Giáo trình Cơ sở Di truyền Chọn giống Thực vật

HOÀNG TRỌNG PHÁN (Chủ biên) TRƯƠNG THỊ BÍCH PHƯỢNG

Gi¸o tr×nh

C¥ Së DI TRUYÒN CHäN GIèNG THùC VËT

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC HUẾ Huế - 2008

3

Lời nói đầu Lịch sử chọn giống vật nuôi và cây trồng nói chung ra đời từ xa xưa, kể từ khi con người biết chăn nuôi và trồng trọt. Tuy nhiên, các ứng dụng của khoa học vào thực tiễn sản xuất nông nghiệp thực sự bắt đầu phát triển kể từ lúc di truyền học và thuyết đột biến chính thức ra đời, gắn liền với tên tuổi của Gregor Mendel và Hugo De Vries. Với sự ra đời của các phương pháp chọn giống ưu thế lai, chọn giống đột biến và, đặc biệt là, với sự phát triển mạnh mẽ của các kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật di truyền trong thời gian qua đã góp phần thúc đẩy sự phát triển đáng kể của lĩnh vực di truyền chọn giống thực vật. Trong khi biên soạn Giáo trình cơ sở di truyền chọn giống thực vật, chúng tôi cố gắng tham cứu nhiều tài liệu nhằm cập nhật kiến thức cũng như các phương pháp dạy học bộ môn ở Đại học. Chúng tôi hy vọng rằng giáo trình này sẽ đáp ứng được phần nào nhu cầu giảng dạy và học tập của giảng viên và sinh viên, và cũng có thể sử dụng như một tài liệu tham khảo bổ ích cho giáo viên Sinh học các trường THPT trong bối cảnh đổi mới giáo dục hiện nay. Nội dung giáo trình gồm 9 chương: Chương 1 giới thiệu các khái niệm cơ bản về giống cây trồng và khoa học chọn giống. Chương 2 đề cập đến vai trò của các vật liệu khởi đầu, nguồn gene thực vật và các biến dị di truyền trong chọn giống thực vật. Chương 3 trình bày những kiến thức cơ sở của lĩnh vực di truyền học số lượng trong chọn giống. Chương 4 phân tích cơ sở di truyền của chọn giống ưu thế lai, chủ yếu là các phương pháp sử dụng các dòng tự phối và tính bất dục đực cũng như một số thành tựu của chọn giống ưu thế lai. Chương 5 đề cập đến các hệ thống sinh sản và bản chất di truyền của tính không tương hợp và ý nghĩa của chúng trong chọn giống thực vật. Chương 6 trình bày khái quát các phương pháp trong chọn giống thực vật. Chương 7 tập trung vào chủ đề ứng dụng của đa bội thể và sự phát sinh đột biến thực nghiệm trong chọn giống thực vật. Các chương 8 và 9 đi sâu vào ứng dụng của lai tế bào soma và kỹ thuật di truyền trong chọn giống thực vật. Cuối mỗi chương đều có các phần Câu hỏi và bài tập và Tài liệu tham khảo để người học tiện ôn tập và tra cứu. Bên cạnh đó, một số thuật ngữ

4

thông dụng trong giáo trình được sử dụng bằng tiếng Anh để giúp người học dễ dàng hơn trong việc tiếp cận với thông tin qua sách báo nước ngoài hoặc internet. Giáo trình Cơ sở di truyền chọn giống thực vật do ThS. Hoàng Trọng Phán và TS. Trương Thị Bích Phượng - những giảng viên đang công tác tại các trường Đại học Sư phạm và Đại học Khoa học thuộc Đại học Huế biên soạn, với sự phân công như sau: ThS. Hoàng Trọng Phán chủ biên và biên soạn các chương 1, 2, 3, 4, 7 và một phần của chương 6; và TS. Trương Thị Bích Phượng biên soạn các chương 5, 8, 9 và một phần của chương 6. Nhân đây, chúng tôi xin trân trọng cảm ơn Dự án Giáo dục Đại học Huế đã tài trợ cho việc biên soạn và xuất bản giáo trình trong khuôn khổ của Dự án Giáo dục Đại học mức B. Chúng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đặc biệt đến PGS. TS. Nguyễn Minh Công, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, đã dày công đọc bản thảo và cho nhiều ý kiến quý báu. Do khả năng còn hạn chế, chắc chắn giáo trình còn nhiều thiếu sót. Chúng tôi rất mong nhận được sự phê bình và chỉ bảo của các đồng nghiệp và bạn đọc để giáo trình được hoàn chỉnh hơn trong lần in sau. Xin trân trọng cảm ơn! Huế, ngày 15 tháng 3 năm 2006 Các tác giả, HOÀNG TRỌNG PHÁN TRƯƠNG THỊ BÍCH PHƯỢNG

5

Mục lục Lời nói đầu

3

Mục lục

5

Chương 1: Khái niệm về giống cây trồng và khoa học chọn giống Hoàng Trọng Phán

I. Khái niệm và phân loại giống cây trồng II. Các hướng cơ bản của chọn giống cây trồng III. Khoa học chọn giống

8 8 12 13

Chương 2: Tạo vật liệu khởi đầu trong chọn giống thực vật Hoàng Trọng Phán

I. Vai trò của vật liệu khởi đầu trong chọn tạo giống II. Nguồn gene thực vật trong chọn giống cây trồng III. Sơ lược các nguồn biến dị di truyền trong chọn giống thực vật

23 23 25 37

Chương 3: Cơ sở di truyền số lượng trong chọn giống thực vật Hoàng Trọng Phán

I. Các tính trạng số lượng và di truyền số lượng II. Ước tính hệ số di truyền (heritability) và phân tích phương sai

42 42 48

Chương 4: Cơ sở di truyền của chọn giống ưu thế lai Hoàng Trọng Phán

60

I. Khái niệm và những biểu hiện của ưu thế lai ở thực vật II. Các phương pháp xác định mức độ biểu hiện ưu thế lai III. Sử dụng các dòng tự phối trong chọn giống ưu thế lai IV. Sử dụng tính bất dục đực trong chọn giống ưu thế lai V. Cơ sở di truyền của ưu thế lai và phương pháp duy trì nó ở các thế hệ sau VI. Một số thành tựu về chọn giống ưu thế lai thực vật ở Việt Nam

60 62 63 70 75 83

6

Chương 5: Các hệ thống sinh sản và tính không tương hợp ở thực vật Trương Thị Bích Phượng

86

I. Mở đầu II. Các hệ thống sinh sản và ý nghĩa của chúng trong di truyền và chọn giống thực vật III. Khái niệm, bản chất di truyền và ý nghĩa của tính không tương hợp

86 86 93

Chương 6: Các phương pháp trong chọn giống thực vật Hoàng Trọng Phán - Trương Thị Bích Phượng 101

I. Các phương pháp chọn lọc cơ bản 101 II. Các nhân tố ảnh hưởng đến chọn lọc 102 III. Các nguyên tắc cơ bản của chọn lọc 103 IV. Sơ lược về các phương pháp chọn giống truyền thống và hiện đại thông dụng 104 V. Chọn giống ở cây tự thụ phấn 113 VI. Chọn giống ở cây giao phấn 116 VII. Chọn giống ở cây sinh sản sinh dưỡng 118 VIII. Chọn giống kháng sâu bệnh 123 Chương 7: Đa bội thể và phát sinh đột biến trong chọn giống thực vật Hoàng Trọng Phán 131

I. Mở đầu II. Đa bội thể và ứng dụng của nó trong chọn giống thực vật III. Phát sinh đột biến thực nghiệm trong chọn giống thực vật

131 132 147

Chương 8: Lai tế bào soma Trương Thị Bích Phượng 157

I. Vấn đề lai ghép ở thực vật II. Đại cương về lai tế bào soma và công nghệ tế bào thực vật III. Phương pháp tạo tế bào trần (protoplast) IV. Liên kết và dung hợp tế bào trần V. Nuôi cấy tế bào lai và tái sinh cây

157 157 158 159 161

7

VI. Chọn lọc các tế bào lai và xác định các dòng tế bào lai và mô sẹo (callus) 164 VII. Ưu thế của lai soma và một số thành tựu của kỹ thuật này trên thế giới và ở Việt Nam 167 Chương 9: Kỹ thuật di truyền trong chọn giống thực vật Trương Thị Bích Phượng 169

I. Mở đầu II. Kỹ thuật chuyển gene III. Kỹ thuật RFLP IV. Kỹ thuật PCR V. Một số kỹ thuật khác và ứng dụng của chúng trong chọn giống thực vật trên thế giới và ở Việt Nam

169 170 183 190 204

8

Chương 1

Khái niệm về Giống Cây trồng và Khoa học Chọn giống Chọn giống cây trồng hay thực vật nói chung (plant breeding) là một lĩnh vực quan trọng của sản xuất nông nghiệp; mục đích của nó là tạo ra ngày càng nhiều giống cây trồng mới có năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu được các điều kiện bất thuận (như sâu bệnh, hạn, úng, nóng, rét...) Về thực chất, đó là sự tiến hoá của thực vật do con người điều khiển, được hình thành từ trong thực tiễn trồng trọt qua hàng ngàn năm kể từ khi con người bắt đầu mò mẫm "thuần hoá" cây trồng dựa theo kinh nghiệm. Cùng với sự phát triển của khoa học và kỹ thuật, đặc biệt là sự phát triển của di truyền học trong suốt 100 năm nay, công tác chọn tạo giống cây trồng đã xây dựng được một nền tảng khoa học vững chắc và không ngừng được hoàn thiện. Nhờ đó đã tạo ra hàng loạt các giống cây trồng mới, nhất là các giống ngũ cốc, góp phần xoá đói giảm nghèo mang lại cuộc sống ấm no và cải thiện sức khoẻ cho con người. Trong chương này chúng ta sẽ lần lượt tìm hiểu các vấn đề sau: (i) Khái niệm và phân loại giống cây trồng; (ii) Các hướng nghiên cứu cơ bản của công tác chọn tạo giống cây trồng; và (iii) Bản chất và nhiệm vụ của ngành khoa học chọn giống. I. Khái niệm và phân loại giống cây trồng 1. Khái niệm về giống Thuật ngữ giống (tiếng Latin: varietas; tiếng Anh: variety) dùng để chỉ một quần thể các sinh vật cùng loài do con người chọn tạo ra và có các đặc điểm di truyền xác định. Tất cả các cá thể của cùng một giống đều có các tính trạng hay thường được gọi là các đặc tính về hình thái-giải phẫu, sinh lý-sinh hoá, năng suất v.v. hầu như giống nhau và ổn định trong những điều kiện sinh thái và kỹ thuật sản xuất phù hợp. Từ khái niệm về giống như vậy, ta có thể hình dung giống cây trồng (crop variety; cultivar) là một nhóm các thực vật có các đặc trưng sau: - Có nguồn gốc chung với các tính trạng hay đặc điểm giống nhau. - Mang tính di truyền đồng nhất (nghĩa là có sự ổn định, ít phân ly) về các tính trạng hình thái và một số đặc tính nông sinh học khác như: chiều cao cây, thời gian sinh trưởng, khả năng chống chịu sâu bệnh v.v. - Mang tính khu vực hoá, nghĩa là tất cả các đặc điểm hay tính trạng

9

của giống được biểu hiện trong những điều kiện ngoại cảnh (như đất đai, khí hậu, các biện pháp kỹ thuật sản xuất) nhất định. Từ đây xuất hiện các khái niệm về giống chịu hạn, chịu mặn, chịu úng v.v. - Do con người tạo ra nhằm thoả mãn một hoặc một vài nhu cầu và thị hiếu nhất định, như: năng suất cao, chất lượng tốt, giá trị thương phẩm cao.... Các giống vật nuôi và cây trồng vì vậy được xem là những phương tiện sống của một nền sản xuất nông nghiệp cụ thể (Hình 1.1). Cải bắp

Cải hoa lơ

Cải chồi Brussels

Su hào

Cải bông

Chọn lấy chồi đỉnh Chọn lấy chồi bên Chọn lấy thân

Chọn lấy các cụm hoa Chọn lấy thân và hoa

Cải xoăn

Chọn lấy lá

Brassica oleracea (cây cải dại phổ biến)

Hình 1.1 Từ cây cải dại phổ biến ban đầu (Brassica oleracea), qua quá trình thuần hoá và chọn lọc lâu dài theo các hướng khác nhau, con người đã tạo ra nhiều giống cải trồng khác nhau ngày nay. Mỗi giống có một tên riêng, ví dụ: cải hoa lơ (B. oleracea var. botrytis); su hào (B. oleracea var. caulorapa) v.v.

Khi đề cập đến khái niệm "giống", thông thường người ta muốn đề cập tới các tính trạng và đặc tính của giống (Hình 1.2). - Tính trạng (characters): Đó là những đặc điểm về hình thái và cấu tạo quan sát được của các cây trong cùng một giống giúp ta phân biệt với các giống khác trong cùng một loài. Để nhận biết các tính trạng như vậy, thường người ta chia ra các nhóm sau đây: + Các đặc điểm về hình thái, như: chiều cao cây, chiều dài bông, số hạt trên bông, số bông trên khóm, kích thước lá v.v. Nói chung đây là những tính trạng số lượng (quantitative characters), nghĩa là có thể "cân-đongđo-đếm" được; chúng thường do nhiều gene kiểm soát và chịu ảnh hưởng lớn của điều kiện môi trường. + Các đặc điểm về cấu tạo, như: độ dày của bông, màu sắc và hình dạng của thân, lá, hoa và quả ... Đây là những tính trạng chất lượng (qualitative characters), thường do một gene kiểm soát, ít chịu tác động

10

của điều kiện ngoại cảnh và có thể quan sát được bằng mắt thường. + Diễn biến của một quá trình sinh học, như: hô hấp, quang hợp, hoặc phản ứng quang chu kỳ v.v. thường tỏ ra rất mẫn cảm với các điều kiện sinh thái của môi trường như nhiệt độ, ánh sáng, độ dài ngày. Tất cả các yếu tố này có thể tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên sự hoạt động của các enzyme kiểm soát một quá trình sinh học cụ thể, và qua đó có thể ảnh hưởng đến các tính trạng chất lượng. - Đặc tính (characteristics): Đó là những tính chất hay đặc điểm sinh lý, sinh hoá đặc trưng có liên quan đến các đặc tính chống chịu của thực vật (như chịu mặn, hạn, rét, úng v.v.) và đặc điểm kỹ thuật canh tác.

(a)

(b)

Hình 1.2 Một số tính trạng hình thái ở các giống lúa trồng (Oryza sativa): (a) màu sắc vỏ trấu, tính có râu - không râu trên mỏ hạt, mật độ và các sắp xếp hạt trên bông; (b) màu sắc vỏ cám, độ bạc bụng và kích thước của hạt gạo.

2. Vấn đề phân loại giống Theo Dennis (1982), sự tiến hoá của giống phải đặt trong bối cảnh quan hệ giữa sinh vật, môi trường và con người, và chia thành ba thời kỳ: Giống ban đầu được hình thành nối tiếp từ sự chọn lọc tự nhiên, được hoàn thiện dần dưới sự tác động của môi trường sinh thái, của lao động con người, nhưng còn mang đậm dấu ấn các đặc tính của quần thể hoang dại. Một số giống địa phương vẫn còn trong tình trạng của giống ban đầu. Giống cải tiến có tiêu chuẩn (về ngoại hình, năng suất...) do con người đặt ra theo nhu cầu để chọn lọc và cải tiến khả năng của sinh vật.

11

Giống cao sản là những giống có năng suất cao hơn hẳn giống cải tiến, và khá phổ biến trên thế giới. Từ sự kết hợp các đặc điểm địa lý và năng suất của sinh vật với nhu cầu của con người, người ta chia thành: - Giống địa phương là giống tồn tại phổ biến ở một vùng địa lý nhất định của một quốc gia hay một khu vực rộng lớn của thế giới, có năng suất kém hơn so với trung bình các giống cao sản của thế giới. - Giống cao sản là giống phổ biến khắp thế giới, có thể phát triển ở nhiều vĩ tuyến khác nhau, với năng suất cao hơn các giống địa phương. - Giống chuyên dụng là giống được tạo ra nhằm thu nhận một loại sản phẩm xác định nhưng được phổ biến trên thế giới do giao lưu thương mại. Về mặt phân loại học, "giống" là đơn vị phân loại dưới loài, có tính chất quy ước dùng để chỉ các quần thể khác nhau trong cùng một loài do con người chọn tạo ra. Về mặt sinh học, các cá thể trong cùng một giống có kiểu gene và kiểu hình nói chung là giống nhau; còn về mặt thực tiễn, điều quan tâm là dạng hình và tính năng sản xuất của giống có đáp ứng được nhu cầu định hướng của việc sử dụng hay không (Hình 1.1 và 1.2). Đối với việc phân loại lúa trồng chẳng hạn, nhiều lỗ lực đã được tiến hành tập trung chủ yếu vào loài lúa trồng châu Á (Oryza sativa), bởi nó là nguồn lương thực chính của hơn một nửa dân số thế giới. Đây là loại cây lương thực chính có lịch sử trồng trọt lâu đời tại châu Á. Ngày nay loài cây này đã được trồng rộng rãi ở nhiều vùng trên trái đất; kể cả Bắc và Nam Mỹ, châu Âu và châu Phi, trải rộng từ vùng xích đạo cho đến các vùng thuộc vĩ tuyến 500 Bắc và xa hơn nữa. Nó có thể trồng thậm chí tại những vùng có độ cao tới 2.600m. Chính những điều kiện môi trường tự nhiên khác biệt này cùng với các phương thức trồng trọt khác nhau đã góp phần tạo ra các kiểu sinh thái mới và các giống lúa mới có khả năng thích nghi khác nhau. Dựa trên đặc điểm bất thụ của con lai F1 và các đặc điểm hình thái, sinh thái và sinh lý, loài lúa trồng châu Á (O. sativa) được chia thành ba loài phụ: Indica, Japonica và Javanica đặc trưng cho ba vùng địa lý tương ứng là Ấn Độ, Trung Quốc-Nhật Bản và Indonesia (xem chương 2). Trong quá trình chọn giống lúa, nhiều giống đặc sản nổi tiếng ra đời gắn liền với các địa danh như: Tám xoan Hải Dương, Tám thơm Hải Hậu, v.v. Các giống lúa do Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI, đặt tại Manila Philippines) lai tạo ra với ký hiệu IR- từng góp phần tạo ra cuộc cách mạng xanh nổi tiếng như: IR-8, IR-36, IR-64,...; hoặc từ Viện di truyền nông nghiệp nước ta như: DT-11, DT-14, DT-17, ...

12

II. Các hướng cơ bản của chọn giống cây trồng Nói chung, sự phát triển của chọn giống cây trồng diễn ra theo các hướng chính sau: (i) Hướng chọn lọc dựa trên sự lai hữu tính (còn gọi là chọn giống truyền thống); (ii) Hướng chọn tạo giống dựa trên các kỹ thuật gây đột biến bằng phóng xạ và hoá chất; (iii) Hướng chọn giống dựa trên sự ứng dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học như: nuôi cấy mô-tế bào, lai tế bào soma, kỹ thuật di truyền và công nghệ DNA tái tổ hợp. Thế giới ngày nay đang phải đối mặt với hàng loạt các thách thức trong việc phát triển công nghệ nhằm đáp ứng lương thực trước việc dân số tăng nhanh trong khi các nguồn tài nguyên thiên nhiên lại có hạn; và có nhiều nguy cơ dẫn tới sự phá vỡ cân bằng các hệ sinh thái nông nghiệp và môi sinh trên toàn cầu. Vì vậy cần phải: 1. Xây dựng các ngân hàng gene hay quỹ gene nhằm góp phần bảo tồn sự đa dạng sinh học và phục vụ cho việc cải tiến các đặc tính mong muốn của một giống loài cụ thể trong các chương trình chọn giống thực vật. 2. Ưu tiên trong công tác chọn tạo giống là tạo ra các giống cây trồng mới có tiềm năng năng suất cao hơn và ổn định về năng suất, đặc biệt là sự giải phóng tiềm năng di truyền bị bắt giữ. 3. Áp dụng phối hợp các kỹ thuật chọn giống đột biến và các phương pháp của sinh học phân tử với các chương trình chọn giống thông thường (để cải tiến và tạo các giống cây trồng mới) cũng như phát triển các hệ thống chọn giống mới. 4. Hướng tới nền sản xuất nông nghiệp phát triển bền vững, trong đó sự cân bằng sinh thái được quan tâm đúng mức, theo hướng sản xuất ngày càng nhiều sản phẩm hơn nhưng giảm thiểu nguy cơ phá hoại thiên nhiên. Dưới đây là một số nhận định có tính chất định hướng đối với công tác chọn giống cây trồng được nêu ra trong một số hội nghị quốc tế gần đây: y Hội nghị Quốc tế do IAEA và FAO phối hợp tổ chức tại Vienna (IAEA 1995) nhấn mạnh khả năng phối hợp sử dụng các kỹ thuật đột biến và sinh học phân tử để cải tiến cây trồng như là một con đường hiệu quả cần áp dụng trong các chương trình chọn giống, đặc biệt là ở các nước đang phát triển, để đạt tới một nền nông nghiệp phát triển bền vững. S. Machi nhận định: "Các kỹ thuật đột biến cung cấp cơ hội tạo ra các biến dị trong quỹ gene vốn không sẵn có với các phương pháp khác. Di truyền học phân tử cho phép định vị một gene quan tâm trên bản đồ giúp các nhà chọn giống thực vật tiến hành chọn lọc marker đối với tính trạng như là bước đầu tiên hướng tới việc phân lập gene để đưa trở lại vào cùng loài cây hoặc các loài khác nhau. Sự tổ hợp của các kỹ thuật đột biến và

13

các phương pháp sinh học phân tử sẽ dẫn tới sự gia tăng hiểu biết về di truyền học cơ sở và sinh lý học thực vật đối với nhiều tính trạng quan trọng cho việc tăng sản lượng của thực vật. Chúng ta đừng quên rằng các công nghệ mới này cũng chỉ là những công cụ trong một bộ công cụ, và để thành công chúng phải được sử dụng trong sự phối hợp rộng rãi với các chương trình chọn giống thực vật thông thường." (tlđd) y Trong phiên khai mạc Hội nghị Di truyền học Quốc tế lần thứ XVIII tại Bắc Kinh (10-15/8/1998), C.C.Tan (1998) nói rằng: "Chọn giống hay cải thiện di truyền cho các giống cây trồng mới với năng suất cao hơn và chất lượng tốt hơn là mục tiêu trọng tâm của chúng ta. Đó là cách thức khả dĩ hiệu quả nhất để giữ cho việc sản xuất lương thực theo kịp đà tăng dân số... Tuy nhiên để tăng hơn nữa năng suất trên mỗi đơn vị diện tích, các kỹ thuật chọn giống mới phải được thực hiện bằng các công nghệ khác... Di truyền học là cơ sở khoa học cho sự phát triển các hệ thống chọn giống." Theo G.S. Khush (1998): "Trong quá khứ việc sản xuất lương thực gia tăng là kết quả của sự gia tăng tiềm năng năng suất của các giống mới cũng như tăng diện tích trồng trọt. Trong tương lai, những sự gia tăng chủ yếu trong diện tích trồng trọt là không thể được... Bằng cách đó, chúng ta phải sản xuất nhiều lương thực hơn từ ít đất đai hơn, với ít thuốc trừ sâu, ít lao động hơn và ít nước hơn. Vì vậy, phải cần đến các giống cây trồng có tiềm năng năng suất cao hơn và ổn định về năng suất. Tiềm năng năng suất của các giống cây trồng được tăng lên thông qua các quy trình lai và chọn lọc thông thường, cải biến các ideotype (kiểu gene cá thể) thực vật, khai thác ưu thế lai và bằng cách làm giàu thêm quỹ gene cây trồng thông qua lai rộng rãi... Sự ổn định về năng suất được tăng cường thông qua kết hợp các gene kháng sâu bệnh và chống chịu stress vô sinh..." III. Khoa học chọn giống 1. Khái niệm và nhiệm vụ của khoa học chọn giống 1.1. Chọn giống cây trồng là gì? Chọn giống cây trồng (plant breeding) là một khoa học dựa trên các nguyên lý của di truyền học và di truyền tế bào học (và đặc biệt là, di truyền học phân tử - bổ sung của tác giả); nó bao gồm các nguyên lý và phương pháp cần cho việc cải tiến bản chất di truyền của các cây trồng. Và kết quả thường là tạo ra các giống cây trồng phù hợp hơn các giống hiện có về một hoặc nhiều phương diện (Singh 1986). Vậy bản chất của chọn giống thực vật là gì? Liệu chọn giống cây trồng là một nghệ thuật hay một khoa học, đây là một vấn đề khó khăn cho bất kỳ ai thích tranh cãi. Khoa học là tri thức thu được thông qua các phương

14

pháp khoa học. Phương pháp khoa học bao gồm sự quan sát, xây dựng một giả thuyết, thí nghiệm kiểm tra và kết luận về sự chấp nhận hay bác bỏ giả thuyết đó (Hình 1.3). Như vậy khoa học là khách quan về cách tiếp cận (đối tượng), trong khi nghệ thuật có tính chủ quan cao. Tiến hành Quan sát Hình thành Giả thuyết Phát triển khung khái niệm: Dự đoán

Đề xuất Giả thuyết mới

Thiết kế Thí nghiệm (Kiểm tra giả thuyết) Nếu chấp nhận,

Nếu chối bỏ, Đề xuất Giả thuyết mới dựa trên nhiều quan sát hơn nữa

Hình 1.3 Phương pháp nghiên cứu khoa học.

Từ lâu, con người phụ thuộc vào các kỹ năng của mình trong khi chọn lọc các cây tốt hơn. Với kiến thức về thực vật rất hạn chế, con người chưa biết gì về sự di truyền các tính trạng, vai trò của môi trường trong sản xuất và cơ sở của sự xuất hiện các biến dị. Các phương pháp chọn lọc đã được thiết kế mà không một chút hiểu biết về các nguyên lý di truyền. Vì vậy, chọn giống cây trồng lúc đó chủ yếu là một nghệ thuật. Nhưng các phương pháp chọn giống cây trồng ngày nay dựa trên các nguyên lý khoa học của các khoa học về thực vật hẳn hòi, đặc biệt là di truyền học và di truyền học phân tử. Như vậy, một phần lớn của công việc chọn giống là thuần tuý khoa học với rất ít nghệ thuật can dự vào. Tuy nhiên, việc chọn đúng các cây mong muốn ngay cả hiện nay phần nhiều mang tính nghệ thuật vì nó tuỳ thuộc chủ yếu vào khả năng quan sát tinh tế của nhà chọn giống để xác định đúng các biến dị có lợi, các cây tốt hơn khả dĩ mang lại nguồn giá trị kinh tế cao... Như vậy, chọn giống cây trồng ngày nay chủ yếu là một khoa học. Một nhà chọn giống cây trồng hiện đại phải biết tất cả những gì anh ta có thể biết về đối tượng của mình, và tham dự vào kiến thức của nhiều môn học có liên quan. 1.2. Lịch sử của chọn giống thực vật

15

y Thật hợp lý khi giả định rằng chọn giống cây trồng khởi thuỷ bắt đầu khi con người lần đầu tiên chọn ra những cây hoang dại nào đó đem về trồng trọt. Quá trình như vậy được gọi là sự thuần hoá (domestication). Trong khi thuần hoá có thể có sự chọn lọc nào đó; và điều này có thể cho ra các kiểu tốt hơn các kiểu hoang dại. Như vậy, sự thuần hoá có thể được xem như một phương pháp chọn giống cây trồng, Sự thuần hoá vẫn còn tiếp diễn cho đến nay, và có lẽ tiếp tục một thời gian nào đó trong tương lai. Điều này đặc biệt đúng trong trường hợp của các cây gỗ, cây thuốc... y Trong một thời kỳ dài của lịch sử trồng trọt và trước đó, chọn lọc tự nhiên đã tác động nhất định trên các loài được thuần hoá. Có thể con người cũng đã áp dụng sự chọn lọc nào đó, một cách có chủ ý hoặc không chủ ý. Sự di chuyển của con người từ vùng này sang vùng khác đã kéo theo sự chuyển chỗ của các loài cây trồng này. Việc đưa vào một khu vực các loài hoặc các giống cây trồng mới từ các vùng khác của thế giới là một phần không thể thiếu của sự chọn giống ngày nay. y Các người Babylon và Assyrian đã thụ phấn nhân tạo cây chà là rất sớm vào khoảng năm 700 trước công nguyên. Năm 1717, Thomas Fairchild tạo ra cây lai nhân tạo đầu tiên. Vào khoảng giữa những năm 1760 và 1766, Joseph Koelreuter (người Đức) đã tiến hành các phép lai rộng rãi ở cây thuốc lá. Andrew Knight (1759-1835) có lẽ là người đầu tiên sử dụng lai nhân tạo để phát triển một số giống cây ăn quả mới. Vào khoảng năm 1840, Le Couter và Shireff sử dụng chọn lọc cá thể ở thực vật (individual plant selection) và thử nghiệm đời con (progeny test) để tạo ra một số giống cây ngũ cốc có ích. Vilmorin (1856) phát triển xa hơn nữa việc thử nghiệm đời con và sử dụng thành công phương pháp này trong việc cải tiến giống củ cải đường (Beta vulgaris). Phương pháp chọn lọc cá thể thực vật đã được phát triển về chi tiết bởi Nilsson-Ehle và đồng sự tại Svalof (Thuỵ Điển) khoảng năm 1900. Đến 1903, Johannsen (Hình 1.4) đưa ra thuyết dòng thuần cung cấp cơ sở di truyền cho sự chọn lọc cá thể ở thực vật.

Hình 1.4 R.C.Darwin, G.Mendel, H.De Vries, W.Johannsen và G.H.Shull (từ trái sang).

16

Chúng ta còn nhớ rằng, trong cuốn sách vĩ đại của mình, Nguồn gốc các loài (Origin of Species), Charles Darwin (Hình 1.4) đã không bắt đầu bằng việc giải thích chọn lọc tự nhiên như ta có thể kỳ vọng. Thay vì thế, chương 1 của cuốn sách này dành một phần khá dài để giải thích bằng cách nào các cây trồng và vật nuôi phát sinh thông qua chọn lọc nhân tạo bởi con người. Các nguyên lý của sự phát triển cây trồng bằng chọn lọc nhân tạo này vẫn còn được dùng làm mô hình cho sự hiểu biết của chúng ta về nguồn gốc các loài bằng chọn lọc tự nhiên. y Thông qua các công trình của Gregor Mendel (Hình 1.4), Hugo Marie de Vries (Hình 1.4), và nhiều người khác, sự phát triển của di truyền học vào đầu thế kỷ XX đã thiết lập nền móng khoa học vững chắc cho chọn giống thực vật. Ở giai đoạn di truyền học cổ điển, các quy luật di truyền của Mendel cung cấp cơ sở ban đầu cho việc xác định được các phương thức di truyền khác nhau. Nhờ đó các nhà nghiên cứu đã đóng góp cho sự phát triển và hiểu biết về chọn giống thực vật. Chẳng hạn, từ các kết quả nghiên cứu của H.G. Shull (Hình 1.4) về chọn giống ngô (Zea mays), ông phát hiện ra rằng sự nội phối (inbreeding) làm giảm đáng kể ưu thế về sức sống và sức sản xuất. Nhưng khi lai giữa các dòng nội phối với nhau, các con lai thu được lại có ưu thế lai cao hơn hẳn các giống ban đầu. Các quan sát này dẫn tới việc tạo ra các giống lai phổ biến ở ngô và nhiều cây trồng khác. Chẳng hạn, vào giữa thế kỷ XIX, năng suất kỷ lục của ngô đạt 5 tấn/ha, thì hiện nay năng suất bình quân ở Mỹ và châu Âu đạt khoảng 10-15 tấn/ha, và kỷ lục vượt 20 tấn/ha; v.v. Cho đến nay, cùng với các chương trình chọn giống thông thường, việc sử dụng các kỹ thuật đột biến trong chọn giống thực vật đã tạo ra hàng loạt giống cây trồng mới; việc áp dụng kỹ thuật di truyền gần đây cho phép tạo ra các giống cây trồng biến đổi gene độc đáo chưa từng có trước đây. Nhiều giống lúa lai siêu cao sản (super hybrid rice) có ưu thế lai vượt trội với năng suất cực cao đã được tạo ra từ chương trình chọn giống lúa lai ở Trung Quốc. [L.P.Yuan (1998) dự kiến đến năm 2000 năng suất hạt có thể đạt 100 kg/ha mỗi ngày, nhưng thực tế đến 2001 năng suất hạt đạt mức kỷ lục là 150-160 kg/ha mỗi ngày.] 1.3. Các nhiệm vụ và mục tiêu của chọn giống thực vật y Các nhiệm vụ chính của chọn giống thực vật: - Nghiên cứu sự phân bố, bảo quản và sử dụng nguồn gene thực vật mà cụ thể là sự đa dạng về giống và loài của đối tượng cần cho chọn giống. - Nghiên cứu các hệ thống sinh sản và cơ sở di truyền của sự chọn giống các cây trồng thuộc các phương thức sinh sản khác nhau và xây

17

dựng các phương pháp chọn lọc thích hợp đối với từng nhóm loài thực vật. - Nghiên cứu và đánh giá vai trò của môi trường trong sự phát triển của các tính trạng ở đối tượng chọn giống. - Nghiên cứu xây dựng và hoàn thiện các hệ thống chọn giống khác nhau ở thực vật: chọn giống truyền thống bằng lai tạo, chọn giống bằng các kỹ thuật đột biến và chọn giống bằng các kỹ thuật của công nghệ sinh học hiện đại cũng như khả năng kết hợp giữa các hệ thống chọn giống này. LAI 1. GIỮA CÁC GIỐNG 2. XA

THUẦN HOÁ

TẠO THU THẬP QUỸ GENE

BIẾN DỊ

NHẬP NỘI BIẾN DỊ CÓ SẴN TRONG TỰ NHIÊN

ĐỘT BIẾN ĐA BỘI HOÁ 1. TỰ ĐA BỘI 2. DỊ ĐA BỘI

BIẾN DỊ DÒNG SOMA

CHỌN LỌC

TẠO BIẾN DỊ MỚI

ĐÁNH GIÁ NHÂN GIỐNG PHÂN PHỐI

DO CÁC CƠ QUAN VỀ HẠT ĐẢM TRÁCH

Hình 1.5 Các hoạt động trong chọn giống thực vật (theo Singh 1986).

Nói đến các hoạt động trong chọn giống thực vật là nói tới việc tạo ra các thay đổi mong muốn trong các kiểu gene của các loài cây trồng và mang lại các lợi ích cho người nông dân. Các hoạt động này bao gồm: tạo ra biến dị, chọn lọc, đánh giá, nhân giống và phân phối (Hình 1.5). Tạo nguồn biến dị (creation of variation) là nhu cầu thiết yếu cho bất kỳ một chương trình chọn giống thực vật nào; không thể có sự cải tiến nếu không có sự biến đổi. Sự thuần hoá, thu thập quỹ gene, nhập nội, lai (giữa các giống và lai xa), đột biến, đa bội thể và biến dị dòng soma tất cả đều là các biện pháp chính cho việc tạo biến dị. Sự chọn lọc (selection) là nhằm phân lập các kiểu gene mong muốn từ hỗn hợp của vô số kiểu gene trong quần thể. Chọn lọc phải dựa trên các kiểu hình của thực vật. Nói chung, có sự biến thiên sai biệt cao độ giữa các kiểu gene và các kiểu hình của các cây. Các quy trình chọn lọc khác nhau lập ra nhằm để vượt qua khó khăn này và được thiết kế cho các tình huống đặc thù, ví dụ cho các loài tự thụ phấn

18

và giao phấn v.v. Đánh giá (evaluation) liên quan tới việc so sánh hiệu quả thí nghiệm của các kiểu gene (các dòng) mới được tạo ra với các giống hiện có. Công việc này có thể mất vài năm thử nghiệm ở nhiều khu vực để thu được một ước lượng về tính ổn định của các dòng mới. Nếu như một dòng mới được tạo ra này là tốt hơn, vượt trội hơn các giống hiện có thì nó sẽ được phóng thích với tư cách là một giống mới cho trồng trọt đại trà. Lợi ích từ giống mới này chỉ có thể thu được khi giống mới được nhân giống và phân phối cho các nhà nông. Các chức năng này được tiến hành bởi các cơ quan trung ương có thẩm quyền. y Các mục tiêu của chọn giống thực vật: Chọn giống cây trồng nhằm mục đích cải thiện các đặc tính của thực vật sao cho chúng ngày càng đáp ứng được hiệu quả mong muốn về mặt nông học và kinh tế. Các mục tiêu đặc thù thường sai khác rất lớn tuỳ thuộc vào loại cây trồng được nghiên cứu. Dưới đây nêu tóm tắt các mục tiêu chính của chọn giống thực vật (phỏng theo Singh 1986): (1) Năng suất cao: Hầu hết các chương trình chọn giống nhằm vào việc tăng năng suất cây trồng. Kết quả là đã tạo ra được các kiểu gene có hiệu quả hơn, ví dụ: các giống lai ở ngô (Zea mays), lúa (O. sativa), v.v. (2) Chất lượng tốt: Chất lượng của sản phẩm cây trồng xác định sự phù hợp của nó đối với các nhu cầu sử dụng khác nhau. Vì vậy, chất lượng là một khía cạnh quan trọng đối với các nhà chọn giống thực vật. Các tính trạng chất lượng ở các giống khác nhau là khác nhau, ví dụ: kích thước hạt, màu sắc, chất lượng xay xát ở lúa mỳ (Triticum aestivum); chất lượng nấu nướng ở lúa (O. sativa); kích thước, màu sắc và hương vị của quả; hàm lượng protein ở ngũ cốc và rau đậu; hàm lượng lysine ở ngũ cốc; v.v. Thực ra, việc cung cấp các giống mới cho sản lượng cao đôi khi không phải do sự cải tiến đặc thù như khả năng kháng bệnh mà là kết quả của hiệu suất sinh lý cao hơn nói chung. Chẳng hạn, từ lâu những nỗ lực nhằm sản xuất đường từ cây củ cải đường (Beta vulgaris) đã không thành công chủ yếu bởi vì hàm lượng đường trong các giống sẵn có lúc đó là thấp, nói chung dưới 7%. Gần hai thế kỷ sau, các giống mới được tạo ra có khả năng cho hàm lượng đường ổn định ở mức 15-18% (Allard 1976). (3) Kháng sâu bệnh: Các giống kháng sâu bệnh được coi là rẻ nhất và phương pháp thông thường nhất được dùng để kiểm soát sâu bệnh. Các giống kháng không chỉ gia tăng mà còn ổn định năng suất. (4) Chống chịu các stress vô sinh: Việc tạo ra các giống mới có khả năng chống chịu các điều kiện bất thuận của ngoại cảnh (như khô hạn, lạnh, úng, mặn...) đã góp phần tăng đáng kể sản lượng lúa gạo ở nước ta

19

cũng như ở nhiều quốc gia khác. (5) Loại bỏ các chất độc: Một số cây trồng có các chất độc cần phải loại thải mới đảm bảo an toàn cho việc tiêu dùng. Chẳng hạn, hạt của cây Lathyrus sativus có độc tố hại thần kinh, β-N-oxalylamine alanine (BOAA) có khả năng gây bại liệt. Tương tự, dầu cải Brassica có erucic acid vốn có hại cho sức khoẻ con người. Việc loại bỏ các chất độc như vậy sẽ làm tăng giá trị dinh dưỡng của các cây trồng này. (6) Thay đổi về thời gian chín: Điều này cho phép luân phiên mùa vụ mới và mở rộng diện tích cây trồng. Việc tạo ra các giống lúa mỳ thích hợp với việc cấy muộn đã cho phép luân phiên lúa gạo-lúa mỳ. Như vậy chọn giống cho các giống cây trồng chín sớm, hoặc các giống thích hợp với ngày cấy khác nhau có lẽ là một mục tiêu quan trọng. (7) Các đặc điểm nông học: Việc cải tiến các đặc tính nông học, như chiều cao cây, khả năng đẻ nhánh, thời gian sinh trưởng, tập tính bò lan hoặc đứng thẳng, khả năng cơ giới hoá khi thu hoạch, bảo quản và chế biến nông sản sau thu hoạch, v.v. thường được quan tâm để đáp ứng nhu cầu của sản xuất và người tiêu dùng. Ví dụ, dạng thân lùn ở các cây ngũ cốc nói chung gắn liền với khả năng chống đổ và đáp ứng với phân bón; hơn nữa nó cho phép thu hoạch bằng máy rất tiện. (8) Tính ngủ nghỉ (của hạt): Ở một số giống, hạt nẩy mầm thậm chí cả trước khi thu hoạch nếu như xảy ra mưa vào thời gian chín, ví dụ: đậu xanh, lúa đại mạch (Hordeum vulgare) v.v. Tuy nhiên, ở một số trường hợp khác, người ta lại mong muốn loại trừ trạng thái ngủ nghỉ. (9) Tính cảm quang: Việc tạo ra các giống lúa mỳ cảm quang và không mẫn cảm với nhiệt độ và các giống lúa (O. sativa) cảm quang cho phép đưa trồng chúng ở các khu vực mới (ví dụ, xem ở mục '10' dưới đây). (10) Các giống cho các mùa vụ mới: Một trong những đóng góp quan trọng nhất của chọn giống thực vật là tạo ra các giống tốt hơn cho các vùng nông nghiệp mới. Điều này đã được thực hiện bằng cách điều chỉnh chu kỳ sinh trưởng của giống sao cho phù hợp hơn với mùa vụ sinh trưởng hiện có. Chẳng hạn, bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma (Co60) liều 1015 Krad lên hạt nẩy mầm, vào năm 2000 nhóm nghiên cứu của PGS.TS. Nguyễn Minh Công đã chọn tạo được giống lúa "Tám thơm Đột biến" (từ giống lúa đặc sản Tám thơm Hải Hậu của Nam Định), với nhiều đặc điểm độc đáo như: không còn cảm ứng quang chu kỳ như ở giống gốc, có khả năng thích ứng rộng ngay cả với các vùng đất cao, nghèo dinh dưỡng, không chủ động được nguồn nước tưới và năng suất có thể đạt 4-5 tấn/ha, trong khi vẫn giữ được mùi thơm của giống gốc. Hơn nữa, đây là giống lúa Tám thơm mới đầu tiên và duy nhất trồng được cả trong vụ xuân. Nhờ

20

vậy góp phần khắc phục được tình trạng khan hiếm gạo Tám thơm trong khoảng tháng 6 đến tháng11 hàng năm (Nguyễn Minh Công và cs 2003). 2. Mối quan hệ giữa khoa học chọn giống với các ngành khoa học khác Sự hiểu biết về mối quan hệ giữa khoa học chọn giống với các ngành khoa học khác có thể được giải đáp thông qua việc trả lời câu hỏi: Một nhà chọn giống cây trồng cần phải biết những gì? Như đã nói ở trên, để có thể thành công, nhà chọn giống cây trồng cần phải biết tất cả những gì anh ta có thể biết về đối tượng (các thực vật) mà anh ta đang nghiên cứu. Theo đó anh ta nên có một sự hiểu biết về các lĩnh vực hay môn học sau đây: (1) Thực vật học (Botany). Một nhà chọn giống cây trồng phải có sự hiểu biết rành rẽ về hình thái học và sự sinh sản của những cây mà anh ta định cải tiến; và cũng nên làm quen với phân loại học về loại cây đó. (2) Di truyền học (Genetics). Các nguyên lý của di truyền học cung cấp cơ sở cho các phương pháp chọn giống cây trồng. Vì vậy, vốn kiến thức sâu rộng có được về môn học này là rất thiết yếu cho việc cải tiến nhanh và hiệu quả một cây trồng nào đó. (3) Sinh lý học thực vật (Plant Physiology). Sự thích nghi của một giống được xác định thông qua sự đáp ứng của nó với các nhân tố môi trường như nóng, lạnh, khô hạn, độ mặn v.v. Kiến thức cơ sở sinh lý học về các hiện tượng này sẽ giúp nhà chọn giống trong việc tạo ra các giống chịu lạnh, chịu hạn hay chịu mặn v.v. Ngoài ra, một vài phương pháp sinh lý học dùng để chọn giống cho năng suất cao cũng đã được xác lập. (4) Hoá sinh học thực vật (Plant Biochemistry). Nhiều kiểu thử nghiệm chất lượng cần thiết cho việc xác định các đặc tính chất lượng của một giống. Các thử nghiệm này thông thường có liên quan đến các phân tích sinh hoá, ví dụ như hàm lượng protein, amino acid, đường v.v. Hiểu biết về hoá sinh học sẽ giúp ích trong khi tiến hành các thử nghiệm này cũng như phát triển các kỹ thuật để chọn lọc các tính trạng như vậy. (5) Nông học (Agronomy). Một nhà chọn giống giỏi trước hết phải là một nhà nông học giỏi. Anh ta phải có khả năng tạo ra một mùa vụ tốt để chọn lọc và đánh giá vật liệu của mình. (6) Thống kê học (Statistics). Để có được một sự so sánh chính xác về các quy trình thí nghệm các giống khác nhau, đòi hòi phải có một sự hiểu biết rành rọt về các phương pháp thống kê. Nhà chọn giống phải nắm vững kỹ thuật chia lô trên đồng ruộng, thiết kế thí nghiệm và các phép phân tích và thử nghiệm thống kê phù hợp. Các nguyên lý thống kê cũng là chỗ dựa căn bản cho sự hiểu biết về di truyền số lượng. (7) Bệnh học thực vật (Plant Pathology). Chọn giống kháng bệnh là

21

một mục tiêu quan trọng của chọn giống cây trồng. Để chọn giống kháng bệnh có hiệu quả, cần thiết phải có sự hiểu biết về các bệnh thực vật và các nguồn gây bệnh. (8) Côn trùng học (Entomology). Các côn trùng gây hại có thể phá hoại mùa màng đáng kể. Sự hiểu biết về các nạn dịch côn trùng là cần thiết để chọn các giống kháng côn trùng, và để bảo vệ vật liệu chọn giống mẫn cảm khỏi bị dịch bệnh gây hại. (9) Virus học (Bacteriology). Các rau đậu có các nốt sần rễ chứa các vi khuẩn Rhizobium có khả năng cố định nitơ từ khí quyển. Hiệu suất của hệ thống này phụ thuộc vào kiểu gene của cả vật chủ lẫn Rhizobium. Vì vậy, hiểu biết về loại vi khuẩn này rất hữu ích trong việc cải tiến cây rau đậu. Ngoài những điều nói trên, nhà chọn giống còn phải: (i) Nhạy bén trước các nhu cầu của thị trường, nhu cầu của nhà nông và các vấn đề sản xuất mùa vụ; (ii) Biết nhìn xa vào tương lai để có thể đón nhận các thách thức mà nông dân có thể đương đầu những năm sau đó; và (iii) Lập kế hoạch cho vài năm tới bởi vì phải mất một thời gian dài, thậm chí cả chục năm, để tạo ra và phóng thích một giống mới. Để trở thành một chuyên gia am tường tất cả các lĩnh vực nói trên quả thật rất khó cho một cá nhân. Thay vì thế, ngày càng có nhiều tổ hợp hay nhóm nghiên cứu được hình thành. Các chuyên gia thuộc các lĩnh vực khác nhau (như di truyền học, bệnh học, côn trùng học và nông học) hợp tác với nhà chọn giống cây trồng trong việc cải tiến giống.

Câu hỏi ôn tập 1. Thế nào là giống? Nêu các đặc trưng của khái niệm giống cây trồng và cho một số ví dụ về các giống cây ngũ cốc ở nước ta. 2. Hãy giải thích những đóng góp của chọn giống thực vật trong việc cải thiện năng suất nông nghiệp. 3. Hãy mô tả ngắn gọn lịch sử chọn giống cây trồng và nêu các đóng góp của các nhà khoa học sau đây trong sự phát triển của ngành chọn giống cây trồng: (i) T. Fairchild, (ii) J. Koelreuter, (iii) A. Knight, (iv) Le Couter và Shireff, (v) Vilmorin, (vi) G. Mendel, (vii) Nilsson-Ehle, (viii) W. Johannsen, và (ix) G.H. Shull. 4. Mô tả các mục tiêu khác nhau của chọn giống thực vật và tìm các ví dụ thích hợp cho mỗi mục tiêu. 5. Hãy phân tích bản chất của chọn giống cây trồng và mối quan hệ giữa nó với các môn học khác mà một nhà chọn giống thực vật phải làm quen để tiến hành cải tiến cây trồng có hiệu quả.

22

Tài liệu Tham khảo Tiếng Việt Nguyễn Minh Công, PV Ro, ĐH Ất, BH Thuỷ, ĐX Tân, LX Trình, HT Phán. 2003. Ứng dụng kết quả của đề tài nghiên cứu khoa học cơ bản cấp Nhà nước thuộc ngành khoa học sự sống mang mã số 4.5.10 và 6.5.10 (giai đoạn 1996-2000) trong chọn tạo các giống lúa chất lượng. Trong: Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Trang: 847-851. NXB KH & KT, Hà Nội. Nguyễn Văn Hiển (chủ biên). 2000. Chọn giống cây trồng. NXB Giáo Dục, Hà Nội. Trần Đình Long (chủ biên). 1997. Chọn giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. Tiếng Anh Allard RW. 1976. Principles of plant breeding. John Wiley & Son, Inc., New York. Chopra VL (Ed.). 1989. Plant Breeding: Theory and Practice. Oxford & IBH Publishing Co. PVT, Ltd. Hayward MD, NO Bosemark, I. Ramagosa, Coordinating ed. M.C. Cerezo. 1994. Plant Breeding: Principles and Prospects. 2nd ed. Chapman & Hall, London. IAEA .1995. Induced Mutations and Molecular Techniques for Crop Improvement (Proceedings of an International Symposium on the Use of Induced Mutations and Molecular Techniques for Crop Improvement), Joint FAO/ IAEA, 19 - 23 June 1995, IAEA, Vienna, Austria. Khush G.S. 1998. "Genetics for sustaining food security in 2020". In: XVIIIth International Congress of Genetics (Abstracts), pp.7-8 .August 1015, 1998, Beijing, China. Singh B.D. 1986. Plant Breeding: Principles and methods. 2nd edn., Kalyani Publishers, New Delhi - Ludhiana, India. Tan C.C. 1998. "Genetics - better life for all" (Presidential address at opening ceremony), In: XVIIIth International Congress of Genetics (Abstracts), pp.1-6. August 10-15, 1998, Beijing, China.

23

Chương 2

Tạo Vật liệu Khởi ñầu trong Chọn giống Thực vật Như ñã ñề cập ở chương trước, ñể có thể tiến hành chọn lọc có hiệu quả, cần phải tiến hành thu thập hoặc tạo ra các thay ñổi ña dạng trong kiểu gene của ñối tượng chọn giống. Vì vậy, việc tạo vật liệu khởi ñầu ñóng vai trò thiết yếu cho bất kỳ chương trình chọn giống thực vật nào. Trong chương này, chúng ta sẽ tìm hiểu: (i) Vai trò của vật liệu khởi ñầu trong chọn tạo giống; (ii) Nguồn gene thực vật trong chọn giống cây trồng; và (iii) Sơ lược các nguồn biến dị di truyền trong chọn giống.

I. Vai trò của vật liệu khởi ñầu trong chọn tạo giống ðể cho công tác chọn giống thực vật thành công, trước tiên phải tiến hành thu thập nguồn vật liệu khởi ñầu phong phú và ña dạng trong tự nhiên hoặc tạo ra các thay ñổi ña dạng trong kiểu gene của các loài cây trồng làm cơ sở cho việc chọn lọc và ñánh giá. Tạo nguồn biến dị (creation of variation) là khâu ñầu tiên của một quy trình chọn tạo giống. Nó ñóng vai trò thiết yếu cho bất kỳ chương trình chọn giống thực vật nào; không thể có sự chọn lọc hay cải tiến nào nếu như không có biến dị. Nguồn biến dị của vật liệu khởi ñầu càng phong phú và ña dạng chừng nào thì sự chọn lọc và cải tiến càng có cơ may thành công chừng ấy (Hình 2.1). Vật liệu khởi ñầu hay nguồn gene trong chọn giống thực vật là tất cả các dạng ñã ñược con người tách ra và trồng trọt từ xa xưa hoặc mới ñược tạo ra cho ñến các loài hoang dại ñược nhà chọn giống sử dụng ñể tạo ra các giống mới bằng các phương pháp chọn giống thích hợp. Sự thành công trong việc tạo ra các giống cây trồng mới phụ thuộc rất lớn vào mức ñộ phong phú và ña dạng của nguồn gene thu thập ñược. Bởi vì từ ñó nhà chọn giống mới có thể chọn ñúng vật liệu khởi ñầu ñáp ứng ñược mục ñích và yêu cầu ñề ra. Các dạng cây trồng khác nhau ở ñây có thể là các giống ñịa phương, các giống ñược thu thập từ nhiều vùng sinh thái khác nhau, giống nhập nội nhưng cũng có thể là các giống ñược tạo ra do quá trình chọn tạo giống phức tạp nào ñó. Ví dụ: Giống lúa ðH60 là giống ngắn ngày có khả năng chịu phèn, chịu nóng ở giai ñoạn trỗ bông, cho năng suất cao trên các vùng ñất khó khăn của các tỉnh miền núi phía Bắc và miền Trung nước ta là kết quả của sự lai tạo giữa giống VN10 của Việt Nam và giống Norin15 của Nhật Bản.

24

Giống lúa CR203 do Viện bảo vệ thực vật nước ta chọn từ giống nhập nội IR8423-132-6-2-2 có khả năng chống rầy và thích ứng rộng của IRRI (thông qua Chương trình thử nghiệm lúa quốc tế = IRTP).

Hình 2.1 Các kiểu biến ñổi ña dạng về hình dạng, kích thước và màu sắc quả ở các giống cà chua (trái) và ớt (phải).

Trong số các nhóm cây hoang dại ñược thu thập từ nhiều vùng ñịa lý khác nhau trên thế giới, người ta rất chú ý ñến các ñặc tính quý hiếm của các dạng có quan hệ họ hàng gần gũi về mặt phân loại ñể sử dụng trong công tác chọn tạo giống. Ví dụ, lúa dại Oryza nivara L. hoặc Oryza officinalis L. là hai loài lúa dại cùng chi với lúa trồng Oryza sativa L. Chúng có nhiều ñặc ñiểm kháng sâu bệnh, kháng rầy và các ñiều kiện phèn mặn ñược sử dụng ñể lai với lúa trồng nhằm tăng cường các ñặc tính ưu việt ñó ở lúa trồng. ðiển hình là giống lúa IR-8423 do Viện lúa quốc tế (IRRI) tạo ra có nguồn gene từ lúa dại O. nivara L. ðể thuận tiện cho quá trình sử dụng các nguồn gene hay vật liệu khởi ñầu này trong công tác chọn tạo giống, dựa theo nguồn gốc xuất xứ của chúng, người ta chia thành hai nhóm chính: Vật liệu khởi ñầu có nguồn gốc trong nước và vật liệu khởi ñầu có nguồn gốc nhập nội. Các quần thể trong mỗi nhóm có thể bắt nguồn từ tự nhiên hoặc nhân tạo (Hình 2.2). Trong số vật liệu khởi ñầu có nguồn gốc trong nước, quan trọng nhất là các giống ñịa phương cổ truyền ñược hình thành ở mỗi vùng qua thời gian dài nên chúng thích nghi và phát triển tốt ở các vùng ñó. Chúng thường mang các ñặc ñiểm quý hiếm về mặt chất lượng, tính chống chịu hoặc năng suất. Ví dụ, lúa tám thơm Xuân ðài ở Xuân Thuỷ - Hà Nam, cam Xã ðoài, bưởi ðoan Hùng, nhãn lồng Hưng Yên, thanh trà Nguyệt Biều - Huế, v.v. Còn các loài nhập nội là những giống ñược ñưa từ các vùng khác nhau trên thế giới ñến nhưng vẫn còn giữ ñược những ñặc tính ban ñầu của nó. Ví dụ, các giống lúa IR-8, IR-64, IR-17494... nhập từ IRRI; hoặc các giống ngô ðK-888, P-11 nhập từ Thái Lan.

25

Vật liệu khởi ñâu

Vật liệu trong nước

Vật liệu từ tự nhiên

Vật liệu nhập nội

Vật liệu nhân tạo

Các câu hoang dại

Các dòng tự phối Các dạng lai tạo

Các quần thể ñịa phương (do chọn giống cổ truyền)

Các dạng ñột biến Bộ sưu tập giông cây trồng thế giới

Các dạng ña bội thể Các dạng nuôi cấy mô Các dạng tạo ra bằng kỹ thuật di truyền

Hình 2.2 Phân loại các vật liệu khởi ñầu.

Trong chọn giống thực vật có nhiều biện pháp ñể tạo nguồn vật liệu khởi ñầu hay các biến dị như: Sự thuần hoá (domestication), sưu tập quỹ gene (germplasm collection), nhập nội (introduction), lai giữa các giống và lai xa (intervarietal and distant hybridization), gây ñột biến bằng các tác nhân vật lý và hoá học ñể thu nhận các dạng ñột biến (mutant) và ña bội thể (polyploid), hoặc bằng cách nuôi cấy mô-tế bào, nuôi cấy bao phấn hoặc noãn ñể tạo ra các dòng thuần; bằng kỹ thuật di truyền có thể tạo ra các cây chuyển gene mang các gene mong muốn như chịu ñược thuốc diệt cỏ, chống ñược sâu bệnh, hoặc có chất lượng sản phẩm tốt. ðó là những vật liệu khởi ñầu quý giá cho quá trình chọn tạo giống

II. Nguồn gene thực vật trong chọn giống cây trồng 1. Vấn ñề phân bố và phân loại nguồn gen thực vật 1.1. Vấn ñề phân bố và phân loại nguồn gene thực vật Giới thực vật vốn rất ña dạng về thành phần loài (khoảng 500.000 loài) và phân bố khắp nơi trên trái ñất. Do nguồn gene thực vật rất phong phú

26

và ña dạng như vậy cho nên cần có sự phân loại hợp lý nhằm hệ thống hoá và cung cấp thông tin cho người sử dụng. Mặc dù ý niệm về sự phân loại ñã có từ xưa, nhưng thực sự chỉ bắt ñầu từ thế kỷ thứ XVIII với hệ thống phân loại của Carl von Linneaus. Về sau này, sự phân loại sinh vật nói chung ñược hoàn thiện thêm nhờ sự phát triển của di truyền học tế bào (cytogenetics) và di truyền học phân tử (molecular genetics). Ngoài ra, ñể tiện sử dụng trong phạm trù chọn giống, người ta còn phân loại nguồn gene thực vật dựa vào nguồn gốc xuất xứ của chúng (xem Hình 2.2).
Theo hệ thống phân loại của Linneaus ñã ñược sửa ñổi, có các ñơn vị phân loại thường dùng (từ trong ngoặc là tiếng Latin), từ lớn ñến nhỏ như sau: Ngành (Divisio), Lớp (Classis), Bộ (Ordines), Họ (Familia), Tộc (Tribus), Chi (Genus), Loài (Species), Nhánh (Proles), Thứ (Varietas), Dạng (Forma), và cuối cùng là Cá thể (Individus). Trong chọn giống thực vật, các nhà nghiên cứu thường dùng các ñơn vị phân loại sau: Họ, chi, loài, thứ, dạng; và khi cần thì thêm họ phụ (subfamilia), loài phụ (subspecies). Ví dụ, cây lúa trồng châu Á thuộc: Phân ngành: Angiospermae. Lớp: Monocotyledonae. Bộ: Glumiflorae.

Họ: Gramineae hay Poaceae. Chi : Oryza Loài: Oryza sativa L.

+ Loài phụ: O. sativa L. ssp. Indica (loài phụ Ấn ðộ) + Thứ: O. sativa L. var. mutica (hạt dài, thẳng và không râu; vỏ trấu màu vàng rơm; gạo trắng) + Dạng: Elongatum (cây cao, lóng dài) Bảng 2.1: Số lượng nhiễm sắc thể lưỡng bội (2n) của một số loài cây trồng thường gặp Loài cây trồng Lúa (Oryza sativa) Ngô (Zea mays) Cao lương (Shorghum vulgare) Kê (Setaria italica) Khoai tây (Solanum tuberosum) ðậu Hà Lan (Pisum sativum) ðậu tương (Glycine hyspida) ðậu côve (Phaseolus vulgaris) ðậu phộng (Arachis hypogea) Vừng (Sasamum indicum)

2n 24 20 20 18 48 14 38 22 40 52

Loài cây trồng Dưa chuột (Cucumis sativus) Dưa hấu (Citrullus vulgaris) Hành tây (Allium sativa) Ớt (Capcium anuum) Bắp cải (Brassica oleracea) Bí ngô (Cucurbita maxima) Cà chua (L. esculentum) Khoai lang (Ipomea batatas) Bông luồi (Gossypium hirsutum) Thuốc lá (Nicotiana tabacum)

2n 14 22 16 24 18 48 24 90 52 48

27

Với hệ thống phân loại này, các ñơn vị phân loại dưới loài có quan hệ với nhau rất chặt chẽ; và trên cơ sở ñó người ta phân biệt lai gần (lai trong cùng loài) và lai xa (lai giữa các loài hoặc giữa các chi khác nhau).
Mỗi loài cây trồng hay thực vật nói chung có một số lượng nhiễm sắc thể ñặc trưng (Bảng 2.1) Dưới ñây ta hãy tìm hiểu sơ lược về nguồn gốc, sự phân loại và phân bố của Chi Oryza nói chung, và của lúa trồng châu Á nói riêng. Theo Watanabe (1997), do tính ña dạng và phức tạp về mặt hình thái và di truyền của chi Oryza ñã gây khó khăn trong việc phân loại và ñặt tên các loài thuộc chi này. Chi Oryza có khoảng 20 loài hoang dại phân bố ở các vùng nhiệt ñới và á nhiệt ñới, và chỉ có hai loài lúa trồng là: O. sativa L. (trồng ở châu Á và nhiều vùng khác khắp ñịa cầu) và O. glaberrima Steud (chỉ trồng ở một số quốc gia Tây Phi). Về nguồn gốc của lúa trồng và sự tiến hoá của chúng, ñến nay có nhiều giả thuyết khác nhau. Tuy nhiên, theo Oka (1991) và Oka và Morishima (1997), tổ tiên của O. sativa là loài O. perennis Châu Á và của O. glaberrima là O. breviligulata. Hai loài này tiến hoá ñộc lập nhau mà tổ tiên của chúng còn chưa ñược xác ñịnh. Về nguồn gốc cây lúa trồng châu Á cũng có nhiều quan ñiểm khác nhau. Matsuo (1997) ñã nêu lên bốn giả thuyết về nguồn gốc của lúa trồng Ấn ðộ, Trung Quốc, các vùng núi ở ðông Nam Á và phạm vi rộng lớn với các nguồn gốc ña chủng loại. Tuy nhiên, hiện giờ người ta tin rằng các khu vực miền núi ở ðông Nam Á rất có thể là nguồn gốc của lúa trồng. Kết luận này ủng hộ học thuyết của Morinaga năm 1967 cho rằng lúa trồng xuất phát từ phía ðông Nam chân núi Hymalaya. ðiều này ñã ñược GS. Bùi Huy ðáp ñề cập từ năm 1964: Việt Nam là một trong những trung tâm sớm nhất của ðông Nam Á ñược nhiều nhà khoa học gọi là quê hương của cây lúa trồng; nó xuất hiện cách ñây chừng 10 - 12 nghìn năm cùng với nền văn hoá Hoà Bình (Bùi Huy ðáp, 1999). Sự phân loại các giống lúa trồng thuộc loài O. sativa dựa trên hai cơ sở chính: (i) ñộ hữu thụ của các cây lai F1, và (ii) các ñặc ñiểm hình thái, sinh lý và sinh thái. Chẳng hạn, dựa vào ñộ hữu thụ của các cây lai F1, lần ñầu tiên năm 1928 Kato và cs ñã phân biệt O. sativa thành hai loài phụ (subspecies), còn gọi là kiểu (type) hay nhóm giống (group): kiểu Indica và kiểu Japonica. Việc khảo sát sự phân bố ñịa lý của hai loài phụ này cho thấy các giống lúa ñịa phương ở Nhật, Bắc Triều Tiên và Bắc Trung Quốc ñều thuộc loài phụ Japonica. Trái lại, các giống lúa ñịa phương Ấn ðộ, Java, Nam Trung Quốc và ðài Loan thuộc loài phụ Indica. Các kết quả

28

nghiên cứu của Terao và Mizushima năm 1943 và Morinaga năm 1953 phát hiện sự tồn tại của một kiểu trung gian không thuộc Indica và Japonica và ñặt tên là kiểu Javanica, vì các giống nghiên cứu này hầu hết bắt nguồn từ Java, tức Indonesia. (Kushibuchi 1997; Watanabe 1997). Năm 1952, Matsuo lấy hình thái học làm cơ sở chính ñể phân loại các giống lúa trên thế giới và ñã phân chia 3 kiểu A, B và C. Trong ñó, kiểu A (Japonica) hầu như chỉ trồng ở Nhật, Bắc Triều Tiên và Bắc Trung Quốc; kiểu B (Javanica) phân bố chủ yếu ở Indonesia và các quần ñảo Thái Bình Dương; và kiểu C (Indica) hầu hết ñược trồng ở Ấn ðộ, Nam Trung Quốc và các nước ðông Nam Á. Ở nước ta, các kết quả phân loại loài phụ các giống lúa của các vùng khác nhau cho thấy quỹ gene lúa gồm 89% lúa Indica, 9,5% lúa Japonica và 1,5% chưa phân loại ñược (Luu Ngoc Trinh và cs, 1998). Phần lớn giống lúa ở vùng Tây Bắc nước ta là lúa Japonica (Chaudhary, 2000). 1.2. Các trung tâm phát sinh cây trồng (Centres of origin) Các thực vật có hoa ñầu tiên xuất hiện cách ñây chừng 150 triệu năm. Nhờ áp dụng chọn lọc nhân tạo mạnh mẽ mà các thực vật từ tự nhiên ñã chuyển sang thích nghi với chế ñộ canh tác với tư cách là các dạng cây trồng. Kết quả là tính biến dị di truyền của các cây trồng ñã giảm ñi nhiều. Có bằng chứng ñáng kể cho thấy rằng các cây trồng ñã không ñược phân bố một cách ñồng bộ trên khắp thế giới. Thật vậy, dựa trên khối lượng khổng lồ vật liệu thu thập ñược từ nhiều vùng khác nhau trên thế giới trong suốt 20 năm kể từ năm 1916, nhà di truyền học người Nga Nicolai Ivanovich Vavilov (1887-1943; Hình 2.3) ñã xây dựng nên học thuyết về các trung tâm phát sinh cây trồng (Centers of origin of cultivated plants; Hình 2.4). N.I. Vavilov cho rằng các cây trồng tiến hoá từ các loài hoang dại trong các khu vực này cho thấy tính ña dạng lớn hơn và ông gọi ñó là các trung tâm phát sinh sơ cấp. Sau ñó, các cây trồng này dịch chuyển sang các khu vực khác chủ yếu do các hoạt ñộng của con người; và tại các khu vực này nói chung không có sự biến ñổi phong phú và ña dạng như ở các trung tâm khởi phát. Nhưng ở một số khu vực, các loài cây trồng nào ñó lại cho thấy sự ña dạng ñáng kể về các dạng hình mặc dù chúng không bắt nguồn ở ñó. Những khu vực như vậy ñược gọi là các Hình 2.3 N.I. Vavilov trung tâm phát sinh thứ cấp của các loài này.

29

Vavilov ñề nghị 8 trung tâm phát sinh cây trồng chính trên thế giới là: Trung Quốc, Ấn ðộ, Trung Á, Tiểu Á, ðịa Trung Hải, Abyssinia, Trung Mỹ và Nam Mỹ. Về sau P.M. Zukovsky ñã bổ sung và phát triển các trung tâm của Vavilov thành 12 trung tâm phát sinh tất cả các cây trồng trên thế giới, ñược tóm tắt như sau (theo Nguyễn Văn Hiển, chủ biên 2000): • Trung tâm Trung Quốc - Nhật Bản: ðây là trung tâm lớn nhất, chứa ñựng một khối lượng khổng lồ các biến chủng của 140 loài cây trồng khác nhau, trong ñó có mặt hầu hết các loài cây trồng quan trọng nhất, như: lúa gạo (O. sativa L., loài phụ Japonica), ñậu tương, kê, cây cải, ngô nếp, các loài cam quýt thuộc chi Citrus, táo, lạc (ñậu phộng), vừng (mè), sâm, cao lương, cây thuốc phiện; ñây cũng là quê hương của các cây chè, ñay, gai, cải dầu v.v. • Trung tâm ðông dương - Indonesia: ðây là trung tâm phát sinh lúa nước (các loài phụ Indica và Javanica); và là quê hương của nhiều loài cây ăn quả nhiệt ñới như: chuối, dứa, xoài, dừa, sầu riêng, mămng cụt, chôm chôm, mít, mãng cầu v.v. • Trung tâm Australia: Tại ñây tìm thấy 500 trong số 605 loài cây có dầu nhiệt ñới, 21 loài thuốc lá, 3 loài thuộc chi Oryza; và là trung tâm ñầu tiên của loài bông Hải ñảo (Gossypium barbadense L.). • Trung tâm Nam Á (chủ yếu là Ấn ðộ): ðây là một trong những trung tâm ñóng vai trò lớn trong lịch sử trồng trọt của thế giới, quê hương tổ tiên của lúa trồng (loài phụ Indica) và mía. ðây cũng là nơi phát sinh của các cây vừng, gai, cao lương, bạc hà, hồ tiêu và nhiều loại cây thuốc và cây rau khác. • Trung tâm Trung Á (bao gồm vùng Tây bắc Ấn ðộ, Afghanistan, Uzhbekistan, tây Thiên Tân): Là nơi phát sinh lúa mỳ mềm, ñậu Hà Lan, ñậu ngựa, ñậu mỏ két, hành tây, dưa bở, táo, lê, nho, anh ñào... • Trung tâm Tây Á (vùng Cận ðông, gồm một vùng lãnh thổ rộng lớn của các tiểu vương quốc Ả Rập thống nhất, Iran, Iraq, Capcas, vùng thượng Turmenia, bán ñảo Ả Rập): Là trung tâm phát sinh lúa mỳ (chi Triticum), mạch ñen (chi Secale), ñại mạch (chi Hordeum), các cây cỏ dùng làm thức ăn cho gia súc như: cỏ linh lăng (Medicago sativa), cỏ ba lá (Trifolium sp.), táo (Malus sp.), và nho. • Trung tâm ðịa Trung Hải (Mediterranean): ðây là trung tâm phát sinh lúa mỳ cứng, củ cải ñường, bắp cải; và là trung tâm thứ cấp của nho, táo, cà rốt, ñậu Hà Lan, ñậu côve. • Trung tâm châu Phi: ðây là trung tâm chính của ñại mạch, ñậu xanh, lạc; và là quê hương của các cây cà phê, ca cao, cao lương, bông châu Phi,

30

thầu dầu, lúa nước châu Phi (O. glaberrima). • Trung tâm Âu - Siberia: ðây là trung tâm phát sinh các cây củ cải ñường, bắp cải, nho, lê, mận, anh ñào, dâu tây, cỏ ba lá, cây hoa bia. • Trung tâm Trung Mỹ (Mexico, Goatemala, Hondurat và Panama): ðây là nơi phát sinh của cây ngô (Zea mays), của nhiều loài cây thuộc bộ ñậu (Fabales) và chi Solanum, với rất nhiều loài khoai tây dại và khoai tây trồng (S. tuberosum); ðây cũng là quê hương của các cây thuộc họ bầu bí, ca cao, bông luồi (G. hirsutum) và thuốc lá. • Trung tâm Nam Mỹ: ðây là nơi phát sinh cây bông Ai cập, khoai tây và ngô; và là quê hương của các cây cà chua, hướng dương, lạc, ớt, bầu bí, dưa, ca cao, cao su và cà phê. • Trung tâm Bắc Mỹ: ðây là nơi phát sinh các cây dâu tây, khoai tây, thuốc lá, nho, bông, hướng dương châu Mỹ, táo, mận ñào v.v.

Hình 2.4 Các Trung tâm của Vavilov về nguồn gốc phát sinh các giống cây trồng trên thế giới (theo Hartlan 1976).

Quan ñiểm này của Vavilov ñược nhiều nhà khoa học trên thế giới thừa nhận và nó giúp cho các nhà chọn giống ñịnh hướng ñúng trong việc tìm kiếm và thu thập nguồn gene mong muốn trong tự nhiên ñể ñáp ứng ñược yêu cầu của chương trình chọn tạo giống ñặt ra. Chẳng hạn, ñể có thể

31

thu thập nhiều dạng lúa hoang dại thì ñến ðông Nam Á vì ñây là cái nôi phát sinh của lúa trồng. Tương tự, nếu muốn thu ñược nhiều dạng ngô và khoai tây hoang dại thì ñến Mexico và một phần Bắc Mỹ. Bằng cách ñó các nhà chọn giống Mỹ ñã phát hiện ñược dạng lúa mỳ hoang dại có khả năng kháng bệnh rỉ sắt ở Ethiopia (thuộc trung tâm phát sinh của lúa mỳ Triticum aestivum). Mặt khác, từ quy luật về dãy biến dị tương ñồng (law of homologous series in variation) của Vavilov cho thấy rằng các loài có quan hệ họ hàng gần với các loài hoang dại là nguồn cung cấp các biến dị di truyền tuyệt vời cho chọn lọc và cải tiến giống cây trồng. Vì vậy, mong muốn hiện nay là thu thập và bảo quản các hạt giống từ các giống cây trồng chất lượng cao, các dòng ñột biến và cả các loài hoang dại có quan hệ họ hàng. J.R. Harlan, trong một chuyến du hành khảo sát thực vật tại Thổ Nhĩ Kỳ (Turkey) vào năm 1948, ñã bị ấn tượng với sự ña dạng cực kỳ phát hiện ở các khu vực nhỏ. Các khu vực này ñược Harlan gọi là các tiểu trung tâm (micrconters) vì sự tiến hoá thực vật ở các tiểu trung tâm này dường như diễn tiến ở tốc ñộ nhanh hơn các khu vực khác, ñặc biệt là ở các vùng ñịa lý rộng lớn hơn. Các tiểu trung tâm này dường như cung cấp một cơ hội tuyệt vời, không chỉ ñể thu thập các kiểu có sẵn, mà còn ñể nghiên cứu sự tiến hoá của các kiểu cây trồng về mặt thực nghiệm. Hơn nữa, khi thảo luận về biến dị tự nhiên ở thực vật, Harlan ñã chỉ rõ các trung tâm ñịa lý về tính ña dạng di truyền của các nguồn gene mà chúng ta dựa vào ñang có nguy cơ bị tuyệt chủng (Harlan 1976). Từ ñó cho thấy nhu cầu cấp bách của việc xây dựng, bảo quản và sử dụng các nguồn gene trong chọn giống cây trồng, cũng như vấn ñề bảo vệ thiên nhiên và không ngừng làm phong phú thêm tính ña dạng của nó. 2. Bảo quản và sử dụng nguồn gene thực vật trong chọn giống 2.1. Thành lập quỹ gene và bảo quản nguồn gene cây trồng Như ñã nói ở trên, khâu ñầu tiên trong chọn giống là thu thập các vật liệu có sắn trong tự nhiên hoặc các giống ñịa phương từ nhiều vùng miền khác nhau, kể cả các giống nhập nội ñể xây dựng nên bộ sưu tập giống gọi là sưu tập quỹ gene (germplasm collection) hay các ngân quỹ gene (germplasm banks). Bởi theo quan ñiểm của di truyền học và chọn giống thì mọi nguồn gene có sẵn trong tự nhiên hoặc các giống ñịa phương thường có chứa các gene quý hiếm như chống chịu sâu bệnh và các ñiều kiện khắc nghiệt của môi trường sinh thái mà chúng sinh sống lâu ñời; hoặc các giống ñặc sản truyền thống thường cho sản phẩm có chất lượng và hương thơm ñặc biệt. ðó là tài sản vô giá mà thiên nhiên ñã ban tặng

32

cho loài người ñể duy trì sự sống của họ.

Hình 2.5 Trung tâm tài nguyên di truyền tại IRRI là trung tâm lớn mạnh nhất về bảo tồn và sử dụng tính ña dạng sinh học của cây lúa (Nguồn: IRRI).

Hơn nữa, trước tình trạng ñô thị hoá các khu vực nông thôn diễn ra nhanh chóng và áp lực gia tăng mạnh mẽ của dân số thế giới buộc các nhà chọn giống phải không ngừng tạo ra các giống cây trồng có năng suất ngày một cao hơn, kéo theo sự thay ñổi cơ cấu cây trồng nông nghiệp theo hướng tập trung vào chỉ một vài giống cho năng suất cao ñồng thời thu hẹp phổ gene của cây trồng. Tất cả ñiều ñó dẫn tới nguy cơ xói mòn tài nguyên di truyền, ñánh mất các giống ñặc sản ñịa phương lâu ñời và tạo ra một nền nông nghiệp phát triển không bền vững. Việc bảo tồn nguồn gene vì vậy ñược xem là nền tảng quan trọng cho sự ổn ñịnh của nông nghiệp và sự an toàn lương thực-thực phẩm của toàn thể nhân loại. ðó không chỉ là công việc của từng quốc gia mà còn là của các tổ chức quốc tế. ðặc biệt, Tổ chức lương-nông (FAO) của Liên Hiệp Quốc (UN) ñã rất chú ý ñến vấn ñề này và có các hoạt ñộng thiết thực nhằm kết nối các Viện nghiên cứu các cây trồng quan trọng như lúa, lúa mỳ, ngô, v.v... thành một mạng lưới hỗ trợ lẫn nhau, ñể có thể duy trì và phát triển nguồn gene cây trồng trên phạm vi toàn cầu. Một số trung tâm lưu trữ và sử dụng nguồn gene thực vật nổi tiếng trên thế giới như: Trung tâm tài nguyên di truyền thực vật quốc tế (IBPGR), Trung tâm nguồn di truyền - Viện lúa quốc tế (IRRI; Hình 2.5), Trung tâm tài nguyên di truyền quốc gia New Dehli - Ấn ðộ, Viện nghiên cứu cây trồng mang tên Vavilov - Liên bang Nga (VIR), Viện cây trồng Bắc Kinh - Trung Quốc, Viện tài nguyên sinh học quốc gia Nhật Bản, v.v.

33

Nhiệm vụ của các trung tâm này là thu thập, mô tả, phân loại, ñánh giá và bảo quản tất cả các loài cây trồng và các tổ tiên hoang dại của chúng theo cả hai phương thức: bảo quản ex situ (bảo quản trong các ñiều kiện nhân tạo như phòng thí nghiệm, vườn ươm...) và bảo quản in situ (bảo quản tại chỗ, trong các ñiều kiện tự nhiên vốn có của sinh vật). Tất cả thông tin liên quan các mẩu giống bảo quản ñược lưu trữ dưới dạng các hồ sơ, ấn phẩm với sự trợ giúp của máy tính. Nhờ ñó các nhà chọn giống có thể dễ dàng tra cứu và yêu cầu cung cấp vật liệu cần thiết cho một chương trình chọn giống cụ thể. Gần ñây, Trung tâm tài nguyên di truyền thực vật quốc tế (International Board for Plant Genetic Resources = IBPGR) ñã phân tích ñánh giá ñược 2 triệu mẩu thuộc 9 loại cây trồng quan trọng về các ñặc tính sinh học; IRRI ñánh giá ñược 85.000 mẩu; Trung Quốc - 65.000 mẩu lúa, trong ñó có 46.887 mẩu ñịa phương, 2.443 mẩu vừa ñược cải tiến, 1.039 chủng lai, 6.388 mẩu nhập nội (Trần Duy Quý, 1997). Việt Nam nằm trong bán ñảo ðông Dương, giữa quần ñảo Malaysia và nam Trung Quốc - một trong những trung tâm phát sinh các giống cây trồng. Do ñiều kiện ñịa lý và khí hậu tự nhiên ñặc trưng ñó mà khu hệ thực vật nước ta nói chung và hệ cây trồng nói riêng rất phong phú về loài và ña dạng về thứ và kiểu gene. Mặt khác, nước ta cũng là nơi thuận lợi ñể trồng các loài cây nhập nội, ñặc biệt là các cây trồng có nguồn gốc từ nam Trung Quốc và nam Ấn ðộ. Các thông báo gần ñây từ Trung tâm Tài nguyên Di truyền Thực vật Viện KHKT Nông nghiệp Việt Nam cho thấy: các giống lúa ở miền Bắc và cao nguyên Trung Bộ nước ta có chỉ số ña dạng di truyền cao nhất; kế ñến là vùng Duyên hải miền Trung và thấp nhất là ñồng bằng Sông Cửu Long (Lưu Ngọc Trình, 1995; ðào Thế Tuấn và cs, 1998). 2.2. Sử dụng nguồn gene thực vật trong chọn giống Cho ñến nay, trên khắp thế giới có hơn 700 ngân hàng quỹ gene ñược ñưa vào hoạt ñộng với hơn 25 triệu mục giới thiệu các loài trồng trọt và hoang dại ñã ñược lập danh mục. Các bộ sưu tập này ñược sử dụng ñể làm giàu thêm các nguồn gene xác ñịnh các tính trạng mong muốn. 2.2.1. Sử dụng các giống ñịa phương Do các giống ñịa phương ñược hình thành từ quá trình chọn lọc tự nhiên và nhân tạo lâu dài trong ñiều kiện ñịa phương, nên có các ñặc ñiểm cơ bản là: (i) thích nghi cao với ñiều kiện ñịa phương; (ii) có tính chống chịu cao ñối với một số sâu bệnh và ñiều kiện ngoại cảnh bất thuận; và (iii) là một quần thể phức tạp gồm nhiều dạng tồn tại trong một trạng thái

34

cân bằng quần thể; chúng có các phản ứng khác nhau với các ñiều kiện của ngoại cảnh và do ñó thường cho năng suất ổn ñịnh trong sự biến ñộng của các ñiều kiện sinh thái ñịa phương. Các giống ñịa phương có các ñặc tính tốt có thể ñược dùng ñể: (i) Trực tiếp chọn ra các dạng tốt nhất, phù hợp với kiểu ñịa lý sinh thái và gây thành giống mới. (ii) Tiến hành các tổ hợp lai giữa các giống khác nhau nhằm kết hợp các tính trạng tốt vào một giống mới. (iii) Cải tiến một vài tính trạng mong muốn nhờ phương pháp gây ñột biến. Ví dụ, từ giống lúa ñặc sản Tám thơm Hải Hậu của Nam ðịnh, bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma (Co60) lên hạt nẩy mầm, ñã chọn tạo ñược giống lúa "Tám thơm ðột biến", với nhiều ñặc ñiểm ñộc ñáo như: không còn cảm ứng quang chu kỳ như ở giống gốc, có khả năng thích ứng rộng ngay cả với các vùng ñất cao, nghèo dinh dưỡng, không chủ ñộng ñược nguồn nước tưới và năng suất có thể ñạt 4-5 tấn/ha, trong khi vẫn giữ ñược mùi thơm của giống gốc (Nguyễn Minh Công và cs 2003). 2.2.2. Sử dụng các tập ñoàn giống cây trồng thế giới Do ñây là những bộ sưu tập quỹ gene quý hiếm và ña dạng ñược tập hợp từ các vùng khác nhau trên thế giới, nên chúng có thể ñáp ứng ñược hầu hết các mục tiêu của các chương trình chọn giống (như chọn lọc, lai tạo, gây ñột biến ...).

Hình 2.6 Một giống lúa bán lùn cho năng suất cao gọi là IR-8 (trái), một phần của cuộc cách mạng xanh lần thứ hai, ñã ñược tạo ra bằng cách lai giữa hai dòng bố mẹ: PETA từ Indonesia (giữa) và DGWG từ Trung Quốc (phải). Cây thấp và cứng hơn của giống lúa mới này cho phép chống ñổ tốt và có khả năng mang các bông lớn trĩu hạt mà không bị oằn xuống (Nguồn: IRRI).

35

Có thể thấy rõ thành quả của các "cuộc cách mạng xanh" (green revolution) ñối với lúa mỳ và lúa nước trong những năm 1960 và 1970 chính là nhờ khai thác sử dụng tập ñoàn giống cây trồng thế giới. Chẳng hạn, nhờ sử dụng gene lùn của hai giống lúa ñịa phương Dee-geo-woo-gen (DGWG) và Taichung Native-1 của ðài Loan thông qua hàng loạt tổ hợp lai ñã tạo ra ñược các giống lùn (dwarf) và bán lùn (semi-dwarf), như: IR8, IR-64, v.v. Các giống lúa này ñã tạo nên bước phát triển nhảy vọt về năng suất và sản lượng lúa châu Á (Hình 2.6). Ở nước ta, việc sử dụng giống lúa IR-8 (NN8) ñã mở ñầu cho kỷ nguyên ứng dụng thành quả của cuộc cách mạng xanh lần thứ hai. Tương tự, giống lúa CR203 do Viện bảo vệ thực vật nước ta chọn ñược bắt nguồn từ giống nhập nội IR8423-132-62-2 là giống có khả năng chống rầy và thích ứng rộng bắt nguồn từ IRRI (thông qua Chương trình thử nghiệm lúa quốc tế). 2.2.3. Sử dụng các dạng cây hoang dại Chẳng hạn, 'Purple Petrowski' là loại lúa dại mới nhất (Hình 2.7) ñược biết là có khả năng chống rụng hạt và chống ñổ cao, cho năng suất cao và kháng bệnh nấm ở mức trung bình. Lúa dại vốn là loại cây cỏ ở nước rất ñược ưa chuộng bởi những người Mỹ bản xứ (Native Americans) ở Lake States, New England, và Canada. Vào những năm 1950 các nhà khoa học ðại học Minnesota bắt ñầu nghiên cứu hàng trăm loại cây trồng biến ñổi, kể cả lúa dại. Vào thời gian ñó, các nông dân ở vùng bắc Minnesota bắt ñầu hình thành một kỹ nghệ trồng lúa dại ñể ñáp ứng lại nhu cầu gia tăng.

Hình 2.7 Lúa dại (trái) và lúa trồng (phải).

Các mục tiêu của chương trình chọn giống lúa dại ở ñây là nhằm phát triển: (i)) Khả năng chống ñổ hơn nữa; (ii) tính chín sớm; (iii) sức kháng các bệnh thuộc về lá; (iv) khả năng chống rụng hạt cao hơn; (v) nhiều nhánh trưởng thành cùng nhau; và (vi) hạt có thể bảo quản khô. Thách thức ñã ñặt ra cho các nhà nghiên cứu lúc ñó là làm sao trồng lúa dại phù hợp cho việc sản xuất thóc. Có những hạn chế trong việc cấy,

36

chăm sóc, và thu hoạch một loài lúa nước. Khi chín, hạt rụng cắm xuống nước và thời gian chín các cây là không ñồng ñều, gây khó khăn cho việc thu hoạch. Ngoài ra, hạt không thể sống ñược trừ phi nó ñược bảo quản trong các ñiều kiện giống như ở ñáy ñầm lầy. Tuy nhiên, vào năm1964 việc chọn lọc lúa trồng ñã thành công ở St. Paul. Kể từ ñó, ñã phân lập ra chín giống lúa thóc dại, mỗi giống ñều có năng suất hoặc các ñặc tính kháng bệnh ñược cải thiện ñáng kể. Ngày nay, những người Mỹ bản xứ thu hoạch bằng tay lúa dại bằng các phương pháp truyền thống. Các giống của ðại học Minnesota ñược trồng bởi những nhà sản xuất thóc thương mại thì việc thu hoạch ñược tiến hành bằng các tổ hợp máy móc ñặc biệt. Hàng năm Minnesota sản xuất hơn 6 triệu pounds lúa dại "trồng lấy thóc", và phần lớn ñược xử lý ñể tung ra thị trường cùng với lúa gạo. Thật thú vị là, việc phân tích DNA gần ñây cho thấy lúa gạo và lúa dại có tổ tiên chung, ngược với suy nghĩ trước ñây cho rằng các loài này tiến hoá tách biệt nhau ở châu Á và Bắc Mỹ. Việc phân tích biến ñổi di truyền ñược phát hiện bằng các marker phân tử (molecular markers), việc xây dựng các bản ñồ liên kết ở mức phân tử, và lập bản ñồ các gene hữu ích như các gene lùn và các locus tính trạng số lượng (quantitative trait loci = QTLs) ñược thực hiện ở lúa và ñậu azuki. Ngoài ra, cải tiến việc sản xuất ñơn bội bằng sự nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, việc ñưa vào các loài cây trồng tính chịu sương giá, kháng virus và kháng côn trùng từ các loài hoang dại bằng lai soma ñược nghiên cứu ở lúa, khoai tây và ñậu azuki. Chẳng hạn, các dòng lúa lai ñược phát triển ở Trung Quốc là trong số các giống lúa có năng suất cao nhất trên thế giới. Tuy nhiên, hai locus tính trạng số lượng (QTL) ñược khám phá gần ñây ở lúa dại năng suất thấp ñược kỳ vọng là có thể nâng cao năng suất của lúa lai lên khoảng 17% với mỗi gene QTL ñược ñưa vào (Tan, 1998). Giống khoai tây Cameraz cho năng suất cao, chống ñược bệnh mốc sương (Phytothora infestans) là kết quả của sự lai xa giữa khoai tây dại Solanum demissum với giống khoai tây trồng S. tuberosum (Hình 2.8). 2.2.4. Sử dụng quần thể các dòng tự phối Thông thường các dòng tự phối (ñược tạo ra do tự thụ phấn hoặc giao phối gần) nên sức sống của các dòng này suy giảm so với dạng ban ñầu. Tuy nhiên, chúng có thể ñược sử dụng như là nguồn vật liệu khởi ñầu ñể tạo ra các giống có biểu hiện ưu thế lai cao ở F1 (bằng cách lai khác dòng ñơn, khác dòng kép ...). Chúng cũng có thể ñược dùng ñể tạo ra các giống hỗn hợp và các giống tổng hợp nhằm sử dụng ưu thế lai nhiều ñời, hoặc sử

37

dụng trong lai tích luỹ nhằm tạo ra các dòng có các tính trạng ñặc biệt như các dòng bất dục ñực tương ñương hoặc các dòng phục hồi (chương 4).

Hình 2.8 Một cây lai soma (hình giữa) giữa khoai tây trồng (hình trái) và loài hoang dại (hình phải).

Vấn ñề sử dụng quần thể các dạng ñột biến và ña bội cũng như các dạng biến ñổi ñược tạo ra từ nuôi cấy mô-tế bào và bằng kỹ thuật di truyền sẽ ñược xem xét ở mục III dưới ñây.

III. Sơ lược các nguồn biến dị di truyền trong chọn giống thực vật 3.1. Các thể ñột biến thực nghiệm ðó là các ñột biến có thể ñược tạo ra bằng cách sử dụng các tác nhân vật lý (như tia X, tia tử ngoại hay tia phóng xạ nói chung) hoặc các hoá chất gây ñột biến (NMU, ES,...). Thông thường một biến ñổi như vậy có liên quan ñến một gene ñơn. Hầu hết các ñột biến là có hại, nhưng ñôi khi một vài thể ñột biến nào ñó lại tỏ ra có lợi. Thể ñột biến này có thể ñược sử dụng trực tiếp ñể gây thành một giống mới, áp dụng phổ biến trong trồng trọt là các giống táo hoặc các cây ăn quả khác, các giống ngũ cốc như lúa, ngô, v.v. Ví dụ, giống ngô DT6 và các giống lúa DT1, DT10 ... do Viện di truyền Nông nghiệp tạo ra hoặc các giống lúa Tám thơm ñột biến, Tép hành ñột biến và Tài nguyên ñột biến do nhóm nghiên cứu sinh của trường ðHSP Hà Nội tạo ra ñều ñược tiến hành bằng con ñường này. Các tính trạng mới này có thể ñược kết hợp bổ sung vào các giống hiện có thông qua lai và lai ngược. Ví dụ, các giống lúa DT-10, DT-11, DT-17 v.v. 3.2. Các thể ñột biến ñơn bội và ña bội ðây là các dạng ñột biến có liên quan tới sự thay ñổi toàn bộ số lượng

38

nhiễm sắc thể. Việc tăng gấp ñôi số lượng nhiễm sắc thể là một kỹ thuật chọn giống thực vật khác tỏ ra hữu ích trong việc cải tiến một số cây hoa và cây trồng ña bội. Các dạng ña bội thể tạo ra thường tăng sức sống và có lá, hoa và quả lớn hơn bình thường. Hoá chất colchicine - một alkaloid ñược chiết xuất từ cây nghệ tây (Crocus) - tỏ ra hữu ích cho mục ñích này.

(a)

(c)

(b)

(d)

Hình 2.9 (a) Một dãy các dòng lúa hầu như ñồng gene (isogenic) của Nipponbare về ñặc tính trổ sớm. (b) Các thể ñột biến về chiều cao cây và khả năng ñẻ nhánh. (c) Lúa siêu lùn. (d) Lúa lùn dwf15.

3.3. Các biến dị tổ hợp từ lai hữu tính Các cá thể trong một loài có sự sai khác nhau rất lớn về các ñặc ñiểm. Nhiều tính trạng trong số ñó có thể truyền lại cho con cháu của chúng. Bằng phương pháp chọn lọc cá thể, các nhà chọn giống thực vật có thể chọn ñi chọn lại về tính trạng mong muốn nào ñó qua các thế hệ liên tiếp, làm dịch chuyển quần thể theo hướng mong muốn. Bên cạnh ñó, các nhà

39

chọn giống thường sử dụng phương pháp lai ñối với các cây giao phấn thuộc các dòng hay các kiểu khác nhau ñể hợp nhất các tính trạng mong muốn của cả hai bố mẹ vào ñời con của chúng. Tuy nhiên, các tính trạng không mong muốn cũng ñi vào các tổ hợp gene ñó, vì vậy phải tiến hành chọn lọc ngay sau quá trình lai qua nhiều thế hệ. ðặc biệt, khi lai khác dòng thường tạo ra các con lai có ưu thế cao hơn hẳn bố mẹ. Hiện tượng này ñược gọi là ưu thế lai (hybrid vigor, hay heterosis) và ñã ñược ứng dụng rộng rãi bởi các nhà chọn giống thực vật ñể tăng năng suất cây trồng. Các giống ngô lai ñược tạo ra ñã góp phần tăng gấp ñôi năng suất ngô ở Mỹ trong những năm 1940, và hầu như tất cả các giống ngô hiện giờ trồng ở Mỹ và châu Âu ñều bắt nguồn từ các hạt lai F1 ñược sản xuất hàng năm. Chọn giống lai ñã mở rộng trong những năm gần ñây, và các giống lai ngày nay phổ biến là ở các cây cho hạt (ngô, kê, lúa), các loại rau màu (bắp cải, cà chua, bầu bí), và nhiều loài hoa. 3.4. Các biến dị soma

Hình 2.10 Các bông chét của thể ñột biến bất dục cái thu ñược. A. Vi ảnh quét ñiện tử của một bông chét cho thấy một nhuỵ không có ñầu nhuỵ và vòi nhuỵ. B. Phần bông chét có vỏ trấu dài, mày ngắn (p) và hai bầu. C. Phần bông chét có nhiều hơn hai bầu. D. Một bông bất dục cái (trái) và một bông bình thường (phải) của dòng biến dị soma 164 (Nguồn: Ling và cs, 1989).

Chẳng hạn, Ling và cs (1989) thông báo một thể ñột biến bất dục cái (164V) phát hiện ñược trong số 140 cây R3 thu ñược từ một dòng soma thuộc giống lúa IR50. Chúng có các ñặc ñiểm chính như: (1) nhuỵ thiếu mất ñầu nhuỵ và vòi nhuỵ và chỉ có một bầu noãn (Hình 2.10A). Một số bầu có một túi phôi, nhưng các bầu khác thì thiếu hẳn các tế bào nhu mô. Các bầu mất hẳn chức năng và cây ñột biến này không có hạt (Hình 2.10D). (2) Các bao phấn thoái hoá ở các mức ñộ khác nhau. Trong khoảng 1/4 số bông chét của một bông, tất cả các bao phấn ñều thoái hoá và số lượng tối ña các bao phấn trên mỗi bông chét là bốn. (3) Ở các bông chét này, mày ngoài phát triển vượt trội trong khi mài trong phát triển dưới

40

mức và trở thành một mẩu nhỏ (Hình 2.10B). Một số bông chét có hai hoặc nhiều hơn hai bầu (Hình 2.10B, C). Việc tạo ra dòng soma thể ñột biến này xuất phát từ nuôi cấy mô sẹo hạt thuộc giống IR50. Ở các thế hệ R1 và R2, tất cả các cây ñều bình thường mặc dù chỉ có 30 cây R2. Thể ñột biến bất dục cái này là một ñột biến lặn ñược hình thành trong khi nuôi cấy in vitro.

Câu hỏi ôn tập 1. Nêu vai trò của vật liệu khởi ñầu trong công tác chọn tạo giống thực vật và cho các ví dụ minh hoạ. 2. N.I. Vavilov ñã có những ñóng góp xuất sắc nào trong nghiên cứu về sự phân bố các nguồn gene cây trồng trên thế giới? 3. Hãy cho biết nội dung của vấn ñề bảo quản và sử dụng nguồn gene thực vật trong chọn giống trên thế giới và ở nước ta. 4. Hãy nêu một số thành tựu ñiển hình của việc ứng dụng của các thể ñột biến thực nghiệm, thể biến dị ña bội, thể biến dị tổ hợp từ lai hữu tính và các thể biến dị soma trong chọn tạo giống thực vật.

Tài liệu Tham khảo Tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị và Lê Thị Muội. 1997. Công nghệ Sinh học Thực vật trong Cải tiến Giống Cây trồng. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. Nguyễn Văn Hiển (chủ biên). 2000. Chọn giống cây trồng. NXB Giáo Dục, Hà Nội. Phạm Thành Hổ. 2000. Di truyền học (tái bản). NXB Giáo Dục, Hà Nội. Trần ðình Long (chủ biên). 1997. Chọn giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. Trần Duy Quý .1997. Các phương pháp mới trong chọn tạo giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. Tiếng Anh Allard RW. 1976. Principles of plant breeding. John Wiley & Son, Inc., New York. Chaudhary R.C. 2000. "Sharing the vision in shaping the strategy for rice research and development in Vietnam for the 21st century: vertical and horizontal supports", In: Rice Research and Development in Vietnam for

41

the 21st Century (Proceedings), CLRRI, Omon, Cantho, pp.83 - 102. Chopra VL (Ed.). 1989. Plant Breeding: Theory and Practice. Oxford & IBH Publishing Co. PVT, Ltd. Falconer D.S. and Mackay T.F.C. 1996. Introduction to Quantitative Genetics. 4th edn. Longman Group, Harlow. Hartlan JR. 1976. The plants and animals that nourish man. Scientific American 235 (3): 88-97. Hayward MD, NO Bosemark, I. Ramagosa, Coordinating ed. M.C. Cerezo. 1994. Plant Breeding: Principles and Prospects. 2nd ed. Chapman & Hall, London. IAEA .1995. Induced Mutations and Molecular Techniques for Crop Improvement (Proceedings of an International Symposium on the Use of Induced Mutations and Molecular Techniques for Crop Improvement), Joint FAO/ IAEA, 19 - 23 June 1995, IAEA, Vienna, Austria. Khush G.S. 1998. "Genetics for sustaining food security in 2020". In: XVIIIth International Congress of Genetics (Abstracts), pp.7-8 .August 1015, 1998, Beijing, China. Kushibuchi K. 1997. "Historical review on genetic studies and breeding of rice. 2. Historical changes in rice cultivars ", In: Science of the Rice Plant, Volume Three: Genetics (Matsuo et al, eds.), pp.837-875. FAPRC, Tokyo, Japan. Ling DH, ZR Ma, MF Chen and WY Chen. 1989. A female-sterile mutant found in a somaclonal line from IR50. Rice Genetics Newsletter, Vol. 6, pp.143-144. National Insitute of Genetics, Mishima, Japan. http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/rgn/vol6/index.html Luu Ngoc Trinh, Dao The Tuan, Tran Danh Suu, D.S. Brar, G.S. Khush and K. Okuno. 1998. "A study of genetic diversity in rice germplasm of Vietnam based on isozyme and molecular techniques". In: XVIIIth International Congress of Genetics (Abstracts), p.201. August 10-15, 1998, Beijing, China. Nickrent. 2006. Food Plants - Grains (Lect. PLB117): www.science.siu.edu/Plant-Biology/PLB117/Nickrent.lecs/ Food1.html Singh B.D. 1986. Plant Breeding: Principles and methods. 2nd edn., Kalyani Publishers, New Delhi - Ludhiana, India. Tan C.C. 1998. "Genetics - better life for all" (Presidential address at opening ceremony), In: XVIIIth International Congress of Genetics (Abstracts), pp.1-6. August 10-15, 1998, Beijing, China.

42

Chương 3

Cơ sở Di truyền Số lượng trong Chọn giống Thực vật I. Các tính trạng số lượng và di truyền số lượng 1. Khái niệm và thí dụ kinh điển 1.1. Tương tác cộng gộp (additive) Tương tác cộng gộp hay còn gọi là sự di truyền đa gene (polygenic) là hiện tượng di truyền đặc trưng của các tính trạng số lượng (quantitative trait), trong đó các gene không allele tác động cùng hướng lên sự biểu hiện của một tính trạng. Mỗi allele (thường là trội) của các gene đa phân như thế thường đóng góp một phần ngang nhau trong sự biểu hiện ra kiểu hình ở một mức độ nhất định. Như vậy, liều lượng các allele tăng dần trong các kiểu gene sẽ tạo ra một dãy biến dị kiểu hình liên tục trong quần thể. Ví dụ: Các thí nghiệm nổi tiếng năm 1909 của nhà di truyền học Thụy Điển (Sweden) Herman Nilsson-Ehle về sự di truyền màu sắc hạt (màu sắc phôi nhũ) lúa mỳ. Khi lai giữa các giống lúa mỳ thuần chủng hạt đỏ với hạt trắng, ở F1 ông thu được toàn dạng trung gian có màu hồng; và tùy theo dạng hạt đỏ được sử dụng trong các thí nghiệm mà ở F2 sẽ có các tỷ lệ phân ly giữa hạt có màu với hạt không màu (trắng) là 3:1, 15:1 hay 63:1. Kết quả phân tích cho thấy chúng do 2-3 gene đa phân chi phối. Sau đây ta hãy xét trường hợp F2 với tỷ lệ 15 có màu :1 không màu, hay cụ thể là 1 đỏ: 4 đỏ nhạt: 6 hồng: 4 hồng nhạt:1 trắng. Giải thích: Màu thẫm hay nhạt của hạt phụ thuộc vào hàm lượng sắc tố cao hay thấp. Do F2 có 16 kiểu tổ hợp với tỷ lệ tương đương trong khi F1 đồng nhất kiểu gene, chứng tỏ F1 cho 4 loại giao tử với tỷ lệ ngang nhau nghĩa là dị hợp tử về hai cặp gene phân ly độc lập. Ở đây, F1 biểu hiện kiểu hình trung gian của hai bố mẹ và F2 xuất hiện một dãy biến dị liên tục cùng hướng. Điều đó chứng tỏ tính trạng này tuân theo quy luật tác động cộng gộp hay đa phân tích lũy. Quy ước: Vì allele cho màu đỏ là trội hơn allele cho màu trắng và mức độ biểu hiện của các hạt có màu ở F2 tùy thuộc vào liều lượng các allele kiểm soát sự hình thành sắc tố đỏ trong kiểu gene, nên người ta thường ký hiệu các gene không allele bằng các chỉ số 1, 2... kèm theo các chữ cái in hoa (A) cho allele trội và chữ cái in thường (a) cho allele lặn, như sau: A1, A2 - đỏ; a1, a2 - trắng. Từ đây ta có thể dễ dàng xác định kiểu

43

gene của F1 hồng (A1a1A2a2), của bố mẹ (P): đỏ (A1A1A2A2) và trắng (a1a1a2a2), và thiết lập sơ đồ lai như sau: Ptc F1 F2

A1A1A2A2 (đỏ) × a1a1a2a2 (trắng) A1a1A2a2 (hồng)

Allele trội

4

3

2

1

0

Kiểu gene

1A1A1A2A2

2A1A1A2a2

4A1a1A2a2

2A1a1a2a2

1a1a1a2a2

2A1a1A2A2

1A1A1a2a2

2a1a1A2a2

1a1a1A2A2 Kiểu hình Tỷ lệ

đỏ

đỏ nhạt

hồng

hồng nhạt

trắng

1/16

4/16

6/16

4/16

1/16

Tương tự, trong trường hợp ba cặp gene chi phối được minh hoạ ở Hình 3.1.

trắng tinh trùng

đỏ thẩm

Phân bố chuẩn

trứng

Trắng

Đỏ thẩm

Hình 3.1 Một phép lai của lúa mỳ đỏ và trắng do ba gene chi phối, cho thấy mối tương quan giữa tỷ lệ của 7 kiểu hình ở F2 và số allele trội trong mỗi kiểu gene.

Một ví dụ độc đáo khác là trường hợp di truyền số dãy hạt trên bắp ngô (xem trong Di truyền học đại cương - Dubinin 1981, tr.135-145). Nhận xét:

44

(1) Bằng cách vẽ một đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa số allele trội có mặt trong kiểu gene (trên trục hoành) và các tần số kiểu hình (trên trục tung) ở F2, ta sẽ thu được một đường cong phân bố chuẩn có dạng hình chuông, gọi là phân phối Gauss. Trong đó kiểu hình trung gian hay các kiểu gene chứa hai allele trội (tương ứng với trị số trung bình) chiếm tỷ lệ cao nhất, còn các kiểu hình hoặc kiểu gene ở hai đầu mút tương ứng với các ngưỡng "cực đoan" bao giờ cũng chiếm tần số thấp nhất (xem Hình 3.1). Đó cũng là quy luật chung cho các tính trạng số lượng. (2) Đối với các tính trạng di truyền theo kiểu đa phân cộng gộp, các hệ số của tỷ lệ kiểu hình có thể xác định bằng cách dựa vào tam giác Pascal. 1.2. Tính trạng số lượng (quantitative trait) Thông thường, các tính trạng có liên quan đến kích thước, khối lượng (thường hay gọi là trọng lượng)... được xác định dựa trên thang định lượng (quantitative scale), được gọi là các tính trạng số lượng. Nói chung, các tính trạng số lượng có các đặc điểm sau: Do nhiều gene quy định; chịu ảnh hưởng lớn của các điều kiện môi trường; và có sự phân bố kiểu hình liên tục trong một quần thể (hình 3.1), nhưng chúng cũng có thể xảy ra dưới dạng các lớp kiểu hình khác nhau, chẳng hạn như trong các ví dụ về dãy màu sắc hạt ở lúa mỳ hoặc số dãy hạt trên bắp ngô nói trên. Vì vậy, đối với các tính trạng này, không có một mối quan hệ chính xác giữa trị số kiểu hình và một kiểu gene cụ thể. Chẳng hạn, ở người, đó là các tính trạng về chiều cao, trọng lượng, hay chỉ số thông minh (intelligence quotient - IQ); ở cây lúa, lúa mỳ đó là số hạt trên mỗi bông, số bông trên mỗi khóm...Tuy nhiên, trong những năm gần đây nhờ sử dụng các chỉ thị hay dấu chuẩn phân tử (molecular marker), người ta đã tiến hành lập bản đồ các gene có hiệu quả lớn lên các tính trạng đặc biệt (như các bệnh phức tạp ở người, năng suất cây trồng...) gọi là các locus tính trạng số lượng (quantitative trait loci = QTL). 2. Một số khái niệm thống kê cơ bản Để nghiên cứu sự biến đổi kiểu hình của các tính trạng số lượng, nhất thiết phải sử dụng các phương pháp của thống kê toán học. Đó là phương pháp lấy mẫu sao cho hợp lý, nghĩa là mẫu phải đủ lớn, mang tính ngẫu nhiên và đại diện; việc xử lý số liệu đòi hỏi phải sử dụng một số đại lượng hay tham số thống kê cơ bản. Dưới đây là một số tham số thống kê thông dụng của lĩnh vực Di truyền học số lượng: - Trung bình cộng (mean):

45

X=

1 n ∑ Xi n i =1

- Độ lệch chuẩn (standard deviation) bằng căn bậc hai của biến lượng: 1 n (X i − X )2 ∑ n −1 i =1

S=

- Sai số trung bình mẫu: m=±S/ n - Biến lượng hay phương sai mẫu (Vx hay S2, variance):

vx =

1 n ( xi − x ) 2 ∑ n − 1 i =1

- Hệ số biến thiên (Cv%, coefficient of variation):

(

)

Cv = S / X x100 - Hệ số tương quan (r, correlation): n

r=

∑(X i =1

i

− X ) (Yi − Y )

⎡ n ⎤⎡ n ⎤ 2 2 ⎢∑ ( X i − X ) ⎥ ⎢∑ (Yi − Y ) ⎥ ⎣ i =1 ⎦ ⎣ i =1 ⎦

;

(-1 ≤ r ≤ + 1)

- Phương pháp Khi-bình phương (Chi-square method) trong đánh giá độ phù hợp giữa các số liệu quan sát và kỳ vọng Nói chung, các số liệu thống kê thu được từ các thí nghiệm vốn sai khác ít nhiều so với các con số mang tính chất lý thuyết, tuỳ thuộc chủ yếu vào mẫu thí nghiệm và phương pháp lấy mẫu. Trong trường hợp đó, chúng ta băn khoăn không rõ liệu sự giả định "xấp xỉ" của chúng ta có thật chắc chắn không? Hay nói theo ngôn ngữ thống kê, "giả thuyết tương đồng H0 được chấp nhận hay bị bác bỏ", nghĩa là kết quả thu được có thật nghiệm đúng với tỷ lệ của một quy luật nào đó hay không? Để có được câu trả lời rốt ráo cho vấn đề này chỉ có cách là sử dụng trắc nghiệm Khi-bình phương (χ2-test). Đây là một công cụ toán thống kê thông dụng cho phép kiểm tra độ phù hợp giữa các trị số thực tế quan sát được (observed, ký hiệu: O) và các trị số lý thuyết được kỳ vọng (expected, ký hiệu: E) của một giả thuyết hay phân phối thực nghiệm khoa học nào đó, hoặc để kiểm tra tính độc lập của hai đại lượng ngẫu nhiên. Nhờ đó ta có thể rút ra quy luật, hoặc hiệu quả của hai phương pháp thí

46

nghiệm nào đó. Đứng về phương diện thực hành, phương pháp này được tiến hành đơn giản như sau: Bước 1: Đặt giả thuyết tương đồng H0 và sau đó tính trị số χ2 thực tế dựa theo công thức: χ2 = ∑ [(Oi − Ei)2/ Ei ] ; i= 1, 2,...,n. Bước 2: Tìm trị số χ2 lý thuyết bằng cách tra Bảng các giá trị của phân phối χ2α với k bậc tự do. Thông thường người ta sử dụng mức xác suất sai lầm P hay mức ý nghĩa α = 0,05 và k = n −1; trong đó n là số lớp kiểu hình và nó còn tuỳ trường hợp cụ thể. Mức α = 0,05 thường được dùng làm ranh giới phân chia giữa miền ấn định chấp nhận giả thuyết H0 và miền ấn định bác bỏ giả thuyết H0. Để tiện lợi, dưới đây nêu ra một vài trị số χ2α = 0,05 lý thuyết thông dụng ứng với một số bậc tự do k (Bảng 3.1). Bước 3: So sánh các trị số χ2 thực tế và lý thuyết. - Nếu như trị số χ2 thực tế nhỏ hơn trị số χ2 lý thuyết, tức là có mức xác suất P hay α > 0,05, giả thuyết H0 được chấp nhận. Nghĩa là kết quả thu được phù hợp với tỷ lệ được giả định. - Ngược lại, nếu như trị số χ2 thực tế lớn hơn hoặc bằng trị số χ2 lý thuyết, tức là có mức xác suất P hay α ≤ 0,05, giả thuyết H0 bị bác bỏ. Nghĩa là kết quả thu được không phù hợp với tỷ lệ được giả định. Ví dụ: Trong thí nghiệm lai một tính của Mendel, ở F2 thu được 705 hoa tím và 224 hoa trắng. Trên nguyên tắc, với hai kiểu hình ở F2 khiến ta có thể nghĩ tới một số tỷ lệ lý thuyết gần với nó như 2 : 1, 3 : 1 hoặc 9 : 7. Nhưng ở đây tỷ lệ "tím : trắng" thực tế là 3,15 : 1 nên tỷ lệ kỳ vọng hợp lý hơn cả là 3 : 1. Đó chính là giả thuyết H0 cần kiểm tra. Bây giờ ta có thể tính toán giá trị χ2 thực tế như sau: Kiểu hình

Số quan sát (Oi)

Số kỳ vọng (Ei)

(Oi − Ei)2/ Ei

Hoa tím

705

3/4 × 929 = 696,75

0,098

Hoa trắng

224

1/4 × 929 = 232,25

0,293

Tổng

929

929

χ2 = 0,391

Bằng cách tra bảng các giá trị của phân phối χ2α = 0,05 với k = 2−1= 1 bậc tự do, ta tìm được trị số χ2 lý thuyết là 3,84. Vì trị số χ2 thực tế (0,391) nhỏ hơn trị số χ2 lý thuyết (3,84) rất nhiều, nên giả thuyết H0 hoàn toàn được chấp nhận. Nghĩa là kết quả thí nghiệm trên phù hợp một cách sít sao với tỷ lệ 3:1. Điều đó có nghĩa rằng sự sai khác giữa các số liệu thực và các con số lý thuyết tương ứng là rất không đáng kể, không có ý nghĩa về phương diện thống kê.

47

Bảng 3.1 Bảng phân phối Khi-bình phương (χ2) Số bậc tự do P = 99 1 2

.95

.80

.000157 .00393 .0642 .020 .103 .446

.50

.20

.05

.01

.455 1.386

1.642 3.219

3.841 5.991

6.635 9.210

3

.115

.352

1.005

2.366

4.642

7.815 11.345

4

.297

.711

1.649

3.357

5.989

9.488 13.277

5

.554

1.145

2.343

4.351

7.289 11.070 15.086

6

.872

1.635

3.070

5.348

8.558 12.592 16.812

7

1.239

2.167

3.822

6.346

9.803 14.067 18.475

8

1.646

2.733

4.594

7.344 11.030 15.507 20.090

9

2.088

3.325

5.380

8.343 12.242 16.919 21.666

10

2.558

3.940

6.179

9.342 13.442 18.307 23.209

15

5.229

7.261 10.307 14.339 19.311 24.996 30.578

20

8.260

10.851 14.578 19.337 25.038 31.410 37.566

25

11.524 14.611 18.940 24.337 30.675 37.652 44.314

30

14.953 18.493 23.364 29.336 36.250 43.773 50.892

3. Mô hình các tính trạng số lượng Để hiểu và xác định được tầm quan trọng của các tính trạng số lượng, ta cần phải xây dựng một mô hình cho phép chia cắt các trị số kiểu hình thành ra các thành phần di truyền và môi trường. Điều này có thể thực hiện theo cách đơn giản bằng cách biểu thị trị số kiểu hình (P: phenotype) cho một kiểu gene (i) trong một môi trường cụ thể (j) như sau: Pij = Gi + Ei trong đó Gi là phần đóng góp về mặt di truyền của kiểu gene (geneotype) i vào kiểu hình, và Ej là độ sai lệch do môi trường (environment) j. Ej có thể âm hoặc dương tùy thuộc vào sự tác động của môi trường j. Cần lưu ý rằng, trong nhiều trường hợp, các quần thể khác nhau có các trị số trung bình khác nhau; và thật khó mà xác định sự khác nhau đó là do các nhân tố di truyền, nhân tố môi trường, hay là sự kết hợp của cả hai gây ra. Các kiểu gene khác nhau có thể tương tác một cách khác nhau với môi trường của chúng để tạo ra kiểu hình. Nếu như các mối tương tác đặc thù như thế xảy ra giữa các kiểu gene và các môi trường, khi đó ta có thể mở rộng mô hình cơ sở nói trên thành mô hình tương tác kiểu gene-môi trường (geneotype-environment interaction), với trị số kiểu hình là: Pij = Gi + Ej + GEij

48

trong đó GEij là số đo sự tương tác giữa kiểu gene i và môi trường j. Vì môi trường biến động nên sự tương tác đó có thể âm hoặc dương. Nói chung, mô hình di truyền có thể được định nghĩa một cách chính xác hơn bằng cách phân chia trị số kiểu gene ra hai thành phần như sau: Gi = Ai + Di trong đó Ai và Di là các thành phần cộng gộp (additive) và trội (dominant). Nếu như thể dị hợp đúng là trung gian giữa các thành phần đồng hợp (như ở ví dụ về sự di truyền màu sắc hạt lúa mỳ nói trên), thì sự đóng góp của thành phần trội là zero; nghĩa là, toàn bộ thành phần di truyền là cộng gộp. Nói cách khác, nếu cho rằng sự tương tác kiểu gene-môi trường là không đáng kể, thì trị số kiểu hình có thể được biểu thị bằng: Pij = Ai + Di + Ej Như đã nói từ đầu, không có sự tương ứng chính xác giữa một kiểu gene với một kiểu hình đối với các tính trạng số lượng. Vì vậy, cách thực tế hơn để kiểm tra các tính trạng này là tách sự biến đổi trong một quần thể đối với một kiểu hình cụ thể thành ra hai phần, phần biến đổi do nhân tố di truyền gây ra và phần biến đổi do nhân tố môi trường gây ra. Khi đó phương sai hay biến lượng kiểu hình (phenotypic variance) sẽ là: VP = VG + VE trong đó VP, VG và VE tương ứng là các biến lượng của kiểu hình, di truyền và môi trường. Và theo cách làm ở trên, nếu ta tách các thành phần cộng gộp và trội để kiểm tra biến lượng kiểu hình, ta có: VP = (VA + VD) + VE trong đó VA và VD tương ứng là các biến lượng di truyền do các hiệu quả cộng gộp và trội. Nếu ta chia biểu thức này cho VP, lúc đó ta thu được tỷ lệ của biến lượng kiểu hình do các thành phần khác nhau gây ra. Cụ thể là, tỷ số giữa biến lượng di truyền cộng gộp và biến lượng kiểu hình được coi là hệ số di truyền (h2; heritability): h2 = VA/VP Đại lượng hệ số di truyền này rất quan trọng trong việc xác định tốc độ và hàm lượng đáp ứng đối với sự chọn lọc định hướng (directional selection), tức chọn lọc đào thải các kiểu hình cực đoan, và nó thường được các nhà chọn giống động vật và thực vật ước tính trước khi bắt đầu một chương trình chọn lọc nhằm cải thiện năng suất hoặc các tính trạng khác.

II. Ước tính hệ số di truyền và phân tích phương sai 1. Hệ số di truyền và ý nghĩa của nó trong chọn giống thực vật

49

1.1. Hệ số di truyền Bây giờ ta thử tìm hiểu vấn đề ước lượng hệ số di truyền (heritability) dựa trên hệ số tương quan của một số tính trạng ở các cặp sinh đôi cùng trứng (monozygotic twins) và sinh đôi khác trứng (dizygotic twins). Ta biết rằng những cặp sinh đôi cùng trứng thì có cùng kiểu gene; như vậy bất kỳ sự sai khác nào giữa chúng phải là kết quả của các nhân tố môi trường. Trên thực tế, các cặp sinh đôi giống hệt nhau là do sự chia xẻ cùng kiểu gene cũng như các điều kiện môi trường như nhau. Một cách để xác định mức độ tương đồng hay giống nhau là tính hệ số tương quan r (correlation) giữa các cá thể về các tính trạng khác nhau. Trị số cao nhất của hệ số r là 1, trong đó tất cả các cặp cá thể đều có cùng trị số kiểu hình như nhau. Nếu như các tính trạng là không có tương quan giữa các cặp cá thể thì r = 0. Một kết quả nghiên cứu về các hệ số tương quan của bốn tính trạng khác nhau ở các cặp sinh đôi cùng trứng (rM) và các cặp sinh đôi khác trứng (rD) nhưng cùng giới tính được cho ở bảng 3.2. Những sai khác giữa các trị số này phải là kết quả của sự tương đồng di truyền thấp hơn ở các cặp sinh đôi khác trứng vốn chia xẻ (tính bình quân) chỉ một nửa các gene của chúng nói chung. Công thức để tính hệ số di truyền như sau: h2 = 2(rM − rD) trong đó rM và rD lần lượt là các hệ số tương quan giữa các cặp sinh đôi cùng trứng và khác trứng. Bằng cách sử dụng công thức này, ta tính được các hệ số di truyền cho bốn tính trạng ở bảng 3.2 biến thiên từ 0,98 đến 0,16. Qua đó cho thấy, hầu hết sự biến đổi các chỉ số IQ và trưởng thành về mặt xã hội dường như là do môi trường, trong khi hầu như sự biến đổi trong số lượng nếp vân tay và chiều cao dường như là do di truyền. Bảng 3.2 Sự tương quan của bốn tính trạng giữa các cặp sinh đôi ở người Tính trạng Số lượng nếp vân tay Chiều cao Chỉ số IQ Chỉ số trưởng thành về mặt xã hội

Hệ số tương quan rD rM 0,96 0,47 0,90 0.57 0,83 0,66 0,97 0,89

Hệ số di truyền 0,98 0,66 0,34 0,16

1.2. Ý nghĩa của hệ số di truyền trong chọn giống thực vật Hiệu quả chọn lọc đối với một tính trạng số lượng phụ thuộc vào ý nghĩa tương đối của các yếu tố di truyền và không di truyền trong sự khác nhau kiểu hình giữa các kiểu gene trong quần thể - một khái niệm gọi là hệ số di truyền. Hệ số di truyền được đo bằng tỷ số của phương sai di truyền

50

và phương pháp kiểu hình hay tổng phương sai. Có hai giá trị thường được sử dụng, đoa là: hệ số di truyền theo nghĩa rộng: hb2 = σ G2 / σ P2 ,và hệ số di truyền theo nghĩa hẹp: hn2 = σ A2 / σ P2 . Ta có thể ước lượng hệ số di truyền của một tính trạng bằng nhiều phương pháp khác nhau, chẳng hạn: Phương pháp phân tích thế hệ phân ly, gồm F2 và con lai trở lại, và thế hệ không phân ly, gồm bố mẹ và F1 (Mather 1949), tương quan giữa bố mẹ và con cái (Frey và Horner 1957) và phương pháp phân tích thành phần phương sai. Trong các phương pháp nêu trên, phương pháp phân tích thành phần phương sai cung cấp tính linh động lớn nhất để dự đoán hiệu quả của các phương pháp chọn lọc. Thành phần phương sai có thể sử dụng để tính toán hệ số di truyền trên cơ sở các thể hệ, lô thí nghiệm và dòng. Vì hệ số di truyền là một đại lượng thống kê biểu thị tỷ số giữa các phương sai nên h2 là một đại lượng đặc trưng cho quần thể xác định trong một môi trường xác định. Bản thân giá trị di truyền của một quần thể không nói lên tính ưu việt của quần thể đó. Giá trị h2 dao động trong khoảng từ 0 đến 1. Trong một dòng thuần các cá thể có cùng kiểu gen nên toàn bộ sự biến động hay sự khác nhau giữa các cá thể hoàn toàn là do các yếu tố ngoại cảnh (h2 = 0). Mục đích của chọn lọc là thay đổi giá trị trung bình của quần thể đối với tính trạng cần cải tiến thông qua sự thay đổi tần số gene. Tuy nhiên, hiệu quả chọn lọc đối với tần số gene ở tính trạng số lượng không thể quan sát trực tiếp mà chỉ có thể xác định thông qua sự thay đổi của giá trị trung bình và những tham số khác của quần thể như các thành phần phương sai. Sự thay đổi giá trị kiểu gene sau một thế hệ chọn lọc được gọi là kết quả chọn lọc (còn gọi là tiến bộ di truyền) là: ΔG = Sh2 trong đó: S là vi sai chọn lọc; ΔG - hiệu số giữa giá trị trung bình của các cá thể được chọn và quần thể ban đầu; và h2 - hệ số di truyền (thường là nghĩa hẹp) Công thức trên cho thấy kết quả chọn lọc sẽ cao nếu hệ số di truyền và vi sai chọn lọc cao. Giá trị của h2 bị ảnh hưởng bởi môi trường nhưng có thể tăng bằng cách sử dụng phương pháp chọn lọc và sơ đồ thí nghiệm thích hợp. Vi sai chọn lọc phụ thuộc vào tỉ lệ cá thể được chọn và mức độ biến động của quần thể. Vi sai chọn lọc tăng cùng chiều với độ biến động nhưng ngược chiều với tỷ lệ chọn lọc. Để chẩn đoán kết quả chọn lọc người ta thường sử dụng giá trị S/σp thay cho S làm vi sai chọn lọc được tiêu chuẩn hoá. Do đó kết quả chọn lọc được biểu thị bằng công thức

51

ΔG = iσph2 trong đó: i = S/σp là cường độ chọn lọc. Đối với các tính trạng số lượng phân phối chuẩn thì i = Yz/p, trong đó Yz là độ cao của toạ độ tại điểm chọn lọc và p là tỷ lệ được chọn. Có thể tính được cường độ chọn lọc (các giá trị i) cho các giá trị p khác nhau bằng cách sử dụng bảng có giá trị Yz trong một số sách thống kê. Chẳng hạn: p%

50

40

30

25

20

15

10

5

2

1

i

0.80

0.97

1.16

1.27

1.40

1.55

1.76

2.06

2.42

2.84

2. Tương quan di truyền và phản ứng liên đới Hai tính trạng, chẳng hạn, chiều cao cây và tổng năng suất chất khô có thể tương quan về kiểu hình. Tuy nhiên, điều quan trọng đối với nhà chọn giống là phải xác định được mối tương quan có cơ sở di truyền hoặc phản ánh những yếu tố môi trường. Tương quan di truyền (rA) được ước lượng thông qua tương quan của giá trị chọn giống giữa hai tính trạng của các cá thể trong quần thể. Tương quan môi trường (rE) là tương quan giữa các độ lệch môi trường biểu thị phần dư của phương sai kiểu hình. Có thể biểu thị phương sai kiểu hình giữa hai tính trạng X và Y theo công thức sau: Cov P Cov A + Cov E rp = =

σ Pxσ Py

2

σ Pxσ Py

2

Nếu đặt e = 1 - h , ta có thể viết lại biểu thức trên như sau Cov A Cov E r p = hx h y + ex e y

σ Axσ Ay

Suy ra:

σ Exσ Ey

rp = hx h y rA + e x e y rE

Thông thường chọn lọc để cải tiến một tính trạng này kéo theo sự thay đổi của một tính trạng khác. Ví dụ khi tăng hàm lượng caroten ở khoai lang làm thay đổi thuỷ phân hay hàm lượng chất khô trong củ. Nếu gọi X là tính trạng được chọn trực tiếp thì phản ứng chọn lọc của X bằng giá trị chọn giống trung bình của các cá thể được chọn. Sự thay đổi của tính trạng gián tiếp Y sẽ bằng hồi quy của giá trị chọn giống của Y với giá trị chọn giống của X. Quan hệ hồi quy của Y đối với X là Cov σ b( A)YX = 2 A = rA AY

σ AX

σ AX

Kết quả chọn lọc của tính trạng X khi chọn trực tiếp là Δ GX = ihxσ AX

52

Do đó phản ứng liên đới của tính trạng Y là

CΔ GY = b( A)YX Δ GX = ihxσ AX rA

σ AY = ihx rAσ AY σ AX

Nếu đặt σ AY = h yσ AY thì phản ứng liên đới sẽ là CΔ GY = ih x h y rAσ PY

Vì vậy kết quả chọn lọc của tính trạng liên đới có thể dự đoán nếu biết được tương quan di truyền và hệ số di truyền của hai tính trạng. 3. Phân tích phương sai và hồi quy Tương tác kiểu gene - môi trường biểu thị một thành phần của kiểu hình có thể làm sai lệch giá trị ước lượng của các thành phần khác. Tương tác kiểu gene môi trường tồn tại khi hai hay nhiều kiểu gene phản ứng khác nhau trước sự thay đổi của môi trường (năm, vụ gieo trồng, địa phương...). Một giống có năng suất cao một giống khác trong môi trường này nhưng có thể thấp hơn trong một môi trường khác. Như vậy tương tác kiểu gene - môi trường làm thay đổi thứ bậc các kiểu gene hay các giống được đánh giá trong các điều kiện khác nhau. Chính điều này gây khó khăn cho nhà chọn giống trong việc xác định tính ưu việt của các giống được đánh giá. Vì vậy việc tính toán mức độ tương quan là rất quan trọng để xác định chiến lược chọn giống tối ưu và đưa ra các giống có khả năng thích nghi thoả đáng với môi trường gieo trồng được dự định. Có bốn mô hình thống kê được sử dụng để đánh giá tính ổn định các tính trạng nông học của các kiểu gene (hoặc là một bộ giống hoặc là các dòng) có triển vọng: (1) Phương pháp phân tích phương sai; (2) phương pháp phân tích hồi quy; (3) phương pháp thống kê tham số; và (4) phương pháp phân tích nhiều biến. Dưới đây chỉ đề cập đến hai phương pháp phổ biến là phân tích phương sai và phân tích hồi quy. 3.1. Phân tích phương sai Phân tích phương sai dựa vào sự đóng góp khác nhau của các kiểu gene khác nhau vào thành phần tương tác. Vì vậy để xác định mức độ tương tác kiểu gene - môi trường các kiểu gene (giống, dòng, gia đình...) được đánh giá trong môi trường khác nhau. Môi trường bao gồm mọi yếu tố ảnh hưởng hay liên quan tới sinh trưởng và phát triển của cây. Allard (1976) phân loại các yếu tố môi trường thành hai nhóm yếu tố có thể dự đoán và không thể dự đoán. Các yếu tố có thể dự đoán xảy ra một cách hệ thống và con người có thể kiểm soát được như: loại đất, thời vụ gieo trồng mật độ và lượng phân bón. Ngược lại, các yếu tố không thể

53

dự đoán thì luôn biến động, không ổn định như: lượng mưa, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng. Khi có tương tác kiểu gene - môi trường (GE) thì giá trị kiểu hình bằng tổng của ba thành phần như sau: P = G + E + GE và phương sai kiểu hình tương ứng được chia thành ba thành phần là: 2 σ P2 = σ G2 + σ E2 + σ GE 2 là thành phần không di truyền của Giống như σ E2 , đại lượng σ GE phương sai kiểu hình. Nếu thí nghiệm được đánh giá ở nhiều điều kiện môi trường (lặp lại theo địa điểm và mùa vụ/năm) thì phân tích phương sai có thể dựa vào Bảng 3.3 dưới đây.

Bảng 3.3: Mô hình phân tích phương sai ngẫu nhiên cho thí nghiệm lặp lại ở nhiều điểm và nhiều năm (theo Nguyễn Văn Hiển và cs - 2000). Nguồn

Số bậc tự do

BPTB

Bình phương trung bình (BPTB) kỳ vọng

Năm (N)

y-1

-

Điểm (Đ)

l-1

-

Lặp lại/Đ/N

ly(r-1)

-

N×Đ

(y-1)(l-1)

-

K.gene (KG)

g-1

MS5

2 2 σ e2 + rσ gyl + rlσ gy + ryσ gl2 + rylσ g2

KG × N

(g-1)(y-1)

MS4

2 2 σ e2 + rσ gyl + rlσ gy

KG × Đ

(g-1)(l-1)

MS3

2 σ e2 + rσ gyl + ryσ gl2

KG × N × Đ

(g-1)(y-1)(l-1)

MS2

2 σ e2 + rσ gyl

Sai số

yl(g-1)(r-1)

MS1

σ e2

*Ghi chú: r là số lần lặp lại; g - kiểu gen; y - số năm (vụ); l - số điểm.

Mô hình thống kê đối với giá trị kiểu hình (ví dụ năng suất, Yield) của kiểu gene thứ i trong môi trường thứ j có thể biểu diễn như sau: Yij = μ + gi + mj + (gm)ij + eij trong đó: μ - trung bình của tất cả các kiểu gene trong các môi trường; gi - ảnh hưởng của kiểu gene thứ i;

54

mj - ảnh hưởng của môi trường thứ j; (gm)ij - tương tác của kiểu gene thứ i và môi trường thứ j; eij - sai số gắn với kiểu gene i và môi trường j. Đối với các thí nghiệm lặp lại ở nhiều địa điểm và nhiều năm khác nhau thì các thành phần phương sai được xác định như sau: MS 5 − MS 4 − MS 2 S g2 = ryl

MS 4 − MS 2 rl MS 3 − MS 2 = ry

σ gy2 = σ gl2

2 = σ gyl

MS 2 − MS1 r

σ e2 = MS 1 Khi đó hệ số di truyền được tính theo công thức sau: h2 =

σ g2 2 σ g2 + (σ gy2 / y ) + (σ gl2 / l ) + (σ gyl / yl ) + (σ e2 / ryl )

3.2. Phân tích hồi quy và tính ổn định Tính ổn định về năng suất hay các đặc điểm nông học khác của một giống trong các điều kiện môi trường khác nhau là một chỉ tiêu quan trọng trong chương trình chọn giống. Có những giống có thể thích nghi với phạm vi môi trường rộng trong khi một số giống khác chỉ thích nghi với phổ môi trường khá hẹp. Tính ổn định về năng suất trong các điều kiện môi trường chịu ảnh hưởng của các kiểu gene cá thể và quan hệ di truyền giữa các cá thể trong một quần thể hay một giống. Trạng thái nội cân bằng (homeostasis) và tính đệm (buffering) được dùng để mô tả tính ổn định của các cá thể hay một nhóm cây trồng. Trên thực tế, các cá thể dị hợp tử (ví dụ các con lai F1) ổn định hơn các bố mẹ đồng hợp tử do chúng có khả năng chống chịu tốt hơn trước những điều kiện bất lợi. Để do tính ổn định thông qua các tham số thống kê, nhiều nhà nghiên cứu đã dùng phương pháp phân tích hồi quy. Một nhóm kiểu gene được đánh giá trong một phạm vi môi trường nhất định. Giá trị trung bình về năng suất hay bất kỳ một tính trạng nào khác của các kiểu gene ở mỗi môi trường được gọi là chỉ số môi trường. Năng suất của mỗi kiểu gene được

55

hồi quy với chỉ số môi trường tương ứng được dùng để đánh giá phản ứng của các kiểu gene với môi trường thay đổi và ước lượng độ lệch so với đường hồi quy (Eberhart và Russel, 1966). Một kiểu gene mong muốn là kiểu gene có năng suất trung bình cao, hệ số hồi quy bằng 1, và độ lệch so với đường hồi quy bằng 0. Mô hình thống kê như sau: Yij = μ + biIj + δij trong đó: μ - trung bình của tất cả các kiểu gene trong tất cả môi trường; Yij - giá trị của kiểu gene thứ i trong môi trường thứ j; bi - hệ số hồi quy của giống thứ i với chỉ số môi trường; Ij - chỉ số môi trường. Hệ số hồi quy được xác định theo công thức: bi = ∑ (Yij I j ) / ∑ I 2j j

j

trong đó: Ij là chỉ số môi trường và bằng: I j = (∑ Yij / g ) − (∑∑ Yij / gl ) i

i

j

⎡ ⎤ Độ lệch so với đương hồi quy là: S di2 = ⎢(∑ δ ij2 ) /( g − 2)⎥ − (σ e2 / r ) ⎣ j ⎦

[

trong đó:

∑δ

2 ij

]

⎡ ⎤ ⎡ ⎤ = ⎢∑ Yij2 − (Yi 2 / I )⎥ − ⎢∑ (Yij I 2j ) / ∑ I 2j ⎥ ⎣ j ⎦ ⎣ j ⎦

 Ghi chú: Có thể tham khảo thêm trong Bài giảng về "Di truyền học quần thể và số lượng" của Bruce Walsh (2006).

4. Một số nhận xét về các mối quan hệ giữa kiểu gene và kiểu hình • Thường biến và mức phản ứng Đối với các tính trạng số lượng, sự biểu hiện ở kiểu hình của một kiểu gene nào đó rõ ràng là tùy thuộc của các nhân tố môi trường, tức là tùy thuộc tùy thuộc vào độ thâm nhập và độ biểu hiện của kiểu gene đó (sẽ được đề cập dưới đây). Hay nói cách khác, kiểu hình là kết quả của sự tương tác giữa kiểu gene và môi trường. Trong một tình huống lý tưởng, phạm vi tác dụng của môi trường lên một kiểu gene nào đó có thể xác định được bằng cách quan sát kiểu hình của các cá thể giống nhau về mặt di truyền được nuôi dưỡng chăm sóc trong các môi trường khác nhau. Ở người, các cặp sinh đôi cùng trứng được tách nuôi riêng lúc sơ sinh đã chứng minh cho một tình huồng như vậy. Tuy nhiên, những chỉ dẫn tốt nhất về các tác dụng của môi trưòng bắt nguồn từ các nghiên cứu ở loài mà có thể nuôi trồng với số lượng lớn trên các môi trường được kiểm soát.

56

Thí dụ kinh điển cho nghiên cứu như vậy được J.Clausen và các cộng sự tiến hành trong thập niên 1940. Để xác định hiệu quả của môi trường lên các kiểu hình, các nhà nghiên cứu này đã trồng các dòng (clones), tức gồm các cá thể giống nhau về mặt di truyền, cắt theo các vĩ độ khác nhau. Chẳng hạn, họ đã thu thập loài thuộc họ hoa hồng là Potentilla glandulosa từ ba vùng: phạm vi ven bờ biển Thái Bình Dương ở vĩ độ 100 mét; vùng lưng chừng dãy núi Sierras ở vĩ độ 1.400 mét (ngọn Mather); và ở độ cao 3.040 mét của dãy Sierras (ngọn Timberline). Từ các mẫu này, họ tạo ra được các dòng bằng cách nhân giống sinh dưỡng và đem trồng ở ba vùng khác nhau đó. Nói khác đi, mỗi kiểu gene thu được từ một trong ba vùng đó được đưa trồng ở cả ba điều kiện môi trường (ứng với các vĩ độ) khác nhau. Từ thí nghiệm này cho thấy rằng dường như cả hai nhân tố di truyền và môi trường đều quan trọng trong việc xác định sự sinh trưởng của cây. Thí dụ, các kiểu gene vùng ven bờ sinh trưởng tốt ở cả vĩ độ thấp và trung bình nhưng nhưng không thể sống được ở vĩ độ cao. Điều đó chỉ ra tầm quan trọng của các nhân tố di truyền. Cách thức mà kiểu hình thuộc một kiểu gene nào đó thay đổi theo môi trường của nó được gọi là mức phản ứng (norm of reaction). Các mức phản ứng có thể sai khác rất lớn trong số các kiểu gene đối với các tính trạng liên quan đến tập tính hay hành vi (behaviour). Dù cho đến nay ta không hề xem tập tính hay hành vi như là một kiểu hình, thế nhưng một số các gene đột biến có ảnh hưởng lên tập tính hay hành vi. Chẳng hạn, các cá thể bị bệnh PKU không được điều trị thì có các chỉ số IQ thấp hơn bình thường; IQ là một tính trạng có thể đo được bằng trắc nghiệm IQ. Tóm lại, mối quan hệ giữa kiểu gene và kiểu hình là phức tạp, không dễ gì căn cứ vào kiểu hình để xác định kiểu gene. Mức phản ứng trên các môi trường khác nhau là một cách để định lượng mối quan hệ đó. • Độ thâm nhập hay độ ngoại hiện (penetrance) và độ biểu hiện (expressivity) Để đánh giá mức độ thể hiện ra kiểu hình của các kiểu gene như thế, năm 1925 Timofeev-Rissovsky đã nêu lên hai khái niệm: độ thâm nhập và độ biểu hiện của gene. Chẳng hạn, các gene xác định các tính trạng ở đậu Hà Lan, các kiểu nhóm máu và nhiều bệnh di truyền ở người đều cho thấy một kiểu hầu như chắc chắn. Tuy nhiên, đối với một số gene, thì một kiểu gene nào đó có thể hoặc không thể cho thấy một kiểu hình nào đó. Hiện tượng này được gọi là độ thâm nhập (penetrance) của một gene. Mức độ thâm nhập (level of penetrance) này có thể tính bằng tỷ lệ của các cá thể mang một kiểu gene nào đó bộc lộ ra một kiểu hình cụ thể. Khi tất cả các cá thể của một

57

kiểu gene cụ thể có cùng kiểu hình như nhau, thì gene đó cho thấy độ thâm nhập hoàn toàn và mức độ thâm nhập này được coi là bằng 1. Mặt khác, gene được coi là thâm nhập không hoàn toàn và mức thâm nhập cụ thể có thể tính được. Chẳng hạn, trong số 160 cá thể thuộc một kiểu gene nào đó có 30 cá thể biểu hiện một kiểu hình bị bệnh, thì mức độ thâm nhập là 30/160 = 0,1875; nghĩa là gene đó chỉ thể hiện ra được kiểu hình có 18,75%. Như vậy sự có mặt của độ thâm nhập không hoàn toàn tại một gene có thể khiến cho một kiểu hình tính trạng trội (giả sử kiểu gene là Aa) bị ngắt quãng một thế hệ trong một phả hệ, rồi lại xuất hiện trở lại ở thế hệ tiếp theo. Đó là do allele trội thâm nhập không hoàn toàn. Chẳng hạn, dạng trội của nguyên bào lưới (retinoblastoma), một bệnh gây các u ác tính ở mắt trẻ em, chỉ thâm nhập khoảng 90%. Ngoài ra, một kiểu gene cụ thể nào đó bộc lộ ra kiểu hình kỳ vọng, tức mức độ biểu hiện (level of expression) hay độ biểu hiện (expressivity), có thể sai khác đi. Chẳng hạn, mặc dù một gene gây ra một bệnh có thể phát hiện được ở hầu hết các cá thể mang một kiểu gene nào đó, nhưng một số cá thể có thể bị ảnh hưởng nặng hơn các cá thể khác. Bệnh Huntington ở người là một tính trạng cho thấy độ biểu hiện biến thiên sai khác theo độ tuổi phát bệnh. Bệnh này nói chung xảy ra ở độ tuổi bắt đầu trung nên, với tuổi trung bình bắt đầu phát bệnh là trên 30 tuổi, nhưng đôi khi có thể xảy ra rất sớm ở tuổi chưa lên 10 hoặc ở một người già hơn. Một số người mang kiểu gene bệnh này chết vì những nguyên nhân khác trước khi bệnh biểu hiện, do độ thâm nhập không hoàn toàn cũng như độ biểu hiện biến thiên đối với gene đó gây ra. • Môi trường và các gene gây chết có điều kiện Vấn đề đặt ra là cái gì là nguyên nhân của độ thâm nhập không hoàn toàn và độ biểu hiện sai khác? Trong một số trường hợp cụ thể, thường thì không thể xác định được nguyên nhân, nhưng cả môi trường và các gene khác cũng được coi là có ảnh hưởng lên độ thâm nhập và độ biểu hiện của một gene. Ví dụ, ở ruồi giấm, các allele của một số gene tác động lên sức sống và có thể gây chết ở nhiệt độ tăng cao trên 28oC nhưng lại ảnh hưởng chút ít hoặc không ảnh hởng ở nhiệt độ thấp hơn. Các gene như thế gọi là các gene gây chết có điều kiện (conditional lethals); nói chung chúng cho thấy các hiệu quả gây chết trong các tình huống môi trường cực đoan. Nhiệt độ cũng có thể ảnh hưởng mạnh mẽ lên kiểu hình của các thực vật. Chẳng hạn, cây anh thảo có hoa đỏ khi trồng ở 24oC nhưng lại có hoa trắng khi trồng ở nhiệt độ trên 32oC. • Các gene sửa đổi và hiện tượng sao hình Nói chung, mức độ biểu hiện của một tính trạng giữa các cá thể có

58

quan hệ họ hàng thường giống nhau hơn là giữa các cá thể không có quan hệ họ hàng, khi cả hai nhóm cá thể đó được nuôi dưỡng chăm sóc trong những môi trường gần giống như nhau. Các gene có ảnh hưởng thứ cấp lên một tính trạng như thế gọi là các gene sửa đổi (modifier/modifying gene) và chúng có thể gây ảnh hưởng lên kiểu hình một cách đáng kể. Nói cách khác, các gene sửa đổi là những gene gây biến đổi các gene khác trong khi chúng biểu hiện ra kiểu hình. Một hiện tượng liên quan gọi là sao hình (phenocopy), xảy ra khi các nhân tố môi trường gây ra một kiểu hình cụ thể mà thông thường được xác định về mặt di truyền. Trong trường hợp này, một môi trường cực đoan có thể làm gián đoạn sự phát triển bình thường bằng một kiểu tựa như của một gene đột biến.

Câu hỏi ôn tập 1. Hãy chỉ ra các mối quan hệ giữa gene và tính trạng. Phân biệt các kiểu tương tác giữa các gene không allele lên sự hình thành một tính trạng. 2. Đặc trưng của các tính trạng số lượng là gì? Phân biệt các cặp khái niệm sau: Tính trạng số lượng và tính trạng chất lượng; độ thâm nhập và độ biểu hiện; tương tác giữa các gene allele và các gene không allele. 3. Khi lai hai giống ngô thuần chủng có 20 dãy hạt và 8 dãy hạt, tất cả bắp ngô F1 đều có 14 dãy hạt, và ở F2 có bảy kiểu hình khác nhau: 20, 18, 16, 14, 12, 10 và 8 (dãy hạt) với số lượng thống kê tương ứng là 40 : 245 : 594 : 793 : 603 : 236 : 38 (bắp). Phương thức di truyền của tính trạng trên là gì? Giải thích, trình bày sơ đồ lai, và minh hoạ kết quả F2 bằng một đồ thị. Hãy rút ra quy luật chung về sự di truyền của loại tính trạng này và chỉ ra cách xác định tỷ lệ kiểu hình kỳ vọng ở F2 đối với trường hợp một tính trạng được kiểm soát bởi n locus độc lập. 4. Hệ số di truyền là gì? Nêu ý nghĩa của hệ số di truyền trong chọn giống thực vật và cho ví dụ. 5. Trình bày các phương pháp phân tích phương sai di truyền, phân tích hồi quy và tính ổn định về năng suất của một giống trong các điều kiện môi trường khác nhau. 6. Bằng các ví dụ khác nhau, anh (chị) hãy phân tích để làm sáng tỏ mệnh đề sau: "Kiểu hình là kết quả của sự tương tác giữa kiểu gene và môi trường".

59

Tài liệu Tham khảo Tiếng Việt Trần Văn Diễn và Tô Cẩm Tú. 1995. Di truyền số lượng (Giáo trình cao học Nông nghiệp). NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. Dubinin NP. 1981. Di truyền học đại cương (bản dịch của Trần đình Miên và Phan Cự Nhân). NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. Phan Hiếu Hiền. 2001. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu (Thống kê thực nghiệm). NXB Nông Nghiệp Tp.Hồ Chí Minh. Nguyễn Văn Hiển (chủ biên, 2000): Chọn giống cây trồng. NXB Giáo Dục, Hà Nội. Phạm Thành Hổ (2000): Di truyền học (tái bản lần thứ 2). NXB Giáo Dục. Trần Đình Long (chủ biên, 1997): Chọn giống cây trồng (Giáo trình cao học nông nghiệp). NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Phan Cự Nhân (chủ biên), Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh. 1999. Di truyền học. NXB Giáo Dục, Hà Nội.Trần Duy Quý (1997): Các phương pháp mới trong chọn tạo giống cây trồng. NXB NN. Tiếng Anh

Allard RW. 1976. Principles of plant breeding. John Wiley & Son, Inc., New York. Walsh B. 2006. Basic population and Quantitative genetics (Lecture 3), pp.1-8, June 2006. University of Aarhus. Chopra, V.L. (Ed., 1989): Plant Breeding: Theory and Practice. Oxford & IBH Publishing Co. PVT, Ltd. Falconer D.S. and Mackay T.F.C. (1996): Introduction to Quantitative Genetics. 4th edn. Longman Group, Harlow. Hartl D.L., Freifelder D. and Snyder L.A. (1988): Basic Genetics. Jones and Bartlett Publishers, Inc., Boston - Portola Valley. Hayward, M.D., N.O. Bosemark and I. Ramagosa, Coordinating ed. M.C. Cerezo (1994): Plant Breeding: Principles and Prospects. 2nd ed. Chapman & Hall, London-Glasgow-Weinheim-New York-Tokyo-MelbourneMadras. Murray, D.R. (1991): Advanced Methods in Plant Breeding and Biotechnology. C-A-B International Publisher, London. Weaver R.F. and Hedrick P.W. (1997): Genetics. 3rd edn. Wm.C.Browm Publishers, Dubuque, Iowa.

60

Chương 4

Cơ sở Di truyền của Chọn giống Ưu thế lai I. Khái niệm và những biểu hiện của ưu thế lai ở thực vật 1. Khái niệm về hiện tượng ưu thế lai Ưu thế lai (heterossis) là thuật ngữ do nhà chọn giống ngô G.H.Shull (Mỹ) đưa ra năm 1914 để chỉ hiệu quả lai biểu hiện vượt trội về sức sinh trưởng, sinh sản và chống chịu của con lai ở thế hệ thứ nhất so với các dạng bố mẹ của chúng. Hiện tượng này thể hiện rất rõ ở những con lai thu được từ sự giao phối giữa các dòng tự phối với nhau.

Hình 4.1 A - Lúa mỳ (Triticum aestivum); B - Lúa mạch đen (Secale cereale), và C - Lúa mỳ lai Triticale (Triticosecale) giữa A và B.

Hiện tượng ưu thế lai được nhà khoa học người Đức I.G.Koelreuter (1733 - 1806) phát hiện đầu tiên vào năm 1760 trong các thí nghiệm về lai xa ở cây thuốc lá (Nicotiana paniculata × N. rustica). Sau này, nhiều nhà nghiên cứu khác trong khi tiến hành nghiên cứu lai ở thực vật đã đề cập đến hiện tượng này. Ví dụ điển hình về lai xa ở thực vật là con lai giữa các chi (intergeneric hybrid) thuộc họ Hoà thảo (Poaceae; Hình 4.1): Lúa mỳ Triticum × Lúa mạch đen Secale → Triticale Tuy nhiên, những vấn đề lý luận của hiện tượng ưu thế lai đã được Darwin nêu lên lần đầu tiên trong tác phẩm " Tác dụng của thụ phấn chéo và tự thụ phấn ở giới thực vật". Các nhà chọn giống Mỹ là Beal (1876) và Shull (1908; Hình 4.2A) đã mở đầu cho việc sử dụng hiện tượng ưu thế lai vào thực tế sản xuất bằng

61

các công trình ở ngô (Hình 4.2B) với những con lai đơn giữa dòng có năng suất cao hơn những thứ ban đầu 10 - 15%. Sau này, Jone (1917) là một trong những người đầu tiên đã đề ra việc sử dụng con lai kép giữa dòng ở ngô. So với con lai kép, mặc dầu giá thành hạt giống con lai đơn có cao hơn, nhưng vì nó có độ đồng đều và năng suất cao hơn nên ở nhiều nước như Mỹ chẳng hạn, giống ngô lai đơn vẫn chiếm phần lớn diện tích trồng ngô trong nước. Trung bình ngô lai có sản lượng cao hơn các thứ ngô bình thường 25-30% . Ngoài ra, nó còn có nhiều đặc tính chống chịu khác hơn hẳn bố mẹ như tính chống nóng, chống lạnh, chống đổ, chống sâu bệnh...

Hình 4.2 A - George Harison Shuhll trong nhà xanh. B - Kết quả thí nghiệm về ưu thế lai ở ngô (Zea mays).

Ưu thế lai thường biểu hiện mạnh mẽ ở các cây giao phấn. Tuy nhiên ở một số cây tự thụ phấn, hiện tượng ưu thế lai cũng thấy xuất hiện rõ rệt như ở lúa, lúa mì, cà chua v.v. Trong những năm sau đó các nhà chọn giống ở nhiều quốc gia đã thu được hiệu quả ưu thế lai ở các cây trồng khác nhau, như ở lúa (J.W.Jones, 1026) ở cà chua (H.Daxcalov, 1961) và ở hầu hết các cây thụ phấn chéo khác. Ngày nay chương trình chọn giống ưu thế lai siêu cao sản được nhiều nước quan tâm. Chẳng hạn các nhà chọn giống ngô ở Mỹ đã tạo ra các tổ hợp lai đạt năng suất cao hơn 25 tấn /ha/vụ. Các nhà chọn giống lúa lai Trung Quốc tạo được tổ hợp lúa lai hệ "2 dòng" có năng suất cao tới 17 tấn /ha/vụ. Giống mía ưu thế lai ROC 20 của Đài Loan đạt năng suất 320 tấn mía cây/ha với hàm lượng đường 15% hay 48 tấn đường/ha/vụ. Nhiều giống ưu thế lai năng suất siêu cao, chất lượng tốt cũng đã được tạo ra ở cà chua, bắp cải, hành tây, khoai tây v.v. 2. Những biểu hiện của ưu thế lai ở thực vật

62

Để tiện lợi cho việc sử dụng ưu thế lai và tạo ra các giống ưu thế lai phục vụ sản xuất người ta chia ưu thế lai theo sự biểu hiện và theo quan điểm sử dụng. Chẳng hạn: Ưu thế lai sinh sản là loại ưu thế lai quan trọng hàng đầu. Các cơ quan sinh sản như hoa, quả, hạt phát triển mạnh, số hoa quả nhiều, độ hữu dục cao dẫn đến năng suất cao hơn. Ưu thế lai sinh dưỡng: Các cơ quan sinh dưỡng như thân, rễ, cành, lá đều sinh trưởng mạnh làm cho cây lai có nhiều cành, nhánh, thân cao to, lá lớn, nhiều rễ, nhiều củ... Đó là các tính trạng có lợi cho chọn tạo giống; đặc biệt là ở những loài cây trồng sử dụng các bộ phận sinh dưỡng như thân, lá, củ... Ưu thế lai thích ứng là ưu thế lai do sự tăng sức sống, tăng tính chống chịu với sâu, bệnh, với các điều kiện ngoại cảnh bất thuận như rét, úng, chua, mặn, phèn... Ưu thế lai tích luỹ là sự tăng cường tích luỹ các chất với hàm lượng cao ở các bộ phận của cây như: tinh bột ở củ, protein và dầu ở hạt, đường ở thân, các ester ở lá v.v.

II. Các phương pháp xác định mức độ biểu hiện ưu thế lai Đối với mỗi giai đoạn chọn tạo giống, nhất thiết phải xác định mức biểu hiện ưu thế lai để có cách đánh giá cụ thể và chính xác con lai. Các công thức tính ưu thế lai Sinha & Khanna (1974) và Omapop (1975) đã nêu ra các công thức tính cho các dạng ưu thế lai sau đây: • Ưu thế lai giả định hay ƯTL trung bình (Heterosis; Hm hay HMP): Được sử dụng trong giai đoạn lai thử. Con lai biểu hiện sự hơn hẳn ở tính trạng nghiên cứu so với số đo trung bình của bố mẹ ở cùng tính trạng. 1 F1 − ( P1 + P2 ) 2 H m (%) = × 100 1 ( P1 + P2 ) 2 trong đó: Hm : ưu thế lai giả định hay ưu thế lai trung bình; F1 : số đo trung bình của tính trạng ở con lai F1; P1 : số đo trung bình của tính trạng ở P1 (mẹ); P2 : số đo trung bình của tính trạng ở P2 (bố). Ưu thế lai thực (Heterobeltiosis)

63

Được sử dụng trong giai đoạn lai lại và đánh giá con lai. Con lai biểu hiện sự hơn hẳn trên tính trạng nghiên cứu so với bố mẹ có số đo cao nhất. H b (%) =

F1 − Pb × 100 Pb

trong đó: Hb (%): ưu thế lai thực; F1 : số đo của tính trạng ở con lai F1; Pb : số đo tính trạng ở bố hoặc mẹ cao nhất.

• Ưu thế lai chuẩn (Standard heterosis) Được sử dụng để đánh giá các tổ hợp lai tốt. Con lai biểu hiện sự hơn hẳn trên tính trạng nghiên cứu (đặc biệt là năng suất) so với một giống đang phổ biến rộng trong vùng (giống chuẩn) mà giống lai định thay thế. H s (%) =

F1 − S × 100 S

trong đó: Hs(%): ưu thế lai chuẩn; F1 : số đo của tính trạng ở con lai F1; S : số đo của tính trạng ở giống chuẩn.

III. Sử dụng các dòng tự phối trong chọn giống ưu thế lai 1. Khái niệm về dòng tự phối Dòng tự phối là thế hệ thu được do sự tự thụ phấn nhân tạo qua một số thế hệ ở các dạng cây giao phấn. Qua nghiên cứu di truyền học các dòng tự phối, người ta đã đi đến các kết luận sau: (i) Dòng tự phối là phương pháp có hiệu quả để khám phá ra tính đa dạng về mặt di truyền của loài, thứ... Ban đầu tự phối đưa đến sự phân ly phức tạp và sự đa dạng của các cá thể. Tuy nhiên về sau, qua một số thế hệ thì chúng ổn đinh, đồng đều dần về mặt di truyền và có những đặc trưng riêng và khác với những dòng khác. (ii) Việc ổn định này xảy ra phụ thuộc vào mức độ giống nhau giữa các cá thể giao phối. Ở ngô, với mức độ cực đại, trải qua quá trình tự phối 6 - 7 thế hệ mới cho phép thu được dòng thuần. (iii) Những cây trong cùng một dòng có sự giống nhau sâu sắc về mặt di truyền là đặc tính cơ bản của dòng thuần. Các cây trong phạm vi một dòng giữ vững đặc tính của chúng qua nhiều thế hệ. (iv) Ở cây giao phấn, sự giao phối gần dẫn đến những sự suy thoái

64

nhất định. Vì lẽ đó mà các dòng tự phối có sức sống không cao và năng suất thấp. Nhưng con lai thu được giữa các dòng tự phối thì lại có ưu thế lai và sản lượng cao. Tuy nhiên, cần đặc biệt chú ý là hiện tượng này chỉ thể hiện rõ ràng nhất ở thế hệ F1. Các cá thể sản sinh ra từ F1 và sau đấy nữa bằng con đường tự thụ phấn và kể cả giao phấn lại có sức sống và sản lượng giảm dần. Nên trong thực tế rất ít khi người ta dùng con lai ở F2, F3 v.v. Bây giờ ta hãy xét trường hợp cụ thể ở ngô. Năm 1905, lần đầu tiên Shull thu được ngô lai giữa dòng có sản lượng cao và ưu thế lai rõ rệt. Nhưng hiện tượng ấy chỉ đặc trưng cho F1 và đến F2 thì sản lượng giảm 35% và đến F3 chỉ còn 50%. Để tính sản lượng của F2 đối với con lai đơn và con lai kép, Sewall Wright đưa ra công thức sau: F2 = F1 −

F1 − P n

trong đó: F2 : sản lượng trung bình của F2; F1 : sản lượng trung bình của F1; P : sản lượng trung bình của dòng tự phối bố mẹ; n: số lượng dòng tự phối. Hệ quả của tự phối Trong quá trình tạo thành các kiểu gene đồng hợp tử, các gene lặn trước kia bị các gene trội lấn át nay ở dạng đồng hợp tử nên biểu hiện ra kiểu hình. Kết quả là sức sống của cây tự phối bị suy giảm, năng suất thấp và nhiều dạng dị hình xuất hiện. Ở thế hệ nội phối I1 (inbreeding), quan sát thấy có sự phân ly mạnh, quần thể trở nên đa dạng. Sự suy giảm sức sống xảy ra ít hơn khi cho thụ phấn bằng các cây chị em. Tuy nhiên, cùng với các thể đồng hợp tử lặn cũng thu được các thể đồng hợp tử trội; và không hẳn tất cả các gene lặn đều có hại. Do đó, bên cạnh việc giảm sức sống, giảm số đo tính trạng thì cũng thu được các dòng tự phối có các tính trạng kinh tế quý để sử dụng cho các tổ hợp lai về sau. Khi tự phối, sẽ xảy ra sự phân ly và giảm sức sống nhưng không phải là vô giới hạn. Khi các cây tự phối đạt đến trạng thái đồng hợp tử thì sự suy giảm dừng lại, không còn phân ly nữa. Các cá thể sinh ra từ cây đồng hợp tử sẽ rất đồng đều về kiểu hình, lúc này ta có một dòng tự phối và cây tự phối đã đạt trị số tự phối tối thiểu (inbreeding minimum). 2. Phương pháp tạo dòng tự phối

65

2.1. Chọn vật liệu ban đầu để tạo dòng tự phối Cây giao phấn có đặc điểm di truyền nổi bật là các cá thể trong quần thể hầu như ở trạng thái dị hợp tử; vì thế đem lai giữa hai quần thể ngẫu phối với nhau thì không thể đạt được tỉ lệ dị hợp tử cao. Mặt khác, các gene lặn nay ở trạng thái đồng hợp tử sẽ phát huy tác dụng làm sức sống của con lai không cao, các gene này cần được loại bỏ khỏi các dạng bố mẹ trong các tổ hợp lai. Để có thể đạt được cơ may cao nhất cho khả năng tạo ra con lai dị hợp tử mà lại chứa rất ít gene lặn có hại thì các dạng làm bố mẹ phải là các dòng đồng hợp tử. Và việc tạo ra các dòng tự phối ở cây giao phấn làm bố mẹ cho các tổ hợp lai đáp ứng được mục tiêu đề ra. Các vật liệu được chọn để tạo các dòng tự phối cần đạt yêu cầu là tạo ra các dòng tự phối có phổ di truyền rộng và khác nhau càng nhiều càng tốt. Các dòng tự phối còn phải có khả năng chống bệnh, thích ứng với các điều kiện ngoại cảnh bất thuận để bổ sung cho con lai. Như vậy, các quần thể địa phương cách xa nhau về mặt địa lý - sinh thái, các giống tổng hợp, các giống lai có năng suất cao, tính chống chịu tốt là những nguồn vật liệu quý để phát triển các dòng tự phối. Trong quá trình tạo dòng tự phối người ta liên tục bổ sung tính trạng cho vật liệu chọn làm dòng tự phối. Bằng cách đó, ở Mỹ và Mexico, người ta đã tạo ra được các dòng tự phối có khả năng cho ưu thế lai cao mà bản thân các dòng này cũng cho năng suất cao gần bằng các giống lai hỗn hợp (composite). 2.2. Các phương pháp tạo dòng tự phối Có ba phương pháp cơ bản để tạo dòng tự phối ở ngô. (i) Phương pháp chuẩn: Chọn các cây khoẻ mạnh và điển hình cho quần thể vật liệu ban đầu, rồi cho tự phối bằng phương pháp cách ly. Các bắp tốt được chọn lựa và gieo theo kiểu bắp/hàng. Sự chọn lọc được lặp lại như vậy ở các thế hệ tiếp theo. (ii) Phương pháp hốc đơn: Đây là một biến dạng của phương pháp chuẩn; hàng được thay thế bằng hốc đơn ba cây trong mỗi chu kỳ chọn lọc. Vì thế, phương pháp này có ưu điểm là cho phép đánh giá được số lượng thế hệ nhiều hơn trên cùng một đơn vị diện tích, nhưng lại hạn chế về khả năng chọn lọc trong mỗi thế hệ. (iii) Phương pháp tạo các dòng lưỡng bội đồng hợp tử bằng kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn in vitro kết hợp với phương pháp gây đa bội hoá có sử dụng hoá chất colchicine. Sau khi cho tự phối 5-6 thế hệ, các dòng thu được phải đồng đều về mọi tính trạng, như: chiều cao cây, hình thái hạt, màu sắc cờ... Khi cho giao phấn giữa các cây trong cùng một dòng, nếu ở thế hệ sau không có gì

66

sai khác với các cây giao phối ban đầu thì dòng ấy coi như đã thuần. Và nếu đem lai 2 dòng tự phối với nhau, ta thu được con lai đơn giữa dòng. Còn nếu cho lai giữa 2 con lai đơn với nhau sẽ cho con lai kép giữa dòng. Tuy nhiên, để tạo ra con lai đơn và kép có sản lượng cao, việc chọn các dạng bố mẹ là một khâu rất quan trọng và phức tạp; các dòng tham gia vào quá trình tạo con lai phải là những dòng thuộc những thứ khác nhau. Chẳng hạn, để tạo ra một con lai kép (xem Hình 4.3) cần phải lấy bốn dòng A, B, C, D từ bốn thứ khác nhau (A x B) x (C x D). Nếu bốn dòng ấy thuộc cùng một thứ, như kiểu (A1 x A2) x (A3 x A4), thì con lai kép có ưu thế lai rất thấp. Muốn cho quá trình sản xuất hạt lai có kết quả cần nghiên cứu về thời gian tự phối để có được dòng đồng hợp tử và phương pháp đánh giá nhanh về giá trị mỗi dòng. Việc xác định giá trị của mỗi dòng chính là đánh giá khả năng kết hợp (combining ability; viết tắt là: KNKH) của chúng. 3. Phương pháp xác định các khả năng kết hợp chung và riêng của các dòng tự phối 3.1. Nguyên tắc đánh giá KNKH của các dòng tự phối Theo Hallauer và Miranda (1988), chỉ có khoảng 0,01- 0,1 % các dòng thuần được tạo ra là có khả năng cho ra các con lai có ưu thế lai cao. Đó chính là các dòng có KNKH cao. Muốn tìm được các dòng đó phải thử KNKH của chúng bằng cách lai thử. Dựa trên sự biểu hiện các tính trạng của con lai để có thể xác định được tiềm năng tạo ưu thế lai của các dòng; và chỉ các dòng cho ưu thế lai cao mới cần giữ lại. KNKH là một đặc tính di truyền, nên được duy trì qua các thế hệ tự phối. Người ta chia KNKH ra làm hai kiểu: khả năng kết hợp chung KNKHC (general combining ability = GCA) và khả năng kết hợp riêng KNKHR (specific combining ability = SCA) . KNKHC được xác định bằng giá trị trung bình ưu thế lai của tất cả các tổ hợp lai có mẫu tham gia vào lai thử. Còn KNKHR là độ lệch của một tổ hợp lai cụ thể nào đó với ưu thế lai trung bình của nó, tức đặc tính của các dòng khi lai với một mẫu thử sinh ra con lai có ưu thế lai hay không. KNKH là một phức hợp tính trạng do nhiều gene kiểm soát. Trong khi KNKHC được kiểm soát bởi kiểu hoạt động di truyền cộng tính (additive) của các gene trội, nên khá ổn định dưới tác động của các yếu tố môi trường ngoài, thì KNKHR lại được xác định bởi các kiểu hoạt động mang tính trội (dominant), át chế (epistasis) hay siêu trội (over-dominant) của các gene và chịu tác động rõ rệt của điều kiện ngoại cảnh (Srinivasan 1991). Vì thế, khi thử KNKHR thường người ta phải tiến hành qua vài vụ

67

ở các vùng sinh thái khác nhau. Trong quá trình tạo và chọn lọc các dòng tự phối, sau khi đã xác định KNKHC người ta mới tiến hành xác định KNKHR. Tuy nhiên, khi xét KNKHC nếu ta loại bỏ các dòng một cách quá chặt chẽ thì đôi khi có thể để mất một số dòng có giá trị về sau. Có nhiều quan điểm khác nhau về thời gian thích hợp cho việc tiến hành thử KNKH. Một số nhà nghiên cứu cho rằng, KNKH là một đặc tính di truyền, được thể hiện khá sớm nên có thể thử KNKHC từ thế hệ tự phối I1, I2, thậm chí ngay cả vật liệu khởi đầu, và thử KNKHR sau đó đối với các dòng có KNKHC cao (Sprague 1946; Cao Đắc Điềm 1988). Bauman (1981) và nhiều nhà chọn giống Mỹ lại cho rằng, ở các thế hệ sớm như I1, I2, I3 có thể chọn các dòng tương đối thuần chủng thông qua đánh giá bằng mắt, còn việc thử KNKH chỉ nên làm ở thế hệ I4 hoặc muộn hơn. 3.2. Các phương pháp thử KNKH Để đánh giá KNKH, người ta thường sử dụng hai hệ thống lai thử là lai đỉnh (top cross) và luân giao hay lai diallel (diallel cross). • Đánh giá KNKHC bằng phương pháp lai đỉnh Phương pháp lai đỉnh do Davis (1927), Jenkins và Bruce (1932) đề xướng, dùng để đánh giá KNKHC bằng cách đem các dòng tự phối hoặc giống định thử, lai với dạng cây mà ta đã biết rõ nhiều đặc tính về mặt di truyền và nông-sinh học quan trọng của nó, gọi là dạng thử (tester). Để tăng tính hiệu quả các của thí nghiệm, có thể sử dụng một số dạng thử khác nhau. Lai đỉnh là một phương pháp có hiệu quả đựơc sử dụng trong giai đoạn đầu của quá trình tạo dòng tự phối khi số lượng dòng còn rất lớn. Tuy nhiên, trong hệ thống lai đỉnh có một vấn đề quan trọng là phải chọn cho được dạng thử thích hợp. Nếu dạng thử có KNKH cao thì khả năng thành công sẽ lớn hơn so với trường hợp KNKH trung bình hoặc thấp. Dạng thử có thể có nền di truyền rộng (giống thụ phấn tự do, giống lai kép hay giống tổng hợp), hoặc có nền di truyền hẹp (dòng thuần hay giống lai đơn). Khi dạng thử có nền di truyền rộng thì kết quả thu được sẽ thấy rõ hơn sự khác biệt giữa các dòng đem thử, và việc đánh giá dòng sẽ dễ dàng hơn (Matzinger, 1953). Mặt khác, nếu sử dụng đồng thời hai dạng thử: một dạng có nền di truyền rộng và một dạng có nền di truyền hẹp, thì sẽ rất có lợi trong việc vừa xác định KNKH của dòng cần nghiên cứu, vừa có khả năng tạo ra giống nhanh để phục vụ sản xuất. Từ kết quả lai đỉnh, người ta có cơ sở để loại bỏ các dòng không phù hợp yêu cầu và chỉ giữ lại những dòng có khả năng cho ra con lai có ưu thế lai để đưa vào đánh giá KNKHR bằng hệ thống luân giao. • Đánh giá KNKHR bằng phương pháp luân giao

68

Luân giao hay còn gọi là lai diallele là hệ thống lai thử, mà trong đó các dòng hoặc giống định thử được đem lại luân phiên với nhau theo mọi tổ hợp có thể có và theo cả hai hướng thụân và nghịch. Phương pháp luân giao dùng để đánh giá KNKH do Sprague và Tatum (1942) đề xuất và sau đó đã được nhiều nhà nghiên cứu phát triển và hoàn thiện; trong đó có Griffing (1954, 1956) là người đã nêu lên bốn phương pháp sử dụng mô hình toán học thống kê để phân tích KNKH của các dòng tự phối, mà cho đến nay vẫn được sử dụng rộng rãi trên thế giới. - Phương pháp1: Tất cả các dòng định thử được đem lai luân phiên với nhau theo mọi tổ hợp lai có thể có, theo cả hai hướng thuận và nghịch. Số tổ hợp lai cần phải tiến hành là n2. - Phương pháp 2: Tất cả các dòng định thử được đem lai luân phiên với nhau theo mọi tổ hợp lai có thể có, nhưng chỉ theo hướng thuận. Số tổ hợp lai cần phải tiến hành là n(n + 1)/2. - Phương pháp 3: Chỉ các dòng khác nhau mới được lai luân phiên với nhau, theo cả hai hướng thuận và nghịch. Số tổ hợp lai cần phải tiến hành là n(n - 1). - Phương pháp 4: Chỉ các dòng khác nhau mới được lai luân phiên với nhau, nhưng chỉ theo hướng thuận. Số tổ hợp lai cần phải tiến hành là n(n - 1)/2; trong đó n là số dòng tham gia vào các tổ hợp lai để thử KNKH. Tuỳ mục tiêu nghiên cứu và điều kiện cụ thể để có thể lựa chọn một phương pháp thích hợp. Với việc áp dụng các phương pháp 1 và 2 ta sẽ nhận được các kết quả chính xác hơn, nhưng đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Còn trong chọn giống người ta thường sử dụng phương pháp 4. Mặc dầu người ta có thể sử dụng phương pháp luân giao để đánh giá KNKHC và KNKHR, nhưng thường các dòng tự phối cần đem thử là rất lớn nên số lượng tổ hợp lai cần tiến hành là rất đồ sộ, khó thực hiện trong thực tế. Vì vậy, phương pháp này thường chỉ được dùng để xác định KNKHR đối với các dòng có KNKHC cao. Trong chọn giống ngô, ngoài việc sử dụng các con lai đơn, kép, giữa dòng, người ta còn tạo ra các dạng con lai giữa 3 dòng, con lai giữa các thứ để dùng vào sản xuất; trong đó dạng con lai giữa các dòng vẫn cho năng suất cao nhất. Nếu như con lai giữa các thứ cho sản lượng 2-2,5 tạ/ha thì con lai kép giữa dòng cho sản lượng chừng 9-12tạ/ha. 4. Các kiểu giống ưu thế lai khác dòng • Giống lai đơn Giống lai đơn được tạo ra từ hai dòng tự phối khác nhau, một dòng

69

làm bố và một dòng làm mẹ, ví dụ: A x B (xem Hình 4.3B). Tạo ra giống lai đơn có ưu thế lai cao là mục tiêu chính của thử KNKHR. Khi đưa các cặp lai đạt năng suất cao nhất vào thí nghiệm so sánh, nếu như vượt đối chứng thì tổ chức sản xuất hạt giống để thử nghiệm sinh thái nhằm tìm ra vùng phân bố của giống mới.

B

70

Hình 4.3 A- Vị trí và cấu tạo của cụm hoa đực, hoa cái và hạt ngô (Zea mays). B- Lai khác dòng kép ở ngô (Từ E. Levetin và K. McMahon, Botany Visual Resource Library © 1998 The McGraw-Hill Co., Inc.)

• Giống lai ba Vì năng suất của hạt lai F1 thương phẩm (từ lai hai dòng) thường thấp, làm cho giá thành hạt lai rất cao. Để khắc phục hạn chế này, con lai đơn được sử dụng làm mẹ để cho lai tiếp với một dòng tự phối khác để tạo ra tổ hợp lai gồm ba dòng: A,B,C theo tuần tự: (A x B) x C. Năng suất của lai ba tuy không cao bằng năng suất của tổ hợp lai đơn nhưng giá thành hạt giống giảm đáng kể. • Giống lai kép Trong lai kép, F1 của một tổ hợp lai được dùng làm bố và F1 của một tổ hợp lai khác dùng làm mẹ. Khi đó năng suất hạt lai đạt được rất cao, làm cho giá thành hạt giống giảm xuống rất thấp đến mức người nông dân bình thường có thể dễ dàng mua được. Theo nguyên tắc, ưu thế lai trong các kiểu giống ưu thế lai được sắp xếp theo thứ tự sau: lai đơn > lai ba > lai kép > lai tổng hợp và giá thành thì ngược lại. Tuy ưu thế lai biểu hiện ở lai kép có thấp hơn nhưng so với giống tổng hợp và các giống giao phấn tự do khác thì vẫn hơn hẳn nên lai kép được ứng dụng rộng rãi ở cây ngô, còn các cây trồng khác chủ yếu sử dụng lai đơn (xem Hình 4.3B)

IV. Sử dụng tính bất dục đực trong chọn giống ưu thế lai 1. Khái niệm bất dục đực Bất dục đực ở thực vật là hiện tượng cây không có khả năng tạo ra hoặc không phóng thích được những hạt phấn có chức năng. Hiện tượng bất thụ đực được chia ra một số kiểu sau: (i) bất thụ hạt phấn: không có hoặc có rất ít hạt phấn có chức năng; (ii) bất thụ đực do cấu trúc: nhị hoặc hoa đực dị dạng hoặc hoàn toàn không có; (iii) bất thụ đực chức năng: hạt phấn phát triển bình thường nhưng bao phấn không mở. Trong ba kiểu trên, kiểu đầu thường gặp nhất và có ý nghĩa quan trọng trong chọn giống thực vật. Nguyên nhân dẫn đến hiện tượng không có hạt phấn của kiểu bất thụ đực này là do tầng nuôi (lớp trong cùng của thành bao phấn) có cấu trúc dị thường hoặc không thực hiện được chức năng của nó dẫn đến làm rối loạn quá trình phát sinh tiểu bào tử (hay hạt phấn). A

Ở các cây thụ phấn chéo có hoa đơn tính như: ngô, dưa hấu, dưa chuột v.v. việc khử đực thì thường không găp khó khăn. Đối với các cây có hoa

71

lưỡng tính thì muốn phát triển giống ưu thế lai cần phải có dòng mẹ bất dục đực mới có thể sản xuất hạt giống với giá thành chấp nhận được. Đặc điểm của dòng bất dục đực là cơ quan sinh dục cái phát triển bình thường, có khả năng tiếp nhận hạt phấn và tạo hạt lai bình thường, trong khi chỉ có cơ quan sinh dục đực là bất thường nên không xảy ra quá trình tự thụ phấn. Con lai thu được ở dòng mẹ bất dục đực có thể sinh trưởng phát triển và cho ưu thế lai như con lai sản xuất theo phương pháp khử đực. Đến nay người ta đã phát hiện được nhiều hệ thống bất dục đực khác nhau ở thực vật, trong đó thành công nhất ở cây thụ phấn chéo là ứng dụng rộng rãi hệ thống bất dục đực tế bào chất (cytoplasmic male sterile: CMS), và ở một số cây trồng khác bất dục đực chức năng di truyền nhân cũng được ứng dụng thành công. 2. Các kiểu bất dục đực Dựa vào đặc điểm di truyền của nó, tính bất dục đực có thể chia thành hai nhóm chính: bất dục đực nhân và bất dục đực tế bào chất. (1) Bất dục đực nhân Bất dục đực nhân bắt nguồn từ đột biến ngẫu nhiên là hiện tượng thường gặp trong tự nhiên, với tần số khá cao. Ví dụ ở ngô, cà chua, lúa mì người ta đã biết đến khoảng hơn 40 gene gây bất dục đực. Theo Duvick (1966), tính bất thụ đực nhân có thể tìm thấy ở tất cả các loài lưỡng bội. Có thể dùng các tia phóng xạ hoặc một số hoá chất để gây bất dục đực. Tính bất dục đực nhân thường do một cặp gene lặn kiểm soát. Khi những cây bất dục đực nhân được thụ phấn bằng phấn của cây sinh sản bình thường thì F1 sinh ra đều hữu thụ. Nhưng ở F2 (do tự thụ phấn) thì cứ 3 cây sinh sản bình thường lại xuất hiện 1 cây bất dục đực. Tuy nhiên, tính bất dục đực cũng có thể do một số gene lặn (Drilscoll 1986) hoặc gene trội kiểm soát (Mathias 1985). (2) Bất dục đực tế bào chất Hiện tượng bất dục đực do tế bào chất kiểm soát được phát hiện đầu tiên bởi Correns năm 1904 ở Satureja, sau đó là Beteson và Gardner (1922) ở cây gai. Tuy nhiên, chỉ sau phát hiện của Khatjinov (1928) và Rhoades (1931) về hiện tượng bất dục đực ở ngô thì vấn đề này mới thực sự có ý nghĩa. Ngay sau khi phát hiện ra hiện tượng này, Khatjinov đã đề nghị ứng dụng nó vào thực tiễn, nhưng mãi 16 năm sau mới được thực hiện khi Mangelsdorf phát hiện lại tính bất dục đực tế bào chất từ một dòng ngô tự phối của thứ Goldenjun. Đột biến này đặc trưng ở tính bất dục hoàn toàn của hạt phấn và được di truyền lại theo dòng mẹ. Về mặt hình thái, cây bất dục đực và cây bình thường có một số điểm

72

khác nhau. Ở cây ngô, cờ của cây bất dục trơ trụi, bao phấn lép và bao phấn nhô ra khỏi gié không có trật tự từ trên xuống dưới như ở cây bình thường, hạt phấn thì nhăn nheo và không chứa tinh bột nên khi thử sẽ không có phản ứng màu xanh với iod (Hình 4.4). Trong điều kiện tự nhiên, do ảnh hưởng của điều kiện khí hậu khắc nghiệt như quá nóng hoặc quá khô... hạt phấn cũng có thể trở nên bất thụ; các đặc tính này rõ ràng là không di truyền được.

Hình 4.4 Hạt phấn bất dục không chứa tinh bột nên khi thử sẽ không có phản ứng màu xanh với iod.

Dựa vào nguồn gốc, bất dục đực tế bào chất (CMS) có thể được chia thành CMS đồng nguồn (autoplasmic) và CMS dị nguồn (alloplasmic). CMS đồng nguồn là trường hợp được hình thành do kết quả của những biến đổi ở bộ gene ty thể trong tế bào chất trong phạm vi một loài. Còn CMS dị nguồn là trường hợp được hình thành do kết quả của quá trình lai khác loài (do tính không tương hợp giũa bộ gene nhân của loài này với bộ gene ty lạp thể của loài khác chẳng hạn) hoặc do sự dung hợp tế bào trần khác loài. Trong số 140 loài được biết có hiện tượng CMS thì có 56% thuộc loại CMS đồng nguồn (Laser và Lersren 1972). Về nguyên nhân gây ra CMS có nhiều giả thuyết khác nhau: Atanasoff (1964) cho rằng, đó là do sự xâm nhiễm của virus, Mặc dầu những bằng chứng của giả thuyết này còn thiếu xác thực, nhưng các nghiên cứu ở cây đậu răng ngựa Vicia faba cho thấy CMS có quan hệ đến các phần tử kiểu như virus có trong tế bào chất, và tính ổn định của CMS có liên quan đến mật độ của các phần tử này (Berthaut 1990). Từ 1905, Rhoades đã từng cho rằng những biến đổi trong ty thể của tế bào chất là nguyên nhân gây ra CMS. Tuy nhiên, mãi gần đây nhờ vào kỹ thuật phân tích của sinh học phân tử, người ta mới chứng minh được rằng các đoạn phân cắt giới hạn do endonuclease tạo ra đối với DNA ty thể (mtDNA) của dạng hữu thụ và bất dục đực khác nhau. Điều này đã được tìm thấy ở nhiều loài cây như: củ cải đường, cao lương , cải dầu, hướng

73

dương, lúa, cà rốt v.v. Vì thế người ta cho rằng, chính hiện tượng tái tổ hợp xảy ra ở mtDNA (trong phạm vi phân tử hoặc giữa các phân tử) đã gây ra CMS (Hallden, 1990). Mặt khác, các phân tích hệ gene ty-lạp thể ở cây lai soma có tính CMS ở thuốc lá, bắp cải...cũng chứng minh cho nhận định rằng, CMS xuất hiện là do rối loạn chức năng của ty thể. Tuy nhiên, ở một số loài khác, CMS lại liên quan đến những biến đổi ở bộ gene của lục lạp (cpDNA), hoặc ít nhất những biến đổi này cũng có liên quan đến CMS như ở thuốc lá, bông hay cao lương. Về cơ chế di truyền kiểm soát tính CMS Rhoades (1931) và Edwardson (1953) là những người đầu tiên nghiên cứu hiện tượng di truyền CMS ở ngô. Lúc đầu người ta cho rằng sự hồi phục tính hữu thụ ở những cây bất thụ chỉ do sự thay đổi tính chất của tế bào chất mà không có sự tham gia của gene nào trong nhân. Tuy nhiên, sau này người ta thấy rằng, đặc tính di truyền chỉ theo tế bào chất rất ít gặp (hình như chỉ có kiểu bất thụ đặc biệt do Rhoades khám phá ra). Trong phần lớn trường hợp, sự hình thành tính CMS có sự tham gia của các yếu tố di truyền trong nhân và tế bào chất. Những công trình nghiên cứu về ngô cho thấy, có thể chia các dòng tự phối làm ba nhóm theo phản ứng của chúng với cây CMS, đó là: (i) Nhóm duy trì tính bất thụ: Các dòng thuộc nhóm này khi đem giao phối với cây bất thụ cho ra thế hệ con lai bất thụ. (ii) Nhóm phục hồi tính hữu thụ: Đó là những dòng khi giao phối với cây bất thụ cho ra con lai có khả năng sinh sản bình thường, nghĩa là chúng phục hồi tính hữu thụ ở cây bất thụ. Số kiểu gene có khả năng phục hồi hoàn toàn tính hữu thụ khi đem giao phối chúng với các dạng CMS là rất hiếm. Theo Duvick (1956) ở Mỹ chỉ có 5 - 10% số dòng tự phối ở ngô là có khả năng này. (iii) Nhóm phục hồi một phần: Khi đem các dòng trong nhóm này giao phối với cây bất thụ thì ở F1 thu được các cây bất thụ, bán bất thụ và hữu thụ bình thường. Sự tồn tại của ba nhóm kiểu gene trên khác nhau về phản ứng với dạng CMS chứng tỏ mối tác động tương hỗ phức tạp giữa tế bào chất, nhân và môi trường ngoài trong quá trình hình thành và di truyền các đặc tính này. Hiện nay ở ngô, người ta đã biết và nghiên cứu khá kỹ hai dạng bất thụ đực tế bào chất là T và M. Hai dạng bất thụ đực này không chỉ khác nhau về hình thái cờ hoa, mức độ bất thụ mà cả về phản ứng của chúng khi giao phối với các dòng tự phối. Cùng một dòng tự phối, khi giao phối với dạng bất thụ này cho ra con lai bất thụ nhưng khi giao phối với dạng bất thụ kia

74

lại cho ra con lai hữu thụ. Theo phản ứng đó, người ta chia các dòng tự phối ra thành những nhóm sau: - Các dòng phục hồi kiểu T nhưng lại củng cố tính bất thụ kiểu M (ví dụ dòng A344', N28) - Các dòng củng cố kiểu bất thụ kiểu T nhưng lại phục hồi tính hữu thụ kiểu M (A144', Co87). - Các dòng củng cố kiểu bất thụ đực kiểu T và M (VIR 29, VIR 40). - Các dòng phục hồi tính hữu thụ kiểu M và T (Ky 21, Mj). Hiện nay còn chưa có một quan niệm thật thống nhất về cơ chế kiểm soát di truyền đối với việc duy trì tính bất thụ và phục hồi tính hữu thụ, đặc biệt là về số lượng các gene trong nhân tế bào. Về cơ bản, hiện có ba giả thuyết chính: (i) giả thuyết đơn gene; (ii) giả thuyết hai gene; và (iii) giả thuyết đa gene. 3. Phương pháp sử dụng tính bất dục đực trong chọn giống ưu thế lai ở thực vật 3.1. Ứng dụng bất dục đực tế bào chất trong sản xuất hạt lai F1 Để không phải khử đực ở dòng mẹ (trong lai đơn) và con lai đơn làm mẹ (trong lai kép) thì con lai đơn làm mẹ phải bất dục còn con lai phải hữu dục bình thường. Dòng mẹ bất dục phải được duy trì và nhân lên để cung cấp đủ số lượng cho sản xuất hạt giống. Theo Jones và Clark (1943), dòng bất dục đực tế bào chất CMS chỉ bất dục đực khi trong tế bào chất chứa kiểu gene bất dục "S" và trong nhân chứa kiểu gene khống chế tính bất dục ở trạng thái đồng hợp thể lặn "rfrf". Khi lai giữa một dòng CMS có kiểu gene bất dục (Srfrf) với các dòng tự phối có đặc điểm di truyền khác nhau thì xảy ra các trường hợp phối hợp các kiểu gene sau đây: Ví dụ: Cây bất dục đực x cây bình thường Như vậy chỉ có kiểu gene Nrfrf, duy trì được kiểu gene bất dục Srfrf của dòng CMS, còn kiểu gene NRfRf và FrRfRf là kiểu gene phục hồi phấn cho dòng CMS. Khi đã có một tổ hợp lai tốt, người ta có thể chuyển gene bất dục đực tế bào chất cho dòng mẹ và gene phục hồi phấn cho dòng bố. Quá trình chuyển gene có thể bắt gặp các trường hợp sau: i) Dòng mẹ đã có sẵn gene duy trì bất dục trong nhân và dòng bố đã có gene phục hồi phấn. ii) Dòng mẹ không có gene duy trì bất dục trong nhân, dòng bố đã có

75

gene phục hồi phấn. iii) Dòng mẹ không có gene duy trì bất dục, dòng bố không có gene phục hồi phấn. 3.2. Ứng dụng hiện tượng bất dục đực chức năng di truyền nhân trong sản xuất hạt lai F1 Bất dục đực chức năng di truyền nhân được biểu hiện ra kiểu hình gắn liền với một điều kiện môi trường cụ thể. Người ta đã phát hiện và sử dụng một số dạng bất dục đực chức năng rất thành công ở một số cây thụ phấn chéo như sau đây. Ở cây dưa chuột, việc sử dụng dạng thuần cái: trong điều kiện bình thường dòng thuần cái chỉ có hoa cái phát triển bình thường, hoa đực bị teo rất sớm do thiếu hoóc môn nhóm auxin. Sử dụng GA3 ở nồng độ 70 ppm phun ở giai đoạn phân hoá hoa sẽ làm cho hoa đực phát triển bình thường và tiến hành tự phối để duy trì dòng thuần cái. Dòng thuần cái được kiểm soát bởi một cặp gene lặn nên có thể chuyển gene thuần cái dễ dàng sang các giống khác. Ở cây cao lương, cây lanh người ta phát hiện và sử dụng dạng bất dục đực chức năng di truyền nhân phản ứng với chu kỳ quang (photoperiod genic male sterile = PGMS). Ở điều kiện ngày ngắn, dòng PGMS hữu dục, lúc này người ta bố trí duy trì. Ở điều kiện ngày dài, các dòng PGMS bất dục, lúc này được dùng làm mẹ trong sản xuất hạt lai. Các PGMS được kiểm soát bởi một cặp gene lặn nên cũng rất dễ dàng chuyển gene sang các giống khác nhau. Tuy nhiên, chỉ ở các vùng mà ngày dài và ngày ngắn khác xa nhau giữa các mùa trong năm thì các PGMS mới có thể ứng dụng được. Nói chung, việc sử dụng hạt lai trong sản xuất đã được áp dụng thành công ở nhiều loại cây trồng như, ngô, cao lương, lúa, cà chua, cà rốt, hành, hướng dương, củ cải đường cũng như nhiều cây rau và cây cảnh.

V. Cơ sở di truyền của ưu thế lai và phương pháp duy trì nó ở các thế hệ sau 1. Cơ sở di truyền của ưu thế lai Hiện tượng ưu thế lai đã biết từ lâu, ngay từ thời Koelreuter (1760) nhưng việc nghiên cứu về bản chất của nó thì còn ít. Vấn đề lý luận liên quan chỉ được bắt đầu chú ý từ những năm đầu của thế kỷ XX, khi xuất hiện những công trình thực nghiệm nhằm giải thích hiện tượng này của Shull (1911), East và Hays (1913). Cho đến nay có nhiều giả thuyết giải thích hiện tượng ưu thế lai dựa

76

trên cơ sở di truyền học. Dưới đây là ba giả thuyết được chấp nhận tương đối rộng rãi, đặc biệt là hai giả thuyết đầu. 1.1. Giả thuyết về tác dụng tương hỗ giữa nhiều gene trội (thuyết tính trội) Giả thuyết về tính trội do Jones đề xướng năm 1917. Tuy nhiên, những ý kiến đầu tiên đưa ra sự xác nhận về tác dụng bổ sung của các gene trội có lợi đối với hiện tượng ưu thế lai lại thuộc về Bruce, Keeble và Pellen (1910) rút ra từ các công trình thực nghiệm ở đậu Hà Lan. Giả thuyết này cho rằng, ưu thế lai là kết quả của sự tác động tương hỗ giữa nhiều gene trội có lợi cho sự sinh trưởng. Các tính trạng có lợi cho sự sinh trưởng của cơ thể do nhiều gene trội kiểm soát, còn các gene lặn tương ứng thì có tác dụng ngược lại. Quá trình tự phối dẫn dến sự đồng hợp tử hoá của hai loại gene này. Sự đồng hợp tử hoá các gene lặn dẫn đến sự suy thoái về sức sinh trưởng. Trong một dòng tự phối không chỉ tích luỹ hoàn toàn các gene trội có lợi. Kiểu gene của các dòng tự phối khác nhau sẽ không giống nhau. Khi đem giao phối chúng với nhau thì ở con lai xuất hiện nhiều gen trội tại các locus khác nhau, trong đó các gene trội lấn át sự biểu hiện của các gene lặn. Kết quả là xuất hiện hiện tượng ưu thế lai và có tính đồng đều ở con lai F1. Dưới đây là một ví dụ có tính chất minh hoạ: Có hai dòng tự phối, giao phối với nhau. Trong cấu trúc di truyền của mỗi dòng, giả sử có 5 vị trí gene khác nhau, đồng thời chỉ có một kiểu liên kết: Căn cứ vào giả thuyết này, sức sinh trưởng của con lai F1 là do kết quả tương tác giữa các gene trội. các con lai ở F1đều có kiểu gene như nhau. Bởi vậy, chúng có sự đồng đều về mặt hình thái. Dòng tự phối I nguyên chỉ có 3 vị trí chứa gene trội, dòng tự phối II cũng vậy. Cả hai dòng ngoài vị trí C ra, thì đều không giống nhau. Song ở con lai F1 thì có đến 5 vị trí gene chứa gene trội. Còn các gene lặn không có lợi thì không có điều kiện phát huy tác dụng . Ngoài ra, sự đồng hợp hoá về mặt kiểu gene do quá trình tự phối gây ra có thể giải thích được sự suy hoá của các dòng tự phối. Trong thực tế chọn giống, bao giờ người ta cũng hướng vào chỗ tạo ra những kiểu gene chứa nhiều gene trội nhất. Tuy nhiên, khó mà có thể tạo ra được những kiểu gene chỉ chứa toàn gene trội ở trạng thái đồng hợp tử AABBCCDDEE. Ngày nay ta biết rằng, trong trường hợp có nhiều gene ảnh hưởng đến sức sống của con lai thì khả năng thu nhận những cơ thể như vậy là rất nhỏ. Trong tự nhiên vẫn tồn tại các gene lặn, mặc dầu chúng luôn luôn bị đào thải do quá trình chọn lọc tự nhiên; và hơn nữa, giữa các gene trội và

77

gene lặn lại có một sự liên kết nhất định. Dùng giả thuyết này người ta có thể giải thích được hiện tượng thoái hoá của con lai ở các thế hệ tiếp theo sau F1. Đó là do kiểu gene ở trạng thái dị hợp tử của F1 qua quá trình tự phối hay giao phối với các dạng khác sẽ phân ly rất mạnh, tính đồng đều và sản lượng giảm sút. Ví dụ có một dòng tự phối ở dạng đồng hợp tử chứa một cặp gene lặn, kiểu gene aaBB và một dòng khác có kiểu gene AAbb. Khi cho hai dòng này giao phối với nhau, ta có con lai F1 là AaBb. Cho F1 tự phấn ta có F2. Theo quy luật phân ly của Mendel thì ở F2 số cá thể chứa cả 2 gene trội chỉ chiếm 9/16. Vì thế không phải tất cả các cá thể ở F2 đều có ưu thế lai. Đến các thế hệ F3, F4 v.v. thì số cá thể dị hợp tử giảm và số dạng đồng hợp tử tăng dần. Kết quả là sau thế hệ F1 ưu thế lai bị giảm sút. Do vậy, cho đến nay chưa có cách nào để duy trì ưu thế lai ở các thế hệ sau F1, và hàng năm người ta phải tạo ra con lai F1 để sử dụng trong thực tiễn sản xuất. Về lý thuyết, hiệu quả ưu thế lai còn chịu ảnh hưởng của mối tương tác giữa các gene trội không allele với nhau. Hiệu quả này giữ một vai trò quan trọng trong ưu thế lai và có liên quan đến khả năng kết hợp riêng của các dòng bố mẹ ban đầu. Mặc dù thuyết tính trội có tính phổ cập rộng rãi nhưng vẫn còn hạn chế trong khi giải thích một số trường hợp. Thực nghiệm ở ngô cho thấy sự tương ứng giữa sức sống của các dòng tự phối với số lượng các gene trội và khả năng kết hợp giữa các dòng tự phối lại không phù hợp với thuyết tính trội. Nói chung, các gene lặn không mang tính chất có hại mà chỉ có hại khi chúng ở trạng thái đồng hợp tử. Di truyền học quần thể xác nhận rằng, tính bão hoà của các quần thể tự nhiên bằng các gene lặn không có lợi ở trạng thái đồng hợp tử hoàn toàn không làm giảm ý nghĩa sinh học của các gene lặn trong việc duy trì mức độ thích nghi cao của các quần thể này. Có thể nói rằng các gene lặn không có lợi, thậm chí các gene gây chết ở trạng thái đồng hợp là một bộ phận cần thiết cho các kiểu gene của những quần thể thích nghi giỏi và chúng được duy trì một cách tích cực và thích hợp qua quá trình chọn lọc tự nhiên. Những công trình nghiên cứu ở ngô và lúa mạch của Vudvort và Turbin cho thấy rằng, sự loại bỏ những gene lặn ở trạng thái đồng hợp đã không cho thấy có một ảnh hưởng tích cực nào. Những dạng thu được bằng con đường như vậy có sản lượng không khác so với những dạng ban đầu và cũng không thấy có sự phụ thuộc giữa sản lượng với tần số bắt gặp của những tính trạng lặn. Thực ra, khi xem xét một cách khách quan thì quan niệm về các gene trội có lợi không phải chỉ là một giả thuyết mà là sự tập hợp của ít nhất của ba giả thuyết về hoạt động của các gene trội. Đó là: tương tác trội -lặn

78

trong mỗi locus; tác dụng tích luỹ giữa các gene trội; và tương tác giữa các gene trội không allele với nhau. 1.2. Giả thuyết về tính siêu trội Do việc giả thuyết về tính trội gặp khó khăn trong khi giải thích một số trường hợp về ưu thế lai, mà sau này giả thuyết tính siêu trội ra đời đã thu hút được sự chú ý của nhiều người. Theo giả thuyết này, chính bản thân tính dị hợp tử là nguyên nhân quan trọng của hiện tượng ưu thế lai. Vì vậy nó còn được là giả thuyết về tính dị hợp tử. Cơ sở của giả thuyết này là quan niệm cho rằng, trong một số sự kết hợp, mối tác động tương hổ giữa hai allele trong một locus có thể dẫn đến chỗ là, thể dị hợp tử Aa có sức mạnh vượt qua cả hai thể đồng hợp tử AA và aa. Nhiều thực nghiệm về đột biến thực nghiệm ở lúa mỳ và lúa mạch đã xác nhận điều này. Người ta giả thiết rằng, ở trạng thái dị hợp tử thì hai allele hoàn thành một số chức năng khác nhau và bổ sung cho nhau. Bởi vậy, khi có hiện tượng đa allele thì tính siêu trội chỉ xuất hiện ở những cặp allele rất khác nhau. Trong trường hợp siêu trội, người ta nói đến mối tương tác giữa các allele trong giới hạn một locus. Mỗi locus không phải chỉ có hai trạng thái trội và lặn mà còn có thể phân thành nhiều trạng thái trung gian nữa, khác nhau về cấu trúc và chức năng sinh lý. Ví dụ, một dòng tự phối có kiểu gene a1a1 giao phối với một dòng tự phối khác có kiểu gene a2a2 thì F1 sẽ có trạng thái dị hợp tử a1a2. Do giữa a1và a2 phát sinh tác dụng lẫn nhau mà mỗi sản phẩm do con lai tạo ra đều có hiệu quả cao hơn trạng thái đồng hợp tử a1a1 và a2a2 của bố mẹ. Kết quả là xuất hiện ưu thế lai. Ở đây giữa a1 và a2 không có quan hệ trội-lặn mà ngược lại, tác dụng bổ sung giữa chúng sẽ vượt qua hiệu ứng của tính trội hay tính siêu trội. Giả thuyết tính siêu trội là sự phát triển những quan niệm về tác dụng kích thích của tính dị hợp tử đã được Shull và East nêu ra từ rất sớm. Khi Shull và East nêu ra cách giải thích này thì vẫn còn chưa có các thực nghiệm chứng minh. Vì vậy, trong một thời gian dài nó không được thừa nhận. Sau này chính East là người đã phát triển giả thuyết này, và các dẫn liệu thực nghiệm của nhiều nhà nghiên cứu khác đã xác nhận sự đúng đắn của nó. Hiện tượng ưu thế lai của con lai kép giữa các dòng ở ngô là một minh chứng cho sự đúng đắn của giả thuyết tính siêu trội. Những con lai kép như vậy thu được bằng sự giao phối giữa 4 dòng ngô tự phối khác nguồn gốc. Nếu như hiện tượng ưu thế lai của các con lai đơn giữa dòng dược

79

dùng làm bố mẹ cho con lai kép mà có thể giải thích bằng sự che phủ tác dụng có hại của các gene lặn bởi các gene trội tương ứng theo như giả thuyết tính trội, thì khi đem giao phối các con lai đơn với nhau do kết quả của sự phân ly và tái tổ hợp của các gene mà có thể hình thành nên một số rất lớn những cây đồng hợp tử lặn. Vì vậy, con lai kép sẽ luôn luôn có sức sống thua kém con lai đơn. Song, thực ra sức sống của con lai kép ở ngô lại không thua những con lai đơn tốt nhất. Điều này phù hợp với giả thuyết tính siêu trội. Khi mỗi locus có nhiều allele thì con lai có thể chỉ là những dạng dị hợp tử như là các con lai đơn. Chẳng hạn khi đem lai (A1 x A2) x (A3 x A4) sẽ hình thành nên 4 kiểu gene A1A3, A1A4, A2A3, A2A4. Mỗi kiểu gene ấy có thể chỉ là những dạng dị hợp tử như là những con lai đơn ban đầu. Thuyết siêu trội mặc dù đã được một số công trình thực nghiệm chứng minh, song quan niệm về mối phụ thuộc của sức sống của con lai vào tính dị hợp tử vẫn còn gây tranh luận. Một số dẫn liệu thực nghiệm đưa ra nhằm đối lập lại giả thuyết này. Chẳng hạn, ở cây tự thụ phấn các con lai có ưu thế lai không phải luôn luôn hơn hẳn các dạng bố mẹ đồng hợp tử về mặt sức sống và tính ổn định trong phát dục. Vì vậy, ở những dạng cây tự thụ phấn, nếu chỉ có dựa vào tính dị hợp tử không thôi, thì rất khó phân biệt được ảnh hưởng của tính siêu trội với hiệu quả tương tác giữa các gene không allele. Trong các công trình về lai diallele giữa các dòng tự phối, người ta thấy rằng hiện tượng siêu trội sẽ không xảy ra khi thiếu mặt sự tương tác giữa các gene không allele. Hơn nữa, khi mối tương tác ấy giảm đi thì hiện tượng siêu trội cũng giảm sút (bằng phương pháp phân tích toán học, người ta phân biệt được hai loại hiệu quả này). Như vậy, thuyết dị hợp tử đã chỉ ra được ý nghĩa quan trọng của tính dị chất đối với sự xuất hiện sức mạnh của con lai. Tính dị chất ấy được hình thành do kết quả của trạng thái dị hợp tử ở nhiều locus. Hiệu quả ưu thế lai cao sẽ xuất hiện khi giữa các allele của mỗi locus có sự khác nhau về mặt chức năng. Sẽ không đúng nếu cho rằng sự khác nhau giữa giả thuyết tính trội và tính siêu trội chỉ giới hạn ở sự tương tác giữa các gene allele và không allele. Điểm khác nhau lớn hơn là ở chỗ, thuyết siêu trội đem lại một ý nghĩa cơ bản cho sự hiện diện của các locus dị hợp tử, còn ở thuyết tính trội thì đó là mối tác động giữa các gene trội có lợi. Thuyết siêu trội mặc dù giải thích được nhiều trường hợp của ưu thế lai một cách rõ ràng, song nó không loại trừ được tất cả tính chất phức tạp của vấn đề. Đặc biệt, đến nay người ta đã tích luỹ được nhiều dẫn liệu trong việc tìm hiểu ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến ưu thế lai. Những con lai có sức sống

80

và sản lượng cao chỉ xuất hiện trong những điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng nhất định. Ngoài ra, những đặc tính về tế bào chất của các dạng đem lai cũng có ảnh hưởng lớn đến ưu thế lai. Sự khác nhau về sức sống của con lai trong lai thuận nghịch đã chứng tỏ điều đó. Giả thuyết về tính dị hợp tử về sau được Emerson (1948, 1952) và Rendel (1953) phát triển theo một hướng khác và gọi là thuyết về cân bằng sinh lý. Emerson phát hiện ra rằng, ở nấm Neurospora, trạng thái dị nhân (heterokaryon) - trong một tế bào chứa hai nhân khác nhau, nhờ quá trình tiếp hợp giữa hai sợi nấm khác nhau - đạt tới trạng thái cân bằng khiến cho sức sống của nó bao giờ cũng cao hơn dạng đồng nhân. Các tác giả của giả thuyết này cho rằng, hai thể đồng hợp tử chứa những cặp allele giống nhau thì ít có lợi cho sự phát triển tối thích của cơ thể hơn là thể dị hợp tử. Rendel cho cơ sở của hiện tượng này là do mối tương tác giữa các sản phẩm được hình thành do hoạt động của các gene, mà chúng chính là những chất sinh trưởng. Ví dụ, thể dị hợp tử của hai dạng nấm đột biến ở Neurospora - một dạng có khả năng tổng hợp axit nicotinic, dạng kia có khả năng tổng hợp axit pantothenic - có thể sống được trong môi trường thiếu cả hai loại axit này. 1.3. Thuyết cân bằng di truyền Thuyết cân bằng di truyền, mà người đề xướng là Turbin (1962, 1971), được coi là một giả thuyết có khả năng liên kết được các luận điểm trong việc giải thích hiện tượng ưu thế lai. Thuyết này cho rằng ưu thế lai là một hiện tượng về tính ưu thế của con lai đối với mức độ phát dục tính trạng này hay tính trạng khác so với bố mẹ. Mức độ biểu hiện của tính trạng, tức kết quả của sự phát dục là đặc trưng cho quá trình này về mặt số lượng. Sự sai lệch trong quá trình phát dục của con lai so với bố mẹ có thể theo hướng tăng lên hoặc giảm đi (ưu thế lai dương hoặc âm). Thông thường ta chỉ nói đến ưu thế lai dương là do ý nghĩa thực tiễn của nó. Thuyết cân bằng di truyền đặc biệt chú ý đến quan điểm giải thích cơ chế điều hoà di truyền lên sự hình thành các tính trạng và làm sáng tỏ mối quan hệ nhân quả giữa các nhân tố di truyền với các tính trạng được kiểm soát. Theo đó, sự hình thành của mỗi tính trạng được xác định bằng ảnh hưởng tương ứng của nhìêu nhân tố di truyền khác nhau về đặc trưng tác dụng. Trong trường hợp đơn giản nhất thì trong số chúng có một số gây ra tác dụng kích thích tức là làm tăng cường các tính trạng, một số khác lại gây ra tác dụng theo hướng ngược lại. Sự biểu hiện của mỗi tính trạng như là kết quả về sự cân bằng tác dụng giữa các xu hướng đối lập. Tính hoạt động của các yếu tố di truyền - tức là

81

hiệu quả kiểu hình của mỗi yếu tố - được xác định không chỉ bằng hoạt động ban đầu của nó mà là sự cân bằng mối tác động của nó với các nhân tố khác. Bởi vậy, mối liên hệ giữa các nhân tố di truyền và các tính trạng được xác định bằng trạng thái của hệ thống di truyền nói chung. Trong cơ thể sống, sự trao đổi chất được thực hiện nhờ sự diễn ra của các quá trình sinh hoá. Các quá trình này được điều hoà nhờ sự tác động đồng thời và cân bằng của các hệ thống enzyme. Và chính các hệ enzyme này lại được các gene và những yếu tố có ý nghĩa di truyền trong tế bào chất kiểm soát. Nói khác đi, toàn bộ hoạt động sống của cơ thể chịu sự kiểm soát của những nhân tố di truyền và trạng thái cân bằng của chúng. Mỗi cơ thể có một trạng thái cân bằng di truyền nhất định đảm bảo cho sự hình thành một kiểu hình thành một kiểu hình nhất định thích ứng với điều kiện sống. Sự phụ thuộc giữa biểu hiện của tính trạng vào trạng thái cân bằng di truyền được thấy rất rõ ở các nghiên cứu về sự bất bình thường trong quá trình phát dục của các cơ thể có biến dị về số lượng nhiễm sắc thể. Ví dụ, các thể lệch bội như trisomic, tetrasomic...có kiểu hình rất khác so với cá dạng lưỡng bội, tam bội, tứ bội...việc thêm vào hay mất đi một hoặc một số nhiễm sắc thể nào đó đều ảnh hưởng đến kiểu hình lớn hơn so với trường hợp mất hoặc thêm vào đó những bộ nhiễm sắc thể nguyên vẹn, tức là những bộ gene cân bằng về mặt di truyền. Tóm lại, từ ba giả thuyết trên cho thấy rằng, những phân tích về mặt lý luận di truyền học của hiện tượng ưu thế lai chứng tỏ tính chất phức tạp và mối liên quan nhiều mặt của nó với những vấn đề khác của di truyền học. Các giả thuyết nói trên không loại trừ nhau mà ngược lại, bổ sung cho nhau. Cho đến nay, vẫn chưa có một giả thuyết nào chứng tỏ rằng nó được thừa nhận làm lý luận chung cho hiện tượng ưu thế lai. Tuy nhiên, như đã nói, hai giả thuyết đầu khá phù hợp với nhiều sự kiện thực tế và có cơ sở khoa học khá chắc chắn. 2. Các phương pháp duy trì ưu thế lai ở thực vật Phương pháp tạo con lai giữa các dòng có ưu thế lai cao đã được hoàn thiện. Song vấn đề phức tạp và khó khăn hơn vẫn chưa được giải quyết là việc củng cố và duy trì hiện tượng ấy ở các thế hệ tiếp theo. Như đã biết, ưu thế lai phụ thuộc vào sự tương tác giữa các gene allele và không allele và việc duy trì ưu thế lai qua các thế hệ sau bằng con đường hữu tính có khả năng rất nhỏ (do sự phân ly và tái tổ hợp). Việc phân tích những cơ sở lý luận của hiện tượng ưu thế lai cho thấy, vấn đề duy trì ưu thế lai chỉ có thể thực hiện được bằng cách tạo ra một hệ thống di truyền đảm bảo được việc truyền một cách ổn định kiểu gene dị hợp tử

82

cho những thế hệ sau. Từ bản chất của hiện tượng ưu thế lai, có thể hy vọng rằng bằng con đường tạo ra những di hợp tử có cấu trúc cân bằng từ những dạng tự đa bội, cũng như việc kết hợp ưu thế lai với phương thức sinh sản sinh dưỡng hoặc bằng một dạng sinh sản vô phối nào đó để duy trì được hiện tượng ưu thế lai 2.1. Duy trì ưu thế lai bằng con đường tạo thể song nhị bội Vấn đề cần được giải quyết là tạo ra những dạng dị đa bội nhân tạo từ những dạng tự đa bội. Randolph (1941) và Miriut (1948) là những người đầu tiên nghiên cưú và đề xướng việc sử dụng hiện tượng này trong vấn đề duy trì ưu thế lai. Miriut đã nghiên cứu các dòng lạc (đậu phộng) thuần chủng tự tứ bội với nguồn gốc khác nhau, nhưng thuộc cùng một loài. Con lai thu được do giao phối giữa các dòng thuần này tỏ ra ổn định. Sự kiện này cho phép Miriut giả định rằng, ở những dòng lạc lai này đã tồn tại một trạng thái dị hợp tử ổn định, dựa trên sự tiếp hợp tốt nhất giữa các nhiễm sắc thể có những gene khác nguồn gốc và sự phân ly của các nhiễm sắc thể chứa những gene cùng nguồn gốc đi về một cực trong quá trình giảm phân. Giả thuyết của Miriut về tính dị hợp tử ổn định ở cây lạc trong một thời gian bị coi là không có cơ sở. Song về sau, nó đã được xác nhận bằng những nghiên cứu khác. Tuy nhiên sơ đồ về sự di truyền và việc duy trì ưu thế lai ở thể đa bội dựa trên cơ sở của sự tiếp hợp và phân ly tốt nhất của nhiễm sắc thể không phải do Randolph và Miriut đề ra hoàn toàn. Vấn đề này về sau đã được Dubinin và Serbakov bổ sung nhiều. Những nghiên cứu về việc tạo ra các dạng dị tứ bội từ những dạng tự tứ bội thuộc cùng một loài ở cây lúa của Lương Định Của (1952) đã xác nhận thêm sự đúng đắn của giả thuyết này. Ở dạng con lai này, các nhiễm sắc thể từ những cặp khác nhau nhưng có chung một nguồn gốc từ bố hoặc mẹ thì cùng phân ly về một cực trong quá trình giảm phân. Wallace (1958) đã sử dụng những dẫn liệu ở bông, cà chua v.v. và đưa ra khái niệm về hiện tượng liên kết giả giữa các nhiễm sắc thể có nguồn gốc khác nhau (từ bố và từ mẹ) ở dạng dị tứ bội đặc biệt này. 2.2. Duy trì ưu thế lai bằng con đường sinh sản sinh dưỡng Đối với các cây có khả năng sinh sản bằng các phương pháp như chiết, giâm cành v.v. thì sau khi thu được thì con lai tốt, ta có thể thông qua con đường sinh sản này để duy trì kiểu gene của con lai F1 không thay đổi, nghĩa là duy trì được ưu thế lai qua các thế hệ.

83

2.3. Phương pháp gây tạo các đột biến về cấu trúc nhiễm sắc thể Việc nghiên cứu một số dạng đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể (như chuyển đoạn hoặc đảo đoạn), đã cho thấy rằng, do những đặc điểm về tiếp hợp và phân ly nhiễm sắc thể trong quá trình giảm phân mà chúng có thể tạo ra những kiểu giao tử đặc biệt, qua đó cho phép duy trì được kiểu gene ban đầu qua các thế hệ.

VI. Một số thành tựu về chọn giống ưu thế lai thực vật ở Việt Nam Ở Việt Nam, trước đây diện tích trồng ngô chỉ là khoảng 400.000 ha và năng suất bình quân chỉ đạt 9-12 tạ/ha. Giống ngô lai đầu tiên của nước ta ra đời năm 1978 tại Trung tâm nghiên cứu Ngô sông Bôi thuộc Viện nghiên cứu Ngô ngày nay. Trong giai đoạn 1980-1990, Trung tâm này đã cho ra đời hàng loạt các giống ngô lai có giá trị trong sản xuất, góp phần đưa năng suất ngô bình quân của nước ta lên tới 1,4 - 1,7 tấn/ha với tổng sản lượng từ 600.000 - 850.000 tấn. Ngô lai được chính thức vào thử nghiệm trong sản xuất từ 1990. Đến 1996, diện tích trồng ngô lai lên tới 230.000 ha (chiếm 40% diện tích trồng ngô trong cả nước) với năng suất bình quân là 2,17 tấn/ha và tổng sản lượng là 1,23 triệu tấn. Năm 2000, diện tích trồng ngô lai ở nước ta lên khoảng 1 triệu ha (~ 60-70% diện tích trồng ngô), năng suất bình quân đạt 3 tấn/ha với tổng sản lượng là 3 triệu tấn. Ở nhiều loại cây trồng khác như: kê, cao lương, lúa mì, lúa mạch, cà chua, hành, củ cải đường, hướng dương ... hiện tượng ưu thế cũng đã được nghiên cứu và sử dụng. Ở cao lương, các dạng con lai giữa dòng có năng suất cao hơn dạng tiêu chuẩn 9-18 tạ /ha. Con lai giữa dòng củ cải đường có năng suất cao hơn dạng tiêu chuẩn 4-5 tạ/ha. Ở một số nước, đặc biệt là Nhật Bản, việc sử dụng ưu thế lai ở các cây rau đem lại kết quả rất to lớn. Ở nhật bản có 26 trong số 33 thứ bắp cải, 32 trong trong số 33 thứ cà chua và cả 12 thứ hành trong sản xuất là dạng cây lai. Với cây hành, sản lượng của cây lai cao hơn dạng bình thường 3045%. Ở Bulgari, 70% tổng diện tích trồng trọt dành cho các dạng cây lai, 100% diện tích trồng cây lai để lấy sản phẩm xuất khẩu. Gần đây, việc sử dụng hiện tượng CMS vào sản xuất lúa lai ba dòng ở một số nước châu Á, như Trung Quốc, Việt Nam, Ấn Độ, Philippine đã tạo ra một bước đột phá lớn về năng suất và sản lượng ở cây lương thực quan trọng đứng hàng thứ hai thế giới này, sau lúa mì. Trung Quốc bắt đầu nghiên cứu vấn đề này từ năm 1964 và đến 10 năm sau thì một quy trình sản xuất lúa lai ba dòng đã được đưa vào sản xuất. Năm 1976, diện tích

84

trồng lúa lai ba dòng ở trung quốc là 140.000 ha. Nhưng đến 1994, diện tích ấy đã là 18 triệu ha, năng suất bình quân cao hơn lúa thuần khoảng 20-30%. Ở nước ta, lúa lai được nghiên cứu từ 1980; năm 1990 một số tổ hợp lúa lai đã được nhập từ Trung Quốc; năm 1997 diện tích trồng lúa lai ở nước ta chiếm hơn 100.000 ha ...

Câu hỏi ôn tập 1. Ưu thế lai là gì? Nêu các biểu hiện ưu thế lai ở thực vật và cho ví dụ. 2. Trình bày các phương pháp xác định mức độ biểu hiện ưu thế lai. 3. Thế nào là dòng tự phối và ưu thế lai khác dòng? Trình bày các phương pháp xác định các khả năng phối hợp chung và riêng của các dòng tự phối. 4. Nêu khái niệm về tính bất dục đực, các kiểu bất dục đực và phương pháp sử dụng tính bất dục đực trong chọn giống ưu thế lai ở thực vật. 5. Cơ sở di truyền học của ưu thế lai là gì? Trình bày các phương pháp duy trì ưu thế lai ở thực vật và cho ví dụ. 6. Nêu một số thành tựu điển hình về chọn giống ưu thế lai thực vật trên thế giới và ở nước ta.

Tài liệu Tham khảo Tiếng Việt Nguyễn Văn Hiển (chủ biên, 2000): Chọn giống cây trồng. NXB Giáo Dục, Hà Nội. Phạm Thành Hổ (2000): Di truyền học (tái bản lần 2). NXB Giáo Dục. Trần Đình Long (chủ biên, 1997): Chọn giống cây trồng (Giáo trình cao học nông nghiệp). NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. Trần Duy Quý. 1994. Cơ sở di truyền và kỹ thuật gây tạo, sản xuất lúa lai. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. Trần Duy Quý (1997): Các phương pháp mới trong chọn tạo giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. Lê Duy Thành (2000): Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB KH & KT, Hà Nội. Nguyễn Thị Trâm. 1995. Chọn giống lúa lai. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. Tiếng Anh

85

Chopra, V.L. (Ed., 1989): Plant Breeding: Theory and Practice. Oxford & IBH Publishing Co. PVT, Ltd. Falconer D.S. and Mackay T.F.C. (1996): Introduction to Quantitative Genetics. 4th edn. Longman Group, Harlow. Hayward, M.D., N.O. Bosemark and I. Ramagosa, Coordinating ed. M.C. Cerezo (1994): Plant Breeding: Principles and Prospects. 2nd ed. Chapman & Hall, London. Murray DR. 1991. Advanced Methods in Plant Breeding and Biotechnology. C-A-B International Publisher, London.

86

Chương 5

Các Hệ thống Sinh sản và tính Không tương hợp ở Thực vật I. Mở đầu Tính không tương hợp trong quá trình sinh sản là khái niệm chỉ hiện tượng hạt phấn không có khả năng nảy mầm hoặc ống phấn không thể xâm nhập vào vòi nhụy và thực hiện được quá trình thụ tinh. Tính không tương hợp có thể xảy ra trong phạm vi giữa các cơ quan sinh sản đực và cái của một cây, gọi là tính không tự hợp, vì vậy ở cây này không thể xảy ra quá trình tự thụ phấn. Tính không tương hợp cũng có thể xảy ra khi giao phấn giữa các nhóm cây có quan hệ họ hàng nhất định với nhau, gọi là tính không tương hợp chéo, các cây giữa các nhóm này không giao phối được với nhau. Hệ thống tính không tương hợp có thể hoạt động ở trạng thái thể bào tử (sporophytic incompatibility) hoặc ở trạng thái thể giao tử (gametophytic incompatibility). Nó kiểm soát sự tương tác giữa vòi nhụy và hạt phấn nhờ sự hoạt động của các allele thuộc locus S. Tuy nhiên ở một số thực vật, tính không tương hợp ở thực vật không phải chỉ do một mà là do hai hoặc nhiều locus can thiệp. II. Các hệ thống sinh sản và ý nghĩa của chúng trong di truyền và chọn giống thực vật 1. Sinh sản vô phối (Apomixis) Sinh sản vô phối là hình thức sinh sản mà cơ thể mới được tạo thành từ một bố mẹ riêng lẽ. Đây là hình thức sinh sản phổ biến ở thực vật và ít xảy ra ở động vật. Tất cả các cơ quan ở thực vật đều có thể được sử dụng cho sinh sản vô phối, trong đó đoạn thân được sử dụng phổ biến hơn cả (Hình 5.1). Ở một vài loài, đoạn thân tạo rễ ở một đầu tạo cây mới. Đoạn thân trên mặt đất nằm ngang (thân bò) tạo các cây con giống nhau tại các mắt. Các đoạn thân nằm dưới đất như rễ, củ, thân hành, thân củ có thể được sử dụng cho sinh sản vô phối. Quá trình nguyên phân ở mô phân sinh dọc theo mép lá cũng tạo ra được các cây nhỏ (Hình 5.2). Ở một số loài, có thể sử dụng rễ cho sinh sản vô phối như ở cây bồ công anh, cây dương lá rụng (Hình 5.3)

87

Hình 5.1 Sinh sản vô phối bằng đoạn thân bò.

Hình 5.2 Cây con tạo thành nhờ nguyên phân ở mô phân sinh mép lá.

Hình 5.3 Sinh sản vô phối từ rễ.

1.1. Nhân giống thực vật Những thực vật có giá trị thương mại quan trọng thường được

88

nhân giống bằng phương thức vô tính nhằm duy trì các đặc điểm mong muốn như màu hoa, hương thơm, tính kháng với bệnh … - Ghép: được sử dụng rộng rãi để nhân các giống cây mong muốn. Chẳng hạn, tất cả các giống táo đều được nhân giống theo cách này. - Sinh sản vô phối: Các loài thực vật có hạt nhưng hạt của chúng đượ tạo ra bằng phương thức sinh sản vô tính, được gọi là hiện tượng vô phối hay sinh sản vô phối (Apomixis). Trong đó, trứng được tạo thành với 2n nhiễm săc thể và phát triển không qua thụ tinh. Ở một kiểu khác, các tế bào của noãn (2n) phát triển thành phôi thay vì tạo trứng hữu thụ. Con lai giữa các loài khác nhau thường bất thụ. Nhiều con lai như thế sử dụng phương thức vô tính để nhân giống cho thế hệ sau. Gần đây, sinh sản vô phối ở cây hạt trần đã được phát hiện (Theo Pichot và cs, 2001). Ở cây bách, hạt phấn hoa là lưỡng bội, có thể phát triển thành phôi khi ở trên đất. - Nhân giống vô phối cây trồng: Nhiều cây nông nghiệp quan trọng như cây ngô (bắp) không thể nhân giống bằng phương pháp vô tính như giâm cành. Nhưng các nhà khoa học có thể chuyển những cây này sang sinh sản vô phối bằng cách tạo các phôi là các dòng di truyền hơn là tạo ra các sản phẩm của phương thức sinh sản hữu tính với các gen thường thấy. Sau 30 năm nghiên cứu, người ta đã tạo ra được cây ngô sinh sản vô phối, tuy nhiên người ta chưa tạo đủ lượng hạt để thương mại sản phẩm. Trong tự nhiên sinh sản vô phối xảy ra khoảng 10% trong số 400 họ cây hoa, nhưng chỉ có 1% trong số 40.000 loài của họ này. Sinh sản vô phối thường xảy ra ở họ Graminae, Compositae, Rosaceae và Asterceae. Chỉ có một số cấy trồng có sinh sản vô phối như cam chanh, xoài, một số cỏ nhiệt đới và một số cây khác. Sinh sản vô phối có thể xảy ra theo 2 cách: hạt vô tính có thể được tạo thành từ những tế bào sinh sản của cây nhưng bị trở ngại không thể trải qua quá trình sinh sản hữu tính (giảm phân). Cách thứ hai là hạt có thể được tạo thành từ tế bào sinh dưỡng. Đôi khi, cả hạt hữu tính và vô tính đều phát triển từ cùng một hoa. Lợi ích rõ nhất của sinh sản vô phối ở cây trồng là cho phép chọn lọc một cây riêng lẽ và nhân lên như những dòng qua hạt của chúng. Thuận lợi thứ hai là mở rộng dãy các cây hoang dại có quan hệ họ hàng có thể đưa vào chương trình chọn giống. Sinh sản vô phối có thể làm giảm chi phí sản xuất cây lai. Các chủ trang trại không thể giữ hạt từ các cây lai vì thực tế chúng không thể sinh sản. Các công ty duy trì các dòng cây giống bố mẹ để đem lai để cung cấp

89

cây lai hàng năm. Với sinh sản vô phối, hạt lai có thể được phát triển từ hạt lai. Điều này dẫn đến tiết kiệm thời gian và chi phí. 2. Nhân giống từ bao phấn và sự phát sinh phôi soma Tù lâu, các nhà di truyền và chọn giống cây trồng đã sử dụng trạng thái đơn bội của cây trồng để tiến hành nghiên cứu và thông qua đa bội hóa thể đơn bội đó để thu được các dạng đồng hợp tử. Tuy nhiên các phương pháp kinh điển để thu nhận cây đơn bội cho hiệu quả rất thấp. Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn cho phép nhanh chóng tạo ra hàng loạt cây đơn bội đã là một biện pháp hữu hiệu đối với lĩnh vực ứng dụng đơn bội vào nghiên cứu di truyền và tạo giống cây trồng. 2.1. Các bước phát triển bình thường và phát triển phôi của hạt phấn Bình thường sau khi được giải phóng, hạt phấn chứa một nhân. Giai đoạn này gọi là giai đoạn hạt phấn đơn nhân. Sau đó nhân chia đôi tạo thành 1 nhân dinh dưỡng và 1 nhân sinh sản. Nhân sinh sản lại chia đôi tạo thành 2 tinh tử làm nhiệm vụ thụ tinh kép cho noãn và nội nhũ của túi phôi. Sunderland (1970) cho rằng trong nuôi cấy in vitro, bước phát triển đầu tiên của hạt phấn vẫn xảy ra như bình thường cho đến giai đoạn 2 nhân. Quá trình tạo phôi thường bắt đầu từ nhân sinh sản, nhân dinh dưỡng hay cả 2 nhân, song chủ yếu là nhân dinh dưỡng, trong khi nhân sinh sản chỉ phân chia một vài lần rồi ngừng hẳn. Có trường hợp ngoại lệ, cây đơn bội phát triển từ nhân sinh sản nhưng thường rất yếu. Cũng có ý kiến ngược lại, chẳng hạn Raghavan (1977) cho rằng phần lớn phôi Hyoscyanus niger mà ông thu được từ nuôi cấy bao phấn có nguồn gốc từ nhân sinh sản. Về nguyên tắc, kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho phép tạo cây đơn bội bằng nhiều phương thức khác nhau nhưng phương thức bắt đầu từ tiểu bào tử vẫn là thuận lợi nhất. 2.2. Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn 2.2.1. Kiểu gene của cây cho bao phấn Kiểu gene của cây mẹ có vai trò quan trọng trong việc xác định tần số sản xuất cây hạt phấn. Ở lúa mì, tần số cảm ứng của callus hạt phấn và sự tạo thành cây xanh tiếp sau đó được điều khiển bởi nhiều gene. Mỗi kiểu gene khác nhau tương ứng với phản ứng sinh sản đơn tính khác nhau trong nuôi cấy bao phấn 2.2.2. Nhân tố thành bao bao phấn (Anther wall factor) Pelletier và Iiami (1972) đã chứng minh rằng hạt phấn của một

90

giống thuốc lá sẽ phát triển thành phôi ngay cả khi chuyển vào bao phấn của một giống khác. Chính kết quả này đã dẫn đến khái niệm “thành bao phấn” (wall factor), nó giúp cho nhiều nhà nghiên cứu sử dụng “ hiệu ứng bảo mẫu” (nursing effect) của bao phấn hoàn chỉnh để phát triển sinh sản đơn tính ở các hạt phấn phân lập cuả nhiều loài. Dịch chiết của bao phấn cũng có tác dụng kích thích sản xuất phôi hạt phấn (Pollen embryo) Các nghiên cứu về mô học đã xác định vai trò của nhân tố thành bao phấn trong việc phát triển phôi hạt phấn. Một số kết quả nghiên cứu cho thấy glutamine riêng rẽ hoặc phối hợp với serine và myo-inositol có thể thay thế nhân tố thành bao phấn trong các thí nghiệm nuôi cấy hạt phấn phân lập. 2.2.3. Môi trường nuôi cấy (culture medium) Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gene và tuổi của bao phấn cũng như các điều kiện mà ở đó cây cho bao phấn sinh trưởng. Sinh sản đơn tính tiểu bào tử ở Nicotiana tabacum và Datura innoxia có thể cảm ứng trên môi trường agar đơn giản chỉ chứa sucrose. Hạt phấn tiếp tục phát triển trên môi trường như thế cho đến giai đoạn hình cầu.. Quá trình sinh trưởng về sau của phôi hạt phấn đòi hỏi phải bổ sung các muối khoáng vào môi trường. Các loài không thuộc họ Solanacêa, thành phần môi trường bao gồm các chất điều khiển sinh trưởng và các hỗn hợp dinh dưỡng phức tạp như dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, nước dừa. Môi trường của một số tác giả Trung Quốc như Chu (N6) và Yu Pei dùng cho nuôi cấy bao phấn ngô. Môi trường N6 cũng được sử dụng cho nuôi cấy bao phấn các loại ngũ cốc khác như lúa, lúa mạch đen. 2.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng Gây sốc nhiệt sẽ tăng tần số sinh sản đơn tính tiểu bào tử. Các nụ được xử lý lạnh ở 3oC hoặc 5oC trong 72 giờ sẽ kích thích hạt phấn phát triển thành phôi (xấp xỉ 58%( ở một số loài thuộc họ Solanaceae (Datura, Nicotiana). Ngược lại bao phấn được duy trì ở 22oC trong cùng thời gian chỉ cho khả năng phát triển phôi khoảng 21% (Nitsch 1974). Nói chung, gây sốc nhiệt từ 2-5oc trong 72 giờ có tác dụng kích thích sự phát triển không bình thường của giao tử đực và tích lũy hạt phấn đơn nhân. Cụm hoa hình chùy (panicles) được tách rời của lúa khi xử lý ở 13oC trong 10-14 ngày cho tần số hạt phấn tạo mô sẹo (callus) cao nhất. Cảm ứng sinh sản đơn tính sẽ có hiệu quả cao nếu bao phấn của các loại ngũ cốc khác (lúa, ngô) được bảo quản ở nhiệt độ thấp trước khi nuôi cấy. Tần số phát sinh cây đơn bội và sinh trưởng của cây nối chung sẽ

91

tốt hơn nếu chúng được nuôi trong điều kiện chiếu sáng. Hạt phấn phân lập dường như mẫn cảm với ánh sáng hơn so với cả bao phấn. Ánh sáng trắng cường độ thấp hoặc ánh sáng huỳnh quang đỏ kích thích phát triển phôi nhanh hơn trong nuôi cấy thuốc lá phân lập so với ánh sáng trắng cường độ cao. 2.2.5. Trạng thái sinh lý của cây cho Bao phấn tách từ cây sinh trưởng trong điều kiện ngắn ngày (8 giờ/ngày) và ở vùng có cường độ ánh sáng cao cho phản ứng tương đối tốt hơn so với cây dài ngày (16 giờ/ngày) có cùng cường độ chiếu sáng. Sự phát sinh phôi hạt phấn có thể được cải thiện xa hơn nếu nhiệt độ dưới điều kiện ngắn ngày duy trì ở 18oC. Sự thay đổi mùa vụ thích hợp và tuổi cây cho bao phấn ảnh hưởng lớn đến phản ứng của các hạt phấn. 3. Sự sinh sản đơn tính đực (Adrogenesis) Chúng ta đã biết, một vài loài tạo ra thế hệ sau chỉ mang nhiễm sắc thể của cây mẹ nhờ các quá trình như sinh sản vô phối và sinh sản đơn tính (được gọi là “gynogenesis”). Có nhiều trường hợp sinh sản tự nhiên nhờ sinh sản vô tính trong đó con cháu lưỡng bội mang nhiễm sắc thể chỉ từ cây bố. Hiện tượng phát sinh cây đơn bội từ các tế bào giao tử đực của thực vật được gọi là sinh sản đơn tính đực. Có 3 phương thức sinh sản đơn tính đực: 3.1. Sinh sản đơn tính trực tiếp từ tiểu bào tử Tiểu bào tử trong bao phấn hay phân lập → phôi → cây đơn bội (Hình 5.4) Cấu trúc dạng phôi (Embryoid) phát triển trực tiếp từ hạt phấn. Quá trình này thường xảy ra trong bao phấn, điển hình là Datura, Nicotiana, Atroppa. 3.2. Sinh sản vô tính qua mô sẹo Tiểu bào tử trong bao phấn → mô sẹo → chồi → cây hoàn chỉnh Cây hoàn chỉnh phát triển từ khối mô sẹo, khối mô này thường phát triển ra ngoài bao phấn. Ví dụ: Oryza, Brassica, Lolium, Hordeum. 3.3. Sinh sản đơn tính hỗn hợp Giai đoạn phát triển mô sẹo xảy ra rất ngắn và khó nhận biết. Ví dụ: Datura.

92

Hình 5.4 Nuôi cấy bao phấn và tiểu bào tử

Hình 5.5 Sự phát sinh phôi soma

Sinh sản đơn tính đực có thể được xác định như là sự đưa hạt phấn trở lại kiểu bào tử của sự phát triển (Maheshwari và cs, 1983). Khi bao phấn được nuôi cấy in vitro, một phần của tiểu bào tử được cảm ứng phân chia tạo thành khối các tế bào gắn kết phát triển thành callus hoặc phôi. Ở trường hợp cây ngũ cốc, sự phân cực của lần phân chia nguyên nhiễm đầu tiên đóng vai trò quan trọng trong quá trình này. Nhìn chung, con đường tạo bào tử được gây ra bởi quá trình nguyên phân đối xứng, làm xáo trộn

93

tính phân cực gốc được yêu cầu để trực tiếp phát triển thể giao tử bình thường của hạt phấn. Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn cho sản phẩm đơn bội đã được mô tả ở 237 loài khác nhau thuộc 83 giống và 37 họ và nó được áp dụng thành công cho việc tạo ra các giống mới của các cây ngũ cốc và các cây họ cà như lúa, lúa mạch, lúa mì, Tritical, cà chua và thuốc lá (Dunwell, 1985). III. Khái niệm, bản chất di truyền và ý nghĩa của tính không tương hợp (incompatibility) Tính không tương hợp trong quá trình sinh sản là một khái niệm chỉ hiện tượng hạt phấn không có khả năng nảy mầm hoặc ống phấn không thể xâm nhập vào nhuỵ và thực hiện được quá trình thụ tinh. Tính không tương hợp có thể xảy ra trong phạm vi giữa các cơ quan sinh sản đực và cái của một cây, gọi là tính không tự hợp (self incompatibility), nghĩa là cây đó không tự xảy ra quá trình tự thụ phấn được. Tính không tương hợp cũng có thể xảy ra khi giao phấn giữa các nhóm cây có quan hệ họ hàng nhất định với nhau, gọi là tính không tương hợp chéo (incompatibility crosspollination), nghĩa là các cây giữa các nhóm này không giao phối được với nhau. Hệ thống tính không tương hợp có thể hoạt động ở trạng thái bào tử thể (sporophytic incompatibility) hoặc ở trạng thái giao tử thể (gametophytic incompatibility). Nó kiểm soát sự tương tác giữa vòi nhuỵ và hạt phấn nhờ sự hoạt động của các allele thuộc locus S. Tuy nhiên ở một số thực vật người ta cũng đã phát hiện ra hiện tượng không phải chỉ do một mà là hai hoặc nhiều locus can thiệp vào tính không tương hợp ở trạng thái giao tử thể. 1. Tính không tương hợp ở trạng thái giao tử thể East và Mangelsdorf (1925) là những người đầu tiên nêu ra hiện tượng tính không tương hợp ở trạng thái giao tử thể ở loài thuốc lá Nicotiana sanderae. Về sau hiện tượng này được xác định là có ở hơn 60 họ thực vật hạt kín điển hình là họ đậu, cà, hoà thảo, mao lương … Trong hệ thông không tự tương hợp do giao tử điều khiển, hiện tượng tự xung khắc không biểu hiện ở sự khác biệt do cấu trúc của hoa mà do chính kiểu gene của cây mang hoa đó điều khiển (sporophyte), hoặc bằng chính kiểu gene của hạt phấn gây ra chứ không phải do kiểu gene của cây đó quyết định Đặc điểm của hệ thống tính không tương hợp ở trạng thái giao tử thể: Phản ứng tự xung khắc do đơn gene có nhiều allele điều khiển. Locus

94

S là một locus đa allele. Tùy từng loài mà số lượng allele đó có thể rất khác nhau. Ví dụ ở cây cỏ ba lá, loài Trifolium hybridum có 22 allele, còn ở loài T. pratense có 212 allele. Kiểu gen của từng tiểu bào tử quy định kiểu hình của hạt phấn. Ví thế những hạt phấn chứa allele khác nhau sẽ hoạt động không giống nhau và chúng độc lập với nhau về phản ứng đối với vòi nhụy. Ví dụ, cây có kiểu gen S1S2 sẽ cho ra hai loại hạt phấn S1 và S2. Allele S1 và S2 hoạt động độc lập với nhau, giữa chúng không có mối quan hệ trội lặn hay một sự tương tác nào khác. Phản ứng của tính không hợp xảy ra giữa hạt phấn (n) và mô vòi nhụy (2n) là cố định cho từng loài. Hạt phấn mang một allele nào đó sẽ không nảy mầm hoặc không sinh trưởng được trong mô vòi nhụy có chứa chính allele đó. Ví dụ sự giao phối S1S2 × S1S2 là không xảy ra do hạt phấn S1 hay S2 không thể nảy mầm hoặc ống phấn không thể sinh trưởng được trong mô vòi nhụy S1S2. Ví thế, có thể thấy rằng tính không tự hợp nằm trong tính không hợp ở trạng thái thể giao tử. Tất cả hạt phấn được tạo ra từ cây S1S2

Núm nhụy

Vòi nhụy

Kiểu gen của nhụy

Hình 5.6 Hệ thống giao tử không tương hợp. Phản ứng không tương hợp của hạt phấn do chính kiểu gene của hạt phấn điều khiển

Ở phấn lớn các họ thực vật được nghiên cứu thì tính không hợp ở trạng thái thể giao tử do một locus kiểm soát. Tuy nhiên hiện tượng này cũng có thể do 2 locus (ở một số loài của họ hòa thảo, cà …) hoặc do nhiều locus khống chế (họ mao lương …). Theo Lundqvist (1956), ở lúa mach 2 locus S và Z kiểm soát tính không hợp nằm trên những nhiễm sắc thể khác nhau và hoạt động độc lập với nhau. Khi sự giống nhau giữa hạt phấn và vòi nhụy xảy ra ở một trong hai locus thì không dẫn đến hiện tượng không hợp. Sự không hợp chỉ xuất hiện khi hạt phấn và vòi nhụy có sự giống nhau về thành phần allele ở cả hai locus. Điều này dẫn đến sự gia

95

tăng về tần số giao phấn chéo so với trường hợp chỉ do 1 locus kiểm soát. 2. Tính không tương hợp ở trạng thái bào tử thể Hệ thống tính không tương hợp ở trạng thái bào tử thể được Hughes và Babcock (1950) phát hiện ở các loài Crepies foetida và Parthenium argentatum. Hiện tượng này khá phổ biến ở các họ hoa chữ thập và hoa kép, như họ cải, cúc … Ở một số loài, tính không tương hợp ở trạng thái bào tử thể còn gắn liền với sự đa hình của hoa nhằm tăng cường sự ngoại phối. Đặc điểm của hệ thống tính không tương hợp ở trạng thái bào tử thể: - Giống như hệ thống tính không tương hợp giao tử thể, tính không tương hợp bào tử thể cũng do một locus đa allele kiểm soát, nhưng quy mô biến dị rộng hơn và việc xác định kiểu gene phức tạp hơn, do có hiện tượng tính trội - Tính không tương hợp bào tử thể chịu sự kiểm soát của nhân lưỡng bội ở trạng thái bào tử thể, hoạt động (kiểu hình) của hạt phấn hay ống phấn do kiểu gene lưỡng bội của cơ thể 2n quy định.

Hạt phấn Sự nảy mầm của hạt phấn bị khóa

Thành tế bào nhụy Màng sinh chất

Hình 5.7 Thể bào tử tạo phấn hoa S1S2 tổng hợp cả SCR1 và SCR2 hợp nhất vào cả hai loại hạt phấn S1 và S2, trong đó: SLG (S-locus glycoprotein) mã hóa một phần thể nhận (receptor) có trong thành tế bào núm nhụy; SRK (S-receptor kinase) mã hóa cho phấn khác của thể nhận. Kinase gắn các nhóm phosphate của protein khác. Kinase là protein xuyên màng, gắn vào màng sinh chất của tế bào núm nhụy; SCR (S-locus Cystein-rich protein) mã hóa tuyến tiết cho cùng một thể nhận.

Về nguyên tắc, hạt phấn không nẩy mầm ở đầu nhụy (lưỡng bội) của hoa chứa cả 2 allele ở thể bào tử tạo ra hạt phấn. Chẳng hạn, hạt phấn S2 được tạo ra bố mẹ S1S2, không thể nẩy mầm trên đầu nhụy của cây S1S3. Nguyên nhân, thể bào tử S1S2 tạo hạt phấn, tổng hợp cả SCR1 và SCR2 đã gắn vào cả hạt phấn S1 và S2. Nếu phân tử SCR gắn vào thể nhận

96

(receptor) trên nhụy, enzyme kinase sẽ khởi động hàng loạt sự kiện dẫn đến ngăn cản sự nẩy mầm của hạt phấn trên núm nhụy (Hình 5.7). Nếu con đường này không được khởi động (như hạt phấn của cây S1S2 trên núm nhụy S3S4) hạt phấn nảy mầm thành công.

Vùng mã hóa của receptor

Vùng mã hóa Tiểu phần mã của cùng hóa kinase của receptor receptor

Hình 5.8 Cấu trúc các locus S ở thể bào tử của cây S1S2

- Giữa các allele có trong hạt phấn và vòi nhụy có mối tương tác, mà thường là quan hệ trội - lặn. Chẳng hạn, khi ở cả hạt phấn và vòi nhụy có tính trội hoàn toàn của một allele này đối với các allele khác và theo một kiểu giống nhau thì xảy ra hiện tượng không tương hợp chéo giữa một số nhóm có kiểu gene khác nhau. Vì thế tính không tương hợp chéo là một dạng của tính không tương hợp bào tử thể. Giả sử, S1 > S2, S3, S4 … thì kiểu gene S1S2 sẽ có phản ứng không tương hợp với các kiểu gene S1S3, S1S4. Tính không tương hợp sẽ trở nên phức tạp hơn nếu quan hệ trội - lặn giữa các allele trong locus S thể hiện không giống nhau ở hạt phấn và vòi nhụy. Ví dụ nếu S1> S2 ở cả hạt phấn và vòi nhụy, còn S1 > S3 ở hạt phấn, S3 > S1 ở vòi nhụy thì S1S2 (mẹ) × S1S3 là không tương hợp trong khi đó phép lai nghịch S1S3 (mẹ) × S1S2 lại tương hợp. Tất cả hạt phấn được tạo ra từ cây S1S2

Núm nhụy

Vòi nhụy

Kiểu gen của nhụy

Hình 5.9 Hệ thống không tương hợp bào tử thể. Phản ứng bất hợp của hạt phấn do kiểu gene của cây (sporophyte) đã sinh ra nó, trong khi đó vòi nhụy sự bất hợp được điều khiển do chính kiểu gene của nó.

97

3. Tính không tương hợp đa hình Ở một số loài Primula vulgaris, Lythrum salicaria tính không tương hợp được tăng cường do hiện tượng đa hình trong cấu trúc hoa, vòi nhụy hoặc chỉ nhị có thể có các dạng dài, ngắn hay trung bình. Hoặc do hiện tượng đối lập về độ lớn giữa hạt phấn với tế bào ở núm nhụy. Dạng cây vòi nhụy dài thường có tế bào núm nhụy to nhưng hạt phấn lại bé, ngược lại dạng cây vòi nhụy ngắn có tế bào núm nhụy bé nhưng hạt phấn lại to. Hiện tượng vòi nhụy ngắn và dài do 2 allele S và s kiểm soát. Sự giao phối chỉ xảy ra ở phép lai nhụy dài (ss) × nhụy ngắn (Ss) hoặc nhụy ngắn (Ss) × nhụy dài (ss). Ở F1 cho tỷ lệ 1 nhụy ngắn : 1 nhụy dài. Nếu cho các cây cùng kiểu nhụy ngắn hoặc nhụy dài giao phối với nhau (Ss × Ss hay ss × ss) thì do tính không hợp được kiểm soát ở bào tử thể nên hạt phấn S hay s trong trường hợp này kém phát triển hoặc không phát triển. 4. Tính tương hợp giả Ở các cây có tính tương hợp, đôi khi cũng xảy ra hiện tượng tương hợp giả. Nguyên nhân có thể do: - Sự tự thụ phấn nhân tạo xảy ra nhiều lần - Tác động của một số nhân tố môi trường như nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng. Nhiệt độ thấp ở giai đoạn nở hoa có thể làm yếu phản ứng của tính không tương hợp. Nhiệt độ cao có thể phá hủy sản phẩm của gene S - Tính tương hợp giả có thể tăng lên ở giai đoạn đầu và cuối của thời kỳ nở hoa. Nguyên nhân do trong các vòi nhụy non có thể thiếu những sản phẩm của các allele S hoặc nồng độ của chúng chưa đủ để ức chế sự sinh trưởng của ống phấn. Vào cuối thời kỳ nở hoa, do sự trao đổi chất xảy ra yếu nên phản ứng của tính không tương hợp cũng giảm sút. - Tính tương hợp giả cũng có thể xuất hiện do sự bất hoạt hoặc đột biến của những allele S nhất định hoặc do tác động của những allele khác. Ngoài ra, một số hóa chất như acid boric hoặc hormone sinh trưởng có thể gây ra tính tương hợp giả. 5. Ý nghĩa của tính không tương hợp trong chọn giống - Hiện tượng đa bội với tính không tương hợp Phản ứng của tính không tương hợp ở trạng thái giao tử thể và bào tử thể có khác nhau + Ở hệ thông tính không tương hợp giao tử thể, khi ở trạng thái lưỡng bội, tính không tương hợp phụ thuộc vào tác dụng độc lập của allele S có mặt trong hạt phấn đơn bội. Khi ở trạng thái đa bội, hạt phấn lưỡng bội chứa

98

không phải là 1 mà là 2 allele S. Tác dụng cạnh tranh cuả 2 allele này trong cùng một hạt phấn làm rối loạn phản ứng của tính không tương hợp. Vì thế, ở các dạng đa bội, tính không tương hợp thường bị phá hủy. + Ở hệ thống tính không tương hợp bào tử thể: hiện tượng đa bội không phá hủy phản ứng của tính không tương hợp. Nguyên nhân do giữa các allele khác nhau mối quan hệ trội -lặn đã được xác định. - Lai xa với tính không tương hợp Trong lai xa giữa các loài với nhau, kết quả của phép lai phụ thuộc vào việc sử dụng bố mẹ có liên quan đến tính không tương hợp như thế nào. Ở các họ Solanaceae, Compositae, Cruciferae, Linaceae … thường lai xa khác loài chỉ thành công khi dạng mẹ có tính tự hợp còn dạng bố có tính không tự hợp. Nguyên nhân có lẽ do các allele không tự hợp có khả năng ức chế các allele tự hợp. - Mối quan hệ giữa tính không tương hợp với các kiểu hạt phấn Ở thực vật hạt kín, quá trình phát sinh các tiểu bào tử xảy ra theo 2 kiểu: + Kiểu hạt phấn hai nhân: Khi hạt phấn chín, ở trạng thái sẵn sàng thụ tinh (sau khi tứ tử được hình thành vài ngày), nhân đơn bội trong hạt phấn trải qua một lần nguyên phân cho ra 2 nhân là nhân sinh sản và nhân sinh dưỡng. Sau đó, đến lúc hạt phấn nảy mầm trên vòi nhụy, trong ông phấn xảy ra một lần nguyên phân nữa của nhân sinh sản cho ra 2 tinh tử. Kiểu này thường thấy ở phần lớn thực vật hạt kín. + Kiểu hạt phấn ba nhân: Với kiểu hạt phấn này, khi ở trạng thái sẵn sàng thụ tinh, trong nó đã chứa 3 nhân (1 nhân sinh dưỡng và 2 tinh tử) do kết quả của 2 lần nguyên phân liên tiếp.Kiểu hạt phấn này thường gặp ở họ hòa thảo và họ cúc. Brewbaker (1957) nhận thấy có sự phụ thuộc giữa 2 kiểu hạt phấn nói trên với tính không tương hợp. Thực vật có kiểu hạt phấn hai nhân thường gắn liền với tính không tương hợp giao tử thể. Các loài có kiểu hạt phấn ba nhân thường có biểu hiện tính không tương hợp bào tử thể. Với những loài đa hình, hạt phấn của chúng có thể là kiểu hai nhân hay ba nhân, nhưng đều thuộc hệ thống tính không tương hợp bào tử thể. Ngoài ra, có sự tương ứng giữa kiểu hạt phấn và nơi xảy ra phản ứng của tính không tương hợp. Ở các loài có kiểu hạt phấn ba nhân, nơi xảy ra phản ứng là núm nhụy, do vậy nó tác động đến sự nảy mầm của hạt phấn. Trong khi đó những thực vật có kiểu hạt phấn hai nhân, phản ứng xảy ra khi ống phấn đang xâm nhập vào vòi nhụy, vì thế nó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của ống phấn.

99

Như vậy có một mối liên quan giữa tính không tương hợp, nơi xảy ra phản ứng và kiểu hạt phấn, hay chính là thời điểm xảy ra nguyên phân lần thứ hai trong hạt phấn. - Tạo dòng đồng hợp tử bằng phương pháp tự phối Hệ thống di truyền tính không tương hợp có ứng dụng thực tiễn lớn trong quá trình chọn giống theo ưu thế lai, mà không cần khử đực ở dạng mẹ. Để thu được các dạng con lai có ưu thế cao nhờ sử dụng tính không tương hợp, cần phải thu được các dòng đồnghợp tử về các allele S bằng phương pháp tự thụ phấn nhân tạo qua 3-4 thế hệ. Tính đồng hợp tử theo các allele khác nhau của các dòng đảm bảo quá trình thụ tinh của các cây mẹ bằng hạt phấn của các dòng khác để thu 100% hạt lai. - Khắc phục tính không lai được giữa các loài + Ức chế sinh lý: có thể sử dụng một số tác nhân gây ức chế như nhiệt độ cao, tia phóng xạ hay các hóa chất ức chế sự tổng hợp RNA hay protein … tác động vào nơi xảy ra phản ứng của tính tương hợp hay không tương hợp (núm nhụy hay vòi nhụy) + Loại bỏ tính không tương hợp trong quá trình giao phối nhờ đột biến Tính không tự tương hợp ở trạng thái bào tử thể không thích hợp cho các nghiên cứu đột biến, trong khi đó tính không tương hợp ở trạng thái giao tử thể rất thích hợp.. Trong thực tế, một hạt phấn đột biến hữu thụ nào đó cho phép xâm nhập được vào túi noãn và truyền những đặc điểm đột biến cho thế hệ sau. Sau khi xử lý nụ hoa đang giảm phân bằng tác nhân gây đột biến sẽ hình thành nên hàng triệu hạt phấn như vậy. các hạt phấn này có thể được hình thành nhờ hiện tượng locus S bị mất hoạt tính hoàn toàn hoặc một phần, hoặc do locus này bị biến mất do hiện tượng mất đoạn nhiễm sắc thể. Nhiều trường hợp các đột biến không làm thay đổi kiểu hình hạt phấn nhưng đã bị biến đổi nên vòi nhụy không nhận diện được chúng. Các dạng đột biến tự hợp đã được tạo ra nhờ phóng xạ ở nhiều chi thực vật như: Oenothera, Prunus, Nicotiana, Petunia và Trifolium. + Khắc phục tính không tương hợp khi lai giữa các loài Một số chi thực vật, sử dụng phóng xạ để xử lý giao tử đực hoặc cái khắc phục được hiện tượng không tương hợp khi lai giữa các loài. Điển hình là nhờ đó lai thành công giữa hai loài thuốc lá N. glauca và N. forgetiana. Có thể sử dụng các phương pháp khác để khắc phục tính bất thụ khi lai khác loài như trộn hạt phấn đã bị làm hỏng bằng methanol với hạt phấn không tương hợp, hoặc trộn hạt phấn không tương hợp với một

100

lượng protein được chiết ra từ bao phấn tương hợp.

Câu hỏi ôn tập 1. Sinh sản vô tính là gì? gồm những dạng nào? Ý nghĩa của sinh sản vô phối trong chọn giống thực vật. 2. Trình bày các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn. 3. Hãy nêu các phương thức sinh sản đơn tính đực? 4. Bản chất di truyền của tính không tương hợp 5. Ý nghĩa của tính không tương hợp trong chọn giống.

Tài liệu tham khảo 1. Grain. 2001. Apomixis: The plant breeder’s dream. Seedling, Grain Publications, Vol 18, Issue 3. 2. Trần Đình Long. 1997. Chọn giống cây trồng. NXB Nông nghiệp. 3. Nguyễn Hoàng Lộc. 1998. Bài giảng nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Đại học Khoa học Huế. 4. Paul M. Pechan and Petr Smykal. 2001. Androgenesis: Affecting the fate of the male gametophyte. Physiologia Plantarum, vol 111. 5. Lê Duy Thành. 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB Khoa học và Kỹ thuật. 6. Yang Wei-Cai. 2002. Self-incompatibility and Ubiquitin/26 proteasome pathway: A sexual link revealed. Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing China.

101

Chương 6

Các Phương pháp trong Chọn giống Thực vật I. Các phương pháp chọn lọc cơ bản Chọn lọc là một trong những phương pháp cơ bản và quan trọng được ứng dụng rộng rãi trong chọn giống. Có hai kiểu chọn lọc cơ bản, đó là: chọn lọc theo kiểu hình và chọn lọc theo kiểu gene; nhưng tất cả đều dựa trên cơ sở là nguồn biến dị di truyền của sinh vật. Ngày nay chúng ta đều biết rằng, chỉ có các biến dị di truyền (các đột biến, biến dị tổ hợp) mới đóng vai trò là nguồn cung cấp nguyên liệu cho quá trình chọn lọc và tiến hoá của sinh vật. Trong khi Darwin xây dựng thuyết chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo, ông cũng đã phân bịêt được các biến dị di truyền (biến dị không xác định) và biến dị không di truyền (biến dị xác định), nhưng chưa giải thích được nguyên nhân của chúng. Về vai trò sáng tạo của chọn lọc, + Chọn lọc tự nhiên Theo quan điểm của Darwin, sinh vật không ngừng phát sinh các biến dị cá thể trong quá trình sinh sản và dưới tác dụng của các điều kiện môi trường sống. Chỉ những biến dị nào có lợi cho bản thân sinh vật thì được giữ lại, còn các biến dị nào không có lợi thì bị đào thải. Chọn lọc tự nhiên thường xuyên diễn ra, giúp cho sinh vật mang các biến đổi thích nghi trên cơ thể ngày càng hợp lý. Có những trường hợp chọn lọc tự nhiên thúc đẩy và hỗ trợ cho chọn lọc nhân tạo, làm cho quá trình chọn lọc phát huy nhanh hơn. Ví dụ, đặc tính chống chịu sâu bệnh, chịu hạn của cây trồng vừa có lợi cho con người, vừa có lợi cho sinh vật. Ngược lại, đối với một số đặc tính như rụng hạt ở cây ngũ cốc, chất lượng nông sản cao... thì giữa chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo mâu thuẫn nhau. Do vậy sự thúc đẩy quá trình hình thành giống mới xảy ra chậm hơn. Vì vậy trong công tác chọn giống, chọn lọc nhân tạo có tác dụng vô cùng quan trọng để tạo ra giống mới. + Chọn lọc nhân tạo Darwin là người đầu tiên tổng kết đầy đủ nhất về vai trò tác dụng của tác dụng nhân tạo. Theo Darwin, biến dị, di truyền và chọn lọc là ba yếu tố quyết định sự tiến hoá của sinh vật. Chọn lọc nhân tạo đã tích luỹ những biến dị có lợi và loại bỏ những biến dị không có lợi cho con người. Chính

102

chọn lọc nhân tạo đã tạo nên các đặc điểm thích nghi kỳ diệu trên cơ thể vật nuôi, cây trồng (phù hợp với các thị hiếu thẩm mỹ và nhu cầu về kinh tế của con người). Nếu như trong chọn lọc tự nhiên, động lực của chọn lọc là đấu tranh sinh tồn, thì trong chọn lọc nhân tạo động lực thúc đẩy chính là lợi ích kinh tế của con người.

II. Các nhân tố ảnh hưởng đến chọn lọc 1. Hệ thống sinh sản của cây trồng Ở cây tự thụ phấn(autogamous), do đặc điểm sinh học về cấu tạo hoa, việc lai tạo với cây trồng khác trong cùng loài gặp nhiều khó khăn. Mặt khác, phần lớn cây tự thụ phấn là đồng hợp tử. Hạt giống thương phẩm của nó đựơc sản xuất bằng phương pháp tự thụ phấn. Còn ở các cây giao phấn hay thụ phấn chéo, việc lai tạo trong tự nhiên xảy ra thuận lợi. Đặc điểm của những cây dị giao là dị hợp tử, do vậy hiệu ứng trội sẽ đóng góp việc hình thành các tính trạng. Phương pháp chọn giống ở cây sinh sản vô tính nói chung là các biến dị xảy ra đều tạo nên các kiểu gene đồng hợp tử hoặc dị hợp tử. Chọn ra kiểu gene mong muốn trong môi trường nhất định sẽ tạo ra các dòng vô tính phục vụ sản xuất. Ở đây nhân tố môi trường có tác động nhất định đến các hệ thống sinh sản của cây. 2. Hiện tượng ưu thế lai Ưu thế lai là hiện tượng thường gặp ở tất cả các loài cây giao phấn và một số loài cây tự thụ như: đậu tương, cà chua, lúa mì, lúa... Hạt lai thương mại hiện nay đã được áp dụng rộng rãi ở cả các cây tự thụ phấn và cây giao phấn (xem chương 4). 3. Cấu trúc của bộ máy di truyền tế bào Mức độ đa bội có ảnh hưởng nhất định đến chiến lược chọn giống cây trồng: tứ bội thể được dùng thông dụng ở các loài cây thức ăn gia súc nhằm làm tăng sản lượng chất khô và các đặc tính tốt khác. Việc chọn lọc một tính trạng nào đó như khả năng chống chịu sâu bệnh của củ cải đường, khoai tây... bằng cách chọn các dạng tam bội tỏ ra có hiệu quả hơn. 4. Tính trạng số lượng và tính trạng chất lượng Tuỳ theo tính trạng nhà chọn giống quan tâm là tính trạng số lượng hay tính trạng chất lượng mà có các phương pháp chọn lọc khác nhau. Thông thường, tính trạng chất lượng được kiểm tra bởi một gene, còn tính trạng số lượng do nhiều gene kiểm tra và chịu ảnh hưởng lớn bởi môi trường và tác động qua lại giữa các gene. Đối với tính trạng số lượng, phương pháp chọn giống thường được áp

103

dụng là chọn lọc theo chu kỳ hay chọn lọc hồi quy. Càng có nhiều gene tham gia thì sẽ ít có cơ hôi tạo ra sự ngẫu nhiên để đạt được một tổ hợp gene tốt nhất của một chu kỳ chọn lọc. Do vậy cần có sự phối hợp của chọn lọc nhằm làm tăng các tổ hợp tốt nhất ở chu kỳ tiếp theo. Trong trường hợp này, phương pháp chọn giống hồi quy giúp thu được các tính trạng tốt ở mỗi chu kỳ. 5. Sự hoạt động của các gene (xem cơ sở di truyền học của hiện tượng ưu thế lai, chương 4)

III. Các nguyên tắc cơ bản của chọn lọc Ngoài những nguyên nhân khách quan ảnh hưởng đến quá trình chọn lọc như mức độ biến dị của tính trạng được chọn à phương pháp chọn lọc, thì nguyên nhân chủ quan cũng góp phần quan trọng và mang tính quyết định, do vậy cần tuân thủ các nguyên tắc cơ bản khi chọn lọc. (1) Có mục tiêu và phương hướng: Mục tiêu và phương hướng của nhà chọn giống càng cụ thể và rõ ràng thì công tác chọn giống càng nhanh chóng có hiệu quả. (2) Chọn vật liệu khởi đầu thích hợp: Nguyên tắc này mang tính quyết định đối với công tác chọn giống. Ví dụ, khi muốn tạo ra cây trồng có tính chịu rét, chịu hạn, chịu mặn hoặc khả năng chống chịu sâu bệnh v.v. cần chọn những vật liệu có các gene chống chịu về những đặc tính này và cần được thực tiễn sản xuất thừa nhận các đặc tính này trên quy mô lớn. (3) Cần dựa vào tính trạng trực tiếp và tính trạng tổng hợp: Các tính trạng có mối quan hệ mật thiết với nhau, sự tương quan này còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Việc phát hiện ra mối tương quan càng sớm bao nhiêu thì kết quả chọn lọc càng nhanh bấy nhiêu. Ví dụ, tính trạng chịu hạn của cây ngoài các đặc điểm về cấu tạo bộ rễ ra thì đặc điểm về kích thước lá, đường kính lá, đặc điểm về hình dáng là góp phần quan trọng cho tính trạng tổng hợp chịu hạn của cây trồng. (4) Vật liệu chọn giống cần đảm bảo trồng trong điều kiện đồng đều và thích hợp: Đây là nguyên tắc bắt buộc, vì chỉ có trong những điều kiện phù hợp như vậy, các đặc tính hay tính trạng của giống cây trồng mới biểu hiện ra và thông qua công việc đánh giá, quá trình chọn lọc đó mới đảm bảo tính khách quan và chính xác. (5) Ruộng chọn giống cần áp dụng các biện pháp kỹ thuật phù hợp: Muốn đánh giá tiềm năng năng suất của giống cây trồng, cần áp dụng những biện pháp kỹ thuật tối ưu về đất đai, thời vụ phân bón, tưới tiêu... Còn muốn đánh giá giống trong điều kiện sản xuất thì áp dụng các quy trình kỹ thuật ngoài sản xuất mà không có bất kỳ một sự ưu tiên nào ngoài

104

việc chọn lọc sao cho các giống ngày càng trở nên thuần chủng. (6) Cần chọn lọc theo đúng mục tiêu đề ra và phải chọn lọc trong môi trường phù hợp: Chẳng hạn, trong việc chọn các giống chịu mặn, chịu úng, chịu hạn... thì các vật liệu chọn giống cần trồng trong điều kiện tự nhiên tương ứng như: mặn, úng, hạn.... Hoặc trong đánh giá khả năng kháng bệnh cũng vậy, vật liệu chọn tạo cần gieo trồng trong mùa vụ có dịch bệnh phát sinh mạnh nhất. (7) Kết hợp chọn lọc ở trong phòng và trên đồng ruộng trong suốt thời kỳ sinh trưởng của giống, khi đó các giống cây trồng mới được chọn ra một cách nhanh chóng và chuẩn xác.

IV. Sơ lược về các phương pháp chọn giống truyền thống và hiện đại thông dụng 1. Một số phương pháp chọn giống truyền thống Chọn giống là một quá trình liên tục để thoả mãn nhu cầu thay đổi của một nền nông nghiệp. Nói chung, các phương pháp chọn giống truyền thống vẫn tương đối phổ biến, trong đó tái tổ hợp giữa các kiểu gene ưu tú vẫn là khâu then chốt để tạo ra vật liệu chọn giống cho quá trình chọn lọc. Các phương pháp chọn giống truyền thống dựa vào sự tái tổ hợp của các gene và nhiễm sắc thể thông qua sinh sản hữu tính của sinh vật (tuân theo các nguyên lý di truyền cổ điển của Mendel và Morgan). Các quy trình chọn giống khác nhau đã được sử dụng cho các kiểu cây trồng khác nhau, tuỳ thuộc vào phương thức sinh sản là tự thụ phấn hay giao phấn. Đối với lúa, phương pháp chọn giống theo phả hệ là thông dụng nhất. Các bố mẹ được chọn kỹ lưỡng và lai thông qua thụ phấn bằng tay (Hình 6.1). Trong chương trình chọn giống kháng, thông thường một dạng bố mẹ là giống đã được cải tiến và dạng kia là một giống kháng hoặc loài hoang dại. Phải mất vài thế hệ lai và chọn lọc để chuyển gene kháng cho dạng bố mẹ đã được cải tiến và phục hồi các đặc tính mong muốn của dạng bố mẹ cải tiến (năng suất, chất lượng hạt, v.v.). Tại Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI, đặt tại Manila - Philippines), mỗi năm có tới hàng chục ngàn dòng chọn giống được kiểm tra và lưu giữ về khả năng kháng rầy nâu và sâu hại lá. Tại đây đã lai tạo và phóng thích nhiều giống lúa mới (IR-8, IR-36, IR-64,...) góp phần tạo nên cuộc "cách mạng xanh" trong những năm 1960 và 1970 ở các nước đang phát triển.

105

Hình 6.1 Hình trên: Hoa lúa, khử nhị đực và tiến hành lai giữa hai giống lúa thông qua thụ phấn bằng tay. Hình dưới: Một giống lúa bán lùn, năng suất cao gọi là IR-8 (trái), một phần của cuộc cách mạng sanh lần thứ hai, được IRRI tạo ra bằng cách lai chéo giữa hai dòng lúa bố mẹ: PETA từ Indonesia (giữa) và DGWG từ Trung Quốc (phải). Với thân thấp hơn và cứng hơn, giống lúa mới có thể mang các bông to hơn nhưng không bị đổ.

2. Một số phương pháp chọn giống hiện đại Sự phát triển của công nghệ sinh học (CNSH) trong vài thập niên gần đây đã và đang đưa lại các kiểu quy trình chọn giống mới. Trong chọn lọc với sự hỗ trợ của marker (marker-assisted selection), các marker DNA liên kết với các tính trạng quan tâm (ví dụ các gene kháng côn trùng) được sử dụng để cải tiến hiệu quả của chọn giống. Các marker DNA còn hỗ trợ cho việc phân tích số lượng, tác dụng và sự đinh khu trên nhiễm sắc thể của các gene thứ yếu ở thực vật, thông qua một quá trình gọi là phân tích các locus tính trạng số lượng (quantitative trait loci = QTL). Kỹ thuật di truyền (genetic engineering) cho phép sử dụng bất kỳ sinh vật nào để làm nguồn cung cấp tính kháng. Chẳng hạn, vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) là nguồn cung cấp gene mã hoá các độc tố diệt côn trùng đã được dùng để tạo ra giống lúa chuyển gene kháng được loại sâu đục thân (xem Hình 6.2). Vấn đề này sẽ được thảo luận kỹ ở chương 9. CNSH bao gồm một các loạt phương pháp và quy trình sử dụng cơ thể sống và các hệ thống sinh học được biến đổi để tạo ra sản phẩm mới và tăng năng suất cây trồng, vật nuôi. Trong trồng trọt và nhất là trong cải

106

lương giống cây trồng, hầu hết các quy trình CNSH sử dụng nuôi cấy mô và tế bào in vitro từ mảnh mô, tế bào phân lập, mô sẹo, tế bào trần hoặc mô phôi để thực hiện quá trình biến đổi, rồi sau đó cho tái sinh cây hoàn chỉnh. Điều cần thiết là phải hiểu và nắm vững sự tái sinh cây từ nuôi cấy mô đối với từng loại xác định trước khi áp dụng để bổ sung cho phương pháp chọn tạo giống hiện hành. kết quả nuôi cấy mô và tế bào mấy chục năm qua cho thấy nuôi cấy tế bào từ các loài cây trồng khác nhau hay các kiểu gene khác nhau trong nội bộ một loài, hoặc thậm chí từ các bộ phận khác nhau trên cùng một cây có phản ứng khác nhau đối với một kỹ thuật nuôi cấy cụ thể. Điều này đã cản trở việc xây dựng các qui trình đồng nhất để có thể áp dụng thường xuyên trong các chương trình chọn giống cho nhiều loài cây trồng. Để ứng dụng kỹ thuật này trong chương trình chọn tạo giống cần phải vạch ra các quy trình cụ thể cho từng loại vật liệu di truyền và môi trường nuôi cấy. 2.1. Nuôi cấy mô và tế bào Đầu thế kỷ 20, Haberlandt đã nhấn mạnh tính toàn năng của tế bào soma ở thực vật và chỉ ra khả năng tạo ra cây hoàn chỉnh bằng con đường nuôi cấy mô và tế bào. Tuy nhiên, đến 50 năm sau việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào đơn hoặc tế bào trần (protoplast) mới trở thành hiện thực. Nuôi cấy mô và tế bào là kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật phân lập hay mảnh mô thực vật tách rời trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng. Sau đó, các mô cấy được cho tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Người ta đã xây dựng được các quy trình tương đối hoàn chỉnh để tái sinh cây cho một số loài như thuốc lá, khoai tây, mía, hoa lan, một số cây ăn quả v.v. Đối với phần lớn cây trồng trên đồng ruộng, như bông và đậu lấy hạt thì việc thiết lập các quy trình để áp dụng rộng rãi khó hơn nhiều. Ở những loài cây này tần số tái sinh thấp và kết quả tái sinh từ nuôi cấy không chỉ thay đổi theo loài mà còn phụ thuộc vào kiểu gene trong một loài, nguồn mô cấy, tuổi và sức khoẻ của mô cấy, môi trường dinh dưỡng và nhiều yếu tố khác. Nhìn chung, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào cho phép nhân nhanh những kiểu gene có giá trị hay vật liệu chọn giống trong một môi trường có kiểm soát. Một số khả năng ứng dụng của nhân nhanh đối với cây trồng là: Nhân quy mô lớn kiểu gene dị hợp tử, nhân kiểu gene tự bất hợp, nhân bố mẹ bất dục trong chương trình chọn giống lai, nhân vật liệu sạch bệnh, bảo quản và trao đổi nguồn gene quốc tế... Ở đây chỉ giới thiệu sơ lược một số kỹ thuật nuôi cấy in vitro liên quan trực tiếp tới quá trình chọn giống. (1) Nuôi cấy phôi, noãn và thụ phấn in vitro Các nhà chọn giống chủ yếu đã và đang tận dụng biến dị di truyền

107

hiện có trong nguồn gene trồng trọt bằng cách sử dụng nhiều sơ đồ lai và chọn lọc khác nhau. Tuy nhiên với thâm canh và độc canh, một ít kiểu gene chọn lọc về những tính trạng có ý nghĩa kinh tế biến dị di truyền ngày một giảm trong nguồn gene trồng trọt. Thậm chí trong một số trường hợp, nguồn biến dị đối với một số tính trạng có ý nghĩa kinh tế không đủ thoả mãn, ví dụ: tính kháng bệnh vàng lụi, sâu đục thân, chịu mặn ở lúa... Để khắc phục những vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến năng suất, nhà chọn giống cần có nguồn gene kháng sâu bệnh từ các loài hoang dại thân thuộc hoặc không thân thuộc. Một khó khăn lớn khi sử dụng các loài hoang dại để lai với cây trồng là tính bất hợp khi lai. Trong một số trường hợp, các phôi lai từ các tổ hợp lai giữa các loài có quan hệ xa nhau thường yếu và không có khả năng sống do sự cung cấp dinh dưỡng từ nội nhũ không đầy đủ và chúng thường bị chết trong một thời gian ngắn sau khi hình thành hợp tử và không thể phát triển thành hạt có khả năng sống. Vì vậy, nuôi cấy phôi hay cứu phôi là một phương pháp để khắc phục hàng rào bất hợp, bảo đảm để phôi non sinh trưởng, nảy mần, và phát triển thành cây con. Thông qua sử dụng phương pháp này người ta đã tạo ra nhiều con lai khác loài ở nhiều loại cây trồng như lúa mì, lúa nước, đại mạch, bông, đậu, đỗ, các loài cây ăn quả, cây cảnh và nhờ vậy nhiều gene có ích đã được chuyển vào cây trồng. Noãn đã thụ tinh đôi khi được nuôi cấy để cứu phôi từ các tổ hợp lai xa mà không cần tách phôi ra khỏi noãn. Noãn chứa phôi lai non được tách ngay sau khi thụ tinh trong điều kiện vô trùng rồi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng. Bằng con đường nuôi cấy noãn phôi có thể nuôi cấy ở giai đoạn sớm hơn so với nuôi cấy phôi tách rời. Hơn nữa, phôi phát triển trong noãn có môi trường hoá học và lý học thuận lợi hơn phôi nuôi cấy bên ngoài noãn. Thụ phấn và thụ tinh in vitro gồm việc thu nhập noãn chưa thụ tinh, cấy noãn trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng, và thụ phấn cho noãn với các hạt phấn tươi. Ống phấn xuyên qua thành noãn và túi phôi sẽ thụ tinh cho tế bào trứng. Phương pháp này đã được áp dụng để tạo con lai giữa các loài mà ống phấn không thể sinh trưởng và xuyên vào noãn bình thường sau khi thụ phấn. (2) Nuôi cấy bao phấn và sản xuất cây đơn bội: Trong phần lớn các chương trình chọn giống việc tạo giống mới cải tiến bao gồm việc gieo trồng quần thể F2 lớn và chọn lọc các dòng mong muốn trong các thế hệ phân ly từ F2 đến F7 để cuối cùng tạo ra các dòng đồng hợp tử. Nuôi cấy bao phấn hay hạt phấn là một kỹ thuật hữu hiệu để tạo ra các dòng đồng hợp tử ngay từ thế hệ đầu tiên (dòng đơn bội kép), do

108

đó tiết kiệm nguồn lực và rút ngắn thời gian cần thiết để tạo ra giống mới. Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các bao phấn chứa tiểu bào tử hay hạt phấn chưa thành thục trên môi trường dinh dưỡng để tạo ra cây đơn bội. Số nhiễm sắc thể của cây đơn bội được nhân đôi để tạo ra cây lưỡng bội đồng hợp tử hoàn toàn, gọi là thể đơn bội kép. Việc nuôi cấy bao phấn rất có ích đối với nhà chọn giống vì thế đơn bội kép có thể được sử dụng để làm các dòng thuần ở cả cây tự thụ phấn và cây giao phấn. Thời gian cần thiết để tạo ra một giống hay một dòng tự phối bằng phương pháp đơn bội kép được rút ngắn nhiều thế hệ so với phương pháp truyền thống. Các dòng đơn bội kép tạo ra cơ hội duy nhất để cải thiện hiệu quả chọn lọc đối với nhiều tính trạng vì trong quần thể không có phương sai trội, đồng thời gene lặn cũng biểu hiện ra kiểu hình. Kỹ thuật này đã được áp dụng thành công ở Trung Quốc trong việc tạo ra giống lúa và lúa mì. Tuy nhiên, hạn chế trong việc áp dụng rộng rãi phương pháp này là khả năng nuôi cấy khó và tính đặc thù cao của kiểu gene. Ví dụ, các nhà chọn giống lúa Indica không thể sử dụng kỹ thuật này có hiệu quả bằng các nhà chọn giống lúa Japonica do các kiểu gene Indica khó nuôi cấy hạt phấn còn bị ảnh hưởng bởi giai đoạn phát triển của bao phấn, điều kiện sinh lý của cây cho phấn, điều kiện xử lý trước khi nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy và hiệu quả lưỡng bội hoá bằng colchicine. (3) Biến dị dòng soma và chọn lọc dòng tế bào: Ban đầu nuôi cấy mô được sử dụng làm kỹ thuật mới để tạo sinh khối và phương pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt cây dồng nhất và như bố mẹ ban đầu của các giống ưu tú. Tuy nhiên, với thời gian các công trình nghiên cứu ở nhiều loài cây trồng có giá trị kinh tế người ta thấy rằng tế bào và mô được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo thường xuất hiện các biến đổi di truyền bao gồm số lượng và cấu trúc nhiếm sắc thể, sự sắp xếp lại trong nhiễm sắc thể, đột biến gene v.v. Các biến dị này được truyền lại cho cây khi tái sinh. Tập hợp các biến dị di truyền hình thành do quá trình nuôi cấy được gọi là biến dị dòng soma (somaclonal variation) (Larkin và Scowcroft, 1983). Biến dị dòng soma chịu ảnh hưởng bởi loài cây, kiểu gene trong loài và mô cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, và tính ổn định của genome. Như vậy bản thân nuôi cấy mô và tế bào là một nguồn biến dị di truyền quan trọng, mới mẻ và phong phú trong các điều kiện đã thích ứng và rất có ích cho sự cải thiện giống cây trồng. Một số thể biến dị dòng soma có ích đã được phân lập, đó là khả năng để kháng virus Fiji, bệnh đốm vàng viền nâu và bệnh sương mai ở mía (Heinz và cộng sự, 1977); khả năng kháng bệnh đốm lá nhỏ ở ngô (Bretell và Ingram, 1979); kháng

109

sương mai ở khoai tây (Shepard và cộng sự, 1980); chịu hạn và chịu lạnh ở lúa (Lê trần Bình và cs, 1996). Một ưu điểm của biến dị di truyền trong quá trình nuôi cấy là khả năng chọn lọc dòng tế bào in vitro. Có thể nuôi cấy và xử lý hàng triệu tế bào trong một không gian hạn chế, chẳng hạn trong đĩa petri và chọn lọc bằng cách xử lý tế bào nuôi cấy trong điều kiện bất lợi là tác nhân chọn lọc. Cũng có thể kết hợp xử lý đột biến trong nuôi cấy để tăng tần số biến dị di truyền. Tuy nhiên, chỉ những tính trạng biểu hiện ở mức tế bào mới có thể xác định được bằng cách sàng lọc tế bào nuôi cấy, bao gồm các đặc tính như kháng thuốc diệt cỏ, chịu mặn hay chịu kim loại như sắt, nhôm, axit amin tương đồng, chịu nhiệt độ thấp, các yếu tố dinh dưỡng và khả năng kháng độc tố do các tác nhân gây bệnh tạo ra. Các kiểu gene phân lập kháng với các điều kiện bất lợi này có thể được sử dụng trực tiếp trong chương trình chọn giống. 2.2. Lai tế bào soma hay dung hợp tế bào trần Trong các phương pháp chọn tạo giống truyền thống lai hữu tính là phương pháp cơ bản nhất để tạo ra biến dị tổ hợp thông qua dung hợp giao tử. Tuy nhiên, việc lai hữu tính chỉ thực hiện được các cá thể trong một loài hay các loài có quan hệ thân thuộc. Lai giữa các loài có quan hệ xa nhau thường rất khó khăn vì hàng rào cản trở việc lai xa làm giảm tính hữu dụng của kỹ thuật lai trong việc tăng nguồn biến dị di truyền cần thiết cho việc cải lương cây trồng. Vì vậy một phương pháp mới được đề xuất bởi Keller và Melchers (1973) là nhằm khắc phục hàng rào lai hữu tính giữa các loài có quan hệ họ hàng xa nhau là phương pháp dung hợp tế bào soma hay dung hợp tế bào trần. Đó là kỹ thuật cho phép hợp nhất các tế bào soma không có thành tế bào của cá thể hoặ các loài khác nhau, và sau đó cho tái sinh cây lai từ các tế bào đã dung hợp. Trong lai hữu tính, các tính trạng liên quan DNA bào quan kiểm soát hoàn toàn giống cây mẹ vì không có sự tổ hợp các cơ quan tử của bố và mẹ. Trong dung hợp tế bào trần, ngoài khả năng dung hợp nhân, còn có khả năng xảy ra hỗn hợp tế bào chất, hình thành tổ hợp di truyền hoàn toàn mới. Ty thể và lạp thể của hai tế bào khác nhau có thể hợp nhất hoặc là tái tổ hợp tạo ra một tế bào dị tế bào chất, gọi là cybrid. Như vậy, bằng con đường lai soma người ta có thể thu được tổ hợp mới của lạp thể hay ty thể và tương tác mới giữa nhân và tế bào chất. Dung hợp tế bào trần là một quá trình nhiều giai đoạn, bao gồm việc phân lập tế bào trần từ các loài khác nhau, dung hợp tế bào trần từ hai loài khác nhau, giám định, nhân sản phẩm dung hợp và cuối cùng là tái sinh cây lai hữu dục là sản phẩm dung hợp.

110

Lai soma được sử dụng có hiệu quả để kết hợp khả năng kháng các bệnh virus ở khoai tây từ các kiểu gene trong một loài cũng như từ các loài khác nhau (Venzen, 1994). Lai soma là một phương tiện có hiệu quả để chuyển bất dục đực tế bào chất và đa dạng hoá nguồn bất dục trong việc tạo giống lai. 2.3. Chuyển gene hay kỹ thuật di truyền Kỹ thuật di truyền thực vật là sự chuyển một đoạn DNA lạ, thường là một gene có chức năng mã hoá cho một thông tin hay đặc điểm có lợi nhất định vào tế bào thực vật như khả năng kháng sâu hại, kháng virus hay kháng thuốc trừ cỏ. Cây tái sinh từ tế bào chuyển nạp có gene lạ được lồng vào genome, biểu hiện ra kiểu hình va di truyền ổn định được gọi là cây chuyển gene. Gene lạ có thể có nguồn gốc từ vi sinh vật thực vật, động vật, thậm chí gene tổng hợp. Quá trình chuyển gene bao gồm nhiều bước: xác định và phân lập gene có ích, nhân gene, chuyển gene vào tế bào thực vật, tái sinh tế bào chuyển nạp thành cây hoàn chỉnh và đánh giá sự biểu hiện của gene. Trong các bước trên, kỹ thuật chuyển gene đóng một vai trò quyết định đối với kết quả chuyển gene. Chuyển gene vào tế bào thực vật có thể thực hiện gián tiếp thông qua vector hay trực tiếp. Sau đây là ví dụ về sự chuyển qua thông qua Ti-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens là vi khuẩn gây khối u ở cây hai lá mầm và phản ứng hình thành khối u là kết quả của sự kiện chuyển gene tự nhiên. Mấu chốt của sự hình thành khối u là Ti-plastmid (Ti: tumor inducing) của vi khuẩn chứa các gene mã hoá sinh tổng hợp các horrmon (auxin và cytokinin) chịu trách nhiệm cho sự hình thành khối u. Các gene này nằm trong vùng T-DNA (transfered DNA) của plasmid. Khi plasmid xâm nhập vào tế bào của cây, cùng T-DNA được chuyển vào genome. Đoạn T-DNA là yếu tố di truyền vận động trong quá trình chuyển gene. Ý nghĩa của Agrobacterium trong kỹ thuật di truyền là khả năng chuyển đoạn DNA vào tế bào thực vật. Lợi dụng phương thức chuyển gene tự nhiên các nhà khoa học thực vật dựa vào kỹ thuật phân tử điều khiển T-DNA để thiết kế hệ vector bằng cách lồng đoạn DNA cần chuyển gắn vào cùng T-DNA của vi khuẩn, sau đó cho cây nhiễm các vi khuẩn chứa plasmid đã biến đổi. Để lây nhiễm người ta nuôi cấy tế bào trần thực vật, tế bào đơn trong trong mooi trường lồng, hoặc đặt mô cấy trong dung dịch huyền phù chứa vi khuẩn có plasmid biến đổi trong một thời gian nhất định. Quá trình chuyển nạp thông qua Agrobacterium gồm các bước sau đây:

111

- Phân lập gene có ích từ thể cho (DNA lạ) và nhân gene - Loại bỏ T-DNA khỏi Ti-plasmid của các dong vi khuẩn đã chọn lọc - Chuyền DNA lạ vào Ti-plasmid cùng với promotor và một gene chỉ thị có khả năng chọn lọc dễ dàng (ví dụ gene uidA của vi khuẩn mã hoá βglucuronidaza thường gọi là gene GUS, hay gene kháng kháng sinh). - Đưa plasmid đã biến đổi vào tế bào thực vật - Chọn tế bào được chuyển gene - Tái sinh tế bào được chuyển gene - Chọn cây biểu hiện được chuyển (cấy chuyển gene) Nhiễm sắc thể Lớp vỏ áo hạt Phôi Cách ly phôi từ hạt lúa

Cách ly gene độc từ tế bào Bt. Sửa đỏi để sử dụng trong pls và tạo ra nhiều bản sao

Đưa các phôi vào môi trường sinh trưởng Máy bắn hạt

Phủ một lớp hạt vàng nhỏ lên gene Bt

Băn các phôi với các tiểu hạt vàng có lồng gene Bt vào trong các tế bào cây lúa Cây lúa chuyển gene

Tái sinh các cây mạ từ các mô sẹo phát triển từ phôi được biến nạp

Cho các phôi sinh trưởng trên môi trường để xác định các phôi nào đã được biến nạp gene Bt

Hình 6.2 Tạo giống lúa Bt bằng phương pháp súng bắn gene (particle bombardment method). Đây là một trong nhiều phương pháp có thể sử dụng để chuyển các gene mới sang cây lúa bằng kỹ thuật di truyền.

Ở một số loài cây dễ nuôi cấy như khoai tây và cà chua, các mẫu lá cắt

112

rời được nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn trong một thời gian ngắn. Sau đó các mẫu lá được đưa vào môi trường dinh dưỡng. Trong khoảng thời gian đó vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và xâm nhập vào các tế bào lá rồi tạo ra một số tế bào chuyển gene. Vì chỉ một phần nhỏ tế bào được chuyển gene nên cần phải tiến hành chọn lọc. Việc chọn lọc thông thường dựa vào gene chọn lọc, đó là gene kháng kháng sinh hay kháng thuốc trừ cỏ. Sau đó các mẫu lá được chuyển vào môi trường khác chứa một chất kháng sinh để diệt Agrobacterium còn sót lại và một chất kháng sinh khác hay thuốc trừ cỏ để loại trừ các tế bào không chuyển gene. Các tế bào được chọn được chuyển sang một loạt các môi trường dinh dưỡng để tái sinh cây. Kết quả tái sinh và tạo cây chuyển gene phụ thuộc vào loài cây. Phương pháp chuyển gene thông qua Agrobacterium được áp dụng rất thành công ở nhiều loài cây hai lá mầm như thuốc lá, khoai tây và cà chua. 2.4. Giám định nguồn gene và chọn lọc dựa nhờ chỉ thị di truyền Giám định chính xác các giống, dòng và nguồn vật liệu khởi đầu cho tạo giống vô cùng quan trọng đối với việc chọn lọc bố mẹ để tạo ra nguồn biến dị di truyền. Ví dụ, quan hệ họ hàng là một yếu tố xác định việc chọn bố mẹ ở cả cây tự thụ phấn lẫn cây giao phấn. Tạo giống dòng thuần thường dựa vào việc sử dụng các dòng có quan hệ thân thuộc, trong khi đó con lai tốt nhất được tạo thành từ tổ hợp của các bố mẹ tự phối có quan hệ xa nhau. Có thể xác định mức độ thân thuộc bằng cách kiểm tra gia phả, năng suất của con lai và những đặc điểm hình thái. Các phương pháp xác định này thường không chính xác. Để tăng độ chính xác trong giám định nguồn gene, những năm gần đây các nhà chọn giống đã áp dụng phương pháp điện di isozyme và tính đa hình về độ dài của phân đoạn cắt hạn chế (restriction fragment length polymorphism, viết tắt: RFLP). Điện di enzyme đựa vào việc định lượng một loạt các enzyme chứa trong các mô đặc thù, chẳng hạn cây đang nảy mầm. Trong mỗi enzyme có thể xác định được các allele khác nhau (allozyme hay isozyme) nhờ tính di động khác nhau trên màng polyacrylamide gel trong một điện trường. Tính di động của enzyme phụ thuộc trọng lượng phân tử, tính tích điện và cấu trúc ba chiều của nó. RFLP là những phân đoạn DNA tạo ra khi DNA được phân giải bởi các enzyme phân giải DNA gọi là enzyme cắt hạn chế (restriction endonulease). Các phân đoạn cắt có độ dài khác nhau và có trọng lượng phân tử khác nhau được tách ra trên môi trường điện di. Các kiểu gene khác nhau tạo ra một bộ RFLP khác nhau khi được cắt bởi cùng một enzyme và đây là cơ sở để phân biệt các cá thể khác nhau. cuối cùng sự

113

khác nhau này có thể nhận biết bằng cách di chuyển các phân đoạn DNA sang màng mỏng và tiếp xúc với đoạn mẫu dò (probe) DNA chỉ thị với P32 thông qua kỹ thuật lai DNA gọi là Southern Blot chẳng hạn. Khả năng ứng dụng lớn nhất của asozyme và RFLP là lập bản đồ di truyền và hỗ trợ cho chọn lọc các kiểu gene mong muốn nhờ chỉ thị di truyền. Sự ra đời của chỉ thị isozyme giữa thập niên 1970 và chỉ thị DNA (DNA marker) từ những năm 1980 cho phép người ta định vị gene với mật độ cao hơn và ứng dụng hiệu quả hơn. Tuy nhiên, hạn chế của chỉ thị isozyme là không đủ tạo bao trùm toàn bộ genome. Để định vị gene bằng một chỉ thị cần phải có liên kết rất chặt (dưới 5 cM). Từ những năm 1980 các nhà nghiên cứu đã xây dựng bản đồ di truyền dựa vào RFLP hoặc đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (random amplified polymorphic DNA, viết tắt: RAPD) nhờ kỹ thuật phản ứng dây chuyền của polymerase (polymerase chain reaction, viết tắt: PCR). Khác với isozyme, chỉ thị DNA có số lượng rất lớn cho phép xây dựng bản đồ bão hoà của toàn bộ genome. Tương tự như chỉ thị isozyme, chỉ thị DNA trội song song, không bị ảnh hưởng của môi trường và phân ly theo quy luật Mendel. Các tính trạng cần cải tiến có thể tương quan với một RFLP trong bản đồ liên kết. Đặc biệt có ích là vật liệu chỉ thị DNA cho phép xây dựng bản đồ và định vị các locus kiểm soát các tính trạng số lượng. Hiện nay bản đồ RFLP đã được thiết lập cho một số cây trồng chính như lúa, ngô, cà chua, khoai tây, đậu xanh.... Các bản đồ này có thể dùng để định vị các gene kiểm soát các tính trạng nông học khác nhau, gồm cả các locus kiểm soát tính trạng số lượng. Ví dụ ở cà chua RFLP đã được sử dụng để định vị gene kháng virus khảm thuốc lá, 6 locus kiểm soát khối lượng quả, 4 locus kiểm soát hàm lượng chất rắn hoà tan, 5 locus kiểm soát độ pH của quả. Định vị gene bằng RFLP giúp các nhà chọn giống giám định và mô tả đặc điểm của giống và chọn lọc các tính trạng phức tạp khó thực hiện được bằng các phương pháp truyền thống. Hơn nữa, kỹ thuật PCR giúp nhà chọn giống xác định sự có mặt của gene có ích rất có hiệu quả, đặc biệt là các gene kháng bệnh - những gene chỉ khẳng định được khi có mặt của vật ký sinh.

V. Chọn giống ở cây tự thụ phấn Tự thụ phấn hay tự phối là việc chuyển phấn hoa từ nhị đực đến nhuỵ cái trong cùng một hoa, hay đến nhuỵ cái của hoa trong cùng một cây. Đó là quá trình kết hợp giao tử đực và giao tử cái của cùng một cây. Cây tự thụ phấn cũng có một số trường hợp giao phấn, phụ thuộc vào: - Giống hay dòng cây trồng

114

- Điều kiện mùa vụ, nhất là nhiệt độ và độ ẩm - Hướng và tốc độ gió vào thời điểm thụ phấn - Quần thể côn trùng thụ phấn. Tự thụ phấn không những duy trì kiểu gene của bố mẹ từ đời này sang đời khác mà còn nhanh chóng phục hồi tình trạng đồng hợp cho kiểu gene trong các đời tiếp theo. Tỷ lệ dị hợp Aa trong các đời tiếp theo sẽ giảm đi một nữa. Mức độ đồng hợp của mỗi đời có thể tính theo công thức (2m – 1/2m)n, với m: số đời, n: số cặp gene đồng hợp. 1. Các phương pháp chọn tạo giống 1.1. Nhập nội Nhập nội thường được dùng như nguồn cung cấp gen hay tổ hợp gen để cải lương một kiểu gen thích ứng tốt nhưng còn thiếu một hay nhiều tính trạng. 1.2. Thích nghi Tính thích nghi là khả năng tự phục hồi và thích ứng của quần thể với vùng khí hậu mới. Quá trình thích nghi là kết quả của sự chuyển dịch lệch di truyền về phía các dạng thích ứng trong một quần thể được đặt trong các điều kiện bất thuận của môi trường. Hiệu quả của quá trình thích nghi phụ thuộc vào: + Mức độ không đồng nhất trong quần thể; + Phương thức sinh sản của loài; + Thời lượng của chu kỳ sống của loài; + Tính chất và cường độ của các điều kiện bất thuận trong môi trường. Cây giao phấn thích nghi nhanh hơn cây tự thụ phấn do có tần số tái tổ hợp cao hơn, sẽ tạo ra các kiểu gene có lợi với tính thích nghi. Trong khi đó một dòng thuần biến đổi rất ít. 1.3. Chọn lọc Chọn lọc là một quá trình nhờ đó cá thể hay một nhóm cá thể được chọn ra từ một quần thể hỗn hợp và không đồng nhất. Chọn tạo giống cây trồng tự thụ phấn bằng chọn lọc hàng loạt hay chọn lọc hõn hợp (chọn lọc quần thể) và chọn lọc cá thể hay dòng thuần (chọn lọc phổ hệ) 1.3.1. Chọn lọc quần thể Ở phương pháp chọn lọc quần thể, người ta chọn bông hay cây tốt rồi trộn lẫn hạt giống của chúng để trồng lại đời sau. Chọn lọc quần thể dựa trên cơ sở chọn lọc kiểu hình, không thử

115

nghiệm đời con, nên có những khuyết điểm sau: - Không thể biết được cây tập hợp lại là đồng hợp hay dị hợp. Cây dị hợp thì đời sau sẽ phân ly nên chọn lọc kiểu hình cần được tiếp tục lặp lại - Không thể biết được kiểu hình ưu tú được chọn do các tính trạng di truyền hay do môi trường. Hiện nay, thực hiện việc tuyển chọn đời con của các cá thể, sau đó dồn hạt giống của những đời con giống nhau đã phần nào làm tăng hiệu quả chọn lọc quần thể. Theo Allard (1960) thì sai biệt chủ yếu giữa chọn lọc quần thể đối với các cây tự thụ phấn liên quan đến số lượng dòng giữ lại. Đối với chọn lọc quần thể thì dạng được chọn chỉ xuất phát từ một bông và các dòng được chọn và giữ lại gộp thành một quần thể hỗn hợp các dòng thuần. Quần thể chọn ra trên thực tế đồng đều về các tính trạng nông học quan trọng như màu hạt, kích cỡ hạt, chiều cao cây, thời gian sinh trưởng và khả năng chống chịu bệnh. Chọn lọc quần thể chủ yếu được dùng để lọc các giống lẫn hoặc lọc các lô hạt giống lẫn của các chương trình sản xuất hạt giống. Việc lọc các giống lẫn bằng chọn lọc quần thể được tiến hành như sau: + Chọn lọc từ 200 đến 2.000 cây (cá thể) đúng dạng hình chính của giống. Số lượng cây chọn tùy thuộc vào nguồn giống có được + Gieo cây đời con trên ô gồm 3-4 hàng và quan sát độ đồng đều của các tính trạng kiểu hình khác nhau. + Trộn hạt các đời con có dạng giống và đồng đều lại để nhân giống. Chọn lọc quần thể được xem như là một phương pháp chọn tạo giống để cải lương các giống cây trồng tự thụ phấn. 1.3.2. Chọn lọc cá thể - Giống dòng thuần Chọn lọc cá thể với mục đích tạo ra giống dòng thuần được thực hiện trong hai trường hợp: - Tạo các dòng thuần từ một giống địa phương thích ứng tốt hay từ một quần thể nhân tạo hay giống quần thể được chọn lọc theo phương pháp chọn lọc quần thể đã và đang được dùng nhiều trong sản xuất. - Tạo các dòng thuần từ một quần thể đang phân ly của thể lai. Trong cả hai trường hợp trên, chi tiết chọn lọc đời sau của từng cá thể phụ thuộc vào các điều kiện sau: - Trường hợp các giống địa phương hình thành từ các quần thể bằng phương pháp chọn lọc quần thể, mang ít cây dị hợp, số lớn cây là đồng hợp tại nhiều locus. - Trường hợp của quần thể đang phân ly, từng cây riêng rẽ ban đầu dị

116

hợp trở thành đồng hợp sau các đời liên tiếp. Nhiều chương trình chọn tạo giống cây trồng tự thụ phấn quan tâm đến việc chọn tạo các giống dòng thuần vì: (i) Giống dòng thuần có độ đồng đều cao về hình dạng và về chất lượng sản phẩm; (ii) Một dòng thuần đã thích ứng với các điều kiện sinh thái và canh tác riêng thì chắc chắn sẽ cho thành tích cao hơn quần thể hỗn hợp các kiểu gene; và (iii) Dễ nhận diện và duy trì một dòng thuần. 1.4. Tạp giao Tạp giao chỉ việc lai hai cá thể có tính di truyền khác nhau. Về mặt chọn tạo giống, tạp giao phối hợp tính trạng của hai giống và tạo thuận lợi cho việc chọn lọc ra các cây mang các đặc tính mong muốn của hai bố mẹ thông qua tái tổ hợp trong quá trình phân ly đời con cháu. Chương trình tạp giao của cây trồng tự thụ phấn chủ yếu gồm hai bố mẹ, nhằm mục đích loại bỏ một khiếm khuyết ra khỏi một giống được xem là thích ứng tốt và ưu việt về các mặt còn lại. Gồm có hai dạng: (1) Lai giống thích ứng với giống thích ứng cao sản (2) Lai dòng có nguồn gene thích ứng với dòng không thích ứng. Các cặp lai dạng (1) được thực hiện giữa các dòng hay giống chị em. Các giống này có cơ sở di truyền hẹp vì trong một địa bàn nhất định, khả năng cao sản chỉ tập trung vào một số ít dòng và các dòng này liên tục được dùng để tạo ra giống mới. Các cặp lai dạng (2) thường được thực hiện với các dạng trung gian có năng suất thấp hơn so với giống thích ứng cao sản nhưng lại cung cấp một tính trạng quan trọng như tính chống chịu với bệnh.

VI. Chọn giống ở cây giao phấn Các loài giao phấn (thụ phấn chéo) có độ dị hợp hay độ không đồng nhất cao về kiểu gene và mang nihều đột biến hơn so với cây tự thụ phấn. Cách sinh sản như vậy tạo cho chúng một thế cấn bằng dị hợp rất lớn trong cấu trúc của một quần thể toàn phối.. Trong thực tế, cây trồng thụ phấn chéo rất thuận tiện cho việc sử dụng các phương pháp chọn giống mới để đạt hiệu quả tối đa bằng cách kết hợp các chu kỳ tự phối và ngoại phối với nhau. Các phương pháp chọn tạo giống hiện nay đối với cây giao phấn chéo có thể chia ra hai nhóm: tạo các thể lai và cải tiến các quần thể. Hai nhóm này tuy độc lập với nhau nhưng không loại trừ nhau. Để tạo ưu thế lai cần thiết phải cố định gen qua nhiều chu kỳ tự phối. Thể đồng hợp đạt được qua quá trình tự phối ban đầu đến cuối chương trình chọn

117

tạo giống lại được chuyển lại thể dị hợp. 1. Tạo thể lai và dòng tự phối Thể lai là đời con thứ nhất (F1) của tạp giao giữa bố mẹ khác biệt về mặt di truyền. Các bố mẹ có thể là dòng thuần, dòng tự phối, giống hay quần thể. Đối với cây trồng thụ phấn chéo thì dòng tự phối được tạo ra bằng cách tự phối từng cây riêng rẽ. Nguồn cho tự phối có thể là các giống thu phấn tự do, hỗn hợp, tổng hợp, nguồn gene phức hợp hoặc bất kỳ một quần thể dị hợp nào. Vật liệu ban đầu để tạo dòng tự phối, nên có nền di truyền rộng, chứa nhiều kiểu gene khác nhau và mang nhiều đặc tính nông sinh học quý, thường là những giống tổng hợp hoặc giống nhập nội. Tuy nhiên nếu vật liệu ban đầu là những giống địa phương thì dòng thuần được tạo ra từ đó lại có tính thích nghi cao, còn nếu vật liệu ban đầu là các giống lai thì kết quả tạo giống mới sẽ nhanh hơn. Có 3 phương pháp cơ bản để tạo dòng tự phối ở ngô (bắp): - Phương pháp chuẩn: chọn các cây khỏe mạnh và điển hình cho quần thể của vật liệu ban đầu rồi cho tự phối bằng phương pháp cách ly. Các bắp tốt được lựa chọn theo kiểu bắp/hàng. Sự chọn lọc được lặp lại như vậy ở các thế hệ tiếp theo - Phương pháp hốc đơn: đây là một biến dạng của phương pháp chuẩn, hàng được thay thế bằng hốc đơn 3 cây trong mỗi chu kỳ chọn lọc. Vì thế phương pháp này có ưu điểm là cho phép đánh giá được số lượng thế hệ nhiều hơn trên cùng một đơn vị diện tích, nhưng lại hạn chế về khả năng chọn lọc trong mỗi thế hệ. - Phương pháp tạo dòng lưỡng bội đồng hợp tử bằng kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn in vitro kết hợp với phương pháp gây đa bội hóa bằng colchicine. Sau quá trình tự phối 5-6 thế hệ như vậy, các dòng thu được phải đồng đều về mọi tính trạng như độ cao cây, hình thái hạt, màu sắc Đem những cây trong cùng một dòng giao phối với nhau, nếu ở thế hệ sau không có gì sai khác với các cây giao phối ban đầu thì các dòng ấy đã thuần. Đem hai dòng tự phối lai với nhau, thu được con lai đơn giữa dòng. Hai con lai đơn giao phối với nhau cho con lai kép giữa dòng.

118

Hình 6.3 Con lai F1 của hai dòng đồng hợp tử đã được chọn lọc.

2. Cải tiến quần thể Theo Sprague, cải tiến quần thể chỉ một hệ thống bao gồm tất cả các biện pháp dùng để tạo ra một dạng cải tiến của cây trồng được nhân lên bằng phương pháp hữu tính. Cải tiến quần thể của các loài giao phấn chéo bao hàm ý nghĩa cải tiến thành tích trung bình của một quần thể gồm các kiểu gene thụ phấn ngẫu nhiên đã trải qua chọn lọc mà sản phẩm cuối cùng còn giữ được một độ dị hợp cao. Về mặt di truyền học, cải tiến quần thể hoàn toàn dựa trên chủ định tận dụng hiệu quả các gen cộng tính hay gene đa phân. Sự tích lũy liên tục hiệu quả di truyền tích cộng đưa đến việc cải tiến tuần tự tăng lên. Cải tiến quần thể có nhiều dạng. Trong mỗi dạng, thủ tục chọn lọc quyết định độ hiệu quả mà các gene cộng tính được khai thác. Liên quan với cải tiến quần thể có thể tóm tắt như sau: - Các tính trạng quan trọng khác nhau có độ phương sai rất lớn. - Quần thể nguồn mang phương sai di truyền cộng tính cao với tính trội một phần. - Các tính trạng có hệ số di truyền cao. - Giữa các tính trạng cần cải tiến không có liên kết. - Không có tổ hợp âm tính giữa các tính trạng mong muốn. Ví dụ: chọn lọc tính chín sớm đưa đến giảm năng suất. - Hiện diện độ biến thiên rất rộng của các gene điều khiển các tính trạng mong muốn mà trước kia chưa từng qua chọn lọc. các gene như thế là dự trữ lớn để tạo ra một cơ sở di truyền rộng cho quần thể khởi đầu.

VII. Chọn giống ở cây sinh sản sinh dưỡng 1. Khái niệm chung

119

Sinh sản sinh dưỡng là hình thức sinh sản mà cơ thể mới được phát triển từ những phần cơ thể ban đầu như củ, thân, mầm, lá … Đó là những bộ phận ở trên hoặc là ở dưới mặt đất (Hình 6.4). - Từ những phần thân dưới mặt đất: những cây trồng mới được nhân lên từ những phần dưới mặt đất như khoai tây, củ gừng, chuối, hành, tỏi,…

Hình 6.4 Sinh sản sinh dưỡng ở một số cấy trồng

- Bằng những chồi bất định: như ở cây tầm gửi, khoai lang và nhiều loài thân bò khác. - Bằng thân hành con như cây bạch đầu khấu, hành, tỏi,… - Sinh trưởng bằng những đoạn sinh dưỡng: những cây này thường được nhân lên bằng những đoạn thân hoặc chồi, mầm cắt ghép như khoai lang, dong riềng,…

Hình 6.5 Cơ thể mởi được hình thành từ mép lá.

Trong sinh sản sinh dưỡng, cây được nhân lên bằng phương pháp vô tính nên qua các đời trồng của hệ vô tính không xảy ra phân ly và tái tổ

120

hợp. Điều này đã dẫn đến: - Các hệ vô tính dần dần tích lũy các đột biến tự nhiên, làm độ dị hợp tăng lên - Các gene có hại cũng được tích lũy dần - Các cơ quan sinh sản thường xuyên không hoạt động nên dần dần đưa đến bất dục đực và cái. Bất dục đực thường xảy ra nhiều hơn. 1.1. Phương pháp chọn tạo Chọn tạo giống cây sinh sản sinh dưỡng thì kỹ thuật được ứng dụng cơ bản giống như các phương pháp chọn tạo giống cây hữu tính, bao gồm: nhập nội, chọn lọc và tạp giao, chỉ khác về cách xử lý quần thể lúc khảo nghiệm. Đối với cây nhân vô tính, khi một kiểu gene đã được xác định nó có thể được duy trì vĩnh viễn bằng phương pháp vô tính hay sinh dưỡng mà không mất độ toàn vẹn di truyền, đó là một lợi thế lớn. Tuy nhiên cũng kèm theo một số nhược điểm sau: - Vì các đời sinh dưỡng nối tiếp nhau không qua sàng lọc di truyền của phân bào giảm nhiễm nên các hệ sinh dưỡng có xu hướng tích lũy thành hệ thống các bệnh truyền nhiễm, nhất là các bệnh virus và mycoplasma. Chúng cũng tích lũy lại các đột biến mà đa số đều gây hại. Để tránh được vấn đề này, cần: (i) Duy trì nguồn giống ưu tú trong điều kiện sạch bệnh là cần thiết; (ii) Bản thân nguồn giống phải được thường xuyên tái tạo lại bằng cách chọn lọc cây dùng làm giống từ một quần thể nhân lên bằng phương pháp sinh dưỡng. Gần đây có thể tránh được một số khó khăn trên bằng cách duy trì các hệ vô tính dưới dạng nuôi cấy mô. - Duy trì nguồn gene cần thiết cho các chương trình chọn tạo giống gặp khó khăn và tốn kém do các nguyên nhân nói trên. - Đa số các giống biểu hiện bất dục đực, sức sống yếu, hạt lép với nhiều mức độ khác nhau. Do đó bất dục là hậu quả của việc các hệ vô tính không được phân bào sàng lọc - Một số loài và nhiều giống của đa số cây nhân vô tính không có hoa. 1.2. Kích cỡ quần thể Đa số giống cây trồng nhân vô tính ở trạng thái dị hợp nên đời "phân ly" đầu tiên là đời F1 chứ không phải F2. Do đó kích cỡ của quần thể đời F1 phải lớn hơn so với cây tự thụ phấn. Ngoài ra một tỷ lệ lớn các cây nhân sinh dưỡng là cây đa bội như mía, khoai tây, khoai lang, chuối… và đòi hỏi phải nhân một quần thể lớn hơn để thu được các kiểu gene mong

121

muốn. Nhiều giống cây nhân sinh dưỡng không ra hoa hoặc ra hoa nhưng bất dục ở mức độ cao, nên cần phải tạo nhiều thể lai hơn so với nhu cầu thông thường đối với cây nhân hữu tính. Như vậy, phương pháp và thủ tục ứng dụng để cải tiến cây nhân vô tính tương tự như đối với cây nhân hữu tính. Sự khác nhau giữa chúng ở một số chi tiết, các chi tiết này mục đích sử dụng cuối cùng, theo mức độ bội thể và tình trạng bất dục trong loài. 2. Cơ sở di truyền 2.1. Dòng vô tính Dòng vô tính là một nhóm của những cây được sản xuất ra từ một cây riêng qua sinh sản vô tính. Như vậy những giống nhân vô tính bao gồm số lượng lớn dòng vô tính. Tất cả các thành viên của dòng vô tính có cùng kiểu gene như cây bố mẹ nếu không có đột biến soma xảy ra. Sự chọn lọc ở một dòng vô tính là không cần thiết. Các đặc tính của dòng vô tính: - Tất cả các cá thể trong một dòng vô tính riêng biệt giống hệt nhau về kiểu gen, vì chúng là kết quả của quá trình sinh sản vô tính nhờ phân bào nguyên nhiễm. - Sự khác nhau của kiểu hình ở trong 1 dòng vô tính là do môi trường - Kiểu hình của một dòng vô tính là do hiệu quả của kiểu gene (G), của môi trường (E) và ảnh hưởng qua lại giữa kiểu gene và môi trường (GE) trên ý nghĩa quần thể (µ). Kiểu hình của một dòng vô tính được biểu thị bằng công thức: P = µ + G + E + GE - Một dòng vô tính có thể được duy trì không giới hạn qua sinh sản vô tính. Nhưng các dòng vô tính cũng luôn luôn thoái hóa do bị tấn công bởi virus hoặc vi khuẩn và do sự phát sinh đột biến soma. Một dòng vô tính có thể bị tiêu diệt phụ thuộc vào khả năng nhạy cảm của nó đối với vật phá hoại như các côn trùng hoặc các bệnh. Hơn nữa, sự khác nhau về gene có thể phát sinh trong một dòng vô tính làm thay đổi những đặc tính của nó. - Nhìn chung, những dòng vô tính có độ dị hợp cao và thể hiện mất sức sống khi lai gần. 2.2. Sự khác nhau về gene Sự khác nhau về gene trong một dòng vô tính có thể phát sinh do đột biến phần sinh dưỡng, sự hỗn hợp cơ học và sinh sản vô tính không thường xuyên. 2.2.1. Đột biến

122

Đột biến phần sinh dưỡng được hiểu là những đột biến chồi (bud mutation). Tần số đột biến nói chung rất thấp (10-7 – 10-5). Thường những đột biến trội sẽ được biểu hiện ở phần mô sinh dưỡng, vì các đột biến lặn chỉ được biểu hiện khi ở dạng đồng hợp tử. Một allele đột biến thành đồng hợp tử khi tất cả các allele trong một tế bào đột biến cùng đồng thời sản xuất ra cùng một allele đột biến hoặc allele đột biến đã có sẵn trong điều kiện dị hợp tử ở dòng vô tính ban đầu. Từ những đột biến chồi có thể chọn được những dòng vô tính mới. Chọn lọc chồi có tầm quan trọng trong việc cải tạo cây lâu năm như cây ăn quả. 2.2.2. Sự hỗn hợp cơ học Hỗn hợp cơ học tạo ra sự khác nhau về gene ở trong một dòng vô tính; về phương pháp, giống như trong trường hợp dòng thuần. Sinh sản vô tính cũng tạo ra sự phân ly và tái tổ hợp do sự phân tách bộ phận của cơ thể để tạo ra cá thể hoặc trao đổi chéo soma. 3. Sự thoái hóa dòng vô tính Các dòng vô tính có thể duy trì được vô thời hạn. Nhưng thực tế, các dòng vô tính có một đời sống giới hạn và dòng cũ bị mất sức sống và năng suất. Sự mất hoặc giảm sức sống và năng suất của các dòng vô tính theo thời gian được biết như là sự thoái hóa dòng vô tính (clonal degeneration). Sự thoái hóa dòng vô tính là vốn có trong dòng vô tính, nhờ sự sinh sản dinh dưỡng của chính bản thân nó. Thực tế, các kết quả nghiên cứu chi tiết đã chứng minh rằng kết quả thoái hóa dòng vô tính là do: + Sự đột biến: Đột biến là một quá trình lặp đi lặp lại, do đó nó có thể trở thành một vấn đề bao trùm một thời gian dài. Hơn nữa một đột biến xảy ra ở tần số khá cao trong một dòng vô tính và trở nên nghiêm trong trong bảo quản các dòng này. + Bệnh virus: Bệnh virus dễ truyền qua nhân giống sinh dưỡng. Theo thời gian ở các dòng vô tính, bệnh virus có thể gây ra lan truyền sự thoái hóa vô tính trầm trọng. + Bệnh vi khuẩn: Một số trường hợp, sự thoái hóa dòng vô tính là kết quả của sự lây nhiễm vi khuẩn. Bệnh kìm hãm sinh trưởng chồi gốc ở cây mía. Sinh sản sinh dưỡng bản thân nó không ảnh hưởng đến sức sống hoặc khả năng năng suất của dòng vô tính. Mặt khác, sinh sản vô tính đã giữ nguyên những tổ hợp gene đặc biệt tạo ra một dòng vô tính mới hoặc những dòng vô tính khác thỏa mãn mong muốn của nhà chọn giống.

123

VIII. Chọn giống kháng sâu bệnh 1. Chọn giống kháng sâu và côn trùng 1.1. Những thiệt hại do sâu và côn trùng gây ra Sâu và côn trùng có thể được chia làm hai loại dựa trên phương thức sử dụng thức ăn của chúng: - Côn trùng chích hút: bọ rầy, rệp, bọ xít - Côn trùng ăn các bộ phận khác nhau của thực vật: đục thân, đục rễ, cuốn lá, đục quả, ăn lá. Tất cả các loại này đều làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm. Sự mất mát về chất lượng thường xuyên hơn và ở mức độ cao hơn sự mất mát về sản lượng. Một giống nhiễm sâu thường đưa đến các hậu quả sau: - Giảm sự phát triển của cây trồng - Phá hủy lá, thân, cành, nụ hoa, hoa, chồi vô tính, quả và hạt, … - Làm gãy cây Mức độ thiệt hại trước hết phụ thuộc vào cường độ tấn công của côn trùng và mức độ nhiễm của ký chủ. Côn trùng còn có thể gây tác hại gián tiếp, rất nhiều loại côn trùng là vật truyền bệnh virus. Sự chấn thương do côn trùng gây ra tạo điều kiện cho nấm và vi khuẩn phát triển. 1.2. Cơ chế của tính kháng sâu và côn trùng Tính kháng sâu và côn trùng được chia làm 4 nhóm: Không ưa thích; Kháng sinh; Chống chịu; Cơ chế tránh. 1.2.1. Cơ chế không ưa thích Ký chủ tạo ra sự không hấp dẫn cho sâu và côn trùng, chính là sự không thích ứng cho việc tạo vùng sống và vùng đẻ trứng. Kiểu kháng này hạn chế khả năng tấn công của sâu hại hoặc sự không chấp nhận tấn công. Sự không chấp nhận xuất hiện khi côn trùng không dùng thức ăn của ký chủ hoặc ký chủ không có thức ăn phù hợp cho côn trùng. Cơ chế không ưa này có liên quan đến nhiều thuộc tính hình thái sinh lý hoặc sinh hóa của cây chủ. 1.2.2. Cơ chế kháng sinh Các chất kháng sinh có tác dụng kháng lại sự ăn cây chủ của sâu để bảo tồn sự phát triển và tái sinh của cây trồng. Trong một số trường hợp, côn trùng bị tiêu diệt khi chúng tàn phá cây trồng. Chất kháng sinh có liên quan đến: Thuộc tính hình thái; đặc tính sinh lý; đặc tính hóa sinh; có thể là tổng hợp của 3 đặc tính trên. 1.2.3. Cơ chế tránh

124

Cây trồng tránh sâu cũng như tránh bệnh, đó không phải là tính kháng thực. Tuy vậy nó có ảnh hưởng như là tính kháng thực trong việc bảo vệ cây trồng khỏi sự phá hoại của côn trùng và sâu hại. Tất cả các trường hợp tránh sâu thực chất là hiện tượng cây chủ không ở trong giai đoạn khi côn trùng đang ở đỉnh cao phát triển. Ví dụ: giống bông ngắn ngày có thể tránh được sự phá hại của sâu phá hoại vào cuối vụ trồng. Có trường hợp, sự phát triển trong điều kiện không phù hợp cho sự phát triển của sâu và côn trùng. Ví dụ: sản xuất khoai tây hạt là để tránh sự phá hại của rệp. 1.2.4. Cơ chế chống chịu Tính chống chịu sâu cũng như tính chống chịu bệnh. Giống chống chịu sâu cũng bị tấn công ở mức độ giống như giống nhiễm nhưng giống kháng vẫn cho năng suất cao hơn. Trong một số trường hợp, giống kháng phục hồi nhanh hơn sau khi bị côn trùng tàn phá. Tính kháng côn trùng thể hiện liên quan đến các thuộc tính hình thái, sinh lý hoặc hóa sinh của ký chủ. 2. Chọn tạo giống kháng bệnh 2.1. Bản chất của tính chống bệnh Tính chống bệnh của cây chủ có thể là thật khi được hình hthành lúc cây chủ và thể gây bệnh tiếp xúc nhau hay có thể do một số cơ chế được gọi chung là “tránh né”. Sự tránh né làm giảm tiếp xúc giữa cây chủ và thể gây bệnh. Sự chống chịu nấm có thể được hình thành do các yếu tố vật lý như tăng độ dày tầng cutin hoặc phân bố thêm các mô cứng. Cũng có thể là do phản ứng cực nhạy làm cho chỗ bị nhiễm bệnh chết đi và cản trở bệnh lan rộng thêm. Đôi khi tính chống chịu biểu hiện ra làm cho sinh trưởng và sinh sản của thể bệnh bị hạn chế một cách đáng kể so với giống hoàn toàn mẫn cảm. 2.2. Phát hiện và đánh giá sức đề kháng Sức đề kháng có thể được phát hiện bằng cách đánh giá cây trồng hoặc bộ phận cây trồng trên đồng ruộng trong điều kiện tự nhiên khi bệnh phát triển. Sàng lọc tính đề kháng trong điều kiện tự nhiên thường được tiến hành khi không có phương pháp gây nhiễm nhân tạo hoặc với các bệnh ít quan trọng, không cần đến phương pháp phức tạp hay tốn kém. Người ta đưa ra các phương pháp sàng lọc nhân tạo đối với các bệnh quan trọng của cây trồng chủ yếu. Một phương pháp sàng lọc tốt phải có đủ các điều kiện sau:

125

+ Có thể lặp lại được + Có thể xác định từng mức tác động khác nhau lên thể gây bệnh + Phản ánh được phản ứng của thể chủ trong điều kiện đồng ruộng + Thao tác được dễ dàng + Ứng dụng được cho các chương trình chọn tạo giống cây trồng + Có thể sàng lọc được một số lượng cây mà không tốn nhiều chỗ và thời gian. Các phương pháp sàng lọc nhân tạo bao gồm: + Tăng liều gây nhiễm của một nòi gây bệnh thích hợp lên thể chủ + gây nhiễm cho cây hay bộ phận của cây bằng phun, tiêm, ngâm hay trộn với đất + Nuôi bệnh trong điều kiện môi trường tối ưu + Cần chú ý tăng liều gây nhiễm vào lúc nuôi bệnh cho cây. Việc sàng lọc để chọn tính đề kháng cũng có thể thực hiện bằng cách xử lý cây được khảo nghiệm với độc tố nòi gây bệnh. Môi trường chọn lọc được tạo ra bằng cách hỗn hợp các hóa chất đặc biệt có thể kích thích sự sinh trưởng của các loài nấm gây bệnh thực vật thích hợp. Có thể gây dịch bệnh nhân tạo trên đồng ruộng ở mức độ thí nghiệm. Các kiểu gene mẫn cảm truyền bệnh được gieo thành hàng xen với các kiểu gene cần được khảo nghiệm. Các hàng truyền bệnh được gây nhiễm với một nòi gây bệnh thích hợp sớm hơn nhiều so với thời điểm phát bệnh tự nhiên, do đó khi mầm gây nhiễm tự nhiên xuất hiện thì trên ruộng thí nghiệm đã đầy mầm bệnh nhân tạo. Bằng cách điều chỉnh thời điểm gieo trồng có thể đảm bảo các kiểu gene khảo nghiệm sẽ ở vào thời kỳ thích hợp đúng lúc thời tiết thuận lợi cho bệnh phát triển. 2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến cách biểu hiện và mức độ đề kháng Bệnh của cây trồng là kết quả tương tác giữa chủ thể, thể gây bệnh, môi trường và khoảng thời gian mà ba yếu tố ây tương tác với nhau. + Tác động của cây chủ Kiểu gene của thể chủ, mức độ phát triển và tình trạng sinh lý của thể chủ có thể ảnh hưởng đến cách phản ứng của nó đối với một bệnh cụ thể nào đó. Phản ứng của cây trồng với bệnh có thể thay đổi theo tuổi vì các gene đề kháng có thể hoạt động trong thời kỳ này mà không hoạt động thời kỳ khác. Sức đề kháng hay mẫn cảm có thể liên quan với giai đoạn phát triển của cây. Thông thường sức đề kháng là tối đa ở giai đoạn trước khi các

126

cấu trúc sinh sản xuất hiện. + Tác động của thể gây bệnh Độ gây hại, sức tấn công và mật độ gây nhiễm của thể gây bệnh phụ thuộc vào các yếu tố có ảnh hưởng đến sức đề kháng của một thể chủ nhất định biểu hiện ra. Các nòi gây bệnh mang các gene gây hại giống nhau có thể khác nhau về sức tấn công và như thế sẽ gây ra mức độ bệnh khác nhau đối với một kiểu gene nhất định của thể chủ. Sức đề kháng có thể giảm khi mật độ gây nhiễm tăng. Thông thường sức đề kháng đa gene biểu hiện ra vào mức độ trung gian chịu ảnh hưởng nhiều hơn của mật độ gây nhiễm, sức đề kháng dọc đơn gene chịu ảnh hưởng ít hơn. Có mối tương quan giữa mật độ gây nhiễm với sức đề kháng đối với các thể gây bệnh do đất mang theo. Tác động của mật độ gây nhiễm đối với sức đề kháng phụ thuộc vào cách sinh sản của thể gây bệnh. + Tác động của môi trường Môi trường tác động khác nhau lên thể chủ và thể gây bệnh. Cả khi thể gây bệnh xâm nhiễm thể chủ trong điều kiện tối ưu và sức đề kháng của thể chủ đối với một yếu tố đặc biệt của môi trường không thay đổi, thì mức đề kháng được quan sát thấy cũng thay đổi từ mức tối đa đến mức tối thiểu tùy thuộc vào các tổ hợp đặc biệt giữa thể chủ và thể gây bệnh. Từng yếu tố riêng của môi trường cũng có thể tác động đến cách phát triển của bệnh qua sự ảnh hưởng của các yếu tố khác. Điều kiện môi trường như thành phần và độ pH của môi trường, cường đọ ánh sáng và nhiệt độ cũng có thể tác động đến sức gây bệnh của thể bệnh. + Nguồn kháng bệnh Sức đề kháng có thể gặp ở các giống địa phương đã thích ứng hay ở giống ngoại lai hoặc ở các loài thân thuộc. Các giống địa phương đã thích ứng là nguồn đề kháng tốt chống các bệnh đã trở nên trầm trọng bất ngờ được nhập vào khi cải lương một tính trạng có giá trị kinh tế nào đó. Các giống địa phương đã thích ứng cũng là nguồn đề kháng có giá trị để chống lại các bệnh ít quan trọng hay chỉ có giá trị địa phương. Sức đề kháng của các giống địa phương được chú ý vì: `+ Sức đề kháng có thể chỉ mang theo một lượng ít các liên kết không mong muốn so với sức đề kháng ngoại lai + Sức đề kháng của giống ngoại lai có thể liên kết với tính mẫn cảm đối với một số loại sâu bệnh mà các giống địa phương đã thích ứng thường không mắc phải. 2.4. Thủ tục chọn tạo giống

127

Thủ tục thường được dùng khi chọn tạo giống kháng bệnh: chọn tạo qua lai trở lại, chọn lọc truy hồi, tạp giao trong loài. 3. Bản chất di truyền Bản chất di truyền của tính kháng sâu cũng tương tự như tính kháng bệnh. Tính kháng sâu có thể do đơn gene điều khiển với một số lượng lớn các cá thể có hiệu lực, có thể do nhiều gene điều khiển có tác dụng cộng tính hoặc do gene tế bào chất. 3.1. Các nguồn gene kháng sâu và côn trùng Nguồn gene kháng sâu và côn trùng có thể tìm thấy ở: + Các giống cây trồng + Nguồn tài nguyên di truyền của các loài + các loài hoang dại có quan hệ huyết thống với cây trồng 3.2. Các phương pháp tạo giống kháng sâu Các phương pháp thường được sử dụng để tạo giống kháng sâu: 3.2.1. Nhập nội: Giống nhập nội kháng với một loại sâu nào đó có thể sử dụng để gieo trồng trong điều kiện môi trường mới nhưng nó vẫn thể hiện các đặc tính nông học quý. Nhưng thường giống nhập nội lại không phát triển tốt trong điều kiện mới, nó có thể nhiễm biotype của một loài sâu hại nào đó hoặc nhiễm một loại sâu mới có mặt trong điều kiện nhập nội. 2.2.2. Chọn lọc: Các kiểu gene kháng sâu có thể cơ mặt trên một giống nhất định của một loại cây trồng nào đó. Trong trường hợp này, việc chọn lọc là để phân lập được các kiểu gene kháng. Đối với cây tự thụ phấn, sử dụng phương pháp chọn hỗn hợp hoặc chọn dòng thuần để chọn giống kháng. Đối với cây giao phấn, thường dùng phương pháp chọn lọc hỗn hợp và chọn lọc hồi quy. Cây giao phấn có hiệu quả chọn lọc cao hơn cây tự thụ phấn vì nó có hệ số biến dị cao hơn. 3.2.3. Lai hữu tính Thường cho lai giữa một giống có các đặc tính nông học tốt nhưng mẫn cảm với sâu với một giống hoang dại nhưng kháng sâu 3.2.4. Biến nạp gene Sử dụng kỹ thuật tách DNA của nguồn bệnh, tách các gene kháng quý hiếm và thực hiện biến nạp các gene này vào các giống cây trồng bằng phương pháp lai tế bào trần, phương pháp xung điện hoặc súng bắn gene. 4. Kỹ thuật sàng lọc 4.1. Sàng lọc trên đồng ruộng

128

Việc sàng lọc tính kháng sâu trong chương trình chọn tạo giống thường được tiến hành trên đồng ruộng vì số lượng cá thể chọn lọc lớn hơn trong điều kiện nhà kính.Hơn nữa, trên đồng ruộng, cây trồng được đặt trong điều kiện các sâu và côn trùng thường xuất hiện trong khu vực. Tuy nhiên thử nghiệm đồng ruộng lại tiến hành trong điều kiện hầu như không có sự điều tiết cuả con người; trong nhiều trường hợp không có khả năng đảm bảo sự lây nhiễm đồng đều cho các cá thể trong quần thể. Do đó sai số thí nghiệm đồng ruộng là lớn hơn nhiều so với thí nghiệm trong phòng. Các kỹ thuật tăng mức độ đồng đều cho lây nhiễm trên đồng ruộng: + Kỹ thuật đơn giản nhất là trồng xen kẽ một hàng giống nhiễm với hai hàng giống định đánh giá. Kỹ thuật này chỉ phù hợp với việc đánh giá các loại sâu và côn trùng phân tán trong vùng. + Mỗi loại côn trùng hoặc sâu thường xuyên được phát hiện ở một vài vùng. việc chọn lọc khả năng kháng với một loại sâu nào đó trên những vùng sẽ đảm bảo sự lây nhiễm tự nhiên mạnh mẽ đối với cây trồng định đánh giá. + Nếu là sâu trong đất, giống cây trồng cần đnh giá sẽ được trồng trong điều kiện đất có số lượng lớn sâu. + Cây nhiễm tự nhiên một số côn trùng có thể xảy ra trong những vụ nhất định. Ví dụ lây nhiễm sâu đục thân lúa trong vụ muộn sẽ nặng hơn trong chính vụ vì thời vụ muộn đôi khi là ký chủ trung gian cho bướm cái đẻ trứng. Do đó việc sàng lọc sẽ thuận lợi hơn rất nhiều trong thời vụ muộn. + Một số lượng đồng đều trứng hoặc sâu non có thể chuyển bằng tay đến từng cây được đánh giá, bảo đảm cho sự lây nhiễm đồng đều. ví dụ nhiễm sâu đục thân lúa bằng cách chuyển đến mỗi cá thể một ổ trứng gồm 60 trứng. Số lượng sâu non nở ra sẽ được đếm và như vậy sẽ xác định được số cá thể kháng sâu. 4.2. Sàng lọc trong nhà kính Trong nhà kính, số lượng cá thể được đánh giá nhỏ hơn trên đồng ruộng nhưng kết quả lại chính xác hơn vì sự lây nhiễm ban đầu đồng đều và chính xác hơn. Sàng lọc trên đồng ruộng và trong nhà kính là hai phương pháp bổ trợ cho nhau. Những cây kháng được chọn trong nhà kính sẽ được trồng để đánh giá trên đồng ruộng và ngược lại. Những khó khăn của việc chọn giống kháng sâu: + Trong một số trường hợp chọn được giống kháng sâu này lại bị các

129

sâu khác gây hại. Điều này có thể do thuộc tính của cây chủ, gene kháng trội một loại sâu này có thể liên kết với gene không kháng loại sâu khác. + Trong một số trường hợp chọn tạo giống kháng sâu làm giảm chất lượng sản phẩm, thậm chí không thể sử dụng được + Trong trường hợp gene kháng sâu chỉ có ở các loài hoang dại. Việc chuyển gene bằng phương pháp lai giữa các loài là rất khó khăn và thường có sự liên kết giữa gene kháng với các gene bất lợi khác. Thường giống hoang dại mang gene kháng lại cho năng suất thấp và chất lượng kém. + Sàng lọc tính kháng sâu là một khâu vô cùng khó khăn trong công tác tạo giống. Đòi hỏi phải có sự phối hợp chặt chẽ giữa các nhà tạo giống với các nhà côn trùng học, các nhà bệnh học, hóa sinh, sinh lý. + Chọn tạo giống kháng sâu là một chương trình dài hạn cần phải được đầu tư thích đáng về tài chính và các mặt khác.

Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Nguyễn Văn Hiển (chủ biên, 2000): Chọn giống cây trồng. NXB Giáo Dục, Hà Nội. Phạm Thành Hổ (2000): Di truyền học (tái bản lần thứ 2). NXB Giáo Dục. Trần Đình Long (chủ biên, 1997): Chọn giống cây trồng (Giáo trình cao học nông nghiệp). NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Nguyễn Hoàng Lộc. 1998. Bài giảng nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Đại học Khoa học Huế. Lê Duy Thành. 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB Khoa học và Kỹ thuật. Tiếng Anh Allard RW. 1976. Principles of plant breeding. John Wiley & Son, Inc., New York. Walsh B. 2006. Basic population and Quantitative genetics (Lecture 3), pp.1-8, June 2006. University of Aarhus. Chopra, V.L. (Ed., 1989): Plant Breeding: Theory and Practice. Oxford & IBH Publishing Co. PVT, Ltd. Falconer D.S. and Mackay T.F.C. (1996): Introduction to Quantitative Genetics. 4th edn. Longman Group, Harlow.

130

Hartl D.L., Freifelder D. and Snyder L.A. (1988): Basic Genetics. Jones and Bartlett Publishers, Inc., Boston - Portola Valley. Hayward, M.D., N.O. Bosemark and I. Ramagosa, Coordinating ed. M.C. Cerezo (1994): Plant Breeding: Principles and Prospects. 2nd ed. Chapman & Hall, London-Glasgow-Weinheim-New York-Tokyo-MelbourneMadras. Murray, D.R. (1991): Advanced Methods in Plant Breeding and Biotechnology. C-A-B International Publisher, London. Weaver R.F. and Hedrick P.W. (1997): Genetics. 3rd edn. Wm.C.Browm Publishers, Dubuque, Iowa.

131

Chương 7

Đa bội thể và Phát sinh Đột biến trong Chọn giống Thực vật I. Mở đầu Như chúng ta đều biết, bên cạnh tính ổn định của những cá thể mang bộ nhiễm sắc thể bình thường, các nhiễm sắc thể có thể bị biến đổi (đột biến) theo hai cách căn bản, đó là các biến đổi về cấu trúc và về số lượng (bảng 7.1). Các biến đổi này có thể gây những hậu quả khác nhau tùy loại, nhưng thường là nghiêm trọng. Chúng có thể gây hiệu quả tức thời lên các nhiễm sắc thể, gây rối loạn trong hoạt động của bộ gene và giảm phân; và từ đó ảnh hưởng tới sức sống, độ hữu thụ...của các cá thể mang chúng. Có bốn kiểu biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể, đó là: lặp đoạn (hay nhân đoạn), mất đọan (hay khuyết đọan), đảo đoạn và chuyển đoạn như ở Hình 7.1. Các kiểu đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể xảy ra là do sự đứt gãy và nối lại bất thường của các đoạn trên cùng một cặp tương đồng hoặc thậm chí giữa các cặp khác nhau như trong trường hợp chuyển đoạn. Nói chung, các đột biến này thường ít gặp, trung bình cứ 1.000 giao tử mới hình thành có một vài đột biến liên quan đến kiểu nào đó. Các hậu quả về sau đều là kết quả của sự tiếp hợp gene-đối-gene giữa các nhiễm sắc thể bình thường và bất thường (kiểu kết cặp không hoàn toàn tương xứng này được gọi là kiểu dị nhân, heterokaryotypic) cũng như các vấn đề sau này xảy ra ở các kỳ sau I và II trong giảm phân. Bảng 7.1 Các kiểu biến đổi (đột biến) nhiễm sắc thể Các kiểu biến đổi về cấu trúc Lặp đoạn (duplication) Mất đoạn (deletion) Đảo đọan (inversion) Chuyển đoạn (translocation)

Các kiểu biến đổi về số lượng Mức nguyên bội (Euploidy) Các thể tự đa bội (autopolyploids) Các thể dị đa bội (allopolyloids) Lệch bội (Aneuploidy) Các thể một (monosomies; 2n − 1) Các thể ba (trisomies; 2n + 1)

Dưới đây chúng ta tập trung xét các biến đổi về số lượng nhiễm sắc thể mà chủ yếu là các dạng đa bội.

132

Mât đoạn

Xen đoạn

Lặp đoạn

Đảo đoạn

Chuyển đoạn

Hình 7.1 Sơ đồ tổng quát các kiểu biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể. Kiểu xen đoạn ở đây là sự chuyển đọan giữa (interstitial translocation).

II. Đa bội thể và ứng dụng của nó trong chọn giống thực vật 1. Khái niệm và phân loại đa bội thể Từ bảng 7.1 cho thấy sự biến đổi số lượng nhiễm sắc thể sai khác nhau ở hai cách cơ bản: (1) Các thể biến dị nguyên bội hay thể đa bội (euploid variants) có số lượng các bộ nhiễm sắc thể khác nhau; và (2) các thể biến dị lệch bội hay thể dị bội (aneuploid variants) có số lượng nhiễm sắc thể cụ thể không phải là lưỡng bội. Nói chung, các kiểu biến đổi số lượng nhiễm sắc thể ảnh hưởng lên sự sống sót lớn hơn các kiểu biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể. • Hiện tượng đa bội (polyploidy) Các thể đa bội (polyploids) là trường hợp trong đó các sinh vật có ba, bốn bộ nhiễm sắc thể trở lên (hình 7.1). Nếu ta gọi x là số nhiễm sắc thể đơn bội cơ bản, khi đó các sinh vật có ba, bốn bộ nhiễm sắc thể... sẽ có số nhiễm sắc thể và tên gọi tương ứng là 3x (thể tam bội: triploid), 4x (thể tứ bội: tetraploid)... Lưu ý: thay vì dùng ký hiệu n để chỉ số nhiễm sắc thể đơn bội như trước đây, ở đây x chỉ số nhiễm sắc thể trong một bộ và n

133

biểu thị cho số nhiễm sắc thể trong một giao tử. Ví dụ: một sinh vật lục bội với 60 nhiễm sắc thể (6x = 2n = 60), thì x = 10 và n = 30.

Quả bình thường

Quả của thể đa bội

Hình 7.2 Đa bội hóa điển hình ở chi

Hình 7.3 Sự hình thành thể đa bội với

Chrysanthemum, với rất nhiều loài đa bội thể khác nhau sinh ra từ loài lưỡng bội (2n = 18).

hoa trái lớn hơn thể 2n bình thường.

Nói chung, hiện tượng đa bội thể tương đối phổ biến ở các thực vật nhưng hiếm gặp ở hấu hết các động vật. Gần như một nửa số thực vật có hoa là các thể đa bội, kể cả các loài cây trồng quan trọng. Chẳng hạn, khoai tây tứ bội (4x = 48), lúa mỳ mềm lục bội (6x = 42), và cây dâu tây bát bội (8x = 56). Ở thực vật bậc cao, Chrysanthemum là một chi điển hình về hiện tượng đa bội hóa (hình 7.2). Trong quá trình giảm phân ở các loài thuộc chi này, các nhiễm sắc thể kết đôi tạo thành các thể lưỡng trị, loài 118 nhiễm sắc thể tạo thành 59 thể lưỡng trị, loài 36 nhiễm sắc thể tạo thành 18 thể lưỡng trị v.v... Mỗi giao tử nhận một nhiễm sắc thể từ mỗi thể lưỡng trị, vì vậy số lượng nhiễm sắc thể trong mỗi giao tử của bất kỳ loài nào cũng chính bằng một nửa số lượng nhiễm sắc thể được tìm thấy trong mỗi tế bào soma của nó. Ví dụ, loài thập bội có 90 nhiễm sắc thể thì tạo thành 45 thể lưỡng trị, do đó mỗi giao tử sẽ mang 45 nhiễm sắc thể. Nhờ vậy qua thụ tinh, bộ đầy đủ 90 nhiễm sắc thể của loài này được phục hồi. Như vậy, các giao tử của cơ thể đa bội rõ ràng là không phải đơn bội như ở cơ thể lưỡng bội. Thông thường, người ta phân biệt hai kiểu thể đa bội: (1) các thể đa

134

bội cùng nguồn hay thể tự đa bội (autopolyploids) là các thể đa bội nhận được tất cả các bộ nhiễm sắc thể của chúng từ cùng một loài; và (2) các thể đa bội khác nguồn hay thể dị đa bội (allopolyploids) là các thể đa bội nhận được các bộ nhiễm sắc thể từ các loài khác nhau. Chẳng hạn, nếu như một hạt phấn lưỡng bội (không qua giảm nhiễm) từ một loài lưỡng bội thụ tinh cho một trứng lưỡng bội cũng của loài đó, đời con sinh ra là các thể tự tứ bội (autotetraploids), hay AAAA, trong đó A biểu thị một bộ nhiễm sắc thể hoàn chỉnh hay bộ gene (genome) của kiểu A. Mặt khác, nếu như hạt phấn lưỡng bội của một loài thụ tinh cho một trứng lưỡng bội của một loài khác có quan hệ họ hàng với loài này, đời con sinh ra sẽ là các thể dị tứ bội (allotetraploids), hay AABB, trong đó B chỉ bộ gene của loài thứ hai. Tất cả các bộ nhiễm sắc thể trong một thể tự đa bội đều là tương đồng, giống như khi chúng ở trong một thể lưỡng bội. Nhưng trong các thể dị đa bội, các bộ nhiễm sắc thể khác nhau nói chung sai khác nhau ở một mức độ nào đó, và được gọi là tương đồng một phần (homeologous), hay tương đồng từng phần (partially homologous). Trong tự nhiên, các thể đa bội xảy ra với tần số rất thấp, khi một tế bào trải qua sự nguyên phân hoặc giảm phân bất thường. Chẳng hạn, nếu trong nguyên phân tất cả các nhiễm sắc thể đi về một cực, thì tế bào đó sẽ có số nhiễm sắc thể là tự tứ bội. Nếu như xảy ra giảm phân bất thường, có thể tạo ra một giao tử không giảm nhiễm có 2n nhiễm sắc thể. Tuy nhiên, trong hầu hết các tình huống, giao tử lưỡng bội này sẽ kết hợp với một giao tử đơn bội bình thường và sinh ra một thể tam bội. Người ta cũng có thể tạo ra các thể đa bội bằng cách xử lý colchicine, một loại hóa chất gây rối loạn sự hình thành thoi vô sắc. Kết quả là, các nhiễm sắc thể không phân ly về các cực được, và thường thì xuất hiện các thể tự tứ bội. • Các thể tự đa bội (autopolyploids) Các cơ thể tam bội (AAA) thường là các thể tự đa bội sinh ra do thụ tinh giữa các giao tử đơn bội và lưỡng bội. Chúng thường bất dục bởi vì xác suất sinh ra các giao tử có được cân bằng là rất thấp. Trong giảm phân, ba cái tương đồng có thể kết cặp và hình thành một thể lưỡng trị, hoặc hai cái tương đồng kết cặp như là một thể lưỡng trị, để lại nhiễm sắc thể thứ ba không kết cặp. Tuy nhiên, do tập tính của các nhiễm sắc thể không tương đồng là độc lập, nên xác suất để một giao tử có chính xác n nhiễm sắc thể là (½)n (sử dụng quy tắc nhân), và xác suất để một giao tử có được chính xác 2n nhiễm sắc thể cũng là (½)n. Tất cả các giao tử khác còn lại sẽ là không có sự cân bằng và nói chung là không hoạt động chức năng trong các hợp tử có chứa chúng. Chẳng hạn, hầu hết các cây chuối là các thể tam bội; chúng sinh ra các giao tử không cân bằng, và kết quả là không có hạt.

135

Các thể đa bội thường lớn hơn các thể lưỡng bội họ hàng (ví dụ, cho hoa trái lớn hơn; Hình 7.3). Các thể tự đa bội có thể giảm phân bình thường nếu như chúng chỉ tạo thành các thể lưỡng trị hoặc các thể tứ trị. Còn nếu như bốn nhiễm sắc thể tương đồng tạo thành một thể tam trị và một thể đơn trị, thì các giao tử nói chung sẽ có quá nhiều hoặc quá ít các nhiễm sắc thể.

Triticum kiểu dại (2n = 14)

Triticum monococcum (2n = 14)

Con lai bất dục Sai sót do giảm phân

T. turgidum (2n = 28)

T. fauschii (kiểu dại) (2n = 14) Con lai bất dục

Sai sót do giảm phân

T. aestivum (2n = 42)

Hình 7.4 Sự hình thành lúa mỳ Triticum aestivum dị lục bội (2n = 42) bằng con đường dị đa bội.

• Các thể dị đa bội (allopolyploids) Hầu hết các thể đa bội trong tự nhiên là các thể dị đa bội, và chúng có thể cho ra một loài mới. Chẳng hạn, lúa mỳ Triticum aestivum là một dạng dị lục bội với 42 nhiễm sắc thể. Qua kiểm tra các loài hoang dại họ hàng

136

cho thấy lúa mỳ này bắt nguồn từ ba dạng tổ tiên lưỡng bội khác nhau, mỗi dạng đóng góp hai bộ nhiễm sắc thể (ký hiệu AABBDD). Sự kết cặp chỉ xảy ra giữa các bộ nhiễm sắc thể tương đồng, vì vậy giảm phân là bình thường và cho ra các giao tử cân bằng có n = 21. Rõ ràng, hiện tượng dị đa bội đóng vai trò quan trọng trong sự tiến hoá của lúa mỳ (xem Hình 7.4). Năm 1928, nhà khoa học người Nga, G. Karpechenko đã tạo ra một thể dị tứ bội đặc biệt; khi ông lai giữa cải bắp Brassica và cải củ Raphanus sativus, cả hai đều có số nhiễm sắc thể lưỡng bội là 18. Ông muốn tạo ra con lai có lá của cây cải bắp và củ của cây cải củ. Sau khi thu được các hạt lai từ một cây lai nhân tạo, đem gieo trồng và phát hiện rằng chúng có 36 nhiễm sắc thể. Tuy nhiên, thay vì thu được các tính trạng như mong đợi, cây lai này có lá của cây cải củ và củ của cây cải bắp! Hình 7.5 cho thấy sự hình thành con lai giữa hai loài cải củ và cải bắp nói trên, được gọi là Raphanobrassica. Trong trường hợp nếu một hạt phấn đơn bội có bộ gene A thụ phấn cho hoa của loài có bộ gene B, sẽ cho ra một con lai bất thụ có thành phần bộ gene AB. Nếu như sau đó xảy ra hiện tượng nội nguyên phân trên một nhánh, có thể sinh ra các tế bào AABB. Nếu các tế bào này tham gia quá trình phát sinh giao tử, qua tự thụ phấn sẽ tạo ra một thể dị đa bội. Lợi dụng đặc điểm này, các nhà chọn giống sử dụng colchicine tác động lên con lai bất thụ để tạo ra các thể dị đa bội. Giao tử

Bố mẹ Con lai F1 bất thụ Thể song nhị bội hữu thụ

Hình 7.5 Sự tạo thành thể song nhị bội hữu thụ Raphanobrassica từ hai loài cải bắp Brassica và cải củ Raphanus đều có 2n = 18.

• Hiện tượng lệch bội (aneuploidy) Trong tự nhiên, thỉnh thoảng ta bắt gặp các cá thể có số lượng nhiễm sắc thể không phải là bội số của số nhiễm sắc thể đơn bội, do chúng bị

137

thừa hoặc thiếu một hoặc vài nhiễm sắc thể cụ thể nào đó. Đó là các thể lệch bội hay thể dị bội (aneuploids).

Giảm phân I ←

Giảm phân II →

Hình 7.6 Sự không phân tách xảy ra trong giảm phân I (bên trái) và giảm phân II (bên phải) với các giao tử được tạo ra.

Nguyên nhân của hiện tượng lệch bội là sự không phân tách (nondisjunction) của hai nhiễm sắc thể tương đồng trong quá trình giảm phân. Sự không phân tách trong giảm phân tự nó được coi là kết quả của sự kết cặp không đúng cách của các nhiễm sắc thể tương đồng trong giảm phân sớm đến nỗi các tâm động không đối diện nhau trên mặt phẳng kỳ giữa, hoặc là không hình thành được hình chéo. Kết quả là cả hai nhiễm sắc thể cùng đi về một cực, làm cho một tế bào con thừa một nhiễm sắc thể và tế bào con kia không có nhiễm sắc thể đó. Khi các giao tử bất thường (n + 1) và (n − 1) này thụ tinh với các giao tử bình thường (n) sẽ sinh ra các hợp tử có bộ nhiễm sắc thể bất thường tương ứng: thừa một chiếc (2n + 1), gọi là thể ba (trisomy) và thiếu một chiếc (2n − 1), gọi là thể một (monosomy). Sự không phân tách phổ biến nhất là trong giảm phân I, nhưng cũng có thể xảy ra cả trong giảm phân II (hình 7.6). Các kiểu tổ hợp nhiễm sắc thể khác như 2n + 2 (thể bốn: tetrasomy) hoặc 2n − 2 (thể không: nullisomy) cũng có thể xảy ra, nhưng ở đây ta không quan tâm. Sự không phân tách cũng có thể xảy ra trong nguyên phân gây ra các thể khảm về các tế bào bình thường và lệch bội. Các thể ba được biết đến ở nhiều loài. Ở thực vật, ví dụ điển hình đó là một loạt các thể ba với những đặc điểm kỳ lạ ở loài cà độc dược Datura stramonium được Alfred Blakeslee nghiên cứu vào khoảng năm 1920. Thực ra, người ta đã phát hiện được tất cả các thể ba về từng nhiễm sắc thể trong số 12 nhiễm sắc thể khác nhau ở loài này; và mỗi thể ba có một kiểu hình đặc trưng, thể hiện rõ nhất là ở vỏ quả. Điều đó chứng tỏ các nhiễm

138

sắc thể khác nhau có các hiệu quả di truyền khác nhau lên tính trạng này (hình 7.7).

Hình 7.7 Quả bình thường của cà độc dược Datura (trên cùng) và 12 kiểu thể ba khác nhau, mỗi kiểu có một vẻ ngoài và tên gọi khác nhau.

Các thể ba cũng được nghiên cứu ở nhiều loài cây trồng như ngô, lúa gạo và lúa mỳ nhằm xác định các nhiễm sắc thể mang các gene khác nhau. Ở hình 7.8 còn cho thấy hiệu quả di truyền của các thể khuyết nhiễm liên quan 7 nhiễm sắc thể khác nhau đối với kiểu bông ở ba giống lúa mỳ khác nhau (A, B và D).

Hình 7.8 Các thể vô nhiễm liên quan 7 nhiễm sắc thể khác nhau ở ba bộ gene lúa mỳ (A, B và D) cho các hiệu quả di truyền khác nhau về kiểu hình bông so với dạng bình thường (hình cuối).

139

2. Sự phân bố và các con đường hình thành thể đa bội trong tự nhiên 2.1. Sự phân bố các thể đa bội trong tự nhiên Hiện tượng đa bội hoá rất phổ biến trong giới thực vật từ hạ đẳng đến thượng đẳng, đặc biệt ở thực vật có hoa. Hơn một nữa một số loài thực vật có hoa là dạng đa bội. Tỉ lệ các dạng đa bội cao nhất là ở cây thảo, nhất là cây thảo nhiều năm và rất ít ở cây gỗ. Các họ sau có hiện tượng đa bội rất phổ biến: Polygonnaceae, Rosaceae, Malvaceae, Gramineae, Cyperaceae, Juncaceae... còn ở các họ Fagaceae, Moraceae, Curcurbitaceae thì hiện tượng đa bội rất ít gặp. Hiện tượng đa bội hoá được hình thành trong các nhóm cây rất không có qui luật và không có quan hệ rõ ràng đến sự phát sinh hệ thống. Song, nó lại tuân theo qui luật về phân bố địa lý. Nói chung, số lượng loài đa bội ở phía bắc lớn hơn ở phía nam rất nhiều. Ví dụ: ở phía bắc Sahara số lượng các loài đa bội chiếm 37,8% tổng số loài, ở trung âu là 50% và ở bắc âu là hơn 70%. Ở các vùng khí hậu khắc nghiệt như bắc cực, hơn 90% số loài là đa bội, nhiều cây trồng có giá trị cao như lúa mì, khoai tây, bông, thuốc lá,nho, chuối .v.v... là những dạng đa bội. Hiện tượng đa bội giữ một vai trò quan trọng trong quá trình tiến hoá của giới thực vật. Trong sự sinh sản hữu tính, việc hình thành hợp tử có thể coi là giai đoạn đầu tiên trong quá trình phát triển của hiện tượng đa bội, Sự hình thành nội nhũ tam bội do kết quả thụ tinh kép ở thực vật hạt kín là bước tiến quan trọng tiếp theo và có ý nghĩa rất lớn trong quá trình tiến hoá. Hiện tượng đa bội giữ một vai trò rất lớn trong sự hình thành các giống cây trồng. Việc chọn lọc ban đầu xảy ra là vô ý thức, song đã giữ lại nhiều dạng đa bội vì chúng có nhiều đặc tính tốt, đáp ứng được nhiều yêu cầu của con người. Ví dụ, theo Mol (1922), cây hoa thuỷ tiên trước đây ở Hà lan là dạng lưỡng bội (2x = 24), sau đó nó bị thay thế bằng dạng tam bội (3x = 36); đến năm1989, dạng tứ bội (4x = 48) được trồng phổ biến ở nhiều nơi. 2.2. Các con đường hình thành đa bội thể Do sự rối loạn trong quá trình phân bào Ta biết rằng, trong tự nhiên tồn tại những cơ chế đảm bảo cho sự ổn định về số lượng nhiễm sắc thể của loài, đó là do các quá trình nguyên phân, giảm phân và thụ tinh. Tuy nhiên, các cơ chế ấy có thể bị rối loạn do những nguyên nhân sau đây: 1. Chỉ có nhân phân chia mà tế bào không phân chia hoặc nhân sau lúc phân chia không phân ly. 2. Các nhiễm sắc thể sau lúc phân chia không phân ly về các cực hay phân ly không đều. 3. Có sự gấp bội nhiễm sắc thể mà không có sự phân ly của chúng về hai cực.

140

Một trong những nguyên nhân trên khi xảy ra đều dẫn đến sự thay đổi số lượng nhiễm sắc thể trong nhân tế bào và tạo thành những tế bào đa bội. Tuy con đường phát sinh mà người ta chia ra hai loại đa bội thể: đa bội thể do quá trình nguyên phân gây ra và đa bội thể do quá trình giảm phân gây ra. Sự rối loạn của quá trình nguyên phân có thể xảy ra ở các tế bào soma hoặc vào thời kỳ phân chia thứ nhất của hợp tử. Các mô hoặc cơ thể đa bội được hình thành từ những tế bào đa bội thường thể hiện không hoàn toàn. Ở chúng thường xen lẫn các tế bào, các mô có những mức bội thể khác nhau. Những cơ thể như vậy gọi là thể khảm. Nếu sự tăng bội bộ nhiễm sắc thể xảy ra vào thời kỳ phân chia thứ nhất của hợp tử thì tất cả các tế bào phôi sẽ là đa bội và ta có một cơ thể đa bội hoàn toàn. Hình 7.6 nêu lên sự đa bội hoá về mặt nguyên tắc, xảy ra trong quá trình giảm phân. Sự rối loạn trong quá trình phân ly nhiễm sắc thể có thể xảy ra trong lúc hình thành tế bào sinh dục. Sự không phân ly của các nhiễm sắc thể về hai cực trong giảm phân dẫn đến sự hình thành những giao tử lưỡng bội. Sự thụ tinh xảy ra giữa những giao tử này sẽ tạo thành những thể tứ bội. Nguyên nhân rối loạn của quá trình nguyên phân dẫn đến sự không phân ly của các nhiễm sắc thể và kìm hãm sự phân chia nhân thường là do sự bất bình thường của sự co ngắn của nhiễm sắc thể, sự mất tính chất phân cực của tế bào đang phân chia hoặc sự tăng về độ nhớt của tế bào chất đưa đến sự thay đổi diện tích của các phần tử keo. Do quá trình lai tạp Ngoài nguyên nhân do sự rối loạn của quá trình nguyên phân và giảm phân, con đường thứ hai để hình thành các dạng đa bội là sự giao phối giữa các cây thuộc những đơn vị phân loại khác nhau, thường xảy ra giữa các loài. 3. Đặc điểm di truyền của thể đa bội 3.1. Đặc điểm di truyền của các thể tự đa bội Thể tự đa bội là những dạng đa bội xuất hiện trên cơ sở gấp bội bộ nhiễm sắc thể của chính loài đó. Các thể tự đa bội được áp dụng rất rộng rãi trong chọn giống thực vật để tạo ra những dạng cây có kiểu gene ổn định. Bằng phương pháp sinh sản sinh dưỡng và tự thụ phấn, các dạng tự đa bội được duy trì rất lâu. Trong sinh sản hữu tính, thể tự đa bội cho ra những dạng đồng nhất về số lượng nhiễm sắc thể và bộ gene nếu như dạng ban đầu là đồng hợp tử. Tuy nhiên, có một vấn đề rất lớn và đặc trưng cho các thể tự đa bội là khả năng sinh sản và kết hạt của nó rất kém. Đặc tính này có liên quan chặt chẽ đến

141

qúa trình giảm phân và một số đặc điểm di truyền khác. Do thể tự tứ bội có sự gấp đôi về số lượng nhiễm sắc thể nên sự tiếp hợp của các nhiễm sắc thể trong giảm phân của nó khác so với dạng lưỡng bội. Sự rối loạn của quá trình phát sinh giao tử chính là nguyên nhân cơ bản làm giảm tính hữu thụ của chúng. Kiểu gene AAaa sẽ cho ra 3 kiểu giao tử với tỉ lệ 1AA :4A a:1aa. Ở F2 sự phân ly theo kiểu hình là 35:1. Tỉ lệ này đã được thực nghiệm chứng minh nhiều lần, mà lần đầu tiên là thu được trong thí nghiệm về màu sắc tím và trắng của hoa cây Dautura stramonium. Khi có sự dị hợp tử về nhiều gene thì khả năng xuất hịên của những dạng đồng hợp tử lặn ở thể tứ bội thuần còn ít hơn nữa so với dạng lưỡng bội. Qua đây ta thấy rõ là, đa bội thể đã ngăn cản việc chuyển trạng thái dị hợp sang đồng hợp tử. Bởi vậy, thể đa bội duy trì tính dị hợp tử tốt hơn dạng lưỡng bội. Đây là một nguyên tắc rất quan trọng ứng dụng vào việc duy trì hiện tượng ưu thế lai. Khả năng sinh sản hữu tính của thể tự tứ bội Các thể tự đa bội có một nét đặc trưng là khả năng sinh sản hữu tính kém và đặc tính này rất ổn định. So với dạng lưỡng bội ban đầu, thường các cây tự tứ bội có khả năng kết hạt kém, hạt phấn ít; bởi vậy sự tăng lên về trọng lượng hạt không bù đắp lại được sự tổn thất do số lượng hạt bị giảm sút gây nên. Tuy nhiên, bằng những phương pháp chọn lọc có hệ thống, có thể nâng cao khả năng sinh sản của nó đến mức gần bình thường so với dạng lưỡng bội. Đồng thời, cần thấy rằng, khả năng kết hạt kém ở cây tự đa bội là một đặc điểm rất có giá trị trong việc chọn giống những cây mà mục đích không phải lấy hạt, như nho, dưa hấu, cam quít, chuối ...cây sinh sản sinh dưỡng và cây cảnh.

Hình 7.9 Clarika delicata (B) là một con lai tứ bội (4n) hữu thụ giữa C. epilobioides (A) và C. ungui (C).

142

Theo Darlington, Kostoff, Mather...thì những nguyên nhân gây ra tính sinh sản kém ở cây tự đa bội chủ yếu là về mặt tế bào học. đó là do sự rối loạn của quá trình giảm phân. Ví dụ, ở luá mạch tứ bội, đáng lẽ hình thành những tế bào sinh dục có 14 nhiễm sắc thể thì con số ấy thường lại là 13 hay 15. Những giao tử này hoặc bị chết sớm hoặc kém sức sống thường là những giao tử đực. Theo quan sát của Fischer, ở ngô tứ bội có khoảng 85% tế bào có từ 8 - 10 bộ 4 nhiễm sắc thể, những cây này có tỉ lệ kết hạt cao. Còn ở những cây có tỉ lệ kết hạt kém thì số lượng bộ bốn này ít đi. Tuy nhiên, cũng có những nghiên cứu cho thấy tính hữu thụ kém của thể tự đa bội, ít hoặc không có liên quan rõ rệt đến sự rối loạn của quá trình giảm phân. Xét theo nguyên nhân tế bào học, về mặt nguyên tắc có thể khắc phục hiện tượng bất thụ bằng cách khống chế sự đa tiếp hợp giữa các nhiễm sắc thể tương đồng tạo điều kiện cho sự tiếp hợp đôi. Muốn vậy, phải tạo được những thể tự đa bội nhưng có nguồn gốc lai giữa những dạng có kiểu nhân rất gần nhau trong cùng một loài. Ví dụ, lai giữa các dạng tự tứ bội của các thứ lúa thuộc hai loài phụ Japonica và Indica của loài Oryza sativa như Lương Đình Của (1952) đã làm. Tóm lại, nguyên nhân gây ra khả năng sinh sản hữu tính kém của các dạng tự đa bội là do sự khống chế của các nhân tố di truyền và những sự rối loạn trong quá trình giảm phân. Những biến đổi về mặt sinh lý cũng có ảnh hưởng đến tính hữu thụ của thể tự đa bội. Song phần lớn chúng là kết quả của sự tác động của hai loại nhân tố trên. Khả năng giao phối của thể tự tứ bội và sự tạo thành thể tam bội Các dạng tự tứ bội thường được đặc trưng bằng khả năng giao phối của chúng với dạng lưỡng bội ban đầu. Song cần chú ý rằng, nếu lấy dạng lưỡng bội làm mẹ lai với dạng tứ bội thì không cho kết quả tốt, nhưng nếu lai ngược lại thì lại có hiệu quả; vì rằng hạt phấn của cây tứ bộicó sức sống kém. Từ đó sẽ hình thành nên dạng tam bội (3n). Tam bội thể nói chung không có khả năng sinh sản hữu tính; vì rằng quá trình giảm phân của nó bị rối loạn. Chẳng hạn, ở dưa hấu tam bội (3n = 33) sẽ hình thành nên những giao tử có số nhiễm sắc thể từ 0 đến 33. Trong số ấy chỉ những giao tử có số nhiễm sắc thể là 11 và 22 mới có khả năng hữu thụ. Vì thế, sẽ có khoảng 95% số giao tử được sinh ra là bất thụ. Rõ ràng tính bất thụ của của tam bội thể là một nhược điểm rất lớn đối với các cây lấy hạt. Song lại rất có giá trị đối với những cây lấy quả mà không cần hạt như dưa hấu, nho, chuối hoặc những cây lấy củ, như củ cải, củ cải đường hoặc cây dùng cho chăn nuôi hoặc cây cảnh.

143

Lần đầu tiên ở Nhật bản, Kihara Yamashita, Kondo, Nishiyama...và sau đó là Kiss Arpad (Hungari) đã tạo ra dạng dưa hấu tam bội mà hiện nay được bán phổ biến trên nhiều thị trường thế giới. Loại dưa hấu này quả to, hương vị ngon, thịt quả dày, hàm lượng đường cao và không hạt. Dưa hấu tam bội này được tạo ra từ quá trình lai giữa dưa hấu tứ bội (dạng mẹ) và lưỡng bội. Vì dưa hấu tam bội không cho hạt nên phải có một hệ thống sản xuất hạt tam bộ riêng. Để có dạng tam bội có sản lượng cao phải chọn mhững dạng lưỡng bội từ các thứ khác nhau, có khả năng kết hợp cao. Khi giao hạt tam bội phải gieo thêm một số hàng hạt lưỡng bội, vì hạt phấn cây tam bội thường kém sức sống, Để phân biệt được cá quả tam, tứ và lưỡng bội, ta có thể sử dụng những đặc điểm về mặt hình thái được kiểm soát một cách di truyền. Nếu như dạng tự tứ bội có vỏ quả màu sáng (gS gSgSgS) thì ta dùng cây lưỡng bội cho phần thuộc thứ có vỏ quả màu xanh (GG) và cây tam bội sinh ra sẽ cho quả có vỏ sọc xanh (GgSgS). 4. Phương pháp gây đa bội và chọn lọc đa bội thể 4.1. Các phương pháp gây đa bội thể Năm 1895 lần đầu tiên Hugo De Vries tìm ra một dạng đa bội trong tự nhiên ở cây Oenothera lamarckiana. Cây này có kích thước khổng lồ và sinh trưởng rất nhanh. Nhưng mãi đến 1907, sau công trình nghiên cứu về tế bào học của Lute người ta mới biết nó là một cây tứ bội. Bằng phương pháp gây mô tái sinh, Winkler (1916) là người đầu tiên đã thu được những dạng đa bội ở một số loài cà như Solanum nigrum và S. lycopersicum. Phương pháp này khá đơn giản: khi cây con được 6; 7 lá thật thì khía 1/2 ngọn cây rồi ghép trở lại chổ cũ, hoặc cắt ngọn chính và những cành bên. Sau 10-14 ngày, từ vết ghép hoặc chổ bị thương tổn sẽ hình thành nên những cành mới. Trong số những cành như vậy, có thể có một số là đa bội. Nguyên nhân gây ra hiện tượng đa bội ở phương pháp này có thể là do sự hình thành các cành đa bội từ những mô đã bị phân hoá sau khi xử lý hoặc do sự kết hợp nhân giữa các tế bào của các mô sát thương. Với phương pháp dùng tia Rơnghen để xử lý, lần đầu tiên vào năm 1930 Goodspeed và Demol đã thu được những dạng đa bội ở thuốc lá và một số cây khác. Bằng phương pháp lai cũng có khả năng thu được những dạng cây đa bội. Có ý nghĩa lớn nhất là công trình của Carpesenco (1927) khi lai giữa củ cải Raphanus sativus với bắp cải Brassica oleracea, con lai thu được bất thụ, nhưng dạng dị tứ bội của nó lại hữu thụ cao. Song, việc tạo dạng đa bội bằng những tác nhân hoá học vẫn là phương pháp được nhiều người chú ý và có hiệu quả nhất. Ngay từ 1896 Gheraximop đã dùng clorofooc, ete, cloralhydrat tác động đến tảo Spyrogyra. Tuy nhiên, chỉ sau những công trình thực nghiệm của

144

Blakeslee và Avery (1937) về việc sử dụng chất colchicine thì vấn đề đa bội thể thực nghiệm mới có những bước tiến khổng lồ. Cùng với Blakeslee và Avery, những công trình rất có giá trị tiếp theo của Levan, Dustin, Kostov, Navasin, Gheraximop, Lương Đình Của v.v. đã mở ra một kỷ nguyên mới trong phương pháp gây đa bội thể thực nghiệm. Khi sử dụng colchicine người ta rút ra những kết luận sau: (i) Colchicine ở dạng dung dịch có khả năng khuếch tán mạnh vào các mô thực vật; (ii) Hiện tượng đa bội hoá chỉ xảy ra do tác dụng của colchicine đến những mô đang phân chia mạnh; (iii) Khả năng cho cây đa bội tăng lên trong những điều kiện gieo trồng tốt; (iv) Thời gian xử lý thích hợp tuỳ thuộc vào thời gian phân bào khác nhau của các loài cây; (v) Nồng độ colchicine được sử dụng tuỳ từng loài cây. Phương pháp xử lý và thời gian xử lý Colchicine là một alkaloid có ở nhiều loài thực vật, nhưng chủ yếu là ở loài Colchicum autumnale (tập trung ở vùng Địa trung hải). Bộ phận của đối tượng được xử lý có thể là hạt, mầm cây, chồi, nách, rễ, hoa... Colchicine rất dễ tan trong nước, ở dạng dung dịch nó khuếch tán rất mạnh vào các mô. Trong phạm vi nồng độ từ 0,01% - 1% colchicine đều gây hiệu quả. Nhưng nồng độ thông dụng nhất cho mọi cây trồng là 0,2%. Khi xử lý colchicine ở nồng độ cao, thời gian ngắn cho hiệu quả hơn khi xử lý nồng độ thấp, thời gian dài. Thời gian xử lý có thể thay đổi từ vài giờ cho đến vài ngày hoặc hơn. Tuy nhiên, nếu thời gian xử lý quá ngắn thì hiệu quả rất thấp. Theo Dermen, nếu thêm vào dung dịch colchicine một vài giọt glycerin thì hiệu quả có thể tăng. • Kỹ thuật xử lý Xử lý hạt hay mầm: Phương pháp xử lý hạt áp dụng cho nhiều loại cây có hạt nhỏ và dễ nảy mầm. Nồng độ thích hợp nhất là 0,1% và 0,2%, xử lý từ 3 giờ đến vài ngày hoặc hơn. Trong một giới hạn nhất định khi nhiệt độ tăng thì hiệu quả tác dụng của colchicine tăng. Đơn giản nhất là ngâm hạt khô vào trong dung dịch colchicine hay đặt trên lớp giấy thấm có tẩm colchicine. Đối với hạt to và khó nảy mầm, nếu xử lý trực tiếp hạt khô vào colchicine thì hiệu quả rất kém, mà trước đó phải ngâm hạt bằng nước. Phương pháp xử lý mầm cho hiệu quả cao nhất. Phương pháp chung la ngâm hạt đang nảy mầm vào dung dịch vào dung dịch xử lý. Với từng loại cây thời gian và nồng độ xử lý mầm thích hợp có khác nhau. Ở những hạt nảy mầm đã có rễ hay cây con thì chỉ xử lý mầm bằng cách đặt ngược mầm vào dung dịch colchicine chứa trong đĩa Petri qua lớp vaỉ màn hoặc thấm colchicine lên mầm bằng bàn chải mềm. Ví dụ:

145

- Lúa (Lương Đình Của, 1951): Đặt hạt trong đĩa Petri cho nảy mầm. Khi mầm dài 3 -5 cm dùng dao khía xiên một nhát ở gốc mầm. Kẹp một sợi bông thấm nước có tẩm dung dịch colchicine 0,05 - 0,1% hoặc rỏ dung dịch colchicine ấy vào vết cắt. Xử lý 2 lần /1 ngày. Sau lần xử lý thứ hai rửa sạch mầm và trồng trong nhà kính. - Củ cải (Taraxevich, 1965): Ngâm hạt nảy mầm trong dung dịch colchicine 0,05%-0,1% trong 6-12 giờ hoặc ngâm mầm non trong dung dịch colchicine 0,1% trong 6 giìơ. - Ngô (Sumnui, 1961)" Hạt sau khi nảy mầm ngâm vào dung dịch colchicine 0,2% trong 18-24 giờ. Cũng có thể xử lý như sau: Khi chồi mầm dài 2-3cm khía một nhát ở gốc mầm rồi nhét vào đấy một lát bông có tẩm dung dịch colchicine 0,2% một ngày đêm; tẩm ướt lát bông bằng colchicine 2-3 lần. Xử ký các bộ phận khác của cây - Ở cây thuộc họ Hoà thảo (Poaceae) phương pháp xử lý cho hiệu quả cao: ngâm toàn bộ rễ vào dung dịch xử lý. Ngâm luân phiên 12 giờ ở dung dịch xử lý rồi lại 12 giờ ở trong nước. - Với các mầm nách, người ta đặt lên đấy hỗn hợp ở dạng sền sệt của colchicine với lanonin hay tiêm trực tiếp dung dịch colchicine vào mầm. - Với hoa, có thể ngâm trực tiếp vào dung dịch colchicine 0,02-0,05%. Ngoài colchicine, để gây tạo cây đa bội người ta còn hay dùng chất acenaphthen. Vì chất này tan rất kém trong nước, nên thường được dùng ở nồng độ thấp. Ví dụ, với hạt lúa mì dùng dung dịch acenaphthen 0,002%. 4.2. Phương pháp chọn lọc đa bội thể Tuỳ theo đối tượng và mục đích nghiên cứu mà có các phương pháp chọn lọc đa bội thể khác nhau. Nếu mục đích cuối cùng là tạo ra một dạng tứ bội có phẩm chất cao thì phải tiến hành trên những dạng lưỡng bội và con lai tốt nhất với số lượng cá thể nhiều nhất trong phạm vi có thể. Nếu mục đích là tạo ra dạng tứ bội dùng để lai với dạng lưỡng bội thì dạng lưỡng bội ban đầu phải thuần và có kết hợp cao. Nói chung, phương pháp gây đa bội thể ở các cây giao phấn có hiệu quả cao và rõ rệt hơn ở cây tự thụ phấn. Nguyên nhân là do, chúng mang tính dị hợp tử cao nên có khả năng sinh sản biến dị nhiều. Về nguyên tắc mà nói, dùng colchicine có thể gây tạo được các tế bào đa bội vào bất kỳ giai đoạn phát triển nào của cây. Song thực tiễn phức tạp hơn nhiều. Thường sau lúc xử lý hạt, mầm, chồi...các cây được sản sinh ra thuộc dạng khảm, tức là trong cơ thể của nó có sự xen lẫn giữa các mô có mức bội thể khác nhau, thường là 2n và 4n. Về mặt lý thuyết, có lợi nhất

146

là tác động vào lần phân chia đầu tiên của hợp tử . Cây được sinh ra từ đó sẽ là đa bội hoàn toàn. Các cây đa bội mới thu được chỉ là những dạng khởi đầu cho công tác chọn giống về sau. Không thể đem nó so sánh trực tiếp với những dạng lưỡng bội đã kinh qua chọn lọc. Khi tiến hành nghiên cứu phải tiến hành trên một quần thể lớn. Nói chung, khi chọn đối tượng phải tìm những loài có số lượng nhiễm sắc thể ít. Việc kiểm tra và chọn lọc phải tiến hành ngay từ sau khi xử lý gây đa bội. Ngay từ thế hệ C0 phải kiểm tra tính khảm của các cây được xử lý. Ở những cây này đỉnh sinh trưởng và chiều cao cây bị kỳm hãm khá mạnh và đôi khi có những biến đổi sâu sắc. Phải thường xuyên loại bỏ những cành lưỡng bội được hình thành trở lại, tạo điều kiện cho sự tạo thành những cành tứ bội. Sau sự kiểm tra sơ bộ về hình thái và giải phẩu thì tách riêng các cây nghi là là đa bội và kiểm tra lại bằng cách xác định kích thước hạt phấn và số lượng nhiễm sắc thể. Đối với những cây khảm, nên phân thành một số nhóm theo những đặc điểm hình thái: (1) Nhóm cây có sai khác rất ít so với dạng lưỡng bội ban đầu; (2) Nhóm các cây phát triển bình thường, nhưng khác với dạng ban đầu về màu sắc, kích thước, lá...; (3) Nhóm gồm những dị dạng đặc biệt. Để xác định tính đa bội, người ta còn dùng các chỉ tiêu về kích thước tế bào khí khổng và số lượng lục lạp. Người ta thấy rằng, kích thước tế bào khí khổng lồ ở dạng tứ bội thường lớn hơn ở dạng lưỡng bội 25-35%. và số lượng lục lạp ở dạng tứ bội cao hơn ở dạng lưỡng bội 30-50%. Ngoài phương pháp tế bào học (đếm số lượng nhiễm sắc thể), chỉ tiêu về kích thước hạt phấn là một bằng chứng để xác định tính đa bội. Trong thế hệ C1 việc chọn lọc có nhiều khó khăn hơn. Vì bên cạnh những cây những cây tứ bội va lưỡng bội, thường xuất hiện những cây tam bội do giao phấn giữa hai loại trên. Mà những cây tam bội thì chúng có nhiều đặc điểm hình thái và giải phẩu mang tính chất trung gian giữa lưỡng bội và tứ bội. Việc chọn lọc ở C1 dựa vào những tiêu chuẩn giải phẩu, hình thái và xác định số lượng nhiễm sắc thể. Trong các thế hệ sau, đồng thời với việc chọn lọc theo những tiêu chuẩn hình thái, giải phẩu và tế bào như trên, cần chú ý đến các đặc điểm về sinh lý, sinh hoá, di truyền (đặc biệt là tính hữu thụ), kinh tế...Sau thế hệ C1 đã có thể tách riêng từng dòng có nhiều đặc điểm mong muốn. Đối với những dòng này phải có chế độ gieo trồng với những điều kiện sống thuận lợi để cũng cố những đặc điểm tốt. Đối với những dòng đặc biệt có nhiều triển vọng, phải tiến hành nghiên cứu so sánh những yêu cầu đề ra và khắc phục những nhược điểm khác bằng các phương pháp chọn giống

147

khác như lai tạo, gây đột biến... Tóm lại, việc tạo ra thể đa bội chỉ là bước đầu trong công tác chọn giống đa bội thể thực nghiệm. Để có kết quả tốt, không những phải có phương pháp xử lý thích hợp mà còn phải áp dụng một cách có hiệu quả các bước tiếp theo là kiểm tra, chọn lọc và kết hợp với các phương pháp chọn giống khác như lai tạo, gây đột biến.

III. Phát sinh đột biến thực nghiệm trong chọn giống thực vật 1. Lược sử nghiên cứu và ứng dụng PSĐB thực nghiệm trong chọn giống thực vật Lịch sử nghiên cứu phát sinh đột biến (PSĐB), theo Auerbach (1978) có thể chia làm 5 giai đoạn sau: Giai đoạn I (từ 1890 đến 1927): Ở giai đoạn này các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu về đột biến, đưa ra những khái niệm cơ bản về đột biến và tìm ra phương pháp hữu hiệu để nghiên cứu chúng. Đáng chú ý nhất là công trình nghiên cứu đột biến của Hugo De Vries (1895) ở cây Oenothera lamarckiana với "thuyết đột biến " nổi tiếng công bố vào năm 1901, chính ông đưa ra thuật ngữ "đột biến". Đến năm 1904, chính De Vries lại đề nghị sử dụng tia X để tạo ra các đột biến. Tuy nhiên, mãi đến năm 1927 Muller mới đưa ra được bằng chứng xác thực đầu tiên về chiếu xạ ion hoá gây ra các đột biến ở ruồi giấm Drosophila. Từ năm 1925 Natxon và Philipop phát hiện ra tia X có khả năng gây ra biến dị di truyền ở vi nấm. Giai đoạn II (từ năm 1927 đến đầu chiến tranh thế giới II): Giai đoạn này đánh dấu bằng những công trình xuất sắc của Hermann Muller với bằng chứng xác thực đầu tiên về chiếu xạ ion hoá gây ra các đột biến ở ruồi giấm Drosophila. Trong khi đó Stadler (1928) tiến hành gây đột biến ở lúa đại mạch và ngô bằng tia X và tia gamma và chỉ rõ tần số đột biến cảm ứng phụ thuộc vào liều xạ tổng số của tác nhân gây đột biến. Thực ra, một loạt thí nghiệm đã được Stadler bắt đầu từ 1924 làm cho tên tuổi của ông vang dội (IAEA, 1995) v.v. Giai đoạn III được tính từ đầu chiến tranh thế giới II đến năm 1953. Giai đoạn này được đánh dấu bằng hàng loạt các công trình phát hiện ra các chất đột biến của Sakharov (1938-1939), Rapoport (1940-1948), Gustafson (1940-1948)... Đó là những chất như Ethylenimine (EI), Diethylsulfate (DES), dimethylsulfate (DMS), Nitrosomethylurea (NMU), Nitrosoethylurea (NEU)... trên các động vật, vi sinh vật và thực vật. Giai đoạn IV (từ 1953 đến 1965): Ở giai đoạn này, kể từ khi Watson và Crick khám phá ra mô hình cấu trúc phân tử DNA, các nhà di truyền

148

học và hoá sinh tập trung chủ yếu vào nghiên cứu thành phần, cấu trúc hoá học của nucleic acid, cơ chế phân tử của quá trình phát sinh đột biến, tiêu biểu là các công trình của Brenner (1961), Henning (1962), Lovless (1963-1965), Xoifer, Dubinin...Các tác giả đều đi đến kết luận rằng các quá trình biến đổi trên phân tử DNA đều liên quan đến quá trình sao chép, tự phục hồi và xuất hiện các đột biến. Giai đoạn V (từ 1965 đến nay) xuất hiện hàng loạt công trình nghiên cứu về đột biến ở động vật, thực vật và vi sinh vật với các tác nhân vật lý và hoá học khác nhau như tia X, tia gamma, chùm neutron, tia laser... cùng các hợp chất alkyl hoá, các hợp chất nitroso... Nét nổi bật nhất ở giai đoạn này là làm sáng tỏ bản chất di truyền của các đột biến và sử dụng tập đoàn phong phú nguồn gen đột biến để tạo giống cây trồng mới. Chẳng hạn, theo thống kê của FAO (1996) thế giới đã tạo ra được 1870 thứ cây trồng và hàng chục vạn chủng, nòi vi sinh vật được áp dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, nông nghiệp, bảo quản và chế biến nông sản, thuốc trừ sâu sinh học...đem lại hiệu quả kinh tế vô cùng to lớn cho nhân loại. 2. Phân loại các tác nhân gây đột biến Nhìn chung, trong lịch sử nghiên cứu PSĐB thực nghiệm ở cây trồng có hai hướng nghiên cứu chính, dựa trên hai loại tác nhân gây đột biến vật lý và hoá học được sử dụng, đó là: PSĐB bằng chiếu xạ ion hoá và PSĐB bằng xử lý hoá học. Trong đó, các nghiên cứu theo hướng sau được bắt đầu muộn hơn hướng đầu chừng 10 năm, kể từ sau các công trình nổi tiếng của Rapoport (1939 - 1943) và Auerbach (1943; 1947) phát hiện ra một loạt các hoá chất có khả năng gây đột biến mạnh, người ta mới kể đến sự ra đời của hướng nghiên cứu này (Lê Duy Thành, 2000). Đặc biệt, nhờ sử dụng các tác nhân gây đột biến cực mạnh (supermutagenes) thuộc nhóm alkyl hoá, các nhà khoa học đã nâng cao tần số đột biến lên hàng trăm, thậm chí hàng ngàn lần. Hướng nghiên cứu này ở các loại ngũ cốc đặc biệt phát triển mạnh từ thập niên 1960 đến nửa đầu thập niên 1980. Ngoài ra, còn có nhiều công trình nghiên cứu phối hợp sử dụng cả hai loại tác nhân vật lý và hoá học. Một số kết quả thu được ở lúa cho thấy hiệu quả gây đột biến của một số hoá chất (như EI, DES, DMS, NEU, NMU), trong một số trường hợp là cao hơn so với chiếu xạ ion hoá bằng tia X, tia γ. 2.2. Tác nhân phóng xạ gây đột biến Đây là các dạng phóng xạ có khả năng ion hoá mạnh. Theo phương thức truyền năng lượng, người ta phân nó làm hai loại: phóng xạ hạt và phóng xạ điện từ. Phóng xạ hạt gồm ba nhóm: Nhóm hạt sơ cấp nhẹ, các dòng điện tử, pozitron; nhóm hạt nặng mang điện tích (proton, detron, hạt

149

α); và nhóm hạt neutron. Còn phóng xạ điện từ bao gồm chủ yếu là tia Rontgen (còn gọi là tia X) và tia γ. Các sóng điện từ (phát ra trong không gian dưới dạng dao động điện từ và từ trường) đặc trưng bằng bước sóng λ qua công thức: C = √.λ trong đó C là tốc độ, √ là tần số dao động. Các kiểu phóng xạ và nguồn phóng xạ được Briggs và Constantin mô tả đầy đủ trong IAEA (1977). Các dạng phóng xạ dùng trong chọn giống cây trồng Trong chọn giống, các dạng phóng xạ được sử dụng phổ biến gồm có: tia X, neutron, các chất đồng vị phóng xạ và tia γ. Trong số đó tia γ từ nguồn phóng xạ Co60 và Cs137 dùng để chiếu xạ hạt giống đã trở thành phương pháp chính dùng để gây đột biến trong cải tiến giống cây trồng. Liều tới hạn đối với các giống lúa Để thu được nhiều đột biến có giá trị chọn giống cao mà không gây phương hại đến sức sống, độ hữu thụ hoặc gây chết cây, người ta đã tìm ra liều lượng tới hạn cho nhiều loài cây khác nhau. Theo đó, ở M1 chỉ còn 30 - 40% cây sống sót và ra hoa kết quả (LD30 - 40). ở cây lúa, liều lượng này là 30 - 50 kR. Trong nghiên cứu chọn giống phóng xạ, người ta thường dùng liều LD50. Theo Sharma (1986), liều LD50 trung bình của tia γ dối với lúa là 32,5 kR, biến thiên từ 25 đến 40 kR. Trong giới hạn đó, nói chung, giữa liều lượng tổng số của các tác nhân gây đột biến và tần số các đột biến cảm ứng có mối tương quan tỷ lệ thuận (Gustafsson và Gadd, 1966). Ngoài ra, người ta cũng tìm ra liều lượng thích hợp (thường thấp hơn liều tới hạn 1,5-2 lần) cho công tác chọn giống đối với một số cây trồng. Ở lúa, đối với xử lý hạt khô, liều này là 15 - 20 kR; đối với hạt hút nuớc bão hoà, liều thích hợp là 10-15 kR. Phương thức tác dụng của tia phóng xạ trên tổ chức sống Theo hiểu biết hiện nay, các mô bị chiếu xạ sau khi nhận năng lượng của bức xạ ion hoá chịu những biến đổi qua hai giai đoạn hoá - lý và sinh học. ở giai đoạn hoá lý (10-10 - 10-6s), một photon của tia γ tác động vào một điện tử trên quỹ đạo nguyên tử của vật chất sống. Sau khi bị kích hoạt, điện tử tách ra và do đó nguyên tử mang điện tích dương. Điện tử được tách ra (quang điện tử) có năng lượng rất cao có thể gây ra sự ion hoá tiếp theo trên đường vận động của nó. Hậu quả là gây nên các tổn thương hoá - sinh. ở giai đoạn sinh học (có thể kéo dài từ vài ngày đến hàng chục năm): nếu như các tổn thương hoá - sinh không hồi phục được sẽ kéo theo các rối loạn chuyển hoá dẫn đến các tổn thương hình thái và chức năng.

150

Tóm lại, hiệu quả sinh học quan sát được sau quá trình bức xạ ion hoá là một kết quả tích luỹ của tác dụng trực tiếp của tia phóng xạ lên phân tử ADN hoặc gián tiếp thông qua các phân tử khác trong tế bào trước khi truyền vào ADN. 3. Ảnh hưởng của các đặc tính di truyền sinh vật lên sự PSĐB Những sai khác về độ nhạy cảm phóng xạ (radiosensitivity) giữa các kiểu gen bên trong một loài đã được thông báo và trong một số trường hợp những sai khác đó có thể là tương đối lớn (Conger và Konzak 1977). Tuy nhiên, những sai khác về độ nhạy cảm phóng xạ giữa các kiểu gen trong một loài thường ít hơn nhiều so với giữa các loài. Vì vậy, các nhà chọn giống thực vật muốn gây tạo đột biến ở một giống cụ thể nếu chưa hiểu rõ mức nhạy cảm phóng xạ, thường phải tiến hành các thí nghiệm xác định phản ứng liều sơ bộ. Năm 1962, Fujii thông báo rằng, các giống lúa từ các miền nhiệt đới như Burma (Myamar) và ấn Độ ít nhạy cảm hơn các giống ở Nhật và Đài Loan. Năm 1967, Ukai tiến hành nghiên cứu trên quy mô gồm 70 giống đã phát hiện ra rằng, những khác biệt tối đa về độ nhạy cảm phóng xạ trong số 70 giống là gấp 3,5 lần khi các hạt khô được đem chiếu xạ gamma và sự sinh trưởng rễ được đo 4 ngày sau nẩy mầm. Ngoài ra, các kết quả của Ukai (1970) còn cho thấy mức nhạy cảm phóng xạ của các giống lúa được di truyền với hệ số di truyền cao (Dẫn theo Ukai, 1997). Siddiq và Swaminathan (1968) cho hay, các giống Indica có khả năng chống lại phóng xạ cao hơn các giống Japonica và Javanica. Các kết quả nghiên cứu khác cho thấy độ nhạy cảm phóng xạ của các giống Indica thay đổi trong phạm vi rộng và khác với các giống Japonica. Điều này chỉ ra rằng, nền di truyền của vật liệu nghiên cứu đóng vai trò quan trọng trong việc xác định tính hiệu quả và hiệu suất của các tác nhân gây đột biến (Mikaelsen và cs, 1971; Sharma, 1986). Từ đây, ta dễ dàng nhận ra mối quan hệ phụ thuộc giữa kiểu gen của từng nhóm giống và các đặc trưng của quá trình phát sinh đột biến (như tần số và phổ đột biến) tuân theo quy luật dãy biến dị tương đồng do Vavilov đưa ra năm 1920. Cần nói thêm rằng, mức nhạy cảm phóng xạ đối với tia γ của 28 giống Japonica và 19 giống Indica được kiểm tra cho thấy phạm vi liều hữu ích đối với chọn giống đột biến, tương ứng là 12-25 krad và 15-30krad (IAEA, 1977). Hiệu quả của chiếu xạ tia γ vào hạt khô và hạt ướt Bên cạnh một số công trình đã đề cập, cho đến nay, trên thế giới còn có rất nhiều thông báo theo hướng nghiên cứu này (Donini và cs, 1984;

151

Kawai, 1966, Siddiq và Swaminathan, 1968). ở nước ta, các kết quả nghiên cứu trong lĩnh vực này cũng được công bố khá sớm (Trần Minh Nam, 1968 - 1970; Trịnh Bá Hữu, Lê Duy Thành và Trần Duy Quý, 1970; Nguyễn Minh Công, Lê Đình Trung và Phạm Quang Lộc, 1978; Trần Duy Quý và cs, 1978 v..v. Nhìn chung, các tác giả đều đi đến nhận định rằng, xử lý hạt ướt cho tần số và phổ của các đột biến cấu trúc NST cũng như của các đột biến hình thái và sinh trưởng - phát triển là cao hơn so với xử lý hạt khô. Hiệu quả của chiếu xạ tia γ vào hạt nảy mầm ở các thời điểm khác nhau Kết quả nghiên cứu về xác định các pha của chu kỳ nguyên phân đầu tiên ở hạt nảy mầm các giống lúa Japonica cho thấy: ở 250C, thời gian hạt hút nước bão hoà chuẩn bị nảy mầm là 36h, và quãng thời gian tiếp theo tương ứng với các pha như sau : 36h - 57h30: pha G1; 57h30 - 60h: pha S; 60h - 71h30: pha G2; và 71h30-77h : pha M (Yamaguchi và Matsubayashi, 1971). Hơn nữa, các kết quả chiếu xạ ở các loài thực vật khác nhau cho thấy sự phụ thuộc của độ cảm ứng phóng xạ vào các pha của chu kỳ tế bào, theo thứ tự như sau: G2 > M > S > G1. Từ những kết quả nói trên, ở nước ta đã xuất hiện một số công trình nghiên cứu về hiệu quả gây đột biến của các tác nhân vật lý và hoá học lên hạt nảy mầm ở các thời điểm khác nhau của một số giống lúa. Đầu tiên là nghiên cứu so sánh hiệu quả của xử lý riêng rẽ và phối hợp giữa tia γ và NMU, NEU (Nguyễn Minh Công, Lê Đình Trung và Phạm Quang Lộc, 1978 - 1982; Phạm Quang Lộc, 1987). Sau đó, hướng nghiên cứu này được triển khai bằng chiếu xạ tia gamma trên một số giống lúa nếp (Đào Xuân Tân, 1995) và một số giống lúa tẻ đặc sản (Đỗ Hữu ất, 1997). Nói chung, các công trình trên đây đều cho thấy: (1) Liều 5kR và thời điểm 50h cho hiệu quả không đáng kể; (2) Xử lý ở thời điểm 69-72h với hai liều 10 và 15kR cho tần số cao về các đột biến có ý nghĩa chọn giống. 4. Các nghiên cứu về cơ chế phát sinh và di truyền của các thể đột biến Theo Hajra và cs (1980), việc gây đột biến ở lúa lần đầu tiên được thông báo bởi Yamada năm 1917. Kế tục các công trình của ông về chiếu xạ tia X lên hạt lúa là hàng loạt công trình được tiến hành trong thập niên 1930. Từ thập niên 1950, việc chiếu xạ hạt lúa bằng tia γ mới trở thành phương pháp chính trong chọn giống đột biến. Trong những năm 1960, các nghiên cứu sử dụng neutron trong chọn giống thực vật được bắt đầu. Từ cuối thập niên 1950 đến nửa đầu thập niên 1960, nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm thu thập thông tin cơ sở về sự tổn thương do chiếu xạ ở cây M1 và tần số khả dĩ tạo ra các đột biến quan sát được ở M2. Hiệu quả của phương pháp chiếu xạ được quan tâm chủ yếu trong giai đoạn đầu

152

của các nghiên cứu là tần số của các ĐBDL ở M2. Tuy nhiên, sau đó người ta chuyển sang xem xét tổng tỷ lệ các đột biến có lợi như chín sớm và bán lùn mà vốn dễ dàng phát hiện ở đồng ruộng. Mặc dù chiếu xạ một lần hạt khô đã được các nhà nghiên cứu sử dụng như là một phương pháp chính, song nhiều phương pháp chiếu xạ gamma cải tiến, như chiếu ngắt quãng (Yamaguchi, 1958a) và chiếu lặp lại nhiều lần (Yamaguchi, 1962b) đã được thử nghiệm. Các nghiên cứu so sánh hiệu quả gây đột biến giữa các tác nhân đột biến khác nhau cũng được bắt đầu. Các nghiên cứu chiếu xạ gamma và tia X ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây lúa nhằm xác định tỷ lệ sống sót (TLSS) và độ hữu thụ của bông ở M1, tỷ lệ ĐBDL ở M2 và tần số các đột biến ở M3 được tiến hành từ đầu thập niên 1960 (Kawai, 1962; Yamagata và Shakudo, 1963; Osone và Oono, 1970). Trong lịch sử nghiên cứu, theo Ukai (1997) [239] nhiều công trình lý thuyết đã được tiến hành nhằm tìm ra một phương pháp chọn lọc hiệu quả hơn. Yamaguchi (1959) đề nghị dùng phương pháp sib của Fisher để ước tính tần số phân ly của các thể đột biến trên mỗi đời con. Yamagata và Shakudo (1963a) đề nghị nên chọn lọc các thể đột biến ở M3 hoặc các thế hệ sau đó, mặc dù họ không phủ nhận ích lợi của việc chọn lọc ở M2. Cũng trong năm này, Osone tiến hành một chương trình nghiên cứu quy mô nhằm kiểm tra mối quan hệ giữa tần số và phổ ĐBDL ỏ M2 và vị trí của hạt bị đột biến trên mỗi bông M1 trong trường hợp chiếu xạ hạt bằng tia γ. Từ kết quả thu được, ông kết luận rằng, các mô khởi sinh của một bông M1 gồm nhiều nhóm, mỗi nhóm bắt nguồn từ một tế bào khởi đầu thuộc mô phân sinh chồi trong các hạt được chiếu xạ. (Ukai, 1997). 5. Các phương pháp phát hiện, thu thập các thể đột biến và sử dụng chúng Cho đến nay, các quy trình và phương pháp phát hiện và chọn lọc các thể đột biến đã được đúc kết và phân tích thấu đáo. Ví dụ, ở cây lúa, thân là cơ quan quan trọng gắn chặt với khả năng chống đổ, và do đó ảnh hưởng tới năng suất hạt. Vì vậy, thân luôn luôn được kể đến như là đặc điểm quan trọng trong công tác chọn giống lúa gần đây. Bằng phương pháp đột biến, hàng loạt giống lúa thấp cây và cứng cây cùng với khả năng cho năng suất cao, chống chịu sâu bệnh và chất lượng tốt lần lượt được tạo ra trong suốt bốn thập kỷ qua. Chính điều này đã góp phần tạo nên cuộc "Cách mạng xanh" từ giữa thập niên 1960. Tính lùn (dwarfism, dwarfness) được định nghĩa như là một đặc trưng xác định về mặt di truyền, trong đó chiều cao cây tại thời điểm chín là thấp hơn kiểu bình thường. Dựa theo sự giảm chiều cao cây, có thể mô tả và phân loại tính lùn theo nghĩa rộng thành ba nhóm: bán lùn (semidwarf), lùn (dwarf, theo nghĩa hẹp) và cực

153

lùn hay siêu lùn (extra dwarf). Trong đó, các thể đột biến bán lùn thường gắn chặt với khả năng chống đổ và kiểu cây cũng như thích nghi với chế độ phân đạm cao, nên chúng có tiềm năng năng suất cao. Vì vậy, việc gây tạo các thể đột biến bán lùn luôn là mục tiêu quan trọng trong chương trình chọn giống đột biến lúa... Nhiều nghiên cứu cho thấy hầu hết các giống hay dòng bán lùn đều có chứa cùng một gen bán lùn bắt nguồn chủ yếu từ giống bán lùn địa phương Đài Loan có tên Dee - geo - woo - gen (DGWG). Điều đáng nói ở đây là, việc chấp nhận sử dụng rộng rãi cùng một gen bán lùn như vậy có thể đưa lại hậu quả xói mòn di truyền, làm giảm tính đa dạng di truyền vốn có ở cây lúa. Từ quan điểm này, nhu cầu về khai thác sử dụng các nguồn đa dạng về tính bán lùn được nhấn mạnh (IAEA, 1982; Maluszynski và cs, 1986). Công cuộc tìm kiếm các gen bán lùn mới không alen với gen sd-1 được tiếp diễn theo hai hướng: (1) thu thập bảo tồn và đánh giá quỹ gen; và (2) phát hiện các gen bán lùn mới bằng phương pháp đột biến. 6. Một số thành tựu của phương pháp chọn giống đột biến trên thế giới và ở Việt Nam Thành tựu chọn giống đột biến lúa trên thế giới Gần đây, theo số liệu của FAO/IAEA, tính đến 12/1997, trên toàn thế giới đã có 1847 giống đột biến, trong đó có 1357 giống cây trồng và 490 giống cây cảnh. Trong số 1357 giống cây trồng các loại thì riêng lúa có 333 giống, trong đó 67,6% được phát triển trực tiếp từ các thể đột biến và 32,4% qua lai tạo. Trong tốp 7 nước đứng đầu về số giống lúa đột biến, Việt Nam xếp thứ bảy (Maluszynski và cs, 1998). Thành tựu chọn giống đột biến lúa ở một số quốc gia tiêu biểu ở Trung Quốc và Đài Loan, hai giống lúa lùn đầu tiên được tạo ra ở Đài Loan năm 1957, một giống thông qua sử dụng trực tiếp thể đột biến là Shuang Chiang 30 - 21 và giống LH1 qua chọn giống lai giữa thể đột biến này với Taichung Native 1 (Hu, 1986). Trường hợp thành công nhất trong số các giống đột biến với tính chín sớm nhờ cải tiến là Yuangfen Zao, được phóng thích năm 1971. Từ năm 1985 đến nay, nó được xếp vào một trong số ba giống lớn nhất ở Trung Quốc, được trồng trên 1 triệu hecta dọc theo Dương Tử Giang (Ukai, 1997) Một giống chín sớm nổi tiếng khác là Zhefu 802 được trồng trên 1.400.000 ha năm 1989. Trung Quốc luôn là nước đứng đầu về số lượng các giống lúa và cây trồng đột biến. Ở Nhật Bản, các dòng đột biến Sakai 64 và Fukei 53 được tạo ra đầu

154

tiên trong các năm 1958 và 1959, sau đó là Sakai 65 và Fukei 54. Từ năm 1966, Futsuhara và cs cho phóng thích giống lúa đột biến đầu tiên ở Nhật là giống bán lùn Reimei bắt nguồn từ Fujiminori do chiếu xạ gamma. Giống nổi tiếng này được trồng ở miền Bắc, trên diện tích 1.410.000ha năm 1969. Hơn nữa, nó cũng được sử dụng làm bố mẹ rất thành công trong các chương trình chọn giống lai. Theo Sato (1982, 1983), trong số 9 giống được tạo ra bằng cách này, đáng kể nhất là giống Akihikari (=Reimei x Toyonisiki) được trồng tới 136.375 ha năm 1970, xếp hàng thứ tư về diện tích trồng trọt ở Nhật. Ấn Độ là quốc gia đứng hàng thứ nhì trong top 6 nước dẫn đầu về số lượng giống cây trồng đột biến, và hàng thứ ba về số lượng giống lúa đột biến. Mặc dù chưa có giống lúa đột biến nào đạt mức kỷ lục như Reimei, Zhefu 802... nhưng sự thành công trong chọn giống lúa đột biến và lai tạo giống năng suất cao ở nước này đạt được trong những năm 1970 đến nay rất to lớn. Gần đây, nhờ sự giúp đỡ tích cực của chương trình chọn giống đột biến từ IAEA, sự nghiên cứu cải tiến giống lúa ở nhiều quốc gia châu Á và Mỹ La tinh đã đạt được những tiến bộ đáng kể. Ơ nước ta, những nỗ lực nghiên cứu theo hướng này, theo các tác giả Lê Duy Thành và Trịnh Bá Hữu (1986), được bắt đầu từ 1966 ở Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội (nay là Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc Gia Hà Nội) và sau đó mở rộng sang các đơn vị khác như: Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (nay là Viện Di truyền Nông nghiệp), Trường Đại học Sư phạm Hà Nội I, Viện Cây Lương thực và Thực phẩm, Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội và Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam. Một số công trình khoa học có giá trị trong lĩnh vực này đã góp phần xác định tính quy luật của PSĐB ở giai đoạn tiền phôi, cơ chế phân tử của quá trình đột biến, hiệu quả của các tác nhân gây đột biến lên tần sốvà các phổ đột biến ở lúa cũng như nghên cứu và sử dụng PSĐB thực nghiệm trong chọn giống lúa. Kết quả là, cho đến nay đã có hàng chục giống cây trồng mới được tạo ra bằng phương pháp đột biến. Chẳng hạn, ở ngô có DT6 và DT8; ở đậu tương có M103, V48, DT84, DT90, DT95...; ở cây lạc có V79, 4329, DT322, DT329... Đối với cây lúa, bằng phương pháp gây đột biến, nhiều giống mới đã được tạo trong một thập kỷ qua. Chẳng hạn, bằng cách xử lý DMS các thể tái tổ hợp thu được từ các tổ hợp lai (Xuân số 2 x 2765) và (NN8 x Xuân số 2), GS.VS.Vũ Tuyên Hoàng và cs đã tạo ra các giống Xuân số 5 và Xuân số 6. Các giống này được phóng thích năm 1991 (Trần Đình Long,

155

chủ biên - 1997). Ở Viện Di truyền Nông nghiệp (DTNN), nhiều giống lúa mới được chọn trực tiếp từ các thể đột biến hoặc qua lai tạo. Chẳng hạn, bằng chiếu xạ tia γ vào hạt của giống lúa địa phương C4-63 đã tạo được các giống DT10 và DT11 có chiều cao 90-100cm, năng suất cao, chống đổ tốt, chịu rét. Các giống này được phóng thích năm 1990 và 1995 (Trần Duy Quý và cs, 2000). Sau đó, DT10 được dùng làm mẹ để lai với CR203 và kết quả là chọn tạo được giống DT13 (Bùi Huy Thuỷ và Trần Duy Quý, 1999). Bằng phương pháp chiếu xạ tia γ 20 krad, các giống DT33 và CM1 đã được tạo ra và phóng thích năm 1994 và 1999. Giống A20 được phóng thích năm 1993 là kết quả của xử lý NMU 0,015% và chọn giống lai giữa các thể đột biến thu được (H20 x H30). Giống này có đặc tính thấp cây, kháng rầy, chịu khô hạn và đất phèn. Nhờ sử dụng A20 làm mẹ trong chọn giống lai, Bùi Huy Thuỷ và Trần Duy Quý đã chọn được các giống có triển vọng DT16 và DT17. Kết hợp chiếu xạ tia γ và lai hữu tính, sau nhiều thế hệ chọn lọc, Nguyễn Văn Bích và Trần Duy Quý đã tạo được các giống nếp mới DT21 và DT22 cho năng suất cao, chất lượng tốt. Bằng chứng sinh động và hiệu quả của việc chiếu xạ tia γ 15 krad vào hạt nảy mầm ở thời điểm 69 giờ là sự biến mất tính cảm quang ở các giống lúa Tám thơm Hải Hậu, Tài nguyên đục và Tép Hành. Nhờ vậy, các thể đột biến tạo ra có thể trồng hai vụ trong năm. Cụ thể "Tám thơm đột biến" (giống quốc gia năm 2000) hoàn toàn mất cảm quang, có TGST ngắn hơn nhưng vẫn giữ được mùi thơm, chịu rét và cho năng suất tương đương giống gốc. Hơn nữa, giống này có khả năng thích ứng rộng (Nguyễn Minh Công và cs, 1999; Đỗ Hữu Ât và cs, 2000), "Tép hành đột biến" (giống quốc gia năm 1999) có nhiều ưu điểm như mất cảm quang, TGST và chiều cao cây đều rút ngắn gần 50% của giống gốc nhưng năng suất cao gấp đôi ... "Tài nguyên đột biến" (giống quốc gia năm 1997) có nhiều ưu điểm nổi bật so với Tài nguyên đục cũng được tạo ra bằng cách trên. Tóm lại, tình hình nghiên cứu và chọn giống đột biến lúa ở nước ta trong 10 năm qua đã đạt được những thành tựu to lớn. Việt Nam được IAEA/FAO xếp vào một trong bảy quốc gia đứng đầu thế giới về số lượng giống lúa đột biến và đứng thứ tư trong khu vực Châu á - Thái Bình Dương (sau Trung Quốc, Nhật Bản và ấn Độ), với 40 giống bao gồm: lúa27, ngô-2, lạc-2. đậu tương-5, cà chua-2 và táo-2 (Trần Duy Quý, 1997). Trong sự tiến bộ vượt bậc ấy, Viện DTNN đóng góp thật đáng kể, với 17 giống lúa và hơn 8 giống cây trồng khác được tạo ra bằng phương pháp đột biến. Với kết quả đó, từ 1995 đến nay, nước ta trở thành thành viên chính thức của Hiệp hội Chọn giống Đột biến ở Khu vực Châu Á mà Viện

156

DTNN là cơ quan đầu mối. Điều này khẳng định hướng đi đúng đắn và có hiệu quả trong lĩnh vực khoa học này.

Tài liệu Tham khảo Tiếng Việt Nguyễn Văn Hiển (chủ biên, 2000): Chọn giống cây trồng. NXB Giáo Dục, Hà Nội. Trần Đình Long (chủ biên, 1997): Chọn giống cây trồng (Giáo trình cao học nông nghiệp). NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. Trần Duy Quý (1997): Các phương pháp mới trong chọn tạo giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp. Lê Duy Thành (2000): Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB KH & KT, Hà Nội. Tiếng Anh Chopra, V.L. (Ed., 1989): Plant Breeding: Theory and Practice. Oxford & IBH Publishing Co. PVT, Ltd. Falconer D.S. and Mackay T.F.C. (1996): Introduction to Quantitative Genetics. 4th edn. Longman Group, Harlow. Hayward MD, N.O. Bosemark, I. Ramagosa, Coordinating ed. M.C. Cerezo (1994): Plant Breeding: Principles and Prospects. 2nd ed. Chapman & Hall, Inc., London. Matsuo Y., Futsuhara F., Kikuchi F., Yamaguchi H. (Eds., 1997): Science of The Rice Plant, Volume Three: Genetics. FAPRC, Tokyo, Japan. Murray, D.R. (1991): Advanced Methods in Plant Breeding and Biotechnology. C-A-B International Publisher, London.

157

Chương 8

Lai Tế bào Soma I. Vấn đề lai ghép ở thực vật Lai ghép hay là lai dinh dưỡng từ lâu đã được thực hiện ở thực vật và có ý nghĩa trong thực tiễn trồng trọt các cây ăn trái, cây cảnh …Lai dinh dưỡng bằng ghép là lai soma, nhưng thực chất thì cây lai dinh dưỡng là một loại cơ thể khảm vừa mang các tế bào và mô của gốc ghép và cành ghép. Giữa các tế bào của mô gốc ghép và cành ghép có thể có sự trao đổi thông tin điều chỉnh sự trao đổi chất tạo cho cành ghép có một số tính chất của gốc ghép, nhưng không xảy ra sự hợp nhân. Vì vậy các tính trạng trung gian chỉ có ở thế hệ cành ghép, khi đem gieo các hạt của cành ghép thì thế hệ sau không còn có tính trạng trung gian vì hạt được hình thành từ hệ gene của cành ghép. Khác với tế bào động vật, tế bào thực vật có thành tế bào là lớp bao ngoài cùng. Thành tế bào gồm cellulose, hemicellulose và pectin. Nếu thành tế bào bị tách bỏ, tế bào thực vật chỉ còn lớp màng sinh chất bọc ngoài gọi là tế bào trần hay protoplast. Khi các protoplast tiếp xúc nhau thì chúng có thể hợp nhất lại làm một. Vì tế bào thực vật có thành tế bào, nên trước đây trong môt thời gian dài,người ta cho rằng kỹ thuật dung hợp protoplast chỉ giới hạn ở các tế bào động vật. Mãi cho đến năm 1960, sau những nghiên cứu thành công của Cocking với việc dung một hỗn hợp các enzyme để tách bỏ thành tế bào thực vật, thì kỹ thuật dung hợp protoplast mới được áp dụng ở thực vật. Tuy nhiên, nó chỉ thực sự phát triển mạnh mẽ và có xu hướng được ứng dụng trong chọn giống chỉ sau khi các kết quả nghiên cứu về việc tái sinh hoàn chỉnh cây thuốc lá từ protoplast của Takebe (1971) và việc tái sinh cây thuốc lá lai do dung hợp protoplast giữa 2 loài N. tabacum và N. langsdorffi của Carlson (1972).

II. Đại cương về lai tế bào soma và công nghệ tế bào thực vật Tế bào thực vật khác biệt với tế bào động vật về nhiều đặc tính trong đó có đặc tính là tế bào thực vật có thành cellulose bao quanh (cell wall) sau đó đến màng nguyên sinh (membrane). Thành cellulose giữ cho tế bào thực vật có hình dáng nhất định, còn các hợp chất pectin nằm trong thành có nhiệm vụ liên kết gắn các tế bào với nhau thành mô. Màng nguyên sinh cho phép protoplast có thể hấp thu vào tế bào các đại phân tử (acid nucleic, protein) thậm chí cả các cơ quan tử như lục lạp, ty thể. Nếu để các

158

protoplast cạnh nhau, chúng có thể hòa làm một, đó là hiện tượng dung hợp tế bào. Nếu các protoplast có nguồn gốc từ các tế bào soma thuộc các giống, loài hoặc chi dung hợp lại thì có thể dẫn đến hiện tượng lai tế bào soma. Sự ra đời của kỹ thuật protoplast cho phép tạo ra những tái tổ hợp di truyền giữa các đơn vị phân loại xa (loài hay chi) mà mà bằng phương pháp lai hữu tính khó hoặc không thể đạt được. Trong quá trình dung hợp, bên cạnh sự kết hợp của các genome nhân, còn có thể xảy ra sự hợp nhất tế bào chất giữa các protoplast. Nhờ vậy, một số tính trạng do các gene trong tế bào chất kiểm soát như tính bất thu, có thể chuyển từ cây này sang cây khác nhờ kỹ thuật này.

III. Phương pháp tạo tế bào trần Có một số phương pháp phân lập protoplast sau đây: 1. Phương pháp cơ học Cho miếng mô vào dung dịch ưu trương để khối tế bào chất cùng màng sinh chất tách khỏi vỏ cellulose. sử dụng kim nhọn và dao phẩu tích để cắt các mô cùng lớp vỏ, sau đó ngâm vào môi trường nuôi cấy pha loãng, tế bào chất sẽ phồng to và tách khỏi vỏ cellulose ra ngoài, tạo thành các protoplast tự do. Phương pháp này cho hiệu suất thấp. Sự phân lập protoplast của thực vật bậc cao bằng phương pháp cơ học được Klercker tiến hành đầu tiên vào năm 1892. Nói chung, các protoplast được phân lập từ các tế bào không bào hóa cao của các mô dự trữ như chồi hành (bulbs) và vảy hành (scales) của các loài thân hành, rễ củ cải, vỏ quả giữa của dưa chuột và rễ củ cải đường. 2. Phương pháp sử dụng enzyme Phương pháp này có hiệu quả cao hơn rất nhiều so với phương pháp cơ học. Phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast. Do vách tế bào có thành phần gồm pectin, cellulose, hemicellulose, nên sử dụng enzyme pectinase, cellulase, hemicellulase để phân hủy lớp vỏ tạo tế bào trần. Tùy theo loại mô và cây được sử dụng, người ta thay đổi nồng độ enzyme thích hợp. Protoplast thực chất là tế bào trần không có thành nên có thể tách được từ nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận của cây (lá, rễ, hạt phấn …), callus, tế bào đơn,… Để protoplast không bị vỡ sau khi thành cellulose bị phân hủy, phải bổ sung những chất tăng áp lực vào dung dịch enzyme để duy trì thẩm thấu giữa nội bào và môi trường bên ngoài.

159

Hình 8.1. Protoplast thuốc lá

IV. Liên kết và dung hợp tế bào trần 1. Dung hợp protoplast và lai vô tính tế bào thực vật 1.1. Xử lý bằng NaNO3 Năm 1970, Power và cs. Đã dung NaNO3 (0,25 M) kích thích dung hợp hai protoplast. Carlson và cs. (1972) cũng dung phương pháp này để sản xuất cây lai đầu tiên (Nicotiana glance × N. langsdorffii). Tuy nhiên phương pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO3 không thích hợp với tế bào bị không bào hoá mạnh như protoplast từ nhu mô lá. 1.2. Xử lý bằng PEG Tác nhân kích thích dung hợp là PEG (polyethylene glycol). Nồng độ và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành công của thí nghiệm dung hợp. PEG có trọng lượng phân tử thấp (<100) không thể tạo ra một sự dính chặt chắc chắn, trong khi PEG trọng lượng phân tử 6000 cho hiệu quả dung hợp cao hơn. Xử lý PEG cùng với pH/Ca2+ có hiệu quả tăng tần số dung hợp và khả năng sống sót của protoplast. PEG có hai tác dụng: hoặc cung cấp cầu nối để Ca2+ có thể liên kết các bề mặt màng với nhau hoặc dẫn đến sự rối loạn điện tích bề mặt màng trong suốt quá trình rửa giải. 1.3. Dung hợp bằng điện Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp bằng hóa chất. Điều quan trọng hơn cả là dung hợp bằng điện không gây độc đối với tế bào như thường tìm thấy ở các protoplast hoặc các thể dị nhân được xử lý bằng PEG. Senda và cs. (1979) là những người đầu tiên nghiên cứu theo hướng dung hợp bằng điện ở Rauwolfia. Sau đó Zimmermann và Scheurich

160

(1981) cũng đã chứng minh rằng các protoplast có thể dung hợp bằng điện trường và đưa ra một protocol có thể sử dụng rộng rãi. Quá trình dung hợp bao gồm hai bước: Đầu tiên các protoplast được đưa vào một ngăn dung hợp nhỏ có 2 dây kim loại song song với nhau đóng vai trò là các điện cực. Tiếp theo, sử dụng điện áp thấp và trường AC dao động nhanh, kích thích các protoplast sắp xếp thành chuỗi tế bào giữa các điện cực. Phương pháp này cho phép tế bào tiếp xúc hoàn toàn với nhau trong một vài phút. Sau khi các tế bào xếp hàng hoàn chỉnh, quá trình dung hợp được thực hiện theo từng đợt ngắn của xung DC điện áp cao. Xung DC điện áp cao tạo ra sự phá vỡ thuận nghịch của màng nguyên sinh chất ở vị trí tiếp xúc của các tế bào, tạo ra sự dung hợp và tái tổ chức lại màng một cách hợp lý. Quá trình bắt đầu từ lúc đưa các protoplast vào bên trong ngăn và chuyển chúng lên môi trường nuôi cấy, có thể được hoàn chỉnh trong 5 phút hoặc ít hơn. Các thể dị nhân hình thành nhờ dung hợp bằng điện đã phân chia trong môi trường nuôi cấy và có khả năng tái sinh chồi hoặc cây lai soma.

Hình 8.2 Dung hợp protoplast và cytoplast

161

Hình 8.3 Dung hợp tế bào

V. Nuôi cấy tế bào lai và tái sinh cây 1. Nuôi cấy protoplast 1.1. Thành phần dinh dưỡng Môi trường nuôi cấy protoplast tương tự với môi trường nuôi cấy dịch huyền phù và callus. Tuy nhiên, nồng độ của Fe, Zn và ammonium dùng trong môi trường nuôi cấy mô ở thực vật có thể là quá cao đối với nuôi cấy protoplast. Hầu hết muối của môi trường B5 (Gamborg và cs, 1968) và MS (Murashige và Skoog, 1962) cải biến một ít là thích hợp. Tăng nồng độ Ca trong môi trường nuôi cấy protoplast từ 2-4 lần so với bình thường là có lợi cho việc duy trì tính toàn vẹn của màng tế bào (Torres 1989). Nồng độ sucrose thích hợp thường từ 3-5%, ở một số loài như thuốc lá, sucrose được sử dụng ở nồng độ thấp hơn chỉ khoảng 1,5%. Các vitamin dùng trong nuôi cấy protoplast cũng giống như trong môi trường nuôi cấy mô tiêu chuẩn. Auxin và cytokinin sử dụng ở các tổ hợp nồng độ khác nhau để cảm ứng tạo vách tế bào và kích thích phân chia các protoplast phân lập. Protoplast ngũ cốc đòi hỏi cung cấp 2,4-D riêng rẽ hoặc tốt hơn là phải phối hợp với cytokinin. Tuy nhiên 2,4-D cũng như các auxin khác (NAAA, IAA) được sử dụng riêng rẽ thường làm mất tiềm năng phát sinh hình thái ở các callus có nguồn gốc protoplast. Các cytokinin thường được sử dụng là BAP, kinetin, 2-iP hoặc zeatin. Mặc dù tổ hợp hai loại hormone trên thay đổi tùy từng loài, nhưng nói chung trong nuôi cấy protoplast thì tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho phân chia tế bào, trong khi các protoplast có nguồn gốc từ những tế bào phân hóa cao

162

lại cần tỷ lệ kinetin/auxin cao để tái sinh cây. 1.2. Áp lực thẩm thấu của môi trường Trong quá trình phân lập và nuôi cấy, các protoplast cần được duy trì cân bằng áp lực thẩm thấu giữa môi trường và nội bào cho tới khi tái sinh được vách tế bào vững chắc. Trong cả hai trường hợp chênh lệch áp lực thẩm thấu giữa môi trường và nội bào theo hướng môi trường nhược trương hoặc ưu trương sẽ dẫn đến tình trạng protoplast bị vỡ hoặc teo lại. Các chất điều chỉnh áp lực thẩm thấu (thông thường là để tăng áp lực thẩm thấu) trong môi trường nuôi cấy protoplast và trong hỗn hợp enzyme là sorbitol, mannitol, glucose, hoặc sucrose. Các protoplast sẽ sinh trưởng ổn định hơn trong trong dịch được tăng nhẹ áp lực thẩm thấu. Đối với các protoplast thịt lá của ở ngũ cốc và đậu thì mannitol hoặc sorbitol là các nhân tố ổn định áp lực thẩm thấu thích hợp hơn cả, trong khi sucrose lại thích hợp hơn glucose hoặc mannitol trong nuôi cấy protoplast của khoai tây, đậu hoa (sweet pea), tước mạch (brome grass) và sắn. Trong nuôi cấy dịch huyền phù thuốc lá, galactose và fructose đã được sử dụng để điều chỉnh áp lực thẩm thấu. Các chất phân ly ion (KCl 335 mmol/L và MgSO4.7H2O 40 mmol/L) cải thiện tốt khả năng sống sót của protoplast. Thông thường các dung dịch enzyme được bổ sung các muối nhất định (CaCl2 5-100 mmol/L) song song với các nhân tố ổn định thẩm thấu không phân ly ion. Cocking và Peberdy (1974) đã phát triển dung dịch rửa protoplast (cell-protoplast washing, CPW) chứa muối và các nhân tố ổn định thẩm thấu thích hợp. Dung dịch CPW có thể được dùng trong suốt quá trình ủ enzyme và rửa protoplast. Thời gian ủ enzyme tùy thuộc vào nồng độ của nó trong dung dịch và loại nguyên liệu được sử dụng. 1.3. Mật độ dàn trải protoplast Mật độ protoplast tối ưu là từ 1×104 đến 1×105/mL. Tuy nhiên, các thí nghiệm lai soma (somatic hybridization) và phát sinh đột biến (mutagenesis) cần tạo dòng tế bào riêng rẽ, do đó phải dàn trải protoplast ở mật độ thấp hơn (100-500 protoplast/mL). Nuôi cấy ở mật độ thấp giúp dễ dàng phân lập và xác định các khuẩn lạc lai khi có mặt của hệ thống chọn lọc. Kao và Michayluk (1975) đã xây dựng môi trường nuôi cấy protoplast (KM 8p) (Bảng 6.2) trong đó các protoplast được nuôi cấy riêng rẽ (ví dụ: Vicia hajastana) có khả năng phân chia cho tới khi tạo thành callus. Môi trường này còn kích thích phân chia nhanh hơn ở các protoplast thịt lá của cỏ linh lăng (alfalfa), đậu (pea), khoai tây, và sản phẩm dung hợp khai tây + cà chua (potato + tomato) được nuôi cấy dàn trải ở mật độ thấp. Các protoplast nuôi cấy trên môi trường này được đặt trong tối vì môi trường

163

1.3.1. Kỹ thuật tầng nuôi dưỡng Một hướng khác trong nuôi cấy protoplast ở mật độ thấp là kỹ thuật tầng nuôi dưỡng (feeder layer technique). Raveh và cs (1973) đã chuẫn bị tầng tế bào nuôi dưỡng bằng cách chiếu xạ tia X (2×103 R) lên các protoplast dịch huyền phù tế bào của thuốc lá, khi đó sự phân chia của tế bào bị ức chế nhưng vẫn cho phép chúng duy trì các hoạt động trao đổi chất. Các protoplast bị chiếu xạ sẽ được rửa sạch ba lần và sau đó dàn trải chúng trên môi trường có agar mềm (soft agar) ở mật độ 2,4×104/mL. Nuôi cấy trải (plating) các protoplast không qua chiếu xạ ở mật độ thấp (10-100 protoplast/mL) trên tầng nuôi dưỡng này. 1.3.2. Đồng nuôi cấy các protoplast Các protoplast của 2 loài khác nhau được nuôi cấy chung (co-culture) để kích thích sự sinh trưởng của chúng hoặc của tế bào lai. Nói chung, phương pháp đồng nuôi cấy được sử dụng trong những thí nghiệm mà các callus hình thành từ 2 loại protoplast có thể phân biệt hình thái được. Ví dụ: Các tế bào lai phân lập một cách cơ học (mechanically isolated hybrid cells) được nuôi cấy cùng với các protoplast phân lập từ chủng bạch tạng (albino strain) sẽ phát triển thành các khuẩn lạc màu xanh là loại khuẩn lạc dễ phân biệt với các khuẩn lạc không có màu xanh của chủng bạch tạng. 1.3.3. Nuôi cấy vi giọt Kỹ thuật nuôi cấy vi giọt (microdrop culture) đã thành công ở trường hợp nuôi cấy các tế bào lai của Thuốc lá + đậu tương (Nicotiana glauca + Glycine max) và Arabidopsis thaliana + Brassica campestris. Kỹ thuật này cần đĩa nuôi cấy Cuprak được thiết kế đặc biệt gồm có một ngăn bên ngoài nhỏ và một ngăn bên trong lớn hơn. Các protoplast riêng rẽ hoặc các thể dị nhân trong giọt môi trường dinh dưỡng (khoảng 0,25-25 µL) được chuyển bằng pipette Drummond vào mỗi ngăn bên trong của đĩa Cuprak. Ngăn bên ngoài chứa đầy nước vô trùng để duy trì độ ẩm bên trong đĩa. Sau khi đậy nắp, đĩa được quấn giấy parafilm, giữ ở điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tối thích. Tỷ lệ tế bào/dung tích môi trường nuôi cấy thích hợp tương đương mật độ 2-4×103/mL. Nếu tăng kích thước giọt (~ 25 µL), tức là giảm mật độ dàn trải sẽ cho hiệu quả nuôi cấy kém hơn. 2. Tái sinh cây từ protoplast 2.1.. Tạo vách tế bào Quá trình hình thành vách tế bào có thể hoàn chỉnh trong vòng hai đến một vài ngày mặc dù các protoplast trong nuôi cấy thường bắt đầu tái sinh vách tế bào ngay sau khi phân lập một vài giờ. Vách tế bào được tạo thành

164

2.2. Phát triển callus/cây hoàn chỉnh Ngay sau khi tạo vách tế bào chung quanh protoplast, các tế bào được tái cấu trúc đã tăng kích thước và sau một tuần xuất hiện sự phân chia tế bào đầu tiên. Sau 2-3 tuần, các khuẩn lạc tế bào có kích thước lớn (macroscopic) được tạo thành và có thể cấy chuyển chúng lên môi trường không có sự điều chỉnh áp lực thẩm thấu (osmotic-free) để phát triển callus. Các callus này được cảm ứng để phân hóa cơ quan, hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh.

Hình 8.4 Protoplast sau khi dung hợp được tái sinh (màu sáng)

Kể từ khi các loài thuộc họ Solanaceae được phân lập và tái sinh cây thành công đầu tiên ở cây thuốc lá (Takebe 1971), đến nay người ta đã thành công ở nhiều họ khác nhau như các loài legume, các cây trồng ăn quả và lấy sợi (fibre and pulp crops), các loài cây gỗ, và thậm chí các loài ngũ cốc như Pennisetum, lúa và lúa mì.

VI. Chọn lọc các tế bào lai và xác định các dòng tế bào lai và callus 1. Chọn lọc các thể lai soma 1.1. Phương pháp mẫn cảm với dược phẩm Power và cs. (1976) ứng dụng sự mẫn cảm khác nhau của protoplast phân lập từ Petunia parodii và P. hybrida đối với actinomycin D. Trên môi trường MS (Murashige Skoog, 1962), các protoplast tế bào thịt lá của P. hybrida phát triển mạnh tạo thành khối callus lớn, trong khi P. parodii các protoplast tạo thành khuẩn lạc bé. Bổ sung actinomycine D vào môi trường nuôi cấy có hiệu quả đối với khả năng tái sinh của protoplast P. paraodii, nhưng ở hybrida các protoplast lại mất khả năng phân chia

165

Mặc dù môi trường nuôi có bổ sung dược phẩm, các thể dị nhân vẫn có thể sinh trưởng và sau cùng phân hóa thành các cây lai soma. 1.2. Các đột biến khuyết dưỡng Chọn lọc các thể lai soma nhờ sự bổ sung di truyền của các đột biến khuyết dưỡng. Phương pháp này chỉ thích hợp khi các dòng lai mong muốn sống sót trên môi trường tối thiểu. Mặc dù phương pháp này ứng dụng cho thực vật bậc cao có một số khó khăn, nhưng Glimelius và cs (1978) đã thành công trong việc chọn lọc một số lượng lớn các thể lai soma bằng cách sử dụng các protoplast khuyết tật enzyme nitrate reductase và các dòng đột biến thuốc lá kháng chlorate. Các protoplast của hai đột biến khác nhau này đã được dung hợp và nuôi cấy trên môi trường chứa nitrate. Trong thí nghiệm đối chứng, các protoplast bố mẹ không sinh trưởng khi có mặt nitrate trong khi các sản phẩm dung hợp đã tái sinh cây 1.3. Chọn lọc bổ sung di truyền Dùng phương thức chọn lọc bằng mắt để phân lập các tế bào lai phát triển trên môi trường nuôi cấy có thành phần gây mẫn cảm đối với các protoplast bố mẹ. Trong nghiên cứu của Cocking (1977), khi dung hợp protoplast giữa dạng hoang dại của Petunia parodii với protoplast bạch tạng albino phân lập từ nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của P. hybrida, P. inflata và P. parviflora trong các thí nghiệm riêng rẽ. Trong tất cả các tổ hợp này, protoplast màu xanh của parodii bị đào thải ở giai đoạn khuẩn lạc có kích thước nhỏ, trong khi các protoplast của các loại bố mẹ khác lại phát triển thành các khuẩn lạc không màu. Trong khi đó, các thể lai sinh sản thành các callus màu xanh và sau đó thành cây lai soma. Phương pháp này cũng dùng để lai soma khác loài ở các chi Daucus, Datura và các chi khác. Hiện tượng bổ sung di truyền trong quá trình dinh dưỡng được dùng rộng rãi và có hiệu quả để nhận biết các sản phẩm dung hợp, như sử dụng các đột biến bạch tạng hay thiếu hụt diệp lục, các gen đánh dấu có liên quan đến tính kháng các chất kháng sinh (Hamil, 1984) hoặc kháng chất diệt cỏ (Evola, 1983). Có trường hợp, khi được nuôi cấy trong môi trường thiếu hormon ngoại sinh thì các tế bào lai có khả năng cho callus và tái sinh cây, còn các tế bào của từng dạng bố mẹ lại không có khả năng ấy (Power, 1977; Shenck, 1982). 1.4. Sử dụng các đột biến bach tạng có các gene không allele cho chọn lọc bổ sung di truyền. Melchers và Labib (1974) đã tiến hành thí nghiệm bằng cách sử dụng

166

protoplast của hai giống thuốc lá Nicotiana tabacum: giống s (sublathal) không tổng hợp được diệp lục bình thường nên rất mẫn cảm với ánh sáng cường độ cao. Giống v (virescent) cũng không tạo được lục lạp bình thường, lá non trắng hoàn toàn và mẫn cảm với ánh sáng cường độ cao. Hai giống này là hai dạng đột biến có thể bổ sung cho nhau khi lai tạo, nghĩa là nuôi cấy ở ánh sáng 800 lux cho tới giai đoạn ra hoa, sau đó thụ phấn chéo sẽ được cây lai F1 có lá xanh bình thường và chịu ánh sáng cao. 2. Chọn lọc tế bào lai Bình thường các tế bào lai được tạo thành trong quá trình dung hợp protoplast từ hai loài xa nhau về quan hệ họ hàng. Cây tái sinh từ tế bào lai như thế sẽ có hệ gene lục lạp (plastome) từ cả hai loài bố mẹ, nhưng hệ gene chức năng chỉ của một loài do có sự đào thải một bộ nhiễm sắc thể. Vì thế, cây có nguồn gốc từ những cây tái sinh đó sẽ là thể lai di truyền chỉ cho các tính trạng tế bào chất. Để chuyển gene tế bào chất một cách hiệu quả, các tế bào của loài cho tế bào chất sẽ được chiếu xạ. Chiếu xạ bằng tia X hoặc γ từ 50-300 Gy có hiệu quả từng phần hoặc bất hoạt hoàn toàn các tế bào cho. Xử lý theo phương thức này ngăn chặn hoàn toàn sự phân chia của các tế bào không dung hợp và có vai trò như một nhân tố chọn lọc để sàng lọc các tế bào lai. Phương thức dung hợp dùng tia γ được ứng dụng thành công trong lai khác loài, khác chi ở cả hai mức độ nhân và cơ quan tử (Nigrutin và cs, 1989). Tác động qua lại giữa nhân và tế bào chất có thể xuất hiện ngay cả trong những sản phẩm dung hợp dùng tia γ khi chúng được xuất phát từ những protoplast thuộc những loài hữu tính không tương hợp nhau. Sự phân chia ở các sản phẩm dung hợp và các tế bào tiếp theo sau sẽ làm tăng khuẩn lạc tế bào mà ở đó sự đào thải không định hướng nhiễm sắc thể đã xuất hiện từ phần cho. Tuy nhiên, giới hạn đào thải phụ thuộc vào hệ gene cho và các điều kiện nuôi cấy xác định. 3. Con lai do sự dung hợp nhân Nhiều dạng con lai soma do kết quả của sự hợp nhất nhân (nuclear hybrid) đã được tạo ra giữa loài cây trồng với loài hoang dại ở chi cải dầu. Ví dụ lai giữa loài B. nigra chứa 1 bộ gene (B) với loài B. napus chứa 2 bộ gene (AC). Bằng phương pháp dung hợp protoplast giữa hai loài này đã tạo ra dạng con lai chứa 3 bộ gene (ABC) Khi dung hợp protoplast giữa Eruca sativa với B. napus người ta đã chuyển được gene kháng côn trùng và chịu khô có ở Eruca vào con lai. Ở khoai tây (Solanum tuberosum), khả năng ứng dụng kỹ thuật dung hợp protoplast là rất lớn. Khi dung hợp protoplast giuwz S. tuberosum

167

(4n) với loài S. brevidens (2n) không cho củ, người ta đã thu được dạng con lai khác loài (6n) cho củ, hữu thụ và có khả năng lai được với S. tuberosum. Con lai này nhận được các gene quý từ loài hoang dại là gene kháng virus gây bệnh xoắn lá ở khoai tây trồng và gene kháng bệnh vi khuẩn ở củ. Cần lưu ý, mặc dù sự dung hợp protoplast giữa các cây thuộc các loài, thậm chí các chi khác nhau xảy ra bình thường nhưng việc tái sinh cây có thể không xảy ra hoặc con lai có sức sống thấp hoặc bất thụ. Trong nhiều trường hợp, gần như toàn bộ hoặc một phần nhiễm sắc thể của một trong hai dạng bố mẹ bị mất đi.. Con lai chỉ nhận được một số nhiễm sắc thể hay một đoạn nhiễm sắc thể của một trong hai dạng bố mẹ, nhưng chúng lại chứa những gene có ích cho mực đích chọn giống. 4. Con lai do sự dung hợp tế bào chất Ty lạp thể chứa bộ gene tương đối nhỏ so với hệ gene trong nhân. Chúng chứa lượng DNA mã hóa cho khoảng 10% polypeptid đảm bảo cho chức năng của các cơ quan tử, 90% còn lại là do các gene nhân mã hóa và được chuyển qua màng của các cơ quan tử. các cơ quan tử được phân bố một cách ngẫu nhiên vào các tế bào con qua các thế hệ tế bào. Trong sinh sản hữu tính, các cơ quan tử gần như chỉ được chuyển qua giao tử cái. Trong khi đó nhờ sự dung hợp protoplast, có hiện tượng đóng góp như nhau của các cơ quan tử có trong tế bào chất từ hai dạng bố mẹ. Sản phẩm dung hợp có thể chứa nhân, ty thể và lạp thể từ cả hai dạng bố mẹ. Nhưng nó cũng có thể chứa nhân của một dạng bố mẹ còn tế bào chất thì lại của cả hai. Dạng con lai như vậy có tên là con lai tế bào chất hay cybrid

VI. Ưu thế của lai soma và một số thành tựu của kỹ thuật này trên thế giới và ở Việt Nam Trong hơn hai thập kỷ qua, người ta đã đạt được nhiều tiến bộ trong kỹ thuật dung hợp protoplast, từ việc tách, dung hợp protoplast đến tái sinh cây ở nhiều loài cây trồng. Dung hợp protoplast là con đường hiệu quả để khắc phục nhiều khó khăn gặp phải trong quá trình lai hữu tính khác loài hoặc khác chi. Kỹ thuật này cũng cho phép tạo ra những thể tái tổ hợp gene ở những loài đa bội hoặc có cơ quan sinh sản hữu tính phát triển kém. Một số thành tựu của việc ứng dụng kỹ thuật dung hợp protoplast đối với việc cải tiến giống cây trồng: - Ở chi cải Brassica, nhờ dung hợp protoplast, đã tổng hợp được loài Brassica napus từ hai loài B. oleracea và B. campestris. - Ở thuốc lá, loài Nicotiana tabacum dễ lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh

168

đốm lửa và nấm đen, trong khi đó loài N. rustica chống được các bệnh trên. Con lai hữu tính giữa hai loài này bất thụ, nhưng con lai soma giữa chúng lại hữu thụ và có khả năng kháng các bệnh trên. - Ở các cây họ cà, nhờ kỹ thuật dung hợp protoplast người ta đã tạo ra được con lai giữa khoai tây với các loài khác của chi Solanum có tính kháng bệnh cao, vốn không lai được với nhau bằng phương pháp hữu tính. - Ở cây họ đậu, bằng kỹ thuật dung hợp protoplast người ta đã tạo ra được con lai soma giữa cỏ ba lá (Trifolium repens) với cây Medi (Medicagosativa) và sử dụng chúng trong việc sản xuất chất tanin từ lá. Tương tự như vậy, con lai soma giữa đậu tương trồng với các loài hoang dại, như giữa Glycine max với G. tomentella, cũng đã được tạo ra. - Ở cây lúa, trong chương trình hợp tác giữa IRRI với Trường Đại học Nottingham, nhờ sử dụng kỹ thuật protoplast người ta đã tạo được một số giống lúa có tính bất dục tế bào chất nhưng lại có khả năng chống chịu sâu bệnh và nhiệt độ thấp. Riêng đối với lúa mì, mặc dầu người ta đã bỏ ra nhiều công sức nhưng cho đến nay những kết quả thu được trong lĩnh vực này còn rất hạn chế.

Câu hỏi ôn tập 1. Nêu các phương pháp phân lập protoplast. 2. Hãy cho biết các ưu điểm của phương pháp dung hợp protoplast bằng điện. 3. Trình bày các giai đoạn của quá trình tái sinh cây từ protoplast. 4. Hãy nêu các phương pháp được sử dụng trong chọn lọc các thể lai soma. 5. Hãy cho biết một số thành tự về kỹ thuật dung hợp protoplast.

Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Như Hiền. 2002. Di truyền và công nghệ tế bào soma. NXB Khoa học và Kỹ thuật. 2. Trần Đình Long. 1997. Chọn giống cây trồng. NXB Nông nghiệp. 3. Nguyễn Hoàng Lộc. 1998. Bài giảng nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Đại học Khoa học Huế. 4. Lê Duy Thành. 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB Khoa học và Kỹ thuật.

169

Chương 9

Kỹ thuật Di truyền trong Chọn giống Thực vật I. Mở đầu Một trong những hướng phát triển gần đây nhất của nuôi cấy mô và tế bào thực vật là biến nạp và biểu hiện các gene ngoại lai trong tế bào thực vật. Biến nạp của các tế bào vi khuẩn được thực hiện bằng cách chuyển DNA từ một tế bào vi khuẩn khác và sự hợp nhất sau đó của DNA ngoại lai này trong nguyên liệu di truyền của vật chủ đã được thiết lập tốt. Tuy nhiên, việc cải biến di truyền ở thực vật bậc cao bằng cách đưa DNA ngoại lai vào trong các tế bào của chúng là một quá trình rất phức tạp. Sử dụng enzyme hạn chế (restriction endonucleases) để cắt phân tử DNA sợi đôi thành những đoạn nhỏ riêng rẽ, phát triển kỹ thuật lai DNA-DNA và các gene chỉ thị (marker genes) cho phép chọn lọc các tế bào biến nạp có khả năng hợp nhất DNA ngoại lai trong tế bào ở Monera, nấm, động vật và thực vật bậc cao. Những nghiên cứu gần đây cho thấy thông tin di truyền mới được biến nạp vào các thực vật eukaryote biểu hiện không chỉ ở mức độ tế bào và sau đó mức độ cơ thể hoàn chỉnh mà còn có thể truyền lại cho các thế hệ sau của chúng. Ý nghĩa thực tiễn của quá trình biến nạp là tạo ra những tính trạng mới hoặc cải tiến những tính trạng đã có. Về một số phương diện nào đó, kỹ thuật này có ưu điểm hơn so với phương pháp chọn giống bằng lai hữu tính. Nếu ở phương pháp lai hữu tính, để chuyển được một gene hay một số gene từ một giống này, qua một giống khác người ta phải tiến hành một quy trình lai trở lại tốn rất nhiều thời gian và công sức. Trong khi đó kỹ thuật chuyển gene không những cho phép vượt qua được những trở ngại do sự xa cách về quan hệ họ hàng giữa thể cho gene và nhận gene mà còn cho phép cây trồng tiếp nhận một cách nhanh chóng những gene mới do con người thiết kế. Có thể thực hiện được điều này bằng cách sử dụng các hệ thống vector sinh học, nhưng không phải đều có thể thực hiện được với bất kỳ cây trồng nào. Việc tái sinh các cây được chuyển gene chủ yếu phụ thuộc vào các tế bào soma có tính toàn thể, mà không phải là tế bào soma nào cũng có khả năng đó. Thành tựu nổi bậc của công nghệ gene ở thực vật bậc cao là tái sinh được cây biến nạp gene đầu tiên vào đầu thập niên 1980. Đến nay, các kỹ thuật phân tử đã được ứng dụng thành công ở nhiều loài khác nhau. Lúc đầu người ta sử dụng các gene chỉ thị để biến nạp, nhưng nay đã thay thế bằng các gene quan trọng có giá trị kinh tế.nhằm mục đích cải thiện phẩm chất cây trồng. Hai nhân tố then chốt thúc đẩy sự phát triển của công nghệ gene ở thực vật bậc cao là: các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ những tế bào biến nạp và các phương pháp đưa DNA ngoại lai vào các

170

Các chỉ thị biến nạp gene đầu tiên đã sử dụng Agrobacterium tumefaciens để đưa vào cây thuốc lá các gene kháng kháng sinh. Agrobacterium là vật truyền hữu hiệu để đưa các DNA ngoại lai vào trong các loài thuộc họ Solanaceae, nhưng ở một số cây trồng khác quan trọng hơn, việc sử dụng nó còn gặp nhiều hạn chế. Trở ngại lớn nhất là tính đặc trưng vật chủ của Agrobacterium, mặc dù những tiến bộ gần đây đã cho phép ứng dụng thành công trên một số giống cây trồng. Sự phát triển của các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ callus và protoplast đã mở ra một hướng mới cho công nghệ di truyền thực vật thông qua các phương pháp biến nạp gene trực tiếp. Nhờ sự phát triển của phương pháp bắn gene (particle bombardment) dựa trên cơ sở tăng gia tốc của các hạt kim loại nặng mang nguyên liệu di truyền vào trong mô thực vật. Việc biến nạp ở các loài cây trồng gặp nhiều thuận lợi hơn. Các phương pháp biến nạp khác cũng có hiệu quả đối với các trường hợp đặc biệt, nhưng khả năng ứng dụng rộng rãi của chúng bị hạn chế. Chẳng hạn các phương pháp biến nạp gene bằng xung điện (electroporation) vào các mô được cắt nhỏ từng phần, phương pháp xử lý hoá học bằng PEG (polyethylene glycol), phương pháp vi tiêm (microinjection) đưa DNA ngoại lai trực tiếp vào tế bào, phương pháp dùng silicon carbide lắc với tế bào có tác dụng như các mũi kim nhỏ giúp DNA bên ngoài xâm nhập vào bên trong tế bào, phương pháp biến nạp gene qua ống phấn.... Kể từ khi tạo được cây chuyển gene đầu tiên, đến nay kỹ thuật này đã có những bước tiến rất lớn. Những thành công của nó không chỉ giới hạn ở những cây mang tính chất mô hình như thuốc lá và các cây họ cà, mf còn đạt được những kết quả ứng dụng ở một số cây trồng quan trọng. Vì thế chúng ta có cơ sở để hy vọng rằng trong tương lai kỹ thuật gene sẽ trở thành một công cụ hỗ trợ không thể thiếu được của chọn giống thực vật.

II. Kỹ thuật chuyển gene 1. Những nguyên tắc chung của kỹ thuật chuyển gene Có một số yếu tố sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gene. Không phải tất cả các tế bào trong cơ thể đều có tính toàn thể, các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gene lạ. Một loại cây nào đó có thể được biến nạp khi nó có khả năng tái sinh và chấp nhận sự biến nạp. Mô tế bào là một tập hợp của nhiều tế bào có phản ứng khác nhau khi gặp một yếu tố tác động đến. Một số ít tế bào trong cây có khả năng tái sinh và chấp nhận sự biến nạp. Những tế bào

171

khác chỉ có một trong hai khả năng ấy. Một số lớn các tế bào trong cơ thể có khả năng điều chỉnh được khả năng đó, một số khác ngược lại không thể làm được. Tương quan giữa các quần thể tế bào kiểu như vậy phụ thuộc vào loài, kiểu gene, cơ quan, thậm chí tùy từng vùng trong một cơ quan. Một trong các cơ chế có thể chuyển các tế bào từ trạng thái tiềm ẩn sang trạng thái thực sự có khả năng tái sinh là sự xuất hiện thương tổn trên cơ thể. Phản ứng với sự thương tổn có lẽ là cơ sở sinh học cho sự tăng sinh và tái sinh của các tế bào soma. Tuy nhiên phản ứng này khác nhau giữa các loài cây, cũng như giữa các nhóm tế bào trong cùng một cây. Nói chung các cây hòa thảo và các cây họ đậu phản ứng này xảy ra rất yếu. Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA. Vì thế gene chỉ có thể được đưa vào tế bào thông qua Agrobacterium, virus, bằng phương pháp vi tiêm hay bằng súng bắn gene. Việc chuyển gene chỉ thành công khi đưa được gene vào nhóm tế bào có khả năng tái sinh và tiếp nhận gene lạ. Tuy nhiên, khả năng biến nạp không có liên quan chặt chẽ với khả năng biểu hiện của gene được biến nạp. DNA không phải của virus có thể liên kết với hệ gene của vật chủ và không di chuyển từ tế bào này qua tế bào khác. Trong khi đó các DNA của virus có thể không liên kết với hệ gene của vật chủ, thậm chí cả khi có rất nhiều bản sao trong tế bào chủ. DNA, RNA của virus di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác và có thể lan truyền khắp trong cây trừ vùng mô phân sinh. - Phản ứng của các loại tế bào thực vật với quá trình chuyển gene Mục đích chính của một quy trình chuyển gene là đưa một cách ổn định một đoạn DNA vào hệ gene nhân của các tế bào có khả năng phát triển thành một cây biến nạp. Ở nhiều loài thực vật, sự xác định kiểu tế bào nào trong cây có khả năng tiếp nhận sự biến nạp là điều khó khăn. Hạt phấn hay tế bào trứng sau khi được biến nạp có thể được dùng để tạo ra cây biến nạp hoàn toàn thông qua quá trình thụ tinh bình thường. Hạt phấn thường được coi là đối tượng lý tưởng để gây biến nạp. Trong khi đó, việc biến nạp gene vào hợp tử in vivo hay in vitro lại gặp nhiều khó khăn. Trong trường hợp này, thường phải kết hợp với kỹ thuật cứu phôi. Việc biến nạp đối với các tế bào đơn của các mô phức tạp như phôi hay mô phân sinh thường cho ra những cây khảm. Tính toàn năng của tế bào thực vật đã tạo điều kiện cho sự tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro qua quá trình phát sinh cơ quan (hình thành chồi) hay phát sinh phôi. Các chồi bất định hay các phôi được hình thành từ các tế bào đơn được hoạt hóa là những bộ phận dễ dàng tiếp nhận sự biến nạp và có khả năng cho những cây biến nạp hoàn chỉnh. 2. Các phương pháp chuyển gene ở cây trồng Khi sử dụng nấm men, nấm, động vật hoặc thực vật như là vật chủ cho tạo dòng, cần có phương pháp đưa DNA vào trong tế bào của những sinh

172

vật này. Nói chung ở một số loài vi khuẩn tế bào được xử lý bằng dung dịch muối. Ở tế bào nấm men, sự tiếp nhận DNA tăng lên khi tiếp xúc với lithium chloride hoặc lithium acetat. Vì vậy người ta sử dụng phương pháp này thường xuyên khi biến nạp nấm men (Saccharomyce cerevisiae). Đối với phần lớn sinh vật bậc cao hơn đòi hỏi phương pháp tinh vi hơn. 2.1. Biến nạp vào tế bào riêng lẻ Cản trở lớn nhất ở sự tiếp nhận DNA ở phần lớn sinh vật là thành tế bào. Tế bào động vật không có thành. Trong nuôi cấy, chúng được biến nạp dễ dàng, đặc biệt khi DNA gắn trên bề mặt của tế bào nhờ kết tủa với calcium phosphat (hình 9.1a). Các enzyme được sử dụng làm mất thành tế bào của nấm men, các loại nấm khác, tế bào thực vật, và dưới những điều kiện thích hợp, người ta có thể tạo ra tế bào trần (hình 9.1b). Tế bào trần tiếp nhận DNA nói chung dễ dàng. Có thể thực hiện chuyển nạp bằng những phương pháp khác nhau:

Hình 9.1 Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào

2.1.1. Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes là hai loài vi khuẩn gây bệnh cho thực vật được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gene ngoại lai vào mô và tế bào thực vật. A. tumefaciens có chứa một plasmid lớn có kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây (Hình 9.2).

173

Tạo khối u

Tổng hợp nopaline

Sử dụng nopaline Các chức năng chuyển T-DNA

Điểm xuất phát sao chép

Hình 9.2 Cấu trúc của Ti-plasmid

Hình 9.3 Agrobacterium gây khối u ở thực vật

Khi cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện rõ nhất là các khối u được hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm (Hình 9.3). Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không cần phải có sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng này có được do A. tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid là T-DNA xâm nhập vào hệ gene của cây bị bệnh. 2.1.1.1. Ti-plasmid là nhân tố gây biến nạp tự nhiên ở thực vật

174

Phần lớn các loại Ti-plasmid gồm 4 vùng A, B, C, D. Vùng A luôn luôn được truyền sang tế bào thực vật nên được gọi là TDNA (Transferred DNA), có chứa 2 hệ gene: Hệ gene gây khối u onc (oncogeneic), chứa ít nhất 3 gene chịu trách nhiệm tổng hợp các hormone auxin và cytokinin và do đó có liên quan đến việc sản sinh ra và duy trì sự phân chia tế bào liên tục. Thứ hai là hệ gene mã hoá cho một số enzyme điều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các acid amine hay đường gọi là opine. Hai loại enzyme đã được nghiên cứu kỹ nhất là octopine synthetase và nopaline synthetase. Vùng B có liên quan đến sự tái sinh Vùng C có liên quan đến sự tiếp hợp Vùng D là vùng độc có chứa các gene vir, giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển T-DNA vào hệ gene nhân của tế bào thực vật Ngoài ra mỗi Ti-plasmid còn chứa các gene nằm ngoài vùng T-DNA mã hoá cho các enzyme phân giải ocpine để làm nguồn dinh dưỡng cacbon và nitrogen cho vi khuẩn. 2.1.1.2. T-DNA và các trật tự biên 25 bp Vùng T-DNA có kích thước từ 10 kb đến 20 kb, nằm kẹp giữ hai trật tự 25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi là biên trái (left border – LB) và biên phải (right border – RB). Toàn bộ phần giới hạn giữa hai đoạn biên này đều được chuyển sang tế bào thực vật. LB và RB là những yếu tố cần thiết để định hướng cho sự chuyển DNA. Việc mất đi 6 bp đầu tiên hoặc 10 bp cuối cùng trong số 25 bp đều ngăn cản sự chuyển của T-DNA. Quá trình chuyển của T-DNA được bắt đầu từ vị trí RB và kết thúc ở vị trí LB. Sự định hướng này là rất quan trọng nếu không việc chuyển sẽ kém hiệu quả. Trong các gene được mã hoá ở vùng T-DNA có 3 gene rất quan trọng trong việc phát triển khối u: một gene mã hoá cho việc chuyển enzyme AMP-isopentonyl transferase và 2 gene mã hoá cho enzyme tham gia vào sinh tổng hợp auxin (tryptophane-2 mono oxygenase và acetamid hydrolase). Sự hoạt động của các gene này tạo điều kiện cho sự phát triển của tế bào thực vật có sự phụ thuộc vào auxin và cytokinin. Đặc điểm này được sử dụng để chọn lọc các tế bào được biến nạp từ trong phần lớn các tế bào không được biến nạp. 2.1.1.3. Vùng vir Chính hoạt động của vùng vir đóng vai trò quan trọng cho việc chuyển T-DNA sang tế bào thực vật. Nó có kích thước khoảng 40 kb và gồm 6 operon: virA, B, D và G là toàn toàn cần thiết cho việc tạo ra độc tính, còn virC và E có liên quan với việc hình thành khối u. Trừ virG và A, các operon khác đều là đa cistron. Nói chung gene virA biểu hiện ở mọi điều kiện, gene virC biểu hiện thấp ở các tế bào sinh dưỡng nhưng thể hiện rất mạnh ở các dịch chiết từ các mô bị tổn thương. Hoạt động của các operon này có liên quan chặt chẽ với sự có mặt của các hợp chất phenol

175

2.1.1.4. Quá trình chuyển T-DNA Đoạn T-DNA muốn được chuyển, trước tiên nó cần phải được hoạt hoá nhờ hoạt động của các gene vir. Hoạt động này xảy ra khi Agrobacterium bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được chiết ra từ vết thương của cây hoặc từ các tế bào nuôi cấy hoặc protoplast. Đầu tiên là sự hoạt động của các sản phẩm được tạo ra từ gene virA (protein virA). Protein này nằm ở màng trong của tế bào Agrobacterium, đóng vai trò như là một chất thụ cảm đối với acetosyringon có trong môi trường. Tín hiệu này sẽ được truyền dẫn qua sự hoạt hoá (có lẽ bằng việc phosphoryl hoá) gene virG. Protein virG sau đó lại gắn vào gene chỉ huy nằm sát gene khởi động thuộc các gene vir khác. Bằng cách như vậy, protein của gene virG đã được hoạt hoá làm tăng quá trình phiên mã của chính nó, đồng thời làm giảm quá trình này của các operon B, C, D và E. Trong tiến trình chuyển T-DNA, ở giai đoạn đầu xuất hiện các vết cắt Ti-plasmid tại hai trật tự biên 25 bp, ở vị trí base thứ ba và thứ tư của mạch đơn phía dưới mới được tổng hợp. Từ đó, một mạch T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay vào đó là một mạch đơn mới được tổng hợp theo hướng 5’-3’, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải. Điều này giải thích tại sao trật tự biên phải lại cần thiết cho sự chuyển T-DNA. Operon D chủ yếu mã hoá cho một loại endonuclease tạo ra các vết cắt nói trên tại hai trật tự biên. Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cường nhờ sự tương tác giữa protein virD2 với một hoặc hai protein do gene virC mã hoá. Protein gene vir E2 gắn vào mạch đơn T-DNA sau khi được cắt ra làm cho nó ổn định trong quá trình chuyển vào nhân tế bào thực vật. Phức hợp protein-mạch đơn T-DNA là cấu trúc cần thiết cho việc chuyển TDNA sang tế bào thực vật và nó phải được sản sinh ra từ Agrobacterium. Gene virB mã hoá cho ít nhất 11 protein để hình thành nên một cầu nối, cho phức hợp trên chuyển từ Agrobacterium sang tế bào thực vật. Tế bào thực vật bị thương tổn là nơi chuyển gene T-DNA. Trong các mô được sử dung để chuyển gene, lá là nguồn tốt nhất cho tái sinh (Hình 9.4). Những tế bào ở mép lá bắt đầu tái sinh và khi những đĩa lá này được nuôi cấy trên môi trường chứa Agrobacterium, những tế bào này rất hiệu quả cho tác nhân chuyển gene. Kỹ thuật đĩa lá được sử dụng hiệu quả cho chuyển gene vào thực vật nhờ sử dụng Ti-plasmid của Agrobacterium. 2.1.2. Chuyển nạp gene trực tiếp vào protoplast Hầu hết các tế bào thực vật được bao bọc bởi thành cellulose nên khó để hấp thụ các phân tử DNA ngoài vào tế bào. Tuy nhiên thành tế bào có thể làm tan nhờ xử lý tế bào với enzyme cellulase (Hình 9.5). Kết quả thu được các protoplast chỉ còn màng sinh chất rất thuận lợi cho các thao tác

176

Hình 9.4 Tái sinh cây từ đĩa lá nhiễm Agrobacterium

Mặc dầu protoplast đã được sử dụng thành công cho nhiều loài, tuy nhiên hầu hết các cây nông nghiệp quan trọng như ngũ cốc là rất khó tái sinh từ protoplast. Gần đây đã thu được một vài thành công trong sinh trưởng ở lúa và ngô từ protoplast của nuôi cấy tế bào phát sinh phôi. Phôi thực vật sinh trưởng in vitro là nguồn tế bào quan trọng cho nuôi cấy. Các cây lúa và ngô hữu thụ được tạo thành từ những tế bào được thao tác di truyền thu được từ nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi. 2.1.2. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng xung điện Tế bào được đặt ở trong một thiết bị có hiệu điện thế cao, xung điện

177

2.1.3. Chuyển gene bằng phương pháp bắn gene

Hinh 9.5 Tái sinh cây từ protoplast

178

Đây là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới. Phương pháp này được Sanford (Cornell University, USA) đề xuất lần đầu tiên vào năm 1987. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng viên đạn có kích thước hiển vi, tỷ trọng cao đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào. Hạt tungsten hoặc vàng có đường kính 1-1,5 μm được dùng làm vi đạn (microprojectile). Vi đạn được trộn với DNA theo một tỷ lệ thích hợp cùng với các chất phụ gia và sau khi kết tủa DNA bao quang vi đạn, hỗn hợp được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng kích thước 0,5-0,8 cm. Đĩa kim loại được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) vừa khít với nòng súng. Thường đạn lớn làm bằng nhựa hoặc bông nén hay các vật liệu nhẹ. Khi bắn, áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao. Ra khỏi đầu nòng, một lưới thép mịn cản viên đạn lớn lại, nhưng các vi đạn vẫn tiếp tục quỹ đạo với gia tốc lớn đến đích và xuyên vào tế bào. Một tỷ lệ nhất định DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào và biểu hiện, thực hiện quá trình biến nạp gene (Hình 9.6).

Hình 9.6 Sơ đồ súng bắn gene

2.1.4. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng kỹ thuật vi tiêm (microinjection) Vi tiêm là kỹ thuật sử dụng phổ biến trong công nghệ tế bào động vật (animal cell biotechnology). Trên hiển vi trường, DNA plasmid có thể được tiêm vào protoplast và thực hiện biến nạp gene thành công ở khá nhiều đối tượng thực vật (Hình 9.7). Tuy nhiên, kỹ thuật này hiện nay ít được các phòng thí nghiệm sử dụng, vì thao tác vi tiêm dưới kính hiển vi đòi hỏi thiết bị vi thao tác (micromanipulator) cực nhạy, thiết bị kéo và mài kim tiêm từ các ống thủy tinh (puller) rất đắt tiền. Ngoài ra, nó còn đòi hỏi kỹ năng thao tác và sự kiên nhẫn cao của kỹ thuật viên.

Hình 9.7 Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng kỹ thuật vi tiêm

179

2.2. Biến nạp toàn bộ cơ thể Ở động vật và thực vật sản phẩm cuối cùng thường không phải là tế bào biến nạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn. Phần lớn thực vật được tái sinh dễ dàng bằng nuôi cấy mô tế bào. Tuy nhiên có vấn đề với phương pháp tái sinh cây một lá mầm như ngũ cốc và các loại cỏ khác. Từ một tế bào biến nạp duy nhất người ta có thể tạo ra một cây chuyển gene, trong đó mỗi tế bào của nó mang DNA tạo dòng và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau, sau khi nở hoa và tạo hạt. Tế bào động vật không thể tái sinh từ tế bào nuôi cấy, vì vậy người ta cần một phương pháp khác cho biến nạp động vật. Phương pháp tiêu chuẩn ở động vật có vú (ví dụ như chuột) là những trứng đã được thụ tinh được lấy ra từ ống dẫn trứng, DNA được đưa vào bằng phương pháp vi tiêm và tế bào biến nạp sau đó được nuôi cấy trở lại trong bộ phận sinh sản của cơ thể mẹ. 2.3 Một số thành tựu của việc tạo các cây trồng biến đổi gene trên thế giới và ở Việt nam 2.3.1. Một số loài cây trồng chính đã được biến nạp gene thành công Nói chung, hầu hết các loài thực vật đều có thể biến nạp được gene. Bảng 9.1. trình bày các loài cây trồng chính đã được biến nạp gene thành công. Thông thường hiệu quả biến nạp gene khác nhau tuỳ thuộc vào thừng loại cây trồng và quá trình biến nạp gene vẫn còn bị hạn chế ở nhiều loài. Ở đây chỉ minh hoạ các kết quả biến nạp gene thành công ở các giống cây trồng quan trọng. - Cây ngô: Cây ngô biến nạp gene đầu tiên tái sinh từ protoplast được biến nạp bằng xung điện đã bất thụ (Rhodes và cs 1988). Tuy nhiên, có thể dùng phôi ngô trong nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh các cây hữu thụ mang gene biến nạp, sử dụng phương pháp bắn gene và chọn lọc bằng chất diệt cỏ “bialaphos” đã cho kết quả là mô callus phát sinh các phôi được biến nạp gene. Các cây biến nạp gene hữu thụ đã được tái sinh, ổn định di truyền và biểu hiện gene bar (kháng chất diệt cỏ glufosinate không chọn lọc) cùng với hoạt tính chức năng của enzyme phosphinothricin acetyltransferase quan sát được trong những thế hệ sau. Hiện nay biến nạp gene ở ngô bằng phương pháp bắn gene đã được sử dụng rộng rãi. Gần đây các kết quả biến nạp gene gián tiếp ở ngô nhờ Agrobacterium cũng đã được thông báo. Các thể biến nạp gene của dòng ngô lai gần (inbredline) A188 đã được tái sinh sau khi nuôi cấy chung (cocultivation) giữa vector “super-binary” với phôi non. Tần số được thông báo ở dòng A188 là khoảng 5-30%. Các thể lai thế hệ thứ nhất giữa dòng A188 và 5 dòng lai gần khác được biến nạp với tần số khoảng 0,45,3% (tính theo số cây biến nạp gene độc lập/phôi).

180

Bảng 9.1. Các cây trồng chính đã được biến nạp gene TT

Loài

Phương pháp biến nạp gene

Thử nghiệm đồng ruộng

1

Chuối

Bắn gene/Agrobacterium

2

Luá mạch

Bắn gene

3

Đậu tây

Bắn gene

4

Canola

Bắn gene/Agrobacterium

5

Sắn

Bắn gene/Agrobacterium

6

Ngô

Bắn gene/Agrobacterium

Kháng côn trùng, chống chịu chất diệt cỏ

7

Bông

Bắn gene/Agrobacterium

Kháng côn trùng, chống chịu chất diệt cỏ

8

Đu đủ

Bắn gene/Agrobacterium

Kháng virus

9

Đậu phụng

Bắn gene/Agrobacterium

Kháng virus

10

Bạch dương

Bắn gene/Agrobacterium

Chống chịu chất diệt cỏ

11

Khoai tây

Agrobacterium

Kháng côn trùng, virus, chống chịu chất diệt cỏ

12

Lúa

Bắn gene/Agrobacterium

Chống chịu chất diệt cỏ

13

Đậu tương

Bắn gene/Agrobacterium

Chống chịu chất diệt cỏ

14

Bí

Bắn gene/Agrobacterium

Kháng virus

15

Củ cải đường

Agrobacterium

Chống chịu chất diệt cỏ

16

Mía

Bắn gene

-

17

Hướng dương

Bắn gene

-

18

Cà chua

Agrobacterium

19

Lúa mì

Bắn gene

Kháng virus Chống chịu chất diệt cỏ, điều khiển sự thụ phấn -

Quả chín muộn, kháng virus -

- Cây lúa: Kết quả tái sinh của cây lúa biến nạp gene bằng xung điện hoặc PEG thông qua nuôi cấy protoplast được thông báo lần đầu tiên cách đây chưa đến 10 năm. Các nghiên cứu sau đó cũng đã sử dụng hai kỹ thuật này để biến nạp gene vào protoplast và phục hồi các cây biến nạp gene hữu thụ. Tuy nhiên, hạn chế của hai phương pháp này là phải xây dựng phương thức tái sinh cây từ tế bào đơn. Mặc dù các phương thức này đang dùng cho một số giống lúa thuộc loài phụ japonica (chẳng hạn: Taipei 309) nhưng hầu hết các giống japonica ưu tú cũng như phần lớn các giống indica là khó tái sinh cây từ protoplast. Phương pháp bắn gene cho phép thực hiện biến nạp gene hiệu quả ở lúa trong các kiểu gene độc lập. Hiện

181

Gần đây, kỹ thuật biến nạp gene ở lúa thông qua Agrobacterium cũng đã có những cải tiến có hiệu quả tương đương với kỹ thuật bắn gene. - Cây lúa mì: Phương pháp bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp gene ở lúa mì. DNA ngoại lai được bắn vào trong vảy nhỏ (scutellum) của phôi non của hai giống lúa mùa xuân và một giống lúa mùa đông. Các callus chống chịu được chọn lọc bằng phosphinothricin hoặc các nhân tố ức chế trao đổi chất tương tự như basta, bialaphos hoặc glufosinate ammonium. Chọn lọc bằng các hợp chất như thế không hiệu quả lắm và kết quả là một số lớn cây thất thoát. Phân tích di truyền và phân tử đã xác nhận sự hợp nhất ổn định của các gene biến nạp. Nói chung công nghệ di truyền lúa mì vẫn còn tập trung ở một hoặc hai giống đặc trưng có khả năng tái sinh cây nhanh, thích hợp với phương pháp bắn gene. - Cây lúa mạch: Wan và Lemaux (1994), đã tái sinh một số lượng lớn các cây lúa mạch biến nạp gene độc lập, tự thụ phấn. Các phôi hợp tử non, các callus mới hình thành và các phôi có nguồn gốc từ tiểu bào tử hạt phấn đã được dùng để bắn gene với plasmid mang gene bar và gusA đơn độc hoặc phối hợp với plasmid khác mang gene protein vỏ của virus gây bệnh lùn vàng ở lúa mạch. Kiểm tra khả năng nảy mầm của phôi non để phân lập các cây biểu hiện hoạt tính bar bằng môi trường chứa bialaphos, mặc dù đây chưa phải là một chất chỉ thị tốt cho sự có mặt hoặc không của gene. - Cây đậu tương: Những cố gắng đầu tiên của cây đậu tương biến nạp tập trung ở việc tái sinh cây từ protoplast và nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi. Mặc dù có những thành công ban đầu, tiến triển của công việc này vẫn còn chậm và việc phục hồi các cây biến nạp gene vẫn đang còn gặp nhiều khó khăn. Công nghệ biến nạp gene ở đậu tương đã có triển vọng hơn nhờ sự phát triển và tối ưu hoá của kỹ thuật bắn gene. Thực tế, đậu tương đã được dùng như một cây mô hình để phát triển kỹ thuật cho nhiều loài cây trồng khó áp dụng công nghệ di truyền. Kết quả đầu tiên ở đậu tương là phục hồi thành công cây biến nạp gene nhờ Agrobacterium. Phương thức này dựa vào sự phát sinh chồi từ lá mầm của giống Peking chọn lọc cho tính mẫn cảm với Agrobacterium. Các mẫu lá mầm được xâm nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kháng kanamycin và có hoạt tính gusA, hoặc kháng kanamycin và chống chịu glyphosate. Có thể biến nạp gene hiệu quả vào protoplast đậu tương bằng các phương thức thông dụng nhưng rất khó tái sinh được cây. Để biến nạp gene vào các giống đậu tương khác nhau, người ta đã phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản phương thức tái sinh cây độc lập (dựa trên cơ sở sự tăng sinh của cụm chồi từ vùng chung quanh mô phân sinh của trụ phôi) với sự tăng gia tốc của vi

182

- Cây đậu tây: Cho đến nay, việc nghiên cứu biến nạp gene ở Phaseolus thành công rất ít. Hai hướng được ứng dụng trong công nghệ di truyền ở đậu tây là kỹ thuật xâm nhiễm bằng Agrobacterium và bắn gene. Tuy nhiên, chỉ có kỹ thuật sau mới có khả năng phục hồi các cây biến nạp. Cây đậu tây biến nạp biểu hiện các gene gusA, bar và protein vỏ của virus khảm màu vàng đã được phục hồi. Các cây biến nạp gene qua năm thế hệ tự thụ phấn vẫn không mất các gene biến nạp hoặc khả năng biểu hiện. Kỹ thuật bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp gene gusA được điều khiển bằng promoter concanavalin A, hoạt tính gus đã biểu hiện trong lá mầm và vỏ hạt của các cây biến nạp. - Cây bông: Phương thức biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens là kỹ thuật đầu tiên được sử dụng để biến nạp gene vào cây bông giống Coker 312 (Umbeck 1987). Cây bông biến nạp gene cũng của giống trên đã được phục hồi sau khi bắn gene vào dịch huyền phù nuôi cấy phát sinh phôi (Finer và McMullen 1990). Hầu hết các giống bông có giá trị kinh tế khác không thể tái sinh cây từ giai đoạn callus. Một số ít các giống đó có thể tái sinh cây nhưng quá trình này thiên về biến dị dòng vô tính (somaclonal variation). Phương thức phân phối gene ngoại lai trực tiếp vào mô phân sinh của trụ phôi cũng đã được phát triển và đã phục hồi cây biến nạp gene. 2.3.2. Biến nạp gene Nif Ở một số loài vi khuẩn và tảo lam sống tự do hoặc cộng sinh tồn tại phương thức biến đổi nitơ phân tử của khí trời thành dạng NH3. Nitrogenease N2

... NH3

Quá trình cố định nitơ tự do của khí trời xảy ra nhờ một loại enzyme là nitrogenease (nitrogene fixation gene-gọi tắt là gene nif) chỉ tồn tại ở một số loài tảo lam và vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh với các loài họ đậu (Fabaceae). Dùng kỹ thuật tách gene nif từ các cơ thể cố định đạm chuyển sang các cây trồng quan trong như lúa, ngô là một mô hình lý tưởng của các nhà tạo giống (Hình 9. 8 ).

183

Hình 9.8 Mô hình biến nạp gene nif

Quá trình cố định đạm thông qua enzyme nitrogenease phải xảy ra trong điều kiện yếm khí nghĩa là không có mặt O2 ở vùng phản ứng. Điều kiện này được thực hiên ở các nốt sần của cây họ đậu như một loại protein là̀ leghemoglobin hoặc legoglobin (gắn O2 như hemoglobin của máu). Muốn cho nitrogenease hoạt động trong tế bào thực vật bậc cao phải tạo ra được vùng phản ứng sạch O2 hoặc đưa vào tế bào một cơ chế bảo vệ như legoglobin. Đó là một vấn đề lớn mà kỹ thuật contransformation (chuyển nạp liên hợp gene) đang tìm cách giải quyết.

III. Kỹ thuật RFLP 1 Đại cương về kỹ thuật RFLP Kỹ thuật này dựa trên cơ sở đặc hiệu trong việc cắt đoạn DNA của một loại hình enzyme đặc hiệu gọi là enzyme giới hạn. Khi sử dụng một hay nhiều enzyme giới hạn, chúng sẽ tìm đúng vị trí đặc hiệu để cắt và cho những đoạn DNA dài ngắn khác nhau. Bất kỳ có sự biến đổi nào trong hệ gene (sự đảo gene, đột biến điểm, tăng giảm các cấu trúc lặp...) đều dẫn đến sự thay đổi các điểm cắt và do vậy, khi dùng phương pháp RFLP sẽ cho bản đồ enzyme giới hạn khác biệt. Cá thể đã có sự biến đổi di truyền nhất định, hay nói cách khác đã có thể thuộc biến chủng khác. Kỹ thuật RFLP dễ làm, có độ chính xác cao và có thể thực hiện trên DNA của nhiều cá thể trong thời gian ngắn. Sau khi xử lý kết quả nhiều lần bằng phương pháp RFLP, mỗi một hệ gene của mỗi cá thể thuần chủng sẽ cho một bản đồ gene xác định và giống nhau. Ngược lại khi bị biến đổi, các cá thể biến chủng sẽ cho bản đồ RFLP khác nhau. Độ sai khác càng xa thì sự biến chủng càng lớn. Khi độ sai khác cao hơn mức xác định, các cá

184

thể này đã có thể thuộc về chủng khác khi xem xét phân loại. 2. Thư viện chỉ thị (marker) phân tử DNA marker là những marker phân tử được tạo ra nhờ kỹ thuật phân cắt DNA bằng các enzyme giới hạn (restriction endonuclease). Khi tạo ra những đọan DNA mới, người ta đã cố gắng tìm kiếm một sự liên kết giữa marker và gene định vị trên nhiễm sắc thể nào đó. Bản đồ di truyền đơn giản của ruồi giấm đã được phát hiện từ năm 1925. Những tính trạng có biểu hiện giống nhau về di truyền được xếp vào cùng một nhóm liên kết gene, trên cùng một nhiễm sắc thể. Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể đo đếm được, gene đó được xem là marker gene. Ví dụ liên kết gene giữa lá mầm có màu tím và tính kháng rầy nâu của một vài giống lúa ở Đông bắc Ấn độ. Khi giống kháng có lá mầm màu tím được lai với giống nhiễm có lá mầm màu xanh, ở thế hệ F2 có xuất hiện con lai có lá mầm màu tím. Như vậy lá mầm màu tím được xem như marker đối với tính kháng rầy nâu. Việc lập bản đồ gene và chọn lọc nhờ marker như vậy rất chậm. Mặt khác số marker quá ít và chỉ có ở quy mô hình thái. Việc áp dụng isozyme marker có ưu điểm hơn, nhưng số marker cũng quá ít, không đáp ứng được nhu cầu nghiên cứu. DNA marker đã được chứng minh là có tầm quan trọng hơn về lâu dài, do số lượng của nó lớn hơn rất nhiều lần isoenzyme marker. Việc áp dụng DNA marker dễ dàng hơn và trong tương lai sẽ rẽ hơn. Muốn phát hiện ra chuỗi mã DNA đặc biệt nào đó, người ta phải áp dụng một kỹ thuật lai DNA-DNA. Các đoạn DNA được tách riêng ra nhờ kỹ thuật điện di sẽ biến tính trước khi nó được chuyển qua màng lọc. Như vậy các DNA trên màng lọc là DNA ở dạng sợi đơn. Để tìm một đoạn DNA đặc biệt nào đó trên màng lọc cần phải có một DNA thăm dò, lai với DNA đặc hiệu, thông qua các liên kết base. Nếu DNA thăm dò đã được đánh dấu bằng chất đồng vị hay hoá chất nào đó thì sẽ xác định được một chuỗi mã di truyền DNA cần nghiên cứu. Về căn bản, bất kỳ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể được xem như một DNA marker. Các DNA marker có thể được chia thành hai nhóm như sau: - PCR-based: ALP, AFLP, SSR, SSCP - DNA/DNA hybridization-based: RFLP, minisatellite Các marker thuộc nhóm PCR-based có thể chia thành: + Marker ngắn, có tính ngẫu nhiên: RAPD, AP-PCR, ADF, AFLP + Amplicon đơn: ALP, SSR, SSCP Những ưu điểm của DNA-marker so với marker hình thái và isozyme marker là:

185

- Đo lường trực tiếp các vật liệu di truyền - Có nhiều marker trong quần thể - Đo lường không chi phối ảnh hưởng môi trường và ảnh hưởng có tính chất phát triển. Bảng 9.2 Các loại DNA marker

Marker RFLP ALP AFLP RAPD DAF SSR AP-PCR SSCP MRHDV-DNA

Tên đầy đủ Restriction fragment length polymorphism Amplicon fragment length polymorphism Amplified fragment length polymorphism Random amplified polymorphic DNA DNA amplification fingerprinting Simple sequence repeat (microsatellite) Arbitrary primer-PCR Single strand conformation polymorphism Moderately repeated, dispersed, and highly variable DNA (minisatellite)

RFLP maker Trong các DNA marker, RFLP là marker được dùng phổ biến và được biết nhiều nhất. Để tạo ra chất thăm dò RFLP marker và thể đa hình DNA gồm nhiều giai đoạn: - Phân lập DNA Trước hết phải chuẩn bị chất thăm dò của marker và bộ lọc DNA lai. Đó là giai đoạn có tính chất quyết định trong phân tích RFLP. Ví dụ cần có DNA từ mô lúa với số lượng nhiều và chất lượng tốt. Mô lúa được nghiền trong nitơ lỏng. Chất đệm khi ly trích DNA có chứa SDS, chất này có thể phân giải màng tế bào và màng nhân, phóng thích DNA vào dung dịch. SDS là chất tẩy khá mạnh, có thể làm biến đổi protein ở nhiệt độ 650C. Sự biến đổi này làm cho DNA gắn với protein bị tách rời ra khỏi DNA cần nghiên cứu. Protein và chất cặn của tế bào được tách rời ra khỏi DNA bằng phenol/chloroform hoặc bằng phương pháp kết tủa chọn lọc của những chất cặn tế bào với potasium acetate. DNA ở pha lỏng sẽ được kết tủa bằng cách thêm isopropanol. Phân lập DNA bằng phương pháp này chỉ áp dụng đối với DNA có kích thước lớn hơn 30 kb và có ít tạp chất polysaccharide. Lượng nhỏ của tạp chất này sẽ gây khó khăn khi chạy điện di trên gel, do đó phải hết sức thận trọng khi tách DNA. Nguồn gốc mô cũng ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng DNA. Mô cây khỏe và trẻ cho kết quả phân lập DNA tốt hơn từ mô già hoặc từ các loài lúa hoang dại do bị lẫn tạp polysaccharide.

186

DNA được phân lập có thể tồn trữ trong điều kiện -200C. Phải chú ý rằng đông lạnh nhiều lần hoặc làm tan băng nhiều lần cũng có thể làm phân huỷ DNA. Trong quá trình phân lập phải sử dụng nhiều dung môi. Có hai dung môi quan trọng là EDTA và Tris. - Tris (Trima, base) được sử dụng với khả năng đệm rất có hiệu quả trong dung môi. Ở pH 8.0, DNA rất ổn định. Trong điều kiện môi trường axit, purine rất dễ bị loại thải (được gọi là “depurination”) do cầu nối phosphodiester dễ bị phá vỡ. Do đó, người ta phải kiểm soát pH của dung môi ở mức 8.0 khi dùng Tris. - DNA có thể bị hỏng bởi các enzyme. Enzyme này có thể truyền từ tay người làm thí nghiệm, hoặc từ không khí. Để ngăn ngừa khả năng DNA bị thuỷ phân bởi enzyme, người ta phải sử dụng thêm EDTA. Tất cả các enzyme thuỷ phân DNA được biết hiện nay đều cần Mg++ làm cofactor. EDTA có thể kìm giữ Mg++ và làm bất hoạt nó trong dung môi. Không có Mg++, enzyme không thể hoạt động. Tiến trình thuỷ phân DNA được thực hiện bằng restriction endonuclease. DNA sẽ được đưa về một bộ sưu tập DNA thống nhất sau khi hoàn tất việc phân cắt các chuỗi mã thành những đoạn (DNA fragment) riêng biệt. Độ lớn của các đoạn này sau khi tiêu hoá khoảng 30 kb, có khi nhỏ hơn 100 bp. Để xác định các DNA fragment thông qua kỹ thuật phân tích Southern, người ta điện di các DNA trên agarose gel. Sau khi điện di, các đoạn DNA được phân ra tùy theo trọng lượng phân tử. Người ta có thể quan sát chúng bằng mắt, nhờ kỹ thuật nhuộm màu DNA với ethidium bromide và xác định dưới tia cực tím. Khi phân tích Southern, các đoạn DNA được chuyển vào các tấm lọc, nhờ lực mao dẫn. Ở giai đoạn prehybridization (trước khi lai DNA) người ta khóa các vị trí trên màng- nơi quá trình lai sẽ xảy ra, các DNA (gene liên kết với marker) sẽ gắn với nucleic acid thăm dò (RFLP-marker) được đánh dấu bằng phóng xạ. Sau khi hybridization, tấm lọc hay màng lọc được rửa để loại bỏ các RFLP-marker không gắn hoặc gắn yếu với DNA đang nghiên cứu. Tiếp đó nó tự ghi trên biểu đồ phát xạ. Sau khi điện di, gel được chụp dưới tia cực tím. Các đoạn DNA xuất hiện thành các đốm liên tục. Nó sẽ cho tín hiệu khi thể hiện ra trên phim X-quang. Các vạch có tính đa hình (polymorphism) có thể được quan sát để đánh giá. Có hàng triệu đoạn DNA sau khi phân cắt bằng một restriction endonuclease nào đó. Nhưng chúng không thể được sử dụng như RFLP marker, nếu từng đoạn này chưa được thanh lọc làm cho thuần khiết và chưa được khuếch đại nhằm có đủ số lượng các đoạn DNA đồng nhất, thuần chủng. Theo ý nghĩa này, RFLP phải có tính chất như sau: - Có số lượng cao trong mỗi quần thể

187

- Đồng trội (Codominant ) - Đo trực tiếp DNA - Không bị ảnh hưởng của môi trường - Không bị ảnh hưởng do yếu tố có tính chất phát triển RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhưng qui trình thực hiện rất phức tạp, nguy hiểm đến sức khoẻ người thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lượng và chất lượng cao. Do đó người ta có xu hướng áp dụng các marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở của phản ứng chuỗi polymerase. 3.3. Lập bản đồ di truyền bằng chỉ thị RFLP Việc lập bản đồ gene cũng như việc chọn lọc giống cây trồng trên cơ sở DNA marker phát triển nhanh, nhờ sự khám phá ra phản ứng chuỗi trùng hợp PCR và một dạng polymerase có tính chịu nhiệt. Xây dựng bản đồ di truyền thường căn cứ trên sự xuất hiện của các biến dị có tính chất nền tảng di truyền của quần thể. Phương pháp phân tích đa hình về chiều dài các đoạn DNA (RFLP) bằng kỹ thuật enzyme giới hạn, là cắt rời DNA hệ gene thành nhiều đoạn ngắn dài khác nhau, từ đó lập nên bản đồ hệ gene, gọi là bản đồ enzyme giới hạn của mỗi cá thể. 3.4. Ứng dụng kỹ thuật RFLP trong chọn giống thực vật Trước đây người ta đã sử dụng các dị thể đánh dấu đơn lẽ trong thực vật bậc cao để xem xét các đặc tính hình thái. Ví dụ, gene gây tính lùn, gene tạo ra sự thiếu lục lạp hoặc làm biến dạng lá cây. Mặc dù các marker rất có ích trong nhiều nghiên cứu ứng dụng cũng như cơ bản, nhưng nó rất hạn chế trong chọn giống cây trồng. Những năm gần đây, có hai loại marker mới đã được phân lập, chúng có nhiều triển vọng trong việc ứng dụng vào công tác chọn giống. Đó là protein marker và DNA marker. Những marker phân tử này khác với marker hình thái ở 5 đặc điểm di truyền như sau: - Kiểu gene của các locus phân tử có thể được xác định ở khắp cây trồng, ở mức độ tế bào, mô. Kiểu hình của tất cả marker hình thái có thể chỉ được phân biệt ở mức độ ở dạng cây bên ngoài. - Một số tương đối lớn các allele được tìm thấy ở các locus phân tử. Trong khi các gene ở các locus chứa marker hình thái, xuất hiện với tần số thấp hơn và thường bị kích thích tạo ra các đột biến gene. - Không ảnh hưởng gây hại đi kèm theo các gene của marker phân tử. Trong khi ở marker hình thái, nó thường kết hợp với ảnh hưởng do kiểu hình bất lợi gây ra. - Alelle của marker phân tử thường là đồng trội, do đó nó cho phép tất cả các kiểu gene được thể hiện trong mọi thế hệ phân ly giữa tính trội và lặn.

188

- Đối với marker hình thái, ảnh hưởng mạnh mẽ của tính lấn át (epistasis) làm hạn chế số marker đang phân ly, do đó nó có thể được đánh giá như một thế hệ phân ly. Trong khi có rất ít ảnh hưởng lấn át hoặc đa tính trạng (pleiotropic) được quan sát ở marker phân tử, cho nên số marker đang phân ly có thể được theo dõi ở từng quần thể. Các ứng dụng thông thường của marker phân tử là: - Xác định mức độ phong phú di truyền - Xác định độ chính xác về di truyền của con lai - Ước đoán mức độ tạp giao - Phát hiện sự du nhập gene hoang dại. Nhiều gene đơn như tính bất dục đực, gene phục hồi phấn hoa, gene kháng bệnh được chuyển nhiều lần từ một vật liệu di truyền vào vật liệu khác. Ở đây tính trạng trội lặn được sử dụng và yêu cầu thời gian cần thiết để chuyển nạp. Các quy trình chọn lọc này cồng kềnh, đắt tiền và yêu cầu ruộng thí nghiệm quá lớn. Marker phân tử đánh dấu các gene có tầm quan trọng về kinh tế. Nếu các gene đơn được đánh dấu bằng liên kết gene chặt chẽ với các marker phân tử, chúng ta sẽ tiết kiệm được tiền của, thời gian để chuyển các gene này vào vật liệu di truyền mà chúng ta mong muốn. Marker phân tử cho phép xác định ở giai đoạn rất sớm sự có mặt hay không của gene mong muốn. Tính chất đồng trội của các marker phân tử cho phép tất cả các kiểu gene được xác định trong lai tạo, ngay cả trong trường hợp gene đơn khó có thể được xác định trực tiếp. Ứng dụng tiến bộ này được thể hiện ở cà chua, gene Mi (kháng tuyến trùng) liên kết chặt chẽ với một alen hiếm Aps-1 (acid phosphatase) locus định vị trên nhiễm sắc thể số 6. Nhiều chương trình lai cà chua đã ứng dụng để chọn lọc con lai với sự hiển diện của alen Aps-1 thay vì tính kháng tuyến trùng. Ở lúa đã tìm thấy gene cảm quang có liên quan chặt chẽ với Est-2 và Pgi-2 trên nhiễm sắc thể số 3. Bởi vì các giống cảm quang trồng được mỗi năm một lần trên ruộng, sự phát triển của các thế hệ rất chậm. Do đó lợi dụng đặc tính liên kết gene này với 2 locus isozyme, quần thể phân ly sẽ được đánh giá và các cá thể có tính cảm quang có thể được tuyển chọn. Tuy nhiên phương pháp isozym marker là không đủ isozyme locus để bao trùm lên toàn bộ bản đồ nhiễm sắc thể. Số isozyme markers quá ít là hạn chế chính trong việc ứng dụng với quy mô lớn các isozyme marker để cải tiến giống cây trồng. Ngược lại, RFLP markers có rất nhiều và bản đồ của nó có thể được chuẩn bị khá đầy đủ. Ở ngô và cà chua có hơn 500 locus RFLP đã được sản xuất. Hiện nay đang thực hiện đánh dấu các gene kháng sâu bệnh với các locus RFLP đánh dấu gene kháng bệnh bạc lá, đạo ôn, rầy nâu và rầy lưng trắng. Sự hữu thụ của của RFLP lớn hơn rất nhiều trong khi đánh dấu

189

các locus điều khiển tính trạng số lượng (QTLs). Thông qua phân tích này, QPLs được ứng dụng đối với tính kháng hạn và kháng mặn ở cây lúa. Các nhà chọn giống có thể áp dụng marker trong nhiều tính trạng khác nhau. Rõ ràng nhất là khi tính trạng mong muốn khó có thể tìm thấy vì nó liên quan đến đặc tính của giống cây trồng như tính kháng sâu bệnh, tính chống chịu hạn, ngập, nhiệt độ cao, mặn ....Những tính trạng này đòi hỏi một quy trình và điều kiện môi trường đặc biệt để đánh giá. Chọn lọc gián tiếp nhờ marker phân tử sẽ làm cho tiến độ chọn giống tiến hành đúng như kế hoạch, hơn nữa có thể kết hợp nhiều tính trạng chọn lọc cùng một lúc. Nhờ đánh dấu được các gene, nhà chọn giống có thể theo dõi tính chất di truyền trong một cặp lai thông qua phân tích RFLP trong quần thể phân ly. Ứng dụng RFLP marker để nghiên cứu bệnh đạo ôn trên lúa đã được công bố. Để đánh dấu được gene kháng, người ta đã sử dụng một bộ giống gần như đẳng gene (nearly isogeneic lines = NIL) từ giống rất nhiễm CO39, và phân tích bằng RFLP cho thấy gene kháng Pi-z(t) liên kết với dòng DNA sao chụp RG64 trên nhiễm sắc thể số 3. Khoảng cách giữa Piz(t) và RG64 là 4,2 ± 1,7 cM. Gene kháng đạo ôn của Tẻ Tép (Pi-3) liên kết với dòng DNA sao chụp RG869 trên nhiễm sắc thể số 6. Khoảng cách giữa Pi-3 và RG64 là 10,6 ±3,8 cM. Mc Couch và cs (1990) đã công bố gene đánh dấu đối với tính kháng bệnh cháy bìa lá và rầy lưng trắng. Gene đánh dấu thông qua RFLP là phương tiện giúp cho việc tuyển chọn các tính trạng chống chịu sâu bệnh hại lúa. Tất cả các giống lúa đều có thể được phân chia thành nhiều kiểu gene khác nhau khi phân tích RFLP. Tanksley và cs (1990) nghiên cứu tại Đại học Cornell về các marker dùng trong bản đồ gene của cây lúa. Có hơn 1000 RFLP marker đã được xác định trên bản đồ gene của cây lúa (Bennett, 1994) thông qua phân tích tính chất đồng phân ly và con số này sẽ dự kiến tăng lên 2000. Các kết quả này với những thông tin cần thiết về bản đồ gene, tạo ra khả năng rất to lớn áp dụng các markers trong chương trình lai tạo giống (Abenes và cs, 1993). Nhiều côn trùng gây hại, nấm, vi khuẩn... gây hại trên cây lúa có tính đa dạng về địa lý và thời gian. Tính đa dạng này thường biểu hiện thông qua sự khác biệt về độc tính và sự khác biệt về cây chủ có tính kháng. Phương pháp phân tích RFLP và RADP đã được ứng dụng giúp hiểu rõ hơn sự biến động của sâu bệnh hại lúa, cũng như để khai thác tốt nhất các giống lúa kháng sâu bệnh. - Rầy nâu: Sử dụng RFLP để lập bản đồ gene kháng với rầy nâu đã được ghi nhận thông qua trường hợp thu nhận gene kháng từ lúa hoang dại Oryza australiensis vào lúa trồng Oryza sativa (Ishii và cs, 1994). Gene kháng rầy nâu được xác định là định vị trên nhiễm sắc thể số 12. Chỉ có marker RG457 trong 14 marker thăm dò có tính đa hình đã phát hiện được

190

trên nhiễm sắc thể 12, tại đây gene kháng rầy nâu của Oryza australiensis đã du nhập vào con lai của tổ hợp lai nói trên. Căn cứ vào tính chất đồng phân ly giữa tính kháng rầy nâu và RG457, cho thấy gene kháng rầy nâu có liên kết với RG457, khoảng cách giữa chúng là 3.68 cM. Với một liên kết chặt chẽ như vậy, nó rất hữu ích khi chúng ta áp dụng phương pháp chọn lọc với sự trợ giúp của marker (MAS: marker aided-selection) để có các giống lúa kháng rầy nâu. Nghiên cứu bản đồ RFLP nhằm mục đích phân lập các QTL điều khiển tính kháng bệnh đạo ôn, đã được thực hiện tại IRRI (Wang và cs, 1992). Nghiên cứu này đã tìm hiểu di truyền tính kháng bệnh đạo ôn trên giống Moroberekan, một giống lúa rẫy địa phương ở Tây phi có tính kháng ổn định với bệnh đạo ôn (Bonman và Mackill, 1988). Một gene thể hiện tính kháng hoàn toàn ký hiệu là Pi-5(t) đã được lên bản đồ. - Bệnh bạc lá: Các phân tích di truyền đã chứng minh có sự hiển diện của ít nhất 19 gene kháng bệnh bạc lá lúa (Ogawa và Khush, 1989; Kinoshita, 1991). Cho đến nay 7 gene kháng bệnh bạc lá đã được lập bản đồ bằng RFLP (Mc Couch và c, 1991; Ronald và Tanskley, 1991; Yoshimura và cs, 1992). Người ta đã sử dụng quần thể phân ly để xác định tính chất đồng phân ly giữa RFLP marker và các gene Xa-1, Xa-2, Xa-3, Xa-4, Xa-5, Xa-10 và Xa-21. Gene Xa-1, Xa-5, Xa-21 là những “gene tags” (vật đánh dấu gene) rất hữu dụng trong chọn lọc một chương trình lai tạo có hiệu quả. Muốn biết marker có phải là công cụ hữu ích trong chọn lọc giống lúa hay không, người ta nghiên cứu bản chất của sự kết hợp gene trong một nền tảng di truyền nào đó. Các marker cung cấp ngay những thông tin về cây lúa nào mang gene gì và nó thể hiện trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử. Các markers cho phép khẳng định chính xác kiểu gene trong đó hai gene hoặc nhiều hơn hai gene kết hợp với nhau. Mối tương tác chưa chắc chắn giữa các gene đơn, cũng có thể được đánh giá bằng phương pháp này. Ví dụ, giống mang cả hai gene Xa-5 và Xa-4 được tìm thấy kháng mạnh hơn đối với một isolate của dòng số 4 so với giống láu mang từng gene này đơn độc (Nelson, 1993).

IV. Kỹ thuật PCR 1. Đại cương về kỹ thuật PCR Phát triển phương pháp cho tạo dòng DNA trong những năm bảy mươi đã có bước nhảy, vì lúc này gene và hoạt tính của gene được nghiên cứu theo dạng mà trước đó không thể có được. Có cái gì đó tương tự xảy ra trong những năm tám mươi là đã tìm ra phương pháp có tính cách mạng: phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction, PCR). PCR làm khuếch đại một đoạn nào đó trong phân tử DNA. Người ta có thể chọn bất kỳ đoạn nào đó với điều kiện là đã biết trình tự ở những đầu cuối. Điều này rất cần thiết vì để bắt đầu PCR mỗi đoạn ngắn

191

oligonucleotide (một mồi) phải lai với một đầu sợi đơn của phân tử DNA (hình 9.9). Đoạn oligonucleotide này là mồi cho phản ứng tổng hợp DNA và giới hạn đoạn cần khuếch đại.

Hình 9.9 Phản ứng PCR khuếch đạị trình tự đích

Để thực hiện phản ứng PCR người ta cho enzyme vào DNA nguồn và

192

mồi và ủ hỗn hợp này, như vậy những sợi bổ sung được tổng hợp. Sau đó đun nóng hỗn hợp ở 940C để cho những sợi mới tạo nên tách ra từ sợi khuôn và làm nguội chúng trở lại để cho các phân tử mồi gắn vào vị trí của nó, cả những sợi mới tạo thành. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose. Lượng DNA mới tạo nên đủ để nhận ra vạch sau khi nhuộm ethidiumbromide. Người ta có thể gắn sản phẩm PCR với một vector plasmid hoặc phage để tạo dòng nghiên cứu ví dụ xác định trình tự DNA. 1.1. Nguyên tắc của PCR Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus) được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có 4 loại deoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) và 2 primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu kỳ (cycle), số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, giải mã hoặc tạo dòng. Primer ở bên trái tác động trên sợi DNA 3’→5’ được gọi là primer thuận (forward primer-ký hiệu là F). Primer ở bên phải tác động trên sợi DNA 5’→3’ được gọi là primer ngược (reverse primer-ký hiệu là R). Nguyên tắc của PCR được trình bày trong hình 9.10 và 9.11. Theo đó, từ chu kỳ thứ 2 Taq polymerase bắt đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài xác định. Các primer thường là một oligonucleotide tổng hợp (synthetic oligonucleotide) có khoảng 10-20 nucleotide. Nếu biết trình tự của đoạn gene cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ thuật điện di. PCR thường tiến hành khoảng 25-35 chu kỳ, qua đó từ 10-6 μg DNA ban đầu có thể khuếch đại (amplification) lên tới trên 1 μ g (khoảng 2 kb). . Mỗi chu kỳ PCR bao gồm 3 giai đoạn có nhiệt độ khác nhau: - G ây biến tính ở 90-95oC trong vài giây cho đến vài phút Trong giai đoạn biến tính phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành 2 sợi đơn (single strands) dùng làm khuôn cho các đoạn mồi bám và enzyme RNA polymerase xúc tác tổng hợp. Tất cả các phản ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trước đó). - Ủ với mồi (annealing) ở 50-55oC Trong giai đoạn này các primer gắn vào các vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu. Các primer bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành và bị đứt gãy liên tục giữa primer sợi đơn và DNA khuôn mẫu sợi đơn. Các liên kết ion ổn định hơn tạo thành một đoạn nhỏ (các primer đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) enzyme polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu. - Tổng hợp (synthesis) ở nhiệt độ 70-72oC trong vài chục giây cho đến

193

Đây là khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có primer theo chiều 5’→3’. Các primer có một vài base gắn vào khuôn mẫu có mối liên kết ion mạnh hơn các lực phá vỡ các liên kết này sẽ không bị đứt gãy. Các primer ở các vị trí không bắt cặp chính xác lại bị rời ra (do nhiệt độ cao) khỏi khuôn mẫu đã không tổng hợp được DNA. Enzyme Taq polymerase bổ sung các dNTP từ 5’→ 3’.

Hình 9.10 Sơ đồ phản ứng trùng hợp DNA polymerase (PCR)

Hình 9.11 Các chu kỳ phản ứng PCR

Phản ứng PCR về nguyên tắc là đơn giản, nhưng để đạt được kết quả tốt cần phải thực hiện rất cẩn thận. Trình tự của đoạn mồi đối với kết quả thí nghiệm cũng quan trọng như đảm bảo đúng nhiệt độ trong từng giai đoạn của chu kỳ phản ứng. Cuối cùng là những vấn đề quan trọng sau khi sử dụng sản phẩm khuếch đại PCR. - Cấu trúc của mồi oligonucleotide cho phản ứng PCR Mồi quyết định sự thành công hay thất bại của thí nghiệm PCR. Khi nó được thiết kế đúng thì xảy ra sự khuếch đại đoạn DNA mong muốn. Nếu đoạn mồi được thiết kế sai không xảy ra phản ứng vì không xảy ra sự tổng hợp hoặc tổng hợp đoạn không mong muốn, thậm chí nhiều đoạn

194

DNA được khuếch đại (Hình 9.12).

Hình 9.12 Kết quả của PCR với các cặp primer khác nhau. Giếng 1 thể hiện đoạn gene duy nhất được khuếch đại với độ lớn mong muốn. Ở giếng 2 không có sản phẩm được khuếch đại do primer không lai với DNA khuôn. Giếng 3 và 4 chứa một sản phẩm có độ lớn sai và một hỗn hợp các phân tử (1 vạch đúng và 2 vạch sai), cả 2 kết quả đều do primer đã gắn sai vị trí trên DNA khuôn

Trình tự đoạn mồi phải tương ứng với trình tự hai đầu của đoạn DNA mong muốn và mỗi đoạn mồi phải bổ sung với sợi khuôn thì mới xảy ra phản ứng lai.

Hình 9.13 Độ dài primer quyết đinh tính chất đặc biệt PCR

- Kích thước của đoạn DNA Đoạn DNA muốn khuếch đại không nên dài hơn 3 kb, trong trường hợp lý tưởng độ lớn của nó nên nhỏ hơn 1 kb. Bằng kỷ thuật PCR thông

195

thường người ta có thể khuếch đại những đoạn có độ lớn cho đến 10 kb nhưng khi độ dài càng lớn thì hiệu quả phản ứng càng thấp và càng khó khăn hơn để thu được kết quả. Có thể khuếch đại một đoạn rất dài (cho đến 40 kb) nhưng người ta phải sử dụng phương pháp đặc biệt hơn. - Kích thước của primer Đoạn mồi nên dài bao nhiêu? Nếu đoạn mồi ngắn quá thi nó sẽ gắn vào những vị trí không mong muốn, nhu vậy những đoạn không mong muốn được khuếch đại lên. Chẳng hạn, DNA tổng số của người được sử dụng với hai mồi có độ dài 8 nucleotide. Kết quả được chỉ ra ở hình 9.13. Nhiều đoạn khác nhau được khuếch đại, vì người ta tính toán trung bình cứ 65 536 bp (= 84) có một ví trí gắn cho mồi. Tổng số có khoảng 46 000 vị trí trong hệ gen người có 3 000 000 kb. Vì vậy rất khó tin là một cặp mồi tạo nên một sản phẩm PCR đồng nhất với khuôn mẫu là DNA người.

Hình 9.14 Nhiệt độ có tác dụng quan trọng lên phản ứng lai giữa primer và DNA khuôn

Khi sử dụng mồi có 17 nucleotide, với trình tự này thì cứ 17 179 869 184 bp có 1 vị trí gắn (= 417). Số này lớn hơn 5 lần base trong tổng số hệ gen người, vì vậy người ta chờ đợi nhiều nhất là có một vị trí gắn. Với một cặp mồi có độ dài 17 nucleotide thì có thể một sản phẩm khuếch đại duy nhất xuất hiện (Hình 9.13).

196

Độ dài của mồi ảnh hưởng đến sự gắn với DNA khuôn nhanh hay chậm, ở mồi dài thì quá trình này chậm hơn. Hiệu quả của phản ứng PCR là số lượng bản sao được tạo ra trong một thí nghiệm, sẽ giảm khi mồi dài, vì với thời gian cho phép trong chu kỳ phản ứng không xảy ra phản ứng lai đầy đủ. Trong thực tế không có mồi nào dài hơn 30 nucleotide được sử dụng. Quan trọng nhất là nhiệt độ gắn vì nó ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của phản ứng. Nếu nhiệt độ cao quá, không xảy ra sự gắn kết, mồi và khuôn đứng riêng lẽ (Hình 9.14a). Nếu nhiệt độ quá thấp những thể lai không đặc hiệu bền vững, trong đó không phải tất cả các cặp base bắt cặp chính xác (Hình 9.14b). Trong trường hợp này những chú ý về độ dài của mồi không có ý nghĩa, vì từ đó chỉ xuất hiện những thể lai chính xác giữa mồi và khuôn. Khi các base bắt cặp không tương ứng thì số lượng vị trí lai với mồi tăng lên nhiều và dẫn đến nhân lên những đoạn không mong muốn. Nhiệt độ lai lý tưởng một mặt phải thấp để xảy ra phản ứng lai giữa mồi và sợi khuôn, mặt khác phải cao để không tạo nên thể lai không đặc hiệu Người ta có thể xác định nhiệt độ dựa trên nhiệt độ phân ly (Tm) của thể lai giữa mồi và khuôn. Ở nhiệt độ Tm thể lai hoàn toàn phân ly, ở nhiệt độ thấp hơn Tm 1-2 độ có thể tạo nên thể lai chính xác giữa mồi và khuôn, không tồn tại thể lai không đặc hiệu. Người ta biết được Tm bằng thực nghiệm, nhưng phần lớn tính theo công thức: Tm = (4 x [ G + C]) + (2 x [ A + T]) 0C Trong đó [G + C] là số lượng nucleotide G và C trong trình tự mồi [A + T] là số lượng A và T. Để xác định nhiệt độ lai cho phản ứng PCR người ta tính Tm cho hai mồi và để nhiệt độ thấp hơn Tm 1-2 độ. Các mồi nên thiết kế để cả hai có cùng Tm. Nếu không như vậy thì nhiệt độ lai đối với mồi này thì cao nhưng với mồi kia thì thấp. Cách tính Tm cho một primer

1.2. Phân tích sản phẩm PCR Sau khi tiến hành PCR, có nhiều phương pháp để phân tích sản phẩm PCR, quan trọng là các phương pháp sau - Điện di - Phân tích trình tự sản phẩm PCR - Phân tích tạo dòng sản phẩm PCR

197

Phần lớn việc kiểm tra kết quả thí nghiệm PCR thực hiện bằng cách lấy một phần sản phẩm PCR cho chạy điện di. Sau khi nhuộm màu với ethidiumbromide nhận ra một vạch. Nếu sản phẩm thu được ít thì chứng minh bằng phản ứng lai Southern blot. Nếu thiếu vạch mong đợi và xuất hiện nhiều vạch khác thì thí nghiệm phải làm lại. Trong một số trường hợp, điện di không những khẳng định được phản ứng PCR đạt kết quả hay không mà từ đó còn thu được những thông tin khác. Ví dụ có thể khẳng định, trong đoạn DNA được khuếch đại có tồn tại những vị trí cắt của enzym giới hạn hay không. Nhằm mục đích này sản phẩm PCR được xử lý bằng một enzym giới hạn và sau đó cho chạy điện di. Và người ta có thể khẳng định dựa trên độ dài của sản phẩm PCR, rằng DNA khuôn ở trong vùng khuếch đại có chứa một đoạn chèn hoặc loại bỏ đi một đoạn không (hình 9.15). Trong cả hai trường hợp đề cập đến một dạng biến đổi của phân tích RFLP ở phản ứng PCR. So với với phương pháp nguyên thuỷ nó có ưu điểm là cần rất ít nguyên liệu ban đầu.

Hình 9.15 Thông qua điện di sản phẩm PCR, thu được thông tin về phân tử DNA khuôn Giếng 1. Chỉ sản phẩm PCR không cắt Giếng 2. Sản phẩm được cắt bằng một enzyme ở vị trí R Giếng 3. DNA khuôn trong vùng nhân có chứa đoạn DNA đưa vào

Khi địện di không cung cấp đủ thông tin thì bước tiếp theo là xác định trình tự sản phẩm PCR. Nhằm mục đích này người ta tạo dòng sản phẩm PCR và sau đó sử dụng phương pháp xác định trình tự thông thường hoặc xác định trực tiếp trình tự sản phẩm PCR. 2. Ứng dụng PCR trong tách dòng các đoạn DNA Khi muốn có thêm những thông tin về sản phẩm PCR thì người ta gắn

198

những đoạn này vào trong một vector và nghiên cứu bằng một phương pháp tiêu chuẩn ưa thích để phân tích DNA tạo dòng. Tuy nhiên ở đây có những khó khăn. Vấn đề đầu tiên gặp phải là đầu cuối của sản phẩm PCR. Những đoạn xuất hiện bằng phản ứng PCR có đầu bằng có thể gắn đầu bằng vào một vector hoặc nối thêm linker hoặc adapter để tạo đầu dính.

Hình 9.16 Khuếch đại DNA được tạo dòng trong vector

Trong thực tế, Taq polymerase gắn với đầu cuối của sợi mới tạo thành thường ở một nucleotide bổ sung thêm, phần lớn là một adenosin. Sản phẩm PCR mạch kép không có đầu dính, mà ở mỗi đầu cuối 3’ có một nucleotide (Hình 9.17). Người ta có thể cắt ra nucleotide bổ sung này bằng một exonuclease và tạo ra những phân tử có đầu bằng. Phương pháp này hạn chế sự cắt tiếp tục của exonuclease và những đầu cuối bị ảnh hưởng.

Hình 9.17 Polynucleotide được tổng hợp từ Taq polymerase thường mang đầu cuối 3’ một adenosine.

Để giải quyết khó khăn này người ta sử dụng một vector tạo dòng đặc biệt hơn với nucleotide T đứng đối diện, có thể được gắn kết với DNA được khuếch đại (Hình 9.18). Để tạo ra một vector thông thường người ta

199

tạo ra một vector với những đầu cuối cắt bằng enzyme giới hạn và sau đó xử lý nó với Taq polymerase và chỉ bổ sung thêm ATP. Vì hỗn hợp này không chứa mồi, nên Taq polymerase chỉ gắn 1 nucleotide T vào đầu bằng của vector đã được cắt ra. Một vector có đầu cuối những T như vậy được gắn với sản phẩm PCR.

Hình 9.18. Tạo dòng sản phẩm PCR trong vector với nucleotide ở đầu cuối

Phương pháp thứ hai được sử dụng nhiều hơn là thiết kế mồi có chứa vị trí cắt giới hạn. Sau phản ứng PCR người ta xử lý những phân tử mới tạo ra bằng một enzyme giới hạn. DNA trong trình tự mồi được cắt và ở đây xuất hiện những đầu dính, có thể đưa chúng có hiệu quả vào một vector tạo dòng bình thường (Hình 9.19). Phương pháp này không hạn chế trong mọi trường hợp, trong đó các đoạn mồi trùm lên một vị trí cắt giới hạn đã có trong DNA khuôn. Người ta có thể gắn những trình tự nhận biết của enzyme như là những đoạn ngắn vào đầu 5’ của mồi (Hinh 9.20). Những đoạn này không lai với khuôn nhưng được sao chép trong phản ứng PCR, như vậy sản phẩm PCR mang ở mỗi đầu cuối một vị trí cắt của enzyme giới hạn. Những khó khăn do sự khiếm khuyết của Taq polymerase: Tất cả những DNA polymerase có lỗi trong khi tổng hợp, nghĩa là thỉnh thoảng nó có thể gắn một nucleotide sai vào sợi DNA đang tổng hợp. Tuy nhiên phần lớn DNA-polymerase sửa chữa được những lỗi này, trong đó nó

200

quay lại để cắt nucleotide đã được gắn vào sai và gắn vào nucleotide đúng. Đặc tính có “chức năng sửa chữa” phụ thuộc vào hoạt tính của exonuclease theo hướng 3’ → 5’ của polymerase.

Hình 9.19. Tạo sản phẩm PCR có đầu dính nhờ sử dụng primer, trong đó có vị trí enzyme cắt giới hạn

Hình 9.20. Primer PCR với vị trí cắt ở đầu 5’ được kéo dài

Taq polymerase thiếu chức năng sửa chữa này, nghĩa là chúng không thể sửa được lỗi. DNA được tổng hợp từ enzyme này không phải luôn luôn là bản sao chính xác của phân tử khuôn. Lỗi gặp phải theo ước đoán là khoảng 1 nucleotide trong 9000, thể hiện lỗi ít, nhưng sau 30 chu kỳ phản ứng thì lỗi lên đến 300 bp. Vì ở phản ứng PCR nhiều bản sao thường xuyên xuất hiện từ bản sao nên lỗi do PCR-polymerase gây ra tăng dần và những bản sao xuất hiện về cuối PCR mang những nucleotide được gắn vào sai từ những chu kỳ trước là những lỗi mới thêm vào trong những chu kỳ tổng hợp cuối.

201

Hình 9.21 Tần suất lỗi cao của Taq polymerase khi tạo dòng sản phẩm PCR

Trong nhiều lĩnh vực ứng dụng những lỗi tổng hợp này không phải là vấn đề lớn. Đặc biệt hơn sự phân tích trình tự trực tiếp sản phẩm PCR cung cấp những trình tự chính xác mặc dù có lỗi do Taq polymerase gây ra, vì theo phân bố thống kê những base được gắn sai nhưng nhiều phân tử khác xuất hiện trên mỗi một đoạn với một lỗi ở một vị trí nhất định có trình tự ở vị trí này là chính xác. Trong trường hợp này sự mắc lỗi là không có ý nghĩa. Mặt khác sẽ như thế nào nếu sản phẩm PCR được tạo dòng. Mỗi một dòng chứa nhiều bản sao của một đoạn duy nhất được khuếch đại trong phản ứng PCR và DNA tạo dòng không nhất thiết có cùng trình tự như phân tử khuôn mà người ta cho vào để khuếch đại (Hình 9.21). Điều này dẫn đến sự không chắc chắn ở tất cả các thí nghiệm với sản phẩm PCR tạo dòng. Vì vậy nếu có thể thì nghiên cứu DNA được khuếch đại trực tiếp và không tạo dòng.

202

3. Ứng dụng PCR vào lập bản đồ di truyền PCR giúp đắc lực cho việc lập bản đồ gene (gene mapping) của sinh vật. Phương pháp này có tên là phân tích DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên (random amplified polymorphic DNA analysis-RAPD). Trong phương pháp RAPD, PCR được thực hiện với các primer chọn ngẫu nhiên. Kết quả là tạo ra một số đoạn DNA có chiều dài khác nhau đặc trưng cho mỗi loài, thậm chí mỗi cá thể. So sánh điện di sản phẩm PCR của nhiều giống có đặc tính khác nhau trong cùng loài, với nhiều primer khác nhau có thể giúp xác định bản đồ gene của sinh vật. Hiện nay, ngoài RAPD còn có nhiều loại chỉ thị phân tử đã được phát triển như đa hình các đoạn cắt giới hạn (restriction fragment lenght polymorphism, RFLP), vi vệ tinh (microsatellite) hay còn gọi là sự lặp lại các đoạn nucleotide đơn giản (simple sequence repeats, SSR), và đa hình DNA khuếch đại chọn lọc (amplified fragment lenght polymorphism, AFLP). Các kỹ thuật này được xây dựng trên cơ sở PCR có triển vọng rất lớn trong nghiên cứu da dạng di truyền (genetic diversity), định vị gene (gene location) và lập bản đồ gene do chúng đơn giản về mặt kỹ thuật, tiết kiệm thời gian và có hiệu quả cao. PCR hiện nay còn được dùng thay thế cho điện di isozyme để phân loại thực vật, xác định mối quan hệ của chúng một cách chính xác. 4. Nguyên tắc và cơ sở di truyền của phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị (MAS-marker aided-selection) dựa vào PCR Một chỉ thị di truyền cần có hai yêu cầu cơ bản: thứ nhất là phải có sự khác biệt giữa cơ thể bố và cơ thể mẹ và thứ hai là nó phải được truyền lại chính xác cho thể hệ sau. Người ta phân ra các kiểu chỉ thị di truyền sau: 4.1. Chỉ thị hình thái Về mặt nguyên tắc, một tính trạng nào đó do một locus kiểm soát mà sự biểu hiện của nó không bị ảnh hưởng bởi tác động của môi trường, có thể dùng làm một chỉ thị hình thái cho quá trình chọn lọc. 4.2. Chỉ thị phân tử: Chỉ thị phân tử là đặc điểm ở khía cạnh hóa học hay cấu trúc phân tử được di truyền lại cho thế hệ sau giống các nhân tố di truyền Mendel nhưng lại có thể định lượng được. Có hai loại chỉ thị phân tử cơ bản: Chỉ thị isozyme: isozyme là những dạng enzyme có cùng một phản ứng hóa học như nhau nhưng lại bị ức chế bởi những phân tử khác nhau. Về mặt di truyền có thể chia isozyme làm hai dạng: isozyme đơn gene và isozyme đa gene. Chỉ thị phân tử DNA: Chỉ thị phân tử DNA rất phong phú, do sự đa dạng của DNA, tính ổn định và sự không lệ thuộc của chúng vào các yếu tố môi trường. Các chỉ thị di truyền phân tử được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hóa giữa loài. Chúng cũng có thể được dùng để chọn tổ hợp lai. Kiểu chỉ thị này được sử dụng rất có hiệu quả để lập bản đồ phân tử cho những cây

203

trồng có phương thức sinh sản sinh dưỡng hay sinh sản vô tính khó khăn. Chỉ thị phân tử được chia ra làm hai nhóm lớn: - Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA hay chỉ thị RFLP - Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR. Cho đến nay có rất nhiều chỉ thị phân tử được phát triển dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR như: AFLP (Amplified fragment length polymorphism), RAPD (Random amplified polymorphism DNA), SSR (Simple sequence repeats), STS (sequence tagged site) … Chọn lọc nhờ chỉ thị dựa vào PCR Tính biến dị di truyền giữa các giống trong một loài cây có thể được phát hiện do sự sai khác về chiều dài của đoạn DNA đích được nhân bản nhờ PCR khi sử dụng cùng một cặp primer. Đó là do sự thay thế base ở các điểm liên kết primer hoặc do sắp xếp lại trật tự DNA trong vùng chứa các điểm đó. Những sự thay đổi như thế được phản ảnh ở tính đa dạng về chiều dài của các đoạn DNA được nhân bản (amplicon length polymorphism) – ALP. Các primer được dùng trong phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị dựa trên PCR thường căn cứ vào các điểm có trật tự nucleotide đã được xác định, gọi là chỉ thị điểm trật tự được đánh dấu - STS (sequence tagged site). Chỉ thị STS đang được sử dụng rất phổ biến trong lập bản đồ geneome. STS là một đoạn DNA ngắn khoảng 60-1000 bp và có thể phát hiện được bằng kỹ thuật PCR. Nó cho phép xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide biết trước của DNA trong geneome. Hai đoạn mồi được thiết kế dựa trên các trình tự nucleotide đã biết giúp ta xác định được vùng DNA cần tìm. Các đoạn mồi STS thường chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao với PCR. Một lượng lớn STS có thể được tạo ra nhờ sử dụng kỹ thuật RFLP và các dòng cDNA làm mẫu dò. Mỗi một STS được xác định tại một điểm trên bản đồ như là mốc trong genome. Dựa trên các kết quả phân tích về chỉ thị STS, RAPD, có thể xây dựng được các bản đồ di truyền liên kết ở một giống cây trồng nào đó. Nhờ vậy việc tìm kiếm các gene kiểm soát hoặc liên quan chặt chẽ đến một tính trạng di truyền nào đó có thể được tiến hành một cách dễ dàng. - Chỉ thị AFLP cho phép phát hiện được tính đa dạng về chiều dài các đoạn DNA được nhân bản chọn lọc. Kỹ thuật này được đánh giá là nhanh chóng và có hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng của cây trồng như lúa, lạc, … - Chỉ thị SSR: SSR là một đoạn DNA có sự lặp lại của một trật tự nucleotide đơn giản nào đó. Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại và số đơn vị lặp lại mà độ dài của SSR được nhân bản sẽ được phát hiện sau quá trình điện di. Chỉ thị SSR đã được dùng để chọn lọc tính kháng bệnh khảm do virus của cây đậu tương, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở lúa hoặc xác lập mối quan hệ thân thuộc

204

giữa các giống cây trồng ở cà chua, lúa, đậu tương, mía, … - Chỉ thị RAPD cho phép phát hiện tính đa hình của các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng một mồi đơn (thường chứa 1012 nucleotide, tối thiểu là 4 bp) chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên. Chỉ thị RADP thường được dùng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể phục vụ cho công tác lai tạo hoặc phân loại. Chúng cũng được sử dụng để xác định những gene kiểm soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở cây trồng như tính trạng chất lượng, tính kháng virus, …

V. Một số kỹ thuật khác và ứng dụng của chúng trong chọn giống thực vật trên thế giới và ở Việt Nam Trong những năm qua, các phương pháp biến nạp gene ở thực vật bậc cao đã có rất nhiều tiến bộ. Hiện nay các phòng thí nghiệm công nghệ gene đang bắt tay vào việc cải thiện có ý nghĩa cho một số loại cây trồng nhờ các công cụ của sinh học tế bào và sinh học phân tử. Trong một vài trường hợp đặc biệt (đậu tương, lúa, ngô và bông) các phương pháp biến nạp gene bị giới hạn bởi genotype. Một số các cây trồng quan trọng cần thiết cho nhu cầu sử dụng của người dân ở các nước đang phát triển ít được chú ý. Công nghệ di truyền thực vật là một bước ngoặt quyết định. Một số cây trồng quan trọng đã được biến nạp gene, một vài vấn đề kỹ thuật vẫn đang còn tồn tại, nhưng chúng đang dần dần được giải quyết. Để có kết quả cần phải thay đổi dần dần sang một phạm vi khác, như là phát hiện và tạo dòng các gene mang các tính trạng đa gene (multigeneic traits). Một điều không thể quên là vấn đề nhận thức của xã hội và dự báo nguy cơ tác động xấu đến môi trường do các sản phẩm có nguồn gốc từ công nghệ tái tổ hợp DNA mang lại. Hiện nay công nghệ biến nạp gene đang được quan tâm hơn thông qua các quỹ tài trợ của các cơ quan quốc tế như là chương trình Rockefeller Foundation (Mỹ), và vấn đề đang được thảo luận nhiều là cần thiết xác định phương thức tốt nhất để chuyển các lợi ích do công nghệ biến nạp gene mang lại đến các nước đang phát triển. Cây biến nạp gene đầu tiên thu được vào năm 1983. Điều này cho phép nhận xét rằng mới chỉ hơn hai thập niên, các công cụ của công nghệ DNA tái tổ hợp và sinh học tế bào đã giúp ích rất nhiều cho các nhà tạo giống thực vật. Việc lựa chọn phương thức sử dụng các cây trồng thu được từ công nghệ DNA tái tổ hợp có thể cung cấp thêm nguồn tài nguyên mới cho công nghiệp và người tiêu dùng, như vậy có thể mở rộng cơ sở kinh tế ở cả các nước công nghiệp lẫn các nước đang phát triển.

205

Câu hỏi ôn tập 1. Nêu nguyên tắc chung của kỹ thuật chuyển gene. 2. Trình bày các phương pháp chuyển gene vào cây trồng. 3. Ứng dụng của kỹ thuật RFLP trong chọn giống thực vật. 4. PCR là gì? Các giai đoạn của phản ứng PCR. 5. Ứng dụng PCR trong tách dòng các đoạn DNA.

Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Hoàng Lộc. 1998. Bài giảng Công nghệ gene thực vật. Đại học Khoa học Huế. 2. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (1989) Molecular Cloning (A laboratory manual). Cold Spring Habor Laboratory. USA. 3. Newton CR and Graham A. 1994. PCR. BIOS Scientific Publishers Limited. 4. Lê Duy Thành. 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB Khoa học và Kỹ thuật. 5. Wiser MF. 2002. Lecture notes for method in cell. Spring