniki pokarmowe, będące produktami wiązania CO2, a sam dostarcza mu soli mineralnych i chroni go przed niekorzystnymi warunkami, w szczególności przed wysychaniem. Fikobiontami w poroście mogą być zielenice bądź sinice. Możliwe jest rozdzielenie i osobne hodowanie obu partnerów, jak również tworzenie sztucznych (tzn. nowych) porostów. Porosty kolonizują ekstremalne ekosystemy, w których żaden z partnerów nie mógłby istnieć samodzielnie. Mikroorganizmy i rośliny. Bardzo często więcej bakterii można znaleźć w przykorzeniowej warstwie gleby, czyli w ryzosferze, niż w strefie pozakorzeniowej. Związki organiczne wydzielane przez korzenie roślin w sposób oczywisty sprzyjają wzrostowi bakterii. Nie wiadomo, jakie korzyści przynosi ten luźny związek roślinie. Są jednak możliwe powiązania mutualistyczne, gdyż wiele bakterii glebowych przeprowadza procesy, które są korzystne dla roślin, jak np. wiązanie azotu czy rozpuszczanie trudno rozpuszczalnych soli. W ostatnich latach stwierdzono, że niektóre bakterie występujące razem z pewnymi trawami są zdolne do wiązania azotu: np. Azotobacter paspali w ryzosferze Paspalum notatum, Azospirillum lipoferum w okolicy korzeniowej Digitaria i kukurydzy. Korzenie wielu roślin są ściśle powiązane z grzybami, a związek taki nazywa się mikoryzą. Wiele grzybów, w tym grzyby jadalne, przerasta korzenie roślin, stymuluje ich wzrost przez wytwarzanie auksyn i wnika do komórek. Znawcy grzybów wiedzą, że liczne gatunki jadalne można znaleźć w pobliżu pewnych drzew (sosna, modrzew, dąb, świerk), które są gospodarzami mikoryzy. Grzyby po wniknięciu do komórek kory pierwotnej tworzą mikoryzę wezykularną lub arbuskularną (w kształcie — odpowiednio — pęcherzyków lub struktur rozgałęzionych). Korzyści obu partnerów to łatwy dostęp do roślinnych produktów asymilacji dla grzyba i bardzo efektywne pobieranie soli mineralnych (fosforany, związki azotu) z gleby dla rośliny.

648

Stosunki między roślinami oraz ekto- i endosymbiotycznymi bakteriami wiążącymi azot zostały już omówione w rozdziale 13. 1. Związek, jaki istnieje między gatunkami rodzaju Rhizobium i brodawkami korzeniowymi, należy do najbardziej zróżnicowanych oddziaływań symbiotycznych. Symbioza ta jest bardzo dobrym przykładem powstawania układu endosymbiotycznego i dostarcza pewnych podstaw dla endosymbiotycznej hipotezy rozwoju komórek eukariotycznych, omówionej w rozdziale 2. 1. Mikroorganizmy i zwierzęta. Liczba symbiotycznych powiązań między zwierzętami i mikroorganizmami jest ogromna. Symbioza w żwaczu przeżuwaczy jest jednym z niewielu przypadków, gdzie korzyści dla obu partnerów są tak oczywiste (rozdz. 14. 1). W badaniach układów symbiotycznych, szczególnie tych, które dotyczą niższych zwierząt i pierwotniaków, pojawiają się różne trudne do przezwyciężenia problemy. Nie wiadomo np., czy mikroflora i fauna zamieszkująca przewód pokarmowy stanowi jakąś ochronę przed mikroorganizmami patogennymi, czy też odgrywa rolę w trawieniu. Omówimy jedynie kilka z rozlicznych przykładów. Symbioza między ogromnymi rurkoczułkowcami (Pogonophora) i bakteriami została już opisana w rozdziale 11. 2. W trofosomie Riftia pachyptila bakterie utleniające siarkowodór rosną jako endosymbionty. Stanowią one jedyne źródło pokarmu zwierzęcia, a krew gospodarza dostarcza im tlenu i H2S. Odkryto też małe Pogonophora, których endosymbiontami są bakterie utleniające metan. Pierwotniaki (orzęski, wiciowce i ameby), zarówno wolno żyjące jak i te, które zamieszkują przewód pokarmowy przeżuwaczy, termitów i karaluchów, są same bardzo często skolonizowane przez bakteryjne ekto- i endosymbionty. We wczesnych latach rozwoju genetyki mikroorganizmów poznano „killer gene", czyli gen-zabijacz, występujący w Paramecium aurelia. Sonneborn jako pierwszy wykazał, że w tym gatunku orzęska można wyróżnić dwie grupy szczepów; szczepy jednej z nich wydzielały toksynę, na którą same były odporne (szczepy zabijaczy). Organizmy drugiej grupy były wrażliwe na toksynę, która je zabijała. Okazało się, że zdolność do wytwarzania toksycznej substancji jest kodowana cytoplazmatycznie, a nie przez geny jądrowe. Cecha „killer" może być przenoszona drogą koniugacji; szczep wrażliwy sam staje się zabijaczem. Stwierdzono, że cecha ta wiąże się z występowaniem cząstek zwanych „kappa", które, jak 649

ostatecznie udowodniono, są endosymbiotycznymi bakteriami. Szczepy zabijaczy można było wyleczyć z cząstek kappa stosując antybiotyki. Cząstki kappa łatwo dają się wyróżnić pod mikroskopem z powodu obecności ciał inkluzyjnych silnie załamujących światło, zwanych ciałkami R. Ciałko R składa się ze zwiniętego łańcucha białkowego, który wydaje się być toksyczną substancją zabójczą. Odkrycie główek fagowych w komórkach kappa jeszcze bardziej skomplikowało badania; w komórkach tych widocznie występują fagi umiarkowane. Niestety nie udało się dotąd otrzymać poza gospodarzem czystych kultur tych niewątpliwie symbiotycznych bakterii. Ostatnio wznowiono badania komórek kappa w związku z odkryciem ciałek R w bakteriach glebowych. Liczne pierwotniaki są gospodarzami metanogenów, sinic i jednokomórkowych glonów. Niektóre z beztlenowych orzęsków i ameb występujących w żwaczu oraz w osadach wód słodkich i słonych zawierają jako endosymbionty metanogeny. Stosując mikroskop fluorescencyjny można łatwo wykazać obecność tych endosymbiontów z powodu fluorescencji ich koenzymów (F420 i metylopteryna). Symbioza opiera się na zdolności pewnych pierwotniaków do wydzielania, w wyniku fermentacji wodoru cząsteczkowego, który może zostać przekształcony w metan przez metanogeny. Do pierwotniaków żwacza zalicza się Endiplodinium, natomiast w osadzie dennym występuje ogromna ameba Pelomyxa palustris i różne małe ameby, a także orzęski takie jak Metopus contortus. Niektóre pierwotniaki zamieszkujące osady denne zawierają symbiotyczne mikroorganizmy fototroficzne i są dzięki ich barwnikom łatwo rozpoznawalne. Symbiotyczne zielenice to zoochlorelle, a glony żółte i brunatnice — zooksantelle. Wiciowiec Cyanophora ma symbiotyczne sinice, zwane cyjanellami. W przewodzie pokarmowym lub w specjalnych uchyłkach jelita wielu owadów znajdują się symbiotyczne orzęski, drożdże i bakterie. Występują one u tych owadów jako ektosymbionty lub endosymbionty w komórkach specjalnych tkanek. Funkcja, jaką spełniają te mikroorganizmy, jest oczywista w przypadku owadów, które odżywiają się substancjami trudno rozkładalnymi (termity odżywiające się drewnem, a mszyce i pluskwiaki różnoskrzydłe sokami roślinnymi). Symbionty albo odgrywają jakąś rolę w trawieniu, albo dostarczają wymaganych dodatkowych składników odżywczych (steroidy, witaminy, aminokwasy). Morfologiczno-anatomicz-

650

ne badania symbiozy owadów z mikroorganizmami są bardzo zaawansowane, szczególnie dzięki pracy grupy P. Buchnera. Wyniki badań fizjologiczno-biochemicznych są natomiast wciąż niezadowalające wskutek niemożności wyhodowania mikroorganizmów symbiotycznych poza organizmem gospodarza. U wielu owadów organami, w których znajdują się endosymbionty (mycetomy), są uchyłki tylnej części przewodu pokarmowego. Również u wielu ssaków roślinożernych działalność mikroorganizmów wspomagająca trawienie zachodzi właśnie w uchyłkach tylnej części przewodu pokarmowego. Niektóre zwierzęta nie czerpią jednak dostatecznych korzyści ze swoich symbiontów; staje się wtedy jasne, dlaczego zdarza się, że zjadają własne ekskrementy (koprofagia). W ten sposób pozyskują pewne podstawowe i dodatkowe składniki pokarmowe, dostarczane przez mikroorganizmy. Skład flory jelitowej człowieka został już omówiony w rozdziale 8. 4. Mutualistyczny charakter związku między człowiekiem i jego florą jelitową staje się oczywisty, gdy np. populacja bakteryjna zostaje wyeliminowana przez kurację antybiotykową bądź chemioterapię. Funkcję, jaką pełni flora jelitowa, szczególnie dobrze widać u zwierząt hodowanych w warunkach sterylnych. Chociaż zwierzęta te mogą normalnie się rozwijać (jeżeli są odpowiednio żywione), to ich wrażliwość na infekcje jest znacznie podwyższona. Wydaje się, że normalna flora bakteryjna pełni ważną rolę ochronną skierowaną przeciw mikroorganizmom patogennym i oportunistycznym. Podobne zależności istnieją między ludźmi i mikroflorą skóry. Ludzka skóra ma charakterystyczną florę bakteryjną składającą się głównie z prątków, paciorkowców, gronkowców i bakterii propionowych, które czerpią składniki pokarmowe z potu. Mikroorganizmy te nie wywołują żadnych szkodliwych skutków dla człowieka, z wyjątkiem wytwarzania substancji o niemiłym zapachu. Korzystne oddziaływanie mikroflory skóry uwidacznia się, gdy jej wzrost zostaje zahamowany przez miejscowe zastosowanie antybiotyków lub przez nadmierną doustną kurację antybiotykową. W takim wypadku może dojść do namnożenia patogennych drożdży (Candida albicans) lub innych grzybów. Wiele ryb morskich jest zaopatrzonych w narządy świetlne, które są zwykle bardzo zróżnicowane morfologicznie. Narządy te są skolonizowane przez bakterie świecące (Vibrio fischeri; patrz rozdz. 8. 4). 651

Przewód pokarmowy człowieka i jego flora Przewód pokarmowy człowieka składa się z przełyku, żołądka, dwunastnicy, jelita czczego i krętego (tworzących jelito cienkie), okrężnicy i odbytnicy. Górne odcinki zawierają jedynie nieliczne bakterie allochtoniczne i bakterie jamy ustnej, które docierają do żołądka wraz z pokarmem. Większość bakterii, w tym patogennych, ginie w czasie przechodzenia pokarmu przez żołądek, z powodu bardzo niskiego pH (0, 5-2, 0). Poza częścią odźwiernikową rzadko jest więcej niż 10 bakterii/ml, o ile pożywienie nie zostało zbyt mocno rozcieńczone płynem. W dwunastnicy występują bakterie mlekowe. W górnej części jelita cienkiego (jelito czcze) pH zaczyna wzrastać, treść jelita staje się zasadowa i flora ulega zmianie. Względnie beztlenowe bakterie jelitowe zużywają cały tlen, dzięki czemu przeważają bezwzględne beztlenowce, takie jak Bacteroides, Eubacterium, Peptostreptococcus i Bifidobacterium. W 1 ml

652

treści pokarmowej można w tym miejscu znaleźć 105-107 bakterii. Ściana jelita cienkiego, które ma 3 m długości i wewnętrzną powierzchnię około 100 m2, pokryta jest warstwą bakterii. W jelicie grubym gęstość bakterii staje się ogromna, rzędu 1010 komórek/g i stanowią one wagowo 20-30% składu kału. Gatunkami dominującymi są tak jak poprzednio Bacteroides, Eubacterium i Bifidobacterium, chociaż okrężnica zawiera też bakterie typu coli, bakterie mlekowe, klostridia i drożdże. Escherichia coli stanowi zwykle nie więcej niż 1% całkowitej masy bakterii. Skład pożywienia i wchłanianie przez nabłonek w różnych częściach przewodu pokarmowego mają decydujący wpływ na aktywność mikroorganizmów w przewodzie pokarmowym. Woda i sole, w tym Na+, K+, SO 4 2 ~ , NO 3 ~ , są wchłaniane w górnej części jelita cienkiego. Tylko 200-300 ml wody dziennie dociera do jelita grubego. Mono- i disacharydy też są wchłaniane w górnej części jelita cienkiego. Nie są wchłaniane α-galaktozydy, gdyż ludzie nie mają odpowiednich α-galaktozydaz. Kiedy nadmiar cukru lub α-galaktozydów z pożywienia dociera do niższej części jelita cienkiego lub do jelita grubego, są one metabolizowane przez bakterie fermentacyjne, które wytwarzają gazy (H2, CO2 i czasem CH4). Prawdopodobnie wzdęcia z oddawaniem wiatrów, które często towarzyszą konsumpcji fasoli i nasion innych roślin strączkowych, są spowodowane występowaniem w nich α-galaktozydów, takich jak rafinoza, stachyoza i werbaskoza, które łącznie mogą stanowić 5-10% masy nasion.

Niektórzy ludzie wytwarzają duże ilości gazów nawet bez spożywania α-galaktozydów, co jest spowodowane mniejszą zdol653

nością do trawienia pewnych wielocukrów i wchłaniania cukrów. Genetycznie zdeterminowana, obniżona zdolność do wchłaniania laktozy jest szeroko rozpowszechniona wśród ras innych niż biała. U ludzi tych laktoza dociera do ostatniego odcinka jelit, gdzie jest fermentowana przez mikroorganizmy, co prowadzi do wytwarzania gazu. Tylko około jednej trzeciej przebadanych ludzi wytwarza metan. W jelicie zdrowego człowieka powstaje niewiele substancji toksycznych, chociaż ulegają tu rozkładowi niewchłonięte metabolity. Nawet azotany nie stanowią wyraźnego zagrożenia, gdyż zostają w dużej mierze wchłonięte w żołądku oraz w górnej części jelita cienkiego i wydalane są przez nerki. Dzięki temu nie dostają się do niższych partii jelita cienkiego i okrężnicy, gdzie mogłyby zostać zredukowane przez bakterie do azotynów, co prowadzi do powstania nitrozoamin. Zarówno azotyny, jak i nitrozoaminy są mutagenne i kancerogenne. Wchłanianie składników pożywienia w różnych odcinkach przewodu pokarmowego jest wciąż słabo poznane. Najlepiej zbadane są systemy trawienne przeżuwaczy i termitów. Z powodu bardzo ważnej roli, jaką odgrywają bezkręgowce w rozkładzie substancji organicznych w glebie, wyjaśnienie metabolizmu mikroorganizmów znajdujących się w ich przewodzie pokarmowym wydaje się warte uwagi.

17. 2. 2. Symbioza antagonistyczna W pewnych związkach symbiotycznych występujących między różnymi mikroorganizmami oraz między mikroorganizmami i roślinami bądź zwierzętami gospodarz ponosi mniejsze lub większe szkody. Wcześniej opisano już kilka rodzajów pasożytnictwa, na przykład: bakteryjnego pasożyta Bdellovibrio bacteriovorus (rozdz. 3. 14), bezwzględne pasożyty komórkowe, jakimi są riketsje i chlamydie (rozdz. 3. 18), organizmy wywołujące choroby roślin {Erwinia, Corynebacterium, Pseudomonas, Uredo, Ustilago, Puccinia, Claviceps) i choroby zwierząt. Mikrobiologia weterynaryjna i lekarska, a także patologia roślin zajmują się między innymi takimi zagadnieniami jak teoretyczne aspekty pasożytnictwa,

654

655

zaburzenia równowagi między mikroorganizmami pasożytniczymi i ich gospodarzami. Bakterie patogenne. Książka ta nie zajmuje się aspektami medycznymi i weterynaryjnymi mikrobiologii, ani immunologią, dlatego też najważniejsze ludzkie patogeny zostały tylko w skrócie przedstawione w tabeli 17. 1.

17. 3. Mikroorganizmy a ewolucja Ziemi Mikroorganizmy odegrały ważną rolę w tworzeniu skorupy ziemskiej. Im też w dużej mierze można przypisać częściowe rozdzielenie mieszaniny pierwiastków i związków, które tworzyły pierwotne skały. Złoża wielu wydobywanych dziś surowców są, wyłącznie lub częściowo, właśnie wynikiem działalności mikroorganizmów. Odkładanie żelaza. Największe złoża rud żelaza to tzw. wstęgowe rudy żelaza (ang. banded iron formation — BIF). Osadzanie się tlenków żelaza zachodziło głównie w okresie od 2, 8 do 1, 6 mld lat temu. Do tego czasu żelazo uwolnione ze skał magmowych dna morskiego jako Fe 2+ gromadziło się w dużych ilościach wraz z innymi 2~ 2+ jonami (S , Mn ) w morzu. Gdy sinice zaczęły przeprowadzać 2~ 2+ 2+ fotosyntezę tlenową, jony S zostały utlenione do SO4 , a Fe 3+ do Fe . Wytrącanie tlenków żelaza zachodziło na dużych obszarach wówczas, gdy głębokie warstwy wody zawierające żelazo kontaktowały się z bogatymi w tlen wodami powierzchniowymi. We wstęgowych rudach żelaza warstwy tlenków żelaza leżą na przemian z warstwami krzemienia (0, 2-2, 0 mm grubości). Uważa się, że warstwowość ta jest wynikiem sezonowego rytmu fotosyntezy w basenie sedymentacyjnym (ryc. 1. 3). Tlen mógł się nagromadzić w atmosferze dopiero wtedy, gdy została utleniona siarka i żelazo znajdujące się w oceanach (około 1, 6 miliarda lat temu). Mikroorganizmy uczestniczyły też w uruchamianiu żelaza zawartego w granitach i w jego ponownym wytrącaniu. Gdy Thiobacillus thiooxidans i T. ferrooxidans utleniają siarkowe składniki pirytów i markasytów do kwasu siarkowego, żelazo zostaje uwolnione w postaci Fe(II). Może ono następnie zostać utlenione do Fe(III) przez T. ferrooxidans (rozdz. 11. 4,

656

ługowanie rud). Po zobojętnieniu wody, Fe(III) wytrąca się jako Fe(OH)3. Wiele złóż bardzo czystych rud żelaza powstało prawdopodobnie wskutek procesu bakteryjnego ługowania zachodzącego przez miliony lat. W innych miejscach rozpuszczaniu żelaza sprzyja obecność kwasów organicznych (kwasów huminowych). Utlenianie Fe(II) do Fe(III) może też być przeprowadzane biologicznie przez takie bakterie żelazowe jak Gallionella lub Siderocapsa (w obojętnym pH), w wyniku czego powstają rudy darniowe i rudy bagienne. Odkładanie węglanu wapnia. W wielu wodach wapń jest obecny jako Ca(HCO3)2 lub CaSO4. W wyniku zmiany pH i zmniejszania ilości CO2 wskutek fotosyntezy, dwuwęglan jest zamieniany na nierozpuszczalny węglan wapnia, który ulega wytrąceniu. W warunkach beztlenowych redukcja siarczanu do siarkowodoru przez bakterie redukujące siarczany również prowadzi do wytrącenia pierwotnego siarczanu wapnia jako węglanu wapnia: CaSO4 + 8[H] + CO2 -> CaCO3 + 3H2O + H2S Duża część wapieni powstała z dwuwęglanu wapnia, który w wodach tropikalnych wytrąca się jako CaCO3, gdy wzrost temperatury wody prowadzi do uwolnienia CO2.

Powstawanie złóż siarki. Pokłady siarki powstają wskutek bakteryjnej redukcji siarczanów. W czasie beztlenowego rozkładu związków organicznych siarczany są preferowanymi akceptorami elektronów. Powstający siarkowodór hamuje wszystkie pozostałe procesy oddychania beztlenowego. Badania izotopowe potwierdziły, że złoża siarki w Teksasie i Luizjanie są pochodzenia biogennego. Siarka znajdująca się w wodzie 32 morskiej występuje w postaci dwóch stabilnych izotopów: 95% jako S 34 i 4% jako S. Podczas bakteryjnej redukcji siarczanów (limitowanej głównie dostępnością donorów elektronów), 3 2 SO 4 2 ~ zawierający lekki izotop ma większą szansę pobrania przez komórkę niż cięższy 3 4 SO 4 2 ~ . Powstający H2S ma więc mniejszą zawartość 34S niż siarczany z wody morskiej. Utlenianie „lekkiego" H2S (czy to biologiczne, czy abiotyczne) prowadzi do powstania „lekkiej" siarki. Tak więc, dzięki określeniu zawartości izotopów w opisywanych złożach, stwierdzono, że są one 657

pochodzenia biogennego. Izotopowy skład siarki biogennej jest całkowicie odmienny od składu siarki pochodzenia wulkanicznego. Można by dalej ciągnąć rozważania o przemianach biogeochemicznych prowadzących do powstawania pokładów węgla, złóż ropy naftowej, gazu ziemnego, krzemionki i boksytów. Przemiany te zachodziły dzięki aktywności metabolicznej mikroorganizmów, a więc takim przemianom, jak: utlenianie, fermentacja, wytwarzanie kwasów, redukcja, asymilacja dwutlenku węgla, wytwarzanie produktów lotnych. Problemami związanymi z rolą mikroorganizmów w tworzeniu, zmienianiu i rozkładaniu skał zajmuje się geomikrobiologia.

17. 4. Ewolucja mikroorganizmów Zarówno podstawowe struktury molekularne, jak i reakcje biochemiczne są takie same we wszystkich żywych organizmach. To stwierdzenie jest wciąż potwierdzane i rozszerzane. Po raz pierwszy zostało sformułowane jako „jedność biochemii" (rozdz. 7. 1). W porównaniu z tą podstawową jednorodnością, różnice i zmiany w szczegółach wydają się mieć mniejsze znaczenie. Można przyjąć, że wszystkie żyjące obecnie organizmy szły wspólną drogą ewolucyjną przez znaczną część swojej historii. Formy życia o wzrastającej złożoności i specjalizacji musiały powstać z form prostszych, które później wymarły. Ich nisze ekologiczne były często potem kolonizowane przez organizmy wywodzące z wyżej rozwiniętych form, których cechy uległy regresji do quasi-prymitywnych. Ewolucja organizmów jest jednym z głównych problemów biologii, bowiem jak stwierdził Dobzhansky „Nothing in biology makes sense except in the light of evolution". * Prymitywna atmosfera Ziemi. Wydaje się, że Ziemia powstała w wyniku zagęszczenia materii międzygwiezdnej, a zachodzące w konsekwencji tego rozgrzanie i roztopienie jądra spowodowało wypchnięcie gazów oraz wody na jej powierzchnię. Eksperci przyjmują, że pierwotna atmosfera Ziemi miała skład podobny do atmosfery Marsa lub Wenus, tzn. 3% N2, 96% CO2, 0, 1% H2O i mniej niż 1% tlenu. Fotoliza pary wodnej obecnej w atmosferze ziemskiej prawdopodobnie prowadziła do powstawania * Wszystko w biologii ma sens jedynie z punktu widzenia ewolucji (przyp. tłum. ).

658

tlenu, ale był on szybko redukowny przez żelazo(II) i siarkowodór. Atmosfera pozbawiona tlenu zapewniała dobre warunki dla ewolucji chemicznej. Ewolucja chemiczna. Hipoteza, że życie mogłoby dotrzeć na Ziemię z kosmosu, nie jest obecnie poważnie brana pod uwagę. Samoodtwarzające się jednostki biologiczne musiały powstać na Ziemi. Zgodnie z modelem zaproponowanym przez Haldane'a i Oparina, w najwcześniejszym okresie nagromadziły się duże ilości materii organicznej. W tym czasie nie było organizmów, które mogłyby wykorzystać związki organiczne i mineralizować je. Od momentu, kiedy Miller eksperymentalnie wykazał, że w odpowiednich warunkach proste cząsteczki organiczne mogą być syntetyzowane z substratów nieorganicznych (H2 CO2, CH4, NH3, H2O), nie ma już żadnych wątpliwości, że na Ziemi zaszła ewolucja chemiczna. Zakłada się, że w zredukowanej, wolnej od tlenu atmosferze, związki organiczne tworzyły się pod wpływem efektywnego chemicznie promieniowania słonecznego i wyładowań elektrycznych. Następnie adsorbowały się one na gliniastych minerałach (montmorylonit) i pirytach, a tym samym gromadziły się w wodzie. Takie minerały o rozwiniętej powierzchni, mogły odegrać ważną rolę w tworzeniu struktury i polimeryzacji podjednostek budulcowych. Stwierdzono, że siarczek żelaza(II) może reagować z siarkowodorem w warunkach ściśle beztlenowych, tworząc piryt i wodór:

Jest to reakcja egzoenergetyczna, w wyniku której uwalnia się energia oraz powstaje upostaciowana i dodatnio naładowana powierzchnia. Tak więc spełnia ona warunki wstępne potrzebne, aby zaszła uporządkowana polimeryzacja organicznych podjednostek budulcowych. Występowanie dużych ilości związków organicznych oraz kationowych i anionowych powierzchni o odpowiedniej strukturze mogło doprowadzić do pojawienia się pierwszych, samoodtwarzających się form życia. Ewolucja biologiczna. Przejście od nieożywionej materii organicznej do komórki żywej musiało się odbyć w stosunkowo krótkim czasie. Istnieje zgodny pogląd, że Ziemia powstała 4, 5-4, 6 miliardów lat temu. W najstarszych odkrytych dotychczas skałach osadowych, liczących 3, 5 miliarda lat, odkryto Stromatolity. Równie stare są skały osadowe, w których 659

znaleziono węgiel organiczny (Corg. )· Stromatolity i Corg. są powszechnie uznawane za pierwsze ślady życia na Ziemi. Ich obecność wskazuje, że wśród najwcześniejszych żywych form przeważały autotrofy. Argumenty przemawiające za tym stwierdzeniem są następujące: 1) Archaiczne Stromatolity wykazują znaczne podobieństwa z formami współczesnymi. Stromatolity to struktury organiczno-osadowe (biogenne), które powstały w wyniku wytrącania minerałów tworzących osady na rosnących mikroorganizmach. Również obecnie nitkowate sinice tworzą Stromatolity. Wiążąc CO 2 wywołują one alkalizację środowiska, co powoduje wytrącanie węglanu wapnia. W ten sposób wokół tych mikroorganizmów powstaje kredowa otoczka. Organizmami biorącymi udział w tworzeniu stromatolitów musiały być nitkowate, autotroficzne bakterie poruszające się ruchem ślizgowym. Cechami takimi charakteryzują się sinice, założono więc, że występowanie archaicznych stromatolitów świadczy o przeprowadzaniu fotosyntezy tlenowej przez sinice 3, 5 mld lat temu. Udział bakterii autotroficznych jest tu bezsprzeczny. Prokariota autotroficzne wiążące dwutlenek węgla występują wśród beztlenowych fototrofów, jak również wśród beztlenowych chemolitoautotrofów (tworzących metan i H 2 S). Zdarzają się wśród nich formy nitkowate. 2) Drugi dowód na to, że źródłem węgla organicznego znajdowanego w archaicznych osadach są bakterie autotroficzne, pochodzi z danych izotopowych. Węgiel organiczny (C o r g ) izolowany z osadów występuje w postaci tzw. „kerogenu", tj. nierozpuszczalnych w kwasach, wysoce spolimeryzowanych produktów przekształceń materiału organicznego. Węgiel, podobnie jak wiele innych pierwiastków, występuje jako mieszanina dwóch izotopów — 1 2 C i 1 3 C. Wszystkie znane drogi autotroficznego wiązania CO 2 prowadzą do wzbogacenia syntetyzowanych substancji komórkowych w lżejszy izotop 1 2 C, co stwierdzono badając współczesne bakterie wiążące CO 2 . Ponieważ archaiczny kerogen ma prawie taki sam skład izotopowy jak dzisiejsze bakterie autotroficze, wydaje się logiczne, że jego powstanie musi być związane z występowaniem bakterii autotroficznych.

Ewolucja prokariota. Na podstawie ustalonych faktów i kilku kontrowersyjnych założeń, można zaproponować wysoce spekulatywny model zdarzeń prowadzących do rozwoju różnych typów metabolicznych (ryc. 1. 3) Przez długi okres dyskutowano, czy pierwsze bakterie prowadziły metabolizm autotroficzny czy heterotroficzny. Biorąc pod uwagę możliwość łatwej wymiany materiału genetycznego we wczesnych etapach ewolucji, nie można wykluczyć, że heterotroficzne bakterie o metabolizmie fermentacyjnym rozwijały się równolegle z autotroficznymi bakteriami beztlenowymi. Obficie występujące związki organiczne mogły pozwolić na wczesny rozwój procesów metabolicznych, które obecnie przeprowadzają współczesne organizmy fermentujące i które odgrywają dominującą rolę w głównych szlakach metabolicznych. Dostępność CO2, siarki, siarczanów, żelaza(III) i wodoru cząsteczkowego (powstającego przy odgazowywaniu magmy i bazaltów, przy

660

tworzeniu pirytów i fotolizie wody) mogłaby pozwolić na rozwój procesów metabolicznych, które znamy jako „oddychanie beztlenowe" (rozdz. 9. 2, 9. 3, 9. 4). W ten sposób prawdopodobnie powstał wydajny system transportu elektronów z wytworzeniem potencjału protonowego, który mógł kierować regeneracją ATP. Na tym etapie mogły się rozwinąć porfiryny zawierające żelazo i nikiel oraz autotrofia węglowa. Pierwszą, jaka powstała, drogą wiązania CO2 jest bez wątpienia szlak acetylokoenzymu A. Obecnie ten typ wiązania CO2 występuje u bakterii acetogennych i metanogenów oraz u wytwarzających siarkowodór bakterii wykorzystujących siarkę lub siarczany jako ostateczne akceptory protonów. Dobrze dziś poznany poziomy przekaz informacji genetycznej — przez bakteriofagi, plazmidy i wolny DNA — pozwala przypuszczać, że podobne mechanizmy umożliwiały wymianę informacji w czasach archaicznych, a tym samym — szybką ewolucję. „Wynalazek" fosforylacji poprzez przenoszenie elektronów i rozwój fotosystemu I pozwoliły na wykorzystanie światła jako źródła energii. Porfiryny magnezowe (chlorofil) służyły jako centra reakcji. Pierwsze organizmy fototroficzne prawdopodobnie asymilowały substancje organiczne na świetle, tak jak to robią Rhodospirillaceae. Możliwość wiązania dwutlenku węgla w cyklu rybulozobisfosforanowym i wykorzystywanie nieorganicznych donatorów wodoru (H2, H2S, S) doprowadziło do powstania typu metabolizmu, jaki znajdujemy dziś u purpurowych bakterii siarkowych (Chromatiaceae). Rozwój drugiego fotosystemu uniezależnił organizmy od zewnętrznych dawców elektronów, takich jak H2, H2S czy substancje organiczne. Fotosystem II pozwala na transport elektronów w łańcuchu otwartym, z wodą jako dawcą elektronów. Ten proces jest bezwzględnie związany z uwalnianiem tlenu. Fotosynteza tlenowa zapoczątkowała rozwój atmosfery tlenowej na Ziemi. Pierwszymi organizmami fotosyntetycznymi wytwarzającymi tlen były sinice. Autotrofia. Znane są trzy drogi autotroficznego wiązania dwutlenku węgla: cykl rybulozobisfosforanowy, reduktywny cykl kwasów karboksylowych i reduktywny szlak acetylo-CoA. Wiązanie CO2 i jego przemiana w metabolity jest procesem redukcyjnym. Przy braku tlenu można wykluczyć ponowne utlenienie metabolitów. Sekwencyjne ułożenie całkowicie odwracalnych reakcji enzymatycznych byłoby więc wystarczające do wytworzenia, w warunkach beztlenowych, zredukowanych związków węgla przy minimalnym wydatkowaniu energii. Tłumaczy to wiarygodnie, 661

dlaczego wiązanie w reduktywnym szlaku acetylokoenzymu A jest tak szeroko rozpowszechnione wśród bakterii bezwzględnie beztlenowych. W obecności tlenu do redukcji CO2 niezbędny jest jednak pewien ciąg reakcji enzymatycznych zawierający etapy odwracalne. Taki ciąg stanowi cykl Calvina. Wyewoluował on prawdopodobnie z głównego ciągu metabolizmu cukrów i jest bardzo energochłonny. Szlak ten wykorzystują tylko tlenowe i beztlenowe organizmy fotosyntetyzujące i niektóre chemolitoautotrofy pochodzące od bakterii purpurowych. Nie znaleziono go u żadnej archebakterii. Potwierdza to przypuszczenie, że cykl Calvina rozwinął się dopiero po rozdzieleniu Archaea i Bacteria. Z drugiej strony, szlak acetylokoenzymu A wydaje się szeroko rozpowszechniony wśród archeonów, a wśród bakterii występuje jedynie u bakterii redukujących siarczany, acetogennych klostridiów i u Acetobacterium. Przejście z pierwotnej zredukowanej atmosfery do atmosfery zawierającej tlen było bez wątpienia największym przewrotem w ewolucji żywych organizmów i minerałów. Przemiana cytochromu w końcowe oksydazy i wykorzystanie tlenu jako ostatecznego akceptora elektronów doprowadziło do powstania metabolizmu tlenowego. Uważa się, że wszystkie prokariota fototroficzne i oddychające tlenowo, jakie dzisiaj znamy, występowały już 2, 1 mld lat temu. Zgodnie z dowodami geologicznymi mała ilość tlenu była obecna w atmosferze już 2, 7 mld lat temu, ale przed 1, 2 mld lat całe życie na Ziemi opierało się już na fotosyntezie i roślinach wytwarzających tlen. Żywe organizmy odegrały też rolę w ewolucji i rozwoju struktury dzisiejszych skał przez utlenianie metali i minerałów. Do około 0, 6 mld lat temu zawartość tlenu w atmosferze prawdopodobnie osiągnęła tylko 2%. Lądy skolonizowane przez rośliny zielone zostały pokryte grubą warstwą roślinności, co doprowadziło do szybkiego wzrostu stężenia tlenu, aż do występującej dziś wartości 21%. Wytwarzaniu tlenu towarzyszyło odkładanie węgla w postaci złóż węgla, gazu ziemnego i ropy naftowej oraz bogatych w węgiel skał osadowych. Dowody kopalne z wczesnego prekambru są bardzo rzadkie. Z powodu małych rozmiarów i braku twardych struktur, skamieliny prymitywnych form żywych przetrwały jedynie w specyficznych warunkach. Formy liczące około 2, 7 mld lat, które widać w pewnych osadach z Minnesoty, uznano za bakterie i sinice. Osady z Afryki Południowej, zawierające, jak się wydaje, pewne struktury podobne do bakterii, są jeszcze starsze i mają 3, 1 mld lat. Są to najstarsze znane ślady komórek kopalnych. 662

Ewolucja eukariotów. Rozwój eukariotów stał się możliwy dopiero wtedy, gdy atmosfera zawierała odpowiednią ilość tlenu. Praktycznie wszystkie eukariota, z bardzo nielicznymi wyjątkami, są tlenowcami. Wiele nisz ekologicznych było już zajętych przez prokariota. Rozwój ich metaboliczno-fizjologicznej różnorodności był wcześniej możliwy dzięki prostej budowie komórkowej, szybkiemu tempu wzrostu, dobrze rozwiniętym systemom regulacyjnym i rozlicznym mechanizmom przekazywania genów. Dalszy rozwój ewolucyjny został prawdopodobnie ograniczony przez takie czynniki, jak mały rozmiar ich genomu i jego haploidalność, a także małe rozmiary komórki. Nowe środowisko, czyli warunki tlenowe, pozwalały na wyższą wydajność energetyczną. Jednak do jej wykorzystania potrzebne były komórki o większych rozmiarach, które mogłyby ulec strukturalnemu zróżnicowaniu, i o kilkakrotnie większym genomie, zdolnym pomieścić więcej informacji. Genom o wielkości 5 x 109 stanowił górną granicę dla jednego dwuniciowego bakteryjnego chromosomu. Dalszy rozwój wymagał nowego modelu. Różnice między komórką prokariotyczną i eukariotyczną są ogromne. Najważniejsze cechy specyficzne dla komórki eukariotycznej można podsumować następująco: 1) Oddzielenie błoną jądrową DNA, będącego nośnikiem informacji, od przestrzeni, w której zachodzi metabolizm. 2) Rozdzielenie transkrypcji (w przestrzeni jądrowej) od translacji (w cytoplazmie). 3) Podział genomu na pewną liczbę odcinków, tzn. na szereg liniowych chromosomów, w miejsce jednego kolistego. 4) Replikacja DNA ograniczona do interfazy; każdy chromosom ma kilka replikonów, a chromosomy siostrzane są rozdzielane w drodze mitozy. 5) Mechanizmy ruchu wewnątrzkomórkowego z udziałem aktyny i tubuliny, umożliwiające również ruch chromosomów w czasie mitozy, mejozy, parowania chromosomów; rozwój systemu pęcherzyków (lizosomy, peroksysomy i inne „mikrociałka"). 6) Geny podzielone w DNA i proces składania RNA (ang. splicing). 7) Asocjacja DNA z histonami w struktury o wyglądzie paciorków (struktura nukleosomu). 8) Mejoza: parowanie chromosomów i redukcja ich diploidalnej liczby do haploidalnej. Umożliwiła ona rozwój rozmnażania płciowego, powstawanie nowej kombinacji genów i spowodowała występowanie fazy haploidalnej i diploidalnej w czasie wzrostu wegetatywnego. 9) Egzocytoza: egzoenzymy nie muszą być syntetyzowane na błonie cytoplazmatycznej i jednocześnie wydzielane, lecz mogą być syntetyzowane na błonach wewnątrzkomórkowych (retikulum endoplazmatyczne) i przenoszone do cystern, których zawartość jest uwalniana na 663

zewnątrz. 10) Endocytoza w postaci fagocytozy i pinocytozy; zdolność do utrzymywania endosymbiontów, l l ) Mitochondria i chloroplasty do regeneracji energii (ATP). 12) Rzęska o strukturze 9 + 2. Jak widać, eucyt znacznie różni się od protocytu pod względem strukturalnym i funkcjonalnym. Znane są nieliczne komórki eukariotyczne, u których brak jest którejś z wymienionych cech. Nie istnieją jednak prymitywne formy, które mogłyby wskazać, w jaki sposób powstawały te nowe cechy. Wydaje się prawdopodobne, że poszczególne etapy (w zmianach prowadzących do nowej właściwości) dawały jedynie niewielką korzyść selekcyjną, szczególnie w porównaniu z następnym organizmem lepiej przystosowanym. Organizmy stanowiące brakujące ogniwa nie przeżyły i były prawdopodobnie tak nietrwałe, że nawet formy pośrednie, których różnice funkcjonalne można byłoby analizować, nie zachowały się w formie skamielin. Bardzo nieliczne współczesne organizmy można uznać za formy pochodzące od „brakujących ogniw". Odtworzenie kolejnych zdarzeń prowadzących do pojawienia się wymienionych powyżej cech nie wydaje się realne. Można jednak stwierdzić, że we wczesnych etapach ewolucji eukariota, powstało szereg modeli organizacji komórkowej, zanim pojawiły się organizmy wielokomórkowe. Szczególne cechy fizjologiczne prokariotów. Należy podkreślić, że eukariota wyspecjalizowane w fotosyntezie i życiu tlenowym pozostawiły organizmom prokariotycznym wiele ważnych funkcji ekologicznych. Należą do nich: wiązanie azotu atmosferycznego, nitryfikacja, denitryfikacja, oddychanie siarczanowe, utlenianie siarki i metali, tworzenie metanu i jego wykorzystywanie. Krążenie azotu i siarki w przyrodzie jest, albo całkowicie albo w znacznej mierze, uzależnione od prokariota. Tak więc prokariota mogą wspólnie, bez udziału eukariota, przeprowadzać podstawowe cykle krążenia pierwiastków na naszej planecie i utrzymywać biosferę w pewnej równowadze, do czego same eukariota nie są zdolne. Prokariota przez miliardy lat były jedynymi organizmami na Ziemi. Eukariota natomiast nigdy nie były same, zawsze towarzyszyły im organizmy prokariotyczne. Dostarczyły one nowych nisz ekologicznych i ochrony organizmom prokariotycznym, ale stały się też ich ofiarami. Organizmy wielokomórkowe, w odpowiedzi na agresywne właściwości prokariotów, rozwinęły wysoce wyspecjalizowane mechanizmy obronne i ochronne. Z drugiej strony eukariota nauczyły się też wyciągać korzyści

664

ze związków z prokariotami i „wzięły je na służbę" jako ektosymbionty (w przewodzie pokarmowym, żwaczu oraz na skórze) lub jako endosymbionty (wiązanie azotu, produkcja biomasy w wyniku fotosyntezy, wykorzystywanie H2S i usuwanie H2). Ewolucja organizmów stawia przed nami fascynujące problemy. Ich wyjaśnianie dopiero się zaczęło.

BIBLIOGRAFIA

I. Podręczniki mikrobiologii Atlas, R. M. (1984), Microbiology, Fundamentals and Applications, MacMillan, Publ. Comp., New York. Brock, T. D., Madigan, M. T. (1991), Biology of Microorganisms. 6. Aufl., Prentice Hall, Engelwood Cliffs. Davis, B. D., Dulbecco, R., Eisen. H. N., Ginsberg, H. S. (1990), Microbiology, 4. Aufl., J. B. Lippincott/Harper & Row, London. Neidhardt, F. C, Ingraham, J. L., Low, K. B., Magsanik, B., Schaechter, M., Umbarger, H. E. (1987), Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, Am. Soc. Microbiol., Washington, D. C. Pelczar, M. J. jr., Chan, E. C. S., Krieg, N. R. (1986), Microbiology, 5. Aufl., McGraw-Hill, New York. Stanier, R. Y., Ingraham, J. L., Wheelis, M. L., Painter, P. R. (1986), The Microbial World, 5. Aufl., Prentice-Hall, Engelwood Cliffs. Thimann, K. V. (1955), The Life of Bacteria, Their Growth, Metabolism and Relationships, MacMillan, New York.

II. Komórka i jej struktura Alberts. B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J. D. (1990), Molekularbiologie der Zelle, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim. Carlile, M. J. (1980), From Prokaryote to Euka-

666

ryote: Gains and Losses, Symp. Soc. Gen. Mikrobiol. 30, 1. Cavalier-Smith, T. (1981), The Origin and Early Evolution of the Eukaryotic Cell, Symp. Soc. Gen. Microbiol. 32, 33. Gunsalus, I. C, Stanier, R. Y. (Herausgeb. ) (1960), The Bacteria. Bd. I, Academic Press. New York. Kleinig, H., Sitte, P. (1984), Zellbiologie, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York. Lodish, H.. Darnell, J., Baltimore, D. (1986), Molecular Cell Biology, Sci. Am. Books, Inc. Mayer, F. (1988), Methods in Microbiology, Vol. 20, Academic Press, London. Neidhardt, F. C, Ingraham, J. L., Schaechter, M. (1990), Physiology of the Bacterial Cell. A Molecular Approach, Sinauer Associates, Inc., Massachusetts, USA.

III. Prokariota Buchanan, R. E.. Gibbon. N. E. (Herausgeb. ) (1974), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl., Williams & Wilkins, Baltimore. Krieg, N. R., Holt, J. G. (1984-1989), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bd. 1-4, William & Wilkins, Baltimore. Lapage, S. P., Sneath, P. A. M., Lessel jr., E. F., Skerman, V. B. D., Seeliger, H. P. R., Clark, W. A. (1975), International Code of Nomenclature of Bacteria, Am. Soc. Microbiol., Washington, D. C. Schleifer, K. H., Stackebrandt, E. (1983), Mole-

cular Systematics of Prokaryotes, Annu, Rev. Microbiol. 37, 143. Skerman, V. B. D. (1967), A Guide to the Identification of the Genera of Bacteria, 2. Aufl., Williams & Wilkins. Baltimore. Starr. M. P., Stolp, H., Trüper, H. G., Balows, A., Schlegel, H. G. (Herausgeb. ) (1981), The Prokaryotes. A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Bd. I und II, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Woese, C. R. (1987), Bacterial Evolution, Microbiol. Rev. 51, 221-272.

IV. Wirusy: klasyfikacja i struktura Davis, B. D., Dulbecco, R., Eisen, H. N., Ginsberg, H. S. (1990). Microbiology, 4. Aufl.. J. B. Lippincott/Harper & Row, London. Fraenkel-Conrat, H., Kimball. P. C, Levy, J. A. (1988), Virology, 2. Aufl., Prentice Hall, Englewood Cliffs. Glass, R. E. (1982). Gene Function. E. coli and its Heritable Elements. Croom Helm, London. Hershey, A. D. (Herausgeb. ) (1971), The Bacteriophage Lambda, Cold Spring Harbor Monograph Series, Cold Spring Harbor, New York. Luria, S. E., Darnell jr., J. E., Baltimore, D. Campbell, A. (1978), General Virology, 3. Aufl., Wiley, New York. Watson, J. D., Hopkins, N. H., Roberts, J. W., Steitz, J. A., Weiner, A. M. (1987). Molecular Biology of the Gene, 4. Aufl., The Benjamin/Cummings Publ. Comp., Inc., Menlo Park. California.

V. Grzyby Esser, K. (1982), Cryptogams. Cyanobacteria. Algae, Fungi, Lichens, Cambridge University Press, London. Smith, J. E.. Berry, D. R. (1975), The Filamentous Fungi. Industrial Mycology, Bd. I, E. Arnold, London. Smith, J. E., Berry, D. R. (1976), The Filamentous Fungi. Biosynthesis and Metabolism, Bd. II, E. Arnold, London. Smith, J. E., Berry, D. R. (1978), The Filamentous Fungi. Developmental Mycology, Bd. III, E. Arnold, London. Webster, J. (1980), Introduction to Fungi, 2. Aufl., Cambridge University Press, London.

VI. Wzrost mikroorganizmów Gunsalus, I. C, Stanier, R. Y. (Herausgeb. ) (1962), The Bacteria, Bd. IV, Academic Press, New York, London. Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt. F. C. (1983), Growth of the Bacterial Cell, Sinauer Ass. Inc., Sunderland, Mass. Malek, I., Fencl., Z. (1966). Theoretical and Methodological Basis of Continuous Culture of Microorganisms, Academic Press, New York, London. Mandelstam, J., McQuillen, K., Dawes, J. (Herausgeb. ) (1982), Biochemistry of Bacterial Growth, 3. Aufl., Blackwell Sci. Publ., Oxford. Schlegel, H. G., Kroger. E. (Herausgeb. ) (1765), Anreicherungskultur und Mutantenauslese, Zentralbl. Bakteriol. 1. Abt. Suppl. 1, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York. Starr, M. P., Stolp, H., Trüper, H. G.. Balows, A., Schlegel, H. G. (Herausgeb. ) (1981), The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Stouthamer, A. M. (1977), Energetic Aspects of the Growth of Microorganisms, in Microbial Energetics (Haddock, B. A., Hamilton, W. A., Herausgeb. ). Cambridge University Press, London. Veldkamp, H. (1976), Continuous Culture in Microbial Physilogy and Ecology, Meadowfield Press, Durham.

VII. Podstawowe procesy metabolizmu i przemiany energii Crosa, J. H. (1989), Genetics and Molecular Biology of Siderophore-Mediated Iron Transport in Bacteria, Microbiol., Rev. 53, 517-530. Gottschalk, G. (1981), The Anaerobic Way of Life of Prokaryotes, in The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria (Starr, M. P. et al., Herausgeb. ), Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Gottschalk, G. (1986), Bacterial Metabolism, 2. Aufl., Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Harold, F. M. (1986), The Vital Force: A study of Bioenergetics, W. H. Freeman, New York. Jones, C. W. (1982), Bacterial Respiration and Photosynthesis, Nelson, Walten-on Thames. Karlson, P. (1990), Kurzes Lehrbuch des Bio-

667

chemie, 13. Aufl., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. Stryer, L. (1990), Biochemie, 4. Aufl., Spektrum der Wissenschaft, Heidelberg.

VIII. Wybrane procesy fermentacyjne Gunsalus, I. C, Stanier, R. Y. (Herausgeb. ) (1961), The Bacteria, Bd. II, Academic Press, New York, London. Reed, G. (Herausgeb. ) (1982), Prescott and Dunn's Industrial Microbiology, The Avi Publ. Comp., Inc., Westpoint. Rehm, H. J. (1980), Industrielle Mikrobiologie, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Thauer, R. K., Morris, J. G. (1984), Metabolism of Chemotrophic Anaerobes: Old Views and New Aspects, Symp. Soc. Gen. Microbiol. 36

(ll), 123. Zehnder, A. J. B. (Herausgeb. ) (1988), Biology of Anaerobic Microorganisms, John Wiley & Sons, Inc., New York.

IX. Transport elektronów w warunkach beztlenowych Blaut, M., Gottschalk, G. (1984), Coupling of ATP Synthesis and Methane Formation from Methanol and Molecular Hydrogen in Methanosarcina barkeri, Eur. J. Biochem. 141, 217. Postgate, J. R. (1984), The Sulphate-Reducing Bacteria, 2. Aufl., Cambridge University Press, London. Thauer, R. K., Jungermann, K., Decker, K. (1977), Energy Conservation in Chemotrophic Anaerobic Bacteria, BacterioL Rev. 41, 100. Thauer, R. K., Morris, J. G. (1984), Metabolism of Chemotrophic Anaerobes: Old Views and New Aspects, Symp. Soc. Gen. Microbiol, 36 (II), 123. Zehnder, A. J. B. (Herausgeb. ) (1988), Biology of Anaerobic Microorganisms, John Wiley & Sons, Inc., New York.

X. Niepełne utlenianie i biotechnologia mikrobiologiczna Crueger, W., Crueger, A. (1980), Biotechnologie-Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie, 3. Aufl., R. Oldenbourg Verlag, München. Demain, A. L., Solomon, N. A. (Herausgeb. )

668

(1986), Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, Am. Soc. Microbiol., Washington. Diekmann, H., Metz, H. (1991), Grundlagen und Praxis der Biotechnologie, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York. Gutcho, S. J. (1973), Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corp., Park Ridge. Kieslich, K. (1976), Microbiol Transformations, Georg Theiem Verlag, Stuttgart, New York. Mann, J. (1978), Secondary Metabolism, Clarendon Press, Oxford. Moo-Young, M. (1984), Comprehensive Biotechnology, Vol. I-IV, Pergamons Press, Oxford. Peppier, H. J., Perlman, D. (1979), Microbial Technology, Bd. I und II, Academic Press, New York, London. Präve, P., Faust, U., Sittig, W., Sukatsch, D. A. (1987), Handbuch der Biotechnologie, R. Oldenbourg-Verlag, München. Rehm, H. J., Reed, G. (Herausgeb. ) (1988ff), Biotechnology. A Comprehensive Treatise in 8 Volumes, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim. Rose, A. H. (Herausgeb. ) (1979), Secondary Products of Metabolism, Academic Press, New York, London. Smith, J. E.. Berry, D. R. (1975), The Filamentous Fungi, Industrial Mycology, Bd. I, E. Arnold, London. Sutherland, I. W. (1982), Biosynthesis of Microbial Exopolysaccharides, Adv. Microbiol. Physiol. 23, 79.

XI. Bakterie chemo- i fototroficzne Clayton, R. K., Sistrom, W. R. (Herausgeb. ), (1978), The Photosynthetic Bacteria, Plenum Press, New York. Jones, C. W. (1982), Bacterial Respiration and Photosynthesis, Nelson, Walten-on Thames. Jones, O. T. G. (1977), Electron Transport and ATP Synthesis in the Photosynthetic Bacteria in Microbial Energetics (Haddock, B, A., Hamilton, W. W., Herausgeb. ), Cambridge University Press, London. Lawlor, D. W. (1990), Photosynthese - Stoffwechsel, Kontrolle, Physiologie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. Renger, G. (1977), Photysynthese, in Biophysik - ein Lehrbuch (Hoppe, W. et al., Herausgeb. ),

Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Richter, G. (1988), Stoffwechselphysologie der Pflanzen, 5. Aufl., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. Schlegel, H. G., Bowien, B. (Herausgeb. ) (1989), Autotrophic Bacteria, Science Techn/Springer Verlag, Madison, Heidelberg. Shively, J. M., Barton, L. L. (1991), Variations in Autotrophic Life, Academic Press, London.

XII. Przemiany azotu Bothe, H., De Bruijn, F. J., Newton, W. E. (Herausgeb. ) (1988), Nitrogen Fixation: Hundred Years After, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York. Hardy, R. W. F., Bottomley, F., Burns, R. C. (Herausgeb. ) (1979), A Treatise on Dinitrogen Fixation, Wiley, New York. Postgate, J. R. (1982), The fundamentals of Nitrogen Fixation, Cambridge University Press, London. Quispel, A. (Herausgeb. ) (1974), The Biology of Nitrogen Fixation, North-Holland, Amsterdam. Schaede, R., Meyer, F. H. (1962), Die pflanzlichen Symbiosen, 3. Aufl., Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York.

XIII. Degradacja substancji organicznych Beck, T. (1968), Mikrobiologie des Bodens, Bayr. Landw. Verlag, München. Bonner, J., Varner, J. E. (Herausgeb. ) (1965), Plant Biochemistry, Academic Press, New York, London. Gibson, D. T. (Herausgeb. ) (1984), Microbial Degradation of Organic Compounds, Marcel Decker, Inc., New York. Giesecke, D., Henderickx, H. K. (Herausgeb. ) (1973), Biologie und Biochemie der mikrobiellen Verdauung, BLV Verlagsgesellschaft, München. Gray, T. R. G., Parkinso, D. (Herausgeb. ) (1967), The Ecology of Soil Bacteria, Liverpool University Press. Hungate, R. E. (1966), The Rumen and Its Microbes, Academic Press, New York, London. McLaren, A. G., Peterson, G. H. (Herausgeb. ) (1967), Soil Biochemistry, Arnold, London. McLaren, A. D., Skujins (Herausgeb. ) (1971), Soil Biochemistry, Dekker, New York.

Parkinson, D., Waid, J. S. (1960), The Ecology of Soil Fungi, Liverpool University Press. Watkinson, R. J. (Herausgeb. ) (1978), Developments in Biodegradation of Hydrocarbons, Appl. Sci. Publishers, London.

XIV. Stałość, zmienność i przenoszenie cech dziedzicznych Bachmann, B. J. (1990), Linkage Map of Escherichia coli K12, Microbiol. Rev. 54, 130-197. Birge, E. A. (1984), Bakterien- und Phagengenetik, eine Einführung, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Bresch, C, Hausmann, R. (1972), Klassische und molekulare Genetik, 3. Aufl., Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Freifelder, D. (1987), Microbial Genetics, Jones and Bartlett Publ., Boston. Glass, R. E. (1982), Gene Function. E. coli and its Heritable Elements, Croom Helm, London. Kaudewitz, F. (1983), Genetik. Ulmer Verlag, Stuttgart. Knippers, R., Fanning, E., Philippsen, P., Schäfer, K. P. (1990), Molekulare Genetik, 5. Aufl., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. Lewin, B. (1974), Genes, Wiley & Sons, New York, London. Lewin, B. (1974, 1977 und 1990), Gene Expression, Bd. I-IV, Wiley & Sons, New York, London and Oxford University Press. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor, Lab., Cold Spring Harbor, New York. Schumann, W. (1990), Biologie Bakterieller Plasmide, Friedr. Vieweg & Sohn Verlagsgeselschaft Braunschweig. Stent, G. S., Calendar, R. (1978), Molecular Genetics, an Introductory Narrative, Freeman, San Francisco. Strickberger, M. W. (1988), Genetik, Carl Hauser Verlag, Wien. Winnacker, E. L. (1987), From Genes to Clones, Introduction to Gene Technology, VCH Verlagsgeschellschaft, Weinheim.

XV. Regulacja metabolizmu Beckwith, J. R., Zipser, D. (Herausgeb. ) (1970), The Lactose Operon, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.

669

Cohen, G. N. (1968), The Regulation of Cell Metabolism, Hermann, Paris. Englesberg, E., Wilcox, G. (1974), Regulation: Positive control, Annu. Rev. Genet. 8, 219. Hecker, M., Babel, W. (Herausgeb. ) (1988), Physiologie der Mikroorganismen, VEB Gustav Fischer Verlag, Jena. Jungermann, K., Möhler, H. (1980), Biochemie, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Neidhardt, F. C. (Heruasgeb. ) (1987), Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and Molecular Biology, Am. Soc. Microbiol. Publ., Washington.

XVI. Mikroorganizmy i środowisko Alexander, M. (1971), Microbial Ecology, Wiley, New York. Atlas, R. M., Bartha, R. (1987), Microbial Ecology: Fundamentals and Applications, 2. Aufl., Benjamin Publ. Comp., Menlo Park, California. Brock, T. D. (1978), Thermophilic Microorganisms and Life at High Temperatures, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Broda, E. (1975), The Evolution of the Bioenergetic Processes, Perganom Press, Oxford, New York. Carlile, M. J., Skehel, J. J. (1974), Evolution in the Microbial World, 24. Symp. Soc. Gen. Microbiol., Cambridge University Press, London. Cavalier-Smith, T. (1981), The Origin and Early Evolution of the Eukaryotic Cell. Symp. Soc. Gen. Microbiol. 32, 33. Ellwood, D. C, Hedger, J. N., Latham, M. J., Lynch, J. M., Slater, J. H. (Herausgeb. ) (1980), Contemporary Microbial Ecology, Academic Press, New York, London. Fletcher, M.. Gray, T. R. G. (Herausgeb. ) (1987). Ecology of Microbial Communities, Symp. Soc. Gen. Microbiol. 4L Holland, H. D., Schidlowski, M. (Herausgeb. ) (1982), Mineral Deposits and the Evolution of the Biosphere. Report of the Dahlem Workshop on Biospheric Evolution and Precambrian Metanogeny, Berlin 1980, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Kaplan, R. W. (1978), Der Ursprung des Lebens, 2. Aufl., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York.

670

Kushner, D. J. (Herausgeb. ) (1978), Microbial Life in Extreme Environments, Academic Press, New York, London. Odum, E. P. (1983), Grundlagen der Ökologie. Bd. I: Grundlagen. Bd. II: Standorte und Anwendung, 2. Aufl., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. Oparin, A. (1957), Die Entstehung des Lebens auf der Erde, 3. Aufl., Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin. Riley, M„ Anilionis. A. (1978), Evolution of the Bacterial Genome. Annu. Rev. Micriobiol. 32, 519. Savage, D. C. (1977), Microbial Ecology of the Gastrointestinal Tract, Annu. Rev. Microbiol. 31, 107. Schlegel, H. G., Jannasch, H. W. (1981), Prokaryotes and Their Habitats, in The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria (Starr, M. P. et al., Herausgeb. ), Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Schleifer, K. H., Stackebrandt, E. (Herausgeb. ) (1985), Evolution of Prokaryotes. Academic Press, Inc., Orlando. Schopf, J. W. (Herausgeb. ) (1983), Earth's Earliest Biosphere, its Origin and Evolution, Princeton University Press, Princeton, N. J. Shilo, M. (Herausgeb. ) (1979), Strategies of Life in Extreme Environments. Dahlem Konferenzen, Berlin, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, Florida, Basel. Tait, R. V. (1981), Meeresökologie, 2. Aufl., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. Tardent. P. (1979), Meeresbiologie, eine Einführung, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. Van den Hoek, Ch. (1978), Algen, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. Werner, D. (1978), Pflanzliche und mikrobielle Symbiosen, Georg Thieme Verlag, Stuttgart. Woese, C. R. (1987), Bacterial Evolution, Microbiol. Rev. 57, 221.

XVII. Cenniejsze podręczniki Florkin. N., Stotz, E. H. (Herausgeb. ) (1962ff), Comprehensive Biochemistry, Bd. Iff, Elsevier, Amsterdam, New York. Gunsalus, I. C. (Herausgeb. ) (1960-1986), The Bacteria, Bd. I-X, Academic Press, Inc., Orlando. Starr, M. P., Stolp, H., Truper, H. G., Balows,

A., Schlegel, H. G. (Herausgeb. ) (1981), The Prokaryotes. A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Bd. I und II, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.

XVIII. Historia Bolle, F. (1954), Mensch und Mikrobe, Safari, Berlin. Brock, T. D. (1988), Robert Koch. A Life in Medicine and Bacteriology, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Bulloch, W. (1960), The History of Bacteriology, Oxford University Press, London. De Kruif, P. (1927 und spätere Auflagen), Mikrobenjäger, Orell-Füssli, Zürich. Dobell, C. (1958). Antonie van Leeuwenhoek and His Little Animals, Russel and Russel, New York. Freund, H., Berg. A. (1963, 1964, 1966), Geschichte der Mikroskopie, Bd. I—III. Umschau Verlag, Frankfurt. Grainger, T. H. (1958), A Guide to the History of Bacteriology, Ronald, New York. Haeckel, E. (1866), Allgemeine Entwicklungsgeschichte der Organismen, Georg Reimer, Berlin. Kamp, A. F., La Riviere, J. W. M., Verhoeven. W. (Herausgeb. ) (1959), A. J. Kluyver, His Life and Work, North-Holland, Amsterdam. Lafar, F. (1904-1905). Handbuch der technischen Mykologie. Bd. I-V, Gustav Fischer Verlag, Jena. Lechevalier. H. A-, Solotarovsky, M. (1974), Three Centuries of Microbiology, Dover Publishers, New York. Mochmann, H. P., Höhler, W. (1984), Meilensteine der Bakteriologie, Fischer Verlag, Jena. Nicolle, J. (1961), Louis Pasteur, the Story of His Major Discoveries, Basic Book, New York. Tomsik, I. (1964), Pasteur und die Generatio spontanea, Huber, Bern. Van Iterson, G., Den Dooren, De Jong, L. E.. Kluyver, A. J. (Herausgeb. ) (1921-1940), Verzamelde Geschriften van M. W. Beijerinck, Bd. I-VI, Martinus Nijhoff, Delft. Waksman, S. A. (1953). Sergei N. Winogradsky. His Life and Work, Rutgers University Press, New Brunswick.

XIX. Metody w mikrobiologii Bergmeyer, H. U. (Herausgeb. ) (1974-1984). Methods of Enzymatic Analysis, 3. Aufl., Bd. I—VI, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, Florida. Basel. Colowick, S. P.. Kaplan, N. O. (Herausgeb. ) (1970ff). Methods in Enzymology, Academic Press, New York, London. Conn, H. J. (1957), Manual of Microbiological Methods, McGraw-Hill, New York. Cowan, S. T., Steel. K. J. (1965), Manual for the Identification of Medical Bacteria, Cambridge University Press. London. Drews, G. (1983), Mikrobiologisches Praktikum für Naturwissenschaftler, 4. Aufl., Springer Verlag, Berlin. Heidelberg, New York. Esser, K. (1976), Kryptogamen, Praktikum und Lehrbuch. Springer Verlag, Berlin Heidelberg, New York. Gerhardt, P. (Herausgeb. ) (1981). Manual of Methods for General Microbiology, Amer. Soc. for Microbiol., Washington, D. C. Gibbs, B. M., Shapton, D. A. (Herausgeb. ) (1968), Identification Methods for Microbiologists. Teil B.. Academic Press, New York, London. Gibbs, B. M., Skinner, F. A. (Herausgeb. ) (1966), Identification Methods for Microbiologists, Teil A., Academic Press, New York, London. Hartman, P. A. (1968). Miniaturized Microbiological Methods. Academic Press, New York, London. Meynell, G. G., Meynell, E. (1970), Theory and Practice in Experimental Bacteriology, Cambridge University Press, London. Norris, J. R.. Ribbons, D. W. (Herausgeb. ) (1979ff). Methods in Microbiology, Academic Press, New York, London. Primrose. S. B.. Wardlaw, A. C. (Herausgeb. ) (1982), Sourcebook of Experiments for the Teaching of Microbiology, Academic Press, New York, London. Sambrock, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor, New York. Süßmuth, R., Eberspächer, J., Haag, R., Springer, W. (1987), Biochemisch-mikrobiologisches Praktikum, Georg Thieme Verlag, Stuttgart. Wallhäuser, K. M. (1984), Sterlisiation, Desinfektion. Konservierung, Keimidentifizierung, Betriebshygiene, 3. Aufl., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York.

671

Winkler, U., Rüger, W., Wackernagel, W. (1976), Bacterial, Phage and Molecular Genetics, Springer Verlag, Heidelberg.

Periodyki Advances in Applied Microbiology Advances in Microbial Ecology Advances in Microbial Physiology Annual Review of Biochemistry Annual Review of Microbiology Critical Reviews in Biochemistry Critical Reviews in Microbiology Current Topics in Cellular Regulation Developments in Industrial Microbiology Ergebnisse der Biologie Fortschritte der Botanik Progress in Industrial Microbiology Symposia of the Society for General Microbiology

Czasopisma* Angewandte Chemie Annales de L'Institut Pasteur Antonie van Leeuwenhoek, Journal of Microbiology and Serology Applied Microbiology Archives of Microbiology

* Czasopisma wydawane w Polsce: Acta Biochimica Polonica, Acta Microbiologica Polonica, Acta Mycologica.

Biotechnology and Bioengineering Canadian Journal of Microbiology Current Microbiology European Journal of Applied Microbiology FEMS Microbiology Ecology FEMS Microbiology Letters FEMS Microbiology Reviews Folia microbiologia International Journal of Systematic Bacteriology Journal of Applied Bacteriology Journal of Bacteriology Journal of General and Applied Microbiology Journal of General Microbiology Journal of General Virology Journal of Molecular Biology Journal of Virology Microbiological Reviews Mikrobiologija Molecular and General Genetics Mycologia Trends in Biochemistry Trends in Microbiology Virology Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie Zentralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde L, II. i III. Dział

Czasopisma dla początkujących Biologie in unserer Zeit Chemie in unserer Zeit Forum Mikrobiologie Scientific American Spektrum der Wissenschaft

SŁOWNICZEK ang. = angielski, fr. = francuski, gr. = grecki, łac. = łacina

aboriri (abortus) łac. — zginąć (przedwczesny poród) abortivus łac. — (rozwój) poronny accipere łac. — przyjąć acetum łac. — ocet acidus łac. — kwaśny adustus łac. — zbrązowiony aer, aeros gr. — powietrze aerugo łac. — grynszpan aes, aeris łac. — ruda, spiż aggregare łac. — zwiększać, gromadzić agilis łac. — ruchliwy, szybki aktis, aktinos łac. — promień allos gr. — różny amber ang. — bursztyn ambo łac. — obaj amphi gr. — otoczenie ampulla łac. — buteleczka amylon gr. — skrobia anabaino gr. — wspinać się anapleroo gr. — uzupełnić angeion gr. — naczynie annulare łac. — odwołać, anulować anthos gr. — kwiat anthrax gr. — węgiel, wąglik

anti gr. — anty apex, apicis łac. — czubek aphanizo gr. — ukryć, zniknąć applanatus łac. — spłaszczony aqua łac. — woda archaios gr. — początkowo armilla łac. — naramiennik arthron gr. — kończyna askos gr. — rura aspergillum łac. — kropidło aspergere łac. — rozpylać aster gr. — gwiazda attenuare łac. — osłabić attrahere łac. — przyciągać aureus łac. — złoty autos gr. — własny auxano gr. — mnożyć axon gr. — oś Β bacillum łac. — pałeczka baeo gr. — karzeł bacterion gr. — pałeczka balio gr. — rzucać bdallo gr. — doić, ssać bdella gr. — pijawka

673

bifidus łac. — podzielony na dwa bini łac. — dwaj, para bioo gr. — żyć bios gr. — życie bis łac. — dwukrotnie blepharon gr. — powieka, rzęsa bolos gr. — rzut bos, bovis łac. — bydło botulus łac. — kiełbasa, jelito bradys gr. — powolny brevis łac. — krótki C caedere łac. — zabić, obciąć cancer łac. — rak capsa łac. — pudełko, kapsułka carbo łac. — węgiel caseus łac. — ser caulis łac. — pień, gałązka cereus łac. — woskowy cerevisia łac. — piwo, drożdże chaite gr. — włosy cheo gr. — lac chimera gr. — smok, potwór chimaira gr. — koza chiton gr. — szata chlamys gr. — płaszcz, suknia chloros gr. — jasno zielone, zbielałe choane gr. — lejek chondros gr. — grudka, chrząstka chroma gr. — barwa chronos gr. — czas chrysos gr. — złoty chthon, chthonos gr. — ziemia, gleba chytra gr. — naczynie cilium gr. — powieka, rzęsa cinereus łac. — popielaty cinnabaris łac. — czerwony circinare łac. — zaokrąglić circulare łac. — otoczyć cisterna łac. — pojemnik clatratus łac. — okratowany, odrutowany clavis łac. — klucz coccum łac. —jagoda, ziarno

674

coelum łac. — niebo colere łac. — hodować, zamieszkiwać columella — kolumienka communis łac. — zwyczajny, pospolity competere łac. — współzawodniczyć complere łac. — uzupełnić confluere łac. — płynąć razem coniungere łac. — wiązać conservere łac. — zachować consortium łac. — wspólnota, spółka contaminare łac. — zakazić convergare łac. — skłaniać się (do) cornutus łac. — rogaty corrodere łac. — pogryźć, zjeść cortex łac. — skóra, osłona crassus łac. — gruby, gęsty cremor łac. — śluz cribrum łac. — sito crista łac. — grzebień D daktylos gr. — palec deiknymi gr. — pokazać delere łac. — zniszczyć deletio łac. — zniszczenie dendron gr. — drzewo derma gr. — skóra deuteros gr. — drugi dexter łac. — prawy, prawa ręka diagnosis gr. — diagnoza dicha gr. — podzielić na dwa diktyon gr. — sieć diplous gr. — podwójny dis gr. — dwukrotnie diskos gr. — krążek dispergere łac. — rozdzielić, rozproszyć dissolvens łac. — rozpuszczalny dissolvere łac. — rozpuścić divaricare łac. — rozprzestrzenić durare łac. — utwardzić dysenteria gr. — biegunka Ε edaphos gr. — gleba eikosi gr. — dwadzieścia

ekleipo gr. — uwalniać, wypuścić ektos gr. — na zewnątrz endon gr. — wewnątrz enteron gr. — wnętrzności, jelita epi gr. — na eremos gr. — pusty, nagi ergon gr. — praca, czyn erythros gr. — czerwony eu gr. — dobry excidere lac. — odciąć extra lac. — zewnętrzny, dodatkowy F facere łac. — robić facultas łac. — możliwość faex, faecis łac. — osad, drożdże fasciare łac. — owijać fermentum łac. — drożdże, zaczyn ferrugineus lac. — rdzawy ferrum łac. — żelazo fertilis łac. — płodny fervere łac. — gotować, wrzeć fervidus łac. — wrzący, ognisty figere łac. — zacisnąć filum łac. — nić, tkanka fimbria łac. — nić, frędzel fimum łac. — nawóz flectere lac. — zgiąć flos, floris łac. — kwiat fluctuare łac. — wahać się fluor łac. — rzeka, strumień fuligo lac. — sadza fulvus łac. — czerwonożółty fungus łac. — grzyb fusus łac. — nić, wrzeciono G galla łac. — żółć gamos gr. — ślub, małżeństwo ganos gr — błysk gaster gr. — żołądek generatio łac. — rodzenie genesis gr. — pochodzenie, powstawanie gignere łac. — rodzić, tworzyć

gignomai, gignesthai, gegona stać się genus łac. — rodzaj globare łac. — zaokrąglać globus łac. — bryła, kula gloios gr — klej glykys gr. — słodki gonos gr. — potomstwo, odrośl gossypium łac. — bawełna grandis łac. — wielki grapho gr. — pisać gratis łac. — wolny, bezpłatny gratuitus łac. — darmowy, gratis griseus łac. — szary gyne, gynaikos gr. — kobieta gyros gr. — pierścień, koło

gr.

Η habitare łac. — mieszkać haima gr. — krew helix gr. — spiralny, kręty helveticus łac. — szwajcarski helvus łac. — miodowożółty hepta gr. — siedem herpeton gr. — zwierzę pełzające heteros gr. — inny, przeciwny heurisko gr. — znaleźć hexadeka gr. — szesnaście hirsutus łac — kolczasty, najeżony holos gr. — cały homoioa gr. — podobny hormao, horman gr. — wyruszyć, zacząć hyalos gr. — szkło hybrida łac. — hybryda, mieszaniec hydor gr. — woda hymen gr. — cienka skóra hyper gr. — nadmierny hyphos gr. — tkanka hypo gr. — mniej, podhypothesis gr. — hipoteza I ictus łac. — uderzenie immunis łac. — wolny

675

imperfectus łac. — niedoskonały inducere łac. — powodować infestare łac. — niepokoić inficere łac. — barwić, truć inhalare łac. — wdychać inserere łac. — wstawić insertio łac. — wstawka integratio łac. — odnowa intra łac. — wewnątrz isos gr. — ten sam Κ kampylos gr. — zakrzywiony karpos gr. — owoc karyon gr. — orzech, jądro kata gr. — niższy, prowadzący na dół kephale gr. — głowa kineo gr. — ruszać się klados gr. — gałąź kleio gr. — zamykać klino gr. — schylać się, skłaniać się koinos gr. — razem koleon gr. — granica kollybos gr. — drobny pieniążek konis gr. — pył kopros gr. — gnój kormos gr. — pień koryne gr. — maczuga, kij krypto gr. — chować kyanos gr. — niebieski kybos gr. — kości (do gry) kyklos gr. — koło kyon gr. — pies kystis gr. — pęcherz kytos gr. — komora, jaskinia L labor, labi łac. — ślizgać się, opadać laevus łac. — lewy lampros gr. — jasny, czysty latere łac. — być ukrytym latus, lateris łac. — bok latus łac. — szeroki

676

legnon gr. — brzeg, skraj leichen gr. — mech, porost leptos gr. — drobny, cienki letalis łac. — śmiertelny leukos gr. — biały lignum łac. — drewno limicola łac. — mieszkaniec osadu limus lac. — błoto, osad linere łac. — zmazać, pokryć lipos gr. — tłuszcz lithos gr. — kamień lobos gr. — strzęp, płat logos gr. — słowo, nauka lophos gr. — wzgórze luna łac. — księżyc lux łac. — światło lyo gr. — rozluźnić, rozpuścić Μ macerare łac. — zmiękczyć marcescere łac. — gnić megas gr. — wielki, szeroki meion gr. — mniej mel, melis łac. — miód melas gr. — czarny meninx gr. — błona mensa łac. — stół merismos gr. — podział meros gr. — część mesos gr. — środkowy meta gr. — zmienny (przedrostek) mikros gr. — mały mitos gr. — nić mixis gr. — mieszanina mobilis łac. — ruchliwy monile łac. — naszyjnik (kołnierz) monos gr. — pojedynczy morphe gr. — kształt mucor gr. — pleśń murus łac. — ściana mutare łac. — zmienić mutatio łac. — zmiana mutuus łac. — wzajemny mykes gr. — grzyb

myon gr. — mięsień myxa gr. — śluz Ν nanus łac. — karzeł natare łac. — pływać necare łac. — zabijać nectere łac. — zawiązać nema gr. — nić neura gr. — ścięgno nidulans łac. — budujący małe gniazda nidus łac. — gniazdo niger łac. — czarny nomos gr. — prawo notare łac. — zaznaczyć novellus łac. — nowy novus łac. — nowy nucleus łac. — ziarno, jądro

O ochros gr. — blady, żółty oculus łac. — oko oikos gr. — dom, gospodarstwo okto gr. — osiem oligos gr. — mało oma gr. — guz, obrzęk omnis łac. — wszyscy, każdy onkos gr. — napęcznienie oon gr. — jajko operari łac. — pracować, zajmować się opsis gr. — wzrok organon gr. — narzędzie oryza łac. — ryż oscillum łac. — huśtawka osmos gr. — pchnięcie, napęd ouron gr. — mocz Ρ pagus łac. — miejsce, obszar pallidus łac. — blady paluster łac. — bagienny panus łac. — guz, obrzęk

par łac. — taki sam, podobny parare łac. — przygotować parasitos gr. — pasożyt partiri łac. — dzielić pathos gr. — cierpienie patior, pati łac. — znosić pecten łac. — grzebień pelos gr. — błoto pente gr. — pięć perficere łac. — kończyć, zakończyć peri gr. — około permeare łac. — przechodzić, przenikać perone gr. — igła petra gr. łac. — skała phago gr. — jeść phaino gr. — pokazywać phaios gr. — szary, brunatny phero gr. — nieść philos gr. — przyjaciel phleos gr. — trzcina phobeo gr. — straszyć, być przerażającym phormos gr. — koszyk phos, photos gr. — światło phthora gr. — zniszczenie phykos gr. — wodorosty phyllon gr. — liść physis gr. — przyroda, wzrost phyton gr. — roślina pikros gr. — ostry, gorzki pilum łac. — włócznia pilus łac. — włos pino gr. — pić pix, picis łac. — smoła planes łac. — wędrować planus łac. — płaski plaque fr. — tarcza plasma gr. — twór platto gr. — tworzyć, wyrabiać pleko (plectos) gr. — pleść (spleciony) pleura gr. — strona, bok plico, plicare łac. — fałdować pneuma gr. — oddech poieo gr. — robić, wyrabiać pollen łac. — mąka polos gr. — oś

677

polys gr. — dużo potens lac. — mocny pous, podos gr. — stopa prodigiosus łac. — cudowny, nienaturalny promovere łac. — powiększyć, przyspieszyć pros gr. — dodatkowo (przedrostek) prostheka gr. — wisiorek, dodatek proteus gr. — bóg grecki (zmiennokształtny) protos gr. — pierwszy pseudo gr. — łudzić, zwodzić, mylić psittakos gr. — papuga psychros gr. — zimny purpureus łac. — purpurowy putidus łac. — zgniły, zwiędły pyon gr. — ropa pyr, pyros gr. — ogień pyren gr. — ziarno Q quasi łac. — jakoby quintus łac. — piąty R racemus łac. — jagoda, winogrono radius łac. — promień radix łac. — korzeń ramiger łac. — rozgałęziony ramus łac. — gałąź re- łac. — z powrotem, znowu reciprocus łac. — odwracalny reduplicatio łac. — podwojenie, powtórzenie repellere łac. — odepchnąć replicatio łac. — powtórzenie reprimere łac. — zatrzymać resistere łac. — stawić opór restringere (restrictus) łac. — ograniczyć (-ony) reticulum łac. — mała sieć retro łac. — z powrotem revertere łac. — wracać rhage gr. — rozdarcie, szczelina rhiza gr. — korzeń rhodon gr. — róża

678

rivus łac. — strumień ruber, rubrum łac. — czerwony rufus łac. — czerwony rugosus łac. — sfałdowany rumen łac. — żwacz ruminare łac. — przeżuwać S sacculus łac. — woreczek saeptum łac. — ogrodzenie, zagroda sal łac. — sól saliva łac. — ślina salivarius łac. — śliski sapros gr. — zepsuty, zgniły Sarcina łac. — pakiet sarcos gr. — mięso schizo gr. — przeciąć to screen ang. — przesiewać secale łac. — zboże (żyto) segregatio łac. — oddzielenie segregare łac. — oddzielić selene gr. — księżyc semi łac. — pół sensus łac. — zmysł sentire łac. — czuć, odczuwać sepo gr. — ulegać zepsuciu sexus łac. — płeć sideros gr. — żelazo situs łac. — położenie skleros gr. — twardy, sztywny skopeo gr. — oglądać skotos gr. — ciemność socius łac. — towarzysz solidus łac. — lity solitus łac. — zwykły solvere (solutus) łac. — rozpuścić, (-ony) soma gr. — ciało sordes łac. — brud soros gr. — zbiornik, kupa (mnóstwo) species łac. — gatunek speira gr. — obrót sphaira gr. — kula spira łac. — skręt, zakręt sporos gr. — siew

staphyle gr. — grono stare lac. — stać stear lac. — łój stele gr. — kolumna stereos gr. — bryłowaty, przestrzenny sterigma gr. — poparcie sterilis łac. — bezpłodny stolo łac. — pęd z korzenia stratum lac. — warstwa strepho gr. — obracać stringere łac. — ściągnąć stroma gr. — podpora, oparcie stylos gr. — kolumna, podpora styptikos gr. — kończący, zamykający submergere łac. — zanurzyć substerno, (substratus) łac. — stanowić oparcie subtilis łac. — cienki sucinum łac. — bursztyn sucus łac. — sok supplere łac. — dopełnić, uzupełnić suppressor łac. — supresor supprimere łac. — zatrzymać suspendere łac. — powiesić symbiosis gr. — współżycie syn gr. — razem synecho, synechein gr. — trzymać razem

Τ tachys gr. — szybki taxis gr. — porządek, ułożenie teichos gr. — ściana telos gr. — koniec temperare łac. — miarkować tenax łac. — uporczywy, silny tenuis łac. — delikatny terminator łac. — kończący tettares gr. — cztery thallos gr. — zielona gałązka theion gr. — siarka theke gr. — pudełko therion gr. — zwierzę thermos gr. — ciepły thrix, thrichos gr. — włos

thuringiensis łac. — turyński thylakos gr. — worek tithemi gr. — (w)sadzać, stawiać, kłaść tolerare łac. — znosić tolype gr. — motek, zwój tomaculum łac. — kiełbasa tome gr. — cięcie tonos gr. — napięcie toxikon gr. — trucizna transire łac. — przejść na drugą stronę transfererre (translatus) łac. — przenosić transitio łac. — przejście transponere łac. — przeskoczyć treis, tria gr. — trzy tremere łac. — drżeć trepo gr. — obracać trope gr. — zmiana trophe gr. — żywienie tropos gr. — kierunek, zwrot tuber łac. — guz, obrzęk tubulus łac. — rurka tumor łac. — obrzęk, guz turbare łac. — mieszać, mącić typhos gr. — gorączka typos gr. — odcisk, forma U ubique łac. — wszędzie ultra łac. — ponad undula łac. — mała fala uredo łac. — pleśń, śnieć uro (ustus) łac. — (s)palić (-ony) utilis łac. — użyteczny uva łac. — winogrono V valere łac. — mieć wartość (znaczenie) variare łac. — zmieniać varius łac. — różny, zmienny ventriculus łac. — brzuszek venus łac. — piękność, powab versi-color łac. — wielobarwny versus łac. — zmieniony

679

vertere łac. — obracać vesicula łac. — banieczka, pęcherz vinosus łac. — winny (winowy) viridescere łac. — zazielenić się viridis łac. — zielony virulentus łac. — trujący virus łac. — kleista ciecz, trucizna viscidus łac. — lepki vitis łac. — winorośl vitreus łac. — szklany vitrum łac. — szkło vivus łac. — żywy

volumen łac. — zwój, krąg voluto, volutare łac. — obracać, toczyć voro, vorare łac. — pożerać X xylon gr. — drewno Z zoon gr. — istota żywa zygos gr. — jarzmo, zaprzęg w parze zyme gr. — drożdże, zaczyn

INDEKS Opracowała Jadwiga Baj

Gwiazdką zaznaczono numery stron, na których hasła znajdują się na rysunku, w podpisie lub w tabeli. Numery stron, na których znajduje się główny opis, są pogrubione. A p. adenina abekwoza 82 Absidia coerula 516 acetoacetylo-CoA 284* Acetobacter 34*, 230*, 241, 409 - aceti 316, 407 subsp, xylinum 72, 85 - pasteurianus 96, 407 Acetobacterium woodii 381*, 402, 454* acetofosforan 284*, 344 acetoina 352, 359-363, 367*, 379*, 419, 621 aceton 334 -, w barwieniu 72 -, produkcja 31 -, produkt fermentacji 334, 366, 369, 370*, 379* acetylacja enzymów 620 acetylaza-CoA 296 acetylen 494 acetoacetylo-CoA 369, 379* acetylo-CoA (acetylokoenzym A) 276, 293, 294, 314, 315*, 318, 324, 334-336, 344, 361, 369, 373*, 453, 539, 620, 624*, 625 -, reduktywna karboksylacja 402 acetylofosforan 334-336, 344, 348, 449*

acetylofosforan kwasu masłowego 334 N-acetyloglukozoamina 72, 74, 76, 80*, 82, 350, 516 2-acetylohydroksymaślan 607 2-acetylomleczan 362, 363, 607, 621, 622 N-acetylomuramidaza 76 acetylotransferaza dihydrolipoamidowa 294 - fosforanowa 335, 362, 369, 377 - mrówczanowa 335 Acholeplasma 122, 161 Achromatium 43, 100, 150 - oxaliferum 100*, 443 Acidaminococcus 120 Acidianus 232* - ambivalens 395 - brierleyi 395 acidofil 230* Acinetobacter 118*, 120, 124 - calcoaceticus 124, 526, 527*, 604 Acrasiomycetes (akrazjowce) 204, 206, 207 Actinomyces 121 Actinoplanes 121, 131*, 133 acylaza 419 - penicylanowa 424 acylo-AMP 284*, 285

681

adaptacja 250, 543, 599 - fenotypowa 542 adenina (A) 47-50, 56, 60, 323 -, metylacja 586 S-adenozylometionina 361 adenylacja antybiotyków 583 - enzymów 620 adenylany, rola w regulacji 628 adenowirus 173, 175*, 178* adenozyna 283 ADP 310*, 311, 620, 621, 624*, 628 adhezyna 581 -, pozytywny efektor 625 -, wzór 283 ADP-glukoza 627 adsorpcja faga 182, 184, 188 aeroby p. tlenowce aerobaktyna 584 Aeromonas 121 - hydrophila 363 aerotaksja 93, 94 aflatoksyna 270, 428 -, wzór 429 agar 35, 229 - kredowy 402 - miękki 242 - odżywczy 135*, 245, 345, 515*, 557*, 631 - skład 515 -, rozkład 515 - z bizmutem 239 Agaricaceae 204 agaropektyna 515 agaroza 515 Agave americana 343 agmatyna 537 Agrobacterium 118, 121, 138 - tumefaciens 138, 192, 193, 584 AIDS (ang. acquired immune deficiency Syndrome) 199 akceptor wodoru (elektronów) 28, 142, 282, 333 - wewnętrzny 314 - zewnętrzny 314 akineta 168 akonitaza 261, 295, 414 ds-akonitynian 296 akrazjowce p. Acrasiomycetes

682

akrazyna 207 aktyna 663 aktynomikoza 130 aktynomycyna D 263, 427 aktywator 618, 619 - plazminogenu tkankowo specyficzny 596 aktywność wodna 231, 232 alanina 321*, 322*, 367* - D 73, 77-79, 159 - L 73 Alcaligenes 118*, 121, 138, 230*, 232*, 515 - eutrophus 90*, 138, 292*, 299, 434, 435, 440*, 448, 449, 604 - latus 494, 495* - faecalis var. myxogenes 431 * aldehyd p-dimetylobenzoesowy 359 - 3-fosfoglicerynowy 286-291, 323, 335, 341, 344, 347-350, 452, 453, 369, 628 -, wzór 286 - glikolowy 408, 452 - octowy 282, 294, 337-339, 343, 344 aldolaza 347, 348, 350, 452 - fruktozobisfosforanowa 287, 288*, 452 - 2-keto-3-deoksyfosfoglukonianowa 291, 292*, 555 - triozofosforanowa 347, 348 aldozofosforan 284*, 452 alginian 431 alkalifile 230* alkaloid 221, 428 alkan(y) 585 - długołańcuchowe p. węglowodory długołańcuchowe alkilacja 557 - puryn 548* alkohol 333 - amylowy (pentanal) 343 - benzylowy 438, 533 - drugorzędowy 408 - etylowy, działanie bakteriobójcze 260 , w barwieniu 72 - izoamylowy 343 - koniferylowy 517, 518 - kumarylowy 518 - pierwszorzędowy 407 -, produkcja 31 - przemysłowy 342

alkohol sinapylowy 518 alkoholocukry 409 alergia 426 alginian 430, 431* allofikocyjanina 166 allolaktoza (α-D-galaktozylo-β-1, 6-D-glukoza) 612 Allomyces 411 Alnus 493 Alternaria 204 Alteromonas putrefaciens 381* -, szczep GS-15 405 Alysiella 150 - filiformis 151* Amanita muscaria 428 - pantherina 428 - phalloides 428 amanitatoksyna 428 ameba 41, 206*-208, 649 Ames 560 amfibolizm 274 amid kwasu nikotynowego 282 amina Pierwszorzędowa 537 aminacja 320 - reduktywna 2-ketokwasów 320, 321* aminoacylo-AMP 285 aminoacylo-tRNA 61* 4-aminobenzoesan 624 aminocukier 83 aminokwas(y) 57, 274, 285, 345, 650 - aromatyczne 322*, 378, 453, 624 -, biosynteza 320-323, 453, 601, 606, 622, 623* -, czynniki wzrostowe 227 -, deaminacja 536* -, dekarboksylacja 537 - diaminowy 73, 281 -, forma D 79 -, produkcja 32, 416-417 -, rodzina asparaginianu 622, 623* - rozkład 368, 378 -, siarkowe 30 -, skróty nazw 62* -, transaminacja 537, 538 -, źródło azotu 227 2-aminopuryna (AP) 548, 549 Amoebobacter 101, 122, 459*, 460, 643

Amoebobacter roseus 83* amon 27, 385 amoniak 28, 135, 320, 367, 374, 488, 507 amonifikacja 536 - azotanów 382, 385-386 AMP 285, 316, 620, 621, 624, 628 -, pozytywny efektor 625, 626 -, wzór 283 cAMP (cykliczny adenozyno-3', 5'-monofosforan) 207, 611-613 ampicylina 556 -, oporność 581, 594 -, wzór 425 Ampulariella 133 amylaza 342, 432, 510 - α 510-512 - β 511 —, produkcja 32 amylo-l, 6-glukozydaza 510 amylopektyna 96, 509-511* amyloza 96, 509-511* -, reakcja z jodem 96 amytal 306 Anabaena 123, 164, 165, - azollae 165, 493, 494 - cylindrica 471 anabolizm 275, 622 anaeroby p. beztlenowce anaerobioza 641* anafaza 38* analiza genetyczna 574 - rentgenowska 48 - restrykcyjna p. DNA, analiza restrykcyjna analog strukturalny (p. też antymetabolit) 261, 262, 630 substratu 629 - - zasad 548, 549, 591 Ancalochloris 643 Ancalomicrobium 122, 156*, 157 3, 6-anhydrogalaktoza 515 antena 462 - zbiorcza 457 anterydium (plemnia) 203, 215 Anthoceros punctatus 494 antigenic shift 199 antocyjan 108 antracen 522, 532*

683

antranilan 532*, 604 Archaea p. archeony antybiotyk(i) 23, 112, 129, 272, 328, Archangium 153*, 503*, 504 419-428, 500, 551 Archaeoglobus 388 -, efekt bakteriobójczy 420 archeony 22*, 24, 116, 117*, 121, 141-144, -, - bakteriostatyczny 420 230, 232, 287, 442, 494, 662 - β-laktamowe 425 -, budowa osłon 396 -, mechanizm działania 59, 65, 263, 583 - metanogenne p. metanogeny - makrolidowe 427 - redukujące siarkę 395 -, metoda seryjnych rozcieńczeń 424 - termofilne 143 - polipeptydowe 135, 260, 427 Arenicola marina 404 -, produkcja 31, 32, 419 arginina 193, 261, 262, 322* -, promieniowce 130 -, synteza 605 -, skrining 422, 423* Armillaria mellea 363, 519 -, test płytkowo-dyfuzyjny (dyfuzyjny na arsen 583 płytkach) 422, 424* arsenian 261 -, ważne w lecznictwie 424—428 Arthrobacter 96, 120, 125, 127, 128, 628 -, zakres działania 422 - atrocyaneus 111 antygen Η 92 - globiformis 108 - O 81, 92 - polychromogenes 111 somatyczny 82 - pyridinolis 127* - powierzchniowy 114 artrokonidia (oidia) 203*, 216 -, produkcja 32 arylokarotenoid 469 - Τ 195 Ascaris lumbricoides 404 - wirusa 179 Ascomycetes (workowce) 204* antykodon 63, 545 -, cykl rozwojowy 214, 215 aseptyka 264 antymetabolit (p. też analog strukturalny) 261, 262, 548, 554, 630, 631* asfalt, degradacja 532 antymon 444, 583 askogon (lęgnia) 214, 215 antymycyna A 261, 306 askospora 214-216, 218, 220, 221, 267 antyport 328, 583 asparagina 322* antyseptyka 264 asparaginian 322*, 537, 606, 626* aparat fotosyntetyczny 168, 457, 466, 469 asparaginylofosforan 623 - Golgiego 40 aspartaza 538 apatyt 29 Aspergillales 420 Aphanizomenon flos-aquae 101 Aspergillus 202, 204, 218, 219, 412, 413, apoproteina 301 432, 516 aporepresor 609, 612 - 614 - flavus 270, 428 apotecjum 204, 215, 216*, 221 - fumigatus 503*, 504 APS (adenozyno-5'-fosfosiarczan) 389 glaucus 232 Aąuaspirillum 118*, 138 - itaconicus 414 - autotrophicum 448* - nidulans 503*, 504 - itersonii 144 - niger 31, 55, 205, 412, 413, 512, 513 - serpens 88, 144 - oryzae 428, 432*, 512 arabinogalaktan 27, 129 - parasitus 428 arabino-3-heksulozo-6-fosforan 524 - terreus 414 arabinoza 129, 508, 509, 613 - wentii 512 -, wzór 508 Asticcacaulis 122, 157

684

asymilacja azotanu 320, 321* - azotu cząsteczkowego p. wiązanie azotu - azotynu 320 - dwutlenku węgla p. wiązanie dwutlenku węgla Athiorhodaceae 457, 475 atmosfera 24*, 26 - prymitywna Ziemi 658 ATP 63, 158, 159, 275, 276, 281, 283-385, 288, 289, 291, 292, 298, 310*, 311, 316, 321, 322*, 371, 580, 613, 620, 624 -, aktywacja siarczanu 389 -, regeneracja 142, 167, 285, 309-311, 328, 332-335, 339-341, 349, 375, 390, 403, 404, 448, 486, 487, 660 -, -, bakterie acetogenne 402 -, -, -, metanogenne 399, 400 -, test ilościowy 365 -, wzór 283 ATPaza 297, 325, 583 atraktant 93 auksotrof 227, 553, 556 auksotrofla 321 auksotrofizm 552 auksyna 193 Aureobasidium 431 - pullulans 512, 514 aureomycyna 130, 427 autoklaw 265 autoklawowanie 270 autoliza 252 autolizat drożdżowy 229 autoradiografia 46 autoradiografii 46, 591 - chromosomu E. coli 47* autoregulacja p. regulacja autogenna autotrof 19, 237, 436, 447, 659 - bezwzględny (obligatoryjny) 143, 446, 449 - względny (fakultatywny) 138, 143, 449 autotrofia 337, 660, 661 - obligatoryjna 445, 446 autotrofizm 236 Avery 566 azochinon 108, 111 Azolla 165, 493, 494 Azomonas agilis 495 Azorhizobium caulinodans 489, 491*, 492

Azospirillum 118*, 122 - lipoferum 495, 648 azot 506 - ciekły 107 - cząsteczkowy 227 -, denitryfikacja p. denitryfikacja -, oznaczanie zawartości 246 -, wiązanie p. wiązanie azotu azotan 82, 654 -, redukcja asymilacyjna 28*, 386, 442 -, - dysymilacyjna 380, 382, 385, 386, 643 Azotobacter 34*, 138, 239, 241, 301, 430, 494 - chroococcum 55, 83*, 108, 495*, 513 -paspali 495*, 648 - vinelandii 431, 495, 496 azotyn 28, 312, 328-385, 549, 654 - akumulacja w wodzie i żywności 386, 387 - redukcja asymilacyjna 382 azydek 239, 575* Bacillaceae 88, 366, 368 Bacillus 31, 45, 102, 121, 134, 135, 138, 230*, 232, 432, 448*, 515, 516 - anthracis 84, 134, 135 - cellulose-dissolvens 505 - cereus 105, 106*, 134, 135, 265, 513 var. mycoides 536 - circulans 34*, 107, 134 - coagulans 34, 107 -, koniugacja 581 - laterosporus 100 - licheniformis 107, 134, 135, 382, 384, 512 - macerans 134, 511, 512, 514 - medusa 100 - megaterium 34*, 98*, 134, 135, 156* , bakteriofagi 188 , lizozym 76 , otoczki 85 , ruch 91 , spory 46*, 106 - pasteurii 134, 538 - plazmidy 581, 584 - polymyxa (asterosporus) 96, 134, 135, 241*, 363, 494, 495*, 512, 514 - stearothermophilus 34*, 134, 135, 232, 265, 512

685

Bacillus subtilis 34*, 134, 135, 187, 265, 292*, 363, 512, 513, 576, 615 , otoczki 84 , proteazy 432* - -, spory 72, 106, 107 - thuringiensis 100, 134, 584 -, transdukcja 568, 569 -, transformacja 567 Bacteria 22*, 116, 117*, 662 -, podział na grupy 118 Bacteriogloea 85 Bacteroides 117*, 121, 140, 357, 404 - fragilis 140 - ruminicola 365 - succinogenes 140, 503*, 653 bacytracyna 79, 260, 427 bakterie acetogenne 314, 378, 381*, 402, 446, 454, 660 - aerotolerancyjne 313 - allochtoniczne 652 - autotroficzne (p. też autotrofy) 39, 101, 494, 660 - beztlenowe (p. też beztlenowce) 94, 121, 295, 313, 316, 643 - celulolityczne 506, 507, 636 - chemolitotroficzne (p. też chemolitotrofy) 118, 121, 138, 454*, 639, 640* , beztlenowe 446 , hodowla wzbogacająca 240* - chemoorganotroficzne 403 - denitryfikacyjne 314, 382-384, 446, 599 - fototroficzne anoksygenowe (beztlenowe) 29*, 65, 67, 69*, 91, 101, 97, 118, 150, 162, 163, 294, 454* , hodowle wzbogacające 474, 475 , materiały zapasowe 473 , wiązanie azotu 472 , występowanie 473, 474 oksygenowe (tlenowe) p. sinice - glebowe 124, 157, 226*, 359, 416, 435, 489, 494, 636, 650 , czas generacji 251 - gramdodatnie 77, 102, 117*, 301, 344, 463, 466 - gramujemne 77, 118, 121, 129, 144, 146, 163, 165, 192, 301, 426, 437, 441, 463

686

, koniugacja 581 , osłony 79-82 - - rzęski 92* - halofilne (halobakterie) 141, 143, 232, 271, 487, 639 - heterotroficzne 118 - hipertermofilne 395 - jelitowe 330, 345, 359, 363, 403, 417, 599, 652 - - typu coli 345, 359, 653 - kopalne 662 - „krwawiącej hostii" 111 - kwasooporne 129, 426 - lizogenne 187-189 - luminescencyjne 647 - maczugowate 45, 120 - metanowe 25, 525, 649 - metylotroficzne 439 - mezofilne 504 - mikroaerofilne 94 - mikroaerotolerancyjne 123, 144 - mlekowe (p. też Lactobacteriaceae) 31, 102, 123, 125, 128, 230, 241*, 302, 344, 359, 379*, 412, 432, 514, 652, 653 - - heterofermentatywne 344, 346, 348, 349 homofermentatywne 346, 411 , produkcja żywności 351-353 , wymagania pokarmowe 345 , występowanie 346 - morskie 233, 364 -, nomenklatura 114 - nitkowate 138, 170, 443, 465 - nitryfikacyjne 230, 237, 435, 436-440, 446, 454*, 636 - octowe 91, 407-409, 417 - „ochrowe" 139 - pasożytnicze 231 - patogenne 110, 119, 584, 652, 655 - pączkujące 122, 157 - pleomorficzne 127 - pochewkowe 121, 138-140 - prochloralne 170 - propionowe 128, 241*, 316, 352, 353, 379*, 651 - przetrwalnikujące, klasyfikacja 102 - purpurowe 70, 94, 100, 101, 110, 117*, 118, 149

bakterie purpurowe bezsiarkowe (p. też Rhodospirillaceae) 157, 162, 163, 237, 242*, 456, 457-62, 469, 471, 494 , metabolizm 470, 472 , błona fotosyntetyczna 479* , hodowla wzbogacająca 474, 475 siarkowe (p. też Chromatiaceae) 83, 162, 237, 242*, 457-461, 473, 494, 641*, 643 - redukujące azotan p. bakterie denitryfikacyjne siarczan (bakterie desulfurykacyjne, sulfidogenne) 118, 119, 136, 302, 314, 333, 336, 387, 446, 454, 639, 657 , izolacja 391 , taksonomia 388 , występowanie 392-394 siarkę 314 - rozkładające agar 515 chitynę 516 mocznik 230* - siarkowe (tiobakterie) 30, 150, 435, 441-444, 446, 449, 639, 649 - sukcynogenne 381* - sulfidogenne 387, 446 - śluzowe 118*, 122, 150, 153-155, 504 , zawartość GC 50 - świecące 363 -366, 651 - termofilne 232, 376, 441, 504 - termokwasolubne 141, 143, 144 - tlenowe 94, 97, 100, 121, 301, 313 - typu coli 345, 653 - typu coli-aerogenes 379 - utleniające butan 526 etan 526 metan p. bakterie metanowe wodór p. bakterie wodorowe tlenowe 447-50 - wiążące azot 83, 138, 488-496 - wodne 101, 144, 155, 157, 226*, 359, 435, 494, 636 - wodno-glebowe 90* - wodorowe 138, 240*, 435, 446, 447, 454* - zielone siarkowe 117*, 163, 458*, 462, 463 - żelazowe (żelaziste) 157, 233, 435, 444, 445, 446, 454*

- żwacza 506 bakteriochlorofil 71, 110, 456, 462, 466-469, 470, 474, 479 - a 457, 458, *, 465-468*, 474 - b 458, 467*, 468*, 474 - c 458*, 467*, 468*, 474 - d 458*, 463, 467*, 468* - e 458*, 463, 467-469 - g 466, 468* bakteriocyna 583, 584 bakteriofag(i) 146, 176, 181-192 -, endonukleazy restrykcyjne 586 - Escherichia coli 181 - fd 174*, 182 - fr 183 - ΦΧ174 174* , jako wektor 551 - λ 183* , cykl życiowy 189* - - lizogenia 190, 191, 195, 562 - łagodne 187-192 - Ml3 174, 594 -, morfologia 181-184 - Mu 547, 551, 552, 562, 565 - P22 182* - PM2 47* - Q17 184 - Qβ 184 - serii Τ 181, 184, 186, 187 - T1 182* - T2 174*, 182*, 183*, 185 - T3 182* - T4 174*, 182*, 185* - T5 182* - T6 174*, 182* - T7 182*, 183* - zjadliwe (wirulentne) 184-187, 192 -, lizozym 76 bakteriofeofityna 479 bakteriorodopsyna 487 bakteroid 442, 490, 491, 492 baktoprenol (undekaprenyl) 78*, 79 balistospora 223 banded iron formation (BIF) p. wstęgowa ruda żelaza barwienie metodą Grama 71, 72, 113, 119, 120

687

barwienie metodą Ziehl-Neelsena 129 - negatywne 83 barwnik(i) akrydynowy 549, 577 - anilinowy 129 - anten 469 - bakterii i grzybów (p. też pigmenty) 108-112 - fenazynowe 111 - fluoryzujące 111, 112 - fotosyntetyczne 40, 162 - kontrastowy 72 - lipofilowy 97 - pirazynowy 111 - zasadowy 71 Basidiomycetes (podstawczaki) 204, 214, 221-223 bazydiospora 221-223 bazydium (podstawka) 221, 222* Bdellovibrio 118*, 122 - bacteriovorus 144-146, 158, 654 Becquerel 107 Beggiatoa 29*, 100, 118*, 150, 151, 152, 443 - alba 443 - gigantea 100* Beijerinck M. W. 238, 541 Beijerinckia 138 - indica 495 benzen 522, 529, 532*, 533 benzoesan 528, 529, 532*, 533 beocyt 164, 169 beztlenowce (anaeroby) 95, 120, 124, 126, 136, 240*, 312, 333, 335, 599 -, metody hodowli 236 - ścisłe (obligatoryjne) 228, 232, 236, 387, 396, 402, 506, 652, 662 - względne (fakultatywne) 228, 333, 381* biała zgnilizna 519 białko(a) 21, 27, 275 -, biosynteza 61*, 63 , hamowanie 263 - błonowe, integralne 66*, 67 peryferyczne 66*, 306 - CAP (ang. catabolite activator protein) 612 - CPR (ang. cyclic AMP receptor protein) 612, 613 - drożdżowe 433 - fikobilinowe 167, 168, 170

-, helisa a 57 - HPr 328 - jaja 76, 331 - korynoidowe 378 - LexA 558, 559 -, oznaczanie metodą Lowry 246 -, Folina-Ciocalteu 246 - RecA 558, 561*, 562, 574 - regulatorowe 609, 610, 612 - represorowe 188, 559 - Rieskego 479 -, rozkład 367*, 368, 535 -, struktura β 57 -, - czwartorzędowa 57, 58, 60 -, - drugorzędowa 57, 60 -, - Pierwszorzędowa 57 -, - trzeciorzędowa 57, 60 - translokujące (przenośnikowe) 327 - transportowe 326, 327 - wiążące jednoniciowy DNA (ang. single strand binding, SSB) 54*, 561* żelazo 331 - z jednokomórkowców (ang. single cell protein) 433, 525 - żelazo-siarkowe 41, 67, 299, 300, 390, 479, 482*, 483, 496, 499 biblioteka genowa 592, 594 biegunka 358, 359, 582, 584 bifenyl 532* Bifidobacterium 121, 125, 302, 346, 357, 653 - bifidum 350 bilans Hardena i Younga 341 biliwerdyna 491 bioautografia 416, 632 biocenoza 634 biodegradacja 378 biogaz 401, 645* biogurt 352 biokonwersja 429 biologiczne zapotrzebowanie tlenu (BZT) 645 bioluminescencja 363-366 biopierwiastki 45 biopolimery degradowalne 534 biorca 571, 573 biosfera 227, 633, 635, 638 biotechnologia 252, 333, 406, 596

biotop morski 515 biotyna 226*, 279*, 324, 345, 355, 356, 417, 458*, 475 -, wzór 280* 1, 3-bisfosfoglicerynian 334, 347 bizmut 239 black smokers p. „dymiące kominy" Blakeslea 211 - trispora 429 Blasia pusilla 494 Blastobacter 122 Blastocladiales 204 Blastocladiella 411 blefaroplast 202 blotting 589 błękit bromotymolowy 360 - metylenowy 110, 236, 554* - Wiktorii 71 błona cytoplazmatyczna 36, 37*, 42*, 57, 64-71, 80*, 90, 92*, 217*, 298, 299, 308*, 309, 323, 452 archeonów 141 metanogenów 396 , model 66* , rozmieszczenie białek 310*, 311 , białka integralne 65 , - peryferyczne 65 - elementarna (unit membrane) 64 - fotosyntetyczna 70, 166* bakterii purpurowych 479 roślin zielonych 484* - jądrowa 38* - mitochondrialna 263, 298, 299, 308*, 309 , rozmieszczenie białek 310, 311 - lipidowa 37 sztuczna 66 - nitrocelulozowa 589 - perybakteroidalna 491 - purpurowa 487 - śluzowa 346 - wewnątrzkomórkowa 67-71, 457, 469 - zewnętrzna 79-82, 165 , funkcje 82 błonica (dyfteryt) 126, 655* błonnik p. celuloza boksyty 657 Boletaceae 204

Bordetella pertussis 655* borelioza 149, 655 Borrelia anserina 149 - burgdorferi 149, 655* - recurrentis 149 Bortels H. 496 Botrytis cinerea 503*, 504, 514 botulizm 376, 655 Boussingault 489 Bovista 223 Bradyrhizobium 489, 491* - japonicum 489, 498 Brefeld O. 35 Brevibacterium 120 - albidum 587* - divaricatum 416 - linens 128 brodawki 489-493, 585 - korzeniowe 356, 447, 489, 490, 649 , przekrój 490 , roślin niemotylkowych 493 - łodygowe 489, 492, 493 bromek etydyny 579, 588 bromina 138 5-bromouracyl (BU) 548, 549 browarnictwo 333, 342 Brucella 121 brunatna zgnilizna 519 Buchner P. 338, 651 Buder 476 bulion odżywczy 536, 557 buławinka czerwona p. Claviceps purpurea bursztynian 261, 262, 277, 295, 296*, 297, 307, 317, 333, 356, 360, 362, 379*, 446 - homoseryny 623 bursztynylo-CoA 296*, 297, 340, 531 2, 3-butanodiol 135, 334, 343, 360-363, 379* -, produkcja 31 butanol 333, 334, 366, 367*, 370, 371, 379* -, produkcja 31 butelka Sohngena 392 Butyrivibrio 122, 141, 146 - fibrisolvens 375, 503*, 507 butyrylo-CoA 369, 370* Byssochlamys nivea 267 BZT p. biologiczne zapotrzebowanie tlenu

689

Cp. cytozyna C(org. 24 Caims 46

Caldariella acidophila 442 Calothrix 123, 152*, 164, 165 Candida 99, 204, 218 - albicans 346, 651 - boidinii 525 - lipolytica 433, 526 - pulcherrima 109*, 110 - reukaitffii 110 - tropicalis 526 - utilis 282* Caryophanon 120 - latum 125 Casuarina equisetifolia 493 Caulobacter 88, 122, 156* - vibrioides 157 Ceanothus 493 cecha diagnostyczna 108 - fenotypowa 564 - taksonomiczna 50 cefalosporyna 79, 141, 263 - C425 - półsyntetyczne 425 celobioza 502, 503, 505 Cellulomonas 121, 127 503*, 504 Cellvibrio 504 -flavescens 503* celulaza 432*, 433, 504, 505, 512 celuloza 27, 72, 79, 124, 227, 332, 336, 517 -, produkty fermentacji 505 - rozkład 127, 130, 133, 155, 368, 375, 502-508, 647 -, - beztlenowy 504-507 -, - bakterie 504 -, - grzyby 504 -, - w żwaczu 505 -507 - - tlenowy 503-504 -, skład 502 celulosom 505 cenozygota (zygospora) 211, 213 centriola 42 centrum allosteryczne 617, 625 - katalityczne 617 Cephalosporium 425 cetylopalmitynian 527

690

Chaetomium 220, 504 - globosum 503* Chargaff 48 chelator 516 chemiczne zapotrzebowanie tlenu (ChZT) 645 chemiosmotyczna teoria konwersji energii 485 chemioterapia 262 - nowotworów 559 chemioterapeutyk 129, 262 chemoautotrofia 237, 398 chemoheteroorganotrof 201 chemoheterotrof 237 chemoklina 471, 641, 643 chemolitoautotrof 436, 444, 661 - bezwzględny (obligatoryjny) 441 - względny (fakultatywny) 441*, 447 chemolitoautotrofia 151, 402, 443 chemolitoheterotrofia 391 chemolitotrof 137, 237, 388 chemolitotrofia 436 chemoorganotrof 137, 237, 241*, 363 chemoreceptor 94 Chemostat 255-258, 606 chemotaksja 82, 93, 94, 457 chemotrof 237 chinon 41, 162, 295, 299, 301, 306, 484 Chitobiaza 516 chitobioza 516 chitotrioza 516 chitozan 516 Chityna 72, 73 - grzybów 209 -, rozkład 130, 516 chitynaza 512, 516 Chlamydia (p. też chlamydie) 122 - psittaci 159, 655* - trachomatis 159, 655* chlamydie 117*, 122, 158-160, 654 chlamydospora 203 chloramfenikol (p. też chloromycetyna) 64, 142, 263, 426, 578 -, oporność 582, 583 chlorek miedziowy 236 - wapniowy, transformacja 567 chlorobakten 469

chlorobia 471 Chlorobiaceae (ρ. też bakterie zielone siarkowe) 394*, 458*, 463-465, 469, 473 -, fotoreakcja 481 -, hodowla wzbogacająca 240* -, transport elektronów 480* Chlorobium 29*, 123, 394*, 472, 495, 647 - limicola 458*, 454, 463-465* - phaeobacteroides 463, 474 - phaeovibrioides 474 - vibrioforme 463 Chlorochromatium aggregatum 463 chlorofil 19 - a 163, 168, 170, 468*, 481-483 -b 170, 481 Chloroflexaceae 163, 458*, 463, 465, 466, 470 Chloroflexus 123, 163, 465, 468, 469, 472 - aurantiacus 458*, 466 chloroform 97, 181 Chloroherpeton 123 - thalassium 465 chloromycetyna (p. też chloramfenikol) 130, 426 Chloronema 123 chloroplast 22, 37*, 40, 43, 70, 301, 345, 477, 481, 661 -, pochodzenie 41, 42 -, rybosomy 59 chlorosom 462, 465, 470 chlorotetracyklina 426 Choanephora circulans 429 - cucurbitarum 211 cholera 144, 655* cholesterol 161 Chondromyces 153* - apiculatus 154 choroba legionistów 655* - papuzia 159 - pasterzy świń 151 - pyska i racic 173, 174* - ryb 155 - weneryczna 124, 159, 655* - zakaźna 199 - ziemniaka 209 - z Lime 149 chrom 583

chromatia (p. też Chromatium) 457, 471 Chromatiaceae (p. też bakterie purpurowe siarkowe) 30, 457-161, 472, 473, 661 - hodowla wzbogacająca 240* Chromatium 29*, 100, 118*, 122, 301, 495, 643, 647 -, błona wewnątrzcytoplazmatyczna 67, 69 -, fototaksja 94, 95 -, rzęski 87*, 88, 91 - okenii 43, 69, 91, 98*, 457, 459*, 460*, 467*, 473 - thiosulfatophilum 455 - vinosum 454*, 457-459* - warmingii 457, 459*, 460*, 473 - weissei 473 chromatofor 69*, 70, 110, 461, 470, 477, 481 chromatografia gazowa 494, 497 chromatyda 38* Chromobacterium iodinum 109* - violaceum 109*, 111 chromofor 112 - fenoksazonowy 427 chromopeptyd 112 chromosom(y) 22, 37 - bakteryjny 22, 43, 46*, 189, 551, 552, 564, 586, 663 - Escherichia coli 553, 576 - homologiczne 38* -, liczba i wielkość 55 -, replikacja (p. też DNA, replikacja) 191 Chytridiales 204 Chytridiomycetes 204, 209, 507 ChZT p. chemiczne zapotrzebowanie tlenu ciałko bazalne (blefaroplast) 42 - R650 ciało owocowe 153*, 154, 504 - podstawowe rzęski 91, 92* - wtrętowe (inkluzyjne) 650 ciemna reaktywacja 558 ciemne pole 90 Circinella 412 ciśnienie osmotyczne 71, 76, 231, 232 - parcjalne tlenu 233-235, 306 Chromyces pfefferianus 412 Cladothrix dichotoma 140 Clavariaceae 204 Claviceps 204, 654

691

Claviceps paspali 221, 428 - glutamicum 32, 416 - purpurea 220, 428 - insidiosum 111 Clitocybe 519 - mediolaneum 127 Clostridium 31, 96, 102, 121, 134, 136, 293, - michiganense 127 301, 432, 466, 495*, 509, 599, 652 - poinsettiae 127 - aceticum 136, 367*, 378, 381*, 402 Coxiella burnetii 159 - acetobutylicum 136, 366, 367*, 369, Cribraria 205* 370, 371 - rufa 207, 208 - acetobutyricum 369 Crick F. 48 - acidi-urici 136, 376* Crenothrix 121 Cristispira 122, 148 - botulinum 136, 270, 376, 655 crossing-over 38*, 39, 190, 561 - butylicum 367* Cryptococcus 218 - butyricum 96, 136, 367*, 370, 373 Cunninghamella 412 - cellobioparum 503*, 505, 507 - cellulosae-dissolvens 136 - blackesleeana 418 cylindrosporum 376 Currie 412 felsineum 514 Curvullaria lunata 418 -formicoaceticum 376, 378 Cyanobacteria p. sinice - histolyticum 136, 366, 367*, 376, 655* Cyanophora 650 Cyathus 223 - kluyveri 366, 367*, 372 -, koniugacja 581 Cycas 165 oroticum 368 cyjanella 650 -pasteurianum 136, 366-368, 381*, 402 cyjankobalamina 226, 356 - pectinovorum 367*, 514 cyjanoficyna 102, 167, 170 - perfringens 655* cyjanek 239, 260, 261, 302, 306 cykl Calvina 390, 662 - propionicum 354, 356, 367* - septicum 376 - Entnera-Doudoroffa p. szlak - sporogenes 136, 367*, 374 - fruktozobisfosforanowy p. szlak -, spory 106* „- glioksalowy (cykl Krebsa-Kornberga) - Sticklanda 367* 296*, 317, 415 - tetani 136, 376, 655* - kwasu cytrynowego p. cykl kwasów trikar- tetanomorphum 241*, 367*, 373 boksylowych - thermoaceticum 302, 368, 376, 378, - kwasów trikarboksylowych (TCA) 402, 454* 275*-277, 281, 285, 293, 295-297, - thermocellum 503*-505 307, 316-319, 340, 390, 395, 414, - thermosulfurogenes 512 415, 445 - thermohydrosulfuricum 368, 512 , bakterie fototroficzne 472 - tyrobutyricum 367*, 373 , reduktywny 390, 454, 455, 661 Cohn F. 163, 542 , regulacja 609, 626, 627 Collybia 203* - ksylulozo-5-fosforanowy wiązania formComamonas carboxydovorans 312 aldehydu 525 Coronaviridae 198 - lityczny faga 184, 189* Corticiaceae 204* - pentozofosforanowy p. szlak Corynebacterium (p. też maczugowce) 45, - pomocniczy 314—320 108, 120, 125, 126, 129, 654 -Q31 - diphtheriae 126, 655* - rybulozobisfosforanowy 138, 436, 439, - fasciens 127 457, 461, 628, 663

692

cykl ksylulozo-5-fosforanowy wiązania formaldehydu 523-525 - żwaczowo-wątrobowy 507 Cyklaza adenylanowa 613 cyklodekstryna 511 cykloheksanon 438 cykloheksimid 64, 239 cykloseryna (oksamycyna) 78*, 79, 141, 557 cylinder protoplazmatyczny 147* Cylindrospermum 164, 168 cynk 413, 583 cysta 107-108, 154* cystationina 623 cysteina 30, 300, 301, 322* —, czynnik redukujący 236 - źródło siarki 227 Cystobacter 153* cystofor 154* cystospora 210 cystyda 223 cytochrom 41, 110, 123, 136, 162, 239, 279, 300, 301, 306, 344, 345, 354, 357, 367, 662 - a 301, 302, 304, 306, 440 - b 301, 304*, 306, 378, 479, 484* - c 300*, 302, 304*-306, 310, 387, 390, 395, 440, 479, 480, 483 - d 305*, 306 - f 483, 484* -, lokalizacja 67 - o 301, 302, 305*, 306 cytokina 491 cytokinina 193 Cytophaga 150, 154, 503*-505, 515, 516 - fermentans var. agarovorans 515* -, zawartość GC 50 cytoplazma 36, 37*, 40, 42*, 46, 57, 78, 217* cytozyna C 47-49, 548*, 549 -, metylacja 586 cytrulina 322*, 605 cytrynian 295, 296, 315, 359, 624, 625, 627 - amononowo-żelazowy 331 „czarne drożdże" 218 czas generacji 244, 247, 251, 255, 544, 637 bakterii wodorowych 447 - podwojenia 34*, 52, 244, 257 drożdży 218

cząsteczka heterodupleksowa 56 - sygnalna 609 cząstka fagowa 181, 187, 192 - wirusa (wirion) 171, 173, 175* - kappa 649, 650 czerń sudanowa 97 czerwień Kongo 83 - metylowa 359, 360 - obojętna 554 czerwonka 358, 655* czynnik(i) alkilujący 189 - antybakteryjny 260 - bakteriobójczy 260, 269 - bakteriostatyczny 260, 269 - chelatujący 76 - chorobotwórczy 584 - edaficzne 343 - F 93, 401, 420, 572-574, 576, 577, , integracja 562 - kompetencji 567 - mutagenny 189*, 547-552, 558 - niklo-tetrapirolowy (F 430 ) 142, 389, - powodujący martwicę nowotworów - redukujący 236 - rho (p) 610 - selekcyjny 543, 553 - sigma 60, 610 - wirulencji 536 - wzrostowy 227, 279, 345 - zestalający (żelujący) 229, 431 - zjadliwości 584 czysta kultura 114, 241-243, 352, 634 -, izolacja 241, 242 - naturalna 346 czysta linia komórkowa 194

579

400* 596

396,

dafnia 644 Darwin K. 21, 543 Datura 194 dawca 571, 573 deaminacja 548*, 549 deaminaza treoninowa 621 deazoryboflawina 142, 398 dehydrataza 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonianowa 293 dehydrogenaza 282, 283, 299

693

dehydrogenaza L-alaninowa 320, 321* 3-deoksy-D-arabinoheptulozo-7-fosforan - aldehydowa 528* (DHAP) 624 - aldehydu 3-fosfoglicerynowego 283, 1-deoksykortyzol 418 287-289, 451 deoksynukleotyd 48 octowego 344 deoksyryboza 47, 314, 323 - alkoholowa 282, 283, 337, 344, 409, depolimeraza 514 depurynacja 557 525, 528* derepresja 630 - bursztynianowa 262, 295-297, 355* - butanodiolowa 363 - operonu argininy 606* - dihydrolipoamidowa 294 - operonów reprymowalnych 612 - 6-fosfoglukonianowa 290-292*, 349 - syntezy enzymu 605 - fosfotriozowa 288* dermatofit 346 - glicerofosforanowa 288* Dermatophilus 121, 131* - glukozowa 409 - congolensis 133 - glukozo-6-fosforanowa 289-292, 349*, dermatoza 133 350, 449, 626 Dermocarpa 123, 164, 169 Derxia 121, 138, 448* - glutaminianowa 320, 321*, 537 - homoserynowa 623 - gummosa 494, 495* - β-hydroksybutyrylowa 369, 370* Desulfobacillus 338 - izocytrynianowa 295, 296* Desulfobacter 118* - jabłczanowa 282, 296*, 355* - hydrogenophilus 454*, - α-ketoglutaranowa 295, 296*, 416, 445, - postgatei 391 446, 609, 627 Desulfobacterium 338, 391, - metanolowa 525 - autotrophicum 454* - mleczanowa 282, 283, 347 Desulfobulbus 118* - mrówczanowa 361, 377, 403 Desulfococcus 338, 391 Desulfonema 338 - NADH 304-306, 310* - pirogronianowa 293-295, 627 - limicola 381* - poliolowa 409 desulforubidyna 390 -, synteza 585 Desulfosarcina 118*, 338, 391 Desulfotomaculum 29*, 102, 121, 134, 136, - szczawioglutaranowa 297 - tlenku węgla 401 338, 391, 495 Deinococcus 117* - nigrificans 136 - radiodurans 558 - orientis 136 dekarboksylacja 276 - ruminis 136, 381*, 394, 507 dekarboksylaza pirogronianowa 294, 337, Desulfovibrio 118*, 122, 146, 302, 338, 393 343, 344, 361 - baarsi 454* - szczawiooctanowa 315* - desulfuricans 381* dekstran 84, 430, 431*, 512 - dismutans 338 -, biosynteza 86 - gigas 55 dekstryno-1, 6-glukozydaza 511 - vulgaris 391 dekstryny 367*, 510, 511 desulfowirydyna 390 delecja 546, 547, 552 desulfuraza 30 Delbriick 51 Desulfurolobus 232* denitryfikacja 28, 137, 382-385, 404, 442, Desulfuromonas 29, 118*, 338 438, 646, 664 - acetoxidans 381*, 394, 395, 471, 472, 647 denitryfikator 157 desulfurylacja 29*, 30

694

detergent 260, 270 detoksykacja 100, 346 Deuteromycetes (Fungi Imperfecti) 204, 214 dezynfekcja 260, 264 diacetyl 352, 363, 585 diagnostyka bakteriologiczna 80, 239 diaminodihydroksychinolina 112 diauksja 250, 251, 607, 612 diazodifenochinon 111 dichlorofenylometylomocznik 169 Dictyostelium 204, 206* - discoideum 207 mucoroides 207 diesteraza z jadu węża 48 dieter dialkiloglicerynowy 142 difosforan tiaminy (TPP) 279*, 280*, 452 - undekaprenylu 86 Digitaria 648 - decumbens 495 dihydropikolan 623 diimid 488, 489 dikarion 203 dikariont 214 dikarboksylan piperydyny 623 2, 5-diketoglukonian 408 dikinaza pirogronian: ortofosforan 315*, 316 diktiosom 37*, 40, 217* dimer pirymidyny 548* - tyminy 558 1, 10-dimetylo-9-dekalol 130 dimetylo-p-fenylo-diamina (N, N-dimetylo-1, 4-diaminobenzen) 124 dimetylosiarczan 549 2, 4-dinitrofenol (DNP) 261, 340, 341, 356 dioksygenaza 529 diplanetyzm 210 diplococcus (dwoinki) 44 Diplodinium 503*, 506 disacharyd 653 ditionian 236 dietylodiwęglan 269, 272 Discomycetes 204, 215, 221 DNA 21, 158, 159, 171 -, analiza restrykcyjna 589 -, denaturacja 50, 55 -, forma ccc (ang. covalently closed circle) 47*, 196

-, - oc (ang. open circle) 47* - hybrydowy 592 - jednoniciowy 559, 580* -, krzywa topnienia 50 - pozachromosomowy 44 -, punkt topnienia 50 -, renaturacja 56 -, replikacja 50-55, 67, 195 -, - ciągła 54* -, - dyspersyjna 51 -, - konserwatywna 51 -, -, mechanizm „toczącego się koła" 189*, 581 -, - nieciągła 53, 54 semikonserwatywna 51-53 -, stopień homologii 56 -, struktura 47-50 - wirusów 173, 178* -, trawienie 588, 589 - zrekombinowany 592 cDNA 591, 595 DNaza I z trzustki 48 Dobzhansky 658 Domagk 262 donor wodoru 236, 237, 282, 312, 333 drożdże 31, 96, 108, 199, 216-218, 285, 294, 337, 339, 343*, 344, 379*, 497, 432*, 493, 513, 515, 523, 525, 526, 653 -, cykl życiowy 217* -, fermentacja alkoholowa 337 341 - Kloeckera 342 - osmotolerancyjne 232 -, pasza 342 -, pączkowanie 203* - piekarniane 34*, 216, 243, 333, 341-343, 433, 625 - piwowarskie 216 -, przekrój komórki 217* -, rozmnażanie 203 -, ściana komórkowa 512 - właściwe {Saccharomycetaceae) 216 - wymiary 33 Dryas 493, drzewo filogenetyczne 116, 117 - bakterii 23, 114, 116-119 - Proteobacteria 118* - wg Haeckla 20*, 21

695

Dubois 364 dur mysi 159 - osutkowy 159 - plamisty 655* - rzekomy 655* dwutlenek azotu 27 - węgla 291, 293, 296, 297, 333, 334, 339, 340, 505, 506 , akceptor elektronów 142 , ciśnienie parcjalne 230, 231 , redukcja do metanu 446 , wiązanie autotroficzne 226, 286 dyfuzja 67 - prosta (bierna) 325*, 326 - ułatwiona 325*, 326 „dymiące kominy" (black smokers) 639 dysmutaza nadtlenkowa 313, 396 dżuma gruczołowa i płucna 358, 655* echineon 166 Ectothiorhodospira 122, 230*, 461 - halochloris 468 - halophila 460 - mobilis 69*, 70*, 460 EDTA 76 efedryna 419 efekt glukozowy 608 - mutagenny 559 - Pasteura 289, 338-341, 624, 625 efektor allosteryczny 631 egzochelina 331 egzocytoza 37*, 40, 196, 663 egzoenzym 67, 123, 154, 267, 433, 663 egzo-β-l, 4-glukanaza 503 egzopeptydaza 535 egzopolisacharydy 136, 165, 169, 430, 431, 513 -, biosynteza 86 egzospora 107 egzosporium 103*, 106* egzosymbiont 170 egzotoksyna 126, 144, 270 Ehrlich 128, 149 ekologia 501, 632 - mikroorganizmów 634-656 ekosystem 395, 634, 635, 636, 640 - beztlenowy 396, 501

696

- ekstremalny 648, 442 - pozbawiony światła 443, 444 - wodny 638-644 ekspresja (fenotypowe wyrażanie) 194, p. też klonowanie ekstrakt drożdżowy 149, 229, 338, 339, 345, 536 - mięsny 229, 536 - słodowy 229 - sojowy 229 ekstynkcja hodowli 246, 252 eksykator 236 ektosymbiont 465, 647, 649, 650, 665 ektosymbioza 646, 648 elastaza 536 Elaeagnus 493 elektroforeza 588, 591 - oligonukleotydów 116 - w pulsującym polu elektrycznym 589 elektroporacja 566, 568, 595 elementy IS 565 - IS2, IS3 574 Endiplodinium 650 endoamylaza 510 endo-β-l, 4-glukanaza 503 endocytoza 41, 664 endolizyna faga 186 Endomyces lactis (Geotrichum candidum, Oospora lactis) 203, 216, 342 Endomycetaceae 204, 216 Endomycopsis 216 endonukleaza restrykcyjna 558, 563, 582, 586-588, 591, 592, 594 - bakteriofaga Pl 587 - BalI 587* - EcoRI 587*, 591 - HaeIII 587* - HhaI 587* - klasa 1 587 - klasa 2 587 -, sekwencje rozpoznawane 587* endooksydaza 306 endopeptydaza 535 endorfiny 596 endospora (spora, przetrwalnik) 102-107, 113, 121, 124, 125, 133, 135, 354, 366, 369, 375

endospora, kiełkowanie 106, 107 - laseczek 134* -, powstawanie p. sporulacja -, właściwości 106 -, wykrywanie 102, 103 endosymbiont 365, 444, 493, 647, 649, 650, 664, 665 - orzęsków 158 - owadów 158 endosymbioza 41, 138, 639, 646 endotoksyna 80 energia swobodna 281, 284*, 303 - świetlna 143, 273, 487 Engelman 94, 476 enolaza 288*, 289 Entamoeba histolytica 316 Enterobacter 121, 241*, 358, 513 - aerogenes 202, 207, 328, 357, 359, 362, 385, 608, 621 Enterobacteriaceae 77, 118*, 119, 140, 144, 228, 230, 239, 294, 344, 345, 357-361, 576 -, cechy diagnostyczne 358* -, czas generacji 251 -, glikogen 96 -, produkty fermentacji 345, 360 -, rzęski 88 enterobakterie morskie 363* enterobaktyna 330* Enterococcus 652 - faecalis 346, 347*, 581 enterotoksyna 123, 270, 358, 584, 655* Entodinium 503*, 506 Entomophthorales 204, 211 enzym(y) adenylujący 620* - allosteryczne 279, 617-620, 629 , model sekwencyjny Kushlanda 618, 619 , - symetryczny Monoda 618, 619 - amylolityczne p. też amylazy 511 - anaboliczne 600 - anaplerotyczne 609 -, centrum allosteryczne 632 -, - katalityczne 278 - denitryfikacyjne 585 -, energia aktywacji 278 -, funkcje 277-280

- indukcyjne 34, 602, 603 - izofunkcyjne (izoenzymy) 621-623 - jabłczanowy 315* - kataboliczne 600, 601, 604, 637 - konstytutywne 319, 600 -, modyfikacja kowalencyjna 620 - pektynolityczne 432*, 514 -, powinowactwo do substratu (Km) 616, 617 - proste 616 -, regulacja syntezy 601-615 -, - przez zmianę katalitycznej aktywności 615-629 - regulatorowe 449, 619-621 -, represja 620 - restrykcyjne (p. też endonukleazy restrykcyjne) 116, 586 -, swoistość substratowa 277 - szlaków biosyntetycznych 600, 630 -, wykorzystanie w przemyśle 431-433 eozyna 110, 554 epidemia grypy 179, 199 epidemiologia 80 epilimnion 641, 644 epimeraza 290*, 348 era archaiczna 24*, 141 - proterozoiczna 24* ergotamina 221, 428 ergotoksyna 221, 428 Erwinia 121, 357, 358*, 429, 432* 654 - carotovora 145*, 514 Erysipelothrix 120 erytrytol 75 Erythrobacter 118 erytromycyna 64, 263, 427 erytrozo-4-fosforan 291, 321, 322*, 351, 452, 453, 624 esteraza 514 Escherichia coli 43, 52, 207, 236, 239, 357, 429, 440, 499, 551, 560, 563, 565, 568, 569, 572*, 578, 587*, 615, 628, 652, 653, 655* , amonifikacja azotanów 382 , bakteriocyny 584 , cechy diagnostyczne 358*, 359* , chromosom 46, 47*, 49, 55 , cykl TCA p. cykl kwasów trikarboksylowych

697

Escherichia coli, czas generacji 251, 637 , czynniki zjadliwości 584 - -, diauksja 250, 251, 607, 608* , długość konturowa DNA 48 , działanie penicyliny 77* - -, formy L 162 , glikogen 96, 97* , lizozym 76 , mureina 75 , mutageneza 556 - -, oddychanie 381*, 385, 404 , plazmidy 578 , podłoże minimalne 226, 228 , polimeraza RNA 60 , replikacja DNA 55 , rozkład laktozy 602 , rozmieszczenie tlenu w kolonii 233* , rybosomy 59* , rzęski 91 , synteza glutaminy 620* , szczepy F + , F~ i Hfr p. komórki F + , F- i Hfr , transport elektronów 305* . typy płciowe 573 , zakres temperatur 573 etanol (p. też alkohol etylowy) 211, 281, 333, 334, 337, 360, 361, 369, 370*, 379*, 505 -, działanie bakteriobójcze 260 -, produkcja 337 -, produkt fermentacji 333, 334, 337-343, 349 - utlenianie 367*, 388, 394, 395, 409, 438 eter dimetylowy 523 etylometanosulfonian 548*, 549 Euascomycetes 204* Eubacterium 121, 653 - cellulosolvens 503* - limosum 368* eucyt (p. też komórka eukariotyczna) 22*, 37, 664 eukariota {Eukaryota) 21, 22, 117*, 142, 163, 299, 328 -, hamowanie syntezy białka 64 Eumycetes (grzyby wyższe) 204 eutrofizacja 646

698

eutrofizacja wód 29 ewolucja 380, 421, 456, 506, 584, 633, 646 - biologiczna 22, 23, 659, 660 - chemiczna 658, 659 -, eukariota 662-664 - fotosyntezy 481 - genomu prokariotycznego 586 - mikroorganizmów 658-664 -, prokariota 660, 661 - Ziemi 657, 658 - zstępująca 160 eza 242 F + p. komórka F + F~ p. komórka F~ FAD (dinukleotyd flawinoadeninowy) 279*, 280*, 299, 302, 307, 412 - wzór 280* fag (p. też bakteriofag) 77, 543, 564 - β 126 - defektywny 569 -, jako wektor 552 - λ 562, 569 - męski 572* - MS2 572 - mutator 551 - Pl 569 P22 568, 569 - PBS1 569 - poronny 568 - transdukujący 50, 568, 569 - umiarkowany 558 fagocytoza 41, 81, 83, 173, 207, 208, 664 fanerozoik 24* farnezol 468* Fasciola hepatica 404 faza wzrostu wykładniczego 545 - zastoju 629 fenazyna 108, 137 fenecytyna 425* fenol(e) 260 -, degradacja 438, 532*, 533 fenotyp 542, 547, 556 fenyloalanina 322* -, rozkład 529, 532* -, synteza 624 feofityna 484

fermentacja 23, 97, 102, 113, 125, 140, 211, 218, 228, 335-379, 642 - acetonowo-butanolowa 372* - alkoholowa 334, 337-344 -, bakterie fototroficzne 472 u drożdży 337-343 u bakterii 343-344 - etanolu i octanu 372 - glukozy 621 - homooctowa 376-378 - kwasów mieszanych (p. też f. mrówkowa) 144, 357, 364 - kwasu glutaminowego 373, 374 - masłowa 312, 334, 370, 375 - masłowo-butanolowa 366-376 - mleczanu i octanu 373 - mlekowa 334, 344-353 Heterofermentacja 348-350 homofermentacja 346-347 - mrówkowa 294, 334, 356-362, 364 Neuberga 339 - octowa 334, 375 - oksydatywna 406, 410, 411 -, pentoz 350 -, produkty końcowe 333, 334, 336, 360, 361, 366-369, 379* - propionowa 334, 353-356 -, regeneracja ATP 334-336 -, substraty 378 - typu Enterobacter 360-362 Escherichia coli 360-362 - węglowodanów 285, 333, 334 fermentor 235, 333, 409, 416, 423, 430 - biogazowy 401 feromony płciowe 581 ferredoksyna 301, 335, 336, 386, 455, 480*-483, 485, 486, 496, 597* ferrichrom 330 ferrioksamina 331 fialida 219 Fibrobacter 121 - succinogenes 507 fibroblast 194 fibryla 42, 169 - osiowa 147*, 148 fikobilina 466, 481 fikobiliproteina 166

fikobilisom 166 fikobiont 647*, 648 filochinon 484* filogeneza bakterii 116 fikocyjanina 166, 167 fikocyjanobilina 166 fikoerytrobilina 166 fikoerytryna 162, 166, 474 filtr bakteriologiczny 147, 171 - membranowy 46, 161, 245, 268 - z ziemi okrzemkowej 268 filtrowanie (filtracja) 268, 270 - jako metoda wzbogacająca 147 fimbria 92, 93 fiolet krystaliczny 71, 554* Fischerella 123, 164, 165 fitol 468* fitoplankton 638, 642 flagellina 91 Flavobacterium 117*, 515, 516, 526 - islandicum 232* flawiny 110, 306 flawodoksyna 361, 496, 497* flawoenzymy 313 flawoproteina 41, 297, 299, 304*, 307, 484* fleina 513 Fleming A. 76, 123, 420 Flexibacter 150, 155 - columnaris 155 flora jelitowa (p. też mikroflora jelitowa) 125, 357, 651 fluorescencja 111, 650 fluorooctan 261 FMN 279*, 299, 365 fobotaksja 95 forma L 77, 162 - przetrwalne 102, 107, 108 formaldehyd 523 formylokinureina 604 fosfatydyloetanoloamina 323 fosfatydyloglicerol 323 fosfatydyloinozytol 323 fosfocukry 284, 328, 335 fosfoenolopirogronian 284*, 288*, 289, 297, 315*, 328, 334, 362, 524, 620, 624, 628 - wzór 286

699

fosfofruktokinaza 287, 288*, 316, 341, 450 - regulacja allosteryczna 341, 624-626 fosfogliceromutaza 288*, 289 3-fosfoglicerynian 312, 318, 334, 341, 451, 453 fosfoglikolan 451 6-fosfoglukonian 290-292*, 348, 349* 6-fosfoglukonolakton 289, 290 fosfoketolaza 344, 348, 350, 351 fosfokreatynina 284* fosfolipidy 21, 79 - błony cytoplazmatycznej 65 - - zewnętrznej 79, 80*, 82 fosforan cytydyny 625 - dihydroksyacetonu 287, 288*, 338, 452 - guanozyny 625 - inozyny 625 - kwasu masłowego 334 - pirydoksalu 279*, 538*, 539* - -, wzór 280* fosforiozy 625 fosforoliza 289, 510 fosforybulokinaza 450, 453, 628 fosforybozylodifosforan 323 fosforylacja 307, 311, 326, 333, 486 - enzymów 620 - fotosyntetyczna 71, 285 - oksydatywna (w łańcuchu oddechowym) 67, 261, 275*, 276, 285, 298, 299, 302, 307, 308, 333, 334, 340, 341, 380, 381*, 385, 387, 390, 399, 403, 404, 440, 447 w warunkach beztlenowych 313 - substratowa 261, 281, 285, 289, 297, 311, 313, 334, 442, 625 fosforylaza 510 - glikogenu 620 Foster J. W. 410 fotoautotrof 237 fotofosforylacja 475, 487 fotoliaza 558 fotolitotrof 237 fotoliza wody 476 fotooksydacja 110 fotopigment 470 fotoprodukcja wodoru 472 fotoreakcja 477, 481 fotoreaktywacja 551, 558

700

fotosyntetyczne centrum reakcyjne 462, 477, 479 fotosynteza 19, 25, 26, 41, 43, 101, 113, 226, 273, 300, 325, 443, 449, 447, 475-186, 497, 664 - anoksygenowa (beztlenowa) 24*, 456, 457, 477-481, 641*, 644 , donory wodoru 457, 471 -, fotoreakcje 477-479 - oksygenowa (tlenowa) 24*, 170, 456, 477, 481-186, 641*, 644, 660, 661 -, produkty 276, 477 -, transport elektronów 478-180 -, cykliczny 478 -, - - odwrócony 478, 480 fotosystem I i II 166, 168, 169, 478, 483, 484*, 661 fototaksja 93, 94, 95, 110, 169, 208 fototrof 237 fotouczulenie (fotosensytyzacja) 110 fotoutlenienie 469, 482 fragmentacja 161 - grzybni 202, 203 fragmenty Okazaki 53 frambezja 149 Frankia 121, 493 fruktoza 281, 328, 612 -, rozkład 350, 367* fruktozan 506, 513 fruktozo-1, 6-bisfosforan 287, 288*, 335, 338, 341, 452, 453, 626, 628 -, wzór 286 fruktozo-6-fosforan 287, 288*, 290*, 291, 323, 341, 351, 452, 524, 625 -, wzór 286 fukoza 82, 85 fuksyna 72 - karbolowa 129, 132* Fuligo septica 204, 208 fumaran 296*, 297, 314, 321, 355, 362, 537, 624* -, akceptor wodoru 403 fumaraza p. hydrataza fumaranowa fungicydy 534 Fusarium 203, 503*, 504, 514 - lycopersici 514 - oxysporum 514

Fusobacterium 121, 140, 652 - nucleatum 368* - symbiosus 316 fuzja białkowa 595 G p. guanina galaktokinaza 345 galaktolipid 345 galaktoza 80*, 83, 85, 129, 345, 509, 515, 653 - wzór 508 α-galaktozyd 654 α-galaktozydaza 345, 653 β-galaktozydaza 345, 575*, 595*, 602, 603, 608*, 611*, 612 Gallionella 122, 156*, 232*, 233, 657 - ferruginea 85, 157, 445 gameta 38, 203, 205, 560 gametangiogamia 205, 211 gametangium 203, 205, 210, 211, 213, 215 Ganoderma applanatum 519 Gasteromyces 204, 223 gatunek (species) 114, 205 Gay-Lussac 337 gaz ziemny 32, 500, 526, 657 Geastrum 223 Gelidium 515 gen(y) araA, araB, araC, araD 613 - azi 575* - bio 190*, 562*, 575* - gal 190*, 562*, 575* - himA 563 - hip 563 - his 575* - hut 614 - ilv 575* - konstytutywny 600 - nif 169, 499 - oporności 564 - podzielone 663 - proA 575* - regulatorowe 610, 611* - relA 615 - src 197 - struktury 611 *-613 - tra 579, 589 - thr 575*

- trp 570, 575*, 613 - uvrA, uvrB, uvrC 558 - xis 563 - zabij acz 649 genom 37, 104 - bakterii prochloralnych 170 - chlamydii 159 - faga 184 - mikoplazm 160 genotyp 542, 543 geomikrobiologia 634, 658 geosmina 130 gęstość hodowli bakterii 244, 259 gleba 35, 124, 129, 130, 133, 134, 146, 154, 155, 165, 346, 353, 357, 376, 410, 447, 517, 638 -, kolonizacja 495 - próchnicza 207 -, rozkład białka 536 -, skład biomasy 501* - uboga 521 glicero-3-fosforan 287 glicerol 75, 360, 373 -, produkcja 31, 338, 339 -, utlenianie 354, 367*, 408, 409 D-glicerynian 318 glicyna 78, 79, 322* glikogen 42*, 167, 509, 510, 624*, 625* -, budowa 96 -, synteza 627 - rozkład 367*, 368 glikolan 317, 319 glikoliza (p. też szlak fruktozo-1, 6-bisfosforanowy) 316, 624 glikoproteina 196, 491 glikozyd 284* glioksalan 314, 317 -, jako substrat 317-319 Gloeobacter 123 - violaceus 164, 167 Gloeocapsa 123, 164 Gloeothece 123, 164 glon(y) 22, 39, 40, 72, 642, 647, 648, - niebieskozielone 163 Gluconobacter (Acetomonas) 241*, 407, 409 - melanogenum 408 - oxydans 292*, 407, 408, 432*

701

glukan 84, 510, 512, 513 α-l, 4-glukanofosforylaza 510 glukoamylaza 431, 511 glukonaza 512 glukoneogeneza 314, 316, 317, 319, 625, 626 glukonian 293, 378, 408 glukonolakton 412 glukonolaktonaza 290 glukopiranoza 502 glukoza 27, 29, 72, 80*, 82, 227, 274, 276, 281, 288*, 291, 314-316, 339, 345, 602, 607, 608 -, szlaki degradacji 286-295, 319, 320, 354, 367* -, transport 327, 328 -, utlenianie częściowe 408, 409 -, wzór 286 glukozoamina 80*, 81 glukozo-1-fosforan 345 glukozo-6-fosforan 284, 286-289, 291, 323, 348, 349*, 510, 613, 627, 628 -, wzór 286 glukozydaza 503 glutamina 168, 322*, 620 - biosynteza 320, 321*, 620 glutaminian 320-322*, 537 - rozkład 367* głaszczka 245 główka faga 182*, 184, 187, 189*, 593* gonidium 152 gonokok 77 gorączka plamista Gór Skalistych 158 - powrotna 148, 149 gospodarz 646 gradient elektrochemiczny 298, 299, 309 - protonów 485-487 Gram 71 gramicydyna S 427 granuloza 96 Griffith 565 grono 44 gronkowce (p. też Staphylococcus) 44, 50, 77, 123, 270, 651 grupa prostetyczna 227, 278-280*, 281, 299, 301, 305*, 306, 398, 409, 412, 492 gruźlica 129

702

grypa 173, 198 grzybnia 213, 215, 218, 220, 221 - pączkująca 211, 216 - pierwotna 221 - powietrzna 212 - wegetatywna 201, 216 - wtórna 221 „grzybnia" promieniowców 45, 130 - powietrzna 130-132* - substratowa 130-133 grzyby (Mycota) 22, 25, 45, 96, 117*, 201-223, 330, 337, 418 - autogamiczne 205 - beztlenowe 507 - celulolityczne 504 - drożdżoidalne 223 - heterotalliczne (dizoiczne) 205 - homotalliczne (hermafrodytyczne, monozoiczne) 205, 210, 213, 215 - kapeluszowe 222 -, klasyfikacja i nazewnictwo 204, 205 - konidialne 224 - niższe (p. też Phycomycetes) 202-205, 209-214 - - wodne 205, 209 - patogenne 221 - pączkujące 216 - pleśniowe 31 -, ściana komórkowa 72 - rozkładające chitynę 516 ligniny 519 -, rozmnażanie bezpłciowe 202, 203, 212 -, - płciowe 203, 205, 210, 212 - sporangiosporowe 202 - wyższe (p. też Eumycetes) 202, 204*, 205, 214-223 guanina (G) 47-49, 323, 548*, 549 Gunnera 165 - macrophylla 494 haczyk 214, 215 Haeckel E. 21, 23 Haemophilus aegyptius 587* - haemolyticus 587* - influenzae 187 Hann 338 hak rzęski 91, 92*

Haldane 658 Halobacterium 121, 143 - cutirubrum 487* - halobium 101, 487* halobakterie p. bakterie halofilne Halococcus 121, 143 Haloferax 121, 143 halofil (p. też bakterie halofilne) 364, 637 - ekstremalny 117* haloruberyna 143 hamowanie (inhibicja) allosteryczne 341, 621, 622, 631 - - przez ATP 625 - kompetycyjne 261, 262 - kooperatywne 622 - łączne 622 - przez produkt końcowy 621, 623*, 627 - wielowartościowe 622 - zwrotne 601, 621, 624, 630 Hansenula holstii 513 - polymorpha 525 Harden 338 Hata 149 heksadekanol 527 heksokinaza 287, 292*, 316 hekson 179 heksoza(y) 276, 322*, 337, 342 -, fermentacja 337, 378 - w błonie cytoplazmatycznej 65* heksozofosforan 290 heksozylotransferaza 84 Helicobacter 122 - pylori 655* helikaza 54, 580* Heliobacillus 466 Heliobacter 495 Heliobacterium 466 heliobakterie 466 Heliospirillum 466 helisa a p. białka, helisa a - podwójna 46*, 48, 53* paranemiczna 51 plektonemiczna 50*, 51 Hellriegel 489 Helvella 204, 221 hem 301, 310*, 366 hemiceluloza 27, 368, 508, 517

hemina 302, 344, 357 hemolizyna 536, 655*, 584 heptoza 80*, 82* herbicyd 169, 534, 585, 597 hermafrodyta 210 Herpesvirus 174, 176, 180 Hesse W. 229 Heterobasidiomycetes 204, 223 heterocysta 165, 167, 168, 493, 494, 496 heterodupleks 564 heteropolisacharyd 85 heterotrof 19, 142, 237, 354 heterotrofizm 236 Hfr p. komórki Hfr hipertermofil 232 hipoksantyna 549 hipolimnion 101, 641-644 hipoteza „jeden gen jeden enzym" 541 - mutacyjna 197 - wielkości dawki 197 Hippophae 493 histydyna 322* -, rozkład 367*, 608 -, źródło azotu 608 histydaza 608 histon 22, 39, 43, 663 hodowla (kultura) beztlenowa 236 , metoda Hungate'a 236 - ciągła 259, 554 -, ciśnienie parcjalne tlenu 235 - czysta p. czysta kultura - mieszana 243, 375 -, nawietrzanie 233-236 - okresowa (statyczna) 244, 249, 251, 255, 259 - płynna 173, 234 - powierzchniowa 235* - selektywna (wybiórcza) 238 -, synchronizacja 259 - tkankowa 159, 172*, 173, 194, 195 - wgłębna 235*, 423 wzbogacająca 35, 124, 181, 238-241, 372, 374, 500, 504 , bakterie denitryfikacyjne 384 , - fototroficzne 474, 475 , - metanowe 526 , - redukujące siarczan 391-393

703

hodowla wzbogacająca, bakterie redukujące siarkę 394 , - wodorowe 447 holoenzym 610 Homobasidiomycetes 204, 223 homocysteina 30, 623 homologia sekwencji DNA 55, 562, 563 homoseryna 322*, 417, 623 hormogonium 164, 168, 169 hormon(y) folikularny 596 -, produkcja 32 - wzrostowy 596 humus 635, 438 -, powstawanie 520-522 hybryd DNA-DNA 589 hybrydyzacja DNA-DNA 55, 114 - komórek roślinnych 568 - Southerna 589, 594 Hydnaceae 204* hydrataza akonitanowa 296* - fumaranowa 296*, 297, 355* hydrazyd kwasu nikotynowego (INH) 129 hydrazyna 488, 489 hydrogenaza 335, 336, 361, 390, 400, 401, 448, 449, 492, 496-498 - cytoplazmatyczna (oksydoreduktaza H 2 : NAD + )448 - związana z osłonami 448, 450 4-hydroksybenzoesan 533, 604 - rtęci 260 Hydrogenomonas thermophilus 454 hydrokortyzon 418 hydroksamat 330 β-hydroksybutyrylo-CoA 369, 370* hydroksylacja cytozyny 548* hydroksyloamina 438, 548*, 549 5-hydroksymetylocytozyna 184, 186 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-CoA 540 hydroksymetylotransferaza serynowa 524* hydroksypolialkany (PHA) 98 hydrolaza szczawiooctanowa 414, 415 hydroliaza 3-hydroksyacyIo-CoA 528* hydrolizat kazeiny 422*, 621 hydrotaksja 208 Hymenomycetes 204*, 221-223 hymenium 222, 223 Hyphomicrobium 122, 156*, 525

704

- vulgare 157 Hyphomonas 122 Hypoxylon 220 identyfikacja bakterii 119 - mikroorganizmów 522 idiofaza 252 immobilizacja enzymów 433 incystacja 210 indol 111, 358*, 359 indolooctan 585 indukcja β-galaktozydazy p. β-galaktozydaza - jednoczesna 603, 604 - profaga 189 - przez produkt 604, 615 - sekwencyjna 603, 604 - substratowa 503 - syntezy enzymów 319, 600, 601, 611 induktor 601, 604, 609-612 - wewnątrzkomórkowy 612 indygoidyna 109* infekcja 264 - jelitowa 80 infekcyjność 180 inhibicja kontaktowa 194 - zwrotna p. hamowanie zwrotne inhibitor 618, 619 - łańcucha oddechowego 306 - kompetycyjny 261, 500 - selektywny 239 inicjacja transkrypcji p. transkrypcja inicjator 613 inkluzje komórkowe 100, 101 Inocyte patouillardii 428 inokulum 238, 241 inozynomonofosforan 323 Insercja 552, 546, 547 insulina 596 integracyjny czynnik gospodarza (ang. integration host factor, IHF) 563 integraza 1 191, 563 interfaza 663 interferon 596 interkalacja 549 interleukina 596 inulina 367*, 513 inwersja genu 565

inwertaza 432* inżynieria genetyczna 32, 33, 577, 592, 598 iperyt 549 Iwanowski 171 izoamylaza 510 izocytrynian 295, 296, 307, 317, 624* izoenzym p. enzym izofunkcyjny izogameta 203 izolacja bezpośrednia mikroorganizmów 238 izoleucyna 322*, 343, 356, 621-623 -, produkcja 417, 607 izomeraza glukozofosforanowa 287, 288*, 524 - glukozowa 432 - heksozowa 432 - pentozofosforanowa 290* - triozofosforanowa 287, 288*, 348, 452 izomeryzacja 287, 291, 345, 524 izopropanol 334 jabłczan 296*, 307, 315*, 317, 355, 362, 404, 624*, 627 -, rozkład 354, 378 Jacob 613 jad kiełbasiany p. toksyna A jaglica (trachoma) 159, 655* jajo kurze 159 jąderko 38, 217* jądro 22, 37*, 39, 541 - grzybów 202, 217* - interfazowe 38 jezioro 165, 640, 638 - amiktyczne 642 - eutroficzne 641*, 165 - holomiktyczne 642 - meromiktyczne 642 - słodkowodne 641 - słone 487 - tropikalne 642 jęczmień 342 jod 71, 76, 515* -, reakcja ze skrobią 96, 511 jodyna 509, 510 jodynina 109* jogurt 333, 352, 363 jon amonowy 161, 320, 321 jonofor 328, 427

kadaweryna 537 kadm 583 Kalanchoe blossfeldiana 193* kał, mikroflora 140, 359 kanał 311, 328 - błony zewnętrznej 82 - koniugacyjny 580* kanamycyna 551 -, oporność 564, 581-583 kanawanina 261, 262 kapronian 333, 334, 372 kapsomer 176, 179, 180, 182, 195 kapsyd 173, 174*, 179, 180, 187, 196, 199, 593, 594 karaluch 649 karbamoilofosforan 167, 605 karbamoilotransferaza ornitynowa (OCTaza) 605 karbenicylina 425* karbinol fenyloacetylowy 419 karboksydobakterie 435, 454*, 450 karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa 315 karboksylacja 355, 362, 455 - kwasów trikarboksylowych 315, 316 - pirogronianu 354 karboksylaza fosfoenolopirogronianowa 315-317 - pirogronianowa 315, 316 - rybulozo-l, 5-bisfosforanowa41, 102, 443, 445, 450, 451, 463 karboksysom 101, 102, 167 karboligaza glioksylanowa 609 karbomycyna A 427 kariogamia 203, 206, 208, 213-217, 221, 223 karoten 166, 469 karotenoid 19, 32, 71, 108, 109*, 143, 155, 456, 469, 470, 474, 479, 481, 482, 487, 505, 627 -, synteza 110, 429, 540 -, degradacja 378 katabolizm 274, 275*, 332, 621 - glukozy 285 - konstytutywny 630 - wielocukrów wewnątrzkomórkowych 510 katalaza 136, 313, 344, 354, 357, 367, 392, 412

705

katechol 528, 529, 532, 604 kazeina 352 KDO p. kwas 2-keto-3-deoksyoktonowy kefir 143, 352 kenozoik 24* kerogen 24, 660 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonian 291-293 2-ketoglukonian 408 α-ketoglutaran 276, 295-297, 307, 320-322*, 416, 445, 537, 620, 624* 2-ketoizowalerianian 607 ketokarotenoidy 166 2-ketomaślan 607, 621, 623 ketozomonofosforan 452 killer gene 649 kiła 148, 149, 655* kinaza adenylanowa 285, 442 - APS 389 - asparaginianowa 623 - fosfoglicerynianowa 285, 288, 289, 334, 451 - glicerynowa 319 - ketodeoksyglukonianowa 293 - octanowa 285, 334-336, 349*, 362, 369, 372, 377 - pirogronianowa 285, 288*, 289, 316, 334 kinureina 604 kiszona kapusta 271, 333, 346, 351, 368 kiszonka 333, 351 klasyfikacja mikroorganizmów 114, 115, 542 - filogenetyczna 115 - sztuczna 115 Klebsiella 121, 358, 404, 431* - pneumoniae 357, 494, 495*, 499 kleistotecjum 204, 215, 216*, 218 kleszcze 149 klon 241, 243 klonowanie molekularne 587, 589-598, -, ekspresja sklonowanego DNA 595 -, problemy bezpieczeństwa 598 -, selekcja zrekombinowanych klonów 594, 595 -, zastosowanie 592, 596 klostridia (p. też Clostridium) 101, 102, 136, 293, 333, 344, 366, 368, 379*, 494, 514, 653

706

- acetogenne 662 -, fermentacja 344 - peptolityczne 368, 374 - sacharolityczne 368, 369, 512 klosz anaerobowy 236 kobalamina 279* kobalt 583 Koch R. 35, 129, 229, 542 kod genetyczny 60-63 -, degeneracja 113 -, niejednoznaczność 543 -, odstępstwa od uniwersalności 62* -, uniwersalność 275 kodon (p. też tryplet) 61*-62, 543 - startowy (inicjacyjny) 62, 546 - stop (nonsensowny, terminacyjny) 62*, 63, 346, 547 koenzym(y) 227, 262, 278-280*, 281, 282, 295, 299, 323 - A (CoA) 279*, 280, 295, 356 - B 1 2 356 - archeonów 141, 142 - F 4 2 0 142, 650 - F 4 3 0 142 - metanogenów 400* - Μ (sulfonian merkaptoetenu) 142, 279*, 398, 400* - Q p. ubichinon kointegrat 565, 582 koklusz p. krztusiec kolba Erlenmeyera 235, 244 - Fernbacha 235, 244 - Kluyvera 235 - Ρ 235 kolifagi 181, 182 kolistyna 260, 557, 584 kolitoza 82 kolonia(e) 111, 241, 242, 408 - Bacillus cereus var. mycoides 135* - bakterii rozkładających agar 515 śluzowych 154 -, charakterystyka 238 -, ciśnienie parcjalne tlenu 233 - mikoplazm 161 - nokardii 131* - prątków 131* - promieniowców 130-132*

kolonie satelitarne 631 - Sphaerotilus natans 139 - Zooglea ramigera 85* kolumella 212 kolumna Winogradskiego 474, 475* komensal 149, 346 komensalizm 243, 646 kometabolizm 501, 534-535 komin hydrotermiczny 640 komora Neubauera 245 - Petroff-Hausera 245 - Thoma 245 komórka bazalna 218 - embrionalna 39 - eukariotyczna (eucyt) 37-42, 663, 664 - F" 573*, 574* - F + 574, 576 - F' 573* - Hfr 572, 574-576 - jajowa 39, 205 - lizogenna 189*, 191 - męska 572* - nowotworowa 65, 194 - permisywna 195 -, potencjał energetyczny 628 - prokariotyczna (protocyt) 42-112. - wegetatywna 102, 103, 105, 107, 274 bakterii śluzowych 154 kompartmentacja 22, 40 kompetencja 564, 566 komplementacja 596, 594 kompleks nitrogenazy 496-498* konalbumina 331 konidiofor 214, 219, 220 konidium (konidiospora, zarodnik konidialny) 202, 214, 219, 220, 223 koniugacja bakterii 561, 570-577, 581 - -, biorca 571, 573 - - dawca 571, 573 , model przekazywania DNA 580* , przeniesienie genów chromosomalnych 574 przerywana 574 , typy płciowe 573* - askospor 217* - orzęsków 649 - jąder 203

konkurencja 243 konopie 514 Konoshita 416 konserwacja owoców 267 - żywności 270-272 konsumenci 26 kontrola allosteryczna 630 - negatywna 612, 613 - pozytywna 612, 613 konwersja fagowa (lizogenna) 127, 188 koprofagia 429, 651 koprofit 220 koprogen 212 korepresor 610, 613, 619 korozja żelaza 393 korteks spory 46*, 103*, 105 kortyzon 418 korynebakterie (p. też maczugowce) 526 kosmid 592, 593 koutlenianie p. kometabolizm koziołkowanie 91, 93 krążenie azotu, fosforu, siarki, węgla p. obieg azotu itd. krezole 260 krętki 45, 113, 119, 120, 146-150, 426 - beztlenowe 149 -, magnetotaksja 95 - tlenowe 149 kriofile p. psychrofile królestwo roślin 21 - zwierząt 21 „kryształ" parasporowy 100 krztusiec (koklusz) 655 krzywa wzrostu 247-255 , faza logarytmiczna (wykładnicza) 249*, 250-252, 254, 255 - -, - stacjonarna 249*, 250, 252 - -, - zamierania 248*, 250, 252 - -, - zastoju (lag faza) 249*-251, 253*, 254 , parametry 253-255 ksantan 138, 430, 431* ksantofil typu phlei 109* ksantyna 367*, 549 ksenobiotyki 534, 535, 585 -, degradacja 243 ksylan 505-509

707

ksylan, budowa 508 -, rozkład 375, 509 ksylanaza 509 ksylobioza 509 ksylonian 408 ksyloza 508, 509 - utlenianie 408 ksylozo-5-fosforan 290 ksylulozo-5-fosforan 290, 335, 344, 348, 349*, 351, 453, 525, 613 kukurydza 648 kultura starterowa 352 - tkankowa p. hodowla tkankowa kumaryna 428 kumys 353 kuracja antybiotykowa 582, 651 - chemioterapeutyczna 651 kurdlan 430, 431* kwas N-acetylomuraminowy 73 - N-acetyloneuraminowy 177 - 7-aminocefalosporanowy 425 - 6-aminopenicylanowy 424, 425* , wzór 419 - arachidonowy 507 - askorbinowy 236, 408 - azotowy 548 - 1, 3-bisfosfoglicerynowy 287, 288-289 - 6-aminopenicylanowy, wzór 286 - benzoesowy 272 - bursztynowy 140, 411 - cytrynowy 31, 412—414 - diaminopimelinowy 73-75, 77, 78*, 159, 322* - diaminomasłowy 73 - 2, 4-dichlorofenooctowy 585 - dihydrolipoinowy 295 - dikarboksylowy 317, 492 - dipikolinowy 103, 104, 106, 133, 136 - foliowy 159, 279*, 345 - fosfoasparginowy 623 - 2-fosfoglicerynowy 286 - 3-fosfoglicerynowy 286-289, 451 - fosforowy 47, 48 - fumarowy 412 - glicerynowy 409 - glukonowy 137, 412, 413 - glukuronowy 85, 409, 509

708

-, - wzór 508 - glutaminowy 135 -, produkcja 32, 128, 416 - D-glutaminowy 73, 74 - guanylowy 417 - huminowy 268 - 4-hydroksybenzoesowy 533* - hydroksytluszczowe 98 - hydroksywalerianowy 97 - inozynowy 417 - itakonowy 414, 415 - kapronowy 367* - 2-keto-3-deoksygalaktonowy 83 - 2-keto-3-deoksyoktonowy (KDO) 80*, 82 - 2-ketoglukonowy 137 - 2-keto-L-gulonowy 429 - linoleinowy 507 - linolowy 507 - liponowy 279*, 280*, 295 - lizergowy 221, 428 - migdałowy 528, 532* - mikolinowy 129 - mlekowy 85, 125, 140, 141, 333, 343, 344, 346, 347 , produkcja 31, 411, 412 - moczowy 317 - mrówkowy 140, 272, 411 - cis, cis-mukanowy 158, 159 - muraminowy 71, 77, 158, 159 - nalidyksowy 64 - nikotynowy 226, 279*, 345, 458 - nukleinowe 263, 275, 291, 368 - octowy 84, 125, 140 , produkcja 409, 411 - oleinowy 507 - olejowy 507 - organiczne 274, 275, 333, 378 , produkcja 410-416 - pantotenowy 279*, 345 - para-aminobenzoesowy (PABA) 226*, 261, 262, 458*, 475 - pirogronowy 84 - poligalakturonowy 514 - poliglutaminowy 84 - poli-β-hydroksymasłowy (PHB) 42*, 95, 97, 103, 167, 170, 434, 449, 473 - poli-β-hydroksyoktanowy 434

kwas(y) poli(hydroksy)tluszczowe 534 - poli-β-hydroksywalerianowy 434 - poli-y-hydroksywalerianowy 434 - propionowy 97, 125, 353, 354 - protokatechowy 528, 529 - sorbowy 272 - szczawiowy 412, 413 - szikimowy 533 - tejchojowy 75, 76, 114 - tetrahydrofoliowy 262, 279*, 280*, 377, 524* - tłuszczowe 285, 317, 388, 506-508, 353, 378 długołańcuchowe 274, 323, 627 nasycone 323 , w lipidzie A 83 - toluilowy 533* - uronowy 83, 508, 515 - urydylowy 323 - walerianowy 506 - wanilinowy 533 kwasooporność 128 kwaśne mleko 346, 363 Lactobacillus 120, 125, 140, 230*, 652 - acidophilus 346, 347*, 352 - alimentaris 347* - bifermentans 347* - brevis 346, 347*, 349* - bulgaricus 346, 352, 353 - casei 346, 350, 353 - coryniformis 347*, 353 - delbrueckii 346, 347*, 352, 353 - fermentum 346, 347* - helveticus 346, 347*, 352 - kandleri 347* - lactis 346, 347*, 352 - leichmanii 353 - plantarum 346, 347*, 350, 352, 353, 363 -, plazmidy 581 - salivarius 347* - viridescens 347* Lactobacteriaceae (ρ. też bakterie mlekowe) 344-346 Lactococcus 123, 125 - cremoris 352 - diacetilactis 346, 347*, 352

- lactis 346, 347*, 352, 363 lakkaza 312 β-laktamaza 425, 495 laktoflawina 345 laktotransferyna 331 laktoza 314, 345, 359, 607, 608*, 612, 653 - rozkład 345, 354, 602 - transport 327 Lamarck 543 lamella 67-69* Lamprocystis 101, 118*, 120, 123, 459*, 643 - hyalina 85 - roseopersicina 457 Lampyris noctiluca 363 laseczki 134-136, 344, 354, 366 - beztlenowe (p. też Clostridium) 136 - tlenowe (p. też Bacillus) 134, 135 Lederberg 543, 658, 570 leghemoglobina 491-493, 496, 498 Legionella 121 - pneumophila 655* Leguminosae 493 lektyny 491 Lemma (rzęsa) 473, 474 len, roszenie 514 Lenzites 418, 519 „lepkie końce" 190*, 191, 592 Leptomitales 204 Leptomitus 209 - lactus 201* Leptospira 122, 148, 149 - biflexa 150 - canicola 150 - icterohaemorrhagiae 150 leptospiroza 148 Leptothrix 121, 141, 232* - buccalis 141 - discophorus 445 - ochracea 85, 139, 140, 445 „letalna synteza" 557 Leuconostoc 120, 123, 125, 343* - cremoris 352, 363 - dextranicum 512 - lactis 347* - mesenteroides 229, 307, 344, 346-349*, 363, 431*, 512 - -, fermentacja 334, 348, 349*

709

Leuconostoc mesenteroides, śluz 84 Leucothrix 118*, 150, 152 leucyna 322*, 343 , biosynteza 607 -, rozkład 539* leukemia 195 leukocyt 41 lewan 84, 86, 513 lęgnia (oogonium) 203, 205, 210, 211 lęgniowce (p. też Oomycetes) 72 liaza izocytrynianowa 296, 317, 415, 524, 525 - malylo-CoA 524*, 525 - mrówczan: H2 361 - pirogroniammrówczan 294, 361 - wodorowa 335 liczba bakterii 244, 245 całkowita 245 , metody określania 244, 245 żywych 245 licznik Coultera 245 ligacja 593*, 594 ligand 618, 619 ligaza 190, 591, 592, 653 - DNA 53 - polinukleotydowa 191 lignan 27 lignina 27, 517-520 -, rozkład 504, 518-520, 533*, 535 -, skład 517 -, synteza 518 ligninaza 519 lignoceluloza 502, 517 lignoproteina 520 likopen 469 limfocyt Β 199 - Τ 199 limfotrop 174 limnologia 640 linia komórkowa 195 liofilizacja 107 lipaza 432, 512 lipid(y) 21, 37*, 40, 42*, 45, 75, 162, 323 - A 80*-82 - archeonów 141 -, biosynteza 323, 324 - błony cytoplazmatycznej 65

710

lipopolisacharyd (LPS) 75, 76, 79, 80-82, 86, 92*, 114, 165, 358, 655* -, jako receptor 185 lipoproteina 75, 79, 80* -, jako receptor faga 185 liposom 328 Listeria 120 - monocytogenes 125, 655* listerioza 125, 655* litoautotrof 141, 445 litotrof 237 litotrofia 237 liza 154, 364 - bakterii 146 - przez faga 181, 185, 187, 188 - „beztlenowa" 79 - erytrocytów 584 - gospodarza 568 - komórki 76, 213 lizat 181 lizogenizacja 189* lizogen 190 lizogenia 187, 189, 195 lizosom 663 lizostafina 536 lizozym 46, 47*, 65, 75, 158, 168, 207, 547* -, działanie 76, 77 - fagowy 185, 187 lizyna 73, 75, 78*, 79, 281, 322*, 622, 623 LPS p. lipopolisacharyd lucyferaza 194, 364-366 luminescencja 364-366 Lycogala epidendron 204*, 208 Lycoperdales 204* Lycoperdon 223 - epidendrum 208 Lyngbya 123, 164 łańcuch oddechowy 40, 41, 275*, 276, 281, 283, 285, 295, 297-314, 383, 445, 448, 625, 626 , lokalizacja 67 - -, składniki 299-302 , inhibitory 306 - pokarmowy 638 beztlenowy 397, 501 - polinukleotydowy 50, 51, 55

łańcuch polipeptydowy 57, 61, 62 , wiązania wewnątrzcząsteczkowe 58* - transportu elektronów (p. też łańcuch oddechowy) 409, 485 , fotosynteza 478, 483 łańcuszek 113 łodyżka 155, 461 ługowanie rud 444, 445 łysinka 171, 173, 181, 187, 188* łzy 76, 331 Macleod 566 maczugowce p. Corynebacterium magnetosom 95 magnetotaksja 93, 95 magnetyt 95, 405 magnez 50, 58, 295, 411, 480 makrocząsteczki 275 makroelementy 225, 329 makrofag 655* malonian 261, 262 malonylo-CoA 324, 627 maltaza 511 maltotrioza 510, 512 maltoza 510, 511 mangan 411, 445, 483 mannan 513 mannaza 512 mannitol 75, 350 mannoza 82 - pobieranie 328 -, wzór 508 -, rozkład 367* mapa genetyczna 574-576 - - chromosomu Escherichia coli 575* , konstrukcja 588 - restrykcyjna 588, 589 masa bakterii 245 - - mokra 45, 245, 246 - - sucha 45, 245, 246, 251, 253 masło 352, 363 maślan 333, 334, 366, 367*, 369-374, 379*, 388, 506 maślanka 352 materiał jądrowy 36 - zapasowy 45, 95-100, 275 maty bakteryjne 466

mączniak prawdziwy 220 - rzekomy winorośli 209 mechanizm „flip-flop" 565 McCarthy 566 megacyna 584 megaplazmid 585 Megasphaera 120 - elsdenii (Peptostreptococcus) 125, 356 mejoza (podział redukcyjny) 38, 39, 203, 208, 213, 214, 216, 221, 223, 560, 663 melasa 229, 342, 353 melibioza 327 Melittangium 153* meningokoki (p. też Neisseria meningitidis) 77 merozygota 560 Meselson 51, 56 metabolit 278, 281 - pośredni 276, 557 - wtórny 112, 252, 419, 421, 597, 627 metabolizm 600 - pośredni 557 -, regulacja 599-632 -, - allosteryczna 621 -, - przez zmianę aktywności enzymów 615-629 -, - rozgałęzionych szlaków biosyntetycznych 606, 607 -, - ścisła 622 - wtórny 419, 421 metafaza 388* metale ciężkie, działanie oligodynamiczne 260 -, oporność 564, 583 metalimnion 641, 644 Metallogenium 122 metalotioneina 595 metan 27, 333, 336, 506, 642, 643, 645, 654, 664 -, powstawanie przez redukcję węglanu 395 -, wykorzystywanie przez bakterie 438, 523 - 525 metanofuran 279*, 398 metanogeny 117, 142-143, 314, 333, 336, 378, 381*, 396-399, 446, 454, 494, 495*, 635, 650, 661

711

metanogeny, budowa i klasyfikacja 396 -, koenzymy i grupy prostetyczne 400* -, regeneracja ATP 399 -, wykorzystanie 401 metanol 82 -, utlenianie 388, 438 -, wykorzystywanie przez mikroorganizmy 523, 525 -, wykorzystanie przez bakterie metanogenne 396, 399 metanopteryna 142, 279*, 398, 400* metanotrof 525 Methanobacterium 116, 121, 396, 495 - arboriphilicus 142 - formicicum 142 - omelianskii 372, 397* - ruminantium 142 - thermoautotrophicum 381*, 401, 454 Methanococcus 121, 396 - vannielii 142 Methanogenes 240* Methanoplanus limicola 142 Methanopyrus 232* Methanosarcina 121, 396, 495 - barkeri 142, 381*, 396, 399, 454* Methanospirillum 396 - hungatei 142 Methanothermus 121 - fervidus 142 Methanothrix 121 - soehngenii 142 methemoglobina 386, 387 Methylobacterium extorquens 525 Methylococcus 523 - capsulatus 232 Methylocystis 108 Methylomonas 137, 434, 523 - clara 525 - methanica 526 Methylosinus 523 - trichosporium 107 metionina 30, 322, 622, 623 metoda(y) antymetabolitowa 630 - auksotroficzna 631 - filtracyjna 245, 410 - Hungate'a 236 - immunologiczne 82

712

- lanych płytek Kocha 242, 245 - penicylinowa 554*-556 - replik 416, 543, 544, 556 - serologiczne 188 - seryjnych rozcieńczeń 424 - van Slyke-Folcha 246 - wzbogacania 147 metoksantyna (PPQ) 409, 525 Metopus contortus 650 metycylina 425* metyloamina 396 metyloglioksal 339 N-metylo-L-2-glukozoamina 425 metyloguanina 548 metylomalonylo-CoA 455 metylometanosulfonian 549 N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (NMG) 548* 2-metylopropan 343 metylopteryna 650 metyloreduktaza metylokoenzymu Μ 400 metylotransferaza 586 metylotrof (p. też mikroorganizmy metylotroficzne) 495 Meyer J. M. 273 mezofil (p. też bakterie mezofilne) 232 mezosom 67 mezozoik 24* miano faga 186 Microbispora 121, 131*, 133 Micrococcus 50, 108, 120, 123 - luteus {lysodeikticus) (d. Sarcina lutea) 109*, 123, 308 , glikogen 96 , lipidy 65* , lizozym 76 Microcyclus 122 Microcystis aeruginosa 101 Micromonospora 121, 131*, 133, 354, 516 - chalcea 504 miedź 306, 411, 414 miejsce attB 562*, 563 - attP 562*, 563 - cos 592, 593* mięczaki 501*, 502 międzygatunkowy przekaz wodoru 336, 501 mięsak 197

mięsak Rousa 194 migdalan 604 mikobaktyna 331 mikobionty 647*, 648 mikoplazmy 143, 160-162 mikoryza 648 - arbuskularna 648 - wezykularna 648 mikotoksyny 428, 429 mikroaerofile 95, 126, 228 mikrocysta 155 mikroelement 225, 228 mikroelektroda tlenowa 233 mikroflora glebowa autochtoniczna 128, 439, 522 zymogenna 522 - jelita 346 - skórna 346, 651 - zymogenna 522 - żwacza 507 mikrokoki 353 mikrokolonia 554* mikrometoda Kjeldahla 246 mikroorganizmy (p. też mikroflora) 21, 22* - allochtoniczne (zymogenne) 636 - autochtoniczne 636 - glebowe 153 - heterotroficzne 27 - metylotroficzne 523 - oportunistyczne 633, 651 - patogenne 31, 651 - rozkładające celulozę 503*, 504 - termotolerancyjne 232 - zymogenne 636 mikroskop elektronowy 36, 45, 57, 58, 64, 90, 564, 579 - fluorescencyjny 650 - świetlny 36 - z ciemnym polem 36 - z kontrastem fazowym 36 mikrotubula 37* miksobakterie 208, 504 miksoksantofil 166 miksospora 107, 108, 153*-155 miksotrof 395 miksotrofia 449 Miller 659

mineralizacja 25, 26, 27, 273 minimalne stężenie hamujące 424 - wymagania odżywcze 239 miozyna Β 208 Mitchell P. 309 mitochondria 22, 37*, 40, 43, 217*, 307, 664 -, odstępstwa od uniwersalności kodu 62* -, pochodzenie 41, 42 -, rybosomy 59 -, transport elektronów 305*, 306 mitomycyna C 189, 263, 558, 577 mitoza 22, 37, 38, 663 mleczan 333, 334, 344, 349, 353, 360, 362, 373, 379*, 505 - utlenianie 316, 354, 388, 403* mleko 331, 345, 346, 352 -, sterylizacja 267 mocznik 50, 71, 135, 358*, 367*, 507 - hydroliza 538 -, źródło azotu model sekwencyjny Kushlanda 618, 619 - symetryczny Monoda 618, 619 - Watsona-Cricka 48 modyfikacja DNA 586 - chemiczna zasad 549 molibden 383, 450, 496 Mollicutes 122, 160 Monilia 204* Monilina fructifola 221 Monoblepharidiales 204* Monod 613 monomorfizm 542 mononukleoza 174* monooksygenaza 365, 439, 523, 527-529 - amonowa 437 montmorylonit 659 Moraxella 120, 124 Morcherella 204, 221 morfopoeza 184 Mortierella 516 mostek dwusiarczkowy 106 - fosfoestrowy 75 - pentapeptydowy 75 - peptydowy 75 - wodorowy (p. też wiązania wodorowe) 48-50, 55

713

mrówczan 293, 335, 360, 361, 505, 506 -, utlenianie 388, 403* -, wykorzystanie przez mikroorganizmy 388, 396, 403*, 523 Mucor 202, 412, 516 - mucedo 210 - racemosus 211 - romannianus 647 - rouxii 431 Mucorales 204, 211, 411, 412 mukoproteina 177 muł 392*, 475* muramidaza 74* muramylopentapeptyd 78 mureina (p. też Peptydoglikan) 80*, 86, 129, 163, 165 - endospory 105 muroendopeptydaza 74* muskaryna 428 mutacja 35, 406, 541, 562, 564 -, częstość 544-546, 547 - delecyjna 546 dominująca 553 - indukowana 548, 565 in vitro 552 - - przez UV 559 - insercyjna 546, 551 - nieukierunkowana 542, 543 - operatora 629 -, pochodzenie 542 -, polarność 547 - punktowa 546, 547 - recesywna 553 - spontaniczna 544, 545 -, wyrażanie się 552, 553 - zmieniająca ramkę odczytu 546-548*, 550 mutagen 548, 549, 555, 559 mutageneza 550*, 556 - transpozonowa 551 - ukierunkowana 552 mutant 32, 542 - auksotroficzny 239, 321, 417, 555, 556, 570, 631 - cichy 545 - defektywny 328, 553 - faga λ 592 - fagooporny 544

714

-

- Fruc 555 - indukowany 548 - jednostopniowy 615 - kataboliczny 554* - konstytutywny 629-631 - opornościowy 554* - R82 - regulatorowy 554* -, selekcja 553 -, - pośrednią metodą replik 543, 544 - supresorowy 545 - warunkowo letalny 187, 557 - wielokrotny 570 -, wzbogacanie puli 555-557 - zależny od temperatury 554*, 557 - z zaburzeniami regulacji 629-632 mutaza metylomalonylo-CoA 355*, 356 mutualizm 243, 646 mycetoma 631 Mycobacterium 45, 108, 121, 138, 241*, 526 - gordonae 448* - leprae 129, 655* - phlei 109* - tuberculosis (prątek gruźlicy) 110, 129, 655* mycoderma aceti 72, 85 Mycoplasma 44, 122, 160 - canis 161 - gallisepticum 161 - hominis 161 Mycoplasmatales 160 mykobakterie p. prątki mykotoksyny 270 myksameba 206*, 208 Myrica 493 Myrothecium verrucaria 503*, 504 Myxococcus 108, 153 Myxomycetes (śluzowce) 204, 207, 208, 209, 428 - cykl życiowy 206* Myxosarcina 123, 164 NAD (dinukleotyd nikotynamidoadeninowy) 279*, 282, 292, 293, 295, 302, 304*, 307, 333 NADH, 283, 291-293, 295, 307, 333, 336, 337, 341, 449, 451, 620, 628

NAD/NADH2 333, 336, 337 NADP 279*, 282, 292 NAD(P)H283, 291, 292, 451 nadtlenek 161, 312, 313 - wodoru 313, 412, 519 naftalen (naftalina) 129, 532*, 585* naftochinon 301 naftol 360, 522 namuł 515 naprawa DNA 548*, 557-559, 551*, 562 - konstytutywna 559 - przez wycięcie 558 - SOS 558, 559 - w ciemności 558 - w obecności światła 558 narośl 192, 193 Natronobacterium 230* nawietrzanie hodowli 233-236 Nectria 204 - cinnabarina 220 - galligena 220 nefelometria 246 Negli 542 Neisseria 96, 118*, 120, 124 - meningitidis 124, 655* - gonrrhoeae 124, 655* nekrotyczne plamy 171, 172 nematocyda 534 Neocallimastix 509 - frontalis 503*, 507 neomycyna 64, 263 -, oporność 583 nerki 315, 316 Neuberg C. 338, 339 - ramosa 157 neuramidaza 177 Neurospora 204, 205, 220 - crassa 55 neurotoksyna 270, 376, 655* neurotrop 174 neutralizm 646 neutrofil 230* Nevskia 122, 156* nić polinukleotydowa p. łańcuch polinukleotydowy - zakaźna 491 Nidulariales 204*

van Niel 476, 533 nigrozyna 83 nikiel 496, 583 nikotyna 585* nisza ekologiczna 635, 636, 658, 663, 664 Nitrobacter 28, 118*, 121, 312, 240* - agilis 437* -, czas generacji 251 - hamburgensis 437* -, lamelle 67 - winogradskii 435-437* Nitrobacteraceae 437 Nitrococcus mobilis 437* nitrogenaza 168-170, 386, 447, 488, 489, 494, 496, 497 -, redukcja acetylenu 497 - żelazo-siarkowa 496 Nitrospira 121 Nitrosococcus 118*, - lamelle 67, 68 - oceanus 68*, 437*, 121 Nitrosolobus 118*, 121 - multiformis 437* Nitrosomonas 28, 118*, 121, 137, 240*, 438, 440* - europaea 435-437* -, czas generacji 251 , lamelle 67 -, karboksysomy 100 Nitrosospira 118, 121 - briensis 437 Nitrosovibrio 118*, 438 nitrozoamina 654 nitryfikacja 28, 436-440, 664 - heterotroficzna 439 -, odwrócony transport elektronów 439, 440 -, rola w glebach 438, 439 nitryfikator p. bakterie nitryfikacyjne Nocardia 108, 121, 129, 131*, 138, 241*, 516, 526, 576 -, koniugacja 581 - opaca 448*, 582 - saturnea 132* nokardie 99, 125, 128, 130, 526 Nostoc 123, 164, 165, 494 - muscorum 166* - punctiforme 494

715

nośnik (p. też wektor) 551 - lipidowy 86 nowobiocyna 64, 557, 558 nowotwór 192-197, 199 - łagodny (dobrotliwy) 194 roślinny 192-194, 584 - złośliwy (rak) 194 - zwierzęcy 194-197 N-serve (Nitrapyrin) 438 NTP p. nukleozydotrifosforan dNTP 590, 591 ddNTP 591 nukleaza 48 nukleoid 42*, 43*, 45-57 nukleokapsyd 171-174, 176-178*, 196 nukleoplazma 541 nukleosom 39, 663 nukleotyd(y) nietypowe 615 - pirydynowy 282, 297, 311 - purynowe i pirymidynowe, biosynteza 32, 322-324, 291, 453 nukleozydotrifosforan (NTP) 627 obieg azotu 28, 664 - fosforu 29 - siarki 29, 30, 664 - węgla 25-28 ocean 638 Oceanospirillum 122 ocet 31 octan 124, 281, 295, 333, 334, 336, 339, 349, 360, 361, 367*, 369-371, 374, 379*, 506, 607 - jako substrat 314, 317, 318, 320, 367* -, utlenianie 388, 394 -, wykorzystanie przez bakterie metanogenne 396, 397 -, źródło węgla 405 oczyszczalnia ścieków 129, 534, 635 oczyszczanie ścieków 243, 644-646 odczynnik Ehrlicha 360 oddychanie 26*, 40, 41, 113, 325, 497 - azotanowe 28, 135, 137, 236, 381, 382-386, 438, 446, 599 - beztlenowe 23, 314, 333, 380, 381*, 447, 533, 661 - fumaranowe 355, 362, 381, 403, 404

716

- mrówczanowe 381* - siarczanowe 102, 381*, 387, 388, 446, 664 - siarkowe 143, 333, 381*, 394, 395 - „świetlne" 451 - tlenowe 24*, 228, 237, 381* - węglanowe 381*, 398, 402, 446 - żelazowe 381* odoskrzelowe zapalenie płuc 160* odpowiedź SOS 558, 559 odra 173 odwodorowanie (p. też utlenianie) 276, 282 odwrotna transkrypcja mRNA 196, 591 - transkryptaza 64, 195, 196, 591 odwrócone powtórzenia 564 odżywianie, typy 236, 237 ogonek faga 182, 183*, 187, 189* oidium (artrokonidium) 203* okenon 469 okres latencji faga 185, 186, 187 okrzemki 642 oksamycyna p. C-cykloseryna β-oksydacja 527, 528* oksydaza 523, 662 - aldehydowa 313 - aminokwasowa 312, 525 - cytochromowa (p. też cytochrom a) 261, 302-306, 310*, 312 - -, test 124, 125 - fenolowa 520 - glukozowa 312, 412, 432, 519 - ksantynowa 312, 313 - NADPH 313 - siarczkowa 443* - siarczynowa 443* - siarkowa 443 oksydoreduktaza chinon: cytochrom c 310* - ferredoksyna: H2 335 - hydroksyloaminowa 438 - NADH: O 310* - pirogronian: ferredoksyna 294, 334, 335, 370*, 377 - pirogronian: H2 335 oksygenacja 451, 522 oksygenaza 418, 522, 529 - alkanowa 527 oksytetracyklina 427

oligonukleotyd 552, 591 onkogen 192 Onkogeneza 192, 197 oogonium (lęgnia) 203 Oomycetes 201*, 204*, 205, 209 oosfera 211 Oparin 658 operator 559, 575*, 609, 613, 629 - lac 612 operon 609, 610 - arabinozy (ara) 610, 613 - argininy 606, 610 - bio 562, 569 - galaktozy (gal) 191, 562, 569, 610 , indukcja 629 - histydyny (his) 610 - hut 614, 615 - indukowany 610 - laktozy (lac) 575*, 610-613 - maltozy 613 - ramnozy 613 - reprymowany 610, 612, 613 - tryptofanu (trp) 610, 613, 614 opina 193 oporność, antybiotyki 194, 566 -, fagi 185 -, herbicydy 194 -, szkodniki 194 opryszczka 174* oranż akrydyny 110, 548*, 573* organelle 22, 41, 42, 170, 202 organizmy aerofilne 94 - haploidalne 39, 44 - metanogenne 24* - oportunistyczne 199 organotrof 237 origin (początek) replikacji plazmidu 577 oriT 580 ornityna 73, 167, 322*, 605 Orthomyxoviridae 198 orzęski 117*, 148, 506, 644, 649, 650 , odstępstwa od uniwersalności kodu 62* osad czynny 128, 645 - denny 14, 133, 333, 443, 446, 641*, 642, 650 - ściekowy 149, 645 Oscillatoria 123, 150, 152*, 164, 165, 169

- agardhii 101 - guillermondii 136 - limnetica 170, 644 - princeps 169 - rubescens 165 Oscillochloris 123 Oscillospira 121 osłonka faga 173, 174*, 176, 177, 180, 195, 196, 198 osłony komórkowe 158, 323, 324, 331, 404, 613 - bakterii gramujemnych 79-82 ospa prawdziwa (variola) 173, 180, 181 - wietrzna (varicella) 173, 174*, 180 otoczka 42*, 67, 83-86, 113, 134, 135, 163, 165, 357, 567 owady 501*, 502 - a wirusy 172, 173 owocnik 202, 203, 214, 215, 219, 222, 223 paciorkowce 44*, 344, 346, 431, 582 -, plazmidy 582 pakiet 44, 72, 86, 113, 123 pakietowce 44* paleozoik 24* pałeczki 44, 45, 113, 119, 120, 160, 347* - gramdodatnie 126 - gramujemne 357, 407, 489 beztlenowe 140, 141 -, magnetotaksja 95 pantotenian 226* Panus 363, 519 papillomawirusy 173 papovawirusy 174 papuzica 655* PAPS (fosfoadenozynofosfosiarczan) 389 para koniugacyjna 574 Paracoccus 120 - denitrificans 118*, 240*, 299, 305, 382, 448*, 525 parafina 379, 526 - rozkład 522, 527, 528* parafiza (wstawka płonna) 219, 223 paraliż dziecięcy (polio) 173 - układu oddechowego 376 Paramecium aurelia 649 Parasponia parviflora 493

717

parch ziemniaka 442 parowanie chromosomów 663 - zasad 53 pasożyt 144, 146, 158 - bezwzględny (obligatoryjny) 122, 209, 220, 654 - komórkowy 158-160 - nabłonka śluzowego 161 - stawonogów 149 pasożytnictwo 646 Paspalum notatum 495, 648 pasteryzacja 102, 264, 267, 270 - mleka 159 Pasteur L. 312, 333, 338, 599 pasza 342 patogen 158, 584 roślin 209 pączek 155, 157 pączkowanie 157, 161, 163, 461 - grzybów 202, 203*, 211, 218, 223 Pediococcus 120, 123, 125 Pedomicrobium 157 pektyna 27, 514 -, rozkład 367*, 368 pektynaza 32, 357 Pelochromatium 474 - roseum 465 Pelodictyon 101, 123, 643 - clathratiforme 463, 464 Pelomyxa palustris 650 Pelosigma 122 Peltigera 494 Penicillium 202, 204, 218, 219, 418, 432 - camemberti 219 - cascicolum 219 - chrysogenum 219, 292, 424* - italicum 514 - notatum 219, 420, 424 - roqueforti 219 penicylina 31, 124, 129, 141, 162, 219, 239, 252, 263, 396, 426, 556, 557 - benzylowa (penicylina G) 419, 425 -, działanie 76, 77, 79 -, oporność 564, 583 - półsyntetyczna 424 penicylinaza 583 penton 179

718

pentoza 48, 337, 342, 508 -, fermentacja 337, 354, 378 Pentozofosforan 290, 291, 299, 344, 524 Peptococcus 120, 123 - anaerobiosus 368* pepton 229, 422*, 536, 621 Peptostreptococcus 120, 653 Peptydoglikan (p. też mureina) 44, 73-79, 92*, 114, 169, 170, 263, 396 -, biosynteza 78, 79 peptydylotransferaza 263 perkolacja 234, 235 permeaza 65, 309, 324, 326, 511 - β-galaktozydowa 575*, 611*, 612 peroksydaza 313, 519 peroksysom 663 Peronosporales 204, 209 perytecjum 204, 215, 216*, 218, 220*, 221 pestycydy 534 - biologiczne 101 Petunia 194 Peziza 204, 221, 418 pęcherzykowe zapalenie jamy ustnej 80 Phallales 204* Phallus 223 Phanerochaete chrysosporium 519, 535 Pholas dactylus 365 Pholiota 519 Phoma 204* Phormidium 123, 165 Photinus pyralis 363, 365 Photobacterium 121 - phosphoreum 364 Phycomycetes (grzyby niższe) 201*, 204, 411 Phycomyces blakesleanus 211 Physarum 204* - polycephalum 208 Phytphthora infestans 209 piaskownik 645 Picornaviridae (ρ. też pikornawirusy) 198 piericydyna A 306 pierścień izoalloksazynowy 300 - β-laktamowy 425*, 427 - pirydynowy 282, 283 - aromatyczny 529-531 pierwiastek śladowy p. mikroelement pierwotniaki 22, 39, 199, 504, 641*, 649, 650

-, wymiary 33 - żwacza 506, 650 pigment (ρ. też barwnik) anten 470 - fluoryzacyjny 137, 330 pikornawirusy 174 pikromycyna 427 Pilolobus 212 pilus 42, 92, 93 - płciowy (pilus F) 92, 572*, 573, 580, 595 - typu I 92 pilzatropina 428 pinocytoza 41, 176, 196, 664 piocyjanina 109*, 137 piocyna 584 piorosfataza 285 piowerdyna 112 pirofosforan tiaminy (TPP) 294, 295, 337, 348, 362, 363 pirofosforylaza 627, 628 pirogallol alkaliczny 236 pirogronian 276, 285, 288*, 289, 291, 292, 294, 297, 307, 314, 315*, 321, 322, 334, 335, 337-339*, 343, 344, 361, 362, 367*, 379*, 453, 454, 606 -, utlenianie 293-295, 316 pirokatechina 530*, 531 pirol 108 pirolochinolinochnon (PQQ) 279*, 280* pirydoksal 538 pirydoksyna 226*, 279* pirymidyna 47, 48, 162, 274, 345, 368, 548, 647 -, czynnik wzrostowy 277 -, rozkład 368 , synteza 601 piryt 444, 659, 660 piwo 31, 342 Planctomyces 117*, 122 Plasmodiophoromycetes 204* Plasmospara viticola 209 plastochinon 301, 482*-484* plastocyjanina 482*-484* plazma krwi 84 plazmid(y) 56, 489, 564, 577 - 586 -, amplifikacja 578 - bakterii gramujemnych 581 -, cechy kodowane 582-586

- ColEl 578, 581, 582 - degradacyjne (TOL, NAH, 2, 4-D, OCT, SAL, CAM, NIC) 585* - F p. czynnik F -, forma ccc (ang. covalently closed circular) 579 -, oc (ang. open circular) 579 -, grupa IncQ 581 - hybrydowe 366 - - IncPl 581 - kodujące bakteriocyny 584 - koniugacyjne 577, 579, 580-582 - kryptyczne 582 —, liczba kopii 577 - liniowe 56, 582 -, mobilizacja 582 -, niezgodność 578 - opornościowe (R) 582, 583 - pBr 322, 592-594 - pC194, 581 - pSUP202, 588 -, początek replikacji (origin) 577 - pomocnicze 582 - RP4 581 - RSF1010 581 -, szeroki zakres gospodarza 581-583 - Ti 193, 194, 595, 597 -, wąski zakres gospodarza 581 -, wektor 193, 194, 551, 552, 577 -, wielkość 579 -, znaczenie biologiczne 582-586 plazmodesma 37* plazmodium 206-208 plazmogamia 203, 205, 206*, 208, 214, 221, 222* plazmoliza 43*, 71 plecha 201, 205, 209 Plectomycetes 204, 215, 218, 219 Plectonema 123, 165 plektenchyma 202 plemnia (anterydium) 203, 210, 211, 214 pleomorfizm 108, 542 pleśń 232 Pleurocapsa 123, 164 pleuropneumonia 161 Pleurotus ostreatus 519 plon bakterii 257, 258

719

plon faga 186 płaszcz spory 46* - wirusa 171, 173, 186, 187 płodozmian 489 płonica (szkarlatyna) 655* płyn Lugola 96 płytka Petriego p. szalka Petriego - podstawowa faga 182, 184, 185 - równikowa 38* pływka (p. też zoospora) 202, 206*, 208, 209 pneumokoki 83 pochewka 85, 86, 139, 165 faga 183*-185 Podangium 153* podkładka 220* podłoże (pożywka) mikrobiologiczne 35, 225, 226, 228-232, 536 - - agarowe 72, 132*, 162, 239, 241 bezazotowe 239 , ciśnienie osmotyczne 231, 232 - - EMB 359 hipertoniczne 162 izotoniczne 162 - - mineralne 129, 170, 345 minimalne 229, 570, 594 - -, pH 229-231, 240 - - płynne 207, 228, 229, 238, 249 selekcyjne 553 - - stałe 229, 238, 250 syntetyczne (zdefiniowane) 170, 505, 226, 228 , wilgotność względna 231 wzbogacone 345 - - złożone 229, 233* podstawczaki 72, 516, 519 podstawka 220* podtlenek azotu 27, 28*, 382, 383 podział komórki 50, 244 koniugacyjny 203 nierówny 104 - - poprzeczny 44, 157, 161, 163, 169 redukcyjny p. mejoza Pogonophora 444, 649 pola irygacyjne 646 - ryżowe 27, 165, 395, 494, 501 polaryzacja błony 485

720

poliasparaginian 167 policistron 610 polietylenoglikol 567 polifosforany 42*, 45, 95, 96, 99, 144, 217*, 473 polifruktoza 84 polifruktozan p. fruktan poligalakturonaza 514 poligalakturonid 514 poli-l, 4-α-D-glukoza 509 poliglukozoamina 516 polihydroksyalkanian (PHA) 434 polihydroksykwasy tłuszczowe p. hydroksypolialkany poli-β-hydroksymaślan 434, 437, 473 poliizoprenoidy 378 polimeraza DNA 53, 196, 591 - - I 54, 590* - - III 54* - RNA 263, 609 archonów 142 DNA zależna 609 Escherichia coli 60 , podjednostki 610 prokariotyczna 64 polimyksyna 260, 427 polinukleotyd 275 poliole 378 polisacharyd 27, 79, 83, 84, 168, 275* -, materiał zapasowy 103, 627 Poliomyelitisvirus 176 polirybosom p. polisom polisiarczek 394* polisom 42*, 59, 60, 63 Polyangium 153*, 154, 503*, 504 Polyoma 195 Polyporaceae 204* Polyporus adustus 519 Polystictus versicolor 519 pompa jonowa 326 zależna od ATP 325 - protonowa 299, 306, 485, 486 napędzana światłem 487 - sodowo-potasowa 328 por 311 -, błona jądrowa 39 - centralny 202

porażenia pobłonicze 126 porfiryny 166, 345, 378, 660 Poria 519 porost 165, 495, 647*, 648 - Peltigera 165 poryna 82 posiew redukcyjny 242* posocznica 137 „postacie oddechowe Beijerincka" 94 potas 58, 411, 477 potencjał protonowy 309, 327, 328, 403* - redoks 301, 302-306 składników łańcucha oddechowego 304* poziomy przekaz informacji genetycznej 661 pożywka p. podłoże półpasiec (herpes zoster) 180 PPLO (ang. pleuropneumonia like organisms) 161 praca osmotyczna 311 prątki (mykobakterie, p. też Mycobacterium) 99, 110, 125, 128-130, 331, 526, 651 glebowe 130 - gruźlicy (p. też Mycobacterium tuberculosis) 128, 129 - patogenne 130 - saprofityczne 129 prekambr 24*, 662 presja selekcyjna 583 prespora 103* primer RNA 53*, 54, 591 probazydium 223 proces Habera-Boscha 488 - paraseksualny 560 - różnicowania 104 Prochloron 170 - hollandica 170 Prodigiozyna 109*, 111 producenci 25 produkcja pierwotna 638, 639, 641*, 643, 646 - wtórna 638, 641* produkty mleczne 346, 352 - zapasowe, synteza 626 profag 188, 189*, 191, 192, 560, 562, 570, 572 -, indukcja 560

profaza 38* Proflawina 547, 549 progametangium 213 progenota 24 prokariota 159, 163, 170, 633 Prokaryota 21 22, 24, 25, 44, 102, 116, 572, 582 -, hamowanie syntezy białka 64 -, symport 328 promienica 130 promieniowanie 557, 558 - jonizujące 269, 271, 550 - UV 47*, 106, 108, 111, 189*, 191, 268, 271, 416, 548*, 550*, 558, 559, 570, 577, 579 , indukcja mutacji 550, 551 - Χ268 - y 268 promieniowce 31, 45, 99, 111, 120, 125, 130-133, 230*, 331, 418, 420, 426, 427, 432, 503*, 512, 514, - celulolityczne 504 -, kolonie 130-132* -, wiązanie azotu 493 promotor 60, 575*, 595, 609 - faga λ 595 - lac 612 2-propanol 31, 281, 343, 366, 367*-371, 378*, 379* propionian 356, 379*, 388, 404, 506 Propionibacterium 121, 354, 404 - acidi-propionici 353, 354 - acnes 354 - freudenreichii 353 - shermanii 353 β-propionolakton 269 propylen 438 2-propylo-β-tiogalaktozyd 602 Prosthecochloris 123, 463 Prosthecomicrobium 122, 156*, 157 proteaza 376, 431, 432 - wewnątrzkomórkowa 535 - zewnątrzkomórkowa 535, 536 proteinazy 655* - asparaginowe 535 - cynkowe 535 - cysteinowe 535

721

proteinazy, produkcja 32 - serynowe 535 Proteobacteria 118*, 119 proteohormony 596 Proteoliza 28*, 358* - białka LexA 559 Proteus 358, 404 -, formy L 162 - mirabilis 89* -, rzęski 87, 89* - vulgaris 92, 357, 536, 538 Protista 21 Protoascomycetes 204, 215, 216 protocyt (p. też komórka prokariotyczna) 22*, 42, 298*, 664 protohem 492 protomer 179 protoplast 40, 43*, 65, 71, 72, 76, 77, 104, 148, 160, 162, 165, 512, 567, 595 - grzybów 203, 213, 221, 512 - glonów 512 protoplastyzacja komórek 566 prototrof 227, 555, 556 prototrofizm 552, 566 próchnica gleby 128, 521 - zębów 84, 85 Prusiner S. 198 prymaza 103* przecinkowce 44, 45, 143 - beztlenowe 140, 146 przeciwciała 179, 181, 595 - monoklonalne 596 -, produkcja 32 przenośniki wodom i elektronów 309 przestrzeń perybakteroidalna 492 - peryplazmatyczna 73, 80*, 82, 390, 409 przeszczep 596 przewód pokarmowy 140, 144, 652 przetrwalnik (p. też endospora, spora) 72, 96, 100, 264, 269 przeziębienie 173, 198 przeżuwacze 649 pseudobaktyna p. piowerdyna Pseudomonadaceae 137, 138 Pseudomonadales 228, 230 Pseudomonas 34*, 42, 45, 118*, 121, 136, 137, 145*, 232*, 241*, 315, 320, 417,

722

430, 432*, 512, 513, 515, 516, 525, 526, 528, 536, 654 - aeruginosa (pyocyanea) 109*, 112, 137, 199, 292*, 330, 381*, 382, 384, 431*, 576, 655* , bakteriocyny 584 - carboxydoflava 448 - carboxydovorans 435, 448*, 450 - denitrificans 118*, 236, 381*, 382, 384 - facilis 448* - fluorescens 137, 241*, 384, 514 var. cellulosa 503*, 504 - indigofera 109*, 111 - pseudoflava 448* - putida 112, 137, 330, 604 -, rzęski 87*, 88, 90 - saccharophila 137, 292*, 448* - stutzeri 381*, 384 - syringae 137 -, transdukcja 568 pseudomureina 141 pseudoplazmodium 206*, 207 pseudopodia 207 pseudouracyl 60 psychrofil (kriofil) 232*, 233 - ekstremalny 637 ptomainy 537 Puccinia 654 Pulcherymina 109*, 110, 111 pullulan 431*, 513 pullulanaza 432, 510, 513 Pullularia 218, 431* pullulans (Dermatium pullulans) 218 purpurowe bakterie bezsiarkowe/siarkowe p. bakterie purpurowe bezsiarkowe/siarkowe puryna 47, 48, 162, 274, 345, 548 -, czynnik wzrostowy 227 -, rozkład 368 -, synteza 601 putyredoksyna 301 putrescyna 537 Pyrenomycetes 204, 215, 219-221 Pyrobaculum 232* Pyrococcus 121 Pyrodictium 121 - brockii 232*, 395

- occultum 143, 230*, 232, 381, 393 Pyronema omphalodes (P. confluens) 221 racemaza mleczanowa 347 rafinoza 653 rak roślinny 192 ramka odczytu, zmiana 546, 547 ramnoza 82, 83 Rauwolfia 194 rdzeń LPS 81 reakcja(e) addycji 419 - alergiczna 425 - anaplerotyczna (uzupełniająca) 277, 297, 314, 315, 317, 415, 455 - Neufelda 83 - Sticklanda 374, 367* - uzupełniające p. reakcja anaplerotyczna - Voges-Proskauera 360, 362 - Wooda i Werkmana 354 rearanżacje jądrowe 38 receptor, chemotaksja 82 - fagowy 185 - komórki 196 redukcja (p. też uwodorowanie) 282 - azotynu 300 - siarczynu 300 reduktaza APS 389, 442, 443* - azotanowa 404 - - A 383, 385 - - Β 386 - azotynowa 383, 385, 386 - cytochromowa 261, 304-306, 310* - fumaranowa 314, 362, 403*, 404 - hydroksypirogronianowa 524*, 525 - NADH-Q (p. też dehydrogenaza NADH) 306 - nitrogenazowa 496 - podtlenku azotu 383 - siarczynowa 386, 389* - tlenku azotu 383 region inc 578 - jądrowy 158 regulacja allosteryczna 629 - autogenna 614 - relaxed 615 - stringent 615

rekombinacja genetyczna 39, 551, 558, 560-564, 569, 582, 583, 597 , częstość 571 ogólna (homologiczna) 561, 562, 567, 574 pokoniugacyjna 571*, 572 zależna od miejsca (zlokalizowana) (ang. site specific) 191, 561-563, 565 „określona przez dwa miejsca" (ang. double site-specific) 562 „określona przez jedno miejsce" (single site specific) 562 z genomem roślinnym 194 rekombinant 561, 567, 571 renina 353, 431 repelent 93* reperacja DNA p. naprawa DNA replikon 663 represja enzymu p. enzym, represja - kataboliczna 602, 607 609, 611*-613, 320, 329, 503 operonu laktozy 612, 613 operonu tryptofanu 613 - wielowartościowa 606, 607* - syntezy enzymów 600-602, 605, 606, 614* represor 609, 613-615, 629 - faga λ 595 - profaga 190 - lac 612 resolwaza 565 restrykcja i modyfikacja DNA (p. też system restrykcyjno-modyfikacyjny) 586-588 retikulum endoplazmatyczne 37*, 40, 217*, 663 retrowirus 174*, 176, 192, 195, 199, 565, 595 - cykl rozwojowy 196, 545 rewersja (mutacja powrotna) 552, 559* rewertant 631, 571 - prototroficzny 632 rezorcyna 236 Rhizobium 41, 118*, 121, 138, 192, 230*, 448, 488-491, 576, 635, 649 - leguminosarum 491* - lupini 491* - meliloti 491*

723

Rhizobium phaseoli 491* - trifolii 491*, 498 -, transdukcja 568 Rhizoctonia solani 503, 504, 514 Rhizopus 202, 412 - arrhizus 211, 418 - nigricans (R. stolonifer) 211-213* - oryzae 211 - rouxii 211 Rhodobacter 118*, 122, 461, 495 - capsulatus 461, 471 - sphaeroides 459*, 461, 485* - sulfidophilus 461 Rhodocyclus 118*, 122 - erythropolis 525 - purpureus 451 Rhodomicrobium 122, 156*, 461 - rubrum 467* vannielii 157, 461, 462* Rhodopila 118*, 122 - globiformis 461 Rhodopseudomonas 118*, 122, 461, 495 - acidophila 461, 471 - palustris 461, 462, 533 - sphaeroides 479 - sulfidophila 462 - sulfoviridis 461 Rhodospirillaceae (p. też bakterie purpurowe bezsiarkowe) 458, 472, 474, 661 -, hodowla wzbogacająca 240* -, transport elektronów 480* Rhodospirillum 118*, 122, 454*, 461, 495 - fulvum 461 - molischianum 461 - photometricum 461 - rubrum 67, 458*, 459*, 461, 467*, 628 Rhodotorula 99, 108, 110 - rubra 647 Rhytisma 204* - acerinum 221 Rhyzophydium pollinis 209 Ricketts 158 Riftia pachyptila 444, 649 Rikettsia 122 - prowazekii 158, 159, 655* - typhi159 riketsje 122, 158, 159, 426, 654

724

rinowirusy 198 RNA 21, 59-64, 158, 159, 171, 250, 251 -, budowa 59, 60 - mRNA 39, 57, 60, 61*, 63, 546, 547, 610 , czas półtrwania 610 - rRNA 23, 39, 57, 115, 116, 610 - - 5S 114 , - archeonów 142 - - 16S 114, 116, 142, 463 , - archeonów 142 - tRNA 39, 61*, 63, 545, 546, 610 - wirusów 176 jednoniciowy 173, 197 dwuniciowy 173 RNA wirusy 198 RNA-zależna polimeraza DNA p. odwrotna transkryptaza robaki 314, 316, 404, 501*, 502 rodnik hydroksylowy 27, 269, 313, 395 rodopina 469 rodopinal 469 rodopsyna 487 rodzaj (genus) 114, 205 rodzina 114, 205 ropa naftowa 26*, 27, 129, 378, 500, 657 - rozkład 522 -, zanieczyszczenie środowiska 532, 533 ropień 655* rostek 210, 214 rośliny 40 - dwuliścienne 595 - jednoliścienne 194 - motylkowe 138, 446, 488-490*, 635 , brodawki 41 - niższe 39 rotenon 306 rozmnażanie płciowe 560 rozprątki (p. też Schizophyta) 113 rozprzęgacz 328, 340 rozwój konwergencyjny 119 równanie Hardena-Younga 338 - Hendersona Hasselbacha 230, 231 - Nernsta 303 - Neuberga 338, 339 rtęć, oporność 564, 583 Rubner 33 rubredoksyna 301

ruch 87, 93-95, 284 - pełzakowaty 465 - ślizgowy 44, 150, 152, 163, 164, 465 sinic 169 -, rzęski 311 ruchome elementy genetyczne 562 ruda bagienna 656 - darniowa 565 - siarczkowa 444, 445 - żelaza 656 Ruminococcus 120, 123, 371 - albus 336, 375, 503*, 507 - flavefaciens 503*, 507 rurka Durhama 359, 392 rybitol 75 ryboflawina 279*, 429 rybonukleotyd 323 rybosom(y) 42*, 46, 57, 58, 59, 61*, 63, 116, 217*, 250, 251, 546, 547 - archeonów 396 - chloroplastów 58, 263 - eukariotyczne (80S) 22, 37*, 58 - mitochondriów 58, 263 - prokariotyczne (70S) 23, 41, 43, 58, 163, 263 ryboza 283, 314, 323 rybozo-5-fosforan 284, 290*, 291, 321, 323, 453 rybulozo-l, 5-bisfosforan 451, 453, 628 rybulozo-5-fosforan 290, 291, 348, 349*, 452, 453, 524 ryby 638, 641* ryfampicyna 64, 142, 263 rystocetyna 79, 422 ryzobia 489, 490*, 492, 496, 498 - wolno żyjące 492 ryzoid 212 ryzomorfa 202, 221 ryzosfera 495, 648 rząd 205 rzęska 44, 67, 87-95, 113, 148 -, działanie 90, 91 - eukariotyczna 42 -, identyfikacja 88-90 -, Ultrastruktura 91, 92 -, ułożenie 87, 88 -, - amfitrychalne 87*, 88

-, - biegunowe (polarne) 90, 91, 138, 139, 157, 364, 441, 463 -, - boczne (lateralne) 89* -, - dwubiegunowe 87*, 88 -, - jednobiegunowe 87*, 88*, 91 -, - lofotrychalne 88 -, - perytrychalne 87*-91, 102, 125, 134, 140, 144, 192, 364, 357, 462 -, - politrychalne 87*, 139, 460* rzeżączka 124 Saccharomyces 342 - cerevisiae 216 , cykl życiowy 217 , drożdże piekarnicze 341 , fermentacja alkoholowa 337-341 , genom 218 , plazmidy 581 - rouxii 232 Saccharomycetaceae (drożdże właściwe) 204, 216 sacharaza dekstranowa 84 - lewanowa 513 sacharoza 71, 162, 284, 354, 513 -, próchnica 84 salicylan 529, 532*, 585* salina 143 Salmonella 96, 121, 140, 404, 576 -, cechy diagnostyczne 358* - enteritidis 655* -, fag P22 182* -, formy L 162 , LPS 80, 82 - paratyphi 655* -, rozkład histydyny 614 -, rzęski 565 -, transdukcja 568, 569 - typhi 358, 655* - typhimurium 80, 82, 358, 559*, 560, 615, 655* samoniezgodność (inkompatybilność) 205 samoskładanie faga 189 samozapłodnienie 205 saprofit 146, 220 Saprolegnia 209, 210, 411 Saprolegniaceae 210 Saprolegniales 204

725

Saprospira 150, 152* - grandis 153 Sarcina 120 - ventriculi 123, 230, 343 - -, celuloza 72, 85 —-, pakiety komórek 86* sarcynoksantyna 109* Scenedesmus acutus 467* Schardinger 511 Schizomycetes 113, 163 Schizophyceae (p. też sinice) 113, 163 Schizophyta 113, 163 Schizosaccharomyces 203 Sclerotina sclerotium 221 scrapie 198 SDS (dodecylosiarczan sodu) 270 sedoheptulozo-l, 7-bisfosforan 452, 453 sedoheptulozo-7-fosforan 453 Sefadeks (Sephadex) (p. też żel dekstranowy) 84, 430 segment G 565 segregacja chromosomów 553 sekwencja insercyjna (element IS) 562, 563-565 - nukleotydowa, określanie 589 sekwencjonowanie DNA 552, 590, 591 , metoda dideoksy wg Sangera 591, 594 , - Maxama-Gilberta 590 selekcja penicylinowa 554* selenocysteina 62 Selenomonas 122, 141, 146, 354 - ruminantium 146, 302, 356, 507 -, rzęski 88, 89* - sputigena 146 Seliberia 122 semialdehyd asparaginianowy 623 - kwasu winowego 318, 319 semichinon 299, 310* septa (grzyby) 201*, 202, 212-214, 222 ser(y) 128, 333, 352 - pleśniowe 352 - twardy 431 - twarogowy 128 serodiagnostyka bakterii 92 serotransferyna 331 Serratia 121, 358*, 363

726

- marcescens (Bacterium prodigiosum) 109*, 111, 357 Sesbania 491* - rostrata 493 sferoiden 469 sferoidenon 469 sferoplast 77, 146 Shepherdia 493 Shigella 121, 140 -, cechy diagnostyczne 358* - dysenteriae 80, 358, 655* - flexneri 584 - paratyphi 81* -, plazmidy 582 -, transdukcja 568 Shine-Delgarno Box 546 siano 132 siarczan 29*, 30, 82, 285, 314, 333 - laurylu 46 - redukcja asymilacyjna 29, 30, 277, 388, 389 -, - dysymilacyjna 29, 30, 380, 387, 389, 390, 395, 446 siarczek 29*, 30, 300, 312, 387, 444 -, utlenianie 150 siarczyn, czynnik redukujący 236 -, konserwacja wina 272 -, redukcja 395 -, utlenianie 442 siarka 29*, 30, 42*, 45, 300, 312, 314, 333 -, izotopy 657 -, krople 69*, 460* , materiał zapasowy 95, 96, 100, 471 -, redukcja 29, 142, 380, 394, 395 -, utlenianie 441, 442, 480 - wewnątrzkomórkowa 150 -, złoża 392, 657 siarkowodór 100, 143, 152, 332, 333, 336, 393, 394, 506 -, utlenianie 441-443, 462, 480 -, źródło siarki 227 Siderocapsa 657

siderofor 111, 112, 330, 331, 405, 584 - hydroksylamowy 330 siedlisko 113, 158, 633, 635 - ekstremalne 163, 495 bakterii fototroficznych 473

siła protonomotoryczna 299, 309, 312, 478 siły van der Waalsa 49, 502 Simonsiella 150 - crassa 151 sinice (Cyanobacteria) 21, 25, 40, 97, 100, 101, 116, 117*, 123, 150, 153, 163-170, 239, 387, 456, 468, 474, 641*, 642, 648, 650, 661, 466, 469 -, budowa 165, 167 - chrookokalne 163, 165, 170 -, ekologia 165 -, fotosynteza 163, 486 -, karboksysomy 100 -, morfologia i klasyfikacja 163-165 - pleurokapsularne 164, 169 -, podłoże wybiórcze 239 -, ruch 169 - wiązanie azotu 29, 168, 493-496 -, wymiary 33 -, wzrost chemoorganotroficzny 170 sirohem 386 skały osadowe 659 skamieliny mikroorganizmów 634 sklerocjum 220 sklerota 206* skrining (ang. screening) 416 skrobia 27, 227, 342, 367, 509 - 511, 624 -, budowa 96 -, rozkład 367*, 368, 375, 510 - , fosforoliza 510 - kwaśna hydroliza 510 -, reakcja z jodem 96, 510, 511 -, transglikozylacja 511 słód 342, 353 Solanaceae 194 solanka 487 sole Grahama 99 solenie żywności 271 somatogamia 221 sonda DNA 33, 564 Sonneborn 649 Sorangium 503*, 504 sorbitol 162, 408, 429, 607 sorboza 408, 417, 429 Sordaria 204 - fimicola 220 sorokarp 206*, 207

sód 328 Sphaerotheca mors-uvae 220 Sphaerotilus natans 100, 121, 138-140, 644 -, pochewki 85 Spirillum 122 - volutans 99, 144, 87*, 88, 90 Spirochaeta 122, 148 - plicatilis 149 - zuelzerae 149 spirochety (p. też Spirochaeta) 117* Spiroplasma 122, 161, 162 - citri 162 Spirulina 123, 152*, 153, 164, 165 spiryloksantyna 469 splicing RNA 663 spora (p. też endospora, przetrwalnik) 46*, 77, 136, 267, 344, 514 - promieniowców 130, 131*, 133 - (zarodnik) 206*-208 sporangiofor (trzonek sporangialny) 131*, 212, 213 sporangiola 212 sporangiospora 211 sporangium (promieniowców) 130, 131*, 133 - (zarodnia grzybów) 202, 206, 208, 209, 212, 213, Sporobolomyces salmonicolor 110, 223 Sporobolomycetaceae 223 Sporocytophaga 108, 154, 155, 241*, 503*, 504, 509 sporofor 130, 131*, 133 Sporolactobacillus 102, 121, 134 - inulinus 344, 353 Sporomusa 454 Sporosarcina 102, 121, 134 - ureae 241*, 135, 136, 538 sporulacja 77, 103-105 , indukcja 105 -, inicjacja 105 - endotroficzna 105 sporysz 220 sprzążka 222 sprzężniaki 72 srebro, oporność 583 stachioza 653 Stahl 51, 56

727

stan zapalny 161 stała Michaelisa-Menten 613 Staphylococcus 120, 123, 232, 578 - aureus 75, 78*, 421, 581, 655* -, koniugacja 581 -, plazmidy 581 -, transdukcja 568 starter RNA 581 Stent 51 Stereum hirsutum 519 steroid 161, 162, 323, 627, 656 -, produkcja 32, 418, 540 -, degradacja 378 sterygma 223 sterylizacja (wyjaławianie) 35, 102, 264 aparatów i instrumentów 269 - chemiczna 269, 270 - częściowa 264 - etapowa (tyndalizacja) 266 - glukozy 268 - metodą radiacyjną (naświetlanie) 264, 268, 269 UHT (ang. ultra high temperature) 267 - mleka 267 - nasion 269 - parą wodną 265-267 - powietrza 271 - przez filtrowanie 268 - żywności 269 sterylizator 267 Stibiobacter senarmontii 444 Stickland 374 Stigmatella 153* stos tylakoidalny 70 stosunek P/O 306 stratyfikacja wody 642 - odwrotna 642 Streptobacillus moniliformis 162 Streptococcus 44, 120, 123, 125, 140, 652 - bovis 346 - lactis 302 - mutans 84 -, plazmidy 581 - pneumoniae 346, 565, 566, 655* -, próchnica 84, 85 - pyogenes 346, 347*, 655* - salivarius 346, 347*, 363

728

- thermophilus 352 -, transformacja 565, 566 streptokoki p. Streptococcus streptokinaza 536 streptolidygina 142 streptolizyna 655* Streptomyces 121, 131*, 516 - aureofaciens 130, 426 - cellulosae 504 - coelicolor 576 - fradiae 418 - griseus 130, 292*, 425 -, koniugacja 581 -, lizozym 76 - sporangium 504 -, transformacja 567 - venezuelae 130, 426 Streptomycetes 420 streptomycyna 129, 130, 263, 425, 426 -, oporność 581-583 -, wzór 426 Streptosporangium 121, 131*, 133 Streptothrix 121 stres 637 - osmotyczny 637 - cieplny 637 stromatolit 24*, 25, 660 struktura β ρ. białka, struktura β strzępka 201-203 - dikariotyczna 214 - płonna 223 - powietrzna 202 - rozłogowa 212 - septowana 221 - workotwórcza 214 sublimat 269 substancje zapasowe 323 subtylina 260 subtylizyna 536 Succinivibrio 12, 141, 146 sucha masa p. masa bakterii sudan III 97 sulfanilamid 261, 262 Sulfolobus 121, 232, 441, 445, - acidocaldarius 230*, 232, 441*, 442, 444 sulfonamid 581, 582

sulfurylaza ADP 442, 443* - ATP 389 supresja genetyczna 547 surowica antyfagowa 186* - krwi 83, 161, 162, 331 suszarka 267 suszenie żywności 270, 271 syfilis p. kiła symbioza 28, 165, 336, 346, 349, 488, 493, 495, 501, 502, 506 - antagonistyczna 654, 655 - mutualna 398, 492, 633, 646-654 symbiont 158, 363 symport 327, 328 synchronizacja hodowli 259 Synechocystis 467* Synechococcus (Anacystis) 123, 164 - lividus 165 Synchytrium endoblasticum 209 syntaza acetylomleczanowa 363 - ATP 40, 67, 285, 299, 307, 309-311, 328 - cytrynianowa 317, 295, 626, 627 - glukozofosforanowa 524* - glutaminianowa 320, 321*, 499 - jabłczanowa 296, 317, 318, 415, 609 - kwasu hydroksyoctowego 621 - pirogronianowa 401 - semialdehydu kwasu winowego 318 syntetaza acylo-CoA 528* - aminoacylo-tRNA 63 - fosfoenolopirogronianowa 315*, 316 - glikogenowa 620, 627 - glutaminowa 320, 321*, 492, 498, 620 Syntrofia 394*, 395, 472, 501, 647 system fosfotrasferazowy (PTS) 328 -, transport glukozy 328 - ferrichromowy 330* - transportu elektronów, fotosyntetyczny 166 - - cukrów (HPr) 613 restrykcyjno-modyfikacyjny 585, 586 szalka Petriego 35, 108, 235, 422*, 543, 555, 631 - Kollego 235 szczawian 378 Szczawiobursztynian 295, 296

szczawiooctan 276, 277, 295-297, 314, 315*, 321, 322*, 355, 362, 404, 624*, 626 szczep 114 - indykatorowy (wskaźnikowy) 186*, 187, 421, 422 szczepienia ochronne 180 szczepionki 596 szkarlatyna p. płonica szlak(i) acetylo-CoA 378, 660-662 oksydatywny 391 - - reduktywny 390, 400-402, 454, 455 - akryloilo-CoA 356 - amfiboliczny 609 - Embdena-Meyerhofa-Parnasa p. szlak fruktozo- 1, 6-bisfosforanowy - Entnera-Doudoroffa (p. też szlak 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonianowy) 137, 449 , bakterie fototroficzne 472 - fosfoketolazowy 350 - fruktozo-1, 6-bisfosforanowy (FBF, glikoliza) 275, 286, 287-289, 291-293, 307, 332, 337, 341, 343, 347-349*, 354, 360, 369, 370, 376, 377, 416, 450, 451, 625 , bakterie fototroficzne 472 - heksozomonofosforanowy p. szlak pentozofosforanowy - kataboliczne zbieżne (konwergencyjne) 532 - 2-keto-adypinowy 530* - 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonianowy (KDFG) 275*, 286, 288*, 291-293, 343, 360 - kwasów trikarboksylowych, oksydatywny p. cykl kwasów trikarboksylowych - metaboliczne zbieżne (konwergencyjne) 604 - metylomalonylo-CoA 355, 356, 404 - mezakonianowy 373* - pentozofosforanowy 275*, 286, 288*, 289-291, 292, 293, 323, 348, 360, 452, 453 - rybulozobisfosforanowy (cykl Calvina -Basshama) 450-455 - serynowy 523, 524, 525 - Warburga-Dickensa-Horeckera p. szlak pentozofosforanowy

729

szok 637 - cieplny (termiczny) 106, 637 - osmotyczny 65, 76 ściana komórkowa 23, 36, 37*, 42*-46, 67, 69*, 70, 71-82, 103, 147*, 160, 275 archeonów 141 bakterii gramdodatnich 75 gramujemnych 75-77 , biosynteza 78, 79 - - grzybów 201, 202, 207, 217* riketsji 158 ścieki 124, 137, 393, 395 -, oczyszczanie 401, 402, 597 - przemysłowe 644 ślina 125, 149 śluz 84-86, 135, 157, 163, 165, 512 śluzorośla 205 śluzowce (Myxomycetes) 204*, 205 - komórkowe 205 - właściwe 205 śluźnia (plazmodium) 208 śmietana 352 środowisko 635 - beztlenowe 332, 333 - ekstremalne 636 śrubowce 44*, 45, 119, 144, 146 światło, działanie bakteriobójcze 109, 110 - UV p. promieniowanie UV świeca Chamberlanda 268 Τ ρ. tymina Taka-amylaza 512 Taka-diastaza 512 taksja 93, 208 taksonomia 114 - numeryczna 115, 116 tallakonidium 203 Tatum 570 technika(i) freeze-etching 68* - Hungate'a 396 - hybrydoma 596 - izotopowe 494 - kultur wzbogacających (p. też hodowla wzbogacająca) 346 - klonowania molekularnego 567 - rekombinacji DNA 193

730

technologia genowa 194, 406, 430, 577, 589, 596-598 tellur 581, 583 telluryn 239 temperatura topnienia DNA p. DNA, punkt topnienia wzrostu mikroorganizmów 232, 233 tempo mutacji 545, 555 telofaza 38* teoria chemiosmotyczna 309, 328 terapia antybiotykowa 346 - antywirusowa 200 - genowa komórek somatycznych 596 terminator 60, 610 termity 649, 502 termofil (p. też bakterie termofilne) 133, 135, 232*, 447 - ekstremalny 117, 143, 232, 395, 402, 637 termoklina 101, 641 terpen 378, 585* terramycyna 427 test Amesa 559*, 560 - dyfuzji na płytkach 422, 424 - z czerwienią fenolową 359*, 360 metylową 362 tetracyklina 130, 263, 426, 427 -, oporność 564, 581, 582, 594 tetrada 113, 123 tetraeter dialkilodiglicerynowy 142 tetrahydrofolian 402 tetraterpenoidy 469 tetroza 378 tępe końce 588 tężec 375, 376, 655* Thermoactinomyces 121 - vulgaris 133, 232 Thermococcus 121, 143, 232* Thermodiscus 121, 143 Thermoplasma 121 - acidophilus 143 Thermoproteales 143 Thermoproteus 14, 121, 232* - neutrophilus 143 - tenax 143 Thermosulfobacterium 388 Thermotoga 117*, 232* Thermus 121

- aquaticus 232 Thiobacillus 118*, 121, 129*, 137, 441 - denitrificans 240*, 384, 441, 442 - ferrooxidans 240*, 435, 440*, 441*, 444, 445, 656 - intermedius 441 -, karboksysomy 100 - neapolitanus 440* - novellus 441 - thiooxidans 230, 441, 444, 445, 656 - tioparus 441 Thiobacterium 121 Thiocapsa 118*, 122 - roseopersicina 457 - pfennigii 69*, 457, 461, 468 Thiocystis 118*, 122 - gelatinosa 457, 459* - violacea 457, 459* Thiodictyon 101, 123, 459*, 460, 643 - elegans 464 Thiomocrospira 441 - pelophila 441* Thiopedia 122, 459*, 460, 643 Thioploca 443 Thiorhodaceae 457, 475 Thiosarcina 122 Thiospirillopsis 152 - floridiana 153 Thiospirillum 118*, 122, 643 - jenese 43, 89, 91, 457, 473 -, rzęski 87* Thiothrix 29, 100, 150, 152, 443 Thiovulum 100, 121, 443 tiamina 226*, 279* 345, 475, 458* -, wzór 280* tiazol 647 tiobakterie p. bakterie siarkowe tiogalaktozyd 603 tioglikolan 236 tiokinaza 525 - jabłczanowa 524*, 525 tiometylogalaktozyd 629 tiosiarczan 312, 390, 441, 443, 480 tlen 304 -, akceptor wodoru 228 -, ciśnienie parcjalne 252, 261 -, transport 492

-, wpływ toksyczny 312, 313 tlenek azotu 28*, 383, 438 - etylenu 269 - węgla 261, 302, 306, 395, 398, 402 , utlenianie 438, 447 tlenowce (aeroby, p. też bakterie tlenowe) 20, 124, 128, 201, 240*, 312, 381* - ścisłe (obligatoryjne) 228, 233 - względne (fakultatywne) 236, 357 tłuszcze 323, 624* - grzybów 201, 217* -, materiał zapasowy 95, 627 togawirusy 174* toksyna(y) 123, 270, 376 - A (jad kiełbasiany) 376 - Bacillus thuringiensis 101 - błonicza 64, 142, 655* - grzybów 428 - a 655* toluen 529, 585 Torula 342, 353 Torulopsis 218 trachoma p. jaglica Trametes 519 transacetylaza 611*, 612 - tiogalaktozydowa 575*, 612 transaldolaza 290, 291 transaminacja 320, 321 transdukcja 192, 561, 568-570, 576 - ogólna (niespecyficzna) 568, 569 - specyficzna 569, 570 transduktant 569 transfekcja 187 transferaza CoA 355, 356, 369 transformacja 107, 124, 187, 433, 541, 561, 565-568, 591, 592, 594 - DNA plazmidowym 568 - międzygatunkowa 114 - naturalna 567 - nowotworowa 192, 193, 195 - protoplastów 567 transformanty nowotworowe 194 transglikozylacja 79, 511, 512 transglikozylaza 511 transhydrogenaza 293 transketolaza 452, 525 transkrypcja 59, 60, 61*, 610, 663

731

transkrypcja archeonów 141 -, inicjacja 610, 613 - operonu 611 - wirusowego DNA 196 translacja 60, 61*, 63, 546, 595, 663 - archeonów 141, 142 -, przedwczesna terminacja 547 translokacja grupowa 325, 326, 328, 329 translokaza 326 transpeptydacja 79 transport 311, 324-331, 583 - aktywny 65, 325*, 326 - cukrów 327, 329, 585 - elektronów cykliczny 478 fotosyntetyczny 71 - - odwrócony 439, 440, 446, 478, 480, 481 - jonów 327 -, mechanizmy 325* - pierwotny 324, 325 - protonów 308, 309 - - wsteczny 308, 311, 312, 478 - substratów 82 - wtórny 324, 326 - zależny od ATP 328 od potencjału protonowego 328 - żelaza 82, 329-331 transpozaza 563*, 564 transpozon 551, 552, 562, 564, 565 -, replikacja 556 transpozycja 548*, 549, 563-565, 574 trąd 129 trądzik 354 Tremellales 204, 223 treonina 322*, 367*, 621-623 Treponema 122 - macrodentium 149 - pallidum 148, 149, 655* - pertenue 149 Treponemataceae 149 Trichoderma reesei 503* - viride 432, 503*, 504 Trichuris vulpis 404 trifosforan deoksynukleotydu 53 trimetafosforan 99 triozofosforan 287, 291, 542 trofofaza 252 trofosom 444

732

trójka p. tryplet trójtionian 390 trucizna komórkowa 306 trufle p. Tuberales trychogyne 215* tryplet (p. też kodon) 61*, 545, 547* tryptofan 111, 322*, 360 - produkcja 417 -, rozkład 532*, 604 -, synteza 624 tryt 46 Tuberales (trufle) 204, 215, 221 tubulina 663 tundra 395, 501 turbidometria 246 turbidostat 256, 258, 259 turgor 71, 101 tusz chiński 83, 84* twaróg 352 tylakoid 40, 110, 165-167, 345, 457, 458*, 461, 469, 481, 484, 485 - lamellarny 457, 470 - pęcherzykowaty 457, 461, 470 - tubularny 457, 461, 470 tymidyna (T) 46, 47* tymina 46-50, 59, 60, 548* tyndalizacja 266 tyrozyna 322*, 417 -, synteza 624 tyrozynaza 312 tytoń 194, 366 ubichinon 301, 305*, 306, 310*, 479, 480 -, wzór 300 ubihydrochinon (koenzym Q) 300, 301 UDP 78 UDP-glukoza 622 ultrawirówka 58, 579 Uncinula necator 220 uniport 328 UQ 279* uracyl 59, 60, 549 Ureaplasma 160 ureaza 135, 537 Uredinales 204*, 223 Uredo 654 urokainian 615

urokinaza 597 Ustilaginales 204, 223 Ustilago 654 utlenianie 282 - alkanów 301 - całkowite 406 - częściowe 406 UTP (trifosforan urydyny) 86 uwodorowanie (p. też redukcja) 282 uzupełnienia p. czynniki wzrostowe Valonia 502 Veillonella 120, 241* - alcalescens (Micrococcus lactolyticus) 125, 302, 354, 356, 507 Vibrio 45, 121 - cholerae 144, 655* -fischeri 364, 365, 651 - harveyi 364 - logei 364 - metschnikovii 88*, 91 - ruch 91 -, rzęski 87, 88* -, transdukcja 568 Vitreoscilla 118*, 150-152 de Vries 541 wakuola 37*, 201, 217* - gazowa 101, 167, 457, 643 walina 322*, 343, 356, 621, 622 -, biosynteza 607 -, produkcja 417 walinomycyna 427, 428 wanad 496, 497 wankomycyna 79 wapń 58, 411 -, endospory 103, 104* -, LPS 75, 76 Warburg O. 299 Watson J. 48 wąglik 135 wąsy faga 182* wątroba 515, 316 Wehmer C. 412 wekowanie 271 wektor(y) (p. też nośnik) 551, 552, 577, 588, 592-595, 598

werbaskoza 653 Werkman 354 wędzenie żywności 271 węgiel 32, 59, 60, 274, 500 -, izotopy 660 -, obieg 276, 502 - organiczny (C org ) 24 -, oznaczanie zawartości 246 -, pokłady 657 węglan 314 -, akceptor wodoru 380 - wapnia 345, 657 węglowodory 277, 317 - alifatyczne, rozkład 378, 522, 523 - aromatyczne, rozkład 228, 378, 522, 523, 528-534 , - beztlenowy 533, 534 - długołańcuchowe 228, 526-528 - lotne 129 wiązania dwusiarczkowe 58* - fosfoestrowe 309 - glikozydowe a 96, 509, 511, 512, 514 - - β 72, 73, 512, 515 - hydrofobowe 58* - jonowe 58* - peptydowe 61, 73 - wodorowe 58* wiązanie azotu 23, 33, 136, 138, 168, 227, 273, 300, 320, 321*, 488-199, 512, 585, 647, 648, 664 , biochemia 496-499 , bakterie fototroficzne 472 , - symbiotyczne 28, 489^94 , — wolno żyjące 494—496 , rola hydrogenazy 597, 498 - -, sinice 169, 170, 494-496 - dwutlenku węgla, archeony 141, 142 autotroficzne (p. też szlak rybulozobisfosforanowy) 41, 237, 312, 390, 400, 436, 443, 447, 450-455, 471, 628, 661 heterotroficzne (p. też reduktywny cykl kwasów trikarboksylowych, reduktywny szlak acetylo-CoA) 455, 471 wiciowce 117*, 642, 649, 650 wić 42 -, grzyby 202 widełki replikacyjne 54*, 55

733

widłonogi 641*, 644 wielocukry 27, 45 - O-swoiste 81 - zapasowe 95, 96, 97, 510 -, rozkład 368, 378 , synteza 627 -, ziarna 69* Wilfarth 489 Wilkins 48 wino 31, 333, 342, 343 Winogradski S. N. 128, 139, 151, 238, 443, 476, 636 Wiolaceina 109*, 111 wioślarki 644 wirion 171, 173-176 -, adsorpcja 177 - złożony 180 wiroid 197 wirowanie różnicowe 470 - w gradiencie gęstości 52, 56 wirówka szybkoobrotowa 410 wirus(y) 21, 159, 171-200 - bakteryjne (p. też bakteriofagi) 173 - DNA 64 - EB 174* - ECHO 174* - grypy 174, 175*, 176-179, 198, 199, - HIV 199 -, klasyfikacja 174-176 - krowianki 180 - limfotropowe 199 - miksotropowe 176 - mozaiki tytoniu (TMV) 172-175, 176, 177 - odry 174* - onkogenne (nowotworowe) 64, 174*, 195 - opryszczki 175* - ospy 158, 174*, 175*, 180 - polioma 175* - poliomielitis 175* - porażenia dziecięcego (polio) 172*, 174* - przewlekły 172 - RNA (retrowirusy) 64, 195 - roślinne 172, 173, 174* - SFV 174* - SV40 174*, 178*, 194, 195 - świnki 174*, 175* - Wielościenne 179, 180

734

- zarazy ziemniaczanej 172 - złożone 182 - zwierzęce 173, 176, 178*, 180 witamina(y) 279*, 345, 475, 650 - B1 (tiamina) 647 - B6 (pirydoksal) 538 - B 1 2 374, 429, 475 - -, wzór 280* - C (kwas askorbinowy) 429 , czynnik wzrostowy 227 -, produkcja 429, 430 włosek korzeniowy 491 włostek 214 włośnia 209 włókno osiowe 147*, 148 - ogonka faga 182 - rzęski 91, 92* woda bromowa 269 - pitna, analiza 359 , wskaźnik zanieczyszczenia 359 wodniczka 99, 473 wodorotlenek żelaza 329 wodór 274, 333-335, 360, 361, 367, 369, 372, 374*, 379, 505, 506 - utlenianie 388, 390, 395, 446-450 , bakterie metanogenne 396, 397 -, uwalnianie 300, 642 Woese C. 23, 116 Wolinella succinogenes 302, 375, 381*, 404 wolutyna 99, 144 Wood 354 woreczek mureinowy (sacculus) 73, 75 worek 214-216, 220*, 221 workowce 72, 516 woski 99 wrzeciono kariokinetyczne 38, 39 współczynnik współdziałania (Hilla) 617 wstawka płonna 219 wstęgowe rudy żelaza 24*, 25, 656 wścieklizna 173 wtórne metabolity 428-430 wydajność komórkowa 440 wypustka 157 - śluzowa 155 wyrostek 155 - cytoplazmatyczny 155 „wysiew z powietrza" 108

- bezpośredni na płytki 241 wytrząsarka 234 wzór restrykcyjny 589 wzrost bakterii 243-260 - dwufazowy p. diauksja - endolityczny 165 -, hodowla ciągła 255-259 - interkalarny 164 - logarytmiczny 246-249, 256 - rozpełzliwy 357 - szczytowy grzybów 202 -, szybkość 254, 256-258 -, wydajność 253, 254 -, zahamowanie 260-264 Xanthobacter 138 - autotrophicum 448*, 495*, 496, 525 Xanthomonas 118*, 121, 138 - campestris 138, 430, 431* X-gal 554* Xylaria 204*, 220 Yersinia 121 - pestis 358, 655* Young 338 zakażenie 264 - kropelkowe 198 - przyranne 137 zakwas piekarski 243 zakwit 495 - glonów 642 - sinic 165 zalążnia 220 zapalenie błony śluzowej nosa i gardła 198 - mózgu 174* - opon mózgowych 124 - płuc 159, 357, 655* - spojówek 159 - żołądka i jelit 655* zaraza ziemniaczana 209 zarodnia 206*, 208, 210, 212 zarodnik 202, 203*, 214, 223 - konidialny p. konidium zasada Adansona 115 - Schiffa 281, 538

- pirymidynowa p. pirymidyna - purynowa p. puryna zatrucie pokarmowe 123, 358, 375, 655* zawartość azotu 245, 346 - białka 245 - GC 50, 102, 114, 123, 143, 162 zbiornik sedymentacyjny 645 zeaksantyna 166 Zea mays 55 zespół Creutzfeldta-Jacoba 198 zgorzel gazowa 375, 376, 655* ziarniak(i) 34, 44, 113, 119, 120, 128, 163, 344, 347*, 375 - gramdodatnie 120, 123, 124 - gramujemne 120, 124, 125, 504 -, magnetotaksja 95 - tworzące endospory 134-136 ziarniniak weneryczny 159 ziarnistości metachromatyczne 99 zielenice 468 zielone bakterie siarkowe p. Chlorobiaceae Zinder 568 zjadliwość 194 złoża siarki 392 złoże zraszane 138, 645 zmienność 541 zoochlorella 650 Zooglea 121 - ramigera 85 zooksantelle 650 Zoopagales 211 zoospora (p. też pływka) 202, 209 - pierwotna 210 zoosporangium 210 Zopf 542 zrywka (Pilolobus) 212 związek(ki) alkilujący 549 - aromatyczne 137, 274, 388 - -, rozkład 532* - fenolowe 330 - grzybobójcze 585 - heterocykliczne 137 - jednowęglowy 523-525 - owadobójcze 585 - poliaromatyczne, rozkład 532 - policykliczne 522 - rakotwórcze 559, 560

735

związek S Reichsteina 418 Zygomycetes 204, 205, 211, 414*, 429 Zygosaccharomyces 217* zygospora 211, 213 zygota 38, 203, 205, 208, 213 - niepełna p. merozygota Zymomonas mobilis 343 źródło azotu 227 - energii 226, 227, 236, 237 - siarki 227 - węgla 226, 227, 236, 237 żachwa 170 żel agarozowy 589, 579

- akrylamidowy 589, 591 - dekstranowy 84 - krzemionkowy 229 żelatyna 35, 229, 535 żelazo 139, 312, 301, 411, 413, 414 -, receptor wodoru 380, 404, 405 -, powstawanie złóż 656 -, utlenianie 444, 445 żółtaczka krwotoczna 150 żwacz przeżuwaczy 27, 125, 136, 140, 146, 148, 333, 336, 344, 353, 375, 395, 505*, 506, 635, 636, 649 -, mikroflora 650 -, przekształcanie celulozy 505-507 żywienie krzyżowe 323