Genetik

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Springer-Lehrbuch

Jochen Graw

Genetik 5., vollständig überarbeitete Auflage

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Professor Dr. Jochen Graw Helmholtz Zentrum München Institut für Entwicklungsgenetik Ingolstädter Landstraße 1 85758 Neuherberg E-Mail: [email protected]

ISBN 978-3-642-04998-9 DOI 10.1007/978-3-642-04999-6 Springer Dordrecht Heidelberg London New York Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.d-nb.de abrufbar. © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1995, 1998, 2002, 2006, 2010 Dieses Werk ist urheberrechtlich geschützt. Die dadurch begründeten Rechte, insbesondere die der Übersetzung, des Nachdrucks, des Vortrags, der Entnahme von Abbildungen und Tabellen, der Funksendung, der Mikroverfilmung oder der Vervielfältigung auf anderen Wegen und der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen, bleiben, auch bei nur auszugsweiser Verwertung, vorbehalten. Eine Vervielfältigung dieses Werkes oder von Teilen dieses Werkes ist auch im Einzelfall nur in den Grenzen der gesetzlichen Bestimmungen des Urheberrechtsgesetzes der Bundesrepublik Deutschland vom 9. September 1965 in der jeweils geltenden Fassung zulässig. Sie ist grundsätzlich vergütungspflichtig. Zuwiderhandlungen unterliegen den Strafbestimmungen des Urheberrechtsgesetzes. Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichenund Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürften. Einbandentwurf: WMX Design, Heidelberg Gedruckt auf säurefreiem Papier Springer ist Teil der Fachverlagsgruppe Springer Science+Business Media (www.springer.com)

Vorwort zur 5. Auflage

Vorwort zur 5. Auflage

„Gründlich, solide, humorfrei“, so beschrieb ein Rezensent die letzte (4.) Auflage der GENETIK. Ich nehme das als ein Kompliment (wenn man „humorfrei“ mit „sachlich“ übersetzt), denn genauso war das Buch konzipiert ‒ und offensichtlich wurde das auch so verstanden. Vor dem Hintergrund des rasanten Fortschritts der modernen molekularen Genetik habe ich mich deshalb gerne entschlossen, eine wiederum stark aktualisierte 5. Auflage herauszubringen. Dabei habe ich das bewährte Grundkonzept beibehalten, um so einen Eindruck von der Breite der Genetik zu vermitteln. Entsprechend wurden im Gesamtaufbau nur geringfügige Umstellungen vorgenommen: So wurde ein (Unter-)Kapitel zu den wichtigsten Modellorganismen der Genetik hinzugefügt (Kapitel 5.4); das frühere Kapitel über die Zukunft der Genetik wurde dagegen weitgehend in den übrigen Text integriert und durch ein neues Abschluss-Kapitel „Genetik und Anthropologie“ ersetzt. Auf diesem Gebiet erwarte ich (ebenso wie in dem Bereich der Verhaltens- und Neurogenetik, Kapitel 13) in den nächsten Jahren Ergebnisse, die unser Bild vom Menschen verändern können. Im Wesentlichen unverändert bleibt die Vielfältigkeit der Lernhilfen und der grafischen Gestaltung mit einem Überblick am Anfang eines Kapitels, mit Merksätzen, Blüten und Eulen zwischendurch sowie den Kernaussagen am Ende eines Kapitels sowie mit den Technik-Boxen, die eine kurze Einführung in technisch-methodische Aspekte geben. Gründlich verändert und aktualisiert wurde in dieser Auflage das Bildmaterial. Dabei spielte die Überlegung eine wichtige Rolle, den Dozenten aussagekräftige Abbildungen für den Unterricht zur Verfügung stellen zu können. An dieser Stelle sei daher allen Kolleginnen und Kollegen sowie denjenigen Verlagen gedankt, die ihr Bildmaterial kostenlos zur Verfügung gestellt haben; die entsprechenden Verweise sind bei den jeweiligen Bildern direkt zu finden. Nur so wurde auch für diese Auflage ein günstiger Preis möglich. Der aufmerksamen Leserin (und natürlich auch dem aufmerksamen Leser) wird es dabei nicht entgehen, dass einige renommierte Verlage nicht zu finden sind. Dies ist der jeweiligen Verlagspolitik geschuldet, die eine kostenfreie Weitergabe in der elektronischen und gedruckten Form leider nicht möglich machte. In meinen Dank schließe ich auch die Personen ein, die ganz wesentlich zum Gelingen dieser Auflage beigetragen haben. Dazu gehören in erster Linie Stefanie Wolf von der Lehrbuchabteilung des Springer-Verlags sowie das gründliche Lektorat von Annette Heß, aber auch die gewissenhafte Erstellung des Stichwortverzeichnisses durch Dr. Sabine Herold und die Produktion durch Tim Reichenthaler (lr-werbeagentur). Schließlich gilt mein Dank auch den vielen Fachkolleginnen und -kollegen, die mich mit Rat und Tat, Bildern und Vorschlägen für gute Formulierungen sowie inhaltlichen Hinweisen unterstützt haben. Ein Lehrbuch kann immer nur die historisch gewachsene und damit die aktuelle Summe des Wissens eines Fachs darstellen (und davon vieles auch nur exemplarisch). Insofern bin ich mir natürlich dessen bewusst, dass manche Kolleginnen und Kollegen die eine oder andere Facette ihres jeweiligen Spezialgebiets vermissen werden. Auf der anderen Seite ist insbesondere die moderne Genetik eine sehr dynamische Disziplin, sodass manches, was heute noch als „ungesichertes Konzept“ oder „spekulativer Ausblick“ gilt (das ist die Definition der „Eulen“ in diesem Buch), morgen schon zum Grundwissen gehören kann. Insofern spiegelt auch diese Auflage eine Momentauf-

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Vorwort zur 5. Auflage

nahme aus dem Frühjahr 2010 wider – und ich bin gespannt darauf, was uns die nächsten Jahre an neuen und spektakulären Erkenntnissen der Genetik bescheren werden. Selbstverständlich bin ich immer offen und dankbar für weitere Verbesserungsvorschläge und Kommentare aus allen Bereichen der community und wünsche auch der 5. Auflage der GENETIK, dass sie weiterhin erfolgreich verwendet wird ‒ und Ihnen, liebe Leserin und lieber Leser, wünsche ich, dass Sie dadurch den Zugang zu einem faszinierenden Fach finden mögen. Neuherberg/Unterschleißheim, im April 2010

Jochen Graw

Vorwort zur 4. Auflage

Nach drei erfolgreichen Auflagen der von Wolfgang Hennig begründeten GENETIK hat mich der Springer-Verlag gebeten, eine aktualisierte 4. Auflage zu erstellen. Ich habe diese Herausforderung gerne angenommen, weil ich in meinen Vorlesungen immer das Gefühl hatte, dass das Fach Genetik besonders dann gut vermittelt werden kann, wenn man die verschiedenen Teildisziplinen in einen engen Zusammenhang stellt. So wächst zwar das Wissen in unserem Fachgebiet derzeit explosionsartig, aber gerade darum treten viele Phänomene klarer hervor. Cytologische, morphologische oder auch formale Argumente bekommen plötzlich einen molekularbiologischen Unterbau und lassen sich leichter verstehen. Wie Wolfgang Hennig in seinem Vorwort zur 1. Auflage schrieb, ist es schwierig, als Einzelautor genetische Fragestellungen vollständig darzustellen. Dennoch ist es mir wichtig, den Studenten der Biologie im Grund- und Hauptstudium (oder wie es im Rahmen des Bologna-Prozesses jetzt heißt: in den Bachelor- und Master-Studiengängen) auch einen Eindruck von der Breite der Genetik zu vermitteln. Ich habe deshalb den historischen Bezug sehr knapp gehalten und die Genetik zunächst einmal von der molekularen Seite her entwickelt. Es folgt dann die Einbindung in die zellulären Strukturen der Pro- und Eukaryoten, so dass die formalen Aspekte (auch die der Populationsgenetik) vor der molekularbiologischen Grundlage (und auch mit dem molekularbiologischen methodischen Repertoire) leichter zu verstehen und zu bearbeiten sind. Die als Genomforschung in den letzten Jahren massiv vorangetriebenen Aspekte der modernen Genetik haben große Auswirkungen auf unser Wissen in den Bereichen der Entwicklungs- und Humangenetik. Weitere Modellsysteme haben sich mit neuen Techniken etabliert (z. B. Arabidopsis, der Zebrafisch und die Maus) und sind aus der modernen genetischen Forschung nicht mehr wegzudenken. Dem trägt die neue Auflage deutlicher als bisher Rechnung. Im Wesentlichen unverändert bleibt die Vielfältigkeit der Lernhilfen und der graphischen Gestaltung mit einem Überblick am Anfang eines Kapitels, mit Merksätzen, Blüten und Eulen zwischendurch sowie den Kernaussagen am Ende eines Kapitels und den Technik-Boxen, die eine kurze Einführung in technisch-methodische Aspekte geben. Allerdings wurden auch hier die Inhalte gründlich aktualisiert. Die Erkenntnisse der modernen Genetik wirken sich zunehmend auf unseren Alltag aus. Ich möchte daher nicht nur an die Fragen zur Lebensmittelherstellung durch gentechnisch veränderte Pflanzen und Tiere in der Landwirtschaft (und den verarbeitenden Betrieben) erinnern, sondern auch an die Fragen zur conditio humana, den Bedingungen, unter denen wir Menschen uns in der Vergangenheit entwickelt haben und wohin wir uns entwickeln können. Das schließt nicht nur die mögliche Beantwortung der Frage ein, welchen Weg die ersten Menschen aus Afrika heraus eingeschlagen haben (war das „die Vertreibung aus dem Paradies“?). Wir können auch nicht bei der Frage nach der Individualität (Stichwort hier: genetischer Fingerabdruck) oder bei der Frage der genetischen Diagnostik und Therapie stehen bleiben, sondern bekommen zunehmend auch den Bereich der genetischen Bedingungen unseres Verhaltens in den Blick. Erstaunlicherweise finden wir auch hier beim Menschen ähnliche Genkaskaden wie bei den „üblichen Modellsystemen“ Drosophila und der Maus. Das gilt sowohl für Grundzüge des Lernens und des Gedächtnisses, für Angst- und Suchtverhalten als auch für neurodegenerative Erkrankungen. In vielen Fällen beginnen wir gerade, solche Mecha-

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Vorwort zur 4. Auflage

nismen als komplexe genetische Modelle zu beschreiben. Wenn wir uns der molekularen Grundlagen, Bedingungen und Grenzen unseres Verhaltens immer bewusster werden, zeigt das aber auch, dass unsere Freiheit nicht unbegrenzt ist, sondern sich „nur“ im Rahmen vorgegebener Möglichkeiten entfalten kann – „Freiheit als Einsicht in die Notwendigkeit“? Ich erwarte daher in den nächsten Jahren intensive Diskussionen darüber, was Pädagogik und Psychiatrie leisten können (und sollen). Damit möchte ich schließlich noch einen Aspekt aufgreifen, der in den letzten Wochen vor Drucklegung des Buches die Debatte der Feuilletons verschiedener renommierter deutscher Zeitungen beherrscht hat, nämlich die Frage nach dem „intelligenten Designer“ – oder ob nicht die ganze Darwin’sche Abstammungslehre auf den Müllhaufen der Geschichte zu schmeißen und durch die biblische Schöpfungsgeschichte zu ersetzen sei. Dem muss natürlich im Vorwort eines Genetik-Lehrbuches insofern widersprochen werden, als in den Naturwissenschaften – und die Genetik gehört hier zweifellos dazu – die „Arbeitshypothese Gott“ nicht vorkommt. Das hat nun nichts damit zu tun, dass alle Naturwissenschaftler gottlos seien, sondern es ist „nur“ eine methodische Beschränkung auf messbare und reproduzierbare Parameter. Dennoch gelingt es mit diesem „beschränkten“ Ansatz, eine Vielzahl von Mechanismen plausibel zu verstehen und zu begründen - Mechanismen, die eben vor 2000 Jahren noch unverstanden waren. Genauso gibt es heute noch offene Fragen, die vielleicht erst bei der nächsten Auflage der GENETIK beantwortet werden können – z. B., ob tatsächlich Mutationen in einem Gen (hier FOXP2) für die Ausprägung von Sprache verantwortlich sind, oder spliceVarianten in einem anderen Gen (hier: fruitless bei Drosophila) für die geschlechtsspezifische Ausprägung des Balzverhaltens. Ich möchte dieses Vorwort nicht schließen, ohne den Personen meinen Dank abzustatten, die zum Gelingen nicht unwesentlich beigetragen haben. Dazu gehören natürlich in erster Linie die Mitarbeiterinnen der Lehrbuchabteilung des Springer-Verlages, Iris Lasch-Petersmann, Stefanie Wolf und Elke Werner sowie in den Anfängen Manuela Kratz; dazu gehört auch das gründliche Lektorat von Bettina Holzheimer. Herr Bernd Reichenthaler (ProEdit) hat es verstanden, auch die letzten „last minute“ Ergänzungen noch einzuarbeiten. Ebenso dankbar bin ich Dr. Christine Schreiber (BIOspektrum/ Elsevier) und besonders Dr. Tanita Casci (Redaktion Nature Reviews Genetics), die mich bei der Suche nach Bildern tatkräftig unterstützt haben. Schließlich gilt mein Dank den vielen Fachkolleginnen und -kollegen, die mir mit Rat und Tat, Bildern und Vorschlägen für gute Formulierungen zur Seite gestanden sind. Dieses Buch ist in vielen Bereichen eine Momentaufnahme aus dem Sommer 2005. Ich bin immer offen und dankbar für weitere Verbesserungsvorschläge und Kommentare aus allen Bereichen der „community“ und wünsche der 4. Auflage der GENETIK, dass sie weiterhin erfolgreich verwendet wird und den Lesern den Zugang zu einem faszinierenden Fach ermöglicht. Neuherberg/Unterschleißheim, im Juli 2005

Jochen Graw

Vorwort zur 3. Auflage

Die schnelle Entwicklung der Biologie in den letzten Jahrzehnten findet keine Parallele in der Geschichte der Naturwissenschaften. Die Genetik hat an dieser Entwicklung einen maßgeblichen Anteil. Es ist sicherlich für jeden Biologen faszinierend, diese Entwicklung miterleben zu können. Gleichzeitig kann man sich aber auch eines Gefühls der Hilflosigkeit nicht ganz erwehren, wenn man versucht, diese Entwicklungen in eine Form zu bringen, die es gestattet, das Fachgebiet in der Ausbildung von Studenten sachgemäß und in sinnvoller Weise darzustellen. Die Notwendigkeit der Beschränkung auf die Darstellung von Grundprinzipien wird stets ausgeprägter, und es erfordert ständige kritische Reflektion, was man überhaupt in den akademischen Unterricht einbeziehen will. Ein Lehrbuch soll dazu dienen, der/dem Studierenden einen Zugang zu seinem Fach dadurch zu schaffen, daß es ihr/ihm ermöglicht, sich mit den Grundlagen vertraut zu machen, die es schließlich gestatten, tiefer in Spezialgebiete des Faches einzudringen. Dennoch erwartet man, auch neue Entwicklung zumindest angedeutet zu finden und häufig gebrauchte Fachbegriffe wiederzufinden. Grenzen hierfür lassen sich heute nur noch willkürlich ziehen. Ich habe mich, ausgehend von solchen Überlegungen, in dieser neu bearbeiteten Auflage bemüht, wichtige neue Befunde einzuarbeiten, ohne in viele Details der neu erkannten molekularen Mechanismen einzudringen. Manche Bewertungen haben sich geändert und „Schleiereulen“ haben ihre Nistplätze verloren oder neue gefunden. Erneut haben mich viele Kollegen mit Hinweisen, Kommentaren und Material unterstützt. Ihnen gilt mein besonderer Dank! Ich hoffe, daß die Genetik auch in dieser Auflage wieder positiv aufgenommen wird. Shanghai, Oktober 2001

Wolfgang Hennig

1.2 Konstanz und Variabilität

Vorwort zur 2. Auflage

Die freundliche Aufnahme eines Lehrbuches durch die Benutzer ruft bei einem Autor eine besondere Motivation für Bemühungen zur Verbesserung hervor. In einem Fach, das sich so schnell entwickelt wie die Genetik, bringt das aber auch besondere Probleme mit sich: Eine Neuauflage müßte eigentlich teilweise neu geschrieben werden. Das ist aus vielerlei Gründen schwierig, wenn nicht unmöglich: Der Autor wäre in diesem Falle außerstande, noch anderes zu tun als sich ständig mit Teilgebieten des Lehrbuches zu beschäften. So bleibt nur ein Kompromiß möglich. Für die 2.-Auflage habe ich eine gründliche Überarbeitung und Korrektur vorgenommen. Das Kapitel „Humangenetik“ habe ich aktualisiert und in diesem Zusammenhang Kapitel zum Human-Genom-Projekt und zur Gentechnologie hinzugefügt. Ich bin allen, die mich auf Fehler aufmerksam gemacht haben und die mir Anregungen und Hinweise gegeben haben, zu Dank verpflichtet. Nicht alle Vorschläge habe ich berücksichtigen können, und ich habe mich auch nicht allen Änderungsvorschlägen zuwenden wollen – ganz abgesehen von sachlich falschen Änderungsvorschlägen (ein Beispiel, das wiederholt kritisiert wurde: es muß richtig Promoter heißen, n-i-c-h-t Promotor!). Ein Grundlagen-Lehrbuch kann einen bestimmten Rahmen nicht überschreiten, wenn es dem Leser Einblicke in Basiswissen zu allen Teilgebieten der Genetik vermitteln soll. Eine wesentliche Umfangserweiterung der „Genetik“ ist aus der Sicht des Einzelautors auch nicht erstrebenswert. Es liegt mir aber daran festzustellen, daß der Verlag allen Vorschlägen zur Gestaltung von meiner Seite her sehr positiv gegenübersteht. Ich hoffe, daß die „Genetik“ weiterhin gern gebraucht wird, und ich bin weiterhin für jeden Kommentar, vor allem auch von studentischer Seite, sehr dankbar. Mainz, Januar 1998

Wolfgang Hennig

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1.2 Konstanz und Variabilität

Vorwort zur 1. Auflage

Dieses Lehrbuch ist aus meiner Genetik-Grundvorlesung entstanden und reflektiert deren Struktur, wie sie sich im Laufe mehrerer Jahre aufgrund der Erfahrung in Prüfungen und durch Gespräche mit Studenten entwickelt hat. Hauptanliegen ist es mir stets gewesen, molekulare und klassische genetische und cytologische Gesichtspunkte soweit wie irgend möglich zu integrieren. Die Entwicklung der Genetik bietet hierzu immer bessere Möglichkeiten. Die Frage, ob der Genetik-Unterricht auf der klassischen Genetik oder auf den Kenntnissen der Molekulargenetik aufbauen soll, wird damit zum Teil gegenstandslos. Der sinnvolle Zugang zur Genetik ergibt sich in meinen Augen von selbst: Der logische Einstieg in das Denkgebäude der Genetik ist am einfachsten, wenn man deren historischer Entwicklung folgt. Wie wäre auf der molekularen Ebene zu erkennen, ob DNA-Veränderungen sich im Phänotyp auswirken? Die Aufklärung elementarer Mechanismen der Frühentwicklung bei Drosophila in den letzten Jahren hat für jeden deutlich werden lassen, daß der Bezug zum Phänotyp, also der Morphologie, die entscheidende Rolle für den Zugang zu den wesentlichen biologischen Fragestellungen spielt. Für einen einzelnen Autor ist es heute wohl unmöglich, in einem Grundlehrbuch der Genetik eine Vollständigkeit in der Darstellung der Fragestellungen anzustreben. Ich habe es als mein Ziel angesehen, grundlegende Mechanismen, deren Verständnis unabdingbar ist, an geeigneten Beispielen darzustellen. Deren Besprechung ergibt sich oft aus einem allgemeineren biologischen Zusammenhang. Ich habe mich daher nicht unbedingt von der Vorstellung leiten lassen, daß zusammengehörige Themen auch an einer Stelle besprochen werden müssen. Ein Beispiel dafür ist das Kapitel 5 über Steuerung der Genfunktion auf chromosomalem Niveau, das mir als Einführung dieser Problematik wichtig erschien, dessen molekulare Grundlagen aber erst später ausgeführt werden. Mein Bemühen war es daher auch, durch ausführliche Querverweise die Erarbeitung einer zusammenhängenden Sicht zu erleichtern. Ich habe in diesem ersten Ansatz darauf verzichtet, Fragen der Verhaltensgenetik und der Evolutionsforschung einzubeziehen. Im allgemeinen sind diese dem Fortgeschrittenenstudium zuzuordnen und hätten den Rahmen des vorliegenden Bandes damit überschritten. Die Populationsgenetik ist nur in sehr kurzer Form angesprochen, da hier das sehr übersichtliche deutschsprachige Lehrbuch von D. Sperlich zur Verfügung steht. Um von Beginn an den Zugang zur Fachliteratur zu erleichtern, habe ich im Text durchgehend für alle wichtigen Fachbegriffe die jeweilige englische Terminologie angeführt. Zudem sind häufig geeignete deutsche Begriffe nicht verfügbar. In solchen Fällen habe ich grundsätzlich die englische Terminologie verwendet. Ich finde beispielsweise durch nichts gerechtfertigt, den Begriff „single copy DNA“ durch eine so abstruse „Übersetzung“ wie „unikale DNA“, der man gelegentlich begegnet, zu ersetzen. Für Fachbegriffe habe ich im Glossar deren sprachlichen Ursprung und seine Bedeutung vermerkt, um damit das Verständnis der Begriffe zu erleichtern. Die Frage, ob es sinnvoll ist, die Namen von Forschern anzuführen, wurde von mir positiv beantwortet: Es sind Menschen, die die entscheidenden Beobachtungen gemacht haben oder Wesentliches zu unserem Verständnis beigetragen haben. Warum sollten sie nicht genannt werden? In Einzelfällen wird diese Zuordnung vielleicht nicht immer der wissenschaftlichen Prioriät entsprechen, aber ich hoffe, daß diese sich als Ausnahmen

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Vorwort zur 1. Auflage

erweisen. Wo irgend möglich, habe ich mich bemüht, mir eine Einsicht in die Originalliteratur zu verschaffen. Die Angabe der Lebensdaten der Forscher soll es dem Leser erleichtern, Parallelitäten in der Forschungsgeschichte der Genetik zu erkennen und die Befunde historisch einzuordnen. Umgekehrt habe ich Daten der Veröffentlichung bewußt überall da weggelassen, wo diese zur historischen Einordnung nicht notwendig sind. Die starke Verwobenheit der Genetik mit anderen biologischen Disziplinen führt zwangsläufig zu der Situation, daß ein umfassendes Genetiklehrbuch, schon durch die damit verbundene zeitliche Belastung, kaum noch von einem Einzelnen zu schreiben ist. Wenn ich dieses Wagnis dennoch unternommen habe, dann in der Hoffnung, daß es dadurch gelingt, eine möglichst einheitliche Konzeption in der Wahl und Darstellung der Inhalte sowie in der didaktischen Behandlung zu verwirklichen. Es muß dabei zugestanden sein, daß Schwerpunkte nach persönlichen Gesichtspunkten gesetzen werden. Dieses selektive Lehrprinzip entspricht dem Konzept, das Wagenschein unter dem Begriff „exemplarisches Lehren“ vorgestellt hat und das künftig auch in der universitären Ausbildung wohl die einzige Lösung angesichts der Fülle des Stoffes bleibt. In diesem Zusammenhang war ich immer wieder versucht, Ausflüge in die allgemeine Biologie zu unternehmen. Das aber ist nur ein Zeichen dafür, wie Genetik heute eigentlich zu verstehen ist, nämlich als allgemeine Biologie. Für alle Verbesserungsvorschläge, Hinweise auf Fehler und Anregungen, insbesondere auch von jenen, denen dieses Buch in erster Linie helfen soll, sich in der immer komplexeren Wissenschaft der Genetik zurechtzufinden – den Studenten der Biologie – werde ich besonders dankbar sein. Kommentare von meinen Studenten während der Entstehung des Buches haben bereits einen Niederschlag gefunden. Insbesondere sind auch didaktische Elemente wie z.B. die Technikboxen, das Glossar, die Zusammenfassung der Kapitel in Kernaussagen und die Hervorhebungen durch die Piktogramme auf Anregungen von Studenten entstanden. Meine positiven Erfahrungen im Grundunterricht mit ausführlichen Illustrationen der behandelten Problematik haben mich veranlaßt, den vorliegenden Text so sorgfältig und vollständig wie möglich durch Abbildungen und Tabellen zu unterstützen. Die erschöpfenden Legenden sollen den Text ergänzen und die Erarbeitung spezieller Punkte anhand der Abbildungen ermöglichen. Ebenso sind in einigen der Tabellen die experimentellen Schritte ausgeführt (z.B. bei den Mendelschen Regeln). Zur Erleichterung der Handhabung des Textes und zur Erhöhung seiner Übersichtlichkeit habe ich Beispiele und Experimente durch ein Blütenpiktogramm (es handelt sich um die Blüte einer Walderdbeere) gekennzeichnet. Textbereiche, in denen Fragen erörtert, ungelöste Probleme vorgestellt oder mehr spekulative Aussagen gemacht werden, sind durch das Piktogramm der Schleiereule hervorgehoben. Ich hoffe, daß die Einarbeitung der didaktischer Elemente das Buch auch für Biologielehrer zum Nachschlagen und zur Anregung geeignet macht. Der schnelle Fortschritt der Genetik zwingt zur ergänzenden Information bereits kurze Zeit nach Beendigung der universitären Ausbildung. Weiter hoffe ich, daß in dieser Hinsicht auch das abschließende Kapitel, das sich mit Fragen der Gentechnologie beschäftigt, besondere Aufmerksamkeit findet, selbst wenn es bei Erscheinen des Buches teilweise bereits überholt sein mag. Viele Kollegen haben mir mit Rat und Vorschlägen sowie durch Material zur Verfügung gestanden. Ihnen gilt mein herzlicher Dank. Wilfried Janning (Münster), Erwin Schmidt (Mainz), Rolf Nöthiger (Zürich), Klaus Rajewsky und Matthias Cramer (Köln), Thomas Börner (Berlin), Peter Huijser (Köln), Klaus Cichutek (Frankfurt), Johannes Löwer (Frankfurt), Koos Miedema (Nijmegen) und Ron Hochstenbach (Nijmegen) haben Teile des Textes kritisch gelesen und wichtige Vorschläge zur Änderung und Ergänzung gemacht. Frau Seipp (Heidelberg) hat den ersten Teil des Manuskriptes mit viel Sorgfalt kommentiert. Weiterhin möchte ich für Materialien und Hilfe danken: Nicole Angelier (Paris), Rudi Appels (Canberra), Dietrich Arndt (BGA Berlin), David Bazett-Jones (Calgary), Hans Becker (Heidelberg), Wolfgang Beermann (Tübingen), Ann Beyer (Baltimore), Harald Biessmann (Irvine), W. Burkart (BfS Salzgitter), Werner

Vorwort zur 1. Auflage

Buselmaier (Heidelberg), B.M. Cattanach (Oxon), P. Colman (Melbourne), Thomas Cremer (Heidelberg), Christine Dabauvalle (Würzburg), Tara Devi (Delhi), John Doebley (St. Paul), William C. Earnshaw (Baltimore), Jan-Erik Edström (Lund), Hans Erni (Luzern), Elvira Finke (BGA Berlin), H. Frank (Tübingen), Joseph G. Gall (Baltimore), Walter Gehring (Basel), Susan Gerbi (Providence), David Glover (London), H. K. Goswami (Bhopal), Caspar Grond (Heidelberg), Rudolf Hagemann (Halle), Barbara Hamkalo (Irvine), Daniel L. Hartl (Boston), Martin Heisenberg (Würzburg), Daniele Hernandez- Verdun (Paris), W. Hilscher (Neuss), Ch. Holderegger (Zürich), Joel Huberman (Buffalo), Peter Huijser (Köln), Bernard John (Caldicot), Eberhard Kaltschmidt (Lüneburg), A. Kleinschmidt (Mainz), R. Koopman (Nijmegen), Christian Krause (Berlin), Peter Lawrence (Cambridge), Ruth Lehmann (Cambridge), Maria Leptin (Tübingen), Markus Lezzi (Zürich), John Lucchesi (Atlanta), Alfred Maelicke (Mainz), Oscar L. Miller, Jr. (Charlottesville), Peter Moens (Toronto), Christiane Nüsslein-Volhard (Tübingen), B.A. Oostra (Leiden), J.B. Rattner (Calgary), Georg Redei (Columbia), Wolf Reik (Cambridge), Ulrich Scheer (Würzburg), H. Schuhmacher (Braunschweig), Heinz Schwarz (Tübingen), Uli Schwarz (Tübingen), Dieter Schweizer (Wien), Dominik Smeets (Nijmegen), Günter Steinbrück (Tübingen), S. Takayama (Tokio), Diethard Tautz (München), Herbert Taylor (Tallahassee), William Theurkauf (Stony Brook), Michael Trendelenburg (Heidelberg), E. Trifanov (Rehovot), Friedrich Vogel (Heidelberg), Peter Vogt (Heidelberg), Eric Weinberg (Philadelphia), Dieter von Wettstein (Kopenhagen), H. Winking (Lübeck) und Ute Wolf (BGA Berlin). Nach vieljähriger Unterbrechung hat sich Herr Oberstudiendirektor B. Gotthardt, Berlin, noch einmal die Mühe gemacht, meine Altsprachenkenntnisse (im Glossar) zu überprüfen und zu ergänzen. Auch ihm möchte ich an dieser Stelle nochmals herzlich danken. Im Verlag bin ich Frau Anne C. Repnow und Frau Manuela C. Wolf für die ausgezeichnete, für beide Seiten unerwartet lange Zusammenarbeit und die vielfachen Hilfen sehr zum Dank verpflichtet. Frau Isolde Gundermann hat das Projekt herstellerisch betreut. Auch meinen vielen, sehr diskreten Gestaltungswünschen haben sie stets positiv gegenübergestanden, und sie haben durch Gestaltungsvorschläge viel zur endgültigen Form des Buches beigetragen. Insbesondere die didaktischen Elemente im Text haben erst durch diese Kommunikation ihre endgültige Gestalt gefunden. Frau Christiane von Solodkoff hat die computergraphische Überarbeitung der Abbildungen ausgeführt. Ein besonderes Anliegen ist mir die Feststellung, daß die Zusammenarbeit mit Sibylle Erni (Luzern) bei der Anfertigung der Abbildungen ein besonders motivierender Teil der Arbeit an diesem Buch war. Sie hat in vielen Fällen eigene Vorschläge zur Anordnung und Ausführung verwirklicht und Fehler in meinen Vorlagen aufgespürt. Ihr gilt mein besonders herzlicher Dank für ihren Einsatz, ihre Ausdauer und ihre Sorgfalt. Ihre Zusage, die Illustrationen auszuführen, hat meinen Entschluß zur Arbeit an diesem Buch entscheidend beeinflußt. Kranenburg, September 1994

Wolfgang Hennig

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1.3 Theoriebildung in der Biologie

Hinweise zum Gebrauch und zur didaktischen Konzeption

Vielfältige Lernhilfen und die optische Gestaltung dieses Lehrbuches bieten dem Leser die Möglichkeit, sich dem komplexen Stoffgebiet Genetik auf verschiedene Weise bzw. auf verschiedenen Leseebenen zu nähern. Für den optimalen Gebrauch – sowohl zum intensiven Studium als auch zur schnellen Information über Teilbereiche – sollen die didaktischen Elemente und die Gliederung des Buches hier erläutert werden. Jedes Hauptkapitel wird durch eine inhaltlich charakteristische, ganzseitige Abbildung eröffnet, die das Interesse am Thema wecken und zum Weiterlesen motivieren soll. Überblick

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Es folgt eine Zusammenfassung des Kapitelinhaltes in einer sehr allgemein gehaltenen Form. Durch die fortlaufende Lektüre dieser Abschnitte kann ein guter Überblick über die Teilprobleme der Genetik erhalten werden. Das erleichtert es auch, Zusammenhänge über die Kapitel hinweg zu erkennen. Die allgemeine Form soll das Interesse an der Detailinformation wecken. Innerhalb der Kapitel sind kurze Zusammenfassungen der wichtigsten behandelten Punkte hervorgehoben, damit sie auf den ersten Blick erkennbar sind. Diese Merksätze sollen die systematische Erarbeitung des Stoffes erleichtern. Sie eignen sich insbesondere auch zum schnellen Wiederholen. Fachbegriffe sind, ebenso wie die Hauptstichworte des jeweiligen Textabschnitts, durch halbfetten Druck hervorgehoben und bilden eine Art roten Faden durch das Buch. Dies trägt zur Übersichtlichkeit und besseren Gliederung des Lehrstoffes bei. Beispiele, die den theoretischen Hintergrund erläutern oder die Erarbeitung einer Fragestellung erleichtern sollen, sind im Textbereich durch eine Blüte gekennzeichnet und erlauben so ein schnelles Auffinden. Abweichend von üblichen Lehrbuchdarstellungen sind in den Text bisweilen auch ungesicherte Konzepte oder Vorstellungen oder auch weitgehend spekulative Ausblicke sowie offene Fragestellungen aufgenommen. Sie werden durch das Symbol einer Schleiereule angezeigt, das auf die Grenzen des gegenwärtigen Wissens aufmerksam machen soll.

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XVIII Hinweise zum Gebrauch und zur didaktischen Konzeption XVIII

Jedes Kapitel schließt mit einer Aufzählung von Kernaussagen, die den Inhalt des Kapitels nochmals in konkreten Punkten zusammenfassen. Es soll hierdurch erleichtert werden, nach der Bearbeitung des Kapitels zu prüfen, ob die wesentlichen Gesichtspunkte des Kapitels erfasst worden sind. Methoden der Genetik werden in getrennten Technik-Boxen dargestellt, auf die im fortlaufenden Text nur gelegentlich ausdrücklich verwiesen wird. Sie sind in den unterschiedlichsten Zusammenhängen relevant. Die Technik-Boxen sind im Inhaltsverzeichnis mit einem gelben Balken markiert. Eine Übersicht über die wichtigsten methodischen Ansätze ist so leicht möglich. Die am Ende des Buches nach Kapiteln sortierte Literaturübersicht soll es einerseits erleichtern, wichtige Originalarbeiten aufzufinden, andererseits aber auch Hinweise auf jüngere Reviews oder Originalarbeiten geben, die zur Vertiefung des Studiums von Teilaspekten geeignet sind. Eine Vollständigkeit ist nicht angestrebt. Im Glossar sind die wichtigsten Fachbegriffe zusammengestellt und kurz in ihrem sprachlichen Ursprung erklärt. Es folgt oft ein Verweis auf die Textstelle, an der der Begriff fachlich erläutert bzw. eine Definition gegeben wird. Dieses Verfahren erscheint besser geeignet als eine kurzgefasste Wiederholung. Es erlaubt eine schnelle Orientierung über wesentliche Begriffe und ihre Bedeutung. Das Sachverzeichnis ist bewusst sehr ausführlich gehalten und soll das Lehrbuch auch zum Nachschlagen geeignet machen. Die zahlreichen Querverweise im laufenden Text dienen dazu, besprochene Begriffe und Fragen, die auch in anderem Zusammenhang relevant sind oder vertieft werden, schnell aufzufinden. Abbildungslegenden sind so gehalten, dass Abbildungen auch ohne Rückgriffe auf den Text verständlich sind. Sie enthalten bisweilen auch Einzelheiten, die im Text nicht erwähnt werden, für ein tiefergehendes Studium jedoch notwendig sind. Der fortlaufende Zusammenhang des Textes wird dadurch besser gewahrt, ohne durch allzu viele Teilaspekte zu unübersichtlich zu werden. Tabellen wurden überall dort eingesetzt, wo es erforderlich erschien, Zahlenmaterial oder andere Daten zum besseren Verständnis besonders übersichtlich und prägnant darzustellen oder zum Nachschlagen zusammenzufassen.

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Kernaussagen

Technik-Box 1

1.1 Gegenstand der Genetik

Inhaltsverzeichnis

Kapitel 1 Was ist Genetik? 1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.2 1.2.1 1.2.2 1.3

Gegenstand der Genetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Kurzer Abriss der Geschichte der Genetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Das Genom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Der Genbegriff. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 Konstanz und Variabilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Umweltbedingte Variabilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 Genetisch bedingte Variabilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Theoriebildung in der Biologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Technik-Box 1: Isolierung genomischer DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

Kapitel 2 Molekulare Grundlagen der Vererbung 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3

Funktion und Struktur der DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 DNA als Träger der Erbinformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 Chemische Zusammensetzung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Konfiguration der DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Physikalische Eigenschaften der Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 Die Verdoppelung der DNA (Replikation) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 Semikonservative Replikation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Mechanismen der Replikation bei Prokaryoten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 Mechanismen der Replikation bei Eukaryoten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 Technik-Box 2: Renaturierungskinetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 Technik-Box 3: Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

Kapitel 3 Verwertung genetischer Informationen 3.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 3.3.6 3.3.7 3.4 3.4.1 3.4.2

DNA, genetische Information und Informationsübertragung . . . . . . . . . . . 52 Der genetische Code . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 Die Entschlüsselung des Codes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 Beweis der Colinearität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 Allgemeingültigkeit des Codes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 Transkription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Allgemeiner Mechanismus der Transkription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Transkription bei Prokaryoten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 Transkription Protein-codierender Gene bei Eukaryoten . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 Reifung eukaryotischer mRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 Spleißen eukaryotischer prä-mRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 Editieren eukaryotischer mRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 Abbau eukaryotischer mRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 Translation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 Initiation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 Elongation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

XIX

XX XX

Inhaltsverzeichnis

3.4.3

Termination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Technik-Box 4: Polymerasekettenreaktion (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Technik-Box 5: Markierung von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Technik-Box 6: Isolierung von mRNA, cDNA-Synthese und RACE . . . . . . Technik-Box 7: In-vitro-RNA-Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

86 89 91 92 94

Kapitel 4 Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene 4.1 4.2 4.2.1 4.2.2 4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.4 4.4.1 4.4.2 4.5 4.5.1 4.5.2 4.5.3 4.5.4 4.5.5 4.6 4.6.1 4.6.2 4.6.3

Bakterien als genetische Modellsysteme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 Extrachromosomale DNA-Elemente: Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 F-Plasmid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 Andere Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 Bakteriophagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 Vermehrungszyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 Bakteriophage λ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 Andere Bakteriophagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 Transformation und Rekombination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 Rekombination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 Genstruktur und Genregulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 Das lac-Operon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 Das Operonmodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 Das trp-Operon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131 RNA-codierende Gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 Kommunikation in Bakterien: Quorum sensing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 Regulation im Genom des Phagen λ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 Regulation des lytischen Zyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 Regulation des lysogenen Zyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144 DNA-Protein-Interaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145 Technik-Box 8: Klonierung von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147 Technik-Box 9: Two-Hybrid-Systeme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150 Technik-Box 10: Restriktionsanalyse von DNA und Southern-Blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 Technik-Box 11: Northern-Blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154

Kapitel 5 Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen 5.1 5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.3 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.3.5 5.3.6 5.3.7 5.4 5.4.1 5.4.2 5.4.3

Die Entdeckung der Zelle. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156 Die eukaryotische Zelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 Die Struktur der Zelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 Chloroplasten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159 Mitochondrien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 Zellkern und Nukleolus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166 Der Zellzyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 Mitose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 Meiose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 Rekombination bei Eukaryoten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177 Genkonversion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 Kontrolle des Zellzyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Kontrollierter Zelltod: Apoptose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190 Genetik des Alterns . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194 Wichtige eukaryotische Modellorganismen in der Genetik . . . . . . . . . . . . 196 Hefen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197 Pflanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 Der Fadenwurm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202

Inhaltsverzeichnis

5.4.4 5.4.5 5.4.6

Die Taufliege . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204 Der Zebrafisch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205 Die Hausmaus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210 Technik-Box 12: Homologe Rekombination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215

Kapitel 6 Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen 6.1 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4 6.1.5 6.2 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.3 6.3.1 6.3.2 6.3.3

Das eukaryotische Chromosom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218 Chromosomen als Träger der Erbanlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218 Morphologie der Chromosomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220 Das Centromer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 227 Das Telomer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229 Repetitive DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233 Organisation der DNA im Chromosom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235 Chromosomale Territorien und Architektur des Zellkerns . . . . . . . . . . . . . . 236 Chromosomale Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240 Nukleosomen und Chromatinstruktur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241 Chromatin und epigenetische Regulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245 Variabilität der Chromosomen und Dosiskompensation . . . . . . . . . . . . . . 249 Die Variabilität der Chromosomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249 Dosiskompensation bei Drosophila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258 Dosiskompensation bei Säugern. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 260 Technik-Box 13: Autoradiographie an Geweben, Zellen und Chromosomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268 Technik-Box 14: Chromosomenbänderung und chromosome painting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269

Kapitel 7 Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene 7.1 7.2 7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.3 7.3.1 7.3.2 7.3.3 7.3.4 7.4 7.4.1 7.4.2 7.4.3 7.5 7.5.1 7.5.2 7.5.3 7.5.4

Protein-codierende Gene: I. Einzelkopiegene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272 Protein-codierende Gene: II. Multigenfamilien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277 Die Globin-Genfamilie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277 Histon-Gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283 Tubulin-Gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285 Kristallin-Gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287 Regulation eukaryotischer Genexpression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289 Der Promotor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289 Transkriptionsfaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291 Enhancer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293 Locus-Kontrollregionen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296 RNA-codierende Gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297 Die 5,8S-, 18S- und 28S-rRNA-Gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297 Die 5S-rRNA-Genfamilie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306 Die tRNA-Genfamilien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 310 Kleine regulatorische RNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313 Mechanismus der RNA-Interferenz. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 314 Kleine interferierende RNA (siRNA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317 Mikro-RNA (miRNA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 319 Piwi-interagierende RNA (piRNA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 320 Technik-Box 15: Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen . . . . . . . . . 324 Technik-Box 16: RNAi: spezifische Inaktivierung von Transkripten . . . . . . 325

XXI

XXII XXII

Inhaltsverzeichnis

Kapitel 8 Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität 8.1 8.1.1 8.1.2 8.2 8.2.1 8.2.2 8.2.3 8.2.4 8.3 8.3.1 8.3.2 8.3.3 8.3.4 8.3.5 8.4 8.4.1 8.4.2 8.4.3

Transposons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 328 Prokaryotische Transposons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 330 Eukaryotische Transposons (mit terminalen invertierten Wiederholungseinheiten) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334 Retroviren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 340 Genomstruktur von Retroviren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342 Humanes Immunschwäche-Virus (HIV) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345 Retroelemente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 347 Mobile Elemente in Introns der Gruppe II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356 Umlagerung von DNA-Fragmenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 357 Kerndualismus: Mikro- und Makronuklei in einer Zelle . . . . . . . . . . . . . . . . 357 Chromatinelimination und -diminution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361 DNA-Amplifi kation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 364 Wechsel des Paarungstyps bei Hefen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371 Die Oberflächenantigene von Trypanosoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377 Das Immunsystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 380 Funktion des Immunsystems der Säuger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 380 Die Immunglobulin-Gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382 Klassenwechsel, Hypermutation und Genkonversion bei Immunglobulin-Genen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 385 Technik-Box 17: Verwendung von Balancer-Chromosomen . . . . . . . . . . . . . 390 Technik-Box 18: P-Element-Mutagenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 391 Technik-Box 19: Enhancer-Trap-Experimente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392

Kapitel 9 Veränderungen im Genom: Mutationen 9.1 9.2 9.2.1 9.2.2 9.2.3 9.3 9.3.1 9.3.2 9.3.3 9.4 9.4.1 9.4.2 9.4.3 9.5 9.5.1 9.5.2 9.6 9.6.1 9.6.2 9.6.3 9.7 9.7.1 9.7.2

Klassifi kation von Mutationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394 Chromosomenmutationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 397 Numerische Chromosomenaberrationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 397 Polyploidie in der Pflanzenevolution und Pflanzenzucht . . . . . . . . . . . . . . . . 402 Strukturelle Chromosomenaberrationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405 Spontane Mutationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 408 Fehler bei Replikation und Rekombination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 408 Spontane Basenveränderungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 409 Dynamische Mutationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 410 Induzierte Mutationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414 Mutationen durch ultraviolette Strahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414 Mutagenität ionisierender Strahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416 Chemische Mutagenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419 Mutagenität und Mutationsraten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 426 Mutagenitätstests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 426 Mutationsraten und Evolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432 Reparaturmechanismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 434 Reparatur UV-induzierter DNA-Schäden durch Photolyasen . . . . . . . . . . . . 434 Exzisionsreparaturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 436 SOS-Rekombinationsreparatur oder postreplikative Reparatur. . . . . . . . . . . 439 Ortsspezifische Mutationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 441 Gentechnische Modifi kationen von Pflanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 441 Gentechnische Modifi kationen von Tieren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444 Technik-Box 20: SSCP-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 450 Technik-Box 21: DNA-Sequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451 Technik-Box 22: Transgene Mäuse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453

Inhaltsverzeichnis

Kapitel 10 Formalgenetik 10.1 10.2 10.2.1 10.2.2 10.3 10.3.1 10.3.2 10.3.3 10.3.4 10.3.5 10.4 10.4.1 10.4.2 10.4.3 10.4.4 10.4.5 10.4.6 10.5 10.5.1 10.5.2 10.5.3 10.5.4 10.5.5

Grundregeln der Vererbung: Die Mendel’schen Regeln . . . . . . . . . . . . . . . . 456 Statistische Methoden. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 466 Mathematische Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 467 Die F2-Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 468 Mendel aus heutiger Sicht – Ergänzungen seiner Regeln . . . . . . . . . . . . . . . 469 Unvollständige Dominanz und Codominanz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 471 Multiple Allelie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 474 Der Ausprägungsgrad von Merkmalen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 477 Polygene Vererbung – Genetik quantitativer Merkmale . . . . . . . . . . . . . . . . . 481 Pleiotropie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 483 Kopplung, Rekombination und Kartierung von Genen . . . . . . . . . . . . . . . . 486 Geschlechtsgebundene Vererbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 486 Kopplung von Merkmalen auf autosomalen Chromosomen. . . . . . . . . . . . . . 489 Klassische Dreipunkt-Kreuzung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 491 Kartierung von Genen durch Tetradenanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 494 Moderne genomweite Kartierung mit Mikrosatelliten- und SNP-Markern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 494 Kartierung von quantitativen Merkmalen und Modifi katorgenen . . . . . . . . 499 Populationsgenetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 501 Die Hardy-Weinberg-Regel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502 Genetische Zufallsveränderungen (random drift) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 506 Natürliche Selektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 508 Migration und Isolation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514 Genetische Aspekte der Artbildung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 518 Technik-Box 23: Kartierung genetischer Merkmale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 525 Technik-Box 24: Immunologische Nachweismethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . 526

Kapitel 11 Entwicklungsgenetik 11.1 11.2 11.2.1 11.2.2 11.2.3 11.3 11.3.1 11.3.2 11.4 11.4.1 11.4.2 11.4.3 11.4.4 11.4.5 11.4.6 11.5 11.5.1 11.5.2 11.5.3 11.6 11.6.1 11.6.2

Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 528 Entwicklungsgenetik der Pflanze. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 529 Musterbildung in der frühen Embryogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 529 Wurzel-, Spross- und Blattentwicklung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 532 Blütenentwicklung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 537 Entwicklungsgenetik des Fadenwurms Caenorhabditis elegans. . . . . . . . . 544 Embryonalentwicklung von C. elegans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 544 Organentwicklung bei C. elegans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 547 Entwicklungsgenetik von Drosophila melanogaster . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 548 Keimbahnentwicklung bei Drosophila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 548 Der frühe Embryo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 550 Die Ausbildung der anterior-posterioren Körperachse . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552 Die Ausbildung der dorso-ventralen Körperachse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 556 Segmentierung bei Drosophila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 558 Imaginalscheiben, Metamorphose und Organentwicklung bei Drosophila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 566 Entwicklungsgenetik bei Fischen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 572 Allgemeine Embryonalentwicklung des Zebrafisches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 573 Frühe Embryonalentwicklung des Zebrafisches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 573 Organentwicklung bei Zebrafischen: Herz und Auge . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 575 Entwicklungsgenetik bei Säugern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 577 Embryonalentwicklung von Säugern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 577 Entwicklung von Zwillingen beim Menschen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 580

XXIII

XXIV Inhaltsverzeichnis XXIV

11.6.3 11.6.4 11.6.5 11.7 11.7.1 11.7.2 11.7.3 11.8 11.8.1 11.8.2 11.8.3

Teratogene Effekte. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 582 Organentwicklung bei Säugern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 584 Keimzellentwicklung und Geschlechtsdeterminierung bei Säugern . . . . . . . 590 Stammzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 593 Totipotenz von Zellkernen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 593 Embryonale Stammzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 595 Somatische Stammzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 598 Epigenetik und genetische Prägung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 599 Was ist genetische Prägung? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 599 Methylierung als epigenetische Markierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 602 Wann erfolgt genetische Prägung? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 605 Technik-Box 25: In-situ-Hybridisierung von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . 610 Technik-Box 26: Morpholinos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 611

Kapitel 12 Genetik menschlicher Erkrankungen 12.1 12.1.1 12.1.2 12.1.3 12.1.4 12.1.5 12.2 12.2.1 12.2.2 12.3 12.3.1 12.3.2 12.3.3 12.3.4 12.3.5 12.4 12.4.1 12.4.2 12.4.3 12.5 12.5.1 12.5.2 12.5.3 12.5.4 12.5.5

Methoden der Humangenetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 614 Zwillingsforschung und Geschwisterpaar-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 616 Stammbaumforschung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 618 Das Human Genome Project . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 618 Kartierung von Erbkrankheiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 620 Genetische Epidemiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 625 Chromosomenanomalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 625 Numerische Chromosomenanomalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 627 Strukturelle Chromosomenanomalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 631 Monogene Erbkrankheiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 632 Autosomal-rezessive Erkrankungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 633 Autosomal-dominante Erkrankungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 638 X-chromosomale Krankheiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 644 Y-chromosomale Gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 653 Mitochondriale Erkrankungen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 655 Komplexe Erkrankungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 658 Gene und Krebs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 658 Asthma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 667 Diabetes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 671 Genbasierte Diagnose- und Therapieverfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 675 Molekulare Diagnostik, Familienberatung und Reihenuntersuchungen . . . 675 Gentechnische Aspekte bei der Behandlung von Krankheiten. . . . . . . . . . . . 678 Pharmakogenomik und individualisierte Medizin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 680 Somatische Gentherapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 681 Genetik und Reproduktionsmedizin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 682 Technik-Box 27: Differenzielle Genexpression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 685 Technik-Box 28: Geninaktivierung bei Mäusen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 686

Kapitel 13 Verhaltens- und Neurogenetik 13.1 13.1.1 13.1.2 13.1.3 13.2 13.2.1 13.2.2 13.2.3 13.3

Endogene Rhythmik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 692 Zugverhalten bei Vögeln . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 692 Zirkadiane Rhythmik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 696 Schlafstörungen des Menschen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 703 Lernen und Gedächtnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 704 Lernverhalten von Drosophila. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 706 Lernverhalten bei Mäusen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 706 Kognitive Störungen bei Menschen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 712 Angst, Sucht und psychiatrische Erkrankungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 713

Inhaltsverzeichnis

13.3.1 13.3.2 13.3.3 13.4 13.4.1 13.4.2 13.4.3 13.4.4 13.4.5

Angst und Depression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 714 Suchtkrankheiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 720 Schizophrenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 726 Neurodegenerative und neurologische Erkrankungen . . . . . . . . . . . . . . . . . 729 Das Rett-Syndrom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 730 Epilepsie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 733 Autismus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 735 Die Alzheimer’sche Erkrankung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 737 Die Parkinson’sche Erkrankung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 743 Technik-Box 29: In-vivo-Reportergen: das grün-fluoreszierende Protein (GFP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 748 Technik-Box 30: Mikroarrays und DNA-Chips . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 749

Kapitel 14 Genetik und Anthropologie 14.1 14.1.1 14.1.2 14.1.3 14.1.4 14.2 14.2.1 14.2.2 14.2.3 14.2.4

Genetische Aspekte zur Evolution des Menschen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 752 Menschen und Affen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 752 Out of Africa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 756 Der Neandertaler: ausgerottet oder assimiliert? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 766 Die Unterschiedlichkeit moderner Menschen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 771 Der Mensch und sein Gehirn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 777 Evolution des menschlichen Gehirns . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 779 Genetische Aspekte zur Evolution der Sprache . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 783 Genetische Aspekte des Bewusstseins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 786 Quo vadis, Homo sapiens? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 791

Literaturverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 793 Glossar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 817 Personenverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 827 Sachverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 831

XXV

1.1 Gegenstand der Genetik

Übersicht über die Technikboxen

Technik-Box 1: Isolierung genomischer DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Technik-Box 2: Renaturierungskinetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 Technik-Box 3: Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 Technik-Box 4: Polymerasekettenreaktion (PCR). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 Technik-Box 5: Markierung von DNA: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 Technik-Box 6: Isolierung von mRNA, cDNA-Synthese und RACE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 Technik-Box 7: In-vitro-RNA-Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 Technik-Box 8: Klonierung von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147 Technik-Box 9: Two-Hybrid-Systeme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150 Technik-Box 10: Restriktionsanalyse von DNA und Southern-Blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 Technik-Box 11: Northern-Blotting. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 Technik-Box 12: Homologe Rekombination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215 Technik-Box 13: Autoradiographie an Geweben, Zellen und Chromosomen . . . . . . . . . . . . . . 268 Technik-Box 14: Chromosomenbänderung und chromosome painting. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269 Technik-Box 15: Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324 Technik-Box 16: RNAi: spezifische Inaktivierung von Transkripten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 325 Technik-Box 17: Verwendung von Balancer-Chromosomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 390 Technik-Box 18: P-Element-Mutagenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 391 Technik-Box 19: Enhancer-Trap-Experimente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392 Technik-Box 20: SSCP-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 450 Technik-Box 21: DNA-Sequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451 Technik-Box 22: Transgene Mäuse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453

XXVII

XXVIII

Übersicht über die Technikboxen

Technik-Box 23: Kartierung genetischer Merkmale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 525 Technik-Box 24: Immunologische Nachweismethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 526 Technik-Box 25: In-situ-Hybridisierung von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 610 Technik-Box 26: Morpholinos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 611 Technik-Box 27: Differenzielle Genexpression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 685 Technik-Box 28: Geninaktivierung bei Mäusen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 686 Technik-Box 29: In-vivo-Reportergen: das grün-fluoreszierende Protein (GFP) . . . . . . . . . . . . 748 Technik-Box 30: Mikroarrays und DNA-Chips. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 749

Kapitel 1

Was ist Genetik? Inhaltsverzeichnis

Assyrisches Relief aus der Zeit Assurnassipal des Zweiten (883 bis 859 v. Chr.). Assyrer beim künstlichen Bestäuben von Dattelpalmen. (Abguss im Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung, Gatersleben; Foto: U. Wobus, Gatersleben)

1.1

Gegenstand der Genetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2

Konstanz und Variabilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.3

Theoriebildung in der Biologie . . . . . . . . . . . . . . . . 13

22

Kapitel 1: Was ist Genetik?

Überblick Vergleicht man verschiedene Organismen miteinander, lassen sich zwei wichtige biologische Eigenschaften erkennen: Einerseits unterscheiden sich Organismen in ihrer Gestalt so deutlich voneinander, dass sie in verschiedene systematische Gruppen eingeteilt werden. Die wesentlichen Unterschiede zwischen diesen Gruppen sind offensichtlich erblich festgelegt, da sie sich mehr oder weniger unverändert auf die folgenden Generationen übertragen. Andererseits unterscheiden sich aber auch die einzelnen Individuen innerhalb einer Organismengruppe voneinander. Diese Unterschiede reflektieren kleinere Variationen in der genetischen Gesamtausstattung und entsprechend unterschiedliche Antworten auf Umweltreize. Die Frage nach der individuellen Variabilität lässt sich experimentell überprüfen und ist die Grundlage genetischer Forschung. Die Genetik wurde durch die Untersuchungen des Augustinerpaters Gregor Mendel in der Mitte des 19. Jahrhunderts begründet. Zwar wurden die Chromosomen im Jahr 1888 von Waldeyer-Hartz als Bestandteile des Zellkerns erkannt, aber die Nukleinsäuren (genauer: Desoxyribonukleinsäure) wurden schon im Jahr 1871 von Friedrich Miescher isoliert, ohne dass damals ihre Bedeutung erkannt wurde. Die molekulare Genetik beginnt mit der Charakterisierung der Desoxyribonukleinsäure als Doppelhelix durch Watson und Crick im Jahr 1953. Diese Struktur ergab sofort Hinweise auf den Mechanismus ihrer Verdoppelung (Replikation) bei der Zellteilung. In der Folgezeit wurde in vielen Labors untersucht, wie die Information abgelesen

1.1 Gegenstand der Genetik Der Begriff Genetik ist aus dem Griechischen γενετική τέχνη (sprich: genetiké téchne) hergeleitet und lässt sich am treffendsten mit „Wissenschaft von der Erzeugung“ übersetzen. Der Begriff „Genetik“ wurde 1905 von William Bateson geprägt (zitiert nach Haynes 1998). Die Fragestellungen der Genetik gehen zwar von der Aufklärung der Regeln und Mechanismen der Vererbung aus, haben aber heute darüber hinaus auch das Ziel, die Unterschiede in der genetischen Ausstattung verschiedener Organismen funktionell zu erklären (funktionelle Genomforschung); eine besondere Dynamik gewinnt die Genetik heute aus der Möglichkeit, auch das Erbgut bereits ausgestorbener Arten zu untersuchen (Evolutionsgenetik; Kapitel 14). Damit steht die Genetik heute im Schnittpunkt anderer biologischer Disziplinen (wie Zellbiologie, Entwicklungsbiologie oder Molekularbiologie) und beeinflusst mit ihren methodischen Ansätzen diese Bereiche. Als uni-

wird: Die Information wird zunächst in eine einzelsträngige Form umgeschrieben (Transkription) und danach in Proteine übersetzt (Translation). Die Veröffentlichung der Gesamtheit aller menschlichen Erbanlagen (Genom) durch weltweite Forschergruppen im Jahr 2004 markiert den vorläufigen Höhepunkt genetischer Forschung. Die Genome höherer Organismen unterscheiden sich im DNA-Gehalt sehr. Das liegt zum großen Teil an den Unterschieden in der Menge von Wiederholungssequenzen und weniger an den Unterschieden in der Zahl Informationscodierender Einheiten (Gene). An dieser Formulierung wird deutlich, dass die Frage „Was ist ein Gen?“ auch heute noch nur ungenau beantwortet werden kann. War es zunächst eine „Einheit“, die die Information für bestimmte Eigenschaften zum Inhalt hatte, so konkretisierte sich das in der Blütezeit der biochemisch orientierten Genetik (etwa in den 60er- und 70er-Jahren des 20. Jahrhunderts) in der griffigen Formel „ein Gen – ein Enzym“. Aufgrund heutiger Kenntnisse wissen wir aber, dass die mRNA vieler Gene nach der Transkription noch vielfältig verändert wird und damit oft nicht nur für ein einziges Protein oder Enzym codiert. Verschiedene regulatorische Elemente oberhalb und unterhalb der codierenden Regionen sind für die richtige zeitlich-räumliche Ausprägung eines Gens wesentlich verantwortlich. Diese Regionen werden im Allgemeinen neben der eigentlichen codierenden Region zu einem Gen dazugezählt. Durch die Entdeckung vielfältiger regulatorischer Funktionen von kleinen RNA-Molekülen wird der Genbegriff heute wieder erweitert.

verselle biologische Disziplin findet sie außerdem in allen Organismenklassen Anwendung, bei Mikroorganismen (z. B. Bakterien und Hefen) genauso wie bei Pflanzen, Tieren und Menschen. Gerade in den letzten Jahren war die Genetik wesentlich daran beteiligt, neue Technologien zu entwickeln, die unter den Stichworten der Gen- bzw. Biotechnologie zusammengefasst werden können.

1.1.1 Kurzer Abriss der Geschichte der Genetik Die Fragen nach dem „Woher“ und „Wohin“ gehören sicherlich zu den Grundkonstanten des menschlichen Wesens. Allerdings sind die Antworten darauf zu verschiedenen Zeiten unterschiedlich ausgefallen, natürlich auch in Abhängigkeit von den zur Verfügung stehenden technischen Möglichkeiten. So stellte man sich noch im 17. Jahrhundert vor, dass eine der Geschlechts-

1.1 Gegenstand der Genetik Abb. 1.1 Homunculus, den man früher im menschlichen Sperma zu sehen glaubte; Zeichnung von Hartsoeker aus seinem Essay de dioptrique (1694). (Nach Hilscher 1999)

zellen ‒ Samen- oder Eizelle ‒ den gesamten Organismus in vollendeter, aber natürlich stark verkleinerter Form enthielte. Einen solchen Homunculus, den man im menschlichen Sperma damals zu erkennen glaubte, zeigt Abb. 1.1. Das Wissen um die Vererbung von Eigenschaften ist aber keine Erfindung der Neuzeit. Wahrscheinlich haben bereits die frühesten Kulturen, die Land- und Ackerbau betrieben haben, ihren Vorteil aus der Erkenntnis gezogen, dass bestimmte nützliche Eigenschaften durch Züchtung von Pflanzen und Tieren, also durch Vererbung, über Generationen hinweg erhalten bleiben können. Die meisten unserer Haustiere haben ihre Eigenschaften erst in jahrhundertelanger Züchtung erhalten, und ein beträchtlicher Teil unserer wichtigsten Kulturpflanzen stammt von den Ackerbau betreibenden Indianern Nord- und Mittelamerikas, aus asiatischen Anbaugebieten sowie dem Mittelmeerraum (Vavilov 1928). Zeugnisse davon finden sich etwa in der assyrischen Darstellung von Gärt-

nern, die Dattelpalmen bestäuben (siehe Foto am Anfang des Kapitels). Die gleiche Bestäubungstechnik hat es 2500 Jahre später Gregor Mendel (1822–1884; Abb. 1.2a) ermöglicht, die Grundregeln der Vererbung zu verstehen. Er hat erkannt, dass einzelne Eigenschaften gesetzmäßig vererbt werden (Kapitel 10.1); sein Vortrag vor dem Naturforschenden Verein in Brünn (1865, publiziert 1866) blieb aber lange Zeit unbeachtet. Erst im Jahr 1900 wurden die Arbeiten Mendels durch Carl Correns, Hugo de Vries und Erich von Tschermak wiederentdeckt. Die Auswirkungen auf ganze Populationen beschrieben dann Godfrey Harold Hardy und Wilhelm Robert Weinberg 1908 in dem nach ihnen benannten Gesetz (Kapitel 10.5.1). Die zellulären Mechanismen der Vererbung haben Walter S. Sutton (1903) und Theodor Boveri (1904) in der Chromosomentheorie der Vererbung zusammengefasst. Sie besagt, dass sich die materiellen Träger der Vererbung im Zellkern (lat. nucleus) befinden; die „anfärbbaren Kernkörperchen“ werden seit 1888 als Chromosomen bezeichnet (Heinrich Wilhelm Waldeyer); sie werden im Kapitel 6 ausführlich besprochen (siehe aber auch Vererbung der Chloroplasten und Mitochondrien, Kapitel 5.2.2 und 5.2.3). Ein erster, sehr abstrakter Genbegriff wurde von Wilhelm Johannsen 1909 geprägt und beschrieb zunächst nicht viel mehr als eine vererbbare Eigenschaft (ein „Etwas“), ohne dafür eine materielle Basis zu kennen. In der Zeit zwischen 1910 und 1915 konnte Thomas Hunt Morgan (1866–1945) durch seine Arbeiten an der Taufliege Drosophila zeigen, dass Gene in linearer Weise auf Chromosomen angeordnet sind. Er entdeckte dabei die geschlechtsgekoppelte Vererbung bei Drosophila und beschrieb das Phänomen der Rekombination von Chromosomen (Kapitel 5.3.3), womit er die relativen Positionen verschiedener Gene auf Drosophila-Chromosomen feststellen konnte (Nobelpreis 1933). Sein Schüler Hermann Joseph Muller (1890–1967) setzte die Arbeiten an Drosophila fort und erkannte zunächst die Möglichkeiten spontaner Veränderungen des Erbguts (Mutationen; Kapitel 9); später induzierte er Mutationen durch Röntgenstrahlen (Nobelpreis 1956). Die verschiedenen (mutierten) Formen eines Gens werden als Allele bezeichnet. Aus Zellkernen isolierte und charakterisierte Friedrich Miescher (1871) in seinem Labor im Tübinger Schloss die Desoxyribonukleinsäure als chemische Substanz (Abk.: DNS; es hat sich aber auch im Deutschen inzwischen die englische Variante „DNA“ (für deoxyribonucleic acid) als Abkürzung durchgesetzt). Die zweite wichtige Nukleinsäure, die Ribonukleinsäure RNS; engl. Abk.: RNA, für ribonucleic acid, wurde 1894 von Albrecht Kossel isoliert (dafür erhielt er 1910

3

44

Kapitel 1: Was ist Genetik?

Abb. 1.2 a, b a Johann Gregor Mendel (Augustinerpater und Begründer der modernen Genetik, 1822–1884). b James Watson und Francis Crick vor dem DNA-Modell

den Nobelpreis für Medizin). Es blieb aber dennoch lange Zeit unklar, ob Proteine oder Nukleinsäuren die Träger der Erbinformation sind. Erst durch die Arbeiten von Oswald Theodore Avery (1877–1955) konnte diese Frage anhand von Transformationsexperimenten an Pneumococcen geklärt werden. Die Strukturanalyse der DNA als Doppelhelix durch James Watson, Francis Crick und Maurice Wilkins im Jahr 1953 schließt diese Frühphase der modernen Genetik ab (Abb. 1.2b); ihre Arbeiten wurden 1962 mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet. Die DNA ist ein langes fadenförmiges, spiralisiertes Doppelmolekül, wobei jede Hälfte aus einem Grundgerüst aus sich abwechselnden Zucker- und PhosphatResten aufgebaut ist. Verbunden sind die beiden Grundgerüste durch organische Basen; die Reihenfolge (Sequenz) dieser Basen beinhaltet die eigentliche genetische Information. Dieser Aufbau lässt intuitiv erahnen, wie die DNA bei der Zellteilung verdoppelt wird (Replikation; Kapitel 2.2): Dabei trennen sich die beiden Hälften, und an jedem dieser Elternstränge wird ein spiegelbildlicher neuer Strang synthetisiert – womit dann aus einer Doppelhelix zwei identische neue Helices werden. Diese semikonservative Form der Replikation wurde durch die eleganten Experimente von Matthew Meselson und Franklin W. Stahl im Jahr 1958

auch tatsächlich bestätigt. In der Folgezeit wurde in vielen Labors untersucht, wie die Information der DNA abgelesen wird: Die Information wird zunächst in mRNA (engl. messenger RNA; dt. Boten-RNA) umgeschrieben (Transkription) und danach in Proteine übersetzt (Translation). Diese Übersetzungsregeln von der DNA/RNA-Sprache (Nukleotidsequenz) in die Sprache der Proteine (Aminosäuresequenz) wird als „genetischer Code“ bezeichnet (Kapitel 3.2); er wurde in den 1960er-Jahren durch Marshall Nirenberg, Heinrich Matthaei und Severo Ochoa geknackt (Martin et al. 1962; Nirenberg erhielt dafür 1968 den Nobelpreis für Medizin). Lange Zeit galt die Richtung des Informationsflusses (DNA → RNA → Protein) als „Einbahnstraße“. Dieses „zentrale Dogma der Genetik“ wurde 1970 umgestoßen, als David Baltimore über das Enzym Reverse Transkriptase (aus RNA-Tumorviren) berichtete, das in der Lage ist, anhand einer RNAMatrize DNA zu synthetisieren. Baltimore erhielt dafür 1975 (im Alter von erst 37 Jahren) den Nobelpreis für Medizin. Ein weiterer Meilenstein in der Genetik war 1967 die Entdeckung von Enzymen, die die DNA an spezifischen Stellen schneiden können (Restriktionsenzyme; Nobelpreis für Medizin 1978 an Werner Arber, Daniel Nathans und Hamilton Smith) – mit Ligasen

1.1 Gegenstand der Genetik

lassen sich DNA-Bruchstücke wieder verbinden. Für diese Entdeckung und die Herstellung der ersten „Hybrid-DNA“ aus verschiedenen Organismen erhielt Paul Berg 1980 den Nobelpreis für Chemie. Ohne diese Befunde wäre in der Folge die Klonierung von Genen nicht möglich gewesen – über die erste künstliche Herstellung eines Plasmids, eines extrachromosomalen DNA-Elementes von Bakterien (Kapitel 4.2), wurde von Herbert Boyer, Annie Chang und Stanley Cohen 1973 berichtet. Die Entwicklung der Polymerasekettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) durch Kary Mullis im Jahr 1986 ermöglichte die Vervielfältigung von DNA außerhalb von Zellen und revolutionierte damit die molekulare Genetik; Mullis erhielt dafür 1993 den Nobelpreis für Chemie. Anfang der 1970er-Jahre beginnt auch die intensive Auseinandersetzung um das, was wir heute unter „Gentechnik“ zusammenfassen. Es zeichnete sich zu dieser Zeit ab, dass man DNA im Reagenzglas neu kombinieren („rekombinante DNA“) und auf verschiedene Organismen übertragen kann. Den führenden Forschern, darunter auch Paul Berg, war durchaus bewusst, dass ein solches Vorgehen ein Wagnis war, und so verlangten sie im Jahr 1974, zunächst alle Experimente mit rekombinanter DNA von Viren, Toxin- oder Resistenzgenen auszusetzen. Dieses Moratorium kam zwar nicht zustande, aber man einigte sich 1975 auf der „Konferenz von Asilomar“ (Berg et al. 1975) darauf, in Verbindung mit staatlichen Sicherheitsbehörden genaue Regeln aufzustellen, an die sich Forscher bei Experimenten mit rekombinanter DNA zu halten hatten. Daraus entwickelten sich auf der Ebene der OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development; Organisation für wissenschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung) gemeinsame Richtlinien, die später in allen industrialisierten Ländern in entsprechende Gesetze mit einheitlichen Sicherheitsstandards umgesetzt wurden; in Deutschland ist es das Gentechnik-Gesetz (GenTG). In der Mitte der 1970er-Jahre wurden durch Allan Maxam und Walter Gilbert (1977) sowie Frederick Sanger (1977) verschiedene Methoden entwickelt, um die Reihenfolge (Sequenz) der Basen in der DNA zu ermitteln; Gilbert und Sanger erhielten dafür 1980 den Nobelpreis für Chemie. Die rasche Entwicklung der Technik der DNA-Sequenzierung und die Einführung von automatisierten Verfahren ließ es Ende der 1980erJahre möglich erscheinen, die gesamten Erbanlagen (Genom) von Organismen und sogar das menschliche Genom zu sequenzieren. In den USA wurden das Department of Energy und die National Institutes of Health damit beauftragt, in drei 5-Jahresplänen von 1990 bis 2005 das Humangenomprojekt durchzufüh-

ren. Aus der amerikanischen Initiative entwickelte sich ein weltweites Netz von Genomforschern, die zunächst die Genome von Mikroorganismen sequenzierten. 1995 konnte die DNA des ersten Bakteriums (Haemophilus influencae) vollständig sequenziert werden. Den vorläufigen Höhepunkt erreichte die Initiative, als im Jahr 2001 zeitgleich die akademischen Institute (International Human Genom Consortium) und die private Firma Celera Genetics (Venter et al. 2001) einen ersten Entwurf für das menschliche Genom publizierten; die endgültige Sequenz wurde 2004 durch das Internationale Humangenom-Sequenzierungskonsortium publiziert. Aber auch diese „endgültige“ Sequenz enthält „nur“ 99 % des Genoms; die Fehlerrate beträgt 1:100.000. Die Geschichte der Genetik (Tabelle 1.1) ist aber auch nicht frei von Verirrungen wie der Einführung des Begriffs Eugenik in die genetische Diskussion durch Francis Galton (1883). Galton trat für eine gezielte Kontrolle der Vererbung beim Menschen ein; er hat dabei „negative“ (präventive) und „positive“ Eugenik unterschieden. Die „negative“ Eugenik will die erbliche Weitergabe von Allelen vermeiden, die Erbkrankheiten verursachen. Damit soll eine angebliche „Verschlechterung des menschlichen Genpools“ verhindert werden. Dieser Aspekt wird durch eine „positive“ Eugenik ergänzt, durch die die Weitergabe günstiger Allele unterstützt wird, um dadurch den menschlichen Genpool zu „verbessern“. Der Missbrauch dieses Begriffs durch die Nationalsozialisten unter Verwendung biologisch falscher Argumente hat Eugenik verständlicherweise nachhaltig diskreditiert. Jede Überlegung zu genetischer Auslese und „Verbesserungsversuchen“ des menschlichen Erbguts durch eine Gentherapie über die Keimbahn muss sich vor dem Hintergrund des Holocaust und der Vernichtung „lebensunwerten“ Lebens rechtfertigen. Auch ein zweites dunkles Kapitel der Genetik muss erwähnt werden, nämlich die Konsequenz aus der Herrschaft des Agronomen Trofim Denisowich Lyssenko (1898–1976) in der Sowjetunion der 1930erund 1940er-Jahre. Er war ein heftiger Verfechter der These von der Vererbbarkeit erworbener Eigenschaften, wie sie von Jean-Baptiste Lamarck (1744–1829) als Vorläufer der Darwin’schen Evolutionstheorie propagiert wurde. Ging es zunächst nur um die dringend notwendige Verbesserung der Pflanzenzucht, so wurde unter Lyssenkos Führung die Genetik in der Sowjetunion bald als eine „schädliche Perversion der Wissenschaft“ bezeichnet, die „die Bemühungen der sowjetischen Forscher behindert, die Tier- und Pflanzenwelt zu verändern“ (zitiert nach Soyfer 2001). Mithilfe Stalins wurde diese Schule nach dem Ende des 2. Weltkrieges in der Sowjetunion und allen Staaten des damaligen Warschauer Paktes (auch in der DDR) durchgesetzt. Genetische Forschung wurde verboten, Labore

5

66

Kapitel 1: Was ist Genetik? Tabelle 1.1 Kurze Geschichte der Genetik 1866

Mendel veröffentlicht seine Schrift „Versuche über Pflanzenhybriden“

1871

Miescher entdeckt Nukleinsäuren

1883

Galton prägt den Begriff „Eugenik“

1903-1904

Begründung der Chromosomentheorie durch Boveri und Sutton

1908

Gesetz über Konstanz der Allelverhältnisse in idealen Populationen (Hardy und Weinberg)

1910–1915

Morgan beschreibt die lineare Anordnung von Genen auf Chromosomen

1926

Muller induziert Mutationen durch Röntgenstrahlen

1944

Avery erkennt die DNA als materiellen Träger der Erbinformation

1953

Beschreibung der DNA als Doppelhelix durch Watson, Crick und Wilkins

1958

Beweis für die semikonservative Replikation der DNA durch Meselson und Stahl

1961–1969

Entschlüsselung des genetischen Codes durch Nirenberg, Matthaei und Ochoa

1967

Arber entdeckt Restriktionsenzyme

1973

Erste Klonierung eines Plasmids durch Boyer, Chang und Cohen

1975

Konferenz von Asilomar zu Moratorium in der Gentechnik

1977

DNA-Sequenzierung nach Sanger

1985

Entwicklung der Polymerasekettenreaktion durch Mullis

1988

Leder und Stewart erhalten Patent für transgene Maus

1990

Start des Humangenomprojekts

1995

Veröffentlichung der kompletten Sequenz des Genoms von Haemophilus influenza

2004

Veröffentlichung des menschlichen Genoms (endgültige Form, 99 %)

2004

Projektstart ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements)

geschlossen und unbequeme Wissenschaftler entlassen und ihr Werk verdammt. Eines der prominenten Opfer der Lyssenko’schen Politik war der Genetiker Nikolai Iwanowitsch Wawilow (1887‒1943; andere Schreibweise: Vavilov), der durch sein „Gesetz der homologen Reihen“ bekannt geworden war. Dieses Gesetz ermög-

lichte die Vorhersage noch unbekannter Pflanzenformen und führte in den 1920er-Jahren zu erfolgreichen Neuzüchtungen. Wawilow starb 1943 im Gefängnis von Saratow. Nach dem Tod Stalins im Jahr 1953 dauerte es noch bis 1962, bis Lyssenkos wissenschaftliche Fehler und Fälschungen offengelegt und er von Chruschtschow entlassen wurde.

Die Fragestellungen der Genetik betreffen die Aufklärung der Regeln und Mechanismen der Vererbung. Die Genetik hat aber heute auch das Ziel, die Unterschiede in der genetischen Ausstattung verschiedener Organismen funktionell zu erklären. Die moderne Genetik beginnt mit den Arbeiten Gregor Mendels in der Mitte des 19. Jahrhunderts. Es folgte die Chromosomentheorie der Vererbung zu Beginn des 20. Jahrhunderts, die Aufklärung der DNA-Doppelhelix-Struktur im Jahr 1953 durch Watson, Crick und Wilkins sowie die Entschlüsselung des menschlichen Genoms im Jahr 2004.

Die rasante Entwicklung der Genetik in den vergangenen 100 bis 150 Jahren hat natürlich auch zu verschiedenen Subdisziplinen geführt. Als Erstes müssen wir dabei die klassische Genetik nennen, die sowohl die Grundelemente der Vererbung (und deren materielle und räumliche Manifestation) erforscht als auch die Mechanismen der Verteilung des Erbmaterials bei der Zellteilung (wobei hier schon wieder die Abgrenzung zur Cytogenetik schwierig wird, die sich vor allem mit der Untersuchung der Chromosomen beschäftigt). Die klassische Genetik ist in vielen Bereichen sehr mathematisch-statistisch orientiert; die meisten dieser Aspekte werden im Kapitel Formalgenetik (Kapitel 10) besprochen. Methodisch ähnlich ist die Populationsgenetik (Kapitel 10.5). Sie umfasst Erkenntnisse von genetischen Regeln, die für Gruppen von Individuen gelten, und wie sie sich auf die Zusammensetzung und die Evolution der Organismen auswirken. Die molekulare Genetik untersucht die biochemischen Grundlagen der Vererbung. Sie will wissen, wie das Erbmaterial molekular aufgebaut ist und wie es in einer Zelle und im Gesamtorganismus seine Funktion ausübt. Diese Aspekte sind Schwerpunkte der ersten Kapitel des Buches. Fragen, die sich auf die genetischen Mechanismen der Zelldifferenzierung und der Embryonalentwicklung von Organismen beziehen, werden der Entwicklungsgenetik (Kapitel 11) zugerechnet. Die Methoden in der Humangenetik unterscheiden sich in mancherlei Hinsicht von denen, die an Tieren und Pflanzen erprobt und gängig sind, daher ist es sicherlich sinnvoll, diese Teildisziplin – auch wegen ihrer Nähe zur Medizin – herauszuheben und die

1.1 Gegenstand der Genetik

wichtigsten Aspekte in einem eigenen Kapitel anzusprechen (Kapitel 12). Besonders interessant ist die Verhaltens- und Neurogenetik, die in den letzten Jahren dank eines verbreiterten Methodenspektrums sehr große Fortschritte gemacht hat (bei Würmern, Fliegen und Mäusen – und zunehmend auch beim Menschen); sie wird im Kapitel 13 vorgestellt. Im Schlusskapitel (14) sollen einige Aspekte zum Thema „Anthropologie und Genetik“ diskutiert werden.

1.1.2 Das Genom Die Gesamtheit der genetischen Informationen, die in einem Virus, einer Bakterien- oder Protozoenzelle bzw. in der Keimzelle eines mehrzelligen Organismus enthalten ist, fasst man unter dem Begriff Genom zusammen. Das Genom von Organismen mit einem Zellkern (Eukaryoten) unterscheidet sich in seiner Größe erheblich von dem prokaryotischer Organismen, die keinen Zellkern besitzen. Besonders große Eukaryotengenome erreichen einen DNA-Gehalt, der um Größenordnungen über dem einer E. coli-Zelle liegt (Abb. 1.3). Das ist zunächst nicht besonders überraschend, da wir davon ausgehen, dass eukaryotische Organismen im Allgemeinen viel mannigfaltiger und komplexer in ihren biologischen Funktionen sind als Prokaryoten. Die Abb. 1.3 zeigt aber auch, dass die Genomgröße

nicht unbedingt mit einem höheren Komplexitätsgrad korreliert: So weisen Salamander, manche Pflanzen, Farne und Moose einen höheren DNA-Gehalt auf als Säuger. Aber auch innerhalb der verschiedenen Organismengruppen sind große Variationsbreiten hinsichtlich der Genomgrößen zu beobachten. So umfasst das Genom des Pufferfisches Fugu etwa 400 Mb (MegaBasen = 106 Basen), des Medaka-Fisches 700 Mb und des Zebrafisches 1,5 Gb (Giga-Basen = 109 Basen). Umgekehrt könnte man zunächst einmal die Frage stellen, wie viel DNA für die Existenz komplexer Organismen mindestens erforderlich ist. Am einfachsten erscheint eine Antwort auf diese Frage, wenn man von der Anzahl der Gene ausgeht, die notwendig ist, um einen Organismus entstehen zu lassen, dessen Komplexität größer ist als die eines Einzellers. Die Genetik hat diese Fragen inzwischen weitgehend beantworten können, nicht zuletzt auch durch das Humangenomprojekt, das sich nicht nur zum Ziel gesetzt hatte, das menschliche Erbgut zu entschlüsseln, sondern auch das einer ganzen Reihe von Modellorganismen. So kam man bei Drosophila auf eine Zahl von etwa 14.000 Genen, was gut mit Annahmen übereinstimmt, die man aus den Mutagenese-Experimenten an Drosophila gewonnen hatte. Umgekehrt waren die ursprünglichen Schätzungen für die Zahl der menschlichen Gene mit weit mehr als

Abb. 1.3 Es ist die Genomgröße verschiedener Organismengruppen gezeigt. Dabei wird offensichtlich, dass kein Zusammenhang zwischen der Genomgröße und dem Komplexitätsgrad der jeweiligen Organismengruppe besteht. Aus praktischen Gründen sind Bakteriophagen und Viren nicht dargestellt; ihre Genomgrößen liegen in der Größenordnung von 103 bis 105 Basenpaaren. Die Angabe erfolgt als C-Wert (in pg DNA pro Zellkern) und bezieht sich auf den einfachen (haploiden) Chromosomensatz. Zur Umrechnung in die heute übliche Angabe in Basenpaaren (bp) gilt: 1 pg = 0,96 × 109 bp. (Nach Gregory 2005; mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Kapitel 1: Was ist Genetik?

100.000 viel zu hoch angesetzt. Man geht heute davon aus, dass das menschliche Genom etwa 30.000 Gene enthält. Es ist damit ähnlich groß wie die Genome der Maus, der Ratte und des Pufferfisches Fugu, deren Genome ebenfalls sequenziert sind. Haben die Genome der Säugetiere auch in etwa die gleiche Größenordnung von ca. 3 Gb, so umfasst das Genom von Fugu etwa nur 15 % des Säugergenoms, das entspricht etwa 400 Mb. Das liegt daran, dass bei Fugu viele Wiederholungssequenzen (repetitive Elemente) fehlen, die bei Säugetieren vorhanden sind.

Die Gesamtheit aller Erbinformationen wird als Genom bezeichnet. Während in Prokaryoten die Genomgröße mit der Anzahl vorhandener Gene direkt in Beziehung steht, besteht bei Eukaryoten eine große Diskrepanz zwischen der Genomgröße und der Anzahl der bei ihnen gefundenen Gene. Eukaryotische Genome sind in ihrem DNA-Gehalt wenigstens 10- bis 100-mal größer als aufgrund der Anzahl der Gene zu erwarten wäre, da sie eine Vielzahl von repetitiven Elementen enthalten.

1.1.3 Der Genbegriff Unser bisheriger Weg durch die Geschichte der Genetik hat uns stufenweise von der Entdeckung diskreter erblicher Merkmale durch Gregor Mendel über die Lokalisation der Gene in linearer Folge auf den Chromosomen bis zur Aufklärung der molekularen Identität derjenigen chemischen Verbindung geführt, die für die Vererbung verantwortlich ist, nämlich der DNA. Die Abschnitte der DNA, die vor allem die Informationen für die Aminosäuresequenz eines Proteins enthalten, werden als „codierende“ Abschnitte bezeichnet. Insofern erschien zunächst einmal die Definition eines Gens als ein codierender Abschnitt vernünftig (EinGen-ein-Protein-Hypothese). Die weitere Aufklärung der molekularen Eigenschaften bestimmter DNASequenzen hat uns jedoch eine große Vielfalt der Eigenschaften von Genen vor Augen geführt, die über die reine Protein-codierende Funktion hinausgeht. Versuchen wir auf der Basis heutiger Kenntnisse genauer zu umreißen, was wir unter einem Gen verstehen, so geraten wir sehr schnell in Schwierigkeiten. Relativ leicht zu treffen ist die Entscheidung, dass solche DNA-Sequenzen, die die codierenden Abschnitte flankieren und die zur Regulation erforderlich sind, als Teil des jeweiligen Gens zu betrachten sind. Wie aber steht es mit Regionen, die vielleicht Tausende von Basenpaaren oberhalb oder unterhalb eines Gens liegen, dessen Regulation aber mit beeinflussen? Und wie verhält es sich bei gemeinsam regulierten und sehr ähnlichen Genen, die auf dem Chromosom

dicht beieinander liegen? Am Beispiel der Globin-Gene (Kapitel 7.2.1), die als Genfamilie bezeichnet werden, werden wir sehen, dass sie zwar unzweifelhaft ein gemeinsames Merkmal beeinflussen, nämlich die Synthese von Hämoglobin. Ebenso unzweifelhaft sind aber die einzelnen Globin-Gene als voneinander getrennte Funktionseinheiten anzusehen, selbst wenn es sich, wie bei den zwei α-Globin-Genen des Menschen, um identische DNA-Sequenzen mit identischer Regulation handelt. Wir haben oben gesehen, dass in der Regel die Information der DNA zuerst in mRNA übersetzt wird, bevor ein Protein gebildet wird. Allerdings wird die mRNA schrittweise fertiggestellt und kann dabei mannigfaltigen Veränderungen unterworfen werden (Kapitel 3.3.4 und 3.3.5), sodass aus einem Gen durchaus mehrere, sehr verschiedene Proteine entstehen können. Auch hier greift die Definition „ein Gen – ein Enzym“ zu kurz. Die praktische Verwendung des Genbegriffs ist in diesem Fall häufig historisch geprägt und von der Funktion der gebildeten Proteine/Enzyme abhängig. Wir werden bei der detaillierten Betrachtung von Bakterien, aber auch von Mitochondrien der Eukaryoten und teilweise auch bei dem Kerngenom von Eukaryoten sehen, dass die Informationen für verschiedene Proteine auf der DNA nicht immer strikt getrennt sind, sondern auch teilweise überlappen bzw. auf den beiden gegenläufigen DNA-Strängen eines Chromosoms unterschiedlich angeordnet sein können. In all diesen Fällen betrachten wir die Funktionseinheit jeweils als ein Gen und sprechen entsprechend von „überlappenden Genen“, wobei die Leserichtung („vorwärts“ bzw. „rückwärts“) zusätzlich unterschieden werden kann. Neben den Genen, die für Proteine codieren, gibt es aber auch noch solche, die für funktionell wichtige RNA-Moleküle codieren. Wir werden dafür im weiteren Verlauf viele Beispiele kennenlernen; hier sei zunächst nur auf die Transfer-RNA (t-RNA) und die ribosomale RNA (rRNA) hingewiesen (bei der rRNA werden die Moleküle aufgrund ihrer Größe unterschieden; aus historischen Gründen wird dabei die Svedberg-Einheit „S“ verwendet, die eine Sedimentationskonstante aus der Ultrazentrifugation darstellt). Beide Gruppen erfüllen wichtige Funktionen bei der Proteinsynthese (Translation, Kapitel 3.4). In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, ob wir etwa die Hunderte oder Tausende von 5S-rRNA-Transkriptionseinheiten als ein Gen oder als mehrere Gene betrachten wollen (Kapitel 7.4.2). Der Ausfall einzelner solcher Transkriptionseinheiten würde die Zellfunktionen nicht beeinträchtigen und damit zu keinem sichtbaren Effekt führen, den wir fordern müssten, wenn wir die Korrelation Gen-Merkmal erhalten wollen, wie sie nach Mendel angebracht wäre. (Die Anzahl der

1.2 Konstanz und Variabilität

5S-rRNA-Kopien im Genom dürfte im Übrigen durch normale zelluläre Prozesse ohnehin ständigen Schwankungen unterworfen sein; S. 300). Weitere Probleme für die Anwendung des klassischen Genbegriffs werden durch die Frage aufgeworfen, ob man die einzelnen Transkriptionseinheiten der rDNA in Eukaryoten, die ja meistens für drei einzelne RNA-Moleküle codieren, als Gene betrachten möchte, oder ob man jedes dieser Moleküle als eigenes Gen ansehen will. Sicherlich könnte man argumentieren, dass sie vielleicht aus einem ursprünglichen Molekül hervorgegangen sind und dass lediglich die Weiterentwicklung der Funktion im Ribosom zu einer Aufspaltung in mehrere (Teil-)Moleküle geführt hat. Dass solche Prozesse der Unterteilung von Genen noch weiter fortschreiten können, sehen wir am Beispiel der geteilten 28S-rRNA von Insekten (Kapitel 7.4), die zunächst in zwei Hälften geschnitten, dann aber durch Basenpaarung wieder zu einer funktionellen Einheit zusammengefügt wird. Ein neues Kapitel eröffnete in diesem Zusammenhang das Auffinden von „kleinen“ RNA-Molekülen, die oft als Gegenstrang-Sequenzen zu anderen Genen auftreten und deren Expression dauerhaft modulieren (Kapitel 7.5). Es ist leicht zu sehen, dass ein allgemein verbindlicher Genbegriff, der die unterschiedlichen Eigenschaften des erblichen Materials in ein einheitliches und leicht zu handhabendes Schema integriert, heute nicht mehr formuliert werden kann. Dennoch hat der Begriff des Gens seine Bedeutung in der Praxis nicht verloren. Man wird den Begriff „Gen“ jedoch jeweils sehr gezielt im Kontext eines gerade zur Diskussion stehenden genetischen Systems verwenden müssen, um ihn mit konkreten molekularen Vorstellungen füllen zu können. Dazu gehört, dass man den Begriff „Gen“ in der Regel mit einer zusätzlichen Erklärung versieht, z. B. ein „Protein-codierendes Gen“.

Folgende Aspekte gehören zu einem Gen:

ï E in Gen ist durch seinen Platz auf dem Chromosom definiert. ï Bestandteil eines Gens sind die Bereiche, die gleichsinnig transkribiert werden, sowie die unmittelbar oberhalb liegenden, zugehörenden Promotor-Bereiche (Kapitel 4.5 und 7.3); das schließt Spleißvariationen (Kapitel 3.3.5) und RNA-codierende Gene (Kapitel 7.4 und 7.5) mit ein.

1.2 Konstanz und Variabilität Die Vielfalt der Erscheinungsformen der Organismen ist eine Eigenschaft der Natur, die wir als selbstverständliche Grunderscheinung des Lebens ansehen. Für

den Biologen stellt diese Mannigfaltigkeit oder Variabilität der Formen und Eigenschaften von Organismen jedoch die Frage nach deren Ursachen. Wir möchten verstehen, nach welchen Gesetzmäßigkeiten Variabilität hervorgerufen wird und wie ihre Weitergabe an nachfolgende Generationen möglich wird. Man könnte zunächst vermuten, dass die Entstehung dieser Mannigfaltigkeit dem Zufall unterliegt. Bei näherer Betrachtung erkennen wir jedoch, dass bestimmte Grenzen der Variabilität einer Eigenschaft innerhalb der Mannigfaltigkeit der Individuen gewöhnlich nicht überschritten werden. Durch ein einfaches Beispiel wird uns verdeutlicht, dass die Variabilität der Erscheinungsformen bestimmten Gesetzmäßigkeiten gehorcht: Trotz aller Vielfalt in der Individualität verschiedener Menschen ist der Mensch als einheitliche Organismengruppe deutlich gegenüber allen anderen Organismengruppen abgegrenzt. Stark abweichende Gestaltformen, wie sie beispielsweise bei fehlerhafter Embryonalentwicklung auftreten können, sind im Allgemeinen nicht lebensfähig; Beispiele dazu werden in den Kapiteln 11.5 und 12 diskutiert. Die Natur hat somit einerseits Mannigfaltigkeit entwickelt, diese aber zugleich bestimmten Gesetzen und Eingrenzungen unterworfen. Für die Existenz solcher Gesetze, die die Entstehung von Mannigfaltigkeit in den Formen und Eigenschaften von Lebewesen kontrollieren, spricht, dass viele dieser Formen und Eigenschaften nicht willkürlich auftreten, sondern dass sie von den Eltern an die Nachkommen weitergegeben werden. Ihre Entstehung und Ausbildung ist also an biologische Eigenschaften gebunden, die zwischen aufeinanderfolgenden Generationen von Organismen erhalten bleiben. Wie wir bei genauerer Betrachtung erkennen, werden sie in bestimmter Weise verteilt. Das Verständnis dieser biologischen Eigenschaften und der Gesetzmäßigkeiten, die ihrer Verteilung in aufeinanderfolgenden Generationen zugrunde liegen, ist der Gegenstand der Genetik. Das Verständnis dieser Gesetze setzt notwendigerweise die Unterscheidung der Einzelelemente, die diese Mannigfaltigkeit bestimmen, voraus und erfordert daher die Erforschung ihrer Eigenschaften und Ursachen. Wenn wir davon ausgehen, dass Variabilität eine Grunderscheinung der erblichen Eigenschaften der Organismen ist, gilt es, experimentelle Ansatzpunkte für die Untersuchung dieser erblichen Grundlage der Variabilität zu finden. Hierfür ist es entscheidend, dass es gelingt, ein Untersuchungsmaterial zu finden, dessen erbliche Eigenschaften so einheitlich wie möglich sind. Mithilfe eines solchen Materials lassen sich dann nicht nur diese verschiedenen Eigenschaften als solche

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Kapitel 1: Was ist Genetik?

gegeneinander abgrenzen, sondern auch diejenigen Einflüsse auf die Ausprägung genetischer Anlagen erkennen und analysieren, die durch die Umwelt verursacht werden. Dass es solche Umwelteinflüsse geben muss, ist leicht zu erkennen: Ziehen wir eine Pflanze bei Dunkelheit aus einem Samen, so wird sie allenfalls schwach grün werden. Erst wenn wir sie dem Licht aussetzen, bildet sich eine ausreichende Menge Chlorophyll, sodass die Pflanze ihre normale grüne Farbe erhält. Die Umgebungsparameter bestimmen also, ob die individuelle Pflanze von ihrer prinzipiellen genetischen Fähigkeit, Chlorophyll zu bilden, Gebrauch macht oder nicht. Diese Beobachtung macht uns deutlich, dass wir bei der Erforschung der Vererbung zwei Aspekte grundsätzlich auseinanderhalten müssen: einerseits die Ausstattung eines Organismus mit bestimmten erblichen Eigenschaften und andererseits sein tatsächliches Erscheinungsbild, das durch diese erblichen Eigenschaften in einer bestimmten Umgebung hervorgerufen wird. Wir umschreiben diese beiden verschiedenen Aspekte demgemäß auch durch zwei verschiedene wissenschaftliche Begriffe: Die Gesamtheit der erblichen Eigenschaften eines Organismus nennen wir den Genotyp, sein tatsächliches Erscheinungsbild aber den Phänotyp.

Wir unterscheiden zwischen dem Erscheinungsbild eines Organismus und seiner genetischen Veranlagung. Das Erscheinungsbild wird in der Genetik als Phänotyp eines Individuums bezeichnet. Die Gesamtheit aller erblichen Eigenschaften eines Organismus bezeichnet man als Genotyp.

1.2.1 Umweltbedingte Variabilität Die Lebewesen, an denen man den Einfluss der Umwelt auf den Phänotyp relativ leicht erforschen kann, sind Pflanzen. Bei ihnen ist eine vegetative Fortpflanzung meist sehr einfach zu erzielen. Da vegetative Fortpflanzung keinerlei Veränderungen des genetischen Materials einschließt, sind alle Individuen, die auf diesem Wege erzeugt werden, genetisch identisch. Dadurch kann Variabilität, die durch genetische Mechanismen erzeugt wird, ausgeschlossen werden, sodass ausschließlich umweltbedingte Variabilität sichtbar wird. Vegetative Vermehrung von Pflanzen kann auf zweierlei Art erfolgen: ï Am einfachsten ist vegetative Vermehrung durch die Teilung von Wurzelstöcken oder durch Steck-

linge zu erreichen. Man kultiviert Teile einer Pflanze, etwa einen Seitentrieb, bis er Wurzeln geschlagen hat, oder eine Wurzel, bis sie weitere Triebe erzeugt hat. Somit stehen weitere Abkömmlinge desselben Genotyps zur Verfügung. ï Einen alternativen Weg bieten Kulturmethoden, die es uns gestatten, aus Einzelzellen (oder aus Protoplasten) ganze Pflanzen zu ziehen. Auch in diesem Fall verfügt man mit allen Individuen, die auf diese Weise von einem gemeinsamen Ausgangsindividuum erhalten wurden, über ein genetisch einheitliches Material. Man bezeichnet genetisch identische Pflanzen, die auf einem dieser Wege entstanden sind, als Klone.

Vegetative Vermehrung bedeutet Vermehrung ohne vorangehende sexuelle Prozesse. Das genetische Material eines Organismus bleibt dadurch im Prinzip unverändert erhalten, sodass die Individuen, die durch vegetative Fortpflanzung entstanden sind, genetisch völlig gleich sind. Man bezeichnet sie als Klone.

Hat man auf einem dieser Wege genetisch einheitliches Untersuchungsmaterial bereitgestellt, können Experimente mit dem Ziel ausgeführt werden, zu ermitteln, inwieweit einerseits Umwelteinflüsse oder andererseits genetische Faktoren einzelne Eigenschaften der betreffenden Organismen bestimmen. Eine wichtige Voraussetzung für solche Versuche ist die Fähigkeit des Versuchsmaterials, in sehr unterschiedlichen Umweltbedingungen überhaupt existieren zu können. Unter diesem Gesichtspunkt hat sich in der Vergangenheit die Schafgarbe (Achillea millefolium, Compositae) als geeignet erwiesen, aber auch Fingerkrautarten (Potentilla, Rosaceae) wurden ausgiebig untersucht. Betrachten wir Pflanzenpopulationen derselben Art in verschiedenen Biotopen, so wird schnell deutlich, dass sich Individuen der einen Population oft sehr erheblich, vor allem in ihrer Größe, von denen anderer Populationen unterscheiden. Studien dieser Art wurden in Nordamerika durch Jens Clausen und Mitarbeiter Ende der 1940er-Jahre durchgeführt. Sie dokumentierten eindringlich, dass die mittlere Größe von Achillea lanulosa stark mit dem jeweiligen Biotop korreliert. Die mittlere Größe der Pflanzen in den niedrigeren, der kalifornischen Küste näher gelegenen Regionen der Sierra Nevada, etwa bei Mather (1400 m Höhe) im Bereich des Koniferengürtels, liegt bei 75 cm. Pflanzen, die in den extremeren Milieubedingungen der subalpinen Tuolumne Meadows (2600 m Höhe) oder des hochalpinen Big-Horn-Sees (3350 m Höhe) wachsen,

1.2 Konstanz und Variabilität

werden im Mittel nur 15 bis 20 cm hoch. Man ist versucht, die Ursache für die geringe Größe in den ungünstigen Wachstumsbedingungen des alpinen Biotops zu sehen. Interessanterweise ist es aber gerade die genetisch bedingte Fähigkeit, solche schwachen Wuchsformen unter Extrembedingungen zu bilden, die es den Pflanzen gestattet, sich in einer Umgebung noch zu vermehren, in der andere Pflanzen gar nicht mehr existieren können. Die geringe Größe hat sowohl den Vorteil eines geringeren Nährstoffbedarfs als auch den besserer Widerstandsfähigkeit gegen ungünstige Klimaeinflüsse. Zudem wird dadurch die Wachstumsphase bis zur Fortpflanzungsreife verkürzt. Dieser Gesichtspunkt ist besonders wichtig, da die Vegetationsperiode in den betreffenden Biotopen besonders kurz ist. Aufgrund der geschilderten Beobachtungen lässt sich auch die Frage stellen, ob die verschiedenen Pflanzenpopulationen sich genetisch so voneinander unterscheiden, dass der für ein Biotop jeweils charakteristische Größenbereich erblich festgelegt ist. Eine Antwort auf diese Frage können wir erhalten, wenn wir vegetativ vermehrte Nachkommen, also genetisch identische Individuen, der verschiedenen Pflanzenpopulationen auf die unterschiedlichen Biotope verteilen und ihr Wachstum verfolgen. Wir erkennen, dass sich das Wachstum der vegetativ vermehrten Pflanzen dem der Populationen in dem entsprechenden Biotop vollständig anpasst. Die Größe der Pflanzen ist somit weitgehend umweltbedingt, nicht aber genetisch fixiert. Wir können aus diesen Beobachtungen ableiten, dass erbliche Eigenschaften einen Bereich festlegen, in dem Variabilität möglich ist. So ist eine optimale Anpassung an die jeweiligen Bedingungen gewährleistet. Dass es hierfür jedoch Grenzen gibt, wird deutlich, wenn wir uns vergegenwärtigen, dass es offenbar prinzipielle Maximal- und Minimalgrößen gibt, durch die die Variabilität eingegrenzt wird: Eine Schafgarbe erreicht weder die Größe einer Sequoia, noch bleibt sie in der Entwicklung bei der Größe eines Lebermooses stehen. Die jeweiligen Umweltbedingungen bestimmen aus diesem insgesamt möglichen Größenspektrum einen jeweils biotopspezifischen Variabilitätsbereich.

Erbliche Eigenschaften bestimmen in Zusammenwirkung mit den jeweils gegebenen Umweltfaktoren den Phänotyp..

Ein Vergleich der Wachstumseigenschaften der verschiedenen Individuen, die durch vegetative Vermehrung entstehen, also genetisch identisch sind, gestattet uns noch einen weiteren wichtigen Schluss: Wir können aus der Größe der Pflanze in einem Biotop keine Rückschlüsse auf die zu erwartende relative Größe in

einem anderen Biotop ziehen. Es gibt somit keine „beste“ genetische Konstitution, sondern die speziellen Eigenschaften kommen, zumindest im Größenwachstum, durch ein komplexes Zusammenspiel von Erbanlagen und Umweltbedingungen zustande. Wenn wir uns also fragen, ob wir durch eine geeignete Zusammenstellung von Genen eine „ideale“ Pflanze experimentell erzeugen könnten, so müssen wir feststellen, dass es diese „ideale“ Pflanze gar nicht gibt, da jedes Individuum seine Eigenschaften stets in einer bestimmten Umgebung, also biotopspezifisch, entwickelt. Die Bedingungen dieser Umgebung aber können wir, wenn überhaupt, dann nur im Rahmen der allgemeinen Eigenschaften eines Biotops festlegen.

Es gibt keine „beste“ genetische Konstitution, da der Phänotyp durch ein komplexes Zusammenspiel von Genotyp und Umweltbedingungen entsteht.

1.2.2 Genetisch bedingte Variabilität Der grundlegende Einfluss der Umweltbedingungen auf das Größenwachstum wirft die Frage auf, inwieweit andere Eigenschaften einem gleich starken Einfluss der Umgebung unterworfen sind. Zur Beantwortung dieser Frage können wir nochmals auf die nordamerikanischen Feldstudien, dieses Mal am Fingerkraut (Potentilla) zurückgreifen. Vergleichen wir die verschiedenen Wachstumsformen, etwa der Blätter, in den unterschiedlichen Biotopen, so erkennen wir, dass – abgesehen von unterschiedlicher Größe – die Blattform von Pflanzen gleicher genetischer Konstitution in den unterschiedlichsten Biotopen sehr ähnlich bleibt, obwohl sie zwischen Pflanzen unterschiedlichen Genotyps beträchtlich variiert. Das Ausmaß der Umweltabhängigkeit in der Ausprägung einer Eigenschaft ist also für verschiedene Eigenschaften unterschiedlich groß. Grenzen in der Variabilität der Ausprägung bestimmter Eigenschaften gibt es für alle Merkmale. Diese Grenzen sind genetisch festgelegt und werden durch die Gesamtheit der erblichen Eigenschaften mitbestimmt. Die Fähigkeit eines bestimmten Genotyps, auf seine Umgebung in unterschiedlicher Weise zu reagieren, bezeichnen wir als die Reaktionsnorm eines Genotyps. Die Reaktionsnorm beschreibt die Variationsbreite des Phänotyps, die einem bestimmten Genotyp unter unterschiedlichen Umweltbedingungen zur Verfügung steht. Sie beschreibt also gewissermaßen die „Möglichkeiten“ eines Genotyps, sich an die Umgebungsbedingungen anzupassen. Ist der Phänotyp nicht mehr mit den Anforderungen der Umwelt in Übereinstimmung zu bringen, ist der Organismus nicht mehr existenzfähig.

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Kapitel 1: Was ist Genetik?

Wir können unsere Erkenntnisse aus diesen Versuchen also zusammenfassen: Die Ausprägung von Eigenschaften wird in erheblichem Ausmaße von den Umgebungsbedingungen bestimmt. Wir bezeichnen – im Gegensatz zur genetischen Variabilität – eine umweltbedingte Variante auch als Modifikation.

Die Interaktion zwischen Umwelt und Genotyp ist ein

allgemeines Phänomen, das alle Organismen betrifft und den Phänotyp der Individuen mit prägt. Die umweltbedingten Variationen von Merkmalen werden auch als Modifikationen bezeichnet.

Wir müssen uns aber vor Augen halten, dass wir aufgrund des Phänotyps eines einzelnen Organismus nicht entscheiden können, ob eine vorwiegend erblich oder eine vorwiegend umweltbeeinflusste Eigenschaft vorliegt. Vielmehr kann eine solche Entscheidung nur durch eine genetische Analyse verwandter Individuen – beim Menschen also z. B. durch Analyse eines Familienstammbaums – getroffen werden. Der Grund für diese Schwierigkeiten ist darin zu suchen, dass Merkmale, die gewöhnlich genetisch bedingt sind, unter bestimmten Umständen durch Milieueinflüsse imitiert werden können. Man spricht in diesem Fall von einer Phänokopie; im Kontext evolutionärer Prozesse spricht man auch von Konvergenz. Dieses Problem wird auch bei der modernen Taxonomie deutlich. Wurden früher Verwandtschaftsbeziehungen zwischen verschiedenen Arten aufgrund von äußeren Merkmalen hergestellt, so zeigt es sich heute, dass die dadurch getroffenen Zuordnungen nicht immer stimmen müssen. Klarheit bringt in vielen Fällen eine DNA-Sequenzanalyse. Um zu überprüfen, ob die Greifvögel und Eulen und die einzelnen Unterarten jeweils monophyletische Gruppen bilden (d. h. eine Abstammungsgemeinschaft mit einem gemeinsamen Vorfahren darstellen), wurden jeweils ein Gen der Mitochondrien und eines aus der Kern-DNA sequenziert. Entsprechend den Erwartungen zeigte sich dadurch, dass jeweils die Familien der Falken, Habichtsartigen, Neuweltgeier, Fischadler und Eulen monophyletische Gruppen bilden, ohne allerdings näher miteinander verwandt zu sein. Falken und Eulen bilden unabhängige Gruppen ohne nähere Verwandtschaft zu den eigentlichen Greifvögeln. Man vermutet, dass sich die Ähnlichkeiten in ihrer Lebensweise auf Konvergenz zurückführen lassen (Storch et al. 2007).

Phänokopien sind umweltbedingte, nicht erbliche Nachahmungen von Phänotypen, die durch bestimmte erbliche Konstitutionen (Vorhandensein bestimmter Allele) hervorgerufen werden.

Dank moderner genetischer Methoden können wir heute wesentlich detailliertere Aussagen über die molekularen Hintergründe genetischer Variabilität machen. Dadurch identifizieren und charakterisieren wir Gene, die für die unterschiedliche Form und Größe der Blätter, der Blütendauer oder auch für die Farbe der Früchte verantwortlich sind (Abb. 1.4). Häufig unterscheiden sich die entsprechenden Gene der verschiedenen Formen von Wildpflanzen nur an wenigen Stellen; wir sprechen dann von Polymorphismen. Wir beginnen zu verstehen, wie Pflanzen auf ihre Umwelt reagieren, d. h. auf abiotische Signale wie Licht, Temperatur, Wind, Feuchtigkeit, Verfügbarkeit von Wasser und Nährstoffen, aber auch auf biotische Signale wie Krankheitserreger oder Konkurrenten. Häufig stellt man dabei fest, dass es sich nicht um die Auswirkungen von Veränderungen in einem einzigen Gen handelt, sondern dass eine größere oder kleinere Gruppe von Genen an der Veränderung solcher quantitativer Merkmale beteiligt ist. So hängt die Geschwindigkeit der Blütenbildung bei der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana; Kapitel 5.4.2) von mindestens 14 Genen ab (für eine schöne Übersicht dazu siehe Alonso-Blanco et al. 2005). Wir werden solche Phänomene an verschiedenen Stellen des Buches besprechen, z. B. unter eher formalen Aspekten im Kapitel 10 (Kapitel 10.3.4 und 10.4.6); entwicklungsgenetische Gesichtspunkte werden im Kapitel 11 betrachtet (für Pflanzen besonders in Kapitel 11.1). Humangenetische Gesichtspunkte werden beispielsweise im Rahmen der genetischen Epidemiologie besprochen (Kapitel 12.1.5). Variabilität ist aber nicht nur die Voraussetzung für die Anpassung einer Organismengruppe an sich verändernde Umweltbedingungen, sondern auch Voraussetzung für die Entwicklung neuer, unabhängiger Arten. Durch zufällige Veränderungen im Erbgut entstehen für einzelne Individuen neue Möglichkeiten, die sich je nach Selektionsdruck auch durchsetzen können. Wir werden diese Aspekte in einigen späteren Kapiteln ausführlich erörtern, z. B. unter dem Stichwort „Populationsgenetik“ (Kapitel 10.5) oder im Kapitel 14 über die Evolution des Menschen.

1.3 Theoriebildung in der Biologie

Abb. 1.4 a, b Es sind Variationen wildlebender Formen der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) dargestellt. a Verschiedene Arabidopsis-Formen unterscheiden sich hinsichtlich der Länge ihrer vegetativen Phase (oder Blütezeit), der Wachstumsrate, der Morphologie der Rosette oder der Morphologie des Blütenstands. b Weitere Variationsmöglichkeiten gibt es hinsichtlich der Größe, Form, Kerbung und Haardichte der Blätter und des Blattstils. (Alonso-Blanco et al. 2005; mit freundlicher Genehmigung von UBC-Press)

1.3 Theoriebildung in der Biologie Biologische Forschung ‒ und damit auch genetische Forschung – ist dadurch charakterisiert, dass Probleme gelöst und Wissenslücken geschlossen werden sollen. Das schon erwähnte Humangenom-Projekt ist dafür ein hervorragendes Beispiel im globalen Maßstab – im täglichen Laboralltag ist aber die Herangehensweise im Prinzip genauso. Die Beantwortung der Fragen erfolgt entweder durch ein systematisch-methodisches Vorgehen (wie im Humangenom-Projekt), oder aber auch durch individuelle Intuition, wie wir es häufig im Labor erleben. Intuition ergibt sich aus der Fülle des zur Verfügung stehenden Wissens und der Erfahrungen und besteht im Wesentlichen darin, aus einer großen Zahl möglicher experimenteller Ansätze denjenigen auszuwählen, der am schnellsten zum Erfolg führt. Allerdings ersetzt Intuition kein Experiment, sondern ist

vielmehr eine Anleitung zur Entwicklung methodischer Konzepte. Nach Mahner und Bunge (2000) können wir 10 Punkte einer allgemeinen wissenschaftlichen Methode formulieren: ï Finde ein Problem bzw. eine Fragestellung. ï Formuliere die Fragestellung klar und eindeutig. ï Suche nach Informationen, Methoden oder Instrumenten, die zur Beantwortung der Fragestellung relevant sein können. ï Versuche, das Problem mithilfe der gesammelten Mittel zu lösen. ï Erfinde neue Ideen (Hypothesen, Theorien oder Methoden), produziere neue empirische Daten oder entwerfe neue Experimente, um das Problem zu lösen. ï Beantworte die Fragestellung mit den jetzt neu vorhandenen Mitteln. ï Leite Folgerungen aus der bisherigen Antwort ab. ï Prüfe die vorgeschlagene Lösung (bei einer Hypothese: Prüfe, ob Vorhersagen tatsächlich eintreffen; bei neuen Daten: Welche Konsequenzen hat es für das bereits vorhandene Wissen?; bei einer neuen Methode: Prüfe ihren möglichen Gebrauch oder Missbrauch). ï Korrigiere eine fehlerhafte Lösung durch Wiederholung der Schritte 1 bis 8. ï Untersuche die Wirkung der Lösung auf das bestehende Hintergrundwissen und formuliere neue Fragestellungen, die sich daraus ergeben. Ein derartiges Vorgehen ist ein allgemein wissenschaftliches Konzept, das auf alle Untersuchungen angewandt werden kann und sollte – unabhängig von den jeweiligen Spezialdisziplinen. Es gilt in der Biologie, und es gilt auch in der Genetik. Ein Kernelement der oben dargestellten „10 Punkte“ ist die Hypothesenbildung; Hypothesen sind überlegt (d. h. mit dem bisherigen Wissen vereinbar), explizit formuliert und vor allem prüfbar. Wenn eines dieser Merkmale nicht zutrifft, sprechen wir von einer Pseudohypothese. Hypothesen können auf verschiedenen Wegen generiert werden: ï durch Verallgemeinerungen aus gesammelten Daten; ï durch Assoziation oder Korrelation verschiedener Variablen, wobei hier statistische Methoden zur Absicherung verwendet werden müssen; ï durch Ähnlichkeiten und Analogien; ï durch „Neuerfindung“: Die Hypothese geht dabei über die verfügbaren Daten hinaus – sie ist transempirisch. Hypothesen variieren in Umfang und Tiefe; wir können aber vor allem phänomenologische und mechanis-

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Kapitel 1: Was ist Genetik?

mische Hypothesen unterscheiden. Dabei bleiben phänomenologische Hypothesen oft an der Oberfläche, wohingegen mechanismische Hypothesen Prozesse zu beschreiben versuchen, die die Beobachtungen erklären. Diese Prozesse können physikalischer, chemischer oder biotischer Natur sein. Für die Anerkennung eines Mechanismus in der Wissenschaft gilt, dass er materiell, gesetzmäßig und prüfbar ist. Das wird deutlich, wenn wir uns die entsprechenden Gegensätze betrachten: immateriell, wundersam, okkult. Wir müssen uns aber dessen bewusst bleiben, dass jede Erkenntnis und jeder Vorschlag prinzipiell verbessert werden kann – es gibt also kein abgeschlossenes und für immer gültiges Weltbild. Der erste Forscher, der ein geschlossenes Konzept entwickelte, das die Evolution von Organismen auf der Grundlage ihrer Erbeigenschaften zu erklären versuchte, war Charles Darwin (1809‒1882). Auf der Grundlage seiner umfangreichen Studien, die er auf seiner Weltreise mit dem Schiff „Beagle“ durchführte, schlug er vor, dass sich alle Organismen im Laufe der Evolution aus gemeinsamen Vorfahren entwickelt haben. Er formulierte damit in seinem Buch On the origin of species by natural selection, das 1859 erschien, die Deszendenztheorie oder Abstammungslehre. Ein anderer Forscher, Alfred Russel Wallace (1823–1913), war etwa gleichzeitig zu ähnlichen Vorstellungen gelangt. Seine wissenschaftlichen Studien sind jedoch weniger beachtet worden als das Buch Darwins, zumal sie wesentlich weniger umfangreiche Dokumentationen zu den entwickelten Ideen über die Abstammung der Organismen enthalten. Diese gleichzeitige Entwicklung ähnlicher Vorstellungen veranschaulicht uns ein allgemeines Phänomen wissenschaftlicher Theorien: Fundamentale neue Vorstellungen reifen in der Wissenschaft allmählich heran und werden oft gleichzeitig für mehrere Forscher greifbar. Sie beruhen auf den Ergebnissen und Einsichten, die im Laufe der Zeit durch viele Wissenschaftler gesammelt worden sind. Schließlich gelingt es dann, solche Einsichten, die oft mit bestehenden Vorstellungen nicht mehr in Übereinstimmung zu bringen sind, in ein neuartiges Konzept umzusetzen. Die Weiterentwicklung wissenschaftlicher Einsichten beruht auf der Formulierung neuer Hypothesen. Wie wir oben gesehen haben, wird eine Hypothese aus einer Anzahl von Beobachtungen und aus deren Analyse formuliert. Eine solche Hypothese stellt noch keine endgültig gesicherte Einsicht dar, sondern formt zunächst nur die Grundlage, bestimmte Beobachtungen im Rahmen eines übergreifenden Konzeptes zu verstehen. Die weitere wissenschaftliche Arbeit besteht nunmehr darin, diese Hypothese zu untermauern oder zu widerlegen. Gelingt es, weitere wichtige Argumente für die Gültigkeit dieser Hypothese zu finden, so wird

diese gegebenenfalls zu einer Theorie. Unter einer Theorie verstehen wir eine nach allen wissenschaftlichen Vorstellungen gut gesicherte Vorstellung zu einem bestimmten Phänomen. So haben wir im Laufe der Besprechung der Eigenschaften des genetischen Materials gesehen, dass die Hypothese, dass Chromosomen die Träger der erblichen Eigenschaften eines Organismus sind, vor allem durch die Analyse von Geschlechtschromosomen zu einer gesicherten Vorstellung, der Chromosomentheorie der Vererbung, entwickelt wurde (S. 173). Die Tatsache, dass auch cytoplasmatische Elemente wie Mitochondrien und Plastiden Erbinformation enthalten, widerlegt (falsifiziert) die Chromosomentheorie der Vererbung nicht, sondern erweitert sie allenfalls, wenn wir nicht überhaupt davon ausgehen wollen, dass nach unseren heute gebräuchlichen Vorstellungen auch Mitochondrien und Plastiden im Prinzip ein „Chromosom“ besitzen. Unabhängig von dieser Frage, was ein Chromosom ist, stellt jedoch die Einsicht, dass solche cytoplasmatischen Organellen ebenfalls Erbinformationen an die Nachkommen vermitteln können, eine Erweiterung der ursprünglichen Vorstellungen der Chromosomentheorie der Vererbung dar. Müssen wir noch mit mehr „Erweiterungen“ der klassischen Genetik rechnen? Schon Mitte der 1950er-Jahre beschrieb R. A. Brink bei Maiskörnern verschiedene Färbemuster, die als Punktierung bzw. Marmorierung bekannt sind und mit der Bildung von Anthocyan zu tun haben. Bei bestimmten Kreuzungen der Maispflanzen wurden jedoch die Mendel’schen Regeln (Kapitel 10.1) über den zu erwartenden Anteil der jeweiligen Färbungen verletzt, ohne dass zunächst eine plausible Erklärung gefunden werden konnte. Ähnliche Phänomene wurden in der Folgezeit auch bei einigen Phänotypen von anderen Pflanzen, aber auch bei Tieren und dem Menschen berichtet. Seit 1968 wird dafür der Begriff „Paramutation“ verwendet, wobei zunächst kein plausibler Mechanismus identifiziert werden konnte. Dachte man früher an „springende Gene“ (Transposons, Kapitel 8.1), so werden heute eher nicht-codierende RNA-Moleküle (Kapitel 7.5) und epigenetische Prozesse (Kapitel 11.7) vermutet (für einen hervorragenden Überblick siehe Chandler 2007). Die von Darwin formulierte Deszendenztheorie ist heute von den Biologen als Grundlage unserer Vorstellungen über die Evolution anerkannt. Sie enthält zwar die Erklärung, dass Organismen durch bestimmte evolutionäre Mechanismen entstehen, aber viele Einzelheiten solcher Mechanismen sind noch ungeklärt. Zur Bewertung der Leistung Darwins muss man übrigens berücksichtigen, dass Mendels Regeln der Vererbung

1.3 Theoriebildung in der Biologie

zu dem Zeitpunkt, an dem Darwins Buch veröffentlicht wurde, noch nicht einmal publiziert, geschweige denn allgemein bekannt waren. Bei Kenntnis der Mendel’schen Untersuchungen hätte Darwin wichtige Gesichtspunkte der Erklärung von Evolutionsmechanismen deutlicher formulieren können. So hatte Darwin zur Erklärung der Evolution die Selektion als wichtigen Mechanismus erkannt, ohne jedoch konkret begründen zu können, was die materielle Basis der Selektion sein könnte. Natürlich beruht diese Vorstellung von der Selektion als wichtigem Evolutionsmechanismus auf der Beobachtung von Variabilität innerhalb von Populationen von Organismen. Die Ursachen für diese Variabilität waren ihm jedoch nicht bekannt, und es war unklar, wie diese Variabilität entstehen kann. Die Beobachtung von phänotypischer Variabilität von Organismen erweist sich somit wiederum als ein wichtiges Grundelement wissenschaftlicher Erkenntnis. Sie ermöglichte es nicht nur, die formalen Regeln der Vererbung zu ergründen (Kapitel 10), die Grundlagen der Veränderungen des genetischen Materials zu erkennen (Kapitel 8 und 9) und Entwicklungsvorgänge aufzuklären (Kapitel 11), sondern sie ist auch ein wichtiges Mittel, um evolutionäre Prozesse zu verstehen.

Kernaussagen ï Die Genetik beschreibt die Regeln und Mechanismen der Vererbung und erklärt funktionell die Unterschiede in der genetischen Ausstattung verschiedener Organismen. ï Die moderne Genetik beginnt mit den Arbeiten Gregor Mendels in der Mitte des 19. Jahrhunderts und hat innerhalb von etwas mehr als hundert Jahren mit der Entschlüsselung des menschlichen Genoms 2001 ihren (vorläufigen) Höhepunkt erreicht. ï Die Gesamtheit aller Erbinformationen wird als Genom bezeichnet. ï In Prokaryoten steht die Genomgröße mit der Anzahl vorhandener Gene direkt in Beziehung. ï Bei Eukaryoten besteht eine große Diskrepanz zwischen der Genomgröße und der Anzahl ihrer Gene. Ursache ist eine Vielzahl von repetitiven Elementen. ï Ein Gen ist durch seinen Platz auf dem Chromosom definiert. ï Bestandteil eines Gens sind die codierenden Bereiche, die gleichsinnig transkribiert werden, sowie die oberhalb liegenden, zugehörenden regulatorischen Bereiche. ï Der Phänotyp ist das Erscheinungsbild eines Organismus, der Genotyp ist die Gesamtheit aller seiner genetischen Eigenschaften. Im Zusammenwirken mit Umwelteinflüssen definiert der Genotyp den Phänotyp; vom Phänotyp kann nicht auf den Genotyp zurückgeschlossen werden. ï Vegetative Vermehrung bedeutet Vermehrung ohne vorangehende sexuelle Prozesse, sodass das genetische Material unverändert bleibt. Die entstehenden Individuen sind identisch (Klone). ï Biologische Variabilität kann genetische und umweltbedingte Ursachen haben. ï Umwelteinflüsse können genetische Effekte imitieren (Phänokopie).

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Kapitel 1: Was ist Genetik?

Technik-Box 1

Isolierung genomischer DNA Anwendung: Genomische DNA ist Ausgangsmaterial für viele genetische Verfahren: Klonierung von DNA-Fragmenten, Southern-Blot-Analyse, PCRAnalyse, Kartierung. Methode: DNA liegt im Zellkern als extrem langes, aber sehr dünnes Fadenmolekül vor. Aufgrund dieser physikalischen Labilität führen hohe Temperaturen und extreme pH-Bedingungen zur Denaturierung oder Präzipitation. Besonders durch Scherkräfte (z.B. beim Pipettieren) entstehen Strangbrüche, so dass üblicherweise nur Fragmente von DNA gewonnen werden; Fragmentlängen von ca. 50kb reichen aber für die meisten molekulargenetischen Arbeiten völlig aus. Durch milde Extraktionsbedingungen (schwach alkalischer Puffer) kann aus Zellen (Gewebeteile, Blut, kleine Organismen) hochreine und biologisch aktive DNA gewonnen werden. Dabei werden durch vorsichtiges Homogenisieren und Zusatz ionischer

Detergenzien die Zellmembranen aufgeschlossen. Wichtig ist die Anwesenheit eines Komplexbildners (z.B. EDTA) für zweiwertige Kationen wie Mg2+ und Mn2+, die nukleolytische Enzyme aktivieren können. Durch EDTA werden diese Kationen aus der Lösung entfernt und Nukleasen dadurch inaktiviert. Proteine werden durch Zugabe eines proteolytischen Enzyms (Proteinase K) abgebaut, das selbst unter den gegebenen Reaktionsbedingungen (schwach alkalisch, EDTA, Detergens) noch aktiv ist und sich schließlich selbst abbaut, wenn kein anderes Substrat mehr vorhanden ist. Für die Gewinnung reiner DNA werden Proteinreste und Abbauprodukte durch Ausschütteln mit Phenol abgetrennt; Phenolrückstände werden durch Ausschütteln mit Chloroform entfernt (Spuren von Phenol können spätere Analysen mit Restriktionsenzymen stören!). DNA kann durch Alkohol (Ethanol, Isopropanol) gefällt werden; nach „Waschen“ mit

Alkohol (zum Entfernen von Salzresten) kann DNA getrocknet und aufbewahrt werden; die Lagerung erfolgt üblicherweise in „TE-Puffer“ (benannt nach seinen Hauptbestandteilen Tris und EDTA: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). Da Phenol und Chloroform gesundheitsschädliche Arbeitsstoffe sind, dürfen sie nur unter einem Abzug verwendet werden; man hat daher Methoden entwickelt, die diesen „klassischen“ Schritt vermeiden. Dazu wurden säulenchromatographische Verfahren entwickelt, die Silikatoberflächen verwenden oder auf der Ionenaustausch-Chromatograhie basieren. Je nach Extraktionsvolumen sind die benötigen Säulen sehr klein und können mit kleinen Reaktionsgefäßen eingesetzt werden. Da bei der DNA-Isolierung oft ein hoher Durchsatz mit gleich bleibender Qualität erforderlich ist, werden bereits viele automatisierte Verfahren angeboten.

Kapitel 2

Molekulare Grundlagen der Vererbung Inhaltsverzeichnis 2.1 Funktion und Struktur der DNA . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.2 Die Verdoppelung der DNA (Replikation) . . . . . . . . . . 28

Das Gemälde „Laokoon 1977“ von Hans Erni könnte als Voraussicht der Fragen gesehen werden, die sich durch die Fortschritte der Molekularbiologie stellen.Es drückt aber auch die Abhängigkeit des Menschen von seinem genetischen Material aus. (Mit freundlicher Genehmigung von H. Erni, Luzern)

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Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung

Überblick Bestimmte erbliche Eigenschaften können durch Infektion von Mäusen mit abgetöteten Erregern übertragen werden. Die chemische Analyse der übertragenen Substanz zeigte, dass es sich um Desoxyribonukleinsäure (DNA) handelt. Der chemische Aufbau der DNA ist sehr einfach. Sie besteht aus einem Rückgrat aus Zuckermolekülen (Desoxyribose), die durch Phosphodiesterbrücken miteinander verknüpft sind. An der Desoxyribose befinden sich heterozyklische Basen. Insgesamt gibt es in der DNA nur vier verschiedene Basen (Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin). Die DNA kommt in Form einer Doppelhelix vor, die aus zwei antiparallel umeinander gewundenen Strängen besteht. Die beiden DNA-Stränge der Doppelhelix werden durch Wasserstoffbrücken zwischen den Basen zusammengehalten. Bei dieser Verknüpfung der Basen durch Wasserstoffbrücken bestehen nur zwei verschiedene Möglichkeiten: Es kann entweder Guanin mit Cytosin oder Adenin mit Thymin verbunden werden. Man bezeichnet solche miteinander verbundenen Basen als Basenpaare

2.1 Funktion und Struktur der DNA 2.1.1 DNA als Träger der Erbinformation Der Eindruck, dass das Geheimnis der chemischen Grundlage der Vererbung in den Proteinen zu suchen sei, beherrschte noch in den 1930er-Jahren die Vorstellungen der Forscher. Dennoch gehen die grundlegenden experimentellen Befunde, die die Grundlage zur Identifikation der DNA als Träger der erblichen Eigenschaften bilden, bereits in die 1920er-Jahre zurück. Frederick Griffith hatte beobachtet, dass bestimmte Bakterienstämme imstande waren, erbliche Eigenschaften an andere Bakterienstämme mit ursprünglich abweichenden Eigenschaften zu übertragen. Für diese Untersuchungen hatte er Streptococcus pneumoniae (auch als Pneumococcus pneumoniae bezeichnet) verwendet, den Erreger der Lungenentzündung. Manche Streptococcus-Stämme formen auf dem Kulturmedium große, ebenmäßige Bakterienkolonien und werden daher als infektiöse S-Stämme (S für engl. smooth) bezeichnet. Subkutane Infektionen von Mäusen mit diesen Erregerstämmen führen zum Tod der Mäuse. Hingegen zeigen Infektionen mit nicht infektiösen R-Stämmen, von denen auf Kulturmedium kleinere, raue Kolonien geformt werden (R für engl. rough), keine letalen Folgen. Auch durch Hitze inaktivierte S-Stämme erzeugen keine Infektionen. Mischt man jedoch hitzeinaktivierte S-Stämme und lebende R-Stämme und infiziert damit eine Maus, so stirbt diese an den Folgen einer Infektion. Man bezeichnet diesen

und die durch Basenpaare verknüpften DNA-Stränge als komplementäre Stränge. Zur konstanten Weitergabe des Erbmaterials muss sich die DNA identisch duplizieren können. Aufgrund ihrer Struktur ist die DNA hierzu sehr einfach in der Lage. Trennen sich die beiden Stränge der Doppelhelix einer Chromatide (nicht unterteilbare Längseinheit des Chromosoms), so kann an jedem der beiden Stränge ein neuer, komplementärer Strang synthetisiert werden, da seine Struktur durch die Basenfolge in dem alten Strang vollständig festgelegt ist. Man bezeichnet diesen Vorgang der Verdoppelung der DNA als Replikation. Durch Replikation entsteht eine zweite DNA-Doppelhelix. Während einer Zellteilung können die beiden Chromatiden auf die Tochterzellen verteilt werden, und die Kontinuität des genetischen Materials ist damit gesichert. Da bei der Replikation in beiden neu gebildeten DNA-Doppelhelices jeweils ein Strang der ursprünglichen DNA-Doppelhelix erhalten bleibt, wird die Replikation als semikonservativ bezeichnet.

Vorgang als Transformation: Die hitzeinaktivierten infektiösen Bakterien transformieren die nicht infektiösen R-Stämme und erzeugen infektiöse Bakterien, indem sie eine zunächst unbekannte Substanz auf die nicht infektiösen Bakterien übertragen. Die Ursachen für diese Transformation blieben unbekannt, bis Oswald Avery, Colin MacLeod und Maclyn McCarthy 1944 die entscheidenden Experimente ausführten. Sie behandelten die infektiösen hitzeinaktivierten Bakterienstämme mit verschiedenen Enzymen, um auf diese Weise zu testen, durch welche chemischen Verbindungen die Transformation ausgelöst wird. Die Begründung Averys für die Wahl des experimentellen Systems erinnert auffallend an Mendels Motivation für die Wahl seines Untersuchungsmaterials: „For purpose of study, the typical example of transformation chosen as a working model was the one with which we have had most experience and which consequently seemed best suited for analysis“ (Avery et al. 1944). Das entscheidende Ergebnis dieser Versuche war der Befund, dass proteolytische Enzyme (Trypsin, Chymotrypsin) und Ribonuklease keinen Effekt auf die Transformationsfähigkeit ausübten, wohl aber Desoxyribonuklease (in der Originalpublikation als „desoxyribonucleodepolymerase“ bezeichnet). Die physikochemischen Untersuchungen der transformierenden Substanz in der Ultrazentrifuge, durch Elektrophorese und durch Messungen des Absorptionsspektrums gaben zusätzliche Hinweise auf den Desoxyribonukleinsäure-Charakter dieser Verbindung. So konnten kaum mehr Zweifel bestehen, dass die biologisch aktive Verbindung, die die Ursache für die Transformation der Pneumokokken war, DNA ist.

2.1 Funktion und Struktur der DNA

Dennoch blieb die eigentliche Basis der biologischen Funktion von DNA noch immer unverstanden, und zu ihrer Erklärung bedurfte man des von Watson und Crick vorgestellten Strukturmodells der DNA-Doppelhelix. Avery und seine Mitarbeiter beschreiben am Schluss der Diskussion ihrer Versuchsergebnisse, in bemerkenswerter Zurückhaltung, die Konsequenzen aus ihren Befunden folgendermaßen: „If the results of the present study on the chemical nature of the transforming principle are confirmed, then nucleic acids must be regarded as possessing biological specificity the chemical basis of which is as yet undetermined“ (Avery et al. 1944).

Die Erkenntnis, dass DNA die Erbinformation enthält,

beruht auf Experimenten, die zeigen, dass DNA imstande ist, erbliche Eigenschaften einer bakteriellen Donorzelle auf eine genetisch andersgeartete bakterielle Rezeptorzelle zu übertragen.

2.1.2 Chemische Zusammensetzung Die chemischen Verbindungen, die die Träger der Erbinformation sind, wurden schon 1871 durch Friedrich Miescher in seinem Labor im Keller des Tübinger Schlosses entdeckt. Miescher untersuchte die Bestandteile von Eiter, den er aus Verbandsmaterial isolierte, das er aus der Tübinger chirurgischen Klinik erhielt. Dabei entdeckte er als wesentlichen Bestandteil des Eiters eine Substanz, die er Nuklein nannte. Ähnliche Verbindungen fand er im Sperma von Lachsen, aber sein Interesse wandte sich bald wieder den Eiweißmolekülen zu. Das Nuklein bezeichnen wir heute als Nukleinsäure. Nukleinsäuren erschienen Miescher als zu einförmig in ihrer chemischen Zusammensetzung, da sie im Wesentlichen große Anteile an Phosphat enthielten. Diese Einförmigkeit konnte sein Interesse nicht erwecken. Erst im Laufe der ersten Jahrzehnte des 20. Jahrhunderts wurden die Bestandteile der Nukleinsäuren und ihr molekularer Aufbau genauer analysiert. Als Hauptkomponenten erkannte man in allen Nukleinsäuren vier heterozyklische organische Basen – Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin – oder, alternativ zum Thymin, das zu diesem nahe verwandte Uracil. Diese Basen sind seitlich an eine Kette von Ribose- oder Desoxyribosemolekülen gebunden, die untereinander durch Phosphodiesterbindungen miteinander verknüpft sind (Abb. 2.1). Man unterschied daher Desoxyribose-haltige Nukleinsäuren, die die Bezeichnung Desoxyribonukleinsäure (DNS oder DNA vom engl. deoxyribonucleic acid) erhielten, von den Ribosehaltigen Nukleinsäuren, Ribonukleinsäure (RNS oder RNA vom engl. ribonucleic acid) genannt. Ein wichtiger, aber zunächst in seiner eigentlichen Bedeutung nicht wahrgenommener Befund war die annähernd äquimo-

lare Menge der organischen Basen. Erwin Chargaff erkannte 1951, dass nur jeweils zwei Basen, nämlich Guanin und Cytosin einerseits und Adenin und Thymin andererseits in der DNA in genau äquimolaren Mengen vorhanden sind. Diese grundlegenden chemischen Eigenschaften, zusammen mit röntgenspektrometrischen Daten der Struktur kristallisierter DNA-Moleküle, die einen helixartigen Aufbau der Moleküle als einfachste Interpretation anzeigten, waren entscheidend für das Verständnis der grundlegenden Struktur von DNAMolekülen. Sie erlaubten es James Watson und Francis Crick (1953a, b), ein Strukturmodell für die DNA zu entwerfen, das es ermöglicht, die grundlegenden Eigenschaften und Funktionen des genetischen Materials aller Lebewesen von der molekularen Seite her zu verstehen. Die DNA ist nach diesem Modell aus zwei antiparallelen Nukleinsäuresträngen aufgebaut, die in einer rechtsgewundenen Spirale miteinander verwunden sind und durch Wasserstoffbrückenbindungen der Basen zusammengehalten werden (Abb. 2.2). Diese Struktur wird als DNA-Doppelhelix bezeichnet. In ihrer äußeren Form ist sie durch zwei Vertiefungen gekennzeichnet: die kleine und die große Furche (engl. minor bzw. major groove). Diese Furchen spielen eine wichtige Rolle für die Interaktion der DNA mit Eiweißmolekülen zur Verpackung der DNA im Chromosom, aber auch für die Bindung regulatorischer Proteinmoleküle (S. 66, 145, 292f). Vor allem die große Furche ist bedeutsam, da in ihr die Basenpaare in ihrer sequenzspezifischen Struktur zur Außenseite der Doppelhelix hin exponiert werden. Das Watson-Crick-Modell der DNA-Doppelhelix enthält als biologisch wichtigstes Strukturelement die Bildung von Basenpaaren durch Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen (Abb. 2.3). Die Basenpaarung erfolgt jeweils zwischen der Amino- und der KetoForm des Adenin (A) und Thymin (T) oder zwischen Cytosin (C) und Guanin (G). Da Adenin und Thymin durch zwei Wasserstoffbrücken miteinander verbunden sind, Guanin und Cytosin aber durch drei, ist die Doppelhelix in AT-reichen DNA-Abschnitten weniger stabil als in GC-reichen Abschnitten. Diese physikalische Eigenschaft kann auch zur experimentellen Bestimmung des mittleren Basengehalts der DNA ausgenutzt werden (S. 26). Für die Stabilität der Doppelhelix ist jedoch nicht allein die Energie der Wasserstoffbrückenbindungen entscheidend, sondern auch molekulare Interaktionen zwischen den Basen (Van-der-Waals-Kräfte).

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Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung

Abb. 2.1 a–d Aufbau der DNA und RNA. a Bausteine der Nukleinsäure sind die Nukleotide, die aus einer Base (hier: Adenin), einem Zucker (hier: 2-Desoxy-DRibose) und einem Phosphatrest bestehen. Die Base ist über eine N-glykosidische Bindung mit dem 1’-C des Zuckers verbunden. Die Verbindung aus Base und Zucker wird als Nukleosid bezeichnet (hier: Adenosin). Der Phosphatrest ist als Ester mit dem 5’-C des Zuckers verbunden; die dargestellte Verbindung heißt Adenosin-5’-monophosphat. b Die Nukleinsäuren werden entsprechend dem Zuckerbaustein als Ribonukleinsäuren (bei Verwendung der D-Ribose; Abk. RNA) oder Desoxyribonukleinsäuren (bei Verwendung der 2-Desoxy-D-Ribose; Abk. DNA) bezeichnet. Die Zuckerbausteine unterscheiden sich durch die Anwesenheit (D-Ribose) oder Abwesenheit (Desoxyribose) einer OH-Gruppe am 2’-C. Die Nummerierung der einzelnen C-Atome im Ring ist angegeben. c Die Basen sind entweder die Purine Adenin (A) bzw. Guanin (G) oder die Pyrimidine Cytosin (C) bzw. Thymin (T). Bei der RNA tritt Uracil (U) an die Stelle von Thymin. Die Nummerierung der einzelnen C-Atome im Ring ist angegeben. Die entsprechenden Nukleoside werden als Adenosin, Guanosin, Cytidin, Thymidin oder Uridin bezeichnet. d Über 5’o3’-Phosphodiesterbindungen am Zucker verbundene Nukleotide formen die Makromoleküle der DNA bzw. RNA. Verschiedene DNA- bzw. RNA-Moleküle unterscheiden sich durch die Folge der organischen Basen (Sequenz). (d nach Löffler u. Petrides 2003, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

2.1 Funktion und Struktur der DNA

Träger der Erbinformationen sind die Nukleinsäuren.

Es handelt sich hierbei um hochmolekulare lineare Kettenmoleküle, die durch ein Zucker-Phosphat-Grundgerüst gebildet werden. In den meisten Organismen ist die Desoxyribose die Zuckerkomponente der Nukleinsäuren des Erbmaterials, die daher als Desoxyribonukleinsäure (DNA) bezeichnet wird. An den Zuckermolekülen befinden sich heterozyklische Purin- oder Pyrimidinbasen. Durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen zwei Basen (Guanin und Cytosin bzw. Adenin und Thymin) können zwei DNA-Ketten miteinander in Wechselwirkung treten und eine schraubenförmige Doppelhelix mit einer tieferen und einer flacheren Furche an ihrer Außenseite bilden.

2.1.3 Konfiguration der DNA DNA-Doppelhelices können in mehreren strukturellen Konfigurationen vorliegen, die von der Basenfolge und den Ionenbedingungen im Lösungsmittel abhängig sind. Die von Watson und Crick vorgeschlagene Konformation wird als B-Konfiguration (B-Konformation) bezeichnet. Alternative Strukturen sind die A- und die Z-Konfiguration (A- und Z-Konformation); die wichtigsten physikalischen Eigenschaften dieser drei Konformationen sind in Tabelle 2.1 zusammengefasst. Die A-Konfiguration erhält man vor allem bei hohen Salzkonzentrationen oder in stark dehydratisiertem Zustand; es erscheint daher zweifelhaft, ob sie unter biologischen Bedingungen vorkommt. Sie unterscheidet sich von der B-Konfiguration dadurch, dass die Basen nicht mehr senkrecht zur Achse der Doppelhelix angeordnet, sondern um etwa 19° gegen die Horizontale gedreht sind. Zugleich beträgt die Anzahl der Basenpaare je Windung der Doppelhelix 11 statt der 10 Basenpaare, die die B-Konfiguration kennzeichnen. Diese Veränderungen in der Struktur bedingen eine Vergrößerung des Durchmessers der Doppelhelix auf 2,55 nm anstatt der 2,37 nm, die in der B-Konfiguration gefunden werden. Die Anordnung der Basenpaare ist übrigens auch in der B-Konfiguration nicht strikt in der gleichen Ebene orientiert, sondern die Ebenen können geringfügig gegeneinander gedreht sein. Hieraus resultieren durch weitere Verschiebungen in der Basenanordnung und des Zucker-Phosphat-Rückgrats sequenzspezifische Unregelmäßigkeiten in der Doppelhelix. In allen bisher beschriebenen Strukturformen der DNA ist die Doppelhelix rechtsgewunden, d. h. sie ist im Uhrzeigersinn gedreht, unabhängig davon, ob man von oben oder von unten auf das korkenzieherartig

Abb. 2.2 Strukturmodell der DNA-Doppelhelix zum Zeitpunkt der Verdoppelung (Replikation). Eine Windung der Doppelhelix der B-Konformation mit etwa 10 Basenpaaren benötigt etwa 3,4 nm, während der Durchmesser der Doppelhelix etwa 2 nm beträgt. Die große und kleine Furche (major groove und minor groove) sind angegeben. Die beiden DNA-Einzelstränge weisen eine entgegengesetzte Orientierung auf (Pfeilköpfe und Angabe der endständigen C-Atome der Desoxyribose)

gedrehte Molekül schaut. Eine Linksdrehung hingegen findet man bei der Z-DNA-Konfiguration (Abb. 2.4). Der Name Z-DNA leitet sich von der Zick-Zack-Struk-

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Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung

tur (engl. zigzag) ab, die die Phosphatgruppen an der Außenseite der Doppelhelix bilden, wenn man sie sich untereinander verbunden vorstellt. Bei der B-DNA

Abb. 2.3 Wasserstoffbrücken bei der Basenpaarung in der DNA. Bestimmte Basen (A und T in DNA bzw. A und U in RNA sowie G und C) können sich durch die Ausbildung von Wasserstoffbrücken paaren (rote Linien). Durch die Paarung solcher komplementärer Basen entstehen doppelsträngige Nukleinsäuren, die die Form einer Doppelhelix annehmen

hingegen zeigen sie sich in einer glatten, schneckenartig um die Doppelhelix gewundenen Linie. Z-DNA kann entstehen, wenn Pyrimidin- und Purinbasen in einem Strang miteinander abwechseln, z. B. also viele GCGCGCGC-Wiederholungen. Auch in dieser Form stehen die Basenpaare nicht senkrecht zur Achse der Doppelhelix, sondern in einem Winkel von 9°. Der Abstand der Basen voneinander ist noch größer als in der A-Konfiguration und beträgt 12 Basen per Helixwindung. Eine volle Windung erfordert 4,56 nm und der Durchmesser beträgt nur 1,85 nm, das Molekül ist also länger und dünner. Die Struktur der Z-DNA ist somit viel gestreckter als die der B-DNA. Das hat auch zur Folge, dass die große Furche beinahe völlig zugunsten einer relativ tiefen kleinen Furche verschwindet. 26 Jahre nach der ersten Beschreibung der Z-DNA durch Wang und seine Mitarbeiter (1979) wurde der Übergangsbereich zwischen der B- und Z-Form kristallisiert (Ha et al. 2005). Dabei zeigte sich, dass zwei Basen aus der Helix herausragen und damit für verschiedene Modifikationen besonders leicht zugänglich sind (Abb. 2.4c). Unter den üblichen physiologischen Bedingungen ist die B-Form energetisch begünstigt. Allerdings wird die Z-Form nicht nur durch die oben erwähnten GChaltigen Sequenzen stabilisiert, sondern auch durch Anlagerungen von Kationen wie Spermin und Spermidin, die Methylierung des Cytosin-Restes sowie besondere Formen der negativen Überspiralisierung (engl. supercoiling). Eine besondere biologische Bedeutung

Tabelle 2.1 Physikochemische Eigenschaften der DNA Konfiguration A

B

Z

Windungsrichtung

rechts

rechts

links

Doppelhelix Ø

2,55 nm

2,37 nm

1,85 nm

Basenpaare pro Helixwindung

~ 11

~ 10

~ 12

Windung zwischen Basenpaaren

33,6°

35,9°

60°

Basenneigung zur Helixachse

19°

–1,2°

–9°

Propellertwist

18°

16°

~ 0°

Helixachse läuft durch

große Furche

Basen

kleine Furche

Große Furche

eng, tief

breit

sehr klein, flach

Kleine Furche

breit, flach

eng

sehr eng, tief

Glykosylbindung

anti

anti

anti (Pyrimidine)

syn (Purine) Nach Dickerson et al. 1983

2.1 Funktion und Struktur der DNA Abb. 2.4 a–c DNA in B- und Z-Konformation. a In der rechtsdrehenden B-Konformation (rechts) verbindet eine gleichmäßige Linie die Phosphatgruppen; die große und die kleine Furche sind deutlich ausgeprägt. Dagegen ist die Unregelmäßigkeit des DNA-Grundgerüsts in der linksdrehenden Z-Konformation (links) offensichtlich. Die Furche in der Z-Konformation ist tief und erreicht die Helixachse. b Aufsicht auf regelmäßige, idealisierte Helices; die stärkeren Linien deuten das ZuckerPhosphat-Grundgerüst an. Die Guanin-Reste sind grau hervorgehoben und zeigen eine annähernd 6fache Symmetrie: Während sich die Guanin-Reste in der ZDNA an der Peripherie befinden, sind sie in der B-DNA im Zentrum. c Ansicht eines DNA-Moleküls (15 bp) mit dem Übergang zwischen der linksdrehenden Z-Form und der rechtsdrehenden B-Form. Zwei Basen an der Übergangsstelle sind aus dem Stapel der Basen herausgedrückt (Adenin und Thymin, Pfeile). Die weiße Linie verbindet die einzelnen Phosphat-Reste der DNA-Kette. O: rot; N: blau; P: gelb; C: grau. (a, b nach Wang et al. 1979; c nach Ha et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

der Z-DNA blieb aber lange unklar; heute erscheint es jedoch als gesichert, dass die Z-Form eine wichtige Rolle in der Transkription spielt (Kapitel 3.3). Es gibt offensichtlich in vielen Genen definierbare Sequenzelemente (engl. Z-DNA forming regions, ZDR), die die Ausbildung von Z-DNA in der Nähe des Transkriptionsstartpunktes begünstigen. Weiterhin wurde in der Folge eine Reihe von Proteinen identifiziert, die spezifisch an DNA in der Z-Form binden. Das bekannteste ist ADAR1, eine Adenosin-Deaminase (engl. adenosine deaminase, RNA-specific), die eine spezifische Funktion beim Editieren von RNA-Molekülen ausübt (Kapitel 3.3.6). Die Bindung an die Z-DNA erfolgt dabei über eine spezifische Z-DNA-Bindungsdomäne der Proteine. Auch manche Virus-Proteine verfügen über eine Z-DNA-Bindungsdomäne, die damit an offene Transkriptionsstartpunkte binden und so die Transkription zellulärer Gene abschalten können. Hier eröffnen sich neue Möglichkeiten einer antiviralen Therapie.

Es wurden eine Reihe weiterer DNA-Strukturen beobachtet, die nicht der üblichen B-Konformation entsprechen (Abb. 2.5). Schon 1957 wurde von einer DNA berichtet, die aus einer Dreifachhelix besteht; besonderes Sequenzmerkmal sind hier sehr lange Bereiche von spiegelbildlichen Wiederholungseinheiten, die abwechselnd aus Purinen und Pyrimidinen gebildet werden. Weitere mögliche Formen sind Haarnadelstrukturen, Entwindungselemente, Tetraplexe und hantelförmige klebrige DNAStrukturen. Es gibt inzwischen zahlreiche Hinweise darauf, dass diese Strukturen an verschiedenen genetischen Prozessen beteiligt sind, z. B. der Regulation der Replikation (Kapitel 2.2), Transkription (Kapitel 3.3) und Rekombination (Kapitel 4.4.2 und 5.3.3), aber auch häufig zu Instabilitäten der DNA führen, die sich als Mutationen manifestieren können (Kapitel 9). Eine lesenswerte aktuelle Übersicht über diese Phänomene geben Bacolla und Wells (2009).

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Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung

Voraussetzungen

Sequenz

Haarnadelstruktur

direkte Wiederholungen

CNGCNGCNG CNGCNGCNG

DNAEntwindungselement

AT-reiche Regionen

AT T C TAT T C T TAAGATAAGA

Einzelstrang Oligo-GBereiche

CGGCGGCGG GCCGCCGCC

Dreifachhelix

RY spiegelbildliche Wiederholungen

GAAGA AGAAG C T TC T TC T TC

Klebrige DNA

2 GA-reiche Abschnitte direkte Wiederholungen

GAAGAAGAAG CTTCTTCTT

Struktur

Konformation

G G

G G G

Tetraplex

G

G G

G G

G G

Die

DNA-Doppelhelix kann in unterschiedlichen Strukturformen vorliegen. Normalerweise bildet sie die rechtsgewundene B-Konfiguration aus. Bei bestimmten Basenfolgen und in bestimmten Stoffwechselsituationen kann sie jedoch eine linksgewundene Z-Konfiguration annehmen. Das hat strukturelle Konsequenzen, da die Doppelhelix in einen gestreckteren Zustand übergeht und die Vertiefungen an der Außenseite der Doppelhelix ihre Struktur verändern.

Besonderes Interesse findet auch die Eigenschaft der DNA, kurvenförmige Molekülbereiche (engl. curved DNA) ausbilden zu können (Abb. 2.6). Man hat solche DNA-Sequenzen aufgrund ihrer besonderen elektrophoretischen Eigenschaften entdeckt. Sie wandert nämlich bei der elektrophoretischen Trennung langsamer ins Gel, als es ihrer eigentlichen Größe entspricht. Das ist auf die veränderte sterische Struktur des DNA-Moleküls zurückzuführen, die die Wanderung durch die Poren eines Gels behindert. Die Biegung der Doppelhelix in eine kurvenförmige Gestalt wird durch die Basenfolge verursacht. Bestimmte Basenfolgen führen zu einer Änderung

Abb. 2.5 Besonders Wiederholungssequenzen neigen zu Anordnungen, die nicht der üblichen B-Konformation entsprechen. Haarnadelstrukturen entstehen durch direkte Wiederholungssequenzen (N in der Sequenz: jede Base). Wiederholungen der Sequenz CGG bilden besonders stabile Haarnadelstrukturen aus. AT-reiche Regionen(z.B. am Startpunkt der DNA-Replikation) können sich leicht öffnen und werden als Entwindungselemente bezeichnet. Tetraplexe bilden sich an G-reichen Sequenzen und führen zu einem stabilen G-Quartett aus 4 DNA-Strängen. Eine Dreifachhelix kann leicht durch lange Stränge spiegelbildlicher Wiederholungen von Purin-Pyrimidin-Sequenzen gebildet werden (R: Purine, A oder G; Y: Pyrimidine, T oder C); die Wiederholung von GAA-TTC ist häufig an der Regulation der Genexpression beteiligt. Klebrige DNA wird durch sehr lange GAA-TTC-Wiederholungseinheiten hervorgerufen und führt zu einer sehr stabilen hantelförmigen Struktur, die auch durch Erhitzen auf 80 °C nicht aufgebrochen werden kann. (Nach Wells et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung des Autors)

der Drehung der Basenpaare gegeneinander, die erzwungen wird, da sonst sterisch unzulässige Überlappungen entstehen. Diese Drehung der Basen führt zu einer Abweichung von der B-Konfiguration, die an den Übergangsstellen einen Knick (engl. kink) in der Richtung der Doppelhelix und damit eine Abweichung ihrer Längsachse von der vorherigen Richtung verursacht. Insbesondere AA-Dinukleotide induzieren eine gebogene DNA-Struktur, wobei die Biegung in einer Ebene liegt, wenn sie in regelmäßigen Abständen relativ zur Doppelhelixwindung (z. B. alle 10 bis 11 Basenpaare) auftreten. Ähnliche Effekte werden noch für bestimmte andere Dinukleotide (z. B. AG oder GA) beobachtet, aber auch längere Sequenzeinheiten können Richtungsveränderungen bedingen. Die funktionelle biologische Bedeutung solcher gebogenen DNA-Doppelhelices ist bisher nicht sehr gut verstanden. Es gibt Hinweise darauf, dass sie wesentliche Bedeutung für die Bindung (bzw. Verhinderung der Bindung) bestimmter Proteine haben. Dementsprechend hat man auch beobachtet, dass gebogene DNA-Bereiche Einfluss auf die Transkription (Kapitel 3.3) und Rekombination (Kapitel 4.4.2 und 5.3.3) ausüben können.

2.1 Funktion und Struktur der DNA

C:

DNA erweist sich trotz ihrer einförmigen chemischen Struktur als ein sehr flexibles Molekül, dessen spezifische Struktureigenschaften innerhalb kleiner Bereiche des Makromoleküls durch bestimmte Basenfolgen verändert werden können.

10.5° per 10 bp 88.6° per 104 bp

Kontrolle

S:

6.9° per 10 bp

14.1° per 10 bp

27.2° per 104 bp

141.2° per 104 bp

Abb. 2.6 Gebogene DNA-Struktur (curved DNA). DNA-Moleküle mit einer Länge von 104 bp werden hinsichtlich ihrer Krümmung verglichen: Alle Moleküle bestehen aus 10-maligen Wiederholungen einer Sequenz, wobei an den Positionen 21, 42, 63 und 84 jeweils einzelne Basenpaare eingefügt wurden, um so eine 10,5-bp-Wiederholung zu erhalten (Kontrolle: GCGAATTCGC, C: GCAAAAAAGC, S: GCGAAAAAAC). In Abhängigkeit von der Sequenz wird eine deutliche Krümmung der DNA erzielt. Rot: Adenosin; blau: Thymidin; gelb: Guanosin; grün: Cytidin. (Nach Strahs u. Schlick 2000, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Aufgrund ihrer vielfältigen strukturellen Variabilität entwickelt sich die DNA zu einem idealen Molekül in der Nanotechnologie. Genetiker und Biochemiker haben DNA-Sequenzen und Strukturen mit neuen funktionellen Eigenschaften entdeckt, die die Expression schädlicher Gene verhindern oder Makromoleküle bei sehr niedrigen Konzentrationen entdecken können. Physikochemiker und Computerspezialisten können starre DNA-Strukturen konstruieren, die als Gerüst für den Aufbau von Material im molekularen Maßstab dienen; sie können einfache DNA-Rechenmaschinen bauen, DiagnostikAutomaten und DNA-Motoren. Die Verbindung des biologischen und technischen Fortschritts eröffnet ein großes Potenzial für die Elektronik sowie für therapeutische und diagnostische Anwendungen (Condon 2006).

Bereits aus diesen wenigen Beispielen wird deutlich, dass die DNA-Doppelhelix bei genauerer Betrachtung keine einförmige, wenig differenzierte Struktur ist, sondern einer Vielfalt von Strukturveränderungen unterliegen kann, die im Zusammenhang mit der zellulären Funktion der DNA Bedeutung gewinnen (S. 292). Das Strukturmodell der DNA-Doppelhelix (Abb. 2.2) lässt erkennen, dass der Außenbereich der Doppelhelix sehr wesentlich durch das PhosphodiesterZucker-Rückgrat der DNA bestimmt wird. Der hohe Gehalt an negativ geladenen Phosphatgruppen, die nicht durch entsprechende positive Ladungen kompensiert werden, verleiht der DNA eine stark negative Gesamtladung. Diese physikalische Eigenschaft wird uns in Zusammenhang mit der Art der Verpackung der DNA im Zellkern noch näher interessieren (S. 240). Ein besonders wichtiger Aspekt der Struktur der DNA-Doppelhelix ist deren Aufbau aus zwei antiparallel orientierten Einzelsträngen. Dem DNA-Modell können wir entnehmen, dass im Phosphat-ZuckerRückgrat der DNA-Ketten die einzelnen Desoxyribosemoleküle durch Phosphodiesterbrücken zwischen ihrer 3’-OH-Gruppe und der 5’-OH-Gruppe des folgenden Desoxyribosemoleküls miteinander verbunden sind (Abb. 2.1d). Hierdurch entsteht eine Asymmetrie innerhalb der DNA-Kette, die zu einer 3’→5’-Orientierung der Desoxyribosemoleküle führt. Das Schema der Abb. 2.2 lässt auch erkennen, dass die miteinander zur Doppelhelix vereinigten DNA-Ketten gegenläufig, also antiparallel angeordnet sind: Der 3’→5’-Orientierung des einen Strangs steht eine 5’→3’-Orientierung des anderen Strangs gegenüber. Diese strukturelle Eigenschaft der Doppelhelix muss uns deutlich vor Augen stehen, da sie wichtige biologische Konsequenzen hat, die später im Einzelnen erörtert werden.

Die beiden gepaarten Nukleinsäurestränge sind in entgegengesetzter Richtung orientiert, haben also den Charakter antiparalleler Ketten.

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Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung

2.1.4 Physikalische Eigenschaften der Nukleinsäuren In den 1950er-Jahren hatte man festgestellt, dass die DNA-Doppelhelix nicht nur denaturiert – also in Einzelstränge zerlegt – werden kann, sondern dass sich DNA-Einzelstränge unter geeigneten Ionen- und Temperaturbedingungen wieder zu einer Doppelhelix vereinigen können. Man bezeichnet diesen Vorgang als Renaturierung oder Reassoziation. Die durch Renaturierung gebildeten Moleküle nennt man auch Hybridmoleküle, und man bezeichnet den Vorgang der Doppelstrangbildung als Hybridisierung. Der Begriff Hybridmolekül soll im Folgenden auf alle durch Hybridisierung bzw. Renaturierung erhaltenen Doppelstrangmoleküle angewandt werden, unabhängig davon, ob die Doppelstränge den Ausgangsmolekülen entsprechen oder nicht. Solche Hybridmoleküle können also aus vollständig komplementären DNA- und RNA-Einzelsträngen oder aus zwei komplementären RNASträngen gebildet werden, oder sie können auch aus Nukleinsäuresträngen entstehen, die nicht vollständig komplementär sind. In den Hybriddoppelsträngen befinden sich dann ungepaarte Abschnitte – man spricht von Fehlpaarungen (engl. mismatching). Einen solchen Doppelstrang nennt man auch eine Heteroduplex. Da die Stabilität der Doppelhelix (S. 19) durch die Basenpaarung bedingt wird, sind solche ungenau zusammengefügten Heteroduplexstränge weniger stabil als vollständig gepaarte Moleküle. Die Stabilität eines Doppelstrangs kann beispielsweise durch thermische Denaturierung ermittelt werden, da der Verlauf der temperaturabhängigen Denaturierung neben der Basenzusammensetzung von der Stabilität der Doppelhelix, also vom Anteil gepaarter und ungepaarter

a

b

Basenpaare abhängig ist. Messen kann man Denaturierung durch Photometrie im Bereich des Absorptionsmaximums von Nukleinsäuren, das bei 260 nm liegt. Die Absorption von doppelsträngigen Nukleinsäuren ist bei einer Wellenlänge von 260 nm niedriger als die von Einzelsträngen. Aus einer thermischen Schmelzkurve (Abb. 2.7) kann man daher Rückschlüsse auf die Genauigkeit der Basenpaarung von Doppelsträngen erhalten, die in einem Hybridisierungsexperiment gebildet wurden. Je größer der Anteil ungepaarter Basenpaare ist, desto niedriger ist der Schmelzpunkt – die Temperatur, bei der 50 % der Doppelstränge geschmolzen sind.

(Einzelstrang-DNA lässt sich durch Basenpaarung komplementärer Stränge zur Doppelhelix renaturieren. Solche Hybridmoleküle können auch aus nicht vollständig komplementären DNA-Molekülen entstehen und weisen dann ungepaarte Abschnitte auf. Die entstandenen Doppelstränge werden in solchen Fällen als Heteroduplex bezeichnet. Das Ausmaß der Fehlpaarungen lässt sich durch Analyse der thermischen Schmelzeigenschaften der Doppelhelix ermitteln, da die Doppelhelix mit einem zunehmenden Anteil ungepaarter Regionen instabiler wird.

Die Möglichkeit der Hybridisierung von Nukleinsäuren hat eine zentrale Bedeutung für die Aufklärung der Genomstruktur, für die Analyse von Genen, ihrer Feinstruktur und ihrer Lokalisation im Genom erlangt. Ein beachtlicher Teil moderner gentechnologischer Methodik macht Gebrauch von der Grundeigenschaft der Nukleinsäuren, sich in komplementären Abschnitten zu Hybriden oder sogar in Tripelhelixstrukturen zu vereinigen.

Abb. 2.7 a, b Schmelzkurve von DNA. a Doppelsträngige Nukleinsäuren können durch Erhitzung in Einzelstränge aufgeschmolzen werden. Die Temperatur, bei der 50 % der Moleküle als Einzelstrang vorliegen, ist der Schmelzpunkt (Tm). b Der Schmelzpunkt ist vom GC-Gehalt der Nukleinsäuren abhängig. Außerdem schmelzen RNA/RNA-Doppelstränge bei höherer Temperatur als sequenzgleiche DNA/ DNA-Doppelstränge. DNA/ RNA-Hybridstränge liegen in ihrer Schmelztemperatur zwischen der von Doppelstrang-DNA und -RNA. (Nach Marmur u. Doty 1962)

2.1 Funktion und Struktur der DNA

Für das Verständnis der allgemeinen Struktur des eukaryotischen Genoms haben Renaturierungsversuche mit genomischer DNA eine grundlegende Rolle gespielt. Von ausschlaggebender Bedeutung war die Erkenntnis, dass die Kinetik der Bildung von Doppelhelices aus Einzelsträngen Information über die Komplexität eines Genoms, also letztlich über die Anzahl unterschiedlicher DNA-Sequenzen, geben kann. Wie wir sehen werden, unterscheidet sich die so ermittelte Komplexität eines Genoms mitunter erheblich von der tatsächlichen Größe des Genoms in Nukleotiden, wie man sie aus der photometrisch oder anderweitig ermittelten DNA-Menge im haploiden Genom (einfacher Chromosomensatz) errechnen kann. Man spricht daher auch von kinetischer Komplexität eines Genoms (im Gegensatz zur Genomgröße, die stets die Menge von DNA im haploiden Genom angibt). Die Bildung einer DNA-Doppelhelix aus Einzelsträngen folgt der Kinetik einer bimolekularen chemischen Reaktion (Reaktion 2. Ordnung), ist also konzentrations- und zeitabhängig. In der Reaktionsgleichung

bedeutet k2 die Reaktionskonstante, die ein wichtiger Parameter für die Berechnung der kinetischen Komplexität einer DNA ist. Die Molarität von Nukleotiden in der Einzelstrangnukleinsäure wird durch c angegeben, und t ist die Zeit in Sekunden. Wenn man die Reaktionsgleichung in folgender Weise umgeformt, kann man ihre grafische Auswertung vereinfachen:

In Abb. 2.8 ist die Reaktionskinetik auf der Grundlage dieser Gleichung als Prozentsatz der Renaturierung in Abhängigkeit vom Produkt aus der Anfangskonzentration c0 (von Nukleotiden in M × l–1 in den Nukleinsäureeinzelsträngen) und der Zeit t (in s) in einer semilogarithmischen Grafik dargestellt. Der Vorteil dieser Darstellungsweise ist, dass Reaktionskinetiken ohne eine Korrektur für unterschiedliche Anfangskonzentrationen von Einzelsträngen direkt vergleichbar sind, da sich Anfangskonzentration und Reaktionszeit umgekehrt proportional zueinander verhalten und somit durch die Darstellung des Produktes beide Größen als variable Einzelparameter in der Grafik eliminiert sind. Aus Abb. 2.8 ist auch zu erkennen, dass mithilfe des c0 × t -Wertes, bei dem die Hälfte der Einzelstränge zum Doppelstrang reassoziiert ist (genannt c0t1/2-Wert), die relative kinetische Komplexität eines Genoms

Abb. 2.8 Renaturierungskinetik der DNA. Diese Darstellung des Verlaufs einer chemischen Reaktion 2. Ordnung wird als c0t-Kurve (gesprochen cot) bezeichnet. Sie ermöglicht den direkten Vergleich der Reaktionskinetiken verschiedener DNAProben, da in der Darstellung Unterschiede in der Reaktionszeit und DNA-Konzentration (durch die Bildung des Produktes aus Anfangskonzentration der denaturierten Nukleotide (c0) und Zeit (t)) nicht zur Geltung kommen. Im c0t1/2-Punkt sind 50 % der Nukleotide zu Doppelsträngen renaturiert. Unterschiede verschiedener DNA-Proben im c0t1/2-Wert zeigen direkt den Unterschied in der Komplexität der DNA an. Abweichungen vom sigmoiden Kurvenverlauf, wie er für die ideale Reaktion 2. Ordnung charakteristisch ist, zeigen die Zusammensetzung der DNA-Probe aus mehreren Fraktionen unterschiedlicher kinetischer Komplexität an, d.h. sie deuten auf das Vorhandensein repetitiver DNA-Sequenzen in der DNA-Probe

beschrieben werden kann. Hat man mehrere Reaktionskinetiken unter gleichen Bedingungen (Ionenstärke, Temperatur, Länge der renaturierenden Stränge) ermittelt, so kann man durch Vergleich der c0t1/2-Werte der verschiedenen Reaktionskinetiken direkte Informationen über die relativen kinetischen Komplexitäten der untersuchten Genome erhalten.

Die Bildung einer Doppelhelix aus komplementären Nukleinsäureeinzelsträngen erfolgt reaktionskinetisch als bimolekulare Reaktion. Sie ist damit von der Konzentration der komplementären Stränge und der Reaktionszeit abhängig. Das gestattet es, durch Messung der Renaturierungskinetik Aufschlüsse über die Komplexität der renaturierenden Nukleinsäuresequenzen zu erhalten.

Ein historisches Beispiel für die genomische DNA der Zwiebel (Allium cepa) gibt Abb. 2.9. Dabei fällt auf, dass der Reaktionsverlauf nicht einer einfachen sigmoiden Kurve folgt. Vielmehr verläuft er flacher – oder sogar in mehreren Stufen. Dieses Reaktionsverhalten ist damit zu erklären, dass ein Teil der DNA-Sequenzen im haploiden Genom nicht nur einmal, sondern mehrfach vorhanden ist. Diese mehrfach vorhandenen DNA-Sequenzen wurden repetitive DNA-Sequenzen

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Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung

figkeitsverteilungen verschiedener repetitiver DNAFraktionen lassen sich selbst bei nahe verwandten Arten keine Vorhersagen machen, da sie sehr starken Veränderungen unterworfen sind.

Das Genom von Eukaryoten zeichnet sich durch den Besitz von Einzelkopie-DNA-Sequenzen und von repetitiven DNA-Sequenzen aus. Der Anteil beider Arten von Sequenzen ist starken Schwankungen unterworfen und variiert selbst zwischen nahe verwandten Arten.

2.2 Die Verdoppelung der DNA (Replikation) Abb. 2.9 Eine c0t-Kurve von genomischer DNA der Küchenzwiebel (Allium cepa). Die Analyse der DNA-Renaturierungskinetiken ist eine wichtige analytische Methode, um schnell einen Überblick über die Komplexität eines Genoms zu erhalten. Dazu wird die DNA in Fragmente von ~ 300 bp gespalten, anschließend mit Hitze denaturiert und durch langsames Abkühlen wieder renaturiert. Die hier dargestellte Renaturierungskinetik lässt den Schluss zu, dass das Genom der Zwiebel aus 4 Komponenten besteht: Zunächst palindromische DNA, die sich unabhängig von der DNA-Konzentration zurückfaltet (etwa 7,2 %), und außerdem Fragmente, die nicht reagieren (9,3 %). 3 Komponenten können aber genauer unterschieden werden und sind in den Einzelkurven a–c dargestellt: a hochrepetitive Sequenzen (Anteil 41,2 %), b mittelrepetitive Sequenzen (36,4 %) und Einzelkopie-Sequenzen (Anteil 5,9 %), die im Wesentlichen den codierenden Anteil enthalten. (Nach Stack u. Comings 1979, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

genannt (oder Wiederholungssequenzen; engl. repetitive oder repeated DNA). Der Reaktionsverlauf erklärt sich aus der Überlagerung der Reaktionskurven verschiedener DNA-Fraktionen, deren Einzelsequenzen mit jeweils spezifischer und unterschiedlicher Häufigkeit im haploiden Genom vorhanden sind. Die detaillierte Untersuchung dieser unterschiedlichen DNAFraktionen hat tief gehende Einblicke in die Organisation des eukaryotischen Genoms vermittelt. Einige wichtige Gesichtspunkte der Zusammensetzung des Genoms aus Fraktionen mit unterschiedlicher Wiederholungshäufigkeit lassen sich direkt aus den Reaktionskinetiken ablesen. So ist festzustellen, dass in praktisch allen untersuchten Genomen neben repetitiven DNA-Sequenzen auch nicht wiederholte Einzelkopiesequenzen (engl. unique sequences) vorkommen. Die Reaktionskinetiken verdeutlichen weiterhin, dass jeder untersuchte Organismus ein ihm eigentümliches Muster repetitiver Sequenzen besitzt. Obwohl im Allgemeinen die Regel gilt, dass bei steigender Genomgröße auch der Anteil repetitiver Sequenzen steigt, kann das im Einzelfall nicht zutreffen. Über die Häu-

Die Befunde von Avery und seinen Mitarbeitern (Kapitel 2.1.1) gaben einen eindeutigen Hinweis darauf, dass nicht Proteine, sondern DNA die für die Vererbung verantwortliche chemische Verbindung ist. Unterstützt wurde diese Interpretation durch Experimente, die Hershey und Chase (1951) ausführten. Infiziert man Bakterien mit Bakteriophagen (Kapitel 4.3), deren Hüllproteine mit 35S und deren DNA mit 32P markiert ist, so findet man, dass im Wesentlichen 32P-markiertes Material in die Bakterienzellen gelangt, während die 35S-Markierung an den Bakterienzellwänden zurückbleibt. Da Stoffwechsel und Vermehrung der Bakteriophagen in der Zelle erfolgen, muss die DNA die maßgebliche chemische Komponente der Bakteriophagen sein, nicht aber das Protein. Fragt man nun nach der „chemischen Basis der biologischen Spezifität“, wie es Avery formulierte, so bietet es sich an, nach einer zentralen Eigenschaft des Erbmaterials zu fragen: Es muss sich im Zusammenhang mit Zellteilungen identisch verdoppeln können, um zu gewährleisten, dass alle Zellen mit der gleichen Erbinformation ausgestattet werden. Die Fähigkeit zur identischen Verdoppelung des Erbmaterials muss daher als eine seiner entscheidenden Grundeigenschaften angesehen werden. Das Watson-Crick-Modell der DNA-Doppelhelix ist mit einer solchen Eigenschaft voll in Einklang zu bringen, wie beide Autoren selbst herausgestellt haben: „We have recently proposed a structure for the salt of deoxyribonucleic acid which, if correct, immediately suggests a mechanism for its selfduplication“ (Watson u. Crick 1953a). Trennen sich die beiden DNA-Stränge der Doppelhelix durch Aufhebung der Basenpaarungen, so kann jeder der beiden Stränge als Matrize (engl. template) für die Synthese eines neuen komplementären Strangs dienen, sodass nach der Neubildung

2.2 Die Verdoppelung der DNA (Replikation)

beider komplementärer Stränge zwei neue, strukturell aber völlig identische DNA-Doppelhelices vorliegen. Durch die genau festgelegten Möglichkeiten der Basenpaarung, nach denen sich ein Thymin jeweils nur mit einem Adenin und ein Guanin stets nur mit einem Cytosin paaren kann, ist auch die Abfolge der Basen in den neu synthetisierten Strängen identisch. Da nach diesem Modell jeweils einer der beiden Stränge der DNA-Doppelhelix bereits vorhanden ist, der andere aber neu gebildet wird, spricht man von einer semikonservativen Replikation der DNA.

Die Struktur der DNA lässt erkennen, dass ihre Ver-

doppelung durch Neusynthese jeweils eines neuen, komplementären Strangs an jedem der beiden vorhandenen Stränge der Doppelhelix erfolgt. Dieser Vorgang wird als semikonservative Replikation bezeichnet.

2.2.1 Semikonservative Replikation Experimentell wurde das Modell einer semikonservativen Replikation der DNA auf zwei Ebenen bestätigt. An bakterieller DNA demonstrierten Matthew Meselson und Franklin W. Stahl 1958 den semikonservativen Charakter der Replikation mittels analytischer Ultrazentrifugationstechniken. Ein Jahr zuvor stellte Herbert Taylor cytologische Untersuchungsbefunde vor, die er an Pflanzenzellen erhalten hatte, aus denen er den gleichen Schluss der semikonservativen ReplikaAbb. 2.10 a, b Nachweis der semikonservativen Replikation der DNA durch Meselson und Stahl. a Schema der semikonservativen Replikation. Jeder der beiden Tochter-Doppelstränge sollte einen vollständigen, aus dem Ausgangs-Doppelstrang übernommenen Strang (schwarz) enthalten sowie einen zweiten, neu synthetisierten Strang (grau). In der 1. Generation beträgt das Verhältnis 1:1, in der 2. Generation 1:4. b Analyse der Auftrennung von DNA in der analytischen Ultrazentrifuge. Die Schwimmdichte der DNA steigt mit dem Anteil an 15N-markierten Nukleotiden. Markiert man DNA, die 15N-Isotope enthält, über einen oder mehrere Replikationszyklen mit 14N-haltigen Nukleotiden, so werden die 15N-Anteile der Markierung stufenweise verdrängt und die Schwimmdichte der DNA wird geringer. Demgemäß beobachtet man eine Verschiebung der DNA-Moleküle im CsCl-Gradienten in Bereiche geringer CsClKonzentration. Diese Verschiebung kann in der analytischen Ultrazentrifuge durch Zentrifugation in CsCl-Gleichgewichtsgradienten festgestellt werden, indem man die Absorption der CsCl-Lösung in der Ultrazentrifugenzelle im UV-Bereich (258 nm) misst. Die Abbildung zeigt die quantitative densitometrische Auswertung solcher Fotos mit Angabe der Anzahl der Zellgenerationen, über die Replikation in 14N-Nukleotidehaltigem Medium erfolgte. (a nach Munk 2000, mit Genehmigung von Springer; b nach Meselson u. Stahl 1958, mit freundlicher Genehmigung des Autors)

tion der DNA in eukaryotischen Zellen zog. Beide Befunde sollen im Folgenden in ihren Einzelheiten besprochen werden. Die Experimente von Meselson und Stahl wurden an dem Bakterium Escherichia coli durchgeführt. Grundlage dieser Experimente war die Überlegung, dass bei einer geeigneten chemischen Kennzeichnung des DNA-Einzelstrangs, der nach dem Watson-CrickModell während der Replikation neu synthetisiert wird, nach zwei Verdopplungsrunden die Hälfte der DNAMoleküle diese chemischen Markierungen enthalten müsste, während die andere Hälfte völlig frei von solchen Markierungen sein sollte (Abb. 2.10a). Zur chemischen Markierung von DNA während der Neusyn-

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Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung

these erweist sich der Gebrauch des schweren Stickstoffisotops 15N geeignet, da es in Form von 15NH4Cl dem Kulturmedium beigefügt werden kann und dann in die heterozyklischen Basen der DNA eingebaut wird. Die Schwimmdichte (engl. buoyant density) der DNA wird hierdurch erhöht. Meselson und Stahl haben sich dieses Verfahren zunutze gemacht und Bakterien zunächst für 14 Generationen in einem 15N-Medium wachsen lassen, sodass die bakterielle DNA mit diesem Stickstoffisotop gesättigt war. Nun wurde das Medium ausgewechselt, und die Bakterien wurden in einem Medium weiter gezüchtet, das einen Überschuss an 14 NH4Cl sowie 14N-haltige Basen enthielt, sodass bei allen weiteren Replikationsrunden der DNA nur noch 14 N-haltige Basen in die DNA eingebaut wurden. Entscheidend für die weitere Analyse war nun, dass man 15 N- und 14N-haltige DNA-Stränge aufgrund des Dichteunterschieds der N-Isotope durch DichtegradientenGleichgewichtszentrifugation voneinander trennen und somit ihre relativen Mengen innerhalb der GesamtDNA ermitteln kann. Führt man eine solche Analyse nach einer Generation Wachstum in 14N-haltigem Medium durch, so findet man, dass die Doppelhelix im Gleichgewichtsgradienten eine Schwimmdichte besitzt, die einen Mittelwert zwischen der Dichte völlig 14N-markierter DNA und völlig 15N-markierter DNA darstellt (Abb. 2.10b). In diesem Fall müssen also die Hälfte der Basen das schwerere Isotop, die andere Hälfte das leichtere Isotop besitzen. Nach einer weiteren Generation Wachstum der Bakterien im 14N-haltigen Medium weist nur noch eine Hälfte der DNA die mittlere Dichte auf, während die andere Hälfte durch eine niedrige Dichte gekennzeichnet ist. Diese Beobachtungen sind nur mit der Erklärung vereinbar, dass alle neu synthetisierten DNA-Stränge das 14N-Isotop tragen und mit jeweils einem der alten (15N-haltigen) DNA-Stränge gepaart sind. Meselson und Stahl (1958) haben ihre Ergebnisse in den folgenden drei Schlüssen zusammengefasst: ï The nitrogen of a DNA molecule is divided equally between two subunits which remain intact through many generations. ï Following replication, each daughter molecule has received one parental subunit. ï The replicative act results in a molecular doubling. Die Wissenschaftler kamen also zu dem Schluss, dass die Ergebnisse der gegenwärtigen Experimente genau mit den Erwartungen aus dem Watson-Crick-Modell für DNA-Replikation übereinstimmen („The results of the present experiments are in exact accord with the expectations of the Watson-Crick model for DNA duplication“).

Einen ganz ähnlichen Ansatzpunkt zur Beantwortung der Frage, wie die Duplikation des genetischen Materials verläuft, wählte Herbert Taylor 1957 in seinen Experimenten. Im Unterschied zu Meselson und Stahl, deren Versuche biophysikalischer Natur waren, führte Taylor seine Versuche unter Verwendung cytologischer Methoden an Wurzelzellen der Pflanze Bellevalia romana (auch: Hyacinthus romanus, Hyazinthe) durch. Als wichtige neue cytologische Methode war gerade die Autoradiographie verfügbar geworden (Technik-Box 13). Diese Technik bietet eine Auflösung, die ausreichend ist, um den Einbau radioaktiver DNA-Vorstufen innerhalb einer einzelnen Chromatide der Chromosomen zu lokalisieren (Chromatiden sind Halb-Chromosomen nach der Verdoppelung im Zellzyklus; Kapitel 5.3.1). Besonders geeignet ist für derartige Versuche 3H-Thymidin, da es ausschließlich in DNA eingebaut wird und diese damit spezifisch markiert. Lässt man Zellen in Medium mit radioaktivem Thymidin wachsen, so findet man Radioaktivität ausschließlich in neu replizierter DNA der Chromosomen. Die Versuche von Taylor entsprechen damit weitgehend denen von Meselson und Stahl: Es werden zunächst markierte Vorstufen während der Replikation in die DNA eingebaut (bei Meselson und Stahl 15N, bei Taylor 3H) und anschließend wird deren Verteilung (bei Meselson und Stahl durch Gleichgewichtszentrifugation von isolierter DNA in der Ultrazentrifuge, bei Taylor durch Autoradiographie von Chromosomen) in anschließenden Replikationszyklen der DNA in nicht markierten Medien untersucht. Während Meselson und Stahl von DNA-Doppelhelices ausgingen, die durch kontinuierliches Wachstum in markiertem Medium durchgehend 15N-markiert waren, erlaubte Taylor die 3H-Markierung während der Phase des Zellzyklus (Kapitel 5.3), in dem die DNA verdoppelt wird. Das gestattet es, bereits nach einer weiteren Replikation in nicht radioaktivem Kulturmedium Hinweise auf die Art der Replikation zu erhalten. Die Ergebnisse Taylors sind in Abb. 2.11 schematisch zusammengefasst. Man beobachtet nach der Replikation in 3H-Thymidin-haltigem Medium in der folgenden Metaphase zunächst ausschließlich vollständig markierte Chromatiden. Bereits nach einer weiteren Phase der DNA-Replikation in unmarkiertem Medium findet man, dass alle Chromosomen eine unmarkierte und eine markierte Chromatide besitzen. Nach einer weiteren Replikationsrunde ist die Hälfte der Chromosomen in beiden Chromatiden unmarkiert, während die andere Hälfte der Chromosomen jeweils eine markierte

2.2 Die Verdoppelung der DNA (Replikation)

Abb. 2.11 a, b Nachweis der semikonservativen Replikation der DNA durch Taylor und Mitarbeiter (1957) an Chromosomen der Hyazinthe (Bellevalia romana). Die damals neue Methode der Autoradiographie (Technik-Box 13) gab die Möglichkeit, die DNA der Chromosomen über mehrere Mitosen hinweg zu verfolgen und ihre Verteilung auf die Tochterchromatiden zu ermitteln. Auch Taylor verwendete, wie Meselson und Stahl, eine Isotopenmarkierung für seine Untersuchungen der Chromosomenverdoppelung. Allerdings gebrauchte er 3H-Thymidin, das eine spezifische radioaktive Markierung der DNA gestattet und im Autoradiogramm leicht zu lokalisieren ist. Lässt man Zellen für einen Zellzyklus in 3H-Thymidin-haltigem Medium wachsen, so wird die radioaktive Vorstufe während der SPhase in die DNA eingebaut. a Betrachtet man die Metaphasechromosomen in der ersten folgenden Mitose, so findet man ausschließlich einheitlich radioaktiv markierte Chromatiden. Durch Behandlung mit Colchicin erreicht man, dass die beiden

Chromatiden eines duplizierten Chromosoms im Centromerenbereich zusammenhängen bleiben. Nach einem weiteren Zellzyklus, der in nicht radioaktivem Medium durchlaufen wurde, zeigen die Chromatiden eine Differenzierung hinsichtlich der radioaktiven Markierung. Eine der Chromatiden ist, wie nach dem ersten Zellzyklus, radioaktiv; die andere bleibt jedoch unmarkiert. Das kann nur bedeuten, dass die ursprünglich in radioaktivem Medium verdoppelte DNA einer Chromatide aus zwei Einzelsträngen besteht, die jeweils einen neuen, nunmehr radioaktiven komplementären Strang synthetisieren und dadurch zwei Chromatiden mit identischer genetischer Information hervorbringen. Jede der Chromatiden besteht nun aus einem radioaktiven und einem nicht radioaktiven Strang. b Bei einer weiteren Verdoppelung in nicht radioaktivem Medium trennen sich diese Stränge, sodass eine unmarkierte und eine halbmarkierte Doppelhelix gebildet wird. (Mit freundlicher Genehmigung des Autors)

Chromatide aufweist. Diese Beobachtungen Taylors und seiner Mitarbeiter lassen sich völlig auf der Basis des Watson-Crick-Modells der DNA-Doppelhelix erklären, wenn man annimmt, dass jede Chromatide aus einer einzigen DNA-Doppelhelix besteht. Diese Frage war zur Zeit der Experimente Taylors sehr umstritten, da viele Wissenschaftler aufgrund cytologischer Beobachtungen annahmen, dass Chromatiden aus mehreren durchgehenden Längseinheiten bestehen. Die Experimente Taylors schließen eine solche Chromatidenstruktur zwar nicht grundsätzlich aus, erfordern jedoch für eine solche Erklärung komplizierte zusätzliche Annahmen über die Struktur und Verteilung von Längselementen der Chromatiden. Damit wurden die Beobachtungen Taylors zugleich ein starkes Argument für die Ansicht, dass eine Chromatide aus einer einzelnen DNA-Doppelhelix besteht. Diese Annahme wurde durch viskosimetrische Messungen an DNA von Drosophila unterstützt. DNA-Moleküle können in einer Länge isoliert werden, die der Länge einer DNA-Doppelhelix in einer Chromatide entspricht. Heute ist die Ansicht allgemein akzeptiert, dass eine

Chromatide aus einer durchgehenden, kovalent geschlossenen DNA-Doppelhelix besteht.

Jede Chromatide besteht aus einer DNA-Doppelhelix. Die Doppelhelix ist damit das Grundelement der Chromosomen.

Die Versuche von Taylor, Meselson und Stahl lieferten den Beweis für die semikonservative Replikation der DNA in Zellen, wie sie nach dem Watson-Crick-Modell als Vermehrungsmechanismus der DNA vorausgesagt worden war. Dieser semikonservative Replikationsmechanismus stellt sicher, dass die Struktur der Doppelhelix, und damit des Erbmaterials, vollständig erhalten bleibt und auf folgende Zellgenerationen – und damit auch auf neue Organismen – übertragen werden kann. Wenn die beschriebenen Experimente uns auch zeigen, nach welchem Grundprinzip DNA identisch repliziert werden kann, so gewähren sie uns doch noch keinen Einblick in den tatsächlichen molekularen Verlauf der Replikation der

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Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung

DNA in der Zelle. Man muss sich nur vor Augen führen, dass in einigen Organismen, z. B. bei Bakterien und manchen Viren, die DNA als ringförmiges, kovalent geschlossenes Molekül vorliegt, oder dass in anderen Fällen die Gesamtmenge an DNA im Genom, also die in einer einzelnen Zelle vorhandene Menge an DNA, eine Länge von einem Meter überschreiten kann, wenn man annimmt, dass die DNA ein einziges kovalentes Molekül darstellt. Selbst wenn es sich bei Eukaryoten um kürzere Moleküle handelt, wie wir schon aus unserer Kenntnis der Existenz mehrerer Chromosomen innerhalb eines Zellkerns ableiten können, bleiben grundlegende Fragen bestehen. Eine dieser Fragen bezieht sich beispielsweise auf einen physikochemischen Gesichtspunkt: Wie können sich die Doppelstränge der DNA im Chromosom während der Replikation voneinander trennen, obwohl hierzu doch eine kontinuierliche Drehbewegung der Doppelhelix erforderlich wäre? Dieser Gesichtspunkt hat in der frühen Diskussion der Frage nach dem Replikationsmechanismus eine wichtige Rolle gespielt. Wir können ihn heute beantworten, da wir wissen, dass im Chromosom Enzyme vorhanden sind, die die DNA öffnen und wieder schließen können bzw. eine Rotation steuern (Topoisomerasen und Helikasen, Tabelle 2.2). Hinzu kommen weitere, weitaus schwieriger zu beantwortende Fragen: Aus der klassischen Cytologie geht hervor, dass DNA ausschließlich im Zellkern vorhanden ist ‒ hier liegt sie aber nicht als isoliertes Molekül vor, sondern ist in den Chromosomen mit Proteinen verbunden. Wie verhalten sich diese Proteine – oder die Chromosomen überhaupt – während der Replikation?

Es hat sich in der Folge gezeigt, dass die molekularen Mechanismen in Pro- und Eukaryoten im Prinzip vergleichbar sind: In beiden Fällen erfolgt die Replikation ausgehend von einem Startpunkt (engl. origin of replication) nach beiden Richtungen (bidirektional). Bei E. coli ist das Chromosom ringförmig und besitzt nur einen einzigen Replikationsstartpunkt; bei Eukaryoten sind verschiedene Startpunkte über das Chromosom verteilt. Die an der Replikation beteiligten Enzyme und zusätzlichen Faktoren sind bei Pro- und Eukaryoten sehr ähnlich; das Grundprinzip ist in Abb. 2.12 dargestellt. Besonders fünf Aspekte sind für alle Replikationsprozesse wesentlich: ï Grundsätzlich fügen die Enzyme, die einen DNAStrang auf der Grundlage der Basenkomplementarität in einen zweiten, komplementären Strang kopieren können (DNA-Polymerasen), die Nukleotide bei der DNA-Synthese ausschließlich an das 3’-OHEnde des wachsenden Strangs an. Damit ist ein Wachstum nur in 5’→3’-Richtung möglich. Die Nukleotide liegen dabei als energiereiche Triphosphate vor (dNTPs: Desoxyribonukleotidtriphosphate); bei der Synthese werden zwei Phosphatreste als Pyrophosphat abgespalten. Die freigesetzte Energie wird dazu verwendet, die Phosphodiesterbindungen des Zucker-Phosphat-Grundgerüstes herzustellen. ï Bei der Besprechung der molekularen Struktur der DNA-Doppelhelix haben wir gesehen, dass die Basenpaarung zu einer antiparallelen Anordnung beider DNA-Einzelstränge führt (Abb. 2.2). Das

Tabelle 2.2 Replikationsproteine in Pro- und Eukaryoten Funktion

Prokaryoten

Eukaryoten

Erkennung der Startsequenz

DnaA (1 Untereinheit)

ORC (6 Untereinheiten)

Beladende Helikase

DnaC (1 Untereinheit)

CDC6 (1 Untereinheit)

Replikative Helikase

DnaB (1 Untereinheit)

MCM (6 Untereinheiten)

Topoisomerase

Typ I und Typ II, Gyrase

Typ I und Typ II

Einzelstrang-bindendes Protein

SSB (1 Untereinheit)

RP-A (3 Untereinheiten)

Primase

DnaG (1 Untereinheit)

Pol α/Primase (4 Untereinheiten)

Polymerase/Exonuklease

Polymerase III (3 Untereinheiten)

Pol δ (3–4 Untereinheiten); Pol ε (5 Untereinheiten)

Klammerlader

γ-Komplex (5 Untereinheiten)

RF-C (5 Untereinheiten)

Klammer

β-Untereinheit

PCNA

Entfernen der Primer

Polymerase I; RNase H

FEN-1, RNase H

Reifung des lagging-Strangs

DNA-Ligase (NAD-abhängig)

DNA-Ligase I (ATP-abhängig)

Nach Kelman 2000; Erläuterung der Abkürzungen im Text

2.2 Die Verdoppelung der DNA (Replikation)

Abb. 2.12 Molekularer Mechanismus der DNA-Replikation. Die Initiation der DNA-Synthese erfolgt im Replikationsursprung und verläuft zunächst nur in 5’o3’-Orientierung (leading strand) am 3’o5’-Strang der Doppelhelix (oben). Aus der Abbildung ist ersichtlich, dass die Synthese des komplementären DNA-Strangs (lagging strand) zunächst in Teilstücken (Okazaki-Fragmenten) erfolgt. Es bildet sich die Replikationsblase mit zwei Replikationsgabeln (Mitte). Unten ist ein Ausschnitt des lagging strand gezeigt, der Einzelheiten des Replikationsvorgangs erkennen lässt. Die Initiation der Replikation dieses Strangs erfordert Primer-RNA-Moleküle (Quadrate), die vor der Ligation der neu synthetisierten Okazaki-Fragmente nukleolytisch entfernt werden. Anschließend werden die Okazaki-Fragmente mithilfe einer Ligase (Kreise) ligiert

führt zu Problemen bei der Neusynthese beider DNA-Stränge, wenn diese am gleichen Initiationspunkt beginnt (Abb. 2.12). Einer der beiden Stränge kann dann nicht kontinuierlich synthetisiert werden. Es werden in diesem Fall kleine Teilstücke von weniger als 1000 Nukleotiden Länge synthetisiert, die nach ihrer Synthese mithilfe einer DNA-Ligase kovalent miteinander verknüpft werden. Die Teilfragmente werden nach ihren Entdeckern OkazakiFragmente genannt (Okazaki u. Okazaki 1969). ï DNA-Polymerasen können keinen neuen DNAStrang ohne einen bereits vorhandenen Startpunkt herstellen. Als Startpunkte können DNA- oder RNA-Sequenzen dienen, die aufgrund ihrer Basenkomplementarität an den zu replizierenden DNAEinzelstrang gebunden sind. Man bezeichnet solche Startsequenzen als Primer. Während der Replikation werden durch eine RNA-Polymerase (auch Primase genannt) zunächst kurze RNA-Primer erzeugt, die nur etwa 4 bis 12 Nukleotide lang sind. An diesen RNA-Primern kann dann die DNA-Polymerase ansetzen und einen fortlaufenden DNA-Strang synthetisieren.

Abb. 2.13 Replikation der DNA in Kernen des zellulären Blastoderms von Drosophila melanogaster. Die Replikationsblase ist deutlich zu erkennen. Die angrenzenden Replikationsstartpunkte sind noch nicht aktiviert. Die DNA ist mit Nukleosomen bedeckt. (Aus McKnight u. Miller 1977, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

ï Aus der Abb. 2.12 ist erkennbar, dass zur Neusynthese der Doppelstrang der DNA über einen gewissen Abstand hinweg geöffnet werden muss. An diesen Prozessen sind Helikasen und Topoisomerasen beteiligt. In die sich öffnende Replikationsgabel hinein kann ein DNA-Strang in 5’→3’-Richtung kontinuierlich synthetisiert werden. Er wird als leading strand bezeichnet. Der Gegenstrang, der in der Form von Okazaki-Fragmenten synthetisiert wird, wird dagegen lagging strand genannt. Es entstehen auf diese Weise zwei Replikationsgabeln (engl. replication forks), die zur Bildung von Replikationsaugen oder -blasen (engl. replication bubble) führen. Solche Replikationsaugen lassen sich elektronenmikroskopisch an replizierender DNA demonstrieren (Abb. 2.13). ï Ein für die Erörterung der Mutationsmechanismen (Kapitel 9.2) wichtiger Gesichtspunkt ist die Fehlerrate, mit der DNA-Polymerasen Nukleotide in die neu synthetisierten DNA-Stränge einbauen. Die Fehlerhäufigkeit liegt bei 10–5 bis 10–6. Sie würde damit zu Veränderungen von Nukleotiden in einem großen Teil der replizierenden Gene führen. Durch

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Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung

Reparaturmechanismen (Kapitel 9.6) sinkt jedoch die effektive Fehlerrate auf 10–9 bis 10–11.

Die Replikationsenzyme, DNA-Polymerasen, können

nur in 5’o3’-Richtung Nukleotide anfügen. Deshalb muss einer der beiden DNA-Stränge in kleineren Teilsequenzen, den Okazaki-Fragmenten, synthetisiert werden. Da die DNA-Polymerase zur DNA-Synthese ein 3’-OH-Ende als Startpunkt benötigt, wird am 5’o3’-Strang zunächst ein RNA-Primer synthetisiert, an dessen 3’-Ende die DNAPolymerase die DNA-Synthese beginnt. Teilfragmente von etwa 1000 Nukleotiden werden dann, nach Abbau der RNA durch die Polymerase-eigene 3’o5’-ExonukleaseAktivität, kovalent aneinander gebunden.

Ein grundsätzliches topologisches Problem der DNAReplikation ergibt sich aus ihrer Helixstruktur. Wenn mit fortschreitender Replikation die Helix entspiralisiert wird, geht dies nur, indem immer wieder Brüche in die Helix eingeführt werden, um so ein Verdrillen (engl. supercoiling) zu vermeiden. Die dafür zuständigen Enzyme werden als Topoisomerasen bezeichnet und in zwei Klassen (I und II) unterteilt. Topoisomerase I ist in der Lage, die Windungszahl der DNA um eins zu erhöhen, während Topoisomerase II diese Zahl um zwei reduziert (Abb. 2.14). In Abb. 2.14a ist ein DNA-Fragment zusammen mit einer gerade replizierenden Region dargestellt (Replikationsauge), und die Replikationsmaschinerie an der Replikationsgabel ist durch ein Stäbchen zwischen den beiden frisch synthetisierten DNA-Strängen symbolisiert. Die topologischen Konsequenzen einer voranschreitenden Replikationsgabel und die Funktionen der Topoisomerasen hängen nun davon ab, ob die Replikationsmaschinerie im zellulären Raum rotieren kann. Stellen wir uns vor, dass das Stäbchen nicht um die Helixachse der noch nicht replizierten DNA vor der Replikationsgabel rotiert (der Replikationsapparat kann an die Membran gebunden und daher immobilisiert sein). In dem Maße, wie die Replikationsgabel voranschreitet, zwingt das Stäbchen die helikalen Win-

Abb. 2.14 a–c DNA-Topologie und Topoisomerase. a Die Entspiralisierung der DNA erzeugt eine Verspannung der Helix, die durch DNA-Topoisomerasen aufgelöst wird. b Die verschiedenen Klassen der Topoisomerasen. c Der katalytische Zyklus der Topoisomerasen vom Typ I: Das Enzym bindet an die DNA, die nukleophile Reaktion des Tyrosins im reaktiven Zentrum führt zur Spaltung des DNA-Rückgrats. Nach der Entspannung verknüpft das Enzym die DNA-Enden erneut und löst sich ab. (Nach Leppard u. Champoux 2005, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

2.2 Die Verdoppelung der DNA (Replikation)

dungen der DNA vor sich in einen immer kürzeren Bereich, und die DNA wird überdreht oder positiv supercoiled. Hinter der Replikationsgabel wird das Replikationsauge immer größer. Wenn dagegen das Stäbchen rotieren kann, können die positiven „Supercoils“ vor der Replikationsgabel auf die Region hinter der Gabel verteilt werden, was zu einer Zwischendrehung der replizierten DNA führt und/oder zu einem Überdrehen der unreplizierten DNA hinter der Replikationsgabel. Ein weiteres Problem tritt auf, wenn sich zwei aufeinander zu bewegende Replikationsgabeln vereinigen. In dem Maße, in dem das parentale, unreplizierte DNA-Fragment immer kürzer wird, müssen Topoisomerasen die endgültige Trennung der beiden neu replizierten Stränge vornehmen: entweder eine Topoisomerase II mit einem Schnitt durch beide Einzelstränge oder eine Topoisomerase I mit einem Schnitt des Einzelstrangs an der Verbindung des Einzel- mit dem Doppelstrang. Der Mechanismus der katalytischen Wirkung beider Topoisomerasen ist unterschiedlich. Topoisomerase I löst die Phosphodiesterbindung nur eines DNAStrangs und lässt den zweiten, nicht unterbrochenen Strang den geöffneten Strang durchqueren; dabei bleibt sie selbst an die offenen Enden kovalent gebunden. Danach wird der unterbrochene Strang wieder geschlossen, sodass die Windungszahl nunmehr um eins erhöht ist. Topoisomerase II hingegen induziert einen Doppelstrangbruch und verschiebt die Doppelhelix durch sich selbst, um sie dann wieder kovalent zu schließen (Abb. 2.14b). Nach den gemeinsamen Aspekten der DNA-Replikation bei Pro- und Eukaryoten (siehe auch Tabelle 2.2) sollen nun die spezifischen Eigenheiten diskutiert werden.

Aus der Helixstruktur der DNA ergibt sich ein grund-

sätzliches topologisches Problem der DNA-Replikation: Wenn mit fortschreitender Replikation die Helix entspiralisiert wird, geht dies nur, indem immer wieder Brüche in die Helix eingeführt werden, um so ein Verdrillen zu vermeiden. Die dafür zuständigen Enzyme werden als Topoisomerasen bezeichnet.

2.2.2 Mechanismen der Replikation bei Prokaryoten Bakterien müssen ihre Genome kopieren, bevor sie sich in zwei Tochterzellen teilen können. Jeder Zellzyklus startet an einer bestimmten chromosomalen Region, die als oriC bezeichnet wird (engl. chromosomal replication origin). Fehler beim Start der Replika-

tion führen zu suboptimalem Bakterienwachstum ‒ daher ist es für Bakterien von besonderer Bedeutung, diesen ersten kritischen Schritt der DNA-Replikation, den Zusammenbau des „Orisoms“ (Protein-oriC-Komplex), präzise zu regulieren. Obwohl Orisomen in den meisten Bakterien vorkommen, stammen unsere Kenntnisse überwiegend aus dem bakteriellen Modellsystem Escherichia coli (E. coli). Eine Übersicht über die Initiationsphase der bakteriellen Replikation gibt Abb. 2.15. In der Initiationsphase wird um den Replikationsstartpunkt herum eine kleine Blase entspiralisierter DNA gebildet, das Replikationsauge. Der oriC des ringförmigen E. coli-Chromosoms besteht aus 245 bp. Die Trennung der beiden Doppelstränge beginnt in einer AT-reichen Region, die schon dadurch eine gewisse Instabilität aufweist; sie enthält dreimal die Sequenz 5’-GATCTATTATTT-3’. In unmittelbarer Nähe zu dieser AT-reichen Region befinden sich die klassischen Erkennungssequenzen für das DnaA-Protein (5’-TTATNCACA-3’), die insgesamt fünfmal vorkommen und als DnaA- oder R-Boxen bezeichnet werden. Trotz der geringen Sequenzunterschiede hat das DnaA-Protein unterschiedliche Affinitäten zu den einzelnen Boxen. Das „aktive“ DnaA-Protein (im Komplex mit ATP) bindet mit geringerer Affinität an die AT-reiche Region oberhalb der DnaA-Boxen. Wenn diese Region durch andere Komponenten entspiralisiert wird, stabilisiert sich die Bindung von DnaA durch dessen hohe Affinität an die einzelsträngige DNA. Für die Umwandlung des Initiations- in den offenen Komplex ist eine Mindestmenge von DnaA-Protein notwendig. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen, dass etwa 20 bis 30 DnaA-Monomere an einem aktiven Replikationskomplex beteiligt sind. Die Bindung von „aktivem“ DnaA an die DnaA-Boxen ist dann der erste Schritt beim Zusammenbau des Initiationskomplexes und erfolgt mit hoher Affinität. Zu diesem Initiationskomplex gehören auch DnaB, eine E. coli-Helikase, sowie weitere Hilfsproteine und Kontrollfaktoren. Offensichtlich erlauben auch die abgestuften Affinitäten und Kooperationseffekte durch andere Mitglieder des Komplexes eine präzise Regulation. Die doppelsträngige Region des Initiationskomplexes umfasst zunächst etwa 28 bp. Wenn Einzelstrang-bindende Proteine (engl. single-stranded DNAbinding proteins, SSB) anwesend sind, vergrößert sich diese Region auf 44 bis 46 bp. Da Einzelstrang-DNA, die mit SSB bedeckt ist, ein schlechtes Substrat für die DnaB-Helikase ist, müssen die SSBs mithilfe des DnaAProteins „aufgeladen“ werden. Dieser Ladekomplex enthält zwei Doppel-Hexamere von DnaB und des eigentlichen „Ladeproteins“ DnaC, jeweils ein DoppelHexamer für jede Replikationsgabel. DnaC verlässt den Komplex unmittelbar nach oder schon während des

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Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung

Ladevorgangs. Das dabei hydrolysierte ATP aktiviert die Helikase-Aktivität des DnaB-Proteins. Dabei rutschen die DnaB-Hexamere in 5’→3’-Richtung weiter

und vergrößern das Replikationsauge auf etwa 65 bp. Die Primase tritt zu dem Initiationskomplex hinzu und synthetisiert die Primer für die beiden leading-Stränge. Nun kann die Klammer der Polymerase (engl. sliding clamp), ein ringförmiges Dimer der β-Untereinheit der DNA-Polymerase III, auf die startbereite Matrize aufgeladen werden. Dadurch wird die intrinsische ATPase-Aktivität des DnaA-Proteins aktiviert. Durch ATP-Hydrolyse wird das „aktive“ DnaA-Protein wieder inaktiviert und die Bildung weiterer Initiationskomplexe verhindert. Der jetzt vorliegende Gesamtkomplex aus DNA und Proteinfaktoren wird auch als „Replisom“ bezeichnet (Abb. 2.15). Nach der Initiationsphase tritt die DNA-Replikation in die Elongationsphase ein. Dabei wird der leading-Strang kontinuierlich synthetisiert, wohingegen der Gegenstrang (lagging-Strang) diskontinuierlich unter Bildung der Okazaki-Fragmente synthetisiert wird. Eine Übersicht über die dabei ablaufenden zyklischen Prozesse und die vielfältigen Cofaktoren gibt Abb. 2.16. In verschiedenen genetischen Ansätzen ist es gelungen, die Faktoren zu identifizieren, die für die bakterielle Replikation essenziell sind. Dazu wurden solche E. coli-Mutanten gesucht, die in der DNAReplikation offensichtlich Defizite aufweisen. Eine typische Strategie isoliert dabei Mutanten, die nicht mehr in der Lage sind, autonom replizierende, aber extrachromosomale DNA-Moleküle zu erhalten (z. B. ein Mini-FPlasmid, Kapitel 4.2.1). Über 60 Mutanten wurden auf diese Weise identifiziert und wichtige Faktoren wie die B-Untereinheit der Gyrase (gyrB), eine Untereinheit des HU-Proteins (hupB) oder die RecD-Untereinheit des RecBCD-Enzyms (recD; zur Übersicht siehe Kato 2005). Bei E. coli sind fünf DNA-Polymerasen bekannt (DNAPolymerase I–V). Viele DNA-Polymerasen besitzen zusätzliche Exonuklease-Aktivitäten und können somit auch Nukleotide aus einer Kette entfernen. Dabei entfernt die 5’→3’-Exonuklease die RNA-Nukleotide des

Abb. 2.15 Schematische Darstellung der Initiation der DNAReplikation bei E. coli. Das aktivierte DnaA-Protein erkennt den Replikationsstartpunkt anhand der DnaA-Boxen und der oberhalb liegenden AT-reichen Sequenzen (HU: Histon-ähnliches DNA-Bindeprotein). Der Replikationsstartpunkt wird im Bereich der AT-reichen Sequenzen aufgeschmolzen und die Helikasen geladen (je 2 DnaB- und DnaC-Komplexe aus je 6 Untereinheiten). Nach einer Umorganisation der Helikasen wird die Primase zum Initiationskomplex geladen. Das Priming erfolgt nach dem Beladen der Ringklammer und der ATP-Hydrolyse des aktivierten DnaA-Komplexes. Die Polymerase III beginnt zu arbeiten, und die Replikation läuft bidirektional ab. (Nach Messer 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

2.2 Die Verdoppelung der DNA (Replikation)

Abb. 2.16 a–d Der Zyklus der DNA-Synthese am laggingStrang. a Während die DNA-Polymerase Okazaki-Fragmente am lagging-Strang synthetisiert, öffnet der Klammerlader eine neue Ringklammer; die Helikase bringt erneut eine Primase an die Replikationsgabel, um die Synthese des nächsten Fragments zu starten. b Nach der Synthese der RNA-Primer verdrängt der Klammerlader die Helikase und lädt die Ringklammer auf die Verbindung des neuen Primers mit der DNA-

Matrize. c Die Vollendung der Okazaki-Fragmente bewirkt die Verlagerung der DNA-Polymerase an die neu geladene Ringklammer. d Die DNA-Polymerase synthetisiert das neue Okazaki-Fragment und vervollständigt damit den Zyklus. Die Entspiralisierung an der Replikationsgabel und die Synthese des leading-Strangs werden während des ganzen Zyklus fortgesetzt. (Nach Langston u. O‘Donnell 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Primers, und die 3’→5’-Exonuklease beseitigt falsch gepaarte DNA-Nukleotide. Die DNA-Polymerase III ist das Hauptenzym der Replikation, während die DNAPolymerase I die RNA-Primer abbaut und danach die Lücken wieder auffüllt. Polymerase I überwiegt mengenmäßig die übrigen DNA-Polymerasen erheblich. In der Bakterienzelle sind etwa 300 bis 400 DNA-Polymerase-I-Moleküle vorhanden. Die Polymerase II ist mit etwa 40 Molekülen vertreten, während von der DNAPolymerase III nur etwa 10 Moleküle vorhanden sind. Die DNA-Polymerasen II, IV und V sind auch an Reparaturmechanismen beteiligt. Eine Übersicht über bakterielle DNA-Polymerasen gibt Tabelle 2.3.

of Biological Chemistry eingereicht hatte, wurden sie zunächst von den Gutachtern abgelehnt: „It is very doubtful that the authors are entitled to speak of the enzymatic synthesis of DNA“; „polymerase is a poor name“. Aufgrund des Einspruchs des Chefredakteurs konnten die Arbeiten aber 1958 erscheinen (Lehmann et al. 1958, Bessmann et al. 1958). Heute wird die DNA-Polymerase I auch als „Kornberg-Polymerase“ bezeichnet; sein Sohn Roger D. Kornberg erhielt 2006 den Nobelpreis für Chemie für die Strukturaufklärung der eukaryotischen RNA-Polymerase II.

Die DNA-Polymerase I wurde in den frühen 1950er-Jahren vor allem durch Severo Ochoa und Arthur Kornberg durch klassische biochemische Verfahren isoliert und charakterisiert; beide wurden für diese Arbeiten 1959 mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet. Als Kornberg jedoch 1957 seine beiden grundlegenden Manuskripte beim Journal

Ermittelt man die Replikationsgeschwindigkeit der DNA in einem E. coli-Chromosom, so findet man, dass diese unabhängig von den Wachstumsbedingungen etwa 500 bis 1000 bp je Sekunde beträgt. Das wirft die Frage auf, wie ein Bakterium mit einer Chromosomenlänge von 4 × 106 bp bei bidirektionaler Replikation sich unter günstigen Bedingungen alle 20 Minuten teilen kann, da die Replikation des Chromosoms etwa 40 Minuten beansprucht. Dieses Problem wird von der

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Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung

Tabelle 2.3 Hauptklassen prokaryotischer DNA-Polymerasen Enzym

Untereinheit (kDa)

Funktion

Pol I

103

„Kornberg-Enzym“: Entfernung der RNA-Primer, Auffüllen der Lücke, Korrektur; 5’ 3’- und 3’ 5’-Exonuklease-Aktivitäta

Pol II

88

DNA-Reparatur; 3’ 5’-Exonuklease-Aktivität

Pol III

α: 130

katalytische Untereinheit

(Core)

ε: 28

Korrektur; 3’ 5’-Exonuklease-Aktivität

τ: 71

Verbindung der Pol-III-Dimere

θ: 10

Funktion unbekannt

Pol IV

40

DNA-Reparatur

Pol V

UmuC: 46 UmuD: 15

DNA-Reparatur

a Durch Behandlung mit der Protease Trypsin wird das Gesamtprotein in 2 Fragmente gespalten. Der C-terminale Teil enthält die 3’ 5’-Exonuklease zusammen mit der DNA-Polymerase-Aktivität („Klenow-Fragment“).

Zelle dadurch gelöst, dass die Initiationsfrequenz der Replikation am Replikationsstartpunkt von der Wachstumsgeschwindigkeit gesteuert wird. Bei hoher Wachstumsgeschwindigkeit beginnt die Initiation einer neuen Replikationsrunde bereits vor Vollendung der vorangehenden Replikation, sodass das Chromosom in diesem besonderen Fall mehr als zwei Replikationsgabeln besitzt.

Die bakterielle Replikation beginnt am oriC und benötigt zunächst die Bindung des aktiven DnaA-Proteins, der DnaB- und DnaC-Proteine sowie Einzelstrang-bindender Proteine. Unter ATP-Verbrauch wird die DNA-Polymerase „aufgeladen“ und die Replikation gestartet.

erreicht (ca. 10 Basen vor der Schnittstelle). Nach einer Serie verschiedener Schnitte und Neuverknüpfung der einzelsträngigen DNA wird der zirkuläre Einzelstrang freigesetzt und zum Doppelstrang vervollständigt. Dieser Prozess benötigt die Bildung eines RNA-Primers mithilfe der RNA-Polymerase und nachfolgend die Verlängerung der Primer durch DNA-Polymerase I und III. Schließlich werden die freien Enden verbunden und die gebildete DNA durch DNA-Gyrase in die verdrillte (supercoiled) Form überführt. Im Gegensatz zur Replikation einer Plasmid-DNA wird die PhagenDNA häufig repliziert, üblicherweise etwa 20-mal.

2.2.3 Mechanismen der Replikation bei Eukaryoten Als Besonderheit soll hier außerdem die DNA-Replikation von Plasmiden (Kapitel 4.2) und Phagen (Kapitel 4.3). erwähnt werden, die nach dem Mechanismus des rolling circle (Abb. 2.17) abläuft. Diese Form der DNA-Replikation verwendet eine ringförmig geschlossene DNA als Matrize. In der Initiationsphase bindet ein sequenzspezifisches Initiatorprotein an eine hochkonservierte doppelsträngige Startsequenz. Diese Bindung des Initiatorproteins ist verbunden mit der Einführung eines Einzelstrangbruchs und der Ausbildung einer haarnadelförmigen Schleife als Terminationssignal. Das Initiatorprotein wird kovalent über einen Tyrosin-Rest im aktiven Zentrum an das freie 5’-Phosphat-Ende gebunden. Mithilfe einer Helikase und stabilisierenden Einzelstrang-bindenden Proteinen wird ein Stück DNA-Einzelstrang freigelegt, an dessen freien 3’-OH-Ende die DNA-Polymerase III den leadingStrang synthetisiert, bis sie das Terminationssignal

Die DNA-Replikation eukaryotischer Zellen ist wesentlich komplexer als bei Prokaryoten, da bei Eukaryoten die Zellteilung nicht nur mit dem Wachstum des jeweiligen Gesamtorganismus, sondern auch mit gewebespezifischen Differenzierungsmustern verbunden ist. Außerdem kommt aufgrund der chromosomalen Organisation des eukaryotischen Genoms im Zellkern ein zusätzlicher Komplexitätsgrad hinzu: Wie wir im Kapitel 6.2.3 im Detail besprechen werden, ist die DNA bei Eukaryoten um Proteinkomplexe gewickelt, die im Wesentlichen aus Histonproteinen bestehen und als Nukleosomen bezeichnet werden. Dabei entsteht eine perlenschnurartige Struktur (Abb. 6.17). Die Replikation des Genoms findet auch nur in einer bestimmten Phase des Zellzyklus statt. Dieser ist in 4 Schritte unterteilt, die G1-, S-, G2- und M-Phase: Die erste Phase, G1 (eng. gap), beginnt am Ende der Zellteilung und ist

2.2 Die Verdoppelung der DNA (Replikation)

Abb. 2.17 a–h Rolling circle-Replikation. a Doppelsträngige Form des Replikons. b Das Initiationsprotein (IP), das zwei Tyrosin-Reste enthält (Y1 und Y2), bindet an einen Einzelstrangbruch und schmilzt die umgebende Region auf. c Nach dem Aufbau des Replisoms beginnt die 3‘-Verlängerung des leading-Strangs (rot). Das IP bleibt mit seinen beiden Tyrosin-Resten mit dem 5‘-Ende des verdrängten leading-Strangs verbunden (grün); der verdrängte leading-Strang ist mit EinzelstrangBindeproteinen bedeckt. d Wenn die Replikationsgabel einen Zyklus der Replikation beendet hat, stoppt die Maschinerie, nachdem der leading-Strang um ein kurzes Fragment bis zur Einzelstrangbruchstelle verlängert wurde. Diese Verlängerung (hellblau) verdrängt die Verbindung zwischen dem alten (grün) und dem wachsenden (rot) leading-Strang; Y2 spaltet diese Verbindung. e Eine Umesterung (Angriff der Phosphotyrosin-Bindung zwischen Y1 und dem 5’-Ende des leading-Strangs durch das freigesetzte 3‘-Ende des verdrängten leading-Strangs) verdrängt das IP, der leading-Strang schließt sich und wird als ein-

zelsträngiger DNA-Ring freigesetzt (grün). Das IP wird jetzt über das Y2 mit dem 5‘-Ende des wachsenden leading-Strangs verbunden. Die Helikase (H) und das Polymerase-III-Holoenzym (Pol) haben den Komplex verlassen. Die Schritte a–e verlaufen bei Phagen und Plasmiden in gleicher Weise ab. f In Phagen wird jetzt der Replikationskomplex wieder zusammengefügt und die 3’-Verlängerung des leading-Strangs beginnt erneut. Dieser Schritt ist identisch mit c, außer dass das IP mit dem verdrängten leading-Strang über Y2 statt Y1 verbunden ist. g Im Plasmid verdrängt das 5’-Ende des neuen leading-Strangs (der mit dem IP über Y2 verbunden ist) sein eigenes 3’-Ende, das dadurch von Y1 gespalten werden kann. h Nach der Spaltung greift das freie 3’-OH-Ende des neuen leading-Strangs die Y2DNA-Bindung an; das bewirkt eine Umesterung, die den Ringschluss des leading-Strangs bewirkt und das IP freisetzt, das über Y1 noch an das Oligonukleotid (die 3’-Verlängerung des neuen leading-Strangs) gebunden ist. (Nach Novick 1998, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

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Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung

Abb. 2.18 a–d Autoradiographische Demonstration von Replikationsstartpunkten in der DNA aus Kulturen menschlicher Zellen. In a und b sind die beiden Enden der Replikationsgabeln sichtbar. Weitere Replikationsstartpunkte befinden sich

innerhalb der Gabel. In c und d ist erkennbar, dass eine Initiation der Replikation mehrfach innerhalb begrenzter DNA-Bereiche erfolgt ist. Der Längenmarker zeigt 50 μm an. (Aus Huberman u. Tsai 1973, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

durch Zellwachstum gekennzeichnet. Nachdem die G1-Phase abgeschlossen ist, wird die DNA in der S-Phase (S = Synthese) repliziert. Nach einer erneuten Wachstumsphase (G2) teilt sich die Zelle während der M-Phase (M = Mitose) in zwei Tochterzellen. Als Schalter zwischen den verschiedenen Phasen fungieren Cycline, cyclinabhängige Kinasen (engl. cyclin-dependent kinases, CDKs) und CDCs (engl. cell division cycle) (für Details des Zellzyklus siehe Kapitel 5.3). Eine naheliegende Frage bezüglich der eukaryotischen DNA-Replikation ist, ob die DNA eines jeden Chromosoms in einem einzigen Schritt verdoppelt wird (vergleichbar dem Mechanismus bei Prokaryoten) oder ob sie in Teilschritten repliziert. Eine erste Antwort hierauf haben autoradiographische Studien über das Replikationsverhalten von Chromosomen geben können. Antonio Lima-de-Faria erkannte schon 1959, dass bestimmte Chromosomenabschnitte zu einem späteren Zeitpunkt replizieren als die übrigen Chromosomenbereiche.

muster weisen darauf hin, dass die Replikation der DNA an unterschiedlichen, voneinander getrennten Stellen beginnt und bidirektional verläuft, da die Radioaktivität häufig symmetrisch um zwei unmarkierte Mittelregionen angeordnet ist (Abb. 2.18). Die mittleren Abstände der Replikationsstartpunkte betragen im Mittel deutlich über 100.000 Basen (= 100 kb; 1 Kilobase [kb] = 1000 Basen) und könnten sogar bei 500 kb liegen. Ein Genom muss Tausende von Replikationseinheiten besitzen, selbst wenn diese im Mittel 500 kb lang sind. Ein haploides menschliches Genom (3 × 109 bp), das innerhalb von etwa 8 Stunden repliziert wird, sollte etwa 10.000 bis 20.000 Replikationsstartpunkte besitzen.

Eukaryotische Chromosomen replizieren nicht konti-

nuierlich von einem Ende zum anderen, sondern verschiedene Chromosomenteilbereiche können zu unterschiedlichen Zeiten replizieren.

Spreitet man gereinigte DNA-Moleküle aus kurzzeitig mit 3H-Thymidin markierten menschlichen Zellen und führt an solchen Präparaten eine Autoradiographie durch, so findet man DNA-Moleküle, die mit mehrfachen Unterbrechungen radioaktiv markiert sind. Die Markierungs-

Die Replikation der DNA beginnt an bestimmten Replikationsstartpunkten und läuft von dort aus nach zwei Seiten. Es gibt in eukaryotischen Chromosomen Zehntausende von DNA-Sequenzen, an denen die Replikation zu unterschiedlichen Zeiten beginnen kann.

Es gibt Anzeichen dafür, dass das differenzielle Replikationsverhalten mit der Aktivität oder Inaktivität der betreffenden DNARegion in dem jeweiligen Zelltyp korreliert (S. 249). Das würde bedeuten, dass der Beginn der Replikation an bestimmten Replikationsstartpunkten gewebespezifisch reguliert wird. Ein Beispiel für gewebespezifische Unterschiede im Gebrauch von Replikationsstartpunkten können wir in der Frühentwicklung von Drosophila finden (Kapitel 11.4). Nach der Befruchtung erfolgt im Drosophila-Ei alle 10 Minuten eine Kernteilung. Das

2.2 Die Verdoppelung der DNA (Replikation)

Intervall zwischen zwei Kernteilungen dient weitgehend der Replikation des Genoms, die in etwa 5 Minuten abgeschlossen sein muss. Um dieses Ziel bei einer Replikationsgeschwindigkeit von etwa 2,6 kb je Minute zu erreichen, sind 20.000 bis 50.000 Replikationsstartpunkte im Genom von Drosophila erforderlich. Diese werden in den frühen Kernteilungen wahrscheinlich alle verwendet und auch gleichzeitig aktiviert. Übereinstimmend damit wurde experimentell festgestellt, dass der mittlere Abstand der Replikationsstartpunkte in der Frühentwicklung bei etwa 8 kb liegt. In anderen Zelltypen von Drosophila ist dieser Abstand wesentlich größer und liegt in Speicheldrüsen im Mittel bei etwa 30 kb.

Der Zeitpunkt des Replikationsbeginns an verschiedenen eukaryotischen Replikationsstartpunkten kann gewebespezifisch reguliert werden.

Nachdem wir nun in der Frage der Zahl der Replikationsstartpunkte einen der ersten wesentlichen Unterschiede zwischen der Replikation bei Bakterien (ein Replikationsstartpunkt) und höheren Zellen (mehrere Zehntausend Startpunkte) gesehen haben, wollen wir uns nun den molekularen Details der eukaryotischen DNA-Replikation zuwenden. Ähnlich wie bei Prokaryoten finden wir eine Initiations-, Elongationsund Terminationsphase. Die Initiationsphase ist gekennzeichnet durch den Aufbau des präreplikativen Komplexes an den entsprechenden Startsequenzen. Diese Startsequenzen wurden zunächst bei der Bäcker-Hefe Saccharomyces cerevisiae als „autonom-replizierende Sequenzen“ (ARS) beschrieben, da sie z. B. in künstlichen Chromosomen (engl. artificial chromosomes) ausreichen, um DNA-Synthese zu erlauben. Die Länge der ARS-Regionen in Hefen gleicht mit etwa 200 bp ungefähr der des Replikationsstarts von Bakterien. Obwohl man bestimmte konservierte Elemente in den ARS-Regionen gefunden hat, weichen diese doch in der Mehrheit der Nukleotide voneinander ab, sodass man insgesamt nur Consensussequenzen angeben kann. Schon bei einer anderen Hefe, Schizosaccharomyces pombe, sind die Sequenzen, die den Replikationsstart steuern, über 800 bis 1000 bp verteilt. Die einzelnen Elemente umfassen etwa 20 bis 50 bp und zeigen keine deutlichen Sequenzhomologien zu denen von S. cerevisiae. Die Replikationsstartpunkte der Metazoa sind insgesamt schlechter definiert und können sich über Tausende von Basenpaaren erstrecken. Das andere Extrem sind die Replikationsstartpunkte der frühen Embryonen von Drosophila und Xenopus, die offensichtlich kaum Sequenzspezifitäten zeigen, vermutlich um eine besonders schnelle DNA-Replikation und damit verbundene Zellteilung zu ermöglichen.

Der Komplex, der den Replikationsstartpunkt erkennt (engl. origin recognition complex, ORC) und als Initiator der Replikation wirkt, besteht bei Eukaryoten aus 6 Einzelkomponenten (ORC1p→6p). Der ORC wurde zwar ursprünglich in S. cerevisiae charakterisiert, aber Folgestudien zeigten, dass er in analoger Form auch in Drosophila, Xenopus und in menschlichen Zellen vorkommt. Der ORC bindet in der G1-Phase des Zellzyklus (vgl. Kapitel 5.3.1) in ATPabhängiger Weise an die AT-reichen Regionen des Replikationsstarts, wobei er Einzelstrangbereiche von einer Größe von 80 bis 85 Basen bevorzugt. Die ORCBindung an das Chromatin ist nicht in allen Spezies vom Zellzyklus abhängig. So bleibt der ORC bei Hefen und Drosophila zunächst an den Replikationsstart gebunden, bis er während der Mitose vom Chromatin entfernt wird. Eine wichtige Rolle beim Zusammenbau des gesamten Initiationskomplexes spielt CDC6 (engl. cell division cycle): Es ist ein ATP-bindendes Protein, das während der G1-Phase kurz vor der Initiation der DNAReplikation exprimiert wird. Das Protein wird unmittelbar nach der Initiation der DNA-Replikation in der S-Phase wieder abgebaut. Man nimmt an, dass das CDC6-Protein – in Verbindung mit ORC – für die zeitliche Kontrolle der Initiationsphase verantwortlich und am Beladen des Initiationskomplexes mit der Helikase beteiligt ist. Der dritte Komplex, der für die Initiationsphase der eukaryotischen DNA-Replikation notwendig ist, wird als MCM (engl. minichromosome maintenance)-Komplex bezeichnet. Er besteht in allen Eukaryoten aus 6 Untereinheiten (MCM2‒7). Einige der Untereinheiten des MCM-Komplexes haben ATP-abhängige DNAHelikase-Aktivitäten, DNA-abhängige ATPase-Aktivitäten und die Fähigkeit, an einzelsträngige DNA zu binden. Der Zusammenbau des MCM-Proteins am Chromatin benötigt die koordinierte Funktion von ORC und CDC6 sowie eines weiteren Proteins, Cdt1 (engl. chromatin licensing and DNA replication factor 1). Cdt1 bindet an den C-Terminus von CDC6 und beschleunigt die Bindung des MCM-Komplexes an Chromatin; Cdt1-Mutationen in S. pombe führen zu einem Block der DNA-Replikation. Interessanterweise können ORC und CDC6 vom Chromatin entfernt werden, wenn der MCM-Komplex am Chromatin gebunden ist, ohne dass die DNA-Replikation beeinträchtigt wird. Die Anwesenheit von Nukleosomen (besonders Histon H3) in unmittelbarer Nachbarschaft von ARS ist offensichtlich für die Ausbildung des präreplikativen Komplexes notwendig. Nach der DNA-Replikation wird der MCM-Komplex übrigens wieder vom Zellkern ins Cytoplasma exportiert und wartet dort bis zur DNA-Replikation vor der nächsten

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42 42

Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung

Abb. 2.19 a–e Der Initiationszyklus bei Eukaryoten. a Die Bildung des präreplikativen Komplexes (Prä-RC) beginnt mit der Bindung von ORC und Mcm10 an den Replikationsursprung; Cdc6 und Cdt1 werden noch hinzugezogen. b Cdc6 und Cdt1 erlauben die Beladung mit dem MCM-Komplex (Mcm2–Mcm7); Cdc6 löst sich aus dem Komplex, sobald Mcm2–Mcm7 gebunden haben. c Die Phosphorylierung (P) des MCM-Komplexes ist verbunden mit Konformationsänderungen, die ein Aufschmelzen der DNA am Replikationsursprung ermöglichen (ORC und Mcm10 sind in dieser Darstellung verborgen). d Die Konformationsänderung überführt den inaktiven MCM-Komplex in eine enzymatisch aktive Helikase, deren ringförmige Struktur

räumlich mit der DNA verbunden ist. Die Ablösung der MCMHelikase aus der Mcm-Verankerung durch Cdc45 initiiert das Aufschmelzen der DNA und führt zur Bindung von RPA (Replikationsprotein A), DNA-Polymerase α und der Primase an den Replikationsursprung. e Das Aufschmelzen der doppelsträngigen DNA bewirkt Konformationsänderungen im ORC, bevor die Replikationsursprünge in einen postreplikativen Zustand übergehen. Man nimmt an, dass ORC und Mcm10 auch nach der Replikation an den Replikationsursprung gebunden bleiben. (Nach Lei u. Tye 2001, mit freundlicher Genehmigung der Company of Biologists Ltd)

Zellteilung, um dann erneut in den Zellkern transportiert zu werden. Alle Komponenten dieses Systems (CDC6, MCM und ORC) können durch CDKs phosphoryliert werden. Dadurch werden zumindest einige Teilfunktionen des jeweiligen Komplexes inaktiviert, sodass damit eine Wiederholung der Replikation im gleichen Zellzyklus verhindert wird (dies wird durch eine erhöhte Synthese von CDKs nach der DNAReplikation erreicht). Ein weiterer Zellzyklus-abhängiger Inhibitor der DNA-Replikation ist Geminin. Es bindet an Cdt1 und verhindert somit die Bildung des Initiationskomplexes. Sein Abbau am Ende der Mitose ist eine Voraussetzung für eine neue Runde der DNAReplikation im nächsten Zellzyklus. Nach dem Öffnen und Entwinden der Doppelstrang-DNA am Replikationsstartpunkt wird die DNAPolymerase zu dem entstehenden Replikationsauge geladen, um eine schnell voranschreitende, bidirektionale DNA-Synthese zu ermöglichen. Die hohe Geschwindigkeit der DNA-Polymerase wird durch einen Faktor erreicht, der als „Ringklemme“ (engl. sliding clamp; wissenschaftliche Bezeichnung: proliferating cell nuclear antigen, PCNA) die DNA umfasst und

nach der Bindung der katalytischen Untereinheit der Polymerase diese an die DNA assoziiert. Da diese Ringklemme selbst keine DNA-bindende Eigenschaft hat, benötigt sie einen Hilfsfaktor (Klammerlader, engl. clamp loader), den Replikationsfaktor C, der selbst wieder aus 5 Untereinheiten aufgebaut ist (RF-C1→5). Zwei DNA-Polymerasen sind bei Eukaryoten in diesem Anfangsstadium essenziell: Pol ε und Pol α. Dabei benötigt die Pol α die Pol ε, wohingegen der Einbau von Pol ε offensichtlich unabhängig von Pol α erfolgen kann. Die Bildung des präreplikativen Komplexes wird in Abb. 2.19 a–c gezeigt. Insgesamt sind am Aufbau des präreplikativen Komplexes 14 Proteine beteiligt, davon können 10 ATP binden und hydrolysieren. Vermutlich ist also die ATPBindung mit der Bildung der Komplexe gekoppelt und die ATP-Hydrolyse mit deren Zerfall. Es ist an dieser Stelle außerdem auf die Ähnlichkeit der Vorgänge bei E. coli hinzuweisen: Es gibt klare funktionelle Ähnlichkeiten zwischen DnaA und ORC, DnaC und CDC6/ Cdt1 und DnaB und MCM2‒7. Allerdings ist der Übergang zur eigentlichen Replikation bei Eukaryoten wesentlich komplexer als bei Prokaryoten.

2.2 Die Verdoppelung der DNA (Replikation)

Eine zentrale Funktion bei der Kontrolle der DNA-Re-

plikation kommt dem ORC-Komplex zu, der von der frühen G1-Phase bis zur Mitose am Replikationsstartpunkt gebunden ist. Er sorgt, im Zusammenwirken mit Proteinkinasen der Zellzykluskontrolle, für die Bildung eines präreplikativen Komplexes, der den Replikationsbeginn ermöglicht. Die im präreplikativen Komplex enthaltenen MCM-Proteine werden im Laufe der S-Phase phosphoryliert und anschließend aus dem Chromatin entfernt. Im Laufe der G1-Phase wird der ORC-Komplex neu gebildet. Erst in der späten G1-Phase des folgenden Zellzyklus kommt es erneut zur Dephosphorylierung der MCM-Proteine, die die erneute Bildung eines präreplikativen Komplexes gestattet und somit eine neue Replikationsrunde einleitet. Die Replikation ist damit eng an die Zellzyklusregulation gebunden.

Die Pol α (auch Primase genannt) beginnt nach ihrer Assoziation an den Initiationskomplex mit der Synthese kurzer RNA/DNA-Hybride, die zunächst aus ca. 10 RNA-Nukleotiden bestehen, denen 20 bis 30 DNANukleotide folgen. Dieses Oligonukleotid wird dann von der Pol ε (oder auch δ) für die fortschreitende Elongation des leading- und des lagging-Strangs genutzt (die Okazaki-Fragmente des lagging-Strangs sind bei Eukaryoten etwa 200 Basen lang). In Säugerzellen muss sich ein Initiationsereignis 4 × 104-mal am leadingStrang ereignen (das entspricht etwa der Zahl der Replikationsstartpunkte in Säugerzellen), aber es muss sich jedes Mal an den Startstellen der Okazaki-Fragmente wiederholen (ca. 2 × 107-mal in Säugerzellen). Der Ersatz der Pol α/Primase durch die schneller voranschreitende Pol δ ist abhängig von der RNA/ DNA-Primersynthese durch Pol α und wird durch eine ATP-Veränderung des Replikationsfaktors C (RF-C) reguliert (unter weiterer Beteiligung des Replikationsproteins A [RPA], eines Einzelstrang-Bindeproteins). Beide Polymerasen, α und δ, sind hervorragend für ihre Funktionen geeignet: Pol α/Primase kann die Synthese de novo initiieren, wohingegen die Pol δ (vor allem durch die Wechselwirkung mit PCNA) die Fähigkeit hat, lange DNA-Abschnitte zu synthetisieren. Die vermutete Dimerisierung der Pol δ könnte bei der Koordination des leading- und des lagging-Strangs eine Rolle spielen (ähnlich wie das Holoenzym der Polymerase III bei E. coli) und bei der Etablierung der asymmetrischen Replikationsgabel wichtig sein, möglicherweise durch die Assoziation der Pol α/Primase zu einer der beiden Hälften der dimeren Pol δ. Eine Übersicht über die eukaryotischen DNA-Polymerasen gibt Tabelle 2.4.

Während der DNA-Replikation wird der leadingStrang kontinuierlich repliziert, während der laggingStrang in der Form kurzer Okazaki-Fragmente synthetisiert wird. Um aus den Okazaki-Fragmenten einen reifen Doppelstrang herzustellen, werden DNA-Ligase I, FEN-1 (engl. flap endonuclease, auch als „Reifefaktor“ bekannt) und RNase H benötigt. Die Beendigung der Replikation erfolgt im Allgemeinen zufällig zwischen den Replikationsstartpunkten. Allerdings wurde bei S. pombe beobachtet, dass es darüber hinaus auch spezielle „Terminator“-Sequenzen gibt. Das entsprechende Fragment, das zunächst auf etwa 800 bp eingegrenzt werden konnte (engl. replication termination site, RTS1), enthält ein Motiv aus ~ 60 bp, das dreimal in voller Länge vorkommt und für die Beendigung der Replikation essenziell ist. Insgesamt binden 4 Proteinfaktoren (swi1 und swi3 sowie rtf1 und rtf2) an RTS1. Die SWI-Proteine gehören zu einer Familie von Proteinen, die bei Eukaryoten hochkonserviert sind und die in eine Vielzahl zellulärer Prozesse eingebunden sind, die alle am ChromatinUmbau beteiligt sind. Dazu gehört auch die Veränderung des Paarungstyps bei Hefen (Kapitel 8.3.4). Vor über 20 Jahren wurde die DNA-Polymerase β als Prototyp für ein Reparaturenzym betrachtet. Es hat sich aber in der Folgezeit gezeigt, dass die Pol β nur für einen Reparaturmechanismus, nämlich den Austausch eines einzigen falschen Basenpaares, verantwortlich ist (engl. basepair excision repair). Weitere Reparaturmechanismen sind die Nukleotid-Austausch-Reparatur (engl. nucleotide excision repair) sowie die Reparatur falscher Basenpaare (engl. mismatch repair) mit der Beteiligung der Polymerasen δ und ε. Doppelstrangbrüche werden mithilfe der Pol α/Primase und der Pol δ repariert, da hierbei die Bildung einer Struktur erforderlich ist, die einer Replikationsgabel ähnelt (Details der Reparaturmechanismen werden im Kapitel 9.6 besprochen). Ein besonderes Problem der eukaryotischen Replikation ist die Bildung der Chromosomen-Enden (der Telomere). Im Gegensatz zur Synthese des leadingStrangs, die bis zum Ende der chromosomalen DNA durchläuft, kann der komplementäre lagging-Strang nicht bis zum Ende repliziert werden, da die DNAPolymerase nicht imstande ist, Nukleotide an 5’-Enden anzufügen. Die Synthese dieses Strangs muss daher über RNA-Primersequenzen und Okazaki-Fragmente erfolgen. Es wäre auch durchaus denkbar, dass am Ende der Chromosomen nur eine Einzelstrang-DNA vorhanden ist. Dies würde aber Probleme bei der folgenden Replikation ergeben: Dieser Bereich könnte überhaupt nicht mehr repliziert werden, sodass die Chromosomen an einem Ende ständig kürzer werden würden.

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Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung Tabelle 2.4 Klassen eukaryotischer DNA-Polymerasen Enzym

Untereinheit (kDa)

Gensymbol (Mensch)

Chromosom (Mensch)

OMIMa

Funktion (Krankheiten)

Pol α

180

POLA

Xp22.3-p21.1

312040

katalytische Untereinheit

49

PRIM1

12q13

176635

Primase

58

PRIM2A

6p12-p11.1

176636

Primase

Pol β

38

POLB

8p11.2

174760

DNA-Reparatur (Krebserkrankungen?)

Pol δ

124

POLD1

19q13.3-q13.4

174761

DNA Replikation & Reparatur (Krebserkrankungen)

51

POLD2

7p13

600815

Regulatorische Untereinheit

66

POLD3

18

611415

Multimerisierung, Wechselwirkung mit PCNA

12

POLD4

11q13

611525

Protein-Protein-Wechselwirkung

261

POLE

12q24

174762

DNA-Reparatur

55

POLE2

14q13-q21

602670

Multimerisierung

17

POLE3

9q33

607267

Protein-Protein-Wechselwirkung

12

POLE4

2p12

607269

Protein-Protein-Wechselwirkung

140

POLG

15q25

174763

Mitochondriale DNA-Replikation (Sterilität, Augenbeweglichkeit, Alpers-Syndrom)

54

POLG2

17q

604983

Prozessivität

78

POLH

6p21.1-p12

603968

DNA-Reparatur

Pol ε

Pol γ

Pol η

(Xeroderma pigmentosum) Pol ι

80

POLI

18q21.1

605252

DNA-Reparatur

Pol κ

99

POLK

5q13.1

605650

DNA-Reparatur

Pol λ

63

POLL

10q23

606343

DNA-Replikation & Reparatur

Pol μ

55

POLM

7p13

606344

DNA-Replikation &Reparatur

Pol θ

198

POLQ

3q13.3

604419

DNA-Polymerase

Pol σ

57

POLS

5p15

605198

Topoisomerase

Pol ζ

344

POLZ

6q21

602776

DNA-Reparatur

OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man (http://www.ncbi.nlm.gov/OMIM): hier befindet sich eine Beschreibung der

a

Krankheiten, die mit Mutationen der jeweiligen Gene verbunden sind.

An Ciliaten-DNA (Tetrahymena) hat man zuerst erkannt, wie solche Schwierigkeiten der DNAReplikation umgangen werden. Es zeigte sich, dass die Enden aus einfachen Wiederholungselementen der DNA-Sequenz (engl. repeats) aufgebaut sind, die zudem noch eine Besonderheit aufweisen: Das 3’-Ende des überhängenden Einzelstrangs ist durch Zurückfaltung

und intramolekulare Basenpaarung mit sich selbst gepaart. Die Replikation erfolgt mithilfe eines besonderen Enzyms, der Telomerase (engl. telomere terminal transferase). Dieses Enzym, das aus RNA und Proteinkomponenten besteht, fügt dem Telomer nach dessen Öffnung am überhängenden Einzelstrang DNA-Wiederholungssequenzen (engl. repeats) an, deren Sequenzeigenschaften

2.2 Die Verdoppelung der DNA (Replikation) Abb. 2.20 a–e Lösungen des Problems der Replikation an einem Ende. a In eukaryotischen Chromosomen werden die Enden (Telomere) im Wesentlichen durch die Aktivität des Enzyms Telomerase erhalten. Die Telomerase verlängert das 3’-Ende mithilfe einer reversen Transkriptase (RT) und einer RNA-Matrize. b Zweiflüglige Insekten (Diptera) lösen das Problem der Replikation am Ende durch Retrotransposition. Dieser Mechanismus ist dem Telomerase-Weg insoweit ähnlich, dass eine reverse Transkriptase das 3’-Ende des Chromosoms als Startstelle für die DNA-Synthese an einer RNA-Matrize benutzt. c Experimente an Telomerase-defizienten Kluyveromyces lactis ergaben Hinweise auf eine rolling circle-Replikation, wobei das 3’-Ende an einer extrachromosomalen, zirkulären Matrize verlängert wird. d In Saccharomyces cerevisiae-Stämmen, die keine Telomerase enthalten, können Telomer-Sequenzen durch einen Reparaturmechanismus beibehalten werden (Bruch-induzierte Replikation bzw. Rekombinations-abhängige Replikation, Kapitel 9.6). Dabei benutzt ein Telomer ein anderes Telomer als Matrize für die Verlängerung. e Die Bildung einer T-Schleife (engl. T loop) erfolgt aufgrund terminaler Wiederholungssequenzen und Verlängerung des eingedrungenen 3’-Endes (hier ist nur die Verlängerung des 3’-Endes gezeigt; für Details siehe Abb. 2.21). In allen Fällen benötigt die Verlängerung des 5’-Endes weitere DNA-Synthese am lagging-Strang. Die blauen Bereiche in a und b stellen die RNA-Sequenzen dar, die durch die reverse Transkription an das Chromosomen-Ende angefügt werden. (Nach de Lange 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Abb. 2.21 a, b Mögliche Struktur des Replikationskomplexes am menschlichen Telomer. a Menschliche Telomere bestehen aus Bereichen (2–30 kb) doppelsträngiger TTAGGG-Wiederholungen, die am 3’-Ende in einzelsträngige Überhänge von 100– 200 Nukleotiden auslaufen. Diese DNA kann als eine T-Schleife (T-Loop) vorkommen, wobei der 3’-Überhang in den Doppelstrang-Bereich eindringt und an den TTAGGG-Wiederholungen eine Verdrängungsschleife bildet (engl. displacement loop; D loop). An diese einzelsträngige TTAGGG-Wiederholungssequenz bindet POT1 (engl. protection of telomers); außerdem sind zwei Faktoren mit dem Komplex assoziiert, die die doppelsträngige Form der Wiederholungssequenz binden (engl.

TTAGGG-repeat-binding factors; TRFs). b TRF1 und TRF2 verbinden sich mit weiteren Proteinen wie Tankyrase bzw. RAP1. Die primäre Aufgabe des TRF2-Komplexes (links) besteht darin, das Chromosomen-Ende zu schützen; der TRF1-Komplex (rechts) spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation der Telomeraseabhängigen Reaktionen. ERCC1/XPF, RAD50, MRE11 und NBS1 sind Proteine, die bei DNA-Reparaturprozessen wichtige Rollen spielen; TIN ist ein TRF-interagierender Faktor, PINX1 ein Telomerase-Inhibitor und WRN eine Helikase, die beim WernerSyndrom eine wichtige Rolle spielt. (Nach de Lange 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

durch die RNA der Telomerase festgelegt werden, also nicht vom Chromosom selbst. Sie sind im Allgemeinen GC-reich. An diesen hinzugefügten Wiederholungsse-

quenzen können dann RNA-Primer synthetisiert werden, die ein Auffüllen des komplementären Strangs bis auf eine endständige kurze Region gestatten.

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46 46

Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung

Heute wissen wir, dass verschiedene Organismen das Problem der Replikation am Ende des Chromosoms auf verschiedene Arten gelöst haben. Einen Überblick dazu gibt Abb. 2.20. Dabei spielt aber der oben dargestellte Mechanismus über eine Telomerase die wichtigste Rolle. Da die Länge der Telomeren verschiedentlich mit Fragen des Alterns eines Organismus in Zusammenhang gebracht wird, wird die Replikation am Ende menschlicher Chromosomen mit besonderer Intensität erforscht. Hier kommt offensichtlich zusätzlich zu dem beschriebenen Telomerase-Mechanismus noch die Ausbildung einer „T-Schleife“ (engl. T-loop) hinzu; dies erinnert an ähnliche Vorgänge während der Rekombination (Kapitel 5.3.3). Eine Übersicht dazu zeigt Abb. 2.21. Eine ausführliche Darstellung der Telomerstruktur bei Säugern findet sich im Kapitel 6.1.4 (Abb. 6.11).

Chromosomen-Enden (Telomere) bringen besondere

Probleme für eine vollständige Replikation mit sich. Um einen allmählichen Verlust von Endsequenzen des Chromosoms zu verhindern, haben sich besondere Mechanismen herausgebildet, mit deren Hilfe Nukleotidsequenzen an die Chromosomen-Enden angefügt werden können, sodass diese ungekürzt erhalten bleiben.

ï Träger der Erbinformation in der Zelle sind die Nukleinsäuren, wie sich durch Transformationsexperimente zeigen lässt. ï Es gibt Ribonukleinsäuremoleküle (RNA) und Desoxyribonukleinsäuremoleküle (DNA). ï RNA kommt meist als Einzelstrang vor, während DNA vorwiegend als Doppelhelix vorliegt. ï DNA kann in unterschiedlichen Konformationen vorliegen. Trotz ihres sehr gleichförmigen Aufbaus weist sie eine große Variabilität in Einzelheiten ihrer Struktur auf. ï Das Watson-Crick-Modell gestattet es, alle wichtigen Eigenschaften des Erbmaterials aus einfachen chemischen Mechanismen zu verstehen. ï Die Replikation erfolgt durch ein komplexes Zusammenspiel von Proteinen unterschiedlicher Funktionen, und sie ist eng mit den Regulationsmechanismen des Zellzyklus verknüpft. ï Die DNA-Replikation ist mit häufigem Fehleinbau von Nukleotiden verbunden. Reparaturprozesse sorgen schon während der Replikation für die Beseitigung der meisten Fehler.

Technik-Box

Technik-Box 2

Renaturierungskinetik Anwendung: Ermittlung der Anteile repetitiver DNA-Sequenzen und des Repetitionsgrades; Ermittlung der kinetischen Komplexität von DNA. Methode: DNA wird zunächst in Fragmente möglichst einheitlicher Länge (vorzugsweise um die 500 Nukleotide) geschert und anschließend denaturiert. Die Einzelstrang-DNA wird dann unter definierten Temperatur- und Ionenbedingungen und in einer genau festgelegten Konzentration renaturiert. Durch Messung des Anteils renaturierter Moleküle in

bestimmten Zeitintervallen kann eine Renaturierungskinetik erstellt werden (Abb. 2.8). Die Messung des Anteils renaturierter Moleküle kann auf unterschiedlichem Wege erfolgen. Häufig angewendet wurde anfangs die Trennung von Einzel- und Doppelstrangmolekülen nach Bindung an Hydroxylapatit durch Elution mit Puffern unterschiedlicher Ionenstärken. Einzel- und Doppelstrangmoleküle eluieren hierbei getrennt. Ihre relativen Anteile können danach durch Radioaktivitätsmessungen oder durch Messung der optischen

Die Renaturierung kann entweder zu Doppelsträngen mit vollständiger Basenpaarung führen, oder es entstehen unvollständig renaturierte Moleküle. Entscheidend für die Art der Renaturierung sind die experimentellen Bedingungen (Ionenstärke, Temperatur) während der Renaturierung und

Dichte jeder Fraktion bei 260 nm nach Denaturierung bestimmt werden. Ein einfacherer Weg ist die photometrische Bestimmung bei 260 nm (hier liegt das Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren). Diese erfolgt am zweckmäßigsten durch Aufnahme einer Schmelzkurve von DNA-Proben in regelmäßigen Zeitintervallen. Die Schmelzkurve der DNA lässt nicht nur den Anteil an renaturierten Molekülen erkennen, sondern gibt auch Aufschluss über die Genauigkeit der Basenpaarungen in den renaturierten Molekülen.

des darauffolgenden Waschens. Oft ist es wünschenswert, auch unvollständig gepaarte Heteroduplexmoleküle zu erhalten. In diesem Fall kann man ähnliche DNA-Sequenzen mit teilweise abweichender Sequenz identifizieren (z. B. Gene aus evolutionär entfernteren Arten).

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Kapitel 2: Molekulare Grundlagen der Vererbung

Technik-Box 3

Gelelektrophorese Anwendung: Auftrennung von Makromolekülen nach unterschiedlichen physikochemischen Kriterien. Voraussetzungen · Materialien: Elektrophorese macht von der Eigenschaft geladener Substanzen Gebrauch, in einem elektrischen Feld zu dem Pol zu wandern, der ihrer Ladung entgegengesetzt ist. Die Ladung von Substanzen lässt sich durch geeignete Umgebungsbedingungen festlegen (z. B. pH-Wert des Puffers). Die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld wird nicht nur von der Ladungsstärke bestimmt, sondern auch von der Konformation der ladungstragenden Moleküle und von den molekularen Eigenschaften des Elektrophoresesystems (z. B. Porenweite des Trägermaterials). Die elektrophoretische Trennung von Makromolekülen erfolgt in geeigneten Puffersystemen in einem Trägermedium, das zur Stabilisierung des Puffersystems, aber auch zur Festlegung des Trennungsbereichs der Moleküle dient. Als Trägermaterialien dienen vor allem Polyacrylamide unterschiedlicher Konzentration (ca. 3 bis 20 %) und unterschiedlichen Vernetzungsgrades. Hierin werden vor allem kürzere DNA-Fragmente, aber auch RNA, nach Größe oder Ladung fraktioniert. Für DNA- und RNATrennungen werden vorzugsweise

Agarosegele (0,8 bis 4 %) verwendet. Besondere Bedeutung hat die Pulsfeld-Elektrophorese erlangt, mit deren Hilfe es möglich ist, sehr große doppelsträngige DNA-Moleküle nach ihrer Größe zu fraktionieren. Am häufigsten erfolgt eine Trennung nach Molekulargewicht oder Konformation. Methode: Die Elektrophorese erfolgt in elektrischen Feldern, die in einer Elektrophoresekammer zwischen Elektroden erzeugt werden. Je nach dem Anwendungsbereich werden geringe (15–150 V) oder auch sehr hohe Spannungen (2000 V) benötigt, um eine Trennung von Makromolekülen zu erreichen. Die Dicke des Trägermaterials variiert, je nach Anwendung, zwischen 1/10 mm und etwa 6–8 mm. Für analytische Anwendungen, zu denen auch die frühen Formen der DNA-Sequenzanalyse zählt, genügt es, sehr geringe Materialmengen aufzutrennen, sodass an die Kapazität des Trägermaterials keine hohen Anforderungen gestellt werden. Die DNA wird nach der Elektrophorese durch Ethidiumbromid angefärbt und unter dem UV-Licht sichtbar gemacht. Mittels der Pulsfeld-Elektrophoresetechnik kann die vollständige DNA ganzer Hefechromosomen voneinander getrennt werden. Die Technik beruht darauf, dass in bestimmten Zeitin-

tervallen während der Elektrophorese die Feldrichtung wechselt. Hierdurch werden selbst sehr große DNA-Moleküle durch ihre Reorientierung bei wechselnder Feldrichtung befähigt, die Poren eines Agarosegels zu durchwandern. Gelelektrophorese kann mit Techniken kombiniert werden, in denen elektrophoretisch aufgetrennte Nukleinsäuren auf Membranfilter übertragen werden und auf diese Weise weiteren molekularen Analysen wie Hybridisierungsexperimenten zugeführt werden können (siehe Southernund Northern-Blotting, Technik-Boxen 10 und 11). Die Größen der untersuchten Makromoleküle werden im Allgemeinen durch ihre elektrophoretische Mobilität im Vergleich zu Markermolekülen bekannter Größe angegeben. DNA wird in Basenpaaren (bp oder kb, also Kilobasenpaaren) angegeben, RNA mit der Anzahl ihrer Basen. Beachte: Ethidiumbromid ist als Lösung (1%) gesundheitsschädlich und wirkt mutagen (Abb. 9.30). Deshalb ist Hautkontakt mit Ethidiumbromid zu vermeiden und es sind geeignete Handschuhe zu tragen. Wässrige Ethidiumbromid-haltige Abfälle dürfen erst nach Inaktivierung des Ethidiumbromid über Aktivkohle entsorgt werden.

Beispiel für eine horizontale Agarosegelelektrophorese von DNA. Das Gel wird in ein elektrisches Feld gebracht und die DNA wird in Taschen im Agarosegel gefüllt (links). Aufgrund der negativen Ladung der DNA wandern die Restriktionsfragmente zur Anode. Rechts wird die Auftrennung der Restriktionsfragmente nach Größe gezeigt. Die weitere Analyse dieser Gele erfolgt z. B. durch Southern-Blotting und Hybridisierung (Technik-Box 10).

Technik-Box

Technik-Box 3

Pulsfeld-Gelelektrophorese (Fortsetzung) Agarose- oder Polyacrylamidgele, wie sie gewöhnlich zur elektrophoretischen Trennung von Makromolekülen verwendet werden, haben nur einen begrenzten Anwendungsbereich für die Auftrennung von DNA-Molekülen. DNA-Doppelstränge, deren Länge 10– 15 kb überschreitet, lassen sich nicht ausreichend voneinander trennen, um exakte Größenbestimmungen zu ermöglichen. Solche exakten Längenmessungen sind jedoch oft erforderlich, vor allem um größere Chromosomenbereiche von Organismen mit großen Genomen (z. B. Säuger) zu analysieren, aber auch für die experimentelle Arbeit mit Klonierungsvektoren, die den Einbau großer DNA-Fragmente gestatten (insbesondere Cosmide und YACs). Bei konventionellen Elektrophoresemethoden werden DNAMoleküle bis zu einer bestimmten Größe, die von der Gelzusammensetzung abhängt, nach ihrer Länge aufgetrennt. Ihre elektrophoretische Mobilität ist umgekehrt zur Länge korreliert. Größere Moleküle lassen sich aber in einer Gelmatrix, die experimentell

handhabbar ist, nicht mehr trennen, zumal sie sich auch in ihrer ausgestreckten Tertiärstruktur von kleineren DNA-Doppelsträngen unterscheiden, die im Gel stärker zu globulärer Struktur tendieren. Die ausgestreckte Struktur langer Moleküle führt dazu, dass diese in den Gelporen hängenbleiben und sich nicht mehr weiterbewegen können. Durch ein besonderes Elektrophoreseverfahren, die PulsfeldGelelektrophorese (engl. pulsed field gel electrophoresis, PFGE), gelingt es jedoch diese Blockierung der Bewegung im elektrischen Feld zu überwinden. Das Pulsfeld-Gelelektrophorese-Gerät besitzt mehrere Elektroden. Während der Elektrophorese wird der Strom in regelmäßigen Intervallen umgepolt (pulsed field). Dadurch können sich die DNA-Doppelstränge in ihrer Ausrichtung umorientieren und durch die Gelporen weiterwandern. Die Länge der Moleküle, die auf diese Weise noch im elektrischen Feld wandern können, hängt von der Dauer der Impulse ab (zwischen einigen Sekunden und mehreren Minuten). Unter geeigne-

ten Bedingungen gelingt es, die DNA ganzer Hefechromosomen (mehrere Hundert kb bis zu mehr als 1 Mb) aufzutrennen. Eine Rolle für das Auflösungsvermögen spielt nicht nur die Pulslänge der Stromrichtung, sondern auch die Anordnung der Elektroden. Außerdem unterstützt eine allmähliche systematische Änderung der Pulslängen während der Elektrophorese die Genauigkeit der Auftrennung unterschiedlich langer Moleküle. Es soll hier nur angemerkt werden, dass die Isolation von DNA-Molekülen der erforderlichen Längen besondere Methoden erfordert. Konventionelle DNA-Isolierungstechniken erlauben es nicht, DNA von Längen wesentlich über 50–100 kb zu isolieren. Für DNA, die mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese analysiert werden soll, führt man daher die DNA-Isolation nach Einbettung des Gewebes (oder der Zellen aus Zellkulturen) in Agarose durch. Die freigesetzten DNA-Moleküle bleiben hierdurch in ein Trägermedium eingebettet, das Brüche der DNA durch mechanische Belastung verhindert.

Es gibt unterschiedliche Arten der Pulsfeld-Elektrophorese-Apparaturen. Die einfachste Art besteht in einer normalen Horizontalgelapparatur, bei der die Polung der Elektroden in regelmäßigen Intervallen umgewechselt wird. Hier gezeigt ist eine CHEF-Apparatur (contour-clamped homogeneous electric field), bei der ein alternierendes Feld in der angegebenen Weise erzeugt wird (die Pfeile geben die alternativen Richtungen des Feldes an).

49

Kapitel 3

Verwertung genetischer Informationen Inhaltsverzeichnis 3.1 DNA, genetische Information und Informationsübertragung . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 3.2 Der genetische Code . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 3.3 Transkription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 3.4 Translation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

Ribosomale DNA während der Transkription in XenopusOocyten. Die Elektronenmikroskopie zeigt uns anschaulich molekulare intrazelluläre Prozesse. (Foto: O. L. Miller Jr., Charlottesville)

52 52

Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

Überblick Der bisher beschriebene einförmige Aufbau der DNA steht in scheinbarem Widerspruch zu der großen Anzahl vielfältiger Informationen, die sie enthalten muss, wenn sie die Grundlage von Vererbungsvorgängen darstellt. Die einzige Variabilität der DNA besteht in der Folge von insgesamt vier unterschiedlichen Basen. Diese Variabilität genügt jedoch, um umfangreiche Information zu speichern, wenn man annimmt, dass diese Information in Form eines Codes vorliegt, der mehrere Basen als Codewort umfasst. Der in der DNA verwendete genetische Code ist ein Triplettcode, der jeweils eine Gruppe von drei aufeinanderfolgenden Basen enthält. Dieser Code ist für alle Organismen nahezu identisch. Die für die Zelle entscheidende Information ist die Festlegung einer spezifischen Aminosäuresequenz in aufeinanderfolgenden Basentripletts der DNA. Diese Triplettbasensequenz kann in der Zelle durch die Bildung entsprechender Proteine umgesetzt werden. Hierzu be-

3.1 DNA, genetische Information und Informationsübertragung Alle bisher besprochenen Eigenschaften der DNA stehen in Einklang mit den Anforderungen an eine chemische Verbindung, die die erbliche Information eines Organismus beherbergt. Dennoch haben wir eine entscheidende Frage bisher nicht gestellt: Welche molekulare Eigenschaft der DNA befähigt sie, die große Vielfalt der Erscheinungsformen von Lebewesen in sich zu vergegenwärtigen? In der DNA-Struktur gibt es ja praktisch nur eine variable chemische Komponente: die an das gleichförmige Zucker-Phosphat-Rückgrat seitlich angefügte Base. Aber auch die hierbei mögliche Variabilität erscheint uns, wie schon Miescher vor mehr als 100 Jahren feststellte, sehr wenig geeignet, die Vielfalt lebender Erscheinungen zu erklären, da sich im Allgemeinen nur vier verschiedene Basen in der DNA miteinander abwechseln. Immerhin fällt uns die Vorstellung, dass nur vier unterschiedliche Einzelelemente eine sehr große Menge unterschiedlichster Information verschlüsseln können, heute viel leichter, da es uns aus der Informatik geläufig ist, dass schon zwei unterschiedliche Elemente – z. B. „0“ und „1“ – sehr viel Information aufzunehmen vermögen, wenn sie in geeigneter Form gruppiert werden. Genau das ist durch die organischen Basen in der DNA möglich: Durch die Vielfalt der Möglichkeiten der Basenreihenfolge im DNA-Strang wird die zur Existenz eines Organismus erforderliche Information in der DNA festgelegt. Die Beantwortung der Frage des Informationstransfers von der DNA als Informationsträger zur praktischen Verwertung im zellulären Stoffwechsel ist etwas komplexer als es zunächst erschien. Prinzipielle

dient sich die Zelle einer weiteren Nukleinsäure, der einzelsträngigen Boten-RNA (engl. messenger RNA, mRNA). Diese mRNA wird an der DNA nach dem gleichen Duplikationsverfahren synthetisiert (Transkription), das auch bei der Replikation zur Anwendung kommt. Die mRNA repräsentiert jedoch nur den einen der beiden DNA-Stränge, der als codierender (codogener) Strang bezeichnet wird. Wie der Name besagt, dient die mRNA als Bote zur Übertragung der genetischen Information ins Cytoplasma. Hier findet mit ihrer Hilfe an den Ribosomen die Proteinsynthese (Translation) statt. Jedes Basentriplett definiert eine Aminosäure. Sie wird von einer transfer-RNA (tRNA) in der von der mRNA festgelegten Reihenfolge an die vorangehende Aminosäure geknüpft. Die tRNA erkennt ein Triplett in der mRNA mithilfe ihres Anticodons. Sie ist mit der zugehörigen Aminosäure beladen, die nun der wachsenden Polypeptidkette angefügt werden kann.

Vorstellungen, in welcher Weise Gene in der Zelle ihre Funktionen ausüben können, hatten sich bereits gegen Ende des 19. Jahrhunderts entwickelt: Sie üben zentrale Aufgaben im Stoffwechsel der Zelle aus. Das kommt in den Worten E. B. Wilsons (1900) zum Ausdruck, wenn er schreibt: „The building of a definite cell-product, such as a muscle fibre, a nerve process, a cilium, a pigment-granule, a zymogen-granule, is ... the result of a specific form of metabolic activity, as one may conclude from the fact that such products have not only a definite physical and morphological character, but also a definite chemical character… In its physiological aspect, therefore, inheritance is the recurrence, in successive generations, of like forms of metabolism …“ Entscheidende Fortschritte im Verständnis der Genwirkung wurden in den 1940er-Jahren gemacht. Hierbei waren vor allem genetische Studien biochemischer Prozesse am Schimmelpilz Neurospora von Bedeutung. Dieser Organismus ist für genetische Untersuchungen besonders geeignet, da sein Lebenszyklus die genetischen Analysen aufgrund der Möglichkeit von Tetradenanalysen besonders vereinfacht (Abb. 10.25 und 10.26). G. W. Beadle und E. L. Tatum kamen 1941 bei der Untersuchung der mutagenen Effekte von Röntgenstrahlen auf den Stoffwechsel zu der Erkenntnis, dass ein Gen für die Synthese einzelner Stoffwechselkomponenten verantwortlich ist. „Inability to synthesize vitamin B6 is apparently differentiated by a single gene from the ability of the organism to elaborate this essential growth substance.“ Dieser Schluss beruhte auf den experimentellen Befunden, dass eine genetische Veränderung eines Gens zu einer Blockierung eines Stoffwechselweges führt, der aber durch die Ergänzung des Zuchtmediums mit geeigneten Verbin-

3.1 DNA, genetische Information und Informationsübertragung

dungen aufgehoben werden kann. Lesen wir die Interpretation der Effekte von Mutationen im Stoffwechsel der Augenfarbstoffe von Drosophila nach (Abb. 10.16, Tabelle 10.7, so ist die Interpretation dieser Befunde durch Beadle und Tatum naheliegend: Ein Gen codiert die Information zur Bildung von Enzymen, also von Proteinmolekülen, die entscheidende katalytische Funktionen in Stoffwechselprozessen ausüben. Die Experimente von Beadle und Tatum führten daher zu der „Ein-Gen-ein-Enzym-Hypothese“, die lange Zeit die Vorstellungen über die Funktion eines Gens bestimmt hat (Abb. 3.1). Die „Ein-Gen-ein-Enzym-Hypothese“ wurde später auf eine „Ein-Gen-ein-Protein-Hypothese“ erweitert. Im Prinzip hat sich diese Form der Definition in vieler Hinsicht als zutreffend erwiesen, wenn wir auch hierzu ergänzende Gesichtspunkte berücksichtigen müssen, die erst nach näherer Betrachtung der Struktur von Genen verständlich werden. Dazu gehören vor allem die recht komplexen Formen der Regulation der Genaktivität durch Promotoren und Enhancer (Kapitel 7.3) und die häufig sehr unterschiedlichen Spleißvarianten (Kapitel 3.3.5); in neuerer Zeit gewinnen aber auch kleine RNA-Moleküle eine funktionelle Bedeutung (Kapitel 7.4 und 7.5). Diese Aspekte nehmen einfachen Formulierungen als Erklärung des Begriffs „Gen“ ihre Allgemeingültigkeit.

Abb. 3.1 Das zentrale Dogma. Die genetische Information, die in der DNA niedergelegt ist, wird durch die messenger-RNA (mRNA) als molekulare Zwischenstufe an die Ribosomen übertragen, wo die Proteinsynthese an der mRNA erfolgt. In Eukaryoten sind die Orte der mRNA-Synthese und der Proteinsynthese durch die Kernmembran getrennt, während in Prokaryoten beides direkt an der DNA erfolgt. Der dogmatische Charakter ist allerdings inzwischen verloren gegangen: RNA kann auch als Matrize zur DNA-Synthese dienen (reverse Transkriptase)

Die ersten molekularen Einblicke in die Funktion von Genen ließen erkennen, dass der Begriff „Gen“ hinsichtlich seiner zellulären Funktion mit einem Enzym, oder allgemeiner, mit einem Proteinmolekül in Beziehung gesetzt werden kann. Diese einfache Formulierung ist heute unvollständig.

Dieser wichtige Schritt im Verständnis der Funktion von Genen wurde unmittelbar begleitet von der Frage nach der molekularen Verbindung zwischen der DNASequenz eines Gens und der zugeordneten Proteinsequenz. Es war zunächst durchaus unklar, ob die Proteine nicht direkt im Zellkern synthetisiert werden und daher in einer direkten räumlichen Beziehung zur DNA-Sequenz stehen. Bereits in den 1940er- und 1950er-Jahren waren jedoch zahlreiche Stoffwechseluntersuchungen am zweiten zellulären Nukleinsäuretyp, der Ribonukleinsäure (RNS, engl. ribonucleic acid, RNA), durchgeführt worden. RNA ist als Zellbestandteil der DNA mengenmäßig weit überlegen, wird aber im Gegensatz zur DNA zum überwiegenden Teil im Cytoplasma gefunden. Viele Experimente zeigten eine direkte Korrelation zwischen intensiver Proteinsynthese und RNA-Synthese. Untersuchungen der Markierungskinetik von RNA nach Pulsmarkierung mit radioaktivem Uridin ließen erkennen, dass RNA im Kern synthetisiert wird, danach aber ins Cytoplasma gelangt. Besonders aufschlussreich waren Versuche von Lester Goldstein und Walter Plaut (1955) an Amoeba proteus. Die Amöben wurden mit Ciliaten gefüttert, die man mit 32P radioaktiv markiert hatte. 2 bis 3 Tage nach dieser Fütterung wurden Zellkerne der Amöben, die sich zu diesem Zeitpunkt als radioaktiv erwiesen, isoliert und in normale Amöben transplantiert, deren eigenen Zellkern man zuvor entfernt hatte. Autoradiographische Präparate, die man zu unterschiedlichen Zeiten nach der Kerntransplantation anfertigte, ließen erkennen, dass die Radioaktivität zunächst für einige Stunden im Kern verbleibt, nach 12 Stunden jedoch auch im Cytoplasma zu finden ist. Da die Behandlung der Präparate mit Ribonuklease, einem Enzym, das RNA abbaut, zu einem vollständigen Verlust der radioaktiven Markierung führt, lässt dieses Experiment darauf schließen, dass RNA sich zunächst im Kern befindet, dann aber ins Cytoplasma übertritt: „The evidence presented shows that RNA is synthesized in the nucleus and that RNA, or at least a nucleusmodified precursor of RNA, is transmitted to the cytoplasm“ (Goldstein u. Plaut 1955). In der Folge konnte experimentell untermauert werden (besonders durch die RNA-Synthesehemmung mit

53

Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

bereits im Elektronenmikroskop und durch Zellfraktionierungen als wichtige Bestandteile des endoplasmatischen Reticulums (ER) identifiziert (Kapitel 5.2.1), wofür er 1974 mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet wurde. Ribosomale RNA ist – im Vergleich zu den anderen RNA-Fraktionen der Zelle – stoffwechselphysiologisch relativ stabil und verteilt sich auf wenige Größenklassen. Die ribosomale RNA ist ein wichtiges Struktur- und Funktionselement der Ribosomen. Heute wissen wir, dass es darüber hinaus noch weitere RNA-Klassen gibt, die sich vor allem durch eine besondere Kürze auszeichnen und eine wichtige Rolle bei der Regulation von Genaktivitäten spielen (Kapitel 7.4 und 7.5). Der wichtigste Fortschritt im Verständnis der Informationsübertragung von der DNA auf Proteine wurde durch Experimente von Brenner, Jacob und Meselson (1961) am Bakteriophagen T2 (Kapitel 4.3) gemacht. Untersuchungen der RNA-Synthese führten zu der Einsicht, dass eine relativ instabile RNA-Fraktion, die nicht mehr als 4 % der totalen zellulären RNA umfasst, die Information der DNA an die Ribosomen im Cytoplasma trägt, um dort die Proteinsynthese zu ermöglichen. Ent-

Actinomycin D), dass RNA ausschließlich an der DNA im Zellkern synthetisiert und anschließend ins Cytoplasma transportiert wird. Damit war jedoch das Problem der Umsetzung der genetischen Information in Proteinmoleküle keinesfalls gelöst. Die genetische Information war in der RNA nunmehr in ein – stoffwechselphysiologisch instabiles – Einzelstrangnukleinsäuremolekül verlagert, der Schritt zum Protein aber noch nicht erfolgt. Um diesen Schritt nachvollziehen zu können, war zunächst die Erkenntnis von Bedeutung, dass zelluläre RNA aus drei Hauptkomponenten unterschiedlicher Eigenschaften und Stabilität besteht: ï ribosomale RNA (rRNA), ï Boten-RNA (engl. messenger RNA, mRNA), ï Transfer-RNA (engl. transfer RNA, tRNA). Der Hauptanteil zellulärer RNA besteht aus Molekülen, die in cytoplasmatischen Partikeln, den Ribosomen, enthalten sind. Diese Moleküle werden daher ribosomale RNA (rRNA) genannt und repräsentieren etwa 40 % des Gewichts eines Ribosoms (Kapitel 3.4). In der Zelle sind etwa 85 % aller RNA-Moleküle rRNA. Ribosomen hatte Georg Palade in den 1950er-Jahren

Tabelle 3.1 Genetischer Code (mit Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren) 2. Base U U

C

A

C Phe

F

UCU

Ser

S

UAU

Tyr

Y

UGU

Cys

C

U

UUC

Phe

F

UCC

Ser

S

UAC

Tyr

Y

UGC

Cys

C

C

UUA

Leu

L

UCA

Ser

S

UAA

Stopp

X

UGA

Stopp

X

A

UUG

Leu

L

UCC

Ser

S

UAG

Stopp

X

UGG

Trp

W

G

CUU

Leu

L

CCU

Pro

P

CAU

His

H

CGU

Arg

R

U

CUC

Leu

L

CCC

Pro

P

CAC

His

H

CGC

Arg

R

C

CUA

Leu

L

CCA

Pro

P

CAA

Gln

Q

CGA

Arg

R

A

CUG

Leu

L

CCG

Pro

P

CAG

Gln

Q

CGG

Arg

R

G

AUU

Ileu

I

ACU

Thr

T

AAU

Asn

N

AGU

Ser

S

U

AUC

Ileu

I

ACC

Thr

T

AAC

Asn

N

AGC

Ser

S

C

Ileu

I

ACA

Thr

T

AAA

Lys

K

AGA

Arg

R

A

Met

M

ACG

Thr

T

AAG

Lys

K

AGG

Arg

R

G

GUU

Val

V

GCU

Ala

A

GAU

Asp

D

GGU

Gly

G

U

GUC

Val

V

GCC

Ala

A

GAC

Asp

D

GGC

Gly

G

C

GUA

Val

V

GCA

Ala

A

GAA

Glu

E

GGA

Gly

G

A

GUG

Val

V

GCG

Ala

A

GAG

Glu

E

GGG

Gly

G

G

AUG

a

G

UUU

AUA

G

A

a

wird auch als Startcodon verwendet.

3. Base

1. Base

54 54

3.1 DNA, genetische Information und Informationsübertragung

sprechend wurde diese RNA-Form als Boten-RNA bezeichnet (engl. messenger RNA; mRNA). „It is a prediction of the hypothesis that the messenger-RNA should be a simple copy of the gene, and its nucleotide sequence should therefore correspond to that of the DNA... Ribosomes are non-specialized structures which synthesize, at a given time, the protein dictated by the messenger they happen to contain” (Brenner et al. 1961).

Das einem Gen zugeordnete Protein wird nicht am Chromosom direkt synthetisiert, sondern an einer einzelsträngigen Nukleinsäure, der messenger-RNA, an den Ribosomen im Cytoplasma der Zelle.

Wie aber wird die Nukleotidsequenz der mRNA in ein Proteinmolekül umgesetzt? Für das Verständnis der

Tabelle 3.2 Aminosäuren a

Unpolare Seitenketten

b Ungeladene polare Seitenketten

Glycin

Alanin

Prolin

Serin

H H H N+ C C

H H H N+ C C

H H H N+ C C

H H H N+ C C

H H

O O-

H CH3

O O-

CH2

CH2

O O-

H CH2

CH2 (Gly; G)

(Ala; A)

(Pro; P)

Valin

Isoleucin

Leucin

Threonin H H H N+ C C

O O-

Tyrosin H H H N+ C C

O

H HC OH O

OH

CH3

(Ser; S)

(Thr; T)

H CH2

O O-

(Tyr; Y) OH

H H H N+ C C H CH H3C

H H H N+ C C

O O-

CH3

H2C

O-

CH3

Tryptophan

H H H N+ C C

-

O H CH2 C CH NH

O-

H CH2 CH

H H H N+ C C H CH2

CH3

O

H H H N+ C C

O

H H H N+ C C

O O

-

(Asn; N)

c

H H H N+ C C

d

(Phe; F)

Seltene Aminosäuren Selenocystein

H H H N+ C C

O -

H CH2 SeH

O

Pyrrolysin

(Met; M)

H H H N+ C C H CH2 CH2 CH2 CH2 H N

(Sec; U)

O-

H N C H

O H CH2 CH2 C NH2 O (Gln; Q)

H H H N+ C C

O

H CH2 H O N+ CH HC N H

H H H N+ C C H CH2 SH

O O-

(Cys; C)

Lysin

H CH2 CH2 + NH2 CH2 H2N C NH

O O-

CH2

Glutaminsäure

C OO (Asp; D)

H H H N+ C C

O -

NH3

(Lys; K)

Asparaginsäure

O

H CH2 CH2

+

(Arg; R)

H H H N+ C C

H H H N+ C C

CH2

(His; H)

H CH2

C O H C H C C H HH C H (Pyr; O)

O

-

Arginin

O-

(Trp; W)

O

Geladene polare Seitenketten Histidin

S CH3

Cystein

O O-

H CH2 CH2

Glutamin

C NH2 O

Methionin

-

H CH3

Asparagin

O

(Leu; L)

Phenylalanim

O

H H H N+ C C

H3C

CH3 (Ile; I)

(Val; V)

H H H N+ C C

H CH

O

O

OH CH2 CH2 C OO (Glu; E)

O O-

55

56 56

Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

molekularen Grundlage dieses Prozesses ist ein weiterer Befund von Mahlon B. Hoagland und Mitarbeitern aus dem Jahre 1958 Voraussetzung. Neben ribosomaler RNA als Hauptkomponente zellulärer RNA war die sogenannte lösliche RNA (engl. soluble RNA, sRNA), heute allgemein transfer-RNA (tRNA) genannt, als zweithäufigste RNA-Fraktion der Zelle beschrieben worden. Mengenmäßig umfasst sie etwa 5–10 % der gesamten RNA. Hoagland und seine Mitarbeiter erkannten, dass an diese RNA, deren Länge nur etwa 80 Nukleotide beträgt, auf enzymatischem Wege Aminosäuren kovalent gekoppelt werden können. Diese Aminosäuren können anschließend von der tRNA enzymatisch mittels Peptidbindungen an Proteine angehängt werden. „It is therefore suggested that this particular RNA fraction functions as an intermediate carrier of amino acids in protein synthesis“ (Hoagland et al. 1958). Dieser Schluss fügt sich nahtlos an einen Vorschlag von Francis Crick an, nach dem die Umsetzung der in der DNA enthaltenen Sequenzinformation in Proteinsequenzen mithilfe eines Verbindungsmoleküls erfolgt, das einerseits spezifische molekulare Interaktionen mit der mRNA eingehen kann, andererseits aber die Aminosäuren auf wachsende Polypeptidketten überträgt, die durch die jeweilige RNA-Sequenz definiert werden (Tabelle 3.1).

Die Übertragung der Information zur Synthese eines

bestimmten Proteins erfordert neben einem an der DNA synthetisierten mRNA-Molekül (Transkription) noch zwei weitere RNA-Typen, die ribosomale RNA (rRNA) und die transfer-RNA (tRNA). Die rRNA ist ein struktureller Bestandteil der Ribosomen; die tRNA ist ein Adaptermolekül, das durch spezifische molekulare Interaktion mit der mRNA während der Proteinsynthese Aminosäuren in der richtigen Folge aneinanderfügen kann (Translation).

Die weitere Untersuchung der tRNA, insbesondere ihre Sequenzanalyse durch Robert W. Holley und Mitarbeiter (1965), hat dieses Konzept bestätigt. Für jede der in Proteinen vorkommenden 20 „klassischen“ Aminosäuren (Tabelle 3.2) gibt es in der Zelle eine oder mehrere spezifische tRNAs, die den von Crick vorgeschlagenen Adaptermolekülen entsprechen (zur Struktur der tRNA siehe Abb. 3.18 und 3.19). Jede tRNA erkennt mithilfe einer jeweils spezifischen Basensequenz (Anticodon) eine komplementäre Basensequenz (Codon) in der mRNA durch Basenpaarung. Auf diese Weise ist durch die mRNA eine bestimmte Abfolge von Aminosäuren im Polypeptid festgelegt. Damit ist der grundsätzliche Ablauf der Übertragung genetischer Information von der DNA im Chromosom auf den Zellstoffwechsel durch die Synthese bestimmter Proteine erklärt: An einem Strang der chromosomalen DNA wird ein RNA-

Molekül synthetisiert, das als mRNA-Molekül durch die Kernmembran ins Cytoplasma gelangt. Hier erfolgt nach Bindung der mRNA an Ribosomen die Synthese von Polypeptiden mithilfe von tRNA-Molekülen, die mit einzelnen Aminosäuren beladen sind.

Für jede der 20 „klassischen“ Aminosäuren gibt es spezielle tRNAs, die mithilfe ihres Anticodons die entsprechenden Codons in der mRNA durch Basenpaarung erkennen. Auf diese Weise können die in der DNA codierten Aminosäuren aneinandergefügt werden.

3.2 Der genetische Code Die Aufklärung der grundsätzlichen Mechanismen der genetischen Informationsübertragung innerhalb der Zelle ließ noch eine Frage unbeantwortet: Wie ist die Information der Proteinsequenzen in der DNA verschlüsselt? Die Antwort lässt sich in vier Punkten zusammenfassen: ï Die genetische Information ist in der DNA in einem Triplettcode verschlüsselt, bei dem jeweils drei Basenpaare (= ein Codon) der Nukleinsäure eine Aminosäure festlegen. ï Die verschiedenen Codons überlappen sich in der Nukleinsäuresequenz nicht, sondern folgen, von einem bestimmten Anfangspunkt ausgehend, ohne dazwischen eingefügte Trennungszeichen („kommafrei“) kontinuierlich aufeinander. ï Der Code ist degeneriert, d. h. mehrere verschiedene Codons können die gleiche Aminosäure identifizieren. ï Der Code ist (im Prinzip) universell. Die ersten drei dieser Eigenschaften des genetischen Codes waren von F. H. C. Crick, L. Barnett, S. Brenner und R. J. Watts-Tobin (1961) in einer zusammenfassenden Bewertung eigener Befunde und der Befunde anderer Autoren herausgestellt worden. Die Aufklärung des Codes (Tabelle 3.1) in seinen Details beanspruchte, länger als von Crick und Kollegen erwartet („... the genetic code may well be solved within a year“), mehrere Jahre unter Einsatz verschiedenster Techniken. Wir wollen die wesentlichen Schritte im Folgenden nachvollziehen, da sie eine grundlegende Leistung der Molekulargenetik umreißen.

3.2.1 Die Entschlüsselung des Codes Der erste Schritt zur Entschlüsselung des Codes wurde durch Marshall W. Nirenberg und J. Heinrich Matthaei (1961) gemacht. In einem zellfreien System aus E. coli synthetisierten sie in vitro Proteine und bewiesen, dass hierfür die Anwesen-

3.2 Der genetische Code

heit von mRNA erforderlich ist. Der entscheidende Befund aber war, dass ein synthetisches Polynukleotid, das nur aus Uridin besteht, die Synthese nur eines Polypeptids zur Folge hat, das ausschließlich aus Phenylalanin aufgebaut ist. Die Synthese solcher Polynukleotide war mittels des Enzyms Polynukleotidphosphorylase möglich, das bei geeigneten Reaktionsbedingungen die Polymerisation von Ribonukleosiddiphosphaten zu Polyribonukleotiden unter Freisetzung von organischem Phosphat zu katalysieren vermag. Marianne Grunberg-Manago und Severo Ochoa hatten dieses Enzym bereits 1955 entdeckt. DoppelstrangRNA aus Poly(A)/Poly(U) führte ebenso wenig zur Synthese von Polypeptiden wie Zugabe von Nukleotiden oder Nukleosiden zum zellfreien System. Die Experimentatoren schlossen aus diesen Versuchen, dass eine Folge von drei Uracilbasen (also UUU in der Sprache des Codes) das Codon für Phenylalanin in einer Polypeptidkette ist: Das erste Codon war entschlüsselt. In der Folge konnten noch 1961 mittels derselben Technik Codons für 13 weitere Aminosäuren festgelegt werden, vorwiegend in der Gruppe von Severo Ochoa. Hierbei war es von Bedeutung, dass unterschiedliche Polynukleotidkombinationen auf synthetischem Wege dadurch hergestellt werden konnten, dass die Nukleotidsequenz, die durch Polynukleotidphosphorylase in vitro erzeugt wird, genau den relativen molaren Verhältnissen der Ribonukleosiddiphosphate im Reaktionsgemisch entspricht. Wesentliche Beiträge zur Bestätigung und Vervollständigung des Codes lieferte auch die Gruppe um Gobind Khorana, die Techniken zur gezielten Synthese längerer Ribonukleotidketten erarbeitet hatte, die dann im zellfreien E. coli-Proteinsynthesesystem auf ihre Codierungseigenschaften getestet werden konnten (Nishimura et al. 1965). Eine wichtige alternative Technik, die von M. W. Nirenberg und P. Leder 1964 entwickelt wurde, beruht auf der Fähigkeit von Ribosomen, RNA-Trinukleotide – also im Prinzip ein Codon – zu binden. Solche Ribosomen-RNA-Komplexe binden eine tRNA mithilfe ihres Anticodons, das mit dem Codon am Ribosom zur Basenpaarung befähigt ist. Trägt die tRNA eine (radioaktiv markierte) Aminosäure (sie wird auch als Aminoacyl-tRNA bezeichnet), so lässt sich diese CodonAnticodon-Bindung in Filterbindungstests leicht demonstrieren, da Membranfilter keine freie tRNA, wohl aber Ribosomenkomplexe binden. Tests bestimmter synthetischer Codons mit verschiedenen Aminoacyl-tRNAs gestatteten es so, die Codon-Anticodon-Kombinationen mit bestimmten Aminosäuren zu korrelieren. Obwohl auch durch diese Methodik eine vollständige Aufklärung des genetischen Codes nicht gelang, waren schließlich doch etwa 50 der 64

möglichen Tripletts bestimmten Aminosäuren zugeordnet. Aus diesen Daten konnte nunmehr die frühere Annahme bestätigt werden, dass der Code degeneriert ist, d. h. dass mehr als ein Triplett eine bestimmte Aminosäure codieren kann. Andererseits hatten die Versuche auch gezeigt, dass jedes Triplett nur eine Aminosäure identifiziert. Der genetische Code war somit, im Wesentlichen durch in-vitro-Experimente, aufgeklärt. Die Voraussagen von Crick und Kollegen über die Eigenschaften des genetischen Codes, wie sie zu Beginn dieses Kapitels aufgeführt sind, hatten sich bestätigt. Immerhin fehlten noch Bestätigungen dieses Konzeptes durch geeignete biologische Experimente. Diese sollten nicht lange auf sich warten lassen, und Teile des genetischen Codes wurden auf solchen Wegen bestätigt, lange bevor die Zuordnung aller Aminosäuren bekannt war. Allerdings ergaben diese biologischen Experimente auch, dass ‒ je nach untersuchtem Organismus ‒ die verschiedenen Codons unterschiedlich häufig benutzt werden und dass auch die unterschiedlichen tRNAs in verschiedener Häufigkeit bzw. Konzentration in den Zellen vorliegen bzw. synthetisiert werden.

Der genetische Code wurde im Wesentlichen durch in-vitro-Experimente aufgeklärt. Er hat den Charakter eines Triplettcodes, dessen Codons ohne Trennung aufeinander folgen, sich aber auch nicht überlappen. Der Code ist degeneriert, d. h. mehrere der aus den vier Basen möglichen Dreierkombinationen identifizieren die gleiche der 20 klassischen Aminosäuren. Außerdem ist der Code bei allen Organismen nahezu identisch.

Zunächst muss jedoch noch ein allgemeiner Aspekt des genetischen Codes (Tabelle 3.1) erörtert werden. Eine genauere Betrachtung der Zuordnung von Tripletts und Aminosäuren lässt erkennen, dass sich die verschiedenen Tripletts, die als Folge der Degeneration des Codes für eine bestimmte Aminosäure codieren, sich häufig nur in der letzten der drei Basen unterscheiden. Die Spezifität des Codes ist also vor allem in den ersten beiden Basen zu suchen, während die letzte Base eine größere Freiheit besitzt. Diese Hypothese, die auch als Wobble-Hypothese bezeichnet wird, hat sich experimentell bestätigt: Eine bestimmte tRNA kann verschiedene Codons erkennen, die für die gleiche Aminosäure codieren.

Der dritte Buchstabe des Codes ist nach der WobbleHypothese flexibel und gewährt größere Freiheit bei der Erkennung durch die tRNA als die ersten beiden Buchstaben.

57

58 58

Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

3.2.2 Beweis der Colinearität

3.2.3 Allgemeingültigkeit des Codes

Zur Bestätigung der Eigenschaften des genetischen Codes durch biologische Experimente haben sich Organismen mit sehr kleinem Genom als besonders geeignet erwiesen, da dies einen leichteren Zugang zu bestimmten Genen gestattet. Besonders beliebt waren daher Phagen (Kapitel 4.3) wie der Bakteriophage T4, das Tabakmosaikvirus (TMV) und der Phage MS2, aber auch einzelne Gene von E. coli, beispielsweise die Tryptophansynthetase. Sie wurde mit genetischen Techniken vor allem durch Yanofsky und Spiegelman (1962) untersucht und ergab eine Reihe von Argumenten für die Korrektheit des genetischen Codes. Insbesondere wurde durch diese Versuche auch die Frage der „Colinearität“ der Codierung zumindest indirekt beantwortet. Dieser Begriff bezieht sich auf die Art der Anordnung der Codons in einem Gen: Verläuft die Nukleotidsequenz in der DNA und die zum gleichen Gen gehörige Aminosäuresequenz vollständig parallel? Mutationsexperimente sprachen für eine solche colineare Anordnung.

Eine wichtige Frage bezüglich der Bedeutung des genetischen Codes betrifft seine allgemeine Gültigkeit: Ist er für alle Organismen gültig oder gibt es verschiedene Arten von genetischen Codes? Nach der Aufklärung des Codes herrschte zunächst für längere Zeit die Überzeugung, dass der Code universell ist, also für alle Organismen gültig ist. Erst später stellte sich heraus, dass diese Regel der Allgemeingültigkeit in einigen Fällen durchbrochen wird: In Mitochondrien von Hefen, Drosophila und des Menschen wurden einige abweichende Codons gefunden (Tabelle 5.1). So codiert das Triplett UGA, das normalerweise eine Termination der Translation verursacht, den Einbau von Tryptophan. In Hefemitochondrien codiert CUA Threonin statt Leucin. Bei Menschen ersetzt der mitochondriale Code für AUA das normalerweise codierte Isoleucin durch Methionin; AGA und AGG bedeuten „Stopp“ statt, wie normalerweise, Arginin; und bei Drosophila wird Serin statt Arginin durch AGA codiert. Neuerdings wurden Abweichungen vom universellen Code auch in Kern-DNA von Ciliaten sowie im Genom von Prokaryoten (Mycoplasma) gefunden. Eine Übersicht über die Evolution des genetischen Codes gibt Abb. 3.2.

Der Phage MS2 vermehrt sich in E. coli-Zellen. Er besitzt als Genom ein EinzelstrangRNA-Molekül von 3500 Nukleotiden, das für drei Gene codiert. Eines davon ist zur Replikation des Phagengenoms erforderlich, es handelt sich also um ein RNA-replizierendes Enzym. Das zweite Gen codiert für das Protein A, das zur Ausbildung neuer Phagen erforderlich ist (engl. maturation protein). Das dritte Gen enthält die Information für das Hüllprotein des Phagen (engl. coat protein). Die Aufklärung sowohl der Nukleotidsequenz als auch der Aminosäuresequenz dieses Gens für das Hüllprotein durch Henri Grosjean und Walter Fiers (1982) ergab, dass die codierende RNA-Sequenz 387 Nukleotide, das Hüllprotein aber 129 Aminosäuren lang ist. Da innerhalb des Hüllproteins allen Aminosäuren das auf der Grundlage des Codes erwartete Triplett in der Nukleotidsequenz entsprach, wurde durch den Vergleich der beiden Sequenzen nicht nur die Richtigkeit des genetischen Codes bestätigt, sondern auch die Colinearität zwischen DNA und Protein bewiesen, d. h. die vollständige Parallelität der Nukleinsäure- und Proteinsequenzen. Zusätzlich wurde vor dem Codon für die erste Aminosäure ein AUG-Triplett gefunden, das bereits aufgrund anderer Kriterien als Startcodon identifiziert worden war.

Ein Vergleich der DNA-Sequenz eines Gens und der

Aminosäuresequenz des zugehörigen Proteins bewies die Richtigkeit des genetischen Codes und die Colinearität, d. h. die lineare Parallelität zwischen DNA- und Proteinsequenz.

Eine besondere Form des genetischen Codes wurde bei manchen Proteinen des RedoxStoffwechsels beobachtet: Diese enthalten Selenocystein (Sec). Dazu gehörten zunächst nur die Enzyme Formatdehydrogenase bei E. coli und Glutathion-Peroxidase bei Maus und Mensch; inzwischen umfasst die Liste eine Reihe weiterer Enzyme (Tabelle 3.3). Selenocystein wird als 21. Aminosäure bezeichnet und durch den Gebrauch des Stoppcodons UGA (in der DNA: TGA) codiert. Wenn das UGA-Codon allerdings für Sec codiert, wird es durch eine spezifische tRNA erkannt, die sich in ihrer Struktur von den üblichen tRNAs an wichtigen Punkten unterscheidet. Diese tRNA ist zunächst mit Serin beladen, das dann in weiteren Schritten an der tRNA zu Selenocystein modifiziert wird. Der spezielle Mechanismus für den Einbau von Sec und seine geringe Verbreitung deuten darauf hin, dass er erst relativ spät in der Evolution entstanden ist (für eine Übersicht siehe Hatfield u. Gladyshev 2002). Allerdings ist die Evolution nicht bei 21 Aminosäuren stehen geblieben: Die 22. natürlich vorkommende Aminosäure ist Pyrrolysin (Pyl), das durch das Codon UAG (DNA: TAG) in verschiedenen MethylaminMethyltransferase-Genen (MtmB, MtbB, MttB) von einigen Archaebakterien wie Methanosarcina barkeri codiert wird. Im Gegensatz zum oben beschriebenen

3.2 Der genetische Code

Kern-Codes

Pilze viele Candida-Sp. viele Ascomyceten

Metazoa Metazoa

Mitochondriale Codes

c

10 Vertebraten 11 Brachiostioma Brachiostoma lanceolatum lanceolatum 13 Brachiostioma Brachiostoma floridae floridae

12

Grünalgen

6

Acetabularia Batophora cestedi

a

4

3

Ciliaten

Urochordaten Hemichordaten 5 Echinodermen Mollusken, Anneliden, Arthropoden, Nematoden

2

Zosterograptus sp. a Naxelia sp. a

4

5

7

8

9

Plathelminten Cnidarier Poriferen Chlorarachnion sp. Euglypha sp.

Pseudomicrothorax dubius h

Calpoda sp. Oligohymenophora Litostomata Nyctothecus ovalis Euplotes spp. andere Spirotricha Condylostoma magnum andere Heterotricha Karyorelictida

f a 1

h b a a

14

f

Diplomonaden andere Diplomonaden a Giardia spp. Firmicuten Mycoplasma spp. g Spiroplasma civi Bacillus subtilis f Micrococcus spp. e

Standard Code f

15

d 14

a UAR Stop b UGA Stop c CUG Leu d AGA Arg 1 UGA Stop 2 AUA Ile 3 AGR Arg 4 AUA Met 5 AAA Lys 6 AGR Ser 7 UAA Stopp 8 CUN Leu

Gln Cys Ser ? Trp Met Ser Ile Asn Gly Tyr Thr

e AUA Ile f UGA Stop g CGG Arg h UGA Stop 9 CGN Arg 10 AGR ? 11 AGA ? 12 AGR Ser 13 AGA ? 14 UAG Stopp 15 UAG Stopp 16 UCA Ser

? Trp ? ?

16

1

N = A, C, G oder U

Mehrdeutigkeit des Codons fragliche Genauigkeit der Veränderung abgeleitete zweite Ordnung

Stramenopila Thalassiosira costatum Skeletonema costatum andere Diatomeen Eustigmatophyten, Xanthophyten, Phaeophyten

1

R = A oder G

Grünpflanzen Hydrodictyon reticulatum Pediastrum boryanum Tetraedoron bitridens Scenedesmus quadricauda Scenedesmus obliquus Coelastrum microporum Landpflanzen Alveolata Plasmodium falciparum Ciliaten

1

? Stop Gly ? Ser Leu Ala Stop

Pilze Saccharomyces spp. andere Hefen Chytriden andere Pilze Acanthamoeba castellani Rotalgen Cyanidium sp. 1 Chondrus crispus 2

Haptophyten Diacronema vlkianum Pavlova lutheri Gephyrocapsa oceanica Isochrysis galbana Phaeocystis poucheti Syracosphaera sp. Cricosphaera roscoffensis Euglenozoen Eugleniden 1 Kinetoplastiden

Abb. 3.2 Stammbaum der verschiedenen Variationen des genetischen Codes. Einzelne Veränderungen kommen unabhängig voneinander offensichtlich immer wieder in verschiedenen Gruppen vor. Die Beziehungen der einzelnen Veränderungen stammen aus verschiedenen Berechnungen, sodass nur die Verzweigungspunkte wichtig sind, die Länge der jeweiligen Äste aber ohne Bedeutung bleibt. Schwarze Kreise deuten weitere Veränderungen in Codons an, die vom Standard-Code abwei-

chen. Rote Kreise weisen auf die Mehrdeutigkeit des Codons hin, wobei das Codon sowohl nach dem Standard-Code als auch entsprechend der Angabe in der Abbildung übersetzt werden kann. Die gelben Kreise deuten an, dass sich die Zuordnung aufgrund neuer Sequenzdaten nur auf eine oder wenige Spezies der Plathelminten bezieht. sp.: einzelne unspezifizierte Spezies; spp.: viele unspezifizierte Spezies. (Nach Knight et al. 2001, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Mechanismus für Sec gibt es für Pyl eine spezifische tRNA, die das Codon UAG als „sinnvoll“ ansieht und

Pyl einbaut. Die Formeln der zwei seltenen Aminosäuren sind in Tabelle 3.2 enthalten.

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60 60

Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

Tabelle 3.3 Einige bekannte Selenoproteine Selenoprotein

Ort des Sec-Einbaus

1. Cytosolische Glutathion-Peroxidase (GPX1) 2. Gastroinestinale Glutathion-Peroxidase (GPX2) 3. Plasmatische Glutathion-Peroxidase (GPX3) 4. Phospholipid-Hydroperoxid-Glutathion-Peroxidase (GPX4) 5. Thioredoxin-Reduktase 1 (TR1) 6. Thioredoxin-Reduktase 2 (TR2) 7. Thioredoxin-Reduktase 3 (TR3) 8. Schilddrüsenhormon-Deiodinase 1 (DI1) 9. Schilddrüsenhormon-Deiodinase 2 (DI2) 10. Schilddrüsenhormon-Deiodinase 3 (DI3) 11. Selenophosphat-Synthetase 2 (SPS2) 12. Selenoprotein Pa (SelPa) 13. Selenoprotein W (SelW) 14. Selenoprotein T (SelT) 15. Selenoprotein R (SelR) 16. Selenoprotein 15 kDa (Sep15) 17. Selenoprotein N (SelN) 18. Selenoprotein T2 (SelT2) 19. Selenoprotein M (SelM) 20. Selenoprotein G-reich (G-rich) 21. Selenoprotein W2 (SelW2) 22. Selenoprotein BthD (BthD) 23. Selenoprotein Pb (SelPb)

(Nach Hatfield u. Gladyshev 2002)

In jüngster Zeit wird jetzt daran gearbeitet, den genetischen Code künstlich noch weiter auszudehnen und „unnatürliche“ Aminosäuren von Organismen (zunächst bevorzugt Bakterien und Hefen) einbauen zu lassen. Das schon oben erwähnte Stoppcodon UAG („amber“; DNA: TAG) wird bei diesen Organismengruppen am seltensten genutzt. Außerdem gibt es in manchen E. coli-Stämmen amber-SuppressortRNAs, die Substrate für endogene Aminoacyl-tRNASynthetasen sind und mit hoher Effizienz natürliche Aminosäuren einbauen. Dieses Paar von tRNA und zugehöriger Synthetase kann so verändert werden, dass

α-Helix

Sec

auch unnatürliche Aminosäuren eingebaut werden können, die vollständig neue Eigenschaften haben. Dies ermöglicht die Herstellung von neuen therapeutischen Proteinen mit verbesserten pharmakologischen Eigenschaften, von fluoreszierenden Proteinen als Sensoren für kleine Moleküle oder Protein-Protein-Wechselwirkungen, von Proteinen, deren Aktivität durch Licht reguliert werden kann, oder von Biopolymeren mit vollständig neuen Eigenschaften. Bis 2009 wurden ca. 40 verschiedene neue Aminosäuren auf diese Weise in Proteine von E. coli, Hefe oder Säugerzellen eingebaut (Cropp u. Schultz 2004, Wang et al. 2009).

3.3 Transkription

Trotz der generellen Gültigkeit des genetischen Codes

gibt es in mitochondrialer DNA und nukleärer DNA einzelner Organismengruppen Abweichungen durch Veränderung der Bedeutung einzelner Codons. Das allgemeine Grundprinzip dokumentiert aber überzeugend die evolutionäre Zusammengehörigkeit aller Lebewesen.

3.3 Transkription Seit der Aufklärung des genetischen Codes sind wir in der Lage, die in der DNA verschlüsselte Information für die Struktur von Proteinmolekülen zu lesen. In der Zelle erfolgen das Ablesen der Information und die Umsetzung in die entsprechenden Proteinmoleküle in mehreren Stufen. Der erste Schritt hierbei ist die Synthese einer einzelsträngigen Boten-RNA (engl. messenger RNA; mRNA), die die Information der DNA für die Proteinsynthesemaschinerie zugänglich macht. Die Synthese von mRNA wird als Transkription bezeichnet. Der Aufbau der mRNA entspricht dem der DNA, jedoch mit drei Unterschieden: ï anstatt Desoxyribose enthält sie Ribose, ï sie ist einzelsträngig, ï anstatt des Thymins wird die Base Uracil eingebaut. Diese Unterschiede zur DNA haben verschiedene Folgen für die chemischen Eigenschaften, deren wichtigste ihre relativ große chemische Instabilität ist. Grund für diese Instabilität sind die zwei Hydroxylgruppen in der Ribose, die aus energetischen Gründen die Bildung von 2’→3’-Ring-Diestern des Phosphats unterstützen, wobei die 3’→5’-Diesterbindung gelöst wird. RNA hydrolysiert daher leichter als DNA. Durch ihren Einzelstrangcharakter besitzt sie zudem eine hohe sterische Flexibilität und kann leicht gefaltet werden, was ihre Verpackung in Proteine zu kompakten Ribonukleoproteinpartikeln (RNP) erleichtert. Solche Verpackungsmechanismen sind in Eukaryoten für den Transport der mRNA ins Cytoplasma besonders wichtig und dienen außerdem als Schutz gegen unerwünschten Abbau durch nukleolytische (Nukleinsäure-spaltende) Enzyme.

RNA unterscheidet sich von DNA durch ihre Einzel-

strängigkeit, durch den Ersatz der Thyminbasen durch Uracil und durch den Besitz von Ribose statt Desoxyribose im Zucker-Phosphat-Rückgrat.

3.3.1 Allgemeiner Mechanismus der Transkription Die Synthese der RNA, auch als Transkription bezeichnet, ist ein hochkomplexer Prozess, der im Zentrum durch die RNA-Polymerase geleistet wird. Diese enzy-

matische Aktivität wurde zuerst von Weiss und Gladstone (1959) in Zellkernen der Rattenleber beschrieben. Das Enzym war in der Lage, RNA in Abhängigkeit von der Anwesenheit von DNA zu synthetisieren. Der Beweis dafür wurde durch Abbau der DNA durch DNase erbracht: Unter diesen experimentellen Bedingungen war kein Einbau radioaktiver RNA-Vorstufen mehr möglich. Erst ein Jahr später wurde in E. coli eine ähnliche enzymatische Aktivität beschrieben (Hurwitz et al. 1960, Stevens 1960). Damit wurde die universelle Rolle der RNA-Polymerase in der Transkription von Pro- und Eukaryoten etabliert. Die RNA-Polymerase katalysiert die Synthese eines RNA-Moleküls in 5’→3’-Richtung durch Aneinanderfügen von Nukleosidtriphosphaten, deren Reihenfolge durch die Basenkomplementarität mit dem DNA-Strang festgelegt ist. Wie auch bei der Replikation wird jeweils das 5’-P eines neuen Nukleotids mithilfe einer Phosphodiesterbindung an die 3’-OH-Gruppe des wachsenden RNA-Moleküls angefügt (Abb. 3.3). Im Unterschied zur DNA-Replikation ist hierfür jedoch kein Primer erforderlich, sondern die RNA-Polymerase kann die RNA-Synthese nach Bindung an eine dafür geeignete DNA-Sequenz, die als Promotor bezeichnet wird (Kapitel 4.3 und 7.3), direkt mit dem ersten Nukleotid beginnen. Allerdings erfolgt die Initiation der Transkription stets mit der Hilfe von Proteinfaktoren, sodass diese praktisch die Funktion eines Nukleinsäureprimers

Abb. 3.3 Schema der Transkription. Die RNA-Polymerase öffnet einen kurzen Bereich der DNA für die Synthese des RNA-Moleküls am antisense-Strang der DNA. Die RNA-Polymerase bedeckt dabei etwa 35 bp. Die Transkriptionsblase besteht aus DNA-Einzelsträngen von etwa 15 Nukleotiden; das DNA-RNA-Hybrid ist ungefähr 9 bp lang. Die RNA-Polymerase katalysiert den Einbau von Ribonukleotiden, die zu den DNA-Basen komplementär sind, und knüpft die Phosphodiesterbindung. Im Gegensatz zur DNAPolymerase braucht die RNA-Polymerase keine Primer – es kann eine RNA-Kette de novo an der DNA-Matrize starten. Das Enzym erzeugt vor sich eine übermäßige Spiralisierung und hinter sich einen zu schwach gewundenen DNA-Abschnitt (vgl. Abb. 2.14). Beim Weiterwandern der Transkriptionsblase wird die RNA unter Rückbildung des DNA-Doppelstrangs aus der Hybridhelix verdrängt. Die RNA-Synthese erfolgt, wie die DNA-Synthese, stets in 5’–3’-Richtung des wachsenden Moleküls. (Nach Seyffert 2003, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

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Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

übernehmen. Erreicht die RNA-Polymerase ein anderes in der DNA codiertes Signal, das Terminationssignal (S. 64), so wird die RNA-Synthese beendet. Damit unterscheidet sich die RNA-Polymerase in drei wichtigen Eigenschaften von DNA-Polymerasen: ï Sie benötigt keinen Primer, ï sie liest nur einen begrenzten, in der DNA selbst definierten Abschnitt der DNA, und ï sie verfügt im Gegensatz zu DNA-Polymerasen über keine Nuklease-Aktivität. Als Endprodukt der RNA-Polymerase-Aktivität liegt ein Einzelstrangmolekül vor. Welcher DNA-Strang in RNA umgesetzt wird, ist durch Signalsequenzen in der DNA festgelegt.

Die

Synthese von RNA erfolgt an der DNA durch RNA-Polymerase in ähnlicher Weise wie die Replikation durch DNA-Polymerase. RNA-Polymerase liest jedoch nur Teilbereiche eines einzelnen DNA-Strangs, die durch ein Startsignal (Promotor) und ein Endsignal (Terminationssignal) gekennzeichnet sind. Sie benötigt, im Gegensatz zur DNA-Polymerase, keinen Nukleinsäureprimer. Eukaryoten besitzen im Gegensatz zu E. coli vier verschiedene RNA-Polymerasetypen, die spezifische RNA-Typen synthetisieren.

Terminologie. Um Verwirrungen in der Terminologie zu vermeiden, ist es wichtig, sich die gebräuchlichen Begriffe deutlich vor Augen zu führen: ï Der DNA-Strang, der als Template (Matrize) für die Transkription dient, wird als Gegenstrang (engl. antisense strand) bezeichnet. Er wird in 3’→5’-Richtung abgelesen. ï Die hieran durch Basenkomplementarität gebildete mRNA wird in 5’→3’-Richtung synthetisiert (also antiparallel). Wir nennen das entstehende mRNAMolekül Sinn-Strang (engl. sense strand). Die mRNA entspricht in ihrer Nukleotidsequenz daher, abgesehen vom Ersatz des Thymins durch Uracil, dem „Sinn-Strang“ oder dem codierenden Strang (engl. coding strand) der DNA, der normalerweise nicht von der RNA-Polymerase gelesen wird. ï Wird vom Sinn-Strang der DNA ein RNA-Molekül synthetisiert, wird diese RNA als antisense-RNA bezeichnet. In ihrer Sequenz entspricht sie dem antisense-Strang der DNA. Solche antisense-RNAMoleküle können nicht nur in vitro für experimentelle Zwecke hergestellt werden, sondern spielen wichtige Rollen bei der Regulation von Genaktivitäten in der Zelle (Kapitel 7.5).

3.3.2 Transkription bei Prokaryoten Prokaryoten besitzen nur eine RNA-Polymerase. Sie besteht aus drei Proteinkomponenten, der α-, der βund der β’-Untereinheit. Zwei α-Untereinheiten formen zusammen mit je einem β- und einem β’-Molekül das Core-Enzym, das zusammen mit dem σ-Faktor das Holo-Enzym mit einem Molekulargewicht von 480 kDa bildet. Sowohl die RNA-Polymerase α als auch der σ-Faktor sind erforderlich, um die Promotorstrukturen zu erkennen, spezifisch daran zu binden und mit der Transkription zu beginnen (Initiationsphase). Ging man ursprünglich davon aus, dass nur ein σ-Faktor existiert (σ70 mit einem Molekulargewicht von 70 kDa), so kennen wir heute 6 zusätzliche σ-Faktoren (σS, σ32, σE, σF, σfecI und σ54). Alle diese σ-Faktoren können in mehreren Schritten an die Core-Polymerase binden. Die Bindung an den Promotor führt zunächst zu einem „geschlossenen Komplex“, der durch lokales Aufschmelzen der DNA im Bereich des Transkriptionsstarts in einen „offenen Komplex“ umgewandelt wird und so die Transkription einleitet. Die Base, an der die Transkription startet und die als erste in mRNA übersetzt wird, wird mit „+1“ bezeichnet; die Basen oberhalb des Transkriptionsstarts werden entsprechend mit „−1“ etc. bezeichnet; es gibt also keine Null. Das Aufschmelzen der DNA im Bereich des Transkriptionsstarts findet im Bereich von −12 bis +4 statt. Ein typischer σ70-abhängiger Promotor enthält zwei konservierte Hexamer-Sequenzen etwa an den Positionen −10 (TATAAT; TATA- oder Pribnow-Box) und −35 (TTGACA), die von jeweils

Abb. 3.4 Wechselwirkungen zwischen dem RNA-PolymeraseKomplex und Promotor-Elementen an einem Aktivator-unabhängigen Promotor. Die Regionen 2 und 4 der σ-Untereinheit des RNA-Polymerase-Komplexes sind für die Erkennung der Hexamer-Sequenzen an den Positionen −10 und −35 verantwortlich. Die α-Untereinheit der RNA-Polymerase besteht aus zwei Domänen: der N-Terminus (αNTD) bindet an die β/β’Untereinheiten, wohingegen der C-Terminus (αCTD) mithilfe zusätzlicher spezifischer Protein-DNA-Wechselwirkung an Elemente oberhalb des Hexamers der Position −35 (UPE) die Bindung des RNA-Polymerase-Komplexes an den Promotor verstärkt. αNTD und αCTD sind flexibel verbunden. Der Pfeil an Position +1 zeigt den Transkriptionsstart. (Nach Lloyd et al. 2001, mit freundlicher Genehmigung von Portland Press)

3.3 Transkription

einer der vier Untereinheiten des σ-Faktors erkannt werden (Abb. 3.4). Andere σ-Faktoren sind für die Initiation der Transkription unter spezifischen Umweltbedingungen verantwortlich (σ32 für Wachstum oberhalb von 37 °C, σE für die Expression „extremer“ Hitzeschockproteine, σS für Stress-Antworten). Die β-Untereinheit (151 kDa, verantwortliches Gen: rpoB) wird als die hauptsächlich katalytische Untereinheit betrachtet. Sie bindet die Ribonukleosidtriphosphate (rNTPs) und bewirkt die Polymerisation der RNA-Kette. Die β-Untereinheit ist das Angriffsziel von Inhibitoren der Transkription wie Rifampicin und Streptolydigin. Im Gegensatz dazu ist die Funktion der β’-Untereinheit (155 kDa, verantwortliches Gen: rpoC) noch nicht voll verstanden. Die β’-Untereinheit enthält viele positiv geladene Aminosäuren, und es wird ihr daher eine unspezifische, DNAbindende Funktion zugeschrieben. Die α-Untereinheit (37 kDa, verantwortliches Gen: rpoA) ist die einzige Untereinheit des Core-Enzyms, die als Dimer vorkommt. Sie hat drei Funktionen: ï Initiation des Zusammenbaus des Core-Enzyms, ï Beitrag zur Erkennung der Promotor-Sequenzen, ï Wechselwirkung mit Transkriptionsfaktoren (Initiation und Anti-Terminatoren).

Die N-terminale Domäne der RNA-Polymerase α ist dabei für die Dimerisierung verantwortlich, wohingegen die C-terminale Domäne für die Wechselwirkungen mit dem Promotor zuständig ist. Verschiedene Möglichkeiten dieser Wechselwirkungen werden in Abb. 3.5 gezeigt. Die Bindestellen der C-terminalen Domäne der RNA-Polymerase α liegen oberhalb der Bindungsstellen für den σ-Faktor (zwischen −35 und −60). Ihre Consensussequenz ist sehr A/T-reich (5’-NNAAAWWTWTTTTNNNAAANNN-3’; W = A oder T, N = jede Base). Offensichtlich binden die zwei C-terminalen Domänen etwas versetzt an diese Bindestelle. Genauere Mechanismen zur Regulation prokaryotischer Genexpression werden wir im Kapitel 4.5 besprechen. Die Ablösung vom Promotor (engl. promoter clearance), also der Übergang von der Initiationsphase in die Elongationsphase, findet nach der Synthese der ersten Basen des Transkripts statt. Der Elongationskomplex ist stabil, wenn das Transkript eine Länge von 9 bis 11 Basen erreicht hat. Für die Elongation der RNA ist nur noch das Core-Enzym erforderlich. Allerdings wissen wir heute, dass die Elongation der Transkription kein monotoner Prozess ist, sondern dass die Elongationskomplexe in vielen verschiedenen Konformationszuständen existieren können. Hilfsproteine wie NusA, NusG, GreA und GreB können diese unterschiedlichen Abb. 3.5 a–c Aktivierung der Transkription durch Wechselwirkungen der RNA-Polymerase mit Aktivatoren. a Der Aktivator (A, immer als Dimer gezeichnet) bindet spezifisch einerseits an die Aktivator-Bindestelle im Promotor und andererseits an die C-terminale Domäne der RNA-Polymerase α (αCTD). Dadurch wird die αCTD an die DNA herangeführt und die ProteinDNA-Wechselwirkung am Promotor verstärkt. b Der Aktivator geht eine spezifische Wechselwirkung mit der Region 4 der σ-Untereinheit ein. Dadurch wird der RNA-Polymerase-Komplex stärker an den Promotor gebunden bzw. verstärkt nachfolgende Schritte während der Transkription. c Der Aktivator bindet spezifisch sowohl an αCTD als auch an die Region 4 der σ-Untereinheit; beide Wechselwirkungen verstärken die Transkription. Die N-terminale Domäne (αNTD) der RNA-Polymerase α bindet an die β/β’-Untereinheiten; der Pfeil an Position +1 zeigt den Transkriptionsstart an. (Nach Lloyd et al. 2001, mit freundlicher Genehmigung von Portland Press)

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Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

Konformationen erkennen und die Verteilung innerhalb dieser Zustände modulieren. Im normalen Zustand ist das Core-Enzym langlebig und aktiv, sodass ca. 60 bis 80 Nukleotide pro Sekunde angefügt werden können. Dieser Elongationskomplex ist sehr stabil und doch zugleich flexibel; das Konzept der „gleitenden Klammer“ (engl. sliding clamp) in Analogie zur DNA-Replikation ist zum Verständnis dieses Prozesses sehr hilfreich. Die Elongation kann aber an bestimmen Stellen („Pause“, „Ende“) oder unter bestimmten Umständen (Fehlpaarungen, Nachschubmangel von rNTPs) angehalten oder verlangsamt werden. Eine besondere Situation ergibt sich, wenn das entstehende Transkript Haarnadelstrukturen (engl. hairpins) ausbilden kann. Dies führt unter Umständen zur vorzeitigen Beendigung der Transkription (engl. attenuation). Die Beendigung der Transkription prokaryotischer Gene (Termination) wird entweder durch spezielle Terminationssequenzen (meist sehr GC-reiche, palindromische Sequenzen, die stabile Haarnadelstrukturen ausbilden können: intrinsische Termination) oder durch die Anwesenheit des Terminationsfaktors ρ ermöglicht. Das ρ-abhängige Terminationssignal umfasst etwa 200 Basen, wobei der 5’-Teil (ca. 40 Basen) noch zur wachsenden RNA gehört. Es bildet keine oder nur geringe Sekundärstrukturen aus und enthält einen hohen Anteil von Cytosin-Resten; allerdings sind bisher keine Consensussequenzen erkennbar. Der ρ-Faktor ist eine RNA-abhängige Ribonukleosid-Triphosphatase und bindet als ringförmiges Hexamer (Molekulargewicht der Monomeren je 46 kDa) an die RNA (es werden 78 Basen gebunden). Der N-Terminus enthält dabei die RNA-Bindungsdomäne und der C-Terminus ist mit der Fähigkeit zur ATP-Hydrolyse assoziiert. Nach der Bindung an die RNA induziert die ATP-Spaltung Konformationsänderungen, die das Transkript durch das Hexamer hindurchziehen (in 5’→3’-Richtung; Abb. 3.6) und so die RNA vom Elongationskomplex ablösen. Die ρ-Faktor-abhängige Termination ist für E. coli und einige andere Organismen essenziell und kann durch das Antibiotikum Bicyclomycin gehemmt werden. Allerdings gilt dies nicht für alle Bakterien: Bacillus subtilis oder Staphylococcus aureus sind in ihrer Transkriptionstermination nicht von einem ρ-Faktor abhängig.

Prokaryoten verfügen über eine einzige RNA-Polymera-

se. Sie besteht aus mehreren Untereinheiten, die das Core-Enzym bilden. Zusammen mit dem σ-Faktor bildet das Core-Enzym das Holo-Enzym. Die korrekte Erkennung des Promotors erfolgt durch die C-terminale Domäne der RNA-Polymerase α und den σ-Faktor. Nach der Initiation ist nur noch das CoreEnzym zur Elongation der RNA erforderlich. Die Termination erfolgt durch GC-reiche, Palindrom-haltige Terminatorsequenzen oder mithilfe des Terminationsfaktors ρ.

Abb. 3.6 Topologisches Modell von mRNA, die an den Terminationsfaktor ρ gebunden ist. Die äußere Form des hier dargestellten Terminationsfaktors ρ basiert auf einer 3D-Rekonstruktion elektronenmikroskopischer Darstellungen. Die mRNA bindet spezifisch an die kontinuierliche Spalte an der oberen Peripherie. Das 3’-Ende der mRNA wird durch den Terminationsfaktor hindurchgeführt und endet an dessen aktivem Zentrum (hier nicht dargestellt). (Nach Richardson 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Neben dem Aufbau der mRNA ist auch deren Abbau ein wichtiger Bestandteil des gesamten RNA-Metabolismus. Der schnelle Abbau von mRNA ist im Übrigen auch zur Regulation von Genaktivitäten wichtig, nämlich um eine Population von Bakterien schnell an sich verändernde Umweltbedingungen anzupassen. Wie immer bei solchen Prozessen, können wir eine Initiationsphase beschreiben, wobei regulatorische Elemente eine wichtige Rolle spielen, und eine „Durchführungsphase“, bei der dann die mRNA vollständig abgebaut wird. In E. coli wird der Abbau der mRNA im Wesentlichen durch die RNase E durchgeführt, dafür sollte das 5’-Ende der mRNA zugänglich sein. Der erste Schnitt erfolgt üblicherweise in AU-reichen Regionen ohne größere Sekundärstrukturen. Es sind darüber hinaus noch eine ganze Reihe weiterer Proteine am mRNA-Abbau beteiligt; dazu gehören vor allem Exoribonukleasen (Polynukleotidphosphorylase, PNPase; RNase II; RNase R) und eine RNA-Helikase (RhlB). Die einzelnen Exoribonukleasen sind dabei teilweise redundant; allerdings sind Mutationen im PNPase-Gen nicht lebensfähig. Diese Exoribonukleasen führen noch nicht zu einem vollständigen Abbau der mRNA, sondern lassen kurze Oligonukleotide übrig, die noch 2 bis 5 Nukleotide umfassen. Diese kurzen Fragmente werden dann durch eine Oligonuklease zu Mononukleotiden abgebaut; Oligoribonukleasen sind spezifisch für sehr kurze Ketten (für einen Überblick siehe Deutscher 2006).

3.3 Transkription

3.3.3 Transkription Protein-codierender Gene bei Eukaryoten Eukaryoten besitzen im Gegensatz zu den Prokaryoten vier verschiedene RNA-Polymerasen (I‒IV). Die Nummerierung erfolgte zunächst entsprechend der biochemischen Aufreinigung über eine DEAE-SephadexSäule: Die RNA-Polymerase I wurde schon bei niedriger Salzkonzentration eluiert, wohingegen die RNAPolymerase III erst bei hoher Salzkonzentration eluiert werden konnte (Roeder u. Rutter 1969). Die vierte RNA-Polymerase wurde erst kürzlich in Pflanzen beschrieben. RNA-Polymerase II (und in geringerem Ausmaß auch Polymerase III) wurde durch ihre Empfindlichkeit gegenüber α-Amanitin, dem Gift des Grünen Knollenblätterpilzes (Amanita phalloides), charakterisiert. RNA-Polymerase I und IV sind dagegen gegen α-Amanitin unempfindlich; Polymerase I kann aber durch das Antibiotikum Actinomycin D gehemmt werden, gegen das wiederum RNA-Polymerase II relativ unempfindlich ist. Die verschiedenen RNA-Polymerasen unterscheiden sich aber nicht nur hinsichtlich ihrer biochemischen Parameter, sondern auch hinsichtlich ihrer funktionellen Charakteristika: RNA-Polymerase I ist primär an der Synthese der 18S- und 25S-rRNA beteiligt, während RNA-Polymerase II die „klassische“ mRNA Protein-codierender Gene transkribiert. Die RNA-Polymerase III ist für die Synthese der zellulären 5S-rRNA und der tRNA verantwortlich. Die kürzlich entdeckte RNA-Polymerase IV ist dagegen für die Bildung der siRNA verantwortlich (engl. small interfering RNA; für weitere Details siehe Kapitel 7.3 bis 7.5). Wir wollen uns hier auf die Transkription Proteincodierender Gene durch die RNA-Polymerase II beschränken. Im Gegensatz zur bakteriellen RNAPolymerase kann RNA-Polymerase II ohne zusätzliche Proteinmoleküle nicht an DNA binden. Solche für die Polymerasebindung essenziellen Proteine werden Transkriptionsfaktoren genannt. Die RNA-Polymerase II von S. cerevisiae besteht selbst aus 12 Untereinheiten, die innerhalb der Eukaryoten hochkonserviert sind. Die beiden größten Untereinheiten (Rbp1 und Rbp2) entsprechen der β- und β’-Untereinheit der bakteriellen RNA-Polymerase. Das Dimer aus Rbp3 und Rbp1 entspricht funktionell der α-Untereinheit des bakteriellen Systems. Einige Faktoren übernehmen Aufgaben, die der σ-Untereinheit entsprechen (z. B. das TATA-Box-bindende Protein [TBP] oder die allgemeinen Transkriptionsfaktoren TFIIB und TFIIF). Die Regulation der Expression Protein-codierender Gene bei Eukaryoten ist komplex. Eine wichtige Rolle spielt dabei der Bereich von ca. 200 bp oberhalb des Transkriptionsstarts, der als Promotor bezeichnet wird und an den der Komplex aus RNA-Polymerase II und

Transkriptionsfaktoren bindet. Außerdem spielen auch noch andere DNA-Elemente (z. B. Enhancer, LocusKontrollregionen) und Chromatinstrukturen wesentliche Rollen. Die Transkriptionskontrolle Protein-codierender Gene wird ausführlich in Kapitel 7.3 besprochen. Der erste Schritt zum Start der Transkription (Abb. 3.7a) ist die Anheftung des TATA-Box-bindenden Proteins (TBP), das die TATA-Box eukaryotischer Promotoren erkennt. Die TATA-Box liegt 24‒32 bp oberhalb des Transkriptionsstarts und ist durch die Consensussequenz 5’-TATAA-3’ gekennzeichnet (nach ihren Entdeckern auch als GoldbergHogness-Box bezeichnet). Mit der Bindung des TBP kommt es zu einer starken Konformationsänderung der DNA, nämlich einem Abknicken um 80°. Nach der Anlagerung des allgemeinen Transkriptionsfaktors TFIID (engl. transcription factor for polymerase II, fraction D) ist der Weg frei für den weiteren schrittweisen Zusammenbau des gesamten Initiationskomplexes. Ein wichtiger Schritt am Ende der Initiationsphase besteht in der Phosphorylierung der carboxyterminalen Domäne (CTD) der großen Untereinheit der RNA-Polymerase II. Ihr wesentliches Charakteristikum ist die häufige Wiederholung (26-mal bei Hefen, 52-mal bei Säugern) des Heptapeptids -Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser-, wobei die Phosphorylierung bevorzugt an den Ser-Resten erfolgen kann (Abb. 3.7b). Dabei gibt es offensichtlich einen „CTDCode“ (Meinhart et al. 2005): Ser-5 ist in einem Promotor-nahen Zustand phosphoryliert und führt zum Aufsetzen der 5’-Kappe an der mRNA (Kapitel 3.3.4); Ser-2 ist phosphoryliert, wenn die RNA-Polymerase II weiter vom Promotor entfernt ist, und bewirkt die Aktivierung der Nacharbeit am 3’-Ende der mRNA. Für die Strukturaufklärung der eukaryotischen RNA-Polymerase II (Abb. 3.7c) erhielt Roger D. Kornberg 2006 den Nobelpreis für Chemie. Ein wesentlicher Aspekt dieser Arbeit bestand darin, durch die strukturelle Analyse (z. B. Nähe des Austrittsortes der neuen mRNA zur CTD-Domäne) auch Hinweise auf funktionelle Zusammenhänge zu erhalten (z. B. die Möglichkeit der „Nachbearbeitung“ der noch ganz frischen mRNA durch die CTD; Cramer et al. 2001). Sein Vater, Arthur Kornberg, erhielt 1959 den Nobelpreis für Medizin für die Charakterisierung der DNA-Polymerase I aus E. coli (S. 37).

3.3.4 Reifung eukaryotischer mRNA Die beiden Enden der jungen mRNA müssen nach der Transkription gegen Abbau geschützt werden, um so eine gewisse Stabilität des Moleküls zu erreichen (mögliche Abbaumechanismen werden im Kapitel 3.3.6

65

66 66

Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

Abb. 3.7 a, b Transkription Protein-codierender Gene bei Eukaryoten. a Initiationsphase: In stark vereinfachter Form ist der sequenzielle Zusammenbau des Initiationskomplexes am Promotor eines eukaryotischen Gens gezeigt. Im ersten Schritt bindet der Transkriptionsfaktor IID (TFIID) mit seiner Untereinheit TBP spezifisch an die TATA-Sequenz („TATA-Box“; daher auch TATABox-bindendes Protein, TBP); diese Bindung wird durch TFIIA unterstützt. Dazu gehören noch weitere TAFs (TATA-Box-assoziierte Faktoren); TFIIB stellt vermutlich eine Bindungsstelle mit der RNA-Polymerase II zur Verfügung. TFIIF ist an die hinzutretende Polymerase gebunden; TFIIH besteht aus 9 Untereinheiten. Nach dem Zusammenbau des Initiationskomplexes (unter Beteiligung von TFIIE) beginnt die Transkription an der Initiator-Region (Inr) mit der Phosphorylierung der mehrfach wiederholten Serin-Reste in der C-terminalen Domäne (CTD) der RNA-Polymerase II. Dadurch löst sich der Transkriptionsapparat von den allgemeinen Transkriptionsfaktoren und dem Promotor. b Struktur des Transkriptions-Initiationskomplexes. Röntgenstrukturanalysen und elektronenmikroskopische Daten ermöglichen eine Rekonstruktion der Einzelkomponenten (links oben) des Initiationskomplexes der Transkription. Der Komplex selbst ist rechts unten dargestellt. Die stabförmige DNA ist an ihren weiß-roten Spiralen zu erkennen; das TATA-Box-bindende Protein (TBP) hat die Startstelle besetzt, die Transkriptionsfaktoren B, E, H und F sind mit der RNA-Polymerase II (Pol) ebenso verbunden wie deren beiden Untereinheiten Rbp4 und 7 (4/7). (a nach Munk 2000, mit freundlicher Genehmigung von Springer); b nach Boeger et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

besprochen). Am 5’-Ende des mRNA-Moleküls wird ‒ noch während der laufenden mRNA-Synthese ‒ ein methyliertes Guanosin (7-Methylguanosin) als „Kappe“ angefügt (engl. cap; Abb. 3.8). Dazu wird vom ursprünglichen 5’-Triphosphat zunächst eine Phosphatgruppe abgespalten, sodass ein 5’-Diphosphat entsteht. Anschließend wird an dieses Diphosphat in umgekehrter Orientierung ein GMP angefügt, sodass das 5’-Ende des Guanosins dem 5’-Ende der wachsenden mRNAKette gegenübersteht; die beiden Nukleotide sind also durch eine 5’→5’-Triphosphatbrücke verbunden. Schließlich wird das hinzugefügte GMP an der Position 7 der Guanosinbase methyliert. Zuletzt werden auch die ursprünglich ersten ein oder zwei Nukleotide an der 2’-Position ihrer Ribose methyliert. Die Enzyme für die Anheftung der 5’-Kappe werden bereits von der CTD der RNA-Polymerase II herangezogen. Die 5’-Kappe verhindert, dass das 5’-Ende der mRNA durch Exonu-

kleasen abgebaut wird, sie unterstützt den späteren Transport der mRNA aus dem Zellkern und ist von großer Bedeutung für die Initiation der Translation. Allerdings erfolgt später die Translation nicht unmittelbar am Beginn der mRNA, sondern etwas unterhalb, sodass hier eine nicht-translatierte Region vorliegt (engl. untranslated region, UTR). Eine ähnliche Situation liegt übrigens auch am Ende der mRNA vor; auch hier wird ein Teil der mRNA nach dem Stoppsignal nicht übersetzt (3’UTR). Am 3’-Ende ist die mRNA polyadenyliert, d. h. sie ist mit einem Poly(A)-Schwanz versehen, dessen Länge ca. 250 Nukleotide umfasst. Die Polyadenylierung erfolgt nach dem Spleißen (Kapitel 3.3.5) des primären Transkripts ebenfalls im Kern. Sie erfordert ein Polyadenylierungssignal (AAUAAA) in der RNA, das etwa 12 bis 30 Nukleotide vor dem 3’-Ende der RNA liegt. Die RNA-Polymerase II, die für die Transkription aller eukaryotischen Protein-codierenden Gene verantwortlich ist, liest weit über die Enden der Proteincodierenden Regionen hinweg. Die korrekten Enden der mRNA-Moleküle werden durch eine Endonuklease erzeugt, die die mRNA-Vorstufe in der Nähe des Polyadenylierungssignals (5’-AAUAAA-3’) im 3’-terminalen Bereich schneidet und damit die Polyadenylierung durch eine Poly(A)-Polymerase (PAP) ermöglicht. Zusätzlich ist eine weniger genau definierte, meist

3.3 Transkription

CH 3 N

O

+

NH

N O O

P

O

NH 2

N

–

CH 2 O

O O

P

O

–

O

–

OH

OH

O NH 2 O

P

N

N

O N

N

CH 2 O

NH 2 N

O

O

O

P

O

CH 3

N

N

CH 2

–

OH

O

Zum Schutz vor Abbau durch Nukleasen erhält die neugebildete mRNA eine Methyl-Guanosin-Kappe am 5’Ende und einen Poly(A)-Schwanz am 3’-Ende.

N

O O

Eine Ausnahme von diesem Polyadenylierungsprozess machen die Zellzyklus-regulierten Histon-Gene, die keine Polyadenylierungssignale besitzen, sodass die Polyadenylierung unterbleibt. Das 3’-terminale Processing der mRNAs erfolgt mithilfe einer Region der Vorläufer-mRNA (prä-mRNA), die etwa 70 bis 90 Nukleotide vom Ende des Protein-codierenden Sequenzbereichs entfernt liegt (Abb. 3.9). Hier befindet sich zunächst eine invertierte Wiederholungssequenz, die ein Palindrom mit einer Stammlänge von etwa 6 bp zu bilden vermag. Etwa 13 bis 17 Nukleotide unterhalb folgt eine purinreiche Sequenz. Die Palindromsequenz ist evolutionär hochkonserviert und von Seeigeln bis zum Menschen identisch. Die purinreiche Sequenz besitzt eine auffallende Sequenzkomplementarität zu einer kleinen RNA, die im Zellkern vorkommt (engl. small nuclear RNA, snRNA; Kapitel 3.3.5); in diesem Fall handelt es sich um die U7-snRNA. Während des Reifeprozesses der mRNA werden Basenpaarungen zwischen der purinreichen Sequenz und der U7-snRNA gebildet. Das Palindrom bleibt als Bestandteil der Histon-mRNAs erhalten und spielt möglicherweise eine Rolle in der Zellzyklus-gesteuerten Translationskontrolle.

CH 3

Abb. 3.8 Messenger-RNA wird nach ihrer Synthese im Kern mit einer Cap-Struktur versehen. Hierzu wird am 5’-Ende der RNA über einen Triphosphorester ein Guanosin, jedoch in einer den übrigen Nukleotiden der RNA entgegengesetzten Orientierung, angefügt. Das Guanin dieses Nukleotids ist methyliert. Auch die folgenden 2 oder 3 Nukleotide können in unterschiedlichen Kombinationen Methylgruppen an der 2’-Hydroxylgruppe der Ribose aufnehmen. Diese Struktur wird an jeder eukaryotischen mRNA gefunden

GU-reiche RNA-Sequenz etwa 30 Nukleotide unterhalb der Schnittstelle am Polyadenylierungsprozess beteiligt. Die Polyadenylierungsschnittstelle ist in ihrer Sequenz nicht definiert, jedoch erfolgt der Schnitt oft nach einem Adenin. Am Polyadenylierungsprozess sind mehr als 20 Faktoren beteiligt; eine ausführliche aktuelle Darstellung findet sich bei Mandel et al. (2008) Der Poly(A)-Schwanz schützt (in Verbindung mit daran gebundenen Proteinen) die mRNA vor vorzeitigem Abbau durch Exonukleasen.

Das Poly(A)-Ende der mRNA erlaubt eine spezifische Isolierung der mRNA über affinitätschromatographische Verfahren, bei denen die Matrix mit kurzen Oligo-dT-Fragmenten beladen ist. Daran kann das Poly(A)-Ende binden, und nach dem Abtrennen anderer cytosolischer Bestandteile kann die mRNA in konzentrierter Form für verschiedene weitere Untersuchungsverfahren gewonnen werden. Kürzlich wurden in einem Hochdurchsatzverfahren alle mRNAs („Transkriptom“) von zwei menschlichen Zelllinien durchsequenziert. Das Ergebnis war überraschend, denn nur zwei Drittel der sequenzierten mRNAs konnten bekannten Genen zugeordnet werden – ein Drittel lag dagegen in Bereichen, in denen bisher keine Gene bekannt waren. Das deutet darauf hin, dass es möglicherweise doch eine größere Zahl von Genen gibt, als bisher angenommen wurde. Vermutlich handelt es sich dabei um Gene, die nur sehr schwach exprimiert werden (Sultan et al. 2008).

3.3.5 Spleißen eukaryotischer prä-mRNA Seit den 1970er-Jahren ist bekannt, dass die meisten eukaryotischen Gene in ihrer genomischen DNA zwischen codierenden Bereichen (Exons) DNA-Sequen-

67

68 68

Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen Abb. 3.9 Struktur des 3’-Endes einer Histon-prä-mRNA. Dem Ende der Protein-codierenden Region folgt eine bei allen Histon-Genen konservierte Sequenz in der mRNA, an die ein Protein bindet (engl. stem loop binding protein, SLBP). Wenige Basenpaare nach dem Ende der gepaarten Sequenz wird das 3’-Ende der mRNA durch eine Endonuklease erzeugt (dicke Pfeile). In einem Abstand von 13–17 bp, je nach Histon-Gen, hinter dem Zentrum der Haarnadel-Sequenz folgt eine ebenfalls in allen Histon-Genen konservierte Sequenz, die mit dem 5’-Ende von U7-snRNA Basenpaarungen eingehen kann. Die schmalen Pfeile deuten die Positionen an, bis zu denen das U7-enthaltende Produkt durch weitere Exonukleasen zurechtgeschnitten wird. Es ist (in schwarz, zwischen den grauen flankierenden Bereichen) die Sequenz der Maus-Histon-H4-12-prä-mRNA um die Hauptschnittstelle der Endonuklease (29 Nukleotide oberhalb bis 35 Nukleotide unterhalb) sowie ein Teil der U7-snRNA der Maus (Pos. 1–62) dargestellt. (Nach Kolev u. Steitz 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

zen enthalten, die man in der reifen mRNA nicht wieder findet (Introns). Sie werden aus den primären Transkripten herausgeschnitten (engl. splicing; im Deutschen hat sich dafür das Verb „spleißen“ eingebürgert). Die Transkripte verfügen erst nach dem Spleißen über ein durchgehendes offenes Leseraster (engl. open reading frame, ORF), das die Synthese der Proteinkette gestattet. Die meisten Protein-codierenden Gene von Eukaryoten zeigen eine derartige Exon-Intron-Struktur (Kapitel 7.1 und 7.2). Spleißen gibt es aber nicht nur bei der Reifung eukaryotischer mRNA, sondern ist ein weit verbreitetes Phänomen. Aufgrund der unterschiedlichen Spleißmechanismen unterscheiden wir vier verschiedene Gruppen von Introns: ï Die Introns der Gruppe I spleißen sich selbst (autokatalytisches Spleißen) und sind unter rRNA-Genen von Protisten, Mitochondrien von Pilzen, Bakterien und Bakteriophagen weit verbreitet. Die entsprechenden Vorläufer-RNA-Insertionen schneiden sich in einem Zwei-Schritt-Mechanismus unter Beteiligung eines externen Guanosinnukleotids selbst heraus. ï Die Introns der Gruppe II werden in Genomen von Bakterien und Organellen gefunden. Diese Introns verfügen zwar auch über die Fähigkeit des autokatalytischen Spleißens, aber der Mechanismus unterscheidet sich von denen der Gruppe I und ist durch eine Lassobildung charakterisiert.

ï Die dritte Gruppe ist die Spleißosom-abhängige Reaktion, wie wir sie bei den meisten eukaryotischen Genen finden; sie zeigt ebenfalls eine Lassobildung. ï Die vierte Gruppe betrifft Introns von tRNA-Genen im Zellkern von Eukaroyten und in Archaebakterien; diese Introns werden in einer ATP-abhängigen Endonuklease-Reaktion herausgeschnitten; dieser Mechanismus unterscheidet sich deutlich von den drei vorgenannten. Aufgrund der besonderen Bedeutung für die Eukaryoten wollen wir die Spleißosom-abhängige Reaktion im Detail betrachten. Das Spleißosom (engl. spliceosome) ist eine komplexe Struktur, die bestimmte Erkennungssignale an den 5’- und 3’-Enden der Introns verwendet. Die Erkennungssequenzen sind relativ einheitlich und umfassen etwa 9 Nukleotide an der 5’- und wenigstens 14 Nukleotide an der 3’-Seite des Introns. Beide Erkennungssequenzen liegen größtenteils innerhalb des Intronbereichs und haben in der DNA an der Schnittstelle am 5’-Ende stets ein GT, am 3’-Ende ein AG (GT-AG-Regel). Am Aufbau des Spleißosoms sind besondere RNAMoleküle beteiligt (snRNAs, engl. small nuclear RNAs, Abb. 3.10). Wie ihr Name sagt, handelt es sich bei den snRNAs um kleine RNA-Moleküle, deren Länge im Allgemeinen nur etwa 100 bis höchstens 300 Nukleotide beträgt. Wir lernen hiermit, nach der rRNA und

3.3 Transkription

U 130– C G A U G U A A AA U GA U G –20 U A A –60 G G U C U G C 120– G U U A U A AG C G A 50– U A A G A U 90 110 GG 100 AUCAAGUGUAGUAUCUGUUCUU A C G C CAUAUAUUAAAUGG AUUUUUG GAACAG 30 40 70– U A C G Sm C G C G C G –80 U U A U C

U2-snRNA

U U C C G G C 10– U C m 3 G PPP AUACGCUU

C G C G C U U U C C –160 C C UG

U G C U C U G U C –140 C A C U C C 150 160 A U U G A A C C GCAUCG CCUGG U

A G A CGUGGCCAGGACC U U C CA C C A 180 170

–

–

–

70 C A G C U U U C A C C G C G G U U1-snRNA A U 60– C G U –80 U C G G C G U G A 150 A G C C U G C G C U SL1 50– G C G A U –90 C 40 100 A AG C G G C AA G G UGGU –UCUCC CGA–UUUCCC U U A C A GCU AAAGGG C G U A U ACCA AGAGG C C U G G U AG A 110 20 G G C A U –120 140– G 30 130 C G G m 3 G PPP AUACUUACCUGG C AUA AUUUCUGGUAGUG 10

Sm

40 UUU

100 C G U

A A

A G U C A U G C G –110 U C A 130– C U U G G Sm A G CAAUUUUUG AC –

U C A G C A 90– G U U G A –60 C A U C UGAAAACUUUUCCCAAUACCCCG

U A U

70

80

120

C

G G A G A –140 C U GG

U4-snRNA

G CU A A A 20 C U U C U C U U 10– U G G U C U C m 3 G PPP AAA

A C

U

A A A U5-snRNA G –50 A U U U C C G U G G –60 A G A G G A C A 70 A U G C A G C 100– U C C C GU A G A Sm A G UUUCGUUCAAUUUUUUG A –

U U U C U 30– A A A AA U

U –40 C C

G A G G C G C G –50 A U U A U U G C

C

–

m 3 G PPP G

C

10– C G C G U U U

G A

A C C G A U G C U 20– A U G A C G G U

C G A

–

G A G U 30– A

U UU

–

G

CU

80

90

C

A C C A G –110 G U A UA

Abb. 3.10 Molekulare Struktur und Funktion der snRNAs. Die Nukleotidsequenzen und Sekundärstrukturen von U1-, U2-, U4- und U5-snRNAs sind dargestellt. Die 5’-Kappe ist durch die Abkürzung m3G angedeutet (2,2,7-Trimethylguanosin). Die farbig unterlegten Abschnitte sind für die Wechselwirkungen mit den Proteinen des Spleißosoms von be-

sonderer Bedeutung. SL1: stem loop 1. Die grün markierte Sm-Box bezeichnet spezifische Bindestellen für Proteine (Sm ist ursprünglich eine Laborbezeichnung für Antigene eines bestimmten Serums, das als „Sm-Serum“ bezeichnet wurde). (Nach Yong et al. 2004, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

der tRNA, eine weitere Klasse nicht Protein-codierender RNA-Moleküle kennen, die funktionelle Aufgaben in ihrer Eigenschaft als Nukleinsäuremoleküle wahrnehmen, nicht aber eine Funktion als Matrize für die Synthese von Proteinen besitzen. Einige snRNA-Typen sind in Tabelle 3.4 aufgeführt. Sie bilden nach ihrer Synthese kleine Ribonukleoproteine (snRNPs). Während ein Teil der snRNP-Partikel zunächst ins Cytoplasma wandert und dort größere

snRNP-Komplexe bildet, befinden sich andere snRNPs ausschließlich im Kern. Drei von ihnen, U3, U8 und U13, sind im Nukleolus (Kapitel 5.2.4) lokalisiert, während U6-snRNA im Kernplasma vorkommt. Die Anzahl der snRNA-Moleküle ist mit bis zu 106 Molekülen in jeder Zelle sehr hoch. Ihre Transkription erfolgt durch die RNA-Polymerase II. Lediglich U6-snRNA macht eine Ausnahme und wird, wie tRNA, durch die RNA-Polymerase III transkribiert. Sie nimmt

69

70 70

Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

Tabelle 3.4 Einige Beispiele für kleine RNA-Moleküle Bezeichnung

Länge (Nukleotide)

Transkription durch

Kopien/2n

Organismus

U1

164

RNA-Polymerase II

30 10 500 3–4

Mensch Maus Xenopus Drosophila

U2

188–189

RNA-Polymerase II

20–40 10 500 5

Mensch Maus Xenopus Drosophila

U3

216

RNA-Polymerase II

6

Maus

U4

142–146

RNA-Polymerase II

4

Drosophila

U5

116–118

RNA-Polymerase II

mehrere

Xenopus

U6

107–108

RNA-Polymerase III

200 3

Maus Drosophila

U7

58

RNA-Polymerase II

5

Seeigel

7SL

300 254

RNA-Polymerase III

3–4 2 1

Mensch Drosophila Schistosaccharomyces pombe

7SK

330

RNA-Polymerase III

≤ 10

Mensch

4,5S

90–94

RNA-Polymerase III

850 690

Maus Ratte

Nach Singer u. Berg (1991)

mit diesem abweichenden Transkriptionsmodus also nicht nur hinsichtlich ihrer ausschließlichen Lokalisation im Kern eine Sonderstellung ein. U6-snRNA unterscheidet sich von anderen snRNAs schließlich noch dadurch, dass sie keine 3-Methylguanosin-Kappe besitzt, sondern lediglich ein γ-Methylphosphat als 5’-Ende. U4- und U6-snRNA findet man häufig durch Basenpaarungen aneinander gebunden im gleichen snRNP-Partikel, während U6-snRNA in anderen snRNP-Partikeln auch alleine vorkommen kann. snRNAs zeichnen sich durch eine relativ große Stabilität aus, die in der Größenordnung der Zeit eines gesamten Zellzyklus liegt. Sie kommen stets in Verbindung mit Proteinen vor und bilden snRNPs mit bis zu 30 verschiedenen Proteinen, wie Lerner und Steitz (1979) festgestellt haben. Diese Partikel sind mit Sedimentationswerten von 10S bis 12S viel kleiner als Ribosomenuntereinheiten. Jeder snRNA-Typ bildet eine

spezielle Art von snRNP-Komplex, der aus mehreren verschiedenen Proteinen besteht. Verschiedene snRNPTypen unterscheiden sich dabei nicht nur in der darin enthaltenen snRNA, sondern zum Teil auch durch unterschiedliche Proteine. In der snRNA kommen verschiedene durch Methylgruppen modifizierte Nukleotide vor, z. B. 6-Methyladenosin oder Pseudouridin. Außerdem besitzen die snRNAs (ausgenommen U6) eine dreifach methylierte Kappe (m32,2,7-Cap) am 5’-Ende. Die Primärstruktur der snRNA erlaubt intramolekulare Basenpaarungen (Abb. 3.10). Solche Sekundärstrukturen sind evolutionär besonders konserviert. Das Spleißosom ist ein Ribonukleoprotein (RNP), das aus fünf kleineren RNPs und vielen assoziierten Proteinen sequenziell und dynamisch um die Vorläufer-mRNA aufgebaut wird (Abb. 3.11). Dabei fungiert das Spleißosom als ein Rückgrat, um die 5’- und die 3’-Schnittstelle im katalytischen Zentrum zu fixieren.

3.3 Transkription

a

b 5‘-Exon

5‘-Exon 5‘-Exon

U2AF 65 BBP U2AF 35 A Py AG 3‘-Exon

GU U1

Prp3p Sub2p

GU A

U1

ATP

AG U2AF 35 U2AF 65

Py

GU

Py

U1

U4

Kinasen

U6

Inhibitoren

ATP

5‘-Exon Py AG

Prp16p OH AG Py

ATP 3‘-Exon

UGA U5

ATP

U4

U2

e

5‘-Exon

c

3‘-Exon

U5 2 OH Py GU

U6

U2

U6

Phosphatasen

3‘-Exon

U5

Prp22p Prp43p

Prp28p Prp44p Prp2p

U1

Inhibitoren

U G A

U5

U2

U2

5‘-Exon

3‘-Exon AG U2AF 35 A U2AF 65

3‘-Exon

AG U6 U2

(Diospyrin)

d

Abb. 3.11 a–e Aufbau des Spleißosoms. a Die 5’-Spleißstelle wird durch U1-snRNP (grün), der Verzweigungspunkt durch BBP (engl. branch point binding protein; rot) und die 3’-Spleißstelle durch U2AF (engl. U2 snRNP auxiliary factor; blau) erkannt. b Die Bindung von U2-snRNP (rot) an den Verzweigungspunkt kann durch Inhibitoren von Kinasen und Helikasen blockiert werden. c Mit der anschließenden Bindung des U4-U5-U6snRNP-Komplexes (lila und türkis) ist das vollständige Spleißosom gebildet. Dieser Komplex ist in rechteckige Klammern gesetzt, da die spezifischen Wechselwirkungen des U4-U5-U6Komplexes mit der prä-mRNA noch nicht im Detail bekannt

sind. d Die Ablösung von U4 und U1 führt zur Aktivierung des Spleißosoms. Dieser Schritt benötigt die Dephosphorylierung mancher Proteine und kann daher durch Phosphatase-Inhibitoren gehemmt werden. e Die Umlagerung benötigt U2-, U5-, und U6-snRNP, und die gespaltene prä-mRNA ermöglicht die Ausführung des 2. katalytischen Schritts. Dieser Schritt kann spezifisch durch Diospyrin-Derivate blockiert werden. Der letzte Schritt ist die Freisetzung des Spleißprodukts und das Recycling der snRNPs. Das Spleißen wird durch eine Reihe von Prps unterstützt (engl. pre-RNA-processing proteins). (Nach Tazi et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Wir wissen, dass die prä-mRNA zusammen mit den snRNPs U2, U5 und U6 Strukturen bilden können, die beide Umesterungsreaktionen in einer Protein-unterstützten, RNA-abhängigen Form durchführen können. Viele konstitutive Komponenten des Spleißosoms sind von Hefen bis zum Menschen konserviert. Allerdings gibt es im Detail einige Unterschiede, die durch den größeren Umfang der Gene, die Zunahme der Introns und die geringere Konservierung der Spleißstellen in den humanen Genen bedingt sind. Obwohl die Phosphatgruppen beim Spleißen nicht verbraucht werden, ist das Spleißen ein ATP-verbrauchender Prozess; dies hängt damit zusammen, dass doppelsträngige RNAMoleküle entwunden werden müssen. Im Einzelnen kann man sich den Spleißmechanismus heute so vorstellen: Die snRNPs U1, U2, U4, U5

und U6 binden schrittweise an die prä-mRNA. Dabei dirigiert die Basenpaarhomologie das U1-snRNP zu den Sequenzen an der 5’-Spleißstelle, das Verzweigungspunkt-Bindeprotein an den Verzweigungspunkt der mRNA (engl. branch point), Hilfsfaktoren des U2-snRNPs an den Pyrimidin-haltigen Bereich und das konstante AG-Dinukleotid am 3’-Ende des Introns sowie die Bindung weiterer Spleißosom-assoziierter Proteine. Dieser erste Schritt ist für die initiale Erkennung der Spleißstellen und damit auch für die Regulation möglicher alternativer Spleißstellen von besonderer Bedeutung. Unterstützt durch Proteinphosphorylierung und weitere Proteine bindet das U2-snRNP über spezifische Basenpaarungen an den Verzweigungspunkt. Der Zusammenbau des Komplexes wird durch die Bindung des Dreifach-snRBPs U4-U5-U6

71

72 72

Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

weitergeführt und bildet zunächst eine Zwischenform, in der alle snRNPs an der prä-mRNA gebunden sind. Nach dem Eintritt des U4-U5-U6-snRNPs sind mehrere Umlagerungen des Spleißosoms nötig, um die beiden Umesterungsschritte der eigentlichen Spleißreaktion durchzuführen. Die Destabilisierung der U1und U4-snRNPs durch weitere Hilfsproteine führt zur Bildung der katalytisch aktiven Form des Spleißosoms, die nur U2-, U5- und U6-snRNPs enthält. Diese Struktur bringt die 2’-OH-Gruppe des Verzweigungspunktes in die Nähe des 5’-Phosphats und ermöglicht damit den ersten Schritt der Umesterung. Ein zweiter Schritt unter Beteiligung weiterer Hilfsproteine erlaubt das Ausschneiden des Introns durch einen Angriff auf die 3’-Phosphatgruppe an der Intron-Exon-Grenze durch die 3’-OH-Gruppe des geschnittenen Exons. Weitere Hilfsproteine sind nötig, um die endgültigen Produkte der Spleißreaktion freizusetzen, d. h. die Freisetzung der verbundenen Exons und des herausgeschnittenen Introns in einer Lassoform (engl. lariat). Spezifische Inhibitoren der Kinase, Phosphatasen oder der Hilfsproteine können die einzelnen Schritte bei der Bildung des Spleißosoms hemmen.

Die meisten eukaryotischen Gene bestehen aus Exons

und Introns. Die Introns werden durch Spleißen aus der Vorläufer-mRNA entfernt. Im Allgemeinen werden Introns bei Eukaryoten mit der Hilfe von Ribonukleoproteinkomplexen herausgeschnitten. Am Aufbau dieser Spleißosomen sind auch kleine RNA-Moleküle (snRNAs) beteiligt. Eukaryotische Zellen enthalten große Anzahlen solcher RNA-Moleküle, die verschiedenen Sequenztypen angehören und in ihrem Vorkommen teilweise auf bestimmte Bereiche der Zelle beschränkt sind.

Interessant ist der Weg der Entdeckung von snRNAs. Bestimmte Antikörper von Patienten mit einer Krankheit, die Systemischer Lupus erythematosus (SLE) genannt wird, reagieren spezifisch mit den snRNPs (Abb. 3.10: Sm-Proteine). Offensichtlich sind Autoimmunkrankheiten dadurch bedingt, dass der betreffende Organismus Antikörper gegen wichtige allgemeine Bestandteile seiner eigenen Zellen herstellt (Tan u. Kunkel 1966; Kapitel 8.4.3).

Über die Bedeutung der Introns, die in sehr vielen eukaryotischen Genen vorkommen, gibt es bis heute nur Spekulationen. Eine der am häufigsten erörterten Möglichkeiten bezieht sich auf die Beobachtung, dass Introns häufig verschiedene funktionelle Domänen eines Proteins voneinander

trennen. Man kann solche Domänen als evolutionäre Bausteine betrachten, die in unterschiedlichen Kombinationen zusammengesetzt werden können und dadurch Proteinstrukturen hervorbringen, die speziellen Funktionen gerecht werden. Ein Beispiel sind die verschiedenen Formen der Lamine, die in der Kernmembran vorkommen und wahrscheinlich durch eine Neukombination von Exons (engl. exon-shuffling) entstanden sind. Eine ganz normale zelluläre Funktion könnten Introns auch dadurch ausüben, dass ihr Spleißen die Möglichkeit zur posttranskriptionellen Regulation der Expression eines Gens bietet. So kodieren manche Introns des Cytochrom-bGens in Hefemitochondrien eine Maturase, die dadurch die Cytochrom-b Synthese regulieren kann. Ein ganz wesentliches Element des Spleißens besteht aber in der dramatischen Erhöhung der Vielfalt, die durch einen definierten DNA-Abschnitt in Proteininformation übersetzt werden kann. War man früher der Ansicht, dass aus einer prä-mRNA nur eine bestimmte mRNA entstehen kann (wie das beispielsweise bei den Globin-Genen der Fall ist; Kapitel 7.2.1), so wissen wir heute, dass viele Gene auch alternative Spleißprodukte ermöglichen, häufig verbunden mit einem unterschiedlichen Transkriptionsstart, und manchmal auch verbunden mit Veränderungen des Leserahmens. Ein schönes Beispiel ist der Opiat-Rezeptor bei Säugern (Abb. 3.12). Durch das „Ausprobieren“ alternativen Spleißens können auch aus Intron-Strukturen neue, funktionelle Exons generiert werden. Ein Beispiel dafür ist das Exon 1a des p75TNFR-Gens, das in den Altweltaffen (und dem Menschen) vor ca. 25 Millionen Jahren aus einem Alu-Wiederholungselement (Kapitel 8.2.3) in der genomischen DNA entstanden ist; das Alu-Element ist vor 58 bis 40 Millionen Jahren an die entsprechende Stelle des Genoms unserer gemeinsamen Vorfahren hineingesprungen (Abb. 3.13).

Die Bedeutung von Introns kann sowohl auf evolutionärer Ebene als auch auf der Ebene der Genregulation zu suchen sein. Alternatives Spleißen erhöht die Vielfalt der exprimierten und übersetzten Information beachtlich.

3.3.6 Editieren eukaryotischer mRNA Die bisherige Darstellung der Umsetzung genetischer Information der DNA in mRNA als ein informationstragendes Molekül, das im zellulären Stoffwechsel ver-

3.3 Transkription 1 a/b 13 16

14

3 5 2 a/b 15 e/d/e/b/a 4

Exon

11 12

Intron (kb)

E11 Promoter ~1,8 ~8 ~0,8 ~5 ~27 ~6 ~0,8 ~2 ~7,5

~8,5

10

~58

7 a/b

6

~66

~7,4

8

~34

9

~23

mMOR-1 mMOR-1A mMOR-1B1 mMOR-1B2 mMOR-1B3 mMOR-1B4 mMOR-1B5 mMOR-1C mMOR-1D mMOR-1E mMOR-1F mMOR-1G mMOR-1H mMOR-1I mMOR-1J mMOR-1K mMOR-1L mMOR-1M mMOR-1N mMOR-1O mMOR-1P mMOR-1Q mMOR-1R mMOR-1S mMOR-1T

Abb. 3.12 Schematische Darstellung der Struktur des Gens für den Opiat-Rezeptor μ der Maus (mMOR). Die Exons sind als Box dargestellt, die Introns nur durch Linien. Die beiden Transkriptionsstartstellen sind durch Pfeile markiert. Die Nummerierung

der Exons ist in der Reihenfolge ihrer Identifizierung angegeben. Die Start- und Stoppstellen der Translation sind durch Striche über den jeweiligen Exons angedeutet. (Nach Pan 2005, mit freundlicher Genehmigung von Ann Liebert)

arbeitet werden kann, hat uns den Eindruck vermittelt, dass die Protein-codierende Information stets vollständig im Genom enthalten ist. Diese Ansicht wurde allgemein vertreten, bis man an mitochondrialer DNA von Protozoen eine überraschende Entdeckung machte: Es bestand ein Unterschied zwischen der im Genom codierten Proteinsequenz und der entsprechenden Nukleotidsequenz in der funktionellen mRNA. Diese Befunde stammen insbesondere vom Erreger der Schlafkrankheit, Trypanosoma brucei und anderen verwandten Protozoen-Arten. Man spricht hier vom Editieren der RNA. Vergleichbare Prozesse wurden später auch in mitochondrialen und nukleären Transkripten anderer Organismen beobachtet, die mittlerweile von Viren über Protozoen, Schleimpilzen (Physarum),

Insekten und Säugern bis zu Pflanzen reichen. RNAVeränderungen, die durch posttranskriptionelles Editieren erzeugt werden, werden durch zwei verschiedene Mechanismen erreicht: ï Sequenzspezifische Deletion von Nukleotiden bzw. sequenzspezifische Insertion von Nukleotiden, die nicht in der DNA codiert sind. ï Enzymatische Veränderungen von Nukleotiden (C→U, A→I; I = Inosin). Diese verschiedenen Arten der RNA-Editierung (engl. editing) scheinen evolutionär nicht miteinander verwandt zu sein, und es wird vermutet, dass sie in der Evolution mehrfach unabhängig entstanden sind. Dafür spricht nicht zuletzt die Beschränkung auf

73

Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen a

mRNA I p75TNFR 5‘ UTR

3‘ UTR

Alu Jo Gen 5‘ UTR

3‘ UTR

mRNA II icp75TNFR 5‘ UTR

3‘ UTR

b A lu Jo icp75TNFR A lu Jo icp75TNFR A lu Jo icp75TNFR A lu Jo icp75TNFR A lu Jo icp75TNFR

RGCCGGGCGC GGCCGACTGC ---------C ACACGTGAGC CGGGCGTGGT CTAGCATGGT AGGCTGCAGT AGGCTGCAGT AAAAAA-AATAAGAA

GGTGGCTCAC AGTGGCTCAC CCAGGAGTTC TCAGGAGTTC GGCGCGCGCC GGCCCGAGCC GAGCTATGAT GAGCTATG--

GCCTGTAATC ACCTATAATC GAGACCAGCC GAGACCAGCC TGTAGTCCCA TGTAGTCCCA CGCGCCACTG ----------

CCAGCACTTT CCAGCACCTT TGGGCAAC TGGGCAAC GCTACTCGGG GCTACTCGGG CACTCCAGCC ----------

GGGAGGCC-G GGGAGGCCAG ATAGCGAGAC ATGGCGAAAC AGGCTGAG AGGCTGAG TGGGCGACAG --GGTGAAAG

AGGCGGGAGG AGGCGGGAAG CCCGTCTCTA CCCATCTCTA GCAGGAGGAT GTGGGAGGAT AGCAGAGACCT AGTGAGACCT

c

ATCGCTTGAG ATCACTTGAG CAAAAAATAC 7bp delTAA CGCTTGAGCC CGCTTGAGCG TGTCTCAAAA TGTCTCAAAA

---------GGTGGGAAGA AAAAATTAGC AGAAATCAGC CAGGAGTTCG CAGGAGTTGG AAAAAAAAAA AAAATTAAAA

69 80 138 151 216 229 296 285 302 293

n nsc

he

n

nse pa im

Me

Sch

Ma ka ken Stu mm ela ffe n Gib bo ns Ora ng -U tan Go rill a

n

Tot en ko pfa ffe n We ißk op fsa ki Wo lla ffe n

tte ose rm Ma

Ko bo ldm ak is

ure

n

p75TNFR

Lem

74 74

6 7 14 18 Ne uw elta ffen

fen ltaf we t l A

25 ORF Spleißstelle

40

Startcodon

Alu 58 63 Mio. Jahre

Abb. 3.13 a–c Entstehung eines neuen, funktionell aktiven Exons aus einem Alu-Element. a Gezeigt ist die Struktur des p75TNFR-Gens, eines Mitglieds der Superfamilie der TumorNekrose-Faktor-Rezeptoren. Das Exon 1a (rot) ist ein alternatives 1. Exon, das von einem Alu-Element (Kapitel 8.2.3) abstammt. b Vergleich der Sequenz des p75TNFR-Gens mit der Sequenz der Alu-Jo-Familie. Wenn man annimmt, dass Alu-Jo die Ausgangssequenz ist, genügt eine A–G-Substitution, um das Startcodon herzustellen; eine weitere C–T-Substitution für die Bildung der Spleißstelle; und eine 7-bp-Deletion, um einen

offenen Leserahmen herzustellen. Die roten Kästchen zeigen die Grenzen des Exons 1a. c Die phylogenetische Analyse des Exons 1a des p75TNFR-Gens bei Primaten zeigt, dass die AluInsertion vor etwa 58 bis 40 Millionen Jahren aufgetreten ist. Die A–G-Substitution ereignete sich relativ schnell danach und bildete das Startcodon. Die C–T-Substitution, die zur Bildung der Spleißstelle führt, sowie die 7-bp-Deletion, die den offenen Leserahmen bewirkt, traten vor etwa 40 bis 25 Millionen Jahren auf. (Nach Xing u. Lee 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

3.3 Transkription

wenige, meist phylogenetisch weit getrennte Organismengruppen; die beiden Hauptmechanismen sollen hier an Beispielen von Eukaryoten näher erläutert werden. Die enzymatische Veränderung von Nukleotiden erfolgt durch Deamidierung: entweder von C→U oder von A→I. Beide Prozesse erfordern Deaminasen (Cytosin-Deaminasen bzw. Adenosin-Deaminasen, Abk. ADAR von engl. adenosine deaminase acting on RNA bzw. CDAR von engl. cytosin deaminase acting on RNA). Die Deamidierung des Adenins ist wesentlich häufiger als die des Cytosins. ADARs wurden zuerst in Xenopus laevis entdeckt und später in vielen Metazoa (inklusive Säugetieren) kloniert und sequenziert (ADAR1 und ADAR2). ADARs wirken an RNA, die vollständig oder weitgehend als Doppelstrang vorliegt. Inosin, das aus dem ursprünglichen Adenosin gebildet wird, wird wie ein Guanosin translatiert. Damit verändert ADAR die Primärsequenzinformation der mRNA. Da allerdings Inosin mit Cytidin paart, können ADARs auch die Sekundärstruktur der doppelsträngigen RNA verändern, indem sie ein AU-Basenpaar in eine ACFehlpaarung umwandeln. Folglich können ADARs auch alle Prozesse beeinflussen, die sequenz- oder strukturspezifische Wechselwirkungen mit RNA eingehen. Es wurde bereits gezeigt, dass ADARs die Bedeutung von Codons verändern, Spleißstellen bilden und RNA zum Zellkern dirigieren. ADARs aus allen Organismen haben eine gemeinsame Domänenstruktur mit einer unterschiedlichen Anzahl von Motiven, die an Doppelstrang-RNA binden (dsRBMs, engl. double-stranded RNA binding motifs), an die sich eine hochkonservierte C-terminale katalytische Domäne anschließt. Organismen unterscheiden sich in der Zahl der exprimierten ADAR-Gene, und die ADARProteine wiederum unterscheiden sich in der Zahl ihrer dsRBMs und dem Abstand zwischen den verschiedenen Domänen. Die ADAR-Proteine 1 und 2 unterscheiden sich geringfügig in ihrer Substratspezifität (besonders in der Erkennung der spezifischen Zielsequenzen). Viele Beobachtungen deuten darauf hin, dass ADARs verschiedener Vertebraten funktionell homolog sind. Umgekehrt wurde noch keine RNA als Substrat der ADARs in Vertebraten identifiziert, die auch bei Invertebraten wie Würmern oder Fliegen ein Substrat wäre. Beispielsweise kommt die ADAR1 von Vertebraten im Gegensatz zu allen anderen ADARs auch mit einer langen N-terminalen Verlängerung vor, die zwei Bindedomänen für Z-DNA besitzt (S. 21). Die verlängerte Form wird über einen Interferon-abhängigen Promotor gesteuert und wird auch im Cytoplasma nachgewiesen (die „normalen“ Formen kommen dagegen im Zellkern

O

HN U

N

O N

ADAR

A N a

O NH

I

N

Ribose

N

N

O

NH N

U

N

HN

N HO

NH zDBD

N

Ribose

dsRBDs

C.D.D

Hs ADAR1 Hs ADAR2 Hs ADAR3 Ce Adr1 Ce Adr2 b

Dm Adar

Abb. 3.14 a, b A–I-Edition durch ADARs (engl. adenosine deaminases acting on RNA). a Die Zeichnung verdeutlicht, dass ADARs an lokal doppelsträngigen Bereichen einer RNA binden, die ADARs und ein Adenosin (A) deamidieren, das dadurch zu einem Inosin (I) wird. Das ursprüngliche Adenin hatte sich in der Doppelstrangsituation mit Uridin (U) gepaart. Da das Inosin aber dem Guanosin ähnlich ist, paart es sich unter Doppelstrangbedingungen mit Cytosin (C). Das betrifft vor allem die Anheftung der tRNA bei der Translation (Kapitel 3.4). b Ausgewählte Mitglieder der ADAR-Familie. Das humane Genom enthält 3 ADAR-Gene (Hs ADAR1–3). Sie unterscheiden sich in der Zahl der Doppelstrang-RNA-bindenden Domänen (dsRBDs) und der katalytischen Deaminase-Domäne (C.D.D); ADAR1 codiert zusätzlich noch für zwei Z-DNA-bindende Domänen (zDBD). Die ADAR-Gene, die von C. elegans (Ce) und Drosophila (Dm) kloniert sind, enthalten zwischen einer und zwei dsRBDs und eine C-terminale katalytische Domäne. (Nach Jepson u. Reenan 2008, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

vor). Daher wird für dieses Enzym auch eine Funktion in der Virusabwehr diskutiert. Wie in Abb. 3.14 gezeigt, sind die Zielsequenzen von ADARs doppelsträngige Strukturen in der noch unreifen RNA. Dazu gehören codierende Sequenzen, Introns und 5’- oder 3’-untranslatierte Sequenzen, aber auch kleine regulatorische RNA-Moleküle (Kapitel 7.5). Viele dieser editierten Stellen innerhalb codierender Regionen verändern die Bedeutung der Codons, sodass mehr als eine Isoform von einem einzigen Gen synthetisiert werden kann. Dadurch

75

76 76

Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

erhöhen ADARs erheblich die Komplexität, die das Genom bietet, und im Einklang mit dieser Hypothese ist die ADAR-Aktivität in den Geweben des Nervensystems besonders hoch. Beispiele dafür sind die verschiedenen Transkripte für Glutamat- und SerotoninRezeptoren. Mäuse, die die editierte R-Form des GluB-Rezeptors nicht bilden können, werden mit Epilepsie geboren und sterben innerhalb der ersten 3 Wochen. Weitere Beispiele sind Gene, die für Natriumoder Chlorid-Kanäle in Drosophila codieren. Die Deamidierung von Cytosin nach Uracil scheint wesentlich seltener zu sein und verläuft offensichtlich nach einem anderen Mechanismus. Im Gegensatz zu den ADARs arbeiten CDARs nach dem Spleißen (Introns unterdrücken die C→U-Edition). Auch die Ausbildung des Spleißosoms hemmt diese Form des Editierens. Es gibt einige sehr gut charakterisierte Beispiele für die C→U-Edition: Das erste (und damit das am besten untersuchte) Beispiel ist die Edition der mRNA für das Apolipoprotein B (Gensymbol: ApoB), weitere Beispiele sind die mRNAs des Gens für Neurofibromatose Typ 1 (Gensymbol: NF1) sowie für N-Acetyltransferase 1 (Gensymbol: NAT1).

Am Beispiel der ApoB-mRNA wurde gezeigt, dass die C→U-Deamidierung hochspezifisch erfolgt: ein Cytosin unter 14.000 Nukleotiden, die die mRNA insgesamt umfasst. Die minimale Sequenz, die zur Erkennung der Austauschregion notwendig ist, umfasst ca. 30 Nukleotide; allerdings spielt auch die Sekundärstruktur der mRNA eine wichtige Rolle. Die Edition der ApoB-mRNA verändert ein CAA-Codon zu einem UAA-Stoppcodon; das verkürzte ApoB-Protein wird als ApoB48 bezeichnet (Abb. 3.15). Beim Menschen ist die Edition auf den Dünndarm beschränkt; in der Leber wird das nicht editierte Protein (ApoB100) gebildet. ApoB100 und ApoB48 haben offensichtlich unterschiedliche Funktionen im Lipidstoffwechsel. Die C→U-Edition der ApoB-mRNA erfordert eine einzelsträngige mRNA mit genau definierten Charakteristika in der unmittelbaren Umgebung der Editionsstelle. Der funktionelle Komplex an der Editionsstelle besteht außer der spezifischen katalytischen Deaminase (die in diesem Fall als Apobec-1 bezeichnet wird) noch aus einem Komplementationsfaktor (ACF, auch als Kompetenz- oder Stimulationsfaktor bezeichnet), der als

Abb. 3.15 C–U-Edition der mRNA am Beispiel der ApoBmRNA. Die Position C-6666 wird zu einem Uridin umgewandelt, sodass anstelle des Glu-Codons CAA ein Stoppcodon (UAA) entsteht. Das verkürzte ApoB48-Protein verfügt nur noch

über die Domäne, die den Zusammenbau der Lipoproteine unterstützt; es fehlt die LDL-Rezeptor-bindende Domäne des ApoB100-Proteins. (Nach Chester et al. 2000, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

3.3 Transkription

ein Adapterprotein zwischen der Deamidase und der RNA fungiert. Es ist bisher unklar, wie weit verbreitet das Editieren der RNA wirklich ist und welche biologische Bedeutung ihm zukommt. Vielleicht sind Fälle, in denen biologische Konsequenzen einleuchten, hier aufschlussreich: Eine mRNA von Paramyxoviren (verantwortlich für Masern und Mumps) wird während der Transkription modifiziert. Das resultiert in einer Population verschiedener viraler Proteine, die durch unterschiedliche, nicht im Genom codierte Leseraster entstehen. Hierdurch könnte das Virus sich dem Immunsystem entziehen. Die Anzahl der bekannten Fälle von RNA-Editierung wächst ständig, und es bleibt abzuwarten, welche zusätzlichen Informationen hieraus noch verfügbar werden, die es uns gestatten, diesem Mechanismus seinen richtigen Platz in unserem Bild der Funktionen des Genoms zuzuweisen.

Durch RNA-Editierung kann mRNA posttranskriptionell durch die kontrollierte Veränderung von Nukleotiden in ihren codierenden Eigenschaften gezielt verändert werden.

Ein weiteres wichtiges Enzym mit Deaminase-Funktion wird als AID bezeichnet (engl. activation-induced deamidase). Es wurde im Zusammenhang mit der Antigen-getriebenen Vielfältigkeit der Immunglobulin-Antwort gefunden (Kapitel 8.4). Jetzt wurde in Mäusen nachgewiesen, dass AID bestimmte Translokationen (Kapitel 9.2.3) auslösen kann, die besonders häufig in einer bestimmten Krebserkrankung, dem Burkitt-Lymphom, auftreten können. Es wird diskutiert, inwieweit AID auch an der Entstehung anderer Krebserkrankungen beteiligt ist (für eine aktuelle Übersicht siehe Conticello 2008).

3.3.7 Abbau eukaryotischer mRNA Üblicherweise initiiert die mRNA ihren Abbau gemeinsam mit dem Beginn der Translation. Wie eine Streifenfahrkarte, die für eine bestimmte Zahl von Fahrten gültig ist, wird der Poly(A)-Schwanz der eukaryotischen mRNA während der Translation kontinuierlich verkürzt, bis eine kritische Untergrenze erreicht ist. Bei niedrigen Eukaryoten liegt sie bei etwa 10 bis 12 A-Nukleotiden, während sie bei Metazoen auch dop-

pelt so viele Basen umfassen kann. Diese Verkürzung vermindert die möglichen Bindungsstellen für das Poly(A)-Bindungsprotein (PABP). Dadurch wird auch die Ringstruktur der translatierten mRNA verändert, weitere Faktoren werden gebunden, die 5’-Kappe wird abgebaut und der Abbau der mRNA wird eingeleitet. Zwei funktionell redundante Mechanismen bauen die übliche mRNA ab: ein 5’→3’-Abbauweg, der die Entfernung der 5’-Kappe zur Voraussetzung hat (engl. decapping), und ein Exosom-vermittelter Abbau vom 3’-Ende her (3’→5’). Die Entfernung der 5’-Kappe erfolgt durch einen Komplex, dessen essenzielle Komponenten die beiden Proteine Dcp1 und Dcp2 sind (engl. decapping protein); dabei ist wohl Dcp2 die katalytische Untereinheit. Nach der Entfernung der Kappe wird die mRNA durch die 5’→3’-Exonuklease Xrn1 abgebaut. Im alternativen Fall werden zunächst die noch verbliebenen Adenin-Reste des Poly(A)-Endes entfernt und das Molekül dann durch einen aus 10 Untereinheiten bestehenden Komplex (das Exosom) vollständig abgebaut. In diesem Fall wird die Kappe am Schluss durch das Aufräum-Enzym DcpS entfernt. Eine schematische Darstellung gibt Abb. 3.16. 1979 wurde zunächst bei Hefen durch Regine Losson und Francois Lacroute ein interessanter Mechanismus entdeckt, der später auch bei vielen anderen Organismen gefunden wurde: Wenn Mutationen dazu führen, dass in der mRNA ein vorzeitiges Stoppcodon entsteht, wird diese mRNA unverzüglich abgebaut. Dieser Vorgang wird im internationalen Schrifttum als „nonsense-mediated decay“ (NMD) bezeichnet und ist seither Gegenstand intensiver Untersuchungen. Im Kern geht es dabei um die Frage, wie die Translationsmaschinerie das „vorzeitige“ von einem „echten“ Stoppcodon unterscheidet. Viele Hinweise sprechen dafür, dass die strukturelle Organisation der Faktoren, die in der 3’-UTR der mRNA binden, bei einem vorzeitigen Stoppcodon nicht in der Lage sind, zu einer schnellen und effizienten Freisetzung des gebildeten Proteins beizutragen (Kapitel 3.4.3). Dadurch können NMD-spezifische Faktoren an die mRNA binden, die Ribosomen ablösen und einen Abbau der mRNA über den Dpc1-Dpc2-Komplex einleiten. Dabei wird, wie oben beschrieben, zunächst die 5’-Kappe der mRNA entfernt und die mRNA vom 5’-Ende her abgebaut. Eine schematische Darstellung dazu gibt Abb. 3.17. Eine wichtige Antwort auf die Frage nach dem Unterschied zwischen einem „vorzeitigen“ und einem „echten“ Stoppcodon finden wir bei der genauen Analyse des Spleißvorgangs. Wenn das Spleißosom ein Intron entfernt, wird am Transkript 20 bis 24 Nukleotide oberhalb der Exon-Exon-Verbindung ein Protein-

77

Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

me7 G

40S AUG 3

4E

4A

b

a

4G

me7 G AUG

4E

AAAAAAA

AAAAAAA c me7 G

i

40S AUG 3

4E

4A

h

80S

4G

X

AUG

AUG

E

AAAAAAA

2

L

AUG

1

me7 G

P

4E

me7 G

40S AUG 3

4A

d g

R3

2

1

40S AUG 3

G

4E

80S me7

4G

4E

C

N P

40S AUG 3

G

A

e 4A

me7

R1

GAU

AAAAAAA

f

80S

4G

4A

80S

4G

A

R3 C

N

AAA

P

R1

GAU

A A

A me7 G

Cap

4E

eIF4E

3

mRNA 4G PABP

40S

R3

eIF3 4A

78 78

eIF4A

80S

40S ribosomale Untereinheit

C

N

eIFAG

R1

P

80S Ribosom eRF1

Abb. 3.16 a–h Lebenszyklus einer eukaryotischen mRNA im Cytoplasma. a Bindung des Elongationsfaktors 4E (elF4E) an die 5’-Kappe und des Poly(A)-Bindeproteins (PABP) an den Poly(A)-Schwanz. b Die Wechselwirkung des PABP mit elF4G führt zur Bildung der geschlossenen Schlaufe. c Der Start der Translation (Kapitel 3.4) verhindert die Entfernung der 5’-Kappe. d Die Wechselwirkung von PABP mit dem Terminationsfaktor eRF3 führt zur Verschiebung des Ribosoms vom 5’- zum 3’-Ende derselben mRNA. e Verkürzung des

2

1

eRF3 Ccr4p-Pop2pNotp-Komplex Dcp1p & Dcp2p

P

L

Lsm1-7p-Pat1p-Komplex Exosom

E X

Xrn1p 5' 3' Exoribonuklease

Poly(A)-Schwanzes durch den Ccr4p-Pop2p-Notp-DeadenylaseKomplex. f Verlust des PABP durch zu starke Verkürzung des Poly(A)Schwanzes. g Die Dissoziation aller Proteine von der mRNA führt zur Bindung des Lsm1-7p-Pat1p-Komplexes und zum Entfernen der 5‘-Kappe durch die Enzyme Dcp1p und Dcp2p. h Der Abbau der mRNA erfolgt in 5’–3’-Richtung durch die Exonuklease Xrn1p oder durch das Exosom in der Gegenrichtung (3’–5’). (Nach Mangus et al. 2003, mit freundlicher Genehmigung von BioMed Central)

3.3 Transkription

Transkription

Kern

ATG

Cytoplasma

Ter

AUG

Ter

Mit vorzeitigem Stoppcodon

Poly(A)-Bindeprotein

> 55 nt

c

m7G

AAAAAAAAA Spleißen & Verarbeiten der prä-mRNA

Kappe-bindender Komplex AUG m7G

3B EJC

3B EJC

Ter

AUG m7G

2 3AL 3B EJC

2 3AL 3B EJC

S

AAAAAAAAA mRNA-Export

AAAAAAAAA

Erste Runde der Translation eRF13

3B 3AL EJC

1

SURF

S

AUG

eRF13

SMG-1 1

Erkennung des vorzeitigen Stoppcodons

SMG-1

2

d

Ohne vorzeitigem Stoppcodon

Ter

2 3AL 3B EJC

m7G

Ter AAAAAAAAA

Phosphorylierung

a AUG

2 3AL 3B EJC

e

Ter

S

AUG

AAAAAAAAA

eRF13

m7G

2 3AL 3B EJC

m7G

SMG-1 2 1 P Ter 3AL 3B EJC

AAAAAAAAA

Erste Runde der Translation PP2A

5/7 2 3AL

2 3B 3AL

EJC

2

3B

EJC

3AL

f AUG

m7G

AAAAAAAAA AUG Ter

3AL

S

eRF13

b

SMG-1

m7G

1 P 5/7 PP2A Ter 3AL EJC

AAAAAAAAA

5/7 PP2A

Dephosphorylierung 3AL

g S

?

Ter AAAA A

mRNA-Abbau

Abb. 3.17 a–g Modellvorstellung des mRNA-Abbaus bei einem vorzeitigen Stoppcodon. Im Zellkern findet die Transkription sowie das Spleißen und Weiterverarbeiten der VorläufermRNA statt. Die reife mRNA wird in das Cytoplasma exportiert; die Exon-Exon-Verbindungen bleiben mit Proteinen markiert (EJC mit seinen Cofaktoren; grün). a Während der ersten Runde der Translation werden die EJCs von den Ribosomen verdrängt. b Sind alle EJCs durch Ribosomen verdrängt, läuft die Translation kontinuierlich weiter. c Bleiben aber nach der ersten Runde

A A

Kontinuierliche Translation

A

der Translation noch EJCs erhalten, wird diese mRNA als defektes Transkript markiert, indem die EJCs durch SMG-1 (schwarz), Upf1, eRF1 und eRF3 (braun) verdrängt werden. d–f Der gebildete SURF-Komplex wird phosphoryliert (Upf1 und SMG-2); dadurch wird ein Umbau der Proteinkomplexe an der mRNA eingeleitet und durch die Dephosphorylierung von Upf1 abgeschlossen. g Schließlich wird die mRNA nach der Entfernung der 5’-Kappe von beiden Enden her abgebaut. (Nach Yamashita et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

79

80 80

Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

komplex gebildet, um den offenen Leserahmen zu markieren (engl. exon-junction complex, EJC). Während der ersten Translationsrunde werden die EJCs von den Ribosomen verdrängt. Im Falle eines „vorzeitigen“ Stopps bleiben aber noch EJCs an der mRNA hängen und markieren diese damit als „defektes“ Transkript. Dadurch wird der enzymatische Abbau-Prozess in Gang gesetzt. Dieser Mechanismus sagt aber voraus, dass ein vorzeitiges Stoppcodon, das etwa 50 bp oberhalb des echten Stoppcodons erscheint, die entsprechende mRNA zum Abbau freigeben sollte. Dies geschieht aber nicht in allen Fällen ‒ offensichtlich ist der Ablauf noch deutlich komplizierter (Holbrook et al. 2004).

Der Abbau der mRNA erfolgt enzymatisch vom 5’-

und 3’-Ende aus. Bei Vorliegen eines „vorzeitigen“ Stoppcodons wird die mRNA in der Regel vorzeitig abgebaut (nonsense-mediated decay).

3.4 Translation Die Umsetzung der mRNA in die darin codierten Proteine wird als Translation bezeichnet. In Prokaryoten beginnt die Translation noch während der Synthese der mRNA. In Eukaryoten hingegen ist zunächst ein Transport der mRNA-Moleküle vom Kern ins Cytoplasma der Zelle erforderlich, da nur dort die Mechanismen zur Proteinsynthese verfügbar sind. Die Trennung des Ortes der Transkription vom Ort der Translation ist durch die Entstehung eines Zellkerns möglich geworden. Wahrscheinlich ist dieser Schritt entscheidend für die Evolution komplizierter Mehrzeller mit differen-

zierten Zell- und Gewebefunktionen gewesen. Die räumliche und zeitliche Trennung von Transkription und Translation gestattet nämlich über die reine Kontrolle der Transkription eines Gens hinaus die Entstehung vielfacher zusätzlicher Regulationsmöglichkeiten für die Expression von Genen. Diese erweitern die Anpassungsfähigkeit einer Zelle an unterschiedliche stoffwechselphysiologische Bedingungen beträchtlich. Verschiedene solcher Regulationsmechanismen werden im Zusammenhang mit der Struktur und Funktion einzelner Gene erörtert werden. An dieser Stelle sollen nur die Grundereignisse während der Translation von mRNA in Proteine dargestellt werden. Die Übersetzung der Nukleotidsequenz eines mRNA-Moleküls in die Aminosäuresequenz eines Polypeptids erfolgt an den Ribosomen. Ribosomen sind cytoplasmatische Partikel aus rRNA und Protein (Tabelle 3.5), sie dienen als Werkzeuge für die Translationsmaschinerie und sorgen dafür, dass die erforderlichen sterischen molekularen Konfigurationen für die mRNA-Ablesung und Proteinsynthese geschaffen werden. Für die Umsetzung der Nukleotidsequenz in eine Proteinsequenz ist Folgendes erforderlich: ï transfer-RNA-Moleküle, beladen mit den jeweils spezifischen Aminosäuren (Aminoacyl-tRNA), ï verschiedene Translations-Elongationsfaktoren, ï Guanosintriphosphat (GTP) als Energielieferant und ï das Enzym Peptidyltransferase.

Die Proteinsynthese in Prokaryoten erfolgt am wachsenden mRNA-Molekül am Chromosom, während sie in Eukaryoten an der mRNA in den cytoplasmatischen Ribosomen abläuft. Sie benötigt in beiden Fällen neben den Ribosomen mit Aminosäuren beladene tRNA (Aminoacyl-tRNA), Elongationsfaktoren, Peptidyltransferase und eine Energiequelle (GTP).

Tabelle 3.5 Zusammensetzung der Ribosomen Organismus

Untereinheit

Proteine

RNA

Nukleotide

E. coli

30S 50S

21 (S1–S21) 31 (L1–L34)a

16S-rRNA 23S-rRNA 5S-rRNA

1541 2904 120

Eukaryoten

40S 60S

33 49

18S-rRNA 28S-rRNA 5,8S-rRNA 5S-rRNA

1,6–2,4 kb 3,6–4,7 kb ca. 160 ca. 120

In Drosophila ist ein zusätzliches 2S-rRNA-Molekül in der 60S-Untereinheit enthalten. Vollständige E. coli-Ribosomen sedimentieren als 70S-Partikel, die Ribosomen von Eukaryoten als 80S-Partikel. a

In der Nummerierung L1–L34 sind einige Proteine enthalten, die keine konstitutiven Komponenten der 50S-Untereinheit sind.

3.4 Translation

3‘ Akzeptorstamm A76 C C 5‘ A 1G C G C G C U A G C Thymidin-Schleife DihydrouridinA U CU Schleife U A A 4 CUGCC s U8 G C A G A G G C G G C15 CUCG T54ψ C D U G A G C G 7 G A A C G mG G variable Schleife C G GG U A C G C G A38 Anticodon-Schleife C32 m6 A37 U33 C36 G A35 U 1 2 cmo5 U34 A 3 Abb. 3.18 Struktur der tRNA. Ein tRNA-Molekül besteht aus mehreren Regionen, die durch intramolekulare Basenpaarungen gekennzeichnet sind und daher als Schleifen bezeichnet werden. In der ebenen Projektion erinnert die Struktur an ein vierblättriges Kleeblatt. tRNAs enthalten viele seltene Nukleotide, die sich in bestimmten, genau festgelegten Positionen befinden. In einzelnen Teilbereichen des Moleküls ist die Anzahl der Nukleotide für verschiedene tRNA-Arten variabel. (Nach Agris et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier) In dieser tRNA kommen folgende modifizierte Nukleoside vor: s4U: 4-Thiouridin; D: Dihydrouridin; cmo5U: Uridin-5-oxy-Essigsäure; m6A: N6-Methyladenosin; m7G: 7-Methylguanosin; T: Ribothymidin; Ψ: Pseudouridin. Die gezeigte tRNA bindet an das Codon für Val (hellblau).

Als Voraussetzung für die Proteinsynthese muss zunächst die transfer-RNA für ihre Aufgabe vorbereitet werden. Die tRNA ist ein RNA-Molekül (Abb. 3.18), dessen Aufgabe es ist, die Codons der mRNA zu erkennen und in die entsprechenden Aminosäuren umzusetzen. Das geschieht mithilfe des Anticodons in der tRNA, einer Region aus drei Nukleotiden, die die zu einem Codon komplementären Basen besitzt. Durch Basenpaarung mit einem Codon in der mRNA kann sich das Aminosäure-beladene tRNA-Molekül (Aminoacyl-tRNA) am Ribosom an den mRNA-Strang binden und dadurch für den Einbau der vorprogrammierten Aminosäure in die wachsende Peptidkette sorgen. Die kristallographisch ermittelte Struktur der tRNA ist durch eine L-Form charakterisiert (Abb. 3.19). Hierzu ist es natürlich erforderlich, dass die tRNA die richtige Aminosäure verfügbar hat. Die Beladung der tRNA mit den Aminosäuren erfolgt durch Aminoacyl-tRNA-Synthetasen. Aminoacyl-tRNA-Synthetasen sind Enzyme, die die dem jeweiligen Anticodon zugeordneten Aminosäuren mittels einer Esterbindung an das 3’-Ende des tRNA-Moleküls binden. Die Art dieser Bindung ist für alle tRNAs identisch, da die letzten drei Nukleotide am 3’-Ende jeder tRNA einheitlich die Sequenz CCA-OH-3’ haben. Dieses Enzym bindet zunächst unter Bildung einer Peptidbindung zwischen der Carboxylgruppe einer Aminosäure und dem α-Phosphat von ATP die zugehörige Aminosäure und fügt diese dann mit ihrer Carboxylgruppe an die C-2- oder C-3-Hydroxylgruppe der Ribose des 3’-terminalen Adenosins der tRNA. Die Bindung der Aminosäuren an die zugehörigen tRNAs erfolgt mit sehr hoher Spezifität. Eine solche hohe Spezifität ist erforderlich, um den Einbau falscher Aminosäuren in die Polypeptidketten zu verhindern. Es gibt für jede der 20 klassischen Aminosäuren eine eigene Aminoacyl-tRNA-Synthetase, die ihrerseits befähigt ist, die Aminosäure auf alle durch die Degeneration des Codes

Abb. 3.19 Sterisches Modell der tRNA. Die verschiedenen Regionen mit Basenpaarung formen in der dreidimensionalen Struktur eine L-förmige Konfiguration. In der Mitte liegt eine scharnierartige Region, die die Beweglichkeit der Arme des Moleküls gegeneinander ermöglicht. (Nach Jonikas et al. 2009, mit freundlicher Genehmigung der RNA Society)

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82 82

Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

erforderlichen zugehörigen Isoakzeptor-tRNA-Moleküle zu übertragen. Die Aminoacyl-tRNA-Synthetase muss daher einerseits eine hohe Spezifität für eine bestimmte Aminosäure besitzen, andererseits aber auch die unterschiedlichen zugehörigen tRNAs exakt identifizieren können. Bei den geringfügigen molekularen Unterschieden zwischen den tRNA-Molekülen ist das eine erstaunliche Leistung des Enzyms. Wahrscheinlich bindet das Protein vor allem im „Scharnierbereich“ der tRNA und erkennt sterische Unterschiede im Inneren des L-förmigen Moleküls. Bei der Besprechung des genetischen Codes wurde bereits deutlich, dass zur Proteinsynthese üblicherweise nur 20 Aminosäuren zur Verfügung stehen. Aus 4 verschiedenen Nukleotiden (A, G, C, U) lassen sich jedoch in einem Triplettcode insgesamt 43 = 64 verschiedene Kombinationen ableiten. Nur drei dieser Basenkombinationen (UAG, UAA, UGA) werden für die Kennzeichnung des Abbruchs (der Termination) der Translation verwendet. Alle übrigen Codons codieren bestimmte Aminosäuren (Tabelle 3.1). Daher müssen verschiedene Aminosäuren mehreren unterschiedlichen Codons zugeordnet sein. Diese Erscheinung wurde bereits als Degeneration des genetischen Codes besprochen (Kapitel 3.2). Jede der 20 „Standard“-Aminosäuren (Tabelle 3.2) erfordert für ihre Bindung an tRNA eine spezifische Aminoacyl-tRNA-Synthetase. Es gibt, im Gegensatz zu den 61 verschiedenen Aminosäurecodons (Tabelle 3.1), nur etwa 50 verschiedene tRNAs in Eukaryoten (in E. coli nur 30 bis 40). Jede dieser tRNAs weist eine hohe Spezifität für eine bestimmte Aminosäure auf, vermag jedoch unterschiedliche Codons, die einer Aminosäure zugeordnet sind, zu erkennen. Ein wichtiger Grund für diese Fähigkeit, mehr als ein Codon zu erkennen, liegt in der Tatsache, dass die meisten Codons für eine bestimmte Aminosäure sich nur im dritten Buchstaben des Codons unterscheiden. Nach der Wobble-Hypothese spielt dieser dritte Buchstabe für die Erkennungsspezifität eine geringere Rolle als die ersten beiden Buchstaben des Tripletts (S. 57). In den übrigen Fällen der Codierung von Aminosäuren durch unterschiedliche Codons mit abweichenden Tripletts gibt es mehrere tRNAs, sogenannte IsoakzeptortRNAs (engl. isoacceptor tRNAs), für eine Aminosäure. Es verdient hierbei noch erwähnt zu werden, dass die verschiedenen Codons für eine bestimmte Aminosäure in unterschiedlichen Organismen unterschiedlich häufig verwendet werden.

Mithilfe von tRNA-Synthetasen werden die durch eine tRNA spezifizierten Aminosäuren durch eine Phosphodiesterbindung an die Ribose des 3’-terminalen Adenosins der tRNA gebunden. Die Bindung der Aminosäuren an die zugehörigen tRNAs erfolgt für jede Aminosäure durch eine spezielle Aminoacyl-tRNA-Synthetase.

Im Ablauf der Translation müssen wir drei Stufen unterscheiden: ï die Initiation der Translation, ï die Elongation der Peptidkette und ï die Termination. Diese drei Stufen sollen in den folgenden Abschnitten nacheinander besprochen werden, wobei wir jeweils Pro- und Eukaryoten parallel betrachten.

3.4.1 Initiation Als Initiation der Translation bezeichnet man die Bindung der ersten Aminosäure eines Polypeptids mithilfe der mRNA am Ribosom. Für eine erfolgreiche Initiation der Translation ist zunächst die Bindung der mRNA an ein Ribosom (Abb. 3.20) notwendig. Bei Prokaryoten (E. coli) erfolgt das an einer purinreichen Sequenz, die 8 bis 12 Nukleotide vor dem Initiationscodon AUG liegt. Diese Sequenz, die von J. Shine und L. Dalgarno (1974) identifiziert und daher auch ShineDalgarno-Sequenz genannt wird (Abb. 3.21), findet eine komplementäre homologe Region am Ende der kleinen (16S) ribosomalen RNA, die sich in der kleinen (30S) Untereinheit des Ribosoms befindet (Tabelle 3.5). Zunächst lagern sich die Translations-Initiationsfaktoren IF1, IF2 und IF3 sowie ein Guanosintriphosphat (GTP) der 30S-ribosomalen Untereinheit an. Danach kann die mRNA mit ihrer Shine-Dalgarno-Sequenz sowie ein fMet-tRNA-Molekül (Formyl-MethionintRNA) an die 30S-Untereinheit des Ribosoms gebunden werden. Die fMet-tRNA ist bei Prokaryoten für den Beginn der Proteinsynthese am AUG-Initiationscodon erforderlich. Bei der Bindung dieser verschiedenen Komponenten an die 30S-Untereinheit des Ribosoms wird der Initiationsfaktor IF3 freigesetzt, der durch seine Ladung zunächst die Zusammensetzung des funktionsfähigen Ribosoms (70S) aus den 30S- und 50S-Untereinheiten verhindert hat. Nach seiner Entfernung vom 30S-Initiationskomplex kann nunmehr durch Anlagerung der 50S-Untereinheit ein funktionsfähiges Ribosom gebildet werden. Die erforderliche Energie wird durch Umsetzung von GTP in GDP und Phosphat gewonnen, gleichzeitig werden auch die beiden Initiationsfaktoren IF1 und IF2 freigesetzt. Das

3.4 Translation

Abb. 3.20 Initiation der Translation bei Prokaryoten. Die 30S-Ribosomenuntereinheit (hellbraun) lagert sich unter Mitwirkung der Initiationsfaktoren IF1 (blau), IF2 (grün), IF3 (hellblau) und der Formylmethionyl-tRNA (fMet-tRNA) am AUG-Codon der mRNA an. Die Plattform der 30S-Untereinheit ist rot dargestellt; die anti-Shine-Dalgarno-Sequenz (aSD) blau. Die Bindung der 30S-Untereinheit an das AUG-

Initiationscodon erfolgt durch Wechselwirkungen zwischen komplementären Nukleotidsequenzen von rRNA und mRNA an der P-Stelle. Die 50S-Untereinheit (oliv) kommt hinzu, GTP wird hydrolysiert und die Initiationsfaktoren werden freigesetzt; der Translationszyklus kann beginnen. (Nach Simonetti et al. 2009, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

mRNA-Leader Initiationscodon

Shine-Dalgar no-Sequenz

5' – AUGUAC

UAAGGAGGU

UGU

3' –

UUCCUCCAA

GUA

AU G

GAA CAA – 3' – 5'

16S-rRNA (3'-Ende) Abb. 3.21 Funktion der Shine-Dalgarno-Sequenz bei der Bindung von mRNA am Ribosom. Durch eine Basenkomplementarität der Shine-Dalgarno-Sequenz mit einem Bereich nahe des 3’-Endes der 16S-rRNA wird eine kurze Doppelstrangregion kurz vor dem Initiationscodon in der mRNA geformt. Die-

se Ribosomenbindungsstelle wird benötigt, um eine korrekte Positionierung des Initiationscodons am Ribosom zu gewährleisten. Bei Eukaryoten ist die Shine-Dalgarno-Sequenz nicht vorhanden, sondern Initiationsfaktoren übernehmen funktionell deren Aufgabe

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Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

neu zusammengesetzte Ribosom besitzt drei Bindungsstellen, die P-Stelle (Peptidylbindungsstelle), die A-Stelle (Aminoacylbindungsstelle) und die E-Stelle (engl. exit site). Die fMet-tRNA befindet sich zunächst

Abb. 3.22 Eine cryo-elektronenmikroskopische Rekonstruktion eines 70S-Bakterienribosoms mit dem ternären Komplex (T; violett/rot) aus Aminoacyl-tRNA (aa-tRNA für GAC, codiert für Asp), dem Elongationsfaktor EF-Tu und GTP. Die aa-tRNA befindet sich noch im Decodierungsschritt (dc) und hat noch nicht die A-Stelle mit ihrer hohen Affinität für aa-tRNAs erreicht. Andere tRNAs an der P- bzw. E-Stelle sind grün bzw. orange. Die Bindestellen für die snRNAs L1 und L7/L12 sind angegeben. A/T: Position A, ternärer Komplex. (Nach Wittek u. Nierhaus 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Abb. 3.23 Die Peptidyltransferase-Reaktion. Die α-Aminogruppe der Aminoacyl-tRNA an der A-Stelle (rot) greift die Carbonylgruppe des Substrats an der P-Stelle (blau) an, um eine neue, um eine Aminosäure verlängerte Peptid-tRNA an der A-Stelle und eine deacetylierte tRNA an der P-Stelle zu bilden. Die 50S-Unterein-

an der P-Bindungsstelle. Nach Knüpfen der Peptidbindung mit der Aminosäure der Aminoacyl-tRNA an der A-Bindungsstelle wird die wachsende Peptidkette wieder an die P-Bindungsstelle verlagert (Abb. 3.22). Der entscheidende Schritt in diesem Zusammenhang, die Knüpfung der Peptidbindung (Peptidyltransferase-Reaktion), ist in Abb. 3.23 erläutert. Die beiden in den A- und P-Bindungsstellen befindlichen, nunmehr benachbarten Aminosäuren können mithilfe einer Peptidyltransferase-Aktivität durch eine Peptidbindung miteinander verknüpft werden: Das Peptid ist um eine Aminosäure verlängert. Gleichzeitig wird die Aminosäure vom ersten tRNA-Molekül freigesetzt, sodass dieses nunmehr als unbeladene tRNA vorliegt. Es sei an dieser Stelle angemerkt, dass die Peptidyltransferase kein Protein ist; diese Aktivität ist vielmehr in der großen Ribosomenuntereinheit angesiedelt ‒ die Peptidyltransferase ist ein Ribozym. Dieser Prozess verläuft in Eukaryoten im Prinzip ähnlich. Allerdings gibt es hier keine Shine-DalgarnoSequenz; die Bindung der mRNA an die kleinere Ribosomenuntereinheit (40S-Untereinheit) erfolgt vielmehr mithilfe der 5’-Kappe der mRNA (Abb. 3.24). An der Initiation sind mehr Initiationsfaktoren beteiligt als in Prokaryoten. Bisher sind wenigstens 12 eukaryotische Initiationsfaktoren (eIFs) bekannt. Das Initiationscodon ist ebenfalls AUG, jedoch benutzen Eukaryoten eine Met-tRNA anstelle einer fMet-tRNA für die Initiation der Translation. Einige der eIFs binden zu Beginn an die 40S-Untereinheit und bereiten sie damit auf die Bindung an die mRNA vor. Die an ein Methionin (Met) gekoppelte Initiator-tRNA bindet ebenfalls an die 40S-Untereinheit, bevor diese mit der mRNA in Wechselwirkung

heit, an der sich das Peptidyltransferase-Zentrum befindet, ist hellgrau dargestellt und die 30S-Untereinheit dunkelgrau; die EStelle ist grün. (Nach Behringer u. Rodnina 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

3.4 Translation

Abb. 3.24 Die Initiation der Proteinsynthese bei Eukaryoten. Sie beginnt mit der Vereinigung von zwei Komplexen: An die 40S-Ribosomenuntereinheit sind mehrere eukaryotische Initiationsfaktoren (eIFs) und die Initiator-tRNA gebunden; der andere Komplex enthält das 5’-Ende der mRNA, an das eine eigene Gruppe von eIFs gebunden ist. Sobald sich der Gesamt-

komplex an das 5’-Ende der mRNA geheftet hat, sucht er die Molekülkette ab, bis er auf ein geeignetes AUG-Initiationscodon trifft. Danach lösen sich einzelne Faktoren und stehen für eine Neuinitiation zur Verfügung; das 80S-Ribosom kann jetzt in die Elongationsphase eintreten (Abb. 3.27). (Nach Abbott u. Proud 2004, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

tritt. Dabei gelangt die Initiator-tRNA in Verbindung mit eIF2-GTP an die P-Stelle der Untereinheit. Danach wird das 5’-Ende der mRNA mit seiner 5’-Methylguanosin-Kappe über den eIF4G und dem Poly(A)-bindenden Protein (PAP) schlaufenförmig mit dem 3’-Ende der mRNA verbunden (Abb. 3.24).

Ribosomen. Sie sind an mRNA-Molekülen von etwa 1000 bis 1500 Nukleotiden Länge zu finden. Polysomen sind bei Eukaryoten im Allgemeinen am rauen endoplasmatischen Reticulum (ER) gebunden, das hierdurch seinen Namen erhalten hat. Sie können elektronenmikroskopisch aufgrund ihrer Größe leicht dargestellt werden (Abb. 3.25).

Zur Initiation der Proteinsynthese erfolgt zunächst die

Bindung eines Ribosoms an die Ribosomenbindungsstelle in der mRNA. Der eigentliche Beginn der Proteinsynthese erfolgt am Initiationscodon der mRNA unter der Mitwirkung von Initiationsfaktoren nach der Zusammensetzung des Ribosoms aus seinen beiden Untereinheiten.

Sowohl die Ribosomen als auch die Initiationsfaktoren können in Pro- und Eukaryoten für weitere Translationsinitiationsereignisse wiederbenutzt werden. Eine Initiation der Translation kann an einem mRNA-Molekül wiederholt erfolgen, noch bevor die Synthese eines zuvor initiierten Polypeptids beendet ist. Es entstehen dadurch die Polyribosomen oder Polysomen, bei denen mehrere Ribosomen mit daran wachsenden Polypeptidketten an einer einzigen mRNA gebunden sind. Die Anzahl von Ribosomen, die in einem Polysom verbunden sein können, sind von der Länge der mRNA-Moleküle abhängig und schwanken zwischen etwa 5 Ribosomen an kurzen mRNA-Molekülen wie etwa an den Globin-mRNAs in Retikulocyten bis zu 50 Ribosomen in besonders großen mRNA-Molekülen. Die mittlere Größe von Polysomen liegt bei etwa 10

3.4.2 Elongation Die Verlängerung der Polypeptidkette während ihrer Synthese am Ribosom bezeichnet man als Elongation (Abb. 3.26). Bei Bakterien bildet die nächstfolgende Aminoacyl-tRNA unter Beteiligung zweier Elongationsfaktoren ‒ EF-Tu und EF-Ts ‒ einen Komplex, der aus der Aminoacyl-tRNA selbst, dem Elongationsfaktor EF-Tu und einem GTP-Molekül besteht. Dieser Komplex bindet aufgrund der Basenpaarung zwischen dem Codon der mRNA und dem Anticodon der Aminoacyl-tRNA im freien A-Bindungsplatz am Ribosom. Die Bindung wird durch die Hydrolyse des GTP fixiert; EF-Tu und GDP werden freigesetzt. Die Regeneration des EF-Tu-GTP-Komplexes aus dem freigesetzten EFTu-GDP erfordert den Faktor EF-Ts. Bei Eukaryoten wird die Rolle von EF-Tu von dem Elongationsfaktor eEF1A übernommen (Abb. 3.27). Durch die GTP-abhängige Konformationsänderung eines weiteren Elongationsfaktors, EF-G, verschiebt sich das Ribosom um 3 Nukleotide (= ein Codon!) in 5’→3’-Richtung an der mRNA entlang.

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Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

Die E-Stelle wurde erst in den 1980er-Jahren entdeckt, nachdem die A- und P-Stelle schon wesentlich früher beschrieben wurden. Die E-Stelle schien zunächst nicht essenziell zu sein, aber die späteren Untersuchungen machten deutlich, dass die E-Stelle eine enorme Bedeutung für die Einhaltung des Leserasters hat. Die E-Stelle bewirkt, dass während der Elongationsphase immer zwei tRNAs an der mRNA gebunden sind. Wenn aufgrund einer Störung an der E-Stelle die Codon-Anticodon-Wechselwirkung aufgehoben wird, kommt es zu einem Verlust der tRNA an der E-Stelle und zu einer Verschiebung des Leserasters. Abschätzungen zeigen, dass ohne diese Stelle das Leseraster nach dem Einbau von 20 bis 50 Aminosäuren verloren ginge – so können natürlich keine größeren Proteine fehlerfrei synthetisiert werden! (Wilson u. Nierhaus 2003).

3.4.3 Termination

Abb. 3.25 Polysomenkette aus Speicheldrüsen von Chironomus tentans. Es handelt sich um eine besonders große mRNA, die in Balbiani-Ringen der Riesenchromosomen synthetisiert wird und für Proteine im Speichel der Larven codiert. Die einzelnen Ribosomen und ihre Untereinheiten mit den wachsenden Proteinketten sind zu erkennen. Der Markierungsbalken entspricht einer Länge von 2 μm. (Nach Franke et al. 1982, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Dabei wandert die tRNA mit ihrem angekoppelten Dipeptid von der A- zur P-Stelle, und die deacetylierte tRNA rückt von der P- zur E-Stelle. Anschließend verlässt die deacetylierte tRNA das Ribosom, sodass schließlich sowohl die A- als auch die E-Stelle wieder frei sind und ein neuer Zyklus beginnen kann. Die in diesen Reaktionen verwendeten Elongationsfaktoren werden in der Zelle wiederverwendet.

Für das Wachsen einer Peptidkette am Ribosom sind

Elongationsfaktoren und eine Peptidyltransferase (Ribozym!) erforderlich, die die Anlagerung der nächsten Aminoacyl-tRNA ans Ribosom und die Verknüpfung der Aminosäuren durch Peptidbindungen kontrollieren. Der Energieverbrauch einer Peptidbindung beträgt 2 Moleküle GTP.

Den Abbruch der Synthese einer Polypeptidkette am Ribosom bezeichnet man als Termination. Die Elongation der wachsenden Peptidkette wird in der zuvor beschriebenen Weise fortgesetzt, bis innerhalb des aktuellen Leserahmens eines der drei Terminations- oder Stoppcodons (UAG, UAA oder UGA) in der mRNA erreicht wird. Diese werden von Terminationsfaktoren (engl. release factors; RF) erkannt, die für den Abbruch der Peptidsynthese und die Freisetzung des Polypeptids sorgen. Dies führt dann zu einem Zerfall des Ribosoms in seine Untereinheiten und zur Ablösung der mRNA. Eine Übersicht für Prokaryoten zeigt Abb. 3.28. Wir können derzeit 2 Klassen von Terminationsfaktoren unterscheiden: Klasse-1-RFs erkennen das Stoppcodon an der ribosomalen Aminoacyl(A)-Stelle und bewirken die Hydrolyse der Esterbindung, die die Polypeptidkette und die tRNA in der Peptidyl(P)-Stelle verbindet. In Prokaryoten erkennt RF1 UAA und UAG als Stoppcodons, wohingegen RF2 spezifisch für UAA und UGA ist; der genetische Code für Mitochondrien und Mykoplasmen ist etwas unterschiedlich und enthält kein UGA-Stoppcodon. Dementsprechend enthalten sie auch nur einen RF, der dem bakteriellen RF1 entspricht. In Eukaryoten erkennt eRF1 alle 3 Stoppcodons. Die Klasse-II-RFs sind GTPasen und stimulieren die Klasse-I-Aktivität; damit wird der Abbau der mRNA abhängig von der Verfügbarkeit von GTP. In Eukaryoten ist eRF3 der entsprechende Klasse-II-Faktor. Die GTPHydrolyse ist notwendig, um die eRF1-Erkennung des Terminationssignals der mRNA mit der effizienten Freisetzung der Peptidkette zu verbinden. Die eRF1-Bindung imitiert die Bindung einer tRNA an ein normales Codon und unterscheidet dadurch ein „echtes“ Stoppcodon von einem falschen. Zusätzlich zu der Wechselwirkung mit

3.4 Translation Zurückweisung einer falschen tRNA undNeustart

GTP GDP GTP 5‘

GTP

3‘ E P A

CodonErkennung

Aktivierung der GTPase

GTP-Hydrolyse

Anlagerung und Korrekturlesen GTP

GTP

GTP

PeptidylTransferase

EF-G.GTP Bindung

GTP

GTP

GTP-Hydrolyse

nächste Runde EF-GFreisetzung

Translokation

Erklärung: 30S

P-Stelle tRNA

50S

A-Stelle tRNA

5‘

GTP

Abb. 3.26 Elongationsschritte während der Translation bei Prokaryoten. Eine Aminoacyl-tRNA (aa-tRNA), deren Anticodon komplementär zum zweiten Codon der mRNA ist, besetzt die leere A-Stelle des Ribosoms. Die Bindung der tRNA geht mit der Freisetzung von EF-Tu-GDP einher. Nach der Anlagerung erfolgt eine Überprüfung der aa-tRNA; eine falsche aa-tRNA wird zurückgewiesen, und es würde ein Neustart erforderlich. Durch die Übertragung der entstehenden Polypeptidkette von der tRNA an der P-Stelle auf die AminoacyltRNA an der A-Stelle wird durch die Peptidyltransferase die

3‘

EF-Tu-GDP-tRNA (tenärer Komplex)

mRNA

GDP

EF-Tu-GDP

GTP

EF-G

Peptidbindung geknüpft; das Ergebnis ist eine DipeptidyltRNA an der A-Stelle und eine deacetylierte tRNA an der PStelle. Nach der Bindung von EF-G und der Hydrolyse des mit ihm assoziierten GTP kommt es zur Translokation des Ribosoms relativ zur mRNA. Dieses Weiterrücken ist von einer Verschiebung der deacetylierten tRNA in die E- und der Peptidyl-tRNA in die P-Stelle begleitet. Anschließend löst sich die deacetylierte tRNA vom Ribosom, und eine neue Runde beginnt. (Nach Ramakrischnan 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Abb. 3.27 Elongation eukaryotischer Translation. Wenn der eukaryotische Elongationsfaktor 1a (eEF1A) mit GTP beladen ist, gibt er die Aminoacyl-tRNA an der A-Stelle des Ribosoms frei. Bei entsprechender CodonAnticodon-Wechselwirkung wird GTP hydrolysiert, und der eEF1-GDP-Komplex verlässt das Ribosom. eEF1A interagiert dann mit eEF1B, wobei der Austausch von GDP durch GTP die aktive Form des eEF1A regeneriert. (Nach Abbott u. Proud 2004, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

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Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

Abb. 3.28 Terminationsschritte der Translation bei Prokaryoten. Freisetzungsfaktoren (engl. release factors, RF) erkennen die Stoppcodons (RF1: UAA, UAG; RF2: UAA, UGA) und besetzen die A-Stelle. RF3 bindet GTP, und nach Hydrolyse der Esterbindung zwischen der noch vorhandenen tRNA und dem Polypeptid wird das fertige Protein freigesetzt. Das Ribosom

eRF1 interagiert eRF3 auch mit dem Poly(A)-Bindungsprotein (PABP), das damit auch einen Einfluss auf die Termination der Translation und den Abbau der mRNA hat (vgl. dazu auch S. 77 über nonsense-mediated decay).

Die

Termination einer Polypeptidkette erfolgt am Stoppcodon der mRNA. Hierbei sind Terminationsfaktoren beteiligt.

Kernaussagen ï Die genetische Information wird in der DNA durch die Reihenfolge von vier verschiedenen organischen Basen festgelegt. ï Die genetische Information eines Gens ist in einem Strang der DNA im Allgemeinen als Code aus vier Basen für die Synthese eines bestimmten Proteins niedergelegt. ï Die genetische Information wird bei Eukaryoten von der DNA mittels eines an ihr synthetisierten komplementären messenger-RNA-Moleküls (mRNA; Transkription) ins Cytoplasma übertragen.

zerfällt in seine Untereinheiten, die für eine neue Translationsrunde zur Verfügung stehen. Bei diesem Schritt sind der Ribosomen-Recycling-Faktor (RRF) und der Elongationsfaktor G (EF-G) wichtig; die Anlagerung des Initiationsfaktors 3 (IF3) führt zur Freisetzung der letzten tRNA. (Nach Ramakrischnan 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

ï Im Cytoplasma erfolgt an den Ribosomen nach der in der mRNA festgelegten Reihenfolge die Polymerisierung der Aminosäuren zu Polypeptiden (Translation). Hierfür sind Aminosäure-beladene transfer-RNA-Moleküle (tRNA) notwendig. ï Die Aufklärung des genetischen Codes und seiner grundlegenden Eigenschaften erfolgte unter Verwendung unterschiedlicher Methoden der Biochemie (z. B. Ribosomenbindungsstudien, Synthesen von Oligonukleotiden) und der Genetik (Mutagenese). ï Transkription dient der Übertragung der genetischen Information auf den Stoffwechsel der Zelle. An der Transkription sind neben der RNA-Polymerase mehrere Proteinfaktoren für die Initiation und Termination beteiligt. ï Translation dient der Übertragung der genetischen Information in Proteinmoleküle. Sie erfolgt an den Ribosomen, die sich bei Prokaryoten an der wachsenden RNA, bei Eukaryoten am endoplasmatischen Reticulum des Cytoplasmas befinden. Sie erfordert neben der Aminosäure-beladenen tRNA eine große Anzahl zusätzlicher Proteine, die für die Initiation, Elongation und Termination der Synthese von Proteinen sorgen.

Technik-Box

Technik-Box 4

Polymerasekettenreaktion (PCR) Anwendung: Vermehrung (Amplifikation) eines bestimmten Nukleinsäurebereichs, der durch zwei Oligonukleotide begrenzt wird.

kann. Voraussetzung ist die Kenntnis der Bindesequenz für die Primer; die Sequenz des Bereichs zwischen den Primern kann dabei unbekannt sein.

Voraussetzungen · Materialien: Die PCR (engl. polymerase chain reaction) beruht auf der Fähigkeit von DNAPolymerasen einiger Organismen (z. B. Thermus aquaticus, Abk. Taq), Temperaturen von rund 100 °C auszuhalten. Damit ist es möglich, nach dem Aufschmelzen doppelsträngiger DNA mithilfe zweier spezifischer Oligonukleotidprimer ein definiertes Fragment zu synthetisieren. Durch die zyklische Wiederholung von Aufschmelzen und Synthese wird eine exponentielle Amplifikation des gewünschten Fragments ermöglicht, sodass mit extrem kleinen Mengen gearbeitet werden

Methode: Der Reaktionsansatz enthält die DNA-Matrize (in der Regel entweder genomische DNA oder cDNA), die hitzestabile DNA-Polymerase, die zwei spezifischen Primer sowie alle vier Desoxynukleotidtriphosphate in einem geeigneten Puffer. Das übliche Schema (siehe auch Abbildung) sieht wie folgt aus: • Zunächst wird durch Erhitzen auf 95 °C die DNA aufgeschmolzen (30 s); • Durch Abkühlen auf die berechnete Bindungstemperatur der Oligonukleotidprimer (in der Regel zwischen 45 und 60 °C) wird eine spezifische,

1

2

Die schematische Darstellung der PCR beginnt im Zentrum mit dem Aufschmelzen der DNA und der anschließenden spezifischen Anlagerung der Primer an ihren jeweiligen Gegenstrang (1). Nach der Bindung der Primer startet die hitzestabile DNA-Polymerase (2). Der neue Zyklus beginnt mit dem erneuten Aufschmelzen der DNA (3), der Anlagerung der Primer und der erneuten Synthese des komplementä-

3

komplementäre Bindung der Primer an die Matrize ermöglicht (30 s); • Die DNA-Polymerase startet bei einer Temperatur von 72 °C und verlängert den Primer in 5’→3’-Orientierung (ca. 1 min pro 1000 bp); • durch Erhitzen auf 95 °C (30 s) wird die Reaktion gestoppt und die beiden DNA-Stränge wieder getrennt. Man kann diesen Synthesezyklus viele Male wiederholen (in der Regel 25–40mal) und erhält auf diese Weise große Mengen identischer Doppelstrangmoleküle, die durch die beiden Primer begrenzt sind. Besonders vorteilhaft an dieser Methode ist die Hitzestabilität der Taq-Polymerase; dadurch können die aufeinander folgenden Denaturierungs- und Hybridisierungsschritte einander abwechseln, ohne dass zwi-

4

ren Strangs (4). Bei n Zyklen führt dies zu einer 2n-fachen Vermehrung eines DNA-Fragments, dessen Enden durch die jeweiligen Primer definiert werden. Die Pfeilrichtung gibt die 3’o5’-Orientierung der DNA-Stränge an; die blauen und roten Stränge sind die ursprünglich vorhandenen Stränge; die Primer sind grün dargestellt und die neu synthetisierte DNA ist lila.

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Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

Technik-Box 4

Polymerasekettenreaktion (PCR) (Fortsetzung) schendurch neues Enzym beigefügt werden muss oder dass Reinigungsschritte erforderlich sind. Die PCR kann für eine große Anzahl unterschiedlicher Aufgaben in der Molekulargenetik eingesetzt werden, z. B.: • Größenbestimmung der Fragmente in der Gelelektrophorese (TechnikBox 3); • Sequenzierung des Fragments (hier ist zunächst die Abtrennung der beiden Primer notwendig, da sonst die Sequenzierreaktion gleichzeitig an beiden Seiten startet; TechnikBox 21);

• Klonierung des Fragments (besonders beliebt sind dabei Vektorsysteme, die mithilfe einer DNA-Topoisomerase eine direkte Klonierung des PCR-Fragments ermöglichen, ohne dass vorher eine Bearbeitung mit Restriktionsenzymen erfolgt; Technik-Box 8). Die PCR bietet eine Reihe von Variationsmöglichkeiten. In der Regel kann sie nicht dazu verwendet werden, quantitative Aussagen über die Menge der Matrize zu machen, da durch die Vielzahl der Amplifikationsschritte die Unterschiede verwischt werden.

Eine Möglichkeit ist jedoch die RealTime-PCR: Dabei wird die Bildung des entstehenden PCR-Produktes während der Synthese gemessen, was z. B. durch die Verwendung von Farbstoffen möglich ist, die nur an doppelsträngige DNA binden. Die Real-TimePCR hat einen hohen Stellenwert bei der Bestätigung von Ergebnissen zur Untersuchung differenziell exprimierter Gene (z. B. aus Mikroarrays, Technik-Box 30). Diese Verfahren können jedoch nicht in den konventionellen PCR-Geräten durchgeführt werden.

Technik-Box

Technik-Box 5

Markierung von DNA Anwendung: Markierung von DNA für Hybridisierungsexperimente. Methode: Die Markierung erfolgt entweder mit radioaktiven Isotopen (32P, 3 H, 14C oder 35S) oder mit Nukleotiden, deren Basen mit Makromolekülen gekoppelt sind, welche einen immunologischen Nachweis (z. B. Digoxigenin = DIG mit Anti-DIG-Antikörpern) oder eine Komplexbildung mit anderen Makromolekülen (z. B. Biotin mit Avidin oder Streptavidin) zu ihrem Nachweis gestatten. Nick Translation. In doppelsträngiger DNA vorhandene Einzelstrangbrüche werden durch E. coli-DNA-Polymerase I unter der Verwendung von markierten Nukleotidtriphosphaten in einer in-vitro-Reparaturreaktion aufgefüllt. DNA-Polymerase I entfernt aufgrund ihrer 5’o3’-ExonukleaseAktivität Nukleotide am freien 3’-Ende des DNA-Strangs an der Stelle des Ein-

zelstrangbruchs und füllt den Einzelstrang gleichzeitig in 5’o3’-Richtung durch ihre Polymerase-Aktivität replikativ auf, sodass markierte Nukleotide in die DNA eingefügt werden. Das Ausmaß der Markierung lässt sich durch den Einsatz von DNase I verändern, mit deren Hilfe eine geeignete Anzahl von Einzelstrangbrüchen in die DNA eingefügt werden kann. Durch Veränderung der DNase-I-Konzentration lässt sich das Ausmaß der DNase-IWirkung leicht kontrollieren. Random Priming. Eine höhere spezifische Aktivität der Markierung von DNA lässt sich durch Random Priming erzielen. Man macht hierbei von der Fähigkeit des Klenow-Fragments von E. coli-DNA-Polymerase I Gebrauch, an geprimter Einzelstrang-DNA einen komplementären DNA-Strang in 5’o3’-Richtung zu synthetisieren. Hierzu ist, wie für jede Replikation, ein Primer am neu zu synthetisieren-

den Strang erforderlich. Als Primer verwendet man hierzu meist eine Mischung von Hexanukleotiden (bisweilen auch längere Oligonukleotide) mit einer zufälligen Basenfolge. Doppelsträngige DNA wird zunächst denaturiert. Nach der Bindung dieser Oligonukleotide an die EinzelstrangDNA in einer Bindungsreaktion (Annealing), die einer Hybridisierung gleicht, fügt man in einem in-vitroSystem markierte Nukleotide und Klenow-Enzym hinzu. Das Enzym initiiert die DNA-Synthese an den Oligonukleotidprimern und synthetisiert unter Verwendung der markierten Nukleotide einen neuen DNA-Strang. Da die Primersequenzen aus zufälligen Nukleotidsequenzen bestehen, binden sie in genügend kurzen Abständen (ca. alle 0,5 bis 2 kb, je nach Primer) an die DNA, um eine vollständige Replikation aller DNA-Bereiche zu garantieren.

DNA-Moleküle sind rot, die neu eingefügten Stränge und die Primer blau dargestellt. Die markierten Nukleotide sind durch blaue Kreise angegeben.

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92 92

Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

Technik-Box 6

Isolierung von RNA, cDNA-Synthese und RACE Anwendung: cDNA ist Ausgangsmaterial einer Vielzahl genetischer Verfahren: Klonierung von cDNAFragmenten, Northern-Blot-Analyse, PCR-Analyse. Methode: Biologisch aktive RNA ist schwieriger zu präparieren als DNA, weil RNasen weit verbreitet (z. B. Hautoberfläche an Händen, endogene RNase im Gewebe) und schwer zu inaktivieren sind. Daher werden zur Präparation von RNA hoch erhitzte, sterile Glaswaren verwendet. Lösungen können auch mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) versetzt werden (Inaktivierung von Enzymen durch Bindung an Histidin-Reste; Vorsicht: gesundheitsschädlich!). Vor Gebrauch muss aber das DEPC selbst durch Hitze inaktiviert werden, da es sonst auch die zugeführten Enzyme zerstört (zerfällt in Ethanol und CO2). Durch hohe Konzentrationen von Harnstoff, Guanidinhydrochlorid oder Guanidinisothiocyanat werden ebenfalls Proteine denaturiert. Weiterhin gibt es auch enzymatische RNase-Inhibitoren, die in hoher Konzentration aus Rinderlinsen isoliert werden können (die Augenlinse braucht sehr langlebige mRNA!). RNA kann ähnlich wie DNA durch Phenolextraktion isoliert werden. Zur Isolierung von RNA aus Gewebe wird dieses zunächst in flüssigem Stickstoff schockgefroren (auch zur Vermeidung von RNase-Aktivitäten!), im Mörser zerrieben und in einem hochmolaren (4 M) Guanidinthioisocyanat-Puffer aufgetaut und homogenisiert. Das Homogenat wird mit 2 M Natriumacetat (pH 4) angesäuert und danach mit wassergesättigtem Phenol und Chloroform/Isoamylalkohol versetzt. Unter diesen Umständen geht die RNA in die wässrigen Phase, während Proteine und DNA in der organischen Phase verbleiben. Die RNA kann aus der oberen, wässrigen Phase

abgenommen und mit Ethanol gefällt werden. Noch vorhandene DNA kann mit RNase-freier (!) DNase abgebaut werden. Für die spätere Herstellung von cDNA (engl. copy-DNA) wird die mRNA über das vorhandene 3’-Poly(A)-Ende angereichert. Da die mRNA nur einen Anteil von 1–5 % der Gesamt-RNA ausmacht, ist ihre spezifische Anreicherung über eine Affinitätschromatographie mit immobilisiertem Oligo-dT notwendig (als Matrix wird Cellulose verwendet; die Länge beträgt etwa 20–50 Oligonukleotide). Es erfolgt eine spezifische Bindung über den Basenpaarungsmechanismus; mit hoher

Salzkonzentration kann die über ihr Poly(A)-Ende gebundene mRNA wieder abgelöst und mit Ethanol gefällt werden. Auch zur cDNA-Synthese macht man sich die Besonderheit der mRNA mit ihrem Poly(A)-Ende zunutze: Man benutzt ebenfalls Oligo-dT-Primer als Startstelle für die reverse Transkriptase (RT), die dann in Anwesenheit aller vier dNTPs (Desoxynukleotidtriphosphate) an der mRNA-Matrize einen komplementären Gegenstrang aus DNA aufbaut. Es entsteht ein DNA/ RNA-Hybrid. Durch Zugabe von RNase H, DNA-Polymerase I und DNA-Ligase (alle aus E. coli) wird der RNA-Strang

5'

mRNA

3'

5'

3'

P AAAAAAAAAA

Adapter 1 (–) OH

TTTTTT 5'

3'

DNA-Synthese (1. Strang)

(Reverse Transkriptase) [Primer oligo [dT] ]

5'

3' Adapter 1 (–)

AAAAAA

Adapter 1 (+)

TTTTTT

3'

5'

DNA-Synthese (2. Strang)

PCR (Taq-Polymerase) [Adapter 1 (–)]

5'

3' Adapter 1 (–) TTTTTT

Adapter 1 (+) 3'

5' PCR (Taq-Polymerase) Adapter 2 (+)

5'

3' Adapter 1 (–)

AAAAAA Adapter 2 (+)

3'

5' PCR (Taq-Polymerase)

Cycling 5'

3'

[Adapter 1 (–) und Adapter 2 (+)] 3'

Adapter 1 (–)

Adapter 2 (–)

Adapter 1 (+)

Adapter 2 (+) 5'

Technik-Box

Technik-Box 6

Isolierung von RNA, cDNA-Synthese und RACE (Fortsetzung) abgebaut und durch einen DNAStrang ersetzt: Die RNase H erzeugt Lücken im RNA-Strang, die durch die DNA-Polymerase I aufgefüllt werden. Noch vorhandene RNA-Abschnitte werden durch die 5’o3’-ExonukleaseAktivität der DNA-Polymerase I abgebaut. Die einzelnen neu synthetisierten DNA-Abschnitte werden durch die DNA-Ligase verknüpft. Ein technisches Problem bei der Präparation von cDNA ist die Isolierung von vollständigen cDNAs, da einerseits mRNAs häufig unvollständig sind (durch natürliche oder experimentell verursachte Degradation), die cDNA-Synthese mit reverser Transkriptase oft unvollständig verläuft und die Synthese des zweiten Strangs der DNA das zurückgefaltete 3’-Ende des ersten Strangs als Primer benutzt. Infolgedessen fehlt in vielen cDNA-Klonen das 5’Ende der mRNA. Die Ermittlung dieses 5’-Endes der mRNA stößt häufig auf Schwierigkeiten. Eine Lösung bietet die RACE-Technik (rapid amplification of cDNA ends). An das 3’-Ende des neu synthetisierten DNA-Einzelstrangs fügt man mit terminaler Desoxynukleotidyltransferase einen Homopolymerschwanz [Poly(dC) oder Poly(dG)] an. Ein hierzu komplementärer Primer, der zusätzlich einen geeigneten Klonierungsadaptor (Adaptor 1) besitzt, (also Poly(dG) oder Poly(dC) mit einer am 5’-Ende gelegenen Restriktionsenzym-Schnittstelle) ermöglicht dann die Synthese des zweiten DNA-Strangs

mittels DNA-Polymerase. In einem weiteren Schritt wird anschließend die doppelsträngige cDNA durch PCR vermehrt. Als Primer dienen dazu ein Oligonukleotid aus einem bekannten internen Sequenzbereich der cDNA, das zusätzlich am 5’-Ende eine Adaptorsequenz besitzt (Adaptor 2), und ein weiterer Primer, der zum Adaptor 1 komplementär ist. Die PCR-Produkte werden durch Gelelektrophorese nach ihrer Länge getrennt, und das gesuchte Produkt wird anschließend durch einen Southern-Blot identifiziert. Die betreffende DNA kann aus dem Gel isoliert, aufgereinigt und mittels der terminalen Restriktionsschnittstellen in den Adaptor kloniert werden. Diese ursprüngliche RACE-Technik hat jedoch verschiedene Nachteile. Einmal werden alle cDNA-Stränge, die mittels RT im ersten experimentellen Schritt synthetisiert werden, an ihrem 3’-Ende mit einem Homopolymerschwanz versehen, unabhängig davon, ob sie vollständige mRNAs repräsentieren oder nicht. Außerdem werden auch bei der Synthese des zweiten DNA-Strangs häufig unvollständige Moleküle synthetisiert. Das führt dazu, dass viele der doppelsträngigen cDNA-Produkte an beiden Enden unvollständig sind. Man hat daher eine Reihe von Verbesserungen der RACE-Technik ausgearbeitet, von der hier die RLM-RACE (RNA ligase-mediated-RACE; auch RLPCR – reverse ligation-mediated PCR – genannt)

erwähnt wird. Bei dieser Methode besitzen nur solche PCR-Produkte einen Adaptor am 3’-Ende, die das vollständige 5’-Ende der mRNA enthalten. Hierzu behandelt man in einem ersten Schritt die mRNA mit alkalischer Phosphatase (AP), die die 5’-Phosphatgruppen von degradierter RNA und von RNA ohne 5’-Kappe (d. h. rRNA, tRNA, 5S-RNA usw.) entfernt. Es verbleibt eine Hydroxylgruppe am 5’Ende der RNA. Nach Inaktivierung der AP behandelt man die RNA mit TabakPyrophosphatase (TAP, engl. tobacco acid pyrophosphatase), die die Anhydridbindung in der 7-Methyl-GpppKappe (Abb. 3.8) hydrolysiert. In dieser Reaktion werden mRNA-Moleküle mit Kappe in RNA-Moleküle mit einem 5’-Phosphat überführt, an welches anschließend mittels T4-RNA-Ligase 5’-Adaptor (Adaptor 1) ligiert wird, während Moleküle mit einer freien 5’-Hydroxylgruppe keine Ligation des Adaptors zulassen. Die erhaltenen RNA-Moleküle werden anschließend mit einem geeigneten 3’-Primer (z. B. Oligo-dT, falls vollständige cDNAs gewünscht werden, oder mit anderen internen Primern, wenn das 3’-Ende bekannt ist) und einem Primer, der komplementär zum Adaptor 1 ist, in cDNA umgesetzt. Auf diese Weise ist garantiert, dass man nur im 5’-Bereich vollständige mRNAs erfasst hat.

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Kapitel 3: Verwertung genetischer Informationen

Technik-Box 7

In-vitro-RNA-Synthese Anwendung: Gewinnung größerer Mengen einheitlicher, markierter RNA (z. B. zur in-situ-Hybridisierung, Technik-Box 25). Methode: Es gibt eine Reihe unterschiedlicher Verfahren zur in-vitro-Synthese von RNA. Als Beispiel soll hier die Synthese mithilfe von T3- oder T7-RNAPolymerase erläutert werden. Beide Polymerasen werden von den gleichnamigen Bakteriophagen gewonnen.

Sie initiieren die RNA-Synthese an jeweils einer spezifischen Promotorsequenz in doppelsträngiger DNA. Die RNA-Synthese verläuft sehr effizient und gestattet die Herstellung großer Mengen von RNA. Erfolgt die Transkription in Gegenwart markierter Nukleotide, so lässt sich RNA sehr hoher spezifischer Aktivität gewinnen. Manche Klonierungsvektoren besitzen auf den beiden Seiten des Polylinkers T3- oder T7-Promotorregionen. Hierdurch wird

BssH II T7

Z Lac MCS Lac I

Amp

94 94

ori

Sac II Xma II Not I Xba I Spe I Bam HI Sma I Pst I EcoR I EcoR V Hind III Cla I SalI/HincII/AccI Xho I Dra II Apa I Kpn I

T3 BssH II

es möglich, gezielt Transkripte jeweils nur des einen DNA-Strangs zu synthetisieren, sodass „sense-“ oder „antisenseRNA“ aus demselben Fragment hergestellt werden kann. Schneidet man die DNA vor der Transkription mit einem geeigneten Restriktionsenzym in der dem Promotor entgegengesetzten Polylinkerregion, so erfolgt die Transkription nur über die Länge des eingefügten DNA-Fragments, nicht jedoch in die anschließende Vektorregion hinein.

Die Abbildung zeigt einen Standardvektor (siehe auch Technik-Box 8) mit einer Polylinkerregion (engl: multiple cloning site; MCS). Diese Region enthält unter anderem Promotorregionen für die RNA-Polymerasen T7 und T3, die gegenläufig am Rande der Polylinkerregion angeordnet sind. Das gestattet es, mit beiden RNA-Polymerasen gegenläufige DNA-Stränge zu transkribieren. Man kann die Transkription dadurch auf den Bereich der eingefügten DNA begrenzen, dass man die Polylinkerregion mit einem geeigneten Restriktionsenzym hinter der DNA-Insertion (gesehen vom Promotor) schneidet. Die Polymerase kann über das Ende des DNA-Strangs natürlich nicht hinauslesen. Geeignet wäre z. B. ein Schnitt mit XhoI, wenn die Klonierung der eingefügten DNA in der EcoRI-Schnittstelle erfolgt ist und mit T7-RNA-Polymerase transkribiert wird. Amp: Ampizillin-Resistenzgen; LacZ/LacI: zur blauweiß-Selektion; ori: Replikationsstartpunkt.

Kapitel 4

Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene Inhaltsverzeichnis 4.1 Bakterien als genetisches Modellsystem . . . . . . . . . . 96 4.2 Extrachromosomale DNA-Elemente: Plasmide . . . . . . 103 4.3 Bakteriophagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 4.4 Transformation und Rekombination . . . . . . . . . . . . 118 4.5 Genstruktur und Genregulation . . . . . . . . . . . . . . . 126 4.6 Regulation im Genom des Phagen λ . . . . . . . . . . . . . 143

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von Bakterien (Escherichia coli). (Foto: U. Schwarz, Tübingen)

96 96

Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

Überblick Die wesentlichen Grundzüge der molekularen Genstruktur und -funktion sind an Prokaryoten aufgeklärt worden. Neben Genen von Escherichia coli (E. coli) haben hierfür besonders extrachromosomale genetische Elemente (Plasmide) und Bakteriophagen eine wichtige Rolle gespielt. Die Untersuchung der Bakterien- und Phagengene hat nicht nur den Schlüssel für den genetischen Code geliefert, sondern auch grundlegende Einsichten in die Feinstruktur und die Regulation von Genen im Stoffwechsel ergeben. Die Bakterien- und Phagengenetik ist daher eine wichtige Grundlage unseres heutigen Verständnisses der Molekulargenetik. Nach der Entdeckung der DNA und der Aufklärung der Trankription und Translation stellt sich die Frage nach der Feinstruktur der Gene und nach den Mechanismen, die die Expression von Genen in der Zelle steuern. Dafür gibt es zwei unterschiedliche Regulationsmöglichkeiten – die der positiven Induktion durch ein Induktormolekül und die der negativen Regulation durch ein Repressormolekül. Die genetische Analyse der Regulation mehrerer Gene des Lactosestoffwechsels bei E. coli ergab, dass sie eine Kontrollregion besitzen, die als Operatorregion bezeichnet wird. Wird an ihr ein Repressormolekül gebunden, kann in dem ihm folgenden Genkomplex keine RNA-Synthese stattfinden, da der Weg der RNA-Polymerase, die im Promotor an die DNA bindet, durch den zwischen Promotor

und Genbereich liegenden Operator mit daran gebundenem Repressormolekül behindert wird. Erst bei Hinzutreten eines Induktors, der den Repressor von der DNA zu entfernen vermag, wird die RNA-Synthese freigegeben. Die Polymerase ist in diesem Fall in der Lage, mehrere hintereinanderliegende Gene zu transkribieren. Man bezeichnet einen in dieser Form regulierten Genbereich als ein Operon. Bakterien werden aber nicht nur durch Nährstoffe im umgebenden Medium reguliert. Sie können über die Abgabe und Aufnahme kleiner Moleküle auch die Konzentration der eigenen Kolonie und möglicherweise auch die von anderen Bakterienstämmen in ihrer Umgebung erkennen. Dieser Prozess, der auch als Quorum sensing bezeichnet wird, erlaubt eine Zell-Zell-Kommunikation auch über Speziesgrenzen hinweg. Für viele prokaryotische Gene sowie für die Regulation des Genoms des Phagen λ erwiesen sich DNA-bindende Proteine als wichtige Elemente. Verschiedene solcher Regulationsproteine sind als Dimere (oder Tetramere) wirksam und haben eine vergleichbare Grundstruktur, die durch zwei miteinander verbundene α-Helixbereiche gekennzeichnet ist. Einer dieser α-Helixbereiche reagiert mit dem entsprechenden α-Helixbereich des zweiten Proteinmoleküls, während der andere sequenzspezifisch mit der DNA in Kontakt tritt.

4.1 Bakterien als genetisches Modellsystem Bakterien (Archaebakterien und Eubakterien) sind einzellige Organismen ohne Zellkern und unterscheiden sich dadurch grundsätzlich von den Eukaryoten. Bakterien (Prokaryoten) sind die kleinste unabhängige Lebensform. Ihre doppelsträngige DNA ist im Allgemeinen ringförmig angeordnet und wird als „Bakterienchromosom“ bezeichnet. Bakterielle Genome schwanken in ihrer Größe erheblich: Das kleinste Bakterienchromosom von Mycoplasma genitalium umfasst 580 kb; das bisher größte sequenzierte Chromosom von Bakterien, Bradyrhizobium japonicum, enthält 9,1 Mb. Neben dem Chromosom besitzt die Bakterienzelle meist noch extrachromosomale DNA in Form von Plasmiden, die in unterschiedlicher Kopienzahl in der Zelle vorliegen und auf denen häufig Gene lokalisiert sind, die der Zelle zusätzliche Fähigkeiten vermitteln (Kapitel 4.2). Lange Zeit hat man einen weiteren grundsätzlichen Unterschied zwischen den Genomen von Pro- und Eukaryoten darin gesehen, dass Prokaryoten ihre Erbinformation als „reine“ Nukleinsäurestränge vorliegen haben, Eukaryoten hingegen „echte“ Chromosomen besitzen, die sich besonders durch die obligatorische Verpackung der DNA in chromosomalen Proteinen

auszeichnen. Erst in den letzten Jahren hat man erkannt, dass auch die ringförmige DNA des klassischen bakteriellen Modellsystems, Escherichia coli, mit chromosomalen Proteinen assoziiert ist, die im Charakter den basischen Histonen der Eukaryoten entsprechen. Die DNA liegt in der E. coli-Zelle in Form von schleifenförmigen (negativen) Überspiralisierungen vor (engl. superhelix). Es ist daher allgemein gebräuchlich geworden, auch bei Prokaryoten von Chromosomen zu sprechen, wenn wir uns auf deren Erbmaterial beziehen. Unter den Bakterien hat das Darmbakterium Escherichia coli (E. coli; Bild siehe Kapitelanfang) für Genetiker eine besondere Bedeutung, da an diesem Modellorganismus eine Vielzahl grundlegender genetischer Mechanismen beschrieben wurde. E. coli wurde 1885 von Theodor Escherich im Kot von Kleinkindern entdeckt und zunächst als Bacterium coli commune bezeichnet; 1919 wurde es zu Ehren seines Entdeckers in Escherichia coli umbenannt. Die verschiedenen E. coli-Stämme sind Gram-negative, kurze Stäbchen mit peritricher Begeißelung. Der üblicherweise im Labor verwendete Stamm K12 ist nicht pathogen; andere Stämme können jedoch als Verunreinigung auf rohen Speisen für schwerwiegende Erkrankungen ver-

4.1 Bakterien als genetisches Modellsystem

antwortlich sein (z. B. E. coli O157:H7 als Auslöser blutiger Diarrhoe und von tödlichem Nierenversagen durch die Bildung des Shiga-Toxins). Der Vorteil der apathogenen Stämme von E. coli liegt vor allem in ihrer guten Kultivierbarkeit (kurze Generationszeit: 20‒30 min; einfaches Medium) und in der Möglichkeit, genetisches Material in Form von Plasmiden (extrachromosomale DNA; Kapitel 4.2) und über bakterielle Virussysteme (Bakteriophagen; Kapitel 4.3) auszutauschen.

Das Genom von E. coli besteht aus einem einzigen

ringförmigen Chromosom, das mit basischen chromosomalen Proteinen assoziiert ist. Der Austausch genetischen Materials über Plasmide und Bakteriophagen ermöglichte intensive genetische Studien.

Ein kurzer Abriss der Eckpunkte der E. coli-Forschung lässt sich auch als Sammlung von Glanzlichtern genetischer Forschung darstellen: ï Kreuzung von E. coli-Mangelmutanten (Sherman u. Wing 1937); ï Fluktuationstest (Luria u. Delbrück 1943); ï Entdeckung parasexueller Prozesse und Rekombination in E. coli (Tatum u. Lederberg 1947); ï erste Kartierung von E. coli-Genen (Lederberg 1947); ï Austausch genetischen Materials durch Bakteriophagen (Hershey u. Chase 1951); ï Entdeckung von Plasmiden als episomale, ringförmige, autosomal replizierende DNA (Lederberg et al. 1952); ï Festlegung der Reihenfolge der E. coli-Gene in einem zirkulären Chromosom (Jacob u. Wollman 1958); ï Beschreibung der Regulationsprozesse am lac-Operon (Jacob u. Monod 1961); ï Isolierung des lac-Repressors (Gilbert u. Müller-Hill 1966); ï Entdeckung der Restriktionsenzyme (Arber u. Linn 1969); ï erster gentechnisch veränderter Organismus (Cohen et al. 1973); ï vollständige Sequenzierung des E. coli-Genoms (Blattner et al. 1997). ï letzte „traditionelle“ Kopplungskarte von E. coli (Berlyn 1998). Für ihre Arbeiten zum Austausch genetischen Materials über Bakteriophagen und Plasmide bekamen Edward Tatum und Joshua Lederberg 1958, Max Delbrück, Alfred Hershey und Salvador Luria 1969 den Nobelpreis für Medizin; für ihre Arbeiten zur Regulation bakterieller Gene erhielten François Jacob und Jacques Monod den Nobelpreis bereits 1965. Werner

Arber wurde für seine Entdeckung der Restriktionsenzyme 1978 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet – ebenfalls für Medizin. Auch Walter Gilbert erhielt einen Nobelpreis, allerdings für Chemie im Jahr 1980 (für seinen Beitrag zur Entwicklung der DNA-Sequenziertechnik). Wir wollen einige der oben genannten Aspekte in den folgenden Kapiteln weiter vertiefen, wobei der Schwerpunkt auf der Darstellung grundsätzlicher genetischer Prinzipien aus heutiger Sicht liegt. Die Vererbung erworbener Eigenschaften wurde seit Lamarck (1809; S. 5) intensiv erörtert und konnte auch Mitte des 20. Jahrhunderts schon nicht mehr als reale Möglichkeit betrachtet werden. Dennoch lieferten Experimente mit Bakterien Ergebnisse, die zunächst eine Vererbung erworbener Eigenschaften als nicht völlig ausgeschlossen erscheinen ließen. Mutationen wurden nämlich in diesem Zusammenhang nicht als zufällige Ereignisse betrachtet, sondern als gezielte Anpassung an die Umwelt. Der Fluktuationstest von Salvador Luria und Max Delbrück (1943) schloss jedoch die Lamarck’sche Interpretation aus. Der Fluktuationstest geht von der Überlegung aus, dass bei einer Verteilung der Zellen einer Ausgangskultur von Bakterien auf eine große Anzahl von Subkulturen und anschließendem Wachstum neu entstehende Mutationen in einem selektierbaren Gen (z. B. eine Resistenz gegen ein Antibiotikum) sichtbar werden lassen. Wenn die Mutation durch ein Agens induziert wird, sollte die Wahrscheinlichkeit dafür in allen Subkolonien im Rahmen zufälliger Schwankungen gleich hoch sein. Wenn Mutationen zur Resistenz dagegen spontan entstehen, kann dies am Beginn, am Ende oder im Verlauf der Wachstumsphase erfolgen, sodass ein hoher Mutantentiter dann vorliegt, wenn die Mutation früh erfolgt ist, und ein niedriger bei später Mutation (daher Fluktuationstest). Die Anzahl der vorhandenen mutanten Bakterien kann man durch Plattieren eines Teils jeder Subkultur auf restriktivem Medium ermitteln. Im ursprünglichen Experiment wurden mit dem Bakteriophagen T1 (Kapitel 4.3) infizierte Bakterien verwendet und auf Resistenz gegenüber dem Phagen getestet. Der Test zeigt, dass die Mutationen spontan entstehen und nur aufgrund des Selektionsdrucks sichtbar werden (Abb. 4.1). Da Mutationen aber selten sind und zu jeder Zeit auftreten können, können sie natürlich auch erst nach der Änderung der Umweltbedingung entstehen. Nach Max Delbrück sprechen wir in diesem Fall von „adaptiver Mutation“ (im Gegensatz dazu wird eine Mutation als „gerichtet“ bezeichnet, wenn die nützliche Mutation präferenziell entstehen würde; für eine umfassende und aktuelle Darstellung siehe Rosenberg 2001).

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Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

Abb. 4.1 Der Fluktuationstest. Würden Mutationen durch das Medium (oder z. B. durch die Infektion mit einem Bakteriophagen erzeugt, so müssten alle Subkulturen im Mittel den gleichen Titer an Mutanten aufweisen (oben). Tatsächlich unterscheiden sich verschiedene Subkulturen einer Ausgangskukltur beträchtlich (unten), was darauf hindeutet, dass sie zu unterschiedlichen Zeiten in der Ausgangskultur entstanden sind, aber nicht nach der Subkultivierung unter Selektionsbedingungen induziert wurden. (Nach Luria u. Delbrück 1943)

Mutationen entstehen spontan und unabhängig von

den phänotypischen Konsequenzen. Mutationen werden sichtbar, wenn sie einen Vorteil (oder auch Nachteil) für den betroffenen Organismus haben.

Ein zweiter Aspekt, der in diesem Zusammenhang angesprochen werden soll, ist der Austausch und die Neukombination von genetischem Material in Bakterien, der später zu einem integrierten Konzept der Rekombination ausgebaut werden konnte (Kapitel 4.4). Ausgangspunkt der Arbeiten von J. Lederberg und E. L. Tatum (1946) war die Möglichkeit, Mutationen in biochemischen Stoffwechselwegen bei E. coli durch ein sehr einfaches Verfahren zu untersuchen. Dieses Verfahren beruht auf der Beobachtung, dass man bestimmte Mutationen bei Wachstum von mutagenisierten Bakterienzellen auf geeigneten Nährböden leicht isolieren kann. Lässt man Bakterien auf einem sogenannten Minimalmedium wachsen, das im Prinzip nur Salze enthält, so werden hier nur Zellen wachsen, die alle essenziellen Verbindungen selbst synthetisieren können. Man bezeichnet diese Art des Wachstums als prototroph. Mutanten, die essen-

zielle Verbindungen aufgrund ihrer Genomveränderung nicht selbst produzieren können, werden nur auf einem Kulturmedium wachsen, das die betreffende Verbindung oder eine geeignete Vorstufe enthält, mit deren Hilfe die von der Zelle benötigten Endprodukte synthetisiert werden können. Man bezeichnet diese Art Wachstum als auxotroph. Lässt man verschiedene Stämme mit unterschiedlichen Mutationen gemischt auf Minimalmedium wachsen, so können durch das Medium die benötigten Wachstumsfaktoren ausgetauscht werden und Zellen als prototroph erscheinen, obwohl sie eigentlich auxotroph sind. In diesem Falle würde der prototrophe Zustand wieder aufgehoben, wenn man die einzelnen Zellen voneinander trennt und sie einzeln in Kultur nimmt. Die Zellen erweisen sich dann als auxotroph. Lederberg und Tatum fanden jedoch in derartigen Experimenten, dass nach Kokultivierung von Zellen, deren einer Typ Biotin (B) und Methionin (M) zum Wachstum erforderte (Konstitution: B−M−P+T+), der andere Prolin (P) und Threonin (T) (Konstitution: B+M+P−T−), mit unerwarteter Häufigkeit prototrophe Kolonien auftraten. Isolierte man aus solchen prototrophen Zellkolonien Einzelzellen und testete sie auf ihre genetische Konstitution, so erwiesen auch sie sich als prototroph (Konstitution also: B+M+P+T+). Diese Konstitution konnte nur als das Ergebnis eines Austauschs von DNA-Abschnitten (Rekombination) angesehen werden, dessen Basis zunächst noch unverstanden war (für Details des Mechanismus siehe Kapitel 4.4). Dennoch war damit der Weg für eine genetische Kartierung des E. coli-Genoms durch Rekombination bereitet. Bereits ein Jahr später publizierte Lederberg eine erste, vorläufige genetische Karte des E. coli-Chromosoms, die 8 Gene enthielt. Er bewies damit, dass das genetische Material von Bakterien in einer den Kopplungsgruppen höherer Organismen ähnlichen Weise linear auf dem Chromosom angeordnet ist. („It was found that genetic markers behaved as if they were part of a system of linked genes. Some evidence for linear order of genes was obtained“; Lederberg 1947.)

Auch bei haploiden Bakterien wird Rekombination von Markergenen beobachtet, die offenbar zwischen Zellen unterschiedlicher genetischer Konstitution ausgetauscht werden können. Durch solche Rekombinationsereignisse kann das Bakteriengenom genetisch kartiert werden.

In den 1950er-Jahren erkannte man durch elegante Experimente von François Jacob und Ellie Wollmann am Institut Pasteur in Paris, dass das E. coli-Chromosom ein geschlossener Ring ohne freie Enden ist, auf dem die einzelnen Gene allerdings linear angeordnet

4.1 Bakterien als genetisches Modellsystem

Abb. 4.2 Allgemeine Darstellung des E. coli-Genoms. Die Start- und Endpunkte der DNA-Replikation, Origin bzw. Terminus, sind angegeben; blaue Pfeile außen deuten die Replikationsrichtung der beiden Replichore an. Der äußere grüne Ring zeigt die relative Expressionsstärke der Gene; darunter sind die rRNA- (blau) und die tRNA-Gene (rot) besonders hervorgehoben. Der blaue Ring zeigt, dass die berechnete Positionsprä-

ferenz mit der gemessenen Expressionsstärke korreliert. Der innere rote Ring gibt den CAI-Wert an (engl. codon adaptation index). Der CAI-Wert ist ein weiteres Maß für die Expressionsstärke, der aber nur für Protein-codierende Gene berechnet werden kann. (Nach Willenbrock u. Ussery 2007, mit freundlicher Genehmigung des Autors)

sind (eine Übersichtsarbeit dazu erschien 1961). Seither werden die genetischen Abstände auf der Genkarte in Minuten (1’‒100’) angegeben; diese Form der Darstellung ergibt sich aus den Zeiten, die für die Übertragung von Genen von einer Bakterienzelle auf eine andere benötigt wurde. Die Details werden im Kapitel 4.2.1 besprochen (Abb. 4.9). Die nächste Chromosomenkarte aus dem Jahr 1964 enthielt dann immerhin schon 99 kartierte Gene, 1983 waren es 881 und 1988 1027. Seit 1997 ist das Genom von E. coli (Stamm K12) vollständig sequenziert. Wir wissen, dass es 4,6 Mb umfasst und 4288 Gene enthält, die für Proteine codieren. Dazu kommen 7 rRNA-Gene und 86 tRNA-Gene. Der Abstand zwischen zwei Genen beträgt nur ca. 100 bp. Die codierenden Informationen liegen bei E. coli auf beiden DNA-Strängen, sodass die DNA sowohl im Uhrzeigersinn als auch im Gegenuhrzeigersinn transkribiert wird (Abb. 4.2). Die in der Datenbank niedergelegte Sequenz des E. coli-Chromosoms (Blattner et al. 1997) startet am „Origin“ (of replication) in der Region zwischen den Genen lasT und thrL. Die Start- und Endpunkte der Replikation unterteilen das Genom in zwei Hälften, die als „Replichore“ bezeichnet werden. Das Replichor I wird im Uhrzeigersinn repliziert und enthält den in der

Sequenzdatenbank angegebenen Strang als leadingStrang, im Replichor II ist das der Gegenstrang. Viele Gene von E. coli sind in derselben Richtung angeordnet, in der auch die Replikation voranschreitet: Alle 7 rRNA-Gene und 53 der 86 tRNA-Gene werden in Richtung ihrer Replikation exprimiert. Das gilt aber nur für 55 % aller Protein-codierenden Gene. Durch die Sequenzierung wurden auch einige bis dahin unbekannte Gene entdeckt, z. B. 7 neue tRNAGene und Gene für den Abbau aromatischer Verbindungen. Zusätzlich wurden 30 offene Leserahmen (engl. open reading frame, ORF) identifiziert, deren Funktion zunächst unklar blieb. Insgesamt codieren die offenen Leserahmen im Durchschnitt für 317 Aminosäuren. 4 ORFs davon codieren allerdings für 1500 bis 1700 Aminosäuren, aber 381 für Proteine, die aus weniger als 100 Aminosäuren bestehen. Protein-codierende Gene repräsentieren etwa 87,8 % des Genoms, 0,8 % codieren für stabile RNAs und 0,7 % enthalten nicht-codierende Wiederholungssequenzen. 11 % des Genoms werden regulatorischen und anderen Funktionen zugeordnet. Die Sequenzierung deckte auch frühere evolutionäre Prozesse auf, indem einigen Abschnitten mehr oder weniger gut erhaltene „Überreste“ von Phagengenen zugeordnet werden konnten.

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Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

Die Sequenzierung des Genoms von E. coli, die insgesamt etwa 6 Jahre in Anspruch genommen hatte, ist allerdings erst der Anfang zum detaillierten Verständnis der Funktion dieses Genoms. Abb. 4.2 zeigt nicht nur die ringförmige Struktur des E. coli-Chromosoms, sondern gibt auch einige Hinweise

auf die relativen Expressionsstärken der Gene sowie Möglichkeiten der Vorhersage. Der CAI-Wert (engl. codon adaptation index) ist eine solche Maßzahl und stark mit der Expressionsstärke von Genen in schnell wachsenden Bakterienkulturen korreliert. Er basiert auf dem Befund, dass nahezu alle stark exprimierten Gene die Codons der am häufigsten vorkommenden tRNAs benutzen. Entsprechend kann man für alle sequenzierten Bakteriengenome eine charakteristische Bevorzugung der Codons ableiten, die am effizientesten für die Translation sind. Entsprechend dieser Definition ist der CAIWert allerdings auf Protein-codierende Gene beschränkt. Durch die Angabe der Positionspräferenz wird versucht, diese Einschränkung aufzuheben. Die Positionspräferenz spiegelt die Häufigkeit eines Trinukleotids wider, bevorzugt in einer Region der DNA vorzukommen, wo die kleine Furche der DNA mit DNA-bindenden Proteinen in Wechselwirkung tritt. Diese Wechselwirkung mit Proteinen führt zu einer stärkeren Verdichtung; Regionen mit schwacher Verdichtung werden üblicherweise stärker exprimiert. Die Positionspräferenz beschreibt also eher eine allgemeine strukturelle Eigenschaft der DNA, nämlich ob sie sich leicht um DNA-bindende Proteine herumwinden kann oder nicht. Die CAI-Werte und die Werte der Positionspräferenz stimmen für E. coli weitgehend überein; Unterschiede werden an zwei Stellen deutlich (bei 0,45 Mb und 2 Mb). Hier sind Gene lokalisiert, die nur unter bestimmten Stoffwechselbedingungen stark exprimiert werden. Das bakterielle Chromosom ist ungefähr 1 mm lang, wohingegen die Größe der Bakterienzelle selbst in der Größenordnung von Mikrometern liegt. Daher ist es offensichtlich, dass die DNA in geeigneter Weise in kompakten Strukturen organisiert sein muss, um in der (relativ) kleinen Bakterienzelle Platz zu finden. Wir wissen Abb. 4.3 a, b Schematische Darstellung der Domänen des E. coli-Chromosoms. a Der Kreis repräsentiert die genetische Karte des Chromosoms; die genetischen Abstände sind in Minuten angegeben. Die farbigen Balken symbolisieren die verschiedenen Domänen (Ori: grün; links: dunkelblau; rechts: rot; Ter: hellblau), wohingegen die unterbrochenen schwarz-weißen Balken weniger strukturierte Regionen darstellen. Zur Orientierung sind einige Gene angegeben. b Das obere Modell zeigt, dass das ringförmige Chromosom aus vier stark strukturierten Domänen besteht (Ori, Ter, links und rechts) sowie aus zwei weniger stark strukturierten Regionen, die sich beidseits an die Ori-Region anschließen. DNA-bindende Faktoren sind durch kleine farbige Quadrate angedeutet. Das untere Modell zeigt die räumliche Konzentration der DNA aufgrund der DNA-bindenden Faktoren, wodurch DNA-Sequenzen in eine räumliche Nähe kommen, die sonst 1000 bp und mehr voneinander entfernt sind. Die Abwesenheit von DNA-bindenden Faktoren in den weniger strukturierten Regionen erlaubt der DNA eine gewisse Flexibilität und Wechselwirkung mit den flankierenden Makrodomänen. (Nach Boccard et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

4.1 Bakterien als genetisches Modellsystem

heute, dass das bakterielle Chromosom in vier größeren Regionen stark verdichtet ist; jede dieser Makrodomänen umfasst etwa 1 Mb. Außerdem gibt es zwei Bereiche, die offensichtlich weniger stark strukturiert sind; eine Übersicht über diese Domänenstruktur gibt Abb. 4.3.

Bakterien haben ein ringförmiges Chromosom; das

Chromosom von E. coli umfasst etwa 4,6 MB. Die Replikation beginnt an einem Startpunkt und verläuft bidirektional zu einem definierten Endpunkt. Beide Stränge codieren für Gene. Das Chromosom enthält vier Bereiche mit hoher Packungsdichte.

Als Ergebnis der enormen Menge an Information, die im letzten halben Jahrhundert an E. coli gesammelt wurde, haben wir jetzt sehr genaue Kenntnis über Genregulation, Proteinaktivitäten, Enzymreaktionen, metabolische Stoffwechselwege, makromolekulare Maschinen und regulatorische Wechselwirkungen. Um allerdings zu verstehen, wie all diese Prozesse untereinander in Wechselwirkung stehen, um eine lebende Zelle zu bilden, bedarf es weiterer Arbeiten: Quantifizierungen, Integration der Daten und mathematischer Modellierung ‒ kurz: Systembiologie. Kein Organismus kann zurzeit mit E. coli in Bezug auf die Menge an zur Verfügung stehenden Daten und experimenteller Zugänglichkeit konkurrieren. Wir können erwarten, dass uns dieser Organismus in den nächsten Jahren für die Modellierung und Simulierung einer ganzen Zelle die Türe öffnet. An dieser Stelle sollen auch einige Hinweise zur genetischen Nomenklatur bei E. coli gegeben werden. Prokaryotische Gene werden mit einem Kürzel aus drei kursiven Kleinbuchstaben bezeichnet, häufig mit Bezug zur Funktion des Gens. Diesem Kürzel folgt ein Großbuchstabe, der eine Differenzierung verschiedener Loci ermöglicht, die den gleichen Phänotyp beeinflussen (z. B. proA, proB). Werden neue Mutationen eines Gens isoliert, erfolgt ihre Unterscheidung durch eine zusätzliche Nummerierung (z. B. proA52). Der Phänotyp selbst wird durch das Kürzel in Normalschrift bezeichnet, dessen erster Buchstabe großgeschrieben wird (z. B. Prolin-auxotroph: Pro−). Soll ein Protein benannt werden, so wird das Kürzel in Normalschrift verwendet und der erste Buchstabe großgeschrieben (z. B. ProA, ProB). Eine Auswahl weiterer, sequenzierter Bakteriengenome enthält Tabelle 4.1. Zwei Beispiele sollen etwas ausführlicher vorgestellt werden: Mycoplasma pneumoniae (M129) enthält nur ein kleines Genom (816 kb) und besitzt keine Zellwand. Es ist vielmehr nur von einer Cytoplasma-Membran mit Cholesterol als essenziellem Bestandteil umgeben. M.

pneumoniae ist ein Humanpathogen, das eine „atypische Pneumonie“ bei älteren Kindern und jungen Erwachsenen hervorruft. Als Oberflächenparasit heftet es sich an die respiratorischen Epithelien an. Diese kleinen Bakterien sind besonders interessant, weil damit die minimale Ausstattung einer sich selbst replizierenden Zelle definiert werden kann. Daher wurde das Genom von M. pneumoniae relativ früh (Himmelreich et al. 1996) komplett durchsequenziert. Es hat einen G/C-Gehalt von ca. 40 % und eine durchschnittliche „Codierungsdichte“ von 90 %. Es wurden dabei 677 offene Leserahmen vorhergesagt. 76 % zeigen sehr große Ähnlichkeiten zu anderen bekannten Genen. Die Reduktion der Genomgröße ist ein Ergebnis der Evolution und wird durch den vollständigen Verlust anaboler Stoffwechselwege erklärt (z. B. keine Aminosäure-Synthese!). Daher pflegt M. pneumoniae einen obligat parasitären Lebensstil, der von der Zufuhr exogener Metabolite essenziell abhängt. Allerdings konnten zunächst die Gene für einige typische Funktionen (Bewegungsvermögen, Chemotaxis, oxidativer Stress) von M. pneumoniae nicht identifiziert werden. Auch durch den „Verzicht“ auf eine Zellwand konnte der Parasit die Zahl der notwendigen Gene verringern. Außerdem benötigt M. pneumoniae für verschiedene grundlegende Prozesse wie DNA-Reparatur, DNA-Rekombination, Zellteilung und Protein-Sekretion deutlich weniger Gene als komplexere Bakterien. Im Gegensatz zum Verlust kompletter Stoffwechselwege wurde aber auch oft die Amplifikation vollständiger Gene oder Gensegmente beobachtet sowie verkürzte Gene, die zusätzlich noch vollständig und aktiv vorliegen. Es wird vermutet, dass es sich hierbei um Relikte früherer Rekombinationsereignisse handelt. Schließlich sind unter den abgeleiteten Proteinen einige wenige, die überraschenderweise die größte Ähnlichkeit mit eukaryotischen Proteinen haben. Die wichtigsten Beispiele dafür sind Gene, die für den pre-B cell enhancing factor (pebf) und den Vorläufer der Carnitin-Palmitoyltransferase II (cpt2) codieren. Beide Gene können Beispiele für einen horizontalen Gentransfer sein, d. h. die Weitergabe genetischen Materials außerhalb der sexuellen Fortpflanzungswege und unabhängig von bestehenden Artgrenzen. Agrobacterium tumefaciens ist ein Pflanzenpathogen mit der einzigartigen Fähigkeit, einen definierten Abschnitt von DNA auf Eukaryoten zu übertragen, der dann in eukaryotische Genome integriert. Diese Fähigkeit des DNA-Transfers wird als wirkungsvolle Methode bei der Produktion transgener Pflanzen (z. B. Sojabohne, Mais und Baumwolle) genutzt. A. tumefaciens wurde als Ursache der Wurzelhalsgalle bei Pflanzen identifiziert, eines Tumors, der sich an der Eintrittsstelle des Bakteriums (kleine Wunde) bildet. Durch die pflanzlichen Wundreaktionen werden Signale erzeugt, die die Genregulation der Agrobakterien umprogrammieren. Die Induktion der Pflanzentumore benötigt dafür nicht

101

102 102

Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene Tabelle 4.1 Auswahl sequenzierter mikrobieller Genomea

a

Fortsetzung Tabelle 4.1

Name

Größe (Mb)

Institution

Jahr

Name

Größe (Mb)

Institution

Jahr

Agrobacterium tumefaciens C58

5,7

Cereon Genomics, Cambridge (USA)

2001

Mycoplasma genitalium

0,6

TIGR

1995

Bacillus antracis

5,1

The Institute of Genome Research (TIGR), Rockville

2003

Mycoplasma pneumoniae M129

0,8

Universität Heidelberg

1996

Bacillus cereus

5,4

Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Paris

2003

Mycoplasma pulmonis

1,0

Genoscope, Evry

2001

Sanger, TIGR

2000

4,2

BSNR (intern. Konsortium)

1997

Neisseria meningitidis

2,3

Bacillus subtilis

TIGR

1997

Universität Minnesota

2001

1,5

Pasteurella multocida

2,3

Borrelia burgdorferi B31

Universität Padua

2004

1,0

Institut für Molekulare Biotechnologie (IMB), Jena

2004

Photobacterium profundum SS9

6,4

Borrelia garinii PBi

Pseudomonas putida KT2440

6,2

TIGR

2003

Salmonella typhimurium LT2

5,0

Washington University, St. Louis

2001

Shigella flexneri 2a str.301

4,8

Mikrobiologisches Genom-Zentrum, Peking

2002

Caulobacter crescentus CB15

4,0

TIGR

2001

Chlamydophila pneumoniae J138

1,2

Universität Yamaguchi

2000

Escherichia coli K12

4,6

Universität Wisconsin

1997

TIGR

1995

Universität Juntendo

2001

1,8

Staphylococcus aureus Mu50

2,9

Haemophilus influenzae RdKW20

2,2

TIGR

2002

Helicobacter pylori 26695

1,7

TIGR

1997

Streptococcus agalactiae 2603V/R

INRA

2001

Eli Lilly & Co, Indianapolis

2001

2,4

Streptococcus pneumoniae R6

2,2

Lactococcus lactis subsp. lactis

2,1

Universität Kyoto

2005

Legionella pneumophilia str. Paris

3,64

2004

Thermococcus kodakarensis KODI

0,9

Genoscope

2003

Leptospira interrogans

4,63

Konsortium aus Sao Paulo

2004

Tropheryma whipplei str. Twist

Listeria monocytogenes EGD-e

2,9

Europäisches Konsortium

2001

Vibrio cholerae O1

4,0

TIGR

2000/ 2001

Sanger-Institut

2001

3,3

Sanger-Institut, Hinxton

2001

Yersinia pestis CO92

4,8

Mycobacterium leprae TN

Sanger

1998

Chinesische Militärakademie für Medizinische Wissenschaften

2004

4,4

Yersinia pestis biovar Medievalis str. 91001

4,8

Mycobacterium tuberculosis H37Rv

Institut Pasteur (Paris)

Gesamtzahl: 1094; Quelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi (Stand: Frühjahr 2010)

4.2 Extrachromosomale DNA-Elemente: Plasmide

mehr als 18 Stunden. Damit ist das pflanzliche Gewebe umdifferenziert und wächst krebsartig weiter. Ein besonderes Kennzeichen dieser Tumore ist, dass sie in Gewebekultur Phytohormon-unabhängig wachsen können. A. tumefaciens verfügt noch über eine weitere Besonderheit: Es enthält außer einem ringförmigen Chromosom auch noch ein lineares Chromosom (sowie zwei extrachromosomale DNA-Moleküle ‒ Plasmide, eines davon ist für die Tumorinduktion wichtig). Das Gesamtgenom hat eine Größe von 5,7 Mb und einen G/C-Anteil von ca. 60 %, ca. 90 % der DNA enthalten codierende Informationen. Das zirkuläre Chromosom (2,8 Mb) enthält einen Replikationsstartpunkt, wie wir es von Bakterien kennen. Das lineare Chromosom (2,1 Mb) hat dagegen einen Replikationsstartpunkt, der an eine evolutionäre Herkunft von Plasmiden denken lässt. Entsprechend sind auch die Gene für essenzielle Prozesse überwiegend auf dem ringförmigen Chromosom lokalisiert. Die Enden des linearen Chromosoms sind kovalent geschlossen und enthalten offensichtlich Haarnadelschleifen. Die Sequenz wurde im Jahr 2001 veröffentlicht (Goodner et al. 2001). Die wichtigsten Eigenschaften des Tumor-induzierenden Plasmids werden im Kapitel 4.2.2 besprochen. Im Frühjahr 2010 berichtete die Gruppe um Craig Venter vom ersten synthetischen Bakterium: dazu wurde DNA in der Größe von 1,08 Mb eines Mycoplasma mycoides – Bakteriums neu konstruiert, vollständig synthetisiert und zusammengesetzt – und dann in Mycoplasma capricolum als Empfängerbakterium übertragen. Die neuen Zellen enthalten nur noch das neue Genom (JCVI-syn.10 – nach John Craig Venter Institut), das durch etliche „Wasserzeichen“ und absichtliche Deletionen charakterisiert ist. Diese Zellen haben die gewünschten Eigenschaften und replizieren sich selbständig. Damit ist es zum ersten Mal gelungen, eine Zelle synthetisch herzustellen (Gibson et al., 2010).

4.2 Extrachromosomale DNA-Elemente: Plasmide Die DNA-Menge im prokaryotischen Genom und zugleich auch die Anzahl von Genen ist generell viel kleiner als in eukaryotischen Genomen (Abb. 1.3). Wohl aus diesem Grund findet man daher in vielen Prokaryoten nur ein einziges Chromosom. Das lässt die Zellteilungsmechanismen von Bakterien viel einfacher ablaufen als in eukaryotischen Zellen, in denen für eine genaue Verteilung der Chromosomen auf die Tochterzellen gesorgt werden muss (Kapitel 5.3.1). Ein weiterer wesentlicher Unterschied zu Eukaryoten ist, wie bereits herausgestellt, die Haploidie der Bakterien. Man würde daher erwarten, dass ein wichtiges Element der Evolution bei Eukaryoten ‒ die Erzeugung neuer Geno- und Phänotypen durch genetische Rekombination ‒ in Pro-

karyoten nicht vorkommt. Wie im letzten Abschnitt gezeigt, wurde von Lederberg und Tatum jedoch entdeckt, dass Rekombination auch bei Bakterien stattfindet. Wie ist das trotz des haploiden Zustands möglich? Bakterienzellen haben trotz ihrer Haploidie einen Ausweg gefunden, um Rekombinationsereignisse zur Veränderung ihrer genetischen Konstitution auszunutzen. Sie können nämlich eine Art sexuellen Prozess durchlaufen, durch den Rekombinationsereignisse induziert werden. Der sexuelle Prozess besteht in einer Paarung oder Konjugation zweier Bakterienzellen unterschiedlichen Genotyps mit einem anschließenden unidirektionalen Transfer des einen Bakteriengenoms in den Konjugationspartner. Konjugation ist nur möglich, wenn einer der Konjugationspartner ein (manchmal auch zwei) extrachromosomales ringförmiges DNAElement besitzt, das 94.500 bp lange F-Plasmid. Man bezeichnet solche extrachromosomalen doppelsträngigen DNA-Elemente allgemein als Plasmide (oder Episomen). Plasmide können sich unabhängig von der Replikation des Genoms der Bakterienzelle replizieren und liegen oft in mehreren identischen extrachromosomalen Kopien in der Zelle vor, deren Anzahl allerdings meist durch Gene in der Plasmid-DNA streng kontrolliert wird. In ihrem Stoffwechsel sind sie jedoch vollständig vom Stoffwechsel der Wirtszelle abhängig, da sie nur wenige Gene besitzen, die für die spezifischen Funktionen eines Plasmids verantwortlich sind.

Bakterienzellen besitzen oft extrachromosomale DNA-Elemente (Plasmide). Solche Plasmide wirken als Geschlechtsfaktoren und ermöglichen eine Konjugation von Bakterien, wobei sich jeweils eine Zelle mit Plasmid und eine ohne Plasmid paaren.

Allerdings gibt es ernst zu nehmende Argumente dagegen, dass der wesentliche selektive Vorteil für Bakterien bei der DNA-Aufnahme darin besteht, genetische Information aufzunehmen bzw. auszutauschen. Vielmehr ist der Austausch genetischen Materials nur ein Nebeneffekt, da sich offensichtlich keine Gene in der Evolution angereichert haben, die den genetischen Austausch bewirken. Denn oftmals haben die neuen genetischen Kombinationen schädliche Auswirkungen; allerdings sehen wir heute nur die überlebenden Formen, also die wenigen Ereignisse, die sich positiv ausgewirkt haben. Eine andere Hypothese, um die Aufnahme von DNA zu erklären, geht davon aus, dass die neue DNA primär als Nahrungsmittel genutzt wird (engl. nutrient hypothesis). Insbesondere gilt dies, wenn im Medium die Konzentration Purin-haltiger Nukleotide und Nukleoside sehr niedrig ist (Redfield 2001). Allerdings stellt sich bei Anwesenheit eines Plasmids das Problem der Gleichverteilung der genetischen Informa-

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104 104

Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

tion auf die beiden Tochterzellen in neuer Weise. Die Plasmide stellen dazu ein ausgefeiltes System zur Verfügung, um die genaue Verteilung ihrer DNA bei der Zellteilung zu gewährleisten. Die Plasmide codieren dafür par-Gene (engl. partitioning); sie kommen in zwei verschiedenen Typen vor: solche, die für Aktin-ähnliche ATPasen codieren, und solche, die für ATPasen des Walker-Typs codieren. Die Aktin-ähnlichen ATPasen (z. B. beim Plasmid R1) bilden dynamische Filamente,

die die jeweiligen Plasmide in die Mitte der Tochterzellen schieben. Wie Mikrotubuli zeigen diese Filamente eine dynamische Instabilität, deren Regulation eine wichtige Komponente während des Segregationsprozesses ist. Die anderen ATPasen vom Walker-Typ bilden hochdynamische, oszillierende Filamente, die für die subzelluläre Bewegung und Positionierung des Plasmids verantwortlich sind. In der Regel wird die Verteilung der Plasmid-DNA außer durch die ATPase noch durch ein DNA-Bindungsprotein vermittelt. Dabei baut das DNABindungsprotein einen Nukleoproteinkomplex auf, der den intrazellulären Plasmidtransport übernimmt. Dieser Mechanismus der Plasmidverteilung ist offensichtlich ein anderer als der, der für die Verteilung der chromosomalen DNA auf die beiden Tochterzellen benötigt wird, und eignet sich damit als ein neuer Angriffspunkt bei der Bekämpfung der Resistenzübertragung durch Plasmide. Ein Modell der Segregation der Plasmid-DNA zeigt Abb. 4.4 (für eine ausführliche aktuelle Darstellung dieses Prozesses siehe Ebersbach u. Gerdes 2005).

4.2.1 F-Plasmid

Abb. 4.4 a–e Modell zur Verteilung von Plasmid-DNA. a Nach der Replikation richten sich die Plasmid-Paare in der Mitte der Bakterienzelle aus; die Centromer-Bindungsproteine (gelb) binden dabei an die Teilungsstellen (rot). b Das ParA-Protein (blau) ergänzt diesen Teilungskomplex, der auch als Segresom bezeichnet wird. c Als Folge der ATP-Bindung polymerisiert das ParA-Protein in beide Richtungen zwischen den Segresomen und schiebt dabei die beiden Plasmid-Stränge in unterschiedliche Richtungen auseinander. d Dabei moduliert das Centromer-bindende Protein die Organisation des ParA-Filaments. e Nach der Zellteilung sind die Plasmid-Stränge gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt, und das ParA-Polymer wird abgebaut. (Nach Hayes u. Barillà 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Das F-Plasmid wird nur einmal in jedem Zellzyklus repliziert und anschließend gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt. Während der Konjugation erfolgt die Replikation nach dem rolling circle-Mechanismus (Abb. 2.17). Diese Replikationsweise ist wichtig, da hierbei zunächst ein einzelsträngiges lineares DNA-Molekül erzeugt wird, das während der Konjugation auf eine F−-Zelle (also eine Zelle ohne F-Faktor) übertragen wird (Abb. 4.5). Da die Replikation und der Transfer eines F-Plasmids während der Konjugation innerhalb von 1 bis 2 Minuten abgeschlossen ist und nach Beendigung einer Konjugation beide Konjugationspartner ein F-Plasmid enthalten (also F+ sind), kann innerhalb kurzer Zeit eine F−-Population von Zellen, die mit wenigen F+-Zellen gemischt wird, in eine F+-Population verwandelt werden. Der Name F-Plasmid (F von engl. fertility) leitet sich von seiner Eigenschaft ab, Konjugation einer Zelle zu ermöglichen. Man bezeichnet das F-Plasmid daher auch als Sex-Plasmid (früher F-Faktor). Der Transfer von Plasmid-DNA während der Konjugation ist nur möglich, wenn zuvor mithilfe von Plasmid-codierten Genprodukten spezielle Oberflächenstrukturen, die Pili, auf der Zellwand gebildet worden sind. Jede Zelle kann 1 bis 3 solcher Pili bilden, deren Länge die der Zelle bei Weitem übersteigt. Sie gestatten die Anheftung einer F+-Zelle an eine F−-Zelle und werden nach der Herstellung des Zellkontaktes von der Donorzelle resorbiert. Das F-Plasmid von E. coli ist ein Musterbeispiel für bakterielle Konjugation. Die TransferRegion (tra) des F-Plasmids codiert für 8 hoch-

4.2 Extrachromosomale DNA-Elemente: Plasmide

konservierte Proteine des Sekretionssystems (engl. type IV secretion system, T4SS), darunter das TraAF (Pilin). Das T4SS-System baut einen Kanal auf, durch den DNA und/oder Proteine von der Spender- zur Empfängerzelle wandern können. Eine elektronenmikroskopische Aufnahme sowie ein Modell des F-Pilus gibt Abb. 4.6 Die DNA-Übertragung wird durch den Kontakt eines Pilus mit einem geeigneten Empfänger eingeleitet; dadurch

wird der Pilus stark verkürzt, und es wird eine stabile Paarungsform gebildet. Durch ein Paarungssignal, das in die Zelle weitergegeben wird, wird die DNA entspiralisiert, in einen Einzelstrang überführt und mit einem „Pilot-Protein“ in die Empfängerzelle übertragen.

Das F-Plasmid ist ein Plasmid, das den Zellen die Fähigkeit vermittelt, eine Konjugation durchzuführen. Dieses Plasmid besitzt die Gene für die Ausbildung von langen Pili, mit deren Hilfe sich Konjugationspartner finden. Während der Konjugation repliziert sich das F-Plasmid durch einen rolling circle-Mechanismus, und eine Kopie des Plasmids wird auf den Konjugationspartner übertragen, während die ursprüngliche Kopie in der Donorzelle zurückbleibt.

Abb. 4.5 a, b Übertragung des F-Plasmids auf eine F−-Zelle. Konjugation ist die Übertragung von DNA von einer Spenderin eine Empfängerzelle, die einen Zell-Zell-Kontakt erfordert. a Die Gene konjugativer Plasmide (wie das F-Plasmid) codieren für Proteine, die für diesen Kontakt notwendig sind, sowie für die Replikation und die Übertragung des Plasmids in die Empfängerzelle. b Manchmal ist die Plasmid-DNA in das Wirtsgenom integriert (Hfr); in diesem Fall führt die Konjugation zu einer (teilweisen) Übertragung der genomischen SpenderDNA. (Nach Redfield 2001, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Eine wichtige Eigenschaft des F-Plasmids ist, dass es gelegentlich in das E. coli-Chromosom integriert werden kann. Die Integrationsstelle ist nicht genau festgelegt, erfordert aber eine DNA-Sequenzhomologie zwischen F-Plasmid und Chromosom. Diese Sequenzhomologie wird durch mobile DNA-Elemente hergestellt, die sowohl in der DNA des F-Plasmids als auch im E. coli-Chromosom vorhanden sind (Transposons, Kapitel 8.1). Im F-Plasmid findet man die Elemente IS2, IS3 und γδ (Abb. 4.7). In das E. coli-Chromosom integriert das F-Plasmid mithilfe dieser „IS“-Elemente an Stellen, an denen sich ein homologes Element befindet. Zellen, in denen das F-Plasmid im Bakterienchromosom integriert ist, werden als Hfr-Zellen bezeichnet. Dieser Name (Hfr von engl. high frequency of recombination) leitet sich von der Fähigkeit dieser Zel-

Abb. 4.6 a, b Der F-Pilus. a Historische elektronenmikroskopische Aufnahme von parallel angeordneten F-Pili (Anfärbung mit Uranylacetat; 2000 Å = 200 nm). b Schematisches Modell der Struktur eines F-Pilus, wie es aufgrund dieser elektronenmikroskopischen und Röntgenstrukturdaten abgeleitet wurde.

Die Untereinheiten überlappen offensichtlich und bilden eine helikale Form (128 Å = 12,8 nm). Heute wissen wir, dass der Pilus pro Windung aus 5 TraA(Pilin)-Untereinheiten zusammengesetzt ist. (Nach Folkhard et al. 1979, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

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Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

Abb. 4.7 Das F-Plasmid. Genetische Karte des F-Plasmids (Gesamtlänge: 94.500 bp). Der oriT-Locus ist der Replikationsursprung und zugleich der Beginn des Transfers des Plasmids in eine andere Wirtszelle während der Konjugation. Die DNASequenzen IS2, IS3 und γδ haben Bedeutung als Integrationssequenzen in das E. coli-Genom. Die tra-Gene sind zum Transfer erforderlich (Aufbau des Pilus; Abb. 4.6), die rep-Gene für die Replikation. Die phi-Gene verhindern die Vermehrung von Phagen. (Nach Seyffert 2003, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

len ab, ihr eigenes Genom mit hoher Frequenz an Empfänger(also F−)-Zellen übertragen zu können. Der Übertragungsprozess gleicht dem der Übertragung des F-Plasmids (Abb. 4.8). Nach einem Einzelstrangbruch im Replikationsstartpunkt des integrierten F-Plasmids wird ein 5’-Einzelstrang-Ende unter gleichzeitiger Replikation nach dem rolling circle-Mechanismus in die Empfängerzelle übertragen. Der DNA-Transfer umfasst aber nunmehr nicht allein die DNA des F-Plasmids, sondern die gesamte chromosomale DNA, in die das F-Plasmid integriert ist. Damit erhält die Empfängerzelle ein zusätzliches bakterielles DNA-Komplement. Das ermöglicht die Rekombination mit der chromosomalen DNA der Empfängerzelle (zum Mechanismus der Rekombination siehe Kapitel 4.4). Die besondere Art der Replikation hat übrigens zur Folge, dass auch die Donorzelle ein vollständiges eigenes Genom behält. Ein vollständiger Transfer des E. coli-Chromosoms erfordert etwa 90 Minuten. Oft wird er jedoch vorzeitig abgebrochen, sodass nur ein Teil des E. coli-Chromosoms in die Empfängerzelle gelangt. Man beobachtet daher einen Häufigkeitsgradienten in der Rekombination von Markergenen der Donorzelle mit der DNA der Empfängerzelle (Abb. 4.9). Markergene, die sich nahe an der Integrationsstelle des F-Plasmids in der DNA der Donorzelle befinden, weisen mit größerer Häufigkeit Rekombination auf als Gene, die weit ent-

Abb. 4.8 a–h Überblick über Mechanismen bei der Konjugation. In der Donor-Zelle sind folgende Ereignisse dargestellt: a Integration des Plasmids in das Chromosom durch Rekombination zwischen die Insertionsstellen; b Übertragung eines beweglichen Elementes (über einen zirkulären Zwischenschritt; Kapitel 8.1.1) vom Chromosom auf das Plasmid; c Beginn der rolling circle-Replikation (Abb. 2.17). In der Empfängerzelle (Rezipient) sind folgende Vorgänge dargestellt: d Rezirkularisation; e Angriff von Restriktionsendonukleasen (Scheren); f Replikation; g, h verschiedene Integrationsmöglichkeiten in das Wirtschromosom. (Nach Thomas u. Nielsen 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

fernt von der Integrationsstelle liegen, weil sie bereits nach kurzer Transferzeit in der Empfängerzelle vor-

4.2 Extrachromosomale DNA-Elemente: Plasmide

zur Integration verwendeten DNA-Sequenzen erfolgen, also durch eine homologe Rekombination, oder durch Rekombination mit einer anderen Stelle des Chromosoms. In diesem Fall wird ein Stück bakterieller DNA in das zirkuläre Plasmid integriert, und diese DNA kann dann bei Konjugationsereignissen in eine Empfängerzelle übertragen werden. F-Plasmide, die ein Stück genomischer DNA enthalten, bezeichnet man als F’-Plasmide. Mittels solcher F’-Plasmide können Empfängerzellen partiell diploid (oder merodiploid) gemacht werden. Man kann damit Komplementationsstudien durchführen oder auch die Konsequenzen von Änderungen der Gendosis untersuchen. Abb. 4.9 F-Duktion von Markergenen. Verschiedene Markergene von E. coli (azi, ton, lac, gal) werden durch F-Duktion mit einem bestimmten Hfr-Stamm übertragen. Ein vollständiger Transfer erfordert etwa 90 Minuten; durch Analyse der Rekombinationsraten nach unterschiedlich kurzen Transferzeiten konnte eine vollständige Chromosomenkarte von E. coli erstellt werden. (Nach Seyffert 2003, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

handen sind. Da in verschiedenen Hfr-Stämmen die Integration des F-Plasmids an unterschiedlichen Positionen und in unterschiedlicher Orientierung relativ zum Bakterienchromosom erfolgt, konnte man durch Rekombinationsexperimente mit unterschiedlichen Hfr-Stämmen eine vollständige genetische Karte des Bakterienchromosoms erstellen.

Plasmide können durch Sequenzhomologien zwischen der Plasmid-DNA und dem Wirtszellgenom in dieses integriert werden. Im Falle des F-Plasmids entstehen auf diese Weise Hfr-Zellen, die bei Konjugation das Wirtszellgenom auf den Konjugationspartner übertragen. In diesem erfolgt in der entstehenden partiell diploiden Konstitution die Rekombination. Da die Integrationsstellen des F-Plasmids über das Wirtszellgenom verteilt sind, können in verschiedenen Hfr-Stämmen unterschiedliche Wirtszellbereiche übertragen werden. Auf diesem Wege war es möglich, das gesamte E. coli-Genom genetisch zu kartieren.

Noch eine weitere Eigenschaft des F-Plasmids hat für die Bakteriengenetik und damit in letzter Zeit für gentechnologische Experimente große Bedeutung erlangt. Das ins bakterielle Genom integrierte F-Plasmid der Hfr-Stämme kann nämlich gelegentlich mit geringer Frequenz (10−7 je Generation) das Chromosom wieder verlassen (ein Vorgang, der als Exzision bezeichnet wird) und als Plasmid weiterexistieren. Die Exzision kann entweder unter Verwendung der ursprünglich

F-Plasmide werden in Hfr-Stämmen gelegentlich aus dem Wirtszellgenom wieder herausgeschnitten. Hierbei nehmen sie bisweilen ein Stück des Wirtszellgenoms mit in den entstehenden extrachromosomalen DNA-Ring auf. Bei der Konjugation wird diese DNA in die Rezeptorzelle eingeführt und erlaubt auf diesem Wege ebenfalls Rekombination von Teilen der Donorzell-DNA mit dem Rezeptorzellgenom.

F-Plasmide haben in der experimentellen Molekulargenetik breite Anwendung gefunden. Viele Plasmide, die zum Klonieren von DNA-Fragmenten eingesetzt werden (Technik-Box 8), basieren auf F-Plasmiden. Im Rahmen des frühen Humangenom-Projekts (Kapitel 12.1.3) war es außerdem nötig, die gesamte DNA in besonders große Fragmente von DNA (> 300 kb) stabil zu klonieren, um sie dann sequenzieren zu können; Rearrangements hätten natürlich die Daten verfälscht. Dazu wurden auf der Basis des F-Plasmids künstliche Bakterienchromosomen hergestellt (engl. bacterial artificial chromosomes; BACs). Als bakterielle Wirtstämme eignen sich besonders solche, die Mutationen in Genen tragen, die für Rekombinationsereignisse wichtig sind (Kapitel 4.4). Das System wurde von Melvin Simon und seiner Gruppe zu Beginn der 1990er-Jahre entwickelt und wird bis heute verwendet (Shizuya et al. 1992).

4.2.2 Andere Plasmide Neben dem F-Plasmid gibt es eine Reihe anderer Plasmide in E. coli. Es handelt sich ebenfalls um zirkuläre doppelsträngige DNA-Moleküle, deren Größe mit Molekulargewichten von meistens etwa 106 bis maximal 108 (1,6 × 103 bis 1,6 × 105 bp) nur wenige Prozent der des Bakterienchromosoms (4 × 106 bp) beträgt. Auch sie besitzen, wie das F-Plasmid, eine Reihe eigener Gene, sind aber zur Replikation weitgehend vom Genom der Wirtszelle abhängig. Obwohl E. coli-Zellen

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Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

gewöhnlich auch ohne Plasmide existenzfähig sind, vermitteln Plasmide unter speziellen Bedingungen Eigenschaften, die ein Überleben der Bakterienzelle erst ermöglichen. Vor allem sind hierbei R-Plasmide zu nennen, die eine Resistenz gegen Antibiotika vermitteln (z. B. gegen Tetracyclin, Ampicillin oder Canamycin). Eine andere Klasse von Plasmiden sind die Col-Plasmide, die durch die von ihnen codierten Proteine (Colicine, z. B. Membranproteine, DNasen oder RNasen) andere Bakterienstämme abtöten, die das betreffende Plasmid nicht besitzen. Wie schon erwähnt, ist die Anzahl von Plasmiden in einer Bakterienzelle im Allgemeinen kontrolliert und liegt zwischen 1 und 50 Kopien je nach Plasmid. Die Übertragung von Plasmiden erfolgt bei manchen Plasmiden, wie beim F-Plasmid, durch Konjugation. Jedoch ist die Effizienz der Übertragung oft sehr viel geringer als beim F-Plasmid. Manche Plasmide können selbst keine Konjugation induzieren, wohl aber bei gleichzeitiger Anwesenheit von konjugationsinduzierenden Plasmiden mit übertragen werden. Allerdings sind nahe verwandte Plasmide meist inkompatibel und können nicht gleichzeitig in einer Zelle anwesend sein.

Manche Plasmide verleihen durch den Besitz von Resistenzgenen den Wirtszellen Resistenz gegen Antibiotika oder andere Bakterienstämme.

Unter den vielen anderen Plasmiden soll hier noch ein Plasmid von Agrobacterium tumefaciens etwas ausführlicher besprochen werden. A. tumefaciens ist in der Lage, an verletzten Pflanzen Tumore („Wurzelhalsgalle“; Abb. 4.10a) zu induzieren. Als Ursache identifizierte man große Plasmide, die aufgrund ihrer Tumor-induzierenden Eigenschaften als Ti-Plasmide bezeichnet werden. Ti-Plasmide tragen Gene für die Opinverwertung, die Erkennung verwundeter Zellen (Rezeptoren für pflanzliche Phenolderivate, z. B. Acetosyringon) und für die Mobilisierung und den Transfer eines bestimmten Plasmid-Fragments, der T-DNA. Die T-DNA enthält die Gene für die Tumorinduktion und Opinsynthese; sie wird links und rechts durch ein Wiederholungselement von 25 bp begrenzt, das als Erkennungssequenz für das Herausschneiden des dazwischenliegenden DNA-Abschnitts dient (Abb. 4.10b). Nach der Übertragung wird die T-DNA in die DNA der Pflanze integriert; der Integrationsort ist zwar weitgehend zufällig, allerdings werden transkriptionsaktive Bereiche bevorzugt. Durch die Wundreaktion werden Signale erzeugt, die zunächst zur Anheftung der Agrobakterien an die Pflanzenzelle führen und im weiteren Verlauf zur Übertragung der T-DNA. Die T-DNA enthält unter anderem auch Gene zur Auxin- und Cytokinsynthese.

Abb. 4.10 a, b Tumorinduktion durch das Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens. a Der Stamm einer Tomatenpflanze wurde angeritzt und eine kleine Menge einer Bakteriensuspension in die Wunde gegeben. Der Pfeil deutet auf die großen Tumore nach 5 Wochen. b Die Plasmidkarte eines Ti-Plasmids zeigt die T-DNA, flankiert von den Wiederholungselementen LB und RB (engl. left border bzw. right border). ori: Replikationsursprung; noc: Nopalinkatabolisierung; nos: Nopalinsynthese; tmr: Cytokinbildung; tms: Auxinbildung; tra: konjugativer Transfer; vir: Virulenzregion. (a nach Escobar et al. 2001, mit freundlicher Genehmigung der National Academy of Sciences, USA; b nach Kempken u. Kempken 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Diese beiden Substanzen führen innerhalb kurzer Zeit zum Tumorwachstum, indem undifferenzierte Zellteilung gefördert wird. Ein besonderes Kennzeichen dieser Tumore ist, dass sie in Gewebekultur Phytohormon-unabhängig wachsen können.

4.3 Bakteriophagen

Ti-Plasmide können aufgrund der dargestellten Integration in das pflanzliche Genom in ausgezeichneter Weise benutzt werden, um Fremdgene in Pflanzen einzubringen (Herstellung „transgener“ Pflanzen). Voraussetzung dafür ist allerdings, dass die Tumorinduzierenden Gene tms und tmr entfernt werden; in diese „entschärften“ Plasmide können nun zwischen der linken und rechten Grenze beliebige Fremdgene inseriert werden, z. B. ein Selektionsmarker (Antibiotikaresistenz), eine Herbizidresistenz oder ein Gen zur experimentellen Analyse regulatorischer Sequenzen (Reportergen, z. B. Glucuronidase, GUS).

Das Ti-Plasmid von A. tumefaciens führt zur Tumorinduktion bei Pflanzen. Ein Teil seiner DNA wird dabei in das Pflanzengenom integriert; diese Eigenschaft kann bei der Herstellung transgener Pflanzen genutzt werden.

Neuere Arbeiten zeigen, dass unter Laborbedingungen das Wirtsspektrum der Agrobakterien auf nicht pflanzliche Eukaryoten ausgedehnt werden kann. Dazu gehören Hefen, filamentöse Pilze, kultivierte Champignons und menschliche Zellkulturen. Damit eröffnen sich weitere Einsatzmöglichkeiten des Ti-Plasmids und auch die Möglichkeit, den Mechanismus eines horizontalen Gentransfers besser zu verstehen – handelt es sich hierbei doch um eine der treibenden Kräfte der Evolution. Man darf dabei auch nicht vergessen, dass Agrobakterien seltene und opportunistische Krankheitserreger beim Menschen darstellen; vor allem für immungeschwächte Patienten. Eine ausführliche Darstellung der Möglichkeiten und Gefahren findet sich bei Lacroix et al. (2006).

4.3 Bakteriophagen Bakteriophagen, meist kurz Phagen genannt, sind Viren höherer Organismen vergleichbar. Sie unterscheiden sich von Plasmiden prinzipiell dadurch, dass sie ein extrazelluläres Stadium durchlaufen können. Beiden ist gemeinsam, dass sie über keinen eigenen Stoffwechsel verfügen, sondern vollständig vom zellulären Stoffwechsel ihrer Wirtszellen abhängig sind. Man kennt einige Tausend verschiedener Phagenarten, die sich in vielen Einzelheiten, unter anderem in Genomgröße und -aufbau, in Gestalt und Wirtsspezifität voneinander unterscheiden. Das Genom eines Bakteriophagen kann aus Folgendem bestehen: ï Einzelstrang-DNA oder ï Doppelstrang-DNA, die – linear oder – zirkulär ist, oder aus ï linearer Einzelstrang-RNA.

Abb. 4.11 a–c Verschiedene Bakteriophagen. a Ikosaedrischer Phage mit Schwanz (z. B. T2, T4, Lambda). b Ikosaedrischer Phage ohne Schwanz (z. B. ΦX174). c Filamentöser Phage (z. B. M13)

Während des extrazellulären Stadiums ist das Genom in eine Proteinhülle verpackt, die auch Capsid (engl. coat oder capsid) genannt wird. Die Hüllproteine werden vom Bakteriophagengenom codiert, während andere für den Bakteriophagen notwendige Moleküle je nach Phagentyp – und damit Genomgröße – entweder im Phagengenom oder im Genom des Wirtsbakteriums codiert werden. Die Proteinhülle des extrazellulären Stadiums ist erforderlich, um die Phagen-DNA vor Abbau (Degradation) zu schützen, zugleich aber auch, um die Infektion neuer Zellen zu ermöglichen. Nach der Form der Phagenpartikel kann man drei Typen von Bakteriophagen unterscheiden (Abb. 4.11): ï filamentöse Phagen, bei denen die DNA in gestreckter Form in ein fadenförmiges Capsid verpackt ist, Beispiel: Bakteriophage M13 (= fd); ï ikosaedrische, schwanzlose Phagen, deren Genom in hochkompakter Form in ein Capsid verpackt ist, Beispiel: Bakteriophage ΦX174; ï ikosaedrische Phagen mit Schwanz, deren Genom ebenfalls in kompakter Form im Kopf des Phagen verpackt ist. Der Schwanz besitzt oft eine besondere Struktur zur Adsorption an die Zellwand sowie zusätzliche Fibrillen, Beispiele: Bakteriophage T4, Bakteriophage λ.

Bakteriophagen sind Viren von Bakterien und können diese in großer Zahl infizieren. Während des extrazellulären Stadiums ist das Phagengenom in eine Proteinhülle verpackt. Bei Adsorption an eine Bakterienzelle wird die DNA in die Wirtszelle injiziert, während die leere Proteinhülle an der Bakterienmembran verbleibt.

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Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

4.3.1 Vermehrungszyklus Die Vermehrungszyklen der verschiedenen Bakteriophagentypen weisen viele Ähnlichkeiten auf. Grundsätzlich kann man zwischen zwei Arten von Zyklen unterscheiden (Abb. 4.12): ï den lytischen Zyklus und ï den lysogenen Zyklus. Virulente Phagen benutzen eine infizierte Bakterienzelle zur Synthese neuer Phagenpartikel. Man bezeichnet diese Art der Vermehrung als lytischen Zyklus. In den meisten Fällen werden die Zellen zerstört (lysiert) und die neu gebildeten Phagenpartikel freigesetzt. Einige filamentöse Phagen (z. B. M13) hingegen entlassen die neu gebildeten Phagen durch die Abschnürung von Ausstülpungen der Zellwand, ohne dass die Zelle hierdurch zerstört wird.

Abb. 4.12 Zyklus des Bakteriophagen λ. Nach der Infektion der Wirtszelle hat der Phage zwei Möglichkeiten: Bei der lytischen Antwort (äußerer Kreis) werden an der Phagen-DNA als Matrize nach dem rolling circle-Mechanismus (Abb. 2.17) neue lineare Phagen-DNA-Moleküle synthetisiert. Gleichzeitig werden die Hüllproteine hergestellt, sodass schließlich eine Verpackung der DNA in den vorbereiteten Phagenkopf und ein Anfügen des ebenfalls vorbereiteten Phagenschwanzes erfolgen kann. Die Zelle lysiert dann und entlässt neue, infektiöse Phagenpartikel. Im lysogenen Zyklus (innerer Kreis) erfolgt zunächst eine Rezirkularisierung der linearen λ-DNA an den Enden mit kurzen,

Temperente Phagen leiten nach der Infektion einer Bakterienzelle einen lysogenen Zyklus ein. Die meisten (mindestens 90 %) der bekannten Phagen gehören zu dieser Klasse. Ein temperenter Phage integriert sich nach der Infektion der Zelle im Allgemeinen zunächst ins Bakteriengenom und verbleibt dort als Prophage ohne wesentliche weitere Stoffwechselfunktionen. Lediglich durch die Synthese eines Repressors wird die Neuinfektion mit dem gleichen Phagentyp verhindert. Da der Prophage ins Bakteriengenom integriert ist, wird er mit diesem repliziert und gelangt so in alle Nachkommen. Unter besonderen Umständen (Schädigung der DNA) kann der Prophage jedoch das Bakteriengenom wieder verlassen und dann in einen lytischen Zyklus eintreten, der die Produktion neuer Phagenpartikel und deren Freisetzung zur Folge hat. Die Zelle wird hierbei zerstört.

einzelsträngigen Abschnitten (engl. cohesive sites; Abk.: cos). Danach integriert der λ-Phage als Prophage (blau) ins bakterielle Genom; er kann in dieser Form über viele Zellgenerationen im Bakteriengenom verbleiben. Der Prophage wird allerdings irreversibel induziert, wenn ein großer DNA-Schaden eine SOS-Reparatur-Antwort auslöst; das führt dann in den lytischen Kreislauf. In sehr seltenen Fällen geschieht dies auch spontan; einige der spontan induzierten Zellen betreten den lytischen Zyklus unvollständig, verlieren den Prophagen und werden nicht-lysogen. (Nach Campbell 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

4.3 Bakteriophagen

Bakteriophagen können nach der Infektion einer Bak-

terienzelle entweder eine Vermehrungsphase durchlaufen und die Zelle danach in Form neuer Phagenpartikel, meist unter Lyse der Zelle, verlassen. Alternativ können sie zunächst in ein inaktives Stadium übergehen, indem sie sich als Prophage ins Wirtszellgenom integrieren. Durch Schädigung der DNA wird der Prophage aktiviert, verlässt das Wirtszellgenom und beginnt einen Vermehrungszyklus mit anschließender Lyse der Zelle.

Beiden Vermehrungszyklen von Phagen sind verschiedene Grundelemente gemeinsam, die zunächst im Zusammenhang mit dem lytischen Zyklus besprochen werden; die Details der Genregulation werden im Kapitel 4.5 ausführlich diskutiert.

Lytischer Zyklus Doppelstrang-DNA-Phagen mit einem lytischen Zyklus durchlaufen die folgenden Schritte, beginnend mit dem Zeitpunkt der Infektion einer Wirtszelle: ï Adsorption an Rezeptoren in der Zellwand der Wirtszelle und Injektion der DNA direkt in die Wirtszelle. ï Die zelleigene RNA-Polymerase beginnt mit der Transkription der Phagen-DNA. Im Allgemeinen führt dieseTranskription unmittelbar zur Synthese einer phagenspezifischen RNA-Polymerase, die die weitere Transkription des Phagengenoms übernimmt, oder die Wirtszell-RNA-Polymerase wird so modifiziert, dass sie weitere phagenspezifische Transkripte produziert. Gleichzeitig wird häufig die Wirtszelltranskription ausgeschaltet, sodass nur noch Stoffwechselprozesse ablaufen, die vom Phagen für seine Vermehrung genutzt werden. ï Die phagenspezifische Transkription stellt, oft in genau programmierter Folge, Proteine zur Verfügung, die zum Aufbau neuer Phagenpartikel notwendig sind. Hierbei handelt es sich um strukturelle Proteine sowie Proteine, die für die Zusammensetzung des neuen Phagen gebraucht werden. In manchen Phagen (z. B. λ) werden die Phagenpartikel vorgefertigt, sodass die Phagen-DNA nach der Replikation direkt in die Hülle überführt werden kann. In anderen Phagen (z. B. M13) erfolgt die Zusammensetzung des Phagen aus DNA und Protein gleichzeitig. Bei RNA-Phagen ist zur Replikation ein besonderes, vom Phagen codiertes Enzym, die reverse Transkriptase (engl. reverse transcriptase) erforderlich, das die RNA über den Umweg eines Doppelstrang-DNA-Moleküls vervielfachen kann. ï Nach Produktion einer größeren Anzahl neuer Phagenpartikel (abhängig vom Phagentyp zwischen 50 und 500) werden diese nach Lyse der Zellwand

freigesetzt. Einige filamentöse Phagen (z. B. M13) entlassen die neuen Phagenpartikel durch Extrusion, d. h. Abschnürung von der Zellwand ohne Zerstörung der infizierten Zelle. Der Wirtsbereich eines Bakteriophagen ist meist sehr eng begrenzt. Oft sind sogar nur einzelne Stämme einer bestimmten Bakterienart zur Vermehrung eines Phagen geeignet. Während der Bakteriophage T4 nicht nur auf vielen E. coli-Stämmen wachsen kann, sondern auch auf einigen anderen Bakterienarten, ist die Vermehrungsfähigkeit für den Bakteriophagen ΦX174 auf den E. coli-Stamm C beschränkt. Hinzu kommt eine weitere Beschränkung der Vermehrung mancher Phagen, die man als Wirtsbeschränkung (engl. host restriction) bezeichnet. Lässt man beispielsweise einen Bakteriophagen λ auf einem E. coli-Stamm K wachsen und infiziert mit dem Lysat dieser Zellen einen E. coli-Stamm B, so kommt es nur zu einer geringfügigen Vermehrung des Phagen. Die Ursache hierfür liegt in einer Modifikation der PhagenDNA, die im B-Stamm erfolgt ist. E. coli B produziert nämlich eine stammspezifische Nuklease (EcoB-Nuklease), die fremde DNA sequenzspezifisch zerschneidet und damit für die Transkription und Replikation unbrauchbar macht. Die zelleigene DNA ist, ebenso wie λ-DNA, die in diesen Zellen repliziert wurde, durch sequenzspezifische Methylierung von Adenin vor dem Abbau durch Nukleasen geschützt. Phagen-DNA aus K-Zellen wird hingegen abgebaut. Ein geringer Erfolg der Infektion auf E. coli K gewachsener Phagen ist durch eine schnelle Methylierung einiger Phagen-DNAMoleküle zu erklären, die dadurch den zellulären Schutzmechanismus der B-Zellen überwinden. Mit diesem Vorgang der Wirtsbegrenzung haben wir die Existenz einer wichtigen Art von Nukleasen kennengelernt, der sequenzspezifischen Endonukleasen oder Restriktionsenzyme (Smith et al. 1972). Diese Enzyme spielen durch ihre weite Verbreitung nicht nur eine Rolle für die Abschirmung von Zellen gegen Infektion mit fremder DNA, sondern sind für die Gentechnologie von entscheidender Bedeutung (Technik-Box 10).

Bakteriophagen haben meist einen eng begrenzten Wirtsbereich und können nur auf wenigen Bakterienstämmen wachsen. Diese Wirtsspezifität beruht auf speziellen Schutzmechanismen, die die Wirtszellen zur Abwehr von Infektionen entwickelt haben. Hierbei spielen vor allem Endonukleasen eine große Rolle, die fremde DNA abbauen, zelleigene DNA aber aufgrund spezifischer Modifikationen, z. B. sequenzspezifischer Methylierung, intakt lassen. Nur wenn die Phagen-DNA dementsprechende Modifikationen besitzt, kann eine erfolgreiche Infektion stattfinden.

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Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

Lysogener Zyklus

4.3.2 Bakteriophage λ

Der lysogene Zyklus kann als eine Erweiterung des lytischen Zyklus um eine inaktive, stabile Phase des Phagen angesehen werden. Üblicherweise wird die Phagen-DNA dabei in das Wirtszellgenom integriert. Die über den lytischen Zyklus hinausgehenden wichtigen Ereignisse im Leben eines temperenten Phagen lassen sich wie folgt zusammenfassen (Abb. 4.12); die Details der Genregulation werden im Kapitel 4.5 ausführlich besprochen: ï Nach der Infektion der Wirtszelle wird zunächst eine RNA vom Phagengenom synthetisiert, die im Wesentlichen ein Repressorprotein codiert. Dieses Repressorprotein unterbindet die weitere Transkription des Phagengenoms. Gleichzeitig entsteht ein phagenspezifisches Enzym, das zur Integration des λ-Genoms ins Wirtszellgenom erforderlich ist. ï Die Phagen-DNA wird dann sequenzspezifisch ins Wirtszellgenom eingefügt und verbleibt dort als Prophage. ï Zur Induktion eines lytischen Zyklus wird das Prophagengenom aus dem Wirtszellgenom herausgeschnitten und beginnt mit der Synthese phagenspezifischer mRNA sowie mit der Replikation, bis schließlich Phagenpartikel aus der lysierten Zelle entlassen werden.

Von allen Bakteriophagen haben Experimente am Phagen λ (der Name ist der des griechischen Buchstaben „Lambda“) die wohl größten Beiträge zur Entwicklung der molekularen Genetik geleistet. Entdeckt wurde er durch Esther und Joshua Lederberg (1953) als Bestandteil des E. coli-Stamms K12, der einen λ-Prophagen in seinem Genom enthält, also lysogen ist. Entscheidend für seine Bedeutung in der Molekulargenetik ist es, dass die Integration von λ als Prophage an einer spezifischen Stelle im E. coli-Chromosom erfolgt, zwischen dem galund dem bio-Gen. Der Integrationsmechanismus bietet darüber hinaus wertvolle Möglichkeiten zur Verwendung des Phagen als Vektor in der Gentechnologie (Technik-Box 8). Ein λ-Phage besteht etwa zur Hälfte aus doppelsträngiger DNA, die etwa 50 Proteine codiert, zur anderen Hälfte aus Protein. Die Genomgröße des Wildtyp-Phagen λ beträgt 48.502 bp; dieser Stamm hat jedoch eine 1-bp-Deletion im Vergleich zum „Ur-λ“. Die Sequenz ist seit 1982 bekannt (Sanger et al. 1982). Einen Überblick über die Struktur des λ-Genoms gibt Abb. 4.13. Nach der Adsorption an eine Wirtszelle mittels der Basalplatte des Schwanzes wird die DNA in die Zelle injiziert. Hier beginnt die Transkription des λ-Genoms, und es werden die für die Replikation der Phagen-DNA

Abb. 4.13 Genomkarte des Bakteriophagen λ im zirkulären Zustand mit frühen und späten Genen sowie den wichtigsten Regulationssequenzen. Gene und offene Leserahmen sind als farbige Kästchen dargestellt, regulatorische Regionen (Promotoren) als Pfeilspitzen. Transkripte sind als Linien oberhalb oder unterhalb der Genkarte dargestellt; Terminatoren als kleine Kreise. Die Zirkularisierung erfolgt im Bereich der kohäsiven Enden (cos; schwarzer Punkt, rechts). Die Anlagerungsstelle (attP) der Phagen-DNA an die DNA von E. coli ist links als schwarzes Rechteck gezeigt. Lysogene Gene sind rot dargestellt, die frü-

hen lytischen Gene, die vom Promotor PR abgelesen werden, sind blau und die späten lytischen Gene, die vom Promotor PR’ abgelesen werden, sind violett. Regionen, die Gene für späte lytische Transkripte für die Kopf- oder Schwanzproteine codieren bzw. für die Zell-Lyse verantwortlich sind, sind entsprechend bezeichnet. Die Gene, die für die Integration (int) bzw. Exzision (xis) benötigt werden, sowie Transkripte, die von cII-aktivierten Promotoren (PRE, PI, PaQ) hergestellt werden, sind orange gezeichnet. (Nach Dodd et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

4.3 Bakteriophagen

erforderlichen Genprodukte und die zur Bildung der Proteinkapsel und des Schwanzes notwendigen Proteine synthetisiert. Die neu replizierte Phagen-DNA wird dann mit den Proteinkomponenten zum Phagen zusammengesetzt. Nach etwa 50 Minuten (bei 37 °C) lysiert die Wirtszelle, und etwa 100 neue Phagen werden aus ihr freigesetzt. In einem alternativen Stoffwechselweg, der den lysogenen Zyklus einleitet, werden nach der Infektion der Wirtszelle nur Proteine hergestellt, die zur Integration des Phagen ins Wirtszellgenom erforderlich sind, während gleichzeitig die Replikation und die Synthese von Hüllproteinen sowie der zur Zusammensetzung des Phagen notwendigen übrigen Komponenten unterdrückt (reprimiert) werden. Es kann dann die Integration ins Wirtszellgenom als Prophage erfolgen. Die Integration des λ-Genoms in das Wirtszellgenom erfolgt durch eine locusspezifische Rekombination (engl. site-specific recombination), an der bakterielle und Phagen-codierte Proteine beteiligt sind. Das λ-Genom besitzt terminale invertierte Repeats von 12 Nukleotiden (engl. cohesive ends, auch als cos-sites bezeichnet). Mittels dieser Elemente kann ein lineares Phagengenom zirkularisiert werden. Vom Phagengenom wird das Enzym Integrase bereitgestellt, das als eines der ersten Gene nach einer Phageninfektion in der Wirtszelle aktiviert wird. Die E. coli-Zelle stellt für die Integration ein Protein, genannt IHF (engl. integration hostfactor), zur Verfügung. Beide Proteine binden an DNA-Regionen im zirkularisierten λ- und im Bakteriengenom, die als attP und attB (von engl. attachment site phage oder bacterial) bezeichnet werden. Beide Regionen weisen eine 15-bpHomologie in der DNA auf (Abb. 4.14), die für die Integration des Phagen Voraussetzung ist. Die gesamte

für die Integration erforderliche Region in der PhagenDNA umfasst 240 bp, während auf der Seite des bakteriellen Genoms nur die 15-bp-Homologie erforderlich ist. An der Phagenintegrationsstelle binden neben dem IHF-Protein noch zwei weitere Phagen-codierte Proteine (Gpint und Gpxis). Die Integrase schneidet beide Integrationsstellen in der in Abb. 4.12a gezeigten Weise durch Doppelstrangbrüche asymmetrisch, ähnlich wie die Topoisomerase II, sodass die λ-Phagen-DNA spezifisch und kovalent ins Bakterienchromosom integriert werden kann. Für die Exzision der λ-DNA ist neben der Integrase noch ein weiteres Enzym, die Exzisionase, notwendig. Sie bindet, zusammen mit der Integrase, an die Integrationsstellen des Prophagen und führt anschließend die der Integration entgegengesetzte Reaktion aus. Der Prophage kann dann als Phage in den lytischen Zyklus übergehen. Obwohl die Exzision gewöhnlich sehr genau erfolgt, beobachtet man gelegentlich Fehler, die zur Folge haben, dass ein Teil der flankierenden DNA des Prophagen, also bakterielle DNA, mit in das replizierende Phagengenom aufgenommen wird. Es kann sich hierbei nur um eine der beiden flankierenden E. coli-Sequenzen handeln, also um DNA aus dem Bereich des galOperons oder des bio-Gens. Da diese DNA mit dem Phagengenom repliziert und anschließend in Phagenpartikel verpackt wird, kann Wirtszell-DNA durch Infektion in eine neue Wirtszelle übertragen und zusammen mit der Prophagen-DNA ins Bakterienchromosom integriert werden. Funktionell besteht kein Unterschied, da auch diese DNA transkribiert werden kann und – sofern die transduzierten Gene nicht defekt sind –

att P

att B

Abb. 4.14 a, b Sequenzspezifische Integration des Phagen λ ins E. coli-Genom. Sequenzhomologien zwischen den attPund attB-Regionen von λ (schwarz) und E. coli (rot) (a, oben) führen zu der Integration der Phagen in einer Position zwischen dem gal- und dem bio-Gen (b, unten). Die horizontalen

Pfeile zeigen die invertierten Repeats an, die vertikalen kurzen Pfeile die Schnittstellen, an denen die att-Regionen geöffnet werden. Die beiden Grenzbereiche links und rechts vom Phagengenom geben die Regionen an, innerhalb derer die Integration des Phagen erfolgt ist

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Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

funktionsfähige Gene vorhanden sind. Die betreffende Bakterienzelle ist mithin merodiploid, wie wir es bereits als Folge der Sexduktion (F-Plasmid) kennengelernt hatten (S. 104). Die locusspezifische Integration von λ hat zur Folge, dass im Allgemeinen nur DNA aus dem der attB-Sequenz benachbarten Genbereich transduziert werden kann. Für das Verständnis der Transduktionsvorgänge durch λ-Phagen ist es wichtig, sich den Replikationsmechanismus des Phagen zu vergegenwärtigen. Die Replikation von λ erfolgt nach dem rolling circleMechanismus (Abb. 2.17).

Der Bakteriophage λ ist ein temperenter Phage, der sich aufgrund einer DNA-Sequenzhomologie zwischen Phagen- und Bakterien-DNA an einer spezifischen Stelle ins Wirtszellgenom integrieren kann. Das Phagengenom bleibt in dieser Prophagensituation mit Ausnahme eines Repressors inaktiv. Der Prophage kann durch Stresseinwirkung auf die Wirtszelle aktiviert werden und geht nach Exzision aus dem Genom in den lytischen Zyklus über.

Bei seinen Arbeiten mit dem Bakteriophagen λ entdeckten Arber und Dussoix 1962, dass sich Bakterien gegenüber eindringender DNA durch Modifikationen schützen können: Sie methylieren ihre eigene DNA und bauen fremde DNA ab – „fremd“ definiert sich für eine Bakterienzelle also durch ein anderes (oder gar kein) Methylierungsmuster der DNA. Die entsprechenden Enzyme wurden Restriktionsenzyme genannt, da sie die Vermehrung von DNA aus Plasmiden bzw. Phagen auf solche des eigenen Stamms beschränkt („Restriktion“). Restriktionsenzyme schneiden sequenzspezifisch, sodass sie sehr schnell wichtige Hilfsmittel der damals noch jungen Molekulargenetik wurden (Technik-Box 10). Werner Arber bekam für diese grundlegenden Arbeiten zusammen mit Daniel Nathans und Hamilton Smith 1978 den Nobelpreis für Medizin. Heute kennen wir über 3500 Restriktionsenzyme, sodass es notwendig wurde, die Namensgebung einheitlich zu gestalten: Der Name des Enzyms soll mit drei Buchstaben beginnen, wobei der erste Buchstabe für die Gattung des Bakteriums steht, aus dem das Enzym isoliert wurde, und die beiden nächsten Buchstaben entsprechen der Art. Weitere Buchstaben oder Ziffern können hinzugefügt werden (z. B. wurde das Restriktionsenzym HindII aus Haemophilus influencae, Serotyp d isoliert). Daher werden auch die ersten drei Buchstaben kursiv gesetzt; eine ausführliche Darstellung der Nomenklaturregeln findet sich bei Roberts et al. 2003. Nathans und Smith haben 1975, in der Frühphase der Molekulargenetik, eine interessante zusammenfassende Darstellung der Restriktionsenzyme veröffentlicht.

4.3.3 Andere Bakteriophagen Der temperente Bakteriophage P1 nimmt insofern eine Sonderstellung ein, als seine DNA während der lysogenen Phase nicht ins Wirtszellgenom integriert wird, sondern als einzelnes zirkuläres DNA-Molekül in der Zelle verbleibt. Die Genomgröße des Phagen beträgt 91.500 bp, also etwas mehr als 20 % der Größe des E. coli-Genoms. Seine Replikation ist an die der Wirtszell-DNA gekoppelt, sodass Tochterzellen ebenfalls je ein P1-DNA-Molekül erhalten. Wird ein lytischer Zyklus induziert (beispielsweise durch Infektion mit P1 oder durch Induktion der Lyse in lysogenen Zellen), so beginnt die Phagen-DNA, Hüllproteine und eine Nuklease zu produzieren, die das Wirtszellgenom langsam zerschneidet. Während der Verpackung der neu replizierten Phagen-DNA in Hüllproteine kann gelegentlich ein Stück der partiell abgebauten Wirtszellgenom-DNA, das zufällig die richtige Länge zur Verpackung besitzt, anstelle der Phagen-DNA verpackt werden. Etwa 0,1 % der entstehenden neuen Phagen enthält solche E. coli-DNA-Bruchstücke anstatt der Phagen-DNA. Solche Phagen können die E. coliDNA nach ihrer Adsorption an Bakterienzellen in diese injizieren. Damit kommt es zur Duplikation des betreffenden Wirtszellgenombereichs in der Rezeptorzelle. Ähnlich wie bei der Übertragung von E. coliDNA durch Hfr-Stämme in F−-Zellen oder bei der F-Duktion kann innerhalb der bakteriellen Genomduplikation Rekombination (Kapitel 4.4.2) erfolgen. Man bezeichnet diese Übertragung bakterieller DNA durch einen Phagen als Transduktion. Die Möglichkeit der Transduktion wurde 1952 am Bakteriophagen P22 bei Salmonella typhimurium durch Norton D. Zinder und Joshua Lederberg entdeckt. Da in diesen Systemen alle Wirtsgene ohne Einschränkung transduziert werden können, spricht man auch von genereller Transduktion (engl. generalized transduction). Sie steht im Gegensatz zur spezialisierten Transduktion (engl. specialized transduction), die wir bereits beim Bakteriophagen λ kennengelernt haben (S. 113). Eine wichtige Rolle bei den Rekombinationsereignissen von P1 spielt die Cre-Rekombinase (engl. cyclization recombinase). Cre katalysiert die Rekombination zwischen zwei loxP-Erkennungssequenzen (engl. locus of X-over of P1, X steht dabei für crossover; Kapitel 4.4.2). Die loxP-Sequenz besteht aus einem zentralen Element von 8 bp, das von zwei palindromischen Sequenzen (13 bp) flankiert wird. Ein chromosomales DNA-Segment, das zwischen zwei gleichgerichteten loxP-Elementen liegt, wird durch die Cre-Rekombinase in Form eines zirkulären Produktes aus dem Chromosom herausgeschnitten (Abb. 4.15). Cre hat heute in der experimentellen Genetik eine überragende Bedeutung, um spezifische Mutationen in Zellkulturen von

4.3 Bakteriophagen a Integration Excision

loxP

5 ‘ ATA AC T TCG TATA ATG TATG C TATACG A AG T TAT 3 ‘ 3 ‘ TAT TG A AG C ATAT TAC ATACG ATATG C T TC A ATA 5 ‘ b

5‘ Substrat

5‘ 5‘ Schnitt im ersten DNA-Strang Strangaustausch und Ligation

5‘ 5‘ Zwischenstufe

5‘ 5‘ Schnitt im zweiten DNA-Strang Strangaustausch und Ligation

5‘ 5‘ Produkt

5‘

5‘ 5‘

DNA-Sequenzen mit kurzen Phagen-DNA-Bereichen, die zur Replikation und Stabilität in der Bakterienzelle erforderlich sind, und kann auf diese Weise Phagenund wirtszellfremde DNA stabil und extrachromosomal erhalten. Durch Induktion des lytischen Zyklus kann diese DNA in guter Ausbeute für experimentelle Zwecke isoliert werden. Dieses DNA-Vektorsystem wird auch als PAC (engl. phage artificial chromosome) bezeichnet und kann DNA-Fragmente zwischen 130 kb und 150 kb aufnehmen (Ioannou et al. 1994).

Erste Schnittstelle Zweite Schnittstelle

Abb. 4.15 a, b Das Cre/loxP-Rekombinationssystem. a Die loxP-Sequenz (Dreiecke) ist angegeben; die zentrale Region, innerhalb der die Rekombination erfolgt, ist grau unterlegt. Die Schnittstellen sind durch Pfeile markiert. Durch die Aktivität der Cre-Rekombinase wird die blaue Sequenz, die sich ursprünglich zwischen zwei loxP-Stellen befunden hat, als zirkuläres DNA-Fragment zusammen mit einer loxP-Stelle herausgeschnitten. Der orange DNA-Strang bleibt mit der zweiten loxP-Stelle zurück. b Während der Rekombination wird zuerst jeweils ein Strang geöffnet; die Stränge werden ausgetauscht, und die Schnittstelle wird wieder verschlossen. Nach einem zweiten Schnitt (mit Strangaustausch und Ligation) an den beiden anderen Strängen ist der Prozess abgeschlossen und das Produkt kann freigesetzt werden. (a nach Lukowski et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung von Springer; b nach Lee u. Saito 1998, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Säugern, in Hefen und Pflanzen, aber auch in der Maus einzuführen („konditionale Mutagenese“; Kapitel 9.7). Die Fähigkeit des Bakteriophagen P1, große Stücke fremder DNA ohne die Anwesenheit phageneigener DNA in Bakterienzellen zu übertragen, wird auch für gentechnologische Experimente ausgenutzt. Man kombiniert hierzu beliebige

Der temperente Bakteriophage P1 wird im lysogenen Zyklus nicht ins Wirtszellgenom integriert, sondern verbleibt als extrachromosomales, ringförmiges DNA-Molekül in der Zelle. Nach Induktion des lytischen Zyklus beginnt eine Phagen-codierte Nuklease das Wirtszellgenom zu zerstören. Gelegentlich können dadurch bakterielle DNA-Stücke einer geeigneten Länge entstehen, die dann in Phagenpartikel verpackt werden und durch Infektion in neue Wirtszellen gelangen. Da P1-Phagenpartikel große DNA-Stücke (ca. 130–150 kb) transduzieren können, sind sie wichtige Werkzeuge der molekularen Genetik.

Der Bakteriophage T4 (Abb. 4.11 und 4.16) gehört zu den geradzahligen T-Phagen (engl. T-even phages: T2, T4, T6). Er ist, wie die übrigen geradzahligen T-Phagen, virulent. Diesen Phagen fällt in der Geschichte der Genetik eine besondere Rolle zu, da sie die ersten tief greifenden Einblicke in die molekulare Struktur von Genen gestatteten und zur Ausarbeitung der Grundlagen der Phagengenetik gedient haben. Diese Rolle geht auf die Arbeiten Max Delbrücks zurück, der in den frühen 1940er-Jahren den Infektionszyklus dieser Phagen aufgeklärt und die ersten experimentellen Techniken der Phagengenetik an ihnen erarbeitet hat. Die experimentelle Arbeit mit dem T4-Phagen macht von seiner Fähigkeit Gebrauch, E. coli-Zellen zu infizieren und sich in ihnen innerhalb von etwa 30 Minuten um das 100fache zu vermehren. Mischt man E. coli-Zellen mit T4, so heftet sich der Phage mit der Basalplatte seines Schwanzes an die Zellwand an und injiziert seine 168.903 bp lange doppelsträngige DNA innerhalb weniger Sekunden in die Zelle. Nach etwa 22 bis 25 Minuten, der latenten Periode (engl. lag period), lysieren die Wirtszellen und entlassen jeweils etwa 100 neu gebildete Phagenpartikel. Diese sind außerordentlich stabil und können über viele Jahre hinweg als Lysat infektiös bleiben. Für experimentelle Arbeiten wird ein Überschuss an E. coli-Zellen mit T4-Phagen gemischt und anschließend auf Agarplatten mit geeignetem Nährmedium ausgesät. Es formt sich durch die wachsenden nicht

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Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

tution also r h+), den anderen mit der Mutation r+ und h (infektiös für Ttor-E. coli-Zellen) (genetische Konstitution also r+ h), so erhält man unter anderem rekombinante Nachkommen der Konstitutionen r+ h+ und r h mit einer Häufigkeit von etwa 2 %.

Abb. 4.16 Lineare DNA und Phagenhülle des Bakteriophagen T2. Die DNA wurde durch einen osmotischen Schock aus dem Phagenkopf eluiert und im Elektronenmikroskop dargestellt. Dieses Bild ist auch für den nahe verwandten Bakteriophagen T4 repräsentativ. (Aus Kleinschmidt et al. 1962, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

infizierten Zellen ein Bakterienrasen, auf dem sich allmählich größer werdende, klare Löcher von etwa 1 mm Durchmesser, sogenannte Plaques, bilden. Diese gehen in ihrem Ursprung auf einzelne T4-infizierte Zellen zurück, die nach der Phagenvermehrung lysieren und benachbarte Zellen mit den neu gebildeten Phagen infizieren. Entscheidend für die Möglichkeit, den Phagen für genetische Untersuchungen zu verwenden, war der Befund, dass man gelegentlich veränderte Plaqueformen beobachten kann, die genetisch bedingt sind, also durch Mutationen im Phagen verursacht werden. Eine für die künftigen Arbeiten ausschlaggebende Beobachtung von Alfred Hershey und Raquel Rotman (1949) war es, dass man nach gleichzeitiger Infektion einer Wirtszelle mit zwei genetisch verschiedenen Phagen in deren Nachkommenschaft Rekombinanten finden kann. Mischt man zwei T2-Phagen, den einen mit den Mutationen r (rapid lysis) und h+ (host-range, Wildtyp) (genetische Konsti-

In ähnlicher Weise konnten Dreifaktorenkreuzungen ausgeführt werden, die geeignet sind, die relativen Abstände der untersuchten Gene festzustellen und damit eine genetische Karte zu konstruieren. Bei der Ausarbeitung der Kreuzungsergebnisse ergaben sich jedoch unerwartete Probleme, als man Kreuzungen mit Markergenen ausführte, die nach der Kartierung eigentlich an den beiden entgegengesetzten Enden des Chromosoms liegen sollten (z. B. h42, ac41 und r67). Sie ergaben Rekombinanten, die für eine Anordnung r67-h42-ac41 sprachen. Als Erklärung hierfür bot es sich schließlich an, ein zirkuläres Chromosom anzunehmen. Das war ein deutlicher Widerspruch zur elektronenmikroskopischen Analyse der Phagen-DNA, die ein lineares DNA-Molekül angezeigt hatte. Einen Ausweg aus dieser Diskrepanz bot die Erklärung, dass das Phagengenom zwar linear ist, aber an beiden Enden die gleichen Gene trägt, d. h. zirkulär permutiert ist. Die Gensequenz von 5 Genen (1 bis 5) im Genom wäre demnach beispielsweise schematisch folgendermaßen zu verstehen: 1–2–3–4–5–1–2. Diese Interpretation hat sich als richtig erwiesen. Die duplizierten Enden variieren, je nach dem Phagen, zwischen einer Länge von 2000 und 6000 Basenpaaren, also mehr als für ein einzelnes Gen erforderlich ist. Zudem hat sich gezeigt, dass die wiederholten Abschnitte des Genoms in verschiedenen Phagen unterschiedliche Bereiche umfassen. Die Erklärung für die Entstehung solcher zirkulären Permutationen gibt die Art des Replikationsmechanismus. Die Replikation erfolgt mithilfe des rolling circle-Mechanismus, durch den zunächst lange lineare Genomkopien produziert werden, die tandemartig hintereinander angeordnet sind (Abb. 2.17). Allerdings ist die Art der Replikation dieses Phagen unter verschiedenen Gesichtspunkten einzigartig: ï Es gibt mehrere Startpunkte der DNA-Replikation. ï Diese Startpunkte werden nur für die erste Runde der Replikation verwendet (Startpunkt-abhängige Replikation). ï die Mehrzahl der Replikationen wird von Rekombinations-Zwischenprodukten an jedem beliebigen Punkt im Genom gestartet (Startpunkt-unabhängige Replikation).

4.3 Bakteriophagen

Die T4-Gene können in zwei funktionelle Gruppen unterteilt werden: Zum einen Gene, die in der frühen Phase der Infektion aktiv sind; sie sind im Wesentlichen für die T4-DNA-Replikation und Transkription verantwortlich. Und zum anderen Gene, die während der späten Phase der Infektion aktiv sind; sie sind dagegen eher für die Hüllproteine und deren Zusammenbau verantwortlich. Diese beiden Gruppen liegen im Phagengenom als Gruppen vor und werden von entsprechenden „frühen“ und „späten“ Promotoren reguliert. Nach der Replikation wird die DNA in den Phagenkopf hineingezogen. Sobald dieser gefüllt ist, wird die DNA abgeschnitten und der verbleibende Doppelstrang wird auf gleiche Weise in einen weiteren Phagenkopf verpackt. Die DNA-Menge, die in einen Phagenkopf passt, ist etwas größer als die des Genoms, sodass jeweils die ersten Gene der nächsten Genomkopie noch in den gleichen Phagenkopf verpackt werden. Dieser Mechanismus erklärt die Anwesenheit duplizierter Enden in jedem Phagen und zugleich deren Verschiedenheit in jedem Phagenpartikel.

Der Bakteriophage T4 ist, wie alle geradzahligen Phagen, ein virulenter Phage, der sich durch sein zirkulär permutiertes Genom auszeichnet. Die zirkuläre Permutation wird durch den rolling circle-Replikationsmechanismus zusammen mit der Art der Verpackung der Phagen-DNA in den Phagenkopf bedingt.

Mit diesen Experimenten war der Weg zur genetischen Analyse des Phagengenoms geebnet. Die T4-DNA enthält insgesamt nur 34,5 % (G + C)-Basen und entsprechend einen Überschuss an (A + T)-Basen (bei E. coli ist das Verhältnis in etwa ausgeglichen). Damit hat das Genom des T4-Phagen gegenüber seinem Wirtsorganismus einen Vorteil: Enzyme, die für Ihre Aktivität DNA aufschmelzen müssen (wie z. B. RNA- oder DNAPolymerasen), können an AT-reichen Sequenzen schneller arbeiten als an solchen Sequenzen, die ein ausgeglichenes Verhältnis von GC und AT haben. Wir wissen heute auch, dass das Genom des T4-Phagen 289 Protein-codierende Gene enthält und zusätzlich 8 tRNA-Gene und Gene für kleine, stabile RNA-Moleküle. 156 Gene waren durch Mutationen charakterisiert. Die Zahlenangaben sind allerdings manchmal etwas ungenau, da einige Gene mehrere codierende Regionen enthalten. Die Gendichte ist beim T4-Phagen etwa doppelt so hoch wie bei E. coli; nicht-codierende Regionen umfassen nur etwa 9 kb (= 5,3 % des Genoms). Regulatorische Regionen sind kompakt und überlappen gelegentlich auch mit codierenden Regionen. In vielen Fällen überlappen die Stoppcodons des einen Gens mit dem Startcodon des nächsten Gens; darüber hinaus gibt es auch viele verschachtelte Gene (engl. nested genes).

Die Analyse des T4-Genoms hat, vor allem durch die Pionierleistungen Seymour Benzers (1957), zu wichtigen ersten Einsichten in die molekulare Feinstruktur von Genen geführt. Ausgangspunkt der Versuche Benzers ist die Überlegung, dass es erforderlich ist, eine große Anzahl von Mutanten zu untersuchen, um Aufschlüsse über die genetische Feinstruktur eines Gens zu erzielen. Benzer hatte bei Abschluss seiner Versuche an der rII-Region ca. 3000 Mutanten untersucht. Für deren vollständige Analyse wären etwa 5.000.000 Kreuzungen erforderlich gewesen, ein Aufwand, der technisch nicht durchführbar gewesen wäre. Es war also notwendig, einen experimentellen Ausweg zu suchen, der eine eindeutige Kartierung mit sehr viel weniger Aufwand ermöglichte. Hierzu bot sich die Verwendung von Mutanten an, denen ein größerer Bereich der rII-Region fehlt. Solche Deletionsmutanten ermöglichen es, in einem ersten Kreuzungsansatz neue Mutanten schnell einer bestimmten Region eines Gens zuzuordnen. Als Kriterium für den Deletionscharakter einer Mutation benutzte Benzer die Tatsache, dass in Rekombinationsexperimenten bestimmte Mutationen mit anderen Mutationen, die ï untereinander normales Rekombinationsverhalten zeigen, keine Wildtyp-Rekombinanten liefern, und dass sie ï keine Reversionen zum Wildtyp liefern. Die Kartierungsexperimente ergaben zunächst, dass es innerhalb der rII-Region des Genoms des Phagen T4 zwei voneinander genetisch unabhängige Einheiten – Cistrons nach Benzers Terminologie – gibt, die rIIA und rIIB genannt wurden. Die weitere Analyse zeigte, dass innerhalb jeder dieser beiden Cistrons viele Mutationen induziert werden können, deren Lokalisation relativ zueinander eindeutig zu unterscheiden ist. Da diese verschiedenen Mutanten zugleich auch Rekombination untereinander zulassen, sind drei wichtige Einsichten aus diesen Kartierungsexperimenten abzuleiten: ï Ein Cistron ist als genetische Einheit nicht identisch mit einer Rekombinationseinheit, sondern komplexer. ï Ein Cistron ist als genetische Einheit nicht identisch mit einer Mutationseinheit, sondern komplexer. ï Die physikalische Dimension einer Mutationseinheit und einer Rekombinationseinheit liegt in der Größenordnung einzelner Nukleotide. Benzer definiert hiermit eine veränderte Form des Genbegriffs, das Cistron. Die Beziehung zwischen einer bestimmten phänotypischen Ausprägung eines Merkmals und einem genau festgelegten genetischen Verhalten wird nicht mehr ‒ wie beim ursprünglichen Genbegriff ‒ dadurch bestimmt, dass sich ein phänoty-

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Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

pisches Merkmal in bestimmte Verteilungs- und Ausprägungsregeln einordnen lässt, wie sie in den Mendel’schen Regeln (Kapitel 10.1) niedergelegt waren, sondern wird nunmehr – wesentlich genauer – damit festgelegt, dass ein Merkmal auf der Grundlage phänotypischer Kriterien genetisch nicht weiter unterteilbar sein darf, um als ein Cistron bezeichnet werden zu dürfen. Obwohl sich diese Definition damit in ihrer rein genetischen Basis in keiner Weise vom Mendel’schen Genbegriff zu unterscheiden scheint, ist sie ‒ ganz im Gegensatz zum Mendel’schen Genbegriff – zugleich auch molekular anwendbar. Benzer konnte aufgrund seiner Arbeiten darauf schließen, dass die kleinsten Rekombinations- und Mutationseinheiten in der Größenordnung einzelner Nukleotide liegen. Heute ist durch DNA-Sequenzierung bewiesen, dass die kleinsten Einheiten für Mutation und Rekombination tatsächlich die Nukleotide sind.

Die genetische Feinkartierung der rII-Region des Phagen T4 lässt erkennen, dass die kleinsten Rekombinationsund Mutationseinheiten in der Größenordnung einzelner Nukleotide liegen, während die klassische Genetik das „Gen“ als Einheit der Rekombination und der Mutation betrachtet hatte.

Es muss abschließend noch ein anderer Phage erwähnt werden, der E. coli-Phage ΦX174. Das Genom dieses Phagen ist sehr klein und besteht aus einem einzelsträngigen DNA-Molekül von nur 5375 Nukleotiden. Von dieser DNA werden 11 verschiedene Proteine codiert, die insgesamt rund 2300 Aminosäuren enthalten. Hierfür wäre eigentlich eine DNA-Länge von ca. 6900 Nukleotiden erforderlich. Die Sequenzanalyse des Phagen durch Frederick Sanger und seine Mitarbeiter (1978) erlaubte es, diesen Widerspruch zu lösen. Es

Abb. 4.17 Molekulare Feinstruktur überlappender Gene im Genom des Bakteriophagen ΦX174. Es sind die Gene D, E und J gezeigt. In der Mitte der Abbildung ist die Basensequenz in der jeweiligen Grenzregion der Überlappung dargestellt (Nukleotidnummern sind darüber angegeben). Die Tripletts der ver-

zeigt sich nämlich, dass sich die Leseraster mehrerer Gene überlappen; d. h. eine Verschiebung des Leserasters um 1 oder 2 Nukleotide gestattet die Synthese eines in seiner Aminosäurefolge völlig anderen Proteins (Abb. 4.17).

Protein-codierende DNA-Sequenzen können im Ausnahmefall auch überlappend angeordnet sein. Durch Verschiebung des Leserasters werden mehrere verschiedene Proteine im gleichen DNA-Bereich codiert.

4.4 Transformation und Rekombination 4.4.1 Transformation In den vorangegangenen Abschnitten haben wir gesehen, dass Bakterien neue genetische Information über Plasmide durch Konjugation und über Bakteriophagen durch Transduktion aufnehmen können. Das kann eine Übertragung genetischer Information zwischen verschiedenen Individuen oder darüber hinaus, bei geringerer Wirtsspezifität, sogar zwischen verschiedenen Wirtsgruppen, zur Folge haben. Wir wollen jetzt noch einen dritten Mechanismus diskutieren, nämlich die Aufnahme nackter DNA aus dem extrazellulären Umfeld; dieser Prozess wird als Transformation bezeichnet und erlaubt einen horizontalen Gentransfer. Wenn die übertragene DNA Informationen mit einem Selektionsvorteil für das aufnehmende Bakterium enthält, wird sich diese Information relativ schnell in einer Population ausbreiten. An dieser Stelle soll jedoch zunächst noch einmal an den Beginn der molekularen Erforschung des Erbmaterials zurückgegangen wer-

schiedenen Leseraster sind durch farbige Rechtecke unter bzw. über den jeweiligen Aminosäuren gekennzeichnet. Jedes Gen ist durch ein großes Rechteck begrenzt. (Nach Sequenzangaben in Sanger et al. 1978)

4.4 Transformation und Rekombination

den. Aus der Beschreibung der Experimente von Avery, die zur Identifikation der DNA als molekulare Trägersubstanz der Erbinformation geführt hatten (S. 4), war zu erkennen, dass ein Hinzufügen von DNA zu Zellen von Mikroorganismen zur Veränderung der Erbinformation führen kann, ohne dass man zunächst die Grundlage dieser Experimente verstehen konnte. In den Experimenten von Avery müssen die Streptokokken DNA aus den abgetöteten Zellen aufgenommen haben. Wir wissen heute, dass Streptococcus und einige andere Prokaryoten – im Gegensatz zu E. coli – DNA sehr leicht in die Zelle aufnehmen können. In den Zellen kommt es dann zu Rekombination (d. h. Neukombination von DNA-Sequenzen, Kapitel 4.4.2) mit der genomischen DNA, sodass die fremde genetische Information in das Genom der Zelle aufgenommen wird. In Averys Experimenten hat das schließlich zur Übertragung der Infektivität der Streptokokken, d. h. zum Tode der Mäuse durch Pneumonie, geführt, obwohl die Erreger zuvor durch Hitze abgetötet worden waren: Die nicht pathogenen R-Typ-Streptokokken waren durch Aufnahme von DNA des pathogenen S-Typ-Stamms transformiert worden. Transformation unterscheidet sich von den zuvor beschriebenen DNA-Übertragungsmechanismen durch Plasmide oder Phagen insofern, als die DNA zur Übertragung in diesem Falle keine Hilfselemente benötigt, sondern direkt von der Zelle aufgenommen wird. Die Effektivität der Aufnahme von DNA ist allerdings für unterschiedliche Bakterien sehr verschieden. Im Gegensatz zu den oben erwähnten Streptokokken bedürfen die E. coli -Zellen einer Vorbehandlung mit CaCl2-Lösungen, um für DNA durchlässig zu werden.

Die Aufnahme fremder DNA in eine Zelle wird als

Transformation bezeichnet. Bakterien unterscheiden sich in ihrer Effektivität der Aufnahme von DNA. Einige Bakterienstämme verfügen über spezielle Mechanismen, extrazelluläre DNA an die Zellmembran zu binden und sie ins Innere der Zelle aufzunehmen.

Von etwa 40 verschiedenen Bakterienspezies, verteilt auf alle taxonomischen Gruppen, weiß man heute, dass sie unter natürlichen Bedingungen transformiert werden können. In den meisten Spezies ist die Bereitschaft („Kompetenz“), DNA aufzunehmen, ein vorübergehender physiologischer Zustand, der stark durch jeweils spezifische Prozesse reguliert wird (z. B. veränderte Wachstumsbedingungen, Nährstoffangebot, Zelldichte). Es kann daher sein, dass wir noch mehr Spe-

zies entdecken werden, die DNA direkt aufnehmen können, wenn wir die entsprechenden Bedingungen kennenlernen. Der Transport von DNA aus dem extrazellulären Milieu in das Cytoplasma ist ein komplexer Vorgang. Dabei ist ein zentraler Schritt die Umwandlung der exogenen, DNase-sensitiven DNA in eine vor DNase geschützte DNA. Es wird nur ein Strang der DNA aufgenommen ‒ der andere Strang des DNA-Moleküls wird zu Nukleotiden abgebaut und bei Gram-positiven Bakterien in das extrazelluläre Milieu, bei Gram-negativen Bakterien wahrscheinlich in den periplasmatischen Raum abgegeben. Ansonsten verwenden alle Bakterien stark verwandte Proteine, um die DNA zu importieren (Ausnahme: Heliobacter pylori); teilweise weist das Kompetenzsystem deutliche Homologien zu den Proteinen auf, die wir beim Aufbau der Pili (Abb. 4.5) schon kennengelernt haben. Dazu gehören etwa 20 bis 50 verschiedene Proteine. Eine vereinfachte Übersicht für die Mechanismen bei Neisseria gonorrhoeae und Bacillus subtilis gibt Abb. 4.18. DNA kann aktiv oder passiv in die Umgebung von Bakterien gelangen. Passive Prozesse beinhalten im Wesentlichen den Abbau von toten Zellen und setzen die Aktivität von Nukleasen oder reaktiver Chemikalien voraus. Allerdings kennen wir auch die Möglichkeit, dass DNA aktiv ins umgebende Medium abgegeben wird. Die Kenntnis beider Prozesse ist wichtig, wenn wir entsprechende Vorgänge in der Natur betrachten (z. B. Transformation bei Bodenbakterien oder im Menschen zwischen seiner üblichen Bakterienflora und pathogenen Bakterien). Wenn wir den Transformationsvorgang selbst etwas genauer beobachten, dann stellen wir fest, dass die extrazelluläre DNA zunächst nicht-kovalent an die entsprechenden Stellen auf der Oberfläche kompetenter Bakterien bindet. Die Zahl der Bindestellen wurde für einige Bakterien bestimmt und schwankt zwischen 30 und 80. Die nachfolgende Translokation der DNA durch die Membran hindurch ist von Stamm zu Stamm unterschiedlich. Einige kompetente Bakterienspezies, z. B. Neisseria gonorrhoeae und Haemophilus influencae, sind sehr selektiv bei der Aufnahme von DNA, wohingegen die meisten anderen Spezies DNA unabhängig von ihrer Sequenz aufnehmen. Die Aufnahme von Plasmid-DNA ist allerdings wegen der nukleolytischen Spaltung und des Abbaus des einen Strangs auf diesem Weg relativ ineffizient. In vitro ist die Aufnahme der DNA relativ schnell (ca. 60‒100 bp pro Sekunde). Die aufgenommene DNA verbleibt nur vorübergehend im Cytoplasma der Bakterien, da diese Form der DNA bei einer Zellteilung nicht repliziert.

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120 120

Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

a Neisseria gonorrhoeae

b Bacillus subtilis

DR PilQ PilP

ComE ComEA

PilD

PilG

ComA

PilF

ComGB

ComEC

ComC ComGA

ComFA

Abb. 4.18 a, b Darstellung des kompetenten Pseudopilus und der DNA-Translokase. a Neisseria gonorrhoeae. Das Hauptpilin (PilE; orange) und das Nebenpilin (ComP, blau) werden durch die Präpilin-Peptidase bearbeitet und zum Pseudopilus zusammengefügt. Das polytope Membranprotein PilG und die NTPase (PilF) nehmen an diesem Prozess ebenso teil wie PilC (nicht dargestellt). Eine spezifische Sequenz in der äußeren DNA ist für die Bindung an den DNA-Rezeptor (DR) verantwortlich. Die ankommende DNA (blau) wird mithilfe eines Kanals durch die äußere Membran transportiert; der Kanal wird durch Sekretin (PilQ) und sein Pilot-Protein (PilP) gebildet. Das periplasmatische DNA-Bindungsprotein (ComE) ist an der Aufnahme beteiligt und liefert die DNA am Eingang des Kanals an der cytoplasmatischen Wand ab (ComA). Ein Strang erreicht das Cytosol, der andere wird abgebaut und die Nuk-

leotide werden in den periplasmatischen Raum abgegeben. b Bacillus subtilis. Das Hauptpseudopilin (ComGC; orange) und die Nebenpseudopiline (ComGD, ComGE und ComGG, blau) werden durch die Präpilin-Peptidase (ComC) bearbeitet und zum Pseudopilus zusammengefügt. Das polytope Membranprotein ComGB und die NTPase (ComGA) nehmen an diesem Prozess teil. Der Pseudopilus ermöglicht der DNA, an den Membran-gebundenen Rezeptor ComEA zu binden, der die gebundene DNA am Kanal an der cytoplasmatischen Membran abliefert (ComEC). Ein ATP-bindendes Molekül (ComFA) ist am Transport der DNA durch die Membran beteiligt. Ein Strang erreicht das Cytosol, der andere wird abgebaut, und die Nukleotide werden in das extrazelluläre Milieu abgegeben. (Nach Chen u. Dubnau 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group

Wenn die aufgenommene DNA zu einem Doppelstrang ergänzt wird, wird sie möglicherweise durch Restriktionsenzyme abgebaut. Da die natürliche Transformation allerdings eine einzelsträngige DNA und anschließende Rekombination (Kapitel 4.4.2) beinhaltet, stellt ein möglicher Abbau durch Restriktionsenzyme kein Hinderungsgrund für einen erfolgreichen Gentransfer dar. Voraussetzung für eine erfolgreiche Rekombination sind kurze (25‒200 bp) Abschnitte mit ähnlichen Sequenzen zwischen aufgenommener und chromosomaler DNA. Die Rekombinationsrate ist auch hier von Stamm zu Stamm unterschiedlich und beträgt etwa 0,1 % bei Acinetobacter baylyi und 25‒50 % bei Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae; die Größe der aufgenommenen Fragmente kann dabei mehrere Kilobasen umfassen.

Horizontaler Gentransfer erlaubt die schnelle Übertragung von DNA und im Falle eines Selektionsvorteils (unter hohem Selektionsdruck) erfolgt eine rasche Ausbreitung in der Population. Die weitere Aufklärung dieses Mechanismus ist deswegen von besonderer Bedeutung in Bereichen mit hohem Selektionsdruck: bei der Bekämpfung von Krankheiten mit Antibiotika (Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen) und in der Landwirtschaft beim Einsatz von Pestiziden (Übertragung von Pestizid-Resistenz; Lutz et al. 2001, Thomas u. Nielsen 2005).

4.4 Transformation und Rekombination

4.4.2 Rekombination Unter Rekombination versteht man allgemein die Neukombination von DNA-Sequenzen. Unter genetischen Gesichtspunkten ist dabei der Austausch zwischen verschiedenen DNA-Molekülen von besonderem Interesse, da er zu einer Neukombination von Merkmalen führt. Der molekulare Mechanismus der Rekombination setzt zwei grundlegende Prozesse voraus: zunächst einmal Aufnahme fremder DNA in die Zelle (durch Konjugation, Transduktion oder Transformation) und dann Schnitt bzw. Bruch des DNA-Moleküls und schließlich dessen Neuverknüpfung. Wir können verschiedene Formen der Rekombination unterscheiden: ï homologe Rekombination: Hier sind ausgedehnte Sequenzhomologien bei Donor- und Ziel-DNA erforderlich; ï sequenzspezifische Rekombination (engl. site-specific recombination): Hier reichen wenige Basenpaare aus (Beispiel: Integration von Phagen-DNA in Bakteriengenom); ï unspezifische Rekombination: Hier sind Enzyme beteiligt, die zwar spezifische Strukturen der DonorSequenzen erkennen, aber weitgehend beliebige Sequenzen als Ziel-DNA benutzen können (Beispiel: Transposons, Kapitel 8.1). Wie wir zu Beginn des Kapitels (S. 98) gesehen haben, stellten Lederberg und seine Mitarbeiter in ihren Arbeiten zur Abhängigkeit von Nährstoffkomponenten bei Bakterien fest, dass bei Kokultivierung auxotropher Stämme mit prototrophen Stämmen Merkmalskombinationen auftreten, die nur durch Austausch und Neukombination genetischen Materials erklärt werden können. Ein frühes Modell („copy-choice-Modell“) schlug vor, dass große Teile der DNA-Stränge nach einem Bruch neu synthetisiert werden und dass ein Fehler in der Wahl des Matrizen-Strangs im Rahmen der DNA-Neusynthese für das Auftreten der Rekombination verantwortlich ist. Dieses Modell wurde allerdings durch ein Experiment eindeutig widerlegt. Zur Klärung der Frage, ob DNA-Neusynthese einen entscheidenden Beitrag zur Rekombination liefert, dienten Versuche von M. Meselson und J. J. Weigle (1961), in denen sie von der Markierungstechnik mit schweren Isotopen Gebrauch machten, die bereits zur biochemischen Demonstration der semikonservativen Replikation erfolgreich eingesetzt worden war (Abb. 2.10). Genetisch unterschiedliche λ-Phagen, deren einer Genotyp mit 13C15N-DNA markiert war, während der andere Genotyp unmarkiert blieb (also 12C14NDNA enthielt), wurden gemeinsam in Zellen von E. coli infektiert. Die daraus erhaltenen Bakteriophagen wurden in CsCl nach ihrer Schwimmdichte aufgetrennt

Abb. 4.19 Mechanismus der Rekombination (I). Infiziert man E. coli-Bakterien mit einer Mischung von Phagen, deren einer Teil mit 13C und 15N markiert ist und die Markergene A, B und C trägt, deren zweiter Teil die normalen Isotopen 12C und 14N sowie die Marker a, b und c enthält, so beobachtet man nach Trennung der neu entstandenen Phagenlysate im CsCl-Gleichgewichtsgradienten, dass sich die Phagen nach unterschiedlicher Dichte auftrennen. Man findet in den Fraktionen niedriger Schwimmdichte neu synthetisierte Phagen, im Bereich mittlerer Schwimmdichte Phagen, deren DNA teilweise die schweren Isotopen enthält, und im Bereich höherer Schwimmdichte Phagen, deren DNA zur Hälfte aus schweren Isotopen besteht. Diese schwere Fraktion besteht aus den ursprünglich markierten DNA-Molekülen, die jedoch während der Replikation der Phagen in der Wirtszelle einen neuen, leichten DNAStrang synthetisiert haben. Sie enthalten die Marker A, B und C. Die mittlere Fraktion enthält ebenfalls ursprüngliche DNABereiche, die jedoch aufgrund von Rekombinationsereignissen unterschiedlich lang sind und nie einen vollständigen Einzelstrang umfassen. Genetisch erweisen sie sich erwartungsgemäß als Rekombinanten (in der Abbildung: A, b, c oder a, B, C). Rekombination schließt also den Austausch von DNA-Stücken ein, wie bereits Taylors Experimente angezeigt hatten

und die verschiedenen Dichtefraktionen auf ihre genetische Konstitution getestet (Abb. 4.19). Es ließ sich zeigen, dass die Bakteriophagen, deren DNA partiell mit 13C15N markiert war, einen genetisch rekombinanten Genotyp besitzen. Wie bereits in Taylors Expe-

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Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

rimenten war damit der direkte Beweis für einen Stückaustausch in Zusammenhang mit Rekombination erbracht. Da die Versuche von Meselson und Weigle noch nicht ausschließen, dass die nicht mit schweren Isotopen markierte Bakteriophagen-DNA durch Neusynthese in Zusammenhang mit der Rekombination entstanden war, wurde ein weiteres Kreuzungsexperiment mit nunmehr ausschließlich 13C15N-markierten Bakteriophagen unterschiedlicher genetischer Konstitution durchgeführt. Erfolgt die Vermehrung dieser Bakteriophagen in E. coli-Zellen, die in unmarkiertem (also „leichtem“) Medium wachsen, so wird die Mehrzahl der Nachkommen teilweise markiert oder unmarkiert sein. Dennoch bleiben stets einige Bakteriophagen unrepliziert und werden zu neuen Phagenpartikeln gepackt. Einzelne solcher noch vollständig 13C15N-markierten DNA-Stränge können zudem aufgrund der hohen Multiplizität der Phagengenome in der Zelle nach der Koinfektion ein Rekombinationsereignis mit einer genetisch ungleichen Bakteriophagen-DNA durchlaufen haben, sodass ihr Genotyp von dem der beiden parentalen Bakteriophagen zu unterscheiden ist. Der Nachweis solcher vollständig 13C15N-markierten und zugleich rekombinanten λ-Phagen gelang. Damit war bewiesen, dass der molekulare Mechanismus der Rekombination auf Brüchen und Wiedervereinigung zweier DNA-Doppelhelices ohne wesentliche DNA-Neusynthese beruht (Abb. 4.20). Das copy-choice-Modell, das eine Rekombination während der DNA-Synthesephase durch Wechsel des Templates annahm, war damit widerlegt.

Rekombination erfolgt durch Bruch und Wiederverheilung zweier DNA-Doppelhelices.

Viele der an Rekombinationsereignissen beteiligten molekularen Mechanismen sind an Prokaryoten aufgeklärt worden. Dabei wurde immer wieder deutlich, dass bei den Rekombinationsprozessen enge Zusammenhänge zu solchen Reparaturmechanismen bestehen, die aufgrund von Fehlern während der DNAReplikation entstehen. Diese Reparaturmechanismen werden allerdings an anderer Stelle (Kapitel 9.6) im Zusammenhang mit der Entstehung von Mutationen besprochen. Wesentliche Schritte eines Rekombinationsereignisses sind: ï Entstehung von DNA-Einzel- oder Doppelstrangbrüchen, ï Paarung zweier homologer DNA-Doppelhelixregionen, ï Austausch zwischen zwei Einzelsträngen der gepaarten Doppelhelices, ï Auflösung der viersträngigen Struktur durch Erzeugung weiterer Brüche – entweder in den bereits

Abb. 4.20 Mechanismus der Rekombination (II). Das Bruchund-Wiederverheilungsmodell geht davon aus, dass nach zwei Brüchen in den zwei beteiligten DNA-Doppelhelices eine Wiederverheilung der DNA-Fragmente in falscher Anordnung erfolgt

rekombinanten Strängen oder in den komplementären Partnersträngen – und Wiederverheilung nach Austausch der Enden. Heute wird das Rekombinationsverhalten bei E. coli am besten durch das Meselson-Radding-Modell erklärt. DNA-Brüche. Die notwendige Voraussetzung eines Rekombinationsereignisses ist ein Doppelstrangbruch in der chromosomalen DNA in der χ-Region (engl. crossover hotspots instigators; χ: griech. Buchstabe chi). Diese χ-Region umfasst eine Octamer-Sequenz (5’-GCTGGTGG-3’), die an ungefähr 1000 Positionen des E. coli-Chromosoms (im Mittel alle 5000 bp) zu finden ist. Sie wird nur als Einzelstrang vom RecBCDKomplex erkannt; die Sequenz des Gegenstrangs wird dagegen nicht erkannt. Der RecBCD-Komplex ist sehr groß (330 kDa) und besteht aus vielen Untereinheiten. Er enthält zwei aktive DNA-Helikasen sowie eine ATPabhängige Doppel- und Einzelstrang-abhängige Exonuklease (gelegentlich auch Exonuklease V genannt), die mit hoher Wirksamkeit nur an linearer DNA als Substrat arbeiten kann. Die Aktivität des RecBCDKomplexes wird durch die χ-Regionen reguliert ‒ die oben erwähnten „hotspots“ der Rekombination. Ein gewisser Bereich der Doppelhelix bleibt im Enzymbereich ungepaart, da sich der RecBCD-Komplex um etwa 300 bp je Sekunde fortbewegt, die Doppelhelix danach aber nur mit einer Schnelligkeit von etwa

4.4 Transformation und Rekombination

Lineare DNA

Genotyp

Rekombinationshäufigkeit

χ0

6 4 2 0

recBCD + χ

6 4 2 0

recBCD +

recBCD + χ

χ

recBCD + χ

recBCχ

recD 0

10

20

30

40 kb

Häufigkeit

χ

6 4 2 0 6 4 2 0 6 4 2 0 6 4 2 0 0

10

20

30

40

Entfernung (kb)

Abb. 4.21 Wechselseitige Abhängigkeit von χ und RecBCD. Links sind einige lineare DNA-Moleküle gezeigt. Die Entspiralisierung beginnt an der linken Seite des Moleküls (Pfeilspitze). Die Orientierung von χ ist durch Pfeile angedeutet; χ0 bedeutet Abwesenheit von χ. In der Mitte sind einige Genotypen des

bakteriellen Wirts gezeigt und rechts idealisierte Darstellungen der Rekombinationshäufigkeit im Bezug zum Abstand vom Ende des jeweiligen Strangs. Ohne χ und ohne RecBC findet keine Rekombination statt. (Nach Eggleston u. West 1997, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

200 bp je Sekunde zurückgebildet wird. RecBC schneidet den DNA-Strang mit der χ-Sequenz kurz hinter dem 3’-Ende der Sequenz endonukleolytisch und erzeugt so eine Einzelstrangregion, an die das RecAProtein binden kann.

Wechselwirkung von RecBCD mit der χ-Sequenz freie einzelsträngige 3’-Enden gebildet, auf die das RecBCD-Enzym das RecA-Protein auflädt. RecA ist das „Gründungsmitglied“ einer wachsenden Zahl von Proteinen, die die Bindung und Hydrolyse von ATP mit mechanischer Arbeit koppeln. Ein katalytischer Kreislauf von ATP-Bindung und -Hydrolyse orchestriert deutliche Konformationsänderungen. Üblicherweise hat allerdings das Einzelstrangbindungsprotein (SSB) eine höhere Affinität zu einzelsträngiger DNA als das RecA-Protein. Erst durch RecBCD wird die Verdrängung des SSB und Bindung von RecA an den Einzelstrang ermöglicht (Abb. 4.22). Strangpaarung. Der mit RecA-Protein assoziierte DNA-Einzelstrang dringt in die intakte DNA-Doppelhelix des homologen Paarungspartners ein (engl. strand invasion; Abb. 4.21). Hier verdrängt der Einzelstrang einen der gepaarten Stränge unter Aufwindung der Doppelhelix und paart mit dem komplementären Strang der denaturierten Doppelhelix; es bildet sich die D-Schlaufe (engl. displacement loop). Man bezeichnet

Die wechselseitige Abhängigkeit der χ-Aktivität und des recBC-Genproduktes des Wirts in Bezug auf den Rekombinationserfolg wurde deutlich bei der Untersuchung entsprechender Mutanten von E. coli (Abb. 4.21). In Abwesenheit des χ-Elements (χ0) wie auch der recBC-Genprodukte (recBC−) findet keine Rekombination statt; die Bakterien verhalten sich in Abwesenheit der dritten Komponente (recD−) wie mit einer konstitutiv-aktivierten χ-Region. Das RecBCD-Enzym bindet an die stumpfen Enden des DNA-Bruchs und initiiert dort die Entspiralisierung der DNA durch die zwei verschiedenen Helikasen (RecB, die langsame, und RecD, die schnellere). Während der Entspiralisierung werden durch die

123

124 124

Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

die hierin enthaltenen doppel- und einzelsträngigen DNA-Moleküle als joint molecules. Einzelstrangaustausch. Das RecA-Protein bildet mit der Einzelstrang-DNA (ssDNA) eine rechtsgewundene Nukleoproteinfibrille mit 18,6 Basen in jeder Helixwindung. Die ssDNA wird in dieser Struktur ungewöhnlich gestreckt, sodass ihre Basen offenbar für die Paarung mit der homologen DNA besonders exponiert sind. Die ssDNA ist in dieser Konformation um 50 % länger als normale ssDNA. Dieser Nukleoproteinfibrille lagert sich die DoppelstrangDNA (dsDNA) an, die an der Rekombination beteiligt ist (Abb. 4.22).

χ

Oben 5‘ Unten 3‘ oberhalb

unterhalb

3‘ 5‘

Bindung von RecBC

χ

Entspiralisierung

χ

3‘ 5‘

Bindung der freien Einzelstrang-DNA durch SSB und RecA χ

3‘

5‘ Verdrängung des SSB Bevorzugte Bindung von RecA

χ

Fortgesetzte Bindung von RecA an das obere χ-Fragment

3‘

5‘

Das Ergebnis dieser molekularen Vorgänge ist eine viersträngige Struktur (Abb. 4.23), wie sie in den 1960er-Jahren von Robin Holliday entwickelt wurde; sie wird daher als Holliday-Struktur (engl. Holliday junction) bezeichnet (eine lesenswerte Übersicht aus dem Blickwinkel des Entdeckers hat Holliday 1974 publiziert). Im Elektronenmikroskop hat man die Existenz von Holliday-Strukturen auch bei prokaryotischen DNA-Molekülen nachweisen können. Die Struktur der DNA-Doppelhelix gestattet die Bildung solcher viersträngiger Kombinationsmoleküle, ohne dass Basenpaarungen entfallen. Zudem ist eine Verschiebung des Überkreuzungspunktes vom ursprünglichen Austauschpunkt durch eine reißverschlussartige Verschiebung der Basenpaarungen in beiden Doppelhelices möglich (engl. branch migration), also eine Wanderung des Verzweigungspunktes. Sie kann mit 50 Nukleotidpaaren je Sekunde sehr schnell erfolgen und über mehrere Tausend Basenpaare fortschreiten. An dieser Wanderung des Verzweigungspunktes sind die Proteine RuvA, RuvB und RuvC entscheidend

3‘ χ

5‘ Homologe Anordnung Eindringen des Einzelstrangs χ

Schlüssel RecBCD SSB

RecA homologe DNA

Abb. 4.22 Bildung der homologen Stränge. Der RecBCKomplex bindet zunächst an das Ende der linearen DNA und beginnt, die Doppelstränge zu entspiralisieren. An die freien Einzelstränge binden Einzelstrangbindungsproteine (SSB) und das RecA-Protein; das RecA-Protein bildet zusammen mit dem oberen DNA-Einzelstrang ein Filament, das in den anderen DNA-Strang einwandert und dort nach homologen Sequenzen sucht. Nach der Wechselwirkung mit χ in der richtigen Orientierung bleibt der RecBCD-Komplex stehen, die RecD-Untereinheit wird modifiziert (angedeutet durch den Farbwechsel gelb – orange), und die Polarität der Nuklease wird umgedreht. (Nach Eggleston u. West 1997, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

4.4 Transformation und Rekombination

a

Abb. 4.23 a–c Modell der Wechselwirkungen von RuvA, RuvB und RuvC an der Holliday-Struktur. a Modell des RuvAB-Komplexes, wie er an der Wanderung des Verzweigungspunktes beteiligt ist. Dabei binden zwei RuvA-Tetramere (gelb; hier ist wegen der Klarheit der Zeichnung nur ein Tetramer gezeigt) an den Verzweigungspunkt und halten ihn in einer ungefalteten, planaren Konfiguration. Die beiden hexameren Ringe aus RuvB (blau) sind gegenläufig orientiert und liegen diametral entgegengesetzt auf zwei DNA-Armen. Sie treiben die Wanderung des Verzweigungspunktes durch ihre (ATP-verbrauchenden) Helikase-Aktivitäten an; die Pfeile deuten die Richtung der DNA-Bewegung an. b Der RuvBC-Komplex trägt wesentlich zur Erhöhung der Auflösungseffizienz der Holliday-Struktur bei. Dazu bindet RuvC

(rot) als Dimer an den Verzweigungspunkt und tritt mit den beiden RuvB-Hexameren (blau) in Wechselwirkung. c Zwei Ansichten (von oben und von der Seite) des hypothetischen RuvABCKomplexes, in dem RuvA und RuvC an entgegengesetzte Stellen des Verzweigungspunktes binden und die Bindung der beiden RuvB-Ringe stabilisieren. Dabei verdrängt RuvC eines der beiden RuvA-Tetramere. Unter diesen Bedingungen schreitet die Wanderung des Verzweigungspunktes voran, aber das RuvC-Dimer „scannt“ die DNA für bestimmte Sequenzen. Wenn dann der Komplex diese bevorzugten Stellen erreicht, wird die DNA geschnitten, die Holliday-Struktur aufgelöst und die Rekombination beendet. (Nach van Gool et al. 1998, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

beteiligt (Abb. 4.23). Wichtigen Anteil an der Entdeckung dieser Zusammenhänge hatten Mutanten von E. coli, die sowohl Defizite in ihrem Rekombinationsverhalten aufwiesen als auch eine erhöhte Sensitivität gegenüber UV-Licht (daher erklärt sich die Abkürzung „ruv“). Die erste ruv-Mutante (heute als ruvB bezeichnet) wurde 1974 von N. Otsuji und Mitarbeitern identifiziert. Die weiteren genetischen, biochemischen und biophysikalischen Arbeiten kamen zu dem Ergebnis, dass RuvA die Holliday-Struktur der rekombinierenden DNA spezifisch erkennt, daran bindet und die Struktur zu einem offenen Viereck öffnet. An diesen Komplex binden dann zwei Ringe, die jeweils aus 6 RuvB-Molekülen gebildet werden. Die Helikase-Aktivität der RuvB-Moleküle führt dazu, dass die DNA

durch diese ringförmige Struktur unter ATP-Verbrauch hindurchgezogen werden kann. Auflösung. Zum Abschluss des Rekombinationsereignisses ist ein weiterer Austausch innerhalb der DNA erforderlich, um das Vierstrangstadium aufzulösen und wieder zwei Doppelhelices herzustellen, ein Prozess, der Auflösung (engl. resolution) genannt wird. Von besonderer Bedeutung ist hierbei RuvC. Nach dem Schnitt durch RuvC muss die DNA wieder durch eine DNA-Ligase verbunden werden. Die Schlüsselbeobachtung, die zur Identifizierung der Auflösung der Holliday-Struktur geführt hat, machten Bernadette Connolly

125

126 126

Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

und Stephen West 1990, als sie in vitro Rekombinationszwischenstufen mit RecA-Protein herstellten und bei der Untersuchung von Zellextrakten eine Fraktion beobachteten, die eine schwache Rekombinationsaktivität zeigte. Diese Fraktion war in der Lage, kleine synthetische Holliday-Strukturen durch Einzelstrangschnitte in kleine Duplexprodukte aufzulösen. Ein Extrakt von ruvC-Mutanten verfügte dagegen nicht über diese Eigenschaften. Heute wissen wir, das RuvC als Dimer spezifisch an die Holliday-Strukturen bindet und sie in eine offene planare Form überführt. In Anwesenheit divalenter Kationen induziert RuvC symmetrische Einzelstrangbrüche in den DNA-Strängen gleicher Polarität. Obwohl das Protein zunächst die Holliday-Struktur als solche erkennt, schneidet sie die DNA spezifisch [5’-(A/T) TT|(G/C)-3’]. Nach der Spaltung wird der Rekombinationsprozess durch eine Ligase-Reaktion abgeschlossen, wobei die Strang-Enden wieder neu verknüpft werden. Das RecBCD-System ist nicht das einzige Rekombinationssystem, das in E.coli vorkommt. Kürzlich wurde ein weiteres System identifiziert, bei dem RecQ als Helikase arbeitet, RecJ als Nuklease wirkt und die Bildung und Stabilisierung des Einzelstrangs durch RecF, O und R erfolgt (RecFRekombinationsmaschine). Der wesentliche Unterschied scheint darin zu liegen, dass der RecBCD-Weg zunächst einen Doppelstrangbruch induziert, wohingegen der RecF-Weg einen Einzelstrangbruch voraussetzt (Amundsen u. Smith 2003).

otische Systeme nach der Replikation und vor der meiotischen Teilung. Eine lesenswerte Zusammenfassung von 40 Jahren Forschung über die HollidayStruktur wurde 2004 von Liu und West veröffentlicht.

4.5 Genstruktur und Genregulation Wir haben im Kapitel über die Transkription (Kapitel 3.3) nur angedeutet, dass das Ablesen der genetischen Information und ihre anschließende Übersetzung in Proteine ein räumlich und zeitlich stark regulierter Prozess ist. Unsere ersten Erkenntnisse über die genauen molekularen Mechanismen der Regulation der Genexpression wurden an Prokaryoten gewonnen. Die zuvor beschriebenen Techniken der Sexduktion und Transduktion haben zur Aufklärung von Genregulationsmechanismen entscheidend beigetragen. Die Aufklärung des Grundprinzips der Regulation verschiedener prokaryotischer Gene führte zu der Einsicht, dass es hierbei zunächst zwei gegensätzliche Regulationsprinzipien zu unterscheiden gilt (Abb. 4.24): ï das der negativen Kontrolle und ï das der positiven Kontrolle.

Bei der Rekombination wird durch Brüche und kreuz-

weise Wiederverheilung der DNA-Enden eine viersträngige Holliday-Struktur gebildet, die eine allmähliche Verschiebung des Überkreuzungspunktes der DNA-Moleküle gestattet. Bei E. coli sind verschiedene Proteine bekannt, die spezifische Aufgaben bei der Rekombination erfüllen. Dazu gehören RecA, der RecBCD-Komplex, RuvAB und RuvC. Innerhalb des E. coli-Genoms gibt es DNA-Sequenzen, an denen Rekombination bevorzugt erfolgen kann.

Das E. coli-Chromosom ist normalerweise ringförmig und besitzt daher keine Einzelstrang-Enden. In normalen Bakterienzellen ist Rekombination allerdings auch nicht von Bedeutung. Erst im Falle einer Konjugation oder einer Transduktion wird ein zweites DNA-Molekül für mögliche Rekombination verfügbar. Dieses Molekül ist linear und bietet daher eine Bindungsstelle für den RecBC-Komplex an. Wie wir später (Kapitel 5.3.3) sehen werden, gelten die hier skizzierten Rekombinationsmechanismen entsprechend auch für eukary-

Abb. 4.24 a, b Prinzipien der Genregulation. a Positive Regulation. Ein Gen wird bei Anwesenheit eines Induktors angeschaltet, indem dieser an die Regulationsregion der DNA bindet und dadurch die Transkription initiiert. b Negative Regulation. Das Gen ist normalerweise durch einen Repressor, der an die Regulationsregion bindet, inaktiviert. Wird das Repressormolekül durch einen Induktor so modifiziert, dass es nicht mehr an die DNA binden kann, wird die Regulationsregion des Gens freigegeben und es kann eine Transkription des Gens initiiert werden

4.5 Genstruktur und Genregulation

Wie zweckmäßig es für eine Zelle ist, über beide Regulationsprinzipien zu verfügen, lässt sich leicht verstehen, wenn wir uns die unterschiedlichen Arten zellulärer Stoffwechselwege vor Augen halten. Auf der einen Seite gibt es Stoffwechselmechanismen, die dafür sorgen müssen, dass bestimmte Substanzen, die im Nährmedium der Zelle auftreten können, umgesetzt oder abgebaut werden. In diesem Falle ist eine Aktivierung des Stoffwechselweges dann erforderlich, wenn die betreffende Substanz vorhanden ist. Man bezeichnet diesen Regulationsvorgang der Anschaltung eines Stoffwechselweges bei Bedarf als positive Genkontrolle. Im Allgemeinen ist ein Induktor zur Anschaltung des Stoffwechselweges notwendig. Eine negative Genkontrolle, also die gezielte Abschaltung eines Gens, ist dann erforderlich, wenn eine im Zellstoffwechsel benötigte Substanz in ausreichenden Mengen vorhanden ist. Es ist in diesem Fall ein Repressor der Genfunktion erforderlich. Ein Beispiel hierfür ist die Umsetzung des Zuckers Lactose (ein β-Galactosid) in seine Bestandteile Glucose und Galactose (Abb. 4.25): Ist Lactose im Nährmedium einer Bakterienzelle vorhanden, werden die Gene eingeschaltet, deren Produkte zum Abbau des Zuckers benötigt werden. Lactose ist in diesem Fall sowohl Induktor als auch Substrat. Bakterienzellen können alle Aminosäuren selbst synthetisieren, nehmen diesen Syntheseweg aber nicht in Anspruch, wenn genügend Aminosäuren im Nährmedium vorhanden sind. In diesem Fall wird ein gewöhnlich aktiver Stoffwechselweg, oft unter Mitwirkung des Syntheseproduktes,

inaktiviert. Das ist z. B. der Fall bei der Biosynthese der Aminosäure Tryptophan. Tryptophan wirkt hier als Repressor. Die Gene, die in E. coli für den Abbau von Lactose oder für die Synthese von Tryptophan notwendig sind, gehören zu den ersten Genen, die von den Bakteriengenetikern der 1960er-Jahre untersucht wurden, sodass wir heute sehr genaue Vorstellungen über den molekularen Regulationsmechanismus haben. Experimentell wurden dabei zwei Ansätze gewählt: ï die experimentelle Mutagenese, d. h. die Induktion von Mutationen, mit der anschließenden Selektion auf Veränderungen in den untersuchten Genen und ï die Erzeugung einer merodiploiden genetischen Konstitution verschiedener Mutationen mittels Transduktion oder Sexduktion und die Untersuchung der Genexpression in solchen Konstitutionen.

Man kann zwischen positiver und negativer Genregulation unterscheiden. In positiven Regulationssystemen wird ein Gen durch einen Induktor aktiviert. In negativen Regulationssystemen wird ein Gen durch einen Repressor inaktiviert.

Um die grundlegenden Prinzipien genetischer Experimente bei der Analyse von Mutanten zu verstehen, ist es zunächst sinnvoll, sich einige wichtige genetische Gesichtspunkte einer solchen Analyse vor Augen zu führen: ï Zwei Mutationen, die sich nicht komplementieren können, müssen im gleichen Cistron („Gen“) erfolgt sein.

Abb. 4.25 a, b Die Funktion der β-Galactosidase. a Umsetzung von Lactose in Galactose und Glucose. b Struktur des Galactoseanalogons Isopropylthiogalactosid (IPTG)

127

128 128

Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

ï Führt eine Mutation in einem positiven Regulationssystem (z. B. Lactoseabbau) dazu, dass das betreffende Gen nicht mehr regulierbar, sondern kontinuierlich aktiv ist, so sprechen wir von einer konstitutiven Expression des mutierten Gens. Die naheliegende Interpretation einer solchen erblichen Veränderung ist, dass durch sie der regulative Bereich des Gens verändert wurde. Wirkt eine solche Mutation nur in cis-Stellung (also auf dem gleichen Chromosom, auf dem das Gen exprimiert wird), so erkennen wir, dass dem betroffenen Protein-codierenden Gen in der DNA ein Bereich zugeordnet sein muss, der für die Regulation der Expression dieses Gens verantwortlich ist. In den folgenden Abschnitten werden die Einzelheiten der positiven und negativen Regulationskontrolle am Beispiel von zwei Genkomplexen von E. coli besprochen, dem lac-Operon und dem trp-Operon.

4.5.1 Das lac-Operon E. coli-Zellen können Lactose als Kohlenstoffquelle verwerten. Es ist daher möglich, Mutationen in den Genen des Lactosestoffwechsels dadurch zu identifizieren, dass mutierte Zellen (lac−) mit Lactose als einziger Kohlenstoffquelle nicht mehr wachsen können. Kombinierte man verschiedene solcher Mutationen (lac−) durch Sexduktion, so waren sie in einer F’lac−/ lac+- oder einer F’lac+/lac−-Konstitution (also merodiploid) stets fähig, Lactose zu verwerten (ihr Phänotyp ist Lac+). Dieses Gensystem wurde in den 1950erJahren insbesondere durch Francois Jacob und Jacques Monod im Detail untersucht (und 1961 publiziert):

Durch Kombination verschiedener lac-Mutationen wurden deren genetische Unterschiede und Gemeinsamkeiten bestimmt (Tabelle 4.2). So lassen sich diese Mutationen zunächst in zwei Komplementationsgruppen einordnen, die als lacZ und lacY bezeichnet werden. Die genauere Untersuchung zeigte, dass lacZ für das Enzym codiert, das zum Lactoseabbau notwendig ist, die β-Galactosidase. Das lacY-Gen hingegen codiert für ein Protein, das für den Transport der Lactose durch die Zellwand ins Zellinnere sorgt; das Enzym wird daher Permease genannt. Im Laufe der weiteren Untersuchung des lac-Gensystems wurde noch eine dritte Komplementationsgruppe entdeckt, lacA, die für eine Transacetylase codiert (Abb. 4.26). Für die Analyse von lac-Mutanten war es sehr hilfreich, dass man anstelle von Lactose verschiedene andere, chemisch synthetisierte Galactoside eingesetzt hat („chemische Genetik“). Dabei zeigte sich, dass beispielsweise Phenylgalactosid in gleicher Weise wie Lactose als Substrat verwendet wird. Ein anderes Analogon, Isopropylthiogalactosid (IPTG) (Abb. 4.25b), kann durch die β-Galactosidase aber nicht gespalten werden; es ist dadurch als Substrat unwirksam. Daher bleibt es in konstanter Konzentration in der Zelle vorhanden, und man beobachtete eine Induktion des gesamten lac-Systems ‒ alle drei Proteine, LacZ, LacY und LacA, werden stets in proportional gleichen Mengen synthetisiert (als „Reporter“ für die Expression der gesamten Gengruppe wird in der Regel nur die Aktivität der β-Galactosidase gemessen). Dies führte letztlich zur Charakterisierung regulatorischer Elemente (Kapitel 4.5.2). Da in der E. coli-Zelle im Allgemeinen eine Induktion der β-Galactosidase notwendig ist, um ihre Expression zu beobachten, musste eine Mutantenklasse

Tabelle 4.2 Lac-Operon-Mutanten, die zur Identifizierung des Regulationssystems essenziell sind Genetische Konstitution

F–lacI–/lacI– lacZ + lacY+ lacA+

Synthese von lac-mRNA

Regulative Eigenschaften

konstitutiv

I: reprimiert

+

+

–

+

+

+

induzierbar

I: trans-wirksam

–

–

+

+

+

+

F lacI /lacI lacZ lacY lacA

induzierbar

FclacOc lacZ+/lacI– lacZ+ lacY+ lacA+

konstitutiv

F lacI /lacI lacZ lacY lacA

FclacOc lacZ–/lacO+ lacZ+ lacY+ lacA+ +

+

+

c

+

+

+

Oc: cis-wirksam

induzierbar

F lacO lacZ /lacO lacZ lacY lacA

konstitutiv

F´lacOc lacZ–/lacO+ lacZ+ lacY+ lacA+

induzierbar

O+: cis-wirksam

F´lacOc lacZ+/lacO+ lacZ– lacY+ lacA+

konstitutiv

Oc: cis-wirksam

Die Daten lassen erkennen, dass O-Mutationen ebenso wie O+ stets nur cis-wirksam sind, während I-Mutationen stets auch trans-wirksam sind.

4.5 Genstruktur und Genregulation

umso mehr auffallen, bei der alle drei Proteine auch in Abwesenheit eines Induktors produziert werden (Tabelle 4.2). Es lag nahe, die Ursache hierfür wiederum auf der Ebene der Regulation zu suchen. Solche Mutationen, die alle in einer Region oberhalb des lacZGens kartierten, wurden unter der Bezeichnung lacIMutationen zusammengefasst. Die wichtigsten Beobachtungen für das Verständnis dieser Mutationen waren, ï dass die Synthese der unterhalb von lacI kartierenden Proteine stets konstitutiv war, wenn keine lacI+Region in der Zelle vorhanden war (also: F’lacI−/ lacI− lacZ+ lacY+ lacA+), ï während bei Anwesenheit einer lacI+-Region, gleichgültig, ob in cis oder trans (also: F’lacI+/lacI− lacZ+ lacY+ lacA+ oder: F’lacI−/lacI+ lacZ+ lacY+ lacA+), die Expression stets normal induzierbar blieb.

Annahme, dass die O-Region einen regulativen DNABereich darstellt. Sie nannten ihn den Operator (Abb. 4.26). Verständlich wird seine Funktion, wenn man annimmt, dass der Operator die Aufgabe hat, den Repressor zu binden, wenn keine Aktivität der durch ihn kontrollierten Gene erforderlich ist. Bei einer strukturellen Veränderung des Operators, die zur Folge hat, dass der Repressor nicht mehr an die Operatorregion binden kann, kommt es zur konstitutiven Synthese der β-Galactosidase. Umgekehrt haben wir ja oben gesehen, dass es Substanzen gibt (wie z. B. IPTG), die die β-Galactosidase induzieren können. Das kann man sich jetzt so erklären, dass diese Substanzen mit dem Repressor in Wechselwirkung treten, ihn aus der Bindung an den Operator verdrängen und so die Expression der 3 Gene ermöglichen.

Also muss lacI+ für ein diffundierbares, mithin transaktives Produkt codieren. Aus diesen Befunden konnte geschlossen werden, dass lacI für die Synthese eines Repressors verantwortlich ist, der normalerweise in der Zelle vorhanden ist ‒ zur Aktivierung der β-Galactosidase muss er aber inaktiviert werden. Mit dieser Annahme lässt sich die konstitutive Synthese der lacZ-, lacY- und lacA-Produkte in lacI−-Mutanten verstehen: Ein nicht mehr funktionsfähiger Repressor ist außerstande, seine inaktivierende Funktion auszuüben.

Die Isolierung des lac-Repressors durch Walter Gilbert und Benno Müller-Hill (1966) war ein wichtiger Meilenstein in der Geschichte der Genetik ‒ zeigte er doch die Bedeutung von Mutanten bei der Analyse komplexer Regulationsmechanismen. Dazu benutzten sie die Eigenschaft von E. coli, im induzierten Zustand mit einer geringeren Konzentration von Lactose auszukommen, als nötig ist, um das System überhaupt zu induzieren. Dieses Phänomen wird dadurch erklärt, dass durch die dann bereits vorhandene Permease Lactose in die Zelle hineingepumpt wird. Es gelang Müller-Hill, eine Mutante zu isolieren, die bei deutlich geringerer IPTG-Konzentration als im Wildtyp induziert werden konnte. Biochemische Experimente zeigten dann, dass Rohextrakte aus diesen Mutanten IPTG stärker binden konnten als der Wildtyp ‒ der lac-Repressor war isoliert (eine schöne Darstellung dieser Arbeiten findet sich bei Müller-Hill 1990).

Mutationen, die zur konstitutiven Genexpression füh-

ren und auch in trans-Stellung wirksam sind, weisen auf die Synthese eines Repressors hin, der im Normalfall die betroffenen Gene inaktiviert. Bei Anwesenheit eines Induktors wird der Repressor in seiner reprimierenden Wirkung unterdrückt.

Es besteht aber noch eine weitere Gruppe von Mutationen, die zur konstitutiven Expression der β-Galactosidase führt, die Oc-Mutanten (c für engl. constitutive). Sie kartieren zwischen lacI und lacZ (Abb. 4.26) und sind von der genetischen Konstitution von lacI unabhängig. In Oc-Mutanten wird also β-Galactosidase auch in der Gegenwart einer lacI−-Mutation konstitutiv exprimiert. Im Gegensatz zu lacI-Mutanten sind alle O-Mutanten jedoch stets nur cis-wirksam (Tabelle 4.2): ï Eine genetische Konstitution F’Oc/O+ lacZ gestattet eine normale Induktion von β-Galactosidase, ï während eine Konstitution F’O+/Oc lacZ eine konstitutive Synthese von β-Galactosidase bewirkt. Im Gegensatz zu allen anderen Mutanten sind also O-Mutanten grundsätzlich nicht komplementierbar. Jacob und Monod erklärten diese Eigenschaft mit der

Die Existenz von Mutationen, die ausschließlich in cis-Stellung wirksam sind und zu einer konstitutiven Expression eines Gens führen, weist auf die Anwesenheit einer Regulationsregion in der DNA hin, die als Operator bezeichnet wird.

4.5.2 Das Operonmodell Damit waren die wesentlichen Elemente eines Regulationssystems entdeckt, das von Jacob und Monod (1961) als Operonmodell bezeichnet wurde. Die Funktionsweise des lac-Operons, wie wir sie heute verstehen, ist in Abb. 4.26 zusammengefasst. Die einzelnen Elemente dieses Funktionsmodells sind folgende: ï Drei Gene codieren für drei unterschiedliche Proteine (β-Galactosidase, Permease, Transacetylase).

129

130 130

Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

Abb. 4.26 Das lac-Operon von E. coli. Drei Gene bilden das lac-Operon: lacZ, lacY und lacA; sie codieren für die Proteine β-Galactosidase, Permease und Transferase. Oberhalb des lacZ-Gens befinden sich die regulatorischen Elemente P (Promotor) und O (Operator). Die 3 Gene des lac-Operons werden unter der Kontrolle des Promotors P in eine einzige, polycistronische mRNA transkribiert, von der dann die 3 Proteine translatiert werden. Das Operon wird durch den Lac-Re-

pressor reguliert, der durch das Gen lacI codiert und dessen Expression durch den eigenen Promotor PI gesteuert wird. Der Repressor LacI inhibiert die Transkription dadurch, dass er an den Operator O bindet. Die Bindung an den Operator wird durch den Induktor (üblicherweise Lactose, aber auch unphysiologisch IPTG; Abb. 4.25b) verhindert. (Nach Shuman u. Silhavy 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Diese Gene werden in eine einzige mRNA transkribiert, deren Synthese durch einen oberhalb liegenden Promotor (P in Abb. 4.26) gesteuert wird. Der Promotor ist der Bindungsplatz der RNA-Polymerase. Das lacI-Gen codiert für ein Proteinmolekül, den Repressor. Wird ein funktionsfähiger Repressor synthetisiert, findet keine Transkription des lacOperons statt. Der Operator, der unterhalb des Promotors liegt, reguliert die RNA-Synthese durch Bindung des Repressors. Ist der Repressor gebunden, kann keine Transkription im Promotor beginnen, da das Repressormolekül die Fortbewegung der RNA-Polymerase verhindert. Ein Induktor (z. B. Lactose oder IPTG) ist durch Bindung an den Repressor imstande, diesen zu inaktivieren. Der Repressor kann dann nicht mehr am Operator gebunden werden, sodass die Transkription vom Promotor durch den Operatorbereich fortschreiten kann.

der Regulation der Repressorsynthese. Das ist jedoch nicht der Fall: Der Repressor wird konstitutiv synthetisiert und ist daher ständig, unabhängig vom Stoffwechselzustand der Zelle, mit einer geringen Anzahl von Molekülen (etwa 10) in der Zelle vorhanden.

ï ï

ï

ï

Bei einer genauen Betrachtung des im Operonmodell vorgeschlagenen Regulationsmechanismus könnte man den Eindruck gewinnen, dass hier die Problematik der Regulation nur um eine Stufe verschoben wird: auf die

Das Zusammenspiel verschiedener Regulationselemente, des Operators, des Repressors und des Induktors, wird dadurch ermöglicht, dass die Repressorsynthese konstitutiv erfolgt. Der Repressor ist normalerweise am Operator gebunden und verhindert dadurch die Initiation der RNA-Synthese durch Blockierung der RNA-Polymerase. Durch Anwesenheit eines Induktors wird der am Operator gebundene Repressor inaktiviert und die Transkription kann initiiert werden. Promotor und Operator erweisen sich somit als cis-wirksame Regulationselemente, während Repressor und Induktor trans-wirksam, also diffusibel sind. Regulationsprozesse verlaufen durch das Zusammenspiel stationärer und diffundierbarer Elemente.

Der sensitivste Indikator für die LacZ-Aktivität ist das chromogene Substrat Bromchlorindolylgalactosid (Xgal). Wenn diese farblose Verbindung durch LacZ hydrolysiert wird, entsteht eine Substanz, die zu einem blauen Indigo-Farbstoff

4.5 Genstruktur und Genregulation

dimerisiert. Stämme, die das lac-Operon bei sehr geringen Lactose-Konzentrationen exprimieren (Lactose-Minimalmedium), bilden hellblaue Kolonien, wenn das Medium auch Xgal enthält. Diese Färbereaktion hat weite Verbreitung in der Molekulargenetik gefunden. Erst längere Zeit nach der Ausarbeitung des zuvor dargestellten Regulationsmodells für das lac-Operon ist aufgeklärt worden, dass die Regulation des lac-Operons in Wirklichkeit komplizierter ist und einen zusätzlichen, positiven Regulationsmechanismus einschließt. Zur Initiation der RNA-Synthese im Promotor ist nämlich die Bindung eines zusätzlichen Regulationselementes erforderlich (engl. catabolite activator protein, CAP, oder cAMP receptor protein, CRP). Das CAP wird mit zyklischem AMP (cAMP) komplexiert und bindet in dieser Form an den lacPromotor. Ohne dieses positive Regulationselement wird weder in lacI−, noch in Oc-Mutanten β-Galactosidase-mRNA synthetisiert. Der Grund für diese zusätzliche Regulation ist einleuchtend: Lactose wird durch β-Galactosidase in Glucose und Galactose gespalten, und auch Galactose wird letztlich in den Glucosestoffwechsel überführt. Ist nun genügend Glucose im Nährmedium vorhanden, so ist eine zusätzliche intrazelluläre Produktion von Glucose nicht notwendig. Da der cAMP-Titer in der Zelle durch Glucose reguliert wird und der cAMP-Gehalt in Gegenwart von Glucose niedrig ist, kann bei höheren Glucosekonzentrationen kein cAMP-CAP-Komplex gebildet und RNA-Synthese im lac-Operon nicht initiiert werden. Da cAMP-CAPKomplexe auch an der Regulation anderer Zuckerabbauender Operons beteiligt sind, erfolgt über dieses positive Regulatormolekül eine Koordination und Integration der Aktivität verschiedener Stoffwechselwege. Der Beantwortung der Frage nach dem Regulationsmechanismus der Synthese einer bestimmten mRNA schließt sich die Frage nach der anschließenden Translation des Messengers an. Es war bereits darauf verwiesen worden, dass die drei im lac-Operon zusammengefassten Proteine β-Galactosidase, Permease und Transacetylase stets in gleichen relativen Mengen synthetisiert werden. Ihre relativen Molekülzahlen in der Zelle verhalten sich wie 1,0:0,5:0,2. Wie ist diese strikte Koppelung zu erklären, warum aber werden sie nicht in gleichen Mengen hergestellt? Die Kopplung der Syntheseraten erklärt sich aus dem polycistronischen Charakter der mRNA. Für alle drei Proteine liegen primär die gleichen Anzahlen von mRNA-Molekülen vor. Nun besitzt jedes Cistron innerhalb des mRNA-Moleküls sein eigenes Translationsinitiationscodon AUG ebenso wie ein Terminationscodon. Bei jedem der Terminationscodons setzt nur ein Teil der Ribosomen die Translation der folgenden

Cistrons fort, während der andere Teil vom Messenger abfällt. Hierdurch wird die Anzahl der von einem polycistronischen mRNA-Molekül hergestellten Proteinmoleküle für jedes in 3’-Richtung der mRNA gelegene Cistron geringer. Hinzu kommt, dass die normale Degradation der mRNA offenbar bevorzugt am 3’-Ende beginnt, sodass für die Translation des lacZ-, des lacYund des lacA-Bereichs in dieser Reihenfolge stets weniger mRNA-Moleküle zur Verfügung stehen. Die Expression der verschiedenen im lac-Operon zusammengefassten Proteine unterliegt also einem polaren Effekt, der für polycistronische Genbereiche charakteristisch ist.

Ein dem Operatormechanismus übergeordneter, cAMP-abhängiger, positiver Regulationsmechanismus koordiniert verschiedene miteinander verwandte Stoffwechselwege. Polycistronische Genbereiche zeigen oft polare Effekte hinsichtlich der relativen Expression der aufeinanderfolgenden Cistrons. Solche Effekte erklären sich durch unterschiedliche Initiationshäufigkeiten der Translation an den verschiedenen Startcodons, aber auch durch differenzielle Degradation der mRNA, die am 3’Ende beginnt.

4.5.3 Das trp-Operon Die Fähigkeit, auf einem „Minimalmedium“, das im Wesentlichen Salze enthält, zu wachsen, unterscheidet Bakterien grundsätzlich von Eukaryoten. Eukaryoten bedürfen der Aufnahme organischer Verbindungen, da sie nicht über die notwendigen Biosynthesewege verfügen, um alle im Stoffwechsel erforderlichen organischen Komponenten selbst zu synthetisieren. Das gilt unter anderem für einen Teil der Aminosäuren, die sogenannten essenziellen Aminosäuren (beim Menschen die 8 Aminosäuren Histidin, Leucin, Isoleucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Tryptophan, Valin). Bakterien hingegen verfügen über die notwendigen Stoffwechselwege, mit deren Hilfe sie bei Bedarf alle benötigten organischen Verbindungen selbst herstellen können. Dazu müssen diese Stoffwechselwege präzise reguliert werden. Ein wichtiger Stoffwechselweg in Bakterien ist die Biosynthese des Tryptophans. Dazu sind die Enzyme Anthranilsynthetase, PhosphoribosylAnthranilat-Transferase, Phosphoribosyl-AnthranilatIsomerase-Indol-Glycerolphosphat-Synthetase, Tryptophansynthetase-α und β erforderlich. Die für diese Enzyme codierenden 5 Gene (trpE, trpG-D, trpCF, trpB, trpA) sind in einem Operon (trp-Operon) zusammengefasst; sie werden als polycistronischer Messenger transkribiert (Abb. 4.27a). Zwei dieser Gene (trpG-D und trpC-F) sind Fusionsgene, d. h. jedes der

131

132 132

Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene a

E. coli trp-Operon Strukturgene trpL

attn

trpE

trpG-D

trpB

trpA

interner Promotor

Attenuator

Promotor Operator

trpC-F

t t'

B. subtilis trp-Operon – aro-Superoperon

b

aroF

aroB

aroH attn

Promotor

hisC

Strukturgene trpE

trpG-D

trpC

trpF

trpB

tyrA

aroE

trpA

Promotor interner Promotor

Attenuator c

Folat-Operon pabB

trpG

pabC

(pabA)

Abb. 4.27 a–c Die Organisation des trp-Operons bei E. coli und B. subtilis. a Das trp-Operon von E. coli ist eine einzige Transkriptionseinheit und enthält eine Promotor/Operator-Sequenz sowie den Attenuator. Dieses Operon enthält außerdem einen unregulierten internen Promotor, der die Bildung der Proteine TrpC-F, TrpB und TrpA verhindert, wenn das Operon maximal reprimiert ist. Am Ende des Operons befinden sich außerdem TandemTerminatoren (t t’). b Das trp-Operon von B. subtilis ist Teil eines Superoperons. Zwei Promotoren treiben die Transkription des

trp-Operons an. Die Transkription, die an jedem der beiden Promotoren beginnen kann, wird aber nur durch eine Attenuationsstelle reguliert, die in der Leitregion des trp-Operons liegt. Ein dritter Promotor liegt im trpA-Gen; er wird benutzt, um die letzten 3 Gene des Superoperons abzulesen. c Bei B. subtilis befindet sich das trpG-Gen in einem anderen Operon, dem Folat-Operon. Die übrigen Gene dieses Operons sind nicht dargestellt, da dies in diesem Zusammenhang eher verwirrend wirkt. (Nach Yanofski 2004, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

entsprechenden Proteine ist bifunktional. Oberhalb der 5 Gene befindet sich eine komplexe regulatorische Region, die die Tryptophan-Konzentration, aber auch die Menge der verfügbaren beladenen und unbeladenen tRNATrp bestimmen kann. Ein einziger Promotor wird benutzt, um die Transkription des gesamten Operons zu induzieren. Die Aktivierung dieses Promotors wird durch einen Tryptophan-aktivierten Repressor effizient reguliert ‒ bei Abwesenheit von Tryptophan in der Zelle werden die erforderlichen Gene der Biosynthesekette angeschaltet. Der aktivierte Repressor verhindert durch Bindung an den Operator die Transkription der Gene des trp-Operons. An der Regulation des trp-Operons ist daneben noch ein zweiter Regulationsmechanismus beteiligt, der als Attenuationsmechanismus bekannt ist. Er ermöglicht eine Feinabstimmung der Tryptophansyntheserate. Zusätzlich zum Promotor/Operator ist nämlich noch ein weiteres cis-wirksames Kontrollelement vorhanden, die Leitsequenz (trpL). Dieses Element liegt zwischen dem Promotor/Operator und dem ersten Enzym-codierenden Cistron (trpE). Die Leitse-

quenz wird transkribiert und codiert für ein Leitprotein (engl. leader peptide). Innerhalb dieser Leitsequenz liegt der Attenuator. Die Funktion dieses Kontrollelements wird uns verständlich, wenn wir uns die entsprechenden Nukleotidsequenzen genauer betrachten (Abb. 4.28). Die wichtigsten Elemente sind: ï die 14 Aminosäuren (52 Nukleotide) lange Leitsequenz-Region, deren zwei Codons für Tryptophan in Aminosäurepositionen 10 und 11 (Nukleotidpositionen 54–59) eine wesentliche Rolle in der Regulation spielen. Vor diesem Leitpeptid befindet sich eine starke Ribosomenbindungsstelle; ï vier DNA-Abschnitte, die in unterschiedlichen Kombinationen Basenpaarungen innerhalb der Transkripte zu Haarnadelschleifen ermöglichen. Diese selbstkomplementären Regionen (invertierten Repeats) liegen in den Nukleotidpositionen (1) 53–68, (2) 76–94, (3) 114–121 und (4) 126–134 (Abb. 4.28a). Haarnadelschleifen sind charakteristische Terminationssignale der Transkription, wenn ihnen eine Poly(A)/

4.5 Genstruktur und Genregulation

Poly(T)-Sequenz (also Poly(U) im Transkript) folgt, wie es am Ende der mRNA des Leitsegmentbereichs der Fall ist (Nukleotidpositionen 133–141). Sie erlauben die Feinregulation der Transkription des trp-Operons, da in Bakterien Transkription und Translation eng gekoppelt sind. Ribosomen entfernen intramolekulare Basenpaarungen in einem Bereich, der in direktem Kontakt mit einem Ribosom steht (etwa 10 Nukleotide). Bei Translation des Leitpeptids bis zum Translations-Stoppcodon UGA in Position 69–71 kann somit die Haarnadelschleife aus den invertierten Wiederholungseinheiten 1 und 2 nicht gebildet werden (Abb. 4.28). Dadurch wird die Ausbildung der Haarnadelschleife aus den invertierten Wiederholungseinheiten 3 und 4 uneingeschränkt möglich. Das führt zu einer Termination der Transkription, da der Abstand zwischen RNA-Polymerase und dem ersten Ribosom nur gering ist. Anders verhalten sich die intramolekularen Basenpaarungen bei Tryptophanmangel. In diesem Fall wird nämlich die Translation des Leitpeptids an den beiden trp-Codons UGG (Positionen 54–59) verzögert oder unterbleibt vollständig, je nach der intrazellulären Tryptophankonzentration. Es kann sich nun eine Haarnadelschleife aus den beiden komplementären Wiederholungseinheiten 2 und 3 direkt nach ihrer Synthese ausbilden. Eine Termination der Transkription durch das Terminationssignal erfolgt nicht, da dieses nicht ausgebildet wird. Mithin läuft die Transkription bis zum Ende des trp-Operons durch, sodass nunmehr Tryptophan synthetisiert werden kann. Dieser Regulationsmechanismus, den man als Attenuationsmechanismus bezeichnet, kann allein dann wirksam sein, wenn Proteinsynthese stattfindet. Das Attenuationssystem erlaubt also eine sehr fein abgestimmte Regulation der Aminosäuresynthese. Vergleichbare Regulationsmechanismen wurden für andere Aminosäuren (Histidin, Threonin, Leucin, Isoleucin, Valin und Phenylalanin) nicht nur bei E. coli, sondern auch bei verschiedenen anderen Bakterien nachgewiesen (z. B. Salmonella typhimurium). Auch in diesen Fällen befinden sich die jeweils spezifischen Aminosäurecodons im Leitpeptid (z. B. 7 Histidincodons im Histidinbiosyntheseweg oder 4 Leucincodons bei der Leucinbiosynthese), sodass das jeweilige Endprodukt nach einem einheitlichen Prinzip an der Regulation stets selbst beteiligt ist.

Das trp-Operon bei E. coli besitzt neben dem negati-

ven Regulationsmechanismus, der auf einer RepressorOperator-Interaktion basiert, ein zusätzliches Regulationssystem, das auf einer Kontrolle der Transkriptionsrate durch intramolekulare Sekundärstrukturen der mRNA beruht. Je nach Translationsgeschwindigkeit können sich

transkriptionshemmende Doppelstrangregionen in der RNA ausbilden, die die Translation abbrechen. Die Translationsgeschwindigkeit wird durch die Konzentration des Endproduktes gesteuert. Bei fehlendem Tryptophan wird sie verzögert, da kein oder wenig Tryptophan in die wachsende Polypeptidkette eingebaut werden kann. Das führt zu einer Fortsetzung der mRNA-Synthese, da keine Haarnadelschleifen mit Terminationseffekt gebildet werden.

Es ist auch interessant, sich in verschiedenen Bakterien die Organisation des trp-Operons zu betrachten. Daraus können wir viel über evolutionäre Prozesse und Anpassungen an veränderte Umweltbedingungen lernen. Als ein Beispiel sei hier das trp-Operon von B. subtilis vorgestellt; eine hervorragende Zusammenfassung und vergleichende Darstellung einer Vielzahl bakterieller Systeme findet der interessierte Leser bei Xie et al. (2003). Das trp-Operon bei B. subtilis (Abb. 4.27b) ist durchaus unterschiedlich organisiert verglichen mit dem von E. coli. Es besteht aus 6 Genen, die innerhalb eines 12 Gene umfassenden Superoperons für aromatische Aminosäuren liegt (Symbol: aro). Dabei liegen jeweils 3 zusätzliche Gene unter- bzw. oberhalb des trpOperons; diese Gene betreffen verwandte Biosynthesewege. Das siebte Gen für die Trypotophan-Synthese (trpG), ist im Folat-Operon lokalisiert (Abb. 4.27c). Das Trp-G-Protein, eine Glutamin-Aminotransferase, ist in zwei verschiedenen Stoffwechselwegen aktiv: Einmal katalysiert es die erste Reaktion im Tryptophan-Weg, und außerdem ist es für eine ähnliche Reaktion im Folsäure-Weg zuständig. Um das trp-Operon innerhalb des aro-Superoperons anzutreiben, sind zwei Promotoren notwendig: Der eine liegt oberhalb des aroF-Gens und der zweite unmittelbar vor dem trpF-Gen. Die Initiation der Transkription durch eine RNA-Polymerase an einem der beiden Promotoren ist abhängig von einer einzigen regulatorischen Entscheidung in der Leitregion des trp-Operons: entweder die Transkription (vorzeitig) zu beenden oder die Fortsetzung in die Strukturgene des Operons zu erlauben. Diese regulatorische Entscheidung basiert auf der Verfügbarkeit sowohl von Tryptophan als auch der beladenen tRNATrp. Tryptophan aktiviert das regulatorische TRAP-Protein (engl. tryptophan-RNA-binding protein); aktiviertes TRAP bindet an die Leitregion und bewirkt die Bildung von RNA-Terminatorstrukturen, die dann die Transkription beenden. Die Anhäufung unbeladener tRNATrp führt dagegen zur Inaktivierung des TRAP-Proteins und die Transkription läuft weiter. Die Regulation ist aber noch etwas komplexer. Weitere Arbeiten führten zur Identifizierung eines Operons, das für die tRNATrp-

133

134 134

Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene a Leitpeptid MKAIPVKLKGWWRTS 1

Transkript

2

3

4

trpE

Antiterminator Pausen-Struktur (Anti-Antiterminator)

Terminator 1

2

2

3

3

4 UUUUU

Alternative RNA-Strukturen

b

trpL

P

trpEDCBA

Schritt 1 Transkription beginnt und Polymerase pausiert

RNA polymerase

trpL

P

trpEDCBA

Schritt 2 Translation beginnt

trpEDCBA

Schritt 3 Ribosom gibt die pausierende Polymerase frei

TrpL-tRNA

P TrpL-tRNA

Schritt 4a angemessene Menge an beladener tRNATrp

Anti-Antiterminator

Schritt 4b ungenügende Menge an beladener tRNATrp Antitermination der Transkription Ribosom hält an einem der beiden Trp-Codons

Terminatorbildung

P

trpEDCBA UGA

TrpL-tRNA Transkription wird beendet

TrpL Ribosom wird freigesetzt

P

trpEDCBA UGA

Antiterminatorbildung

Polymerase setzt Transkription fort

4.5 Genstruktur und Genregulation

Bestimmung verantwortlich ist; es wird als at-Operon bezeichnet, weil es ein Anti-Trap-Protein produziert. Das AT-Protein bindet Tryptophan-aktiviertes TRAP und hemmt damit die Fähigkeit von TRAP, an die Leitsequenz zu binden. Es bleibt jedenfalls bemerkenswert, dass es bei B. subtilis mit dem AT/TRAP-System

noch eine zweite Regulationsebene zur Steuerung der Trp-Biosynthese gibt. Eine vergleichende Darstellung der unterschiedlichen Regulationsstrategien ist in Abb. 4.29 dargestellt; einen Stammbaum der verschiedenen trp-Operons in Bakterien zeigt Abb. 4.30.

B. subtilis

E. coli erhöhte Expression blockiertes Ribosom AntiTermination

erhöhte Expression

Protein

UGG

Trp-tRNATrp

AT-inaktiviertes TRAP AT

tRNATrp

AT

AT AT

AntiTermination

+ Repression

verminderte Expression

Termination

Trp Trp-aktivierter trp-Repressor

Biosynthese

Trp-aktiviertes TRAP

verminderte Expression

Abb. 4.29 Vergleich der Regulation der Tryptophan-Biosynthese bei E. coli und B. subtilis. In E. coli aktiviert Trp den trpRepressor; er bindet an die trp-Operatorregion und verhindert die Initiation der Transkription. In B. subtilis aktiviert Trp das TRAP-Protein. Das aktivierte TRAP bindet an die Leitsequenz des trp-Operons und bewirkt die Beendigung der Transkription. Wenn sich in E. coli unbeladene tRNATrp anhäuft, hält das translatierende Ribosom der Leitsequenz an einem der beiden Trp-Codons an; es bildet sich die Antiterminatorstruktur, und die Transkription wird fortgesetzt. In B. subtilis aktiviert die

Anhäufung unbeladener tRNATrp dagegen die Antiterminationstruktur im at-Operon und erlaubt damit die Transkription der Strukturgene des at-Operons. Unbeladene tRNATrp verhindert auch die Translation der Trp-Codons der Leitsequenz. Das angehaltene Ribosom bewirkt so die AT-Transkription und -Translation. Das gebildete AT bindet an das Trp-aktivierte TRAP, verhindert so die Bindung von TRAP an seine RNA-Bindungsstellen und erhöht damit die Transkription des trp-Operons. (Nach Yanofsky 2004, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Abb. 4.28 a, b Organisation und regulatorische Funktionen der Leitregion des trp-Operons bei E. coli. a Die Leitsequenz umfasst 162 Nukleotide; das Transkript kann 3 alternative Sekundärstrukturen bilden: 1:2, die Pause- oder Anti-Antiterminator-Struktur; 2:3, die Antiterminator-Struktur; und 3:4, die Terminator-Struktur (die Ziffern entsprechen der Reihenfolge der linearen Segmente der Leitsequenz). Zusätzlich codiert Segment 1 ein Leitpeptid von 14 Aminosäuren, das zwei nebeneinanderliegende Trp-Reste besitzt. Die Fähigkeit, dieses Peptid zu synthetisieren, wird genutzt, um die An- oder Abwesenheit der beladenen tRNATrp zu bestimmen. Wenn die Ribosomen die Proteinsynthese abbrechen, weil sie an dieser Stelle nicht weiterkommen, wird die RNA-Antiterminator-Sequenz gebildet. Das verhindert die Ausbildung von TerminatorStrukturen und ermöglicht die Fortführung der Transkription. Wenn dagegen Trp in großer Menge vorliegt, wird die Leitsequenz synthetisiert und das translatierende Ribosom abgelöst, die Terminator-Struktur wird gebildet und die Transkription durch Tandem-Terminatoren (t t’) beendet. b Regulation des

trp-Operons von E. coli durch Attenuation. Die Bildung der RNA-Strukturen hängt ab von der Position des Ribosoms auf der mRNA und der Ribosomen-Freisetzung an der Region der Leitsequenz. Die Entscheidung der Termination ist abhängig von der Menge an beladener tRNATrp. Wenn das Operon transkribiert wird, bleibt die RNA-Polymerase nach der Transkription des Pause-Signals stehen (Schritt 1). Dann beginnt die Translation (Schritt 2) und das translatierende Ribosom gibt die pausierende RNA-Polymase frei (Schritt 3). Wenn in der Zelle ausreichende Konzentrationen an beladener tRNATrp vorhanden sind, erreicht das Ribosom das Stoppcodon der Leitsequenz und wird freigesetzt. Es bilden sich die Anti-Antiterminatorund Terminatorstrukturen der RNA, und die Transkription ist beendet (Schritt 4a). Wenn die Zelle dagegen zu wenig tRNATrp besitzt, bleibt das Ribosom, das das Leitpeptid synthetisiert, am Trp-Codon stehen. Dadurch bildet sich die AntiterminatorStruktur, und die Transkription wird in Richtung der Strukturgene des Operons fortgesetzt (Schritt 4b). (Nach Yanofsky 2004, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

135

136 136

Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

4.5 Genstruktur und Genregulation

4.5.4 RNA-codierende Gene In E. coli wird die rRNA von 7 nicht zusammenhängenden Operons (rrnA-E und rrnG-H) synthetisiert. Diese Operons sind asymmetrisch um den Replikationsursprung (oriC) auf einer Hälfte des ringförmigen Chromosoms angeordnet (Abb. 4.31a). Es werden drei Formen der rRNA hergestellt, und die Reihenfolge in den Operons ist Promotor → 16S-rRNA → 23S-rRNA → 5S-rRNA. In der Verbindungsregion zwischen den 16S- und 23S-rRNA-Genen sowie am distalen Ende der Operons liegen einige verschiedene tRNA-Gene. Wie aus Abb. 4.31b ersichtlich ist, sind die 7 Operons nicht vollständig identisch. Aus Untersuchungen mit vollständigen RNA-Extrakten (d. h. den Produkten von allen 7 Operons) ist inzwischen bekannt, dass die 7 rrn-Operons zunächst in primäre Transkripte (30S-Vorläufer-rRNA) kopiert werden. Diese Vorläufer-rRNA wird dann durch verschiedene RNasen in die jeweiligen rRNAs zerlegt (Abb. 4.32). Die Organisation der verschiedenen rRNA-Moleküle innerhalb einer einzigen Transkriptionseinheit hat den Vorteil, dass damit unmittelbar die zum Aufbau der Ribosomen erforderlichen äquimolaren Mengen der verschiedenen rRNAMoleküle zur Verfügung stehen. Obwohl die Zusammenfassung der 3 rRNA-Gene in einem Operon bei Bakterien den Regelfall darstellt, so gibt es doch auch Ausnahmen. Der Vergleich der 7 Operons in Abb. 4.31b macht deutlich, dass sie nicht vollständig identisch sind; daraus kann im Umkehrschluss auch auf funktionelle Unterschiede geschlossen werden. Es sind auch in der Tat mindestens fünf der 7 Operons nötig, um optimales Wachstum zu erzielen. Zur schnellen Anpassung an den Wechsel verschiedener Nährstoffe und Temperaturen sind sogar alle 7 Operons nötig. Aus Untersuchungen an Plasmodium wissen wir beispielsweise, dass die 18S-rRNA unter verschiedenen Wirtsystemen von verschiedenen Operons abgelesen wird (von Typ C im Moskito und vom Typ A in Säugern).

Abb. 4.30 Evolution des trp-Operons in Bakterien. Die Organisation des trp-Operons und seiner regulatorischen Elemente ist als Stammbaum dargestellt; es werden nur solche trp-Gene gezeigt, die an der primären Trp-Biosynthese beteiligt sind. Die Äste für Helicobacter pylori und Corynebacterium glutamicum sind farblich hervorgehoben, um den Ursprung des gesamten trp-Operons durch horizontalen Gentransfer deutlich zu machen. Die verschiedenen genetischen Elemente sind entweder experimentell bestätigt oder durch Com-

Die rrn-Operons bei E. coli werden in großem Umfang transkribiert; unter Wachstumsbedingungen besteht mehr als die Hälfte der Gesamt-RNA einer Bakterienzelle aus rRNA. Aus den Sequenzen der Promotoren der 7 rrn-Operons wissen wir, dass sie alle dieselbe Grundstruktur aufweisen. Jedes Operon hat zwei σ70Promotoren (S. 62) hintereinander, P1 und P2, die durch etwa 100 bp voneinander getrennt sind. Der P2-Promotor wiederum liegt etwa 200 bp oberhalb des Beginns der reifen 16S-rRNA. Keiner der beiden Promotoren hat eine perfekte Consensussequenz; allerdings gibt es Hinweise darauf, dass die außerordentliche hohe Transkriptionsrate von zusätzlichen Sequenzelementen abhängt, die weiter oberhalb liegen, und von spezifischen Proteinen, die daran binden können.

In Bakterien sind die 16S-, 23S- und 5S-rRNA-Gene in 7 rrn-Operons zusammengefasst. Sie werden in Form eines einzigen primären Transkripts von der DNA abgelesen und durch RNasen in ihre jeweiligen Endprodukte gespalten.

Auch die Gene, die für den zweiten (neben der rRNA) in der Bakterienzelle mengenmäßig vorherrschenden RNA-Typ, die transfer-RNA, codieren, bilden Genfamilien. Aus dem genetischen Code lässt sich ableiten, dass es 64 verschiedene tRNASorten geben sollte. Diesen müssen sich die insgesamt 20 Aminosäuren der verschiedenen Codons zuordnen. Einige tRNAs sind jedoch in der Lage, verschiedene Codons für die gleiche Aminosäure zu erkennen (S. 57, Wobble-Hypothese), sodass in E. coli nur etwa 40 verschiedene tRNA-Gene vorhanden sind. In E. coli ist je ein Gen für jede dieser tRNAs vorhanden. In E. coli finden sich die tRNA-Gene in unterschiedlichen Kombinationen. So enthält eine Gruppe von tRNA-Genen die Sequenzen für tRNALeu, tRNAMet und tRNAGln (Abb. 4.33), während eine andere Gruppe neben tRNAIle, tRNAAla und tRNAThr (neben rDNASequenzen) enthält. Die Gene der zuerst genannten Gruppe werden in eine gemeinsame Vorläufer-tRNA transkribiert und anschließend durch Spleißen vonei-

puter-gestützte Sequenzvergleiche abgeleitet. Bei großen Operons mit mehr als 5 dazwischen liegenden Genen ohne Funktionen in der Trp-Biosynthese (weiße Pfeile) ist die Zahl dieser Gene angegeben. trpS: Gen für Tryptophanyl-tRNASynthetase; mtrB: Gen für TRAP (engl. trp RNA-binding attenuation protein); rtpA: Gen für ein anti-TRAP-Protein (AT); ltbR: Gen für den Leucin- und Tryptophan-Biosyntheseregulator. (Nach Merino et al. 2008, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

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138 138

Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

nander getrennt. Hieran sind verschiedene Enzyme beteiligt, so die Ribonuklease P (RNase P) und die Ribonuklease D (RNase D), aber es kann nicht ausgeschlossen werden, dass auch ein RNA-kontrolliertes Spleißen erfolgt. Eine RNA-Komponente der RNase P ist in in-vitroExperimenten ausreichend, um die Vorläufer-tRNA a

richtig zu zerschneiden. Zunächst werden hierbei die 5’-Enden der tRNAs erzeugt (Abb. 4.33), danach werden durch die exonukleolytisch wirkende RNase D die 3’-Enden bis zum charakteristischen 3’-CCA-OH-Ende der funktionsfähigen tRNA (S. 81) entfernt. In den sieben anderen Gengruppen von E. coli liegen ribosomale RNA-Gene, 5S-rRNA-Gene und tRNA-

mnE

mnH

mnB 0/100

mnA mnC

89.5 86.5 84.5

oriC

90.5

5.1

80

20 E. coli K-12

72.1 mnD

60

56.1

40

mnG b UAS

P1

P2

FIS II

FIS I

H-NS C

UAS-Region

H-NS B

23S rRNA

Diskriminator

UP-Element FIS III

tRNAGlu2

16S rRNA

-35

-10

H-NS A

nut-ähnliche Sequenz

+1

-35

-10

P1 Start

P1-Promotor

Abb. 4.31 a, b rRNA-Gene bei E. coli. a Die 7 rrn-Operons von E. coli sind asymmetrisch um den Replikationsursprung (oriC) angeordnet. Die Pfeile deuten die Transkriptionsrichtung an; die Angabe der Gene ist in Minuten (vgl. S. 107). b Die Struktur der 7 rrn-Operons von E. coli zeigt zunächst die tandemartige Anordnung der beiden Promotoren P1 und P2. Die grauen Kästchen deuten die 16S-, 23S- und 5S-Gene sowie des tRNAGlu2-Gens im Verbindungsbereich an. Die Terminator-Region am Ende jedes Operons besteht aus einem rho-unabhängigen und einem rho-abhängigen Terminator (T1 und T2). Die Bindungsstellen

5S rRNA T1 T2

+1

16 S

P2 Start

P2-Promotor

leader-Sequenz

für die Transkriptionsfaktoren FIS (engl. factor of inversion stimulation) und H-NS (engl. heat-stable nucleoid-structural protein) in der UAS-Region (engl. upstream transcription activation sequence) sind angegeben. Außerdem sind zusätzliche regulatorische Elemente gezeigt: das UP-Element (engl. upstream element; für direkte Wechselwirkungen mit der RNA-Polymerase), die starke Diskriminator-Sequenz sowie die nut-ähnliche Sequenz (engl. N-protein utilization; wichtig für die Antitermination und die Reifung der Ribosomen). (Nach Hillebrand et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung von de Gruyter)

4.5 Genstruktur und Genregulation

Gene zusammen vor und werden in dieser Form als ein gemeinsames 30S-Transkript abgelesen (Abb. 4.31b). In Eukaryoten sind solche Genanordnungen nicht bekannt und auch unwahrscheinlich, da die verschiedenen RNA-Typen hier durch unterschiedliche RNAPolymerasen transkribiert werden. In E. coli hingegen erfolgt die Transkription sowohl der rRNA als auch der tRNA und mRNA durch dieselbe RNA-Polymerase. Die 5’-Enden der tRNAs werden durch die RNase P hergestellt, während die rRNA-Moleküle durch die Ribonuklease III aus Transkriptbereichen herausgeschnitten werden, die durch intramolekulare Basenpaarungen doppelsträngig sind (Abb. 4.32). Die RNase P ist ein Ribozym, das in Prokaryoten nur eine kleine Proteinuntereinheit enthält. Die RNA-Untereinheit besteht aus einer tRNA-spezifischen Domäne und einer katalytischen Domäne.

Abb. 4.32 Reifung der 16S- und 23S-rRNA bei E. coli. Die Sequenzen, die die 16S- und 23S-rRNA flankieren, sind zueinander komplimentär und bilden deshalb Doppelstrang-Strukturen aus (die Basenpaare sind durch kurze dünne Striche gekennzeichnet). Schnittstellen für die RNasen sind angegeben: Pfeil mit III: RNase III; mit E: RNase E; mit G: RNase G. Die reife rRNA ist durch die dicke Linie dargestellt; die ausgeschnittenen Reste sind punktiert. (Nach Evguenieva-Hackenberg 2005, mit freundlicher Genehmigung von Blackwell)

Abb. 4.33 Struktur einer der Gruppen von tRNA-Genen im Genom von E. coli. Sieben tRNA-Gene liegen innerhalb dieser Region und werden in einem primären Transkript abgelesen. An den durch Pfeile gekennzeichneten Stellen wird das primä-

In E. coli liegen manche tRNA-Gene isoliert vor, andere gemeinsam in Gruppen mit rRNA-Genen. Nach der Transkription durch die RNA-Polymerase müssen sie weiterbearbeitet werden; dabei spielt die RNase P eine wichtige Rolle.

4.5.5 Kommunikation in Bakterien: Quorum sensing Die Regulation der Genexpression kann bei Bakterien neben der spezifischen Induktion oder Repression sowie der globalen Kontrolle durch das Nährstoffangebot und Stress auch durch den Bakterientiter gesteuert werden. Bakterien können die Mindestanzahl anderer Bakterien erfassen (engl. quorum sensing) und damit darauf reagieren, wie dicht ihr Lebensraum besiedelt ist. Der Begriff des Quorum sensing wird zunehmend auch im Deutschen verwendet. Es handelt sich dabei um ein System der Zell-Zell-Kommunikation, mithilfe dessen Bakterien auf chemische, Hormon-ähnliche Moleküle antworten. Im einfachsten Fall initiiert die Anhäufung eines derartigen Moleküls über einen bestimmten Schwellenwert („Quorum“) eine Signalkaskade, die in eine populationsweite Veränderung der Genexpression mündet. Da die Konzentration des Signalmoleküls im Allgemeinen mit der Populationsdichte korreliert, stellt dieser Mechanismus eine Möglichkeit für Bakterien dar, auf veränderte Umweltbedingungen zu reagieren. Dabei wird die Substanz, die von den Bakterien ins Medium ausgeschieden wird, als Autoinduktor (engl. autoinducer) bezeichnet, da sie im einfachsten Fall auf die eigene Zelle zurückwirkt. Der Autoinduktor bindet dabei an einen Rezeptor auf oder in der Bakterienzelle und verändert oberhalb eines bestimmten Schwellenwertes die Genexpression.

re Transkript durch die RNA-Ribonuklease P geschnitten. Die Sekundärstruktur der RNA ist hypothetisch. (Nach Nakajima et al. 1981, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

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140 140

Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

Dabei gibt es zwei bevorzugte Molekülgruppen, die als Autoinduktoren wirken: acetylierte Homoserinlactone (AHL; Abb. 4.34a) und modifizierte Oligopeptide; daneben spielen aber auch verschiedene Chinoline und das 4,5-Dihydroxy-2,3-pentandion (DPD)eine Rolle. Viele acetylierte Homoserinlactone können frei die Membran passieren und dann im Cytplasma von spezifischen Rezeptoren gebunden werden. Die RezeptorLigand-Komplexe binden anschließend an die Promotoren ihrer Zielgene und aktivieren die entsprechenden Gene (Abb. 4.35). Oligopeptid-Autoinduktoren werden dagegen in der Regel von membranständigen Rezeptoren gebunden, und die Signaltransduktion erfolgt dann über eine Phosphorylierungskaskade. Erst in jüngerer Zeit wurden Autoinduktoren auf der Basis von Chinolinen bei Pseudomonas aeruginosa entdeckt. Ein zweites Autoinduktor-System (AI-2) verwendet DPD

als Ausgangsmolekül, um daraus verschiedene Tetrahydroxymethylfuran(THMF)-Derivate herzustellen (Abb. 4.34b).

Abb. 4.34 a, b Signalmoleküle beim Quorum sensing. a Strukturformeln verschiedener Acyl-Homoserinlactone. b Stoffwechselwege zur Bildung von AI-2. Das Vorläufermolekül DPD (4,5-Dihydroxy-2,3-pentandion) entsteht beim Abbau der Aminosäure Methionin (über die Zwischenprodukte S-Adenosylmethionin und S-Ribosylhomocystein). DPD kann spontan zu einem Furanderivat zyklisieren (DHF: 2,4-Dihydroxy-2-me-

thyldihydrofuran-3-on); die S-Form bildet bei Hydratisierung die S-Tetrahydroxyform (THMF), die mit Borat reagieren kann und über eine Diester-Bindung mit LuxP verbunden wird. Die R-Form bildet entsprechend das R-THMF, das mit LsrB co-kristallisieren kann. (a nach Kumari et al. 2008, mit freundlicher Genehmigung von Springer; b nach van Houdt et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung der FEMS)

Das LuxR/I-System war das erste bekannte Quorum-sensing-System und wurde von K. H. Nealson und Mitarbeitern 1970 bei Vibrio fischeri beschrieben. Das Luciferase-Operon wird dabei durch zwei Proteine reguliert, LuxI (das für die Produktion des AHL-Autoinduktors verantwortlich ist) und LuxR (das durch diesen Autoinduktor aktiviert wird und die Transkription des Luciferase-Operons erhöht). In der Folge wurden die LuxI-Proteine als AHL-Synthetasen charakterisiert; die LuxR-Proteine sind Transkriptionsfaktoren, die durch die Bindung von AHL stabilisiert werden (ohne AHL-Bindung werden sie schnell abgebaut).

4.5 Genstruktur und Genregulation

Ein komplexeres System des Quorum sensing besitzt das marine Leuchtbakterium Vibrio harveyi (Abb. 4.36). Es verfügt über zwei unabhängige Systeme, eines für die Kommunikation innerhalb der Spezies auf der Basis von AHL (Autoinduktor 1, AI-1), und ein zweites System (AI-2) für die Kommunikation mit anderen Spezies auf der Basis von THMF-Derivaten als Autoinduktor (AI-2; Abb. 4.34b und 4.36a). Die jeweiligen Signalmoleküle werden durch verschiedene „SensorKinasen“ erkannt, die über eine längere Signalkette zur Transkription einer nicht-codierenden RNA führen, die die luxR-mRNA destabilisiert und damit die Aktivierung des Luciferase-Operons verhindert. Nach der Bindung des jeweiligen Autoinduktors werden die Kinasen jedoch zu Phosphatasen und dephosphorylie-

Abb. 4.35 Modell der Biolumineszenz-Aktivierung bei Vibria fischeri. Bei hoher Zelldichte (und dabei entsprechend hoher Konzentration von AHL) kann der Autoinduktor AHL an seinen Rezeptor binden. Der Rezeptor-Ligand-Komplex aktiviert daraufhin die Transkription des Rezeptor-Gens sowie das Luciferase-Operon. (Nach Reading u. Sperandino 2006, mit freundlicher Genehmigung der FEMS)

Abb. 4.36 a, b Das LuxS/AI-2-System. a Vibrio harveyi benutzt zwei Sensor-Kinasen (LuxN und LuxO), um AI-1 bzw. AI-2 zu erkennen. LuxQ erkennt den Komplex aus AI-2 und seinem periplasmatischen Rezeptor LuxP. Nachdem das Signal wahrgenommen wurde, wandeln sich die Kinasen zu Phosphatasen, und das gesamte komplexe System wird dephosphoryliert. Das dephosphorylierte LuxO aktiviert nicht länger die Transkription nicht-codierender RNA (ncRNA), sodass die LuxR-mRNA nicht

mehr länger abgebaut wird; so aktiviert LuxR das LuziferaseOperon. b In Salmonella und E. coli ist das periplasmatische Protein LsrB der AI-2-Rezeptor. Nach seiner Bindung an LsrB wird AI-2 durch das LsrABC-Transportsystem in die Zelle transportiert. Dort wird AI-2 durch LsrK phosphoryliert, um so mit dem Repressor LsrR in Wechselwirkung zu treten; dadurch kann LsrR die lsr-Transkription nicht länger unterdrücken. (Nach Reading u. Sperandino 2006, mit freundlicher Genehmigung der FEMS)

141

142 142

Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

ren das gesamte System, sodass auch die nicht-codierende RNA nicht mehr gebildet wird und LuxR das Luciferase-Operon wieder aktivieren kann. In anderen Bakterien werden durch AI-2 nur Gene reguliert, die für einen ABC-Transporter codieren; bei S. typhimurium wird das gebildete Protein als Lsr bezeichnet (LuxS-reguliert). Dieser ABC-Transporter kommt auch bei E. coli vor und weist Homologien zu einem Zucker-Transporter auf (ABC-Transporter sind eine Klasse von Membranproteinen, die als gemeinsames Strukturelement eine ATP-bindende Kassette (engl. ATP binding cassette) besitzen und spezifische Substrate aktiv über eine Zellmembran transportieren). In der Zelle wird AI-2 phosphoryliert und bindet an den Rezeptor (LsrR), der als Transkriptionsfaktor an der Regulation des lsr-Operons beteiligt ist (Abb. 4.36b).

Bakterien verfügen über die Möglichkeit, Signalmolekü-

le abzugeben, und über geeignete Rezeptoren, solche Signalmoleküle aufnehmen. Wir unterscheiden dabei vor allem zwei Molekülgruppen, acetylierte Homoserin-Lactone und modifizierte Oligopeptide. Durch die aktivierten Rezeptoren werden spezifische Stoffwechselwege beeinflusst. Dieser Mechanismus ist erst ab bestimmten Schwellenwerten aktiv; er wird deshalb auch als Quorum sensing bezeichnet.

Abb. 4.37 Quorum sensing im enterohämorrhagischen E. coli. AI-3 und Epinephrin/Norepinephrin werden durch denselben Rezeptor in der äußeren Membran der Bakterien erkannt. Diese Signale werden in den periplasmatischen Raum transportiert, wo sie mit zwei wichtigen sensorischen Kinasen in Wechselwirkung treten (QseC; QseE). QseC überträgt das Signal an das Regulon der Flagellen (durch Phosphorylierung des

Es gibt zunehmend Hinweise in der Literatur, dass die von Bakterien ausgeschütteten Signalmoleküle nicht nur zur Kommunikation unter Bakterien dienen, sondern auch in Eukaryoten wirksam sind (engl. interkingdom signaling). So wird darüber spekuliert, inwieweit diese bakteriellen Signalmoleküle bei Infektionsprozessen auch von Zellen des betroffenen Organismus aufgenommen werden und immunologische, hormonelle oder neuronale Antworten des Wirts beeinflussen können. Ein besonderes Beispiel ist das Epinephrin-Norepinephrin-System (AI-3), das zunächst beim enteropathogenen E. coli-Stamm EHEC gefunden und später auch in anderen Bakterien nachgewiesen wurde (Abb. 4.37). Epinephrin und Norepinephrin kommen auch in den Nervenzellen des Gastrointestinaltrakts vor und beeinflussen über entsprechende Rezeptorsysteme die Muskelkontraktion, die Blutströmung sowie die Chlorid- und Kaliumsekretion im Darm. Die weitere Aufklärung dieser komplexen Wechselwirkung eines Bakteriums mit seinem Wirt wird sicherlich auch neue therapeutische Möglichkeiten eröffnen.

QseB-Regulators, der an den Promotor des flhDC-Gens bindet und dadurch die Expression des Flagellen-Regulons aktiviert). Dagegen führt die Signalübertragung durch QseE über eine komplexe Signalkette zur Transkriptionsaktivierung von LEE (engl. locus of enterocyte effacement). OM: äußere Membran, IM: innere Membran. (Nach Reading u. Sperandino 2006, mit freundlicher Genehmigung der FEMS)

4.6 Regulation im Genom des Phagen λ

4.6 Regulation im Genom des Phagen λ Im Vermehrungszyklus des temperenten Bakteriophagen λ nimmt ein Regulationsmolekül – der λ-Repressor – eine zentrale Funktion in der Entscheidung darüber ein, ob der Phage nach der Infektion in eine lytische Phase eingeht oder ob er als Prophage ins Wirtszellgenom eingebaut wird (Abb. 4.12). Für die Regulation der Expression des λ-Genoms ist die Art der Anordnung der Gene im Chromosom von entscheidender Bedeutung. Funktionell verwandte Gene liegen im λ-Genom in Gruppen beieinander. Das gestattet eine gemeinsame Regulation jeder dieser Gruppe von Genen durch eine gemeinsame Kontrolle auf dem Transkriptionsniveau. Nach einer λ-Infektion liegt das Phagengenom zunächst als lineare Doppelhelix ohne jegliche Regulationssignale vor. Zunächst zirkularisiert sich das λ-Chromosom durch Ligation der cos-Sites (Abb. 4.13). Hierdurch werden die „späten Gene“ (engl. late genes) aneinandergekoppelt, die für die Produktion der Phagenkopfproteine verantwortlich sind und im linearen Genom voneinander getrennt liegen. Mithilfe der wirtszelleigenen RNA-Polymerase beginnt nun die Transkription der „frühen“ Phagengene (N und cro) (engl. early genes) an deren jeweiligem Promotor PL oder PR (Abb. 4.13). Die Transkription verläuft in entgegengesetzter Richtung: Wir können hieraus ersehen, dass die beiden antiparallelen DNA-Stränge hinsichtlich codierender Funktionen gleichwertig sind und dass die Richtung der Genorientierung innerhalb kurzer Abstände des Genoms wechseln kann. An den Terminationssequenzen am Ende des N- und des cro-Gens wird die Transkription beendet. Die Translationsprodukte, das N-Protein und das CroProtein, sind Regulationsmoleküle mit unterschiedlicher Funktion: Das N-Protein wirkt als Antiterminator der Transkription der Gene N und cro, sorgt also für eine Fortsetzung der Transkription über die beiden frühen Gene hinaus. Damit ist es in der Lage, die Transkription und dadurch zugleich auch die Translation der „verzögerten frühen Gene“ (engl. delayed early genes) zu veranlassen. Mit der Transkription dieser Gene wird der lytische Zyklus des Phagen eingeleitet. Das Cro-Protein dient als Repressor für die Synthese des λ-Repressors im Gen cI und wird daher bisweilen auch als Antirepressor bezeichnet. In dieser Funktion unterstützt es die Funktion des N-Proteins (pN), da der λ-Repressor die Transkription aller λ-Gene, ausgenommen seine eigene Synthese, verhindert. Im lytischen Zyklus darf daher kein λ-Repressor vorhanden sein.

4.6.1 Regulation des lytischen Zyklus Betrachten wir zunächst die weitere Regulation des lytischen Zyklus. Mit der Transkription der Gene O, P

und Q nach Einsetzen der Antitermination durch pN wird einerseits die Replikation des Phagengenoms durch die Genprodukte von O und P ermöglicht. Das im Gen Q codierte Protein wirkt als Antiterminator der Transkription im Bereich der späten Gene S bis R (Abb. 4.13). Die Transkription der „späten Gene“ wird im Promotor PR initiiert. Ist das Q-Protein vorhanden, so kann die Transkription über den gesamten, 26 kb langen Bereich der „späten Gene“ durchlaufen. Das Q-Protein bindet zuerst an die DNA in Bereich des späten Promotors PR, bevor es an die RNA-Polymerase bindet. Diese durch das Q-Protein modifizierte RNAPolymerase ist dann imstande, den 196 bp unterhalb des Promotors PR gelegenen Terminator TR zu überwinden und dadurch die Expression der „späten Gene“ zuzulassen. Die „verzögerten frühen Gene“ sind nicht ausschließlich für die Einleitung des lytischen Zyklus verantwortlich, sondern sie sind auch für den Beginn der Lysogenisierung unentbehrlich. Sie aktivieren nämlich außer den für die Replikation und Phagenkopfproteine verantwortlichen Genen auch das Gen cII, dessen Produkt, das Protein pcII, zusammen mit dem cIII-Genprodukt die Transkription des λ-Repressors im Gen cI ermöglicht (Abb. 4.13). Die Gene cI, cII und cIII gehören zu den „verzögerten frühen Genen“. Bereits als eines der beiden „frühen Gene“ (N und cro) wurde jedoch der Antirepressor Cro aktiviert, der als Repressor des cI-Gens wirkt. Wie ist dieser scheinbare Widerspruch zu erklären? Offenbar liegt an dieser Stelle des Regulationssystems der Schalter für die Entscheidung zwischen lytischem und lysogenem Zyklus des Phagen. Zum Verständnis dieses Schalters ist es erforderlich, zunächst die Feinstruktur des cI-Gens näher zu betrachten (Abb. 4.38a). Das Gen zeichnet sich dadurch aus, dass es zwei Promotorregionen, PRM und PRE, besitzt. Der Promotor PRE liegt rechts vom PR-Promotor, der die – in entgegengesetzter Richtung – verlaufende Transkription von cro beginnen lässt. Die Transkription des cI-Gens beginnt zunächst im rechten Promotor PRE mit Unterstützung der Proteine pcII und pcIII. Das pcIIProtein bewirkt eine Modifikation der RNA-Polymerase, ohne die die Bindung der RNA-Polymerase am Promotor nicht möglich ist. pcIII schirmt pcII gegen Abbau durch wirtszellspezifische Proteinasen ab. Die nach Initiation in PRE synthetisierten mRNA-Moleküle besitzen einen starken Ribosomenbindungsplatz und verursachen dadurch eine schnelle Synthese des λ-Repressors. Der Repressor bindet nunmehr sofort an den Operator OL der „frühen Gene“, die durch den Promotor PL angeschaltet werden und inhibiert damit die Synthese des Antiterminators pN. Gleichzeitig bindet der λ-Repressor aber auch an den Operator OR der durch PR regulierten Gene, sodass die weitere Synthese von Cro unterbunden wird. Der Ope-

143

144 144

Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene a

PRM

PL clll

OL1 OL2 PL

N

cl

OL3

cro

PRE cll O P

OR1 OR2 OR3 PRM PR

b Lysogener Zyklus

λ-Repressor cl

RNA-Polymerase OR3

cro OR2

PRM

OR1 PR

Induktion c Lytischer Zyklus cro

RNA-Polymerase

cl OR3

OR2

OR1

cro

Abb. 4.38 a–c Regulation des λ-Genoms. a Feinstruktur des cIGens und des N-Gens. Die Operatorregionen besitzen stets je 3 Bindungsstellen (O1 bis O3) unterschiedlicher Bindungsaffinität für die Regulationsproteine. b Im lysogenen Zyklus binden zwei Dimere des λ-Repressors (dicker Pfeil) kooperativ an die Bindestellen OR1 und OR2. Der Repressor an OR2 hat die RNA-Polymerase an den Promotor (PRM) des benachbarten Repressor-Gens cI herangeführt. Der gebundene Repressor hält die RNA-Polymerase von dem anderen benachbarten Promotor PR fern; dadurch bleiben die lytischen Gene ausgeschaltet. Mit geringerer Affinität bindet der Repressor auch an OR3 (gestrichelter Pfeil) und schaltet dadurch die Transkription von cI ab. Ein zweiter Promotor der lytischen Gene (PL) befindet sich etwa 2400 bp entfernt und die Wechselwirkungen zwischen den Repressoren, die an OL und OR binden, unterstützen diese Reaktion. c Wenn der Repressor durch die Induktion des lytischen Zyklus zerstört ist, fällt die Transkription des cI-Gens ab (wegen des Verlusts der Selbststimulation), und die Transkription der rechtsseitigen lytischen Gene beginnt. Cro bindet besonders stark an OR3 (dicker Pfeil) und unterdrückt dadurch direkt die Synthese des Repressors. Möglicherweise bindet Cro auch an die OR2 und OR1-Bindestellen, um damit die Transkription der frühen Gene abzuschalten (gestrichelter Pfeil). (b, c nach Ptashne 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

rator OR liegt unmittelbar rechts neben dem Promotor PRM (Abb. 4.38b). Er besteht aus drei einander sehr ähnlichen, aber nicht identischen Bindungsregionen (OR1,

OR2 und OR3), die unterschiedliche Bindungsaffinitäten für den λ-Repressor besitzen. Sie nehmen von OR1 nach OR3 ab. OR1 und OR2 wirken kooperativ in der Bindung des λ-Repressors, sodass eine Bindung von Repressor an OR1 die unmittelbare Bindung eines weiteren Repressormoleküls an OR2 zur Folge hat. Dieser Repressorkomplex stimuliert die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor PRM, womit die weitere Synthese des λ-Repressors ermöglicht wird. Erst bei großem Überschuss von Repressormolekülen werden diese auch am schwachen Operatorbindungsplatz OR3 gebunden. Da diese Region mit dem Promotor PRM überlappt, wird die Synthese des λ-Repressors nunmehr inhibiert. Der Bindungsplatz OR3 dient somit der Feinregulation der Produktion des Repressors. Der Promotor PRE wird bei Bindung von λ-Repressor in OR1 und OR2 nicht mehr beansprucht, da er der Produkte der Gene cII und cIII bedarf. Diese werden aber durch den nunmehr vorhandenen λ-Repressor reprimiert. Die Hauptfrage ist aber mit der Aufklärung dieser molekularen Mechanismen noch nicht beantwortet: Wie erfolgt die Entscheidung zwischen lytischem und lysogenem Zyklus? Nach der Infektion des Phagen und der ersten Phase der Transkription spielen zwei Regulationsmoleküle eine zentrale Rolle für die folgenden Ereignisse: der λ-Repressor und das Cro-Protein als Antirepressor. Das Cro-Protein übt seine reprimierende Wirkung auf die λ-Repressorsynthese durch Bindung an OR3 aus, kompetiert also für diesen Bindungsplatz mit dem λ-Repressor. Es kann, ebenso wie der λ-Repressor, auch an die anderen beiden Bindungsstellen OR2 und OR1 binden. Die Bindungsaffinitäten für die verschiedenen Bindungsregionen sind jedoch genau die entgegengesetzten zu denen des λ-Repressors. Offenbar entscheiden subtile Unterschiede in der Konzentration der verschiedenen Regulatorproteine, ob der lysogene oder der lytische Weg eingeschlagen wird.

Die Regulation des Vermehrungszyklus des Bakteriophagen λ erfolgt durch eine komplexe Interaktion von Repressorproteinen mit Regulationssequenzen in der DNA der kontrollierten Gene. Die DNA-Bindungsstellen für Regulationsproteine besitzen aufgrund geringfügiger Nukleotidsequenzunterschiede unterschiedliche Bindungsaffinitäten für die Regulationsproteine. Durch quantitative Unterschiede in der intrazellulären Konzentration der Regulationsmoleküle wird die Transkriptionsrate reguliert.

4.6.2 Regulation des lysogenen Zyklus Ist der lysogene Zyklus eingeschlagen, erfolgt die Integration des Phagen nach den bereits früher beschriebenen Mechanismen (Abb. 4.12). Nach der Integration

4.6 Regulation im Genom des Phagen λ

erhält der Prophage die Synthese einer geringen Menge an λ-Repressor aufrecht. Die Anwesenheit des Repressors hat zur Folge, dass die übrigen Phagengene reprimiert bleiben. Nur gelegentlich kommt es zur Derepression, wenn aus sekundären Gründen der Repressortiter absinkt. In einem Lysogen kann der lytische Zyklus durch UV-Bestrahlung oder chemische Mutagene induziert werden. Durch solche physiologischen Stresssituationen werden in der Wirtszelle DNA-Reparaturmechanismen aktiviert („Induktion“). In diesen Reparaturmechanismen spielt das RecA-Protein eine zentrale Rolle (S. 123). Das RecA-Protein verfügt über eine Protease-Aktivität, die unter anderem den λ-Repressor zwischen der DNA-Binde- und der Dimerisierungsdomäne spaltet. Hierdurch ist eine Initiation der Transkription in den „frühen Genen“ möglich, die damit einen lytischen Zyklus einleiten können. Diese induzierte lytische Vermehrung des Phagen ist biologisch gesehen sinnvoll, da unter Bedingungen, die erhöhte Mutagenitätsraten zur Folge haben, eine unmittelbare Vermehrung sinnvoller ist als die Aufrechterhaltung des Prophagenstatus. Die Funktion des λ-Repressors erklärt uns noch eine zweite Eigenschaft eines Lysogens: Die Immunität gegen erneute Infektion (Superinfektion) mit einem neuen λ-Phagen. Ursache hierfür ist das Vorhandensein des λ-Repressors, der neu injizierte Phagen-DNA sogleich gegen Transkription reprimiert und damit sowohl die Integration als auch einen lytischen Zyklus verhindert.

6

3 55 a λ-Cro

b λ-CI

92

60 1 205 105 2 137

c CRP

d Trp-Repressor

e Lac-Repressor

Abb. 4.39 a–e Bänder-Darstellung von Strukturen DNA-bindender Domänen verschiedener „Helix-turn-Helix“-Proteine. Die Moleküle sind so orientiert, dass die erste „Gerüst“-Helix (rot) des Helix-turn-Helix-Motivs von rechts oben vertikal nach unten verläuft und die zweite „Erkennungs“-Helix (blau) auf der Rückseite des Moleküls horizontal von rechts nach links verläuft. a λ-Cro (3–55). b λ-CI (6–92). c CRP (catabolite repressor protein). d Trp-Repressor. e Lac-Repressor. (Nach Lewis et al. 1998, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Immunität einer Bakterienzelle gegen erneute λ-Infek-

tion (Superinfektion) wird durch die λ-Repressormoleküle bewirkt, die im Lysogen vorhanden sind. Sie reprimieren die Expression eines neu in die Zelle injizierten λ-Genoms.

4.6.3 DNA-Protein-Interaktionen Bei den verschiedenen Regulationsmechanismen spielen molekulare Interaktionen zwischen der DNA und Regulationsproteinen eine bedeutende Rolle. Sowohl der λ-Repressor als auch das Cro-Protein, das CRP (engl. catabolite repressor protein; S. 131), der trp-Repressor und der lac-Repressor üben ihre Funktionen durch eine direkte Bindung an DNA aus. Alle diese Proteine haben eine relativ kleine Bindungsregion in der DNA, die 10 Basen in der Doppelhelix kaum überschreitet. Sie besitzen aber eine hohe und genau kontrollierte Bindungsspezifität und -affinität, wie sie am Beispiel der unterschiedlichen Bindungsaffinitäten des λ-Repressors und des Cro-Proteins besonders deutlich geworden sind.

Durch die Arbeiten von Marc Ptashne und Mitarbeitern haben wir Einsicht in die physikochemischen Eigenschaften solcher Repressor-DNA-Komplexe bekommen. Alle zuvor genannten Repressoren zeichnen sich durch eine einheitliche Struktur aus: Sie bestehen aus zwei α-Helixregionen, die über einen kurzen Proteinbereich miteinander verbunden sind, der beide Helices gegeneinander dreht. Man bezeichnet solche Strukturen als Helix-turnHelix- oder als Helix-loop-Helix-Motive (HLH) (Abb. 4.39; siehe auch Abb. 7.15). An der DNA-Bindungsstelle bildet der Repressor ein Multimer aus identischen Peptiden. Der lac-Repressor ist ein Tetramer, der gal-Repressor ein Dimer. Die röntgenkristallographische Analyse des DNA-Repressorkomplexes zeigt uns die sterische Anordnung des Repressorkomplexes: Beim gal-Repressor greift einer der α-Helixbereiche jedes Dimers in die major groove der DNA ein, während der zweite α-Helixbereich mit dem des anderen Dimers in Kontakt steht. Durch experimentelle Veränderung derjenigen Aminosäuren innerhalb der

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Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

α-Helixregion, die in die große Furche der DNA eingreift, haben Marc Ptashne und Mitarbeiter (Irwin u. Ptashne 1987) und Benno Müller-Hill und Mitarbeiter (Suckow et al. 1996) feststellen können, welche Aminosäuren für die jeweils spezifische Erkennung der DNASequenz an einer Bindungsstelle verantwortlich sind. Durch gezielte Substitutionen solcher Aminosäuren konnte die Bindungsspezifität eines Repressormoleküls gezielt in die eines anderen Repressors umgewandelt werden. Aus diesen Versuchen geht hervor, dass die Regeln der Sequenzerkennung in der DNA für verschiedene Repressoren sehr ähnlich sind. Diese Versuche lassen zudem erkennen, dass Proteine in der Lage sind, die sehr kurzen, spezifischen Basensequenzen in einer DNA-Doppelhelix von außen zu erkennen.

Verschiedene

DNA-bindende Regulationsmoleküle besitzen eine gemeinsame Grundstruktur. Sie bestehen aus zwei voneinander getrennten α-Helixregionen: mit jeweils einer bilden sie untereinander Dimere. Die zweite α-Helixregion greift in die große Furche der DNA-Doppelhelix an einer spezifischen Erkennungssequenz ein. Die Erkennungsspezifität wird einerseits durch die Basensequenz auf der Seite der DNA und andererseits durch die Aminosäuresequenz auf der Seite des Proteins bestimmt.

Kernaussagen ï Prokaryoten besitzen stets nur ein Chromosom, das aus Einzel- oder Doppelstrang-RNA oder aus Einzeloder Doppelstrang-DNA besteht. ï Auch Prokaryotenchromosomen enthalten spezifische chromosomale Proteine, jedoch keine Histone. ï Neben den Chromosomen können prokaryotische Zellen extrachromosomale Elemente enthalten (Plasmide oder Episomen). ï Diese extrachromosomalen Elemente ermöglichen auch bei den haploiden Prokaryoten Rekombinationsvorgänge. ï Bakteriophagen (kurz Phagen) sind Bakterienviren und können entsprechend extrazelluläre Phasen durchlaufen. ï In Ausnahmefällen können bei Prokaryoten sich überlappende Gene vorkommen. ï Die ersten Genregulationsmodelle wurden an Bakterien erarbeitet; es gibt negative (Repression) und positive (Induktion) Kontrollmechanismen. ï Nach dem Operonmodell besteht ein Gen aus ciswirksamen Promotor- und Operatorbereichen am 5’-Ende einer Gruppe von Genen. Diese werden über trans-wirksame Repressoren und Induktoren reguliert. ï Der Regulation eines Genkomplexes nach dem Operonmodell können andere Regulationsmechanismen übergeordnet sein. ï Ein Feinregulationsmechanismus ist der Attenuationsmechanismus. Er ist durch ein zusätzliches ciswirksames Regulationselement charakterisiert, der Leitsequenz vor dem ersten Cistron. Die Translationsgeschwindigkeit dieser Leitsequenz bestimmt, ob im darauffolgenden Abschnitt des primären Transkripts intramolekulare Basenpaarungen entstehen können, die als Terminationssignale für die Transkription wirken. ï Bakterienzellen verfügen über Signalmoleküle, die über entsprechende Rezeptoren Stoffwechselwege beeinflussen. ï Die Aufklärung der Regulationsmechanismen des Bakteriophagen λ hat Einblicke in die Mechanismen der DNA-Protein-Interaktionen gewährt. Die DNABindung erfolgt über α-Helixbereiche von HelixLoop-Helix-Proteinen (HLH-Proteinen) durch die Erkennung spezifischer kurzer Nukleotidsequenzen in der großen Furche der DNA.

Technik-Box

Technik-Box 8

Klonierung von DNA Anwendung: Analyse bestimmter DNA-Segmente; genetische Manipulation. Voraussetzungen · Materialien: Als Vektoren werden zur Klonierung entweder bakterielle Plasmide, Bakteriophagen (vorwiegend λ, M13, aber auch P1), Cosmide (künstliche λ-Derivate), künstliche Bakterienchromosomen (engl. bacterial artificial chromosome, BAC) oder künstliche Hefechromosomen (engl. yeast arti-

ficial chromosome, YAC) verwendet. Jeder Vektor nimmt DNA-Fragmente eines bestimmten, begrenzten Größenbereichs auf (Plasmide bis zu etwa 12 kb, λ-Phagen etwa zwischen 12 und 23 kb, Cosmide um 30 kb, P1-Phagen um 90 kb sowie BACs und YACs mehrere Hundert kb). Die heute verwendeten Vektoren sind gegenüber ihren Ursprungsformen durchweg stark verändert, da man sie den Bedürfnissen der Gentechnologie angepasst hat. Jeder Vektor zeich-

net sich durch eine Reihe spezifischer Eigenschaften aus, sodass man die Wahl des Vektors von der Anwendung der Klonierung abhängig macht. Klonierungsvektoren sind stets mit einer Reihe von besonderen DNA-Sequenzelementen ausgestattet, die die molekularbiologische Arbeit beträchtlich vereinfachen. Sie besitzen beispielsweise Polylinkerregionen (engl. multiple cloning sites, MCS) mit verschiedenen Restriktionsschnittstellen, die das Einfügen fremder DNA-Sequenzen (DNADie Abbildung zeigt die Klonierung in einem E. coli-Plasmid. Diese werden durch Restriktionsenzyme (hier: EcoRI) geöffnet. Durch Ligation mit dem entsprechenden Fragment der zu untersuchenden DNA wird diese in den Vektor eingefügt. Nach anschließender Transformation in kompetente E. coli-Zellen kann eine Selektion auf die gesuchten DNA-Sequenzen erfolgen. Der Vektor enthält ein Resistenzgen gegen Ampicillin (ampR), das lacZ-Gen zur Selektion auf die Anwesenheit eines Inserts und einen Klonierungsbereich mit verschiedenen Schnittstellen für Restriktionsenzyme (engl. multiple cloning site). In der Regel wird dieser Klonierungsbereich von Startsequenzen für RNA-Polymerasen (z. B. T7- und T3-RNA-Polymerasen) flankiert, die für die Herstellung von sense- und antisense-Transkripten (Technik-Box 7), aber auch als Startstellen für die PCR (Technik-Box 4) und DNA-Sequenzierung (TechnikBox 21) verwendet werden können. (Nach Kempken u. Kempken 2004)

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Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

Technik-Box 8

Klonierung von DNA (Fortsetzung) Inserts) erleichtern. Primerbindungsregionen (engl. primer binding sites) erleichtern die direkte Sequenzanalyse von klonierten DNA-Sequenzen, da man zur Initiation der Polymerasereaktion in der Sanger-Methode (TechnikBox 21) einheitliche Primer verwenden kann. Außerdem verfügen die Vektoren oft über Promotorregionen, die eine Initiation einer RNA-Synthese an definierten Promotorregionen mit spezifischen RNA-Polymerasen gestatten. Beispielsweise werden viele Vektoren mit T3- und T7-Promotorsequenzen versehen, die sich an den entgegengesetzten Enden des Polylinkers befinden. Auf diese Weise ist es möglich, gezielt Transkripte des einen oder des anderen DNA-Strangs des eingefügten DNA-Fragments herzustellen (TechnikBox 7). Zur Vereinfachung der experimentellen Handhabung können sich außerhalb der Polylinkerregion besondere Restriktionsenzymschnittstellen befinden, mit deren Hilfe die gesamte Polylinkerregion einschließ-

lich Insert-DNA für weitere Manipulationen herausgeschnitten werden kann. Man spricht dann von einer „Cartridge-Struktur“ der Polylinkerregion. Eines der wichtigsten Kriterien für die Brauchbarkeit von Klonierungsvektoren ist ihre Eignung zur Unterscheidung zwischen Vektoren mit und ohne fremde DNA-Inserts. Ein Weg hierzu ist die Verwendung von Antibiotikaresistenzgenen. Eine einfachere Methode besteht heute im Gebrauch des lacZ-Gens von Escherichia coli (Abb. 4.26). Dieses Gen ist so mit einer Polylinkerregion kombiniert, dass nach Induktion des lacZ-Gens eine Unterscheidung zwischen Vektormolekülen mit Inserts fremder DNA und solchen ohne Inserts stattfinden kann: Ist die Polylinkerregion intakt, d. h. ist keine DNA-Insertion erfolgt, so kann das lacZ-Gen nach Induktion voll exprimiert werden und produziert eine funktionelle β-Galactosidase, die durch Substratreaktionen nachgewiesen werden kann und zur Blaufärbung der Bakterienkolonie führt. Ist

hingegen ein DNA-Fragment in die Polylinkerregion eingefügt worden, so ist das lacZ-Gen unterbrochen und nicht mehr imstande, ein funktionelles Enzym zu erzeugen. Die betreffenden Bakterienkolonien bleiben daher ungefärbt. Somit ist eine Unterscheidung zwischen Bakterienkolonien mit klonierten DNA-Sequenzen und Kolonien ohne DNA-Inserts sehr einfach möglich (Blau-Weiß-Selektion). Methode: Beliebige DNA-Sequenzen, z. B. Genom-DNA eines beliebigen Organismus, werden mithilfe biochemischer Techniken in einen der zuvor beschriebenen Klonierungsvektoren eingefügt. Das erfolgt z. B. an den Restriktionsschnittstellen einer Polylinkerregion. Behandelt man den Vektor mit dem gleichen Restriktionsenzym wie die genomische DNA, so besitzen die einzelnen Moleküle beider DNAs die gleichen offenen Restriktionsschnittstellen an ihren Enden. Hierdurch ist eine Verbindung eines Vektormoleküls

Prinzip der Blau-Weiß-Selektion. a In den verwendeten E. coli-Zellen befindet sich ein mutiertes lacZ-Gen, das eine Deletion im 5’-Bereich seines offenen Leserahmens (ORF) trägt. Das Repressormolekül blockiert im Grundzustand die Expression des lac-Operons (Kapitel 4.5.1). b Der im Medium enthaltene synthetische Induktor IPTG (Isopropyl-β-thiogalactopyranosid) bindet an den Repressor, der dadurch seine Konformation ändert und sich vom Operator löst. c Der Operator ist frei und das ΔLacZProtein wird gebildet, das aber wegen seiner N-terminalen Deletion inaktiv ist. d Der Vektor trägt das α-Peptid, das mit ΔLacZ einen enzymatisch aktiven Komplex bilden kann (α-Komplementation). Dieser Komplex wandelt das im Medium enthaltene, farblose X-Gal in einen blauen Indigo-Farbstoff um. O: Operator; P: Promotor; T: Terminator. (Nach Kempken u. Kempken 2004)

Technik-Box

Technik-Box 8

Klonierung von DNA (Fortsetzung) mit einem Molekül genomischer DNA durch Basenpaarung an der Restriktionsschnittstelle möglich, sofern diese überhängende Einzelstrang-Enden besitzt. Mittels einer DNA-Ligase können dann die aneinandergesetzten DNA-Moleküle in ein kovalent verbundenes Molekül umgewandelt werden. Bestehen keine überhängenden Restriktionsschnittstellen, so kann die Ligase auch solche Enden aneinanderfügen, wenn auch mit geringerer Effizienz. Die ligierten Vektor-GenomDNA-Moleküle werden dann in geeignete Gastzellen, meist von Escherichia coli, transformiert. In diesen werden sie wie gewöhnliche Plasmide repliziert und bilden somit einen festen Bestandteil der Gastzellen. Da jede Gastzelle nur ein DNA-Molekül aufnimmt, kann man nach der Transformation die

Zellen auf Agarplatten aussäen. Nach deren Wachstum erhält man durch die Isolierung einzelner Bakterienkolonien homogene Zellpopulationen, die nur einen DNA-Inserttyp besitzen. Die Charakterisierung des Inserts erfolgt durch PCR (Technik-Box 4) über die vorhandenen Primerbindungsstellen oder über Koloniehybridisierung (modifizierter Southern-Blot; TechnikBox 10) mit einer spezifischen, markierten Sonde. Die Gesamtheit aller Bakterienzellen bezeichnet man als Klonbank oder Klonbibliothek. Werden genügend Zellen transformiert, so repräsentiert die erhaltene Klonbibliothek das gesamte Genom eines Organismus, d. h. man kann unter günstigen Umständen alle DNA-Sequenzen eines Genoms in der Bibliothek wiederfinden. Die Isolie-

rung einzelner Zellen gestattet deren Vermehrung und dadurch die Vermehrung einer einzelnen, im Plasmid enthaltenen DNA-Sequenz. Beachte: Die Klonierung ist die Herstellung eines gentechnisch veränderten Organismus (GVO) und unterliegt damit den Bestimmungen des Gentechnik-Gesetzes (GenTG). In Abhängigkeit der klonierten DNA, des verwendeten Vektors und des Wirtsorganismus müssen verschiedene Sicherheitsstufen beachtet werden (S1 S4: ohne bis hohes Risiko für Mensch und Umwelt). Gentechnische Arbeiten dürfen nur in angemeldeten bzw. genehmigten Anlagen durchgeführt werden; über die Klonierungen sind standardisierte Aufzeichnungen anzufertigen.

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Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

Technik-Box 9

Two-Hybrid-Systeme Für molekulare Prozesse in Zellen sind Protein-Protein-Interaktionen von außerordentlicher Bedeutung. Viele zelluläre Mechanismen verlaufen unter der Beteiligung von Proteinkomplexen. Auf der Grundlage der Proteinstruktur kann man jedoch kaum Aufschluss darüber erhalten, ob ein Protein – und eventuell mit welchen anderen Proteinen – eine Interaktion eingeht. Eine wichtige Methode zum Auffinden von Proteininteraktionen ist das Two-Hybrid-System. Das Prinzip dieser Methode basiert auf der Erkenntnis, dass Transkriptionsfaktoren oft zwei wichtige Proteindomänen besitzen: eine DNA-Bindungdomäne (DBD) und eine Aktivierungsdomäne (AD). Die Aktivierungsdomäne ist zur Aktivierung der Transkription erforderlich. In der Praxis fusioniert man eine DBD mit einem Protein A und eine zugehörige AD mit einem Protein B. Bringt man beide Proteine in eine Zelle, so kann bei Interaktion beider Proteine aufgrund der Anwesenheit beider Domänen die Transkription eines Gens induziert werden, wenn es die für die Bindung der DBD erforderliche Regulationssequenz besitzt. In der Praxis kombiniert man für diesen Zweck eine DNA-Bindungssequenz, die als Bindungssequenz für die gewählte DBD-Domäne geeignet ist, mit einem Reportergen (z. B. lacZ). Dieses Reportergen erlaubt es, dass Zellen, in denen miteinander interagierende Proteine mit den erforderlichen AD und DBD enthalten sind, an der Ausprägung des durch das Reportergen erzeugten Phänotyps erkannt werden können. Im Falle von lacZ würde man eine Blaufärbung der Zellen sehen. Man verwendet für Two-HybridExperimente im Allgemeinen Hefe

(Saccharomyces cerevisiae), obwohl mittlerweile auch Säugerzelllinien erfolgreich verwendet worden sind. Als DBD kann man beispielsweise die DNA-Bindungsdomäne des LexA-Repressor-Proteins (Kapitel 9.6.3) oder die des Hefeproteins GAL4 einsetzen. Als AD wird die Aktivierungsdomäne von GAL4 oder auch die des viralen VP16-Proteins verwendet. Als Reportergene sind Gene der Aminosäure-Synthesewege von Hefe besonders nützlich, da sie auf geeigneten selektiven Medien ein differenzielles Wachstum derjenigen Hefezellen ermöglichen, die interagierende Proteine enthalten. So werden beispielsweise das LEU2-Gen oder das HIS3-Gen als Reportergene verwendet. Diese Gene gestatten in Leucin- bzw. Histidin-freiem Medium das Wachstum von LEU2−- bzw. HIS3−Mutanten, wenn sie durch Proteininteraktionen von Fusionsproteinen mit AD und DBD-Domänen induziert werden.

Die Verwendung von zwei Reportergenen gestattet eine bessere Identifikation von Zellen, in denen DBD- und AD-Fusionsproteine Interaktionen eingehen. Zunächst wird z. B. auf Histidinfreiem Medium auf HIS3-Funktion von HIS3-Mutanten getestet. Positive Zellen können dann durch Induktion des lacZ-Gens auf Medium mit X-Gal auf β-Galactosidase-Aktivität geprüft werden. Im Two-Hybrid-Screen kombiniert man das Protein, zu dem man ein unbekanntes interagierendes Protein sucht, mit der DBD- oder der AD-Domäne und die Insert-DNA einer cDNABibliothek mit der komplementären Domäne. Dann co-transfiziert man beide Komponenten gemeinsam mit dem Reportergenkonstrukt in Hefezellen und selektiert auf die Funktion des Reportergens.

Technik-Box

Technik-Box 9

Spezialfall: GAL4/UAS-System (Fortsetzung) Die funktionelle Untersuchung von Genen rückt in das Zentrum molekularbiologischer Forschung. Hierzu ist es insbesondere erforderlich, Gene nach Bedarf zu unterschiedlichen Zeitpunkten in der Entwicklung und in unterschiedlichen Zelltypen exprimieren zu können. Voraussetzung für solche Versuche ist es, geeignete Genkonstrukte, insbesondere solche mit speziellen Regulationsregionen, in das Genom des untersuchten Organismus einzubringen. Bei Drosophila schafft das P-Element-Transformationssystem diese Voraussetzung. Zur gezielten Regulation hat sich das GAL4/UASSystem bewährt. (engl: upstream transcription activating sequence) Zur Durchführung eines GAL4/ UAS-Experiments werden zwei genetische Komponenten benötigt: Ein Stamm mit dem Gal4-Gen der Hefe, das unter der Kontrolle gewünschter Regulationselemente steht, die eine

zellspezifische Expression des Gens gestatten. Die zweite Komponente ist eine Transformante mit dem untersuchten Gen, das unter der Transkriptionskontrolle einer UAS-Region steht. Der GAL4-Transkriptionsfaktor kann an die UAS-Region binden und daEnhancer

durch das dahinter geschaltete Gen aktivieren. Es gibt bereits eine Sammlung solcher Drosophila-Stämme, die aus den Stockzentren abgerufen werden können, sodass es oft nicht notwendig ist, diese Konstrukte selbst herzustellen.

P-Element mit Gal4 -Gen (Hefe)

Chromosom, Stamm A

GAL4-Protein

Transkription

UAS

Gen X

UAS

Gen X

Chromosom, Stamm B

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Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

Technik-Box 10

Restriktionsanalyse von DNA und Southern-Blotting Anwendung: Charakterisierung von DNA-Sequenzen durch Kartierung von Restriktionsenzym-Schnittstellen; Ermittlung von Sequenzhomologien durch Hybridisierungsexperimente. Restriktionsenzyme: Einer der entscheidenden Fortschritte für die Analyse von DNA war die Entdeckung der Restriktionsenzyme. Restriktionsenzyme sind Endonukleasen, die die DNA sequenzspezifisch schneiden. Die Erkennungssequenzen sind für verschiedene Restriktionsenzyme unterschiedlich lang und liegen für die meisten Enzyme im Bereich von 4 bis 8 Nukleotiden. Bei 50 % G+C-Gehalt einer DNA und zufallsgemäßer Nukleotidverteilung ist der erwartete mittlere Abstand der Erkennungssequenzen in einem DNA-Molekül durch die Länge der Erkennungssequenz (L in Nukleotiden) bestimmt und kann nach der Formel A = 4L errechnet werden, da für jede Nukleotidposition 4 Basen möglich sind. Die Erkennungssequenzen sind in sehr vielen Fällen symmetrisch und daher in der Lage, ein Palindrom zu formen. Die Schnittstelle in Bezug auf die Erkennungssequenz ist jedoch unterschiedlich. So kann sie genau in der Mitte liegen (Abb. a). In diesem Fall erhält man eine glatte Schnittstelle (engl. blunt end). Wenn sie nicht in der Mitte liegt, erfolgt der Schnitt meist symmetrisch in Bezug auf die Mitte. Als Ergebnis erhält man an der Schnittstelle einen 5‘- oder 3‘-Einzelstrangüberhang (staggered ends oder protruding ends; Abb. b und c). Solche Einzelstrang-Enden sind für die Gentechnologie sehr nützlich, da sie leicht mit einem komplementären Einzelstrang-Ende assoziieren und somit einen neuen Doppelstrang bilden können. Die dann noch vorhandenen Einzelstrangbrüche können mit einer DNA-Ligase entfernt werden, die eine

kovalente Bindung in den DNA-Einzelsträngen herstellt, sofern das jeweilige 5‘-Ende ein Phosphat und das 3‘-Ende eine OH-Gruppe zur Bildung der Phosphodiesterbindung (Abb. d) enthält. Man bezeichnet daher solche Einzelstrang-Enden auch als sticky ends oder cohesive ends. Durch Dephosphorylierung der 5‘-Enden lässt sich daher die Bildung von intramolekularen oder intermolekularen kovalenten Ligationsprodukten verhindern. Das ist für eine effektive Klonierung von DNARestriktionsfragmenten sehr wichtig. Unterschiedliche Restriktionsenzyme, die die gleiche Erkennungssequenz haben, bezeichnet man als Isoschizomere. So erkennen z. B. MboI und Sau3A das gleiche Tetranukleotid (GATC), an dessen Enden die

Schnitte erfolgen. Diese Sequenz entspricht einem Teil der Erkennungssequenz von BamHI (Abb. c), obgleich BamHI ein Hexanukleotid erkennt. Das ermöglicht es, MboI- oder Sau3A-geschnittene DNA-Fragmente in BamHIgeschnittene Vektoren einzuligieren (nicht aber umgekehrt!). Die Verwendung von Restriktionsenzymen gestattet die Herstellung von Restriktionskarten der DNA. Solche Restriktionskarten sind für Klonierungsexperimente wichtig, da sie wichtige Anhaltspunkte für sinnvolle weitere Klonierungsschritte geben. Sie gestatten auch den Vergleich verschiedener DNA-Fragmente und können auch Hinweise auf Heterozygotien im Genom geben (Nachweis von Mutationen und Polymorphismen).

In der Abbildung (a–c) sind verschiedene Restriktionsenzyme in ihrer Sequenzspezifität und die resultierenden Einzelstrang-Enden in der DNA gezeigt. Das Teilbild d stellt die Struktur der 3‘- und 5‘-Enden der Einzelstränge dar.

Technik-Box

Technik-Box 10

Restriktionsanalyse von DNA und Southern-Blotting (Fortsetzung) Methode: DNA-Moleküle (z. B. klonierte DNA-Fragmente oder Genom-DNA) werden in Parallelreaktionen mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen geschnitten. Die Reaktionsprodukte werden auf Agarosegelen in nebeneinanderliegenden Spuren elektrophoretisch nach ihrer Größe aufgetrennt. Nach Inkubation mit Ethidiumbromid lassen sich die Restriktionsfragmente im UV-Licht sichtbar machen. Ihre Länge kann durch Vergleich mit MarkerDNA-Fragmenten errechnet werden. Durch Vergleich der Resultate von Restriktionsexperimenten mit einzelnen

oder mehreren Enzymen lassen sich die Positionen von RestriktionsenzymSchnittstellen relativ zueinander ermitteln. Es können so „Restriktionskarten“ einer unbekannten DNA-Sequenz erstellt werden. Nach alkalischer Denaturierung der zunächst noch doppelsträngigen Fragmente im Gel wird die DNA durch Diffusion auf Membranfilter übertragen, an denen sie irreversibel fixiert wird. Diese Filter werden mit markierten Nukleinsäuren hybridisiert. Hybride werden durch Autoradiographie (bei radioaktiven Nukleinsäuren und bei

der Verwendung von fluoreszierenden Agenzien zur Markierung, z. B. AMPPD; 3-(2‘-Spiroadamantan)-4-methoxy-4(3‘‘-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan) oder durch Färbungen (bei DIG-markierten Nukleinsäuren und Reaktion mit Enzym-gekoppelten Antikörpern) erkannt. Diese Methode wird nach ihrem Erfinder Edwin Southern als Southern-Blotting bezeichnet. Beachte: Der Umgang mit radioaktiven Stoffen unterliegt der Strahlenschutzverordnung; dabei sind geeignete Maßnahmen zu ergreifen.

Southern-Blotting. a Es ist die technische Ausführung eines Southern-Blots dargestellt: Aus einem Vorratsgefäß wird Puffer über ein saugfähiges Papier zu dem darüberliegenden Gel gesaugt. Über dem Gel befindet sich eine Membranfolie (häufig Nylon, blau), die wiederum mit Filterpapier und Papiertüchern abgedeckt ist. Ein Gewicht verteilt den Druck gleichmäßig auf das gesamte Gel und stabilisiert den Aufbau. Durch diese Anordnung wird der Puffer durch das Gel hindurchgesaugt und nimmt dabei die DNA mit, die auf der Membranfolie haften bleibt. Die Effizienz der Übertragung (üblicherweise über Nacht) kann durch Färbung mit Ethidiumbromid überprüft werden. (Abb. 9.30). b Ergebnis eines Southern-Blots. Genomische DNA verschiedener Hefestämme (YM4721) wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten; die Plasmide pGAD424 und pGC1 sind zusätzlich aufgetragen. Die Restriktionsfragmente im Agarosegel sind nach Anfärbung mit Ethidiumbromid im UV-Licht zu erkennen (links). Nach dem Blotten und Hybridisieren mit einer radioaktiv markierten DNA-Probe werden im Autoradiogramm (rechts) solche Restriktionsfragmente erkennbar, die mit der verwendeten Probe Sequenzhomologien aufweisen; der Marker deutet die Größe der erhaltenen Fragmente an. (a nach Munk 2001; b nach Kück 2005, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

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Kapitel 4: Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene

Technik-Box 11

Northern-Blotting Anwendung: Analyse von gewebeoder entwicklungsstadienspezifischen RNA-Fraktionen auf Sequenzhomologien in Hybridisierungsexperimenten. Methode: Vergleichbar der Übertragung von DNA auf Membranfilter in Southern-Blotting-Experimenten (Technik-Box 10), wird beim NorthernBlotting zunächst RNA unter denaturierenden Bedingungen (zur Lösung inter-

und intramolekularer Basenpaarungen) elektrophoretisch nach Größe getrennt und dann durch Diffusion aus dem Gel auf Membranfilterfolie übertragen. Diese wird dann in Hybridisierungsexperimenten mit den interessierenden Nukleinsäuren, die markiert sind, auf RNA-Fraktionen untersucht, die mit der markierten Nukleinsäure Komplementarität zeigen. Der Name der Methode geht in diesem Fall nicht auf den Erfin-

Die Methode des Northern Blotting entspricht im Prinzip der eines Southern-Blots (Technik-Box 10): Zunächst wird eine Gelelektrophorese von RNA durchgeführt, bei der die RNA-Moleküle im elektrischen Feld nach Molekulargewicht aufgetrennt werden. Wegen der starken Neigung der RNA, Sekundärstrukturen zu bilden, erfolgt die Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen. Nach der Trennung wird die RNA vom Gel auf einen Membranfilter übertragen. Dieser wird mit radioaktiver (oder anders markierter) Nukleinsäure (Einzelstrang-DNA oder RNA) hybridisiert. Anschließend erfolgt die Autoradiographie (oder Färbungsreaktion), die es gestattet, zur Probe homologe RNA-Fraktionen aufgrund ihrer Hybridbildung zu identifizieren. Hier ist das Ergebnis eines Northern-Blots von RNA aus verschiedenen

der zurück, sondern dient lediglich der Unterscheidung vom Southern-Blotting, das ursprünglich nach seinem Entdecker Edwin Southern benannt wurde, aber auch: engl. southern für „südlich“; engl. northern für „nördlich“. Beachte: Der Umgang mit radioaktiven Stoffen unterliegt der Strahlenschutzverordnung; dabei sind geeignete Maßnahmen zu ergreifen.

Algenstämmen (CC406, CC1051) gezeigt, die mit einer radioaktiv markierten Probe für das Exon 1 des psaA-Gens hybridisiert wurde (das plastidäre psaA-Gen codiert für das Apoprotein des Photosystem-I-Reaktionszentrums). a Die gesamte RNA zweier Algenstämme wurde in einem denaturierenden Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Banden der prominenten rRNAs sind am linken Rand als Größenmarker angegeben, wobei die cytoplasmatischen Moleküle durch Fettdruck hervorgehoben sind. b Das Autoradiogramm zeigt nach Hybridisierung, dass in den beiden Stämmen die psaA-mRNA in unterschiedlicher Größe vorliegt; die jeweilige Größe der RNA-Fragmente ist am rechten Rand angegeben. (Nach Kück 2005, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Kapitel 5

Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen Inhaltsverzeichnis 5.1 Die Entdeckung der Zelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156 5.2 Die eukaryotische Zelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 5.3 Der Zellzyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 5.4 Wichtige eukaryotische Modellorganismen in der Genetik. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

Metaphase der Lungenzelle eines Molches. Die modernen mikroskopischen Techniken gestatten eindrucksvolle Einblicke in die strukturelle Organisation von Zellen. Durch differenzielle Färbung werden die Komponenten der Metaphasezelle sichtbar: Centrosomen (magenta), Chromosomen (blau), Mikrotubuli (grün) und Intermediärfilamente (rot). (Foto: Alexey Khodjakov)

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Überblick Hauptmerkmal einer Zelle höherer Organismen (Eukaryoten) ist ihre Untergliederung in Cytoplasma und Zellkern. Der Lebenszyklus einer eukaryotischen Zelle ist aus cytologischer Sicht im Wesentlichen durch den Wechsel zwischen einem Stadium der Zellteilung (Mitose) und der dazwischenliegenden Phase (Interphase) gekennzeichnet. Während der Interphase ist vor allem der Zellkern mit dem Nukleolus und diffusem Chromatin sichtbar, während sich im Cytoplasma der Zelle Organellen wie Mitochondrien, Plastiden (in Pflanzenzellen) oder der Golgi-Apparat erkennen lassen. Während der Zellteilung (Mitose) werden im Kern Chromosomen sichtbar, der Nukleolus hingegen verschwindet und die Kernmembran löst sich auf. Gleichzeitig bildet sich ein Spindelapparat, mit dessen Hilfe sich die Chromosomen gleichmäßig auf die zwei neu entstehenden Tochterzellen verteilen. Während die Kernmembran sich neu bildet, dekondensieren die Chromosomen und bilden das diffuse Interphasechromatin; auch der Nukleolus bildet sich neu. Untersucht man die Zellteilungen während der Keimzellentwicklung, so stellt man einen grundsätzlichen Unterschied zwischen den letzten zwei Teilungen (Meiose) vor der Gametenbildung fest. In der ersten dieser Zellteilungen wird die Anzahl der Chromosomen auf die Hälfte reduziert. Das geschieht durch die Paarung je zweier morphologisch gleicher Chromosomen, die während der ersten meiotischen Zellteilung zu den entgegengesetzten Spindelpolen wandern. In der zweiten meiotischen Teilung werden (wie bei der Mitose) die beiden Chromatiden eines jeden Chromosoms auf die Tochterzellen verteilt. Bei jeder gewöhnlichen Zellteilung wird die gleichmäßige Verteilung des gesamten genetischen Materials bei unveränderter Gesamtzahl der Chromosomen sichergestellt, während für die Keimzellentwicklung die Anzahl der Chromosomen halbiert wird. Die Untersuchung der Verteilung der Geschlechtschromosomen zeigte, dass die meiotische Paarung je zweier Chromosomen zwischen den beiden elterlichen (homologen) Chromosomen des Organismus erfolgt.

5.1 Die Entdeckung der Zelle Die Zelle als ein Grundbaustein aller Organismen wurde bereits 1665 durch Robert Hooke (1635–1703) bei seinen Untersuchungen an Pflanzen beschrieben; er führte auch die Bezeichnung cell ein. Diese Beobachtungen waren mithilfe eines einfachen Mikroskops gemacht worden (Abb. 5.1). Obwohl in der Folge Nehemiah Grew (1614–1712) und Antoni van Leeuwenhoek (1632–1723) die mikroskopische Feinstruktur von Tieren und Pflanzen in vielen Details studierten, setzte das mangelhafte Auflösungsvermögen der

In einem Chromosom ist eine große Anzahl von Genen gekoppelt. Vor der ersten meiotischen Teilung läuft ein Prozess ab, der für den Austausch von Genen zwischen jeweils zwei homologen Chromosomen sorgt, die Rekombination. Während der Rekombination findet ein Crossing-over, also ein Stückeaustausch zwischen je einer Chromatide zweier homologer Chromosomen, statt. Das führt zu einer Vermischung von Allelen während der Keimzellentwicklung. Ein zentrales Element im Ablauf der Zellteilungen ist die präzise Regulation der einzelnen Teilschritte. Der Zellzyklus startet dabei in der G1-Phase; nach dem Überschreiten eines Kontrollpunktes ist die Zelle irreversibel auf Teilung programmiert. In der anschließenden S-Phase wird die DNA repliziert. Nach der G2-Phase erfolgt die eigentliche Zellteilung, die Mitose. An der Regulation des Zellzyklus ist eine Reihe von regulatorischen Proteinen beteiligt. Man unterscheidet zunächst Cycline und Cyclin-abhängige Kinasen. Dazu kommen noch eine Reihe phosphorylierbarer Proteine, die wichtigsten sind Rb, E2F und p23. Eng verknüpft mit der Regulation des Zellzyklus ist auch der programmierte Zelltod (Apoptose). Das Phänomen wurde zunächst in einigen Mutanten des Fadenwurms Caenorhabditis elegans beobachtet; heute wissen wir, dass Apotose in der normalen Entwicklung vielzelliger Organismen eine fundamentale Rolle spielt. Im Gegensatz dazu zeigen andere Mutanten von C. elegans ein eher gegensätzliches Phänomen, nämlich eine verlängerte Lebenszeit. Die „Genetik des Alterns“ steht aber noch am Anfang. Im Rahmen des Buches wird immer wieder auf verschiedene Modellorganismen verwiesen. Deshalb sollen die wichtigsten eukaryotischen Modellsysteme hier kurz zusammenfassend vorgestellt werden: die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, bei den Pflanzen die Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana, der oben bereits erwähnte Fadenwurm Caenorhabditis elegans, die Tau- oder Fruchtfliege Drosophila melanogaster, der Zebrafisch Danio rerio und die Hausmaus Mus musculus.

frühen Mikroskope solchen Studien enge Grenzen. Erst die Verbesserungen der optischen Qualität, insbesondere durch die Korrektur sphärischer und chromatischer Aberrationen, erlaubten es, Feinheiten im Bau tierischer Gewebe zu erkennen. So beschrieb Theodor Schwann (1810–1882) im Jahre 1839 tierische Zellen und erkannte, dass auch sie Zellkerne besitzen. Der Zellkern war bereits 1831 von Robert Brown (1773–1858) (nach ihm ist die Brown’sche Molekularbewegung benannt) bei Orchideen entdeckt worden. Matthias Jacob Schleiden (1804–1881) schloss, dass der Zellkern eine zentrale Rolle für die Zellent-

5.1 Die Entdeckung der Zelle

Abb. 5.1 Das Mikroskop von Robert Hooke. Die Beleuchtung erfolgte mittels einer Öllampe

wicklung spielt, nahm jedoch an, dass Kerne während der Zellteilung aus „Protoplasma“-Körnchen neu entstehen. Karl Wilhelm von Nägeli (1817–1891) erkannte 1848, dass Zellen durch Zellteilung auseinander entstehen, aber erst Rudolf Ludwig Virchow (1821–1902) kam zu der Erkenntnis, dass alle Zellen stets durch Teilung aus bereits existierenden Zellen entstehen („omnis cellula e cellula“). Die Bedeutung des Zellkerns wurde durch die Erkenntnisse Oskar Hertwigs (1849–1922) im Jahre 1875 und Eduard Strasburgers (1844–1912) zwei Jahre später (1877) hervorgehoben. Sie erkannten, dass die Befruchtung auf einer Vereinigung je eines Zellkerns mütterlichen und väterlichen Ursprungs als Folge der Verschmelzung zweier Keimzellen beruht. Beide Wissenschaftler schlossen daraus, dass die Erbeigenschaften im Zellkern enthalten sein müssen. In den 70erJahren des 19. Jahrhunderts waren von verschiedenen Cytologen färbbare Körperchen im Kern beobachtet worden, die während der Zellteilungen sichtbar sind. Für diese Kernbestandteile wurde 1888 von Wilhelm von Waldeyer-Hartz (1836–1921) die Bezeichnung Chromosomen eingeführt, die auf die charakteristischen Färbungseigenheiten dieser Kernstrukturen Bezug nimmt (Chromosomen werden ausführlich im Kapitel 6 besprochen). Die wichtige Rolle der Chromosomen im Zellkern wurde durch die cytologischen Stu-

dien der Zellteilung deutlich. Hierbei spielten vor allem Untersuchungen an befruchteten Eiern eine Rolle), wie sie unter anderem von Walther Flemming (1843–1905) und Carl Rabl (1853–1917) durchgeführt wurden. Eine der wichtigsten Erkenntnisse war, dass die Anzahl der Chromosomen während der Zellteilung (Mitose) (Flemming 1882) unverändert bleibt. Etwa gleichzeitig beschrieben Edouard van Beneden (1846–1910), Theodor Boveri (1862–1915), Thomas Harrison Montgomery (1873–1912) und andere Cytologen, dass durch einen besonderen Zellteilungsmechanismus während der Entstehung männlicher und weiblicher Keimzellen eine Halbierung der Anzahl der Chromosomen stattfindet und dass durch die Vereinigung der Keimzellen die ursprüngliche Chromosomenanzahl, wie man sie in somatischen Zellen findet, wiederhergestellt wird. Für diesen besonderen Teilungsmechanismus wurde von J. B. Farmer und E. Moore (1905) der Begriff Meiose eingeführt. Bereits 1885 zieht August Weismann (1834– 1914) in seiner berühmten Abhandlung Die Continuität des Keimplasmas als Grundlage einer Theorie der Vererbung einen entscheidenden Schluss aus all diesen Befunden, ohne ihn jedoch mit den Mendel’schen Beobachtungen in Verbindung zu bringen. Fast gleichzeitig wurden auch die chemischen Verbindungen entdeckt, die, wie sich erst viel später (1944) herausstellte, die erblichen Eigenschaften bestimmen: Friedrich Miescher (1844–1895) isolierte 1871 im Keller des Tübinger Schlosses aus Eiter die Nukleinsäuren als einen Hauptbestandteil des Chromatins. Er selbst erkannte die Bedeutung seiner Entdeckung nicht, sondern vermutete wegen der chemischen Einförmigkeit dieser Verbindungen, dass Proteine die wichtigeren Bestandteile des Chromatins seien. Eine endgültige Vorstellung über die chromosomale Grundlage der Vererbung zu entwickeln, gelang erst im ersten Jahrzehnt des 20. Jahrhunderts nach der Wiederentdeckung der Mendel’schen Regeln (1900), obwohl zahlreiche wissenschaftliche Beobachtungen, die eindeutige Hinweise auf die materielle Basis des Erbmaterials enthielten, bereits in der zweiten Hälfte des 19. Jahrhunderts gemacht worden waren. Edmund Beecher Wilson (1856–1939), Walter Stanborough Sutton (1876–1916) und Theodor Boveri (1862–1915) zeigten zu Beginn des 20. Jahrhunderts, dass das mitotische und meiotische Verhalten der Chromosomen vollständig den Erwartungen der genetischen Analysen über das Verhalten des Erbmaterials entspricht. Sie schufen hierdurch die Chromosomentheorie der Vererbung. Als endgültiger Beweis für die Richtigkeit dieser Theorie wird die Übereinstimmung zwischen dem Erbgang und dem cytologischen Verhalten der Geschlechtschromosomen und dem Erbgang geschlechtsgebundener Merkmale gewertet.

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

5.2 Die eukaryotische Zelle 5.2.1 Die Struktur der Zelle Hauptmerkmal einer Zelle höherer Organismen ist ihre Untergliederung in Cytoplasma und Zellkern (Abb. 5.2). Beide Zellbereiche werden durch eine doppelte Kernmembran voneinander getrennt. Der Zellkern enthält den Nukleolus (Kapitel 5.2.4) und die Chromosomen (Kapitel 6); das Plasma des Zellkerns wird auch als Karyoplasma bezeichnet. Organismen, die einen Zellkern besitzen, bezeichnet man als Eukaryoten (der Begriff „Eukaryonten“, der häufig gebraucht wird, ist sprachlich nicht korrekt). Sie stehen im Gegensatz zu den Prokaryoten, die keinen durch eine Kernmembran abgesonderten Kern in ihren Zellen besitzen und dadurch grundlegende Unterschiede in ihrem zellulären Stoffwechsel aufweisen. Der Erwerb eines Zellkerns dürfte evolutionär entscheidend für die Entstehung vielzelliger Organismen mit Zellen und Geweben unterschiedlichster Funktionen und Formen gewesen sein. Innerhalb der Zelle setzt sich die Kernmembran in Membransystemen fort, die das Cytoplasma durchziehen und daher endoplasmatisches Reticulum genannt werden. An diesen Membransystemen laufen die meisten Stoffwechselprozesse ab, und sie sind teilweise dicht mit Ribosomen besetzt („raues“ endoplasmatisches Reticulum). Zudem dienen diese Membranen einer Kompartimentierung – also einer strukturellen Unterteilung – der Zelle, die funktionell wichtig ist. Umgeben werden tierische Zellen von einer Zellmembran, pflanzliche Zellen zusätzlich noch von einer

Zellwand. Die Verstärkung der zellulären Umhüllung bei Pflanzen ist zur Erhaltung des Binnendrucks (Turgor) erforderlich. Beide Strukturen dienen nicht nur der Abgrenzung der Zellen nach außen, sondern erfüllen auch wichtige Aufgaben für das jeweilige Gewebe – und damit letztlich für den Gesamtorganismus – durch die Kontrolle von Transportvorgängen sowohl in die Zelle hinein als auch aus der Zelle heraus. In ähnlicher Weise werden auch Transportvorgänge durch die Kernmembran kontrolliert. Im Cytoplasma von Eukaryotenzellen (Abb. 5.2) finden wir verschiedene Organellen, wie den GolgiApparat, ein membranbildendes Organell, sowie Mitochondrien (Kapitel 5.2.3) und – in Pflanzen – Chloroplasten (Kapitel 5.2.2) und Vakuolen. Im Zellkern sind insbesondere ein oder mehrere Nukleoli auffällig sowie in vielen Fällen stark färbbare, meist amorphe Einschlüsse, das Heterochromatin. Der Nukleolus ist ein Organell, das in allen stoffwechselaktiven Zellkernen beobachtet wird, jedoch in bestimmten Phasen des Zellzyklus aufgelöst bzw. neu gebildet wird (Kapitel 5.2.4). Beim Heterochromatin handelt es sich um inaktives Chromatin (Kapitel 6.1.2). Die Struktur des Cytoplasmas wird durch ein Skelett von Mikrofibrillen bestimmt, das Cytoskelett. Am Aufbau des Cytoskeletts sind vor allem dünne Mikrofilamente (7 nm) und dickere Mikrotubuli (25 nm) beteiligt. Mikrofilamente bestehen aus Aktinmolekülen, die zu Filamenten polymerisieren; Mikrotubuli werden aus Tubulinen zusammengesetzt. In vielen tierischen Zellen gibt es noch zusätzliche Elemente, die intermediären Filamente (engl. intermediate filaments), deren Durchmesser genau zwischen dem der zuvor genannten Fila-

tierische Zelle

pflanzliche Zelle

Exocytose Golgi-Apparat Mitochondrium Mikrotubuli Lysosom Centrosom mit Centriolen Zellkern mit Chromatin Kemmembran Nucleolus freie Ribosomen Mikrofilamente Cytoplasmamembran glattes ER raues ER Peroxisom

Chloroplast

Oleosomen

Vakuole Plasmodesmos Zellwand Mittellamelle

intermediäre Filamente

Abb. 5.2 Die Struktur der Zelle. Grafische Darstellung einer tierischen Zelle (links) und einer Pflanzenzelle (rechts). Die Or-

ganellen sind nicht im richtigen Maßstab angegeben. (Nach Munk 2000, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

5.2 Die eukaryotische Zelle

mente liegt (8 bis 10 nm). Intermediärfilamente sind aus unterschiedlichen Proteinen zusammengesetzt, so unter anderem Vimentin, Desmin und verschiedene Keratine. Die verschiedenen cytoplasmatischen Filamente sind im Zellskelett auf komplexe Weise miteinander verwoben und in der Zellmembran verankert. Dieses Cytoskelett ist nicht nur für die Regulation von Stoffwechselvorgängen, sondern vor allem auch für die Ausbildung der jeweiligen Zellform von entscheidender Bedeutung.

Das Cytoplasma eukaryotischer Zellen ist durch ein

Membransystem, das endoplasmatische Reticulum, durchsetzt, das mit der Kernmembran verbunden ist. Die Verbindung des Karyoplasmas mit dem Cytoplasma erfolgt über Poren in der Kernmembran. Sowohl im Karyoplasma als auch im Cytoplasma befinden sich fibrilläre Elemente, die ein Kernskelett bzw. ein Cytoskelett aufbauen. Kern- und Cytoskelett sind nicht nur für die Form des Kerns und der Zelle bestimmend, sondern stehen auch im Dienste des Stoffwechsels.

Betrachten wir die Entwicklung eines vielzelligen Organismus, so sehen wir, dass aus einer einzigen befruchteten Eizelle eine Vielzahl von Zelltypen unterschiedlicher Form und Funktion gebildet wird. Diese Zellen entstehen durch Zellteilungen, die als mitotische Teilungen bezeichnet werden (Details der Mitose siehe Kapitel 5.3.1). Im Ablauf des Lebenszyklus eines Organismus müssen neben der Vielzahl unterschiedlicher Zellen, die die verschiedenen Teile des Individuums aufbauen, auch Zellen entstehen, die dafür sorgen, dass sich das betreffende Individuum fortpflanzen kann: die Keimzellen, auch als Geschlechtszellen oder Gameten bezeichnet. In den meisten Tieren wird bereits sehr früh in der Entwicklung eines Individuums festgelegt, welche Zellen sich später zu Keimzellen entwickeln. Später werden wir im Detail sehen, dass sich die Entwicklung der Keimbahnzellen mancher Organismen deutlich von der Entwicklung somatischer Zellen unterscheiden kann (Kapitel 11). Da die Entstehung eines neuen Organismus (außer bei vegetativer Vermehrung) die Verschmelzung zweier Keimzellen voraussetzt, müssen wir erwarten, dass bei der Entstehung der Keimzellen eine Veränderung in der Ausstattung dieser Zellen hinsichtlich ihrer Erbeigenschaften erfolgt. Keimzellen müssen somit Besonderheiten aufweisen, die sie grundsätzlich von anderen Zellen unterscheiden. Ein wesentlicher Aspekt ist dabei die Halbierung des Chromosomensatzes in der Meiose (siehe dazu im Detail Kapitel 5.3.2). Im Gegensatz zu Tieren verfügen die Pflanzen über die Möglichkeit der vegetativen Vermehrung. Um eine geschlechtliche Fortpflanzung von Pflanzen zu gestatten, die vegetativ vermehrt wurden, muss in jedem so

vermehrten Pflanzenteil die Fähigkeit zur Entwicklung von Keimzellen vorhanden sein. Die meisten Pflanzenzellen scheinen im Gegensatz zu tierischen Zellen die Fähigkeit beizubehalten, sich zu regenerieren und auch sich zu Keimzellen zu entwickeln (Totipotenz).

In mehrzelligen Organismen unterscheidet man zwischen Keimzellen und somatischen Zellen. Keimzellen können bei Tieren bereits frühzeitig in der Entwicklung determiniert sein. In einer Pflanze behalten Gruppen von Zellen ihre Totipotenz, und es kommt erst im Laufe des Wachstums zu der Entscheidung, ob eine Keimzelle geformt wird.

5.2.2 Chloroplasten Bei Pflanzen zeigen sich Vererbungsmuster, die offensichtlich auf der genetischen Information aus Plastiden, insbesondere der Chloroplasten, beruhen. Correns hat schon 1909 Beobachtungen an der Wunderblume Mirabilis jalapa gemacht, aus denen er darauf schloss, dass bestimmte erbliche Eigenschaften auch mit dem Cytoplasma übertragen werden. Diese Beobachtungen lassen sich in zwei Punkten zusammenfassen: ï Reziproke Kreuzungen geben unterschiedliche Phänotypen. ï Der Phänotyp wird ausschließlich vom mütterlichen Phänotyp bestimmt. Während sich die erste dieser Beobachtungen noch mit einer geschlechtsgebundenen Vererbung erklären ließe (Kapitel 10.4.1), ist das für die zweite nicht mehr möglich. Die Beobachtungen von Correns beziehen sich auf die fleckenartige Verteilung (Weißbuntheit) grüner und nicht gefärbter Bereiche auf den Blättern der Pflanze in bestimmten Kreuzungen. Bestäubt man Blüten von rein grünen Zweigen mit Pollen von rein weißen oder weiß-grün gescheckten Zweigen, oder führt man eine Selbstbestäubung einer Blüte eines rein grünen Zweiges durch, sind alle Nachkommen rein grün. Selbstbestäubung von Blüten eines rein weißen Zweiges hingegen ergibt, ebenso wie die Befruchtung ihrer Blüten mit Pollen von grünen Pflanzen, ausschließlich weiße Nachkommen, die aber aufgrund des Chlorophyllmangels bereits als Keimlinge absterben. Nachkommen von Blüten aus gescheckten Zweigen einer Pflanze, die mit Pollen grüner Pflanzen bestäubt werden, ergeben grüne, gescheckte oder rein weiße Nachkommen, wobei die letzteren wiederum absterben. Das Phänomen ist bei Pflanzen weit verbreitet; aktuelle Beispiele an der Ackerschmalwand Arabi-

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

dopsis thaliana zeigt Abb. 5.3a‒c. Eine Übersicht über mögliche Segregationstypen gibt Abb. 5.3d. Diese Beobachtungen zeigen uns, dass sich stets der mütterliche Phänotyp ausprägt. Wir sprechen hierbei von einer mütterlichen oder matroklinen Vererbung. Dieser Vererbungsmodus muss unterschieden werden von mütterlichen Effekten (engl. maternal effects), die als entwicklungsphysiologische Effekte nur für die Entwicklung der befruchteten Eizelle wichtig sind (Kapitel 11.4.2). Die mikroskopische Analyse der Zellen von Mirabilis jalapa lässt uns erkennen, dass die matrokline Vererbung der Blattfarbe durch die Chloroplasten (oder Plastiden) bedingt wird, je nachdem, ob diese zur Chlorophyllsynthese befähigt sind oder nicht. Plastiden sind cytoplasmatische Organellen von Pflanzen, die im Dienste der Photosynthese stehen und den dazu erforderlichen Mechanismus beherbergen. Plastiden enthalten meistens Chlorophyll. Dieses verleiht den Zellen die grüne Farbe. Ist kein Chlorophyll in den Plastiden vorhanden, erscheinen die Zellen weiß. Beide

Plastidenformen können gleichzeitig in der Zelle vorkommen und führen zu einer schwächeren grünen Färbung. Eine schematische Darstellung eines Chloroplasten zeigt Abb. 5.4. Der Schlüssel für den matroklinen Erbgang liegt darin, dass Plastiden rein mütterlich vererbt werden, da der Pollenschlauch keine Chloroplasten übertragen kann. Das allein würde als Erklärung nicht ausreichen, sondern wir müssen zusätzlich annehmen, dass die Plastiden eine eigene Erbinformation dafür enthalten, ob sie Chlorophyll bilden können oder nicht. In der Tat hat es sich gezeigt, dass die Chloroplasten ein eigenes Genom besitzen. Es codiert für eine Anzahl von Proteinen, die in den Plastiden benötigt werden. Die Tatsache, dass die Plastiden über ein eigenes Genom verfügen, hat natürlich dessen Analyse vorangetrieben. Dabei hat sich gezeigt, dass deren Genome in ihren molekularen Eigenschaften weitaus mehr den Genomen von Prokaryoten gleichen als denen von Eukaryoten. Eukaryotische Zellen haben also offensichtlich im Laufe der Evolution prokaryotische Elemente in sich

Abb. 5.3 a–d Cytoplasmatische Vererbung bei der Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana. a–c Die Pflanzen zeigen grüne und weiße Bereiche, die durch unterschiedliche Mutationen im Chloroplastengenom hervorgerufen werden. d Die unterschiedliche Färbung erklärt sich aus der Segregation der Plastiden. Enthält eine Zygote Plastiden mit und ohne Fähigkeit zur Chlorophyllbildung, so kann es im Laufe der weiteren Zellteilungen zu einer Segregation beider Plastidentypen kommen. Als Folge davon bildet die Pflanze grüne und ungefärbte Bereiche aus. (a–c Nach Yu et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

5.2 Die eukaryotische Zelle

aufgenommen und funktionell für sich nutzbar gemacht (Symbiontenhypothese). Diese Hypothese wurde zuerst von Constantin Mereschkowsky (1905) formuliert und zunächst mit großer Skepsis aufgenommen. Sie wurde dann aber später durch eine Reihe elektronenmikroskopischer und biochemischer Experimente unterstützt, die gezeigt haben, dass Plastide DNA, RNA und Ribosomen enthalten. Molekulargenetische Untersuchungen machen es heute vollkommen klar, dass die

nächsten bakteriellen Homologe der Plastiden in der Tat die Cyanobakterien sind (Abb. 5.5). Nur Cyanobakterien und Chloroplasten haben zwei Photosysteme und spalten Wasser, um Sauerstoff zu produzieren. Die DNA der Plastiden besteht aus einem zirkulären doppelsträngigen DNA-Molekül von 120 bis 180 kb Länge. Im Allgemeinen enthalten Plastiden mehrere identische Kopien dieser DNA-Moleküle. Die DNA von Plastiden codiert für etwa 60 bis 200 Proteine, die grundlegend zur Zellfunktion der Pflanzenzelle beitragen. Im

Mitochondrium

Chloroplast Stroma

Lumen

Innenmembran

innere äußere Mitochondrienmembran

Matrixraum

innere äußere Chloroplastenmembran

Thylakoidmembran

Abb. 5.4 Membranen von Mitochondrien und Chloroplasten im Vergleich. Chloroplasten besitzen eine zusätzliche Membran, die Thylakoidmembran, und damit einen dritten Reaktionsraum, den Thylakoidraum (auch als Lumen bezeichnet).

Die Thylakoidmembran ist während der Differenzierung der Proplastiden zu Chloroplasten aus Einstülpungen der inneren Chloroplastenmembran hervorgegangen. (Nach Munk 2000, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Abb. 5.5 Schematische Darstellung des Erwerbs, der Reduktion oder des Verlustes von Genomen und Kompartimenten während der Evolution. Schwarze Pfeile deuten evolutionäre Pfade an, weiße Pfeile endosymbiotische Ereignisse der Wirtszelle: (1) Der proteobakterielle Endosymbiont führte am Beginn der Evolution der Eukaryoten zur Entstehung der Mitochondrien; (2) Beginn der

Chloroplasten-enthaltenden Zellen; (3) die zweite Stufe der Endosymbiose führt zu verschiedenen Algen, aber auch zu anderen Organismen wie Plasmodien (mit Resten von Chloroplasten) und Trypanosomen, die keine Plastiden mehr besitzen. Schwarze Kreise: Zellkerne; Ellipsen in den Organellen: bakterielle Genome. (Nach Raven u. Allen 2003, mit freundlicher Genehmigung des Autors)

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Genom der Chloroplasten sind insbesondere zwei Gruppen von Genen codiert: Gene, die für die Erhaltung und Expression des eigenen genetischen Systems verantwortlich sind (Gene für rRNAs, tRNAs, ribosomale Proteine, Untereinheiten von RNA-Polymerasen), sowie Gene, die für die Photosynthese wichtig sind. Nur die genetische Information, die im Genom von Plastiden vorhanden ist, wird mütterlich (matroklin) vererbt. Chloroplasten sind nicht selbstständig lebensfähig, sondern funktionieren nur in engem Zusammenspiel mit dem Zellkern: Etwa 5000 Genprodukte sind kerncodiert und müssen aus dem Cytoplasma in die Chloroplasten transportiert werden (Abb. 5.6). Dazu gehören auch Teile der Chloroplastenmembran und viele der in den Chloroplasten erforderlichen Enzyme. Allerdings stammen nur etwa 800 bis 2000 von diesen Genen ursprünglich aus den endosymbiotischen Vorläufern. Die enge Kopplung zwischen nukleärem und cytoplasmatischem Erbmaterial wird durch ein wichtiges Enzym der Plastiden, die Ribulosebiphosphat-Carboxylase, besonders eindringlich veranschaulicht. Diese Carboxylase ist für die CO2Bindung während der Photosynthese verantwortlich und kommt daher in den Blättern grüner Pflanzen in großen Mengen vor. Sie ist aus 16 Proteinuntereinheiten zusammengesetzt, von denen 8 aus je 450 Aminosäuren bestehen und im Plastidengenom codiert werden. Sie werden dementsprechend auch in matrokliner

Weise vererbt. Die übrigen 8 Polypeptide von je 100 Aminosäuren werden jedoch im Zellkern codiert und vererben sich somit gemäß den Mendel’schen Regeln. Photosynthetisch aktive Chloroplasten sind durch hohe Transkriptions- und Translationsraten charakterisiert, wodurch eine große Menge des Enzyms Ribulosebiphosphat-Carboxylase synthetisiert werden kann. Damit ist auch ein schneller Austausch der Komponenten der Elektronentransferkette möglich ‒ eine wichtige Voraussetzung für eine effiziente Photosynthese. Außer der Photosynthese führen die Chloroplasten noch weitere essenzielle Funktionen für die Pflanzenzelle aus, z. B. Synthese von Aminosäuren, Fettsäuren und Lipiden, Pflanzenhormonen, Nukleotiden, Vitaminen und Sekundärmetaboliten.

Cytoplasmatische Organellen wie Chloroplasten besitzen ein eigenes Genom aus doppelsträngiger zirkulärer DNA. Diese Genome entsprechen in vielen Zügen denen von Prokaryoten (besonders Cyanobakterien); daher leiten sich Chloroplasten von prokaryotischen Symbionten eukaryotischer Zellen ab. Der Erbgang von Plastidengenen wird häufig auch unter dem Begriff der extranukleären (oder cytoplasmatischen) Vererbung behandelt. Die zirkulären Plastidengenome sind relativ groß (bis zu 200 Gene) und werden als Plastom bezeichnet. Sie kommen in den Plastiden in mehreren Kopien vor, die sich genetisch teilweise unterscheiden.

Thylakoid-Vorläufer SRP

SecA Sec ATP

Tat ΔpH

SRP FtsΥ GTP Alb3

Thylakoid-Lumen

spontan

Vorläufer des Stromas und der inneren Hülle

Stroma

Cytosol

Abb. 5.6 Die meisten Proteine des Chloroplasten werden im Cytoplasma synthetisiert und müssen zunächst über die beiden Hüllmembranen in das Stroma transportiert werden. Dabei wird ein entsprechendes Leitpeptid durch eine Stromaspezifische Peptidase entfernt (rechte Schere). Für den Weitertransport in das Lumen der Thylakoidmembran gibt es vier verschiedene Transportwege; drei davon sind abhängig von

weiteren Leitsequenzen, die durch eine Thylakoid-spezifische Peptidase entfernt werden (3 Scheren im Lumen). Zwei Prozesse werden durch energiereiche Phosphate angetrieben (ATP bzw. GTP) und einer durch einen pH-Gradienten (ΔpH). Alb3: Translokase; FtsY: SRP-Rezeptor; Sec: sekretorisches Protein; SRP: signal recognition particle; Tat: twin-arginine translocase. (Nach Leister 2003, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

5.2 Die eukaryotische Zelle

Man geht davon aus, dass zwischen 320 und 480 Gene für die Letalität von Setzlingen verantwortlich sind, insgesamt rechnet man mit etwa 1000 Genen, die für die Aufrechterhaltung der Chloroplasten-Funktion benötigt werden. Wir werden sehen, ob neue Mutanten-Screens in Arabidopsis und anderen Pflanzen uns zeigen können, welche Gene der Chloroplasten für ihre Funktion essenziell sind.

5.2.3 Mitochondrien Mitochondrien sind seit über 100 Jahren als Bestandteile von Zellen bekannt. In Leberzellen machen sie etwa 15‒20 % des Zellvolumens aus. Ein Mitochondrium wird von zwei Membranen umgeben (Abb. 5.4), die als äußere und innere Mitochondrienmembran bezeichnet werden. Die äußere Membran hüllt das Mitochondrium vollständig ein und bildet seine äußere Grenzschicht. Im Inneren des Organells befinden sich die Cristae, eine Reihe doppelschichtiger Membranen, die am Rand des Organells auf die innere Mitochondrienmembran stoßen. Die Cristae enthalten einen Großteil des Apparates, der für die Atmung und ATP-Bildung erforderlich ist. Die Membranen gliedern das Organell in zwei wässrige Kompartimente: die Matrix im Inneren des Mitochondriums, und den Intermembranraum zwischen äußerer und innerer Membran. Neben verschiedenen Enzymen enthält die mitochondriale Matrix auch Ribosomen und mehrere ringförmige DNA-Moleküle, die allerdings kleiner sind als die der Plastiden. Ihre mittlere Größe liegt bei 15 bis 20 kb. Sie sind in 1 bis 10 identischen Kopien in jedem Mitochondrium vorhanden. Eine Ausnahme machen jedoch höhere Pflanzen, deren mitochondriale Gene auf mehrere zirkuläre DNA-Doppelstrangmoleküle unterschiedlicher Größe verteilt sind. Die molekulare Struktur der mitochondrialen DNA ist in einigen Organismen vollständig sequenziert (http://www.mitop.de:8080/mitop2). Sie enthält im Allgemeinen etwa 40 Gene. Auch Mitochondrien enthalten in ihrer DNA Gene für organellspezifische ribosomale RNAs, die in ihrer Größe und Sequenz mit der rRNA von Bakterien verwandt sind. Auch einzelne ribosomale Proteine und einige tRNAs werden, je nach Organismus, in den Organellen codiert, während DNAund RNA-Polymerasen sowie Regulationsfaktoren und die meisten Strukturproteine der Mitochondrien aus dem Kern stammen. Somit stellt das Organellengenom nur eine kleine Anzahl von Genprodukten für die Funktion des Organells selbst zur Verfügung. Welche dieser Komponenten vom Kern und welche aus dem Organell stammen, ist abhängig vom Organismus, also ganz offensichtlich nicht funktionell bestimmt.

Die DNA von Mitochondrien trägt grundlegend zur Zellfunktion der Eukaryotenzelle bei. Im Genom der Mitochondrien (Abb. 5.7) sind insbesondere Enzyme des Energiestoffwechsels codiert, und ein Teil der organellspezifischen Translationsmaschinerie der Mitochondrien wird von der eigenen DNA zur Verfügung gestellt. Dennoch sind Mitochondrien nicht selbstständig lebensfähig, sondern funktionieren nur in engem Zusammenspiel mit dem Zellkern. Selbst Teile der Mitochondrienmembran und viele der in ihnen erforderlichen Enzyme sind im Kern codiert und müssen daher in diese Organellen importiert werden. Außerdem kann auch ein Genaustausch zwischen Kerngenom und mitochondrialem Genom stattfinden. Genetische Information, die im Genom von Mitochondrien vorhanden ist, wird mütterlich (matroklin) vererbt; paternale Mitochondrien aus den Spermien sind selektiv mit Ubiquitin markiert und werden abgebaut. Der Unterschied in der rDNA zwischen nukleärem und mitochondrialem Genom hat die auch aus anderen Gründen diskutierte Ansicht unterstützt, dass Mitchon-

IH1 D-loop

IH2

12S rRNA

Cyt b

V

P

IL

E ND6

L

ND1 I M ND2 W

A N C

L S H ND4

leichter Strang Y S

COI

ND5

Menschliche mitochondriale DNA (16.569 bp)

Q

schwerer Strang

T

F

16S rRNA

D COII

R K

8

6

ATPase

G

ND4L

ND3 COIII

Abb. 5.7 Karte des mitochondrialen (mt) Genoms des Menschen. Das kleine menschliche mitochondriale Genom (16,6 kb) wird fast vollständig und von beiden Seiten transkribiert. Die Transkription beginnt am Promotor IL am leichten Strang oder an einem der beiden Promotoren (IH1, IH2) am schweren Strang. Diese Elemente befinden sich alle in der D-Schleife (engl. displacement), die an der DNA-Replikation beteiligt ist und die wichtigste nicht-codierende Region des mitochondrialen Genoms darstellt. Das mt Genom codiert für 22 tRNA-Gene (schwarze Rauten), 2 rRNA-Gene (violett) und 13 Protein-codierende Gene (grün: NADH-Ubiquinon-Oxidoreduktasen 1–6 [7 Gene]; dunkelblau: Apocytochrom b; orange: CytochromOxidasen I–III; hellblau: ATPasen 6 und 8). (Nach Kyriakouli et al. 2008, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

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164 164

Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Genexport und Verlust

a α-protobakterieller Symbiont

Mitochondrium

primitiver Eukaryot

b

moderner Eukaryot

primitiver Zellkern

Zellkern

Erwerb von symbiotischen Genen und fremden Genen; Gensubstitutionen

Abb. 5.8 a, b Das Schicksal der mitochondrialen VorläuferGene. Die frühe Genwanderung erfolgte über zwei Routen: a Der α-proteobakterielle Symbiont hat bei seinem Übergang in eine Organelle massiv Gene verloren. Viele Gene, die für die Funktion der Mitochondrien wichtig sind, wurden an den Zellkern weitergegeben; nur ein kleiner Teil verblieb im Mitochondrium (mtDNA). b Ein hypothetischer primitiver Zellkern des Wirts erwarb mehrere Hundert Gene des Symbionten. In einigen Fällen ersetzen Gene, die aus anderen Quellen für das Kerngenom erworben wurden, mitochondriale Funktionen,

die ursprünglich durch den α-proteobakteriellen Symbionten codiert wurden (z. B. enthält die mtDNA eines Flagellaten eine typische Eubakterien-ähnliche RNA-Polymerase, wohingegen dieses Enzym in allen anderen Eukaryoten eine Struktur hat, die der RNA-Polymerase eines T3-Phagen ähnelt, und im Kern codiert wird). Farbcode: rot: α-proteobakterielle Gene; blau: Kerngene des ursprünglichen Wirts; gelb: α-proteobakterielle Gene, die Gene des Wirts ersetzt haben; grün: Fremdgene, die aus anderen Quellen erworben wurden. (Nach Burger et al. 2003, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

drien in den eukaryotischen Zellen ursprünglich Symbionten prokaryotischen Ursprungs waren, bevor sie sich zu obligatorischen Bestandteilen eukaryotischer Zellen entwickelt haben. Diese Symbiontenhypothese wird heute als Erklärung auch für die Entstehung von Mitochondrien weitgehend akzeptiert (Abb. 5.8).

mitochondrialen Gene. Ein wichtiger Unterschied zwischen eukaryotischen und prokaryotischen Genen ist die Existenz nicht-translatierter DNA-Bereiche innerhalb von Genen, der Introns. Gibt es solche Introns in mitochondrialen Genen? Die Antwort hängt auch hier vom Organismus ab, der betrachtet wird. In menschlichen Mitochondrien hat man keine Introns feststellen können, während in Hefe Introns gefunden wurden. Überhaupt erweist sich das menschliche mitochondriale Genom als besonders kompakt: Es fehlen alle nicht-codierenden Zwischenstücke zwischen Genen (oder Intergenregionen). Außerdem gibt es nur einen einzigen Promotor, und selbst Translations-Terminationssignale werden erst bei der Polyadenylierung der mRNA erzeugt, nämlich durch Anhängen von (A)n an terminale U- oder UANukleotide. In diesem Zusammenhang ist es umso überraschender, dass Mitochondrien dennoch einen sehr grundlegenden Unterschied in ihrem genetischen Material

Mitochondrien

besitzen ein eigenes Genom aus doppelsträngiger zirkulärer DNA, das sich von prokaryotischen Symbionten eukaryotischer Zellen ableitet. Dass mitochondriale Gene sowohl Eigenschaften prokaryotischer als auch eukaryotischer Gene zeigen können, ist dadurch zu erklären, dass ein Austausch von Genen zwischen Kern und Mitochondrien stattfinden kann. Der Erbgang von Mitochondrien-Genen erfolgt über die Mutter (matrokline Vererbung).

Interessant ist natürlich in diesem Zusammenhang die Frage nach der Struktur der Protein-codierenden

5.2 Die eukaryotische Zelle

Tabelle 5.1 Besonderheiten des mitochondrialen Codes des Menschen Codon

Allgemeine Bedeutung

a – Dynamin-ähnliches Protein

Bedeutung in humanen Mitochondrien

UGA

Stopp

Trp

AUG

Initiations-Met

Met (intern)

AUA

Ile

Met (intern)

AUA, AUU, AUC

alle Ile

Initiations-Met

AGA, AGG

beide Arg

Stopp

– Fis1/hFis1 – Mdv1 (in Hefe)

b

gegenüber dem Kern aufweisen. Der genetische Code, der sonst universell ist (Kapitel 3.2), besitzt einige mitochondrienspezifische Abweichungen (Tabelle 5.1). Er wird daher auch als mitochondrialer genetischer Code bezeichnet. Die Replikation der mitochondrialen DNA ist zwar nicht an die S-Phase gebunden, ihre Kopienanzahl im Cytoplasma, und damit auch das Replikationsverhalten, wird jedoch vom Zellkern kontrolliert. Mitochondrien teilen sich während der Proliferation und werden auf die Tochterzellen aufgeteilt. Bei der Teilung der Mitochondrien können zwei Phasen unterschieden werden: (Replikation und) Teilung der mitochondrialen DNA und die daran anschließende Teilung der Matrix. Elektronenmikroskopische Studien identifizierten zunächst einen mitochondrialen Teilungsring an der Einschnürungsstelle der sich teilenden Mitochondrien. Eine wichtige Komponente ist Dynamin, eine eukaryotenspezifische GTPase. Dynamin ist aber auch an einem weiteren wichtigen Vorgang des Mitrochondrien-Lebenszyklus beteiligt, nämlich der Fusion von Mitochondrien. Wir sehen also, Mitochondrien sind sehr dynamische Strukturen, die rasch fusionieren können und sich ebenso schnell auch teilen können; eine Übersicht über den Mechanismus der Teilung von Mitochondrien und die beteiligten Spieler gibt Abb. 5.9. Wie in anderen DNA-Molekülen auch, können in mitochondrialer DNA Mutationen entstehen. Eine der ersten bekannten mitochondrialen Mutationen war die Mutante poky von Neurospora crassa (auch mi-1 genannt), die von Mary und Herschel Mitchell isoliert und als cytoplasmatische Mutation beschrieben wurde (Haskins et al. 1953). Diese Mutante, die durch ihr schlechtes Wachstum gekennzeichnet ist, verursacht einen Verarbeitungsfehler, der zur Folge hat, dass ungenügende Mengen an (mitochondrialer) 19S-rRNA bereitgestellt werden.

– Fzo1/mfn – Mgm1/OPA1

Abb. 5.9 a, b Schematische Darstellung sich teilender und sich vereinigender Mitochondrien. a Mitochondriale Teilung: Fis1 (engl. fission protein; grün) ist gleichmäßig über die äußere mitochondriale Membran verteilt; dabei unterdrückt offensichtlich die Interaktion mit sich selbst eine Bindung anderer Proteine. Zu diesen möglichen Interaktionspartnern gehört Mdv1 (engl. mitochondrial division; rosa). Allerdings gibt es bei Menschen kein Korrelat für Mdv1, sodass Fis1 mit Dnm1 (engl. dynamin-related; blau) direkt in Wechselwirkung treten muss. b Die Fusion von Mitochondrien wird durch Interaktionen von Fzo1 (engl. fuzzy onions; codiert für Mitofusin) oder eines seiner Homologen an gegenüberliegenden Membranen eingeleitet. Dieser Prozess wird durch Mgm1 (bei Hefen; engl. mitochondrial genome maintenance; codiert für eine GTPase. Beim Menschen OPA1 – Mutationen in dem entsprechenden Gen führen zu dominanter optischer Atrophie) und durch Ugo1 (japanisch für Fusion) unterstützt. (Nach Kiefel et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Das wiederum führt zu einem Mangel an kleinen mitochondrialen Ribosomenuntereinheiten. Hierdurch wird die mitochondriale Proteinsynthese gestört, sodass es zu einem langsamen Wachstum der Zellen kommt.

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Erste mitochondriale Mutationen, die beim Menschen zu Erbkrankheiten führen, wurden 1988 in zwei Arbeitsgruppen entdeckt (Holt et al. 1988; Wallace et al. 1988); heute sind Hunderte von Punktmutationen, Deletionen und Rearrangements bekannt und mit Krankheiten assoziiert. Viele Krankheiten betreffen die Gehirn- und Muskelfunktionen ‒ die Organe mit hohem Energieverbrauch. Dazu kommt häufig eine Milchsäure-Acidose, hervorgerufen durch die schlechte Verwertung von Pyruvat. Allerdings sind die klinischen Bilder oft sehr heterogen. Sie verschlimmern sich häufig mit fortschreitendem Alter aufgrund der Anhäufung pathogener mitochondrialer DNA in spezifischen Geweben. Eine Ursache dafür ist die mögliche unterschiedliche Verteilung von pathogener mitochondrialer DNA und mitochondrialer DNA des Wildtyps von der befruchteten Eizelle auf die Tochterzellen sowie die Akkumulation pathogener mitochondrialer DNA in bestimmten Organen im Laufe des Lebens. Zellen, in denen pathogene und Wildtyp-DNA gemeinsam vorkommen, werden als heteroplasmisch bezeichnet; homoplasmische Zellen enthalten nur pathogene mitochondriale DNA oder Wildtyp-DNA. Mitochondriale Dysfunktionen werden zunehmend auch mit Alterungsprozessen in Organismen in Verbindung gebracht. Eine wichtige praktische Anwendung findet eine genetische Eigenschaft, die dem mitochondrialen Genom von Pflanzen zugeschrieben wird. Es handelt sich um die cytoplasmatische männliche Sterilität (engl. cytoplasmic male sterility, CMS), die auch als Pollensterilität bezeichnet wird. Sie wird ausschließlich mütterlich vererbt, wie es für mitochondriale Vererbung zu erwarten ist, da über die männliche Keimbahn keine funktionellen Mitochondrien in die Nachkommen gelangen. In der Pflanzenzucht ist diese Form der Sterilität bei der Erzeugung von Hybriden, die oft besonders günstige Eigenschaften besitzen, von großem Nutzen, da sie Selbstbefruchtung der zur Erzeugung von Hybriden verwendeten Linien verhindert. Dadurch werden aufwendige manuelle Schutzmaßnahmen gegen Selbstbefruchtung überflüssig. Allerdings gibt es in vielen Fällen Gene, die im Zellkern codiert sind und die Fertilität wiederherstellen (engl. restorer of fertility, Rf).

5.2.4 Zellkern und Nukleolus Im Vergleich zu seiner großen Bedeutung hat der Kern einer Eukaryotenzelle eine relativ unauffällige Morphologie (Abb. 5.10). Sein Inhalt stellt sich als eine zähflüssige, formlose Masse dar, die durch eine kompliziert gebaute Kernhülle vom Cytoplasma abgegrenzt wird. Im Kern einer Zelle, die sich nicht teilt („Inter-

Abb. 5.10 Der Interphasezellkern (eines weiblichen Säugetiers) zeigt eine kompartimentalisierte Struktur. Die Chromosomen sind in Territorien angeordnet (hier sind 4 Chromosomenterritorien dargestellt: CTa–CTd). Chromozentren (C) bestehen aus inaktivem Heterochromatin; ihre Zahl pro Zellkern ist unterschiedlich, da sie dazu neigen, sich zu vereinigen. Der Kernmembran, die von Poren durchsetzt ist, lagert sich innen eine Proteinschicht aus Laminen an. Die Kernporen sind mit dem Interchromatin-Kompartiment (IC) verbunden und können auch aktive Transkriptionseinheiten beherbergen (Stern). Abgeschaltete, spät replizierende heterochromatische Regionen (h) sind an der Peripherie des Zellkerns angeordnet; ebenso das inaktivierte X-Chromosom (Xi). Genreiches, früh replizierendes Chromatin befindet sich im Inneren des Zellkerns. Die Chromosomenterritorien sind radial nach innen angeordnet, und zwar entsprechend ihres Genreichtums, ihrer Größe und Expressionsstärke. CTa ist ein großes Chromosom mit reprimierten heterochromatischen Domänen, die mit der Kernmembran verbunden sind oder einen Teil eines Chromozentrums bilden (schwarze Pfeilspitzen). Kleine, genarme (CTb) Chromosomen befinden sich in der Außenzone, während kleine und genreiche (CTc) Chromosomen eher im Inneren des Zellkerns angetroffen werden. CTd und CTc bilden NORs (engl. nucleolar organizing region), die funktionell in den Nukleolus (N) übergehen (offene Pfeilspitzen). Das gestrichelte Rechteck deutet die Möglichkeit von Wechselwirkungen von Genen verschiedener Chromosomen an (hier CTc und CTd). Aktive Chromatinschlaufen befinden sich meistens an der Oberfläche der Chromosomenterritorien und reichen in das IC hinein. Die Vermischung einzelner Domänen von CTa und CTb durch große oder mittelgroße Chromatinschlaufen (schwarze Pfeile) ermöglicht die gemeinsame Anwesenheit ihrer Gene in Regionen hoher Expression. (Nach Folle 2008, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

5.2 Die eukaryotische Zelle

phasezelle“), erkennt man die Chromosomen (als stark auseinandergefaltete Nukleoproteinfasern, in der Regel als Chromatin bezeichnet), ein oder mehrere elektronendichte Kernkörperchen (Nukleoli, die an der Synthese der ribosomalen DNA und dem Zusammenbau der Ribosomen mitwirken), Cajal-Körperchen (Biogenese von nukleärer RNA), Sprenkel (engl. speckles, die am Spleißen beteiligt sind; Abb. 5.11) und das Kernplasma (Karyoplasma). Das Kernplasma ist durch ein Kernskelett, d. h. ein Netzwerk aus Proteinfibrillen, strukturell gegliedert (Kernmatrix). Es ist nicht zuletzt für die Verdoppelung und die Positionierung der Chromosomen wichtig, bestimmt aber zugleich auch die Form des Kerns (vgl. Kapitel 6.2.1 über chromosomale Territorien). Die Kernhülle besteht aus zwei Membranen, die eine Barriere bilden, um Ionen, gelösten Stoffen und Makromolekülen den Weg zwischen Zellkern und Cytoplasma zu versperren. An manchen Stellen sind die Membranen verbunden und bilden runde Poren; diese Kernporen spielen eine entscheidende Rolle bei Transportvorgängen durch die Kernmembran (Abb. 5.12). Der inneren Kernmembran ist eine Proteinschicht angelagert, die aus Laminmolekülen geformt wird. Diese Laminlage ist offenbar nicht nur für die Strukturierung des Kerns und die Anheftung der Chromosomen an die Kernmembran unentbehrlich, sondern sie ist auch an der Kontrolle des Stofftransports zwischen Zellkern und Cytoplasma beteiligt. Bereits die klassischen Cytologen hatten erkannt, dass Nukleoli in den sekundären Konstriktionen oder Nukleolusorganisatorregionen (NORs; Abb. 6.6) gebildet werden. Heute wissen wir, dass die Nukleoli Orte der Synthese von rRNA sind. Für die Entstehung eines neuen Nukleolus am Ende der Meiose ist der Beginn der Transkription ribosomaler DNA die Voraussetzung. Unterbleibt sie oder wird sie experimentell durch Hemmung der RNA-Polymerase I verhindert, so wird kein Nukleolus geformt. Unter normalen Stoffwechselbedingungen bildet sich der Nukleolus bei Beginn der rRNA-Synthese nach einer beendeten Mitose durch die Zusammenlagerung von pränukleolären Körpern (engl. prenucleolar bodies), die bereits vorgeformt sind und aus dem vorangegangenen Zellzyklus stammen. Offenbar sind die wachsenden Transkripte erforderlich, um die Bildung eines Nukleolus aus seinen verschiedenen Komponenten zu ermöglichen. Es wird angenommen, dass die 5’-Enden der Transkripte unmittelbar nach ihrer Synthese mit Proteinen des Zellkerns, insbesondere mit Fibrillarin, assoziiert werden und damit die zur Bildung von präribosomalen Partikeln erforderlichen RNA-Proteininteraktionen einleiten. Vergleichbare Vorgänge kennen wir in Zusammenhang mit der Bildung von Lampenbürstenschleifen (Abb. 6.28, 6.29).

Abb. 5.11 Die Elektronenmikroskopie lässt einige Organellen im Zellkern einer Eizelle von Xenopus sichtbar werden: Die Cajal-Körperchen, die Sprenkel und die granuläre Komponente des Nukleolus enthalten heterogene Partikel mit Durchmessern in der Größenordnung von 2,5–5 nm. GC: granuläre Komponente; DFC: dichte fibrilläre Komponente; FC: fibrilläre Komponente. (Nach Handwerger u. Gall 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Abb. 5.12 a, b Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Kernporen in Xenopus-Oocyten. a Querschnitt durch eine Oocytenkernmembran. Die Doppelmembran ist deutlich zu erkennen, ebenso die in regelmäßigen Abständen gelegenen Kernporen. b Aufsicht auf eine Kernmembran mit Kernporen. Porenkomplexe sind in großer Anzahl vorhanden und regelmäßig angeordnet. Das Zentralgranulum der Poren ist sichtbar. (Fotos: C. Dabauvalle, Würzburg)

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Der Nukleolus ist der Ort der chromosomalen rRNA-

Synthese während der Interphase. In ihm ist die rDNA der Nukleolusorganisatorregion für die Transkription dekondensiert. Die Bildung eines Nukleolus erfolgt durch die Anlagerung vorgefertigter Proteinkomplexe aus dem letzten Zellzyklus an die neu entstehenden Transkripte.

Ultrastrukturell kann man in den Nukleoli drei Komponenten unterscheiden (vgl. Abb. 5.11): ï im Inneren die fibrillären Zentren (engl. fibrillar centers), ï umgeben von dichten fibrillären Komponenten (engl. dense fibrillar components), ï und außen die granulären Komponenten (engl. granular components). Diese Architektur reflektiert weitgehend die gerichtete Reifung der Ribosomen-Vorläufer, wobei die Transkription der rRNA wahrscheinlich an der Schnittstelle zwischen den fibrillären Zentren und den dichten fibrillären Komponenten stattfindet. Die wachsenden Transkripte reichen hinaus in den Körper der dichten fibrillären Komponenten, und die wachsenden Ribosomen-Vorläufer wandern in die granuläre Komponente. Diese deutlichen morphologischen Unterscheidungen sind nicht nur Ausdruck funktioneller Unterschiede, sondern natürlich auch der biochemischen Zusammensetzung: ï Fibrilläre Zentren enthalten DNA, einschließlich rDNA, in einer Form, die Transkription erlaubt, und darüber hinaus entsprechende Transkriptionsfaktoren, z. B. RNA-Polymerase I, DNA-Topoisomerase I und DNA-bindende Faktoren. Entsprechend kann man auch wachsende Vorläufer von rRNAs erkennen; die so gebildete morphologische Struktur lässt sich mit Silber anfärben. ï Die dichte fibrilläre Komponente wird als der Ort betrachtet, an dem die frühe Vorläufer-rRNA nachbearbeitet und modifiziert wird. Sie enthält außerdem Fibrillarin als die Hauptkomponente von Riboproteinen (snoRNPs) und kann ebenfalls durch Silber angefärbt werden. ï Die granuläre Komponente umfasst etwa 75 % der Masse des Nukleolus und enthält schon weitgehend reife Ribosomen-Vorläufer; diese Struktur kann nicht mit Silber angefärbt werden.

Die unterschiedlichen stoffwechselphysiologischen Prozesse, die im Nukleolus ablaufen, spiegeln sich in der Ultrastruktur des Nukleolus wieder. Fibrilläre Zentren sind die Hauptsyntheseorte der rRNA. In der granulären Komponente des Nukleolus befinden sich die reifen Ribosomen-Vorläufer.

5.3 Der Zellzyklus 5.3.1 Mitose Eine Vermehrung von Zellen durch Zellteilungen ist nur dann möglich, wenn sichergestellt ist, dass die Erbinformation jeder Zelle vollständig und gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt wird. Jede Zelle muss also über die Fähigkeit verfügen, ihre Erbinformation identisch zu verdoppeln, sodass beide Zellteilungsprodukte, die Tochterzellen, eine gleiche Ausstattung an Erbinformation erhalten. Den Lebenszyklus einer Zelle können wir nach zwei Gesichtspunkten unterteilen: ï die Verdoppelung der Erbinformation und ï die Zellteilung. Es hat sich herausgestellt, dass in den weitaus meisten Zellen die Verdoppelung der Chromosomen auf eine erste Stoffwechselphase folgt, die man G1-Phase (G von engl. gap = Lücke) nennt. Den Zeitraum des Zellzyklus, innerhalb dessen sich die Chromosomen verdoppeln, nennt man Synthese- oder S-Phase. Es folgt ein weiterer Zeitabschnitt bis zur Zellteilung, währenddessen die Zelle stoffwechselaktiv ist, die G2-Phase (Abb. 5.13). Dieser schließt sich endlich die Zellteilung oder Mitose (M-Phase) an. Die Abfolge von G1-, S- und G2-Phase und der Mitose bezeichnet man als einen Zellzyklus. Die Chromosomen im Zellkern sind während der G1-, der S- und der G2-Phase nicht sichtbar. Vielmehr ist der Kern mit diffusem Chromatin angefüllt, das den Chromosomen entspricht. Dieser Zeitabschnitt des Zellzyklus wird insgesamt auch als Interphase bezeichnet (= Phase zwischen zwei Mitosen). In der klassischen Cytologie nannte man einen Interphasekern auch Ruhekern, da man annahm, er befinde sich in einem Ruhestadium zwischen zwei Mitosen. Dieser Begriff ist nach unserem heutigen Wissen jedoch falsch, da gerade in der Interphase die Erbinformation abgelesen und im Stoffwechsel der Zelle verwertet wird. Die Interphase ist daher der Teil des Zellzyklus, in dem eine hohe Stoffwechselaktivität herrscht.

Der Lebenszyklus einer Zelle ist durch zwei Ereignisse untergliedert: durch die Verdoppelung des Erbmaterials (S-Phase) und durch die Zellteilung (Mitose). Den Abschnitt zwischen zwei Mitosen bezeichnet man als Interphase. Der erste Abschnitt der Interphase zwischen der Zellteilung und der S-Phase wird als G1-Phase, der Abschnitt zwischen der S-Phase und der Mitose als G2-Phase bezeichnet.

5.3 Der Zellzyklus

Mit Beginn der Mitose (Abb. 5.13 und 5.14) werden die Chromosomen im Zellkern als individuelle Einheiten sichtbar. Nach Maßgabe ihrer Struktur unterscheidet man verschiedene Stadien während der Zellteilung, die durch den Zustand und die Bewegung der Chromosomen definiert werden. Selbstverständlich handelt es sich bei der Zellteilung um einen kontinuierlich fortlaufenden Prozess. Aber es ist gebräuchlich, auch in solchen kontinuierlich verlaufenden Prozessen bestimmte Stadien durch leicht erkennbare Merkmale zu identifizieren. Wir wollen uns in diesem Kapitel auf die morphologischen Aspekte beschränken; die regulatorischen Aspekte, die mit der Zellteilung und dem Zellzyklus zu tun haben, werden weiter unten besprochen (Kapitel 5.3.5). Während der Interphase sind die Chromosomen fast vollständig in einen diffusen Zustand übergegangen. Man spricht hier von einer Dekondensation der Chromosomen. Der Kern enthält einen oder mehrere Nukleoli. Während der Prophase beginnt eine Kontraktion der Chromosomen, die auch als Kondensation bezeichnet wird. Sie ist in der Metaphase abgeschlossen. Gleichzeitig bildet sich der Nukleolus zurück und verschwindet. Während der Metaphase kann man im Mikroskop kompakte, stark anfärbbare Chromosomen unterscheiden, die sich nunmehr in der Mitte des Zellkerns in einer Ebene angeordnet haben (Äquatorialebene). Man erkennt erst jetzt deutlich, dass die Metaphasechromosomen in der Längsrichtung zweigeteilt sind – eine Folge der Verdoppelung in der S-Phase. Beide Untereinheiten – die Chromatiden – hängen nur noch in einem kleinen Bereich, dem Centromer, zusammen. Mittelpunkt des Centromers eines jeden Chromosoms ist das Kinetochor, an dem ein Teil der Spindelfasern ansetzt (Abb. 6.8). Nach der Anordnung in der Äquatorialebene beginnen die Chromatiden, sich vollständig voneinander zu trennen; eine Übersicht über die daran beteiligten Proteine in Hefen und Säugern gibt Abb. 5.15. Die Trennung der Chromatiden wird begleitet durch eine Bewegung in entgegengesetzter Richtung auf die Kernpole. Zu diesem Zeitpunkt hat sich die Kernmembran aufgelöst. Der frühere Bereich des Kerns ist durch einen fibrillären Apparat, die Spindel, eingenommen, die für die Verteilung der Chromosomen verantwortlich ist. Die Spindel wird im Allgemeinen von den Spindelpolen her ausgebildet, die sich an gegenüberliegenden Stellen des Cytoplasmas außerhalb des Bereichs der ehemaligen Kernmembran befinden. Nur in Ausnahmefällen werden intranukleäre Spindeln ausgebildet. Tierische Zellen besitzen Centriolen, die im Centrosom liegen. Dieser Zellbereich ist das Organisationszentrum der Spindel. Von ihm aus werden die Spindelfasern gebildet, mikrotubuläre Elemente aus

M-Kontrollpunkt

Kontrollpunkt Abb. 5.13 Der Zellzyklus. Der Zellzyklus beginnt mit der G1-Phase nach der Mitose (M). Wird der Restriktionspunkt (R) überschritten, so beginnt die Replikationsphase der DNA (SPhase). Nach Abschluss der Replikation folgt die G2-Phase, nach deren Abschluss die Zelle in eine neue Mitose eintritt. Der Zeitraum vom Beginn der G1-Phase bis zum Beginn der nächsten Mitose wird als Interphase bezeichnet. Die verschiedenen Phasen variieren, je nach Zelltyp, in ihrer Dauer (vgl. Tabelle 5.3). Im Schema sind die relativen Längen der verschiedenen Phasen dargestellt, wie man sie beispielsweise in Zellkulturen findet. Der gesamte Zellzyklus dauert in vielen Fällen etwa 20 Stunden

Tubulinen, die zum Teil direkt mit dem gegenüberliegenden Centrosom verbunden sind (Polarfibrillen, auch Polfasern genannt; engl. polar fibrils), zum Teil aber auch direkt an den Kinetochoren der Chromosomen ansetzen (Kinetochorfibrillen, auch Chromosomenfibrillen genannt; engl. kinetochore fibers). Die Enden der Spindelfasern, die sich durch die Anlagerung von Tubulinmolekülen verlängern und auf die Centromerregionen der Chromosomen zu wachsen, werden mit einem Plus-Zeichen (+), die zu den Polen hin gerichteten Enden mit einem Minus-Zeichen (−) gekennzeichnet. Sie sind nicht nur für die korrekte Lokalisation der Chromosomen in der Äquatorialebene des Kerns verantwortlich, sondern steuern vor allem auch die Trennung der Chromatiden. Diese verschiedenen Prozesse werden durch unterschiedliche Proteine ermöglicht, die am Aufbau der Spindel beteiligt sind. So enthält eine Spindel Proteine wie Tubuline, die durch Polymerisation Fibrillen ausbilden, Dynein oder Dynein-ähnliche Moleküle und Kinesine. Diese Proteine, die die Bewegungsfunktionen innerhalb der Spindel unterstützen, werden daher Motorproteine genannt.

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Abb. 5.14 Die Mitose. Während der frühen Prophase wandern die Centriolen zu entgegengesetzten Positionen an der Kernmembran und das Chromatin beginnt, sich zu kondensieren, sodass zunächst langgestreckte Chromosomen sichtbar werden. Im Laufe der Prophase kontrahieren sich die Chromosomen weiter, die zwei Chromatiden werden erkennbar und der Nukleolus löst sich auf. In der späten Prophase löst sich die Kernmembran auf, die Spindel beginnt sich auszubilden und die Chromosomen wandern in die Äquatorialebene des ehemaligen Kerns. In der Metaphase liegen alle Chromosomen in der Äquatorialebene. Homologe Chromosomen sind hierbei im Allgemeinen zufallsgemäß verteilt und ungepaart.

In der Anaphase trennen sich die Chromatiden jedes Chromosoms und wandern zu entgegengesetzten Spindelpolen. Auf diese Weise ist sichergestellt, dass jede Tochterzelle einen vollständigen Satz Chromosomen erhält. In der späten Anaphase liegen die Chromatiden nahe an den Spindelpolen und die Durchschnürung der Zelle beginnt. In der Telophase formt sich die neue Kernmembran, die Centriolen verdoppeln sich und die Dekondensation der Chromosomen beginnt. Während der Interphase haben sich die Chromosomen dekondensiert und formen ein Chromatingerüst im Zellkern. Der Nukleolus hat sich neu ausgebildet. Das Schema zeigt die Mitose einer Tierzelle

5.3 Der Zellzyklus

Abb. 5.15 Chromosomen-Trennung während der Mitose. Die Ausrichtung der Chromosomen an der Metaphasen-Spindel und ihre nachfolgende Trennung in der Anaphase hängen wesentlich davon ab, dass zwischen den Schwesterchromatiden zunächst Verbindungen geschaffen und später wieder gelöst werden. In der Mitose ist dafür der Cohesin-Komplex verantwortlich, der aus mindestens 5 Untereinheiten besteht. Der Cohesin-Komplex bildet dabei ringförmige Strukturen aus, die die Chromosomen in der Metaphase umschlingen. Um die Schwesterchromatiden in der Anaphase wieder zu trennen, wird zunächst Scc1 (engl. sister chromatid cohesion protein 1) durch die Protease Separase gespalten. Separase wird durch Securin bis zum Beginn der Anaphase inaktiv gehalten; die Aktivierung der Separase wird durch den APC/C-Komplex (engl. anaphase promoting complex/cyclosome) veranlasst, wo-

Das

diffuse Chromatin des Interphasekerns wird während der Mitose inaktiv und kondensiert sich unter Bildung kompakter Metaphasechromosomen. Der Zusammenhalt von homologen Chromosomen und Chromatiden wird durch Proteine bedingt, deren kontrollierter proteolytischer Abbau in der Anaphase die Trennung von Chromosomen bzw. Chromatiden ermöglicht.

rin er durch Cdc20 unterstützt wird und durch Anheftung von Ubiquitin-Resten zum Abbau am Proteasom vorbereitet. In Säugerzellen wird die Hauptmenge des Cohesins an den Chromosomenarmen schon in der Prophase in einem Separase-unabhängigen Weg entfernt. Allerdings verbleibt ein Teil des Cohesins an den Centromeren, was offensichtlich ausreicht, um die Schwesterchromatiden zusammenzuhalten. Die Schwesterchromatiden können sich erst dann trennen, wenn Scc1 durch Separase gespalten wird. Der Spindel-Kontrollpunkt verhindert den Beginn der Anaphase, solange die Kinetochoren nicht an der Mitosespindel angeheftet sind. Die Bestandteile dieses Kontrollsystems binden an APC/C, was die UbiquitinLigase inaktiv hält und damit die Separase-Aktivierung verhindert. (Nach Marston u. Amon 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Die beginnende Trennung der Chromatiden kennzeichnet die Anaphase. Die Bewegung der Chromatiden in Richtung auf den jeweiligen Pol wird dadurch erreicht, dass das Tubulin am kinetochornahen Ende der Kinetochorfibrillen depolymerisiert und die Fibrille dadurch verkürzt wird. Gleichzeitig mit diesem Bewegungsprozess der Chromatiden beginnen die Polarfibrillen sich zu verlängern, sodass die Pole auseinanderrücken. Hier-

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

durch wird der Platz für die Teilung der Zelle durch eine in der Mitte zwischen den Polen gelegene Einschnürung geschaffen. Während der späten Anaphase erreichen die Chromatiden die Spindelpole, und die Zelle beginnt, sich in der Mitte zwischen den Spindelpolen zu teilen. Hieran sind fibrilläre Elemente entscheidend beteiligt, die vor allem aus Aktin aufgebaut sind. Die Spindel löst sich auf, und in der Telophase beginnen die Chromatiden zu dekondensieren. Eine neue Kernmembran wird ausgebildet, ein neuer Nukleolus entsteht, und die Zellmembran schließt sich zwischen beiden neu entstehenden Kernen (Cytokinese), sodass die Bildung der Tochterzellen beendet ist und ein neuer Zellzyklus beginnen kann. Zwischen den beiden Zellen bleibt ein Aggregat aus Polarfibrillen und aus anderen Rückständen des Teilungsprozesses zurück, das als Phragmoblast und später, in stark kondensiertem Zustand, auch als Flemming-Körper (engl. midbody) bezeichnet wird. Auch die Ausbildung der Kernmembran ist ein komplexer Prozess, an dem sowohl cytoplasmatische als auch Chromosomen-assoziierte Proteine (Lamine) beteiligt sind. Offenbar erfolgt die Organisation der Kernmembran unter Kontrolle der Chromosomen. Die verschiedenen Bestandteile des Kernskeletts und des Karyoplasmas werden zunächst während der Bildung der Kernmembran in der Telophase vom Kerninneren ausgeschlossen und danach, unter aktiver Kontrolle, durch die Kernporen in den Kern reimportiert.

Mithilfe des Spindelapparates, der aus fibrillenbilden-

den Proteinen, vorwiegend Tubulin, und Motorproteinen aufgebaut ist, erfolgt die Verteilung der Chromosomen auf die Tochterzellkerne. Nach Abschluss der Zellteilung gehen die Chromosomen wieder in ihren stoffwechselphysiologisch aktiven Zustand über und dekondensieren zum Interphasechromatin.

5.3.2 Meiose Bei der Entwicklung der Geschlechtszellen wird die Anzahl der Chromosomen halbiert, um bei der Verschmelzung der männlichen und weiblichen Gameten wieder die für den jeweiligen Organismus charakteristische Zahl zu erreichen. Aber es genügt hierbei nicht, die Anzahl der Chromosomen willkürlich auf die Hälfte zu reduzieren, sondern es muss eine genau kontrollierte Verteilung erfolgen, die sicherstellt, dass alle Tochterzellen die vollständige genetische Ausstattung erhalten. Bei mitotischen Zellteilungen werden nur die Chromatiden verteilt, und die Chromosomenanzahl bleibt somit unverändert. Hingegen sind für die Meiose zusätzliche zelluläre Mechanismen erforderlich, um die Homologen gleichmäßig zu verteilen. Diese Prozesse

verlaufen in zwei Zellteilungen, die als meiotische Teilungen oder Reifeteilungen bezeichnet werden; die damit verbundenen besonderen Prozesse werden unter dem Begriff Meiose zusammengefasst (Abb. 5.16). Diese wesentlichen Ereignisse der beiden meiotischen Teilungen sind: ï die Trennung der homologen Chromosomen (im Gegensatz zur Mitose!) in der ersten meiotischen Teilung (Meiose I) und ï die Trennung ihrer Chromatiden (wie in der Mitose!) während der zweiten meiotischen Teilung (Meiose II). Die kontrollierte Verminderung der Chromosomenzahl auf die Hälfte erfolgt dadurch, dass sich zunächst die homologen (replizierten) Chromosomen in der Prophase paaren (Synapsis), sich aber in der darauffolgenden Anaphase wieder trennen und zu den entgegengesetzten Spindelpolen wandern (Segregation). Damit erhält in dieser ersten meiotischen Teilung jede Tochterzelle einen vollständigen Chromosomensatz. Ein wichtiger Gesichtspunkt hierbei ist, dass die Verteilung der väterlichen und mütterlichen Chromosomen zufallsmäßig erfolgt, sodass in den Tochterzellen jede mögliche Kombination der Chromosomen vorliegen kann. Das hat zur Folge, dass die Keimzellen völlig neue Allelkombinationen besitzen können und somit nach der Befruchtung in den Nachkommen neue Genotypen und Phänotypen entstehen. Da die Chromosomenzahl in dieser ersten Reifeteilung (Meiose I) durch die Trennung der homologen Chromosomen auf einen haploiden Wert reduziert worden ist, nennt man diese Teilung auch Reduktionsteilung. Bevor sich diese Zellen zu Gameten differenzieren, erfolgt eine weitere Teilung, die zweite meiotische Teilung (Meiose II), auch Äquationsteilung genannt. Da sich bereits während der Interphase vor der ersten meiotischen Teilung, also vor der Reduktionsteilung, die Chromosomen, wie in jedem normalen mitotischen Zellzyklus, verdoppelt haben, besteht jedes der homologen Chromosomen aus zwei Chromatiden. In der der ersten meiotischen Teilung folgenden Interphase durchlaufen die nunmehr haploiden Zellen keine weitere S-Phase, da die Chromosomen bereits repliziert sind. Während der zweiten meiotischen Teilung werden nun die beiden Chromatiden jedes Chromosoms genauso auf die Tochterzellkerne verteilt wie während jeder mitotischen Zellteilung. Die entstehenden haploiden Tochterzellen besitzen somit jeweils eine Chromatide eines jeden Chromosoms. Eine S-Phase wird auch während der darauf folgenden Entwicklung der haploiden Zellen zu Gameten meistens nicht durchlaufen; vielmehr findet die nächste Verdoppelung der Chromosomen im Allgemeinen erst nach der Befruchtung in der Zygote statt. Von diesem grundlegenden Schema der Meiose gibt es eine ganze Reihe von Abweichungen in ver-

5.3 Der Zellzyklus

Abb. 5.16 Die Meiose. Die aufeinanderfolgenden Stadien der Meiose sind schematisch dargestellt. Während der ersten meiotischen Teilung werden homologe Chromosomen voneinander getrennt (Präreduktion), während der zweiten meiotischen Teilung die Chromatiden der einzelnen Chromosomen. Jede (diploide) primäre Meiocyte ergibt auf diese Weise vier haploide Meioseprodukte. Im männlichen Geschlecht differenzieren sich diese haploiden postmeiotischen Zellen zu Spermatozoen. Im weiblichen Geschlecht degenerieren meist drei der Meioseprodukte, während die vierte haploide Zelle sich zur Eizelle entwickelt. In

einigen Organismen durchlaufen die haploiden Meioseprodukte zusätzliche mitotische Teilungen. Die Prophase der ersten meiotischen Teilung wird aufgrund morphologischer Kriterien der Chromosomenstruktur in eine Reihe von Stadien unterteilt, die bei den meisten höheren Organismen als charakteristische meiotische Chromosomenzustände auftreten. Rekombinationsereignisse in der ersten meiotischen Prophase führen für bestimmte Chromosomenabschnitte zu einer Postreduktion, d.h. zu einer Verteilung väterlicher und mütterlicher Allele erst in der zweiten meiotischen Teilung. Dargestellt ist die Meiose von Tieren

schiedenen Organismen. Beispielsweise können vor der Reifung der Gameten noch Mitosen durchlaufen werden und die Anzahl haploider Zellen dadurch erhöht werden (Kapitel 10.4.4). Jedoch bleibt das Grundprinzip stets erhalten: Aus einer diploiden Keimbahnzelle entstehen haploide Geschlechtszellen. Die Erkenntnis der Verteilung der Chromosomen während der Entstehung der Keimzellen stellte einen grundlegenden Schritt auf dem Weg zur Chromosomentheorie der Vererbung dar. Die endgültige Bestätigung der Richtigkeit dieser Theorie erfolgte schließlich durch die Analyse des Erbgangs von Geschlechtschromosomen (Kapitel 10.4.1).

In der Keimbahn wird die Anzahl der Chromosomen auf einen haploiden Zustand reduziert. Die Meiose schließt zwei Zellteilungen ein. Die erste (Reduktionsteilung) dient der Trennung homologer Chromosomen, die zweite (Äquationsteilung), wie jede normale Mitose, der Trennung der Chromatiden. Zur Trennung der Homologen während der Reduktionsteilung ist es erforderlich, dass sich die Homologen zuvor paaren (Synapsis). Im Unterschied zu normalen Mitosen erfolgt während der Interphase zwischen der ersten und der zweiten Reifeteilung keine DNA-Synthese. Dadurch erhält jede Zelle nach der Meiose nur einen einzigen Chromosomensatz und ist also haploid.

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Wir haben bei der Besprechung der meiotischen Teilungen gesehen, dass die Verteilung väterlicher und mütterlicher Chromosomen während der Reduktionsteilung zufallsgemäß erfolgt. Das ist für die Entstehung eines neuen Individuums genau genommen nicht erforderlich, sondern die Reduktionsteilung könnte im Prinzip auch so erfolgen, dass es zu einer Trennung der väterlichen von den mütterlichen Chromosomen kommt. Bei der Betrachtung populationsgenetischer Gesichtspunkte (Kapitel 10.5) werden wir aber sehen, dass die zufallsgemäße Verteilung der Chromosomen eine wichtige Bedeutung für die Evolution hat: Die Mischung väterlicher und mütterlicher Allele führt zur Entstehung neuer Genotypen und Phänotypen, die neue Möglichkeiten für Selektionsprozesse und andere evolutionäre Mechanismen bieten. Welche Konsequenzen die zufallsgemäße Verteilung der elterlichen Chromosomen für die Anzahl möglicher Kombinationen hat, wird deutlich, wenn man sich die Anzahl der theoretisch möglichen Kombinationen vor Augen hält. Diese werden durch den Ausdruck 2n beschrieben, wobei n die Anzahl der Chromosomenpaare ist. Für eine menschliche Keimzelle (haploid 23 Chromosomen) ergibt das 8.388.608 Möglichkeiten. Damit ist aber die Vielfalt der möglichen Genotypen in der Nachkommenschaft noch keinesfalls beschrieben. Da zur Befruchtung eine zweite Keimzelle mit einer ebenso großen Anzahl von Möglichkeiten ihrer genetischen Konstitution hinzukommt, beträgt die Anzahl möglicher genetischer Konstitutionen (8,39 × 106)2 = 7 × 1013! Dabei sind Crossing-over-Ereignisse noch nicht einmal berücksichtigt.

Die

zufallsgemäße Verteilung der väterlichen und mütterlichen Chromosomen in der ersten meiotischen Teilung führt zu einer beträchtlichen Variabilität in der genetischen Konstitution der Keimzellen. Die Variabilität führt zu neuen Genotypen und Phänotypen in der Nachkommenschaft. Für Evolutionsprozesse ist die Variabilität von großer Bedeutung, da sie Ansatzpunkte für Selektion bietet.

Die Zellen, in denen die erste Reifeteilung (Meiose I) erfolgt, werden Meiocyten I genannt. Deren Interphase verläuft normal und schließt eine S-Phase ein. Nach der S-Phase weisen die Meiocyten I, wie jede diploide Zelle nach der S-Phase, einen 4C-Wert (= 4

Chromatiden) auf. Zu Beginn der Prophase I werden Chromosomen sichtbar, die sich bereits jetzt strukturell von mitotischen Prophasechromosomen unterscheiden (Abb. 5.16). Die langgestreckten Chromosomen, deren zwei Chromatiden während des frühesten Prophasestadiums, Leptotän genannt, noch nicht getrennt erkennbar sind, haben ein perlschnurartiges Aussehen, da sie Verdickungen aufweisen. Diese Verdickungen werden als Chromomeren bezeichnet. Oft sind die Chromosomenenden der Kernmembran angelagert. Mit fortschreitender Kondensation, d. h. Verkürzung der Chromosomen, beginnen sich die Homologen an einzelnen Stellen zu paaren. Dieses Stadium heißt Zygotän. Die Paarung schreitet allmählich, ausgehend von bereits gepaarten Bereichen, über die gesamte Länge der Chromosomen fort. Sie erfolgt hierbei nicht kontinuierlich, sondern beginnt an mehreren Stellen gleichzeitig. Im Pachytän sind die Homologen vollständig gepaart (es besteht Synapsis). Man spricht bei dieser Chromosomenkonfiguration von Bivalenten (= zwei gepaarte homologe Chromosomen. Die Zelle ist noch diploid oder 2n!). Gelegentlich kann man nun bereits die beiden Chromatiden jedes der homologen Chromosomen erkennen, obwohl diese meist erst im folgenden Stadium, dem Diplotän deutlich sichtbar werden. Für den chromosomalen Strukturzustand, in dem alle 4 Chromatiden der zwei homologen Chromosomen sichtbar sind, ist daher auch die Bezeichnung Tetrade gebräuchlich. Im Allgemeinen kann man in allen Tetraden eine oder mehrere Stellen erkennen, an denen sich die Chromatiden der homologen Chromosomen zu überkreuzen scheinen. Man nennt eine solche Überkreuzung ein Chiasma. Chiasmata zeigen an, dass innerhalb der betreffenden Tetrade Rekombination, also ein Austausch der Chromatiden homologer Chromosomen stattgefunden hat. Den Vorgang, der zur Bildung eines Chiasmas führt, nennen wir Crossingover. Wir werden später bei der Darstellung der Rekombination (Kapitel 5.3.3) überwiegend diesen Begriff verwenden. Die genaue Stelle des Austausches im Chromosom kann man hieraus jedoch nicht ableiten, da sich im Allgemeinen bereits bald nach dem Rekombinationsereignis die Chiasmata in Richtung auf die Chromosomenenden verlagern. Man bezeichnet diesen Vorgang als Terminalisierung der Chiasmata. Möglicherweise steht die Terminalisierung mit den molekularen Mechanismen der Rekombination in Zusammenhang (Kapitel 5.3.3). Insgesamt nimmt die Anzahl der Chiasmata innerhalb eines Bivalentes proportional zur Länge der Chromosomen zu.

5.3 Der Zellzyklus

Während des Diplotänstadiums kontrahieren sich die Chromosomen weiter, und die homologen Paarungspartner beginnen sich zu trennen, sodass schließlich ein Zwischenraum zwischen ihnen entsteht. Der Zusammenhalt erfolgt im Wesentlichen nur noch durch die Chiasmata. Chiasmata haben damit eine wichtige Funktion, denn sie garantieren den Zusammenhalt der Homologen bis zur Anaphase und damit gleichzeitig deren gleichmäßige Verteilung auf die zwei Tochterzellen. In der Diakinese wird die Kondensation der Chromosomen abgeschlossen. Die Abstoßung (Repulsion) der Homologen ist besonders ausgeprägt. Der Nukleolus ist nicht mehr zu sehen, und die Kernmembran beginnt sich aufzulösen. Eine Spindel entwickelt sich, und die Spindelansatzstellen (Centromeren) der homologen Chromosomen beginnen, sich nach den Spindelpolen zu orientieren. Dieser Prozess ist während der Metaphase I beendet. Die Chromosomen haben sich in der Äquatorialebene angeordnet. Die Centromere der Homologen sind in Richtung auf die gegenüberliegenden Spindelpole orientiert. Damit kann in der Anaphase I die Verteilung der Chromosomen beginnen. Die Homologen trennen sich nunmehr unter Auflösung der Chiasmata vollständig und wandern zu den entgegengesetzten Spindelpolen. In der Telophase I beginnt die Dekondensation der Chromosomen und die Ausbildung einer neuen Kernmembran.

Während die Interphase vor der ersten meiotischen

Tochterzellen verteilt. Diese sind natürlich – wie die Meiocyten II – haploid (n), besitzen aber nur noch eine Chromatide je Chromosom (1C). Der Verlauf der zweiten Reifeteilung weist im Übrigen keine Besonderheiten auf.

In der zweiten meiotischen Teilung werden die Chromatiden verteilt. Jeder Tochterkern besitzt nunmehr einen haploiden (n), nicht replizierten Chromosomensatz.

Zur Verdeutlichung soll an dieser Stelle die Terminologie der Chromosomenstruktur während der Meiose nochmals zusammengefasst werden. Während der Interphase vor der ersten Reifeteilung kommt es zunächst zur Replikation der Chromosomen. Ein Chromosom besteht zu diesem Zeitpunkt aus einer einzigen Chromatide. Durch die Replikation verdoppelt sich die in jedem Chromosom enthaltene DNA-Doppelhelix. Nach der S-Phase besteht jedes Chromosom daher aus zwei Chromatiden (die je eine DNA-Doppelhelix enthalten). Gepaarte homologe Chromosomen (auch Bivalent genannt, da aus zwei Chromosomen gebildet) bestehen somit aus insgesamt vier Chromatiden und werden daher auch als Tetrade bezeichnet. Endergebnis der Meiose ist die Verteilung dieser vier Chromatiden (= DNA-Doppelhelices) einer Tetrade auf vier Zellen.

Teilung normal verläuft, zeichnet sich die Chromosomenstruktur in der Prophase durch Besonderheiten aus. Zunächst kommt es zur allmählich fortschreitenden Paarung der Homologen, die mit einer Kondensation beider Homologen einhergeht. Während dieser Paarungs- und Kondensationsvorgänge kommt es zur Rekombination, die in der späten Prophase durch Chiasmata (Überkreuzungen) sichtbar wird. Die Chiasmata sind zum Zusammenhalt der Homologen notwendig. Durch diese Paarung wird sichergestellt, dass die Tochterzellen jeweils eines der Homologen jedes Chromosomenpaares erhalten.

Die wesentlichen Punkte der zwei meiotischen Teilungen lassen sich im folgenden Schema zusammenfassen: Die Hauptereignisse während der ersten meiotischen Teilung sind ï die Chromosomenkondensation, ï die Paarung der Homologen, ï die Rekombination und Bildung von Chiasmata, ï die Trennung der Homologen und Verteilung auf zwei Tochterkerne. Das Hauptereignis während der zweiten meiotischen Teilung ist ï die Trennung der Chromatiden.

In der Meiose II werden die Zellen jetzt Meiocyten II genannt (Abb. 5.16). Ihre Interphase ist meist kurz und unterscheidet sich von einer normalen Interphase grundsätzlich dadurch, dass keine Verdoppelung der Chromosomen stattfindet. Meiocyten II sind haploid (n), besitzen jedoch noch 2 Chromatiden (2C) in ihren Chromosomen. Diese werden in der zweiten Reifeteilung, die vergleichbar zu einer Mitose verläuft, auf die

Ein entscheidender Prozess in der Meiose ist die Bildung synaptonemaler Komplexe, die im Zygotän und Pachytän zwischen den homologen Chromosomen zu beobachten sind (Abb. 5.17). Voraussetzungen für die meiotische Paarung von Chromosomen sind letztlich Sequenzhomologien auf der DNA-Ebene. Barlow und Hultén (1996) konnten mithilfe von Fluoreszenz-insitu-Hybridisierung (Technik-Box 14) zeigen, dass die

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Abb. 5.17 Der Synaptonemale Komplex. Klassische Morphologie eines synaptonemalen Komplexes, dargestellt am Beispiel eines elektronenmikroskopischen Längsschnitts eines Käfers (Blaps cribrosa). LE: laterales Element; CE: zentrales Element; RN: Rekombinationsknoten; ch: Chromatin. (Nach Schmekel u. Daneholt 1998, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Bildung der Synapsis an den Chromosomenenden (den Telomeren, Kapitel 6.1.4) beginnt. Sie konnten insbesondere nachweisen, dass die Wiederholungssequenzen an den Telomeren (TTAGGG) eng mit den synaptonemalen Komplexen assoziiert sind, wohingegen andere Wiederholungselemente der DNA sich in Schleifen außerhalb des synaptonemalen Komplexes befinden. Während des Zygotän beginnt die Homologenpaarung (Synapsis), die im Pachytän die Chromosomen in ihrer gesamten Länge erfasst hat. Etwa gleichzeitig mit der Paarung der meiotischen Prophasechromosomen bildet sich zwischen den beiden Homologen der synaptonemale Komplex aus. Es handelt sich dabei um eine proteinreiche Struktur, die aus zwei lateralen und einem zentralen Längselement besteht, die durch transversale Filamente zusammengehalten werden (Abb. 5.17). Zusätzlich findet man auf ultrastrukturellem Niveau besonders elektronendichte Strukturen, die Rekombinationsknoten (engl. recombination nodules). Diese Rekombinationsknoten besitzen einen Durchmesser von etwa 100 nm. Detaillierte Untersuchungen haben gezeigt, dass die Rekombinationsknoten den enzymatischen Apparat enthalten, der für die Rekombination erforderlich ist (für Details siehe Kapitel 5.3.3). Außerdem stimmen sie zahlenmäßig recht gut mit der Anzahl von Rekombinationsereignissen überein; diese Argumentationskette wird durch ihre Lokalisation im Bereich von Chiasmata

im späten Pachytän unterstützt. Wir können frühe und späte Rekombinationsknoten unterscheiden: Während die frühen eher die Stellen eines nicht reziproken Austauschs markieren (Genkonversion), markieren die späten Rekombinationsknoten eher die Bereiche der homologen Rekombination. Die Rekombinationsknoten sind nicht zufällig über das Chromosom verteilt; sie zeigen vielmehr regionale und geschlechtsspezifische Unterschiede. Eine Erklärung könnte sein, dass sie bevorzugt in Regionen vorkommen, die besonders DNase-I-sensitiv sind, d. h. in der Umgebung von Promotoren aktiver Gene. Das erklärt zumindest die regional unterschiedliche Verteilung; wir wissen auch, dass geschlechtsspezifisch unterschiedliche Muster der Genexpression in der Keimbahn vorkommen. Die geschilderte Grundstruktur des synaptonemalen Komplexes ist von der Hefe bis zum Menschen praktisch identisch und zeigt kaum Variabilität. Die ersten molekularen Befunde sprechen demgemäß auch für eine beträchtliche evolutionäre Stabilität zumindest mehrerer der am Aufbau synaptonemaler Komplexe beteiligten Proteine. Der Zusammenbau des synaptonemalen Komplexes beginnt schon im Leptotän mit der Bildung des Achsenelementes entlang jedem der 46 Chromosomen des Menschen. Im frühen Zygotän, wenn jedes Paar der homologen Chromosomen schon etwas aneinander hängt, kommen die beiden Achsenelemente an mehreren Stellen zusammen und bilden die lateralen Elemente des sich bildenden synaptonemalen Komplexes, das durch Brücken-Proteine der zentralen Region stabilisiert wird (Abb. 5.18). SCP1 (engl. synaptonemal complex protein 1) ist dabei eine der Hauptkomponenten der transversalen Filamente; es hat strukturelle Ähnlichkeiten mit Lamin (Abb. 5.10). Die Phosphorylierung von SCP1 ist wahrscheinlich ein Signal, um den synaptonemalen Komplex wieder aufzulösen. Diese Auflösung benötigt weiterhin einen Ubiquitin-abhängigen Abbau von Proteinen, der durch das Ubiquitin-konjugierende Enzym Ubc9 (engl. ubiquitin-conjugating enzyme) vermittelt wird. Für eine lange Zeit war es umstritten, inwieweit Doppelstrangbrüche zur Ausbildung des synaptonemalen Komplexes notwendig sind. Nun scheint diese Frage von der Biologie unterschiedlich beantwortet zu sein: In Weibchen der Taufliege Drosophila und im Fadenwurm C. elegans ist die Synapsis in der Abwesenheit von Doppelstrangbrüchen möglich. In einer großen Zahl von Organismen setzt dagegen die Bildung der Synapsis Doppelstrangbrüche in der DNA voraus. Dazu gehören insbesondere Hefen, Arabidopsis und die Spermatocyten der Säuger (Page u. Hawley 2003).

5.3 Der Zellzyklus

Abb. 5.18 Schema eines Chromosoms im Zygotän. Die maternalen Schwesterchromatiden sind in rot und orange dargestellt, die paternalen in hell- und dunkelblau. Die Chromatiden sind in einem Satz von Schlaufen entlang der lateralen Elemente (schwarze Balken) angeordnet. In der Region, in der sich die DNA-Stränge vor der Bildung des synaptonemalen Komplexes (SC) aneinander ausgerichtet haben, strahlen die Schlaufen von den Achsen aus und können miteinander in Berührung kommen. Im Bereich des synaptonemalen Komplexes sind die lateralen Elemente (schwarz) an den zentralen Elementen (grün) ausgerichtet. (Nach Bishop u. Zickler 2004, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Mutanten bieten immer interessante Hinweise auf die jeweilige Funktion der betroffenen Gene. Mutationen im Zip1-Gen der Hefe führen zu einer um 50‒70 % verminderten Rekombinationsrate (Page u. Hawley 2003). ‒ In der Drosophila-Mutante Nmr4 dissoziiert C(3)G, eine Komponente der transversalen Filamente, fehlerhaft von den Chromosomen ab. Das bewirkt einen Phänotyp, in dem die Chromosomen in der Oozyte verteilt sind anstatt im Karyomer gruppiert (Minikern) zu sein. ‒ In Mäusen, denen das Protein des synaptonemalen Komplexes Scp3 fehlt, kommt es vermehrt zu Aneuploidien, da sich keine Chiasmata zwischen homologen Chromosomen ausbilden. In den Scp3−/−-Mutanten ist das Scp2-Protein eher punktförmig im Zellkern lokalisiert als an den Filamenten der Oocyten im Pachytän; und die Dissoziation der Cohesine von den Chromosomen ist verändert (Castro u. Lorca 2005). Wenn wir die Lage der Chromosomen in der frühen Prophase betrachten, kann es vorkommen, dass bei der schrittweisen Paarung der Homologen im Leptotän gelegentlich nicht-homologe Chromatiden (oder Chromosomen) zwischen zwei sich paarenden Homologen liegen. In diesem Fall ist die vollständige, kontinuierliche Ausbildung des synaptonemalen Komplexes für zwei Chromosomenpaare unmöglich. Man bezeichnet eine solche physische Ver-

knüpfung zweier gepaarter Bivalente mit dem englischen Begriff interlocking. In solchen Fällen würde es zu Komplikationen bei der Homologentrennung in der Anaphase kommen. Die Zelle verfügt jedoch über Korrekturmechanismen, die eine derartige Verknotung von Chromosomen dadurch auflösen, dass die DNA geöffnet und nach einer Verlagerung der Chromatiden wieder kovalent verknüpft wird. Beide Chromosomenpaare liegen nunmehr voneinander getrennt vor, und der synaptonemale Komplex kann sich über die volle Länge der Chromosomen ausbilden. Hierbei spielt wahrscheinlich die Topoisomerase II eine wichtige Rolle. Dieses Enzym ist in der Lage, DNA-Doppelstränge zu öffnen und wieder zu schließen (Abb. 2.14). Es ist in den lateralen Elementen der synaptonemalen Komplexe nachweisbar.

Meiotische Rekombination wird von der Ausbildung synaptonemaler Komplexe begleitet.

5.3.3 Rekombination bei Eukaryoten Wir haben im Kapitel über Rekombination bei Prokaryoten (Kapitel 4.4.2) schon einige grundsätzliche Elemente dieses Mechanismus gelernt. Bei Eukaryoten werden durch die Rekombination in der Meiose homologe Regionen väterlicher und mütterlicher Chromosomen ausgewechselt. Im Ergebnis besitzt ein Partner eines solchen Austauschereignisses nunmehr sowohl Allele väterlichen als auch mütterlichen Ursprungs, während das andere an der Rekombination beteiligte Chromosom über die komplementäre Allelkombination verfügt. Die Anzahl der möglichen Allelkombinationen in den Nachkommen wird also durch Rekombinationsereignisse noch einmal erhöht. Eine entscheidende Grundlage für die Rekombination ist die Homologenpaarung und die Bildung des synaptonemalen Komplexes. Ohne Homologenpaarung wäre es der Zelle nicht möglich, dafür zu sorgen, dass beide Tochterzellen einen vollständigen Chromosomensatz erhalten. Meiotische Rekombination ist also eng mit anderen meiotischen Mechanismen verbunden, insbesondere mit der Bildung des synaptonemalen Komplexes (Abb. 5.19). Das Verständnis dieses Mechanismus ist auch für die Formalgenetik und hierbei insbesondere für Kopplungsanalysen und genetische Kartierungen von fundamentaler Bedeutung (Kapitel 10.4). Austauschereignisse können natürlich auch zwischen den Chromatiden desselben Chromosoms (Schwesterchromatiden) stattfinden. Man spricht dann von Schwesterchromatidenaustausch. Ein

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Abb. 5.19 a, b Aufbau des synaptonemalen Komplexes und Chromatidenaustausch in der Meiose (der Hefe). a In der schematischen Darstellung sind die wichtigsten Proteine gezeigt, die an der Bildung des synaptonemalen Komplexes (SC) beteiligt sind. Zip3 (engl. zipper; eine SUMO-E3-Ligase; engl. small ubiquitin related modifier) aktiviert dabei zunächst Zip1, das Hauptprotein des zentralen Elementes des synaptonemalen Komplexes. Unter Beteiligung einer 5’-3’-DNA-Helikase (Mer3) und den MutS-Homologen Msh4 und Msh5 (DNA-Reparatur-Proteine) bildet sich ein Komplex, der sich an die Holliday-Strukturen anlagern kann. Die Sporulationsproteine 16 und 22 (Spo16, Spo22) sind dagegen für

die Stabilisierung der entsprechenden DNA-Strukturen verantwortlich. Beide Wege gemeinsamen führen dann schließlich zur erfolgreichen Bildung des synaptonemalen Komplexes und der Ausbildung von Crossing-over-Strukturen (Holliday-Struktur). b Es ist die Bildung des synaptonemalen Komplexes während der verschiedenen Phasen der Meiose gezeigt. Die beteiligten Proteine sind mit ihrer jeweiligen Wirkung angegeben. DSB: Doppelstrangbruch; SEI: Einwanderung eines DNA-Strangs (engl. single-end invasion); CO: Crossing-over; NCO: kein Crossing-over. (Nach Shinohara et al. 2008, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

5.3 Der Zellzyklus

Schwesterchromatidenaustausch hat normalerweise jedoch keine erkennbaren Folgen, da einerseits die genetische Information in beiden Chromatiden identisch ist, sich der Austausch andererseits aber auch nicht in Form eines Chiasmas äußert, da die Schwesterchromatiden eng gepaart bleiben. Es stehen uns heute jedoch cytologische Techniken zur Verfügung, die es gestatten, Schwesterchromatidenaustauschereignisse sichtbar zu machen (Kapitel 9.7.1). Immerhin können als Folge von Fehlern bei der Rekombination Veränderungen in Schwesterchromatiden auftreten, die zu genetisch veränderter Information in einer oder beiden Schwesterchromatiden führen.

Durch Austausch von Chromosomenbereichen zwischen den homologen Chromosomen (Rekombination) wird die Variationsbreite der genetischen Konstitution noch zusätzlich zur Zufallsverteilung der väterlichen und mütterlichen Chromosomen erhöht. Der molekulare Mechanismus der Rekombination kann auch zwischen Schwesterchromatiden ablaufen. Solche Austauschereignisse sind jedoch normalerweise wegen des identischen Informationsgehalts der Schwesterchromatiden genetisch nicht zu erkennen.

Genetische Analysen haben gezeigt, dass Rekombination nicht grundsätzlich auf die meiotische Prophase beschränkt ist, sondern auch in mitotischen Zellen erfolgt. In späteren Kapiteln wird noch deutlich werden, dass Rekombinationsereignisse für bestimmte Gensysteme (z. B. Paarungstypwechsel bei Hefen, Kapitel 8.3.4; Reifung der Antikörper, Kapitel 8.4) eine wichtige Rolle spielen. Rekombination erweist sich somit als ein allgemeiner biologischer Mechanismus, der nicht nur evolutionär (durch Rekombination in Keimzellen), sondern auch entwicklungsphysiologisch (durch Rekombination innerhalb bestimmter Gene in somatischen Zellen) von grundlegender Bedeutung ist. Das wirft die Frage nach dem evolutionären Ursprung von Rekombinationsmechanismen auf. Zweifellos sind Rekombinationsereignisse in den Keimzellen für die Nachkommen primär nicht relevant oder können sich sogar nachteilig auswirken, falls hierdurch ungünstige Allelkombinationen entstehen oder durch den Crossing-over-Mechanismus Defekte erzeugt werden (Kapitel 9.2.1). Die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die an Rekombinationsereignissen beteiligt sind, lässt erkennen, dass sie auf Mechanismen beruhen, die ursprünglich wohl für DNA-Reparaturen entstanden sind. Wir hatten bereits bei der Besprechung der Replikation gesehen, dass für die

DNA-Synthese ein Korrekturmechanismus erforderlich ist, der Replikationsfehler eliminiert, die durch Fehleinbau von Nukleotiden durch die DNA-Polymerase verursacht werden. Es zeigt sich nun, dass sich ein zellulärer Mechanismus, der für die Evolution höherer, diploider Organismen eine wahrscheinlich entscheidende Rolle gespielt hat, aus einem grundlegenden Mechanismus entwickelt hat, der für die identische Verdoppelung und für die Instandhaltung des genetischen Materials unentbehrlich ist. Der molekulare Mechanismus der Rekombination war lange Zeit Gegenstand kontroverser Meinungen. Cytologische Beobachtungen, unter anderem von Harriet B. Creighton und Barbara McClintock, die eine direkte Korrelation zwischen genetischem Austausch und cytologisch sichtbaren Veränderungen in den Chromosomen bewiesen, hatten bereits darauf hingedeutet, dass Rekombination mit einem Stückaustausch zwischen homologen Chromatiden verbunden ist. Wir wissen heute, dass das Bruch-undWiederverheilungsmodell (engl. breakage and reunion), das von Robin Holliday (1964) ausgearbeitet wurde, die Ereignisse im Prinzip richtig beschreibt. Es ist heute als „Holliday-Modell“ nach verschiedenen Ergänzungen im Detail weitgehend akzeptiert (Abb. 5.20). Beobachtungen, die für einen Bruch- und Wiederverheilungsmechanismus sprechen, hatten bereits Herbert Taylor und seine Mitarbeiter 1957 beschrieben. In seinen Experimenten, mit denen er Beweise für den semikonservativen Charakter der Replikation erbracht hatte, hatte er auch festgestellt, dass regelmäßig Chromatiden zu finden sind, die nur teilweise radioaktiv markiert waren, während die homologe Chromatide genau das komplementäre Muster aufwies. Das war nur mit direktem Stückaustausch zwischen den beiden Chromatiden zu erklären.

Rekombination erfolgt durch Bruch und Wiederverheilung zweier DNA-Doppelhelices.

Die wesentlichen Schritte eines Rekombinationsereignisses bei Eukaryoten sind in Abb. 5.21 zusammengefasst. Der erste Schritt eines Rekombinationsereignisses ist die Induktion eines Einzel- oder Doppelstrangbruchs in der chromosomalen DNA. Erste experimentelle Hinweise auf die Bedeutung derartiger Brüche als erster Schritt der Rekombination ergab deren Induktion bei Hefe durch Bestrahlung oder chemische Agenzien (Kapitel 9.4). Durch derartige Ereignisse wird die Häufigkeit von Rekombinationsereignissen in einer Grö-

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Abb. 5.20 a–e Das Holliday-Modell. a Nach der DNA-Replikation und vor der meiotischen Zellteilung werden an definierten Punkten in zwei homologen Chromosomen Einzelstrangbrüche in die DNA eingeführt. b, c Es findet ein Strangaustausch statt, um eine Überschneidung (Crossing-over) zu erzeugen (engl. Holliday junction; benannt nach Robin Holliday). c Die symmetrische Auflösung in zwei mögliche Orientierungen

(violette oder grüne Pfeile) erlaubt die Trennung der rekombinierenden Chromosomen. d, e In Abhängigkeit von der Orientierung der Auflösung werden Produkte mit oder ohne Crossing-over gebildet. DNA-Fehlpaarungen, die in der Heteroduplex-DNA vorhanden sind, können repariert werden, was zu Genkonversion führt. (Nach Liu u. West 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

ßenordnung von 1000- bis 3000fach erhöht. Die molekulare Analyse von Hefechromosomen hat darüber hinaus zeigen können, dass eine erhöhte Anzahl von Doppelstrangbrüchen in einer bestimmten, genau definierten Chromosomenregion direkt mit einer erhöhten Rekombinationsrate von Genen im betreffenden Chromosomenbereich gekoppelt ist. Bei der meiotischen Rekombination werden Doppelstrangbrüche durch ein Topoisomerase-ähnliches Protein (SPO11) erzeugt; die-

ses Protein ist bei Hefen, Maus und Mensch konserviert; bei Mäusen und Menschen ist es überwiegend in den Ovarien, Testes und im Thymus exprimiert. Die Enden der DNA werden so zurechtgeschnitten, dass Einzelstrangüberhänge entstehen. Dadurch können sich Rekombinationsproteine anlagern, wie z. B. das Replikationsprotein A (RPA), RAD51 und RAD52. Dabei ist RAD52 ein DNA- und Protein-bindendes Protein, das die RAD51-Rekombinase stimuliert. Die

5.3 Der Zellzyklus

Abb. 5.21 Homologe Rekombination. Rekombination wird eingeleitet durch einen Doppelstrangbruch, der zu Genkonversion mit oder ohne Crossing-over führt. Zunächst werden die Enden der Doppelstrangbrüche herausgeschnitten, um einzelsträngige DNA zu erzeugen, an die das Rekombinationsprotein RAD51 bindet. Der Zusammenbau eines RAD51-Nukleoproteinfilaments führt zu Wechselwirkungen mit der homologen Doppelstrang-DNA und zur Strang-Einwanderung. Dieser Prozess wird auch als Einzelstrang-Einwanderung bezeichnet; die Übergangsstrukturen werden durch RAD54 stabilisiert. In manchen Rekombinationswegen (Mitte) wird daraufhin das zweite DNA-Ende erfasst; daran ist wahrscheinlich RAD52 beteiligt. Dieses Zwischenprodukt kann doppelte Holliday-Verbindungen ausbilden, und die verbleibenden Lücken können durch

neue DNA-Synthese gefüllt werden. Die daraus resultierende Holliday-Verbindung kann auf „klassische“ Weise unter Beteiligung von RAD51C, XRCC3 aufgelöst werden. Alternativ können sich die DNA-Stränge durch die gemeinsame Wirkung von BLM (Blooms-Syndrom-Protein) und Topoisomerase IIIα (TopoIII) trennen. Die BLM-TopoIII-Reaktion führt überwiegend zu Produkten ohne Crossing-over; Mutationen in BLM verursachen einen Anstieg in der Bildung von Crossing-overs. Rekombinanten können aber auch in einem MUS81-abhängigen Weg gebildet werden, der keine Holliday-Verbindung ausprägt (rechts). In ähnlicher Weise können Doppelstrangbrüche in einer DNASynthese-abhängigen Reaktion repariert werden; dieser Weg bedarf der SRS2-Helikase (links). (Nach Liu u. West 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Montage des RAD51-Nukleoproteinfilaments führt zu Wechselwirkungen der homologen Doppelstrang-DNA und zum Eindringen eines Einzelstrangs (engl. strand invasion). RAD54 stabilisiert diese Übergangsstrukturen und ermöglicht es, dass die nachfolgenden Reaktionen stattfinden können. In manchen Rekombinationswegen wird daraufhin das zweite DNA-Ende erfasst; daran ist wahrscheinlich RAD52 beteiligt. Dieses Zwischenprodukt kann doppelte Holliday-Verbindungen ausbilden, und die verbleibenden Lücken können durch neue DNA-Synthese gefüllt werden. Die daraus resultierende Holliday-Verbindung kann auf „klassische“ Weise unter Beteiligung von RAD51C und XRCC3 (engl. X-ray repair cross-complementing protein 3; gehört zur RecA-Proteinfamilie) aufgelöst werden. Das RAD51B-RAD51C-Dimer besitzt eine Einzelstrang-DNA-abhängige ATPase-Aktivität.

In Bakterien ist eine Verschiebung des Überkreuzungspunktes vom ursprünglichen Austauschpunkt durch eine reißverschlussartige Verschiebung der Basenpaarungen in beiden Doppelhelices möglich (branch migration; vgl. Abb. 4.23). Ein ähnlicher Mechanismus ist bei Eukaryoten noch nicht in der Klarheit wie bei Bakterien bewiesen. Von Mitgliedern der RecQ-Familie der DNA-Helikasen, wie dem Bloom-Syndrom-Protein (BLM) oder dem Werner-Syndrom-Protein (WRN), konnte in vitro gezeigt werden, dass sie in der Lage sind, eine Wanderung des Verzweigungspunktes zu bewirken. Anderseits ist es eher unwahrscheinlich, dass Proteine wie das BLM eine dem bakteriellen RuvB-Protein vergleichbare Funktion als Motor der Verschiebung des Verzweigungspunktes ausüben, da Mutationen im humanen BLM-Gen zu einem Anstieg der Schwesterchromatidenaustausche führen.

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Rekominante können aber auch Nebenwege einschlagen, die keine Holliday-Verbindung beinhalten. So kann die doppelte Holliday-Struktur beispielsweise durch den MUS81-Komplex vermieden werden. Dabei handelt es sich um ein Hefe-Protein mit endonukleolytischen Aktivitäten, das die Zwischenprodukte der eindringenden Einzelstränge schneidet, bevor sie zu wahren Holliday-Strukturen reifen können. In ähnlicher Weise kann der Doppelstrangbruch auch durch einen anderen Nebenweg repariert werden; daran ist wesentlich die SRS2-Helikase (engl. suppressor of RAD six screen mutant 2) beteiligt. Dabei kann SRS2 RAD51 von einem der beiden Einzelstrang-Enden entfernen. Das verhindert, dass ein zweites Einzelstrang-Ende zwischen die beiden Doppelstränge eindringt und so eine doppelte Holliday-Struktur hergestellt wird; dadurch vermindert SRS2 schließlich die Wahrscheinlichkeit einer Crossing-over-Bildung.

a

b

Viele Proteine, von denen heute bekannt ist, dass sie an den Rekombinationsereignissen essenziell beteiligt sind, wurden ursprünglich in strahlengenetischen Experimenten in Hefen identifiziert; die entsprechenden Mutanten wurden mit RAD (engl. radiation) bezeichnet und einfach nach ihrem Auftreten durchnummeriert. Auch in höheren Organismen gibt es offenbar spezifische Rekombinationsstellen in der DNA, wie beispielsweise Untersuchungen an Pilzen gezeigt haben. Es erscheint durchaus möglich, dass solche Rekombinationssequenzen generell vorhanden sind. Die höhere Struktur eukaryotischer Chromosomen, die Ausbildung synaptonemaler Komplexe mit Rekombinationsknoten sowie die Anreicherung spezifischer DNA-Sequenzen in deren lateralen Elementen (Abb. 5.17 und 5.18) sind als Anzeichen für die Existenz solcher speziellen Sequenzen zu werten. Wir wissen außerdem, dass die Rekombinationsraten bei Männern und Frauen unterschiedlich sind, dass sie in Richtung der Telomeren höher ist als an den Centromeren und dass sie positiv mit dem GCGehalt der DNA korreliert sind. Die detaillierte Aufklärung dieser Rekombinations-hotspots ist sicherlich eine der spannenden Aspekte der nächsten Zukunft. Interessanterweise gibt es solche hotspots nicht bei C. elegans und D. melanogaster, den beiden Spezies, in denen die Bildung einer Synapse der Rekombination vorausgeht. Lesenswerte, aktuelle und detailliertere Zusammenfassungen, als es im Rahmen eines Lehrbuches möglich ist, bieten die Aufsätze von Coop u. Przeworski (2007) für die Evolution der humanen Rekombination und von Gaut et al. (2007) für die der Pflanzen.

c Abb. 5.22 a–c Zwillingsfleck beim Menschen. a Zwei unterschiedliche klonale Zellpopulationen auf dem Hintergrund von gesundem Gewebe. b Zwillingsflecken als Ergebnis eines mitotischen Crossing-overs. Vor dem Crossing-over sind die jeweiligen Chromosomen heterozygot für rezessive Mutationen. Die Tochterzellen werden hemizygot für die rezessiven Allele. Es ist hier ein Beispiel aus Drosophila gezeigt; sn: singed, y: yellow. c Paarweise Hautanomalien beim Menschen: ein Becker-Nävus (großer, unregelmäßig braun gefärbter Hautfleck) mit verstärktem Haarwuchs auf der linken Seite und ein Naevus depigmentosus (angeborener, schwach pigmentierter Fleck) mit Leberflecken auf der rechten Seite. Die Mittelline ist nicht betroffen. (Aus van Steensel et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

5.3 Der Zellzyklus

Bei der Rekombination wird durch Brüche und kreuzweise Wiederverheilung der DNA-Enden eine viersträngige Holliday-Struktur gebildet.

Rekombinationen können auch in mitotischen Zellen stattfinden; allerdings ist dies etwa 100bis 1000-mal seltener als in der Meiose. Im Allgemeinen wird man Rekombinationen in der Mitose jedoch nicht erkennen, da sie nicht in der abweichenden genetischen Konstitution von Nachkommen sichtbar werden und geeignete zelluläre Marker für diese Art von Mosaikmustern im Allgemeinen nicht vorliegen. Unter geeigneten experimentellen Bedingungen können wir aber auch mitotische Crossing-over-Ereignisse sichtbar machen und diese sogar für entwicklungsbiologische Untersuchungen einsetzen. Das Ergebnis mitotischer Rekombination wurde zuerst an Drosophila beschrieben (Abb. 5.22a und b). Erfolgt ein solches mitotisches Rekombinationsereignis während der frühen Entwicklung in Zellen, so können wir später in den daraus entstehenden Gewebebereichen unterschiedliche Färbungsmuster erkennen. Registriert man viele solcher Muster, so macht man die bemerkenswerte Beobachtung, dass sie bestimmte Grenzen einhalten, die nicht überschritten werden. Curt Stern hat (1936) den Begriff Zwillingsfleck (engl. twin spot) für solche Konstitutionen eingeführt. In der Dermatologie sind solche Zwillingsflecken als Didymosis bekannt und bedürfen noch der molekularen Untersuchung; ein Beispiel zeigt Abb. 5.22c.

in einer Anordnung im Ascus, die den Teilungsschritten während der Meiose und der darauf folgenden Mitose entspricht, da die Teilungsspindeln wegen der engen Asci keinen Überlappungen oder Verschiebungen unterliegen können. Zwei nebeneinanderliegende Sporen reflektieren daher stets die genetische Konstitution einer DNA-Doppelhelix zu Beginn der ersten meiotischen Teilung. Tabelle 5.2 zeigt uns die quantitativen Ergebnisse einer Tetradenanalyse. Neben den erwarteten elterlichen und rekombinanten Genotypen (Abb. 5.23) finden wir zwei abweichende genetische Konstitutionen. Diese lassen sich anhand des Holliday-Modells (Abb. 5.20) auf zweierlei Weise erklären: Nach Abb. 5.23 kann eine abnormale 4:4-Segregation durch ein Rekombinationsereignis entstehen, das als zweites Austauschereignis in den gleichen DNASträngen bei der Lösung der Holliday-Verzweigung entsteht. Erfolgt darauf eine Korrektur der Heteroduplexbereiche in einer der neu entstandenen Doppelhelices, so erhält man eine 5:3-Segregation. Erfolgt die Korrektur in beiden neuen Doppelhelices, so folgt ein 6:2-Segregationsverhältnis. Ein 5:3- und 6:2-Verhältnis kann aber auch zustande kommen, wenn nach

Tabelle 5.2 Beispiel für Genkonversion (Markergene m1 und m2) Kreuzung: a m1 m2+ b × a+ m1+ m2 b+ Die Analyse der Nachkommen-Genotypen ergibt folgende Ascosporenverteilungen:

5.3.4 Genkonversion

I. Kein Crossing-over 4:4-Verhältnis aller Sporen

Das Holliday-Modell der Rekombination gestattet es, weitere genetische Beobachtungen molekular zu erklären, die in Experimenten gemacht werden, in denen man die genetische Analyse aller Nachkommen eines einzelnen Rekombinationsereignisses durchgeführt hat. Hierfür hat sich vor allem die Tetradenanalyse in Hefen und Schimmelpilzen besonders bewährt (Abb. 10.25 und 10.26). Einer der wichtigsten Befunde solcher Tetradenanalysen war die gelegentliche Abweichung vom 1:1-Verhältnis, das bei Rekombinationsereignissen zwischen zwei Markergenen in der Nachkommenschaft eigentlich erwartet wird (Abb. 5.23). Man bezeichnet diese Abweichungen als nicht-reziproke Rekombination oder als Genkonversion. Genkonversion ist eine allgemeine Erscheinung. Sie wird jedoch besonders leicht nachweisbar, wenn nach den zwei meiotischen Teilungen noch eine Mitose folgt, wie das bei Neurospora crassa oder Sordaria brevicollis der Fall ist. In beiden Arten findet man die 8 Ascosporen

II. Normales Crossing-over 4:4-Verhältnis III. Genkonversion (Abb. 5.23) aberrantes 4:4-Verhältnis 6:2- oder 2:6-Verhältnis 5:3- oder 3:5-Verhältnis Beispiel eines Ascus mit einer 2:6-Konversion im Marker m1 a m1 m2+ b a m1 m2+ b a m1+ m2+ b Konversion Konversion a m1+ m2+ b a m1+ m2 b+ a m1+ m2 b+ a m1+ m2 b+ a m1+ m2 b+ Zum Verständnis der molekularen Grundlage der 2:6-Segregation siehe Abb. 5.23.

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Abb. 5.23 Rekombination, Genkonversion und Tetradenanalyse: Segregationsmuster von Markerallelen nach Rekombination in Neurospora-Ascosporen. Die abnormale Verteilung der Marker, die bei Tetradenanalysen zu beobachten ist, lässt sich nach dem Holliday-Modell des Rekombinationsmechanismus erklären, wenn man annimmt, dass in Heteroduplexregionen der DNA ein Korrekturmechanismus einen Angleich der Nukleotidsequenz des einen Strangs an den anderen vornimmt. Links sind schematisch die DNA-Einzelstränge der vier Chromatiden in der meiotischen Prophase dargestellt. Oben ist ein Crossing-over-Ereignis mit den Folgen auf der molekularen Ebene dargestellt. Die Konstitution

jeder Chromatide hinsichtlich eines Markerallels ist angegeben. Durch Heteroduplexbildung sind zunächst unterschiedliche DNASequenzen in den beiden Einzelsträngen der Doppelhelix einer Chromatide zu finden. Diese werden in der Folge entweder unterschiedlich oder nicht korrigiert. Die Fälle, in denen Korrektur erfolgt, sind durch einen Kreis hervorgehoben. Die jeweils resultierenden Ascosporenzahlen und -anordnungen sind rechts wiedergegeben. Auch hier können Ascosporenverteilungen auftreten, die von denen ohne Rekombination nicht zu unterscheiden sind. Sie entstehen dann, wenn keine Korrektur der Heteroduplexregion erfolgt. Man spricht hier von aberranter 4:4-Segregation

5.3 Der Zellzyklus

Abb. 5.20 die Auflösung der Holliday-Verzweigung durch ein zweites Austauschereignis in den noch nicht betroffenen DNA-Strängen der Doppelhelices erfolgt. Auch hier erhält man zunächst eine abnormale 4:4-Segregation oder, im Falle von Korrekturen in den Heteroduplexregionen der Doppelhelices, 5:3- oder 6:2-Segregation. Abschließend muss noch darauf verwiesen werden, dass Genkonversion auch zwischen nicht homologen Chromosomenregionen auftreten kann, sofern beide am Konversionsereignis beteiligten Chromosomenbereiche eine homologe DNA-Sequenz besitzen. Hier kann es dann zu lokal begrenzten Austauschereignissen kommen, die den zuvor beschriebenen im Prinzip entsprechen. Höchstwahrscheinlich sind für Genkonversion jedoch DNA-Replikationsmechanismen verantwortlich, wie sie in Zusammenhang mit DNAReparaturprozessen wirksam werden (Kapitel 9.6.3).

Außerordentliche Segregationsverhältnisse, Konversi-

on genannt, sind besonders bei Tetradenanalysen in Pilzen leicht nachweisbar. Sie lassen sich durch die Entstehung und nachfolgende Korrektur von Heteroduplexregionen in der DNA als Folge der Rekombination verstehen.

Genkonversion ist ein wichtiger Mechanismus bei der Entstehung von manchen Erbkrankheiten. In diesen Fällen kommt es bei einer Rekombination zu einem nicht-homologen Austausch zwischen einem Gen und einem benachbarten Pseudogen, wobei ein Teil der Pseudogensequenz die Sequenz des funktionellen Gens ersetzt. In vielen Fällen führt das zu Veränderungen der Aminosäuresequenz und/oder einem vorzeitigen Stoppcodon. Bekannte Beispiele dafür sind die Gene CRYBB2 (βB2Kristallin, Genkonversion führt zu Katarakt), CYP21A2 (Steroid-21-Hydroxylase; Genkonversion führt zur angeborenen Nebennierenhyperplasie) oder VWF (von-Willebrand-Faktor; Genkonversion führt zu einer Blutgerinnungsstörung ‒ von-Willebrand-Erkrankung). Für eine genomweite Übersicht sei auf den Aufsatz von Bischof et al. (2006) verwiesen.

5.3.5 Kontrolle des Zellzyklus Im Jahre 1953 beschrieben Alma Howard und Stephen Pelc zum ersten Mal im Detail den Zellzyklus. Sie ließen Pflanzen (Vicia faba) mit einer 32P-Markierung wachsen und zeigten, dass es in die DNA des Zellkerns nur während der Interphase eingebaut wurde und dass es vom Ende der Zellteilung bis zur erneuten Aufnahme des Isotops in neue DNA etwa 12 Stunden dauerte. Aus der Analyse der hetero-

genen Meristem-Zellen leiteten Howard und Pelc ab, dass die DNA-Synthese etwa 6 Stunden benötigt und die Zellen in die Prophase der nächsten Mitose ungefähr 8 Stunden nach dem Ende der DNA-Synthese eintreten. Sie waren damit die ersten, die einen Zeitrahmen für das Leben einer Zelle angegeben haben, und sie schlugen vier Phasen für einen Zellzyklus vor: eine Phase der Zellteilung, die Prä-S-Phase (auch als G1-Phase-bezeichnet), die S-Phase (die Periode der DNA-Synthese), und G2, die prä-mitotische Phase (Abb. 5.13). Wie wir heute wissen, ist die Dauer eines Zellzyklus durch den besonderen Charakter des jeweiligen Zelltypus bestimmt und weist große Unterschiede auf (Tabelle 5.3. Betrachtet man hingegen die relative Dauer der einzelnen Abschnitte des Zellzyklus, so findet man Variabilität in der Länge überwiegend in der G1-Phase. Zellen, die nicht mehr mitotisch aktiv sind oder sich zumindest zeitweilig nicht mehr teilen, überschreiten einen bestimmten Punkt in der G1-Phase nicht. Dieser Zeitpunkt wird als Restriktionspunkt (R) bezeichnet. Er übt eine wichtige Kontrollfunktion im Zellzyklus aus, da er dafür sorgt, dass eine Zelle nicht in die Replikationsphase eintreten kann, bevor die notwendigen Voraussetzungen hierzu erfüllt sind. Besonders wichtig ist es, dass die DNA keine Brüche oder anderweitige Veränderungen enthält, die zu Problemen bei der Replikation führen würden. Weitere Kontrollpunkte (engl. checkpoints), die den Fortgang des Zellzyklus regulieren, befinden sich in der G2-Phase vor dem Beginn der M-Phase und in der M-Phase. In den Regulationsprozessen, die erforderlich sind, um solche Kontrollpunkte im Zellzyklus zu überschreiten, spielen eine Reihe von Proteinen eine wichtige Rolle, die stadienspezifisch aktiviert werden. An allen diesen Kontrollpunkten sind Proteinkinasen und Proteasen beteiligt sowie besonders die Regulationsproteine Cycline und die Cyclinabhängigen Kinasen (CDKs), deren Konzentration in der Zelle den Übergang zwischen den einzelnen Phasen bestimmt. Dies gilt für die Mitose und Meiose in ähnlicher Weise (Abb. 5.24). Das Aktivitätsspektrum der Proteinkinasen selbst wird durch Modifikation des Grades ihrer Phosphorylierung beeinflusst. Hat eine Zelle den Restriktionspunkt in einem Zellzyklus überschritten, so ist sie irreversibel auf die Beendigung des begonnenen Zellzyklus festgelegt und durchläuft eine weitere Mitose. Zellen, die ihre Teilungsaktivität eingestellt oder zeitweilig unterbrochen haben, sind in der G0-Phase. Sie haben den Restriktionspunkt nicht überschritten, und ihre Chromosomen sind nicht verdoppelt, da sie keine S-Phase durchlaufen haben.

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186 186

Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Tabelle 5.3 Zellzykluslängen in verschiedenen Zelltypen Art

Interphase (min)

Mitose (min)

Drosophila melanogaster, Ei

3

6

Physarum polycephalum

420

40

Psammechinus (Embryo, erste Teilungen) (200–300-Zell-Stadium)

14

28 32

Hühnerfibroblasten (Zellkultur)

700

23

Mausfibroblasten (Zellkultur)

1300

40

Hamsterfibroblasten (Zellkultur)

640

24

Säugerzellkultur

900

60

Vicia faba, Wurzelmeristem

1000

120

Ratte, Corneaepithelzellen

14.000

70

Nach Mazia (1961) und Kihlman et al. (1967)

Zellen, die sich im normalen Proliferationszustand befinden, müssen eine Reihe jeweils für sich geregelter Schritte vollziehen: ï Wachstum, ï Replikation der DNA (Verdoppelung der Chromosomen), ï Chromosomensegregation während der Zellteilung, ï Zellteilung. Zum Durchlaufen dieser einzelnen Phasen des Zellzyklus sind sich periodisch wiederholende Mechanismen erforderlich, deren Einzelkomponenten sowohl auf sich selbst regulatorisch zurückwirken als auch auf darauffolgende Prozesse Einfluss nehmen. Der Restriktionspunkt (R-Punkt; Abb. 5.13), der entscheidend für den Übergang der G1-Phase in die S-Phase ist, wird dadurch definiert, dass der Zellzyklus vorher Mitogen-abhängig ist und sensitiv gegen Proteinsyntheseinhibitoren. Bis zum R-Punkt wird der Zellzyklus durch das Cytokin TGFb (engl. transforming growth factor) blockiert. Nach Durchlaufen des Restrik-

Abb. 5.24 a, b Cyclin-abhängige Kinase-Aktivität (CDK) in Mitose und Meiose. a Während der G1-Phase steigt die G1-abhängige CDK-Aktivität (rot) und induziert den Abbau von Sic1 und die Inaktivierung von APC/C (engl. anaphase promoting complex/cyclosome). Dadurch wird der Eintritt in den Zellzyklus und die Anhäufung der S-Phasen-CDKs (grün) ermöglicht; die S-PhasenCDKs initiieren die DNA-Replikation. Mitotische CDKs (blau) fördern dann den Eintritt in die Mitose. Am Ende der Mitose werden die mitotischen CDKs inaktiviert, was zum Abbau des mitotischen Spindelapparates und zum Eintritt in die G1Phase führt. Die mitotischen CDKs werden durch Cyclin-B inaktiviert. b Während des meiotischen Zellzyklus kontrolliert eine G1-ähnliche CDK (rot; lme2 in Hefe) den Eintritt in den Zellzyklus und fördert die Aktivierung der S-Phasen-CDKs (grün; Cdc28-cyclinB-5/6 [Clb5/6] in Hefe) durch Induktion des Sic1-Abbaus und Inaktivierung von APC/C. Meiotische CDKs (blau; Cdc28-cyclinB-1/3/4 [Clb1/3/4] in Hefe) steuern die Trennung der Chromosomen während der Meiose I. Danach steigt die meiotische CDK-Aktivität erneut an und ermöglicht damit den Eintritt in die Meiose II. Die vollständige Inaktivierung der meiotischen CDKs bewirkt dann den Abschluss der Meiose II. Die Dauer der einzelnen Stadien ist nicht skaliert. (Nach Marston u. Amon 2004, modifiziert; mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

5.3 Der Zellzyklus

tionspunktes ist der Zellzyklus Mitogen-unabhängig und wird durch Proteinsyntheseinhibitoren nicht mehr gehemmt. Mitogene sind extrazelluläre Wachstumsfaktoren (auch „primäre Messenger“), die als Liganden an Rezeptoren in der Plasmamembran binden und dadurch eine Signalkaskade induzieren. Diese führt letztlich zu Regulationsvorgängen auf der Transkriptionsebene. Wachstumsfaktoren (Mitogene) sind extrazelluläre Signale (Proteine), die das Zellwachstum stimulieren und den Fortschritt des Zellzyklus kontrollieren. Es gibt allgemeine Wachstumsfaktoren, wie z. B. PDGF (engl. platelet-derived growth factor), die auf unterschiedliche Zelltypen wirken, und zellspezifische Faktoren, wie z. B. NGF (engl. nerve growth factor). Ihre Bindung an den Rezeptor führt über G-Proteine zu einer Induktion von „sekundären Messengern“ (kleine Moleküle wie cAMP, Inositoltriphosphat oder Diacylglycerol). Über die sekundären Messenger werden intrazelluläre Zellzyklus-regulierende Proteine induziert. Die Zellzyklusregulation ist besonders gut an der Bäckerhefe S. cerevisiae untersucht. Das Grundprinzip soll an diesem Organismus dargestellt werden; es sind aber auch in vielen anderen Modell-Organismen die entsprechenden Gene bekannt (für eine Übersicht siehe Tabelle 5.4). Hauptkomponenten der Zellzyklusregulation der Hefe sind zwei Proteinklassen: ï Cycline; sie umfassen die Cycline A, B, D und E. Cycline sind die primären Zellzyklus-regulierenden Proteine. Sie sind zyklisch aktiv und verleihen den CDKs (Cyclin-abhängige Kinasen, engl. cyclin-dependent kinases; Abb. 5.24) ihre Substratspezifität. ï CDKs werden durch Komplexbildung mit Cyclinen aktiviert und durch sterische Modifikation zur Subs-

Beide Komponenten sind für sich genommen inaktiv. Die Bildung von CDK-Cyclin-Komplexen ist stadienspezifisch und wird durch extrazelluläre Signale (Mitogene) ausgelöst. Die Konformation der CDKs wird bei einer Komplexbildung mit Cyclinen so verändert, dass sie befähigt werden, Phosphatgruppen von ATP auf Zielproteine zu übertragen. Zielproteine sind die Cyclin-CDK-Substrate wie z.B. das Retinoblastoma-Protein (Rb-Protein). Die Funktion eines Cyclin-CDKSubstrat-Komplexes lässt sich am Beispiel dieses Proteins gut darstellen. Das Rb-Protein (codiert von einem Tumorsuppressorgen, Kapitel 12.4.1) hat 12 Phosphorylierungsstellen, deren Phosphorylierung das Protein inaktiviert. Bis zum R-Punkt ist das Rb-Protein hypophosphoryliert und somit aktiv, danach wird es bis zur Mitose durch Phosphorylierung inaktiviert. Die Phosphorylierung erfolgt durch Cyclin-CDK-Komplexe. Im aktiven Zustand unterdrückt das Rb-Protein die Transkription von Genen, die erforderlich sind, um den Zellzyklus voranzutreiben, da es den Transkriptionsfaktor E2F bindet (E2F-regulierte Gene codieren für Cyclin E, c-Ras, c-Myc). Hierdurch kommt es zur Unterbrechung des Zellzyklus. Die Phosphorylierung des Rb-Proteins bewirkt eine Dissoziation des Rb-E2FKomplexes und der freigesetzte E2F-Faktor kann die Transkription E2F-abhängiger Gene induzieren. Das führt zugleich zu einer Autoregulation der Synthese von Cyclin E.

Abb. 5.25 Die Regulation des Zellzyklus. G0, M, G1, S und G2 bezeichnen die einzelnen Phasen des Zellzyklus (Ruhe, Mitose, erste „Lücke“ [engl. gap], DNA-Synthese und zweite „Lücke“). Der Restriktionspunkt (R) befindet sich zwischen G1- und S-

Phase. RB bezeichnet das unphosphorylierte Rb-Protein, RB-p dagegen seine phosphorylierte Form. (CDC: cell division cycle; CDK: cyclin-dependent kinase). (Nach Lundberg u. Weinberg 1999, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

tratbindung befähigt. Die ATP-transferierenden Aminosäuren werden hierbei in eine geeignete sterische Position gebracht. CDKs müssen zu ihrer Aktivierung zudem phosphoryliert werden (Abb. 5.25).

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Tabelle 5.4 Gen-Bezeichnungen von Schlüssel-Regulatoren des Zellzyklus Allg. Bezeichnung

S. cerevisiae

S. pombe

C. elegans

Xenopus

Drosophila

Säuger

G1-Phase-Cyclinabh. KinaseKomplex

CDC28-CLN1

cdc2-cig1, cdc2-puc1

--

--

--

Cdk4-Cyclin-D

S-Phase-Cyclinabh. KinaseKomplex

CDC28-CLB5 CDC28-CLB6

cdc2-cig2

--

--

--

Cdk2-Cyclin-A Cdk2-Cyclin-E

M-Phase-Cyclinabh. KinaseKomplex

CDC28-CLB1 CDC28-CLB2 CDC28-CLB3 CDC28-CLB4

cdc2-cdc13

--

--

--

Cdk1-Cyclin-B Cdk1-Cyclin-A

--

MIH1

cdc25

CDC-25

CDC25

String

CDC25A, CDC25B, CDC25C

--

SWE1

wee1

WEE-1

WEE1

WEE

WEE1

Separase

ESP1

cut1

SEP-1

--

Three Rows (THR), Separase (SSE)

ESPL1

Securin

PDS1

cut2

IFY-1

PTTG

Pimples (PIM)

PTTG1

--

SPO11

rec12

SPO-11

--

MEI-W68

SPO11

Shugoshin

SGO1

sgo1

--

--

MEI-S332

--

Polo-Kinase

CDC5

plo1

PLK-2

PLX1

POLO

PLK1

Aurora-Kinase

-IPL1 --

-ark1 --

AIR-1 AIR-2 --

Aurora-A Aurora-B --

Aurora-A Aurora-B Aurora-C

--

CDC14

clp1

CDC-14

--

--

CDC14A, CDC14B

--

MAD2

mad2

MDF-2

MAD2

MAD2

MAD2L1, MAD2L2

CDC28-CLN2 CDC28-CLN3

Cdk6-Cyclin-D Cdk2-Cyclin-E

Aurora-A (Eg2) Aurora-B --

AIR: Aurora/Ipl1-related kinase; ark1: Aurora-Kinase-1; Cdk: cyclin-dependent kinase; CLB: Cyclin B; CLN: Cyclin; clp1: Cdc14-related protein phosphatase-1; ESP1: extra spindle poles-1; ESPL1: extra spindle poles-like-1; IFY-1: interactor of FZY-1; MAD2: mitotic arrestdeficient-2; MDF-2: mitosis-arrest-deficient related-2; MIH1: mitotic inducer homologue-1; PDS1: prevents the dissociation of sisters-1; PLK/plo/PLX/POLO: Polo-Kinase; PTTG: pituitary tumor-transforming protein; Rec: Recombinationsprotein; SEP-1: Separase-1; SGO1: shugoshin-1; SPO: Sporulationsprotein; Swe1: Saccaromyces WEE1. (nach Marston u. Amon 2004)

Dieser Regulationsmechanismus erlaubt es, eine der Ursachen abnormaler Zellproliferation zu verstehen. Fehlt das Rb-Protein aufgrund einer Mutation oder ist es durch Mutation defekt, kann kein (funktioneller) Rb-Komplex mehr

gebildet werden. Infolgedessen kommt es zu ungehemmter Zellproliferation, da nunmehr der E2F-Faktor uneingeschränkt zur Verfügung steht. Das Rb-Protein liefert uns somit ein erstes Beispiel für eine Ursache genetisch bedingter Tumorbildung. Die Zelle

5.3 Der Zellzyklus

benötigt kein extrazelluläres Signal mehr, um den Restriktionspunkt zu überschreiten: Ein mutiertes Gen kann die Funktion eines Wachstumsfaktors imitieren und somit zur ungehemmten Zellproliferation führen. Noch eine weitere Klasse von Proteinen ist an der Regulation des Zellzyklus beteiligt, die CKIs (CDKInhibitoren). Ihre Funktion besteht in der Inhibition des Zellzyklus durch Blockierung der CDKs. Sie umfassen bei Säugern zwei Familien: CDK4- und CDK6-Inhibitoren (INK4A, p15, p16, p18, p19) und die Cip/Kip-Familie (p21, p27, p57), die allgemein auf Cycline wirkt. Die Cip/Kip-Proteine reprimieren über die Hemmung des Cyclin/CDK-Komplexes und der damit verbundenen Hypo-Phosphorylierung der RbProteinfamilie indirekt die Transkription. In diesem hypophosphorylierten Zustand bleiben die Rb-Proteine von den E2F-Proteinen getrennt, sodass deren Zielgene nicht transkribiert werden. Zusätzlich können die Cip/Kip-Proteine die Aktivität von verschiedenen Transkriptionsfaktoren direkt modulieren (Abb. 5.26).

Der

Zellzyklus ist einer komplizierten Regulation unterworfen. So ist der Eintritt in die S-Phase von der Überwindung des Restriktionspunktes abhängig. Dessen Überwindung wird zentral durch eine Proteinkinase in Wechselwirkung mit anderen Proteinen, insbesondere Cyclinen, reguliert. Die Proteinkinase selbst wird durch phosphorylierende Enzyme in ihrer Aktivität kontrolliert. Weitere Zellzykluskontrollpunkte gibt es am Übergang von der G2-Phase zur Mitose und während der Mitose.

Pflanzen enthalten deutlich mehr Cycline als andere Organismen: So verfügt Arabidopsis thaliana über mindestens 32 Cycline mit verschiedenen Expressionsmustern, die eine große Plastizität der sesshaften Pflanzen gegenüber intrinsischen Signalen und sich verändernden Umweltfaktoren widerspiegeln. In der Pflanze hat die Untersuchung der Funktion von Zellzyklus-Genen und Genen, die die Zellteilung beeinflussen, in starkem Maße davon profitiert, dass nicht nur Zellen in Zellkultur untersucht werden können, sondern auch transgene Pflanzen und Mutanten von Pflanzen, insbesondere von Arabidopsis thaliana (Abb. 5.27; siehe aber auch Kapitel 5.4.2). Für den Zusammenhalt von Chromatiden (engl. chromatid cohesion) während der Mitose bis hin zur Anaphase ist ein Protein, das Cohesin, verantwortlich. Eines der mitotischen

MyoD

p57 Cylin CDK

p27

Ngn-2

p21 Rb p107 p130

E2F

p27

E2F1

c-Myc

CBP

STAT3

Abb. 5.26 Einfluss der Cip/Kip-Proteine auf die Transkription. Die CDK-Inhibitoren p21, p27 und p57 reprimieren die Transkription indirekt über die Hemmung des Cyclin-CDKKomplexes. Dadurch bleiben die Rb-Proteine (Rb/p110, p107 und p130) in einem hypophosphorylierten Zustand, in dem sie auch von den E2F-Transkriptionsfaktoren getrennt bleiben. Cip/Kip-Proteine können die Transkription aber auch direkt beeinflussen: p57 und p27 können mit ihrem N-Terminus mit MyoD und Neurogenin-2 (Ngn-2) in Wechselwirkung treten, sie dadurch stabilisieren und so die Transkription ihrer Zielgene fördern. Andererseits bindet p21 an E2F1, c-Myc und STAT3 und hemmt so deren Aktivitäten. Wenn p21 an den p300/CBPKomplex bindet, wird dessen reprimierende Aktivität unterdrückt (und führt somit indirekt zu einer Aktivierung). (Nach de Besson et al. 2008, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Cohesine wird bei der Hefe vom Gen Scc1, ein meiotisches Cohesin vom Gen Rec8 codiert. Eine Protease, genannt APC/C (engl. anaphase promoting complex/ cyclosome), aktiviert während der Anaphase einen anderen Proteasekomplex, der aus einem zunächst inaktiven Komplex der Proteine Separase (Gen Esp1 der Hefe) und Securin (Gen Pds1 der Hefe) besteht. APC/C baut Securin, das ubiquitiniert ist, proteolytisch ab und setzt dadurch Separase als aktive Protease frei, die nunmehr Cohesin abbaut und dadurch die Chromatidentrennung ermöglicht. APC/C ist ein Multiproteinkomplex, der die Progression des Zellzyklus durch die Anaphase in Mitose und Meiose kontrolliert. Seine Wirkung erstreckt sich auf Cohesine und Condensine sowie auf den Cyclin B/Cdc20Komplex. APC/C überprüft den Zustand der Spindel: Stellt er eine ausreichende Tension im Spindelapparat fest, wird der Mitose-Kontrollpunkt aktiviert und der Zellzyklus kann in die Anaphase eintreten. Bei Defekten im Spindelmechanismus oder bei der Segregation wird der Zellzyklus blockiert. Eine Übersicht dazu zeigt Abb. 5.28.

189

190 190

Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

a

b

d

e

f

c

Abb. 5.27 a–f Pflanzliche Phänotypen mit Veränderungen in Zellzyklus-regulierenden Genen. a–c Phänotypen von E2Fa- und DPa-Überexpression in 12 Tage alten Setzlingen. a Nicht transformierte Kontrolle; b E2Fa- und c E2Fa-DPa-Überexpression bei Pflanzen. Alle Pflanzen wurden in der gleichen Vergrößerung fotografiert (Balken: 2,5 mm). d–f TrichomMutanten: elektronenmikroskopische Aufnahmen. d Wildtyp; e stichelMutante: Das STICHEL-Gen codiert für ein Protein mit Sequenzähnlichkeit zur DNA-Polymerase-γ-Untereinheit von Eubakterien; f zwichel-Mutante: Das ZWICHEL-Gen codiert für ein Ca2+-Calmodulin-reguliertes Kinesin. (a–c nach de Veylder et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier; d–f nach Schnittger u. Hülskamp 2002, mit freundlicher Genehmigung der Royal Society)

5.3.6 Kontrollierter Zelltod: Apoptose Die Zellbiologie ist sich der Tatsache, dass es einen genetisch programmierten Zelltod gibt, erst in den letzten 35 Jahren bewusst geworden. Das ist umso

erstaunlicher, als in entwicklungsbiologischer Hinsicht Zelltod ein allgemeines biologisches Phänomen ist. Hinzu kommt, dass cytologische Hinweise auf Zelltod bereits in den Arbeiten von Walther Flemming (1882) und später in den Arbeiten anderer Cytologen vorhan-

5.3 Der Zellzyklus Mad2 BubR1

APC/CCdc20

Securinseparase

Separase

Cyclin BCdk1

Cdk1

Cohesin

Kinetochor Mikrotubuli Prometaphase

Metaphase

Anaphase

Telophase

Abb. 5.28 Regulation der Anaphase und des Ausgangs aus der Mitose durch APC/C. Während der Prometaphase sind die Kontrollproteine des Spindelapparates (wie Mad2 und BubR1) an den Kinetochoren aktiv; diese sind aber nicht (oder noch nicht vollständig) in Verbindung mit den Mikrotubuli (grün). Aktivierte Mad2- und BubR1-Proteine verhindern die Fähigkeit von APC/C (engl. anaphase promoting complex/cyclosome), Ubiquitin auf die Proteine Securin und Cyclin B zu übertragen; dadurch wird der Übergang in die Anaphase und der Ausgang aus der Mitose verhindert. Wenn in der Metaphase

alle Kinetochore mit den Mikrotubuli verbunden sind, kann APC/C Ubiquitin auf Securin und Cyclin B übertragen; dadurch wird auch die Protease Separase aktiviert und Cdk1 inaktiviert. Die Separase zerschneidet dann die Cohesin-Komplexe (rot), die die Schwesterchromatiden zusammenhalten und initiiert damit deren Trennung. Die Cdk1-Inaktivierung führt zur Dephosphorylierung der Cdk1-Substrate durch Phosphatasen und ermöglicht damit den Ausgang aus der Mitose. (Nach Peters 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

den sind. Erst durch J. F. R. Kerr (1972) wurde das Phänomen des programmierten Zelltods als Apoptose bezeichnet und als wichtiges biologisches Prinzip erkannt; seither hat es vielseitige Beachtung gefunden. Im Gegensatz zur Apoptose steht die Zellnekrose, bei der die Zelle üblicherweise platzt und ausfließt. Apoptose spielt nicht nur in jeder normalen Entwicklung eines multizellulären Organismus eine Rolle, sondern hat auch große Bedeutung im Zusammenhang mit der Tumorentstehung. Im Rahmen der normalen Zellzykluskontrolle werden Zellen, die Defekte aufweisen wie etwa unvollständige Replikation oder DNASchäden, gezielt vernichtet. Bei einer mangelhaften Kontrolle des Zellzyklus können solche beschädigten Zellen jedoch überleben und unter Umständen in einen Zustand ungehemmter Proliferation übergehen und somit eine Tumorbildung verursachen. Als Beispiel für programmierten Zelltod ist der Nematode Caenorhabditis elegans besonders geeignet

(siehe auch Kapitel 5.4.3 und 11.2). Dieser nur 1,2 mm lange Wurm, dessen Generationszeit nur 3,5 Tage beträgt, ist zellkonstant. Der adulte Hermaphrodit enthält genau 959 somatische Zellen, adulte Männchen 1031. Zum Zeitpunkt der Gastrulation enthält der wachsende Organismus 650 Zellen, die sich weiterhin teilen. Dennoch enthält der Wurm zum Zeitpunkt des Schlüpfens nur 558 Zellen. Das Schicksal aller Zellen ist während der Entwicklung genau festgelegt. Das bedeutet, dass auch der Tod bestimmter Zellen genetisch vorprogrammiert ist. Im Hermaphroditen werden insgesamt 1090 somatische Zellen durch Mitose gebildet. Hiervon sterben 131 durch genetisch programmierten Zelltod. Mutanten von C. elegans, deren Gene ced-3 oder ced-4 (engl. cell death abnormality) defekt sind, haben gezeigt, dass diese Gene eine zentrale Bedeutung für den Zelltod haben: In ced-3- oder ced-4-Mutanten überleben Zellen, die normalerweise während der Ent-

191

192 192

Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

wicklung absterben. Das Gen ced-3 codiert eine Cystein-Protease, die Proteine nach einer Asparaginsäure schneiden; solche Proteasen werden daher auch als Caspasen bezeichnet. Sie spielen eine Schlüsselrolle in apoptotischen Prozessen. Das Protein, das vom ced4-Gen codiert wird, bindet mit seiner N-terminalen Region an die ced-3-Caspase und aktiviert diese. Es handelt sich also um einen Caspase-Aktivator, der auch als Adaptormolekül bezeichnet wird. So wie es unterschiedliche Caspasen gibt, existieren auch eine Reihe von Caspase-Aktivatoren (Adaptorproteine). Manche dieser Proteine besitzen sogenannte death effector domains (DED) oder death domains (DD), mit deren Hilfe sie an andere Moleküle binden. Solche Komplexe vermitteln dann das eigentliche apoptoti-

C. elegans CED-9

CED-4

CED-3

Effektor-Caspase

sche Signal. Diese kumulieren in ihrer Wirkung auf die Mitochondrien, insbesondere in der Freisetzung von Cytochrom c, was wiederum die Caspase-Kaskade und zentrale Proteine des Zellkerns aktiviert. Damit ist der Tod der Zelle besiegelt. Inzwischen wissen wir, dass die wesentlichen Elemente des Apoptosemechanismus in der Evolution konserviert sind; eine Übersicht dazu gibt Abb. 5.29. So ist ICE (engl. interleucin-converting enzyme) ein humanes Homolog zu ced3 und Apaf1 das Säuger-Homolog für ced4. Für die Entdeckung und Charakterisierung der ced3- und ced4-Mutanten erhielt Robert Horvitz 2002 den Nobelpreis für Medizin. Andere Proteine verhindern durch ihre Anwesenheit die Induktion des apoptotischen Weges. Ein Beispiel ist das ced-9-Gen. Das ced-9-Protein inhibiert die

Drosophila EGL1

Säuger antiapoptotische Bcl-2-Familie

?

ARK

Sickle Reaper Grim Hid

DRONC

Apaf-1 Cytochrom c

Caspase 9 Diab

Iap

Omi

Omi

Effektor-Caspase

Effektor-Caspase Deap

Iap

Smac

Smac

Zelltod

Zelltod

Zelltod

Phagocytose

Phagocytose

Phagocytose

Abb. 5.29 Evolutionäre Konservierung der Apoptosewege in C. elegans, Drosophila und Säugern. Funktionell homologe Caspasen und ihre Regulatoren sind durch dieselben Farben angedeutet. In C. elegans wird die Initiator-Caspase CED-3 durch CED-4 aktiviert, aber durch CED-9 gehemmt. In Säugern beinhaltet der apoptotische Weg die Translokation der proapoptotischen Bcl2-Familienmitglieder in die Mitochondrien, was zur Freisetzung von Cytochrom c, zur Oligomerisierung von Apaf-1, zur Aktivierung von Caspase-9 und der Effektor-Caspasen führt. In Säugern

proapoptotische Bcl-2-Familie

und in Drosophila binden die Inhibitorproteine der Apoptose (IAPs bzw. DIAPs) an die Caspasen und hemmen die aktivierten Caspasen. Die mitochondrialen Proteine Omi und Smac/Diablo treten ebenso in Wechselwirkung mit den IAPs und halten sie davon ab, die Caspasen zu hemmen. Dadurch induzieren sie Apoptose; wohingegen in Drosophila die Proteine Sickle, Reaper, Grim und Hid zusätzlich die DIAP-vermittelte negative Regulation der Caspasen unterdrücken können. (Nach Twomey u. McCarthy 2005, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

5.3 Der Zellzyklus

Caspase-Aktivität. Das entsprechende Säugergen, bcl2, war das erste Gen, dessen Bedeutung für die Apoptose erkannt worden war. Mittlerweile hat man gefunden, dass es nur ein Mitglied einer größeren Genfamilie ist, die zentrale Steuerungsfunktionen in apoptotischen Prozessen ausübt. Die meisten Gene dieser bcl2-Familie inhibieren Apoptose (bcl-x, A1, mcl-1, bclw), während andere Gene aktivierend wirken (bax, bad, bak u. a.). In Knock-out-Mäusen verursacht das Fehlen eines funktionellen bcl-2-Gens massiven Zelltod, z. B. in Lymphgeweben, und führt zu einem frü-

hen Tod der Maus. Eine Übersicht über den Apoptoseweg bei Säugern ist in Abb. 5.30 dargestellt. Eine wichtige Rolle in der Regulation der Apoptose spielen auch Proteine, die von Tumorsuppressorgenen (vgl. Kapitel 12.4.1) codiert werden; eines davon ist das p53-Protein. p53 greift in den Zellzyklus an zwei Kontrollpunkten ein: an dem G1-Restriktionspunkt und dem G2/M-Kontrollpunkt. Normalerweise liegt p53 in der Zelle in einem labilen Zustand vor; wird aber während des Zellzyklus ein Feh-

UV-Strahlung DNA-Schaden Entzug von Wachstumsfaktoren

Ligand des „Todesrezeptor“ „Todesrezeptor“ antiapoptotische Bcl-2-Familie

proapoptotische Bcl-2-Familie

p2 0

Adaptorprotein FADD, RAIDD

AIF Endonuklease

Bax

Procaspase-8, -10

L-Bid

p10

EndoG

Mitochondrium

Bak

Omi

CytoC

Bid

Apoptose

Endonuklease

Apaf-1

Serin-Protease

CytoC

p10

aktive Caspase-8, -10

AIF

Smac

p2 0

Procaspase-9

p20

p10

Omi

IAP p20

X-IAP

p10

aktive Caspase-9

p20 p10

aktiver Effektor Caspase-3, -7, -6

Caspase-abhängige Apoptose

Abb. 5.30 Apoptosewege in Säugern. Der extrinsische Apoptoseweg (links) wird durch Liganden des „Todesrezeptors“ induziert; dazu gehören u.a. TNF, Trail und FasL. Das führt zur Bildung eines Multiproteinkomplexes, zu dem der Rezeptor selbst, Adaptermoleküle wie TRADD, FADD, RAIDD und Initiator-Caspasen (z.B. Procaspase-8) gehören. Durch die Mehrzahl der Stimuli wird aber der intrinsische Apoptoseweg initiiert; zu diesen Stimuli gehören Bestrahlung, cytotoxische Stoffe, und DNA-Schäden. Der Verlust des mitochondrialen Membranpotenzials und die Freisetzung proapoptotischer Proteine führt zur Bildung eines neuen Proteinkomplexes, dem Apoptosom. Diesem Komplex gehören Apaf-1, Cytochrom c, ATP/

dATP und die Initiator-Caspase (Procaspase-9) an. Er führt zur autokatalytischen Aktivierung der Caspase 9 und der nachgeschalteten Effektor-Caspasen. Pro- und antiapoptotische Bcl-2-Homologe regulieren die Freisetzung proapoptotischer mitochondrialer Proteine, während die Aktivität der Caspasen durch die IAPs negativ reguliert wird. Smac und Omi verstärken die Caspase-Aktivität, indem sie den inhibitorischen Wirkungen des IAPs (Inhibitorproteine der Apoptose) entgegenarbeiten, wohingegen AIF (Apoptose-induzierender Faktor) und EndoG zum Caspase-unabhängigen Zelltod beitragen. (Nach Twomey u. McCarthy 2005, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

193

194 194

Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

ler in der DNA entdeckt (z. B. ein Doppelstrangbruch), der bei Fortschreiten des Zellzyklus zur Manifestation als Mutation in der DNA führen würde, so wird innerhalb von ca. 30 Minuten p53 posttranslational stabilisiert. Da p53 ein Transkriptionsfaktor ist, induziert seine Akkumulation die entsprechenden Zielgene, z. B. p21, das wiederum den Cyclin D/CDK4/6- bzw. Cyclin E/ CDK2-Komplex hemmt und somit die Dissoziation von Rb und E2F verhindert (Abb. 5.25). Die p53-abhängige Arretierung in G2 hemmt die Cyclin B/CDC2-Aktivität (ebenfalls über p21), die Cyclin-B- und CDC2-Transkription wird durch p53 selbst gehemmt. Bei diesem komplexen Vorgang sind noch weitere Proteinkinasen und ihre Substrate daran beteiligt, Apoptose auszulösen.

Apoptose oder programmierter Zelltod ist ein natür-

licher, genetisch programmierter Prozess. Er spielt nicht nur in der normalen Entwicklung vielzelliger Organismen eine fundamentale Rolle, sondern ist auch für Kontrollprozesse, wie sie in jeder Zelle regelmäßig ablaufen, ein wichtiges Element zur Verhinderung der unkontrollierten Proliferation von Zellen.

Ein wichtiger Aspekt im apoptotischen Prozess ist die Kondensation des Chromatins. Dieser Vorgang ist streng gekoppelt mit der Phosphorylierung des Histons H2B, und zwar genauer an den Serin-Resten 14 (in menschlichen Zellen) bzw. Serin-10 (in Hefezellen). Neuere Arbeiten konnten nun zeigen, dass der Phosphorylierung eine Deacetylierung am Lysin-Rest 11 vorangeht, wenn wachsende Zellen milde mit dem Stressor und Apoptose-Auslöser H2O2 behandelt werden. Wenn die Zellen eine H2B-Mutante tragen, in der der Lysin-Rest 9 gegen einen GlutaminRest ausgetauscht ist (der die acetylierte Form vorspiegelt), kann H2O2 keine Apoptose auslösen. Diese Arbeit von Ahn et al. (2006) deutet darauf hin, dass an der Auslösung von Apoptose auch epigenetische Vorgänge beteiligt sein können (vgl. auch Kapitel 11.8).

5.3.7 Genetik des Alterns 1988 berichteten David Friedman und Thomas Johnson von einer Mutante in C. elegans, die eine deutliche Verlängerung der Lebenserwartung zeigte: In Abhängigkeit von der gewählten Umgebungstemperatur waren es zwischen 40 und 60 % Zunahme im Durchschnitt und zwischen 60 und 110 % im Maximum: lebt ein „normaler“ Wurm höchstens 22 Tage, so bringt es „age-1“ auf Spitzenwerte um 46 Tage. Die Autoren haben durch detaillierte genetische Analysen nachgewiesen, dass die Ursache für die Langle-

bigkeit eine einzige rezessive Mutation ist; 1996 wurde die kausale Mutation in dem Gen entdeckt, das für die katalytische Untereinheit der Phosphatidylinositol-3Kinase (PI3K) codiert (Morris et al. 1996). Weitere Untersuchungen machten deutlich, dass PI3K Teil eines Signalweges ist, der auch bei Säugern bekannt ist und von dem Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 (engl. insulin-like growth factor 1, IGF1) ausgeht. Diese Signalwege beeinflussen schließlich den Transkriptionsfaktor DAF-16, der die Expression von vielen Genen beeinflusst, die Stressresistenz, angeborene Immunität und den Fremdstoffmetabolismus betreffen. Eine Zusammenfassung dieser Signalkette zeigt Abb. 5.31. Die homologen Gene des Menschen sind FOXO1, FOXO3A, FOXO4 und FOXO6. Bei C. elegans wurden etwa 100 Gene identifiziert, bei denen Mutationen zur Verlängerung der Lebenszeit führen. Es gibt also offensichtlich viele „Altersgene“ ‒ und die Genetik des Alterns steht erst am Anfang einer interessanten Entwicklung. Langlebigkeits-Gene wurden aber auch in anderen Organismen gefunden. Zwei wichtige Beispiele sind sir-2 und Tor, die ursprünglich in Hefe identifiziert wurden. sir-2 codiert für eine NAD-abhängige Proteindeacetylase, die möglicherweise für die Lebenszeit-verlängernde Wirkung der Nahrungseinschränkung verantwortlich ist; Tor (engl. Target of rapamycin) codiert für eine Kinase, die an der Erkennung von zugänglichen Aminosäuren beteiligt ist. Identifiziert wurde Tor in der Hefe durch die Wachstum-hemmende Wirkung von Rapamycin, das in der Medizin zur Immunsuppression eingesetzt wird. In Säugern kooperiert Tor mit PI3K-abhängigen Effektoren, um die Größe proliferierender Zellen zu regulieren. Die Tor-Kinase moduliert Signale für Zellwachstum, indem sie auf den Status von Nährstoffen, Energie, Wachstumsfaktoren und zellulären Stress antwortet. Wenn Tor durch die Zugänglichkeit von Nährstoffen (insbesondere durch Aminosäuren) aktiviert wird, koordiniert es die Synthese und den Abbau von Proteinen und fördert das Wachstum, wenn Nährstoffe reichhaltig vorhanden sind. Tor-Gene sind stark konserviert und wurden außer in Hefen auch in C. elegans, Drosophila, der Maus und dem Menschen nachgewiesen. In einer interessanten Übersicht diskutieren Monique Stanfel und ihre Koautoren (2009) verschiedene Studien an Mausmodellen, die darauf hinweisen, dass die Hemmung des Tor-Signalweges zu einem Schutz vor einigen Alters-abhängigen Erkrankungen führt (z. B. Krebs, die Huntington’sche Erkrankung und Herz-KreislaufErkrankungen). Ob dies zu einer „Anti-Aging-Pille“ führen wird, bleibt abzuwarten.

5.3 Der Zellzyklus

C. elegans

Menschen

Insulin-ähnliche Liganden INS-N?

IGF1

DAF-2

IGF1R

Cytoplasma AGE1 Pl3K PTEN PTEN IP3

PDK1

PDK1

AKT-1, AKT-2, SGK-1 AKT TOR-Signalweg

TOR-Signalweg

JNK- und RASSignalweg

JNK- und RASSignalweg DAF-16

Zellkern

FOXO?

DAF-16 FOXO?

Transkriptionskontrolle

viele Zielgene

Abb. 5.31 Einige molekulare Signalwege, die an der Verlängerung der Lebensspanne beteiligt sind. Der IGF1-Signalweg beinhaltet eine Kaskade von Phosphorylierungsschritten, die schließlich den Transkriptionsfaktor DAF-16 regulieren. INS-N ist ein Insulin-ähnliches Peptid, und DAF-2 sein Zelloberflächenrezeptor mit einer Tyrosinkinase-Aktivität; beim Menschen hat der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor (IGF1) mit seinem Rezeptor (IGF1R) eine ähnliche Funktion beim Start der Signalkaskade. AGE-1 entspricht der humanen Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K). IP3 ist Phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat, das durch AGE-1 produziert wird und seinerseits PDK-1 aktiviert. PTEN ist eine Phosphatase mit IP3 als Substrat; es unterdrückt AGE-1. PDK-1 ist eine IP3-abhängige Kinase, die die Serin/Threonin-Kinasen AKT1, AKT-2 und SGK-1 aktiviert. DAF-16 ist ein Transkriptionsfaktor mit einer Forkhead-Domäne (ein humanes Homolog ist FOXO3A.) Die TOR-, JNK- und RAS-Signalwege münden ebenfalls auf dem Niveau der DAF-16-Regulation in diese Signalkette ein. TOR ist eine Kinase, die auf die intrazellulären Spiegel von Aminosäuren antwortet (besonders Leucin). (Nach Christensen et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Andere Gene, wie z. B. methuselah (mth) oder I‘m not dead yet (Indy) (ursprünglich in Fliegen identifiziert) oder klotho (Kl; das erste Langlebigkeitsgen, das in der Maus identifiziert wurde), sind Gegenstand intensiver Untersuchungen (2009). Dabei haben Mutationen in den entsprechenden Genen unterschiedliche Wirkungen auf die Lebensdauer. Homozygote methuselah (mth)-Mutanten in Drosophila überleben – wie der Name nahelegt – ihre Wildtyp-Artgenossen um durchschnittlich 35 % und zeigen eine signifikante Widerstandsfähigkeit gegen oxidativen und HitzeStress sowie gegen Hunger; umgekehrt zeigen die Mutanten eine Verminderung ihrer Reproduktionsfähigkeit. Das Gen codiert für einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor mit 7 hydrophoben (Transmembran-)Domänen; eine Domäne auf der Außenseite wirkt als Ligandenbindungsstelle. Auch Mutationen im Gen, das für den Liganden des Mth-Proteins codiert (stunted; Gensymbol: sun), bewirken ebenso eine Lebensverlängerung wie die konstitutive Expression Mth-antagonistischer Peptide. Es gibt eine Reihe von mth-Allelen, die sich in ihrer Lebensdauer unterscheiden; populationsgenerische Untersuchungen machen deutlich, dass damit eine Evolution der Lebensdauer möglich ist (Paaby u. Schmidt 2008). Überraschenderweise gibt es in der menschlichen Genom-Datenbank keine Sequenz, die der mthSequenz von Drosophila entspricht. Eine interessante Kontroverse über die Funktion einer anderen Langlebigkeitsmutante (Indy) wurde zu der Zeit ausgetragen, als das Manuskript dieser Auflage entstand. Ursprüngliche Arbeiten zeigten, dass eine Verminderung der Aktivität des INDY-Proteins mit einer Verlängerung der Lebensdauer verbunden ist, ohne dass dadurch andere wichtige physiologische Systeme beeinträchtigt werden (so sind weder die Fruchtbarkeit, noch die metabolische Rate oder die Beweglichkeit der Mutanten beeinträchtigt). INDY ist ein Transmembran-Transporter von Zwischenprodukten des Krebs-Zyklus (Citrat, Succinat, Fumarat, α-Ketoglutarat). Eine Analyse der IndyMutanten zeigt, dass durch die verminderte Transporteraktivität offensichtlich die Enzymaktivität der Komplexe I und III der Elektronen-Transportkette der Mitochondrien vermindert wird; man kann daraus auf eine verminderte Produktion reaktiver Sauerstoffspezies schließen. Allerdings ist die Gesamtmenge an ATP in der Zelle nicht signifikant verändert, was durch eine entsprechend höhere Zahl an Mitochondrien in der Zelle der Mutanten hervorgerufen sein könnte (Neretti et al. 2009). Allerdings behauptet eine andere Arbeitsgruppe (Toivonen et al. 2009), dass die beobachtete Verlängerung der Lebensdauer der Drosophila-Mutanten nicht mit der Mutation im Indy-Gen co-segregiert.

195

196 196

Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Vielmehr hängt die Verlängerung der Lebensdauer weitgehend von der Anwesenheit eines Tetracyclinabhängigen Agens ab und wird weiter modifiziert durch ein (oder mehrere) X-chromosomale Gene. Die Autoren schließen ihren Kommentar mit den Worten: „It seems that Neretti et al. have attempted to brush these inconvenient facts under the rug, and we feel that we should draw attention to this.“ Doch das war nicht das Ende der Kontroverse. In einer weiteren Veröffentlichung zeigten Wang und Mitarbeiter (2009), dass die beobachtete Unabhängigkeit der Verlängerung der Lebensdauer und der Indy-Mutation möglicherweise ein Fütterungseffekt ist. So kann die Verlängerung der Lebensdauer offensichtlich nur beobachtet werden, wenn die INDY-Aktivität um 25‒75 % vermindert ist und wenn das Futter kalorienreich ist – unter Bedingungen eines kalorienreduzierten Futters wirkt sich die Mutation nicht mehr lebensverlängernd aus.

a

Im Gegensatz zu den lebensverlängernden Mutationen bei Drosophila führt die klotho-Mutation der Maus zu einem deutlich beschleunigten Alterungsprozess (Abb. 5.32). Dieser beschleunigte Alterungsprozess beinhaltet neben einer signifikanten Verkürzung der Lebensdauer (die Tiere sterben durchschnittlich im Alter von ungefähr 60 Tagen) vor allem Unfruchtbarkeit, Arteriosklerose, Atrophie der Haut, Osteoporose und Emphyseme. Das klotho-Gen codiert für ein Membranprotein, das Sequenzhomologien zur β-Glucosidase aufweist. Denselben Phänotyp wie die klotho-Mutanten weisen auch Fgf23-Mutanten der Maus auf (engl. fibroblast growth factor); diese neueren Arbeiten deuten darauf hin, dass das Klotho-Protein als ein Cofaktor von Fgf23 für dessen Bindung an den Fgf-Rezeptor verantwortlich ist (Kurosu u. Kuro-o 2009). Unabhängig von einzelnen Genen spielt offensichtlich aber auch die Integrität der Chromosomen eine wichtige Rolle, insbesondere der Schutz vor einem Abbau an den Enden der Chromosomen (Telomere). Ein wichtiges Enzym in diesem Zusammenhang ist die Telomerase, die für eine Verlängerung der Enden verantwortlich ist. Während die Telomerase-Aktivität in Keimzellen üblicherweise relativ hoch ist, ist sie in somatischen Zellen üblicherweise deutlich geringer – mit dem Ergebnis, dass in Körperzellen die Telomerlänge mit zunehmendem Alter abnimmt, was zu einem entsprechenden Zellverlust führt (zur Übersicht siehe Aubert u. Lansdorp 2008). Wir werden diesen Aspekt ausführlicher im Kapitel 6.1.4 diskutieren.

b

Langlebigkeit ist offensichtlich auch – zumindest teilweise – genetisch programmiert. Bei verschiedenen Modellorganismen wurden Mutanten identifiziert, die zur Lebensverlängerung beitragen. Die detaillierten Untersuchungen stehen erst am Anfang.

5.4 Wichtige eukaryotische Modellorganismen in der Genetik

Abb. 5.32 a, b Mutation im klotho-Gen der Maus führt zu vorzeitigem Alter. a Es sind Wildtyp-Mäuse (+/+) und ihre homozygoten klotho-Wurfgeschwister (kl/kl) im Alter von 8 Wochen gezeigt; links auf dem ursprünglichen agouti-Hintergrund und rechts auf einem albino-Hintergrund. b Die Vergrößerung der homozygoten klotho-Mäuse zeigt deutlich die Verkrümmung der Wirbelsäule (Kyphose). Keine klotho-Mutante wird älter als 100 Tage (die durchschnittliche Lebensdauer der Mutanten beträgt ca. 60 Tage; eine Wildtyp-Maus wird etwa 2 Jahre alt. (Nach Kuro-o et al. 1997, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Wesentliche genetische Erkenntnisse wurden an verschiedenen Modellorganismen gewonnen. Diese sind dadurch gekennzeichnet, dass sie für die standardisierte Laborarbeit angepasst wurden und viele Mutanten der jeweiligen Organismen bekannt sind. Diese dienen als genetische Marker und können heute zusammen mit Daten der Genomsequenzierung zur Beantwortung vieler Fragen genutzt werden. Je nach Fragestellung und möglichen Ressourcen, die zur Verfügung stehen, werden verschiedene eukaryotische Modellsysteme verwendet: Hefen, Pflanzen, Würmer, Fliegen, Fische, Nager und auch höhere Tiere. Im Rahmen dieser kurzen einführenden Darstellungen sollen exemplarische Vertreter dieser

5.4 Wichtige eukaryotische Modellorganismen in der Genetik

Modellsysteme vorgestellt werden, ohne dass diese Zusammenstellung den Anspruch der Vollständigkeit hat.

son yeast). Verteilt auf die 16 Chromosomen findet man auch ca. 750 DNA-Sequenzen, die als Replikationsursprung der DNA-Verdoppelung dienen (engl. autonomously replicating sequence, ARS).

5.4.1 Hefen Der Begriff „Hefe“ wird umgangssprachlich meistens für die Bäcker- oder Brauhefe Saccharomyces cerevisiae genutzt (Abb. 5.33); als Modellsystem in der Genetik wird aber darüber hinaus häufig auch die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe verwendet. Die Bäckerhefe ist ein einzelliger Pilz und einer der ältesten domestizierten Mikroorganismen; schon die Sumerer und Babylonier verwendeten die Hefe zum Bierbrauen und die Ägypter zur Herstellung von Wein und Sauerteig. In die Genetik wurde die Hefe 1949 durch Carl und Gertrude Lindgren eingeführt, als sie das Kreuzungssystem von Hefen beschrieben und die erste genetische Karte für die Bäckerhefe erstellten. Danach wurde die Hefe immer stärker als Modellsystem genutzt; die erste Transformation (Einbringen von Fremd-DNA) gelang 1978 Hinnen und Mitarbeitern. Als 1985 die Chromosomen der Hefe mithilfe der Pulsfeldelektrophorese aufgetrennt wurden (Carle u. Olson 1985), schuf das die Möglichkeit, die einzelnen Chromosomen zu isolieren und zu klonieren; 1996 wurde die Hefe als erstes eukaryotisches Gesamtgenom publiziert (Goffeau et al. 1996). Die 16 Chromosomen enthalten eine Gesamtsequenz von 13,5 Mb (Mb: Megabasenpaare = 1 Million Basenpaare), die für ca. 5700 Gene codieren. Nur etwa 5 % der Gene enthalten Introns; die Gendichte ist mit ca. 70 % insgesamt relativ hoch und damit sind repetitive, intergenische Sequenzen selten. Dazu gehören auch einige Transposons, (Kap. 8.1), die in 5 Klassen unterteilt werden (Ty-Elemente 1‒5; engl. transpo-

Abb. 5.33 Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wird in der Genetik häufig als Modellorganismus eingesetzt. (Elektronenmikroskopische Aufnahme: Dr. Friederike Eckardt-Schupp, Helmholtz Zentrum München)

Neben der chromosomalen DNA findet man im Zellkern der meisten Laborstämme von S. cerevisiae etwa 50 bis 190 Kopien eines zirkulären Plasmids, das wegen seiner Größe als „2-μm-Plasmid“ bezeichnet wird. Dabei handelt es sich um ein 6318 bp langes, doppelsträngiges DNA-Molekül, das autonom repliziert wird und vier Gene enthält, die im Wesentlichen an der Aufteilung des replizierten Plasmids und an der Regulation der Kopienzahl beteiligt sind. Von besonderem Interesse ist das FLP-Gen, das für eine sequenzspezifische Rekombinase codiert. Sie induziert eine Rekombination an den FRT-Sequenzen (engl. FLP-recognition target sites), die in invers-repetitiven Sequenzen liegen. Heute wird dieses System in der Molekulargenetik zum Austausch von Genkassetten bei der Herstellung transgener Tiere verwendet (Technik-Box 28). S. cerevisiae wird wegen ihrer leichten Handhabung in vielen Fällen ähnlich dem Bakterium E. coli als Modellorganismus verwendet. So werden künstliche Hefechromosomen (engl. yeast artificial chromosomes, YACs) als Klonierungsvektoren für große Genomfragmente eingesetzt. Die Hybrid-Systeme von S. cerevisiae bieten darüber hinaus die Möglichkeit, Protein-Protein-, DNA-Protein- und RNA-Protein-Wechselwirkungen zu analysieren (Technik-Box 9). Aufgrund vieler in der Evolution konservierter Grundmechanismen können diese bei der Hefe modellhaft für viele Eukaryoten relativ einfach untersucht werden; dazu gehören die Regulation der Genexpression, des Zellzyklus, der Zellteilung, des Paarungstyps, der Aminosäurebiosynthese sowie allgemeine Mechanismen der Signaltransduktion. S. cerevisiae kommt in der freien Natur überwiegend in der diploiden Wachstumsphase vor. Industriell genutzte Stämme sind dagegen häufig polyploid; im Labor werden sowohl diploide als auch haploide Zellen verwendet. Hefestämme werden in der Regel bei 30 °C auf festen Nährböden oder in Flüssigkultur angezogen, die entweder ein Vollmedium oder ein Minimalmedium enthalten können. In Abb. 5.34 ist der Lebenszyklus der Bäckerhefe dargestellt. Wir sehen, dass die Hefezellen sowohl in haploidem als auch in diploidem Zustand über längere Perioden existenzfähig sind und sich durch Knospung (engl. budding) vermehren können. Diploide Zellen, die sich unter guten Nährstoffbedingungen durch Teilung vermehren, beginnen bei Nährstoffmangel die Meiose und formen 4 haploide Ascosporen, die zunächst in der Mutterzelle verbleiben und dadurch einen Ascus formen. Die Ascosporen

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Abb. 5.34 Lebenszyklus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Die Haplophase ist rot, die Diplophase blau dargestellt. Nach der Meiose, die in einem Ascus vier haploide Ascosporen hervorbringt, vermehren sich diese vegetativ durch Teilung, oder zwei Zellen entgegengesetzten Paarungstyps (a oder α) verschmelzen zu einer Zygote. Auch diese diploide Zelle kann

sich vegetativ vermehren. Unter bestimmten Umweltbedingungen kann aber auch eine meiotische Teilung eingeleitet werden. Es erfolgt somit ein regelmäßiger Wechsel zwischen Haploidie und Diploidie. Die Ascosporen unterschiedlicher Paarungstypen (a und α) können sich spontan auseinander bilden

bilden nach ihrer Freisetzung durch Zellteilungen Kolonien von Einzelzellen, die im Prinzip unbegrenzt im haploiden Zustand verbleiben können. Sie gehören jeweils einem von zwei gegensätzlichen Geschlechtstypen oder Paarungstypen (engl. mating types), a und α, an. Zellen solcher gegensätzlicher Paarungstypen können miteinander fusionieren und ihre Kerne verschmelzen lassen, sodass wieder ein diploider Zustand erreicht ist (vgl. dazu im Detail Kapitel 8.3.4). Die Bäckerhefe stellt auch ein bevorzugtes Objekt der Formalgenetik dar (Kapitel 10), da sie sowohl in der haploiden als auch in der diploiden Phase im Labor kultiviert werden kann. Außerdem werden die vier Produkte

der Meiose (Tetrade) im Ascus zusammengehalten und können leicht analysiert werden („Tetradenanalyse“, Kapitel 10.4.4). Der Ascus von S. cerevisiae ist eine ungeordnete Tetrade; die Produkte der Meiose bleiben zwar zusammen, die Reihenfolge ihrer Entstehung kann aber nicht nachvollzogen werden (vgl. dagegen die geordnete Tetrade bei Neurospora crassa). Wie bei vielen anderen Mikroorganismen ist eine kostengünstige Anzucht in der Lage, eine große Zahl von Zellen für die Untersuchungen bereitzustellen, wodurch die statistische Aussagekraft erhöht und auch seltene Ereignisse festgestellt werden können. Die Tetradenanalyse wurde traditionell zur Genkartierung genutzt. Obwohl solche Analysen nach Auf-

5.4 Wichtige eukaryotische Modellorganismen in der Genetik

klärung der Genomsequenz nicht mehr benötigt werden, wird die Tetradenanalyse z. B. für den Nachweis eingesetzt, ob eine Mutation einen oder mehrere Genorte betrifft oder aber zu einem letalen Phänotyp führt. S. cerevisiae wird häufig dazu genutzt, Gene mithilfe von Mutagenese zu identifizieren und zu charakterisieren (Kapitel 9). Ein Vorteil der Bäckerhefe gegenüber anderen Eukaroyten besteht darin, dass heterothallische Stämme im Labor sowohl in der haploiden als auch in der diploiden Phase stabil kultiviert werden können. Um eine Mutation mit erkennbarem Phänotyp zu entdecken, wird eine haploide Kultur physikalisch (z. B. durch UVStrahlung) oder chemisch (z. B. durch Ethylmethansulfonat, EMS) mutagenisiert. Durch geeignete ScreeningVerfahren bzw. Untersuchungen in definierten Mangelmedien können entsprechende Mutanten zunächst isoliert und dann funktionell charakterisiert werden. Abschließend soll noch ein Hinweis zur genetischen Nomenklatur bei der Hefe gegeben werden. Jedes Gen wird bei der Hefe nach Möglichkeit durch drei Buchstaben und eine Zahl symbolisiert, wobei dominante Allele in Großbuchstaben (z. B. HIS3) und rezessive Allele dieses Gens in Kleinbuchstaben geschrieben werden (z. B. his3).

Die Bäckerhefe ist ein einzelliger Mikroorganismus,

der aufgrund seiner leichten Handhabbarkeit und seiner kurzen Generationszeit eine gewisse „Vorreiterrolle“ bei der Analyse eukaryotischer Genomstrukturen und -funktionen hatte.

5.4.2 Pflanzen Wichtige pflanzengenetische Untersuchungsobjekte sind die Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana (Brassicaceae; Abb. 5.35), das Löwenmäulchen Antirrhinum majus (Scrophulariaceae; Abb. 5.36) und der Mais (Zea mays; Abb. 5.37). War früher eher Antirrhinum das klassische Modellsystem der Pflanzengenetiker (für eine Übersicht siehe Schwarz-Sommer et al. 2003), so hat sich in neuerer Zeit Arabidopsis etabliert (Sommerville u. Koornneef 2002). Zu den vorteilhaften Eigenschaften von Arabidopsis zählen eine kurze Generationszeit (Blüte 8‒12 Wochen nach der Aussaat), geringe Größe (15‒20 cm) und viele Nachkommen (1000 Samen pro Individuum). Arabidopsis hat das kleinste bekannte Pflanzengenom (ca. 125 Mb; The Arabidopsis Genome Initiative 2000); es enthält ca. 26.000 Gene, die auf 5 Chromosomenpaaren liegen. Das mitochondriale Genom umfasst knapp 155 kb und codiert für 58 Gene; das Chloroplastengenom umfasst knapp 367 kb und enthält die genetische Information für 158 Gene (die aktuellen Informationen können im Internet unter den Adressen

Abb. 5.35 a–c Arabidopsis thaliana, ein Modell für molekulargenetische Studien in höheren Pflanzen. a Eine reife Arabidopsis thaliana-Pflanze. b Reife Blüte des Arabidopsis-Wildtyps. c Die homöotische Blütenmutante agamous-1 wurde in einem der ersten genetischen Screens auf Entwicklungsmutanten gefunden. (Nach Page u. Grossniklaus 2002, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

http://www.arabidopsis.org bzw. http://mips.helmholtzmuenchen.de/plant/genomes.jsp abgerufen werden). Überraschend war das Vorkommen von etwa 60 % duplizierten Genomabschnitten; man vermutet heute, dass das Arabidopsis-Genom aus einem Vorläufer durch Duplikation und anschließender Eliminierung eines Teils dieser Sequenzen hervorgegangen ist. Die erste Beschreibung der Art erfolgte 1588 durch den sächsischen Arzt Johannes Thal; 1842 wurde diese Pflanze von Gustav Heynold endgültig der Gattung Arabidopsis zugeordnet und trägt seither die Bezeichnung Arabidopsis thaliana. Ein früher „Meilenstein“ in der Anwendung von A. thaliana in der Genetik war der Nachweis der Kontinuität der Chromosomen während der Interphase durch Laibach (1907). Danach dauerte es bis in die 1980er-Jahre, bis A. thaliana wieder in großem Stil in die genetischen Labors zurückkehrte: einmal bei der Transformation von A. thaliana mittels A. tumefaciens unter Verwendung gentechnisch hergestellter Ti-Plasmide, und dann später mit der relativ leichten Herstellung einer großen Zahl von Mutanten, die vor allem in der Entwicklungsgenetik der Pflanzen herausragende Fortschritte brachte (Kapitel 11.2).

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Abb. 5.36 a–c Natürliche Variation bei Antirrhinum. a Antirrhinum majus ist an den Küsten des Mittelmeeres (bes. Spanien und Frankreich) weit verbreitet. Es wächst aufrecht, hat nur geringe seitliche Verzweigungen, große Blätter und rote Blüten. b Antirrhinum charidemi kommt nur in Südost-Spanien vor, einer der trockensten Gegenden auf dem europäischen Festland. Es hat viele seitliche Verzweigungen, kleine Blätter und

rosa Blüten. c Antirrhinum molle wird an Klippen und Geröllhalden in den Pyrenäen gefunden. Es ist stark verzweigt, hat wuchernde Halme und Organe mittlerer Größe, die mit vielen Haaren bedeckt sind, elfenbeinfarbene Blüten und ein rotes Muster der Blattadern. (Nach Schwarz-Sommer et al. 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

kursiv geschrieben (z. B. KNOX), ihre mutierten Allele dagegen klein und kursiv (kn1). Dominante Mutationen werden mit dem Zusatz „d“ versehen. Gensymbole umfassen in der Regel 3 Buchstaben (manche ältere nur 2); bei Transgenen werden Promotor und cDNAKonstrukte durch zwei Doppelpunkte getrennt (z. B. 35S::KNAT1).

Abb. 5.37 Die Kultivierung des Mais. Es wird allgemein angenommen, dass der Vorfahr des modernen Mais (Zea mays mays) ein mexikanisches Gras ist: Teosinte (Z. mays parviglumis). Die zwei Unterarten sind untereinander fruchtbar, zeigen aber viele morphologische Unterschiede: Teosinte (links) hat viele lange, seitliche Verästelungen. Die Verästelungen des Mais (rechts) sind dagegen eher kurz. Der Maiskolben hat seine Körner auf der Oberfläche, wohingegen sie bei Teosinte in den dreieckigen Hülsen eingeschlossen sind. (Nach Doebley et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Bei Arabidopsis hat sich eine von der üblichen genetischen Nomenklatur teilweise abweichende Schreibweise entwickelt: So werden Wildtyp-Allele durchgehend mit Großbuchstaben und

Morphologisch lassen sich bei einer Pflanze drei Grundorgane unterscheiden: die Sprossachse, die Wurzel und die Blätter. Den aus Sprossachse, Vegetationskegel (Meristem) und Blättern gebildeten Bereich, in dem das Wachstum der Pflanze durch Zellteilungen im Meristem erfolgt, bezeichnet man als Spross. Die Entwicklung der Organe erfolgt durch die Proliferation von Meristemen (Bildungsgewebe). Einen wichtigen Einfluss auf die Entwicklung hat die Organisation der Pflanzenzelle. Die Zellwand sorgt dafür, dass die Zellen ihre Nachbarschaft nicht verlassen können. Gestaltveränderungen (Morphogenesen) in der Entwicklung einer Pflanze werden daher durch lokale Aktivitäten von Zellen ausgeführt. Zur Koordination von Entwicklungsvorgängen sind andererseits langreichende Signale (z. B. Phytohormone) notwendig. Für die Kommunikation zwischen den Zellen einer Pflanze können die Plasmodesmen eine zusätzliche Rolle spielen, da sie Zellen miteinander verbinden.

5.4 Wichtige eukaryotische Modellorganismen in der Genetik

Abb. 5.38 Lebenszyklus von Zea mays. Die Haplophase ist rot, die Diplophase blau dargestellt

Der Lebenszyklus einer Blütenpflanze (in Abb. 5.38 am Beispiel des Mais dargestellt) lässt sich grob in drei große Abschnitte gliedern: Embryogenese, postembryonale (vegetative) Entwicklung und generative Entwicklung. Die Gameten werden in den Blüten gebildet: zunächst bilden sich männliche haploide Mikrosporen als Pollen in den Antheren und weibliche haploide Makrosporen in den Fruchtkno-

ten. Jeder haploide Pollenkern teilt sich noch einmal mitotisch, sodass jedes Pollenkorn zwei haploide Kerne besitzt. Beim Auswachsen des Pollens zum Pollenschlauch erfolgt eine weitere Teilung eines der beiden Kerne. Hierdurch werden zwei Gametenkerne geformt, von denen einer mit dem Eizellkern verschmilzt. Bei der Bildung der Eizelle hat die weibliche Megaspore zunächst in drei Mitosen den Embry-

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

osack gebildet, der acht Kerne enthält. Einer der Kerne ist der Eizellkern, der mit dem einen der beiden Gametenkerne des Pollenschlauchs verschmilzt und den Zygotenkern (2n) formt. Der zweite Gametenkern des Pollenschlauchs verschmilzt mit zwei Kernen des Embryosacks und bildet dadurch einen triploiden Kern (3n) mit zwei Sätzen mütterlicher und einem Satz väterlicher Chromosomen. Dieser triploide Kern teilt sich und bildet in der Folge das triploide Endosperm, ein Nährgewebe für den Embryo. Diese beiden Komponenten, das Teilungsprodukt des Zygotenkerns, der Embryo, und das Endosperm, formen die Maiskörner. Die Zygote wächst zur diploiden Maispflanze heran, während das Endosperm degeneriert, wenn es seine Aufgabe als Nährstoffreservoir für den keimenden Samen erfüllt hat. Wichtig für das Verständnis der Ergebnisse der Maisgenetik ist es zu realisieren, dass das Endosperm in seiner genetischen Konstitution der Konstitution der Zygote, also der F1-Generation, entspricht, jedoch aufgrund seines triploiden Charakters eine doppelte Gendosis mütterlichen Ursprungs besitzt. Für die experimentelle Maisgenetik ist es außerdem entscheidend, dass durch geeignete Maßnahmen unkontaminierte Pollen einer Pflanze erhalten und eine unkontrollierte Befruchtung verhindert werden kann. Darüber hinaus hat der Mais natürlich als landwirtschaftliche Nutzpflanze eine enorme ökonomische Bedeutung, die dazu führt, dass (molekular-) genetische Untersuchungen und gentechnologische Verfahren am Mais in großem Umfang durchgeführt werden.

Pflanzen spielen in der Genetik eine herausragende

Rolle als Modellorganismen; in den letzten Jahren hat sich Arabidopsis thaliana besonders unter entwicklungsgenetischen Gesichtspunkten breit etabliert. Hier können viele Prozesse untersucht werden, die für die spätere Anwendung in Nutzpflanzen von großer Bedeutung sind.

5.4.3 Der Fadenwurm Bereits im vorletzten Jahrhundert studierten Biologen, unter ihnen Theodor Boveri, die Frühentwicklung der Nematoden. Damals waren parasitische Vertreter wie die Spulwürmer bevorzugte Untersuchungsobjekte. Mitte der 1960er-Jahre führte Sidney Brenner, ursprünglich ein Phagengenetiker, den Fadenwurm Caenorhabditis elegans als Modellsystem in die Genetik ein. Eine erste wichtige Zusammenfassung wurde von ihm 1974 publiziert. Sidney Brenner bekam für seine Arbeiten 2002 den Nobelpreis für Medizin.

Die ersten Untersuchungen in Sidney Brenners Labor wurden an Kulturen von C. elegans durchgeführt, die mit Ethylmethansulfonat (EMS; Kapitel 9.4.3) als mutagenem Agens behandelt wurden. So wurden in den Jahren ab 1967 bis in die Mitte der 1970er-Jahre über 300 EMS-induzierte Mutationen identifiziert, die meisten davon mit einem rezessiven Erbgang. Die Hauptklasse der Mutanten betraf die Fortbewegung der Würmer – ihre unkoordinierten Bewegungen führten zu dem entsprechenden Gensymbol „unc“ (engl. uncoordinated); andere Mutationen betrafen die Größe und Form des Wurms (z. B. dumpy; Gensymbol dpy-1). C. elegans wurde seither zu einem System entwickelt, das sich in vielerlei Hinsicht für genetische Studien eignet (für Details siehe Übersichten bei Ankeny 2001 und Jorgensen u. Mango 2002). C. elegans kommt in zwei Geschlechtsformen vor, als Männchen oder als Zwitter (Hermaphrodit; Abb. 5.39). Die Entscheidung, ob ein Wurm zum Männchen oder zum Zwitter wird, hängt von der Anzahl der X-Chromosomen ab: Neben den fünf autosomalen Chromosomenpaaren besitzen Männchen ein, Zwitter zwei X-Chromosomen. Die Zwitter produzieren zu Beginn ihres Lebens Samen, später nur noch Eier. Mit dem gespeicherten Samen können sie die Eier selbst befruchten. Selbstbefruchtung vereinfacht die Untersuchung homozygoter Nachkommen, da neu induzierte Mutationen homozygotisiert werden können, ohne dass Geschwister untereinander gekreuzt werden müssen. Die Zwitter können aber auch von Männchen befruchtet werden, so dass auch Mutationen kartiert und Komplementationstests durchgeführt werden können. Die Haltung der Tiere ist einfach: C. elegans wird auf einem Bakterienrasen plattiert, der als Nahrungsquelle dient. Sowohl die Ei- als auch die Körperhülle des Wurms sind durchsichtig. Mutanten können daher mithilfe eines Mikroskops oder eines Binokulars einfach identifiziert werden. C. elegans ist als erwachsenes Tier nur ca. 1 mm groß, hat einen Durchmesser von 70 μm und besteht aus einer definierten Anzahl von Zellen: Das Männchen enthält 1031 somatische Zellen, der Zwitter dagegen nur 959 somatische Zellen; dazu kommt noch eine variable Zahl von Keimzellen. Diese Konstanz der Zahl seiner somatischen Zellen ist eine der hervorstechendsten Eigenschaften von C. elegans. C. elegans hat eine vollständig definierte und weitgehend unveränderliche Zellgenealogie; die Entwicklung der einzelnen Zellen kann in lebenden Tieren beobachtet werden. Obwohl der erwachsene Zwitter nur 959 Zellen besitzt, werden ursprünglich 1090 Zellen gebildet – 131 Zellen sterben ab. Die Untersuchung dieses Phänomens hat zum Konzept des programmierten Zelltods (Apoptose) geführt (Kapitel 5.3.6).

5.4 Wichtige eukaryotische Modellorganismen in der Genetik

Abb. 5.39 a, b Morphologie und Lebenszyklus von Caenorhabditis elegans. a Der Wurm C. elegans kommt in zwei Geschlechtern vor: als Hermaphrodit (oben) und als männliches Tier (unten). Hermaphroditen sind cytogenetisch durch zwei X-Chromosomen (X/X) charakterisiert, wohingegen die Männchen nur ein X-Chromosom besitzen (X/0). Morphologisch zeigen Hermaphrodite eine Vulva (Pfeilspitze); männliche Tiere verfügen über einen fächerartigen Schwanz (Pfeil). b Die ersten 14 Stunden des Lebenszyklus des Wurms umfassen die

Embryonalentwicklung, danach schlüpfen die Larven aus der Eihülle und durchlaufen die vier Larvenstadien L1–L4. Unter besonderen Umständen und eingeschränktem Nahrungsangebot kann die L1-Larve einen alternativen Entwicklungsweg einschlagen (Dauerzustand, engl. dauer stage), bei dem die Larve über Monate hinweg unter widrigen Umständen überleben kann. (Nach Jorgensen u. Mango 2002, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

C. elegans kann eingefroren lange Zeit aufbewahrt werden, sodass es leicht möglich ist, viele Mutantenlinien im Labor zu halten. Mehr als 1000 Gene von C. elegans wurden durch Analyse von Mutanten charakterisiert und kartiert. Das Genom von C. elegans wurde durch das C. elegans Sequencing Consortium bereits

1998 publiziert (die aktuelle Version kann im Internet unter der Adresse http://www.ensembl.org/Caenorhabditis_elegans abgerufen werden). Es ist mit etwa 100 Mb nur etwa 20-mal so groß wie das von E. coli und etwa 6-mal so groß wie das der Hefe. Es enthält ca. 19.000 Gene und damit ca. 50 % mehr als Drosophila.

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans zeichnet sich

durch eine einzigartige Eigenschaft aus: die Konstanz der Zellzahl. Dadurch konnten grundlegende biologische Prozesse wie Apoptose an diesem Modellsystem erarbeitet werden. Außerdem kann er einfach und kostengünstig kultiviert werden; er weist eine kurze Generationszeit auf. Neben seiner einfachen Anatomie erleichtert seine Transparenz die mikroskopische Beobachtung.

Die Einzigartigkeit von C. elegans hinsichtlich der konstanten Zellzahl macht diesen Wurm zu einem hervorragenden Modell, um daran systematisch funktionelle Genomforschung zu betreiben. Dies wird natürlich auch dadurch unterstützt, dass das gesamte Genom sequenziert ist und bereits eine Vielzahl genetischer Untersuchungsverfahren an C. elegans etabliert ist. Damit wird es möglich, die Zusammenhänge der verschiedenen, zunächst jeweils isoliert betrachteten Signal- und Stoffwechselwege zu beschreiben und auch deren Modulation durch variierende Umweltbedingungen. In diesem Zusammenhang ist die vergleichende Expressionsanalyse von Genen besonders wichtig (Technik-Box 27). Interessierte Leser können sich auf der „wormbase“ über aktuelle Fortschritte informieren (www.wormbase.org).

5.4.4 Die Taufliege Die Taufliege Drosophila melanogaster (Abb. 5.40a) entwickelte sich in den letzten 100 Jahren zu dem Standard-Modellorganismus der Genetiker: Waren es zunächst die klassischen Mutations- und Kartierungsexperimente (T. H. Morgan in den 1930er- und 1940erJahren; Kapitel 9 und 10), so kam es in den 1970er- und 1980er-Jahren zu einer Drosophila-Renaissance unter dem Stichwort Entwicklungsgenetik (Kapitel 11.4). Die Geschwindigkeit der Generationsfolge macht Drosophila so beliebt: Der gesamte Entwicklungszyklus von Eiablage zu Eiablage dauert bei 25 °C ca. 2 Wochen. Die Weibchen legen bis zu 100 Eier pro Tag (Durchmesser: ~ 0,2 mm, Länge: ~ 0,5 mm). Nur 1 Tag beansprucht die Embryonalentwicklung, in 4 Tagen werden die durch Häutungen getrennten Larvenstadien durchlaufen, 5 Tage dauert die Metamorphose zur Fliege in der Puppencuticula (Abb. 5.40b). In den Morgenstunden („Taufliege“) des 5. Tages nach der Verpuppung schlüpfen die Fliegen; nach etwa 4 Stunden sind die Fliegen geschlechtsreif. So ist es auch nicht verwunderlich, dass das Genom von Drosophila zu den ersten gehörte, dessen vollständige Sequenz veröffentlicht wurde (Adams et al. 2000; aktualisierte Versionen gibt es auf der ENSEMBL-

Abb. 5.40 a, b a Drosophila melanogaster. b Lebenslauf von D. melanogaster. (Nach Müller u. Hassel 1999, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Datenbank: http://www.ensembl.org/Drosophila_ melanogaster; http://www.flybase.org). Das Genom

5.4 Wichtige eukaryotische Modellorganismen in der Genetik

Wichtige Hilfsmittel der Drosophila-Genetik sind die Balancer-Chromosomen (Technik-Box 17) oder die Transposon-vermittelte Mutagenese (P-ElementMutagenese; Technik-Box 18). In Verbindung mit klassischer Mutagenese durch Röntgenstrahlen oder Chemikalien (Kapitel 9.4.2 und 9.4.3) ist es möglich, Hochdurchsatz-Verfahren anzuwenden, um alle möglichen Mutationen zu identifizieren, die einen biologischen Prozess betreffen („Saturationsmutagenese“).

Abb. 5.41 a, b Muster der Flügeladern bei Drosophila. a Der Wildtyp zeigt in seiner typischen Flügelform 5 Längsadern (L1– L5) und zwei Queradern (a-cv und p-cv). b Wenn das knot-Gen deletiert ist, sind die Längsadern 3 und 4 fusioniert, und die Querader a-cv fehlt. (Nach de Celis 2003, mit freundlicher Genehmigung von Wiley

Christiane Nüsslein-Volhard und Erich Wieschaus publizierten die ersten Ergebnisse ihres genomweiten Screens 1980. Darin beschrieben sie die Mutagenese von Drosophila mit Ethlymethansulfonat und analysierten die Musterbildung im Embryo. Damit gelang zum ersten Mal in einem vielzelligen Organismus eine Saturationsmutagenese, noch dazu in Bezug auf embryonale Stadien. Sie konnten dabei Mutationen in den meisten wichtigen musterbildenden Genen identifizieren; die Arbeiten wurden 1995 mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet. Der genetische Ansatz ist in Abb. 5.42 dargestellt; die wesentlichen Aussagen zur Entwicklungsgenetik werden im Kapitel 11.4. besprochen.

umfasst 160 Mb (davon ca. 117 Mb Euchromatin) und ist damit eine Größenordnung kleiner als ein Säugergenom. Die ca. 14.000 Gene sind in drei autosomalen Chromosomenpaaren und einem Geschlechtschromosomenpaar organisiert. Cytogenetische Untersuchungen werden durch das Auftreten von Riesenchromosomen in den Speicheldrüsen erleichtert (Abb. 6.25). Ein wesentlicher Vorteil von Drosophila ist die leichte Erkennbarkeit vieler äußerer Charakteristika. Dazu gehören z. B. die roten Augen, die klare Segmentierung des Körpers und die Musterung der Flügel (ein Beispiel einer Mutante ist in Abb. 5.41 dargestellt). Ein weiteres sicheres Merkmal ‒ bei Männchen ‒ sind die Geschlechtskämme (engl. sex combs); für die Analyse der genetischen Steuerung der Neurogenese hat sich die stereotype Anordnung ihrer Makrochaeten (große Borsten) und Mikrochaeten (kleine Borsten) als bedeutungsvoll erwiesen. Auch die Larve zeigt viele Marker, die die Charakterisierung klar unterscheidbarer Phänotypen erlaubt. Diese Vielzahl der klar und einfach definierbaren äußeren Merkmale, verbunden mit der leichten Handhabbarkeit und der kurzen Generationszeit, haben Drosophila lange Zeit zu dem Star unter den genetischen Modellorganismen gemacht ‒ und entsprechend groß ist heute die Sammlung der verschiedenen Fliegenstämme (erhältlich z. B. bei http://flystocks.bio.indiana.edu).

Die Taufliege Drosophila melanogaster ist seit den 1930er-Jahren einer der wichtigsten Modellorganismen in der Genetik. Aufgrund der einfachen Haltung, der schnellen Generationszeit und der einfachen Phänotypisierung in den Larvenstadien und im adulten Tier war Drosophila lange Zeit einzigartig. Besonders in der Entwicklungsgenetik können viele Mechanismen erfolgreich auf höhere Organismen übertragen werden.

5.4.5 Der Zebrafisch Der bei Aquarienliebhabern schon lange bekannte Zebrafisch Danio rerio (Abb. 5.43a) ist seit Beginn der 1980er-Jahre durch die Arbeiten von George Streisinger für Entwicklungsgenetiker immer interessanter geworden (z. B. Streisinger et al. 1981). Er ist ein Vertreter der Knochenfische und mit Medaka (Oryzias latipes) und Fugu (Takifugu rubripes) verwandt, zwei weiteren Fischmodellen (Abb. 5.43b). Das Genom des Zebrafisches ist in 25 Chromosomen organisiert; es gibt keine Geschlechtschromosomen. Das Genom umfasst etwa 1990 Mb und ist damit deutlich kleiner als das menschliche Genom (die aktuelle Fassung der Sequenz kann man unter http://www.ensembl.org/Danio_rerio einsehen); bisher sind ca. 16.000 Gene identifiziert. Eine weitere wichtige Datenbank der Zebrafisch-Genetiker ist http://www.zfin.org.

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Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Abb. 5.42 Kreuzungsschema für Mutanten-Screen in Drosophila. Männliche Fliegen wurden mit Ethylmethansulfonat (EMS) mutagenisiert und mit jungfräulichen Fliegenweibchen verpaart, die einen Balancer für das zu untersuchende Chromosom tragen (grau). Da die Mutation in den Spermatiden induziert wird, vererbt jedes F1-Männchen ein mutagenisiertes Chromosom (rot) mit einem Spektrum an Mutationen. Einzelne

F1-Männchen, die ein mutagenisiertes Chromosom in trans zu dem Balancer tragen, werden zu dem Balancer-Stamm zurückgekreuzt, um F2-Männchen und -Weibchen zu erzeugen, die dasselbe mutagenisierte Chromosom tragen. Etwa 25 % der F3-Fliegen zeigen einen Phänotyp. (Nach Johnston 2002, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Die Zucht des Zebrafisches in Aquarien ist problemlos; ein Weibchen kann unter optimalen Bedingungen bis zu 200 Eier pro Woche ablegen. Bei einer durchschnittlichen Lebensdauer von 2 bis 4 Jahren und dem Beginn der sexuellen Reife im Alter von 3 bis 4 Monaten bedeutet das, dass ein Weibchen im Laufe ihres Lebens etwa 15.000 bis 35.000 Eier ablegen kann. Diese konstant hohe Zahl an Nachkommen von definierten Zuchtpaaren prädestiniert den Zebrafisch natürlich für HochdurchsatzAnsätze in der modernen Genomforschung. Seine Embryonalentwicklung verläuft sehr schnell (Abb. 5.44): Nach 24 Stunden sind die meisten Organe erkennbar, nach 2 Tagen schlüpft die Larve und beginnt zu schwimmen, und nach 5 Tagen sucht sie unabhängig nach Nahrung. Ein wesentlicher Vorteil des Zebrafisches ist die Transparenz seiner Embryonen. Diese erlaubt es, nicht

nur ihre Entwicklung genau zu verfolgen, sondern ermöglicht auch eine einfache Manipulation der Embryonen. Daher ist der Zebrafisch in den letzten Jahren zu einem besonders beliebten Studienobjekt der Entwicklungsgenetiker geworden (siehe auch Kapitel 11.5). Für genetische Experimente, insbesondere auch zur Isolation und Charakterisierung von Mutanten (Abb. 5.45), bietet der Zebrafisch gegenüber anderen Wirbeltieren einen weiteren Vorteil: den der großen Zahl an Nachkommen. Das führte dazu, dass in einer Reihe von Mutagenese-Experimenten viele Mutanten identifiziert wurden. Allerdings erschwert das teilweise duplizierte Genom die Analyse. Es sind mehrere Laborstämme des Zebrafisches etabliert. Die ursprünglichen Stämme, die für die Mutagenese-Experimente verwendet wurden, sind der AB-

5.4 Wichtige eukaryotische Modellorganismen in der Genetik

Abb. 5.43 a, b Zebrafische. a Ausgewachsene Zebrafische sind etwa 2–3 cm lang. b Evolutionäre Beziehungen der Knochenfische und wahrscheinliche Konsequenzen der Genomduplikation an der Basis ihrer Auffächerung. Wie auf der linken Seite angedeutet, kann die Verdoppelung von Genen bzw. des ganzen Genoms dazu führen, dass einzelne Gene auch wieder verlorengehen oder dass die paralogen Gene Teilfunktionen übernehmen bzw. ganz neue Funktionen entwickeln.

Diese Funktionsveränderungen sind nicht nur auf die nichtcodierenden Regionen (farbige Symbole) beschränkt, sondern können sich auf die codierende Region auswirken (orange; Unterschiede rot). Die Genom-Duplikation hat auf die jeweiligen Modellsysteme unterschiedliche Auswirkungen. MJ: Millionen von Jahren. (a Foto: Dr. Laure Bally-Cuif, CNRS, Gif-sur-Yvette; b nach Furutani-Seiki u. Wittbrodt 2004, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Stamm und der Tübinger Stamm (Tü). Der AB-Stamm wurde von G. Streisinger in Eugene (USA) begründet, indem Fische aus einer Zoohandlung gekreuzt wurden. Auch der Tübinger Stamm hat seinen Ursprung in einer Zoohandlung und wurde von Christiane NüssleinVolhard für ihre großen Mutagenese-Screens verwendet. Dieser Stamm wurde auch als Referenzstamm für die Sequenzierung des Zebrafisch-Genoms ausgewählt. Dagegen stammen zwei indische Linien aus Wildfängen: Der Stamm wild-type India Calcutta (WIK) ist für Kartierungsexperimente mit dem Tübinger Stamm sehr gut geeignet; 68 % der Mikrosatelliten-Marker sind informativ. Der Stamm IN (India) wurde dagegen in

Kartierungsexperimenten mit dem AB-Stamm eingesetzt; er ist aber schwieriger zu züchten und enthält offensichtlich einige Mutationen, die die Lebensfähigkeit beeinträchtigen. Ähnliche Züchtungsprobleme zeigt der Stamm SJD (von S. L. Johnson, St. Louis, USA); die Ursache liegt hier allerdings in einem verzerrten Geschlechtsverhältnis. Aufgrund der noch relativ kurzen Geschichte des Zebrafisches als genetischem Modellorganismus ist der genetische Werkzeugkasten noch nicht ganz so ausgereift wie bei Drosophila oder der Maus. Von besonderer Bedeutung sind Mutagenese-Screens (Abb. 5.45), bei denen Elterntiere mit einem mutagenen Agens behan-

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208 208

Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

Abb. 5.44 Lebenslauf des Zebrafisches. Die Zygote sitzt auf dem großen Dotter; eine Stunde nach der Befruchtung (1 hpf; engl. hours post fertilization) ist das 4-Zell-Stadium erreicht. Nach 4 Stunden haben sich die Zellen bereits mehrfach geteilt (Hohlkugelstadium). Die Gastrulation beginnt etwa 6 Stunden nach der Befruchtung (Keimscheibenstadium), und etwa 8 Stunden nach der Befruchtung verdickt sich die spätere Kopfregion; der Embryo bedeckt zu etwa 80 % die Dotterkugel (80 % Epibolie). 10 Stunden nach der Befruchtung bilden sich die ersten Somiten, und die Augen entstehen aus dem Diencephalon. Nach 18 Stunden (19 Somiten) wird der Körperplan erkennbar sowie erste Muskelbewegungen des Schwanzes. Nach etwas mehr als 1 Tag (29 hpf) sind die wesentlichen Charakteristika

der Wirbeltiere sichtbar: Gehirn, Augen, Ohren und innere Organe. Das Herz beginnt bereits vor dem Ende des ersten Tages zu schlagen. Innerhalb der nächsten Stunden differenzieren viele Zelltypen, und weitere Organe können nach und nach ihre Funktionen aufnehmen. Nach 2 Tagen schlüpft die ZebrafischLarve und beginnt zu schwimmen. Nach 5 Tagen (engl. days post fertilization, dpf) schwimmen die Larven bereits größere Distanzen und können selbstständig Futter suchen. Die Entwicklung des Zebrafisches hängt stark von der Temperatur ab; das hier dargestellte Schema bezieht sich auf eine Umgebungstemperatur von 28,5 °C. (Nach Haffter et al. 1996, mit freundlicher Genehmigung der Company of Biologists)

5.4 Wichtige eukaryotische Modellorganismen in der Genetik

Abb. 5.45 Mutantenscreen beim Zebrafisch. Mutationen werden durch chemische Mutagenese (Ethylnitrosoharnstoff, engl. ethylnitroso urea, ENU; Kapitel 9.4.3) üblicherweise in männlichen Keimzellen induziert; die mutagenisierten Männchen werden mit Wildtyp-Weibchen (wt) verpaart. Die resultierende F1-Generation ist heterozygot für einzelne Mutationen (m); dominante Mutationen zeigen schon hier ihren Phänotyp. Um rezessive Mutationen zu erkennen, werden F1Tiere zunächst erneut mit Wildtyp-Tieren gekreuzt, um viele F2-Fische zu erhalten („F2-Familien“). In diesen Familien werden die Fische dann zufällig untereinander gekreuzt; in der nächsten Generation (F3) treten auch rezessive Mutationen durch einen Phänotyp in Erscheinung (roter Fisch in F3). Alternativ können die Männchen der F1-Gründergeneration auch

dazu verwendet werden, gekoppelte DNA- und SpermienBibliotheken anzulegen. Diese Bibliotheken können dazu verwendet werden, gezielt nach Mutationen in individuellen Genorten zu suchen (TILLING; engl. targeting induced local lesions in genomes). Bei dieser Methode werden Exons eines bestimmten Krankheitsgens von einer individuellen oder gepoolten DNA aus der F1-Bibliothek mit PCR amplifiziert. Wenn eine Mutation identifiziert wurde, kann der entsprechende Fisch in der Erhaltungszucht identifiziert werden oder das eingefrorene Sperma zur in-vitro-Fertilisation verwendet werden, sodass er für eine Analyse des Phänotyps zur Verfügung steht. (Nach Lieschke u. Currie 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

209

210 210

Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

delt werden (in der Regel Ethylnitrosoharnstoff, ENU; Kapitel 9.4.3). Daneben hat sich aber auch eine Insertionsmutagenese auf der Basis von Retroviren bewährt; die Retroviren werden während des Blastula-Stadiums in Zebrafisch-Embryonen injiziert. Zwar ist die Effizienz der ENU-Mutagenese deutlich höher, aber die beiden Systeme zeigen unterschiedliche Spezifität hinsichtlich der betroffenen Gene. Eine Methode, die Aktivität von Genen zu vermindern (und im besten Fall ganz auszuschalten), besteht darin, die mRNA durch entsprechende antisense-RNA abzufangen. Zur Verbesserung der Stabilität der eingesetzten antisense-RNA werden dazu kurze Oligonukleotide eingesetzt, in denen die Ribose in der RNA durch einen Morpholinring ersetzt ist (Laborjargon: „Morpholinos“; vgl. auch Technik-Box 26). Die Morpholinos werden in die befruchtete Eizelle injiziert und die Auswirkungen können im wachsenden Embryo beobachtet werden. Dabei kann die kontralaterale Seite eines Fisches auch als „interne Kontrolle“ herangezogen werden. Diese Methode ist beim Zebrafisch weit verbreitet; neben RNAProdukten können auch Informationen für markierte Proteine injiziert und die Effekte in verschiedenen Zellen optisch verfolgt werden.

Der Zebrafisch ist noch ein relativ neues, aber sehr

interessantes Objekt zur entwicklungsgenetischen Untersuchung von Wirbeltieren. Seine Vorteile sind die hohe Geschwindigkeit der Embryonalentwicklung, die Durchsichtigkeit der Embryonen und die hohe Zahl der Nachkommen. Im Zebrafisch wurde eine Reihe von Hochdurchsatz-Untersuchungen auf dominante und rezessive Mutationen durchgeführt.

5.4.6 Die Hausmaus Die Maus (Mus musculus; Abb. 5.46a) wurde seit den frühen Tagen der Genetik als Modell verwendet. Sogar Mendel selbst soll zunächst in seiner Klosterzelle Mäuse gezüchtet und gekreuzt haben, bis es ihm von der kirchlichen Hierarchie verboten wurde ‒ so hat er dann seine Experimente mit Gartenerbsen fortgesetzt. Und so wurden die „Mendel’schen Gesetze“ (Kapitel 10.1) statt an unterschiedlichen Mäusen (z. B. albino vs. pigmentierten) an glatten und runzligen Erbsen entwickelt. Aber schon zu Beginn des 20. Jahrhunderts wurden Mendels Ergebnisse an der Maus wiederholt, und in den darauffolgenden Jahren konzentrierten sich die Arbeiten mit der Maus auf das Problem, Tumormodelle zu etablieren und zu verstehen, warum sich Tumore unter bestimmten Bedingungen transplantieren lassen, aber unter anderen Bedin-

gungen abgestoßen werden. Diese Arbeiten mündeten schließlich in die Charakterisierung des Haupthistokompatibilitätsantigens (engl. major histocompatibility antigen, HLA). Der zweite wichtige Punkt der ersten 50 Jahre Mausgenetik konzentrierte sich auf die Frage, warum es unterschiedliche Inzidenzen für das Auftreten von Tumoren bei einzelnen Mausstämmen gibt ‒ und die Beantwortung führte dann zur Entdeckung der Retroviren (speziell des Brustkrebsvirus der Maus; engl. mouse mammary tumor virus, MMTV). In den 1960er-Jahren änderten sich die Themen der Mausgenetik: 1961 publizierte Mary Lyon die nach ihr benannte „Lyon-Hypothese“ zur zufälligen Inaktivierung eines X-Chromosoms in weiblichen Mäusen, um mit dieser Erklärung das Problem der Dosiskompensation bei Säugern zu lösen (siehe dazu im Detail Kapitel 6.3.3). Die Fortschritte der „biochemischen Genetik“ ermöglichte die physiologische Charakterisierung einer größeren Zahl von Mutanten, die die Aktivitäten oder biophysikalischen Eigenschaften von Proteinen in der Elektrophorese oder in der Isoelektrischen Fokussierung veränderten. Als „Nebenprodukte“ dieser Arbeiten entstand über die Jahrzehnte eine Vielzahl verschiedener Inzuchtstämme der Maus (Abb. 5.46b), was später zu einer der Goldminen der Mausgenetik werden sollte. Bis 1980 gab es etwa 300 verschiedene Inzuchtstämme. Allerdings dauerte es auch bis 1980, bis die Zuordnung der 20 Kopplungsgruppen zu den 20 Chromosomen der Maus abgeschlossen war. Eine Übersicht über die züchterischen Möglichkeiten der Maus gibt Abb. 5.47. Eine neue Ära der Mausgenetik begann, als Ende 1980 die erste transgene Maus publiziert wurde (Gordon et al. 1980). Schon ein Jahr später konnte T. E. Wagner und seine Gruppe zeigen, dass ein vollständiges β-Globin Gen des Kaninchens in das Mausgenom überführt werden konnte und dann in der Maus im richtigen „Gewebe“, also den Erythrocyten, exprimiert wird. Damit hat sich die Maus zu einem der wichtigsten Modellorganismen in der Genetik überhaupt entwickelt. Die Methoden zur Herstellung von transgenen Mäusen, zum Aus- und Abschalten von Genen, gezielter und zufälliger Mutagenese, wurden entscheidend verfeinert; eine Übersicht über den genetischen „Werkzeugkasten“ der Maus gibt Abb. 5.48. Ein Gensymbol besteht üblicherweise aus drei Buchstaben (heute reicht das aber manchmal schon nicht mehr aus). Die genetische Nomenklatur der Maus sieht vor, dass rezessive Gene klein und kursiv geschrieben werden. Bei dominanten Allelen ist der erste Buchstabe groß; Allelsymbole werden hochgestellt. Mitglieder von Genfamilien werden durchnum-

5.4 Wichtige eukaryotische Modellorganismen in der Genetik

meriert (z. B. Pax6 für paired-box-Gen 6) oder durch Buchstaben ergänzt (z. B. Cryga für γA-Kristallin).

a

Das Mausgenom ist seit 2001 vollständig sequenziert (ca. 2500 Mb, 30.000 bis 35.000 Gene; http://www.ensembl.org/mus_musculus) und entspricht weitgehend dem des Menschen (ca. 2900 Mb, 36.000 Gene; http://www.ensembl.org/ homo_sapiens; Venter et al. 2001; International Human Genom Sequencing Consortium 2001). Auch die chromosomale Organisationsform ist sehr ähnlich: Die Geschlechtschromosomen X und Y entsprechen sich funktionell, und den 23 Paaren autosomaler Chromosomen des Menschen stehen 19 Chromosomenpaare der Maus gegenüber. Über 90 % des Genoms von Maus und Mensch können in entsprechende Abschnitte konservierter Syntenie unterteilt werden. Dies entspricht den Regionen, in denen die Reihenfolge der Gene in beiden Spezies in der Evolution erhalten blieb. Die Maus hat aber in solchen Genfamilien eigenständige Entwicklungen durchlaufen, die für die Reproduk-

DBA/1 DBA/2 C CBA CHI C12I C3H/St C3H/Bi C3H/An

DBA Littles Mäuse aus den Fellfarben-Experimenten x

C3H/He C3H/HeJ C3HeB/FeJ Dealers Zucht in Ohio

BALB/c A/J A/St A/Bi A/He A/HeJ

x

Cold Spring Harbor Albinos

C58 C57BL/6 C57BL

C57BL/10

Lathrops Zucht

C57BR/cd C57BR/a C57L

C57BR AKR

RF

Furths A & R-Zucht SWR

Europäische weiße Mäuse

SJL Schweizer Webster-Mäuse

b

(1909)

12

16

20

24

28

32

36

Abb. 5.46 a, b Die Hausmaus. a Links eine Wildtyp-Maus vom Stamm C57BL/6, rechts eine gescheckte Fellfleckenmutante. b Stammbaum einiger wichtiger Inzucht-Mausstämme, die

40

44

48

52

56

60

häufig in den Labors verwendet werden. (a Foto: Dr. Claudia Dalke, Helmholz Zentrum München, Neuherberg; b nach Green 1966, mit freundlicher Genehmigung von McGraw Hill)

211

212 212

Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen a Rekombinante Inzuchtstämme elterliche Inzuchtstämme

Chr. 6 Kongen

x

50 % jeder Elternteil

d Chromosomen-Substitutionsstämme

x

Bruder-SchwesterPaarung für 20 Generationen

Chr. 2

RI-Linien, reine Inzucht

Y-Chr

x

F1

c Kongene Stämme

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 XY

Chr. 1 F2

x

x

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 XY

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 XY

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 XY b Erweiterte Kreuzungslinien

50 % jeder Elternteil

x

F1

e Genomweit markierte Mäuse elterliche Inzuchtstämme

x

Chr. 1 Stämme Stamm 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 XY

Stamm 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 XY

F2

F3

F6

x

x

x

x

zufällige Kreuzungen (nicht BruderSchwester)

x

zufällige Kreuzungen (keine gemeinsamen Großeltern) bis F8 oder weiter

X-Chr. Stämme Stamm 1

weder Inzucht noch homozygot

Stamm 2

x

Stamm 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 XY

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 XY

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 XY

Abb. 5.47 a–e Derivate von Inzuchtstämmen. a Rekombinante Inzuchtstämme (RI-Stämme) werden durch das Kreuzen von zwei verschiedenen Inzuchtstämmen entwickelt. Die F1Nachkommen sind an allen Genorten vollständig heterozygot. Ab hier wird eine Serie von Bruder-Schwester-Verpaarungen angesetzt; die Nachkommen werden für 20 Generationen immer wieder untereinander gekreuzt. Im Ergebnis erhalten wir vollständige Inzuchtstämme, die für eine einzigartige Kombination an allen Genorten der elterlichen Genome homozygot sind. b Bei den erweiterten Kreuzungslinien (engl. advanced intercross lines) ist die Absicht, die Rekombinationsfrequenz zu erhöhen; daher werden Paarungen zwischen Geschwistern und Cousins vermieden. Durch die große Zahl an Tieren wird es erleichtert, quantitative Merkmale besser zu kartieren (vgl. Kapitel 10.4.6). c Kongene Stämme werden hergestellt, um ein einzelnes (mutiertes) Gen von einem genetischen Hintergrund auf einen anderen zu überführen. In unserem Beispiel

wurde eine Maus mit einem definierten Allel (blau) auf dem Chromosom 6 nach einem anderen Stamm (rot) ausgekreuzt. Die Heterozygoten werden dann selektioniert und erneut mit dem roten Stamm gekreuzt; nach etwa 10 Generationen ist das blaue Allel mit einigen flankierenden Sequenzen vollständig auf dem roten Hintergrund. d Bei der Chromosomen-Substitution wird ein ganzes Chromosom auf einen anderen genetischen Hintergrund überführt; solche Stämme werden auch als „konsom“ bezeichnet. e Genomweit markierte Mäuse (engl. genome tagged mice) sind von ihrem Konzept her den kongenen Stämmen ähnlich; allerdings wird dabei nicht ein einzelnes Gen auf einen anderen Hintergrund übertragen, sondern überlappende Fragmente des Genoms, sodass am Ende eine Stammsammlung aufgebaut ist, die das gesamte Genom in einzelnen Bruchstücken auf einem anderen genetischen Hintergrund repräsentiert. (Nach Peters et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

tion, die Immunität und die Entwicklung des Geruchssinns verantwortlich sind. Das deutet darauf hin, dass diese physiologischen Systeme für die Maus besonders wichtig sind. In den frühen Abschnitten der Embryonalentwicklung sind Maus und Mensch allerdings kaum zu unterscheiden. Prinzipielle Abläufe wie Oogenese, Spermatogenese, Befruchtung und Organentwicklung sind vergleichbar. Auch biochemische und physiologische

Abläufe sind in vielen Fällen bei Mensch und Maus ähnlich. Mäuse haben unter optimalen Lebensbedingungen eine Lebenserwartung von 2 bis 3 Jahren. Der Lebenszyklus der Maus von der Befruchtung bis zum geschlechtsreifen Tier dauert 9 Wochen – für einen Säuger eine relativ kurze Zeitspanne. (Eine interessante Zusammenfassung von 100 Jahren Mausgenetik mit vielen Hinweisen auf Originalarbeiten findet sich in zwei Aufsätzen von Kenneth Paigen 2003).

5.4 Wichtige eukaryotische Modellorganismen in der Genetik

Abb. 5.48 Genetisch veränderte Mäuse können heute auf sehr unterschiedlichen Wegen gewonnen werden. Ausgangspunkt ist immer ein elterlicher Inzuchtstamm. Zufällige Mutagenese kann durch Gabe von Ethylnitrosoharnstoff (ENU) erfolgen; das Abschalten von Genen durch direkte Applikation von RNAi oder durch Herstellung einer transgenen Maus. Andere Verfahren benutzen embryonale Stammzellen der Maus, um Gene auszuschalten (engl. knock out). Eine Möglich-

keit, um die Ausschaltung eines Gens räumlich oder zeitlich zu steuern, erfordert die Kombination von loxP-Stellen und der Cre-Rekombinase. Wenn die Cre-Rekombinase aktiv ist (durch Verwendung von Tamoxifen oder eines entsprechenden gewebespezifischen Promotors), schneidet sie das von zwei loxPStellen flankierte Gen aus; zurück bleibt nur eine loxP-Stelle (Technik-Box 28). (Nach Argmann et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Eine besonderer Ansatz zur systematischen, standardisierten phänotypischen Charakterisierung der Maus wird in der „Deutschen Mausklinik“ verfolgt, die am Helmholtz Zentrum München in Neuherberg im Jahr 2002 eröffnet wurde (http://www.helmholtz-muenchen.de/en/ieg/gmc/

index.html). Hier arbeiten Spezialisten aus verschiedenen Gebieten zusammen, um Mausmutanten auf (fast) alle möglichen Krankheitsbilder nicht-invasiv zu untersuchen. Dazu gehören Allergien, Augenerkrankungen, Energie-Metabolismus, Immunologie, klinisch-chemische Parameter, Knochen- und Knorpel-

213

214 214

Kapitel 5: Zelle, Zellteilungen und Modellorganismen

entwicklung, Lungenfunktion, Neurologie, Schmerzempfinden, Steroid-Metabolismus, Verhalten und schließlich pathologische Untersuchungen.

Die Maus ist seit über 100 Jahren ein etablierter Mo-

dellorganismus in der Genetik. Neben der relativ kurzen Generationszeit besteht der große Vorteil der Maus darin, dass es möglich war, viele verschiedene Mutanten- und Inzuchtlinien zu generieren. In den letzten Jahrzehnten wurden viele Verfahren zur gezielten genetischen Modifikation an der Maus entwickelt und etabliert.

Kernaussagen ï Die Zellen höherer Organismen zeichnen sich durch eine Untergliederung in Zellkern und Cytoplasma aus (Eukaryoten). Der Kern ist durch eine Kernmembran vom Cytoplasma abgegrenzt; das Karyoplasma ist aber über Poren in der Kernmembran mit dem Cytoplasma verknüpft. Sowohl im Cytoplasma als auch im Karyoplasma befinden sich fibrilläre Elemente, die das Cytoskelett bzw. das Kernskelett aufbauen. ï Cytoplasmatische Organellen wie Mitochondrien und Plastiden besitzen ein eigenes Genom aus doppelsträngiger, zirkulärer DNA. Sie haben sich aus intrazellulären symbiotischen Parasiten entwickelt und ihre Eigenständigkeit zugunsten einer engen funktionellen Interaktion mit dem nukleären Genom aufgegeben. Das Plastidengenom enthält bis zu 200 Gene, das mitochondriale Genom jedoch nur etwa 40. Der genetische Code der Mitochondrien unterscheidet sich teilweise vom Universal-Code, mitochondriale DNA wird nur matroklin vererbt. ï Der Lebenszyklus einer Zelle ist durch die DNA-Replikation (S-Phase) und die Teilung der Zelle (Mitose, M-Phase) gekennzeichnet. Die dazwischenliegenden „Lücken“ werden als G1- bzw. G2-Phase bezeichnet. ï Das diffuse Chromatin kondensiert in bestimmten Phasen der Mitose (besonders in der Metaphase) und wird dadurch lichtmikroskopisch sichtbar. Mithilfe des Spindelapparates erfolgt die Verteilung der Chromosomen auf die Tochterzellkerne. ï In der Keimbahn wird die Anzahl der Chromosomen in zwei Schritten auf den haploiden Zustand reduziert (Meiose): In der ersten Zellteilung (Reduktionsteilung) werden die homologen Chromosomen getrennt, in der zweiten Zellteilung (Äquationsteilung) werden die Chromatiden getrennt. ï Durch Austausch von Chromosomenbereichen zwischen homologen Chromosomen (Rekombination) wird die Variabilität der genetischen Konstitution erhöht. ï Neben reziproker Rekombination gibt es auch nicht-reziproke Rekombination (Genkonversion). Genkonversion erklärt sich durch die molekularen Mechanismen der Rekombination, kann aber auch bei DNA-Neusynthese im Rahmen der DNA-Reparatur eintreten. ï Der Zellzyklus ist einer komplexen Regulation unterworfen: Der Eintritt in die S-Phase ist von der Überwindung des Restriktionspunktes anhängig. Wichtige Proteine hierbei sind Cycline und Cyclin-abhängige Proteinkinasen. ï Apoptose (programmierter Zelltod) ist ein genetisch programmierter Prozess zur Verhinderung von unkontrollierter oder unerwünschter Zellproliferation. Eine zentrale Rolle in der Regulation der Apoptose spielt p53, das auch für ein Tumorsuppressorgen codiert.

Technik-Box

Technik-Box 12

Homologe Rekombination Techniken zum gezielten Ersatz einer genomischen DNA-Sequenz durch eine andere von vorrangiger Bedeutung sind heute in vielen Gebieten der Genetik von vorrangiger Bedeutung. Man nutzt für solche Zwecke homologe Rekombinationsmechanismen (engl. site-specific recombination). Im Idealfall soll ein Rekombinationsexperiment dieser Art zum Austausch genomischer DNA-Sequenzen führen. Eine solche Situation lässt sich durch ein zweistufiges Experiment erreichen, wie es im Folgenden dargestellt wird. Es beruht auf dem Gebrauch von Replacement-Vektoren. Bei solchen Vektoren befindet sich ein Markergen innerhalb der Sequenz, die zur genomischen DNA-Sequenz homolog ist. Der Einsatz solcher Vektoren erfordert ein doppeltes Rekombinationsereignis (Genkonversion!) innerhalb der homologen Sequenzbereiche. Dem Genom wird hierbei zunächst zusätzlich fremde DNA (die des Markergens) hinzugefügt. In einem

zweiten Schritt wird dieses Markergen wieder entfernt. Das Experiment macht zunächst von einer positiven Selektion, danach von einer negativen Selektion Gebrauch. Im hier gezeigten Beispiel enthält das Vektorkonstrukt zwei Markergene. Einer dieser Marker liegt innerhalb der Sequenzregion, die bei der Rekombination ins Genom eingeführt werden soll. Es kann beispielsweise das menschliche HPRT-Gen (HPRT: Hypoxanthinphosphoribosyltransferase) verwendet werden, wenn man HPRT−Zellen zur Transformation verwendet und in HAT-Medium selektiert (HATMedium: Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin). Aminopterin blockiert die Synthese von Purinen und Thymidylat. Das Hypoxanthin ermöglicht durch die HPRT die Purinsynthese. Als zweites Markergen dient beispielsweise das Thymidinkinase-Gen (TK) von Herpes simplex. Es liegt außerhalb des homologen Sequenzbereichs. Selektiert man nach der

1. Schritt: Einfügen von HPRT Gen A

Gen B

Gen C

Gen D

HPRT

Gen E

TK

2. Schritt: Substitution von HPRT durch verändertes Gen C * Gen A

Gen A

Gen E

HPRT

Gen A

Gen C *

Gen D

Gen B

Gen C *

Gen D

Gen E

Transformation auf TK− und HPRT+, so erhält man Transformanten, die einen Austausch in der gewünschten Genomregion besitzen: Zufällige Integration des Vektorkonstrukts in das Genom hat nämlich einen TK+- und HPRT+-Phänotyp zur Folge. TK+-Zellen aber können durch Behandlung mit dem Thymidinanalogon Gancyclovir abgetötet werden. Die aus der ersten Transformation erhaltenen Zellen werden nun in einem zweiten Schritt mit einem Vektor transformiert, der lediglich die gewünschte modifizierte Gensequenz (z. B. mit einer Punktmutation) enthält. Durch eine erneute Genkonversion im gewünschten Genbereich wird nun das HPRT-Gen durch die mutierte Gensequenz ersetzt. Transformanten können als HPRT−Zellen in Medium mit 6-Thioguanin selektiert werden. Auf diese Weise ist der gezielte Ersatz eines Allels durch ein beliebig modifiziertes Allel möglich, ohne dass zusätzliche fremde DNA im Genom verbleibt.

215

Kapitel 6

Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen Inhaltsverzeichnis 6.1 Das eukaryotische Chromosom . . . . . . . . . . . . . . . 218 6.2 Organisation der DNA im Chromosom . . . . . . . . . . 235 6.3 Variabilität der Chromosomen und Dosiskompensation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249

Synchrone Teilungen der Zellen eines Embryos von Drosophila im syncytialen Blastoderm. Tubulinfibrillen erscheinen rot, Actinfibrillen grün. (Foto: B. Theuerkauf, Stony Brook)

218 218

Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Überblick Die Chromosomen sind die lichtmikroskopisch sichtbaren, materiellen Träger der Gene. Bedeutet das aber, dass sie lediglich eine Ansammlung kettenartig aneinandergefügter Gene sind? Aus cytologischen Beobachtungen wissen wir, dass die Chromosomen, und damit die Gene, in Mitose und Meiose gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt werden. In den Centromerbereichen der Chromosomen dienen die Kinetochore als Ansatzpunkte für die Mikrotubuli des Spindelapparates. So werden die Chromosomen bzw. deren Untereinheiten, die Chromatiden, bei der Zellteilung auf die Tochterzellen aufgeteilt. Besondere terminale Domänen, die Telomere, gewährleisten, dass die freien Enden der DNA im Chromosom nicht von Exonukleasen abgebaut werden oder durch Reparaturenzyme mit den freien Enden der DNA eines anderen Chromosoms verschmelzen. Bei der weiteren Untersuchung der molekularen Struktur des Genoms machte man die unerwartete Entdeckung, dass das eukaryotische Genom zum größten Teil nicht aus Protein-codierenden DNA-Sequenzen besteht. Ein großer Teil der DNA-Sequenzen gehört zur repetitiven DNA, die in vielen, teils identischen, teils ähnlichen Kopien im Genom vorhanden ist. Ein Teil dieser DNA, vor allem hochrepetitive Sequenzen, ist in heterochromatischen Chromosomenabschnitten lokalisiert. Andere sind in Einzelkopien über das gesamte Genom verstreut. Die erstaunlich großen Unterschiede im DNA-Gehalt der Genome höherer Organismen müssen hauptsächlich Unterschieden in der Menge repetitiver DNA zugeschrieben werden. Die chromosomale DNA wird in einer ersten Stufe in der Form von kompakten Nukleosomen organisiert. Sie windet sich hierzu zweimal um einen Komplex aus Histonproteinen. Eine Kette derartiger DNA-Histonpartikel bildet eine Chromatinfibrille von 10 nm Durchmesser. Diese Fibrille wird jedoch zusätzlich in Fibrillen höherer Ordnung verdrillt. Aktives und inaktives Chromatin unterscheiden sich dabei in dem Ausmaß der Kondensation; die unterschiedliche Methylierung, Acetylierung und Phosphorylierung der Histone („Histoncode“) spielen hierbei eine weitere wesentliche Rolle. Insulator-Elemente sind an der

6.1 Das eukaryotische Chromosom 6.1.1 Chromosomen als Träger der Erbanlagen Kurz nach der Wiederentdeckung der Mendel’schen Regeln (Kapitel 10.1) formulierten Sutton und Boveri die Chromosomentheorie der Vererbung. Sie besagt, dass die Erbeigenschaften eines Organismus in seinen

Ausbildung offener Chromatinstrukturen und an der Anheftung der Chromatiden an der Kernmembran beteiligt. Die Kompartimentierung des Zellkerns in chromosomale Territorien und Interchromatindomänen erlaubt die räumliche Trennung verschiedener funktioneller Abläufe im Zellkern, wie Transkription und Reifung der RNA. Chromosomen sind dynamische Strukturen, die strukturell und funktionell eng mit dem Stoffwechsel und dem Differenzierungsgrad der jeweiligen Zelle verbunden sind. Ihre Bedeutung geht weit über das hinaus, was man von einem reinen „Gen-Depot“ erwarten würde. So hat die unterschiedliche Konstitution der Geschlechtschromosomen in den beiden Geschlechtern zur Folge, dass die Anzahl der Kopien der auf diesen Chromosomen gelegenen Gene im männlichen und weiblichen Geschlecht unterschiedlich ist. Solche quantitativ unbalancierten Genkonstitutionen werden in der Regel vom Organismus nicht toleriert. Verschiedene Organismengruppen haben daher spezifische Mechanismen entwickelt, um für einen funktionellen Ausgleich (Dosiskompensation) der verschiedenen Genkopienzahlen zu sorgen. In Drosophila erfolgt der Ausgleich in der Genaktivität durch erhöhte Aktivität der X-chromosomalen Gene im Männchen. In Säugetieren wird eines der beiden X-Chromosomen des weiblichen Geschlechts inaktiviert, sodass ein der hemizygoten X-Chromosomenkonstitution des männlichen Geschlechts funktionell gleichwertiger Zustand zustande kommt. Dabei ist es von grundlegender Bedeutung, dass eine einmal erfolgte Inaktivierung innerhalb eines Organismus im Allgemeinen erhalten bleibt. Das Chromosom muss mithin eine Information aufnehmen, die dafür sorgt, dass es in allen folgenden Zellgenerationen inaktiv bleibt. Man bezeichnet eine solche Information als chromosomale Prägung (Imprinting). Eine weitere Konsequenz der X-Chromosomeninaktivierung ist, dass verschiedene Zellen von Säugerweibchen eine unterschiedliche Konstitution hinsichtlich der aktiven X-chromosomalen Gene besitzen können. Säugerweibchen sind daher funktionelle Mosaike in Bezug auf die Ausprägung geschlechtsgebundener Gene.

Chromosomen niedergelegt sind. Diese Theorie wurde sehr bald durch mehrere Forscher bestätigt; als Folge dieser Erkenntnis hat die Chromosomenforschung während der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts eine wichtige Rolle in der Genetik gespielt und eine große Zahl von Beobachtungen zur Verfügung gestellt, die wir erst heute anhand molekularer Forschungsergebnisse allmählich verstehen lernen. Ein Widerspruch zwischen den Mendel’schen Regeln und cytologischen Beobachtungen scheint in

6.1 Das eukaryotische Chromosom

Tabelle 6.1 Die Chromosomenanzahlen verschiedener Organismen

Art

Chromosomenanzahl (2n)

Aspergillus nidulans Neurospora crassa Saccharomyces cerevisiae Chlamydomonas reinhardtii Vicia faba (Saubohne) Allium cepa (Zwiebel) Antirrhinum majus (Löwenmäulchen) Arabidopsis taliana Zea mays (Mais) Oryza sativa (Reis) Triticum aestivum (Weizen) Hordeum vulgare (Gerste) Secale cereale (Roggen) Nicotiana tabacum (Tabak) Solanum tuberosum (Kartoffel) Lycopersicum esculentum (Tomate) Pisum sativum (Erbse) Brassica oleracea (Kohl) Pinus ponderosa Ophioglossum reticulatum (polyploid) Caenorhabditis elegans Planaria torva Ascaris megalocephala var. univalens (Spulwurm) Stylonychia mytilus Musca domestica (Hausfliege) Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) Culex pipiens (Mücke) Apis mellifera (Honigbiene)

8 (n) 7 (n) 17 (n) 16 (n) 12 16 16 10 20 42 42 (6n) 14 14 48 (4n) 48 (4n) 24 14 18 24 1260 11 ƃ, 12 Ƃ 16 2

Bombyx mori (Seidenspinner) Lysandra atlantica (Schmetterling) Danio rerio (Zebrafisch) Triturus viridescens (Salamander) Rana pipiens Xenopus laevis (Krallenfrosch) Gallus domesticus (Haushuhn) Columba livia (Taube) Cavia porcellus (Meerschweinchen) Mus musculus (Hausmaus) Rattus norvegicus (Ratte) Mesocricetus aureatus (Goldhamster) Cricetulus griseus (Chinesischer Hamster) Oryctolagus cuniculus (Kaninchen) Felis domesticus (Katze) Canis familiaris (Hund) Bos taurus (Stier) Equus caballus (Pferd) Equus asinus (Esel) Ovis aries (Schaf) Sus scrofa (Schwein) Macaca mulatta (Rhesusaffe) Gorilla gorilla Pan troglodytes (Schimpanse) Pongo pygmaeus (Orang-Utan) Homo sapiens (Mensch)

ca. 300 12 8 6 32 Ƃ (2n) 16 ƃ (n) 56 446 25 22 26 36 ca. 78 80 64 40 42 44 22 44 38 78 60 64 62 54 40 48 48 48 48 46

der Feststellung zu liegen, dass die Anzahl der Chromosomen bei den meisten Organismen relativ niedrig ist (Tabelle 6.1), jedenfalls zu gering, um mit der Vorstellung vereinbar zu sein, dass jedes Chromosom einer Erbeigenschaft zuzuordnen ist. Obwohl über die tatsächliche Anzahl der Erbeigenschaften (Gene) verschiedener Organismen noch bis in jüngste Zeit sehr widerstreitende Ansichten vertreten wurden, wurde doch sehr bald erkannt, dass jedes Chromosom Hunderte oder sogar Tausende von Erbeigenschaften tragen muss. Dieser Schluss steht nunmehr aber in eindeutigem Widerspruch zu der Regel Mendels, dass sich Merkmale unabhängig voneinander auf die Nachkommen verteilen, da alle in einem Chromosom gelegenen Gene gekoppelt bleiben, also nicht unabhängig voneinander verteilt werden (Kapitel 10.1 und 10.4). Dieser scheinbare Widerspruch zu Mendels experimentellen Ergebnissen konnte durch die Genetiker dadurch aufgelöst werden, dass sie erkannten, dass die in den Untersuchungen Mendels studierten Merkmale (Tabelle 10.1) auf unterschiedlichen Chromosomen liegen oder in einigen Fällen im Chromosom so weit voneinander entfernt liegen, dass stets ein Crossingover zwischen den gekoppelten Genen stattfindet. Daher verteilen sie sich während der Meiose tatsächlich scheinbar unabhängig voneinander auf die Keimzellen. Im Gegensatz zur Uniformität der Chromosomen innerhalb eines Organismus und zwischen Organismen einer Art steht die große Variabilität der Zahlen und Morphologie der Chromosomen, die man beim Vergleich verschiedener Arten und vor allem höherer Gruppen des Tier- und Pflanzenreichs findet (Tabelle 6.1). Weder die Anzahl noch die Gestalt der Chromosomen weist dabei eine Korrelation zur Entwicklungshöhe des betreffenden Organismus auf. Einzellige Organismen, wie etwa Ciliaten, können eine große Anzahl von Chromosomen besitzen, komplexe Vielzeller hingegen wenige. In manchen Organismengruppen allerdings wird offensichtlich eine größere evolutionäre Erhaltung einer bestimmten Chromosomenanzahl angestrebt als in anderen. Es bleibt offen, ob das mit der Tendenz zu einer relativ einheitlichen Genomgröße zusammenhängt, oder ob hier auch eine Stabilisierung der Chromosomenanzahl selbst eine Rolle spielt. Beispielsweise liegen die Chromosomenzahlen von Säugern im Allgemeinen zwischen 2n = 40 bis 50. Knochenfische (Teleostei) hingegen besitzen meist sehr viele und kleine Chromosomen; Vögel sind ganz allgemein durch den Besitz vieler Minichromosomen gekennzeichnet. Die korrekte Zahl der menschlichen Chromosomen mit 2n = 46 wurde erst 1956 publiziert und ist seither allgemein akzeptiert.

219

220 220

Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Eine Ursache für diesen späten Befund war die Tatsache, dass in den 1920er- und 1930er-Jahren der Zugang zu menschlichen und insbesondere zu männlichen Spermatogonien sehr begrenzt war ‒ „frisches Material“ war nur von exekutierten Häftlingen zu erhalten. Spermatogonien waren eine der wenigen Quellen menschlicher Zellen, die sich schnell teilen. Im Gegensatz dazu gelang die korrekte Bestimmung der Chromosomenzahl bei vielen Säugetieren schon früher. 1921 publizierte Theophilus S. Painter über die Anzahl menschlicher Chromosomen und kam bei vielerlei technischen Unzulänglichkeiten zum Ergebnis: Es sind 48 menschliche Chromosomen. Erst wichtige technische Verbesserungen (Einführung der hypotonen Schock-Methode zur Spreitung des Kernmaterials und die Kombination von Colchizin als Metaphase-Blocker mit der Zellkultur) machte die richtige Bestimmung mit 46 durch Joe Hin Tijo und Albert Levan im Jahr 1956 möglich – übrigens zunächst als Poster auf dem 1. Internationalen Humangenetik-Kongress in Kopenhagen! Erst danach begann die Entwicklung der humanen Cytogenetik und ihrer Anwendung in der Medizin (siehe dazu Kapitel 12.2). Die korrekte Zahl der Hefechromosomen wurde übrigens sogar erst 1985 durch Carle und Olsen publiziert (für weitere historische Details siehe Gartler 2006).

Biochemische Natur der Chromosomen Die Chromosomen als Träger der Erbsubstanz enthalten als zentralen biochemischen Bestandteil natürlich DNA. Der zweite wichtige Bestandteil der Chromosomen sind eine Gruppe basischer Proteine, die als Histone bezeichnet werden. Histone haben ein relativ niedriges Molekulargewicht (~ 20 kDa) und zeichnen sich durch eine hohe Bindungsaffinität für DNA aus. Wir unterscheiden fünf Haupttypen von Histonen, abgekürzt als H1, H2A, H2B, H3 und H4. Sie sind von fundamentaler Bedeutung für die dichte Packung der Chromosomen; die Histone H2A, H2B, H3 und H4 bilden ein Octamer, um das sich die DNA zweifach herumwindet. Diese Einheit wird als Nukleosom bezeichnet. Der Abstand zwischen zwei Nukleosomen beträgt etwa 160-200 bp, sodass sich eine Struktur ergibt, die an eine Perlenkette erinnert (siehe dazu auch Abb. 6.17). Wir werden diese Struktur später im Detail diskutieren (Kapitel 6.2.2 bis 6.2.4). Die Histon-Gene werden im Kapitel 7.2.2 ausführlich vorgestellt. Die Gesamtheit aus DNA und daran gebundenen Proteinen wird als Chromatin bezeichnet.

6.1.2 Morphologie der Chromosomen Die Untersuchung des Zellzyklus hat uns gezeigt, dass wir Chromosomen lichtmikroskopisch nur während der Mitose, nicht aber in der Interphase erkennen können. In der klassischen Cytologie hatte man sich die Frage gestellt, ob Chromosomen auch während der Interphase in ihrer Individualität erhalten bleiben, oder ob sie sich während der Telophase auflösen und erst während der folgenden Prophase neu ausbilden. Diese Frage hätte bereits durch die cytologischen Beobachtungen Walther Flemmings (1843–1905) und Balbianis (siehe Abb. 6.26) definitiv beantwortet werden können, nachdem auch Carl Rabl (1853–1917) sich aufgrund cytologischer Untersuchungen an Amphibienzellkernen bereits im Sinne einer chromosomalen Kontinuität durch den gesamten Zellzyklus hindurch ausgesprochen hatte. Dennoch wurde die Tatsache der Konstanz der Chromosomenindividualität erst auf der Grundlage der Beobachtungen von Cytologen in den 1930er-Jahren endgültig akzeptiert. Es waren gleichzeitig Emil Heitz (1892–1965), Hans Bauer (1905–1988) und Theophilus Shickel Painter (1889–1969), die diesen wichtigen Schluss zogen. Es ist heute eindeutig geklärt, dass Chromosomen während der Interphase nicht nur in ihrer Individualität erhalten bleiben, sondern dass sie im Interphasekern auch bestimmte Lagebeziehungen zueinander eingehen. Wenn man Metaphasechromosomen innerhalb eines Zellkerns beobachtet, stellt man fest, dass sie nicht gleich aussehen, sondern verschiedene Formen haben. Idealtypisch ist dies in Abb. 6.1a dargestellt; als Beispiel eines gesamten Chromosomensatzes ist der des Menschen gezeigt (Abb. 6.1b). Bei den menschlichen Chromosomen herrschen neben selteneren punktförmigen stäbchenartige oder v-förmige Gestalten vor. Bei den v-förmigen Chromosomen gibt es solche, bei denen die beiden Chromosomenarme annähernd gleich lang sind, und solche, bei denen ein Arm deutlich kürzer ist als der andere. Sehen wir uns diese Chromosomen während ihrer Anaphasebewegungen an, so erkennen wir, dass bei den stäbchenförmigen Chromosomen stets ein Ende des Chromosoms in Richtung auf den Spindelpol orientiert ist, bei den v-förmigen aber der Bereich des Chromosoms, an dem sich beide Arme treffen. Aufgrund dieses Verhaltens nennt man die betreffenden Chromosomen auch akrozentrisch (= telozentrisch) oder metazentrisch. Zwischen beiden Extremformen der Chromosomenmorphologie gibt es ein Kontinuum

6.1 Das eukaryotische Chromosom

Abb. 6.1 a, b Verschiedene Chromosomenformen. a Schematische Darstellungen: links in der Metaphasekonfiguration, rechts in ihrer charakteristischen Anaphaseanordnung. Die Centromere sind durch Kreise dargestellt. Die Spindel zeigt Mikrotubuli, die an den Centromeren ansetzen (Kinetochorfibrillen), und durch die gesamte Spindel von Pol zu Pol durchlaufende Mikrotubuli (Polarfibrillen). b Menschlicher Chromosomensatz mit 46 Chromosomen (unsortiert; historische Darstellung). (b nach Gartler 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

von Varianten, das von geringfügig ungleichen Chromosomenarmlängen bis zu einer Morphologie reicht, bei der ein zweiter Chromosomenarm kaum erkennbar ist. Man spricht demgemäß von submetazentrischen oder subtelozentrischen Chromosomen.

Chromosomen sind normalerweise nur in der Mitose und Meiose, also in der kondensierten Form der Pro-, Meta- und Anaphase, sichtbar. Ihre Größe und Form variiert stark und ist jeweils charakteristisch für eine Spezies.

Die Chromosomenform kann uns auch wichtige Hinweise auf deren Evolution geben, denn metazentrische Chromosomen können durch Verschmelzung zweier akrozentrischer Chromosomen entstanden sein oder akrozentrische durch Trennung beider Arme eines metazentrischen Chromosoms. Die Verschmelzung akrozentrischer Chromosomen wird auch Robertson’sche Fusion (zentrische Fusion) (engl. Robertsonian fusion) genannt und ist ein für die Evolution von Säugerchromosomen charakteristisches Phänomen. Erscheinungen dieser Art sind insbesondere für die Ermittlung populationsgenetischer und evolutionärer Zusammenhänge von Bedeutung.

Die zweite auffallende Eigenschaft eines Prophaseoder Metaphasechromosoms ist dessen deutliche Längsteilung: Es besteht aus zwei Längsuntereinheiten, die wir Chromatiden nennen. Sie sind das Produkt des Verdoppelungsmechanismus der Chromosomen, der während der S-Phase abläuft (Replikation). Es entstehen dabei in allen Chromosomen aus einer Chromatide zwei Schwesterchromatiden. Die Chromatiden sind zunächst bis in die frühe Prophase eng gepaart, trennen sich aber mit der fortschreitenden Kondensation der Chromosomen und hängen schließlich nur noch in ihren Centromerbereichen zusammen. Erst in

221

222 222

Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

der Anaphase trennen sie sich unter Einfluss der Spindel und wandern zu den entgegengesetzten Spindelpolen. Durch diesen Mechanismus ist gewährleistet, dass beide Tochterzellkerne eine Chromatide eines jeden Chromosoms erhalten. Eine Chromatide enthält einen DNA-Doppelstrang und ist damit das Grundelement eines Chromosoms; von der Anaphase bis zur S-Phase besteht ein Chromosom aus einer Chromatide – nach der Verdoppelung der DNA und vor der Teilung der Zelle aus zwei („Schwesterchromatiden“). Wenn man von einem Chromosom spricht, wird man daher – je nach dem Zusammenhang – zuvor klären müssen, ob man ein Chromosom vor oder nach der S-Phase meint. Den Status des Zellkerns kennzeichnet man daher auch sinnvollerweise durch Angabe der Anzahl an Chromatiden (C-Wert) eines Chromosomenpaares (2C oder 4C während des mitotischen Zellzyklus oder C, 2C oder 4C während der Meiose, Kapitel 5.3.2).

Grundeinheit eines Chromosoms ist die Chromatide.

Ein Chromosom besteht vor der Replikation aus einer einzigen Chromatide, nach der Replikation in der S-Phase aus zwei identischen Schwesterchromatiden. Eine Chromatide besteht aus einem kontinuierlichen DNA-Doppelstrang.

Bei der Anwendung von besonderen Färbungsverfahren, die als Bänderungstechniken bezeichnet werden, kann man ein hohes Maß an Auflösung in der Chromosomenfeinstruktur erreichen. Sie erlaubt die eindeutige individuelle Identifikation eines jeden Chromosoms auch in Organismen, deren Karyotyp früher eine Unterscheidung der verschiedenen Chromosomen allenfalls in der sehr groben Form von Chromosomengruppen gestattete. Als Karyotyp bezeichnet man die Gesamtheit der Eigenschaften eines Chromosomensatzes, also die Anzahl und die spezifische Form der einzelnen Chromosomen. Das beste Beispiel für die Vorteile der erhöhten Auflösung durch Bänderungstechniken sind menschliche Chromosomen (Abb. 6.2), bei denen man mit herkömmlichen Techniken lediglich 7 Chromosomengruppen und 2 Geschlechtschromosomen auf der Grundlage ihrer Größenunterschiede identifizieren konnte. Man unterscheidet heute im Wesentlichen vier Färbemethoden, die unterschiedliche, aber genau reproduzierbare Färbungsmuster der Chromosomen ergeben. G-Banden erhält man nach einer Vorbehandlung in warmer Salzlösung oder mit proteolytischen Enzymen (Proteinase K oder Pronase E) und anschließender Giemsa-Färbung oder durch die Verwendung ATspezifischer Fluoreszenzfarbstoffe (z. B. DAPI, DIPI). Giemsa-Färbung hat den Vorteil, dass sie permanent erhalten wird und nicht ausbleicht. Das klassische Bandenmuster umfasst etwa 350 Banden; hochauflösende

Verfahren erhöhen die sichtbaren Banden auf 850‒1250. Q-Banden sieht man als fluoreszierende Chromosomenabschnitte nach Quinacrin-Färbung; Quinacrin färbt besonders AT-reiche Abschnitte an (3 oder mehr AT-Basenpaare) und entspricht damit weitgehend den G-Banden. R-Banden (engl. reversed bands) erkennt man nach einer Behandlung mit Fluoreszenzfarbstoffen, die bevorzugt GC-reiche DNA anfärben (z. B. Mithramycin, Acridinorange). Schließlich findet man C-Banden nach Behandlung der Chromosomen mit Alkali und Säure und anschließender Giemsa-Färbung. Prominente C-Banden sieht man an den Chromosomen 1, 9, 16 und dem distalen Y-Chromosom. Das C-Bandenmuster variiert beträchtlich innerhalb einer Population („Heteromorphismus“). Die C-Banden entsprechen dem konstitutiven Heterochromatin (s. u.); das sind Bereiche, die nur wenige Gene enthalten und nicht transkribiert werden. Die C-Bandenmuster sind erblich und wurden früher als genetische Marker verwendet. Dass es sich hierbei um keine zufälligen Eigenschaften chromosomaler Verpackung handelt, wird durch zwei Tatsachen belegt. Zum einen findet man, dass bestimmte Bänderungsmuster im Laufe der Evolution, zwar in veränderten chromosomalen Positionen, aber im Übrigen doch strikt konserviert erhalten bleiben. Solche Befunde wurden vor allem bei der vergleichenden Untersuchung von Primatenkaryotypen gemacht. Offenbar bleiben bestimmte Genkombinationen in der gleichen Gruppierung von Banden erhalten, durchlaufen aber chromosomale Verschiebungen ganzer Gruppen von Banden. Zum anderen weisen bestimmte Bandenmuster wie das G- und das R-Bandenmuster eine enge Korrelation zur DNA-Synthese der betreffenden Chromosomenabschnitte auf. Das zeigt, dass die Möglichkeit, bestimmte Chromosomenbereiche differenziell zu färben, eine grundlegende strukturelle Eigenschaft der Organisation von Chromosomen reflektiert. Die Erstellung von Bänderungskarten der menschlichen Chromosomen hat große Bedeutung für die genetische Kartierung erlangt. Nicht nur Stammbaumanalysen in Zusammenhang mit erblichen Krankheiten, sondern auch molekulare Techniken, mit denen die Isolierung menschlicher Gene möglich ist, gestatten es, durch geeignete Methoden deren chromosomale Lokalisation in bestimmten Chromosomenbanden zu ermitteln. Es sind umfangreiche Genkarten mithilfe dieser Techniken erstellt worden. Zu Details siehe Technik-Box 14. Die Darstellung und Beschreibung menschlicher Chromosomen wurde 1971 auf einer Konferenz in Paris normiert. Grundlage ist ein idealisiertes Karyogramm („Ideogramm“; Abb. 6.2), das auf einer GiemsaFärbung der Chromosomen basiert. Entsprechende

positive und negative Banden ergeben zusammen mit den Einschnürungen des Centromers charakteristische Muster. Die unterschiedlichen Arme werden mit p (franz. petit) und q (franz. queue) abgekürzt. Die einzelnen Regionen und die jeweiligen Banden in den Regionen eines Arms werden vom Centromer aus mit

q

p

11,2 11,1 11 12,11 12,13 12,3 13,1 13,2 13,3 14,11 14,13 14,2 14,3 21,1 21,2 21,31 21,32 21,33 22,2

12

13

44

43

42,2 42,3

42,12 42,13

31,1 31,2 31,3 32,2 32,1 32,3 33,1 33,2 33,3 33,4

22,1 22,3

14,12

12,12 12,2

42,11

32,2 32,3 41

32,1

31,1 31,2 31,3

25,3

23,1 23,2 23,3 24,1 24,2 24,3 25,1 25,2

21,1 21,2 21,3 22

12

21,1 13,3 13,2 13,1 12 11,2 11,1 11

21,2

22,3 22,2 22,1 21,3

31,1

31,3 31,2

32,3 32,2 32,1

13

1

q

p

q

p

32,11 32,13 32,31

31,2

23,2

22,2

21,2

13,2

36,2

21,3 22,1 22,3 23,1 23,3 24,1 24,2 24,3 31,1 31,3 32,12 32,2 32,32 32,33

12 13,1 13,3 21,1

11,2

11,1 11,1

11,2

12

13

37,1 37,2 37,3

35 36,1 36,3

31,1 31,2 31,3 32,1 32,2 32,3 33,1 33,2 33,3 34

11,1 11,1 11,2 12,1 12,2 12,3 13 14,1 14,2 14,3 21,1 21,2 21,3 22,2 22,1 22,3 23,1 23,2 23,3 24,1 24,2 24,3

11,2

12

25,1 24,3 24,2 24,1 23,3 23,2 23,1 22,3 22,2 22,1 21 16,3 16,2 16,1 15 14 13,2 13,2 13,1

25,3 25,2

14

2

q

p

q

p

26,3 26,1 25,3 25,2 25,1 24,3

12

13

11,2 11,1 11,1 11,2 12 13,1 13,2 13,3 14 15,1 15,2 15,3 21,1 21,2 21,3 22,1 22,2 22,31 22,32 22,33 23 24,2 24,1 24,3 25,1 25,2 25,3 26,1 26,2 26,3

22,2

24,1 23 22,3 22,1 21,33 21,32 21,31 21,2 21,1 14,3 14,2 14,1 13 12,3 12,1 11,1 11,1 11,2 12,1 12,3 13,11 13,13 13,31 13,33 21,1 21,2 21,3 22,1 22,2 22,3 23 24 25,1 25,2 25,31 25,32 25,33 26,1 26,2 26,31 26,32 26,33 27,1 27,2 27,3 28 29

24,2

26,2

15

3

q

p

q

p

23,2 23,3 24,2 24,1 24,3

22,1 22,2 22,3 23,1

12,1 12,2 13 21

11,2

11,2 11,1 11,1

13,2 13,13 13,12 13,11 12,3 12,2 12,1

13,3

31,1 31,21 31,22 31,23 31,3 32,1 32,2 32,3 33 34,1 34,2 34,3 35,1 35,2

28,3

26 27 28,1 28,2

14 13 11 11 12 13,1 13,2 13,3 21,1 21,21 21,23 21,2 21,3 22,1 22,2 22,3 23 24 25 12

16,3 16,2 16,1 15,33 15,32 15,31 15,2 15,1

16

4

q

p

q

p

11,1 11,1 11,2 12 21,1 21,2 21,31 21,32 21,33 22 23,1 23,3 23,2 24,1 24,2 24,3 25,1 25,2 25,3

11,2

13,3 13,2 13,1 12

15 21,1 21,2 21,3 22,1 22,2 22,3 23,1 23,2 23,3 31,1 31,2 31,3 32 33,1 33,2 33,3 34 35,1 35,2 35,3

14,3

12,1 12,2 12,3 13,1 13,2 13,3 14,1 14,2

15,33 15,32 15,31 15,2 15,1 14,2 14,3 14,1 13,3 13,2 13,1 12 11 11,1 11,2

17

5

q

p

q

p

21,1

12,2 12,3

12,1

11,1 11,2

11,22 11,21 11,1

11,32 11,31

21,2 21,31 13,32 21,33 22,1 22,2 22,3 23

11,23

22,1 22,2 22,31 22,32 22,33 23,1 23,2 23,3 24,1 24,2 24,3 25,1 25,2 25,3 26 27

21

12 13 14,1 14,2 14,3 15 16,1 16,2 16,3

12,3 12,2 12,1 11,2 11,1 11,2 11,1

25,3 25,1 24,3 24,2 24,1 23 22,3 22,2 22,1 21,33 21,32 21,31 21,2 21,1 25,2

18

6

q

p

q

p

22,3 22,2 22,1 21,3

22,2 22,3 31,1 31,2 31,31

22,1

21,3

13,11 12 11 11 12 13,11 13,12 13,13 13,2 13,31 13,32 13,33 13,41 13,42 13,43

13,2 13,13 13,12

13,3

31,32 31,33 32,1 32,2 32,3 33 34 35 36,1 36,2 36,3

21,2

21,11 21,12 21,13

11,23

13 12,3 12,2 12,1 11,2 11,1 11,1 11,21 11,22

21,1 15,3 15,2 15,1 14,2 14,3 14,1

21,2

19

7

q

q

p

12,3 12,2 12,1 11,23 11,22 11,21 11,1 11,1 11,21 11,22 11,23 12 13,11 13,12 13,13 13,2 13,31 13,32 13,33

13

11,23 11,22 11,21 11,1 11,1 11,21 11,22 11,23 12,1 12,2 12,3 13,1 13,2 13,3 21,11 21,12 21,13 21,2 21,3 22,1 22,2 22,3 23,1 23,2 23,3 24,11 24,12 24,13 24,21 24,22 24,23 24,3

22 21,3 21,2 21,1 12

23,1

23,3 23,2

20

8

q

p

q

p p

21,33 22,1 22,2 22,31

21,31

13 21,11 21,13

12

11

11,1

12

13,3 13,2

11,2 11,1 21,2 11,1 21,1 21,2 21,2 21,3 22,12 21,2 22,2 22,3

12

13

22,33 31,1 31,2 31,3 32 33,1 33,2 33,3 34,11 34,12 34,13 34,22 34,3

22,32

21,32

21,2

21,12

11,2

13,1

24,3 24,2 24,1 23 22,3 22,2 22,1 21,3 21,2 21,1

21

9

21,3

21,1

q

p

11,21 11,22 11,23 12,1 12,2 12,3 13,1 13,2 13,31 13,33 13,32

11,2 11,1 11,1

12

13

22,1 22,2 22,3 23,1 q 23,2 23,31 23,32 23,33 24,1 24,2 24,31 24,32 24,33 25,1 25,2 25,3 26,11 26,12 26,13 26,2 26,3

21,2

15,3 15,2 15,1 14 p 13 12,33 12,32 12,31 12,2 12,1 11,23 11,22 11,21 11,1 11,1 11,21 11,22 11,23

22

10

q

p

14,2

24,1 24,2 24,3 25

23,3

13,3 13,4 13,5 14,1 14,2 14,3 21 22,1 22,2 22,3 23,1 23,2

11,2 11,12 11,11 11 21,1 12,2 12,3 13,1 13,2

12

13

14,3 14,1

15,4 15,3 15,2 15,1

15,5

11

q

p

q

p

12

11,32 11,31 11,2 11,1 11,1 11,21 11,22 11,23

24,32 24,33

13,33 13,32 13,31 13,2 13,1 12,3 12,2 12,1 11,23 11,22 11,21 11,1 11 12 13,11 13,12 13,13 13,2 13,3 14,1 14,2 14,3 15 21,1 21,2 21,31 21,32 21,33 22 23,1 23,2 23,3 24,11 24,12 24,13 24,21 24,22 24,23 24,31

Y

12

q

p

28

26,1 26,2 26,3 27,1 27,2 27,3

25

24

23

11,23 11,22 11,21 11,1 11,1 11,2 12 13,1 13,2 13,3 21,1 21,2 21,31 21,32 21,33 22,1 22,2 22,3

11,4 11,3

22,2 22,13 22,12 22,11 21,3 21,2 21,1

22,31

22,33 22,32

X

Abb. 6.2 Menschliche Chromosomen mit 850 Banden. Die relative Länge von Chromosomen und Banden basiert auf exakten Messungen. (Aus Vogel u. Motulsky 1996, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

q

p

36,33 36,32 36,23 36,22 36,21 36,13 36,12 36,11 35,2 35,3 35,1 34,3 34,2 34,1 33

36,31

6.1 Das eukaryotische Chromosom

steigenden Zahlen durchnummeriert: Die erste Bande in der zweiten Region des kurzen Arms von Chromosom 1 ist 1p21. Die Verbesserung der Auflösung hat allerdings zu einer Ausweitung des Systems geführt. Im Beispiel der Abb. 6.3 ist das Chromosom 14 in verschiedenen Auflösungsstufen gezeigt: 14q32 bezeich-

223

Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

p

1

1

q

2

3 2 1 1 2 3 1 2 3

,2 ,1 ,1 ,2

4

1

3 2 ,2 1 ,1

1

1

1

2

1 2 3

1

,3 ,1

1 ,2 ,3 ,3

Bande

2 ,1

,1

,1

3

,1

3 ,2

2 ,2

4 ,2

2

,2 ,1

,2

1

2

1 Region

3 2

,1

1 ,2 2 3

1 3

Arm

224 224

,3 ,1

3 ,2

,1

,3 ,1

2 ,2

4 ,2 ,3

,3

Bande 14q32

net Chromosom 14, den langen Arm, Region 3, Bande 2. Hochauflösende Aufnahmen zeigen allerdings 3 Unterbanden dieser Bande. Um dies darzustellen, wird nach einem Punkt die entsprechende Nummer der Unterbande angefügt; die distale Unterbande wird also als 14q32.3 bezeichnet (Nummerierung vom Centromer aus!). Bei noch höherer Auflösung erweitert sich die Bezeichnung auf 14q32.33 für die letzte Bande. Die bisher letzte Fassung der Nomenklatur-Regeln stammt aus dem Jahre 2005 (Shaffer u. Tommerup 2005).

,1

1 ,2 ,3

Unterbande 14q32.3

3 2

,11 ,12 ,13 ,2 ,31 ,32 ,33

Unterbande 14q32.33

Abb. 6.3 Idealtypisches Karyogramm des menschlichen Chromosoms 14 nach Giemsa-Färbung bei verschiedenen Auflösungen (Stufe 320, links; Stufe 500, Mitte, und Stufe 900, rechts). Man teilt die Regionen in Banden ein, die vom Centromer weg nach außen gezählt werden, die mit q11 (einseins, nicht elf!), q12, q13 usw. bezeichnet werden. Die Unterbanden, die bei Stufe 500 sichtbar werden, werden mit einer Dezimalstelle angegeben; die Unterbanden ab Stufe 900 mit zwei Dezimalstellen, jeweils mit einem Punkt getrennt (kein Komma). (Nach Miller u. Therman 2001, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Abb. 6.4 Neue Untersuchungstechniken gestatten es, die einzelnen Chromosomen individuell zu färben und somit eindeutig zu identifizieren. Da diese Färbung auf in-situ-Hybridisierung mit chromosomenspezifischen Proben durchgeführt werden, können nicht nur Aneuploidien, sondern auch Translokationen leicht erkannt und bestimmten Chromosomen zugeordnet werden. (Foto: Ilse Chubda)

Eine genauere Analyse ist jedoch aus humangenetischer Sicht, insbesondere für die Chromosomenanalyse in Zusammenhang mit genetischer Familienberatung, von entscheidender Bedeutung. Die Anwendung differenzieller Färbungsmethoden hat früher ungeahnte Möglichkeiten für eine äußerst genaue Kartierung jedes einzelnen Chromosoms gegeben. Hinzu kommen neue Techniken der in-situ-Hybridisierung (Chromosomenpainting), die den Anwendungsbereich der Bänderungstechniken signifikant erweitern (Abb. 6.4 und 6.5).

Nukleolusbildungsorte Betrachtet man Chromosomen genauer, so erkennt man in einzelnen Chromosomen eines Chromosomensatzes neben der primären Konstriktion im Bereich des Centromers (S. 227) eine weitere Einschnürung (sekundäre Konstriktion; Abb. 6.6a). In cytologisch günstigen Fällen kann man erkennen, dass an dieser Stelle des betreffenden Chromosoms während der Interphase und der frühen Prophase der Nukleolus mit dem Chromosom verbunden ist (Abb. 6.6b). Wir wissen heute, dass der Nukleolus von diesem Chromosomenbereich her gebildet wird. Er wird daher auch Nukleolusbildungsort oder Nukleolusorganisator (engl. nucleolus organizer region, NOR) genannt. NORs befinden sich, je nach Organismus, nur an einem Teil der Chromosomen. Sie sind für die Zelle lebenswichtig, da sie die Gene für ribosomale RNA tragen, die als struktureller Bestandteil der Ribosomen für die Proteinsynthese erforderlich ist (S. 82). Der Nukleolus ist ein Organell, dessen Bildung den funktionellen Zustand der betreffenden Gene anzeigt (Kapitel 3.4), und er ist daher in allen stoffwechselaktiven Zellen zu finden. Die Anzahl der NORs in den Metaphasechromosomen stimmt nicht immer mit der Anzahl der in der Interphase sichtbaren Nukleoli überein. Hierfür gibt es zwei Ursachen: Erstens neigen Nukleoli in vielen Organismen zur Verschmelzung. Diese kann soweit gehen, dass nur ein Nukleolus sichtbar ist, obwohl mehrere NORs im Genom enthalten sind. Zweitens hat man beobachtet, dass in manchen Zellen nicht alle NORs aktiv werden und einen Nukleolus bilden.

6.1 Das eukaryotische Chromosom

Abb. 6.5 Chromosomenpainting durch Fluoreszenz-in-situHybridisierung (FISH) mit einer DNA-Sequenz, die spezifisch Chromosom 11 erkennt. Der Karyotyp zeigt eine Metaphase aus HeLa-D98/AH-2-Zellen. Es handelt sich um eine Zellkultur eines hochmalignen cervikalen Adenokarzinoms des Menschen (Patient: Henrietta Lacks, daher HeLa), die seit Langem als Standardzellkultur gebraucht wird. Der Karyotyp der HeLaD98/AH-2-Linie ist im Gegensatz zu vielen anderen Zellkulturen besonders stabil. Er zeigt in mehr als 50 % der Zellen 61 Chromosomen, mit spezifischen Monosomien, Trisomien und Markerchromosomen, die von Chromosomenrearrangements abstammen. Die Identität verschiedener dieser Chromosomen konnte erst durch FISH ermittelt werden, da auch die Analyse der Bandenmuster keinen vollständigen Aufschluss über die Herkunft der Fragmente erbrachte. Die Fluoreszenz identifiziert spezifisch und ausschließlich Chromosom 11. Die zur Hybridisierung verwendete Probe besteht aus einer Mischung von DNA-Sequenzen, die ausschließlich auf Chromosom 11 zu finden sind. (Foto: D. Rueß und C. Grond, Heidelberg)

Abb. 6.6 a, b Lokalisation des Nukleolus im Chromosom. Sekundäre Konstriktion (Pfeile) an der Stelle des Nukleolusorganisators im X-Chromosom von PtK1-Zellen (Marsupialia). b Elektronenmikroskopische Darstellung des Nukleolus in Riesenchromosomen von Chironomus thummi. Der Nukleolus umgibt das 4. Chromosom ringförmig. (a aus Robert-Fortel et al. 1993, mit freundlicher Genehmigung von Springer; b Foto: Ch. Holderegger, Zürich)

Die sekundäre Einschnürung (Konstriktion) in man-

chen Chromosomen kennzeichnet die chromosomale Region, in der während der Interphase der Nukleolus gebildet wird. Sie wird daher auch Nukleolusbildungsort genannt.

Es soll noch erwähnt werden, dass sekundäre Konstriktionen bisweilen weit terminal im Chromosom auftreten und dann einen kurzen Chromosomenbereich abtrennen, den man als Satelliten bezeichnet. E. Heitz hat für solche Chromosomen auch den Namen SATChromosomen eingeführt. Die Konstriktion kann in einem solchen Fall eine NOR-Region enthalten oder auch nicht. Einige Hinweise auf eine besondere molekulare Chromosomenstruktur in solchen Bereichen hat man in jüngster Zeit durch die Analyse des Fragilen-X-

Syndroms erhalten (Kapitel 12.3.3). Hier findet man, dass die erhöhte Bruchhäufigkeit mit einer besonderen Sequenzstruktur der DNA verbunden ist. Man kann allgemeiner davon ausgehen, dass hier eine strukturelle Organisation innerhalb der Chromatiden vorliegt, die vielleicht mit der Anwesenheit von Heterochromatin korreliert ist. Der cytologische Begriff des Satelliten, wie er hier definiert ist, darf nicht mit dem Begriff Satelliten-DNA verwechselt werden (S. 228). Es besteht kein Zusammenhang zwischen beiden Erscheinungen.

Euchromatin und Heterochromatin Bereits an ungefärbten Metaphasechromosomen, deutlicher aber in gefärbten Chromosomenpräparaten, kann man erkennen, dass Chromosomen nicht gleich-

225

226 226

Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Abb. 6.7 a–c Prometaphasechromosomen aus Gehirnganglien verschiedener Drosophila-Arten. Neben der unterschiedlichen Form der Geschlechtschromosomen (X und Y) sind stärker gefärbte, heterochromatische Bereiche zu erkennen. Diese umfassen einen Arm der X-Chromosomen, die gesamten Y-Chromosomen und die Centromerbereiche der Autosomen (A) Balken: 5μm. a Drosophila hydei, b D. neohydei, c D. eohydei. (Nach Hennig 1978)

förmig strukturiert sind, wenn man einmal von den bereits besprochenen Strukturelementen absieht. Sie sind in kompaktere – und zugleich auch stärker anfärbbare – Abschnitte und weniger kompakte Bereiche unterteilt. Kompakte Chromosomenregionen findet man regelmäßig um die Centromerbereiche herum, manchmal auch terminal, oder sie umfassen ganze Chromosomenarme oder sogar ein ganzes Chromosom (Abb. 6.7). Aufgrund ihrer stärkeren Färbbarkeit führte E. Heitz (1928) für sie die Bezeichnung Heterochromatin ein. Eine einfache Erklärung für die stärkere Färbbarkeit ist, dass die Chromatiden in solchen Chromosomenbereichen stärker kondensiert (verpackt) sind, sodass sie höhere Konzentrationen an DNA enthalten. Heterochromatische Chromosomenbereiche sind übrigens nicht nur in Pro- und Metaphasechromosomen erkennbar, sondern bleiben auch in der Interphase sichtbar, da sie im Allgemeinen nicht an der Dekondensation der Chromosomen während der Telophase teilnehmen, sondern in ihrem kondensierten Zustand verbleiben und zudem oft im Interphasekern miteinander verschmelzen. Auch dieses Verhalten weist auf besondere Eigenschaften des Heterochromatins hin. Chromosomale Regionen, die in allen Zellen in beiden homologen Chromosomen an der gleichen Stelle heterochromatisch bleiben, bezeichnet man als konstitutives Heterochromatin (z. B. Centromer-, Telomer- und Nukleolusorganisator-Regionen). Kennzeichnendes Merkmal für konstitutives Heterochromatin ist sein hoher Anteil an repetitiven, nichtcodierenden Sequenzen, die wenige Gene enthalten. Im Gegensatz dazu betrifft fakultatives Heterochro-

matin nur einen von zwei homologen Partnern; das bekannteste Beispiel sind die Barr-Körper als Ausdruck des inaktivierten X-Chromosoms bei Säugern (Kapitel 6.3.3). Im Gegensatz dazu findet man in den schwächer gefärbten Bereichen (Euchromatin) aktive Gene. In diesen Bereichen kann die DNA von DNase I leichter geschnitten werden, da das Chromatin eine offenere Konfiguration hat, um so Transkriptionsfaktoren und RNA-Polymerasen den Zugang zu erleichtern (aber eben auch den Nukleasen). In der selben Zeit, als Heitz das Heterochromatin beschrieb, beobachtete H. J. Muller bei Drosophila-Mutanten, dass Gene, die aus dem Euchromatin durch chromosomale Rearrangements in heterochromatische Bereiche umgelagert wurden, dadurch inaktiviert werden (Muller 1930). Dieser Positionseffekt wurde später für viele Gene nachgewiesen (engl. position effect variegation, PEV) und gilt unabhängig davon, zu welcher Zeit und in welchem Gewebe das jeweilige Gen ursprünglich exprimiert wurde. Weitere genetische Tests ergaben, dass der Prozess der Inaktivierung selbst Gegenstand von Modifikationen sein kann; so wurden zwei Gene identifiziert, die diesen Positionseffekt verstärken bzw. unterdrücken können (engl. Enhancer of variegation, E(var), bzw. Suppressor of variegation, Su(var)). Su(var)3-9 codiert für eine Methyltransferase und methyliert im Histon H3 das Lysin an der Position 9; das so modifizierte Histon H3 wird als ein Dimer von HP1 (heterochromatisches Protein 1) gebunden und führt zu einer stärkeren Kondensation des Chromatins.

6.1 Das eukaryotische Chromosom

Einige Chromosomenbereiche zeichnen sich durch

differenzielle Färbungseigenschaften aus, die auf einem höheren Kondensationsgrad dieser Chromosomenregion beruhen. Solche Chromosomenabschnitte werden als heterochromatisch bezeichnet; in diesen Bereichen findet üblicherweise keine Transkription statt.

Die Regel, dass Gene im Heterochromatin nicht exprimiert werden, stimmt allerdings nicht vollständig. So veröffentlichte J. Schultz 1936 seine Beobachtungen, dass das light-Gen von Drosophila sogar heterochromatische Strukturen braucht, um exprimiert zu werden. Durch klassische genetische Analyse wurde diese Beobachtung bei Drosophila auf etwa 40 Gene ausgeweitet. Durch die vollständige Sequenzierung des Drosophila-Genoms konnte gezeigt werden, dass im Heterochromatin von Drosophila etwa 450 exprimierte Gene liegen, das sind ~ 2,7 % aller Gene dieser Spezies. Die Mechanismen, die hinter diesen Befunden liegen, werden noch intensiv bearbeitet; es kann erwartet werden, dass wir einige interessante Aspekte über die Evolution von Genen und ihren Funktionen erfahren. Für eine aktuelle Übersicht sei auf Yasuhara und Wakimoto (2006) verwiesen.

6.1.3 Das Centromer Das Centromer ist wichtig, um das Chromosom während der Mitose mit den Spindeln zu verknüpfen und damit eine korrekte Verteilung auf die beiden Tochterzellen zu gewährleisten. Fehlfunktionen des Centromers führen dazu, dass die Verteilung entweder ganz unterbleibt (engl. nondisjunction) oder zumindest fehlerhaft verläuft. Dabei werden die Begriffe „Centromer“ und „Kinetochor“ leider oft als austauschbar benutzt. Um Unklarheiten zu vermeiden, soll der Begriff Centromer verwendet werden, um den Chromatin-Kern (mit den Histonen) an der primären Konstriktion zu beschreiben (erkennbar als Einschnürung schon in der Prophase). Der Begriff Kinetochor soll dagegen verwendet werden, um den Proteinkomplex zu beschreiben, der am Centromer die Anheftung der Spindel vermittelt und die Bewegung des Chromosoms in der Metaphase der Mitose und Meiose bewirkt (Abb. 6.8; Kapitel 5.3.1 und 5.3.2). Chromosomen, denen das Centromer mit Kinetochor fehlt, können bei der Zellteilung nicht korrekt verteilt werden und gelangen entweder durch Zufall in die eine oder andere Tochterzelle oder gehen ganz verloren. Beispiele für solche Chromosomen sind manche B-Chromosomen, die in der Keimbahn einiger Organismen vorkommen und

Abb. 6.8 a, b Das Kinetochor. a Schematische Darstellung eines mitotischen Chromosoms mit gepaarten Schwesterchromatiden. Die Chromatide auf der rechten Seite ist an Mikrotubuli gebunden, während die linke frei ist. Einige Elemente, die bei elektronenmikroskopischen Darstellungen sichtbar werden, sind angedeutet (innere und äußere Platte des Kinetochors, Mikrotubulus und die faserige Corona). b Elektronentomographische Darstellung eines Schnitts durch ein Kinetochor eines Metaphasechromosoms (PtK1-Zellen, Marsupialia). Man erkennt zwei Mikrotubuli, die in der äußeren Platte des Kinetochors enden; die Enden der Mikrotubuli sind gebogen. Balken: 200 nm. (a nach Cheeseman u. Desai 2008, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group; b nach McEwen et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

durch Zufallsverteilung in den prämeiotischen und meiotischen Teilungen an die Tochterzellen weitergegeben werden (S. 253). Andere centromerenlose Chromosomen entstehen als Folge von strukturellen Veränderungen in Chromosomen. Diese defekten Chromosomen gehen bei der nächstfolgenden Zellteilung ver-

227

228 228

Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Abb. 6.9 Das Centromer und die perizentrische Region. Das Centromer 1 der Spalthefe umfasst etwa 35 kb und besteht aus einem zentralen Kernbereich (cnt) mit nicht-repetitiven Sequenzen in der Mitte, aber flankierenden repetitiven Element (imr), und äußeren Regionen (otr), die aus zwei Elementen (schwarz/weiß) aufgebaut sind. Die kurzen vertikalen Linien repräsentieren tRNA-Gene, die an den Übergängen der Domänen vorkommen. Der zentrale Kernbereich verfügt über ein unübliches Chromatin, bei dem das Histon H3 durch das Centromerprotein A (CENP-A) ersetzt ist. Auf dieser Plattform

wird das Kinetochor zusammengefügt. Die äußeren Regionen bestehen aus repetitiven Elementen, die in Nukleosomen verpackt sind (Abb. 6.17). Allerdings sind die Nukleosomen aufgrund der Wirkung von Histon-Deacetylasen (HDACs) schwächer acetyliert, sodass Wechselwirkungen mit Cohesin (Abb. 5.15) möglich werden. Außerdem spielt die RNAi- und siRNA-Maschinerie eine wichtige Rolle bei der Etablierung des Heterochromatins (Kapitel 7.5). (nach Pidoux u. Allshire 2005, mit freundlicher Genehmigung der Royal Society)

loren (Kapitel 9.3). Das Centromer ist zudem für den Zusammenhalt der Chromatiden bis zur Anaphase bzw. der Homologen in der meiotischen Anaphase I verantwortlich.

denen Proteine, die spezifisch an den Centromerbereich binden, gibt Abb. 6.9. Gene, die in diesen Bereich gelangen, werden transkriptionell abgeschaltet. An den inneren Kernbereich bindet das Kinetochor, das damit in ein Meer stillen Chromatins eingebettet ist. Dieser Bereich ist sehr AT-reich; die jeweiligen Randsequenzen der zentralen Domäne sind spezifisch für jedes Chromosom. Auch die Proteinzusammensetzung des Centromers unterscheidet sich deutlich vom Rest der Chromosomen, wie wir weiter unten sehen werden. Zu den bisher identifizierten Säuger-Centromerproteinen (CENP) gehören: ï CENP-A: Es ist nur in aktiven Centromeren vorhanden und zeigt Ähnlichkeit zu Histon H3. ï CENP-B: Es bindet an die DNA in der CENP-Box, die man in menschlicher α-Satelliten-DNA (Centromer-assoziiert) und in der Mini-SatellitenDNA der Maus findet. Deletion des Gens für CENP-B in Mäusen zeigt keine phänotypischen Effekte. ï CENP-C: Es ist nur in aktiven Centromeren vorhanden. Im Gegensatz zu CENP-B ist es für die Centromerenfunktion erforderlich. ï CENP-E: Es ist möglicherweise ein Motorprotein für die Bewegung der Chromosomen in der Spindel.

Die Form der Chromosomen wird durch das Centro-

mer bestimmt. Die Region des Centromers bildet in der Metaphase die primäre Konstriktion. Sie dient dem Ansatz der Spindelfasern, die für die Verteilung der Chromatiden während der Zellteilung sorgen

Das Chromatin des Centromers ist cytologisch von dem Rest des Chromosoms verschieden und besteht aus konstitutivem Heterochromatin. Die DNA im Centromerbereich besteht aus einer Vielzahl repetitiver Elemente (die allerdings zwischen den Organismen nicht konserviert sind), dazu gehören die α-Satelliten bei Menschen, die Mini-Satelliten bei der Maus oder AATAT- und TTCTC-Satelliten bei Drosophila. Bei der Spalthefe umfasst der Centromerbereich 35‒110 kb und ist aus einer Kernregion und einer äußeren Region zusammengesetzt; dabei bestehen die äußeren Bereiche aus repetitiven Elementen und entsprechen dem transkriptionsinaktiven Heterochromatin. Eine Übersicht über die repetitiven DNA-Elemente und die verschie-

6.1 Das eukaryotische Chromosom

Außerdem ist im Centromerbereich Topoisomerase IIa vertreten, die für Chromosomenkondensation und die Trennung von Schwesterchromatiden erforderlich ist. Weiterhin sind Proteinkinasen gefunden worden, deren Funktion wahrscheinlich mit der Anheftung der Chromosomen an die Spindel zusammenhängt.

Repetitive DNA-Elemente sind Grundbestandteile al-

ler Centromerbereiche. Sie sind in bestimmten Mustern organisiert, und diese sind chromosomen- und artspezifisch. Besondere Centromerproteine erlauben eine veränderte Packungsdichte am Centromer.

Wenn es darum geht, bestimmte Genomabschnitte für die Methylierung der Histone und die nachfolgende Ausbildung von Heterochromatin zu kennzeichnen, spielen offensichtlich auch kleine RNA-Moleküle eine wichtige Rolle. Dies gilt für die Ausbildung des Heterochromatins am Centromer in ähnlicher Weise, wie wir es später für die Inaktivierung des X-Chromosoms (Kapitel 6.3.3) und als generellen Mechanismus bei der RNA-Interferenz (Kapitel 7.5) kennenlernen werden. Hinweise auf die Beteiligung kleiner RNA-Moleküle lieferten Mutanten der Spalthefe, die diesen Mechanismus betreffen – diese Mutanten sind nicht in der Lage, eingefügte Reportergene an dieser Stelle zu inaktivieren. Eine wesentliche Rolle spielen hierbei die Transposon-ähnlichen Wiederholungseinheiten, die die Centromerregion flankieren (zur Übersicht siehe Horn u. Peterson 2006).

Abb. 6.10 Verlust der Telomere führt zu genomischer Instabilität. Die Abbildung zeigt Chromosomen einer embryonalen Fibroblastenzelle der Maus in der Metaphase; die DNA fluoresziert rot und die Telomer-Signale grün (Oligonukleotid gegen die repetitive Telomersequenz TTAGGG). Fusionen der Enden linearer Chromosomen treten auf, wenn die schützende „Kappe“ verloren geht, die üblicherweise an den Chromosomenenden vorhanden ist. Da die Telomersequenz selbst noch vorhanden ist (grüne Fluoreszenz), ist die Ursache der Instabilität hier also nicht der Verlust der Telomersequenz, sondern eines damit assoziierten Proteins, TRF2 (engl. telomere repeat binding factor 2). (Nach Bertuch u. Lundblad 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

6.1.4 Das Telomer Telomere sind cytologisch durch keine besonders auffälligen Strukturen gekennzeichnet; sie erscheinen heterochromatisch, wenn sie überhaupt als besonderer Chromosomenabschnitt erkennbar sind. Auf ultrastrukturellem Niveau lassen sie im Zygotän eine Verdickung erkennen, die zunächst von der Bildung des synaptonemalen Komplexes ausgeschlossen ist: Die Paarung der Homologen beginnt meist in einem Chromosomenbereich, der etwas proximal des Telomers liegt. Das weist auf einen gewissen Sonderstatus der Chromosomenenden hin. Nach Abschluss der Homologenpaarung im Pachytän sind jedoch auch die Telomere vollständig an der Bildung des synaptonemalen Komplexes beteiligt. Entfernt man allerdings ein Telomer durch Röntgenstrahlen, die einen Bruch induzieren, so wird das Chromosom instabil. Verkürzte und damit instabile Telomere sind charakteristische Eigenschaften altersabhängiger Erkrankungen, des Vergreisungssyndroms (engl. premature ageing syndrome) und

einiger Krebserkrankungen. Ein Beispiel von solchen instabilen Chromosomen ist in Abb. 6.10 gezeigt; hier führt die Telomer-abhängige Instabilität zu Fusionen verschiedener Chromosomenenden. Funktionell sind den Telomeren besondere Aufgaben zuzuweisen: ï Sie müssen Fusionen mit anderen Chromosomen verhindern und die Enden der DNA-Doppelhelix gegen exonukleolytische Angriffe schützen. ï Sie müssen besondere Eigenschaften besitzen, um die vollständige Replikation der Doppelhelix zu ermöglichen. ï Sie tragen zur spezifischen Lokalisation der Chromosomen im Kern bei. In der meiotischen Prophase sind sie oft mit der Kernmembran assoziiert. Diese unterschiedlichen Aspekte der Funktion müssen sich in einer entsprechenden molekularen Struktur widerspiegeln. Eine besondere molekulare Struktur der

229

230 230

Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

DNA am Telomer ist auch zu erwarten, wenn man sich den Mechanismus der DNA-Replikation vergegenwärtigt. Im Gegensatz zur Synthese des leading strand, die bis zum Ende der chromosomalen DNA durchläuft, kann der komplementäre Strang (lagging strand) nicht bis zum Ende repliziert werden, da die DNA-Polymerase nicht imstande ist, Nukleotide an 5’-Enden anzufügen. Die Synthese dieses Strangs muss daher über RNAPrimersequenzen und Okazaki-Fragmente erfolgen. Es wäre durchaus denkbar, dass an einem Ende der Chromatiden eine Einzelstrang-DNA vorhanden ist. Das würde aber Probleme bei der folgenden Replikation ergeben: Dieser Bereich könnte überhaupt nicht mehr repliziert werden, sodass die Chromatide an einem Ende ständig kürzer werden würde. Diese Probleme und verschiedene Formen ihrer Lösung wurden ausführlich in Kapitel 2 erörtert (Abb. 2.20 und 2.21).

Wichtige Strukturelemente der Chromosomen sind

deren Enden, die als Telomere bezeichnet werden. Chromosomenarme ohne Telomer sind instabil.

Molekulare Telomerstruktur von Säugern Telomere sind genarme chromosomale Regionen, die durch repetitive DNA-Elemente gekennzeichnet sind; diese bestehen in ihrem Grundgerüst aus dem Hexamer TTAGGG (zur Übersicht siehe Abb. 6.11). Neben den repetitiven DNA-Elementen sind bestimmte Proteine für das Telomer charakteristisch; dazu gehören TRF1 und TRF2 (engl. telomere repeat binding factor), die an diese Hexamere und weitere Faktoren binden können. Ein drittes Charakteristikum ist ein einzelsträngiger Überhang von insgesamt 150 bis 200 Nukleotiden, der aus dem TTAGGG-Hexamer aufgebaut ist und als „G-reicher Überhang“ bezeichnet werden kann. Die Telomerase (Gensymbol Tert) ist eine reverse Transkriptase, die die 3’-OH-Gruppe am Ende dieses Überhangs erkennt und von dort das Telomer verlängert, indem sie daran ein RNA-Molekül als Matrize anfügt (Gensymbol Terc). Der G-reiche Überhang kann sich aber auch zurückfalten und mit der doppelsträngigen Region des TTAGGG-Elementes in Wechselwirkung treten. Die entstehende Struktur wird als Telomer-Schlaufe (engl. T-loop) bezeichnet und behindert den Zugang der Telomerase. Offensichtlich enthält das Telomer aber auch Histone, und zwar in Modifikationen, wie wir sie bereits oben für das konstitutive Heterochromatin kennengelernt haben (mehrfache Methylierungen am Lys-9 [Histon 3] bzw. Lys-20 [Histon 4]). An diesen Methylierungen sind auch Proteine der RetinoblastomaFamilie beteiligt, die wir schon bei der Zellzyklusregulation kennengelernt haben (Kapitel 5.3.5) und auch als

klassische Tumorsuppressorgene noch kennenlernen werden (Kapitel 12.4.1). In Abwesenheit der Retinoblastoma-Proteine geht diese Histon-Methylierung schnell verloren; außerdem werden die Telomere länger. Viele Argumente sprechen daher dafür, dass die Methylierung der Histone im Wesentlichen dazu führt, in Wechselwirkung mit der Vielzahl von Proteinen (Abb. 6.11) eine hochkompakte Chromatinstruktur zu schaffen. Veränderungen in dieser kompakten heterochromatischen Struktur haben nicht nur Auswirkungen auf die Telomerstabilität, sondern auch auf die Expression der Gene in den Subtelomer-Regionen. Dieses Phänomen ist auch als „Telomer-Positionseffekt“ bekannt und bei Säugern und Hefen beschrieben. Auch wenn die Bildung der Telomere bei vielen Eukaryoten ähnlich verläuft, gibt es im Detail manche Unterschiede. Diese betreffen die Sequenz der TelomerWiederholungselemente (z. B. in vielen Insekten TTAGG, in Pflanzen TTTAGGG), aber auch die Häufigkeit der Wiederholungselemente. So ergibt sich z. B. für Ciliaten eine Telomerlänge von nur 20 bp und bei Hefen einige Hundert Basenpaare. Bei Hefen konnte außerdem gezeigt werden, dass das Zellzyklus-regulierende Protein Cdc13 bei der Aktivitätskontrolle der Telomerase eine wichtige Rolle spielt. Hefemutanten, die keine Telomerase-Aktivität aufweisen, zeigen ein hohes Maß an größeren chromosomalen Rearrangements. Bei der Maus spielt allerdings eher die Verminderung des proliferativen Potenzials oder eine erhöhte Apoptose eine wichtige Rolle. Für die grundsätzliche Charakterisierung der Telomerase-Funktion in verschiedenen Organismen wurden im Jahr 2009 Elizabeth Blackburn, Carol Greider und Jack Szostak mit dem Nobelpreis ausgezeichnet. Eine lesenswerte und sehr persönliche Darstellung des langen Weges zwischen schwierig zu interpretierenden experimentellen Ergebnissen und der Aufklärung eines grundlegenden genetischen Phänomens haben die späteren Preisträger bereits 3 Jahre vorher veröffentlicht. Darin betonen die Autoren die besondere Bedeutung von Forschungsarbeiten, die durch Neugierde angetrieben sind und zunächst keine offensichtlichen Anwendungsmöglichkeiten bieten. Wenn durch eine falsche Einschätzung der Bedeutung der Grundlagenforschung der autokatalytische Kreislauf zwischen Grundlagenforschung und angewandter Forschung durchbrochen werde, wird auch der kontinuierliche Fortschritt in den angewandten Bereichen der Wissenschaft, Medizin und Technik eher begrenzt sein (Blackburn et al. 2006).

6.1 Das eukaryotische Chromosom a

c Erläuterungen:

Telomere G-StrangÜberhang

subtelomere Regionen

1) Der TRF1-Komplex TANK

TRF1

150-200 nt

PTOP 3‘ OH

RAP1 TRF2

TRF2

TRF1

POT1

TIN2

TTAGGG TTAGGG AATCCC AATCCC

2) Der TRF2-Komplex ERCC1

10-15 kb (Mensch) 25-40 kb (Maus)

TRF2

Telomerase MRE11/ NBS/RAD50

PARP2 WRN

b

BLM ATM 3) Die Telomerase TERT

T-Loop

KU86 TERC

Eindringen des G-Strang-Überhangs D-Loop 3‘ OH

eingeschränkter Zugang der Telomerase an das Telomer

DKC1

Abb. 6.11 a–c Telomerstruktur, Telomerase-Aktivität und Telomer-bindende Proteine bei Säugern. a Telomere enthalten eine Doppelstrang-DNA mit TTAGGG-Wiederholungselementen (grüne Pfeile); dieser Bereich umfasst beim Menschen üblicherweise 10–15 kb, bei der Maus 25–40 kb. Telomere sind darüber hinaus durch einen 150–200 Nukleotide langen G-reichen EinzelstrangÜberhang (blaue Pfeile) gekennzeichnet, dessen 3’-OH-Ende von der Telomerase erkannt wird und für die Telomer-Verlängerung genutzt wird (Abb. 2.20 und 2.21). An diese Telomerstruktur sind zwei wichtige Proteinkomplexe gebunden, TRF1 und TRF2 (engl. telomere repeat binding factor). b Der G-reiche Einzelstrang dringt in den Bereich der Wiederholungselemente ein (rot) und bildet damit zwei Schleifen aus, die T-Schleife (engl. telomere loop) und die D-Schleife. Diese Konformation behindert den Zugang der

Telomerase an das 3’-OH-Ende. c Die einzelnen Teilkomponenten der jeweiligen Komplexe TRF1 (1), TRF2 (2) und der Telomerase (3) sind gezeigt. ATM: Ataxia telangiectasia; BLM: BloomSyndrom; DKC1: Dyskeratosis congenita; ERRCC1: excision repair cross-complementing 1; KU86: Autoantigen (andere Bezeichnung XRCC5: X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 5); MRE11: meiotisches Rekombinationsprotein 11; PARP2: Poly[ADP-Ribose]Polymerase-2; POT1: protection of telomers 1; PTOP: POT1- und TIN2-organisierendes Protein; RAD50: DNA-Reparatur-Protein 50; RAP1: Repressor-Aktivator-Protein; TANK: Tankyrase; TERC: RNA-Komponente der Telomerase; TERT: Reverse Transkriptase der Telomerase; TIN2: TRF1-interagierender, nukleärer Faktor ; WRN: Werner-Syndrom. (Nach Blasco 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

An den Telomeren werden Proteinkomplexe gebildet,

dieses Phänomen auf die Verkürzung der Telomere während der Replikation zurück und entwickelte die Hypothese, dass die Länge der Telomersequenzen die mögliche Zahl von Replikationsrunden vorherbestimmen könnte. Etwa ein Jahrzehnt später entdeckten Cooke und Smith (1986), dass die durchschnittliche Länge der Telomere in Keimzellen wesentlich länger war als in adulten Körperzellen. Sie zogen dabei auch in Betracht, dass adulte Zellen im Gegensatz zu den Keimzellen keine Telomerase-Aktivität mehr enthalten ‒ die Telomerase wurde in dieser Zeit zum ersten Mal in Tetrahymena beschrieben. Der zunächst hypothetische Zusammenhang zwischen Telomerlänge und

die zusammen mit Methylierungen von Histonen zu einer sehr stabilen und hochkompakten Struktur führen. Die Ausbildung der T-Schleife durch den G-reichen Überhang erschwert der Telomerase den Zugang.

1965 berichtete Leonhard Hayflick, dass menschliche Zellen, die in Zellkultur gehalten werden, nach einer bestimmten Zahl von Teilungen aufhören, sich weiter zu teilen ‒ wir nennen diesen Vorgang heute replikative Alterung (engl. replicative senescence). Alexei Olovnikov führte 1973

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

replikativem Potenzial wurde zu einem anerkannten molekularen Mechanismus, als gezeigt wurde, dass primäre menschliche Fibroblasten unbegrenzt replizieren können, wenn das Telomerase-Gen überexprimiert wird. Allerdings ist es nicht einfach, dieses zelluläre Telomerase-Modell auf Alterungsprozesse von Organismen zu übertragen, da der Verlust der Telomerase-Aktivität in verschiedenen Organismen unterschiedliche Konsequenzen hat. In Mäusen, Hefen, Pflanzen und Würmern wird der Verlust der Telomerase-Aktivität zumindest für mehrere Generationen toleriert. Umgekehrt ist die relativ mäßige Halbierung der Telomerase-Aktivität in Menschen (z. B. durch Haploinsuffizienz) schon nach 1 bis 3 Generationen für eine Reihe schwerer klinischer Symptome verantwortlich. Diese eher indirekte Beziehung zwischen dem klinischen Phänotyp und Mutationen in Genen, die die Telomerlänge beeinflussen, erschwerte eine genetische Analyse und führt möglicherweise immer noch zu einer Unterschätzung des Einflusses der Telomerlänge auf menschliche Erkrankungen. Während der Embyonalentwicklung von Vertebraten ist die Telomerlänge in den meisten Geweben des Organismus identisch, aber nach der Geburt werden die Telomere in proliferativen somatischen Zellen stark verkürzt. Einige Gewebe, wie die Darmmukosa, aber auch die peripheren Blutzellen, haben einen starken Umsatz und benötigen eine hohe Zellproliferation; diese Zellen zeigen ein größeres Ausmaß an TelomerVerkürzungen. Umgekehrt zeigen Gewebe mit einer geringe(re)n Mitose-Rate (wie z. B. Muskel und Gehirn) eine stabile Telomerlänge. Und wieder andere Gewebe (z. B. Leber, Nierenrinde) zeigen eine altersabhängige Verkürzung der Telomere; es scheint im Übrigen auch in Stammzellen zu einer Verkürzung des Telomers kommen zu können. Insgesamt lassen sich heute einige interessante Perspektiven aufzeigen: Menschliche Granulocyten und Lymphocyten zeigen mit zunehmenden Alter eine deutliche Abnahme der Telomerlänge, wobei diese Abnahme bei den Lymphocyten stärker ausgeprägt ist (von ~ 10 kb bei der Geburt auf ~ 4 kb im Alter von ca. 90 Jahren) als bei den Granulocyten, deren Untergrenze etwa bei 6 kb liegt. Die Telomerlänge kann heute als ein erbliches Merkmal verstanden werden, wobei es aber auch Unterschiede zwischen verschiedenen Chromosomen gibt: Besonders kurze Telomerlängen hat offensichtlich der kurze Arm des menschlichen Chromosoms 17. Auch das inaktive X-Chromosom zeigt eine beschleunigte Verkürzung der Telomerlänge gegenüber dem aktiven X-Chromosom.

Dennoch greift es wohl zu kurz, die Telomerlänge nur in Abhängigkeit einer unvollständigen Replikation zu betrachten. Vielmehr kommen noch weitere Aspekte dazu, von denen wir wissen, dass sie das Telomer empfindlich machen, z. B. macht die Guanin-reiche Natur der Telomere sie besonders anfällig für oxidative Schädigungen. Weiterhin sind Fehler bei der Auflösung der G-reichen Telomerstrukturen möglich sowie Deletionen der T-Schlaufen durch homologe Rekombination, die offensichtlich nur unzureichend korrigiert werden können. Mutationen, die die Struktur und/oder Funktion der Proteine beeinträchtigen, die am Aufbau der Telomerkomplexe beteiligt sind, führen häufig zu Krebserkrankungen. Allerdings sind auch andere Krankheiten damit verbunden, die oft dem Formenkreis des frühzeitigen Alterns zuzurechnen sind. Dazu gehören vor allem die Dyskeratosis congenita, das Bloom- und das Werner-Syndrom. Die X-chromosomale Form der Dyskeratosis congenita ist durch Mutationen im Dyskerin-Gen (DKC1) verursacht; dieses Gen codiert für ein Nukleolus-Protein, das an der Modifikation spezifischer kleiner RNA-Moleküle beteiligt ist, insbesondere ribosomaler RNAs und der RNA-Komponente der humanen Telomerase (TERC). Das TERC-Gen selbst war natürlich ebenso Gegenstand vieler Untersuchungen, und Mutationen in TERC führen zu verminderter humanen Telomerase-Aktivität (bis zu 50 % Restaktivität, da die RNA-Komponente für die volle Telomerase-Aktivität benötigt wird). Mutationen in DKC1, TERC und TERT (codiert für die Telomerase selbst) führen alle zu Defekten der enzymatischen Aktivität der Telomerase sowie zu Fehlern in der Elongation oder Erhaltung der Telomere und damit zu einer fortschreitenden Verkürzung der Telomere, und zwar bei den betroffenen Patienten mit zunehmendem Alter, aber auch bei nachfolgenden Generationen. Dieser Aspekt führt zu einer Antizipation in Stammbäumen von Patienten mit Telomerase-Defekten, wobei allerdings keine offensichtliche Korrelation zwischen dem Typ der Mutation, dem Eintrittsalter der Krankheit und deren Schweregrad besteht.

Die Telomerlänge in Körperzellen nimmt mit zunehmendem Alter ab (replikative Alterung). Dieser Prozess wird beschleunigt durch Mutationen in den Genen DKC1, TERC und TERT; entsprechende Erkrankungen sind durch vorzeitige Alterungsprozesse gekennzeichnet.

Obwohl Körperzellen üblicherweise keine Telomerase Aktivität zeigen (mit Ausnahme von Stammzellen), wird in über 90 % der Tumorproben eine Telomerase-Expression beobachtet. Eine mögliche Krebstherapie versucht daher, die Telo-

6.1 Das eukaryotische Chromosom

merase im Krebsgewebe gezielt zu hemmen, wobei allerdings die lange Dauer bis zum Absterben der Telomerase-abhängigen Krebszellen nicht sehr verheißungsvoll erscheint. Allerdings befindet sich ein Molekül, das die RNA-Komponente der Telomerase angreift, GRN163L, zurzeit (Frühjahr 2010) in der klinischen Prüfung (Phase II). Ein anderer Ansatz ist die Stimulierung spezifischer Immunantworten gegen Telomerase-exprimierende Krebszellen, um sie so gezielt abzutöten. Auch hierzu werden klinische Studien durchgeführt, von denen man sich besonders bei Krebserkrankungen der Brust und Prostata deutliche Therapiefortschritte verspricht. Eine interessante Übersicht zu dieser Thematik wurde von Aubert u. Lansdorp 2008 veröffentlicht.

6.1.5 Repetitive DNA Die Untersuchung von Reaktionskinetiken (Abb. 2.8) von eukaryotischer DNA ließ bereits frühzeitig erkennen, dass aufgrund unterschiedlicher Sequenzhäufigkeiten mehrere DNA-Sequenzfraktionen unterschieden werden müssen. Am auffälligsten in einigen Organismen waren DNA-Anteile, die besonders schnell renaturierten und einen relativ großen Anteil an der Gesamt-DNA umfassen können. Man bezeichnete diese DNA-Fraktionen daher als hochrepetitive DNA (engl. highly repetitive DNA). Zuerst ausführlich untersucht wurde eine hochrepetitive DNA-Fraktion der Maus, die bereits zuvor als Satelliten-DNA (engl. satellite DNA) bekannt gewesen war. Die Bezeichnung Satelliten-DNA ist durch die analytische Methodik bedingt, die zur Entdeckung dieser DNA-Fraktion geführt hat. In den frühen 1960er-Jahren war Gleichgewichtsultrazentrifugation von DNA, vor allem in CsCl oder Cs2SO4, eine der wenigen verfügbaren Methoden, um DNA zu fraktionieren. Grundlage der Fraktionierung ist in solchen Experimenten die mittlere Basenzusammensetzung der DNA, da das Kriterium der Trennung die Schwimmdichte (engl. buoyant density) ist. Die Schwimmdichte wird durch die Basenzusammensetzung bestimmt. Während der Zentrifugation stellt sich im Zentrifugenröhrchen ein Gradient aus Cs+-Ionen ein, der schließlich ein Gleichgewicht erreicht und bei unveränderten Zentrifugationsbedingungen stabil bleibt. Da die Schwimmdichte der DNA mit abnehmendem AT-Gehalt steigt, erfolgt eine Trennung der DNA-Moleküle nach ihrem mittleren AT- (oder GC-)Gehalt. Es zeigt sich, dass bei praktisch allen Eukaryoten der Hauptanteil der DNA-Moleküle einen mittleren GC-Gehalt von etwa 40 % hat. In CsCl-Gradienten bedingt das bei 20 °C

eine Schwimmdichte von 1,701 g × cm−3. Neben dieser Hauptfraktion findet man beinahe immer zusätzliche kleinere Fraktionen, die sich in ihrem jeweiligen GC-Gehalt deutlich von dem der Hauptbande unterscheiden und dadurch eine andere Schwimmdichte besitzen. Im Gleichgewichtsgradienten erscheinen sie daher als getrennte Fraktionen, sogenannte Satellitenfraktionen.

Hochrepetitive DNA zeichnet sich meist durch eine besondere, von der Hauptmenge der DNA abweichende Basenzusammensetzung aus. Sie erscheint in Gleichgewichtszentrifugationsexperimenten aufgrund ihrer abweichenden Schwimmdichte als Satellitenbande.

Auf hochrepetitive DNA-Fraktionen wird auch oft der Begriff simple sequence DNA angewendet. Er beruht darauf, dass hochrepetitive DNA-Sequenzen meist aus sehr einfachen, tandemartig wiederholt angeordneten DNA-Sequenzen bestehen. Die Länge einer dieser wiederholten Sequenzen ist bisweilen äußerst kurz und kann, beispielsweise bei Satelliten-DNA der Maus, nur 5 Basenpaare umfassen. In anderen Fällen können solche Grundsequenzen jedoch auch einige Hundert Basenpaare lang sein. Die tandemartig angeordneten DNA-Sequenzen sind in den meisten Fällen nicht identisch, sondern ihre Nukleotidsequenzen weichen im Allgemeinen erheblich von der als Consensussequenz ermittelten Grundsequenz ab, sie divergieren (engl. diverged nucleotide sequences). Repetitive Elemente des Typs der simple sequence DNA werden oft auch als Mikrosatelliten bezeichnet. Unter diesem Begriff haben sie sich vor allem als Marker zur Kartierung von Genen einen festen Platz im Methodenspektrum der Genetik erobert (Kapitel 10.4.5). Mikrosatelliten entstehen vermutlich bei der DNA-Replikation, wenn kurzzeitig freie DNA-Enden vorliegen. Diese freien Enden können gegenüber dem komplementären Strang um einige Nukleotide versetzt werden. Diese Nukleotide werden dann erneut synthetisiert und dadurch dupliziert. Der zufällige Entstehungsmechanismus macht verständlich, dass die so gebildeten Mikrosatelliten bei verschiedenen Individuen sehr heterogene Längen aufweisen. Diese Längenpolymorphismen macht man sich bei der Erstellung genetischer Fingerabdrucke zunutze: Durch den Vergleich der Längen dieser Genregionen können sowohl Individuen eindeutig identifiziert als auch Verwandtschaftsbeziehungen (z. B. Vaterschaftsnachweise) aufgeklärt werden.

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Satelliten-DNA besteht aus meist kurzen, tandemartig

wiederholt angeordneten DNA-Sequenzrepeats. Die Einzelelemente weichen im Allgemeinen in ihrer Nukleotidsequenz voneinander ab.

Häufig wird angenommen, dass es sich bei SatellitenDNA ausschließlich um hochrepetitive DNA handelt. Daher soll hier darauf verwiesen werden, dass auch codierende DNA-Sequenzen als Satelliten-DNA erscheinen können, wenn sie eine von der Hauptmenge der DNA genügend abweichende Basenzusammensetzung haben und in größerer Kopienanzahl im Genom vorliegen. Das bekannteste Beispiel hierfür ist die extrachromosomale rDNA in Xenopus-Oocyten (S. 301). Der Begriff Satelliten-DNA enthält daher keinerlei Definitionen für bestimmte DNA-Sequenzen, sondern bezieht sich allein auf die Tatsache, dass bestimmte DNA-Fraktionen im Gleichgewichtsgradienten eine von der Hauptmenge der genomischen DNA abweichende Schwimmdichte zeigen. Funktionell wissen wir bis heute relativ wenig über Satelliten-DNA. Viele Anzeichen, darunter insbesondere ihre chromosomale Lokalisation, deuten jedoch in erster Linie eher auf strukturelle Aufgaben hochrepetitiver DNA im Chromosom. Damit stimmt überein, dass man solche hochrepetitiven DNA-Sequenzen bevorzugt in Centromer- und Telomerbereichen findet (S. 228 und 230). Neben hochrepetitiver DNA enthalten Eukaryotengenome noch erhebliche Anteile von niedriger repetitiven DNA-Sequenzen. Die meisten dieser DNASequenzen sind über das gesamte Genom verstreut zu finden, bilden aber bisweilen ähnliche tandemartige Anordnungen, wie das für hochrepetitive DNA die Regel ist. Da die Häufigkeit solcher DNA-Sequenzen im Allgemeinen sehr viel geringer ist als die der hochrepetitiven Sequenzfraktionen, unterschiedet man etwas willkürlich „mittelrepetitive“ (engl. middle repetitive) und „niedrigrepetitive“ (engl. low repetitive) Anteile. Beide DNA-Fraktionen gehören unterschiedlichen Familien repetitiver DNA-Sequenzen an. Im Gegensatz zu hochrepetitiver DNA sind die Kopien dieser Familien jedoch im Genom verstreut (engl. interspersed repetitive sequences). Wir unterscheiden aufgrund der Größe zwei Klassen von mittelrepetitiven Sequenzen: kurze Sequenzen von 200 bis 400 bp Länge werden als SINEs (engl. short interspersed elements) bezeichnet. Zu ihnen gehören auch die Alu-Elemente, die den größten Teil der mittelrepetitiven Sequenzen des menschlichen Genoms ausmachen. Ihren Namen haben sie aufgrund ihrer Eigenschaft erhalten, dass sie alle die Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms AluI enthalten. Alu-

Elemente haben eine Größe von ca. 300 bp und kommen etwa 700.000- bis 1.000.000-mal im menschlichen Genom vor. Die zweite Klasse mittelrepetitiver Sequenzen hat eine Länge von mehreren Kilobasen (1,4‒6 kb) und wird daher als LINEs (engl. long interspersed elements) bezeichnet; sie kommen in geringerer Kopienzahl im Genom vor (60.000 bis 100.000). Aufgrund ihrer Eigenschaft, von bestimmten Restriktionsenzymen geschnitten zu werden, werden sie verschiedenen Familien zugeordnet; die bekannteste ist die KpnFamilie (wird mit dem Restriktionsenzym KpnI geschnitten). Vollständige Elemente dieser Familie enthalten eine Reverse Transkriptase; sie sind daher nichtvirale Retroelemente. Weitere Details der SINE- und LINE-Elemente werden aufgrund ihrer TransposonEigenschaften im Kapitel 8.2.3 besprochen. Es gibt auch eine Reihe von Genen, die in größeren Kopienzahlen vorhanden sind. Insbesondere sind hier die Gene für strukturelle RNA-Moleküle zu nennen (ribosomale RNA, Kapitel 7.4.1 und 7.4.2), aber auch Protein-codierende Gene können in größeren Kopienzahlen vorkommen. Als Beispiel seien die Gene für Histonproteine genannt (Kapitel 7.2.2), die, je nach Organismus, mit 50 bis zu mehreren Hundert Kopien im haploiden Genom vertreten sind.

Neben hochrepetitiver DNA besitzen eukaryotische Genome größere Anteile an mittel- und niedrigrepetitiven DNA-Sequenzen. Diese sind im Genom verstreut und bestehen aus längeren DNA-Sequenzen als hochrepetitive DNA. Unter solchen DNA-Sequenzen befinden sich auch Gene. Ein anderer Teil mittelrepetitiver DNA-Sequenzen gehört zur Klasse der „mobilen genetischen Elemente“ (Transposons).

Abschließend soll hier noch eine Fraktion repetitiver DNA-Sequenzen erwähnt werden, die sich von den bisher besprochenen repetitiven DNA-Sequenzen grundsätzlich dadurch unterscheidet, dass sie nicht mit einer Reaktionskinetik 2. Ordnung reassoziiert, sondern als Reaktion 1. Ordnung, also nach Art einer monomolekularen Reaktion. Das bedeutet, dass es sich um intramolekulare Renaturierung handeln muss. Die Kinetik 1. Ordnung unterscheidet sich von der einer Reaktion 2. Ordnung dadurch, dass sie nicht von der Zeit oder der Konzentration der Reaktionspartner abhängig ist. Die Renaturierungsgeschwindigkeit dieser DNA-Fraktionen ist so hoch, dass man sie mit der normalen Messung einer Renaturierungskinetik praktisch nicht erfasst, da die Renaturierung bereits beendet ist, wenn man mit der Messung beginnt. Es fiel bei Renaturierungsexperimenten bereits frühzeitig auf, dass praktisch in allen eukary-

6.2 Organisation der DNA im Chromosom

otischen Genomen eine solche schnelle Anfangsreaktion zu beobachten ist, die etwa 1 % der DNA umfassen kann. Elektronenmikroskopische Untersuchungen und spätere DNA-Sequenzanalysen zeigten, dass es sich hierbei um denaturierte DNA-Moleküle handelt, die aufgrund interner gegenläufiger (d. h. invertierter) komplementärer Nukleotidsequenzen einen (partiellen) Doppelstrang formen. Solche gegenläufigen komplementären Sequenzbereiche werden auch als inverted repeats, und die gebildeten Molekülstrukturen als fold-back-Elemente oder Palindrome bezeichnet. Gemeinsam ist ihnen, dass sie im Allgemeinen einen internen, nicht komplementären DNAAbschnitt enthalten, der im Renaturierungsprodukt als Einzelstrangschleife (engl. hairpin loop) zu finden ist. Es ist inzwischen geklärt, dass auch solche DNA-Sequenzen überwiegend Teile von Transposons sind. Es besteht ein Zusammenhang der DNA-Struktur mit dem Integrationsmechanismus, der für die Insertion des Transposons ins Genom verantwortlich ist (Abb. 8.4). Aber auch Regulationselemente in der DNA können Palindromcharakter besitzen. Palindrome sind uns auch aus der „RNA-Welt“ bekannt (z. B. bei den verschiedenen t-RNAs oder den kleinen Kern-RNAs, snRNA; Kapitel 7.4 und 7.5). In Tabelle 6.2 ist eine Übersicht über die Eigenschaften repetitiver DNA-Sequenzen zusammengestellt. Wir können erkennen, dass die zunächst rein operationale Einteilung in Sequenzklassen unterschiedlicher Repetitionshäufigkeiten zur Entdeckung verschiedener wichtiger Grundbausteine eukaryotischer Genome geführt hat.

Ein kleiner Teil eukaryotischer DNA-Sequenzen zeich-

net sich durch intramolekulare gegenläufig komplementäre Sequenzbereiche (inverted repeats) aus und können durch Basenpaarungen Einzelstrangschleifen (hairpin loops) formen.

6.2 Organisation der DNA im Chromosom In den vorangehenden Kapiteln haben wir Chromosomen von zwei Ebenen her betrachtet, ohne diese miteinander zu verbinden. Zunächst haben wir den wichtigsten molekularen Bestandteil eines Chromosoms, die DNA, als Träger der Erbinformation erörtert. Später haben wir die lichtmikroskopisch erkennbaren Eigenschaften, also die Cytologie der Chromosomen, kennengelernt. Wir haben bei der Besprechung des mitotischen und des meiotischen Zellzyklus gesehen, dass die Chromosomen massiven strukturellen Veränderungen unterliegen: Die Strukturen, die gemeinhin als Chromosomen bezeichnet werden, erscheinen in ihrer mikroskopisch erkennbaren Struktur erst im Laufe der Prophase, bleiben während der Zellteilung erhalten und werden in der Telophase wieder unsichtbar. Während des übrigen, zeitlich weitaus überwiegenden Teils des Zellzyklus ist die Anwesenheit der Chromosomen (und die der DNA) im Zellkern nur mit besonderen Techniken festzustellen. Die chromosomale DNA muss mithin eine sehr grundlegende strukturelle Reorganisation durchlaufen, um diese verschiedenen chromosomalen Organisationszustände einzunehmen. Um diese Ebenen miteinander zu verbinden und um unser Verständnis der Chromosomenstruktur zu erweitern, lassen sich nunmehr zwei Fragen formulieren: ï Wie ist die DNA im Chromosom strukturell organisiert? ï Gibt es noch andere molekulare Grundbausteine der Chromosomen, die von allgemeiner Bedeutung sind? Darauf sollen die nächsten Abschnitte Antworten geben: Durch eine besondere Klasse basischer Proteine, die Histone, entsteht eine perlenschnurartige Aufwicklung der DNA in Form von Nukleosomen, die eine extrem hohe Packungsdichte im Zellkern erlaubt und in ihrer Gesamtheit als Chromatin bezeichnet wird.

Tabelle 6.2 Eigenschaften repetitiver DNA-Sequenzen Bezeichnung

Sequenztyp

Lokalisation

Sequenzen mit bekannter Funktion

hochrepetitive DNA, simple sequence DNA oder Satelliten-DNA

kurz (5 bis einige Hundert bp)

vorwiegend im Heterochromatin

unbekannt

mittelrepetitive DNA

mehrere Hundert bp bis mehrere kb

verteilt im Genom in vielen Positionen

Transposons, Genfamilien

Einzelkopie-DNA

mehrere kb

im gesamten Genom

Gene

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236 236

Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Und wir werden sehen, dass jedes Chromosom im Zellkern sein eigenes Territorium hat und innerhalb dessen die Anordnung der chromosomalen Regionen funktionellen Anforderungen genügt.

Für die verschiedenen Organisationszustände der Chromosomen wollen wir uns der Architektur des Zellkerns insgesamt zuwenden. Sie ist durch dreidimensionale Netzwerke höherer Chromatinstrukturen einerseits und Kompartimentierung andererseits gekennzeichnet. Beides ist für die Integration biologischer Prozesse wie DNA-Replikation, Transkription und Reifung der mRNA essenziell. Schon am Ende des 19. Jahrhunderts erkannten Carl Rabl (1885) und wenig später Theodor Boveri (1888, 1909) durch lichtmikroskopische Untersuchungen, dass Chromosomen während der Interphase als individuelle, voneinander getrennte Funktionseinheiten vorkommen; eine besondere Form wurde später für das X-Chromosom beschrie-

ben („Barr-Körper“; Barr u. Bertram 1949). Seit den 1970er-Jahren haben es neue Methoden der Zellbiologie erlaubt, diese Chromosomenterritorien nicht nur wiederzuentdecken, sondern im Kontext der Architektur des Zellkerns auch mögliche Funktionen zu beschreiben. Farblich kombinierte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen an einzelnen Zellen zeigten, dass einzelne Chromosomen an bestimmten Stellen („Territorien“) im Zellkern zu finden sind. Ein typisches Beispiel aus einer Hühnerzelle zeigt Abb. 6.12. Ob es ein reproduzierbares Arrangement der Chromosomen in den jeweiligen Zellkernen gibt, ist noch unklar. Es verdichten sich aber zumindest bei menschlichen Chromosomen die Hinweise darauf, dass die kleineren Chromosomen üblicherweise innen und die größeren an der Peripherie des Zellkerns zu finden sind. Allerdings ist für die Position weniger die Größe des Chromosoms entscheidend als vielmehr die Zahl der Gene (bzw. Gendichte). Besonders deutlich wird dies an den fast gleich großen, menschlichen Chromosomen 18 und 19 (85 bzw. 67 Mb): Das genärmere Chromosom 18 befindet sich üblicherweise am Rande des Zellkerns, wohin-

Abb. 6.12 a–d Chromosomen-Territorien in einer Hühnerzelle. a DAPI-gefärbte, diploide Metaphase einer Hühnerzelle. b Dieselbe Metaphase nach in-situ-Hybridisierung mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen. Die Proben zur Anfärbung der Hühnerchromosomen wurden mit einem kombinatorischen Schema mit Östradiol (1, 4, 5, 6), Digoxigenin (2, 4, 6, Z) und Biotin (3, 5, 6, Z) markiert. c Östradiol- und Digoxigenin-markierte Proben werden über Sekundärantikörper nachgewiesen, die mit Cy3 und FITC markiert sind; biotinylierte Proben

werden über Cy5-gekoppeltes Streptavidin nachgewiesen. d Der optische Schnitt in der Mitte eines Fibroblasten-Zellkerns des Huhns zeigt wechselseitig ausschließliche Chromosomen-Territorien, wobei homologe Chromosomen an unterschiedlichen Stellen lokalisiert sind (beachte, dass in diesem Schnitt jeweils nur eines der beiden Chromosomen-Territorien für die Chromosomen 4 und 6 sichtbar ist). (Cremer u. Cremer 2001, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

6.2.1 Chromosomale Territorien und Architektur des Zellkerns

6.2 Organisation der DNA im Chromosom

gegen das gendichtere Chromosom 19 im Inneren des Zellkerns vorkommt (Abb. 6.13). Auch das Bandenmuster der mitotischen Chromosomen ist ein Beispiel für Kompartimentierung. Die Arme der mitotischen Chromosomen bestehen aus früh replizierenden Banden (den hellen Giemsa-Banden = R-Banden), die sich mit den mittel bis spät replizierenden, dunklen Giemsa-Banden (= G-Banden) abwechseln. R-Banden haben eine höhere Gendichte und enthalten Haushaltsgene (engl. housekeeping genes) und gewebespezifische Gene, wohingegen G-Banden arm an Genen sind und nur gewebespezifische Gene enthalten. Die höchste Gendichte ist in einer Unterfraktion der R-Banden, den T-Banden, enthalten. Spät replizierende C-Banden, die wahrscheinlich überhaupt keine Gene enthalten, beinhalten das centromere Heterochromatin und einige Elemente des konstitutiven Heterochromatins. Es war lange allgemein anerkannte Ansicht, dass die DNA-Replikation an Hunderten verschiedener Stellen in R/T-Banden beginnt, die im Inneren des Zellkerns lokalisiert sind. Allerdings zeigen neuere Arbeiten an primären Fibroblastenzellen, dass die Replikation nur an wenigen Stellen in der Nähe des Nukleolus beginnt. Das in der mittleren Phase der Replikation replizierende Chromatin der G-Banden wird überwiegend in der Mitte des Zellkerns und der Gegend des Nukleolus gefunden, aber auch an Einbuchtungen der Kernlamina. Spät replizierendes Chromatin enthält die heterochromatische Region und ist

sowohl an der Peripherie als auch im Inneren des Zellkerns enthalten. Die Markierung der DNA mit Thymidin-Analoga ergab Hinweise darauf, dass in verschiedenen lebenden Säugerzellen bei der DNA-Synthese Chromatinaggregate entstehen. Diese „Replikations-Foci“ bestehen aus Clustern aktiver Replikons zusammen mit den Replikationsfaktoren; sie haben einen DNA-Gehalt von ca. 1 Mb. Während der S-Phase ist die Replikationsmaschinerie mit einem Replikations-Focus für die Zeit verbunden, die notwendig ist, um dessen Replikation zu beenden (ca. 1 Stunde). Erstaunlicherweise bleiben die Replikations-Foci aber auch nach der Replikation sichtbar und können unabhängig vom aktuellen Zustand des Zellzyklus durch mehrere Zellzyklen beobachtet werden. Neben den bisher besprochenen Kompartimenten des Zellkerns, die von Chromosomen angefüllt werden, gibt es auch definierte Bereiche, die offensichtlich frei von Chromatin sind. Dieser Interchromatinbereich ist mit einem Netz von Ribonukleoproteinen angefüllt. Es ist vorstellbar, dass hier gespleißte RNA mit Proteinen komplexiert und zu den Kernporen transportiert wird, um so ein Verwirren der RNA im Inneren der kompakten Chromatindomänen zu verhindern. Weiterhin gibt es deutliche Hinweise darauf, dass transkriptionell stille Gene in der Nähe des centromeren Heterochromatinclusters lokalisiert sind; aktive Gene sind dagegen an anderen Stellen positioniert. Die Position einzelner Gene erscheint dynamisch und abhängig vom Zustand der Transkription. Eine Zusammenfassung dieses Modells beinhaltet Abb. 6.14.

Untersuchungen der höheren Ordnung des Chromatins zeigten, dass Chromosomen in bestimmten Kompartimenten des Zellkerns (Territorien) zu finden sind. Der Ort eines Gens innerhalb eines Chromosoms beeinflusst seinen Zugang zur Maschinerie spezifischer Kernfunktionen wie der Regulation der Transkription und das Spleißen. Diese Betrachtungsweise lässt sich mit einem topologischen Modell der Genregulation verbinden. Abb. 6.13 a, b Chromosomen-Territorien genreicher und genarmer Chromosomen. Im Zellkern eines nicht stimulierten menschlichen Lymphocyten sind 3-dimensionale Rekonstruktionen der Territorien der Chromosomen 18 (rot: genarm) und 19 (grün: genreich) gezeichnet. Die Territorien des Chromosoms 18 werden üblicherweise an der Peripherie des Zellkerns gefunden, wohingegen die Territorien des Chromosoms 19 im Inneren des Zellkerns gefunden werden. a x/y-Ansicht: Der Schnitt durch die Mitte des Nukleus ist als grauer Schatten gezeigt. Es können nur die Territorien unterhalb der Schnittebene gesehen werden. b x/z-Ansicht: Der Pfeil markiert die Seite, von der der Schnitt in a betrachtet wurde. (Cremer u. Cremer 2001, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group))

An dieser Stelle kommen mögliche neuartige Strukturen ins Spiel, die als Insulatoren von Chromatinregionen bezeichnet werden. Insulatoren werden in vielen Organismen (von Hefen bis zu Menschen) gefunden. Es sind Sequenzelemente, die die Wechselwirkungen zwischen Enhancern und Promotoren (Kapitel 7.3) verhindern, wenn sie zwischen diesen lokalisiert sind. Sie verhindern auch Positionseffekte auf die Wirkung von Transgenen. Sie markieren offensichtlich Grenzen zwischen größeren Transkriptionseinheiten als dies einzelne Gene alleine darstellen. Daher sind sie Schlüsselelemente in dem Prozess, voneinander unabhängige

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Abb. 6.14 a–g Modell einer funktionellen Chromosomenarchitektur. Es sind die einzelnen Charakteristika des Modells der Chromosomen-Territorien mit Interchromatin-Kompartimentierung am Beispiel einer menschlichen HeLa-Zelle dargestellt. Obwohl es für viele Einzelaspekte experimentelle Beweise gibt, ist das Gesamtbild (noch) spekulativ. a ChromosomenTerritorien haben komplexe gefaltete Oberflächen. Die Vergrößerung zeigt das topologische Modell der Genregulation: Eine große Chromatinschleife mit vielen aktiven Genen (rot) dehnt sich von der Oberfläche des Chromosomen-Territoriums in das Interchromatin-Kompartiment aus. b Chromosomen-Territorien enthalten unterschiedliche Bereiche für die kurzen bzw. langen Chromosomenarme sowie für das Centromer (Stern). Im oberen Bereich sind aktiv transkribierte Gene (weiß) auf der Chromatinschleife lokalisiert, die von dem centromeren Heterochromatin entfernt ist; das untere Bild zeigt die Verwendung derselben Gene (schwarz) im centromeren Heterochromatin, was zu ihrer Abschaltung führt. c Chromosomen-Territorien haben variable Chromatindichten (dunkelrot: hohe Dichte; hellgelb: geringe Dichte). d Ein Chromosomen-Territorium zeigt früh-replizierende (grün) und mittel- bis spät-replizierende (rot) Chromatinbereiche. Jeder Bereich enthält ca. 1 Mb.

Genarmes Chromatin (rot) ist bevorzugt an der Peripherie des Zellkerns und in engem Kontakt mit der Kernlamina (gelb) lokalisiert, aber auch an den Einbuchtungen der Lamina und um den Nukleolus (nu) herum. e Höhere Chromatinstrukturen formen eine Hierarchie von Chromatinfasern. Die Vergrößerung zeigt den topologischen Aspekt der Genregulation und deutet an, dass aktive Gene (weiße Punkte) an der Oberfläche knäuelartiger Chromatinfasern liegen. Stille Gene (schwarze Punkte) liegen eher im Inneren der Chromatinstrukturen. f Interchromatin-Kompartimente (grün) enthalten Komplexe (orange Punkte) und größere Domänen (Anhäufungen oranger Punkte), die kein Chromatin enthalten. Dort findet stattdessen Transkription, Spleißen, DNA-Replikation und -Reparatur statt. g Chromosomen-Territorien mit Chromatindomänen in der Größenordnung ~ 1 Mb (rot) und Interchromatin-Kompartimente (grün) dehnen sich zwischen diesen Bereichen aus. Die Vergrößerung zeigt die topologischen Beziehungen zwischen den Interchromatin-Kompartimenten und aktiven bzw. stillen Genen. Aktive Gene (weiß) sind an der Oberfläche dieser Domänen lokalisiert, wohingegen stille Gene (schwarz) im Inneren zu finden sind. (Cremer u. Cremer 2001, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Domänen der Genexpression zu etablieren. Erste Hinweise auf diese Rolle der Insulatoren beim Aufbau von Chromatindomänen erhielt man bei der Analyse des gypsy-Insulators von Drosophila. Drosophila eignet sich für solche Untersuchungen in besonderer Weise, da die polytänen Chromosomen (Riesenchromosomen mit vielen Chromatiden; vgl. Kapitel 6.3.1 und Abb. 6.25) eine gute Auflösung bei geringer mikroskopischer Vergrößerung zeigen. Proteinkomponenten des gypsy-Insulators kommen an ca. 500 Stellen im Drosophila-Genom vor. Diese Stellen sind jeweils an

den Grenzen der Banden zu den Interbanden der polytänen Chromosomen vorhanden, was eine Funktion bei der Trennung von kondensiertem (= stillem) und nicht-kondensiertem (= aktivem) Chromatin nahelegt. Diese 500 Insulatoren verschmelzen aufgrund von Wechselwirkung mit daran gebundenen Proteinen zu ca. 25 größeren Strukturen, die als „Insulator-Körperchen“ bezeichnet werden und überwiegend in der Peripherie diploider Zellen vorhanden sind. Dadurch trennen die Insulatoren die Chromatinfasern in Schleifen oder Domänen und bilden dabei rosettenartige Struk-

6.2 Organisation der DNA im Chromosom

Abb. 6.15 a, b Insulator-Elemente organisieren Chromatinfasern im Zellkern durch die Einrichtung getrennter Kompartimente höherer Chromatinstrukturen. a Die Domänen des offenen Chromatins (gelbe Nukleosomen) werden von Insulatoren begrenzt (rote Ovale), die durch ihre Wechselwirkungen eine Schlaufe bilden. Hochkondensiertes Chromatin (blaue Nukleosomen) ist auf ein bestimmtes Kompartiment beschränkt. Das Chromatin wird im inneren Kompartiment stark umgebaut, und die Histon-modifizierenden Enzyme, die zur Kondensati-

on des Chromatins beitragen, sind hier reichlich vorhanden. Dagegen werden Proteine, die an der Öffnung des Chromatins beteiligt sind, durch die Insulatoren gebunden und sind in den äußeren Segmenten angereichert. b Das Diagramm zeigt einen Teil des Zellkerns mit kompartimentiertem Chromatin. Durch Wechselwirkungen der Insulatoren mit der Kernlamina oder den Kernporen-Komplexen ist dieser Teil des Chromatins mit der Peripherie des Zellkerns verankert. (Labrador u. Corces 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

turen. Diese sind wahrscheinlich an perinukleäre Substrate gebunden (die Kernlamina), die als Gerüst dienen, um die Organisation des Zellkerns aufrechtzuerhalten (Abb. 6.15).

Das Konzept der Insulatoren wird ergänzt durch unterschiedliche Modifikationen der Histone (Methylierung des Histons H3 an Lys9 korrespondiert mit Heterochromatin und inaktivem Zustand; Methylierung an Lys4 sowie Acetylierung der Histone H3 und H4 korrespondiert dagegen mit dem aktiven Zustand). Zusätzlich sind weitere Proteine in der inaktiven Region mit dem Chromatin assoziiert (z. B. bei Hefe Swi6 ≅ Drosophila HP1). Für das β-Globin-Cluster wurde gezeigt, dass die flankierenden Insulator-Sequenzen Bindestellen für das CTCF (engl. CCCTC-binding factor)-Protein enthalten. Werden Transgene mit CTCF-Bindestellen flankiert, behalten sie den Zustand hoher Histonacetylierung unabhängig vom Transkriptionszustand des Gens oder der Anwesenheit aktiver Enhancer in der entsprechenden Domäne. Gerade das Beispiel der Insulatoren des β-Globin-Genclusters zeigt aber auch, dass Insulatoren dynamisch sein müssen, um die unterschiedliche Aktivierung der individuellen β-Globin-Gene während der Embryonalentwicklung zu erklären. Ein mögliches Modell dazu ist in Abb. 6.16 vorgestellt. Es gibt außerdem Hinweise, dass während der Evolution verschiedene Klassen von Genen in solchen

Es ist eine interessante Hypothese, dass die Insulator-Sequenzen gleichzeitig auch diejenigen Stellen repräsentieren, die aufgrund von Strukturuntersuchungen als Matrix-Binderegionen bekannt wurden (engl. matrix attachment region, MAR; oder auch scaffold attachment region, SAR). MARs bzw. SARs wurden als DNA-Sequenzen charakterisiert, die die Anheftung individueller Chromatinschleifen an eine Protein-haltige Matrix bzw. an ein Kernskelett sowohl in Interphase-Kernen als auch im mitotischen Chromosom bewirken. Eine derartige Identität von struktureller und funktioneller Wirkung wurde für die MAR-Elemente der apoB-, Interferonund α1-Antitrypsin-Gene des Menschen und für das Lysozymgen des Huhns gezeigt. Ein weiteres Beispiel ist der schon erwähnte gypsy-Insulator von Drosophila. Hier wurden Wechselwirkungen nicht nur mit der Kernmatrix gezeigt, sondern auch mit Topoisomerase II und Histon H1 (als Übersicht dazu siehe Zhan et al. 2001).

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Insulator-Elemente etablieren Domänen unterschiedlicher Genexpression dadurch, dass die lineare Information der Chromatinfasern in eine dreidimensionale Struktur übersetzt wird (Kompartimentierung). Wahrscheinlich ist die Anwesenheit von Insulatoren auch für den Übergang der Banden/Zwischenbanden der polytänen Chromosomen von Drosophila verantwortlich. Die Methylierung und Acetylierung der Histone H3 und H4 trägt zur Aufrechterhaltung der offenen Chromatinstruktur bei. Die Chromatinorganisation spiegelt das offensichtliche Clustering aktiv exprimierter Gene im Eukaryotengenom wider. Insulatoren beeinflussen auch die Enhancer-Funktion durch die Veränderung der DNA-Topologie. Die Anheftung der Insulatoren an die Kernlamina oder Kernporenkomplexe bildet das notwendige Gerüst.

6.2.2 Chromosomale Proteine

Abb. 6.16 a–c Dynamik von Insulatoren. Die Regulation der Insulator-Funktion führt zu verschiedenen Mustern der Chromatinorganisation. a Lineare Anordnung des Interphase-Chromatins. Das hoch kondensierte Chromatin ist blau markiert, und offene Chromatindomänen sind gelb gekennzeichnet. Domänen mit regulierbaren Insulatoren sind rot; diese Insulatoren können während der Zelldifferenzierung verändert werden. b Während der Entwicklung sind Domänen höherer Chromatinstrukturen durch aktive Insulatoren (rote Quadrate) organisiert. Inaktive Insulatoren und ihre flankierenden Regionen bleiben im heterochromatischen Kompartiment. c In einem bestimmten Gewebe werden die Chromatindomänen nach der Aktivierung der flankierenden Insulatoren geöffnet, und nach der Inaktivierung anderer Insulatoren werden dessen Regionen heterochromatisch. (Labrador u. Corces 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Domänen zusammengefasst wurden. Man schätzt, dass ca. 20 % der Drosophila-Gene in einer der etwa 200 Gruppen benachbarter Gene gefunden wurden, die in gleicher Weise exprimiert werden. Jede dieser Gruppen umfasst ca. 10 bis 30 Gene. Obwohl die Art der Cluster bei Hefen ähnlich ist, gibt es keine funktionelle Beziehung. Auch beim Menschen gibt es derartige Cluster, allerdings entspricht das einzige signifikant co-replizierende Cluster Haushaltsgenen.

Die Proteinbestandteile der Chromosomen haben schon lange das Interesse der Forscher gefunden, bevor die DNA in ihrer Funktion als Träger der Erbinformation erkannt worden war. F. Miescher hatte sich für die stark basischen Proteine des Chromatins interessiert, da man in der Variabilität der Proteine Aufschluss über die Art der Erbsubstanz gesucht hatte (S. 19). Die Bezeichnung Chromatin war von Flemming 1882 zur Kennzeichnung des färbbaren Materials im Interphasekern eingeführt worden. Albrecht Kossel beschrieb 1884 das erste Chromatin-assoziierte Protein, das er aus Gänseerythrocyten durch Extraktion mit Säure gewonnen hatte (für diese Arbeiten erhielt er 1910 den Nobelpreis für Medizin). Aus Interphasechromatin erhält man dabei vorwiegend eine Proteinfraktion, die als Histonfraktion bezeichnet wird. Sie besteht aus mehreren verschiedenen Proteinen, den Histonen. Wir unterscheiden vier Histontypen (H2A, H2B, H3 und H4; Tabelle 6.3). Die Histone sind, wie ihre Isolationsmethode anzeigt, stark basische Proteine, und sie formen das Grundgerüst fast aller eukaryotischen Chromosomen. Die positive Ladung dieser Proteine wird durch zahlreiche basische Aminosäuren bedingt (bes. Lysin- und Arginin-Reste). Sie dient dazu, die negative Ladung der Phosphatgruppen der DNA zu kompensieren. Histone können dadurch eine enge Bindung mit der DNA eingehen. Durch die Bindung der Histone an die chromosomale DNA werden charakteristische Strukturen, die Nukleosomen, geformt, die im Elektronenmikroskop sichtbar gemacht werden können (Abb. 6.17). Sie sind die Grundelemente eukaryotischer Chromosomen in nahezu allen Zelltypen. Histone umfassen mengenmäßig jedoch nur die Hälfte der im Chromosom vorhandenen Proteine. Zu den anderen Proteinkomponenten im Chromatin

6.2 Organisation der DNA im Chromosom

Tabelle 6.3 Eigenschaften von Histonen Typ

Aminosäuren

Molekulargewicht [Da]

Lys/Arg-Verhältnis

Bemerkungen

H1

215

21.000

20,0

variabel

H2A

129

14.500

1,25

reich an Lys, Variabilität begrenzt

H2B

125

13.700

2,50

reich an Lys, Variabilität begrenzt

H3

135

15.300

0,72

reich an Arg, sehr konserviert

H4

102

11.200

0,79

reich an Arg, sehr konserviert

Während Histon H1 bereits zwischen nahe verwandten Organismengruppen starke Aminosäuresequenzunterschiede zeigt, ist die Variabilität der Histone H2A und H2B begrenzt; Histone H3 und H4 hingegen unterscheiden sich in ihrer Aminosäuresequenz zwischen verschiedenen Organismen kaum. Es gibt eine Reihe gewebespezifischer oder entwicklungsstadienspezifischer Histonvarianten, die die oben verzeichneten Zellzyklus-regulierten Histone ersetzen können.

Abb. 6.17 Nukleosomen im Chromatin aus Oocyten des Salamanders Pleurodeles waltlii. (Aus Scheer 1987, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

gehören insbesondere HMG-Proteine (engl. high mobility group), kleine basische Proteine, die universelle Bestandteile der Chromosomen sind. Weitere Proteine gehören zur Familie der Nukleophosmine bzw. Nukleoplasmine. Diese Proteine sind im Tierreich weit verbreitet und haben vielfältige Aufgaben, z. B. bei der Chromatinbildung, der Genomstabilität und als molekulare Chaperone bei der Erhaltung der Nukleosomenstruktur. Nukleoplasmin wurde 1978 von Laskey und Mitarbeitern aus Eiern des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis isoliert; Nukleophosmin wurde zuerst als Phosphoprotein identifiziert, das in hoher Konzentration im Nukleolus vorkommt. Anders zusammengesetzt ist lediglich das Chromatin in männlichen Keimzellen. Hier werden die Histone bei vielen Organismen durch noch stärker basische Proteine ersetzt. Oft handelt es sich dabei um Protamine, wie sie besonders charakteristisch in Lachssperma vorkommen. Diese Proteine verpacken die

DNA im Spermienkopf in einer nicht nukleosomalen Struktur.

6.2.3 Nukleosomen und Chromatinstruktur Ein Nukleosom wird von vier verschiedenen Histontypen, H2A, H2B, H3 und H4 (Tabelle 6.3) gebildet. Von jedem dieser Histone sind je zwei Moleküle im Nukleosom vorhanden. Die vier Histone bilden daher ein Oktamer (Abb. 6.18), um das sich im Chromosom 146 Basenpaare der DNA-Doppelhelix in knapp zwei (genau 1,75) Linkswindungen (also gegen den Uhrzeigersinn) anordnen. Ein Histonoktamer wird auch als Nukleosomenkern bezeichnet, im Englischen hat sich für die daran beteiligten Histone der Begriff der core histones eingebürgert. Ein Oktamer besteht aus einem zentralen H32/H42-Tetramer und zwei seitlich daran anliegenden Dimeren aus H2A/H2B. Die DNA windet

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Abb. 6.18 a, b Atomstruktur eines Nukleosoms. a Nukleosomenkern (146 bp DNA), links von oben, rechts von der Seite. Die DNA-Stränge sind braun und grün dargestellt, die Histone blau (H3), grün (H4), orange (H2A) und rot (H2B). b Die 73-bp-Hälfte des Nukleosomenkerns von oben. Die vertikale Dyadenachse liegt bei dem zentralen Basenpaar („0“, oben im Bild). Jede weitere der 7 Doppelhelixwindungen ist nummeriert (1 bis 7). Die Histone sind in b farblich gekennzeichnet wie in a; die carboxy- (C) und aminoterminalen (N) Enden sind angegeben. (Aus Luger et al. 1997, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

sich durch Vertiefungen an der Oberfläche dieses Nukleosomenkerns. Positiv geladene Aminosäuren an den sogenannten β-Brücken zwischen den Histonen treten in Kontakt mit der negativ geladenen DNA. Diese rela-

tiv einfache Konstruktion der Histon-DNA-Interaktion erlaubt eine leichte Dissoziation, wie sie wahrscheinlich für Replikation und Transkription unabdingbar ist.

6.2 Organisation der DNA im Chromosom

Die Röntgenstrukturanalyse des Nukleosoms (Abb. 6.18) hat wichtige Einzelheiten der Organisation der Histone aufgezeigt. Die C-terminalen Regionen der Histone sind einander sehr ähnlich und bestehen aus zentralen α-Helices, die über β-Schleifen auf jeder Seite mit zwei kürzeren seitlichen α-Helices verbunden sind. Je zwei β-Schleifen formen durch Kontakt eine β-Brücke. Die 16 β-Schleifen ergeben somit 8 Brücken, von denen jede einen Kontaktpunkt mit der DNA schafft. Die zentralen Helices dienen der Dimerisierung der Histone, die sich in diesem Bereich berühren (man spricht von einer Handshake-Region). Die N-terminalen Enden der N-terminalen α-Helices berühren sich ebenfalls und formen vier weitere Kontaktstellen mit der DNA in deren kleinen Furche (engl. minor groove). Somit haben 12 der 14 Helixwindungen der DNA um das Nukleosom Kontakt mit den Histonen. Wahrscheinlich stehen auch die beiden verbleibenden Windungen der DNA noch in Kontakt mit dem Histonkern. Die zentrale Struktur aus den α-Helices bezeichnet man auch als Histonfalte (engl. histone fold). Betrachtet man die sterische Konfiguration des Nukleosoms, so wird erkennbar, dass es nahezu symmetrisch ist. Das Symmetriezentrum liegt in der Mitte der DNA, die den Histonkern umgibt. Man nennt diese DNA-Position die Dyadenachse. Bei der Besprechung der DNA-Struktur wurde darauf hingewiesen, dass die DNA trotz ihrer scheinbaren Gleichförmigkeit sequenzspezifische Unregelmäßigkeiten aufweist. Das bedeutet, dass auch die strukturelle Organisation im Nukleosom nicht einförmig ist. Eine echte Symmetrie lässt sich nur erreichen, wenn die DNA-Sequenz aus einer invertierten Wiederholungseinheit von 73 bp besteht, die im Bereich der Dyadenachse ihr Zentrum hat. Jede Abweichung in der Sequenz führt zu veränderten Bindungseigenschaften zwischen DNA und dem Histonkern. Es ist auf dieser Grundlage leicht einzusehen, dass Nukleosomen dazu tendieren, sequenzspezifische, in ihrer Bindungsenergie bevorzugte und sterisch begünstigte Positionen in der DNA einzunehmen. Das erklärt den Vorgang der „Nukleosomenpositionierung“ (engl. nucleosome positioning), d. h. es gibt DNA-Sequenzen, innerhalb derer Nukleosomen bevorzugte Positionen einnehmen, oder andere, die aufgrund der DNA-Struktur nukleosomenfrei sind. Ein Beispiel dafür sind DNA-Sequenzen, deren einer Strang nur Purinbasen, deren anderer aber nur Pyrimidinbasen enthält (also z. B. Poly(dA)/Poly(dT)). Diese DNA-Struktur gestattet es aus sterischen Gründen nicht, Nukleosomen zu formen. Entsprechende DNA-Sequenzen finden sich beispielsweise in Centromerregionen der Chromosomen und im Heterochromatin, teilweise aber auch in Promotorbereichen. Das erleichtert die Erfüllung spezieller Aufgaben, da diese DNA-Bereiche andere Proteine binden bzw. für die

Bildung von Transkriptionskomplexen leicht zugänglich sein müssen. Die strukturellen Eigenschaften der Nukleosomen sind von erheblichem biologischen Interesse, da sie Erkennungssignale für Regulationsfaktoren liefern können. Eine bekannte Erscheinung ist die aufgrund der Dyadenstruktur des Nukleosoms abweichende Konformation der DNA im Bereich von 1,5 Windungen beiderseits der Dyadenachse. Diese Eigenschaft wird von der im HIV (Kapitel 8.2.2) codierten Integrase benutzt, um bevorzugt in der in diesem Bereich erweiterten major groove der DNA zu binden und die Integration des Virus ins Genom zu bewirken. Im Chromosom sind Nukleosomen im Allgemeinen in regelmäßigen Abständen angeordnet. Abhängig vom Zelltyp folgen zwei Nukleosomen in Abständen von etwa 160 bis 200 Basenpaaren. Hiervon entfallen 20 bis 60 Basenpaare auf das Verbindungsstück (engl. linker) zwischen den 146 Basenpaaren, die den Nukleosomenkern umgeben (Abb. 6.18). Ein Nukleosomenstrang hat einen Durchmesser von etwa 10 nm und entspricht damit den elektronenmikroskopisch identifizierten 10-nm-Fibrillen. Die Verpackung in Nukleosomen verkürzt die DNA um einen Faktor von 7. Durch DNA-sequenzspezifische Eigenschaften kommt es jedoch oft zu bestimmten Anordnungen der Nukleosomen in bestimmten Chromosomenbereichen, oder es werden nukleosomenarme oder -freie Bereiche geschaffen. Die Röntgenstrukturanalyse des Nukleosoms hat einen weiteren sehr wichtigen Aspekt ergeben: Die terminalen Bereiche der Histone dringen aus dem Nukleosom nach außen, sodass sie zu Interaktionen mit anderen Molekülen in der Lage sind. Diese Histonbereiche unterliegen jedoch Modifikationen, die ihre Konformation und damit auch Funktion beeinflussen. Insbesondere die Lysine können acetyliert werden, aber auch Phosphorylierung an Serinen, Methylierung an Lysinen, ADP-Ribosylierung oder Ubiquitinierung werden beobachtet. Die Folgen von Acetylierung sind besonders gut untersucht: Histone in transkriptionsaktiven Bereichen der Nukleosomenkette sind meist acetyliert, während sie in transkriptionsinaktiven Chromatinbereichen nicht acetyliert sind. Alle Modifikationen von Histonen haben Konsequenzen für die Chromatinstruktur, und das genaue Verständnis der komplexen Muster der Modifikationen wird eine notwendige Voraussetzung zum Verständnis von Genregulationsvorgängen sein (Kapitel 7.3). Allerdings ist die Verteilung der Nukleosomen im Chromatin nicht konstant; es muss ja möglich sein, die Positionen der Nukleosomen zu wechseln, wenn die Veränderungen des Differenzierungsmusters oder veränderte Umweltbedingungen einen besonderen Zugang zur DNA nötig machen, um so Genaktivierung starten

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

zu können. Dazu gibt es besondere enzymatische Maschinen, die diese Aufgabe erledigen können. Dazu gehören vor allem die beiden Familien SWI/SNF (engl. switch) und ISWI (engl. imitator of switch); den möglichen Mechanismus erläutert Abb. 6.19.

Die

niedrigste Organisationsstufe der chromosomalen DNA in der 10-nm-Fibrille wird durch die Bildung von Nukleosomen erreicht. Basische chromosomale Proteine, die Histone, bilden Proteinoktamere, um die sich die DNA in zwei Windungen mit einer Gesamtlänge von 146 Basenpaarungen herumlegt. Nach etwa 20 bis 60 Basenpaaren folgt ein weiteres Nukleosom, sodass Nukleosomenketten entstehen, die elektronenmikroskopisch als 10-nm-Fibrillen erscheinen und eine etwa 7fache Verkürzung der DNA-Länge verursachen. Wegen des hohen Proteinanteils (der Durchmesser der DNA beträgt ja nur etwa 2,4 nm) bezeichnet man diese 10-nm-Fibrillen auch als Nukleoproteinfibrillen (10 nm entsprechen 100 Å; diese Längeneinheit wurde früher für sehr kleine Abstände verwendet, 10 Å = 1 nm).

a

Das Bild eines Nukleosoms suggeriert, dass wir es mit einem dicht gepackten Proteinkomplex zu tun haben. Die physikalische Strukturanalyse von Nukleosomenkristallen zeigt jedoch, dass im Inneren eines Nukleosoms viel freier Raum vorhanden ist. Wahrscheinlich gewährt es dem gesamten Nukleosom eine Flexibilität, wie sie für stoffwechselphysiologische Veränderungen der Chromosomenstruktur erforderlich ist, insbesondere in Zusammenhang mit der Transkription. Elektronenmikroskopische Daten deuten zwar darauf hin, dass die Nukleosomenstruktur der DNA teilweise auch während der Transkription erhalten bleibt. Welchen Strukturveränderungen das Chromatin während der Transkription aber im Einzelnen unterworfen ist, ist noch ungeklärt. Sicherlich müssen die Nukleosomen strukturell verändert werden, wenn der durch die RNA-Polymerase geformte Transkriptionskomplex ein Nukleosom passiert. Von einem Verständnis der strukturellen und funktionellen Konsequenzen der Chromatinorganisation selbst auf diesem einfachen Niveau sind wir noch weit entfernt.

oder

SWI/SNF

ACF

CHRAC

ungeordnet

regelmäßig

b oder SWI/SNF CHRAC

ACF

CHRAC

ACF

und verschiedene Positionen

verschoben

Abb. 6.19 a, b Gleiteigenschaften der SWI/SNF- und ISWI-Remodellierungskomplexe. a Die SWI/SNF- und ISWI-Remodellierungsproteine, wie ACF (engl. ATP-utilizing chromatin-assembly and remodelling factor) und CHRAC (engl. chromatin-accessibility factor), haben gegensätzliche Gleiteigenschaften an Nukleosomen. SWI/SNF-Proteine überführen eine geordnete Nukleosomenstruktur in eine unregelmäßige Anordnung, während die ISWI-Proteine den umgekehrten Prozess steuern. b Die beiden Remodellierungsgruppen haben unterschiedliche Effekte auf einzelne Nukleosomen, die als zweidimensionale Projektionen dargestellt sind. Die Position des Histon-Oktamers auf der DNA

zentriert

Endposition

ist als ein beiges Oval gezeigt. Die durchgehenden blauen Linien deuten die verschiedenen Positionen der DNA an; die punktierten Linien bezeichnen die DNA an verschiedenen Positionen entlang des Oktamers. Die Remodellierung durch die SWI/SNFKomplexe führt zu verschiedenen Positionen und erzeugt eine spezielle Nukleosomenspezies, bei der die DNA um ca. 50 bp verschoben ist. ISWI-Proteine (wie ACF und CHRAC) bilden aber keine verschobenen Nukleosomen, sondern positionieren die Nukleosomen in Abhängigkeit von weiteren Proteinpartnern entweder zentriert oder am Ende. (Nach Saha et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

6.2 Organisation der DNA im Chromosom

Welche große Bedeutung der strukturellen Organisation der DNA im Chromosom zukommt, wird deutlich, wenn wir uns den DNA-Gehalt eines diploiden Kerns vor Augen halten. So enthält beispielsweise das menschliche Genom DNA in einer Gesamtlänge von 94 cm. Bei 46 Chromosomen sind das im Mittel 2 cm DNA je Chromosom. Ein normaler Interphasekern hat einen Durchmesser von nur etwa 10 mm, und ein mittleres Metaphasechromosom des Menschen ist ungefähr 5 mm lang. Um die DNA in einem Chromosom und dieses in einem Zellkern unterzubringen, muss die DNA-Doppelhelix also um das etwa 4000fache verkürzt werden. Durch die Bildung von Nukleosomen erfährt die DNA gegenüber der Länge einer freien Doppelhelix eine Verkürzung um einen Faktor 7. Wir müssen hieraus schließen, dass noch weitere Schritte der Verpackung der DNA erfolgen müssen, um die in einem einzelnen Chromosom enthaltene DNA-Menge in einen Interphasekern von 10 mm Durchmesser zu verpacken. Die elektronenmikroskopische Beobachtung von 25‒30-nm-Fibrillen (Abb. 6.20) deutet bereits an, dass es zunächst wohl zu einer weiteren Auffaltung der Nukleosomenkette kommt. Einen wichtigen Beitrag zu dieser Auffaltung liefert ein weiteres Histonprotein, das Histon H1 (Tabelle 6.3). Wir wissen heute, dass es sich einerseits mit seinem globulären Mittelteil der DNA am Nukleosom so anlagert, dass die DNA-Spirale stabilisiert wird. Andererseits kommt es aber auch (zumindest mit seinem C-terminalen Bereich) mit der DNA in Kontakt, die zwei aufeinanderfolgende Nukleosomen verbindet. Es wird daher angenommen, dass es an einer Aufwindung der nukleosomalen 10-nm-Fibrille zur 25‒30-nm-Fibrille beteiligt ist. Hierfür spricht auch die Beobachtung, dass das Histon H1 in inaktivem Chromatin vorhanden ist, in transkriptionsaktivem Chromatin hingegen nicht oder in nur geringeren Mengen gefunden wird. Eine schematische Vorstellung der Vorgänge, an denen das Histon H1 beteiligt ist, und die zu einem entsprechend höheren Verpackungsgrad führen, vermittelt Abb. 6.20. Eine Möglichkeit, die Funktion eines Proteins zu verstehen, besteht in der Suche nach bzw. in der Herstellung von entsprechenden Funktionsverlust-Mutanten (engl. loss of function). Die entsprechende Histon-H1-Verlust-Mutante der Maus ist als heterozygote Mutante lebensfähig, und der Verlust von etwa 50 % der Histon-H1-Proteine führt in embryonalen Stammzellen der Maus zwar zur Verkürzung der Nukleosomen, aber nur zum Abschalten von 29 Genen – offensichtlich ist das Histon H1 also kein allgemeiner Repressor der Transkription. Allerdings ist ein vollständiger Verlust von Histon H1 in homozygo-

ten Mutanten mit Leben nicht kompatibel; die Embryonen sterben während ihrer Entwicklung an vielfältigen Defekten (zur Übersicht siehe Catez et al. 2006). Für die molekulare Struktur der 25‒30-nm-Fibrille gibt es nach 30 Jahren intensiver Forschung noch immer keine endgültigen Vorstellungen. Im Prinzip werden zwei Strukturmodelle diskutiert (Abb. 6.21): ï Ιn der eingängigen Helix (oder Solenoid) wickeln sich die Nukleosomen so auf, dass die nachfolgenden Nukleosomen in der kompakten Struktur benachbart sind und durch die Verbindungs-DNA verbunden bleiben. Die Verbindungs-DNA kann aber in das Innere der Faser abknicken und so variable DNA-Längen annehmen. ï Das zweigängige Helix-Modell basiert auf einer Zick-Zack-Anordnung der Nukleosomen, wobei die Verbindungs-DNA, die die Nukleosomen verbindet, auf der gegenüberliegenden Seite der Faser zu liegen kommt. Auch die 25‒30-nm-Fibrille ist nur eine mittlere Stufe in der höheren strukturellen Organisation des Chromosoms. Sind unsere begründeten Vorstellungen von der molekularen Struktur schon auf diesem Niveau äußerst begrenzt, so wird die Diskussion über noch höhere Organisationsstufen im Wesentlichen nur noch durch Spekulationen beherrscht.

Nicht alle DNA-Bereiche sind aufgrund ihrer Sequenz geeignet, eine nukleosomale Struktur anzunehmen. Auch während der Transkription müssen die Nukleosomen zumindest kurzfristig verändert oder entfernt werden, um der Polymerase die Fortbewegung an der DNA während der RNA-Synthese zu gestatten. Chromosomale DNA ist in Längsfibrillen unterschiedlicher Hierarchiestufen organisiert. Die niedrigste Organisationsstufe ist eine 10-nm-Fibrille, die folgende eine 25–30-nm-Fibrille. Diese Fibrillen werden durch Interaktionen zwischen DNA und Proteinen erzeugt; eine besondere Bedeutung hat dabei das Histon H1.

6.2.4 Chromatin und epigenetische Regulation Ein wichtiges Element für die Regulation des funktionellen Zustands der Histonproteine sind posttranslationale Modifikationen. Besondere Bedeutung haben dabei vor allem Phosphorylierung, Acetylierung und Methylierung, aber auch Ubiquitinierung und ADPRibosylierung sind bekannt. Diese Veränderungen spielen sich vor allem an den nach außen abstehenden N-terminalen Bereichen der Histone ab (Abb. 6.22). Besonders intensiv untersucht ist die Acetylierung und

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Abb. 6.20 a, b Bindung von Histon H1 an Chromatin. a Die Bindung von Histon H1 an das Chromatin ist ein Mehrschritt-Prozess, der durch eine Ladungs-abhängige Wechselwirkung von schwacher Affinität der C-terminalen Domäne mit der Verbindungs-DNA (engl. linker) eingeleitet wird. Diese schwache Wechselwirkung erlaubt der globulären Domäne, das Nukleosom nach einem optimalen Platz abzusuchen. Die passende Platzierung der globulären Domäne induziert Konformationsänderungen im H1-Histon und dem Chromatin. b Abhängigkeiten der H1-Nukleosomen-Wechselwirkung: (1) Die einzigartigen strukturellen Eigenschaften des Histons H1 sind die Hauptursache für die Bindung an das Chromatin; (2) regulatorische Cofaktoren verstärken die Bindung; (3) posttranslationale Modifikation an H1 oder dem Chromatin vermindern die Bindung von H1; (4) Transkriptionsfaktoren (TF) und ähnliche regulatorische Faktoren konkurrieren mit H1 um spezifische Bindestellen am Chromatin; (5) Proteine, die unspezifisch an das Chromatin binden (z. B. HMGs), konkurrieren mit H1 um die Bindung ans Chromatin und vermindern entsprechend die Wechselwirkung von H1 mit dem gesamten Chromatin. (Nach Catez et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

6.2 Organisation der DNA im Chromosom

Abb. 6.21 a, b Schematische Darstellung von zwei verschiedenen Topologien der Faltung von Chromatinfasern. a Eingängige Helixstruktur, in der abwechselnde Helixwindungen blau und violett gezeichnet sind. Die Struktur beschreibt eine linkshändige Helix. b Zweigängige Helixstruktur, in der abwechselnde Nukleosomenpaare blau und violett gezeichnet sind. Die Nukleosomen folgen einem linkshändigen helikalen Weg. (Nach Robinson u. Rhodes 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Deacetylierung der Histone, die durch spezifische Enzyme katalysiert wird (Histon-Acetyltransferasen, HATs; und Histon-Deacetylasen, HDACs). Die wichtigsten Stellen der Acetylierung in H3-Histonen sind die Lysin-Reste 9, 14, 18 und 23; in den H4-Histonen sind die Lysin-Reste 5, 8, 12 und 16 bevorzugte Ziele der Acetylasen. Phosphorylierung der H3-Histone erfolgt bevorzugt an Ser10 und ist direkt korreliert mit der Induktion besonders früher Gene wie c-jun, c-fos und c-myc. So ist beispielsweise die gleichzeitige Acetylierung von H4 an Lys16 und die Phosphorylierung von H3 an Ser10 Voraussetzung für die verstärkte Transkription bestimmter Abschnitte des männlichen X-Chromosoms. Methylierung erfolgt in den H3-Histonen bevorzugt an den Lysin-Resten 4, 9 und 27. Allerdings können diese Lysin-Reste einfach, zweifach oder gar dreifach methyliert sein, was eine weitere Komplexitätsebene hinzufügt; ein Beispiel für eine spezifische immuncytologische Analyse einer zweifachen Methylierung des Histons H3 eines Chromosoms von Drosophila zeigt Abb. 6.23. Histonspezifische Methyltransferasen (HMTs) sind bekannt und spielen vermutlich eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genaktivitäten.

Abb. 6.22 a, b Domänenorganisation und N-Terminus des Histons H3. a Allgemeine Chromatinorganisation. Wie in anderen Histonen ist der N-Terminus des Histons H3 (rot) hochkonserviert und in der Chromatinfaser nach außen gerichtet. Es sind verschiedene posttranslationale Modifikationen bekannt, z. B. Acetylierung (grünes Dreieck), Phosphorylierung (weißer Kreis) und Methylierung (gelbes Sechseck). Weitere Modifikationen können an der globulären Domäne vorkommen. b Schematische Darstellung möglicher Modifikation am N-Terminus des Histons H3. Die Aminosäuresequenz des N-Terminus des menschlichen Histons H3 ist im Ein-Buchstaben-Code angegeben. Zum Vergleich ist der N-Terminus des menschlichen CENPA-Proteins gezeigt, einer centromerspezifischen H3-Variante, sowie des Histons H4, des nukleosomalen Partners von H3. Der Abstand zwischen den acetylierbaren Lysin-Resten (rot), potenziellen Phosphorylierungsstellen (blau) und Methylierungsstellen (violett) ist konstant. Der Lysin-Rest an Position 9 des Histons H3 (Stern) kann sowohl acetyliert als auch methyliert werden; der Lysin-Rest 9 im CENP-A-Protein (fett) kann ebenfalls chemisch modifiziert werden. (Nach Strahl u. Allis 2000, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Die oben grob wiedergegebenen Befunde zur Modifikation der Histone im Rahmen zellulärer Signalketten führten zur Hypothese eines „Histon-Codes“ durch Strahl und Allis im Jahr 2000. Die vielfältige Modifikation der N-terminalen Überhänge der Histone bewirkt unterschiedliche Veränderungen der elektrostatischen Bedingun-

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248 248

Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

gen, unter denen Faltung oder Entfaltung des Chromatins möglich ist. Damit kann die Verwendung verschiedener Modifikationen (und ihrer Kombinationen) als dauerhafter Signalverstärker im Rahmen spezifischer Signalketten bei bestimmten zellulären Prozessen dienen (z. B. Mitose, Aktivierung oder Abschaltung von Genen). Eine Übersicht über diese Möglichkeiten gibt Abb. 6.24. Man kann die Modifikationen von Histonen als Teil epigenetischer Prozesse (Kapitel 11.8) interpretieren, die es erlauben, Informationen durch die Aufrechterhaltung des

Modifikationsmusters von Histonen über Zellteilungen hinweg weiterzugeben.

Abb. 6.23 a, b Immuncytologische Analyse einer HistonModifizierung in polytänen Drosophila-Chromosomen. Der Antikörper markiert zweifach methyliertes Histon H3 an der Position Lysin-9. Die Markierung (grün) erfasst hauptsächlich das konstitutive Heterochromatin des Centromers des 4. Chromosoms (links, Mitte) sowie einige Banden des Telomers am X-Chromosom (rechts). Die DNA ist mit Propidium-Iodid gefärbt (rot; Balken: 10 μm); durch Überlagerung ergeben sich gelbe Farben (Mitte). b Möglicher Weg zur Bildung des Heterochromatins in der perizentrischen Region. Die Bildung des Heterochromatins beginnt mit dem Autausch des Histons H2A

durch die Variante H2Av; das führt zur Acetylierung des Histons H4 an Lys12 (im Ein-Buchstaben-Code: K12). Die anschließende Methylierung des Lys9 (K9) am Histon H3 ermöglicht die Bindung von HP1; HP1 seinerseits führt zu einer dichteren Verpackung des Chromatins, verbreitet sich durch Selbstdimerisierung über die ganze Region und führt schließlich zur Trimethylierung des Histons H4 am Lys20 (K20).(Nach Ebert et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer) b (nach Lam et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung von Springer); b nach Lam et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Durch Acetylierung, Methylierung und Phosphorylierung können Histone modifiziert werden. Die dadurch ermöglichten unterschiedlichen Verpackungsdichten tragen zur Aktivierung und Inaktivierung von Genen über einen größeren Bereich bei und können über mehrere Zellteilungen aufrechterhalten werden.

6.3 Variabilität der Chromosomen und Dosiskompensation

6.3 Variabilität der Chromosomen und Dosiskompensation

Bisher haben wir eine Form von Variabilität der Chromosomenstruktur betrachtet, die den Organismus insgesamt betrifft, also mit seiner genetischen Ausstattung in Beziehung steht. Variabilität der Chromosomenstruktur findet man aber auch, wenn man verschiedene Zelltypen vergleicht. Es gibt gute Gründe zu vermuten, dass solch eine Variabilität mit der Funktion der Chromosomen in den betreffenden Zelltypen zu tun hat. Ein besonderer Typ von cytologisch ungewöhnlichen Chromosomen lässt sich in manchen Geweben, vor allem von Insekten, beobachten. Sie zeichnen sich durch eine ungewöhnliche Größe und einen großen strukturellen Detailreichtum aus (Abb. 6.25). Aufgrund ihrer Größe

werden diese Chromosomen Riesenchromosomen oder polytäne Chromosomen genannt. Diese Bezeichnung beschreibt den Aufbau dieser Chromosomen: Sie bestehen aus einer großen Anzahl exakt gepaarter Chromatiden, die durch wiederholte Replikation der chromosomalen DNA ohne darauf folgende Zell- und Kernteilungen entstehen. Sie wurden zuerst von T. S. Painter 1933 beschrieben und in hervorragender Qualität zeichnerisch dargestellt. Diese Karten blieben in modifizierter und ergänzter Form etwa 40 Jahre gültig. Eine wichtige Eigenart von Riesenchromosomen ist ihr Querscheibenmuster. Man spricht auch von Banden, die auf den Chromosomen quer zu ihrer Längsrichtung zu beobachten sind. Die Banden entstehen dadurch, dass die chromosomale DNA in diesen Chromosomenbereichen stärker konzentriert ist als in den beiderseitig angrenzenden Chromosomenabschnitten, den Interbanden. Die Banden sind zwar in ihrer Anordnung längs der Chromosomenachse sowohl in ihrer Dicke als auch ihrem Abstand sehr

Abb. 6.24 Die Histon-Code-Hypothese. Histone werden an ausgewählten Aminosäureresten modifiziert und es wurde gezeigt, dass manche Muster mit biologischen Prozessen gekoppelt sind (z. B. Acetylierung und Transkription). Immer mehr deutet darauf hin, dass verschiedene Modifikationen am N-Terminus der Histone H3 (rot) oder H4 (schwarz) in ihrer Abfolge oder in Kombinationen bestimmte biologische Abläufe steuern. Dabei können die vielfältigen Modifikationen in Form einer Hierarchie oder in definierten Kombinationen in bestimmten Regionen der Chromatinfaser wirksam werden. Bekannte Proteine, die mit bestimmten Modifikationen asso-

ziiert sind oder an die entsprechenden Stellen binden, sind angegeben. Zusätzlich wird auch darüber diskutiert, dass die N-terminale Domäne des CENP-A-Proteins (blau) im Zusammenhang mit der Mitose ebenfalls modifiziert wird (z. B. durch Phosphorylierung); der gelbe Bereich in Klammern bezeichnet ein Motiv, in dem sich Serin- und Threonin-Reste mit ProlinResten abwechseln. RCAF: replication-coupling assembly factor; SMC: structural maintenance of chromosome; Sir3/4: silent information regulator; Tup1: thymidine monophosphate uptake. (Nach Strahl u. Allis 2000, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

6.3.1 Die Variabilität der Chromosomen Polytäne Chromosomen (Riesenchromosomen)

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

variabel, kennzeichnen aber gerade dadurch eine bestimmte Chromosomenregion eindeutig. In unterschiedlichen Zellen und Entwicklungsstadien sind die Banden eines bestimmten Chromosomenabschnitts im Prinzip stets gleich. So kann man sie zur Identifizierung nicht nur des Chromosoms, sondern auch der Position innerhalb eines Chromosoms benutzen. Man hat daher für Organismen, für die eine Kartierung von Interesse ist, Chromosomenkarten auf der Grundlage der Bandenmuster erstellt; sie wurde eine wichtige Grundlage für genetische und molekulare Analysen des Drosophila-Genoms. Bereits frühzeitig hat man eine Verbindung zwischen den Banden und den Chromomeren der meiotischen Prophasechromosomen vermutet. Übereinstimmend mit der Interpretation der Bedeutung von Chromomeren hat man geschlossen, dass die Banden die chromosomalen Orte der Gene sind, während Interbanden eine Art Brückenfunktion zugeschrieben wurde.

Abb. 6.25 Mitotischer Karyotyp (oben) und Teil des polytänen Karyotyps von Drosophila melanogaster in der gleichen Vergrößerung (unten). Es sind die Chromosomen 3L, 3R und X gezeigt. (Nach Aulard et al. 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Abb. 6.26 Balbiani-Ringe im Chromosom IV von Chironomus tentans nach metachromatischer Toluidinblaufärbung. DNAreiche Chromosomenbereiche (Querscheiben) erscheinen dunkel, während RNA-reiche Regionen (Balbiani-Ringe, Puffs) rot gefärbt sind. (Foto: W. Hennig, Mainz)

Dieses Modell wurde auch durch die Beobachtung unterstützt, dass die Konstanz der Bandenstruktur eines Chromosoms nicht absolut ist. Genaue Vergleiche ließen erkennen, dass sehr charakteristische lokale Veränderungen in unterschiedlichen Geweben oder im Laufe der Entwicklung des Organismus auftreten können. Wolfgang Beermann hatte 1952 erkannt, dass diese Veränderungen eine Folge sich ändernder Genaktivität sind. Bei Beginn der Transkription eines Gens wird die DNA einer Banden dekondensiert und damit für die an der RNA-Synthese beteiligten Moleküle und Enzyme zugänglich. Die Region verliert ihre starke Lichtbrechung im Phasenkontrastmikroskop (und zugleich ihre verstärkte Färbbarkeit durch DNA-spezifische Farbstoffe). Man bezeichnet solche Chromosomenregionen als Aufblähungen (engl. puff). Diese Aufblähungen können bisweilen mehrere benachbarte Banden einschließen, oder sich sogar schrittweise über eine Reihe von Banden hinweg bewegen. Besonders große Aufblähungen nennt man nach ihrem Entdecker E. G. Balbiani (1881) Balbiani-Ringe. Am bekanntesten sind die Balbiani-Ringe in den Riesenchromosomen von Chironomiden (Zuckmücken; Abb. 6.26). Dass in solchen Aufblähungen RNA synthetisiert wird, lässt sich durch den Einbau radioaktiv markierten Uridins nachweisen (Abb. 6.27). Bei Einstellung der Transkription erfolgt eine Kondensation der chromosomalen DNA und damit eine Rückbildung in die stärker lichtbrechenden Querscheiben. Die Tatsache, dass in Riesenchromosomen eine intensive RNA-Synthese zu beobachten ist, kennzeichnet diese Chromosomen als Interphasechromosomen. Das erklärt auch ihre Länge: Wie bei normalen Interphasechromosomen ist die chromosomale DNA der

6.3 Variabilität der Chromosomen und Dosiskompensation

Abb. 6.27 RNA-Synthese in Riesenchromosomen. Durch den Einbau radioaktiv markierten Uridins in die neu synthetisierte RNA lässt sich zeigen, welche Chromosomenbereiche aktive Gene enthalten. Hier wurde eine Speicheldrüse von Chironomus tentans für 6 Stunden mit 3H-Uridin-haltigem Medium inkubiert. Die Riesenchromosomen wurden anschließend autoradiographisch analysiert. Die schwarzen Regionen im Chromosom sind Silberkörnchen, die im autoradiographischen Film an belichteten Stellen nach Entwicklung sichtbar werden (Technik-Box 13). Einbau radioaktiver RNA-Vorstufen wird in den Aufblähungen beobachtet, wie nach der Interpretation Beermanns zu erwarten ist. (Aus Pelling 1964, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Riesenchromosomen dekondensiert, und die Chromosomen sind nur dadurch sichtbar, dass sie aus einer Vielzahl lateral gepaarter Chromatiden bestehen. Der Interphasecharakter dieser Chromosomen wird auch dadurch deutlich, dass in ihnen durch Autoradiographie mit radioaktivem Thymidin Replikation nachgewiesen werden kann. Sie durchlaufen also gewissermaßen sich wiederholende S-Phasen, ohne zwischendurch einen vollen Zellzyklus, der eine Mitose beinhaltet, abzuschließen. Messungen des DNA-Gehalts haben ergeben, dass die Vermehrung der DNA in den Riesenchromosomen mit dem Faktor 2n erfolgt. Die Anzahl der Verdoppelungsschritte (n) kann mehr als 13 betragen, sodass der Polytäniegrad in diesem Fall über 8192 liegt (z. B. in Speicheldrüsenchromosomen von Zuckmücken). Durch die Angabe des Polytäniegrades kennzeichnet man die Anzahl der Chromatiden im Riesen-

chromosom. In Drosophila-Polytänchromosomen von Speicheldrüsen liegt der endgültige Polytäniegrad bei 1024 oder 2048. In anderen Geweben (z. B. Malpighigefäßen, Darmepithel) ist er niedriger (64 oder 128). Vergleichen wir einen mitotischen Metaphasechromosomensatz mit einem Riesenchromosomensatz aus den Speicheldrüsen von Drosophila, so müssen wir einige grundsätzliche Unterschiede feststellen. Der auffallendste Unterschied liegt darin, dass die Chromosomenanzahl in den Speicheldrüsenkernen der einer haploiden Zelle entspricht. Die Ursache hierfür ist nicht Haploidie dieser Zellen, sondern die somatische Paarung der Chromosomen. Somatische Paarung ist eine Besonderheit von Drosophila und anderen Insekten. Im Gegensatz zu den meisten anderen Organismen sind hier homologe Chromosomen in allen Geweben, also nicht nur in meiotischen Zellen, gepaart. In den Riesenchromosomen erfolgt diese Paarung so intensiv, dass eine Unterscheidung der beiden Homologen normalerweise nicht mehr möglich ist. Liegen allerdings Chromosomenaberrationen vor, z. B. eine Inversion, so werden beide Homologe im Bereich der Aberration sichtbar. Liegt dagegen eine Deletion in einem der Homologen vor, bildet sich eine Paarungslücke. Solche Heterozygotien waren von großer Bedeutung für die praktische genetische Arbeit, da sie die cytologische Kartierung von Genen sehr erleichterten. Durch vergleichende Analyse der Phänotypen von Heterozygoten mit dem cytologischen Bild der Speicheldrüsenchromosomen kann man ein Gen auf einen Teilbereich einer Bande genau kartieren. Durch solche Analysen wurde der white-Locus von Drosophila melanogaster einem Teilbereich der Bande 3C2 des X-Chromosoms zugewiesen. Auch heute haben solche cytologischen Karten eine wichtige Bedeutung für die Identifizierung der chromosomalen Lokalisation von Genen, zumal der Aufwand hierfür durch moderne in-situ-Hybridisierungstechniken gering ist.

In vielen spezialisierten Zellen von Insekten findet man Riesenchromosomen (Polytänchromosomen), die durch mehrfach aufeinanderfolgende Replikation der Chromatiden ohne deren Trennung und ohne Zellteilungen entstehen. Es handelt sich dabei um Interphasechromosomen. Sie zeigen eine Gliederung in Banden (oder Querscheiben) und Interbanden. Dieses Muster ist chromosomenspezifisch und gestattet eine Kartierung von Genen bis auf Teilbereiche einer Bande. Banden können sich dekondensieren und sich aufblähen. Solche Aufblähungen (engl. puff) sind ein Anzeichen für Transkription im betreffenden Chromosomenbereich. Die Anzahl von Riesenchromosomen in Drosophila entspricht der eines haploiden Chromosomenkomplements.

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Besonders auffallend und daher besonders ausgiebig untersucht sind die überreplikativen Bereiche in Larven von Sciara- und Rhynchosciara-Arten (Trauermücken der Familie Sciaridae). In Rhynchosciara angelae werden gegen Ende des 4. Larvenstadiums (Tag 62 der larvalen Entwicklung) gleichzeitig mehrere große Aufblähungsbereiche gebildet, in denen die DNA bis zu 16fach überrepliziert wird (Amplifikation). Gleichzeitig erfolgt eine intensive Transkription, die mRNA für Sekretproteine liefert; während der Präpuppenperiode bildet sich die Amplifikation allmählich wieder zurück. Die fibrillären Sekretproteine sind in großen Mengen zur Bildung des Kokons erforderlich (S. 273f). Wir lernen hiermit einen der Mechanismen kennen, die Zellen zur Verfügung haben, um große Mengen bestimmter Moleküle in kurzer Zeit zu produzieren.

Lampenbürstenchromosomen Eine ungewöhnliche cytologische Struktur finden wir auch bei den Prophasechromosomen einiger Organismen während der ersten meiotischen Teilung. Ganz allgemein sind meiotische Prophasechromosomen durch die vielen Chromomeren charakterisiert, die sich perlschnurartig auf den Chromosomenachsen zeigen. In manchen Organismen bilden sich – meist in der weiblichen Keimbahn – von diesen Chromomeren

Abb. 6.28 Schematische Darstellung der Feinstruktur der Lampenbürstenchromosomen. Links oben ist ein Bivalent in seiner Grundstruktur wiedergegeben. Die paarigen lateralen Schleifen sind rechts und unten vergrößert zu sehen. Jede der Schleifen wird von einer der Chromatiden eines Chromosoms durch Dekondensation der DNA im Zusammenhang mit der Transkription geformt. (Aus Gall 1956, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

schleifenartige Strukturen aus, die den Chromosomen ein diffuses Aussehen geben. Wegen ihres Erscheinungsbildes werden diese Chromosomen auch Lampenbürstenchromosomen (engl. lamp-brush chromosomes) genannt, da sie im Extremfall den früher zur Reinigung von Petroleumlampen gebräuchlichen Bürsten ähnlich sehen (Abb. 6.28). Solche Lampenbürstenchromosomen sind vor allem in den primären Oocyten vieler Organismen zu beobachten, treten jedoch bisweilen auch im primären Spermatocytenstadium auf. Am eindrucksvollsten sind Lampenbürstenschleifen bei einigen Amphibienarten ausgebildet. An der Basis einer jeden Schleife befindet sich ein Chromomer. Die Anzahl der Schleifen entspricht ungefähr der der Chromomeren. Es werden also Tausende von Schleifen geformt, jedoch scheint nicht jedes Chromomer Schleifen auszubilden. Da es sich um Prophasechromosomen handelt, ihre Chromatiden also bereits verdoppelt sind, wird jeweils ein Paar von Schleifen gebildet, dessen einer Partner jeweils einer Chromatide zuzuordnen ist. Während der Oocytenentwicklung, die bei Amphibien normalerweise ein halbes Jahr oder noch viel länger andauern kann, sind einige Veränderungen in der Ausbildung von Schleifenpaaren zu beobachten, d. h. nicht alle Schleifenpaare sind während der gesamten meiotischen Prophase I zu sehen. Während nun die Mehrzahl dieser Schleifen eine sehr einheitliche Struktur aufweist und sich nur in der Länge unterscheidet, fällt eine Minderheit durch eine besondere, für jede Schleife charakteristische Morphologie auf. Da sie hierdurch zur Identifikation und Kartierung der jeweiligen Chromosomen geeignet sind, werden sie in der englischen Literatur als landmark loops bezeichnet. Wir müssen Lampenbürstenschleifen jedenfalls als aktive Gene ansehen (Abb. 6.29). So stellt sich die Frage, welche Beziehung zwischen Lampenbürstenschleifen und Genen besteht. Die Länge der Lampenbürstenschleifen in manchen Arten, wie beispielsweise Notophthalmus, übersteigt bei Weitem die Länge einzelner Gene. Durch in-situ-Hybridisierungsexperimente konnten S. E. Bromley und J. G. Gall (1987) zeigen, dass zumindest ein Teil der Schleifen mehrere Transkriptionseinheiten beherbergt. Diese Beobachtung schließt an die Befunde von Riesenchromosomen an, deren Banden ebenfalls oft mehr als eine Transkriptionseinheit enthalten. Offenbar ist die Ausbildung solcher großer Lampenbürstenschleifen, wie sie besonders gut ausgebildet bei D. hydei gefunden werden, eine Besonderheit einer begrenzten Anzahl von Drosophila-Arten, während kleinere Schleifen des Y-Chro-

6.3 Variabilität der Chromosomen und Dosiskompensation

gen anderen Arten enthalten mehr als 250.000 Basenpaare (bisweilen weit über 1.000.000 bp) DNA, wie die elektronenmikroskopische Darstellung transkriptionsaktiver Lampenbürstenschleifen beweist. Die DNA dieser Y-chromosomalen Lampenbürstenschleifen ist in sehr komplexer Weise aus repetitiven (wiederholten) DNA-Sequenzen aufgebaut.

In manchen Organismen werden in der Prophase der ersten Reifeteilung Lampenbürstenchromosomen gebildet. Von den Chromomeren auf der Chromosomenachse werden zwei laterale symmetrische Schleifen ausgebildet, die transkriptionsaktiv sind. Jede dieser Schleifen ist einer der Chromatiden zuzuordnen.

Überzählige und keimbahnlimitierte Chromosomen

Abb. 6.29 a–c Transkription in Lampenbürstenschleifen. a Lampenbürstenchromosomenschleifen von Notophthalmus viridescens. Durch Hybridisierung mit 3H-markierter RNA wurden die wachsenden Transkripte an der Schleife radioaktiv markiert und anschließend autoradiographisch sichtbar gemacht. Die markierte Probe ist komplementär zu den neu synthetisierten RNA-Molekülen an der DNA-Achse. Es wird spezifisch die RNA im sphere-Locus im Chromosom 6 markiert. b Immunolokalisation von RNA-Polymerase II in den Schleifen von Triturus vulgaris. Der Antikörper erkennt die unphosphorylierte Form der C-terminalen Domäne; Balken: 10 μm. c Phasen-KontrastDarstellung zu b. (a nach Gall et al. 1981; b, c Morgan 2002, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

mosoms wohl bei den meisten, wenn nicht allen Drosophila-Arten, zu finden sind. Besonders deutlich wird das an Lampenbürstenschleifen, die von Fertilitätsgenen im Y-Chromosom von Drosophila während des primären Spermatocytenstadiums ausgebildet werden, wie Meyer, Hess und Beermann zu Beginn der 1960erJahre feststellten (Meyer et al. 1961). Große Lampenbürstenschleifen in D. melanogaster, D. hydei und eini-

Eukaryotische Genome enthalten nicht nur Gene, die in normalen Chromosomen gefunden werden (A-Chromosomen), sondern auch vielfältige „egoistische“ genetische Elemente, die nicht den Mendel’schen Gesetzen gehorchen. Nennenswert davon sind vor allem die B-Chromosomen, die von E. B. Wilson bereits 1907 beschrieben wurden, wenngleich ihre egoistische Natur erst später erkannt wurde. B-Chromosomen (auch als überzählige Chromosomen bezeichnet) werden in allen wesentlichen Gruppen von Tieren und Pflanzen gefunden. Sie sind wahrscheinlich aus A-Chromosomen entstanden, folgen jetzt aber ihrem eigenen evolutionären Weg. Ihr irreguläres mitotisches und meiotisches Verhalten erlaubt ihnen, sich eigennützig in der Keimbahn zu etablieren und ermöglicht eine höhere Übertragungsrate als wir das von normalen Chromosomen kennen. B-Chromosomen sind in ihren cytologischen Eigenschaften als heterochromatisch zu bezeichnen, und damit stimmt auch überein, dass sie offenbar vorwiegend aus repetitiver DNA aufgebaut sind. Die B-Chromosomen können als ein Nebenprodukt der Evolution betrachtet werden; viele Hinweise deuten darauf hin, dass sie von A-Chromosomen abstammen, z. B. von polysomen A-Chromosomen, von zentrischen Fragmenten, die aus Fusionen hervorgegangen sind, oder von Amplifikationen perizentrischer Regionen fragmentierter A-Chromosomen. Es gibt außerdem Hinweise, dass B-Chromosomen auch beim genetischen Austausch naher verwandter Arten entstehen können. Für eine detaillierte Darstellung sei der interessierte Leser auf eine ausführliche Übersichtsarbeit von Camacho et al. (2000) verwiesen. Es gibt jedoch auch keimbahnspezifische Chromosomen (limitierte Chromosomen; L-Chromosomen), die in den Keimzellen

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

durch besondere Mechanismen verteilt werden. Am bekanntesten sind die limitierten Chromosomen der Nematocere Sciara (Diptera), deren komplizierter Verteilungsmechanismus in Abb. 6.30 dargestellt ist. Die Verteilung der Chromosomen ist in dieser Art nicht allein durch die Unterscheidung von somatischen und Keimbahnzellen, sondern auch durch das Geschlecht des Individuums bestimmt. Somatisch besteht das Genom von Sciara coprophila aus drei Autosomenpaaren und einem X-Chromosom im männlichen Soma oder zwei X-Chromosomen in weiblichen Somazellen. Ungewöhnlich ist nun bereits, dass in (haploiden) Spermatozoen neben je einem Autosom zwei X-Chromosomen (mütterlichen Ursprungs) vorhanden sind, während ein (haploides) Ei einen Autosomensatz, jedoch nur ein X-Chromosom besitzt. Die Geschlechtschromosomenkonstitution ist also in Soma und Keimbahn umgekehrt. Als Folge dieser Geschlechtschromosomenkonstitution erhält die Zygote drei X-Chromosomen. Je nach Geschlecht werden ein oder zwei der X-Chromosomen während der frühen Furchungsteilungen bei der Bildung somatischer Zellen eliminiert. Der zur Elimination erforderliche Mechanismus kann zwischen den X-Chromosomen männlichen und weiblichen Ursprungs unterscheiden, denn im Männchen bleibt stets das mütterliche X-Chromosom somatisch erhalten, während im weiblichen Soma stets ein X-Chromosom mütterlichen und eines väterlichen Ursprungs zu finden ist. Die X-Chromosomen müssen also in ihrem Ursprung gekennzeichnet sein, ein Zustand, den man mit dem Begriff „genetische Prägung“ (engl. imprinting) charakterisiert. Eine solche chromosomale Prägung scheint auch bei den Autosomen vorzuliegen, denn die Autosomen in den Spermatozoen sind stets mütterlichen Ursprungs. Diese bereits hochgradig spezialisierte Chromosomenkonstitution wird noch zusätzlich durch die Anwesenheit keimbahnlimitierter Chromosomen kompliziert. In der Zygote finden wir drei große metazentrische L-Chromosomen, zwei väterlichen und eins mütterlichen Ursprungs. Diese L-Chromosomen werden in einem Eliminationsschritt nach der 5. oder 6. Zellteilung, noch vor der Elimination der X-Chromosomen, aus den somatischen Zellen entfernt. Im Gegensatz zu den früher beschriebenen B-Chromosomen werden die limitierten Chromosomen gezielt eliminiert. Sie durchlaufen einen normalen Zellzyklus bis zur Metaphase, bleiben dann aber zwischen den Tochterzellkernen liegen, da die Chromosomenenden sich offenbar nicht in zwei Chromatiden spalten und dadurch voneinander trennen können. Auch in der männlichen Keimbahn erfolgen mehrere komplexe Eliminationsschritte. Zunächst wird eines der L-Chromosomen entfernt, in einem nächsten

Schritt verliert die Zelle eines der väterlichen X-Chromosomen. Diese ersten Eliminationsschritte erfolgen während der Spermatogonienmitosen. Die übrigen Eliminationsereignisse fallen ins Spermatocytenstadium. In einer ersten meiotischen Teilung (Abb. 6.31), die als monozentrische Mitose verläuft, werden die väterlichen Chromosomen von den Homologen mütterlicher Herkunft getrennt, wobei alle verbliebenen L-Chromosomen unabhängig von ihrem Ursprung mit den mütterlichen Chromosomen segregieren. Die väterlichen Chromosomen sammeln sich in einem kleinen Eliminationsvesikel und degenerieren. Aus dieser Teilung entsteht demnach eine einzige sekundäre Spermatocyte. Diese teilt sich mittels einer normalen bipolaren Spindel (Abb. 6.31). Hierbei erfährt jedoch das X-Chromosom, das den übrigen Chromosomen in der Verteilung vorausläuft, keine Chromatidenverteilung, wie sie für die übrigen Chromosomen stattfindet, sondern beide Chromatiden werden zusammen an einen Pol verlagert. Die Zelle, die diesen Zellkern erhält, wird zum Spermatozoon, während die andere Zelle degeneriert. Der komplizierte Eliminationsmechanismus hat sich offenbar in einer Reihe verwandter NematocerenArten erhalten. Das deutet auch darauf hin, dass der Besitz von keimbahnlimitierten Chromosomen für diese Gruppe von Organismen selektive Vorteile bietet. Wie schon im Falle der B-Chromosomen müssen wir davon ausgehen, dass die heterochromatischen L-Chromosomen in der Keimbahn eine biologische Funktion haben.

In manchen Organismen kommen überzählige Chromosomen vor (B-Chromosomen) oder solche, die auf die Keimbahnzellen beschränkt sind (L-Chromosomen). Die vorhandenen hochkomplexen Verteilungsmechanismen – z. B. bei Sciara – deuten an, dass mit dieser Ausstattung selektive Vorteile verbunden sein müssen. In einigen Fällen ist die Verteilung von limitierten Chromosomen mit chromosomalem Imprinting verbunden, das in den Nachkommen diese Chromosomen nach väterlicher oder mütterlicher Herkunft unterscheiden lässt.

Geschlechtschromosomen Betrachten wir den diploiden Karyotyp (die Gesamtheit der Chromosomen in ihrer spezifischen Form und Größe) eines beliebigen Organismus, so werden wir in vielen Fällen feststellen können, dass sich ein oder mehrere Chromosomen auf der Basis ihrer identischen Morphologie oder Bänderung nicht als homologe Chromosomen klassifizieren lassen (Abb. 6.32b). Es lässt sich leicht feststellen, dass diese Schwierigkeit meist nur für ein Geschlecht besteht, während sich im

6.3 Variabilität der Chromosomen und Dosiskompensation

Abb. 6.30 Chromosomenkonstitution in verschiedenen Keimzell- und Somazellstadien von Sciara coprophila. Oben: Chromosomenelimination in Spermatogenese und Soma des Männchens. Unten: Chromosomenelimination in somatischen Zellen des Weibchens. Die somatischen Zellen von Männchen und Weibchen unterscheiden sich lediglich in der Elimination der X-Chromosomen: Im Männchen werden beide paternalen X-Chromosomen eliminiert und nur das maternale X-Chro-

mosom bleibt erhalten, während im Weibchen eines der paternalen X-Chromosomen im Genom verbleibt. Die L-Chromosomen sind auf die Keimbahn beschränkt und werden beim Männchen teilweise nach einem komplizierten Mechanismus in der Frühentwicklung bzw. während der Meiose entfernt. Ungewöhnlich ist auch die unterschiedliche X-Chromosomenkonstitution in Keimzellen und somatischen Zellen des Männchens. (Aus Metz 1938)

Abb. 6.31 Schematische Darstellung der ersten und zweiten meiotischen Teilung in der männlichen Keimbahn von Sciara coprophila (vgl. Abb. 6.30). Oben: In der ersten meiotischen Teilung bildet sich eine monopolare Spindel, die die noch vorhandenen L-Chromosomen, das mütterliche X-Chromosom und ein Homologes jedes der zwei Autosomenpaare zum Pol wandern lässt, während die übrigen vier Chromosomen aus der Zelle eliminiert werden. Unten: In der zweiten meiotischen Teilung wandert das X-Chromosom mit beiden Chromatiden vorab zum Spindelpol. Von den übrigen Chromosomen folgt jeweils nur die eine Chromatide, während die andere eliminiert wird. Die Abbildung lässt noch die klumpenförmigen Reste des Eliminationschromatins aus der ersten Teilung erkennen. (Aus Gerbi 1986, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

anderen Geschlecht alle Chromosomen völlig normal in Zweiergruppen sortieren lassen (Abb. 6.32a): Hierbei fehlt das eine der beiden ungleichen Chromosomen des anderen Geschlechts, während das andere doppelt, also diploid vorhanden ist wie alle übrigen Chromosomen auch. Ganz offensichtlich besteht also ein Zusammenhang des Vorhandenseins dieses morphologisch abweichenden Chromosoms mit dem Geschlecht des

Organismus. Derartige Chromosomen werden daher als Geschlechtschromosomen bezeichnet – im Gegensatz zu allen übrigen Chromosomen, die man Autosomen nennt. Die wichtigste Konsequenz des Besitzes von unterschiedlichen Geschlechtschromosomen wird uns bei der Betrachtung der Meiose deutlich: Die Gameten besitzen zur Hälfte jeweils das eine oder das andere

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Abb. 6.32 a, b Metaphasechromosomen von Drosophila melanogaster. a Weibchen mit zwei X-Chromosomen. b Männchen mit einem X- und einem Y-Chromosom. Zwei der Autosomenpaare sind metazentrisch, das dritte Paar ist punktförmig

Geschlechtschromosom. Im Geschlecht mit identischen Geschlechtschromosomen gibt es diesen Unterschied in den Gameten natürlich nicht. Welches Geschlecht dabei die „normale“ und welches die abweichende Chromosomenkonstitution zeigt, hängt vom Organismus ab. Bei Säugern beispielsweise ist das Männchen das heterogametische Geschlecht, während bei Vögeln oder bei Schmetterlingen (Lepidopteren) das Weibchen heterogametisch ist. Zur nomenklatorischen Kennzeichnung von Geschlechtschromosomen verwendet man generell die Namen X- und Y-Chromosom, wenn das Männchen heterogametisch ist, oder W- (≈ Y) und Z-Chromosom (≈ X), wenn das Weibchen heterogametisch ist. In einem Fall haben also die Weibchen die Geschlechtschromosomenkonstitution XX, die Männchen die Konstitution XY, im anderen die Weibchen die Geschlechtschromosomen WZ, die Männchen ZZ. Nicht bei allen Organismen findet man unterschiedliche Geschlechtschromosomen in einem der Geschlechter. Bei manchen Tiergruppen besitzt das heterogametische Geschlecht lediglich ein Geschlechtschromosom im diploiden Satz, während dasselbe Chromosom im homogametischen Geschlecht doppelt vorhanden ist. In diesem Fall kennzeichnen wir die Geschlechtschromosomenkonstitutionen mit XX und X0. Wir können diese Beobachtung, mehr noch als die Strukturunterschiede in Organismen mit zwei verschiedenen Geschlechtschromosomen, als Hinweis darauf verstehen, dass Geschlechtschromosomen funktionell, also hinsichtlich ihrer genetischen Information, nicht identisch sind. Im Prinzip sind die Geschlechtschromosomen im heterogametischen Geschlecht stets haploid, ein Zustand den man auch als hemizygot bezeichnet. Für die Ausprägung der auf hemizygoten Chromosomen lokalisierten Gene hat das schwerwiegende Konsequenzen, denn ein dort vorhandenes Allel wird stets voll ausgeprägt, unabhängig davon, ob es im anderen

(homogametischen) Geschlecht rezessiv oder dominant erscheint. Cytologen bezeichnen Geschlechtschromosomen aufgrund der unterschiedlichen Morphologie auch als heteromorph und nennen sie dementsprechend Heterosomen. Obwohl weit weniger gebräuchlich, ist diese Bezeichnung in mancher Hinsicht zweckmäßiger als der Begriff Geschlechtschromosomen, denn dieser suggeriert eine direkte Funktion des Chromosoms bei der Geschlechtsbestimmung des Organismus. Das ist jedoch nur bedingt richtig, wie später noch gezeigt wird (Kapitel 11.6.5). Das Geschlechtschromosom des Männchens von Drosophila, das Y-Chromosom, hat z. B. keinerlei geschlechtsbestimmende Funktionen, während beim Menschen wichtige männliche geschlechtsbestimmende Gene auf dem Y-Chromosom liegen. In beiden Fällen ist das männliche Geschlecht heterogametisch. Nicht näher eingegangen wird hier auf Fälle multipler Geschlechtschromosomen, wie sie z. B. bei einigen Marsupialiern (Beuteltieren), Rodentiern (Nagern) und anderen Vertebraten, aber auch bei Insekten oder Pflanzen gelegentlich beobachtet werden. Es können in solchen Fällen mehrere X- oder Y-Chromosomen vorhanden sein. Der Erbgang von Geschlechtschromosomen ist nicht nur von großer praktischer Bedeutung, sondern seine Erforschung hat grundlegende Mechanismen der Chromosomenverteilung in Meiose und Mitose aufgedeckt (Kapitel 5.3.1 und 5.3.2). Sein Verständnis ist daher besonders wichtig.

Bei vielen Organismen findet man Geschlechtschromosomen (Heterosomen), die sich von den übrigen Chromosomen (Autosomen) dadurch unterscheiden, dass sie sich trotz ihres homologen Charakters morphologisch unterscheiden. Während das eine Geschlecht zwei identische Geschlechtschromosomen besitzt (es ist homogametisch), ist das andere durch zwei unterschiedliche Geschlechtschromosomen heterogametisch. Heterogametie kann im männlichen (X/Y-Chromosomen) oder weiblichen Geschlecht (W/Z-Chromosomen) auftreten. In manchen Organismen fehlt das zweite Geschlechtschromosom im heterogametischen Geschlecht ganz (X/O-Typ) oder es sind mehr als zwei Geschlechtschromosomen vorhanden.

Das Genom eines Organismus ist genetisch sehr genau balanciert. Es toleriert größere Abweichungen nicht (insbesondere wenn diese die Chromosomenanzahl betreffen), ohne mit schwerwiegenden Störungen der Funktion des genetischen Materials zu reagieren. Umso erstaunlicher ist es, dass bei einem einzigen Chromosomenpaar Abweichungen offenbar nicht zu vergleichbar schwer-

6.3 Variabilität der Chromosomen und Dosiskompensation Abb. 6.33 a–f Dosiskompensation oder Inaktivierung des X-Chromosoms. Die Höhe der Genexpression der Geschlechtschromosomen ist für das homo- und heterogametische Geschlecht in verschiedenen Spezies dargestellt. Die grünen Balken deuten die Dosiskompensation an (Erhöhung der Transkription im heterogametischen Geschlecht), die Inaktivierung des mütterlichen (Xm) bzw. des väterlichen (Xp) Chromosoms durch das Fehlen eines roten oder blauen Balkens. a In Caenorhabditis elegans wird die Dosiskompensation durch die Herunterregulierung der X-chromosomalen Genexpression auf 50 % in den XX-Hermaphroditen gegenüber den X0-Männchen erreicht. b In Drosophila melanogaster ist die Expression des einen X-Chromosoms in den Männchen (X/Y) hochreguliert, um das Niveau der Expression der Weibchen (XX) zu erreichen. c Auch in Hühnern gibt es eine Form der Dosiskompensation, aber es ist noch nicht klar, ob es sich um eine Hochregulierung im heterogametischen Geschlecht oder um eine Hemmung im homogametischen Geschlecht handelt. d Für Schnabeltiere wird eher eine Dosiskompensation als eine X-Inaktivierung diskutiert. e In weiblichen Beuteltieren erfolgt die X-Inaktivierung durch genetische Prägung: Das väterliche X-Chromosom ist in allen Geweben stillgelegt. f In der Plazenta einer weiblichen Maus ist bevorzugt das väterliche X-Chromosom stillgelegt, aber im Fetus und in der erwachsenen Maus erfolgt die Inaktivierung zufällig. (Nach Reik u. Lewis 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

wiegenden Defekten führen: bei Veränderungen der Geschlechtschromosomenzahlen durch Nondisjunction. Mehr noch: Die Verteilung der Geschlechtschromosomen in beiden Geschlechtern selbst schließt bereits eine abnormale Konstitution ein. Während eines der Geschlechtschromosomen im einen Geschlecht in diploider Anzahl vorhanden ist, liegt es im anderen Geschlecht nur haploid (hemizygot) vor. Ist überhaupt ein zweites Geschlechtschromosom vorhanden, wie in allen X/Yoder W/Z-Gechlechtsbestimmungsmechanismen oder

in davon abgeleiteten Geschlechtschromosomenkonstitutionen, so ist dieses in einem Geschlecht haploid vorhanden, fehlt aber im anderen Geschlecht vollständig. Diese genetische Situation kann nicht einfach durch eine (partielle) genetische Identität der Geschlechtschromosomen erklärt werden. Wie lässt es sich aber dann erklären, dass hier unterschiedliche Genkopienzahlen keine Funktionsstörungen hervorrufen, während das im übrigen Genom fast stets der Fall ist?

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Wie wir sehen werden, gibt es verschiedene molekulare Kontrollmechanismen, die dafür sorgen, dass die Aktivität der geschlechtschromosomalen Gene in beiden Geschlechtern im Prinzip gleich bleibt und dass das Expressionsniveau X-chromosomaler Gene dem autosomaler Gene entspricht (Dosiskompensation; Abb. 6.33). Es sind drei prinzipiell unterschiedliche Dosiskompensationmechanismen bekannt. ï Der erste wird bei C. elegans verwirklicht und bewirkt eine Halbierung der Aktivitäten in jedem der beiden X-Chromosomen der Hermaphroditen. ï Der zweite wird bei Drosophila und wahrscheinlich bei anderen Insekten gefunden. Er beruht auf einer Verdoppelung der Aktivität X-chromosomaler Gene im Männchen im Vergleich zur Aktivität dieser Gene im Weibchen. ï Der dritte Mechanismus wurde bei Säugern realisiert. Er sorgt dafür, dass im weiblichen Geschlecht jeweils nur ein X-Chromosom aktiv ist, während das andere inaktiviert wird. Wir werden hier nur die Mechanismen bei Drosophila und den Säugetieren im Detail besprechen; für weitere Details sei der interessierte Leser auf die Übersicht von Lucchesi et al. (2005) verwiesen.

Die ungleiche Anzahl von Geschlechtschromosomen in den beiden Geschlechtern verlangt einen regulativen Ausgleich der Expression der auf ihnen gelegenen Gene. Der hierfür erforderliche Mechanismus wird als Dosiskompensation bezeichnet.

6.3.2 Dosiskompensation bei Drosophila Das Problem des Dosisunterschieds bei geschlechtsgekoppelten Genen war den Drosophila-Genetikern bereits frühzeitig bewusst geworden. Da es aus genetischen Experimenten herzuleiten war, dass die Allele beider X-Chromosomen von Drosophila zur Ausprägung kommen, schlug H. J. Muller 1932 einen Dosiskompensationsmechanismus vor, nach dem die beiden X-chromosomalen Gene im Weibchen nur in reduziertem Maße aktiv sind, sodass ihre Gesamtaktivität der des X-Chromosoms im Männchen entspricht. Diesem Modell Mullers widersprachen Experimente von Mukherjee und Beermann (1965), die in ihren Untersuchungen von der damals neu entwickelten Methode der Autoradiographie Gebrauch machten (TechnikBox 13). Sie markierten neu synthetisierte RNA mit 3 H-Uridin und ermittelten die Einbauraten, d. h. die RNA-Syntheseraten, für X-chromosomale und autosomale Gene in Riesenchromosomen männlicher und weiblicher Speicheldrüsen. Es zeigte

sich, dass die RNA-Syntheseaktivität in den X-Chromosomen beider Geschlechter gleich und zudem vergleichbar mit der von Genen in den stets diploiden Autosomen war. Die Wissenschaftler schlossen aus diesen Beobachtungen auf eine Hyperaktivität des X-Chromosoms im Männchen. Diese Interpretation wurde in der Folge durch weitere Studien sowohl auf dem RNAals auch auf dem Proteinsyntheseniveau untermauert.

In Drosophila wird eine Dosiskompensation durch eine erhöhte Genaktivität im X-Chromosom erreicht.

Wie lässt sich eine Hyperaktivität des X-Chromosoms im Männchen molekular erklären? Es ist plausibel anzunehmen, dass eine Kopplung dieses Regulationsmechanismus mit der Geschlechtsbestimmung vorliegen sollte, da ja die unterschiedlichen Chromosomenkonstitutionen direkt mit dem Geschlecht des Organismus zusammenhängen. Thomas Cline konnte schon 1978 zeigen, dass ein für die Geschlechtsbestimmung zentrales Gen, Sex-lethal (Sxl), zugleich auch die Dosiskompensation kontrolliert. Zusätzlich sind jedoch für die erhöhte X-chromosomale Genaktivität im Männchen eine Reihe autosomaler Gene (u. a. male specific lethal, msl) mit verantwortlich. Ihr Ausfall hat letale Folgen im männlichen, nicht aber im weiblichen Geschlecht, wie J. M. Belote und John Lucchesi (1980) zeigen konnten. Die Letalität erscheint auf diesem Hintergrund verständlich: Wird die Aktivität des X-Chromosoms im Männchen nicht erhöht, so werden zu wenig Genprodukte produziert und die Entwicklung wird so gestört, dass die Männchen sterben. Heute wissen wir, dass die Dosiskompensation in Drosophila durch einen Komplex aus Proteinen und RNA vermittelt wird, der als Dosiskompensationskomplex bezeichnet wird (engl. dosage compensation complex, DCC). Die Proteine werden durch die Gene maleless (mle) und die vier Gene male-specific lethal1, 2 und 3 (msl1, msl2, msl3) sowie males-absent-on-the-first (mof) codiert. Die Vermutung, dass die Genprodukte des mleGens, der msl- und mof-Gene die Hyperaktivität des X-Chromosoms im Männchen kontrollieren, ließ sich durch Untersuchungen der zellulären Lokalisation der fünf genannten Proteine beweisen. Diese Proteine binden in Männchen als Multiproteinkomplex spezifisch an das X-Chromosom (Abb. 6.34), während sie in Weibchen am X-Chromosom nicht nachweisbar sind. Das MLE-Protein ist eine ATP-abhängige RNA-Helikase. MOF hat Histon-Acetyltransferase (HAT)-Aktivität und bindet an das N-terminale Ende von Histon H4. Ein weiteres Protein ist JIL1, eine Histon-H3-Kinase. Zusätz-

6.3 Variabilität der Chromosomen und Dosiskompensation

Männchen

Weibchen H3

H3-P MSL2

SXL ATP

ADP MLE

roX

H4

H4-ac

JIL1

MOF

MLE

JIL1

MOF

MSL2 MSL1 MSL3 MSL MSL3

roX MSL1 MSL1 MSL

Abb. 6.34 Dosiskompensation bei Drosophila melanogaster. In D. melanogaster gibt es zwei Chromosomen-weite Färbungssysteme. Der Dosiskompensationskomplex lokalisiert Hunderte Bindestellen auf dem männlichen X-Chromosom. Die Verteilung eines Proteins aus diesem Komplex, MSL3, ist grün auf einer männlichen polytänen Chromosomenpräparation dargestellt. Das POF-Protein (engl. painting of the fourth; rot) färbt das 4. Chromosom in beiden Geschlechtern. Die DNA ist mit DAPI (blau) gegengefärbt. Balken: 5 μm. (Nach Larsson u. Meller 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

lich sind für die Bindung des Multiproteinkomplexes zwei RNA-Moleküle, roX1 und roX2, erforderlich, die beide im X-Chromosom codiert werden. Nach gegenwärtigen Vorstellungen über die molekularen Prozesse, die zur Aktivitätserhöhung im X-Chromosom führen, werden zunächst die MSL-Proteine an spezifischen Stellen des X-Chromosoms gebunden, die die roX-Gene einschließen. Sie bilden Komplexe mit den roX-RNAs, die dann in der Lage sind, an weitere X-chromosomale Loci zu binden. Von hier aus breiten sie sich über flankierende Chromosomenbereiche aus. Die Bindung dieser RNP-Komplexe bewirkt Veränderungen in der Chromatinstruktur, die zur Erhöhung der Transkriptionsrate im männlichen X-Chromosom führen.

Die Hyperaktivität des X-Chromosoms im Männchen

wird durch sechs chromosomale Proteine induziert, die durch Kombination mit strukturellen RNA-Molekülen (roX1 und roX2) eine Veränderung der Chromatinstruktur und dadurch eine erhöhte Transkriptionsaktivität ermöglichen. Die Expression solcher Proteine im Weibchen wirkt sich ebenso letal aus wie das Fehlen dieser Proteine im Männchen. In beiden Fällen ist die fehlerhafte Dosiskompensation für die Letalität verantwortlich.

Abb. 6.35 Der Dosiskompensationskomplex. In DrosophilaMännchen vermittelt die Expression von MSL2 die stabile Expression der anderen Proteine und RNA-Untereinheiten und koordiniert den Zusammenbau des Dosiskompensationskomplexes. Der Komplex besitzt eine Helikase/ATPase- (MLE), Histonacetyltransferase- (MOF) und Histonkinase-Aktivität (JIL1). In Drosophila-Weibchen ist SXL exprimiert und blockiert die MSL2-Produktion. Die resultierende MSL2-Defizienz verhindert die Bildung des Dosiskompensationskomplexes und führt zu einer verminderten Expression und/oder zur Instabilität von MSL1, MSL3 und beider roX-RNAs (hier durch Transparenz dargestellt). Im Gegensatz dazu haben MLE und MOF noch weitere Funktionen in Weibchen, da beide exprimiert sind. (Nach Gilfillan et al. 2004, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Wie bereits erwähnt, spielt das Sxl-Gen nicht nur bei der Geschlechtsbestimmung eine wichtige Rolle, sondern auch bei der Dosiskompensation. Untersucht man seine Funktionen, wird deutlich, dass bei der Aktivierung der ersten zygotisch aktiven Gene im syncytialen Blastoderm (frühes Entwicklungsstadium bei Drosophila; vgl. Abb. 11.17) eine Dosiskompensation X-chromosomaler Gene im Männchen noch nicht erfolgt sein kann. Dosiskompensation würde den Zählmechanismus, der das X:A-Verhältnis im Embryo ermittelt und damit das Geschlecht bestimmt, außer Kraft setzen. Dosiskompensation kann daher erst in späteren Entwicklungsphasen voll wirksam werden. Das SXL-Protein spielt aber umgekehrt in weiblichen Fliegen eine ganz besondere Rolle: SXL inhibiert nämlich dauerhauft die Translation der msl2-mRNA in Weibchen durch die Blockade der entsprechenden Wechselwirkung mit dem Ribosom. Die Unterdrückung von MSL2 verhindert die DCC-Bildung in Weibchen, da MSL1 und MSL3 das MSL2-Protein benötigen, um dauerhauft exprimiert zu werden. Die wichtigsten Komponenten des DCC sind in Abb. 6.35 zusammengefasst.

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

6.3.3 Dosiskompensation bei Säugern Auf einem ganz anderen Weg wird die Dosiskompensation in Säugern erreicht. Auf der Grundlage cytologischer Studien und genetischer Daten wurde von Mary Lyon 1961 die Hypothese (Lyon-Hypothese) formuliert, dass im weiblichen Geschlecht von Säugern eines der X-Chromosomen inaktiv ist. Auf der cytologischen Seite war ein zentraler Befund für das Verständnis der Dosiskompensation die Beobachtung von M. L. Barr, dass in Interphasezellen von weiblichen Säugern ein stark anfärbbarer Chromatinkörper, auch Geschlechtschromatin (engl. sex chromatin) genannt, zu beobachten ist, der in männlichen Zellen fehlt. Der klassischen Definition nach handelt es sich hierbei um Heterochromatin. Heterochromatin wird aber als funktionell inaktives chromosomales Material angesehen. Die Korrelation dieses Geschlechtschromatins mit dem nach Lyon inaktiven X-Chromosom würde somit die Lyon-Hypothese unterstützen. Diese Korrelation lässt sich tatsächlich durch einfache cytologische Methoden beweisen. Nach seinem Entdecker (Barr u. Bertram 1949) wird das Geschlechtschromatin auch Barr-Körper (engl. Barr body) genannt. Dieser Barr-Körper entsteht durch eine ringförmige Struktur des inaktiven X-Chromosoms. Entscheidend war, dass cytologische Beobachtungen erkennen ließen, dass dieser heterochromatische Körper im Falle von Geschlechtschromosomenanomalien fehlt oder auch in erhöhter Anzahl vorhanden ist. Die Anzahl vorhandener Barr-Körper ist jeweils um eins geringer als die Gesamtzahl der vorhandenen X-Chromosomen (Abb. 6.36). Das bedeutet, dass Klinefelter-Männer (XXY) einen Barr-Körper besitzen, Turner-Frauen (X0) keinen, während XXX-, XXXX- oder XXXXX-Individuen zwei, drei oder vier Barr-Körper aufweisen. Das ist ein sehr eindeutiger Hinweis darauf, dass alle gegenüber der männlichen Normalkonstitution (mit einem X-Chromosom) überzähligen X-Chromosomen inaktiviert werden, und zwar unabhängig vom Geschlecht des Individiums. Sie bleiben auch in der Interphase kondensiert und liegen als spätreplizierendes Heterochromatin vor. Diese Interpretation wird von der genetischen Seite her gestützt. Die maßgeblichen Experimente sind leicht zu verstehen, wenn man die Folge einer Inaktivierung eines der X-Chromosomen in Individuen bedenkt, die für ein Markergen heterozygot sind. Wichtig ist hierbei, dass man ein Markergen auswählt, das zellautonom zur Ausprägung kommt, dessen Genprodukte also auf die Zelle beschränkt bleiben, in der das Gen aktiv ist. Offensichtlich können Zellen in diesem Falle

Abb. 6.36 a, b Barr-Körper. a Barr-Körper in Interphase-Zellkernen von Säugern mit unterschiedlichen Anzahlen von XChromosomen. Es bleibt jeweils nur ein X-Chromosom aktiv, während die übrigen als inaktives („fakultatives“) Heterochromatin (= Barr-Körper) erscheinen. Im Allgemeinen verschmelzen sie nicht miteinander, sodass die genetische Konstitution aus einem Interphasekern (beim Menschen z. B. in Schleimhautabstrichen von den Innenseiten der Wangen) leicht zu ermitteln ist. Allerdings kann eine bestimmte Anzahl von Barr-Körpern durch unterschiedliche Konstitutionen der Geschlechtschromosomen verursacht werden wie die obere Zeile anzeigt. b Menschliche XXX-Zellen, gefärbt mit fluoreszierenden Antikörpern gegen Histon H1. Zwei der X-Chromosomen bilden Barr-Körper. Die Barr-Körper sind durch die Antikörperfärbung besonders deutlich sichtbar. (Foto: T. Yang)

nur eine Ausprägung eines der beiden Allele zeigen, wenn eines der X-Chromosomen inaktiv ist. Es stellt sich dann die Frage, ob in allen Zellen dasselbe X-Chromosom inaktiv ist, oder ob verschiedene Zellen unterschiedliche X-Chromosomen inaktivieren und wenn ja, wie diese Zellen zueinander angeordnet sind. Die Antwort lässt sich sehr einfach an Markergenen ablesen, die die Fellfarbe von Tieren bestimmen. Sieht man sich solche Gene in weiblichen Katzen an, so erkennen wir – je nach genetischer Konstitution ‒ eine gefleckte Färbung des Fells. Dieses Muster beantwortet zwei unserer Fragen: Erstens kann offenbar jedes der beiden X-Chromosomen inaktiv werden. Zweitens betrifft die Inaktivierung

6.3 Variabilität der Chromosomen und Dosiskompensation

jeweils Gruppen benachbarter Zellen, bei denen dasselbe X-Chromosom inaktiv ist, wie die fleckenförmige Verteilung des Ausprägungsmusters beider Allele belegt. Dieses bei Tieren beobachtete Verteilungsmuster ist keine Ausnahme, sondern kann auch beim Menschen beobachtet werden (Abb. 6.37). Aus der vergleichenden Untersuchung von weiblichen Individuen aufeinanderfolgender Generationen lässt sich leicht erkennen, dass die Ausprägung des Allels nicht an bestimmte Körperregionen gebunden ist, sondern sich zufallsgemäß im Körper verteilt. Wir können also davon ausgehen, dass das Ausprägungsmuster des einen X-Chromosoms gegenüber dem des anderen nicht genetisch fixiert ist.

Abb. 6.37 a, b Mosaike als Folge der Inaktivierung eines X-Chromosoms beim Menschen. a Zeichnung der BlaschkoLinien nach dessen Originalarbeit. Diese Linien entsprechen verschiedenen Wachstumszonen der Haut während der Embryonalentwicklung. b Schweißtest bei einer Frau, die heterozygot für eine X-gekoppelte Erkrankung ist (hypohidrotische ektodermale Dysplasie: Unfähigkeit zu schwitzen); dadurch wird ein funktionelles, X-chromosomales Mosaik sichtbar. (Nach Traupe 1999, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

Wie erklärt sich dann die Bildung von homogenen Bereichen, die sich mit Bereichen der Ausprägung des alternativen Allels abwechseln? Die Antwort können wir aus einem Schema der Entwicklung eines Organismus ableiten. Dieses Schema zeigt uns, dass Gruppen miteinander verwandter Zellen (Zellklone) bestimmte Gewebe, Organe oder andere Unterteile eines Organismus bilden (in der englischsprachigen Literatur wird dafür der Begriff cell lineage gebraucht). Übertragen wir dieses Schema einer klonalen Zelldifferenzierung auf die Inaktivierung des X-Chromosoms, so gelangen wir zu der Erkenntnis, dass Gruppen benachbarter Zellen, die eine einheitliche Genexpression des einen Allels zeigen, in der Entwicklung (Ontogenese) des Organismus aus einer gemeinsamen Urprungszelle herstammen müssen, in der die Entscheidung über die Aktivität oder Inaktivität eines bestimmten Allels erfolgt ist. Diese Entscheidung muss, wenn man das Fleckenmuster betrachtet, irreversibel sein, da offensichtlich innerhalb eines Farbbereichs kein Umschlag zur Expression des anderen Allels erfolgt. Zudem können wir erkennen, dass die Größe eines Farbflecks uns Informationen über den Zeitpunkt der Inaktivierung des anderen X-Chromosoms vermittelt: Ist der Fleck groß, so sind viele Mitosen nach dieser Entscheidung erfolgt. Das bedeutet, dass die Entscheidung früher in der Entwicklung des Organismus erfolgt sein muss als bei kleineren Flecken. Wir können hinsichtlich der Entscheidung über die Inaktivierung eines X-Chromosoms als wichtigste Schlüsse Folgendes zusammenfassen (siehe auch Abb. 6.38): ï Die Entscheidung über die Aktivität eines X-Chromosoms erfolgt in der frühen Embryonalentwicklung. ï Die Entscheidung erfolgt nicht zu einem bestimmten Zeitpunkt innerhalb der Entwicklung, sondern kann zeitlich für verschiedene Zellen variieren. ï Die Entscheidung ist irreversibel, d. h. ein einmal inaktiviertes X-Chromosom bleibt in allen folgenden Zellgenerationen inaktiv.

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Abb. 6.38 a–g Inaktivierungszyklus des X-Chromosoms bei Säugern. a In der Zygote sind beide X-Chromosomen aktiv. b Die Inaktivierung des väterlichen X-Chromosoms erfolgt durch genetische Prägung in allen Zellen während der Präimplantationsphase. c Dieses Inaktivierungsmuster bleibt in der Plazenta erhalten. d Im Embryo wird dagegen die genetische Prägung gelöscht. e In späteren embryonalen Stadien wird in den Zellen ein X-Chromosom inaktiviert; dabei bleibt es dem Zufall überlassen, ob dies das väterliche oder mütterliche X-Chromosom ist. Diese Inaktivierung bleibt lebenslang erhalten. f In den Vorläuferkeimzellen erfolgt eine erneute Löschung des Inaktivierungsmusters (weiß), und je nach Geschlecht des Trägers werden die reifen Gameten (g) als väterlich (P, blau) oder mütterlich (M, rot) gekennzeichnet. Das aktive X-Chromosom wird als Xa gekennzeichnet; das inaktive entsprechend mit Xi. (Nach Reik u. Lewis 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Über die molekularen Ursachen der Inaktivierung der X-Chromosomen bei Säugern gibt es heute schon recht präzise Vorstellungen. Die frühen Ereignisse dieses Prozesses werden durch ein Inaktivierungszentrum (engl. X-chromosome-inactivation centre, Xic) kontrolliert. Aufgrund cytogenetischer Daten wird die Größe des Xic-Genorts mit etwa 1 Mb angegeben. Diese Region enthält mindestens vier Gene, die an der X-Inaktivierung beteiligt sind: Xist codiert für eine RNA (engl. X inactive-specific transcript), die allerdings nicht translatiert wird. Xist ist für die Funktion von Xic wichtig. Die anderen Elemente innerhalb der Xic-Region sind verantwortlich für die Xist-Expression. Eines davon ist DXPas34, das ursprünglich aufgrund seines Methylierungsprofils auf dem aktiven X-Chromosom definiert wurde. Das andere ist TsiX, das die Information für ein Transkript enthält, das vom Gegenstrang zu Xist abgelesen wird und dessen Aktivität zu Beginn der Inaktivierung reguliert (Abb. 6.39). Ein hervorragendes Modell, um die frühen Vorgänge bei der X-Inaktivierung zu untersuchen, sind embryonale Stammzellen (ES) der Maus. Durch in-situHybridisierung mit Fluoreszenzmarkern (engl. fluorescence in situ hybridization, FISH) kann die Xist-RNA erkannt werden: In weiblichen ES-Zellen erscheinen zwei punktförmige Signale, wohingegen bei männli-

chen ES-Zellen nur ein derartiges Signal erscheint (Abb. 6.40). Werden die weiblichen ES-Zellen zur Differenzierung angeregt, häufen sich Xist-Transkripte auf dem später inaktiven X-Chromosom an, wohingegen die Expression von Xist an den aktiven männlichen und weiblichen X-Chromosomen abgeschaltet wird. Der Beginn der X-Inaktivierung erscheint daher unmittelbar mit der Anhäufung von Xist-Transkripten gekoppelt zu sein. Dabei ist die Hochregulierung der Xist-Expression offensichtlich auch mit einer Verlängerung der Lebenszeit der Xist-Transkripte verbunden. Wichtige Hinweise auf die Funktion von Xist kamen von verschiedenen Maus-Mutanten. Das Ausschalten des Xist-Gens in Knock-out-Mäusen zeigt, dass Xist für die Inaktivierung in cis, d. h. auf demselbem Chromosom, notwendig ist; umgekehrt zeigt die Überexpression von Xist in transgenen Mäusen und auch in entsprechenden ES-Zellen eine weitreichende Hemmung der gesamten Transkription in cis. Diese Hemmung ist zunächst abhängig von der kontinuierlichen XistExpression und zunächst noch umkehrbar. Xist muss über 48 Stunden aktiv sein, um eine Abschaltung zu erzielen. Wenn 72 Stunden erreicht sind, ist der Fortschritt der X-Inaktivierung nicht mehr von Xist abhängig, und es erscheint das Gesamtbild der sekundären X-Inaktivierung. Dazu gehört vor allem die Hypoace-

6.3 Variabilität der Chromosomen und Dosiskompensation

Abb. 6.39 a, b Funktionelle Elemente im X-Inaktivierungszentrum der Maus (Xic). a Karte der regulatorischen Elemente, die am „Zählen“ und „Auswählen“ bei der X-Inaktivierung der Maus beteiligt sind. Es sind die wichtigsten Gene dargestellt: das XistGen, die antisense-Tsix-RNA, Xite, die Bindestellen im DXPas34Gen für den CCCTC-bindenden Faktor (CTCF); außerdem ist die Region für die Paarung des Xic gezeigt. b Der wahrscheinliche Mechanismus des „Zählens“ und „Auswählens“ beinhaltet die

Paarung der Xic-Genorte zu Beginn der X-Inaktivierung. Homologe X-Chromosomen innerhalb eines Zellkerns sind dargestellt und ihr Xic ist rot hervorgehoben. Durch Paarung der Xic-Genorte kann die Xist-Transkription an einem Chromosom initiiert werden, wodurch dieses Chromosom schließlich inaktiviert wird, wohingegen das andere aktiv bleibt. Xa: aktives XChromosom; Xi: inaktives X-Chromosom. (Nach Ng et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Abb. 6.40 Xist-Transkription in embryonalen Stammzellen der Maus. Das Muster der Xist-RNA-Expression in weiblichen ES-Zellen wurde während der Differenzierung mithilfe der insitu-Fluoreszenzmarkierung (FISH) untersucht. Das linke Bild zeigt eine undifferenzierte ES-Zelle mit zwei punktförmigen Xist-RNA-Signalen, die auf die Anwesenheit von zwei instabilen Xist-Transkripten an beiden aktiven X-Chromosomen hinweisen. Das mittlere Bild zeigt, dass nach der Differenzierung

das Xist-Transkript von einem der beiden Allele stabilisiert wird und das in cis zu inaktivierende X-Chromosom bedeckt. Das X-Chromosom, das aktiv bleibt, behält auch die instabile Form des Xist-Transkripts. Das rechte Bild zeigt, dass die XistRNA das inaktive X-Chromosom bedeckt und das Xist-Gen des aktiven Chromosoms ausgeschaltet wurde. (Nach Avner u. Heard 2001, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

tylierung der Histone. (Die noch undifferenzierten Zellen sind hyperacetyliert, wohingegen die Zellen, die schon festgelegt sind, hypoacetyliert sind.) Deletionsexperimente in der Xic-Region machen deutlich, welche Abschnitte für die Auswahl des zu

inaktivierenden X-Chromosoms verantwortlich sind. Die Deletion des DxPas34-Locus, der in der Initiationsregion des TsiX-antisense-Transkripts liegt, beseitigt sowohl die antisense-Aktivität von TsiX als auch die XistTranskription (oder vermindert sie zumindest stark).

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Abb. 6.41 a–e Modell der X-Inaktivierung bei Säugern. Das Modell stellt einige der Elemente vor, die an der Inaktivierung des XChromosoms beteiligt sind. a Vor der Inaktivierung wird die XistRNA als instabile Form (gestrichelte rote Linien) exprimiert, und die vermuteten hemmenden Faktoren (rot) verhindern entweder die Hochregulierung von Xist und/oder seine Assoziation mit dem Chromosom in cis. b Die Menge an Xist-RNA steigt durch Stabilisierung, durch erhöhte Transkription oder durch Entfernung der blockierenden Faktoren. LINE-Elemente können an diesem Ausbreitungsprozess beteiligt sein entweder durch Assoziation mit Nukleoprotein-Komplexen (einschließlich Xist) oder durch einen Mechanismus, der als Repeat-abhängiger Abschalt-Prozess diskutiert wird (engl. repeat-induced gene silencing, RIGS). c Die stabilisierte Xist-RNA bedeckt das X-Chromosom vor seiner endgültigen Inaktivierung. d Als Ergebnis der Umhüllung durch die Xist-RNA wird die Transkription der Gene des X-Chromosoms abgeschaltet. e Modifikationen des Chromatins (Histon-Deacetylierung, Methylierung von Promotoren X-gekoppelter Gene sowie Ergänzung des Chromatins durch die Histon-Variante Makro-H2A) überführen das von Xist-RNA bedeckte Chromosom in einen stabilen, inaktiven und kondensierten Zustand. (Nach Avner u. Heard 2001, mit freundlicher Genehmigung durch die Nature Publishing Group)

Ein weiterer wichtiger Hinweis über die Auswahl des zu inaktivierenden Chromosoms kommt aus Untersuchungen über die X-Inaktivierung in extra-

embryonalem Gewebe wie dem Trophektoderm. Hier spielt sich offensichtlich ein Mechanismus ab, der über genetische Prägung gezielt das väterliche X-Chromosom ausschaltet (Abb. 6.38). Die Inaktivierung des paternalen X-Chromosoms wird außerdem in allen Geweben der Beuteltiere gefunden; es wird daher auch die Hypothese vertreten, dass dies die ursprüngliche Form der X-Inaktivierung sei und dass die zufällige X-Inaktivierung erst später bei der Evolution der Eutheria (Plazenta-Tiere) „erfunden“ wurde. Die Inaktivierung des X-Chromosoms beginnt am Xic und breitet sich von dort über das gesamte X-Chromosom aus (Abb. 6.41). Diese Ausbreitung kann über weite Distanzen erfolgen – 100 Mb oder mehr sind dabei keine Seltenheit. Wenn durch Translokation autosomale Bereiche in die Nachbarschaft von Xic kommen, werden diese ebenso von der X-Inaktivierung erfasst. Die Inaktivierung dieses autosomalen Materials unterscheidet sich nicht von dem des X-Chromosoms – höchstens in seinem Ausmaß: Es ist gewöhnlich nicht so effektiv und nicht so ausgeprägt, und es ist mit einer begrenzten Ausdehnung der XistRNA im autosomalen Bereich assoziiert. Ergänzt wird die Ausbreitung der Xist-RNA auch durch eine Acetylierung und Methylierung von Histonen, wie wir es im Heterochromatin schon kennengelernt haben (S. 226, 247) und wie wir es im Kapitel über epigenetische Regulationsmechanismen noch einmal unter anderen Gesichtspunkten diskutieren werden (Kapitel 11.8). Eine Zusammenfassung gibt Abb. 6.42. Mary Lyon (2003) vermutete, dass repetitive Sequenzen vom LINE-Typ für die Ausbreitung der Xist-RNA verantwortlich sind, indem sie als Zwischenstationen oder Verstärkerelemente wirken. Sowohl im menschlichen X-Chromosom als auch im X-Chromosom der Maus wurden doppelt so viele LINE-Elemente gefunden wie in den Autosomen, und es scheint, dass sowohl die Zahl der LINE-Elemente als auch ihre Verteilung innerhalb des X-Chromosoms mit der Effizienz der X-Inaktivierung korrelieren. Eine Analyse von mehr als 600 Genen des X-Chromosoms des Menschen zeigte allerdings, dass ca. 15 % der X-gekoppelten Gene der Inaktivierung „entkommen“ (bei der Maus sind es übrigens deutlich weniger). Die meisten davon liegen auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp). Die Häufigkeit, mit der Gene auf dem kurzen Arm von der Inaktivierung verschont bleiben, entspricht der Häufigkeit autosomaler Gene bei Translokationen von Autosomen auf das X-Chromosom. Die Häufigkeit der Nicht-Inaktivierung ist damit ein Zeichen dafür, dass der kurze Arm des menschlichen X-Chromosoms unter evolutionären Gesichtspunkten erst „kürzlich“ zum X-Chromosom hinzugekommen

6.3 Variabilität der Chromosomen und Dosiskompensation Abb. 6.42 Zeitplan der X-Inaktivierung. Die Inaktivierung des XChromosoms beginnt mit der paternalen Expression des Xist-Gens im 2-Zell-Stadium, gefolgt von der Bedeckung des paternalen X-Chromosoms (Xp) durch Xist-mRNA im 4-Zell-Stadium sowie Hypoacetylierung und Hypomethylierung im 8-Zell-Stadium. In der Morula (16-Zell-Stadium) erfolgt dann Methylierung des Histons H3 an Lys-9 und Lys-27. Im Blastozystenstadium trennen sich die embryonalen und extra-embryonalen Zellen; die genetische Prägung bleibt in den Trophoblasten (die später zur Plazenta werden) erhalten, aber nicht in den Zellen der inneren Zellmasse (ICM), die das eigentliche Gewebe des Embryos bilden werden. (Nach Reik u. Lewis 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

ist. Dieser Abschnitt enthält auch deutlich weniger LINE-Elemente – umgekehrt ist deren Dichte am höchsten in der Region Xq13-Xq21, die das menschliche XIC enthält. Weiterhin sind etwa 10 % der X-gekoppelten Gene in unterschiedlichem Ausmaß inaktiviert, was zu einer beachtlichen Heterogenität der Genexpression bei Frauen führt. Ein aktuelles Modell für die X-Inaktivierung bei Säugetieren zeigt Abb. 6.43. Die charakteristischen Eigenschaften der X-chromosomalen Inaktivierung – ihr Ausmaß, ihre Stabilität und genaue Regulation während des Entwicklungsprozesses – lässt vermuten, dass hier mehrere Moleküle und Faktoren in genau aufeinander abgestimmter Weise miteinander interagieren, wie wir das auch von anderen epigenetischen Prozessen kennen. Von beson-

derem Interesse ist dabei die besondere Stabilität des inaktiven X-Chromosoms in der Gebärmutter von Säugern, z. B. auch im Vergleich zu Beuteltieren. Ein zweiter interessanter Punkt ist die Ähnlichkeit zwischen den verschiedenen Wegen der Dosiskompensation bei Drosophila und Säugern. Auch wenn das Ergebnis im Detail unterschiedlich ist (Drosophila: Überaktivität im X-Chromosom; Säuger: Inaktivierung), so gibt es doch eine auffallende Parallele: Auch hier spielen zwei kleine, nicht-codierende RNA-Transkripte (roX1 und roX2) eine wichtige Rolle. Insbesondere bindet offensichtlich das roX2-Transkript an MOF, eine Histon-Acetyltransferase, die dadurch aktiviert wird. Wie wir auch schon bei der Besprechung des Heterochromatins im Allgemeinen gesehen haben,

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Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

sind Wechselwirkungen mit RNA offensichtlich weit verbreitet, wenn es darum geht, größere Bereiche des Chromatins abzuschalten.

Bei Säugern erfolgt die Dosiskompensation durch Inaktivierung eines X-Chromosoms in weiblichen Zellen. Die Inaktivierung erfolgt in der frühen Embryonalentwicklung und betrifft zufallsmäßig das väterliche oder mütterliche Chromosom. Das inaktive X-Chromosom ist als Barr-Körper cytologisch sichtbar. Die Inaktivierung des X-Chromosoms geht vom X-Inaktivierungszentrum aus und beruht im Wesentlichen auf der Expression des Xist-Transkripts, das für kein Protein codiert. Als Ergebnis der Xist-Bedeckung wird die Transkription der Gene des X-Chromosoms abgeschaltet. Dabei werden die Promotoren der X-gekoppelten Gene methyliert und das entsprechende Chromatin deacetyliert.

Abb. 6.43 a, b Flucht vor der X-Inaktivierung. a Ein Gen, das durch X-Inaktivierungsprozesse abgeschaltet wird (z. B. das Rps4-Gen der Maus, das für das ribosomale Protein S4 codiert), wird nach dem Beginn der Inaktivierung am Xist-Locus und der Ausbreitung des Inaktivierungsprozesses schließlich stabil abgeschaltet. Ein Gen, das der Inaktivierung entkommt (z. B. das Smcx-Gen, das für eine Lysin-spezifische Demethylase codiert; andere Gensymbole: Jarid-1c oder Kdm5c), wird zunächst auch abgeschaltet, aber während des Inaktivierungsprozesses wieder reaktiviert. Inaktivierte Regionen sind blau und reaktivierte Regionen gelb dargestellt. b In der Maus sind die Bereiche des X-Chromosoms, die der X-Inaktivierung entkommen („Ausnahme“), deutlich kleiner als beim Menschen (jeweils gelb dargestellt). Möglicherweise bindet in der Maus CTCF (engl. CCCTCbinding factor) an die CpG-Inseln der Gene, die dadurch nicht reaktiviert werden können. (Nach Disteche et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung von Karger)

6.3 Variabilität der Chromosomen und Dosiskompensation

Kernaussagen ï Eukaryotische Chromosomen bestehen aus DNA, RNA und Proteinen. ï Chromosomen sind normalerweise nur im kondensierten Zustand während der Pro-, Meta- und Anaphase der Mitose bzw. Meiose im Lichtmikroskop sichtbar. ï Die Grundeinheit eines Chromosoms ist die Chromatide; nach der Replikation (aber vor der Verteilung auf die Tochterzelle) besteht ein Chromosom aus zwei identischen Schwesterchromatiden. ï Das Chromosom ist in Domänen differenziert, die durch verschiedene Färbemethoden sichtbar gemacht werden können (Bänderung). ï Die Form der Chromosomen wird durch das Centromer bestimmt. Über die Kinetochoren dient das Centromer in der Metaphase als Ansatz für die Spindelfasern, die für die Verteilung der Chromatiden während der Zellteilung sorgen. ï Weitere wichtige Strukturelemente der Chromosomen sind deren Enden, die als Telomere bezeichnet werden. Chromosomenarme ohne Telomere sind instabil. ï Repetitive DNA-Elemente sind nicht nur Grundbestandteile von Centromeren und Telomeren, sondern finden sich an vielen heterochromatischen Stellen des Genoms. Man unterscheidet hoch-, mittel- und niedrigrepetitive Elemente. Hochrepetitive DNA hat möglicherweise strukturelle Funktionen im Genom. ï Der Hauptanteil chromosomaler Proteine dient der Verpackung der DNA, die trotz ihrer hohen negativen Ladung auf kleinstem Raum im Zellkern untergebracht werden muss. Demgemäß sind stark basische Proteine zur Kompensation der negativen Ladungen der Phosphatgruppen der DNA notwendig. In somatischem Gewebe dienen hierzu vor allem die Histone.

ï Je zwei Moleküle der Histone H2A, H2B, H3 und H4 bilden ein Nukleosom, um das sich die DNA-Doppelhelix windet. Zur Stabilisierung dient ein Molekül des Histons H1. Nukleosomen bilden eine 10-nm-Fibrille, die die niedrigste Organisationsstufe der Chromatide darstellt; die zweite Organisationsstufe ergibt eine 25–30-nm-Fibrille. Im Chromosom gibt es Chromatinfibrillen höherer Ordnung, deren Organisation sich mit den dynamischen Veränderungen der Chromosomen im Laufe des Zellzyklus ändert. ï Chromosomen sind in bestimmten Kompartimenten des Zellkerns (Territorien) zu finden. ï Insulator-Elemente trennen Bereiche unterschiedlicher Transkriptionsaktivitäten auf den Chromosomen. ï Die ungleiche Anzahl von Geschlechtschromosomen in den beiden Geschlechtern verlangt einen regulativen Ausgleich der Genexpression ihrer Gene (Dosiskompensation). In Drosophila erfolgt diese Dosiskompensation durch erhöhte Genaktivität im X-Chromosom, bei Säugern durch zufällige Inaktivierung eines der beiden X-Chromosomen im weiblichen Geschlecht. Das inaktive X-Chromosom ist als Barr-Körper sichtbar; die Inaktivierung geht vom XInaktivierungszentrum aus.

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268 268

Kapitel 6: Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen

Technik-Box 13

Autoradiographie an Geweben, Zellen und Chromosomen Anwendung: Lokalisation radioaktiv markierter Moleküle in biologischen Materialien. Voraussetzungen · Materialien: Zur Markierung werden β-Strahler mit niedrigem Energiespektrum verwendet. Besonders geeignet sind 3H- und 14 C-markierte Verbindungen, aber auch 35S- und 125I-markierte Moleküle sind mit Einschränkungen einsetzbar. Neuerdings finden auch nicht-radioaktive Verbindungen wie Digoxigenin (DIG) oder Biotin, die an Nukleotide gebunden werden, mit einem anschließenden Nachweis durch Antikörper oder Avidin Verwendung. Diese sind mit alkalischer Phosphatase oder anderen Enzymen gekoppelt (Immunologische Nachweismethoden, Technik-Box 24). Deren Bindung an DIG (DIG-spezifische Antikörper) oder

Biotin (Avidin oder Streptavidin) lässt sich durch die enzymatische Umsetzung eines Substrats in Farbstoff oder durch Enzym-induzierte Chemofluoreszenz nachweisen (z. B. mit AMPPD; 3-(2,-Spiroadamantan)-4-methoxy-4(3,,-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan). Beachte: Der Umgang mit radioaktiven Stoffen unterliegt der Strahlenschutzverordnung; dabei sind geeignete Maßnahmen zu ergreifen. Methode: Nach dem Einbau markierter Verbindungen in biologische Materialien (besonders Nukleinsäure und Proteine) werden cytologische oder elektronenmikroskopische Präparate hergestellt. Diese werden mit einem lichtempfindlichen Film überzogen (heute meist mit flüssiger fotografi-

Autoradiographie. Radioaktiv markiertes Gewebe wird auf einen Objektträger gebracht und mit lichtempfindlicher Emulsion bedeckt. Nach Exposition des Films wird er entwickelt. Die durch Silberkörnchen gekennzeichneten Regionen des Präparats lassen die Lokalisation radioaktiven Materials im Gewebe erkennen. In den Fotos sind die Resultate einer Autoradiographie zu sehen (rechts). Im Phasen-

scher Emulsion) und für die erforderliche Zeit im Dunkeln exponiert. Der fotografische Film wird durch die beim Zerfall der Radioisotopen emittierte Energie lokal geschwärzt. Nach der Entwicklung ermöglichen die belichteten Stellen des Films die Lokalisation der markierten Verbindungen innerhalb eines Gewebes, einer Zelle oder eines Chromosoms. Die erreichte Auflösung ist von den verwendeten Verbindungen abhängig. Mit 3 H-markierten Verbindungen werden die höchsten Auflösungen (ca. 1 μm bei cytologischen Präparaten) erzielt. Damit ist die Lokalisation von Nukleinsäuren in definierten Bereichen von Metaphasechromosomen möglich.

kontrast lassen sich cytologische Strukturen des Gewebes identifizieren (oben), während im Durchlicht (unten) die Silberkörnchen in der Emulsion deutlich erkennbar sind. Falls erforderlich, lassen sie sich nachträglich auch wieder durch Behandlung mit Abschwächerlösung entfernen, um die darunterliegenden Gewebeteile genauer erkennen zu können.

Technik-Box

Technik-Box 14

Chromosomenbänderung und chromosome painting Anwendung: Identifizierung bestimmter Chromosomen oder chromosomaler Regionen in Präparaten von Pflanzen, Tieren und Menschen. Diese Techniken haben insbesondere in der diagnostischen Humangenetik große Bedeutung. Voraussetzungen: Gewinnung von Zellen, Wachstum der Zellen in Kultur, Arretierung der Chromosomen in der Metaphase durch Zugabe von Colchicin in die Kultur und Analyse am Mikroskop. Methode: In Metaphasechromosomen-Präparaten wird nach unterschiedlicher Vorbehandlung eine Bänderung der Chromosomen sichtbar: G-Banden. Vor der Färbung mit Giemsa-Lösung, einem DNA-bindenden Farbstoff (Azurblau: demethyliertes Methylenblau), werden die Chromo-

somen kontrolliert mit Trypsin behandelt. Die dunklen Banden bezeichnet man dann als G-Banden, helle Banden sind G-negativ. Q-Banden. Man färbt die Chromosomen mit einem Fluoreszenzfarbstoff, der bevorzugt an AT-reiche DNA bindet (z. B. Quinacrin, 4’,6-Diamino-2-phenylindol [DAPI] oder Hoechst 33258), und betrachtet sie anschließend unter UV-Licht. Die fluoreszierenden Banden bezeichnet man als Q-Banden; sie sind identisch mit den G-Banden. R-Banden. Dabei sind alle Banden gefärbt, die G-negativ sind (reverses G-Bandenmuster). Man denaturiert die Chromosomen vor der GiemsaFärbung durch Erhitzen in einer Salzlösung; dabei denaturiert besonders die AT-reiche DNA. R-Banden sind Qnegativ. Dasselbe Muster erhält man,

Differenzielle Färbung von Chromosomen mit Fluoreszenzfarbstoffen. (Foto: Ilse Chubda)

wenn GC-spezifische ChromomycinFarbstoffe (Chromomycin A3, Olivomycin, Mithramycin) gebunden werden. Neue Möglichkeiten der Chromosomenidentifizierung auch im Interphasekern, also im dekondensierten Zustand, bietet die in-situ-Hybridisierung mit einer Mischung unterschiedlich markierter, repetitiver DNA-Fragmente, die chromosomenspezifisch sind (Abb. 6.4). Nach geeigneten Erkennungsreaktionen für die markierten Nukleotide (meist durch Bindung fluoreszenzmarkierter Antikörper) lässt sich das betreffende Chromosom hochspezifisch darstellen. Durch unterschiedliche Markierungen verschiedener DNA-Fragmente lassen sich auch mehrere Chromosomen oder Chromosomenabschnitte gleichzeitig differenziell färben (engl. chromosome painting; siehe auch in-situHybridisierung, Technik-Box 25).

Colchicin, Alkaloid der Herbstzeitlose, Colchicum autumnale. Die giftige Wirkung beruht auf einer Mitosehemmung, verursacht durch Interaktionen mit Tubulin, dem Hauptbestandteil der mitotischen Spindel. Durch die Bindung an Tubulin verhindern Colchicin und verwandte Verbindungen (wie Colcemid) die Entstehung von Mikrotubuli

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Kapitel 7

Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene Inhaltsverzeichnis 7.1 Protein-codierende Gene: I. Einzelkopiegene . . . . . . . 272 7.2 Protein-codierende Gene: II. Multigenfamilien . . . . . . 277 7.3 Regulation eukaryotischer Genexpression . . . . . . . . . 289 7.4 RNA-codierende Gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297 7.5 Kleine regulatorische RNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . 313

Miller-Spreitung der wachsenden Transkripte an der DNA einer Lampenbürstenschleife von Drosophila. (Foto: I. Siegmund und W. Hennig, Mainz)

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

Überblick Die Struktur und Funktion eukaryotischer Gene ist in vielerlei Hinsicht komplexer als die prokaryotischer Gene, und das nicht nur wegen des wesentlich größeren Umfangs des Genoms, der Trennung von Transkription (im Zellkern) und Translation (im Cytoplasma) und der großen funktionellen Differenzierungsfähigkeit somatischer Zellen. Dazu gehören auch die Intron/Exon-Struktur sowie die Zusammenfassung vieler Gene zu Familien identischer oder ähnlicher DNA-Sequenzen. Die Kontrolle ihrer Expression erfolgt auf verschiedenen Ebenen und umfasst Promotor, Enhancer und Locus-Kontrollregionen. Die molekulare Struktur eukaryotischer Gene wurde daher erst viel später charakterisiert als die prokaryotischer Gene. Unser Verständnis der DNA-Struktur des Eukaryotengenoms nahm nach der Entdeckung repetitiver DNA in den frühen 1960er-Jahren schnell zu. Im Jahr 1966 isolierten H. Wallace und M. Birnstiel das Gen für die ribosomale RNA von Xenopus als erstes eukaryotisches Gen. In den 1980er-Jahren revolutionierte die Etablierung der Polymerasekettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR; Scharf et al. 1986) die gentechnische Methodik. Mit ihr wurde es möglich, unbekannte DNA-Fragmente zwischen den Startstellen einer DNA-Polymerase in vitro soweit zu amplifizieren, dass sie einer Detailanalyse zugänglich wurden. In dieser Phase begannen die systematischen Analysen des menschlichen Genoms, die „Humangenomprojekte“, die mit Hochdurchsatztechniken menschliche DNA und die anderer Organismen komplett sequenziert haben. Höhepunkt war im Jahr 2001

7.1 Protein-codierende Gene: I. Einzelkopiegene Die Zahl der Gene eines Genoms verändert sich während der Evolution immer dann, wenn eine erbliche Änderung der Kopienzahl eines Gens auftritt (verursacht durch Duplikation, Genverlust oder Polyploidisierung) und wenn die Individuen, die diese Mutationen tragen, unterschiedlich viele Nachkommen haben. So werden sich die Unterschiede in der Zahl der Gene entweder durch Zufall („genetische Drift“, Kapitel 10.5.2), als Ergebnis einer besseren Überlebensfähigkeit oder einer höheren Reproduktionsrate verfestigen. Die Genomanalysen der letzten Jahre haben deutlich gemacht, in welchem Ausmaß Genduplikationen und Genomduplikationen in der Evolution vorkommen. Dabei stellte sich heraus, dass eine beachtenswerte Zahl von Genen eng verwandt ist mit anderen Genen in demselben Genom; die Zahl der Gene, die „jüngst“ dupliziert wurden, variiert von Spezies zu Spezies zwischen 11 % und 65 % (11,2 % bei Haemophilus influenzae; 27,5 % bei Drosophila melanogaster; 28,6 %

die gleichzeitige Publikation des menschlichen Genoms durch ein Konsortium öffentlicher Wissenschaftler (International Human Genom Sequencing Consortium) und die Firma Celera (Venter et al. 2001); eine vollständige Liste der heute sequenzierten Genome findet sich bei http:// www.enseml.org. Eine Aufgabe der modernen Genetik ist es jetzt, diesen Sequenzen auch ihre entsprechenden Funktionen zuzuordnen. In den folgenden Abschnitten werden wir aber sehen, dass unsere gegenwärtigen Kenntnisse der Regulationsmechanismen eukaryotischer Gene noch begrenzt sind. Die Diskussion der Komplexität eukaryotischer Chromosomenstruktur im letzten Kapitel hat uns bereits verdeutlicht, dass die Regulationsvorgänge sehr eng an den strukturellen Zustand eines Chromosoms gekoppelt sind. Wie erfolgt eine funktionsgerechte und zeitlich koordinierte Dekondensation eines Chromosoms? Wie können Regulationsmoleküle ihre Signalsequenzen in der DNA erkennen, wenn diese in Histone und andere chromosomale Proteine verpackt ist? Bevor wir imstande sein werden, derartige Fragen zu beantworten, werden wir auch nicht in der Lage sein, die Regulation eukaryotischer Gene in allen Einzelheiten zu verstehen. Und in diesem Zusammenhang werden vollständig neue Mechanismen der Genregulation deutlich, die sich mit dem Stichwort „nicht-codierende, regulatorische RNA“ treffend zusammenfassen lassen. Neben den schon früher besprochenen rRNA- und tRNAGenen eröffnet sich uns eine ganz neue „RNA-Welt“.

bei Saccharomyces cerevisiae; 44,7 % bei Caenorabditis elegans; 65 % bei Arabidopsis thaliana; Otto u. Yong 2002). Die Zahl der neuen Duplikationen wird bei Fliegen auf etwa 31 Duplikationen pro Genom und 1 Million Jahre geschätzt, auf 52 in Hefen und auf 383 in Nematoden. Diese Häufigkeit von Duplikationen im Genom ist die Ursache dafür, dass wir heute immer mehr „Genfamilien“ entdecken. Wie sich aber schon aus diesen wenigen Beispielen ableiten lässt, ist die Situation in verschiedenen Organismen durchaus sehr unterschiedlich. Bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae gibt es z. B. nur ein einziges Gen für Aktin (ACT1), während in allen übrigen bisher untersuchten Eukaryoten mehrere Aktin-Gene gefunden wurden. Solche Unterschiede bestehen aber nicht nur zwischen niederen und höheren Eukaryoten. So besitzt Drosophila beispielsweise nur ein einziges Gen für die schwere Muskelmyosinkette (engl. myosin heavy polypeptide, Myh), während in Säugern mehrere Myh-Gene vorhanden sind. Es lassen sich also kaum Voraussagen

7.1 Protein-codierende Gene: I. Einzelkopiegene

über die genetische Konstitution eines bestimmten Gens in einem bestimmten Organismus treffen, sondern man muss in unterschiedlichen Organismen jeweils andere genetische Konstitutionen erwarten. Als Beispiel für ein Einzelkopiegen soll an dieser Stelle das Fibroin-Gen des Seidenspinners Bombyx mori näher besprochen werden, das unter anderem wegen seiner praktischen Bedeutung für die Seidenherstellung viel Interesse auf sich gezogen hat. Seide gehört zu den fibrillären Proteinen, die in tierischen Zellen in großen Mengen synthetisiert werden. Fibrilläre Proteine kommen im Cytoskelett aller Zellen, in der extrazellulären Matrix und in vielen spezialisierten Zelltypen wie Muskelzellen oder keratinisierenden Zellen (Epithelzellen) vor. Seide gibt es in vielen unterschiedlichen Varietäten, und sie übersteigt in ihrer Vielfalt die Variabilität anderer fibrillärer Proteine bei Weitem. Das bekannteste Beispiel des Vorkommens von Seide ist der Kokon, den die Seidenspinnerraupe bei ihrer Verpuppung erzeugt. Seide wird in ähnlicher Weise von vielen anderen Lepidopteren erzeugt, aber z. B. auch von Spinnen zum Bau ihrer Netze verwendet. Seide ist aufgrund ihrer besonderen Struktur, die einen weiten Bereich verschiedener Proteinkonformationen einschließt, die stabilste Naturfaser. Sie hat daher sowohl theoretisches Interesse im Zusammenhang mit dem Studium von Proteinkettenstrukturen als auch praktische Beachtung wegen ihrer Bedeutung in der Seidenherstellung gefunden. Seidenproduzierende Schmetterlinge gehören zu den wenigen genetisch intensiv untersuchten Insekten. Hauptlieferant für Seide ist seit über 4000 Jahren der Seidenspinner, Bombyx mori.

Der Hauptbestandteil der Seide ist das Fibroin. Es wird

von einem Einzelkopiegen in bestimmten Zellen der Seidendrüsen des Seidenspinners synthetisiert. Das Fibroin formt zusammen mit anderen Proteinen den Seidenfaden, der seinem Aufbau aus fibrillären Proteinen seine besondere Stabilität verdankt. Ähnliche fibrilläre Proteine sind Bestandteile des Cytoskeletts der Zelle.

Für die Synthese des wichtigsten Bestandteils des Seidenfadens, des Fibroins, ist das Fibroin-Gen verantwortlich. Am Aufbau des Seidenfadens bei B. mori sind noch die Produkte eines weiteren Fibroin-Gens, des Gens für die leichte Fibroinkette (engl. light chain fibroin gene), sowie die Produkte mindestens zweier Serizin-Gene beteiligt. Die Synthese des Fibroins beginnt am 4. bis 5. Tage des 5. Larvalstadiums der Raupe, und zwar ausschließlich in den großen hexagonalen Zellen der hinteren Seidendrüsen. Die Seidenproteine werden

im Lumen dieser Drüsen in Form einer wässrigen Lösung gesammelt. Diese besteht zu 30 % aus Protein. Das ist eine Konzentration, die man in vitro gar nicht herstellen kann, da sie unmittelbar zur Gelierung der Lösung führen würde. Während das Fibroin im stark gefalteten hinteren (posterioren) Teil der Drüse synthetisiert wird, entstehen die Serizinbestandteile im mittleren Abschnitt der Drüse. Im vorderen (anterioren) Bereich der Drüse mischen sich beide Bestandteile miteinander und mit den Produkten der zweiten Drüse und werden dann durch einen gemeinsamen ausführenden Gang als Seidenfaden ausgeschieden. Dieser besteht daher aus zwei umeinander gewundenen Fibroinketten, die in eine Lage amorphen Serizins eingebettet sind. Der entstehende Seidenfaden ist nur schwer wieder in Lösung zu bringen. Die besondere Struktur des Fibroins wird durch die mechanische Streckung beim Spinnen erzielt: Die Moleküle des Fibroins orientieren sich hierbei in einer Längsstruktur. Die Seidendrüsen beanspruchen schließlich bis zu 40 % des gesamten Körpergewichts der Larve. Sie vermögen innerhalb von etwa 4 Tagen einen Seidenfaden von 13 bis 25 μm Durchmesser und von bis zu 4000 m Länge zu produzieren. Mit dessen Hilfe wird der Kokon geformt, aus dem nach weiteren 9 bis 14 Tagen der Seidenspinner schlüpft. Das Fibroin wird von einem einzigen Gen im Genom des Seidenspinners codiert. Das ist überraschend, wenn man sich die Menge an Genprodukt vor Augen hält, die in einer sehr kurzen Zeit bereitgestellt werden muss. Es werden in 4 Tagen etwa 300 μg Fibroin, das sind etwa 1015 Fibroinmoleküle, in jeder Zelle der Drüse gebildet. Da sich in einer Zelle etwa 1010 Fibroin-mRNA-Moleküle befinden, werden von jedem mRNA-Molekül in 4 Tagen etwa 105 Fibroinmoleküle hergestellt. Das würde bedeuten, dass an jedem der beiden Allele in einer diploiden Zelle mehr als 104 Transkripte in jeder Sekunde synthetisiert werden müssten. Eine solche Syntheseleistung ist auch bei höchster Transkriptionsrate nicht erreichbar. Die hohe Syntheserate von Fibroin hat daher bereits frühzeitig zu der Frage Anlass gegeben, ob eine Amplifikation des Fibroin-Gens in den hinteren Seidendrüsen erfolgt. DNA-Messungen an den Seidendrüsen hatten ergeben, dass jede Zelle der hinteren Seidendrüsen DNA enthält, wie sie einem Ploidiegrad der Zelle von 400.000 entsprechen würde. Zur Klärung der Frage, ob es hier zur Amplifikation der FibroinGene, ähnlich der der rDNA in Xenopus-Oocyten (S. 300), oder einfach zur Vervielfachung des Genoms durch Polyploidisierung oder Polytänisierung kommt, wurden von Yoshiaki Suzuki Hybridisierungsexperimente durchgeführt. Diese bewiesen, dass der relative Anteil der Fibroin-DNA im Verhältnis zur GesamtDNA (0,0022 %) in diploiden Zellen und in der hin-

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

teren Seidendrüse gleich ist. Damit war eine spezifische Amplifikation des Fibroin-Gens ausgeschlossen (Suzuki et al. 1972). Auch eine Polytänisierung lässt sich ausschließen, da die Drüse keine Polytänchromosomen besitzt. Die Drüsenzellen erzielen also ihre hohe Syntheseleistung für Fibroin durch Polyploidisierung des gesamten Genoms um einen Faktor von etwa 105 bis 106.

Obwohl Fibroin in den Seidendrüsen der Seidenraupe innerhalb weniger Tage in besonders großen Mengen synthetisiert wird, ist es im Genom nur als Einzelkopiegen vorhanden. Die hohe Syntheseleistung wird durch ein besonders hohes Maß von Polyploidisierung der Fibroinsynthetisierenden Zellen ermöglicht.

Das Fibroin-Gen von B. mori besteht aus zwei Exons (Abb. 7.1), die mRNA umfasst 16 kb und codiert für

insgesamt 5263 Aminosäuren; das entsprechende Protein hat ein Molekulargewicht von ca. 350.000 kDa. Jedes Exon codiert für kristalline und nicht-kristalline Protein-Domänen. Das Exon 1 enthält 25 bp, die nicht translatiert werden, und 42 bp, die für 14 Aminosäuren codieren. Ein kurzes Intron (970 bp) befindet sich zwischen Exon 1 und Exon 2; Exon 2 besteht aus 12 repetitiven Unterdomänen, die in ihrer Größe zwischen 111 und 255 bp schwanken (für weitere Details hinsichtlich der einzelnen Motive siehe Abb. 7.1). Der Aufbau dieses Polypeptids ist im Hinblick auf die Evolution seiner Struktur interessant. Die tandemartige Anordnung der identischen Untereinheiten spricht sehr dafür, dass die heutige Struktur des Gens im Laufe der Evolution durch Duplikationen von Grundsequenzen entstanden ist. DNA-Sequenzduplikationen spielen also nicht nur für die Vervielfachung ganzer Gene eine Rolle, sondern sind auch für die innere Struktur von Genen wichtig. Es gibt auch andere

Wiederholungs-Motive (kristalline Regionen)

Grenz-Motive GGAGCAGGAGCAGGAAGC

(GGNGCN) m GGNTCW Exon 1

Exon 2 A01

5‘

GGAGCTGCCTCT

(GGNGCN) n GGNTAY

R01

A02 R02

A03 A04 R03

A05 R05

3‘

A06

R06

R04

A07 R07

A08 R08

A10 R09

R10

A11 R11

A09

R12

(nicht-kristalline Regionen)

GGTGCAGGAGCTGGTGCAGGTGCTGCCGCTGGTTCT GGTGCGGGTGCCGGAGCTGGTTATG GGAGCTGCTGCTTCT

Abb. 7.1 Das Fibroin-Gen von B. mori. Die Wiederholungssequenzen des Fibroin-Gens sind hierarchisch organisiert. Das Diagramm zeigt den Aufbau aus zwei Exons und einem Intron. Exon 2 enthält die integrierten kristallinen Wiederholungseinheiten, die nicht-kristallinen Regionen sowie die Grenzmotive. Das Exon

2 ist aus 12 repetitiven Untereinheiten aufgebaut (R01–R12); dazwischen liegen Bereiche, die für amorphe Domänen codieren (A01–A11). Die einzelnen Einheiten sind in der Größe variabel. n=0-6; N: jede Base; m=1-8; W: A oder T; Y: T oder C. (Nach Craig u. Riekel 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

7.1 Protein-codierende Gene: I. Einzelkopiegene

Abb. 7.2 a, b Grundstruktur von Proteinen. a α-Helix. Die Peptidkette ist schraubenartig (helical) rechtshändig aufgewunden. Dabei windet sich die Peptidkette im Uhrzeigersinn um die Helixachse (Blickrichtung N→C; kleines Bild). Die Wasserstoffbrückenbindungen stehen mehr oder weniger parallel zur Helixachse. Eine C=O-Gruppe bildet immer mit der Aminogruppe des viertnächsten Aminosäurerestes eine Wasserstoffbrückenbindung (die Sauerstoffatome sind dunkelrot hervorgehoben). Die starren Ebenen der Peptidbindungen sind parallel zur Helixachse angeordnet. Die Helix bildet keinen Zylinder, sondern eine eckige Struktur mit den Cα-Atomen in den Ecken (kleines Bild). Die Ganghöhe ist 0,54 nm; die Seitenketten sind radial nach außen orientiert, sodass die Möglichkeiten einer sterischen Behinderung minimalisiert ist. b β-Faltblatt. Die C=O-Gruppe bildet eine Wasserstoffbrückenbindung mit der Aminogruppe des drittnächsten Aminosäurerestes; dadurch ändert die Peptidkette ihre Richtung um fast 180°. (Nach Christen u. Jaussi 2005, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

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276

Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene Abb. 7.3 Aufbau eines Seidenmoleküls. Der Seidenfaden besteht aus vier antiparallel (horizontale Pfeile) orientierten Fibroinmolekülen (rot). Diese antiparallel angeordneten Polypeptidketten bilden β-Faltblattstrukturen (Abb. 7.2) aus. Die Glycinseitenketten (kleine rote Kreise) je zweier Fibroinmoleküle einerseits und die Alaninund Serinseitenketten (große grüne Kreise) andererseits sind zueinander orientiert. Dieser Strukturaufbau zeigt die Bedeutung des Aufbaus des Polypeptids mit jeweils einem Glycin in jeder zweiten Position der Ketten. Die unterschiedlichen Seitenketten der Aminosäuren (Glycin einerseits, Alanin und Serin andererseits) bedingen zugleich unterschiedliche Abstände der Moleküle (rechts angegeben). (Nach Marsh et al. 1955, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Proteine, die einen gleichartigen Aufbau aus wiederholten gleichen oder sehr ähnlichen Untereinheiten zeigen. Zu diesen Proteinen gehören beispielsweise die Proteine der Augenlinse (Kristalline). Die Hypothese, dass das Fibroin-Gen aus duplizierten Modulen aufgebaut ist, wird auch dadurch unterstützt, dass hier die verschiedenen Codons für Alanin, Serin und Glycin nur selektiv gebraucht werden. Für Glycin wird im Wesentlichen GGU und GGA verwendet, für Serin UCA und für Alanin GCU. Wir begegnen hier einem Beispiel für selektiven Codongebrauch (engl. codon usage), der darauf hinweist, dass auch die dritte Basenposition eines Codons einem selektiven Evolutionsdruck unterliegen muss.

Das Gen für Fibroin ist ein Beispiel für den selektiven

Gebrauch von Codons (engl. codon usage), der bei vielen Eukaryoten als gruppenspezifisches Charakteristikum zu beobachten ist.

Aufgrund der repetitiven Genstruktur ist auch das Fibroin-Protein sehr gleichförmig. Es ist sehr reich an Glycin-, Serin- und Alanin-Resten und baut sich aus identisch wiederholten Untereinheiten auf: Gly – Ala – Gly – Ala – Gly – [Ser – Gly – (Ala – Gly)n]8 – Ser – Gly – Ala – Ala – Gly – Tyr. Im Wesentlichen alternieren also in diesem Molekül Ser-Gly- und Ala-Gly-Gruppen miteinander. Im Polypeptid weist das Glycin als Seitenkette in die zur Ala-

nin- oder Serinorientierung entgegengesetzte Richtung. Das hat zur Folge, dass sich im Seidenfaden kristalline β-Faltblattstrukturen (engl. β-sheets oder β-pleated sheets) aus den antiparallel gelagerten, durch Wasserstoffbrücken miteinander verbundenen Polypeptidketten ausbilden können. Die Faltblattstrukturen sind für die hohe Stabilität des Seidenfadens verantwortlich (Abb. 7.2). Die β-Faltblattstruktur ist in vielen fibrillären Proteinen und als Teilstruktur globulärer Proteine zu finden. Die beim Fibroin zu beobachtende Aneinanderlagerung von vier antiparallel orientierten Strängen wird auch in anderen Proteinfasern gefunden (Abb. 7.3). Hierbei kann es generell zur Assoziation von zwei bis fünf Peptidketten kommen. Die gestreckte Anordnung der Fibroinmoleküle im Seidenfaden wird durch die mechanischen Vorgänge während der Entstehung des Seidenfadens beim Verlassen der Spinndrüse hervorgerufen. Eine gewisse Dehnbarkeit des Fadens wird durch ein Tyrosin-Rest erzeugt, der im amorphen Endbereich der Moleküle liegt, aber auch dadurch, dass die Wasserstoffbrücken eine leichte Kontraktion der im kristallinen Proteinbereich (β-sheets) gestreckten Polypeptidketten verursachen. Diese fügen sich zudem unter einer geringfügigen Spiralisierung der Polypeptidketten aneinander. Auch das trägt zur Dehnbarkeit des Seidenfadens bei.

Die β-Faltblattstruktur des Fibroins vergegenwärtigt die neben der α-Helixstruktur wichtigste Proteingrundkonformation. Beide Strukturen spielen eine große Rolle für die Entwicklung quarternärer Proteinstrukturen.

7.2 Protein-codierende Gene: II. Multigenfamilien

7.2 Protein-codierende Gene: II. Multigenfamilien 7.2.1 Die Globin-Genfamilie Das Hämoglobin ist eines der am besten untersuchten eukaryotischen Proteine. Der Grund dafür ist darin zu suchen, dass Blutkrankheiten, die auf Anomalien dieses Proteinkomplexes beruhen, sehr weit verbreitet sind und wegen ihrer schwerwiegenden physiologischen Folgen medizinisch große Bedeutung besitzen (Kapitel 12.3). Als Sauerstoffüberträger ist das Hämoglobin (Hb) in den Erythrocyten lebensnotwendig. Wichtige Schritte in der Analyse des Hämoglobins waren die Ermittlung der vollständigen Aminosäuresequenz sowie die röntgenkristallographische Untersuchung, die das Strukturmodell des Hämoglobins ergab (Abb. 7.4). Hämoglobin A (HbA) ist ein Komplex aus vier Proteinketten, von denen je zwei identisch sind. Sie werden als α- und β-Globinketten bezeichnet. Jede dieser Ketten ist in sich gefaltet und schließt eine funktionelle Gruppe ein, die Hämgruppe. Diese aus Porphyrinringen aufgebaute Gruppe enthält ein zentral gelegenes Fe2+-Ion, das für die Sauerstoff-bindende Funktion des Hämoglobins verantwortlich ist.

α-Ketten aller dieser Hämoglobinvarianten gleich sind, unterscheiden sich die anderen beiden Ketten voneinander: HbA1 besitzt zwei β-Ketten, HbA2 zwei δ-Ketten und HbF zwei γ-Ketten (Tabelle 7.1). Der Name HbF erklärt sich daher, dass das HbF den Hauptanteil des fötalen Hämoglobins ausmacht. Wie uns Abb. 7.5 zeigt, werden im Laufe der Ontogenese des Menschen verschiedene Hämoglobinketten synthetisiert und in verschiedenen Kombinationen zu funktionsfähigen Tetrameren zusammengefügt.

Das Hämoglobin ist ein Komplex aus vier Polypep-

tidketten (Globinen) mit einer funktionellen Gruppe aus Porphyrinringen, die ein zentral gelegenes Fe2+-Ion einschließen. Diese als Hämgruppe bezeichnete funktionelle Gruppe ist für die Sauerstoff-übertragende Funktion des Hämoglobins verantwortlich.

Das menschliche Blut enthält vom 6. Lebensmonat an fast ausschließlich HbA, das sich in zwei Fraktionen trennen lässt, HbA1 (97 %) und HbA2 (2,5 %), sowie eine kleine Menge an HbF (0,5 %). Während die

Abb. 7.4 Die tetramere Struktur des Hämoglobins. Das Hämoglobin ist ein Komplex aus vier Proteinketten, je zwei identischen α- und zwei identischen β-Globinketten. Über 70 % des Proteins sind durch α-Helices charakterisiert (Zylinder A–H; im α-Globin fehlt die Helix D). Im Mittelpunkt jeder Kette liegt die Hämgruppe, die für den Sauerstofftransport verantwortlich ist. Die Kontaktpunkte der verschiedenen Ketten unterliegen Konformationsveränderungen bei Sauerstoffaufnahme und -abgabe. Die amino- und carboxyterminalen Regionen der Ketten sind gekennzeichnet. (Nach Löffler u. Petrides 2003, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Lebensalter

Bezeichnung

Hb-Ketten

Anteil

bis zur 8. Woche

Hb Gower 1

ζ2 ε2

100 %

ab der 8. Woche

Hb F

α2 γ2

+ Hb Gower 2

α2 ε2

+ Hb Portland

ζ2 γ2

Hb A1

α2 β2

97 %

Hb A2

α2 δ2

2,5 %

Hb F

α2 γ2

0,5 %

ab Geburt

Tabelle 7.1 Hämoglobinvarianten im Laufe der Ontogenese des Menschen

277

Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

Die Gründe für die Verwendung verschiedener Proteinketten unter unterschiedlichen Entwicklungsbedingungen lassen sich leicht verstehen, wenn wir die jeweiligen Bedingungen des Sauerstoffaustausches beachten. Während der frühen Embryonalentwicklung besteht zunächst kein eigener Blutkreislauf. Unter diesen sehr ungünstigen Bedingungen wird der Sauerstoffaustausch durch ein Hämoglobin mit besonders hoher Bindungsaffinität für Sauerstoff versehen. Später, nach Entwicklung des embryonalen Blutkreislaufs, sind die Bedingungen der Sauerstoffversorgung des Fötus zwar günstiger, aber der Sauerstoffaustausch mit dem mütterlichen Blut muss immer noch durch die Plazentabarriere erfolgen. Die Bindungsaffinität für

Dottersack

Knochenmark

Leber

a Expressionsstärke

278

Milz

α β γ b ε

ζ

δ Alter des Embryos 6 (Wochen) ζ2ε2

18

30

Geburt

α2γ2

c

ζ2γ2 α2ε2

Sauerstoff kann nunmehr geringer sein, muss aber immer noch höher sein als nach der Geburt, wo ein ungehinderter Sauerstoffaustausch in der Lunge erfolgen kann. Das Hämoglobin wird nach der Geburt ausschließlich in den roten Blutkörperchen, den Erythrocyten, gefunden. Sie stammen von Stammzellen des hämatopoietischen Systems im Knochenmark ab (Abb. 11.58). In frühen Entwicklungsstadien besitzt der Fötus jedoch noch kein Knochenmark. Daher wird Hämoglobin zunächst im Dottersack gebildet, später in der Leber und der Milz. Erst ab dem 4. Lebensmonat des Embryos beginnt im Knochenmark allmählich die Proliferation von Retikulocyten, die sich im Blut zu Erythrocyten ausdifferenzieren. Gleichzeitig nimmt die Synthese von Hämoglobin in Leber und Milz ab, sodass bereits kurz nach der Geburt ausschließlich nur noch die Retikulocyten für die Hämoglobinsynthese verantwortlich sind (Abb. 7.5). Erythrocyten besitzen bei Säugern keinen Kern mehr, sind aber mit großen Mengen Hb-mRNA beladen, sodass sie zur Hb-Synthese in der Lage sind.

α2β2

Abb. 7.5 a–c Entwicklungsspezifisches Expressionsmuster der Globinketten in der menschlichen Entwicklung. a Während der ersten 3 Monate der Entwicklung wird Hämoglobin im Dottersack synthetisiert. Danach folgt eine Phase, in der die Hauptsyntheseorte Leber und Milz sind. Hier wird hauptsächlich das fötale Hämoglobin produziert. Ab der Geburt übernimmt das Knochenmark die Hämoglobinsynthese. b, c Die Phasen der Produktion der verschiedenen Hämoglobinketten sind angegeben. Die Expression der Globin-Gene ist somit einer stark gewebespezifischen und entwicklungsspezifischen Regulation der Transkription unterworfen. (Nach Brittain 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Die Zusammensetzung der Hämoglobinmoleküle verändert sich während der fötalen Entwicklung und nach der Geburt aufgrund der physiologischen Erfordernisse des Sauerstoffaustausches im Blut. Die Hämoglobinsynthese erfolgt je nach Lebensalter des Menschen in unterschiedlichen Geweben, ist nach der Geburt jedoch auf die Retikulocyten beschränkt.

Die Beschreibung des Hämoglobins gewährt uns einen interessanten Einblick in den Ablauf wissenschaftlicher Forschung: Die Beobachtung verschiedener Blutkrankheiten (Thalassämien, Sichelzellenanämie; vgl. dazu Kapitel 12.3) führte zur Aufdeckung der genetischen und dann der molekularen Ursache dieser Krankheiten. Man lernte, die molekularen Grundlagen einer wichtigen Stoffwechselfunktion, der Sauerstoffübertragung, durch physikochemische Analysen zu verstehen. Die weitere Aufschlüsselung des Systems führte uns zu allgemeinen Einsichten über die Art der Funktion eukaryotischer Gene (wie im Folgenden in mehreren Schritten noch sichtbar werden soll).

7.2 Protein-codierende Gene: II. Multigenfamilien

Im Zusammenhang mit Einsichten in die eukaryotische Genstruktur und -funktion sind an den zuvor geschilderten Einzelheiten die folgenden Gesichtspunkte von näherem Interesse: ï Hämoglobin setzt sich aus mehreren ähnlichen Proteinen zusammen. ï Diese Proteine werden nicht nur zu unterschiedlichen Zeiten während der Ontogenese synthetisiert, ï sondern sie treten während der verschiedenen Entwicklungsstadien auch in verschiedenen Zelltypen auf. Wir müssen es also mit einer komplizierten Steuerung von Genfunktionen in Abhängigkeit von Zelldifferenzierungsprozessen zu tun haben. Die Entdeckung verschiedener Globinmoleküle in den 1960er-Jahren legte es nahe, anzunehmen, dass diese von verschiedenen Genen codiert werden. Es stellt sich damit natürlich als erste Frage die nach der Lokalisation der zugehörigen verschiedenen Globin-Gene im Genom. Durch vergleichende Stammbaumanalysen von Familien mit Hämoglobinanomalien gelang es relativ bald zu erkennen, dass die Gene für die α- und β-Ketten entweder sehr weit voneinander entfernt im gleichen Chromosom oder sogar auf verschiedenen Chromosomen liegen müssen, da in Heterozygoten für α- und β-Varianten eine häufige Segregation dieser unterschiedlichen Typen zu beobachten war. Hingegen ließ sich zunächst keine Rekombination zwischen β- und δ-Varianten finden, sodass man für diese beiden Ketten von einer engen Koppelung ausgehen musste. Die verfeinerte Analyse zeigte später, dass beide Gene tatsächlich sehr dicht benachbart sind, da man Kombinationsmoleküle aus β- und δ-Ketten entdeckte. Die Zuordnung der α- und β-Ketten zu bestimmten Chromosomen wurde dann mit der Hilfe von Zellhybriden möglich. Fusioniert man menschliche Zellen mit den Zellen von Mäusen, so verlieren diese Hybridzellen allmählich Chromosomen, und zwar bevorzugt die menschlichen Chromosomen. Die Chromosomenkonstitution solcher Hybridzelllinien kann man durch Chromosomenbänderung leicht ermitteln. Zudem sind die Hämoglobin-Gene des Menschen und die der Maus so unterschiedlich, dass man sie in Nukleinsäurehybridisierungsexperimenten leicht unterscheiden kann. Es gelang auf diese Weise, die β-Kette auf dem Chromosom 11 und die α-Kette auf dem Chromosom 16 des Menschen zu lokalisieren.

Nachdem in der Folge weitere Details der Lokalisation verschiedener Globin-Gene bekannt wurden, gelang schließlich A. Efstratiadis und seinen Kollegen 1980 die Isolierung der DNA-Bereiche, die für die menschlichen Hämoglobin-Gene codieren. In der Folgezeit wurden auch die Globin-Gene veschiedener anderer Säugetiere sequenziert. Dabei zeigte es sich, dass sowohl die α- als auch die β-Globin-Gene sehr komplexen evolutionären Veränderungen unterworfen sind, die dazu führen, dass viele Gene verdoppelt und andere wieder stillgelegt wurden; für Details siehe Abb. 7.6. In der α-Gruppe (engl. α-cluster) erkennen wir, dass innerhalb von etwa 30 kb DNA neben zwei identischen Kopien des α-Gens (α1 und α2) ein ζ-Gen (ζ2) (griech. Buchstabe zeta: ζ) vorhanden ist. Darüber hinaus gibt es weitere Gensequenzen, die als ψα1 und ψζ1 (griech. Buchstabe psi: ψ) bezeichnet werden. Die DNA-Sequenzanalyse ließ erkennen, dass es sich um unvollständige, nicht funktionsfähige Genkopien handelt. Sie werden daher als Pseudogene (daher psi) bezeichnet. In der β-Gruppe (engl. β-cluster) sind innerhalb einer DNA-Gesamtlänge von 50 kb neben den Genen für die namensgebende β-Kette auch noch Gene für die δ-Kette und die ε-Kette sowie zwei Gene für γ-Ketten (Gγ und Aγ) vorhanden, die sich nur geringfügig voneinander unterscheiden (Tabelle 7.2). Außerdem finden sich auch hier zwei Pseudogene (ψβ1 und ψβ2). Sieht man sich beide Globin-Gengruppen an, so fällt auf, dass die verschiedenen Gene in der Reihenfolge ihrer Aktivität während der Ontogenese angeordnet sind (vgl. Abb. 7.5). Da das für beide Gruppen gilt, kann man davon ausgehen, dass diese Anordnung nicht zufällig ist. Der strukturelle Zusammenhang der Globin-Gene wird noch deutlicher, wenn man die Aminosäuresequenzen der aufeinanderfolgenden Gene, z. B. in der β-GlobinGruppe, vergleicht (Tabelle 7.2). Alle Globinketten der β-Gruppe besitzen 146 Aminosäuren. Die β- und δ-Ketten unterscheiden sich in 10 der Aminosäuren, die β- und γ-Ketten in 40 Aminosäuren, während die beiden γ-Ketten (Gγ und Aγ) sich nur in einer einzigen Aminosäure (Position 136) unterscheiden. Die Divergenz der Aminosäuresequenzen wird also mit wachsendem Abstand auf dem Chromosom größer. Es liegt daher nahe, anzunehmen, dass zwischen diesen Genen ein bestimmter evolutionärer Zusammenhang besteht.

279

280

Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

0

20

40

εI

εII ψβX

60

βC

80

εIII

εIV ψβZ

100

βA

120

εV

εVI

140 kb

ψβY

βF

Ziege β ε

γ ψη

δ

β

Galago β ε

Gγ Aγ

ψη

δ

β

Mensch β ε

γ

ψδ

β

Kaninchen β γ bh0 bh1 bh2 bh3 b1

b2

Maus β

ζ

I

α IIα

Ziege α ζ

ψζ α2 α1 γα

ζ2

ψα2 ζ1 ψα1 α2 α1 θ

Pferd α

Mensch α ζ0 ζ1 α θ1 ζ2 ζ3 θ2 ζ ζ θ ζ ζ θ Kaninchen α ζ

α1

α2

Maus α

Abb. 7.6 Die β-Globin-Gengruppe. In allen Organismen mit Globin-Genen haben sich mehrere, funktionell verschiedene Globin-Gene entwickelt. Die Gruppe der β-Globin-Gene liegt beim Menschen auf dem Chromosom 11 und enthält mehrere Pseudogene (durch ψ gekennzeichnet). Die Abbildung zeigt, dass die ursprüngliche Form der Gengruppe bei den Galagos noch am deutlichsten erhalten ist; bei den anderen Säugetie-

ren wurden einzelne oder mehrere Gene verdoppelt oder stillgelegt (Pseudogene). Die Gene sind so über etwa 50 kb (Kaninchen) bzw. mehr als 140 kb (Ziege) verteilt. Die Gene werden zu unterschiedlichen Zeiträumen während des Lebens exprimiert; die Expression wird über eine Locus-Kontrollregion gesteuert. (Nach Hardison 1998, mit freundlicher Genehmigung der Company of Biologists)

Die Hämoglobin-Genfamilie enthält Gene, die in mehreren Kopien in tandemartiger Anordnung im Genom vorkommen. Die meisten der HämoglobinGene sind strukturell und funktionell verschieden. Man geht davon aus, dass sich die Genfamilie im Laufe

der Evolution durch Verdopplungsmechanismen vermehrt hat. Die Hämoglobin-Gene haben dadurch im Laufe ihrer Evolution die Möglichkeit zur differenzierten Anpassung an unterschiedliche Stoffwechselsituationen erhalten. Insekten und niedere Vertebraten besit-

7.2 Protein-codierende Gene: II. Multigenfamilien Tabelle 7.2 Einige Struktureigenschaften der menschlichen Globin-Gene Gen

Länge (AS)

Introns

Anzahl ASSubstitutionen

verglichen mit

α-Globin

141

2

–

–

α1-Globin

141

2

–

–

α2-Globin

141

2

0

α1-Globin

ζ2-Globin

141

2

60

α1-Globin

θ2-Globin

141

2

58

α1-Globin

146

2

78 (von 141)

α-Globin

ε-Globin

146

2

36

β-Globin

γ-Globin

147

2

40

β-Globin

G

γ-Globin

147

2

1

A

δ-Globin

146

2

10

β-Globin

Leghämoglobin

143

3

Myoglobin

153

2

β-Globin

A

γ-Globin

Nach EMBL-Datenbank

zen nur ein oder zwei Hämoglobin-Gene, während das Entstehen einer embryonalen Entwicklungsform bei Säugern mit weiteren Verdopplungsschritten und mit der Aufspaltung in embryonale, fötale und adulte Hämoglobine einhergeht. Der kritischen Situation der Sauerstoffversorgung durch die Plazenta hinweg wird durch die Entstehung geeigneter Proteine mit höherer Sauerstoffaffinität Rechnung getragen. Auf die für die Entstehung von Pseudogenen verantwortlichen Mechanismen werden wir, ebenso wie auf Vermehrungsmechanismen für chromosomale DNA, an anderer Stelle noch zurückkommen (Kapitel 8.3.3).

Die für die Synthese der verschiedenen Globinketten

erforderlichen Gene liegen bei Säugetieren in zwei Gruppen (engl. cluster) auf zwei verschiedenen Chromosomen. In der Evolution waren diese Gruppen starken Veränderungen unterworfen. Die Anordnung der funktionellen Gene in jeder Gruppe entspricht der Folge ihrer Aktivierung im Laufe der Ontogenese.

Die antarktischen Korokodileisfische (Familie Channichthyidae, Unterordnung Notothenioidei) sind die einzigen Wirbeltiere,

deren Blut kein Hämoglobin enthält. Dieser überraschende Phänotyp ist in vielen Eisfisch-Spezies mit Deletionen der Globin-Gene assoziiert, die in den rotblütigen Knochenfisch-Spezies typischerweise als eng gekoppelte Paare von α- und β-Globin-Genen angeordnet sind. 15 der 16 Eisfisch-Spezies haben das β-Globin-Gen verloren, aber ein verkürztes α-GlobinPseudogen behalten. Eine Eisfisch-Spezies (Neopagetopsis ionah) besitzt einen kompletten α/β-GlobinGenkomplex, der allerdings funktionell inaktiv ist. Dieser Komplex besitzt zwei eindeutige β-GlobinPseudogene, deren phylogenetische Ursprünge die gesamte antarktische Notothenoid-Radiation umfassen; dieser Befund lässt sich durch die Einführung dieses Gens durch wiederholtes Einkreuzen aus einer anderen Population erklären (Introgression). Am wahrscheinlichsten erscheint ein Szenario, dass in der Evolution der Globin-Gene der Eisfische ein Verlust des transkriptionell aktiven α/β-Globin-Genkomplexes stattgefunden hat, bevor sich die jetzt existierenden Spezies voneinander getrennt haben. Während der weiteren Evolution wurden zwei Alleltypen fixiert: das α-Globin-Pseudogen in der Mehrheit der Spezies und der inaktive α/β-Globin-Genkomplex in N. ionah (Near et al. 2006).

281

282

Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

Evolution der Globin-Gene Noch bevor man mehr über die strukturelle Anordnung der verschiedenen Globin-Gene im Genom wusste, nahm man aufgrund der Aminosäuresequenz der verschiedenen Globinketten an, dass es sich um eine Genfamilie handelt, die sich im Laufe der Evolution nach und nach durch mehrere Genduplikationsschritte entwickelt hat. Diese Überlegungen beruhten nicht allein auf der Kenntnis der menschlichen Hämoglobine, sondern bezogen den Vergleich der Hämoglobine und verwandter Moleküle wie dem des Myoglobins aus anderen Organismengruppen mit ein. Neuere Arbeiten haben die Familie der Globin-Gene noch um zwei weitere Mitglieder erweitert: Neuroglobin und Cytoglobin. Das Myoglobin ist ein Protein, das in der Muskulatur den Sauerstofftransport übernimmt. Das Neuroglobin wird überwiegend in den Nervenzellen exprimiert. Man vermutet, dass es eine Schutzfunktion bei der Sauerstoffunterversorgung hat und Sauerstoff schneller zu den Mitochondrien transportieren kann. Das Cytoglobin (auch bekannt unter der Bezeichnung Histoglobin) kommt in vielen verschiedenen Geweben in unterschiedlicher Menge vor; auch dieses Protein dient wahrscheinlich der Sauerstoffversorgung der Zellen. Für beide Proteine wird darüber hinaus aber auch eine Sauerstoff-verbrauchende Funktion bzw. die eines Sauerstoffsensors vermutet. Aufgrund der Abweichungen und Ähnlichkeiten der DNA- bzw. Aminosäuresequenzen kann man einen Stammbaum der Globin-Gene entwerfen. Er gibt den einfachsten Entwicklungsweg im Laufe der Evolution zwischen den verschiedenen Molekülen wieder (Parsi-

Abb. 7.7 Evolutionäres Modell der menschlichen GlobinGene. Die unterschiedlichen Chromosomen, auf denen die menschlichen Globin-Gene lokalisiert sind, sind oben angege-

nomieprinzip: der direkte Weg, auf dem man eine phylogenetische Entwicklung ableiten kann). Noch vor der Aufspaltung der α- und β-Globin-Genfamilien müssen verschiedene Duplikationsschritte erfolgt sein, die zunächst das Neuroglobin von der gesamten Genfamilie vor ca. 800 Millionen Jahren abspalteten. Die nächste Duplikationsrunde (vor ca. 600 Millionen Jahren) ergab die Vorläufer der Hämoglobine einerseits und der Cyto-/Myoglobine andererseits (Abb. 7.7). Weitere Duplikationen vor ca. 450 Millionen Jahren führten dann zur getrennten Entwicklung des Cytoglobins und Myoglobins sowie der α-und β-Globine; die weitere Entwicklung der Hämoglobine ist dann entwicklungsgeschichtlich wesentlich jünger. Bei der Betrachtung der Intron-Exon-Struktur der α- und β-Globin-Gene fällt auch auf, dass die Lage und Länge der Introns fast in demselben Maß konserviert ist wie die der Exons. Die Entdeckung der Cyto- und NeuroglobinGene ist ein Erfolg der systematischen Sequenzierung des menschlichen Genoms und einiger Modellorganismen wie Maus und Zebrafisch. Beide Gene wurden zunächst in den EST-Datenbanken (engl. expressed sequence tag, EST) unter vielen, nicht zugeordneten cDNA-Sequenzen gefunden. Das entsprechende Gen der Ratte wurde durch einen systematischen Ansatz der Protein-Analytik identifiziert, als hochregulierte Proteine in einer fibrotischen Leber untersucht wurden. Beide „neuen“ Gene erwiesen sich in der Folge jedoch als entwicklungsgeschichtlich älter als die schon lange bekannten Hämoglobine.

ben. Funktionelle Gene sind farbig, Pseudogene grau. (Nach Pesce et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

7.2 Protein-codierende Gene: II. Multigenfamilien

Die Globin-Gene haben sich im Laufe der Evolution

durch mehrere aufeinanderfolgende Duplikationen aus einem ursprünglichen Globin-Gen entwickelt. Ihre evolutionäre Geschichte kann durch Vergleiche der Aminosäureveränderungen aufgeklärt werden.

7.2.2 Histon-Gene Hinsichtlich ihrer Nukleotidsequenz gehören die Gene für die Histone zu den evolutionär am besten erhaltenen Multigenfamilien. Das ist angesichts der Funktion der Histone als Strukturbestandteile der Nukleosomen nicht überraschend (Abb. 6.18). Wir unterscheiden zunächst 5 Klassen von Histonen, die als H1, H2A, H2B, H3 und H4 bezeichnet werden. In Säugetieren wurden in allen Histonklassen (ausgenommen H4) weitere Untertypen identifiziert. Die variantenreichste Klasse ist dabei die der H1-Histone: Hier kennen wir 7 verschiedene Untertypen, die als H1.1 bis H1.5, H10 und H1t bezeichnet werden. Auch für die stärker konservierten Klassen der Histone H2A, H2B und H3 sind verschiedene Untertypen beschrieben. Während der Replikation müssen große Mengen von Histonen zur Bildung neuer Nukleosomen bereitgestellt werden. Das erklärt eine Kopplung der Histonsynthese an die Regulation des Zellzyklus. Besonders hoch ist der Bedarf an Histonen in Zellen, die sich schnell teilen; also vor allem während der frühembryonalen Entwicklung. Dies ist sicher ein Grund für die Vielzahl der Histon-Gene im Genom. Trotz der evolutionären Erhaltung der Aminosäuresequenzen zumindest einiger der Histone ist die Anordnung ihrer Gene im Genom jedoch sehr unterschiedlich. Die Mehrzahl der Histon-Gene ist in Gruppen (engl. cluster) organisiert (Tabelle 7.3). Mit Ausnahme von Vögeln und Säugetieren bilden die Wiederholun-

gen von H1 und den 4 Kern-Histon-Genen H2A, H2B, H3 und H4 oder nur ein Quartett dieser 4 Kern-Histone dabei tandemartige Muster. Zusätzlich zu diesen Hauptclustern gibt es auch kleinere Cluster; es wurden auch einzelne Histon-Gene beobachtet. Die HistonGene bei Vögeln und Säugetieren kommen ebenso in Gruppen vor, bilden aber keine tandemartigen Wiederholungsmuster. Die Hauptgruppe der menschlichen Histon-Gene liegt auf dem Chromosom 6 (6p21.3). Es enthält die Gene für die 5 wichtigsten H1-Histone (H1.1 bis H1.5), das H1t-Gen und in der Nachbarschaft Gene für die Kern-Histone. Eine zweite, kleinere Gruppe befindet sich auf dem Chromosom 1 (1q21) und besteht nur aus Genen, die für Kern-Histone codieren (Abb. 7.8). Eine entsprechende Organisation wurde auch für die Maus und die Ratte beschrieben. Wie oben bereits angedeutet, ist es notwendig, dass während der S-Phase Histone für die neu synthetisierte DNA in stöchiometrischer Menge bereitgestellt wird. Nun gibt es aber einige Histone, die besonders in Geweben mit geringer Teilungsrate exprimiert werden, z. B. überwiegend in ausdifferenzierten Leber-, Nierenund Gehirnzellen. Diese Histone können also auch unabhängig von der S-Phase gebildet werden und werden als Ersatz-Histone (engl. replacement) bezeichnet; dazu gehören die H10-, H2A.X-, H2A.Z- und H3.3BHistone. Diese Ersatz-Histone liegen außerhalb der oben erwähnten Gruppen; so befindet sich das menschliche H10-Histon-Gen auf dem Chromosom 22. Alle bekannten S-Phase-abhängigen Histon-Gene besitzen keine Introns und haben vergleichsweise kurze 5’- und 3’-untranslatierte Regionen. Ihr 3’-Ende ist gekennzeichnet durch ein invertiertes Wiederholungselement, das möglicherweise zu einer Haarnadelschlaufe der mRNA führt. Diese Struktur ist an der koordinierten Reifung der Histon-mRNA und der Regulation ihrer Lebenszeit während der S-Phase beteiligt. Diese spezifischen Symmetrieelemente kom-

Tabelle 7.3 Histon-Gene Art

Kopienanzahl (n)

Anordnung der Gene

Saccharomyces cerevisiae

2

gegenläufig

Drosophila melanogaster

100

teilweise gegenläufig in Cluster

Drosophila hydei

120

teilweise gegenläufig in Cluster

Strongylocentrotus purpuratus

500

gleiche Orientierung in Cluster

Notophthalmus viridescens

700

teilweise gegenläufig in Cluster

Xenopus

25

teilweise gegenläufig in Cluster

Huhn

10 + 1

teilweise gegenläufig in Cluster

Mensch

10–25

in Cluster

283

284

Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene 6p21.3-22 H1 H2A H2B H3 H4 H2A H2B H4

22q13.1 H1 H2A H2B H3 H4

H1°

17q21 HILS.1

22 17q25 H3.3B

17

4q24 H2A.Z

11q23,2 H2A.X

1q21 H2A H2B H3 H4 H2A H2B

11

6 4 1q41 H3.3A 1q42 H3t

1

men bei den Ersatz-Histonen nicht vor, die dafür aber verhältnismäßig lange und polyadenylierte 3’-Regionen enthalten. Ein wichtiges Element für die Regulation des funktionellen Zustandes der Histonproteine sind posttranslationale Modifikationen. Besondere Bedeutung haben dabei vor allem Phosphorylierung, Acetylierung und Methylierung, aber auch Ubiquitinierung und ADPRibosylierung sind bekannt. Diese Veränderungen spie-

Abb. 7.8 Schematische Darstellung der Verteilung von Histon-Genen auf die menschlichen Chromosomen. Jeder Punkt repräsentiert ein Histon-Gen. Die einzelnen Klassen sind durch unterschiedliche Farben dargestellt. Rechtecke repräsentieren die Ersatz-Histone. Mit freundlicher Genehmigung von Detlef Doenecke, Göttingen, 2010)

len sich vor allem an den nach außen abstehenden N-terminalen Bereichen der Histone ab (Abb. 6.22 bis 6.24).

Die Struktur der Histon-Gene und die Weiterverarbeitung ihrer prä-mRNAs unterscheiden sich von den meisten anderen eukaryotischen Protein-codierenden Genen. Die meisten Histone besitzen weder Introns noch einen Poly(A)-Schwanz.

7.2 Protein-codierende Gene: II. Multigenfamilien

7.2.3 Tubulin-Gene Tubuline sind als Grundbausteine der Mikrotubuli unverzichtbare Strukturelemente von Zellen. Ihre Aminosäuresequenz ist, zumindest in den funktionell wichtigen Proteinregionen, in verschiedenen Organismengruppen weitgehend unverändert erhalten. Für den Aufbau von Mikrotubuli sind im Wesentlichen zwei Tubulinmoleküle, das α- und das β-Tubulin, erforderlich. Neuerdings wurden weitere Mitglieder der Tubulinfamilie entdeckt, die als γ-, δ-, ε-, ζ-, η- und ι-Tubuline bezeichnet werden; zusätzlich findet man bei Pantoffeltierchen (Paramecium) auch noch θ- und κ-Tubuline. Das Minimalset der Tubuline sind die α-, β- und γ-Tubuline, die in allen eukaryotischen Zellen vorkommen; die übrigen Tubuline haben eine evolutionär beschränkte Verteilung. Das δ-Tubulin-Gen wurde in Chlamydomonas als das Produkt des UNI3-Gens identifiziert. Die Deletion des UNI3-Gens führt zu Zellen mit Defekten in der Zahl der Flagellen. Haben die Zellen üblicherweise zwei Flagellen, so haben die Mutanten keine, eine oder zwei Flagellen. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Mutanten die Triplett-Form der Mikrotubuli nicht bilden können, sondern über weite Strecken nur die Duplett-Form enthalten. Erst am distalen Ende gibt es auch die Triplett-Form. Das deutet darauf hin, dass das δ-Tubulin vor allem für die Stabilität der Flagellen verantwortlich ist. Mikrotubuli erfüllen sehr unterschiedliche Aufgaben in den Zellen. Im Spindelapparat haben sie zentrale

Funktionen bei der Verteilung der Chromosomen in Mitose und Meiose (Kapitel 5.3.1, 5.3.2 und 6.1.3). Als Bestandteile von Flagellen und Cilien sind sie für die Fortbewegung von Zellen entscheidend. Außerdem sind sie am Aufbau des Cytoskeletts wesentlich beteiligt. Gemäß diesen unterschiedlichen Funktionen werden in verschiedenen Zelltypen auch strukturell verschiedene Tubulinarten benötigt; zwei Beispiele sind in Abb. 7.9 dargestellt. Die Beteiligung von Mikrotubuli an einer breiten Palette zellulärer Strukturen wurde schon in frühen zellbiologischen Arbeiten erkannt. Dies führte zur der Multi-Tubulin-Hypothese (Fulton u. Simpson 1976), die die Verschiedenheit der Tubuline berücksichtigte und vorschlug, dass verschiedene Mikrotubuli-Strukturen innerhalb einer Zelle aus verschiedenen Tubulinen aufgebaut sind. Es ist heute offensichtlich, dass die meisten eukaryotischen Organismen mehrere Gene haben, die für die verschiedenen Isoformen der α- und β-Tubuline codieren. So enthalten die Basalkörperchen von Drosophila das β1-Tubulin, während in den Axonemen der Spermien-Flagellen nur das β2-Tubulin genutzt wird. Diese Verschiedenheit wird durch ein kaleidoskopartiges Muster posttranslationaler Modifikationen weiter verstärkt. Neben den üblichen Modifikationen wie Acetylierung, Palmitoylierung, Phosphorylierung und Polyglutamylierung erscheinen Detyrosinierung und Polyglycylierung als Tubulinspezifische Modifikationen. Gene für die α-, β- und γ-Tubuline kommen in jedem eukaryotischen Organismus vor, der bisher untersucht wurde. Die Tubulin-Gene sind hochkonserviert innerhalb einer Spezies, aber auch zwischen den verschiedenen Spezies. In den meisten Metazoen gibt

Abb. 7.9 a, b Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Mikrotubuli. a Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Schnitts durch eine Säugetiercentriole, die den typischen Kranz von 9 Mikrotubuli-Tripletts zeigt. b Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Längsschnitts durch eine Trypanosomen-Zelle, die den Basalkörper einer Flagelle zeigt. Basalkörper an der Basis von Flagellen (und Cilien) sind strukturell den Centriolen ähnlich und zeigen eine 9fache Symmetrie. Ebenso ist in der Nähe des Basalkörpers der Kinetoplast sichtbar, eine Organelle, die das mitochondriale Genom der Trypanosomen enthält und mit dem Basalkörper durch eine Serie von Filamenten verbunden ist. f: Flagelle, bb: Basalkörper, k: Kinetoplast, m: Mitochondrium. (Nach McKean et al. 2001, mit freundlicher Genehmigung der Company of Biologists)

285

286

Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

588

979

782

950

Abb. 7.10 Stammbaum der Tubulin-Gene in verschiedenen Organismen. Die Zahlen an den Verzweigungen geben ihre Häufigkeit an (Bootstrap-Nummern). Die Bootstrap-Nummern sind für die δ-, ζ- und η-Tubulin-Gene nicht eindeutig und daher weggelassen. Das ftsZ-Gen von E. coli wurde als Referenz verwendet. (Nach Dutcher 2003, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

ftgZ- E. coli ι Paramecium κ Paramecium Saccharomyces Trypanosoma Arabidopsis Plasmodium Chlamydomonas Paramecium Giardia Homo Xenopus Drosophila Ciona θ -Paramecium Saccharomyces Trypanosoma Arabidopsis Chlamydomonas Paramecium Plasmodium Giardia Drosophila Homo Xenopus Ciona Saccharomyces Giardia Plasmodium Trypanosoma Paramecium Arabidopsis Chlamydomonas Drosophila Ciona Homo Xenopus Giardia Plasmodium Trypanosoma Ciona Homo Xenopus Chlamydomonas Paramecium Trypanosoma Chlamydomonas Paramecium Ciona Xenopus Chlamydomonas Ciona Homo Xenopus Paramecium Plasmodium Giardia Trypanosoma

ι

α

β

γ

ε

ζ η

δ

7.2 Protein-codierende Gene: II. Multigenfamilien

es mehrere Genkopien; so findet man beispielsweise im menschlichen Genom mindestens 15 α-Tubulin-Gene, 21 β-Tubulin-Gene sowie 3 γ-Tubulin-Gene. Einzellige Organismen haben im Allgemeinen eine oder zwei Kopien der α-, β- oder γ-Tubulin-Gene. Die verschiedenen Tubulin-Gene liegen in vielen Organismen über das Genom verstreut oder in kleinen Gruppen zusammen. Beispielsweise sind in D. melanogaster alle Tubulin-Gene auf Chromosom 3 zu finden, während sie in D. hydei auf die Chromosomen 2 und 3 verteilt sind. Im Gegensatz zu den Histon-Genen besitzen die Tubulin-Gene Introns und die mRNA wird jeweils entsprechend weiter verarbeitet; sie verhalten sich in vielerlei Hinsicht wie Einzelkopiegene. Als Multigenfamilie haben die Tubulin-Gene einen gemeinsamen evolutionären Ursprung. Sie haben sich durch Genduplikation und anschließende Divergenz ihrer Nukleotidsequenzen entwickelt (Abb. 7.10), wie wir es in ähnlicher Weise bereits bei den Globin-Genen beobachten konnten. Im Unterschied zu diesen ist jedoch keine regulative Rückkopplung und stufenweise Aktivierung oder Inaktivierung der Transkription während der Ontogenese zu beobachten.

Die Tubulin-Multigenfamilie unterscheidet sich von

Aufgrund der biochemischen Eigenschaften werden sie in vier saure(re) (A1 bis A4) und drei basische(re) (B1 bis B3) unterteilt; die entsprechenden Gensymbole der Maus sind Cryba1 bis Cryba4 und Crybb1 bis Crybb3. Vier dieser Gene bilden bei Säugern ein Cluster (Cryba4 und Crybb1‒Crybb3); die beiden anderen Gene liegen isoliert auf anderen Chromosomen. Im Gegensatz zu den β-Kristallinen liegen die γ-Kristalline als Monomere vor mit einem Molekulargewicht von ca. 21 kDa. Sechs γ-Kristallin-Gene liegen in einem Cluster (Cryga bis Crygf); beim Menschen sind zwei dieser Cryg-Gene Pseudogene (ψCRYGE und ψCRYGF). Ein weiteres Cryg-Gen (Crygs) liegt isoliert auf einem anderen Chromosom. Mutationen in den Cryb- bzw. Cryg-Genen verursachen bei Mäusen und Menschen eine Vielzahl von dominanten Trübungen der Augenlinse, auch als Katarakt (Cataracta congenita) bzw. „grauer Star“ bezeichnet, die entweder schon bei der Geburt sichtbar sind oder sich im frühen Kindesalter entwickeln (vgl. dazu auch das Kartierungsbeispiel in Tabelle 10.10). Schon die biochemischen Untersuchungen der 1980er- und frühen 1990er-Jahre zeigten, dass die β/γKristalline aus vier Motiven aufgebaut sind, die durch antiparallele β-Faltblattstrukturen gekennzeichnet sind

den anderen bisher besprochenen Multigenfamilien durch die weite Verteilung der Gene auf unterschiedliche Positionen im Genom. Trotz ihrer strukturellen und funktionellen Verschiedenheit haben die einzelnen TubulinGene einen gemeinsamen evolutionären Ursprung. Auch sie sind durch Genduplikationen entstanden.

7.2.4 Kristallin-Gene Kristalline sind bekannt als Strukturproteine der Augenlinse bei Wirbeltieren; sie wurden von C. T. Mörner 1894 in Straßburg aufgrund biochemischer Trennverfahren zunächst in α-, β- und γ-Kristalline unterteilt; die Bezeichnung „Kristalline“ weist auf ihre Funktion bei der Aufrechterhaltung der Transparenz der Linse hin. Die Kristalline sind sehr langlebige Proteine, da die Linsenzellen nicht absterben, sondern so alt werden wie der Gesamtorganismus. Auch wenn Kristalline zunächst nur in der Augenlinse gefunden wurden, so erlauben sensitive Verfahren heute ihren Nachweis auch in einigen anderen Geweben. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeiten der Proteine bilden die β- und γ-Kristalline eine eigene Familie. Die β-Kristalline bilden Oligomere; die Komplexe haben Molekulargewichte von ca. 200 kDa (die Monomere haben ein Molekulargewicht zwischen 23 und 33 kDa). Wir kennen heute bei Säugern sieben β-Kristalline, die durch sechs Gene codiert werden.

Abb. 7.11 a–d Die Strukturen der β/γ-Kristalline. a Das βB2Kristallin, der Prototyp der β-Kristallin-Dimere. Die beiden Monomeren sind grün bzw. blau dargestellt; das Verbindungsstück (engl. linker) der beiden Domänen ist rot. b Das γB-Kristallin, der Prototyp der monomeren γ-Kristalline. c Eine „KristallinDomäne“, bestehend aus zwei griechischen Schlüssel-Motiven. d Ein griechisches Schlüssel-Motiv. (Nach D’Alessio 2002, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

287

288

Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

(Abb. 7.11a); aufgrund der Ähnlichkeit mit den künstlerischen Verzierungen auf Gefäßen aus dem antiken Griechenland werden diese Motive auch als „griechische Schlüssel“ bezeichnet (engl. Greek key motif). Die Anordnung dieser Motive in den entsprechenden Genen gibt uns interessante Hinweise auf die Evolution dieser Genfamilie: Jedes Gen enthält nämlich die Information für vier dieser Motive ‒ bei den Cryb-Genen sind sie jeweils in einem eigenen Exon codiert, wohingegen die Cryg-Gene jeweils zwei Motive in einem Exon zusammengefasst haben. Dabei ist die Sequenz-

ähnlichkeit zwischen dem 1. und 3. Motiv größer als zu dem 2. und 4. Motiv. Diese Befunde führten zu der Hypothese, dass der evolutionäre Weg der Cryb/CrygGenfamilie mit einem einzigen Motiv startete. Nach einer Duplikation dieses Motivs erfolgte eine Fusion, die durch eine zweite Duplikationsrunde ergänzt wurde (Abb. 7.12). Und in der Tat gibt es diese Proteine, die nur eine Domäne (d. h. 2 Motive) enthalten, nämlich das Spherulin 3a des Schleimpilzes, ein Metalloproteinase-Inhibitor (SMPI) von Streptomyces oder ein „Killer-Toxin“ in Hefe. Zwei-Domänen-Proteine sind das

Abb. 7.12 Zusammenfassung der wichtigsten Schritte in der Evolution der β/γ-Kristallin-Genfamilie. M bezeichnet einen vermuteten monomeren Vorläufer, der für ein einziges griechisches Schlüssel-Motiv codiert. M’ und M’’ deuten Duplikationen und Unterschiede an, die Zahlen 1–4 bezeichnen die einzelnen Motiv-Typen. Die Balken, die die eingerahmten M-Motive verbinden, deuten Introns an (dicker Balken: Intron zwischen

Domänen; dünner Balken: Intron zwischen Motiven); eine fehlende Abgrenzung zwischen den Motiven bedeutet, dass die An- oder Abwesenheit eines Introns noch nicht bestimmt wurde. F: Vorläufer von Spherulin 3a; S: Vorläufer von Protein S; C: Vorläufer des G. cydonium-Proteins; G: Vorläufer der Cryg-Gene; B: Vorläufer der Cryb-Gene. (Nach D‘Alessio 2002, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

7.3 Regulation eukaryotischer Genexpression

Protein S von Myxcococcus xanthus und das EpidermisDifferenzierungsprotein des Amphibiums Cynops pyrrhogaster (Abb. 7.11b).

Die

Cryb- und Cryg-Gene codieren für die β/γKristalline; diese hochkonservierten Proteine sind wichtige Strukturproteine der Augenlinse von Säugern und zeichnen sich durch vier antiparallele β-Faltblattstrukturen aus (griechische Schlüssel-Motive). Sie sind aus einem Vorläufergen mit einem Motiv durch wiederholte Duplikationen entstanden.

Wenn man einfach die Cryb- und Cryg-Gene vergleicht, ergibt sich die interessante evolutionäre Frage nach dem Verlust der Introns zwischen den einzelnen Motiven. Dazu berichtete die Gruppe von Graeme Wistow, dass sie in den Datenbanken des MausGenoms das fehlende Zwischenglied (engl. missing link) gefunden haben: halb Cryb, halb Cryg; die Motive 1 und 2 liegen gemeinsam in einem Exon, wohingegen die Motive 3 und 4 jeweils von einem eigenen Exon codiert werden. Das neue Gen wird als CrygN bezeichnet (Wistow et al. 2005).

7.3 Regulation eukaryotischer Genexpression Wir haben in den vorangehenden Abschnitten einiges über die Anordnung eukaryotischer Gene in Chromsomen gelernt. Wir haben gesehen, dass Gene entweder isoliert in ihrem genomischen Kontext vorliegen können oder als Genfamilien in Clustern – jedes Mal haben wir aber die Frage nach der Regulation ihrer „richtigen“ Expression ausgelassen. Dabei bedeutet „richtig“: Zu den richtigen Zeiten an den richtigen Orten – denn oft wird ein Gen und sein Produkt nicht nur einmal, sondern zu verschiedenen Zeiten und in verschiedenen Organen bzw. Geweben benötigt. Dabei müssen wir auch noch beachten, dass das eukaryotische Genom nicht nur ein paar wenige, sondern ~30.000 Gene enthält, die in einem fein abgestimmten Netzwerk wirksam werden sollen. Man kann schon allein aufgrund dieser Vorstellung erahnen, dass verschiedene Ebenen der Transkriptionskontrolle notwendig sind. Nachdem im Kapitel 3.3.3 die Grundprinzipien der Transkription dargelegt wurden, wollen wir im folgenden Abschnitt betrachten, welche strukturellen Elemente an der Regulation von Genen in Eukaryoten beteiligt sind. Wir konzentrieren uns dabei auf diejenigen Gene, die für Proteine codieren und durch die RNA-Polymerase II transkribiert werden.

7.3.1 Der Promotor Der Bereich, der dafür verantwortlich ist, dass die Transkription eines Gens durch die RNA-Polymerase-II-Maschinerie initiiert wird, wird als Promotor bezeichnet (siehe dazu auch Kapitel 3.3.3). Wir können dabei den Kernbereich des Promotors und den proximalen Promotor unterscheiden. Der Kern-Promotor (engl. core promoter) ist der kleinste notwendige Abschnitt, um die Transkriptionsmaschinerie zu starten. Typischerweise umfasst der Kern-Promotor den Transkriptionsstartpunkt sowie etwa 35 Nukleotide (nt) oberhalb und unterhalb (es ist dabei üblich, den Transkriptionsstartpunkt mit „+1“ zu bezeichnen; die Nukleotide oberhalb werden mit einem „−“ versehen). Innerhalb dieses Kernbereichs können wir oft verschiedene Sequenzmotive erkennen: die TATA-Box, den Initiatior (Inr), das Erkennungselement für den Transkriptionsfaktor TFIIB (engl. transcription factor IIB recognition element, BRE) und Elemente unterhalb des Promotors (engl. downstream promoter element, DPE). Abb. 7.13 gibt dazu einen Überblick. Unter den Elementen des Kern-Promotors ist die TATA-Box am längsten bekannt (Breathnach u. Chambon 1981). Ihren Namen verdankt sie der Consensussequenz TATAAA; allerdings gibt es eine Reihe von Sequenzvariationen. In Metazoen ist die TATA-Box üblicherweise 25 bis 30 Nukleotide oberhalb des Transkriptionsstartpunktes lokalisiert. In Hefen variiert ihre Lage stärker; hier ist sie im Bereich von −40 bis −100 nt zu finden. Systematische Untersuchungen an Promotoren menschlicher Gene oder von Genen bei Drosophila zeigen, dass nur etwa 32 % bzw. 43 % der jeweils untersuchten Promotoren eine TATA-Box enthalten. Überwiegend bindet an die TATA-Box das „TATA-BoxBindungsprotein“ (TBP). Allerdings muss man beachten, dass es auch verwandte (engl. related) Faktoren (TBPr) gibt, die diese Bindungsstelle ebenfalls benutzen können. Es wird allgemein angenommen, dass das TBP über seine Wechselwirkungen mit der RNA-Polymerase II diese an die richtige Startposition dirigiert. TBP ist ein universeller Transkriptionsfaktor, der von allen drei eukaryotischen RNA-Polymerasen benötigt wird. Kristallographische Studien haben gezeigt, dass TBP sattelartig auf der TATA-Box sitzt und die DNA in einem Winkel von 80° in Richtung auf die große Furche biegt. So entsteht eine Konformation der DNA, die eine Bindung von TFIIB zu beiden Seiten der TATABox gestattet. Bei genauer Analyse verschiedener Promotoren fällt auf, dass Gene mehrere TATA-Boxen besitzen können. Dabei gehorcht die eine der kanonischen Consensussequenz (TATAAA), die andere weicht davon ab. So wird beispielsweise der Promotor des

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

Abb. 7.13 Elemente des Promotor-Kernbereichs. In der Abbildung sind einige Elemente dargestellt, die an der Transkription durch RNA-Polymerase II beteiligt sind. Jedes dieser Elemente wird nur in bestimmten Promotoren gefunden, sodass jeder Promotor in spezifischer Weise nur einige, alle oder auch keines dieser Motive enthalten kann. Das BRE (engl. transcription factor IIB recognition element; upstream [BREu] bzw. downstream [BREd]) ist eine 5’- bzw. 3’-Verlängerung einiger TATA-Boxen. Das DPE (engl. downstream core promoter element) benötigt ein Initiator-Element (Inr) und befindet sich genau an der Position

+28 bis +32 (gerechnet in Bezug auf den Transkriptionsstart, der als +1 gezählt wird). Das MTE (engl. motif ten element) wirkt in Kooperation mit Inr und benötigt einen definierten Abstand dazu. DCEs (engl. downstream core elements) kommen mehrfach vor (hier sind 3 angedeutet: I–III); sie sind für die basale Aktivität des Promotors wichtig. Das XCPE1 (engl. X core oromoter element 1) kommt in etwa 1 % der menschlichen Promotoren vor – die meisten davon besitzen keine TATA-Box. (Nach Juven-Gershon et al. 2008, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Hitzeschock-Proteins Hsp70 über die kanonische Bindestelle TATAAA aktiviert; diese Form wird durch einen Hitzeschock und den Transkriptionsfaktor E1A stimuliert. Wird nun diese kanonische TATA-Box durch die TATA-Box des SV40-Virus ersetzt, so geht die Stimulierung durch E1A verloren, aber die Aktivierungsmöglichkeit über den Hitzeschock bleibt erhalten. Der Initiator beinhaltet den Transkriptionsstartpunkt und wurde in vielen Eukaryoten identifiziert; Abb. 7.13 zeigt, dass allerdings seine Consensussequenz in verschiedenen Gattungen unterschiedlich sein kann. Der Transkriptionsstart erfolgt üblicherweise an dem Adenin-Rest innerhalb dieser Consensussequenz; dieses Nukleotid wird mit +1 gezählt (A+1). Der uns schon bekannte Faktor TFIIB bindet auch an den Initiator, die Spezifität wird über seine Untereinheiten TAFII150 bzw. TAFII250 vermittelt (engl. TBPassociated factor, TAF). Allerdings kann gereinigte RNA-Polymerase auch bei Abwesenheit eines Initiatorsignals und von TAFs die Initiation starten. Weitere spezifische Interaktionspartner mit dem Initiator sind TFII-I (ein basisches Helix-Loop-Helix-Protein) und YY1 (ein Zinkfinger-Protein). Das DPE-Element wurde zunächst in Drosophila identifiziert, da es den Transkriptionsfaktor TFIID (und außerdem TAFII40 und TAFII60) bindet; später wurde es auch in Menschen und anderen Spezies charakterisiert. Das DPE-Element kommt häufig in Promotoren vor, die über keine TATA-Box verfügen. Das DPE ist 28 bis 32 Nukleotide unterhalb des Tran-

skriptionsstarts lokalisiert. Diese Positionsgenauigkeit ist für die Funktion essenziell, da TFIID nicht nur an das DPE-Element, sondern zugleich auch an den Initiator bindet. Auch wenn die Consensussequenz etwas degeneriert erscheint, führen Mutationen an entscheidenden Stellen zu einer Verminderung der Transkriptionsaktivität um das 10- bis 50fache. Ausnahmen von dieser strengen Positionsregel gibt es im β-Globin-Promotor, dessen DPE (hier als DCE bezeichnet; engl. downstream core element) im Bereich von +10 bis +45 lokalisiert ist. Die Funktionen der TATA-Box und des DPE-Elementes erscheinen nach dem bisherigen Kenntnisstand antagonistisch: Durch biochemische Methoden wurde ein Protein charakterisiert (NC2/DR1-Drap1), das die TATA-abhängige Transkription hemmt. Mutationen, die zu Veränderungen dieses Proteins führen, beeinflussen diese Repressorwirkung deutlich. Allerdings wird die stimulierende Wirkung auf das DPE-Element dadurch nicht aufgehoben. Das BRE-Element liegt in der Regel unmittelbar oberhalb der TATA-Box; auf sein 3’-C folgt unmittelbar das 5’-T der TATA-Box. Das BRE-Element dient der spezifischen Bindung von TFIIB. Allerdings erscheinen die bisherigen funktionellen Untersuchungen etwas widersprüchlich, da die Daten, die an unterschiedlichen Systemen generiert wurden, sowohl eine positive als auch eine negative Wirkung auf die Aktivität des Kern-Promotors zeigen. Der proximale Promotor befindet sich direkt oberhalb des Kernbereichs und umfasst etwa die Region

7.3 Regulation eukaryotischer Genexpression

von −50 bis −200 in Bezug auf den Transkriptionsstartpunkt. In diesem Abschnitt sind typischerweise viele Erkennungsstellen für eine Gruppe sequenzspezifischer DNA-bindender Transkriptionsfaktoren. Dazu gehören SP1, CTF (CCAAT-bindender Transkriptionsfaktor, der auch als nuclear factor I [NF1] bezeichnet wird) oder CBF (CCAAT-Box-bindender Transkriptionsfaktor, der auch als nuclear factor Y [NF-Y] bezeichnet wird). Der proximale Promotor enthält oft als charakteristisches Element die CAAT-Box, die etwa 80 Nukleotide oberhalb des Initiationscodons liegt. Oft ist außerdem eine GC-reiche Region (GC-Box, Consensussequenz: GGGCGG) etwa 60 bis 100 Nukleotide vor dem Initiationscodon zu finden. Im Gegensatz dazu sind CpG-Inseln lange GC-reiche DNAAbschnitte (500 bp bis 2 kb), die Wiederholungen von CG-Dinukleotiden enthalten. Die CpG-Inseln vor aktiven Genen sind in der Regel nicht methyliert; ihre Methylierung führt zur Abschaltung der entsprechenden nachfolgenden Gene. Promotoren, die CpGInseln enthalten, besitzen typischerweise keine TATABox oder DPE-Elemente, aber dafür eine Vielzahl von GC-Box-Motiven, an die SP1-Transkriptionsfaktoren binden. Im Unterschied zur TATA-Box-gesteuerten Transkription startet die über CpG-Inseln gesteuerte Transkription an mehreren schwachen Startstellen, die oft über 100 bp verteilt sind. In diesem Fall erfolgt die Steuerung über die Kombination von SP1 mit Initiator-Elementen. Es ist allerdings nicht notwendig, dass ein Promotor alle diese Elemente zugleich enthält; es ist insbesondere ein weitverbreitetes Missverständnis, dass alle Promotoren eine TATA-Box enthalten müssen. Die verschiedenen genannten Elemente treten in unterschiedlichen Kombinationen oder in Kombination mit weiteren Sequenzelementen oberhalb auf. Es handelt sich also um eine modulare Organisation der Regulationsregion, die erhebliche Freiheiten in der Art ihres Aufbaus besitzt. Interessanterweise ist die Orientierung der CAAT-Box und der GC-Box nicht festgelegt, wohl aber die der TATA-Box. Durch die TATA-Box wird aber die Richtung der Transkription festgelegt, sodass ihre Orientierung entscheidend für die Transkription ist. Die Aktivitäten des Kern-Promotors werden durch zahlreiche weitere Elemente ergänzt, darunter Enhancer, Silencer oder Insulatoren.

Die Transkription Protein-codierender Gene erfolgt

durch die RNA-Polymerase II und wird durch eine Vielzahl von Elementen im Promotorbereich reguliert. Im KernPromotor (−35/+35) gibt es oft eine TATA-Box, einen Initiator, BRE- und DPE-Elemente. Der proximale Promotor (−50 bis −200) kann die CAAT-Box und GC-Boxen enthalten.

7.3.2 Transkriptionsfaktoren Die Bindung der basalen Transkriptionsfaktoren und der RNA-Polymerase II an die DNA erfolgt in einer genau festgelegten Reihenfolge (Abb. 3.7). Eine der Aufgaben der Transkriptionsfaktoren dürfte es sein, für eine genaue Positionierung der RNA-Polymerase in Bezug auf das Initiationscodon zu sorgen, um dadurch einen auf das Nukleotid genauen Beginn der RNA-Synthese zu garantieren. Fehlerhafte Initiation würde ja zu Leserasterverschiebungen oder zum Verlust von bzw. zur Anfügung zusätzlicher Aminosäuren führen. Der gesamte Initiationskomplex bedeckt etwa 110 Nukleotide und erstreckt sich ungefähr über den Nukleotidbereich −80 bis +30, wobei Nukleotid +1 definitionsgemäß das erste Nukleotid des Initiationscodons ist.

Protein-codierende Gene werden von der RNA-Polymerase II transkribiert. Sie bedarf zur Bindung an die DNA zusätzlicher Transkriptionsfaktoren. Die Transkriptionsfaktoren vermitteln die sequenzgenaue Bindung an den Promotor, der meist aus einer TATA-Box etwa 25 Nukleotide vor dem Startcodon besteht. Es sind jedoch weitere upstream-Sequenzelemente wie die CAAT-Box oder die GC-Box erforderlich, um die richtige Initiation der RNASynthese zu ermöglichen.

Die RNA-Polymerase selbst hat verschiedene komplexe Funktionen zu erfüllen, die in unterschiedlichen Molekülbereichen des Enzyms ablaufen. Zunächst einmal muss sie für eine Öffnung der DNA-Doppelhelix sorgen und den nicht transkribierten DNA-Strang festhalten. Mithilfe des transkribierten Strangs muss sie nach der Initiation der RNA-Synthese neue Nukleotide an das 3’-Ende des wachsenden RNA-Moleküls durch die Bildung neuer Phosphodiesterbindungen anfügen. Die bei der Transkription entstehende DNA-RNAHybridregion ist nur kurz und umfasst nicht mehr als 12 bis 14 Nukleotide. Schließlich müssen neu synthetisierte RNA-Bereiche von der DNA abgelöst werden, und die DNA muss wieder zur Doppelhelix zusammengefügt werden.

Die RNA-Polymerase II besitzt verschiedene funktionelle Domänen, die bei der Initiation unterschiedliche Aufgaben wie die Öffnung der Doppelhelix, Entfernung des nicht transkribierten Strangs, Anfügen von Nukleotiden u. a. übernehmen.

Die bisher dargestellte Folge von Ereignissen gilt für alle RNA-Polymerase-II-transkribierten eukaryotischen Gene. Es stellt sich natürlich die Frage, wie es

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

nun zu einer differenziellen Regulation unterschiedlicher Gene kommt. Der Schlüssel zur differenziellen Genregulation in Eukaryoten liegt im Vorhandensein zusätzlicher Transkriptionsfaktoren, die imstande sind, die Spezifität der Genaktivierung zu steuern. An dieser Stelle wollen wir uns ein besonders gut untersuchtes Beispiel näher betrachten, das der Regulation von Genen durch Steroidhormone (Abb. 7.14). Das Prinzip des molekularen Mechanismus der Regulation der RNA-Synthese durch Steroidhormone kann folgendermaßen zusammengefasst werden. Die Hormone werden nach Passieren der Zellmembran durch intrazelluläre Rezeptormoleküle gebunden, die hierdurch einer Konformationsänderung unterliegen und sofort in den Zellkern transportiert werden. Der Steroidhormonkomplex ist ein Oligomer, das sequenzspezifisch an ein DNA-Element bindet, das z. B. im Falle des am besten bekannten Hormonbindungsmechanismus, dem des Glucocorticoidrezeptors, als Glucocorticoid-Response-Element (GRE) bezeichnet wird. Solche GREs findet man im Regulationsbereich aller Gene, die durch Glucocorticoide reguliert werden. Nach Bindung des Steroidhormonkomplexes an diese GREs erfolgt die Initiation der Transkription im Promotor. Vergleichbare DNASequenzelemente, die man allgemein auch als Enhan-

cer-Elemente bezeichnet, hat man auch für andere Steroidhormone, z. B. für Östrogen und Ecdyson, identifizieren können, aber auch für andere Regulationsproteine. Man kann deshalb davon ausgehen, dass diese Art der Regulation der Transkription einen sehr fundamentalen eukaryotischen Genregulationsmechanismus darstellt.

Steroidhormone sind Regulatoren der Transkription durch sequenzspezifische Bindung an die DNA mithilfe von spezifischen Rezeptorproteinen.

Transkriptionsfaktoren gehören zu verschiedenen Gruppen von Proteinen, die jeweils durch ähnliche Strukturbereiche gekennzeichnet sind. Insbesondere gehören hierzu die Helix-Turn-Helix-Proteine, die Zinkfinger-Proteine, die Homöodomänen-Proteine, die Leucin-Zipper-Proteine sowie die Helix-Loop-HelixProteine. Einige dieser Proteine kommen immer als Dimere vor (Hetero- oder Homodimere; Abb. 7.15). ï Das Helix-Turn-Helix-Motiv besteht aus etwa 20 Aminosäuren, die jeweils 7–9 Aminosäuren lang und durch eine β-Schleife getrennt sind; die zweite Helix liegt als DNA-Erkennungshelix im Bereich der großen Furche der DNA (engl. major groove; Beispiel: Baf).

Abb. 7.14 Genregulation durch Glucocorticoidrezeptoren. Im oberen Teil der Abbildung ist schematisch die Regulationsregion eines Gens mit Promotorregion (mit der TATA-Box und einem weiteren Regulationselement, beide grün) und einem weiter upstream gelegenen Enhancerelement dargestellt. Es handelt sich um eine vereinfachte Darstellung der Glucocorticoidbindungsregion, die die Bindungsstelle für den Glucocorticoidrezeptor (GR) (dunkelblau) und eine Bindungsstelle für den nuclear factor 1 (NF1) (hellblau) enthält. Die Verpackung im Chromatin ist darunter (Mitte) mit den Nukleotidpositionen relativ zum Transkriptionsstart (+1; Pfeil) dargestellt. Zur Initiation der Transkription ist die Entfernung eines Nukleosoms und eine genaue Positionierung des zweiten Nukleosoms erforderlich. Hierdurch werden die erforderlichen Interaktionen zwischen Enhancer und Promotor mit den Transkriptionsfaktoren (rotes Dreieck: Komplex aus mehreren Regulationsproteinen) ermöglicht (unten). Die Pfeile geben jeweils den Startpunkt und die Richtung der Transkription an. (Nach Wolffe 1994, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

7.3 Regulation eukaryotischer Genexpression

ï Zinkfinger bestehen aus etwa 30 Aminosäuren, von denen 4 (4 Cys- oder 2 His- und 2 Cys-Reste) koordinativ ein einzelnes Zn2+-Ion binden und damit diese Struktur stabilisieren; viele Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren verfügen über mehrere dieser Motive (Beispiele: TFIIIa, Glucocorticoid-Rezeptoren). ï Die Homöodomäne umfasst einen Bereich von 60 Aminosäuren und ist sehr stark konserviert (siehe auch Kapitel 11.4.5; zur Nomenklatur: die DNASequenz, die diese Domäne codiert, bezeichnet man als Homöobox). Der DNA-bindende Teil der Domäne ähnelt dabei dem Helix-Turn-Helix-Motiv (Beispiele: Antp, Ubx). ï Die Leucin-Zipper-Proteine formen eine amphipathische α-Helix, bei der jede 7. Aminosäure ein Leucin ist. Diese Aminosäuren bilden auf der hydrophoben Oberfläche eine gerade Reihe. Die α-Helices der interagierenden Proteine winden sich umeinander und bilden eine Superhelix; dabei kommen die Leucin-Reste der beiden Proteine nebeneinander zu liegen. Diese Proteine enthalten außerdem in ihrer DNA-Binderegion noch einen hohen Anteil basischer Aminosäuren (Arg oder Lys); daher werden sie oft auch als „basische Zipper“ (bZIP) bezeichnet (Beispiele: ATF-2, c-jun, Creb). ï Die Helix-Loop-Helix-Proteine enthalten eine konservierte Region aus etwa 50 Aminosäuren, die für die Bildung des Proteindimers wichtig ist. Diese Region besteht aus zwei kurzen α-Helices, die durch einen Abschnitt ohne Sekundärstruktur („loop“) getrennt sind; bei Dimeren können sich diese α-Helices der beiden Untereinheiten wie beim Leucin-Zipper ineinander zu einer Superhelix verdrillen. Auch die Helix-Loop-Helix-Proteine enthalten in ihrer DNA-Binderegion noch einen hohen Anteil basischer Aminosäuren (Arg oder Lys); daher werden sie oft auch als „bHLH-ZIP“-Proteine bezeichnet (Beispiele: Myc und Max als Heterodimere). Das Prinzip der spezifischen Genregulation mithilfe von stadien- oder zelltypspezifischen Transkriptionsfaktoren, die sequenzspezifisch an bestimmte DNAElemente binden, gibt uns einen ersten Einblick, auf welche Weise komplexe eukaryotische Zellen bestimmte Differenzierungswege einschlagen können. Dieses Prinzip eröffnet zugleich die Möglichkeit der gemeinsamen Regulation unterschiedlicher Gene, die zu einem bestimmten Differenzierungszustand einer Zelle führen. Eine interessante Theorie diskutieren Kærn et al. (2005), indem sie stochastische Prozesse in die Regulation der Genexpression einführen.

Sie erklären damit Variabilität und Heterogenität innerhalb von Populationen genetisch identischer Zellen. Im Zentrum ihrer Überlegungen steht dabei die Beobachtung, dass Fluktuationen in der Konzentration regulatorischer Signale („Rauschen“) signifikante Auswirkungen auf die Genexpression haben und durch positive oder negative Rückkopplungsmechanismen weiter verstärkt werden können. Wenn man annimmt, dass von einem Transkriptionsfaktor 1000 Moleküle im Cytoplasma, aber nur 10 Moleküle im Zellkern sind, so ist der Wechsel von einem Molekül vom Cytoplasma in den Zellkern für die Konzentration im Cytoplasma unerheblich, verändert aber die Konzentration im Zellkern um 10 % und hat damit sicherlich einen signifikanten Effekt auf die Transkription des betreffenden Zielgens. Derartige stochastische Prozesse haben möglicherweise entscheidenden Einfluss auf Vorgänge während der Embryonalentwicklung und Differenzierung, z. B. bei der Flügelentwicklung in Drosophila in Abhängigkeit der Expression der beiden Proteine Delta und Notch (Kapitel 11.4.6).

7.3.3 Enhancer „Enhancer“ (engl. für Verstärker) der Transkription bei höheren Eukaryoten sind definiert als DNA-Elemente, die die Transkription verstärken, auch wenn sie sich in großer Entfernung zum Promotor befinden. Ihre Wirkung ist dabei unabhängig von ihrer Orientierung. (Der Begriff hat sich inzwischen auch im deutschen Sprachraum durchgesetzt und wird daher nicht mehr übersetzt). Das eukaryotische Genom illustriert am besten die verschiedenen Positionen, von denen aus Enhancer die Transkription aktivieren: So befindet sich z. B. der Enhancer des Drosophila-Gens cut, der im Flügelrand aktiv ist, 85 kb oberhalb des cut-Promotors. Dagegen befindet sich der Enhancer des δ-KristallinGens des Huhns (das für ein Strukturprotein der Augenlinse codiert) im 3. Intron der Transkriptionseinheit. Der Enhancer des Gens, das für die α-Kette des T-Zell-Rezeptors codiert, liegt dagegen 69 kb unterhalb des Promotors. Um als Verstärker zu wirken, sind die Wechselwirkungen zwischen dem Enhancer und seinem zugehörigen Promotor essenziell. Dabei ist es nicht nur wichtig, dass der Enhancer über eine lange Entfernung „seinen“ Promotor erkennt, sondern auch, dass er nur einen von oftmals vielen Promotoren in seiner unmittelbaren Nachbarschaft aktiviert. Es gibt dabei zwei Mechanismen, wie diese Enhancer-Promotor-Spezifität erreicht wird: Erstens gibt es spezifische Wechselwirkungen zwischen Enhancer-bindenden Proteinen und Faktoren, die mit dem Promotor in Wechselwirkung stehen. Zweitens können auch Insulator-Elemente dazu benutzt

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

7.3 Regulation eukaryotischer Genexpression

Abb. 7.15 a–d Modelle von DNA-bindenden Proteinen. a HelixTurn-Helix. Die beiden α-Helices der DNA-bindenden Domäne des Helix-Turn-Helix-Motivs (hier ein Inhibitor der Autointegration viraler DNA, engl. barrier-to-autointegration factor, BAF) sind rot dargestellt; potenzielle Seitenketten, die mit der DNA interagieren, sind blau. Der N-Terminus der Helix 5 (H5) liegt in der großen Furche der DNA, von der hier die molekulare Oberfläche gezeigt ist. Die Helices H1–3 (grün) sind nicht an der DNA-Wechselwirkung beteiligt. b Zinkfinger. Das Zn2+-Ion ist koordinativ an zwei His- (blau) und zwei Cys-Reste (gelb) gebunden. Die schwarzen Kreise symbolisieren Aminosäuren, die strukturell nicht wichtig sind, aber an der sequenzspezifischen DNA-Bindung beteiligt sind. Die beiden rosa Kreise deuten zwei strukturell wichtige große hydrophobe Aminosäuren an. Eine Verbindungssequenz, deren Consensus in Grün und im Ein-Buchstaben-Code angegeben ist, verbindet häufig benachbarte Zink-Finger-Motive (unten). c Homeo-Box. Es ist ein (unvollständiges) Heterodimer zweier Proteine mit Homeodomänen gezeigt (hier: HOXA9 [Homeobox-

Protein A9] und PBX1 [Prä-B-Zell-Leukämie Homeobox 1]); die Farbe der Homeodomäne wechselt von blau am N-Terminus zu rosa am C-Terminus. Die interagierenden Homeodomänen sind rosa, und die Kontaktbereiche sind mit einem roten Oval gekennzeichnet. d Leucin-Zipper. Die α-Helices des LeucinReißverschlusses (engl. zipper; rot; hier Ausschnitt des CRE-bindenden Proteins, CREB [CRE: cAMP-responsive element]) gehören zu zwei Proteinen, die ein Homodimer bilden, indem sie sich als Spirale umeinander winden. Die Leucin-Reste, die mit der DNA in Wechselwirkung treten, sind gelb wiedergegeben. Ein Mg2+Ion (grün) mit umgebenden Wassermolekülen (rot) befindet sich in dem Hohlraum zwischen der DNA und der basischen Region des CREB-Proteins. (a nach Cai et al. 1998, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group; b nach Knight u. Shimeld 2001, mit freundlicher Genehmigung des Autors; c nach Kuriyan u. Eisenberg 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group; d nach Mayr u. Montminy 2001, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

werden, unerwünschte Enhancer-Promotor-Wechselwirkungen zu unterbinden. Beide Mechanismen werden offensichtlich in der Natur benutzt.

Promotor bringen (Abb. 7.16). Dann können kovalente Modifikationen der beteiligten Proteine die erhöhte Transkriptionsrate stabilisieren. Wichtig ist in diesem Zusammenhang, dass der C-terminale Bereich der RNA-Polymerase II in frühen Stadien der Transkription stark phosphoryliert ist. Ebenso scheint die Acetylierung von Histonen die repressive Eigenschaft des Chromatins zu vermindern; allerdings können auch andere Transkriptionsfaktoren (z. B. p53) oder basale Transkriptionsfaktoren (TFIIE und TFIIF) acetyliert und dadurch aktiviert werden. Tatsächlich besitzen viele transkriptionelle Aktivatoren und CoAktivatoren eine Histonacetylase-Aktivität, wohingegen Repressoren der Transkription über DeacetylaseAktivitäten verfügen. Zum dritten spielen Wirkungen auf die Chromatin- und Nukleosomenstruktur offensichtlich eine große Rolle. Enhancer können anscheinend zumindest teilweise der Repression der Transkription durch Chromatin entgegenwirken. Die Erhöhung der Nukleosomenmobilität und die Veränderung der superhelikalen Verdrillung sind mögliche Aspekte dieser Wirkung. Neben diesem weitgehend akzeptierten Schlaufenmodell der Enhancerwirkung gibt es aber auch Hinweise aus Untersuchungen an einzelnen, isolierten Zellen, die zeigen, dass es daneben auch einen binären Mechanismus gibt. Dabei erhöht der Enhancer nicht die Transkriptionsrate direkt, sondern vielmehr die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Gen transkribiert wird und diese Eigenschaft erhalten bleibt. Damit bekommt der Effekt des Enhancers auf die Chromatinstruktur, der oben schon diskutiert wurde, eine zentrale Bedeutung. Dies ist besonders dann von Interesse, wenn die Aktivierung oder Inaktivierung von Genen dazu führt, dass bestimmte Zelltypen ent-

Das autoregulatorische Element 1 (AE1) in Drosophila ist ein gutes Beispiel für die bevorzugte Wechselwirkung zwischen einem Enhancer und dem Kernbereich eines Promotors. In seinem natürlichen Kontext hat dieser Enhancer einen gleichen Abstand zu den Genen Sex combs reduced (Scr) und fushi tarazu (ftz), er aktiviert aber selektiv die ftz-Expression. Die Scr- und ftz-Gene unterscheiden sich in ihren Promotor-Elementen: der ftz-Promotor enthält eine TATA-Box, wohingegen der ScrPromotor zwar über keine TATA-Box verfügt, aber dafür Initiator und DPE-Sequenzen enthält. In synthetischen Testkonstruktionen kann zwar der AE1Enhancer die Transkription von Promotoren ohne eine TATA-Box aktivieren; wenn aber gleichzeitig ein Promotor mit einer TATA-Box angeboten wird, aktiviert er bevorzugt den Promotor mit der TATA-Box. Die einzelnen Komponenten eines Promotors sind also für die produktive und spezifische Wechselwirkung zwischen dem Enhancer und dem korrespondierenden Promotor wichtig. Die vorhandenen Daten machen allerdings deutlich, dass eine Vielzahl verschiedener Faktoren zur verstärkenden Wirkung von Enhancern beitragen. Zunächst treten sequenzspezifische DNA-Bindungsproteine in direkten Kontakt mit entsprechenden Sequenzen des Enhancers. Diese Wechselwirkungen führen schließlich (möglicherweise über einen Scanning- bzw. facilitate tracking-Mechanismus) zu großen Schleifen, die den Enhancer in räumliche Nähe zum zugehörigen

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

Abb. 7.16 Vier Modelle zur Erklärung der Wirkung eines entfernt liegenden Enhancers: Schlaufenbildung, Wanderung (oder Abtasten), erleichterte Wanderung und Verknüpfung wurden vorgeschlagen, um die Wirkung eines entfernten Enhancers auf sein Zielgen zu erklären. Jedes Modell impliziert, dass der Aktivierungskomplex, der durch den Enhancer gebildet wird, mit dem Promotor zusammentrifft. Eine Ausnahme bildet das Modell der Verknüpfung: Hier sollen die verknüpfenden Proteine die Kommunikation zwischen dem Enhancer und dem Zielgen vermitteln. Im „Verknüpfungsmodell“ lenkt die sequenzielle Bindung von Transkriptionsfaktoren entlang der DNA Veränderungen der Chromatinkonformation und definiert so die Transkriptionsdomäne. Transkriptionsfaktoren werden vom Enhancer bis zum Promotor des entsprechenden Gens durch Proteine aneinander gebunden, die keine DNA binden und das Chromatin modifizieren. Im „Schlaufenmo-

dell“ binden die Transkriptionsfaktoren an den Enhancer und den Promotor des jeweiligen Gens; die dazwischenliegende DNA bildet eine Schlaufe. So wird direkt ein aktiver Transkriptionskomplex am Promotor gebildet. Im „Wanderungsmodell“ binden Transkriptionsfaktoren spezifisch an die Sequenz des Enhancers. Der gebildete Komplex wandert die DNA-Sequenz entlang, bis er andere Transkriptionsfaktoren erkennt, die an den jeweiligen Promotor bereits gebunden haben. Auf diese Weise startet die Transkription mit einer hohen Rate. Wenn Aspekte der „Schlaufen“- und „Wanderungsmodelle“ kombiniert werden, so spricht man von einer „erleichterten Wanderung“. Hellblaue Rechtecke stellen den Enhancer dar, der Aktivierungskomplex ist rot gezeichnet. Die Gene sind schwarz, und der Promotorkomplex ist jeweils durch einen blauen Kreis dargestellt. Verknüpfende Proteine sind grün. (Nach Li et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier))

stehen und damit Schlüsselentscheidungen in zellulären Differenzierungsprogrammen herbeigeführt werden.

vität von DNase I sind. LCRs wurden erstmals in β-Globin-Genen beschrieben. Die Hinweise dazu kamen einerseits von Experimenten mit transgenen Tieren, zum anderen aus der molekularen Charakterisierung von Patienten, die an Thalassämien erkrankt waren. So waren in einigen Patienten zwar die β-Globin-Gene intakt, wurden aber nicht exprimiert. Der gemeinsame Defekt bei Menschen und Mäusen war eine große Deletion oberhalb des β-GlobinGenclusters, die dazu führt, dass der gesamte Bereich des Chromatins in einem „geschlossenen“ Zustand war und somit die Genexpression in dieser Region unterdrückt. Die bedeutendste Eigenschaft der LCRs ist ihre starke Erhöhung der Transkriptionsaktivität. Die β-Globin-LCR ist 6 bis 22 kb oberhalb des ersten, embryonal exprimierten Globin-Gens (des ε-Globin-Gens) lokalisiert und besteht aus fünf DNase-I-übersensitiven Bereichen. Vier dieser DNase-I-übersensitiven Bereiche werden nur in erythroiden Zellen angetroffen und sind offensichtlich für die zelltypspezifische Expression

Enhancer verstärken die Genexpression. Es sind Se-

quenzelemente, die außerhalb des Promotors liegen und unabhängig von der Orientierung ihrer Sequenz ihre aktivierende Wirkung entfalten können. Die Wechselwirkung mit dem Promotorbereich wird durch spezifische Proteine vermittelt

7.3.4 Locus-Kontrollregionen Locus-Kontrollregionen (engl. locus control region, LCR) sind definiert durch ihre Fähigkeit, die Expression gekoppelter Gene auf physiologische Werte zu erhöhen, wobei diese Wirkung gewebespezifisch erfolgt und von der Zahl der Kopien abhängt. LCRs fallen oft mit Stellen im Genom zusammen, die in den aktiven Zellen sehr sensitiv gegenüber der Akti-

7.4 RNA-codierende Gene

der β-Globin-Gene verantwortlich. Drei dieser vier LCRs enthalten eine hochkonservierte Sequenz, die für die Bindung des Transkriptionsfaktors Maf verantwortlich ist. An dieses Maf-Erkennungselement (engl. Maf recognition element, MARE) binden neben Maf allerdings auch andere, verwandte bZIP-Transkriptionsfaktoren als Homo- oder Heterodimere. Besonders wichtig erscheint dabei der Transkriptionsfaktor NF-E2, dessen Bindung mit einer über 100fachen Erhöhung der β-Globin-Gen-Transkription korreliert. Auch die RNA-Polymerase II kann offensichtlich an diese LCRs binden, wobei die wechselseitige Bindung an LCR und Promotor noch von weiteren Proteinen unterstützt wird. Eine zweite wichtige Eigenschaft der LCRs ist ihre Abhängigkeit von der Kopienzahl. Wenn nur einer der fünf DNase-I-hypersensitiven Bereiche deletiert ist, wird die Expression der β-Globin-Gene positionsabhängig, d. h. abhängig davon, ob sie in einem „offenen“ Chromatinbereich vorkommt oder nicht. Damit ist ein wesentlicher Unterschied zu den Enhancern dokumentiert, deren Wirkung von der Position unabhängig ist. Allerdings gibt es eine wesentliche Gemeinsamkeit der Wirkung der Enhancer und der LCRs, nämlich die Wirkung über große Strecken innerhalb des Genoms. Entsprechend werden auch ähnliche Mechanismen diskutiert: Schlaufenbildung, Entlangfahren und Verknüpfung (Abb. 7.17). Ein zentraler Aspekt ist allerdings, dass die LCR nur mit einem Promotor eines β-Globin-Gens zu einer bestimmten Zeit in Wechselwirkung tritt; ein „Flip-Flop“ zwischen zwei oder mehr Promotoren ist allerdings in Abhängigkeit vom Entwicklungs- und Differenzierungszustand des Gesamtorganismus möglich. Dabei ist es unerheblich, wie

diese Wechselwirkung zustande kommt, also ob der Holokomplex aus LCR und gebundenen Faktoren direkt eine Schlaufe mit dem Promotorkomplex ausbildet oder ob er die DNA entlangfährt, bis er die entsprechenden Promotoren erkennt. Dabei werden mit zunehmendem Entwicklungszustand die Bindungen an die eher distal liegenden Promotoren immer stabiler. LCRs sind aber nicht nur auf das β-GlobinGencluster beschränkt; im Menschen sind über 20 Genfamilien beschrieben, die über LCRs kontrolliert werden. Dazu kommen noch weitere Gene bzw. Genfamilien bei der Maus, der Ratte oder anderen Organismen, sodass insgesamt bei höheren Eukaryoten mit einer großen Zahl von LCRs zu rechnen ist.

Locus-Kontrollregionen erhöhen die Expression ganzer Gencluster in zelltypspezifischer Weise. Neben Bindestellen für Transkriptionsfaktoren haben sie offensichtlich auch Einfluss auf die Chromatinstruktur in dem entsprechenden Bereich.

7.4 RNA-codierende Gene 7.4.1 Die 5,8S-, 18S- und 28S-rRNA-Gene Ribosomale Gene waren die ersten eukaryotischen Gene, die molekular analysiert wurden. Ausgangspunkt war die Beobachtung, dass bestimmte Mutanten des Krallenfrosches Xenopus laevis unter ihren Nachkommen 25 % lebensunfähige

a 5‘

3‘ Insulator

Enhancer/ Locus-Kontrollregion

HS5

HS4 HS3 HS2 HS1

Co-Aktivator/ Pol-IIIRepressor Komplex

Gen

3‘-Enhancer

Insulator

b ε

Gγ Aγ

Abb. 7.17 a, b Das β-Globin-Gencluster und seine regulatorischen Regionen sind ein klassisches Beispiel zur Analyse der Genregulation. a Ein typisches Gencluster ist mit vielen möglichen regulatorischen Regionen dargestellt. b Der β-Globin-Locus enthält hintereinander die verschiedenen β-Globin-ähnlichen Gene (gelb); die entsprechenden regulatorischen Sequenzen

ψβ

δ β

3‘HS

sind angegeben: Die DNaseI-hypersensitiven Stellen (HS1–5) wirken als Insulator (HS5, türkis) bzw. als „Locus-Kontrollregion“ (HS1–4, blau). In der 3’-Region unterhalb des Genclusters befindet sich ein weiterer Enhancer (lila), der ebenfalls durch seine Überempfindlichkeit gegen DNaseI charakterisiert ist. (Nach Mahajan et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

Kaulquappen aufwiesen, während weitere 50 % der Embryonen nur einen anstelle von zwei Nukleoli besaßen. Diese Befunde deuteten darauf hin, dass es sich um eine heterozygote Defizienz des Nukleolus in beiden Eltern handeln könnte. Eine solche genetische Konstitution spaltet erwartungsgemäß in je 25 % Homozygote (mit und ohne Nukleolus) und 50 % Heterozygote auf. Der Tod von 25 % der Nachkommen konnte durch eine homozygote Defizienz des Nukleolus erklärt werden. Diese Beobachtungen beweisen, dass der Nukleolus eine lebenswichtige Funktion in der Zelle wahrnehmen muss, und Wallace und Birnstiel zeigten 1966 durch Hybridisierungsexperimente, dass der Verlust der Nukleoli mit dem Verlust von ribosomaler DNA gekoppelt war. Wir haben in Kapitel 3.4 gesehen, dass die Ribosomen der Ort der Proteinbiosynthese (Translation) sind, an dem sich die verschiedenen Komponenten (mRNA, tRNA) treffen und die Verknüpfung der Aminosäuren vermittelt wird. Da ribosomale RNA ein struktureller Bestandteil der Ribosomen ist, kann es nicht überraschen, dass ein Verlust des Nukleolus, also möglicherweise aller Gene, die für rRNA codieren, letal sein muss, wie es in den zuvor erwähnten Xenopus-Embryonen beobachtet wurde. Etwa 90 % der zellulären cytoplasmatischen RNA befindet sich als struktureller Bestandteil in den Ribosomen (Abb. 3.25). Die Gene für diese ribosomale RNA liegen in den Nukleolusorganisatorregionen (NORs) der Chromosomen (Abb. 6.6). Die Untersuchung von Ribosomen hatte ergeben, dass sie vier verschiedene RNA-Moleküle als Strukturbestandteile enthalten, die sich aufgrund unterschiedlicher Größen leicht unterscheiden lassen. Da sie zunächst durch ihre Sedimentationseigenschaften (S = Svedberg-Einheit) charakterisiert wurden, erhielten sie die Bezeichnungen 28S (23S in Prokaryoten), 18S (16S in Prokaryoten), 5,8S (einheitlich etwa 160 Nukleotide) und 5S (einheitlich etwa 120 Nukleotide). Zusätzlich wird in Drosophila-Ribosomen noch ein 2S-rRNAMolekül eingebaut. Die Zahl von Nukleotiden in diesen RNA-Molekülen schwankt innerhalb der Eukaryoten erheblich. So kann „28S“-rRNA zwischen 25S und 28S (4000 bis 5000 Nukleotide) variieren und „18S“rRNA zwischen 16S und 19S (im Mittel 2000 Nukleotide). In ähnlicher Weise wie bei Bakterien (S. 137) sind auch bei Eukaryoten die Gene für verschiedene rRNAs gekoppelt. Mithilfe von Hybridisierungsexperimenten mit den verschiedenen RNA-Fraktionen konnte man die ersten Aufschlüsse über die molekulare Feinstruktur der ribosomalen DNA gewinnen, die man aus Xenopus-DNA isoliert hatte. Gene für die 5,8S-, 18Sund 28S-rRNA findet man eng gekoppelt, äquimolar

und in jeweils mehreren Kopien auf einem einzigen DNA-Molekül, wenn man ausreichend lange Stücke der DNA isoliert. Zwischen diesen RNA-codierenden Abschnitten liegen jedoch noch andere DNA-Bereiche mit höherem GC-Gehalt, die zu keiner der ribosomalen RNA-Fraktionen komplementär und nur teilweise in den Transkripten enthalten sind. Sie besitzen offenbar die Funktion, die einzelnen ribosomalen Gene voneinander zu trennen (engl. intergenic spacer, IGS). In der DNA sind die einzelnen Gene abwechselnd in vielen Kopien als hintereinanderliegende Blöcke angeordnet; innerhalb eines Blocks (engl. repeat unit oder rDNA-repeat) sind die 5,8S-, 18S- und 28S-rRNAGene in jeweils gleicher Reihenfolge zu finden. Bei den Verbindungselementen unterscheidet man nach ihrem Transkriptionsverhalten nicht-transkribierte (NTS) und transkribierte Elemente (engl. external transcribed spacer, ETS). In Abb. 7.18a ist diese Anordnung bei verschiedenen Organismen dargestellt. Mit Ausnahme von S. cerevisiae ist die 5S-rRNA nicht mit den drei übrigen ribosomalen RNA-Genen verbunden; ihr ist deshalb ein eigenes Unterkapitel gewidmet. Es ist funktionell verständlich, dass von den rRNAGenen mehr als eine Genkopie benötigt wird, da große Mengen an ribosomaler RNA zur Deckung des Bedarfs an Ribosomen erforderlich sind. Die Sequenzidentität der vielen Genkopien wirft aber die Frage auf, wodurch verhindert wird, dass diese sich allmählich durch Mutationen verändern und dass auf diese Weise eine Sequenzheterogenität innerhalb der Genfamilie entsteht. Umgekehrt stellt sich – angesichts der beträchtlichen evolutionären Ähnlichkeit der codierenden Regionen – die Frage, wie sich eine solche (in sich sequenzhomogene) Genfamilie im Laufe der Evolution in eine sequenzveränderte, aber in sich ebenfalls homogene Genfamilie umwandeln kann. Als Erklärung sind zwei verschiedene Möglichkeiten vorstellbar. Einerseits könnte eine solche Genfamilie bei jeder individuellen Ontogenese durch ein Stadium gehen, in dem nur noch eine einzige Kopie vorhanden ist. Diese wird dann amplifiziert, um die Genfamilie für den betreffenden Organismus neu aufzubauen. Solche Vermehrungsmechanismen sind im Eukaryotengenom vorhanden (Kapitel 8.3.3). Einem teilweise vergleichbarem Beispiel dieser Art begegnen wir im Prinzip auch bei der Vermehrung der rDNAKopien während der Makronukleusentstehung in Ciliaten, wo im generativen Mikronukleus ein einziges Gen für rRNA vorhanden ist (Kapitel 8.3.1). Eine Alternative hierzu könnten Korrekturmechanismen sein, die für eine regelmäßige Sequenzangleichung der verschiedenen rDNA-Kopien sorgen. Einer der bekannten zellulären Mechanismen, dem eine solche Funktion zufallen könnte, ist die Rekombination zwischen den Tandemkopien in beiden Schwesterchro-

7.4 RNA-codierende Gene

Abb. 7.18 a, b rRNA-Gene. a Molekulare Strukturen von rRNAGenen in verschiedenen Organismen; im Gegensatz zu den meisten Eukaryoten sind bei Hefen die Gene für die 5S-rRNA in dem Gesamtcluster enthalten. NTS: nicht-transkribiertes Zwischenstück (engl. non-transcribed spacer). b Zusammenhang zwischen Nukleolus, sekundärer Einschnürung, NOR und ribosomalen RNA-Genen. Typischerweise ist nur ein Teil der rRNA-Gene in der Nukleolus-organisierenden Region (NOR) aktiv; anschließende Transkription durch RNA-Polymerase I und Weiterverarbeitung der Vorläufer-rRNA bewirkt die Bildung des Nukleolus. In der Metaphase verursachen die rRNA-Gene, die während der vorangehenden Interphase aktiv waren, wegen der dauerhaften Bindung von Transkriptionsfaktoren die Bildung einer sekundären Einschnürung. Diese ist so weit dekondensiert, dass sie mit

den Standard-Mikroskopiertechniken als unsichtbar erscheint. Innerhalb der NORs sind die hintereinander angeordneten rRNAGene durch Zwischenstücke voneinander getrennt; diese Bereiche enthalten üblicherweise mehrere Wiederholungssequenzen und den Promotor des rRNA-Gens (der Transkriptionsstart ist mit +1 angegeben). Der transkribierte Bereich umfasst sowohl externe Sequenzen (engl. external transcribed sequence, ETS) als auch zwei interne Sequenzen (engl. internal transcribed sequences, ITS), die die 18S-, 5,8S- und 25S-rRNA-Sequenzen voneinander trennen. Daher sind vielfältige Weiterverarbeitungsschritte nötig, um aus dem einen Primärtranskript schließlich die verschiedenen strukturellen RNAs herzustellen. (a nach Srivastava u. Schlessinger 1991; b nach Preuss u. Pikaard 2007, beide mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

matiden. Dass solche Rekombinationsereignisse zwischen verschiedenen Wiederholungseinheiten vorkommen, zeigt Abb. 7.19a.

Die Gene für 28S-, 18S- und 5,8S-rRNA findet man als wiederholte Gengruppen hintereinander in der DNA. Die wiederholten Gengruppen sind durch Zwischenelemente voneinander getrennt.

Direkt in Zusammenhang mit der Frage der Sequenzidentität der multiplen Gene steht die Frage nach der Kontrolle ihrer Anzahl. Bei allen Eukaryoten sind einige Hundert ribosomale RNA-Gene vorhanden (Tabelle 7.4). Da Nukleolusorganisatorregionen (NORs) die Eigenschaft haben, eine sekundäre Konstriktion zu bilden (S.167), lassen sich die rRNA-Gene leicht in den Chromosomen lokalisieren. Hierdurch und aus in-situ-Hybridisierungsexperimenten wissen wir, dass die Anzahl von NORs im Genom verschiedener Organismen sehr variabel ist. Während Drosophila melanogaster zwei NORs, je eine in jedem Geschlechtschromosom, besitzt, findet man in Drosophila hydei drei, eine im X- und zwei im Y-Chromosom, und im menschlichen Genom gibt es fünf NORs (auf den Autosomen 13, 14, 15, 21 und 22). In Xenopus laevis hingegen ist eine einzige NOR in Chromosom 12 zu finden, und die Hefe Saccharomyces cerevisiae hat ebenfalls eine einzige chromosomale Region für rDNA in Chromosom 12 (die rDNA-Gene umfassen etwa 60 % des gesamten Chromosoms 12). Ganz offensichtlich gibt es Regulationsmechanismen, die die Anzahl der rDNA-Kopien im Genom annähernd konstant halten. Besonders deutlich wird das in Experimenten an „bobbed“ (bb)Mutanten von Drosophila, die durch Ritossa und Spiegelmann (1965) als Defizienzmutanten für ribosomale DNA erkannt worden sind. Deletiert man rDNA bis zu einem Minimum von etwa 30 Kopien, so zeigen die Individuen in zunehmendem Ausmaß allgemeine morphologische Defekte. Diese beginnen mit einer Verkürzung der Borsten auf dem Scutellum und reichen bei starken bobbedEffekten (d. h. wenig rDNA) bis zu einem stark deformierten Abdomen. Die Anzahl vorhandener rDNAKopien korreliert dabei direkt mit der Stärke des bobbedPhänotyps. Unterhalb einer Zahl von etwa 30 Kopien reicht die Anzahl der rRNA-Gene nicht mehr aus, um lebensfähige Individuen entstehen zu lassen. Häufiger – und leichter – als eine Reduktion der Anzahl von rDNA-Kopien in bestimmten Zellen lässt sich das Gegenteil, eine Überrepräsentation ribosomaler RNAGene beobachten, die man als Amplifikation bezeichnet. Die Oocyten vieler Amphibien besitzen eine große

Abb. 7.19 a–e Veränderungen der Kopienzahl von rRNA-Genen. a Rekombination zwischen den Wiederholungseinheiten reduziert die Kopienzahl: In diesem Fall gehen 8 Wiederholungselemente verloren. b Für das Replikations-abhängige Amplifikationsmodell sind 3 Kopien von 150 gezeigt. In diesem Modell startet die Replikation an einem der rARS (rARS-2; ARS: autonom replizierende Sequenz) bidirektional. c Die nach rechts laufende Replikationsgabel wird an der Replikationsgrenze gestoppt (engl. replication fork boundary, RFB; Fob1: Gensymbol für fork blocking less); dieser Stopp bewirkt einen Doppelstrangbruch (DSB, Schere). d Der Einzelstrang drängt sich in einen homologen Schwesterchromatidenstrang ein und bildet eine neue Replikationsgabel. e Die neue Replikationsgabel trifft sich mit der sich nach links bewegenden Replikationsgabel und bildet zwei Schwesterchromatiden; eine davon bildet eine zusätzliche Kopie von rDNA, angedeutet durch die gestrichelte Linie. (Nach Kobayashi 2006, mit freundlicher Genehmigung der Japanischen Gesellschaft für Genetik)

7.4 RNA-codierende Gene Tabelle 7.4 Die Anzahl ribosomaler RNA-Gene bei verschiedenen Eukaryoten Art

Anzahl (haploid: n, diploid: 2n)

Saccharomyces cerevisiae

140 (n)

Tetrahymena thermophila

1 (n) im Mikronukleus, ca. 104 im Makronukleus

Acetabularia mediterranea

1900 (n)

Vicia faba

9500 (n)

Drosophila melanogaster

150 ( ), 250 ( ), (2n)

Xenopus laevis

800 (2n)

Homo sapiens

560 (n)

Anzahl (je nach Art 600 bis 1000) von extrachromosomalen Nukleoli. Im reifen Zustand der Oocyten liegt die DNA dieser extrachromosomalen Nukleoli bei Xenopus laevis kappenförmig der Kernmembran an. Extrachromosomale Nukleoli enthalten ringförmige DNA-Moleküle, die sich als Kopien der chromosomalen ribosomalen DNA erwiesen. Die gesamte Menge an extrachromosomaler rDNA, die in einer Oocyte gebildet wird, ist außerordentlich groß. Ein repliziertes Genom (4C) von X. laevis enthält 0,02 pg DNA, während eine Oocyte 25 pg DNA enthält. Die Menge an DNA in diesen Zellkernen ist damit auf das 1000fache der Menge an DNA eines normalen diploiden Kerns angewachsen. Dies ist erforderlich, um den Ribosomenbedarf des sich entwickelnden Eis zu decken. Sie gehen während der meiotischen Teilungen verloren, sodass in der Eizelle wieder ein normaler haploider Satz an rDNA vorhanden ist. Dass es sich bei der Amplifikation ribosomaler DNA bei Xenopus um keine Ausnahmeerscheinung handelt, beweisen Befunde bei einer Reihe von Insekten, bei denen man in den Oocyten ebenfalls extrachromosomale DNA findet, die durch Amplifikation aus der chromosomalen rDNA entsteht. Diese extrachromosomale rDNA wird oft in Form auffälliger, stark färbbarer DNA-Körperchen (engl. DNA bodies) gefunden. Klassische Beispiele hierfür sind die nach ihrem Entdecker genannten Giardina-Bodies (Giardina 1901) in den Oocyten von Schwimmkäfern der Familie Dytiscidae (Gelbrandkäfer) und die DNA-Körperchen in Oocyten des Heimchens Achaeta domesticus (Cave u. Allen 1969). Bei Hefen diskutiert Kobayashi (2006) ein Modell, das von verschiedenen Möglichkeiten einer unterbrochenen Replikation der Wiederholungselemente (Abb. 7.19) bzw. Störungen bei deren Transkription (Abb. 7.20) ausgeht. Das Muster ist dabei relativ ähnlich: Es entstehen Doppelstrang-

brüche, die unter anderem dadurch repariert werden können, dass sich der freie Strang an den ungleichen Schwesterstrang anlagert und dadurch zur Bildung zusätzlicher Wiederholungseinheiten beiträgt. Eine wichtige Rolle spielt dabei ein cis-Element, das offensichtlich für kein Protein codiert.

Die Anzahl und Lage der rDNA-Kopien im Genom variiert in verschiedenen Organismen beträchtlich. Es ist jedoch stets mehr als ein Gen vorhanden. Eine starke Abnahme an rDNA im Genom eines Organismus führt zu vielfältigen (pleiotropen) Effekten und schließlich zur Letalität, sobald eine Mindestanzahl von Genkopien unterschritten wird.

Wie wir oben gesehen haben (Abb. 7.18), liegen bei Eukaryoten die Gene der 18S-, 5,8S- und 28S-rRNA dicht beieinander. An dieser DNA wird ein primäres Transkript (engl. pre-rRNA) synthetisiert, das vor dem für die 18S-rRNA codierenden Abschnitt der DNA beginnt und bis hinter das 3’-Ende der 28S-rRNA reicht; es entsteht eine 40‒41S-Vorläufer-rRNA. Der Beginn des Zusammenbaus des Ribosoms erfolgt schon während der Transkription der rRNA-Gene und führt zu einem 90S-„Vorläufer-Ribosom“. Der Bereich zwischen dem 3’-Ende dieses primären Transkripts und dem Beginn der nächsten Transkriptionseinheit (d. h. der folgenden DNA-Wiederholungseinheit) wird als nicht transkribiertes Zwischenstück bezeichnet (engl. non-transcribed spacer, NTS). Da der Beginn der Transkriptionseinheit noch nicht zur 18S-rRNA gehört, wird er auch als externes transkribiertes Zwischenstück (engl. external transcribed spacer, ETS) bezeichnet, dem der Bereich zwischen 18S- und 28S-rRNA als internes transkribiertes Zwischenstück (engl. internal transcribed spacer, ITS) gegenübersteht. Die Synthese ribosomaler RNA in Eukaryoten erfolgt durch ein spezielles Enzym, die RNA-Polyme-

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

Abb. 7.20 a–c Modell der Transkriptions-induzierten rDNAAmplifikation. a Im Wildtyp reprimiert Sir2p (eine HistonDeacetylase; engl. silent mating type information regulator) die Aktivität des EXP-Promotors (E-pro), und erlaubt damit Cohesin, mit den IGS (engl. intergenic spacer) zu assoziieren. b Wenn die Sir2p-Repression wegfällt, ist E-pro aktiv und dessen Transkription entfernt Cohesin (Ringe) von den IGS. Das Fehlen von Cohesin ermöglicht es, dass ungleiche Schwesterchromatiden als Matrize für die Reparatur des Doppelstrangbruchs genutzt

werden können und Veränderungen in der Kopienzahl die Folge sind (Abb. 7.21). c Doppelstrangbrüche können auch durch intrachromosomale Rekombination repariert werden. In diesem Fall erscheint ein zusätzlicher rDNA-Ring (ERC). Die Striche repräsentieren einzelne Chromatiden (doppelsträngige DNA). Die IGS mit passierender Replikationsgabel sind in den Klammern dargestellt. (Nach Kobayashi 2006, mit freundlicher Genehmigung der Japanischen Gesellschaft für Genetik)

rase I, die ausschließlich diese Gene transkribiert. Im Gegensatz zu anderen Genen ist die Promotor-DNASequenz, die die RNA-Polymerase I zur Bindung und Initiation der Transkription benötigt, sequenzmäßig nicht gut definierbar. Vergleicht man die rDNA-Promotorregionen bei verschiedenen Organismen, so lässt sich keine Consensussequenz feststellen. Vielmehr ist der gesamte Sequenzkontext in einem Bereich von etwa 40 Nukleotiden oberhalb (−40) bis zu etwa 10 Nukleotiden (+10) nach dem Initiationscodon (+1 bis +3) für die Initiation der Transkription wichtig. Möglicherweise sind aber auch noch weitere Sequenzen oberhalb des Transkriptionsstarts für die Initiation der Transkription bedeutsam. Eine völlig offene Frage ist

zudem, ob die Initiation der Transkription in der G1-Phase an jedem rDNA-Wiederholungselement willkürlich beginnen kann, oder ob sie am Promotor (P, Abb. 7.18b) des ersten rDNA-Wiederholungselementes beginnt und sich von hier aus in die weiteren Wiederholungselemente fortsetzt. Elektronenmikroskopische Bilder sprechen für die letztgenannte Alternative. Innerhalb des NTS befinden sich vor dem 5’-Ende des ETS zwei zusätzliche Promotorregionen (P’) neben derjenigen am 5’-Ende des ETS (P), die durch ihre DNA-Sequenzhomologie ermittelt wurden. Durch Miller-Spreitungen lässt sich zeigen, dass in diesen Bereichen tatsächlich gelegent-

7.4 RNA-codierende Gene Abb. 7.21 a, b Transkription von rDNA in Xenopus-Oocyten. a Diese Analyse zeigt das hohe Auflösungsvermögen der MillerSpreitungstechnik. Es werden Einzelheiten des Transkriptionsmechanismus erkennbar, die biochemisch nur schwer nachweisbar sind. Oben ist die normale Transkription dargestellt. In der Mitte sieht man eine falsche Termination (erst an T3). Im unteren Bild erfolgt eine falsche Initiation an P’. b Die einzelnen Schritte der weiteren Bearbeitung des primären Transkripts sind dargestellt. (a nach Meissner et al. 1991, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

lich eine Initiation der Transkription erfolgt (Abb. 7.21a). Andererseits enthält der NTS auch drei Terminationssequenzen für die Transkription. Zwei dieser Sequenzen (T1, T2) liegen nahe des 3’-Endes der 28S-rRNA-Sequenz, die dritte (T3) liegt weit innerhalb des NTS, nur 215 bp vor dem Beginn des Promotors P, unmittelbar vor dem ETS der folgenden rDNA-Wiederholungseinheit. In 99 % aller Transkriptionseinheiten erfolgt die Initiation am Promotor (P) und die Termination am Terminationssignal T2, das sich nur 235 bp unterhalb des Endes der 28S-rRNA-Region befindet.

Die Transkription eukaryotischer rDNA erfolgt durch

die RNA-Polymerase I. Innerhalb der rDNA-Wiederholungseinheiten sind mehrere Promotorsequenzen vorhanden, die im Gegensatz zur evolutionären Konservierung der rRNA-Sequenzen bei verschiedenen Organismen keine Ähnlichkeit in der Nukleotidsequenz erkennen lassen. Sowohl Initiation als auch Termination der Transkription erfolgen überwiegend jeweils an einem bestimmten Promotor- bzw. Terminationssignal.

Durch Spleißen (engl. splicing; Kapitel 3.3.5) wird das primäre Transkript in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten zerschnitten, bis die im Ribosom enthaltenen rRNA-Moleküle übrig bleiben. Dieses Zerschneiden des Primärtranskripts erfolgt bei Eukaryoten unmittelbar nach der Transkription im Zellkern. Der Verarbeitungsmechanismus dieser Vorläufer-rRNA ist relativ gut untersucht. An ihm sind neben der Ribonuklease III, die innerhalb einer intramolekularen Doppelstrangregion der primären Transkripte angreift und die 18S-rRNA und 28S-rRNA herausschneidet (Abb. 7.21b), eine Reihe anderer Enzyme beteiligt. Die endgültige Größe der Moleküle wird unter Anlagerung ribosomaler Proteine bereits während der Transkription durch weitere nukleolytische Enzymaktivitäten erzielt. Dabei scheint eine Methylierung von Basen in den funktionellen rRNA-Bereichen von grundlegender Bedeutung zu sein, die bereits kurz nach der Synthese der RNA erfolgt. Ausgiebig untersucht wurde dieser Prozess in HeLaZellen, einer menschlichen Tumorzelllinie. In HeLaZellen werden die Endprodukte, also 5,8S-, 18S- und 28S-rRNA, im primären Transkript (40‒41S-VorläuferrRNA) zunächst vorwiegend (zu 80 %) an den 2’-OH-

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

Gruppen der Ribose und in geringerem Umfang (zu etwa 20 %) an ihren Basen methyliert. Offenbar beschützen diese Methylgruppen die betreffenden Molekülbereiche gegen die an der Weiterverarbeitung beteiligten Endonukleasen. Die Bedeutung einer anderen gelegentlichen Modifikation von Basen innerhalb der rRNA, die Substitution von Uridin durch Pseudouridin, ist unbekannt. Etwas tiefere Einsicht hat man bei Hefen erzielt, bei denen zumindest acht aufeinanderfolgende Spleißereignisse bis zur endgültigen Struktur der rRNA-Moleküle durchlaufen werden müssen.

Die Verarbeitung der Vorläufer-rRNA in Eukaryoten

erfolgt in mehreren Schritten. Dabei spielen Methylierungen an Basen und an der Ribose in bestimmten Regionen des Moleküls eine Rolle beim Schutz gegen nukleolytischen Abbau.

Bei der Weiterverarbeitung der Vorläufer-rRNA in Eukaryoten spielen auch zusätzliche RNA-Moleküle eine Rolle, z. B. snRNA-Moleküle (engl. small nuclear RNA). Sie sind universelle RNA-Komponenten des Zellkerns und im Allgemeinen mit Proteinen zu Ribonukleoproteinpartikeln (snRNP) verpackt (Tabelle 3.4). Von ihnen wird die U3-snRNA-Fraktion, ebenso wie U8-snRNA und U13-snRNA, in hoher Konzentration in Nukleoli gefunden. Die übrigen snRNAs befinden sich als snRNPs im Nukleoplasma. Auch die U3-snRNA ist im Allgemeinen an Ribonukleoproteinpartikel (RNPs) gebunden, die erforderlich sind, um die ersten Verarbeitungsschritte am 5’-Ende des primären Transkripts auszuführen. Wahrscheinlich hat sie weitere Aufgaben in späteren Schritten, die die Entfernung des ITS zur Folge haben (Abb. 7.21b). Obwohl der generelle Aufbau und die Transkription der ribosomalen DNA bei allen Eukaryoten vergleichbar sind, gibt es einige Unterschiede, die sich nicht auf die nicht-transkribierten Regionen beschränken. Der wichtigste Strukturunterschied betrifft die 28S-rDNA-Region einiger rDNARepeats. In Drosophila – und vielen anderen Organismen – kann die 28S-rDNA Introns besitzen, die die Kontinuität der 28S-rRNA unterbrechen. In den meisten Fällen werden Gene mit dem Intron transkribiert, und das Intron wird durch Spleißen des primären Transkripts entfernt. Bei Drosophila bleiben jedoch rRNA-Gene, die ein Intron besitzen, inaktiv oder ihre Transkription bricht am Beginn des Introns ab. In Drosophila gibt es zwei verschiedene Intron-Typen (Typ I und II), die ganz unterschiedliche DNA-Sequenzen besitzen und zu Familien transponierbarer Elemente gehören (Kapitel 8.1).

An der Verarbeitung primärer Transkripte bei Eukaryoten sind kleine RNA-Moleküle (snRNAs) beteiligt. Sie sind mit Proteinen zu Ribonukleoproteinpartikeln (RNPs) vereinigt. Manche rDNA-Wiederholungselemente besitzen innerhalb der 28S-rRNA-Region ein Intron. Solche Introns werden in vielen Organismen durch Spleißen aus dem primären Transkript entfernt.

Die molekulare Analyse der rDNA in Tetrahymena hat einen molekularen Mechanismus von grundlegender Bedeutung aufgedeckt. Das in der 28S-rRNA enthaltene Intron ist imstande, sich selbst, ohne einen Beitrag von Proteinen, aus dem primären Transkript herauszuschneiden. Damit wurde deutlich, dass nicht nur Proteine, sondern auch Nukleinsäuren katalytische Funktionen übernehmen können. Eine solche Feststellung ist für evolutionäre Überlegungen entscheidend. Geht man davon aus, dass Nukleinsäuren die Ausgangsmoleküle bei der Entwicklung des Lebens waren, so muss man deren Funktionsfähigkeit hinsichtlich ihrer Replikation, aber auch zur Synthese anderer Nukleinsäuren und Proteine erklären können. Für beide Prozesse aber sind Enzyme unentbehrlich, da sie wichtige katalytische Aufgaben bei der Synthese von Polymeren übernehmen. Die autokatalytischen Fähigkeiten der rRNA beweisen, dass solche katalytischen Funktionen im Prinzip nicht nur von Proteinen, sondern auch von Nukleinsäuren übernommen werden können. Damit ist es nicht notwendig, für die ersten Prozesse bei der Entstehung lebender Materie die Existenz von proteinartigen Katalysatoren zu fordern. Vielmehr könnten deren Aufgaben wohl ursprünglich von Nukleinsäuren versehen worden sein. Eine wichtige Frage ist, inwieweit die verschiedenen rDNA-Kopien im Genom überhaupt transkribiert werden und ob sie vielleicht in verschiedenen Zelltypen differenziell reguliert werden. Hinweise darauf, dass die Initiationsfrequenz der RNA-Polymerase I stark variiert, gibt es aus Miller-Spreitungsexperimenten nicht. Viele Spreitungsversuche wurden an Keimbahnzellen ausgeführt, und es spricht alles dafür, dass in diesen Zellen die überwiegende Mehrheit der rDNAKopien aktiv ist. Umgekehrt gibt es jedoch Zelltypen, in denen Miller-Spreitungsexperimente an rDNA nicht besonders erfolgreich verlaufen. Wahrscheinlich liegt die Ursache darin, dass hier nur ein kleiner Teil der vorhandenen rDNA-Gene aktiv ist und diese damit nur schwer auffindbar sind. Dafür sprechen auch ultrastrukturelle Studien von Nukleoli, die zeigen, dass die Anteile an fibrillären Zentren, dichten fibrillären Komponenten und granulären Komponenten in verschiedenen Zelltypen unterschiedlich sind.

7.4 RNA-codierende Gene

Ein seit Langem bekanntes Phänomen der Transkription ribosomaler DNA ist die Erscheinung der nukleolären Dominanz (engl. nucleolar dominance). Mit diesem Begriff wird angedeutet, dass unter bestimmten experimentellen Bedingungen nicht die gesamte zelluläre rDNA transkribiert wird, sondern dass nur einzelne von mehreren Nukleoli aktiviert werden. Der am besten untersuchte Fall einer nukleolären Dominanz liegt in Hybriden zwischen Xenopus borealis und X. laevis vor. In solchen Hybriden sind in der frühen Ent-

wicklung ausschließlich die ribosomalen Gene aktiv, die dem Genom von X. laevis zugehören, während rDNA des X. borealis-Genoms inaktiv bleibt. Vermutlich sind für diese differenzielle Aktivierung der X. laevis-rDNA die Nukleotidsequenzen in der NTSRegion verantwortlich. Die NTS-Bereiche beider Xenopus-Arten weichen in ihrer Nukleotidsequenz erheblich voneinander ab, während die rRNA-codierenden Bereiche praktisch identisch sind. Die Xenopus-Arten unterscheiden sich in ihren NTS-Bereichen durch die Zahl der Enhancer (engl. enhancer Abb. 7.22 a, b Abschalten von rRNA-Genen. a Aktive und stille ribosomale Gene sind durch assoziierte Proteine voneinander abgegrenzt: Aktive Promotoren sind mit RNA-Polymerase I assoziiert, enthalten hyperacetylierte Histone H4 und unmethylierte Histone H3 sowie eine unmethylierte HpaII-Schnittstelle in einem oberhalb liegenden Kontrollelement. Im Gegensatz dazu ist der Promotor der stillen rRNA-Gene methyliert und mit dem nucleolären Umbaukomplex asssoziiert (engl. nucleolar remodelling complex, NoRC); die Histone H3 sind an Lys9 ebenfalls methyliert. b Das Modell der NoRC-vermittelten Abschaltung von rRNA-Genen beinhaltet zunächst die Bindung des Transkriptions-Terminator-Faktors (TTF-I) an den Terminator T0 der transkribierten rRNA-Gene; Histon H4 ist acetyliert. Um die Gene abzuschalten, wird durch TTF-I eine Bindung von NoRC an den Promotor des rRNAGens vermittelt. Im weiteren Verlauf werden im Bereich des rRNA-Promotors Histone deacetyliert und die DNA methyliert. Als Folge davon kann UBF (engl. upstream binding factor) nicht mehr binden und die Bildung des Transkriptionskomplexes wird verhindert. Das Fragezeichen deutet an, dass der Zeitpunkt des Nukleosomen-Umbaus nicht genau bekannt ist. HDAC1: Histon-Deacetylase 1; DNMT: DNA-Methyltransferase. (Nach Grummt u. Pikaard 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

imbalance) und wahrscheinlich auch hinsichtlich der Signalsequenzen für die RNA-Polymerase I. Damit kann das Phänomen bei Xenopus hinreichend erklärt werden. Formal ähnliche Ergebnisse sind auch bei Hybriden von Pflanzen beschrieben; hier werden allerdings eher epigenetische Mechanismen diskutiert: Dazu gehört vor allem die Modifikation der Histone in der entsprechenden Region, wie wir das bereits in allgemeiner Form im Kapitel 6.2.4 kennengelernt hatten: Histon H4 wird am Lysin-9-Rest deacetyliert und stattdessen Histon H3 methyliert; damit verbunden ist eine Cytosin-Hypermethylierung im Promotorbereich der rRNA-Gene. Insgesamt bewirkt dieser Prozess eine Kondensation des Chromatins (Abb. 7.22; zur Übersicht siehe auch McStay u. Grummt 2008).

Es kann zur bevorzugten Transkription der rDNA in

bestimmten Nukleoli kommen. Diese Erscheinung wird als nukleoläre Dominanz bezeichnet. Hierbei spielen epigenetische Mechanismen eine wichtige Rolle.

7.4.2 Die 5S-rRNA-Genfamilie Im Unterschied zu der oben besprochenen 5,8S-, 18Sund 28S-rRNA-Genfamilie bilden die 5S-rRNA-Gene eine eigene Genfamilie; die 5S-rRNA-Gene von Xenopus waren die ersten eukaryotischen Gene, die gereinigt, kloniert und sequenziert wurden. Es gibt davon zwei Typen: Die größere Familie wird in den Oocyten von Xenopus exprimiert und besteht aus ca. 20.000 Kopien pro haploidem Genom; diese 20.000 Kopien sind auf Gruppen von jeweils ca. 1000 Kopien auf die meisten Chromosomen von Xenopus verteilt. Jede Kopie variiert in der Länge zwischen 650 und 850 bp; sie enthält aber immer ein aktives Gen und ein Pseudogen, die durch ein AT-reiches Zwischenstück getrennt sind. Im Gegensatz dazu liegt die zweite 5S-rRNA-Genfamilie „nur“ mit ca. 400 Kopien im haploiden Genom vor, und zwar meistens in einer Gruppe auf einem Chromosom. Diese Gruppe von rRNA-Genen wird üblicherweise in den Körperzellen exprimiert; jede Genkopie des „somatischen Typs“ ist einheitlich 880 bp lang und besteht aus einem einzigen Gen und einem GC-reichen Zwischenstück. Ihre Transkription erfolgt durch eine andere Polymerase als die der 28S-, 18S- und 5,8S-rDNA. Es handelt sich um die RNA-Polymerase III, die auch für die Synthese der tRNA verantwortlich ist. Auch die RNAPolymerase III ist ein hochmolekularer Enzymkomplex (Mr = ca. 650.000) und besteht aus 10 bis 15 Untereinheiten.

Donald Brown und Ronald Roeder ist es mit ihren Kollegen gelungen (Bogenhagen et al. 1980; Bieker et al. 1985), einen Einblick in den Regulationsmechanismus zu gewinnen, der die differenzielle Transkription der somatischen bzw. oocytenspezifischen 5S-rRNA-Gene sicherstellt. Der erste überraschende Befund bei der Analyse der Regulationsregion der 5S-rRNA-Gene war, dass diese Region innerhalb des RNA-codierenden DNA-Bereichs (engl. internal control region) liegt. Durch Deletionsversuche an einem isolierten somatischen 5S-rRNA-Gen und anschließender Expression durch Injektion in Xenopus-Oocyten gelang es, die für die Regulation verantwortlichen DNA-Sequenzen festzulegen. Man kann einerseits alle flankierenden DNA-Sequenzen im 5’- und 3’-Bereich entfernen, ohne die Transkription zu unterbinden, andererseits aber durch Deletionen ausschließlich im Bereich +50 bis +68 jegliche Transkription verhindern. Dieser Bereich lässt sich in weitere funktionelle Unterabschnitte aufgliedern. Erst durch neuere Untersuchungen haben sich die Anzeichen gemehrt, dass auch DNA-Sequenzen im 5’-Bereich der Gene für die Regulation eine Bedeutung haben. Die Termination der Transkription erfolgt in einer T-reichen Region des Gens, die von einem GC-Bereich umgeben ist. Die während der Transkription entstehenden Poly(U)/Poly(dA)-Hybridabschnitte sind relativ instabil und führen zum Abbruch der Transkription.

Bei Xenopus gibt es zwei Arten von 5S-rRNA-Genen, von denen eine nur in den Oocyten aktiv ist und die andere somatisch exprimiert wird. Die 5S-rRNA wird durch die RNA-Polymerase III transkribiert. Eine Nachbearbeitung des Transkripts ist nicht nötig, da eine korrekte Termination am Ende des 5S-rRNA-Moleküls erfolgt und keine Introns vorhanden sind. Die Regulation der Transkription der 5S-rRNA erfolgt durch eine Region innerhalb des codierenden DNA-Bereichs.

Eine Schlüsselfunktion in der Regulation der Transkription der 5S-rRNA-Gene nehmen drei Transkriptionsfaktoren (TFIIIA, TFIIIB und TFIIIC) ein. Sie müssen sich an die interne Kontrollregion eines 5S-Gens anlagern, bevor die RNA-Polymerase III in der Lage ist, die Trankription zu initiieren. Dabei wird der Transkriptionsfaktor TFIIIA im Sequenzbereich +47 bis +85 der codierenden Region an die DNA gebunden (Abb. 7.23). Dieses Protein ist der erste eukaryotische Transkriptionsfaktor, der identifiziert und in seiner Struktur aufgeklärt worden ist (darum TF „A“, die „III“ bezieht sich auf seine Funktion gemeinsam mit RNA-Polymerase III). Es handelt sich

7.4 RNA-codierende Gene

Abb.7.23 a, b Initiation der Transkription der 5S-rDNA. a Der Transkriptionsfaktor TFIIIA bindet zunächst unter Bildung eines instabilen Komplexes reversibel an die Regulationsregion der DNA. Ein weiterer Transkriptionsfaktor, TFIIIC, stabilisiert diesen Komplex. Erst nach Bindung eines weiteren Transkriptionsfaktors, TFIIIB, kann die RNA-Polymerase III binden und die Transkription initiieren. Vgl. die Initiation der Transkription durch RNA-Polymerase II (Abb. 3.7). b Vergleich

der für die Bindung von TFIIIA wichtigen Sequenzbereiche der 5S-rDNA und der 5S-rRNA. Die an der Bindung beteiligten G-reichen Nukleotidbereiche sind schwarz hervorgehoben. TFIIIA steht in der DNA vor allem mit dem Sinn-Strang (d. h. RNA-gleichen Strang) in Kontakt. In der RNA bindet TFIIIA in einer Doppelstrangregion im gleichen Sequenzbereich. (Nach Bieker et al. 1985, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

um ein Zink-Metalloprotein aus 344 Aminosäuren und mit einem Molekulargewicht von 38,5 kDa. Die Primärstruktur dieses Proteins ist, nicht zuletzt im Kontext seiner möglichen evolutionären Geschichte, besonders auffallend, denn es ist im aminoterminalen Bereich aus 9 Wiederholungseinheiten aufgebaut, die drei Viertel des gesamten Polypeptids einschließen. Die einzelnen, 30 Aminosäuren langen Wiederholungssequenzen sind nicht völlig identisch, wie man es auch bei anderen Proteinen mit internen Repetitionen ihrer Aminosäuresequenzen beobachtet. Entscheidend für die Funktion des TFIIIA-Proteins sind jedoch Paare von Cysteinen und Histidinen, die in festgelegten Positionen jeder Wiederholungseinheit zurückkehren. Je ein Paar von Cysteinen und Histidinen innerhalb einer Wiederholungseinheit bindet nach Ergebnissen der Strukturanalyse des Proteins durch Atomabsorptionsspektroskopie ein Zinkion. Hierzu erfolgt eine Faltung des Polypeptids in 9 fingerartige Domänen (Zinkfinger; Abb. 7.15). Diese Domänen treten mit der DNA in Kontakt, indem sie in die große Furche der DNA eingreifen und GG-Sequenzen im anticodierenden Strang

der DNA erkennen. Die Hauptfunktion der Zinkfingerregion ist es, mit der DNA einen stabilen Komplex zu bilden. Die Transkription wird durch das Carboxylende des TFIIIA-Proteins eingeleitet, das selbst nicht mit der DNA direkt in Kontakt tritt. Es ist eine der besonderen Eigenschaften eines solchen, einmal geformten Transkriptionskomplexes, dass dieser sehr stabil bleibt und dadurch eine häufig wiederholte Initiation der Transkription gestattet. Wie ist aber der Unterschied in der Transkription der oocytenspezifischen und der somatischen 5S-rRNAGene zu erklären? Der Unterschied in der Nukleotidsequenz der beiden Typen von 5S-rRNA-Genen beschränkt sich auf 3 Nukleotide in der internen Kontrollregion der 5S-rRNA-Gene. Offenbar genügt dieser Unterschied, um die Bindungsaffinität zwischen DNA und TFIIIA so zu verändern, dass hierdurch die differenzielle Regulation der somatischen und der oocytenspezifischen Gene erzielt wird. Die somatischen 5S-rRNA-Gene haben eine höhere Affinität zu TFIIIA als die oocytenspezifischen 5S-rRNA-Gene. Das resul-

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

tiert bei einer begrenzten Menge an TFIIIA-Protein in der Zelle, wie sie in somatischen Zellen vorliegt, in einer bevorzugten Transkription der somatischen 5S-rRNA-Gene, die zwischen 200- und 1000fach über der transkriptionellen Aktivität der oocytenspezifischen Gene liegen kann. Dadurch weisen somatische Zellen praktisch nur eine Transkription der somatischen 5S-rRNA-Gene auf. Offenbar spielt zusätzlich die Bindung von Histon H1 eine entscheidende Rolle in diesem Regulationsmechanismus. Isoliert man Chromatin aus somatischen Zellen, so sind die oocytenspezifischen 5S-rRNA-Gene mit H1-Histon assoziiert und inaktiv, während die somatischen 5S-rRNA-Gene als Transkriptionskomplexe ohne Histon H1 vorliegen. TFIIIA-Bindung und Histon-H1-Verpackung haben entgegengesetzte Effekte auf die Aktivität der oocytenspezifischen Gene. Nach Assoziation der oocytenspezifischen Gene mit Histon H1 in einer nukleosomalen Konstitution sind diese irreversibel reprimiert. Dabei konkurriert Histon H1 wahrscheinlich positionell mit der Bindungsstelle von TFIIIA. Die antagonistische Rolle von Histon H1 zur Bindung von Transkriptionsfaktoren verweist aber auch deutlich auf Regulationsfunktionen auf der übergeordneten Ebene der allgemeinen Chromatinkonstitution. Da die Konzentration von TFIIIA in somatischen Zellen niedrig ist, reicht die erhöhte Bindungsaffinität für TFIIIA der somatischen 5S-rRNA-Gene aus, um diese in einem aktiven Zustand zu halten. Andererseits ist die Konzentration von TFIIIA in Oocyten sehr hoch, sodass eine Abnahme der Transkriptionsrate in der reifen Oocyte und im frühen Embryo schwer zu verstehen wäre, wenn nicht ein weiterer Regulationsparameter hinzukäme. Diesen finden wir in der Fähigkeit der oocytenspezifischen 5S-rRNA-Moleküle, selbst auch TFIIIA zu binden. Sie bilden 7S-Ribonukleoproteinpartikel (RNP) sowie größere RNPs von 42S, die zusätzlich noch tRNA und weitere Proteine enthalten. Beide werden in nachweisbaren Mengen nur in Oocyten prävitellogener Entwicklungsstadien gefunden, scheinen also eine Speicherfunktion zu besitzen. Durch die Bindung von TFIIIA an 5S-rRNA wird mit steigender 5S-rRNA-

Konzentration in der Zelle die Menge an freiem TFIIIA bzw. TFIIIA in Transkriptionskomplexen reduziert, sodass ein Rückkopplungseffekt eintritt. Bei steigender 5S-rRNA-Konzentration nimmt die Transkriptionsrate ab. Das führt zu einer schnellen Abnahme der Transkription oocytenspezifischer Gene während der frühen Entwicklung (Tabelle 7.5).

Die unterschiedliche Transkription der somatischen und der oocytenspezifischen 5S-rRNA-Gene beruht auf einem Unterschied in der Bindungsaffinität des TFIIIA zur 5S-rDNA und auf dem Titer des Transkriptionsfaktors in der Zelle. Bei niedrigem Titer des Transkriptionsfaktors erfolgt die Bindung ausschließlich an die somatischen 5S-rRNA-Gene. Das Histon H1 wirkt kompetitiv zum TFIIIA-Faktor. Da das TFIIIA-Molekül auch an 5S-rRNA binden kann, wird bei steigender 5S-rRNA-Menge ein Teil der TFIIIA-Moleküle in 7S-RNPs verpackt und damit der Bindung an die 5S-rRNA-Gene entzogen. Das führt zur Abnahme der 5S-rRNA-Synthese in älteren Oocyten.

Ähnlich wie bei Xenopus gibt es auch bei Pflanzen unterschiedlich regulierte 5S-rDNARegionen. Haben wir bei Xenopus gesehen, dass die stärkste Expression während der Oogenese auftritt, so beobachten wir die stärkste Expression bei Arabidopsis in den Samen. Arabidopsis besitzt Tausende von 5S-rDNA-Genen pro haploidem Genom, die im perizentromeren Chromatin der Chromosomen 3, 4 und 5 jeweils hintereinander angeordnet sind. In Abb. 7.24 ist die Struktur der 5S-rDNA-Gene bei Arabidopsis gezeigt: Von den insgesamt sechs Genorten sind nur zwei aktiv und werden von der RNA-Polymerase III abgelesen, während die anderen vier abgeschaltet sind. Verschiedene Mutationen in den internen Promotoren (interne Kontrollregion) verhindern die Transkription. Die beiden aktiven 5S-rDNA-Blöcke umfassen etwa 150 kb; jeder enthält etwa 300 5S-rDNA-Einheiten hintereinander. Wie bei Xenopus gibt es auch in Arabidopsis in jedem dieser beiden aktiven Blöcke zwei unterschiedliche Gruppen von 5S-rDNA-Genen, die sich in 1 bis 3 Substitutio-

Tabelle 7.5 Titer von TFIIIA-mRNA und TFIIIA-Protein in verschiedenen Zelltypen von Xenopus Stadium

mRNA-Moleküle/Zelle

Frühe Oocyte

5 × 106

Oocytenstadium 4–6

1 × 106

Befruchtetes Ei

?

3 × 109

Gastrula

?

9 × 104

Schwimmende Kaulquappen

1

1–2 × 104

Nach Davidson (1986)

Proteinmoleküle/Zelle

7.4 RNA-codierende Gene

nen von Nukleotiden in der transkribierten Region unterscheiden; die eine Gruppe repräsentiert etwa 80–85 % der Transkripte – allerdings variiert diese relative Häufigkeit in verschiedenen Geweben der Pflanze und ist abhängig von ihrem Entwicklungszustand. Der-

zeit werden zwei epigenetische Regulationsmechanismen für diese unterschiedliche Aktivierung bzw. Inaktivierung diskutiert: Methylierung des Histons H3 an den Lysin-Resten 4 und 27 sowie Acetylierung am Lysin-Rest 9 charakterisieren den euchromatischen Zustand, wähAbb. 7.24 a, b 5S-rDNA in Arabidopsis thaliana. a Struktur der 5SrDNA-Einheiten. Oben sind zwei nacheinander angeordnete 5SrDNA-Einheiten gezeigt. Unten ist eine 5S-rDNA-Einheit dargestellt; das 120-bp-Transkript enthält die interne Kontrollregion mit den Promotorelementen A, IE und C. Oberhalb davon befinden sich drei Motive, die für die Transkription wichtig sind (an den Positionen −28, −13 und −1). Die Region unterhalb der transkribierten Sequenz enthält das Poly(T)Cluster, das als Terminator dient. b Lokalisation transkribierter und nicht-transkribierter 5S-rDNA. Die Genorte für die 5S-rDNA (rot) befinden sich in der pericentromeren Region (vergrößert dargestellt) der Chromosomen 3, 4 und 5. Diese Regionen enthalten eine 180-bp-Wiederholungssequenz (gelb) sowie andere Gene (blau). Die drei Regionen auf dem Chromosom 3 und die kleine Region auf dem Chromosom 5 werden nicht transkribiert (durchgestrichener Pfeil). Einzig die Regionen auf dem Chromosom 4 und die größere Region auf dem Chromosom 5 enthalten transkribierte 5S-rDNA-Gene. (Nach Douet u. Tourmente 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

rend Methylierung des Histons H3 an Lysin 9 und 27 mit der heterochromatischen Situation der 5S-rDNA in Zusammenhang steht (zu Details dieses epigenetischen Mechanismus siehe Kapitel 6.2.4 und 11.8.2). Als zweiter Mechanismus wird die Existenz einer regulatorischen RNA diskutiert (siRNA, engl. silencing RNA; Kapitel 7.5), die möglicherweise aus einem zusätzlichen Transkript von 210 bp entsteht, das außer den üblichen 120 bp noch 90 bp des Spacers enthält.

Posttranskriptionelle Modifikationen Obgleich die Sekundärstruktur der tRNA-Moleküle sich außerordentlich gleicht (Abb. 3.18), wie man auch nach ihrer Funktion bei der Translation erwarten würde, bestehen im Detail doch Längen- und Sequenzunterschiede. Die Längen der verschieden tRNAs liegen zwischen 73 und 93 Nukleotiden. Besonders auffallend ist weiterhin, dass tRNA-Moleküle viele seltene Basen aufweisen, die posttranskriptionell auf enzymatischem Wege erzeugt werden (Abb. 7.26). Vor allem

7.4.3 Die tRNA-Genfamilien Im Gegensatz zu E. coli ist im Genom von Eukaryoten jede der tRNAs in mehreren Genkopien vertreten. Die Zahl identischer Gene ist unterschiedlich, sie liegt zwischen weniger als 10 (Hefe) und einigen Hundert (mehr als 200 in Xenopus laevis) im haploiden Genom (Tabelle 7.6). Wie wir gesehen haben, liegen bei E. coli die rRNAund tRNA-Gene manchmal beisammen ‒ in Eukaryoten dagegen unterscheidet sich die Verteilung der tRNAGene in den Chromosomen grundsätzlich von der der rRNA-Gene. Identische Gene liegen selten zusammen, sondern können sich in unterschiedlichen chromosomalen Positionen befinden. Die Transkription erfolgt, wie die der 5S-rRNA und die der U6-snRNA, durch die RNA-Polymerase III. Transkribiert werden die Gene in eine Vorläufer-tRNA, die anschließend weiterbearbeitet wird. Einige der eukaryotischen tRNA-Gene haben Introns. Wesentlich für das korrekte Spleißen ist wahrscheinlich auch die besondere Sekundärstruktur der tRNA, die evolutionär von Prokaryoten bis zu höheren Eukaryoten trotz aller Nukleotidsequenzunterschiede erhalten geblieben ist (Abb. 3.18 und 3.19). Die Reifung der eukaryotischen Vorläufer-tRNAs zur reifen tRNA wurde in vielen Organismen untersucht. Die Vorläufer-tRNAs zeichnen sich dadurch aus, dass sie sowohl im 5’- (engl. leader sequence) als auch im 3’-Bereich (engl. trailer sequence) zusätzliche Sequenzen tragen. Die Abspaltung der 5’-Zusatzsequenz erfolgt durch die Ribonuklease P (RNase P). Die eukaryotische RNase P enthält im Gegensatz zu den Prokaryoten 4‒10 Proteinuntereinheiten, die auch für die Nuklease-Funktion absolut notwendig sind. Die Nachbearbeitung des 3’-Überhangs beginnt durch die Aktivität der Endonuklease RNase Z. (Abb. 7.25). Die CCA-Sequenz wird durch das Enzym Nukleotidyltransferase am 3‘-Ende an die Diskriminator-Base angeheftet; die Diskriminator-Base ist für die spezifische Aminoacylierung wichtig.

Auch tRNAs werden als Genfamilien codiert. Sie wer-

den, wie 5S-rRNA, durch die RNA-Polymerase III transkribiert. Es wird zunächst eine Vorläufer-tRNA gebildet, die anschließend weiterbearbeitet wird

Tabelle 7.6 Anzahl von tRNA-Genen in verschiedenen Organismen Art

Anzahl der Gene (n)

Saccharomyces cerevisiae

360

Tetrahymena pyriformis

800

Drosophila melanogaster

800

Xenopus laevis

7000

Rattus norvegicus

6500

Homo sapiens

1300

Aus Singer u. Berg (1991)

Abb. 7.25 Reifung der tRNA in Eukaryoten. Die Endonukleasen RNase P (blaue Schere) entfernt das übestehende 5‘-Ende und die RNase Z (rote Schere) baut das überstehende 3‘-Ende ab. RNase Z schneidet unterhalb der Diskriminator-Base unmittelbar vor der CCA-Sequenz am 3’-Ende der tRNA; sie ist wichtig für die Auswahl der Aminosäure. (Nach Redko et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

7.4 RNA-codierende Gene

Methylierungen spielen hierbei eine Rolle. Die meisten Basen bestimmen durch intramolekulare Basenpaarungen eine dreidimensionale Struktur des Moleküls, wie sie am Beispiel der tRNA für Phenylalanin zuerst ermittelt wurde. Zu dieser Basenpaarung tragen aber auch molekulare Interaktionen im Zucker-Phosphat-Bereich des Moleküls bei. Die L-förmige tRNA (Abb. 3.19) trägt am 3’-Ende, das sich durch eine kurze Einzelstrangregion mit einer CCA-Gruppe auszeichnet, die spezifische Aminosäure. An seinem entgegengesetzten Ende enthält die tRNA, eingebettet in Doppelstrangregionen, einen 7 Basen langen Einzelstrangbereich, der das Anticodon enthält. Das Anticodon wird stets durch modifizierte Basen flankiert. Diese strikt eingehaltene sterische Konfiguration im Anticodonbereich ist wahrscheinlich wichtig für die Kontrolle der genauen Basenpaarung zwischen Codon und Anticodon. Unterschiede in der tRNALänge finden sich vor allem im Übergangsbereich zwischen den beiden Armen des L-förmigen Moleküls. In diesem Bereich ist auch die Anzahl der Basenpaarungen gering. Wahrscheinlich verleiht diese Struktur dem Molekül eine Flexibilität (Scharnierwirkung), die auch für den Translationsprozess von Bedeutung sein kann. In einer zweidimensionalen Darstellung nimmt das Molekül die Form eines vierblättrigen Kleeblatts an

(engl. cloverleaf; Abb. 3.18), dessen vier „Blätter“ bestimmte Teilbereiche des Moleküls charakterisieren. Sie werden als D-Loop, Anticodon-Loop, TψC-Loop und Akzeptorstamm bezeichnet. Die meisten doppelsträngigen Bereiche enthalten evolutionär konservierte Basenpaare. Wir kennen bei Hefen inzwischen 38 Genprodukte, die an der Weiterverarbeitung bzw. Modifikation der tRNA beteiligt sind. Mutationen in diesen Genen konnten in der Regel aufgrund des verminderten Wachstums der Hefezellen identifiziert werden; die weitere genetische und biochemische Charakterisierung entschlüsselte den gesamten Mechanismus. Langsames Wachstum war beispielsweise in Mutanten beobachtet worden, denen Pus3p fehlt (verantwortlich für die Modifikationen an ψ38 und ψ39), denen Trm7p fehlt (2’-O-Methylierung an den Positionen 32 und 34) oder denen Trm5p fehlt (m1G- bzw. m1I-Bildung an Position 37).

Abb. 7.26 Chemische Struktur verschiedener seltener Nukleotide

tRNA-Moleküle bilden eine spezifische, evolutionär stark konservierte Sekundärstruktur (Kleeblattstruktur) durch intramolekulare Basenpaarungen aus. tRNA enthält eine größere Anzahl seltener Basen, die posttranskriptionell erzeugt werden.

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

Die vergleichende Untersuchung verschiedener tRNAs in verschiedenen Organismen kann uns auch etwas über die Evolution dieser Moleküle erzählen, hier bei Candida. Die Insertion eines A im Intron der Serin-codierenden tRNACGA verschiebt die Spleißstelle um eine Base und verwandelt das 5’-CGA-3’-Anticodon in ein 5’-CAG-3’-Anticodon. Damit ist eine neue tRNA kreiert, die anstelle von Serin für Leucin codiert. Die resultierende Ser-tRNACAG hat ein A an Position 37 (A37), wie es für Ser-tRNAs typisch ist. Andererseits benutzen tRNAs mit einem Leucin-Anticodon 5’-CAG-3’ m1G37, um eine Rasterverschiebung zu vermeiden. Daher bewirkt die spätere Einführung eines G an Position 37 die Aufrechterhaltung der Genauigkeit und erlaubt zusätzlich das Erkennen der tRNA durch die Leucin-tRNA-Synthetase. Damit wurde eine Situation geschaffen, in der die SertRNACAG mit beiden Aminosäuren beladen werden konnte. Im 3. Schritt des evolutionären Weges mutierte das U an Position 33 in ein G und vermindert damit die Beladung der tRNACAG durch Leucin auf 3‒5 % (im Vergleich zu Serin), indem es den Anticodon-Arm verzerrt und dadurch die Bindungseffizienz vermindert. Dieser Vorgang lässt sich auf etwa 272 ± 25 Millionen Jahre zurückdatieren und gibt einen Eindruck, welche Mechanismen bei der Evolution des genetischen Codes wirksam sind (Miranda et al. 2006).

Bewegung von tRNA in der Zelle Man ging lange Zeit davon aus, dass die meisten tRNAs nach der Synthese und Nachbearbeitung in einer Art „Einbahnstraße“ aus dem Zellkern in das Cytoplasma transportiert werden, und dort an der Translation mitwirken. Allerdings wurde in der Zwischenzeit festgestellt, dass dieses Modell zu stark vereinfacht ist. So zeigt es sich in Hefen, dass die Endonuklease, die für das Spleißen der tRNA zuständig ist, mit der äußeren Wand der Mitochondrien assoziiert ist. Diese unerwartete cytoplasmatische Lokalisation eines Schlüsselenzyms der tRNA-Reifung erklärt, warum nichtgespleißte, unreife tRNAs im Zellkern von Hefen akkumulieren, wenn sie eine Mutation tragen, die das Transportsystem von tRNAs aus dem Zellkern heraus betreffen. Die Erkenntnis, dass wichtige Schritte der tRNAReifung außerhalb des Zellkerns stattfinden, führte zu einer weiteren unerwarteten Entdeckung, dass nämlich tRNAs auch wieder in den Zellkern zurück transportiert werden können. Es wird vermutet, dass sich dahinter ein Kontrollmechanismus verbirgt, der die tRNAs auf ihre Funktionsfähigkeit überprüft. Die kürzliche Entdeckung eines neuen Poly(A)-Polymerase-Komplexes bei Hefen unterstützt diese Hypothese, da dieser Komplex tRNAs abbauen kann, die falsch gefaltet sind. Abb. 7.27 fasst diese neuen Import-ExportAbb. 7.27 Spleißen und Transport von tRNA in Saccharomyces cerevisiae. Es werden tRNA-Moleküle, die am 5’- und 3’-Ende bearbeitet wurden, aus dem Zellkern durch das Ran-GTP-abhängige System heraustransportiert; das Spleißen der tRNAs mit einem Intron findet dann im Cytoplasma statt. Sowohl gespleißte als auch ungespleißte DNA werden in den Zellkern zurücktransportiert, wo sie auf ihre Funktionalität hinsichtlich der Aminoacetylierbarkeit untersucht werden. Nicht funktionelle tRNA (d. h. falsch gefaltete tRNA), deren 3’-Ende nicht durch eine Aminosäure geschützt ist, werden durch den Poly(A)-Polymerase-Komplex abgebaut. (Nach Dahlberg u. Lund 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

7.5 Kleine regulatorische RNAs

Mechanismen der tRNAs in Hefen zusammen. Es soll an dieser Stelle erwähnt sein, dass bei Vertebraten das Spleißen von tRNA auf den Zellkern beschränkt ist.

tRNA-Moleküle werden in Hefe nicht nur aus dem

Zellkern ins Cytoplasma transportiert, sondern können auch wieder in den Zellkern zurückkommen.

7.5 Kleine regulatorische RNAs Ein wesentliches Moment in der funktionellen Analyse von Genen besteht immer darin, Mutationen zu untersuchen, die zu einem Funktionsverlust oder Funktionsgewinn führen (siehe auch Kapitel 9). In der experimentellen Genetik gibt man sich aber nicht damit zufrieden, nur die Mutationen zu untersuchen, die wir quasi in der Natur vorfinden (oder durch ungerichtete Mutagenese zufällig erzeugen), sondern man will oft bestimmte Gene ausschalten oder hinzufügen. Die Herstellung von Knock-out-Mäusen bzw. von transgenen Mäusen (Technik-Boxen 22 und 28) sind dafür aktuelle Beispiele. Manchmal gibt es aber auch einfachere Wege, um Gene auszuschalten. Guo und Kemphues (1995) haben es bei dem Fadenwurm C. elegans durch die Zugabe von Gegenstrang-RNA versucht. Überraschenderweise stellten sie dabei fest, dass der Sinn-Strang genauso aktiv ist wie der Gegenstrang; die gleichzeitige Injektion eines Sinn- und eines Gegenstrangs in einen C. elegans-Embryo erhöhte jedoch die Effizienz des Ausschaltens um den Faktor 10. Es stellte sich dann heraus, dass die aktiv inhibitorische Spezies die Doppelstrang-RNA ist (dsRNA; Fire et al. 1998). Es ergab sich ferner, dass dieses Ausschalten von Genen durch RNA (RNA-Interferenz, auch als RNAi abgekürzt) über mehrere Zellteilungen hinweg aufrechterhalten wurde – ein typisch epigenetisches Phänomen. In dieser Zeit häuften sich auch ähnliche Berichte aus anderen Organismen, z. B. bei Neurospora crassa (Cogoni u. Macino 1997) oder in Pflanzen (Napoli et al. 1990). Für ihre grundlegenden Arbeiten auf diesem rasant expandierenden Gebiet bekamen Andrew Z. Fire und Craig C. Mello im Jahr 2006 den Nobelpreis für Medizin. 1990 versuchte eine Gruppe von Wissenschaftlern um C. Napoli, die Blütenfarbe von Petunien zu verstärken, indem die Integration eines Transgens die Expression der Chalkon-Synthase verstärken sollte (Chalkon-Synthase ist wesentlich an der Pigmentierung bei Petunien beteiligt; Napoli et al. 1990). Überraschenderweise hatten die veränderten

Pflanzen aber keine verstärkten Farben, sondern waren vielfarbig oder sogar weiß. Das deutete darauf hin, dass nicht nur das Transgen, sondern auch die endogenen Pigmentgene ausgeschaltet wurden. Eine weitere Überraschung war, dass die weiße Blütenfarbe auch noch auf die nächsten Generationen übertragen wurde. Spätere Experimente ergaben, dass dieses Abschalten des Transgens mit dem endogenen Abwehrsystem der Pflanze gegen Viren verknüpft war. Moderne Pflanzen haben also offensichtlich ein gut funktionierendes Abwehrsystem gegenüber Virusangriffen, das auf der Ebene der RNA-Erkennung wirkt. Allerdings haben die Viren wiederum in einem klassischen evolutionären Wettbewerb Gegenproteine entwickelt, z. B. HC-Pro (engl. helper component proteinase). Dieses setzt offensichtlich oberhalb der dsRNA-Bildung an und aktiviert ein pflanzliches Gen, das für ein Calmodulin-ähnliches Protein codiert und den Abschaltmechanismus insgesamt reguliert (engl. regulator of gene silencing – Calmodulin-related protein, rgs-CaM). Ausgehend von HC-Pro werden jetzt gentechnologische Strategien erarbeitet, um das Abschalten von Transgenen in Pflanzen zu verhindern und so ihre effiziente Expression zu ermöglichen. Wie wir oben bereits gesehen haben, wurde RNAInterferenz zuerst in C. elegans entdeckt. Dieser Wurm hat für solche Experimente einige methodische Vorteile, da er quasi in dsRNA-Lösungen gebadet oder mit Bakterien gefüttert werden kann, die dsRNA produzieren. Außerdem war von C. elegans schon früh das gesamte Genom bekannt. Dadurch konnte in diesem Organismus der erste genomweite RNA-InterferenzScreen durchgeführt werden, wobei mehr als 16.000 der bekannten 19.427 Gene von C. elegans untersucht wurden. Dabei wurden 1722 Mutanten phänotypisch identifiziert. Überraschend dabei war, dass Gene mit ähnlicher Funktion in bestimmten Regionen als Cluster auftreten. Diese Regionen umfassen mehrere MegaBasen, und die darin vorkommenden Gene neigen zu ähnlichen Expressionsmustern (Kamath et al. 2003). Die spätere Beobachtung von RNA-Interferenz in Kulturen von Säugerzellen war zunächst nicht trivial, da die Einführung von dsRNA in eine Interferonähnliche Abwehrantwort mit Apoptose mündete. Erst die direkte Einführung einer besonders kurzen Form (21 bis 23 Nukleotide) von RNA „triggerte“ die RNAInterferenz-Maschinerie auch in Säugerzellen – allerdings zunächst mit geringer Effizienz. Neuere Arbeiten beschreiben die Konstruktion von Vektoren, die über invertierte Wiederholungssequenzen Haarnadelstrukturen ausbilden und damit zu einer stabilen und effizienten Abschaltung von Genen führen. Heute gehen wir davon aus, dass das Ausschalten von Genen über RNA-Interferenz ein alter Selbstvertei-

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

digungsmechanismus von Eukaryoten ist, um Infektionen durch RNA-Viren oder Transposons (Kapitel 8.1) abzuwehren. Während der Replikation des viralen Genoms wird dsRNA produziert, die von der Zelle erkannt und abgebaut werden kann. Wie wir aber sehen werden, ist dieser Aspekt nur der Anfang eines komplexen Regelwerks.

7.5.1 Mechanismus der RNA-Interferenz RNA-Interferenz ist noch ein relativ junges Forschungsgebiet, und wir werden abwarten müssen, ob sich tatsächlich alle Arten der RNA-vermittelten Genabschaltung unter diesen Mechanismus subsummieren lassen. Die dsRNA-induzierte Abschaltung von Genen benötigt eine breite Palette verschiedener Enzyme; dazu gehören Helikasen, RNasen und RNA-abhängige RNAPolymerasen. Ein Charakteristikum der dsRNA-indu-

zierten Abschaltwege in Nematoden, Trypanosomen, Fliegen, Pflanzen und Säugern ist die Spaltung einer dsRNA durch eine Doppelstrang-spezifische RNase, die als Dicer bezeichnet wird. Dicer spaltet dsRNA in Fragmente von 21 bis 25 Nukleotiden, die dann für die Abschaltung verantwortlich sind; sie enthalten am 3’-Ende jeweils einen Überhang von 2 Nukleotiden. Diese kleinen dsRNA-Fragmente wurden zunächst in Pflanzen beobachtet und später in vielen anderen Spezies entdeckt. Sie bilden mit einigen Proteinen Ribonukleotid-Protein-Komplexe, die in Abhängigkeit von ATP den RNA-Doppelstrang aufschmelzen und in seine aktive Form überführen (engl. RNA-induced silencing complex, RISC). Dieser Komplex präsentiert den Gegenstrang der ursprünglichen dsRNA seiner Zielsequenz und leitet damit das Abschalten des entsprechenenden Gens ein; einen groben Überblick über den allgemeinen Mechanismus gibt Abb. 7.28.

Abb. 7.28 Allgemeiner Mechanismus der RNA-Interferenz. Die anfänglich doppelsträngige RNA (aus verschiedenen Quellen) wird durch die Nuklease Dicer in kleine, interferierende RNA-Fragmente (~ 20–30 Nukleotide) gespalten. Ein Strang des verarbeiteten Doppelstrangs bindet an das Argonaute-Protein und ermöglicht dadurch eine sequenzspezifische Bindung (über Watson-Crick-Basenpaarung) an seine Ziel-RNA. Wenn die Ziel-RNA erkannt ist, wird die Expression über einen der angegebenen Mechanismen moduliert, wobei die Auswahl vom biologischen Kontext abhängt. (Aus Carthew u. Sontheimer 2009, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

7.5 Kleine regulatorische RNAs

Eine zentrale Rolle bei der RNA-Interferenz spielt das Enzym Dicer: es ist eine dsRNA-spezifische Nuklease der RNaseIII-Familie; sie enthält ein dsRNAbindendes Motiv und am N-Terminus eine DexH/ DEAH-RNA-Helikase/ATPase-Domäne sowie ein Motiv, das als „PAZ“-Domäne bezeichnet wird (PAZ aus Piwi-Argonaute-Zwille – das sind verwandte Proteine aus Drosophila; Abb. 7.29a). RNaseIII produziert

aus langer dsRNA Sequenz-unabhängig einheitlich kleine RNA-Fragmente, wovon die Bezeichnung Dicer abgeleitet wurde (aus dem Amerikanischen: Würfelschneidemaschine). Dicer ist evolutionär stark konserviert; homologe Proteine wurden in Hefen, Würmern, Pflanzen und Säugern gefunden. Einige Beispiele sind in Abb. 7.29 gezeigt.

Abb. 7.29 a–c Struktur der Enzyme der RNaseIII-Familie. a Die Enzyme der RNaseIII-Familie enthalten mehrere funktionelle Domänen: Am N-Terminus besitzt nur das humane Dicer-Enzym eine Helikase-Aktivität (DEXD/H-Box), der in der Mitte des Proteins für Dicer charakteristische Domänen folgen (DUF283, engl. domain of unknown function; PAZ, benannt nach den ersten drei Mitgliedern dieser Familie: Piwi, Argonaut und Zwille). Dahinter befinden sich ein oder zwei katalytische RNaseIIIDomänen. Am C-Terminus enthalten einige Enzyme ein Motiv für die Bindung doppelsträngiger RNA (engl. double-stranded RNA-binding domain, dsRBD). b Zwei typische RNaseIII-Enzyme sind dargestellt: links die Kristallstruktur der RNAfreien RNaseIII von Thermotoga maritima; rechts die RNaseIII von Aquifex aeolicus, die geschnittene dsRNA enthält. Die Farben der Proteindomänen entsprechen denen in a; die RNA ist gold, Mg2+-Ionen in den aktiven Zentren sind violett dargestellt, und die Schnittstellen in der DNA sind durch Pfeile markiert. Aus dieser Struktur wird deutlich, dass die dsRBD (blau) eine deutliche Rotation bei der Substrat-Bindung durchführen. c Der molekulare Mechanismus ist am Beispiel der dsRNA-Spaltung durch das DicerEnzym von Giardia intestinalis gezeigt: links die Kristallstruktur in der RNA-freien Form und rechts mit gebundener dsRNA. In diesem Modell führt das Ankoppeln des 3’-Überhangs des RNA-Substrats in der PAZ-Domäne zur Spaltung in einem Abstand von 65 Å (6,5 nm) vom 3’-Ende. (Nach Jinek u. Doudna 2009, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

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316

Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

Heute können wir drei Klassen kleiner, nichtcodierender, regulatorischer RNA-Moleküle unterscheiden: siRNA (engl. short interfering RNA), miRNA a

b

siRNA (Mensch)

(engl. micro RNA) und piRNA (engl. PIWI-interacting RNA). Sie werden im Folgenden besprochen; einen detaillierten Überblick gibt Abb. 7.30.

miRNA (Mensch) AAAAA

c piRNA (D. melanogaster) sense-Transkript eines Transposons

prä-miRNA

Dicer Drosha 3’ lange dsRNA

5’

DGCR8

m7G

5’

Zellkern Cytoplasma

prä-miRNA

3’

Zerkleinern

5’ PIWI / AUB

3’ Dicer

antisense-piRNA miRNA-miRNA*Duplex AGO2

siRNA-Duplex

Argonaute

TRBP

TRBP

Bindung an RISC-Komplex

Bindung an RISC-Komplex

Spaltung des BeifahrerStrangs

5’

3’ AGO3-Bindung Bearbeitung des 3’-Endes

3’

5’ AGO3 sense-piRNA

Zerkleinern

5’ Entfernung des BeifahrerStrangs

Entfernung des BeifahrerStrangs Zerkleinern der Ziel-mRNA 3’ Freisetzung des Produkts Recycling von RISC

mRNA m7G 5’

5’

3’ antisenseTranskript eines Transposons 3’

Deadenylierung PIWI-Bindung Bearbeitung des 3’-Endes 5’

AAAAA Hemmung der Translation

3’

mRNA

Ribosom

Abb. 7.30 a–c Biogenese und Wirkungsmechanismen der wichtigsten Klassen kleiner regulatorischer RNAs. a Kurze interferierende RNA (siRNA) entsteht aus langer doppelsträngiger RNA (dsRNA), die bei der viralen Replikation, der Transkription zellulärer Gene oder der experimentellen Transfektion entstehen können. Die Endonuklease Dicer schneidet diese dsRNA in einem Abstand von ~ 21–25 Nukleotiden. Danach wird ein Strang des siRNA-Duplex (der Fahrer-Strang) an das Argonaute-Protein (AGO2) gebunden, das den Kern des RNA-induzierten Abschaltungskomplexes (RISC) darstellt. Während der Bindung wird der Beifahrer-Strang durch das Argonaute-Protein gespalten und abgestoßen. Dieses kann mit dem verbleibenden RNA-Strang perfekt an die Zielsequenz binden und zerschneidet sie. Danach wird die zerkleinerte RNA abgestoßen und RISC steht erneut zum Schneiden von RNA zur Verfügung. b miRNAs sind im Genom codiert und umfassen als primäre Transkripte ~ 65–70 Basen, die durch Haarnadelschleifen charakterisiert sind. Im Zellkern werden diese Haarnadelstrukturen durch den Drosha-DGCR8-Komplex entfernt und die prä-miRNA wird ins Cytoplasma entlassen. Dort schneidet Dicer die prä-miRNA auf die Größe der miRNA

(~ 21–25 Nukleotide). Die miRNA liegt noch als Duplex vor, wobei ein Strang als „Fahrer“ an das Argonaute-Protein bindet und der andere Strang („Beifahrer“) entfernt wird. Es wird vermutet, dass die miRNA-vermittelte Inaktivierung die Translation direkt hemmt und über eine Entfernung des Poly(A)-Schwanzes der mRNA zu einer Destabilisierung der mRNA führt. c piRNAs umfassen ~ 24–31 Nukleotide und schalten in Keimzellen von Tieren mobile genetische Elemente (Transposons) ab. Die Vorläufer der piRNAs sind einzelsträngig, sodass ein Dicer-vermittelter Mechanismus entfällt. Die Wirkung der piRNA wird durch einen Komplex mit Proteinen der PIWI-Familie vermittelt (dazu gehören in Drosophila PIWI, Aubergine [AUB] und Argonaute 3 [AGO3]). PIWI oder AUB-vermitteltes Zerschneiden von sense-Transkripten führt zu sense-piRNAs, die dann mit AGO3 einen Komplex bilden und so das Zerschneiden von antisense-Transkripten der Transposons einleiten. Diese zerschnittenen antisense-Transkripte führen jedoch wieder zu antisense-piRNAs, die daraufhin PIWI und AUB binden und damit das Zerschneiden der sense-Transkripte der Transposons herbeiführen. (Nach Jinek u. Doudna 2009, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

7.5 Kleine regulatorische RNAs

Die siRNAs werden aus doppelsträngiger RNA (dsRNA) gebildet, die Hunderte bis Tausende Basenpaare umfasst und durch RNA-Polymerase III synthetisiert werden. Ursprünglich dachte man, dass nur exogene dsRNA (als Folge viraler Infektionen) zu siRNA führen kann, aber inzwischen wissen wir, dass es auch endogene siRNA-Vorläufer gibt. Diese längeren Vorläufermoleküle werden durch verschiedene Mechanismen zu kurzen (21–25 Nukleotide) dsRNA-Molekülen abgebaut, die dann die eigentliche biologische Wirkung entfalten. Die miRNAs werden aus einzelsträngiger RNA gebildet, die als antisense-Transkripte zu bekannten Genen transkribiert wurden; sie haben ihren Ursprung in intergenischen Regionen oder in Introns. Gene, die miRNA codieren, werden üblicherweise durch RNAPolymerase II transkribiert, zu Strukturen mit Haarnadelschleifen weiterverarbeitet und in das Cytoplasma transportiert. Dort werden sie – ähnlich wie die siRNA – zu kleinen (21–25 bp) Fragmenten abgebaut. Die piRNAs haben eine Länge von 24–31 Nukleotiden, und sie inaktivieren mobile genetische Elemente (Transposons; Kapitel 8.1) in männlichen Keimzellen. Die Vorläufer der reifen piRNAs sind einzelsträngige RNAs; die Gene für piRNAs liegen in der Regel in Clustern bisher nicht annotierter Regionen des Genoms.

RNA-Interferenz ist eine evolutionär sehr alte Metho-

de vieler Organismen, um sich gegen virale Infektionen zu schützen. Dabei wird dsRNA durch eine Typ-III-RNase (Dicer) in kleine Fragmente (21 bis 23 Nukleotide) gespalten, die sich an ihre Zielregion in der mRNA anlagern. Die Wirkung der einzelnen siRNA-Moleküle wird durch Amplifikation mithilfe einer RNA-abhängigen RNA-Polymerase vervielfacht.

Die bisherigen Arbeiten haben dazu geführt, auch über ein mögliches therapeutisches Potenzial der RNA-Interferenz und siRNA nachzudenken – quasi als Alternative oder Ergänzung zu einer Impfung. In einer Vielzahl von Experimenten wurde die prinzipielle Anwendbarkeit dieses Ansatzes zur Heilung von Krankheiten im Tiermodell bestätigt (für eine Übersicht siehe Bumcrot et al. 2006). Zwei Beispiele mögen das beleuchten: Aderneubildung in der Choroidea (Aderhaut) des Auges ist eine wichtige Ursache der altersabhängigen Macula-Degeneration (eine häufige Erblindungsursache im Alter). In der Maus ist es gelungen, die Aderneubildung durch Gabe von siRNA gegen den vasculären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) um 84 % zu vermindern (Cashman et al. 2006). Allerdings kann eine Übersättigung mit

siRNA in Leberzellen erwachsener Mäuse auch tödliche Folgen haben (Grimm et al. 2006).

7.5.2 Kleine interferierende RNA (siRNA) Der klassische Auslöser der RNA-Interferenz ist eine lange, lineare dsRNA, die eine perfekte Basenpaarung mit ihrer Zielsequenz ermöglicht. Wie wir oben gesehen haben, wird sie dann durch Dicer weiterverarbeitet. Ursprünglich wurde diese lange dsRNA in transgenen Pflanzen oder in Pflanzen nach einer Virusinfektion entdeckt. Später hat man Centromere, Transposons (Kapitel 8.1) oder andere repetitive Sequenzen als Quellen der siRNA identifiziert, und heute wissen wir, dass siRNA auch aus spezifischen genomischen Transkripten hergestellt werden kann. siRNAs sind also nicht nur Produkte exogener Nukleinsäuren, sondern entstehen ebenso aus endogenen genomischen Regionen. Sie werden durch RNA-Polymerase III synthetisiert, und diese Vorläufer haben eine obligate Phase im Zellkern. In Abb. 7.30a ist auch der zentrale Schritt der Herstellung aktiver siRNA-Moleküle gezeigt, nämlich die Bildung von RISC (engl. RNA-induced silencing complex). Dazu lagern sich mindestens drei Proteine aneinander: Dicer, Argonaute-2 (Ago2) und TRBP (engl. trans-activation-responsive RNA-binding protein); dieser Komplex bindet die dsRNA, schneidet sie in die kurzen siRNA-Fragmente und verwirft einen der beiden RNA-Stränge, der im englischen Schrifttum als „passenger strand“ und hier als „Beifahrer-Strang“ bezeichnet wird. Dabei zeigen die basischen Argonaute-Proteine RNA-bindende und Mg2+-abhängige Endonuklease-Aktivitäten. Durch diese Reaktion wird RISC aktiviert, und der „guide strand“ („FahrerStrang“) kann seine inaktivierende Wirkung entfalten. Dabei erscheint die Auswahl des zu eliminierenden Strangs nicht von der Anwesenheit des Zielstrangs abhängig zu sein, sondern allein von den relativen thermodynamischen Stabilitäten der beiden Enden des Doppelstrangs: Derjenige der beiden Stränge, dessen 5’-Ende die weniger stabile Basenpaarung zeigt, wird als Fahrer-Strang bevorzugt. Die thermodynamische Asymmetrie führt damit eher zu einer abgestuften Wirkung und folgt weniger einem Alles-oder-nichtsPrinzip. Die Details dieses Mechanismus scheinen allerdings bei verschiedenen Spezies unterschiedlich ausgestaltet und sind Gegenstand vielfältiger Untersuchungen. Ebenso verhält es sich mit den verschiedenen Cofaktoren, die notwendig sind, um die unterschiedlichen siRNAs herzustellen und RISC zu aktivieren. Die verschiedenen Möglichkeiten, wie siRNA Zielgene inaktivieren kann, sind in Abb. 7.31 zusammengefasst. In der klassischen RNA-Interferenz führt der

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

Abb. 7.31 Mechanismen der Inaktivierung durch siRNA. Während der klassischen RNA-Interferenz (rechts unten) erkennt der siRISC-Komplex (Ago) perfekt komplementäre mRNA und führt zu einer Ago-katalysierten Spaltung der mRNA. Nach der Spaltung wird der funktionelle siRISC-Komplex regeneriert und die gespaltene mRNA weiter abgebaut. siRNA kann aber auch unvollständig an Zielsequenzen binden (rechts oben). In einigen Fällen kann sie Zielgene durch miRNA-ähnliche Mechanismen (Hemmung der Translation, exonukleolytischer Abbau; Abb. 7.32) stilllegen. Schließlich kann der siRISC-Komplex aber auch zur Bildung von Heterochromatin führen (links) – dabei bindet er an entstehende Transkripte und RNA-Polymerasen (RNA-Pol II in Hefen und RNA-Pol IV/V in A. thaliana). In Pflanzen (links unten) führt das zur Aktivierung einer DNA-Methyl-

transferase (DMT), die DNA methyliert und damit zur Bildung von Heterochromatin führt. In Hefen (und wahrscheinlich auch in Tieren; links oben) ist eine Histon-Methyltransferase (HMT) beteiligt, die den Lysin-Rest 9 im Histon H3 methyliert und dadurch zur Bildung von Heterochromatin führt. In den meisten Eukaryoten (außer Insekten und Säugern) induziert der siRISCKomplex die Synthese sekundärer dsRNAs und siRNAs durch RNA-abhängige RNA-Polymerasen (RdRP; Mitte unten). Diese sekundären dsRNAs werden durch Dicer gespalten und dem Pool der aktiven siRISC-Komplexe hinzugefügt. In Nematoden treten viele dieser sekundären siRNAs als einzelsträngige Transkripte mit 5’-Triphosphaten (PPP) auf und benötigen keine Bearbeitung durch Dicer. (Nach Carthew u. Sontheimer 2009, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

gebundene Einzelstrang RISC zu einem perfekt passenden Transkript, das dann abgebaut wird. Der RNAAbbau erfolgt durch die Piwi-Domäne des Argonauten-Proteins und ist sehr präzise: Es wird die Phosphodiesterbindung zwischen den Nukleotiden 10 und 11 (gezählt vom 5’-Ende her) gespalten, wobei Produkte mit einem 5’-Monophosphat und mit einem 3’-OHEnde entstehen. Nach diesem initialen Schnitt wird der Abbau durch Exonukleasen vollendet. Durch zusätzliche Faktoren und unter ATP-Verbrauch kann RISC wieder in seine aktive Form zurückgeführt werden. Wenn jedoch der siRNA-Strang nicht korrekt auf Transkripte passt, kann eine Hemmung der Ziel-RNA

durch Repression der Translation erfolgen – dieser Mechanismus ist nicht unterscheidbar von der Inaktivierung durch miRNA, den wir im nächsten Abschnitt besprechen werden. Eine weitere Möglichkeit der Inaktivierung durch RISC besteht in der Bildung von Heterochromatin; dieser Mechanismus ist am besten in der Hefe untersucht, kommt aber auch in Pflanzen und Tieren vor. Dabei wird das Argonauten-Protein durch die gebundene siRNA an spezifische chromosomale Regionen herangeführt, wobei die siRNA offensichtlich wachsende Transkripte erkennt. Durch diese Wechselwirkung wird die Methylierung von Histon H3 am Lysin-Rest 9 (H3K9) erleichtert und die Kondensation

7.5 Kleine regulatorische RNAs

des Chromosomenabschnitts eingeleitet. In Pflanzen erfolgt die Heterochromatisierung eher über DNAMethylierung statt über Histon-Methylierung.

7.5.3 Mikro-RNA (miRNA) Obwohl wir in den vergangenen Jahren schon einiges über miRNAs gelernt haben, sind wir noch weit davon entfernt, einfache Regeln ihrer Entstehung und ihres Wirkmechanismus aufzustellen. miRNAs zeigen sehr verschiedene Aspekte und widersetzen sich einer einfachen Klassifizierung. Mannigfaltigkeit ist eine Schlüsseleigenschaft von Lebensvorgängen – und die miRNAs bilden darin keine Ausnahme. miRNAs werden bei Pflanzen und Tieren gefunden und von einer verblüffenden Anzahl von Genen codiert. Diese Gene werden von der RNA-Polymerase II transkribiert, sie erhalten eine 5’-Kappe und ein Poly(A)-Ende. Ein miRNATranskript kann entweder Gruppen verschiedener miRNAs enthalten oder auch ein Protein-codierendes Transkript; in diesem Fall befindet sich der miRNAcodierende Bereich oft in einem Intron. Es ist wahrscheinlich, dass viele miRNAs durch Nukleotidaustausche entstanden sind und nicht so sehr durch Duplikationsereignisse. Bei miRNAs, die in Introns liegen, ist durch die Regulation der Expression des Gesamtgens auch die Expression der miRNA gewährleistet, sodass keine eigenen regulatorischen Mechanismen entwickelt werden müssen. Das primäre miRNA-Transkript enthält zunächst noch zusätzliche Abschnitte oberhalb und unterhalb der eigentlichen miRNA-Sequenz, die abgeschnitten werden müssen, um eine reife und aktive Form der miRNA zu erhalten. Üblicherweise bilden in einer primären miRNA ungefähr 33 Nukleotide einen unvollständig gepaarten Stamm mit einer Haarnadelschleife. Im ersten Verarbeitungsschritt, der im Zellkern stattfindet, schneidet Drosha (in Tieren) bzw. in Pflanzen durch das Dicer-ähnliche Enzym Dcl1 (engl. dicer-like 1) diesen Stamm mit Haarnadelschleife ab; in einem zweiten Schritt wird eine terminale Haarnadelschleife abgeschnitten, sodass dann der reife miRNA-Doppelstrang mit einer Länge von ca. 22 Nukleotiden entsteht. In Pflanzen wird der zweite Schritt auch durch Dcl1 im Zellkern durchgeführt, wohingegen in Tieren dieser zweite Schritt durch Dicer im Cytoplasma erfolgt (Abb. 7.28). Ein wesentlicher Unterschied zwischen miRNAs und den meisten siRNAs besteht in der Genauigkeit der Enden. Dies wird durch den ersten Schnitt erreicht, der üblicherweise in einem Abstand von 11 Nukleotiden von dem Übergang des doppelsträngigen Stamms zu der flankierenden Region durchgeführt wird. Dieser Abstand entspricht genau einer Windung der dsRNAHelix und ist der minimale Abstand, bei dem ein

RNaseIII-Enzym schneiden kann. In analoger Weise schneidet Dicer in einem Abstand von ungefähr 22 Nukleotiden (2 dsRNA-Helix-Windungen) vom Ende, weil die PAZ-Domäne von Dicer bevorzugt an die Enden eines dsRNA-Strangs bindet. Allerdings ist dieser Mechanismus im Detail noch komplexer und von mehreren Cofaktoren abhängig, die sich auch von Spezies zu Spezies unterscheiden können. Der nächste Schritt besteht wie bei den siRNAs in der Bindung an RISC, wobei die Auswahl des Strangs, der an RISC gebunden bleibt, nicht so eindeutig ist wie bei den siRNAs. Die an RISC gebundene miRNA dirigiert den gesamten Komplex an die Bindestelle des Zieltranskripts; diese Bindestellen liegen bei Pflanzen in der codierenden Region und bei Tieren in der Regel in der nicht-translatierten Region des 3’-Endes. Im Gegensatz zu den Pflanzen erfolgt bei Tieren die Bindung nicht durch vollständige Basenpaarung, sondern enthält auch Ausbuchtungen und Fehlpaarungen; wichtig sind aber vollständige Basenpaarungen der Nukleotide 2‒8 der miRNA (engl. seed region). Wie klassische Mutationen (Kapitel 9), können auch Mutationen in miRNAs zu Erbkrankheiten führen. Punktmutationen in der seedRegion von miR-96 führen zu einem nicht-syndromischen, progressiven Verlust des Hörvermögens. Mencía et al. (2009) berichten von zwei verschiedenen Mutationen (+13G→A; +14C→A) in zwei Familien; der dritte „Fall“ (Lewis et al. 2009) ist eine Mutation in der Maus und betrifft die nächste Base in der seed-Region (+15A→T). Die Autoren der Familienstudie untersuchten den Einfluss der Mutationen auf einige Zielgene. Dabei zeigte die Wildtyp-Form von miR-96 in allen Fällen eine Hemmung um etwa 50 %, die durch die mutierten Formen teilweise wieder aufgehoben wurden. Die Autoren der Maus-Mutante stellten darüber hinaus fest, dass in der Mutante zwei Gene fast vollständig abgeschaltet sind. Beide Gene werden in den Haarzellen der Cochlea exprimiert und sind vermutlich für deren Degeneration verantwortlich. Die beiden Arbeiten zeigen in sich ergänzender Weise zum ersten Mal die Bedeutung von Mutationen in einer miRNA für den Ausbruch einer Erbkrankheit mit Mendel’schem Erbgang. Allerdings sind die Mechanismen, durch die die entsprechenden Zielgene durch miRNA stillgelegt werden, noch Gegenstand intensiver Arbeiten. Einige Möglichkeiten sind in Abb. 7.32 dargestellt; es werden insbesondere drei Modelle diskutiert: 1. Konkurrenz zwischen dem miRNA-aktivierten RISC und dem 5’-Ende der mRNA um die Methylguanosin-Kappe;

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

Abb. 7.32 Verschiedene mögliche Mechanismen der miRNAvermittelten Hemmung. Nicht-reprimierte mRNA rekrutiert Initiationsfaktoren und ribosomale Untereinheiten von zirkulären Strukturen, die die Translation verstärken (oben). Wenn miRISC-Komplexe an mRNAs binden, können sie die Initiation der Translation im Stadium der Erkennung der 5’-Kappe unterdrücken (links oben) oder später im Stadium der Bindung an die 60S-Ribosomenuntereinheit (links unten). Alternativ können sie

auch die Deadenylierung der mRNA initiieren und dadurch die Zirkularisierung der mRNA hemmen (unten). Sie können ebenso ein vorzeitiges Ablösen der mRNA vom Ribosom initiieren (rechts unten). Schließlich besteht die Möglichkeit, den mRNAAbbau durch Deadenylierung und anschließendes Entfernen der 5’-Kappe zu beschleunigen. (Nach Carthew u. Sontheimer 2009, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

2. Stimulierung der Deadenylierung am 3’-Ende der mRNA durch den miRNA-aktivierten RISC; 3. Blockade der Assoziation der 60S-ribosomalen Untereinheit und der 40S-ribosomalen Untereinheit durch den miRNA-aktivierten RISC.

entsprechenden murinen Homologe Miwi und Mili sowie das Zebrafisch-Homolog Ziwi haben sich als essenziell für die Spermatogenese erwiesen. Kleine doppelstränge RNA-Moleküle, die mit dieser Proteinfamilie interagieren, werden als piRNAs bezeichnet. Neben dem Piwi-Protein spielt auch das Protein Aubergine (Gensymbol Aub) eine wichtige Rolle. Es wird bei Drosophila benötigt, um die Polzellen (Abb. 11.18) zu bilden; es zeigt Ähnlichkeit mit dem Translations-Initiationsfaktor 2C. PiRNAs unterscheiden sich von den oben besprochenen si- und miRNAs durch ihre durchschnittliche Länge von 24‒31 Nukleotiden. Außerdem sind sie (wie die miRNA von Pflanzen) am 3’-Ende methyliert. Abb. 7.33 gibt einen Überblick über die Biogenese der piRNAs sowie über den Mechanismus, mit dessen Hilfe die Wirkung der piRNAs wesentlich verstärkt werden kann. Dieser Mechanismus erinnert an die Verstärkung der siRNA-Wirkung, die wir bereits in Abb. 7.31 kennengelernt haben. Die Gene für piRNAs befinden sich in wenigen genomischen Regionen; einzelne Gruppen umfassen

Wir sind im Moment noch nicht in der Lage, einen einheitlichen Wirkmechanismus zu beschreiben und die verschiedenen Aspekte diesem zuzuordnen – es könnte natürlich auch sein, dass es verschiedene Mechanismen gibt, die Spezies- und Kontext-abhängig (z. B. im Zellzyklus) unterschiedlich ablaufen.

7.5.4 Piwi-interagierende RNA (piRNA) Die piRNAs haben ihren Namen aufgrund der Bindung an Piwi-Proteine, einer Untergruppe der Argonaute-Proteine. Sie wurden zunächst in Drosophila identifiziert und sind für die Funktion der Keimzellen unerlässlich (engl. P element-induced wimpy testes); die

7.5 Kleine regulatorische RNAs

A

B

C

D

E

genomisches piRNA-Cluster

Bearbeitung primärer piRNAs Piwi/Aub antisense- 5’ UACGCAGAGGCCUAAGUAAAUAGUC 3’ piRNA

CUCC 5’ UAUCCG AUGCGU 3’ AGCCGACGG 3’ AGCCGACGGUAUCCGAUGCGUCUCC 5’ C 5’ UGCGUCUC GUAUCCGA CG C 5’ GA UCUC CC UGCG 3’ AG 3’ AGCCGACGGUAUCCGA UGCGUCUCC 5’ 3’ AGCCGACGGUAUCCGA

Piwi/Aub 5’ UACGCAGAGGCCUAAGUAAAUAGUC 3’ Ziel: Transposon3’ CCCUCGAGCCGACGGUAUCCGAUGCGUCUCCGGAUUCAUUUAUCAGCUAAGUAACCCGGCG 5’ Transkript

Spaltung eines Transposon-Transkripts erzeugt neue sense-piRNAs

antisensepiRNA

Piwi/Aub 5’ UACGCAGAGGCACCUAUGCGAUCGG 3’

AGO3

AGO3 3’ AGCCGACGGUAUCCGAUGCGUCUCC 5’ sensepiRNA

Spaltung eines Transkripts aus einem piRNA-Cluster erzeugt neue antisense-piRNAs

3’ AGCCGACGGUAUCCGAUGCGUCUCC 5’ genomisches 5’ GCCGCAUACGUCGGCUGCCAUAGGCUACGCAGAGGCACCUAUGCGAUCGG CAAUUCUCAGUC 3’ piRNA- Cluster 5’ UACGCAGAGGCACCU AUG

CGAUCGG 3’

5’ UACGCA GA

GGCACCUA UG CGAUCG G 3’ CGG 3’ AU CG UG UA CACC GG GA AUGCGAUCGG 3’ CA CCU CG 5’ UA 5’ UACGCAGAGGCA 5’ UACGCAGA GGCACCUA UGCGAUCG G 3’

Abb. 7.33 Amplifikation der piRNA-Biogenese. Piwi-vermittelte Spaltungen erzeugen neue piRNAs, wodurch ein sich selbst verstärkender Kreislauf entsteht. Der Zyklus beginnt mit der Bearbeitung der primären piRNAs, die aus defekten Kopien von Transposons in heterochromatischen Regionen entstehen (A–E). Piwi-Proteine spalten die Zielgene zwischen den Nukleotiden 10 und 11 vom 5’-Ende der piRNAs; eine Endonuklease spaltet das 3’-Ende der piRNA-Vorläufer. Primäre piRNAs haben eine antisense-Orientierung zu exprimierten Transposons und binden entweder Piwi- oder Aubergine (Aub)-Proteine. Die Piwi/Aub-Komplexe identifizieren und spalten ihre Zieltranskripte der Transposons und erzeugen dadurch neue piRNAs,

die das AGO3-Protein binden. Dieser sekundäre piRNA-AGO3Komplex führt zu einem zweiten Spaltungsereignis an einem anderen Transkript eines piRNA-Clusters, das zur Bildung einer neuen antisense-piRNA führt, die erneut an Piwi oder Aub binden kann. Eine Verstärkung kann dann auftreten, wenn die Transkription von Transposons und/oder prä-piRNA-Transkripten zusätzliche, unbearbeitete RNAs in das System pumpt (grüne Pfeile). Der Kreislauf wird so lange aufrechterhalten, wie sekundäre piRNAs in der Lage sind, ihre Zieltranskripte in den Transposon-Elementen zu erkennen und zu schneiden, wodurch neue piRNA entsteht. (Nach O’Donnell u. Boeke 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

1‒10 kb und codieren für 10 bis 4500 piRNAs (Abb. 7.34a). piRNAs aus diesen genomischen Clustern werden offensichtlich zunächst in einem langen Transkript hergestellt und später weiterverarbeitet; daraus erklärt sich die häufig beobachtete asymmetrische Orientierung der piRNAs. Besondere Sekundärstrukturen oder doppelsträngige Vorläufermoleküle sind bisher nicht entdeckt worden. Die Funktion der piRNAs liegt wahrscheinlich hauptsächlich in der Kontrolle beweglicher genetischer

Elemente (Transposons), da die Sequenzen der piRNA häufig Sequenzhomologien zu Transposons aufweisen. Aufgrund der Lokalisation der Piwi-Proteine werden aber auch andere Funktionen diskutiert, z. B. epigenetische Markierungen bestimmter chromosomaler Regionen oder die Bearbeitung von RNA in männlichen Keimzellen in den chromatoiden Körpern, einer dynamischen Struktur im Cytoplasma haploider Spermatiden. Eine Übersicht über diese möglichen Funktionen gibt Abb. 7.34b.

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

Abb. 7.34 a, b Mögliche Mechanismen der piRNA-vermittelten Hemmung. a Gruppen von piRNAs entstehen aus einzelnen Genorten, die 20–100 kb umfassen; einige werden bidirektional transkribiert. Die Balken deuten die Zahl der indivuellen piRNAs an, die in jedem Intervall identifiziert wurden (rot: oberer Strang; blau: unterer Strang). b Der piRNA-Komplex (piRC) kann im Zellkern verschiedene Funktionen ausführen, z. B. die Markierung wichtiger genomischer Bereiche durch epigeneti-

sche Mechanismen (wie in Ciliaten) oder durch Spaltung einer RNA (wie in S. pombe). Der piRC kann ebenso im Cytoplasma seine Wirkung entfalten, um eine Transposon-Aktivität zu unterbinden (wie in Drosophila), oder könnte auf die chromatoiden Körper einwirken, die als RNA-Bearbeitungszentrum verstanden werden. (Nach Seto et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

7.5 Kleine regulatorische RNAs

Kernaussagen ï Das eukaryotische Genom ist komplexer organisiert als das von Bakterien. ï Fibroin ist der Hauptbestandteil der Seide und wird durch ein einziges Gen codiert. Die hohe Syntheseleistung wird durch ein besonders hohes Maß von Polyploidisierung der Fibroin-synthetisierenden Zellen des Seidenspinners ermöglicht. ï Durch Verdoppelung von Genabschnitten sind viele Genfamilien entstanden. ï Hämoglobin wird durch verschiedene Globinketten aufgebaut. Die Zusammensetzung des Hämoglobins verändert sich während der Embryonalentwicklung. Die beiden Globin-Genfamilien liegen auf zwei verschiedenen Chromosomen. ï Die Histon-Gene bilden ebenfalls Multigenfamilien. Die meisten Histon-Gene besitzen keine Introns und bilden kein Poly(A)-Ende. Durch vielfältige posttranslationale Modifikationen sind sie an der Kondensation bzw. Dekondensation des Chromatins beteiligt. ï Die Tubulin-Gene sind innerhalb des Genoms weit verteilt und bilden keine Cluster. ï Die Kristallin-Gene sind für die Transparenz der Augenlinse verantwortlich; es gibt zwei Cluster von Genen sowie verschiedene Einzelgene, die zur β/γKristallin-Genfamilie gehören. ï Die Transkription eukaryotischer Gene wird durch komplexe Wechselwirkungen des Promotorbereichs mit Transkriptionsfaktoren reguliert.

ï Enhancer verstärken die Genexpression und liegen außerhalb des Promotorbereichs; sie wirken unabhängig von ihrer Orientierung. ï Locus-Kontrollregionen sind an der Regulation der Expression von Genclustern beteiligt, indem sie unter anderem an der Kondensation bzw. Dekondensation des Chromatins mitwirken. ï Die „RNA-Welt“ umfasst die Genfamilien der rRNAund tRNA-Gene sowie Gene, die für kleine regulatorische RNA-Moleküle codieren. ï Die Gene für 28S-, 18S- und 5,8S-rRNA findet man als tandemartig wiederholte Gengruppen in der DNA. Auch die Gene für die 5S-rRNA sind in vielen tandemartig angeordneten Kopien vorhanden, liegen aber an anderer Stelle im Genom. rRNA-Moleküle können aufgrund intramolekularer Basenpaarungen spezifische Sekundärstrukturen ausprägen. ï Auch tRNAs werden als Genfamilien codiert. tRNAMoleküle bilden eine spezifische, evolutionär stark konservierte Sekundärstruktur (Kleeblatt) aus. ï RNA-Interferenz ist eine evolutionär sehr alte Methode zur Abwehr viraler Infektionen. Sie beruht auf der Herstellung sehr kurzer RNA-Moleküle, die mit der mRNA in Wechselwirkung treten und so die Translation der homologen mRNA blockieren können. ï Wir kennen bisher drei Gruppen kleiner regulatorischer RNAs: siRNA, miRNA und piRNA, die an der Abschaltung entsprechender Zielgene auf verschiedenen Ebenen beteiligt sind.

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Kapitel 7: Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene

Technik-Box 15

Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen Anwendung: Methoden zur Analyse der Genexpression, insbesondere zur Charakterisierung von DNA-ProteinWechselwirkungen im Promotorbereich. Voraussetzungen: Markierte DNAFragmente oder Oligonukleotide, die die Bindungsstelle repräsentieren; Proteine (Proteinextrakt aus isolierten Zellkernen, rekombinante Proteine oder gereinigte Proteine); Elektrophorese unter nicht-denaturierenden Bedingungen. Methoden: Man macht sich dabei die Tatsache zunutze, dass Makromoleküle unterschiedlicher Größe und Ladung in der Gelelektrophorese ein unterschiedliches Ladungsverhalten aufweisen. Nach der Gelelektrophorese eines definierten DNA-Fragments findet man dieses als eine Bande im Gel. Bindet an dieses DNA-Fragment vorher aber ein Protein, dann wandert der DNA-Protein-Komplex aufgrund seiner Größe (und veränderten Ladung) in der Regel langsamer als die freie DNA, d. h. die Bande wird nach oben verschoben (engl. band shift; andere Bezeichnungen: gel retarda-

tion assay, GRA; electrophoretic mobility shift assay, EMSA). Damit dieser DNA-Protein-Komplex während der Elektrophorese nicht zerfällt, dürfen keine denaturierenden Bedingungen angewendet werden. Zum Nachweis der Banden wird die DNA vor der Inkubation mit dem Protein in der Regel radioaktiv markiert (Technik-Box 5). Eine wichtige Kontrolle zur Unterscheidung einer sequenzspezifischen DNAProtein-Wechselwirkung von einer allgemeinen DNA-Protein-Wechselwirkung ist die Zugabe eines sehr großen Überschusses an nicht markierter, unspezifischer DNA (z. B. bakterielle DNA oder ein synthetisches Heteropolymer, Poly-dI-dC). Dadurch wird bei einer spezifischen Bindung die DNA aus dem Komplex mit dem Protein nicht verdrängt. Mit dieser Methode können Bindestellen auf der DNA auf ca. 30 bp eingegrenzt werden. Um die Identität des DNA-bindenden Proteins nachzuweisen, kann der DNA-Protein-Komplex mit spezifischen Antikörpern inkubiert werden. Je nach der relativen Größe und Ladung des neuen Komplexes ist es möglich, dass sich die Lage der Bande

im Gel noch einmal verschiebt („Supershift“). Eine andere Methode zur genaueren Sequenzbestimmung der Proteinbindestelle an der DNA gründet auf der Tatsache, dass die entsprechenden Stellen der DNA für eine Behandlung mit DNase I nicht zugänglich sind (Schutz vor DNase-I-Abbau; engl. DNA protection assay). Wenn die DNA vor der Inkubation an einem Ende radioaktiv markiert und nach der Inkubation mit dem Bindeprotein und der anschließenden DNase-IBehandlung auf übliche Weise (Technik-Box 1) extrahiert wurde, kann sie auf einem Sequenzgel aufgetrennt werden (Technik-Box 21). Im Vergleich mit DNA, die nicht mit dem Bindeprotein inkubiert wurde, erscheinen in der Sequenz mit Bindeprotein freie Stellen („Fußabdrücke“; engl. footprints), die die Sequenz der Bindestellen genau angibt. Beachte: Beide Methoden arbeiten ausschließlich in vitro und müssen daher funktionell (in Zellkulturen oder transgenen Organismen) überprüft werden.

Technik-Box

Technik-Box 16

RNAi: spezifische Inaktivierung von Transkripten Anwendung: Methode zur gezielten Ausschaltung eines Gens durch antisense-RNA. Voraussetzungen: Klonierung des zu inaktivierenden Gens. Methoden: Die Ausschaltung von Genaktivitäten (engl. silencing) durch RNAi (engl. RNA-mediated interference) basiert auf den Befunden, dass dsRNA durch spezielle Enzyme in kurze (~ 21–25 nt) Fragmente zerlegt wird, die Proteine aktivieren, welche dann die Ziel-mRNA spalten und damit inaktivieren (Kapitel 7.5; Abb. 7.30). Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die gewünschten kurzen, inaktivierenden RNA-Moleküle zu erhalten: • Das zu inaktivierende Gen wird in doppelter Kopie, aber in inverser

Orientierung hinter starke Promotoren geschaltet. Die dabei entstehende RNA bildet doppelsträngige RNA-Moleküle aus, die durch eine Haarnadelstruktur gekennzeichnet sind. Durch die Ausbildung dieser Strukturen kann die dsRNA durch Dicer geschnitten werden. • Man kloniert ein Doppelstrang-Oligonukleotid von ca. 50 bp in einen Expressionsvektor. Das Oligonukleotid enthält links und rechts je 19 bis 29 Nukleotide der Zielsequenz und ist durch 4 bis 11 Nukleotide verbunden. Eine RNA-Polymerase synthetisiert das kurze Fragment, das aufgrund seiner Sequenz eine Haarnadelschleife formt und damit als kurze inhibitorische RNA wirken kann (engl. short interfering RNA, siRNA).

Die Herstellung der kurzen RNA-Moleküle erfolgt in vitro; mithilfe gängiger Methoden können sie in die Zellen transfiziert und mit jeweils geeigneten Assays ihre hemmende Wirkung überprüft werden. Entsprechende vorgefertigte siRNAs für das spezifische Abschalten von menschlichen Genen sowie von Genen der Ratte und der Maus sind erhältlich (z. B. http://www. imagenes-bio.de). Die Methode ist auch geeignet, transgene Organismen herzustellen, sodass mit der Wahl geeigneter Promotoren das gewünschte Zielgen zeit- und gewebespezifisch ausgeschaltet werden kann.

325

Kapitel 8

Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität Inhaltsverzeichnis 8.1 Transposons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 328 8.2 Retroviren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 340 8.3 Umlagerung von DNA-Fragmenten . . . . . . . . . . . . . 357 8.4 Das Immunsystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 380

Mosaikfarbmuster in Blüten beruhen häufig auf somatischen Transpositionen. Das Bild zeigt eine Chrysantheme. (Foto: W. Hennig, Mainz)

328 328

Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Überblick In den Genomen aller Organismen sind genetische Elemente (Transposons) vorhanden, die ihre Positionen innerhalb des Genoms verändern können. Dabei können sie auch DNA-Stücke aus der Nachbarschaft ihrer Insertionsstellen im Genom verlagern. Transposons sind daher in der Lage, komplexere Veränderungen im Genom zu induzieren und eventuell sogar Neukombinationen funktioneller Genbereiche zu bewirken, wie es etwa durch Verlagerung und Neukombination von Exons vorstellbar ist. Verschiedene Transposons zeigen einen ganz unterschiedlichen molekularen Aufbau. Einige von ihnen weisen starke Ähnlichkeiten mit Retroviren auf. Auch Retroviren sind Bestandteile eukaryotischer Genome. Im Unterschied zu Transposons sind sie jedoch in der Lage, infektiöse Partikel zu bilden und sich dadurch auch zwischen Organismen in einer Population, d. h. horizontal, auszubreiten. Viele Retroviren sind pathogen und können Tumore induzieren. Das ist darauf zurückzuführen, dass sie bisweilen defekte zelluläre Gene oder Stücke davon mit sich tragen, die die normalen Funktionen dieser Gene beeinflussen und dadurch zu zellulären Fehlleistungen oder Fehlprogrammierungen führen können. Es handelt sich vor allem um solche Gene, die allgemeine Funktionen

8.1 Transposons Zu den Grundbestandteilen des genetischen Materials der meisten Organismen (ausgenommen Viren) gehören bewegliche genetische Elemente, die als Transposons bezeichnet werden; im Englischen ist auch der Begriff transposable elements gebräuchlich. Es handelt sich hierbei um verschiedene Gruppen von DNASequenzen, die mithilfe unterschiedlicher molekularer Mechanismen in der Lage sind, ihre Positionen im Genom zu verändern. Diese DNA-Sequenzen enthalten im Allgemeinen ein oder mehrere Protein-codierende Gene sowie DNA-Bereiche, die für die Transpositionen (Ortsveränderungen) im Genom notwendig sind. Man schätzt den Anteil des Genoms, der bei Drosophila melanogaster auf solche DNA-Sequenzen entfällt, auf etwa 20 %. Im menschlichen Genom könnte ein ähnlicher DNA-Anteil auf transponierbare DNASequenzen entfallen. Trotz des hohen Anteils von Transposons am genetischen Material hat es relativ lange gedauert, bis diese genetischen Elemente entdeckt wurden. Das liegt daran, dass man ihr Vorhandensein nur unter besonderen Umständen erkennen kann, nämlich wenn sie ihre Positionen im Genom verändern und dadurch Veränderungen verursachen, die im Phänotyp sichtbar werden. Selbst dann lässt sich die Existenz eines Transposons nur schwer erkennen oder nachweisen, da

in der Zellzyklusregulation oder in der Steuerung grundlegender zellulärer Stoffwechselvorgänge wahrnehmen. Diese Gene werden aufgrund der Tatsache, dass sie bei fehlerhafter Expression zu Tumoren führen können, insgesamt unter der Bezeichnung Onkogene zusammenfasst. Andere Retroviren induzieren allein schon durch ihre Anwesenheit und ihre Vermehrung in der Zelle Krankheiten, wodurch diese zerstört werden kann. Das bekannteste Beispiel hierfür ist das Aids-Virus (HIV). In früheren Jahren ist man immer davon ausgegangen, dass durch die Differenzierung zwar die Entwicklungsmöglichkeit und das Expressionsmuster einer Zelle festgelegt wird, dass aber dennoch die DNA jeder Zelle das gesamte Genom des jeweiligen Organismus enthält. Es gibt allerdings einige Einschränkungen, da sich in bestimmten Zellen irreversible Veränderungen der Genom-DNA vollziehen, die mit der Funktion des betroffenen Zelltyps zusammenhängen. Beispiele für die Veränderungen von DNA im Zusammenhang mit zellulärer Differenzierung bieten uns nicht nur Einzeller wie Hefen oder Ciliaten, sondern auch Gene, die eine zentrale Rolle im Säugerimmunsystem spielen: die Immunglobulin-Gene.

man es ja mit einer anderweitig bedingten Mutation zu tun haben kann. Genetische Hinweise auf die Anwesenheit von Transposons geben ungewöhnlich hohe Mutationsraten bestimmter Gene, bei denen zudem häufig Reversionen zum Wildtyp auftreten. Andere spezifische phänotypische Merkmale können Transposons nicht zugeordnet werden. Einen Überblick über verschiedene Transposons gibt Tabelle 8.1. Die ursprünglichen Hinweise auf die Existenz von Transposons ergaben sich tatsächlich aus der Beobachtung von genetischer Instabilität bestimmter Gene. Die klassischen genetischen und cytologischen Untersuchungen solcher Gene stammen von Barbara McClintock, die in den 1940er-Jahren transposable Elemente als Ursache für Bereiche veränderter Pigmentierung bei Maiskörnern erkannte (Abb. 8.1); allerdings blieb die Bedeutung dieser Studien noch lange unbeachtet. Bei Bakterien wurden in den 1960er-Jahren Transposons bei Untersuchungen polarer genetischer Effekte identifiziert, wie sie in bakteriellen Operons häufig beobachtet werden können. Ein Teil solcher Effekte war mit nonsense-Mutationen (Kapitel 9.1), die ja supprimierbar sein sollten, nicht zu erklären, sondern ließ die Insertion von DNA-Stücken vermuten. Gegen Ende der 1960er-Jahre wurde bei Drosophila beobachtet, dass bestimmte Gene eine besonders hohe Mutabilität aufweisen. Sehr bald festigte sich der Verdacht, dass mobile DNA-Elemente für diese Mutabilität verant-

8.1 Transposons

Abb. 8.1 Flecken auf Maiskörnern und Transposoneigenschaften. Die Flecken auf Maiskörnern zeigen instabile Phänotypen, die auf einem Wechselspiel zwischen transposablen Elementen (TE) und einem Gen beruhen, das für ein Enzym im AnthocyanStoffwechsel codiert. Bereiche der Aleuronschicht (Wabenschicht) mit revertantem (pigmentiertem) Phänotyp entstehen

durch das Ausschneiden des TEs in einer einzigen Zelle. Die Größe des Flecks spiegelt die Zeitspanne seit dem Ausschneiden des TEs in der Kornentwicklung wider. Das Verständnis der genetischen Basis dieser und ähnlicher mutierter Phänotypen führte zur Entdeckung der TEs. (Nach Feschotte et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Tabelle 8.1 Transposons Organismus

Name

Art

Kopienzahl

E. coli

Tn3 Tn10

terminale invertierte Wiederholungseinheiten IS10 invertiert

11 1 bis mehrere

Mammalia

LINE-1 (L1)

Retrotransposon

~ 105

Mammalia

SINEs

Retroposons

5 × 105

Maus

IAP

Retroposon

20–1000

Zea mays

Cin4

Retroposon

50–100

A/Ds

terminale invertierte Repeats

35

Spm/En

terminale invertierte Repeats

30

S. cerevisiae

Ty

Retroposon

35

Caenorhabditis elegans

Tc1

terminale invertierte Repeats

30–300

Dictyostelium discoideum

Tdd-1

Retroposon

50–100

Trypanosoma brucei

Ingi

Retrotransposon

200

Bombyx mori

R2

Retrotransposon

25

D. melanogaster

copia

Retrotransposon

30

gypsy

Retrotransposon

10

P-Faktor

Retroposon

20

I-Faktor

Retroposon

1–10

329

330 330

Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

wortlich sind. In den 1980er-Jahren wurde schließlich das Phänomen der Hybriddysgenese (engl. hybrid dysgenesis) durch Mary Kidwell (1983) beschrieben: Bei bestimmten Kreuzungen von Drosophila-Stämmen kommt es zu hohen Mutationsraten in der Nachkommenschaft (S. 338). Durch die Untersuchung von DNASequenzen, die durch die neuen Methoden der Gentechnologie ermöglicht wurden, konnte sehr bald gezeigt werden, dass alle zuvor beobachteten genetischen Instabilitäten auf bestimmte DNA-Sequenzen ‒ die Transposons ‒ zurückzuführen sind, die ihre Position im Genom verändern können. Die nähere Untersuchung solcher Transposons hat uns grundlegende neue Einsichten in die Struktur des Genoms vermittelt – und Barbara McClintock 1983 den Nobelpreis für Medizin.

Die meisten Prokaryoten und alle Eukaryoten besitzen in ihrem Genom bewegliche genetische Elemente, sogenannte Transposons. Ihre Anwesenheit wurde zunächst durch genetische Instabilität bestimmter Gene erkannt.

8.1.1 Prokaryotische Transposons Prokaryotische mobile DNA-Elemente sind im Allgemeinen nur mit wenigen Kopien im Genom vorhanden. Ihre Transpositionshäufigkeit liegt bei etwa 10−6 je Zellgeneration. Dennoch wird der Anteil der Mutationen, die durch Insertionen oder Exzisionen von mobilen beweglichen Elementen induziert werden, auf 20 bis 40 % geschätzt und umfasst damit einen beträchtlichen Teil aller Mutationen. Oft gibt es bevorzugte Insertionsstellen. Die eingefügten Elemente üben, je nach ihrem Insertionsplatz, unterschiedliche Effekte auf benachbarte Gene aus. Besonders auffallend sind polare Effekte, die auch zu ihrer Entdeckung Anlass gaben (S. 131). Außerdem steigen die Mutationshäufigkeiten in der direkten Nachbarschaft von beweglichen Elementen bisweilen um einen Faktor von 100 bis 1000 an. Bei E. coli lassen sich grundsätzlich zwei Arten von beweglichen Elementen unterscheiden, die ï Insertionselemente und ï komplexe Transposons. Die Insertionselemente (engl. insertion elements) oder IS-Elemente sind mit Längen zwischen 768 bp (IS1) und 2132 bp (IS21) bei einer mittleren Länge von wenig mehr als 1000 bp relativ kurz. Ihre wichtigsten Bestandteile sind ihre beiden terminalen invertierten Wiederholungselemente, die bei verschiedenen Familien solcher Elemente in ihrer Länge zwischen 18 bp und 41 bp variieren. Die terminalen invertierten Repeats werden durch eine Protein-codierende Region

miteinander verbunden, die für eine Transposase, also ein Enzym codiert, das für die Transposition des IS-Elementes erforderlich ist. Wir kennen über 1500 verschiedene IS-Elemente, die in verschiedenen Familien zusammengefasst werden können. Eine Zusammenstellung der wichtigsten Familien bei Prokaryoten enthält die Tabelle 8.2. Prokaryoten enthalten oft mehrere IS-Elemente ‒ manche allerdings auch gar keine. Einen Überblick über die Verteilung von ISElementen in verschiedenen Prokaryoten vermittelt Abb. 8.2; dabei wird auch deutlich, dass es in der Entwicklung von Prokaryoten offensichtlich auch einen Austausch von IS-Elementen zwischen verschiedenen bakteriellen Familien gegeben hat (horizontaler Gentransfer). Die terminalen invertierten Wiederholungseinheiten können in zwei funktionelle Domänen unterteilt werden: Die eine ist innerhalb des Sequenzelementes lokalisiert und an der Bindung der Transposase beteiligt (vgl. dazu auch das OE-Element in Tn10, Abb. 8.3a). Die zweite Domäne umfasst nur die beiden äußersten 2‒3 bp; sie sind an der Spaltung und der Strangübertragung beteiligt, die für die eigentliche Transposition des gesamten IS-Elementes verantwortlich ist. Außerdem sind oft Promotorelemente in einer der Wiederholungseinheiten oberhalb des Transposase-Gens lokalisiert; entsprechend einer allgemeinen Übereinkunft wird dieses Wiederholungselement als das linke bezeichnet. Diese Anordnung erlaubt eine Autoregulation der Transposase-Expression durch TransposaseBindung. Zusätzlich spielen Bindungsstellen für wirtsspezifische Proteine eine Rolle, die häufig in den Wiederholungseinheiten oder in ihrer Nähe gefunden werden; diese Proteine können an der Modulation der Transpositionsaktivität oder der Transposase-Expression beteiligt sein. Die Transposase selbst weist zwei Domänen auf: eine N-terminale Region, die für die DNA-Bindung verantwortlich ist, und eine C-terminale Region für die katalytischen Eigenschaften. Dies erlaubt die Bindung an die DNA schon während des Translationsprozesses. Eine Besonderheit stellen IS91-Elemente und ihre Abkömmlinge dar. Sie unterscheiden sich insofern vom herkömmlichen Schema der IS-Elemente, dass sie keine terminalen invertierten Wiederholungseinheiten haben und durch einen rolling circle-vermittelten Mechanismus (Abb. 2.17) im Genom „wandern“. Als Folge davon können sie auch benachbarte DNA-Sequenzen übertragen, wobei die Transposition nur durch eine Kopie des Elementes vermittelt wird. Es gibt Hinweise, dass diese Gruppe von IS91-(ähnlichen) Elementen für die Mobilisierung fast jeder Gruppe von Antibiotika-Resistenzgenen verantwortlich ist (Toleman et al. 2006).

8.1 Transposons

Tabelle 8.2 Einige Eigenschaften von Insertionselementen bei Prokaryoten Familie

Gruppe

Größe (bp)

DR (bp)

Ende

IR

ORF

IS1

–

770

9 (8–11)

GG(T)

ja

2

IS3

IS2 IS3 IS51 IS150 IS407

1300–1350 1200–1300 1300–1400 1400–1550 1200–1250

5 3 (4) 3 (4) 3–5 4

TG(A/T)

ja

2

IS4

–

1300–1950

9–12

C(A)

ja

1

IS5

IS5 IS427 IS903 IS1031 ISH1 ISL2

1100–1350 800–1000 1000–1100 850–950 900–1150 800–1100

4 2 (4) 9 3 8 2–3

GG GA/G GGC GAG – –

ja

1 (2) 1 1 1 1

IS6

–

750–900

8

GG

ja

1

IS21

–

1950–2500

4 (5,8)

TG

ja

2

IS30

–

1000–1250

2–3

–

ja

1

IS66

–

2500–2700

8

GTA

ja

3

IS91

–

1500–1850

0

–

nein

1

IS110

–

1200–1850

0

–

nein

1

IS200/IS505

IS200 IS605 IS607

600–800 1500–2300 1350–2600

0

– – –

nein nein nein

1 2 2

IS256

–

1300–1500

8–9

GG/A

ja

1

IS481

–

950–1100

5–6

TGT(A/G)

ja

1

IS630

–

1100–1200

2

–

ja

1

IS982

–

1000

(7)

AC(C/G)

ja

1

IS1380

–

1650

4

CC/G

ja

1

ISAs1

–

1200–1350

8

C

ja

1

ISL3

–

1300–1550

8

GG

ja

1

Tn3

–

> 3000

5

GGGG

–

–

DR: direkte Wiederholungselemente; IR: invertierte Wiederholungselemente; ORF: Zahl der offenen Leserahmen, die an der Transposition beteiligt sind. (Nach Siguier et al. 2006)

Neben diesen einzelnen IS-Elementen gibt es auch komplexe Transposons (engl. compound transposons). Diese bestehen aus zwei identischen flankierenden ISElementen und einem dazwischen liegenden Bereich, der beliebige Gene umfassen kann. Beispielsweise besteht das Transposon Tn10 aus zwei flankierenden IS10-Elementen und einem dazwischen liegenden Gen, das der Zelle Tetracyclinresistenz verleiht (Abb. 8.3).

Die Enden von Tn10 sind invertierte Wiederholungselemente der IS10-Sequenz: Die rechte Seite codiert eine funktionelle Transposase, wohingegen die linke Seite eine degenerierte Kopie der rechten Seite darstellt. Die beiden Enden der IS10-Sequenz werden als die äußeren bzw. inneren Enden bezeichnet (engl. outer end, OE; inner end, IE). Diese beiden Elemente bestimmen die Spezifität der Transposase-Bindung: jeweils 23

331

332 332

Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Abb. 8.2 Verteilung der Familien von Insertionselementen in Eubakterien und Archaebakterien. Die verschiedenen Familien sind farbcodiert. Es ist nur der wichtigste Teil der bekannten

Insertionselemente dargestellt (extrahiert aus der Datenbank „ISfinder“, http://www-IS.biotoul.fr). (Nach Siguier et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

bp an den jeweiligen Enden, die als fast perfekte invertierte Wiederholungselemente vorliegen (siehe die Halbpfeile in Abb. 8.3a; engl. terminal inverted repeats, TIR). Allerdings enthält das OE darüber hinaus auch eine Bindestelle für ein Wirtsprotein, das für die Integration verantwortlich ist (engl. integration host factor, IHF). Im Gegensatz zu IS91 wird Tn10 über einen nichtreplikativen Mechanismus übertragen (Abb. 8.3b): Tn10 wird zuerst aus der Spender-DNA ausgeschnitten, und die Transposase vermittelt die Paarung der freien Enden des Transposons, bevor die neue Integration beginnt. Dies stellt sicher, dass die beiden Enden an einer gemeinsamen Zielsequenz integrieren, was eine wichtige Voraussetzung für eine erfolgreiche Transposition darstellt. Wenn dann der Transpositionskomplex („Transpososom“) unter Beteiligung eines zweiwertigen Kations (Mg2+ oder Mn2+) gebildet ist, folgt die eigentliche, dreistufige Integrationsreaktion: ï Doppelstrangbruch an der Übergangsstelle zwischen den TN10-Sequenzen und der ursprünglichen Spender-DNA (dabei werden die flankierenden Spender-Sequenzen abgespalten); ï Ausbildung einer Haarnadelschleife;

ï Auflösung der Haarnadelschleife, um ein freies 3’-OH-Ende am Transposon-Ende zu erhalten, das in einer Transester-Reaktion auf eine PhosphatGruppe übertragen werden kann (Strangtransfer). Dabei ergibt sich am Gegenstrang eine Lücke von 9 bp, die durch Reparaturenzyme geschlossen wird (Kapitel 9.6); die Transposition ist abgeschlossen. Ein weiteres gut untersuchtes Beispiel ist Tn7. Dieses Transposon hat zwei unterschiedliche Mechanismen entwickelt, um seine Verbreitung zu gewährleisten: Der eine Mechanismus erfolgt mit geringer Häufigkeit, dafür aber eher sequenzunabhängig. Dabei integriert das Tn7 bevorzugt in Plasmide, wenn sie gerade in die Bakterienzelle eingeschleust werden. Dieser Mechanismus garantiert ein breites Wirtsspektrum und trägt zur weiten Verbreitung von Tn7 innerhalb der Bakterien bei. Der andere Transpositionsmechanismus bewirkt eine spezifische Insertion von Tn7 mit hoher Frequenz an einer Stelle, die als attTn7 bezeichnet wird (engl. attachment site for Tn7). Die Insertion an dieser Stelle ist für den Wirt nicht schädlich und bewirkt eine „friedliche Koexistenz“ von Transposon und Wirt (eine lesenswerte Übersicht über Tn7 bieten Peters u. Craig 2001).

8.1 Transposons

Abb. 8.3 a, b Bakterielle Transposons. a Tn10 besteht aus zwei gegeneinander invertierten terminalen IS10-Sequenzen (1329 bp); die linke codiert eine defekte, die rechte eine funktionsfähige Transposase (T‘ase). Das 9147 bp lange Transposon enthält sieben offene Leserahmen; vier codieren eine Tetracyclinresistenz (tetRA, tetRC; tetRD und tetRR), die drei anderen (jemA bis jemC) haben keine definierte Funktion. Die Halbpfeile deuten die 23 bp der invertierten terminalen Wiederholungselemente (TIR) an der inneren (IE) bzw. äußeren Grenze (OE) der IS10-Elemente an. Die Determinanten für die Spezifität der Transposase-Bindung liegen innerhalb von TIR. Die Transposase kommt mit dem OE in der terminalen Region (T, offenes Rechteck) und in der subterminalen Region (ST, schwarzes Rechteck) in Kontakt. Die Bindestelle für den Wirtsfaktor, der für die Integration verantwortlich ist (engl. integration host factor,

IHF) ist ebenfalls angegeben (gestreiftes Rechteck). Das erste Basenpaar des rechten IS10-Elementes wird als erstes Basenpaar des Transposons definiert. b Mechanismus der TN10-Transposition, Tn10 ist in die Spender-DNA eingebettet. Die Transposase (gestreifte Ovale) bindet an die OE-Elemente (schwarze Rechtecke). Nach der Bildung des Transpososoms katalysiert die Transposase die chemischen Schritte beim Ausschneiden. Sobald die flankierende Spender-DNA von den Enden des Transposons entfernt wurde, bindet das Transpososom an die Ziel-DNA (graues Rechteck) und katalysiert die Übertragungsreaktion. Die Reparaturfunktionen des Wirts füllen dann die Lücken der 9 bp auf, die bei der Übertragungsreaktion entstanden sind, was zu einer Verdoppelung der ursprünglich kurzen Zielsequenz führt (karierte Rechtecke). (Nach Haniford 2006, mit freundlicher Genehmigung von Informa)

333

334 334

Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Allerdings bewirken beide Mechanismen zusammen eine gute Ausbreitungsmöglichkeit für Tn7 und die Resistenzgene, die von Tn7 übertragen werden. Das Tn7-Gen aadA ist für die Entstehung von Spectinomycin- und Streptomycinresistenz verantwortlich; es codiert für eine Adenylyltransferase (3’’(9)-O-Nukleotidyltransferase), die Aminoglykoside durch Adenylierung modifiziert. Durch dieses Enzym werden auch die Aminoglykoside Spectinomycin und Streptomycin adenyliert und dadurch inaktiviert. Ein zweites Gen des Tn7, dhfr, codiert den Typ I der Dihydrofolatreduktase (DHFR), ein Enzym, das im Gegensatz zur genomischen DHFR eine gesteigerte Resistenz gegen einen Inhibitor dieses Enzyms aufweist (gegen Trimethoprim, ein Folsäureanalogon). Die Insertionssequenz attTn7 befindet sich übrigens im 3’-Bereich des Gens, das für die GlukosaminSynthetase codiert (Gensymbol: glmS). Dieses Gen ist für alle Zellen essenziell und findet sich daher hochkonserviert im gesamten Bereich biologischer Systeme, von Bakterien bis zum Menschen. Von daher ist es nicht überraschend, dass Tn7-Transposons mit derselben Frequenz wie bei Bakterien auch in das Genom menschlicher Zellen (in vitro) an den entsprechenden Zielsequenzen inserieren können. Es gibt daher Überlegungen, Tn7 als möglichen Vektor in der humanen Gentherapie einzusetzen (Kuduvalli et al. 2005).

Bei Prokaryoten sind 20 bis 40 % aller Mutationen

auf Transposons zurückzuführen. In E. coli sind einfache IS-Elemente bekannt, die durch terminale invertierte Repeats und ein dazwischen liegendes Gen (Transposase) charakterisiert sind, sowie komplexere Transposons, die oft zusätzlich Gene für Antibiotikaresistenzen tragen.

Eine neue Klasse von IS-Elementen wird als ISCR bezeichnet (engl. insertion sequences common region) und in engem Zusammenhang zur raschen Ausbreitung von mehrfacher Antibiotikaresistenz gesehen. ISCRs sind mit Genen verbunden, die die Resistenz gegen Chloramphenicol, Trimethoprim, Quinoline, Aminoglycoside und β-Lactamase tragen; sie sind assoziiert mit genetischen Elementen von Salmonella, die pathogene Eigenschaften haben. Sie haben IS91-ähnliche Eigenschaften. Anstelle der üblichen invertierten Wiederholungselemente haben sie an den jeweiligen Enden Sequenzen, die auf der einen Seite als Replikationsstartpunkte dienen (ori-IS) und auf der anderen Seite als Terminator (ter-IS). Zurzeit ist es zwar noch etwas zu früh, die Bedeutung dieser ISCR-Transposons genau zu erkennen; es ist aber klar, dass sie eine sehr große Bedeutung

bei der Etablierung bakterieller Vielfalt einerseits und dem Entstehen von Resistenzclustern gegen Antibiotika andererseits haben; vier oder fünf Resistenzgene zusammen sind schon keine Seltenheit (Walsh 2006).

8.1.2 Eukaryotische Transposons (mit terminalen invertierten Wiederholungseinheiten) Bei Eukaryoten gelang die Identifikation von Transposons auf der molekularen Ebene zunächst nach Klonierung repetitiver DNASequenzen von Drosophila und deren Analyse durch in-situ-Hybridisierung. Es stellte sich heraus, dass repetitive DNA-Sequenzen in den Riesenchromosomen verschiedener Individuen des gleichen Drosophila-Stamms teilweise an unterschiedlichen Stellen lokalisiert waren. Die genauere Analyse der DNASequenz ergab, dass einige solcher repetitiven DNASequenzen in ihrer Struktur große Ähnlichkeit mit Retroviren besitzen, d. h. dass sie Protein-codierende Abschnitte enthalten, deren Eigenschaften den bei Retroviren gefundenen Proteinen gleichen (Kapitel 8.2.3). In Eukaryoten findet man eine große Vielfalt von Transposons (Tabelle 8.3). Wir wollen der Übersichtlichkeit wegen drei Gruppen unterscheiden. Es handelt sich um ï Transposons mit terminalen invertierten Wiederholungseinheiten („DNA-Transposons“) ï Retrovirus-ähnliche Transposons: Retrotransposons ï Transposons ohne terminale Wiederholungseinheiten: Retroposons. Dabei sollen Retrotransposons und Retroposons zusammen mit den Retroviren besprochen werden (Kapitel 8.2); im Folgenden werden wir uns auf die Transposons mit terminalen invertierten Wiederholungseinheiten konzentrieren. Die verschiedenen Mechanismen sind in Abb. 8.4 dargestellt.

Transposons gehören verschiedenen Gruppen unterschiedlicher Struktur und Häufigkeit an. In allen Fällen sind sie jedoch durch flankierende Duplikationen der Insertionsstelle im Genom gekennzeichnet. Wir unterscheiden RNA-abhängige Transposons (Klasse I) und DNA-abhängige Transposons (Klasse II).

Die grundlegenden Eigenschaften eukaryotischer Transposons und die Konsequenzen ihrer Anwesenheit im Genom lassen sich folgendermaßen zusammenfas-

8.1 Transposons

Tabelle 8.3 Sequenzstruktur eukaryotischer Transposons Name

Gastgenom

Länge (bp)

Enden

Art

Duplikation (bp)

Ty1

Saccharomyces cerevisiae

5900

334

LTR

5

Cin4

Zea mays

ca. 7000

Poly(A)

Ac

Zea mays

4600

11

IR

8

Tc1

Caenorhabditis elegans

1610

54

IR

2

Tdd-1

Dictyostelium discoideum

4800

313

LTR

8–10

Ingi

Trypanosoma brucei

5200

253

DR

4

R2

Bombyx mori

4200

Poly(A)

P-Faktor

Drosophila melanogaster

2907

31

I-Faktor

Drosophila melanogaster

5371

3’-Ende: (TAA)4

10–14

F-Faktor

Drosophila melanogaster

4700

nicht spezifiziert

8–13

gypsy

Drosophila melanogaster

7469

482

LTR

4

copia

Drosophila melanogaster

5164

302

LTR

5

micropia

Drosophila hydei

5461

239

LTR

4

mariner

Drosophila mauritiana

1286

28

IR

2

Alu

Homo sapiens

ca. 75–7500

Poly(A)

variabel

L1

Homo sapiens

ca. 6000

Poly(A)

ca. 12 (variabel)

L1

Mus musculus

ca. 6000

Poly(A)

ca. 14 (variabel)

3–16

14 IR

8

Daten nach verschiedenen Autoren (s. auch Berg u. Howe 1989)

sen: Normalerweise sind sie stabil mit mehreren Kopien ins Genom integriert. Die Anzahl der Kopien im Genom sind für verschiedene Familien von Transposons jeweils charakteristisch und können zwischen weniger als 10 Kopien und mehreren Hunderttausend Kopien liegen. Die verschiedenen Kopien einer Sequenzfamilie sind nicht identisch, sondern können sowohl in ihrer Nukleotidsequenz als auch in ihrer Struktur, z. B. durch interne oder terminale Deletionen, voneinander abweichen. Durch genetische oder Umwelteinflüsse (z. B. Hitze, Stress, Bestrahlung), die wir nur teilweise kennen, können Transposons dazu veranlasst werden, ihre Genompositionen zu verändern. Danach wird wiederum eine stabile Phase der Integration erreicht. Sie sind also in dieser Hinsicht in ihrem Verhalten einem λ-Prophagen sehr ähnlich, wenn sie auch gewöhnlich keine definierten Integrationsstellen haben.

Durch Transpositionen, die in der Regel mit zufälliger Integration in beliebige Genompositionen verbunden sind, können Mutationen induziert werden. Hierbei kann es vorkommen, dass ein Transposon benachbarte DNA-Bereiche aus seiner ursprünglichen Position in eine neue Genomposition überträgt. Neben einer – wahrscheinlich kleinen – Anzahl vollständiger Transposons enthält jedes Genom eine größere Anzahl defekter Transposons, die entweder gar nicht mehr zur Transposition in der Lage sind oder der Gegenwart vollständiger Elemente der gleichen Transposonfamilie bedürfen, um eine Ortsveränderung im Genom vorzunehmen. Die Ursachen hierfür sind uns durch die molekulare Analyse von Transposons verständlich geworden: Die vollständigen Transposons stellen die Genprodukte zur Verfügung, die erforderlich sind, um eine Transposition zu vollziehen. Viele partiell defekte transponierbare Elemente können hiervon zur Transposition Gebrauch machen.

335

336 336

Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Abb. 8.4 a–c Strukturelle Eigenschaften und Klassifikation transposabler Elemente. Eukaryotische transposable Elemente (TE) werden in zwei Klassen eingeteilt, je nachdem, ob das Zwischenprodukt der Transposition eine RNA (Klasse 1) oder eine DNA (Klasse 2) ist. Bei allen Klasse-1-Elementen bildet das Element-codierte Transkript (mRNA) und nicht das Element selbst (wie bei Klasse-2-Elementen) das Zwischenprodukt der Transposition. Jede Gruppe von TEs enthält autonome und nicht-autonome Elemente. Autonome Elemente enthalten offene Leserahmen (ORFs, rote Kästchen) und codieren für Proteine, die für die Transposition notwendig sind. Die Integration von fast allen TEs führt zur Duplikation kurzer genomischer Sequenzen an der Stelle der Insertion. Diese Duplikationen (Pfeile, die die Elemente flankieren) variieren in ihrer Größe und Sequenz zwischen den verschiedenen Familien der TEs. a Klasse-2-Elemente: DNA-Transposons haben invertierte Wiederholungssequenzen (schwarze Dreiecke) und Duplikationen von Zielsequenzen (Pfeile) an ihren Enden. Nicht-autonome Mitglieder dieser Klasse leiten sich i. d. R. von autonomen Mitgliedern durch interne Deletionen ab. b, c Klasse-1-Elemente können nach ihrem Transpositionsmechanismus und ihrer

Struktur in zwei Gruppen unterteilt werden. b LTR-Transposons haben lange Wiederholungssequenzen an ihren Enden (engl. long terminal repeats, LTRs; schwarze Dreiecke). Autonome Elemente enthalten mindestens zwei Gene, gag und pol. gag codiert für ein Capsid-ähnliches Protein und pol für ein PolyProtein, das verschiedene enzymatische Aktivitäten enthält (Protease, reverse Transkriptase, RNase H, Integrase). Nichtautonome Elemente haben die meisten oder alle codierenden Elemente verloren. Ihre inneren Bereiche (grüne Kästchen) sind unterschiedlich groß und ohne Beziehung zu den autonomen Elementen. c Transposons ohne eine LTR enthalten stattdessen lange oder kurze Wiederholungselemente (LINEs bzw. SINEs). Die codierenden Regionen beinhalten ORF1 (codiert für ein gag-ähnliches Protein), EN (Endonuklease) und RT (reverse Transkriptase). LINEs und SINEs enden mit einer einfachen Sequenzwiederholung, üblicherweise Poly(A). Alle SINEs-Elemente, die bisher charakterisiert wurden, enthalten einen Promotor der RNA-Polymerase III (schwarze Streifen) in der Nähe des 5’-Endes. Im 3’-Bereich gibt es Übereinstimmungen zwischen SINEs und LINEs Elementen. (Nach Feschotte et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Eukaryoten besitzen viele unterschiedliche Gruppen

men enthält (engl. open reading frames, ORFs). Möglicherweise handelt es sich dabei um die ursprünglichen Elemente dieser repetitiven DNA-Sequenzfamilie, die noch die benötigten enzymatischen Mechanismen für selbstständige Transpositionen beherbergen. Die übrigen transponierbaren Elemente könnten aus ihnen durch Deletionen entstanden sein und verwenden jetzt einen modifizierten Transpositionsmechanismus, der sich andere zelluläre Mechanismen zunutze macht. Solche defekten oder modifizierten transponierbaren Elemente enthalten noch andere Genomsequenzen oder sogar andere Transposons. Hierdurch können im Genom beliebige größere DNA-Abschnitte in neue Positionen umgelagert werden, die für die Evolution neuer Gene oder für Veränderungen in den Regulationseigenschaften von Genen Bedeutung erlangen können. Dabei führt die Insertion in Gene oder deren Regulationsregion nicht notwendigerweise zur Inaktivierung, sondern kann Änderungen in deren Regulation verursachen.

von Transposons. Ihre Häufigkeit im Genom variiert in weiten Grenzen. Transpositionen können durch Umwelteinflüsse oder genetisch induziert werden und führen dadurch oft zu Mutationen.

Die Gesamtlänge der terminalen invertierten Wiederholungseinheiten ist bei verschiedenen transponierbaren Elementen unterschiedlich. Sie variiert zwischen mehreren Hundert Basenpaaren und mehreren Kilobasen. Diese Längenvariabilität beruht auf der unterschiedlichen Anzahl interner Wiederholungseinheiten, aus denen sie zusammengesetzt sind. Die inneren Bereiche der Wiederholungselemente zwischen den terminalen invertierten Repeats sind in Länge und Sequenz im Allgemeinen sehr unterschiedlich und weisen wenig Verwandtschaft untereinander auf. Es gibt transponierbare Elemente mit einer identischen internen 4-kb-DNA-Region, die drei offene Leserah-

8.1 Transposons

Abb. 8.5 Molekulare Struktur eines P-Elementes von Drosophila melanogaster. Der 2907 bp lange P-Faktor besteht aus terminalen, invertierten Wiederholungseinheiten von 31 bp und zwei weiteren, innen liegenden von 11 bp. Die vier Exons, die in der Keimbahn für die Transposase (87 kDa) codieren, sind

angegeben. In somatischen Zellen wird dagegen das 3. Intron (IVS3) nicht gespleißt, sodass wegen des neuen Stoppcodons ein 66-kDa-Repressor-Protein gebildet wird. (Nach Castro u. Carareto 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Eine besondere Klasse dieser transponierbaren Elemente mit invertierten Wiederholungseinheiten bei Drosophila sind die P-Elemente. Da dieses Transposon zudem große Bedeutung als Vektor für Transformationsexperimente in der Gentechnologie gewonnen hat (Technik-Box 18), soll es hier stellvertretend für andere Transposons mit terminalen invertierten Repeats besprochen werden. Die Entdeckung des P-Faktors geht auf populationsgenetische Untersuchungen in den 1960er-Jahren zurück, die zeigten, dass in reziproken Kreuzungen zwischen bestimmten Stämmen von D. melanogaster bei den Nachkommen unterschiedliche Effekte auftreten, die später als Hybriddysgenese (engl. hybrid dysgenesis) bezeichnet wurden (S. 338). Durch Rubin, Kidwell und Bingham wurde dann gezeigt, dass für die mit Hybriddysgenese verbundenen Phänomene ein Transposon, eben das P-Element, verantwortlich ist (Bingham et al. 1982, Rubin et al. 1982). Es ist 2907 bp lang (Abb. 8.5), und seine Insertionsstelle in das Genom ist durch eine flankierende 8-bp-Genomduplikation gekennzeichnet. Das P-Element selbst besitzt zwei kurze terminale invertierte Wiederholungseinheiten von je 31 bp Länge, dem sich in geringem Abstand (ca. 100 bp) zwei kurze invertierte Wiederholungssequenzen von 11 bp anschließen. Diese beiden Wiederholungseinheiten sind für die Spezifität und Effizienz der Transposase verantwortlich. Der mittlere Sequenzbereich des P-Elementes enthält 4 Exons, die für die

Transposase codieren und als ORF 0, ORF 1, ORF 2 und ORF 3 bezeichnet werden. Die merkwürdige Nummerierung erklärt sich daraus, dass ORF 0 zuletzt entdeckt wurde. Die Transposase wird von einer 2,5 kb langen mRNA translatiert, die durch Spleißen der Exons entsteht. Obwohl eine Transkription der Transposase auch in somatischen Zellen stattfindet, ist die funktionelle mRNA ausschließlich in der Keimbahn vorhanden. In somatischen Zellen findet man ausschließlich ein größeres Transkript. Es ist dadurch gekennzeichnet, dass das dritte Intron in ihm noch enthalten ist, sodass wegen des dadurch entstehenden vorzeitigen Stoppcodons (Abb. 8.5) eine funktionelle Transposase nicht synthetisiert werden kann. Ursache dafür ist ein Spleiß-Repressor in den somatischen Zellen; die resultierende, verkürzte Transposase ist nicht nur inaktiv, sondern wirkt als Repressor der Mobilität des P-Elementes. Diese verkürzte Transposase ist auch dafür verantwortlich, dass in Wildtyp-Stämmen die Mobilität des P-Elementes auf Kreuzungen zwischen Weibchen des M-Stamms und Männchen des P-Stamms beschränkt ist, denn in Weibchen des P-Stamms bleibt das Repressormolekül auch in den Eizellen aktiv. Der Unterschied zwischen Keimbahntranskripten und somatischen Transkripten der P-Elemente findet eine Parallele in der Fähigkeit zur Transposition im Genom: Während unter bestimmten Bedingungen (denen der Hybriddysgenese, S. 338) Transpositionen in der Keimbahn mit hoher Frequenz vorkommen, fehlen

337

338 338

Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

unter gleichen Bedingungen jegliche somatischen Transpositionen. Ursache für diesen Unterschied ist die Unfähigkeit somatischer Zellen, das dritte Intron aus dem primären Transkript zu entfernen. Führt man jedoch in somatische Zellen experimentell ein P-Element ein, dessen ORFs 2 und 3 nicht mehr durch ein Intron getrennt sind, so erfolgen auch in somatischen Zellen Transpositionen mit hoher Frequenz. Drosophila hat also einen spezifischen Mechanismus entwickelt, der Transpositionen in den Keimzellen gestattet, sie aber gleichzeitig in somatischen Zellen ausschließt.

Genom. Diese sind selbst nicht mehr in der Lage zur Transposition, wenn ihre Transposase aufgrund der internen Deletionen defekt ist oder die invertierten Repeats durch terminale Deletionen unvollständig sind oder fehlen. Defekte in den terminalen Wiederholungseinheiten verhindern weitere Transpositionen vollständig. In Gegenwart von P-Elementen mit funktionsfähiger Transposase sind defekte P-Elemente hingegen dann noch zu Transpositionen imstande, wenn sie zumindest noch ihre terminalen invertierten Wiederholungselemente besitzen.

Diese Beobachtung ist bedeutungsvoll, da sie erneut dafür spricht, dass Transposons biologische Funktionen ausüben müssen. Die Inaktivierung des Transpositionsmechanismus in somatischen Zellen erscheint biologisch dann sehr sinnvoll, wenn dafür gesorgt werden soll, dass neue Transpositionsereignisse in den Keimzellen auf Nachkommen übertragen werden sollen. Erfolgen nämlich zugleich viele Transpositionsereignisse in somatischen Zellen, so ist die Wahrscheinlichkeit sehr groß, dass der Organismus ein Fortpflanzungsalter gar nicht erreicht: Durch hohe Transpositionsraten in somatischen Zellen steigt die Wahrscheinlichkeit, dass essenzielle Gene zerstört und dadurch letale Effekte hervorgerufen werden.

Das P-Element ist ein 2,9 kb langes Transposon mit terminalen invertierten Wiederholungseinheiten von einer Länge von 31 bp. Der mittlere Bereich des P-Elementes codiert für eine Transposase. Die Synthese der funktionellen Transposase wird durch einen keimbahnspezifischen Spleißmechanismus gesteuert.

Die Transposase schneidet ein P-Element genau aus seiner Insertionsstelle heraus; dabei wird die ursprüngliche Genomkonstitution, wie sie vor der Insertion des P-Faktors bestand, wiederhergestellt: Man beobachtet genetisch eine Reversion der durch Insertion des P-Faktors verursachten Mutation. In vielen Fällen erfolgen Exzisionen jedoch ungenau. Das hat zur Folge, dass ï Teile des P-Faktors im ursprünglichen Insertionsplatz zurückgelassen werden oder ï dass Teile der flankierenden DNA – entweder an einer Seite des P-Faktors oder an beiden Seiten – zusammen mit dem P-Element aus dem Genom herausgeschnitten werden. Solche ungenauen Exzisionen können auf der Anwesenheit von Sequenzwiederholungen innerhalb des P-Elementes beruhen, die bereits erwähnt wurden. Die für eine ungenaue Exzision erforderlichen Wiederholungssequenzen können sehr kurz sein: Es genügen bereits direkte Sequenzwiederholungen in der DNA von 2 bis 6 bp. Es leuchtet daher ein, dass die Wahrscheinlichkeit groß ist, dass auch außerhalb des P-Elementes liegende Sequenzwiederholungen in solche Exzisionen einbezogen werden können. Das Ergebnis ungenauer Exzisionsereignisse ist die Existenz zahlreicher unvollständiger P-Elemente im

Die Erscheinung der Hybriddysgenese äußert sich in Sterilität, degenerierten Gonaden (darum auch ursprünglich engl. gonadal dysgenesis genannt) oder – bei Fertilität – in hohen Mutationsraten, die insbesondere von Chromosomenrearrangements begleitet sind, sowie in männlicher Rekombination (engl. male recombination); bei Drosophila gibt es im Männchen normalerweise keine Rekombination. Die Hybriddysgenese beschränkt sich auf Kreuzungen zwischen bestimmten Stämmen, z. B. zwischen P- und M-Stämmen (Abb. 8.6). Eine Kreuzung zwischen diesen Stämmen ist nur dann dysgenisch (engl. dysgenic), wenn das Männchen aus einem P-Stamm, das Weibchen aus einem M-Stamm kommt. Die reziproke Kreuzung liefert völlig normale Nachkommen. Die Erklärung für diese ungewöhnlichen Kreuzungsergebnisse liegt darin, dass alle P-Stämme P-Elemente im Genom besitzen, während M-Stämme keine P-Elemente im Genom enthalten. Gelangen P-Elemente über das männliche Genom in eine Eizelle, deren Genom keine P-Elemente enthält, so werden die P-Elemente aktiviert und beginnen mit hoher Frequenz zu transponieren. Hierdurch werden Mutationen und Chromosomenbrüche induziert, die zu defekten Gonaden bzw. zu hohen Mutationsraten in den Nachkommen führen. Warum aber beobachtet man dann solche Effekte nicht auch in der reziproken Kreuzung? Der Grund hierfür liegt in der oben erwähnten Eigenschaft des P-Elementes, in somatischen Zellen das Spleißen des Transposase-Gens zu unterdrücken (P-Cytotyp). Normalerweise wird dadurch jegliche Transpositionsaktivität unterdrückt. Führt man jedoch in eine Zelle, die keinen Repressor besitzt (also einen M-Cytotyp hat, z. B. die Eizelle des M-Stamms), P-Elemente ein, so

8.1 Transposons

Abb. 8.6 a, b Hybriddysgenese bei Drosophila melanogaster. a In Weibchen des P-Stamms wird das Repressor-Protein (66 kDa) während der Oogenese aufgrund des Nicht-Spleißens des 3. Introns gebildet und in den Oocyten gespeichert. Dieser maternale Speicher bewirkt nach der Befruchtung durch ein Spermium des P-Stamms eine effektive Hemmung der Transposase, die in den Pol-Zellen und ihren Nachkommen in der Keimbahn gebildet wird. b Bei reziproken Kreuzungen von P- und M-Stämmen kommt es in den Nachkommen gehäuft zu Mutationen

und zu Sterilität, wenn die Männchen der Kreuzung aus einem P-Stamm kommen. Entstammen die Weibchen einem P-Stamm, so sind alle Nachkommen normal. Die Ursache für diesen Dysgeneseeffekt liegt in der aktiven Transposase in den Spermien der P-Stämme. Bei der Befruchtung des Eis des M-Stamms wird dadurch eine hohe Rate von Transpositionen induziert, da das Cytoplasma des Eis des M-Stamms keinen Repressor enthält. Der M-Cytotyp wird über mehrere Generationen aufrechterhalten. (Nach Rio 1991, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

339

340 340

Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

können diese mithilfe ihrer Transposase aktiviert werden. Da das Genom von M-Stämmen während der Oogenese nicht imstande ist, das Spleißen der Transposase zu verhindern, und vom Spermium kein Cytoplasma mit P-Repressor zur Verfügung gestellt wird, beginnen die P-Elemente aufgrund des Fehlens des Spleiß-Repressors zu transponieren.

Hybriddysgenese beruht auf der Induktion von Trans-

positionen in genetischen Konstitutionen, bei denen in repressorloses Eicytoplasma bei der Befruchtung Transposons (z. B. P-Elemente) mit eigener Transposase-Aktivität eingeführt werden.

Die Verwendung des P-Elementes zur Herstellung transgener Fliegen wurde erstmals von Rubin und Spradling (Rubin u. Spradling 1982, Spradling u. Rubin 1982) in die experimentelle Genetik eingeführt: Sie injizierten ein P-Element, das ein funktionelles rosy-Gen enthielt, in DrosophilaEmbryonen mit einer rosy-Mutation und stellten dadurch die Wildtyp-Funktion in den Nachkommen wieder her. Seither wurde das P-Element zu einem vielfältigen Werkzeug in der Drosophila-Genetik weiterentwickelt; es kann für die spezifische Einführung von Mutationen (engl. gene tagging), Genunterbrechung (engl. gene disruption) und induzierbare Genexpression verwendet werden. Im Kern kommt es darauf an, durch ein Paar brauchbarer Enden ein transponierbares Konstrukt herzustellen, das durch eine in trans vorhandene Transposase aktiviert werden kann. Transposase wird entweder durch Co-Injektion eines Konstrukts zur Verfügung gestellt, das zwar Transposase produziert, aber sich selbst nicht bewegen kann (z. B. durch „beschädigte“ Enden; engl. wings-clipped elements), oder durch Einführung des Konstrukts in einen Embryo, der eine autosomale Kopie der Δ2-3Transposase besitzt. Die verschiedenen Möglichkeiten der P-Elemente in der experimentellen DrosophilaGenetik werden ausführlich von Ryder und Russell (2003) erörtert. Eine weitere wichtige Gruppe der DNA-Transposons ist die Tc1/mariner-Familie. Als Scott Emmons und seine Mitarbeiter 1983 das transponierbare Element Tc1 im Genom von C. elegans entdeckten, realisierten sie vermutlich nicht, dass das nur die Spitze eines Eisbergs war. Wir wissen heute, dass Homologe von Tc1 und des nahe verwandten mariner-Transposons (aus Drosophila mauritiana) sowie des pogo-Transposons aus Drosophila melanogaster vermutlich die in der Natur am weitesten verbreiteten Transposons sind. Man findet sie in Pilzen, Pflanzen, Ciliaten und Tieren,

einschließlich Namatoden, Arthropoden, Fischen, Fröschen und Menschen. Die Tc1/mariner-Elemente haben eine Länge von 1300 bis 2400 bp und enthalten das Gen für eine Transposase; an den Enden enthalten sie invertierte Wiederholungseinheiten. Diese Wiederholungselemente haben eine unterschiedliche Länge; bei Tc1 enthalten sie weniger als 100 bp, bei Tc3 über 400 bp. Die Tc1/mariner-Elemente, die in den Genomen von Vertebraten gefunden wurden, sind alle „tot“, d. h. sie sind Überbleibsel ehemals aktiver Elemente, die aber nach erfolgreicher Kolonialisierung der Genome durch Mutationen inaktiviert wurden. Allerdings gelang es der Gruppe um Zsuzsanna Izsvák (Ivics et al. 1997), ein Tc1-ähnliches Transposon aus Lachs wieder zu rekonstruieren und zum Leben zu erwecken. Dazu konstruierten sie eine Consensussequenz der Transposase-Gene aus verschiedenen Vertretern der Lachs-Familie, indem sie die inaktivierenden Mutationen entfernten. Diese Transposase bindet spezifisch an die invertierten Wiederholungselemente von Transposons im Lachs und vermittelt präzise cut-and-paste-Transpositionen in Fischen, aber auch bei Mäusen und Menschen. Die Autoren nannten dieses rekonstruierte Transposon sleeping beauty; es kann experimentell zur genetischen Transformation und Insertionsmutagenese verwendet werden, und es wird erwartet, dass mit seiner Hilfe eine nichtvirale Gentherapie möglich wird (Frommolt et al. 2006).

8.2 Retroviren Die Retroviren sind für eine ganze Klasse von transponierbaren Elementen das Standardparadigma (Abb. 8.7), deshalb sollen sie hier auch zu Beginn besprochen werden. Bei Retroviren handelt es sich um infektiöse virale Partikel, deren Genom aus Einzelstrang-RNA besteht (Abb. 8.8). Die Wirkung von Retroviren wurde bereits sehr früh durch Experimente entdeckt, bei denen Hühnern Leukämie durch zellfreie Substrate übertragen werden konnte. Peyton Rous erkannte in der Folge (1911), dass das Rous Sarcoma Virus (RSV) in Hühnern Tumore zu induzieren vermag. Das RSV wird daher auch Avian Sarcoma Virus (ASV) genannt. Die Fähigkeit, Tumore zu induzieren, wurde auch für andere Retroviren nachgewiesen. Sie werden deshalb auch Onkoviren genannt; die Entdeckung der cancerogenen Wirkung der Onkoviren war auch ein wichtiger Schritt, genetische Aspekte von Krebserkrankungen zu definieren (Kapitel 12.4.1).

8.2 Retroviren

Die Virussystematik (Tabelle 8.4) basiert heute auf molekulargenetischen Kriterien. Die Retroviren lassen sich in α‒ε-Retroviren unterteilen (in diese Gruppen gehören viele der Onkoviren). Weiterhin gehören die Lentiviren und Spumaviren zu dieser Gruppe. Der heute bekannteste pathogene Vertreter der Lentiviren

ist das menschliche Immunschwäche-Virus HIV (von engl. human immunodeficiency virus) oder Aids-Virus (engl. acquired immunodeficiency syndrome virus; Kapitel 8.2.2). Spumaviren hingegen scheinen keine pathogenen Vertreter einzuschließen.

5‘-LTR

Abb. 8.7 Übersicht über Retroelemente. Es sind die wichtigsten Klassen von transponierbaren Retroelementen gezeigt. Retroviren sind infektiöse Agenzien, die über ihre LTRs (engl. long terminal repeats) in das Wirtsgenom integrieren und die Transkription ihrer Gene steuern (gag: group specific antigen; env: envelope; pol: reverse Transkriptase). LTR-Retrotransposons sind ähnlich, haben aber kein env-Gen. Die LINE-Elemente sind die wichtigsten Vertreter der LTR-freien Retrotransposons in Säugern. Die SINE-Elemente sind die wichtigsten Vertreter der nicht-autonomen Retroposons in Säugern; sie sind üblicherweise recht klein (< 300 bp). Retropseudogene entstehen, wenn mRNA die LINE-Maschinerie benutzt, um Kopien von sich selbst herzustellen und mit geringer Effizienz ins Genom einzubauen. (Nach Deininger et al. 2003, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

gag

pol

env

3‘-LTR

Retroviren 5‘-LTR

gag

pol

3‘-LTR

LTR-Retrotransposons pol II

ORF1

ORF2 AAAAAA

LTR-freie Retrotransposons (LINEs) pol III AB

AAAAAA

Nicht-autonome Retroposons (SINEs)

Exon 1 Exon 2

Exon 3

Exon 4 AAAAAA

Retropseudogene

Abb. 8.8 a, b Modell eines Retrovirus. a Dreidimensionales Modell. b Aufbau eines Retroviruspartikels am Beispiel des HIV1. Im Inneren des Partikels findet man das konische Capsid, das aus dem Protein p24 besteht. Es enthält zwei virale RNA-Genome, die im Komplex mit dem Nukleocapsidprotein p7 vorliegen und alle Charakteristika einer zellulären mRNA haben. Das Capsid ist von einer Hüllmembran umgeben, welche die ex-

ternen und transmembranen Glykoproteine gp120 und gp41 enthält. Die Innenseite der Membran wird von einer Schicht von Matrixproteinen (p17) ausgekleidet. Das Link-Protein p6 verbindet das Capsid mit der Membran. (a H. Frank, Tübingen; b nach Modrow u. Falke 1997, mit freundlicher Genehmigung von Spektrum Akademischer Verlag)

341

342 342

Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität Tabelle 8.4 Virusklassifikation Familiea

Beispiele

DNA-Viren (Einzelstrang-DNA) Inoviridae

Phage M13

Microviridae

Phage ΦX174

Geminiviridae

Maize streak virus

Parvoviridae

B19-Virus

DNA-Viren (Doppelstrang-DNA) Myoviridae

Phage T4

Siphoviridae

Phage λ

Podoviridae

Phage T7

Poxviridae

Vaccinia-Virus

Herpesviridae

Humaner Herpesvirus 1

Polyomaviridae

Affenvirus 40 (SV40)

Papillomaviridae

Humaner Papillomvirus 16

Adenoviridae

Humaner Adenovirus C

DNA- und RNA-revers-transkribierende Viren Hepadnaviridae

Hepatitis-B-Virus

Retroviridae

Humanes Immunschwäche-Virus (HIV)

RNA-Viren (Doppelstrang-RNA) Cystoviridae

Pseudomonas Phage Φ6

Reoviridae

Rotavirus A

RNA-Viren (Einzelstrang-RNA; Gegenstrang) Paramyxoviridae

Masern-Virus

Rhabdoviridae

Tollwut-Virus

Filoviridae

Ebola-Virus

Orthomyxoviridae

Influenza-A-Virus

RNA-Viren (Einzelstrang-RNA; Sinnstrang) Picornaviridae

Polio-Virus

Potyviridae

Kartoffelvirus Y

Tombusviridae

Tabak-Nekrosis-Virus A

Togaviridae

Röteln-Virus

Flaviviridae

Hepatitis-C-Virus

a

Auswahl, keine vollständige Liste Nach Pringle (1999)

8.2.1 Genomstruktur von Retroviren Das Genom von Retroviren zeigt eine charakteristische Grundstruktur (Abb. 8.9), nämlich lange invertierte Wiederholungselemente an den Enden (engl. long terminal repeats, LTR), die einen Protein-codierenden

Bereich einschließen, dessen Länge zwischen 5 und 9 kb liegt. Ein LTR wird durch die folgenden Sequenzelemente charakterisiert: ï Die Enden der LTRs enthalten kurze terminale invertierte Wiederholungselemente; das eine Ende ist meistens durch eine 5’-TG-3’-Sequenz, das andere durch eine 5’-CA-3’-Sequenz gekennzeichnet; ï einen Transkriptionspromotor; ï eine Kappe; ï ein Polyadenylierungssignal; ï unmittelbar hinter dem 3’-Ende des linken LTR befindet sich die Minusstrang-Primerbindungsstelle (engl. first oder (–)-strand primer binding site), die für die reverse Transkription der RNA erforderlich ist; es handelt sich oft um eine tRNA-Bindungsstelle; ï vor dem 5’-Ende des rechten LTR befindet sich die – meist purinreiche – Plusstrang-Primerbindungsstelle (engl. second oder (+)-strand primer binding site). Retroviren können über die LTRs ins Genom integrieren (Proviren) und können dann als endogene Bestandteile eukaryotischer Genome angesehen werden. Die Protein-codierenden Genbereiche sind für die Vermehrung des Virus erforderlich und enthalten die Information ï für Proteine, die mit der Nukleinsäure des Virus assoziieren und diese verpacken (gag, für engl. group-specific-antigens), ï für eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, auch reverse Transkriptase (RT) genannt (pol, für engl. polymerase), und ï für die Hüllproteine (env, für engl. envelope), die in der Zellmembran für die äußere Verpackung des Virus sorgen. Im endogenen Zustand geht von Retroviren normalerweise keine pathogene Wirkung aus, während sie im exogenen Zustand pathogen sein können. Zum Verständnis ihrer pathogenen Wirkungen ist es notwendig, den Lebenszyklus der Retroviren zu betrachten (Abb. 8.10). Die Infektion einer Wirtszelle erfolgt nach der Adsorption des Virus mithilfe seines Hüllproteins an Rezeptoren in der Zellmembran. Von der viralen RNA wird durch die virale reverse Transkriptase und die RNase H, unter Umständen noch innerhalb des Capsids, in der Zelle ein doppelsträngiges DNA-Molekül gebildet, das als Template zur Synthese von mRNA dient. Die Replikation des Virusgenoms beginnt mithilfe einer tRNA als Primer durch Synthese des Minusstrangs der DNA am 5’-Ende des Virusgenoms. Durch die RNase H wird anschließend

8.2 Retroviren

5‘ LTR

3‘ LTR

Enhancer Promoter

Enhancer Promoter

U3

R U5

gag

pro

pA SD 5‘-Kappe

pol

env SA

U3

R U5

pA 5‘-Kappe

genomische DNA gag-mRNA gag-pro-pol-mRNA

AAAA

env-mRNA

AAAA

Abb. 8.9 Genomische Organisation eines Retrovirus. Der Provirus enthält lange Wiederholungseinheiten an beiden Enden (engl. long terminal repeats, LTR), die in drei Regionen unterteilt werden: U3 (engl. unique to the 3’-end of the mRNA), R (engl. repeatet terminus of the transcript) und U5 (engl. unique to the 5’-end of the mRNA). U3 enthält die Enhancer- und PromotorSequenzen, die die virale Transkription antreiben; die R-Domä-

ne codiert für die 5’-Kappen-Sequenz und das Poly(A)-Signal. gag, pro, pol und env sind Protein-codierende Regionen; die notwendigen Spleißstellen sind ebenfalls angegeben (SD: splice donor; SA: splice acceptor). Die env-mRNA enthält keine gagpro-pol-Sequenzen („Knick“ in der unteren Darstellung, wird herausgespleißt). (Nach Uren 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

der RNA-Strang des 5’-Endes entfernt. Das 5’-Ende des neu entstandenen DNA-Einzelstrangs bindet nunmehr an das 3’-Ende eines weiteren viralen RNA-Moleküls und kann über das restliche Genom hinweg durch die reverse Transkriptase repliziert werden. Die Synthese des Plus-DNA-Strangs beginnt an der Primerbindungsstelle des 3’-Endes des Virusgenoms. Als Primer für die Replikation dienen wahrscheinlich Oligonukleotide, die durch die RNase H gebildet werden. Nach Synthese eines etwa 300 bp langen DNA-Fragments am 3’-Ende des Genoms im Bereich des rechten LTR kann diese Einzelstrang-DNA als Primer der Plus-DNAStrangsynthese im linken LTR dienen. Dieser komplexe Replikationsmechanismus erklärt die veränderte Struktur der LTRs in der doppelsträngigen viralen DNA, die sich nunmehr, möglicherweise durch Bildung eines Rings, als Provirus ins Genom der Wirtszelle einfügen kann (Abb. 8.11).

nome komplexe Regulationssysteme für die Synthese der verschiedenen Virusbestandteile enthalten, die im Wesentlichen auf differenziellem Spleißen verschiedener Transkripte beruhen. Es ist durchaus möglich, dass vergleichbare komplexe Regulationsmechanismen auch für andere Retroviren bestehen.

Nach Integration eines Retrovirus ins Genom kann es durch die wirtszelleigene RNA-Polymerase II nach Initiation am Promotor des LTR transkribiert werden. Hierdurch werden die für die Virusproduktion aus Virus-codierten Proteinen erforderlichen mRNAs hergestellt. Diese gestatten die erneute Produktion viraler Partikel, die aus der Zelle entlassen werden und damit infektiös sind. Die Virusproduktion ist oft letal für die Zelle. Besonders durch die intensive Untersuchung von HIV ist in den letzten Jahren erkannt worden, dass manche Retrovirusge-

Die Integration des Virusgenoms ins Wirtszellgenom erfolgt im Allgemeinen zufallsgemäß. Jedoch können bestimmte Genomsequenzen bevorzugt als Insertionsstellen dienen. Offenbar wird die Provirus-DNA, deren Transkription am Promotor innerhalb des 5’-LTR beginnt, gelegentlich über den 3’-LTR hinweg abgelesen und bildet somit Transkripte, die flankierende Genombereiche enthalten. Solche RNA-Sequenzen können in ein Viruspartikel eingeschlossen werden. Vermutlich durch illegitime Rekombination zwischen den zwei hierin enthaltenen RNA-Molekülen während der reversen Transkription entstehen nach erneuter Infektion einer Zelle partiell defiziente retrovirale Genome mit Sequenzen zellulärer Gene. Als Folge hiervon kann das Virus zu einem Tumor-induzierenden Virus werden. Führt der Einschluss eines zelleigenen Gens in ein Virusgenom zur Entstehung eines Tumorvirus, so wird das betreffende Gen allgemein als virales Onkogen (v-onc) bezeichnet. Sein im Wirtszellgenom natürlich noch immer vorhandenes normales zelluläres Gegenstück bezeichnet man als zelluläres Onkogen (c-onc, von engl. cellular oncogene) oder auch als Protoonkogen.

343

344 344

Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Abb. 8.10 a–f Infektionszyklus eines Retrovirus. a Die Hüllproteine des Virus treten in Kontakt mit Rezeptoren an der äußeren Zellmembran, und das Virus dringt in die Zelle ein. b Die virale RNA wird durch die reverse Transkriptase in Doppelstrang-DNA umgewandelt. c Diese kann als Provirus ins Wirtszellgenom integriert werden. d Polyadenylierte Transkripte sorgen für die

Produktion neuer virusspezifischer Proteine, die anschließend zur Verpackung (e) neu synthetisierter viraler RNA dienen. f Die Zelle entlässt dann, meist unter Lyse, neue Viren. (Nach Balvay et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

8.2 Retroviren

Viele endogene Retroviren re-infizieren nicht unmittelbar ihre eigenen Wirtszellen, sondern können in vitro und/oder in vivo auch andere Spezies infizieren. So infiziert beispielsweise das endogene ALV des Huhns eher Zellen von Wachteln, Fasanen und Truthahn als Hühnerzellen. Ähnlich infiziert ein MLV der Maus eher Zellen des Menschen oder der Ratte als der Maus selbst. Jay Levy prägte 1973 für Viren, die bevorzugt fremde Spezies infizieren, den Begriff „Xenotropismus“ (im Gegensatz zu ecotrop bzw. amphotrop). Dies hat zum einen Konsequenzen für die biologische Medizin, denn man muss sicherstellen, dass Präparate (z. B. monoklonale Antikörper, rekombinante Therapeutika), die in tierischen Zellkulturen hergestellt werden, nicht durch Retroviren kontaminiert werden. Auf der anderen Seite können Retroviren offensichtlich auch in der Evolution als Vektoren für einen horizontalen Genaustausch dienen. So ist der Wirtswechsel bei endogenen Retroviren eine bekannte Tatsache und setzt in der Regel eine Infektion des neuen Wirts voraus, bevor die Insertion in das Genom stattfindet. Abb. 8.12 zeigt die Co-Evolution und Kreuzinfektionen mit MLV-verwandten Genomen in Säugern. Zurzeit können wir die Neuinfektion der Koalabären in Australien mit einem endogenen Retrovirus (KoRV) beobachten: Ausgehend von einem kleineren Gebiet im Norden Australiens vor etwa 100 oder 200 Jahren breitet sich das KoRV in der Keimbahn der Koalabären in unterschiedlicher Kopienzahl nach Süden aus (Stoye 2006).

8.2.2 Humanes Immunschwäche-Virus (HIV)

Abb. 8.11 Insertionsmechanismus eines Retrovirus. Das terminale Dinukleotid (pGT) wird spezifisch vom Ende der viralen DNA durch das Enzym Integrase entfernt. Bei der Weiterverarbeitung wird die OH-Gruppe des unveränderten CA-Dinukleotids an beiden Enden der Stränge exponiert und wirkt in der nachfolgenden Schnitt- und Verknüpfungsreaktion als nukleophile Gruppe. Damit ist die DNA des Retrovirus als Provirus in das Wirtsgenom integriert; an den Reaktionen ist ein zweiwertiges Kation beteiligt (Me2+: Mg2+ oder Mn2+). (Nach Asante-Appiah u. Skalka 1997, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Retroviren sind infektiöse virale Partikel, deren Genom aus RNA besteht. Sie können als Proviren ins Genom eingebaut und mit ihm an Nachkommen vererbt werden. Manche Retroviren können die Bildung von Tumoren induzieren.

Seit der ersten Ausbreitung von HIV unter Menschen in den 1930er-Jahren in Zentralafrika wurden ca. 60 Millionen Menschen weltweit durch HIV-1 infiziert (ein Modell des Virus ist in Abb. 8.8 dargestellt). Im Gegensatz zu HIV-1 ist die Infektion durch HIV-2, das ebenfalls die Immunschwäche-Krankheit Aids hervorrufen kann, aufgrund der geringeren Transmissionsraten wesentlich stärker regional begrenzt geblieben. Die HIV-1-Stämme haben sich in der Zwischenzeit durch Mutation und Rekombination sehr stark verändert: 24 zirkulierende Formen der wichtigsten HIV-1-Gruppe wurden bis zum Jahr 2002 registriert. Darunter sind 11 Untergruppen bzw. Unter-Untergruppen und 13 zirkulierende rekombinierte Formen. Neue genetische Formen entstehen weiterhin überall auf der Welt und verändern die molekulare Epidemiologie der Infektion ständig. Diese große Unterschiedlichkeit der einzelnen HIV-1-Viren und ihre außerordentliche Fähigkeit, auch ohne Selektionsdruck ein hohes Maß an genetischer Variabilität zu erzeugen, behindern vor

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346 346

Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Abb. 8.12 Xenotropie und speziesübergreifende Ausbreitung von Retroviren. Links sind die Stammbäume der Wirte und rechts der Retroviren gezeigt. Die horizontalen Linien deuten eine Co-Evolution an, wohingegen die schrägen Linien Kreuzinfektionen über verschiedene Wirtsarten hinweg andeuten. Zwei eng verwandte Retroviren infizieren Affen (Gibbon) und Beuteltiere (Koalabär), und zwei verwandte endogene Retroviren wurden in Fleischfressern (Fuchs) und Wiederkäuern (Schaf ) gefunden. BaEV: baboon endogenous retrovirus; FeLV: feline leu-

kemia retrovirus; GaLV: gibbon ape leukemia virus; HC2: human endogeneous retrovirus HC2; KoRV: Koala retrovirus; MeEV: Meles endogenous retrovirus; MiEV: mink endogenous retrovirus; MLV: murine leukemia virus; MRRS: murine retrovirus-related sequence; OrEV: Oryctolagus endogenous retrovirus; OvEV: ovine endogenous retrovirus; PERV: porcine endogeneous retrovirus; RV: Retrovirus; VuEV, Vulpes endogenous retrovirus. (Nach Weiss 2006, mit freundlicher Genehmigung des Autors)

allem die Entwicklung effektiver Impfstoffe. Eine gleichbleibend hohe Umsatzrate, bei der täglich Milliarden neuer Viren hergestellt werden, eine durchschnittliche Generationszeit von 2 bis 6 Tagen, verbunden mit einer hohen Mutationsrate (eine Eigenschaft, die HIV mit vielen anderen Retroviren teilt, die Replikationsfehler nicht korrigieren können) und eine Selektion durch Immunität führten zu einer schnellen genetischen Evolution. Seit dem Beginn der HIV-1-Infektion durch Übertragungen von Schimpansen in Zentralafrika haben die Unterschiede in den env-Aminosäuresequenzen schon 25 bis 35 % innerhalb der verschiedenen Untergruppen erreicht. Diese hohe Mutationsrate wird möglich, weil die Retroviren eine spezifische, fehlerreiche Form der Replikation haben. Dazu gehören auch alternative „Sprünge“ der reversen Transkriptase zwischen den beiden genomischen RNA-Strängen, die in jedem Viruspartikel vorliegen, wodurch wie-

der neue, mosaikartige Formen hergestellt werden können (Abb. 8.13). In früheren Klassifikationen wurden HIV-1-Isolate aufgrund ihrer gag- und env-Sequenzen klassifiziert, die zunächst von einem gemeinsamen Ursprung ausgingen. Die Entdeckung jeweils neuer Formen verlangte dann aber ein neues Klassifikationsschema. Derzeit unterscheidet man drei phylogenetische Gruppen (M = Hauptgruppe, O = Ausreißer, N = non-M/nonO). Weltweit werden die meisten Infektionen durch die M-Gruppe hervorgerufen, zu der auch alle ursprünglich identifizierten Untergruppen gehören. Die O-Gruppe ist im Wesentlichen auf Zentralafrika (Kamerun und dessen Nachbarländer) beschränkt, aber selbst dort ist die O-Gruppe eine Minderheit. Bisher wurden wenige N-Fälle bekannt, ebenfalls alle aus Kamerun. Jede dieser drei Gruppen soll unabhängig voneinander von Schimpansen auf Menschen übertragen worden sein, da evolutionsgenetische Untersu-

8.2 Retroviren

Abb. 8.13 Mosaikartige Struktur der HIV-1-Formen. Die Buchstaben und Farben stellen die unterschiedlichen Untergruppen der HIV-1-Hauptgruppe „M“ dar. Die Buchstaben am Ende des Namens geben an, aus welchen Untergruppen die jeweilige Form zusammengesetzt ist (z. B. AE aus den Untergruppen A und E); cpx bedeutet eine komplexe Zusammensetzung.

Zwischen den flankierenden LTR-Elementen befinden sich die Gene, die für die verschiedenen HIV-Proteine codieren. CRF: zirkulierende rekombinierte Form; A bis U: Untergruppen der HIV1-Hauptgruppe M. (Nach Thomson et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

chungen unterschiedliche Ähnlichkeiten mit dem Schimpansen-Virus (SIV) zeigen. Es gibt also nicht einen einzigen Flaschenhals, sondern ab einer bestimmten Phase der SIV-Evolution ging die Übertragung auf den Menschen offensichtlich relativ einfach und dafür gleich mehrfach. Innerhalb der Hauptgruppe M wurden bisher 9 Untergruppen identifiziert, die mit den Buchstaben A‒D, F‒H, J und K bezeichnet werden. Dabei können die Untergruppen A und F nochmals in A1 bis A3 bzw. F1 und F2 unterteilt werden. Innerhalb dieser Untergruppen können auch regionale Cluster identifiziert werden, z. B. die Untergruppe C aus Indien und Äthiopien, G aus Spanien und Portugal oder B aus Thailand. Die Formenvielfalt wird noch dadurch verstärkt, dass zwischen den verschiedenen Untergruppen Rekombinationen auftreten können, wenn Patienten mit verschiedenen Untergruppen infiziert wurden. Diese im Blut zirkulierenden, rekombinierten Formen (engl. circulating recombinant forms, CRFs) wurden in vielen Fällen durch vollständige Sequenzierung der Virusgenome charakterisiert und sind in Abb. 8.13 in

ihrer Mosaikform dargestellt. Abb. 8.14 zeigt die geographische Verteilung der verschiedenen genetischen Formen von HIV-1.

8.2.3 Retroelemente Eine wichtige Klasse transponierbarer DNA-Sequenzen wird aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit zu Retroviren (Tabelle 8.1) unter der Bezeichnung Retrotransposons zusammengefasst. Es gibt eine größere Anzahl von Familien unterschiedlicher Retrotransposons (in Drosophila etwa 50), die sich in der Sequenz und der Länge ihrer LTRs unterscheiden und auch im codierenden Bereich jeweils charakteristische Eigenschaften aufweisen, sodass es möglich ist, jedes dieser Elemente einer bestimmten Sequenzfamilie zuzuweisen. Die Struktur der LTRs ist sowohl für die Transkription als auch für den Transpositionsmechanismus von entscheidender Bedeutung. Funktionsfähige Retrotransposons bedürfen je zweier terminaler LTRs; Elemente mit nur einem LTR sind stets immobil.

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Abb. 8.14 Geographische Verteilung verschiedener genetischer Formen von HIV-1. Die Frequenz der verschiedenen HIV1-Untergruppen und rekombinierten Formen wurde auf der Basis veröffentlichter Daten abgeschätzt. Die verschiedenen Länder sind entsprechend der überwiegenden Untergruppe farblich markiert (grau: niedrige HIV-1-Erkrankungsrate). Die

Kreisdiagramme geben die Verhältnisse der verschiedenen Untergruppen zueinander wider; die Größe der Kreise entspricht dem relativen Anteil HIV-1-Infizierter in der jeweiligen Region im Verhältnis zur Gesamtzahl. (Nach Ariën et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Die von Retrotransposons codierten Enzyme unterscheiden sich natürlich teilweise von denen der Retroviren (so wird z. B. kein Hüllprotein gebraucht). Im Einzelnen codieren Retrotransposons für: ï eine Protease, ï eine reverse Transkriptase, ï eine Ribonuklease H, ï eine Integrase.

der reversen Transkriptase können dann an weiteren primären Transkripten, über die Zwischenstufe eines DNA/RNA-Hybridmoleküls, doppelsträngige DNAMoleküle gebildet werden. Dieses Molekül stellt eine komplette Kopie des Transposons dar und kann linear oder zirkulär sein. Unter den zirkulären Molekülen findet man auch solche, die nur noch eine LTR besitzen, ähnlich wie es bei den RNA-Molekülen beobachtet wird, die das Retrovirusgenom bilden. Mithilfe der Integrase können die zirkulären DNA-Moleküle mit zwei LTRs dann an beliebigen Stellen ins Genom integriert werden (vgl. dazu auch den Insertionsmechanismus eines Retrovirus; Abb. 8.11). Allerdings besteht für die verschiedenen Transposons hinsichtlich der Integrationsstellen offenbar eine gewisse Präferenz für bestimmte Sequenzen. Solche Präferenzen können sich auf die allgemeine Basenzusammensetzung einer

Die wesentlichen Schritte des Transpositionszyklus eines Retrotransposons bestehen in der Transkription des Elementes durch RNA-Polymerase II, die im Promotor des linken, also 5’-LTR die RNA-Synthese initiiert, und das gesamte Element in ein primäres Transkript kopiert. Die Transkription endet im rechten, also 3’-LTR. Die Transkripte dienen zunächst zur Synthese der verschiedenen bereits erwähnten Enzyme. Mittels

8.2 Retroviren

Region (meist AT-reich) oder aber auf bestimmte Nukleotidsequenzen beziehen. Ausgesprochene Sequenzspezifität der Insertion hat man beispielsweise bei einigen Insertionen des Transposons copia im white-Locus oder denen des Transposons gypsy im bithorax-Locus von Drosophila gefunden. Die Struktur der primären Transkripte erklärt uns auch, auf welche Weise Retrotransposons flankierende Genomsequenzen bei Transpositionen mit sich führen können. Unterbleibt nämlich eine Termination der Transkription in der rechten (3’-)LTR, so liest die RNA-Polymerase die daran anschließenden GenomDNA-Sequenzen mit. Bei einer reversen Transkription des Primärtranskripts werden diese dann zu Bestandteilen des Retrotransposons und können an neuen Genompositionen integriert werden. Im Gegensatz zu Retroviren sind – zumindest die meisten – Retrotransposons nicht in der Lage, infektiöse (extrazelluläre) Partikel zu produzieren. Somit scheint eine „horizontale“ Ausbreitung zwischen Individuen nicht möglich. Allerdings gab es seit Anfang der 1980er-Jahre erste Hinweise darauf, dass Transposons bei Drosophila übertragen werden könnten. Man dachte zunächst, dass es sich dabei um Besonderheiten handelt, die im Detail aber nicht aufgeklärt wurden. In den folgenden Jahren nahmen aber entsprechende Berichte zu, und wir können heute von über 100 vermutlichen Ereignissen dieser Art allein bei Drosophila ausgehen – was natürlich an der weltweiten Verbreitung von Drosophila liegt, aber auch daran, dass Drosophila und seine verwandten Stämme genetisch so gut untersucht sind. Wenn man sich die übertragenen Transposons betrachtet, fällt auf, dass 52,4 % DNA-Transposons sind, gefolgt von 42,6 % LTR-Transposons und 5 % Nicht-LTR-Transposons. Dieses Spektrum erlaubt natürlich auch Hinweise auf den Mechanismus. Im Falle von LTR-Transposons wissen wir heute, dass sie infektiöse Partikel bilden können. Daher ist der Übergang zwischen einem Retrotransposon und einem Retrovirus aber auch etwas fließend: Lange Zeit wurde gypsy als ein Retrotransposon betrachtet, bis seine Infektiosität entdeckt wurde; heute gilt gypsy als ein Retrovirus. Andere Mechanismen des horizontalen DNA-Transfers schließen auch DNA-Viren (inklusive Bakteriophagen) ein sowie spezifische Wechselwirkungen zwischen Parasiten und ihren Wirten. In manchen Fällen ist aber auch noch nicht einmal die Richtung des Gentransfers klar (für eine aktuelle Übersicht siehe Loreto et al. 2008). Zumindest einige Retrotransposons werden sowohl in der Keimbahn als auch in somatischen Zellen intensiv transkribiert. Das erste bei Drosophila identifizierte

Retrotransposon – copia – wurde aufgrund seines hohen Transkripttiters (Name!) aus kultivierten Zellen isoliert. In diesen kultivierten Zellen gibt es zwei Haupttranskripte von 5 kb und 2 kb Länge. Das längere umfasst das gesamte Retrotransposon: Es startet in der 5’-LTR und endet in der 3’-LTR; dabei hat es einen durchgehenden offenen Leserahmen für ein Protein aus 1409 Aminosäuren. Die Proteinsequenzen entsprechen den oben genannten vier Proteinen. Durch eine autokatalytische Protease wird das Protein in seine reife Form überführt; eine Mutation in dem Bereich, der für das aktive Zentrum der Protease codiert, verhindert die Ausbildung der reifen Virus-ähnlichen Partikel. Das kürzere Transkript (2 kb) ist offensichtlich ein alternatives Spleißprodukt und enthält die wesentlichen Informationen, um Virus-ähnliche Partikel (engl. virus-like particles, VLP) zu bilden, die im Elektronenmikroskop nachweisbar sind. Die Menge der gebildeten copiaTranskripte ist streng reguliert und hat ihr Maximum während des Larvenstadiums (Yoshioka et al. 1990). Zur gleichen Gruppe wie copia werden auch die Ty-Elemente der Hefen gezählt (engl. transposons in yeast; Ty). Die Transposition in Hefe ist ein sehr seltener Prozess und kommt mit einer Frequenz von 10−5 bis 10−7 pro Ty-Element und Generation vor. Allerdings gibt es Situationen, in denen diese Frequenz deutlich erhöht wird. Dazu gehören Umweltveränderungen wie tiefe Temperaturen, UV-Strahlung oder Stress (z. B. Stickstoffmangel). Die erhöhte Transpositionsrate erlaubt möglicherweise eine schnellere Anpassung an veränderte Umweltbedingungen. Nach der Transkription der genomischen Ty-Elemente im Zellkern werden die Ty-RNAs ins Cytoplasma exportiert, wo die entsprechenden Proteine hergestellt werden. Dabei verbinden sich die Strukturproteine zu Virus-ähnlichen Partikeln, und die TyRNA, tRNA und Ty-codierte Enzyme werden in diese Partikel eingeschlossen. In einem Reifeprozess werden die Partikel umgebaut, die RNA durch die reverse Transkriptase umgeschrieben und der gesamte Komplex in den Zellkern zurücktransportiert; dort kann dann das Ty-Element in eine neue Stelle des Genoms integrieren. Die Bedeutung der Virus-ähnlichen Partikel für den Transpositionsprozess wurde durch die Beobachtung gestützt, dass Mutationen in den Genen für diese Strukturproteine in vivo vor der Transpositionsreaktion schützen kann. Die Ähnlichkeit des Ty-Elementes mit Retroviren wird deutlich, wenn man sich die genomische Struktur dieses Elementes betrachtet (Abb. 8.15). Mitglieder der copia/Ty-Element-Familie kommen nicht nur bei Drosophila und Hefen vor, sondern sind darüber hinaus in Pflanzen, Amphibien und Schlangen weit verbreitet. Üblicherweise beträgt die Kopienzahl im Genom 10 bis 100; in einigen Pflanzen (Gerste, Bohne) kann sie aber auch bis zu 100.000 betragen.

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Abb. 8.15 a–d Struktur und Organisation eines typischen TyElementes. a Die einzelnen Strukturelemente des Ty1-Genoms sind denen der Retroviren sehr ähnlich, insbesondere die flankierenden LTR-Regionen mit den Domänen U3, U5 und R. b Die mRNA des Ty1-Transposons ist 5,7 kb lang und umfasst die Bereiche zwischen den beiden R-Domänen der flankierenden LTRs. Die codierende Sequenz (5,2 kb) enthält zwei überlappende offene Leserahmen. c Die genomische Struktur und die

Retrotransposons

zeichnen sich durch eine genau festgelegte Struktur mit LTRs und einer Reihe Proteincodierender Gene aus, insbesondere durch eine reverse Transkriptase. Trotz ihrer Ähnlichkeit zu Retroviren bilden sie im Allgemeinen keine infektiösen Partikel, sondern werden als Bestandteile des Genoms vererbt.

Neben den zuvor beschriebenen Gruppen von Transposons ist noch eine Vielzahl anderer Transposons bekannt, die keine auffälligen gemeinsamen Struktureigenschaften zeigen. Lediglich der zugrunde liegende Transpositionsmechanismus könnte ihnen allen gemein sein. Dafür spricht, dass viele dieser beweglichen Elemente eine Poly(A)-Region an einem Ende besitzen. Das wird als Anzeichen dafür angesehen, dass die Transposition über den Zwischenschritt von polyadenylierten Transkripten erfolgt, die mittels einer reversen Transkriptase in DNA umgewandelt werden, wie wir es bereits für Retrotransposons gesehen haben. Man hat daher diese Gruppe von Transposons auch Retroposons genannt, im Unterschied zu den Retrotransposons, die durch LTRs und die übrigen Merkmale retroviraler Elemente charakterisiert sind. Diese Bezeichnung erscheint sehr sinnvoll, da sie eine wesent-

Proteindomänen sind dargestellt, die von den beiden Genen TYA und TYB codiert werden. d Durch proteolytische Spaltung des Translationsprodukts P1 entsteht das Protein 2, das Capsid (CA); durch Spaltung von P3 entstehen die einzelnen Enzyme: PR (Protease), IN (Integrase) und RT-RH (reverse Transkriptase). PBS: tRNA-Primer-Bindestelle; PPT1 und PPT2: vermutete Polypurin-Regionen (engl. putative polypurine tracts). (Nach Roth 2000, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

liche Eigenschaft der betreffenden Transposons herausstellt – die Transposition durch einen Mechanismus, der eine Funktion der reversen Transkriptase einschließt. Sie soll daher im Folgenden auch beibehalten werden, obwohl sie in der wissenschaftlichen Literatur nicht durchgängig verwendet wird. Im Übrigen besitzen Retroposons keine terminalen direkten oder invertierten Repeats. Ihre innere Struktur ist häufig durch ORFs gekennzeichnet, die für DNA-Bindeproteine, reverse Transkriptasen und Invertasen codieren. Zu den Retroposons gehören auch prozessierte Pseudogene. Die bekanntesten Retroposons sind: ï der I-Faktor von Drosophila, ï die LINEs-Familie, ï die SINEs-Familie.

Retroposons sind durch einen Transpositionsmechanismus gekennzeichnet, der eine reverse Transkription polyadenylierter RNA einschließt.

Der I-Faktor Ähnlich wie der P-Faktor wurde auch der I-Faktor durch genetische Experimente entdeckt, die der P-Element-induzierten Hybriddysgenese (S. 338) sehr ähnlich sind. Es stellte sich dann heraus, dass auch der

8.2 Retroviren

I-Faktor ein Transposon mit einer Länge von 5371 bp ist. Im Genom wird es an beiden Seiten von einer 12-bp-Duplikation genomischer DNA flankiert, die aber bei verschiedenen Insertionsstellen von I-Elementen in ihrer Länge zwischen etwa 10 und 14 bp variieren kann. Der I-Faktor besitzt zwar keine terminalen Wiederholungseinheiten, aber die Sequenzen an den Enden sind stark konserviert. Er ist am rechten Ende durch die Sequenz TCA(TAA)n charakterisiert; kurz vor dem 3’-Ende liegt ein Polyadenylierungssignal (5’-AATAAA-3’), das eine Polyadenylierung der Transkripte ermöglicht. In seinem mittleren DNABereich besitzt der I-Faktor zwei ORFs, die durch ein Intron von 471 bp (mit einem zusätzlichen internen, 228 bp langen ORF) getrennt werden. ORF1 codiert für ein Protein, das den gag-Proteinen der Retroviren sehr ähnlich ist. ORF2 codiert für ein Protein, das Ähnlichkeiten mit einer Endonuklease, einer reversen Transkriptase und RNase-H-Molekülen hat (Chaboissier et al. 1990). Bei Drosophila gibt es in Bezug auf den I-Faktor zwei Stämme: induzierende Stämme (I-Stämme), die etwa 10 Kopien des I-Faktors an verschiedenen Stellen des Genoms integriert haben, und reaktive Stämme (R-Stämme) ohne funktionelle I-Faktoren. Die I-Faktoren des I-Stamms sind reprimiert und transponieren nicht in I-Stämmen. Wenn aber R-Weibchen mit I-Männchen gekreuzt werden, sind die I-Faktoren in der Keimbahn von Fliegenweibchen aktiv, die aus dieser Kreuzung hervorgehen. Dies führt zu vielfältigen Mutationen und im Extremfall auch zu embryonalem Tod (Hybriddysgenese). Diese beobachtete Sterilität ist vollständig maternal determiniert und unabhängig vom Genotyp des Embryos. Die Anzahl der toten Embryonen ist ein direktes Maß der Transpositionsfrequenz des I-Faktors. Die I-Faktor-Transposition ist offensichtlich auf die weibliche Keimbahn beschränkt; es wird nicht in der männlichen Keimbahn beobachtet.

LINEs

auf etwa 1 pro 50 Spermien geschätzt; bei der Maus finden wir ca. 3000 potenziell aktive L1-Elemente. Retroposons mit DNA-Sequenzen, die den L1-Elementen sehr ähnlich sind, wurden in vielen Säugergenomen nachgewiesen. Offenbar leiten sie sich alle von einem ursprünglichen Element ab, das zwei ORFs besaß. Der erste, kürzere ORF codiert für ein DNAbindendes Protein, das Ähnlichkeit mit dem retroviralen gag-Genprodukt aufweist. Das Protein, das durch den zweiten ORF codiert wird, hat die Eigenschaften einer Endonuklease und einer reversen Transkriptase; es ist dadurch in der Lage, sich nach der Transkription im Genom zu bewegen. Die Transkription erfolgt durch die RNA-Polymerase II. Innerhalb einer Art sind die verschiedenen Kopien der L1-Sequenzfamilie weniger divergent in ihren Nukleotidsequenzen als zwischen verschiedenen Organismen. Man muss daher davon ausgehen, dass die Sequenzfamilie einer Art aus einem oder einigen wenigen ursprünglichen Elementen abzuleiten ist. Die Länge der L1-Elemente unterscheidet sich zwischen den verschiedenen Genomen. So ist die menschliche L1-Sequenz (L1Hs = L1 von Homo sapiens) 6,5 kb lang, während die der Maus (L1Md = L1 von Mus domesticus) 7 kb lang ist. Komplette L1-Elemente besitzen einen Poly(A)-Bereich am 3’-Ende und haben flankierende Duplikationen der Insertionsstelle im Genom, die wie beim I-Faktor für verschiedene Genomfragmente zwischen 5 und 19 bp in der Länge variieren können. Diese strukturellen Eigenschaften deuten darauf hin, dass der Insertionsmechanismus über ein polyadenyliertes Transkript und einen reversen Transkriptasemechanismus verläuft. Der überwiegende Teil der genomischen L1-Elemente (die auch die früher KpnIFamilie genannten Sequenzen einschließen) ist defekt und meist am 5’-Ende unvollständig (engl. truncated), wie man es für unvollständige Produkte der reversen Transkriptase erwartet. Nur wenige Tausend der Genomelemente haben ihre vollständige Länge. Für die kürzeren Elemente beobachtet man eine zunehmende Variabilität in der DNA-Sequenz der ORFs. Das deutet auf einen evolutionär älteren Ursprung solcher defekten Elemente hin, die allmählich durch Mutationen degenerieren. Eine Übersicht über die Bedeutung der L1-Elemente für die Evolution im Genom gibt Abb. 8.16a‒e.

LINE-1 (engl. long interspersed nuclear elements; L1) ist das wichtigste Retroposon in Säugern. Dabei handelt es sich um repetitive DNA-Sequenzen von 4 bis 10 kb Länge, die sich mit etwa 500.000 Kopien über das Genom verteilt zwischen anderen DNA-Sequenzen eingestreut finden; das macht in der Summe etwa 17 bis 20 % des Genoms aus. L1-Elemente integrieren bevorzugt in A/T-reichen genomischen Regionen. Obwohl im menschlichen Genom nur etwa 80 bis 100 Kopien aktiv sind, wird die Frequenz der Retrotransposition

Eine Expression von L1-Elementen hat man in frühen Entwicklungsstadien männlicher und weiblicher Keimzellen der Maus gefunden, insbesondere vor dem Einsetzen der zweiten meiotischen Teilung (Meiose II; Abb. 5.16). Es gibt allerdings vereinzelte Hinweise, dass L1-Elemente auch in somatischen Zellen transkribiert werden können, besonders in Stammzellen und Tumorzellen, nicht aber in differenzierten Zellen.

Der I-Faktor von Drosophila ist ein Retroposon, das in

ähnlicher Weise wie der P-Faktor Hybriddysgenese auszulösen vermag.

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

In der Pflanze wurde 1987 Cin4 als erstes L1-Element charakterisiert, und zwar als eine Insertion im 3’-untranslatierten Bereich im A1-Gen von Mais. Im Folgenden wurden mehrere Kopien identifiziert, die im 3’-Bereich identisch mit Cin4 waren, allerdings im 5’-Bereich eine große Heterogenität aufwiesen. Man schätzt, dass das Mais-Genom etwa 50 bis 100 Kopien des Cin4-Elementes enthält; die größte ist 6,6 kb lang.

Im Säugergenom gibt es Retroposons, deren vorherrschender Vertreter das LINE-1-Element ist. Seine Länge (4 bis 10 kb) kennzeichnet es als long interspersed nuclear element. Es kommt im menschlichen Genom mit einer Häufigkeit von bis zu 1 Million Kopien vor. Die Transkription erfolgt durch RNA-Polymerase II.

Abb. 8.16 a–h Genetische Bedeutung von L1-Retroelementen. a Typische Insertion eines am 5’-Bereich verkürzten L1Elementes in eine neue Stelle des Genoms. b Modifikation der Standard-Insertion, bei der das 5’-Segment invertiert ist. c Wenn ein L1-Element unterhalb oder oberhalb zusätzliche Sequenzelemente enthält, können diese an die neue Stelle im Genom mit übertragen werden. d Die Insertion von L1Elementen bewirkt manchmal die Deletion einer Sequenz (Δ) oder Rearrangements (Pfeilköpfe) an der 5’-Integrationsstelle. e Während des Übertragungsprozesses können andere RNA-

Moleküle (hier als Beispiel U6) eingefangen werden und als chimäres Molekül integriert werden. f Ein L1-Element kann in trans Aktivitäten zur Insertion nicht-autonomer RNAs unterstützen. g Chromosomale Duplikationen oder Deletionen können aufgrund von ungleichen Rekombinationen zwischen Elementen (in diesem Fall Alu-Elementen) auftreten, die schon in das Genom integriert sind. h Insertion mobiler Elemente kann eine genomische Instabilität bewirken, was zu heterogenen, illegitimen Rekombinationsereignissen führen kann. (Nach Deininger et al. 2003, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

8.2 Retroviren

SINEs Die short interspersed nuclear elements sind ebenfalls repetitive DNA-Sequenzen mit etwa 1 Million Kopien im Genom, die zwischen andere DNA-Sequenzen eingefügt, aber nur einige Hundert Basenpaare (weniger als 500 bp) lang sind. SINEs repräsentieren damit immerhin etwa 10 % der menschlichen DNA; man findet im Mittel alle 5 kb ein solches Element (bevorzugt in G/C-reichen Regionen). Im Gegensatz zu den zuvor besprochenen Retroposons haben SINEs keine eigenen Protein-codierenden DNA-Sequenzen. Die Gesamtlänge von kompletten SINEs liegt bei 300 bp, wie sie z. B. die am besten charakterisierte SINEFamilie in Säugern besitzt, die menschliche Alu-Familie. Identifiziert wurde diese Familie von Retroposons als repetitive DNA-Sequenzfamilie, deren Kopien zwischen andere DNA-Sequenzen eingefügt sind, und die durch das Restriktionsenzym AluI geschnitten werden können. Alu-Elemente besitzen eine interne Wiederholungsstruktur, die sich auf die Duplikation einer etwa 130 bp langen DNA-Sequenz zurückführen lässt (Abb. 8.17). Allerdings unterscheiden sich die linke und rechte Hälfte des Elementes sowohl in ihrer allgemeinen Sequenz, da sie nur ~ 70 % Basenhomologie besitzen, als auch in der Tatsache, dass nur die linke Wiederholungseinheit einen RNA-Polymerase-III-Promotor besitzt. Die Alu-Elemente enthalten zwar keine Protein-codierenden DNA-Sequenzen, sie zeigen aber eine auffallende Homologie zu einer RNA, der 7SLRNA, die zu den kleinen cytoplasmatischen RNAs (engl. small cytoplasmic RNA, scRNA; Tabelle 3.4) gehört. 7SL-RNA ist ein Bestandteil des intrazellulären Transmembrantransportsystems und wird, wie auch

5S-rRNA, U6-snRNA und tRNAs, durch RNA-Polymerase III transkribiert (S. 306). In anderen Säugergruppen findet man SINEs, die sich von anderen RNA-Polymerase-III-transkribierten Genen, z. B. U3-snRNA oder t-RNA, ableiten. Auffallend ist hierbei, dass die SINEs oft im 3’-Bereich der ursprünglichen RNAs verkürzt (engl. truncated) sind. Die SINEElemente der Maus werden als B1 (von der 7SL-RNA abgeleitet) und B2 (von tRNA abgeleitet) bezeichnet. Es gibt viele Hinweise darauf, dass SINE-Elemente für ihre Transposition die von L1-Elementen codierten Proteine benötigen (Abb. 8.16f). Die neue Insertion von SINEs in Introns kann zu einem veränderten Spleißen führen, da die Alu-Elemente über verschiedene Spleißstellen verfügen (9 potenzielle 5’-Spleißstellen und 14 potenzielle 3’-Spleißstellen). So führt eine Mutation im Intron 6 des CTDP1Gens (C-terminale Domäne der RNA-Polymerase II, Phosphatase-Untereinheit) zunächst zu einem veränderten Spleißen eines Alu-Exons und schließlich zu einem komplexen Krankheitsbild aus angeborenen Katarakten, Fehlbildungen im Gesicht und Neuropathien. Aber auch ungleiche Rekombinationen (Abb. 8.16g) und eine Kopf-zu-Kopf-Anordnung der AluElemente (Abb. 8.16h) können zu verschiedenen Krankheitsformen bzw. zu genomischer Instabilität der entsprechenden Region führen. Alu-Elemente sind in den Vorläufern der Primaten und Nager aus der 7SL-RNA entstanden und hatten als monomeres Element zunächst eine Länge von nur ~ 150 bp. Später in der Evolution der Primaten fusionierten zwei Monomere zu dem ~ 300 bp langen Dimer. Im weiteren Verlauf der Evolution wurden einige SINE-Elemente durch Mutationen inaktiv, neue Gruppen entstanden und haben sich ausgebreitet. Dabei können die jeweiligen Insertionen als „diagnostische Marker“ für evolutionsbiologische Analysen verwendet werden.

Prozessierte Pseudogene

Abb. 8.17 Molekulare Struktur eines Alu-Elementes. Alu-Elemente sind ungefähr 300 bp lang; sie sind aus zwei ähnlichen, aber nicht äquivalenten Hälften aufgebaut (linker Arm und rechter Arm). Der linke Arm enthält funktionelle, aber schwache A- und B-Boxen des internen Promotors der RNA-Polymerase III. Der rechte Arm enthält im Vergleich zum linken Arm eine 31-bp-Insertion. Die beiden Arme sind in der Mitte durch eine A-reiche Region getrennt; am rechten Ende befindet sich ein Poly(A)-Schwanz. (Nach Häsler u. Strub 2006, mit freundlicher Genehmigung von Oxford University Press)

Pseudogene haben große Sequenzähnlichkeiten mit funktionellen Genen; sie werden aber üblicherweise nicht transkribiert, weil ihnen entweder funktionelle Promotoren oder andere regulatorische Elemente fehlen. Prozessierte Pseudogene (auch als Retropseudogene bezeichnet; engl. processed pseudogenes) sind durch Retrotransposition der mRNA funktioneller Gene durch LINE-1-Elemente in das Genom eingefügt worden (Abb. 8.18). Ihre typischen strukturellen Eigenschaften sind ï das Fehlen von Introns, ï der Besitz einer Poly(A)-Sequenz am 3’-Ende und ï das häufige Fehlen des 5’-Endes.

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Abb. 8.18 a–g Prozessierte Pseudogene. a, b Prozessierte Pseudogene werden gebildet, wenn das Gen transkribiert und die reife mRNA ausgebildet ist. c Die Retroposition des Gens wird durch die L1-Endonuklease-Domäne vermittelt (violettes Rechteck), die einen ersten Schnitt (gelber Stern) in der genomischen DNA an der Insertionsstelle setzt (Zielsequenz TTAAAA). d Dieser Schnitt ermöglicht es der L1-reversen-Transkriptase (violettes Oval), an dieser Stelle zu starten und den parentalen mRNA-Strang als Matrize zu benutzen. d, f Es wird ein zweiter Schnitt gesetzt und die Synthese des zweiten Strangs kann be-

ginnen. g Durch die zwei Schnitte wird eine cDNA-Synthese in den Überhang-Regionen ermöglicht. Dieser Prozess führt zu einer Verdoppelung der Sequenzen, die der Zielsequenz benachbart waren. Dies ist ein molekulares Charakteristikum retrotransponierter Gene; weitere sind ihre Intronlosigkeit sowie die Anwesenheit von Poly(A)-Sequenzen. Die direkten Wiederholungseinheiten und die Poly(A)-Sequenzen degenieren allerdings im Laufe der Zeit und sind daher nur in evolutionär jungen Retrokopien zu identifizieren. (Nach Kaessmann et al. 2009, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

8.2 Retroviren

Prozessierte Pseudogene haben oftmals viele Mutationen angehäuft, wie Verschiebungen der Leseraster, Stoppcodons oder eingestreute Wiederholungselemente. Im Maus-Genom sind etwa 5000 solcher prozessierter Pseudogene bekannt, beim Menschen etwa 8000. Man kann sie als „molekulare Fossilien“ betrachten, da sie bedeutende Ressourcen für evolutionäre Betrachtungen und für die vergleichende Genomforschung darstellen. Experimentell können sie allerdings Schwierigkeiten bereiten, da ihre Sequenzen in der PCR oder in Hybridisierungsexperimenten mit den „elterlichen“ Genen interferieren; auch in den Datenbanken werden solche Gene manchmal noch irrtümlich als funktionell bezeichnet (vgl. dazu http://www. pseudogene.org). Viele prozessierte Pseudogene stammen von Genen ab, die für ribosomale Proteine codieren; einen allgemeinen Überblick dazu vermittelt Abb. 8.19. Es gibt extreme Beispiele, so sind z. B. mehr als 140 Pseudogen-Kopien des Gens für das ribosomale Protein RPL21 über das menschliche Genom verteilt.

Prozessierte Pseudogene sollten von einer anderen Klasse von Pseudogenen unterschieden werden, die durch Duplikationen von Genomsequenzen entstanden sind und durch Verlust ihrer Regulationselemente oder aufgrund von Mutationen (z. B. Deletionen) nicht funktionell sind. Beide Arten von Pseudogenen lassen sich strukturell aufgrund ihrer Entstehung leicht unterscheiden. Genduplikationen enthalten noch ihre Introns und besitzen keine 3’-terminalen Poly(A)-Regionen, da diese erst posttranskriptionell angefügt werden. Prozessierte Pseudogene hingegen enthalten häufig terminale Poly(A)-Bereiche, aber keine Introns, da diese bereits während der Transkription entfernt werden.

Es gibt zwei Arten von Pseudogenen. Die eine entsteht durch reverse Transkription polyadenylierter mRNAs und darauffolgende Integration ins Genom. Die zweite Art leitet sich von duplizierten Genen ab, die aufgrund von Defekten (z. B. durch ein fehlendes 5’-Ende) nicht funktionsfähig sind.

Transferase (115) Rezeptor (111) Endopeptidase (110) Strukturmolekül (172)

Zinkbindung (98)

Nukleinsäurebindung (172)

Hydrolase (95)

DNA-Bindung (201)

Isomerase (84)

Integrase (59) Proteinbindung (59) Ligase (54) Chaperone (46)

Oxidoreduktase (264)

Bindung (44)

andere (854)

nicht klassifiziert (804)

ribosomale Proteine (1134)

Abb. 8.19 Abstammung prozessierter Pseudogene. Die Klassifizierung der prozessierten Pseudogene erfolgt entsprechend funktioneller Kategorien. „Nicht klassifiziert“ sind solche Pseudogene, die von Genen abstammen, die nicht in vorgegebene Kategorien fallen; „andere“ sind solche, deren Kategorien ins-

gesamt nur wenige Mitglieder umfassen. Es fällt auf, dass der größte Einzelblock solche Gene sind, die für ribosomale Proteine codieren. (Nach Zhang et al. 2004, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

8.2.4 Mobile Elemente in Introns der Gruppe II Introns der Gruppe II (Kapitel 3.3.5) sind große RNA-Moleküle, die autokatalytische Spleiß-Eigenschaften haben und daher auch als Ribozyme bezeichnet werden. Sie kommen in Organellen von Protisten, Pilzen, Algen und Pflanzen vor, aber auch in Bakterien. Diese Introns bilden spezifische Sekundärstrukturen aus, die durch 6 größere Domänen gekennzeichnet sind (Abb. 8.20a). Die Spleißreaktion der meisten Gruppe-II-Introns wird durch Proteine unterstützt, die durch das Intron selbst codiert werden (z. B. Maturase) oder die vom Wirt zur Verfügung gestellt werden. Einige der Protein-codierenden Introns der Gruppe II treten auch als mobile Elemente auf. Sie können effizient in intronlose Allele desselben Gens integrieren, aber mit geringerer Frequenz auch an anderen Stellen des Genoms. Die Mobilität hängt von den Funktionen der Proteine ab, die in dem Intron codiert werden (Endonuklease und reverse Transkriptase; Abb. 8.20b), aber natürlich auch von der Intron-RNA. Da Gruppe-II-Introns ihre Ziel-DNA hauptsächlich über die Basenpaarung der Intron-RNA erkennen, können sie durch Veränderungen dieser Intron-RNA auch auf andere Ziele umgelenkt werden. Diese Eigenschaft, verbunden mit einer hohen Frequenz und Spezifität der Insertion, ermöglicht es, mobile Gruppe-II-Introns auch als programmierbare Vektoren zum Ausschalten spezifischer Gene in Bakterien zu verwenden („Targetron“). Die Bedeutung mobiler Retroelemente in Introns ist in ihrer vollen Bedeutung noch unverstanden. Wie andere transponierbare Elemente könnten auch die mobilen Elemente der Gruppe-II-Introns eine wichtige Rolle bei der vertikalen Diversifikation durch Rekombination und genetische Umorganisationen gespielt haben. Die spezifischen Eigenschaften, nämlich ihr autokatalytisches Spleißen, das Vorkommen einer reversen Transkriptase und die Mobilität deuten darauf hin, dass sie eine aktive Rolle in der Evolution der Bakterien spielten. So können sie beispielsweise für die Anpassung der thermophilen Cyanobakterien an extreme Umweltbedingungen wichtig gewesen sein.

Abb. 8.20 a, b Allgemeine Eigenschaften der selbst-spleißenden Introns der Gruppe II. a Struktur eines typischen mobilen Elementes (basierend auf RmInt1 von Sinorhizobium meliloti). In der Sekundärstruktur des noch nicht gespleißten Introns sind die 6 helikalen Ribozym-Domänen von I bis VI durchnummeriert; EBS1–3 sind die entsprechenden Exon-bindenden Sequenzen und IBS1–3 die Intron-bindenen Sequenzen. Mit griechischen Buchstabenpaaren sind längere doppelsträngige Bereiche markiert (α-α’, ε-ε’, ζ-ζ’, λ-λ’, κ-κ’). Die Intron-codierten

Proteine (engl. intron encoded protein, IEP), LtrA des ltrB-Introns von Lactobacillus lactis und RmInt1, sind gezeigt; die Proteine enthalten mehrere Domänen der reversen Transkriptase (RT0– 7) und einer Maturase (X). Die DNA-bindende Domäne (D) und die Endonuklease-Domäne (En) sind nur in LtrA enthalten, das daher auch länger ist (599 Aminosäuren statt 419). b Die beiden Schritte in der Umesterungsreaktion der Gruppe-II-Introns; das ausgestülpte A in der Ribozym-Domäne VI ist angegeben. (Nach Toro 2003, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

8.3 Umlagerung von DNA-Fragmenten

Einzellige Organismen können auf unterschiedliche Anforderungen ihrer Umgebung nicht durch die differenzielle Funktion einzelner Zellgruppen reagieren, wie das bei multizellulären Organismen möglich ist. Dennoch können sie durch spezialisierte Mechanismen den wechselnden Anforderungen des Lebensraumes gerecht werden. Hierzu ist auch die Entstehung von Mechanismen zu rechnen, die es den Zellen gestat-

ten, zwischen einem vegetativen und einem sexuellen Fortpflanzungsmodus zu wechseln. Ciliaten zeichnen sich durch besonders komplizierte Mechanismen aus, die für einen Wechsel zwischen einem generativen und einem vegetativen Zustand der Zelle verantwortlich sind. Grundlage dieser Schaltmöglichkeit ist der Besitz zweier Zellkerne, der mit dem Begriff Kerndualismus beschrieben wird. Einer der beiden Zellkerne steht im Dienst generativer, also sexueller Prozesse, während der andere Zellkern für die vegetativen Funktionen der Zelle verantwortlich ist. Die Kontinuität der genetischen Konstitution ist, wie bei mehrzelligen Organismen, dadurch garantiert, dass der vegetative Kern aus dem generativen durch eine Kernteilung entsteht, der jedoch keine Zellteilung folgt. Bevor der vegetative Kern seine Funktion erfüllen kann, sind seine Chromosomen komplexen Veränderungen unterworfen. Abb. 8. 21 zeigt den Konjugationszyklus der Ciliaten mit der Entwicklung des Makronukleus.

Abb. 8.21 a, b Konjugationszyklus bei Ciliaten. a Der Lebenszyklus von Oxytricha trifallax mit zwei Makronuklei (cremefarben) und zwei Mikronuklei (blau). Wenn Nährstofforganismen (üblicherweise die Alge Chlorogonium) erreichbar ist, proliferieren die Ciliaten kontinuierlich. Hunger induziert jedoch Cystenbildung oder Konjugation von Zellen. In einer Cyste verbleiben nur ein Makronukleus und ein Mikronukleus. Trockene oder gefrorene Cysten bleiben über Jahrzehnte lebensfähig; sie schlüpfen im Wasser, das Nährstofforganismen enthält und setzen die Proliferation fort. Bei der Paarung verschmelzen zwei Zellen, führen eine Meiose durch (es sind dann zeitweise 8 haploide Mikrokerne sichtbar) und tauschen die haploiden Makrokerne aus. Aus zwei haploiden Mikronuklei bildet sich ein diploider Mikronukleus. Die zwei neuen

Mikronuklei teilen sich mitotisch, und einer der beiden entwickelt sich zu einem neuen Makronukleus. Die nicht benutzten Mikronuklei (nicht gezeigt) und der alte Makronukleus (2 X) degenerieren. Die verbleibenden neuen diploiden Mikronuklei teilen sich erneut und ergeben zwei Mikronuklei. Am Ende der Entwicklung teilt sich der Makronukleus, sodass die volle Anzahl von zwei Makronuklei und zwei Mikronuklei im Zellkern wiederhergestellt ist. Die Zellen setzen die Proliferation fort, solange Nahrung vorhanden ist, oder bilden andernfalls wieder Cysten. b Lichtmikroskopische Aufnahme von Oxytricha noca; die Anfärbung erfolgte zur Darstellung der vier Mikronuklei (mi) und der zwei Makronuklei (ma). (Nach Prescott 2000, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Introns der Gruppe II können auch Proteine codieren, die eine Mobilität dieser Introns im Genom ermöglichen.

8.3 Umlagerung von DNA-Fragmenten 8.3.1 Kerndualismus: Mikro- und Makronuklei in einer Zelle

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Der Kerndualismus mit einem generativen und einem vegetativen Kern ist ein allgemeines Kennzeichen aller Ciliaten. Der generative Mikronukleus durchläuft vor dem sexuellen Paarungsprozess, der Konjugation, einen Meiosezyklus, der zur Bildung von vier haploiden Mikronuklei führt. Drei dieser Kerne degenerieren, während der vierte eine mitotische Teilung durchläuft, die zwei haploide Pronuklei ergibt. Während der Paarung zweier Zellen (die von entgegengesetzten Paarungstypen abstammen) wird jeweils ein haploider Mikronukleus ausgetauscht und bildet mit dem zelleigenen haploiden Pronukleus ein Synkaryon. Der nunmehr diploide generative Kern der Exkonjuganten teilt sich mitotisch. Einer der Tochterkerne bildet den neuen generativen Mikronukleus der Zelle, der andere entwickelt sich zum vegetativen Makronukleus. Der alte Makronukleus der Exkonjuganten ist während der Konjugation degeneriert, sodass die Zelle nunmehr wieder aus zwei Kernen mit prinzipiell identischer genetischer Information besteht (Abb. 8.22).

Wie der Name Makronukleus besagt, zeichnet sich dieser vegetative Kern durch seine Größe aus. Da Kerngrößen im Allgemeinen mit dem DNA-Gehalt korreliert sind, deutet die gegenüber dem Mikronukleus angewachsene Größe auf eine erhöhte Ploidie des Makronukleus hin. Ein Vergleich zwischen der DNA eines Makronukleus und der eines Mikronukleus zeigt jedoch, dass bei der Entwicklung des Makronukleus das generative Genom nur partiell ploidisiert wird. Dieser differenzielle Vermehrungsprozess des Mikronukleusgenoms ist mit ungewöhnlichen Entwicklungsschritten verbunden.

Abb. 8.22 Entwicklung des Makronukleus in Stylonychia lemnae. Die Cilien (grün) sind durch einen α-Tubulin-spezifischen Antikörper dargestellt; die DNA erscheint durch eine Gegenfärbung blau. In der Zeitachse ist das Auftreten der wichtigsten Stadien der Makrokernentwicklung angegeben. Oben, von links nach rechts: (1) Zwei Stylonychia-Zellen mit unterschiedlichem Paarungstyp während der Konjugation; der alte Makrokern wird abgebaut. (2) Eine Stylonychia-Zelle enthält Fragmente des alten Makrokerns und eine Makronukleus-Anlage, die wegen des geringen DNA-Gehalts nur schwach angefärbt ist. (3) Eine Stylonychia-Zelle in der zweiten DNA-Synthese-Phase; sie enthält einen vergrößerten zukünftigen Makronukleus. (4) Eine Zelle enthält einen reifen Makronukleus mit Replikationsbanden nahe an dessen distalen Spitzen. (5) Stylonychia mit einem reifen Mak-

ronukleus und zwei Mikronuklei. Unten sind morphologische Details der einzelnen Schritte dargestellt (von links nach rechts): (1) Mikrokerne während der Meiose (mm) und Fragmente des alten Makrokerns (oM). (2) Tochterkerne (m) aus einem diploiden Synkaryon bilden Vorläufer für neue Mikrokerne oder den zukünftigen Makronukleus. (3) Zunehmende Amplifikation der Chromosomen der Mikrokerne führt zu gebänderten polytänen Chromosomen in den Anlagen des Makronukleus (A1–A5). (4) Nach dem Abbau der polytänen Chromosomen enthält der zukünftige Makronukleus nur noch wenig DNA (P). (5) Die Replikation der verbleibenden DNA erfolgt in einer zweiten DNASynthese-Runde (R). (6, 7) Ein früher Makronukleus (eM) und ein verlängerter, reifer Makronukleus sind dargestellt. (Nach Postberg et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Ciliaten zeichnen sich durch einen Kerndualismus aus: Sie besitzen einen Mikronukleus, der im Dienste der generativen Prozesse steht, und einen Makronukleus, der für die vegetativen Funktionen der Zelle verantwortlich ist.

8.3 Umlagerung von DNA-Fragmenten

Diese ungewöhnlichen Vorgänge auf dem Kernniveau werden von ebenso ungewöhnlichen Vorgängen auf der DNA-Ebene begleitet. Vergleicht man die DNA von Mikro- und Makronukleus in Renaturierungsexperimenten (Kapitel 2.1.4), so fällt auf, dass im Mikronukleus ein erheblicher Anteil der DNA zur repetitiven DNA-Fraktion gehört (in dem Ciliaten Stylonychia etwa 55 %). Im Makronukleus kann man hingegen durch Renaturierungsexperimente keine repetitiven Sequenzen mehr nachweisen. Gleichzeitig mit der Verminderung der Genomgröße nimmt erwartungsgemäß die kinetische Komplexität des Genoms ab. Die Größe des Makronukleusgenoms von Stylonychia wird um einen Faktor von nahezu 100 gegenüber der Größe des Mikronukleusgenoms reduziert. Das Genom des Makronukleus enthält nur etwa 1,5 % der DNA-Sequenzen des generativen Genoms. Die Veränderungen des Genoms während der Bildung des Makronukleus sind aber noch viel tief greifender als die Eliminations- und Ploidisierungsvorgänge erwarten lassen. Es kommt zu einer völligen Umgestaltung des Genoms. Der Charakter des Makronukleusgenoms ist von allen übrigen eukaryotischen Genomstrukturen dadurch abgehoben, dass die DNA hier in etwa Gen-großen Fragmenten vorliegt, also nicht mehr in Chromosomen organisiert ist. Das bedeutet, dass man Gene im Prinzip einfach dadurch voneinander trennen kann, dass man sie elektrophoretisch in Agarosegelen nach ihrer Größe auftrennt. Das erlaubt eine einfache Isolierung bestimmter Gene. Vergleicht man diese nun mit ihren Äquivalenten im generativen Genom des Mikronukleus (also gewissermaßen die somatische Form des Gens mit der der Keimbahn), so zeigt sich, dass die Veränderungen nicht nur auf einem Zerfall der Chromosomen beruhen, sondern dass zusätzliche Veränderungen an den Genen erfolgt sind. Die Gen-großen Fragmente bestehen

selbstverständlich nicht allein aus den Protein-codierenden DNA-Abschnitten, sondern enthalten auch die DNA-Sequenzen im 5’- und 3’-Ende der codierenden Region, die zur Regulation der Transkription und zur Replikation erforderlich sind. Zusätzlich enthalten die DNA-Fragmente aber auch Telomerbereiche, die für ihre Replikation ebenfalls unerlässlich sind (Kapitel 6.1.4). Diese Telomere werden erst im Laufe der Umgestaltung des Genoms während der Makronukleusentwicklung angefügt. Ihre molekulare Struktur ist für unterschiedliche Gene einheitlich (5’-C4A4C4A4C4-3’; Abb. 8.23). Diese Form der DNA-Bearbeitung eliminiert die „Last“ der nicht-codierenden DNA und produziert ein vereinfachtes, verkürztes Genom mit einer hohen Kopienzahl der Gene und unterstützt so eine rasche vegetative Zellproliferation.

Während der Makronukleusentwicklung wird der größte Teil der Genom-DNA eliminiert. Die Gene verbleiben im Makronukleus in der Form von Gen-großen DNAFragmenten, die eigene Replikationsstartpunkte und Telomere besitzen.

Noch tief greifendere Veränderungen erfahren Gene in hypotrichen Ciliaten. Ein Sequenzvergleich der DNA-Moleküle im Makronukleus mit ihren Vorläufern aus dem Mikronukleus zeigt, dass die Vorläufer aus dem Mikronukleus durch viele kurze A/T-reiche, nicht-codierende Sequenzen unterbrochen sind, die als intern eliminierte Sequenzen (IES) bezeichnet werden und während der Entwicklung des Makronukleus eliminiert werden. Ein typisches Beispiel ist das Gen, das das β-Telomer-Bindungsprotein codiert (βTP). Da die verschiedenen hypotrichen Ciliaten unterschiedlich viele IES-Elemente enthalten, zeigen die verschiedenen Ciliaten auch beim βTP-Gen unterschiedlich viele IES-Elemente: So hat Stylonychia

Abb. 8.23 a, b Genomorganisation bei Ciliaten. a Anordnung der Gene im Mikrokern. b Ausschneiden eines Gens und Anheftung von Telomersequenzen während der Entwicklung des Makronukleus. (Nach Prescott 2000, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Abb. 8.24 a, b „Verrührte“ Gene bei Ciliaten. a Struktur des „verrührten“ Gens Aktin-1 in Oxytricha nova und Oxytricha trifallax. Segmente, die für den Makronukleus vorgesehen sind (engl. macronuclear-destined segments, MDS) sind als Blöcke gezeichnet; intern eliminierte Segmente (IES) sind als Linien zwischen den Blöcken dargestellt. MDS2 ist in beiden Organismen invertiert (angedeutet durch die horizontalen Pfeile). b Rekombinationsmodell zum Entwirren des Aktin-1-Gens in O.

nova. Durch Faltung ordnet sich die Mikrokern-DNA entsprechend den Wiederholungssequenzen am Ende der MDS-Bereiche an. Rekombinationen zwischen den paarweisen Wiederholungselementen sind durch „X“ angedeutet. Das Aktin-1-Gen ist über ein 15-bp-Verbindungsstück mit einem 3,3-kb-Gen verbunden. ATG: Startcodon; TAS: Telomer-Anheftungsstelle; TGA: Stoppcodon. (Nach Prescott 2000, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

8.3 Umlagerung von DNA-Fragmenten

mytilus zwei IES-Elemente, Oxytricha nova drei und Oxytricha trifallax sechs IES-Elemente; die IES-Elemente sind alle an unterschiedlichen Stellen. Im Gegensatz dazu enthält dieses Gen aber auch ein „reguläres“ Intron ‒ und das ist bei diesen drei Ciliaten an der gleichen Stelle. Gensegmente, die durch die Insertion der IES-Elemente entstehen, werden auch als MDS-Elemente bezeichnet (engl. macronuclear-destined segments): Die sechs IES-Elemente im βTP-Gen des Mikronukleus von O. trifallax teilen das Gen also in sieben MDSs. Dabei entsprechen diese MDS-Elemente in keiner Weise funktionellen Domänen (wie das bei Exons häufig der Fall ist), sondern sind rein zufälliger Natur. In einigen Genen sind allerdings die MDS-Elemente in „Unordnung“ geraten, d. h. die Reihenfolge im Genom des Mikronukleus entspricht nicht der Reihenfolge, wie sie später im Gen des Makronukleus zu finden ist. So wird beispielsweise das Aktin-1-Gen in O. nova von acht IES-Elementen in neun MDS-Segmente unterteilt, die die ungewöhnliche Reihenfolge aufweisen: 3-4-6-57-9-2-1-8. Ähnlich ist es auch in O. trifallax (Abb. 8.24). Am Ende der jeweiligen IES-Elemente findet man Wiederholungseinheiten, die bei den „verrührten“ Genen (engl. scrambled) länger sind als bei denen mit geordneter Abfolge der einzelnen Elemente. Vermutlich sind einfach längere Wiederholungseinheiten für die Rekombinationsprozesse nötig, um die „verrührten“ Gene wieder zu entwirren. Aufgrund der Struktur der IES-Elemente mit den terminalen, invertierten Wiederholungseinheiten werden sie auch als degenerierte Transposons betrachtet. Die Insertion von IES-Elementen in die Gene des Mikronukleus, die damit einhergehende Bildung der MDS-Elemente und ihr „Verrühren“ in manchen Genen der Ciliaten repräsentiert ein neues evolutionäres Phänomen in der Molekulargenetik. Oberflächlich betrachtet weist die Entwirrung von Genen bei Ciliaten Ähnlichkeit zu anderen Umordnungsprozessen im Genom auf, z. B. zur V(D) J-Rekombination im Immunsystem von Vertebraten (Kapitel 8.4). Allerdings sind die verwendeten Mechanismen grundsätzlich unterschiedlich. Im Fall der Ciliaten wird diskutiert, dass die Spezifität des Herausschneidens durch RNA-Moleküle des maternalen Makronukleus gesteuert wird (Meyer u. Garnier 2002).

IES-Elemente unterteilen Gene des Mikronukleus von Ciliaten zufällig in verschiedene Abschnitte. Bei der Entwicklung der Makrokerne werden diese Elemente entfernt.

Neue Untersuchungen an den Ciliaten Tetrahymena thermophila und Stylonychia lemnae deuten darauf hin, dass es bei der internen DNA-Deletion deutliche Verbindungen zu den schon früher besprochenen Mechanismen der RNAInterferenz gibt (Kapitel 7.5). Verschiedene Autoren haben gezeigt, dass neben den IES-Elementen auch kurze (28 bp) homologe dsRNA-Moleküle vorkommen, die von den zu deletierenden Elementen abgelesen werden, kurz bevor die Deletion selbst stattfindet. Der Verlust von Genen, die für ein Dicer-ähnliches Protein oder das Argonauten/Piwi-ähnliche Protein TWI1 codieren, blockiert die Deletion. Umgekehrt führt die Injektion von kurzer dsRNA zur Deletion von DNA mit derselben Sequenz. Beide Beobachtungen legen eine Verbindung zu einem RNAi-Mechanismus nahe (Yao u. Chao 2005, Jönsson et al. 2009). Einen möglichen Mechanismus skizziert Abb. 8.25.

8.3.2 Chromatinelimination und -diminution Die Cytologie der Chromosomen in Keimzellen lässt uns Unterschiede in deren Konstitution im Vergleich zu somatischen Zellen erkennen. In manchen Organismen gibt es keimbahnlimitierte Chromosomen, die entweder aufgrund des Fehlens eines Centromers, ähnlich wie double-minutes (Kapitel 8.3.3), mitotisch instabil sind und in somatischen Zellen während der Zellteilungen verloren gehen, oder durch besondere Verteilungsmechanismen aus somatischen Zellen eliminiert werden (Abb. 6.30). In der Keimbahn ist die Anzahl mitotischer Teilungen jedoch oft begrenzt, sodass Verluste durch mitotische Instabilität weniger zur Auswirkung kommen. Es könnte jedoch auch eine Selektion zugunsten einer bestimmten Anzahl solcher limitierter Chromosomen in den Keimzellen stattfinden, die aus unbekannten Gründen besonders günstige Fortpflanzungsraten garantiert. Neben diesem durch den Verlust von Extrachromosomen gekennzeichneten Unterschied zwischen Keimbahn und Soma hat man in einigen Organismen auch Unterschiede in der Größe von keimbahnlimitierten und somatischen Chromosomen beobachtet. Sie beruhen darauf, dass bei Teilungen, die zur Entstehung somatischer Zellen führen, Stücke der Chromosomen herausgeschnitten werden und verloren gehen. Man bezeichnet diesen Vorgang als Chromatindiminution oder Chromatinelimination. Das klassische Beispiel für solche Diminutionsprozesse ist die Elimination von Teilen der Chromosomen im Pferdespulwurm Parascaris equorum. Entdeckt wurde das Phänomen der Chromatindiminution bereits Ende des 19. Jahrhunderts

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Mikrokern MDS1 MDS1

alter Makrokern Synthese der Matrize

MDS2

MDS1

MDS2

MDS1 MDS1

MDS2

genomische DNA Piwiähnlich

dsRNA Piwiähnlich

Piwiähnlich

Piwiähnlich

Piwiähnlich

kleine RNAs Piwiähnlich MDS1

MDS2 Piwiähnlich

Chromatinmodifizierende Enzyme

H3K9me3 H3K27me3

MDS1

MDS2

Anheften der Telomere Korrekturlesen Makrokern-Anlage

Ausschneiden der DNA

MDS1

MDS2

MDS1 MDS1

MDS2

Abb. 8.25 Modell der Makronukleus-Entwicklung in stichotrichen Ciliaten. Das gesamte Genom des Mikrokerns wird früh in der Makronukleus-Entwicklung in doppelsträngige RNA (dsRNA) transkribiert und danach in kleine dsRNA-Fragmente gespalten. Die dsRNAs binden an Piwi-ähnliche Proteine und werden so in den alten Makronukleus transportiert. Dort werden sie abgebaut, wenn sie homolog zu Sequenzen des Makronukleus sind (grün). Die verbleibenden, Mikronukleus-spezifischen kleinen dsRNAs (rot) wandern in die sich entwickelnde Anlage des neuen Makronukleus und binden dabei an Chromatin-

modifizierende Enzyme, welche die entsprechenden Sequenzen zum Ausschneiden markieren. Da bei den stichotrichen Ciliaten die IES-Elemente sehr klein sind, ist das Ausschneiden ungenau und muss durchkorrigiert werden. Als „Vorlage“ dienen Matrizen, die noch im alten Makronukleus synthetisiert wurden. Der Vorgang wird durch das Anheften der Telomere an die neuen funktionellen Gene abgeschlossen. (Nach Jönsson et al. 2009, mit freundlicher Genehmigung des Mary Ann Liebert Verlags)

durch T. Boveri, der sie anschließend auch cytologisch genau untersuchte (Abb. 8.26a). Der Pferdespulwurm Parascaris equorum var. univalens besitzt in den Keim-

bahnzellen ein einziges Chromosomenpaar. Bereits während der zweiten Zellteilung nach der Befruchtung beobachtete Boveri, dass die Chromosomen in einem

8.3 Umlagerung von DNA-Fragmenten

Teil der neu entstandenen Zellkerne zerfallen. Es verbleiben kleine Chromosomen (40 bis 70), die in allen somatischen Zellen in gleicher Form zu finden sind. Dieser Prozess setzt sich über die ersten vier Zellteilungszyklen nach der Befruchtung fort. Zellkerne, die noch unveränderte Chromosomen enthalten, vergleichbar denen der Zygote, findet man danach nur noch in Zellen, die der Keimbahn angehören. Eine detailliertere Darstellung der Trennung von Keimbahn und somatischen Zellen gibt Abb. 8.26b für den Schweinespulwurm.

In manchen Organismen beobachtet man den Verlust

von Chromosomenstücken während der embryonalen Frühentwicklung (Chromatindiminution). Dieser Verlust erfolgt ausschließlich in Zellen, die sich zu somatischen Zellen entwickeln.

Eine weitere Besonderheit dieses Prozesses ist, dass ein einziges Chromosom in mehrere Einzelchromosomen zerfällt, von denen jedes ein Centromer besitzt. Man bezeichnet daher das ursprüngliche Chromosom auch als Sammelchromosom (Abb. 8.27). Ultrastrukturelle Untersuchungen sprechen dafür, dass die Spindelfasern über die gesamte Länge dieses Chromosoms hinweg angreifen können. Es wird daher auch als holokinetisch bezeichnet. Offenbar sind viele Centromerenähnliche Regionen über das gesamte Chromosom verteilt, die nach einem Zerfall in viele kleinere Chromosomen dafür sorgen, dass jedes der neu entstandenen Chromosomen sein eigenes Centromer erhält.

Chromatindiminution kann durch den Zerfall holoki-

netischer Chromosomen in Stücke erfolgen. Stücke, die erhalten bleiben, besitzen ein eigenes Centromer und werden daher mitotisch normal verteilt.

Vergleichbare Eliminationsprozesse hat man nicht nur in anderen Nematoden, sondern auch bei anderen Tierstämmen beobachtet. Sehr ausführlich untersucht wurde die Chromatindiminution bei einer Reihe von Crustaceenarten der Gattung Cyclops. In manchen Wasserfloharten werden lange terminale Blöcke der Chromosomen zwischen der 5. und 7. Zellteilung nach der Befruchtung aus allen künftigen somatischen Zellen eliminiert, bei anderen Arten werden die Stücke der DNA entfernt, die zwischen Chromosomenbereichen liegen, die somatisch erhalten bleiben. Hierbei handelt es sich stets um Chromosomenabschnitte, die vor ihrer Elimination als Heterochromatin erscheinen (Abb. 8.28). Miller-Spreitungsexperimente deuten darauf hin, dass die Elimination der DNA in Form von DNA-Ringen erfolgt. Die Chro-

Abb. 8.26 a, b Chromatindiminution bei Nematoden. a Schematische Darstellung der Chromatindiminution bei Parascaris univalens. Links ist die Anaphase der zweiten Teilung im 2-Zell-Stadium gezeigt. Chromatindiminution findet nur in den oberen Zellen (A, B) statt, aber nicht in der unteren P1-Zelle. Rechts sieht man den Embryo im 4-Zell-Stadium nach der zweiten Teilung: Die Zellen A, B und S2 entwickeln sich zu somatischen Zellen (EMSt: Entoblast, Mesoblast, Stomatoblast), wohingegen die P2-Zelle die Keimbahn repräsentiert. Eine ähnliche Bezeichnung der embryonalen Zellen wird übrigens heute auch bei C. elegans verwendet (Abb. 11.12). b Keimbahn-Soma-Differenzierung im Schweinespulwurm (Ascaris lumbricoides var. suum; Nematoda). Während der ersten 4 Teilungen nach der Befruchtung erfolgt eine Trennung von Keimbahnund Somazellen durch Elimination eines Teils des Chromatins aus den künftigen somatischen Zellen (Chromatindiminution). Die Vorläufer der Urkeimzelle (P0–P3) sind durch schwarz-weiße Halbkreise dargestellt und die Urkeimzellen (P4, P5a, P5b, aus denen alle späteren Keimzellen entstehen) durch gefüllte Kreise. Ab der 5. Zellteilung sind Keimbahn und Soma endgültig getrennt. Die präsomatischen Zellen S1a, S1b und S2–S4 sind der Chromatindiminution ausgesetzt (durch weiße Kreise dargestellt, umgeben von 4 schwarzen Punkten). Die somatischen Zellen werden frühzeitig für die angegebenen Differenzierungswege determiniert. So bildet die S1-Zelle nur Ektoderm, während Entoderm nur aus einem Teil der S2-Nachkommen entsteht. Im Extremfall führt dies zu Organismen mit konstanter Zellzahl. Das bekannteste Beispiel ist ein anderer Nematode, Caenorhabditis elegans. (a nach Boveri 1899; b aus Tobler et al. 1992, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Abb. 8.27 Sammelchromosomen in einem 2-Zell-Stadium von Parascaris univalens. Die Chromosomenkomplemente von Keimbahnzelle P1 (unten) und präsomatischer Schwesterblastomere S1 (oben) bestehen übereinstimmend aus zwei vollständigen Chromosomen und einem überzähligen Fragment (f ). Die Chromosomen setzen sich aus einem euchromatischen interkalaren Abschnitt (blau, DAPI) und, diesen beidseitig flankierend, heterochromatischen (HET-)Blöcken zusammen. Aus dem interkalaren Abschnitt werden im Zuge der Disintegration der Sammelchromosomen in den Gründerzellen der somatischen Bahnen die zahlreichen somatischen Chromosomen freigesetzt; die damit verbundene Abkopplung der HET-Blöcke führt zu deren Elimination im Soma (Chromatindiminution). Das Heterochromatin besteht fast ausschließlich aus zwei hochrepetitiven DNA-Sequenzen, einem Penta- und einem Dekanukleotid. Wie die in-situ-Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid-Sonden zeigt, konstituieren die repetitiven Einheiten stets getrennte Segmente in den HETBlöcken. In der Regel unterscheiden sich die HET-Blöcke in Größe, Zahl und/oder Anordnung der Segmente. In den hier dargestellten Metaphaseplatten bestehen vier HET-Blöcke, drei chromosomal und einer im Fragment, aus jeweils einem proximalen Pentanukleotid- (gelb, FITC) und einem distalen Dekanukleotid-Segment (violett, Cumarin; 2). Im fünften HET-Block mit nur einem Segment (1) ist das Pentanukleotid-Segment erheblich kürzer als dasjenige am anderen Chromosomenende, besonders demonstrativ in S1 aufgrund der parallelen Ausrichtung der HET-Blöcke. Die Existenz des überzähligen Fragments in beiden Schwesterzellen zeigt, dass Fragmente von Sammelchromosomen mit interkalarem Chromatin in der Lage sind, mitotisch zu segregieren. (Nach Niedermaier u. Moritz 2000, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

matindiminution in Cyclops ist nicht, wie bei Parascaris, mit einem Zerfall der Chromosomen verbunden, sondern verläuft durch die Exzision von Teilbereichen der Chromosomen wahrscheinlich unter Ringbildung der eliminierten DNA. Die Kontinuität der Chromatiden wird nach dem Verlust eines Chromosomenbereiches

Abb. 8.28 Chromatinelimination während der 5. Furchungsteilung von Cyclops divulsus. Das in künftigen somatischen Zellen aus den Chromosomen eliminierte Heterochromatin bleibt in der Anaphase in der Äquatorialebene zurück und geht dadurch aus dem Kern verloren. (Foto: S. Beermann)

offenbar wiederhergestellt. Eine Zusammenfassung der verschiedenen Eliminationsprozesse in den verschiedenen Zelltypen gibt Tabelle 8.5 am Beispiel von Sciara.

Chromatindiminution kann auch durch den Verlust interkalarer Chromosomenbereiche unter Beibehaltung der Integrität des (verkürzten) Chromosoms erfolgen.

8.3.3 DNA-Amplifikation Zellen können auf verschiedene Weise ihren DNAGehalt erhöhen: Im einfachsten Fall erfolgt eine Vervielfachung oder Ploidisierung des gesamten Genoms (Kapitel 10.3.5). Komplizierter verlaufen partielle Vermehrungen des Genoms, wie wir sie bei der Bildung von Riesenchromosomen durch Polytänisierung kennengelernt haben (Kapitel 6.3.1). Dass Polyploidisierung dazu dient, einen besonders hohen Bedarf an bestimmten Genprodukten durch zellspezifische Vermehrung ihrer Gene sicherzustellen, haben wir bei der Besprechung der Polyploidisierung des Genoms des Seidenspinners in den hinteren Seidendrüsen gesehen (S. 273). Auch die Ausbildung polytäner Chromosomen bei Insekten steht im Dienste besonders hoher Stoffwechselproduktivität von solchen Zellen, die zellspezifische Genprodukte in großer Menge bereitstellen müssen. Allen Zellen, die eine Vermehrung ihres Genoms durch Polyploidisierung oder Polytänisierung erreichen, ist gemein, dass diese Vermehrung erst nach der letzten Zellteilung der betreffenden Zellen erfolgt.

8.3 Umlagerung von DNA-Fragmenten

Tabelle 8.5 Chromosomenelimination bei Sciara Zelltyp

Eliminierte Chromosomen

Relevantes cytologisches Ereignis

Vorgeschlagener Mechanismus

Primäre Spermatocyten (Meiose I)

paternales X-Chromosom

keine Paarung homologer Chromosomenabschnitte Bildung einer monopolaren meiotischen Spindel

unterschiedliches kinetisches Verhalten von maternalen und paternalen Chromosomen

paternale Autosomen

keine Anlagerung in der Metaphase Knospenbildung und Herstellung von Mikrotubuli Sekundäre Spermatocyten (Meiose II)

maternaler autosomaler Chromatidensatz L-Chromatidensatz

Aufrechterhaltung der ersten polaren Spindelstruktur und Bildung einer asterenlosen Spindel

Elimination erfolgt über den Spindelapparat

Non-disjunction des maternalen X-Chromosoms Anwesenheit von Knospengenerierten Mikrotubuli Embryonale somatische Zellen

ein paternales X-Chromosom in weiblichen Embryonen

unvollständige Bewegung eliminierter Chromosomen während der Anaphase

Fehler bei der Trennung der Schwesterchromatiden

ein paternales X-Chromosom in männlichen und weiblichen Embryonen

atypische Chromosomenkondensation in der Interphase

aktive Beteiligung der Kernmembran

alle L-Chromosomen bis auf zwei

Ausschleusung der Chromosomen durch eine Ausbuchtung des Zellkerns

zwei paternale X-Chromosomen in männlichen Embryonen alle L-Chromosomen Embryonale Keimzellen

Nach Goday u. Esteban (2001)

Dadurch ergeben sich auch aus solchen zellspezifischen Veränderungen in DNA-Gehalt und Zusammenstellung keine Probleme für die gleichmäßige Verteilung des genetischen Materials auf die Tochterzellen während späterer Zellteilungen. Auf der anderen Seite beobachten wir Amplifikationen chromosomaler Regionen in Krebszellen; der Anstieg in der Kopienzahl von Onkogenen kann die Initiation und Progression verschiedener Tumorarten begünstigen. Dabei können cytogenetisch zwei Arten von Amplifikationen unterschieden werden (Abb. 8.29): extra- und intrachromosomale Amplifikationen. Extrachromosomale Amplifikationen (oder double-minutes) haben bis zu mehrere Hundert Kopien eines geno-

misches Segments und bilden Mini-Chromosomen mit Spiegelsymmetrie. Intrachromosomale Amplifikationen werden auch als homogen gefärbte Regionen (engl. homogeneously staining region, HSR) bezeichnet und stellen hintereinander angeordnete Wiederholungselemente dar (in Kopf-Schwanz- oder Schwanz-SchwanzOrientierung); im frühen Stadium der Amplifikation liegen 10 Kopien oder weniger vor. Derzeit diskutierte Modelle schlagen vor, dass Doppelstrangbrüche den Prozess der Amplifikation initiieren. Doppelstrangbrüche können Genamplifikationen in vielfältiger Weise einleiten; dazu gehören unter anderem ungleiche Schwes-

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366 366

Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Abb. 8.29 a–c Genamplifikation. a Extrachromosomal: doubleminute. Elektronenmikroskopische Aufnahme, die den doppelten Charakter erkennen lässt und zugleich zeigt, dass keine Centromerregion vorhanden ist. b Metaphasechromosomen von Mus musculus mit HSRs. Obere Reihe: G-Banden im normalen Chromosom 1 (links) und in zwei Chromosomen 1 mit HSRs (Mitte: M. m. domesticus und rechts: M. m. musculus). Im rechten Chromosomenpaar ist die HSR durch eine Inversion in

zwei Teile untergliedert (siehe c). Untere Reihe: Die C-Banden lassen die HSRs neben dem Centromerenheterochromatin deutlich hervortreten. c Schema der in b gezeigten Chromosomen. Die Pfeile geben die Insertionsstelle der HSR und die Inversion an (HSR: homogen gefärbte Region). (a Foto: B. Hamkalo, Irvine; b aus Winking et al. 1991, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

terchromatidenaustausche, DNA-Replikation nach dem rolling circle-Modell, Bruch-induzierte Replikation, Start der DNA-Synthese durch Rückfaltung und der Bruch-Fusion-Brücken-Zyklus (engl. breakagefusion-bridge cycle). Letzterer wurde von Barbara McClintock schon 1941 vorgeschlagen, um intrachromosomale Amplifikation zu erklären. Der Zyklus beginnt mit einem Doppelstrangbruch, an den sich die Replikation des gebrochenen Moleküls und die Fusion der Schwesterchromatiden anschließt. In der Anaphase bildet sich eine Brücke; aufgrund mechanischer Spannung zerreißt das Molekül asymmetrisch und erzeugt ein Chromatid mit einem invertierten Wiederholungselement am abgebrochenen Ende. Wesentliche Elemente dieser Prozesse sind in Abb. 8.30 dargestellt.

In den molekularen Mechanismus einer intrachromosomalen Amplifikation haben uns die ChorionGene von Drosophila melanogaster Einblicke ermöglicht. Diese Gene, die im Chromosom 3 und im X-Chromosom liegen, also in zwei getrennten Gruppen angeordnet sind, sind für die Synthese großer Mengen von Strukturproteinen der Eihülle verantwortlich. Diese werden in den Stadien 11 bis 14 der Oogenese (Kapitel 11.4.1) zur Entwicklung des Chorions benötigt und in den Follikelzellen des Ovariums gebildet. Durch Untersuchung der DNA-Sequenzen, die die Chorion-Gencluster flankieren, konnte nachgewiesen werden, dass die intrachromosomale Amplifikation der Chorion-Gengruppe deren eigentlichen Genbereich zu beiden Seiten um etwa 40 bis 50 kb überschreitet. Insgesamt umfasst der amplifizierte Bereich knapp 100 kb DNA. Allerdings ist in diesen flankierenden Bereichen der Grad der Amplifikation nicht identisch mit dem der darin eingeschlossenen Chorion-Gene, sondern nimmt mit wachsendem Abstand vom Gencluster ab (Abb. 8.31a, b). Im Fall der intrachromosomalen Amplifikation der DNA ist das Verständnis der Kontrolle der Initiation der Replikation (S. 41) in den Replikationsstartpunkten hilfreich, um den Mechanismus der Überreplikation leichter zu verstehen. Insbesondere die Cha-

Unter

bestimmten physiologischen Bedingungen kann es zur extrachromosomalen oder intrachromosomalen Vermehrung (Amplifikation) bestimmter Gene in der Zelle kommen. Extrachromosomale Genkopien erscheinen als kleine punktförmige Chromosomen (doubleminutes) ohne Centromer. Intrachromosomale Genvermehrung zeigt sich durch die Entstehung von homogen gefärbten Regionen.

8.3 Umlagerung von DNA-Fragmenten

Abb. 8.30 a–d Die Rolle von Palindromen bei der Genamplifikation. a Ein Palindrom, das zwei Schwesterchromatiden (blau) verbindet, kann auf verschiedenen Wegen entstehen; das gebildete palindromische Chromosom hat zwei Centromere. Nach einem Bruch kann es durch Rekombinations-abhängige, Bruch-induzierte Replikation zwischen den Wiederholungssequenzen (z. B. eine LTR, hier als orangenes Trapez gezeichnet) repariert werden; dabei kann die zweite LTR an einer anderen Stelle des Chromosoms lokalisiert sein. Alternativ können neue dizentrische Chromosomen gebildet werden. Grüne und gelbe Flächen deuten die Orientierung der Gene in den palindromischen Regionen an. b Die Bildung von Palindromen kann in der Nähe von Doppelstrangbrüchen durch kurze invertierte Elemente eingeleitet werden. Eine 5’-3’-Exonuklease baut die DNA so lange ab, bis die zwei komplementären Einzelstrang-

bereiche der zwei Wiederholungselemente sich aneinanderlagern und eine Haarnadelstruktur ausbilden, die nach einer DNA-Synthese (startend am 3’-Ende) ligiert werden. c Die invertierten Sequenzen bilden eine kreuzförmige Holliday-Struktur, die durch eine Resolvase aufgelöst wird. Die entstehenden Haarnadelstrukturen werden ligiert. In Hefen werden die Haarnadel-Enden durch den Mre-Rad50-Xrs2-Komplex zusammen mit Sae2 geöffnet; die offenen Enden neigen zur Rekombination. d Exponierte DNA-Enden können durch Bruch-induzierte Replikation repariert werden, nachdem Proteine eine StrangEinwanderung nach dem Modell der homologen Rekombination eingeleitet haben. Dieser Mechanismus kann in Regionen stattfinden, in denen vereinzelte Homologien bestehen, sodass eine nicht-reziproke Translokation entsteht. (Nach Haber u. Debatisse 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Abb. 8.31 a–c Amplifikation der Chorion-Gene in Drosophila. a Die Zwiebelschalenstruktur der verschachtelten Replikationsgabeln wird durch das wiederholte „Feuern“ des zentralen Replikationsursprungs verbunden mit einer bidirektionalen Fortbewegung der Replikationsgabel erzeugt. Diese Struktur wurde durch elektronenmikroskopische Verfahren (Abb. 8.29a) und durch zweidimensionale Gelelektrophorese während der Amplifikationsstadien in Fliegen beobachtet. b Die quantitative Analyse der veränderten Kopienzahlen zeigt die absolute Zunahme der Kopienzahlen, aber auch die Ausbreitung in die Bereiche links und rechts des Amplifikationskontrollelementes 1 (ACE1). c Organisation des Chorion-Locus auf dem Chromosom 3. Die genetische Karte zeigt, dass fünf Regionen, die für

die Amplifikation wichtig sind – ACE3 (blau, 440 bp) und AERA bis D (hellblau) – durch vier Chorion-Transkriptionseinheiten (S18, S15, S19, S16) unterbrochen werden (Pfeile). Die Replikation startet meistens (70–80 %) in der Region ori-β (violett, 884 bp). Innerhalb des ori-β ist die β-Region von besonderer Bedeutung für die Initiation der Replikation. In der α-Region (ACE3) liegen die Bindestellen (BS) für Mip120 (rote Kreise) bzw. Myb (rote Sterne), die für die Amplifikation wichtig sind. In AER-C und AER-D gibt es zwei Sequenzen, die an 10 von 11 Positionen mit der ARS-Consensussequenz identisch sind. (ACE: amplification control element; AER: amplification enhancing region; ARS: autonom replizierende Sequenz von Hefen). (Nach Claycomb u. Orr-Waever 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

8.3 Umlagerung von DNA-Fragmenten

rakterisierung von Drosophila-Mutanten hat es ermöglicht, entsprechende trans-aktive Faktoren zu identifizieren, da betroffene Drosophila-Weibchen steril sind; der Phänotyp der fragilen Eihülle kann unter dem Mikroskop gut erkannt werden. Folgende Proteine sind an der Amplifikation der Chorion-Gene beteiligt: ORC2 (bindet die DNA am Replikationsstart), Cyclin E (aktiviert die Cdk2-Kinase), DBF4 (aktiviert die Cdc7-Kinase und bindet ORC2) und Proteine, die für die Replikation nötig sind (z. B. Cdt, Mcm2-7, Mcm6), bzw. Transkriptionsfaktoren, die in der S-Phase aktiv sind (z. B. E2F, DP, Rb). Weiterhin wurde ein Proteinkomplex identifiziert, der mit ORC assoziiert ist und Komponenten enthält, die dem Onkoprotein Myb entsprechen. Die notwendigen cisregulatorischen Sequenzen wurden für das Cluster auf dem Drosophila-Chromosom 3 im Detail untersucht (Abb. 8.31c) und zeigten insbesondere die Bedeutung des Replikationsursprungs ori-β. Eine eindrucksvolle Darstellung dieses Prozesses auf zellulärer Ebene gibt Abb. 8.32. Eine weitere Variante der Genamplifikation zeigen cytologische Untersuchungen an Zellen aus Tumoren oder solche aus Zellkulturen, die unter dem Einfluss von Cytostatika gezüchtet wurden. Cytostatika sind Agenzien, die Zellteilungen durch die Blockierung der DNA-Replikation verhindern. Nach mehreren Zellgenerationen der Behandlung mit einem solchen Replikationshemmer beobachtet man, dass die Zellen gegen das Cytostatikum resistent werden und sich wieder mitotisch zu vermehren beginnen. Vergleicht man diese resistenten Zellen mit den ursprünglichen Zellen, so findet man die schon oben erwähnten doubleminutes und homogen gefärbten Regionen (HSR; Abb. 8.29). Die molekulare Analyse beider chromosomaler Elemente zeigt, dass sie auf Amplifikation von DNAAbschnitten zurückgeführt werden können. Im Fall der double-minutes erfolgt diese Amplifikation extrachromosomal und führt zur Entstehung mehrerer kleiner Chromosomen. Die double-minutes besitzen zwar einen Replikationsstartpunkt, sind aber mitotisch instabil, da das Fehlen eines eigenen Centromers ihrer geregelten Verteilung während der Mitose im Wege steht. Sie werden daher, ähnlich wie häufig auch die keimbahnlimitierten B-Chromosomen (Kapitel 6.3.1), zufallsgemäß auf die Tochterzellen verteilt. Ihre Doppelstruktur ist eine Folge der Replikation ohne darauf folgende Trennung der Chromatiden. Diese bleiben über die Mitosen hinweg gepaart. Anders verhält es sich bei den HSRs. Bei ihnen haben wir es mit intrachromosomalen Amplifikationen zu tun, die natürlich als feste Bestandteile des Chromosoms mit dem betreffenden Chromosom ganz normal mitotisch verteilt werden, auch wenn sie, wie gewöhnlich, heterozygot

vorliegen. Beide Arten von Amplifikation findet man normalerweise in somatischen Zellen, insbesondere in Tumorzellen und in Zellkulturen. HSRs sind aber auch in Keimzellen beobachtet worden, sodass sie vererbt werden können. Die Entstehung von double-minutes oder HSRs wird ausschließlich unter besonderen Umständen beobachtet, vor allem als Folge der Behandlung mit Replikationsinhibitoren. Es spricht aber vieles dafür, dass Amplifikationsereignisse in eukaryotischen Zellen regelmäßig, wenn auch nur mit geringer Häufigkeit, vorkommen. Unter Einfluss von Cytostatika kann es dann zur Selektion auf Zellen mit solchen Amplifikationsereignissen kommen, die geeignet sind, die Resistenz der Zellen gegen den Inhibitor zu erhöhen. Das klassische und bestuntersuchte Beispiel für die Entstehung zellulärer Resistenz ist die Amplifikation der Gene für Dihydrofolatreduktase (DHFR) unter Methotrexatbehandlung. Methotrexat (= Amethopterin) ist ein Analogon von Dihydrofolat, einer Vorstufe in der Synthese von Thymin aus Uracil. Als solches Analogon inhibiert es sehr effizient das Enzym Dihydrofolatreduktase, das die Umsetzung von Dihydrofolat in Tetrahydrofolat katalysiert (Abb. 8.33). Behandelt man Zellkulturen mit niedrigen Konzentrationen Methotrexat (10−8 M), so blockiert man in den meisten Zellen die Replikation. Eine Minderheit von Zellen (etwa eine von 107) erweist sich als resistent gegen diese Konzentration des Inhibitors. Diese Zellen können ihre DNA replizieren und sich somit mitotisch weiter vermehren. Der Grund für die Resistenz ist eine zunächst geringfügige Vermehrung der Anzahl an Genkopien für die Dihydrofolatreduktase in der Zelle. Hierdurch können die Zellen die Blockierung ihrer Replikation durch eine erhöhte Produktion des Enzyms überwinden, das nunmehr eine geringe, aber ausreichende Menge Desoxythymidinmonophosphat zur Verfügung stellt (Abb. 8.33). Kultiviert man diese Zellen unter langsam zunehmenden Konzentrationen von Methotrexat, die schließlich bis zum 105-fachen der Anfangskonzentration gesteigert werden können, so erfolgt eine allmähliche weitere Vermehrung der Dihydrofolatreduktase-Gene. Das hat eine weitere Erhöhung der Resistenz gegen den Inhibitor zur Folge. Die erhöhte Resistenz wird in den steigenden Anzahlen von double-minutes reflektiert. Offenbar selektiert man auf diejenigen Zellen, die bei der Zellteilung durch Zufallsverteilung die größeren Anzahlen an double-minutes erhalten und dadurch besonders effizient replizieren können. Ein einzelnes double-minute besitzt im Mittel 2 bis 4 Kopien des Dihydrofolatreduktase-Gens, sodass die Zellen schließlich mehr als 100 zusätzliche Genkopien enthalten können. Vermehrt man diese Zellen unter abnehmenden Methotrexatkon-

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Abb. 8.32 a–i Visualisierung der Amplifikation in Follikelzellen von Drosophila durch Immunfluoreszenz. Die DrosophilaAmplikons in den Follikelzellen sind in besonderer Weise zur Visualisierung geeignet, da die Amplifikation erst stattfindet, wenn die genomische Replikation beendet ist. In der Reihe a–f sind Felder von Follikelzellen gezeigt, wohingegen in der Reihe g–i der Zellkern einer einzelnen Follikelzelle zu sehen ist. Die weißen Kreise skizzieren einzelne Zellkerne. a–c Das DUP-Protein (andere Bezeichnung: Cdt1, engl. chromatin licensing and DNA replication factor 1; Abb. 2.19) ist während der Initiation der Replikation aktiv. Es ist in den Amplikons (rot, b, e) in der Initiationsphase (Stadium 10b) zusammen mit BrdU (grün, c) nachweisbar (a: überlagerte Darstellung von b und c, hellgrüne/gelbe Regionen deuten die gleichzeitige Anwesenheit einer roten und grünen Fluoreszenz an). d–f Ebenso werden Elongationsfaktoren der Replikation wie PCNA (engl. proliferating cell nuclear antigen; Abb. 2.19) zunächst in den Startpunkten der

Replikation sichtbar (f, grün) (d: überlagerte Darstellung von e und f, hellgrüne/gelbe Regionen deuten ebenfalls die gleichzeitige Anwesenheit einer roten und grünen Fluoreszenz an). g Im Stadium 11 endet die Initiationsphase und das DUP(Cdt1)Protein (rot) bewegt sich vom zentralen Replikationsursprung weg, an den das Initiatorprotein ORC2 (engl. origin recognition complex, grün; Abb. 2.19) noch gebunden ist. Kurze Zeit danach entfernt sich auch ORC2 von dem Komplex. h Im Stadium 13 bewegt sich die Replikationsgabel immer weiter vom Ursprungsort weg und mit BrdU (grün) ist ein Färbemuster zu erkennen, das einem doppelten Balken entspricht. Dazwischen (gelb) ist gleichzeitig auch noch das Protein DUP (Cdt1) anwesend, das rot fluoresziert. i Der Elongationsfaktor PCNA (grün) zeigt ein ähnliches Muster und befindet sich an der gleichen Stelle wie DUP (Cdt1; rot). Der weiße Balken entspricht 1 μm. (Nach Claycomb u. Orr-Waever 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

8.3 Umlagerung von DNA-Fragmenten

Abb. 8.33 Mechanismus der Hemmung der DNA-Replikation durch Methotrexat (Amethopterin). Stoffwechselprozesse bei der Umwandlung von Desoxyuridinmonophosphat (dUMP) in Desoxythymidinmonophosphat (dTMP): Die Umsetzung von dUMP in dTMP durch Methylierung wird von der Thymidylatsynthetase katalysiert. Als Kohlenstoffquelle dient ein Tetrahydrofolatderivat. Tetrahydrofolat wird mithilfe der Dihydrofolatreduktase (DHFR) aus Dihydrofolat regeneriert. Blockiert

man die DHFR, so kann kein Tetrahydrofolat mehr gebildet werden und die Neusynthese von dTMP unterbleibt. Als Folge des Mangels an dTMP wird die Replikation gehemmt. Die Hemmung der DHFR erfolgt durch das Cytostatikum Methotrexat (= Amethopterin). Seine Wirkung erklärt sich aus seiner Eigenschaft als Dihydrofolatanalogon. In dieser Eigenschaft bindet es mit hoher Affinität an das Enzym, das damit dem Stoffwechsel entzogen wird.

zentrationen weiterhin, so nimmt die Anzahl der double-minutes wieder ab. Die Beibehaltung ihrer großen Anzahl wird allein durch die Selektion auf einen funktionsfähigen Zustand der DNA-Replikation der Zelle, nicht aber durch gezielte Verteilungsmechanismen in der Mitose erreicht. Entfällt der Selektionsdruck, so gehen die überzähligen Chromosomen verloren, da sich Zellen mit double-minutes unter normalen Wachstumsbedingungen langsamer vermehren und damit selektiv benachteiligt sind. Auch HSRs können bei nachlassendem selektiven Druck allmählich verloren gehen, obgleich das nicht regelmäßig beobachtet wird.

Krebspatienten, die sich einer Chemotherapie durch Cytostatika unterziehen, ist somit leicht verständlich. Amplifikation dieser Art wird jedoch nicht in normalen Zellen entdeckt (Frequenz < 10−9), d. h. es gibt offensichtlich in normalen Zellen Mechanismen, die eine Amplifikation verhindern (Albertson 2006).

Die Analyse verschiedener Enzyme hat erkennen lassen, dass die induzierbare Amplifikation der Dihydrofolatreduktase kein Sonderfall ist, sondern dass vergleichbare Ereignisse auch bei anderen Genen auftreten. Die Frequenz induzierbarer Amplifikationsereignisse liegt etwa zwischen 10−4 und 10−7 je Zellzyklus. Die Größe der Grundeinheit eines amplifizierten Genombereichs umfasst etwa 105 bis 106 bp. Bei einer Genomgröße von 109 bis 1010 bp (das entspricht 104 bis 105 potenziellen Amplifikationseinheiten) bedeutet das, dass mindestens jede zehnte, möglicherweise aber sogar jede einzelne Zelle einen amplifizierten Genbereich enthalten kann. Das bietet eine ausreichende Basis für sehr effektive Selektionsprozesse, wie sie unter dem Einfluss von Stoffwechselinhibitoren beobachtet werden. Die im Laufe der Behandlungszeit zunehmende Resistenz von

Eukaryotische Zellen sind auf unterschiedliche Weise in der Lage, die im Genom vorhandene Zahl bestimmter Gene zu vermehren. Solche zellspezifische Vermehrung von Genen erfolgt, wenn der Bedarf an einem bestimmten Genprodukt die Kapazität des Genoms der betreffenden Zelle übersteigt. Zusätzliche Genkopien können entweder durch Polyploidisierung oder Polytänisierung des gesamten Genoms bereitgestellt werden. Alternativ kann es zur Vervielfachung begrenzter Genbereiche – entweder intra- oder extrachromosomal – kommen.

8.3.4 Wechsel des Paarungstyps bei Hefen Hefezellen können haploid oder diploid sein (Abb. 5.34). Der Generationswechsel zwischen dem haploiden und diploiden Zustand ist mit der Konjugation, also der Fusion, zweier haploider Zellen verbunden. Deren Fusionsprodukt kann sich entweder als diploide Zelle vermehren oder unter ungünstigen Umweltbedingungen (z. B. Nahrungsmangel) einen Meiosezyklus durchlaufen und unter Sporenbildung wieder in den haploiden Zustand übergehen. Die Konjugation zweier haploider

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Zellen kann nur zwischen Zellen eines unterschiedlichen Paarungstyps (engl. mating type) erfolgen. Bei Saccharomyces cerevisiae, der Bäckerhefe, werden diese beiden Zelltypen unterschiedlichen Paarungstyps als aund α-Zellen bezeichnet. Der Paarungstyp der Zelle wird durch den mating-type-Locus (MAT) bestimmt, der in der Form von zwei (in diploiden Zellen) Allelen, MATa und MATα, vorkommen kann. Konjugieren können nur haploide Zellen mit verschiedenen Allelen (also: MATa ∞ MATα). Diploide Zellen sind demgemäß bezüglich des MAT-Locus grundsätzlich heterozygot. Der MAT-Locus liegt auf dem Chromosom 3 (Abb. 8.34); der zentrale Genabschnitt (Ya bzw. Yα) umfasst rund 700 bp und definiert die sexuelle Identität der Zelle. Der Wechsel des Paarungstyps erfolgt durch Genkonversion, wobei den beiden HM-Regionen (engl. hidden MAT), HML (links) und HMR (rechts), wichtige Funktionen zukommen; die beiden Regionen befinden sich an den entgegengesetzten Enden des Chromosoms, 180 bzw. 120 kb von MAT entfernt. Im Allel mit der Konstitution Ya wird ein Transkript (a1) gebildet, dessen Synthese in der Region Ya initiiert wird und über Z1 bis in die Z2-Region erfolgt. Im Yα-Allel hingegen wird ebenso ein im Yα-Segment beginnendes α1-Transkript gebildet. Allerdings wird noch ein zweites Transkript, α2, gebildet, das ebenfalls in Yα beginnt, jedoch gegenläufig transkribiert wird (Abb. 8.34). Alle drei Gene codieren für Transkriptionsfaktoren.

EL

Yα

HMLα

IL

Das α1-Protein ist ein positives Regulationsmolekül, das α-spezifische Genfunktionen induziert. Zu diesen induzierten Genen gehört ein kleines, 13 Aminosäuren langes Peptid, MFα1, das als Pheromon wirkt. Dieses Pheromon wird von α-Zellen sezerniert und von einem MFα1-spezifischen Rezeptor in der Zellmembran von Paarungstyp-a-Zellen als Ligand gebunden. Es bewirkt eine Konformationsänderung des Rezeptors und aktiviert dadurch ein intrazelluläres, an den Rezeptor gebundenes G-Protein (Guaninnukleotid-bindendes Protein), das seinerseits eine Kaskade intrazellularer Stoffwechselprozesse induziert und unter anderem durch Phosphorylierung des pcdc28 zur Blockierung der Zelle in der G1-Phase führt. Das α2-Produkt hingegen wirkt als negativer Regulator (also Repressor) auf a-zellspezifische Gene, die damit in α-Zellen inaktiv bleiben. Das a1-Produkt wird auch in diploiden (a/α) Zellen gebildet (Abb. 8.34). Hier inhibiert es, zusammen mit dem α2-Peptid, die Expression des HO-Gens (das für eine Endonuklease codiert), des α1-Gens und einer Serie weiterer Gene, deren Funktionen zur Konjugation erforderlich sind.

Hefen sind als Haplonten oder Diplonten lebensfähig. Haploide Zellen unterschiedlicher Paarungstypen können fusionieren und diploide Zellen bilden. Der Paarungstyp von Saccharomyces cerevisiae wird durch die genetische Konstitution des MAT-Locus bestimmt.

a1

RE

“an”

C

MATa

Ya

EH

Ya

IR

HMRa Spaltung durch die HO-Endonuklease

RE

HMLα

“aus”

α2

C

Abb. 8.34 Der MAT-Locus von Saccharomyces cerevisiae. Der MAT-Locus befindet sich auf dem Chromosom 3 und wird von zwei anderen DNA-Elementen links und rechts flankiert (HMLα und HMRa. Die beiden Allele Ya (650 bp) oder Yα (750 bp) definieren die sexuelle Identität der Zelle. Der Paarungstyp-Wechsel wird durch Aktivität einer HO-Endonuklease eingeleitet: Sie schneidet beide DNA-Stränge am MAT-Locus, wodurch ein Genkonversions-Mechanismus induziert wird (siehe auch Abb. 8.36), der die Region Ya durch Sequenzen von Yα ersetzt, die

MATα

α1

Yα

Ya

HMRα

von HMLα kopiert werden. HMLa und HMRa enthalten vollständige Kopien der Paarungstyp-Gene, die aber stillgelegt sind. MATa-Stämme rekombinieren bevorzugt mit HMLα, auch wenn HMR Yα anstelle von Ya enthält. Diese Donor-Präferenz (RE „an“) ist von einem Rekombinations-Enhancer (RE) abhängig, einem Sequenzelement aus 244 bp. E und I sind weitere regulatorische Sequenzen (silencer); C: Centromer. (Nach Haber 1998, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

8.3 Umlagerung von DNA-Fragmenten

Haploide S. cerevisiae-Stämme können sich in der Konstitution eines weiteren Gens (homothallic, HO) unterscheiden, das als funktionelles Allel (HO) oder als mutantes, nicht funktionelles Allel (ho) vorliegen kann. Das HO-Gen codiert für eine Endonuklease, die für den Wechsel des Paarungstyps notwendig ist. In hoStämmen ist diese Endonuklease nicht aktiv, sodass diese ho-Stämme (die auch heterothallisch genannt werden) einen stabilen Paarungstyp (a oder α) haben. Bei homothallischen HO-Stämmen hingegen verändert sich der Paarungstyp der haploiden Zellen nach jeder Zellteilung (ausgenommen der ersten nach der Meiose) mit großer Häufigkeit spontan: Eine Zelle, deren ursprünglicher Paarungstyp a war, kann Tochterzellen hervorbringen, die dem α-Paarungstyp zugehören und umgekehrt. Es entsteht somit eine Zellpopulation, die aus sich selbst heraus zur Konjugation (also eigentlich Selbstbefruchtung) befähigt wird, indem sie selbst Zellen des entgegengesetzten Geschlechts liefert (sie ist

homothallisch). Heterothallische Zellpopulationen benötigen hingegen zur Konjugation eine Population von Zellen entgegengesetzten Paarungstyps, da sie diese nicht selbst produzieren können. Haploide S. cerevisiae-Stämme können spontan ihren Haplotyp verändern. Das Umschalten von MATa nach MATα oder umgekehrt erfolgt durch einen Genkonversionsprozess, bei dem die Information am MATGenort durch eine der stillen flankierenden Kassetten HMLα oder HMRa ersetzt wird. Diese Genkonversion wird durch die HO-Endonuklease initiiert, die einen Doppelstrangbruch setzt (Abb. 8.35); sie schneidet an einer Stelle, die die Grenze bildet zwischen der Y-Sequenz (die spezifisch für die MATa- bzw. MATαAllele sind) und der gemeinsamen Z-Sequenz (Abb. 8.35). An der Veränderung des Paarungstyps in haploiden HO-Zellen sind drei Loci beteiligt (Abb. 8.34 und 8.35). Wie wir heute wissen, erfolgt die Umschaltung des

Abb. 8.35 a, b Molekularer Mechanismus des Paarungstyp-Wechsels. a Durch die Aktivität der im HO-Gen codierten Endonuklease wird zunächst ein Doppelstrangschnitt im MATa-Locus verursacht. Einer der freien DNAStränge dient dann, ähnlich wie bei der normalen Rekombination, nach Einwanderung des intakten DNA-Strangs des HMLα-Locus als Primer für begrenzte DNA-Neusynthese. Als Resultat ist die Yα-Region (blau) des HMLα-Bereichs in den aktiven MATa-Locus (rot) kopiert, ohne dass der HMLα-Bereich selbst verändert wurde. b Einzelschritte der Genkonversion beim Paarungstyp-Wechsel. (Nach Haber 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Paarungstyps durch eine Interaktion des eigentlichen MAT-Locus mit zwei anderen DNA-Abschnitten, HMLα und HMRa, die den MAT-Locus links (HML) und rechts (HMR) flankieren. HML liegt 180 kb links, HMR 120 kb rechts vom MAT-Locus. Beide DNA-Bereiche sind Kopien des MAT-Locus, und zwar einmal des MATαAllels (HML), das andere Mal des MATa-Allels (HMR). Im Gegensatz zum MAT-Locus selbst werden die HMLund HMR-Regionen nicht transkribiert. Dafür sorgen die vier SIR-Gene (engl. silent information repressor, SIR), die auf die Transkriptionskontrollelemente von a1, α1 und α2 in den HML- und HMR-Regionen einwirken und deren Transkription reprimieren. Dadurch wird sichergestellt, dass nur das jeweils im eigentlichen MATLocus vorhandene Allel transkribiert wird, obwohl im Genom prinzipiell beide Allele verfügbar sind. Der molekulare Mechanismus des Abschaltens der HM-Regionen ist in den letzten Jahren relativ gut aufgeklärt worden. Es sind hierbei Multiproteinkomplexe beteiligt, wie sie auch in anderen chromosomalen Regionen mit inaktivem Chromatin (in Telomeren, Centromeren) und einzelnen inaktivierten Genen (rDNA u. a.) gefunden werden. Die Abgrenzung der Regionen (~3 kb), die durch Chromatinkondensation einer Abschaltung unterliegen, erfolgt durch spezifische DNA-Elemente (HML-E, HML-I, HMR-E, HMRI; E = essential, I = important). Die Abschaltung des Chromatins im MAT-Locus reflektiert damit offenbar einen generellen Mechanismus der Chromatininaktivierung, dazu gehört auch die geringe Acetylierung von Histonen. Der Wechsel zwischen a- und α-Konstitution im MAT-Locus erfolgt durch replikatives Einlesen der jeweils entgegengesetzten Allelkonstitution in den MAT-Locus (Abb. 8.35). Hierzu wird zunächst ein versetzter Doppelstrangschnitt in die Z1-Region des MATLocus durch die HO-Endonuklease eingeführt. Danach erfolgt eine Paarung der HML- oder HMR-Region mit dem MAT-Locus. Dieser Paarung folgt ein Einlesen der DNA-Sequenz eines Teils der HML- bzw. HMR-Region durch Genkonversion. Üblicherweise rekombinieren MATa-Stämme mit HMLα, auch wenn HMR Yα anstelle von Ya enthält. Diese Donor-Präferenz wird durch ein kurzes DNAElement (244 bp) reguliert, das als RekombinationsEnhancer (RE) bezeichnet wird (Abb. 8.34); es liegt zwischen dem HMLα-Element und dem Centromer (~ 16 kb unterhalb von HMLα). In MATa-Zellen binden die Transkriptionsfaktoren Mcm1 (engl. minichromosome maintenance) und Fkh1 (engl. forkhead) an den Rekombinations-Enhancer und aktivieren ihn dadurch. Mutationen an zwei Basenpaaren innerhalb der Mcm1-Bindestelle heben die RE-Aktivität vollständig auf. In MATα-Zellen bindet dagegen das MATa2Protein an den RE und verhindert dadurch dessen

Aktivierung durch Mcm1 und Fkh1. Das führt dazu, dass im RE-unabhängigen Mechanismus HMR der bevorzugte Donor ist und sich eine Konversion von MATα nach MATa ergibt.

Spontane Veränderungen des Paarungstyps beruhen auf einer Endonuklease-kontrollierten DNA-Veränderung im MAT-Locus. Im Genom sind stets zwei zusätzliche Kopien des MAT-Locus vorhanden, je eines für den a- und den α-Paarungstyp. Durch Genkonversion kommt es zum Wechsel des Paarungstyps.

Ähnliche Mechanismen der Veränderung des MAT-Locus findet man auch in anderen Hefen, wenn auch zum Teil mit bemerkenswerten Unterschieden. Beispielsweise wird die Veränderung des Paarungstyps in Schizosaccharomyces pombe durch Imprinting (Kapitel 11.8) eines der DNA-Stränge im Paarungstyp-Locus (hier mat1 genannt) kontrolliert. Das hat zur Folge, dass bei S. pombe im Gegensatz zur Bäckerhefe jeweils nur eine der Tochterzellen einen veränderten Paarungstyp aufweist, während in Saccharomyces cerevisiae jeweils beide Tochterzellen im Paarungstyp verändert sind. Besondere Bedeutung kommt dabei einer Gruppe von Genen zu, die als swi-Gene bezeichnet werden, da sie für einen effizienten Wechsel (engl. switching) des Paarungstyps verantwortlich sind. Für eine neuere Übersicht siehe Broach (2004). Die Evolution des Paarungstyp-Wechsels in verschiedenen Spezies hat zu interessanten Entdeckungen geführt. Das System ist offensichtlich in einem zweistufigen Prozess entstanden, wobei zunächst die stillen HML/HMRKassetten erschienen und später das Gen für die HOEndonuklease, das sich von einem mobilen Element ableiten lässt. Beides, HO-vermittelter Wechsel des Paartungstyps und die stillen HM-Kassetten, kommen in dieser Form nur in Saccharomyces und deren nächsten Verwandten vor. Die entfernter verwandte Spezies Kluyveromyces lactis hat zwar die stillen HM-Regionen, wechselt aber den Paarungstyp ohne die HO-Endonuklease. Sehr weit entfernte Verwandte wie Candida albicans und Yarrowia lipolytica haben keine stillen Kassetten, und in Pichia angusta liegen die Gene MATα2, MATα1 und Mata1 direkt nebeneinander auf demselben Chromosom. Einen Vergleich der Organisationsformen verschiedener MAT-Regionen in Hefen gibt Abb. 8.36. Die Erkenntnisse aus dem Paarungstyp-Wechsel bei der Bäckerhefe haben aber nicht nur wissenschaftliche Bedeutung, sondern sie haben auch zu neuen Erkenntnissen bei dem Pilz Candida albicans geführt. Infektionen mit C. albicans sind für eine Reihe von Erkrankungen verantwortlich, die von Scheidenent-

8.3 Umlagerung von DNA-Fragmenten

Abb. 8.36 Vergleich der Organisation der MAT-Region bei 9 Hefespezies und Neurospora. Die Hauptlinie gibt die Organisation der α-Form an, wohingegen die a-Form jeweils darunter dargestellt ist; vertikale Linien verbinden orthologe Gene. Die Position der Schnittstelle der HO-Endonuklease ist angegeben, wenn sie vorhanden ist. Die Farben entsprechen konservierten Genen: rot: α-Typ; grün: a-Typ; blau: homologe Gene zum Chromosom 3 (Bereich YCR033W-YCR038W) von S.

cerevisiae; weiß: homologe Gene zum Chromosom 3 (Bereich YCR042W-YCR045W); orange: homologe Gene zum Chromosom 10; grau: homologe Gene zum Chromosom 12; violett: homologe Gene zum Chromosom 14; grauer Gradient: CAN1; rosa: DIC1; gelb: APN2. Die Gen-Namen in Klammern sind speziesspezifisch. (Nach Butler et al. 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nationalen Akademie der Wissenschaften der USA)

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

acchromyces cerevisiae

Candila albicans

Wechsel der Paarungstypen

HML a

HMR α Konversion

c Homozygotie

HML a Konversion

HMR α

MAT

MAT

a

α

HML a

HMR α

HML a

HMR α

MAT

MAT

α

a

b Paarung von Haploiden a x α

MTL

MTL

a

a

α

α

MTL

MTL

a

α

a

α

d Paarung von Homozygoten a/a x α/α

MAT

MAT

α

a

MTL

MTL

a

α

a

α

MTL MAT

a a α α

a α

Meiose

zufälliger Verlust von Chromosomen MAT

a

MAT

α

Abb. 8.37 a–d Vergleich des Mechanismus des PaarungstypWechsels zwischen S. cerevisiae und C. albicans. a, c Während S. cerevisiae den Paarungstyp-Wechsel durch eine Rekombination und Expression des stillen α- bzw. a-Allels vollzieht (a), muss C. albicans zunächst für α bzw a homozygot werden (c). b Der Paarungsvorgang erzeugt bei S. cerevisiae eine diploide Zelle

für MAT (α/a), die durch eine Meiose wieder in den haploiden Zustand zurückkehrt. d Bei C. albicans entsteht dagegen eine tetraploide, heterozygote Zelle (α/α/a/a) für MTL (engl. mating type like locus), die wahrscheinlich über einen zufälligen Verlust von Chromosomen wieder zum diploiden Zustand zurückkehrt. (Nach Soll 2003, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

zündungen bis zu Infektionen des Blutkreislaufs reichen und in zunehmendem Maße zum Tod führen. Der „Erfolg“ dieses Hefepilzes rührt daher, dass er sowohl als ein relativ gutartiger Begleiter seines Wirts in dessen natürlicher Flora an vielen Stellen eines gesunden Körpers lebt – aber als Antwort auf veränderte Bedingungen der Wirtsphysiologie ist er in der Lage, in fast jedes Gewebe einzudringen. Seine Fähigkeit, Biofilme herzustellen, dem Immunsystem zu entkommen und sich gegen Antipilzmittel erfolgreich zur Wehr zu setzen, lässt auf ein hohes Maß an Plastizität und Adaptionsfähigkeit schließen. Bis 1985 wusste man nur, dass der Pilz zwischen Sprosszellen und

Hyphen wechseln kann, und bis 1999 waren keine Paarungstyp-Gene bekannt. Daher dachte man lange Zeit, dass eine Paarung, der primäre Mechanismus der Rekombination, bei C. albicans nicht stattfindet. Inzwischen kennen wir aber eine Reihe von phänotypischen Wechsel-Systemen bei C. albicans, vor allem auch aus klinisch relevanten Isolaten. Auch die entsprechenden Gene für den Paarungstyp-Wechsel sind identifiziert; das entsprechende Gensymbol ist MTL (engl. matingtype like locus). Im Gegensatz zu S. cerevisiae durchläuft aber C. albicans ein tetraploides Stadium während des Paarungsprozesses (Abb. 8.37) – dadurch ist die Regulation des gesamten Prozesses wesentlich komple-

8.3 Umlagerung von DNA-Fragmenten

xer und erklärt auch seine späte Entdeckung. Es wird auch darüber spekuliert, dass die spezifische Pathogenität von C. albicans mit der Regulation seiner Paarungsfähigkeit zusammenhängt. Es scheint kein Zufall zu sein, dass die Paarungsfähigkeit erleichtert ist, wenn C. albicans auf der Haut immobilisiert ist, und dass ein bestimmter Phänotyp selektiv die Haut kolonisiert. Möglicherweise ergeben sich aus diesen Befunden auch neue therapeutische Möglichkeiten für die Bekämpfung der Candidosen.

8.3.5 Die Oberflächenantigene von Trypanosoma Der Erreger der Schlafkrankheit, der Flagellat Trypanosoma brucei, wird durch die Tsetse-Fliege Glossina palpalis (Muscidae) übertragen. Der Flagellat (Protozoa) vermehrt sich nach der Übertragung durch die Stechfliege im Blut des Menschen über einige Monate, bis er in die Cerebralflüssigkeit übergeht und einen tödlichen Krankheitsverlauf auslöst. Der Lebenszyklus von T. brucei ist in Abb. 8.38 schematisch dargestellt. Zu Beginn der Infektion ist das Immunsystem in der Lage, sich weitgehend gegen die Erreger zu wehren. Eine kleine verbleibende Population des Flagellaten entkommt aber der Erkennung durch die Immunabwehr dadurch, dass er ein neues Oberflächenprotein bildet. Dessen Glykoproteine (engl. variable surface glycoproteins, VSGs) wirken als Antigendeterminanten und sind mit etwa 107 Molekülen in der Plasmamembran integriert. Jedes Individuum von T. brucei hat ein Repertoir von etwa 100 solchen Glykoproteinen mit unterschiedlichen Antigenvarianten verfügbar, die im Laufe des Infektionszyklus zur Ausprägung kommen. Ihr häufiger Wechsel (etwa 1–10-mal in 106 Individuen) gestattet es dem Parasiten, der menschlichen Immunabwehr zu entrinnen. VSGs sind glykosylierte Polypeptide mit einer Länge von etwa 500 Aminosäuren, die als Homodimere auftreten. Sie werden von einer Multigenfamilie von etwa 1500 Genen im Genom des Parasiten codiert. Jedes Gen besteht aus einer variablen und einer konstanten Region. Konstante Bereiche, die in der Plasmamembran fixiert sind, sind nicht vollständig identisch, sondern nur ähnlich. Hingegen enthält der Aminoterminus die voneinander verschiedenen Antigendeterminanten. Lediglich eines dieser Gene ist jeweils aktiv und befindet sich im Subtelomerbereich eines der vielen Chromosomen des Parasiten. Die Subtelomerbereiche können sich in der Evolution schnell verändern (sie liegen zwischen den Telomerbereichen und den konventionellen euchromatischen Regionen des Chromosoms).

Abb. 8.38 Der Entwicklungszyklus von Trypanosoma brucei. Mit dem Stich einer Tsetse-Fliege gelangt der Erreger über die Haut in die Blut- und Lymphbahn, über die er sich als lange, schlanke Form verbreitet. Die Trypanosomen gelangen zurück in die Tsetse-Fliege, wenn diese nach einem Stich in einen infizierten Menschen die plumpe, gedrungene Form wieder aufnehmen. Im Mitteldarm des Insekts verwandeln sich die Erreger in die prozyklische Form und wandern in die Speicheldrüse ein. Dort entwickeln sie sich zu der infektionsfähigen, metazyklischen Form. Die ruhenden und metazyklischen Formen exprimieren ein variables Glykoprotein auf ihrer Oberfläche (VSG), das von einer der vielen Telomer-nahen Expressionsstellen (ES) abgelesen wird. Prozyklische Parasiten exprimieren dagegen Procycline, deren Genorte eher im Inneren der Chromosomen liegen. (Nach Dreesen et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Abb. 8.39 Die vier Gruppen von VSG-Genorten in T. brucei. Die Karte für jeden Genort gibt auch die ungefähre Zahl der Gene im Genom an. Gene und Pseudogene sind als Pfeile dargestellt: intakte VSGs (engl. variant surface glycoproteins) sind schwarz, VSG-Pseudogene grau und andere Gene weiß (alle gehören zur Gruppe der ESAGs, engl. expression-site associated genes); in Klammern steht die Nummer der entsprechenden ESAG-Familie. Ein ingi-Retrotransposon ist geriffelt dargestellt; kurze Pseudogene sind als Balken mit ψf gekennzeichnet. Die verschiedenen Wiederholungselemente sind durch schmale

Balken dargestellt; die Größe der Wiederholungseinheit ist angegeben. Die 70-bp-Wiederholungseinheit ist durch dünne vertikale Linien angegeben (n > 3). VSG-Promotoren sind als geknickte Pfeile dargestellt; die dicken horizontalen Linien unter den VSG-Reihen zeigen die Stellen des Strangwechsels. Die Anwesenheit eines ingi-Elementes ist typisch für die Strangwechsel-Regionen in VSG-Reihen. BES: bloodstream expression sites; MVSG: metacyclic VSG; telo: Telomer. (Nach Horn u. Berry 2005, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Es gibt vier Typen von VSG-Loci, alle sind subtelomerisch lokalisiert (Abb. 8.39): ï Das „stille Archiv“ der VSGs beinhaltet lange Wiederholungseinheiten, die zwischen 5 und über 150 Gene enthalten. Davon sind nur rund 4 % intakte Gene, 65 % Pseudogene, 21 % Genfragmente und 9 % wahrscheinlich unvollständige Gene. ï Die zweite Gruppe besteht aus ca. 100 Minichromosomen, die wahrscheinlich als Lager für stille VSGs dienen. ï Die dritte Gruppe umfasst etwa 15 bis 20 spezialisierte Transkriptionseinheiten, von denen VSGs während des Aufenthaltes im Blut des Wirts abgelesen werden (engl. bloodstream expression site, BES). Diese Bereiche sind polycistronisch und üblicherweise ~ 50 kb lang. Alle BES-Elemente werden flankiert von Regionen, die viele Retrotransposons und 50-bp-Wiederholungselemente

enthalten. Die BES dehnen sich unterhalb eines RNA-Polymerase-I-Promotors über mehrere Gene aus, die mit den Expressionsstellen assoziiert sind (engl. expression-site-associated genes, ESAGs) und umfasst auch noch einen Bereich von mehreren Hundert unvollständigen Wiederholungseinheiten, die sehr TAA-reich sind und als „70-bp“-Elemente bezeichnet werden (und auch bei den VSGs vorkommen). ï Die vierte Gruppe umfasst einen Satz metazyklischer VSG-Gene (MVSG), die in der infektiösen, metazyklischen Population der Tsetse-Fliege aktiv sind. Da die subtelomere Region offensichtlich das gesamte VSG-System enthält, hat diese Region viele kritische Funktionen in der Antigen-Variation zu erfüllen: Das „stille Archiv“ muss sich weiterentwickeln können; es

8.3 Umlagerung von DNA-Fragmenten

Abb. 8.40 a, b VSG-Wechsel durch Genkonversion. a VSGWechsel ist häufig von Homologiebereichen oberhalb und innerhalb der 3’-konservierten Regionen (schwarze Rechtecke) der VSG-Gene (farbige Rechtecke) abhängig. Die TelomerWiederholungseinheiten, die am Ende der aktiven VSG-Expressionsstellen liegen, sind durch Dreiecke gekennzeichnet. Oberhalb der Donor- und Akzeptor-VSGs befindet sich eine unterschiedliche Anzahl der charakteristischen 70-bp-Wiederholungseinheiten (schraffierte Rechtecke). Genkonversion führt zur Duplikation des stillen VSG (rotes Rechteck B) in die aktive

VSG-Expressionsstelle und ersetzt darin das vorher aktive VSG (blaues Rechteck C). b Mosaikförmige VSGs können durch segmentelle Genkonversion verschiedener VSG-Pseudogene (farbige Rechtecke) entstehen; die senkrechten Linien deuten Stoppcodons an. Im unteren Teil sind schematisch resultierende mosaikartige Gene dargestellt; damit wird die große Vielfalt verschiedener chimärer Formen von VSGs angedeutet. (Nach Taylor u. Rudenko 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

muss einen Mechanismus geben, um stille Information in die BES zu kopieren; es muss einen Mechanismus geben, der alle bis auf einen BES während des Aufenthaltes in der Blutbahn stilllegt; und die anderen Expressionsstellen müssen über die längsten Zeiträume während des Lebenszyklus ebenfalls abgeschaltet sein. Der VSG-Wechsel, d. h. der Prozess der AntigenVariation, ist in erster Linie ein Genkonversions-

Mechanismus: VSGs werden individuell in BES kopiert und eliminieren dabei das gerade aktive Gen. Üblicherweise läuft die kopierte Sequenz von der 70-bp Wiederholungseinheit bis zu den konservierten Elementen in oder hinter der codierenden Region. Einen Überblick dazu gibt Abb. 8.40. Wie auch beim Paarungstyp-Wechsel der Hefen geht man davon aus, dass ein Doppelstrangbruch den Prozess des VSG-Wechsels einläutet.

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Ein fundamentaler Prozess des VSG-Systems ist die strikte Transkriptionskontrolle, dass nämlich nur ein Gen transkribiert wird und alle anderen stillgelegt sind. Die Gene, die nicht transkribiert werden, haben keinen Promotor und befinden sich in reprimiertem Chromatin. Komplexere Kontrolle ist für die zwei Typen der Expressionsstellen notwendig, da sie als Familien vorkommen und nur eine Stelle aktiv ist („allele Exklusion“). Es ist zurzeit Gegenstand der Forschung, abzuklären, welche Funktion die Telomere in diesem Prozess haben. Weitere Besonderheiten von Trypanosomen sind das Trans-Spleißen und das Editieren von RNA in größerem Ausmaß, als wir es von anderen Organismen kennen. Beim Trans-Spleißen wird an einem Ende intronloser, polycistronischer Transkripte eine Sequenz von 35 Nukleotiden aus einer Donor-DNA addiert, die von einem weiter entfernt liegenden Bereich sich wiederholender Gene codiert wird. Der Reifungsprozess dieser RNA wird durch das Anheften einer Reihe von Adenosinmolekülen am 3’-Ende abgeschlossen (Polyadenylierung). Beim Editieren der RNA werden Transkripte dadurch verändert, dass einzelne Basen deletiert oder inseriert werden. Bei Trypanosomen betrifft dies in besonderem Maße die Protein-codierenden Gene der Mitochondrien (bis zu 50 % der Nukleotide).

Trypanosoma, der Erreger der Schlafkrankheit, zeich-

net sich durch variable Oberflächenantigene an seiner Plasmamembran aus. Durch den Wechsel dieser Antigene nach der Infektion vermag der Parasit der Immunabwehr zu entrinnen. Der Wechsel des exprimierten Antigens ist mit DNA-Veränderungen verbunden.

8.4 Das Immunsystem 8.4.1 Funktion des Immunsystems der Säuger Das Immunsystem ist ein Abwehrsystem eines Organismus, sich gegen infektiöse Agenzien wie Viren, Bakterien, Pilze etc. zu wehren. Wir können zwei grundsätzlich verschiedene Arten der Immunantwort unterscheiden, die „angeborene“ Immunantwort (engl. innate immunity) und die adaptive oder erworbene Immunreaktion. Die angeborene Immunantwort richtet sich im Wesentlichen gegen Mikroben und Parasiten und ist weit verbreitet; die erworbene Immunantwort ist dagegen hochspezifisch und nur bei Wirbeltieren bekannt. Immunität wird also durch das Zusammenwirken vieler

verschiedener Zellen erreicht; einige davon zirkulieren im Körper, andere sind in verschiedenen Organen des Lymphsystems konzentriert. Eine wichtige Säule der erworbenen Immunantwort sind Antikörper. Diese sind imstande, körperfremde Stoffe (Antigene) zu erkennen und sich daran anzulagern. Diese Anlagerung führt zur Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes, der anschließend durch spezialisierte Zellen des Immunsystems vernichtet werden kann. Die Synthese von Antikörpern erfolgt ausschließlich in speziellen Zellen des Immunsystems, den Lymphocyten. Hauptklassen dieser Zellen sind die B- und die T-Lymphocyten. Sie erfüllen jeweils charakteristische Aufgaben im Bereich der Immunabwehr. Beide Lymphocytentypen gehören, wie auch die übrigen Zellen des Immunsystems und die Erythrocyten, dem hämatopoietischen (blutbildenden) System an. Sie entstehen, wie alle Blutzellen, aus Stammzellen im Knochenmark (Abb. 8.41). Die Antikörper sind zunächst an die Membran naiver Lymphocyten gebunden; nach der Erkennung eines körperfremden Stoffes durch einen B-Lymphocyten beginnt dieser zu proliferieren und bildet eine große Anzahl von Plasmazellen. Alle von ihm abgeleiteten Plasmazellen produzieren den gleichen spezifischen Antikörper gegen ein bestimmtes Antigen (klonale Selektion; Burnet 1959, Talmage 1957). Dieser Antikörper wird nun jedoch nicht mehr vorwiegend als membrangebundene Form synthetisiert, sondern wird in einer löslichen Form ins Blut abgegeben. T-Lymphocyten (auch T-Zellen genannt) werden ebenfalls im Knochenmark gebildet, müssen jedoch zunächst im Thymus eine Reifungsphase durchlaufen, um funktionsfähig zu werden. T-Zellen unterstützen die B-Lymphocyten in ihrer Funktion, indem sie mit ihrem an der Zellmembran gebundenen T-Zell-Rezeptor an B-Lymphocyten gebundene Antigene erkennen und an diese binden. Im Gegensatz zu B-Lymphocyten erkennen T-Zellen nur gebundene Antigene. Hierfür ist ein Erkennungssignal an der Antigen-tragenden Zelle, das Histokompatibilitätsantigen, erforderlich. Aufgabe der T-Zellen ist es nun, einerseits dieses Histokompatibilitätsantigen, andererseits den AntigenAntikörper-Komplex am B-Lymphocyten mittels des T-Zell-Rezeptors zu erkennen. T-Zellen sind selbst nicht imstande, Antikörper zu sezernieren. Es werden mehrere Typen von T-Zellen unterschieden, die cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL) (auch Killer-T-Zellen genannt), Helfer-T-Zellen (TH-Zellen) und Suppressor-T-Zellen (TS-Zellen). Wie der Name andeutet, haben CTLs die Aufgabe, Zellen mit körperfremden Antigenen an ihrer Zelloberfläche zu vernichten. TS-Zellen dämpfen eine immunologische Reaktion; TH-Zellen dagegen sezernieren Proteinfaktoren, die die Immunreaktion anderer Zellen, beispielsweise von

8.4 Das Immunsystem

Abb. 8.41 Das hämatopoietische System. Aus den hämatopoietischen Stammzellen im Knochenmark entstehen einerseits die myeloiden Stammzellen, die sich zu Granulocyten und (kernlosen) Erythrocyten entwickeln, und andererseits über die lymphoiden Stammzellen die Zellen des Immunsystems. Hierzu gehören die Lymphocyten, die für die Antikörperproduktion verantwortlich sind. (Nach Müller u. Hassel 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

B-Lymphocyten, stimulieren. Sie sind ein unentbehrlicher Bestandteil des Immunsystems. Das wird besonders deutlich daran, dass sie die Wirtszellen des Aids-Virus (HIV) (Kapitel 8.2.2) sind, die durch das Virus letztlich zerstört werden. Hierauf beruht die Zerstörung der Funktionen des Immunsystems durch das Aids-Virus.

Antikörper werden in Lymphocyten synthetisiert. Ein Lymphocyt vermag nur ein bestimmtes Antigen zu erkennen. Nach der Erkennung eines körperfremden Antigens durch die Antikörper an der Zellmembran eines Lymphocyten beginnt dieser zu proliferieren und dadurch Plasmazellen zu erzeugen, die Antikörper gegen das gleiche Antigen erzeugen können.

Nicht alle B-Lymphocyten, die durch ein Antigen aktiviert werden, differenzieren zu Plasmazellen, die Antikörper freisetzen. Manche bleiben als Gedächtniszellen (engl. memory cells) zurück und können im Falle später erforderlicher Immunreaktionen besonders schnell aktiviert werden und eine sekundäre Immunreaktion einleiten. Der überwiegende Teil der peripheren Lymphocytenpopulation unseres Immunsystems gehört solchen Gedächtniszellpopulationen an. Auf der Existenz von Gedächtniszellen im Immunsystem beruht der erhöhte immunologische Schutz gegen Infektionen, der einem Organismus durch Impfung vermittelt werden kann. Durch die Injektion von Antigenen (Aktivimpfung) in Form eines bestimmten Krankheitserregers wird die primäre Immunreaktion eingeleitet. Als Antigene können entweder inaktivierte Erreger oder dem Erreger verwandte, aber nicht pathogene Organismen oder auch einzelne Antigene eines Erregers dienen. Die Immunreaktion verläuft mit einer gewissen Verzögerung, da zunächst B-Lymphocyten zur Proliferation aktiviert werden müssen. Erst nach deren Vermehrung kann die Immunabwehr voll zur Geltung kommen. Der entscheidende Effekt einer Schutzimpfung ist jedoch nicht das Einsetzen dieser Abwehrreaktion (primäre Immunreaktion), sondern die gleichzeitige Bereitstellung von Gedächtniszellen. Im Falle einer wiederholten Infektion setzt die Immunreaktion (sekundäre Immunreaktion) sehr viel schneller ein, da nunmehr die Gedächtniszellen zur Verfügung stehen. Diese Gedächtniszellen proliferieren wesentlich schneller als die B-Lymphocyten während der primären Antikörperreaktion. Das hat zur Folge, dass die Immunabwehr bei wiederholter Reizung durch das gleiche Antigen wesentlich schneller einsetzt und damit einen besseren Schutz bietet. Impft man fertige Antikörper (Passivimpfung), so wird das Immunsystem selbst nicht aktiviert und der Impfschutz ist zeitlich sehr begrenzt, da die Spenderimmunoglobuline innerhalb weniger Wochen abgebaut werden.

Der Nutzen von Schutzimpfungen beruht auf der Eigenschaften von Lymphocyten, bei einem ersten Kontakt mit einem Antigen mitotisch Zellen zu erzeugen, die eine langfristige Funktion als Gedächtniszellen besitzen. Bei erneuter Infektion mit einem Antigen ermöglichen sie eine sehr schnelle sekundäre Immunreaktion.

Die Erkennungssignale, die von Antikörpern erkannt werden, umfassen oft nur wenige (5 bis 10) Aminosäuren eines Proteins, sind also im Allgemeinen recht klein, verglichen mit der Größe eines Proteinmoleküls. Man bezeichnet den Molekülbereich, der durch einen bestimmten Antikörper erkannt wird, als Antigende-

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

terminante (oder Epitop). Ein einzelnes Protein besteht demnach aus einer Vielzahl von Antigendeterminanten. Hierbei lässt sich zwischen stärker immunogenen, d. h. die Proliferation der B-Lymphocyten stärker induzierenden Epitopen und schwächer oder gar nicht immunogenen Epitopen unterscheiden. Da ein Lymphocyt nur jeweils einen bestimmten Antikörpertyp produzieren kann, sind zur Erkennung der unterschiedlichen Antigendeterminanten die Antikörper vieler verschiedener Lymphocyten erforderlich. Die Immunabwehr bedarf jedoch nur eines einzigen Lymphocytentyps, um ihre Aufgabe zu erfüllen. Die geringe Ausdehnung eines durch einen Antikörper erkannten Epitops lässt erwarten, dass man gleiche oder sehr ähnliche Epitope in unterschiedlichen Proteinen wiederfindet, da kurze identische Aminosäuresequenzen in vielen Proteinen vorkommen. Dadurch wird die Anzahl möglicher unterschiedlicher Antigendeterminanten reduziert. Dennoch ist die Anzahl unterschiedlicher Epitope, die insgesamt durch Antikörper erkannt werden müssen, beträchtlich. Die Schätzungen der Anzahl unterschiedlicher Antigendeterminanten, auf die das Immunsystem funktionell vorbereitet sein muss, um einen vollständigen immunologischen Schutz zu bieten, liegen zwischen 106 und 107. Man könnte allerdings argumentieren, dass nicht alle Epitope eines Proteins durch einen Antikörper erkannt werden müssen, um dieses als körperfremd zu erkennen und zu inaktivieren. Die Anzahl der erforderlichen unterschiedlichen Antikörper wäre dann erheblich niedriger. Das wirft sehr schwerwiegende Fragen hinsichtlich der genetischen Codierung des Immunsystems auf, wie sich aus der folgenden Abschätzung leicht erkennen lässt: Die genetische Information, die erforderlich ist, um einen bestimmten Antikörper zu codieren, liegt bei 6000 bp DNA (siehe unten). Zur Codierung aller möglichen Antikörper wären daher mindestens 6 × 109 bp DNA (106 × 6000 bp) erforderlich. Diese DNA-Menge würde bereits die Größe des menschlichen Genoms (2 × 109 bp) überschreiten. Die Vielfalt der Reaktionen des Immunsystems muss daher auf einem anderen genetischen Mechanismus beruhen als auf der getrennten Codierung vieler unterschiedlicher Gene. Diese Eigenschaften werfen daher schon bei oberflächlicher Betrachtung zwei grundlegende Fragen auf: ï Wodurch können so viele unterschiedliche Antikörper bereitgestellt werden, dass sie imstande sind, eine Diversität von über 106 Erkennungsstrukturen für unterschiedliche Antigendeterminanten abzudecken? ï Wie unterscheidet das Immunsystem zwischen körpereigenen Stoffen, die ja von der Immunabwehr nicht angegriffen werden dürfen, und körperfremden Antigenen, die zuverlässig entfernt werden müssen?

Auf beide Fragen können wir heute zumindest in prinzipieller Form Antworten geben. Zusammenfassend lauten die Antworten: ï Die große Vielfalt der verschiedenen Antikörper wird durch Veränderungen in der DNA-Struktur der betreffenden Gene im Laufe der Lymphocytendifferenzierung hervorgebracht. ï Der Schutz des Organismus gegenüber Angriffen durch das eigene Immunsystem erfolgt dadurch, dass Lymphocytenklone, die gegen körpereigene Antigene gerichtet wären, deletiert oder anergisiert (ruhiggestellt) werden. Auf beide Antworten soll im Verlauf unserer weiteren Betrachtung etwas genauer eingegangen werden. Zuvor werden jedoch die zentralen molekularen Gesichtspunkte, die zum Verständnis der Antikörperreaktionen erforderlich sind, zusammengefasst. Die große Anzahl der benötigten Antikörper schließt die Möglichkeit aus, dass sie alle unabhängig voneinander im Genom codiert werden (Keimbahnhypothese). Auf welche Weise die Bildung einer Vielzahl verschiedener Antikörper erreicht wird und wie die zellspezifische Produktion jeweils nur eines dieser Antikörper gesteuert wird, wurde durch die Aufklärung der molekularen Struktur der Gene deutlich, die Antikörper codieren: der Immunglobulin-Gene (Ig). Ausgangspunkt dieser Erkenntnis war der Vergleich der Ig-Genstruktur in Antikörper-produzierenden Zelllinien (Mausmyelomazellen) mit der entsprechenden Ig-Genstruktur in beliebigen somatischen oder Keimbahnzellen von Mäusen. Hierbei stellte sich heraus, dass die Gene im Laufe der Differenzierung der Zellen zu Lymphocyten ihre DNA-Struktur verändern.

8.4.2 Die Immunglobulin-Gene Die Grundzüge der Struktureigenschaften von Antikörpern lassen sich in den folgenden Punkten zusammenfassen (Abb. 8.42): ï Ein Antikörper besteht aus einem Komplex von zwei identischen schweren (H-Ketten, engl. heavy chain) und zwei identischen leichten (L-Ketten, engl. light chain) Proteinketten, die über Disulfidbrücken untereinander verbunden sind. ï Jede leichte Kette ist aus einer variablen (V für engl. variable) und einer konstanten (C für engl. constant) Region aufgebaut. Beide Regionen sind über eine J-Region (für engl. joining) miteinander verbunden. ï Jede schwere Kette besteht aus einer variablen und drei hintereinander liegenden, nahezu identischen konstanten Regionen. Die variablen und die kons-

8.4 Das Immunsystem

ï

ï

ï

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ï

tanten Regionen sind über eine D- (für engl. diversity) und eine J-Region miteinander verbunden. Die variablen Regionen einschließlich der D- und J-Region beider Ig-Ketten sind für jeden Antikörpertyp individuell charakteristisch und vermitteln die Antigenspezifität. Die V-, D-, J- und C-Regionen werden in unterschiedlichen Bereichen der DNA codiert. Während der Entwicklung eines B-Lymphocyten werden diese Bereiche durch Rekombinationsereignisse in der DNA aneinandergesetzt. Auf diese Weise entstehen die unterschiedlichen Antigenspezifitäten. Nach der Konstruktion eines funktionellen H- oder L-Kettengens im Lymphocyten erfolgen zusätzliche (somatische) Mutationen, insbesondere auch in den hypervariablen Bereichen der V-Region, die zur Erhöhung der Antigenspezifität beitragen. Die DNA-Rearrangements, die zur Bildung eines funktionellen Ig-Gens erforderlich sind, erfolgen nur in einem der beiden homologen Chromosomen, das Homologe bleibt genetisch inaktiv. Diese Erscheinung bezeichnet man als allele Exklusion (Allelausschluss) (engl. allelic exclusion). Es gibt zwei verschiedene Genloci für leichte Ketten, die auf unterschiedlichen Chromosomen liegen (beim Menschen in den Chromosomen 2 und 22, bei der Maus in den Chromosomen 6 und 16). Sie werden als κ- und λ-Ketten (Lκ und Lλ) bezeichnet. Beide Genloci kommen ausschließlich alternativ, nie gleichzeitig zur Expression. In den schweren Ketten, die beim Menschen auf dem Chromosom 14, bei der Maus auf dem Chromosom 12 codiert werden, können unterschiedliche konstante Regionen vorkommen. Sie bestimmen nicht die Antigenspezifität, sondern andere spezifische Funktionen der Antikörper (Membranbindung; Aktivierung des Komplementsystems ‒ bestehend aus Proteinen, die Zellen abtöten, an die Antikörper gebunden sind; Aktivierung und Bindung von Makrophagen; Induktion von Phagocytose; Induktion von Histaminausschüttung der Mastzellen u. a.). Die Erkennungsspezifität des Antikörpers wird hierdurch nicht verändert. Die Änderung einer konstanten Region bezeichnet man als Klassenwechsel (engl. class switch). Evolutionär sind die verschiedenen V- und C-Regionen durch Duplikationen auseinander entstanden.

Das Modell lässt uns die evolutionäre Verwandtschaft der variablen, N-terminalen und der konstanten Regionen unmittelbar erkennen. Sowohl die variable als auch die konstante Region sind aus zwei β-Faltblättern

Abb. 8.42 a, b Struktur eines IgG-Antikörpers. a Jede schwere Kette (engl. heavy chain, H) besteht aus drei konstanten Regionen (CH1, CH2, CH3; hellblau; engl. constant, C) und einer variablen Region (VH; rosa) am N-Terminus. Jede leichte Kette (engl. light chain, L) besteht aus einer konstanten Region (CL; hellblau) und einer N-terminalen variablen Region (VL; orange). Die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten bilden die Antigen-bindende Domäne (Antigen: blau). Mögliche Glykosylierungsstellen in der CH2-Region sind angedeutet (rot). Jedes IgG-Molekül lässt sich durch Proteasen spalten; Papain spaltet das Molekül in der „Knick“-Region (engl. hinge) in zwei Fragmente: Fab (engl. fragment antigen binding) und Fc (engl. fragment crystallizable). b Das Bändermodell eines Antikörpers zeigt einen IgG-Antikörper, der aus vier Polypeptidketten besteht: zwei identische leichte Ketten in rosa und gelb und zwei identische schwere Ketten in lila und orange. (a nach ZafirLavie et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group; b nach Harris et al. 1998, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

zusammengesetzt, die durch Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind. Die Proteinbereiche zwischen den beiden β-Faltblättern sind in ihrer sterischen Anordnung nach der Außenseite des Antikörpers gerichtet und bilden den Antigenerkennungsbereich.

383

384 384

Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Ein Immunglobulinkomplex besteht aus zwei leichten

und zwei schweren Proteinketten. Diese untergliedern sich in einen konstanten und einen variablen Abschnitt. Der variable Bereich vermittelt die Erkennung des Antigens. Die funktionellen Gene für Antikörper werden während der Differenzierung von Lymphocyten im Knochenmark durch komplexe intrachromosomale Rekombinationsereignisse aus Teilstücken zusammengesetzt. Durch Kombination unterschiedlicher Teilstücke vermag jeder Lymphocyt ein für ihn spezifisches ImmunglobulinGen zusammenzustellen.

Dieser allgemeinen Zusammenfassung der wesentlichen Eigenschaften der Ig-Gene folgt nun eine tiefer gehende Besprechung verschiedener Phänomene, die die zusätzliche Komplexität dieses Gensystems deutlich werden lässt. In vielen Punkten stellt sie aber immer noch noch eine starke Vereinfachung der wirklichen Situation dar. Insbesondere erfolgt im Rahmen dieser Darstellung eine Beschränkung auf die Mechanismen, die bei der Bildung der schweren Kette (H-Kette) eines Antikörpers wichtig sind. Insgesamt gibt es 7 verschiedene Genorte, die durch ähnliche Mechanismen, d. h. durch somatische Rekombination, die Antigen-Rezeptoren für T- und B-Lymphocyten herstellen; dieser Prozess wird allgemein als V(D)J-Rekombination bezeichnet. Zu diesen Genen gehören Loci für die schwere (IgH) und für die beiden leichten Immunglobulinketten (Igλ und Igκ), die den Antigen-Rezeptor sowie die sezernierten Antikörper der B-Zellen codieren, sowie die Gene für die T-Zell-Rezeptoren β, δ und α, γ. Der Umbau dieser Loci ist im Hinblick auf die jeweilige Zelllinie, das Entwicklungsstadium der Differenzierung und des jeweiligen Allels streng kontrolliert. Auf die Entstehung und Bedeutung des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes (engl. major histocompatibility complex, MHC) kann in diesem Zusammenhang nicht eingegangen werden; es wird daher auf speziellere Literatur der Immungenetik verwiesen. Der Genort für die schwere Kette der Immunglobuline (IgH) befindet sich beim Menschen auf dem Chromosom 14 nahe dem Telomer (14q32). Bei der Maus umfasst der IgH-Genort etwa 3 MB in der Nähe des Telomers des Chromosoms 12; eine Übersicht ist in Abb. 8.43 dargestellt. Wir kennen etwa 150 oder mehr funktionelle Segmente für die variable Region (VH), die etwa 15 Segmentfamilien zugeordnet werden können. Diese Segmente sind allein über ca. 2,7 MB verteilt und liegen ca. 100 kb oberhalb der etwa 12‒13 Gensegmente, die für die D-Region der H-Kette codieren (DH). Diese DH-Gensegmente liegen etwa 50 kb oberhalb der vier J-Abschnitte (JH), die nur etwa 2 kb umfassen und gerade 700 bp unterhalb des letzten DH-

Gensegments liegen, das als DQ52 bezeichnet wird. Die verschiedenen Exons der konstanten Region beginnen mit Cμ etwa 7 kb unterhalb der JH-Gensegmente und umfassen etwa 200 kb. Ein starker Enhancer (Eμ) liegt in dem Intron zwischen JH und Cμ. Mehrere verschiedene Mechanismen führen zur Verschiedenheit der variablen Region der schweren Ketten. Dazu gehört in erster Linie die zufällige Rekombination jeweils eines der verschiedenen VH, DH, und JH-Segmente ‒ V(D)J-Rekombination. Die einzelnen Segmente sind dabei durch Rekombinations-Signalelemente getrennt, die aus 7 bzw. 9 bp bestehen und durch Verbindungsstücke von 12 oder 23 bp voneinander getrennt sind. Die VH- und JHSegmente sind im 3’-Bereich jeweils von einem 23-bpVerbindungselement flankiert, wohingegen die DHGensequenzen an beiden Seiten von 12-bp-Verbindungselementen flankiert sind. Die 12/23-Regel diktiert daher die große Mehrheit der IgH-V(D)J-Rearrangements. Enzymatisch unterstützt wird die V(D)J-Rekombination durch die RAG-Endonuklease, die durch die Genprodukte der beiden Gene RAG1 und RAG2 gebildet wird (engl. recombination activating gene, RAG). Die RAG-Endonuklease induziert Doppelstrangbrüche in der DNA, und zwar spezifisch an den Grenzen zwischen zwei codierenden Segmenten und ihren flankierenden Rekombinations-Signalsequenzen. Die RAG-Funktion benötigt Rekombinations-Signalsequenzen mit einem 12-bp-Verbindungsstück auf der einen und einem 23-bp-Verbindungsstück auf der anderen Seite. Aufgrund der verschiedenen Zufälligkeiten führt aber nicht jedes der verschiedenen Rekombinationsereignisse zu einem funktionsfähigen Translationsprodukt, da die V(D) J-Tripletts nicht immer einen offenen Leserahmen mit dem Cμ-Segment bilden. Hinsichtlich der somatischen Rekombinationsereignisse bei der Bildung der funktionellen Ig-Gene ist es bemerkenswert, dass die Konstruktion eines funktionellen Gens nur innerhalb einer kontinuierlichen DNA-Sequenz erfolgt (also nur in cis). Eine Rekombination mit dem Allel des homologen Chromosoms oder gar mit den Genen einer anderen Kette, wie man es aus den Beobachtungen der Effekte meiotischer Rekombination bei den Globin-Genen erwarten könnte, erfolgt nicht. Diese Allel-Exklusion gibt es übrigens nicht nur bei IgH, sondern auch bei den Genorten für den T-Zell-Rezeptor β (Tcrb) und die beiden leichten Kette der Immunglobuline (Igk, Igl). Dabei scheint das Replikationsmuster für die Entscheidung verantwortlich zu sein, in welchem Allel die Rekombination stattfindet: In 80 bis 90 % der B-Zellen sind es die früh replizierenden Allele, bei denen die V(D)J-Rearrangements stattfin-

8.4 Das Immunsystem

VH-Gene

VH

DFL16.1

(ungefähr 150)

Dq52 JH

DH(12)

Eμ

Cμ

Cδ

Cγ3 Cγ1 Cγ2b Cγ2α Cε Cα

3’ EH

JH(4)

DH J558

3609

Q52

7183

andere

Abb. 8.43 Organisation des Genorts für die H-Kette und Entstehung eines aktiven Gens. a Der Genort für die schwere Immunglobulinkette der Maus umfasst etwa 3 MB. Etwa 150 VH-Gensegmente befinden sich oberhalb der 12 DH- und der 4 JH-Segmente. Einige VH-Familien sind darunter angedeutet. Drei bekannte cis-

regulatorische Elemente (der intronische Enhancer Eμ, der Dq52Promotor und die 3’-Locus-Kontrollregion) sind als rote Kreise angedeutet. Die roten Rechtecke symbolisieren Genabschnitte für verschiedene konstante Elemente (Cμ bis Cα). (Nach Chowdhury u. Sen 2004, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

den. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass früh replizierende Gene allgemein ein bevorzugtes Substrat für Chromatin-Umbau und daher in der G0/ G1-Phase für RAG leichter zugänglich sind (Krangel 2003).

mRNA der H-Ketten in einer aktiv Ig-produzierenden Plasmazelle etwa 10 % der gesamten mRNA. Eine wichtige Rolle spielt alternatives RNA-Spleißen für die Produktion unterschiedlicher Formen von IgM (siehe unten). Membrangebundenes IgM unterscheidet sich nämlich von sezerniertem IgM durch den Besitz eines besonderen M-Segmentes, das an die Cμ-Kette des freigesetzten IgM (auch μS-Kette genannt) angefügt wird und zur Bildung der μM-Kette führt. Dieses M-Segment besteht bei der Maus aus einem 41 Aminosäuren langen Peptidbereich, der sich durch einen hydrophoben Charakter auszeichnet und dadurch seine besondere Eigenschaft als Transmembranabschnitt der IgM-H-Kette erlangt. Bis zur Aktivierung der Proliferation von B-Lymphocyten durch ein Antigen wird lediglich die Transmembranform des IgM produziert. Danach beginnt die Synthese sezernierter IgM-Ketten durch frühzeitige Termination der Transkription hinter dem Cμ4-Exon.

Ein wichtiger Mechanismus für die Herstellung spe-

zifischer Antikörper ist die somatische Rekombination zwischen verschiedenen Segmenten in den Genbereichen, die für die variablen Regionen der schweren bzw. der leichten Ketten der Immunglobuline codieren [V(D)JRekombination]; diese Rekombination ist auf ein Allel beschränkt.

Die molekulare Struktur der funktionellen Ig-Gene nach Abschluss der V(D)J-Rekombination gleicht der anderer eukaryotischer Gene. Sie zeichnen sich durch den Besitz von Exons und Introns aus und besitzen ein Signalpeptid, wie es generell für Proteine erforderlich ist, die durch Membranen des endoplasmatischen Reticulums transportiert werden müssen. Die Transkription der Ig-Gene unterscheidet sich daher auch nicht prinzipiell von der anderer Protein-codierender eukaryotischer Gene. Es wird zunächst ein primäres Transkript gebildet, aus dem die Introns herausgeschnitten werden. Das mRNA-Molekül wird mit einer 5’-Kappe und einem Poly(A)-Schwanz versehen, bevor es ins Cytoplasma transportiert und im endoplasmatischen Reticulum an den Ribosomen translatiert wird. Wie bei anderen differenzierten Zelltypen mit einer hohen Rate an zellspezifischer Proteinproduktion, so ist auch bei den Immunglobulinen der Anteil der Ig-spezifischen mRNA an der gesamten RNA der Zelle sehr hoch. So umfasst die

8.4.3 Klassenwechsel, Hypermutation und Genkonversion bei ImmunglobulinGenen Antikörper lassen sich in fünf verschiedene Klassen einteilen, die durch die jeweiligen unterschiedlichen konstanten Regionen der schweren (H-)Ketten charakterisiert sind: IgM, IgG, IgA, IgD und IgE (Tabelle 8.6). Von einigen dieser Klassen wiederum gibt es mehrere Unterklassen, die sich durch geringfügige Unterschiede in der Aminosäuresequenz der betreffenden konstanten Region unterscheiden. Die verschiedenen Klassen sind durch jeweils eigene DNA-Bereiche

385

386 386

Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Tabelle 8.6 Immunglobulinklassen des Menschen Klasse

schwere Kette

leichte Kette

Molekulargewicht (kDa)

Eigenschaften/Vorkommen

IgA

α

κ oder λ

360–720

in Tränen, Nasensekret, Muttermilch, Darmsekret

IgD

δ

κ oder λ

160

in Plasmamembran von B-Zellen

IgE

ε

κ oder λ

190

bindet an Mastzellen, setzt Histamin für allergische Reaktion frei

IgG

γ

κ oder λ

150

lösliche Antikörper im Blut, passiert die Plazentaschranke

IgM

μ

κ oder λ

950

in Plasmamembran von B-Zellen, vermittelt Erstreaktion des Immunsystems; aktiviert Complementsystem

Nach Karp (2005)

bestimmt, die in der zuvor genannten Folge im Genlocus der schweren Kette angeordnet sind (Abb. 8.43). Zellen eines bestimmten B-Lymphocytenklons erkennen stets nur ein bestimmtes Antigen. Unterschiedliche Lymphocytenklone hingegen sind dagegen im Allgemeinen gegen unterschiedliche Antigene gerichtet. Das macht es notwendig, dass ein Lymphocytenidiotyp aber zugleich verschiedene Funktionen bei der Antikörperproduktion wahrnehmen kann. So muss er z. B. sowohl membrangebundene als auch in Blut- bzw. Lymphbahn sezernierbare Antikörper herstellen können. Diese verschiedenen Aufgaben werden durch die jeweils vorhandene konstante Region der schweren Kette gesteuert. Jeder B-Lymphocyt kann Antikörper gleicher Antigenspezifität mit unterschiedlichen konstanten Regionen (Cμ, Cδ, Cγ, Cα und Cε) synthetisieren. Auf diese Weise entstehen Antikörper der unterschiedlichen Immunglobulinklassen IgM, IgD, IgG, IgA und IgE. Die Gensegmente für die verschiedenen konstanten Regionen schließen sich im IgHLocus an die V-D-J-Region an. Von dieser sind sie, ebenso wie untereinander, durch Introns bzw. nicht Protein-codierende DNA-Abschnitte abgetrennt (Abb. 8.43). Die Synthese der verschiedenen H-Ketten in einer Antikörper-produzierenden Zelle erfolgt in der durch ihre Folge in der DNA festgelegten Sequenz. Die Umschaltung der Zelle zur Produktion einer neuen Antikörperklasse bezeichnet man als Klassenwechsel (engl. class switching).

Verschiedene Antikörper können sich auch in den kon-

stanten Regionen der H-Ketten unterscheiden. Die fünf verschiedenen Antikörperklassen (IgM, IgG, IgA, IgD und IgE) sind durch eine jeweils charakteristische konstante Region gekennzeichnet und vermitteln unterschiedliche funktionelle Aufgaben, ohne die Antigenspezifität zu verändern.

Zur Ausprägung der verschiedenen CH-Regionen bedient sich die Zelle zweier unterschiedlicher molekularer Mechanismen, dem der DNA-Rearrangements und dem des alternativen RNA-Spleißens. Eine Antikörper-produzierende Zelle beginnt zunächst stets mit der Synthese von IgM. Nach einem kurzen Zwischenstadium kommt als zweiter Isotyp in derselben Zelle auch IgD zur Ausprägung. Dieser erste Klassenwechsel wird durch alternatives RNA-Spleißen erreicht. Durch Änderungen im Terminationsverhalten bei der RNASynthese werden primäre Transkripte gebildet, die auch die unterhalb von Cμ liegende Cδ-Region umfassen. Durch RNA-Spleißen wird die Cδ-Region an die V-D-J-Region angefügt. Hierdurch wird die Synthese von IgD ermöglicht. In der gleichen Zelle wird jedoch auch noch IgM gebildet. Die Umschaltung zwischen verschiedenen Antikörperklassen ist wahrscheinlich in Zusammenhang mit dem Differenzierungsprozess eines B-Lymphocyten zu sehen, der durchlaufen werden muss, bevor er einen funktionellen Zustand erreicht. Antikörper-produzierende Zellen unterliegen nach der Entstehung ihrer funktionellen Ig-Gene einer intensiven Selektion im Organismus. Würden alle nur möglichen Antigene durch Antikörper erkannt und unschädlich gemacht, müssten notwendigerweise auch die Antigene des Organismus selbst betroffen sein. B-Lymphocyten mit Antigenspezifitäten, die Antigendeterminanten des Organismus selbst betreffen würden, werden jedoch von der weiteren Entwicklung ausgeschlossen. Fehler in diesem Selektionsprozess führen zu Autoimmunkrankheiten. Die Produktion von IgM und IgD in einem B-Lymphocyten zeigt, dass diese Selektionsprozesse beendet sind. Von dem Zeitpunkt an, an dem beide

8.4 Das Immunsystem

Isotypen membrangebunden an einem B-Lymphocyten vorhanden sind, kann er unter Bildung von Plasmazellen und Gedächtniszellen proliferieren und damit seine immunologische Aufgabe im Rahmen des Immunsystems wahrnehmen. Erst nach der Expression von IgM und IgD in B-Lymphocyten kann die Zelle zur Produktion anderer IgKlassen umprogrammiert werden. Dieser Klasssenwechsel ist stets mit weiteren Rekombinationsereignissen des IgH-Genlocus verbunden. Sie führen zur Ausschaltung bestimmter C-Regionen durch Elimination ihrer DNA aus dem Gen. Im Gegensatz zu den Rearrangements, die zur Bildung der V-D-J-Regionen führen, kann die Rekombination der C-Regionen auch zwischen homologen Chromosomen ablaufen. Die Rekombination erfolgt zwischen repetitiven DNAAbschnitten, die zwischen den verschiedenen C-Regionen liegen; hierbei spielen die sogenannten S-Sequenzen (S für engl. switch) eine Rolle, wie von M. M. Davis und Mitarbeitern (1980) erkannt worden ist. Solche S-Sequenzen haben im Gegensatz zu den für die V-, D- und J-Rekombination wichtigen invertierten Wiederholungselementen keinen Palindromcharakter. Sie haben jedoch einen relativ hohen Guanosin-Gehalt im nicht-codierenden Strang. Im Elektronenmikroskop erkennt man in diesem Bereich ausgedehnte Schlaufen („G-Loops“), die aus DNA-RNA-Hybriden bestehen und während der Transkription entstanden sind. Die Guanosin-Reste in dieser Schlaufe sind jedoch Substrat für einen enzymatischen Mechanismus, der in der letzten Zeit immer deutlicher in den Mittelpunkt vieler Untersuchungen gerückt ist und zur Erklärung viele Phänomene in der Erhöhung der Spezifität der Antikörper beigetragen hat: die Aktivierungs-induzierte Cytidin-Deaminase (AID; Abb. 8.44). Dieses Enzym entfernt Aminoreste im Cytidin des Transkripts, das dadurch zu Uridin wird. Die Uracil-Base wird aber durch die ubiquitäre Uracil-Nukleosidglykosylase herausgeschnitten; die AP-Endonuklease 1 schneidet die DNA an der Stelle, an der sich jetzt keine Base mehr befindet, und so entsteht die Möglichkeit, in Abhängigkeit von der Transkription durch anschließende Reparaturverfahren nach einem Doppelstrangbruch Rekombinationsprozesse einzuleiten (Abb. 8.45). Schon lange kennt man aber noch einen anderen Mechanismus, der zunächst als Hypermutation bekannt geworden ist und schließlich auch auf AID zurückgeführt werden konnte. Die Mutationsrate in B-Zellen beträgt ungefähr eine Mutation pro 1 kb und Zellzyklus; sie ist damit um das 106-fache höher als die spontane Mutationsrate in anderen somatischen Zellen. Diese Reaktion wird ausgelöst, wenn ein Antikörper an der Oberfläche von B-Zellen mit einem Antigen in Kontakt kommt; die Reaktion beinhaltet im Kern die

Einführung von Punktmutationen in die variablen Regionen der Immunglobulin-Gene. Einige der mutagenisierten Antikörper werden eine höhere Affinität zu dem Antigen aufweisen, und Zellen, die diese Antikörper mit höherer Affinität besitzen, proliferieren mehr und überleben bevorzugt. Aufeinanderfolgende Zyklen von Mutation und Selektion führen dann zur Optimierung der Antikörperbindung. Der Bereich der Hypermutation ist auf einen kurzen Abschnitt von 1 bis 2 kb im Bereich des V-Exons der Immunglobulin-Gene (besonders die CDR1-Region) beschränkt und offensichtlich abhängig von der Aktivität des Promotors und damit von der Transkription. Es gibt außerdem Hinweise darauf, dass die Chromatinstruktur eine wichtige Rolle spielt, um den Bereich der Hypermutation einzugrenzen. In den für die Hypermutationen zugänglichen Bereichen arbeitet jedoch die AID auch an genomischer DNA; die entstehenden Uracil-Reste können durch verschiedene Reparaturmechanismen ersetzt werden (Abb. 8.44b); in der Summe führt es zu vielen verschiedenen Punktmutationen. Ein dritter Mechanismus (Genkonversion) zur Erhöhung der Antikörpervielfalt wird bei Hühnern und anderem Geflügel beobachtet. Dabei erzeugen AID und Uracil-Nukleosidglykosylase eine basenfreie Stelle, die geschnitten wird. Das resultierende 3’-Ende wird dadurch repariert, dass von einem benachbarten Pseudogen neue Sequenzinformation kopiert wird. Die belegte 5’→3’-Direktionalität der Genkonversion lässt vermuten, dass ein Einzelstrangbruch die Startstelle für die Genkonversion hervorbringt.

Klassenwechsel, Hypermutation und Genkonversion sind Mechanismen, die dazu beitragen, dass die Vielfalt der Antikörper noch weiter gesteigert werden kann. Alle Mechanismen lassen sich auf die Wirkung einer Aktivierungs-induzierten Deaminase (AID) zurückführen.

Die eben besprochenen Mechanismen leiten natürlich unmittelbar zu der Frage über, ob vergleichbare DNA-Rearrangements auch bei der Aktivierung anderer Gene ablaufen. Insgesamt muss jedoch festgestellt werden, dass DNA-Veränderungen in Zusammenhang mit zellulärer Differenzierung offenbar die Ausnahme sind, denn sie wurden nur bei einer kleinen Anzahl von Fällen beobachtet. Bemerkenswert ist allerdings, dass bei diesen Genomveränderungen der Ig-Gene molekulare Mechanismen eingesetzt werden, die wir bisher schon als Mechanismen kennengelernt haben, die von Bedeutung für Evolutionsprozesse sind: Mutation und Rekombination. Ganz offensichtlich machen multizelluläre Organismen zur Entwicklung ihrer hohen funktionellen Komplexität von allen verfügbaren molekularen Mechanis-

387

Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

a

AID-abhängige Mechanismen am Genort der schweren Kette P VDJ

Hypermutation P

VDJ

E

Cγ3

Sμ Cμ Cδ

Cγ1

Genkonversion

E

ψV

P

Cγ2b

Cγ2a

Cε

Cα 3‘RR

Klassenwechsel VDJ

E

P

VDJ

E

Sε

Sμ μ

3‘RR ε

δ

μ δ

388 388

ε

b

5‘ 3‘

C G

3‘ 5‘ AID

C

5‘ 3‘

3‘ 5‘

G

MMR

BER

Replikation der UG-Fehlpaarung

UNG UNG 5‘ 3‘

C G

3‘ 5‘

5‘ 3‘

A G

3‘ 5‘

5‘ 3‘

G

3‘ 5‘

fehleranfällige Reparatur 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ 3‘

A T und/oder G C und/oder T A

3‘ 5‘

5‘ 3‘

fehlerfreie Reparatur 5‘ 3‘

C G

3‘ 5‘

EXO1

fehleranfällige Reparatur durch nahe gelegene AT-Paare 5‘ 3‘

3‘ 5‘

5‘ 3‘

3‘ 5‘

5‘ 3‘

Abb. 8.44 a, b Hypermutation, Genkonversion und Klassenwechsel. a Am Beispiel des Genorts der schweren (H-)Kette werden die verschiedenen Mechanismen erläutert, die durch die Aktivierungs-induzierte Deaminase (AID) hervorgerufen werden. Die variable Region (VDJ, blaue Rechtecke) und die konstante Region (graue Rechtecke) sind zusammen mit den switch-Regionen (grüne Ovale), dem Promotor (P), dem Enhancer (E) und der 3’-regulatorischen Region (RR; jeweils schwarze Kreise) angedeutet. Die dünnen Pfeile deuten die Transkriptionsrichtung an. Somatische Hypermutation bewirkt Punktmutationen (X) in der Nähe des V-Exons. Genkonversion beinhaltet die Übertragung (Kopie) von Sequenzinformation von einem Pseudogen (ψV) in die variable Region. Klassenwechsel beinhaltet die Schlaufenbildung und Deletion von DNA zwischen zwei switch-Regionen (hier zwischen Sμ und Sε), wobei die konstante Region der schweren (H-)Kette ausgetauscht wird. b Die Aktivierungs-induzierte Cytidin-Deaminase (AID) initiiert somatische

POLη

C G

C T

und/oder C G G T und/oder C T G T

U MSH2 MSH6 G

3‘ 5‘

A T

fehlerfreie Reparatur 3‘ 5‘

5‘ 3‘

C G

A T

3‘ 5‘

3‘ 5‘ 3‘ 5‘

Hypermutation durch die Deaminierung von Cytosin. Die resultierende UG-Fehlpaarung kann auf eine der drei angegebenen Möglichkeiten aufgelöst werden: Wenn die Fehlpaarung bis zur Replikation nicht repariert wird, wird die DNA-Polymerase ein A gegenüber U und ein C gegenüber G einfügen und damit schließlich eine C–T- und G–A-Mutation (Transition) bewirken (links). Das Ausschneiden der fehlgepaarten Base durch UracilDNA-Glykosylase (UNG) kann durch den Einbau verschiedener Basen repariert werden (engl. base excision repair, BER; Mitte). Eine UG-Fehlpaarung kann auch durch einen komplexen Mechanismus repariert werden, der zu Mutationen an AT-Basenpaaren in der Nähe der ursprünglichen Fehlpaarung führen kann (engl. mismatch repair, MMR; rechts). EXO1: Exonuklease 1; MSH: Homologon zum E. coli-Protein MutS; POLη: DNA-Polymerase η. (a nach Papavasiliou u. Schatz 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier; b nach Odegard u. Schatz 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

8.4 Das Immunsystem

men oft mehrfachen, unterschiedlichen Gebrauch, um die Vielfalt ihrer Funktionen auszuweiten. Wenn allerdings das Immunsystem einen Fehler macht und sich gegen körpereigene Stoffe richtet, spricht man von

Autoimmunkrankheiten. Dazu gehören die Multiple Sklerose, der Jugenddiabetes, die Graves-Krankheit (Basedow’sche Krankheit), die rheumatoide Arthritis oder der systemische Lupus erythematosus.

Abb. 8.45 Beim Klassenwechsel führen die wiederholten SSequenzen zu R-Schlaufen. Die Aktivierungs-induzierte Cytidin-Deaminase (AID) bewirkt eine Vielzahl von Schädigungen der DNA, was letztendlich dazu führt, dass nach Transkription und der Einführung eines Doppelstrangbruchs ein Rekombi-

nationsmechanismus zum Klassenwechsel führt. Blaue Ovale: phosphoryliertes Histon H2B (an Ser-14); grüne Ovale: phosphoryliertes Histon H2AX; Pol II: RNA-Polymerase II. (Nach Odegard u. Schatz 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

389

390 390

Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Kernaussagen ï Mobile genetische Elemente (Transposons) sind wichtige Bestandteile vieler prokaryotischer und aller eukaryotischer Organismen. ï Transposons unterscheiden sich in ihrer molekularen Struktur und in den Transpositionsmechanismen. ï Transposons sind für evolutionäre Prozesse von Bedeutung. ï Retroviren sind infektiöse Partikel, die in ihrer Genomstruktur einer Gruppe von Transposons gleichen. ï Das Genom von Retroviren kann in das Genom der Wirtszelle integriert werden. ï Integration und Exzision von Retroviren können zur Entstehung von Tumor-induzierenden Retroviren führen. Die cancerogene Wirkung beruht auf der Integration zellulärer Gene oder Teilen davon in das Virusgenom (Onkogene).

ï Ciliaten zeichnen sich durch einen Kerndualismus aus: ein Mikronukleus im Dienst generativer Prozesse und ein Makronukleus für die vegetativen Funktionen. Bei der Bildung des Makronukleus wird der größte Teil der Genom-DNA eliminiert. ï Bei der zellulären Differenzierung kann gezielte Vermehrung bestimmter Gene erfolgen. ï Im Laufe der Differenzierung kann es zur Elimination von Teilen des in Keimzellen vorhandenen Genoms kommen. ï Zelluläre Differenzierung kann mit der Reorganisation von DNA zum Zweck der Bildung funktioneller Gene verbunden sein. Die höchste bekannte Komplexität solcher DNA-Veränderungen findet sich im Zusammenhang mit der Funktion des Säugerimmunsystems.

Technik-Box 17

Verwendung von Balancer-Chromosomen Anwendung: Stabilisierung von Mutationen in heterozygoten Stämmen zur Vermeidung des Verlustes der Mutation durch Crossing-over. Voraussetzungen · Materialien: Die Methode beruht auf der Möglichkeit, durch heterozygote Inversionen die Entstehung von Nachkommen mit Rekombination im Inversionsbereich zu unterdrücken (S. 251). Eine wichtige Voraussetzung für die Anwendung dieser Methodik ist weiterhin die Verfügbarkeit von dominanten und rezessiv letalen Mutationen im Inversionschromosom. Methode: Mutationen, die man als experimentell nützlich identifiziert hat, lassen sich bei Drosophila (und anderen diploiden Organismen) am einfachsten in homozygoter Konstitution in einer Stammkollektion halten. In vielen Fällen ist das jedoch nicht möglich, da ein homozygoter Zustand letal, semiletal oder steril ist. Eine he-

terozygote Konstitution würde ständige Selektion zur Vermeidung eines Verlustes dieser Mutation erforderlich machen. Diese Selektion würde bei rezessiven Mutationen sehr erschwert, da diese durch Crossing-over leicht verloren gehen können, selbst wenn das ursprünglich mutierte Chromosom mit genetischen Markern versehen ist. Aus diesen Gründen sind für Drosophila eine Reihe sogenannter Balancer-Chromosomen entwickelt worden, die es gestatten, für jede gewünschte Mutation einen stabilen Stamm aufzubauen. Dieser enthält die jeweilige Mutation in heterozygotem Zustand, und die ständige Selektion erübrigt sich, ohne dass die Gefahr des Verlustes besteht. Das Prinzip der Wirkung und Konstruktion eines Balancer-Chromosoms ist sehr leicht zu verstehen. Im Wesentlichen enthält ein solches Chromosom drei Elemente: • eine längere einfache oder komplexe Inversion, die den größten Teil des Chromosoms abdeckt;

• einen dominanten Marker, der es gestattet, dieses Chromosom leicht zu identifizieren; • einen rezessiven Letalfaktor, der verhindert, dass das Chromosom in einer homozygoten Konstitution vorkommt. Hauptelement ist die Inversion, die durch die entstehenden Chromosomenaberrationen verhindert, dass Nachkommen mit Crossing-over überlebensfähig sind. Der Letalfaktor ist wichtig, da sich durch seine Anwesenheit eine Selektion in jeder Generation erübrigt, denn es kann keine Homozygotie für das Balancer-Chromosom entstehen. Homozygotie des Balancer-Chromosoms ist oft auch schon durch den dominanten Marker nicht möglich, da viele dominante Mutationen homozygot letal sind. Beispiele für häufig gebrauchte Markerchromosomen von Drosophila sind: ClB, Muller 5 und TM3.

Technik-Box

Technik-Box 18

P-Element-Mutagenese Anwendung: Induktion von Mutationen mit gleichzeitiger molekularer Markierung des mutierten Gens. Reversion von Mutationen durch Exzision und gerichtete Mutagenese (engl. targeted mutagenesis). Voraussetzungen · Materialien: Die Methode beruht in Drosophila auf der Möglichkeit, P-Elemente zum Transponieren zu induzieren (Tabelle 8.3; Abb. 8.5) und solche Transpositionsereignisse durch genetische Markierung des P-Elementes sichtbar zu machen (vgl. auch Enhancer-Trap-Elemente, Technik-Box 19). Methode: Voraussetzung für einen erfolgreichen Einsatz dieser Technik ist die Konstruktion zweier unterschiedlicher Drosophila-Stämme, die jeweils nur ein P-Element im Genom enthalten. Der eine Stamm besitzt ein P-Element, dessen Transposase funktionsunfähig ist und durch ein geeignetes Markergen (z. B. white oder rosy) ersetzt ist. In den heute verwendeten Stämmen

ist dieses P-Element auf dem X-Chromosom lokalisiert. Es kann infolge der defekten Transposase nicht transponieren. Der zweite Stamm enthält auf einem beliebigen anderen Chromosom ein anderes defektes P-Element. In diesem ist die Transposase funktionsfähig, jedoch verhindern defekte terminale Repeats die Exzision und unterbinden daher Transpositionen. Kombiniert man jedoch durch Kreuzung beide partiell defekten P-Elemente (vergleichbar den HybriddysgeneseExperimenten; Abb. 8.6), so wird das Transposase-defiziente P-Element in die Lage versetzt zu transponieren, da das zweite P-Element eine funktionelle Transposase zur Verfügung stellt. Dieses P-Element mit funktioneller Transposase wird daher auch Jumpstarter-Element (Js) genannt und das entsprechende Chromosom Jumpstarter-Chromosom. Transpositionen sind in den folgenden Generationen dadurch sichtbar, dass der genetische Marker des Transposase-defekten P-Elementes nicht mehr geschlechts-

gekoppelt (X-chromosomal) vorliegt. Die neue Lokalisation des transponierten P-Elementes lässt sich am einfachsten durch in-situ-Hybridisierung auf Riesenchromosomen mit den terminalen Regionen des P-Elementes oder einer Probe des Markergens ermitteln. Durch die Art der Kreuzung wird das Jump-starter-Chromosom aus dem Genom enternt, das eine Transposition des Transposase-defekten Elementes enthält. Dadurch ist das transponierte P-Element in seiner neuen Position stabilisiert, denn es kann wegen seiner defekten Transposase nicht autonom transponieren. Andererseits besteht die Möglichkeit, durch Einkreuzen eines Jump-starter-Chromosoms das transponierte P-Element aus seiner neuen Position erneut transponieren zu lassen und dadurch eine komplette Exzision, also eine genetische Reversion des betroffenen Gens zu erzeugen. Die genetische Feinstruktur von Revertanten kann für die Funktionsanalyse eines Gens von großer Bedeutung sein.

P-Element-Mutagenese. Zur Mutagenese geht man von zwei Stämmen aus, von denen einer ein modifiziertes P-Element besitzt (meist im X-Chromosom), das selbst keine Transposase mehr codiert, aber ein Markergen zu seiner Erkennung besitzt. Der andere Stamm besitzt ein P-Element, das Transposase produziert, aber selbst nicht springen kann, da es an den Enden defekt ist. Durch die Kombination beider Elemente im Genom wird das Xchromosomale P-Element aktiviert und springt in eine andere Genomposition. Durch das Markergen lässt sich die Transposition erkennen und das mutierte Chromosom ermitteln. Die besondere Konstruktion des transponierten P-Elementes gestattet die direkte Isolierung des mutierten Genombereichs durch das im P-Element befindliche Plasmid.

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Kapitel 8: Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität

Technik-Box 19

Enhancer-Trap-Experimente Anwendung: Induktion von Mutationen mit gleichzeitiger molekularer Markierung des mutierten Gens zur Isolierung des mutierten Gens durch molekulare Klonierung. Darstellung gewebespezifischer Expression des mutierten Gens im Organismus durch β-Galactosidase-Expression. Methode: In Enhancer-Trap-Experimenten macht man, in vergleichbarer Weise wie in der P-Mutagenese (Technik-Box 18), Gebrauch von der Möglichkeit, Transpositionen von PElementen gerichtet zu induzieren. Das transponierende P-Element hat in dieser Versuchsanordnung jedoch eine komplexere Struktur. Seine wichtigste Komponente ist das lacZ-Gen von Escherichia coli (Abb. 4.26), das unmittelbar auf den 5´-terminalen invertierten Repeat (Abb. 8.5) des P-Elementes folgt. Normalerweise erfolgt daher eine schwache Expression des lacZ-Gens durch die Promotoraktivität des linken invertierten Repeats des P-Ele-

mentes. Befindet sich das P-Element nach einer Transposition innerhalb der Regulationsregion eines Gens, z. B. hinter einem Enhancerelement (Kapitel 7.3.3), so wird die Expression des lacZ-Gens gesteigert. Untersucht man dann die jeweiligen Gewebe durch geeignete Farbreaktionen des Enzyms auf β-Galactosidase-Aktivität, so ist diese in allen Fällen zu erwarten, in denen die Regulationsregion (bzw. das Enhancerelement) zu einem Gen gehört, das in dem betreffenden Gewebe aktiv ist. Die Methode ermöglicht es daher, solche Gene aufzuspüren, die in bestimmten Zellen oder Entwicklungsstadien aktiv sind. Durch die Zufügung weiterer genetischer Elemente zum transponierenden PElement wird die Untersuchung solcher Gene stark vereinfacht. Innerhalb des P-Elementes kann sich nämlich ein Klonierungsvektor befinden, der es gestattet, Genom-DNA-Bereiche in der Nachbarschaft des interessierenden Gens direkt zu isolieren. Hierzu genügt

es, DNA einer einzigen Fliege zu isolieren und sie mit bestimmten Restriktionsenzymen zu schneiden. Die gewonnene Mischung von DNA-Fragmenten wird mit DNA-Ligase inkubiert und dient anschließend zur Transformation eines geeigneten Bakterienstamms. Der im P-Element enthaltene Vektor kann sich unter diesen Bedingungen unter Einschluss eines Stückes flankierender DNA zirkularisieren und die bakterielle Gastzelle transformieren. Besitzt der Vektor ein Gen für eine Antibiotikumresistenz, so kann die Kultivierung der Bakterien selektiv unter Zusatz dieses Antibiotikums erfolgen, sodass nur mit dem Vektor transformierte Bakterien wachsen. Die Transformanten, die unter selektiven Bedingungen isoliert werden, enthalten die gesuchten Genombereiche. Hat man auf diese Weise ein Stück flankierender DNA eines Gens kloniert, ist es mit konventionellen Klonierungsmethoden leicht, das betreffende Gen vollständig zu isolieren. Enhancer-Trap-Experimente. Links: Schematische Darstellung der experimentellen Anordnung. Fotos rechts: Expressionsmuster nach einem Enhancer-Trap-Experiment. Im vorliegenden Fall ist das betroffene Gen in unterschiedlichen Geweben aktiv. Das Gen liegt im rechten Arm des Chromosoms 3 von Drosophila melanogaster. Oben: Die sieben gefärbten Streifen entsprechen den geradzahligen Parasegmenten 2 bis 14 des Stadiums 10 der Embryonalentwicklung. Mitte: Färbungsmuster einzelner Zellen in einem larvalen Gehirn. Unten: Färbung von Zellen in der Augen-AntennenImaginalscheibe im Bereich der zukünftigen Ommatidien. (Foto: W. Janning, Münster)

rosy

Kapitel 9

Veränderungen im Genom: Mutationen Inhaltsverzeichnis 9.1 Klassifi kation von Mutationen . . . . . . . . . . . . . . . . 394 9.2 Chromosomenmutationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 397 9.3 Spontane Mutationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 408 9.4 Induzierte Mutationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414 9.5 Mutagenität und Mutationsraten . . . . . . . . . . . . . . 426 9.6 Reparaturmechanismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 434 9.7 Ortsspezifische Mutationen . . . . . . . . . . . . . . . . . 441

An Malaria erkranktes Mädchen an der thailändischen Grenze. Mutationen können Resistenz verleihen. (Foto: P. Charlesworth, JB Pictures, New York)

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Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Überblick Ausgangspunkt aller Erkenntnisse über die Regeln und die molekularen Mechanismen der Vererbung sowie über die Umsetzung von erblicher Information in Stoffwechselfunktionen ist die Variabilität von Merkmalen. Diese Variabilität erst gestattet es uns, bestimmte biologische Eigenschaften und Prozesse auf ihre Ursachen hin zu untersuchen. Biologische Variabilität dient aber nicht nur als eine Grundlage für die experimentelle Erforschung von Erbvorgängen. Sie bietet vielmehr die Voraussetzungen für die Evolution der Organismen. Sie ist somit ein grundlegender und unverzichtbarer Bestandteil der Natur. Es ist daher nicht verwunderlich, dass Mechanismen, die Veränderungen des genetischen Materials verursachen, also Variabilität erzeugen, zu den fundamentalen Genomfunktionen von Organismen gehören. So werden während der Replikation des genetischen Materials mit einer bestimmten Häufigkeit Fehler induziert. Außerdem kann es zu spontanen Basenveränderungen durch die chemische Instabilität einiger Nu-

9.1 Klassifikation von Mutationen Die Veränderung von Genen im Laufe der Evolution ist eine entscheidende Voraussetzung für die Entstehung und Evolution von Organismen. Schon bei der Betrachtung der phänotypischen Variabilität zwischen Organismen im 1. Kapitel hatten wir festgestellt, dass eine der Ursachen für phänotypische Unterschiede zwischen den Individuen einer Population die genetische Variabilität, also die Existenz unterschiedlicher Allele ist. Ohne diese genetische Variabilität wäre es unmöglich gewesen, die Existenz einzelner Gene und die Regeln der Vererbung von Merkmalen zu erkennen. In diesem Kapitel wollen wir uns mit den molekularen Ursachen der Veränderungen von Genen und mit deren Folgen näher befassen. Die Veränderung eines Gens bezeichnen wir als eine Mutation. Diese Bezeichnung wurde von Hugo de Vries 1901 eingeführt. Der Träger einer Mutation ist eine Mutante. Hat man zwei phänotypisch verschiedene Ausprägungen eines Gens vor Augen, so ist es nicht immer möglich, festzustellen, bei welcher dieser Formen eine Mutation vorliegt und welche als „normal“ anzusehen ist. In der Genetik sprechen wir vom Wildtyp als derjenigen Form, die in der freien Natur überwiegend vorkommt. Ähnliches gilt dann unter Laborbedingungen für definierte Stämme von Bakterien, Hefen, Pflanzen, Fliegen, Fischen oder Mäusen. Welche Möglichkeiten der Unterscheidung gibt es bzw. ist eine Unterscheidung überhaupt erforderlich? Eines der ersten Beispiele einer Mutation war die Augenfarbe der Fruchtfliege Drosophila: Sie kann beispielsweise rot oder weiß sein. Das gelegentliche Auftreten weißäugiger Fliegen in einem

kleotide kommen, oder es treten Fehler in Zusammenhang mit Rekombinationsvorgängen auf. Neben solchen und anderen endogenen Mutationsmechanismen können Veränderungen aber auch von außen her induziert werden, so insbesondere durch natürliche oder technisch hergestellte energiereiche Strahlung sowie durch chemische Stoffe. Da Genomveränderungen sehr oft eine schädliche Auswirkung haben, besitzen alle Zellen besondere Reparaturmechanismen, die einen erheblichen Teil neu entstandener Mutationen eliminieren können. Offenbar hat sich zwischen der Effektivität solcher Reparaturmechanismen und der Häufigkeit spontaner Mutationen ein Gleichgewicht eingestellt, das sich vom Gesichtspunkt der Evolution her als günstig erwiesen hat, um einerseits zu häufige Schäden im Genom zu vermeiden, andererseits aber Veränderungen mit einer ausreichenden Häufigkeit auszulösen, sodass Evolutionsprozesse und eine Anpassung an eine sich ständig verändernde Umwelt überhaupt erst ermöglicht werden.

sonst rotäugigen Stamm hatte in diesem Fall die rote Augenfarbe als den Wildtyp ausgewiesen (auch durch das Zeichen „+“ gekennzeichnet) und die weiße Augenfarbe als Mutation. Für diese Anwendung des Wildtypbegriffs auf rotäugige Fliegen lässt sich das Argument anführen, dass in rotäugigen Populationen gelegentlich weißäugige Fliege auftreten, jedoch in weißäugigen Stämmen viel seltener rotäugige Fliegen. Das ist verständlich, wenn man annimmt, dass Veränderungen in der Richtung des Ausfalls einer Genfunktion, die eine rote Augenfarbe bedingt, häufiger ablaufen als in der umgekehrten Richtung, d. h. die Wiederherstellung eines funktionellen Zustands eines defekten Gens. Wir wissen heute, dass die Ursache für die weiße Augenfarbe bei Drosophila tatsächlich im Ausfall der Funktion eines Gens liegt (das Gen wurde aufgrund der phänotypischen Veränderung in der Mutante als „white“ bezeichnet). Ein experimenteller Test hierfür lässt sich dadurch erbringen, indem man das whiteGen durch eine Deletion im Chromosom entfernt. Auf diese Weise lässt sich der Phänotyp einer Nullmutation ermitteln, d. h. der Ausfall einer Genfunktion (engl. loss of function). Wir wissen heute, dass das Protein eine ATPase-Aktivität besitzt, die an den AnionenTransport über Membranen gekoppelt ist; außerdem ist das Protein an der Biosynthese des Auges der Fliege beteiligt ‒ so erklärt sich der Verlust der roten Augenfarbe bei einem Ausfall seiner Funktion. Natürlich gibt es auch Mutationen, bei denen unmittelbar ersichtlich ist, welches Allel den Wildtyp darstellt und welches eine Mutation enthalten muss. Man denke beispielsweise an Erbkrankheiten des Menschen, wie sie im Kapitel 12 beschrieben werden. Auch die Ausbil-

9.1 Klassifikation von Mutationen

dung eines Beines anstelle einer Antenne am Kopf von Drosophila, wie es bei der Mutante Antennapedia der Fall ist (Abb. 11.28), kann unmittelbar als Folge einer Mutation, also der Entstehung eines Allels mit einer neuen Funktion, verstanden werden. In diesem Fall haben wir es mit einer neomorphen Mutation zu tun, d. h. es entsteht ein neuer Phänotyp (engl. gain of function). Wir wollen uns zunächst den Fragen zuwenden, in welchen Zelltypen Mutationen überhaupt auftreten können und welche Konsequenzen sie für Zelle und Organismus haben. Betrachten wir die unterschiedlichen Formen der Ausprägung eines Merkmals in einer Population und deren Verteilung zwischen den Individuen dieser Population genauer, so erkennen wir, dass diese Veränderungen von Genen in Keimzellen entstanden sein müssen, da sie sonst nicht erblich sein können. Dass Mutationen jedoch nicht ausschließlich in Keimzellen entstehen, haben wir bereits bei der Besprechung der Entstehung somatischer Mosaike gesehen (Abb. 6.37). Wir sprechen hier von einer somatischen Mutation, da es sich um eine Veränderung in der genetischen Konstitution somatischer Zellen handelt. Diese ist natürlich in aufeinanderfolgenden Generationen von Organismen nicht erblich. Wir können aus diesen Betrachtungen den allgemeinen Inhalt des Begriffs Mutation ableiten: Jede Veränderung der genetischen Konstitution einer Zelle, die nicht durch die normalen Fortpflanzungsmechanismen, also durch die Verschmelzung zweier haploider Gameten, hervorgerufen wird, ist eine Mutation. Der Begriff der Mutation beschränkt sich somit nicht auf Veränderungen einzelner Gene, wie wir sie am white-Locus gesehen haben, sondern beinhaltet auch Genomveränderungen größeren Ausmaßes, etwa den Verlust eines Chromosoms.

Jede Veränderung der genetischen Konstitution einer Zelle, die nicht mit sexueller Fortpflanzung in Zusammenhang steht, ist eine Mutation. Mutationen können in Keimzellen und in somatischen Zellen in gleicher Weise auftreten.

Die biologischen Folgen von Mutationen sind unterschiedlich, je nachdem, ob sie sich in der Keimbahn oder in somatischen Zellen ereignen. Zur sichtbaren Ausprägung kommt eine Neumutation in somatischen Zellen natürlich nur, wenn sie nicht zum Tod der betreffenden Zelle führt und wenn sie darüber hinaus phänotypisch überhaupt zu einer Ausprägung kommen kann, indem sie entweder dominant oder geschlechtsgekoppelt ist (eine rezessive Mutation kann sich phänotypisch nur dann ausprägen, wenn sie zwei-

mal in einer Zelle vorkommt ‒ ein sehr seltener Fall; siehe dazu aber auch die Diskussion um Tumorsuppressorgene, Kapitel 12.4.1). Das phänotypische Ausprägungsmuster somatischer Mutationen im Organismus können wir mit dem der Inaktivierung eines Säuger-X-Chromosoms (Abb. 6.37) vergleichen: Erfolgt eine somatische Mutation in einem frühen Entwicklungsstadium des Organismus, so erwarten wir, dass sie im adulten Organismus in einer größeren Anzahl von Zellen wiederzufinden ist, als wenn sie erst in einem späteren Stadium der Ontogenese eingetreten ist. Für Keimbahnmutationen gilt selbstverständlich das Gleiche. Tritt eine Mutation in einem frühen Stadium der Keimzellentwicklung auf, also etwa in frühen Oogonien, in Spermatogonien oder sogar in Stammzellen, so wird eine größere Anzahl von Gameten diese Mutation besitzen, als wenn sich die Mutation erst postmeiotisch ereignet. In diesem Falle bleibt sie auf einen einzelnen Gameten beschränkt. In Kreuzungsexperimenten kommen frühe Mutationen in der Keimbahn im Auftreten mehrerer Nachkommenindividuen mit der gleichen Mutation zum Ausdruck.

Die Anzahl veränderter somatischer Zellen oder Keimzellen lässt Rückschlüsse auf den Zeitpunkt während der Entwicklung zu, zu dem diese Mutation erfolgt ist.

Bevor wir nun die Einzelheiten der Mechanismen und Folgen von Mutationen erörtern, muss noch ein weiterer wichtiger allgemeiner Gesichtspunkt hervorgehoben werden: Da Mutationen für die Evolution von Organismen als Grundlage für die Neuentstehung erblicher Eigenschaften und als Basis für Selektionsprozesse und anderer Evolutionsmechanismen unabdingbar sind, müssen wir sie zu den grundlegenden Eigenschaften lebender Organismen zählen. Das schließt aber nicht aus, dass Mutationen für einzelne Individuen sehr oft mit Nachteilen verbunden sind, da sie zufallsgemäß erfolgen und dadurch viel häufiger zur Zerstörung der Funktion genetischer Eigenschaften führen als zu nutzbringenden Veränderungen. Biologische Prozesse können also hinsichtlich ihres Nutzens von unterschiedlichen Gesichtspunkten aus bewertet werden, je nachdem, ob wir ein einzelnes Individuum oder eine ganze Population von Organismen betrachten.

Mutationen sind ein Grundphänomen lebender Systeme. Auf der Ebene des Einzelindividuums haben sie oft negative Folgen. Für die Evolution von Organismen sind sie unentbehrlich.

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Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Eine Klassifikation von Mutationen ist nach verschiedenen Gesichtspunkten möglich. Oft wird eine Unterscheidung zwischen spontanen und induzierten Mutationen getroffen. Andere unterscheiden verschiedene Haupt- und Unterklassen von Mutationen, etwa Chromosomenmutationen verschiedenen Charakters oder mehrere Klassen von Genmutationen. Häufig geschieht dies unter Gesichtspunkten der praktischen Anwendung; es verdeckt aber die Tatsache, dass die Grenzen fließend sind und vergleichbare Mutationsereignisse auf mehreren Ebenen auftreten können. So kann beispielsweise eine Deletion sowohl in einem Chromosom auftreten und eine größere Gruppe von Genen einschließen, als auch innerhalb eines einzelnen Gens, wo sie nur einen Teilbereich der Nukleotidsequenz umfasst. Ein grundlegender Unterschied zwischen beiden Mutationstypen besteht nicht: In beiden Fällen ist ein (längeres oder kürzeres) Stück chromosomaler DNA verloren gegangen. Allerdings sind Chromosomenmutationen (Kapitel 9.2) oft schon im Lichtmikroskop erkennbar, wohingegen Punktmutationen sich auf einzelne oder wenige, nebeneinanderliegende Nukleotide beziehen und molekulargenetisch festgestellt werden müssen. Chromosomenmutationen sind also Änderungen in der Zahl oder Struktur der Chromosomen. Bei strukturellen Änderungen sind größere Abschnitte des Chromatins betroffen. Prinzipiell wird auf dieser Ebene zwischen folgenden Veränderungen unterschieden: Deletion (Verlust eines Chromosomenfragments), Insertion (Einschub eines Chromosomenfragments), Inversion (Umkehrung eines Chromosomenfragments) und Translokation (Verlagerung eines Chromosomenfragments). Diese Mutationen können häufig durch verschiedene Bänderungsverfahren (Kapitel 6) sichtbar gemacht werden. Veränderungen der Chromosomenzahl werden auch als Genommutationen bezeichnet und betreffen entweder den gesamten Chromosomensatz oder ein einzelnes Chromosom. Bei der Reduzierung des normalen, diploiden Chromosomensatzes auf einen einfachen Chromosomensatz sprechen wir von Haploidisierung, während eine Vermehrung des Chromosomensatzes als Polyploidisierung bezeichnet wird (z. B. dreifacher Chromosomensatz: triploid). Auch das Fehlen oder zusätzliche Auftreten einzelner Chromosomen wird zu den Genommutationen gerechnet. Solch eine Veränderung wird als Aneuploidie bezeichnet und das betroffene Chromosom entsprechend benannt (z. B. Trisomie 21: das Chromosom 21 des Menschen ist dreifach vorhanden). Wenn nur ein Nukleotid oder wenige, aufeinanderfolgende Nukleotide verändert sind, sprechen wir von Punktmutationen. Auch hier können wir verschiedene Typen unterscheiden, besonders häufig sind Substitutionen, Deletionen oder Insertionen. Wird bei

einer Substitution eine Pyrimidinbase durch eine andere Pyrimidinbase bzw. eine Purinbase durch eine andere Purinbase ersetzt (AT↔GC oder GC↔AT), spricht man von einer Transition. Erfolgt statt des Einbaus einer Purinbase ein Pyrimidineinbau (oder umgekehrt), wird diese Art der Mutation auch als Transversion bezeichnet (AT↔TA, AT↔CG, GC↔CG oder GC↔TA; Abb. 9.1). Die Auswirkungen von Punktmutationen können sehr verschieden sein: Wenn die Mutationen im codierenden Bereich der Exons auftreten, finden wir häufig Veränderungen im Einbau von Aminosäuren (engl. missense mutation). Da aber eine Aminosäure oft durch mehrere Tripletts codiert werden kann, die sich nur in der 3. Base unterscheiden (Kapitel 3.2), ist dies nicht immer der Fall; hat also eine Mutation keinen Einfluss auf die eingebaute Aminosäure, sprechen wir von einer stillen Mutation. Bei vielen Erbkrankheiten finden wir aber eine sehr wichtige Änderung: Es wird nämlich ein Stoppcodon erzeugt (TAG, TAA, TGA; engl. nonsense mutation), sodass die Synthese des Proteins an der betroffenen Stelle abbricht. Das umgekehrte Phänomen, dass ein vorhandenes Stoppcodon in ein Aminosäure-codierendes Codon umgewandelt und damit die Proteinkette verlängert wird, ist dagegen seltener. Auch die Veränderung des Startcodons ATG ist selten; in diesem Fall

Abb. 9.1 Bei Basensubstitutionen können Purine durch Purine bzw. Pyrimidine durch Pyrimidine ersetzt werden (rote Pfeile); hier sprechen wir von einer Transition. Wenn dagegen ein Purin durch ein Pyrimidin ausgetauscht wird (blaue Pfeile), sprechen wir von einer Transversion

9.2 Chromosomenmutationen

muss dann ein anderes ATG unterhalb verwendet werden, was entweder zu einem verkürzten Protein führt (wenn das neue ATG im selben Leserahmen bleibt) oder zu einem ganz anderen Protein (wenn das zweite ATG in einem anderen Leserahmen liegt). Punktmutationen können außerdem das Spleißen betreffen (wenn sie in den entsprechenden konservierten Bereichen auftreten; Kapitel 3.3.5) oder die Regulation der Genexpression beeinflussen (wenn sie im Promotor auftreten; Kapitel 4.5 und 7.3). Durch Deletionen oder Insertionen innerhalb Protein-codierender Regionen kann sich der Leserahmen verändern; solche Rasterschub-Mutationen (engl. frame shift mutation) können zu einem völlig andersartigen Protein führen, auch wenn die mRNA selbst nur eine geringfügige Veränderung aufweist (z. B. Deletion von 1 oder 2 bp). Eine Übersicht über diese verschiedenen Formen von Punktmutationen gibt Tabelle 9.1. Mutationen können nicht nur Protein-codierende Gene betreffen, sondern auch rRNA- und tRNA-Gene, sodass deren Funktion auf verschiedene Weise beeinträchtigt werden kann. Natürlich sind darüber hinaus Mutationen nicht auf codierende Regionen des Genoms beschränkt. Vielmehr dürften die meisten Mutationen in Introns, in Spacerregionen oder in repetitiver DNA ohne phänotypisch sichtbare Folgen bleiben (siehe

dazu auch Kapitel 9.3.3 über dynamische Mutationen sowie Kapitel 11.8 über Epigenetik).

Mutationen, Veränderungen der DNA, können spontan auftreten und durch Strahlung oder Chemikalien induziert werden. Mutationen können nach ihrer Größe oder der Art ihrer DNA- bzw. Chromosomenveränderungen unterschiedlich klassifiziert werden.

9.2 Chromosomenmutationen Chromosomenmutationen spielen sowohl in der Natur als auch in der experimentellen Genetik eine wichtige Rolle, da sie im Gegensatz zu den meisten Genmutationen Auswirkungen auf die Verteilungsmechanismen der Chromosomen in Meiose und Mitose ausüben können oder auch bestimmte Allelkombinationen im Genom stabilisieren können. Grundsätzlich lassen sich zwei Typen von Veränderungen auf dem Genomniveau unterscheiden: ï numerische Chromosomenaberrationen und ï strukturelle Chromosomenaberrationen. Beide Typen von Chromosomenveränderungen lassen sich, je nach der speziellen Art der Veränderung, noch weiter untergliedern.

Tabelle 9.1 Auswirkungen von Mutationen Klassifikation Wildtyp

9.2.1 Numerische Chromosomenaberrationen

Leseraster CTG

GGG TAC

AGA A

Leu

Gly

Arg

Missense-Mutation (Aminosäureaustausch)

CCG

GGG TAC

AGA A

Pro

Gly

Arg

Stille Mutation

CTC

GGG TAC

AGA A

Leu

Gly

Arg

CTG

GGG TAA

Leu

Gly

CTG

GGG GTA

CAG

Leu

Gly

Gln

Nonsense-Mutation (Stoppcodon) Insertion

Tyr

Tyr

Tyr

AGA A

Stopp

Val

AA

G Deletion

CTG

GGT

ACA

GAA

Leu

Gly

Thr

Glu

Oben: codierender Strang der DNA, unten: abgeleitete Aminosäuresequenz; rot: Mutation mit Auswirkung auf die Aminosäuresequenz; grün: stille Mutation.

Unter diese Kategorie von Chromosomenmutationen fallen alle Veränderungen der Anzahl von Chromosomen im Genom. Diese können verursacht sein durch ï Verschmelzungen (Fusionen) von zwei Chromosomen, ï Spaltung (Fissionen) einzelner Chromosomen in zwei Chromosomen oder ï Vervielfachung der Chromosomenzahl (Ploidisierung).

Fusionen von Chromosomen Fusionen von Chromosomen führen nicht notwendigerweise zu phänotypischen Veränderungen, da eine Verschmelzung von zwei Chromosomen nicht mit dem Verlust oder mit Veränderungen von Genen verbunden sein muss. Für die Vererbung von Merkmalen an Nachkommen haben Fusionen jedoch insofern Konsequenzen, als neue Kopplungsbeziehungen zwischen Genen entstehen können. Noch tiefer greifende Folgen haben Verschmelzungen eines Autosoms mit einem Geschlechtschromosom. Es kann in der Folge zur phänotypischen Expression rezessiver Allele des autosomalen Anteils des Fusionschromosoms kommen, die

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Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Bei beiden Prozessen, sowohl der Verschmelzung als auch der Spaltung von Chromosomen, müssen strukturelle oder zumindest funktionelle Veränderungen der Chromosomen in den Centromerbereichen ein-

treten. Die Spaltung eines metazentrischen Chromosoms erfordert nicht nur die Entstehung zweier vollständiger Centromere, wenn man davon ausgeht, dass das vorhandene Centromer halbiert wird, sondern es müssen auch zwei Telomere gebildet werden, die die Bruchstelle verschließen. Die Art der Entstehung neuer Telomere war in der klassischen Cytologie ein kontroverser Diskussionspunkt. Heute ist sie für uns aufgrund der Kenntnisse der molekularen Eigenschaften von Telomeren leichter verständlich (Kapitel 6.1.4). Die Neuentstehung einer Centromerregion in einer Region, die vorher keine Centromerfunktion hatte, ist zwar selten, aber in der klassischen Cytologie ist die Existenz solcher inaktiver Centromerregionen, die unter bestimmten Umständen aktiviert werden können, schon lange bekannt. Beispiele hierfür sind die polyzentrischen oder holokinetischen Chromosomen, wie sie bei Parascaris und anderen Nematoden, aber auch bei Insekten und Pflanzen beobachtet werden. In diesen Chromosomen existieren mehrere DNA-Bereiche mit fakultativer Centromeraktivität. Die Bildung von neuen Centromeren stellt auch eine Möglichkeit dar, um nach Translokationen dem neuen Chromosom mitotische Stabilität zu verleihen. Auch in der Humangenetik kennen wir solche Fälle. In einem Übersichtsaufsatz beschreibt Warburton (2004) 70 Fälle von Centromer-Neubildungen, die an 19 verschiedenen Chromosomen beobachtet werden. Einige Beispiele sind in Abb. 9.2 dargestellt. Offensichtlich handelt es sich dabei nicht um zufällige Prozesse im menschlichen Genom, denn die Regionen 3q, 13q und 15q sind dabei besonders häufig betroffen. Aller-

Abb. 9.2 Chromosomale Rearrangements bei der Neubildung von Centromeren. Perizentrische Deletionen beinhalten das Ausschneiden eines zentrischen Fragments (üblicherweise ein Ringchromosom), das ein endogenes Centromer enthält, und die Fusion der zwei azentrischen Arme. Durch Neubildung eines Centromers können diese Chromosomen die Mitose erfolgreich durchlaufen. Parazentrische Deletionen beinhalten das Ausschneiden

eines azentrischen Fragments, das durch Neubildung eines Centromers die Mitose erfolgreich durchlaufen kann, sowie die Fusion des zentrischen mit einem azentrischen Fragment. „Invdups“ beinhalten die Inversion und Duplikation eines distalen Abschnitts des Chromosoms; manchmal wird dieser Prozess von komplementären terminalen Deletionen begleitet. (Nach Warburton 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

zuvor nur gelegentlich in seltenen homozygoten Konstitutionen sichtbar wurden. Außerdem haben solche Chromosomenaberrationen notwendigerweise Konsequenzen für die Genregulation, da die autosomalen Gene nunmehr einem Dosiskompensationsmechanismus unterstellt werden müssen. Chromosomenverschmelzungen, die man im Prinzip auch als Translokationen ansehen kann (S. 407), haben in der Entwicklung der Säugergenome eine wichtige Rolle gespielt. Hier ist es häufig zur Verschmelzung akrozentrischer zu metazentrischen Chromosomen gekommen, einem Vorgang, der auch als Robertson-Translokation (engl. Robertsonian translocation) oder zentrische Fusion beschrieben wird. Offenbar sind mit der Verschmelzung oder dem Auseinanderfallen von Chromosomen kleine genetische Effekte verbunden, die im Einzelnen nur schwer nachweisbar sind, aber Vor- und Nachteile für Selektionsprozesse mit sich bringen.

Chromosomenverschmelzungen

und -spaltungen sind zwar nicht notwendigerweise mit einer Änderung der Genzusammensetzung verbunden, haben aber kleinere, schwer nachweisbare Veränderungen in der Genexpression zur Folge, die für selektive Mechanismen bedeutsam sein können.

Spaltung von Chromosomen

9.2 Chromosomenmutationen

dings zeigt der Vergleich der entsprechenden DNASequenzen, dass es keine typische „NeocentromerSequenz“ gibt. Vielmehr liegt der neuen Bildung von Centromeren ein epigenetischer Prozess zugrunde, der auf der Anwesenheit des Centromer-Proteins A (CENPA, S.228) beruht. Dieser Prozess ist unabhängig von der primären Sequenz, an die CENP-A gebunden hat.

Einer Ploidisierung des Genoms sind wir bereits als Eigenschaft spezialisierter Zelltypen begegnet (Kapitel 8.3.3, DNA-Amplifikation). Wir müssen jedoch diese somatische Form der Polyploidisierung als Antwort auf die Notwendigkeit entwicklungsbiologischer Prozesse von der erblichen Form der Polyploidisierung unterscheiden.

Unter der Ploidisierung versteht man eine Vermehrung der Chromosomenzahl des Genoms. Grundsätzlich kann diese gleichmäßig alle Chromosomen erfassen, etwa in Form einer Verdreifachung des Genoms, einer Triploidisierung. Man spricht dann allgemein von Polyploidie. Die Organismen bleiben in solchen Fällen euploid. Die Veränderung der Chromosomenanzahl kann sich aber auch auf einzelne Chromosomen beschränken, die in abnormaler Zahl, also vermehrt oder vermindert gegenüber den übrigen Chromosomenanzahlen, vorkommen. In diesem Fall handelt es sich um Aneuploidie. Beispielen für aneuploide Genomkonstitutionen begegnen wir in der Monosomie oder Trisomie durch Nondisjunction. Aneuploidie führt nur in Ausnahmefällen zu lebensfähigen genetischen Konstitutionen. Die Konsequenzen in der Humangenetik werden ausführlich im Kapitel 12.2 diskutiert. Polyploidisierung führt in der Regel zunächst zu genomischer Instabilität während der Mitose und Meiose, aber auch zu Veränderungen der zellulären Archi-

Abb. 9.3 a–d Allopolyploider Ursprung verschiedener Pflanzenarten. a Fusion eines Pollens von Arabidopsis thaliana ohne Reduktionsteilung mit einer Eizelle der tetraploiden Art A. arenosa führt zur allotetraploiden Art A. suecica. b Die Hybridisierung zwischen den hexaploiden Arten Spartina maritima und S. alterniflora bringt S. x townsendii hervor, die wegen der unbalancierten Chromosomenzahl unfruchtbar ist. Autopolyploidisierung dieses ursprünglichen Hybrids führt zur lebensfähigen allododecaploiden Art S. anglica. c Die Hybridisierung der diploiden Art Senecio squa-

lidus mit der tetraploiden Art S. vulgaris bildet die sterile triploide Form S. x baxteri. Eine folgende Genomduplikation ergibt die fertile, allohexaploide Art S. cambrensis. d Die frühere Hybridisierung der diploiden Arten Gossypium herbaceum und G. raimondii führte zu einer nicht lebensfähigen Form in der F1-Generation. Die folgende Genomduplikation ergab eine fruchtbare allotetraploide Art, die sich heute in 5 verschiedene Baumwollsorten aufgespalten hat, einschließlich G. hirsutum. (Nach Hegarty u. Hiscock 2008, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Chromosomenfusionen

und -spaltungen erfordern Veränderungen bzw. Neuentstehung von Telomeren und Centromeren.

Vervielfachung der Chromosomenzahl (Polyploidie)

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Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

tektur (vor allem Größe des Zellkerns und der Zellkernoberfläche). Sie spielt jedoch auch in der Evolution eine große Rolle, denn nach Durchgang durch diesen Flaschenhals genomischer Instabilität können sich neue, besser adaptierte Spezies etablieren. Dadurch wurde Ploidisierung ein unverzichtbares Mittel in der Praxis der Pflanzenzucht. Polyploidie ist auch in der Natur weit verbreitet, wenn es auch nicht mehr immer direkt erkennbar ist (Abb. 9.3). So sind auch viele Genome von Vertebraten im Laufe der Evolution offenbar durch Ploidisierung entstanden. Während natürliche Polyploidie bei Tieren die Ausnahme ist, kann sie bei Pflanzen häufig beobachtet werden; bei Kulturpflanzen ist Polyploidie sogar die Regel (Tabelle 9.2).

Die Vervielfachung der Chromosomenzahl bezeichnet man als Polyploidie.

Bei Polyploidisierung ist generell die Vervielfachung des eigenen Genoms (Autopolyploidie) von der Vervielfachung der Chromosomen in der Folge von Kreuzungen verschiedener Arten (Allopolyploidie) zu unterscheiden. In Autopolyploiden sind alle Homologen gleichwertige Paarungspartner. Das führt z. B. bei Autotetraploiden in der meiotischen Prophase normalerweise zur Bildung von Quadrivalenten (Abb. 9.4). Die Segregation in der Meiose führt dann zu einer normalen Verteilung der Homologen in den Gameten in einem Verhältnis von 1:1:1:1. Betrachten wir nun eine Situation, in der zwei ver-

schiedene Allele eines Gens in beiden Eltern (Konstitution jeweils AAaa) vorhanden sind, so können in der Nachkommenschaft bereits fünf verschiedene Genotypen auftreten (AAAA, AAAa, AAaa, Aaaa, aaaa). Die Häufigkeit der verschiedenen Genotypen ist abhängig vom Abstand eines Gens vom Centromer, da Crossing-over zwischen jeweils zwei Chromatiden in unterschiedlichen Kombinationen die Häufigkeiten der Allelkombinationen verändern. Gelegentlich kommt es in Autopolyploiden nicht zur Bildung von Quadrivalenten, sondern es entstehen beispielsweise ein Trivalent und ein Univalent oder zwei Bivalente (Abb. 9.4). In diesem Fall kann es zu ungleicher Segregation während der Meiose kommen, sodass die Meioseprodukte aneuploid (hyper- oder hypoploid) werden. Solche Aneuploidien sind in einigen Prozent der Nachkommen polyploider Pflanzen regelmäßig zu beobachten. Folge davon ist eine partielle Sterilität der Pflanzen in der Nachkommenschaft. Es stellt sich die Frage, welche phänotypischen Folgen Polyploidie hat. Es gibt drei offensichtliche Vorteile der Polyploidie: Heterosis, genetische Redundanz und asexuelle Reproduktion. Wie wir bereits oben gesehen haben, zeigen polyploide Organismen eine größere genetische Vielfalt als diploide Organismen, daher können schädliche rezessive Allele länger durch dominante Wildtyp-Allele maskiert werden. Der doppelte Satz von Genen kann außerdem verstärkt zu evolutionären Experimenten genutzt werden. In manchen Fällen führt Polyploidie außerdem dazu, dass Selbstbefruchtung möglich wird (z. B. Allopolyploiden von Arabidopsis thaliana oder Autopolyploiden von Petunia hybrida).

Tabelle 9.2 Ploidie von Kulturpflanzen Pflanze

Ausgangszahl der Chromosomen (n)

Heutiger 2n-Wert

Ploidie

Malus ssp. (Apfel)

17

34 oder 51

2–3×

Pyrus communis (Birne)

17

34 oder 51

2–3×

Prunus ssp. (Pflaume)

8

15, 24, 32, 48

2–6×

Nicotiana tabacum (Tabak)

12

48

4×

Fragaria ananassa (Erdbeere)

7

56

8×

Triticum aestivum (Weizen)

7

42

6×

Solanum tuberosum (Kartoffel)

12

48

4×

Coffea arabica (Kaffee)

11

22, 44, 66, 88

2–8×

Musa sapientum (Banane)

11

22, 33

2–3×

A. Allopolyploide

B. Autopolyploide

Nach Leibenguth (1982)

9.2 Chromosomenmutationen

Abb. 9.4 a–c Polyploidiebildung führt zu meiotischer und mitotischer Instabilität. a In der frühen Anaphase der Meiose I ist die Paarung homologer Chromosomen der F1-Hybriden wegen der Unterschiedlichkeit in der Form und Zahl der Chromosomen gestört. Durch Genomduplikation wird die Paarungsfähigkeit wiederhergestellt; das führt zu Allotetraploiden, in denen die zwei homöologen Chromosomensätze unabhängig paaren (als homöolog bezeichnet man zwei sich entsprechende Chromosomen zweier unterschiedlicher Genome zur Unterscheidung von echten homologen Chromosomen). In Autotetraploiden führt die Paarung häufig zu Multivalenten, da vier Chromosomen desselben Typs vorhanden sind. b Zwei Beispiele meiotischer Unregelmäßigkeiten, die zum Verlust eines Chromosoms (links) bzw. zu Aneuploidie (rechts) führen. c In tierischen Zellen entspricht die Zahl der Centrosomen dem Anstieg der Genomgröße. Es werden mehrfache Spindeln gebildet, die zu unbalancierten Mitoseprodukten führen. (Nach Comai 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Polyploidie spielt bei der evolutionären Entstehung neuer Karyotypen eine wichtige Rolle. Allerdings können unterschiedliche Paarungen in der meiotischen Prophase zu Aneuploidien der Gameten führen (Flaschenhals genomischer Instabilität). Vorteile polyploider Organismen sind stärkere Heterosis und Genredundanz.

Abb. 9.5 Hybridbildung und die adaptive Landschaft. Der „Hyperspace“ möglicher Phänotypen und Genotypen kann als eine adaptive Landschaft dargestellt werden. Fitness-Optima (engl. adaptive peaks) sind in Blau gezeichnet. Adaptive Landschaften sind nicht festgelegt, sondern können sich durch Veränderungen der Umwelt oder des Lebensraums ebenfalls ändern. Die durchschnittlichen Phänotypen der Spezies und ihrer Hybride sind als Kreuze gezeigt und die Verteilung der Nachkommen als Punkte. Die Spezies 1 und 2 sind jeweils an unterschiedliche Fitness-Optima angepasst. Natürliche Selektion agiert hauptsächlich innerhalb jeder Spezies, und die Hybriden sind „hoffnungsvolle Monster“, weit entfernt von phänotypischen Optima (durchgezogene Pfeile). Man kann sich daher schlecht vorstellen, wie Hybride neue Optima erreichen. Polyploide Hybride können jedoch vielfältige Vorteile gegenüber ihren Eltern haben (z. B. Heterosis, extreme phänotypische Eigenschaften und reproduktive Isolation). Homoploide Hybride haben zwar anfangs geringe Vorteile, aber ihre Nachkommen können extrem hohe Variabilität besitzen. Diese Schübe in der Variabilität können dazu beitragen, dass Homoploide neue Fitness-Optima finden, die von denen ihrer Eltern weit entfernt sind (gestrichelte Pfeile). (Nach Mallet 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Polyploidisierung ist eine mögliche Form der Speziesbildung. Polyploide Spezies sind von ihren Eltern in der Reproduktion isoliert, weil im Falle einer Paarung von Tetraploiden mit Diploiden triploide Nachkommen produziert werden, die zwar selbst lebensfähig, aber in der Regel steril sind. Polyploidisierung ist also ein einfacher evolutionärer Sprung, der etwa 2‒4 % der Speziesbildung bei Blütenpflanzen erklärt. Untersuchungen der Flora unter extremen Bedingungen, z. B. in der Arktis, zeigen, dass 78 % von 161 Spezies polyploid sind (der durchschnittliche Ploidiegrad ist 6). Viele haben ihre Markerheterogenität fixiert, was eine

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Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

vollständige Allopolyploidie bedeutet. Nach ihrer Bildung hatten die neuen allopolyploiden Hybride zunächst die üblichen Schwierigkeiten „hoffnungsvoller Monster“: deutliche Unterschiede zu ihren Eltern, ohne adaptive Geschichte zu irgendeiner ökologischen Nische und mit offensichtlich geringer Aussicht auf Überleben. Wenn es allerdings gelingt, neue ökologische Nischen zu besetzen, die zugleich frei und räumlich getrennt sind, können diese Nachteile überwunden werden. Beispiele dafür aus jüngerer Zeit sind die invasiven allopolyploiden Pflanzen Senecio cambrensis in Wales und Spartina anglica in England. In einer allgemeinen Form ist die Beziehung zwischen Polyploidisierung und Speziesbildung in Abb. 9.5 dargestellt.

9.2.2 Polyploidie in der Pflanzenevolution und Pflanzenzucht Viele Studien haben gezeigt, dass in der Evolution der Angiospermen mehrfach Polyploidisierungen aufgetreten sind. Weitere wichtige Beispiele beinhalten Genomduplikationen in den gemeinsamen Vorläufern moderner Nutzpflanzen (Abb. 9.6). Wenn es diese weit verbreiteten, aufeinanderfolgenden Episoden der Genomduplikation gibt, ergibt sich natürlich die Frage, welche evolutionären Prozesse

Abb. 9.6 Abgeleitete Polyploidiesierungsereignisse während der Evolution von Angiospermen. Die blauen Ovale deuten große Duplikationsereignisse an. Die Zahlen sind grobe Schätzungen des Zeitabstands zwischen den Duplikationsereig-

dann dazu geführt haben, dass sich schließlich so kleine Genome wie das von Arabidopsis gebildet haben. Die Antwort ergibt sich daraus, dass nach der Polyploidisierung ein Teil des redundanten Genommaterials wieder verloren ging. So hat z. B. der Mais in seiner Evolution die Hälfte aller verdoppelten Gene in den 11 Millionen Jahren seit der letzten Polyploidisierungsrunde wieder verloren. Dieses Phänomen gibt es jedoch nicht nur bei den Angiospermen, sondern auch in der Hefe: Sequenzanalysen der engen Verwandten Saccharomyces cerevisiae und Kluyveromyces waltii zeigen ein 2:1-Verhältnis der Kopplungsgruppen dieser zwei Linien. Ein allgemeines Schema dieses zyklischen Prozesses aus Polyploidisierung und zufälligem Überleben von Genen zeigt Abb. 9.7. Die Entstehung allopolyploider Genotypen spielt auch eine wichtige Rolle in der experimentellen Pflanzenzüchtung. Viele Kulturpflanzen, wie Getreide, Tabak, Kohl u. a., sind allopolyploid. Der erste Schritt zur Allopolyploidie sind gelegentliche Fremdbefruchtungen, die zur Bildung von Hybriden führen. Arthybriden sind definitionsgemäß steril und damit nicht zur sexuellen Fortpflanzung imstande. Die Sterilität beruht vorwiegend auf der mangelnden Fähigkeit der Chromosomen, sich meiotisch richtig zu paaren. Eine Folge davon ist die ungerichtete Segregation, die zu Aneuploidie der Gameten führt und damit zur Letalität

nissen (in Millionen Jahren); die Verzweigungsäste sind nicht skaliert. (Nach Adams u. Wendel 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

9.2 Chromosomenmutationen

der Nachkommenschaft. Da sich solche Pflanzenhybriden jedoch oft vegetativ fortpflanzen und damit zah-

Abb. 9.7 Modell der zyklischen Polyploidie und dem zufälligem Überleben von Genen. Die kleinen Kästchen stellen Gene dar, die entlang der homöologen Chromosomen innerhalb eines Zellkerns (großer Kasten) angeordnet sind; die Färbung deutet jeweils einen neuen Satz von Genen an, der durch eine Polyploidisierungsrunde hinzukommt. Differenzielles Überleben von Genen führt zum Abweichen von der Co-Linearität in homöologen Genen. (Nach Adams u. Wendel 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

lenmäßig vermehren können, steigt die Wahrscheinlichkeit, dass sich bei zufälliger Segregation der Chromosomen gelegentlich einzelne Gameten bilden, die je einen haploiden Chromosomensatz beider Elternarten besitzen. Befruchten sich zwei solcher Gameten, so entsteht eine allotetraploide Zygote (Abb. 9.4), die je ein diploides Genom beider Eltern enthält (auch als amphidiploid bezeichnet). Solche Zellen können sich auch meiotisch normal teilen, da nunmehr jedes Chromosom einen homologen Paarungspartner besitzt. Die Folge ist eine normale Segregation. Man kann die Zelle also hinsichtlich ihres Segregationsverhaltens mit einer diploiden Zelle mit der doppelten Chromosomenanzahl vergleichen. Sie unterscheidet sich jedoch von einer normalen diploiden Zelle dadurch, dass die sich entsprechenden Chromosomen beider Ausgangsgenome partiell homolog sind. Die Paarung – und damit auch das Crossing-over – erfolgt im Allgemeinen bevorzugt zwischen den beiden homologen Partnern eines allopolyploiden Genoms, sodass beide Genome gewissermaßen nebeneinander bestehen bleiben. Das ist auch bei Allopolyploiden höheren Grades (z. B. Hexapolyploiden) der Fall. Unsere heute gebräuchlichen Weizensorten sind typische Beispiele für Allopolyploidie. Durch Chromosomenanalysen hat man festgestellt, dass die Evolution des Genoms des hexaploiden Weizens (Triticum aestivum, 2n = 42), dessen Ursprünge in Babylonien und Indien liegen, in zwei Ploidisierungsschritten unter Einbezug des Genoms dreier diploider Arten verlaufen sein muss. Ausgangsarten waren vor mehr als 10.000 Jahren wahrscheinlich die diploiden Arten Triticum monococcum (2n = 14; heute als Einkorn noch kultiviert, mit der Chromosomenkonstitution AA) und eine weitere, nicht sicher bestimmte Art, wahrscheinlich Aegilops speltoides (Synonym: Triticum speltoides) (2n = 14; mit der diploiden Konstitution BB). Ein natürliches tetraploides Hybrid beider Arten, Triticum turgidum (2n = 28), das seit etwa 10.000 Jahren bekannt ist, hat die Chromosomenkonstitution AABB. Es wird noch heute als Emmerweizen kultiviert. Nach einer Kreuzung mit der diploiden Art Aegilops squamosum (Synonym: Triticum tauschii) (2n = 14; diploide Chromosomenkonstitution DD) entstand vor etwa 8000 Jahren der hexaploide Weizen Triticum aestivum (Chromosomenkonstitution AABBDD). Er besitzt 2n = 42 Chromosomen, die aus drei verschiedenen Ursprungsgenomen mit haploid je 7 Chromosomen abgeleitet sind, wie uns seine Entstehungsgeschichte gezeigt hat. Abb. 9.8 zeigt verschiedene Weizen- und Gerstenarten.

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Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Abb. 9.8 Ähren von wilden und domestizierten Formen von Weizen und Gerste. Die obere Reihe zeigt diploide wilde Urformen, die mit dem tetraploiden und hexaploiden Weizenarten verwandt sind: (i) Triticum urartu (AuAu), (ii) Aegilops speltoides (SS) und (iii) Aegilops tauschii (DD). (iv) Kultivierte diploide Weizenform T. monococcum (AmAm). Wilde und domestizierte Form von tetraploidem Weizen: (v) Triticum turgidum ssp. dicoccoides (AABB) und (vi) Triticum turgidum ssp. durum (AABB). (vii) Triticum aestivum (Saatweizen, AABBDD) ist aus der Hybridisierung zwischen der tetraploiden domestizierten Spezies T. turgidum ssp. dicoccum und der wilden diploiden Form Aegilops tauschii hervorgegangen. Die untere Reihe zeigt zwei Unterarten von Gerste: (i) Der wilde Vorläufer Hordeum spontaneum (HH) hat spröde Blattspindeln, sodass die Körner leicht aus den Ähren fallen (rechts). (ii) Die zwei kultivierten Hauptformen von Hordeum vulgare (HH): sechsreihig (links) und zweireihig (rechts). Die Genomkonstitution ist unter den jeweiligen Speziesnamen angegeben. (Nach Feuillet et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Die heutige hexaploide Kulturform des Weizens (Triticum aestivum) ist ein Beispiel für die Entstehung allopolyploider Formen durch stufenweise Hybridbildung zwischen verschiedenen diploiden Ausgangsarten.

Der Vorteil allopolyploider Konstitutionen liegt letztlich in einem größeren Reichtum an unterschiedlichen Allelen. Hierdurch sind die Pflanzen anpassungsfähiger (Vergrößerung des Genpools, Kapitel 10.5). Außerdem bewirkt die Vervielfachung der Kopienzahl eines Gens oft eine Erhöhung der Menge an Genprodukt, dem entscheidenden Kriterium in der kommerziellen Pflanzenzüchtung, wenn es sich um Nahrungspflanzen handelt. Die Entstehung allopolyploider Konstitutionen ist nicht allein der natürlichen Selektion geeigneter Formen überlassen, sondern kann auch experimentell erfolgen. Ausgangsformen hierfür sind wiederum Amphidiploide, die durch Kreuzungen verschiedener Arten und anschließende Ploidisierung, beispielsweise durch Colchicinbehandlung, erhalten werden. Ein

wichtiges Beispiel hierfür ist die Züchtung der Gattungshybride Triticale durch Kreuzungen von Weizen (Triticum) (2n = 42) und Roggen (Secale) (2n = 14). Durch Bestäubung von Triticum mit Pollen von Secale wurden zunächst (unfruchtbare) Hybriden erzeugt. Die Embryonen kultivierte man in Colchicin-haltigem Nährmedium und erhielt so tetraploide Pflanzen, die sich als fruchtbar erwiesen. Schließlich haben in der klassischen Pflanzenzüchtung noch zwei weitere Möglichkeiten genetischer Eingriffe in das Genom Bedeutung erlangt. Sie werden als Additions- und Substitutionsbastardisierung bezeichnet. In Additionsbastarden findet sich ein überzähliges Chromosomenpaar aus einer anderen Art (Fremdaddition, engl. alien addition). So lassen sich zum Weizengenom einzelne Chromosomen des Roggens hinzufügen. Die allopolyploide genetische Konstitution des Weizengenoms ist

9.2 Chromosomenmutationen

in der Lage, solche „überzähligen“ Chromosomen, die ja zu Aneuploidie führen, zu akzeptieren. In diploiden Genomen würden solche Aneuploidien zur Letalität führen. In ähnlicher Weise können einzelne Chromosomenpaare eines Allopolyploiden durch ein Chromosomenpaar fremden Ursprungs ersetzt werden (Fremdsubstitution, engl. alien substitution).

Durch die gezielte Kreuzung von Arten lassen sich ex-

perimentell neue allopolyploide Arten erzeugen, die als Kulturpflanzen für die Ernährung von großer Bedeutung sein können, da sie vorteilhafte Eigenschaften der verschiedenen Ausgangsarten in sich vereinigen.

Die Kombination fremder Genombestandteile war eines der wichtigsten Mittel der klassischen Pflanzenzüchtung, um gewünschte Eigenschaften bei Kulturpflanzen, in erster Linie hohen Ertrag und spezifische Resistenzen sowie Adaptation an besondere Wachstumsbedingungen, herauszuzüchten. Die aufgeführten Beispiele lassen erkennen, welch mühsamen und oft weitgehend empirischen Weg der Züchter zu gehen hatte, um die gesuchten Varietäten zu erzeugen. Durch die Herstellung transgener Pflanzen (Kapitel 9.7.1) werden entsprechende Gene direkt ins Genom eingefügt und somit züchterische Schritte vereinfacht.

9.2.3 Strukturelle Chromosomenaberrationen Strukturellen Chromosomenveränderungen sind wir bereits wiederholt begegnet. Es handelt sich hierbei stets um Abweichungen, die durch – meist mehrere – Brüche im Chromosom verursacht werden. Solche Brüche können repariert und damit die strukturelle Integrität des Chromosoms wiederhergestellt werden. Liegen gleichzeitig mehrere Brüche in einem oder verschiedenen Chromosomen vor, so kann es zu „falschen“ Reparaturen kommen. Ohne sie würde das Chromosom sein Centromer oder Telomer verlieren und wäre damit funktionsunfähig (Kapitel 6.1.3 und 6.1.4.) Falsche Reparaturen von Chromosomenbrüchen haben eine Veränderung der Anordnung der Gene im Genom zur Folge. Die verschiedenen Möglichkeiten, die sich hierbei ergeben, sind (Abb. 9.9): ï Duplikationen, ï Deletionen, ï Inversionen und ï Translokationen. Alle Arten von Chromosomenaberrationen (oder Chromosomenrearrangements) sind nicht nur in populationsgenetischer Hinsicht von Bedeutung, sondern waren es auch für die Kartierung von Genen in

der experimentellen Genetik. Sie gestatteten die gezielte Herstellung bestimmter genetischer Konstitutionen und die Stabilisierung bestimmter Allelkombinationen. Auch in der Humangenetik spielen Chromosomenaberrationen eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Erbkrankheiten. Aberrationen können spontan entstehen oder induziert werden. Ihre Induktion erfolgt in erster Linie durch energiereiche Strahlung (Röntgenstrahlung), kann aber auch durch chemische Mutagenese erfolgen. Chromosomenaberrationen sind in vielen Fällen bereits cytologisch zu erkennen, da sie mit Veränderungen in der Form oder Länge der betroffenen Chromosomen, in den Paarungseigenschaften während der meiotischen Prophase oder in den Bandenmustern der Chromosomen (Kapitel 6.1.2) verbunden sind.

Duplikationen und Deletionen Bei der Entstehung von Duplikationen und Deletionen führen partielle Homologien in der DNA-Sequenz zu einer Verschiebung in der meiotischen Paarung und zu nicht homologem Crossing-over. Vergleichbare Ereignisse können sich natürlich auch über größere Abstände im Chromosom hinweg abspielen, sodass längere Chromosomenabschnitte dupliziert werden. Allerdings stellen alle Duplikationen genetisch gesehen Aneuploidien dar, und wir wissen, dass diese meist letal sind. Daher werden im Genom – nach Maßgabe der beteiligten Gene – auch meist nur kürzere Deletionen vorgefunden.

Inversionen Inversionen erscheinen auf den ersten Blick als genetisch nicht sehr interessant, da man erwarten würde, dass hier die genetische Information unverändert erhalten geblieben ist. Das ist insofern nicht ganz richtig, als im Bruchstellenbereich Defekte induziert werden können, die Konsequenzen des Bruchereignisses selbst sind (z. B. fehlerhafte Reparatur) und deren Folgen daher nicht auf der Tatsache der Invertierung eines Chromosomenbereichs beruhen. Andererseits kommt es durch die Inversion eines Chromosomenbereichs jedoch zu Verlagerungen von Genen in andere Bereiche des Chromosoms. Hieraus können aufgrund einer veränderten Chromatinkonstitution Veränderungen in der Aktivität der Gene entstehen. Solche Effekte sind vor allem dann zu beobachten, wenn ein euchromatischer Chromosomenbereich durch eine Inversion (oder auch Translokation) in einen heterochromatischen Chromosomenabschnitt verlagert wird. Wie wir früher gesehen haben, unterscheiden sich heterochromatische Chromosomenbereiche sowohl durch ihre strukturelle Organisation als auch durch speziell mit ihnen assoziierte chromosomale Proteine von euchromatischen

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Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Abb. 9.9 a–i Verschiedene Formen chromosomaler Umgestaltungen. Die Chromosomen sind schwarz gezeichnet und ihre Centromere grau. Gelbe Pfeile repräsentieren Sequenzen, die über einen längeren Bereich eine signifikante Übereinstimmung zeigen; die Pfeilrichtung gibt die jeweilige Orientierung an. Die chromosomalen Umgestaltungen und die (vorhergesagten) Rekombinationsprodukte sind von links nach rechts entsprechend der beteiligten Mechanismen sortiert (verschiedene Chromosomen: interchromosomal; innerhalb eines Chromosoms: intrachromosomal; innerhalb einer Chromatide: intrachromatid); von oben nach unten: gleichsinnige,

invertierte und komplexe Umgestaltungen. a, d, g Falsche Anlagerung von Fragmenten in der gleichen Orientierung führt zu Deletionen bzw. Duplikationen, innerhalb einer Chromatide auch zu einem azentrischen Fragment. b, e, h Falsche Anlagerung von Fragmenten in der entgegengesetzten Orientierung führt zu Inversionen. c, f, i Komplexe Austausche zwischen Fragmenten mit Sequenzhomologien können auch für Deletionen oder Duplikationen (c: u. U. auch mit Einschluss des Centromers) bzw. Inversionen verantwortlich sein. (Nach Stankiewicz u. Lupski 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Chromosomenabschnitten. Wird ein Gen in solche Regionen verlagert, so kann es in die strukturelle Organisation des heterochromatischen Chromosomenbereichs einbezogen werden, sodass es zu einer Kondensation des Chromosoms auch in diesem Gentragenden Bereich kommt. Das wiederum kann die Inaktivierung der einbezogenen Gene zur Folge haben. Offenbar wird durch die Bruchstellen die Untergliederung der strukturellen Domänen eines Chromosoms teilweise zerstört, sodass deren Grenzen nicht mehr eindeutig definiert werden. Das führt zu einer Variabilität in den Grenzen des heterochromatischen Chromosomenbereichs in verschiedenen Zellen und damit zu Unterschieden in der Ausprägung der Gene im diesem Grenzbereich. Eine andere pathologische Konsequenz einer Inversion ergibt sich, wenn der Bruchpunkt innerhalb eines Gens liegt. In der Humangenetik ist die Inversion unter

Beteiligung des Introns 22 des F8-Gens die häufigste Ursache der Hämophilie A (Kapitel 12.3.3).

Bei der Verlagerung von Genen in heterochromatische Chromosomenbereiche durch Inversionen oder Translokationen kann die andere Chromatinkonstitution der neuen chromosomalen Umgebung die normale Expression von Genen beeinflussen.

Die Anwesenheit heterozygoter Inversionen in einem diploiden Organismus kann schwerwiegende Folgen während der Meiose haben, wenn es im Inversionsbereich zu Crossing-over kommt. Da die Lage der Inversion relativ zur Lage des Centromers in dieser Hinsicht von großer Bedeutung ist, unterscheidet man zwischen Inversionen, die sich auf einen Chromosomenarm beschränken (parazentrischen Inversionen) und sol-

9.2 Chromosomenmutationen

chen, die den Centromerbereich einschließen (perizentrische Inversionen). Im Falle eines Crossing-overs innerhalb einer perizentrischen Inversion entstehen Chromatiden mit partiellen Duplikationen und Deletionen, die in den Nachkommen zu Aneuploidien führen und damit im Allgemeinen eine letale Wirkung haben. Erfolgt ein Crossing-over innerhalb einer parazentrischen Inversion, so kommt es bereits während der ersten meiotischen Anaphase zu Störungen, da die entstehenden Chromatiden entweder ihr Centromer verloren haben oder zwei Centromere besitzen. Cytologisch ist das in der Anaphase durch die Ausbildung von Chromatidenbrücken erkennbar, wie sie charakteristischerweise durch Chromatiden mit zwei Centromeren gebildet werden. Chromatidenbrücken zerbrechen gegen Ende der Anaphase. Da Chromatidenstücke ohne Centromer während der Zellteilung verloren gehen, entstehen sowohl bei Verlust des Centromers (azentrisches Fragment) als auch bei der Anwesenheit zweier Centromere (dizentrisches Fragment) aneuploide Gameten, die ebenfalls zur embryonalen Letalität führen, wenn sie nicht bereits als Keimzellen eliminiert werden. Unter den Nachkommen sind damit nur solche Individuen zu finden, die im Inversionsbereich kein Crossing-over aufweisen. Alle Chromosomen mit Crossing-over innerhalb der Inversion sind hingegen nicht lebensfähig. Daher sind heterozygote Inversionen, insbesondere, wenn sie längere Chromosomenbereiche einschließen, zur Stabilisierung bestimmter Allelkombinationen geeignet. Solche Chromosomenkonstitutionen kann man in der Natur bei bestimmten Organismen häufig finden. Zum Beispiel sind Chironomiden-Populationen (Diptera) oft durch eine sehr ausgiebige und populationsspezifische Inversionsheterozygotie gekennzeichnet. In der experimentellen Genetik werden Inversionen mit dem gleichen Ziel, der Verhinderung von Rekombination in bestimmten Chromosomenbereichen, verwendet. Sie sind daher ein wesentlicher Bestandteil eines Balancerchromosoms (Technik-Box 17). Cytologisch sind heterozygote Inversionen in polytänen Chromosomen ebenso gut wie heterozygote Deletionen oder Inversionen zu erkennen. Da Chromatiden stets eine starke Tendenz zur Paarung haben, ist auch der Inversionsbereich weitgehend gepaart. Um diese Paarung überhaupt zu gestatten, bildet sich zwischen den homologen Chromosomen eine Inversionsschleife aus, die lediglich im Bereich der ursprünglichen Bruchpunkte kurze ungepaarte Abschnitte zeigt. In Drosophila ist die exakte Kartierung von Inversionen auf diese Weise sehr einfach.

Heterozygote Inversionen führen zu Chromosomenaberrationen, wenn Crossing-over innerhalb des invertierten Chromosomenabschnitts erfolgt. Die hierdurch bedingte Letalität der Nachkommen solcher Rekombinationschromatiden hat zur Folge, dass Allelkombinationen innerhalb einer heterozygoten Konstitution durch Crossing-over nicht verändert werden. Diese Möglichkeit zur Stabilisierung bestimmter Allelkombinationen ist sowohl in natürlichen Populationen als auch experimentell in Balancerchromosomen von Bedeutung.

Deletionen und Duplikationen chromosomaler Segmente werden heute auch als Kopienzahlvariationen (engl. copy number variants, CNVs) bezeichnet. Bei Menschen sind sie eine Ursache individueller Unterschiede, aber auch ein wichtiger Faktor der Evolution. Darüber hinaus sind sie für das Entstehen einiger Krankheiten verantwortlich (z. B. Geisteskrankheiten, Entwicklungsstörungen und Krebs). Kopienzahlmutationen entstehen häufiger als andere Mutationen, wobei der prinzipielle Mechanismus bei verschiedenen Organismen (z. B. Bakterien, Hefen und Menschen) ähnlich zu sein scheint. Allerdings haben Mäuse eine deutlich geringere Entstehungshäufigkeit als Primaten, ohne dass wir die Ursache dafür kennen. Man geht davon aus, dass etwa 12 % des menschlichen Genoms von Kopienzahlvariationen betroffen ist. Kopienzahlvariationen können meiotisch und in somatischen Zellen entstehen und sind damit auch ein Unterscheidungsmerkmal eineiiger Zwillinge. Veränderungen in der Kopienzahl von chromosomalen Abschnitten (und damit der darin enthaltenen Gene) beeinflussen natürlich auch die Expressionsstärke dieser Gene; sie können aber auch Grundlage neuer evolutionärer Prozesse werden. Zur Erklärung des Entstehungsprozesses von Kopienzahlvariationen werden heute vor allem Störungen der DNA-Replikation und die Replikation von nicht zusammenhängenden DNAFragmenten favorisiert (Abb. 9.10)

Translokationen Translokationen entstehen durch Brüche in zwei oder mehr verschiedenen Chromosomen. Es folgt eine Verheilung der chromosomalen Bruchstücke in neuen Kombinationen. Hierbei können auch multiple Translokationen entstehen, die komplexe meiotische Prophasepaarungsfiguren zur Folge haben. Erfolgt eine Translokation in Form eines Austausches von Chromosomenteilen zwischen zwei Chromosomen, so sprechen wir von einer reziproken Translokation. Wie wir schon für Deletionen, Duplikationen oder Inversionen gesehen haben, sind auch Translokationen in Drosophila und anderen Insekten an den Riesenchromoso-

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408

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen a

9.3 Spontane Mutationen 9.3.1 Fehler bei Replikation und Rekombination

b

c

d

e

f

g

Abb. 9.10 a–g Mögliche Entstehung von Kopienzahlvariationen. Es sind aufeinanderfolgende Sprünge der Replikationsgabel zu verschiedenen genomischen Positionen (verschiedene Farben) gezeigt, wobei sich jeweils kurze Homologiebereiche ausbilden. Die Pfeilspitze deutet die DNA-Syntheserichtung an. a Abgebrochener Arm einer Replikationsgabel, die eine neue fortschreitende Replikationsgabel (b) ausbildet. c, e Das verlängerte Ende löst sich wiederholt ab und bildet an einer anderen Stelle eine neue Replikationsgabel (d) aus. f Der Sprung führt zu dem ursprünglichen Schwesterchromatidenstrang (blau) zurück. Es wird eine neue Replikationsgabel ausgebildet, die die Replikation abschließt. g Das Endprodukt enthält Sequenzen unterschiedlicher genomischer Regionen. (Nach Hastings et al. 2009)

men leicht zu erkennen, da sich hier komplexe Chromosomenpaarungen ergeben.

Die Verlagerung von (terminalen) Chromosomenbe-

reichen oder ganzen Chromosomenarmen an ein anderes Chromosom bezeichnet man als Translokation.

Die Ursache von Replikationsfehlern in der DNA haben wir bereits bei der Besprechung der Replikationsmechanismen kennengelernt (Kapitel 2.2). Der DNA-Polymerase unterlaufen beim Einbau von Nukleotiden aufgrund der Basenkomplementarität mit dem komplementären Strang in einem wachsenden DNAStrang relativ häufig Fehler (ungefähr 1 in 104 Nukleotiden). Obwohl der DNA-Polymerasekomplex solche Fehler unmittelbar im Zusammenhang mit der Replikation korrigieren kann (Korrekturleseaktivität der 3’→5’-Exonuklease im Polymerasekomplex; engl. proof reading), kommt es trotzdem zum Fehleinbau von Nukleotiden. Die trotz der Reparaturvorgänge verbleibende Fehlerrate liegt noch immer in einer Größenordnung von 10−6 bis 10−11 Nukleotiden. Das erscheint zwar niedrig, doch in einem Genom, das wie das menschliche 2,75 × 109 Nukleotidpaare enthält, hat diese Fehleinbaurate noch immer eine Mutationshäufigkeit von 1 Nukleotid in mindestens 1 von 100 replizierenden Zellen oder sogar in jedem Replikationszyklus zur Folge. Da in einem menschlichen Individuum bis zu 106 Zellen in jeder Sekunde replizieren, ist die gesamte Mutationshäufigkeit in jedem einzelnen Individuum außerordentlich hoch. Selbst bei E. coli erwartet man noch etwa 8 Basensubstitutionen per Replikationszyklus in jeder Zelle. Auch wenn man davon ausgehen kann, dass ein Teil dieser Fehler noch durch andere, nicht an die Replikation gekoppelte Reparaturmechanismen korrigiert wird (Kapitel 9.6.1 und 9.6.2), so verbleibt noch immer eine überraschend hohe basale Mutationsrate durch Replikationsfehler. Die Bedeutung der Korrekturleseaktivität wird deutlich, wenn man Mutationen des entsprechenden Gens betrachtet: mutD-Mutanten von E. coli zeigen eine 1000fach höhere Mutationsrate als Wildtyp-Bakterien. Ursache sind Mutationen in dem Gen, das für die ε-Untereinheit der DNA-Polymerase III codiert. Eine weitere Ursache für Replikationsfehler ist das Schlittern (engl. slippage) der DNA-Polymerase über repetitive Bereiche: Häufig löst sich die DNA-Polymerase kurzzeitig vom elterlichen Strang und setzt kurz darauf wieder neu an. Besonders in Bereichen, in denen sich ein Nukleotid mehrfach wiederholt (z. B. 7-mal Guanosin in Folge), kann dies zu einer Deletion oder auch einer Insertion führen (Folge: 6- oder 8-mal Guanosin an dieser Stelle), sodass dadurch der Leserahmen verändert wird.

9.3 Spontane Mutationen

Eine wichtige Frage stellt sich im Zusammenhang mit Korrekturen von Replikationsfehlern: Wie ist das Korrektursystem in der Lage, den neu synthetisierten DNA-Strang vom alten Strang zu unterscheiden? Diese Unterscheidung wäre notwendig, wenn die Korrektur einer Base nicht dem Zufall unterliegen, sondern gezielt im richtigen Strang erfolgen soll, um eine Mutation zu vermeiden. Bei E. coli spielen hier methylierte Basen in der DNA eine Rolle, die mit geringer Frequenz im alten Strang, nicht jedoch im neu synthetisierten Strang vorkommen. Adenin und Cytosin werden innerhalb bestimmter DNA-Sequenzen methyliert (Abb. 11.62) und dienen so zur Kennzeichnung des ursprünglichen DNAStrangs. Da die Methylierung postreplikativ und etwas verzögert erfolgt, sind neu replizierte DNA-Bereiche noch unmethyliert und dadurch als korrekturbedürftige Regionen gekennzeichnet. Eine zweite häufige Mutationsursache sind spontane Basenveränderungen, die dann natürlich auch zu Fehlern in der Replikation führen, ohne dass der Replikationsmechanismus als solcher fehlerhaft arbeitet. Wir werden das im nächsten Abschnitt im Detail betrachten. Ein anderer wesentlicher genetischer Prozess, nämlich die Rekombination (Kapitel 4.4.2 und 5.3.3), ist störanfällig und Ursache vieler Mutationen. Auch hier sind repetitive Bereiche besonders gefährdet. Solche Sequenzwiederholungen können dazu führen, dass es während der meiotischen Homologenpaarung zu Fehlpaarungen und als Konsequenz zu Rekombinationsfehlern kommt. Das führt zu Duplikationen oder Deletionen im betroffenen DNA-Bereich. Eine besondere Rolle spielen diese Phänomene bei der Entstehung struktureller Chromosomenaberrationen (Kapitel 9.2.3).

gelöst werden kann. Sie ist temperaturabhängig und erfolgt bei einem pH-Wert von 7 bei 37 °C mit einer Häufigkeit von etwa 1 von 300 Purinnukleotiden täglich; ï der tautomere Charakter der Basen, aufgrund dessen sie von der normalen Ketoform (Thymin, Guanin) in die seltenere Enolform übergehen können, bzw. von der normalen Aminoform (Cytosin, Adenin) in die seltene Iminoform; ï spontane Desaminierung, insbesondere von Cytosin zu Uracil, seltener von Adenin zu Hypoxanthin. Bei der Untersuchung der rII-Region des Bakteriophagen T4 hatte Benzer (1961) beobachtet, dass bestimmte Regionen des Gens mit besonders hoher Frequenz mutierten. Sie wurden deshalb als hotspots für Mutationen bezeichnet. Es hat sich herausgestellt, dass viele dieser Mutationen auf einer Umwandlung von 5-Methylcytosin in Thymin als Folge einer Desaminierung beruhen. 5-Methylcytosin-Positionen in der DNA sind somit ein bevorzugter Angriffspunkt für Mutationen. Cytosin und 5-Methylcytosin verlieren gelegentlich spontan ihre Aminogruppen (Desaminierung; Abb. 9.11). Dadurch wird Cytosin in Uracil umgewandelt. Uracil kommt jedoch in der DNA als normale Komponente nicht vor. Es wird daher im Allgemeinen enzyma-

Bei der Replikation der DNA werden mit hohen Feh-

lerraten der DNA-Polymerase auch falsche Nukleotide eingebaut. Die meisten Fehler werden jedoch durch einen Polymerase-eigenen Reparaturmechanismus korrigiert. Rekombinationsfehler aufgrund von Fehlpaarungen während der meiotischen Homologenpaarungen können zu Deletionen und Duplikationen führen.

9.3.2 Spontane Basenveränderungen Nukleotidveränderungen können entweder spontan durch die chemischen Eigenschaften der Nukleotide selbst auftreten, oder sie können induziert sein. Als Ursachen für spontane Nukleotidsubstitutionen kommen in Betracht: ï die Instabilität der N-Glykosylbindungen zwischen Basen und Desoxyribose, die bei Purinnukleotiden mit einer niedrigen Frequenz spontan

Abb. 9.11 Desaminierung von Cytosin und von 5-Methylcytosin hat unterschiedliche Folgen. Das aus Cytosin entstehende Uracil wird durch die endogene Uracil-Glykosylase entfernt, und Reparatursysteme korrigieren die DNA aufgrund des komplementären G. 5-Methylcytosin wird hingegen in Thymin verwandelt, sodass es als Folge der Desaminierung zu einem Basenaustausch kommt

409

410

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

tisch (durch die Uracil-Glykosylase) entfernt. Durch Reparaturenzyme wird nach Maßgabe des komplementären G wieder ein C in die DNA eingefügt, sodass normalerweise diese Desaminierung schließlich keine bleibende Mutation zur Folge hat. Anders sieht es jedoch aus, wenn die Umwandlung in Uracil kurz vor oder während der Replikation erfolgt, sodass zur Reparatur keine Zeit verbleibt. In diesem Fall wird als komplementäres Nukleotid im neuen DNA-Strang ein A eingefügt, sodass nach weiteren Replikationen schließlich ein ATBasenpaar anstelle des ursprünglichen GC-Basenpaares steht. Desaminiertes 5-Methylcytosin hingegen verhält sich hinsichtlich seiner Eigenschaften bei der Basenpaarung wie Thymin. Auch hier wird bei der Replikation ein AT-Basenpaar anstelle eines GC-Basenpaares erzeugt. Da methyliertes Thymidin durch Reparaturenzyme jedoch nicht aus der DNA entfernt wird, führt die Desaminierung von 5-Methylcytosin unabhängig von ihrem Zeitpunkt stets zu einer Basensubstitution. Eine weitere Quelle für spontane Mutationen ist die Tautomerie (Wechsel zwischen zwei strukturell verschiedenen Formen) einiger Basen (Abb. 9.12 und

Abb. 9.13 Ungewöhnliche Basenpaarungen durch die Bildung tautomerer Formen

9.13). Im tautomeren Zustand kommt es zu anomalen Basenpaarungen, die in den folgenden Replikationen zu permanenten Basenveränderungen und damit zu Mutationen führen können.

Spontane Basenveränderungen in der DNA können aufgrund der Instabilität der Aminogruppen von Cytosin und 5-Methylcytosin erfolgen oder wenn Basen während der Replikation in einen selteneren tautomeren Zustand übergehen.

9.3.3 Dynamische Mutationen

Abb. 9.12 Tautomerie der Basen. Die Keto- und Aminoformen werden bevorzugt gebildet

Der Begriff dynamische Mutation wurde eingeführt, um die einzigartigen Eigenschaften von expandierenden, instabilen repetitiven DNA-Sequenzen von anderen Mutationsformen zu unterscheiden. Im Jahr 1991 berichteten Kremer und Mitarbeiter bzw. La Spada und Mitarbeiter das erste Mal von „expandierenden TriplettMutationen“ als Ursache verschiedener Erbkrankheiten, dem fragilen X-Syndrom und einer besonderen Form der Muskelatrophie. In beiden Fällen ist eine einfache DNA-Wiederholungssequenz (CCG bzw. CAG) bei den betroffenen Patienten erhöht. Bei Gesunden variiert zwar die Zahl dieser Tripletts ebenfalls, ist aber deutlich niedriger und liegt unter einem bestimmten Schwellenwert. Seit ihrer Entdeckung ist die Zahl der bekannten menschlichen Krankheiten in fragilen chromosomalen Bereichen ständig gestiegen, und dynamische Mutatio-

9.3 Spontane Mutationen

nen wurden zu einer bedeutenden Ursache menschlicher Erkrankungen (Tabelle 9.3). Die bisherigen Arbeiten zur Aufklärung dieses Mechanismus zeigen: ï Die Mutation manifestiert sich als eine Veränderung (üblicherweise Erhöhung) der Kopienzahl der Wiederholungen.

ï Seltene Ereignisse führen zu Allelen mit erhöhter Wahrscheinlichkeit, die Kopienzahl zu erhöhen. ï Die Krankheit, die durch die Ausbreitung der Wiederholungen verursacht wird, zeigt eine Abhängigkeit ihres Schweregrades bzw. des Zeitpunktes (Alter) ihres Beginns von der Kopienzahl.

Tabelle 9.3 Erkrankungen durch Trinukleotid-Wiederholungen Krankheit

Gen

Locus

Protein

Trinukleotid

Wiederholungshäufigkeit gesund

krank

Lokalisation

Fragiles-X-Syndrom (A)

FMR1 (FRAXA)

Xq27.3

FMR-1-Protein

CGG

6–53

60–200 (Prä)* > 230 (Voll) **

5’-UTR

Fragiles-X-Syndrom (E)

FMR2 (FRAXE)

Xq28

FMR-2-Protein

GCC

6–35

61–200 (Prä) > 200 (Voll)

5’-UTR

Friedreich’sche Ataxie

X25

9q1321.1

Frataxin

GAA

7–34

34–80 (Prä) > 100 (Voll)

Intron 1

Myotone Dystrophie

DMPK

19q13

MyotoneDystrophieProteinkinase (DMPK)

CTG

5–37

50–1000

3’-UTR

Spino-bulbare Muskel-Atrophie (Kennedy)

AR

Xq13-21

AndrogenRezeptor (AR)

CAG

9–36

38–62

codierend (N-terminal)

Chorea Huntington

HD

4p16.3

Huntingtin

CAG

6–35

36–121

codierend (N-terminal)

Dentatorubralpallidoluysische Atrophie

DRPLA

12p13.31

Atrophin-1

CAG

6–35

49–88

codierend (N-terminal)

Spino-cerebellare Ataxie 1

SCA1

6p23

Ataxin-1

CAG

6–44

39–82

codierend (N-terminal)

Spino-cerebellare Ataxie 2

SCA2

12q24.1

Ataxin-2

CAG

15–31

36–63

codierend (N-terminal)

Spino-cerebellare Ataxie 3 (MachadoJoseph-Erkrankung)

SCA3

14q32.1

Ataxin-3

CAG

12–40

55–84

codierend (N-terminal)

Spino-cerebellare Ataxie 6

SCA6

19p13

Calcium-Kanal

CAG

4–18

21–33

codierend (N-terminal)

Spino-cerebellare Ataxie 7

SCA7

3p12-13

Ataxin-7

CAG

4–35

37–306

codierend (N-terminal)

Spino-cerebellare Ataxie 8

SCA8

13q21

GegenstrangRNA zu Ataxin-8

CTG

16–37

110 bis <250

3’-UTR

Spino-cerebellare Ataxie 12

SCA12

5q31-33

PP2a-PR55

CAG

7–28

66–78

5’-UTR

Nach Cummings u. Zoghbi (2000), aktualisiert nach OMIM (2010);*Prämutation; **Vollmutation

411

412

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Abb. 9.14 Zusammenhang zwischen Anzahl der Triplettwiederholungen und Eintrittsalter der Erkrankung. Verschiedene Daten der Literatur wurden zusammengetragen, um die Abhängigkeit des Eintrittsalters der Erkrankung von der Anzahl der Triplettwiederholungen darzustellen. Die Kurven wurden an ein einfaches exponentielles Modell angepasst. Für einige Erkrankungen ist auch das Eintrittsalter der homozygoten

Träger angegeben (gefüllte Symbole). DRPLA: Dentatorubralpallidoluysische Atrophie; HD: Chorea Huntington; MUD: Machado-Joseph-Erkrankung (= SCA3); SBMA: Spino-bulbare Muskelatrophie; SCA: Spino-cerebellare Ataxie. (Nach Gusella u. MacDonald 2000, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Diese Eigenschaften zusammengenommen führen dazu, dass die entsprechenden Krankheiten im Verlaufe von Generationen immer früher auftreten und der Schweregrad zunimmt (Abb. 9.14; Details einiger Beispiele siehe Kapitel 12.3.3 und 13.3.3). Die ersten expandierenden Wiederholungssequenzen, von denen berichtet wurde, waren die Trinukleotide CCG/CGG und CAG/CTG. Ursprünglich ging man daher davon aus, dass nur Trinukleotid-Wiederholungen expandieren könnten. Da außerdem diese beiden Formen der Wiederholungselemente Sekundärstrukturen ausbilden können, nahm man an, dass dies eine notwendige Vorbedingung für die genetische Instabilität sei. Allerdings wurden in der Zwischenzeit auch größere Wiederholungselemente gefunden (bis zu 42 bp). Der Grenzwert der Kopienzahl, ab dem die Krankheit auftritt, hängt möglicherweise mit der Länge der Okazaki-Fragmente während der Replikation zusammen. Die Sekundärstruktur der CAG/CTG- und CGGWiederholungen ist in der Lage, die Bindung und Spaltung der bakteriellen Okazaki-Flap-Endonuklease (FEN1) zu hemmen. Das eukaryotische Homolog der Hefe ist das Genprodukt von Rad27, ein Enzym, von dem man weiß, dass es eine wichtige Rolle bei der Instabilität von DNA-Wiederholungselementen spielt: Mutanten von Rad27 zeigen häufig DNA-Brüche und Instabilitäten der Kopienzahl. Diese Befunde deuten

darauf hin, dass auch hier Mechanismen aus dem Bereich der DNA-Replikation eine wichtige Rolle bei der Veränderung der Kopienzahl dieser DNA-Wiederholungselemente spielen. Allerdings zeigt das gewebespezifische Auftreten von expandierenden Tripletts in replikationsarmen Geweben (wie in Teilen des Gehirns), dass es sich dabei wahrscheinlich eher um Reparaturprozesse handelt, die Elemente der Replikationsmaschinerie mitbenutzen, als um Fehler in der DNA-Replikation selbst. Dieser Befund zeigt aber darüber hinaus auch, dass neben der ererbten Kopienzahl die weitere Erhöhung der Kopienzahl in bestimmten Geweben im Laufe des Lebens für den Zeitpunkt (und den Schweregrad) der Erkrankung entscheidend sind. Die expandierenden Tripletts betreffen vor allem drei Bereiche der Gene (Abb. 9.15): ï nicht-codierende Elemente (Promotor oder Enhancer-Bereiche, 3’-UTR), die dazu führen, dass das betroffene Gen abgeschaltet wird (loss of function bzw. Haploinsuffizienz, z. B. beim fragilen X-Chromosom-Syndrom) oder das Transkript in seiner Stabilität betroffen ist (Spinocerebellare Ataxie 8); ï die Ausbildung von Glutamin(Gln)-reichen Wiederholungssequenzen im translatierten Protein (CAG = Codon für Gln, z. B. Chorea Huntington). Offensichtlich sind lange Poly-Glutamin-Bereiche toxisch für die Zelle (z. B. durch die Bildung größerer Aggregate im Zellkern, engl. nuclear inclusions);

9.3 Spontane Mutationen

Protein: Funktionsverlust RNA: Funktionsgewinn Protein: Funktionsgewinn Forschungsbedarf

codierend

(CAG)n in AR (CAG)n in SCA1, SCA2, SCA3, CACNA1A, SCA7, TBP (GCG)n in PABP2 (CTG)n in JPH3

(CAG)n in Huntingtin

nicht-codierend

5‘ UTR

Exon

(CGG)n in FMR1 (CCG)n in FMR2 (CGG)n in FMR1 (CAG)n in PPP2R2B

Intron

Exon

Intron

(GAA)n in FRDA (ATTCT)n in ATXN10 (CCTG)n in ZNF9

Abb. 9.15 Mögliche Position von Wiederholungseinheiten in Genen. Die schematische Darstellung zeigt alle wichtigen Wiederholungseinheiten mit ihren möglichen Positionen in einem Gen. Die Farben deuten an, welcher Mechanismus dem jeweiligen Krankheitsbild zugeordnet wird. Die Wiederholungseinhei-

Exon

3‘ UTR

(CTG)n in DMPK (CTG)n in SCA8

ten oberhalb des Gens befinden sich in codierenden Abschnitten, wohingegen die Wiederholungseinheiten, die unterhalb des Gens dargestellt sind, nicht-codierende Bereiche betreffen. Erklärung der Gensymbole siehe Tab. 9.3, Abb. 9.14 (Nach Brouwer et al. 2009, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

ï die Wiederholungssequenzen können das Spleißen der RNA beeinflussen und verändern so die Funktion des betroffenen Proteins. Neben den Faktoren, die die Wiederholungssequenzen direkt betreffen, gibt es auch noch weitere Faktoren, die einen Einfluss auf die Entwicklung der Krankheit haben. So spielt offensichtlich das Geschlecht eine wichtige Rolle bei der Übertragung von einer Generation auf die andere. Die meisten Fälle einer erblichen myotonen Dystrophie werden über die mütterliche Linie vererbt, wohingegen die jugendliche Form der Chorea Huntington über die Väter vererbt wird (Abb. 9.16). Obwohl der grundleAbb. 9.16 Das präzygote Modell der Expansion der FRA-X-Mutation. Dem Modell liegt die Annahme zugrunde, dass die Expansion einer maternalen Prämutation zu einer Vollmutation während der Meiose stattfindet. Die befruchtete Eizelle trägt ein Allel mit einer Vollmutation. Nach der Trennung von den somatischen Zellen (vgl. Abb. 8.26b) haben die zukünftigen Keimzellen eine Vollmutation. Einige Allele werden zu Prämutationen schrumpfen. Um zu erklären, warum Vollmutationen nur durch Frauen übertragen werden, muss es einige Selektionsmechanismen gegen Vollmutationen in der männlichen Keimbahn geben. In den reifen Hoden überwiegen Allele mit Prämutationen. In somatischen Zellen und in der weiblichen Keimbahn gibt es derartige Selektionsprozesse nicht. Zellen mit Prämutationen sind grün und Zellen mit Vollmutationen (FM) orange dargestellt. (Nach Brouwer et al. 2009, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

413

414

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

gende Mechanismus (expandierende Wiederholungssequenzen) offensichtlich einzigartig und charakteristisch für diese dynamischen Mutationen ist, ergeben sich für die jeweiligen Erkrankungen unterschiedliche Pathogenesemechanismen.

9.4 Induzierte Mutationen Im Gegensatz zu den Mutationen, die durch endogene Fehler hervorgerufen werden und die wir oben besprochen haben, stehen in diesem Abschnitt Mutationen im Vordergrund, die durch Umwelteinflüsse hervorgerufen werden. Dazu gehören Strahlung (UV-Licht, ionisierende Strahlung) und chemische Stoffe. Diese mutagenen Agenzien sind in unterschiedlicher Weise und in unterschiedlichem Ausmaß schon immer vorhanden oder von menschlichen Aktivitäten abhängig; daher wird hier beispielsweise nicht unterschieden, ob das UV-Licht von der Sonne oder aus dem Solarium kommt.

9.4.1 Mutationen durch ultraviolette Strahlung Ultraviolette Strahlung wirkt direkt auf die DNA ein. Wir unterscheiden drei Wellenlängenbereiche: UV-A (320‒400 nm), UV-B (280‒320 nm) und UV-C (200‒280 nm). UV-Strahlung verfügt nicht über genügend Energie, um tief in Gewebe einzudringen ‒ daher ist ihr Einfluss begrenzter als der anderer Strahlungsformen. Die Effekte von UV-Strahlung werden daher praktisch ausschließlich bei Einzellern und in Zellen an der Oberfläche multizellulärer Organismen beobachtet. Zwar ist die höchste Eigenabsorption von Nukleinsäuren bei 254 nm (UV-C), die

intensivste Wirkung entfalten UV-Strahlen allerdings im UV-B-Bereich. Die Wirkung ultravioletter Strahlung besteht in der Induktion von anomalen Pyrimidin-Dimeren (besonders Thymin-Dimeren) zwischen benachbarten Basen in der DNA. Durch Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen werden Cyclobutanringe (engl. cyclobutane pyrimidine dimers, CPD) gebildet, die zu einer Aufhebung der Basenpaarungen mit dem komplementären Strang der DNA führen (Abb. 9.17). Darüber hinaus spielen auch 6-4-Pyrimidin-Photoreaktionsprodukte eine wesentliche Rolle bei der Dimerenbildung. Purin-Dimere und Pyrimidin-Monoaddukte sind demgegenüber seltener. CPDs werden zwischen den 5,6-Bindungen von zwei an beliebigen Stellen nebeneinander liegenden PyrimidinBasen gebildet. 6-4-Pyrimidin-Photoreaktionsprodukte sind charakterisiert durch stabile Bindungen zwischen den Positionen 6 und 4 zweier benachbarter Pyrimidine und scheinen bevorzugt an 5’-TC- und 5’-CC-Sequenzen gebildet zu werden. In Säugerzellen sind CPDs für über 80 % der UV-B-induzierten Mutationen verantwortlich. Dabei sind offensichtlich 5-MethylcytosinReste besonders häufig in Mutationsereignisse verwickelt: einmal über die spontane Desaminierung zu Thymidin (S. 409) und zum anderen wegen der Verschiebung der Energieabsorption von 5-Methylcytosin zu höheren Wellenlängen gegenüber dem unmethylierten Cytosin. 5-Methylcytosin trägt in Säugerzellen signifikant zu Sonnenlicht-induzierten Mutationen bei. Demgegenüber ist die Bildung von Thymidin-Dimeren nicht die am häufigsten produzierte Dipyrimidin-Läsion nach Sonnenlichtexposition in Säugerzellen, auch wenn diese über Jahrzehnte als Äquivalent für UV-Schäden dargestellt wurde (für einen ausführlichen Überblick dazu siehe Pfeifer et al. 2005). Verschiedene Mechanismen, die an der UV-induzierten Mutagenese an CyclobutanDimeren beteiligt sind, zeigt Abb. 9.18.

Abb. 9.17 Mutagener Einfluss von UV-Strahlung. Zwischen nebeneinanderliegenden oder gegenüberliegenden Thymin-Basen werden unter dem Einfluss von UV-Strahlung überwiegend Cyclobutan-PyrimidinDimere (CPD) gebildet; es entstehen aber auch in nennenswertem Umfang 6-4-Photoreaktionsprodukte (6-4-PP). Beide können durch entsprechende Photolyasen wieder zurückgebildet werden. (Nach Essen u. Klar 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

9.4 Induzierte Mutationen m C AA GCC m

Replikation

CAA GT T

Replikation m C GG GCC m

Sonnenlicht

Reparatur m C GG GCC m

fehleranfällige Polymerase

m C GG G TU

Desaminierung

Desaminierung

m C GG G TC

Pol η

CAA G TU

fehlerfreie Replikation Pol η

C AG G TC

Replikation fehleranfällige Polymerase

Abb. 9.18 Mechanismen der UV-Mutagenese an CyclobutanPyrimidin-Dimeren (CPD). Der Sequenzkontext (5’-mCGG) ist besonders anfällig für CPD-Bildung durch Sonnenlicht wegen der Anwesenheit der Base 5-Metylcytosin (mC). Die Umgehung von CPD durch eine fehleranfällige DNA-Polymerase kann eine C→T- oder CC→TT-Mutation induzieren. Desaminierung kann innerhalb des CPD vorkommen und das 5-Methylcytosin alleine oder das 5-Methylcytosin und das benachbarte

m C AG GC C m

Replikation

C AG G TC

Cytosin zusammen betreffen (doppelte Desaminierung). Wenn das desaminierte CPD umgangen werden kann (hauptsächlich durch die fehlerfreie DNA-Polymerase η), wird eine C→TTransition oder eine CC→TT-Tandemtransition entstehen. Die Startsequenz ist durch ein blaues Kästchen gekennzeichnet; die Sequenzen, die durch die Mutation entstehen, sind rot umrahmt. (Nach Pfeifer et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Im Gegensatz zu UV-B induziert UV-A überwiegend oxidative Schäden an der DNA; entsprechend unterscheiden sich auch die Mutationsspektren, die durch UV-A und UV-B induziert werden. Typische oxidative DNA-Schäden sind die Bildung von 8-Oxo7,8-dihydro-2’-desoxyguanosin (8-oxo-dG) und DNAStrangbrüche. Ein Vergleich der UV-B- und UV-Ainduzierten Mutationsspektren ist in Abb. 9.19 dargestellt.

Abb. 9.19 Die Mutationsspektren von UV-B (oben) und UV-A (unten). Die Daten zeigen die Werte, wie sie in Maus-Fibroblastenzellen nach UV-A- (18J/cm2) bzw. UV-B-Bestrahlung (0.05J/cm2) mit einem Reportergen erhalten wurden. Die Mutationsraten stiegen insgesamt um das 4,6fache (UV-A) bzw. das 12fache (UV-B) an. Das UV-B-Spektrum unterscheidet sich vom UV-A-Spektrum vor allem durch den deutlich überwiegenden Anteil von C→T-Transitionen (inklusive der CC→TTTandemmutationen). UV-A erhöht dagegen deutlich den Anteil der G→T-Transversionen. (Nach Pfeifer et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

415

416

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

UV-B-Strahlung

induziert die Entstehung von Cyclobutanringen zwischen Pyrimidinen in der DNA. Eine besondere Rolle spielt dabei 5-Methylcytosin. Das Mutationsspektrum von UV-B unterscheidet sich deutlich von dem, das durch UV-A induziert wird.

9.4.2 Mutagenität ionisierender Strahlung Im Gegensatz zu UV-Licht vermag kürzerwellige Strahlung in Gewebe einzudringen und dort Mutationen zu induzieren. Die molekularen Mechanismen sind hierbei heterogen, da nur ein geringer Anteil der Mutationen durch die direkte Wirkung kurzwelliger Strahlung auf die DNA zustande kommt, während der Hauptteil solcher Mutationen auf den ionisierenden Effekten energiereicher Strahlung beruht. Ionisierende Effekte üben sowohl Röntgenstrahlung (engl. X-ray) als auch Protonen-, Neutronenstrahlung und α-, βund γ-Strahlung aus, wie sie von Radioisotopen emittiert wird. Die durch Ionisierung entstehenden Radikale sind in der Lage, Einzel- und Doppelstrangbrüche in der DNA, aber auch Veränderungen einzelner Basen hervorzurufen. Während Einzelstrangbrüche repariert werden können und seltener zu Mutationen führen, führen Doppelstrangbrüche entweder zu Chromosomenumlagerungen oder sind spätestens nach der Mitose für die betroffene Zelle durch Verlust von Chromosomenstücken letal. Auch Umlagerungen führen oft zu Aneuploidie und damit zum Zelltod (Kapitel 9.2.1). Doppelstrangbrüche sollten im Prinzip durch Reparaturprozesse entfernt werden können, da die Kontinuität des Chromosoms durch einen Bruch in der DNA nicht notwendigerweise sofort völlig zerstört wird. Vielmehr werden Chromosomen durch chromosomale Proteine in ihrer Struktur in einem ausreichenden Maß zusammengehalten, um eine Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen zu gestatten. Doppelstrangbrüche sind auch das primäre Ereignis bei somatischer Rekombination (Kapitel 9.3.1) sowie bei Transpositionsereignissen (Kapitel 9.2.3). Basenveränderungen als Folge energiereicher Strahlung erfolgen in Gegenwart von Sauerstoff durch freie Radikale, die durch die Ionisierung entstehen. Ihre Häufigkeit kann durch die in den Zellen vorhandenen Enzyme reduziert werden, deren spezielle Aufgabe es ist, freie Radikale oder entsprechende Oxidationsprodukte (z. B. H2O2) zu entgiften. Die Mutationsfrequenz ist hierbei stark abhängig vom physiologischen Zustand einer Zelle. Aktive Gene sind offenbar mutagenen Effekten besonders stark ausgesetzt. Das ist verständlich, da hier ja die DNA nicht durch eine Verpackung in chromosomale Proteine geschützt ist und somit der Radikal-Einwirkung unmittelbar zugänglich

ist. Umgekehrt sind Zellen, deren Genom sich in einem Ruhezustand befindet, wie etwa ruhende Pflanzensamen, weniger anfällig für mutagene Einflüsse.

Energiereiche Strahlung bewirkt vorwiegend Chromosomenbrüche. Diese Wirkung der Strahlung beruht vor allem auf ihrer ionisierenden Eigenschaft. Durch Strahlung entstehen auch freie Radikale und andere Oxidationsprodukte in der Zelle. Sie führen zu Basenveränderungen.

Röntgenstrahlung Die mutagene Wirkung von Röntgenstrahlung war durch H. J. Muller 1930 in genetischen Studien an Drosophila erkannt worden. In seinen Analysen machte er von der Ermittlung geschlechtsgebundener Letal-Mutationen Gebrauch. Die Arbeiten von Muller an Drosophila melanogaster hatten zwei grundlegende Parameter der mutagenen Wirkungen von Röntgenstrahlung erkennen lassen: ï Die Anzahl von geschlechtsgebundenen letalen Mutationen steigt, zumindest im niedrigen Strahlungsbereich, linear mit der verabreichten Strahlungsdosis, und ï die Anzahl von Mutationen ist kumulativ, d. h. es ist nicht von Bedeutung, ob eine bestimmte Strahlungsmenge in einer einzigen Dosis (akute Bestrahlung) oder in mehreren geringen Dosen (chronische Bestrahlung) verabreicht wird. Für höhere Strahlungsdosen verändert sich diese Relation, da hierbei einerseits nicht ohne Weiteres erkennbare Doppelmutationen auftreten können, die zu einer scheinbaren geringeren Zunahme der Mutationshäufigkeit führen. Vor allem aber verfälscht die mit der Strahlungsdosis zunehmende Häufigkeit des Zelltodes, der durch die physiologischen Auswirkungen der Strahlung verursacht wird, die Messung der Mutationsrate. Die Muller’schen Arbeiten wurden später an der Maus als Modellorganismus fortgesetzt. Die grundlegenden Arbeiten von Hertwig (1935), Brennecke (1937) und Schäfer (1939) an bestrahlten männlichen Mäusen zeigten, dass die Wurfgröße der Mäuse nach Verpaarung zunächst deutlich verkleinert ist und danach in eine vorübergehende sterile Phase übergeht. Da kein Effekt auf die Beweglichkeit der Spermien zu beobachten und die Zahl der befruchteten Eizellen unverändert war, musste man annehmen, dass die verminderte Wurfgröße auf den Tod der Embryonen nach der Befruchtung zurückzuführen war. In der Tat zeigten spätere Experimente, dass die Ursache dafür chromosomale Veränderungen waren, die durch die Bestrahlung an reifen Spermatozoen erzeugt wurden. In früheren Stadien der Spermatogenese werden über-

9.4 Induzierte Mutationen

Abb. 9.20 Ansätze zur Erfassung von Keimbahnmutationen in der Maus. Die verschiedenen Methoden beinhalten die Analyse von Spermien exponierter Männchen (Quadrate), des Inhalts der Gebärmutter von unbehandelten Weibchen (Kreise), die mit behandelten Männchen verpaart waren, oder der ersten Generation von Nachkommen (F1) aus Paarungen exponierter Männchen mit unbehandelten Weibchen. (Nach Singer et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Abb. 9.21 Mutationsraten bei verschiedener Dosisleistung. Die Mutationsraten für Maus-Spermatogonien (aus verschiedenen Ergebnissen des Spezifischen-Lokus-Tests; Abb. 9.20) sind offensichtlich nicht nur von der Gesamtdosis (angegeben in R) abhängig, sondern auch von der dabei verwendeten Dosisleistung (blaue Punkte: hohe Dosisleistung: 72–90 R/min = „akute Belastung“; rote Punkte: niedrige Dosisleistung: 0,8 R/ min und niedriger = „chronische Belastung“). Die Daten sind mit ihren 90%-Vertrauensgrenzen angegeben. (Nach Russell u. Kelly 1982, mit freundlicher Genehmigung des Autors)

wiegend kleinere Deletionen erzeugt. Eine Übersicht über die verschiedenen Methoden zur Abschätzung

des genetischen Risikos von Strahlung (aber auch von Chemikalien, Kapitel 9.4.3) in Mäusen gibt Abb. 9.20. Allerdings haben sich nicht alle Ergebnisse der Muller’schen Experimente an Säugetieren bestätigt. So ist es beispielsweise durchaus ein Unterschied, ob dieselbe Strahlenbelastung mit hoher oder niedriger Dosisleistung aufgenommen wird; ein klassisches Beispiel dazu ist in Abb. 9.21 dargestellt.

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Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Abb. 9.22 a, b Biologische Dosimetrie. Dargestellt ist die Ausbeute an dizentrischen Chromosomen in Lymphocyten des peripheren Blutes bei Menschen in Abhängigkeit von der absorbierten Strahlungsdosis. Es fällt dabei auf, dass im Bereich niedriger Dosen nicht immer eine lineare Dosis-Wir-

kungs-Beziehung besteht. a Für Neutronen und Röntgen- bzw. γ-Strahlung; b für geladene Partikel (die Energie ist jeweils in MeV in Klammern angegeben). (Nach Edwards 1997, mit freundlicher Genehmigung von Kluge Carden Jennings Publisher)

Abb. 9.23 Sterblichkeitsrisiko für solide Tumoren und für Leukämie bei den Überlebenden des Atombombenabwurfs auf Hiroshima und Nagasaki. Die Werte sind mit den zugehörigen Standardabweichungen für jeden Dosispunkt angegeben (oben: Sterblichkeit aufgrund solider Tumore; unten: Sterblich-

keit aufgrund von Leukämie). Die Diagramme auf der rechten Seite zeigen in höherer Auflösung den Bereich niedriger Organdosen (bis 200 mSv). Es sind dabei die Untersuchungen von 1950 bis 1990 berücksichtigt. (Nach Kellerer 2000, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Strahlenbelastung des Menschen

wird dieses Verfahren als Biologische Dosimetrie bezeichnet. Es kann eingesetzt werden, wenn der Verdacht besteht, dass eine Person einer erhöhten Strahlenbelastung ausgesetzt war. Beispiele für die nicht immer linearen Dosis-Wirkungs-Beziehungen verschiedener Strahlenarten sind in Abb. 9.22 aufgeführt.

Die Bestimmung von Chromosomenaberrationen kann auch zur Bestimmung der personenbezogenen Strahlendosis von Menschen verwendet werden. Es werden dazu die Lymphocyten des peripheren Blutes herangezogen. Im Gegensatz zu den physikalischen Verfahren, die die Strahlung an einem Ort bestimmen,

9.4 Induzierte Mutationen

Abb. 9.24 Strahlenbelastung nach dem Tschernobyl-Unfall. Die Verteilung des radioaktiven Niederschlags in Europa ist am Beispiel des 137Cs gezeigt. (Nach De Cort et al. 1998, mit freundlicher Genehmigung der Europäischen Kommission)

Zwei Ereignisse haben uns die Wirkung von radioaktiver Strahlung in grausamer Weise vor Augen geführt: die Atombombenabwürfe auf Hiroshima und Nagasaki am Ende des 2. Weltkrieges (im August 1945) und der Unfall im Kernkraftwerk Tschernobyl (im April 1986 in der früheren Sowjetunion); der Störfall im amerikanischen Kernkraftwerk Harrisburg (1979) blieb dagegen weitgehend folgenlos. Die Folgen der beiden Atombombenabwürfe wurden sehr intensiv untersucht. Neben den Todesfällen gleich danach wurde in den Folgejahren eine massive Zunahme an Krebserkrankungen festgestellt, besonders an Leukämie und Dickdarmkrebs. Dabei fällt auf, dass im Bereich der niedrigen Dosis keine besondere Zunahme zu beobachten war (Abb. 9.23). Die Zunahme der Krebserkrankungen bei den betroffenen Patienten ist auf Zunahme der Mutationen in den Körperzellen (somatische Zellen) zurückzuführen. Die Untersuchungen an etwa 50 % der Nachkommen überlebender Atombombenopfer zeigten keine signifikanten Unterschiede cytologisch messbarer chromosomaler Veränderungen (Übersicht in Verger 1997). Die Belastung durch den radioaktiven Niederschlag nach dem Tschernobyl-Unfall war dagegen offensichtlich anders. Hier wurden vor allem 137Cs, 90Sr und 131J, aber auch 239Pu und 240Pu freigesetzt. Die radioaktive Wolke breitete sich bis nach Skandinavien und Mitteleuropa aus; einen Überblick über die Belastung der Böden mit 131J im Kerngebiet des Unfalls, im Dreiländereck von Russland, Weißrussland und der Ukraine,

gibt Abb. 9.24. Besonders die Belastung mit radioaktivem Jod führte in den folgenden Jahren zu einer massiven Zunahme der Erkrankungen von Kindern und Jugendlichen an Schilddrüsenkrebs, wobei die Häufigkeit mit der aufgenommenen Schilddrüsendosis korreliert (Abb. 9.25). Die nächsten Jahre werden zeigen, mit welchen weiteren Krankheitsbildern wir noch rechnen müssen.

9.4.3 Chemische Mutagenese Nukleotidveränderungen können durch eine große Zahl chemischer Agenzien induziert werden, wobei eine Reihe unterschiedlicher chemischer Mechanismen eine Rolle spielen. Solche chemisch induzierten Mutationen hatten eine große Bedeutung für die Aufklärung des genetischen Codes und haben damit wesentliche Beiträge zur Aufklärung der molekularen Grundlagen der Vererbung und Genfunktion geliefert und liefern sie auch heute noch. In zunehmendem Maße gewinnen sie heute eine praktische Bedeutung durch die weite Verbreitung mutagener Substanzen in unserer Umwelt, vor allem in unserer Nahrung. Die mutagenen Effekte solcher Substanzen übertreffen in ihrem Ausmaß gegenwärtig wahrscheinlich bei Weitem die der energiereichen Strahlung. Hierbei darf nicht unerwähnt bleiben, dass chemische Mutagene auch in normalen, d. h. natürlichen Nahrungsmitteln enthalten sind, ohne dass sie – etwa

419

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

12

Jugendliche

Kinder (0-14) Jugendliche (15-18) junge Erwachsene (19-34)

10

11,3

9,7

9,5

Fälle pro 100.000 Einwohner

420

8

6,6

6,9

6 5,6 4,0

4

3,4

3,5

2,3

2 1,2

0,8 0,3

0,1

0,3 0,2

1,4 0,4

2,9 1,0

4,2

3,8

2,9

5,7 4,9

4,2 3,1

3,2

3,0

1,9

2,1

2,6 1,4

0,8

5,7

junge Erwachsene

3,4 2,6 2,5 1,7

Kinder

0,7

0,0 0 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002

zur Stabilisierung, Färbung oder aus Geschmacksgründen – absichtlich hinzugefügt wurden oder unbeabsichtigt aus der Verpackung in Nahrungsmittel gelangen. Sie sind entweder natürliche Bestandteile der Nahrungsstoffe oder entstehen durch Stoffwechselprozesse im Körper. Zu solchen Nahrungsbestandteilen können z. B. Glykoside gehören. Diese können sich, nach Abspaltung des Zuckers, die im Darm bakteriell erfolgt, in reaktive und damit mutagene Verbindungen verwandeln. Solche Stoffwechselprozesse können z. B. zur Entstehung von Darmkrebs führen. Nach der Art ihres Wirkungsmechanismus unterscheiden wir als chemische Mutagene die folgenden Gruppen mutagener Agenzien (Tabelle 9.4): ï Basenanaloga; ï basenmodifizierende Agenzien, die sich grob unterteilen lassen in ï alkylierende Agenzien, ï depurinierende Agenzien, ï desaminierende Agenzien, ï hydroxylierende Agenzien u. a.; ï interkalierende Agenzien; ï Crosslinking-verursachende Agenzien. Die Wirkungsweise chemischer Mutagene unterscheidet sich nicht nur von der vorher besprochenen strahleninduzierten Mutagenese, sondern jede Gruppe von Chemikalien hat auch ihr eigenes Wirkungsspektrum. Innerhalb der einzelnen Gruppen sind natürlich auch noch Unterschiede zu beachten, so z. B. in Bezug auf

Abb. 9.25 Schilddrüsenkrebs aufgrund der Strahlenbelastung nach dem Tschernobyl-Unfall. Es ist jeweils die Anzahl der Schilddrüsenkrebserkrankungen pro 100.000 Einwohner in verschiedenen Altersgruppen in Weißrussland angegeben. Die Spitze der Häufigkeit bei Kindern wurde 1996 registriert, 10 Jahre nach dem TschernobylUnfall. Die Gruppe der Jugendlichen zeigte ihr Maximum später (2001), danach beginnt die Häufigkeit abzunehmen. In der Gruppe der jungen Erwachsenen ist dagegen noch immer eine Zunahme zu beobachten. (Nach Cardis et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung der IOP Publishing Ltd und Y. E. Dimidchik)

die Reaktionsgeschwindigkeit oder die Basenspezifität innerhalb der Gruppe der alkylierenden Agenzien. Allerdings kommt es auch immer auf den betrachteten Endpunkt an. So ist Ethylnitrosoharnstoff (engl. ethylnitrosourea, ENU; Abb. 9.27) ein relativ schwaches Mutagen, wenn man seine Wirkung auf die Häufigkeit der Induktion von Schwesterchromatidenaustauschen betrachtet (Abb. 9.35). Allerdings hat es sich als besonders wirksam bei der Erzeugung von Punktmutationen in Keimzellen erwiesen. Es wird daher in der experimentellen Mutationsforschung bei Drosophila, Pflanzen und Mäusen gerne eingesetzt, um eine große Zahl an Nachkommen mit erblichen Defekten zu erhalten (siehe dazu z. B. Hrabé de Angelis et al. 2000). In Tabelle 9.5 ist der Unterschied im Mutationsspektrum zwischen spontan auftretenden, strahlen- und ENUinduzierten Mutationen am Beispiel des „spezifischen Locus-Tests“ der Maus dargestellt, der sieben rezessive Gene umfasst, welche als sichtbare Marker leicht erkannt werden können (die Gene betreffen vor allem Fellfarben). Die Belastung mit chemischen Mutagenen ist für den Menschen von ähnlicher Bedeutung wie die Belastung mit Strahlung. Daher wurde auch die kombinierte Wirkung dieser beiden Klassen mutagener Agenzien untersucht. Dabei zeigte sich, dass in vielen Fällen eine überadditive Wirkung auftritt, wenn man es mit der jeweiligen individuellen Wirkung unter den entsprechenden Testbedingungen vergleicht (z. B. bei der Kombination von Röntgenstrahlen und alkylierenden Agenzien auf die Ausbildung einer Leukämie; UNSCEAR 2000).

9.4 Induzierte Mutationen

Tabelle 9.4 Mutagene und ihre Wirkung Trivialname

Chemische Bezeichnung

Wirkung, Besonderheiten

Senfgas

Di-(2-chlorethyl)sulfid

Transitionen u. a.

EMS

Ethylmethansulfonat

Ethylierung von Basen, aktiviert fehlerhafte Reparatur

EES

Ethylethansulfonat

Ethylierung von Basen, aktiviert fehlerhafte Reparatur

ENU

Ethylnitrosoharnstoff

Ethylierung von Basen, aktiviert fehlerhafte Reparatur

MNNG

N-Methyl-N’-nitro-Nnitrosoguanidin

Desaminierung; besonders wirksam während der Replikation

5-BU

5-Bromouracil

Transitionen durch Tautomerie

5-BrdU

5-Bromodeoxyuridin

Transitionen durch Tautomerie

2-AP

2-Aminopurin

Transitionen durch Tautomerie

Proflavin

2,9-Diaminoacridin

Leserasterverschiebungen durch Interkalation

Acridinorange

Dimethyl-2,8diaminoacridin

Leserasterverschiebungen durch Interkalation

Alkylierende Agenzien

Basenanaloga

Acridinfarbstoffe

Desaminierende Verbindungen Schweflige Säure

Oxidative Desaminierung von A, G und C, ergibt Transitionen

Salpetrige Säure

Oxidative Desaminierung von A, G und C, ergibt Transitionen

HA

Hydroxylamin

GC→AT-Transitionen durch Hydroxylierung der NH2-Gruppe von C

Benzo(a)pyren

3,4-Benzpyren (reaktive Verbindung: 7,8-Diol-9,10-oxid)

Entstehung reaktiver Diol-Epoxid-Radikale im Stoffwechsel

Andere

Vinylchlorid

indirekt durch Stoffwechselzwischenprodukte

Aflatoxin B1

indirekt durch Stoffwechselzwischenprodukte

Tabelle 9.5 Relative Mutationshäufigkeiten Behandlung

Gene agouti (a)

brown (b)

chinchilla (c)

dilute (d)

short ear (se)

pink-eyed (ps)

spotting (s)

Kontrolle

0

7 (46 %)

3 (20 %)

1 (7 %)

0

4 (27 %)

0

Strahlung

2 (1 %)

34 (20 %)

18 (10 %)

25 (14 %)

2 (1 %)

22 (13 %)

71 (41 %)

ENU

10 (6 %)

21 (12 %)

25 (14 %)

37 (21 %)

10 (6 %)

61 (35 %)

9 (5 %)

Häufigkeitsverteilung der betroffenen Gene im spezifischen Locus-Test der Maus (vgl. Abb. 9.20) nach Behandlung der Tiere mit unterschiedlichen Mutagenen (Strahlung: Röntgen- oder γ-Strahlung) im Vergleich zu dem wichtigsten experimentellen Mutagen, Ethylnitrosoharnstoff (engl. ethylnitrosourea, ENU), und mit spontanen Mutationen. Nach Favor (1994)

421

422

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Aufgrund vieler experimenteller Hinweise wurde im Rahmen des 1981 erlassenen Chemikaliengesetzes vorgeschrieben, dass alle Chemikalien, die neu auf den Markt kommen, auch auf ihre mutagene Wirkung getestet werden müssen; für Stoffe, die schon länger am Markt waren, wurde diese Überprüfung nachträglich durchgeführt (dies geschah natürlich nicht in einem deutschen Alleingang, sondern war innerhalb der OECD und der EU eng abgestimmt; andere Staaten haben daher ähnliche Gesetze). In Kapitel 9.5.1 werden einige Testsysteme dazu vorgestellt.

ï 5-Bromouracil (5-BU) oder 5-Bromodeoxyuridin (5-BrdU), die in ihrer stabileren Ketoform mit Adenin paaren, in der instabileren Enolform mit Guanin (Abb. 9.26). ï 2-Aminopurin (2-AP), das in seiner stabilen Aminoform mit Thymin paart, in der instabileren Iminoform mit Cytosin (Abb. 9.26).

Basenverluste Der Verlust von Basen kann spontan oder durch chemische Agenzien erfolgen. Er wird durch die APEndonuklease (engl. apurinic acid endonuclease) erkannt, die die Phosphodiesterbindung neben der fehlenden Base löst und damit für die DNA-Polymerase I ein freies 3’-Ende zur DNA-Neusynthese vorbereitet. Nach Einbau einer begrenzten Anzahl von Nukleotiden wird der reparierte DNA-Einzelstrang durch eine Ligase geschlossen. Normalerweise sollte hier also aufgrund des gewöhnlichen DNA-Synthesemechanismus automatisch das richtige Nukleotid eingebaut werden und keine Mutation resultieren. Ein Basenverlust kann jedoch auch durch Desaminierung eines Cytosins erfolgen, da die N-glykosidische Bindung dieser Base weniger stabil ist als die der übrigen Basen und insbesondere bei höheren Temperaturen destabilisiert wird. Wie wir bereits gesehen haben (Abb. 9.11), wird hier eine Basensubstitution von GC nach AT induziert.

Basenveränderungen können sich spontan aufgrund der chemischen Eigenschaften (Instabilität und Tautomerie) von Nukleinsäurekomponenten ereignen oder durch chemische Einflüsse von außen induziert werden.

Basensubstitutionen durch Tautomerie und Basenanaloga Obwohl die tautomeren Formen der Basen sehr instabil sind und daher selten vorkommen, können sie gelegentlich während der Replikation zu Basenaustauschen führen. So kann beispielsweise die Iminoform des Adenins mit Cytosin Wasserstoffbrücken ausbilden und damit zum Fehleinbau eines Nukleotids führen (Abb. 9.12 und 9.13). Eine größere Rolle bei Mutationen spielen jedoch tautomere Formen von Basenanaloga, also Verbindungen, die anstelle einer bestimmten normalen Base in die DNA eingefügt werden können. Es handelt sich hierbei um geringfügig modifizierte Formen von Basen, die eine stärkere Tendenz zur Ausbildung ihrer tautomeren Formen besitzen als die normalen Basen. Experimentell häufig verwendete Basenanaloga sind:

Abb. 9.26 Basenpaarungen mit Basenanaloga. Die selteneren tautomeren Formen der Basenanaloga bilden sich mit größerer Häufigkeit als die der normalen Basen

9.4 Induzierte Mutationen

Die Ausbildung der seltenen tautomeren (Imino- bzw.

Enol-)Formen der Basen in der DNA oder die Substitution von Basen durch Basenanaloga (z. B. 2-Aminopurin oder 5-Bromouracil) führt zu Veränderungen von Basenpaaren in Zusammenhang mit der Replikation.

Die Wirkung alkylierender Agenzien Das erste bekannte chemische Mutagen, Senfgas (engl. mustard gas; chemische Bezeichnung: Bis(2-chlorethyl)sulfid oder 2,2’-Dichlordiethylsulfid), wurde während des 2. Weltkrieges von Charlotte Auerbach in Edinburgh unter militärischer Geheimhaltung untersucht. Die Ergebnisse wurden nach Kriegsende veröffentlicht (eine Zusammenfassung findet sich bei Auerbach 1978). Alkylierende Agenzien

-Methylguanin

gehören zu den effektivsten mutagenen Verbindungen. Agenzien wie Ethylmethansulfonat (engl. ethylmethane sulfonate, EMS) und Ethylnitrosoharnstoff (engl. ethylnitrosourea, ENU) werden daher, und aufgrund ihres großen Wirkungsspektrums, in der experimentellen Mutagenese bevorzugt verwendet (Abb. 9.27). Sie können, wie alle übrigen basenmodifizierenden Verbindungen, die DNA auch ohne Replikation verändern, da sie vorhandene Basen in der DNA modifizieren. Angriffspunkte für Alkylierung sind – neben den an der Wasserstoffbrückenbildung beteiligten Molekülpositionen – insbesondere der N7 des Guanins und der N3 des Adenins. Alkylierung dieser Positionen destabilisiert die N-glykosidischen Bindungen der betreffenden Basen und führen daher zu Depurinierung mit ihren bereits besprochenen Konsequenzen.

Abb. 9.27 Mutagene Wirkung alkylierender Agenzien. Das an der Position O6 alkylierte Guanin kann nicht mehr 3, sondern nur noch 2 Wasserstoffbrücken ausbilden (rote Striche). Es paart daher bei der Replikation nicht mehr mit Cytosin, sondern mit Thymin unter Ausbildung von 2 Wasserstoffbrücken. Bei der nächsten Replikationsrunde wird die Mutation dann dadurch fixiert, dass das Thymin sich wie üblich mit einem Adenin paart – aus einem G/C-Paar wird dann ein A/T-Paar. Darunter: Einige wichtige alkylierende Verbindungen

423

424

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Eine weitere besonders anfällige Position ist der O6 des Guanosins (Abb. 9.27), der leicht methyliert wird und dadurch O6-Methylguanosin bildet. Diese modifizierte Base paart während der folgenden Replikationen häufig mit Thymin statt mit Cytosin. In E. coli dient eine O6-MethylguanosinMethyltransferase als Schutzmechanimus gegen diese Methylierung, dieses Enzym wird vom ada-Gen codiert. Sie kann bei Methylierungen des Zucker-Phosphat-Rückgrats die Methylgruppen aus der DNA entfernen. Das ada-Gen vermittelt der Zelle einen etwas ungewöhnlichen Adaptationsmechanismus (engl. adaptive response): Zellen, die man unter Zusatz einer niedrigen Dosis eines methylierenden Agens (z. B. Nitrosoguanidin, Abb. 9.27) kultiviert hat, besitzen eine stark erhöhte Resistenz gegen methylierende Verbindungen, die auf einer stark erhöhten zellulären Konzentration des von ada codierten Enzyms beruht. Vergleichbare Mechanismen der Entfernung von Methylgruppen durch Methyltransferasen wurden auch bei Eukaryoten gefunden. DNA-ReparaturMethyltransferasen sind als Enzyme etwas ungewöhnlich, weil sie durch die Übernahme der Methylgruppe von der DNA inaktiviert werden, also keine wiederholbare katalytische Aktivität besitzen. Man bezeichnet sie auch als Selbstmord-Enzyme (engl. suicide enzymes). Andere alkylierte Basen werden mithilfe von Glykosylasen aus der DNA entfernt. Durch Alkylierungen wird auch das Gleichgewicht der tautomeren Formen der Basen in Richtung der selteneren tautomeren Formen verschoben. Solche Basenmodifikationen führen zu: ï Basenpaarsubstitutionen während der Replikation; ï Fehlern in der RNA-Synthese mit allen Konsequenzen falscher Codons für die Proteinsynthese; ï Crosslinking innerhalb der DNA oder der DNA mit Proteinen; ï DNA-Brüchen und als Folge davon Chromosomenaberrationen.

Alkylierung von Nukleinsäuren führt zu Depurinie-

rung von Nukleotiden, Fehlpaarungen methylierter Basen, zu Verschiebungen im Gleichgewicht tautomerer Formen oder zu Crosslinking. Folgen davon sind Fehlpaarungen von Basen während der Replikation, Hemmung der Replikation, Fehler bei der RNA-Synthese und Chromosomenaberrationen.

Die Wirkung desaminierender und hydroxylierender Verbindungen Wie der Name bereits anzeigt, werden durch desaminierende Verbindungen die Aminogruppen der Basen

Abb. 9.28 Die Wirkung verschiedener Mutagene (vgl. Tabelle 9.4)

Adenin, Guanin und Cytosin abgespalten, sodass Hypoxanthin, Xanthin oder Uracil entstehen. Hypoxanthin paart mit Cytosin, sodass hierdurch eine Basenpaarsubstitution von AT nach GC erfolgt. Xan-

9.4 Induzierte Mutationen

Abb. 9.30 Modell der Interkalation durch Ethidiumbromid (EtBr). Aufgrund der flachen Molekülstruktur kann sich EtBr (blau) zwischen die gestapelten Basenpaare schieben. Dadurch kann es während der Transkription und Replikation zu Störungen kommen (Einbau bzw. Verlust von Nukleotiden). (Nach Munk 2001, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Abb. 9.29 Interkalierende Verbindungen. Die flachen Ringe schieben sich zwischen die Basenpaare in der DNA-Doppelhelix und verursachen dadurch Deformationen der Doppelhelix. Hierdurch kommt es zu Replikationsfehlern, insbesondere zu Leserahmenverschiebungen

thin paart unverändert ‒ wenn auch mit einer Wasserstoffbrückenbindung weniger ‒ mit Cytosin, sodass eine Desaminierung von Guanosin ohne Folgen bleibt, während die Substitution von Cytosin zu Uracil und schließlich (durch Exzisionsreparatur) zu Thymin führt. Die wichtigste desaminierende Verbindung ist salpetrige Säure (Tabelle 9.4, Abb. 9.28). Hydroxylamin (HA) induziert, wahrscheinlich durch Hydroxylierung der Aminogruppe des Cytosins, während der Replikation eine Paarung von Cytosin mit Adenin, sodass es zu einer Substitution von GC-Basenpaaren durch AT-Basenpaare kommt. Man bezeichnet solche Veränderungen von einer Purinbase in die andere (A in G oder G in A) oder von einer Pyrimidinbase in eine andere als Transitionen, während der Austausch von Purinbasen gegen Pyrimidinbasen (oder umgekehrt) Transversionen sind (Abb. 9.1).

Desaminierende und hydroxylierende Agenzien induzieren Basenveränderungen.

Die Wirkung interkalierender Verbindungen Interkalierende Verbindungen haben ihren Namen daher erhalten, dass sie sich zwischen die Basen der DNA-Doppelhelix einfügen (Tabelle 9.4, Abb. 9.29 und 9.30). Es handelt sich meist um polyzyklische Verbindungen wie Acridinfarbstoffe (z. B. 2,8-Diaminoacridin = Proflavin oder Acridinorange), die sich aufgrund ihrer flachen Konformation zwischen die Basenpaare einschieben können. Sie erzeugen daher eine lokale Deformation der Doppelhelix, die zu Replikationsfehlern führt. Als Folge hiervon kann es zu Deletionen oder zum zusätzlichen Einbau von Basenpaaren kommen. Interkalierende Verbindungen können daher gezielt zur Erzeugung von Veränderungen des Leserasters (engl. frameshift mutations) eingesetzt werden.

Interkalierende Agenzien fügen sich zwischen die Basenpaare in der DNA-Doppelhelix ein und verursachen dadurch Replikationsfehler (Leserasterverschiebungen).

Crosslinking Verschiedene chemische Verbindungen können kovalente Bindungen mit den Basen einer DNA-Doppelhelix eingehen. Eine für experimentelle Vernetzung gebrauchte Verbindung ist das Psoralen (Abb. 9.31),

425

426

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

gene Wirkung wegen ihrer relativen chemischen Inaktivität und ihrer geringen Wasserlöslichkeit zunächst gar nicht erwarten würde. Solche Verbindungen entstehen unter anderem bei der Verbrennung organischen Materials. Abb. 9.31 Psoralen. Dieses Furocumarin (und seine Derivate) kann DNA nach Interkalieren vernetzen. Die 4’,5’- oder 3,4-Doppelbindung (rot) des Psoralen reagiert in einer Photoreaktion bei langwelligem UV-Licht mit den 5,6-Doppelbindungen von Pyrimidinen in der DNA unter Bildung eines Cyclobutanrings (Abb. 9.17). Liegt eine weitere Pyrimidinbase im komplementären Strang der DNA vor, so kann die noch freie der beiden reaktiven Doppelbindungen des Psoralens mit dieser in einer weiteren Photoreaktion einen weiteren Cyclobutanring ausbilden, sodass nunmehr ein kovalentes Crosslinking der DNA vorliegt. Psoralen kann auf dieser Grundlage auch zur Demonstration von Doppelstrangregionen in RNA dienen. Außerdem kann es Nukleinsäuren auch kovalent an Proteine binden, sodass die Bindungsstellen von Proteinen an DNA ermittelt werden können. (Nach Wiesehahn u. Hearst 1978, mit freundlicher Genehmigung der Nationalen Akademie der Wissenschaften der USA)

Ein Beispiel für ein solches Mutagen mit hoher krebserzeugender (cancerogener) Wirkung ist das Benzpyren, unter anderem ein Bestandteil des Zigarettenrauches (Abb. 9.32). Als polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoff ist seine chemische Reaktivität nicht sehr hoch. Im Organismus werden derartige inerte Kohlenwasserstoffe jedoch zu wasserlöslichen Verbindungen umgesetzt, die dann ausgeschieden werden können. Bei solchen Umsetzungen werden häufig Zwischenprodukte gebildet, die eine hohe mutagene Wirkung ausüben können. So werden Oxidationsprodukte geformt (z. B. stark reaktive DiolEpoxid-Derivate), die dann mit der Aminogruppe des Guanin reagieren können.

das zunächst in der DNA interkaliert und dann unter Lichteinfluss (360 nm) sowohl mit einzelnen als auch mit zwei Basen kovalente Bindungen eingehen kann. Sind zwei Basen komplementärer DNA-Stränge eine Bindung mit einem Psoralenmolekül eingegangen, so wird die Replikation und Transkription der Doppelhelix unterbunden. Auch einige Antibiotika, wie Mitomycin C, verursachen solche Vernetzungen innerhalb der DNA. Sowohl pro- als auch eukaryotische Zellen können Crosslinks mittels ihrer Reparaturmechanismen entfernen. Hierbei sind jedoch oft eine direkte Exzision der betroffenen Basen und eine anschließende DNANeusynthese durch DNA-Polymerase nicht möglich, da das komplementäre Nukleotid aufgrund der Vernetzung nicht als Template dienen kann. In einem solchem Fall werden zur Reparatur der Nukleotid-Exzisionsmechanismus (NER) oder der RekombinationsReparaturmechanismus aktiviert (S. 439). An beiden Mechanismen ist in diesem Fall eine spezielle DNAPolymerase, die E. coli-DNA-Polymerase II (polB) beteiligt.

Viele chemische Mutagene üben ihre Wirkung durch Intermediärprodukte ihres Stoffwechsels im Organismus aus, die wasserlöslich und oft besonders reaktiv sind. Insbesondere Oxidationsprodukte spielen hierbei eine wichtige Rolle.

9.5 Mutagenität und Mutationsraten Betrachtet man die unterschiedlichen relativen Mutationshäufigkeiten in der Maus nach Bestrahlung oder Behandlung mit ENU (Tabelle 9.5), ist es verständlich, dass wohl jedes Gen sein eigenes Mutationsspektrum besitzt, das noch dazu für unterschiedliche Mutagene variiert. In der Tat können sich die Mutationsraten verschiedener Gene über zwei Größenordnungen voneinander unterscheiden (10−5 bis 10−7 Mutationen je Zellgeneration; Tabelle 9.6).

Mutationsraten sind nicht einheitlich, sondern variieren stark.

9.5.1 Mutagenitätstests

Vernetzung führt zu Replikationsfehlern.

Andere Mutagene Es gibt eine große Anzahl anderer chemischer Mutagene, deren Wirkungsmechanismen oft nicht bekannt sind bzw. auf unterschiedlichen Wegen ablaufen können. Überraschenderweise gehören dazu auch viele organische Verbindungen, von denen man eine muta-

Eine wichtige Aufgabe der angewandten Genetik ist es, die Mutagenität chemischer Verbindungen zu testen. Man hat hierfür eine Reihe von Testmöglichkeiten entwickelt, die ein abgestuftes Verfahren ermöglichen und die bakterielle Testsysteme, Zellkulturen und verschiedene Tierversuche einschließen. Diese gestuften Verfahren ermöglichen eine gute Abschätzung der Eigenschaften von Verbindungen, die möglicherweise mutagen sind.

9.5 Mutagenität und Mutationsraten

Abb. 9.32 a, b Mutagene Wirkung von Benzolderivaten. a Die Aktivierung von Aflatoxin B1 (AFB1), 2-Acetylaminofluoren (AAF) und Benz[a]pyren (BP) benötigt die Aktivität der Cytochrom-P450-abhängigen Monooxygenasen (CYPs). Die an sich inerten Moleküle werden dadurch zunächst oxidiert und hydroxyliert und somit löslich. CYP3A4 aktiviert AFB1 an der 8,9-Doppelbindung, wodurch das Exo-8,9-oxid entsteht. AAF wird durch CYP1A2 in das N-Hydroxy-AAF umgewandelt, was durch eine Sulfotransferase-Reaktion (SULT) schließlich in die genotoxische Form, das N-Sulphoxy-AAF, überführt wird. BP wird zunächst durch CYP1A1 oder CYP1B1 in das 7,8-Epoxid

umgewandelt (nicht dargestellt). In der weiteren Umsetzung zu Benzpyren-7,8-diol-9,10-epoxid (BPDE) wird es stark reaktiv. b Von den verschiedenen stereoisomeren Formen hat das (+)-anti-BPDE das größte genotoxische Potenzial. Mit GuaninResten der DNA kann es eine kovalente Bindung eingehen. Diese Komplexe führen zur Deformation der Doppelhelix, die Reparaturmechanismen (Kapitel 9.6) in Gang setzen, aber dabei zu G→T-Transversionen führen. Die roten Pfeile zeigen auf die Stellen, an denen der nukleophile Angriff durch die DNA erfolgen kann. (Nach Luch 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Ames-Test

ï zusätzliche erbliche Defekte in der Zellwand der Bakterien, die diese besonders permeabel für Chemikalien machen und ï ein Plasmid, das die mutagene Wirkung durch Plasmid-Gene verstärkt, die dem umu-Gensystem verwandte Funktionen ausüben (S. 440).

Der gegenwärtig wichtigste mikrobiologische Test ist der Ames-Test, der durch Bruce Ames 1973 eingeführt wurde (Abb. 9.33). Man verwendet dabei mehrere genetisch verschiedene Stämme von Salmonella thyphimurium. Diese besitzen: ï unterschiedliche Mutationen im his-Gen (HistidinGen) und sind zugleich durch eine uvrB-Mutation (S. 436) in ihrem Reparatursystem defekt und daher besonders empfindlich gegen Mutagene;

Der Test beruht auf einer Suche nach Revertanten von einer his−-Konstitution zur his+-Konstitution der Zellen. Da in verschiedenen Salmonella-Stämmen unterschied-

427

428

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Tabelle 9.6 Mutationsraten Organismus Bakteriophage T2

E. coli

Gen

Rate

r nach r (Reversion)

1 × 10 −8

je Replikation

h+ nach h

3 × 10 −9

je Replikation

lac − nach lac + (Reversion)

2 × 10 −7

je Zellteilung

2 × 10 −6

je Zellteilung

4 × 10 −4

je Zellteilung

6 × 10

−8

je Zellteilung

+

+

his nach his

−

Streptomycinresistenz −

try nach try

+

Chlamydomonas reinhardtii

pens nach penr

1 × 10 −7

je Zellteilung

Neurospora crassa

ad− nach ad+ (Reversion)

4 × 10 −8

in asexuellen Sporen

Saccharomyces cerevisiae

his− nach his+

Histidinunabhängigkeit (Reversion) ad− nach ad+

3 × 10 −9

in asexuellen Sporen

Argininunabhängigkeit (Reversion)

9 × 10 −7

in asexuellen Sporen

Sh nach sh

1 × 10 −6

je Generation

Su nach su

2 × 10

je Generation

y + nach y

1 × 10−4

je Keimzelle

bw + nach bw

3 × 10 −5

je Keimzelle

Mus musculus

D nach d

3 × 10 −5

je Keimzelle

Homo sapiens

+ nach Hämophilie A

3 × 10 −5

je Keimzelle

+ nach albino

3 × 10 −5

je Keimzelle

+ nach Duchenne’sche Muskeldystrophie

1 × 10 −4

je Keimzelle

+ nach Achondroplasie

7 × 10

−5

je Keimzelle

+ nach Chorea Huntington

1 × 10 −6

je Keimzelle

+ nach Retinoblastom

2 × 10 −5

je Keimzelle

+ nach Neurofibromatose

3–25 × 10−5

je Keimzelle

Zea mays

Drosophila melanogaster

−6

Gene in der Reihenfolge ihrer Nennung: r: rapid lysis, h: host range, lac: β-Galaktosidase, his: hixtidine auxotrophy, try: Tryptophansynthetase, pen: Penicillin resistence, ad: adenine independence, Sh: Shrunken, su: sugary, y: yellow, bw: brown eyes, D: Dilution. +: von Wildtyp (gesund)

liche his-Mutationen verfügbar sind, die entweder Basensubstitutionen oder Leserastermutationen innerhalb der Protein-codierenden Region des his-Gens besitzen, kann man unterschiedliche Arten der mutagenen Wirkung erfassen. Hierzu plattiert man die Bakterienzellen auf Agarplatten mit einem niedrigen Titer von Histidin zusammen mit einer Mikrosomenfraktion aus Rattenleber aus, um ein limitiertes (auxotrophes) Wachs-

tum und die Replikation der Zellen zu ermöglichen. Viele Mutagene werden erst durch die Replikation effektiv, wie wir zuvor gesehen haben (S. 423). Die Mikrosomen (bei der Zellfraktionierung aus dem endoplasmatischen Reticulum entstehende Membranfragmente, die sich zu Vesikeln zusammenschließen) enthalten Enzyme (z. B. Oxidasen), die imstande sind, potenzielle Mutagene umzusetzen. Dadurch ist es möglich, zugleich auch

9.5 Mutagenität und Mutationsraten

Abb. 9.33 Ames-Test. Verschiedene Histidinmangelmutanten von Salmonella typhimurium werden mit einer Spur Histidin auf einem Glucose-Minimalmedium angezüchtet; nur die Zellen, die zur Histidin-Unabhängigkeit revertieren (His+), können Kolonien bilden. Die ursprüngliche geringe Menge an Histidin erlaubt den Zellen einige wenige Teilungen, in denen eine Mutation auftreten und fixiert werden kann. Die His+-Revertanten können als Kolonien gegenüber einem leichten Hintergrundwachstum leicht gezählt werden. Die Kontrolle zeigt die spontane Mutationsrate an. Wenn ein Mutagen zur Platte dazugegeben wird, erhöht sich die Zahl der Revertanten pro Platte; üblicherweise ist diese Zunahme dosisabhängig. Die Verwendung unterschiedlicher Histidinmutanten gestattet die Analyse der Art der mutagenen Wirkung (Basenpaarsubstitutionen oder Leserasterverschiebungen, vgl. Tabelle 9.1). (Nach Mortelmans u. Zeiger 2000, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

die mutagene Wirkung von zumindest einigen der Stoffwechselprodukte der getesteten Verbindung zu erfassen. Man bestimmt anschließend die Anzahl von Revertanten zu his+ ‒ also zu prototrophem Wachstum ‒ auf normalen Agarplatten ohne Zusatz und auf solchen, denen die Testverbindung zugefügt wird. Umfangreiche Daten lassen heute erkennen, dass man größenordnungsmäßig etwa 80–90 % der krebserregenden Verbindungen mithilfe dieses Tests als mutagen identifizieren kann(Abb. 9.34). Ein ebenso hoher Prozentsatz nicht-karzinogener Verbindungen weist keine mutagenen Wirkungen in diesem Test auf. Damit hat dieser relativ billige und einfach durchzuführende Test eine Schlüsselrolle als Mutagenitäts- und Karzinogenitätstest erlangt. Durch den Einschluss von Säugerzellbestandteilen in Form der Lebermikrosomenfraktion schließt das Testsystem eine säugerspezifische Komponente ein. Die hohe Sensitivität des Tests wird

Abb. 9.34 a, b Mutagene Wirkungen im Ames-Test. Zwei Salmonella-Histidinmangelmutanten (TA98, TA100) wurden in der in Abb. 9.33 beschriebenen Weise getestet. Reversionen im Stamm TA98 beruhen auf Leserastermutationen, wohingegen Reversionen im Stamm TA100 durch Basenpaarsubstitutionen hervorgerufen werden. a Aflatoxin B1 erweist sich im Ames-Test als starkes Mutagen, das vor allem Basensubstitutionen induziert. Hiervon unterscheidet sich seine Wirkung zur Induktion von Leserastermutationen im Stamm TA98, die nur vergleichweise gering ist. b Kaffeesäure (3,4-Dihydroxyzimtsäure) zeigt im Ames-Test unter Verwendung des Teststamms TA100 eine deutliche, dosisabhängige anti-mutagene Antwort. Im Stamm TA98 ist dieser Effekt nicht so deutlich ausgeprägt. (Nach Karekar et al. 2000, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

deutlich, wenn man sich vor Augen hält, dass man mit ihm bereits nachweisen kann, dass Kondensate des Rauches von 1/100 einer Zigarette deutliche mutagene Effekte anzeigen.

Der Ames-Test ist ein wichtiges bakterielles Testsystem zur ersten Abschätzung einer möglichen mutagenen Wirkung von chemischen Verbindungen.

429

430

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Schwesterchromatidenaustausch Für manche Mutagene ist jedoch die direkte Verwendung von Säugerzellkulturen als Testsystem wichtig, bevor man auf direkte Tierversuche an Ratten oder Mäusen übergeht, die nach wie vor unentbehrlich sind. In Zellkulturen kann die mutagene Wirkung durch die Häufigkeit der Induktion von Schwesterchromatidenaustauschen (engl. sister chromatid exchange, SCE) ermittelt werden. Deren Nachweis beruht auf der Eigenschaft von Chromosomen, die über einen von zwei Zellzyklen in BrdU-haltigem Medium gewachsen sind, nach Giemsa-Färbung eine unterschiedlich starke Färbung der beiden Chromatiden zu zeigen. Die schwächere Färbung wird durch den Gehalt an BrdU in der einen Chromatide verursacht. Da die Zellen über einen Zellzyklus ohne BrdU gewachsen sind, besitzt die zweite Chromatide nur einen BrdU-markierten DNA-Strang. Lässt man die Zellen nun in Gegenwart von Mutagenen wachsen, so wird die Anzahl der SCEs drastisch erhöht. Man konnte zeigen, dass die Häufigkeit von SCEs eine direkte Korrelation zur Mutagenität der betreffenden Induktorsubstanzen aufweist (Abb. 9.35). Natürlich kann man auf diesem Wege nur Substanzen identifizieren, die Chromosomenbrüche verursachen, während Basensubstitutionen und andere Mutationen unentdeckt bleiben.

Mutagenitätstests

an Säugerzellkulturen können durch die Ermittlung der Häufigkeit der Induktion eines Schwesterchromatidenaustausches erfolgen. Damit wird die Häufigkeit von Chromosomenaberrationen ermittelt.

Test auf Aneuploidie Aneuploidien führen bei Menschen oft zu Fehlbildungen oder – häufiger – zu Fehlgeburten. Es ist daher wichtig zu wissen, ob Chemikalien diese Mutationsereignisse auslösen können. Als Testsystem eignen sich dafür natürlich Mäuse; es bedarf aber auch einer sehr sensitiven und spezifischen Methode, Fehlverteilungen einzelner Chromosomen nachzuweisen. Wie wir bereits an früherer Stelle gesehen haben (Abb. 6.4), können chromosomenspezifische DNA-Proben eingesetzt werden, um einzelne Chromosomen spezifisch

Abb. 9.36 a, b Aneuploidie-Test mit Mausspermien. a Darstellung BrdU-positiver und -negativer Spermien der Maus. Die Spermien wurden mit einem fluoreszierenden Anti-BrdU-Antikörper markiert (grün) und mit Propidiumiodid gegengefärbt (rot). b Beispiel für fünf Disomien (X88, Y88, YY8, XX8 und XY8) und eine Diploidie (XX88) in Mausspermien. Es wurden die Geschlechtschromosomen (X, Y) und das Chromosom 8 untersucht. (Nach Adler et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Abb. 9.35 Zwischen der Häufigkeit der Induktion von Genmutationen und der Induktion von Schwesterchromatidenaustauschen (SCEs) in ovarialen Zellen des chinesischen Hamsters besteht eine lineare Beziehung. Das gilt für so unterschiedliche Mutagene wie Mitomycin C, Proflavin, Ethylmethansulfonat (EMS) und N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff (ENU). (Nach Carrano et al. 1978, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

9.5 Mutagenität und Mutationsraten

anzufärben. Verbunden mit einer guten Bildverarbeitung ist es leicht möglich, Diploidien als eine besondere Form der Aneuploidie in Spermien behandelter Mäuse zu erkennen. Voraussetzung für diese Untersuchung ist allerdings, dass es in den Reifeprozessen der Spermien zu keinen Verzögerungen in den Meiosen kommt, was durch den spezifischen Einbau von BrdU überprüft wird (Abb. 9.36a). Das Beispiel in Abb. 9.36b zeigt fünf disome Spermien (d. h. mit einem zusätzlichen Chromosom) und ein diploides Spermium nach Behandlung der Maus mit Chemikalien. In diesen Versuchen zeigte sich, dass Diazepam (Valium ) und Griseofulvin (ein Fungizid) Disomien und Diploidien induzieren können, wohingegen andere Stoffe nur Diploidien (z. B. Carbendazim, Pestizid; Thiobendazol, Wurmmittel) oder nur Disomien (z. B. Colchizin, Spindelgift; Trichlorfon, Pestizid) induzieren. Ein quantitativer Vergleich der Mausdaten nach Valiumbehandlung mit entsprechenden Proben männlicher Patienten mit chronischem Valium-Missbrauch deutet allerdings darauf hin, dass die Keimzellentwicklung bei Männern 10- bis 100-mal empfindlicher ist als die der Maus (Adler et al. 2002).

Der Mikrokerntest Doppelstrangbrüche, die nicht repariert werden, oder chromosomale Rearrangements durch falsch reparierte Brüche führen zu chromosomalen Anomalitäten, die durch die oben genannten Tests nur unzureichend erfasst werden. Diese Veränderungen können zwar durch klassische cytogenetische Techniken erkannt werden, allerdings nur unter hohem Zeitaufwand. Für schnelle Routineuntersuchungen wurde deshalb der Mikrokerntest entwickelt. Mikrokerne werden sichtbar in Zellen, die sich teilen und Chromosomen enthalten, die keine Centromere (acentrische Chromosomen) enthalten und/oder solche Chromosomen, die nicht zu den Polen wandern können. In der Telophase bildet sich um diese zurückgelassenen Chromosomen (fragmente) eine Hülle; später entspiralisieren sich die Chromosomen und erscheinen wie ein Interphasekern ‒ eben nur kleiner, daher der Name „Mikrokern“. Die Zahl der Mikrokerne in einem Präparat (z.B. aus dem Knochenmark behandelter Mäuse) ist ein Maß für induzierte Chromosomenbrüche bzw. Chromosomenverluste. In einer modifizierten Form kann dieses Testsystem auch in Zellkulturen angewendet werden (Fenech 2000).

Transgene Mäuse in der Mutagenitätstestung Um quantitative Risikoabschätzungen an einem Säugetier durchzuführen, stand lange Zeit nur der schon beschriebene spezifische Locus-Test bei der Maus (Abb. 9.20) zur Verfügung. Allerdings versuchte man schon bald, auf der Basis transgener Mäuse empfindli-

chere Testsysteme zu etablieren. Diese sind unter der Bezeichnung „MutaMouse“ und „Big Blue Mouse“ bekannt geworden. Sie verwenden das bakterielle lacZ bzw. lacI als Reportergen für die Mutationen (Abb. 9.37a). Die Reportergene sind jeweils in das MausGenom als Teil eines λ-„Shuttle“-Vektors integriert, der leicht als Phagenpartikel aus der genomischen Maus-DNA durch in-vitro-Verpackung erhalten werden kann. Die transgenen Mäuse, die den λ-Vektor tragen, werden mit der Testsubstanz behandelt, und die mutierten Phagen werden aufgrund der Farbe der Plaques bei der Anwesenheit von X-Gal erkannt. Im lacZ-System werden farblose oder hellblaue Plaques vor einem blauen Hintergrund als Mutanten bewertet, wohingegen im lacI-System blaue Plaques vor einem farblosen Hintergrund Mutationen anzeigen. Obwohl die Entwicklung dieses transgenen Assays zur Entdeckung von Mutationen in jedem Gewebe eines lebenden Tieres ein epochales Ereignis war, ist die Methode doch sehr zeitaufwendig und teuer. Daher wurde bald das cII-Gen als Reportergen eingesetzt, das eine Positiv-Selektion ermöglicht und mit seiner geringen Größe (300 bp) auch schnell sequenziert werden kann (es kann in beiden Maussystemen – MutaMouse und Big Blue Mouse – eingesetzt werden). Das λ-CIIProtein ist eine essenzielle Komponente in der Entscheidung über vegetative Vermehrung oder Lysogenisierung, die ein Bakteriophage nach der Infektion einer Wirtszelle trifft (Kapitel 4.6). Dieses System ist ein exzellentes Beispiel einer fruchtbaren Zusammenarbeit verschiedener genetischer Teildisziplinen zur eleganten Lösung eines gemeinsamen Problems, hier der Abschätzung von Mutationsraten. Alle drei Reportergene (lacZ, lacI, cII) haben in allen Geweben etwa die gleiche spontane Mutationsrate (10−5). Man geht davon aus, dass die spontanen Mutationen im Wesentlichen durch Desaminierung von 5-Methylcytosin im Dinukleotid CpG hervorgerufen werden, da bakterielle Transgene in Säugerzellen sehr stark methyliert sind. Wegen diesem starken Hintergrund von Basenpaaraustauschen sind seltene Mutationen wie Deletionen nur schwer zu erkennen. Es gibt auch Hinweise, dass dieses System gegenüber der genotoxischen Wirkung von γ-Strahlen unempfindlich ist. Daher wurde die Spi−Selektion in das System eingeführt (engl. sensitive to P2 interference, Abb. 9.37b). Die Besonderheit dieser Form der Spi−-Selektion besteht darin, dass sie bevorzugt Deletionen im λ-Phagen erkennt und positiv selektioniert. Allerdings ist die Größe der Deletion wegen der Größenbeschränkung der Verpackung des λ-Genoms auf etwa 10 kb begrenzt (die lineare λ-DNA benötigt zwei cossites, die durch 38 bis 51 kb DNA getrennt sein müssen; vgl. S. 113). Um jetzt das System noch weiter zu optimieren, wurde das gpt-Gen als zusätzliches Reportergen für Punktmutationen eingeführt: Das gpt-Gen kodiert für

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432

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Abb. 9.37 a, b Mutationstest mit transgenen Mäusen. a Schema des Mutationsassays mit lacZ-, cII- und lacI-Genen der MutaMouse oder der Big Blue Mouse. b Schema des gpt-delta-Mutagenitätstests: Zwei verschiedene E. coli-Wirtszellen werden mit einem λEG10-Phagen infiziert. Der eine E. coli-Stamm (YG6020) exprimiert Cre-Rekombinase für die 6-Thioguanin(6TG)-Selektion und der andere ist lysogen für die Spi−-Selektion. In den Zellen, die Cre-Rekombinase exprimieren, wird die λEG10-DNA in ein Plasmid umgeformt, das die Gene gpt und cat (codiert für Chloramphenicol-Acetyltransferase) trägt. Die E. coliZellen, die Plasmide tragen, die im gpt-Gen mutiert sind, können auf Platten mit 6-TG und Chloramphenicol positiv selektioniert werden. Mutierte λEG10-Phagen, denen die red/gam-Genfunktion fehlt, können als Spi−Plaques in P2-lysogenen E. coli-Zellen positiv selektioniert werden. Dadurch können die Mutationsraten von Punktmutationen und Deletionen in der gleichen DNA-Probe verglichen werden. (Nach Nohmi et al. 2000, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

eine Guaninphosphoribosyl-Transferase und modifiziert 6-Thioguanin (6-TG) in eine Substanz, die für E. coli toxisch ist, sodass nur Mutanten überleben können, bei denen das gpt-Gen entweder durch Deletionen oder Punktmutationen zerstört ist. Da das gpt-Gen nur 456 bp groß ist, kann die Punktmutation auch schnell durch Sequenzierung charakterisiert werden; dieses System ist als „gpt delta“ bekannt. In der Praxis wird vielfach vorgeschlagen, eine Batterie bestehend aus verschiedenen einfachen Mutagenitätstest vor der Einführung neuer Chemikalien, pharmazeutischer Produkte o. Ä. durchzuführen. Dazu gehören in der Regel ein Mutagenitätstest auf der Basis des Salmonellen-Systems, ein Test auf chromosomale Aberrationen in

CHO-Zellen oder humanen Lymphocyten sowie ein Mikrokerntest aus dem Knochenmark von Maus oder Ratte. Tabelle 9.7 gibt einen Überblick über das derzeitige Testprotokoll, das die EU für die Überprüfung auf genotoxische Wirkungen einer Chemikalie vorschreibt. Das Protokoll ist abhängig von der jeweiligen Anwendung der Chemikalie; in anderen industrialisierten Ländern gibt es ähnliche Regularien.

9.5.2 Mutationsraten und Evolution Vor etwa 75 Jahren postulierte Haldane (1935), dass die männliche Mutationsrate bei Menschen deutlich höher sei als die weibliche, da die männlichen Keimzellen wesentlich mehr Zellteilungen und damit DNA-Repli-

9.5 Mutagenität und Mutationsraten

Tabelle 9.7 EU-Testschema auf genotoxische Wirkungen von Chemikalien Chemikalie Industrieprodukte Erste Stufe

Pestizide

Pharmazeutische Stoffe

Tierarzneimittel

NahrungsHaarfärbemittelmittel zusatzstoffe

Bakterielle Genmutationen in-vitroin-vitro-Test auf Test auf CA Genmutationen (Säugerzellen) (bevorzugt MLA)

in-vitro-MLA oder CA

in-vitro-MN oder CA

Wenn positiv, Test auf KeimzellEffekte

in-vitro-Test auf Genmutationen (bevorzugt MLA)

in-vitro-MN oder CA

Wenn positiv: in-vivo-MN oder CA Zweite Stufe

Kosmetika

in vitro-CA in vitro-MN in vitro-UDS in-vitro-SHE-CT

Wenn positiv: in-vivo-Test

Wenn in vivo positiv, Test auf Keimzell-Effekte

In Einzelfällen können weitere Tests nötig werden. CA: Chromosomenaberration; MLA: Maus-Lymphoma-Assay; MN: Mikrokerntest; UDS: ungerichtete DNA-Synthese; SHE-CT: Zell-Transformationstest in Zellen des syrischen Hamsters (für oxidative Substanzen). Nach Cimino (2006)

kationsrunden pro Generation erleben, als dies bei weiblichen Keimzellen der Fall ist. Diese Hypothese ist in der Zwischenzeit zwar weitgehend akzeptiert, allerdings war die Größenordnung des Verhältnisses der männlichen zur weiblichen Mutationsrate (ausgedrückt als Faktor α) lange Zeit umstritten. Die Kenntnis dieser Größenordnung ist wichtig, um zu wissen, ob die Mutationsrate im Wesentlichen durch Fehler während der DNA-Replikation verursacht wird. Darüber hinaus besteht die Frage, ob es eine schnellere „molekulare Uhr“ für solche Organismen gibt, die eine kürzere Generationszeit haben als solche mit einer langen Generationszeit („Generationszeit-Hypothese“). Frühere Arbeiten benutzten eine direkte Methode, um Mutationsraten zu bestimmen (wobei sich die nachfolgenden Betrachtungen im Wesentlichen auf Punktmutationen beziehen). Am Beispiel der X-gekoppelten Bluterkrankheit Hämophilie A (S. 645) wurde bei 119 Patienten ein Wert für α von 15 berechnet; dieser Wert deckte sich zunächst mit vielen Beobachtungen an anderen Krankheiten. Allerdings treten die beobachteten Mutationen an wenigen Stellen gehäuft auf, die als CpG-Dinukleotide charakterisiert werden können. In Säugerzellen wird nämlich das C in einem CpG-Dinukleotid relativ häufig methyliert; Desaminierung verändert das Methylcytosin zu einem Thymin, das damit eine C→T-Transition bewirkt (S. 409).

Da Methylierung in der DNA der Spermien häufiger vorkommt als in Oocyten, scheint dies zunächst die höhere Mutationsrate zu erklären. Es werden allerdings auch C→G-Transversionen beobachtet, daher kann man die Methylierung dafür nicht verantwortlich machen. Zusammen gesehen wird deutlich, dass die unterschiedliche Methylierung und nachfolgende Transitionen nicht die Hauptursachen dafür sind, dass man bei Menschen einen relativ hohen Wert für α findet. So zeigen vergleichende Untersuchungen an ausgewählten Genen bei höheren Primaten, Katzen, Nagern und Vögeln, dass es offensichtlich einen deutlichen „Generationszeit-Effekt“ gibt – der Wert für α ist bei höheren Primaten etwa 3-mal so hoch wie bei Nagern und wird mit etwa 5 bis 6 angegeben (Li et al. 2002). Weitere Daten zeigen, dass offensichtlich darüber hinaus auch die chromosomale Region die Mutationsrate beeinflusst. So haben benachbarte Gene ähnlich hohe (oder auch ähnlich niedrige) Mutationsraten. Dies gilt auch über Speziesgrenzen hinweg im Vergleich Maus – Mensch – Schimpanse. Dabei korrelieren Regionen mit einem hohen GC-Gehalt auch mit einer höheren Mutationsrate. Es deutet viel darauf hin, dass dabei Rekombinationsereignisse die Entstehung von Mutationen wesentlich beeinflussen. So korreliert die hohe Mutationsrate in der pseudoauto-

433

434

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

somalen Region des Y-Chromosoms deutlich mit ihrer hohen Rekombinationsrate. Warum Mutationsraten mit Rekombinationsraten verknüpft werden können, lässt sich nach Untersuchungen an Hefe und Säugetieren erklären. Offensichtlich ist die Reparatur von Doppelstrangbrüchen während der Rekombination ein mutagener Prozess. Es gibt Arbeiten, die darauf hindeuten, dass ein hoher GC-Gehalt die Rekombinationshäufigkeit erhöht. Neben der Desaminierung des C wäre dies eine weitere Erklärung dafür, dass Mutationen bevorzugt an CpG-Dinukleotiden auftreten. Ein dritter wichtiger mutagener Mechanismus in der Evolution ist die Verdopplung von Genomfragmenten. Die Analyse des menschlichen Genoms hat gezeigt, dass es zu etwa 5 % aus verstreuten Verdopplungen besteht, die in den vergangenen 35 Millionen Jahren entstanden sind. Es können dabei zwei Kategorien unterschieden werden: segmentale Duplikationen zwischen nicht homologen Chromosomen einerseits und andererseits Duplikationen, die im Wesentlichen auf ein Chromosom beschränkt bleiben. Letztere entstehen vor allem durch ungleiche Crossingover und führen zur Bildung von Clustern eng verwandter Gene (z. B. Globin-Gene, Hox-Gene, einige Kristallin-Gene). Ein weiterer möglicher Mechanismus der Genduplikation besteht in der Wirkung von Transposons, wobei hier beide Möglichkeiten (intraund interchromosomale Duplikation) in der Evolution realisiert wurden. Diese „segmentale Evolution“ ist von Vorteil, denn durch sie können vielfach neue Funktionen ausprobiert werden, ohne alte zu verlieren, wie das normalerweise bei Mutationen der Fall ist. Das menschliche Y-Chromosom (Kapitel 12.3.4) liefert auch dafür ein gutes Beispiel. Denn der Bereich, der nicht zur pseudoautosomalen Region gehört (und das sind immerhin ca. 57 Mb der insgesamt 60 Mb; Abb. 12.35), liegt als haploide Region in männlichen Zellen vor. Damit fehlt ihm der natürliche Rekombinationspartner, und so bleiben die Kombinationen der verschiedenen Allele auf dem Y-Chromosom in der Regel über Generationen männlicher Verwandter hinweg unverändert. Chromosomale Rearrangements sind also selten, sodass die überwiegende Zahl der Mutationen einfach verfolgt werden kann. Studien an Y-Chromosomen sind daher besonders interessant, weil sie überwiegend nur solche Mutationen zeigen, die das Ergebnis intraalleler Prozesse sind; rekombinatorische Prozesse, die in anderen Chromosomen hinzukommen, entfallen hier. Daher kann man in populationsgenetischen Untersuchungen erwarten, dass im Y-Chromosom eine geringere Häufigkeit

von Sequenzunterschieden als im übrigen Genom zu finden ist, was auch tatsächlich beobachtet wurde. Auf der Basis dieser Untersuchungen ist es auch möglich, verwandtschaftliche Zusammenhänge verschiedener menschlicher Populationen im evolutionären Zusammenhang darzustellen. Auch die Forschung am Y-Chromosom stützt die These, dass Vorfahren der heutigen Menschen vor etwa 70.000– 50.000 Jahren aus Afrika ausgewandert sind (Kapitel 14.1).

9.6 Reparaturmechanismen Zellen verfügen über verschiedene Reparaturmechanismen, die Schäden an der DNA entfernen können. Die Mechanismen dafür sind zum Teil auch von der Art des Schadens abhängig (z. B. die Photolyase-Reaktion zur Entfernung der Thymidin-Dimere; Abb. 9.17). Sie haben unterschiedliche Genauigkeitsgrade, mit der die Reparatur durchgeführt wird: So ist zwar die SOSReparatur (Kapitel 9.6.3) sehr störanfällig, erlaubt aber der Zelle trotz eines großen Schadens überhaupt zu überleben. Dagegen sind Reparaturmechanismen genauer, die eher über Rekombinationsmechanismen ablaufen. Die Überprüfung der DNA auf mögliche Schäden und deren erfolgreiche Reparatur ist häufig auch Voraussetzung für den Eintritt der DNA in die Mitose. Die Überprüfung an geeigneten „Checkpoints“ (Kapitel 5.3.5) kann den Fortschritt im Zellzyklus so lange verlangsamen, bis die Reparatur stattgefunden hat. Oftmals spielen veränderte Struktureigenschaften der geschädigten DNA eine wichtige Rolle bei ihrer Erkennung. Wir können also zwischen Schäden unterscheiden, die vor der DNA-Replikation entstanden sind und repariert werden (z. B. Doppelstrangbrüche), und solchen, die während der Replikation erkannt werden und die Replikation stoppen. Wichtige Untersuchungen dazu wurden nach Bestrahlung bei Hefen durchgeführt; daher tragen viele Gene aufgrund ihrer strahlenbiologischen Geschichte die Bezeichnung „RAD“ im Namen. Im Folgenden sollen einige der wichtigsten Reparaturmechanismen vorgestellt werden.

9.6.1 Reparatur UV-induzierter DNA-Schäden durch Photolyasen Einer der wichtigsten UV-induzierten DNA-Schäden ist die Bildung von Cyclobutan-Pyrimidin-Dimeren (CPDs). In archaischen Zeiten (vor 3,2‒2,5 Milliarden Jahren) bestand kein Ozon-Schutzschild auf der Erde, sodass die UV-Strahlung der Sonne ungefiltert auf der Erde ankam. Man nimmt an, dass damals die DNA-

9.6 Reparaturmechanismen a

Klasse-II-CPD-Photolyasen Methanobacterium thermoautotrophicum

Arabidopsis thaliana Chlamydomonas reinhardtii

Myxococcus xanthus

Drosophila melanogaster Fowlpox virus

6-4-Photolyasen

Danio rerio, 64PHR

Potorous tridactylis Monodelphis domestica

Xenopus laevis, 64PHR

Oryzias latipes

Drosophila melanogaster, 64PHR

Carassius auratus Arabidopsis thaliana, 64PHR

Anacystis nidulans

Streptomyces griseus

Synechocystis sp. PCC6803

Thermus thermophilus

Halobacterium halobium Thermus thermophilus Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae

Salmonella typhimurium Neurospora crassa

Trichoderma harzianum

Klasse-I-CPD-Photolyasen

b

T4-Endonuklease V

Photolyase 3

3

2

2 4

H3 H4

1

4

H2B H2A

H3 H4

1

H2B H2A

5

5

5‘ 0

5‘ 3‘

6

effiziente Reparatur >34 % moderate Reparatur 34–24 % ineffiziente Reparatur <24 %

Abb. 9.38 a, b Reparatur von UV-Schäden durch Photolyasen. a Das Dendrogramm zeigt die Sequenz-Beziehungen innerhalb der verschiedenen Photolyase-Subfamilien. In den fett gedruckten Arten wurden die Enzyme der KlasseI-CPD-Photolyasen bereits als Kristalle dargestellt. b Ortsspezifische Reparatur von CPDs in einem rekonstituierten Nukleosom durch E. coli-Photolyase (links) und durch T4-

0

3‘

6

effizienter Schnitt >18 % moderater Schnitt 8–18 % ineffizienter Schnitt <8 %

Endonuklease V (rechts). Relativ effiziente Reparatur und Einschnitte werden an den Stellen beobachtet, an denen die DNA durch H2A-H2B gebunden ist und das Zucker-Phosphat-Rückgrat zur Spitze des Nukleosoms hin orientiert ist. (a nach Essen u. Klar 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer; b nach Thoma 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

435

436

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

schädigende Wirkung des UV-Lichts etwa 3 Größenordnungen höher war als heute. Wenn man diese Umweltsituation annimmt, ist es nicht verwunderlich, dass sich bei Archaebakterien, Eubakterien und Eukaryoten ein effizientes Reparatursystem gegenüber UVSchäden entwickelt hat. Das verantwortliche Enzym wurde als Flavoprotein charakterisiert und wegen der lichtabhängigen Reaktion zunächst als „photoreaktivierendes Enzym“ bezeichnet; heute hat sich die Bezeichnung „Photolyase“ allgemein eingebürgert. Die Photolyase ist neben der NAD(P)H-abhängigen Oxidoreduktase in der Chlorophyll-Biosynthese photosynthetischer Organismen das einzige lichtabhängige Enzym. Photolyasen reparieren sowohl die CPDs als auch die 6-4-Photoprodukte (Abb. 9.17) in einer lichtabhängigen Reaktion. Es handelt sich dabei um monomere Proteine mit einem Molekulargewicht von 45‒66 kDa. Abhängig von ihrer Substratspezifität können wir zwei Klassen unterscheiden: CPD-Photolyasen reparieren CPD-Schäden in doppel- und einzelsträngiger DNA, während die 6-4-Photoprodukte durch 6-4-Photolyasen repariert werden; die CPD-Photolyasen können noch weiter in Klasse-I- und Klasse-IICPD-Photolyasen unterteilt werden (Abb. 9.38a). Bei Tieren und Menschen zeigen die Cryptochrome eine hohe Sequenzähnlichkeit zu den Photolyasen (40 bis 60 % Sequenzidentität). Alle Photolyasen und Crypotochrome besitzen FAD (Flavin-Adenin-Dinukleotid) als lichtempfindlichen Cofaktor und Chromophor. In Photolyasen überträgt dieser Cofaktor nach der Anregung ein Elektron vorübergehend auf die schadhafte Stelle der DNA, um die Reparatur über einen Radikalmechanismus anzutreiben. Die Reparatur beinhaltet die Spaltung der Pyrimidin-Dimere, wobei nahes UVoder blaues Licht (λ = 320‒500 nm) zur Anregung verwendet wird. Voraussetzung für die erfolgreiche Reparatur ist allerdings die freie Zugänglichkeit der Schadstelle im Nukleosom (Abb. 9.38b).

UV-induzierte Dimere können mithilfe von Reparatur-

mechanismen aus der DNA entfernt werden. Durch Photolyasen werden Cyclobutan-Dimere und 6-4-Photoprodukte enzymatisch unter Lichteinwirkung entfernt.

9.6.2 Exzisionsreparaturen Fehlpaarungen in der DNA können auch durch das Ausschneiden der schadhaften Stelle repariert werden (Exzisionsreparatur). Wir unterscheiden dabei drei Wege: Die Basen-Exzisionsreparatur (BER) entfernt vor allem UV-A-induzierte oxidative DNA-Schäden; die Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) entfernt UV-Binduzierte Photoprodukte, wobei die 6-4-Photoprodukte

5-mal schneller abgebaut werden als CPD; im Gegensatz zur Phospholyase-Reaktion verläuft NER lichtunabhängig. Andere Substrate für NER sind DNA-Schäden, die durch polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe hervorgerufen werden sowie durch Substanzen, die zur Vernetzung von DNA führen (z. B. Cisplatin). Eine dritte Variante ist die Fehlpaarungsreparatur (engl. mismatch repair), die falsch gepaarte Basen erkennt oder kleine DNA-Schlaufen, die durch das Schlittern der DNA an repetitiven Sequenzen während der Replikation entstehen. In E. coli ist dafür die DamMethylase verantwortlich, die alle Adenine in der 5’-GATC-3’-Sequenz methyliert. Unmittelbar ist zunächst nur der Elternstrang methyliert, der neu synthetisierte Strang aber noch nicht. Durch eine Reihe verwandter Mutator-Proteine (MutS, MutL, MutH) sowie Exonukleasen, Helikasen, DNA-Polymerase III, Einzelstrang-bindende Proteine (SSB) und Ligasen wird die fehlerhafte Stelle erkannt und repariert. Wenn trotz dieser Reparaturmechanismen der Schaden bestehen bleibt, gibt es Polymerasen, die die Schadstelle umgehen können (engl. translesion synthesis); das Enzym, das in diesem Zusammenhang am besten untersucht ist, ist die DNA-Polymerase η. Die Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) wurde bei E. coli durch den Befund nachgewiesen, dass eine Reparatur von CPDs auch ohne Lichteinfluss erfolgen kann. In UV-empfindlichen Mutanten von E. coli wurde das hierzu erforderliche Uvr-System (engl. UV repair) entdeckt, das vier Gene (uvrA, uvrB, uvrC und uvrD) umfasst. Die Gene uvrA und uvrB codieren für Enzyme, die einen Proteinkomplex mit endonukleolytischer Aktivität (Ultraviolett-endo I) bilden. Dieser Proteinkomplex sucht in der DNA nach Fehlern oder wird an Stellen, an denen es zur Unterbrechung der Replikation kommt, an die DNA angelagert. Das UvrB-Protein bildet dann einen stabilen Komplex mit der DNA (UvrB-DNA), der vom UvrC-Protein erkannt wird. Der daraufhin gebildete UvrBC-Komplex induziert zunächst einen endonukleolytischen Einzelstrangschnitt an der 3’-Seite, dann einen Einzelstrangschnitt an der 5’-Seite der defekten DNA. Die Einzelstrangbrüche werden durch eine Exonuklease erkannt und haben die Entfernung von sechs Nukleotiden zur Folge. Danach ist die DNA-Polymerase I in der Lage, durch Neusynthese die entstandene Einzelstrangregion in der DNA aufzufüllen. Eine Ligase stellt abschließend, wie bei der normalen DNAReplikation, die kovalente Bindung der neu synthetisierten Nukleotide mit dem DNA-Strang wieder her. Im Säugersystem ist der Prozess komplexer und umfasst 20 bis 30 Proteine, die in einer definierten Reihenfolge tätig werden. Das allgemeine Schema ist in Abb. 9.39

9.6 Reparaturmechanismen

Globale GenomReparatur (GCR)

3‘

Transkriptions-gekoppelte Reparatur (TCR) 3‘

5‘

3‘

5‘ XPC (hHR23B & Centrin-2)

3‘

5‘ Pol II

I CSA CSB TFIIH

II

XPG

TFIIH

XPA

XPB

XPG

XPD

RPA

NER eliminiert DNA-Schäden aus allen Stellen des Genoms und wird daher auch als „globaler GenomReparaturmechanismus“ (GGR) bezeichnet. Im Gegensatz dazu wird ein DNA-Schaden in transkriptionsaktiven Genen viel schneller repariert als irgendwo im Genom; diese Form von NER wird als „Transkriptionsgekoppelte Reparatur“ bezeichnet (engl. transcription coupled repair, TCR). Beide Formen unterscheiden sich nur im ersten Schritt der Erkennung des DNA-Schadens (Abb. 9.39): der globale Schaden im Genom wird durch einen Komplex mit der wesentlichen Komponente XPC erkannt, wohingegen ein Schaden, der während der Transkription erkannt wird, zu einer Blockade der RNA-Polymerase II führt.

V

Wie oben schon für die Photolyase-Reaktion erwähnt, vermindert eine Verpackung der DNA in Nukleosomen auch die Effizienz des NER-Systems in Hefen. Die Korrelation der DNAReparatur-Raten mit bestimmten Positionen im Nukleosom lässt vermuten, dass manche Eigenschaften der Nukleosomen, wie ihre Beweglichkeit und vorübergehendes Auswickeln der nukleosomalen DNA, die Erkennung des Schadens erleichtern. Ein Modell, das die heutigen Kenntnisse über den Einfluss der Nukleosomenstruktur auf die Photolyase und das NER-System zusammenfasst, ist in Abb. 9.40 dargestellt.

Abb. 9.39 Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER). (I) Im globalen Genom-Reparaturmechanismus (links) wird der DNA-Schaden durch einen Komplex erkannt, dessen wesentliche Komponente XPC ist. Im Transkriptions-gekoppelten Reparaturmechanismus (rechts) wird durch den Schaden die Polymerase II blockiert. (II) Der Schaden wird eingegrenzt; daran sind das Replikations-Protein A (RPA) und der Transkriptionsfaktor IIH (TFIIH) beteiligt. (III) An beiden Seiten wird die DNA durch die Endonukleasen XPG (5–6 Nukleotide oberhalb) und XPF (20–22 Nukleotide unterhalb) geschnitten. (IV) Das schadhafte Oligonukleotid wird entfernt. (V) Der komplementäre Strang wird als Matrize benutzt, um ein neues Oligonukleotid zu synthetisieren, das die Lücke füllt. Daran sind vor allem die DNAPolymerasen δ und/oder ε beteiligt. Ligase I schließt den verbleibenden Einzelstrangbruch. XPA–G: Proteine, deren Ausfall zu Xeroderma pigmentosum führt; CSA/CSB: Proteine, deren Ausfall zum Cockayne-Syndrom führt; TTD-A: Protein, dessen Ausfall zur Trichothiodystrophie führt (Untereinheit von TFIIH); hHR23B: homologes Protein des Menschen zu RAD23; ERCC1: excision repair cross complementation group 1. (Nach Leibeling et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Im Gegensatz zu NER wurden die Kernelemente des BER-Systems in der Evolution wesentlich stärker konserviert. Grundsätzlich läuft BER in zwei Schritten ab: Zunächst wird der Schaden erkannt und die schadhafte Base ausgeschnitten (nicht das ganze Nukleotid ‒ das Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA bleibt zunächst erhalten!). Daran sind unterschiedliche DNA-Glykosylasen beteiligt. Ein solches Enzym schneidet zunächst die Glykosylbindung zwischen der Base und dem Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA. Erst nach dem Ausschneiden der Base spaltet eine Endonuklease die zugehörige Zucker-Phosphat-Bindung an der pyrimidin- bzw. purinfreien Stelle (engl. apyrimidine/apurine, AP). 3’-Enden werden durch strukturspezifische Nukleasen (z. B. FEN-1) weiter bearbeitet, und die Lücke in der DNA wird durch eine DNA-Polymerase aufgefüllt und durch eine Ligase geschlossen. Dieser Reparaturmechanismus wird durch Glykosylasen mit jeweils unterschiedlichen Eigenschaften kontrolliert.

TTD-A III

XPF (ERCC1)

TFIIH XPG

IV Polymerasen

Ligasen und andere

angegeben. Beim Menschen sind für das NER-System im engeren Sinne sieben Gene (XPA bis XPG) verantwortlich; Mutationen führen zu Erbkrankheiten wie z. B. Xeroderma pigmentosum (XP; vgl. dazu auch Kapitel 12.4.1 und Abb. 12.37).

Eine faszinierende Eigenschaft von DNAReparaturenzymen ist es, aus einem Meer von Basen die wenigen herauszufinden, die modifiziert sind und somit in der nächsten Replikationsrunde zu einer „falschen“ Basenpaarung führen. Banerjee und Mitarbeiter (2005) haben dazu am Beispiel des Enzyms 8-Oxoguanin-Glykosylase einen inte-

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438

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Photolyase

Nukleotid-Exzisionsreparatur

a

(ii) Spiralisierung

(i) Entfaltung/Unterbrechung

(iii) Entfaltung/Unterbrechung

Eigenschaften der Nukleosomen DNA-Schaden Aktivitäten zum Remodelling Histon-Modifikationen Histon-Varianten Nicht-Histon-Proteine

Beweglichkeit Ausbreitung der Spiralisierung

Ausbreitung der Ausbuchtung

b

Zusammenbau

c Schaden-Erkennung Chromatin-Remodeling Schaden-Bestätigung Lichtinduzierte Reparatur (350-450 nm) Einschneiden Ausschneiden DNA-Reparatur-Synthese

Repositionierung

ressanten Mechanismus vorgeschlagen: Dieses Enzym erkennt eine oxidierte Form des Guanins (oxoG), die ein zusätzliches Sauerstoffatom trägt (wenn diese Base nicht entfernt wird, führt das in der nächsten Replikationsrunde zum Einbau eines „T“ im neu synthetisierten Gegenstrang). Offensichtlich besteht die Erkennung von oxoG durch das Reparaturenzym in der Ausbil-

Regeneration der Nukleosomen und der höheren Chromatinstrukturen

dung einer Wasserstoffbrücke zu dem zusätzlichen Sauerstoffatom. Außerdem verfügt das Enzym über zwei „Taschen“ – eine spezifisch für oxoG und eine für das „normale“ G. Andererseits braucht die Glykosylase auch den Kontakt zu dem „richtigen“ C im Gegenstrang. Eine Reparatur erfolgt also nur im üblichen Basenpaar-Kontext und nach der Bindung in der oxoG-

9.6 Reparaturmechanismen

Abb. 9.40 a–c Dynamische Eigenschaften von Nukleosomen erleichtern DNA-Schaden-Erkennung und Reparatur. a Nukleosomen befinden sich in verschiedenen Zuständen, die in einem dynamischen Gleichgewicht stehen (Pfeile) und zu veränderten Positionen führen (Beweglichkeit): (i) Teilweise Entfaltung führt dazu, dass die Enden der nukleosomalen DNA (die üblicherweise an H2A-H2B-Histone gebunden sind) bevorzugt freigesetzt werden und damit den Zugang zu DNA-Schäden erleichtern. Die Bindung der Verbindungs-DNA an die Histone führt zur Bildung einer Ausbuchtung; die Ausbreitung der Ausbuchtung bewirkt eine veränderte Nukleosomenposition. (ii) Über- oder Unterspiralisierung führt zu einer veränderten Einstellung der Rotation. Die Ausbreitung des Spiralisierungsdefekts bewirkt eine veränderte Nukleosomenposition. (iii) Nukleosomen können dissoziieren und sich neu zusammenfügen. Dabei sind die Histone H2A und H2B schwächer gebunden und werden bevorzugt freigesetzt. Der erneute Zusammenbau an einer anderen Stelle führt zu einer veränderten Nukleosomenposition. Die Gleichgewichte werden durch die Eigenschaften der Nukleosomen eingestellt (DNA-Sequenz, Histon-Zusammensetzung und ihrer Modifikationen) und können durch DNA-Schäden beeinflusst werden. b Photolyase erkennt DNA-Schäden bevorzugt in Verbindungsregionen oder in teilweise entfalteten bzw. unterbrochenen Nukleosomen und entfernt die Pyrimidin-Dimere mithilfe von Lichtenergie. c In Hefe benötigt NER eine Reihe verschiedener Cofaktoren sowie einen freien Bereich von ca. 100 bp. Der reparierte Strang (rot) ist empfindlich gegenüber Nukleasen und wird durch Nukleosomen-Rearrangements erneut in das Nukleosom eingebaut. Blau: Histone; grau: DNA; rote Balken: reparierte Bereiche; rote Kreise: DNA-Schaden; grün: Protein, das den DNA-Schaden erkennt. (Nach Thoma 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

spezifischen Tasche. Die Wasserstoffbrückenbindung zum Sauerstoff ist offensichtlich notwendig, um in einem Zwischenschritt eine erneute Kontrolle zu ermöglichen und so den Ausbau einer „richtigen“ Base zu verhindern.

Die Exzisionsreparatur verläuft ohne Lichteinwirkung

durch endonukleolytische Einzelstrangschnitte neben dem Schaden und durch die Entfernung der defekten Nukleotide, die dann durch DNA-Polymerasen neu eingefügt werden.

9.6.3 SOS-Rekombinationsreparatur oder postreplikative Reparatur Die bisher besprochenen Mechanismen der Reparatur durch Photolyasen oder durch die verschiedenen Formen der Exzisionsreparatur (NER/BER) führen zu einer vollständigen Reparatur von Dimeren und auch von anderen Defekten, ohne dass gleichzeitig eine Replikation der DNA erfolgt. Wenn diese Systeme aber

ausgelastet oder nicht in der Lage sind, den Schaden zu reparieren, könnte das den Tod der Zelle zur Folge haben. Um den Zelltod zu vermeiden, verfügen alle Zellen über Mechanismen, Schäden zunächst zu tolerieren. Dabei wird die Transkription erneut gestartet und der Schaden erst später repariert. Wenn UV-induzierte DNA-Schäden nicht durch NER repariert werden können, treten zunächst Einzelstrangbrüche auf. Diese können beobachtet werden, wenn genomische DNA im alkalischen Sucrosegradienten aufgetrennt wird. Werden die Zellen allerdings etwas länger inkubiert, „verwandelt“ sich die fagmentierte genomische DNA in eine hochmolekulare Form, wie wir sie in der unbestrahlten Kontrolle finden. Dieser Prozess wird als postreplikative Reparatur (PPR) bezeichnet. Die niedermolekulare DNA, die im alkalischen Sucrosegradienten entdeckt wurde, entsteht durch angehaltene Replikationsgabeln, sodass Einzelstranglücken entstehen. Die Schäden, die für das Anhalten der Replikation verantwortlich sind, werden dabei nicht beseitigt, selbst wenn die Lücken aufgefüllt werden. Wenn sie aber durch einen Exzisionsmechanismus erkannt werden, können sie vor der nächsten Replikationsrunde „richtig“ repariert werden. In E. coli ist dieses System Teil des SOS-Regulons und wird als Antwort auf Einzelstrangschäden in der DNA induziert. Dabei werden die Fehler allerdings oft nicht richtig korrigiert, sondern führen im Gegenteil zu zusätzlichen Fehlern in der DNA. Die Funktion dieser sogenannten SOS-Reparatursysteme beruht im Prinzip auf einer Reduktion der Genauigkeit der Replikation. Es gibt in E. coli zwei SOS-abhängige Systeme, die DNA-Schäden tolerieren können: Das eine System wird als „Transläsionssynthese“ bezeichnet (engl. translesion synthesis, TLS); der zweite Mechanismus basiert im Wesentlichen auf Rekombinationsereignissen und wird daher auch als homologe Rekombinationsreparatur (engl. homologous recombination repair, HRR) bezeichnet. In beiden Mechanismen nimmt das RecA-Protein eine Schlüsselstellung ein: Bei der TLS aktiviert es über seine Protease-Aktivität die entsprechenden Enzymsysteme, und bei der HRR vermittelt es die Rekombination. Der Protease-Aktivität von RecA sind wir bereits bei der UV-Induktion des lytischen Zyklus des Bakteriophagen λ begegnet. Diese Protease-Funktion wird durch UV-Bestrahlung aktiviert (Kapitel 4.6.2). Normalerweise wird das SOS-Reparatursystem durch das LexA-Protein, ein Produkt des lexA-Gens, reprimiert. Wird das LexAProtein jedoch durch die Aktivität der RecA-Protease, die nur auf bestimmte Proteine proteolytisch wirkt und nur durch Störungen in der DNA-Replikation induziert

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440

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

wird, abgebaut, kommt es zur Induktion des TLS-SOSReparatursystems. Dieses System schließt die Funktion der Gene umuC, umuD und dinB ein. Nach der Induktion des SOS-Reparaturmechanismus wird das UmuDProtein synthetisiert; durch die Wirkung des RecAProteins werden die 24 N-terminalen Aminosäuren abgespalten (das verkürzte Protein wird als UmuD’ bezeichnet). Das UmuC-Protein ist eine DNA-Polymerase (E. coli-DNA-Polymerase V), die jedoch alleine nur sehr geringe Polymerase-Aktivität besitzt. Erst in Kombination mit UmuD’, RecA und SSB erlangt diese Polymerase ihre volle Aktivität, die 10‒100fach höher ist als die der E. coli-DNA-Polymerasen I, II oder III (Holoenzym). Allerdings verfügen die UmuC/UmuD’-Komplexe über keine 3’→5’-proofreading-Exonuklease-Aktivität. Neben dieser eigenen Polymerase-Aktivität üben UmuC und UmuD auch eine Kontrollfunktion auf die DNA-Polymerase III von E. coli aus, die dazu führt, dass die Replikationsgeschwindigkeit des normalen Replikationsenzyms im Falle von DNA-Defekten vermindert wird. Die Gene des umuDC-Operons nehmen damit zugleich eine Kontrollfunktion (engl. checkpoint) für DNA-Schäden wahr. Vergleichbare Gene für DNAPolymerasen hat man auch bei Hefen (REV1, REV3, REV7) und beim Menschen gefunden. Die Sequenzierung des menschlichen Genoms und vieler Modellorganismen führte in jüngerer Zeit zur Entdeckung vieler konservierter prokaryotischer und eukaryotischer Gene, die ortholog oder paralog zu den E. coli-Genen dinB, umuC und umuD sind. Die zugehörigen Proteine gehören zu einer ausgedehnten Superfamilie der Y-DNA-Polymerasen (Tabelle 9.8), die sich von den bisher bekannten Polymerasen in vier Punkten unterscheiden: ï Sie haben eine 2‒4fach höhere Fehlerrate, wenn sie an unbeschädigter DNA arbeiten.

ï Sie haben keine 3’→5’-proofreading-ExonukleaseAktivität. ï Ihre Aktivität ist auf wenige Basen beschränkt. ï Sie unterstützen einen Prozess, der die Verlängerung eines DNA-Strangs über eine Schadenstelle hinaus ermöglicht.

Das induzierbare SOS-Reparatursystem mit Transläsionssynthese ist bei E. coli eine physiologische Antwort auf DNA-Schäden, wenn sie nicht vor der Replikation repariert wurden. Im Mittelpunkt steht dabei die UmuDC-Polymerasen-Aktivität. Durch ausgedehnte Speziesvergleiche ist bekannt, dass dieses System in vielen Organismen vorkommt.

In der homologen Rekombinationsreparatur (HRR) veranlasst RecA in Verbindung mit einer Reihe weiterer Proteine (Tabelle 9.9) die Auflösung der angehaltenen Replikationsgabel: Kommt der Replikationskomplex an eine schadhafte DNA-Stelle, löst er sich und überspringt den Schaden, um an anderer Stelle fortzufahren. Es entsteht eine Replikationslücke im Tochterstrang, die über 800 Basen umfassen kann. Bei der „rekombinatorischen Reparatur“ bindet das RecAProtein an die Einzelstrang-DNA-Enden links und rechts der Replikationslücke und sucht die Schwesterchromatide oder das homologe Chromosom nach homologen Sequenzen ab. Ist eine solche Stelle gefunden, dringt der Komplex in die Doppelhelix ein, verdrängt den homologen und bindet den komplementären Strang. Dieser dient dann als Matrize zum Auffüllen der Replikationslücke. Der verdrängte Strang paart sich mit dem Strang, der den DNA-Schaden aufweist. Durch Endonuklease-Schnitte und anschließende Ligation bilden sich letztendlich wieder zwei kom-

Tabelle 9.8 Die UmuC/DinB-Superfamilie von DNA-Polymerasen Name

Alternative Bezeichnung

Organismus

Pol V

UmuD’2C/UmuC

Bakterien

Pol IV

DinB

Bakterien

Pol η

Rad30

Hefe

XP-V

Pol η/Rad30A

Mensch

Pol ι

Rad30B

Mensch, Maus

Pol κ

DinB1

Mensch, Maus

Rev1

Deoxycytidil-Transferase

Hefe, Mensch

Pol ζa

Rev3–Rev7

Hefe

a Die Pol ζ gehört nicht direkt zur UmuC/DinB-Superfamilie; sie spielt aber eine wichtige Rolle in der TLS bei Hefen und Menschen und wurde deshalb in die Tabelle aufgenommen. Nach Sutton et al. (2000)

9.7 Ortsspezifische Mutationen

plette Doppelhelices aus (Abb. 9.41). Zu beachten ist, dass der ursprüngliche DNA-Schaden bei dieser Reparatur nicht behoben wird, sondern nur die Lücke im Tochterstrang. In Hefen und höheren Eukaryoten ist dieses System in ähnlicher Form ebenfalls vorhanden (Tabelle 9.9).

9.7 Ortsspezifische Mutationen Im Gegensatz zu den zufälligen und ungerichteten Mutationsereignissen, die wir bisher in diesem Kapitel besprochen hatten, verfügt die moderne Genetik über verschiedene Möglichkeiten, gezielt in das Erbgut von Modellorganismen einzugreifen. Diese gentechnisch veränderten Organismen werden auch als „transgen“ bezeichnet. Im Folgenden sollen die Herstellung transgener Pflanzen und Tiere besprochen und mögliche Entwicklungstrends aufgezeigt werden.

Abb. 9.41 Die Reparatur von Doppelstrangbrüchen über homologe Rekombination. In der Initiationsphase nach einem Doppelstrangbruch werden die einzelnen Stränge jeweils über einen kurzen Bereich in 5’→3’-Richtung abgebaut. Die freien 3’-Enden werden benutzt, um in den Doppelstrang-Bereich der homologen DNA einzuwandern (die dicken und dünnen Linien erlauben die Unterscheidung der beiden Chromosomen). Die Holliday-Struktur wird mithilfe der Rekombinationsenzyme RecA, RuvAB, RuvC und Ligasen aufgelöst. Die RecFOR-Proteine sind bei der Herstellung aktiver RecA-Nukleoproteinfilamente zum Neustart der DNA-Replikation wichtig; SSB: Einzelstrang-bindende Proteine. (Nach McGrew u. Knight 2003, mit freundlicher Genehmigung von Informa)

9.7.1 Gentechnische Modifikationen von Pflanzen In der pflanzlichen Gentechnik gibt es drei etablierte Methoden, DNA zu übertragen: durch Vektoren auf der Basis von Agrobacterium tumefaciens, die biolistische Transformation und die Protoplastentransformation. Wir wollen die verschiedenen Methoden im Folgenden kurz skizzieren. Als Überträger der DNA wird häufig das Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens (Kapitel 4.2.2) verwendet, das bei Pflanzen Tumore verursacht. Dieses

Tabelle 9.9 Beteiligte Enzyme bei der postreplikativen Reparatur Bakteriophage T4

E. coli

Eukaryoten

Rekombinase

UvsX

RecA

Rad51/Rad54, Dmc1

Einzelstrang-Bindungsprotein

Gen 32

SSB

RPA

RMP

UvsY

RecOR, RecBCD

Rad52, Rad55/Rad57

Helikase an der Replikationsgabel

UvsW

RecG, RuvAB

Abbau der Enden (5’→3’-Exonuklease)

gp46/gp47

SbcCD, RecBCD

Auflösung der Holliday-Strukturen

Endonuklease VII

RuvC/Rus

Replikations-Neustart RMP

gp59

PriA, RestartPrimosom

Replikative Helikase

gp41

DnaB

DNA-Polymerase

T4-Polymerase

DNA-Polymerasen II/III

a

a

RMP: an der Replikation beteiligte Proteine (engl. replication-mediated proteins). Nach Cox (2002)

Rad50, Mre11, Xrs2/ Nbs1

DNA-Polymerasen α, δ, ε, RFC, PCNA etc.

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442

Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Bakterium besitzt ein Ti-Plasmid, auf dem die Tumorinduzierenden Eigenschaften codiert werden (Abb. 4.8). Ein kleiner Teil des Ti-Plasmids kann von Agrobacterium in zweikeimblättrige Pflanzen übertragen werden. Die ersten Arbeiten zur Übertragung einer fremden DNA (hier: Transposon Tn7) mittels A. tumefaciens wurden 1980 publiziert, und schon 3 Jahre später wurden in grundlegenden Arbeiten von mehreren Forschergruppen Resistenzen gegen Antibiotika übertragen. Dabei wurde das Ti-Plasmid soweit modifiziert, dass es seine Tumor-induzierende Wirkung verloren hat. Seither wurde eine stetig wachsende Zahl von Pflanzen nahezu aller systematischen Gruppen erfolgreich transformiert. Das Ti-Plasmid selbst ist über 200 kb groß und daher für Klonierungsarbeiten schwierig zu handhaben. Heute werden daher binäre Vektorsysteme verwendet, bei denen die Funktionen des Ti-Plasmids auf zwei Plasmide verteilt sind. Dabei trägt das „große“ die Region, die für die Virulenz und damit die Übertragung der DNA in die Pflanzenzelle verantwortlich ist (Komplementationsgruppen virA bis virG). Das kleinere Plasmid enthält die Signalsequenzen, die zum Ausschneiden der später zu übetragenden DNA benötigt werden und kann dazwischen Markergene zur Selektion und weitere erwünschte Gene enthalten. Dieses Plasmid kann in E. coli-Zellen vermehrt werden, sodass alle notwendigen Klonierungsarbeiten leicht durchführbar sind. Erst das fertige Plasmid muss dann in A. tumefaciens-Zellen übertragen werden, die bereits das größere Plasmid tragen. Einen schematischen Überblick dazu gibt Abb. 9.42. Die Transformation selbst erfolgt dann an geeigneten Teilen der Pflanze (z. B. Blattstücken) oder auch an der ganzen Pflanze (z. B. Arabidopsis). Nach einer geeigneten Inkubationszeit mit den Agrobakterien werden diese mit Antibiotika abgetötet, die transformierten Pflanzenzellen selektioniert und mit Phytohormonen regeneriert. Nach 2 bis 6 Wochen bilden sich Spross und Kallus; wenn dann Blattstücke auf Medium ohne Phytohormone inkubiert werden, bilden sich nach weiteren 3 bis 6 Wochen Wurzeln, und es ensteht eine regenerierte transgene Pflanze. Zur genetischen Veränderung stehen noch weitere Methoden zur Verfügung: 1985 wurde von Michael Fromm und seinen Kollegen die Transformation von Maisprotoplasten beschrieben. Dabei wird die Zellwand durch Pektinasen (Abbau des Pektins) und Zellulasen (Abbau der Zellulose) abgebaut. Dadurch entstehen zellwandlose Protoplasten, die zur Stabilisierung in einem isoosmotischen Medium gehalten werden müssen. Für die Transformation in Protoplasten können einfache E. coli-Vektoren verwendet werden, die über ein Resistenzgen sowie einen pflanzenspezifischen Promotor und Terminator verfügen, zwischen

Abb. 9.42 Schematische Darstellung eines binären Vektorsystems für die Transformation mittels A. tumefaciens. Das größere Plasmid (oben) besteht aus dem Ti-Plasmid mit der Virulenzregion (vir), aber ohne T-DNA. Das kleinere Plasmid (unten) kann in E. coli kloniert werden und enthält die modifizierte T-DNA: Aus der T-DNA wurden die Gene für die Tumorinduktion und Nährstoffsynthese (Nopalinsynthese) entfernt. Die T-DNA trägt ein Markergen für die Selektion in Pflanzenzellen (SMG: kleines G-Protein, engl. small G-protein) und weitere Gene („Gen“) können eingefügt werden. A. t. ori: Replikationsursprung für die Vermehrung in A. tumefaciens; E. c. ori: Replikationsursprung für die Vermehrung in E. coli; kanR: Kanamycin-Resistenzgen für die Selektion; LB: linke Grenze; RB: rechte Grenze; P1, P2: Promotoren; T1, T2: Terminatoren. (Nach Kempken u. Kempken 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

die das gewünschte Gen kloniert werden kann. Die eigentliche Transformation der DNA erfolgt über Polyethylenglykol oder elektrische Depolarisierung (Elektroporation). Dieser Weg escheint zwar zunächst einfacher, allerdings ist die Regeneration zur intakten

9.7 Ortsspezifische Mutationen

Pflanze häufig schwierig, sodass die Anwendung dieser Methode eingeschränkt ist. Seit 1987 wird außerdem die biolistische Transformation verwendet, bei der pflanzliche Zellen mit Gold- oder Wolframpartikeln beschossen werden, die DNA-beschichtet sind. Mit dieser Methode gelang die Transformation wichtiger einkeimblättriger Pflanzen (Reis: 1988, Mais: 1990, Weizen: 1992). Als Vektor wird ebenso wie bei der Protoplastentransformation ein einfaches E. coli-Plasmid vewendet. Obwohl duch diese Methode wichtige Erfolge erzielt wurden, ist die Effizienz der Methode relativ gering. Für eine ausführliche und vergleichende Darstellung der verschiedenen Argumente für und gegen dieses Transformationssystem sei auf die Übersicht von Taylor und Fauquet (2002) verwiesen.

Zur Herstellung transgener Pflanzen sind vor allem drei Transformationssysteme etabliert: Vektoren auf der Basis von Agrobacterium tumefaciens, die Protoplastentransformation und die biolistische Transformation.

Nachdem auch bei der Pflanze die großen spektakulären Sequenzierungsprogramme ganzer Genome weitgehend abgeschlossen sind, steht die funktionelle Aufklärung der Gensequenzen im Vordergrund. Dabei ist es wichtig, das gesamte Genom mit Mutationen abzudecken (zu „sättigen“; engl. saturation mutagenesis), um so für alle Gene die Funktion anhand der Funktionsverlust-Mutanten (engl. loss of function) zu untersuchen. Mithilfe zufälliger Insertions-Mutagenese durch Transposons wurden über 225.000 unabhängige Linien bei Arabidopsis etabliert. Diese Technik erlaubt nicht nur die Identifikation von Null-Mutanten (engl. knockout mutants), sondern auch die Charakterisierung von Promotoren und Enhancern (Alonso et al. 2003).

Das Anwendungsspektrum transgener Pflanzen ist breit: So gibt es Bemühungen, die Erträge einzelner Pflanzen zu steigern, die Pflanzen resistent gegen Schädlinge zu machen oder gegen Unkrautvernichtungsmittel, um so die Unkrautbekämpfung zu erleichtern. 1985 wurden erstmals transgene Pflanzen beschrieben, denen Resistenzen gegen ein Herbizid verliehen worden waren. Mit der Generierung insektenresistenter Tabak- und Tomatenpflanzen wurde 1987 ein weiterer wichtiger Schritt in der pflanzlichen Gentechnik gemacht. Ein anderes bedeutendes Ereignis war 1988 die Kontrolle der Fruchtreife bei Tomaten, die ab 1994 als erstes gentechnisch verändertes Nahrungsmittel kommerziell erhältlich war; diese Tomate konnte sich aber am Markt nicht durchsetzen. Pflanzen können auch zur gezielten Herstellung von Bioprodukten verwendet werden. Dazu können nicht nur die Kohlenhydrat- oder Fettsäurenzusammensetzungen geändert werden (z. B. Raps als „Biodiesel“). Es wurde auch bei der Tollkirsche die Alkaloidzusammensetzung verändert (1992), sodass Pflanzen auch für die Gewinnung von Arzneimitteln herangezogen werden können. Weitere Überlegungen sind, Pflanzen mit ganz neuen Eigenschaften als Bioreaktoren zur Herstellung nachwachsender Rohstoffe zu verwenden, nachdem bereits 1992 Pflanzen vorgestellt wurden, die bioabbaubaren Kunststoff synthetisieren. Der kommerzielle Anbau von transgenen Nutzpflanzen in der Landwirtschaft ist seit 1996 kontinuierlich gestiegen, er betrug weltweit im Jahr 2006 über 100 Millionen Hektar (Abb. 9.43) und ist bis 2008 auf ca. 125 Millionen Hektar gewachsen – das sind etwa 10 % der gesamten Ackerfläche weltweit. In der Europäischen Union werden auf etwa 100.000 Hektar transgene Pflanzen angebaut (ISAAA-Report 2008).

Abb. 9.43 Zunahme globaler Anbauflächen biotechnologischer Kulturpflanzen von 1995 bis 2006. (Nach Einsele 2007, mit freundlicher Genehmigung des International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications)

443

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Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Ein wichtiges Produkt unter den gentechnisch veränderten Nutzpflanzen ist Bt-Mais, der ein Gen des Bakteriums Bacillus thuringiensis enthält. Dieses Gen codiert für ein kristallines Protein (Gensymbol cry), das auf Larven einiger Insekten, Schmetterlinge und Zweiflügler als Gift wirkt. Es soll damit einen wirksamen Schutz gegen Schädlinge wie den Maiszünsler (Ostrinia nubilalis) bieten und die Anwendung entsprechender versprühter Insektizide überflüssig machen. Wir kennen heute eine Vielzahl von cry-Genen, die sich hinsichtlich der Spezifität ihrer toxischen Wirkung unterscheiden: Die cryI-Gene codieren für Proteine, die auf Schmetterlinge (Lepidoptera) giftig wirken, cryII-Genprodukte sind für Schmetterlinge und Zweiflügler (Diptera) giftig, cryIII codiert für Toxine gegen Käfer (Coleoptera) und cryIV-Genprodukte sind für Zweiflügler giftig. Außer in gentechnisch verändertem Mais wurden verschiedene cryGene auch in Baumwolle, Kartoffeln und Reis eingeführt. Derart veränderte Mais- und Baumwollarten wurden bereits im Jahr 2004 weltweit auf 22,4 Millionen Hektar Ackerland angebaut. In der öffentlichen Diskussion ist vor allem die Spezifität der Toxin-Wirkung umstritten sowie mögliche Resistenzentwicklungen bei den Schädlingen und die Entwicklung von Allergien beim Verbraucher; eine aktuelle Übersicht über Bt-Toxine findet sich bei Soberón et al. (2009). Ein Problem beim Anbau gentechnisch veränderter Pflanzen ist ihre Interaktion mit der Umwelt. Pollen werden von Wind und Insekten weiterverbreitet, sodass eine vollständige Beschränkung auf die Anbaufläche nicht möglich ist. Bei einer Untersuchung einer transgenen, herbizidresistenten Winterraps-Sorte wurden transgene Pollen trotz eines 8 m breiten Streifens von nicht-transgenen Rapspflanzen um das betroffene Feld noch im Umkreis von 200 m nachgewiesen; in Einzelfällen sogar bis in einer Entfernung von 4 km. Durch diese Ausbreitung kann es auch zu Kreuzungen mit verwandten Wildarten kommen und dabei auch zu einer Übertragung der Herbizidresistenz, was die Handhabung deutlich erschwert. In Untersuchungen zur Pollenverbreitung von transgenen Rapssamen und ihren Auskreuzungen wurden überraschend hohe Auskreuzungsraten von 0,26 % in Sareptasenf gefunden. Die Bastarde entwickelten sich gut, bildeten aber keine vermehrungsfähigen Samen. Aber auch das Ausfallen von Samen der transgenen Pflanzen selbst bei der Ernte kann zum Überdauern der Pflanzen beitragen. Das Überdauerungsvermögen ist vom Genotyp der Pflanze und der Art der Bodenbearbeitung abhängig. Diese Fragen werden uns sicherlich in den nächsten Jahren weiter beschäftigen, wenn immer mehr transgene Pflanzen kommerziell eingesetzt werden; eine interessante

Zusammenfassung des derzeitigen Standes unseres Wissens über Genfluss, Invasivität und die ökologische Bedeutung gentechnisch veränderter Pflanzen findet sich bei Warwick et al. (2009).

9.7.2 Gentechnische Modifikationen von Tieren Der Transfer von DNA in Tiere unterscheidet sich von dem in Pflanzen vor allem in zweierlei: Da Tiere keine vegetative Form der Fortpflanzung kennen, muss der Transfer die Keimzellen erreichen, um in der nächsten Generation wirksam zu werden. Zum anderen sind Zellkulturtechniken bei tierischen Zellen leichter zu handhaben, da die aufwendigen Vorbereitungen zum Verdauen der Zellwände wegfallen. Von daher ist es nicht verwunderlich, dass die ersten transgenen Tiere vor denen der Pflanze hergestellt wurden (Drosophila: Spradling u. Rubin 1982; Maus: Palmiter et al. 1982). Einige wesentliche Aspekte der Herstellung transgener Tiere sollen am Beispiel der Maus besprochen werden. Dabei werden zwei Wege grundsätzlich unterschieden: das Einbringen eines zusätzlichen Gens durch zufällige Integration, ohne das Genom gezielt zu verändern (durch Vorkerninjektion in die befruchtete Eizelle; Abb. 9.44; Technik-Box 22), und das Ausschalten eines Gens durch homologe Rekombination (in embryonalen Stammzellen und der nachfolgenden Übertragung in die Blastocyste; Technik-Box 28). Eine dritte Methode der DNA-Übertragung soll nur kurz angedeutet werden: der somatische Kerntransfer. Dabei werden Zellkerne aus embryonalen oder adulten Körperzellen in kernlose Oocyten übertragen. Diese Methode war in der Entwicklungsbiologie schon lange etabliert (Abb. 11.52) und erlaubt prinzipiell das „Klonen“ eines Organismus, ohne dass dabei veränderte DNA eingesetzt wird (dies ist erst durch Kombination mit einer der beiden anderen Methoden möglich). Im ersten spektakulären Experiment an Säugern wurde einem Schaf aus einer Milchdrüsen-Epithelzelle der Zellkern entnommen und in eine kernlose Oocyte injiziert. Das entstandene Klonschaf Dolly (Abb. 11.53) bekam mehrere Nachkommen, alterte aber früh und musste eingeschläfert werden. Da die spezifische Veränderung genetischer Information über homologe Rekombination bei der Maus ein komplexes Verfahren mit vielen Möglichkeiten darstellt (wegen seiner Zielgenauigkeit wird es im Englischen auch als gene targeting bezeichnet), wollen wir es etwas genauer betrachten. Hierzu werden zunächst Zellen aus frühen Embryonalstadien (z. B. Blastocys-

9.7 Ortsspezifische Mutationen

Abb. 9.44 a, b Transgene Mäuse (I). a Bei dem Vektor für die Vorkerninjektion ist es wichtig, dass neben den codierenden Sequenzen ein Promotor vorhanden ist. Üblicherweise kloniert man die zu untersuchende Sequenz in einen Bereich, der viele Restriktionsschnittstellen aufweist (engl. multiple cloning site, MCS). Außerdem ist am 3‘-Ende eine Poly(A)-Region (pA) notwendig. b Zur Erzeugung der transgenen Maus werden aus einem Spendertier nach Superovulation befruchtete Eizellen im Einzellstadium entnommen. Die DNA (aus a) wird in einen der beiden sichtbaren Vorkerne injiziert und die Zygoten danach in den Eileiter einer scheinträchtigen Maus transferiert. Mit den transgenen Tieren kann eine Zucht aufgebaut werden. (Nach Schenkel 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

ten) gewonnen und als pluripotente Zelllinien etabliert (embryonale Stammzellen, Abk.: ES-Zellen; Kapitel 11.7.2). Diese Zelllinien sind inzwischen für viele Mausstämme etabliert. Diese ES-Zellen können wie in einer normalen Zellkultur mit Vektoren transfiziert werden, die in E. coli kloniert werden. Der Vektor enthält dabei das veränderte Gen mit flankierenden genomischen Sequenzen, um später eine homologe Rekombination (Kapitel 5.3.3) zu ermöglichen. In der Regel wird nur eine spezifische Funktion des Zielgens verändert (z. B. Einführung eines Stoppcodons nach dem ersten Exon). Ein typischer Vektor ist in Abb. 9.45a dargestellt. Eine homologe Rekombination tritt nach der Transfektion einer Zelle nur mit sehr geringer Frequenz auf (10−6 bis 10−9); deshalb müssen solche Zellen selektioniert werden können, in denen eine Rekombination tatsächlich stattgefunden hat. Die entsprechend

identifizierten und angereicherten Zellen werden dann in Blastocysten einer anderen Linie injiziert. Nach dem Austragen durch eine Amme erhält man Mosaike (Abb. 6.37), da nur manche Zellen der Maus Nachkommen der übertragenen ES-Zelle sind. Nur wenn sich aus den übertragenen ES-Zellen auch Keimzellen entwickelt haben, besteht die Möglichkeit, die Linie stabil zu etablieren. Das Verfahren ist in Abb. 9.45b schematisch dargestellt; für weitere Details siehe Technik-Box 28. Beide Methoden sind in den letzten Jahren wesentlich ausgebaut und verfeinert worden. So lassen sich über Vorkerninjektion beispielsweise auch Reportergene einbringen (z. B. das Gen für das grünfluoreszierende Protein, GFP; Technik-Box 29) oder RNA-Gene zur Inaktivierung definierter Zielsequenzen (RNAi, siRNA; Kapitel 7.5). Besonders interessant ist die gewebespezifische Expression der Cre-Rekombinase des Phagen P1 (Abb. 4.15). Durch die Aktivität der Cre-Rekombinase wird aus genomischer DNA ein Abschnitt dauerhaft entfernt, der durch loxP-Sequenzen flankiert ist (engl. locus of cross-over (x) des Phagen P1; loxP). Diese loxPStellen können natürlich in einen Vektor so eingefügt werden, dass sie eine Wunschsequenz flankieren (z. B. das erste Exon); im Laborjargon spricht man dann von „gefloxten Genen“. Durch Kreuzung einer transgenen Maus, die die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors gewebespezifisch exprimiert, mit einer Maus, die loxP-flankierte Elemente enthält, wird in den Hybriden die mit loxP-flankierte Stelle nur in dem Gewebe entfernt, das die Cre-Rekombinase exprimiert („konditionale Mutagenese“). Dies erlaubt die Untersuchung von Mutanten, bei denen das Ausschalten einer Genfunktion im gesamten Organismus letal ist. Der Methodenkasten der Mausgenetiker enthält jedoch noch weitere ortsspezifische Rekombinasen, um so für das Herausschneiden jeder Kassette eine eigene, spezifisch induzierbare Rekombinase zu erhalten. Eine davon ist die FlpRekombinase aus Hefe, die Genomfragmente entfernt, die durch FRT-Stellen flankiert sind (engl. Flp recombinase target). Eine weitere mögliche Rekombinase wurde aus Streptomyces isoliert (ΦC31); allerdings scheint diese Rekombinase eher für intermolekulare Rekombination geeignet als für intramolekulare. Eine interessante Zusammenstellung der verschiedenen Möglichkeiten findet sich bei Sauer (1994). Die Herstellung transgener Mäuse ist inzwischen in vielen Labors etabliert; zwei Labors bemühen sich besonders um die Archivierung der Mutanten: in Europa das Europäische Mausmutanten-Archiv (EMMA: http://www.emmanet.org/) und in den USA

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Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Abb. 9.45 a, b Transgene Mäuse (II). a Für die homologe Rekombination wird ein Vektor konstruiert, der in seinen Intron-Exon-Strukturen und flankierenden Regionen komplementär zum Chromosom ist. Um ein Gen gezielt auszuschalten, wird eine positive Selektionskassette in ein Exon kloniert. Die negative Selektionskassette befindet sich außerhalb des Homologiebereichs. Findet später Rekombination in den beiden mit Kreuzen gekennzeichneten Regionen statt, so erhält man ein Exon, das zusätzlich die positive Selektionskassette enthält; die Pfeile geben die Stellen an, an denen Oligonukleotide für die PCR zur Kontrolle der erfolgreichen homologen Rekombination hybridisieren. b Der Vektor wird in embryonale Stammzellen (ES-Zellen; Stammhintergrund 129/sv [agouti]: gelbe Pigmentierung auf schwarzem oder braunem Hintergrund des Fells) transfiziert. Nach Selektion werden die Klone gepickt und mit PCR oder Southernblot auf homolog rekombinierte Produkte untersucht. Die rekombinanten ESZellklone werden in Blastocysten injiziert, die aus C57BL/6Mäusen stammen (Fellfarbe schwarz), die dann in scheinschwangere Mäuse übertragen werden (CD1-Auszuchtmäuse [albino]: Fellfarbe weiß), um chimäre Mäuse zu generieren. Die Chimären werden mit C57BL/6Mäusen gekreuzt, um Keimbahntransmission zu erhalten. A: agouti; Neo: Neomycin-Resistenzgen als positiver Selektionsmarker; TK oder DTA: Thymidinkinase oder Diphteria-ToxinA-Gen als negative Selektionsmarker. (a nach Schenkel 2006; b nach Sung et al. 2004, jeweils mit freundlicher Genehmigung von Springer)

das Jackson-Labor (http://www.jax.org/index.html). Von dort können viele wichtige Mausmutanten bezogen werden. Allerdings ist aus vielen Gründen die Maus nicht immer der geeignete Modellorganismus. Daher werden auch an anderen Tieren entsprechende Verfahren etabliert; im wissenschaftlichen Bereich betrifft das in erster Linie die Ratte (Ratten-GenomDatenbank: http://www.rgd.mcw.edu/).

Aber auch in der Tierzucht wird versucht, bei Schafen, Rindern und Schweinen mithilfe der Gentechnik neue Zuchtziele zu erreichen bzw. die Ursachen für die Anfälligkeit für bestimmte Krankheiten (z. B. Scrapie beim Schaf und BSE bei Rindern) zu charakterisieren, um sie schließlich vermeiden zu können. Zu diesem Zweck wurde 2004 auch ein Förderprogramm der Bundesregierung initiiert, das die funktionelle Genomanalyse von Nutztieren zum Ziel hat (FUGATO). Es sollen

9.7 Ortsspezifische Mutationen

Abb. 9.46 Das IGF2-Gen und quantitative Merkmale beim Schwein. Die beobachteten Unterschiede zwischen den verschiedenen Schweinen (höhere Muskularität, weniger Rückenfett und ein größeres Herz bei den Hausschweinen) können auf einen Nukleotidaustausch (G→A) im Intron 3 des IGF2-Gens zurückgeführt werden: Diese Mutation hat keinen Einfluss auf die genetische Prägung des IGF2-Gens (Abb. 11.58) und verändert auch nicht die Methylierung dieser Region, die im Skelettmuskel untermethyliert ist. Die Wildtyp-Sequenz bindet einen Kernfaktor; diese Wechselwirkung wird durch die Mutation und durch Methylierung beseitigt. Aus Transfektionsanalysen ist bekannt, dass diese Intronsequenz als Silencer wirkt,

wohingegen diese Wirkung der mutierten Sequenz signifikant schwächer ist. Schließlich ist die Expression von IGF2 postnatal im Skelett- und Herzmuskel etwa 3-mal höher, bleibt dagegen unverändert in der Leber und den pränatalen Stadien der Muskeln. Diese Ergebnisse erklären die phänotypischen Befunde: Das IGF2*Q-Allel ist mit hohem Muskelwachstum und einem vergrößerten Herzen verbunden, hat aber keinen Einfluss auf das Geburtsgewicht oder die Leber. Damit ist der IGF2-QTL für die Schweinezucht besonders interessant, da er nur das Muskelwachstum nach der Geburt beeinflusst, nicht aber das Geburtsgewicht. (Nach Andersson u. Georges 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

die Genome von Schweinen, Rindern, Schafen, Geflügel und Honigbienen analysiert werden. Im Vordergrund steht dabei die Entwicklung von Gentests zur schnellen Untersuchung von Erbkrankheiten. Allein beim Schwein verursachen genetisch bedingte Erkrankungen einen Verlust von etwa 30 Millionen Euro pro Jahr. Eine wichtige Motivation für eine genbasierte Zucht ist auch der Tierschutzgedanke, der nicht nur „Qualzuchten“ verbietet, sondern auch über die Erkennung von Genvarianten, die die Widerstandskraft gegenüber Infektionen beeinflussen, die Züchtung resistenter oder weniger anfälliger Tiere ermöglichen will. Langfristig wird allerdings die Suche nach wirt-

schaftlich interessanten Genen immer mehr an Bedeutung gewinnen: Dabei wird es darum gehen, Gene zu identifizieren, die mit einer verbesserten Fleisch-, Fett und Milchqualität in Zusammenhang stehen. Solche Leistungsmerkmale werden in der Regel als „quantitative Merkmale“ vererbt (Kapitel 10.3.4 und 10.4.6; Abb. 9.46). Ein frühes Beispiel für die Verbesserung der Zucht ist die Erkennung des Stress-Syndroms bei Schweinen (malignes Hyperthermie-Syndrom, MHS). In Belastungssituationen können betroffene Tiere an Kreislaufversagen verenden. Zur Diag-

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Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

nose dieser autosomal-rezessiven Erkrankung mit variabler Penetranz wurden früher betroffene Tiere als Ferkel mit Halothan narkotisiert: Gesunde Tiere sacken dabei schlaff zusammen, während betroffene Tiere verkrampfen. Das verantwortliche Gen codiert für einen Ryanodin-Rezeptor (Gensymbol RYR1), dessen Defekt (Aminosäureaustausch von Arginin zu Cystein an der Codonposition 614: Arg614Cys) den Transport von Calcium-Ionen durch die Zellmembran und damit die Muskelkontraktion beeinflusst (Fujii et al. 1991). Tiere mit diesem Gendefekt setzen allerdings auch überdurchschnittlich viel mageres Fleisch an, sodass durch die Selektion auf eine höhere Fleischleistung die Anfälligkeit für MHS mitgezüchtet wurde. Es gibt eine Reihe weiterer Beispiele dafür, dass bestimmte Allele mit Vergrößerungen einzelner Muskeln gekoppelt sind. Abb. 9.47 zeigt das Beispiel eines belgischen Bullen; Ursache in diesem Fall ist der homozygote Funktionsverlust des Myostatin-Gens. Die Tierzucht bewegt sich darauf hin, zur Zucht eine Vielzahl genetischer Tests heranzuziehen. Es wird sicherlich auch nicht mehr lange dauern, bis die vollständigen Sequenzen der für die Landwirtschaft wichtigsten Tiergenome komplett vorliegen. Zu den neuen Zuchtzielen gehört neben einer verbesserten Produktivität auch, Medikamente zu erzeugen. Das Schaf „Tracy“ produzierte in seiner Milch das für die Lungenfunktion wichtige Protein α1-Antitrypsin (AAT), das zur Behandlung von Zystischer Fibrose (S. 636) und von Lungenemphysemen eingesetzt werden kann (50 % des Proteingehalts der Milch von „Tracy“ war humanes AAT!). Zwar war der Integrationsort des humanen AAT-Gens nicht stabil, sodass es nicht in gewünschter Form auf die Nachkommen von „Tracy“ übertragen werden konnte. Allerdings wurde dieses Phänomen bei einem anderen Tier nicht beobachtet, und schließlich konnte daraus eine Herde mit über 600 Tieren aufgebaut werden, die AAT jeweils in einer Konzentration von 13–16 g/l Milch lieferten. Das führte zu einer Produktion von über 1 kg klinisch-reinem AAT pro Woche (Reinheitsgrad > 99,999 %; Colman 1999). Bei Schweinen wird daran gearbeitet, die Zelloberflächen so zu verändern, dass sie vom menschlichen Immunsystem nicht als fremd erkannt werden. Sollte dies gelingen, könnten Schweine als Organspender infrage kommen. Ansatzpunkte dazu sind die Expression menschlicher Komplementinhibitoren (wie CD29) und

Abb. 9.47 Doppelmuskel in Rindern. Vergleich eines Blauen Belgiers (oben) mit dem Doppellender-Phänotyp mit einem Charolais-Bullen (unten), der dieses Merkmal nicht aufweist. Der Doppellender-Phänotyp wird durch eine homozygote Funktionsverlustmutation im Myostatin-Gen hervorgerufen. Die weiße Farbe des Weiß-Blauen Belgiers wird durch eine Mutation im Gen für den Mastzellwachstumsfaktor (MGF) hervorgerufen, der ein Ligand für den Kit-Rezeptor ist. (Nach Andersson 2001, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

die verminderte Bindung von Antikörpern durch die Expression der menschlichen α-1,2-Fucosyltransferase. Die kombinierte Expression dieser beiden Komponenten in transgenen Schweinen zeigte schon einen deutlichen Fortschritt in der Resistenz peripherer Blutzellen dieser Schweine gegenüber einer Lysis durch humanes Serum (Costa et al. 2002). Aufgrund des zunehmenden Bedarfs an Transplantationsmaterial enthalten derartige Entwicklungen großes medizinisches Potenzial.

9.7 Ortsspezifische Mutationen

Kernaussagen ï Mutationen sind ein Grundphänomen von Lebewesen. Sie sind die Grundlage für evolutionäre Prozesse. ï Mutationen können sich in Keimzellen und in somatischen Zellen in gleicher Weise ereignen. ï Verschiedenartige molekulare Mechanismen sind für spontane Mutationen verantwortlich. ï Reparaturmechanismen sorgen für eine teilweise Korrektur von Mutationen. Spontane Mutationsraten und die Effektivität von Reparaturmechanismen stehen in einem Gleichgewicht, das durch die Erfordernisse der Evolution bestimmt wird. ï Mutagenitätstests gestatten eine allgemeine Abschätzung der mutagenen Wirkung von chemischen Verbindungen. ï Die gezielte Übertragung von Genen in verschiedene Organismen erlaubt deren Überexpression oder gezielte Hemmung; der neue Organismus wird als „transgen“ bezeichnet.

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Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Technik-Box 20

SSCP-Analyse (single strand conformation polymorphism-Analyse) Eine der wichtigsten Aufgaben der Molekularbiologie in der Medizin ist die Identifikation von Punktmutationen und von Polymorphismen in der DNA einzelner Gene. Eine geeignete Möglichkeit hierfür bietet sich in der Gelelektrophorese von EinzelstrangDNA unter nicht-denaturierenden Gelbedingungen. Einzelstrang-DNA erhält man durch Denaturierung der DNA (Technik-Box 2). Die Einzelstränge bilden, abhängig von den Temperaturund Salzbedingungen, eine komplexe Sekundärstruktur, die spezifisch für die Nukleotidsequenz ist und sich daher bei beiden Strängen unterscheidet. Als Folge unterschiedlicher Sekundärstrukturen wandern DNA-Stränge gleicher Länge, aber unterschiedlicher Basensequenzen unterschiedlich schnell

im elektrischen Feld, da sie durch die Gelporen in unterschiedlichem Maße in ihrer Bewegung behindert werden. Die Gelzusammensetzung ist entscheidend für die Auflösung bei der Trennung. Man kann durch diese Methode unter geeigneten Bedingungen Mutationen einzelner Basen erkennen. Sie hat daher in der Humangenetik eine wichtige Bedeutung für diagnostische Zwecke erlangt; das Gleiche gilt für die Überwachung von Zuchtergebnissen bei Tieren. Allerdings ist die Anwendung der SSCP-Analytik auf relativ kurze DNA-Stränge begrenzt (bis zu etwa 400 nt), für längere Moleküle erzielt man keine ausreichende Auflösung der elektrophoretischen Mobilität.

Die Abbildung zeigt vier SSCP-Analysen verschiedener Glaukom-Patienten; dabei wurden jeweils unterschiedliche Bereiche des OPTC-Gens untersucht. Die Pfeile in den jeweils linken Bildern deuten auf Proben mit unterschiedlichem Muster hin (SSCP-PAGE: SSCP-Analyse auf Polyacrylamid-Gelen). Die entsprechenden Proben wurden sequenziert und heterozygote Stellen identifiziert (Pfeile in den Se-

In der Praxis führt man SSCP-Experimente in Kombination mit der PCRTechnik aus. Man amplifiziert einen Genbereich, der aus diagnostischen Überlegungen interessant ist, mittels geeigneter Primer durch PCR an genomischer DNA und analysiert die PCRProdukte auf nativen PolyacrylamidGelen. Ein verändertes Bandenmuster ist ein deutlicher Hinweis darauf, dass eine Mutation vorliegt – um die mutierte Stelle jedoch zu identifizieren, muss der Bereich aber sequenziert werden (Technik-Box 21). Im folgenden Beispiel ist das für die Mutationsanalytik des menschlichen OpticinGens (OPTC) dargestellt, das für eine spezielle Form des Glaukoms (Grüner Star) verantwortlich ist.

quenzen mit Angabe der heterozygoten Basen). Über den jeweiligen Doppelbildern ist der Basenaustausch für die jeweilige Position der cDNA angegeben; in Klammern der dazugehörige Aminosäureaustausch an dem betroffenen Codon. (Nach Acharya et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung des Autors)

Technik-Box

Technik-Box 21

DNA-Sequenzierung Anwendung: Ermittlung der Nukleotidsequenz von DNA. Methode: Zur Ermittlung der Nukleotidsequenz von DNA wurden im Wesentlichen zwei Methoden entwickelt, die Didesoxy-Kettenterminationsmethode (engl. chain termination method) von Sanger und die MaxamGilbert-Methode, die auf chemischer Degradation von DNA beruht. Heute wird vorzugsweise die Sanger-Methode (Sanger et al. 1977) für Sequenzbestimmungen gebraucht. Sanger-Methode. Sie macht von der Möglichkeit Gebrauch, mithilfe von DNA-Polymerase an Einzelstrang-DNA von einem Primer aus einen neuen komplementären DNA-Strang zu synthetisieren. Diese Synthese erfolgt in Gegenwart von Nukleotidtriphosphaten, denen in niedriger Konzentration Didesoxynukleotide, d. h. Nukleotide, deren 3,-Hydroxylgruppe an der Desoxyribose fehlt, beigefügt sind. Es kommt unter diesen Bedingungen zu einem Abbruch der DNA-Synthese, sobald ein Didesoxynukleotid in den neu synthetisierten Strang eingebaut wird, da wegen der fehlenden 3,-OH-Gruppe der Desoxyribose kein weiteres Nukleotid angefügt werden kann. Der Einbau von Didesoxynukleotiden erfolgt zufallsgemäß, sodass eine Mischung von neu synthetisierten DNA-Strängen unterschiedlicher Länge entsteht. Der Größenbereich liegt zwischen einem und mehreren Hundert Nukleotiden, die an den Primer (etwa 15–29 Nukleotide) angefügt werden. Diese werden auf Polyacrylamidgelen nach

ihrer Länge fraktioniert. Führt man die DNA-Synthese in vier getrennten Reaktionen durch, denen jeweils ein anderes Didesoxynukleotid beigefügt wird (also ddA, ddG, ddC oder ddT), so erfolgt in jedem einzelnen Reaktionsansatz der Kettenabbruch jeweils nur nach einem spezifischen Nukleotid (also nach einem A, G, C oder T). Diese Reaktionsgemische werden getrennt und in parallelen Positionen auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen und elektrophoretisch getrennt. Alle Reaktionsgemische enthalten neben den Didesoxynukleotiden ein radioaktiv markiertes Nukleotid (z. B. 32P- oder 35Smarkiert). Man kann daher solche Gele autoradiographisch analysieren, wodurch die verschiedenen Molekülgruppen im Film durch strahlungsinduzierte Schwärzungen sichtbar werden (Technik-Box 13). Solche Autoradiogramme gestatten es, die Basensequenz der DNA direkt abzulesen. Moderne Sequenzierautomaten verwenden statt der radioaktiv markierten Nukleotide solche, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind. Es können damit Leseweiten bis knapp 1000 Basen erzielt werden (siehe Abb. c). Maxam-Gilbert-Methode (1977). Sie beruht auf einer ganz anderen experimentellen Grundlage als die SangerMethode. Durch nukleotidspezifische partielle chemische Spaltung der DNA (z. B. hinter G, C, A + G, C + T oder vorzugsweise A) werden in getrennten Reaktionen DNA-Moleküle unterschiedlicher Länge erzeugt, die jedoch am Ende jeweils das gleiche Nukleotid besitzen. Das andere Ende des Mole-

küls ist radioaktiv markiert, sodass wir, vergleichbar mit der Sanger-Methode, nach einer elektrophoretischen Auftrennung der Moleküle nach ihrer Größe und anschließender Autoradiographie die Längen aller Moleküle feststellen können, die das gleiche Nukleotid am Ende besitzen. Die Längen der Moleküle in den verschiedenen Teilreaktionen gestatten es wiederum, die genaue Nukleotidsequenz aus dem Autoradiogramm abzulesen. Zum chemischen Abbau der DNA dienen verschiedene Agenzien, die die DNA entweder an spezifischen Nukleotiden methylieren (Dimethylsulfat: Methylierung von G) oder durch Schwächung der Glykosidbindung der Basen depurinieren (mit Piperidin: A und G) und infolgedessen die DNA an der betreffenden Stelle hydrolysieren oder Pyrimidinringe (C und T) öffnen (Hydrazin), sodass ebenfalls Hydrolyse erfolgt. Bei stark alkalischem pH (1,2 N NaOH) und hoher Temperatur (90 °C) werden die Phosphodiesterbindungen nach A, in geringerem Maße auch nach C, geöffnet. Die Maxam-Gilbert-Methode bietet Vorteile, wenn es darum geht, DNA-Protein-Interaktionen auf ihre Sequenzspezifität hin zu untersuchen. Bindet nämlich ein Proteinmolekül sequenzspezifisch an die DNA, so kann in der betreffenden Region keine Spaltung der DNA erfolgen. Im Sequenzgel werden daher im Bindungsbereich des Proteins keine Moleküle sichtbar, die in diesem Sequenzbereich gespalten worden sind. Auf diese Weise lassen sich Proteinbindungsstellen an der DNA mit großer Genauigkeit ermitteln.

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Kapitel 9: Veränderungen im Genom: Mutationen

Technik-Box 21

DNA-Sequenzierung (Fortsetzung)

DNA-Sequenzierung. a Es sind die DNA-Sequenz und die in den verschiedenen Reaktionen entstehenden Einzelstränge gezeigt. Die Reaktionsgemische werden auf ein Sequenzgel aufgebracht, das nach Größentrennung der Nukleinsäureketten autoradiographiert wird (b). b Ausschnitt aus einem DNASequenzgel nach Sanger (Didesoxynukleotid-Methode). Die Elektrophoreserichtung ist von oben nach unten, d. h. die Größe der Nukleotidketten nimmt nach oben zu. In den vier Bahnen sind der Reihenfolge nach die Sequenzierungsgemische mit Didesoxy-T (T), Didesoxy-C (C), Didesoxy-G (G) und Di-

c

desoxy-A (A) aufgetragen. Die radioaktiven Banden (durch 32P-markiertes dC hervorgerufen) zeigen daher in dieser Reihenfolge Kettenabbrüche mit dem betreffenden Nukleotid an. Die stufenweise Folge der radioaktiven Banden gibt daher die Folge der Nukleotide in der DNA wieder (rechts). Das 5,-Ende des DNA-Strangs liegt unten. c Es ist ein Sequenzbeispiel gezeigt, das mit einem modernen Sequenzierautomaten erhalten wurde. Der rote Pfeil weist auf eine heterozygote Base hin. Diese Methode ist damit auch geeignet, in genomischer DNA heterozygote Träger von Punktmutationen zu identifizieren.

Technik-Box

Technik-Box 22

Transgene Mäuse Anwendung: Dauerhafter Transfer von fremdem Erbmaterial zur Herstellung neuer Eigenschaften in Tieren. Voraussetzungen: Mikroinjektionsanlagen, Tierhaltungskapazitäten. Methoden: Durch direkte DNA-Mikroinjektion in den Vorkern einer befruchteten Eizelle kann neue genetische Information in das Genom eines Tieres eingeführt werden; die Methode ist insbesondere für Mäuse etabliert (Abb. 9.44, 9.45). In etwa 30 % der Fälle wird die von außen zugeführte DNA stabil in das Genom integriert; der Integrationsort ist weitgehend zufällig. Die Eizelle mit der fremden DNA wird chirurgisch in den Uterus von scheinschwangeren Ammenmüttern übertragen. Es werden transgene Tiere geboren, die die veränderte Erbinformation an die nächste Generation weitergeben. Die Herstellung transgener Tiere ist allerdings nicht auf die Maus beschränkt, sondern inzwischen in vielen Tierarten möglich , darunter auch Nutztiere wie Schweine und Rinder. Die Herstellung transgener Tiere kann zu verschiedenen Zwecken verwendet werden:

• Zusätzliches Einführen von WildtypSequenzen eines Gens zur Korrektur von Mutationen; dabei wird allerdings die ursprüngliche Mutation nicht entfernt. • Einführung eines neuen Gens zur Funktionsanalyse oder zur Herstellung spezifischer Produkte (z. B. Arzneistoffe in der Milch); dabei ist allerdings auf die Wahl eines geeigneten Promotors zu achten, um eine zeitlich/räumlich spezifische Expression zu erhalten. • Expressionsanalyse: Durch Kopplung von Promotorfragmenten mit einem Reportergen (z. B. lacZ) ist es möglich, die zeitliche und räumliche Aktivitätsmuster von Promotorfragmenten in vivo zu untersuchen. Spezialfall: Induzierbare Systeme Oft ist die Expression eines Transgens nur zu bestimmten Entwicklungsabschnitten oder zu bestimmten Zeitpunkten erwünscht. Diese Feinregulation ist mit der traditionellen Methode eines einzelnen Promotors in der Regel nicht möglich, sodass hierzu binäre Systeme verwendet werden. Am bekanntesten ist das Tet-on/Tet-off-System (Baron u. Bujard 2000; siehe Abbildung), das auf

der Tetracyclin (Tet)-abhängigen Wirkung eines Transaktivators beruht (üblicherweise wird das Derivat Doxycyclin verwendet, das über das Trinkwasser verabreicht werden kann). Dieser Tet-abhängige Transaktivator (tTA) besteht aus einem gewebespezifischen Promotor, dem tetR-Gen (aus E. coli) und Sequenzen für die Aktivierungsdomäne des Proteins VP16 des Herpes-simplex-Virus. Der zweite, unabhängige Bestandteil enthält das zu exprimierende Gen unter einem Promotor, der Bindestellen für den Transaktivator enthält (tetO). Beide Komponenten können zunächst als unabhängige Transgene in Mauslinien etabliert werden; durch Kreuzung werden die Komponenten in einer Maus zusammengebracht. In Abwesenheit von Doxycyclin können tTADimere spezifisch an die tetO-Sequenzen binden, wodurch die Expression des Zielgens induziert wird. Durch Gabe von Doxycyclin im Trinkwasser kann diese Expression gestoppt werden. – Es wurde auch das umgekehrte System entwickelt (reverses Tet-on/Tet-off-System). Dabei wurde das tetR-Gen so mutiert, dass eine Bindung von tetR an tetO nur in Anwesenheit von Doxycyclin stattfinden kann.

Das Tet-on/Tet-off-System. a Im klassischen System bindet tTA mit seiner DNA-Bindedomäne (rot) in Abwesenheit von Doxycyclin (dox, gelb) an die tet-Operatoren stromaufwärts der TATA-Box und aktiviert die Transkription des Zielgens. Ist Doxycyclin vorhanden, so bindet dieses an tTA. Es kommt zu einer Konformationsänderung (rotes Viereck), sodass tTA von tetO dissoziiert; die Aktivierung des Zielgens wird damit aufgehoben. b Im reversen System kann rtTA nicht an die tet-Operatoren binden, sodass die Transkription des Zielgens nicht aktiviert wird. Ist Doxycyclin vorhanden, so bindet dieses an rtTA. Es kommt zu einer Konformationsänderung, sodass rtTA jetzt an die tet-Operatoren stromaufwärts der TATA-Box binden kann; damit wird die Transkription des Zielgens aktiviert. (Nach Hillen u. Berens 2002, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

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Kapitel 10

Formalgenetik Inhaltsverzeichnis 10.1 Grundregeln der Vererbung: Die Mendel’schen Regeln . . . . . . . . . . . . . . . . .

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10.2 Statistische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 466 10.3 Mendel aus heutiger Sicht – Ergänzungen seiner Regeln . . . . . . . . . . . . . . . . . 469 10.4 Kopplung, Rekombination und Kartierung von Genen . . . . . . . . . . . . . . . . . 486 10.5 Populationsgenetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 501

Das Untersuchungsmaterial Gregor Mendels: Pisum sativum. (Tuschezeichnung: S. Erni, Luzern)

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Kapitel 10: Formalgenetik

Überblick Die Ausprägung einzelner Merkmale ist über mehrere Generationen hinweg genetisch eindeutig festgelegt. Bestimmte Eigenschaften treten daher in Individuen aufeinanderfolgender Generationen immer wieder in gleicher Art und Weise auf. Gregor Mendel (1822–1884) hat sich diese Beobachtung zunutze gemacht und durch konsequente Kreuzungsanalyse von Pflanzen mit ausgewählten Merkmalen die Grundregeln der Vererbung erkannt. Der erste Schritt für das Verständnis von Vererbungsvorgängen war die Erkenntnis, dass es konkrete erbliche Einheiten – die Gene – gibt (Mendel selbst sprach noch von „Merkmalen“). Für das Verständnis der Vererbung in höheren Organismen (Pflanzen und Tieren) war als zweiter Schritt die Erkenntnis entscheidend, dass jedes Gen in jeder Zelle zweifach vorhanden ist (Diploidie). Schließlich folgte als dritter Schritt die Feststellung, dass die in Körperzellen doppelt vorhandenen Gene sich in den Keimzellen voneinander trennen müssen, um in den Gameten in einer einfachen Ausführung (haploid) an die Nachkommen übergeben werden zu können. Eine wichtige Voraussetzung für Mendels Experimente war, dass es für Gene unterschiedliche Ausprägungsformen (Allele) gibt. In den diploiden Zellen eines Organismus können entweder zwei identische (homozygote) oder zwei unterschiedliche (heterozygote) Allele vorhanden sein. Im heterozygoten Zustand ist häufig nur das eine Allel erkennbar, wenn man das Erscheinungsbild (den Phänotyp) des betreffenden Organismus betrachtet. Mendel hat diese Eigenart als Dominanz einer Merkmalsform bezeichnet. Die nicht sichtbare Form des Gens nannte er rezessiv. Die rezessive Form eines Gens ist nur dann sichtbar, wenn sie in einem Individuum homozygot auftritt. Aufgrund dieser Erkenntnisse lässt sich die relative Anzahl unterschiedlicher Phänotypen der Nachkommen errech-

10.1 Grundregeln der Vererbung: Die Mendel’schen Regeln Der Augustinerpater Gregor Mendel (1822–1884) gilt wegen der Auswertung und Interpretation seiner in großer Zahl angelegten Kreuzungsexperimente als Gründer der Genetik als wissenschaftlicher Disziplin. Er beschrieb diese Versuche und deren Ergebnisse in seiner Arbeit Versuche über Pflanzenhybriden, die 1866 veröffentlicht wurde. Diese Veröffentlichung des Naturforschenden Vereins zu Brünn folgte auf einen Vortrag seiner Ergebnisse in einer der wissenschaftlichen Sitzungen derselben Vereinigung. Mendel bewies hier, dass erbliche Information in diskreten Einheiten, die er als Merkmale bezeichnete, an die Nachkommen weitergegeben werden: Er hatte damit die Existenz der Gene entdeckt. Zugleich aber konnte er durch seine

nen. Diese Vorhersage gilt auf statistischer Grundlage, da die Vereinigung von zwei Gameten in der Zygote dem Zufall unterliegt und man nur Aussagen über die mittleren Häufigkeiten bestimmter Kombinationen machen kann. Mendel hatte jedoch nur einen kleinen Ausschnitt aus der Vielfalt der Eigenschaften des Erbmaterials erfasst. So besitzen verschiedene Allele eines Gens nicht immer klare Dominanz-Rezessivitäts-Beziehungen. Durch die Kombination zweier unterschiedlicher Allele können beispielsweise neue Phänotypen entstehen (unvollständige Dominanz), oder beide Allele können unabhängig voneinander zum Ausdruck kommen (Codominanz). Viele phänotypische Merkmale werden nicht nur durch ein einziges Gen bestimmt, sondern durch das Zusammenspiel mehrerer Gene (polygene Vererbung). Auch können einzelne Gene mehrere Merkmale in ihrer Ausprägung beeinflussen (Pleiotropie). Alle diese Eigenschaften von Genen führen zu Phänotypen, die sich nach den Mendel’schen Gesetzen allein nicht ohne Weiteres vorhersagen lassen, sondern komplizierterer genetischer Analysen bedürfen. Die Verteilung von Allelen kann nicht nur auf der Ebene von Individuen, sondern auch innerhalb von Populationen betrachtet werden. Die quantitative und qualitative Zusammenstellung der Gesamtheit der Gene innerhalb einer Generation (Genpool) ist abhängig von einer Reihe von Faktoren, z. B. Selektion, Gründereffekt (bei kleinen Gruppen von Individuen) und Zu- oder Abwanderung von Individuen. Populationen von Organismen unterliegen also im Laufe der Zeit Veränderungen, die schließlich dazu führen können, dass eine Population sich genetisch von anderen, zunächst gleichartigen Populationen entfernt und zu einer neuen Art weiterentwickelt hat.

Kreuzungsversuche die Grundregeln aufklären, die der Verteilung und der Wechselwirkung der Gene bei der Weitergabe an die nächste Generation zugrunde liegen. Die Versuche wurden hauptsächlich an der Erbse (Pisum sativum) durchgeführt, jedoch zum Teil an verschiedenen Phaseolus-Arten wiederholt, sodass Mendel von ihrer allgemeinen Gültigkeit überzeugt war. Mendel hat seine Entdeckung zwei wichtigen methodischen Ansätzen zu verdanken, die er ganz bewusst zur Grundlage seiner Versuche gewählt hatte: ï Zum einen war es die Wahl eindeutig und klar gegeneinander abgrenzbarer Merkmale, die er durch die Kreuzungen hinweg leicht verfolgen konnte, die dem Erfolg seiner Analyse zugrunde lag. Die klare Abgrenzbarkeit des Charakters eines Merkmals ist bis heute eine der wichtigsten Forde-

10.1 Grundregeln der Vererbung: Die Mendel’schen Regeln

rungen für seine Verwendung in genetischen Versuchen geblieben. ï Ein zweites, bis dahin in der Biologie ganz ungebräuchliches Mittel war die Verwendung statistischer Methoden für die Auswertung seiner Kreuzungsexperimente. Mendel war als Physiker ausgebildet, sodass ihm die Anwendung mathematischer Methoden und die Forderung nach klarer Abgrenzung experimenteller Parameter in naturwissenschaftlichen Versuchen vertraut waren. Die Beobachtungen Mendels sind zunächst völlig unverstanden geblieben und bis zur Jahrhundertwende nicht weiter beachtet worden. Das ist umso überraschender, als Darwins Deszendenztheorie 1859, also kurz vor der Veröffentlichung von Mendels Schrift Versuche über Pflanzenhybriden, der Öffentlichkeit vorgelegt worden war. Hätte Charles Darwin (1809– 1882) die Mendel’schen Arbeiten in ihrer Bedeutung wahrgenommen, wäre er vielleicht zu Erkenntnissen über den Verlauf der Evolution der Organismen gekommen, die erst im 20. Jahrhundert von anderen Wissenschaftlern formuliert wurden. Genau zur Jahrhundertwende, im Jahre 1900, begann sich die Genetik endgültig als eine eigene biologische Disziplin zu profilieren. Drei Wissenschaftler – Hugo de Vries (1848– 1935), Erich von Tschermak-Seysenegg (1871–1962) und Carl Erich Correns (1864–1933) – erkannten aufgrund eigener neuer Experimente die Bedeutung der Arbeiten Mendels gleichzeitig. In den folgenden Abschnitten wollen wir zunächst Mendels Experimenten und deren Ergebnissen, in den wichtigsten Abschnitten mit seinen eigenen Worten, nachgehen. Mendel wählte für seine Versuchsserien an Erbsen sieben Merkmale aus Unterschieden „in der Länge und Färbung der Stengel, in der Grösse und Gestalt der Blätter, in der Stellung, Farbe und Grösse der Blüthen, in der Lage der Blüthenstiele, in der Farbe, Gestalt und Grösse der Hülsen, in der Gestalt und Grösse der Samen, in der Färbung der Samenschale und des Albumens“. Er begründet diese Auswahl damit, dass ein Teil der vorhandenen Merkmale „eine sichere und scharfe Trennung nicht“ zulässt, „indem der Unterschied auf einem oft schwierig zu bestimmenden ,mehr oder weniger’ beruht ... Solche Merkmale waren für die Einzelversuche nicht verwendbar, diese konnten sich nur auf Charactere beschränken, die an den Pflanzen deutlich und entschieden hervortreten.“ Die von Mendel gewählten Merkmale und ihre alternativen Formen sind in Abb. 10.1 und Tabelle 10.1 zusammengefasst. Mendel kombinierte in seinen Versuchen jeweils zwei alternative Formen eines Merkmals und führte reziproke Kreuzungen damit durch. Als reziproke Kreuzungen bezeichnet man Kreuzungen, bei denen

Individuen einer bestimmten genetischen Konstitution einmal als weiblicher Partner (bei Pflanzen also als Pollenempfänger), das andere Mal als männlicher Partner (bei Pflanzen als Pollenspender) dienen. Pflanzen bieten für solche Versuche besondere Vorteile, wenn sie einhäusig (monözisch) sind, da in diesem Fall die männlichen und weiblichen Blüten auf einer Pflanze zu finden sind. Man kann mit ihnen Selbstbefruchtungen durchführen, sodass die genetische Konstitution der Gameten einheitlich ist. Erzeugt man durch wiederholte Selbstbefruchtung reine Linien, d. h. Pflanzen, die in allen Nachkommengenerationen ein Merkmal stets nur in derselben Ausprägungsform aufweisen, sind die Ausgangsbedingungen der mit diesen Linien durchgeführten Versuche eindeutig festgelegt. Neue Merkmalsformen oder Merkmalskombinationen in der Nachkommenschaft können dann ausschließlich ein Ergebnis der Kreuzungsbedingungen sein. Als erstes Ergebnis solcher Kreuzungen zeigte es sich, dass stets nur eine der beiden alternativen Merkmalsformen in den Hybriden (wir sprechen heute von der F1-Generation oder 1. Filialgeneration) zur Ausprägung kommt, während die alternative Form eines Merkmals nicht sichtbar ist (Abb. 10.2). Diese Beobachtung, dass reziproke Kreuzungen reiner Linien stets gleiche Nachkommen ergeben, ist heute unter der Bezeichnung 1. Mendel’sche Regel oder als Uniformitäts- oder Reziprozitätsregel eine der Grundregeln der Genetik. Die Interpretation dieser Beobachtungen ist in Abb. 10.3 gegeben. Mendel nahm an, dass der Organismus zwei Ausführungen eines jeden Merkmals (im Beispiel also für die Parentalgeneration P: AA oder aa) besitzt. In den Nachkommen (F1) sind ebenfalls zwei Ausführungen zu finden, nun jedoch in veränderter Kombination: Es ist je eine Ausführung des väterlichen und des mütterlichen Merkmals vorhanden. Wie erklärt sich diese Neukombination und wie kommt sie zustande? Die Erklärung finden wird in Abb. 10.4a. Während gewöhnliche Zellen eines Organismus jeweils zwei Ausführungen des Merkmals besitzen, enthalten Gameten (Keimzellen) nur eine dieser beiden Ausführungen, d. h. diese werden während der Keimzellentwicklung auf verschiedene Zellen verteilt. Bei der Befruchtung verschmelzen eine väterliche und eine mütterliche Keimzelle zur Zygote, und es entsteht so wieder eine Zelle mit zwei Ausführungen des Merkmals. Zur leichten formalen Analyse von Kreuzungsexperimenten und den zu erwartenden Ergebnissen führte R. C. Punnett zu Beginn des 20. Jahrhunderts (1911) die in Abb. 10.4b gezeigte Darstellung ein, das heute als Punnett-Viereck bezeichnete Schema. In diesem Schema werden in den äußeren horizontalen und ver-

457

458

Kapitel 10: Formalgenetik

Abb. 10.1 Die von Gregor Mendel untersuchten sieben Merkmale von Pisum sativum (Nummerierung wie in Tabelle 10.1). (Originalzeichnung: S. Erni, Luzern)

10.1 Grundregeln der Vererbung: Die Mendel’schen Regeln

Abb. 10.2 1. Mendel’sche Regel. Monohybride Kreuzung zweier reiner Linien unterschiedlicher Blütenfarbe von Pisum sativum. Die Staubfäden des weiblichen Kreuzungspartners (links) sind entfernt worden, um Selbstbefruchtung zu verhindern. Der Pollen

wird mit einem Pinsel auf die Narbe der Samenpflanze übertragen. Die Nachkommen (F1-Generation) zeigen alle einheitlich die dominante Blütenfarbe (purpur), unabhängig davon, welche Linie als Pollen- oder Samenpflanze für die Kreuzung verwendet wurde

Abb. 10.3 Mendels Interpretation der Ergebnisse der monohybriden Kreuzung: Schema der Verteilung der Merkmale auf zellulärer Ebene. Die dominanten Merkmale (Blütenfarbe purpur) sind mit großen Buchstaben, die rezessiven Merkmale (Blütenfarbe weiß) mit kleinen Buchstaben charakterisiert. Mendel

nahm an, dass jede gewöhnliche Zelle der Pflanze zwei Ausführungen jedes Merkmals enthält, die sich nur bei der Keimzellentwicklung voneinander trennen und auf einzelne Gameten verteilen (Haploidie). Bei der Befruchtung wird der Zustand mit zwei Merkmalen wiederhergestellt (Diploidie)

Abb. 10.4 a, b a Genetische Konstitution der in Abb. 10.2 gezeigten Individuen. Das Schema in Abb. 10.3 gestattet es, die genetische Konstitution dieser Individuen zu erklären. Die reinen Linien der Parentalgeneration (P) besitzen jeweils homozygot das dominante (AA) oder das rezessive (aa) Merkmal. Durch Aufspaltung in den Gameten kommt es zur heterozygoten Konstitution (Aa) in der Filialgeneration (F1). Nur die

dominante Merkmalsform (Allel) A kommt zur Ausprägung im Phänotyp. b Die geeignete Darstellung der Kreuzung und ihrer Ergebnisse ist das Viereck nach Punnett. In den horizontalen und vertikalen Außenreihen werden alle jeweils möglichen Gametenkonstitutionen der Eltern eingetragen. Die genetischen Konstitutionen der Nachkommen und ihre Häufigkeiten können dann im Inneren des Vierecks direkt abgelesen werden

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460

Kapitel 10: Formalgenetik

tikalen Positionen alle möglichen genetischen Konstitutionen der väterlichen und mütterlichen Keimzellen eingetragen. In den inneren Feldern des Vierecks ergeben sich dann aus den Kombinationen beider Gametenkonstitutionen alle genetischen Konstitutionen der Nachkommen. Diese Art der Auswertung hat sich als besonders übersichtlich erwiesen, und wir werden noch sehen, dass sie auch bei komplexeren genetischen Konstitutionen der Gameten und bei der Untersuchung der Häufigkeiten der unterschiedlichen F2-Konstitutionen sehr gute Dienste leistet. Sie ist daher anderen Kreuzungsschemata vorzuziehen. Mendel führte zur Kennzeichnung der in den Hybriden sichtbaren Merkmalsform den Begriff dominant, für die unsichtbare Form des Merkmals die Bezeichnung rezessiv ein. „Der Ausdruck ,recessiv‘ wurde deshalb gewählt, weil die damit benannten Merkmale in den Hybriden zurücktreten oder ganz verschwinden, jedoch unter den Nachkommen derselben, wie später gezeigt wird, wieder unverändert zum Vorschein kommen“ (Mendel 1866). Dieses Ergebnis bedeutete zugleich, dass alle Hybride das gleiche Erscheinungsbild aufweisen. Es ist hierbei ohne Bedeutung, aus welcher der beiden reziproken Kreuzungen die dominante Form des Merkmals kommt. Mendel verweist übrigens auch darauf, dass diese Beobachtung bereits zuvor von anderen Beobachtern beschrieben worden war und von ihm praktisch nur bestätigt wird. Für die Darstellung dominanter und rezessiver Merkmale in Kreuzungen ist es üblich, dominante Merkmale mit großen, rezessive mit kleinen Buchstaben anzugeben (siehe dazu im Detail S. 477). Die Buchstaben sind Abkürzungen der Bezeichnungen der Merkmale und werden kursiv gesetzt.

1. Mendel’sche Regel: Nachkommen reziproker Kreuzungen reiner Linien besitzen einen einheitlichen Phänotyp.

Es soll noch erwähnt werden, dass bei dem letzten der in Tabelle 10.1 verzeichneten Merkmale (Achsenlänge) die Hybriden größer sind als beide Homozygoten. Mendel selbst schreibt hierzu: „Was das letzte Merkmal anbelangt, muss bemerkt werden, dass die längere der beiden Stamm-Achsen von der Hybride gewöhnlich noch übertroffen wird, was vielleicht nur der großen Ueppigkeit zuzuschreiben ist, welche in allen Pflanzentheilen auftritt, wenn Axen von sehr verschiedener Länge verbunden sind.“ Man bezeichnet diese Erscheinung, dass ein Hybrid in seiner Erscheinungsform die Homozygoten übertrifft, heute als Heterosis oder Überdominanz (Shull 1908). Wir werden hierauf in anderem Zusammenhang zurückkommen (S. 510).

Die in den zuvor beschriebenen Experimenten erhaltenen Hybriden wurden nun von Mendel untereinander weitergekreuzt. Es zeigte sich, dass in der Nachkommenschaft (heute F2-Generation oder 2. Filialgeneration genannt) beide ursprünglichen Merkmale wieder sichtbar werden. Allerdings treten diese nicht mit gleicher Häufigkeit auf, sondern das rezessive Merkmal wird nur in 25 % aller Nachkommen gefunden. Das gleiche gilt auch für die reziproke Kreuzung (Abb. 10.5). Wir wollen uns diese Ergebnisse anhand der von Mendel selbst beobachteten Zahlenverhältnisse vor Augen führen. In Tabelle 10.2 sind die Ergebnisse Mendels für die sieben zuvor beschriebenen Merkmale zusammengestellt. Das 3:1-Verhältnis wird in diesen Versuchen innerhalb gewisser Grenzen recht gut erreicht. Wir erkennen aber auch, von welcher Bedeutung es ist, dass eine ausreichende Anzahl von Nachkommen untersucht wird, um dem theoretischen Wert möglichst nahezukommen. Kreuzt man die verschiedenen Individuen der F2-Generation durch Selbstbefruchtung weiter, so stellt sich heraus, dass die Individuen mit der rezessiven Form eines Merkmals diese Form in allen weiteren Generationen konstant zur Ausprägung bringen (Abb. 10.5). Bei den F2-Individuen mit dominanten Merkmalsformen zeigt jedoch in den folgenden Generationen nur 1/3 unverändert die dominante Merkmalsausprägung, während die übrigen 2/3 wiederum bei 25 % ihrer Nachkommen die rezessive Merkmalsform sichtbar werden lassen. 75 % der Individuen der folgenden Generation tragen die dominante Merkmalsform. Auch in den folgenden Generationen verhalten sie sich bei Kreuzungen untereinander jeweils wie es für die Individuen der F2-Generation beschrieben wurde. „Das Verhältnis 3:1, nach welchem die Vertheilung des dominanten und recessiven Charakters in der ersten Generation erfolgt, löst sich demnach für alle Versuche in die Verhältnisse 2:1:1 auf, wenn man zugleich das dominirende Merkmal in seiner Bedeutung als hybrides Merkmal und als Stamm-Character unterscheidet“ (Mendel 1866). Mendel zieht nun auf der Grundlage dieser Versuche den folgenden Schluss: „Bezeichnet man A das eine der beiden constanten Merkmale, z. B. das dominirende, a das recessive, und Aa die Hybridform, in welcher beide vereinigt sind, so ergibt der Ausdruck: A + 2 Aa + a die Entwicklungsreihe für die Nachkommen der Hybriden je zweier differirender Merkmale.“ In Abb. 10.6 ist dieses Ergebnis in Anlehnung an Abb. 10.3 durch Darstellung der genetischen Konstitutionen der verschiedenen Individuen wiedergegeben.

10.1 Grundregeln der Vererbung: Die Mendel’schen Regeln

Abb. 10.5 2. Mendel’sche Regel. Kreuzung der F1-Individuen der in Abb. 10.2 dargestellten Kreuzung durch Selbstbefruchtung. Die Nachkommen (F2) spalten im Verhältnis 3:1 auf und zeigen in 25 % der Individuen das rezessive Merkmal der P-Generation (weiße Blüten). Diese Individuen behalten ihren rezessiven Phänotyp bei Kreuzungen mit anderen Individuen rezessiven Phänotyps bei. Sie sind also reinerbig für das rezessive Merkmal. Kreuzt man hingegen die Individuen mit dominantem Phänotyp (purpurfarbige Blüten) durch Selbstbefruchtung weiter, so

erhält man in der folgenden Generation (F3) bei 2/3 der Individuen erneut eine Aufspaltung in Pflanzen mit rezessivem oder dominantem Phänotyp im Zahlenverhältnis 1:3. Das restliche Drittel der Individuen mit dominantem Phänotyp behält diesen unverändert auch in den folgenden Generationen bei. Die genetische Konstitution der F2-Individuen ist somit zu 25 % reinerbig (homozygot) für das rezessive Merkmal (weiß: aa), zu 25 % reinerbig (homozygot) für das dominante Merkmal (purpur: AA) und zu 50 % mischerbig ( heterozygot ; Aa) (vgl. Abb. 10.6)

Tabelle 10.1 Mendels sieben Merkmale Merkmal

Ausprägungsform dominant

Ausprägungsform rezessiv

(1) Gestalt der reifen Samen

kugelrund bis rundlich

unregelmäßig kantig, tief runzelig

(2) Farbe des Endosperms

blassgelb, hellgelb, orange

mehr oder weniger intensiv grün

(3) Färbung der Samenschale

grau, graubraun oder lederbraun mit oder ohne violette Punktierung bei violetter Fahne und purpurnen Flügeln der Blüten und rötlichen Stengeln an den Blattachsen

weiß bei gleichzeitig weißer Blüte

(4) Form der reifen Hülse

einfach gewölbt

eingeschnürt und mehr oder weniger runzelig

(5) Farbe der unreifen Früchte

licht- bis dunkelgrün

lebhaft gelb

(6) Stellung der Blüten

achsenständig

endständig

(7) Achsenlänge

lang

kurz

Nach Mendel (1866)

461

462

Kapitel 10: Formalgenetik

Abb. 10.6 Mendels Interpretation der Ergebnisse der monohybriden Kreuzung. Schema der Verteilung der Merkmale in der in Abb. 10.5 dargestellten Kreuzung auf zellulärer Ebene. Einzelheiten der Abbildung sind in der Legende zu Abb. 10.3 erklärt

Tabelle 10.2 F2-Generation einer monohybriden Kreuzung Merkmal

Phänotyp F1

Phänotypen F2

Anzahl F2-Individuen

Verhältnis der F2-Phänotypen

(1) Samenform

rundlich

rundlich kantig

5474 1850

2,96:1

blassgelb grün

6022 2001

3,01:1

violett weiß

705 224

3,15:1

gewölbt eingeschnürt

882 299

2,95:1

dunkelgrün gelb

428 152

2,82:1

achsenständig endständig

651 207

3,14:1

lang kurz

787 277

2,84:1

(2) Endosperm

(3) Samenschale

(4) Hülse

(5) Früchte

(6) Blüten

(7) Achse

blassgelb

violett

gewölbt

dunkelgrün

achsenständig

lang

Nach Mendel (1866)

Diese Beobachtungen Mendels, dass Kreuzungen der F1 untereinander zur Aufspaltung in verschiedene Phänotypen genau definierter Häufigkeiten führt, sind

in der 2. Mendel’schen Regel, der Spaltungsregel, zusammengefasst.

10.1 Grundregeln der Vererbung: Die Mendel’schen Regeln

2. Mendel’sche Regel: Kreuzungen der heterozygo-

ten (mischerbigen) Nachkommen (F1) zweier reinerbiger Elternlinien untereinander führen zur Aufspaltung der Phänotypen nach bestimmten Zahlenverhältnissen.

Durch diese Versuche beweist Mendel, dass es Merkmale in verschiedenen Ausführungsformen gibt, die Varianten desselben genetischen Elementes (oder, wie wir heute sagen: Gens) sind. Man bezeichnet diese alternativen Formen als verschiedene Allele eines Gens. In jedem Individuum sind jeweils zwei Allele desselben Gens vorhanden. Diese beiden Allele innerhalb eines Organismus können identisch oder verschieden sein. Sind beide Allele in einem Organismus identisch, so nennt man die genetische Konstitution des Organismus homozygot, es liegt Homozygotie vor. Sind die beiden Allele verschieden, so ist die genetische Konstitution heterozygot, es liegt Heterozygotie vor. Diese genetische Konstitution eines Organismus bezeichnet man – zur Unterscheidung von seinem Erscheinungsbild (Phänotyp) – als seinen Genotyp.

Gene liegen in den somatischen Zellen eines Indivi-

duums jeweils zweifach vor: Jede Zelle besitzt zwei Allele. Diese beiden Allele können identisch oder verschieden sein. Der rezessive Phänotyp kommt nur in solchen Individuen zum Ausdruck, die homozygot für das rezessive Allel sind. Sind beide Allele unterschiedlich, kommt nur der dominante Phänotyp zur Ausprägung.

In den bisher beschriebenen Experimenten wurde die Vererbung jeweils eines Merkmalspaares untersucht. Man bezeichnet solche Kreuzungen daher auch als monohybride Kreuzungen. Als einen konsequenten weiteren Schritt führte Mendel Kreuzungen mit Pflanzen durch, die sich in mehreren Merkmalspaaren unterschieden. Je nach der Anzahl der untersuchten Merkmalspaare spricht man dann von dihybriden Kreuzungen, trihybriden Kreuzungen usw. Für solche polyhybride Kreuzungen erwiesen sich insbesondere Samenmerkmale als besonders geeignet, da sie am leichtesten zu analysieren sind (Abb. 10.1). Mendels Beispiel für eine dihybride Kreuzung ist in Abb. 10.7 dargestellt. Das Wesentliche der Ergebnisse dihybrider Kreuzungen lässt sich wie folgt zusammenfassen: Unter neun verschiedenen Gruppen von Nachkommen, die sich aufgrund ihrer Merkmalskombinationen unterscheiden lassen, findet man bei weiteren Kreuzungen in den folgenden Generationen, dass sie hinsichtlich ihrer Merkmalsausprägung drei Hauptgruppen zuzuordnen sind (Kombinationen I + IV, II, III; Tabelle 10.3). Die erste Gruppe (I + IV) zeigt nur eine

Form der Merkmale, und diese kommt auch in allen folgenden Generationen unverändert zum Ausdruck. In einer zweite Gruppe (II) ist jeweils eines der Merkmalspaare in den folgenden Generationen unverändert, während das andere in beiden alternativen Formen vorkommen kann. In der dritten Gruppe (III) treten für beide Merkmale beide alternative Formen in den Nachkommen auf (Tabelle 10.3, Analyse der F1-Phänotypen). Mendel schreibt: „Daher entwickeln sich die Nachkommen der Hybriden, wenn in denselben zweierlei differirende Merkmale verbunden sind, nach dem Ausdrucke: AB + Ab + aB + ab + 2 ABb + 2 aBb + 2 AaB + 2 Aab + 4 AaBb Diese Entwicklungsreihe ist unbestritten eine Combinationsreihe, in welcher die beiden Entwicklungsreihen für die Merkmale A und a, B und b gliedweise verbunden sind. Man erhält die Glieder der Reihe vollzählig durch Combinirung der Ausdrücke: A + 2 Aa + a B + 2 Bb + b.“ Ein gleicher Versuch wurde mit drei Merkmalen durchgeführt und ergab ein dementsprechendes Ergebnis. Mendel schloss daraus, dass alle Merkmalsformen in allen denkbaren Kombinationen auftreten können, wenn man eine ausreichende Anzahl künstlicher Befruchtungen ausführt. Mendel hatte damit erkannt, dass Merkmale im Prinzip unabhängig voneinander auf die Nachkommen übertragen werden. Dieser Befund wird allgemein als 3. Mendel’sche Regel oder als Prinzip der unabhängigen Segregation von Merkmalen (engl. independent assortment) bezeichnet.

3. Mendel’sche Regel: Allele verteilen sich im Prinzip unabhängig voneinander und unabhängig von den Allelen anderer Gene auf die Nachkommen (Unabhängigkeitsregel).

Eine weitere Versuchsreihe Mendels war nun der Frage gewidmet, wie die „Keim- und Pollenzellen der Hybriden“ (Mendel 1866) beschaffen sein müssen, um die Ergebnisse seiner Kreuzungen zu erklären. Die Erklärung gibt Mendel mit den folgenden Worten: „Da die verschiedenen constanten Formen ja in einer Blüthe derselben [d. h. Hybridpflanze] erzeugt werden, erscheint die Annahme folgerichtig, dass in den Fruchtknoten der Hybriden so vielerlei Keimzellen (Keimbläschen) und in den Antheren so vielerlei Pollenzellen gebildet werden, als constante Combinationsformen möglich sind, und dass diese Keim- und Pol-

463

464

Kapitel 10: Formalgenetik Tabelle 10.3 Verlauf, Ergebnisse und Interpretation von Mendels dihybrider Kreuzung Fragestellung: Besteht Koppelung?

Kreuzung: homozygote Doppelmutante mit Wildtyp

Kreuzung: P: Verwendet werden Merkmale (1) und (2) aus Tabelle 10.1. Die Samenpflanze der P-Generation enthält die dominanten Formen der Merkmale (A und B), die Pollenpflanze die rezessiven (a und b). Genotypen:

A/A B/B

Phänotypen:

rund und gelb

×

a/a b/b kantig und grün

F1: Analyse und Phänotypen: F1: Analyse der Phänotypen

Genotypen:

A/a B/b

Phänotypen:

rund und gelb

Kreuzung der F1 untereinander: Kreuzung: F1 untereinander

A/a B/b

×

A/a B/b

Analyse der F2-Phänotypen:

F2: Analyse der Phänotypen

Merkmalskombination

Anzahl

I. rund und gelb II. kantig und gelb III. rund und grün IV. kantig und grün

315 101 108 32

insgesamt

556

Interpretation

Kreuzung der F2 in Einzeltests: Kreuzung: Selbstbefruchtung F2

Merkmalskombination I: rund und gelb

×

rund und gelb

F3: F3: Analyse der Phänotypen

Merkmale

Anzahl

Allele in Eltern

rund und gelb rund und gelb oder grün rund oder kantig und gelb rund oder kantig und gelb oder grün

38 65 60 138

AB ABb AaB AaBb

Merkmalskombination II: kantig und gelb

×

kantig und gelb

F3: Merkmale

Anzahl

Allele in Eltern

kantig und gelb

28

aB

kantig und gelb oder grün

68

aBb

Merkmalskombination III: rund und grün

×

rund und grün

F3: Merkmale

Anzahl

Allele in Eltern

rund und grün rund oder kantig und grün

35 67

Ab Aab

10.1 Grundregeln der Vererbung: Die Mendel’schen Regeln

Merkmalskombination IV: kantig und grün

×

kantig und grün

Merkmale

Anzahl

Allele in Eltern

kantig und grün

30

ab

F3:

Interpretation

Interpretation: Mendel teilt die Nachkommen aus Selbstbefruchtung aller Merkmalskombinationen in drei Gruppen ein. Deren erste ist dadurch gekennzeichnet, dass die jeweiligen Merkmale in allen folgenden Generationen unverändert auftreten. Diese Gruppe muss also homozygot für jedes der Merkmale sein. Gruppe 1:

Merkmale

Pflanzen

Konstitution

AB

38

A/A B/B

Ab

35

A/A b/b

aB

28

a/a B/B

ab

30

a/a b/b

gemittelt:

33

Die zweite Gruppe ist nur für eines der beiden Merkmale homozygot, spaltet aber bei Selbstbefruchtung für das andere in der folgenden Generation auf. Gruppe 2:

Resultat: unabhängige Vererbung oder nicht

Merkmale

Pflanzen

Konstitution

ABb

65

A/A B/b

aBb

68

a/a B/b

AaB

60

A/A b/B

Aab

67

A/a b/b

gemittelt:

65

Die dritte Gruppe spaltet für beide Merkmale in der folgenden Generation auf, ist also für beide Merkmale heterozygot. Gruppe 3:

Merkmale

Pflanzen

Konstitution

AaBb

138

A/a B/b

Ergebnis: Das Zahlenverhältnis der Pflanzen in den Gruppen 1 bis 3 ist: 33 : 65 : 138 = 1 : 1, 97 : 4, 18 also etwa 1 : 2 : 4 Resultat: Mendel erkannte, dass sich alle Genotypen und ihre Häufigkeiten durch die folgende mathematische Formulierung ermitteln lassen: (A + 2Aa + a) (B + 2Bb + b) = AB +

2ABb +

Ab +

2AaB +

4AaBb +

2Aab +

aB+

2aBb+

ab

Häufigkeiten im Experiment:

38

65

35

60

138

67

28

68

30

gerundet:

1

2

1

2

4

2

1

2

1

Diese Feststellung besagt, dass sich alle Merkmale in den Nachkommen untereinander frei miteinander kombinieren können, d. h. dass sie unabhängig voneinander auf die Keimzellen verteilt werden. Daten nach Mendel (1866)

465

466

Kapitel 10: Formalgenetik

Abb. 10.7 a, b 3. Mendel’sche Regel. Dihybride Kreuzung (vgl. Tabelle 10.3). Die Eltern sind für zwei verschiedene Merkmale (A und B) heterozygot. a Die Abbildung zeigt, entsprechend den Abb. 10.3, 10.4 und 10.6, den Erbgang auf zellulärer Ebene. Die Konstitution der Gameten der P-Generation repräsentiert alle möglichen Kombinationen der in den diploiden Zellen

vorhandenen Allele. Durch die zufällige Kombination der Gameten in der Zygote können neun verschiedene Genotypen entstehen. b Darstellung der Kreuzung im Punnett-Viereck. Hieraus ist das für eine dihybride Kreuzung zweier heterozygoter Eltern charakteristische Zahlenverhältnis der Phänotypen von 9:3:3:1 leicht abzuleiten

lenzellen ihrer inneren Beschaffenheit nach den einzelnen Formen entsprechen. In der That lässt sich auf theoretischem Wege zeigen, dass diese Annahme vollständig ausreichen würde, um die Entwicklung der Hybriden in den einzelnen Generationen zu erklären, wenn man zugleich voraussetzen dürfte, dass die verschiedenen Arten von Keimund Pollenzellen an der Hybride durchschnittlich in gleicher Anzahl gebildet werden.“ Mendel führt auf der Grundlage dieser Überlegungen Kreuzungsversuche durch, die diese Annahmen bestätigen sollten. Auch sie wurden in reziproken Ansätzen ausgeführt, um die Gleichwertigkeit von Samen- und Pollenzellen zu prüfen. Die Ergebnisse bestätigten die Annahmen vollständig, und Mendel hat damit erkannt, dass während der Bildung der Geschlechtszellen eine Verteilung der Allele erfolgt. Bei der Befruchtung wird je ein Allel eines jeden Gens durch die beiden Gameten in der Zygote vereinigt. Wir sprechen daher von einem haploiden Zustand (Haploidie) der reifen Keimzellen und einem diploiden Zustand (Diploidie) der übrigen (= somatischen) Zellen eines Organismus.

10.2 Statistische Methoden

In höheren Organismen erfolgt ein Wechsel zwischen

Diploidie in somatischen Zellen und Haploidie in Geschlechtszellen. Bei der Verschmelzung zweier haploider Geschlechtszellen entsteht eine diploide Zygote, deren Tochterzellen ebenfalls diploid sind.

Es ist wiederholt darauf hingewiesen worden, dass der Erfolg der Mendel’schen Versuchsanordnung auf der Verwendung statistischer Methoden beruht. Das wird aus seinen Versuchsdaten deutlich, wenn wir uns die Tabelle 10.2 ansehen. Für alle Merkmale sind relativ große Anzahlen von Nachkommen auf ihren Phänotyp hin untersucht worden. Es ist deutlich, dass die Abweichung vom theoretischen Wert 3:1, der nach den Mendel’schen Vorstellungen erwartet werden muss, umso größer ist, je geringer die Anzahl der ausgezählten Phänotypen ist (Merkmale 3, 5, 6 und 7). Das ist auch nach den Regeln der Statistik verständlich, denn bei kleineren Mengen sind Zufallsschwankungen stets stärker ausgeprägt. Hiernach stellt sich die Frage, wann eine genügende Anzahl von Phänotypen untersucht worden ist, um sicher zu sein, dass das Ergebnis richtig interpretiert wird und man nicht durch Zufallsschwankungen falsche Rückschlüsse über einen Vererbungsgang zieht. Dieses Problem stellt sich vor allem dann, wenn man in Mehrfaktorenkreuzungen eine große Anzahl unterschiedlicher Phänotypen erhält und man sicherstellen muss, dass diese nicht falsch interpretiert werden. Für die Kartierung von Genen durch Crossing-over ist es besonders wichtig zu entscheiden, wie groß die Genauigkeit eines ermittelten Wertes ist.

10.2 Statistische Methoden

10.2.1 Mathematische Grundlagen Bei einer statistischen Behandlung von Kreuzungsergebnissen geht man davon aus, dass ein experimentell ermittelter Wert im Rahmen einer Zufallsverteilung (Normalverteilung) schwankt. Eine solche Normalverteilung wird durch den Mittelwert μ und die Standardabweichung σ charakterisiert. Die Standardabweichung σ lässt erkennen, ob eine Gauß-Verteilungskurve schmal (σ klein) oder sehr breit (σ groß) ist. Unter Einbezug des Wertes der Standardabweichung kann man die Verteilungskurve normieren und erhält dann eine normierte Normalverteilung. Diese normierte Normalverteilung ist eine Verteilung mit dem Mittelwert μ = 0 und der Standardabweichung σ = 1 (Abb. 10.8). Beschreibt man die Fläche unter einer Normalverteilungskurve als Funktion von x (also: Φ(x)), so gibt der Flächenanteil jedes einzelnen Teilelementes dieser Fläche dΦ(x) = ϕ(x) dx die Wahrscheinlichkeit wieder, in einem Experiment einen x-Wert zu erhalten, der zwischen den Grenzwerten x und x + dx dieses Flächenelementes liegt. Je kleiner ein Flächenelement ist, das durch zwei experimentell erhaltene x-Werte begrenzt wird, desto geringer wird die Wahrscheinlichkeit, dass ein experimentell erhaltener Wert dem Mittelwert μ zugeordnet werden kann. In Abb. 10.8 ist das jeweils für ein Vielfaches von σ angegeben: Wir sehen dabei, dass etwa 95 % aller Werte innerhalb des Bereichs von μ − 2σ und μ + 2σ liegen; der genaue Wert für 95 % beträgt dabei μ ± 1,96σ (und entsprechend für 99 % μ ± 2,58σ). Diese mathematischen Grundlagen gestatten es also, Aussagen über die Wahrscheinlichkeit zu machen, dass ein experimenteller Wert innerhalb eines Schwankungsbereichs liegt, der noch als zulässig angesehen wird. Die Größe dieses Bereichs kann vom Experimentator festgelegt werden. Natürlich sind die Ergebnisse umso zuvery Wendepunkt der Kurve

Wendepunkt der Kurve σ

σ

x

x μ-4σ

μ-3σ

μ-2σ

μ-σ

μ

μ+σ

μ+2σ

μ+3σ

μ+4σ

68,27% 95,45 % 99,73 % 99,99 %

Abb. 10.8 Normalverteilung. Die Kurve zeigt die Wahrscheinlichkeit einer Zufallsabweichung von Beobachtungsdaten vom theoretischen Mittelwert μ. Die Standardabweichung σ wird durch die Wendepunkte der Kurve definiert. Rund 95 % aller Beobachtungen liegen zwischen μ − 2σ und μ + 2σ; weitere Flächenanteile der Normalverteilung sind in der Abbildung angegeben. (Nach Sachs 2002, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

lässiger, je kleiner die zugestandene Schwankungsbreite ist. Diese Überlegungen machen deutlich, dass es kein eindeutiges Maß dafür gibt, ob ein experimenteller Wert tatsächlich dem theoretisch erwarteten Wert entspricht. Vielmehr lassen uns statistische Behandlungen nur sehen, wie groß die Wahrscheinlichkeit ist, dass ein experimentell ermittelter Wert der Erwartung entspricht. Wir erkennen aus dieser Diskussion ein weiteres wichtiges Element der statistischen Behandlung von Daten: Es muss zunächst eine theoretische Grundlage dessen formuliert werden, was geprüft werden soll. Die statistische Behandlung besteht dann darin, mathematisch zu testen, ob ein experimentelles Ergebnis dieser theoretischen Vorgabe wahrscheinlich entspricht oder nicht. Man bezeichnet einen solchen Vorgang der Formulierung einer theoretischen Grundlage, die mit dem Ergebnis übereinstimmen soll, als Hypothesentest. Es ist ein Prüfverfahren, das Auskunft darüber gibt, ob die Hypothese richtig oder falsch ist, d. h. ob sie „angenommen“ oder „verworfen“ werden soll. Sind die Abweichungen von der Hypothese klein, d. h. sind sie rein zufallsbedingt, dann wird die Hypothese angenommen. Sind die Abweichungen hingegen durch den Zufall allein nicht erklärbar – handelt es sich also um signifikante Abweichungen – dann wird die Hypothese abgelehnt. Die Hypothese, dass Abweichungen dem Zufall zuzuschreiben sind, nennt man die Nullhypothese (H0). Die Gegen- oder Alternativhypothese wird in der Statistik mit HA bezeichnet. Es sei nur nebenbei bemerkt, dass dieses Vorgehen ganz generell der Methodik empirischer naturwissenschaftlicher Forschung entspricht: Wir formulieren Arbeitshypothesen, die wir dann durch geeignete Experimente zu bestätigen versuchen. Gelingt das in ausreichendem Maße, so akzeptieren wir eine Hypothese als richtig und bezeichnen sie dann als eine Theorie (z. B. Chromosomentheorie der Vererbung). Ist es jedoch nicht möglich, diese Hypothese zu bestätigen und widersprechen die Ergebnisse unserer Experimente, die zur Bestätigung gedacht waren, ihren Annahmen, so müssen wir diese Hypothese als unrichtig verwerfen (Kapitel 1.3). Eine Methode zur Bestätigung oder Ablehnung von Hypothesen kann übrigens auch in dem Versuch bestehen, Möglichkeiten zur Widerlegung (Falsifizierung) der Aussage zu prüfen. Gelingt es trotz aller Bemühungen nicht, eine Hypothese zu widerlegen, so wird meistens auch das als ein Argument für ihre Richtigkeit akzeptiert.

Statistische Methoden dienen dazu, die Wahrscheinlichkeit zu ermitteln, mit der experimentell ermittelte Daten den theoretisch geforderten Ergebnissen eines Experiments entsprechen. Die theoretischen Werte erhält man durch Formulierung einer Nullhypothese.

467

468

Kapitel 10: Formalgenetik

10.2.2 Die χ2-Methode Experimentelle Daten kann man als verschiedene x-Werte unserer normierten Zufallsverteilung ansehen. Um den Grad der Wahrscheinlichkeit zu prüfen, dass sie einem erwarteten Mittelwert μ zugeordnet werden dürften, hat man durch mathematische Anwendung der Kurvenfunktion ϕ(x) einen Wert χ2 (chi-Quadrat, engl. chi-square) eingeführt, mit dessen Hilfe die Wahrscheinlichkeit der Richtigkeit einer bestimmten Hypothese leicht abgeschätzt werden kann. Dieser Wert χ2 errechnet sich nach der Gleichung:

wobei B der Beobachtungswert und E der erwartete Wert ist. Die Verminderung um 1/2 vom Absolutwert der Abweichung (beobachtet – erwartet) wird als YatesKorrektur bezeichnet. Sie erhöht die Genauigkeit der χ2-Bestimmung, wenn die Zahlen in beiden erwarteten Klassen klein sind. Die Yates-Korrektur entfällt jedoch immer, wenn die Freiheitsgrade größer als 1 sind (d. h. bei der Auswertung dihybrider Kreuzungen mit der Erwartung einer 9:3:3:1-Aufspaltung). Ein weiterer Parameter ist zur Berechnung noch zu berücksichtigen. Wollen wir nämlich mehrere Werte, die miteinander zusammenhängen, wie etwa die 9:3:3:1-Verteilung einer dihybriden Kreuzung, auf ihre Signifikanz beurteilen, so müssen wir die Anzahl der Freiheitsgrade berücksichtigen. Die Anzahl der Freiheitsgrade ist im Allgemeinen um 1 geringer als die Gesamtzahl der Möglichkeiten. Das ist leicht einzusehen, wenn wir uns die 9:3:3:1-Verteilung betrachten. Von den vier Möglichkeiten verschiedener Phänotypen hat man, von einem Phänotyp aus gesehen, nur noch drei alternative Möglichkeiten, d. h. die Anzahl seiner Freiheitsgrade ist 4 − 1 = 3. Die Korrelation zwischen dem experimentell ermittelten χ2-Wert, der Anzahl der Freiheitsgrade und der Wahrscheinlichkeit (p) (engl. probability) ist komplex und wird daher in Tabellen zusammengefasst (Tabelle 10.4). Je höher die Wahrscheinlichkeit, je größer also der Wert von p, desto verlässlicher entsprechen die experimentellen Daten der aufgestellten Nullhypothese. Nach allgemeiner Übereinkunft wird ein Wert von p ≥ 0,05 als statistisch signifikant angesehen, d. h. Werte, die in einen solchen p-Wertbereich fallen, sprechen mit großer Wahrscheinlichkeit für die Richtigkeit der Hypothese. Es steht natürlich jedem frei, das Kriterium für die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen und erst höhere Werte von p als statistisch signifikant anzusehen. In unserer normierten Normalverteilung (Abb. 10.8) würde damit der vom Mittelwert μ als zufällige

H0 trifft zu

HA trifft zu β

Teststärke 1−β

α Kritischer Wert (Schwellenwert) der Teststatistik (Prüfgröße) TS

TS

Abb. 10.9 Trennschärfe von Stichprobenverteilungen. Es sind zwei Stichprobenverteilungen angegeben: Die linke repräsentiert die Nullhypothese (H0), die rechte die Alternativhypothese (HA). Der Balken markiert den kritischen Wert (Schwellenwert): Erreicht oder überschreitet dieser Wert der Teststatistik den kritischen Wert, dann wird die Nullhypothese abgelehnt, d. h. die Alternativhypothese akzeptiert. Wird der kritische Wert durch die Teststatistik nicht erreicht, dann besteht keine Veranlassung, die Nullhypothese abzulehnen, d. h. sie wird beibehalten. Mit kleiner werdender Irrtumswahrscheinlichkeit α nimmt die Trennschärfe (Teststärke: 1 − β) ab. Häufig begnügt man sich mit α = 0,05 (= 5 %) und einer Teststärke von etwa 80 %. (Nach Sachs 2002, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Abweichung zulässige Bereich der Verteilungskurve stärker eingeengt. Einen Überblick über die verschiedenen Größen, die für diese statistischen Überlegungen relevant sind, gibt Abb. 10.9. Zur Veranschaulichung wollen wir diese Berechnungen am praktischen Beispiel der Mendel’schen Experimente für die F2-Generation einer monohybriden Kreuzung durchführen (Tabelle 10.2). Zum Vergleich wurden die Resultate der Kreuzung mit der niedrigsten und der höchsten Anzahl ermittelter Phänotypen (Merkmale 5 und 2) ausgewählt und dem χ2-Test unterworfen (Tabelle 10.5). Die Berechnung lässt uns erkennen, dass beide Datensätze einen p-Wert von deutlich über 0,05 haben, also mit einer sehr hohen Wahrscheinlichkeit dafür sprechen, dass die Nullhypothese einer 1:3-Verteilung richtig ist. Wir können aus dem Beispiel auch erkennen, dass die größere Anzahl ausgewerteter Phänotypen (Merkmal 2) eine größere Wahrscheinlichkeit für die Richtigkeit der Nullhypothese mit sich bringt. Beurteilungen von Kreuzungsdaten können auch mit anderen statistischen Mitteln, z. B. mithilfe der Varianz erfolgen. Die χ2-Methode ist jedoch am gebräuchlichsten.

Die am häufigsten verwendete statistische Methode zur Prüfung von Kreuzungsergebnissen ist die χ2-Methode. Sie dient dazu, die Wahrscheinlichkeit zu ermitteln, mit der ein experimentell ermittelter Wert dem erwarteten Mittelwert einer normierten Zufallsverteilung entspricht.

10.3 Mendel aus heutiger Sicht – Ergänzungen seiner Regeln Tabelle 10.4 Die χ2-Verteilung. Kritische Werte χ2 (p, f ) Irrtumswahrscheinlichkeit p f

0,99

0,975

0,95

0,90

0,70

0,50

0,30

0,10

0,05

0,025

0,01

0,001

1

0,00016

0,001

0,004

0,0158

0,148

0,455

1,07

2,71

3,84

5,02

6,62

10,8

2

0,0201

0,0506

0,103

0,211

0,713

1,39

2,41

4,61

5,99

7,38

9,21

13,8

3

0,115

0,216

0,352

0,584

1,42

2,37

3,67

6,25

7,81

9,35

11,3

16,3

4

0,297

0,484

0,711

1,06

2,19

3,36

4,88

7,78

9,49

11,1

13,3

18,5

5

0,554

0,831

1,15

1,61

3,00

4,35

6,06

9,24

11,1

12,8

15,1

20,5

6

0,872

1,24

1,64

2,20

3,83

5,35

7,23

10,6

12,6

14,4

16,8

22,5

7

1,24

1,69

2,17

2,83

4,67

6,35

8,38

12,0

14,1

16,0

18,5

24,3

8

1,65

2,18

2,73

3,49

5,53

7,34

9,52

13,4

15,5

17,5

20,1

26,1

9

2,09

2,70

3,33

4,17

6,39

8,34

10,7

14,7

16,9

19,0

21,7

27,9

10

2,56

3,25

3,94

4,87

7,27

9,34

11,8

16,0

18,3

20,5

23,2

29,6

11

3,05

3,82

4,57

5,58

8,15

10,3

12,9

17,3

19,7

21,9

24,7

31,3

12

3,57

4,40

5,23

6,30

9,03

11,3

14,0

18,5

21,0

23,3

26,2

32,9

13

4,11

5,01

5,89

7,04

9,93

12,3

15,1

19,8

22,4

24,7

27,7

34,5

14

4,66

5,63

6,57

7,79

10,8

13,3

16,2

21,1

23,7

26,1

29,1

36,1

15

5,23

6,26

7,26

8,55

11,7

14,3

17,3

22,3

25,0

27,5

30,6

37,7

16

5,81

6,91

7,96

9,31

12,6

15,3

18,4

23,5

26,3

28,8

32,0

39,3

17

6,41

7,56

8,67

10,1

13,5

16,3

19,5

24,8

27,6

30,2

33,4

40,8

18

7,01

8,23

9,39

10,9

14,4

17,3

20,6

26,0

28,9

31,5

34,8

42,3

19

7,63

8,91

10,1

11,7

15,4

18,3

21,7

27,2

30,1

32,9

36,2

43,8

20

8,26

9,59

10,9

12,4

16,3

19,3

22,8

28,4

31,4

34,2

37,6

45,3

30

15,0

16,8

18,5

20,6

25,5

29,3

33,5

40,3

43,8

47,0

50,9

59,7

40

22,2

24,4

26,5

29,1

34,9

39,3

44,2

51,8

55,8

59,3

63,7

73,4

50

29,7

32,4

34,8

37,7

44,3

49,3

54,7

63,2

67,5

71,4

76,2

86,7

60

37,5

40,5

43,2

46,5

53,8

59,3

65,2

74,4

79,1

83,3

88,4

99,6

70

45,4

48,8

51,7

55,3

63,3

69,3

75,1

85,5

90,5

95,0

100,4

112,3

80

53,5

57,2

60,4

64,3

72,9

79,3

86,1

96,6

101,9

106,6

112,3

124,8

90

61,8

65,6

69,1

73,3

82,5

89,3

96,5

107,6

113,1

118,1

124,1

137,2

100

70,1

74,2

77,9

82,4

92,1

99,3

106,9

118,5

124,3

129,6

135,8

149,4

f: Anzahl der Freiheitsgrade

10.3 Mendel aus heutiger Sicht – Ergänzungen seiner Regeln Mendel hat durch seine Versuche das Prinzip der Vererbung verstehen gelernt und es in beeindruckender Weise wissenschaftlich dokumentiert. Obwohl viele Einzelbeobachtungen über die Vererbung von Eigen-

schaften bereits vor ihm beschrieben worden waren, haben diese einen rein deskriptiven Charakter behalten, und es ist erst ihm gelungen, seine Beobachtungen durch eine sorgfältige Wahl des Versuchsmaterials und durch die Anwendung statistischer Methoden in einem theoretischen Konzept zusammenzufassen und in einen kausalen Zusammenhang zu bringen.

469

470

Kapitel 10: Formalgenetik Tabelle 10.5 Berechnung des χ2-Wertes für ausgewählte F2-Generationen der Experimente in Tabelle 10.2 Merkmal (2) Hypothese

Merkmal

Beobachtet B

Erwartet E

|B−E| − 1/2 = A

A2/E = χ2

3/4

blassgelb

6022

6017

4,5

0,00337

1/4

grün

2001

2006

4,5

0,01009 Σ χ2 = 0,01346

p liegt nach Tabelle 10.4 zwischen 0,95 und 0,90 Merkmal (5) Hypothese

Merkmal

Beobachtet B

Erwartet E

|B−E| − 1/2 = A

A2/E = χ2

3/4

dunkelgrün

428

434

5,5

0,0697

1/4

gelb

151

145

5,5

0,2086 Σ χ2 = 0,2783

p liegt nach Tabelle 10.4 zwischen 0,7 und 0,5

In den letzten Jahren ist in der wissenschaftlichen Literatur wiederholt Kritik an Mendel geübt worden, und man hat die Korrektheit seiner Daten aus statistischer Sicht angezweifelt. Die quantitativen Analysen der Kreuzungsdaten geben eine von der Zufallserwartung abweichende Verteilung, die wohl nur damit erklärt werden kann, dass Mendel stark abweichende Ergebnisse in seine publizierten Datensammlungen nicht eingeschlossen hat. Der Vorwurf besteht also letztlich darin, dass Mendel seine Ergebnisse manipuliert hat, um seine Schlüsse deutlicher herauszustellen. Es erscheint durchaus denkbar, dass Mendel in der Tat extrem abweichende Kreuzungsdaten nicht in seine Dokumentation einbezogen hat. Nach unseren heutigen Vorstellungen muss das als Manipulation angesehen werden. Ganz unabhängig von der Frage, ob die Behauptung der Manipulation gerechtfertigt ist, geht die Kritik an der Tatsache vorbei, dass Mendel auf der Grundlage seiner Beobachtungen Erkenntnisse formulieren konnte, die völliges Neuland in der Biologie darstellten und die sich als sachlich richtig erwiesen haben. Es lässt sich heute kaum ermessen, welchen Stellenwert biologische Experimente und zudem die Auswertung quantitativer Daten zu einer Zeit hatten, in der die Biologie als rein deskriptive Wissenschaft betrieben wurde. Es ist zudem ein fragwürdiger Versuch, die wissenschaftliche Aufrichtigkeit Mendels mit den Augen moderner Wissenschaftler zu beurteilen. Uns kommt aufgrund der sich in den letzten Jahren stets

zunehmenden Häufigkeit versuchter Manipulation von Daten ein solcher Verdacht nur allzu leicht auf, zumindest, wenn es sich um Ergebnisse von grundlegender Bedeutung handelt. Wir müssen uns jedoch vor Augen halten, dass der Stellenwert der Wissenschaft zu Mendels Zeit zu gering war, als dass die Manipulation von Daten von irgendeinem Vorteil gewesen wäre oder praktische Bedeutung gehabt hätte. Die Bedeutungslosigkeit der Mendel’schen Befunde für nahezu ein halbes Jahrhundert spricht für sich selbst. Obwohl sich Mendels Interpretationen seiner Versuchsergebnisse auch von unserer heutigen Kenntnis der molekularen Grundlagen der Vererbung her als richtig erwiesen haben, lassen sich einige Beobachtungen über die Vererbung bestimmter Merkmale nicht ohne zusätzliches Wissen verstehen. Man hat daher bisweilen von „Ausnahmen von den Mendel’schen Regeln“ gesprochen, um anscheinend abweichende Erbgänge zu erklären. Die Bezeichnung „Ausnahme“ wird jedoch den Tatsachen nicht gerecht: Die Grundannahme Mendels, dass ein Wechsel zwischen Diploidie und Haploidie besteht und dass Merkmale bei der Bildung der Gameten im Prinzip unabhängig voneinander verteilt werden, behält auch für scheinbar abweichende Vererbungsphänomene ihre prinzipielle Geltung. Die vermeintlichen Ausnahmen sind dadurch bedingt, dass zusätzliche Eigenschaften im Charakter und in der Art der Verteilung des genetischen Materials vorliegen, die Mendels Regeln nicht erfassen. Diese Regeln bedürfen daher der Ergänzung.

10.3 Mendel aus heutiger Sicht – Ergänzungen seiner Regeln

10.3.1 Unvollständige Dominanz und Codominanz Ein Beispiel für eine scheinbare Ausnahme von den Mendel’schen Regeln bietet die Blütenfarbe der Wunderblume Mirabilis jalapa, wenn man eine reine weiße und eine reine rote Rasse kreuzt (Abb. 10.10). Die F1-Hybriden sind weder weiß noch rot, wie nach Mendel zu erwarten wäre, sondern rosa. Sie zeigen also eine Merkmalsausprägung, die wie eine Mischung der Elternmerkmale aussieht. Man hat diese Art der Vererbung daher früher auch als intermediär bezeichnet. Kreuzt man solche F1-Hybriden untereinander, so findet man unter den Nachkommen solche mit weißer, mit roter und mit rosa Blütenfarbe. Die relativen Anzahlen dieser drei Merkmalstypen entsprechen denen, die nach den Mendel’schen Regeln für eine Aufspaltung erwartet werden (1:2:1, Abb. 10.5). Allerdings bedürfen alle neu beobachteten Phänotypen einer sorgfältigen Überprüfung der 1:2:1- Aufspaltung hinsichtlich ihres monogenen Charakters, um sie von ähnlichen Aufspaltungen zu unterscheiden, die durch Interaktionen zwischen mehreren Genpaaren hervor-

Abb. 10.10 Unvollständige Dominanz. Bei Kreuzung einer roten und einer weißen Rasse der Wunderblume Mirabilis jalapa zeigt die F1 eine rosa Blütenfarbe. Kreuzungen der F1 untereinander führt in der F2 zur Aufspaltung in Pflanzen mit roten, rosa und weißen Blüten im Verhältnis 1:2:1. Die heterozygoten und die homozygoten Konstitutionen sind also zu unterscheiden und lassen im Gegensatz zu Kreuzungen von Heterozygoten mit einem dominanten und einem rezessiven Allel die Zahlenverhältnisse der verschiedenen Genotypen direkt erkennen (vgl. Abb. 10.5). (Daten aus Showalter 1934; Blütenbilder aus Storch et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

gerufen werden können. Dies ist anhand einer Analyse der F3-Nachkommen in einfacher Weise möglich: Die als homozygot beurteilten F2-Individuen dürfen nach einer inter-se-Kreuzung in der F3-Generation niemals eine Aufspaltung zeigen, während die als heterozygot eingestuften Individuen stets erneut eine 1:2:1-Aufspaltung zeigen. Zurück zur Wunderblume: Die Pflanzen mit weißen und roten Blüten erweisen sich in weiteren Kreuzungen als homozygot, während Pflanzen mit rosa Blüten sich stets wieder in gleicher Weise in Nachkommen mit weißer, roter und rosa Blütenfarbe aufspalten (Abb. 10.5). Das zeigt uns, dass die rosa Farbe durch das Zusammenspiel beider Allele, dem für weiße und dem für rote Blütenfarbe, zustande kommt. Von unserem heutigen Wissen lässt sich diese Erscheinung relativ leicht verstehen: Das Allel für weiße Farbe ist nicht in der Lage, überhaupt Pigment zu erzeugen, während das für rote Farbe in heterozygotem Zustand nicht genügend roten Farbstoff zu bilden vermag, sodass eine Zwischenfarbe als Merkmal entsteht. Für diesen Fall erscheint die Bezeichnung „intermediäre Vererbung“ durchaus als angemessen. Wir werden jedoch noch sehen, dass die Vererbungsverhältnisse nicht immer so leicht zu überblicken sind. Beispielsweise führt die Kreuzung von weißäugigen und rotäugigen D. melanogaster durchaus nicht zu Nachkommen mit rosa Augen. Außerdem lässt sich eine „gemischte“ Ausprägung eines Merkmals oft nicht ohne Weiteres erkennen. Man bezeichnet daher diese Art eines Erbgangs heute etwas neutraler als unvollständig dominant. In unserem Beispiel hat sowohl das Allel für rote Blütenfarbe als auch das für weiße Blütenfarbe den Charakter einer unvollständigen Dominanz: Keines von beiden herrscht in der Ausprägung vollständig vor. Übrigens hat Mendel in seinen Experimenten bereits beobachtet, dass eine solche Mischung von Merkmalscharakteren vorkommt, allerdings nicht bei Pisum sativum, sondern bei Phaseolus-Arten. „Aber auch diese räthselhafte Erscheinungen würden sich wahrscheinlich nach den für Pisum geltenden Gesetzen erklären lassen, wenn man voraussetzen dürfte, dass die Blumen- und Samenfarbe des Ph. multiflorus aus zwei oder mehreren ganz selbständigen Farben zusammengesetzt sei, die sich einzeln ebenso verhalten, wie jedes andere constante Merkmal an der Pflanze“ (Mendel 1866). Mendel neigt also dazu, seine abweichenden Beobachtungen nicht mit Mischung (unvollständiger Dominanz) der Merkmale, sondern durch eine multifaktorielle Vererbung zu erklären. Eine Überraschung erlebten allerdings Lolle und Mitarbeiter (2005), als sie eine Mutante bei Arabidopsis untersuchten, die Fusionen

471

472

Kapitel 10: Formalgenetik

der Blüte zeigt (engl. HOTHEAD, Gensymbol HTH). Die Autoren haben insgesamt 11 Mutationen an diesem Genort entdeckt. Wenn sie nun homozygote Mutanten durch Selbstbestäubung weiterzüchten wollten, traten unter den Nachkommen Wildtyp-Pflanzen auf, und zwar mit einer Häufigkeit von 10−1 bis 10−2. Die molekulare Analyse zeigte in allen Fällen, dass diese Wildtyp-Nachkommen heterozygote HTH-Gene tragen. Noch komplizierter wird die Sache durch den Befund, dass dieses Phänomen wohl im Wesentlichen über die männliche Keimbahn (den Pollen) hervorgerufen wird. Die weitere Analyse zeigte, dass die Reversion zum Wildtyp mit gängigen Hypothesen, wie verminderte Penetranz, Epistasie (Kapitel 10.3.3) oder Genkonversion, nicht erklärbar ist. Die Autoren spekulieren deshalb über einen „Speicher“, in dem die genetische Information früherer Generationen aufbewahrt wird. Neuere Arbeiten geben aber eine viel einfachere Erklärung: eine Bestäubung durch Wildtyp-Pollen, die offensichtlich durch eine Kontamination hervorgerufen wurde. Unter vollständigen Isolationsbedingungen bleiben auch die Mutanten stabil (Mercier et al. 2008).

Abb. 10.11 Biosynthese der Oberflächenantigene des AB0Blutgruppensystems. Die Blutgruppenspezifität liegt in dem hier dargestellten Bereich von Glykoproteinen, die sich an der Oberfläche von Erythrocyten befinden. Das A-Antigen unterscheidet sich vom B-Antigen lediglich in einer N-Acetylgruppe (Pfeil). Die genetische Ursache liegt in der unterschiedlichen Spezifität der Glykosyltransferase, die im Fall der Blutgruppe A ein UDP-N-Acetylgalactosamin (α1,3-GalNac) auf das

Bestimmte Allele erzeugen bei Heterozygotie einen neuen Phänotyp, der als eine Mischung der Eigenschaften beider Allele angesehen werden kann. Man bezeichnet eine solche Merkmalsausprägung als unvollständige Dominanz der Allele.

Wir haben nun gesehen, dass die klassische Einteilung von Merkmalsformen in solche mit rezessiven und dominanten Eigenschaften der tatsächlichen Vielfalt der Merkmalsausprägung nicht genüge tut. Unser Beispiel von unvollständiger Dominanz haben wir zunächst mit der Möglichkeit erklärt, dass eines der beiden Allele nicht wirksam ist und dass das andere Allel nicht imstande ist, den Ausfall dieses Allels funktionell völlig zu kompensieren. Nun könnte man aber auch annehmen, dass jedes von zwei Allelen funktionell, jedoch jeweils für eine etwas anders geartete Merkmalsausprägung verantwortlich ist. In diesem Fall könnten stets beide Allele voll zur Ausprägung kommen, unabhängig davon, ob sie homozygot oder heterozygot vorliegen. Eine solche Situation lässt sich aus dem Bereich der Humangenetik besonders gut veranschaulichen. Wir

α-Fucose-(1,2)-β-Galactose-Disaccharid überträgt. Im Fall der Blutgruppe B wird dagegen eine UDP-Galactose (α1,3-Gal) ohne die entsprechende N-Acetyl-Gruppe übertragen. Bei der Blutgruppe „0“ ist die Glykosyltransferase inaktiv, sodass das α-Fucose-(1,2)-β-Galactose-Disaccharid ohne Zusatz bleibt (es wird auch als H-Antigen bezeichnet). (Nach Yazer 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

10.3 Mendel aus heutiger Sicht – Ergänzungen seiner Regeln

wollen dazu das Beispiel der verschiedenen Blutgruppenallele des AB0-Blutgruppensystems betrachten. Das AB0-Blutgruppensystem wurde von Karl Landsteiner 1901 entdeckt und ist bis heute das wichtigste Blutgruppensystem in der Transfusionsmedizin (Landsteiner erhielt dafür 1930 den Nobelpreis für Medizin). Die antigenen Determinanten des Systems sind Oligosaccharide an Glykoproteinen und Glykolipiden. Als solche sind sie natürlich nicht direkt die Produkte des AB0-Gens, das auf dem Chromosom 9q34 lokalisiert ist. Das AB0-Gen codiert Enzyme, die als Gklykosyltransferasen bekannt sind und verschiedene Zuckerreste auf den gleichen Akzeptor (das H-Antigen) übertragen ‒ erst dadurch werden die A- oder B-Antigene produziert. Es gibt im Wesentlichen drei Allele (A, B, 0): Das A-Allel codiert eine α1→α3-N-Acetyl-

Galaktosylamino-transferase, und das B-Allel codiert eine α1→α3-Galaktosylaminotransferase; das 0-Allel produziert kein aktives Enzym (Abb. 10.11). Inzwischen kennen wir über 70 verschiedene Allele des AB0Gens; Abb. 10.12 zeigt eine kleine Auswahl. Die Vielfältigkeit der Allele zusammen mit weiteren genetischen Mechanismen wie Rekombination und Genkonversion erklären die hohe genetische Diversität des AB0-Systems (Yip 2002). Die unterschiedlichen Blutgruppenarten A, B, AB und 0 werden mithilfe immunologischer Methoden identifiziert. Glykosidgruppen sind sehr immunogen und induzieren, z. B. nach Injektion in Kaninchen, eine intensive Antikörperproduktion (Kapitel 8.4). Mithilfe solcher Antikörper sind Glykosidgruppen an den Erythrocytenmembranen leicht nachweisbar, da sie eine Abb. 10.12 Wichtige Allele des AB0-Gens. Es sind die vorhergesagten Längen der offenen Leserahmen verschiedener Allele des AB0-Gens dargestellt (rechts: Länge in Nukleotiden). Die offenen Balken repräsentieren den translatierten Bereich des üblichen A-Allels (A1-Consensussequenz); die schwarzen Balken (bzw. Striche) stellen veränderte Bereiche dar. Die durchgehenden Linien deuten die wichtigsten Stellen für Aminosäureaustausche an (die entsprechende Nukleotid-Position in der cDNA ist oben angegeben; der Stern kennzeichnet die B-Allel-Mutationen, die sich an den Positionen 796 und 803 befinden). Im B-Allel gibt es insgesamt sieben veränderte Nukleotide gegenüber der A1-Consensussequenz, vier davon führen zu Aminosäureaustauschen. Das übliche 0-Allel (01) hat eine Deletion (G261), die zu einer Verschiebung des offenen Leserahmens führt: Die veränderte Aminosäuresequenz beginnt nach Codon 88 und endet nach insgesamt 117 Aminosäuren an einem vorzeitigen Stoppcodon; das Protein besitzt keine enzymatische Aktivität. (Nach Olsson u. Chester 2001, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

Abb. 10.13 Die Allele, die für die Glykosyltransferase A (GTA) bzw. für die Glykosyltransferase B (GTB) codieren, sind gegeneinander codominant: Wenn beide Allele vorliegen, führt das zur Blutgruppe AB. Sie sind aber jeweils dominant über das rezessive Allel GT“0“, das keine enzymatische Aktivität besitzt. (Nach Zschocke 2008, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

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Kapitel 10: Formalgenetik

Agglutination der Erythrocyten bewirken. Das ist auch die Ursache, warum Bluttransfusionen beim Menschen in Fällen unterschiedlicher Blutgruppencharaktere gegebenenfalls zu Unverträglichkeiten führen: Werden beispielsweise in ein Individuum mit der Blutgruppeneigenschaft A Erythrocyten mit dem Blutgruppenantigen B transfundiert, so beginnt das Immunsystem mit einer Antikörperproduktion gegen diese organismusfremden Erythrocyten: Die entstehenden Antikörper verursachen eine Agglutination der Erythrocyten. Betrachten wir uns nun die Genetik des AB0Blutgruppensystems, so ist diese aus dem zuvor Gesagten leicht zu verstehen: Im diploiden Zustand sind jeweils zwei der drei Allele ‒ A, B oder 0 ‒ vorhanden. Möglich sind also die Genotypen A/A, B/B, A/B, 0/A, 0/B und 0/0, die durch die speziellen Zelloberflächenantigene charakterisiert werden. So reagieren die Erythrocyten homozygoter A/A- oder heterozygoter 0/A-Individuen mit Anti-A-Antiserum, die Erythrocyten homozygoter B/B- und heterozygoter 0/B-Individuen mit Anti-B-Antiserum und die Erythrocyten heterozygoter A/B-Individuen sowohl mit Anti-A- als auch mit Anti-B-Antiserum. Homozygote 0/0-Erythrocyten hingegen agglutinieren mit keinem der Antikörper. Dieses Beispiel zeigt, dass bestimmte Merkmale, wie hier die Blutgruppenantigene, gleichwertig im Phänotyp zur Ausprägung kommen, also keine Beziehungen zueinander zeigen, die durch die Begriffe „rezessiv“ oder „dominant“ beschrieben werden können. Vielmehr sind beide dominant, d. h. sie kommen bei ihrer Anwesenheit im Genom unabhängig von der Konstitution des zweiten Allels auch voll zur Ausprägung. Man bezeichnet solche Merkmale als codominant (Abb. 10.13).

In Fällen, in denen zwei Allele ihren jeweiligen Charak-

ter nebeneinander im Phänotyp ausprägen, sprechen wir von Codominanz der Allele.

Um die Blutgruppensystematik zu ergänzen, sei darauf hingewiesen, dass es noch weitere Unterscheidungsmerkmale gibt. Dazu gehört das I/i-System, das von A. S. Wiener und Mitarbeitern 1956 beschrieben wurde. Die entsprechenden Antigene werden durch lineare bzw. verzweigte Poly-N-Acetyllactosaminoglykane determiniert. Dabei wird die lineare Form (i) während der Embryonalzeit ausgebildet und ist im Erwachsenen durch die verzweigte Form (I) ersetzt. Diese Umwandlung ist von dem Enzym β1,6N-Acetylglucosamintransferase abhängig, das im Englischen auch als I-branching enzyme bezeichnet wird. Das entsprechende Gen liegt auf dem Chromosom 6p24-p23.

10.3.2 Multiple Allelie Aus den vorangegangenen Beispielen für die unterschiedliche Ausprägung von verschiedenen Allelen bestimmter Merkmale können wir ableiten, dass es nicht nur zwei Ausführungen eines Merkmals gibt, sondern sehr unterschiedliche Formen von Allelen. Man kann nach der Art der Ausprägung verschiedene Arten von Allelen unterscheiden (Muller 1932), wobei diese Arten der Ausprägung nicht immer ganz eindeutig sind. So gibt es: ï Allele, die nicht funktionsfähig sind (Nullallele). Sie werden vielfach auch als amorphe Allele bezeichnet, da durch den Ausfall einer Funktion der Phänotyp oft zerstört wird; ï Allele, die nur partiell funktionell sind (hypomorphe Allele). Sie zeigen einen variablen Phänotyp; ï Allele, die über das normale Maß hinaus aktiv sind (hypermorphe Allele); ï Allele, die als Antagonisten zu den Wildtypallelen wirken (antimorphe Allele); ï Allele, die voll funktionell, aber für eine veränderte Eigenschaft verantwortlich sind (neomorphe Allele). Sie zeigen einen neuen Phänotyp, der sich qualitativ von dem des Wildtyps unterscheidet. Die verschiedenen Arten von Allelen können im Prinzip bei jedem Gen vorkommen; es gibt also eine sehr große mögliche Anzahl unterschiedlicher Allele für jedes Merkmal. Wir fassen die Erscheinung der Möglichkeit zur Ausbildung so verschiedenartiger Allele nach der Definition von T. H. Morgan unter dem Begriff der multiplen Allelie zusammen. So sind beispielsweise für das wichtige Kontrollgen der Augenentwicklung, PAX6, bis jetzt (April 2010) über 300 verschiedene Allele bekannt und für das F8-Gen, dessen Mutationen für die Ausprägung der Bluterkrankheit (Hämophilie A) verantwortlich sind, über 1200 verschiedene Allele. Diese verschiedenen Allele sind in öffentlichen Datenbanken allgemein zugänglich (http:// pax6.hgu.mrc.ac.uk; http://hadb.org.uk). Es ist an dieser Stelle allerdings hilfreich, sich noch etwas genauer über die Wirkungsmöglichkeiten verschiedener Allele Gedanken zu machen. So lassen sich die oben genannten Kategorien der amorphen und hypomorphen Allele auch unter dem Gesichtspunkt des Funktionsverlustes (engl. loss of function) zusammenfassen. Wenn das verbleibende, funktionsfähige Allel aber nicht ausreicht, die Genfunktion aufrechtzuerhalten, sprechen wir auch von Haploinsuffizienz. Allele, die Haploinsuffizienz zeigen, fallen in zwei Kategorien: Einige wenige codieren für große Mengen gewebespezifischer Proteine (z. B. Typ-ICollagen, Globin), andere betreffen regulatorische Proteine, die nahe an ihrem Schwellenwert arbeiten.

10.3 Mendel aus heutiger Sicht – Ergänzungen seiner Regeln

Dies betrifft eine Reihe von Transkriptionsfaktoren wie Pax3 oder Pax6. Einen Überblick über den Zusammenhang zwischen Gendosis und der biologischen Wirkung bei unterschiedlichen Funktionen gibt Abb. 10.14. Andere Kategorien (hypermorph, antimorph und neomorph) sind mit einer Änderung der Funktion verbunden (engl. gain of function). Ein Spezialfall dieses Mutationstyps wird auch als „dominant negativ“ bezeichnet: So kann es beispielsweise für die Aktivität eines Proteins notwendig sein, dass es sich mit anderen zu einem Komplex zusammenlagert. Abb. 10.15 zeigt ein Beispiel für ein Kanalprotein, das aus 4 gleichen Untereinheiten aufgebaut ist (homotetramerer Komplex). Die Mischung der Proteine des Wildtyp- und Mutantenallels im Verhältnis von 1:1 (wie es bei Hete-

Abb. 10.14 Zusammenhang zwischen der Gendosis und dem Phänotyp. Der phänotypische Unterschied zwischen homozygoten Wildtypen (AA) und Heterozygoten (Aa, mit der Hälfte der funktionellen Gendosis) ist für solche Gene gering, deren Grenzerträge bei abnehmender Gendosis abnehmen (violett). Dieser Fall wird für die meisten Gene erwartet, die für Enzyme codieren. Im Gegensatz dazu wird eine Dosisabnahme bei einem Protein mit einer linearen Dosis-Wirkungsbeziehung einen größeren Effekt auf den Phänotyp haben (rot); dies wird in der Regel bei Strukturproteinen und regulatorischen Proteinen der Fall sein. In ähnlicher Weise sind unterschiedliche Wirkungen zu erwarten, wenn die Gendosis durch Duplikationen (AA,AA) zunimmt: Bei einer linearen Dosis-Wirkungsbeziehung sind deutliche Effekte auf den Phänotyp zu erwarten, aber nicht bei einer Funktion mit abnehmendem Grenzertrag. Einige Gene (vor allem solche, die für Untereinheiten in Proteinkomplexen codieren) können zu einer Abnahme der Fitness des Organismus sowohl bei der Verminderung als auch bei der Erhöhung ihrer Gendosis führen (grün). Die verschiedenen schwarzen Linien deuten die relative Fitness bei definierten Gendosen und verschiedenen Dosis-Wirkungsbeziehungen an. (Nach Kondrashov u. Koonin 2004, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

rozygoten der Fall ist) führt aber dann nur in einem von 16 Kombinationsmöglichkeiten zu normalen Dimeren, aber in 15 von 16 Möglichkeiten zu einer veränderten Funktion. Für monomere Proteine können dominant-negative Effekte dann auftreten, wenn die Verfügbarkeit eines Substrats der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in einer Reaktionskette ist: Eine Mutation führt beispielsweise dazu, dass ein Enzym das Substrat zwar noch binden, aber nicht mehr umsetzen kann. Dies gilt nicht nur für komplexe Stoffwechselwege, sondern auch für Signalkaskaden und Funktionen in der Transkriptionskontrolle. Es ist für das Verständnis von Erbvorgängen und die richtige Interpretation von Merkmalsanalysen entscheidend, sich zu vergegenwärtigen, dass nicht das Vorkommen zweier unterschiedlicher Allele, wie es vielleicht durch die Erscheinung der Diploidie impliziert werden könnte, sondern die multiple Allelie in einer Population

Abb. 10.15 Schematische Darstellung eines dominant-negativen Effektes bei einem homotetrameren Membran-Kanal. Heterozygotie für eine Nullmutation, die zu einem instabilen Protein führt, bewirkt nur die verminderte Anzahl (8 von 16) strukturell normaler Kanäle (links). Im Gegensatz dazu führt Heterozygotie einer dominant-negativen Form dazu, dass zufällig ein stabiles, aber falsch gefaltetes Protein eingebaut wird, sodass eine wesentlich größere Anzahl von Kanälen betroffen ist. Theoretisch besteht nur 1 von 16 gebildeten Kanälen aus 4 Wildtyp-Untereinheiten und ist entsprechend funktionsfähig (rechts); die 15 anderen Formen mit sind funktionsunfähig (die Zahlen deuten die unterschiedlichen Häufigkeiten an). Grün: Wildtyp-Protein; gelb: mutiertes Protein. (Nach Zschocke 2008, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

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Kapitel 10: Formalgenetik

der Normalfall ist. Das Vorkommen verschiedener Allele mit unterschiedlichen Konsequenzen für den Phänotyp (beim Menschen oftmals verbunden mit unterschiedlichen Formen oder Schweregraden der Erkrankung) ist auch für das funktionelle Verständnis der betroffenen Domänen des jeweiligen Proteins von besonderer Bedeutung. Tabelle 10.6 verdeutlicht das am Beispiel des Gens, das für den „Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktor“ (Mitf) codiert. Wie der Name andeutet, führen Mutationen oft zu kleinen Augen (bei Mäusen, Hamstern, Menschen); es wird

aber deutlich, dass die Auswirkungen der verschiedenen Allele ein sehr breites Spektrum aufweisen. Nicht jede Mutation führt zu einem veränderten Phänotyp (bzw. zum Ausbruch einer Krankheit). Inwieweit solche Polymorphismen aber empfindlicher gegenüber bestimmten Erkrankungen machen, wird derzeit von der genetischen Epidemiologie bei der Analyse multifaktorieller Krankheiten, wie Asthma, Herz-KreislaufErkrankungen oder Allergien, untersucht. Das Vorkommen unterschiedlicher Allele eines Merkmals erfordert eine klare Nomenklatur zu ihrer

Tabelle 10.6 Multiple Allelie des Mitf-Gens der Maus Allel

Phänotyp

Molekularer Defekt

Unvollständige Dominanz:

Heterozygot

Homozygot

Mitf or (Oak Ridge)

leichte Abschwächung der Haarfarbe, blasse Ohren und Schwanz, Bauchstreifen oder Kopfflecken

weiße Haut, kleine oder abwesende Augen, Probleme beim Durchbruch der Schneidezähne, Osteopetrosis

Arg216Lys

Mitf wh (white)

Abschwächung der Haarfarbe, verminderte Pigmentierung am Auge, Flecken an Zehen, Schwanz und Bauch, Innenohrdefekte, keine Melanocyten in der Haut

weiße Haut, kleine Augen, innere Iris schwach pigmentiert, Spinalganglien kleiner als normal, Innenohrdefekte, MastzellDefizienz

Ile212Asn

Mitf ws (white spot)

weißer Bauchfleck, Zehen und Schwanz oft weiß

weiße Haut, rote Augen von annähernd normaler Größe

Deletion am N-Terminus

Mitf ew (eyeless-white)

ohne Befund

weiße Haut, Augen meist nicht gebildet, Augenlider geschlossen

Deletion

Mitf ce (cloudy-eyed)

ohne Befund

weiße Haut, blasse und kleine Augen (neblig weiß), Innenohrdefekte

Arg263Stopp

Mitf rw (red-eyed white)

ohne Befund

weiße Haut mit einem oder mehreren pigmentierten Flecken am Kopf und/oder Schwanz, kleine rote Augen

Deletion im 5’-Bereich

Mitf vit (vitiligo)

ohne Befund

die ersten Haare haben noch Flecken am Brust und Bauch, späte graduelle Depigmentierung, retinale Degeneration

Asp222Asn

ohne Befund

ohne besonderen Befund; verminderte Tyrosinase-Aktivität in der Haut

Insertion von C; Spleißeffekt: 18 bp alternatives Exon

Rezessiv:

Kein Phänotyp: Mitf sp (spotted)

Nach Steingrimsson et al. (1994)

10.3 Mendel aus heutiger Sicht – Ergänzungen seiner Regeln

Kennzeichnung. Man hat sich darauf geeinigt, das am häufigsten vorkommende Allel als Wildtypallel zu bezeichnen. Es wird in genetischer Schreibweise durch den Zusatz eines „+“-Zeichens zur Genbezeichnung (z. B. w+) oder einfach durch ein „+“ in der genetischen Formel gekennzeichnet (z. B. w/+ statt w/w+). Mutante Allele, d. h. vom Wildtyp abweichende Allele, werden durch die Genbezeichnung (z. B. w) und gegebenenfalls durch eine nähere Bezeichnung des Allels (z. B. wa für white apricot) gekennzeichnet. Generell werden Gene und ihre Symbole kursiv gesetzt; die entsprechenden Abkürzungen für die Proteine bleiben aber zur Unterscheidung unverändert (z. B. Mitf – Gen; Mitf – Protein). Rezessive Gene werden durch einen kleinen Anfangsbuchstaben gekennzeichnet, dominante Gene haben einen großen Anfangsbuchstaben. Menschliche Gensymbole erscheinen im Unterschied zu denen der Maus in der Regel immer mit Großbuchstaben. Es gibt aber zunehmend auch den Versuch, dasselbe Gensymbol mit dem Zusatz „h“ (für human), „m“ (für mouse), „d“ (für Drosophila), „x“ (für Xenopus) oder „z“ (für Zebrafisch) zu kennzeichnen.

Wir sprechen von multipler Allelie, wenn mehrere Al-

lele eines Merkmals vorhanden sind. Grundsätzlich muss multiple Allelie für alle Merkmale als gegeben angesehen werden, da jede Veränderung im Gen ein eigenes Allel hervorbringt, unabhängig davon, ob man es in seiner phänotypischen Ausprägung von anderen Allelen unterscheiden kann oder nicht.

10.3.3 Der Ausprägungsgrad von Merkmalen Vergleichen wir verschiedene Individuen hinsichtlich der Ausprägung bestimmter Merkmale miteinander, so können wir bisweilen feststellen, dass sie sich in der Intensität der Ausprägung unterscheiden. Zeigt ein Teil der Individuen gleichen Genotyps die erwartete Merkmalsform nicht, spricht man von unvollständiger Penetranz (geringer als 100 %). Sind alle Individuen des gleichen Genotyps identisch, ist die Penetranz vollständig (oder 100%). Diese Kennzeichnung kann sowohl auf dominante als auch auf rezessive oder unvollständig dominante Allele angewendet werden. Man beachte aber, dass die Penetranz ein „Alles-oderNichts-Phänomen“ ist: Individuen zeigen den Phänotyp oder nicht. Als Beispiel für eine unvollständige Penetranz können wir die Myoclonus-Dystonie beim Menschen betrachten. Diese Krankheit ist eine Bewegungsstörung, die durch eine Kombination von

schnellen, kurzen Muskelkontraktionen (Myoclonus) und anhaltendem Verdrehen und wiederholten Bewegungen charakterisiert ist, was zu ungewöhnlichen Körperhaltungen führt. Die Krankheit wird durch Mutationen im ε-Sarcoglykan-Gen verursacht. Kürzlich wurde berichtet, dass bei einem paternalen Erbgang die Penetranz der Erkrankung vermindert ist: Der Vater war klinisch unauffällig, aber der Träger der Mutation. Die Erklärung dafür ist maternales Imprinting (Kapitel 11.8), das das mutierte Gen im Vater offensichtlich stillgelegt hat und einen autosomalrezessiven Erbgang vortäuschte (Müller et al. 2002). Die Autoren vermuten, dass die Großmutter (die für die Analyse nicht mehr zur Verfügung stand) das mutierte, aber durch Imprinting stillgelegte Gen auf ihren Sohn übertragen haben könnte. In der männlichen Keimbahn wird das Imprinting aufgelöst, und bei den Kindern wird dadurch die Mutation wieder wirksam. Vermutlich liefert die Analyse solcher nicht-mendelnder Erbgänge unter epigenetischen Gesichtspunkten (Kapitel 11.8) in vielen Fällen eine Erklärung für zunächst nicht erklärbare Phänomene wie verminderte Penetranz, wobei die klinische Erkrankung eine oder mehrere Generationen überspringt. Dies erschwert dann die genetische Beratung. Unter der Expressivität verstehen wir dagegen den Grad der Ausprägung eines Merkmals. Auch hier kann die unvollständige Expression auf Faktoren im Genom oder der Umwelt zurückzuführen sein. Als Beispiel kann eine Form der Mikrophthalmie der Maus dienen, die als „Small eye“ in die Literatur eingegangen ist und durch eine Mutation im Hauptkontrollgen der Augenentwicklung, Pax6, verursacht wird. Selbst wenn wir nur jeweils ein Allel betrachten, fällt auf, dass heterozygote Tiere verschiedene Schweregrade zeigen (z. B. unterschiedliche Augengröße, Hornhaut- und/oder Linsentrübung, Verbindung zwischen Hornhaut und Linse). Oftmals ist die beobachtete Variabilität noch größer, wenn die Mutation in verschiedene Laborstämme eingekreuzt wird (homozygote Tiere sind nicht lebensfähig). Wir haben also gesehen, dass sich gleiche Allele unter bestimmten Bedingungen nicht immer in gleicher Form auswirken. Man hat dafür auch den Begriff der Reaktionsnorm geprägt, der zum Ausdruck bringt, wie Umwelteinflüsse (z. B. Licht, Temperatur, Nährstoffangebot, Standort) die Ausprägung der Phänotypen bei einem gegebenen, konstanten Genotyp beeinflussen. Penetranz und Expressivität werden also sowohl von anderen genetischen Faktoren als auch von der Umwelt beeinflusst und bereiten einer genetischen

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Kapitel 10: Formalgenetik

Analyse daher oft große Probleme. Für genetische Experimente sind Merkmale mit wechselnder Expressivität und unvollständiger Penetranz meist wenig geeignet.

Allele können in allen oder nur in einzelnen Individu-

en zur Ausprägung kommen, je nachdem, ob ihre Penetranz vollständig oder reduziert ist. Auch der Grad der Ausprägung eines Merkmals kann variieren. Dieser Grad der Ausprägung wird als Grad der Expressivität eines Allels bezeichnet.

In unseren bisherigen Beispielen für die verschiedenen Arten von Genfunktionen sind wir davon ausgegangen, dass die Wirkung eines Gens auf ein oder mehrere Merkmale unabhängig von der Funktion anderer Gene ist. Diese Annahme ist jedoch fragwürdig. Vielmehr müssen wir davon ausgehen, dass viele Merkmale durch Wechselwirkungen mehrerer Gene hervorgerufen werden können. Für diese Wechselwirkung verschiedener Gene zur Ausprägung eines Phänotyps wurde von Bateson (1909) der Begriff Epistasie geprägt. Im engeren Sinne versteht man darunter allerdings die Wechselwirkung zweier nicht-alleler Gene, wobei das eine Gen die Wirkung des anderen unterdrückt. Dadurch verändert sich die in der F2-Generation beobachtete Aufspaltung gegenüber den nach den Mendel’schen Gesetzen erwarteten Werten von 9:3:3:1 (dihybride Kreuzungen) zu 15:1, 9:7, 12:3:1 oder 13:3. Die Kreuzung von Linien mit klaren parentalen Phänotypen und erwarteten Aufspaltungen erlaubt daher, Hierarchien in Genwirkungsketten aufzubauen. Oftmals legen derartige genetische Experimente die Grundlagen für die spätere biochemische Aufklärung der entsprechenden Mechanismen. Die Analyse epistatischer Phänomene hat in den letzten Jahren besonders bei der Erforschung komplexer Erkrankungen des Menschen an Bedeutung gewonnen (Cordell 2002; Kapitel 12.4). Die Folgen eines relativ einfachen Zusammenspiels mehrerer Gene können wir uns an einem Stoffwechselprozess verdeutlichen, der ausgehend von den Arbeiten von Beadle und Ephrussi (1937) bereits relativ frühzeitig in der Geschichte der Drosophila-Genetik aufgeklärt wurde (für eine Übersicht Lloyd et al. 1998). In Abb. 10.16 ist der Stoffwechselweg für eine Farbstoffklasse dargestellt, die Ommochrome genannt wird. Diese Farbstoffe bilden die Hauptpigmente der Augen und einiger innerer Organe von Insekten. Sie kommen jedoch auch in vielen anderen Arthropoden sowie in Mollusken vor, hier hauptsächlich im Pigment des Integuments. In den Metamorphosesekreten vieler Arthropoden sind sie möglicherweise als biologische

Endprodukte des Tryptophanstoffwechsels bei Tryptophanüberschuss vorhanden. Das gilt insbesondere für Insekten, die eine geringere Auswahl zwischen verschiedenen Tryptophanstoffwechselwegen haben als andere Organismen. Es gibt in den Komplexaugen der Insekten noch eine zweite Gruppe von Augenfarbstoffen, die Drosopterine (Pteridinfarbstoffe). Sie verleihen den Augen einen roten Farbanteil, während Ommochrome bräunliche Pigmenttöne verursachen. Der Ausfall von Drosopterin führt bei normaler Ausbildung von Ommochromen daher zu bräunlichen Augentönen. Beide Pigmentsorten sind für die Augenfunktion wichtig, da sie die Abschirmung des Lichteinfalls zwischen den Ommatidien herstellen. Die Abb. 10.16 zeigt, dass die Ommochrome, ausgehend von der Aminosäure Tryptophan, durch mehrere enzymatisch katalysierte Schritte geformt werden. Aus der Drosophila-Genetik sind uns verschiedene Augenfarbenmutanten bekannt, deren Untersuchung ergeben hat, dass sie auf Defekten im Stoffwechselprozess der Ommochrome beruhen. Der Ausfall eines Enzyms führt zu einem Block in diesem Stoffwechselweg. Werden überhaupt keine Ommochrome gebildet, kommen nur noch die durch die Drosopterine verursachten Farben zur Geltung. Die Augen sind dann leuchtend rot, wie es bei der Mutation vermilion (v) der Fall ist, wenn sie homozygot (v/v) vorliegt. Hier ist das Enzym Tryptophanpyrrolase (oder Tryptophanoxygenase) nicht mehr funktionell (Abb. 10.16), und alle späteren Schritte des Stoffwechselweges sind damit blockiert. In der Mutante cinnabar (cn), die homozygot hellrote Augen zeigt, ist das Enzym Kynurenin-3-Hydroxylase, das die Umsetzung von Kynurenin in 3-Hydroxykynurenin katalysiert, nicht funktionsfähig. Wie man leicht erkennen kann, wirkt sich eine Mutation in cinnabar (cn/cn) aber dann nicht mehr aus, wenn bereits eine homozygot mutante Konstitution in vermilion (v/v) vorliegt (Genotyp also: cn/ cn; v/v. Phänotyp: vermilion). Der Phänotyp der Doppelmutante unterscheidet sich nicht von dem der Einfachmutante (Genotyp: cn+/cn+; v/v. Phänotyp: vermilion). Hingegen ist aus dem Stoffwechselschema leicht zu verstehen, dass die alternative Einfachmutante (cn/ cn; v+/v+) sehr wohl einen anderen Phänotyp (nämlich cinnabar) aufweist (Tabelle 10.7). Entscheidend ist also, an welcher Stelle in der Hierarchie des Stoffwechselweges die Mutation liegt. Mutationen in frühen, übergeordneten Stufen überdecken solche auf späteren, nachgeordneten Stufen. Die Mutation vermilion ist also funktionell epistatisch über cinnabar. Die Erscheinung der Epistasie von Mutationen ist für alle Stoffwechselwege zu erwarten, wenn nicht Teile davon auf Nebenwegen umgangen werden können.

10.3 Mendel aus heutiger Sicht – Ergänzungen seiner Regeln

Abb. 10.16 a, b Augenfarbstoffe (Xanthommatin) von Drosophila melanogaster und die Augenfarbenmutanten vermilion (v) und cinnabar (cn). a Stoffwechselweg des Tryptophans mit den zugehörigen Enzymen, ihren Genen und der phänotypi-

schen Ausprägung von Mutationen. b Umsetzung von L-Tryptophan in Xanthommatin

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Kapitel 10: Formalgenetik

Tabelle 10.7 Augenfarbenmutanten von Drosophila Genetische Konstitution

Phänotyp (Augenfarbe)

white

vermilion

cinnabar

scarlet

+/+

+/+

+/+

+/+

rot (Wildtyp)

w/w

+/+

+/+

+/+

white

+/+

+/+

+/+

white-apricot

+/+

+/+

+/+

white-eosin

w ch/wch

+/+

+/+

+/+

white-cherry

w co/w co

+/+

+/+

+/+

white-coral

w/+

+/+

+/+

+/+

rot (Wildtyp)

+/+

v/+

+/+

+/+

rot (Wildtyp)

+/+

+/+

cn/+

+/+

rot (Wildtyp)

+/+

+/+

+/+

st/+

rot (Wildtyp)

+/+

v/v

+/+

+/+

vermilion

+/+

+/+

cn/cn

+/+

cinnabar

+/+

+/+

+/+

st/st

scarlet

+/+

v/v

cn/cn

+/+

vermilion

+/+

v/v

cn/cn

st/st

vermilion

+/+

+/+

cn/cn

st/st

cinnabar

+/+

v/v

+/+

st/st

vermilion

w a/w a e

w /w

e

Die Tabelle fasst verschiedene Augenfarbenmutanten von Drosophila zusammen, die in den verschiedenen Kapiteln genannt werden. Die Mutanten des white-Gens sind in der Reihenfolge der Intensität der Augenfärbung (ansteigend) angeordnet. Die Intensität ist durch die Menge an Pigment im Auge bestimmt. Die Mutation w a beruht auf der Insertion eines Transposons (copia) in den white-Locus, der hierdurch nicht vollständig inaktiviert wird. Die Gene vermilion, cinnabar und scarlet codieren für Enzyme des Ommochrom-Stoffwechselweges (Abb. 10.16). Sie sind in der Reihenfolge ihrer katalytischen Wirkung im XanthommatinSyntheseweg angegeben. Hieraus wird ihre jeweilige epistatische Funktion im Vergleich zu den übrigen Enzymen des gleichen Stoffwechselweges deutlich. Die generelle epistatische Wirkung von white-Mutationen ist ebenfalls dargestellt.

Am Beispiel der Augenfarbe von Drosophila lässt sich noch ein weiterer Fall von Epistasie darstellen, der uns einen zusätzlichen Einblick in das funktionelle Zusammenwirken von Genen verschafft. Für die Augenfarbe ist es nicht allein erforderlich, dass die Pigmente gebildet werden, sondern diese müssen auch an ihre zellulären Positionen gebracht und dort fixiert werden. Eine Rolle in diesem Lokalisationsprozess der Augenfarbstoffe spielt das uns bereits bekannte Gen white (w), das im X-Chromosom von Drosophila liegt. Das Genprodukt ist für den Transport von Vorläufern von Augenpigmenten über Zellmembranen verantwortlich. Im Falle einer Mutation ist dieser Prozess gestört und das Komplexauge bleibt ungefärbt, also weiß, wie

der Name des Gens anzeigt; wir kennen heute (April 2010) über 1700 Allele dieses Gens (Datenbank „Flybase“: http://flybase.org). Diese Expression des whiteGens selbst ist unabhängig davon, ob die Augenpigmente gebildet werden oder nicht. Ein w/w-Genotyp führt also stets zu weißen Augen, unabhängig von der genetischen Konstitution der übrigen AugenfarbenGene. Das Gen white wirkt mithin epistatisch über die Gene, die zur Bildung der Ommochrome und Drosopterine beitragen.

Unterdrückt ein Gen die Ausprägung anderer, nichtalleler Gene, so sprechen wir von Epistasie.

10.3 Mendel aus heutiger Sicht – Ergänzungen seiner Regeln

10.3.4 Polygene Vererbung – Genetik quantitativer Merkmale Wir sind bisher davon ausgegangen, dass Merkmale durch jeweils ein Gen bestimmt werden, wie es aufgrund der Mendel’schen Kreuzungsversuche zunächst als richtig erscheinen könnte. Aber Mendel selbst hatte bereits darauf hingewiesen, dass Merkmale auch durch mehrere Gene beeinflusst sein können (S. 471). Sehr bald nach der Wiederentdeckung der Mendel’schen Regeln wurde deutlich, dass in sehr vielen Fällen Merkmale nicht durch einzelne Gene, sondern durch das Zusammenwirken mehrerer Gene bestimmt werden. Man spricht in einem solchen Fall von Polygenie oder multifaktorieller Vererbung. Dieses Zusammenspiel mehrerer Gene bei der Merkmalsausprägung macht es oft sehr schwierig, die erblichen Komponenten eines Phänotyps zu identifizieren und zu analysieren. In vielen Fällen helfen hier nur quantitative Analysen weiter (engl. quantitative trait loci, QTL). Eine besondere Bedeutung gewinnt die quantitative Analyse in der Praxis der Tier- und Pflanzenzüchtung, wenn es darum geht, günstige erbliche Eigenschaften wirtschaftlich nutzbar zu machen. Hierzu ist oft zunächst die Kenntnis des Anteils der erblichen Komponenten am Phänotyp eines Tieres oder einer Pflanze entscheidend für eine praktische Nutzung. Ein gut untersuchtes Beispiel für die Wirkung mehrerer Gene ist die Körnerfarbe von Weizen, die 1909 durch den Pflanzengenetiker Hermann Nilsson-Ehle (1873–1949) untersucht wurde. Kreuzt man eine Weizensorte mit einheitlich dunkelroter Körnerfarbe mit einer anderen Sorte, die eine sehr helle Körnerfarbe hat, so findet man in der F1 eine einheitliche hellrote Körnerfarbe, die zwischen der der beiden Elternsorten liegt. Nach unseren bisherigen Kenntnissen würden wir daraus schließen, dass es sich um eine unvollständige Dominanz handelt. Kreuzen wir jedoch die F1 untereinander weiter, so finden wir in der F2-Generation Ähren mit fünf verschiedenen Körnerfarben (dunkelrot, rot, hellrot, schwach rot und weiß), die mit einer relativen Häufigkeit von 1:4:6:4:1 zu beobachten sind. Eine dihybride Kreuzung scheint wegen der größeren Anzahl verschiedener Phänotypen (dihybrid: 4) und aufgrund der dafür charakteristischen Zahlenverhältnisse (dihybrid: 9:3:3:1) nicht in Betracht zu kommen. Dies gilt aber nur, wenn man die Ergebnisse unter dem Gesichtspunkt einer voneinander unabhängigen Vererbung zweier verschiedener Merkmale betrachtet. Nilsson-Ehle hat jedoch seine Ergebnisse auf einen dihybriden Vererbungsgang zurückführen können, bei dem beide Gene auf dasselbe Merkmal – die Körnerfarbe – einwirken und zudem noch zwei verschiedene

Allele eine Rolle spielen. Dabei muss man in Betracht ziehen, dass die weißen Eltern zum Farbpigment nichts beitragen (aabb: nicht-additive Allele), wohingegen die roten Eltern nur solche Allele enthalten, die zur Farbintensität einen Beitrag leisten (AABB: additive Allele). Noch komplexere Ergebnisse erhält man, wenn man die Einwirkung von drei Genen auf die Weizenfarbe untersucht. Hierbei entstehen – bei jeweils zwei Allelen – insgesamt sieben verschiedene Körnerfarben im Verhältnis 1:6:15:20:15:6:1. Beide Beispiele verdeutlichen, dass eine quantitative Analyse von Kreuzungsergebnissen entscheidend dafür sein kann, ob es gelingt, die Anzahl erblicher Komponenten zu ermitteln, die zur Ausprägung eines Merkmals beitragen. Dabei stellt sich natürlich die Frage, wie man die Zahl der beteiligten Gene abschätzen kann. Für kleine Zahlen beteiligter Gene hat sich die (2n + 1)-Regel bewährt: Wenn n die Zahl der additiven Gene darstellt, gibt 2n + 1 die Gesamtzahl der möglichen Phänotypen in der F2-Generation an. Bei unserem obigen Beispiel mit zwei Genen erhalten wir damit die beobachteten fünf verschiedenen Phänotypen; bei drei Genen entsprechend sieben verschiedene Phänotypen. Für große Zahlen beteiligter Gene hat sich dagegen die Regel bewährt, dass der Anteil der Individuen mit einem der beiden extremen Phänotypen jeweils 1/4n beträgt. In unserem obigen Beispiel waren die dunkelroten oder die weißen Ähren jeweils mit einem Anteil von 1/16 vertreten. Wenn wir das entsprechend einsetzen (1/4n = 1/16), erhalten wir 1/42 = 1/16 und damit n = 2. Es muss aber an dieser Stelle betont werden, dass diese Abschätzungen der Zahl beteiligter Gene Folgendes zur Voraussetzung hat: ï Alle relevanten Allele sind in gleicher Weise und additiv an der Ausprägung des Phänotyps beteiligt, und ï Umweltfaktoren spielen keine Rolle. Leider trifft diese Vereinfachung selten zu. Die besprochenen quantitativen Beispiele für Vererbungsgänge lassen erkennen, welche Schwierigkeiten sich bei einer genetischen Analyse von Merkmalen ergeben müssen, die multifaktoriell beeinflusst werden und vielleicht in ihrer Ausprägung sogar noch starken Umwelteinflüssen unterworfen sind. Mithilfe moderner Methoden aus der Genomforschung wird es jedoch immer mehr möglich, auch solche komplexen Phänotypen genetisch zu analysieren (vgl. dazu auch Kapitel 10.4.6 und 12.4).

Wirken mehrere Gene auf ein Merkmal ein, so spricht man von Polygenie. Polygenie kann für viele Merkmale als Regelfall angesehen werden.

481

482

Kapitel 10: Formalgenetik

Als Beispiel dafür kann die Fellfarbe der Maus dienen, die durch mehrere Gene kontrolliert wird. Wir kennen heute über 120 Gene mit insgesamt über 800 Allelen, die bei der Maus für die verschiedenen Fellfarben verantwortlich sind. Eine kleine Auswahl ist in Abb. 10.17 zusammengestellt. Ursprünglich wurde jede Fellfarbe durch Kreuzungsexperimente mit einem spezifischen Genort verknüpft, z. B. A für agouti (wildfarben), B für black (schwarz) oder C für chromogen (farbig). Später wurden Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Genen identifiziert: So haben rein braune Mäuse den Genotyp a/a b/b C/−, schwarze agouti-Mäuse haben den Genotyp A/− B/− C/− und albino-Mäuse (weiß) den Genotyp −/− −/− c/c (dabei geben die Großbuchstaben ein dominantes Allel und Kleinbuchstaben ein rezessives Allel an; das Minuszeichen bedeutet eine Deletion).

Das graue Fell der Wildtyp-Mäuse (agouti) entsteht durch eine Mischung gelber und schwarzer Segmente in den einzelnen Haaren. Schwarze Mutanten (aa) bilden kein gelbes Pigment mehr aus, albino-Mutanten (cc) haben die Fähigkeit zur Pigmentbildung insgesamt verloren. Die Kreuzung zwischen schwarzen (CCaa) und albino-Tieren (ccAA) führt zu einer agouti-F1 (CcAa) und in der F2 zu der für eine Modifikation charakteristischen Aufspaltung von (9 agouti):(3 schwarz):(4 albino): ï Alle Mäuse, die mindestens ein C- und ein A-Allel haben, sind agouti; ï Homozygotie für aa führt zu schwarzen Mäusen, wenn mindestens ein C-Allel vorhanden ist; ï Homozygotie für cc führt immer zu albino-Mäusen, unabhängig von der Allelkonfiguration am agoutiLocus.

Abb. 10.17 a–m Polygenie der Fellfarben der Maus. Es sind Beispiele verschiedener Maus-Mutanten mit veränderter Fellfarbe gezeigt. Mit Ausnahme von (i) sind alle Mutationen im Stamm C57BL/6J; im Folgenden sind die Gennamen und Allelsymbole angegeben. a ashen (Rab27aash/Rab27aash); b cappuccino (cno/cno); c C57BL/6J, Wildtyp; d underwhite (Matpuw/Matpuw); e C57BL/6J, Wildtyp; f black-eyed white (Tyr c-bew/Tyr c-bew); g albino (Tyrosinase-Null: Tyr c-2J/Tyr c-2J); h acromelanic (Tyr c-a/Tyr c-

a

); i Transgen-Insertion (Mitf mi-vga9/Mitf mi-vga9); j dominant spotting 2 (Kit W-2J/Kit W-2J); k derselbe Stamm wie in j, aber eine Unterlinie, die für minimale Fleckenzahl selektioniert wurde; i dieselbe Mutation wie in j, ergibt aber in einem anderen Inzuchtstamm (JU/CtLm) einen stärkeren Phänotyp; m belted (Adamts20bt/ Adamts20bt). (Nach Bennett u. Lamoreux 2003, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

10.3 Mendel aus heutiger Sicht – Ergänzungen seiner Regeln

In der Maus wurde die Formalgenetik der FellfarbenMutationen zunächst durch C. C. Little (1913) ausgiebig beschrieben, ohne dass zu diesem Zeitpunkt die molekularen Zusammenhänge bekannt waren. Heute kennen wir viele der Wirkungsketten, die für Fellfarben verantwortlich sind. Ein zentraler Stoffwechselweg in diesem Zusammenhang ist die Synthese von Melanin aus Tyrosin; das Gensymbol für das erste Enzym dieser Kette, die Tyrosinase, war früher C; das heutige Symbol ist Tyr (da früher die Allele mit dem alten Gensymbol C bezeichnet wurden, nehmen die neuen Allelbezeichnungen vielfach noch darauf Bezug, z. B. Tyrc-bew; Abb. 10.17). In Abb. 10.18 sind die beiden Stoffwechselwege zu Eumelanin und Pheomelanin gezeigt, die beide zunächst die Tyrosinase-Aktivität voraussetzen. Auf dem Weg zum Eumelanin werden noch weitere Enzyme benötigt, die durch die Gene Tyrp1 und Tyrp2 codiert werden (engl. tyrosinaserelated protein). Hier müssen wir also auch wieder mit epistatischen Effekten rechnen, wie wir das bereits bei den Augenfarbstoffen von Drosophila gesehen haben. Neben diesen direkten genetischen Wechselwirkungen gibt es aber auch modifizierende Wechselwirkungen. Wir sprechen von Modifikation, wenn das Produkt eines Gens durch ein nicht-alleles Gen verändert wird. Die Vielfältigkeit der Fellfarben der Maus eignet sich auch besonders gut zur Untersuchung dieser Effekte; in Abb. 10.17 (j‒l) sind dafür Beispiele gegeben. Besonders interessant sind dabei die Phänomene, wenn dieselbe Mutation in unterschiedlichen Inzuchtstämmen zu verschieden starken Phänotypen führt. Hier verfügen dann die beiden Inzuchtstämme über unterschiedliche Modifikatoren, die prinzipiell einer genetischen Analyse zugänglich sind. Wenn die Modifikation die phänotypische Ausprägung der mutierten Gene unterdrückt, obwohl diese immer noch vorhanden sind, bezeichnen wir solche Gene als Suppressorgene. Ihre Aktivitäten wurden in vielen Organismen untersucht, besonders aber bei Drosophila. So unterdrückt beispielsweise ein Gen mit der Bezeichnung su-Hw den Phänotyp, der durch das Mutantenallel Hairy-wing (behaarte Flügel; Gensymbol: Hw) verursacht wird. In der Tier- und Pflanzenzüchtung ist die Kenntnis der genauen genetischen Einflüsse von großer Bedeutung für die Isolierung optimaler genetischer Konstitutionen. Jedoch lassen sich diese oft nicht eindeutig analysieren. Man ist daher vielfach auf rein empirische Verfahren zur Erzeugung von Rassen mit gewünschten Eigenschaften angewiesen. Man beginnt mit Kreuzungen zweier hinsichtlich eines Merkmals reiner Linien und isoliert aus der F1 phänotypisch besonders vorteilhafte Pflanzen. Diese werden, soweit möglich, durch

Selbstbefruchtung weitergezüchtet, und in den folgenden Generationen werden wiederum die geeignetsten Phänotypen zur weiteren Vermehrung ausgewählt. Hierbei kann es entweder gelingen, neue reine Linien zu gewinnen oder man findet Phänotypen, die durch bestimmte, genau definierte Kreuzungen reproduzierbar erzeugt werden können. Ein wichtiger Gesichtspunkt hierbei ist, dass sich Heterozygote häufig als besonders vorteilhaft hinsichtlich ihrer Eigenschaften erweisen. Man bezeichnet diese Eigenschaft, der wir bereits in Zusammenhang mit den Mendel’schen Experimenten begegnet sind (Größe der Hybride, S. 460), als Heterosis oder Überdominanz. Solche HeterosisEffekte sind auch populationsgenetisch besonders interessant, da sie eine Selektion auf Beibehaltung verschiedener Allele zur Folge haben (S. 638). Ein Beispiel für den Erfolg solcher züchterischen Praxis ist die Tomate. Sie wurde von den Ur-Einwohnern Amerikas (wahrscheinlich in Mexiko) domestiziert; die Beere der ursprünglichen Wildform (Lycopersicon esculentum) wiegt nur wenige Gramm, wohingegen moderne Sorten bis zu 1 kg wiegen können. Zusätzlich zum Gewicht variiert auch die Form erheblich. Der quantitative Charakter der Veränderung der Fruchtgröße hat lange Zeit die Anwendung klassischer Mendel’scher Techniken verhindert. Zurzeit werden etwa 30 QTLs diskutiert, die für die meisten Variationen bei Größe und Form der Tomaten verantwortlich sind; Mutationen in sechs Genorten scheinen essenziell dafür zu sein, kleine Beeren der Wild-Tomaten in extrem große Tomaten zu verwandeln. Ein Gen, das bisher charakterisiert werden konnte (fw2.2), codiert für ein Transmembranprotein, das offensichtlich als negativer Regulator der Zellteilung wirkt. Neben den verschiedenen QTLs spielt auch Heterosis eine wichtige Rolle, wenn es um die Steigerung von Ernteerträgen geht. Abb. 10.19 zeigt ein Beispiel für die Tomate. Durch Verwendung spezifischer Linien (engl. introgression line) gelingt es, die genomischen Bereiche, die für den Effekt der Überdominanz von Heterozygoten verantwortlich sind, immer weiter einzugrenzen.

Die Komplexität der Interaktionen erblicher Eigenschaften setzt in der züchterischen Praxis der gezielten Erzeugung neuer Zuchtrassen oft Grenzen. Neue Methoden der Genomforschung erlauben es aber heute, die einzelnen Komponenten gezielt zu charakterisieren.

10.3.5 Pleiotropie Haben wir im vorangegangenen Abschnitt gelernt, dass in vielen Fällen ein Merkmal durch eine Vielzahl von

483

484

Kapitel 10: Formalgenetik

Abb. 10.18 Die Biosynthesewege zu Eumelanin und Pheomelanin. Zur Herstellung von Eumelanin werden Aktivitäten von Tyrosinase, Tyrp1 und Tyrp2 benötigt, wohingegen zur Syn-

these von Pheomelanin nur Tyrosinase und Cystein notwendig sind. Die Enzyme sind grün hervorgehoben. (Nach Wakamatsu u. Ito 2002, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

Abb. 10.19 a, b Ertragssteigerung durch Heterosis bei Tomaten. In kultivierten Tomaten (Solanum lycopersicum) kann die Ertragssteigerung durch Heterosis durch die Verwendung spezifischer Linien zum Einkreuzen in individuelle Komponenten aufgeteilt werden. a Genotypen der beiden Linien; die Linie P enthält ein unterschiedliches Fragment des Chromosoms 8. b Repräsentative Pflanzen und Ernteerträge der verschiedenen Genotypen sind dargestellt. Das heterozygote Element auf dem Chromosom 8 erhöht den Ernteertrag um mehr als 50 % gegenüber den beiden homozygoten. (Nach Lippman u. Zamir 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

10.3 Mendel aus heutiger Sicht – Ergänzungen seiner Regeln

Genen beeinflusst werden kann, so muss unser Bild von der Komplexität genetischer Mechanismen noch dadurch erweitert werden, dass umgekehrt ein Gen auch auf mehrere Merkmale einwirken kann. Man bezeichnet solche genetischen Effekte als Pleiotropie (Plate 1910). Als Beispiele für pleiotrope Genwirkungen wollen wir im Folgenden die Globin-Gene betrachten (Kapitel 7.2.1), deren Produkte in Form des Hämoglobins für den Sauerstofftransport im Organismus verantwortlich sind. Eine Erbkrankheit des Menschen ist die Sichelzellenanämie. Diese Blutkrankheit ist in bestimmten Regionen der Erde sehr weit verbreitet und spielt daher medizinisch eine wichtige Rolle (Kapitel 10.5.3)). Wie schon der Name Anämie besagt, leiden Patienten an Blutarmut oder genauer gesagt an einem Mangel an funktionsfähigen Erythrocyten. Dieser Mangel wird durch ein verändertes β-Globinprotein verursacht. Durch veränderte physikochemische Eigenschaften des β-Globins kommt es in einem Teil der Erythrocyten zu einer Kristallisation von Hämoglobin, das dadurch seine Funktion nicht mehr wahrnehmen kann. Hämoglobin ist für die Bindung und den Transport von Sauerstoff sowie für den Abtransport von CO2 im Blut verantwortlich. In der defekten Form sind seine Bindungsaffinitäten stark verändert, und in kristalliner Form kann das Hämoglobin überhaupt keinen Sauerstoff mehr binden. Die Kristallisation des Hämoglobins führt zu einer Formveränderung der Erythrocyten, da diese durch die Hämoglobinkristalle eine sichelförmige Gestalt annehmen (Abb. 12.12). Sichelzellenerythrocyten sind nicht mehr funktionsfähig und werden dem Blut durch Phagocytose entzogen. Das Krankheitsbild äußert sich für uns sichtbar im Wesentlichen in Heterozygoten, da homozygote Individuen meist kurz nach der Geburt sterben. Das ist nicht überraschend, da wir davon ausgehen müssen, dass in

homozygotem Zustand kein funktionsfähiges Hämoglobin gebildet werden kann. Lediglich noch vorhandene mütterliche Erythrocyten, die die plazentale Blutbarriere durchschritten haben, sind neben fötalem Hämoglobin für kurze Zeit (einige Wochen) verfügbar und ermöglichen ein begrenztes Überleben. Die molekulare Ursache dieser Krankheit ist bekannt (Kapitel 12.3.1). An dieser Stelle wollen wir nur die Folgen der Krankheit in Heterozygoten näher betrachten. Vergegenwärtigen wir uns die biologische Bedeutung der Versorgung der Zellen mit Sauerstoff, so lässt sich ein sehr komplexes Krankheitsbild erwarten. In Tabelle 10.8 finden wir eine Zusammenstellung der Symptome, die an einem Patienten zu beobachten sind, der an Sichelzellenanämie leidet: Tatsächlich ist eine Vielzahl körperlicher Funktionen betroffen, und es gelingt nicht einmal, dem genetischen Defekt auch nur ein einziges Merkmal, abgesehen von dem der Sichelzellbildung, als besonders charakteristisch zuzuordnen. Dieses Beispiel macht deutlich, in welchem unerwarteten Ausmaß komplexe Phänotypen auf die Wirkung eines einzelnen in seiner Funktion gestörten Allels zurückführbar sein können. Wahrscheinlich muss man für sehr viele Gene solche pleiotropen Wirkungen annehmen. Wir erkennen mit der fortschreitenden Erörterung von Genfunktionen in zunehmendem Maße, dass es erst deren funktionelle Verknüpfung ist, die die Organismen existenzfähig macht. Bei näherer Betrachtung ist das aber auch nicht verwunderlich, da die verschiedenen Bauteile eines Individuums letztlich keine voneinander getrennten Aufgaben haben, sondern nur im Zusammenwirken ihre richtige Funktion finden. Das spiegelt sich bereits im Zusammenspiel der Gene wider.

Tabelle 10.8 Krankheitssymptome bei Sichelzellenanämie Ursache

Effekt

A. Primäre Effekte im Blut Bildung von Sichelzellen, deren Abbau

Anämie, allgemeine schlechte physische Konstitution

B. Sekundäre Effekte im Blutkreislauf Sauerstoffmangel

C. Weitere Effekte Akkumulation von Sichelzellen

Herzfehler, Schäden im Gehirn, Schäden an verschiedenen Organen, Lungenentzündung, Nierenfehler

Milzschäden

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486

Kapitel 10: Formalgenetik

Viele Gene beeinflussen verschiedene Merkmale zugleich. Diesen Einfluss eines Gens auf mehrere Merkmale bezeichnet man als Pleiotropie.

10.4 Kopplung, Rekombination und Kartierung von Genen Die Mendel’schen Regeln besagen, dass Merkmale unabhängig voneinander vererbt werden. Dieses zentrale Dogma hat sich in 150 Jahren moderner Genetik im Wesentlichen bestätigt, wenngleich wir in den letzten Abschnitten einige Modifikationen im Detail anbringen mussten. Wir haben aber andererseits auch gesehen, dass die Chromosomen Träger der genetischen Information sind. Es scheint nun ein offensichtlicher Widerspruch zwischen den Mendel’schen Regeln und den cytologischen Beobachtungen zu bestehen: Die Anzahl der Chromosomen erscheint zu niedrig, um mit der Vorstellung vereinbar zu sein, dass jedes Chromosom einer Erbeigenschaft zuzuordnen ist. Obwohl die tatsächliche Anzahl der Gene verschiedener Organismen noch immer nicht genau bekannt ist (man schätzt bei Säugetieren etwa 30.000), wurde doch sehr bald erkannt, dass jedes Chromosom Hunderte oder sogar Tausende von Genen tragen muss. Dieser Schluss widerspricht aber der Regel Mendels, wonach sich Merkmale unabhängig auf die Nachkommen verteilen, da die in einem Chromosom gelegenen Gene gekoppelt bleiben, also nicht unabhängig voneinander verteilt werden. Dieser scheinbare Widerspruch zu Mendels experimentellen Ergebnissen konnte durch die Genetiker gelöst werden, als sie erkannten, dass die in Mendels Untersuchungen beobachteten Merkmale auf unterschiedlichen Chromosomen liegen oder in einigen Fällen im Chromosom soweit entfernt liegen, dass stets Rekombinationsereignisse (Kapitel 5.3.3) zwischen den gekoppelten Genen stattfinden. Daher verteilen sie sich während der Meiose tatsächlich scheinbar unabhängig voneinander auf die Keimzellen.

Gene, die so nahe beieinander auf einem Chromosom liegen, dass Rekombinationsereignisse selten stattfinden, bezeichnet man als „gekoppelt“.

10.4.1 Geschlechtsgebundene Vererbung Ein besonderer Fall von Kopplung tritt auf, wenn Gene gemeinsam auf dem Geschlechtschromosom liegen. Bereits ein einfaches Schema des Erbgangs von Genen, die in den Geschlechtschromosomen von Drosophila

liegen, zeigt, dass dieser sich in zwei Punkten deutlich von den Erwartungen nach den Mendel’schen Regeln unterscheidet (Abb. 10.20): ï Die Nachkommen einer Kreuzung haben im Hinblick auf geschlechtsgekoppelt vererbte Allele nicht unbedingt alle den gleichen Phänotyp. ï Die Ergebnisse reziproker Kreuzungen sind nicht identisch. Die Ursachen für diese scheinbare Unstimmigkeit mit den Mendel’schen Regeln sind im Punnett-Viereck leicht zu erkennen (Abb. 10.20c, d). Der hemizygote (also haploide) Zustand des X-Chromosoms im Männchen lässt rezessive Allele sichtbar werden, die im heterozygoten Weibchen durch ein dominantes Allel verborgen bleiben. Diese Parallelität in der Merkmalsexpression geschlechtsgekoppelter Gene und der cytologisch sichtbaren meiotischen Verteilung von Geschlechtschromosomen ließ auch die letzten Zweifel an der Richtigkeit der Chromosomentheorie der Vererbung, d. h. der Annahme, dass die Chromosomen die Träger der erblichen Information sind, verstummen. Calvin Blackman Bridges (1889–1939) erzielte durch seine genetischen Experimente mit geschlechtsgekoppelten Merkmalen von Drosophila wichtige Einsichten (Bridges 1913). Er beobachtete nämlich, dass in Kreuzungen von Weibchen, die für das X-chromosomale Gen white homozygot das Wildtypallel besaßen (+/+), mit weißäugigen Männchen (w/Y) entgegen der Erwartung gelegentlich weißäugige Männchen auftraten, die steril waren. Umgekehrt fand er in der F1 einer Kreuzung homozygot weißäugiger Weibchen (w/w) mit rotäugigen Männchen (+/Y) Weibchen mit weißen Augen, die sich als fertil erwiesen. Die Ergebnisse seiner genetischen Analyse dieser Ausnahmetiere sind in Abb. 10.20e zusammengefasst. Sie führten zu der Erkenntnis, dass mit geringer Häufigkeit Fehler in der Verteilung der Geschlechtschromosomen während der Meiose auftreten können (Abb. 10.21), und zwar sowohl in der ersten als auch in der zweiten Reifeteilung (Abb. 10.21a, b). Im einen Fall werden die homologen Chromosomen (1. Reifeteilung) nicht voneinander getrennt, sondern wandern zusammen zum gleichen Spindelpol. In der zweiten meiotischen Teilung werden dann die Chromatiden normal getrennt, sodass einerseits X/Xoder X/Y-Gameten entstehen, andererseits aber auch Gameten, denen beide Geschlechtschromosomen fehlen. Man spricht dann von einer primären Nondisjunction, d. h. einer Nichttrennung der Homologen während der ersten Reifeteilung. Ein gleicher Fehler kann aber auch erst während der zweiten meiotischen Teilung auftreten. In diesem Fall werden in einer der

10.4 Kopplung, Rekombination und Kartierung von Genen

Abb. 10.20 a–e Der Erbgang eines geschlechtsgekoppelten Merkmals bei Drosophila, dargestellt am Beispiel des whiteGens (w) im X-Chromosom. Geschlechtsgekoppelte Merkmale sind daran zu erkennen, dass die Phänotypen der Nachkommen (F1) zweier für unterschiedliche Allele homozygoter Eltern in Abweichung von der 1. Mendel’schen Regel in reziproken Kreuzungen nicht gleich sind. a In der dargestellten Kreuzung trägt das Männchen das rezessive mutante Allel von white (weiße Augen). Die F1 zeigt durchweg das dominante Wildtypallel w+ (also rote Augen). b In der dargestellten, reziproken Kreuzung trägt das Weibchen das rezessive mutante Allel von white. In der F1 der reziproken Kreuzung wird bei 50 % der Tiere (d. h. alle Männchen) der white-Phänotyp ausgeprägt. c, d Diese Ergebnisse werden bei der Betrachtung des Erbgangs X-chromosomaler Gene anhand der Punnett-Vierecke verständlich. Da

das Y-Chromosom kein white-Allel trägt, kann das einzelne, hemizygote X-chromosomale Allel voll zur Ausprägung kommen. e Gelegentlich findet man in Kreuzungen Nachkommen, deren Phänotyp von den nach dem normalen Erbgang zu erwartenden Phänotypen abweicht (ungefähr 1 in 1000; Ausnahmen in a bzw. b). Von diesen erweisen sich die Männchen als steril. Bridges vermutete, dass es sich bei den Ausnahmetieren um Individuen handelt, die durch fehlerhafte Geschlechtschromosomenverteilung während der elterlichen Meiose entstehen. Er führte daher eine Testkreuzung durch, in der er die weißäugigen Ausnahmeweibchen mit Wildtypmännchen auskreuzte. Die Phänotypen der Nachkommenschaft scheinen seine Annahme zu bestätigen: Alle Nachkommen dieser Kreuzung zeigen einen Wildtyp-Phänotyp (0Y-Zygoten sind letal)

sekundären Meiocyten die Chromatiden nicht getrennt und wandern zum gleichen Spindelpol. Es entstehen dann ebenfalls X/X- oder Y/Y-Gameten und Gameten ohne Geschlechtschromosom. Man nennt diesen Fall

sekundäre Nondisjunction, d. h. eine Nichttrennung der Chromatiden während der zweiten Reifeteilung. Bridges hat damit einen – relativ häufigen – Fehler bei der Chromosomenverteilung entdeckt, der generell bei

487

488

Kapitel 10: Formalgenetik

a

b primäre Meiocyten (2n)

Meiose I

sekundäre Meiocyten

Meiose II

Gameten (n)

d

c P:

Keimzellen:

P:

XY

XY

0

X

Keimzellen:

Y

normal

Nondisjunction

XX

XX

0

X

X

normal

Nondisjunction

Testkreuzung mit Wildtyp-Männchen (w+/Y):

Testkreuzung mit white-Weibchen (w/w):

w+

Y

w

ww+

wY

Yw

w

ww+

wY

0w

0w

0

0w+

0Y

ww+Y

ww+Y

ww

www+

wwY

w+Y

wildtyp

w

w

w+

w+w

w+w

Y

Yw

0

w+Y

e Phänotypen:

ww+

wildtyp

wwY

+

wildtyp

0w

white

(steril)

wY

white

ww Y

wildtyp

0w

white

(steril)

wY

(letal)

www +

+

white

Abb. 10.21 a–e Ursache der in Abb. 10.20 dargestellten Ausnahmen. a, b Während der ersten (primäre Nondisjunction, a) oder der zweiten Reifeteilung (sekundäre Nondisjunction, b) kann eine Fehlverteilung von Chromosomen auftreten. Die jeweils entstehenden Gameten sind dargestellt. Während der Meiose der P-Generation kommt es zu fehlerhafter Verteilung (Nondisjunction) der Geschlechtschromosomen. c, d Als Folge davon entstehen Keimzellen mit zwei Geschlechtschromosomen (XX oder XY)

oder ohne jedes Geschlechtschromosom (0). Daher findet man in der Nachkommenschaft Weibchen mit drei X-Chromosomen (XXX) und Männchen ohne Y-Chromosom (X0) (vgl. Abb. 10.20e). Diese Chromosomenkonstitutionen lassen sich genetisch durch weitere Testkreuzungen bestätigen. e Phänotypen der verschiedenen aus Testkreuzungen resultierenden Nachkommen. X0Männchen sind steril, 0Y-Zygoten letal und Weibchen mit drei X-Chromosomen reduziert vital. XXY-Tiere sind fertile Weibchen

10.4 Kopplung, Rekombination und Kartierung von Genen

allen Chromosomen auftreten kann, und der nicht nur während der Meiose auftritt, sondern auch während der Mitose beobachtet werden kann. Die Interpretation des Vererbungsgangs bei Nondisjunction-Ereignissen ist in Abb. 10.21c‒e zusammengefasst.

Geschlechtsgekoppelte Vererbung äußert sich durch

nicht identische Phänotypen in reziproken Kreuzungen: Rezessive Allele werden im heterogametischen Geschlecht aufgrund der Hemizygotie stets sichtbar.

10.4.2 Kopplung von Merkmalen auf autosomalen Chromosomen In den Grundzügen ist die Zuordnung von Genen zu einem bestimmten Chromosom (Kopplung; engl. linkage) bei einem autosomalen Erbgang gleich wie bei der geschlechtsgebundenen Vererbung. Allerdings entfällt natürlich der genetische Marker „Geschlecht“, sodass man zusätzliche genetische Informationen benötigt. Daher muss bei einer autosomalen Kopplungsanalyse die F2-Generation betrachtet werden (Rückkreuzung; engl. back-cross); bei X-gekoppelten Erbgängen wird der Zusammenhang schon in der F1 sichtbar. Die wichtigsten Erkenntnisse hierzu wurden von den Drosophila-Genetikern bereits in den Frühzeiten genetischer Studien an diesem Modellorganismus der klassischen Genetik gewonnen. Thomas Hunt Morgan (1866‒1945) zeigte in einem klassischen Experiment als Erster die Kopplung von Genen, die dadurch nachweisbar wird, dass bestimmte Merkmale in den Nachkommen stets zusammen bleiben (gekoppelt sind). Chromosomen werden daher in der genetischen Nomenklatur auch als Kopplungsgruppen (engl. linkage groups) bezeichnet. Morgan verwendete in seinem Experiment Merkmale für die Augenfarbe (pr = violett/purple und pr+ = rot) und die Flügelform (vg = stummelflügelig/vestigial und vg+ = normal). Dabei ist das Wildtypallel (rote Augen und normale Flügel) jeweils dominant über das Mutantenallel. Er kreuzte dabei als Elterntiere (Parentalgeneration: P) Wildtyp-Fliegen mit solchen, die sowohl Stummelflügel als auch violette Augen hatten. Die erste Generation von Nachkommen (Filialgeneration 1: F1) ist heterozygot für beide Marker und zeigt damit den Phänotyp der Wildtyp-Tiere. Bei der Kreuzung dieser F1-Tiere untereinander hätte man nun entsprechend der Unabhängigkeitsregel für dihybride Kreuzungen eine 9:3:3:1-Aufspaltung der Phänotypen erwartet (S. 466).

Morgan hatte aber 1339 Wildtypen, 1195 Stummelflügler mit violetten Augen, 151 Tiere mit violetten Augen und normalen Flügeln sowie 154 Fliegen mit Stummelflügeln und normalen, roten Augen beobachtet. Man braucht in diesem Fall keinen χ2-Test, um zu erkennen, dass das beobachtete Ergebnis deutlich vom Erwartungswert abweicht. Die jeweiligen Allele von pr und vg werden offensichtlich überwiegend gemeinsam (gekoppelt) vererbt, und andere Kombinationen als die in den beiden Elternstämmen sind eher die Ausnahme. Morgan (1911) erklärte dies damit, dass die Gene in einer linearen Anordnung vorliegen. Ein Austausch kann offensichtlich nur in seltenen Fällen durch Rekombinationen zwischen den homologen Chromosomen väterlicher und mütterlicher Allele erfolgen (Abb. 10.22). Die entsprechenden Merkmale werden damit in der Nachkommenschaft voneinander getrennt. Morgan schlug vor, dass die bereits früher beobachteten Chiasmata während der meiotischen Prophase eine Folge von Rekombinationsereignissen sind. Weitere detaillierte Untersuchungen ließen bald erkennen, dass die Rekombinationshäufigkeiten proportional zum Abstand zweier Merkmale auf dem Chromosom zunehmen: Die Wahrscheinlichkeit, dass eine Rekombination zwischen zwei Markergenen innerhalb eines Chromosoms stattfindet, ist umso größer, je weiter sie voneinander entfernt liegen. Morgans Schüler Alfred Harry Sturtevant (1891–1970) erkannte, dass man hierdurch genetische Chromosomenkarten erstellen kann, in denen alle zugänglichen Merkmale eingetragen sind (Sturtevant 1913). Für die relativen Abstände der Merkmale wurden deren relative Rekombinationshäufigkeiten zugrunde gelegt. Der Abstand zweier Merkmale in einer solchen Karte gibt die relative Anzahl von Rekombinationsereignissen zwischen diesen Merkmalen während einer Meiose an. Für diese relativen Abstände führte John B. S. Haldane (1892‒1964) als Maß die Morgan-Einheit (1919) ein. Eine Morgan-Einheit (cM, Centi-Morgan) ist als 1 % Rekombination definiert. In unserem Beispiel sind die 151 Fliegen mit violetten Augen und normalen Flügeln und die 154 Tiere mit Stummelflügeln und normalen Augen Folgen von Rekombinationsereignissen. Da die Gesamtzahl der untersuchten Tiere 2839 beträgt, errechnet sich die Rekombinationsfrequenz R zu 0,107 (Verhältnis der beobachteten Rekombinanten zu der Gesamtzahl der F2-Tiere = 305:2839). Anders formuliert, die Rekombinanten haben einen Anteil von 10,7 % an den F2-Nachkomen, d. h. der genetische Abstand beträgt 10,7 cM.

489

490

Kapitel 10: Formalgenetik

Abb.10.22 Schematische Darstellung der Experimente Morgans zum Nachweis von Kopplung von Genen in Drosophila melanogaster. Im oberen Teil der Abbildung wird der Erbgang der zwei Merkmale purple (pr) und vestigial (vg) dargestellt, wie er ohne Rekombination erfolgt. Im unteren Teil der Abbildung ist eine einfache Rekombination gezeigt. Während der meiotischen Prophase werden Stücke homologer Chromatiden ausgetauscht. Die Folge ist eine Neuverteilung der elterlichen Allele. Im Mittel erfolgt eine Rekombination in jedem Chromosom in jeder meiotischen Prophase.

Abb. 10.23 Ausschnitt aus der genetischen Karte des Rindes. Im Chromosom 24 werden die genetischen Abstände (in cM) mit ihrer cytogenetischen Lage verglichen (die schwarz-weißen Blöcke links zeigen schematisch das Ergebnis einer GiemsaFärbung des Chromosoms). Auf der rechten Seite sind einige Marker und Gene in ihrer relativen Anordnung zueinander dargestellt; Genorte in den Boxen sind durch Rekombination noch nicht aufgelöst, sodass deren Reihenfolge willkürlich ist. Die Lokalisation einiger Gene ist nur näherungsweise angegeben, da die Genauigkeit der genetischen Kartierung begrenzt ist (kursiv). (Nach Kurar et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

Solche Chromosomenkarten wurden natürlich in der Vergangenheit für viele Organismen erstellt. In Abb. 10.23 ist eine Karte des Chromosoms 24 des Rindes aus einer früheren Phase des Sequenzierprojektes des Rindergenoms dargestellt. Die Abbildung gibt auch

einen Eindruck von den Grenzen der genetischen Kartierung, da nicht in allen Fällen die Reihenfolge der Gene und Marker aufgelöst werden kann. Inzwischen ist auch das Rindergenom vollständig sequenziert und kann unter http://www.ensembl.org/Bos_taurus/Info/

10.4 Kopplung, Rekombination und Kartierung von Genen

Index eingesehen werden. Es enthält über 3,2 Millionen Nukleotide und codiert für über 30.000 Transkripte (Stand: April 2010). Es muss an dieser Stelle allerdings betont werden, dass die genetischen Abstände, die in cM angegeben werden, keine physikalisch exakten Abstände sind, wie sie in den modernen Sequenz-Datenbanken zu finden sind und in Mb (Mega-Basen) angegeben werden. Sie sind vielmehr das rechnerische Ergebnis eines Zufallsereignisses (der Rekombination), dessen Häufigkeit vor allem auch von der Sequenzumgebung abhängt. Rekombinationen sind während der Meiose in Weibchen meist häufiger als in Männchen und an den Telomeren in der Regel häufiger als in der Nähe der Centromere. Daher wird der genetische Abstand zweier Gene, insofern er in einem Experiment bestimmt wurde, auch in der Regel mit einer Standardabweichung (SD) für eine Wahrscheinlichkeit von 95 % angegeben. Wie bei Wahrscheinlichkeitsbetrachtungen üblich, wird die Standardabweichung umso kleiner, je größer die Zahl der beobachteten Tiere oder Pflanzen (n) ist. Es gilt daher für die Berechnung der Standardabweichung SD die Formel: SD = 100 (1-R) R/n Wir können nun an Morgans Beispiel weiterrechnen und erhalten als SD des Abstands von pr und vg 0,6 cM. Mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % beträgt also der Abstand von pr und vg 10,7 ± 0,6 cM. In einer historischen Chromosomenkarte von Drosophila (Strickberger 1988) finden wir einen Abstand dieser beiden Gene von 12,5 cM – es besteht also kein großer Unterschied zwischen den beiden Werten. In die Berechnung von Chromosomenkarten gehen jedoch viele Kartierungsdaten ein. Haldane hat dafür die Kartierungsfunktion eingeführt: ω = 1/2 ln(1 − 2R) dabei ist ω der Abstand auf der Genkarte und R die Rekombinationsfrequenz. Im Unterschied zum genetischen Abstand, der durch die Rekombinationshäufigkeit bestimmt wird, kann man den physikalischen Abstand heute nach Abschluss der großen Sequenzierprojekte messen und in bp (bzw. Mb) ausdrücken. Er beträgt in unserem Beispiel 11,3 Mb (http://www. ensembl.org/Drosophila_melanogaster/Info/Index; Stand: April 2010). Eine Komplikation in solchen Kartierungen ist das Auftreten von mehreren Rekombinationsereignissen zwischen zwei Merkmalen. Für kurze Abstände ist die Wahrscheinlichkeit von Doppel-Rekombinationen gering und kann daher vernachlässigt werden. Mehrfache Rekombinationen sind jedoch desto häufiger zu erwarten, je weiter entfernt zwei Merkmale auf dem

Chromosom liegen. Bei der Erstellung von Chromosomenkarten müssen hierfür geeignete Korrekturen eingeführt werden. Bei der experimentellen Durchführung solcher Kartierungsversuche mithilfe zweier Merkmale stellt sich das Problem, dass DoppelRekombinationen in den Nachkommen nicht sichtbar werden und dass dreifache Rekombinationen nicht von einfachen Rekombinationen zu unterscheiden sind. Dreifach-Rekombinationen können jedoch meist wegen ihrer geringen Wahrscheinlichkeit vernachlässigt werden und sollen daher nicht weiter betrachtet werden. In der Praxis umgeht man diese Kartierungsprobleme dadurch, dass man aus dem Vergleich aller Rekombinationsfrequenzen, die man zwischen mehr als zwei Merkmalen experimentell ermittelt, die Häufigkeit von Mehrfach-Rekombinationen errechnet. Das ist rechnerisch leicht möglich, da sie sich aus dem Produkt der beobachteten Rekombinationshäufigkeiten der verschiedenen Markergene ergibt.

10.4.3 Klassische Dreipunkt-Kreuzung In Tabelle 10.9 sind die Kreuzungsergebnisse zusammengestellt, die man bei einer Kreuzung von Mais zwischen drei gekoppelten rezessiven Markergenen erhält: virescent (v), glossy (gl) und variable sterile (va). Ausgangsmaterial der Kreuzung waren zwei reine Linien, die eine homozygot mutant für alle drei Markergene, die andere Wildtyp für alle drei Markergene. Die heterozygote Nachkommenschaft ist nach der 1. Mendel’schen Regel erwartungsgemäß phänotypisch reiner Wildtyp. Kreuzt man diese Pflanzen in einer Testkreuzung mit dem rezessiv homozygoten Elter zurück (S. 498), so können wir die genetische Konstitution der Gameten in den Nachkommen dieser Kreuzung direkt erkennen (letzte Spalte in Tabelle 10.9). Wir erkennen, dass in den Gameten erwartungsgemäß die ursprünglichen genetischen Konstitutionen (also + + + und gl va v) wieder auftreten, dass zusätzlich aber auch Zusammensetzungen auftreten, die nur durch Rekombination zu verstehen sind (gl va +, + va +, + va v, gl + +, gl + v und + + v). Zugleich sehen wir, dass die Häufigkeiten dieser Konstitutionen sehr unterschiedlich sind. Man kann zunächst einmal davon ausgehen, dass Doppel-Rekombinationen durch die Phänotypen mit der geringsten Häufigkeit repräsentiert werden (obwohl das dann nicht unbedingt der Fall zu sein braucht, wenn zwei Marker einen sehr großen Abstand haben, zwei andere aber einen sehr geringen). Wir stellen daher zunächst eine hypothetische Folge der drei Markergene auf. Die niedrigste Austauschfrequenz besteht für die beiden (komplementären) Konstitutionen + va v und gl + +. Um solche Strukturen durch Doppel-Rekombination zu erhalten, muss gl

491

492

Kapitel 10: Formalgenetik

zwischen den beiden anderen Markergenen liegen: v gl va. Einzelaustausche können also zwischen v und gl (wobei va mit gl gekoppelt bleibt) oder zwischen gl und va (wobei v mit gl gekoppelt bleibt) erfolgen (Abb. 10.24). Die Errechnung der Genabstände ergibt für v und gl einen Abstand von (62 + 4 + 7 + 60)/726 = 133/726 = 18,3 cM und für gl und va einen Abstand von (40 + 4 + 7 + 48)/726 = 99/726 = 13,6 cM. (Hierbei müssen natürlich die Doppel-Rekombinationen mitgezählt werden, da sie jeweils eine Rekombination zwischen den Markern durchlaufen haben!) Die Folgen der Doppel-Rekombination für die Ermittlung von Abständen werden deutlich, indem wir aus Tabelle 10.9 errechnen, welchen Abstand wir zwischen den äußeren Markern erhalten, wenn wir diesen direkt aus einer Zweifaktorenkreuzung ermitteln. In Tabelle 10.9 ist die Gesamthäufigkeit der Austausche zwischen v und va (62 + 40 + 48 + 60)/726 = 210/726 = 0,289 oder 28,9 %. Aus unserer Kartierung mithilfe der Dreifaktorenkreuzung errechnet sich der Gesamtabstand zwischen v und va auf 18,3 cM + 13,6 cM = 31,9 cM. Wir sehen, dass der Abstand zu klein wird, wenn wir zu große Abstände für die Kartierung wählen, da die DoppelRekombinationen nicht zu erkennen sind. Durch umfangreiche Kartierungsexperimente hat man, vor allem bei Drosophila, dennoch sehr genaue Chromosomenkarten erstellen können. Ihre Auflösung wurde in den bestuntersuchten Chromosomenabschnitten am rosy-Locus von D. melanogaster bis nahezu zum Nukleotidniveau vorangetrieben.

Tabelle 10.9 Dreipunkt-Kreuzung beim Mais Phänotypen der Nachkommen aus der Testkreuzung

Anzahl der Individuen

Genotyp der Gameten des hybriden Elters

Wildtyp

235

+

variable sterile, glossy

62

+ gl va

variable sterile

40

+ +

virescent, variable sterile

4

v + va

virescent, variable sterile, glossy

270

v

gl va

glossy

7

+

gl +

virescent, glossy

48

v gl +

virescent

60

v +

Aus Srb et al. (1965)

+ +

va

+

Abb. 10.24 Folgen einer doppelten Rekombination in einem Chromosom zwischen drei Markergenen (vgl. Tabelle 10.9). In den Keimzellen einer heterozygoten F1-Nachkommenschaft der Kreuzung zweier verschiedener homozygoter Linien des Mais können aufgrund von Rekombination und Doppel-Rekombination neben den Wildtyp-Chromosomen sechs weitere Kombinationen von Allelen der heterozygoten Markergene (virescent (v), variable sterile (va), glossy (gl)) auftreten. Die ursprünglichen Chromosomenbereiche der beiden elterlichen Chromosomen sind rot bzw. schwarz gekennzeichnet, sodass der rekombinante Charakter der Chromosomen leicht erkennbar ist. Die Häufigkeit, mit der die verschiedenen Kombinationen auftreten, ergibt sich aus den Abständen der Markergene (Tabelle 10.9)

10.4 Kopplung, Rekombination und Kartierung von Genen

Jedes Chromosom enthält Hunderte von Genen, die

linear angeordnet sind. Man bezeichnet ein Chromosom daher auch als Kopplungsgruppe. Die Lage von Genen relativ zueinander und ihr Abstand im Chromosom lassen sich durch die Ermittlung der Rekombinationshäufigkeiten zwischen ihnen festlegen.

Eine zusätzliche Schwierigkeit für die genaue Genlokalisation im Chromosom wirft die Beobachtung von Herman Joseph Muller (1890–1967) auf, dass eine Rekombination die Wahrscheinlichkeit einer zweiten Rekombination in seiner unmittelbaren Nachbarschaft entweder erhöhen oder erniedrigen kann. Man spricht demgemäß von negativer oder positiver Interferenz. Auch in unserem Beispiel in Tabelle 10.9 können wir diese Erscheinung wiederfinden. Nach einer allgemeinen Regel ergibt sich die Häufigkeit, mit der zwei voneinander unabhängige Ereignisse gleichzeitig eintreffen, aus dem Produkt der Häufigkeiten, mit dem jedes der beiden Ereignisse allein auftritt. Es gibt verschiedene erweiterte Kartierungsfunktionen, die Interferenzen berücksichtigen. Hiernach erwarten wir für Doppel-Rekombination zwischen v und va eine Häufigkeit von 0,183 × 0,136 = 0,025 oder 2,5 %. In Tabelle 10.9 finden wir jedoch nur 11/726 = 0,0149 oder 1,49 % DoppelRekombinationen. Die Frequenz ist demnach niedriger als für zwei voneinander unabhängige Ereignisse zu erwarten ist. Es muss also eine gegenseitige Beeinflussung zweier Rekombinationsereignisse bestehen. Diese Erscheinung wird als intrachromosomale Interferenz bezeichnet. Der Quotient zwischen der beobachteten und der erwarteten Häufigkeit beträgt in unserem Beispiel 1,49/2,5 = 0,6. Diesen Wert bezeichnet man auch als Koinzidenz-Koeffizienten. Besteht keinerlei Interferenz, so ist sein Wert 1. Liegt sein Wert niedriger als 1, ist also die beobachtete Häufigkeit von Doppel-Rekombinationen niedriger als erwartet, spricht man von positiver Interferenz. Ist der Wert größer als 1, so liegt negative Interferenz, also eine erhöhte Frequenz von Doppel-Rekombinationen vor. Erklären lässt sich diese Erscheinung nach unseren heutigen Vorstellungen am besten damit, dass der molekulare Mechanismus, der für eine Rekombination verantwortlich ist, mit erhöhter Wahrscheinlichkeit in der unmittelbaren Umgebung dieser Rekombination eine weitere verursachen kann, da hier besondere Paarungsverhältnisse der Chromatiden vorgegeben sind, die diese wiederholte Aktivität der beteiligten Rekombinationsenzyme unterstützen. Positive Interferenz (d. h. gegenüber der Erwartung verminderte Wahrscheinlichkeit von

Rekombination) hingegen könnte man durch die besondere Struktur der Chromatiden in der weiteren Umgebung eines bereits eingetretenen Rekombinationsereignisses verstehen, die die Induktion weiterer Rekombination erschwert oder verhindert.

Besonderheiten der molekularen Mechanismen bei der Rekombination führen zu Veränderungen in den bei Zufallsverteilung erwarteten Häufigkeiten bei dicht benachbarten Genen. Es kann hierbei zu einer Erhöhung oder Erniedrigung der Rekombinationsfrequenz kommen. Diese Erscheinung wird als negative oder positive Interferenz bezeichnet. Sie lässt sich quantitativ durch den Quotienten aus beobachteter und erwarteter Austauschhäufigkeit (Koinzidenz-Koeffizient) beschreiben.

Interferenz beobachtet man nicht nur auf dem Niveau der generellen intrachromosomalen Rekombination, sondern auch auf einer höheren Ebene, nämlich sowohl auf dem Chromatiden- als auch auf dem Chromosomenniveau. Generell ist zu erwarten, dass die Häufigkeit, mit der die vier verschiedenen Chromatiden eines Chromosomenpaares an Rekombination teilnehmen, für alle Chromatiden im Mittel gleich ist. Es können jedoch Abweichungen von den erwarteten Zufallshäufigkeiten auftreten, die als Chromatiden-Interferenz bezeichnet werden. Liegt Chromatiden-Interferenz vor, sind bestimmte Chromatiden eines Bivalentes häufiger oder zu selten an Rekombinationsereignissen beteiligt. Man erwartet auch, dass alle Chromosomen eines Chromosomensatzes Rekombinationshäufigkeiten aufweisen, die zu ihrer Länge proportional sind. Vor allem bei strukturellen Chromosomenaberrationen beobachtet man aber Verschiebungen in den relativen Rekombinationshäufigkeiten. In heterozygoten Chromosomenbereichen, in denen eine Paarung teilweise gestört ist, kann es zu verminderter Rekombinationshäufigkeit kommen. Eine solche Reduktion der Rekombinationsfrequenz in einzelnen Chromosomenabschnitten wird stets begleitet von einer erhöhten Rekombinationsfrequenz in anderen Chromosomenbereichen. In solchen Fällen spricht man von interchromosomaler Interferenz.

Interferenz wird auch hinsichtlich der Häufigkeiten der Beteiligung von Chromatiden und Chromosomen an Rekombination beobachtet. Das ist insbesondere bei Chromosomenaberrationen der Fall, bei denen reduzierte Rekombinationshäufigkeiten in einer Region durch erhöhte Rekombinationsfrequenzen in anderen Chromosomenbereichen kompensiert werden. Man spricht dann von Chromatiden-Interferenz und interchromosomaler Interferenz.

493

494

Kapitel 10: Formalgenetik

10.4.4 Kartierung von Genen durch Tetradenanalyse Die Beobachtung von Chiasmata während der meiotischen Prophase hatte Morgan zu der Annahme veranlasst, dass Rekombination in direktem Zusammenhang mit der meiotischen Paarung der Chromosomen während der frühen Prophase steht. Rekombination wäre in diesem Fall eindeutig dem 4-Strang-Stadium (4C) zuzuordnen. Man kann sich aber die Frage stellen, ob Rekombination nicht bereits vor der S-Phase, also im 2-Strang-Stadium (2C) erfolgen kann. Diese Frage erscheint zunächst als rein formalistisch. Wie wir aber sehen werden, hat ihre Beantwortung Konsequenzen für die quantitative Verteilung der Rekombinanten in der Nachkommenschaft. Zudem werden wir später noch sehen, dass trivial und rein formalistisch erscheinende Fragestellungen durch ihre Beantwortung oft interessante Einblicke in molekulare Mechanismen der Zelle gestatten. Die Frage des Zeitpunktes meiotischer Rekombination lässt sich am einfachsten an Untersuchungsmaterial beantworten, bei dem wir die Produkte einer Meiose vollständig analysieren können. Hierzu hat sich in der klassischen Genetik der Ascomycet Neurospora crassa als besonders geeignet erwiesen. In diesem Organismus sind die Meioseprodukte (Ascosporen) in einem Fruchtkörper (Ascus) in der gleichen räumlichen Anordnung zu finden, wie sie aus den beiden meiotischen Teilungen hervorgehen. Man nennt diese haploiden Meioseprodukte Tetraden (dieser Begriff darf nicht mit der Bezeichnung Tetrade für die gepaarten Bivalente in der meiotischen Prophase verwechselt werden, S. 174). Der Schimmelpilz Neurospora unterscheidet sich von vielen anderen Organismen außerdem dadurch, dass sich der Meiose noch eine mitotische Teilung anschließt, sodass ein Ascus insgesamt acht haploide Ascosporen in genau der räumlichen Orientierung enthält, in der sie entstanden sind (Abb. 10.25). Die Ascosporen lassen sich manuell leicht voneinander trennen und daher auch getrennt auf ihre genetische Konstitution untersuchen. Im einfachsten Fall kann jedoch bereits die Farbe der Ascosporen dazu dienen, Rekombinationsereignisse zu erkennen. In Abb. 10.25 sind die Ergebnisse eines solchen Versuches dargestellt. Es lassen sich sechs verschiedene Ascotypen hinsichtlich der Ascosporenfarbe und ihrer Anordnung im Ascus unterscheiden. In der quantitativen Auswertung überwiegen deutlich zwei Typen (I und II). Ein Vergleich mit Abb. 10.26 erklärt dieses Ergebnis: Es handelt sich um die Segregationsprodukte der beiden elterlichen Homologen, ohne dass im Bereich zwischen Centromer und dem Markergen Rekombination stattgefunden hat. Hingegen repräsen-

tieren die Typen III und IV verschiedene Rekombinationstypen zwischen den Chromatiden, die in der Abbildung erklärt werden. Aus Abb. 10.26 ist ersichtlich, dass im Falle der Rekombination im 2-StrangStadium, also vor der Replikation, nur zwei Typen von Asci zu erwarten sind, die sich nicht von der Konstitution der Asci unterscheiden lassen, in denen gar keine Rekombination erfolgt ist. Die Beobachtung von sechs verschiedenen Ascustypen ist also allein damit zu erklären, dass die Rekombination im 4-Strang-Stadium, also nach vollendeter Replikation, erfolgt. Carl C. Lindegren (1932) machte sich die Möglichkeit der genetischen Ascosporenanalyse von Neurospora zunutze und untersuchte die Segregation von Merkmalen zum Zwecke der Erstellung genetischer Karten des Schimmelpilzes. Die Kartierung erfolgt in diesem experimentellen System übrigens – im Gegensatz zu den bereits früher besprochenen Kartierungen bei Drosophila – oft durch Ermittlung des Abstands zum Centromer, obwohl prinzipiell die Ermittlung relativer Markerabstände, vergleichbar der Methodik, wie sie bei Drosophila verwendet wird, ebenso möglich ist. Eine Tetradenanalyse in höheren Eukaryoten ist nur in Ausnahmefällen möglich. Eine solche Ausnahme finden wir in besonderen genetischen Konstitutionen von Drosophila. Es gibt X-Chromosomen, die aufgrund von Nondisjunction im Centromer miteinander verschmolzen sind und sich daher wie ein einziges Chromosom verhalten, obwohl sie genetisch eine diploide Konstitution repräsentieren. Man bezeichnet ein solches Chromosom als ein attached-X-Chromosom. Da beide Arme eines attached-X-Chromosoms unterschiedliche Allele eines Merkmals besitzen können, kann durch Rekombination eine Segregation dieser Allele erfolgen.

Durch Analyse aller haploiden Meioseprodukte (Tetradenanalyse) können in einigen Organismen Rekombinationsereignisse direkt sichtbar gemacht werden. Das gestattet die Analyse der Rekombinationsmechanismen. Sie zeigt, dass Rekombination im 4-Strang-Stadium erfolgt. Eine Tetradenanalyse kann auch zur Kartierung von Merkmalen verwendet werden.

10.4.5 Moderne genomweite Kartierung mit Mikrosatelliten- und SNP-Markern Wir haben gesehen, dass in der Frühphase der Genetik Abstände zwischen den Genen aufgrund äußerlich sichtbarer Marker bestimmt wurden (z. B. Flügelform und Augenfarbe bei Drosophila; Blatt- und Samenfarbe beim Mais); ähnlich war die Situation lange Zeit in der Mausgenetik (Augen- und Fellfarben). Daher war es

10.4 Kopplung, Rekombination und Kartierung von Genen Abb. 10.25 Tetradenanalyse zur Feststellung der Segregation von Markergenen nach Rekombination bei Neurospora. Links sind die verschiedenen Austauschmöglichkeiten zwischen den Chromatiden der homologen Chromosomen dargestellt. Je nachdem, welche Chromatiden an der Rekombination beteiligt sind und wie ihre Positionen in der Anaphase sind, resultieren unterschiedliche Ascosporenanordnungen nach der Meiose (rechts). Da nach den meiotischen Teilungen eine weitere mitotische Teilung erfolgt, finden sich acht Ascosporen in den Asci. Die Lagebeziehungen der Chromatiden im Ascus bleiben vom Beginn der ersten meiotischen Anaphase an erhalten. Dadurch können sämtliche aus einem Rekombinationsereignis abstammenden Rekombinationsprodukte in ihren ursprünglichen Lagebeziehungen erhalten werden. Da alle Ascosporen einzeln isoliert werden können, ist es möglich, am Phänotyp der Ascosporen nicht erkennbare Markergene, wenn erforderlich, durch Analyse der einzelnen Ascosporen zu ermitteln. Hat keine Rekombination stattgefunden, sind die jeweils vier Sporen, die aus der Verteilung der Chromatiden eines Elternchromosoms entstehen, von denen des anderen Elters getrennt. Die Häufigkeit der verschiedenen Anordnungen ist durch den Abstand der Marker vom Centromer bestimmt . Zum Verständnis des Rekombinationsmechanismus siehe auch Abb. 5.23

zunächst notwendig, für die Untersuchung von Kopplungsgruppen (d. h. zur Analyse, auf welchem Chromosom eine neue Mutation lokalisiert ist) jeweils eine

eigene Kreuzung mit Trägern von Markergenen durchzuführen. Besondere Test-Stämme erlaubten später die Möglichkeit, die Kopplung mit mehreren Genen in

495

496

Kapitel 10: Formalgenetik

Abb. 10.26 Tetradenanalyse bei Neurospora zum Nachweis der Rekombination im 4-Strang-Stadium. Während Rekombination im 4-Strang-Stadium (d. h. nach der Replikation) zu unterschiedlichen Anordnungen der genetisch markierten Ascosporen im Ascus führt (III und IV), kann Rekombination im 2-Strang-Stadium (d. h. vor der Replikation) nur Vertei-

lungsmuster (II) der Ascosporen ergeben, die sich von der Anordnung von Ascosporen ohne Rekombination (I) nicht unterscheiden lassen. Die Abbildung zeigt Chromosomen in verschiedenen Stadien der meiotischen Prophase I und nach der Meiose bzw. nach einer weiteren mitotischen Teilung der Ascosporen sowie die daraus entstehenden Asci

einer Kreuzung zu erfassen. Diese Situation blieb im Prinzip unverändert bis in die 1980er-Jahre. Mit dem Beginn des internationalen Humangenomprojekts wurden dann allerdings zunehmend molekulare Marker entwickelt, die sich leicht durch PCRMethoden (Technik-Box 4) analysieren lassen. Beson-

ders geeignet sind dafür Mikrosatelliten, die kurze repetitive Elemente enthalten, die von spezifischen Sequenzen flankiert sind und dadurch eindeutige chromosomale Zuordnungen erlauben. Für viele genetische Modellsysteme (z. B. Drosophila, Zebrafisch, Maus, Ratte) und für den Menschen gibt es inzwischen meh-

10.4 Kopplung, Rekombination und Kartierung von Genen

rere Tausend solcher Mikrosatelliten-Marker, sodass eine sehr hohe Markerdichte auf den einzelnen Chromosomen vorhanden ist. Charakteristisch für diese Marker ist neben ihrer Lage auf dem Chromosom die Länge ihres jeweiligen repetitiven Elementes, die sich zwischen verschiedenen Stämmen einer Art unterscheiden kann. In Abb. 10.27 ist als Beispiel der Marker D11Mit36 gezeigt (dabei bezeichnet „D11“ das Chromosom 11 der Maus, „Mit“ den Hersteller – hier das Massachusetts Institute of Technology, und „36“ ist die laufende Nummer des Herstellers). Für eine genomweite Kopplungsanalyse einer unbekannten Mutation ist es notwendig, die Aufspaltung in der F2-Generation zu betrachten (Kapitel 10.4.2); eine geschlechtsgebundene Vererbung wird in der Regel schon bei der Zucht einer Mutante offensichtlich. Wir wollen uns das Vorgehen am Beispiel einer fortschreitenden Trübung der Augenlinse bei der Maus betrachten, die dominant vererbt wird (dieser Phänotyp der Maus ist ein gutes Modell für den „Grauen Star“ des Menschen). Die Mutation ist im Maus-Stamm C3H (braune Fellfarbe) aufgetreten; für die Kopplungsanalyse hat es sich bewährt, eine Auskreuzung nach dem Stamm C57BL6 (schwarzes Fell) durchzuführen. Für die Auswahl der Mikrosatelliten-Marker bedeutet das, dass sich die Länge ihrer Wiederholungselemente zwischen den Stämmen C3H und C57BL6 so unterscheiden müssen, dass diese Unterschiede in Agarose-Gelen

nach der PCR eindeutig und leicht identifizierbar sind – andernfalls sind diese Marker nicht informativ. Abb. 10.28a gibt nun das Kreuzungsschema einer solchen Analyse wieder. Da es sich um ein dominantes Merkmal handelt, bleibt der Phänotyp in allen Generationen erhalten. Bei Verwendung von homozygoten Mutanten ist die F1-Generation uniform heterozygot. Die Rückkreuzung zu dem Wildtyp-Stamm ergibt dann in der F2-Generation eine 1:1-Aufspaltung der Phänotypen; die Analyse der F2-Generation erlaubt damit die Bestimmung der Kopplung mit einem Chromosom mithilfe der Mikrosatelliten-Marker. Tabelle 10.10 zeigt das Ergebnis; dabei wurden nur Merkmalsträger verwendet. Obwohl in die Analyse nur wenige Tiere der F2-Generation einbezogen wurden, ist das Ergebnis eindeutig: Die Mutation liegt auf dem Chromosom 11. Eine genauere Analyse des Chromosoms, das die Mutation trägt (Haplotyp-Analyse; Abb. 10.28c) erlaubt die Bestimmung der Reihenfolge der verwendeten fünf Marker und ihrer relativen Abstände; die Genkarte für diese fünf Marker zeigt Abb. 10.28d. Aufgrund der Lage auf dem Chromosom können in den vorhandenen Datenbanken nun diejenigen Gene herausgesucht werden, die innerhalb des kritischen Intervalls zwischen den flankierenden Markern liegen und damit als Kandidaten für diesen Phänotyp (hier: Grauer Star) infrage kommen. Dieser Ansatz wird als positionelle Kandidatengenanalyse bezeichnet. Ein wichtiges

Abb. 10.27 Beispiel für einen Mikrosatelliten-Marker: D11Mit36. Es ist die Sequenz eines typischen MikrosatellitenMarkers der Maus dargestellt. Mit den grünen Primern wird in der PCR ein Fragment amplifiziert, dessen Größe in den unterschiedlichen Maus-Stämmen verschieden ist (zwischen 220 bp und 326 bp). Ursache sind unterschiedliche Längen der Wie-

derholungssequenzen (rot). Dieser Marker ist auf dem Chromosom 11 lokalisiert, und zwar in einer Entfernung von 48 cM vom Centromer. Die Stämme C57BL, C3H, DBA, BALB und AKR gehören zu Mus musculus und repräsentieren gängige Laborstämme. (Quelle: http://www.informatics.jax.org/)

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498

Kapitel 10: Formalgenetik

Abb. 10.28 a–d Kartierung einer unbekannten Mutation bei der Maus. a Kartierungsschema für Kopplungsanalyse. Eine dominante Mutation (fortschreitende Linsentrübung, engl. Progressive opacity, Po) liegt homozygot vor (Merkmalsträger schwarze Symbole, auf dem Hintergrund des Laborstamms C3H) und wird mit einer Wildtyp-Maus (leere Symbole) des Stamms C57BL/6 gekreuzt. Die Nachkommen in der F1-Generation sind in allen Genen heterozygot. Ein Tier dieser F1Generation wird mit einem Wildtyp der Parentalgeneration zurückgekreuzt. Die Nachkommen in der F2-Generation spalten entsprechend den Mendel’schen Regeln auf und können auf Kopplung des Phänotyps mit verschiedenen Markern untersucht werden. (Wenn keine homozygoten Mutanten zur Verfügung stehen, kann man den Ansatz mit heterozygoten Eltern durchführen: Man erhält in der F1-Generation 50 % Träger und muss für die Aufspaltung in der F2-Generation einen Träger mit einem Wildtyp zurückkreuzen.) b Eine rezessive Mutation (ohne Augenlinse, engl. aphakia, ak) liegt auf dem Hintergrund des Stamms C57BL/6 vor und wird mit Wildtypen des Laborstamms AKR gekreuzt. In der F1-Generation zeigt kein Tier das Merkmal; alle Nachkommen sind heterozygot. Ein Tier dieser F1-Generation wird mit einer homozygoten Mutante der Parentalgeneration zurückgekreuzt. Die Nachkommen in der

F2-Generation spalten entsprechend den Mendel’schen Regeln auf und können jetzt auf Kopplung des Phänotyps mit verschiedenen Markern untersucht werden. c Haplotyp-Analyse der unbekannten Mutation Po. 43 Merkmalsträger einer F2Rückkreuzungsgeneration werden auf Kopplung mit verschiedenen Markern des Chromosoms 11 untersucht. Dabei sind 30 Tiere heterozygot für alle Marker und damit nicht informativ. Die schwarzen Kästchen deuten jedoch an, in welchen Tieren offensichtlich Rekombinationen stattgefunden haben, da die Kataraktträger homozygot für die jeweiligen Marker sind. Die Mutation befindet sich also zwischen den Markern D11Mit242 (5 Rekombinationen zwischen diesem Marker und der unbekannten Mutation) und D11Mit36 (1 Rekombination). Der genetische Abstand berechnet sich zu 11,6 bzw. 2,3 cM; mithilfe der Formel auf S. 491 kann auch die 95%-Vertrauensgrenze angegeben werden. d Die Daten der Haplotyp-Analyse werden in eine Karte des Maus-Chromosoms 11 eingetragen; rechts sind die Abstände aus der Haplotyp-Analyse angegeben. Das Kandidatengen Cryba1 (grün; 45 cM vom Centromer entfernt) codiert für ein Strukturprotein der Augenlinse (βA1/A3-Kristallin); die für die Linsentrübung (Po; rot) kausale Mutation wurde tatsächlich in diesem Gen identifiziert. (c, d nach Graw et al. 1999, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

10.4 Kopplung, Rekombination und Kartierung von Genen

Tabelle 10.10 Genomweite Kopplungsanalyse für eine unbekannte Mutation (Progressive Linsentrübung; Gensymbol: Po)

a

Marker

Zahl der getesteten Tiere

% Homozygote

Kopplunga

D1Mit211

46

37

nein

D1Mit216

46

50

nein

D2Mit148

46

57

nein

D2Mit206

43

63

nein

D3Mit307

46

50

nein

D3Mit44

46

41

nein

D3Mit77

46

39

nein

D4Mit203

46

47

nein

D5Mit138

46

39

nein

D6Mit102

46

48

nein

D7Mit31

46

57

nein

D8Mit121

45

53

nein

D8Mit242

46

83

nein

D9Mit12

45

58

nein

D9Mit95

45

60

nein

D10Mit42

46

63

nein

D10Mit86

41

66

nein

D11Mit36

46

2

ja

D11Mit224

39

21

ja

D11Mit242

45

11

ja

D11Mit263

46

9

ja

D11Mit271

44

20

ja

D12Mit221

46

57

nein

D12Mit259

46

52

nein

D13Mit14

46

54

nein

D13Mit53

45

47

nein

D13Mit64

46

54

nein

D13Mit67

46

57

nein

D15Mit171

44

50

nein

D15Mit85

46

57

nein

D16Mit146

45

44

nein

D16Mit189

44

41

nein

D17Mit185

46

54

nein

D18Mit60

42

62

nein

D19Mit10

46

52

nein

Kopplung wird angenommen, wenn die Zahl der homozygoten Tiere für den jeweiligen C57BL/6-Marker kleiner als 25 % ist. Die Marker, bei denen Kopplung festgestellt wurde, sind dunkel hinterlegt. (Nach Graw et al. 1999)

Zusatzkriterium ist natürlich, dass das Kandidatengen auch in den entsprechenden Geweben (hier: Augenlinse) exprimiert wird. In diesem Fall wurde eine Punktmutation im Cryba1-Gen als Ursache identifiziert; das Cryba1-Gen codiert für ein Strukturprotein (βA1/A3-Kristallin) der Augenlinse. Bei der Kartierung rezessiver Merkmale wird im Prinzip ähnlich verfahren (Abb. 10.28b). Dabei muss in der Elterngeneration der Mutantenphänotyp homozygot vorliegen, da rezessive Merkmale nur in der homozygoten Situation ausgeprägt werden. Nach der Auskreuzung zu einem homozygoten Wildtyp-Stamm entspricht die F1-Generation phänotypisch dem Wildtyp, ist aber genotypisch heterozygot. Die Rückkreuzung wird nun immer zum homozygoten MutantenStamm erfolgen, da nur so in der F2-Generation der Mutantenphänotyp erscheint (50 % der Nachkommen sind homozygot für das rezessive Merkmal; die anderen 50 % sind heterozygot und zeigen daher den Phänotyp des Wildtyps). Genauso wie für einen dominanten Erbgang kann damit die Kopplung mit entsprechenden Markern untersucht und eine positionelle Kandidatengenanalyse durchgeführt werden.

Durch die hohe Dichte der Mikrosatelliten-Marker in vielen Modellorganismen ist es möglich, Mutationen sehr präzise und schnell zu kartieren. Dadurch können positionelle Kandidatengene für eine Mutation erkannt werden; in der Regel erlaubt es auch eine zügige molekulare Charakterisierung der Mutation.

Im Rahmen der großen Sequenzierprojekte wurden sehr viele Einzelbasen-Polymorphismen identifiziert (engl. single nucleotide polymorphisms, SNPs). Beim Menschen rechnet man damit, dass ca. alle 1000 bp ein SNP zu finden ist ‒ die Markerdichte ist also extrem hoch. Verbunden mit einem schnellen Nachweis ist es die hohe Markerdichte, die die SNP-Analyse so interessant macht.

10.4.6 Kartierung von quantitativen Merkmalen und Modifikatorgenen Wie wir bereits oben gesehen haben (Kapitel 10.3.4), werden quantitative Merkmale durch mehrere Gene vererbt. Wenn man nun die einzelnen Gene dazu (engl. quantitative trait locus, QTL) kartieren möchte, steht man vor Problemen, da eine Kartierung in der Regel ungenaue Ergebnisse bringt und im besten Fall Kopplung mit verschiedenen Chromosomen deutlich wird. Verschärft wird das Problem möglicherweise durch Phänomene, die wir als Epistasie, Codominanz etc. bereits kennengelernt haben. Es ist daher sinnvoll,

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500

Kapitel 10: Formalgenetik

von vornherein eine möglichst große Zahl von Individuen zu sammeln, um die Population möglichst vollständig abzubilden. Außerdem ist es sinnvoll, einen komplexen Phänotyp in einfachere Merkmale zu unterteilen (z. B. Beschränkung bei der „Größe“ auf nur 10 % aller Werte an den jeweiligen Enden der Skala). Der erste Schritt in einer QTL-Kartierung besteht üblicherweise darin, solche Populationen zu gewinnen, die von homozygoten Inzuchtlinien abstammen. Die daraus hervorgehenden F1-Populationen werden in der Regel heterozygot für alle Marker und auch die QTLs sein. Ausgehend von der F1-Population werden Kreuzungen angesetzt (z. B. Rückkreuzungen, F2-„inter-se“Kreuzung und Kreuzungen, um reine Inzuchtlinien zu erhalten), und die Aufspaltungen der Marker und QTLs werden statistisch modelliert. Im Allgemeinen nimmt man natürlich an, dass die Marker unabhängig aufspalten, aber häufig ist das Ergebnis verzerrt (verursacht beispielsweise durch eine falsche Klassifikation eines Trägers). Wenn die einzelnen Daten vorhanden sind, werden statistische Beziehungen zwischen den Markern und den quantitativen Merkmalen hergestellt; dabei können einfache Techniken (Varianz-Analyse, engl. analysis of variance, ANOVA) oder komplexere

Verfahren herangezogen werden. Die Lokalisation des QTLs benötigt aber auf alle Fälle wenigstens eine grobe genetische Karte mit bekannten Abständen der Marker und Berechnungen einer maximierten Wahrscheinlichkeitsfunktion. Im einfachen Fall wird man zunächst Einzelmarker-Tests durchführen und dabei die entsprechenden statistischen Testverfahren anwenden (t-Test, VarianzAnalyse, einfache Regressionsanalyse); ein allgemeines Beispiel dafür ist in Abb. 10.29 angegeben. Die Intervall-Kartierung wurde von Eric Lander und David Botstein 1989 in die Literatur eingeführt und benutzt die vorhandenen genetischen Karten als Rahmen für die Kartierung von QTLs. Die Intervalle, die durch eine geordnete Serie von Markerpaaren vorgegeben sind, werden schrittweise abgesucht (z. B. in 2-cM-Schritten), und mithilfe statistischer Verfahren wird überprüft, ob ein QTL innerhalb eines Intervalls vorhanden ist oder nicht. Dabei ist es wichtig zu wissen, dass die Intervall-Kartierung statistisch die Kopplung mit einem einzigen Gen innerhalb jedes Intervalls überprüft. Das Ergebnis wird üblicherweise als „LODScore“ angegeben (engl. logarithm of the odds; siehe dazu aber auch die Kartierung in der Humangenetik,

Abb. 10.29 Experimentelles Design einer Kartierung quantitativer Merkmale. Es ist eine Standard-Rückkreuzung gezeigt für die Marker M (mit den Allelen M1 und M2) und R (mit den Allelen R1 und R2) und dem quantitativen Merkmal Q und dessen Allelen Q1 und Q2. Die Haplotypen sind durch einen Schrägstrich getrennt. Für den Merkmals-Wert (Y) wird eine Normalverteilung angenommen (N) mit einem Mittelwert μ und einer Varianz σ2 in den elterlichen Populationen P1 und P2. B1 und B2 stellen die Nachkommen der reziproken Rückkreuzung dar.

Der Merkmals-Wert in den Nachkommen der Rückkreuzung hat eine Verteilung, die das Gemisch der F1-Wert-Verteilung und der jeweiligen Eltern-Population repräsentiert. Mithilfe statistischer Verfahren kann nun entschieden werden, ob es eine Beziehung zwischen den genotypischen Daten (Markern) und den Informationen aus der Rückkreuzung gibt. (Nach Doerge 2002, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

10.5 Populationsgenetik

Kapitel 12.1.4. Dabei wird die Wahrscheinlichkeitsfunktion unter der Nullhypothese (kein QTL) mit der alternativen Hypothese (QTL an der Testposition) verglichen, um so wahrscheinliche Orte für einen QTL zu ermitteln. Die Intervall-Kartierung durchsucht die geordneten genetischen Marker in einer systematischen und linearen Form. Es wird bei jedem Schritt immer dieselbe Nullhypothese überprüft und dieselbe Wahrscheinlichkeit angenommen. Wenn schließlich alle LOD-Scores zusammengenommen werden, erhält man ein Profil über die genetische Karte (Abb. 10.30). Überprüft man, welches der verschiedenen Maxima einem einzigen QTL entspricht, muss man fragen, wann Ergebnisse als statistisch signifikant

zu bezeichnen sind. Es ist nicht einfach, einen QTL sicher zu definieren: einmal, weil die Wahrscheinlichkeit üblicherweise eine Funktion von Mischungen von Normalverteilungen ist, und zum anderen, weil die Teststatistik nicht mehr einer Standardverteilung der Statistik folgt, wenn vorher die Daten unter der Nullund der Alternativhypothese maximiert wurden. Es sind daher die Ergebnisse von entsprechenden Computerprogrammen mit einer gewissen Vorsicht zu interpretieren; eine Übersicht über gängige Kartierungsprogramme enthält die Web-Seite http://linkage.rockefeller.edu/soft (Stand: April 2010).

Die Kartierung quantitativer Merkmale (QTLs) ist von besonderer Bedeutung zum Verständnis komplexer Erkrankungen beim Menschen und zur Optimierung der Erträge in der Tier- und Pflanzenzucht. Erforderlich sind allerdings in der Regel komplexe Zuchtschemata und entsprechende Auswertungsprogramme.

10.5 Populationsgenetik

Abb. 10.30 Analyse einer Kartierung quantitativer Merkmale. Die dargestellten Daten stammen ursprünglich aus einer Untersuchung am Chromosom 11 der Maus zur Kartierung des Schweregrades einer experimentellen, allergischen Encephalomyelitis (Entzündungen im Gehirn und Rückenmark). Diese Erkrankung der Maus wird als Modell für Multiple Sklerose beim Menschen verwendet. Verschiedene MikrosatellitenMarker wurden in 633 F2-Mäusen genotypisiert; die Schwere der Erkrankung wurde über mehrere Messungen des Hängenlassens ihrer Schwänze bestimmt. Die Analyse wurde mithilfe des Programms „QTL-Cartographer“ (http://statgen.ncsu.edu/ qtlcart/WQTLCart.htm) und verschiedener Ansätze durchgeführt; die rote Linie repräsentiert das 95%-Signifikanz-Niveau: • Die Einzelmarker-Analyse mithilfe des t-Tests (schwarze Punkte) erkennt einen signifikanten Marker (D11Mit36; Abb. 10.29). • Die Intervall-Kartierung (blaue Linie) identifiziert 4 Maxima und damit mögliche Lokalisationen für die QTLs. • Die zusammengesetzte Intervall-Kartierung (grüne Linie) findet zwei signifikante QTLs. Der wesentliche Unterschied zwischen den verwendeten Verfahren liegt darin, dass die zusammengesetzte Intervall-Kartierung „Fenster“ definiert und damit mögliche Assoziationen mit Merkmalen ausschließt, die außerhalb dieses Fensters liegen. (Nach Doerge 2002, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Die Beobachtung phänotypischer Variabilität innerhalb von Populationen hat zu der Erkenntnis geführt, dass auch für die Vererbung von Genen innerhalb von Populationen Regeln bestehen. So entstand eine besondere Teilwissenschaft der Genetik ‒ die Populationsgenetik. Zu den Aufgaben der Populationsgenetik gehört das Studium der Variabilität der Organismen in Raum und Zeit und die Aufklärung der hierauf einwirkenden Faktoren. Ziel der Populationsgenetik ist es, auf diese Weise die Wege und Parameter evolutionärer Prozesse zu verstehen. Neben der klassischen Populationsgenetik entwickelt sich heute die genetische Epidemiologie als eine Disziplin, die vor allem versucht, die Beiträge bestimmter Allele zur Entstehung weit verbreiteter Krankheiten zu ermitteln.

Definition des Populationsbegriffs Die Bezeichnung Populationsgenetik besagt, dass sich dieses Wissensgebiet mit Populationen von Organismen beschäftigt. Was aber verstehen wir unter einer Population? Wäre es nicht angemessener, von Arten (engl. species) zu sprechen, da diese oft als Grundelemente der Evolution angesehen werden? Die genauere Betrachtung des Begriffs Art lässt uns erkennen, dass unter diesem Begriff eine Vielzahl von Individuengruppen zusammengefasst ist, die sich in manchen Fällen über die gesamte Erde verteilen können. Jede dieser Gruppen wird als Population bezeichnet. Obwohl der Artbegriff so definiert ist, dass alle Organismen, die sich untereinander fortpflanzen können, zu einer gemeinsamen Art zu zählen sind, hat eine solche Definition bei weltweit verstreuten Populationen

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502

Kapitel 10: Formalgenetik

wenig praktische Bedeutung. Tatsächlich erfolgt die Vermehrung von Organismen – und damit auch ihre Evolution – innerhalb meist recht kleiner Gruppen oder Fortpflanzungsgemeinschaften, die weitgehend oder vollständig voneinander getrennt existieren. Da die Eigenschaften eines Biotops im Allgemeinen selbst in kleinen Arealen schnell wechseln, genügen solche Biotopunterschiede häufig zur Abtrennung einer Organismengruppe von der nächsten Population der gleichen Art. Beispielsweise kann ein Berg oder ein Fluss zur Trennung einzelner Populationen voneinander führen. In der Genetik sind es diese Fortpflanzungsgemeinschaften, die im Mittelpunkt des Interesses stehen und denen wir den Begriff Population zuweisen (Johannsen 1903). Wenn künftig von Population gesprochen wird, ist daher eine geschlossene Fortpflanzungsgemeinschaft gemeint, die meist nur einen kleinen Teil der Organismen umfasst, die einer Art zugehören. Alle Allele, die die Mitglieder einer Population besitzen, werden als Genpool bezeichnet.

Grundelemente der Evolution sind Fortpflanzungsgemeinschaften oder Populationen.

Zuwanderung von Individuen aus anderen Populationen) ausgeübt werden. Wenn diese Voraussetzungen gegeben sind, sprechen wir davon, dass sich die Population in einem Gleichgewicht befindet. Die Verteilung der Allele lässt sich nach Hardy und Weinberg durch eine einfache Beziehung darstellen, die sich direkt aus den Mendel’schen Regeln ableiten lässt: Beschreibt man die Häufigkeiten zweier Allele A und B in einer Population mit p und q, wobei deren Summe natürlich 100 % ergeben muss (also p + q = 1), so lässt sich die Verteilung dieser Allele in einer Population im Gleichgewicht wie folgt beschreiben: pA2 + 2(pAqB) + qB2 = 1 Diese mathematische Formulierung lässt sich unmittelbar aus einem Punnett-Viereck verstehen, wenn wir diesem die Häufigkeiten der Allele hinzufügen (Abb. 10.31). Dieses Kreuzungsschema veranschaulicht, dass die Allelfrequenzen und Allelverteilung in aufeinanderfolgenden Generationen unverändert bleiben müssen.

10.5.1 Die Hardy-Weinberg-Regel Bereits kurz nach der Wiederentdeckung der Mendel’schen Regeln hatten 1908 zwei Wissenschaftler, Godfrey Harold Hardy (1877–1947) und Wilhelm Robert Weinberg (1862–1937), unabhängig voneinander erkannt, dass bestimmte Regeln für die quantitative und qualitative Verteilung von Allelen unter den Individuen einer Population zwischen aufeinanderfolgenden Generationen von Organismen bestehen, sofern bestimmte Randbedingungen über die Generationen hinweg unveränderlich bleiben. Zu diesen Randbedingungen gehört, ï dass alle Organismen diploid sind und ï sich sexuell fortpflanzen, ï dass keine Beschränkungen in der Fortpflanzungsfähigkeit zwischen den verschiedenen Individuen der Population – ausgenommen das Geschlecht – bestehen (Panmixie), ï dass die Mendel’schen Regeln gelten und ï dass es sich um eine genügend große Population handelt (idealerweise um eine unendlich große Population), um zufällige Verteilungsabweichungen auszuschließen. Diese Randbedingungen definieren eine solche Population als Mendel-Population. Zu den Randbedingungen kommt die Forderung hinzu, ï dass auf die Zusammensetzung der Population keine Einflüsse von außen (z. B. Selektion oder

Abb. 10.31 Die Ermittlung von Allelfrequenzen innerhalb einer Population ist leicht möglich, wenn man alle möglichen Gametenkombinationen mit ihren jeweiligen Frequenzen in einem Punnett-Viereck analysiert. Die Produkte aus den jeweiligen Allelfrequenzen zeigen ihre Frequenz in den verschiedenen Genotypen bei den Nachkommen an. Es ergibt sich für Homozygote der Konstitution AA die Häufigkeit 0,42 = 0,16, für Heterozygote (Aa) die Häufigkeit 2 × 0,4 × 0,6 = 0,48 und für Homozygote der Konstitution aa die Häufigkeit 0,62 = 0,36. Diese Verteilung bleibt in den folgenden Generationen erhalten, sofern nicht die freie Kombinierbarkeit der Gameten gestört oder die Häufigkeit einzelner Genotypen durch Selektion, Migration oder andere Eingriffe verändert werden

10.5 Populationsgenetik

Die Hardy-Weinberg-Regel besagt, dass in einer Men-

del-Population Allelfrequenzen und Allelverteilungen in aufeinanderfolgenden Generationen gleich bleiben.

Ein solcher Schluss erscheint uns bei genauerer Betrachtung als wenig überraschend. Er verbirgt jedoch verschiedene interessante Einzelheiten über den Aufbau von Populationen. Unabhängig davon leistet die Hardy-Weinberg-Regel wertvolle Dienste bei der Analyse von Populationen, da sie beispielsweise Hinweise zu geben vermag, ob bestimmte Allele möglicherweise unter Selektionsdruck stehen, und sie gibt uns die Möglichkeit, Veränderungen in den Allelfrequenzen unter Selektionsdruck zu errechnen. Die Anwendungsmöglichkeiten für die Hardy-Weinberg-Regel sollen zunächst an einem Beispiel dargestellt werden (Tabelle 10.11). Die Blutgruppenallele M und N des Menschen sind codominant und werden immunologisch aufgrund ihrer Antigene auf den Erythrocytenmembranen ermittelt. Die Tabelle zeigt uns, dass beide Blutgruppenallele in allen untersuchten menschlichen Populationen vertreten, aber in ihren Häufigkeiten sehr unterschiedlich verteilt sind. Dennoch lässt sich

ihre Verteilung in allen Fällen recht genau durch die Hardy-Weinberg-Formel beschreiben. Das spricht zunächst einmal dafür, dass sich die betreffenden Allele in der Population in einem Gleichgewichtszustand befinden. Diese Annahme könnte dann falsch sein, wenn sich die Population in einem Zustand schneller Veränderungen befindet und sich die Allelverteilung, obwohl sie unter Selektionsdruck steht, zufällig annähernd in einem Zustand befindet, der einem Gleichgewichtszustand entspricht. Hierüber müssten Untersuchungen in folgenden Generationen Aufschluss geben, bei denen man Veränderungen erkennen würde. Natürlich sind solche Analysen bei menschlichen Populationen durch die lange Generationsdauer starken Einschränkungen unterworfen. Die Verteilung der M- und N-Blutgruppen lehrt uns, dass unterschiedliche Gleichgewichtszustände innerhalb verschiedener Populationen bestehen können (Abb. 10.32). Die Beziehungen zwischen der Verteilung zweier Allele in Homo- und Heterozygoten im Gleichgewichtszustand lassen sich am besten durch Grafiken veranschaulichen (Abb. 10.33). Diese Grafiken zeigen uns, dass in vielen Fällen ein relativ großer Anteil eines Allels in den Heterozygoten vorliegt. Handelt es sich um ein rezessives Allel, tritt es in dieser Form nicht in Erscheinung. Als Folge davon erscheint

Tabelle 10.11 Prüfung eines Populationsgleichgewichts für die Blutgruppen MN Population

Genetische Konstitution (M und N) und Allelfrequenzen (p und q) Beobachtet

Errechnet

Erwartet nach Hardy-Weinberg

M/M

M/N

N/N

p(M)

q(N)

2pq(MN)

p2(NN)

Eskimos

0,835

0,150

0,009

0,914

0,086

0,157

0,0074

Australische Aborigines

0,024

0,304

0,672

0,176

0,824

0,290

0,679

Ägypter

0,278

0,489

0,233

0,523

0,477

0,499

0,228

Deutsche

0,297

0,507

0,196

0,545

0,455

0,496

0,207

Chinesen

0,332

0,486

0,182

0,575

0,425

0,489

0,181

Nigerianer

0,301

0,495

0,204

0,549

0,451

0,495

0,245

Die beobachteten Häufigkeiten der verschiedenen genetischen Konstitutionen sind in den betreffenden Spalten (M/M, M/N und N/N) angegeben. Die beobachteten Werte sind normal gesetzt, der zunächst errechnete Wert für p(M) ist halbfett hervorgehoben und dient zur rechnerischen Ermittlung der übrigen Werte (kursiv). Aus der Häufigkeit von homozygoten M-Individuen (Spalte: M/M) wurde die Allelfrequenz von M zunächst nach Hardy-Weinberg errechnet (Spalte: p(M)). Die Allelfrequenz von N (Spalte: q(N)) wurde dann nach der Formel q = 1 − p errechnet. Die erwarteten Häufigkeiten der Heterozygoten (Spalte: erwartet 2pq(MN)) und der Individuen, die homozygot für N sind, (Spalte: erwartet p2(NN)) wurden aus den errechneten Allelfrequenzen von M und N ermittelt. Die verschiedenen Populationen zeigen eine gute Übereinstimmung der Frequenzen der verschiedenen Genotypen mit der Erwartung aufgrund der Hardy-Weinberg-Regel. Es ist anzunehmen, dass in diesen Populationen ein Gleichgewicht hinsichtlich der Blutgruppenallele M und N besteht. Die Tabelle veranschaulicht, dass ein Gleichgewicht für sehr unterschiedliche Allelfrequenzen eingestellt werden kann. Verändert nach Boyd (1950)

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504

Kapitel 10: Formalgenetik

10.5 Populationsgenetik

Eine wichtige autosomal-rezessive Erbkrankheit ist die Phenylketonurie (PKU). Diese Krankheit, die auf einem Enzymdefekt im Phenylalaninstoffwechsel beruht, tritt in europäischen Populationen mit einer Häufigkeit von etwa 1 Homozygoten in 10.000 Individuen auf. Die Häufigkeit des PKU-Allels in Homozygoten ist mithin q PKU² = 2/20.000 Abb. 10.32 Verteilung von homo- und heterozygoten Individuen in einer Population. Als Beispiel ist die Häufigkeit der Allelfrequenz M (blau) und N (rot) aus Tabelle 10.11 für die Blutgruppenverteilung bei Deutschen gewählt. Ein großer Anteil der Allele befindet sich in Heterozygoten (dunkelblau und dunkelrot). Im Falle rezessiver und dominanter Allele sind die Heterozygoten im Phänotyp nicht direkt sichtbar, sodass die Population einheitlicher erscheint als sie ist

oder q PKU =

10-4

Die Allelfrequenzen sind also q PKU = 0,01 und p = 0,99 Die Häufigkeit des PKU-Allels in Heterozygoten ist damit 2 × 0,01 × 0,99 = 0,0198. Das veranschaulicht uns die Bedeutung der in Abb. 10.33 dargestellten Allelverteilung. Bei einer geringen Allelfrequenz befindet sich der größere Anteil dieses Allels in Heterozygoten (in unserem Beispiel: 2 % Heterozygote gegenüber 0,01 % Homozygote!).

Bei geringer Allelfrequenz befindet sich der größere Anteil des Allels in Heterozygoten.

Abb. 10.33 Beziehungen der Häufigkeiten der verschiedenen Genotypen zueinander. Das Feld ist in Rasterflächen in Stufen von 20 % unterteilt. Jeweils senkrecht untereinanderliegende Kurvenpunkte gehören zusammen

uns die Population phänotypisch relativ gleichförmig, obwohl sie genotypisch aus Individuen dreier verschiedener Konstitutionen besteht (Abb. 10.32). Dieser Gesichtspunkt wird uns in Zusammenhang mit humangenetischen Aspekten der Populationsgenetik noch näher beschäftigen (S. 637). An dieser Stelle soll zur Verdeutlichung der Anwendungsweise der HardyWeinberg-Regel diesen Betrachtungen bereits etwas vorgegriffen und ein weiteres Beispiel aus der Humangenetik besprochen werden (S. 635).

In unseren bisher besprochenen Beispielen haben wir uns mit der Frequenzverteilung unterschiedlicher Allele autosomaler Gene befasst, d. h. von Genen, die stets mit zwei Allelen im Genom vertreten sind. Die quantitativen Verhältnisse ändern sich jedoch, wenn wir die Allelverteilung geschlechtsgekoppelter Gene betrachten. Es ist offensichtlich, dass in einem solchen Fall die genetische Konstitution des Individuums des hemizygoten Geschlechts stets direkt im Phänotyp zum Ausdruck kommt. Das hat zur Folge, dass wir die Frequenzen beider Allele eines geschlechtsgekoppelten Gens direkt aus den relativen Häufigkeiten beider Allele im hemizygoten Geschlecht ablesen können (Abb. 10.34). Ein Beispiel für ein Merkmal des Menschen, das X-chromosomal vererbt wird, ist die Rot-Grün-Farbenblindheit. Die Häufigkeit des Allels für Protanopie (Rotblindheit) bei europäischen Männern beträgt 2 %, die des Allels für Deuteranopie (Grünblindheit) 6 %. Demgemäß sind die Häufigkeiten homozygoter Ausprägung von Protan-

10.5 Populationsgenetik

aufweisen, gilt im Gleichgewicht zunächst die HardyWeinberg-Formel analog: p+q+r=1 Die genotypischen Gleichgewichtshäufigkeiten werden durch die trinomische Entwicklung (p + q + r)2 bestimmt. Die Werte für die Genotypen sind dann:

Abb. 10.34 Häufigkeit von Allelen bei geschlechtsgekoppelter Vererbung im hemizygoten Geschlecht. Die Häufigkeiten der Phänotypen reflektieren hier direkt die Häufigkeit der Allele in der Population

opie bei Frauen 0,04 %, die von Deuteranopie 0,36 %. Diese Zahlen veranschaulichen uns die großen Unterschiede in der Gefährdung beider Geschlechter bezüglich der Ausprägung X-chromosomaler Erbkrankheiten.

Die Frequenz geschlechtsgekoppelter Allele lässt sich im hemizygoten Geschlecht direkt erkennen.

Die Betrachtung von zwei Allelen an einem Locus ist nur ein Beispiel. Für Gene, von denen es mehr als zwei Allele gibt (und das ist im Allgemeinen der Fall!), kann man verschiedene Ansätze wählen (nach Strickberger 1988): Wenn wir uns für die genotypischen Häufigkeiten interessieren, die nur durch eines der Allele (z. B. A) bestimmt werden, dann können wir die Häufigkeit von A1 als p bezeichnen und die Häufigkeiten aller anderen Allele an diesem Locus (A2, A3, ... An) zur Häufigkeit q zusammenfassen. Die Gleichgewichtshäufigkeit wird dann wie für zwei Allele berechnet: p2(A1A1) + 2p(A1)q(A2...An) + q2(A2...An) = 1 Das letzte Glied besteht aus zahlreichen Heterozygoten. Da uns aber nur die Genotypen von A1 im Verhältnis zu allen anderen interessieren, ist die genaue Zusammensetzung dieses Gliedes für unsere Betrachtung nicht wichtig. Wenn es unser Ziel ist, Gleichgewichtswerte für die Genotypen von drei oder mehr Allelen zu finden, müssen wir jede Allelhäufigkeit als ein Element in einer polynomischen Entwicklung betrachten. Wenn es beispielsweise nur drei mögliche Allele (A1, A2, A3) eines Gens gibt, die die jeweiligen Häufigkeiten p, q und r

p2(A1A1) + 2pq(A1A2) + 2pr(A1A3) + q2(A2A2) + 2qr(A2A3) + r2(A3A3) = 1 Dass das Gleichgewicht in einer Generation erreicht wird, gilt so lange, wie wir unsere Betrachtung auf ein einziges Gen beschränken, ohne uns darum zu kümmern, was bei anderen Genen geschieht. Ein Beispiel ist in Tabelle 10.12 dargestellt: Dabei wird an der Schnecke Cepaea nemoralis die Häufigkeit der Farbe der Gehäusebänderung untersucht. Daran sind drei Allele eines Gens beteiligt (Dominanzreihe: B > b’ > b). Wenn wir jedoch die Produkte von zwei unabhängig aufspaltenden Genpaaren gleichzeitig betrachten (z. B. Aa und Bb), dann steigt die Zahl möglicher Genotypen auf 32 (d. h. AABB, AABb, AaBB, AaBb usw.). Es nehmen nun noch mehr Glieder an der polynomischen Entwicklung teil: Wenn wir die Genhäufigkeiten von A, a, B und b mit p, q, r und s bezeichnen, dann werden die Gleichgewichtsverhältnisse ausgedrückt als (pr + ps + qr + qs)2 = 1 oder p2r2(AABB) + 2p2rs (AABb) + 2p2s2 (AAbb) + 2pqr2 (AaBB) + .... + q2s2 (aabb) = 1 Wir können nun kurz überlegen, wie lange es wohl dauert, bis in einer Population diese Gleichgewichtsbedingung erfüllt ist. Wenn wir nur von den Heterozygoten ausgehen (AaBb × AaBb), bei denen die Häufigkeit aller Gene gleich sind (z. B. p = q = r = s = 0,5), dann werden alle vier Gametentypen (AB, Ab, aB und ab) sofort mit den Gleichgewichtshäufigkeiten (0,25) gebildet und das genotypische Gleichgewicht wird in einer Generation erreicht. Dies ist aber die einzige Situation, in der das Gleichgewicht so schnell erreicht wird. Wenn wir uns die andere Extremsituation vorstellen, nämlich eine Population, die mit den beiden homozygoten Genotypen beginnt (AABB × aabb), dann werden nur zwei Gametentypen (AB und ab) gebildet und das Gleichgewicht kann in der F1-Generation noch nicht erreicht werden, da noch zahlreiche Genotypen fehlen (z. B. AAbb, aaBB usw.). Erst über die doppelt Heterozygoten (AaBb) können Gameten des Typs ab

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Kapitel 10: Formalgenetik

Tabelle 10.12 Häufigkeit dreier Phänotypen in einer natürlichen Population der Schnecke Cepaea nemoralis Phänotypen

Genotypen

Erwartungswerte bei Panmixie

Farbe

Anzahl

Anteil

braun

88

0,413

BB, Bb’, Bb

p2 + 2pq + 2pr

rosa

83

0,390

b’b’, b’b

q2 + 2qr

gelb

42

0,197

bb

r2

Summe

213

1,0

1,0

In der Population sind drei multiple Allele vorhanden (B, b’ und b); die zugehörigen Allelfrequenzen sind p, q und r. Auswertung: 1. Schritt: r = √r2 = √0,197 = 0,444 q2 + 2qr + r2 = (q + r)2 = 0,587 2. Schritt: rosa + gelb: (Wurzel ziehen) q + r = 0,766 (Ergebnis für r einsetzen) q + 0,444 = 0,766 → q = 0,322 3. Schritt: Gleichgewichtsansatz: p+q+r=1→q+r=1−p Einsetzen und Auflösen nach p → p = 0,234 Nach Cain et al. (1960)

und AB gebildet werden. Bei völliger Unabhängigkeit der Gene erfolgt diese Umkombination mit der Wahrscheinlichkeit von 0,5; sie ist aber seltener, wenn die beiden Gene gekoppelt sind. Die Annäherung an das Gleichgewicht ist in diesem Fall von der Rekombinationsfrequenz abhängig und ist umso langsamer, je geringer die Rekombinationshäufigkeit (d. h. je enger die Kopplung) ist. Im Gegensatz zu diesen theoretischen Überlegungen erreichen nicht alle Gameten mit gekoppelten Genen in natürlichen Populationen die Gleichgewichtshäufigkeiten. Eine mögliche Erklärung ist, dass gewisse Kombinationen gekoppelter Allele vorteilhafter sind. Dieses Phänomen wird als Kopplungsungleichgewicht bezeichnet und spielt bei der Kartierung in der Humangenetik eine wichtige Rolle.

10.5.2 Genetische Zufallsveränderungen (random drift) Die Kriterien für die Gültigkeit der HardyWeinberg-Regel schließen einen Parameter ein, den wir uns im Folgenden näher betrachten wollen: Die Hardy-Weinberg-Regel ist streng genommen nur für Populationen unendlicher Größe gültig. Natürlich gibt es derartige Populationen gar nicht. Im Allgemeinen kann man davon ausgehen, dass Individuenzahlen über 1000 einer solchen Forderung nach unendlicher Größe weitgehend genügen können. Immerhin sollte dabei nicht übersehen werden, dass solche Individuenanzahlen in vielen Populationen gar nicht vorhanden sind. Vielmehr sind lokale Populatio-

nen häufig durch viel geringere Individuenzahlen gekennzeichnet, insbesondere, wenn ihre Areale sehr eng begrenzt sind. Bei vielen größeren Tieren sind hohe Individuenzahlen eher die Ausnahme. Oft hat man es gerade bei großen Tieren mit extrem kleinen Populationen zu tun, da einzelne Individuen häufig große Gebiete beanspruchen. Ein eindringliches Beispiel dieser Art ist der große Panda (Airulopoda melanoleuca), bei dem jedes einzelne Individuum einen Lebensraum von 2 bis 4 km2 beansprucht. In solchen Fällen ist die Anwendung der Hardy-Weinberg-Regel wegen der geringen Individuenanzahlen nicht mehr zulässig. Welche Folgen hat eine geringe Populationsgröße auf die Allelverteilung? Betrachten wir die Abb. 10.31, so ist nicht ersichtlich, warum die Hardy-Weinberg-Regel nicht auch für solche kleinen Populationen gelten sollte. Ein wichtiger Grund für die Ungültigkeit dieser Regel liegt jedoch darin, dass in allen Populationen zufällige Fluktuationen in der Allelverteilung vorkommen. Solche Fluktuationen verlaufen in kleinen Populationen besonders auffallend, und sie können bei kleinen Individuenzahlen leicht zum Verschwinden eines Allels aus der Population führen. Die Ursache lässt sich leicht veranschaulichen, wenn wir uns vorstellen, dass wir eine Münze werfen und nach der Häufigkeitsverteilung von „Zahl“ oder „Bild“ sehen. Wirft man die Münzen sehr häufig, etwa 10.000-mal, so würde man erwarten, dass man im Mittel in 50 % der Fälle das Bild und in den übrigen 50 % die Zahl findet. Allerdings würde man dieses Mittel normalerweise nicht genau erzielen, sondern die

10.5 Populationsgenetik

Häufigkeiten würden sich nach Maßgabe einer GaußKurve um diesen Mittelwert verteilen. Letztlich wäre es, mit allerdings außerordentlich geringer Wahrscheinlichkeit, sogar möglich, dass alle Würfe dieselbe Seite der Münze zeigen. Werfen wir die Münze hingegen nur wenige Male, so ist die Wahrscheinlichkeit, dass wir stets nur die Zahl oder nur das Bild erhalten, wesentlich größer. Dieses Beispiel lässt sich auf die Gametenverteilung bei der Fortpflanzung anwenden. Bei einer großen Population ist die Wahrscheinlichkeit, dass zwei verschiedene Allele mit der ihrer Häufigkeit in der Population entsprechenden Frequenz zur Fortpflanzung beitragen, viel größer als in einer kleinen Population. In kleinen Populationen sind daher große Schwankungen in der Allelverteilung unter den Nachkommen zu erwarten. Die Konsequenzen von kleinen Populationsgrößen auf die Allelverteilung lassen sich in populationsgenetischen Experimenten veranschaulichen (Abb. 10.35). In solchen Experimenten macht man Gebrauch von Populationskäfigen, in denen bestimmte Anzahlen von Individuen mit anfangs genau festgelegter genetischer Konstitution, in unserem Beispiel Heterozygotie für das Gen brown (bw) von Drosophila, gehalten werden. Entnimmt man jeder neuen Generation eine kleine Anzahl von Individuen zur Ermittlung ihrer genetischen Konstitution, so kann man den Verlauf zufälliger Veränderungen in der Allel-

Abb. 10.35 Experiment zur Demonstration der Folgen von Zufallsveränderungen der Allelzusammenstellung bei kleinen Populationen bei Drosophila melanogaster. In Populationskäfigen werden in 19 aufeinanderfolgenden Generationen jeweils 16 Individuen nach zufälliger Auswahl weitergekreuzt. Die ursprüngliche Häufigkeit des Allels bw (brown) von 50 % nimmt ab und verschiebt sich mit gleicher Wahrscheinlichkeit zu den Extremen (Wildtyp bzw. homozygot bw). (Nach Buri 1956, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

zusammenstellung verfolgen. Das Experiment zeigt, dass nach anfänglicher Heterozygotie aller Tiere der Grad der Heterozygotie rasch abnimmt. Bereits nach relativ wenigen Generationen (im Bild in der 7. Generation) gibt es einzelne Populationen, in denen nur noch eines der ursprünglichen zwei Allele vorhanden ist. Die Anzahl solcher homozygoter Populationen nimmt sehr schnell zu. Hierbei werden beide möglichen homozygoten Konstitutionen mit gleicher Wahrscheinlichkeit erreicht. Würde der Verlauf der Veränderungen in unserem Beispiel über weitere Generationen verfolgt, so würden wir beobachten, dass schließlich alle Populationen für das eine oder das andere Allel homozygot sind. Man nennt diesen Vorgang Fixierung (engl. fixation) eines Allels. Verantwortlich hierfür ist allein die zufällige Veränderung der Allelzusammenstellung, die man insbesondere in kleinen Populationen leicht verfolgen kann. Der Prozess wird als genetische Zufallsdrift (engl. random drift) bezeichnet.

Zufällige Veränderungen (Zufallsdrift) in den Allelfrequenzen haben insbesondere in kleinen Populationen einen großen Einfluss. Zufallsdrift führt zu unvorhersehbaren Veränderungen im Genpool, die zur Fixierung des einen oder anderen Allels führen können.

Es muss nochmals betont werden, dass sich derartige genetische Zufallsdriftphänomene in allen Populationen ereignen. Wie schnell sie allerdings die Allelzusammensetzung in einer Population beeinflussen, hängt von der Größe der Population, also der Anzahl der Individuen ab. Die klassische Populationsgenetik hat dazu mit idealisierten Populationen gearbeitet („Wright-Fischer-Population“), die aus diploiden, hermaphroditischen Individuen bestehen und durch zufällige Paarung charakterisiert sind. Die Population reproduziert sich in diskreten Generationen, wobei jede Generation bei der Geburt gezählt wird. Die neuen Individuen entstehen aus den Gameten der Eltern, die unmittelbar nach der Reproduktion sterben. Damit hat jedes Elternteil eine gleichgroße Wahrscheinlichkeit, eine Keimzelle zu einem Individuum beizutragen, das überlebt und in der nächsten Generation erneut Nachkommen hervorbringt. Wenn diese idealisierte Population groß genug ist, ist die Zahl der Nachkommen von Individuen in einer Population normal verteilt (Abb. 10.8). Dieser idealisierten Population kommen übrigens hermaphroditische marine Organismen ziemlich nahe, die eine große Zahl von Eiern und Samen ablegen, aus denen sich dann zufällig neue Zygoten bilden. Das Ausmaß, mit dem genetische Drift einen Anstieg in der Unterscheidbarkeit bei neutralen Allelen (also ohne Selektion) zwischen isolierten Populationen oder

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Kapitel 10: Formalgenetik

die Variabilität innerhalb einer Population bewirkt, beträgt in diesem Modell 1/(2N), wobei N die Zahl der diploiden hermaphroditischen Individuen darstellt; der Faktor 2 kommt wegen der Diploidie hinzu. Es leuchtet allerdings unmittelbar ein, dass sich dieses idealisierte Modell nur mit starken Einschränkungen eignet, die Realität abzubilden. Die moderne Populationsgenetik hat deshalb den Begriff der effektiven Populationsgröße eingeführt; diese ist dabei von mehreren Faktoren abhängig. Sie kann reduziert werden, wenn: ï von zwei Geschlechtern eines nur in geringer Zahl von Individuen vorkommt; ï die Zahl der Nachkommen deutlicher schwankt als durch Zufall zu erwarten wäre; ï die Population altersmäßig stark strukturiert ist. Es gibt natürlich noch weitere Einflussfaktoren auf die effektive Populationsgröße, wie das Vorkommen von Inzucht oder der Erbgang (autosomal, X-gekoppelt, Y-gekoppelt oder über Organellen). Außerdem spielen regionale Verteilungen und Wanderungsbewegungen eine Rolle. Dabei ist insbesondere zu beachten, dass Wanderungsbewegungen in gewissem Umfang die effektive Populationsgröße erhöhen können (Kapitel 10.5.4). In besonderem Maße ist zu beachten, welche Auswirkung die Mutation auf die betroffenen Organismen hat – führt sie eher dazu, dass die Organismen mehr Nachkommen haben, oder führt sie umgekehrt dazu, dass die betroffenen Organismen krank sind und somit weniger Nachkommen haben werden? Diese Auswirkungen auf die Fitness spiegeln sich dann in den Auswirkungen der Selektion wider, was wir im nächsten Kapitel ausführlich besprechen werden. Wenn wir allerdings die Frage beantworten wollen, wie groß die Wahrscheinlichkeit ist, dass sich eine Mutation durchsetzt (fixiert wird), dürfen wir diesen Faktor aber nicht vergessen. Für die mathematische Darstellung hat man deshalb den Selektionskoeffizienten eingeführt, der die Auswirkungen der Mutation in Bezug auf die Fitness der Wildtypen angibt (bei diploiden Organismen wird er an homozygoten Mutanten gemessen). Den Zusammenhang zwischen der Wahrscheinlichkeit einer Fixierung der Mutation, der effektiven Populationsgröße und des Selektionskoeffizienten zeigt Abb. 10.36: je größer das Produkt aus effektiver Populationsgröße und Selektionskoeffizient ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass sich eine Mutation in der Population durchsetzt.

10.5.3 Natürliche Selektion Mit der genetischen Zufallsveränderung haben wir einen Mechanismus kennengelernt, der die genetische

Zusammenstellung von Populationen verändert. Hinsichtlich der von Darwin (1859) erkannten Evolutionsprozesse erscheint aber dieser Prozess in seiner rein zufallsorientierten Wirkung wenig geeignet, die Entwicklung von Organismen in Richtung auf eine zunehmende Komplexität zu unterstützen, wie sie im Verlauf der Evolution entstanden ist. Das kann nur heißen, dass andere, wirksamere Evolutionsmechanismen die Weiterentwicklung des genetischen Materials beeinflussen müssen. Von Darwin selbst wurde hierfür der Prozess der natürlichen Selektion als wesentliches Hilfsmittel der Evolution erkannt. Da über die Begriffe der Evolution und der natürlichen Selektion oft Missverständnisse herrschen, ist es wichtig, die Vorstellung der Evolution der Organismen durch Abstammung voneinander, also

Abb. 10.36 Die Wahrscheinlichkeit der Fixierung einer Mutation. In einer begrenzten Population können auch schädliche Mutationen durch genetische Drift fixiert werden und günstige Mutationen können verloren gehen, wie das Ergebnis von Modellrechnungen zeigt. λ ist die Wahrscheinlichkeit, mit der eine semidominante Mutation in einer Population fixiert wird. Sie steigt mit zunehmendem Produkt aus effektiver Populationsgröße (Ne) und Selektionskoeffizient s. Der Vorzeichenwechsel deutet den Übergang von einer schädlichen (negativer s) zu einer günstigen Mutation an (positiver s). (Nach Charlesworth 2009, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

10.5 Populationsgenetik

nach der Deszendenztheorie, und die Vorstellungen über die dabei wirksamen evolutionären Mechanismen auseinanderzuhalten.

Natürliche Selektion ist ein wichtiger Evolutionsmechanismus.

Im Gegensatz zur allgemeinen Akzeptanz der Deszendenztheorie durch die Biologen herrschen über die dafür verantwortlichen Mechanismen und ihre relative Bedeutung für die Evolution durchaus unterschiedliche Auffassungen. In der Geschichte des 20. Jahrhunderts hat die Selektionstheorie Darwins als Erklärung für evolutionäre Prozesse vielerlei Kontroversen ausgelöst. Dennoch kann es keine Zweifel darüber geben, dass natürliche Selektion einen der wesentlichen Evolutionsmechanismen darstellt. Selektion wird als Hilfsmittel für die Erzeugung aus der Sicht des Menschen besonders vorteilhafter Individuen (Kulturpflanzen oder Haustiere) verwendet. Unsere wichtigsten Nahrungspflanzen sind auf diese Weise ebenso entstanden, wie etwa die vielerlei Rassen von Hunden, denen wir täglich begegnen können und deren nahe genetische Verwandtschaft nicht immer direkt einsichtig ist. Gerade dieses Beispiel vermittelt uns einen guten Eindruck von den Möglichkeiten, Organismen durch Selektion auf bestimmte Eigentümlichkeiten gezielt zu verändern. Wir wollen nun die Erfolge von Züchtungsprozessen anhand einiger quantitativer Beispiele noch etwas genauer darstellen. In Tabelle 10.13 sind die Ergebnisse von gezielten Züchtungsversuchen an Tieren und Pflanzen dargestellt, die den Ertrag an bestimmten Produkten, die aus den betreffenden Organismen gewonnen werden, steigern sollen. Die in dieser Tabelle zusammengestellten Daten lassen deutlich erkennen, dass die Eigenschaften der Versuchsorganismen unter selektivem Druck in die gewünschte Richtung verändert werden können. Es ist hierbei wichtig herauszustellen, dass diese Selektionseffekte nicht auf der Selektion einzelner Gene aufgrund ihrer besonderen Wirkungen beruhen, sondern dass sie den Genotyp aufgrund meist komplexer genetischer Interaktionen in eine bestimmte Richtung treiben. Die Art der in unserem Beispiel vorgenommen Selektion lässt sich auch grafisch veranschaulichen (Abb. 10.37). Gehen wir von einer Verteilung einer bestimmten Eigenschaft eines Organismus, im Beispiel also der Hitzetoleranz, innerhalb einer Population aus, so ist natürlich nicht zu erwarten, dass alle Individuen dieser Population eine genau identische Hitzetoleranz aufweisen, sondern es herrscht eine gewisse Variabilität. Diese

Tabelle 10.13 Züchtungserfolge an Hühnern und Mais a Erhöhung der Eierproduktion bei Hühnern der Rasse White Leghorn flock unter Selektionsdruck Jahr

Zahl Eier/Jahr

1933

125,6

1965

249,6

Nach Lerner (1958, 1968) b Öl- und Proteingehalt von Mais als Selektionskriterien Generation

Ölgehalt (%)

Proteingehalt (%)

Selektion auf hohen Öl- bzw. Proteingehalt: 1

4,7

10,9

50

15,4

19,4

Selektion auf niedrigen Öl- bzw. Proteingehalt: 1

4,7

10,9

50

1,0

4,9

Nach Woodworth et al. (1952)

lässt sich gewöhnlich in einer Verteilungskurve darstellen, die der einer Gauß-Verteilung gleicht. Der Prozess der Selektion lässt sich nun dadurch veranschaulichen, dass sich aus dieser Verteilung bevorzugt (oder ausschließlich) die Individuen fortpflanzen (bzw. weitergezüchtet werden), deren Eigenschaften besonders ausgeprägt in der gewünschten Richtung liegen. Man hat also eine gerichtete Selektion vorliegen. Die Folge solcher gerichteter Selektion ist eine allmähliche Weiterentwicklung. Wenn sich dabei der Mittelwert des Merkmals verschiebt, kann dies auch zu einer Verringerung der genetischen Variabilität führen; wir sprechen dann von einer stabilisierenden Selektion. Diese Selektion resultiert in einer Verringerung der Breite phänotypischer Unterschiede, also in einer Vereinheitlichung des Phänotyps. Das Ausmaß der Verringerung der genetischen Variabilität ist natürlich abhängig von der Neumutationsrate in der Population; in Abb. 10.37 ist eine Verringerung der genetischen Variabilität nicht berücksichtigt. Die Tatsache, dass Selektion in der Tier- und Pflanzenzüchtung erfolgreich angewandt werden kann, beweist natürlich noch nicht, dass Selektion auch in der Natur eine wesentliche Rolle spielt. Beweise hierfür haben jedoch populationsgene-

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Kapitel 10: Formalgenetik

Abb. 10.37 a, b Hypothetisches Beispiel der Wirkung einer positiven gerichteten Selektion auf den Mittelwert eines bestimmten Merkmals. Dabei werden Individuen bevorzugt, die für eine bestimmte Eigenschaft einen höheren Wert haben. a Die Erwartung für die Wirkung einer positiven gerichteten Selektion auf die Verteilung eines bestimmten Merkmals (z. B. Hitzetoleranz). In der ersten Generation tötet ein selektives Ereignis (z. B. Hitze über mehrere Tage) die Mehrzahl der Individuen einer Population (G1) vor der Paarungsfähigkeit. Die Überlebenden (S1) verpaaren sich, und der Mittelwert der Hitzetoleranz der Nachkommen (G2) ist etwas größer als der ihrer Eltern. Der Unterschied im Mittelwert der Populationen zwischen G1 und G2 deutet an, dass eine Evolution stattgefunden hat. Dieser Prozess wiederholt sich für mehrere Generationen, sodass sich in der 5. Generation (G5) der Mittelwert des Merkmals deutlich von dem der ersten Generation (G1) unterscheidet. b Eine Hypothese zur korrelierten Evolution der Plastizität der Hitzetoleranz oder eines zweitrangigen Merkmals, das die Hitzetoleranz verstärkt (z. B. die Expression von Hitzeschock-Proteinen). In der Originalpopulation führt die

Exposition gegenüber Hitze für ein paar Stunden oder Tage zum Anstieg der Hitzetoleranz in einigen Individuen, was zu einer guten Anpassung führen würde, wenn die Hitze anhält. Allerdings zeigt eine gleich große Anzahl von anderen Individuen eine Abnahme der Hitzetoleranz, was offensichtlich zu einer schlechten Anpassung führen würde, wenn die hohe Temperatur anhält. Für die Population als Ganzes ist die durchschnittliche plastische Antwort Null. Wenn sich allerdings nach einem solchen selektiven Ereignis die Überlebenden (S1) verpaaren und eine neue Generation (G2) entsteht, tendiert die plastische Antwort dieser neuen Generation zu einem Anstieg der Hitzetoleranz. So kann natürliche Selektion einen evolutionären Anstieg sowohl in Bezug auf die „angeborene“ (oder „konstitutive“ bzw. „intrinsische“) Hitzetoleranz (a) bewirken als auch eine Verschiebung in der durchschnittlichen Plastizität von Individuen (b), sodass sie – im Durchschnitt – toleranter gegenüber Hitze werden, wenn sie erhöhten Temperaturen ausgesetzt sind (adaptive Plastizität). (Nach Garland u. Kelly 2006, mit freundlicher Genehmigung der Company of Biologists)

tische Beobachtungen geliefert. Das wohl bekannteste Beispiel dieser Art sind Populationsstudien mit dem Birkenspanner Biston betularia, die in den 1950erJahren in Großbritannien durchgeführt wurden. Der Birkenspanner kommt in der Natur in zwei Formen,

einer schwarz-weißen Form (bezeichnet als „typica“) und einer dunklen Form (bezeichnet als „carbonaria“) vor (Abb. 10.38a). Die dunkle carbonaria-Form wurde in dieser Zeit überwiegend in den Industriegebieten Großbritanniens gefunden, während die gefleckte, hel-

10.5 Populationsgenetik

lere Form in den Wäldern ländlicher Regionen vorkam (Abb. 10.38b). Der Verdacht, dass die Verbreitung der dunkleren Variante von B. betularia eine Folge der Industrialisierung war, begründete sich darauf, dass in älteren Sammlungen ausschließlich die hellere, gefleckte Variante vorkommt, die den Farbschutzanforderungen ihres ursprünglichen Lebensraumes (Name!), der durch den Flechtenbewuchs der Birken gekenn-

zeichnet ist, viel mehr entspricht. Die eigentlich helle Rinde der Birke war dort durch den Rauch aus den Industrieschloten (Ruß) dunkler gefärbt, und die empfindlichen Flechten sind abgestorben, sodass die helle, gefleckte Form leichter zu entdecken war als eine gleichmäßig dunkle Form und damit einen Selektionsnachteil hatte (entsprechend hatte die dunkle Form einen Selektionsvorteil, da sie nicht so leicht entdeckt wurde). Diese Anpassung bezeichnet man als Industriemelanismus. Allerdings zeigen neuere Arbeiten, dass mit dem Verschwinden des Rußes aus den Industrieschloten aufgrund verstärkter Umweltschutzmaßnahmen bzw. aufgrund veränderter wirtschaftlicher Strukturen auch die dunkle Form des Birkenspanners wieder verschwindet (Saccheri et al. 2008).

Ein bekanntes Beispiel für natürliche Selektion ist der Industriemelanismus, d. h. eine Anpassung an durch Industrieverschmutzungen veränderte Umweltgegebenheiten.

Abb. 10.38 a, b Der Birkenspanner Biston betularia in Aussehen und Verteilung. a Biston betularia; links: Form typica, rechts: Form carbonaria. b Verteilung von Biston betularia in natürlichen Populationen in Großbritannien. Die dunklen Formen (carbonaria und insularia) herrschten in Industriegebieten vor, während die helle Form (typica) in eher ländlichen Gebieten überwogen. (a nach Hopkin 2004; b nach Kettlewell 1958, jeweils mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Es muss noch betont werden, dass nicht alle populationsspezifischen Unterschiede notwendigerweise auf Selektionsprozessen beruhen müssen. Beispielsweise sind die bereits mehrfach erörterten Blutgruppenunterschiede menschlicher Populationen (Tabelle 10.11) höchstwahrscheinlich auf natürlichen Zufallsdrift, nicht aber auf Selektion zurückzuführen. Menschliche Populationen haben sich im Allgemeinen aus sehr kleinen Gruppen von Individuen entwickelt, sodass unterschiedliche Allelfrequenzen in erster Linie als Folge von Gründereffekten (S. 515) anzusehen sind, wenn nicht direkte Hinweise auf Selektionsprozesse bestehen. Wir haben gesehen, dass sich aufgrund von Selektionsmechanismen bestimmte Individuen einer Population besser fortpflanzen als andere Individuen derselben Population. Man kann diesen Unterschied in der Fortpflanzungsfähigkeit quantitativ erfassen, indem man die relativen Beiträge der verschiedenen Genotypen der Individuen zur Nachkommenschaft zueinander in Beziehung setzt. Man erhält dann ein relatives Maß für den Fortpflanzungserfolg der verschiedenen Genotypen innerhalb einer Population, das als Fitness (W) des betreffenden Genotyps bezeichnet wird. Individuen mit der relativ höchsten Fortpflanzungsrate erhalten dabei definitionsgemäß die Fitness W = 1 (also 100 %), während alle übrigen Genotypen eine dazu in Bezug gesetzte niedrigere Fitness besitzen. Hieraus wird deutlich, dass es sich bei der Fitness um einen Relativwert handelt, der nur innerhalb einer Population von Bedeutung ist. Die Fitness von Individuen in unterschiedlichen Populationen ist daher nicht vergleichbar.

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512

Kapitel 10: Formalgenetik

Fitness ist ein Maß für den relativen Fortpflanzungs-

erfolg eines bestimmten Genotyps in einer bestimmten Umwelt.

Es ist möglich, die relative Fitness auf ein einziges Allelpaar zu beziehen und einen Vergleich der verschiedenen möglichen Genotypen (also A/A, A/a und a/a) hinsichtlich ihrer Fitness durchzuführen. Im Allgemeinen wird man jedoch die Gesamtheit der Eigenschaften in Hinblick auf die Fortpflanzungsfähigkeit vergleichen, da Fortpflanzungsfähigkeit durch eine Vielzahl komplexer Parameter bestimmt wird. So kommt es nicht nur auf die Lebensfähigkeit und physische Vitalität eines Individuums an, sondern auch auf die Fertilität, die niedrig sein oder sogar fehlen kann (in diesem Fall ist die Fitness W = 0), oder auf das Paarungsverhalten und andere individuelle Eigenschaften. Wir wollen im Folgenden dieses Konzept der Fitness an einem Beispiel darstellen, das wir bereits in anderen Zusammenhängen aus unterschiedlichen Gesichtspunkten betrachtet haben, dem der erblichen Krankheit Sichelzellenanämie (S. 485). Diese Krankheit nimmt in der Medizin insofern eine Sonderstellung ein, als sie trotz ihrer schwerwiegenden Folgen unter bestimmten Lebensumständen, zumindest für Heterozygote von Vorteil sein kann. Solche Heterozygoten sind in diesem Fall sogar besser fortpflanzungsfähig als homozygote Individuen, d. h. die genetische Konstitution HbS/HbA führt zu einer relativ höheren Fitness als beide homozygote Konstitutionen (also HbA/HbA und HbS/HbS). Man kennzeichnet eine solche Situation auch mit dem Begriff

Heterozygotenvorteil (oder Heterosis, S. 460). Wie lässt sich der Heterozygotenvorteil erklären? Zum Verständnis des Vorteils der Heterozygoten müssen wir zunächst untersuchen, an welche äußeren Bedingungen dieser Vorteil geknüpft ist. Bei der Betrachtung der Verbreitung von Sichelzellenanämie fällt auf, dass die Verbreitung eine recht gute Übereinstimmung mit Regionen aufweist, in denen Malaria herrscht (Abb. 10.39). Malaria ist eine Blutkrankheit, die durch Parasiten verursacht wird, die Erythrocyten als Nahrungsquelle gebrauchen und dadurch Anämie und andere Krankheitserscheinungen verursachen. Die Krankheit kann, je nach dem Erregertyp, tödlich verlaufen. Sie wird durch Mückenstiche (Gattung Anopheles) übertragen. Die Analyse der Übereinstimmung zwischen der Verbreitung von Malaria und einer erhöhten Frequenz von HbS-Allelen in der Population der betreffenden Gebiete hat gezeigt, dass Heterozygote für HbS eine erhöhte Resistenz gegen die Infektion aufweisen. Offenbar werden die Parasiten bevorzugt zusammen mit den Sichelzellen, die auch bei Heterozygoten auftreten, phagocytiert. Wenden wir auf dieses Beispiel die Hardy-WeinbergRegel an, so sehen wir in Tabelle 10.14, dass die Heterozygoten überrepräsentiert sind. Wir können hieraus die relative Fitness der verschiedenen Genotypen errechnen. Ein zur Fitness in Bezug stehender Parameter der Populationsgenetik ist der Selektionskoeffizient (s). Er ergibt sich aus der Fitness W nach der Gleichung s = 1 − W. Dieser Wert gibt mithin den selektiven Nachteil eines Genotyps an: Ist die Fitness W = 1, so ist s = 0, d. h. Abb. 10.39 Vergleich der Verbreitung von Sichelzellenhämoglobin (HbS) und Malaria (Plasmodium falciparum) in Afrika. Die teilweise Überlagerung beider Verbreitungsgebiete wurde zuerst von Haldane erkannt und in ihrer genetischen Grundlage interpretiert. (Nach Wellems u. Fairhurst 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

10.5 Populationsgenetik

Tabelle 10.14 Verteilung von HbA-, HbS-Allelen und Fitness-Werte der verschiedenen Genotypen Population

Genetische Konstitution (A und S) und Allelfrequenzen (p und q) Beobachtet

Errechnet

Erwartet nach Hardy-Weinberg

A/A

A/S

S/S

p(A)

q(S)

2pq(AS)

p2(SS)

Kinder

0,6585

0,3101

0,0314

0,8114

0,1886

0,3060

0,0356

Erwachsene

0,6116

0,3807

0,0076

0,7820

0,2180

0,3410

0,0475

Relative Fitnessa

0,9288

1,2277

0,2420

Fitness

0,7570

1

0,1971

Selektionskoeffizient

sAA = 0,2430

b

sSS = 0,8029

a

Die relative Fitness ergibt sich aus dem Verhältnis der Häufigkeit eines Genotyps bei Kindern und der Häufigkeit des betreffenden Genotyps bei Erwachsenen. Hierbei wird angenommen, dass bei Kindern eine Selektion noch nicht stattgefunden hat.

b

Die höchste Fitness ist definitionsgemäß 1. Die hervorgehobenen Daten in der Tabelle zeigen, dass bei Erwachsenen die relative Anzahl von S/S-Individuen stark abgenommen hat, während der Anteil von Heterozygoten (A/S) an der Gesamtpopulation der untersuchten Individuen (654 Erwachsene) deutlich gestiegen ist. Der selektive Nachteil der S/S-Individuen kommt in einer geringen Fitness bzw. einem hohen Selektionskoeffizienten zum Ausdruck. Individuen, die homozygot für A sind, haben hingegen eine relativ hohe Fitness und demgemäß einen niedrigen Selektionskoeffizienten. Daten nach Allison (1956)

der betreffende Genotyp hat in der betreffenden Population keinen selektiven Nachteil. Wir sehen an diesem Beispiel deutlich, dass Fitness eine relative Größe ist: Während heterozygote (HbS/ HbA) Individuen in malariaverseuchten Gebieten einen Fitnessvorteil gegenüber allen anderen Konstitutionen haben, ist ihre Fitness in anderen Regionen, die nicht durch Malariainfektionen belastet sind, deutlich niedriger als die der Homozygoten HbA/HbA-Individuen: Fitnesswerte aus verschiedenen Populationen sind nicht vergleichbar. Ein Vergleich der Fitness der verschiedenen HbGenotypen ist geeignet, uns den Begriff des Heterozygotenvorteils zu verdeutlichen. Hierzu können wir die Fitness einfach als ein Merkmal betrachten, auch wenn es polygen bedingt ist. Der „Phänotyp Fitness“ unterscheidet sich demnach für alle drei möglichen genetischen Konstitutionen, HbA/HbA, HbA/HbS und HbS/ HbS. Zugleich können wir die Situation dieser Genotypen hinsichtlich ihrer Fitness in malariagefährdeten Regionen der Erde und in malariafreien Gebieten vergleichen. Während in Malariagebieten die Heterozygoten die höchste Fitness besitzen, also einen Heterozygotenvorteil aufweisen oder überdominant sind, nehmen sie in Nichtmalariagebieten die für unvollständige Dominanz charakteristische Position ein: Die Fitness liegt zwischen der der beiden Homozygoten. Das würde zugleich bedeuten, dass eine Population, die aus einem malariagefährdeten Gebiet in eine nicht gefährdete

Region versetzt wird, einen Wechsel ihrer Allelzusammenstellung durch Selektion zugunsten des HbA-Allels durchlaufen muss. In der Tat hat man bei Gruppen amerikanischer Farbiger, die vor Jahrhunderten als Sklaven aus Afrika geholt wurden, festgestellt, dass sich die Häufigkeit des HbS-Allels der der übrigen amerikanischen Bevölkerungsgruppen weitgehend angeglichen hat.

Unter bestimmten Umweltbedingungen haben Heterozygote die höchste Fitness. Man spricht dann von Heterozygotenvorteil, Überdominanz oder Heterosis.

Der zuvor besprochene Vergleich wirft die Frage auf, ob es auch einen Heterozygotennachteil gibt. Tatsächlich findet man auch solche Situationen. Ein Beispiel ist die Inkompatibilität des Rhesusfaktors beim Menschen. Der Rhesus-Faktor ist ein Blutgruppenantigen, vergleichbar denen des AB0- oder MN-Blutgruppensystems (S. 473, 503). Erkannt wurde er durch K. Landsteiner und A. S. Wiener 1940. Seine wichtigste Bedeutung in der Humanmedizin lässt sich vereinfacht dadurch veranschaulichen, dass Rh−-Mütter nach der Geburt eines Rh+-Kindes Antikörper gegen den Rhesusfaktor entwickelt haben. Während einer weiteren Schwangerschaft mit einem Rh+-Kind kommt es zu Abwehrreaktionen und infolgedessen zu schweren Hämolyseerscheinungen, die oft noch vor der Geburt zum Tode des Kindes führen.

513

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Kapitel 10: Formalgenetik

Genetisch lässt sich diese Situation wie folgt erklären: Der Rhesusfaktor wird vom Rh−-Allel nicht gebildet. Das Rh+-Kind eines Rh+-Vaters induziert daher in einer homozygoten Rh−-Mutter die Immunabwehr, da sich der Rhesusfaktor aufgrund seiner heterozygoten Konstitution dem mütterlichen Immunsystem gegenüber als körperfremdes Antigen verhält. Wir haben es also hier mit einem bedingten Heterozygotennachteil zu tun. In vereinfachter Form wollen wir hier davon ausgehen, dass er durch ein Allelpaar D und d bestimmt wird, dessen rezessive Form (d) kein Antigen produziert. Man erhält dann die in Tabelle 10.15 dargestellten Möglichkeiten der genetischen Konstitutionen von Eltern und Kindern. Der Selektionskoeffizient von D/d-Kindern homozygot Rhesus-negativer Frauen ist relativ gering (kleiner als 0,05), sodass die Selektion gegen das d-Allel sehr langsam verläuft.

Heterozygote können unter bestimmten Bedingungen gegenüber den Homozygoten auch benachteiligt sein. Man spricht dann von Heterozygotennachteil.

Wir haben bisher im wesentlichen Aspekte einer negativen Selektion erörtert. Es gibt aber auch die Sichtweise, dass ein signifikanter Anteil der Variationen die Fähigkeit eines Organismus zum Überleben und zur Reproduktion verstärkt. Diese positive Selektion stört die Muster der genetischen Variation im Verhältnis zu dem, was unter einem üblichen neutralen Modell zu erwarten wäre. Anzeichen einer positiven Selektion sind beispielsweise eine Asymmetrie in der Verteilung der Allelhäufigkeiten, verminderte genetische Variationen und verstärkte Kopplungsungleichgewichte im Verhältnis zu den Erwartungen unter neutralen Bedingungen. Eine einfache Möglichkeit, positive Selektion zu erkennen, ist der dn/ds-Test: Dabei wird das Verhältnis nicht synonymer Substitutionen (dn) zu synonymen Substitutionen (ds) in Protein-codierenden Sequenzen verglichen (bei einer synonymen Substitution führt der Austausch einer Base zu keiner Änderung der Aminosäure; Kapitel 3.2). Das dn/ds-Verhältnis vermittelt Informationen über die evolutionären Kräfte, die auf ein bestimmtes Gen einwirken. Unter neutralen Bedingungen ist dn/ds = 1 und bei negativer Selektion ist das Verhältnis < 1. Ein dn/ds-Verhältnis > 1 gibt einen deutlichen Hinweis auf positive Selektion. Für detailliertere Darstellungen sei der interessierte Leser auf weiterführende Fachartikel hingewiesen (z. B. Biswas u. Akey 2006); positive Selektion spielt auch in der Evolution des Menschen eine besondere Rolle (Kapitel 14).

Tabelle 10.15 Genetische Konstitution des Rhesus-Faktors Konstitution des Vaters: D/D

D/d

d/d

D/D

D/D

D/d

Konstitution der Mutter: D/D

D/d D/d

D/D

D/D

D/d

D/d

D/d

d/d

d/d d/d

d/D

d/D

d/d

d/d Gefährdete Eltern/Kind-Konstitutionen sind hervorgehoben. Nach Vogel u. Motulsky (1996)

10.5.4 Migration und Isolation Bei der Definition des Begriffs einer Mendel-Population hatten wir als eines der Kriterien erwähnt, dass keine äußeren Einflüsse auf eine solche Population einwirken dürfen, um der Hardy-Weinberg-Regel Gültigkeit zu verleihen. Ein solcher unzulässiger Einfluss ist, wie wir bereits gesehen haben, die natürliche Selektion. Es gibt aber noch weitere Gründe, warum sich der Genpool einer Population verändern kann. Eines der einfachsten Ereignisse, das zu Genpoolveränderungen führen muss, ist der Zustrom von Individuen aus anderen Populationen mit einem anderen Genpool. Man kennzeichnet diese Art von Veränderungen einer Population mit dem Begriff Migration. Durch Migration kann es nicht nur zu Verschiebungen in den Allelfrequenzen in der Population kommen, sondern, wie auch bei Mutationen, zum Erwerb gänzlich neuer Allele. Der Zeitraum, der erforderlich ist, bis sich wesentliche Veränderungen im Genpool einer Population durch Zuwanderung von Individuen ergeben, ist von der Anzahl hinzugewanderter Individuen und von deren genetischer Konstitution abhängig. Relativ schnelle Veränderungen sind durchaus möglich, wenn eine regelmäßige Zuwanderung erfolgt. Anderenfalls sind neue Allele natürlich den gleichen Selektionsmechanismen aufgrund ihrer Fitness in der neuen Population unterworfen, die wir bereits besprochen haben. Strömen hingegen regelmäßig Individuen ein, so kann es, insbesondere bei kleinen Populationen, zu relativ schnellen Veränderungen des Genpools kommen.

10.5 Populationsgenetik

Migrationseffekte können im Übrigen nicht allein auf dem Zustrom von Individuen beruhen, sondern auch auf deren Auswanderung, denn einwandernde Individuen gehen naturgemäß einer anderen Population verloren. Solche Wanderungsbewegungen, die zwischen benachbarten Populationen eine erhebliche Rolle spielen können, führen zur Ausbildung von Gradienten in der Häufigkeit bestimmter Allele zwischen benachbarten Populationen. Ein aktuelles Beispiel hierfür ist die Verteilung des CCR5-Δ32-Allels des Gens, das für den ChemokinRezeptor CCR5 codiert. Chemokine und ihre Rezeptoren spielen eine zentrale Rolle bei der Immunabwehr. Der CCR5-Rezeptor wird von den meisten HIV-Stämmen benutzt, um in CD4+-T-Zellen und in Makrophagen einzudringen. Das CCR5-Δ32-Allel enthält eine 32-bp-Deletion, die zu einem vorzeitigen Stoppcodon führt und den Rezeptor ausschaltet. Dieses Allel hat in Europa eine durchschnittliche Häufigkeit von etwa 10 %; das bedeutet, dass etwa 1 % der Europäer für diese Mutation homozygot sind und damit weitgehend resistent gegen eine HIV-Infektion sind; Heterozygote haben im Vergleich mit Wildtypen eine erhöhte Resistenz gegenüber HIV. Die Mutation entstand vermutlich vor etwa 700 Jahren, und ihre weite Verbreitung deutet auf eine starke positive Selektion hin. Das CCR5-Δ32Allel kommt in nennenswerter Häufigkeit nur in Europa vor; innerhalb von Europa ist die Häufigkeit im Norden am höchsten und nimmt nach Süden hin ab (Abb. 10.40). Zwischen diesen Regionen großer und geringer Häufigkeit ist ein Gradient in der Allelfrequenz zu finden, der sicher eine Konsequenz von Migrationsprozessen der letzten 700 Jahre ist.

Migration, d. h. der Zustrom oder die Auswanderung

Abb. 10.40 a, b Häufigkeitsgradient in der Verteilung der CCR5-Δ32-Mutation in Europa. Die Deletionsmutation Δ32 im Gen des Chemokin-Rezeptors CCR5 verleiht eine Resistenz gegenüber einer HIV-Infektion. Die Allelfrequenz beträgt im Durchschnitt in Europa 10 %, was eine Häufigkeit für homozygote Träger von etwa 1 % ergibt. a Diese Mutation entstand wahrscheinlich vor etwa 700 Jahren in Skandinavien und hat sich von dort über Europa ausgebreitet. Die schwarzen Pfeile deuten entsprechende Wanderungsbewegungen der Wikinger an. Die Farbskala deutet die Allelfrequenz in einem mittleren Stadium der Wanderungsbewegung an. b Die heutigen Allelfrequenzen zeigen eine weite Verbreitung in Europa. Die Quadrate geben Regionen an, in denen die Allelfrequenzen experimentell bestimmt wurden; der Farbgradient dazwischen ist extrapoliert. N/S: Breitengrad; die Allelfrequenzen sind farbcodiert; 1 = 100 %. (Nach Galvani et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

von Individuen, kann zu Änderungen im Genpool einer Population führen.

Eine wichtige Frage ist, wie es überhaupt zur Entstehung völlig getrennter Populationen kommen kann, wie wir sie z. B. oben für die Entstehung der unterschiedlichen CCR5-Allele kennengelernt haben. Man vermutet, dass hierfür vornehmlich Gründereffekte (engl. founder effects) durch geographische Isolation von Organismengruppen eine Bedeutung haben. Solche Gründereffekte führen praktisch stets zur Entstehung neuer Populationen mit einem charakteristischen eigenen Genpool. Das ist einfach zu verstehen, da ja eine geringe Anzahl von Individuen, die gewöhnlich den Anstoß zur Entstehung einer solchen neuen Population geben, genetisch kaum jemals repräsentativ für den Genpool ihrer Ursprungspopulation sein dürften. Zudem spielt in solchen neuen, zunächst meist sehr kleinen Populationen die Zufallsveränderung des Gen-

pools (Zufallsdrift oder random drift) eine erhebliche Rolle. Daher kann es auch nach der Gründung einer neuen Population in einer geographischen Isolation noch zu erheblichen Verschiebungen im Genpool kommen.

Durch die Isolation einiger Individuen einer Population kann es zur Neugründung von Populationen mit verändertem Genpool kommen. Man bezeichnet die genetischen Konsequenzen der durch Isolation neu entstandenen Populationen als Gründereffekte.

Der Neugründung von geographisch isolierten Populationen sehr ähnlich sind übrigens Situationen, in denen lokale Populationen plötzlich zusammenbrechen und danach aus wenigen Individuen neu aufgebaut werden.

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Kapitel 10: Formalgenetik

Solche zeitlichen Einschränkungen in der Individuenzahl einer Population, wie sie z. B. bei Kleinsäugern (z. B. Mäusen) häufig auftreten können, bezeichnet man in ihrer Auswirkung auf die Populationsstruktur auch als Flaschenhalseffekt. Ein Flaschenhalseffekt kann durch die starke Auswirkung von Zufallsdrift, Mutation und der nicht repräsentativen Auswahl weniger überlebender Individuen kurzfristig zu drastischen Veränderungen in der Zusammensetzung des Genpools einzelner Populationen führen. Viele populationsgenetische Hinweise sprechen dafür, dass die Entwicklung des Menschen auf der Erde sehr stark durch Gründereffekte bestimmt worden ist. Der Art Homo sapiens werden drei ethnische Gruppen zugeordnet, die Afrikanische, die Kaukasische und die Orientalische. Obwohl sich die genetischen Eigenheiten dieser ethnischen Gruppen noch unterscheiden lassen, sind sie heute über alle Kontinente verteilt und unterliegen in zunehmendem Maße der Vermischung. Genetische Studien haben gezeigt, dass der Grundbestand an Genen und Allelen in allen ethnischen Gruppen praktisch identisch ist, dass aber die Allelfrequenzen zwischen den ethnischen Gruppen deutliche Unterschiede zeigen. Das lässt sich aus der getrennten Evolution der ethnischen Gruppen verstehen. Ursprünglich bestanden nur kleine menschliche Populationen, deren Individuenzahl durch die natürlichen Lebensbedingungen beschränkt wurde. Hierdurch konnten sich sehr unterschiedliche Genpools entwickeln, wie sie sich noch heute in der Allelfrequenz mancher menschlicher Populationen reflektieren. Wir haben beispielsweise gesehen, dass Eskimos in ihren MN-Blutgruppenallelen eine von anderen Populationen stark abweichende Allelfrequenz zeigen (Tabelle 10.11), obwohl sie eigentlich den Orientalen zuzuordnen sind, also in der MN-Allelfrequenz den asiatischen Populationen vergleichbar sein sollten. Die ursprünglichen Eskimopopulationen sind jedoch als kleine Gruppen von Asien nach Nordamerika eingewandert und zeigen somit alle Kennzeichen einer durch einen Gründereffekt entstandenen Population. Die quantitativen Folgen eines Gründereffektes lassen sich an einem Beispiel vor Augen führen, an welchem man die Ausbreitung einer dominanten Form der Porphyrie (Porphyria variegata) in Afrika untersuchen konnte. Diese Stoffwechselkrankheit ist neben anderen Symptomen durch eine bestimmte Art der Hautentzündung, die besonders an Fleckungen der Hände sichtbar wird (Abb. 10.41), gekennzeichnet. Sie erhielt nach dem Namen der zuerst untersuchten Familie die Bezeichnung „van Rooyen-Hände“ (Stine u. Smith 1990). Ihren Ausgang nahm diese Krankheit von dem Ehepaar Ariaantje und

Abb. 10.41 Hände einer typischen Patientin mit Porphyria variegata. Die Abbildung zeigt verschiedene Formen dieser Hauterkrankung von lichtempfindlichen Verletzungen bis zu pigmentierten Narben. (Nach Meissner et al. 1996, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Gerrit Janz in Kapstadt. Das Ehepaar ließ sich 1688 zur Zeit der holländischen Kolonisierung Südafrikas durch die Niederländische Ostasien-Kompanie in Kapstadt auf neu erworbenem Farmland nieder. Die Frau war ein Waisenkind, das man mit sieben anderen Waisenmädchen aus Holland nach Südafrika gesandt hatte, um den Frauenmangel im neu besiedelten Gebiet zu beheben. Das Ehepaar Janz hatte nach 300 Jahren etwa 8000 lebende Nachkommen, die durch das Merkmal der „van Rooyen-Hände“ leicht identifizierbar waren. Die Möglichkeit zur Ausbreitung in unbesiedeltem Land bei im Übrigen günstigen Lebensbedingungen gestattete also die Entstehung einer so großen neuen Population mit spezifischen genetischen Eigenschaften; der geschätzte Selektionskoeffizient liegt zwischen 0,02 und 0,07. Die ursächliche Mutation ist ein Arg→Trp-Austausch im Codon 59 (R59W) des Gens, das für die Protoporphyrinogen-Oxidase codiert (Gensymbol: PPOX); die Mutation führt zu einem Verlust der enzymatischen Aktivität aufgrund der verminderten Bindung des essenziellen Cofaktors Flavin-AdeninDinukleotid (FAD).

Bei der Evolution des Menschen haben Gründereffekte eine große Rolle gespielt.

Wie wir schon früher in diesem Kapitel gesehen haben, ist die Entwicklung von aussagekräftigen genetischen Markern ein entscheidendes Mittel, um genetische Informationen präziser zu interpretieren. Das galt für

10.5 Populationsgenetik

Abb. 10.42 a, b Haplotyp-Struktur in verschiedenen menschlichen Populationen am Beispiel des CYP7A1-Gens. a Kopplungsungleichgewicht der SNP-Marker (identifizierbar über die jeweiligen rs-Nummern) im CYP7A1-Gen in den HapMap-Populationen der Kaukasier (CEU), der Afrikaner (YRI), der Japaner (JPT) und der Chinesen (CHB). Ein Farbschema zeigt das Kopplungsungleichgewicht: Dunkelrot deutet ein starkes Kopplungsungleichgewicht an, wohingegen die weiße Farbe ein Gleichgewicht andeutet („kein Kopplungsungleichgewicht“). Die hellroten und hellblauen Farben symbolisieren ein schwa-

ches Kopplungsungleichgewicht. b (nächste Seite) In jedem Haplotypen repräsentieren die blauen Balken das Allel 1 und die roten Balken das Allel 2; schwarze Balken deuten an, dass das entsprechende Allel in der Population nicht vorhanden ist. Die Zahlen neben den Haplotypen sind die entsprechenden Haplotyp-Häufigkeiten. Die roten Dreiecke symbolisieren die entsprechenden SNPs. In den Regionen, in denen Rekombination stattfindet, ist die Rekombinationshäufigkeit zwischen den beiden Blöcken angegeben. (Nach Nakamoto et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung des Autors)

den Technologiesprung bei der Entdeckung der Mikrosatelliten-Marker (S. 497), und das gilt in gleicher Weise für die Entdeckung der Einzelnukleotid-Polymorphismen (engl. single nucleotide polymorphisms,

SNPs). Diese SNPs erlauben die Untersuchung von genetischen Unterschieden innerhalb einer Spezies ‒ im menschlichen Genom kennen wir über eine Million solcher SNPs. Sie kommen sowohl in codierenden

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Kapitel 10: Formalgenetik

Regionen als auch in nicht-codierenden Bereichen vor und können somit funktionelle Auswirkungen haben (Aminosäure-Austausche, Spleißen, Genregulation) oder einfach „nur“ als neutrale Mutationen vorkommen. Besonders aussagekräftig wird eine SNP-Analyse aber vor allem dann, wenn nicht nur ein SNP betrachtet wird, sondern Haplotypen (Abb. 10.28 und 12.4). Auf diese Weise lassen sich Wanderungsbewegungen in Populationen beobachten und komplexe Eigenschaften mit bestimmten chromosomalen Regionen besonders leicht assoziieren. Ein besonders ehrgeiziges Projekt ist die Erstellung einer Haplotyp-Karte (engl. haplotype map) des menschlichen Genoms durch das Internationale HapMap-Konsortium (2005). Dazu wurden in 269 DNA-Proben von vier Populationen über eine Million SNPs untersucht (http://www.hapmap.org/). Einen Eindruck von den Möglichkeiten vermittelt Abb. 10.42: Hier werden SNPs im Bereich des CYP7A1-Gens verglichen, das für die Cholesterin-7αHydroxylase codiert; dieses Enzym kontrolliert den

geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Umwandlung von Cholesterin in Gallensäuren. Dementsprechend werden Mutationen in diesem Gen mit verschiedenen Erkrankungen in Verbindung gebracht, wie z. B. Hypercholesterinämie, Arteriosklerose und Gallensteinen. Die Analyse zeigt zunächst, dass sich die vier untersuchten Populationen hinsichtlich der identifizierbaren Haplotypen unterscheiden; für die kaukasische und afrikanische Population lässt sich eine identische Rekombinationsstelle identifizieren (die Rekombinationsfrequenz ist dabei auch ähnlich und liegt bei etwas über 80 %). Von besonderem Interesse für die Klinik ist ein SNP im Promotor, der für die unterschiedliche Expression von CYP7A1 diskutiert wird.

10.5.5 Genetische Aspekte der Artbildung Wir haben gesehen, wie es durch Verschiebungen des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts aufgrund unterschiedlicher Mechanismen (genetische Drift, Selektion, Migration) zum Aufbau neuer Populationen kommen

10.5 Populationsgenetik

kann. Eine fundamentale Frage ist allerdings, ob diese Mechanismen auch geeignet sind, weitergehende evolutionäre Prozesse zu erklären. Die Bildung neuer Arten ist eine dieser fundamentalen Fragen. Dabei wird bei Organismen, die sich sexuell fortpflanzen, Artbildung so verstanden, dass durch die Evolution die Variationen innerhalb einer Population so in taxonomische Unterschiede überführt werden, dass inhärente Schranken gegenüber einem Genfluss errichtet werden. Damit können sich schließlich Mitglieder nur noch innerhalb, aber nicht mehr zwischen Populationen fortpflanzen. Man unterscheidet in der Evolutionsbiologie allgemein zwischen allopatrischer Artbildung (d. h. Populationen entwickeln sich in geographischer Isolierung), parapatrischer Artbildung (d. h. Populationen grenzen aneinander) und sympatrischer Artbildung (d. h. Populationen überlappen sich). Als Isolationsmechanismen kommen z. B. in Betracht: ï Inkompatibilität von Gameten, auch durch Neumutationen, ï abnormale Chromosomenverteilung in Gameten (meiotic drive), ï sexuelle Isolation, die auf Unterschieden im Paarungsverhalten beruht, ï die Besetzung unterschiedlicher ökologischer Nischen oder Isolation durch Rhythmusverschiebungen sexueller Vorgänge (Blütezeit, Paarungsfähigkeit). Darwin selbst hatte nur vage Vorstellungen davon, welche Mechanismen bei der Artbildung wirksam sind – etwa ein Kontinuum, ausgehend von adaptiven Unterschieden innerhalb der Arten. Der russische Genetiker Theodosius Dobzhansky und der deutsche Systematiker Ernst Mayr entwickelten Mitte des 20. Jahrhunderts drei konzeptionelle Anstöße: ï Dobzhansky und Mayr stellten Listen von Merkmalen auf, die einen Genfluss zwischen Arten verhindern, wie z. B. unterschiedliche Lebensräume und Sterilität von Hybriden („Barrieren“). Sie beobachteten dabei, dass einige dieser Barrieren die Nachkommen von Hybriden verhindern, andere den Erfolg und die Weiterverbreitung von Hybriden verhindern, wenn sie gebildet werden. ï Arten können im Hinblick auf diese Merkmale definiert werden. Dadurch werden auch Ansatzpunkte für genetische Untersuchungen der Artbildung deutlich. ï Und schließlich untersuchten sie diese Barrieren direkt: So korrelierte Dobzhansky die Testisgröße in Hybriden verschiedener Arten von Drosophila pseudoobsucura mit sieben verschiedenen genetischen Markern (das ist im Prinzip ähnlich wie die modernen Methoden der QTL-Analyse, S. 500).

In der Zwischenzeit konnten einige dieser „BarrierenGene“ isoliert werden, die meisten davon in Drosophila. Diese Gene sind oft mit der Unfähigkeit verbunden, Nachkommen zu produzieren (für eine aktuelle Übersicht siehe Noor u. Feder 2006). Wir wollen uns ein Beispiel dazu etwas im Detail ansehen, nämlich die Sterilität von Hybriden der beiden Drosophila-Arten Drosophila melanogaster und Drosophila simulans. Diese Untersuchungen gehen ursprünglich auf Arbeiten von Dobzhansky zurück und zeigen, dass die Sterilität der Hybriden-Männchen aus D. melanogaster und D. simulans im Verlust eines Gens begründet ist, das für die männliche Fertilität essenziell ist (JYα). Das Gen ist bei D. melanogaster auf dem 4. Chromosom lokalisiert, bei D. simulans aber auf dem 3. Die genetische und molekulare Analyse zeigt, dass JYα während der Evolution von D. simulans auf das Chromosom 3 übertragen wurde. Aufgrund dieser Transposition fehlt das JYαGen bei einem Teil der Hybriden vollständig, sodass es zur Sterilität kommt. Das JYα-Genprodukt hat eine Na+/K+-ATPase-Aktivität (Kationenaustauscher). Diese Veränderung der chromosomalen Struktur ist ein schönes Beispiel für die Entstehung einer reproduktiven Isolation von Arten, ohne dass eine Sequenzveränderung der DNA selbst die Ursache ist (Masly et al. 2006). Weitere wichtige Fragen zur Inkompatibilität von Hybriden betreffen vor allem die Rolle der geschlechtsbestimmenden Chromosomen. Dabei geht es darum, dass die Sterilität überwiegend durch Hybridformen im heterogametischen Geschlecht hervorgerufen wird, also durch Sterilität der heterogametischen Männchen (XY, wie bei Säugern und Drosophila) oder der heterogametischen Weibchen (ZW, wie bei Vögeln und Schmetterlingen). Dieser Effekt wird dadurch erklärt, dass die Allele, die die Unverträglichkeit der Hybriden verursachen, im Durchschnitt in Bezug auf die reproduktive Fitness rezessiv sind und sich somit nur im heterogametischen Geschlecht auswirken können. Zum anderen ist die Spermatogenese selbst ein Prozess mit einer wesentlich höheren Wahrscheinlichkeit zu Mutationen als die Oogenese. Eine weitere Erkenntnis in diesem Zusammenhang ist die Beobachtung, dass bei Kreuzungsexperimenten Einkreuzungen auf einem Geschlechtschromosom einen wesentlich höheren Einfluss auf die reproduktive Fitness haben als auf Autosomen. Ein derartiges Experiment zwischen den Drosophila-Arten D. mauritiana und D. sechellia ist in Abb. 10.43 dargestellt. Hierbei zeigte es sich, dass Einkreuzungen auf dem X-Chromosom in 60 % der Fälle zu Sterilität der (männlichen) Hybriden führen, wohingegen Einkreuzungen, die die Autosomen betreffen, nur in 18 % zur Sterilität der männlichen Hybriden führen.

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Abb. 10.43 Verteilung der Einkreuzungen von Drosophila mauritiana in das D. sechellia-Genom. In einem experimentellen Ansatz wurden Chromosomenabschnitte von D. mauritiana (mit einem Marker für die Augenfarbe) in D. sechellia eingekreuzt und für 15 Generationen nach D. sechellia zurückgekreuzt. Die umgekehrten Dreiecke über jedem Chromosom (X, 2, und 3) zeigen die Insertionsstellen: schwarz: lebensunfähige Hybride; rot: sterile Hybridenmännchen; weiß: fertile Hybride (oder nicht getestete). Die horizontalen Linien unter jedem Chromosom geben die un-

gefähre Größe von 108 der 142 Einkreuzungen an. Pfeile deuten darauf hin, dass das D. mauritiana-Material über die Markerauflösung an dieser Stelle hinausreicht; schwarz: Einkreuzungen, die zu lebensunfähigen Hybriden führen; rot: Einkreuzungen, die zu sterilen hybriden Männchen führen; grau: Einkreuzungen, die zu fertilen Hybriden führen. Am Chromosomenarm 3R ist die Inversion, die D. melanogaster von den Arten des D. simulansStamms unterscheidet (D. simulans, D. mauritiana und D. sechellia), eingeklammert. (Nach Masly u. Presgraves 2007)

Neben der erwähnten Sterilität von Hybriden finden wir im Tierreich auch viele Beispiele für sexuelle Isolation, die auf unterschiedlichem Paarungsverhalten beruht. Dabei gibt es unterschiedliche Signale, die das Männchen aussendet, und entsprechend unterschiedliche Kriterien des Weibchens bei der Partnerwahl. Solche Signale können akustischer, optischer oder chemischer Natur sein; eine kleine Auswahl zeigt Abb. 10.44. Die Kombination von klassischen Ansätzen der quantitativen Genetik, verbunden mit modernen genomweiten Technologien, verspricht einen baldigen Fortschritt im Verständnis der komplexen genetischen Grundlage der Partnerwahl und der damit verbundenen evolutionsgenetischen Prozesse.

Fisch eine der umfangreichsten Familien der Vertebraten. Cichliden kommen in Süd- und Zentralamerika, Afrika, Madagaskar und Indien vor; diese Verteilung beruht auf dem erdgeschichtlich alten Zusammenhang des Südkontinents (Gondwanaland) in der frühen Jurazeit (vor ca. 200 Millionen Jahren). Die größte Artenvielfalt finden wir in den großen Seen Ostafrikas (Abb. 10.45), wo sich anpassungsfähige Radiationen gebildet haben, die aus Hunderten von endemischen Arten bestehen (d. h. Arten, die nur hier vorkommen). Merkwürdigerweise zeigen aber nur die Cichliden diesen Artenreichtum ‒ andere Fischarten in diesen Seen zeigen dieses Phänomen nicht. Eine zweite offene Frage ist, warum die verschiedenen Cichlidenarten nicht miteinander konkurrieren, sondern vielmehr nebeneinander existieren können. Es gibt verschiedene Erklärungsmöglichkeiten; drei sollen hier skizziert werden: ï Die Buntbarsche verfügen über zwei Kiefer: ein „normales“ Maul zum Saugen, Schaben, Beißen und

Eine besondere Herausforderung für die molekulare Evolutionsforschung ist der Artenreichtum der Cichliden (Buntbarsche). Mit mehr als 3000 Spezies ist dieser

10.5 Populationsgenetik

Abb. 10.44 a–c Signale zur Partnerwahl. Die Komplexität der Partnerwahl entsteht nicht nur als Folge einer Vielzahl unterschiedlicher Signalmechanismen und/oder Verhaltensmöglichkeiten, die zur Attraktivität beitragen, sondern auch daraus, dass jeder Mechanismus selbst aus vielen Einzelkomponenten besteht. Drei Beispiele sind herausgegriffen, die zeigen, wie sexuelle Auswahl in einer Kombination von Komponenten eines einzigen Mechanismus wirkt. a Das akustische Signal eines Grillen-Männchens (Teleogryllus commodus). Hier sind vier individuelle Merkmale herausgestellt: der Abstand zwischen den einzelnen Lauten bzw. den einzelnen Rufen, die Länge des Zirpens und die Zahl der Triller-Einheiten. b Visuelle Signale im Guppy-Männchen (Poecilia reticulata). Vier individuelle Färbemerkmale sind hervorgehoben: orange, schwarz, schillernd und verschwommen-schwarz. Die Körpergröße und die Größe des Schwanzes werden auch oft als Merkmale betrachtet, die einer sexuellen Auswahl unterliegen. c Chemische Signale in Fliegenmännchen (Drosophila serrata). Hier sind neun individuelle Kohlenwasserstoffe gezeigt, die unter verschiedenen Aspekten bei der Partnerwahl eine Rolle spielen und die im Gaschromatogramm identifiziert wurden. (Nach Chenoweth u. Blows 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Abb. 10.45 a–c Die Evolution der Cichliden. a Das Verteilungsmuster der Cichliden ist gezeigt, mit Vertretern aus Indien, Sri Lanka und Madagaskar, die die ältesten Linien bilden, und dazu die monophyletischen Linien der afrikanischen und amerikanischen Linien als Geschwistergruppen. Diese Darstellung stimmt mit der ursprünglichen Verteilung auf dem Urkontinent Gondwanaland überein. b Der Urkontinent Gondwanaland in seiner Form vor ca. 200 Millionen Jahren. c Das Zentrum der CichlidenArtenvielfalt liegt in Ostafrika, wo sie die Flüsse und Seen bewohnen. Mehr als 2000 Cichliden-Arten sind dort bekannt. Die meisten Arten befinden sich in den großen Seen Ostafrikas, dem Tanganjika-, Malawi- und Victoria-See (die geschätzten Zahlen der Arten sind in eckigen Klammern angegeben); mehr als 200 Arten leben in den Flüssen. (Nach Salzburger u. Meyer 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

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Abb. 10.46 Artbildung durch genetischen Konflikt. Genetische Konflikte zwischen maternalen und zygotischen Genen in Bezug auf das Geschlechtsverhältnis der Nachkommen können zur Artbildung beitragen. Die Evolution der Geschlechtschromosomen erfolgt dabei in verschiedenen Schritten: Zunächst bevölkert eine kleine Gruppe von Fischen ein neues Habitat. In dieser kleinen Population konkurrieren Brüder um Partnerinnen, sodass die Selektion Mütter bevorzugt, die eine große Zahl weiblicher Nachkommen haben. Dadurch ist die Population offen für einen dominanten Repressor des männlichen Geschlechts (W; nicht notwendigerweise übereinstimmend mit dem schon existierenden XY-System), weil dadurch die relative Anzahl der Weibchen erhöht wird. Andererseits entsteht eine neue Farbmutation (z. B. orange-blotch) in enger Kopplung mit dem Weibchen-determinierenden Gen W. Männchen, die diese Weibchen als Partnerinnen erkennen, erlangen einen selektiven Vorteil, der eine Korrelation zwischen dem weiblichen Merkmal und der männlichen Bevorzugung herstellt und zur Fixierung der neuen Farbvariante in der Population beiträgt. Das Ergebnis ist ein neues System der Festlegung des Geschlechts über heterogametische Weibchen (WZ). Wenn die Population wächst, nimmt die Wahrscheinlichkeit der Inzucht ab, und das optimale Geschlechtsverhältnis kehrt zum Wert 0,5 zurück. Unter diesen Bedingungen kann ein neues Männlichkeit-bestimmendes Gen (Y‘, nicht notwendigerweise eines der früheren XY- oder WZ-Systeme) in die Population eindringen, da es die relative Zahl der Männchen erhöht. Eine neue Farbmutation (z. B. eine rote Rückenflosse) entsteht in enger Kopplung mit dem Männlichkeit-bestimmenden Gen auf dem Y-Chromosom. Weibchen, die diese neuen Männchen bevorzugen, erhalten einen selektiven Vorteil, da dadurch ihre Nachkommen zu einem optimalen Geschlechtsverhältnis kommen. Das Ergebnis ist die Fixierung des neuen Gens zur Festlegung der Männlichkeit und die Evolution eines Systems der Festlegung des Geschlechts über heterogametische Männchen (X‘Y‘). Dieser Zyklus ist besonders wahrscheinlich bei der Gründung neuer Populationen. Die Vorhersagen dieses Modells beinhalten Unterschiede in den Geschlechts-bestimmenden Mechanismen nahe verwandter Arten und die Kopplung von Farbpolymorphismen mit Geschlechts-bestimmenden Genen. Beide Vorhersagen wurden bei den ostafrikanischen Cichliden bestätigt. (Nach Kocher 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Abb. 10.47 Evolution der visuellen Empfindlichkeit. Die spektrale Antwort der Stäbchen- und Zapfenzellen der Retina wird durch die Aminosäuresequenz des Opsins bestimmt, das die Proteinkomponente des Sehpigments darstellt. Menschen verfügen über drei Opsine in den Zapfen (rot, grün und blau); jedes Opsin wird durch ein eigenes Gen codiert. Im Gegensatz dazu verfügen die Cichliden über fünf Opsin-Gene, deren Genprodukte für langwelliges (LWS), grünes (RH2), blaugrünes (S2b), blaues (S2a) und ultraviolettes Licht (S1) empfindlich sind. Ein einzelner Fisch exprimiert allerdings nur drei Gene in den Zapfenzellen, die in einem „Volkstanz-Muster“ (engl. square-dance mosaic) in der Retina angeordnet sind. Eine einzelne Zapfenzelle, die für kurzwelliges Licht empfindlich ist (und entweder S1 oder S2a exprimiert), ist umgeben von vier Paaren von Zapfenzellen, die Opsine exprimieren, die für längerwelliges Licht empfindlich sind. Die spektrale Feinabstimmung der Zapfen erfolgt bei den Cichliden im Wesentlichen durch zwei Mechanismen: Kleine Verschiebungen in der Wellenlänge (um 5–10 nm) der maximalen Absorption werden durch wenige Aminosäureaustausche im entsprechenden Opsin verursacht. Stärkere Unterschiede in der visuellen Empfindlichkeit werden durch die Expression unterschiedlicher OpsinGene hervorgerufen: Einige Arten exprimieren die Gene für das rot-empfindliche, für das grün-empfindliche und das blauempfindliche Opsin (z. B. Dimidiochromis compressiceps; unten), wohingegen andere die Gene für das grün-empfindliche, für das blau-grün-empfindliche und das ultraviolett-empfindliche Opsin exprimieren (z. B. Metriadima zebra; oben). Veränderungen in der visuellen Empfindlichkeit sind von besonderem Interesse, da sie wahrscheinlich direkt die Partnerwahl beeinflussen. Die Evolution der weiblichen Vorlieben bei der Partnerwahl ist wahrscheinlich für die spektakulären Variationen im männlichen Färbungsmuster verantwortlich, das für die Cichliden so charakteristisch ist. (Nach Kocher 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

10.5 Populationsgenetik

ein anderes „inneres“, das aus dem 5. Kiemenbogen gebildet wurde und sich im Pharynx befindet; es dient dazu, die Bissen zu zerquetschen, aufzuweichen und zu zerteilen, bevor sie aufgenommen werden. Die Mäuler sind äußerst vielseitig und anpassungsfähig; sie können ihre Form auch im Laufe des Lebens eines einzelnen Individuums ändern. Genetische Analysen deuten darauf hin, dass eines der beteiligten Gene bmp4 sein könnte (engl. bone morphogenetic protein, bmp). ï Ein zweiter Punkt ist das ausgeklügelte Zuchtverhalten und vor allem die verschiedenen Formen der Brutpflege: Die meisten der ostafrikanischen Buntbarsche sind Maulbrüter, d. h. die Weibchen picken die Eier auf und inkubieren sie in ihrem Maul für mehrere Wochen. ï Neue Befunde zeigen auch, dass die sexuelle Auswahl der Männchen durch die Weibchen zur Paarung aufgrund unterschiedlicher Färbungen eine wichtige Rolle spielt. Offensichtlich hängen die reproduktiven Barrieren, die dieses Auswahlverfahren bildet, von den Lichtverhältnissen in den Seen ab. Für die Wirkung unterschiedlicher Färbungsmuster spielt natürlich einmal die Bildung des Musters eine Rolle, aber auch die Entwicklung der Sehfähigkeit. Ein besonders rätselhaftes Muster, orange-blotch, wird in zahlreichen Arten des Malawi- und Viktoria-Sees gefunden. Auf der Basis vieler Kreuzungsversuche wird vermutet, dass das Gen X-chromosomal lokalisiert ist, aber durch ein autosomales Gen modifiziert wird. Allerdings ist der X-gekoppelte Farben-Polymorphismus die Grundlage der sexuellen Selektion und der Gattenwahl innerhalb der neu gebildeten Spezies. Eine treibende Kraft der Speziesbildung ist die zyklische Wiederholung des genetischen Konflikts zwischen maternalen und paternalen Genen über das Geschlechtsverhältnis der Nachkommen (Abb. 10.46). Auf der anderen Seite ist die Empfindlichkeit der Augen (und insbesondere der Retina) ein wichtiges Charakteristikum. Variationen in den Sehpigmenten können die Sehfähigkeit verändern und damit schließlich auch die Paarungspräferenzen. So verfügen einige der Cichliden im Malawi-See über Sehpigmente in den Zapfen der Retina, die UV-sensitiv sind und damit die UV-Reflexionen erkennen können, wie es bei vielen blauen Cichliden üblich ist. Die Unterschiede in der visuellen Empfindlichkeit zwischen den Buntbarschen des Malawi-Sees ist zum großen Teil durch unterschiedliche Expression der Opsin-Gene verursacht. Eine positive Selektion (S. 514) wurde außerdem in der Evolution des Rhodopsin-Gens sowie der Opsin-Gene gefunden, die für lange Wellenlängen empfindlich sind (Abb. 10.47).

Eine Art „Turbo-Evolution“ konnte bei Schmetterlingen in der Südsee beobachtet werden und hat die Art Hypolimnas bolina vor dem Aussterben gerettet. Der Schmetterling ist durch ein maternal vererbtes Wolbachia-Bakterium infiziert. Dieses Bakterium tötet spezifisch männliche Embryonen ‒ im Jahr 2001 gab es daher nur noch ca. 1 % männliche Schmetterlings-Individuen. Bei der nächsten Zählung im Jahr 2006 zeigte sich ein ausgeglichenes 1:1-Geschlechtsverhältnis; die Population hatte sich erholt. Genetische Untersuchungen zeigten, dass die Wolbachia-Bakterien weiterhin vorhanden und auch durchaus infektiös sind ‒ aber nur noch in anderen Stämmen. Vielmehr hatte dieser Stamm einen Suppressor gegen die Wolbachia-Bakterien eingekreuzt, der dazu führte, dass sich die Population innerhalb von nur 10 Generationen wieder erholen konnte. Die Autoren (Charlat et al. 2007) vermuten, dass sich ähnliche Flaschenhals-Prozesse häufiger in der Evolution ereignet haben.

Durch evolutionäre Prozesse entstehen aus Variationen innerhalb von Populationen inhärente Barrieren, sodass keine Fortpflanzung zwischen den isolierten Populationen möglich ist – eine neue Art ist entstanden.

Kernaussagen ï Die 1. Mendel’sche Regel (Uniformitäts- oder Reziprozitätsregel) besagt, dass reziproke Kreuzungen reiner Linien stets Nachkommen mit gleichen Merkmalen ergeben. ï Die 2. Mendel’sche Regel (Spaltungsregel) besagt, dass Kreuzungen der zuvor beschriebenen F1-Generation untereinander zur Aufspaltung in verschiedene Phänotypen mit genau festgelegter Häufigkeitsverteilung führen. ï Die 3. Mendel’sche Regel (Prinzip der unabhängigen Segregation von Merkmalen) besagt, dass Merkmale im Prinzip unabhängig voneinander auf die Nachkommen übertragen werden. ï Das genetische Verhalten von Merkmalen ist, vor allem bei komplexen Kombinationen, oft nur durch statistische Analysen von Kreuzungsergebnissen interpretierbar. ï Aus den Mendel’schen Beobachtungen ist zu schließen, dass die Vererbung durch die Weitergabe von Genen erfolgt. Diese sind bei höheren Organismen in jeder somatischen Zelle in zwei Kopien (Allele) vorhanden (Diploidie), die bei der Bildung der Geschlechtszellen verteilt und somit einzeln (Haploidie) an die Nachkommen weitergegeben werden.

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ï Für alle Gene gibt es unterschiedliche Formen der Ausprägung (verschiedene Allele), die dominant oder rezessiv sein können. ï Die Erscheinung der unvollständigen Dominanz lässt sich so verstehen, dass keines von zwei Allelen imstande ist, sich im Phänotyp voll gegen das andere durchzusetzen. Hierdurch entsteht ein neuer Phänotyp, der sich vom Phänotyp der homozygoten genetischen Konstitutionen unterscheidet. ï Die Erscheinung der Codominanz beruht darauf, dass zwei Allele sich unabhängig voneinander voll manifestieren und sich an ihrer jeweils spezifischen Ausprägung erkennen lassen. ï Merkmale sind oft durch die Existenz mehrerer verschiedener Allele in einer Gruppe von Organismen gekennzeichnet. Man spricht dann von multipler Allelie. ï Ein Merkmal kann durch mehrere Gene beeinflusst werden. Man bezeichnet das als Polygenie. ï Ein Gen kann Einflüsse auf mehrere phänotypische Merkmale ausüben. Man bezeichnet eine solche Genwirkung als Pleiotropie. ï Merkmale können in unterschiedlichem Maße oder gar nicht zur Ausprägung kommen. Man spricht dann von unterschiedlicher Expressivität und Penetranz eines Merkmals. ï Manche Gene können in mutanter Form die Ausprägung anderer Gene unterdrücken. Man spricht dann von Epistasie.

ï Populationen sind der Angriffspunkt für evolutionäre Prozesse. ï In Mendel-Populationen bestehen Regeln für die Verteilung von Allelen in der Population. Sie beschreiben auch die Verteilung der Allele in aufeinanderfolgenden Generationen. ï Die Allelzusammenstellung einer Population wird durch Zufallsveränderungen beeinflusst (Zufallsdrift, random drift). ï Selektion ist ein wichtiger Mechanismus der Evolution. Es gibt verschiedene Arten der Selektion (gerichtete, stabilisierende und disruptive). ï Zur Charakterisierung des relativen Fortpflanzungserfolgs bestimmter Genotypen innerhalb einer Population dient der Begriff Fitness. Die Häufigkeiten der verschiedenen Genotypen stellen sich so ein, dass die Population die größtmögliche Gesamtfitness erzielt. ï Fitnesswerte gelten nur innerhalb einer Population und können zwischen verschiedenen Populationen nicht verglichen werden. ï Das genetische Gleichgewicht, das in einer Population durch die unterschiedliche Fitness der verschiedenen Genotypen eingestellt wird, ist unvermeidlich mit genetischer Bürde verbunden. ï Neben der Selektion und Zufallsdrift gibt es noch eine Vielzahl weiterer Evolutionsmechanismen wie Migration, Isolation und Gründereffekte, die Auswirkungen auf den Genpool von Populationen haben.

Technik-Box

Technik-Box 23

Kartierung genetischer Merkmale Anwendung: Methode zur Lokalisation genetischer Merkmale auf einem Chromosom. Voraussetzungen: Einfache Erkennung des genetischen Merkmals; Vielzahl von Polymorphismen zwischen verwandten Stämmen des jeweiligen Modellorganismus. Methode: Die klassische Kartierung durch Rückkreuzung ist die wichtigste Methode zur Lokalisierung genetischer Merkmale (in der Regel Mutationen) bei höheren Organismen (Pflanzen und Tiere). Voraussetzung dafür ist, dass zwei Stämme nicht nur für das zu lokalisierende Gen bzw. Merkmal polymorph sind, sondern sich auch noch in einer Vielzahl von genetischen Markern (in der Regel Mikrosatelliten oder Polymorphismen einzelner Basen – engl. single nucleotide polymorphism, SNP) unterscheiden. Die Markerdichte entscheidet über die Genauigkeit der Kartie-

rung. Bei der Maus gibt es derzeit ca. 10.000 Mikrosatelliten (Abb. 10.27) und mehr als 10-mal so viele SNPs (http://mousesnp.roche.com). Verschiedene Paarungsschemata für die unterschiedlichen Erbgänge sind in Abb. 10.28 dargestellt: zunächst werden Tiere der beiden ausgewählten Eltern-Linien (P: parental) gekreuzt, danach werden die erhaltenen Tiere der F1-Nachkommen (F: filial) mit einem der Elternstämme zurückgekreuzt. Die Analyse der Rekombinationshäufigkeit kann dann in den Nachkommen dieser Kreuzung durchgeführt werden (F2). Waren die Elternstämme in Bezug auf das zu untersuchende Merkmal beide homozygot (homozygot für die Mutation bzw. homozygot Wildtyp), sind alle Tiere der F1-Generation heterozygot. Waren die mutanten Elterntiere heterozygot, ist auch nur die Hälfte der F1Tiere heterozygot. Bei einem rezessiven Merkmal erfolgt die Rückkreuzung der heterozygoten F1-Tiere immer zu der Linie, die das Merkmal trägt (sonst

wird in der F2-Generation das zu untersuchende Merkmal nicht sichtbar); bei dominanten Mutationen wird dagegen zu dem parentalen Wildtyp-Stamm zurückgekreuzt, da im anderen Fall die F2-Tiere keine phänotypischen Unterschiede aufweisen (hetero- bzw. homozygot für die Mutation). Der Abstand R der Mutation von den untersuchten Markern (in cM) hängt ab von der Zahl der beobachteten Rekombinanten (a) bezogen auf die Zahl (n) der untersuchten F2-Nachkommen: R [cM] = (a/n) 100 Die Standardabweichung ist abhängig von der Zahl der untersuchten F2Nachkommen: SD [cM] = 100 √ [(1−R)R]/n Ein Beispiel für die Kartierung einer Mutation, die zu einer Linsentrübung der Maus führt, ist in der Tabelle 10.10 angegeben

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Kapitel 10: Formalgenetik

Technik-Box 24

Immunologische Nachweismethoden Anwendung: Nachweis und Lokalisation von Antigenen (Proteine, andere Makromoleküle, auch DNA oder DNA/ RNA-Hybride usw.) in Chromosomen, Zellen oder Geweben oder an elektrophoretisch fraktionierten und auf Membranfilter übertragenen Proteinen.

man ein bestimmtes Protein identifizieren und damit seine elektrophoretischen Eigenschaften erkennen kann. Diese Methode wird als Western-Blotting bezeichnet. Verwandte Techniken: Northern-Blotting (Technik-Box 11), Southern-Blotting (Technik-Box 10), Autoradiographie (Technik-Box 13).

Voraussetzungen · Materialien: Der Nachweis beruht auf Antigen-Antikörper-Reaktionen mit Antiseren, die durch Immunfluoreszenz, Färbung oder Autoradiographie sichtbar gemacht werden. Methode: Zunächst wird durch Immunisierung eines geeigneten Tieres (Kaninchen, Maus, Ratte, Ziege, Huhn) mit dem zu untersuchenden Antigen ein Antiserum erzeugt, das dieses Antigen spezifisch erkennt (zum theoretischen Hintergrund: Kapitel 8.4). Dieses Antiserum lässt man dann mit dem Untersuchungsmaterial reagieren. Da die Antikörper dieses Antiserums im Allgemeinen nicht markiert sind, also auch nicht sichtbar werden, verwendet man zu ihrer Erkennung ein sekundäres Antiserum, das gegen die konstante Region der primären Antikörper gerichtet ist. Die sekundären Antikörper binden daher an die primären Antikörper. Sie sind in geeigneter Weise markiert, d. h. sie werden mit Fluoreszenzfarbstoffen (FITC, Rhodamin usw.), mit Enzymen (Peroxidase, alkalische Phosphatase), die eine Erkennung durch die Produktion von Farbstoffen bei Reaktion mit geeigneten Substraten gestatten, oder – für die Verwendung in der Elektronenmikroskopie – mit Goldpartikeln gekoppelt. Die Fluoreszenzfarbstoffe sind direkt sichtbar. Enzyme lassen sich durch eine Substratreaktion, die zur Färbung führt, nachweisen. Die Verwendung markierter sekundärer Antikörper hat den großen Vorteil, dass man diese Kopplung mit geeigneten Markermolekülen nur einmal durchzuführen braucht, den gleichen Antikörper dann aber zur Erkennung vieler unterschiedlicher primärer Antikörper einsetzen kann. So erkennt z. B. ein in einer Ziege gegen die konstante Region einer IgG-Kette des Kaninchens erzeugter Antikörper (bezeichnet als Ziege-anti-Kaninchen-IgG, engl. goat-anti-rabbit-IgG) alle IgG-Antikörper des Kaninchens. Er kann daher zum Nachweis sehr vieler unterschiedlicher primärer Antikörper eingesetzt werden, ohne dass es jedes Mal erforderlich ist, eine neue Kopplungsreaktion mit einem Markermolekül auszuführen. Immunreaktionen sind nicht nur auf dem histologischen bzw. cytologischen und ultrastrukturellen Niveau möglich, sondern können auch mit Proteinen durchgeführt werden, die an Membranfilter gebunden sind. In solchen Versuchen werden Proteingemische zunächst durch geeignete elektrophoretische Methoden in Polyacrylamidgelen nach Ladung oder Größe aufgetrennt und anschließend elektrophoretisch auf eine Membran (Nitrocellulose o. a.) übertragen, an der sie irreversibel fixiert bleiben. Auf dieser Membran ist der immunologische Nachweis möglich, sodass

Immunologie. Zur zellulären Lokalisation eines Antigens (Proteins) bindet man zunächst primäre Antikörper, die gegen dieses Protein gerichtet sind, an das Antigen. In einem zweiten Schritt werden dann sekundäre Antikörper, die gegen den konstanten Teil der primären Antikörper gerichtet und damit universell verwendbar sind, gebunden. Diese sind mit fluoreszierenden Gruppen oder Enzymen gekoppelt, die den Nachweis dieser sekundären Antikörper gestatten

Kapitel 11

Entwicklungsgenetik Inhaltsverzeichnis 11.1 Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 528 11.2 Entwicklungsgenetik der Pflanze . . . . . . . . . . . . . . 529 11.3 Entwicklungsgenetik des Fadenwurms Caenorhabditis elegans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 544 11.4 Entwicklungsgenetik von Drosophila melanogaster . . . 548 11.5 Entwicklungsgenetik bei Fischen . . . . . . . . . . . . . . 572 11.6 Entwicklungsgenetik bei Säugern . . . . . . . . . . . . . 577 11.7 Stammzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 593 11.8 Epigenetik und genetische Prägung . . . . . . . . . . . . 599

Scanningelektronenmikroskopische Aufnahme eines Blütenstandes von Antirrhinum majus. Das Foto zeigt das apikale Meristem während der ersten Blütenentwicklung. Es ist erkennbar, wie sich die verschiedenen Organe in konzentrischen Wirteln entwickeln. (Foto: P. Huijser, Köln)

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Überblick Die Genetik hat in den letzten Jahren zu großen Fortschritten im Verständnis der molekularen Grundlagen von Entwicklungsprozessen beigetragen. So ist es bei Arabidopsis, Drosophila, Caenorhabditis, der Maus und einigen anderen Organismen gelungen, durch die Untersuchung von Mutanten den Mechanismus der Embryonalentwicklung zumindest in seiner allgemeinen Grundlage zu verstehen: Sie wird durch ein hierarchisches System von Genen gesteuert. An den frühen Differenzierungsschritten des Drosophila-Embryos sind DNA-bindende Transkriptionsfaktoren und RNA-bindende Regulationsproteine beteiligt, die die Aktivität nachgeordneter Gene regulieren. Nukleinsäure-bindende Proteine spielen als molekulare Signale (Morphogene) für die Determination der Achsen des Embryos eine wichtige Rolle. So wird die Grundlage für die beiden embryonalen Achsen (anterior – posterior und dorsal – ventral) bereits während der Oogenese gelegt. Das sich entwickelnde Ei enthält in seinem Cytoplasma positionelle Informationen. Diese Information besteht aus mRNA-Molekülen, die nach der Befruchtung im frühen Embryo translatiert werden und Proteine bilden, die durch ihre asymmetrische Lokalisation und durch Diffusion Gradienten ausbilden. Durch unterschiedliche Konzentrationen der Proteine kommt es zur unterschiedlichen Regulation der Aktivität funktionell nachgeordneter Proteine. In vereinfachter Form können wir also sagen, dass lokalisiert auftretende Transkriptionsfaktoren eine differenzielle Genaktivität in unterschiedlichen Bereichen des Embryos induzieren, die zu weiterer zellulärer Differenzierung führt. Die Untersuchungen von Entwicklungsprozessen an Tieren und Pflanzen deuten darauf hin, dass die molekularen Grundprinzipien von Determinations- und Differenzierungsprozessen evolutionär sehr alt sind. Nach der Erkenntnis, dass Vererbungsprozesse bei allen Organismen nach den gleichen Grundprinzipien erfolgen, zeich-

11.1 Einführung Die Entwicklung zu einem vielzelligen Organismus ist der komplizierteste Vorgang, den eine Zelle erfahren kann. Darauf beruht auch die Faszination und Herausforderung der Entwicklungsbiologie im Allgemeinen. Eine Vielzahl genetischer Netzwerke steuert diese komplexen Prozesse. Mithilfe von Mutanten können wir entwicklungsbiologische Vorgänge bei Pflanzen und Tieren viel besser verstehen. In der Entwicklungsbiologie werden im Wesentlichen fünf Entwicklungsprozesse unterschieden, die sich natürlich in der Realität teilweise überlagern und wechselseitig beeinflussen. Wir finden sie sowohl im Pflanzen- als auch im Tierreich: ï Die Furchungsteilungen folgen als Periode schneller Zellteilungen unmittelbar auf die Befruchtung.

net sich damit auch ab, dass zelluläre Differenzierung bei allen lebenden Organismen auf ähnlichen molekularen Grundlagen erfolgt. Es gehört zu den überraschenden Befunden der molekularen Genetik, dass eine ganz unerwartet große Anzahl von Genen mit grundlegenden Funktionen in der Zelldifferenzierung und Zellfunktion evolutionär über alle höheren Organismen hinweg erhalten geblieben ist. Die verschiedenen Zelltypen eines multizellulären Organismus besitzen im Prinzip alle die gleichen genetischen Fähigkeiten. Aus embryologischen Experimenten (Gewebe-, Zell- und Kerntransplantationen) wurde die Möglichkeit abgeleitet, dass Zellen letztlich in der Lage sind, einen vollständigen Organismus neu entstehen zu lassen. In letzter Zeit haben die Versuche zur Klonierung mithilfe somatischer Zellen gezeigt, dass viele somatische Zellen multipotent sind. Das Klonschaf „Dolly“ war dafür das bekannteste Beispiel, bevor es unerwartet jung starb. Über die Klonierung von Organismen aus Körperzellen wird ebenso diskutiert wie über den Nutzen von Stammzellen. Seien es embryonale Stammzellen aus der Blastocyste oder adulte Stammzellen aus dem Knochenmark oder anderen Geweben – in Kultur können sie zu Zellen vieler unterschiedlicher Gewebe heranwachsen. Viele erhoffen sich hiervon, ein präzise steuerbares Ersatzteillager für Patienten aufzubauen. Die Kerntransplantationsergebnisse haben aber auch gezeigt, dass offensichtlich in bestimmten Bereichen das mütterliche und väterliche Genom unterschiedlich ist. Bevor man dieses Phänomen molekular bearbeiten konnte, wurde dafür der Begriff „genetische Prägung“ (engl. imprinting) eingeführt. Wir wissen heute, dass Imprinting im Wesentlichen auf Methylierung beruht und in den frühen Phasen der Embryonalentwicklung gelöscht und später dann geschlechtsspezifisch erneuert wird.

Dabei kommt es zu keinem Zellwachstum; es gibt nur die Phasen der DNA-Replikation und Mitose mit Zellteilung. ï Bei der Musterbildung wird innerhalb des Embryos ein räumliches und zeitliches Muster von Zellaktivitäten aufgebaut, sodass eine erste wohlgeordnete Struktur entsteht. Dabei werden zunächst die Achsen des Embryos definiert. Die anterior ↔ posteriore Achse entspricht bei Tieren der KopfSchwanz-Orientierung und bei Pflanzen der von der Wachstumsspitze zu den Wurzeln (auch als apikal ↔ basale Achse bezeichnet). Die dorsal ↔ ventrale Achse beschreibt bei Tieren die Achse, die zur Bildung einer Rück- bzw. Vorderseite führt. Auch die daran anschließende Ausbildung der unterschiedlichen Keimblätter (Ektoderm, Meso-

11.2 Entwicklungsgenetik der Pflanze

derm, Entoderm) gehört noch zur Phase der Musterbildung. ï Der dritte wichtige Schritt ist die Morphogenese (Formentstehung). Embryonen ändern dabei in charakteristischer Weise ihre dreidimensionale Form; die erste Phase wird im Tierreich als Gastrulation bezeichnet. Hier zeichnet sich schon der Bauplan in seinen Grundzügen ab. ï Der vierte Schritt ist die Zelldifferenzierung. Dabei kommt es zu gerichteten Zellteilungen, räumlich verschiedenen Mitoseraten oder gerichteten Zellstreckungen. ï Der letzte Schritt ist das Wachstum, das auf verschiedenen Wegen erfolgen kann (Zellvermehrung, Zunahme der Zellgröße, Ablagerung extrazellulären Materials wie Knochen oder Schale). Das Wachstum kann auch gestaltbildend wirken. In diesem Kapitel wollen wir uns aber im Wesentlichen auf die ersten drei Punkte konzentrieren und kennenlernen, welche Gene hier steuernd eingreifen. Wir können dabei natürlich nicht alle Details der Morphologie ansprechen; interessierte Leser mögen an dieser Stelle auf grundlegende Werke der Entwicklungsbiologie und Embryologie zurückgreifen. Es werden im Zusammenhang mit der Entwicklungsgenetik vor allem die Prozesse besprochen, die durch die Analyse von Mutanten funktionell charakterisiert werden konnten.

11.2 Entwicklungsgenetik der Pflanze Im Kapitel 5.4.2 haben wir bereits die Pflanzen als genetische Modellsysteme kennengelernt. Im Allgemeinen lässt sich der Lebenszyklus einer Blütenpflanze grob in drei große Abschnitte gliedern: Embryogenese, postembryonale (vegetative) Entwicklung und generative Entwicklung. Der Embryo entwickelt sich in der Samenanlage nach der Befruchtung der Eizelle durch ein Pollenkorn; der entstandene Embryo reift und geht in einen Ruhezustand über, in dem der trockene Samen mit dem voll entwickelten Embryo ungünstigen Bedingungen widersteht und zugleich verbreitet werden kann. Mit der Keimung des Samens wird der Embryo zum Keimling, der an den Enden der apikal-basalen Körperachse primäre Meristeme (Bildungsgewebe) trägt, aus denen Spross und Wurzel hervorgehen. Das Sprossmeristem bildet während der vegetativen Entwicklungsphase vor allem Blätter. Physiologische Veränderungen, als Blühinduktion bezeichnet, leiten die generative Phase ein. Das Sprossmeristem bringt nun Blüten hervor, in denen männliche und weibliche Organe durch Meiose haploide Sporen bilden. Die Sporen entwickeln sich zu Gametophyten, die die Gameten enthalten.

Einen wichtigen Einfluss auf die Entwicklung hat die Organisation der Pflanzenzelle. Die Zellwand sorgt dafür, dass die Zellen ihre Nachbarschaft nicht verlassen können. Gestaltveränderungen (Morphogenesen) in der Entwicklung einer Pflanze werden daher durch lokale Aktivitäten von Zellen ausgeführt. Zur Koordination von Entwicklungsvorgängen sind andererseits langreichende Signale (z. B. Phytohormone) notwendig. Für die Kommunikation zwischen den Zellen einer Pflanze können die Plasmodesmen eine zusätzliche Rolle spielen, da sie Zellen miteinander verbinden.

11.2.1 Musterbildung in der frühen Embryogenese Der Embryo entwickelt sich an der Mutterpflanze in einer Samenanlage, die zum Zeitpunkt der Befruchtung einen weiblichen Gametophyten (den Embryosack) enthält, der in seiner reifen Form aus 7 Zellen besteht. Von diesen Zellen werden zwei befruchtet: die haploide Eizelle und die diploide Zentralzelle. Dadurch entstehen die Zygote und eine triploide Zelle, aus der das Endosperm hervorgeht. Blütenpflanzen unterscheiden sich danach bei der Bildung der Keimlinge: Die Keimlinge von Monokotylen entwickeln eine Keimblattanlage, die das Sprossmeristem überwächst und in eine seitliche Lage drängt. Dikotyle (wie Arabidopsis) entwickeln dagegen zwei Keimblattanlagen, die das Sprossmeristem symmetrisch flankieren. Bei Arabidopsis dauert die Entwicklung von der Befruchtung zum fertigen Embryo etwa 9 Tage, die anschließende Reifung noch einmal einige Tage. In dieser Zeit wächst der Embryo auf fast 20.000 Zellen und etwa 500 μm Größe heran. Die Embryogenese von Arabidopsis (Abb. 11.1) wird anhand morphologischer Kriterien in 20 Stadien eingeteilt; die frühen Stadien werden nach der Zellzahl des Pro-Embryos (Quadrant, Oktant) bezeichnet. Die darauf folgenden verschiedenen Stadien der Morphogenese sind entsprechend ihrer charakteristischen Formen benannt: Kugel, Herz und Torpedo. Die frühembryonale Phase der Musterbildung, bei der die Körpergrundgestalt entsteht, endet mit dem Herzstadium. Die apikal-basale Polaritätsachse ist die Hauptachse der Pflanze. Sie wird bereits nach der Befruchtung etabliert, wenn sich die Zygote auf die etwa 3fache Länge streckt und dann asymmetrisch in eine kleine apikale und eine große basale Zelle teilt (Abb. 11.1). Die basale Zelle teilt sich wiederholt horizontal, wodurch ein Zellstrang aus 7 bis 9 Zellen entsteht. Von diesen Zellen bilden alle bis auf die oberste den embryonalen Suspensor, der den Embryo mit der Samenanlage verbindet; die oberste Zelle nimmt sekundär ein embryonales Schicksal an und trägt zur Bildung des

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Abb. 11.1 a–f Entwicklung des apikal-basalen Musters während der Embryonalentwicklung von Arabidopsis thaliana. Die obere Reihe zeigt eine schematische Darstellung der Embryonalentwicklung von Arabidopsis, die untere Reihe zeigt die entsprechenden mikroskopischen Darstellungen im Interferenz-Kontrast. a 2-Zell-Stadium: Die Zygote hat sich asymmetrisch in eine apikale (ac) und basale (bc) Tochterzelle geteilt. b Oktantstadium: Der Pro-Embryo, der sich aus der apikalen Zelle entwickelt hat, besteht aus zwei Lagen von je 4 Zellen (ut: obere Lage, grau; lt: untere Lage, hellgrau). Die basale Zelle hat eine Reihe von Zellen produziert, darunter die Hypophyse (hy, schwarz) und den Suspensor (su, weiß). c Dermatogenstadium: Perikline Teilungen haben 8 epidermale Zellen und 8 innere Zellen hervorgebracht. d Kugelstadium: Die inneren Zellen der

unteren Lage haben sich periklin geteilt und werden zu Vorläufern des Grundgewebes und des Leitgewebes. Die Hypophyse teilt sich asymmetrisch in eine obere linsenförmige Zelle (das spätere Ruhezentrum, engl. quiescent center, QC) und eine untere trapezförmige Zelle (die spätere zentrale Wurzelhaube, engl. central root cap, crc). e Herzstadium: Die Körpergrundgestalt des Keimlings ist angelegt: apikales Sprossmeristem (SAM); Vorläufer der Kotyledonen (cot); die zentrale Region aus der unteren Lage des Oktantstadiums hat sich noch einmal in eine obere (ult) und untere (llt) Lage unterteilt. f Keimling: apikales Sprossmeristem (SAM); Vorläufer der Kotyledonen (cot); Hypokotyl (hc); Wurzel (engl. root, rt); Ruhezentrum (QC); zentrale Wurzelhaube (crc). (Nach Vroemen u. de Vries 1999, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Wurzelmeristems bei. Die apikale Zelle dagegen durchläuft zwei Runden vertikaler Zellteilungen und dann eine Runde horizontaler Zellteilungen und erreicht damit das Oktantstadium. In diesem Stadium besteht der Pro-Embryo aus zwei Lagen von je 4 Zellen und kann insgesamt in drei Regionen unterteilt werden: Die apikale Region besteht aus der oberen Lage und entwickelt sich später zum Sprossmeristem und den Keimblättern. Die untere Lage repräsentiert die zentrale Region und wird zu den Schulterregionen der Keimblätter, dem Hypokotyl, der Wurzel und den Stammzellen des Wurzelmeristems. Die basale Region entspricht der obersten Zelle des 7- bis 9-zelligen Zellstrangs und geht somit auf die basale Tochterzelle der Zygote zurück. Sie wird zur Hypophyse, die das Ruhezentrum und die untere Lage der Stammzellen des Wurzelmeristems hervorbringt. Neben dem apikal-basalen Muster wird auch ein radiales Muster aufgebaut (Abb. 11.2). Die 8 Zellen des Oktant-Pro-Embryos teilen sich parallel zur Oberfläche (perikline Zellteilungen), sodass außen liegende

Epidermiszellen und innen liegende subepidermale Zellen entstehen. Die weitere Entwicklung der Epidermis erfolgt durch Zellteilungen, deren Teilungsebene senkrecht zur Oberfläche liegt (antikline Teilungen); die periklinen Zellteilungen bleiben auf die zentrale Region des jungen Embryos beschränkt. Das Ergebnis der radialen Musterbildung ist eine konzentrische Anordnung von Gewebeschichten. Die bedeutendsten Mutationen, die die stabile Festlegung der apikal-basalen Achse des Embryos beeinflussen, betreffen das Gen GNOM (GN). Die mutanten Keimlinge sind klein und verdickt; es fehlt die Wurzel, und sie zeigen verdickte, fusionierte Keimblätter. Der früheste Defekt ist eine variable Teilung der Zygote. Das GN-Gen codiert für einen Guaninnukleotid-Austauschfaktor für kleine G-Proteine der Familie Auxin-sensitiver Gene, die eine wichtige Rolle beim intrazellulären Membranfluss spielen (Transport von Membranproteinen zur Plasmamembran). Das GnomProtein wird für die koordinierte polare Lokalisierung

11.2 Entwicklungsgenetik der Pflanze

Abb. 11.2 Entwicklung des radialen Musters. Die obere Reihe und das Bild unten links zeigen schematische Längsschnitte; die Bilder unten rechts zeigen Querschnitte durch eine Wurzel. Die unteren und oberen dicken Linien markieren klonale Grenzen zwischen den Abkömmlingen der apikalen und der basalen Tochterzelle der Zygote und zwischen der apikalen und der

des Auxinefflux-Carriers PINFORMED1 (PIN1) in der basalen Plasmamembran benötigt. Weitere Mutationen in der apikal-basalen Musterbildung betreffen die Gene MONOPTEROS (MP) und BODENLOS (BDL). Sie verändern die Zellteilungsebene der apikalen Tochterzelle der Zygote und verhindern später die Entstehung der Hypophyse. MP ist ein Transkriptionsfaktor und bindet an Auxin-Bindestellen im Promotorbereich solcher Gene, die durch Auxin aktiviert werden. BDL ist ein Protein, das als negativer Regulator der Auxin-Antwort wirkt. Auxin, das wichtigste Phytohormon der Pflanze, hat also auch schon in der frühesten Phase der Pflanzenentwicklung eine zentrale Rolle.

zentralen embryonalen Domäne. Der Farbcode der einzelnen Zelltypen ist angegeben; die Stammzellen sind jeweils dunkler gefärbt. gt: Grundgewebe; hy: Hypophyse; lsc: linsenförmige Zelle; pc: Perizykel; vp: vaskuläres Primordium. (Nach Laux et al. 2004, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Bei der frühen Embryonalentwicklung von Arabidopsis wird zunächst die apikal-basale Polaritätsachse und danach ein radiales Muster aufgebaut. Mutationen in den beteiligten Genen führen zu massiven Störungen in der frühen Musterbildung. Das Pflanzenhormon Auxin ist bereits an vielen frühen Entwicklungsprozessen beteiligt.

Die Auxin-Verteilung verändert sich dynamisch an den entscheidenden Punkten der pflanzlichen Embryonalentwicklung: Nach der Befruchtung ist die Auxin-Aktivität in der apikalen Zelle (und ihren Tochterzellen) höher als in der basalen (was bis zum 32-Zell-Stadium so bleibt). Danach ist

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ein inverses Muster der Auxin-Maxima zu beobachten, wobei die höchste Auxin-Aktivität in den obersten Suspensor-Zellen gefunden wird ‒ einschließlich der der Hypophyse, dem Vorläufer des Wurzelmeristems. Später wiederum wird Auxin-Aktivität in den Apizes der Kotyledonen (Keimblätter) und in den provaskulären Zellen gefunden. Dabei spielt der polare AuxinTransport eine zentrale Rolle, wobei Auxin in spezifische Zellen oder Gewebe der Pflanze geleitet wird, um bestimmte Entwicklungsprozesse anzustoßen oder aufrechtzuerhalten. Ein lesenswerter Übersichtsartikel dazu ist die Arbeit von Tanaka et al. (2006).

11.2.2 Wurzel-, Sprossund Blattentwicklung Vom Herzstadium bis zum reifen Embryo werden die frühembryonal angelegten Regionen und Gewebe weiter untergliedert. Aus dem apikal-basalen Muster bilden sich Meristeme mit den dazwischen liegenden Keimlingsstrukturen (Keimblätter, Hypokotyl und embryonale Wurzel). Aus dem zweiten, radialen Muster werden die hauptsächlichen Gewebetypen (von außen nach innen Epidermis, Grundgewebe und Leitgefäße) aufgebaut. Das nun aktive primäre Wurzelmeristem bildet den größten Teil der embryonalen Wurzel. Es setzt sich aus zwei Teilen zusammen, die von verschiedenen Regionen des jungen Embryos abstammen: Das Ruhezentrum des Wurzelmeristems und die Initialen (Stammzellen) für die zentrale Wurzelhaube sind Abkömmlinge der Hypophyse und gehen somit auf die basale Tochterzelle der Zygote zurück. Die Initialen des Wurzelmeristems, die Zellstränge nach oben abgeben und so zur embryonalen Wurzel beitragen, sind dagegen von der unteren Lage des Oktant-ProEmbryos abgeleitet und damit Nachkommen der apikalen Tochterzelle der Zygote (Abb. 11.2). Das Wurzelmeristem wird im Herzstadium aktiv; es weist eine charakteristische radiale Organisation auf, die sich in der konzentrischen Anordnung der Wurzelgewebe widerspiegelt. Je 8 Zellstränge sind in den Schichten von Cortex und Endodermis zu finden; in der Epidermis gibt es etwa 16 Zellstränge und doppelt so viele in der lateralen Wurzelhaube. Um das Ruhezentrum, das aus 4 teilungsinaktiven Zellen besteht, gruppieren sich die Initialen. Nach unten hin bildet eine Lage von Initialen immer wieder Zellen für den zentralen Teil der Wurzelhaube, die sich beim Eindringen in den Boden abnutzt und von den neu gebildeten Zellschichten ersetzt wird. Nach oben hin bildet eine Lage von Initialen Zellen, die sich zu Strängen anordnen und so die bestehende Wurzel verlängern. Die Primärwurzel wächst vor allem durch Teilung der Stammzellen in der meristematischen Zone. Die

neu entstandenen Zellen verlängern die embryonal gebildete Wurzel. Wenn die Zellen das Meristem verlassen, kommen sie in die Streckungszone, wo sie sich in der Längsachse der Wurzel strecken; auch diese Zellstreckung trägt zum Wurzelwachstum bei. Schließlich gelangen die Zellen in die Differenzierungszone, in der sie ihre charakteristischen Merkmale ausbilden (z. B. Wurzelhaare, Caspari’sche Streifen, Seitenwurzel, Leitgewebe Phloem und Xylem). Arabidopsis-Mutanten, die die Wurzelbildung betreffen (Abb. 11.3), zeigen im Wesentlichen einen Einfluss auf das radiale Muster und deuten damit darauf hin, dass es während der Wurzelbildung vor allem auf den radialen Informationsfluss ankommt. Besonders zwei Mutanten (scarecrow, scr und short-root, shr) haben dieses Bild geprägt. Beide sind Funktionsverlustmutationen. Die initialen Tochterzellen in der Epidemis bzw. des Cortex teilen sich nicht in der üblichen asymmetrischen Weise, sodass nur eine einzige Schicht des Grundgewebes gebildet wird, wo sonst die zwei Schichten von Cortex und Endodermis entstehen. Die beiden Mutanten unterscheiden sich allerdings in einem wichtigen Detail: So hat die eine Grundgewebsschicht in scr-Mutanten differenzierte Anteile des Cortex und der Endodermis, wohingegen die shr-Mutanten nur Cortex-Eigenschaften aufweisen. Mutationen im WOODEN-LEG (WOL)-Gen führen zu einer verringerten Zahl an Zellen im Leitgewebe der Wurzel, und alle Zellen des Leitgewebes differenzieren in Xylemgewebe. WOL kontrolliert Zellteilungen, aber nicht die Differenzierung. Die molekulare Analyse hat gezeigt, dass das Gen für eine Histidinkinase codiert, die auch als Cytokin-Rezeptor bekannt ist (CRE1) und offensichtlich für die Übertragung des Cytokin-Signals von der Oberfläche der Zellen des Leitgewebes zu deren Zellkern verantwortlich ist. Im Herzstadium ist sowohl die apikal-basale als auch die radiale Organisation des Embryos definiert. Aber es gibt noch eine andere Form der Musterbildung, die zwischen epidermalen Zellschicksalen in der Wurzel und im Hypokotyl in Bezug auf ihre Umgebung entscheidet: Zellen, die mit dem interzellulären Raum von zwei darunter liegenden Cortex-Zellen in Kontakt sind (H-Zellen), werden sich zu Haarzellen in der Wurzel und zu Spaltöffnungen (Stomata) im Hypokotyl entwickeln, wohingegen die Zellen, die nur in Kontakt mit einer cortikalen Zelle sind (N-Zellen), sich weder zu Haar- noch zu Stomatazellen entwickeln (Abb. 11.2). Möglicherweise erreichen die entsprechenden Signalmoleküle ihre Zielzellen über den interzellulären Raum (Laux et al. 2004). Die oberirdischen Teile der vegetativen Pflanze, Spross und Blätter, entwickeln sich aus dem primä-

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Abb. 11.3 a–c Schematische Darstellung von Wildtyp und von Wurzelmutanten bei Arabidopsis. a Wildtyp-Wurzel: Die verschiedenen Zelltypen sind durch einen Farbcode erläutert. b Das Ruhezentrum wirkt durch die Hemmung der Differenzie-

rung der umliegenden Initialzellen als Organisationszentrum des Wurzelmeristems. c Unvollständige radiale Muster der drei Arabidopsis-Mutanten scr, shr und wol. (Nach Nakajima u. Benfey 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

ren Sprossmeristem des Keimlings (Abb. 11.1), das im reifen Embryo aus annähernd 100 Zellen besteht und im Durchmesser etwa 50 μm groß ist. Das Sprossmeristem ist charakteristisch in Schichten und Zonen organisiert: Die äußere der drei Schichten ist aus der Epidermis des Embryos hervorgegangen; sie bildet später die epidermalen Abschlussgewebe von Spross, Blättern und Blütenorganen. Die Zellen der inneren Schichten sind aus subepidermalen Zellen des Embryos hervorgegangen und bringen unter anderem die sporogenen Gewebe der Blüten hervor, die die Keimzellen bilden. Das Sprossmeristem ist außerdem in Zonen gegliedert, die verschiedene Funktionen erfüllen. Eine zentrale Zone an der Spitze ist für die Integrität des Sprossmeristems wichtig und enthält teilungsaktive Zellen, die das Meristem laufend erneuern, aber auch Tochterzellen zur Seite und nach unten abgeben. Die zentrale Zone wird flankiert von der peripheren Zone, in der Blätter mit den dazugehörigen Achselmeristemen angelegt werden. Die Blattanlagen werden durch neue Zellen, die aus der zentralen Zone stammen, verdrängt und verlassen das Meristem. Durch perikline Teilungen der subepidermalen Zellen werden die Anlagen dann in Blattprimordien umgewandelt. Die darin ent-

haltenen Achselmeristeme bleiben inaktiv, solange die zentrale Zone des primären Sprossmeristems inhibierend wirkt (apikale Dominanz). Unterhalb der zentralen Zone ist die Rippenzone angesiedelt, deren Zellen zum Wachstum des Sprosses beitragen. Wie wir oben gesehen haben, gibt es im Pflanzenembryo neben dem apikal-basalen Muster aber auch ein radiales Muster. In Arabidopsis und anderen Dikotyledonen durchläuft aber der apikale Teil ein bilaterales Symmetriestadium; dabei stehen die beiden embryonalen Blätter (die Kotyledonen) einander direkt gegenüber. Missbildungen oder offensichtliche Fusionen der Kotyledonen in frühen Keimlingen können Defekte bei diesem Übergangsprozess anzeigen. Eine Reihe von Arabidopsis-Mutanten zeigt genau derartige Phänotypen, darunter pin-formed, monopteros und pinoid (die den Auxin-Transport und/oder dessen Signalweg beeinflussen) oder shoot meristemless (stm) und cup-shaped cotyledon 1 und 2 (cuc1 und cuc2), die zusätzliche Defekte bei der Bildung des apikalen Sprossmeristems zeigen. Das Expressionsmuster von CUC2 und STM ist in Abb. 11.4a gezeigt; Abb. 11.4b zeigt beispielhaft und schematisch zwei DoppelMutanten (cuc1 cuc2 und pin1 pid) und deren Wirkung auf den Auxin-Fluss.

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Abb. 11.4 a–e Bildung des apikalen Sprossmeristems. a Expressionsmuster von CUC2 und STM während der Embryonalentwicklung von Arabidopsis. Die schematische Darstellung einer frontalen Ansicht eines schrittweise sich ändernden Embryos (vgl. oben als Referenz). Die Striche durch den Embryo zeigen die Schnittebene an; die Expressionsmuster von CUC2 bzw. STM sind schematisch dargestellt. b Arabidopsis-Embryonen im Übergangsstadium bzw. frühen Herzstadium, wobei sich der Embryo in die Domänen der Kotyledonen (hell- bzw. dunkelgrün) und des Meristems (orange) teilt. Die Pfeile deuten die Richtung des Auxin-Transports an. c Querschnitt durch den apikalen Bereich eines Wildtyp-Embryos; die Domänen zukünftiger Gewebe sind angedeutet: apikales Sprossmeristem (dunkles orange), der Bereich zwischen den Kotyledonen (helles orange), die adaxiale Domäne der Kotyledonen (Spitze; dunkelgrün) und die abaxiale Do-

mäne der Kotyledonen (unten, hellgrün). Das Meristem hat einen geringen Gehalt an Auxin, aber eine hohe Expression von CUC – umgekehrt ist die Situation an den Vorläufern der Kotyledonen. d Querschnitt durch eine tassenförmige Doppelmutante (cuc1 cuc2): Es findet keine Trennung der Keimblätter statt, und es wird kein apikales Sprossmeristem gebildet. e Querschnitt durch die apikale Domäne eines pin1 pid-Embryos: Diese Embryonen bilden keinen PIN1-Auxin-Transporter (und auch keine PID-Kinase, die PIN1 an die apikale Seite der Zelle positioniert). Ohne hohe Auxin-Konzentrationen in den Vorläufern der Keimblätter würde sich CUC überall in der apikalen Domäne anreichern und das Auswachsen der Kotyledonen verhindern. (a nach Paquette u. Benfey 2001, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier; b–e nach Jenik u. Barton 2005, mit freundlicher Genehmigung der Company of Biologists)

11.2 Entwicklungsgenetik der Pflanze

Abb. 11.5 a–d Signale zwischen Meristem und Blättern. a Es ist ein Keimling dargestellt, der für die starke FunktionsverlustMutation stm-1 homozygot ist. Es wird kein apikales Sprossmeristem gebildert, und die Keimblätter sind fusioniert (Pfeil). b Es ist das Blatt einer Pflanze gezeigt, die ektopisch STM exprimiert. An der adaxialen Blattoberfläche werden ektopische Sprossmeristeme gebildet (Pfeil). c Das Modell zeigt eine mögliche Wechselwirkung zwischen STM, AS1 und KNAT1/2: SHOOTMERISTEMLESS (STM) codiert für einen KNOX-HomöodomänenTranskriptionsfaktor, der im ganzen apikalen Sprossmeristem

exprimiert wird, ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1) codiert für einen MYB-Transkriptionsfaktor, und KNAT1 (und KNAT2; KN1-like in Arabidopsis thaliana, auch als BREVIPEDICELLUS bezeichnet, Gensymbol: BP) für einen KNOX-Homöodomänen-Transkriptionsfaktor. Genetische Analysen deuten darauf hin, dass STM im apikalen Sprossmeristem AS1 negativ reguliert, das seinerseits die Expression von KNAT1 bzw. KNAT2 hemmt. d Als Alternative wird diskutiert, dass AS1 und STM antagonistisch auf die Expression von KNAT1 (bzw. KNAT2) einwirken. (Nach Scofield u. Murray 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Blätter entstehen aus Gruppen von Gründerzellen, die die periphere Zone des Sprossmeristems verlassen. Die Blattanlage umfasst Zellen aus allen drei Schichten des Meristems. Erkennbar wird die Blattanlage als seitlicher Höcker; offensichtlich ändert sich mit der Ausgliederung der Blattanlage die Orientierung der Zellen. Das neu gebildete Blattprimordium besteht aus etwa 100 Zellen, während die Zellzahl in einem fertig ausgebildeten Primärblatt von Arabidopsis auf annähernd 130.000 Zellen geschätzt wurde. Das Blatt wird in drei Regionen gegliedert: die Spreite, die Mittelrippe und den Stiel (Petiole). In der Spreite können wir weiterhin die Epidermis, das Palisadenparenchym, das Schwammparenchym und die Leitbündel unterscheiden. Die Abfolge dieser Gewebe in der Spreite spiegelt die dorso-ventrale Achse des Blattes wider. Als dorsal wird die Oberfläche zum Spross hin (adaxial), als ventral die vom Spross wegzeigende (abaxiale) Unterseite bezeichnet. Die von der Basis zur Spitze des Blattes verlaufende Längsachse wird proximo-distal genannt.

Die Entwicklung der Blatthaare (Trichome) ist als genetisches System ideal, da aufgrund ihrer charakteristischen Verzweigungen und ihrer regelmäßigen Verteilung auf der Blattfläche mutante Phänotypen leicht erkannt werden können. Trichome entwickeln sich aus einzelnen Epidermiszellen junger Blattprimordien mit einem Abstand von etwa 4 Zellen. Die Verzweigung der Trichome orientiert sich an der Längsachse des Blattprimordiums: Der zuerst gebildete Ast zeigt zur Blattbasis, der sich erneut verzweigende Hauptast zur Spitze. Die Auswahl einer Trichomzelle erfolgt durch laterale Inhibition. Mutationen in zwei Genen, GLABRA1 (GL1) und TRANSPARENT TESTA GLABRA (TTG), führen zu einem Ausfall der Trichomentwicklung. GL1 codiert für einen Transkriptionsfaktor mit Myb-Domäne, TTG für ein Protein mit WD40-Wiederholungseinheiten (konservierter Bestandteil von G-Proteinen: 40 Aminosäuren mit einem zentralen Trp-Asp-Motiv; diese beiden Aminosäuren werden im Ein-Buchstaben-Code mit W bzw. D abgekürzt). Die Prozesse bei der Trichomentwicklung sind ähnlich der bei der Bildung von Wurzelhaarzellen. Mehr als 40

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Abb. 11.6 a–c KNOX-Genexpression und Blattformen. Der Rand eines einfachen Blattes kann glatt (a, links), buchtig (b, links) oder gefiedert (c, links) sein. Es ist ein hypothetisches Modell gezeigt, wie die Rekrutierung der KNOX-Funktion in Blättern zur unterteilten Form führt. a In Arabidopsis sind die Gene SHOOTMERISTEMLESS (STM), KNAT1 und UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO) im apikalen Sprossmeristem exprimiert (lila), wohingegen ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1), AS2 und das Giberellin-Biosynthese-Gen GA20ox1 in den Blättern exprimiert wird (grün). STM hemmt AS1, AS2 und GA20ox1 und stimuliert UFO, wohingegen AS1 und AS2 KNAT1 hemmen. Diese Wechselwirkungen begrenzen die nicht determinierenden Faktoren auf das apikale Sprossmeristem und umgekehrt die determinierenden Faktoren auf das Blatt, was zu einer einfachen

Blattform führt. b Die ektopische Expression von KNAT1 oder STM in Arabidopsis durch einen CAMV-35S-Promotor hemmt die Expression von GA20ox1 in den Blättern, was zur buchtigen Blattform beiträgt. Ebenso führt die ektopische Expression von UFO zu buchtigen Blättern. c Dieses Modell postuliert, dass an der Bildung der gefiederten Blattform, wie wir sie von der Tomate (Mitte) kennen, die Überexpression von KNOX-Genen in den Blättern beteiligt ist und so einerseits zur Hemmung mancher Gene (z. B. GA20ox1) und andererseits auch zur Aktivierung von KNOX-Zielgenen in den Blättern führt (z. B. UFO). Allerdings führen in anderen Spezies (z. B. Erbse, rechts) KNOXunabhängige Signalwege zu gefiederten Blättern. (Nach Tsiantis u. Hay 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Mutationen sind beschrieben, die die Morphogenese der Trichome betreffen. Die Analyse von Mutanten hat auch viel zum Verständnis der Sprossentwicklung beigetragen. Im Zentrum steht dabei die Beschränkung der Zellzahl im Sprossmeristem durch ein einfaches Rückkopp-

lungssystem und damit die Aufrechterhaltung dieser Stammzellnische im zentralen Bereich. Verlustmutationen in diesem Rückkopplungssignalweg haben entsprechend unterschiedliche Auswirkungen: Mutationen in einem der drei CLAVATA(CLV)-Gene führen zu einem 1000fachen Anstieg der Zellzahlen im api-

11.2 Entwicklungsgenetik der Pflanze

kalen Sprossmeristem, wohingegen Mutationen in dem Homöoboxgen WUSCHEL (WUS) dazu führen, dass das apikale Sprossmeristem nicht erhalten bleibt. CLV-Proteine schränken die Aktivität von WUS ein, wohingegen WUS die Aktivität von CLV3 erhöht – damit wird ein Rückkopplungsmechanismus aufgebaut, der die Größe des Meristems erhält. Allerdings ist darüber hinaus noch die Aktivität des Transkriptionsfaktors KNOX wichtig. Die entsprechende Mutation knotted-1 (kn1) wurde zuerst in Mais entdeckt und verursacht dort Knoten in den Blättern, die durch undeterminiertes Gewebe gebildet werden. In Arabidopsis eng verwandt damit ist das Gen STM (SHOOTMERISTEMLESS), dessen Funktionsverlust dazu führt, dass das Sprossmeristem nicht erhalten bleiben kann. Zu dieser Genfamilie gehören insgesamt 4 Gene: STM, KNAT1, KNAT2 und KNAT6 (engl. KN1like in Arabidopsis thaliana). Abb. 11.5 zeigt die massiven Auswirkungen einer Funktionsverlust-Mutation im Gen stm-1. Auch die Blattformen werden durch das Zusammenspiel verschiedener Gene erzeugt, wobei Gene, die wir bisher schon kennengelernt haben, wichtige Rollen spielen (z. B. CUC, KNAT1, KNOX, PIN1, STM); allerdings sind hier noch die Gene AS1 und AS2 (ASYMMETRIC LEAVES) beteiligt. Ein Modell dieser Interaktionen für verschiedene Blattformen ist in Abb. 11.6 gezeigt.

Das Wurzelmeristem wird im Herzstadium aktiv und

weist eine radiale Organisation auf. Mutationen, die die Wurzelbildung betreffen, beeinflussen im Wesentlichen das radiale Muster. Das Sprossmeristem ist dagegen in Schichten und Zonen gegliedert. Diese Gliederung wird durch eine Rückkopplung aufrechterhalten, an der die Genprodukte von CLV und WUS beteiligt sind. Die Form der Blätter wird durch verschiedene aktivierende und reprimierende Prozesse unter wesentlicher Beteiligung des Transkriptionsfaktors KNOX gesteuert.

Verschiedene Experimente in den letzten Jahren deuten darauf hin, dass „kleine“ RNAMoleküle (Kapitel 7.5) eine bedeutende Rolle bei der Ausbildung der Asymmetrie der Blätter spielen: Die Oberseite (adaxial) entwickelt sich in größerer Nähe zum apikalen Sprossmeristem als die Unterseite (abaxial). An der Aufrechterhaltung dieser Polarität sind eine ganze Reihe verschiedener Transkriptionsfaktoren beteiligt. Einige dieser Transkriptionsfaktoren werden aber nicht nur über ein hierarchisches Netz von anderen Transkriptionsfaktoren reguliert, sondern sind darüber hinaus auch Zielgene verschiedener miRNAs. Offensichtlich sind diese miRNAs wichtig,

um eine Balance zwischen verschiedenen antagonistischen Determinanten zu halten. Dies ist in der Entwicklungsbiologie bisher einmalig, und man wird beobachten müssen, ob sich hier ein neues entwicklungsbiologisches Paradigma herausbildet oder ob es auf (einige) Pflanzenarten beschränkt bleibt. Eine aktuelle Übersicht über dieses Phänomen bietet Chitwood et al. (2007).

11.2.3 Blütenentwicklung Blüten entsprechen einem modifizierten Spross, in dem das Längenwachstum in den Internodien unterbleibt und dadurch mehrere Blattrosetten dicht übereinander zu liegen kommen. Diese Blattrosetten (Wirtel, engl. whorl) formen bei Arabidopsis und Antirrhinum die unterschiedlichen Bestandteile der Blüte, die Blütenhülle (Perianth) aus den Kelchblättern (Sepalen, engl. sepals) und den Blütenblättern (Petalen, engl. petals) sowie den reproduktiven Organen, d. h. den Staubblättern (engl. stamens) und den Fruchtblättern (Karpelle, engl. carpels). Die jeweils charakteristische Morphologie der verschiedenen Blütenbestandteile bietet die Möglichkeit, nach Mutationen dieser verschiedenen Strukturen zu suchen und ihre funktionelle Hierarchie zu bestimmen. Mutationen, die Blütenbildung betreffen, lassen sich in zwei Hauptgruppen einordnen: ï Mutationen in der Blühinduktion (engl. floral evocation) und ï Entwicklungsveränderungen der Blüten. Die Induktion der Blütenbildung erfolgt durch ein internes und umweltbedingtes Signal im apikalen Meristem der Sprossachse, das zur Entstehung eines Blütenmeristems führt und die Ausbildung der blütenspezifischen Strukturen zur Folge hat. Zu den umweltbedingten Signalen gehören in erster Linie Temperatur und Licht. In der Abb. 11.7a sind Beispiele für Arabidopsis-Mutanten gezeigt, deren Blütenentwicklung verändert wird: In der agamous-Mutante werden die Staubblätter durch Blütenblätter ersetzt, und statt der Fruchtblätter beobachten wir eine Wiederholung der Abfolge Kelchblätter-Blütenblätter-Blütenblätter. Diese Veränderung entspricht einer homeotischen Transformation, wie sie ursprünglich bei Drosophila entdeckt und beschrieben wurde (Kapitel 11.4.5). Bei einer Überexpression von APETALA3 (AP3) und PISTILLATA (PI) bilden sich Blütenblätter, wo sich normalerweise Kelchblätter befinden, und Staubblätter an der Stelle von Fruchtblättern. Unter diesen Bedingungen werden keine Blätter in Blütenorgane umgeformt, sondern erst dann, wenn auch SEPALLATA zusätzlich konstitutiv exprimiert wird. Mutationen, die die struk-

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

turelle Differenzierung der Blüte betreffen, lassen sich verschiedenen Klassen zuordnen: ï Eine erste Gruppe von Mutationen betrifft die frühen Ereignisse nach der Blüteninduktion: Sie verhindern die Ausbildung der eigentlichen Blüten (des Blütenprimordiums). So werden bei manchen Mutanten nur Hochblätter gebildet, bei anderen unterbleibt die normale Differenzierung der Blüte völlig, und es werden stattdessen nur sprossartige Gebilde anstelle der Blüte geformt. ï Eine zweite Gruppe von Mutationen führt zu Symmetrieveränderungen der Blüte. ï Eine dritte Gruppe von Mutationen bewirkt die Veränderungen der Identität der Wirtel innerhalb der Blüte (homöotische Mutationen). Dieser letzte Mutantentyp zeigt einige formale Ähnlichkeiten mit bestimmten Aspekten der Embryogenese von Drosophila (Kapitel 11.4) und soll deshalb hier besprochen werden. Die Blütenorgane der meisten Dikotyledonen sind in Wirteln angeordnet; die vier Blütenwirtel enthalten von außen nach innen die Sepalen (Kelchblätter, w1), Petalen (Blütenblätter, w2), Stamina (Staubblätter, w3) und zum Fruchtknoten verwachsene Karpelle (Fruchtblätter, w4). Die Zahl der Organe, ihre Typen und ihre Anordnung charakterisieren den „Bauplan“ einer Blüte (Abb. 11.8a).

Abb. 11.7 a, b Blüten bei Arabidopsis. a. Die agamous (ag)Mutante im Vergleich zum Wildtyp. In der ag-Mutante entwickeln sich Blütenblätter an den Positionen, die üblicherweise von Staubblättern eingenommen werden, und ein anderes Blütenmeristem ersetzt die Fruchtblätter. b Die Herstellung von Funktionsgewinn-Mutanten durch konstitutive Überexpression der Gene APELATA3 (AP3) und PISTILLATA (PI) führt zu Blüten mit Blütenblättern an Stellen, wo sich sonst Kelchblätter befinden, und mit Staubblättern, wo sich üblicherweise Fruchtblätter entwickeln (oben). Wenn auch noch SEPALLATA (SEP) ektopisch exprimiert wird, werden alle Blätter (außer den Keimblättern) in Blütenblätter umgewandelt (unten). Werden alle derartigen Gene ausgeschaltet (Mitte: ap2 pi ag spt), führt das zu Blüten, die nur aus Blättern bestehen. (Nach Pruitt et al. 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Eine intensive Analyse von Mutanten bei Antirrhinum und Arabidopsis in der Gruppe um Heinz Saedler führte zunächst zur Identifizierung verschiedener rezessiver Mutanten, die eine unmittelbare Blütenbildung zeigen. Das gab Anlass zu der Hypothese, dass die „Grundeinstellung“ der Pflanze das Blühen ist und ein Repressor notwendig ist, um vegetatives Wachstum sicherzustellen. Ein Beispiel für ein solches Gen von Antirrhinum ist deficiens (def), dessen Mutation bei Antirrhinum zur Veränderung der beiden mittleren Wirtel 2 und 3 führt und statt Staubblättern Fruchtblätter und statt Petalen Sepalen entstehen lässt. Dieses Gen codiert für das DEF-A-Protein, das eine Domäne mit DNA-bindenden Eigenschaften enthält. Es gleicht strukturell Transkriptionsregulationsfaktoren von Hefen (Gen MCM1) und Säugern (Gen SRF). Ein sequenzverwandtes Protein (AG) hat man auch als Produkt des Gens agamous (ag) von Arabidopsis gefunden (Abb. 11.7). Alle diese Proteine gehören zu einer Gruppe von Transkriptionsfaktoren, die eine DNA-bindende Region besitzen und Dimere bilden. Die DNA-bindende Domäne dieser Gruppe von Proteinen wird als MADS-Box bezeichnet (abgeleitet von den jeweils ersten Buchstaben der Proteinbezeichnungen MCM1, AG, DEF-A, SRF; SchwarzSommer et al. 1990).

11.2 Entwicklungsgenetik der Pflanze Abb. 11.8 a–c Das ABC-Modell. a Bauplan von Anthirrhinum majus. Von außen nach innen enthalten die Blütenwirtel 5 Sepalen (w1); w2 ist hier sichtbar als Ring (Petalen); w3 bildet die Stamina und w4 den Fruchtknoten (Karpelle). b Das vereinfachte ABC-Modell der Identitätsgene für die Blütenorgane. Das Schema gibt einen Längsschnitt durch eine Blütenhälfte wieder, der alle 4 Typen von Blütenorganen repräsentiert. Im Wildtyp sind die genetischen A-, B- und C-Funktionen räumlich so verteilt, dass A in Wirtel 1 und 2, B in Wirtel 2 und 3 und C in Wirtel 3 und 4 aktiv sind. c Modell der genetischen Kontrolle der Identität von Blütenorganen. Oben (1) ist das erweiterte ABCE-Modell für Wildtypen gezeigt; die Identitäten sind unten angegeben. Das Modell der „gleitenden Grenzen“ (Mitte, 2; engl. sliding boundary) erklärt die Anwesenheit morphologisch identischer petaloider innerer und äußerer Wirtel (wie bei Lilien und Tulpen). Das Modell der „verblassenden Grenzen“ (unten, 3; engl. fading borders) versucht die graduellen Übergänge zwischen Blütenteilen in einigen basalen Angiospermen zu erklären. (a, b nach Saedler et al. 2001, mit freundlicher Genehmigung von Panstwowe Wydawnictwo Naukowe; c nach Soltis et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Schließlich führten weitere Untersuchungen zur Unterscheidung von drei Mutantengruppen: ï A-Mutanten ersetzen die Organe in w1 und w2: Statt Sepalen und Petalen werden Stamina- bzw. Karpellen-ähnliche Strukturen gebildet; ï B-Mutanten haben veränderte Organe in w2 und 3, wo Sepalen und Karpelle gebildet werden; diese sind steril; ï C-Mutanten zeigen keinerlei Geschlechtsorgane; Petalen und Sepalen ersetzen Stamina und Karpelle in w3 bzw. w4. Die drei Funktionen scheinen die Organidentität in einer kombinatorischen Weise zu spezifizieren: Die A-Funktion spezifiziert Sepalen und ‒ zusammen mit der B-Funktion ‒ die Petalen, wohingegen B- und C-Funktionen für Stamina benötigt werden und die C-Funktion alleine die Karpellenbildung determiniert. Allerdings ist dieses Modell (Abb. 11.8b) stark vereinfacht und bildet die Wirklichkeit nicht vollständig ab – so gibt es in Antirrhinum keine rezessive Mutante der A-Klasse (und der A-Phänotyp wird durch eine dominante C-Klasse-Mutation hervorgerufen). Aufgrund der Spezifität der einzelnen Genklassen in Bezug auf die Ausbildung der Organidentität können wir diese Gene als homöotische Gene bezeichnen (vgl. dazu auch Kapitel 11.4.6). Auf der Grundlage weiterer Arbeiten an Petunien wurde das ursprüngliche ABC-Model um eine weitere Kategorie (D) erweitert; die D-Funktions-Gene führen bei Überexpression in transgenen Petunien zur ektopischen Bildung von Samenanlagen im Perianth und

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

wurden deshalb auch als Hauptgen (engl. master control gene) der Samenanlagen (engl. ovule) bezeichnet. Das klassische Beispiel eines D-Klasse-Gens ist SEEDSTICK, das aber mit AGAMOUS aus der C-Klasse eng verwandt ist. Die Gene der D-Klasse sind außerdem nicht immer ortholog. Von besonderer Bedeutung für die Bildung der gesamten Blütenorgane bei Arabidopsis sind Gene, die in der E-Klasse zusammengefasst werden; sie sind mit dem ABC-System eng verbunden. Als aktuelles Modell für Blütenbildung bei Angiospermen ist daher das ABCE-Modell dargestellt (Abb. 11.8c). Neuere Arbeiten zeigen, dass an der Feinregulation dieses Systems auch miRNA-Gene beteiligt sind (der interessierte Leser sei beispielsweise auf die Arbeit von Cartolano et al. (2007) verwiesen). Die Untersuchungen zur Sequenz der Gene des ABCE-Systems haben auch gezeigt, dass die Herausbildung der Identitäten der reproduktiven Organe vor etwa 300 Millionen Jahren erfolgte; ein Stammbaum innerhalb der zweikeimblättrigen Pflanzen ist in Abb. 11.9 dargestellt. Man nimmt an, dass es eine ursprüngliche Funktion der C-Gene ist, zwischen reproduktiven (C-Expression „an“) und nicht-reproduktiven Organen (C-Expression „aus“) zu unterscheiden. Überlagert wird dies durch die unterschiedliche Expression der B-Gene, um zwischen männlichen und weiblichen reproduktiven Organen zu unterscheiden. Das ABC-Modell erlaubt auch, einige „Sprünge“ in der Evolution der Pflanzen zu erklären: Eine Verschiebung im Expressionsmuster der A-, B-, C-Genfunktionen führt zu einem völlig anderen Muster der Blütenorgane ‒ wie in Abb. 11.8c gezeigt ist. Solche homöotischen Mutanten können durchaus kritische Schritte in den makro-evolutionären Übergangsperioden darstellen, wenn sich die wenigen einzelnen Individuen in großen Wildtyp-Populationen zunächst halten und dann durchsetzen können. Eine solche Mutante ist die Spe-Mutante (engl. stamenoid petals) in Capsella bursapastoris (Hirtentäschelkraut). Diese Mutante wurde schon vor knapp 200 Jahren beschrieben (Opiz 1821) und ist in der Natur verbreitet. Diese Mutante zeichnet sich durch eine staminale Pseudopetalie aus und wurde auch schon als eigene Art bezeichnet (C. apetala). Die molekulare Erklärung ist eine Verschiebung der Expressionsmuster der A- und C-Funktionsgene im 2. Wirtel: Verlust der A-Aktivität auf Kosten der C-Aktivität.

Homöotische

Gene, die bei Pflanzen im Rahmen des ABC-Systems identifiziert wurden, codieren für Transkriptionsfaktoren. Die DNA-bindende Domäne wird als MADS-Box bezeichnet.

Wir haben oben gesehen, dass Temperaturen (und hier vor allem kühle Temperaturen zwischen wenigen Grad über dem Gefrierpunkt und etwa 15 °C) für die Blühinduktion wichtig sind; dieser Effekt wird auch als Vernalisation bezeichnet. Oft vergeht allerdings eine längere Zeitspanne zwischen dem auslösenden Temperaturereignis und dem tatsächlichen Beginn der Blüte ‒ die Pflanze muss sich also „daran erinnern, dass Winter war“. Eine Reihe neuer Arbeiten zeigt nun, dass Vernalisation zu einem epigenetischen Wechsel im klassischen Sinn des Wortes führen kann: einer Veränderung, die auch in Abwesenheit des Signals stabil bleibt. Ein wichtiges Gen in diesem Zusammenhang ist FLOWERING LOCUS C (FLC): FLC codiert für einen MADS-Box-Transkriptionsfaktor und ist ein starker Repressor der Blütenentwicklung. In der ersten Wachstumsperiode verhindert eine hohe Konzentration an FLC eine Blüte ‒ bis zur Vernalisation. FLC-Expression wird durch ausgedehnte Kälteeinwirkung reprimiert, und diese Repression von FLC wird für den Rest des Pflanzenlebens aufrechterhalten, auch wenn die Kälteperiode endet: die „Erinnerung an den Winter“ manifestiert sich also als stabile Repression von FLC, und Vernalisation ist ein epigenetischer Wechsel in der FLC-Expression. Der „WinterCode“ für die Abschaltung von FLC liegt offensichtlich in einer Methylierung des Chromatins im Bereich des FLC-Gens (Methylierung von Histon H3 an den Positionen K9 und K27: H3K9 und H3K27; Kapitel 6.2.4). Abb. 11.10 vermittelt einen Eindruck von der Komplexität dieser Regulation ‒ und auch von den vielen offenen Fragen in diesem Zusammenhang. Zu diesem „Winter-Code“ kommt aber auch noch die Messung der Tageslänge – denn erst, wenn im Frühjahr oder Sommer auch die Tage lang genug sind, bilden sich die Blüten aus. Dazu braucht die Pflanze ein System, um diesen Lichtwechsel zu erkennen. Bei Arabidopsis zeigte sich, dass das zentrale Element der Tageslängenmessung in der zyklischen Regulation des Gens CONSTANS (CO) liegt. Das CO-Gen codiert einen Zinkfinger-Transkriptionsfaktor und aktiviert lichtabhängig das FT-Gen (FLOWERING LOCUS T). Die Signalkaskade kann nur beginnen, wenn gleichzeitig CO exprimiert wird (am Nachmittag) und genügend Licht vorhanden ist (Koinzidenz-Modell; Abb. 11.11a). Einen Überblick über diese Signalkaskade sowie über die Integration räumlicher und zeitlicher Expressionsmuster bei der Induktion der Blütenbildung gibt Abb. 11.11b‒f.

11.2 Entwicklungsgenetik der Pflanze

Abb. 11.9 Evolution des Expressionsmusters von MADS-BoxGenen in Blüten von Angiospermen. Der Stammbaum der Blütenpflanzen zeigt für die verschiedenen Regulationsmodelle (Abb. 11.8c) die dazugehörigen Modellorganismen: (i) Das klassische ABC-Modell, wie es für die Kern-Eudikotylen und einige Monokotylen entwickelt wurde. (ii) Das Modell der „gleitenden Grenzen“ ist auf einige basale Eudikotylen sowie Monokotylen anwendbar. (iii) Das Modell der „verblassenden Grenzen“ kann

die Erscheinungsformen bei basalen Angiospermen erklären. Der gestrichelte Pfeil weist darauf hin, dass mindestens bei einem Angiosperm (Asimina, Flaschenbaum bzw. Elefantenfuß) ein Schema existiert, das dem klassischen ABC-Schema entspricht. Der Stamm der Eudikotylen ist grau unterlegt; die Kern-Eudikotylen sind dunkler grau. C: Karpellen; P: Petalen; Se: Sepalen; Sm: Staminodien; ST: Stamina; T: Tepalen (Nach Soltis et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Abb. 11.10 Das Modell der Chromatin-abhängigen Regulation der FLC-Expression sieht vor, dass der FLC-Locus in drei verschiedenen Konfigurationen existieren kann: einem aktiven Zustand, einem reprimierten Zustand und einem heterochromatischen Ruhezustand. Ac: acetylierte Lysine der Histone H3 und H4; EFS: EARLY FLOWERING IN SHORT DAYS; ELF: EARLY FLOWERING; FLD: Flowering locus D; FVE: Gen für späte Blüte; HDAC: Histon-Deacetylase; meK9: methyliertes Lysin 9 des His-

tons H3; meK27: methyliertes Lysin 27 des Histons H3; 3mek4: trimethyliertes Lysin 4 des Histons H3; MSI: MULTICOPY SUPPRESSOR OF IRA1; PAF: RNA-POLYMERASE-ASSOCIATED FACTOR; PIE: PHOTOPERIOD-INDEPENDENT EARLY FLOWERING; RNApolII: RNA-Polymerase II; VIP: VERNALIZATION INDEPENDENT PLOWERING; VRN: VERNALIZATION. (Nach Reyes 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Abb. 11.11 a–f Kontrolle der Blütenbildung durch Photoperiodizität. a Die Funktion des Takt-gesteuerten Schlüsselgens der Blütenentwicklung wird durch Licht reguliert und induziert dadurch die Expression der Blüten-Gene. Die Blütenbildung wird beschleunigt, wenn die Expression des Schlüsselgens am Nachmittag mit Tageslicht zusammenfällt. b–d Räumliches Expressionsmuster (blau) im Blatt von bekannten Komponenten (schwarze Schrift) oder von unbekannten Transkriptionsfaktoren (TFs; grüne Schrift). e–f Das tägliche Expressionsmuster von bekannten Komponenten im photoperiodischen Signalweg der Blütenbildung unter den Bedingungen eines langen bzw. kurzen Tages. Die Gene, die durch die „innere Uhr“ reguliert wer-

den, sind durch ein Uhr-Symbol gekennzeichnet. Die hemmende oder aktivierende Wirkung der Proteine ist durch Pfeile bzw. Querstriche angedeutet. AP: APETALA; CDF: CYCLING DOF FACTOR; CO: CONSTANS; COP: CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC; cry: Cryptochrom; EBS: EARLY BOLTING IN SHORT DAYS; FKF1: FLAVINBINDING, KELCH REPEAT, F-Box; FD: Interaktionspartner von FT; FLC: FLOWERING LOCUS C; FT: FLOWERING LOCUS T; GI: GIGANTEA; HAP: Transkriptionsaktivator, LHP: LIKE HETEROCHROMATIC PROTEIN; phyA–E: Phytochrome A–E; RFI: RED AND FAR-RED INSENSITIVE; SPA: SUPRESSOR OF PHYA-105; TFL: TERMINAL FLOWER; TF(s): Transkriptionsfaktor(en); TSF: TWIN SISTER OF FT. (Nach Imaizumi et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

11.2 Entwicklungsgenetik der Pflanze

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

11.3 Entwicklungsgenetik des Fadenwurms Caenorhabditis elegans 11.3.1 Embryonalentwicklung von C. elegans Den Fadenwurm Caenorhabditis elegans haben wir bereits im Kapitel 5.4.3 als einen wichtigen Modellorganismus der modernen Genetik kennengelernt. Die Embryonalentwicklung von C. elegans (Abb. 11.12) verläuft sehr schnell – die Larve schlüpft bei einer Inkubationstemperatur von 20 °C nach ca. 15 Stunden. Allerdings erfordert die Reifung der verschiedenen Larvenstadien bis zum erwachsenen Tier dann noch einmal etwa 50 Stunden. Die Eizelle von C. elegans hat einen Durchmesser von 50 μm; die Polkörper bilden sich nach der Befruchtung. Bevor der männliche und weibliche Zellkern verschmelzen, kommt es schon zu einer unvollständigen Furchung; sie wird aber erst nach der Fusion vollendet. Diese erste Furchung verläuft asymmetrisch; dabei entstehen eine größere anteriore AB-Zelle und eine kleinere posteriore P1-Zelle (Abb. 11.13). Bei der zweiten Teilung entsteht aus der AB-Zelle die anteriore

ABa- und die posteriore ABp-Zelle, während aus der P1-Zelle die P2- und die EMS-Zelle entsteht. Die EMSZelle entwickelt sich zu Epidermis, Muskel- und sensorischen Zellen weiter (Name!). In diesem Stadium kann man bereits die Hauptachsen erkennen, da P2 posterior und ABp dorsal liegt. Durch weitere Furchungen der AB-Zellen entstehen vor allem Hypodermis (die Außenschichten des Wurms) und zu einem geringeren Anteil auch Muskulatur. EMS teilt sich in E (entwickelt sich später zum Darm) und MS (entwickelt sich zu Muskeln, Drüsen und zu einem geringen Anteil auch zu Neuronen). Aus P2 gehen P3 und C hervor: C bildet Muskeln, Hypodermis und Neuronen, und P3 teilt sich in P4 und D. Während sich die D-Zelle ebenfalls zu Muskulatur weiterentwickelt, entstehen aus P4 die Keimzellen. Auch im Weiteren ist das Geschick einer Zelle genau vorherbestimmt. Im 28-Zell-Stadium setzt die Gastrulation ein, sobald die Nachkommen der E-Zelle, die den Darm bilden, nach innen wandern. Die Embryonalentwicklung gilt mit dem Erreichen des „Brezelstadiums“ und des daran anschließenden Schlüpfens der Larve als beendet. Die frisch geschlüpfte Larve hat jetzt 558 Zellkerne. Eine Übersicht über die Zellgenealogie in der frühen Phase von C. elegans gibt Abb. 11.14a.

Abb. 11.12 a–e Übersicht über die Embryonalentwicklung von C. elegans. Es sind die wichtigsten morphogenetischen Veränderungen in der Embryonalentwicklung von C. elegans dargestellt; links in differenziellem Interferenz-Kontrast („NomarskiOptik“), rechts schematisch. Die Ansicht auf den Embryo ist von lateral oder ventral; die anteriore Seite ist immer links. Der Startpunkt ist die erste Furchungsteilung; die Zeitangaben beziehen sich auf eine Kultur bei 20°C. a Gastrulation: Die ersten Zellen, die von der Bauchseite nach innen wandern, sind Vorläufer der Eingeweidezellen, gefolgt von Vorläuferzellen des Mesoderms und der Keimbahn. b Der Verschluss der ventralen Spalte erfolgt durch kleinräumige Bewegungen der ventralen ektodermalen Zellen. c Bildung der Epidermis und der dorsalen Interkalation: Die zwei Reihen der dorsalen epidermalen Zellen verschieben sich zu einer einzigen dorsalen Zellreihe, was zu einer Verlängerung der dorsalen Epidermis im Verhältnis zur ventralen führt. d Ventraler epidermaler Einschluss durch Ausbreitung der epidermalen Zellschichten. e Vierfaches Längenwachstum des Embryos; die Bildung der Cuticula beginnt ca. 650 Minuten nach der ersten Furchungsteilung. Das Längenwachstum ändert die Form des Embryos nicht mehr wesentlich. (Nach Chin-Sang u. Chisholm 2000, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

11.3 Entwicklungsgenetik des Fadenwurms Caenorhabditis elegans

Eine Besonderheit, die wir schon an anderer Stelle (Kapitel 5.4.3) und insbesondere im Zusammenhang mit Apoptose (Kapitel 5.3.6) kennengelernt haben, ist die definierte Zellzahl des erwachsenen Wurms. Von den 1090 somatischen Zellen des Zwitters sterben 131 in einer reproduzierbaren Art und Weise während der Entwicklung zum erwachsenen Wurm ab („programmierter Zelltod“). Davon sterben 113 während der Embryonalentwicklung, und 98 Zellen von diesen 113

Abb. 11.13 Die ersten beiden mitotischen Teilungen des C. elegans-Embryos. Die maternalen (o) und paternalen (s) Vorkerne erscheinen üblicherweise an den entgegengesetzten Polen der befruchteten Eizelle und wandern dann so, dass sie sich am posterioren Pol treffen. Danach drehen sie sich und bewegen sich in die Mitte, wobei die ersten mitotischen Spindelfasern entlang der anterior-posterioren Achse gebildet werden. Die kleinere, posteriore Zelle teilt sich nach der größeren, anterior gelegenen Tochterzelle. Die Spindel der AB-Zelle bleibt transversal, während sich die P1-Spindel dreht, um mit der anterior-posterioren Achse übereinzustimmen. Die Blastomeren des 4-Zell-Stadiums definieren damit die dorso-ventrale Achse (dorsal: ABp, ventral: EMS; anterior: links, ventral: unten). (Nach Lyczak et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

sind Nachfahren der ursprünglichen AB-Zelllinie, die hauptsächlich die neuronale Zellpopulation bilden. Eine Gesamtübersicht über die Zellgenealogie des Fadenwurms gibt Abb. 11.14b. Wenn wir uns nun die molekularen Spieler in diesen Prozessen ansehen wollen, so können wir bei C. elegans auf eine Reihe von Mutanten mit charakteristischen Phänotypen zurückgreifen (siehe Übersicht bei Rose u. Kemphues 1998). Die erste Gruppe umfasst Mutationen, die für den Embryo letal sind und die Gene betreffen, die in der Eizelle bereits exprimiert werden (maternale Gene). Eine Gruppe davon wird als Par-Gene bezeichnet (partitions defective) und beeinflusst die Polarität der ersten Furchungsteilung. Mutationen in einem der sechs Par-Gene führen zu Änderungen in den frühen Teilungsmustern und zu einem Stopp der Embryonalentwicklung, ohne dass sich die Gesamtzellzahl ändert. Durch die PAR-Proteine wird offensichtlich die Verteilung von solchen Faktoren reguliert, die für die Etablierung der Zellstammbäume notwendig sind (z. B. SKN-1 (skin in exzess), GLP-1 (germline proliferation defective), PIE-1 (pharynx and intestine in excess) und MEX-3 (muscle in excess)). Die PAR-Proteine enthalten wichtige Motive für die intrazelluläre Signalgebung (z. B. Kinase-Aktivitäten, ATP-Bindungsstellen, PDZDomänen), sie sind außerdem meistens an der Peripherie solcher Zellen asymmetrisch verteilt, die sich asymmetrisch teilen. Sie definieren damit nicht-überlappende anterior-posteriore Domänen in der Zygote und in der P1-Zelle sowie dorso-ventrale Domänen in den P2- und P3-Zellen. Ein zweiter wichtiger Schritt ist der Aufbau der Zelllinien, die aus der EMS-Zelle hervorgehen. In genetischen Screens wurden unter anderem Gene identifiziert, die zu verstärkter Mesodermbildung führen (more mesoderm; Gensymbol mom). Drei momGene codieren für Mitglieder des Wnt-Signalweges: mom-2 ist homolog zu Wnt-2, mom-5 entspricht Mitgliedern der frizzled-Rezeptor-Genfamilie und mom-1 entspricht porcupine, das in anderen Systemen eine Rolle bei der Wnt-Sekretion spielt. In mom-Mutanten hat die E-Zelle dieselben hohen Konzentrationen des Proteins POP-1 (posterior pharynx defective) wie die MS-Zelle. Das POP-1-Protein zeigt Homologie zu den LEF-1/TCF-1-Transkriptionsfaktoren, die im Wnt-Signalweg wichtig sind. Eine weitere Auswirkung der mom-Mutationen betrifft die Orientierung der Spindelapparate und hat damit ebenfalls Konsequenzen für die Orientierung der Tochterzellen. Ein dritter Signalweg, der uns auch später noch (Vulva-Entwicklung) und in anderen Organismen immer wieder begegnen wird, ist der Delta/NotchSignalweg. In apx-1-Mutanten (anterior pharynx in excess) bilden die Nachkommen der ABp-Zellen nicht

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

ihren üblichen Phänotyp aus und produzieren stattdessen Pharynxzellen mit anderen ABa-ähnlichen Zellen. Die molekulare Analyse dieses Gens hat gezeigt, dass es für ein Protein codiert, das dem Delta-Protein bei Drosophila ähnlich ist. Delta ist ein Ligand des NotchRezeptors, und das homologe Gen für Notch ist Glp-1; das GLP-1-Protein ist an der Oberfläche beider ABZellen lokalisiert. Daher arbeiten die beiden Proteine APX-1 und GLP-1 vermutlich als Signal und Rezeptor

bei der Wechselwirkung der P2- mit der ABp-Zelle, und die Spezifität der Wechselwirkung wird durch die Lokalisation von APX-1 kontrolliert.

Die frühe Embryonalentwicklung von C. elegans läuft nach einem genau festgelegten Teilungsschema seiner Zellen ab. Faktoren der Wnt- und Delta/Notch-Signalwege spielen dabei eine wichtige Rolle.

Abb. 11.14 a, b Zellgenealogie von C. elegans. a Die frühe Abstammungslinie von C. elegans zeigt den Ursprung der 6 Gründerzellen und die wichtigsten daraus entstehenden Organe, wie anteriorer und posteriorer Pharynx, Darm und Rectum. Aus Gründen einer besseren Übersicht sind weitere Organe, die von einigen wenigen Nachkommen der AB-, MS- und C-Zellen gebildet werden, nicht dargestellt. b Die Abstammungslinien eines Zwitters von C. elegans während der Embryonalphase und den 4 Larvenstadien. Die Gewebe, die während der Larvenstadien angelegt werden, sind jeweils unten angegeben. Die Linien, die während der Larvenstadien den Darm bilden, sind nicht dargestellt, da diese keine neuen Zellen produzieren. (a nach Maduro 2006, mit freundlicher Genehmigung von Wiley; b nach Kipreos 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

11.3 Entwicklungsgenetik des Fadenwurms Caenorhabditis elegans

11.3.2 Organentwicklung bei C. elegans Die frisch geschlüpfte Larve ähnelt in ihrem Aufbau dem erwachsenen Tier; sie ist jedoch noch nicht geschlechtsreif. Die postembryonale Entwicklung vollzieht sich im Laufe von vier aufeinanderfolgenden Häutungen. Die Zellen, die jetzt beim reifenden Tier dazukommen, stammen im Wesentlichen von der posterioren P-Zelle ab. Diese Nachkommen sind als Vorläuferzellen entlang der Körperachse verteilt. Jede dieser Vorläuferzellen gründet eine eigene Zelllinie, die bis zu 8 Zellteilungen durchläuft. Als Beispiel für diese weitere Differenzierung wird hier die Entwicklung der Vulva vorgestellt, die für die Reproduktion erforderlich ist. Sie entsteht aus den Vorläuferzellen P5p, P6p und P7p (Abb. 11.15). Diese 3 Zellen gehören zu einer Gruppe von 6 hypodermalen Vorläuferzellen, aus denen primär P6p ausgewählt wird, den Entwicklungsweg zu einer Vulva einzuschlagen. Aus dieser Zelle gehen 8 Tochterzellen hervor, die zum Vulva-Gewebe beitragen. Die flankierenden Zellen P5p und P7p schlagen den sekundären Entwicklungsweg ein und bringen nur 7 Tochterzellen hervor. Aus diesen insgesamt 22 Abkömmlingen wird schließlich die Vulva gebildet. Die weiter außen liegenden Zellen P3p, P4p und P8p schlagen einen dritten Weg ein: Aus ihnen gehen je zwei Tochterzellen hervor, die zu einer mehrkernigen hypodermalen Zelle verschmelzen, die als hyp7 bezeichnet wird. Obwohl üblicherweise die Entwicklungswege dieser 6 Vorläuferzellen P3p bis P8p nicht verändert werden, haben eine Reihe genetischer und zellbiologischer Experimente (vor allem gezieltes Abtöten einzelner Vorläuferzellen) gezeigt, dass alle 6 Zellen prinzipiell jeden der drei Wege einschlagen können. Diese Zellen haben also das gleiche entwicklungsbiologische Potenzial. Das initiierende und auch über das weitere Zellschicksal entscheidende Signal zur Vulva-Entwicklung geht von einer Zelle aus, die als Ankerzelle bezeichnet wird und über der Zelle P6p liegt. Sie aktiviert durch den epidermalen Wachstumsfaktor (engl. epidermal growth factor, EGF) in der P6p-Zelle eine RAS-MAP-Kinase-Signalkette, sodass diese Zelle den primären Entwicklungsweg einschlägt. Im nächsten Schritt zwingt die P6p-Zelle die benachbarten Zellen P5p und P7p über die Aktivierung eines Notch-ähnlichen Rezeptors in den sekundären Entwicklungsweg und verhindert damit die Ausbildung mehrerer Initiationszentren (laterale Inhibition). Störungen in diesem Signalweg führen zur Ausbildung von Phänotypen, die entweder keine Vulva besitzen (vulvaless; Verlust des aktivierenden Signals der Ankerzelle) oder zusätzliche Vulvae ausbilden (multivulva; Verlust der lateralen Inhibition).

Abb. 11.15 a–c Die Vulva-Entwicklung bei C. elegans. a In der seitlichen Ansicht ist ein Hermaphrodit im 3. Larvenstadium gezeigt (anterior ist links und ventral unten). Die Ankerzelle (engl. anchor cell, AC) befindet sich als Teil der Gonaden oberhalb von P6.p. b Die Stammbäume der Zellen P3.p bis P8.p wurden aus direkten Beobachtungen der Zellteilungen in lebenden Würmern ermittelt. Die primären, sekundären und tertiären Zellen sind mit den entsprechenden Ziffern gekennzeichnet und wurden aufgrund der Eigenschaften ihrer Abkömmlinge charakterisiert. S: Fusion mit Hyp7; L: Längsteilung und Anheftung an die ventrale Cuticula; T: Transversalteilung und Ablösung von der ventralen Cuticula; N: keine Teilung. Die gestrichelte Linie bei P3p deutet an, dass diese Teilung nur selten stattfindet. c Seitliche Ansichten ausgewachsener Hermaphroditen des Wildtyps sowie der Mutanten Multivulva und Vulvaless. Die Stammbäume der einzelnen Zelllinien sind unter b angegeben. (Nach Kornfeld 1997, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Die Vulva entsteht durch schrittweise Differenzierung von Vorläuferzellen, die zunächst das gleiche entwicklungsbiologische Potenzial haben. Dieser Prozess wird durch den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und eine Ras-MaP-Kinase-Signalkette einerseits und laterale Inhibition andererseits gesteuert.

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

11.4 Entwicklungsgenetik von Drosophila melanogaster Die Taufliege Drosophila melanogaster (Kapitel 5.4.4) ist einer der wichtigsten Modellorganismen der Genetik allgemein, aber auch der Entwicklungsgenetik. Die Forschung der letzten Jahre hat uns gezeigt, dass viele grundlegende morphologische Prozesse bei der Ausbildung von Körperachsen, der Musterbildung und der Organentwicklung bei Drosophila von Genen gesteuert werden, die auch in höheren Tieren und dem Menschen von entscheidender Bedeutung sind. Von daher kommt Drosophila in der modernen Entwicklungsgenetik eine zentrale Rolle zu. Im Folgenden sollen einige der wichtigsten Aspekte kurz und exemplarisch dargestellt werden; für weiterführende Darstellungen sei der interessierte Leser auf die angegebenen Übersichtsartikel verwiesen.

11.4.1 Keimbahnentwicklung bei Drosophila Die wichtigsten grundlegenden morphologischen Eigenschaften eines Embryos werden bei Drosophila bereits während der Oogenese festgelegt. Hierbei handelt es sich nicht nur um die Hauptachsen des bilateralsymmetrischen Körpers des Embryos (also die anterior-posteriore und die dorso-ventrale Achse), sondern es werden gleichzeitig mit den Achsen auch die Hauptabschnitte der Längsgliederung der Embryonen (Kopf, Thorax, Abdomen) in ihrer relativen Position im Embryo vorprogrammiert. Erreicht wird dies durch eine lokalisierte Positionierung von Molekülen im Cytoplasma des (unbefruchteten) Eis. Die Frage nach den Mechanismen, die solchen Induktionsvorgängen zugrunde liegen, richtet sich im Wesentlichen auf zwei Aspekte: ï Wie wird eine differenzielle räumliche Verteilung von Molekülen während der Oogenese erreicht? ï Um was für Moleküle handelt es sich, und wie sind diese Moleküle in der Lage, unterschiedliche Entwicklungswege von Zellen zu induzieren? Die Entwicklung der weiblichen Gameten von Drosophila, wie die einiger anderer Insekten, weist einige Besonderheiten auf. Die Oogonien (Urkeimzellen) entwickeln sich nämlich nicht ausschließlich zu Oocyten, sondern ein Teil von ihnen bildet Nährzellen (engl. nurse cells), die das Wachstum der Oocyten unterstützen, wie ihr Name andeutet. Außerdem tragen zur Entwicklung der Oocyten noch die somatischen Follikelzellen bei, die ihren Ursprung in den somatischen mesodermalen Zellen der Gonadenanlagen haben. Die Ovarien bestehen somit aus unter-

schiedlichen Zelltypen und werden auch als meroistische Ovarien bezeichnet. Sie unterscheiden sich damit von den holistischen Ovarien anderer Insekten, in denen sich alle Oogonien zu Oocyten weiterentwickeln und das Ovarium somit überwiegend aus wachsenden Keimzellen besteht. Ein Drosophila-Ovarium ist in ein Bündel von Ovariolen gegliedert. In jeder Ovariole finden wir eine Reihe von Oocyten in unterschiedlichen Entwicklungsstadien, die sich in jeweils getrennten Eikammern befinden (Abb. 11.16). Distal in jeder Ovariole findet sich zunächst ein nicht weiter untergliederter Bereich, der als Germarium bezeichnet wird. Am distalen Ende des Germariums liegen die Stammzellen, die durch eine mitotische Zellteilung eine primäre Oogonie und eine neue Stammzelle bilden. Jede dieser Oogonien teilt sich weitere vier Mal. Damit ist das Ende der mitotischen Aktivität der weiblichen Keimzellen erreicht. Zu diesem Zeitpunkt beginnen sich einzelne Eikammern auszubilden. Jede dieser Eikammern enthält alle 16 Zellen, die sich von einer gemeinsamen primären Oogonie herleiten, also klonalen Ursprungs sind. Eine dieser Zellen entwickelt sich als Oocyte weiter, während die übrigen 15 Nährzellen bilden. Innerhalb jeder Eikammer entwickelt sich mithin nur eine einzige Oocyte zum Ei. Da die Nährzellen sich von Oogonien ableiten, sind sie (im Gegensatz zu den Follikelzellen) ihrer Herkunft nach als Keimzellen anzusehen. Dieser ontogenetische Ursprung ist deshalb von Bedeutung, weil von diesen Zellen der überwiegende Teil der genetischen Information für die Entwicklung der Oocyte geliefert wird. Das Oocytengenom selbst vollbringt nur eine geringfügige eigene RNA-Syntheseleistung. Die 15 Nährzellen sind untereinander und mit der Oocyte durch cytoplasmatische Brücken verbunden. Die Lage der Oocyte in Bezug zu den Nährzellen wird durch ihre Entstehung während der Zellteilungen festgelegt und bleibt im Laufe der Entwicklung erhalten. Sie liegt im proximalen Teil der Eikammer (Abb. 11.16), dehnt sich jedoch im Laufe der Entwicklung immer mehr in distaler Richtung aus und füllt am Ende ihrer Entwicklung die gesamte Eikammer, während die Nährzellen degenerieren. Die insgesamt etwa 1000 Follikelzellen umschließen anfänglich die gesamte Eikammer. Ab Stadium 8/9 der Oogenese beschränken sie sich jedoch darauf, die wachsende Oocyte zu umgeben, um am Ende der Oogenese ebenfalls zu degenerieren. Einer der wichtigen Beiträge der Follikelzellen zur Entwicklung des Eis ist die Sekretion des Chorions, die mit einer Amplifikation der Chorion-Gene in diesen Zellen verbunden ist, wie bereits früher dargestellt wurde (Kapitel 8.3.3; Abb. 8.31). Außerdem liefern sie wichtige Informationen für die Polarität des Embryos.

11.4 Entwicklungsgenetik von Drosophila melanogaster

In den Nährzellen werden aber nicht nur solche Gene exprimiert, die für die Entwicklung der Oocyte wichtig sind, sondern auch solche, die für die ersten Entwicklungsschritte der Eizelle nach der Befruchtung von Bedeutung sind. Entscheidend für ihre Funktion ist es, dass sie zwar während der Oogenese transkribiert werden, ihre eigentliche Wirkung aber erst im Embryo, also in den Nachkommen, ausüben. Für diese Wirkung ist daher ausschließlich die mütterliche genetische Konstitution entscheidend, während die genetische Konstitution dieser Gene im Embryo für dessen eigene Entwicklung ohne Bedeutung bleibt. Wir bezeichnen diese Gene als maternale Gene; im Gegensatz dazu werden die zygotischen Gene vom Embryo selbst exprimiert. Der Transport der mRNA aus den Nährzellen in die Oocyte erfolgt offenbar mithilfe des Cytoskeletts der Nährzellen unter der Beteiligung von Myofibrillen und anderen Mikrofibrillen des Nährzellcytoplasmas. Dieser Transport bedarf der Mitwirkung bestimmter Gene, zu denen unter anderem das Gen chickadee gehört. L. Cooley zeigte 1992, dass bei dem Ausfall der Genfunktion von chickadee die Ausbildung des cytoplasmatischen Aktinnetzwerks unterbleibt, das unter anderem die Nährzellkerne in einer festen Position verankert. Das Gen chickadee codiert für Profilin, ein Protein, das für die Polymerisation von Aktin erforderlich ist. Durch die Störungen im Cytoskelett der Nährzellen wird der Materialtransport in die Oocyte weitgehend verhindert.

Die Nährzellen stehen über cytoplasmatische Brücken untereinander und mit der Oocyte in Verbindung. Sie liefern den überwiegenden Teil der genetischen Information, die zur Entwicklung der Oocyte benötigt wird. Bei den Genen, die für die Entwicklung des Embryos erforderlich sind, unterscheidet man zwischen maternalen und zygotischen Genen.

Abb. 11.16 Oogenese in einem Ovarialschlauch bei Drosophila. Die weibliche Urkeimzelle (Oogonie) teilt sich in vier Mitosen in 16 Zellen, die durch cytoplasmatische Schläuche miteinander verbunden sind. Eine dieser Zellen wird zur Oocyte und die 15 anderen zu Nährzellen. Während die Oocyte zunächst diploid bleibt und erst später durch eine meiotische Teilung haploid wird, werden die Nährzellen polytän. Follikelzellen umgeben die Nährzellen und die Oocyte. Die so entstandene Struktur schnürt sich vom Keimstock ab und bildet eine Eikammer. Die nacheinander erzeugten Eikammern sind noch an ihren Polen miteinander verbunden. Die Oocyte wächst, während ihr die Nährzellen über die cytoplasmatischen Brücken Material zuführen (z. B. Vitellogenine und Phosphovitine). (Nach Müller u. Hassel 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Wichtige maternale Gene, die für die frühe Einrichtung der Körperachsen benötigt werden, sind bicoid, oskar und gurken (Kapitel 11.4.3). Wir wollen uns die Festlegung in der Eizelle während ihrer Reifung daher etwas genauer betrachten. Sie erfolgt während des mittleren Abschnitts der Oogenese (Stadium 7 bis Stadium 9; Abb. 11.17) und benötigt dabei die Hilfe von Mikrotubuli. Mikrotubuli sind polare Cytoskelett-Proteine, die unter Verbrauch von ATP den Transport von Molekülen und Organellen über eine größere Distanz unterstützen. Der Auf- und Umbau des gerichteten Mikrotubuli-Gerüsts in den Nährzellen, die die Eizelle umgeben, ist in Abb. 11.17 gezeigt. Mikrotubuli ermöglichen den Transport von bicoid-mRNA an den anterioren

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Abb. 11.17 Die Wechselwirkung zwischen Keimbahn und Körperzellen etabliert die anterior-posteriore Achse bei Drosophila. In den Stadien 2–6 der Oocyten-Entwicklung sind die Mikrotubuli der Keimbahn (rot) mit ihren Minus-Enden am posterioren Pol der Oocyte organisiert und ihre Plus-Enden ragen bis in die Nährzellen hinein. Während dieser Stadien exprimiert die Oocyte das gurken-Gen (grün). Im Stadium 7 antworten die posterioren Follikelzellen (violett) mit einem bisher unbekannten Molekül (violetter Pfeil). Die Mikrotubuli in den Nährzellen werden abgebaut (gestrichelte rote Linien) und in der Oocyte

neu aufgebaut (durchgezogene rote Linien). Der Zellkern wandert in die anterior-dorsale Ecke. Im Stadium 8 werden die posterioren Mikrotubuli in der Eizelle abgebaut (gestrichelte rote Linien). Im Stadium 9 dirigieren die Mikrotubuli die mRNA von bicoid (blau) und von oskar (gelb) an den anterioren bzw. posterioren Pol der Eizelle und organisieren damit die spätere anterior-posteriore Achse des Embryos. Der Zellkern in der anterior-dorsalen Ecke exprimiert erneut gurken (grün) und definiert damit die dorso-ventrale Achse. (Nach Steinhauer u. Kalderon 2006, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

Bereich und von oskar-mRNA (und später auch nanos) an den posterioren Bereich der sich entwickelnden Oocyte. Außerdem erlaubt die Mikrotobuli-Umorganisation die Wanderung des Zellkerns der Oocyte vom posterioren Ende der Eizelle an ihren anterior-dorsalen Cortex. Dort wird gurken-mRNA exprimiert (und in diesem Fall auch das Protein gebildet!); die entsprechende gurken-Kappe über dem Zellkern definiert die dorsale Seite der Eikammer. Die verschiedenen RNAMoleküle bleiben auch nach dem weiteren Umbau der Mikrotubuli mit dem Cortex der Eizelle verankert, um so eine Störung der Lokalisation zu vermeiden.

Alle übrigen, noch im Dotter liegenden Energiden entwickeln sich zu somatischen Zellen. Sie durchlaufen zunächst zwei weitere Kernteilungen (Teilungen 9 und 10) und wandern dann, ausgenommen etwa 25 Kerne, die die Dotterzellen bilden, ins periphere Cytoplasma. Hier bilden sie das aus einer Lage von Kernen bestehende syncytiale Blastoderm ohne diffusionshemmende Zellmembranen, innerhalb dessen sie durch Aktin-haltige Mikrofilamente und Tubulin-haltige Mikrotubuli gegeneinander abgegrenzte Bereiche des Periplasmas besetzen. Es bilden sich jedoch noch immer keine Zellen, sondern es werden in diesem syncytialen Zustand zunächst drei weitere nahezu synchrone Kernteilungen (Teilungen 11 bis 13) durchlaufen, die an den Polen des Embryos einsetzen und von hier aus wellenförmig zur Mitte hin fortschreiten. Sie ergeben schließlich eine einschichtige Lage von 5000 bis 6000 Zellkernen in der Peripherie des Eis. Erst zu diesem Zeitpunkt beginnt die Zellularisierung des Blastoderms durch die Ausbildung von Kernmembranen von der Peripherie des Eis her. Obwohl die Zellen zunächst noch zum Dotter hin offen bleiben, spricht man nun vom zellulären Blastoderm. Es folgt eine weitere Kernteilung (Teilung 14), der sich schließlich die Gastrulation anschließt. Erst mit Beginn der Gastrulation werden die inneren cytoplasmatischen Brücken zwischen den Zellen endgültig geschlossen, und die Zellen erlangen ihre volle Individualität.

11.4.2 Der frühe Embryo Nach der Befruchtung beginnt der Zygotenkern sich in schneller Folge in Abständen von etwa 8 Minuten zu teilen und durchläuft zunächst sieben synchrone Kernteilungszyklen, ohne in diesem Entwicklungsabschnitt jedoch Zellen zu formen (Syncytium; Abb. 11.18). Die hierdurch entstandenen 128 Zellkerne (auch Energiden genannt) liegen, von einer dünnen Lage Cytoplasma umgeben, im Dotter im Inneren des Eis. Sie teilen sich ein weiteres Mal (Teilung 8), und anschließend beginnen 2 bis 6 der Tochterkerne dieser Teilung ins posteriore Cytoplasma des Eis (auch Polplasma genannt) einzuwandern. Sie bilden dort die Polzellen als Vorläufer der künftigen Keimzellen. Das Polplasma ist durch granuläre Partikel (engl. polar granules) vom übrigen Cytoplasma unterschieden. Diese Granula enthalten die für die Keimzellinduktion verantwortlichen Moleküle (Keimbahndeterminanten).

Nach einer Serie von Kernteilungen bildet sich im Drosophila-Embryo zunächst ein syncytiales, dann ein zelluläres Blastoderm mit einer einschichtigen peripheren Lage von Zellkernen bzw. Zellen.

11.4 Entwicklungsgenetik von Drosophila melanogaster

Abb. 11.18 a–d Frühe Embryonalentwicklung (Furchung) von Drosophila. a Nach der Verschmelzung der Zellkerne von Eiund Samenzelle finden rasche Kernteilungen statt, wobei sich keine Zellwände bilden. Dadurch entsteht ein Syncytium mit vielen Zellkernen in einem gemeinsamen Cytoplasma. b Nach der 9. Teilung wandern die Zellkerne an die Peripherie und bilden das syncytiale Blastoderm (c). Einige Kerne bleiben im

Dotter zurück; auch diese werden später mit Zellmembranen umhüllt (Vitellophagen). d Nach etwa 3 Stunden entstehen Zellwände (zelluläres Blastoderm). Etwa 15 Polzellen bilden eine abgetrennte Gruppe am posterioren Ende des Embryos; daraus entwickeln sich später die Keimzellen (anterior: links; posterior: rechts). (Nach Müller u. Hassel 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Tabelle 11.1 Genetik der Eientwicklung in Drosophila: Determinanten embryonaler Musterbildung Embryonales Muster: Termini

anterior

posterior

dorso-ventral

torsolike

exuperantia

(cappuccino)

pipe

trunk

swallow

(spire)

nudel

fs(1)Nasrat

staufen

staufen

windbeutel

oskar

gastrulation defective

torsoa

vasa

snake

l(1)pole hole

pumilio

easter

capicuac

hunchbackb

spätzle

fs(1)pole hole

bicoid

b

b

nanos

valois tudor mago nashi Tolla tube pelle cactus

Nach Johnston u. Nüsslein-Volhard (1992); Jiménez et al. (2000) Gene der dorso-ventralen Achsendetermination und der Termini, die das zum Signaltransduktionsweg gehörende Transmembranprotein codieren b Morphogene c Wirkung durch tor-vermittelte Hemmung der Repression (tor: target of rapamycin; vgl. Kapitel 11.4.4) a

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Da sich im Drosophila-Embryo zunächst keine zelluläre Struktur ausbildet, sondern das syncytiale Blastoderm lange erhalten bleibt, können die maternalen Gene ihre Funktion im Embryo durch die ortsspezifische Lokalisation ihrer Genprodukte im Periplasma des Eis ausüben. Diese Genprodukte haben die Aufgabe, jeweils spezifische zygotische Gene in ihrer embryonalen Expression zu steuern. In der klassischen Embryologie hat man solche Genprodukte auch als morphogene Substanzen (oder einfach Morphogene) bezeichnet, da sie die Entwicklung bestimmter morphologischer Muster regulieren. Wir haben oben schon bicoid, oskar, nanos und gurken kennengelernt, deren Genprodukte in der noch unbefruchteten Eizelle an bestimmten Stellen vorkommen und die Achsen vorherbestimmen. In Tabelle 11.1 ist eine Übersicht mit weiteren maternalen Genen und einigen der ihnen zugeordneten Genfunktionen zusammengestellt. Die Tabelle lässt erkennen, dass für die strukturelle Längsgliederung des Embryos drei verschiedene Gruppen von Genen erforderlich sind, zu denen jeweils ein Morphogen gehört. Diese drei Gruppen von Genen bestimmen ï die anteriore Region, ï die posteriore Region und ï die Enden des Embryos (Akron- bzw. Telsonbereich). Eine weitere, vierte Gruppe von Genen ist für die Ausbildung ï der dorso-ventralen Achse des Embryos verantwortlich. Die Anzahl der beteiligten Gene in jeder dieser vier Gruppen ist offensichtlich unterschiedlich. Bemerkenswert ist aber auch, dass diese Gengruppen unterschiedliche Mechanismen zur Erfüllung ihrer Aufgaben gebrauchen, sodass wir sie getrennt betrachten müssen.

Die Längsgliederung des Embryos erfolgt durch Gen-

gruppen, die eine anteriore, eine posteriore Region und die terminalen Regionen festlegen. Eine vierte Gruppe von Genen bestimmt die dorso-ventrale Achse.

Ein Vergleich der verschiedenen Mechanismen wird uns erkennen lassen, dass einem Morphogen kein einheitlicher chemischer Charakter und keine einheitliche Funktion zugeschrieben werden kann. Verschiedene Morphogene haben vielmehr unterschiedliche Wirkungsweisen, sodass auch ihre unterschiedliche molekulare Natur verständlich wird. Die Definition des Begriffs Morphogen ist daher rein funktionell und bezieht sich auf die Fähigkeit einer Substanz, ein Spektrum von Reaktionen zu induzieren, die zur Entwicklung spezifischer Strukturen führen. Alle übrigen

beteiligten Gene unterstützen die morphogenetischen Funktionen eines Morphogens. Dieses skizzierte Modell der morphologischen Organisation eines Embryos geht davon aus, dass es im Eicytoplasma positionelle Information gibt, die für eine differenzielle Regulation zygotischer Gene sorgt und dadurch die unterschiedliche Differenzierung der (späteren) Zellen in verschiedenen Bereichen des Embryos steuert. Wir wollen nun betrachten, um was für Moleküle es sich bei dieser positionellen Information handelt und wie sie die Regulation zygotischer Gene bewirken. Für die Aufklärung der genetischen Kontrolle der frühen Embryonalentwicklung von Drosophila erhielt Christiane Nüsslein-Volhard zusammen mit Edward Lewis und Eric Wieschaus 1995 den Nobelpreis für Medizin.

11.4.3 Die Ausbildung der anteriorposterioren Körperachse Der maternale Ursprung der genetischen Information für die Organisation des anterioren Bereichs bedingt, dass der mütterliche Genotyp für die Entwicklung dieser Region im Embryo ausschlaggebend ist, nicht jedoch der des Embryos. Das lässt sich experimentell dadurch belegen, dass Mutationen in maternal aktiven Genen bei Homozygotie (im Falle rezessiver Mutationen) der Mutter (nicht jedoch des Vaters!) eine defekte Entwicklung des Embryos verursachen. Solche Effekte zeigen z. B. Mutationen im Gen bicoid von D. melanogaster. Im Falle maternaler Homozygotie von Nullmutationen dieses Gens (bcd/bcd) fehlt dem Embryo der gesamte anteriore Bereich, der Kopf und Thorax umfasst. Es differenziert sich allein das Abdomen zusammen mit den Termini (Abb. 11.19). Ein solcher Befund besagt zunächst natürlich noch sehr wenig über die tatsächliche Funktion des bicoid-Gens, da der Ausfall der anterioren Region auch ein indirekter Effekt sein könnte. Diese Möglichkeit einer indirekten Wirkung scheint dadurch unterstrichen zu werden, dass auch durch Mutationen in drei anderen Genen ‒ swallow (swa), exuperantia (exu) und staufen (stau) ‒ in den entsprechenden homozygot mutanten mütterlichen Konstitutionen ganz ähnliche Defekte hervorgerufen werden wie durch bicoid. Zugleich wird uns aber durch die Identifikation mehrerer Gene des gleichen embryonalen Phänotyps deutlich, dass es durch die Analyse von Phänotypen möglich ist, Gruppen von Genen zu erkennen, die eine Rolle bei der Entwicklung bestimmter morphologischer Strukturen spielen (Tabelle 11.1). In unserem Beispiel lässt sich aufgrund der vergleich-

11.4 Entwicklungsgenetik von Drosophila melanogaster

Die Mutantenanalyse zeigt, dass an der Organisation des Kopf- und Thoraxbereichs des Embryos eine Gruppe von vier Genen beteiligt ist, die bei Veränderungen ihrer Funktion gleiche phänotypische Auswirkungen zeigen.

Abb. 11.19 Morphologie embryonaler Mutanten von Drosophila melanogaster. Die obere Reihe von Schemata zeigt die im Wildtyp (links) aufgrund des Ausfalls in Mutanten identifizierten Regionen. Bei den Schemata der Mutanten ist die jeweils ausgefallene Region des Embryos farbig hervorgehoben: anterior (links) mit Kopf (He) und Thorax (Th), posterior (Mitte) mit Teilen des Abdomens (Ab) und terminal (rechts) mit Akron (Ac) und Telson (Te). Die hellrote Färbung markiert den anterioren Bereich in bicoid-Mutanten, der sich zu einem Telson statt zu einem Akron entwickelt. Die mittlere Reihe der Schemata zeigt die bei den jeweiligen Mutanten gefundenen Phänotypen der Embryonen. Links: Wildtyp, zweite von links: anteriore Mutation (hier: bicoid), zweite von rechts: posteriore Mutation (hier: nanos) und rechts: terminale Mutation (hier: torso). Die untere Reihe von Schemata zeigt die embryonalen Phänotypen einer dreifachen Mutante (links) und von Doppelmutanten (alle übrigen), bei denen Gene, die in den angezeigten Regionen normalerweise aktiv sind, mutiert sind. Der Strich zeigt jeweils den Ausfall eines Gens an, das für die betreffende Region des Embryos erforderlich ist. A: anterior, P: posterior, T: terminal. (Nach Johnston u. Nüsslein-Volhard 1992, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

baren Effekte der verschiedenen Mutationen annehmen, dass insgesamt vier Gene (bicoid, swallow, exuperantia, staufen) an der Organisation der anterioren Region des Embryos beteiligt sind.

Die funktionelle Abfolge der Funktionen der verschiedenen Gene einer solchen Gengruppe lässt sich durch die Überlegung ermitteln, dass beim Vergleich zweier mutierter Gene das jeweils übergeordnete Gen einen epistatischen Effekt über den Funktionszustand des untergeordneten Gens ausübt (S. 478). Wird ein Genprodukt durch Mutation so verändert, dass es seine normale Funktion auf Genprodukte, die in nachfolgenden Schritten erforderlich sind, nicht mehr ausüben kann, so ist eine Reversion dieser Mutation entweder durch Hinzufügen des funktionellen Genproduktes selbst oder durch geeignete Genprodukte, die nachgeordnet funktionell sind, nicht aber durch zuvor benötigte Genprodukte möglich. Bei der Untersuchung der Embryonalentwicklung von Drosophila haben wir besonders günstige Voraussetzungen für derartige Experimente vorliegen. Da während der gesamten Frühentwicklung ein Syncytium ohne diffusionshemmende Zellmembranen vorliegt, können Transplantationsexperimente durch Injektion von Cytoplasma mit dem gewünschten Genprodukt durchgeführt werden. Sind diese Genprodukte in der Lage, den Effekt einer Mutation zu kompensieren, sprechen wir von einer Rettung (engl. rescue) des Embryos. So kann im Falle eines bei der Mutter defekten bicoid-Gens der Embryo durch Injektion von Cytoplasma aus der anterioren Region eines Wildtyp-Embryos gerettet werden, in der das bicoidGenprodukt vorhanden ist.

Die Hierarchie in der Funktion von Genen lässt sich aufgrund ihrer epistatischen Effekte ermitteln. Eine ausgefallene Genfunktion kann durch Zugabe des betreffenden Genproduktes, z. B. durch Injektion (Cytoplasmatransplantation), gerettet werden.

Solche Injektionsexperimente sind für den Nachweis entscheidend, dass ein Genprodukt mit morphogenem Charakter vorliegt. Im Falle der anterioren Region des Embryos war es für dessen Identifikation entscheidend, dass die Injektion von anteriorem Cytoplasma aus unbefruchteten Wildtyp-Eiern in das anteriore Ende eines Eis einer homozygot mutanten bicoid-Mutter den Ausfall der anterioren Region im Embryo weitgehend kompensieren kann, nicht jedoch die Injektion von Cytoplasma aus swallow-, exuperantiaoder staufen-Mutanten. Die Annahme einer morpho-

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

genen Wirkung des bicoid-Genproduktes im Eicytoplasma wird zusätzlich dadurch gestützt, dass eine Injektion von anteriorem Cytoplasma aus Eiern von Wildtyp-Weibchen auch in anderen Eiregionen eine Bildung von Kopfstrukturen induziert. Weiterführende Informationen über den Charakter des bicoid-Genproduktes und seine Funktion ergab die Isolierung dieses Gens und seine Nukleotidsequenzanalyse. Aus der Nukleotidsequenz des Gens war abzuleiten, dass es sich um ein Protein-codierendes Gen handelt. Das Protein wurde aufgrund seiner Struktur als Transkriptionsfaktor der Homöoboxfamilie identifiziert (Abb. 7.15). Die Synthese von Proteinen dieses Gens in Bakterien ermöglichte die Herstellung eines Antiserums. Durch die Verfügbarkeit der DNA des bicoid-Gens und von Antiserum gegen das von ihm codierte Protein konnten die Synthese und Lokalisation der Genprodukte während der Oogenese und im Embryo sowohl auf der mRNAEbene als auch auf der Proteinebene analysiert wer-

den (Abb. 11.20). Diese Experimente bewiesen, dass die mRNA des Bicoid-Proteins vom Stadium 6 bis 9 der Oogenese in den Nährzellen der Eikammer synthetisiert und von hier in den anterioren Bereich der Oocyte importiert wird. In der Oocyte bleibt die mRNA bis in die Embryonalentwicklung hinein nachweisbar. Das Bicoid-Protein hingegen lässt sich immunologisch erst vom Zeitpunkt der Ablage des befruchteten Eis an nachweisen. Besonders auffallend ist seine Verteilung im Ei: Im syncytialen Blastoderm bildet dieses Protein einen deutlichen Gradienten über etwa 2/3 der Eilänge mit seiner höchsten Konzentration im anterioren Bereich des Embryos. Bemerkenswert ist auch die Lokalisation des BicoidProteins: Bis zum syncytialen Blastoderm befindet es sich im Cytoplasma, wandert dann aber in die Zellkerne ein. Hier übt es seine eigentliche Wirkung als Transkriptionsfaktor aus, indem es zygotische Gene reguliert, die zur Ausbildung der anterioren Region des Embryos erforderlich sind.

Abb. 11.20 a–e Der Gradient des Morphogens Bicoid im Drosophila-Ei. a bicoid-mRNA ist ausschließlich im anterioren Teil des Cytoplasmas der Eizelle lokalisiert. b Nach der Befruchtung wird das Bicoid-Protein translatiert und diffundiert nach posterior, wobei es einen Gradienten ausbildet, der etwa 60 % der Länge des Embryos erfasst. c Hohe Konzentrationen von Bicoid aktivieren die Transkription von orthodenticle im anterioren Bereich des Embryos. d Bei nied-

rigerer Konzentration von Bicoid wird die Transkription von hunchback aktiviert. (Beachte, dass der posteriore Streifen von hunchback unter unabhängiger Kontrolle durch das terminale System steht!) e Bicoid reprimiert die Translation von caudal-mRNA und bewirkt damit einen umgekehrten Gradienten des Caudal-Proteins (von posterior nach anterior). (Nach Ephrussi u. Johnston 2004, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

11.4 Entwicklungsgenetik von Drosophila melanogaster

Wichtige Aufschlüsse über die Funktion der verschiedenen Gene, die an der Organisation des anterioren Bereichs des Embryos beteiligt sind, hat die Analyse der Verteilung des BicoidAntigens in Embryonen aus homozygot mutanten exuperantia-, staufen- oder swallow-Müttern gegeben. In allen drei Fällen ist das Bicoid-Protein nicht mehr im anterioren Bereich des Eis lokalisiert, sondern findet sich im gesamten Periplasma verteilt. Es hat sich zeigen lassen, dass diese drei Gene für die anteriore Lokalisation der bicoid-mRNA verantwortlich sind. Wodurch lässt sich beweisen, dass tatsächlich das bicoid-Gen das für die Ausbildung der anterioren Region verantwortliche Morphogen ist, nicht aber eines der Gene swallow, exuperantia oder staufen? Die zuvor beschriebenen Injektionsversuche mit anteriorem Cytoplasma zeigen ja nur, dass in diesem Bereich des Eis Substanzen lokalisiert sind, die die Induktion anteriorer Strukturen verursachen, ohne diese Substanzen selbst zu identifizieren. Die Antwort wurde durch die Injektionen von bicoid-mRNA in Embryonen gegeben. Sie zeigten, dass bicoid-mRNA ausreicht, um die Ausbildung anteriorer Strukturen zu induzieren. Diese Induktion erfolgt nicht nur in der anterioren Region, sondern kann ektopisch beispielsweise auch in posterioren Embryobereichen erfolgen, wenn die Injektion hier erfolgt. Warum aber werden dann in swallow-, exuperantiaund staufen-Mutanten keine anterioren Strukturen im gesamten Eibereich ausgebildet, obwohl hier die bicoidmRNA ja über das gesamte Ei verteilt ist? Die Antwort liegt in der Art der Verteilung des Bicoid-Proteins: Seine Konzentration muss einen bestimmten Mindestwert erreichen, um eine induktive Wirkung zu erzielen. Mithin ist die Wirkung des Morphogens konzentrationsabhängig. Aufgrund dieser (und anderer hier nicht erörterter) Befunde lässt sich die Morphogenese der anterioren (also Kopf- und Thorax-)Region des Embryos zusammenfassend folgendermaßen beschreiben: Während der Oogenese wird mRNA der swallow-, staufen- und exuperantia-Gene in den Nährzellen synthetisiert. Die Produkte dieser Gene sorgen für einen Transport der bicoid-mRNA durch die interzellulären Brücken in die Oocyte und für deren Verankerung im Cytoplasma des anterioren Bereichs des Eis. Diese Verankerung im Cytoplasma verhindert eine Diffusion der bicoidmRNA im Ei. Erst nach der Fertilisation des Eis beginnt die Translation der bicoid-mRNA. Das hierbei produzierte Bicoid-Protein diffundiert nunmehr frei im Cytoplasma und verbreitet sich dadurch in einem Gradienten mit abnehmender Proteinkonzentration nach dem posterioren Pol des Embryos zu.

Das Morphogen der anterioren Region eines Drosophila-Embryos ist das Bicoid-Protein, ein Transkriptionsfaktor der Homöoboxfamilie. Die mRNA von bicoid wird mithilfe der Genprodukte anderer maternaler Gene im anterioren Periplasma des Eis verankert. Nach ihrer Translation im Blastoderm bildet sich durch Diffusion ein Gradient des Bicoid-Proteins.

Die Verteilung in Form eines Gradienten ist für die Funktion des Bicoid-Proteins entscheidend. Bevor wir diese weiter verfolgen, wollen wir jedoch zunächst die Entwicklung in der posterioren Region der Oocyte und des Embryos bis zum Blastoderm betrachten. Eine dem Bicoid-Protein vergleichbare Funktion als Morphogen hat das Gen nanos (nos) für den posterioren Bereich (Tabelle 11.1) Dieses Gen ist das posteriore Morphogen und verhält sich hinsichtlich seiner Lokalisation ganz analog dem bicoid-Gen: Die mRNA wird während der Oogenese in den Nährzellen synthetisiert und im posterioren Abschnitt des Eis deponiert. Wie die bicoidmRNA, so wird auch die nanos-mRNA im Cytoplasma der posterioren Eiregion verankert. Hierfür sind noch die Produkte weiterer Gene (Tabelle 11.1) notwendig, die auch die Bildung der Polzellen induzieren. nanos codiert für ein Protein, das nach seiner Synthese einen Gradienten in anteriorer Richtung bildet. Diese Verteilung scheint durch das pumilio-Genprodukt unterstützt zu werden. Im Gegensatz zum Bicoid-Protein ist das Nanos-Protein jedoch kein Transkriptionsfaktor. Seine Wirkung ist vielmehr die eines Repressors, der die Translation bestimmter mRNAs in der posterioren Region des Embryos verhindert.

Am posterioren Pol des Eis bildet sich ein Proteingradient des nanos-Genproduktes aus, der ebenfalls von maternalen Genen während der Oogenese vorprogrammiert wird.

Nach der Ermittlung der genetischen Elemente, die an der Entstehung der embryonalen Längsachse beteiligt sind, müssen wir uns der Frage zuwenden, auf welchem Wege die beteiligten Gene die Regionalisierung des Embryos bewirken. Betrachten wir zunächst die Funktion des Bicoid-Proteins. Die Funktion dieses Proteins als Morphogen für die anteriore Region des Embryos lässt sich dadurch demonstrieren, dass man die Anzahl der Genkopien von bicoid in der Mutter erhöht: Der vom Bicoid-Protein erzeugte anterior-posteriore Gradient verschiebt sich in Richtung auf das posteriore Ende des Embryos. Das resultiert im Embryo in einer Verschiebung der anterioren Region nach hinten, wie sich durch die Expressionsmuster zygotischer Gene, die in der anterioren Region

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

transkribiert werden (Tabelle 11.1) zeigen lässt. Zumindest zwei zygotische Gene stehen direkt unter der Transkriptionskontrolle des Bicoid-Proteins (Abb. 11.20). Eines dieser Gene ist das Gen hunchback (hb). Sein zygotisches Transkriptionsmuster entspricht dem des Bicoid-Proteingradienten: Es wird nur im anterioren Bereich des Embryos aktiviert. Bei Fehlen des BicoidGradienten (z. B. in bcd/bcd-Mutanten) wird das Gen zygotisch im anterioren Bereich des Embryos nicht transkribiert. Die Untersuchung des hunchback-Gens hat erwiesen, dass das Gen mehrere Bicoid-Proteinbindungsstellen in seiner Promotorregion besitzt, die aber jeweils unterschiedliche Bindungsaffinitäten für das Bicoid-Protein haben. Die Bindung von Bicoid-Protein an die verschiedenen Promotorregionen ist stark konzentrationsabhängig. Damit wird eine prinzipielle Funktion des Bicoid-Proteingradienten im Embryo deutlich: Bindungsstellen niedriger Affinität für ein regulatorisches Protein erfordern eine hohe Konzentration des betreffenden Proteins, Bindungsstellen hoher Affinität eine niedrigere Konzentration für dessen Bindung. Geht man davon aus, dass es mehrere Gene mit Bindungsstellen unterschiedlicher Affinität für das Bicoid-Protein gibt, so wird verständlich, dass diese durch die unterschiedlichen Bicoid-Proteinkonzentrationen entlang dem Gradienten differenziell reguliert werden können. Mithin wird die kontinuierliche Verteilung des Bicoid-Proteins in einem diffusionsbedingten Gradienten in ein diskretes Muster unterschiedlicher Genaktivitäten umgesetzt. Der Gradient dient also dazu, eine bestimmte positionelle Information im Embryo zu schaffen, die in differenzielle Genaktivität umgesetzt wird. Wenn eine solche positionelle Information, die in einem Gradienten niedergelegt ist, tatsächlich eine Bedeutung für die Entwicklung des Embryos hat, müssen wir annehmen, dass nicht allein hunchback durch das Bicoid-Protein reguliert wird, sondern noch weitere Gene mit zumindest teilweise unterschiedlicher Affinität ihrer Promotorregionen zum Bicoid-Protein. In Tabelle 11.1 sind weitere Gene aufgeführt, die für die Entwicklung der anterioren Region bedeutsam sind. Das zuvor beschriebene Modell der differenziellen Genregulation durch eine Kombination unterschiedlicher Konzentrationen von Transkriptionsfaktoren mit Promotorregionen unterschiedlicher Affinität lässt sich auch auf die Entwicklung der posterioren Region des Embryos anwenden. Wir hatten bereits gesehen, dass das Nanos-Protein, das posteriore Morphogen, ebenfalls einen Gradienten, nun aber vom posterioren Ende des Embryos in anteriore Richtung, ausbildet. Die Funktion des Nanos-Proteins unterscheidet sich allerdings grundsätzlich von der des Bicoid-Proteins. Das Nanos-Protein wirkt als Repressor auf die Translation

von mRNA; Ziel dieser Translationskontrolle ist insbesondere die mRNA des Gens hunchback (Struhl et al. 1992; Schulz u. Tautz 1994). Die Transkription dieses Gens wird nämlich nicht allein durch den BicoidGradienten im anterioren Bereich des Embryos induziert, sondern hunchback wird bereits während der Oogenese transkribiert, und man findet diese maternale mRNA gleichförmig über den gesamten Embryo verteilt. Das Nanos-Protein dient offenbar dazu, die Translation von hunchback-mRNA im posterioren Bereich des Embryos zu reprimieren. Hierdurch wird wiederum die Transkription zweier zygotischer Gene ‒ knirps und giant ‒ ermöglicht, die für die Differenzierung der posterioren Region erforderlich sind. Die Entwicklung der posterioren Region des Embryos verläuft damit im Prinzip vergleichbar der der anterioren Region: Durch Bildung eines Gradienten in der Verteilung eines Morphogens (posterior: Nanos-Protein, anterior: Bicoid-Protein) wird eine positionelle Information erzeugt, die anschließend zur differenziellen Aktivierung von Genen ausgewertet wird. Diese Effekte sind in der Übersicht der weiteren Entwicklung des Drosophila-Embryos in den Abb. 11.22 und 11.24 dargestellt.

Der nach posterior abfallende Konzentrationsgradient des Bicoid-Proteins und der nach anterior abnehmende Gradient des Nanos-Proteins bestimmen die räumliche Expression des hunchback-Gens im Embryo durch Induktion und Repression. Die Konzentrationsgradienten der Morphogene werden auf diese Weise in Genexpressionsmuster umgesetzt.

11.4.4 Die Ausbildung der dorso-ventralen Körperachse Einem vollständig anderen Prinzip der Funktion eines Morphogens begegnen wir bei der Entwicklung der Termini des Embryos (Akron und Telson) und bei der Festlegung der dorso-ventralen Achse. Beide Differenzierungsprozesse machen von vergleichbaren molekularen Mechanismen Gebrauch. Diese sollen im Folgenden am Beispiel der Entwicklung der dorso-ventralen Achse dargestellt werden. Durch Veränderungen des Musters der dorso-ventralen Morphologie in Mutanten konnte eine Reihe von Genen identifiziert werden, die an der Entwicklung der dorso-ventralen Symmetrie beteiligt sind (Tabelle 11.1). Ihre Mutation führt entweder ï zu einer Dorsalisierung oder ï zu einer Ventralisierung des Embryos. Morphologisch lassen sich diese Effekte besonders gut durch die Untersuchung der ventralen Cuticula erken-

11.4 Entwicklungsgenetik von Drosophila melanogaster

nen, da hier normalerweise Reihen von Dentikeln (Härchen) gebildet werden. Diese Cuticularborstenreihen sind in dorsalisierten Embryonen verkürzt oder fehlen ganz. Anders als bei der Körperlängsachse lassen sich solche Mutationen nicht durch die lokalisierte Transplantation von Cytoplasma (oder durch Entfernen von Cytoplasma) kompensieren. Das weist darauf hin, dass die Festlegung der dorso-ventralen Achse im Gegensatz zur anterior-posterioren Körperachse nicht durch cytoplasmatische lokalisierte Determinanten im unbefruchteten Ei erfolgt. Als wichtige genetische Elemente des dorso-ventralen Systems haben sich die Gene Toll und dorsal erwiesen. Beides sind maternal in der Keimbahn exprimierte Gene. Ihre Funktion bedarf weiterer maternaler Gene, von denen einige in den somatischen Zellen der Ovarien, den Follikelzellen aktiv sind. Das Genprodukt von Toll hat sich als ein Transmembranprotein erwiesen, das als Rezeptor für ein lokalisiertes externes Signal in der Eimembran vorhanden ist. Dieses Signal wird mittels des Transmembranproteins ins Zellinnere übertragen und leitet die spezifischen Genfunktionen ein, die zur Ausbildung der dorso-ventralen Achse erforderlich sind. Die Lokalisation des Zielbereichs dieses Signals im Ei lässt sich aus dem Effekt von Mutationen von Toll ableiten. Funktionsverlust-Mutationen führen zu dorsalisierten Embryonen, Mutationen mit einer Überexpression dagegen zu ventralisierten Embryonen. Die Überexpressions-Mutation bedarf also keines externen Signals, um die Übertragungsfunktion des Transmembranproteins auszuführen, sondern der Signaltransduktionsweg ist konstitutiv aktiviert. Das normal wirksame Signal muss somit die ventrale Seite des Embryos definieren. Damit stimmt der Effekt der Funktionsverlust-Mutation von Toll überein. Hier entstehen dorsalisierte Embryonen, d. h. das zur Entstehung der ventralen Seite notwendige Signal kann durch das Fehlen des Toll-Transmembranproteins nicht mehr ins Zellinnere übertragen werden. Ligand des TollRezeptors ist ein Fragment des Genprodukts von spätzle. Auch das Gen dorsal wird während der Oogenese transkribiert und in ein Protein translatiert, das im gesamten Eicytoplasma bis zum syncytialen Blastoderm gleichförmig verteilt ist. Dann erfährt es eine auffallende Veränderung seiner Lokalisation. Im ventralen Bereich des Embryos wandert es in die Kerne ein, während es im dorsalen Bereich im Cytoplasma verbleibt. Der molekulare Mechanismus für diesen Übergang vom Cytoplasma in den Zellkern ist in seinen Grundzügen bekannt: Die Bindung des extrazellulären Liganden (das Spätzle-Fragment) aktiviert den Transmembranrezeptor Toll, was dazu führt, dass das TubeProtein die cytoplasmatische Serin/Threoninkinase Pelle aktiviert. Die Pelle-Aktivität wiederum kontrol-

liert den Abbau des Cactus-Proteins, das mit dem Dorsal-Protein einen Komplex im Cytoplasma bildet. Wenn Cactus in der Folge der Signalkette abgebaut wird, wird das Dorsal-Protein frei und kann in den Zellkern eindringen, wo es die Transkription spezifischer Zielgene reguliert. Hierzu gehören die Gene twist und snail (Abb. 11.21). Wie bicoid kann dorsal daher als Morphogen angesehen werden.

Die dorso-ventrale Achse des Embryos wird mithilfe eines Transmembranproteins und eines lokalisierten extrazellulären Signals in der Perivitellinflüssigkeit über einen Signaltransduktionsmechanismus festgelegt. Das Signal wird in den ventralen Follikelzellen der Eikammer gebildet. Signalempfänger als Morphogen ist das (maternale) Dorsal-Protein im Eiperiplasma.

Der Lokalisationsmechanismus für das Dorsal-Protein unterscheidet sich jedoch grundlegend von dem des Bicoid- und des Nanos-Proteins. Während die anteriorposterioren Determinanten während der Oogenese in denjenigen cytoplasmatischen Regionen niedergelegt werden, die ihrer Funktion im Embryo bedürfen, erfolgt die endgültige Lokalisation von Dorsal-Protein am Ort seiner Wirkung erst im Blastoderm unter Vermittlung eines

Abb. 11.21 Differenzierung der dorso-ventralen Achse des Drosophila-Embryos. Querschnitt durch ein frühes Gastrulationsstadium. Die ventralen Zellen sind mit einem Antikörper gegen das Genprodukt von twist gefärbt; twist codiert einen Transkriptionsfaktor mit einem Helix-Loop-Helix-Motiv, der für die Mesodermentwicklung notwendig ist. Dieses zygotische Gen wird, wie auch snail, seinerseits durch das Dorsal-Protein (ebenfalls ein Transkriptionsfaktor) aktiviert. (Aus Leptin u. Grunewald 1990, mit freundlicher Genehmigung der Company of Biologists)

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Signaltransduktionsmechanismus. Nur die Dorsal-Proteinmoleküle, die das Signal am Ende dieser Signaltransduktion empfangen, sind fähig, ihre intranukleäre Position zu erreichen. Für die Funktion dieses Mechanismus sind nicht nur die Keimbahnkomponenten der Oogenese entscheidend, wie bei bicoid und nanos, sondern auch die somatischen Follikelzellen. Auch diese weisen eine topologische Differenzierung auf, die es ihnen gestattet, je nach ihrer Position relativ zur Oocyte den ventralen Bereich des Embryos festzulegen. Das verdeutlicht, welche entscheidende Bedeutung die topologische Organisation des Ovars für die Entwicklung des Embryos hat. Die Entstehung der Termini der longitudinalen Achse des Embryos (Akron und Telson) unterliegen einem vergleichbaren Signaltransduktionsmechanismus wie die dorso-ventrale Differenzierung. Im Falle der Termini funktioniert das Produkt des Gens torso als Transmembranrezeptorprotein. Auch torso wird während der Oogenese transkribiert. Das Genprodukt von torso-like hat sich als der Ligand des Torso-Rezeptorproteins erwiesen. Es wird von einer kleinen Gruppe von Follikelzellen an den Polen der Oocyte synthetisiert, in die Perivitellinflüssigkeit ausgeschieden und aktiviert an den Polenden den Rezeptor Torso, der gleichmäßig in der Plasmamembran verteilt ist. Der Ligand wird nach seiner Freisetzung nur über eine kurze Distanz diffundieren, da er durch die Bindung an die extrazelluläre Domäne des Rezeptors schnell weggefangen wird. Durch diesen Mechanismus wird die Rezeptor-Tyrosinkinase-Aktivität von Torso nur an den beiden Eipolen stimuliert, die daraufhin eine Ras-Raf-Signalkaskade in Gang setzt. Die Mitglieder dieser evolutionär stark konservierten Signalkette sind wiederum Kinasen, die hier das Genprodukt von capicua (Gensymbol cic), einen Transkriptionsrepressor, so modifizieren, dass die zygotischen Gene tailless und huckebein an den terminalen Bereichen des Embryos exprimiert werden können. Der Transkriptionsrepressor cic wird überall im Embryo exprimiert und wirkt, wenn er nicht wie an den Enden durch das Torso-Signal gehemmt wird, zusammen mit Groucho (Gro) als Repressor von tailless und huckebein (Jiménez et al. 2000).

Auch die Termini des Embryos werden mithilfe eines

Signaltransduktionsmechanismus festgelegt, der von dem Transmembranprotein des Gens torso und seinem Liganden (Gen: torso-like) Gebrauch macht. Der Ligand wird in Follikelzellen gebildet, die an den Eipolen liegen. Durch Torso, eine Rezeptor-Tyrosinkinase, wird ein Trankriptionsrepressor, capicua (Gen: cic), gehemmt, sodass die zygotischen Gene tailless und huckebein spezifisch an den Termini exprimiert werden können.

Die Darstellung der Achsenentwicklung des Drosophila-Embryos hat uns gelehrt, wie eine kleine Gruppe von etwa 30 Genen eine positionelle Information im Ei aufbauen kann, die die Entwicklung des Embryos in seinen Grundcharakteren festlegt. Die Interaktion dieser Gene resultiert in der Bereitstellung spezieller Transkriptionsfaktoren, die spezifische Muster von Genaktivitäten im Embryo induzieren und damit seine weitere Entwicklung festlegen. Die Aufklärung dieser grundlegenden Vorgänge biologischer Entwicklungsprozesse wurde durch die beeindruckende Kombination genetischer, morphologischer, cytologischer und molekularer Techniken möglich. Obwohl die hier dargestellten Mechanismen speziell den Drosophila-Embryo betreffen, können wir annehmen, dass vergleichbare Mechanismen auch bei der Embryogenese anderer Organismen eine grundlegende Rolle spielen.

11.4.5 Segmentierung bei Drosophila In den vorangegangenen Abschnitten haben wir uns mit der Entstehung der positionellen Information für die embryonalen Achsen beschäftigt. Nun wollen wir uns der Frage zuwenden, welche Aufgaben diese positionelle Information im Embryo im Einzelnen erfüllt. Wir haben gesehen, dass die Verteilung des Bicoidund des Caudal-Proteins im syncytialen Blastoderm (Abb. 11.20), durch ihre jeweiligen Konzentrationen drei Regionen des Embryos definieren: ï eine anteriore, die durch eine hohe Konzentration des Bicoid-Proteins gekennzeichnet wird, ï eine posteriore mit einer hohen Konzentration des Nanos-Proteins und ï eine mittlere Region, die durch niedrige Konzentrationen (oder Abwesenheit) dieser beiden Proteine charakterisiert ist. Welche Bedeutung hat diese Verteilung? Der Embryo von Drosophila wird stufenweise in kleinere Längseinheiten unterteilt, deren niedrigstes Niveau die Segmente sind (Abb. 5.40). Segmente sind die charakteristischen Bauelemente des Grundbauplans der Articulata. In der hierarchischen Folge sind für die Längsgliederung des Embryos folgende Gengruppen verantwortlich (Abb. 11.22): ï Für die grobe Untergliederung des Embryos sind die Gapgene (engl. gap = Lücke) zuständig, da ihr Ausfall zu jeweils spezifischen strukturellen Lücken in der anterior-posterioren Organisation des Embryos führt. ï Die Längseinheiten in der Größe von Doppelsegmenten werden durch Paarregelgene (engl. pair rule genes) definiert.

11.4 Entwicklungsgenetik von Drosophila melanogaster

Gapgene

Maternale MorphogenGradienten z. B. nanos bicoid

Gapgene (Lückengene) haben ihre Bezeichnung daher erhalten, dass bei Ausfall dieser Gene (Loss-of-functionMutationen) bestimmte Regionen des Embryos nicht ausgebildet werden. Zu den Gapgenen gehören die folgenden sechs Gene, deren Mutation zum Fehlen oder der abnormalen Entwicklung der dabei vermerkten Regionen des Embryos führt: ï hunchback (hb): Deletion von Kopf und Thorax; ï Krüppel (Kr): Deletion von Thorax und vorderen Abdominalsegmenten; ï knirps (kni): Deletion des Abdomens; ï giant (gt): Kopf und Abdomendefekte; ï tailless (tll): Defekte der Termini; ï huckebein (hkb): Defekte der Termini.

Gapgene z. B. Krüppel

Paarregelgene z. B. even-skipped

A8 A7 A6 A5

A4 A3

Segmentpolaritätsgene z. B. engrailed wingless

A1 T1 T2 T3

A2

Hox-Gene z. B. Ultrabithorax abdominal A

T1 T2 T3 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8

Thorax

Abdomen

Abb. 11.22 Genetische Grundlage der Segmentierung von Drosophila. In einer hierarchischen Folge werden durch Gradienten maternaler Morphogene zunächst die Gapgene, dann die Paarregelgene und schließlich die Segmentpolaritätsgene aktiv. Sie untergliedern den Embryo in stets kleinere Untereinheiten. Als Beispiele für maternale Morphogene sind die Verteilungsmuster der Aktivitätszonen von nanos (rot) und bicoid (blau) angegeben. Gapgene werden durch Krüppel (grün) repräsentiert und Paarregelgene durch even-skipped (rotbraun). Als Segmentpolaritätsgene sind die Aktivität von engrailed (hellblau) und wingless (gelb) dargestellt, die in einem gegeneinander versetzten Muster zur Ausprägung kommen. Die Hox-Gene werden durch Ultrabithorax (hellrot) und abdominal A (rot) repräsentiert. Segementpolaritätsgene und Hox-Gene wirken zusammen, um die Differenzierung in den Segmenten der zukünftigen Larve zu steuern. (Nach Sanson 2001, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

ï Gene, die die Segmentstruktur festlegen, werden als Segmentpolaritätsgene bezeichnet (engl. segment polarity genes).

Der Drosophila-Embryo wird unter der Kontrolle verschiedener Gruppen von Genen allmählich in Segmente unterteilt. Diese bilden die Grundstruktur des Körpers für die weitere Differenzierung.

Alle diese Gene codieren für Transkriptionsfaktoren. Das von kni codierte Protein trägt eine Leucin-ZipperRegion, die von anderen Transkriptionsfaktoren her bekannt ist. Die übrigen fünf Gene gleichen dem Transkriptionsfaktor TFIIIA und besitzen als DNA-bindende Region einen Zink-Finger-Bereich (Abb. 7.15). Die Analyse der Funktion der Gapgene beruht vor allem auf der Untersuchung der Auswirkungen von Mutationen in den betreffenden Genen und auf der Transplantation von Cytoplasma. Sie hat das folgende, hier nur grob umrissene Bild ihrer Wirkung im frühen Embryo ergeben. Es soll am Beispiel von hunchback und Krüppel dargestellt werden, wie es vor allem von H. Jäckle und Mitarbeitern erarbeitet wurde (Übersicht in Rivera-Pomar u. Jäckle 1996). Die Expression von hunchback wird nach dem 10. Kernteilungszyklus im Embryo durch das Bicoid-Protein induziert, wie man es von diesem Protein in seiner Eigenschaft als Transkriptionsfaktor erwartet. Die Transkription erfolgt nur im vorderen Bereich des Embryos, der dem Bereich des anterioren Bicoid-Gradienten entspricht (Abb. 11.19). Zusätzlich erfolgt noch eine Transkription im posterioren Bereich des Embryos, die durch das Gen torso (S. 553) induziert wird. Die Expression von Krüppel hingegen ist auf einen mittleren Bereich des Embryos beschränkt. Diese Region entspricht der Region des Embryos mit den niedrigsten Konzentrationen von Bicoid- und Nanos-Protein (S. 555), sodass diese beiden Proteine offenbar als Repressor von Krüppel wirken: Die Expression von Krüppel wird sowohl durch das Bicoid-Protein als auch durch das Nanos-Protein unterdrückt. Die Aktivierung und Repression von Krüppel steht zudem unter der Kontrolle des vom Hunchback-Protein geformten Gradienten. Die Hunchback-Proteinkonzentration nimmt auch Einfluss auf andere Gapgene. Damit wird das Hunchback-Protein selbst zum Morphogen, das die Expression anderer

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Abb. 11.23 a–c Expression verschiedener zygotischer Gapgene im frühen Drosophila-Embryo. Die Expression der Gene im Wildtyp-Embryo ist durch in-situ-Hybridisierung dargestellt. a Das Gen hunchback ist im anterioren Bereich und in einer

begrenzten posterioren Region des Embryos aktiv. b Das Gen Krüppel ist in einer mittleren Region des Embryos aktiv. c Das Gen knirps ist in einem mittleren Bereich, etwas posterior von Krüppel, aktiv. (Fotos: D. Tautz, Plön)

Gene konzentrationsabhängig reguliert. Die Expression einiger Gapgene wird durch in-situ-Hybridisierungen sichtbar (Abb. 11.23).

lieren. Hierbei fehlen in Mutanten jeweils die Segmente, in denen das mutierte Paarregelgen normalerweise zur Ausprägung kommt. Die meisten, wenn nicht alle Paarregelgene codieren wie die ihnen übergeordneten Gapgene wiederum Transkriptionsfaktoren. Jedes Paarregelgen wird durch bestimmte Gapgene in seiner Transkription kontrolliert. Die Aktivierung der verschiedenen Paarregelgene erfolgt für unterschiedliche Paarregelgene phasenverschoben relativ zum Segmentmuster, sodass ihre Wirkungsbereiche insgesamt 15 solcher embryonalen Regionen definieren (Abb. 11.22). Primäre Zielgene der von den Gapgenen codierten Transkriptionsfaktoren sind die Paarregelgene hairy (h), even-skipped (eve) und runt (run). Deren Promotoren können durch unterschiedliche Konzentrationen der Transkriptionsfaktoren differenziell reguliert werden, sodass hierdurch eine regionale Feinregulation der Genexpression möglich wird. Die Bildung von Diffusionsgradienten der Transkriptionsfaktoren im Cytoplasma ermöglicht also bei unterschiedlichen relativen Konzentrationen der verschiedenen Proteine unterschiedliche Induktionsmuster der Gene. Verschiedene Zellen sind durch ihre jeweils spezifische Kombination von Regulationssignalen individuell gekennzeichnet. Die Ausbildung der Expressionsstreifen wird nicht allein durch die Konzentration der Gapgenprodukte gesteuert, sondern gleichzeitig auch durch gegenseitige Repression der Paarregelgenprodukte. So regulieren die primären Paarregelgene hairy, even-skipped und runt die Paarregelgene paired und fushi tarazu (ftz). So kontrolliert das Genprodukt von even-skipped die Expression von fushi tarazu. Aktivierungs- und Inhibitionseffekte der Paarregelgene und der Gapgene zusammen ermöglichen die Bildung von Zonen alternierender Genexpression der Paarregelgene und führen gleichzeitig zu einer Verschärfung der gegenseitigen Abgrenzungen der Wirkungsbereiche dieser Gene.

Gapgene

codieren Transkriptionsfaktoren, deren Lokalisation und Aktivität durch die Konzentration der anterior-posterioren Achsendeterminanten (Morphogene) und durch gegenseitige Repression bestimmt wird. Sie erzeugen eine grobe Untergliederung der Längsachse des Embryos.

Wir erkennen aus diesem vereinfacht wiedergegebenen Regulationsmodell, dass im Embryo eine intensive Verknüpfung verschiedener regulativer Genfunktionen erfolgt. Wie schon bei den primären maternalen Achsendeterminanten, so ist auch bei den zygotischen Gapgenen festzustellen, dass die Proteinkomponenten, die von ihnen codiert werden, einer gewissen Diffusion im Cytoplasma des syncytialen Blastoderms unterliegen. Die Abgrenzung der verschiedenen, von ihnen kontrollierten Regionen des Embryos ist daher nicht sehr scharf. In diesen Grenzregionen kommt es zu Interaktionen zwischen den verschiedenen Transkriptionsfaktoren mit den durch sie regulierten Genen. Diese Interaktionen sind für die endgültige Festlegung der Grenzen der verschiedenen strukturellen Bereiche des Embryos wichtig. Es soll noch erwähnt werden, dass für die Organisation der Abdominalsegmente, die nicht unter der Kontrolle des Krüppel-Gens stehen, das Gen knirps (kni) verantwortlich ist, das die Abdominalsegmente 7 bis 12 unter seiner Kontrolle hat.

Interaktion zwischen Gapund Paarregelgenen Mutationen in Paarregelgenen führen zum Verlust der Hälfte aller Segmente. Das bedeutet, dass Paarregelgene die Ausbildung jedes zweiten Segmentes kontrol-

11.4 Entwicklungsgenetik von Drosophila melanogaster

Abb. 11.24 a–l Beispiele der musterbildenden Genexpression bei Drosophila, die zur Segmentierung führt. Der anteriore Teil der Embryonen ist jeweils links und dorsal oben. a Muster von Bicoid (rot) und Caudal (grün) und ihre Verteilung entlang der anterior-posterioren Achse im präblastodermalen Embryo. b Beispiel der Expression von Gapgenen (knirps, kni; links) und Verteilung der verschiedenen Transkriptionsfaktoren, die durch Gapgene codiert werden, entlang der Längsachse (zusätzlich zu den schon vorhandenen Gradienten; grau gestrichelt, rechts). c Expression eines Paarregelgens (hairy, h), das eine Serie von 7 Streifen im gleichen Abstand entlang der anterior-posterioren Achse hinzufügt (rechts). Die schon vorher angelegten Gradienten sind grau gestrichelt. d–l Die Analyse von Mutanten war von besonderer Bedeutung (z. B. von caudal- und bicoid-defizienten Mutanten). Expression der Gapgene kni und giant (gt) im Wildtyp (d, e), in caudal-Mutanten (g, h) sowie in caudal (cad)-/ bicoid (bcd)-Doppelmutanten (j, k). Präparationen der Cuticula zeigen das Wildtyp-Muster (f), den Phänotyp der cadMutante (i) und den Verlust der Segmentation in Embryonen ohne cad- und bcd-Aktivität (l). Beachte in i die Bildung der abdominalen Segmente in der cad-Mutante aufgrund der Aktivierung der posterior wirksamen Gene durch Bicoid. hb: hunchback; hkb: huckebein; Kr: Krüppel; tll: tailless. (Nach Niessing et al. 1997, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

Einen Eindruck von der Präzision dieses Regulationsmechanismus vermittelt die longitudinale Ausdehnung der verschiedenen Expressionsbereiche. So umfasst der endgültige Aktivitätsbereich der Gene even-skipped und fushi tarazu nur jeweils etwa 3 Zellen in longitudinaler Richtung bei einer gesamten Segmentlänge von 5 Zellen. In der Abb. 11.24 sind die Zusammenhänge zwischen maternal codierten Transkriptionsfaktoren, Gap- und Paarregelgenen sowie das Wechselspiel mit anderen, terminalen Regulationsfaktoren im Zusammenhang dargestellt. Dabei wird die hierarchische Struktur des genetischen Netzwerks deutlich, die letztlich zu einer klaren morphologischen Struktur führt. Von besonderer Bedeutung für die Charakterisierung der einzelnen Gene und ihrer Stellung innerhalb der Kaskade war die detaillierte Analyse von Mutanten. Die frühe Embryonalentwicklung von Drosophila ist damit zu einem Paradigma der modernen Entwicklungsgenetik geworden, und es wird sich zeigen, inwieweit diese Mechanismen auch bei der Entwicklung höherer Organismen anzutreffen sind.

Die unter der Transkriptionskontrolle der Gapgene stehenden Paarregelgene erzeugen das segmentale Muster des Embryos. Hierbei spielen Interaktionen dieser Gene untereinander und mit Gapgenen eine Rolle und führen zur Präzisierung des Segmentierungsmusters.

Die Musterbildung in den frühen Embryonalstadien von Drosophila kann aber auch als intellektuelle Herausforderung verstanden werden, die vorhandenen genetischen Daten mit weiteren zellbiologischen, biochemischen und biophysikalischen Daten zusammenzuführen und die biologischen Prozesse mathematisch zu modellieren. Wenn diese mathematischen Modelle die experimentellen Befunde gut nachbilden, kann man davon ausgehen, dass die Vorstellungen über die grundlegenden biologischen Prozesse wohl weitgehend richtig sind. Ergeben sich aber deutliche Unterschiede, so lassen sich daraus Hinweise für weitere, notwendige Experimente ableiten. In Abb. 11.25 ist eine solche Modellierung für verschiedene Lückengene dargestellt.

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik Abb. 11.25 a–g Modellierung des Netzwerks der Genregulation im Drosophila-Embryo an fünf Zeitpunkten. a Beobachtete Expression von bicoid (bcd), caudal (cad) und tailless (tll), die nicht modelliert wurden, aber als exogene Einflussgröße auf die Expression der Lückengene des Rumpfes zugelassen wurden. b Beobachtete Expression der Lückengene des Rumpfes. c–f Simulierte Expression der Lückengene hunchback (hb), Krüppel (Kr), knirps (kni) und giant (gt) bei verschiedenen Rechenmodellen (Unc-GC, Unc-Logic, RPJ-GC und RPJ-Logic). Die horizontale Achse gibt jeweils die anterior-posteriore Position an (zwischen 35 % und 92 % der Länge des Embryos). Die vertikale Achse repräsentiert die relative Proteinkonzentration an fünf Zeitpunkten. g Schematische Darstellung eines kombinierten NetzwerkModells. Die umrahmten Proteinsymbole repräsentieren die Expressionsdomänen der Lückengene im Rumpf (die Endungen „a“ und „p“ unterscheiden die anteriore und posteriore Expressionsdomäne). Pfeile deuten Aktivierungen an, stumpfe Enden dagegen eine Hemmung. (Nach Perkins et al. 2006)

Segmentpolaritätsgene Die Segmentpolaritätsgene haben die Aufgabe, das Zellmuster innerhalb eines Segmentes zu kontrollieren. Demgemäß führen Mutationen in diesen Genen auch zu Deletionen, Duplikationen oder zu veränderten Polaritätsmustern der Zellen innerhalb eines Segmentes. Die Segmentspolaritätsgene stehen unter der Regulationskontrolle der Paarregelgene. Ihr embryonales Genaktivitätsmuster lässt sich durch in-situ-Hybridisierung am Embryo besonders schön darstellen (Abb. 11.26), da die Aktivität durch die Ausbildung von transversalen Streifen angezeigt wird. Die Expression bestimmter Segmentpolaritätsgene wird durch die Konzentration des Genproduktes bestimmter Paarregelgene bestimmt: So wird bei hoher Konzentration der Genprodukte von even-skipped oder fushi tarazu das Segmentspolaritätsgen engrailed (en) aktiviert. Da das engrailed-Gen unter der Kontrolle zweier Paarregelgene mit alternierender Aktivität steht, kommt es seinerseits in jedem einzelnen Segment zur Expression. Innerhalb des Segmentes definiert das engrailed-Produkt die Zellen an der posterioren Segmentgrenze. In ähnlicher Weise stehen andere Segmentpolaritätsgene unter der Kontrolle unterschiedlicher Paarregelgene,

sodass die Individualität aller Zellen innerhalb jedes Segmentes genau festgelegt wird. Es soll noch darauf hingewiesen werden, dass die genetische Analyse der Funktion von engrailed dazu geführt hat, eine zur klassischen Aufteilung des Insektenkörpers in Segmente, die im Wesentlichen auf morphologischen Kriterien beruht, alternative Untergliederung als Grundprinzip der Längsgliederung vorzustellen. Die Parasegmente bestehen aus dem posterioren Teil eines Segmentes und dem anschließenden anterioren Teil des folgenden Segmentes. In Abb. 11.27 ist ersichtlich, wie diese Signalkaskade wirkt: In schmalen Streifen an beiden Seiten der Grenze der Parasegmente findet man Zellen, die die Proteine Wingless und Hedgehog sezernieren. Die Paarregelgene, die die Transkription von wingless (wg) und hedgehog (hh) stimulieren, etablieren also zwei weitere Streifen pro Segment. Die Proteine Wingless und Hedgehog wiederum sorgen dafür, dass die Gene spitz (spi) und Serrate (Ser) aktiviert werden. Die entsprechenden Genprodukte codieren für Liganden des epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR) bzw. des Notch-Signalwegs. Diese vier Signale wirken auf kurze Distanz, und gemeinsam kontrollieren sie die epidermale Differenzierung auf dem Ein-Zell-Niveau

11.4 Entwicklungsgenetik von Drosophila melanogaster

Homöotische Gene Nach Festlegung der Segmentgrenzen und der innersegmentalen Organisation verbleibt als letzter Schritt die Identifikation jedes Segmentes in seiner jeweils spezifischen Identität: Am leichtesten lässt sich das am Thorax aufzeigen. Jedes Thoraxsegment besitzt seine besonderen Eigenheiten neben anderen, die es mit den anderen Thoraxsegmenten teilt. So besitzt einerseits jedes Thoraxsegment ein Beinpaar. Andererseits gibt es Flügel bei Dipteren nur im zweiten Thorakalsegment (Mesothorax), im dritten (Metathorax) hingegen Halteren, während das erste (Prothorax) keine von beiden Strukturen besitzt. Jedem Segment muss also seine eigene spezifische Identität vermittelt werden. Veränderungen dieser Segmentidentität kann man durch Mutationen erhalten: Mutationen im bithoraxGenkomplex (BX-C) können zur Umwandlung des Meta- in einen (zweiten) Mesothorax führen. Als Folge davon besitzt die Fliege zwei Paar Flügel. Da durch solche Mutationen ein Segment den Charakter eines anderen Segmentes annimmt, hat man sie als homöotische Mutationen bezeichnet. Die betroffenen Gene heißen dementsprechend homöotische Gene (oder homöotische Selektorgene).

Abb. 11.26 a–c Streifenbildung des Segmentpolaritätsgens engrailed (en). a Das En-Protein wird in einem charakteristischen 14-Banden-Muster während der frühen Embryonalentwicklung von Drosophila exprimiert (Nachweis durch einen monoklonalen Antikörper gegen das En-Protein). b Jeder zweite En-Streifen (dunkelbraun) überlappt mit Fushi-tarazu-Streifen (Ftz; hellbraun). c Ftz ist für die Ausbildung jedes zweiten En-Streifens verantwortlich: In Embryonen von ftz-Mutanten fehlen die Ftz-abhängigen En-Streifen. (Nach Pick 1998, mit freundlicher Genehmigung der Company of Biologists)

innerhalb eines Segmentes. Dieses Beispiel von Drosophila ist ein Paradigma dafür geworden, wie in einem naiven Feld präzise Muster gebildet werden und schließlich zur Differenzierung verschiedener Zelltypen führen.

Eine Unterteilung in Parasegmente ist eine alternative

Untergliederung des Insektenkörpers. Parasegmente bestehen jeweils aus dem posterioren Teil eines Segmentes und dem anterioren Teil des folgenden Segmentes.

Der Begriff „Homöosis“ wurde 1894 von William Bateson geprägt, als er eine Klasse von biologischen Variationen beschrieb, in der ein Element einer segmentförmig wiederholten Struktur in die Identität eines anderen überführt werden kann. Er beobachtete dies sowohl bei Pflanzen (Kapitel 11.2.3) als auch bei Skeletten von Tieren. Die ersten Gene, die bei Drosophila in den 1920er- und 1930er-Jahren als homöotische Gene identifiziert wurden, waren bithorax, aristapedia und proboscipedia. Wir sollten aber nicht vergessen, dass das Phänomen als solches auch noch früher beschrieben wurde (z. B. Goethe: Die Metamorphose der Pflanzen). Seit Mitte der 1980er-Jahre wissen wir, dass die meisten homöotischen Gene sich zwei Genkomplexen im Chromosom 3 von D. melanogaster zuordnen lassen, dem Antennapedia-Komplex (ANT-C) und dem bithoraxKomplex (BX-C). Zum BX-C gehören die Gene Ultrabithorax (Ubx), abdominal-A (abd A) und Abdominal-B (Abd B). Ultrabithorax ist für die Ausbildung des dritten thorakalen Segmentes verantwortlich. Sein Ausfall führt zur Umbildung des dritten in ein zusätzliches zweites Thoraxsegment, wie es in der Ausbildung eines zweiten Flügelpaares zum Ausdruck kommt. Die beiden anderen Gene, abd A und Abd B, kontrollieren die Eigenschaften der Segmente des Abdomens. BX-C enthält zusätzlich zu diesen Protein-codierenden Genen eine komplexe Zusammenstellung von Regulationselementen, die über

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

PS En

PS En

Stadien 9-10 Wg PS

Wg

Hh

Hh PS

En

En

Stadien 11 Ser

Wg

PS

Hh

En

Ser

Wg

S

PS

Hh

En

Ser

S

Stadien 12 Ser

Rho

Wg

Hh

Rho

Ser

Rho

Wg

Hh

Dentikelstreifen 5

6

1

S

2

3

4

5

Rho

Ser

Dentikelstreifen 6

1

S

2

3

4

5

6

Ende der Embryogenese Ser

Wg

En Hh

Rho

Ser

Wg

En Hh

Rho

Ser

Segment

Abb. 11.27 Musterbildung innerhalb eines Segmentes während der Embryonalentwicklung von Drosophila. Die Darstellung der einzelnen Schritte gilt für die ventrale Seite des Abdomens. PS bezeichnet die Grenze der Parasegmente und S die der Segmente; anterior ist links und posterior rechts. Die apikale Seite der Zellen ist oben, die basale unten. Kleine blaue Punkte repräsentieren den extrazellulären Gradienten des Wg-Proteins. Stadium 9–10: Die Expression von Wg und En/Hh sind voneinander abhängig und der Wg-Gradient ist symmetrisch. Stadium 11: Die Expression von Wg und En/Hh werden voneinander unabhängig und der Wg-Gradient wird unsymmetrisch. Zur gleichen Zeit wird die Expressionsdomäne von Ser durch die repressive Wirkung von Wg und Hh begrenzt. Dadurch entsteht ein Ser-Streifen mit einer Breite von

2–3 Zellen pro Parasegment. Stadium 12: Hh aktiviert die Expression von Rho in zwei Reihen von Zellen posterior zur En/ Hh-Domäne, und Ser aktiviert Rho in einer Reihe von Zellen anterior von dieser Domäne. Das führt zu einem Streifen von Rho, der genau 3 Zellen breit ist, da anterior zur En/Hh-Domäne Wg-Signale die Rho-Expression verhindern. Am Ende des Stadiums 12 sind die PS-Grenzen nicht länger sichtbar und die Segmentfurchen haben sich unmittelbar hinter den En-Zellen gebildet. Am Ende der Embryogenese sezernieren die posterioren En-Zellen sowie die Rho- und Ser-Zellen Dentikel, die den ventralen Dentikelstreifen des Abdomens der Larve bilden. En: Engrailed, Hh: Hedgehog, Rho: Rhomboid, Ser: Serrate, Wg: Wingless. (Nach Sanson 2001, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

die gesamte 300 kb lange Region dieses Genbereichs verteilt sind. Diese Regulationselemente kontrollieren die Segmentspezifität der Abdominalsegmente. Der ANT-Komplex besteht aus fünf Genen: labial (lab), Antennapedia (Antp), Sex comb reduced (Scr), Deformed (Dfd) und proboscipedia (pb). Unter die Kontrolle dieses Genkomplexes fallen die Kopf- und Thoraxsegmente. Ein klassisches Beispiel für die Auswirkung einer homöotischen Mutation zeigt Abb. 11.28, nämlich die Ausbildung eines Beins anstelle einer Antenne aufgrund einer Mutation im Antp-Gen. Alle homöotischen Gene haben ein Sequenzelement, das als Homöobox bezeichnet wird. Es handelt

sich um eine 180 bp lange DNA-Sequenz, die ein 60 Aminosäuren langes Proteinfragment codiert: die Homöodomäne (Abb. 7.15). Die klassische Homöodomäne besteht aus drei α-Helices, deren erste und zweite eine antiparallele Richtung gegeneinander einnehmen, während die dritte Helix im rechten Winkel gegen die beiden ersten Helices angeordnet ist. Die dritte Helix greift sequenzspezifisch in die große Furche der DNA ein. Proteine, die diese Homöodomäne besitzen, sind durchweg Transkriptionsfaktoren, die mit ihrer Hilfe sequenzspezifisch an DNA binden. Die Homöodomänen anderer homöotischer Gene haben prinzipiell vergleichbare Strukturen, obwohl ihre Aminosäurese-

11.4 Entwicklungsgenetik von Drosophila melanogaster

Abb. 11.28 a, b Homöotische Mutation. a Wildtyp-Kopf von Drosophila melanogaster. b Durch die homöotische Mutation

Antennapedia wird die Antenne in ein (phylogenetisch homologes) Bein verwandelt. (Foto: W. Gehring, Basel)

quenzen und damit ihre Bindungsspezifitäten unterschiedlich sind. Aber auch eine Reihe anderer Transkriptionsfaktoren besitzt eine Homöodomäne (z. B. auch die, die durch das maternale Gen bicoid oder das zygotische Gen engrailed codiert werden). Man beachte daher, dass nicht jedes Gen mit einer Homöobox auch ein homöotisches Gen ist. Vergleichbare Cluster von Homöoboxgenen finden wir auch bei Säugern. Bei Mäusen und Menschen wurde das Cluster bestehend aus dem ANT- und BX-Komplexes vervierfacht (Abb. 11.29) und wird heute als HoxA-, HoxB-, HoxC- und HoxD-Cluster bezeichnet. Wir kennen insgesamt 39 Hox-Gene bei der Maus; Hox-Gene werden aufgrund ihrer Sequenzähnlichkeiten und der Position im Cluster in 13 paraloge Gruppen eingeteilt (beachte, dass nicht jedes Cluster vollständig ist!). Ein charakteristisches Merkmal der Hox-Cluster ist, dass die Anordnung der Gene auf dem Chromosom der relativen Position ihrer Expression entlang der anteriorposterioren Achse entspricht, wobei sich die jeweilige Expressionsdomäne der Gene am 3’-Ende des Clusters am vorderen Körperende befindet.

Es ist Gegenstand vieler Untersuchungen, die Serie der Regulationsvorgänge der Hox-Gene im Detail zu charakterisieren. Jüngere Arbeiten deuten darauf hin, dass es sich hierbei um ein komplexes Netzwerk handelt, an dem viele Faktoren beteiligt sind, die wir in früheren Kapiteln jeweils für sich betrachtet haben: ï Bildung von Kompartimenten im Zellkern: Aktives Chromatin ist eher im Inneren des Zellkerns lokalisiert (Kapitel 6.2.1); ï Chromatin-Elemente: Insulatoren und andere Abgrenzungselemente (engl. boundary elements) grenzen die Domänen der Expression gegenüber anderen Regulationsbereichen ab (Kapitel 6.2.1); ï Enhancer und Promotoren: weitreichende Enhancer und direkte Regulationen von Transkriptionsfaktoren an ihren spezifischen Promotoren führen zum korrekten Transkriptionszustand (Kapitel 7.3); ï Regulation auf RNA-Ebene: Eine Feinregulation erfolgt durch miRNAs, die zwischen den einzelnen Genen des Hox-Clusters lokalisiert sind ‒ Mutationen in solchen miRNA-Genen können ebenfalls zu homöotischen Transformationen führen (Kapitel 7.5); ï posttranslationale Modifikationen und das Zusammenspiel mit vielen Cofaktoren schließen den Regulationsmechanismus ab.

Homöotische

Gene bestimmen zusammen mit Gap-, Paarregel- und Segmentpolaritätsgenen die Segmentidentitäten. Mutationen in homöotischen Genen (homöotische Mutationen) verschieben die Identität eines Segmentes. Alle homöotischen Gene haben eine Homöobox (aber nicht alle Gene mit einer Homöobox sind homöotische Gene!).

Für interessierte Leser sei für eine ausführliche Darstellung auf die Arbeit von Chopra und Mishra (2006) verwiesen, deren breitere Darstellung den Rahmen dieses Genetik-Lehrbuches sprengen würde.

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

chen den Grenzen der Funktion von homöotischen Genen oder von Segmentpolaritätsgenen. Während der Metamorphose zur Fliege proliferieren die Zellen der Imaginalscheiben weiter und differenzieren schließlich zu verschiedenen Organen wie Labialanhängen, Antennen, Augen, Flügeln oder Halteren, Beinen und Genitalplatten. Die Differenzierung von larvalen Imaginalscheiben in Strukturen der Fliege wird durch das Metamorphosehormon Ecdyson ausgelöst.

Unter der Kontrolle homöotischer Gene bilden sich während der Differenzierung der Imaginalscheiben Kompartimente aus, die bestimmte Bereiche der Strukturen der Imago umfassen.

Wir wollen im Folgenden die Organentwicklung an zwei Beispielen diskutieren: die Entwicklung der Flügel und der Augen.

Flügelentwicklung bei Drosophila

Abb. 11.29 Organisation des Hox-Clusters und seine Konservierung in der Evolution. Der Hox-Gencluster bei Drosophila – bestehend aus dem Antennapedia-Komplex (Ant-C) und dem Bithorax-Komplex (BX-C) – findet sich im Prinzip bei den Säugetieren in vierfacher Form (Hox-A bis Hox-D). Einander entsprechende Nummern bzw. Farben kennzeichnen orthologe Gene, die eine besonders hohe Sequenzübereinstimmung haben. Beachte auch, dass die 3’–5’-Anordnung auf dem Chromosom dem anterior-posterioren Expressionsmuster entspricht – bei der Fliege und bei der Maus. (Nach Müller u. Hassel 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

11.4.6 Imaginalscheiben, Metamorphose und Organentwicklung bei Drosophila Die Funktion der homöotischen Selektorgene wird durch ein Zusammenspiel von Gap-, Paarregel- und Segementpolaritätsgenen zum Zeitpunkt der Zellularisierung bestimmt, also nach Festlegung der segmentalen Organisation. Zu diesem Zeitpunkt werden auch die Anlagen der Imaginalscheiben festgelegt, aus denen sich während der Metamorphose die meisten Strukturen der Imago entwickeln (Abb. 11.30). Die Imaginalscheiben entstammen dem embryonalen Ektoderm und stülpen sich als einfache epitheliale Säckchen ins Körperinnere ein. Sie bleiben als solche bis zur Metamorphose erhalten. Die Entwicklung der adulten Strukturen aus den Imaginalscheiben verläuft unter Bildung von Kompartimenten. Die Grenzen zwischen den verschiedenen Kompartimenten entspre-

Im Falle der Flügelimaginalscheiben wird die Bildung eines Flügels und seines ersten Grundmusters noch im embryonalen Epithel festgelegt, also zu einer Zeit, in der auch das Segmentmuster entsteht und die einzelnen Segmente ihre Identität erhalten. Aus 15 bis 20 Zellen, die sich während der Embryogenese vom lateralen Ektoderm des mittleren Thoraxsegmentes einstülpen, entstehen während der Larvalstadien 50.000 Zellen. Die Flügelimaginalscheiben sind durch eine Kompartimentgrenze in eine anteriore und eine posteriore Entwicklungsregion unterteilt (Abb. 11.31). In der Flügelimaginalscheibe bilden Zellen an der Grenze zwischen anteriorem und posteriorem Kompartiment eine Signalregion, die die Musterbildung entlang der anterior-posterioren Flügelachse steuert. Dieses Signalzentrum entsteht aufgrund einer Folge von Ereignissen, die hier kurz skizziert werden sollen. Das Gen hedgehog (hh) wird im posterioren Kompartiment der Imaginalscheibe exprimiert; das Hedgehog-Protein sorgt für die Expression des decapentaplegic(dpp)-Gens in der benachbarten Zelle auf der anderen Seite der Grenze, indem es die Wirkung von Proteinen hemmt, die normalerweise dpp reprimieren. Das Dpp-Protein, ein Signalprotein aus der TGF-β-Familie, wird nunmehr an der Kompartimentgrenze sezerniert und dient sowohl im anterioren als auch im posterioren Kompartiment als Positionssignal zur Musterbildung längs der anteriorposterioren Achse. Eines der Zielgene der weitreichenden Wirkung des Dpp-Proteins ist spalt (sal). Das salGen wird in einem Bereich exprimiert, der sich mit dem von dpp nur teilweise deckt; die sal-Expression setzt vielmehr in einer Region ein, wo die Konzentration des Dpp-Proteins gerade bestimmte obere bzw. untere Schwellenwerte überschreitet (Abb. 11.32).

11.4 Entwicklungsgenetik von Drosophila melanogaster

Abb. 11.30 Imaginalscheiben von Drosophila melanogaster. Lokalisation der Imaginalscheiben in der Larve und die zuge-

hörigen Strukturen in der Imago. (Nach Nöthiger 1972, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Abb. 11.31 Die Flügelimaginalscheibe von Drosophila (rot) ist ein zweiseitiger Sack, der zylindrische Zellen enthält, die das zukünftige Flügelblatt (wb) und die Thorax-Regionen (t) sowie eine darüberliegende, schuppenartige peripodiale Membran (pm) enthält; letztere wurde von der embryonalen Epidermis

angefügt und entwickelt sich während der Larvalstadien. Die Imaginalscheibe ist in ein anteriores (A) und posteriores (P) Kompartiment unterteilt. Hh-mRNA wird durch in-situ-Hybridisierung sichtbar gemacht (links). (Nach Tabata u. Takei 2004, mit freundlicher Genehmigung der Company of Biologists)

Eine zweite Orientierungsachse bildet sich zwischen der Flügelober- und -unterseite aus. Wir haben es hier mit einem dorsalen bzw. ventralen Kompartiment zu tun.

Die beiden Kompartimente entstehen im zweiten Larvalstadium, nachdem sich die Flügelscheibe gebildet hat. Sie unterscheiden sich in der Expression des homöotischen

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Selektorgens apterous (ap), das nur im dorsalen Kompartiment aktiv ist. Die ap-Expression führt zur Sekretion von Proteinen, die von den Genen fringe und Serrate codiert werden. An der Kompartimentgrenze treten dorsale Zellen mit ventralen Zellen in Wechselwirkung: Die dorsalen Zellen bilden das Serrate-Protein, ein Transmembranprotein, das als Ligand an einen Rezeptor (Notch) in der Nachbarzelle bindet. Das fringe-Gen codiert für eine UDP-Glykosyltransferase, die bestimmte Motive des Notch-Rezeptors so modifiziert, dass er mit dem Liganden Serrate nicht mehr so gut in Wechselwirkung treten kann, aber umgekehrt die durch Delta (einen anderen Transmembranliganden von Notch aus dem ventralen Kompartiment) verstärkt. So sind diejenigen Zellen, die die höchsten Konzentrationen von Notch aufweisen, genau die Zellen an der dorso-ventralen Grenze, wo Serrate auf ventrale Zellen einwirken kann (die kein fringe exprimieren) und wo das ventrale Delta sein Signal stärker an die dorsalen Zellen vermitteln kann, die fringe exprimieren.

Neben diesen Signalen, die über kurze Distanzen ausgetauscht werden, gibt es auch ein weiter reichendes Signalsystem. Damit fungiert auch die Grenze zwischen dem dorsalen und ventralen Kompartiment als Organisationszentrum (wie wir das an der Grenze zwischen anteriorem und posteriorem Kompartiment bereits gesehen haben). Als Signalmolekül dient hier das Wingless-Protein, ein sezerniertes Glykoprotein. Wingless ist vor allem für die Ausbildung der Borsten am Rand der Flügel verantwortlich.

Abb. 11.32 a, b Der Flügel von Drosophila wird durch zwei Morphogene gestaltet, Hedgehog (Hh) und Decapentaplegic (Dpp). a Hh, das im posterioren Kompartiment exprimiert wird, erzeugt einen Gradienten, der nur kurz in das anteriore Kompartiment hineinreicht. Hh gestaltet die zentrale Domäne des Flügels und induziert in einem Zellstreifen an der anteriorposterioren Grenze bei hohen, mittleren und niedrigen Schwellenwerten die Expression von engrailed (en), patched (ptc) und

dpp. Dpp induziert bei hohem bzw. niedrigem Schwellenwert die Expression von spalt (sal) bzw. optomotorblind (omb) und gestaltet den Flügel jenseits der zentralen Domäne. b Die ektopische Expression von hh bewirkt eine spiegelbildliche Duplikation des ganzen anterioren Kompartiments, wohingegen Dpp eine spiegelbildliche Verdoppelung der anterioren Domäne ohne die zentrale Domäne bewirkt. (Nach Tabata u. Takei 2004, mit freundlicher Genehmigung der Company of Biologists)

Die Flügel von Drosophila entwickeln sich aus den entsprechenden Imaginalscheiben, die bereits früh in ein anteriores und posteriores Kompartiment unterteilt sind. Der Grenzbereich fungiert als Organisator; dort wird das Gen decapentaplegic aktiviert. Eine zweite Organisationsachse entwickelt sich an der Grenze zwischen dem dorsalen und ventralen Kompartiment; hier wird wingless exprimiert.

11.4 Entwicklungsgenetik von Drosophila melanogaster

Der Ursprung der Wingless-Forschung liegt in den 1970er Jahren, als Sharma und Chopra (1976) eine flügellose Drosophila-Mutante beschreiben. Sie charakterisieren wingless als eine rezessive Mutation auf dem Chromosom 2. Allerdings erschien die Mutation zunächst komplex, denn unter den Nachkommen von flügellosen Mutanten waren nicht nur wieder flügellose (wie es für einen klassischen rezessiven Erbgang zu erwarten wäre), sondern auch Fliegen mit einem oder zwei Flügeln in einem Verhältnis von 2:1:1. Die Autoren beschrieben dieses Verhalten damals als unvollständige Penetranz und Expressivität, und jeder Versuch, eine homogene flügellose Population zu etablieren, schlug fehl; nach 5 Generation betrug der Anteil der flügellosen Nachkommen 70% (gegenüber 40% in der Ausgangspopulation). Die Autoren beobachteten allerdings auch zusätzliche Effekte der Mutation auf die Ausprägung des Mesothorax und die Anordnung der Haare, insbesondere das Fehlen der Borsten. Die Mutation in der ursprünglichen wingless-Mutante besteht in einer Deletion von ~300 bp in der 3‘-UTR des wingless-Gens und stellt ein hypomorphes Allel dar (www.flybase.org); das ursprüngliche Gensymbol war wg1 (aktuell: Wnt). Heute wissen wir, dass das sezernierte Wingless-Protein der Ligand für seinen Rezeptor Frizzled-2 ist und damit eine ganze Signalkaskade in Gang setzt - den „Wnt-Signalweg“.

Augenentwicklung bei Drosophila Die Augen von Drosophila sind Facetten- oder Komplexaugen, die aus vielen morphologisch identischen Untereinheiten, den Ommatidien, bestehen (Abb. 11.33). Die Anzahl der Ommatidien innerhalb eines Auges schwankt; innerhalb des normalen Temperaturbereichs, in dem Drosophila normalerweise fortpflanzungsfähig ist (18–25 °C), werden je nach Temperatur zwischen 750 und 1020 Ommatidien gebildet. Jedes Ommatidium besteht aus 8 Photorezeptorneuronen (R1 bis R8), 4 darüber liegenden transparenten Kegelzellen, die einen lichtbündelnden Kristallkegel bilden, und zusätzlichen (roten) Pigmentzellen. Das Auge entwickelt sich ab der Mitte des 3. Larvenstadiums aus dem einlagigen Epithelblatt der Augenimaginalscheibe, die sich im Kopf befindet. Eines der frühesten Ereignisse der Augendifferenzierung ist die Bildung einer Rinne in der Imaginalscheibe, der morphogenetischen Furche (engl. morphogenetic furrow), die von posterior über das Scheibenepithel nach anterior wandert. Die Furche bewegt sich langsam und braucht etwa 2 Tage, um die gesamte Imaginalscheibe zu überqueren. Sie hinterlässt dabei alle 2 Stunden eine Reihe zukünftiger Ommatidien. Während sie sich vorwärtsbewegt, beginnen sich die Zellen hinter ihr zu differenzieren und in Reihen angeordnete sechseckige Ommatidien zu bilden. Jede Reihe ist gegenüber der vorheri-

gen um ein halbes Ommatidium versetzt, sodass ein charakteristisches Wabenmuster entsteht. Zuerst entstehen die R8-Photorezeptorneuronen. Sie erscheinen in regelmäßigen Abständen in jeder Ommatidienreihe und sind durch etwa 8 Zellen getrennt. Jede R8-Zelle leitet eine Reihe von Signalen ein, die dazu führen, dass um R8 herum eine Gruppe von 20 Zellen ein Ommatidium bildet: Zunächst differenzieren R2 und R5 auf einander entgegengesetzten Seiten zu zwei funktionell identischen Neuronen; zwischen R2 und R5 entstehen auf einer Seite R3 und R4. Nachdem sich so ein Halbkreis um R8 gebildet hat, kommen R1 und R6 hinzu; mit der Differenzierung von R7 wird dann der Kreis geschlossen. Im reifen Ommatidium wird diese Anordnung dann später weiter modifiziert. Der entscheidende Schritt in der Augenentwicklung von Drosophila ist die Wanderung der morphogenetischen Furche: Da die Augenimaginalscheiben im Gegensatz zur oben besprochenen Flügelimaginalscheibe nicht von vorneherein in ein anteriores und posteriores Kompartiment unterteilt ist, kommt diese Unterteilung hier der Furche zu. Das lässt sich auch an unterschiedlichen Expressionsmustern deutlich machen. Anterior der Furche wird das Gen eyeless (ey) exprimiert, das für die Entwicklung der Augen essenziell ist. Mutationen in diesem Gen führen bei betroffenen Fliegen zur Verkümmerung oder zum völligen Fehlen der Komplexaugen (Abb. 11.34a). Eine Reihe von Experimenten hat gezeigt, dass seine ektopische Expression in anderen Imaginalscheiben dort ebenfalls eine Augenentwicklung in Gang setzt (z. B. in Flügeln, an Beinen oder Antennen). Daher wird eyeless auch als Schlüsselgen (engl. master control gene) der Augenentwicklung bezeichnet. Eyeless gehört zur Klasse der Pax-Gene (so genannt nach ihrem charakteristischen Merkmal, der paired-Box, die zuerst bei dem Drosophila-Gen paired definiert wurde und für eine DNA-bindende Domäne codiert). Entsprechende Gene finden sich auch bei Säugern, und Mutationen in dem homologen Gen Pax6 führen ebenfalls zu schweren Störungen in der frühen Augenentwicklung. Walter Gehring und seinen Kollegen gelang 1995 ein klassisches Experiment (Halder et al. 1995), in dem sie zeigten, dass das Pax6-Gen der Maus in der Lage ist, in Drosophila ektopisch die Entwicklung funktioneller Ommatidien-Augen zu induzieren (Abb. 11.34b). Damit wurde von genetischer Seite ein zentrales Dogma der Evolutionsbiologie aufgehoben, dass nämlich die Entwicklung der Komplexaugen bei Fliegen und der Linsenaugen bei Säugern unabhängig verlaufen sei. Offensichtlich sind die genetischen Signalketten in der Evolution zwischen diesen verschiedenen Spezies konserviert, sodass wir von einem gemeinsamen Entwicklungsweg ausgehen müssen (siehe auch den

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Abschnitt über die Augenentwicklung bei Säugern, Kapitel 11.6.4). Allerdings ist das Konzept eines einzigen Schlüsselgens durch weitere Untersuchungen ins Wanken geraten. Denn bevor die morphogenetische Furche startet, wird im gesamten Augenfeld dpp exprimiert (noch unter der Kontrolle des maternalen Dorsal-Gradienten). Dpp ist offensichtlich notwendig, um die erste Welle der morphogenetischen Furche auszulösen. Dazu gehört dann auch die Expression von ey, aber auch

anderer Gene wie sine oculis (so) und eyes absent (eya; Abb. 11.35). Diese Gene sind nach entsprechenden Mutanten bei Drosophila benannt, die über keine Augenstrukturen verfügen. Auch für sie gibt es entsprechende homologe Gene bei Säugern. Erwähnenswert ist in diesem Zusammenhang aber noch das Gen twin of eyeless (toy), das über eine Genduplikation mit ey eng verwandt ist. Wie oft in solchen Fällen, überlappen die Funktionen von ey und toy teilweise; für toy gibt es interessanterweise kein homologes Gen bei Vertebraten.

Abb. 11.33 a–g Aufbau eines Ommatidiums von Drosophila. a–c Frühe Stadien in der Entwicklung eines einzelnen Ommatidiums (Schnitt durch die Epidermis der Augenimaginalscheibe). Die zentrale Retinulazelle R8 sinkt in die Tiefe. d Ein fertiges Ommatidium. Die Retinulazellen (Photorezeptoren) erhalten das Licht durch die Linse und den Kristallkegel; die Retinulazelle R7 liegt über R8. Die Photorezeptorzellen sind von Pigmentzellen umgeben, die jedes Ommatidium als getrennte optische Einheit

funktionieren lassen. e–g Wechselwirkung zwischen R7 und R8. Ohne das Boss-Signal (Bridge-of-sevenless) der R8-Zelle kann sich keine R7-Zelle entwickeln, wie durch entsprechende Mutanten deutlich wird. Boss ist ein membrangebundener Ligand, der an den Rezeptor Sevenless der R7-Zelle bindet. Ohne dieses Signal fehlt R7 im reifen Ommatidium (weiße Stelle in g) und wird zu einer überzähligen Zelle des Linsensystems. (Nach Müller u. Hassel 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

11.4 Entwicklungsgenetik von Drosophila melanogaster Abb. 11.34 a, b Komplexauge von Drosophila. a Elektronenmikrosopische Aufnahme des Kopfes von Drosophila: rechts der Wildtyp mit dem typischen roten Facettenauge, links eine eyeless-Mutante ohne Augen. b Ektopische Bildung von Ommatidien am Bein von Drosophila. (a Foto: R. Dahm und J. Berger, Tübingen; b Foto: W. J. Gehring, Basel)

Die Zellen hinter der morphogenetischen Furche von Drosophila kann man auch als posteriore Zellen auffassen, da sie das hedgehog(hh)-Gen exprimieren. Durch die Sekretion dieses Signalproteins wird decapentaplegic (dpp) wieder in den Zellen der Furche aktiviert und die Differenzierung der R8-Zellen eingeleitet. Das System ist dynamisch, denn nach einer Weile schalten die Zellen in der Furche dpp wieder ab und beginnen dafür hh zu exprimieren, dessen Gen-

produkt wiederum die dpp-Expression in den weiter anterioren Zellen aktiviert – so schiebt sich die Furche vorwärts. Der dritte Spieler, den wir ebenso bereits bei der Flügelentwicklung kennengelernt haben, ist wingless. Dieses Gen wird an den Seitenrändern exprimiert und verhindert, dass die Furche dort ihren Anfang nimmt. Ein weiterer interessanter Prozess führt zur regelmäßigen Anordnung der R8-Photorezeptorzellen. Zunächst haben alle nach der Furche entstehenden Zellen das gleiche Potenzial. Allerdings beginnen nach der Furchenwanderung die einen Zellen etwas früher und die anderen etwas später mit ihrer Differenzierung. Zum Differenzierungsprogramm gehört auch, dass eine R8-Zelle im Umkreis von etwa 3 Zellen keine weitere R8-Zelle duldet. Daher werden Signalketten aktiviert, die die Differenzierung zu R8-Zellen in den benachbarten Zellen unterdrücken („laterale Inhibition“). An diesem Prozess ist das scabrous-Gen (sca) beteiligt, das für ein Fibrinogen-ähnliches, sezerniertes Protein codiert, der Notch/Delta-Signalweg, dem wir auch schon bei der Flügelentwicklung begegnet sind, sowie das einen Inhibitor codierende Gen hairless (H). Zu den wichtigen Genen, die an der Differenzierung der R8-Zellen beteiligt sind, gehört auch atonal (ato), das durch eya, so und hh reguliert wird. Die ato-positiven Zellen werden auch als larvale „Augengründerzellen“ bezeichnet. Sie senden das Signalprotein aus, das durch das Gen spitz (spi) codiert wird. Es bewirkt in den Nachbarzellen von R8 über den EGF-RezeptorSignalweg die Spezialisierung der Zellen zu den Photorezeptoren R2‒R7. Unter den verschiedenen Drosophila-Mutanten mit Störungen in der Augenentwicklung sollen an dieser Stelle noch zwei weitere erwähnt werden: sevenless

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Abb. 11.35 Genexpressionsmuster in der frühen Augenentwicklung bei Drosophila. Die Spezifizierung des Augenfeldes erfolgt durch eine Gruppe von Proteinen (Dac: dachshund, Ey: eyeless, Eya: eyes absent, So: sine oculis, Toy: twin of eyeless). Während des 3. Larvenstadiums läuft eine Differenzierungswelle („morphogenetische Furche“) über die Imaginalscheibe hinweg – und hinter dieser Welle entstehen die Photorezeptorzellen (PR). Der Prozess wird durch Notch (N) und den epidermalen Wachstumsfaktor (EGFR) unterstützt. Während des Puppenstadiums bilden sich unter dem Einfluss des Gens spalt (sal) die inneren Photorezeptoren (inner PR) R1–R6; die Gene

(sev) und bridge-of-sevenless (boss). In beiden Fällen entwickelt sich keine R7-Zelle, sondern eine zusätzliche Kegelzelle. Detaillierte genetische Experimente zeigten nun, dass sev für einen Transmembranrezeptor mit Tyrosinkinase-Aktivität codiert; dieses Gen wird normalerweise in den zukünftigen R7-Zellen exprimiert. Umgekehrt codiert boss für einen membrangebundenen Liganden, der in den R8-Zellen exprimiert wird. Die Bindung des Boss-Proteins an den SevRezeptor setzt eine intrazelluläre Signalkette in Gang, die zur Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren und zur endgültigen Differenzierung der R7-Photorezeptorzelle führt.

Das Komplexauge von Drosophila besteht aus ca. 800

wabenmusterförmig angeordneten Ommatidien. Sie entwickeln sich aus der Augenimaginalscheibe. Durch die wandernde morphogenetische Furche wird die Imaginalscheibe vorübergehend in ein anteriores und ein posteriores Kompartiment unterteilt. Hinter der Furche beginnt die Differenzierung der Photorezeptorzellen R1 bis R8. Das Gen eyeless ist das Schlüsselgen für die Augenentwicklung;

prospero (pros) und senseless (sens) sind an der Differenzierung von R7 und R8 beteiligt. Die weitere Differenzierung in die einzelnen Subtypen der Retinulazellen [blass (pale) oder gelb (yellow)] wird von den Genen orthodenticle (otd), spineless (ss) und melted (melt) unterstützt. Das Gen homothorax (hth) ist verantwortlich für die Ausbildung Polarisations-sensitiver Photorezeptoren an der dorsalen Randzone (engl. dorsal rim area, DRA). Rh: verschiedene Rhodopsine mit unterschiedlichen spektralen Empfindlichkeiten. (Nach Morante et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

es kann in anderen Imaginalscheiben ektopisch funktionelle Ommatidien induzieren. Es ist verwandt mit dem Säugergen Pax6, das in Drosophila vergleichbare Effekte zeigt. Die genetischen Grundprinzipien der Augenentwicklung sind offensichtlich zwischen Fliegen und Säugern stark konserviert.

11.5 Entwicklungsgenetik bei Fischen Der Zebrafisch (Danio rerio; Kapitel 5.4.5) ist in den letzten Jahren besonders für Entwicklungsgenetiker immer interessanter geworden. Ein wesentlicher Vorteil des Zebrafisches ist die Transparenz seiner Embryonen, wodurch ihre Entwicklung genau verfolgt werden kann. Sie verläuft wie die eines typischen Teleostiers und ist als Modell auch für die Entwicklung anderer Vertebraten geeignet.

11.5 Entwicklungsgenetik bei Fischen

11.5.1 Allgemeine Embryonalentwicklung des Zebrafisches Im Gegensatz zu dem frühzeitig festgelegten Schicksal der Blastodermzellen in Drosophila, die eine als Mosaikentwicklung gekennzeichnete frühembryonale Entwicklung durchlaufen, ist die Entwicklung des Zebrafisches regulativ. Das bedeutet, dass frühembryonale Zellen relativ lange undeterminiert bleiben oder lange die Fähigkeit zur Änderung ihrer Determination behalten. Die abgelaichten Eier sind transparent und messen ca. 0,6 bis 0,7 mm, die Embryonalentwicklung ist, je nach Temperatur, in 2 bis 4 Tagen abgeschlossen. Der erwachsene Zebrafisch ist etwa 2 bis 3 cm groß und braucht ungefähr 12 Wochen, um fortpflanzungsfähig zu werden. Nach der Befruchtung bildet sich im Ei durch cytoplasmatische Strömungen und Umschichtung der Komponenten eine animale Kappe mit klarem Plasma, in dem sich der Eikern befindet; darunter (im vegetativen Bereich) ist das Ei reich mit Dottermaterialien angefüllt (Abb. 5.44). Die ersten Zellen, die sich am animalen Pol der Eikugel bilden, sind anfänglich nach unten hin zum dottergefüllten Restei offen. Es wird also nicht die ganze Eizelle vollständig in Tochterzellen zerlegt (partiell discoidale Furchung). Wenn 16 und mehr Zellen vorliegen, bilden sie einen scheibenförmigen Verband, der dem Restei aufliegt. Dieser Zellverband wird durch Zellteilungen zu einer mehrschichtigen Keimscheibe (Blastoderm). Sie nimmt durch anhaltende Zellteilungen und durch Abflachung an Umfang zu und umwächst die Dotterkugel. Nach etwa 5,5 Stunden erstrecken sie sich schon über die halbe Strecke (man spricht je nach Position des Umwachsungsrandes von z. B. 40, 70 oder 100 % Epibolie). Jetzt setzt die Gastrulation ein: Die zukünftigen Entoderm- und Mesodermzellen der tieferen Schicht am Rande des Blastoderms wechseln die Richtung und wenden sich nach innen; sie wandern zur zukünftigen Dorsalseite. Dabei strebt das Gewebe von allen Seiten auf die Mittellinie des Embryos zu und dehnt sich gleichzeitig aus, während sich der Embryo in anteriorposteriorer Richtung in die Länge zieht. Das Mesoderm und Entoderm kommen schließlich unter das Ektoderm zu liegen. Nach 9 Stunden kann man die Chorda erkennen, und nach 10 Stunden ist mit der Bildung der ersten Somiten anterior die Gastrulation abgeschlossen. Als Nächstes folgen die Neurulation und die Bildung der Somiten. Dabei streckt sich der Embryo in die Länge und die Anlagen der primären Organsysteme sind zu erkennen. Das Nervensystem entwickelt sich schnell. Die optischen Bläschen, aus denen sich die Augen entwickeln, kann man nach 12 Stunden als Aus-

stülpungen des Gehirns erkennen. Die Somiten bilden sich in Intervallen von 2 bis 3 Stunden; nach insgesamt 18 Stunden sind 18 Somiten vorhanden. In diesem Alter beginnt der Körper zu zucken, nach 48 Stunden schlüpft der Embryo, und der junge Fisch beginnt zu schwimmen und zu fressen. In Abb. 11.36 sind zwei Beispiele für Mutanten mit Entwicklungsstörungen gezeigt, die aufgrund äußerer Merkmale einfach erkannt werden konnten: Die Mutation neckless (nls) betrifft das aldh1-Gen – die Mutanten zeigen Störungen in Hinterhirn, Flossen, Pankreas und Herz. Die Mutation giraffe (gir) betrifft das cyp26aGen, und die betroffenen Fischembryonen weisen einen verkürzten Schwanz auf. Beide Mutationen greifen in den Retinsäure-Signalweg ein. Wenn in das Schwimmbecken mit Wildtyp-Fischen Retinsäure (10−7 M) gegeben wird, zeigen sich ähnliche charakteristische Merkmale (verkürzter Schwanz und Defekte in der Kopfentwicklung). Der Zebrafisch bietet aber über die einfache Identifikation von Mutanten hinaus noch einen weiteren Vorteil, nämlich die Möglichkeit, durch Injektion von Morpholino-antisense-RNA die Aktivität von Genen gezielt auszuschalten (TechnikBox 26). Dies erleichtert die funktionelle Charakterisierung von Genen; in Abb. 11.36c und f sind zwei Beispiele gezeigt, und zwar für das aldh1-Gen sowie für das cyp26a-Gen. Die mit Morpholinos behandelten Tiere zeigen ähnliche Störungen wie die Mutanten, bei denen die Gene durch Punktmutationen verändert sind.

Der Zebrafisch ist noch ein relativ neues, aber sehr interessantes Objekt zur entwicklungsgenetischen Untersuchung von Wirbeltieren. Seine Vorteile sind die hohe Geschwindigkeit der Embryonalentwicklung und die Durchsichtigkeit der Embryonen.

11.5.2 Frühe Embryonalentwicklung des Zebrafisches Viele frühere entwicklungsbiologische Arbeiten wurden an Fröschen durchgeführt. Als der Zebrafisch neu als entwicklungsgenetisches Modell eingeführt wurde, begann bald auch die Suche nach solchen Genen, die sich bei Fröschen als wichtig für bestimmte Entwicklungsstufen herausgestellt hatten. Dies wurde allerdings dadurch erschwert, dass das Zebrafisch-Genom in weiten Bereichen dupliziert ist und daher viele Gene überlappende Funktionen haben.

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Abb. 11.36 a–f Mutanten des Zebrafisches. a Wildtyp-Embryo eines Zebrafisches im Alter von 30 Stunden nach der Fertilisation (hpf ). b Embryo mit einer Mutation im aldh1a2-Gen (nls, neckless). c Wildtyp-Embryo, dem im 1-Zell-Stadium ein Morpholino gegen aldh1a2 injiziert wurde. d Wildtyp-Embryo, der ab 8 hpf mit Retinsäure (10−7 M) behandelt wurde. e Emb-

ryo mit einer Mutation im cyp26a-Gen (gir, giraffe). f WildtypEmbryo, dem im 1-Zell-Stadium ein Morpholino gegen cyp26a injiziert wurde. Stern: Kopfdefekte, Pfeil: Herz-Ödem, Pfeilspitze: Schwanzknick, Klammer: Schwanzverkürzung. (Nach Skromne u. Prince 2008, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

Einige der besonders eindrucksvollen Mutanten des Zebrafisches haben hier jedoch weitergeholfen. In Embryonen, die für die dino-Mutation homozygot sind, zeigen dorsale Zellen schon im Gastrulastadium ventrale Eigenschaften ‒ und umgekehrt ahmen in swirl-Embryonen die ventralen Zellen dorsale Eigenschaften nach. Diese Phänotypen ließen vermuten, dass die beiden Gene für dorsalisierende bzw. ventralisierende Aktivitäten codieren. In Übereinstimmung damit kann der dino-Phänotyp durch die Zugabe von BMP4-mRNA unterdrückt werden, wohingegen die Funktion von swirl durch Injektion von BMP4-mRNA (teilweise) wiederhergestellt werden kann. Die Analyse dieser beiden Mutanten unterstützte also das Modell, das von Xenopus her bekannt war, dass nämlich gegenläufige Gradienten von BMP und BMP-Antagonisten das dorso-ventrale Muster aufbauen. Spätere Untersuchungen zeigten dann auch im Detail, dass bei der dino-Mutante das Chordin-Gen des Zebrafisches betroffen ist und in der swirl-Mutante das BMP2-Gen. Das Streifenmuster des erwachsenen Zebrafisches ist ein weiteres imposantes Beispiel über die Konsequenzen frühembryonaler Musterbildung und ihrer genetischen Kontrolle. Zebrafische übertreffen dabei sogar die Komplexität der Hautfärbungen bei Säugern, da sie nicht nur die schwarzen Melanocyten haben,

sondern darüber hinaus die gelben Xantophoren und silbernen Iridophoren. Die genaue genetische Analyse des Streifenmusters weist die meisten Mutanten zwei Epistasie-Gruppen zu. Eine Epistasie-Gruppe beeinflusst die Melanocyten der späten Streifen (engl. late stripe melanocytes, LSM) und enthält die Mutationen rose, primrose, leopard und panther. Die zweite Gruppe ist durch Defekte der frühen Streifenbildung gestört (engl. early stripe melanocytes, ESM); dazu gehört aber nur eine Mutation: sparse. Doppelmutanten von sparse mit irgendeinem Mitglied der LSM-Gruppe führt zum Verlust aller Streifen. Beispiele für diese Streifenbildung zeigt die Abb. 11.37. Die molekulare Analyse hat gezeigt, dass die sparse-Mutation das Gen kit betrifft, das bei der Maus für Veränderungen der Fellfarbe verantwortlich ist und in Fischen und Mäusen für eine Rezeptor-Tyrosinkinase codiert (bei der Maus ist die vergleichbare Mutation als dominant spotting bekannt). Die Mutation im kit-Gen verhindert das Auswandern der Melanocyten-Vorläuferzellen aus der Neuralleiste und deren Überleben. Die rose-Mutation betrifft das Gen ednrb, das für den Endothelin-Rezeptor B codiert. Auch hier gibt es vergleichbare Mausmutanten (piebald-lethal). Allerdings unterscheiden sich die genetischen Verhältnisse zwischen Zebrafisch und der Maus insoweit, dass die Maus beide Gene braucht, damit sich

11.5 Entwicklungsgenetik bei Fischen

Abb. 11.37 a–f Streifenmuster-Mutanten des Zebrafisches. a Die wichtigen inneren Organe und Streifenmuster einer Zebrafisch-Larve. b Das Streifenmuster eines erwachsenen Zebrafisches. Die Melanophoren-Streifen bestehen aus ca. 6 Zellreihen, wohingegen die Xanotophoren-Streifen aus ca. 9 Zellreihen aufgebaut sind. c In der (heterozygoten) leopard-Mu-

die Melanocyten entwickeln können, wohingegen beim Zebrafisch ein Gen für eine Klasse benötigt wird. Weitere Untersuchungen haben ergeben, dass die in Abb. 11.37 ebenfalls dargestellte obelix-Mutante durch eine Mutation in Kir7.1 verursacht wird; dieses Gen codiert für einen K+-Kanal und wird in Melanophoren benötigt, um deren Aggregation zu fördern und die Integrität der Grenzen zu kontrollieren. Moreira und Deutsch veröffentlichten 2005 ein mathematisches Modell, das die Streifenbildung beim Zebrafisch simuliert und dabei auch die Wirkung einzelner Mutationen berücksichtigt. Die Modellierung unterstreicht in besonderer Weise die Bedeutung der Haftung zwischen einzelnen Zellen bei der Zellwanderung sowie Mechanismen der Regulation von Stammzellen. Alle Wechselwirkungen, die im Modell berücksichtigt werden, haben allerdings nur lokale Bedeutung.

tante ist die Streifengrenze verbreitert. d In der homozygoten leopard-Mutante ist nur noch ein Punktmuster sichtbar. e Die heterozygote obelix-Mutante zeigt breite und unterbrochene Streifen. f In der homozygoten obelix-Mutante erscheinen die Streifen-Zellen vermischt. (Nach Moreira u. Deutsch 2005, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

Der Zebrafisch eignet sich hervorragend zur Untersuchung früher Musterbildung bei Vertebraten. Das gilt nicht nur für die Ausbildung der zentralen anterior-posterioren und dorso-ventralen Körperachsen, sondern auch für Muster, die beim erwachsenen Fisch als Streifen sichtbar werden.

11.5.3 Organentwicklung bei Zebrafischen: Herz und Auge Die Durchsichtigkeit des Zebrafisch-Embryos macht diesen Organismus in ganz besonderer Weise geeignet, die Herzentwicklung zu studieren. Ein zweites prominentes Organ des Zebrafisches ‒ dieses Mal aufgrund seiner relativen Größe ‒ ist das Auge. Bei der Besprechung der genetischen Regulation der Organentwicklung beim Zebrafisch wollen wir uns deshalb auf diese beiden Organe als Beispiele konzentrieren.

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Abb. 11.38 a–c Fluoreszenz-Immunhistochemie in Verbindung mit konfokaler Mikroskopie bewirken eine Auflösung auf zellulärer Ebene und ermöglichen die Aufklärung von pathologischen Mechanismen während der Embryonalentwicklung. Aufgrund eines Falschfarben-Effekts zeigen die blauen Zellen die Expression eines Myosin-Proteins an (codiert durch cmlc2), das an das grün fluoreszierende Protein (GFP) gekoppelt ist. a Myokard-Vorläuferzellen des Wildtyps bilden im 20-SomitenStadium ein polarisiertes Epithel, wobei eine atypische Pro-

teinkinase C (aPKCλ; grün) in den apicolateralen Membranen exprimiert wird und β-Catenin (rot) in den basolateralen Membranen lokalisiert ist. b, c In den hand2- (b) und natter-Mutanten (c) ist dieser Prozess gestört; die hand2-Mutation betrifft den Transkriptionsfaktor Hand2 und die natter-Mutation das Gen, das für Fibronektin codiert. Die einfache Struktur und die geringe Zahl von Zellen erlaubt die detaillierte Untersuchung der Entwicklung der Herzklappen. (Nach Beis u. Stainier 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Die Vorläuferstrukturen des Herzens beim Zebrafisch kann man aufgrund des Expressionsmusters des Transkriptionsfaktors Nkx2.5 ungefähr 16 Stunden nach der Fertilisation erkennen. Zunächst zeigen sich zwei diskrete Domänen, die die Mittellinie flankieren; diese fusionieren etwa 3 Stunden später und bilden den primitiven Herzschlauch (engl. heart tube). Obwohl das Fischherz nicht in eine linke und rechte Kammer getrennt ist, vollzieht es dennoch dieselbe rechtsgerichtete Drehung, die den Beginn der Kammertrennung bei Luft atmenden Wirbeltieren kennzeichnet. Dieser Prozess findet etwa 36 Stunden nach der Befruchtung statt; etwa 12 Stunden vorher geht ihm eine vorübergehende Biegung in die Gegenrichtung voraus, die durch die asymmetrische Expression von bmp-4 in dem sich entwickelnden Herzschlauch sichtbar wird. Im Zebrafisch kennen wir jetzt eine ganze Reihe von Mutanten, bei denen die Links-Rechts-Asymmetrie entweder umgekehrt wird oder nur zufällig ausgebildet wird. Allerdings weisen diese Mutanten auch noch weitere Defekte in der Entwicklung auf, vor allem des Notochords und der Bodenplatte [z. B. floating head (flh), no tail (ntl) und cyclops (cyc)]. Andere Mutanten weisen Defekte in der späteren Entwicklung auf und betreffen die Entwicklung der Herzschläuche, die Entwicklung und Orientierung der Kammern, die Bildung der Herzklappen und das konzentrische Wachstum. Beispiele sind cloche (clo), pandora (pan; Spt6, ein Elongationsfaktor der Transkription), miles apart (mil1; Sphingosin-1-phosphat-Rezeptor), bonnie and clyde (bon; Homöobox-Transkriptionsfaktor der Mix-Familie), tremblor (tre; Na+/K+-Austauscher, Slc8a1a), silent partner (sil) oder island beat (isl; Ca2+-Kanal, Cacna1c; die durch die Mutation betroffenen Proteine sind ‒ soweit bekannt ‒ in Klammern angegeben).

Eine besonders eindrucksvolle Möglichkeit (die allerdings in einem Buch nicht wirklich überzeugend dargestellt werden kann) ist die Anwendung bildgebender Verfahren (Antikörperfärbung mit konfokaler Mikroskopie) und die Beobachtung von Zellwanderungen in vivo. So wandern HerzmuskelVorläuferzellen während ihrer Reifung zur Mittellinie und bilden zusammenhängende Populationen mit Fibronektin. Die Mutantenanalyse hat gezeigt, dass diese Anheftung an Fibronektin für die Wanderung selbst nicht essenziell ist, wohl aber für den zeitlichen Verlauf. Die Ablagerung von Fibronektin um die Myokardzellen herum ist allerdings unbedingt nötig, damit sich die Zellen richtig anheften können und die wandernde Population ihre epitheliale Integrität erhält. Diese in-vivoUntersuchungen machen deutlich, dass Fibronektin für die Reifung des Myokard-Epithels notwendig ist und dass Zell-Substrat-Wechselwirkungen die Zellform und auch die Morphogenese beeinflussen. In hand2-Mutanten (Abb. 11.38) sind die Myokard-Vorläuferzellen aber nicht nur in der Zahl vermindert, sie zeigen auch keinerlei Anzeichen einer Polarisation. Damit konnte mit in-vivo-Verfahren gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor Hand2 die Polarität der wandernden Myokardzellen reguliert (Beis u. Stainier 2006). Das Auge des Zebrafisches ist mit dem Ende der Embryonalphase vollständig entwickelt, da die frei schwimmende Larve auf selbstständige Nahrungssuche (Protozoen und kleine Larven von Metazoen) angewiesen ist. Die Augenentwickung kann 11 Stunden nach der Befruchtung beobachtet werden, wenn die Augenvorläufer als Ausstülpungen des Diencephalons sichtbar werden. Die ventralen Ganglienzellen in der Retina sind 28 Stunden nach der Befruchtung (engl. hours

11.6 Entwicklungsgenetik bei Säugern

Abb. 11.39 a–c Retina-Mutationen des Zebrafisches. Es sind transversale Schnitte eines 5 Tage alten Zebrafisch-Embryos gezeigt. a Die Retina des Wildtyps ist voll entwickelt. GCL: Ganglienzellschicht; INL: innere Körnerschicht; IPL: innere plexiforme Schicht; ON: Sehnerv; ONL: äußere Körnerschicht; OPL: äußere plexiforme Schicht; OS: äußere Segmente der Photorezeptoren; RPE: retinales Pigmentepithel. Balken: 50 μm. b In der

lakritz-Mutante fehlt die Ganglienzellschicht fast vollständig, dafür ist die innere Körnerschicht dicker. c In der oval-Mutante sind die Photorezeptoren spezifisch betroffen: Die Löcher werden durch degenerierte Zellen hervorgerufen, und die verbleibenden Photorezeptoren sind deutlich verkürzt oder fehlen in den äußeren Segmenten vollständig. (Nach Neuhauss 2003, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

post fertilization, hpf) ausgebildet, das Chiasma opticum wird nach 32 hpf gebildet, die Retina insgesamt ist im Alter von 60 hpf voll entwickelt, das visuelle System einschließlich des Tectum opticum nach 65 hpf. Durch einfache Verhaltenstests, aber auch aufwendige elektrophysiologische Verfahren (Elektroretinogramm), konnte eine Vielzahl von Mutanten beim Zebrafisch identifiziert und charakterisiert werden, deren Augenentwicklung oder die Entwicklung des visuellen Systems „hinter dem Auge“ gestört ist. Zwei Beispiele dazu sind in Abb. 11.39 dargestellt: Die lakritz-Mutante hat keine Ganglienzellen (Ursache: Mutation im Gen ath5, das für den Transkriptionsfaktor Atonal codiert) und die oval-Mutante keine Photorezeptoren (Ursache: Mutation im Gen ift88, das für ein intraflagellares Transportprotein codiert).

logie und der Embryologie sei aber auf die einschlägige zoologische bzw. medizinische Fachliteratur verwiesen.

Im Zebrafisch können bestimmte Organe in ihrer Ent-

wicklung besonders gut verfolgt werden. Dazu gehören das Herz wegen der Durchsichtigkeit des Embryos und das Auge wegen seiner Größe. Es wurde eine Vielzahl von Mutanten identifiziert und charakterisiert, die als Modelle für entsprechende Erbkrankheiten des Menschen dienen.

11.6 Entwicklungsgenetik bei Säugern In diesem Kapitel sollen kurz einige entwicklungsgenetische Aspekte des Menschen und des wichtigsten genetischen Modells für Säugetiere, der Maus, zusammen angesprochen werden. Für Details der Entwicklungsbio-

11.6.1 Embryonalentwicklung von Säugern Der Lebenszyklus der Maus von der Befruchtung bis zum geschlechtsreifen Tier dauert 9 Wochen – für einen Säuger eine relativ kurze Zeitspanne. Das Ei wird noch im Eileiter befruchtet; hier erfolgt auch die erste Furchungsteilung nach etwa 24 Stunden. In diesem Stadium ist das befruchtete Ei bzw. der sich entwickelnde Embryo von einer äußeren Schutzhülle umgeben, der Zona pellucida, die aus Mucopolysacchariden und Glykoproteinen besteht. Alle weiteren Furchungsteilungen folgen in Intervallen von 12 Stunden. Auf diese Weise entsteht eine kompakte Zellkugel, die Morula. Im 8-Zell-Stadium vergrößern die Blastomere die Kontaktflächen, über die sie sich berühren (Verdichtung). Danach sind die Zellen polarisiert: Auf ihren äußeren Oberflächen befinden sich Mikrovilli, die inneren sind dagegen glatt. Die weiteren Furchungsteilungen verlaufen in unterschiedlichen Orientierungen, sodass eine Morula im 32-Zell-Stadium 10 innere und 22 äußere Zellen enthält. Eine Eigenheit der Säugerentwicklung ist, dass aus den schon im Morulastadium angelegten zwei Zellgruppen zwei unterschiedliche Gewebe hervorgehen: Die inneren Zellen bilden die innere Zellmasse (engl. inner cell mass, ICM), aus der sich der eigentliche Embryo entwickelt (und auch Amnion und Dottersack); die äußeren Zellen bilden das Trophektoderm, das sich zu extraembryonalen Strukturen wie der Plazenta

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

entwickelt. In diesem Stadium (3,5 Tage nach der Befruchtung) bezeichnet man den Embryo als Blastocyste. Das Trophektoderm pumpt jetzt Flüssigkeit in das Innere der Blastocyste, sodass sie sich zu einem Vesikel weitet (Abb. 11.40). Nun teilt sich die innere Zellmasse: Aus der Schicht an der Oberfläche wird das primitive Entoderm, das an der Bildung der extraembryonalen Membranen beteiligt ist, und aus den übrigen Zellen der inneren Zellmasse entwickelt sich das primitive Ektoderm (auch Epiblast genannt). Erst nach 4,5 Tagen nistet sich der Embryo in der Gebärmutterwand ein, nachdem er die Zona pellucida verlassen hat. In dieser Phase sind dann auch die anterior-posteriore und dorso-ventrale Achse des Embryos endgültig festgelegt. Es gibt aber deutliche Hinweise darauf, dass schon die Eintrittsstelle des Spermiums und die Position des zweiten Polkörperchens an der Definition der Achsen beteiligt sind. Für das spätere Verständnis der Diskussion und Verwendung von embryonalen Stammzellen (Kapitel 11.7) ist es wichtig zu wissen, dass embryonale Stammzellen aus dem frühen Morulastadium totipotent sind. Ein wichtiges Gen zur Aufrechterhaltung der Totipotenz in diesem Stadium ist Oct4. Während noch alle Blastomeren bis hin zur Morula Oct4 exprimieren, findet sich nach der Differenzierung in innere Zellmasse und Trophektoderm eine Oct4-Expression nur noch in der inneren Zellmasse und wird später auf das primitive Ektoderm und die Vorläuferzellen der Keimzellen beschränkt. Ein Verlust der Oct4-Genaktivität ist für den Embryo letal, da er dann die Fähigkeit verliert, das primitive Ektoderm auszubilden. Die Gastrulation findet während der nächsten Tage statt. 6 Tage nach der Befruchtung hat sich im Epiblasten eine innere Höhle mit der Form eines Bechers mit einem U-förmigen Querschnitt gebildet. Aus dieser gekrümmten Epithelzellschicht (in diesem Stadium ca. 1000 Zellen) entwickelt sich der eigentliche Embryo. Seine Körperachse wird nach etwa 6,5 Tagen erstmals sichtbar, wenn mit der Bildung des Primitivstreifens (engl. primitive streak) die Gastrulation einsetzt. Der Streifen beginnt als eine lokale Verdickung an einer Stelle außen am Becher; hier befindet sich das spätere Hinterende des Embryos. Die Innenseite wird dann zur Dorsalseite des Embryos. Proliferierende Epiblastenzellen wandern durch den Primitivstreifen hindurch, breiten sich zur Seite und nach vorne hin zwischen dem Ektoderm und dem viszeralen Entoderm aus und bilden so das Mesoderm. Der Primitivstreifen verlängert sich zunächst in Richtung des späteren Vorderendes des Embryos. Dort bildet sich ein Bereich, in dem die Zellen dicht gepackt sind und der als Primitivknoten (engl. Hensen’s node) bezeichnet wird. Aus Zellen, die durch den Primitivknoten nach vorne wandern, entsteht direkt in der Mittellinie die Chorda dorsalis (engl. notochord; dieser Begriff

Abb. 11.40 Frühentwicklung der Säuger. Nach den ersten Furchungen bildet sich zunächst eine Morula, die sich nach weiteren Zellteilungen zur Blastocyste weiterentwickelt. Die Blastocyste enthält die innere Zellmasse, die sich zum eigentlichen Embryo weiterentwickelt, und die äußersten Trophoblasten, die das extraembryonale Gewebe bilden

wird auch im Deutschen schon häufig verwendet). Auf beiden Seiten bildet sich in zwei Streifen das paraxiale Mesoderm. Es liefert die Zellpopulationen für das somitische Mesoderm, aus dem durch Abknospung die ersten segmentierten Strukturen des Embryos, die Somiten (engl. somites), entstehen. Somiten differenzieren unter dem Einfluss des Notochords und des darüber liegenden Oberflächenektoderms in Sklerotom (später entwickelt sich daraus das Skelett), Myotom (später entwickelt sich daraus das Muskelgewebe) und Dermatom (später entwickelt sich daraus das Hautgewebe).

Die erste Phase der Embryonalentwicklung der Säugetiere umfasst zunächst die Bildung der Morula und der Blastozyste. Aus der inneren Zellmasse entwickelt sich der Embryo, aus dem umgebenden Trophoblasten entsteht extraembryonales Gewebe. In der Gastrulation werden die drei Keimblätter angelegt (Ektoderm, Entoderm, Mesoderm).

Eine zentrale Rolle in dieser Phase der Gastrulation spielt das Gen sonic hedgehog (Shh), das mit dem hedgehog-Gen von Drosophila eng verwandt ist. Es wird im Notochord exprimiert und beeinflusst als Morphogen alle umliegenden Gewebe. Mutationen im Shh-Gen führen bei der Maus zu massiven Defekten bei der Ausbildung der Mittellinie; es findet keine Bil-

11.6 Entwicklungsgenetik bei Säugern

Abb. 11.41 a–d Sonic-Hedgehog-Signale im Wirbeltierembryo. Das vom Gen sonic hedgehog (Shh) codierte Protein kann in einer membranassoziierten Form exprimiert werden oder in einer Form, die sich von der Oberfläche der produzierenden Zelle ablöst und in die Zellzwischenräume diffundiert, wo es entfernte Ziele erreichen kann. a Shh, das von der Chorda direkt dem darüberliegenden Neuralrohr präsentiert wird, induziert die Bildung der Bodenplatte (engl. floor plate) im Neu-

ralrohr. b Anschließend produziert die Bodenplatte selbst ein Shh-Signal, das die Neuroblasten stimuliert, zu Motoneuronen zu werden (c, d). Shh, das von der Chorda in die umgebenden Räume entlassen wird, stimuliert die Zellen des Sklerotoms, aus den Somiten auszuwandern (b) und sich um die Chorda zu scharen. Hier bilden sie einen Teil der Wirbelkörper (d). (Nach Müller u. Hassel 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

dung der Somiten statt und die spätere Induktion der Neuralplatte unterbleibt. Eine Übersicht über den Einfluss von Shh gibt Abb. 11.41. Es wurde noch eine Reihe weiterer Mausmutanten mit Defekten in der Gastrulation identifiziert und molekular charakterisiert. Dies im Detail zu erörtern, würde allerdings den Rahmen dieses Buches sprengen.

doch sind die Vordergrenzen nicht für alle entsprechenden Gene gleich. Daraus ergibt sich für die Definition bestimmter Segmentbereiche eine Zuordnung zur Expression der jeweiligen Hox-Gene – dies wird auch als Hox-Code bezeichnet (Kessel u. Gruss 1991). Gesteuert wird die Expression der Hox-Gene unter anderem durch einen Gradienten von Retinsäure (engl. retinoic acid; Oxidationsprodukt des Vitamin A). In hohen Dosen hat Vitamin A daher teratogene Effekte (Kapitel 11.6.3), die sich in der Verkrüppelung der Extremitäten darstellen.

Ein Aspekt soll aber dennoch angesprochen werden, der bereits bei der homöotischen Transformation von Drosophila erwähnt wurde. Wir haben dort gesehen, dass die segmentale Identität durch die Gene des Antp- bzw. Bx-Komplexes vermittelt werden. Das Hox-Cluster ist bei Säugetieren durch zweifache Duplikation vervierfacht (Abb. 11.29). Die Reihenfolge der Gene auf dem Chromosom entspricht der Reihenfolge, in der die Gene entlang der anterior-posterioren Körperachse aktiviert werden (Colinearität zwischen der Position der Gene auf dem Chromosom und den Orten ihrer Expression). Das bedeutet, dass die Gene am 3’-Ende des Clusters früh und anterior und die Gene am 5’-Ende später und weiter hinten im Embryo exprimiert werden. Man sieht dabei wechselnde Expressionsmuster, die sich wellenförmig über große Bereiche des Embryos ausbreiten. Bei Ausbildung der longitudinalen Körperachse werden alle Vertreter der vier HoxCluster mit scharfen anterioren Grenzen exprimiert,

Am Ende der Gastrulation beginnt die Entwicklung des Nervensystems, ein Prozess, der auch als Neurulation bezeichnet wird. Durch Induktion des sich bildenden Mesoderms entsteht in dem darüber liegenden Oberflächenektoderm die Neuralplatte. Durch Proliferation wächst die Neuralplatte und faltet sich dabei zunächst nach innen (Neuralfalte), bevor sich die Neuralfalten annähern und verbinden. Damit schnüren sie sich vom Oberflächenektoderm ab und schließen sich zum Neuralrohr (engl. neural tube). Im Kopfbereich des Neuralrohrs entsteht die Anlage des Gehirns, während sich die eher posterioren Teile zum Rückenmark ausbilden. An den Rändern der sich auffaltenden Neuralplatte entsteht eine Population von Zellen, die als Neuralleistenzellen (engl. neural crest cells) bezeichnet werden. Sie zeichnen sich durch hohe Mobilität aus und bilden die Stamm-

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

zellen für viele verschiedene Zelltypen (z. B. Pigmentzellen, Spinalganglien, Ganglien des vegetativen Nervensystems, Nervenzellen des Gastrointestinaltrakts oder Zellen des Nebennierenmarks). Ein entscheidender Schritt in diesem Prozess ist das Schließen des Neuralrohrs, das offensichtlich an drei verschiedenen Bereichen unabhängig initiiert wird: Zunächst im Bereich des Übergangs des Hinterhirns zur (späteren) Wirbelsäule im Stadium von 6 bis 7 Somiten (Tag 8,5 der Embryonalentwicklung; E 8,5); von hier breitet sich der Verschluss des Neuralrohrs nach rostral (zur Kopfvorderseite) und caudal (zum Schwanz hin) weiter aus. Der zweite Initiationspunkt liegt an der Grenze zwischen Vorder- und Mittelhirn, und der dritte Initiationspunkt befindet sich an der äußerst rostralen Seite des Vorderhirns. Abb. 11.42 zeigt zwei verschiedene Mausmutanten am Tag 15,5 der Embryonalentwicklung mit klassischen Neuralrohrdefekten, die auf Fehler im Schluss des Neuralrohrs basieren (das Celsr1-Gen codiert für einen 7fachen Transmembranrezeptor, wohingegen das betroffene Gen der curly tail-Mutante noch nicht bekannt ist.

In der Neurulation bilden sich die grundlegenden

Elemente des Nervensystems: das Neuralrohr, an dessen Vorderende sich das Gehirn entwickelt und dessen posteriorer Bereich zum Rückenmark wird. Die Neuralleistenzellen zeichnen sich durch eine hohe Mobilität aus und sind Ausgangspunkt vieler neuronaler Zelltypen

Nach 8,5 Tagen, im Endstadium der Gastrulation, kommt es im Embryo auch zu umfassenden Faltungen, in deren Verlauf sich das Entoderm, das zunächst die ventrale Oberfläche des Embryos bedeckt, nach innen verlagert und den Darm bildet. Herz und Leber nehmen ihre endgültige Stellung im Verhältnis zum Darm ein, und der Kopf beginnt sich abzuzeichnen. Der Embryo dreht sich dann so, dass er von seinen extraembryonalen Membranen eingehüllt ist. Nach 9 Tagen ist die Gastrulation beendet: Der Kopf des Embryos ist deutlich zu erkennen, und die Vorderextremitäten beginnen sich zu entwickeln. Am 10. Tag nach der Befruchtung hat bereits die Entwicklung aller Organe eingesetzt.

11.6.2 Entwicklung von Zwillingen beim Menschen Genetische Einflüsse auf die menschliche Entwicklung lassen sich in der Humangenetik durch die Zwillingsforschung erkennen. Wie wir oben in der Zusammenstellung gesehen haben, ist die Ausbildung der Embryonalhäute (Amnion und Chorion) ein wichtiger Schritt in der frühen Embryonalentwicklung. Diese Embryonalhäute üben einerseits Schutzfunktionen, andererseits aber auch Ernährungsfunktionen aus.

Abb. 11.42 a, b Mausmutanten mit Neuralrohrdefekten. Mäuseembryonen nach 15,5 Tagen der Embryonalentwicklung zeigen das Auftreten von a Craniorachischisis in der Celsr1-Mutante und b Exencephalie und eine offene Spina bifida in einer curly tail (ct)-Mutante. Bei der Craniorachischisis ist das Neuralrohr vom Mittelhirn bis zum unteren Bereich der Wirbelsäule offen (a: zwischen den dünnen Pfeilen). In dem in b gezeigten Embryo ist die Exencephalie auf das Mittelhirn beschränkt (b: dünner Pfeil), wohingegen die Spina bifida die lumbo-sacrale Region betrifft (b: Pfeilspitze). Beachte den geringelten Schwanz in beiden Embryonen (a, b: dicke Pfeile). (Nach Copp et al. 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Für uns ist an dieser Stelle die Ausbildung der äußeren Embryonalhaut, des Chorions, von besonderem Interesse. Bei der Entwicklung von Zwillingen können zwei Arten des Chorions entstehen (Abb. 11.43): entweder ein einheitliches, das beide Embryonen umschließt, oder zwei getrennte Embryonalhäute, jede für einen der Embryonen. Dizygote Zwillinge haben stets getrennte Embryonalhäute, während bei mehr als zwei Drittel der monozygoten Zwillinge ein gemeinsames Chorion gebildet wird. Bei diesen Zwillingen ist die Entstehung der beiden Individuen erst nach der Bildung der Blastocyste durch Teilung der inneren Zellmasse erfolgt, da die äußere Zelllage der Blastocyste (das Trophektoderm) das Chorion bildet (Abb. 11.40). Ist die Teilung der Individuen bereits im 2-Zell-Stadium oder spätestens bis zum Morulastadium (etwa 16 Zellen) erfolgt, bilden sich zwei Blastulae und damit zwei getrennte Chorions. Ob sich monozygote Zwillinge in einem Chorion oder in getrennten Embryonalhäuten entwickelt haben, ist deshalb von Bedeutung, weil Individuen in einem einzigen Chorion ein viel einheitlicheres Milieu während der gesamten pränatalen Entwicklung vorfinden als im Falle getrennter Embryonalhäute. Der Vergleich monozygoter Zwillinge monochorionischen Ursprungs mit solchen dichorionischen Ursprungs sollte uns Aufschlüsse über das Ausmaß entwicklungsbedingter (also umweltbedingter) Einflüsse auf die Ausprägung erblicher Eigenschaften gestatten, da ja die erblichen Eigenschaften identisch sind.

11.6 Entwicklungsgenetik bei Säugern

Abb. 11.43 a–d Zwillinge im Uterus. a Dizygote Zwillinge haben stets zwei getrennte Plazenten und getrennte Amnions. b, c Monozygote Zwillinge haben eine gemeinsame Plazenta, können aber je nach dem Zeitpunkt der Teilung der inneren Zellmasse ein Amnion (c) oder zwei Amnions (b) besitzen.

Zwillinge können eineiig (monozygot) oder zweieiig

(dizygot) sein. Dizygote Zwillinge entstehen durch gleichzeitige Befruchtung zweier Eizellen durch zwei Spermien. Die genetische Konstitution entspricht daher der beliebiger Geschwisterpaare. Monozygote Zwillinge gehen auf ein einziges befruchtetes Ei zurück. Sie entstehen durch

d Die Schemazeichnung gibt die Zeitachse der normalen menschlichen Embryonalentwicklung an; die Zeitangaben für monozygotische Zwillinge sind eingearbeitet. ICM: innere Zellmasse. (Nach Hall 2003, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Teilung der sich entwickelnden inneren Zellmasse zu einem früheren Zeitpunkt in der Embryonalentwicklung. Die weitere Embryogenese kann, abhängig vom Zeitpunkt der Teilung, in einem einzigen Chorion oder in zwei getrennten Chorions verlaufen. Die Untersuchung der Ausprägung von Merkmalen bei eineiigen Zwillingen ver-

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

mag durch einen diskordanten oder konkordanten Phänotyp Hinweise über die erblichen Komponenten eines bestimmten Merkmals zu geben.

11.6.3 Teratogene Effekte Wir haben in den früheren Abschnitten über Modellorganismen der Entwicklungsgenetik gesehen, dass die molekulare Charakterisierung von Mutanten wesentlich dazu beiträgt, die jeweiligen Mechanismen zu verstehen. Dies gilt auch in besonderer Weise für die Säugetiere und insbesondere für den Menschen, wie wir in Kapitel 12 über Humangenetik noch sehen werden. Allerdings gibt es in der Medizin immer wieder Krankheitsformen, die durch Schädigungen des Embryos von außen hervorgerufen werden. Solche Erkrankungen nennen wir teratogen. Oftmals muss aber das schädigende Agens auf eine ganz spezielle Entwicklungssituation treffen, um seine Wirkung zu entfalten. In der experimentellen Biologie kann man natürlich auch die Wirkung bestimmter Stoffe auf die Embryonalentwicklung systematisch untersuchen.

produktbezeichnung: Contergan ; Abb. 11.44a) bei Schlafstörungen häufig verschrieben. Allmählich fiel auf, dass nach Einnahme dieses Schlafmittels während früher Phasen einer Schwangerschaft häufig Kinder geboren wurden, die unvollständig entwickelte Gliedmaßen besaßen, also eine Entwicklungsstörung aufwiesen, die als Phocomelie bezeichnet wird (Abb. 11.44b). Die nähere Untersuchung dieses Phänomens zeigte, dass Thalidomid in der Tat während einer eng begrenzten Periode der Embryonalentwicklung eine Anzahl unterschiedlicher Entwicklungsstörungen hervorzurufen vermag (Tabelle 11.2). Diese teratogene Wirkung des Medikaments wird ausschließlich zwischen dem 21. und 36. Tag der Embryonalentwicklung beobachtet. Das frühe und zudem zeitlich sehr begrenzte Wirkungsspektrum machte es natürlich zunächst schwierig, die Wirkung des Medikaments zu erkennen und genauer zu analysieren, bis nach der Geburt von etwa 7000 betroffenen Kindern in den frühen 1960er-Jahren die Ursache von W. Lenz erkannt wurde: Eine einzige Tablette mit Thalidomid im kritischen Entwicklungszeitraum genügte, eine Missbildung beider Arme und Beine hervorzurufen (eine sehr persönliche Darstellung der Problematik findet sich bei Lenz 1992).

Ein besonders erschütterndes Beispiel ist mit dem Namen Contergan verbunden. Um 1960 wurde das Medikament Thalidomid (Firmen-

Tabelle 11.2 Contergan -Schäden Entwicklungstag

Missbildung

21

Gehörlosigkeit, Facialislähmung, Augenmuskellähmung

23

Missbildung des Daumens

24–26

Fehlen oder weitgehender Verlust der Arme

27–29

Nierenmissbildungen, Analatresie

29–31

Armmissbildungen, Fehlen der Beine, Herzmissbildungen, Duodenalmissbildungen

30–33

Beinmissbildungen, Herzmissbildungen

36

Triphalangie des Daumens, Analstenose

Tage nach Konzeption, berechnet unter der Annahme, dass diese 14 Tage nach der Menstruation erfolgte. Es können Abweichungen bis zu 5 Tagen erfolgen. Aus Lenz (1970)

Abb. 11.44. a Chemische Struktur von Thalidomid. b Thalidomidembryopathie. Phänotyp eines Kindes mit Entwicklungsstörungen aufgrund der Einnahme von Thalidomid durch die Mutter während der Schwangerschaft. Das Medikament wurde während der Entwicklung der Gliedmaßen eingenommen (vgl. Tabelle 11.2) und verhinderte deren normale Entwicklung. (Aus Tariverdian u. Buselmaier 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

11.6 Entwicklungsgenetik bei Säugern

Die Untersuchung der Thalidomidembryopathie macht uns auf ein weiteres praktisches Problem aufmerksam. Der teratogene Effekt ist nämlich in Tierexperimenten mit Mäusen und Ratten nicht nachweisbar. Allein bei Primaten sind begrenzte Effekte beobachtet worden, die im Wesentlichen in einer reduzierten Anzahl von Neuronen in den Spinalganglien bestanden. Möglicherweise ist das sogar der primäre Effekt des Thalidomids. Es könnte sekundär einen Effekt auf die Induktionsprozesse ausüben, die zur Entwicklung der Gliedmaßen erforderlich sind. Wir wissen, dass die korrekte Innervation entscheidenden Einfluss auf die Differenzierung von Organen ausüben kann. Auf jeden Fall wird an diesem Beispiel die Problematik von Tierexperimenten und ihrer Interpretation hinsichtlich der Auswirkungen von Medikamenten auf den Menschen deutlich sichtbar. Uns interessiert in diesem Zusammenhang aber auch die Tatsache, dass einige der in Tabelle 11.2 beschriebenen Missbildungen in gleicher Form auch als angeborene erbliche Defekte beobachtet werden können (Tabelle 11.3). Sie gleichen stark den Phänotypen des (dominanten) Oram-Holt-Syndroms und des FanconiSyndroms. Wir haben es also bei der Thalidomidembryopathie mit dem Beispiel einer Phänokopie einer Erbkrankheit zu tun, die durch das Medikament Thalidomid verursacht wird. Wenn wir die Ursachen für die Entstehung von Phänokopien verstehen wollen, müssen wir uns darüber bewusst sein, dass diese durchaus identisch mit den genetischen Ursachen für einen bestimmten Phänotyp

sein können. Stellen wir uns einerseits vor, dass ein (erblicher) Phänotyp durch die permanente Inaktivierung eines Gens (also dessen Ausfall) verursacht wird, so ist es ebenso gut auch vorstellbar, dass dasselbe Gen, obwohl in voll funktioneller Form im Genom vorhanden, durch äußere Einflüsse, etwa durch eine spezifisch darauf einwirkende chemische Verbindung, während des maßgeblichen Zeitraums in seiner Funktion gestört wird. Das würde zu dem gleichen Phänotyp führen, wie er bei einem defekten Gen entsteht. Der einzige Unterschied ist, dass die umweltbedingte Inaktivität nicht erblich ist, sodass also alle Nachkommen einen normalen Phänotyp besitzen. Unter Thalidomideinfluss konnte in Einzelfällen eine diskordante Ausprägung von Entwicklungsdefekten bei Zwillingen beobachtet werden. Diese Beobachtung ist in Zusammenhang mit unseren vorangehenden Beobachtungen über Differenzen in den Ommatidienzahlen in Komplexaugen von Drosophila interessant. Wie bereits dort erörtert (S. 569), können während der Entwicklung geringfügige Differenzen in der Entwicklungsgeschwindigkeit der Embryonen auftreten, die wiederum Folgen für die Ausprägung von Merkmalen haben können. Offenbar treten bei Zwillingen bisweilen Unterschiede von mehreren Tagen in der Entwicklungsgeschwindigkeit auf, die zur Folge haben, dass bei Thalidomidgabe einer der Embryonen medikamentös geschädigt wird, der andere aber nicht, da er sich nicht mehr oder noch nicht im kritischen Entwicklungsstadium befand. Vergleichbare teratogene Wirkungen können durch die unterschiedlichsten Medikamente, durch

Tabelle 11.3 Thalidomidembryopathie als Phänokopie genetischer Defekte. Vergleich zwischen der phänotypischen Ausprägung der Thalidomidembryopathie und zwei Erbkrankheiten, dem dominanten Oram-Holt-Syndrom und dem rezessiven autosomalen Fanconi-Syndrom Missbildung

Thalidomidembryopathie

Oram-Holt-Syndrom

Fanconi-Syndrom

Augenmuskellähmung

++

+

+

Phokomelie (3 Finger)

++

++

–

Radiusaplasie

++

++

++

Triphalangie Daumen

++

+

–

Herzfehler

++

++

+

Nierenmissbildungen

++

–

++

Duodenalatresie

++

–

+

Facialislähmung

++

–

+

Gehörgangatresie

++

–

+

++: häufig, +: selten, –: nicht beobachtet Nach Lenz (1970)

583

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Nikotingenuss und andere umweltbedingte Einflüsse während der Schwangerschaft verursacht werden. In vielen Fällen sind Embryopathien in ihren Ursachen noch viel schwieriger zu ermitteln als beim Thalidomid, das wegen seines charakteristischen Wirkungsspektrums noch relativ schnell als Ursache erkannt worden war. Zu den schwerwiegenden Embryopathien gehört die Alkoholembryopathie, die durch Alkoholgenuss während der Schwangerschaft ausgelöst wird (Abb. 11.45). Sie äußert sich in schwerwiegender Retardation der geistigen Entwicklung (mittlerer Intelligenzquotient (IQ) von 68) und in allgemeinen Entwicklungsstörungen. Beispielsweise haben Alkoholembryopathie-Patienten bei einem mittleren Lebensalter von 16½ Jahren nur das Vokabular von 6½-Jährigen. Man nimmt an, dass ein Drittel bis die Hälfte der Kinder von Alkoholikerinnen, die während der Schwangerschaft regelmäßig Alkohol zu sich nehmen, von Entwicklungsstörungen betroffen sind. In Deutschland und den USA rechnet man mit einer Häufigkeit solcher Defekte von etwa einem in 500 bis 750 Neugeborenen. In der Häufigkeit congenitaler mentaler Defekte liegen sie damit unmittelbar

hinter dem Down-Syndrom (S. 628) und der Spina bifida. Das Beispiel der Thalidomidembryopathie lehrt uns aber auch, dass bereits eine einmalige Einnahme einer schadenverursachenden Substanz während der Schwangerschaft schwerwiegende Folgen für das Kind mit sich bringen kann. Ebenso kann natürlich bereits ein einmaliger Alkoholgenuss zu Fehlentwicklungen führen. Es kann hier ein ähnlicher Wirkungsmechanismus zugrunde liegen, wie er für die Thalidomidwirkungen erörtert wurde.

Die Milieuempfindlichkeit der Merkmalsausprägung im Phänotyp hat zur Folge, dass die Einwirkung bestimmter Substanzen wie Medikamente, Alkohol, Nikotin u. a. während der Embryonalentwicklung schwere irreversible, aber nicht-erbliche Schäden hervorrufen kann. Diese Schäden gleichen oft Phänotypen, die auch erblich bedingt sein können, da sie auf der Störung normaler Genfunktionen beruhen können, wie sie auch durch Mutationen induziert werden.

11.6.4 Organentwicklung bei Säugern Nach der endgültigen Festlegung der Körperachse entsteht im Verlauf der weiteren Embryonalentwicklung eine Vielzahl von Organen. Die Entscheidung, an welcher Stelle und zu welchem Zeitpunkt Organe ausgebildet werden, wird durch verschiedene Induktionsprozesse gesteuert, deren detaillierte molekulare Untersuchung derzeit Gegenstand vieler experimenteller Arbeiten ist. Eine Reihe von Genfamilien taucht dabei in Variationen immer wieder auf; wir haben auch einige Vertreter schon bei Drosophila und Caenorhabditis kennengelernt: Es sind die Hox-, Pax-, BMP-, hedgehog-, Fgf- und Wnt-Gene, die wichtige Funktionen in diesen Prozessen ausüben. Wir wollen uns im Rahmen dieses Buches auf die Entwicklung der Augen und der Gliedmaßen beschränken. Wir hatten dabei die Aspekte der Augenentwicklung sowohl bei Drosophila als auch beim Zebrafisch besprochen, sodass interessante Querbeziehungen hergestellt werden können.

Augenentwicklung bei Säugern

Abb. 11.45 Kind mit Alkoholembryopathie. Alkoholkonsum während der Schwangerschaft führt zu schweren Entwicklungsstörungen des Kindes, die geistige Retardation, aber auch Organmissbildungen einschließen. (Aus Tariverdian u. Buselmaier 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Während der Gastrulation ist das sich entwickelnde Auge noch als ein zentrales Augenfeld im vorderen Kopfbereich lokalisiert (Abb. 11.46a). Unter dem Einfluss von Genen, die für die Ausbildung der Mittellinie verantwortlich sind (also vor allem Shh), teilt sich das Augenfeld auf und wandert seitwärts. Der Ausfall von Shh in einer entsprechenden Knock-out-Mutante der

11.6 Entwicklungsgenetik bei Säugern

Maus führt zur Ausbildung einer zentralen Augenanlage („Zyklopenauge“), die sich aber nicht weiterentwickelt. Die Auswirkungen auf die Entwicklung des Gehirns und des gesamten Kopfbereichs sind jedoch so massiv, dass diese Mausmutanten in der Regel nicht lebensfähig sind. Eine vergleichbare Erbkrankheit des Menschen ist die Holoprosencephalie.

Üblicherweise beginnt die Darstellung der Augenentwicklung mit der paarigen Entstehung der Linsenplakode als Verdickung des Oberflächenektoderms (bei der Maus am Tag 9,5 der Embryonalentwicklung, E 9,5). Die Plakoden können allgemein als Anlagen der Sinnesfelder im Ektoderm des Embryos aufgefasst wer-

Chiasma opticum

Abb. 11.46 a–d Schema der Augenentwicklung bei Säugern. a In den frühen Phasen der Embryonalentwicklung teilt sich das zentrale Augenfeld in zwei Augenanlagen. Die Linsenplakoden stülpen sich ein und bilden nach dem Abschnüren vom Oberflächenektoderm das Linsenbläschen. Aus dem Linsenbläschen entwickelt sich die Linse (b), aus dem Oberflächenektoderm bildet sich die Hornhaut (c), und die Retina entsteht aus den beiden Schichten des Augenbechers (d; RPE: retinales Pigmentepithel). (Nach Graw 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

den. Die Linsenplakode steht in engem Kontakt mit dem darunter liegenden Neuroektoderm des Diencephalons. Dadurch wird die Einstülpung der Linsenplakode induziert. Die gebildete Linsengrube schließt sich zu einem Linsenbläschen zusammen (E 11,5) und schnürt sich vom Oberflächenektoderm ab. Das neu gebildete Oberflächenektoderm entwickelt sich weiter zur Hornhaut (Cornea), während das doppelwandige Neuroektoderm zur Netzhaut (Retina) wird: Der äußere Teil bildet das Pigmentepithel und der innere Teil die Neuroretina. An der Spitze des doppelwandigen Augenbechers entwickeln sich Iris und Ciliarkörper, wohingegen die Verbindung des Augenbechers zum Zwischenhirn (der Augenbecherstil) den Platz bereitstellt, in dem der Sehnerv retrograd zum Gehirn auswächst. Die Linse (Abb. 11.46b) entwickelt sich aus dem Linsenbläschen, indem von posterior zunächst die primären Linsenfasern in das Lumen des Linsenbläschens einwachsen und es ausfüllen. In einem zweiten Schritt lagern sich die sekundären Linsenfaserzellen appositionell auf die primären Faserzellen auf. Dieser Prozess der Bildung sekundärer Faserzellen aus der germinativen Zone des anterioren Linsenepithels hält ein Leben lang an. Da aber umgekehrt keine Zellen in der Linse absterben, enthält der zentrale Linsenkern Zellen, die so alt sind wie der Organismus selbst. Um beim Lichteinfall durch die Linse keine störenden Streulichteffekte zu bewirken, werden im Zuge der terminalen Faserzelldifferenzierung im Zentrum der Linse alle Zellorganellen (Zellkerne und Mitochondrien) abgebaut. Die inneren Zellen werden über kleine Membrankanäle (engl. gap junctions) mit Metaboliten aus den anterioren Epithelzellen versorgt. Die Augenentwicklung beim Menschen verläuft im Prinzip ähnlich. Das Augenbläschen bildet sich in der 4. Schwangerschaftswoche und 1 Woche später das Linsenbläschen. Am Ende der 5. Woche ist die Linse mit den primären Linsenfasern gefüllt, und der Differenzierungsprozess kann beginnen. Die Hornhaut bildet sich als Ergebnis verschiedener Induktionsprozesse während der Augenentwicklung, wobei am Ende ein typisches Oberflächenektoderm in ein transparentes, vielschichtiges Gewebe transformiert wird (Abb. 11.46c). Dazu tragen Zellen verschiedenen Ursprungs bei, vor allem Neuralleistenzellen. Unter dem Einfluss von Thyroxin und Hyaluronidase wird das Stroma der Hornhaut dehydratisiert und seine Kollagen-haltige Matrix wird transparent. Die Retina bildet sich aus den zwei Schichten des Augenbechers (Abb. 11.47d). Die Zellen der äußeren Schicht bilden das Pigmentepithel. An den Rändern, wo die innere und die äußere Schicht ineinander übergehen, entwickelt sich die Iris und das Epithel des Ciliarkörpers (der Ciliarmuskel wird durch einwandernde Mesenchymzellen gebildet). Aus den Zellen der inneren Schicht entwickelt sich das vielschichtige Netz-

Abb. 11.47 a–i Linsen von Mäusen mit angeborenen dominanten Katarakten. Die Linsen wurden von Mäusen im Alter von 3 Wochen präpariert. In a ist eine Wildtyp-Linse zum Vergleich gezeigt. Obwohl alle 8 Mutationen Gene betreffen, die für γ-Kristalline codieren (Gensymbol Cryga – Crygf), ist die Stärke der Schädigung unterschiedlich. Eine Korrelation mit der Art der Mutation ist nicht möglich. In vielen Fällen ist ein semi-dominanter Effekt zu beobachten (d. h. in homozygoten Trägern ist das Merkmal stärker ausgeprägt; links: heterozygote Träger, rechts: homozygote Träger). Die Mutationen betreffen die Gene Cryga (b, c), Crygc (d, e), Crygd (f, g) und Crygd (h, i). (Nach Graw et al. 2004, mit freundlicher Genehmigung der Association of Researchers in Vision and Ophthalmology)

hautgewebe mit Gliazellen, Ganglienzellen und den lichtempfindlichen Photorezeptorzellen. Ein erster systematischer Ansatz zur Sammlung von Augenmutanen in der Maus wurde Ende der 1970erJahre von Kratochvilova und Ehling (1979) begonnen, als sie männliche Keimzellen mit Röntgenstrahlen behandelten und die Nachkommen auf induzierte, erbliche Katarakte und äußerlich sichtbare Veränderungen der Augen (z. B. kleine Augen = Mikrophthalmie; engl. small eye) untersuchten. Die Methode wurde später auf die Induk-

11.6 Entwicklungsgenetik bei Säugern Tabelle 11.4 Wichtige Gene der Augenentwicklung bei Säugern Gen

Chromosom Mensch

Phänotyp bei Mutationen

Maus*

Mensch

Maus

Transkriptionsfaktoren: Pax6

11p13

2 (58)

Aniridie, Peter’s Anomalie, einige mit Katarakt und Glaukom

Mikrophthalmie, Katarakt, Hornhauttrübung; homozygot: keine Augen und nicht lebensfähig

Rx

18q21

18 (38)

Anophthalmie, Mikrophthalmie

homozygot: Anophthalmie

Sox2

3q26

3 (15)

Anophthalmie, Mikrophthalmie

heterozygot: kein Phänotyp; homozygot: letal

Pitx2

4q25

3 (58)

Rieger-Syndrom

heterozygot: Rieger-Syndrom; homozygot: letal

Pitx3

10q25

19 (47)

Katarakt; Fehlbildungen im vorderen Augenabschnitt

homozygot: keine Linse

FoxC1

6p25

13 (20)

Fehlbildungen im vorderen Augenabschnitt

heterozygot: Fehlbildungen im vorderen Augenabschnitt; homozygot: letal

FoxE3

1p32

4 (50)

Fehlbildungen im vorderen Augenabschnitt

heterozygot: milde Linsenanomalien; homozygot: keine Linse

Eya1

8q13

1 (10)

Peter’s Anomalie, Katarakt, Nystagmus; Erkrankungen des Ohrs und der Niere

viele Symptome außerhalb des Auges; homozygot: letal

Maf

16q23

8 (61)

Katarakt, Mikrophthalmie, Fehlbildungen im vorderen Augenabschnitt

heterozygot: Katarakt; homozygot: Mikrophthalmie, Katarakt und Erkrankungen in anderen Organen (z. B. Niere)

Chx10

14q24

12 (38)

Mikrophthalmie und Katarakt

Mikrophthalmie

Mitf

3q14

6 (40)

Waardenburg-Syndrom

Mikrophthalmie; verschiedene rezessive und dominante Allele

Pax2

10q22

19 (43)

Anomalien am Auge (Kolobom) und an der Niere

Anomalien am Auge (Kolobom) und an der Niere

Msx2

5q34

13 (32)

Missbildungen des Gesichtsschädels inkl. des Auges

bei Überexpression Apoptose im Augenbläschen

Signalmoleküle: Shh

7q36

5 (16)

Holoprosencephalie

Zyklopenauge; schwere allgemeine Entwicklungsstörungen

BMP4

14q22

14 (15)

Anophthalmie/Mikrophthalmie mit zusätzlichen Erkrankungen

heterozygot: Fehlbildungen im vorderen Augenabschnitt; homozygot: keine Linseninduktion

BMP7

20q13

2 (102)

keine Augenerkrankungen

bei Überexpression Schädigung der Retina und der Linse

*in Klammern: Position in cM; Nach Graw (2003); ergänzt nach OMIM (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim; April 2010)

tion von Mutationen durch das chemische Mutagen Ethylnitrosoharnstoff (ENU) ausgeweitet und wird heute in vielen großen Labors in genetischen Screens angewendet. Aus den Experimenten der letzten 25 Jahre sind über

200 unabhängige Linien dominanter Augenmutanten der Maus hervorgegangen und in der Neuherberger Sammlung vorhanden (Favor u. Neuhäuser-Klaus 2000). Eine Übersicht über die wichtigsten Gene gibt Tabelle 11.4.

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Dabei zeigte sich, dass eine große Gruppe von Mutanten mit Mikrophthalmie auf Veränderungen im Pax6-Gen zurückgeführt werden können. Wir haben schon bei der Besprechung der Drosophila-Augenentwicklung gesehen, dass das Pax6-Gen der Säuger dem eyeless-Gen von Drosophila entspricht und dass es oft als Schlüsselgen (engl. master control gene) der Augenentwicklung bezeichnet wird. Heterozygote Mutanten der Maus zeichnen sich durch kleine Augen aus, homozygote Mutanten haben keine Augen und sind oft wegen weiterer Missbildungen nicht lebensfähig. Heterozygote Merkmalsträger des Menschen leiden an Aniridie (Verlust der Iris), Katarakten (Linsentrübung) oder Peter’s Anomalie. Die ektopische Expression des Pax6-Gens der Maus in Drosophila setzt die Kaskade der Augenentwicklung in Gang: In einem bahnbrechenden Experiment (Halder et al. 1995) konnten Walter Gehring und seine Mitarbeiter 1995 zeigen, dass dadurch an Antennen oder Gliedmaßen von Drosophila elektrophysiologisch aktive Ommatidien-Augen gebildet werden. Damit hat sich die Hypothese der getrennten Evolution der Ommatidien-Augen und Linsenaugen als falsch herausgestellt (Kapitel 11.4.6; Abb. 11.34b). Das Gen Pax2 ist für die Entwicklung des posterioren Augenabschnitts und die Entwicklung des Sehnervs verantwortlich. Heterozygote Pax2-Mutanten der Maus zeichnen sich durch ein Kolobom des Sehnervs aus (Erhalt der embryonalen Augenbecherspalte); entsprechende Erbkrankheiten des Menschen sind ebenso beschrieben. Sowohl bei der Maus wie auch beim Menschen treten zusätzlich zu den Störungen der Augenentwicklung auch Nieren- und Gehirnschäden auf. Ein weiteres interessantes Gen ist Pitx3. Es ist ein Transkriptionsfaktor mit dem charakteristischen Merkmal einer Homöobox, der während der frühen Linsenentwicklung exprimiert wird. Mutationen dieses Gens zeigen bei Menschen in verschiedenen Familien dominante Fehlentwicklungen des vorderen Augenabschnitts, die mit Katarakten verbunden sind; das humane PITX3Gen liegt auf dem Chromosom 10q24. Bei der Maus liegt es auf dem Chromosom 19 und wird bei der rezessiven Mutante aphakia nicht exprimiert. Die homozygote Mutante aphakia (ak) wurde als beidseitig aphak („ohne Linse”) beschrieben; auch eine Pupille wird nicht gebildet. Die anomale Augenentwicklung homozygoter ak-Mäuse wird zuerst im Stadium des Linsenbläschens beobachtet und führt zu einem Stillstand der Linsenentwicklung auf der Stufe des Linsenstils; dieses Stadium ist üblicherweise nur ein Zwischenschritt bei der Abschnürung des Linsenbläschens. Die späteren Veränderungen betreffen die Entwicklung des gesamten Auges und führen schließlich zu einem vollständigen Zusammenbruch der morphologischen Augenstrukturen.

Pitx3 spielt außer in der Augenentwicklung auch bei der Gehirnentwicklung eine wichtige Rolle, wo es in der Substantia nigra exprimiert wird: diese Region bildet Nervenzellen mit Dopamin als Neurotransmitter, und der Verlust von Dopamin gehört zu den wichtigen molekularen Charakteristika der Parkinson‘schen Erkrankung (Kapitel 13.4.5). In den aphakia-Mäusen fehlen auch die dopaminergen Neuronen, sodass die aphakia-Mutanten auch als Parkinson-Modelle betrachtet werden (Smidt et al. 2004). Unterstützt wird dieser Befund durch epidemiologische Untersuchungen, die zeigen, dass Parkinsonismus auch mit einem Polymorphismus im Promotor des PITX3-Gens assoziiert ist (Fuchs et al. 2009). Innerhalb der Sammlungen von Augenmutanten der Maus nimmt die Gruppe der γ-Kristallin-Mutanten den größten Platz ein. Die γ-Kristalline gehören zur Familie der β/γ-Kristalline (Kapitel 7.2.4). Das sind Strukturproteine der Augenlinse mit charakteristischen Faltungsmotiven (vier Griechische Schlüsselmotive), die von insgesamt 13 Genen codiert werden. Die Gene für die γ-Kristalline sind in einem Cluster von sechs Genen (Cryga → Crygf) auf dem Chromosom 1 der Maus lokalisiert. Diese eng verwandten Gene codieren mit drei Exons jeweils ein Protein mit einem Molekulargewicht von 20 kDa. Die Cryg-Gene werden bei Säugetieren überwiegend in der Linse exprimiert. Allerdings kommen beim Menschen nur noch vier der sechs CRYGGene vor; zwei sind nur noch als Pseudogene aufgrund ihrer Sequenzähnlichkeit erkennbar. Alle bekannten Cryg-Mutationen bewirken Veränderungen der Linsenfaserzellen; die Katarakt-Augen sind allerdings insgesamt immer kleiner als die Augen des Wildtyps (Abb. 11.47). Die wesentlichen Effekte der Mutationen in den Cryg-Genen sind Veränderungen im Differenzierungzustand der Linsenfaserzellen, die bereits am Tag 15 der Embryonalentwicklung einsetzen. Auch beim Menschen sind Mutationen in den CRYG-Genen als Ursache für angeborene Katarakte beschrieben. Überraschenderweise findet man in den Cryg-Genen der Maus und den CRYG-Genen des Menschen eine ganze Reihe von Polymorphismen, die aber nicht mit den angeborenen Linsentrübungen zusammenhängen. Es könnte aber sein, dass sie einen Einfluss auf die Ausbildung der Alterskatarakt (Cataracta senilis) beim Menschen haben.

Gliedmaßenentwicklung bei der Maus Eine Übersicht über die Entwicklung der Gliedmaßen der Maus ist in Abb. 11.48 gezeigt; sie ist der Entwicklung bei Menschen und Hühnern sehr ähnlich. Die Gliedmaßen entwickeln sich aus kleinen Knospen (engl. limb buds), die an den entsprechenden Stellen entlang der Kopf-Schwanz-Achse des Embryos entstehen und im Kern aus undifferenzierten Mesenchym-

11.6 Entwicklungsgenetik bei Säugern

Abb. 11.48 Stadien der Gliedmaßenentwicklung bei Mäusen. Die vorderen Gliedmaßen der Maus in verschiedenen Stadien der Embryonalentwicklung (von oben nach unten: Tag 11, 13, 14 und 15). Die Gliedmaßen sind mit Alcian-Grün gefärbt, um das Skelettmuster zu zeigen, das zunächst als Knorpel angelegt wird. (Nach Tickle 2002, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

zellen bestehen. Die Gliedmaßenknospe hat drei Polaritätsachsen (Abb. 11.49): ï die proximo-distale Achse (Schulter zur Fingerspitze); ï die anterio-posteriore Achse (Daumen zu kleinem Finger); ï die dorso-ventrale Achse (Knöchel zur inneren Handfläche). Als besonders wichtige Areale in der Gliedmaßenentwicklung sind die Polaritätszone (engl. zone of polarizing activity, ZPA) und der apikale epidermale Kamm (engl. apical epidermal ridge, AER) zu nennen. In der zuletzt genannten Region sind insbesondere verschiedene Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (engl. fibroblast growth factor, Fgf) aktiv. Einer der Schlüsselfaktoren ist dabei Fgf10; Fgf10-Mutanten (Fgf10−/−) haben keine Arme und Beine. Entsprechende Phänotypen findet man auch, wenn der Rezeptor im Ektoderm nicht aktiv ist. Neben den Fgfs spielen Mitglieder der Wnt-Familie eine wichtige Rolle: Wnt7a ist für die dorso-ventrale Musterbildung verantwortlich. Es wird im dorsalen Ektodem

Abb. 11.49 Zell-Zell-Interaktionen bei der Gliedmaßenentwicklung. Die obere Reihe zeigt die signalgebenden Regionen aus einer dorsalen Ansicht; in der Mitte ist ein Schnitt durch eine Gliedmaßenknospe gezeigt. Die Achsen sind in einem Diagramm angegeben mit p: proximal, di: distal, d: dorsal. Die untere Reihe zeigt die Expression von Genen, die für Signalmoleküle codieren: links im apikalen ektodermalen Kamm verschiedene Fibroblastenwachstumfaktoren, im dorsalen Ektoderm Wnt7a (Mitte), und Shh und Bmp2 in der Region polarisierender Aktivität (rechts), die auch hohe Konzentrationen an Retinsäure enthält. (Nach Tickle 2002, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

exprimiert, aber nicht im AER oder im ventralen Ektoderm. Neben Wnt7a wird Wnt5a in einem Gradienten im Mesenchym der Gliedmaßenknospe exprimiert. Wnt5aKnock-out-Mäuse haben stark verkürzte Gliedmaßen, wobei die eher distalen Regionen stärker betroffen sind. Die Signalmoleküle in der ZPA sind vor allem Retinsäure (ein Vitamin-A-Derivat; vgl. auch Kapitel 11.6.1), Sonic Hedgehog (Shh) und BMPs (engl. bone morphogenetic proteins). Die wichtigsten BMPs der Säuger (BMP2 und BMP4) entsprechen dabei dem DrosophilaProtein Decapentaplegic (Dpp), und Shh gehört zur Familie der Hedgehog-Proteine, die wir ebenfalls von Drosophila her bereits kennen (siehe dort den Abschnitt über Flügelentwicklung, S. 566). Dabei kontrolliert Shh die Breite der Gliedmaßen, und die BMPs determinieren den Fingertyp. Endogene Retinoide sind wahrscheinlich dafür verantwortlich, dass die ZPA etabliert und der proximale Teil der Gliedmaßen ausgebildet wird (Schultergürtel und Oberarm), wohingegen Shh und BMPs zusammenwirken, um die mittleren (Elle und Speiche) und distalen Segmente (Finger) zu bilden. Dies erklärt auch die teratogene Wirkung von Vitamin A.

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Abb. 11.50 a, b Expressionsmuster von Hox-Genen bei der Gliedmaßenentwicklung. Als Antwort auf Signale (vgl. Abb. 11.49) werden einige Transkriptionsfaktoren in der Gliedmaßenknospe exprimiert: a Überlappende Muster der Expression der 5’-Hoxa-Gene. b Überlappende Muster der Hoxd-Gene. Zur Vereinfachung sind nicht alle Gene der 5’-Region des Clusters angegeben, und nur die mesenchymalen Zellen am posterior-distalen Ende der Gliedmaßen exprimieren Hoxd13 und Hoxa13. (Nach Tickle 2002, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

Eine dritte Gruppe von Genen umfasst zwei Mitglieder des Hox-Genclusters, Hoxa (Hoxa9−Hoxa13) und Hoxd (Hoxd9−Hoxd13), die in überlappenden Domänen in den frühen Gliedmaßenknospen exprimiert werden. Dabei werden die 5’-liegenden Gene später und eher distal exprimiert (Abb. 11.50). Die Analyse einiger Mutanten der Maus zeigt, dass die Hoxa11 und Hoxd11-Gene beispielsweise das mittlere Segment der Gliedmaßen betreffen und Hoxa13 und Hoxd13 eher die Entwicklung der Finger. Ein schönes Beispiel für die Bedeutung des ShhSignalweges ist die Mutante Doublefoot (Gensymbol Dbf). Dabei handelt es sich um eine spontane Mutante, die eine ausgeprägte Polydaktylie (Überzahl von Fingern und/oder Zehen) ohne eine anterior-posteriore Achse aufweist (Abb. 11.51). Die Mutation kartiert auf dem Maus-Chromosom 1 in einer Region, die dem menschlichen Chromosom 2q25 entspricht ‒ einer Region, in der zwei Genorte für Brachydaktylie (Verkürzung der Finger) vorkommen. Die Mutante zeigt zwar ein normales Expressionsmuster von Shh und Ptc1, aber Ihh wird ektopisch exprimiert und führt zur Vergrößerung der Extremitätenknospe. Doppelmutanten (Shh−/−, Dbf+/−) zeigen den Doublefoot-Phänotyp an den Zehen, aber den Shh-Null-Phänotyp am Kopf; offensichtlich beeinflusst Dbf also den Shh-Signalweg bei der Gliedmaßenentwicklung (Shh−/−-Mutanten haben nur einen rudimentären Zehen), nicht aber bei der Entwicklung des Kopfskeletts. Die Doublefoot Mutante enthält eine große Deletion (~600 kb), die etwa 25 Gene oberhalb des Ihh-Gens betrifft (Babbs et al., 2009). Wie bei den schon früher besprochenen Beispielen gilt auch hier, dass die erwähnten Gene nur einige wenige ausgewählte Beispiele repräsentieren und die Entwick-

Abb. 11.51 a, b Skelett-Muster im rechten Hinterbein einer Maus. a Wildtyp-Embryo (+/+). b Doublefoot-Mutante (Dbf/+) am Tag 17,5 der Embryonalentwicklung. Dieses Beispiel des Doublefoot-Phänotyps zeigt einen Zeh „zwischen den Zehen“ (dicker roter Pfeil) und eine Gabelung eines Zehs (kleiner roter Pfeil); beachte auch die Abwesenheit des zweigliedrigen 1. Zehs. (Nach Crick et al. 2003, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

lung der Gliedmaßen ein wesentlich komplexerer Prozess ist, der in einem allgemeinen Lehrbuch der Genetik nur angedeutet werden kann. Eine Übersicht über die wichtigen Gene in der Entwicklung der Extremitäten gibt Tabelle 11.5.

11.6.5 Keimzellentwicklung und Geschlechtsdeterminierung bei Säugern Die Keimzellen des Menschen können während der frühembryonalen Entwicklung bereits 27 Tage nach der Zygotenbildung erkannt werden, wenn sie aus dem Dottersack auswandern und den Keimstreifen (engl. gonadal ridge) besiedeln. Am 46. Tag nach der Gestation beginnt die sexuelle Differenzierung der Keimzellen. Männliche Keimbahn. Die männliche Keimzellentwicklung beginnt mit mitotischen Teilungen der primordialen Keimzellen. Ihre Teilungsprodukte werden Gonocyten genannt. Bereits während der Embryonalent-

11.6 Entwicklungsgenetik bei Säugern

Tabelle 11.5 Molekulare Basis der Musterbildung während der Extremitätenentwicklung Gene für Signalmoleküle

Gene für Rezeptoren

Phänotyp bei Mutationen

Fibroblasten-Wachstumsfaktor (Fgf): Fgf8

Fgfr1

Pfeiffer-Syndrom

Fgf4

Fgfr2

Apert-Syndrom, Pfeiffer-Syndrom, Jackson-Weiss-Syndrom

Fgf9

Fgfr3

Achondroplasia

Wnt7a

frizzleds

Abwesenheit von Elle und Wadenbein

Wnt3a

frizzleds

Abwesenheit von Elle und Wadenbein

Wnt5a

frizzleds

Abwesenheit von Elle und Wadenbein

Shh

Patched, Smoothened

Holoprosenzephalie

Ihh (Knorpel)

Hip (Hedgehog interacting protein)

Maus: Tod bei Geburt (vergrößerter Embryo); Anophthalmie

Gli3

Greig-Cephalosyndactylie, Pallister-Hall-Syndrom

Fgf10 Wnt-Signale:

Hedgehog-Signale:

Morphogenetische Knochenproteine (BMPs): Bmp2

Bmp-Rezeptoren

Maus: Tod während der Embryonalentwicklung (Herzentwicklung)

Bmp4

Polydaktylie, Microphthalmie

Bmp7

Maus: Tod nach der Geburt: schwere Skelett- und Knochendefekte

Gene, die als Antwort auf Signale exprimiert werden: Hoxa9–Hoxa13

Hand-Fuß-Genital-Syndrom

Hoxd9–Hoxd13

Polysyndaktylie

Spalt

Townes-Brockes-Syndrom

Lmx1

Erkrankungen an Finger- und Zehennägeln sowie der Kniescheibe

Tbx3

Erkrankungen an der Elle und den Brustdrüsen

Tbx4

Kleine Kniescheibe

Tbx5

Holt-Oram-Syndrom

Nach Tickle (2002) ; ergänzt nach OMIM (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim) und MGI (http://www.informatics.jax. org/); April 2010

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

wicklung entstehen durch weitere Mitosen in einem Zellzyklus von 16 Tagen Spermatogonien, die sich jedoch cytologisch von den Spermatogonien des geschlechtsreifen Mannes unterscheiden. Nach mehreren weiteren Zellteilungen bilden sich primäre Spermatocyten. Diese durchlaufen die Meiose, und jede primäre Spermatocyte bildet dabei nach einem sekundären Spermatocytenstadium vier haploide Spermatiden, die sich dann zu Spermatozoen ausdifferenzieren. Die Gesamtzahl an Zellteilungen, die bis zur endgültigen Differenzierung eines Spermatozoons durchlaufen werden, ist demnach abhängig vom Lebensalter und beträgt bis zu mehreren Hundert. In der Keimbahn eines 35-jährigen Mannes werden über 500 Zellteilungen durchlaufen, bevor eine primäre Spermatocyte gebildet wird. Die Entwicklung der Keimzellen verläuft in schlauchförmigen Strukturen – Tubuli genannt –, die sich aufgerollt in großer Anzahl in den Testikeln befinden. Die Stammzellen und Spermatogonien befinden sich randlich nahe den Epithelzellen. Spermatocyten proliferieren in Richtung auf das innere Lumen der Tubuli. Noch weiter zentral in den Tubuli finden sich meiotische Teilungsstadien. Die Spermatiden werden mit zunehmendem Entwicklungsalter in das freie innere Lumen der Tubuli verlagert. Hier werden sie in Richtung auf die Ausführgänge transportiert und erreichen den Beginn der Epididymis als ausdifferenzierte Spermatozoen. Insgesamt werden beim Mann etwa 50.000 Spermien pro Sekunde, also mehr als 4 Milliarden Spermien pro Tag gebildet. Sinkt die tägliche Produktion unter 500 Millionen, ist die Fertilität des betreffenden Mannes bereits beträchtlich gestört.

Die während der Embryonalentwicklung beginnende

Entwicklung männlicher Keimzellen führt zu Beginn der Geschlechtsreife nach mehreren Teilungen und Differenzierungsschritten zu primären Spermatogonien, die wiederum durch Teilung primäre Spermatocyten bilden. Jede primäre Spermatocyte durchläuft die zwei Reifeteilungen und bildet vier haploide Spermatiden, die sich zu reifen Spermien differenzieren.

Weibliche Keimbahn. Die Entwicklung weiblicher Keimzellen des Menschen unterscheidet sich von der männlicher Keimzellen ganz prinzipiell dadurch, dass weibliche Keimzellen sich nur während der Embryonalentwicklung vermehren. Aus den Stammzellen entstehen durch Mitosen Oogonien, die sich ebenfalls mitotisch teilen. Nach einigen weiteren Mitosen gehen sie ins Oocytenstadium über, das schließlich in die Reifeteilungen einmündet. Mit dem 7. Monat der Entwicklung des Fötus degenerieren alle noch vorhandenen Oogonien, sodass sich zum Zeitpunkt der Geburt alle künftigen Eizellen bereits im Oocytenstadium befinden. Die etwa 2,6 Millionen Oocyten gehen nach Erreichen der Diakinese der meiotischen Prophase I in ein Ruhestadium (Dictyotän) über, in dem

sie bereits bei der Geburt vorliegen. Dieses Stadium wird erst mit der Induktion der Ovulation einzelner Eizellen während der Zeit der Geschlechtsreife durch Geschlechtshormone beendet. Durch die Ovulation wird der Abschluss der Reifeteilungen induziert, die nach dem allgemeinen Schema der Meiose verlaufen (Abb. 5.16). Die Oocyte vollendet während des Eisprungs die Reifeteilung I und beginnt mit der Reifeteilung II, sodass ein haploider Pronukleus entsteht. Eine reife Eizelle hat seit der Teilung der Stammzelle insgesamt nicht mehr als 24 Zellteilungen durchlaufen. Von den verfügbaren Oocyten in den Ovarien einer Frau reifen insgesamt nur etwa 400 zu befruchtungsfähigen Eizellen heran. Die meiotischen Prozesse in der weiblichen Keimbahn unterscheiden sich generell von denen der männlichen Keimzellenentwicklung darin, dass nur eines der vier haploiden Meioseprodukte zu einer Eizelle differenziert wird, während die drei übrigen haploiden Kerne als Polkörper degenerieren (vgl. jedoch die Entwicklung von Pflanzenembryonen; Abb. 5.38).

Im Gegensatz zu männlichen Keimzellen teilen sich weibliche Keimzellen nur während der embryonalen und fötalen Entwicklung. Die Stammzellen bilden Oogonien und primäre Oocyten. Zum Zeitpunkt der Geburt haben sich auf diese Weise etwa 2,6 Millionen Oocyten gebildet, die im Diakinesestadium der ersten Reifeteilung in eine Ruhephase eintreten, während gleichzeitig alle verbleibenden Oogonien degenerieren. Die Ruhephase der Oocyten wird nach Erlangung der Geschlechtsreife durch Geschlechtshormone beendet, die den Eintritt jeweils einzelner Oocyten in die weiteren Meiosen stimulieren. Wie auch in anderen Organismen entwickelt sich nur jeweils eines der vier haploiden Meioseprodukte zum Ei, während die drei übrigen haploiden Zellen als Polkörper degenerieren.

Eine wichtige Frage in diesem Zusammenhang ist aber natürlich auch, durch welche genetischen Faktoren das Geschlecht festgelegt wird. Ein zentraler Genschalter befindet sich bei Säugern im Y-Chromosom. Ist ein Y-Chromosom vorhanden, so wird der Embryo zum Männchen; fehlt es, so entsteht ein Weibchen. Durch genetische Analysen von Individuen mit partiell defizienten Y-Chromosomen hat man das Gen, das für die Induktion des männlichen Geschlechts verantwortlich ist (TDF für engl. testis-determining factor), einem begrenzten Abschnitt des kurzen Armes des menschlichen Y-Chromosoms zuweisen können. Der TDF wird von dem von Sinclair und Mitarbeitern (1990) isolierten SRY-Gen (engl. sex determining region Y) codiert. Das SRY-Gen ist ausschließlich während der frühen Embryonalentwicklung aktiv und wird nur in Sertolizellen exprimiert. Seine Aufgabe ist es, während der frühen Embryonalentwicklung (etwa in der 7. Woche) die geschlechtlich zunächst

11.7 Stammzellen

nicht differenzierten primordialen Gonaden zu veranlassen, sich zu Testes zu entwickeln. Untersuchungen an Maus-Chimären haben gezeigt, dass das SRY in mesodermalen Sertolizellen aktiv ist und für die Produktion eines Hormons (AMH, abgeleitet vom engl. anti-Müllerian duct hormone) verantwortlich ist, das für die Degeneration der (weiblichen) Müller’schen Gänge sorgt. Möglicherweise ist es zudem für die Repression von Genen verantwortlich, die die Differenzierung der Ovarien induzieren. In Abwesenheit eines funktionsfähigen SRY entwickeln sich die Gonadenanlagen zu Ovarien und induzieren damit die weibliche Geschlechtsentwicklung. In beiden Geschlechtern sorgen die von den Gonaden produzierten geschlechtsspezifischen Sexualhormone für die weitere Entwicklung des jeweiligen Geschlechts. Hierzu gehört im Männchen vor allem das von den Leydig-Zellen sezernierte Testosteron. Diese Hormone steuern zunächst die vollständige Ausbildung der Gonaden mit den zugehörigen Ausführgängen und sorgen im weiteren auch für die Ausbildung der sekundären Geschlechtsmerkmale. Somit ist bei Säugern die Geschlechtsbestimmung kein zellautonomer Prozess wie bei Drosophila, sondern wird durch die Gonaden über eine hormonelle Steuerung auf den gesamten Organismus ausgeübt. Besonders deutlich kommt diese allgemeine, zellübergreifende Funktion der männlichen Geschlechtshormone bei einer Erbkrankheit, der testikulären Feminisierung (engl. testicular feminization syndrome, TFM; OMIM 300 068), zum Ausdruck. Diese Krankheit beruht auf dem Ausfall des cytoplasmatischen Testosteronrezeptors durch eine Mutation im TFM-Locus. Als Folge davon können die Zellen bei männlichem (X/Y-) Genotyp, trotz normaler Testosteronproduktion in den Testes, nicht mehr auf das Hormon ansprechen, und es wird demzufolge ein weiblicher Phänotyp ausgebildet. Die betroffenen Individuen entwickeln sich zu (sterilen) Frauen, da ihre Zellen auf das in der Nebenniere produzierte Östrogen normal zu reagieren vermögen.

Bei

Säugern erfolgt die Geschlechtsbestimmung durch ein Y-chromosomales Gen, das die embryonalen Gonadenanlagen als Testes determiniert. Bei Abwesenheit dieses Gens differenzieren sich die Gonadenanlagen zu Ovarien. Die Ausprägung der geschlechtsspezifischen Merkmale erfolgt unter hormonaler Kontrolle.

11.7 Stammzellen 11.7.1 Totipotenz von Zellkernen Wir wissen, dass es möglich ist, genetisch identische Pflanzen durch vegetative Vermehrung zu erzeugen.

Hierzu zerteilt man z. B. Wurzelstöcke. Eine alternative Möglichkeit der vegetativen Vermehrung ist die in-vitroKultur von Protoplasten, die es erlaubt, genetisch identische Individuen aus Einzelzellen zu gewinnen. Zwei in diesem Zusammenhang wichtige Fragen haben wir jedoch bisher noch nicht gestellt: Sind alle Zellen eines Individuums genetisch völlig identisch? Besitzen sie die gleiche genetische Information, die die Zygote besessen hat, von der sie abstammen? Beide Fragen gehören zu den Grundfragen der Entwicklungsbiologie und haben demgemäß die Biologen bereits in den Frühzeiten der experimentellen Forschung interessiert. Beobachtungen der klassischen Cytologen zeigen, dass man bei geeigneten Organismen im Mikroskop Unterschiede im Karyotyp zwischen Keimbahn- und Somazellen erkennen kann (S. 254 und 363). Solche Befunde lassen es nicht als abwegig erscheinen zu vermuten, dass zelluläre Differenzierung mit dem teilweisen Verlust – oder zumindest mit Veränderungen – genetischer Information verbunden ist. Versuche von H. Driesch (1867–1941) gegen Ende des 19. Jahrhunderts hatten jedoch andererseits gezeigt, dass die verschiedenen Blastomeren von Seeigelembryonen in der Lage sind, einen vollständigen Organismus entstehen zu lassen (Driesch 1900). Gleiche Schlüsse wurden auch später hinsichtlich der Zellen in der inneren Zellmasse in Säugerblastulae gezogen, von denen jede einzelne in der Lage ist, einen vollständigen Embryo entstehen zu lassen (S. 578). Experimente Hans Spemanns (1868–1941) ließen auch erkennen, dass Säugerzellen ganz allgemein in einem hohem Maße zu Regenerationsprozessen befähigt sind und daher, wenn überhaupt, nur geringe Restriktionen hinsichtlich ihrer genetisch programmierten Fähigkeiten aufzuweisen scheinen (Spemann 1938). Allerdings zeigen die gleichen embryologischen Experimente auch Einschränkungen der Differenzierungsfähigkeit an. Vor allem Experimente an Seeigeln hatten erkennen lassen, dass die Differenzierungskapazität von Seeigelblastomeren bereits vom 32-Zell-Stadium an begrenzt ist. Auch solche Einschränkungen der Entwicklungsfähigkeiten von Zellen erweisen sich bei genauerer Untersuchung als eine allgemeine Erscheinung, die mit zellulärer Differenzierung verbunden ist. Diese Feststellung wirft erneut die Frage auf, inwiefern solche Einschränkungen auf Veränderungen im genetischen Material zurückzuführen sind. Sie könnten auch rein epigenetisch bedingt sein, d. h. durch sekundäre Faktoren, die auf die Expression des genetischen Materials einwirken. Um diese Problemstellung besser beurteilen zu können, wollen wir uns zunächst auf die Beantwortung der Frage nach der Unveränderlichkeit des genetischen Materials in somatischen Zellen konzentrieren. Eine geeignete experimentelle Technik zur Beantwortung der Frage nach der Gleichheit des genetischen Materials in differenzierten Zellen eines Organismus ist die der Kerntransplantation. Führt man beispiels-

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

weise den Zellkern einer ausdifferenzierten Zelle eines adulten Individuums nach Entfernung der beiden Pronuklei in eine befruchtete Eizelle ein, so sollte man erwarten, dass diese nunmehr mit einem Zellkern einer differenzierten Zelle ausgestattete Eizelle in der Lage ist, sich zu einem vollständigen Individuum zu entwickeln, wenn tatsächlich alle Informationen des Genoms unverändert vorhanden sind (Abb. 11.52). Solche Versuche wurden von T. J. King und R. Briggs (1956) an Rana pipiens unternommen. Sie zeigten, dass Zellkerne aus Blastulae die Entwicklung bis hin zur Kaulquappe gestatten. In Versuchen, in denen sie Zellkerne späterer Entwicklungsstadien, etwa aus späten Gastrulae oder sogar von somatischen Zellen aus Kaulquappen, verwendeten, nahm die Entwicklungsfähigkeit in den Transplantationsexperimenten jedoch mit fortschreitender Differenzierung der Donorzellen drastisch ab, sodass schließlich keine entwicklungsfähigen Embryonen mehr erzeugt wurden. Lediglich bei der Verwendung von Keimzellkernen aus Kaulquappen blieb die Differenzierungsfähigkeit erhalten. Diese Versuche scheinen daher eine zunehmende Restriktion der funktionellen Fähigkeiten des Genoms somatischer Zellen mit zunehmendem Differenzierungsgrad der Zelle anzuzeigen. Die Frage, ob es sich um irreversible Veränderungen des genetischen Materials oder lediglich um sekundäre Restriktionen der Expressionsfähigkeit bestimmter Gene handelt, konnte jedoch durch diese Experimente nicht beantwortet werden. Ähnliche Versuche wurden von John Gurdon (1968) an Xenopus durchgeführt. Seine Ergebnisse wichen von denen der Experimente an Rana ab. Gurdon gelang es in einigen Fällen, wenn auch mit geringer Häufigkeit, durch Kerntransplantationen von Darmzellkernen fertile Xenopus-Individuen zu erhalten. Übereinstimmend sprechen somit embryologische Experimente, insbesondere an Tieren, für eine gewisse Beschränkung der Differenzierungsfähigkeit somatischer Zellen. Diese Klonierungsversuche sprechen dafür, dass solche Beschränkungen experimenteller Natur sind und dass vielen somatischen Zellen eine Pluripotenz oder sogar Totipotenz ihrer Differenzierungsfähigkeit erhalten bleibt. Auch in einer Reihe von Säugerarten war der Kerntransfer in Eizellen erfolgreich. So konnten zunächst embryonale Zellkerne von Schafen, Rindern, Kaninchen und einigen anderen Säugerspezies die Embryonalentwicklung in Gang setzen. Mittlerweile ist es gelungen, durch Kerntransfer aus einer Zelle ein lebensfähiges Schaf („Dolly“) zu erzeugen (Abb. 11.53). Dabei stammte der Spenderkern aus einer Zelllinie, die aus adultem Eutergewebe gewonnen wurde (Wilmut et

Abb. 11.52 a–d Kerntransplantation bei Xenopus und der Maus. a Oogenese und frühe Entwicklung bei Xenopus. b In Eizellen von Xenopus wird nach einem Kerntransfer eine reprogrammierte Genexpression im späten Blastulastadium nach mindestens 12 Zellteilungen beobachtet. c In Oocyten von Xenopus wird nach einem Kerntransfer eine reprogrammierte Genexpression ohne DNA-Replikation und Zellteilungen beobachtet. d In der Maus wird nach einem Kerntransfer in Eizellen die reprogrammierte Genexpression im Blastocystenstadium beobachtet. (Nach Gurdon et al. 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nationalen Akademie der Wissenschaften der USA)

al. 1997). Ebenso gelang es, Mäuse aus ausdifferenzierten adulten Ovarienzellen zu klonen. Zudem waren sowohl besagtes Schaf als auch die Mäuse, die aus den Kerntransplantationen entstanden, fertil. Folglich sind somatische Zellkerne prinzipiell fähig, die Ontogenese sogar bis zur Fortpflanzungsfähigkeit zu steuern. Dennoch scheinen dazu auch bei Säugern nicht alle differenzierten Zellkerne gleichermaßen geeignet. Bei den Mausexperimenten konnten sich etwa bei der Verwendung von Kernen aus Nervenzellen keine Tiere entwickeln. In allen Experimenten war die Erfolgsquote äußerst niedrig. Nur ein kleiner Prozentsatz der jeweiligen behandelten Oocyten entwickelte sich über Frühstadien hinaus. Das berühmte Schaf „Dolly“ war das einzige lebende Lamm unter 277 Versuchen. In der Regel gilt: Je fortgeschrittener das Entwicklungssta-

11.7 Stammzellen

Obwohl tierische Zellen im Allgemeinen noch einen hohen Grad an Differenzierungsfähigkeit besitzen (sie sind pluripotent), ist ein Teil der Zellen nicht mehr zur Entwicklung eines ganzen Organismus fähig (sie sind nicht totipotent). Bei Pflanzen sind mehr Zellen totipotent, jedoch kann auch hier nicht von einer allgemeinen Totipotenz gesprochen werden.

11.7.2 Embryonale Stammzellen

Abb. 11.53 Das Schaf Dolly. Das Lamm Nr. 6LL3 (später als „Dolly“ bekannt geworden) entstand aus dem Zellkern einer Brustdrüsenzelle eines finnischen „Dorset“-Muttertieres und einer schottischen „Blackface“ als Empfängerin. (Nach Wilmut et al. 1997, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

dium einer Zelle ist, desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit, dass ihr Kern die Embryonalentwicklung vollständig unterstützen kann. Dieses Experiment revolutionierte die Biowissenschaften und wird sich voraussichtlich stark auf die Gesundheitsversorgung auswirken. Insbesondere zwei Anwendungsgebiete zeichnen sich ab: ï Zum einen sind derartige Klonierungsverfahren ideal, um genetische Modifikationen an landwirtschaftlichen Nutztieren vorzunehmen, vorausgesetzt, dass somatische Zellen aus erwachsenen Tieren leicht gewonnen, im Labor kultiviert und genetisch modifiziert werden können. Neben den „klassischen“ Fragestellungen zu biologischen Prozessen und Krankheiten dieser Tiere können solche genetisch veränderten Nutztiere auch als „Bioreaktoren“ biologische Produkte (z. B. in der Milch) oder Spenderorgane herstellen (Edwards et al. 2003). ï Zum anderen hat die Herstellung von „Dolly“ durch den Transfer eines Zellkerns aus einer erwachsenen Zelle auch das Interesse an der Klonierung von Menschen wiedergeweckt. Was lange undenkbar schien, bekommt auf einmal realistischere Züge, nimmt aber auch in der Wissenschaft selbst beängstigende Formen an: So hat der südkoreanische Forscher Hwang Woo viele seiner bahnbrechenden Stammzellstudien gefälscht. Die gesellschaftliche Diskussion ist kontrovers, wenn auf der einen Seite der Kinderwunsch unfruchtbarer Paare oder das Bedürfnis nach maßgeschneiderten Spenderorganen und auf der anderen Seite grundsätzliche ethische und religiöse Überzeugungen stehen (McKinnall 2002; Schramm 1999).

Wir haben gesehen, dass Zellen und ihre Zellkerne offensichtlich in unterschiedlichem Ausmaß in der Möglichkeit ihrer weiteren Entwicklung festgelegt sind: So zeigen beispielsweise die mesenchymalen Vorläufer der Muskelzellen (S. 578) noch keine Anzeichen für die komplexe Anordnung der kontraktilen Filamente, die sie in ihrem Inneren später entwickeln werden. Die Unterschiede zwischen den einzelnen Zellen bestehen wahrscheinlich in kleinen Veränderungen, die durch Aktivitätsänderungen einiger weniger Gene (Transkriptionsfaktoren) verursacht werden. In diesem Zustand werden die Zellen hinsichtlich ihrer weiteren Entwicklungsmöglichkeiten determiniert. Es können z. B. aus mesodermalen Zellen der Somiten (S. 578) noch Muskel-, Knorpel-, Unterhaut- und Gefäßgewebe entstehen, aber keine anderen Gewebe. Ist die Entwicklungsrichtung einer Zelle einmal festgelegt, so „vererbt“ sie diesen Determinierungszustand auf alle ihre Nachkommen. Die Frage ist daher, worauf diese Unterschiede in der Differenzierungskapazität zurückzuführen sind: auf Veränderungen in der Genomstruktur oder auf epigenetische Mechanismen. Wir werden sehen, dass Differenzierungsprozesse auf beiden Ebenen bestimmt werden können. Zunächst aber wollen wir uns die Zellen etwas genauer betrachten, die als Stammzellen bezeichnet werden. Diese sind in der Lage, in verschiedene Zelltypen zu differenzieren und sich an der Entwicklung aller embryonalen Gewebe einschließlich der späteren Keimzellen zu beteiligen. Diese Definition gilt in besonderem Maße für die embryonalen Stammzellen, die die Blastocysten von Säugetieren bilden (S. 578). In eingeschränktem Maße gilt dies aber auch noch für Zellen adulter Gewebe, die die Fähigkeit zur wiederholten differenziellen Zellteilung haben, wobei die Mutterzelle eine Stammzelle bleibt und die Tochterzelle sich differenziert. So leiten sich sämtliche Blutzellen in erwachsenen Säugetieren aus einer Population pluripotenter Stammzellen im Knochenmark ab. Ähnliches gilt für männliche Keimzellen, die fortwährend Spermatogonien produzieren. Weiterhin kennen wir retinale Stammzellen oder neuronale Stammzellen.

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

In den frühen Embryonalstadien besitzen Wirbeltiere ein beachtliches Regulationspotenzial, wenn Teile des Embryos entfernt oder anders angeordnet werden. Allerdings haben dabei verschiedene Organismen an unterschiedlichen Stellen ihre jeweiligen Grenzen. Isoliert man die animalen und vegetativen Hälften eines 8-Zell-Embryos des Krallenfrosches Xenopus, so entwickeln sich diese nicht mehr normal. Anders dagegen bei der Maus: Hier sind die Zellen der inneren Zellmasse (Morula-Stadium mit insgesamt 32 Zellen; S. 578) noch nicht determiniert. Die Zellen der inneren Zellmasse der Maus sind bis zu 4,5 Tage nach der Befruchtung noch pluripotent und können daher in dieser Zeit in viele verschiedene Zelltypen differenzieren. Schleust man sie in die innere Zellmasse einer anderen Blastocyste vergleichbaren Alters ein, können sie an der Bildung aller embryonalen Gewebe einschließlich der zukünftigen Keimzellen beteiligt sein. Diese Eigenschaft ermöglicht die Erzeugung von chimären Mäusen, die Zellen mit zwei verschiedenen Genotypen besitzen. Man kann dazu Zellen der inneren Zellmasse eines Tieres entnehmen und sie in einen Wirtsembryo injizieren, wo sie sich wie die übrigen Zellen der inneren Zellmasse verhalten. Sowohl der Verlust als auch das Hinzufügen von Zellen kann durch den Mausembryo ausgeglichen werden. Verschiedene Embryonen der Maus können auch im Morula-Stadium durch Anlagerung verschmelzen (Morula-Aggregation). Daraus entsteht dann ebenfalls eine Chimäre. Bilden sich aus der hinzugefügten Zelle Keimzellen, so stammen alle Nachkommen des erwachsenen Tieres von der hinzugefügten Zelle ab. 1981 gelang es Evans und Kaufman, Zellen aus der inneren Zellmasse der Maus zu isolieren und in vitro zu kultivieren. Diese Zellen werden als embryonale Stammzellen (ES-Zellen) bezeichnet. Unter geeigneten Kulturbedingungen wachsen solche ESZellen unbegrenzt, ohne ihre Pluripotenz zu verlieren. So wie sich durch die Übertragung von Zellen aus der inneren Zellmasse eines Mausembryos in einen anderen Mausembryo Chimären herstellen lassen, so lassen sich auch einzelne ES-Zellen nach einer in-vitro-Kultur wieder mit frühen Mausembryonen kombinieren. Nach der Injektion von ES-Zellen in „Empfänger-Blastocysten“ können sie sich in den entwickelnden Embryo integrieren und bilden so eine Chimäre. Dieses System eröffnete die Möglichkeit, genetisch veränderte DNA zunächst in ES-Zellen zu transfizieren und nach geeigneter Selektion auch stabil zu integrieren. Die anschließende Einschleusung dieser veränderten ES-Zellen in Embryonen und die Produktion von Chimären haben den Grundstein für die enorm gestiegene Bedeutung der Maus als Tiermodell für genetische Untersuchungen gelegt. Es können im Prinzip Maus-

mutanten mit Mutationen in praktisch jedem Gen auf diese Weise gezielt hergestellt werden (Technik-Box 28). Für die Entwicklung dieser Methode wurden Mario Capecchi, Martin Evans und Oliver Smithies 2007 mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet. Analog zu den ES-Zellen der Maus wurden auch ES-Zellkulturen von menschlichen Embryonen hergestellt (Thomson et al. 1998). Diese menschlichen Embryonen aus der PräImplantationsphase stammten in der Regel aus „überzähligen“ Embryonen von in-vitro-Fertilisationen. Die Frage, wie mit solchen „überzähligen“ Embryonen und daraus entwickelten ES-Zellen umgegangen werden soll, ist seit Jahren Gegenstand heftiger Kontroversen zwischen Wissenschaftlern, aber in noch stärkerem Maße innerhalb der Gesellschaft. Offensichtlich handelt es sich doch um menschliche Embryonen, die ausschließlich zu Menschen werden können. Da sie sich aber noch nicht eingenistet haben, sprechen ihnen viele die volle Menschenwürde ab. Dieser Standpunkt erscheint dem Autor allerdings mit der „Unantastbarkeit der Menschenwürde“ nicht zu vereinbaren. ES-Zellen der Maus – und in etwas eingeschränkterem Umfang auch ES-Zellen des Menschen – können unter definierten Bedingungen wie „normale“ Zellkulturen gehandhabt werden (Passier u. Mummery 2003). In Suspensionskulturen von ES-Zellen der Maus führt Zellaggregation zu einer Differenzierung in mehrschichtige Strukturen, die als „embryoide Körper“ (engl. embryoid bodies) bezeichnet werden. Zwar fehlt eine Körperachse, doch die Differenzierung schreitet wie bei einem frühen Mausembryo fort und führt zu einer Reihe differenzierter Gewebe, wie Dottersack, Herz- und Skelettmuskelzellen, embryonalen und definitiven hämatopoietischen Zellen, Endothelzellen, Nerven- und Gliazellen (Abb. 11.54). Es ist möglich, diese Differenzierung von ES-Zellen der Maus durch Wachstumsfaktoren und/oder Retinsäure oder durch die Hemmung spezifischer Signalwege zu steuern. So führt die ektopische Expression der Transkriptionsfaktoren GATA-4 oder GATA-6 in ES-Zellen der Maus zur Differenzierung in viszerales Entoderm. Während bei ES-Zellen der Maus die wesentlichen Differenzierungsschritte in den embryoiden Körpern ablaufen, differenzieren ES-Zellen des Menschen auch in der Zellkultur z. B. zu Neuronen, Pankreaszellen, Herzmuskelzellen, hämatopoietischen Zellen oder Endothelzellen. Es ist klar, dass für diese Differenzierungsschritte hohe lokale Zelldichten notwendig sind, und die zusätzliche Anwesenheit von Wachstumsfaktoren beeinflusst das Differenzierungsprogramm. Diese Technologien sollen in der Transplantationsme-

11.7 Stammzellen

Abb. 11.54 Von der Blastocyste zu embryonalen Stammzellen und Körperzellen. Zellen werden der inneren Zellmasse entnommen und können als embryonale Stammzellen in Kultur gehalten werden. Unter geeigneten Bedingungen können sie

weiter ausdifferenzieren. HSC: hämatopoietische Stammzellen. (Nach Placzek et al. 2009, mit freundlicher Genehmigung der Royal Society)

dizin Anwendung finden, insbesondere für Herzinfarktpatienten und Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen.

endothelialen Wachstumsfaktor (engl. vascular endothelial growth factor, VEGF) überexprimieren. Aktuell überlegt man allerdings, ob diese Herzmuskelzellen aus embryonalen Stammzellen oder aus adulten Stammzellen gewonnen werden können (Nir et al. 2003; Passier u. Mummery 2003).

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind in der westlichen Welt die häufigste Todesursache; die mangelhafte Funktion der Herzmuskelzellen ist dabei einer der Gründe, der zu einer verringerten Pumpleistung des Herzens führt. In vielen fortgeschrittenen Fällen ist eine Herztransplantation daher die Methode der Wahl. Ihre Verwendung wird aber durch die Verfügbarkeit der Spenderorgane einerseits und die Immunantwort des Empfängers andererseits begrenzt. Um diese Begrenzungen zu umgehen, sollen ES-Zellen eingesetzt werden. So ist es in Mäusen bereits gelungen, Herzmuskelzellen, die aus ES-Zellen der Maus abgeleitet wurden, in das Herz einer mdx-Mutante (muskuläre Dystrophie, X-gekoppelt) zu transplantieren. Die so behandelten Mäuse überlebten offensichtlich deutlich besser als die Kontrollen, wobei die Wirkung noch gesteigert werden konnte, wenn die transplantierten Zellen genetisch so verändert waren, dass sie den vaskulo-

Die Parkinson’sche Krankheit (Kapitel 13.4.5) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die in erster Linie durch einen Verlust von dopaminergen Neuronen im Mittelhirn charakterisiert ist. Dementsprechend setzt eine Therapie auch primär an der Substitution des Neurotransmitters Dopamin an. Alternativ zur symptomatischen Therapie wird die Transplantation von fötalen dopaminergen Neuronen diskutiert. Trotz vielfacher ethischer und technischer Probleme haben weltweit über 300 Patienten Transplantate von embryonalen Neuronen erhalten (Gerlach et al. 2002). In Experimenten an Mäusen wurden dafür Zellen verwendet, die aus ES-Zellen gewonnen wurden (Passier u. Mummery 2003). Diese Ergebnisse zeigen ein mögliches Potenzial von ES-Zellen auch für die medizinische Therapie.

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Embryonale Stammzellen werden aus der inneren Zell-

masse von Blastocysten vor der Implantation in den Uterus gewonnen. Stammzellen haben die Fähigkeit zur wiederholten differenziellen Teilung, wobei die Mutterzelle eine Stammzelle bleibt und die Tochterzelle differenzieren kann. Totipotente Stammzellen haben dabei die Möglichkeit, wieder einen vollständigen Organismen zu generieren. Pluripotente Stammzellen können viele Gewebe eines Organismus aufbauen (zu dieser Gruppe gehören die embryonalen Stammzellen). Multipotente Stammzellen können zu einigen spezialisierten Geweben oder Zelltypen differenzieren; so können hämatopoietische Stammzellen Erythrocyten, Leukocyten und Thrombocyten bilden, aber keine Zellen außerhalb des Blutsystems.

11.7.3 Somatische Stammzellen Stammzellen wurden nicht nur aus embryonalem Gewebe gewonnen, sondern kommen auch in vielen Geweben eines erwachsenen Organismus vor (sie werden daher oft auch als „adulte“ Stammzellen bezeichnet). Solche Gewebe sind z. B. Haut, Knochenmark, Gehirn, Leber, Pankreas oder Darm. Obwohl üblicherweise angenommen wird, dass sich diese somatischen Stammzellen nur zu den Geweben weiterentwickeln können, aus denen sie entnommen wurden, haben verschiedene neuere Untersuchungen gezeigt, dass somatische Stammzellen auch in völlig andere Zelltypen differenzieren können. Dieser phänotypische Sprung wird von einem veränderten Expressionsprofil begleitet und wird als Transdifferenzierung bezeichnet. Eine Übersicht über die verschiedenen technischen Möglichkeiten gibt Abb. 11.55. Betrachtet werden dabei vor allem die verschiedenen Stammzellen des Knochenmarks, die als mesenchymale und als hämatopoietische Stammzellen bezeichnet werden. Erwartungsgemäß entwickeln sich aus den hämatopoietischen die entsprechenden Zellen des Blutes (z. B. Erythrocyten, Leukocyten und Thrombocyten), wohingegen aus den mesenchymalen Stammzellen z. B. Knochen- oder Knorpelgewebe, aber auch neuronale Zellen, Leberzellen, Herz- und Skelettmuskelzellen entstehen können. Die verschiedenen Zelltypen, die aus diesen somatischen Stammzellen abgeleitet werden, zeigen dann gewebespezifische Funktionen (Pfendler u. Kawase 2003). Im Mausmodell eines Herzinfarktes wanderten Zellen, die von Knochenmark-Stammzellen abgeleitet waren, nach der Injektion in die ischämische Herzregion und differenzierten dort zu Herzmuskelzellen und neuen Blutgefäßen, was zu einer verminderten Apoptose von Herzmuskelzellen

Abb. 11.55 a–d Strategien zur Reprogrammierung des Zellkerns. a Zellkerne aus somatischen Zellen können durch Injektion in eine vorher entkernte Eizelle reprogrammiert werden (Kerntransfer). b Wenn eine pluripotente Zelle (wie eine embryonale Stammzelle = ES-Zelle) mit einer somatischen Zelle fusioniert wird, entwickelt sich daraus eine tetraploide Zelle, die einen pluripotenten Zustand besitzt (Zellfusion). c Ektopische Expression der Transkriptionsfaktoren Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc ist ausreichend, um somatische Zellen zu reprogrammieren (induzierte pluripotente Stammzellen = iPS; direkte Reprogrammierung). d Unter spezifischen Kulturbedingungen können Keimzellen zu pluripotenten Zellen reprogrammiert werden (Zellkultur-induzierte Reprogrammierung). 2N: diploide Zelle; 4N: tetraploide Zelle. (Nach Amabile u. Meissner 2009, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

und zu einer verbesserten Herzfunktion führte (Orlic et al. 2001). Neuronale Stammzellen kommen im Hippocampus und der subventrikulären Zone vor. Sie können unter der Wirkung des epidermalen Wachstumsfaktors (engl. epidermal growth factor, EGF) oder des Fibroblasten-Wachstumsfaktors (engl. fibroblast growth factor, FGF) in verschiedene neuronale Zelltypen differenzieren, vor allem in Neurone, Oligodendrocyten und Astrocyten. Die gleichen Zelltypen können aber auch aus den oben erwähnten (und gereinigten) mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks gewonnen werden. Werden solche Zellen nach einem (simulierten) Gehirnschlag in den Cortex

11.8 Epigenetik und genetische Prägung

eines Rattengehirns injiziert, so wandern diese Zellen entlang des Corpus callosum, exprimieren neuronale Marker und führen zu einer deutlich verbesserten Funktion der Extremitäten (die ja oft nach einem Schlaganfall gelähmt sind; Zhao et al. 2002).

Somatische (oder adulte) Stammzellen kommen in

Menschen und Tieren in verschiedenen Organen vor, z. B. im Knochenmark. Über ein komplexes Steuerungssystem machen es diese somatischen Stammzellen möglich, dass sich hochspezialisierte Gewebe kontinuierlich erneuern.

Die Gruppe um Rudolf Jaenisch hat 2007 gezeigt, dass aus Hautzellen (der Maus) pluripotente Stammzellen gewonnen werden können (Hanna et al., 2007). Durch den Einbau von Genen, die für die Transkriptionsfaktoren Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc kodieren, wurden sie so umprogrammiert, dass sie zu pluripotenten Zellen werden. Die Autoren nannten sie daher „induzierbare pluripotente Zellen“ – iPS. Daraus können zahlreiche Gewebe und Organe entstehen, aber kein vollständiger Organismus. Die Gruppe hat weiterhin berichtet, dass sich damit im Prinzip auch Krankheiten heilen lassen - am Beispiel der Sichelzellenanämie im Mausmodell. Dabei übertrug er das Wildtyp-Allel des β-Globin-Gens des Menschen in iPS-Zellen von Mäusen, die bisher das menschliche Sichelzellen-Allel des β-Globin-Gens trugen (βs-Globin), wodurch das βs-Globin-Gen gegen die Wildtyp-Form ausgetauscht wurde. Da dabei Zellen desselben Tieres verwendet wurden, gibt es keine Abstoßungsreaktionen, wenn die Zellen ins Knochenmark übertragen werden. Die Tiere überlebten ohne Einschränkung mindestens 20 Wochen nach der Bestrahlung. Damit eröffnet sich die realistische Möglichkeit einer somatischen Gentherapie. Es bleiben natürlich noch einige Fragen hinsichtlich der therapeutischen Sicherheit offen (z.B. Vermeidung retroviraler Vektoren, die das Risiko einer Insertionsmutagenese in sich tragen) – aber der „proof of principle“ ist geglückt. Die Gruppe um Marius Wernig ging noch einen Schritt weiter (Vierbuchen et al. 2010): Die Autoren konnten zeigen, dass aus embryonalen und postnatalen Fibroblasten-Zellen der Maus durch Zusatz von drei Transkriptionsfaktoren neuronale Zellen entstehen können; die Effizienz des Verfahrens ist mit knapp 20% relativ hoch. Die so induzierten neuronalen Zellen (iN) exprimieren verschiedene Neuronen-spezifische Proteine, bringen ein Aktionspotential hervor und bilden funktionsfähige Synapsen. Die drei entscheidenden Gene sind Ascl1

(codiert für einen Helix-Loop-Helix Transkriptionsfaktor, der homolog zu dem achaete-scute Komplex bei Drosophila ist), Pou3f2 (Synonym: Brn2; codiert für einen Homeobox-Transkriptionsfaktor mit einer PouDomäne) und Myt1l (codiert für einen Myelin-Transkriptionsfaktor). Dieser Weg der direkten Umwandlung von Fibroblasten in Nervenzellen ohne den Umweg über iPS ist natürlich ein großer Fortschritt auf dem Weg zu möglichen Therapieverfahren. Die nächsten Schritte sind schon vorgezeichnet und werden der Antwort auf wichtige Fragen dienen: lassen sich die an Mäusen gewonnen Erkenntnisse auf Menschen übertragen? Kann die neue Methode ein Tumorrisiko ausschließen? Lässt sich das Verfahren auch auf andere Zelltypen übertragen? Es wird spannend!

11.8 Epigenetik und genetische Prägung Der Begriff „Epigenetik“ meint „außerhalb der konventionellen Genetik“. Er wird heute üblicherweise verwendet, um stabile Veränderungen in der Regulation der Genexpression zu beschreiben, die während der Entwicklung und Zellproliferation entstehen und festgeschrieben werden (Jaenisch u. Bird 2003). Diese Verwendung des Begriffs hat eine frühere Bedeutung verdrängt, wobei unter „Epigenetik“ die Interpretation des Genotyps während der Entwicklung zu einem bestimmten Phänotyp verstanden wurde (Waddington 1940).

11.8.1 Was ist genetische Prägung? Aus den Beobachtungen der Entwicklungsfähigkeit von Säugerembryonen lassen sich Hinweise auf spezifische Regulationsmöglichkeiten von Genen ableiten, die als epigenetische Veränderungen des Genoms bezeichnet werden. Insbesondere Kerntransplantationsversuche von James McGrath und Davor Solter (1983) an Eizellen von Mäusen haben bewiesen, dass für die Entwicklung eines normalen Embryos sowohl der väterliche als auch der mütterliche Pronukleus erforderlich sind. Injiziert man nach der Entfernung des väterlichen Pronukleus aus einer befruchteten Eizelle entweder einen zweiten mütterlichen Pronukleus oder injiziert umgekehrt nach Entfernung des mütterlichen Pronukleus einen zweiten väterlichen Pronukleus in die befruchtete Eizelle, so bleibt die embryonale Entwicklung auf frühe Präimplantationsstadien beschränkt. Diese Versuche beweisen, dass beide Genome der Eltern für die Embryonalentwicklung spezifisch und unterschiedlich programmiert sein müssen und dass nur in ihrem Zusammenwirken ein neuer Organismus entstehen kann. Es kann sich also nicht um irreversible Veränderungen des Genoms (z. B. Verlust oder Veränderung von DNA-Sequenzen) han-

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Abnahme der KleinhirnFaltung (mat)

Calcr Tfpi2 6 Casd1 Sgce Peg10 Frühe Ppp1r9a EmbryoPon3 letalität Pon2 (mat) Asb4 Dix5 Fötales Wachstum Mest (mat & pat) Mirn335 Copg2as1 Copg2as2 Copg2 Klf14 Nap1l5 Mkm1-ps1 (?)

5

Abb. 11.56 Geprägte Gene der Maus: chromosomale Imprinting-Regionen und Phänotypen. Es sind die chromosomalen Regionen der Maus angegeben, deren Gene durch Imprinting reguliert werden. (Nach Williamson et al. 2009, mit freundlicher Genehmigung der Autoren)

Nesp Nespas Gnasxl Ex1A Gnas

Nnat Blcap

H13 Mcts2

Gatm

Sfmbt2 Fötales Wachstum/ Plazentawachstum (mat) Plazentawachstum (pat) Zdbf2

2

Neonatales Verhalten & Letalität (mat & pat)

1

Chromosom:

Fötale Letalität (mat) Frühe Embryoletalität (pat)

PWS Postnatale Letalität (mat) AS (mat) Postnatales Wachstum und Überleben (pat)

Fötales Wachstum/ Plazentawachstum (mat)

7

Zim2 Zim1 Apeg3 Peg3 Usp29 Zim3 Zfp264 Atp10a Ube3a Ube3a-as lpw *Snord115 *Snord116 *Snord64 Snrpn Snurf Pec2 Pec3 Ndn Magel2 Mkm3 Zfp127as Peg12 Ampd3 Inpp5f Inpp5f_v2 Inpp5f_v3 H19 Igf2as Igf2 Ins2 Th Ascl2 Tspan32 Cd81 Tssc4 Kcnq1 Kcnq1ot1 Cdkn1c AF313042 Slc22a18 Phlda2 Nap1l4 Tnfrst23 Osbpl5 Dhcr7 Begain Dlk1 Mico1 Miko1-os Pde4d Meg3 antiRti1 *miRNAs Rtl1 Rian AK050713 AK053394 *C/D snoRNAs *miRNAs & Mirg Dio3

13

Htr2a

14

17 Slc22a3 18 19 Slc22a2 Aim Neonatale Igf2r Letalität & Fötales Wachstum Wachstum Impact (pat) (mat & pat) Tbc1d12 Ins1 (?)

Kcnk9 Peg13 Trappc9 Slc38a4

15

maternal exprimierte kleine nukleoläre RNA- und mikro-RNA-Gene paternal exprimierte kleine nukleoläre RNA- und mikro-RNA-Gene Regionen mit ungewöhnlichen Phänotypen mit maternaler (Mat) oder paternaler (Pat) Duplikation (?) widersprüchliche Daten

* *

Dcn

12

Fötale Letalität & Wachstum (mat & pat)

11 Ddc Grb10as Grb10 Plagl1 Cobl Fötales Zrs1 Commd1 Wachstum/ Plazentawachstum (mat & pat)

10

Geprägte Gene in Clustern sind soweit wie möglich in der richtigen Reihenfolge Geprägte Gene in rot sind maternal exprimiert Geprägte Gene in Blau sind paternal exprimiert

Postnatales Wachstum/ (mat) Mir184 A19 Rasgrf1

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600 Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

11.8 Epigenetik und genetische Prägung

deln, da sich die Entwicklungsstörungen bereits zeigen, bevor die künftigen Keimzellen determiniert sind. Bis zu diesem Zeitpunkt müssen noch totipotente Zellen vorhanden sein. Es handelt sich also um einen epigenetischen Regulationsprozess, der das väterliche und mütterliche Genom unterscheidet. Dieser Prozess wird als genetische Prägung bezeichnet; häufig wird auch im Deutschen der angelsächsische Begriff „Imprinting“ verwendet. Imprinting bedeutet, dass es eine auf chromosomaler Ebene niedergelegte Information geben muss, die sich in folgenden Differenzierungsprozessen in der Regulation differenzieller Genaktivität auswirkt. Er sagt jedoch weder etwas darüber aus, ob dies nur bestimmte Gene betrifft oder ob das gesamte Genom betroffen ist, noch gibt er Auskunft darüber, auf welchen molekularen Mechanismen diese chromosomale Information beruht. In den letzten Jahren hat unser Wissen über die molekularen Grundlagen des Imprintings jedoch deutlich zugenommen, zumal es auch eine wesentliche Ursache verschiedener Erbkrankheiten des Menschen ist (Prader-Willi-Syndrom, Angelman-Syndrom, Beckwith-Wiedemann-Syndrom). Eine wichtige Frage betrifft die Größe der Chromosomenbereiche, die einem Imprintingeffekt unterliegen. Sind es einzelne Gene oder umfasst das Imprinting größere kontinuierliche Genomabschnitte? Hierauf geben uns genetische Experimente an Mäusemutanten eine Antwort. Untersucht man die Keimzellen von Mäusen, die hinsichtlich bestimmter Translokationen heterozygot sind, so findet man eine erhöhte Rate von Segregationsstörungen während der Meiose, die durch Nondisjunction zu aneuploiden Keimzellen führen. Durch eine systematische genetische Analyse von Translokationen haben Cattanach und Jones (1994) spezifische Regionen im Mäusegenom kartieren können, die Imprintingeffekte zeigen. Danach ist ein Imprinting für in der Embryogenese wichtige Gene nur für einige begrenzte Abschnitte des Genoms nachweisbar (Abb. 11.56). In weiten Bereichen ist es hingegen für die Embryonalentwicklung bedeutungslos, ob Gene väterlichen oder mütterlichen Ursprungs sind. Eine genauere Analyse von Chromosomenregionen, die Imprinting zeigen, deutet darauf hin, dass es (bei der Maus) über 60 Gene sind, die entsprechend ihrem Ursprung aus der Eizelle oder den Spermatozoen unterschiedlich exprimiert werden (http://www.mgu. har.mrc.ac.uk/research/genomic_imprinting). Eines der zuerst identifizierten Gene, die Imprinting zeigen, ist das Igf2-Gen (engl. insulin-like growth factor 2) im Chromosom 7 der Maus (De Chiara et al. 1991). Im Embryo ist das väterliche Allel exprimiert, während das mütterliche Allel

inaktiv bleibt. Das Igf2-Gen wird unter anderem in der Plazenta exprimiert und fördert das Wachstum des Embryos. Die Hemmung des väterlichen Allels führt zu Mäusen, die nur noch 60 % des üblichen Geburtsgewichts haben. Besonders interessant ist, dass ein damit funktionell zusammenhängendes Gen, das für den entsprechenden Rezeptor codiert (engl. insulin-like growth factor 2 receptor, Igf2r) und auf dem Chromosom 17 liegt, ebenfalls Imprinting zeigt (Barlow et al. 1991). Allerdings ist hier das mütterliche Allel im Embryo aktiv, während das väterliche Gen inaktiv bleibt. Eine schematische Darstellung mütterlicher bzw. väterlicher Imprintingmechanismen gibt Abb. 11.57. Das Igf2r-Gen wird erwartungsgemäß auch in der Plazenta exprimiert und ist für eine Hemmung des embryonalen Wachstums verantwortlich; seine Inaktivierung führt zu Mäusen mit etwa 140 % des normalen Geburtsgewichts. Dabei codiert Igf2r eigentlich ursprünglich gar nicht für einen Igf2-Rezeptor, sondern für einen Mannose-6-phosphatRezeptor. Die Bindung für Igf2 hat dieser Rezeptor erst später in der Evolution erworben – und zwar nur bei Beuteltieren und Säugetieren mit einer Plazenta, aber nicht bei Vögeln, Fröschen und Kloakentieren. Der von Igf2r codierte Rezeptor fängt den Igf2 an der Zelloberfläche ab, führt ihn in die Zelle und dort zu den Lysosomen, in denen Igf2 abgebaut wird (der „normale“ Rezeptor für Igf2 wird durch Igf1r codiert und vermittelt dagegen die wachstumsfördernden Eigenschaften). Wenn wir uns nun die Imprinting-Muster in der Evolution betrachten, so stellen wir fest, dass Igf2 in Beuteltieren, Nagern, Paarhufern und Primaten einem Imprinting

Abb. 11.57 Epigenetische Repression und Aktivierung. Oben: Ein maternal reprimiertes Gen ist maternal methyliert und dadurch stillgelegt. Unten: Ein paternal reprimiertes Gen ist durch ein antisense-Transkript stillgelegt. Die maternale Kopie des antisenseTranskripts ist durch Methylierung stillgelegt – dadurch kann das sense-Transkript exprimiert werden. (Nach Reik u. Walter 2001b, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Abb. 11.58 Evolution der genetischen Prägung am Igf2-Genort. In Kloakentieren unterliegen weder Igf2 noch das Gen des Igf2-Rezeptors (Igf2r) einem Imprinting. Bei Beuteltieren, Paarhufern und Nagern sind beide Gene durch genetische Prägung reguliert, wohingegen bei Primaten das Imprinting des Igf2r wieder verloren ging. (Nach Wilkins u. Haig 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

unterliegt, aber nicht in Kloakentieren und Vögeln. Umgekehrt wird Igf2r in Beuteltieren, Nagern und Paarhufern genetisch geprägt, aber nicht in Kloakentieren, Vögeln, Primaten und ihren nächsten Verwandten – den Spitzhörnchen (Tupaia) und den fliegenden Lemuren (Abb. 11.58). Diese phylogenetische Verteilung wird am einfachsten durch ein gleichzeitiges Entstehen von Imprinting an beiden Genen erklärt. Dem Erwerb der Igf2-Bindestelle durch den Mannose-6-phosophat-Rezeptor in Vorläufern der heutigen Beuteltiere und Säugetiere (mit Plazenta) folgte später der Verlust der genetischen Prägung in Primaten. Diese phylogenetischen Daten zeigen einen Zusammenhang von Imprinting mit Lebendgeburten, wohingegen ein Imprinting bei eierlegenden Wirbeltieren fehlt. Allerdings wurde inzwischen auch Imprinting bei Caenorhabditis elegans beschrieben (Sha u. Fire 2005). Es werden derzeit drei Theorien diskutiert, die versuchen, den selektiven Vorteil des genomischen Imprinting in der Evolution zu erklären (Wilkins u. Haig 2003): ï Die Evolutionsmodelle schlagen vor, dass Imprinting einer Population erlaubt, sich verändernden

Umweltbedingungen schneller anzupassen, da sie einen Teil ihrer Allele (nämlich die abgeschalteten) in jeder Generation vor der natürlichen Selektion bewahrt. Während dieser Zeit könnten Mutationen akkumulieren, die nach Beendigung der Abschaltung einen selektiven Vorteil bringen. Diese Hypothese erscheint allerdings nicht sehr plausibel. ï Die „Eierstock-Zeitbomben“-Theorie schlägt vor, dass Imprinting entstand, um die weiblichen Organismen einer Spezies vor der Entstehung von Teratomen (Tumore der Keimzellen) in der Gebärmutter durch unbefruchtete Oocyten zu schützen. Entsprechend dieser Hypothese sollen dann paternale Gene für die normale Entwicklung des Trophoblasten verantwortlich sein. Eine Schwäche dieser Hypothese ist, dass sie Imprinting von solchen Genen nicht erklären kann, die nicht an der Entwicklung des Trophoblasten beteiligt sind. ï Die „Verwandtschafts“-Hypothese (auch als „Konflikt-Theorie“ bekannt) besagt, dass Imprinting wegen eines evolutionären Konflikts in Individuen zwischen Allelen maternalen und paternalen Ursprungs entstand. In ihrer einfachsten Form beschreibt diese Theorie den Konflikt zwischen Genen, die im Embryo stark exprimiert werden (väterliches Imprinting), aber dafür zusätzliche Ressourcen der Mutter auf deren Kosten oder ihrer anderen Nachkommen in Anspruch nehmen; mütterliches Imprinting schont dagegen die mütterlichen Ressourcen für weitere zukünftige Nachkommen („Kampf der Geschlechter im Genom“).

Das väterliche und das mütterliche Genom von Pronuklei von Mäusen zeigen eine unterschiedliche funktionelle Programmierung, was als Imprinting (genetische Prägung) bezeichnet wird. Imprinting betrifft nur eine begrenzte Anzahl von Genen. Imprinting von Genen, das bereits in der Zygote erfolgt ist, ist in der Regel auch im adulten Organismus noch vorhanden. In Einzelfällen können aber Gene, die während der Embryogenese inaktiviert wurden, in adulten Stadien wieder exprimiert werden.

11.8.2 Methylierung als epigenetische Markierung Fragt man nach dem molekularen Mechanismus des Imprinting, so bieten sich zwei mögliche Antworten an: ï Modifikationen von DNA-Sequenzen; ï Modifikation chromosomaler Proteine. Über die Modifikationen von Histonen durch Acetylierung, Methylierung oder Phosphorylierung haben wir im Rahmen der Chromatinorganisation (Kapitel 6.2.4) schon ausführlich gesprochen (Stichwort „Histon-

11.8 Epigenetik und genetische Prägung

Abb. 11.59 a, b Cluster genetischer Prägung bei Mensch und Maus. Es sind Ausschnitte der menschlichen Chromosomen 11p15.5 (a: Beckwith-Wiedemann-Cluster; ~ 1 Mb) und 15q11– q13 (b: Prader-Willi-Syndrom/Angelman-Syndrom; ~ 2 Mb) sowie der homologen Regionen auf dem distalen (a) bzw. zentralen (b) Bereich des Chromosoms 7 der Maus gezeigt. Die relative Lage und die Richtung der Transkription sind durch Pfeile angedeutet. Der Zustand der genetischen Prägung ist durch verschiedene Farben gekennzeichnet: rot: maternal exprimiert;

blau: paternal exprimiert; schwarz: beide Allele sind exprimiert; grün: Imprinting nicht bekannt oder nicht genau definiert. Fragezeichen deuten an, dass die orthologen Gene der Maus oder des Menschen zurzeit (April 2010) noch nicht bekannt sind. Zentren der genetischen Prägung (engl. imprinting centers, IC) sind durch Kreise in der jeweiligen Farbe des elterlichen Ursprungs der Prägung markiert. CEN: Centromer; TEL: Telomer. (Aus Reik u. Walter 2001a, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

code“). Darüber hinaus deuten auch viele Experimente auf die Möglichkeit hin, dass DNA-Modifikationen bei der differenziellen Regulation von Genen eine wichtige Rolle spielen.

Eine veränderte Expression von Genen spielt auch bei der Krebsentstehung eine wichtige Rolle (Kapitel 12.4.1). Zunehmend werden in der Therapie heute auch Inhibitoren der Histon-Deace-

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

tylasen (HDACs) eingesetzt, die zu einem Stillstand des Tumorwachstums führen und damit bessere Ansatzpunkte für eine weitere Therapie liefern (Jones u. Baylin 2007). Auf der anderen Seite hat die Hemmung der HDACs während der Embryonalentwicklung oft teratogene Effekte; so ist beispielsweise die Valprainsäure dafür bekannt, einen fehlerhaften Schluss des Rückenmarkskanals (Spina bifida) zu verursachen (Menegola et al. 2006). Die Methylierung von Basen in der DNA ist generell ein geeignetes Markierungsmittel für einen bestimmten Funktionszustand der DNA, da es der Zelle leicht möglich ist, methylierte DNA-Abschnitte über die Replikation hinweg zu erhalten. Obwohl ein neu synthetisierter DNA-Strang nach der Replikation zunächst unmethyliert ist, kann eine Identifizierung methylierter Basen im komplementären, aufgrund der semikonservativen Replikation also ursprünglichen Strang, durch Methylasen leicht erfolgen. Da Methylgruppen offenbar bevorzugt in CpG-Inseln (engl. CpG islands) vorliegen, ist die Erhaltung der Methylierung aufgrund der Symmetrie der Anordnung methylierten Cytosins über beliebig viele Zellgenerationen leicht möglich. Solche CpG-Inseln findet man häufig im Promotorbereich vieler Säuger-Gene. Etwa 88 % der Maus-Gene, die durch Imprinting geregelt werden, haben CpG-Inseln, verglichen mit einem Durchschnitt von 47 % aller Gene. Ebenso wie eine gewisse Häufigkeit direkter Wiederholungssequenzen in der Nachbarschaft dieser CpG-Inseln reicht das aber als einziges Charakteristikum für ImprintingRegionen nicht aus. Allerdings zeigt die große Mehrheit der geprägten Gene Unterschiede im Methylierungsmuster zwischen den elterlichen Allelen, wobei die Methylierung unterschiedliche Bedeutung haben kann (sowohl Aktivierung als auch Repression). Weiterhin fällt auf, dass Gene, die über Imprinting reguliert werden, oft in Clustern oder Domänen zusammengefasst sind (Abb. 11.56 und 11.59), die dann auch während der Replikation asynchron replizieren, d. h. die paternalen Kopien replizieren früher als die maternalen. Außerdem haben genetische Experimente gezeigt, dass diese Cluster eine höhere Rekombinationsrate während der männlichen Meiose zeigen. Wenn nun Imprinting (als Methylierung) eingeführt ist, muss es „gelesen“ werden, d. h. es muss in differenzielle Genexpression „übersetzt“ werden. Wir haben oben schon gesehen, dass viele dieser Gene in Clustern vorliegen, sodass nicht nur Wechselwirkungen mit Transkriptionsfaktoren vorstellbar sind, sondern auch Wechselwirkungen dieser benachbarten Gene und ihrer Kontrollregionen (Promotoren, Silencer und Insulator- oder Begrenzungselemente (engl. boundary elements); Kapitel 6.2), aber auch durch überlappende antisense-Transkripte:

ï Ein gewöhnlicher Weg, um ein Gen abzuschalten, ist die starke Methylierung seines Promotors. In vielen getesteten Genen sind die paternal methylierten Promotoren für DNase I nicht mehr zugänglich. Es ist daher davon auszugehen, dass die methylierten Stellen durch Proteine blockiert sind, die methylierte DNA-Abschnitte spezifisch erkennen (Abb. 11.60a). Diese „geschlossenen“ Chromatinkonformationen verhindern natürlich auch, dass der Promotor für Transkriptionsfaktoren zugänglich wird. ï Eine beachtliche Anzahl von geprägten Genen (ca. 15 %) sind mit Gegenstrang-Transkripten (engl. antisense transcripts) assoziiert. Überraschenderweise sind bisher alle entdeckten GegenstrangTranskripte selbst durch Imprinting reguliert und paternal exprimiert (Ausnahme: TsiX, das Gegenstrang-Transkript zu Xist; siehe Inaktivierung des X-Chromosoms, Kapitel 6.3.3). Durch Wechselwirkung mit dem Sinn-Strang der mRNA können sie die Translation erschweren oder sogar blockieren (Abb. 11.60b; Kapitel 7.5) Dabei haben die Gegenstrang-Transkripte oft ihren Ursprung in einem Intron und sind co-linear mit der DNA; sie können auch bis in den Promotor reichen und auf diese Weise das Gen ausschalten. ï Wie man aus Abb. 11.59 ersieht, liegen die beiden Gene Igf2 und H19 sehr dicht beisammen. Aus der Beobachtung, dass sowohl das paternal exprimierte Igf2 als auch das maternal exprimierte H19 einen gemeinsamen Enhancer benutzen, entstand die Vermutung, dass Chromatin-Grenzstrukturen an der Regulation beteiligt sein könnten (Abb. 11.60c). Das Modell besagt, dass H19 im unmethylierten Zustand einen „geschlossenen“ Zustand darstellt. Das maternale, unmethylierte H19-Allel zeigt auch eine besondere Chromatinstruktur mit mehreren DNase-Isensitiven Bereichen. Wenn die Region oberhalb von H19 deletiert wird, geht auch das Imprinting weitgehend verloren. ï Bei vielen Genen, die über Imprinting reguliert werden, ist das aktive Allel methyliert. Dies führte zu der Vermutung, dass diese Sequenzen Silencer enthalten, die durch Methylierung stillgelegt werden (Abb. 11.60d) Diese Beobachtungen von Gegenstrang-Transkripten, Chromatinstrukturen und Silencern stützen die Idee, dass verschiedene Elemente zusammenkommen müssen, damit genetische Prägung wirksam wird. Ein besonderes Element ist dabei das Prägungszentrum (engl. imprinting center, IC), das für die Ausbreitung der genetischen Prägung über einen größeren Chromatinabschnitt verantwortlich ist. Hinweise auf die Existenz solcher Prägungszentren kamen von verschiedenen Deletionsmutationen aus unterschiedlichen chromosomalen Bereichen, in denen zunächst

11.8 Epigenetik und genetische Prägung

Imprinting beruht im Wesentlichen auf der Methylierung von DNA als Erkennungsmechanismus für Geninaktivierung. Es wird ergänzt durch weitere Mechanismen (Expression von Gegenstrang-Transkripten, Chromatinstrukturen, Silencer). Die genetische Prägung eines chromosomalen Abschnitts wird oft von einem Prägungszentrum gesteuert (imprinting center).

Immer wieder wird diskutiert, ob epigenetische Markierung eine Vererbung erworbener Eigenschaften ermöglicht und damit die alte Sicht von Lamarck (1809; Kapitel 1.1.1) mit einem molekularen Mechanismus untermauern könnte. Aus Sicht der Bakteriengenetik wurde diese Frage in den 1940er- und 1950er-Jahren mithilfe zweier Testsysteme eindeutig verneint: der Fluktuationstest durch S. Luria und M. Delbrück (1943) und der ReplikaPlattierungstest durch J. und E. Lederberg (1953).

Abb. 11.60 a–d Lese-Mechanismen bei geprägten Genen. a Unterschiedliche Abschaltung durch Methylierung von CpGInseln bzw. des Promotors. b Regulation durch GegenstrangTranskripte in Verbindung mit Methylierung von CpG-Inseln bzw. der Promotoren. c Allel-spezifische Regulation benachbarter Gene durch unterschiedliche Methylierung von Begrenzungselementen innerhalb einer CpG-Insel. Faktoren wie der CCCTC-bindende Faktor (CTCF; rote Scheibe) binden an das unmethylierte Allel und blockieren damit den Zugang des oberhalb liegenden Promotors an den unterhalb liegenden Enhancer (grün), was zur Abschaltung des oberen Gens führt. d Verschiedene Methylierung führt zu unterschiedlicher Bindung von Abschaltungsfaktoren (rot; hier empfindlich gegenüber Methylierung), was den Promotor in cis blockiert. (Aus Reik u. Walter 2001a, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Imprinting beobachtet wurde; sind jedoch einzelne Bereiche deletiert, wird die Prägung des ganzen Abschnitts aufgehoben.

Neben dem Fluktuationstest (Kapitel 4.1, Abb. 4.1) lieferte der Replika-Plattierungstest noch eindeutigere Beweise für die zufällige Natur von Mutationsereignissen. Zunächst plattiert man Bakterien auf normalem Medium in einer solchen Dichte aus, dass sie zu vereinzelten, isolierten Kolonien auswachsen. Anschließend werden diese Kolonien mit einem Samtstempel („Lederbergstempel“) auf zwei neue Platten übertragen, die sich in der Zusammensetzung ihres Mediums unterscheiden (z. B. An - und Abwesenheit eines Antibiotikums). Bei Anwesenheit des Antibiotikums können nur Bakterien mit einer entsprechenden Resistenz wachsen. Auch in diesem Test zeigt es sich, dass nur einzelne Bakterienkolonien auf dem selektiven Medium wachsen, dass dieses also keine genetische Veränderungen verursacht, sondern nur bestehende Mutationen sichtbar werden lässt.

11.8.3 Wann erfolgt genetische Prägung? Genomisches Imprinting verändert sich in charakteristischer Weise während des Lebenszyklus eines Organismus (Abb. 11.61). Während der Entwicklung der Keimzellen zu reifen Spermien bzw. Eizellen wird genetische Prägung etabliert. Nach der Befruchtung wird die genetische Prägung zunächst aufrechterhalten und in dem sich entwickelnden Organismus weitergegeben. In den frühen Entwicklungsstadien der Keimzellen des neuen Organismus wird das Imprinting dann gelöscht und in einem späteren Zeitpunkt der Keimzellentwicklung reprogrammiert. Damit hat sich der Kreislauf wieder geschlossen. In Körperzellen wird das Imprinting-Muster im Prinzip aufrechterhalten; es kann aber auch während der Entwicklung und Differenzierung modifiziert werden.

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Abb. 11.61 a, b Reprogrammierung der Methylierung während der Embryonalentwicklung. a Der Methylierungsstatus der Hauptmasse des Genoms verändert sich während der frühen Phase der Embryonalentwicklung deutlich. Nach der Fertilisierung wird die Hauptmasse des Genoms aktiv demethyliert (Phase I), gefolgt von einer zweiten, passiven Demethylierungsphase. Der Methylierungsgrad erreicht in der Blastocyste (E 3,5) sein Minimum. Nach der Implantation wird die Hauptmasse des Genoms im embryonalen Ektoderm (grün) und im Mesoderm (rot) übermethyliert durch aktive de-novo-Methylierung. Das Genom des extraembryonalen Gewebes (primitives Endoderm: gelb; Trophoblast: blau) bleibt dagegen hypomethyliert. Die parentalen Methylierungen in den geprägten Genen (orange) bleiben erhalten. Interessanterweise unterliegt die X-Inaktivierung im extraembryonalen Gewebe (primitives Endoderm: gelb, Trophoektoderm: blau) der Prägung, wohingegen sie in

den embryonalen Geweben zufällig erfolgt. Auch die VorläuferKeimzellen werden während der frühen Embryonalentwicklung demethyliert. Die erneute Methylierung beginnt in den männlichen Keimzellen im Stadium der Prospermatogonien am Tag 16 der Embryonalentwicklung und in den Oocyten nach der Geburt bei der Reifung. b Der Methylierungsstatus von geprägten Genen während der Embryonalentwicklung und während der Entwicklung der Keimzellen. Als Beispiel sind die Prägungszentren IC1 und IC2 gezeigt. Modifikationen an den Zentren sind grau unterlegt; weiß bedeutet „keine Veränderung“. Elterliche Chromosomen sind entsprechend ihres Geschlechts gefärbt (rot: weiblich; blau: männlich). Das Lesen der Prägung (transkriptionale Interpretation der primären Prägung) im sich entwickelnden Embryo ist durch Pfeile am Chromosom angedeutet. (a nach Li 2002; b nach Reik u. Walter 2001b, jeweils mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

11.8 Epigenetik und genetische Prägung

Abb. 11.62 DNA-Methylierung und Demethylierung. DNAMethylierung in Säugern vollzieht sich an CpG-Dinukleotiden. Methylgruppen (beige Ovale) können an unmethylierter DNA durch de-novo-Methylierung durch die DNA-Methyltransferase 3a (Dnmt3a) angefügt werden. Wenn die DNA repliziert wird, wird die Methylierung an dem alten Strang erkannt, und im Tochterstrang wird durch Dnmt1 ebenfalls eine Methylgruppe eingefügt (Elemente der Replikationskomplexe sind farblich

Der Entwicklung der Geschlechtszellen kommt also für die Programmierung der genetischen Prägung eine entscheidende Rolle zu. Durch das Löschen der vorhandenen Prägung in der frühen Entwicklung wird eine Reprogrammierung ermöglicht, die das aktuelle Geschlecht widerspiegelt. Während dieses vollständigen Löschvorgangs (engl. erasure) wird das gesamte Genom der Keimzellen demethyliert. Dieser Löschvorgang beeinflusst auch die asynchrone Replikation; in der Maus ist er etwa am 13. bis 14. Tag der Embryonalentwicklung abgeschlossen. Nach dem Löschen beginnt die de-novo-Methylierung in der Spätphase der Entwicklung sowohl der Eials auch der Samenzellen, allerdings aufgrund der unterschiedlichen Entwicklungs- und Differenzierungsschritte in unterschiedlichen Stadien. Sie erfolgt in den männlichen Keimzellen früher (im Stadium der Prospermatogonien; in der Maus ab dem 15. bis 16. Tag der Embryonalentwicklung und später). Damit geht die Remethylierung dem Wiedereintritt der Zellen in die Mitose und Meiose voraus. Remethylierung in der weiblichen Keimzelle erfolgt später, nämlich nach der Geburt während der Reifephase der Oocyten. Die Enzyme, die an diesen Prozessen beteiligt sind, sind DNA-Methyltransferasen (Dnmt), insbesondere Dnmt1, Dnmt3a und Dnmt3b (Abb. 11.62).

hervorgehoben). In Anwesenheit von Dnmt1 (orange) wird so die halb-methylierte DNA wieder vollständig methyliert, sodass das Methylierungsmuster erhalten bleibt. Eine DNA wird in Abwesenheit von Dnmt1 bei jeder Replikationsrunde passiv demethyliert, da keine neue Methylgruppe in die DNA eingefügt wird; durch Demethylasen erfolgt dagegen eine aktive Demethylierung. (Aus Reik u. Walter 2001a, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Die genetische Prägung wird in der frühen Phase der Keimzellentwicklung gelöscht und in den späteren Phasen geschlechtsspezifisch reprogrammiert. Beteiligte Enzyme sind im Wesentlichen DNA-Methyltransferasen.

Neue Arbeiten am Agouti-Locus („wildfarben“; Gensymbol A) der Maus geben Hinweise darauf, dass epigenetische Markierungen nicht immer vollständig gelöscht werden und deshalb für komplexe Variationen der Phänotypen verantwortlich sind (Abb. 11.63). Der Agouti-Locus der Maus (Kapitel 10.3.4) codiert für einen inhibitorischen Liganden von Melanocortin-Rezeptoren. Das Gen ist für die Haarfarbe der Maus, aber auch für die zelluläre InsulinAntwort (mit-)verantwortlich. Der Agouti-Locus kontrolliert die Verteilung schwarzer und gelber Pigmente, wodurch die helle und dunkle Bänderung einzelner Haare der Wildfärbung vieler Tierarten entsteht. Durch Mutationen dieses Locus geht die gelbe Bande des Einzelhaares entweder verloren (non-agouti) oder dehnt sich aus (gelb oder agouti). Das dominante Allel (A) codiert die gelbe und das rezessive Allel (a) die schwarze Haarfarbe. Das Maus-Allel Avy ist das Ergebnis der Insertion eines Retrotransposons (IAP, Tab. 8.1) ober-

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Abb. 11.63 a–c Das Avy-Allel. a Im Avy-Allel ist ein Retrotransposon (intra-cisternal A particle, IAP) in das Pseudoexon 1a des agouti-Gens (wildfarben, Gensymbol: a) integriert, wobei die Transkriptionsrichtung von den LTRs (Pfeilspitzen) entgegengesetzt zu der des Agouti-Promotors verläuft. b Isogene C57BL/6Avy-Mäuse zeigen ein Kontinuum des Phänotyps, das von vollständig gelber Fellfarbe über verschiedene Stufen von gelben/ wildfarbenen Flecken zu vollständig wildfarbenem Fell reicht (da es sich hier nicht um einen „echten“ agouti-Phänotyp handelt, hat sich dafür der Begriff „pseudo-agouti“ eingebürgert). Das Ausmaß der gelben Fellfarbe korreliert stark mit dem Körpergewicht der erwachsenen Mäuse: Gelbe Mäuse exprimieren agouti wegen der IAP-Insertion in allen Zellen und neigen zu Fettleibigkeit, Diabetes und einer höheren Tumorrate; gefleckte Mäuse haben Mosaike von Zellen, die agouti exprimieren oder auch nicht; in pseudo-agouti-Mäusen wird die agouti-Expression nur von den Haar-spezifischen Promotoren gesteuert, und sie entsprechen daher dem Wildtyp mit normalem Körpergewicht. c Kreuzungsschema, um pseudo-agouti-Nachkommen von gelben Muttertieren herzustellen. Gelbe Avy/Avy-Muttertiere werden mit a/aZuchttieren gekreuzt und bringen pseudo-agouti-Nachkommen hervor, wenn sie ein Avy-Allel tragen, das von einem pseudo-agouti-Großvater abstammt. Das gestreifte Oval im gelben Kreis deutet an, dass das gelbe Weibchen wahrscheinlich ein rezessives pseudo-agouti-Epiallel trägt, das durch das dominante gelbe Epiallel maskiert wird. Die Zahl der Avy/a-Nachkommen von jedem Typ ist angegeben (n); a/a-Mäuse wurden der besseren Übersichtlichkeit weggelassen. (Nach Morgan et al. 1999, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

halb des Agouti-Gens. Die Avy-Expression ist unter diesen Umständen abhängig von der LTR-Region des Retrotransposons, sie führt zur gelben Fellfarbe und korreliert mit Hypomethylierung der LTR. Isogene Mäuse zeigen aber eine variable Expressivität und führen damit zu Mäusen mit einer gewissen Bandbreite der Fellfarben von gelb bis agouti (agouti-Mäuse haben eine methylierte LTR). Der Genort zeigt ein epigenetisches Vererbungsmuster, das der mütterlichen, aber nicht der väterlichen Keimbahn folgt: Mütter mit gelber Fellfarbe haben mehr gelbe Nachkommen als Mütter mit der

Fellfarbe agouti. Die Untersuchung der DNA-Methylierung an reifen Gameten, Zygoten und Blastocysten zeigte, dass die väterlichen und mütterlichen Allele unterschiedlich behandelt werden: Das väterliche Allel wird schnell demethyliert, wohingegen das mütterliche Allel langsamer, aber auch vollständig demethyliert wird ‒ was zeigt, dass Methylierung offensichtlich nicht die entscheidende epigenetische Markierung in diesem Fall darstellt; es werden zurzeit Histon-Methylierung der IAP-LTRs oder ein RNA-basierter Mechanismus diskutiert (Blewitt et al. 2006).

11.8 Epigenetik und genetische Prägung

Kernaussagen ï Zentrale Differenzierungsprozesse, insbesondere in der Frühentwicklung von Tieren, aber auch bei der Organdifferenzierung von Pflanzen, werden auf dem Niveau der Transkription reguliert. Hierbei spielen sowohl DNAbindende Transkriptionsfaktoren als auch differenzielles Spleißen von primären Transkripten eine Rolle. ï Geschlechtsbestimmung erfolgt bei Drosophila durch die Aktivierung eines Schlüsselregulationsgens und nachgeordneter Regulationsgene mittels eines molekularen Zählmechanismus, der das Zahlenverhältnis zwischen autosomalen und X-chromosomalen Proteinmolekülen ermittelt. Das relative Verhältnis der Menge beider Molekülklassen bestimmt, ob das Schlüsselregulationsgen aktiv oder inaktiv ist und legt so den Geschlechtsdifferenzierungsweg fest. ï Bei Säugern erfolgt die Geschlechtsdifferenzierung ebenfalls durch ein, hier im Y-Chromosom gelegenes, zentrales Regulationsgen (SRY). Das männliche Geschlecht wird als Folge der Aktivierung dieses Gens (bei Anwesenheit des Y-Chromosoms) durch männliche Geschlechtshormone festgelegt. Inaktivität des Schlüsselgens führt zur Ausprägung des weiblichen Geschlechts durch die Wirkung weiblicher Geschlechtshormone. ï Die frühe embryonale Entwicklung von Drosophila wird durch Gene, die während der Oogenese in der Mutter aktiv sind (maternale Gene), und durch Gene, die im Embryo aktiviert werden (zygotische Gene), bestimmt. Maternale Gene sorgen für die gezielte Lokalisation von Molekülen (Morphogenen) im Ei, die im Embryo als Transkriptionsfaktoren die Transkription zygotischer Gene differenziell regulieren. ï Während der Embryogenese werden durch die Lokalisation von Morphogenen insbesondere die beiden Achsen des Embryos festgelegt. Außerdem bedingt die Lokalisation der Achsendeterminanten zugleich auch eine Untergliederung der Körperlängsachse.

ï Morphogene sind Moleküle, die verschiedene Differenzierungsprozesse steuern. Sie können durch unterschiedliche Mechanismen wirksam werden. ï Die Determination von Körperregionen in Drosophila erfolgt durch Lokalisation von Molekülen in bestimmten Regionen des Eicytoplasmas oder durch Signaltransduktion, deren Initiation von somatischen Zellen des Ovars ausgeht. ï Regulationsgene, die in ihrer Funktion den Regulationsgenen bestimmter Entwicklungswege von Drosophila entsprechen (homöotische Gene), werden auch bei Vertebraten und Pflanzen gefunden. Die in der Frühentwicklung von Drosophila vorgefundenen Regulationsmechanismen sind daher von allgemeiner biologischer Bedeutung. ï Pflanzliche Zellen sind im Allgemeinen totipotent. ï Die meisten tierischen Zellen sind nicht totipotent, behalten jedoch eine relativ große Plastizität ihrer Entwicklungsfähigkeit (sie sind pluripotent). Dazu gehören auch embryonale Stammzellen. ï Viele tierische Zellen werden während der Frühentwicklung eines Organismus für ihre spätere Funktion determiniert. Die Differenzierung tritt erst später ein. Stammzellen haben die Fähigkeit zur wiederholten Teilung, wobei die Mutterzelle eine Stammzelle bleibt und die Tochterzelle differenzieren kann. ï Die Differenzierung von Zellen wird durch spezielle Signale ausgelöst (z. B. Hormone). Dies kann unter Kulturbedingungen mit embryonalen und adulten Stammzellen nachgeahmt werden. ï Bei Keimzellen kann elterliches Imprinting (genetische Prägung) die Expression von Genen im Embryo bestimmen. Imprinting beruht im Wesentlichen auf der Methylierung von DNA als Erkennungssignal. ï Die genetische Prägung wird in der frühen Phase der Keimzellentwicklung gelöscht und in den späten Phasen geschlechtsspezifisch reprogrammiert.

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Kapitel 11: Entwicklungsgenetik

Technik-Box 25

In-situ-Hybridisierung von Nukleinsäuren Anwendung: Nachweis von DNAoder RNA-Molekülen in ihrer natürlichen zellulären Lokalisation durch mikroskopische Analyse.

Je nach den unterschiedlichen Eigenschaften dieser verschiedenen Nukleinsäuremoleküle sind Modifikationen der Grundtechnik erforderlich.

Voraussetzungen · Materialien: Die in-situ-Hybridisierungsmethodik umfasst eine Reihe unterschiedlicher Techniken, die sich auf verschiedene Fragestellungen zur Lokalisation einer Nukleinsäuresequenz beziehen. Es lässt sich Folgendes nachweisen: • chromosomale DNA, • wachsende Transkripte in ihrer Position am Chromosom, • RNA-Fraktionen im Cytoplasma und • DNA von Viren oder Bakteriophagen.

Methode: Die Grundtechnik der insitu-Hybridisierung besteht in der Inkubation cytologischer (histologischer) Präparate mit einer markierten Nukleinsäureprobe. Nach der Inkubation werden überschüssige, nicht-hybridisierte, markierte Nukleinsäuren durch Waschen entfernt. Anschließend wird eine zur mikroskopischen Untersuchung der Lokalisation der gebildeten Hybride geeignete Nachweisreaktion ausgeführt. Markierung von Nukleinsäuren kann durch radioaktive Nu-

In-situ-Hybridisierung. Auf Chromosomen- oder Gewebepräparaten wird zunächst eine normale Hybridisierungsreaktion mit markierten Nukleinsäuren ausgeführt. Die markierten Hybride können durch Autoradiographie oder mithilfe von Antikörpern (je nach Markierungsverfahren) nachgewiesen werden; DIG: Digoxigenin.

kleotide erfolgen, wobei infolge der niedrigen Strahlungsenergie und der daher geringen Reichweite der Strahlung (β-Strahlung) vor allem Tritium (3H) geeignet ist (Technik-Box 13). Es wird aber auch radioaktiver Schwefel (35S) bzw. Phosphor (32P; 33P) eingesetzt. Neuerdings werden jedoch vorwiegend nicht-radioaktive Markierungsmethoden, wie die durch Biotin oder Digoxigenin, verwendet. In beiden Fällen kann der Nachweis entweder durch Farbreaktionen oder durch Fluoreszenz erfolgen. Beachte: Der Umgang mit radioaktiven Stoffen unterliegt der Strahlenschutzverordnung; dabei sind geeignete Maßnahmen zu ergreifen.

In-situ-Hybridisierung mit einer Crygd-Probe am Auge. Dargestellt ist das Auge eines 15,5 Tage alten Embryos der Maus; der Schnitt wurde mit einer RNA-Sonde hybridisiert, die dem Gegenstrang des Crygd-Transkripts entspricht (codiert für das γD-Kristallin). Die RNA ist mit Digoxigenin markiert, das über eine Enzym-gekoppelte Antikörperreaktion erkannt wird. Die Blaufärbung tritt vor allem im vorderen Bereich der Linse auf und markiert damit den Bereich, in dem die Crygd-mRNA vorhanden ist. Der schwarze Ring entspricht dem stark pigmentierten retinalen Pigmentepithel. (Bild: Jochen Graw, Neuherberg)

Technik-Box

Technik-Box 26

Morpholinos Anwendung: Methode zur gezielten Ausschaltung eines Gens durch antisense-RNA. Voraussetzungen: Kenntnis der DNA-Sequenz des zu inaktivierenden Gens. Methoden: Antisense-Oligonukleotide sind Nukleotide, die an eine kurze komplementäre Sequenz einer mRNA binden und dadurch deren Translation verhindern. Sie sind gut geeignet,

Schematische Darstellung des Rückgrats eines MorpholinOligonukleotids. Anstelle der Vernetzung der Basen über ein Ribosemolekül (wie in der RNA) und Phosphatreste sind die Morpholinos über einen Morpholinring und Phosphoamid-Gruppen verbunden. Die Basen, die mit dem Morpholinring verbunden sind, bleiben allerdings dieselben, sodass die üblichen Basenpaar-Reaktionen ablaufen können.

Vergleich von genetischem und Morpholino-induziertem Funktionsverlust von Fgf8 im Zebrafisch. Gezeigt sind Geschwister von Zebrafischembryonen im Alter von 24 Stunden (a, c: Wildtyp; b: homozygote ace-Mutation). Die ace-Mutanten exprimieren kein Fgf8, was zum Verlust der Bildung des Kleinhirns (Cerebellum) führt (Pfeilspitzen in a deuten auf das Kleinhirn; der Stern in b zeigt den Verlust des Kleinhirns). In d ist ein Zebrafischembryo gezeigt, dem

die Funktion eines Gens zu untersuchen, weil sie geeignet, die Funktion eines Gens zu untersuchen, weil sie sehr schnell eingesetzt werden können, schnell wirken und ihr Einsatz sehr billig ist. Kurze mRNA wird aber rasch von Nukleasen abgebaut (siehe dazu auch Technik-Box 16, RNAi und siRNA). Durch den Einsatz von Morpholinos werden nun diese Schwierigkeiten überwunden. Dabei handelt es sich um kurze Oligonukleotide, in denen die Ribose in der mRNA durch einen Morpholinring ersetzt ist (siehe Abbildung Rückgrat eines Morpholin-Oligonukleotids). Diese Morpholinos werden so konstruiert, dass sie möglichst an oder in der Nähe der Initiationsstelle für die Translation binden. Sie haben darüber hinaus wesentlich bessere antisense-Eigenschaften als mRNA-Oligonukleotide. Sie können leicht in kultivierte Zellen eingebracht werden. Ein weiteres umfangreiches Anwendungsgebiet in der Entwicklungsgenetik ist die Ausschaltung von Genen beim Zebrafisch: Durch Injektion von Morpholinos auf der einen Seite des Fischembryos wird das zu untersuchende Gen ausgeschaltet, während die andere Seite eine endogene Kontrolle darstellt (ein Beispiel dazu ist in der Abbildung zu Fgf8 im Zebrafisch gezeigt). Weitere Vorteile von Morpholinos sind: • Sie werden nicht durch Nukleasen abgebaut. • Sie binden sehr effektiv an den komplementären mRNA-Teil. • Sie zeigen eine äußerst geringe Tendenz, sich an nichtkomplementäre Sequenzen zu binden. • Sie verteilen sich schnell im Cytosol und im Kern. Dadurch werden sie zu idealen Instrumenten für die Untersuchung der Funktion eines Gens.

im Ein-Zell-Stadium ein Morpholino injiziert wurde, der für den Gegenstrang von Fgf8 codiert und die Translation von Fgf8-mRNA verhindert. Man beachte, dass der Phänotyp des Fgf8-Morpholino-induzierten Fischembryos sich nicht von der homozygoten ace-Mutante (b) unterscheidet. Die Embryonen sind von der Seite fotografiert, die anteriore Seite ist oben, die dorsale Seite unten). (Bild: Laure BallyCuif, Gif-sur-Yvette)

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Kapitel 12

Genetik menschlicher Erkrankungen Inhaltsverzeichnis 12.1 Methoden der Humangenetik . . . . . . . . . . . . . . . 614 12.2 Chromosomenanomalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . 625 12.3 Monogene Erbkrankheiten . . . . . . . . . . . . . . . . . 632 12.4 Komplexe Erkrankungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 658 12.5 Genbasierte Diagnoseund Therapieverfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 675

Gleichheit und Individualität (hier ein Tibeter) – diese beiden Charakteristika des Menschen wurden durch das Human Genome Project noch deutlicher. (Foto: W. Hennig, Mainz)

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Überblick Obgleich sich die Vererbung von Eigenschaften des Menschen in ihren Grundprinzipien und Regeln nicht von denen anderer Organismen unterscheidet, stellt sie den Genetiker vor besondere Probleme. Die Erforschung der genetischen Grundlage menschlicher Krankheiten wird oft durch die Familiengröße limitiert. In der klassischen Humangenetik waren Familienstammbäume das wichtigste Werkzeug. Manche grundsätzlichen Fragen ließen sich zudem durch die vergleichende Untersuchung von Zwillingen lösen. In der Praxis boten diese Analysen aber meistens nur die Möglichkeit, Wahrscheinlichkeitsaussagen über das Vorkommen von Erbkrankheiten bei Kindern betroffener Eltern zu machen. Durch die Entwicklung gentechnologischer Methoden hat die Humangenetik einen revolutionären Wandel erlebt. Es war gelungen, eine Anzahl von Genen zu isolieren, deren Mutation schwere Erbkrankheiten zur Folge hat. Die molekulare Analyse dieser Gene hat dabei in vielen Fällen neue Einsichten in die molekulare Struktur und Funktion von Genen vermittelt. Dies wird nach der nunmehr vollständigen Sequenzierung des menschlichen Genoms und vieler Modellorganismen (z. B. Maus, Drosophila, Hefe) mit noch höherer Geschwindigkeit voranschreiten. Dabei werden aber durch die Einbeziehung von immer mehr Menschen in gendiagnostische Verfahren auch die individuellen Unterschiede stärker zum Vorschein kommen. Es eröffnen sich dadurch aber auch neue Ansätze zur Therapie genetischer Defekte, z. B. durch geeignete Eingriffe in den Stoffwechsel,

12.1 Methoden der Humangenetik Obgleich die Vererbung von Eigenschaften beim Menschen sich in keiner Weise von der bei anderen Organismen unterscheidet, hat die Humangenetik eine besondere Stellung in der Genetik erlangt. Diese wird einerseits durch ihre Bedeutung für die Medizin bedingt, andererseits aber auch durch das allgemeine Bedürfnis des Menschen, die biologischen Grundlagen seiner Existenz zu verstehen. Der Erforschung dieses Hintergrundes steht, wie in allen auf den Menschen direkt bezogenen Wissenschaften, das ethische Verbot gegenüber, Experimente am Menschen auszuführen. Um zu einer Einsicht zu gelangen, mussten wir in der Vergangenheit in erster Linie auf Experimente zurückgreifen, die uns die Natur selbst zur Verfügung stellt, d. h. es wurde versucht, aus Veränderungen in der Nachkommenschaft auf erbliche Eigenschaften und deren Erbgänge zu schließen. Das wichtigste Mittel der klassischen Humangenetik hierfür war die Analyse von Familienstammbäumen. Sie ermöglichte es in günstigen Fällen, eine Veränderung als erblich zu erkennen

um bestehende erbliche Defekte zu kompensieren. Andererseits besteht im Prinzip die Möglichkeit der Korrektur des Erbmaterials. Gegenwärtig stehen wir erst am Beginn eines neuen Zeitalters der Humangenetik, dessen Möglichkeiten erst allmählich deutlich werden. Besonders wichtige Konsequenzen ergeben sich gegenüber den moralischen und ethischen, aber auch den rechtlichen Fragen, die sich in diesem Zusammenhang stellen. Die größten Fortschritte wurden bisher bei den monogenen Erkrankungen gemacht, die in klaren Formen den Mendel’schen Regeln folgen. Hier gibt es in vielen Fällen eine ausgefeilte molekulare Diagnostik und eine sichere Therapie auf gentechnischer Grundlage. Durch die Kombination pränataler Diagnostik mit den Techniken der Molekulargenetik ist es heute möglich, eindeutige Aussagen über die genetische Konstitution selbst von heterozygoten rezessiven Krankheiten bei Eltern und ihren Kindern zu erhalten. Hierdurch wird die genetische Familienberatung erleichtert, ohne damit jedoch die ethischen Fragen zu lösen, die der Humangenetik durch diese neuen Methoden zunehmend gestellt werden. Die Untersuchung menschlicher Krankheiten lässt aber auch erkennen, dass viele Erbkrankheiten auf komplexen genetischen Konstitutionen beruhen (z. B. Asthma, Diabetes). Dabei spielen oft Umweltfaktoren eine so große Rolle, dass präventive Diagnosen sehr schwer sind. Das bedeutet aber zugleich, dass für diese Krankheiten Therapien in naher Zukunft noch nicht wahrscheinlich sind.

und sie in ihren spezifischen Eigenheiten zu verstehen. Die zweite klassische Methode der Humangenetik, die Zwillingsforschung (Abb. 12.1), vergleicht die Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen genetisch identischen und nicht identischen Individuen. Wir haben bereits bei der Besprechung der Meiose gesehen, dass allein die Kombinationsmöglichkeiten zwischen väterlichen und mütterlichen Chromosomen bei der Gametenbildung so groß sind (S. 174), dass zufällig identische genetische Konstitutionen bei den Nachkommen praktisch ausgeschlossen werden können. Das gilt selbst dann, wenn man von möglichen Rekombinationsereignissen ganz absieht. So scheint es, dass es genetisch identische Individuen gar nicht gibt. Dieser Schluss ist jedoch nicht ganz richtig. Es wurde bereits gezeigt, dass biologische Mechanismen niemals fehlerfrei sind, sondern dass gelegentlich Abweichungen vom Normalzustand auftreten (ein Beispiel ist Nondisjunction, S. 486). Biologische Abweichungen können bereits während der frühen Entwicklung eines Organismus auftreten, natürlich auch beim Menschen. Eine Abweichung, die relativ häufig zu

12.1 Methoden der Humangenetik

der gleichen befruchteten Zygote abstammen, sind sie genetisch identisch. Beim Menschen kennen wir solche genetisch identischen Individuen als eineiige (= monozygote) Zwillinge. Es ist einleuchtend, dass eineiige Zwillinge das gleiche Geschlecht haben. Die einzigen Unterschiede monozygoter Zwillinge sind Merkmale, die auf somatisch-genetischen Veränderungen nach dem Zygotenstadium beruhen, z. B. das Muster der X-Inaktivierung bei Frauen oder das Repertoire der funktionellen Immunglobulin-Gene, aber auch in einer ungleichmäßigen Verteilung der Mitochondrien. Im Gegensatz hierzu sind zweieiige (= dizygote) Zwillinge durch eine gleichzeitige Befruchtung zweier reifer Eizellen durch zwei verschiedene Spermatozoen entstanden (Abb. 11.43). Sie sind also genetisch nicht identisch und können daher auch ein unterschiedliches Geschlecht haben. Die vergleichende Untersuchung von mono- und dizygoten Zwillingen hat der Humangenetik in einer eigenen Forschungsrichtung, die man als Zwillingsforschung bezeichnet, wichtige Einsichten vermittelt. Auch heute hat sie für verhaltensgenetische Fragestellungen Bedeutung.

Abb. 12.1 a–c Zwillinge. a Ähnliche monozygote Zwillinge. b Ähnliche dizygote Zwillinge. c Unähnliche monozygote Zwillinge. (Aus Tariverdian u. Buselmaier 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

beobachten ist, ist die Aufteilung embryonaler Zellen, die aus der Zygote durch mitotische Teilungen entstanden sind, zu einem sehr frühen Zeitpunkt in der Embryonalentwicklung. Sie können sich in zwei (oder mehr) Zellgruppen organisieren, die sich unabhängig voneinander zu einem vollständigen Organismus entwickeln. Da diese beiden (oder mehr) Organismen von

Als ein Sonderfall monozygoter Zwillinge sind die Siamesischen Zwillinge bekannt, die mit einer Häufigkeit von etwa einer in 500 aller Zwillingsgeburten auftreten. Sie entstehen durch eine unvollständige Trennung der inneren Zellmasse (Abb. 11.40) in der Blastocyste. Das führt zur (teilweisen) Entwicklung zweier Individuen, die nicht vollständig getrennt sind. Daher sind, wie beim ersten – aus Siam (dem heutigen Thailand; „Siamesische“ Zwillinge) – beschriebenen Fall, die beiden Individuen in einer mehr oder weniger begrenzten Körperregion miteinander verbunden. Sie lassen sich chirurgisch voneinander trennen, wenn jedes Individuum alle Organe besitzt. Im Falle einer weniger vollständigen Trennung haben die miteinander verwachsenen Individuen beispielsweise zwei Köpfe, teilen sich aber im Übrigen einen gemeinsamen Körper. In wieder anderen Fällen haben sie nur einen Kopf und sind im unteren Körperbereich verdoppelt. Solche partiellen Zwillinge sterben oft noch vor ihrer Geburt oder kurz danach. Die Häufigkeit Siamesischer Zwillinge, bezogen auf alle Geburten, ist mit 5 × 10−4 niedrig im Vergleich zu anderen genetischen oder „epigenetischen“ Defekten. Vergleichbare Entwicklungsdefekte werden natürlich auch bei Tieren beobachtet.

In der klassischen Humangenetik waren die Stammbaumforschung und die Zwillingsforschung die wichtigsten Methoden zur Analyse menschlicher Gene. Die Genomforschung hat das Methodenspektrum wesentlich erweitert.

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

12.1.1 Zwillingsforschung und Geschwisterpaar-Analyse Die mittels der Zwillingsforschung erzielten Ergebnisse liegen auf zwei Ebenen der genetischen Forschung. Zunächst gestattet es die genetische Identität monozygoter Zwillinge, durch direkten Vergleich Hinweise auf die erbliche Grundlage morphologischer oder anderer Merkmale zu erhalten, da eine phänotypische Identität in diesem Falle mit hoher Wahrscheinlichkeit zugleich auch die Identität der Erbeigenschaften anzeigt. Vielleicht wichtiger noch sind aber Schlüsse über die Variabilität erblicher Ausprägungsformen, die wir aus der vergleichenden Untersuchung monozygoter Zwillinge ziehen können. Der Phänotyp eines Organismus ist stets das Ergebnis der Funktion der erblichen Anlagen in ihrer Zusammenwirkung mit den Umweltgegebenheiten. Betrachten wir diese Feststellung im Hinblick auf Zwillinge etwas genauer, so werden wir erkennen, dass sowohl monozygote als auch dizygote Zwillinge uns kaum anderweitig zu erlangende Informationen über die Einflüsse der Umwelt auf die Ausprägung menschlicher Erbanlagen im Phänotyp verfügbar machen können. Umweltfaktoren. Eine interessante Beobachtung ist es, dass die Entstehung monozygoter Zwillinge selbst offenbar vorwiegend entwicklungsphysiologisch (also durch Umwelteinflüsse) bedingt ist, wenn auch erbliche Faktoren nicht ganz ohne Bedeutung sind. Die Häufigkeit dizygoter Zwillinge hingegen ist sowohl durch äußere Faktoren als auch genetisch beeinflusst. Als äußere Faktoren sind hierbei Außentemperaturen und das Lebensalter der Mutter zu nennen: Bei niedrigeren Außentemperaturen steigt der Anteil dizygoter Zwillinge ebenso wie mit dem Lebensalter der Mutter. Häufigkeit. In den Vereinigten Staaten liegt die Häufigkeit dizygoter Zwillinge von Müttern, die jünger als 30 Jahre alt sind, bei 0,6 %. Von Müttern, deren Lebensalter bei Ende 30 liegt, werden etwa 1,3 % dizygote Zwillinge geboren. Genetische Faktoren, die die Häufigkeit von Zwillingen beeinflussen, werden bei Familien sichtbar, bei denen vorwiegend Mehrfachgeburten vorkommen. In manchen Populationen ist die Häufigkeit dizygoter Zwillinge offenbar aufgrund genetischer Faktoren beträchtlich erhöht. Beispielsweise liegt der Anteil von Zwillingen bei Nigerianern bei etwa 4 % aller Geburten. Die Häufigkeit monozygoter Zwillinge hingegen ist nicht altersabhängig. Ihr mittlerer Anteil liegt bei etwa 0,4 % aller Geburten. Ausprägung von Merkmalen. Die Zwillingsforschung hat in der Geschichte der Humangenetik eine wichtige Rolle bei der Erforschung genetisch bedingter Merkmale gespielt:

Die erste klassische Zwillingsstudie wurde von Galton bereits 1875 publiziert. Die systematische Analyse von Ähnlichkeiten bei monound dizygoten Zwillingen wurde durch den Dermatologen Siemens 1924 eingeführt, der die Korrelationsanalyse mit Zwillingsdaten verband: Er bestimmte die Zahl der Muttermale in dem einem und im anderen Zwilling und verglich die Korrelation in mono- und dizygoten Zwillingspaaren. Die Korrelation in eineiigen Zwillingen beträgt 0,4 und nur noch 0,2 in zweieiigen Zwillingen ‒ diese Untersuchung machte zunächst zwar „nur“ den genetischen Beitrag bei der Variation der Zahl der Muttermale deutlich (die „Erblichkeit“ beträgt 40 %; siehe unten), die Methode wurde in der Folgezeit aber auf eine Vielzahl von Merkmalen angewendet. Für die Untersuchung von Verhaltensmerkmalen wird die Zwillingsforschung auch künftig nicht ohne Bedeutung sein. Der Vergleich bei monozygoten Zwillingen kann uns Aufschluss darüber verschaffen, ob die Ausprägung eines Merkmals stark von der Umwelt beeinflusst oder weitgehend genetisch festgelegt ist. Man untersucht hierzu monozygote und dizygote Zwillinge und stellt den Prozentsatz an übereinstimmender (Konkordanz) und abweichender Ausprägung (Diskordanz) fest. In Abb. 12.2 sind die Ergebnisse von Zwillingsstudien für einige Risiko-Faktoren von HerzKreislauf-Erkrankungen sowie für Persönlichkeitsmerkmale zusammengestellt. Wir erkennen, dass viele der untersuchten Eigenschaften auch bei monozygoten Zwillingen ein großes Maß an Diskordanz aufweisen, also in einem hohen Maße durch die Umwelt beeinflusst sind. Eine Ausnahmestellung nehmen manche Erbkrankheiten, z. B. der Albinismus, ein, für die bei monozygoten Zwillingen stets eine 100 % konkordante Ausprägung zu beobachten ist. Solche Krankheiten sind rein genetisch bedingt, wie es aufgrund der Ursache (z. B. Ausfall eines Genproduktes) auch zu erwarten ist. Erblichkeit (engl. heritability, h2) wird in der Humangenetik als das Verhältnis der genetischen Varianz zu der gesamten Varianz betrachtet; häufig findet man dafür die Formel h2 = G/V = (A + D)/(A + D + E), wobei G die genetische Varianz darstellt (bestehend aus der Varianz aufgrund additiver genetischer Effekte, A, und der Varianz aufgrund dominanter Effekte, D). V bedeutet die gesamte Varianz des Phänotyps; sie setzt sich aus der genetischen Varianz und der umgebungsbedingten Varianz (E) zusammen. Viele psychische Krankheiten haben zwar eine beträchtliche erbliche Komponente in ihrer Expression, ihre Ausprägung

12.1 Methoden der Humangenetik

Abb. 12.2 Einige Ergebnisse klassischer Zwillingsstudien. Es ist der Prozentsatz der Varianz dargestellt, der durch genetische Faktoren (lila), durch gemeinsame Umweltfaktoren (grün), durch individuelle Umweltfaktoren (beige) und durch Altersunterschiede (blau) hervorgerufen wird. Die Phänotypen wurden an niederländischen Zwillingen (männlich und weiblich) festgestellt (in einigen Fällen auch in ihren Eltern und Geschwistern). Die Zahl in Klammern gibt das häufigste Alter

an (Modalwert). Für Persönlichkeitsmerkmale beträgt die Erblichkeit ~ 50 %; die Erblichkeit der Intelligenz erscheint stark altersabhängig und steigt zwischen 5 und 18 Jahren stark an. Es gibt insgesamt einige wenige Unterschiede in der Erblichkeit zwischen Frauen und Männern. HDL: high-density lipoprotein; LDL: low-density lipoprotein. (Nach Boomsma et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

wird aber auch durch einen nicht unerheblichen Beitrag der Umwelt gesteuert. Expressivitäts- und Penetranzunterschiede machen es in solchen Fällen besonders schwierig, den Anteil des genetischen Beitrags genauer zu bestimmen. Das gilt insbesondere für alle Verhaltensmerkmale. Aussagen über angeblich erblich bedingte „abnormale“ Verhaltensweisen (z. B. Kriminalität) sind daher mit größter Zurückhaltung zu bewerten. In gleicher Weise wie dizygote Zwillinge weisen Geschwister ein hohes Maß an genetischer Ähnlichkeit auf. Geschwisterpaare unterscheiden sich nur durch wenige Rekombinationen, sodass große Chromosomenabschnitte übereinstimmen. Für ein zufällig ausgewähltes Chromosomensegment ist zu erwarten, dass Geschwisterpaare keinen, einen oder zwei elterliche Haplotypen gemeinsam haben (die entsprechenden Häufigkeiten sind 25 %, 50 % bzw. 25 %). Wenn beide Geschwister von einer genetisch bedingten Krankheit betroffen sind (engl. affected sib pairs), dann ist es wahrscheinlich, dass sie ein Chromosomensegment gemeinsam haben, das das Krankheitsgen enthält (bei dominanten Krankheiten besitzen sie mindestens einen übereinstimmenden Haplotyp; bei rezessiven

Krankheiten müssen beide Haplotypen übereinstimmen). Dabei ist es wichtig, zwischen Segmenten zu unterscheiden, die aufgrund der Abstammung identisch sind (engl. identical by descent), und solchen, bei denen die Herkunft unklar ist, weil beide Eltern dasselbe Allel besitzen (engl. identical by state). Mikrosatelliten-Marker mit mehreren Allelen sind für derartige Untersuchungen wesentlich effizienter als Marker mit nur zwei Allelen (SNPs), um eine Identität nach Abstammung festzustellen. Wenn dazu mehrere Marker verwendet werden, wird die Spezifität weiter erhöht, da jeder einzelne Haplotyp wahrscheinlich selten ist. Eine Vielzahl betroffener Geschwisterpaare lässt sich ohne vorherige Annahmen über den Erbgang (autosomal, rezessiv, X-gekoppelt) der Erkrankung analysieren. Es ist auch oft viel einfacher, die Daten von erkrankten Geschwisterpaaren zu sammeln als von ausgedehnten Familien. Ein Nachteil der Geschwisterpaar-Analysen besteht aber darin, dass die ermittelten Kandidatenregionen oft zu groß sind, um allein aufgrund dieser Positionsangabe das betroffene Gen zu erkennen (Positionsklonierung).

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Zwillings- und Geschwisterpaar-Analysen sind wich-

tige Werkzeuge der Humangenetik und haben viel dazu beigetragen, genetische Ursachen bei komplexen Erkrankungen zu erkennen. Zwillingsstudien erlauben dabei auch, den genetischen und umweltbedingten Anteil an Erkrankungen abzuschätzen.

12.1.2 Stammbaumforschung Für das Verständnis erblicher Krankheiten beim Menschen hat die Analyse von Familienstammbäumen, teilweise zusammen mit cytologischen Chromosomenuntersuchungen, eine zentrale Rolle gespielt. Erst die Molekularbiologie gibt uns in letzter Zeit die experimentellen Mittel in die Hand, die es gestatten, die Schwierigkeiten der Stammbaumanalyse teilweise zu umgehen. Auch heute sind cytogenetische Analysen wichtige Werkzeuge der Humangenetik. Mithilfe der Stammbaumforschung hat man eine Reihe der wichtigsten Erbkrankheiten des Menschen erkennen und wenigstens teilweise bestimmten Chromosomen oder sogar Chromosomenregionen zuordnen können. Durch Ermittlung der Häufigkeit von Rekombinationsereignissen zwischen Genen, die zu

Abb. 12.3 Symbole in der Humangenetik

Erbkrankheiten führen, und geeigneten Markergenen war es zunächst gelungen, genetische Chromosomenkarten des menschlichen Genoms zu erstellen. Aus praktischen Gründen – auch rezessive Allele sind im männlichen Geschlecht aufgrund der Hemizygotie leicht zu erkennen – waren geschlechtsgekoppelte Krankheiten oder morphologische Merkmale besonders einfach zu kartieren, sodass die Genkarte des X-Chromosoms besonders früh gut untersucht war. Im Folgenden werden einige Beispiele für Erbkrankheiten des Menschen dargestellt, die die Unterschiede zwischen dominanten und rezessiven sowie geschlechtsgekoppelten Merkmalen und ihre Konsequenzen in der Humangenetik veranschaulichen sollen. Die besonderen Erfordernisse der Humangenetik, deren fast ausschließliche Grundlage bis vor Kurzem Familienstammbäume waren, haben zu einer besonderen genetischen Symbolik geführt, die in Abb. 12.3 zusammengefasst ist. Diese Symbolik gestattet es, den Erbgang von Krankheiten (oder anderen Merkmalen) in einem Familienstammbaum leicht zu übersehen.

12.1.3 Das Human Genome Project Das Humangenom-Projekt (engl. Human Genome Project) geht in seiner Grundidee in die Zeit zurück,

12.1 Methoden der Humangenetik

in der die DNA-Sequenzierungstechniken von Sanger sowie Maxam und Gilbert entwickelt wurden (Technik-Box 21). Öffentliche Diskussionen begannen um 1986, als Renato Dulbecco den Bezug zwischen Krebsforschung und der Sequenzierung des menschlichen Genoms herausgestellt hatte. Ein solches Programm einzuführen, war keine triviale Frage der Organisation von Forschungsprojekten, denn seine Durchführung musste notwendigerweise mit einem erheblichen finanziellen Aufwand verbunden sein. Man hat die Kosten für die Sequenzierung der 3 × 109 Basenpaare DNA des menschlichen Genoms auf etwa 3 Milliarden Dollar geschätzt. Dieser Betrag liegt in der Größenordnung von Projekten der Hochenergiephysik, und ein solcher Betrag an Forschungsgeldern wurde in vergleichbarer Weise noch nie für ein biologisches Projekt verfügbar gemacht. Dennoch wurde das Projekt von vielen Wissenschaftlern unterstützt, darunter den Nobelpreisträgern W. Gilbert und J. D. Watson, sodass seine Realisierung schließlich möglich wurde. Die Durchführung des Humangenom-Projektes in einer sinnvollen und koordinierten Weise verlangte erhebliche technische Vorbereitungen. Es war nicht nur erforderlich, die Aufgaben der DNA-Sequenzierung über die beteiligten Laboratorien zu verteilen, sondern es musste z. B. auch neue Computer-Software zur Auswertung der erhaltenen Sequenzdaten geschaffen werden, oder es waren Entscheidungen darüber zu treffen, in welcher Weise die Klonierung des menschlichen Genoms erfolgen sollte. Sollten die erhaltenen Klone in zentralen Sammlungen aufbewahrt werden? Wie und von wem dürfen die Daten verwendet werden? Die Frage der Aufbewahrung klonierter DNA-Bereiche hat sich mittlerweile durch die technischen Möglichkeiten der PCR-Technik (Technik-Box 4) erübrigt, da es bei der Kenntnis einer DNA-Sequenz mithilfe geeigneter Primer leicht möglich ist, diese Sequenz jederzeit erneut aus genomischer DNA zu erhalten. Die durch die Sequenzierung des menschlichen Genoms aufgeworfenen ethischen und sozialen Probleme sowie die rechtlichen Aspekte konnten ebenfalls nicht unbeachtet gelassen werden, obgleich sie sich kaum von den Problemen unterscheiden, die durch die Verwendung gentechnologischer Methoden ganz allgemein entstehen. Inzwischen ist das menschliche Genom vollständig sequenziert und in Datenbanken der weiteren Untersuchung zugänglich. In großen Sonderheften berichteten Nature (Vol. 409, Feb. 2001) und Science (Vol. 291, Feb. 2001) über die fast vollständige Rohfassung. Der Eindruck jedoch, der durch Presseveröffentlichungen oft erweckt wurde und noch immer erweckt wird, dass damit die Probleme von Erbkrankheiten gelöst seien und der Mensch nun für jede

Manipulation verfügbar sei, reflektiert den Mangel an Information über die tatsächliche Bedeutung des Human Genome Projects und seiner Konsequenzen in der Öffentlichkeit: Durch die Kenntnis der DNASequenz des menschlichen Genoms ist noch nicht mehr über seine Funktion bekannt, als wir ohne die Kenntnis der DNA-Sequenz gewusst haben. Die Sequenz versetzt uns jedoch in die Lage, die codierten Proteinsequenzen zu entschlüsseln und die betreffenden Gene auf ihre Regulation und Funktion hin zu untersuchen. Die DNA-Sequenz hat somit eine Schlüsselfunktion, die uns die Tür öffnet, um weitere Erkenntnisse zu sammeln, hat aber ohne weitere Forschung ebenso wenig Konsequenzen wie der Besitz eines Schlüssels, wenn man nicht weiß, wo das Schloss ist, in das er passt. Die Sequenzierung kompletter Genome hat sich naturgemäß nicht auf das menschliche Genom beschränkt, sondern es sind derzeit bereits eine Reihe anderer Genomprojekte beendet, die das E. coli-Genom und andere Mikroorganismen ebenso einschließen wie das Genom von Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, der Maus, der Ratte, des Huhns und einiger Pflanzen (z. B. Arabidopsis thaliana). Weitere Genomsequenzierungsprojekte sind in Arbeit. Das menschliche Genom umfasst 3 × 109 Basenpaare DNA in 23 Chromosomen (haploid; diploid: 44 Autosomen und ein Geschlechtschromosomenpaar: XX bei der Frau, XY beim Mann). Die genetische Karte umfasst etwa 3000 Centi-Morgan (cM) und die Anzahl der Gene wird heute auf ca. 30.000 geschätzt. Das bedeutet, dass nur wenige Prozent der DNA auf Protein-codierende Genombereiche entfallen: Nehmen wir die mittlere Größe eines Gens mit 1500 Basenpaaren (500 Aminosäuren) an, so umfassen ca. 30.000 Gene nur 5 × 107 Basenpaare oder 1,5 % der gesamten Genom-DNA. Diese Schätzung muss jedoch aufgrund der Kenntnisse, die aus den bisherigen DNA-Sequenzdaten des menschlichen Genoms gewonnen wurden, modifiziert werden. So ist inzwischen bekannt, dass viele eukaryotische Gene multiple Promotorregionen besitzen, die in verschiedenen Geweben unterschiedlich aktiv werden. Hinzu kommt die Kenntnis von alternativem Spleißen, bei dem in unterschiedlichen Zellen unterschiedliche Exons zu Proteinen kombiniert werden können. Durch solche funktionellen Unterschiede im Gebrauch von Gensequenzen wird das Ausmaß der im Genom tatsächlich enthaltenen Informationen für Proteinsequenzen gegenüber der Anzahl von Genen erhöht, die aus einer vereinfachten Genomanalyse sichtbar werden, bei der lediglich die Anzahl Protein-codierender Einheiten ermittelt wird. Wir wissen von der Besprechung der Genstruktur (Kapitel 7), dass eukaryotische Gene in der Form von Introns DNA-Sequenzbereiche enthalten, die keine

619

620

Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Proteine codieren und im Genprodukt nicht mehr wiederzufinden sind. Der Anteil von Introns ist bei menschlichen Genen besonders groß und kann mehr als das 10fache der eigentlichen Protein-codierenden Sequenz betragen. Unter der Annahme, dass das generell für alle Gene gilt, ließen sich etwa 20 % der Größe des menschlichen Genoms durch die Anwesenheit großer Intronabschnitte in den Genen erklären. Etwa 60 % des Genoms entspricht EinzelkopieDNA oder ist niedrig repetitiv. Die restlichen 30‒40 % des menschlichen Genoms entfallen zum größten Teil auf repetitive DNA-Sequenzen. Hiervon sind etwa 10 % hochrepetitive Sequenzen, und 20 % des Genoms werden durch mittelrepetitive Sequenzen repräsentiert. Zur hochrepetitiven DNA im menschlichen Genom zählen neben Mikrosatellitensequenzen auch Telomerensequenzen (TTAGG-Repeats, S. 231) und Centromeren-DNA. Mittelrepetitive DNASequenzen umfassen zu einem erheblichen Teil Transposons, zu denen unter anderem LINEs und SINEs zählen (Kapitel 8.2.3), aber auch Pseudogene (Kapitel 7.2.1), die im menschlichen Genom relativ häufig vorkommen. Als eine wichtige Komponente des menschlichen Genoms haben sich Wiederholungseinheiten aus Diund Trinukleotiden erwiesen, die bereits in anderem Zusammenhang erörtert wurden (dynamische Mutationen, Kapitel 9.3.3). Entdeckt wurden solche Trinukleotidrepeats als Bestandteile menschlicher Gene, deren Mutation zu einigen der wichtigsten Erbkrankheiten oder zu Tumoren führt (Tabelle 9.3). Zu den Erbkrankheiten, die auf Mutationen von Wiederholungsregionen zurückgehen, gehören Chorea Huntington (S. 642), die Duchenne’sche Muskeldystrophie (DMD) (S. 649) und das Fragile-X-Syndrom (S. 652).

Durch das Human Genome Project wurde es ermög-

licht, das gesamte menschliche Genom zu sequenzieren (3 Milliarden Basenpaare; ~ 30.000 Gene). Ein großer Anteil des Genoms (30–40 %) enthält repetitive Sequenzen.

12.1.4 Kartierung von Erbkrankheiten Im Kapitel 10.4 haben wir bereits einiges über das Kartieren von Genen erfahren; wir haben uns dort allerdings auf die experimentellen Systeme beschränkt. Dabei stand im Vordergrund, wie man das experimentelle System optimieren kann, um möglichst präzise Kartierungsinformationen zu erhalten (z. B. über Erhöhung der Zahl untersuchter Nachkommen in der F2-Generation oder Auskreuzungen zu anderen Stämmen etc.). In der Humangenetik ist die Ausgangssituation im Allgemeinen umgekehrt: Hier haben wir vor-

Abb. 12.4. Haplotyp-Analyse. Zwei große Familien, in der viele Mitglieder an erblichem grauen Star (Katarakt) leiden (schwarze Symbole; Pfeile: Index-Patienten), wurden zunächst mit SNPs genomweit untersucht (Teilnehmer sind durch einen Stern gekennzeichnet); eine Haplotyp-Analyse mit polymorphen Mikrosatelliten-Markern erfolgte für die Region mit Kopplung auf dem Chromosom 17. Der entscheidende Bereich wird in der Familie 1 durch die Rekombinationen in den Mitgliedern III-1 und IV-2 definiert und in Familie 2 durch deren Mitglieder III-3 und IV-1. WT: Wildtyp; MUT: mutierte Form des CRYBA1-Gens (Deletion von 3 Basen im Exon 4). Obwohl die kausale Mutation in den beiden Familien identisch ist, zeigt der Vergleich der Haplotyp-Analyse, dass beide Mutationen unabhängig voneinander entstanden sind. (Nach Lu et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung von Molecular Vision)

gegebene Familien und müssen die Methoden so optimieren, dass auch für kleine Familien die maximalen Informationen möglich sind. Auch dabei hat uns das Humangenom-Projekt riesige Schritte vorangebracht, denn jetzt steht nicht nur die vollständige Sequenz des Genoms (und damit eine exakte „physikalische Karte“) zur Verfügung, sondern auch ein umfangreiches molekulares Methodenspektrum. Dazu gehört neben der Möglichkeit der schnellen Sequenzierung mit großer Reichweite die hohe Dichte an Mikrosatelliten-Markern, die Möglichkeit, Polymorphismen auf der Ebene einzelner Basen zu erkennen (engl. single nucleotide polymorphism, Abk.: SNP – sprich: „snip“) und als Marker einzusetzen, sowie die PCR-Technologie (Technik-Box 4). Die genetische Kartierung menschlicher Krankheitsgene funktioniert also im Prinzip genauso wie die genetische Kartierung eines jeden anderen diploiden Organismus, der sich sexuell fortpflanzt. Das Ziel besteht darin, herauszufinden, wie häufig zwei Genorte durch meiotische Rekombination getrennt werden, um auf diese Weise den genetischen Abstand (ausgedrückt in cM, S. 489) sowie die Lage des gesuchten Krankheitsgens in Bezug auf die ausgewählten Marker bestimmen zu können. Eine Rekombination ist aber, wie wir bereits früher gesehen haben, umso wahrscheinlicher, je weiter entfernt die betrachteten Gene oder Marker voneinander sind. Umgekehrt werden Allele umso wahrscheinlicher gemeinsam vererbt, je dichter sie beieinander liegen. Solch ein Block von gemeinsamen Allelen wird auch als Haplotyp bezeichnet. Haplotypen markieren also chromosomale Bereiche, die sich durch Stammbäume und Bevölkerungsgruppen verfolgen lassen. Die Analyse der Haplotypen in einer Familie ist in der Regel sehr informativ, um innerhalb eines gegebenen kritischen Intervalls einzelne Rekombinationsereignisse zu erkennen, die dann die Region der möglichen Kandidatengene weiter einengen können (Abb. 12.4).

D17S921 D17S805 CRYBA1EXON4 rs1047790 D17S1294 D17S1293 D17S966 D17S1299 D17S1868 D17S787

D17S921 D17S805 CRYBA1EXON4 rs1047790 D17S1294 D17S1293 D17S966 D17S1299 D17S1868 D17S787

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IV

D17S921 D17S805 CRYBA1EXON4 rs1047790 D17S1294 D17S1293 D17S966 D17S1299 D17S1868 D17S787

III

II

I

184 217 WT C 255 291 291 195 188 137

178 217 WT C 251 291 277 199 192 159

*

III:1

184 217 MUT T 247 283 269 191 188 137

184 217 MUT T 247 283 269 191 188 137

176 217 WT C 247 271 295 191 194 141

IV:1 184 227 WT C 259 275 295 195 196 141

*

III:2

*

176 217 WT C 247 271 295 191 194 141

II:3

184 217 MUT T 247 283 269 191 188 141

178 219 WT C 251 291 281 195 192 141

178 217 WT C 251 291 277 199 192 159

184 227 WT C 259 275 295 195 196 141

IV:2 178 219 WT C 251 291 281 195 192 141

*

III:5

184 217 MUT T 247 283 269 191 188 137

Familie 1

184 217 MUT T 247 283 269 191 188 137

178 184 217 217 WT MUT C T 251 247 291 283 277 269 199 191 192 188 159 137

* III:3

182 215 WT C 255 291 291 195 188 137

*

184 217 WT C 247 283 269 191 188 137

II:1

I:2

IV:3

? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

176 217 WT C 247 271 295 191 194 141

176 231 WT T 251 279 285 195 192 165

*

III:4

*

? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

184 217 MUT T 247 283 269 191 188 137

176 217 WT T 251 279 285 195 192 165

IV:4

? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

176 217 WT C 251 279 285 195 192 165

*

176 231 WT C 255 275 285 187 194 141

I:1

III:6

? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

II:4 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

182 217 WT C 251 279 277 195 192 159

III:7 182 217 WT C 247 283 295 199 194 152

182 217 WT C 251 279 277 195 192 159

184 217 WT C 263 283 295 199 188 159

* II:2

178 215 WT C 259 275 277 195 196 152

III:4

182 231 WT C 247 291 285 203 194 159

182 231 WT C 247 291 285 203 194 159

IV:1 178 227 WT C 263 287 281 203 190 165

176 217 MUT C 251 287 277 195 190 165

176 217 MUT C 251 287 277 195 190 165

III:1

II:1

? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

176 217 MUT C 251 287 277 195 190 165

I:1

178 227 WT C 263 287 281 203 190 141

? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

184 217 WT C 259 271 295 199 194 165

II:3

? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

III:2

184 217 WT C 259 271 295 199 194 165

Familie 2

178 227 WT C 263 287 281 203 190 141

178 229 WT C 255 287 291 199 194 165

I:2

178 217 MUT C 251 287 277 195 190 165

178 229 WT C 255 287 291 199 194 165

178 227 WT C 259 271 295 199 194 165

II:2

III:3

176 217 WT C 259 275 295 203 196 137

12.1 Methoden der Humangenetik

621

622

Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Wenn es nun zwischen den betrachteten Genorten in der Meiose zu einem Crossing-over kommt, entstehen zwei rekombinierte Chromatiden mit neuen Allelkombinationen. In der Prophase I der Meiose (Kapitel 5.3.2) liegen zwar vier Chromatiden vor, aber an einem Rekombinationsereignis sind immer nur jeweils zwei Chromatiden beteiligt – die anderen beiden bleiben unverändert. Daher erzeugt ein Crossing-over immer zwei rekombinierte und zwei nicht rekombinierte Chromatiden, was einer Rekombinationshäufigkeit von 50 % (oder 0,5) entspricht. Die Rekombinationshäufigkeit ist also nie größer als 50 %, unabhängig von der Länge des physikalischen Abstands. Der Zusammenhang zwischen der Rekombinationshäufigkeit und dem genetischen Abstand gehorcht unter mathematisch-statistischen Gesichtspunkten dabei einer Normalverteilung und unterstellt ein rein zufälliges Auftreten von Rekombinationen, die sich außerdem nicht beeinflussen. Aufgrund dieser Überlegungen hat Haldane (1919) die nach ihm benannte Kartierungsfunktion aufgestellt (Kapitel 10.4.2). Allerdings hat sich im Laufe der Jahre gezeigt, dass die oben genannten Voraussetzungen nicht immer zutreffen. Insbesondere sind die Crossing-over nicht zufällig verteilt, sondern hängen auch vom Vorkommen ähnlicher Sequenzen und von der chromosomalen Region ab (im Allgemeinen finden wir besonders in männlichen Meiosen Rekombinationen häufiger an den Telomeren, wohingegen die Regionen nahe am Centromer nur in weiblichen Meiosen Rekombinationen zeigen). Generell treten in der weiblichen Meiose Rekombinationen häufiger auf als in männlichen, und außerdem behindert natürlich die Entstehung eines Crossing-overs das Entstehen eines zweiten in seiner Umgebung; dieser Vorgang wird als Interferenz bezeichnet. Moderne Computerprogramme können diese Phänomene berücksichtigen. Die Zahl an Chiasmata in einer männlichen Meiose wird mit durchschnittlich 49 pro Zelle angegeben. Da jedes Crossing-over 50 % Rekombinanten ergibt, errechnet sich daraus eine genetische Länge des männlichen Genoms von 2450 cM. Dieser Wert stimmt gut überein mit der experimentell bestimmten genetischen Länge. Das weibliche Genom umfasst dagegen (ohne das X-Chromosom) 4296 cM (Collins et al. 1996). Wenn man nun die physikalische Länge des menschlichen Genoms mit 3000 Mb annimmt, so ergibt sich, dass im Durchschnitt 1 männliches cM etwa 1,05 Mb entspricht und 1 weibliches cM 0,70 Mb; als Faustregel kann man sich daher merken, dass beim Menschen der genetische Abstand von 1 cM einen physikalischen Abstand von etwa 1 Mb bedeutet. Das wesentliche Interesse der Humangenetik richtet sich heute nach Abschluss der Sequenzierung des menschlichen Genoms darauf, Krankheitsgene

zunächst zu kartieren und dann zu charakterisieren. Dazu bedarf es einer großen Zahl von Markern, die in hoher Dichte über das gesamte Genom verteilt sind und die außerdem schnell zu analysieren sind. Die in der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts als Marker verwendeten Blutgruppen umfassen nur etwa 20 Genorte, und auch die später entwickelten biochemischen Verfahren haben keine wesentliche Verbesserung gebracht. Es sind heute insbesondere drei Kategorien von Markern, die diesen Ansprüchen genügen: ï Restriktionslängenpolymorphismen (engl. restriction fragment length polymorphism, RFLP): Sie erforderten früher ein Hybridisierungsverfahren (Southern Blot); heute kann es aber vielfach durch PCR-basierte Verfahren ersetzt werden; ï Mikrosatelliten (Di-, Tri- und Tetrarepeats) mit hohem Informationsgehalt; ï SNPs können in automatischen Verfahren schnell nachgewiesen werden. Für alle drei Kategorien liegt die Zahl der bekannten Marker über 105, bei SNPs sogar noch einmal eine Größenordnung darüber. Der Informationsgehalt der RFLPVerfahren ist allerdings in der Humangenetik begrenzt, da es maximal zwei Allele gibt: Restriktionsschnittstelle vorhanden oder nicht. Bei den Mikrosatelliten gilt diese Einschränkung nicht – hier sind natürlich durch die Vielzahl der Wiederholungsmöglichkeiten auch eine entsprechend hohe Zahl an Allelen möglich, womit die Wahrscheinlichkeit steigt, auch in kleinen Familien informative Marker verwenden zu können. Hat man nun eine Familie mit klarem Mendel’schen Erbgang und informativen Markern gefunden, stellt sich die Frage, wie man Kopplung statistisch sichern kann. In Abb. 12.5 sind zwei Varianten einer Familie gezeigt mit unterschiedlichem Informationsgehalt. In Abb.12.5a ist klar, dass die Krankheit zunächst mit dem Allel A1 assoziiert ist: von der Großmutter (I-2) über die Mutter (II-1) zu den Kindern III-1, III-3 und III-4; bei III-6 liegt offensichtlich eine Rekombination vor. In der Situation von Abb. 12.5b ist das nicht mehr klar: Da über die Generation der Großeltern keine Informationen vorliegen, kann bei der Mutter (II-1) die Krankheit mit beiden Allelen, A1 oder A2, assoziiert sein. Allerdings lässt das Verhältnis in der 3. Generation eine Assoziation mit A1 wahrscheinlicher erscheinen als mit A2. Im Stammbaum in Abb. 12.5b ist es also nicht möglich, zweifelsfrei die Rekombinationsereignisse zu bestimmen. Es ist aber möglich, die Wahrscheinlichkeit der beiden Alternativen zu berechnen, ob die beiden Genorte (Krankheit und Marker A1) gekoppelt sind (Rekombinationshäufigkeit = Θ) oder nicht (Rekombinationshäufigkeit = 0,5 - das heißt maximale Rekombinationshäufigkeit). Das Verhältnis dieser bei-

12.1 Methoden der Humangenetik

Abb. 12.5 a, b Erkennung von Rekombinationen. Es sind zwei Versionen einer Familie mit einer autosomal-dominanten Erkrankung angegeben, die mit dem Marker A assoziiert ist. Dieser Marker kommt in verschiedenen Allelen (A1 bis A6) vor. a Wir können zweifelsfrei erkennen, dass bei den Familienmitgliedern III-1 bis III-5 keine Rekombinationen vorliegen; bei III-6 hat dagegen eine Rekombination stattgefunden. b Wenn in derselben Familie allerdings Informationen über die Großeltern (Generation I) fehlen,

erscheint die Situation nicht mehr so eindeutig: Bei der Mutter (II1) könnte die Krankheit mit dem Allel A1 oder A2 assoziiert sein. Entsprechend könnten formal entweder die Kinder III-1 bis III-5 rekombinant sein und III-6 nicht rekombinant oder umgekehrt (III-1 bis III-5 nicht rekombinant und III-6 rekombinant). Da aber Rekombinationsereignisse selten sind, erscheint die zweite Interpretation wahrscheinlicher. (Nach Strachan u. Read 2005, mit freundlicher Genehmigung von Taylor & Francis)

den Wahrscheinlichkeiten zeigt an, welche Wahrscheinlichkeit überwiegt (engl. odds), und der Logarithmus daraus wird als LOD-Score bezeichnet (engl. logarithm of the odds). Morton hat 1955 gezeigt, dass die Berechnung der LOD-Scores die effizienteste statistische Methode darstellt, um Stammbäume auf Kopplung zu untersuchen, und er entwickelte Formeln, um den LOD-Score für bestimmte Standardsituationen als Funktion von Θ zu erhalten. Die entsprechenden Daten für unsere zwei Standardfamilien aus Abb. 12.5 sind in Tabelle 12.1 angegeben. Positive LOD-Scores lassen eine Kopplung wahrscheinlicher erscheinen, wohingegen negative LOD-Scores eher für eine Ablehnung dieser Hypothese sprechen. Man beachte aber, dass nur Rekombinationshäufigkeiten Θ zwischen 0 und 0,5 aussagekräftig sind; bei Θ = 0,5 lässt sich aber Kopplung und Nicht-Kopplung nicht mehr unterscheiden (beide Möglichkeiten sind gleich wahrscheinlich), sodass der Quotient 1 und damit der entsprechende Logarithmus 0 wird. Computerprogramme können die entsprechenden Kurven grafisch darstellen (Abb. 12.6). Die nächste Frage betrifft den Schwellenwert, ab dem wir einen LOD-Wert als signifikant betrachten können. Es hat sich allgemein durchgesetzt, dafür einen Wert von 3 anzunehmen. Das beruht darauf, dass dann die Wahrscheinlichkeit der Kopplung 1000fach über der Wahrscheinlichkeit der Nicht-Kopplung liegt (der Logarithmus von 1000 ist 3). Mathematische Überlegungen können zeigen, dass dieser 1000fache Überschuss der Wahrscheinlichkeit dem allgemein üblichen Grenzwert von p < 0,05 entspricht, den man in der Statistik als Signifikanzschwelle für eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % wählt. Umgekehrt wird eine Kopplung mit einem LOD-Wert kleiner als −2 ausgeschlossen; LOD-Werte zwischen −2 und +3 lassen keine klaren Aussagen zu.

Tabelle 12.1 Berechnung der LOD-Werte der Familien aus Abb. 12.5 Familie Aa Θ

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Z

–∞

0,58

0,62

0,51

0,30

0

Θ

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Z

–∞

0,28

0,32

0,22

0,08

0

Familie Bb

Vorbemerkungen: Unter der Annahme, dass die Gene wirklich gekoppelt sind (Rekombinationshäufigkeit Θ), beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass eine Meiose nicht rekombinant ist, 1 – Θ. Wenn die Gene tatsächlich aber nicht gekoppelt sind, beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass eine Meiose rekombinant oder nicht rekombinant ist, in gleicher Weise 1/2. a

Es gibt 5 Nicht-Rekombinante und 1 Rekombinante. Die Gesamtwahrscheinlichkeit für Kopplung ist (1 – Θ)5×Θ. Die Wahrscheinlichkeit für keine Kopplung ist (1/2)6. Das Verhältnis der Wahrscheinlichkeiten ist (1 – Θ)5×Θ/(1/2)6. Der LOD-Wert (Z) ist der Logarithmus des Verhältnisses beider Wahrscheinlichkeiten; bei verschiedenen beobachteten Rekombinationshäufigkeiten ergeben sich obige LODWerte.

b

Wenn A1 mit der Erkrankung gekoppelt ist, gibt es 5 NichtRekombinante und 1 Rekombinante; wenn A2 mit der Erkrankung gekoppelt ist, gibt es 5 Rekombinante und 1 Nicht-Rekombinante. Die Gesamtwahrscheinlich ist 1⁄2 [(1 – Θ)5 Θ/(1/2)6] + 1/2 [(1 – Θ) Θ 5 /(1/2)6].

Der LOD-Wert (Z) ist der Logarithmus des Verhältnisses beider Wahrscheinlichkeiten; bei verschiedenen beobachteten Rekombinationshäufigkeiten ergeben sich obige LOD-Werte.

Wir haben uns aus Gründen der Einfachheit nur auf die Kopplung mit einem Marker beschränkt; die

623

624

Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Abb. 12.6 Kurven von LOD-Werten. Aufgetragen sind die LODWerte gegen die Rekombinationshäufigkeit bei einem Satz hypothetischer Kopplungsexperimente. Kurve 1: Nachweis einer Kopplung (Z > 3) ohne Rekombination; Kurve 2: Hinweis auf eine Kopplung (Z > 3), wobei die wahrscheinlichste Rekombinationshäufigkeit einen Wert von 0,23 erreicht; Kurve 3: Ausschluss einer Kopplung (Z < −2) für Rekombinationshäufigkeiten von unter 0,12; über größere Rekombinationshäufigkeiten sind keine Aussagen möglich; Kurve 4: für keine der Rekombinationshäufigkeiten lässt sich eine Aussage machen. (Nach Strachan u. Read 2005, mit freundlicher Genehmigung von Taylor & Francis)

Aussagekraft der Methode wird jedoch deutlich verbessert, wenn mehr Marker in die Untersuchung einbezogen werden. Die Auswertung über entsprechende Computerprogramme ergibt dann ein „kritisches Intervall“, innerhalb dessen das gesuchte Gen zu finden sein sollte – ein Beispiel dafür zeigt die Abb. 12.7, wobei aufgrund der Vielzahl der Marker auch ein LOD-Wert zwischen 2 und 3 eine klare Interpretation liefert. Es sei abschließend darauf hingewiesen, dass die Aussagekraft der Methode sehr davon abhängt, dass der Phänotyp eindeutig bestimmt werden kann (krank/nicht krank) und dass die Marker klar voneinander unterschieden werden können. Falsche Klassifizierungen auf der einen oder anderen Seite können leicht zu unklaren Ergebnissen führen. Wir werden später sehen (Abschnitt 12.4), wie diese Methode auch bei komplexen Erkrankungen angewendet werden kann.

Die Notwendigkeit, sich auf ein vollständiges genetisches Modell festlegen zu müssen, erweist sich bei einer Kopplungsanalyse von nur eingeschränkt mendelnden Merkmalen als ernsthaftes Problem. Modellfreie Kopplungsanalysen bieten eine Möglichkeit zur Lösung. Dabei lässt man nicht betroffene Personen außer Acht und sucht stattdessen nach chromosomalen Abschnitten, die bei betroffenen Personen übereinstimmen. Dabei ist es wichtig, zwischen Abschnitten zu unterscheiden, die aufgrund der Abstammung übereinstimmen (engl. identical by descent), und solchen, bei denen die Übereinstimmung rein zufällig ist (engl. identical by state). Verfahren, die übereinstimmende Abschnitte untersuchen, lassen sich innerhalb von Kernfamilien (Geschwisterpaar-Analysen, engl. sibpair analysis), bei ausgedehnten Familien oder bei Bevölkerungsgruppen anwenden, die sich auf eine kleine Ursprungsgruppe zurückführen lassen. Betrachtet man bei der Geschwisterpaar-Analyse einen beliebigen Chromosomenabschnitt, so ist zu erwarten, dass Geschwisterpaare mit einer Häufigkeitsverteilung von 1/4, 1/2 oder 1/4 entweder in Bezug auf keinen, einen oder beide elterlichen Haplotypen übereinstimmen. Wenn beide Geschwister an einer genetisch bedingten Krankheit leiden, besitzen sie beide den chromosomalen Bereich, der den Krankheitslocus enthält. Ist die Krankheit dominant, so haben sie mindestens einen der elterlichen Haplotypen gemeinsam, und bei einer rezessiven Erkrankung verfügen sie jeweils über beide Haplotypen. Man sucht also bei erkrankten Geschwisterpaaren mit geeigneten Markern (Mikrosatelliten, SNPs) nach solchen chromosomalen Bereichen, die bei beiden Geschwisterteilen dieselben Haplotypen häufiger enthalten, als aufgrund einer zufälligen Verteilung zu erwarten wäre. Durch die Verwendung „interner“ Kontrollen lassen sich diese Probleme umgehen, wenn nämlich aus jeder Familie drei Mitglieder (der Proband und beide Eltern: „Trios“) typisiert werden. Solche Tests machen zwar mehr Arbeit, liefern dafür aber verlässlichere Daten als die üblichen Fall-Kontroll-Studien. Das Hauptproblem besteht in der Praxis darin, dass Eltern zur Verfügung stehen müssen – was bei spät einsetzenden Krankheiten schwierig sein kann.

Die Kartierung von Erbkrankheiten in größeren Familien erfolgt durch die Verwendung von MikrosatellitenMarkern, die die Bestimmung von LOD-Werten erlaubt. Bei LOD-Werten, die größer sind als 3, wird eine Kopplung als sehr wahrscheinlich angenommen. Bei kleinen Familien lässt sich das Verfahren nicht anwenden.

12.2 Chromosomenanomalien

schiedenen, benachbarten Arbeitsrichtungen: Populationsgenetik (Kapitel 10.5), quantitativer Genetik, Epidemiologie und Biostatistik. Im Zentrum der genetischen Epidemiologie steht der Versuch, genetische und umweltbedingte Einflüsse auf die Krankheitsentstehung zu unterscheiden. Dazu wurden in den letzten Jahren viele verschiedene Verfahren herausgebildet, die alle einen großen statistischen Aufwand betreiben, um Genorte zu identifizieren, die mit komplexen Krankheiten assoziiert sind. Wir werden später einige Ergebnisse dazu vorstellen (siehe Kapitel 12.4 über komplexe Erbkrankheiten).

D17S787

D17S1868

D17S1299

D17S966

D17S1293

D17S1294

D17S805

D17S921

CRYBA1

Chromosomale Region 17q11.2 -21.32

LOD-Wert

4 2 0 -2

-4 -6 0

10

20

30 40 Lokalisation (Mb)

50

60

Abb. 12.7 Kartierung unter Verwendung mehrerer Marker. Die waagrechte Achse gibt die genetischen Abstände in Mb an, die senkrechte Achse die LOD-Werte. In der Nähe von Markern, die mit dem Krankheitsgen rekombinieren, werden die Werte stark negativ. Der höchste Wert der Kurve zeigt die wahrscheinlichste Position für das Krankheitsgen an. Fünf Marker aus der chromosomalen Region 17q11.2–21.32 (Familie 1 aus Abb. 12.4) zeigen positive LOD-Werte > 2; die Region enthält das Kandidatengen CRYBA1, in dem die kausale Mutation beobachtet wurde. (Nach Lu et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung von Molecular Vision)

12.1.5 Genetische Epidemiologie Die Suche nach statistischen Assoziationen zwischen der Krankheit und einem Markergenotyp in der allgemeinen Bevölkerung ist eine zunehmend interessanter werdende Alternative zur Kopplungskartierung in Familien. Kopplungen und Assoziation sind unterschiedliche Phänomene, wobei der wesentliche Unterschied darin besteht, dass Kopplung eine Beziehung zwischen zwei Genorten und Assoziation eine Beziehung zwischen Allelen darstellt. Für die Aussagekraft von Assoziationsstudien auf Populationsbasis ist die Auswahl der Kontrollen von ganz entscheidender Bedeutung. Es reicht oft nicht aus, Studenten oder Personal der Universität als Kontrollen zu verwenden, da sie möglicherweise nicht typisch für die Population sind, aus der die Patienten stammen. Aus derartigen Überlegungen heraus hat sich langsam ein neues Feld entwickelt – die genetische Epidemiologie. Der Begriff wurde von Neel und Schull 1954 geprägt, um das Zusammenwirken zweier Disziplinen zu beschreiben, die zur Erklärung verbreiteter Krankheiten ihre Ursache und die Verbreitung in der Bevölkerung analysieren wollen. Aufgrund ihrer „HybridNatur“ zehrt die genetische Epidemiologie von ver-

Die genetische Epidemiologie gewinnt durch die technischen Möglichkeiten der automatisierten, genomweiten Markeranalyse mithilfe von SNPs eine Genauigkeit, die es erlaubt, viele Krankheiten molekular zu charakterisieren, wenn sie in der Bevölkerung häufig genug vorkommen. Dazu werden populationsbezogene Studien und keine familienbezogenen Studien durchgeführt.

Eine besondere Form der Assoziationsstudie ist der Transmissions-Disequilibrium-Test (TDT). Dabei werden zunächst erkrankte Probanden ermittelt und mit ihren Eltern auf ausgewählte Markerallele getestet. Um herauszufinden, ob ein bestimmtes Markerallel mit der Krankheit assoziiert ist, werden diejenigen Eltern herausgesucht, die für dieses Markerallel heterozygot sind. Im Kern besteht der entscheidende Test im Vergleich der Häufigkeiten, mit denen das eine oder das andere Allel von den Eltern auf die erkrankten Kinder weitergegeben wird. Dabei kann das Markerallel selbst ein Anfälligkeitsgen sein oder mit einem benachbarten Anfälligkeitsgen gekoppelt sein.

12.2 Chromosomenanomalien In Kapitel 6 haben wir bereits viel über die Struktur und den Aufbau menschlicher Chromosomen erfahren. Insbesondere wurden dort auch die verschiedenen Färbetechniken vorgestellt, mit denen in der humanen Cytogenetik gearbeitet werden kann (Abb. 6.2 und 6.5). Ein klassisches Karyogramm (Abb. 6.2) zeigt einen haploiden menschlichen Chromosomensatz mit 22 Autosomen und ein Geschlechtschromosom (X oder Y). Menschliche Chromosomen sind in der Regel metazentrisch mit einem kurzen (p = petit) und einem langen (q = queue) Arm. Chromosomenmutationen haben wir in allgemeiner Form bereits im Kapitel 9.2 besprochen und dabei einige Konsequenzen in der Evolution der Pflanzen kennen gelernt. Im Folgenden wollen wir uns auf die humangenetischen Konsequen-

625

626

Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

zen konzentrieren. Hier standen numerische und strukturelle Veränderungen der Chromosomen wegen

ihrer leichten Analyse im Mikroskop lange Zeit im Zentrum der Untersuchungen.

Abb. 12.8 Keimzellentwicklung des Menschen. Das Schicksal der Keimzellen ist abhängig vom somatischen Umfeld. Die Keimzellen vermehren sich sowohl in den sich entwickelnden Ovarien als auch in den Hoden vor der Geburt mitotisch, aber der Zeitpunkt ihres Eintritts in die Meiose und die Dauer der Meiose ist in den beiden Geschlechtern unterschiedlich. In der weiblichen Keimzellentwicklung (oben) folgt einer kurzen Periode der mitotischen Proliferation der Eintritt aller Zellen in die meiotische Prophase. Etliche Zellen werden apoptotisch abgebaut, sodass sich das Reservoir der sich entwickelnden Oocyten deutlich vermindert. Vor der Geburt treten alle überlebenden Oocyten in eine längere Phase meiotischen Stillstands ein. Zum Zeitpunkt der Geburt sind alle ruhenden Oocyten von somatischen Zellen umgeben, die sich später zu Follikelzellen entwickeln. Nach der Pubertät werden einzelne Urfollikelzellen stimuliert, um während der gesamten reproduktiven Lebensphase das Wachstum der Oocyten zu initiieren. Typischerweise wird eine voll ausgewachsene Oocyte jeden Monat ausgestoßen; andererseits können wachsende Oocyten auch apopto-

tisch abgebaut werden (Atresie). Dieser Prozess setzt sich solange fort, bis die Kohorte der Oocyten aufgebraucht ist und die Frauen in die Menopause eintreten. In den fötalen männlichen Keimzellen (unten) folgt einer kurzen Phase mitotischer Proliferation eine ausgedehnte Phase mitotischen Stillstands. Nach der Geburt beginnen die männlichen Keimzellen (Spermatogonien) sich erneut mitotisch zu teilen, und erst nach der Pubertät teilen sich die Keimzellen auch meiotisch. Da die Spermatogonien sich weiterhin mitotisch teilen und Tochterzellen in die Meiose schicken, werden bei Männern Spermien lebenslänglich hergestellt. Während der meiotischen Teilungen bleiben die einzelnen Spermatocyten über cytoplasmatische Brücken verbunden. Diese Verbindungen gehen erst im post-meiotischen Prozess der Spermiogenese verloren. Dabei wird das Chromatin dicht verpackt, der Schwanz des Spermiums entwickelt sich, und fast das gesamte Cytoplasma wird abgestoßen und in Residualkörperchen eliminiert (hier als leere Zellen dargestellt). (Nach Hassold u. Hunt 2001, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

12.2 Chromosomenanomalien

12.2.1 Numerische Chromosomenanomalien Bei den numerischen Chromosomenanomalien kann der basale Chromosomensatz (Euploidie) vervielfacht sein, wir sprechen dann von Polyploidie (Beispiel: 3n = Triploidie). Andererseits kann auch ein einzelnes Chromosom in seiner Zahl erhöht (Hyperploidie; Beispiel: 2n + 1 = Trisomie) oder erniedrigt sein (Hypoploidie; Beispiel: 2n – 1 = Monosomie). Da hierbei das Gleichgewicht der Chromosomenzahl gestört ist, sprechen wir von Aneuploidien. Diese wichtige Klasse von Krankheiten wird durch einen Fehler in den meiotischen Teilungen verursacht, den wir bereits kennengelernt haben: durch Nondisjunction, also eine unvollständige Verteilung der Chromosomen oder Chromatiden während einer der Reifeteilungen (Abb. 12.8). Solche Verteilungsfehler führen zur Aneuploidie der Tochterzellen (Täckholm 1922). Das bedeutet, dass diese nicht mehr ein vollständiges diploides Komplement des Genoms besitzen (Euploidie), sondern dass ihnen ein Chromosom fehlt oder Tabelle 12.2 Häufigkeit der verschiedenen Chromosomenstörungen bei Neugeborenen Chromosomenstörung

Häufigkeit bei der Geburt

Trisomie 21 (Down-Syndrom)

1/700

Trisomie 18 (Edwards-Syndrom)

1/3000

Trisomie 13 (Pätau-Syndrom)

1/5000

47,XXY (Klinefelter-Syndrom)

1/1000

47,XYY (XYY-Syndrom)

1/1000

47,XXX (Triple-X-Syndrom)

1/1000

45,X0 (Turner-Syndrom)

1/2000–5000

Nach Tariverdian u. Buselmaier (2004)

eines der Chromosomen überzählig vorhanden ist. Nondisjunction kann alle Chromosomen eines Genoms betreffen, und zwar mit ungefähr gleicher Wahrscheinlichkeit. In den meisten Fällen sind Aneuploidien letal, d. h. die Organismen mit abnormalen Anzahlen von Chromosomen sind nicht lebensfähig. Nur in Ausnahmefällen werden Kinder geboren, die abweichende Chromosomenzahlen besitzen. Im Allgemeinen sind auch diese Individuen mehr oder weniger schwer behindert. Dabei sind Monosomien, d. h. Konstitutionen, bei denen eines der zwei homologen Chromosomen fehlt, mit Ausnahme des X-Chromosoms (X/0) grundsätzlich letal. Trisomien, also eine Triplikation eines der Chromosomen, können hingegen offenbar zumindest in einigen wenigen Fällen besser kompensiert werden. Kinder mit aneuploiden Chromosomenzahlen werden nur dann lebend geboren, wenn diese die Geschlechtschromosomen oder die Autosomen 13, 18 oder 21 betreffen. Dass aneuploide Anzahlen der übrigen Autosomen nicht gefunden werden, besagt nicht, dass für diese Chromosomen keine Nondisjunction vorkommt. Aber derartige Abweichungen haben so schwerwiegende Entwicklungsstörungen in der Embryonal- und Fötalentwicklung zur Folge, dass es bereits frühzeitig zum Abort kommt, oft bereits in den ersten Wochen der Schwangerschaft. Die Geburt von Kindern mit Aneuploidien (Trisomien; Tabelle 12.2) der Chromosomen 13 (PätauSyndrom, Karyotyp 47,XY,+13) und 18 (Edwards-Syndrom, Karyotyp 47,XY,+18) besagt jedoch nichts über die Lebensfähigkeit solcher Kinder. Entwicklungsstörungen, wie sie durch diese Chromosomenkonstitutionen verursacht werden, manifestieren sich bisweilen erst später, sodass ein Teil der Kinder noch lebend geboren wird, dann aber innerhalb kurzer Zeit stirbt. Lediglich Individuen mit Aneuploidien von Chromosom 21 oder der Geschlechtschromosomen sind in einem gewissen Prozentsatz der Fälle lebensfähig. Offenbar spielt hierfür die übrige genetische Konstitution eine Rolle, denn auch Individuen mit Aneuploidien des Chromosoms 21 und der Geschlechtschromo-

Tabelle 12.3 Häufigkeit von Aneuploidien während der Embryonalentwicklung Häufigkeit von Aneuploidien

Häufigste Aneuploidien

Spermien

1–2 %

verschiedene

Oocyten

~ 20 %

verschiedene

Embryonen vor der Implantation

20 %

verschiedene

spontane Aborte

35 %

45,X; +16; +21; +22

Totgeburten

4 %

+13; +18; +21

Nach Hassold u. Hunt (2002)

627

628

Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Tabelle 12.4 Entstehung von Trisomien bei Menschen Entstehung (%) Trisomie

Fallzahl

paternal MI

maternal MII

28

postzygotische Mitose

MI

MII

54

13

6

17

26

57

76

9

2

18

7

14

15

34

16

104

100

18

143

33

56

11

21

642

3

65

23

3

22

38

3

94

3

XXY

142

46

38

14

3

XXX

50

60

16

18

15

5

6

MI: Meiose I; MII: Meiose II Durch Rundungseffekte kann die Summe der Prozentangaben auch 99 bzw. 101 ergeben. Nach Hassold u. Hunt (2001)

somen sterben zu einem erheblichen Anteil bereits während der Frühentwicklung. Nur Organismen mit einem hierfür geeigneten genetischen Hintergrund scheinen zu überleben. Die tatsächliche Häufigkeit fehlerhafter Chromosomenverteilung während der Meiose ist wahrscheinlich noch höher als in Tabelle 12.2 angegeben. Tabelle 12.3 deutet an, dass eine Vielzahl spontaner Aborte (~ 35 %) auf Aneuploidien zurückzuführen ist. Die Aneuploidien entstehen offensichtlich überwiegend in der Meiose I der Eizell-Entwicklung (Tabelle 12.4).

Chromosomenanomalien sind für viele Fehlgeburten

verantwortlich; betroffene Individuen sind offensichtlich nicht lebensfähig.

Das Down-Syndrom Die wohl bekannteste Chromosomenaberration des Menschen ist eine triploide Konstitution des Chromosoms 21, auch Trisomie 21 oder Down-Syndrom (Morbus Langdon-Down) genannt (Abb. 12.9). Die früher gebräuchliche Bezeichnung Mongolismus weist auf eine oberflächliche phänotypische Ähnlichkeit der Augenform der Symptomträger mit denen von Individuen mongolider Abstammung hin, sollte aber heute sowohl zur Vermeidung der Entstehung von Diskriminationsgefühlen als auch wegen der Unrichtigkeit der Bezeichnung nicht mehr gebraucht werden. Die Ähn-

lichkeit mit Individuen der asiatischen Population beruht auf einer schmalen Falte am inneren Augenwinkel. Symptome. Patienten mit Trisomie 21 zeichnen sich generell durch eine mentale Retardation aus. Hinzu kommen physische Gebrechen wie eine verzögerte Entwicklung des Skeletts und eine generelle Verminderung des Tonus der Muskulatur. Das verursacht auch den für ein Down-Syndrom typischen Gesichtsausdruck (Abb. 12.8). Dieser entwickelt sich häufig erst bei älteren Kindern, sodass es oft schwierig ist, eine Trisomie 21 bereits nach der Geburt zu erkennen. Ein relativ zuverlässiges Indiz für das Vorliegen eines Down-Syndroms beim Neugeborenen ist der abnormale Verlauf der Falten in den Handinnenflächen. Ein großer Prozentsatz der betroffenen Individuen hat zudem Herzanomalien und Störungen des Immunsystems, die früher meist zum Tode der Kinder um das 9. Lebensjahr herum führten. Die Lebenserwartung hat sich heute durch die Verfügbarkeit von Antibiotika zur Abwehr von Infektionen trotz der allgemeinen Schwäche des Immunsystems erheblich erhöht, sodass die mittlere Lebenserwartung von Patienten mit Trisomie 21 nunmehr bei 50 Jahren liegt. Häufigkeit und Lebensalter der Mutter. Die Häufigkeit des Down-Syndroms ist mit einer von 700 Geburten (also 1,25 × 10−3) relativ hoch und unterscheidet sich zwischen verschiedenen menschlichen Populationen kaum. Allerdings korreliert die Häufigkeit der Erkrankung des Kindes stark mit dem Lebens-

12.2 Chromosomenanomalien

Abb. 12.9 Phänotyp eines Kindes mit Down-Syndrom. (Foto: J. v. d. Burgt, Nijmegen)

alter der Mutter: Die Wahrscheinlichkeit, ein Kind mit einer Trisomie 21 zu gebären, steigt ab dem 30. Lebensjahr von etwa 0,5 % (bei einem Lebensalter zwischen 20 und 30 Jahren) auf 6 % bei einem Mutterschaftsalter von 45 und mehr. Das weist darauf hin, dass die Mehrzahl der Trisomien 21 durch eine aberrante Meiose in der Mutter verursacht wird, obwohl auch väterliche Trisomien 21 nachgewiesen sind. Die Ursache dürfte darin zu suchen sein, dass der lange Zeitraum, den Oocyten in der meiotischen Prophase I verbleiben, mit einer zunehmenden Fehlerhaftigkeit der meiotischen Teilungsmechanismen einhergeht. Diese Annahme wird dadurch unterstützt, dass auch andere Aneuploidien mit steigendem Lebensalter der Mutter zunehmend häufiger auftreten (Abb. 12.10), wenn auch nicht durchweg im gleichen Ausmaß wie die Trisomie 21. Allerdings muss hier die Frage offenbleiben, ob es nicht bei zunehmendem Alter der Mutter zu einer erhöhten Häufigkeit früherer Aborte für andere Chromosomenaberrationen kommt, sodass die Zunahme der Häufigkeit chromosomaler Aberrationen dadurch teilweise verdeckt wird. Diese Einschränkung ist auch hinsichtlich der Feststellung zu machen, dass Trisomien 13 und 18 in ihrer Häufigkeit generell geringer sind als Trisomien des Chromosoms 21. Alle diese Angaben beziehen sich auf Lebendgeburten. Trisomien 13 und 18 werden offensichtlich viel häufiger pränatal abortiert als eine Trisomie 21. Das kommt auch in der geringen postnatalen Lebensfähigkeit der Kinder zum Ausdruck: bei Trisomie 18 im Mittel drei (Jungen) bis neun Monate (Mädchen), bei Trisomie 13 drei bis vier Monate. Man kann also annehmen, dass alle Chromosomen im Mittel etwa gleich häufig in der Meiose fehlverteilt werden.

Abb. 12.10 Mütterliches Alter und Trisomien. Die Abbildung zeigt Abschätzungen des mütterlichen Alters für alle Trisomien bei allen klinisch registrierten Schwangerschaften. Nicht alle individuellen Trisomien zeigen dieselbe Steigung (z. B. ist der Anstieg für die Trisomie 16 linear). Daraus kann geschlossen werden, dass die Trennungs-Mechanismen bei den jeweiligen Chromosomen unterschiedlich sind. (Nach Hassold u. Hunt 2001, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Fehlerhafte Chromosomenverteilungen während der meiotischen Teilungen sind häufig und betreffen alle Chromosomen mit etwa gleicher Wahrscheinlichkeit. Die daraus resultierenden Aneuploidien der Nachkommen sind jedoch mit Ausnahme der Trisomie des Chromosoms 21 und der Monosomie des X-Chromosoms nicht lebensfähig.

Geschlechtschromosomenaberrationen Die Häufigkeit von Anomalien der Geschlechtschromosomen gleicht etwa der von Autosomen. Das ist nach unseren Überlegungen im vorangehenden Abschnitt auch zu erwarten. Die phänotypischen Effekte von Geschlechtschromosomenaberrationen sind jedoch insgesamt weniger schwerwiegend als bei

629

630

Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

autosomalen Trisomien. Im Gegensatz zu autosomalen Aneuploidien sind auch Individuen mit Monosomie des X-Chromosoms lebensfähig (korrekte Schreibweise: 45, X0; abgekürzt: X0-Konstitution; TurnerSyndrom). Zu erklären ist diese offenbar geringere Empfindlichkeit des Organismus gegen Veränderungen der Geschlechtschromosomenzahl durch deren besondere Stellung im Genom: Das heterogametische Geschlecht besitzt ja ebenfalls nur eine Dosis des X-Chromosoms. Auch Triploidien des X-Chromosoms (Triple-X) haben weniger schwerwiegende Effekte als die von Autosomen. Das ist auf einen Mechanismus zurückzuführen, der dafür sorgt, dass die im homo- und heterogametischen Geschlecht ungleiche Anzahl von Allelen durch eine Veränderung ihrer Stoffwechselaktivität kompensiert wird (Dosiskompensation; Kapitel 6.3.3). Dieser Mechanismus wirkt nicht nur geschlechtsabhängig, sondern ist in der Lage, die Anzahl an Geschlechtschromosomen in jeder genetischen Konstitution zu zählen und für eine funktionelle Angleichung der betreffenden Genaktivitäten an einen haploiden Zustand des X-Chromosoms durch Inaktivierung überzähliger X-Chromosomen zu sorgen. Turner-Syndrom. Ein X0-Genotyp, der postnatal selten zu finden ist (eine unter 5000 Geburten: Frequenz 2 × 10−4), führt zwar zu einem weitgehend normalen weiblichen Phänotyp, hat aber das Ausbleiben sexueller Reifung und damit Sterilität zur Folge. Diese genetische Konstitution ist als Turner-Syndrom bekannt. Der Genotyp tritt mit 1 % bei einem relativ hohen Prozentsatz aller Schwangerschaften auf und ist zu 75 % auf die Befruchtung mit Spermien ohne Geschlechtschromosom zurückzuführen, ist also väterlichen Ursprungs. Der geringe Anteil von X0-Genotypen bei der Geburt ist auf den frühzeitigen spontanen Abort der meisten X0-Embryonen zurückzuführen, die einen erheblichen Anteil (nahezu 20 %) der chromosomalen Aberrationen bei spontanen Aborten darstellen. Trisomie des X-Chromosoms. Eine Trisomie des X-Chromosoms führt zu physisch weitgehend normalen, fertilen Frauen mit gelegentlich auftretender Veranlagung zu mentaler Retardation. Auch bei diesem Phänotyp dürfte der bereits erwähnte Dosiskompensationsmechanismus eine wichtige Rolle spielen. Die Häufigkeit der X-Trisomien der Kinder nimmt mit dem Lebensalter der Mutter zu. Aneuploidien des Y-Chromosoms. Diese haben insgesamt weniger schwerwiegende phänotypische Folgen als die anderer Chromosomen. Das dürfte nicht zuletzt auf die geringere Anzahl von Genen zurückzuführen sein, die im Y-Chromosom liegen (Kapitel 12.3.4). So ist die Anwesenheit eines zusätzlichen Y-Chromosoms im männlichen Geschlecht (korrekte Schreibweise: 47,XYY; Kurzform: XYY) nicht beson-

ders auffällig und bleibt oft unerkannt. Die Männer sind fertil. Es wird gelegentlich behauptet, dass Männer dieses Genotyps in erhöhtem Maße zu Kriminalität neigen. Diese Behauptung ist experimentell nicht belegbar. Hingegen scheinen XYY-Männer in Intelligenztests schlechter abzuschneiden als XY-Männer. Klinefelter-Syndrom. Hingegen hat die Anwesenheit eines Y-Chromosoms zusätzlich zu einem normalen weiblichen X-Chromosomensatz (XXY) schwerwiegende Auswirkungen, da das Y-Chromosom Träger männlicher geschlechtsbestimmender Gene ist. Demzufolge sind XXY-Individuen männlich, mit Penis, Skrotum und Testes, diese allerdings in verminderter Größe. Da die Spermatogenese anomal verläuft, sind sie steril, und sie erscheinen oft mental retardiert. Man bezeichnet diese Konstitution als Klinefelter-Syndrom. Die Häufigkeit des Klinefelter-Syndroms nimmt, ähnlich wie die des Down-Syndroms, mit dem Alter der Mutter zu; im Durchschnitt wird eine unter 1000 Geburten mit dem Klinefelter-Syndrom beobachtet (Frequenz 10−3). Fehlt das X-Chromosom völlig, so entsteht eine frühembryonal letale Nullisomie. Das gilt auch, wenn das Y-Chromosom alleiniges Geschlechtschromosom (Konstitution 0Y) ist; die 0Y-Konstitution ist letal. Man könnte erwarten, dass Frauen mit X-Trisomie oder Männer mit XYY-Konstitution in ihren Nachkommen eine erhöhte Anzahl von Geschlechtschromosomenaneuploidien aufweisen. Das ist jedoch nicht der Fall. Offenbar unterliegen aneuploide Keimzellen bevorzugt dem Zelltod während ihrer Entwicklung und werden wohl schon während prämeiotischer Mitosen eliminiert.

Häufigkeit von Aborten Bei der Berechnung von Häufigkeiten chromosomal bedingter spontaner Aborte ist ein erheblicher Unsicherheitsfaktor dadurch gegeben, dass spontane Aborte innerhalb der ersten beiden Schwangerschaftsmonate meist gar nicht als solche erkannt werden. In vielen Fällen werden solche Schwangerschaften sogar überhaupt nicht wahrgenommen. Es wird vermutet, dass die Anzahl spontaner Aborte innerhalb dieser ersten zwei Monate wenigstens ebenso hoch ist wie während der gesamten darauffolgenden Schwangerschaftsperiode. Da der Anteil spontaner Abbrüche von Schwangerschaften bei etwa 15 % liegt, muss man davon ausgehen, dass insgesamt wenigstens 30 % aller Schwangerschaften vorzeitig beendet werden, meist vor dem 5. Schwangerschaftsmonat. Es ist sogar nicht auszuschließen, dass bis zur Hälfte aller Schwangerschaften spontan abbrechen. Ein nicht unerheblicher Anteil spontaner Aborte beruht auf Chromosomenaberrationen. Nehmen wir noch eine – unbekannte – Anzahl anderer, nicht leicht sichtbarer genetischer

12.2 Chromosomenanomalien

Defekte wie Homozygotien letaler Allele oder Neumutationen hinzu, so wird offensichtlich, dass ein hoher Prozentsatz der spontanen Schwangerschaftsabbrüche genetische Ursachen hat.

Geschlechtschromosomenaberrationen

führen zu unterschiedlichen phänotypischen Defekten. Überzählige Chromosomen (XXX oder XYY) zeigen geringere Effekte, während das Fehlen des zweiten X-Chromosoms (X0) oder nur ein Y-Chromosom im Genom (0Y) zu schweren Störungen führen. Spontane Aborte sind häufig durch Chromosomenaberrationen verursacht.

12.2.2 Strukturelle Chromosomenanomalien Veränderungen in der Struktur der Chromosomen gibt es in vielfältiger Weise. Man bezeichnet sie je nach ihrer Art als: ï Deletionen, ï Duplikationen, ï Inversionen oder ï Translokationen. Grundsätzlich können diese Strukturveränderungen an jeder Stelle im Chromosom auftreten und ein unterschiedliches Ausmaß erreichen. Wir sprechen aber nur dann von Chromosomenanomalien, wenn sie sich mit cytogenetischen Methoden, d. h. mit den verschiedenen Methoden der Chromosomenanalytik im Mikroskop nachweisen lassen. Können die Mutationen nicht mehr mit dem Mikroskop erkannt werden, werden sie eher dem Bereich der Molekulargenetik zugeordnet. Obwohl die Grenze natürlich im Einzelfall fließend sein mag, hat sie dennoch aufgrund des unterschiedlichen methodischen Repertoires weiterhin Bestand. Bei Deletionen (Verlust eines Teils des Chromosoms; Abb. 12.11a) können wir unterscheiden zwischen terminalen Deletionen, bei denen Endfragmente entstehen, und interstitiellen Deletionen, bei denen das Fragment aus einem mittleren Chromosomenbereich stammt. Geht ein Telomerfragment verloren, so wird das Chromosom instabil und in den meisten Fällen abgebaut. Wenn der Bruchbereich bei interstitiellen Deletionen auch das Centromer einschließt, entsteht ein zentrisches und ein azentrisches Chromosomenfragment. Das azentrische Fragment geht im Verlauf der Mitose oder Meiose jedoch verloren, da es keine Ansatzstelle für die Spindelfaser besitzt. Dieser Verlust von genetischem Material ist die Ursache, dass größere Deletionen häufig bereits im heterozygoten Zustand letal sind.

Translokationen (Abb. 12.11b) sind chromosomale Strukturveränderungen, in deren Verlauf entweder ein Chromosomenfragment in eine neue Lage im gleichen Chromosom eingebaut wird oder auf ein anderes Chromosom übertragen wird. Es können auch zwei Fragmente zwischen Chromosomen wechselseitig ausgetauscht werden. Dabei müssen zwei verschiedene Chromosomenstücke abbrechen, die dann wechselseitig ausgetauscht werden (reziproke Translokation); von einer nicht-reziproken Translokation spricht man, wenn ein Chromosomenfragment direkt auf ein anderes Chromosom übertragen wird. Bei stabilen reziproken Translokationen besitzt nach dem Austausch der Fragmente jedes der beiden beteiligten Chromosomen ein Centromer; weitere mitotische Zellteilungen können ungestört ablaufen. Es wurde weder genetisches Material hinzugefügt noch entfernt, „nur“ die Anordnung der Kopplungsgruppen wurde verändert. Allerdings kommen dadurch in vielen Fällen Gene in eine andere chromosomale Umgebung, wodurch sich ihr Expressionsmuster verändert. Wir werden sehen, dass damit oft Krankheiten verbunden sind (besonders Krebserkrankungen; Kapitel 12.4.1). Wird jedoch auch das Centromer durch die Translokation erfasst, entsteht ein azentrisches und ein dizentrisches Chromosom. Wie bereits oben erwähnt, wird das azentrische Chromosom in der Mitose bzw. Meiose verloren gehen. In dem dizentrischen Chromosom wird entweder eines der beiden Centromere inaktiviert, oder es wird durch die zwei Ansatzpunkte für die Spindelfasern in der Mitose zerrissen und damit zerstört, da für die Stabilität der gebrochenen Chromosomen funktionsfähige Telomerstrukturen notwendig wären. Ein Spezialfall ist die Robertson’sche Translokation (auch als „zentrische Fusion“ bekannt; Abb. 12.11c); davon spricht man, wenn bei zwei akrozentrischen Chromosomen (die Chromosomen 13‒15, 21 und 22) die kurzen Arme in der Nähe des Centromers abbrechen und die beiden langen Chromosomenarme in der Gegend des Centromers verschmelzen. Dabei entsteht ein Translokationschromosom, das die beiden langen Arme der beteiligten Chromosomen enthält. Das reziproke Translokationsprodukt, bestehend aus den beiden kurzen Armen, geht verloren. Die Träger solcher Translokationen haben nur 45 Chromosomen, wobei ihnen das genetische Material der kurzen Arme zweier akrozentrischer Chromosomen fehlt, was aber in der Regel ohne besondere Auswirkungen bleibt. Allerdings treten in der ersten meiotischen Teilung Probleme bei der Paarung mit den homologen Chromosomen und vor allem bei der anschließenden Verteilung auf die Tochterzellen auf, die zur Weitergabe der Translokation sowohl in balancierter als auch in nicht balancierter Form führen kann (wobei balanciert heißt, dass kein

631

632

Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Abb. 12.11 a–e Strukturelle Chromosomenaberrationen. a Schema zur Entstehung und den Folgen von Deletionen: (1) Terminale Deletion mit Verlust des Fragments gh; (2) interstitielle Deletion mit Verlust des Fragments bc; (3) interstitielle Deletion mit Bildung eines Ringchromosoms und Verlust der Fragmente abc und gh. b Schema zur Entstehung einer reziproken Translokation: Die Fragmente nopqr und gh werden ausgetauscht. c

Schema zur Entstehung einer zentrischen Fusion: Die genaue Bruch- und Vereinigungsstelle im Centromerbereich ist nicht bekannt; die kleinen Fragmente gehen verloren. d Schema zur Entstehung einer Duplikation: Das Fragment bc wird verdoppelt. e Schema zur Entstehung einer Inversion: Das Fragment cd verändert seine Orientierung im Chromosom. (Nach Tariverdian u. Buselmaier 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Verlust oder Zugewinn von Chromosomensegmenten stattfindet). Unter einer Duplikation (Abb. 12.11d) versteht man ein zweimaliges Auftreten desselben Chromosomenfragments im haploiden Chromosomensatz. Als Ursache wird im Allgemeinen ein illegitimes Crossingover angenommen. Dabei kommt es zu einem Kontakt zwischen zwei homologen Chromosomen an nicht homologen Stellen, und ein Chromatidenstück des einen Chromosoms wird mit dem des anderen Chromosoms vereinigt. Duplikationen spielen in der Evolution eine wichtige Rolle (vgl. dazu die Evolution der Hox-Gencluster von Drosophila zu den Säugern, Abb. 11.29). Bei einer Inversion (Abb. 12.11e) liegt eine Drehung eines Chromosomenstücks um 180° vor. Hierzu sind zwei Bruchereignisse innerhalb des Chromosoms

notwendig. Das herausgebrochene Stück dreht sich und wird umgekehrt in die Bruchstelle wieder eingebaut. Oftmals sind an den Bruch- und Wiedervereinigungsreaktionen ähnliche Sequenzelemente beteiligt (als Beispiel siehe die schwere Form der Hämophilie A; Abb. 12.28 und 12.29).

12.3 Monogene Erbkrankheiten Mutagenese-Studien in vielen Organismen haben gezeigt, dass die Mehrzahl (über 90 %) der Mutationen rezessiv gegenüber dem Wildtyp ist. Entsprechend sind auch die meisten erblichen Krankheiten des Menschen autosomal-rezessiv. Dominanz und Rezessivität sind keine Eigenschaften von Genen per se (wir hatten das Problem auch schon allgemein im Kapitel 10.3 ange-

12.3 Monogene Erbkrankheiten

sprochen). Ein dominantes Allel bestimmt bei Heterozygoten den Phänotyp. Es gibt unterschiedliche Dominanzgrade; Semidominanz bezeichnet einen intermediären Phänotyp. Dominante Mutationen betreffen meist Struktur- oder regulatorische Proteine. Für die verschiedenen Auswirkungen dominanter Mutationen beschreiben die Begriffe amorph, hypomorph und hypermorph qualitative Veränderungen gegenüber dem Wildtyp; antimorph bezeichnet antagonistische Wechselwirkungen mit dem Wildtyp (dominant-negativ) und neomorph einen neuen Phänotyp (toxisches bzw. neues Protein oder die ektopische Expression eines Gens). Die Begriffe amorph und hypomorph entsprechen der molekularen Klassifikation von Haploinsuffizienz (Verlust einer Genfunktion: loss of function); hypermorph beruht auf einer Erhöhung der Gendosis bzw. der konstitutiven Proteinaktivität. Rezessivität bedeutet, dass nur homozygote Allelträger das Krankheitsmerkmal klinisch ausprägen, während Heterozygote sich nicht von Gesunden mit zwei Wildtyp-Allelen unterscheiden. Rezessive Mutationen betreffen meist Gene, die für Enzyme codieren, und defekte Gene führen meist zum Ausfall des Genproduktes; oft reicht aber ein Wildtyp-Allel zur Aufrechterhaltung der Funktion aus. Wenn wir nun im Folgenden jeweils einzelne Krankheiten beispielhaft ansprechen, so wird dazu immer die OMIM-Nummer angegeben. Dies ist eine ständig aktualisierte Datenbank menschlicher Erbkrankheiten; für aktuelle Entwicklungen sei der interessierte Leser daher dorthin verwiesen (Online Mendelian Inheritance in Man; http://www.ncbi.nih.gov/ Omim).

Abb. 12.12 Autosomal-rezessiver Familienstammbaum. Erbkrankheiten werden nur gelegentlich sichtbar und heterozygote Träger sind phänotypisch nicht ohne Weiteres erkennbar. In vielen Fällen gestatten jedoch bereits heute molekulare Analysen der DNA die Erkennung einer Heterozygotie. Das Schema zeigt auch die erhöhte Gefährdung durch Homozygotie von Kindern aus Verwandtenehen. (Symbole wie in Abb. 12.3)

12.3.1 Autosomal-rezessive Erkrankungen Die meisten rezessiven Allele haben Häufigkeiten zwischen 1:100 und 1:1000; entsprechend kommen die Erkrankungen mit Häufigkeiten zwischen 1:10.000 und 1:1.000.000 vor; allerdings ist die Häufigkeit bei Verwandtenehen größer. Im Allgemeinen ist aber der Erbgang oft schwierig zu ermitteln, denn rezessive Erkrankungen gelangen innerhalb einer Familie nur gelegentlich zur Ausprägung (Abb. 12.12). Der Kranke stammt nämlich von gesunden (aber heterozygoten) Eltern ab; beide Geschlechter sind von der Krankheit in gleicher Weise betroffen. Oft ist es daher nicht ohne Weiteres möglich, den erblichen Charakter einer Krankheit nachzuweisen, vor allem in Fällen, in denen die Frequenz des betreffenden Allels niedrig ist. Die Aufklärung der molekularen Ursachen der Sichelzellenanämie (OMIM 603903) gehört sicherlich zu den Meilensteinen der Genetik und soll daher hier kurz skizziert werden (manche Aspekte wurden bereits in früheren Kapiteln besprochen, z.B. 10.3.5 und

Abb. 12.13 Sichelzellenanämie. Es ist das periphere Blut eines Patienten gezeigt, der an Sichelzellenanämie leidet. Die Pfeile deuten auf sichelförmige Erythrocyten hin. (Nach Tariverdian u. Buselmaier 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

10.5.3). Die erste Beschreibung findet sich bei Herrick, der 1910 den Begriff der sichelförmigen roten Blutkörperchen prägte, die er bei einem Patienten beobachtet hatte (Abb. 12.13). E. A. Beet und J. V. Neel beschrieben 1949 unabhängig voneinander, dass es sich bei der Sichelzellenanämie um eine erbliche Krankheit mit rezessivem Erbgang handelt. Linus Pauling und seine Mitarbeiter legten 1949 die Grundlage für die folgende Periode der biochemischen Analyse des Hämoglobins. Sie fanden, dass die Sichelzellenanämie an das Auftreten eines elektrophoretisch anomalen Hämoglobins (HbS) im Blut gebunden ist, das in Homozygoten anstelle des Hämoglobins A (HbA) gefunden wird und in Heterozygoten neben dem HbA in gleicher Menge

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

wie dieses gebildet wird. Schließlich konnte V. M. Ingram 1956 zeigen, dass der Unterschied zwischen HbA und HbS in der Veränderung einer einzigen Aminosäure liegt: Anstelle der Glutaminsäure an der Position 6 der β-Kette des HbA ist bei HbS ein Valin vorhanden. Die zugrunde liegende Mutation im β-GlobinGen (GAG→GTG) weist der Sichelzellenanämie einen definierten Platz im Bereich der Thalassämien zu, die durch Mutationen in den verschiedenen Globin-Genen (Kapitel 7.2.1) verursacht werden, aber hier aus Platzgründen nicht im Detail besprochen werden können. Wegen der zentralen Bedeutung der Erythrocyten für die Sauerstoffversorgung ist es jedoch nicht erstaunlich, dass diese Mutationen eine Vielzahl von Organsystemen betreffen (pleiotroper Effekt; Kapitel 10.3.5). Sichelzellenanämie ist besonders häufig in MalariaGebieten. Die Ursache dafür ist, dass Heterozygte in Malaria-Gebieten einen selektiven Vorteil hatten, da sich der Malaria-Erreger in den sichelzellförmigen Erythrocyten schlecht vermehren konnte (HeterosisEffekt; Kapitel 10.5.3; Abb. 10.39). Zu den am längsten bekannten Beispielen für einen autosomal-rezessiven erblichen Stoffwechseldefekt gehört auch der Oculocutane Albinismus (OMIM 203100). Diese häufigste Form von Albinismus (Häufigkeit ca. 3 × 10−5) wird durch Mutationen im Tyrosinase-Gen (Gensymbol: TYR; Chromosom 11q14–21) verursacht und führt dazu, dass Epidermiszellen keine funktionelle Form des Enzyms Tyrosinase synthetisieren und damit auch den Farbstoff Melanin nicht bilden können (Abb. 12.14). Der Enzymdefekt führt zu einer blassen Haut, nicht pigmentiertem, fast weißem Haar und schwach blauen oder rötlichen Augen, da durch die fehlenden Pigmente die Blutkapillaren in der Iris durchscheinen. Hieraus resultieren Sehstörungen und eine hohe Empfindlichkeit für Sonnenbrand sowie, damit verbunden, ein hohes Risiko für Hautkrebs (Kapitel 12.4.1). Albinismus ist ein Merkmal, bei dem man auch somatische Mutationen nachweisen konnte. Kommt es während der Embryonalentwicklung bei Heterozygoten zu einer Neumutation des zweiten (Wildtyp-) Allels, so können an geeigneten Stellen des Körpers Albinismusflecken sichtbar werden, die durch Gruppen von homozygot mutanten Zellen verursacht werden, die keine Tyrosinase synthetisieren können (Mosaike). Albinismus ist auch bei Tieren häufig zu finden. Auch das Tay-Sachs-Syndrom (GM2-Gangliosidose, OMIM 272800) beruht auf einem nicht funktionellen Enzym, Hexosaminidase A, das im Zentralnervensystem für den Abbau des Gangliosids GM2 erforderlich ist (Abb. 12.15). Das Enzym ist ein Hexamer aus zwei verschiedenen Prote-

Alkaptonurie

Abb. 12.14 Stoffwechsel des Phenylalanins. Im normalen Stoffwechsel wird Phenylalanin durch Hydroxylierung in Tyrosin umgewandelt. Tyrosin wird entweder über mehrere Schritte zu CO2 und Wasser abgebaut oder in andere organische Verbindungen umgewandelt. Durch Ausfall von an diesen Stoffwechselschritten beteiligten Enzymen kann es zu Blockierungen des betreffenden Stoffwechselweges kommen. Solche Enzymdefekte führen entweder zu Erbkrankheiten wie PKU, Tyrosinose oder Alkaptonurie oder, im Falle der Blockierung der Umsetzung von Tyrosin in Melanin, zum Ausfall von Pigmenten, die Albinismus zur Folge haben

inen: den α- und β-Ketten. Die α-Kette wird auf Chromosom 15 codiert (15q22‒q25; Gensymbol: HEXA), die β-Kette auf Chromosom 5 (5q13; Gensymbol: HEXB). Das Fehlen des Enzyms führt zur Anreicherung des Gangliosids GM2 im Zentralnervensystem und führt zu Blindheit und geistiger und motorischer

12.3 Monogene Erbkrankheiten

Abb. 12.15 Stoffwechsel der Sphingoglykolipide mit den beteiligten Enzymen. Die roten Punkte geben Enzymschritte an, die bei Ausfall des Enzyms durch Mutation bekannte Erbkrankheiten verursachen. Die roten Ziffern identifizieren die betreffende Krankheit wie folgt: 1, GM1-Gangliosidose; 2, TaySachs-Syndrom (= GM2-Gangliosidose); 3, Gaucher-Krankheit (adulte Form); 4, Faber`sche Lipogranulomatose; 5, NiemannPick-Krankheit (Sphingomyelin-Lipidose); 6, Krabbe-Syndrom; 7, Sandhoff-Syndrom; 8, Fabry-Syndrom; 9, Metachromatische Leukodystrophie. Die meisten dieser Krankheiten des Sphingoglykolipid-Abbaus führen zu einem frühen Tod der betroffenen Individuen (innerhalb der ersten 10 Lebensjahre) und zu

geistiger Retardation, wie es bei ihrer zellulären Lokalisation als Membranbestandteile von Nervenzellen nicht überrascht. Die oben genannten Enzymdefekte führen zu Störungen im Abbau der Sphingoglykolipide und als Folge davon zur Akkumulation von Intermediärprodukten des Abbauweges. Die Krankheiten 2, 3 und 5 sind bekannte Beispiele für Erbkrankheiten, die stark gehäuft in menschlichen Populationen (aschkenasische Juden in Osteuropa) auftreten, die lange Zeit in Isolation lebten und in denen wahrscheinlich genetische Drift zu einer Anreicherung dieser Allele geführt hat, wenn es sich nicht um Allele handelt, die Selektionsvorteile bieten (Kapitel 10.5.2)

Degeneration der Patienten. Diese Entwicklung beginnt bereits wenige Monate nach der Geburt und führt innerhalb der ersten 5 Lebensjahre zum Tod. Eine Therapie ist bis heute nicht möglich.

relativ effektive Therapie entwickelt werden. Das Enzym wird auf Chromosom 12 (Genort: 12q22‒ q24.1; Gensymbol: PAH) codiert. Es ist im Katabolismus der Aminosäure Phenylalanin erforderlich, um eine Umwandlung von Phenylalanin in Tyrosin zu katalysieren (Abb. 12.14). Unterbleibt diese Umsetzung, wird ein Nebenstoffwechselweg eingeschlagen, der über Phenylpyruvat zu einer Reihe von Stoffwechselprodukten führt, die nicht effektiv ausgeschieden werden, sondern sich im Blut anreichern. Auf diesem Wege wirken sie hemmend auf die postnatale Entwicklung des kindlichen Gehirns (Abb. 12.16), sodass eine irreversible mentale Retardation

Phenylketonurie (OMIM 261600). Eine ganz ähnliche, aber für die Betroffenen günstigere Aussicht auf eine erfolgreiche Therapie bei rechtzeitiger Diagnose besteht für eine weitere häufige, autosomal-rezessive Erbkrankheit, die Phenylketonurie (PKU). Die Ursache dieser Krankheit – Fehlen des Enzyms Phenylalanin-Hydroxylase – ist bereits lange bekannt. Aufgrund der Kenntnis der Enzymfunktion konnte eine

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Abb. 12.16 Phenylketonurie(PKU)-Patient. (Aus Tariverdian u. Buselmaier 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

auftritt, die schließlich zum frühen Tod des Individuums führt. Die Kenntnis der Stoffwechselfunktion des betroffenen Enzyms hat es ermöglicht, eine Therapie zu entwickeln, die zu einer relativ normalen Entwicklung der homozygoten PKU-Patienten führt, wenn sie rechtzeitig, d. h. von der Geburt an bis mindestens ins 6. Lebensjahr, durchgeführt wird. Sie besteht aus einer Phenylalanin-armen Diät, die so abgestimmt wird, dass die Aminosäure, die ja für den Organismus als Bestandteil vieler Proteine unentbehrlich ist, in gerade ausreichender Menge vorhanden ist. Auf diesem Wege können die schädlichen hohen Konzentrationen der Abbauprodukte vermieden werden, sodass es zu einer normalen Entwicklung des Gehirns kommt. Diese Therapie setzt eine frühzeitige Erkennung der Homozygoten voraus, da eine Behandlung nach dem Auftreten deutlicher Symptome zu spät wäre. Hierzu ist ein einfacher Test (Guthrie-Test) entwickelt worden, der heute routinemäßig bei Neugeborenen zur Früherkennung eingesetzt wird. Der Test beruht auf der Verwendung von Bakterienstämmen, die kein eigenes Phenylalanin synthetisieren können. Phenylalanin muss im Kulturmedium enthalten sein, damit die Bakterien wachsen können. Man kann also eine Blutprobe mit Kulturmedium versetzen und dann testen, ob die Bakterien auf diesem Medium wachsen können oder nicht. Der Test ist so aufgebaut, dass die Bakterienstämme mit der Phenylalaninmenge, die im normalen Blut

vorhanden ist, nicht wachsen, da der Titer zu niedrig ist. Bei homozygoten PKU-Individuen hingegen reicht die erhöhte Konzentration an Phenylalanin im Blut aus, um ein Wachstum der Bakterien zu ermöglichen. Die Diagnose ist von erheblicher Bedeutung, da die Häufigkeit der Krankheit mit einem Homozygoten in 10.000 Individuen (also 10–4) relativ hoch ist und eine Therapie, ganz abgesehen von den humanitären Gesichtspunkten, erhebliche Kosten für die Patientenversorgung vermeiden hilft. PKU ist auch ein Beispiel für Pleiotropie. In diesem Fall wird die Fehlfunktion durch die Anreicherung von Stoffwechselprodukten verursacht, die normalerweise nicht oder nur in sehr geringen Mengen auftreten. Diese wirken dann auf unterschiedliche Merkmale ein. Die Mukoviszidose, auch als Zystische Fibrose bezeichnet (OMIM 219700), ist die häufigste autosomal-rezessive Erbkrankheit. Sie tritt fast nur unter der kaukasischen Bevölkerung auf, also wesentlich seltener unter Farbigen oder Asiaten. Bis in die 1950er- und frühen 1960er-Jahre starben die meisten Erkrankten bereits im Säuglings- oder Kindesalter. Durch eine erhebliche Verbesserung der Therapie liegt die mittlere Lebenserwartung heute geborener Patienten bei über 40 Jahren. Die Wahrscheinlichkeit, an Mukoviszidose zu erkranken, beträgt in Europa und den USA etwa 1:2500. In Deutschland leben 6000 bis 8000 an Mukoviszidose Erkrankte; die Häufigkeit der Heterozygoten beträgt etwa 4 %. Die Krankheit wird meist aufgrund häufig wiederkehrender Erkältungskrankheiten im Kindesalter diagnostiziert. Damit ist die Zystische Fibrose bei der weißen Bevölkerung die häufigste autosomal-rezessive Erbkrankheit. Ursache der Erkrankung ist eine Mutation in einem Gen, das für ein Membranprotein codiert (engl. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, Gensymbol: CFTR; Chromosom 7q31.2). Bei etwa 70 % der Patienten fehlt in diesem Protein an der Position 508 die Aminosäure Phenylalanin (ΔF508; Abb. 12.17a). Ursache dieser hohen Allelfrequenz ist ein Gründereffekt; es wird vermutet, dass die ΔF508-Mutation zur Zeit des Neolithikums in der Umgebung Dänemarks ihren Ursprung gefunden hat (Abb. 12.17b). Das CFTR-Protein reguliert den Chloridtransport durch die Zellmembran; bei dem mutierten Protein ist dieser Transport gestört. Die Mutation beeinflusst damit die Sekretion in der Lunge, der Bauchspeicheldrüse, der Leber, dem Dünndarm, der Haut sowie den Geschlechtsorganen. In der Lunge entsteht aufgrund des gestörten Chloridaustausches ein zähflüssiger Schleim, der die Bronchien, die Bronchiolen und Alveolen verstopft. Ihre mit Flimmerhärchen ausgestattete Wand ist normalerweise mit einer dünnen Schleimschicht überzogen, auf der eingeatmete Partikel haften bleiben und ausgehustet werden können. Der zähe, dicke Schleim

12.3 Monogene Erbkrankheiten

Abb. 12.17 a, b Das CFTR-Gen. a Das CFTRGen und sein Protein. Das Gen, dessen Mutation für Mukoviszidose verantwortlich ist, wurde 1989 durch Positionsklonierung auf dem Chromosom 7q31.2 entdeckt. Der genomische Bereich umfasst 250 kb und enthält 27 Exons. Es codiert für ein Transmembranprotein mit 1480 Aminosäuren, das als CFTR bezeichnet wird (engl. cystic fibrosis transmembrane conductor). Das Protein besteht aus zwei hydrophoben Bereichen (TM) mit jeweils sechs transmembranen α-Helices, außerdem enthält es zwei Nukleotid-bindende Domänen (NBD1 und 2) zur Bindung von ATP und eine regulatorische cytoplasmatische Domäne (R), die zahlreiche geladene Aminosäurereste und die Mehrzahl der potenziellen Phosphorylierungsstellen enthält. b Die regionale Verteilung der ΔF508-Mutation in Europa weist auf einen Ursprung in Nordeuropa hin (vermutlich Dänemark). Die Häufigkeit nimmt nach Süden deutlich ab; erstaunlich ist die große Häufigkeit in der Ukraine. (a: nach Romey 2006, mit freundlicher Genehmigung von Editions John Libbey Eurotext; b nach Estivill et al. 1997, mit freundlicher Genehmigung durch Wiley)

der erkrankten Person führt dagegen zur Verengung der Luftwege und behindert das Atmen. Zugleich entwickeln sich Infektionen, da Bakterien ebenfalls nicht entfernt werden und in den Atemwegen verbleiben. Solche immer wiederkehrenden Infektionen schädigen das Lungengewebe. Die Zerstörung und Verengung der Bronchien schreitet mit der Zeit so weit fort, bis schließlich die Lunge versagt. Infolge der nicht normal funktionierenden Schweißdrüsen enthält der Schweiß erheblich mehr Kochsalz (NaCl) als der von gesunden Personen. Das hauptsächlich aus Wasser bestehende Sekret wird bei gesunden Menschen am Grund der Drüsen gebildet und fließt dann durch einen Gang zur Hautoberfläche. Anfangs ist es reich an Natrium- und Chlorid-Ionen, aber während seiner Passage werden diese wieder resorbiert, sodass die ausgeschwitzte Flüssigkeit nur noch schwach salzhaltig ist. Bei Patienten mit Mukoviszidose hingegen nimmt das Epithel keine Chlorid-

Ionen (und damit auch schlechter Natrium-Ionen) auf, sodass der Schweiß ungewöhnlich salzig bleibt. Auf dieser veränderten Schweißzusammensetzung beruht auch der „Schweißtest“, der bei Mukoviszidose-Verdacht durchgeführt wird. Bei rund 90 % der Erkrankten verhindert ein durch zähen Schleim ausgelöster Verschluss der entsprechenden Kanäle den Abfluss der in der Bauchspeicheldrüse gebildeten Verdauungsenzyme. Durch fibrös verändertes Gewebe kann weiterhin die Produktion des Hormons Insulin gestört werden, sodass ein Diabetes die Folge sein kann. Zurzeit gibt es noch keine kausale Therapie. Bis jetzt lassen sich nur bestimmte Symptome verbessern, mildern oder sogar zum Verschwinden bringen. Die Problematik des Verdauungsapparats ist mittlerweile gut behandelbar. Gegen das Versagen der Bauchspeicheldrüse werden den Patienten Kapseln mit entsprechenden Verdauungsenzymen eingegeben. Dazu wer-

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

den eine kalorien- und vitaminreiche Nahrung und fettlösliche Vitamine empfohlen. In über 90 % ist der Tod oder die Invalidität auf Manifestationen in der Lunge zurückzuführen. Im Zentrum entsprechender Behandlungen stehen die Antibiotikatherapie sowie physiotherapeutische Übungen. Ein neuerer Therapieansatz besteht im Inhalieren des Enzyms DNase. Dieses Enzym trägt zur Verflüssigung des Schleims dadurch bei, dass es die langen, verklebenden Stränge der DNA zerlegt, die aus abgestorbenen Zellen frei werden. An den Möglichkeiten einer somatischen Gentherapie (Kapitel 12.5.4) wird seit Jahren gearbeitet. Dabei soll ein gesundes Gen in die betroffenen Zellen (vor allem der Lunge) eingeschleust werden und zur Synthese der Wildtyp-Forn von CFTR führen. Eine Möglichkeit, das Gen in die Zellen einzubringen, besteht darin, Adenoviren als Träger zu verwenden. Diese Viren dringen in die Zellen ein und infizieren die Zelle. Bei dieser Methode haben sich jedoch viele Probleme ergeben. Andere Therapieansätze mit nicht viralen Vektoren befinden sich in der Erprobung. Ausgedehnte populationsgenetische Untersuchungen haben nicht nur große Unterschiede in der regionalen Häufung der Zystischen Fibrose gezeigt, sondern auch eine hohe Zahl heterozygoter Träger in den betroffenen Populationen, die bei etwa 1:20 bis 1:25 liegt. Die Häufigkeit der Erkrankten beträgt in Mitteleuropa etwa 1:2000 bis 1:2500. Obwohl die Krankheit für die betroffenen Kinder in früheren Jahrhunderten tödlich war, hat sich die Zahl der Heterozygoten auf hohem Niveau gehalten. Daraus können wir schließen, dass die Heterozygoten gegenüber beiden homozygoten Formen einen deutlichen Selektionsvorteil hatten (Heterosis-Effekt, S. 460). Gabriel und seine Mitarbeiter berichteten 1994, dass im Mausmodell Heterozygote im Vergleich mit Wildtypen einen deutlichen Resistenzvorteil gegenüber dem Choleratoxin haben, was dieses Phänomen erklären kann. Die hohe Zahl von Erkrankungen und die deutlich verbesserten Therapiemöglichkeiten haben in den letzten Jahren eine alte Diskussion neu entfacht: Soll man Neugeborene auch auf Zystische Fibrose testen? Erfolgreiche Screening-Programme in einigen Staaten in den USA sprechen ebenso dafür wie auch neue Technologien, die ein ausgedehntes Testprogramm für verschiedene genetische Bedingungen erlauben (Wagener et al. 2003). Neuere Studien deuten an, dass durch Routine-Untersuchungen von Neugeborenen vor allem die Kindersterblichkeit deutlich gesenkt werden kann (Grosse et al. 2006). Ein wichtiges Gegenargument, nämlich die fehlende Therapiemög-

lichkeit, ist durch den medizinischen Fortschritt weitgehend entfallen – und für die Betroffenen eröffneten sich durch eine frühere Diagnose eine bessere Therapie, wie wir das bei den PKU-Patienten bereits gesehen haben.

Die meisten Erbkrankheiten sind autosomal-rezessiv und oft schwierig zu diagnostizieren. Der Anteil an Trägern kann auch bei geringer Häufigkeit von Homozygoten hoch sein. Die Gefahr der Homozygotie ist bei Verwandtenehen besonders groß. In Mitteleuropa ist die Zystische Fibrose (Mukoviszidose) die häufigste autosomal-rezessive Erkrankung.

12.3.2 Autosomal-dominante Erkrankungen Seltener als mit rezessiven Erkrankungen haben wir es mit dominanten Erbkrankheiten zu tun. Dabei tritt die Erkrankung schon bei Heterozygoten auf. Es genügt also eine einfache Dosis des veränderten Allels, damit eine Krankheit ausbricht. Ein Beispiel für einen autosomal-dominanten Erbgang gibt Abb. 12.5. Von autosomal-dominanter Erkrankung spricht man, wenn das betroffene Gen auf einem Autosom und nicht auf einem Geschlechtschromosom liegt. Im klassischen Sinne spricht man von Dominanz nur, wenn der Phänotyp eines Heterozygoten dem Phänotyp des homozygoten Trägers entspricht. In der klinischen Praxis sind aber Homozygote öfters stärker erkrankt (Semidominanz). Die Übertragung eines autosomal-dominanten Merkmals erfolgt in der Regel von einem erkrankten Elternteil auf die Hälfte der Kinder, wobei das Geschlecht keinerlei Rolle spielt. Aber auch Neumutationen treten sofort in Erscheinung, da schon die Veränderung eines Allels das entsprechende Krankheitsbild hervorruft. Verringerte Penetranz und Expressivität (Kapitel 10.3.3) erschweren manchmal eine klare genetische Analyse in einer Familie. Viele autosomal-dominante Erkrankungen haben Häufigkeiten in der Größenordnung von 1:10.000. Das Marfan-Syndrom (OMIM 154700; Abb. 12.18) bezeichnet eine Störung im Aufbau des Bindegewebes, die sich auf das Skelettsystem, die Augen und auf das kardio-vaskuläre System auswirkt. Charakteristische Symptome sind lange und schmale Extremitäten (Spinnenfinger), überstreckbare Gelenke und Herzfehler, die meist zum Tode führen. Die Krankheit hat eine Häufigkeit von etwa 1:5000; ungefähr ein Viertel aller Fälle wird durch Neumutationen hervorgerufen. Obwohl es eine Reihe klarer Merkmale für diese Krankheit gibt, ist eine Diagnose nicht immer ganz

12.3 Monogene Erbkrankheiten

Abb. 12.18 a, b Marfan-Syndrom. a Phänotyp eines Patienten. b Spinnenfingrigkeit bei Marfan-Syndrom. (Nach Tariverdian u. Buselmaier 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Abb. 12.19 a, b Fibrillin-1 und wichtige Mutationen seines Gens. a Das Fibrillin-1-Protein ist schematisch mit seinen verschiedenen Modulen dargestellt. Besonders auffällig sind die vielen Calcium-bindenden Motive, die dem epidermalen Wachstumsfaktor ähnlich sind (cbEGF). b Die häufigsten MissenseMutationen, die das Calcium-bindende, EGF-ähnliche Motiv (cbEGF) betreffen, führen zu Aminosäureaustauschen bei einem der 6 konservierten Cystein-Reste oder der Consensussequenz der Calcium-Bindungsstelle. (a nach Ramirez u. Pereira 1999, mit freundlicher Genehmigung durch Elsevier; b nach Robinson et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung durch Wiley)

einfach, da sie auch in verschiedenen Schweregraden auftreten kann. Das verantwortliche Gen Fibrillin1 (FBN1, Chromosom 15q21; OMIM 134797) umfasst etwa 235 kb genomischer DNA und besteht aus 65 Exons (Abb. 12.19a). Die mRNA ist knapp 10 kb lang und codiert für ein Glykoprotein (MW: ~ 320 kDa), das aus vielen

Domänen besteht. Diese lassen sich in drei Klassen Cystein-reicher Wiederholungsmotive unterteilen; die wichtigste weist starke Homologien zum epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) auf. Die Fibrillinproteine (ein weiteres Fibrillin-Gen, FBN2, ist auf dem Chromosom 5 lokalisiert; Mutationen im FBN2-Gen führen zu ähnlichen, aber nicht identischen Symptomen) sind die

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Hauptkomponenten der extrazellulären Mikrofibrillen (Durchmesser: etwa 10–12 nm), die in vielen Geweben vorkommen. Die Mikrofibrillen treten entweder alleine auf (wie in den Zonulafasern des Ciliarkörpers im Auge) oder zusammen mit Elastin in elastischen Fasern (z. B. der Aorta). Bisher war man davon ausgegangen, dass die Wirkung der Mutationen im Wesentlichen auf einem dominant-negativen Effekt beruht, wobei die veränderten Fibrillin-Monomere den geordneten Aufbau der reifen Mikrofibrillen stören. Als ein weiterer Aspekt wird allerdings auch ein erhöhter proteolytischer Abbau des veränderten Fibrillinproteins diskutiert. Die funktionelle Analyse der über 560 verschiedenen Mutationen (Collod-Bérou et al. 2003) wird in naher Zukunft das Wissen über den Mechanismus der Krankheitsentstehung verbessern. Zwar ist im Prinzip das gesamte Gen Ziel von Mutationen, es ist aber auffallend, dass die Mutationen in den Exons 26 bis 28 überrepräsentiert sind. Dies mag damit zusammenhängen, dass diese Fälle schwerwiegender sind als andere und damit leichter erkannt werden. Außerdem zeigt Abb. 12.18a sehr deutlich, dass ein Calcium-bindendes, EGF-ähnliches Motiv ein charakteristisches Merkmal des Fibrillin-1-Proteins ist. Mutationen, die zur Ausprägung des Marfan-Syndroms führen, betreffen vor allem die hochkonservierten Cystein-Reste sowie diejenigen Aminosäuren, die an der Calcium-Bindung beteiligt sind (Abb. 12.19b). Umgekehrt ist bemerkenswert, dass trotz der Größe des Gens größere strukturelle Veränderungen fast nicht vorkommen (vgl. dagegen Mutationen im F8-Gen, die für schwere Formen der Hämophilie A verantwortlich sind; Abb. 12.29). Unter den über 560 Mutationen konnten 398 in Bezug auf den Übertragungsweg untersucht werden. Dabei zeigte sich, dass nur 210 (knapp 53 %) familiär übertragen wurden – 188 (über 47 %) waren dagegen offensichtlich Neumutationen. Die familiäre Hypercholesterinämie (OMIM 143890) ist die häufigste autosomal-dominante Erkrankung mit einer weltweiten Häufigkeit von 1:500. Allerdings tritt sie aufgrund von Gründereffekten in einigen Populationen häufiger auf (Afrikaner in Transvaal, christliche Libanesen, Finnen, Schotten und FrankoKanadier). Bei Heterozygoten ist die Konzentration von Serum-Cholesterin, das an eine bestimmte Klasse von Lipoproteinen (low density lipoprotein, LDL) gebunden ist, auf das 2‒3fache der Norm erhöht (200‒400 mg LDL-Cholesterin/dl statt 75‒175 mg/dl bei Gesunden). Herzanfälle treten aufgrund coronarer Arteriosklerose (im englischsprachigen Raum auch als

Atherosklerose bezeichnet; Ablagerung von Cholesterin-Plaques in den Herzkranzgefäßen) bereits im 3. Lebensjahrzehnt auf. Bei Homozygoten (Häufigkeit 1:250.000) sind diese Werte noch einmal deutlich erhöht (über 450 mg/dl, und zwar unabhängig von Diät und Lebensstil!), sodass Herzanfälle bereits im frühen Kindesalter auftreten können. Neben den Herzerkrankungen treten in unterschiedlichem Ausmaß auch Cholesterin-Ablagerungen unter der Haut und im Auge auf. Eine familiäre Situation ist in Abb. 12.20 dargestellt. Die genetischen Ursachen liegen dabei nicht in einer gesteigerten Cholesterin-Synthese, wie man zunächst vermuten könnte, sondern vielmehr im unvollständigen Recycling des LDL-Cholesterins. Dieses LDL-Cholesterin-Recycling ist in Abb. 12.21 schematisch dargestellt ‒ und daraus wird auch ersichtlich, welche Gene eine wichtige Rolle spielen. Es handelt sich dabei in erster Linie um Mutationen im Gen, das für den LDL-Rezeptor codiert (Gensymbol: LDLR, Chromosom 19p13; OMIM 606945); das Gen umfasst 45 kb und enthält 18 Exons. Homozygote Patienten werden aufgrund unterschiedlicher Schweregrade in zwei Gruppen eingeteilt (weniger als 2 % Restaktivität des LDL-Rezeptors und 2‒25 % Restaktivität); die Restaktivität des LDL-Rezeptors verhält sich umgekehrt proportional zu den Plasmaspiegeln des LDL-Cholesterins. Dabei vermittelt der LDL-Rezeptor die Endocytose von LDL und des daran gebundenen Cholesterins. In der Zelle wird das gebundene Cholesterin wieder freigesetzt und hemmt das Enzym 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase (HMG-CoAReduktase), das Schlüsselenzym der endogenen Cholesterin-Biosynthese. Auf diese Weise wird bei Gesunden ein Gleichgewicht zwischen Cholesterin-Aufnahme über die Nahrung und eigener CholesterinSynthese eingestellt. Dieses hemmende Signal fehlt, wenn der LDL-Rezeptor durch Mutationen verändert ist. In der klinischen Therapie wird dieses fehlende Signal durch Inhibitoren der HMG-CoA-Reduktase ersetzt (Statine). Wie bei vielen häufigen Erbkrankheiten steigen auch die Informationen über Mutationen im LDLRGen ständig an; zum Zeitpunkt des Drucks (April 2010) waren über 1700 Einträge in Datenbanken verzeichnet (davon 1081 verschiedene Allele; http://www.ucl.ac.uk/ fh). Die Listen beinhalten Punktmutationen und große Deletionen. Unter funktionellen Gesichtspunkten können fünf Gruppen unterschieden werden: ï Die Mutationen führen dazu, dass kein immunpräzipitierbares Protein gebildet wird (Null-Allel); Ursache dafür können Mutationen im Promotor, an

12.3 Monogene Erbkrankheiten

Abb. 12.20 a, b Dominanter Erbgang bei familiärer Hypercholesterinämie aufgrund von Mutationen im LDL-RezeptorGen (LDLR). a Der Index-Patient in der Abbildung (Pfeil) ist ein Kind mit dem klinischen Phänotyp familiärer Hypercholesterinämie. Die dunklen Hälften in den Symbolen zeigen Familienmitglieder, die für die Asp461Asn-Mutation im LDLR-Gen heterozygot sind; die hellgrauen Hälften symbolisieren Heterozygote für eine 21-bp-Duplikation im Exon 4 des LDLRGens. Der Index-Patient ist damit gemischt heterozygot (engl. compound heterozygote). Die Gesamtcholesterin-Konzen-

tration im Plasma vor der Behandlung ist jeweils unter den Zahlen angegeben (in mmol/l; zur Umrechnung in mg/dl, muss die Zahl mit 38,6 multipliziert werden). Die Mutter des Patienten war 3-mal verheiratet (Symbole mit 1–3 markiert). b Durchschnittliche Plasma-Cholesterinspiegel in gesunden (+/+), heterozygoten (+/−) und gemischt heterozygoten (−/−) Mitgliedern der Familie; die Heterozygoten unterscheiden sich signifikant von den Gesunden (t-Test). (Nach Soutar u. Naoumova 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Spleißstellen, Veränderungen im Leserahmen oder große Deletionen sein. Die codierten Proteine sind – zumindest teilweise – in Bezug auf ihren Transport zwischen dem endoplasmatischen Reticulum und dem Golgi-Komplex blockiert. Die meisten Transportdefekte betreffen die Bindungsdomäne und die EGF-ähnliche Domäne. Die Proteine werden zwar synthetisiert und transportiert, können aber LDL nicht binden (Defekte in der Liganden-Bindedomäne). Die Proteine werden synthetisiert, transportiert und binden LDL, können sich aber in der Zellmembran nicht zu Clustern zusammenschließen, sodass keine Endocytose stattfindet (Internalisierungsdefekt). Die Ursachen dafür liegen in Mutationen, die die cytoplasmatische Domäne betreffen. Die Proteine werden synthetisiert, transportiert, binden LDL und transportieren es in die Zelle, können dort aber das LDL nicht entladen und damit auch nicht an die Zelloberfläche zurückkehren. Diese Recycling-Defekte werden durch Veränderungen in der Vorläuferdomäne verursacht.

enten mit der klinischen Diagnose einer familiären Hypercholesterinämie. Das Gen für das ApoB100 (Gensymbol: APOB) befindet sich auf dem Chromosom 2p23-24; die häufigste Mutation führt zu einem Gln→Arg-Austausch an der Position 3500 des Proteins und verändert damit entscheidend die Domäne, mit der das ApoB100-Protein an den LDL-Rezeptor binden kann. In Mitteleuropa hat der familiäre Defekt des APOB-Gens eine Häufigkeit von ca. 1:1000; in anderen Regionen der Welt ist er aber seltener. Abschließend sei darauf hingewiesen, dass wir nach intensiver Forschung auf diesem Gebiet wissen, dass weitere Gene an der Erhöhung der Cholesterin-Konzentration im Blut beteiligt sind. Dazu gehören PCSK9 (engl. proprotein convertase subtilisin/kexin type 9; OMIM 607789; Chromosom 1p34.1-p32) und LDLRAP1 (engl. LDL receptor adaptor protein; OMIM 603813; Chromosom 1p36-p35); Mutationen im LDLRAP1Gen sind auch für eine rezessive Form der Hypercholesterinämie (ARH, autosomal-rezessive Hypercholesterinämie) verantwortlich. Damit wird deutlich (wie wir das auch aus den biochemischen Abläufen schließen können; Abb. 12.21), dass die Erhöhung der LDLCholesterin-Konzentration im Blut und damit das Risiko für Atherosklerose, Herzinfarkt und Schlaganfall einem komplizierten Regelmechanismus unterliegt.

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ï ï

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Allerdings muss in diesem Zusammenhang auch erwähnt werden, dass das Erscheinungsbild der familiären Hypercholesterinämie nicht nur durch Mutationen am LDL-Rezeptor-Gen, sondern auch durch Mutationen verursacht werden kann, die das Gen für seinen Liganden, das Apolipoprotein B100 (ApoB100) betreffen. Diese Form betrifft etwa 2 bis 6 % der Pati-

641

642

Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

LDL

LDL

ApoB

ApoB Membran

Bündelung Endocytose LDLRAP1

LDLRAP1 LDLRAP1

Transport zur Membran LDL

ApoB

LDL-RezeptorRecycling

LDLRezeptor

Clathrinbedeckte Einsenkung

Golgi LDL-RezeptorBiosynthese

Posttranslationale Modifikationen

Endoplasmatisches Reticulum

Abb. 12.21 Der LDL-Rezeptor-Zyklus. Das LDL-Partikel bindet an den extrazellulären Teil des LDL-Rezeptors (LDLR), vermittelt durch dessen Liganden, das Apolipoprotein B (ApoB). Das LDL-Rezeptoradaptierte Protein (LDLRAP1) bindet an den intrazellulären Teil des LDL-Rezeptors, der für die Internalisierung des Gesamtkom-

Bei

autosomal-dominanten Erbkrankheiten entspricht der Phänotyp der heterozygoten Genträger weitgehend dem der homozygoten; beide Geschlechter sind gleichmäßig betroffen. Die Übertragung erfolgt in der Regel von einem der Eltern auf die Hälfte der Kinder; sporadische Fälle beruhen meistens auf Neumutationen. Viele autosomal-dominante Erkrankungen haben Häufigkeiten von 1:10.000. Die häufigste autosomal-dominante Erkrankung ist die familiäre Hypercholesterinämie.

Unter dem Stichwort „dynamische Mutationen“ haben wir bereits in einem früheren Kapitel (9.3.3) expandierende Triplettmutationen besprochen. Sie fallen natürlich unter die dominanten Erkrankungen, da bereits ein mutiertes Allel ausreicht, um das Krankheitsbild auszulösen. Sie werden hier aber doch etwas gesondert behandelt, da die Natur der Mutationen zu einem variablen Krankheitsbild führt, das sich auch innerhalb einer betroffenen Familie im Laufe der Generationen verstärken kann. Als Beispiel wird hier die Chorea Huntington besprochen. Die Chorea Huntington (auch Veitstanz genannt, OMIM 143100) äußert sich im fortgeschrittenen

plexes verantwortlich ist. Dieser Komplex häuft sich in einer Clathrin-bedeckten Einsenkung an; der LDL-Rezeptor wandert danach erneut zur Zellmembran und reguliert damit seine eigene Biosynthese durch einen negativen Rückkopplungsmechanismus. (Nach Dedoussis et al. 2004, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

Zustand in motorischen Defekten, die durch eine allmähliche Degeneration der Neurone in den Basalganglien des Gehirns bedingt werden. Damit verbunden sind Gedächtnisstörungen, Abnahme der kognitiven Fähigkeiten, Gefühlsstörungen und Persönlichkeitsveränderungen. Die Patienten sterben etwa 10 bis 20 Jahre nach dem Ausbruch der Erkrankung an Herz- oder Lungenerkrankungen. Die Neuropathologie zeigt eine Atrophie des Nucleus caudatus und des Putamen; eine diffuse Degeneration des Neostriatums ist pathologisch besonders charakteristisch. Die Krankheit bricht erst relativ spät aus, meist um das 40. Lebensjahr. Die Häufigkeit der Chorea Huntington beträgt etwa 1:10.000. Formal folgt die Erkrankung einem klassischen autosomal-dominanten Erbgang mit vollständiger Penetranz. Da es sich hierbei um eine spät manifest werdende Krankheit handelt, sind oft schon Kinder geboren, wenn die ersten Symptome auftreten. Für die Nachkommen besteht somit ein Risiko von 50 %, daran zu erkranken. Das betroffene Gen (Gensymbol: HD; Chromosom 4p16.3) umfasst etwa 185 kb und enthält 67 Exons. Es gibt zwei Spleißprodukte; die entsprechenden mRNAs sind 10,5 und 13,5 kb lang. Beide Transkripte codieren für dasselbe Protein (Huntingtin) mit 3142 Aminosäu-

12.3 Monogene Erbkrankheiten

Abb. 12.22 a, b Verteilung der CAG-Kopienzahl sowie Altersabhängigkeit der Chorea Huntington. a Verteilung der CAG-Kopienzahl in Chromosomen von Patienten, die an der Erkrankung Chorea Huntington leiden, und bei Gesunden. Die Häufigkeit der gesunden CAG-Allelgröße (blau) und der Krankheitsallele (rot), gezeigt als Anteil an der Gesamtheit, ist gegen die Kopienzahl aufgetragen. Diese Chromosomen wurden von Individuen mit unterschiedlichem genetischen und ethnischen Hintergrund aus verschiedenen Teilen der Welt gewonnen. b Beziehung zwischen

der Kopienzahl und dem Eintrittsalter der Erkrankung. Die Zahl der CAG-Wiederholungen in 1226 Patienten mit Chorea Huntington ist gegen das Eintrittsalter der Erkrankung aufgetragen. Zwar ist die Korrelation zwischen dem Eintrittsalter und der Kopienzahl hoch signifikant, aber aufgrund der großen Spannbreite des möglichen Eintrittsalters insgesamt lassen sich keine individuellen Vorhersagen treffen. Blaue Punkte: individuelle Fälle; rote Punkte: durchschnittliches Eintrittsalter bei der jeweiligen Kopienzahl. (Nach MacDonald 1998, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Abb. 12.23 Paternale Vererbung der Erkrankung Chorea Huntington. Die Zahl der CAG-Kopien zwischen verschiedenen Generationen. Die Länge der expandierenden CAG-Wiederholungen, die zu Erkrankungen führen, in Müttern (links) und in Vätern (rechts) ist jeweils gegen die Kopienzahl in den jeweiligen erkrankten Kindern aufgetragen. Die diagonale Linie (gestrichelt) zeigt die Beziehung an, wenn keine Veränderung in

der Kopienzahl auftritt. Bei der Mehrzahl der Übertragungen (insgesamt 25 über die Mutter und 37 über den Vater) hat sich die Kopienzahl nur um einige wenige Einheiten nach oben oder unten verändert; allerdings zeigen ca. 1/3 der Fälle, die über den Vater übertragen wurden, eine deutliche Erhöhung der Kopienzahl. (Nach MacDonald 1998, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

ren und einem Molekulargewicht von ca. 350 kDa. Genetische Hinweise machen klar, dass nicht der Verlust der Huntingtin-Funktion für den Ausbruch der Krankheit verantwortlich ist; allerdings sterben die entsprechenden homozygoten Nullmutanten der Maus bereits während der Embryonalentwicklung (heterozygote zeigen keine Krankheitsbilder). Ursache für den Ausbruch der Chorea Huntington ist eine CAG-Triplettwiederholung im ersten Exon, die stark polymorph ist und für eine unterschiedliche Anzahl von Glutamin-Resten codiert. In Gesunden vari-

iert die Anzahl der Triplettwiederholungen zwischen 6 und 35; bei Kranken beträgt sie typischerweise etwa 40 bis 50 (Abb. 12.22); liegen allerdings mehr als 70 Wiederholungen vor, tritt die Krankheit bereits im Jugendalter auf. Homozygote Patienten unterscheiden sich dagegen in ihrem Schweregrad fast nicht von den heterozygoten Geschwistern, was den dominanten Charakter der Erkrankung unterstreicht. Allerdings ist eine Übertragung über die männliche Keimbahn oft mit einer deutlichen Zunahme der Anzahl von Triplettwiederholungen verbunden (Abb. 12.23). Dies wird in der

643

644

Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

als Unterschied in der Länge der Triplettwiederholungen in der DNA von Spermien nachgewiesen werden. Auch die Tatsache, dass eineiige Zwillinge dieselbe Anzahl von Triplettwiederholungen aufweisen, deuten darauf hin, dass es sich hierbei nicht um einen somatischen Vorgang handelt, sondern dass die Expansion der Tripletts offensichtlich während der Entwicklung der männlichen Keimzellen stattfindet (siehe auch Kapitel 9.2.3). Besondere Beachtung, auch in der humangenetischen Beratung, kommt den Trägern mit einer mittleren Anzahl (zwischen 25 und 35) von Triplettwiederholungen zu, wobei es noch keine ganz einheitliche Definition gibt. Entsprechend heterogen sind auch die Angaben zur Häufigkeit, die zwischen 1,0 und 3,9 % variieren. Aus den Trägern dieser mittleren Tripletthäufigkeit rekrutieren sich nämlich die Erkrankten der nächsten Generation. Transgene Mäuse, die die CAG-Triplettwiederholungen stabil in das Huntingtin-Gen integriert haben, sind hervorragende Modelle für diese schwerwiegende Erkrankung. Sie erlauben nicht nur, den Krankheitsverlauf im Detail zu untersuchen (Abb. 12.24), sondern auch verschiedene andere genetische Einflüsse (z. B. des Glutamat-Rezeptors 6) und Umweltfaktoren (z. B. eine Stimulierung der Umgebung) zu variieren. Erste Untersuchungen deuten darauf hin, dass eine abwechslungsreiche Umgebung das Eintrittsalter bei der Maus herausschieben kann (van Dellen u. Hannan 2004).

12.3.3 X-chromosomale Krankheiten

Abb.12.24 a, b Mausmodell für die Erkrankung Chorea Huntington. a Eine transgene Maus mit einer stabilen CAG-Wiederholungseinheit im Huntingtin-Gen ist ein präzises Modell für die Chorea Huntington („HD-Maus“). Eine zusätzliche TAA-Wiederholung in der Nähe des Gens für den Glutamat-Rezeptor 6 verändert das Eintrittsalter. Die Maus zeigt ein charakteristisches Klammern mit den Hinterpfoten, wenn sie am Schwanz gehalten wird. Das ist ein robustes und reproduzierbares Anzeichen für den Beginn der Erkrankung. b Die Elektronenmikroskopie zeigt zwei einzelne, homogene Einschlüsse in den Zellkernen (Pfeil auf ni; engl. nuclear inclusions) des Striatum einer HD-Maus im Alter von 11 Monaten. Die Zellkerne (nuc) haben tiefe Einstülpungen. (Nach van Dellen u. Hannan 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

weiblichen Keimbahn nicht beobachtet. Offensichtlich findet die Verlängerung der Triplettwiederholungen bevorzugt während der Spermatogenese statt und kann

Genauso wie bei autosomalen Erkrankungen können wir auch bei Erkrankungen, deren Mutationen in Genen auf dem X-Chromosom liegen, dominante und rezessive Allele unterscheiden. Der wesentliche Unterschied bei den X-chromosomal vererbten Erkrankungen liegt darin, dass die beiden Geschlechter in unterschiedlichem Ausmaß betroffen sind. Da die Männer nur ein X-Chromosom haben, die Frauen aber zwei, gibt es im Falle einer X-gekoppelten Mutation für Männer und Frauen unterschiedliche Möglichkeiten. Die Männer können jeweils hemizygot für das mutierte oder Wildtyp-Allel sein (Hemizygotie: Gen kommt nur einmal im Genotyp vor), während die Frauen entweder heterozygot oder homozygot für jedes Allel sein können. Das spielt bei dominanten Allelen in der Regel keine Rolle (Ausnahme: semidominante Allele), ein rezessives Allel dagegen wird sich beim Mann unmittelbar manifestieren, da er im Gegensatz zum weiblichen Geschlecht kein zweites (Wildtyp-)Allel besitzt. X-chromosomal-dominante Allele können ohne umfangreiche Familiendaten relativ schwer als solche identifiziert werden, da sich der Erbgang nur dann von

12.3 Monogene Erbkrankheiten

einem autosomal-dominanten Erbgang unterscheiden lässt, wenn Kinder von väterlichen Trägern vorhanden sind. In diesem Fall sind nur weibliche Nachkommen von der Krankheit betroffen, diese aber ohne Ausnahme. Generell sind Männer von X-chromosomalen dominanten Erbkrankheiten oft stärker betroffen als Frauen, wenn die Krankheiten nicht sogar letal sind. Eine solche verstärkte Expression in einem Geschlecht scheint mit der Definition eines dominanten Allels nicht im Einklang zu stehen. Die Ursache hierfür liegt jedoch darin, dass das defekte Allel als Folge der Inaktivierung eines der beiden X-Chromosomen nicht in allen Zellen des weiblichen Organismus zur Ausprägung kommt (Abb. 6.37). Diese Inaktivierung des zweiten X-Chromosoms in weiblichen Säugern dient zur Dosiskompensation, die erforderlich ist, um die Dosisunterschiede X-chromosomaler Gene im männlichen und weiblichen Geschlecht auszugleichen. Der Dosiskompensationsmechanismus wurde bereits an anderer Stelle ausführlich besprochen (Kapitel 6.3.3). Folge dieses Mechanismus ist es, dass in der Hälfte der Zellen einer heterozygoten Frau das funktionelle X-chromosomale Gen aktiv ist und somit für einen Ausgleich der Fehlfunktion des zweiten Allels in anderen Zellen sorgen kann. Auch für einen solchen Kompensationseffekt sei eine Krankheit als Beispiel angeführt, die Vitamin-D-Resistenz (OMIM 307800). Sie äußert sich als Rachitis und führt zu Skelettdefekten und geringerem Wuchs des betroffenen Individuums. Weibliche Patienten sind meist weniger betroffen als männliche, die oft schon vor der Geburt sterben.

X-chromosomal-dominante Erbkrankheiten sind selten. Bei der Stammbaumanalyse fallen sie dadurch auf, dass die männlichen Nachkommen betroffener Männer stets gesund sind. Frauen erkranken erwartungsgemäß doppelt so häufig wie Männer, jedoch ist der Ausprägungsgrad der Krankheit aufgrund der Inaktivierung eines X-Chromosoms in Zusammenhang mit der Dosiskompensation oft geringer als beim Mann.

Im Gegensatz zu den X-chromosomal-dominanten Erkrankungen kommen X-chromosomal-rezessive Erkrankungen häufiger vor. Dabei erfolgt die Übertragung über alle gesunden Töchter kranker Väter bzw. über die Hälfte der gesunden Schwestern kranker Männer. Die phänotypisch gesunden, aber genotypisch heterozygoten Überträgerinnen werden auch als Konduktorinnen bezeichnet. Umgekehrt können Söhne erkrankter Väter das Krankheits-Allel nicht von ihrem Vater erben (das eine X-Chromosom des Mannes kommt immer von seiner Mutter).Wir wollen uns hier auf zwei wichtige und bekannte Beispiele beschränken (Hämophilie A und Duchenne’sche Muskeldystrophie). Ein klassischer Stammbaum für X-chromosomalrezessive Krankheiten ist in Abb. 12.25 am Beispiel der Bluterkrankheit (Hämophilie A) in europäischen Fürstenhäusern dargestellt. Hämophilie. Eine der wohl bekanntesten Erbkrankheiten des Menschen ist die Hämophilie A (OMIM 306700), eine X-gekoppelte rezessive Krankheit, die auf einem Blutgerinnungsdefekt beruht. Dieser wird durch die fehlende Aktivität eines Proteins, des Blutgerinnungsfaktor VIII (Gensymbol: F8), ver-

I Albert

Victoria

II Friedrich III

Victoria

Ludwig

Alice

Leopold

Helene

Beatrice

Heinrich

III Heinrich

Irene Friedrich

Alexandra

Nicolaus II

Alice

Alexander Victoria Leopold Moritz

Alfons XIII

IV Waldemar

Heinrich

Alexei

Abb. 12.25 Stammbaum der Nachkommen von Königin Victoria. Der Stammbaum zeigt das charakteristische Muster einer geschlechtsgekoppelten rezessiven Erbkrankheit, der Hämophilie A. Männliche Nachkommen zeigen die Krankheit (dunkelgrün), während weibliche Nachkommen Überträgerinnen sind (rosa). Die ersten Erkrankungen in diesem Familienstammbaum wurden in den Nachkommen von Königin Vic-

Rupprecht

Alfonso

toria beobachtet. Die Mutation muss daher entweder in der Keimbahn der Mutter von Königin Victoria erfolgt sein oder in (frühen) mitotischen Zellen der Keimbahn von Königin Victoria, da mehrere ihrer Kinder erkrankten bzw. Träger waren. Gesunde Familienmitglieder sind hellgrün gezeichnet. (Nach Vogel u. Motulsky 1997, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

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646

Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

ursacht. Dieses Protein ist als einer der vielen zur Blutgerinnung erforderlichen Faktoren unentbehrlich. Als Folge eines defekten Gens können äußere Verletzungen oder auch spontane innere Blutungen neben der Bildung von großen Hämatomen (Abb. 12.26) zu gefährlichen Blutverlusten führen. Die Bekanntheit dieser Krankheit, obwohl ihre Häufigkeit mit einem unter 7000 bis 10.000 Männern (Frequenz des Allels ist also 10−4) geringer ist als die vieler anderer erblicher Defekte, beruht zum Teil darauf, dass sie als Erbkrankheit in den europäischen Königsfamilien weit verbreitet ist. Ihr Ursprung konnte bis zu Königin Victoria von England (1819–1901) zurückverfolgt werden, deren Sohn Leopold als erster Familienangehöriger an Hämophilie A litt (Abb. 12.25). Durch ihre Enkeltöchter, die als heterozygote Träger (engl. carrier) das rezessive Allel weitervererbten, gelangte es in das spanische und russische Königshaus. Der Ursprung des für die Hämophilie A verantwortlichen defekten Gens in dieser Familie ist nicht bekannt, da es zuvor in der Familie nie aufgetreten war. Es ist also wahrscheinlich auf eine Mutation in einer der elterlichen Keimzellen oder, weniger wahrscheinlich, sehr früh in der Entwicklung der Keimzellen von Königin Victoria zurückzuführen. Zwischen diesen beiden Möglichkeiten kann nicht unterschieden werden, da nicht bekannt ist, ob Königin Victoria selbst heterozygote Trägerin des Allels war. Jedenfalls haben mindestens 3 ihrer 9 Kinder das Allel geerbt. In den folgenden Generationen starben 10 ihrer männlichen Nachkommen innerhalb von 5 Generationen an dieser Krankheit. Das berühmteste Beispiel ist der Zarewitsch Aleksej, der

Abb. 12.26 Hämophilie-A-Patient. Bei diesem Kind hat sich ein großes Hämatom entwickelt. (Aus Tariverdian u. Buselmaier 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Sohn Zar Nikolaus II von Russland und Alix von Hessen-Darmstadt (Alexandra von Russland), der die Krankheit von seiner Mutter erbte. Wie wir aus dem Stammbaum ablesen können, kommen rezessive X-gekoppelte Allele bei der Frau definitionsgemäß nicht sichtbar zur Ausprägung, wenn das X-Chromosom heterozygot ist (Abb. 12.25). Hingegen spielt der rezessive Charakter in der hemizygoten Konstitution des Mannes keine Rolle, da sich das Allel hier voll manifestieren kann. Die Wahrscheinlichkeit, dass eine Frau homozygot ist, wird durch die Häufigkeit des Allels in Männern angezeigt (Kapitel 10.5.1): Ist die Häufigkeit 1/10.000 (10−4), so ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine Frau heterozygote Trägerin ist, 1/5000 (2 × 10−4). Unterstellt man, dass das Allel durch zufällige Partnerwahl weitervererbt wird, so ist die Häufigkeit, mit der Träger der Krankheit Kinder bekommen, 10−4 × 2 × 10−4. Homozygote Frauen sind also mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,5 × 2 × 10−8 = 10−8 zu erwarten, da nur die Hälfte der Töchter aus einer solchen Verbindung das Hämophilie-A-Allel der Mutter erhält. Das gesamte F8-Gen ist mit über 2000 kb sehr groß; aus 26 Exons entsteht eine mRNA von knapp 10 kb, die für ein Protein von 2332 Aminosäuren codiert (Abb. 12.27a). Durch Spaltung mit Thrombin wird der inaktive Vorläufer in die aktive Form überführt; die sogenannte „B-Domäne“ geht dabei verloren. Mutationen, die zu Hämophilie A führen, können überall im Gen vorkommen. Sie haben aber unterschiedlich starke Konsequenzen für die Restaktivität des Faktor VIII und damit für den Schweregrad der Erkrankung (0–2 %: schwer; 2–5 %: mittel; 5–25 %: leicht). Der Faktor VIII bildet mit weiteren Komponenten der Blutgerinnungskaskade einen Komplex (Abb. 12.27b). Etwa die Hälfte aller schweren Fälle wird durch Inversionen verursacht, wobei aufgrund von Sequenzhomologien Teile des Introns 1 bzw. des Introns 22 mit Bereichen außerhalb des F8-Gens in Wechselwirkung treten (Abb. 12.28 und 12.29). Durch die Inversion zwischen den jeweiligen Bruchpunkten werden funktionell inaktive Proteine gebildet. Die „Intron-22-Inversion“ (Abb. 12.29) weist auf ein interessantes Phänomen hin, nämlich auf die Anwesenheit von zwei längeren Sequenzelementen am telomeren Ende des X-Chromosoms, die offensichtlich deutliche Homologien zu einer Region im Intron 22 des F8-Gens aufweisen. Diese Region innerhalb des großen Introns 22 enthält selbst noch zwei weitere Gene, die als F8A und F8B bezeichnet werden. Das F8A-Gen besteht aus 3 Exons; es ist in antisense-Orientierung zum F8-Gen angeordnet. Im Gegensatz dazu hat das F8B-Gen dieselbe Orientierung wie das F8-Gen selbst und benutzt die nachfolgenden

12.3 Monogene Erbkrankheiten

Abb.12.27 a, b Der Faktor VIII und sein Gen. a Vom Gen zum aktiven Protein: Die 26 Exons des F8-Gens werden in eine ca. 9 kb große mRNA übersetzt; das reife Protein wird durch Thrombin in 4 Fragmente gespalten (Pfeile an den Arg-Resten). Dabei wird die B-Domäne entfernt und die 3 verbleibenden Fragmente (A1, A2 und A3-C1-C2) werden über Cu2+ komplexiert. b Eigenschaften und Wechselwirkungen des F8-Proteins: Es ist das gesamte F8-Protein einschließlich des Signalpeptids (SP) am N-Terminus dargestellt; die Ziffern geben die jeweiligen Positionen der Aminosäuren an. Die Stellen für die Wechselwirkungen mit anderen Faktoren der Gerinnungskaskade sind angegeben mit PL:

Phospholipide; VWF: von-Willebrand-Faktor; F9/F9a: (aktivierter) Faktor 9; F10/F10a: (aktivierter) Faktor 10. Das Muster der glykosylierten Asn-Reste ist für den Transport des F8-Proteins aus dem endoplasmatischen Reticulum wichtig (Quadrate: schwarz, glykosyliertes Asn; weiß, nicht glykosyliertes Asn; schwarz/weiß, teilweise glykosyliertes Asn; grau, potenziell glykosyliertes Asn). Die sulphatierten Tyr-Reste (weiße Kreise) sind für die effiziente Aktivierung durch Thrombin an den benachbarten Schnittstellen wichtig; die Bildung der Disulfidbrücken (S-S) trägt zur richtigen Faltung des Proteins bei. (Nach Graw et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Exons 23 bis 26 des F8-Gens. Diese Anordnung ist spezifisch für den Menschen; bei der Maus gibt es keine Gene im Intron 22. Die Expression des F8B-Gens in transgenen Mäusen führt zu massiven Entwicklungsstörungen, besonders im Auge (Valleix et al. 1999).

Die Therapie der Hämophilie A bestand in früheren Jahren zunächst in Bluttransfusionen. Mit fortschreitender Kenntnis der Biochemie gelang es, den Faktor VIII über verschiedene säulenchromatographische Verfahren soweit zu reinigen, dass er gefriergetrocknet gelagert und in medizinisch überwachter Heimselbstbehandlung in kleinen Volumina intravenös appliziert werden kann. Wegen der kurzen Halbwertszeit (ca.

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Abb. 12.28 F8-Intron-1-Inversion als Ursache der Hämophilie A. Im Intron 1 des F8-Gens befindet sich ein Sequenzabschnitt (int1h1, blau), der außerhalb des Gens (int1h2, rot) wiederholt ist; die Pfeile deuten die Orientierung der Elemente an. Die folgenden Schritte in der Abbildung erläutern, wie es durch

homologe Rekombination zu der beobachteten Inversion kommt. Diese Inversion ist für etwa 1 % der schweren Fälle von Hämophilie A verantwortlich. (Nach Graw et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Abb. 12.29 F8-Intron-22-Inversion als häufigste Ursache einer schweren Hämophilie A. Im Intron 22 befindet sich eine Region (A), die starke Sequenzhomologien zu zwei Regionen außerhalb des F8-Gens aufweist; sie sind ebenfalls durch A gekennzeichnet, weisen aber eine umgekehrte Orientierung auf (Pfeile). Durch intrachromosomales Crossing-over zwischen den mit A gekennzeichneten antiparallelen Sequenzen kommt es

nach Bruch und Religation zur Inversion des Bereichs zwischen Exon 1 und Exon 22 des F8-Gens. Die Exons 23–26 bleiben in ihrer ursprünglichen Orientierung und damit nach der Inversion vom Rest des Gens getrennt. Diese Inversion ist für etwa 35–45 % der schweren Fälle von Hämophilie A verantwortlich. (Nach Bolton-Maggs u. Pasi 2003, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

13 Stunden) muss dies daher bei schweren Fällen zur Vorbeugung von Blutungen etwa alle 2 bis 3 Tage wiederholt werden. Allerdings haben der Ausbruch von HIV und unzureichende Kontrollen bei der Verwen-

dung von Blutplasma bei der Herstellung der Präparate Ende der 1980er-Jahre zu massiven HIV-Infektionen bei Bluterkranken und damit zu einer dramatischen Erhöhung der Todesrate geführt. Heute werden viele

12.3 Monogene Erbkrankheiten

Präparate gentechnologisch hergestellt, wobei sowohl bei den Zellkulturen (keine Wachstumsfaktoren aus Rinderserum) als auch bei der Stabilisierung des gereinigten Faktors (kein Albumin aus Rinderserum) auf Komponenten aus Rinderblut wegen einer möglichen BSE-Kontamination verzichtet wird. Insgesamt hat jedoch die Einführung der Heimselbstbehandlung zu einer deutlichen Verbesserung der Lebensqualität und Verlängerung der Lebensdauer der Hämophilie-APatienten geführt. Eine weitere wesentliche Komplikation bei der Hämophilie-Behandlung, die vor allem bei den schweren Fällen auftritt, ist die Entwicklung von Antikörpern gegen den therapeutisch gegebenen Faktor VIII, womit dessen Wirkung zunächst zunichte gemacht wird. Durch eine lang dauernde Therapie mit stark erhöhter Gabe von Faktor VIII kann der Körper in vielen Fällen allerdings dazu gebracht werden, den exogenen Faktor VIII quasi als „körpereigenes Protein“ zu erkennen. Zur Verbesserung der Therapie wird heute auch an Verfahren einer somatischen Gentherapie gearbeitet; die bisherigen Ergebnisse der ersten klinischen Studien müssen noch etwas zurückhaltend beurteilt werden, da sie oft nur mit sehr hohem Aufwand für einige Monate eine relativ geringe Erhöhung der Faktor-VIII-Restaktivität bewirken. Die Entwicklung einer robusten Gentherapie für Hämophilie A wird Auswirkungen auf das gesamte Gebiet der somatischen Gentherapie haben (Walsh 2002; Manno 2002). Die Muskeldystrophien vom Typ Becker bzw. Duchenne sind klassische Beispiele für Pioniertaten in der Molekulargenetik einerseits und allelische Heterogenität andererseits. Die Duchenne’sche Form (OMIM 310200) ist durch eine Muskelschwäche gekennzeichnet, die von den Beinmuskeln ausgehend auf Rumpf und Schultergürtel übergreift. Es entwickelt sich schließlich eine Muskelatrophie, die dazu führt, dass die Kinder mit ca. 12 Jahren einen Rollstuhl brauchen. Mit der Zeit werden auch die Atemmuskeln schwächer und die Jugendlichen benötigen im Alter zwischen 15 und 20 Jahren Atemhilfen. Veränderungen am Herzmuskel werden zwischen 14 und 18 Jahren bei etwa 90 % der Patienten beobachtet. Trotz verbesserter Therapieverfahren liegt die Lebenserwartung bei nur ungefähr 25 Jahren. Die Patienten sterben überwiegend an Atemwegserkrankungen; zweithäufigste Todesursache sind Herzprobleme. Die Duchenne’sche Muskeldystrophie hat eine Häufigkeit von etwa 1:3500 neugeborenen Jungen und gehört damit zu den häufigsten schweren Erbkrankheiten (Abb. 12.30). Der Becker’sche Typ (OMIM 300376) hat etwa das gleiche Erscheinungsbild, jedoch einen gutartigeren und langsamer fortschreitenden Verlauf; dieser Typ ist wesentlich seltener (1:20.000). Die Krankheit beginnt in

der Regel jenseits des 10. Lebensjahres, und Invalidität tritt erst im Alter von 40 oder 50 Jahren auf. Die Lebenserwartung ist nur wenig verkürzt. Von medizinischer Seite wird aber betont, dass es sich hier nicht um eine gutartige Verlaufsform der Muskeldystrophie vom Typ Duchenne, sondern um ein eigenständiges Krankheitsbild handelt (Tariverdian u. Buselmaier 2004). Beide Krankheiten sind auf dem X-Chromosom lokalisiert (Xp21.2) und werden durch Mutationen im Dystrophin-Gen (Gensymbol: DMD) verursacht. Das Dystrophin-Gen ist das mit Abstand größte Gen, das im Menschen für ein Protein codiert: Seine 79 Exons bedecken etwa 2,6 Millionen bp (Abb. 12.31a). Diese Größe macht es anfällig für Rearrangements und Rekombinationen, die zu Mutationen führen. In den meisten Fällen sind die Mutationen Deletionen von einem oder mehreren Exons (60 %); daneben werden auch Punktmutationen (32 %), Duplikationen (6 %) und Translokationen gefunden. Im Allgemeinen kann man sagen, dass Mutationen, die den offenen Leserahmen unterbrechen und die zu einem vorzeitigen Abbruch der DystrophinSynthese führen, eine Duchenne’sche Muskeldystrophie verursachen. Mutationen, die den Leserahmen nicht

Abb. 12.30 Patient mit Duchenne’scher Muskeldystrophie im finalen Stadium. (Nach Tariverdian u. Buselmaier 2004, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Abb. 12.31 a, b Dystrophin: Gen und Protein. a Das Dystrophin-Gen wird in verschiedenen Geweben durch unterschiedliche Promotoren gesteuert (z. B. B: Gehirn, M: Muskel, P: Purkinje-Zellen). Das jeweils erste Exon ist beige, gemeinsame Exons sind blau und nicht translatierte Exons sind türkis dargestellt. Die Pfeile deuten den Transkriptionsstart an, und die rote Box markiert einen charakterisierten Enhancer. Die entsprechenden Dystrophin-Proteine (Dp) sind mit ihrem Molekulargewicht (in kDa) angegeben. b Schematische Darstellung des DystrophinGlykoprotein-Komplexes (DGC) und Etiologie der Muskeldys-

trophie: Dystrophin steht im Skelettmuskel in Wechselwirkung mit cytoplasmatischen, Transmembran- und extrazellulären Proteinen. Mutationen im Dystrophin-Gen und in Genen, die für andere Komponenten des DGCs codieren, verursachen Muskeldystrophien. BMD: Becker’sche Muskeldystrophie; CMD: congenitale Muskeldystrophie; CYS: Cystein; DG: Dystroglykan; DMD: Duchenne’sche Muskeldystrophie; LGMD: Muskeldystrophie des Schulter- und Beckengürtels (engl. limb-girdle muscular dystrophy); NOS: Stickoxid-Synthase. (Nach Khurana u. Davies 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

12.3 Monogene Erbkrankheiten

Abb. 12.32 Fragiles-X-Syndrom: Analyse eines Familienstammbaums durch Restriktionsanalyse von genomischer DNA verschiedener Familienmitglieder. Im oberen Teil ist der Familienstammbaum einer Familie dargestellt, die ein FragilesX-Syndrom aufweist. Unten sind die Restriktionsanalysen der genomischen DNA verschiedener Familienangehöriger gezeigt. Bei Individuen ohne das defekte Gen (N) sind nur die

Restriktionsfragmente vorhanden, die im funktionellen Allel vorkommen (a und n). In betroffenen Individuen (schwarz) ist eine diffuse Verteilung höhermolekularer DNA-Fragmente zu beobachten, die die Restriktionsfragmente a und n ersetzen. Erwartungsgemäß sind bei Heterozygoten (halb gefüllt) beide Signale nebeneinander ausgeprägt. (Nach Oostra u. Verkerk 1992, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

verändern, resultieren eher in der milderen Form der Becker’schen Muskeldystrophie. Das Dystrophin ist ein bedeutendes Strukturelement in den Muskelzellen, das die Proteine des internen Cytoskeletts mit denen in der Zellmembran verbindet (Abb. 12.31b). Ein Verlust dieser Funktion führt zur Zerstörung der Muskelfasern, zu Lecken in der Zellmembran und zu Veränderungen in Signalkaskaden.

Viren mit vergrößerter Verpackungskapazität und verkürzten Mikrodystrophin-DNAs im Tierversuch erprobt. Inzwischen gibt es auch schon klinische Untersuchungen der Phasen I und II. Die verschiedenen Aktivitäten geben zur Hoffnung Anlass, dass diese schwere Krankheit bald heilbar wird (Farini et al. 2009).

In den letzten Jahren wurden verschiedene Ansätze einer somatischen Gentherapie erprobt. Ausgangspunkt war zunächst die Applikation von Dystrophin-DNA in einem Plasmid unter der Kontrolle des sehr aktiven CMV-Promotors. Zur Optimierung wurden neue Adeno-assoziierte

X-chromosomale rezessive Erbkrankheiten kommen im männlichen Geschlecht stets zur Ausprägung, im weiblichen nur bei Homozygotie und daher mit wesentlich geringerer Häufigkeit. Allele, deren Ausprägung vor dem Erreichen der Geschlechtsreife zum Tod des Individuums führen, können nur im heterozygoten Zustand weitervererbt werden und sind stets rezessiv.

651

652

Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Bei dem Fragilen-X-Syndrom (Martin-Bell-Syndrom, OMIM 309550) handelt es sich um eine X-gebundene, rezessive Krankheit, die neben verschiedenen morphologischen Anomalien wie verlängertem Gesicht, abnormal großen Ohren und großen Testes vor allem mit geistiger Retardierung, Hyperaktivität und Autismus verbunden ist. Die Häufigkeit liegt bei Männern bei ca. 1:5000. Der Defekt ist in der Region Xq27.3 lokalisiert, die sich – wie auch der Name anzeigt – durch eine hohe Bruchempfindlichkeit des X-Chromosoms der Betroffenen auszeichnet. Auffallend ist der Erbgang dieser Krankheit: Als Besonderheit ist das Vorkommen von männlichen Überträgern zu bezeichnen. Bei diesen Männern kommt die Krankheit trotz ihrer hemizygoten Konstitution nicht zur Ausprägung. In deren Töchtern zeigen sich ebenfalls keine Anzeichen der Krankheit. In den männlichen Nachkommen der folgenden Generation kommt sie aber mit einer Häufigkeit von 40 %, in Männern der übernächsten Generation mit der normalerweise zu erwartenden Häufigkeit von 50 % zum Ausbruch.

Die Erklärung dieses ungewöhnlichen Erbgangs besteht darin, dass im ersten (nicht translatierten) Exon des FMR1-Gens (engl. Fragile X Mental Retardation) eine (CGG)n-Wiederholungseinheit vorhanden ist. Die Anzahl der CGG-Repeats variiert und ist bei Patienten mit Fragilem-X-Syndrom durch über 700 bp der CGGWiederholungseinheit gekennzeichnet, während normalerweise nur 6 bis 53 Kopien des CGG-Repeats vorhanden sind. Kennzeichnend ist die Instabilität der Repeathäufigkeiten dieser Region (Abb. 12.32). In Überträgern ist eine Vergrößerung des fraglichen DNABereichs auf 180 bis 600 bp festzustellen, der in den folgenden Generationen weiter ausgedehnt wird und dann erst zur Ausprägung der Krankheit führt. Das Anwachsen der Länge des DNA-Bereichs auf eine Länge, die noch keine pathologischen Effekte zur Folge hat (zwischen 55 und 200 CGG-Wiederholungseinheiten), bezeichnet man als Prämutation (engl. premutation). Die Häufigkeit der Prämutationen wird mit 1:259 bei Frauen und 1:813 bei Männern angegeben; Vollmutationen werden nur durch Frauen übertragen (Abb. 9.16)

Abb. 12.33 a, b Das FMR1-Gen und die zelluläre Funktion des Proteins. a Die Positionen verschiedener Domänen im FMR1Gen sind angegeben; die CGG-Wiederholung befindet sich im 1. Exon. NLS: Kern-Lokalisationssignal; NES: Kern-Exportsignal; KH und RGG: RNA-bindende Domänen; cc: superspiralisierte (engl. coiled-coil) Region. b Modell des intrazellulären Weges des FMR-Proteins. Das neu gebildete FMR-Protein gelangt über

sein Kern-Lokalisationssignal (NLS) in den Zellkern und dort in den Nukleolus, wo es an die 60S-Untereinheit der sich formierenden Ribosomen bindet. Gemeinsam mit anderen Proteinen wird dieser Komplex (über das Kern-Exportsignal, NES) wieder in das Cytoplasma entlassen. (Nach Kooy et al. 1998, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

12.3 Monogene Erbkrankheiten

Das betreffende FMR1-Gen (Abb. 12.33a) ist in vielen Geweben des Embryos und des erwachsenen Menschen exprimiert; seine höchste Konzentration erreicht es im Gehirn. Das FMR1-Genprodukt FMRP (FMR-Protein) ist ein selektiv RNA-bindendes Protein, das zwei RNA-bindende Domänen enthält, die als KHbzw. RGG-Domäne bezeichnet werden; es zirkuliert zwischen dem Zellkern und Cytoplasma. Im Cytoplasma ist das FMRP an mRNA gebunden (Ribonukleoprotein-Komplex) und mit Polyribosomen oder Ribosomen des endoplasmatischen Reticulums assoziiert. FMRP bindet an ca. 4 % der mRNA des Gehirns und ist am Transport der mRNA an die entsprechenden Ribosomen beteiligt (Abb. 12.33b). In Neuronen ist das FMRP mit der Translationsmaschinerie in den Dendriten assoziiert; es wird diskutiert, dass es eine wichtige Rolle bei der neuronalen Reifung spielt. Es ist bekannt, dass die räumliche Regulation der Proteinsynthese für das Zellwachstum, die Zellpolarität und das Management der synaptischen Plastizität verantwortlich ist (wichtig für Lern- und Gedächtnisleistungen). In betroffenen Männern wird eine Methylierung des CGG-Bereichs und des Promotors des FMR1Gens beobachtet, die in gesunden Männern fehlt. Verbunden ist diese offenbar mit einer Inaktivierung des betroffenen Gens und damit einem Funktionsverlust des FMRP, da die pathologisch expandierten Tripletts mit einer verminderten Transkription des FMR1-Gens verbunden sind. Die pleiotropen Effekte des FragilenX-Syndroms lassen sich über den gestörten mRNAMetabolismus erklären, wenn das FMRP nicht oder

nicht in genügendem Maße zu Verfügung steht (für einen aktuellen Übersichtsartikel sei auf die Arbeit von Oostra u. Willemsen 2009 verwiesen).

Abb. 12.34 Evolution des menschlichen Y-Chromosoms. Die Abbildung zeigt die Verkürzung des Y-Chromosoms und die blockweise Ausweitung seiner nicht rekombinierenden Regionen (NRY). Die wichtigsten Ereignisse sind angegeben und zeitlich grob geschätzt (in Millionen Jahren). Neue nicht rekombinierende Gene sind in Klammern gesetzt und die phylogenetischen Verzweigungen durch Pfeile angedeutet. In den blauen Regionen ist freie Rekombination möglich (pseudoautosomale Regionen); die roten Bereiche sind spezifisch für das

Y-Chromosom und erlauben keine Rekombination. Die grüne Region repräsentiert die PCDHX/Y-Sequenz (Protocadherin X/Y), die vom X-Chromosom auf das Y-Chromosom übertragen wurde (andere ebenso wahrscheinliche Translokationen wurden der Einfachheit wegen weggelassen). Die Abbildung ist nicht maßstabsgerecht gezeichnet; die Centromere wurden weggelassen, da ihre Lokalisierung in vielen Stadien des Evolutionsprozesses unklar ist. (Nach Lahn et al. 2001, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Die Ausprägung des Fragilen-X-Syndroms beruht auf einer funktionellen Inaktivität des FMR1-Gens, die auf der Vermehrung von CGG-Tripletts innerhalb des Gens beruht. Die Inaktivität des FMR1-Gens ist durch die Methylierung des CGG-Tripletts verbunden, die auch den Promotorbereich erfasst. 12.3.4 Y-chromosomale Gene Zu den geschlechtsgekoppelten Merkmalen zählen natürlich auch solche auf dem Y-Chromosom. Y-chromosomale Merkmale erkennt man dadurch, dass stets nur männliche Nachkommen Träger dieses Merkmals sind und es ‒ im Gegensatz zu X-chromosomalen Merkmalen (Kapitel 12.3.3) ‒ stets auch zur Ausprägung bringen. Insofern ist das Y-Chromosom ein sehr bizarrer Teil des menschlichen Genoms: ein großer Block von DNA, der weitgehend nicht rekombiniert, permanent in hemizygotem Zustand gehalten und ausschließlich durch Männer weitergegeben wird. Man geht davon aus, dass die X- und Y-Chromosomen ursprünglich homologe Chromosomen waren, und sich vor ca. 300 Millionen Jahren voneinander getrennt haben; heute ist das Y-Chromosom aufgrund mangelnder Rekombination mit dem Partnerchromosom

653

Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Zwei Krankheiten korrespondieren mit zwei Genklassen auf dem Y-Chromosom, das Turner-Syndrom und die männliche Unfruchtbarkeit. Das Turner-Syndrom haben wir im Kapitel 12.2.1 bereits als 45,X0-Karyotyp kennengelernt. Das Turner-Syndrom kann als Verlust eines X-Chromosoms angesehen werden (bezogen auf XX-Frauen), aber auch als Verlust

SRY RPS4Y ZFY PCDHY TTY1 TSPY AMELY

12

VCY CDY XKRY

AZFc

Y

USP9Y DBY UTY TB4Y

AZFa

11.2

PRY TTY1 TTY2 TSPY

AZFb

11.3 11.2 11.1 11.1

Euchromatische Region

weitgehend degeneriert. Die Y-Chromosomen haben sich in vielen verschiedenen Gruppen von Tieren und Pflanzen unabhängig entwickelt; die Y-Chromosomen der Säuger haben einen gemeinsamen Ursprung, aber nichts gemeinsam mit den entsprechenden Chromosomen in Vögeln oder Drosophila. Insgesamt sind die Y-Chromosomen reich an repetitiver DNA (transponierbare Elemente und Satelliten-DNA), wie wir es oft in genomischen Regionen geringer Rekombinationshäufigkeit finden; ein großer Teil des Y-Chromosoms ist heterochromatisch. Einen Überblick über die heutigen Vorstellungen der Evolution des menschlichen Y-Chromosoms gibt Abb. 12.34. Obwohl Y-chromosomale Merkmale leicht zu erkennen sind, spielen sie keine große Rolle in der Humangenetik. Ursache hierfür ist die relativ geringe Anzahl von Genen, die auf dem Y-Chromosom liegen; im spezifisch männlichen Teil des Y-Chromosoms (~ 60 MB; davon nur ~ 35 MB euchromatisch) kennen wir 158 Transkriptionseinheiten (zum Vergleich: Das X-Chromosom umfasst etwa 160 MB und enthält ca. 1000 Gene). Hinzu kommt, dass das Y-Chromosom an seinen beiden Enden je eine Region mit Homologie zum X-Chromosom beherbergt (pseudoautosomale Regionen, PAR) (Abb. 12.35). Diese Bereiche können mit den entsprechenden Regionen des X-Chromosoms rekombinieren und unterscheiden sich damit nicht von der Situation von Autosomen; die entsprechenden Merkmale kommen also nicht geschlechtsgekoppelt zur Ausprägung. Die codierenden Sequenzen auf dem Y-Chromosom können in zwei Gruppen eingeteilt werden, nämlich diejenigen, die noch Homologien zu Genen auf dem X-Chromosom aufweisen, und solchen, die dies nicht haben. Zur ersten Gruppe gehören 27 Gene, davon sind allerdings schon 13 zu Pseudogenen degeneriert. Eines der bestuntersuchten Gene dieser ersten Gruppe ist das ursprünglich als TDF (engl. testis determining factor) bezeichnete, jetzt SRY genannte Gen (engl. sex determining region on Y); das entsprechende Gen auf dem X-Chromosom ist SOX3. SRY hat eine entscheidende Bedeutung für die männliche Geschlechtsbestimmung (Kapitel 11.6.5) und wirkt offenbar mit einer Reihe autosomaler Gene (z. B. SOX9 und DAX1) zusammen. Mehrere weitere Y-chromosomale Gene, die AZF-Gene (engl. azoospermic factor), sind für die männliche Fertilität von Bedeutung. Wir unterscheiden drei Cluster von AZF-Genen (a‒c; Abb. 12.35). Zu ihnen gehören auch RBMY (abgeleitet von engl. RNA-binding motif) und DAZ (engl. deleted in azoospermia). Beide Gene enthalten Sequenzmotive in den abgeleiteten Proteinsequenzen, wie sie für Proteine charakteristisch sind, die an RNA binden. DAZ gehört allerdings zur zweiten Gruppe von Genen, die keinerlei Homologie zu Bereichen des X-Chromosoms aufweisen.

Heterochromatische Region

654

PRY TTY2 DAZ BPY2 PRY CDY

SMCY EIF1AY RBMY

RBMY

Abb. 12.35 Aktive Gene des menschlichen Y-Chromosoms. Die Gene auf der rechten Seite des Chromosoms haben aktive Homologe auf dem X-Chromosom, wohingegen die Gene auf der linken Seite spezifisch für das Y-Chromosom sind. Gene in Rot sind in vielen Geweben exprimiert („Haushaltsgene“); Gene in Schwarz sind nur in den Testes exprimiert, und Gene in Grün sind weder allgemein noch Testes-spezifisch exprimiert; AMELY (Amelogenin Y]) wird in den sich entwickelnden Zähnen exprimiert, wohingegen PCDHY (Protocadherin Y) im Gehirn exprimiert wird. Mit Ausnahme von SRY (engl. sex-determining region Y) liegen alle Testes-spezifischen Gene in mehreren Kopien vor; einige dieser Familien bilden dichte Cluster. AZFa, AZFb und AZFc (Azoospermie-Faktoren) markieren drei Regionen, die bei unfruchtbaren Männern häufig deletiert sind. Bereiche auf dem Chromosom: beige: euchromatische Region der nicht rekombinierenden Region (NRY); schwarz: heterochromatischer Anteil des NRY; grau: Centromer; rot: pseudoautosomale Regionen (die Gene wurden aus Gründen der Vereinfachung weggelassen). (Nach Lahn et al. 2001, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

12.3 Monogene Erbkrankheiten

eines Y-Chromosoms (bezogen auf XY-Männer). Insbesondere für die untersetzte Statur der Turner-Patientinnen wird der Mangel eines Gens verantwortlich gemacht, SHOX (engl. short stature homebox). In der Maus, deren Degeneration des Y-Chromosoms schon weiter vorangeschritten zu sein scheint, gibt es jedenfalls bei X0-Individuen keinen dermaßen hervorstechenden Phänotyp. Die männliche Unfruchtbarkeit kommt bei Männern mit einer Häufigkeit von 1:1000 vor und ist im Wesentlichen durch Fehler der Spermatogenese verursacht; davon wiederum entstehen etwa 10 % der Fälle durch neue Deletionen im Y-Chromosom. Die häufigste Deletion wird im Bereich des AZFc-Clusters beobachtet.

Die Anzahl Y-chromosomaler Merkmale ist gering. Sie treten nur im männlichen Geschlecht auf. Das wichtigste Gen auf dem Y-Chromosom bestimmt das männliche Geschlecht (SRY), einige weitere sind für die Fertilität der Spermien notwendig.

12.3.5 Mitochondriale Erkrankungen Wie wir bereits in Kapitel 5.2.3 gesehen haben, verfügen die Mitochondrien über ein eigenes ringförmiges Genom von 16.569 bp, das für 37 Gene codiert (13 Gene für die Atmungskette, 2 rRNA-Gene, 22 tRNAGene). Die meisten Proteine der Mitochondrien werden zwar im Kerngenom codiert (etwa 1500 Gene), dennoch wollen wir uns wegen einiger Besonderheiten

Abb. 12.36 a, b Stammbaum einer mitochondrialen Erkrankung. a Ein Stammbaum einer chinesischen Familie über 4 Generationen zeigt die matrilineare Form der Vererbung einer nicht-syndromischen Hörschädigung. Es sind Männer und Frauen betroffen; die Penetranz der Erkrankung ist unvollständig. Die mit Stern gekennzeichneten Kinder wurden mit einem Aminoglykosid-haltigen Antibiotikum behandelt, das bei vorhandener Mutation in der mitochondrialen DNA zu Taubheit

der mitochondrialen Vererbung in diesem Kapitel auf die Gene des mitochondrialen Genoms beschränken. Da die Mitochondrien nur über die Eizellen vererbt werden (und die Samenzellen bei der Befruchtung keine Mitochondrien weitergeben), sprechen wir von einem matrilinearen Erbgang. Wie wir in Abb. 12.36a sehen, unterscheidet sich dieser Erbgang von den bisher besprochenen: Ähnlich wie bei einem X-gekoppelten Erbgang wird die Erkrankung immer über die Mutter vererbt, aber es sind in der Regel Männer und Frauen in gleicher Weise betroffen. Da eine Zelle aber über Hunderte oder 1000 Mitochondrien verfügt, tragen nicht alle Mitochondrien die Mutation; in diesem Fall sprechen wir von Heteroplasmie (die DNA der Mitochondrien einer Zelle unterscheidet sich). Eine homoplasmische Zelle dagegen enthält nur Mitochondrien einer einheitlichen DNA-Sequenz. Ein Beispiel für das unterschiedliche Ausmaß der Heteroplasmie in einer Familie zeigt Abb. 12.36b: Bei der gesunden Mutter des Patienten tragen nur etwa 0,5 % der Mitochondrien die Mutation; eine ungünstige Verteilung der betroffenen Mitochondrien bei der Entwicklung der Oocyten führt aber dazu, dass etwa 50 % der Mitochondrien ihres Sohnes die Mutation tragen und es deswegen zum Ausbruch der Erkrankung kommt. Diese unterschiedliche Verteilung führt dazu, dass weniger Mitglieder einer Familie erkranken, als man bei der formalen Anwendung Mendel’scher Regeln erwarten würde; wir sprechen deswegen von einer verminderten (oder unvollständigen) Penetranz (was die Analyse dieses Erbgangs schwierig macht). Mitochondriale Mutationen betreffen in besonderer Weise den Energiestoffwechsel der Zellen (Abb.

führt. b Stammbaum einer kleinen heteroplasmatischen Familie über 3 Generationen mit einer Mutation in der mitochondrialen DNA, die zur Leber’schen Opticusneuropathie führt (Abb. 12.39). Die Prozentzahlen geben den Anteil der mutierten mitochondrialen DNA im Blut an. (a nach Liao et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier; b nach Huoponen 2001, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

655

656

Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Abb. 12.37 Drei Kennzeichen des mitochondrialen Metabolismus mit besonderer Bedeutung für die Pathophysiologie von Erkrankungen. 1. Die Energie-Produktion durch oxidative Phosphorylierung, 2. die Entstehung reaktiver Sauerstoffmoleküle (Superoxid-Anion, OH-Radikale) als Nebenprodukt der oxidativen Phosphorylierung und 3. die Regulation der Apoptose. Erklärung der wichtigsten Abkürzungen: I, II, III, IV und V: Komplexe I–V der oxidativen Phosphorylierung; AIF:

Apoptose-induzierender Faktor; ANT: Adeninnukleotid-Translokator; BD: Benzodiazepin-Rezeptor; CD: Cyclophilin D; CoQ: Ubiquinon; Cyt c: Cytochrom c; EndoG: Endonuklease G; GPx: Glutathion-Peroxidase; LDH, Lactatdehydrogenase; MnSOD: Mangan-abhängige Superoxiddismutase; PDH: Pyruvatdehydrogenase; TCA: Tricarbonsäure-Zyklus; VDAC: spannungsabhängiger Anionenkanal. (Nach Wallace 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

12.37). Sie machen sich daher besonders in solchen Geweben zuerst bemerkbar, die einen hohen Energiebedarf haben. Dazu zählen das Gehirn (einschließlich der Retina), das periphere Nervensystem, die Muskulatur (Skelett- und Herzmuskel), Leber und Nieren. Eine repräsentative Übersicht über Mutationen und dazugehörige Krankheitsbilder gibt Abb. 12.38. Das MELAS-Syndrom (OMIM 540000) umfasst eine mitochondriale Encephalomyopathie, Lactat-Acidose und Schlaganfall-ähnliche Episoden, die schon im Alter von 4‒15 Jahren beginnen. Das Krankheitsbild kann auch verbunden sein mit Kleinwuchs, Diabetes und Migräne; die Expressivität ist innerhalb einer Familie sehr variabel. Die molekulare Ursache ist eine Punktmutation (3243 A→G) im tRNALeu-Gen. Das MERRF-Syndrom (engl. myoclonic epilepsy with redragged fibers; OMIM 545000) ist charakterisiert durch Myoklonusepilepsien (kurze ruckartige Muskelzuckungen), Demenz, Taubheit, Ataxie und Neuropa-

thien. Die molekulare Ursache ist eine Punktmutation (8344 G→A) im tRNALys-Gen. Die erbliche Leber’sche Opticusneuropathie (engl. Leber hereditary optic neuropathy, LHON; Häufigkeit: 1:10.000; OMIM 535000) betrifft nur den Sehnerv und führt zu einem plötzlichen Visusverlust (zuerst einseitig, später beidseitig). Typischerweise sind Männer im Alter von 23‒26 Jahren betroffen. Die molekularen Ursachen sind in den meisten Fällen eine von drei Mutationen (11778 G→A im ND4-Gen (56 %), 3460 G→A im ND1-Gen (31 %) oder 14484 T→C im ND6-Gen (6,3 %); es sind 15 weitere Mutationen in der mtDNA beschrieben. Ein Beispiel für die Degeneration der Ganglienzellschicht in der Retina eines LHON-Patienten ist in Abb. 12.39 gezeigt. Mutationen im Mitochondriengenom somatischer Zellen haben vielfältige Auswirkungen auf altersabhängige Prozesse und neurodege-

12.3 Monogene Erbkrankheiten

DEAF 1555

F

T D-Loop

12s rRNA

V

P

Cyt b

LHON 14484

0

LDYS 14459

Amerika A E

ND6

16s rRNA MELAS 3243 L

ND5

LHON 3460 Amerika C ND1

Afrika L

I ADPD 4336

L H

Q

M

S

Amerika D ND4

ND2 AN C Y

W

S

PC 6340 PC 6663

ND3 COIII

D

R

LHON 10663

G

ATPase6

COII

PC 6261

LHON 11778 ND4L

Amerika B, Asien B COI

PC 6252

Asien F

Europa H

K ATPase8 NARP 8993 / Leig‘s 8993

MERRF 8344

Abb. 12.38 Erbkrankheiten durch Mutationen in der mitochondrialen DNA. Die zirkuläre Anordnung der mitochondrialen DNA und die Darstellung der Gene bzw. Kontrollregionen (sowie deren Abkürzungen) entsprechen weitgehend der Abb. 5.7. Die kleinen Buchstaben innen und außen deuten die tRNAGene für die jeweiligen Aminosäuren an (im Ein-BuchstabenCode; siehe Einband-Innenseite). Die Pfeile im Inneren, gefolgt von Kontinentbezeichnungen mit Buchstaben, zeigen die Positionen von Polymorphismen an, die in der jeweiligen geographischen Region vorherrschend sind. Die Pfeile außerhalb

des Kreises deuten die Positionen repräsentativer pathogener Mutationen an (Zahl: Nukleotidposition der Mutation). DEAF: Taubheit; MELAS: mitochondriale Encephalomyopathie, Laktatazidose und schlaganfallähnliche Episoden; LHON: Leber’sche erbliche Opticusneuropathie; ADPD: Alzheimer’sche und Parkinson’sche Erkrankungen; MERRF: Myoklonische Epilepsie mit zottigen roten Muskelfasern (engl. ragged red fibers); NARP: Neuropathie, Ataxie und Retinitis pigmentosa; LDYS: LHON mit Dystonie; PC: Prostatakrebs. (Nach Wallace 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

nerative Erkrankungen. Durch die Aktivität der Atmungskette ergibt sich eine relativ hohe Konzentration reaktiver Sauerstoffspezies, die zu Strangbrüchen an der mitochondrialen DNA führen kann. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass Störungen in der oxidativen Phosphorylierung, besonders im Complex I, mit der Alzheimer’schen und der Parkinson’schen Erkrankung (Kapitel 13.4.4 und 13.4.5) in Verbindung stehen. Das betrifft sowohl mögliche Mutationen in der mitochondrialen DNA als auch in Genen, die für Proteine codieren, die mit Mitochondrien bzw. mitochondrialen Proteinen in Wechselwirkung treten. Diese Untersuchungen

sind aber noch nicht so weit fortgeschritten, dass allgemeingültige Schlüsse und therapeutische Ansätze abgeleitet werden können (Schapira 2006).

Mutationen in der mitochondrialen DNA werden matrilinear vererbt und führen zu Erkrankungen, die überwiegend Gewebe mit hohem Energiebedarf betreffen (Gehirn einschließlich der Retina, das periphere Nervensystem, die Muskulatur, Leber und Nieren). Wegen des heteroplasmischen Zustands vieler Zellen zeigen diese Erkrankungen häufig verminderte Penetranz.

657

658

Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Abb. 12.39 a, b Horizontalschnitt einer Retina (Färbung mit Hämatoxylin und Eosin). a Kontroll-Retina mit retinalen Ganglienzellen und Nervenfaserschichten zwischen den Pfeilen. b Die Retina eines Patienten mit Leber’scher Opticusneuropa-

thie (LHON/3460) zeigt einen deutlichen Verlust an retinalen Ganglienzellen und Nervenfaserschichten (zwischen den Pfeilen). (Nach Carelli et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

12.4 Komplexe Erkrankungen

12.4.1 Gene und Krebs

Viele Krankheiten lassen sich nicht dem klassischen Muster „mendelnder“ Erbgänge zuordnen. Man beobachtet zwar eine familiäre Häufung, die aber nicht den Erwartungen einfacher rezessiver oder dominanter Erbgänge entspricht. Diese komplexen Erkrankungen umfassen multifaktorielle Merkmale (Interaktion zwischen Genen und Umwelt, z. B. Körperhöhe, Gewicht, Intelligenz, Hautfarbe, Fruchtbarkeit) und polygene Merkmale (Zusammenspiel vieler Gene, z. B. Brustkrebs, Asthma, Hypertonie (15–20 %), Diabetes mellitus (4–5 %), Alkoholismus). Diese Erkrankungen zeigen eine kontinuierliche Variabilität. Die genetische Prädisposition bildet den Rahmen für ein Gesamtbild, das durch Umwelteinflüsse mitgestaltet wird. Pathologische Abweichungen vom Normbereich werden durch Festlegung empirischer Grenzwerte definiert. Wir haben im Kapitel über die formalen Aspekte der Genetik (Kapitel 10.3.4) bereits einen Eindruck von der Schwierigkeit erhalten, die Einzelkomponenten solcher Krankheiten zu charakterisieren. In diesem Abschnitt wollen wir von der Seite der Krankheit her einige Beispiele vorstellen (Krebs, Asthma und Diabetes). Dabei wird deutlich, dass ihre genetischen Aspekte nur in wenigen Fällen schon klar herausgearbeitet worden sind. Der Abschluss der ersten Phase des Humangenom-Projektes erleichtert jetzt aber doch in vielen Fällen den genetischen Zugang.

Eine Krebszelle unterscheidet sich von einer „normalen“ Zelle durch ihre unbegrenzte Teilungsfähigkeit (unabhängig von Wachstumsfaktoren; Fehlen von Wachstumsbegrenzungen wie z. B. Kontaktinhibition). Krebsgewebe hat die Fähigkeit, in gesundes Gewebe einzuwandern und eine neue Kolonie außerhalb des ursprünglichen Gewebeverbands zu gründen (Metastasierung). Ursachen dafür sind Mutationen, die bestimmte Signalwege an- oder ausschalten. Mutationen können die Körperzellen und die Keimzellen betreffen; die entsprechenden Tumore unterscheiden sich im Zeitpunkt ihres Auftretens. Es können drei Gruppen von Genen unterschieden werden: Onkogene, Tumorsuppressorgene und Mutatorgene.

Onkogene Onkogene wurden in den 1960er-Jahren zunächst in Viren entdeckt, die Tumore induzieren (DNA-Tumorviren oder Retroviren, Kapitel 8.2). Die viralen Onkogene sind Kopien normaler zellulärer Gene, die im Laufe der Evolution von den Viren aufgenommen wurden und die Zellproliferation aktiv fördern. Ein einziges mutiertes Allel kann den Phänotyp der Zellen beeinträchtigen (dominant); die nicht mutierten Formen dieser Gene bezeichnete man früher häufig als Proto-Onkogene; heute sprechen wir eher von aktivierten Onkogenen. Die viralen Onkogene wurden vielfach

12.4 Komplexe Erkrankungen

Tabelle 12.5 Beispiele für virale Onkogene Onkogen

Virus

Spezies

Tumor

Biochemische Funktion

sis

Simian Sarkom-Virus

Affe

Sarkom

Wachstumsfaktor

erbB

Erythroblastosis-Virus der Vögel

Huhn

Leukämie

Tyrosinkinase

fms

Felines Sarkom-Virus

Katze

Leukämie

Tyrosinkinase

kit

Felines Sarkom-Virus

Katze

Sarkom

Tyrosinkinase

src

Rous-Sarkom-Virus

Huhn

Sarkom

Tyrosinkinase

abl

Abelson murine leukemia virus

Maus

Leukämie

Tyrosinkinase

raf

Murines Sarkom-Virus

Maus

Sarkom

Tyrosinkinase

Ha-ras

Harvey-Sarkom-Virus

Ratte

Sarkom

GTP-Bindungsprotein

Ki-ras

Kirsten-Sarkom-Virus

Ratte

Sarkom

GTP-Bindungsprotein

akt

AKT8-Virus

Maus

Thymuskarzinom

Serinkinase

myc

Myelocytomatosis-Virus der Vögel

Huhn

Leukämie

Transkriptionsfaktor

myb

Myeloblastosis-Virus der Vögel

Huhn

Leukämie

Transkriptionsfaktor

rel

Reticuloendotheliosis-Virus der Vögel

Truthahn

Leukämie

Transkriptionsfaktor

fos

Murines Osteosarcoma-Virus

Maus

Osteosarkom

Transkriptionsfaktor

jun

Sarcoma-Virus der Vögel

Huhn

Sarkom

Transkriptionsfaktor

erbA

Erythroblastosis-Virus der Vögel

Huhn

Leukämie

Transkriptionsfaktor

tax

HTLV1

Mensch

Leukämie, Lymphom

Transkriptions-Regulator

Nach Schulz (2005)

als mutierte Versionen zellulärer Gene klassifiziert, die an der Regulation wichtiger zellulärer Funktionen beteiligt sind: Wachstumsfaktoren (z. B. SIS), Zelloberflächenrezeptoren (z. B. ERBB, FMS), Teile von Signalkaskaden (RAS-Familie), DNA-bindende Kernproteine (Transkriptionsfaktoren, z. B. MYC, JUN), Regulatoren des Zellzyklus (Cycline, Cyclin-abhängige Kinasen und ihre Inhibitoren). Eine Übersicht über virale Onkogene gibt Tabelle 12.5. Onkogene können durch verschiedene Mechanismen aktiviert werden: Eine Amplifikation von Genen wie ERBB und MYC wird in vielen Brustkrebsformen gefunden und führt zu einer Erhöhung der Genexpression. Punktmutationen führen zu Aktivierungen von Genen in Signalkaskaden, z. B. RAS, wie es bei einer Reihe von Tumoren (Dickdarmkrebs, Lungenkrebs, Brustkrebs, Blasenkrebs) gefunden wird. Translokationen können neuartige, chimäre Gene schaffen, z. B. das ABL-BCR-Produkt, das zu einer konstitutionell aktiven Tyrosinkinase führt. Ein bekanntes Beispiel

dafür ist das sogenannte „Philadelphia-Chromosom“, das bei einer chronisch-myeloischen Leukämie gefunden wurde. Einige zelluläre Onkogene sind in Tabelle 12.6 aufgeführt. Ein wichtiges Beispiel für Onkogene ist RAS. In Säugern sind drei verschiedene Typen des RAS-Gens bekannt (H-ras, K-ras und N-ras). Sie codieren für kleine Proteine, die zur Superfamilie der Guaninnukleotid-bindenden Proteine gehören (kurz: G-Proteine). Sie oszillieren alle zwischen einer aktiven Form (GTPBindung) und einer inaktiven Form (GDP-Bindung). Die aktive Konformation wird durch die im RAS-Protein enthaltene GTPase-Aktivität wieder in die inaktive Form umgewandelt. Unter normalen Bedingungen haben ruhende Zellen nur 5 % des gesamten RASProteins im aktiven Zustand ‒ im aktivierten Zustand steigt dieser Anteil dagegen auf 50 % an. RAS-Proteine sind an der inneren Seite der Zellmembran lokalisiert, wo sie eine wichtige Rolle als GTPase-Schalter in verschiedenen Signalketten spielen; Abb. 12.40 gibt dazu

659

660

Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Tabelle 12.6 Beispiele für zelluläre Onkogene

a

Onkogen

ChromosomenPositiona

Tumor

Aktivierungsmechanismus

Biochemische Funktion

TGFA

2p13

Karzinome

Überexpression

Wachstumsfaktor

FGF1

5q31

solide Tumore

Überexpression

Wachstumsfaktor

WNT1

12q12

Karzinome

Überexpression

Wachstumsfaktor

IGF2

11p15.5

versch. Krebserkrankungen

Überexpression

Wachstumsfaktor

ERBB1

7p12

Karzinome

Überexpression, Mutation

Tyrosinkinase

ERBB2

17q21.1

Karzinome

Überexpression

Tyrosinkinase

KIT

4q12

Krebserkrankungen (Hoden, Darm, Bindegewebe)

Mutation

Tyrosinkinase

RET

10q11.2

Krebserkrankungen (Schilddrüse und andere endogene Drüsen)

Mutation, Inversion

Tyrosinkinase

MET

7q31

Karzinome (bes. Niere)

Überexpression, Mutation

Tyrosinkinase

IGF1R

15q25

Karzinome (bes. Leber)

Überexpression

Tyrosinkinase

SMO

7q32

Krebserkrankungen (Haut, Gehirn)

Mutation

G-Protein-gekoppelter Rezeptor

HRAS

11p15.5

versch. Krebserkrankungen

Mutation

GTP-bindendes Protein

NRAS

1p13.2

versch. Krebserkrankungen

Mutation

GTP-bindendes Protein

KRAS

12p12.1

Karzinome

Mutation

GTP-bindendes Protein

BRAF

7q34

Melanome, Krebserkrankungen (bes. Dickdarm)

Mutation

Tyrosinkinase

CTNNB1

3p22

Karzinome (bes. Dickdarm, Leber)

Mutation

Cytoskelett, Transkriptionsaktivator

MYC

8q24.12

versch. Krebserkrankungen

Translokation, Überexpression, Mutation

Transkriptionsfaktor

MYCN

2p24.1

Krebserkrankungen

Überexpression

Transkriptionsfaktor

MYCL1

1p34.3

Karzinome

Überexpression

Transkriptionsfaktor

RELA

11q12

Leukämie

Translokation

Transkriptionsfaktor

MDM2

12q14.3

Sarkome und andere solide Tumore

Überexpression

Transkriptionsregulator, Ubiquitin-Ligase

SKP2

5p13

Krebserkrankungen

Überexpression

Ubiquitin-Ligase

CCND1

11q13

versch. Krebserkrankungen

Überexpression

Zellzyklus-Regulation

CCDN2

12p13

Krebserkrankungen

Überexpression

Zellzyklus-Regulation

CDK4

12q14

Krebserkrankungen

Überexpression, Mutation

Zellzyklus-Regulation

BCL2

18q21.3

Lymphome und versch. Krebserkrankungen

Translokation, Überexpression

Apoptose-Regulation

nach OMIM, nach Schulz (2005)

12.4 Komplexe Erkrankungen

Abb. 12.40 Die RAS-Signalkette. Aktivierende Mutationen, die zur Krebsentstehung führen, wurden in den 3 RAS-Isoformen und einigen ihrer nachfolgenden Effektorgenen beschrieben (rot); inaktivierende Mutationen in den Gegenspielern (Tumorsuppressorgenen) sind grün dargestellt; zusätzliche Komponenten, von denen im Mausmodell bekannt ist, dass sie zur Tumorauslösung benötigt werden, sind blau dargestellt. Die Aktivierung der Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs; z. B. EGFRezeptor) führt zur Aktivierung der Signalkaskade durch viele Schritte, die in der Evolution konserviert sind. GRB2: growth factor receptor bound protein; SOS: son of sevenless; NF1: Neurofibromin 1; Ras: Onkogen des Ratten-Sarkom-Virus; RBD: RASBindedomäne; Rassf1: Ras association domain family member 1; PLC-ε: Phospholipase C-ε; RalGDS: Ras-like guanine nucleotide dissociation stimulator; Raf: regulator of a-fetoprotein; PI(3)K: Phosphatidylinositol-3-Hydroxykinase; Tiam1: T-cell lymphoma invasion and metastasis-1; MEK: MAPK (Mitogen-aktivierte Proteinkinase)/ERK (extracellular signal-regulated kinase); AKT: Onkogen aus einer Thymom-Zelllinie des Mausstamms AKR; RSK: Ribosomales-Protein-S6-Kinase; TSC2: Tuberous sclerosis 2; mTOR: mammalian target of rapamycin. (Nach Shaw u. Cantley 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

einen Überblick. RAS-Proteine werden durch verschiedene extrazelluläre Signale (Wachstumsfaktoren wie EGF oder PDGF) aktiviert. Die RAS-Signalkaskade ist in allen menschlichen Tumoren ein wichtiger Stoffwechselweg, denn in ca. 30 % aller Fälle wird sie falsch reguliert: Mutationen in den RAS-Genen sind die häufigsten Mutationen, die man in menschlichen Tumoren entdeckt. Allerdings ist die Frequenz gewebe- und tumorspezifisch: RASMutationen kommen in fast allen Pankreas-Adenokarzinomen vor, zu 50 % bei Dickdarmkrebs, in 25‒50 % der Lungen-Adenokarzinome, aber so gut wie nicht bei Brust-und Gebärmutterkrebs. Außerdem sind diese

Mutationen im RAS-Gen offensichtlich nicht zufällig auf die verschiedenen Isoformen verteilt, sondern betreffen überwiegend das K-RAS (vor allem bei Dickdarmkrebs); Mutationen in N-RAS findet man bei Leukämien und Mutationen in H-RAS bei Blasenkrebs. Insgesamt werden vier verschiedene RAS-Proteine gebildet, da durch differenzielles Spleißen zwei Transkripte des K-RAS-Gens entstehen, die für zwei unterschiedliche Proteine codieren. Das H-RAS-Onkogen codiert ein 189 Aminosäuren langes Protein mit einem Molekulargewicht von Mr = 21.000, das p21RAS-Protein. In vielen Krebszellen ist dieses Protein in einer einzigen Aminosäure in der Position 12 verändert: An der Stelle eines Glycins ist ein Valin zu finden (G12V). Diese Aminosäureveränderung wird durch eine Basenveränderung (Transversion) im Codon 12 von GGC nach GTC verursacht. Durch die Expression zellulärer Gene aus Karzinomzellen in Zellkulturen (von sogenannten präneoblastischen Zellen, also Zellen, die nicht von einem Tumor abstammen) konnten Robert Weinberg und Mitarbeiter (McCoy et al. 1984) zeigen, dass das zelluläre RAS-Onkogen (mit einem Valin in der Aminosäureposition 12) eine karzinogene Wirkung besitzt. Erwartungsgemäß war das proto-RASGen, welches in den gesunden Zellen desselben Krebspatienten vorhanden war, in einem solchen Test nicht karzinogen. Wir müssen daraus schließen, dass zelluläre Onkogene, d. h. mutierte Allele der ProtoOnkogene, zur Entstehung bösartiger (maligner) Tumoren beitragen. Das normale Ras-Protein ist membrangebunden und besitzt sowohl GTP-/GDP-Bindungsaktivität als auch GTPase-Aktivität. Die Membranbindung wird durch posttranslationale Modifikationen erreicht (Farnesylierung). Die Aufgabe von RAS ist es, durch Wachstumsfaktoren an der Zelloberfläche ausgelöste Proliferationssignale in das Zellinnere zu übertragen. Dabei wird es durch extrazelluläre Signale von einer GDP-bindenden inaktiven Konformation in eine signalübertragende GTP-bindende Konformation überführt. Diese Autotermination der Signaltransduktion wird durch die Mutation der Aminosäure 12 gestört, sodass RAS-Onkoproteine (mit Valin in Aminosäureposition 12) eine gesteigerte SignaltransduktionsEigenschaft aufweisen. Das erklärt die hohe Proliferationsrate der betroffenen Zellen. Aufgrund des hohen Anteils an RAS-Mutationen in verschiedenen Krebsarten versucht man, die so daueraktivierte Form des RASProteins zu blockieren. Abschalten der RAS-Aktivität kann auf vielen Wegen erfolgen: Hemmung der RASProteinsynthese durch antisense-Oligonukleotide oder RNA-Interferenz; Hemmung der Verankerung in der Membran durch Hemmung der Farnesyltransferase;

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Blockade der Wechselwirkung von RAS mit seinen Kooperationspartnern durch den Einsatz spezifischer Antikörper gegen die mutierte Form des RAS-Proteins. Diese Strategien waren bisher in vitro erfolgreich ‒ eine interessante Zusammenstellung findet sich bei Friday und Adjei (2005). Erste klinische Tests waren Erfolg versprechend (Gollamudi et al. 2009).

Tumorsuppressorgene Die Produkte von Tumorsuppressorgenen hemmen die Zellproliferation. Bei manchen Krebserkrankungen haben die mutierten Allele diese Funktion verloren. Es müssen in der Regel beide Allele inaktiviert sein, um das Verhalten der Zelle zu verändern (rezessiv). Ein wichtiges Charakteristikum für die Funktion von Tumorsuppressorgenen ist der Verlust der Heterozygotie im Krebsgewebe (meist durch Deletion eines größeren DNA-Abschnitts einschließlich des Tumorsuppressorgens selbst). Ein sehr gut untersuchtes Beispiel hierfür ist das Retinoblastom (OMIM 180200), ein Tumor der Retina des menschlichen Auges (Abb. 12.41). Es handelt sich um eine autosomale Erbkrankheit, die mit einer Häufigkeit von 1:20.000 Geburten auftritt; es gibt keinen signifikanten Einfluss des Geschlechts, ethnischer Zugehörigkeiten, Umweltoder sozio-ökonomischer Faktoren. Das Retinoblastom repräsentiert den Prototyp einer erblichen Krebserkrankung und ist bei Kindern die häufigste Krebserkrankung am Auge. Zu Beginn des 20. Jahrhunderts hatten erkrankte Kinder nur eine geringe Überlebenschance. Wenn heute die Erkrankung früh erkannt wird, kann sie mit sehr guter Prognose (~ 95 % Überlebenswahrscheinlichkeit) behandelt werden, wobei oft sogar das Sehvermögen erhalten werden kann (weitere Tumorsuppressorgene siehe Tabelle 12.7). Das verantwortliche Gen, das bei RetinoblastomErkrankungen mutiert ist, (engl. retinoblastoma gene, RB1), wurde im Chromosom 13q14 des Menschen lokalisiert. Der Erbgang des Retinoblastoms wird zwar als dominant bezeichnet, jedoch kommt es nur bei einer Mutation in beiden Allelen des Gens in derselben Zelle zur Tumorbildung (Abb. 12.42), sodass der Dominanzbegriff hier eigentlich nicht korrekt angewendet wird. Die zweite Mutation im ursprünglichen Wildtyp-Allel erfolgt spontan in somatischen Zellen, sodass in den betroffenen Geweben eine gemischte Heterozygotie vorliegt (engl. compound heterozygosity). Da bei etwa 90 % der Träger Tumore entstehen, lässt sich die Anwendung des Dominanzbegriffs aus der medizinischen Praxis rechtfertigen. Die Ursache für diese hohe Ausprägungsrate liegt darin, dass die Mutationsrate des zweiten, ursprünglich normalen Allels sehr hoch ist,

Abb. 12.41 a, b Retinoblastom. a Rechtes Auge eines Patienten: Das Retinoblastom wird häufig zuerst als weißer Reflex (Leukocoria) auf Fotografien erkennbar – das linke Auge zeigt das bekannte Phänomen des „roten Auges“. Die Überlebenswahrscheinlichkeit beträgt fast 90 %, aber die Prognose für den Augapfel selbst ist schlecht. b Die Retina zeigt den sich ausbreitenden Tumor (Schweregrad C mit mittlerem Risiko). (Nach Balmer et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Tabelle 12.7 Beispiele für Tumorsuppressorgene und die entsprechenden Erkrankungen Erkrankung

Chromosomale Lokalisation

Gen

Ataxia telangiectasia (Luis-Bahr-Syndrom)

11q22–q23

ATM

Brust- und Ovarialkrebs

13q12–q13

BRCA1

Brustkrebs

17q13

BRCA2

Wilm’s Tumor

11p13

WT1

Li-Fraumeni-Syndrom

17p13

TP53

Neurofibromatose I (v. Recklinghausen,sche Krankheit)

17q12–q22

NF1

Neurofibromatose II

22q12.2

NF2

Polyposis intestinalis I (Familiäre Adenomatöse Polypose, FAP)

5q21

APS

Malignes Melanom

9p21

CDKN2

12.4 Komplexe Erkrankungen

Abb. 12.42 Genetik des Retinoblastoms. Das Gen (RB1) liegt im langen Arm von Chromosom 13 des Menschen; eine Mutation ist durch ein „X“ angedeutet. Wenn in somatischen Zellen heterozygoter Träger erneut eine Mutation auftritt (dunkelgelbes Chromosom im linken Schema), entwickeln sich diese Zellen zu Tumoren. In der nicht erblichen Form bedarf es zweier

somatischer Mutationen, bis der Tumor ausbricht. Daher tritt die erbliche Form bereits im Kindesalter auf und täuscht einen dominanten Erbgang vor, während die nicht-erbliche Form erst später im Leben zu Krebs führt. (Nach Knudson 2001, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

sodass der größte Teil der Träger der Erbkrankheit diese schließlich auch zur Ausprägung bringt. Das RB1-Gen codiert ein Protein (p110RB1) eines Molekulargewichtes von Mr = 110.000 (928 Aminosäuren). Es handelt sich um ein besonders großes Gen, das sich über 150 kb der DNA erstreckt und 27 Exons enthält. Das p110RB1 ist heute als ein negativer Regulator des Zellzyklus charakterisiert und an Differenzierungsprozessen und Apoptose beteiligt. Es bindet an die E2F-Transkriptionsfaktoren und unterbindet dadurch die Transkription vieler Gene, die für die S-Phase benötigt werden. Diese E2F-Proteine besitzen auch eine CDK-Bindedomäne und aktivieren solche Gene, die für den Übergang der G1- in die S-Phase verantwortlich sind. Eine zweite Gruppe von E2F-Proteinen besitzt nur eine Bindungsdomäne für p110RB1; sie werden in der G0- und G1-Phase in den Zellkern transportiert. Die Aktivität des p110RB1-Proteins wird durch das Ausmaß seiner Phosphorylierung gesteuert: Der Phosphorylierungszustand des Proteins ist während der G1-Phase und in G0-Zellen niedrig, in der späten G1und der S-Phase dagegen erhöht. Dieses Verhalten erinnert uns stark an das Zellzyklus-regulierender Proteine. Wie bereits zuvor besprochen, spielt in der

Regulation des Zellzyklus insbesondere der Übergang zur S-Phase (Abb. 5.13) eine Rolle. Dieser Zeitpunkt wird durch eine Phosphokinase, das p34CDC2-Protein, kontrolliert (Abb. 5.25). Die Zellzyklus-regulierende Funktion von p110RB1 ist plausibel, wenn man annimmt, dass dieses Protein im funktionellen Zustand ein Festhalten der Zelle in der G1- (oder G0-)Phase zur Aufgabe hat. Eine Mutation zur Funktionsunfähigkeit würde damit den Übergang in die S-Phase und damit die Proliferationsfähigkeit der Zelle freigeben und zur Tumorentstehung führen.

Tumore können genetisch prädisponiert sein und durch somatische Mutation zur Ausbildung kommen. Ein klassisches Beispiel ist die heterozygote Konstitution des Retinoblastom-Gens. Weitere (somatische) Mutationen im Wildtyp-Allel erfolgen mit so großer Häufigkeit, dass 90 % der Heterozygoten ein Retinoblastom entwickeln. Ein zweites wichtiges Beispiel eines Tumorsuppressorgens codiert für das p53-Protein. Das zugehörige Gen, TP53, liegt auf dem Chromosom 17p13. Homozygote Mutationen führen

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

zum Li-Fraumeni-Syndrom (OMIM 151623). In den betroffenen Familien treten bereits in einem niedrigen Lebensalter mehrfache primäre Tumoren auf, so unter anderem Brustkrebs, Gehirntumore, Osteosarkome und Leukämie. Die molekulare Analyse hat gezeigt, dass bereits eine Veränderung der Dosis von p53-Protein zur Tumorbildung führen kann. In diesem Fall manifestiert sich eine Mutation als dominant, obgleich das Li-Fraumeni-Syndrom allgemein als rezessiv angesehen wird. Bei dem p53-Protein handelt es sich um einen Transkriptionsfaktor, der als Homotetramer an DNA bindet und die Transkription von Genen induzieren kann, die unter seiner Kontrolle stehen. Das 393 Aminosäuren lange Protein hat aber – ähnlich wie RB1 – eine Schlüsselfunktion in der Zellzykluskontrolle am Übergang von der G1- zur S-Phase (Abb. 5.25). Eine der Funktionen des p53-Proteins liegt in der Aufgabe, die DNA-Replikation zu verhindern, wenn die DNA Schäden aufweist. Die Replikation wird erst nach Reparatur dieser Schäden freigegeben, oder es kommt – bei zu großen Schäden – zur Apoptose. Bei Deletion des TP53-Gens (oder einer loss-of-function-Mutation) wird die DNA jedoch ungehindert repliziert. Als Folge davon kommt es zu Mutationen, die unter anderem wiederum onkogenen Charakter haben können. Die Funktion von p53 ist also sehr komplex. Eine detaillierte Darstellung würde allerdings den Rahmen dieses Buches sprengen; der interessierte Leser sei daher hier auf weiterführende Literatur verwiesen (z. B. Aylon u. Oren 2007). Die Therapie von p53-induzierten Tumoren erweist sich als besonders problematisch, da herkömmliche Chemotherapien im Allgemeinen auch mutagene Effekte haben. Durch Ausfall der DNA-Reparaturkontrolle bei p53-Mutation werden daher die Auswirkungen von Mutationen noch verstärkt und können damit erst recht zu Tumor-induzierenden Neumutationen führen. Es zeigt sich in diesem Fall, dass die Kenntnis der molekularen Bedeutung eines Genproduktes Hinweise auf die Zweckmäßigkeit oder Unzweckmäßigkeit von Therapieansätzen geben kann. Beim Li-FraumeniSyndrom ist der Einsatz einer Chemotherapie offensichtlich unzweckmäßig. Auch präventive Röntgenuntersuchungen (z. B. durch Mammographie) sollten vermieden werden, da sie durch die hohe Mutationsfähigkeit durch Ausfall des DNA-Reparatursystems leicht zu Tumor-induzierenden Mutationen führen können. Es ist in den letzten Jahren erkannt worden, dass genetisch programmierter Zelltod (Apoptosis) eine wichtige Rolle beim Schutz des Organismus vor Tumorerkrankungen spielt. Das p53-Protein ist eines der wichtigen Kontrollproteine, die normalerweise dafür sorgen, dass defekte Zellen einem kontrollierten Zell-

tod unterliegen. Bei seiner Abwesenheit entfällt dieser Kontrollmechanismus, und die Zellen können sich durch den Ausfall der Replikationskontrolle zu Tumorzellen entwickeln.

Das Tumorsuppressorgen TP53 ist an der Kontrolle des Zellzyklus beteiligt. Bei Ausfall der normalen Funktion unterbleibt die Kontrolle auf DNA-Schäden, und es wird keine Apoptose eingeleitet, sodass es zur unkontrollierten Proliferation von Zellen und zur Tumorbildung kommt. Ein weiteres Beispiel für genetische Prädisposition bei Krebserkrankungen ist Brustkrebs (OMIM 114480), nach Hautkrebs die bei Frauen zweithäufigste diagnostizierte Krebserkrankung. Zwar tritt die überwiegende Mehrzahl (70‒80 %) der Fälle sporadisch auf, aber die restlichen 20‒30 % zeigen doch Häufungen in Familien; das Auftreten von Brustkrebs in solchen Familien ist auch mit einem erhöhten Risiko für Gebärmutterkrebs verbunden. Man nimmt an, dass etwa 5-10 Prozent der erblichen Brustkrebserkrankungen mit Mutationen in den Genen BRCA1 und BRCA2 (engl. breast cancer) verbunden sind (auf den Chromosomen 17q21 bzw. 13q12). Keimbahnmutationen in BRCA1 und BRCA2 führen zu einem Risiko für Brust- und Gebärmutterkrebs, das deutlich über dem Bevölkerungsdurchschnitt liegt; allerdings ist das genaue Risiko nicht bekannt und vom Kontext abhängig (Stärke der familiären Belastung, Zugehörigkeit zu ethnischen Gruppen, Umweltfaktoren etc.). Frauen, die Mutationen im BRCA1-Gen tragen, haben ein Risiko von 51‒85 % für Brustkrebs und 22‒66 % für Gebärmutterkrebs; Mutationen im BRCA2Gen führen zu einem geringeren Risiko (33‒95 % für Brustkrebs und 4‒47 % für Gebärmutterkrebs). Umgekehrt führen aber BRCA2-Keimnbahnmutationen zu einem höheren Risiko für Krebserkrankungen an Prostata, Pankreas, Galle und Magen sowie für maligne Melanome und männlichen Brustkrebs. Jedes der beiden BRCA-Gene wird als Tumorsuppressorgen charakterisiert: ï Der Erbgang innerhalb der betroffenen Familien folgt einem dominanten Muster. ï In den beiden Genorten wird bei den betroffenen Familien im Krebsgewebe ein Verlust der Heterozygotie festgestellt, wobei das Krebs-prädisponierende Allel erhalten bleibt. Im Gegensatz zu den familiären Fällen wird allerdings bei den spontanen Brustkrebserkrankungen beim Verlust der Heterozygotie fast immer das Wildtyp-Allel behalten, sodass in diesen Fällen das Knudson,sche Modell (Abb. 12.42) nicht zutrifft.

12.4 Komplexe Erkrankungen

Abb. 12.43 BRCA-Reparatur-Netzwerk. Eine aufgrund eines Doppelstrangsbruchs angehaltene Replikationsgabel führt zur Aktivierung des ATR-Proteins. Diese Kinase phosphoryliert eine Variante des H2A-Histons (γH2AX), aber auch BRCA1 und BRCA2 (auch als FANCD1 bezeichnet). Durch diverse ProteinProtein-Wechselwirkungen werden viele Reparatur-Komplexe an die defekte Stelle herangeführt. Die Proteine der Komplementationsgruppe einer Fanconi-Anämie (FANC) haben für

die DNA-Reparatur weitere wichtige enzymatische Funktionen (FANCJ/BRIP1 ist eine DNA-Helikase; FANCN/PALB2 bindet und stabilisiert BRCA2; FANCD2 (D2) und FANCI (I) werden bei einem DNA-Schaden phosphoryliert und ubiquitiniert). Der FAcore-Komplex enthält weitere FANC-Proteine. ATR: ataxia telangiectasia/Rad3 related protein; BLM: Bloom syndrome protein; P: Phosphorylierung; Ub: Ubiquitinierung. (Nach Wang 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Homologe Gene zu BRCA1 und BRCA2 gibt es auch bei anderen Säugern; die Gene werden ubiquitär exprimiert. Wir gehen heute davon aus, dass beide Proteine Teil eines Netzwerks sind, das für die irrtumsfreie Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen und damit die Integrität und Stabilität des Genoms insgesamt verantwortlich ist. Dies geschieht im Wesentlichen durch Wechselwirkung mit Proteinen, die an der Rekombinationsreparatur beteiligt sind (Kapitel 9.6.3). Eine Übersicht über den aktuellen Stand des Wissens vermittelt Abb. 12.43.

Phänotyp“ aufweisen. Entsprechend bezeichnet man als Mutatorgene solche Gene, die zu Veränderungen in der DNA-Replikation (Kapitel 2.2) oder der Reparatur der DNA (Kapitel 9.6) führen können. Mutationen in Mutatorgenen sind rezessiv erblich, und es besteht ebenfalls ein „Zwei-Treffer-Mechanismus“.

Mutatorgene Das aktuelle Konzept eines „Mutator-Phänotyps“ in der Krebserkrankung gründet auf Beobachtungen, die Boveri vor über 100 Jahren (1902) publizierte. Er vermutete, dass die charakteristischen Wachstumsmuster menschlicher Krebszellen von chromosomaler Aneuploidie verursacht sein könnten. Muller (1951) baute diese Hypothese dahingehend aus, dass Krebs dann entsteht, wenn eine einzige Zelle viele verschiedene Mutationen enthält. Spätere Beobachtungen der „Mutator-DNA-Polymerasen“ (Mutationen in DNAPolymerasen, die dadurch eine geringere Genauigkeit haben; Kunkel 1992) und die Identifikation von Mutationen in DNA-Reparatur-Genen, die mit Krebserkrankungen verbunden waren (siehe oben), haben die Hypothese verstärkt, dass Krebszellen einen „Mutator-

Ein klassisches Beispiel ist die seltene autosomal-rezessive Hautkrebserkrankung Xeroderma pigmentosum (Abb. 12.44). Sie beruht auf erblichen Defekten im UV-Reparatursystem. Patienten mit dieser Krankheit sind hochgradig empfindlich gegen Sonnenlicht oder andere Formen von UVBestrahlung. Es entstehen bei ihnen mit hoher Frequenz Hauttumore an exponierten Körperregionen, besonders im Gesicht oder an den Händen. Außerdem zeigen sie neben veränderter Pigmentierung weitere Krankheitssymptome, wie etwa neurale Degeneration und mentale Retardierung, deren Bezug zu Defekten in den DNA-Reparatursystemen weniger offensichtlich ist. Diese Krankheit ist bei verschiedenen Individuen nicht notwendigerweise auf den gleichen Defekt im UV-Reparatursystem zurückzuführen. Vielmehr sind mittlerweile bereits acht verschiedene Gene (bezeichnet als Komplementationsgruppen XP-A bis XP-G sowie Komplementationsgruppe XP-V) bekannt, deren Mutation zu einem Xeroderma-Phänotyp führen kann.

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Abb. 12.44 a–d Klinische Symptome von Xeroderma pigmentosum (XP). a Trockene Haut mit verschiedenen Hauttumoren (hauptsächlich Strahlenkeratose und großen squamösen Karzinomen an der linken Backe). b Relativ scharfe Abgrenzung von XP-Veränderungen der Haut an Sonnen-exponierten Flä-

chen. c Hautmelanom (Pfeil) mit Flecken. d Basalzell-Karzinom (Pfeil) inmitten typischer unter- und überpigmentierter Haut. (Nach Leibeling et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer

Der Xeroderma-Phänotyp lässt sich Mutationen in zwei unterschiedlichen Reparaturwegen zuordnen (Abb. 9.39; Kapitel 9.6.2): der Nukleotid-Exzisionsreparatur (GGR; Gene XP-A bis XP-G) und der Transkriptions-abhängigen Nukleotid-Exzisionsreparatur (TCR; Gen XP-V). Die Gene der Gruppe XP-A bis XP-G codieren für eine Gruppe von Helikasen, die für Einzelstrangschnitte in der DNA erforderlich sind, die schließlich zur Entfernung von Thymin-Dimeren führt. Außer XP-C sind sie sowohl bei der GGR als auch bei der TCR erforderlich. Das Gen XP-V codiert die DNA-Polymerase η. Es gibt darüber hinaus noch andere Erbkrankheiten, die ihre Ursache ebenfalls in Defekten in DNAReparatursystemen haben, beispielsweise das seltene Cockayne’s Syndrom. Diese Krankheit zeigt einige Symptome, die auch bei Xeroderma sichtbar werden, z. B. Defekte im Nervensystem und mentale Retardierung, aber auch Tremor, Trübungen der Augenlinsen und Gehörstörungen. Für diese Krankheit hat man zwei Komplementationsgruppen, CS-A und CS-B identifiziert, die ebenfalls für Proteine mit Helikase-Funktionen codieren. Diese Enzyme zeigen enge Verwandtschaft zu den von E. coli bekannten Reparaturenzymen des Uvr-Systems.

Genetische Defekte in den UV-Reparatursystemen führen unter anderem zur Entstehung von Hauttumoren in Körperregionen, die einer UV-Bestrahlung ausgesetzt werden. Diese Beispiele lassen uns einige wesentliche Gesichtspunkte der Tumorbildung zusammenfassen: ï Tumoren sind auf die Fehlfunktion von Genen zurückzuführen, die wichtige zentrale Aufgaben im Zellstoffwechsel haben. Oft handelt es sich um Gene, deren Produkte für die Regulation des Zellzyklus, der Proliferationsfähigkeit oder der Differenzierung von Zellen erforderlich sind. ï Fehlfunktionen in Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen entstehen durch Mutation. ï Als Tumor-verursachende Mutationen sind nicht nur der Ausfall oder die strukturelle Veränderung eines Proteins anzusehen, sondern sie können auch durch fehlerhafte Regulation (Überproduktion, konstitutive Proteinsynthese in Zellen, in denen ein Gen normalerweise inaktiv ist), durch überzählige Genkopien, die durch Retroviren in die Zelle eingeführt werden, oder auch durch Translokation in den Funktionsbereich anderer Gene verursacht werden.

12.4 Komplexe Erkrankungen

Generell kommen somit alle Arten von Mutationen als mögliche Ursachen für die Tumorinduktion in Betracht. Die hohen spontanen Mutationsraten, denen jede einzelne Zelle unterworfen ist, erklären auch, warum mit steigendem Lebensalter die Gefahr der Tumorentstehung größer wird: Die Effektivität der Reparatursysteme sinkt mit steigendem Lebensalter, sodass damit die Gefahr einer unkorrigiert verbleibenden Mutation essenzieller Gene erhöht wird.

Es wurde eine Anzahl von Genen identifiziert, deren Deletion oder Mutation zur Tumorbildung führt. Als Folge kann es zu erblicher Prädisposition für die Ausbildung bestimmter Tumoren kommen. Diese entstehen jedoch in vielen Fällen erst in Kombination mit auslösenden Umweltfaktoren. 12.4.2 Asthma Asthma (OMIM 600807) ist eine chronische Entzündung und Überempfindlichkeit der (oberen) Atemwege mit wiederholten Anfällen von Atemnot, Husten und Kurzatmigkeit. Ursache ist eine krankhafte Reaktion der Atemwegsschleimhaut auf verschiedene Reize. Asthma bronchiale betrifft alle Altersklassen. Mit 10 % sind jedoch Kinder unter 10 Jahren – vorwiegend Jungen – besonders stark vertreten. Es ist die häufigste chronische Erkrankung im Kindesalter. Bei erwachsenen Asthmakranken sind Frauen in der Überzahl. Die Gesamthäufigkeit in der Bevölkerung beträgt etwa 3,8 %; die Häufigkeit unter Verwandten 1. Grades ist höher (9,8 %). Bei einem Asthmaanfall schwillt die schon entzündlich gereizte Bronchialschleimhaut an. Eine oftmals vermehrte, zähe Schleimproduktion verengt die Atemwege weiter. Zudem zieht sich die Muskulatur der kleineren Atemwege (Bronchien und Bronchiolen) krampfartig zusammen. Durch diese Vorgänge wird die Atmung, vor allem die Ausatmung, erschwert und damit die Sauerstoffversorgung der Lunge verschlechtert. Viele Asthmafälle werden durch spezifische äußere Reize wie Pollen, Staub, Tierhaare, Schimmel und einige Lebensmittel (Allergene) hervorgerufen. Auch Infektionen der Atemwege führen unter Umständen zu Asthma. Ein großer Teil der Patienten leidet unter Belastungsasthma, das nach körperlicher Anstrengung auftritt und zusätzlich durch unspezifische Reize (z. B. kalte, trockene Atemluft, Rauch, Parfüm, Staub, Abgase) ausgelöst werden kann. Asthma ist damit ein klassisches Beispiel für eine komplexe Erkrankung.

Die Entzündung ist durch die Freisetzung von Mediatoren gekennzeichnet (unter anderem Histamine, Proteasen, Leukotriene und Cytokine) und mit Verletzungen des Epithels, Veränderungen der Permeabilität und Übersekretion von Schleim verbunden. Sie führen schließlich zu einer erhöhten bronchospastischen Antwort auf verschiedene chemische (Staub, Allergene) oder physikalische Reize (Kälte). Asthma ist oft verbunden mit erhöhtem IgE-Spiegel im Serum und der Prädisposition für andere atopische Erkrankungen (Heuschnupfen, Neurodermitis). Die ersten systematischen Untersuchungen zur Genetik von Asthmaerkrankungen wurden schon zu Beginn des 20. Jahrhunderts publiziert (Cooke u. van der Veer 1916). Die Erblichkeit wird nur innerhalb einer gewissen Bandbreite zwischen 36 und 72 % angegeben; auch die Konkordanz zwischen eineiigen Zwillingen ist nicht 100 %. Dennoch haben genomweite Untersuchungen für Asthma-Gene zunächst Kopplungen mit bestimmten Bereichen auf einigen Chromosomen ergeben. Durch kombinierte Anstrengungen der genetischen Epidemiologie, dem Einsatz geeigneter Mausmodelle und der Anwendung verschiedener Hochdurchsatz-Technologien ist es gelungen, einige Aspekte deutlich herauszuarbeiten. Unser heutiges Wissen über diese komplexe Erkrankung verdeutlicht Abb. 12.45. In einer Asthmastudie mit 460 Kaukasiern in Großbritannien und den USA wurde das erste Gen direkt mit Asthma und bronchialer Überreaktion assoziiert (van Eerdewegh et al. 2002). Dazu wurden zunächst Geschwisterpaare untersucht, die neben Asthma auch an bronchialer Überreaktion leiden oder einen erhöhten Serum-Spiegel von IgE aufweisen. LOD-Werte von knapp 4 deuteten auf die Region 20p13 hin – die kritische Region umfasst aber immerhin 4,3 cM. Durch eine Analyse von 135 Basenaustauschen (engl. single nucleotide polymorphisms, SNPs) in 23 Genen (was 90 % der kritischen Region entsprach) wurde ADAM33 als das Gen mit dem höchsten Assoziationsgrad identifiziert. Da möglicherweise eine Kombination bestimmter SNPs das Risiko für eine Asthma-Erkrankung erhöht, wurden entsprechende Haplotypen erstellt und mit einer Kontrolle von 2000 Gesunden verglichen. Insgesamt 14 Haplotypen ergaben dabei eine hohe oder sehr hohe Signifikanz. Der Weg zur Identifizierung von ADAM33 als Prädispositionsgen für Asthma ist in Abb. 12.46 zusammengefasst. ADAM33 gehört zur Familie von membrangebundenen Metalloproteasen (engl. a disintegrin and metalloprotease domain). Die ADAM-Proteine waren zunächst als Zelloberflächenproteine identifiziert worden. Sie

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Abb. 12.45 Asthma als komplexe Erkrankung. Asthma ist eine komplexe Erkrankung, die eine Überreaktion, verstärkte Schleimproduktion und Entzündungen der Atemwege sowie erhöhte IgE-Werte im Serum beinhaltet. In genetisch prädisponierten Personen lösen anomale Reaktionen der T-Zellen auf äußere Reize (z. B. virale Infektionen oder Allergene) diese Symptome aus. Die roten Symbole in der Abbildung repräsentieren Kandidatengene, für die eine Assoziation mit Asthma gezeigt wurde. ADAM33:

Disintegrin und Metalloproteinase; C5a(R): Komplement-Faktor 5a (Rezeptor); CD (Zahl): Oberflächenantigene; CTLA4: cytotoxic T lymphocyte-associated; DPP10: Dipetidylpeptidase 10; IL-(Zahl/R): Interleukine (Rezeptoren); MCHII: major histocompatibility complex II; PHF11: plant homeodomain (PHD) finger protein-11; TIM1: T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing protein; TCR: T-Zell-Rezeptor. (Nach Wills-Karp u. Ewart 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

haben aber auch Funktionen in der Zelladhäsion, in der Weitergabe zellulärer Signale und in der Proteolyse. Die Expression von ADAM33 in Fibroblasten der Lunge und Muskelzellen der Bronchien (aber nicht in Epithelzellen der Bronchien) unterstützen ebenfalls seine Rolle bei Asthma. Insbesondere die Kombination einzelner Basenaustausche ist mit Asthma hoch signifikant assoziiert.

zellulären Mucin-Domäne) nach einer Hepatitis-AInfektion in der Lage ist, vor Asthma zu schützen. Das geht einher mit der Beobachtung, dass die stark rückläufigen Zahlen der Hepatitis-A-Infektionen in westlichen Ländern seit den frühen 1970er-Jahren mit einer Verdoppelung der Asthma-Rate einhergeht. Dieser mögliche Zusammenhang unterstützt die „HygieneHypothese“, die besagt, dass Allergien heute deshalb immer häufiger auftreten, weil Menschen weniger mit Keimen in Berührung kommen als früher. Die Untersuchung unterstreicht die Bedeutung von Gen-UmweltInteraktionen für die menschliche Gesundheit.

Ein weiteres interessantes Gen ist TIM1 (engl. T-cell immunoglobulin and mucindomains containing protein). Die mögliche Beteiligung dieses Gens an der Ausprägung von Asthma wurde durch einen Vergleich mit entsprechenden Fragmenten der Maus ermöglicht (Details des experimentellen Ansatzes zeigt Abb. 12.47). Interessant dabei ist, dass dieses Gen schon vorher als HAVCR1Gen identifiziert wurde ‒ weil es nämlich den zellulären Rezeptor für das Hepatitis-A-Virus codiert. Außerdem wurde gezeigt, dass eine Variante des TIM1-Gens mit einem Einschub von 6 Aminosäuren (in der extra-

Asthma ist eine chronische Entzündung und Überempfindlichkeit der oberen Atemwege, die häufig durch äußere Reize hervorgerufen wird. Wie für komplexe Erkrankungen typisch, werden mehrere chromosomale Regionen für beteiligte Gene diskutiert. Kandidaten sind ADAM33, das für eine membrangebundene Metalloprotease codiert, und TIM1, das für einen Hepatitis-A-Virus-Rezeptor codiert.

12.4 Komplexe Erkrankungen

Abb. 12.46 Die Entdeckung des Asthma-Gens ADAM33. Eine klassische genomweite Untersuchung zeigte eine deutliche Assoziation der chromosomalen Region 20p13 mit Asthma. Die Region (2,5 MB) wurde mithilfe von BACs (S. 107) sequenziert; es wurden darin 40 Gene identifiziert. Eine Feinanalyse mithilfe von SNPs in den codierenden Abschnitten von 23 dieser Gene zeigte die höchste signifikante Assoziation für

ADAM33. Der Transmissions-Disequilibrium-Test (TDT; S. 625) und eine Haplotyp-Analyse (S. 621) in 5 Familien unterstützte die Assoziation von ADAM33 mit Asthma und bronchialer Überempfindlichkeit (BHR). Die Expression von ADAM33 in der Lunge wurde durch Northern Blot und PCR bestätigt. IgE: Immunglobulin E. (Nach Wills-Karp u. Ewart 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

BALB/c-Mäuse mit hoher IL-4-Aktivität und BHR

HBA-congene Mäuse mit niedriger IL-4Aktivität und BHR

Congene und Rückkreuzungsstämme

Fragment von DBA/2Mäusen, homolog zum menschl. Chr. 5q23-35 Chromosom 11

Chromosom 11

(BALB/c x HBA)F1 Genetische Kopplungsanalysen deuten auf Kim1

Phänotypisierung der N2-Mäuse

Kopplungsanalyse

Chromosom 11

Positionsklonierung Tim3 Tim1

Assoziationsstudie Atopie-freie Kontrolle

Atopische Fälle

Tim1Variante T-Zelle Validierung in Patienten und Kontrollen

Hemmung

TH2

kein Asthma

HAV Tim TH2 T-Zelle

Abb. 12.47 Identifizierung von TIM1 als mögliches AsthmaEmpfindlichkeitsgen. In diesem Ansatz wurde die Aussagekraft congener Mausstämme verwendet, um neue Kandidatengene zu identifizieren. Die Mäuse der verschiedenen Stämme (BALB/c bzw. HBA) unterscheiden sich in ihrer physiologischen Konstitution (hohe bzw. niedrige IL-4-Aktivität und bronchiale Überempfindlichkeit, BHR); genetisch sind die HBA-Mäuse durch ein Fragment des DBA/2-Stamms charakterisiert, das diese geringe Aktivität auf einem BALB/c-Hintergrund vermittelt. Die Asthmaanfälligkeit war gering wie bei den ursprünglichen DBA-Mäusen und zeigt, dass es sich dabei um einen rezessiven Phänotyp handelt. Auskreuzung nach BALB/c und Rückkreuzung erlaubt die Aufspaltung der Phänotypen und ermöglicht

Asthma

eine Kopplungsanalyse. Die Feinkartierung auf dem Chromosom 11 ergab Hinweise auf Mitglieder der Tim-Genfamilie (engl. T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing protein) in dem Fragment, das ursprünglich aus den DBA/2-Mäusen kam. Tim1 der Maus ist homolog zu dem Gen HAVCR1 des Menschen, das für den zellulären Rezeptor des Hepatitis-Virus codiert (die ältere Bezeichnung Kim1 bezieht sich auf die Niere: kidney injury molecule). Eine Insertion von 6 Aminosäuren in diesem Gen ist offensichtlich in der Lage, nach einer Hepatitis-A-Infektion das Ausbrechen von Asthma zu vermeiden – oder umgekehrt: Eine Deletion von 6 Aminosäuren führt zu einer erhöhten Empfindlichkeit. (Nach Wills-Karp u. Ewart 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

12.4 Komplexe Erkrankungen

12.4.3 Diabetes Unter normalen physiologischen Bedingungen führt der Eintritt von Glucose in die β-Zellen des Pankreas zur Sekretion von Insulin. Das abgegebene Insulin wird über das Blut zu den peripheren Geweben transportiert, wo es an die Insulin-Rezeptoren bindet. Die Insulin-Rezeptoren gehören zur Klasse der Tyrosinkinasen und setzen eine Kaskade biochemischer Prozesse in Gang, die am Ende die Aufnahme von Glucose durch die Zelle bewirken und seine Umwandlung in Energie oder in die Speicherform Glykogen. Die dauerhafte Erhöhung des Blutzuckerspiegels ist dagegen eine Krankheitsform und wird als Diabetes bezeichnet. Sie ist in der Bevölkerung der westlichen Welt eine wichtige Ursache von Herzinfarkt, Schlaganfall, Nierenversagen, Gefäßschäden und Blindheit (Abb. 12.48). Klinisch unterscheidet man verschiedene Formen (OMIM zeigt über 370 Einträge zu diesem Stichwort!),

Abb. 12.48 Genetische Determination und pathogene Stoffwechselwege führen zu Diabetes mellitus. Genetische Anfälligkeit (blau) in Verbindung mit Umweltfaktoren kann zu einem Anstieg des Blutzuckerspiegels führen (grün-roter Gradient), der wiederum zu verschiedenen weiteren klinischen Manifestationen führen kann. Die wichtigsten sind Ketoacidose und Koma (dunkelrot), aber auch Angiopathien, die schließlich zu Erkrankungen verschiedener Organe führen können (rot). Typ-

die aber im Wesentlichen zwei Grundtypen zugeordnet werden können: ï Typ I ist insulinabhängig und tritt meist im Adoleszenzalter auf (0,2–0,3 % der Gesamtbevölkerung, 5–10 % aller Diabetesformen, OMIM 222100); ï Typ II (2–5 % der Gesamtbevölkerung, 90–95 % aller Diabetesfälle, OMIM 125853) ist nicht von Insulin abhängig und tritt meist in späterem Alter auf (leichtere Verlaufsform). Weiterhin können von diesen beiden Grundtypen noch zwei weitere Formen abgegrenzt werden. Die eine wird als „MODY-Diabetes“ bezeichnet (engl. maturityonset diabetes of the young; OMIM 125850), weil diese Form meist vor Anfang des 20. Lebensjahres auftritt. MODY folgt übrigens einem autosomal-dominanten Erbgang und ist für etwa 1–2 % der Fälle von Diabetes verantwortlich. Die andere Form kann als „Schwangerschaftsdiabetes“ bezeichnet werden: Etwa 1–3 % der

I-Diabetes (violett) führt über Autoimmunprozesse zur Zerstörung des Pankreas und kann durch Insulin behandelt werden. Dagegen ist Typ-II-Diabetes (blau) durch eine Insulinresistenz gekennzeichnet. MODY (braun; engl. mature onset diabetes of the young) wird als autosomal-dominantes Merkmal vererbt und durch Mutationen in verschiedenen Genen hervorgerufen (Tabelle 12.8). (Nach Vogel u. Motulsky 1997, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Frauen zeigen während der Schwangerschaft eine Glucoseintoleranz; die meisten davon (90 %) entwickeln später Diabetes mellitus. Typ-I-Diabetes wird durch eine Unfähigkeit zur Insulinproduktion aufgrund der Zerstörung der β-Zellen des Pankreas verursacht. Die genetische Analyse dieses Typs gestaltete sich lange Zeit sehr schwierig und hat viel dazu beigetragen, Diabetes als den „Alptraum der Genetiker“ zu bezeichnen; sogar die Konkordanz unter eineiigen Zwillingen ist mit 40–50 % relativ gering. In den letzten Jahren haben sich allerdings die Hinweise verdichtet, dass es sich beim Diabetes Typ I im Wesentlichen um eine Autoimmunerkrankung handelt, d. h. der Erkennung von körpereigenen Stoffen als „fremd“. Die Hinweise dazu kamen aus drei Quellen: Die Anwesenheit entzündlicher Infiltrate in den Langerhans’schen Inseln, die Kopplung an den Haupthistokompatibilitäts-Komplex (engl. major histocompatibility complex, MHC) und die Anwesenheit von Autoantikörpern, die mit Autoantigenen der Langerhans’schen Inseln reagieren. Der Haupthistokompatibilitäts-Komplex wird bei Menschen als humaner Leukocyten-Antigen-Komplex bezeichnet (engl. human leucocyte antigen complex, HLA). Der Genort auf dem Chromosom 6 enthält über 200 Gene, die die Proteine der HLA-Klassen I und II codieren. Die Hauptaufgabe der HLA-Proteine ist die Präsentation von Peptiden als Antigene für die entsprechenden Rezeptoren auf CD4+- und CD8+-T-Zellen. Die Moleküle der Klasse I werden in den meisten kernhaltigen Zellen exprimiert und von den Genorten HLA-A, -B oder -C codiert. Die Klasse-II-Proteine werden meistens in Antigen-präsentierenden Zellen gefunden (z. B. Makrophagen und dendritische Zellen) und von den Genorten HLA-DP, -DQ und -DR codiert. Die Gene für beide Klassen zeigen einen hohen Grad an Polymorphismen und entsprechend viele Allele. Im Typ-I-Diabetes konnten nun ganz deutlich Risiko-Patienten von Nichtrisiko-Patienten aufgrund spezifischer HLA-Allel-Kombinationen (Haplotypen) unterschieden werden. Die deutlichste Kopplung ergab sich dabei zu den DQ- und DR-Gruppen der HLA-II-Klasse. Unter den Autoantigenen ragen drei in besonderer Weise heraus: Das erste ist eine Isoform der Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD65). Dieses Enzym besteht aus 585 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 65 kDa; das entsprechende Gen ist auf dem Chromosom 10 (10p11) lokalisiert. Etwa 60–80 % der neu diagnostizierten Typ-I-Diabetiker besitzen Autoantikörper gegen dieses Enzym, die überwiegend gegen bestimmte Oberflächenstrukturen (Epitope) des mittleren und C-terminalen Bereichs des Enzyms gerichtet sind. Das zweite wichtige Autoantigen gehört zur Familie der membrangebundenen Protein-Tyrosinphosphata-

sen und wird als IA-2 oder ICA512 bezeichnet. Es besteht aus 979 Aminosäuren, die zu einem Molekulargewicht von 106 kDa führen; das Gen ist auf dem Chromosom 2 (2q35) lokalisiert. Das Protein kommt in sekretorischen Vesikeln endokriner und neuronaler Zellen vor; Untersuchungen an Knock-out-Mäusen deuten darauf hin, dass es für die Sekretion von Insulin wichtig ist. Auch gegen dieses Enzym haben eine große Anzahl neu diagnostizierter Diabetiker (60–70 %) Antikörper, die exklusiv die intrazelluläre Domäne von IA-2 erkennen. Das dritte wichtige Autoantigen ist das Insulin selbst. Es ist nur aus 51 Aminosäuren aufgebaut; das Gen ist auf dem Chromosom 11 (11p15) lokalisiert. Die Mehrzahl der Autoantikörper erkennt Oberflächenstrukturen der B-Kette. Autoantikörper gegen Insulin findet man schon bei sehr jungen Kindern in vor-diabetischen Stadien; allerdings ist die Zahl der jugendlichen Typ-I-Diabetiker mit Autoantikörpern gegen Insulin geringer (nur 30–50 %) als bei den oben genannten Gruppen. Der Nachweis dieser Autoantikörper ist schon lange vor dem Ausbruch der Erkrankung möglich, was deutlich macht, dass Typ-I-Diabetes eine chronische Erkrankung darstellt. Andererseits hat diese Untersuchung auch gewisse Vorhersagekraft hinsichtlich der Ausbruchswahrscheinlichkeit von Diabetes. Bei Anwesenheit aller drei Autoantikörper besteht eine Wahrscheinlichkeit von 60–80 %, dass die Krankheit auch ausbricht. Eine genetische Ursache für die Bildung der Autoantikörper liegt wahrscheinlich in verschiedenen Kombinationen von HLA-Haplotypen, die unter bestimmten Umweltbedingungen zu einer Autoimmunreaktion führen. Führende Kandidaten für die Herstellung dieser Bedingungen sind Virusinfektionen. Patienten, die an Diabetes Typ I leiden, haben oft weitere Autoimmunerkrankungen wie Schilddrüsenerkrankungen (15‒30 %) oder Zoeliakie (4‒9 %). Diese Erkrankungen haben eine familiäre Häufung und zeigen organspezifische Autoantikörper, die zu prognostischen Biomarkern entwickelt werden können. Gene, die für den Ausbruch dieser Erkrankungen diskutiert werden, sind wiederum bestimmte HLA-Haplotypen sowie MIC-A (MHCI-verwandtes Gen A), PTPN22 (codiert für eine Tyrosinphosphatase) und CTLA4 (codiert für das cytotoxische T-Lymphocyten-assoziierte Antigen-4; Barker 2007). Mutationen im Insulin-Gen (Gensymbol: INS) selbst verursachen seltene Formen des Diabetes und zeigen ähnliche Verlaufsformen wie MODY. Andere Variationen des Insulin-Gens (unterschiedliche Zahl von Wiederholungssequenzen oder SNPs) spielen eine größere

12.4 Komplexe Erkrankungen

Abb. 12.49 Polymorphismen im Insulin-Gen. Variationen im Insulin-Gen spielen eine wichtige Rolle in der Anfälligkeit gegenüber Diabetes, besonders die VNTR-Region (engl. variable number of tandem repeats) in seinem Promotor. Die Anzahl der Wiederholungen des 14-bp-Elementes korreliert mit der Expression von Insulin im Pankreas und Thymus, aber auch mit der Expression des IGF2-Gens (Insulin-Wachstumsfaktor 2) in der Plazenta; dieses Gen liegt unmittelbar unterhalb des Insulin-Gens. Eine niedrige Zahl der Wiederholungseinheiten (26–63) ist mit

einem hohen Risiko für Diabetes verbunden, wohingegen eine hohe Anzahl der Wiederholungseinheiten (140–200) als Schutz vor Diabetes betrachtet wird. Oberhalb des Insulin-Gens befindet sich das Gen für die Tyrosin-Hydroxylase (TH), ein wichtiges Enzym bei der Herstellung von Dopamin. Weitere Polymorphismen sind durch ihre relative Lage zum Transkriptionsstart (in bp) und die entsprechenden Restriktionsenzyme angegeben. UT (blau): nicht translatierte Bereiche des Transkripts. (Nach Černá 2008, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Rolle bei der Anfälligkeit gegenüber Typ-I- und TypII-Diabetes (Abb. 12.49). Die unterschiedliche Anzahl der Wiederholungselemente (VNTR, engl. variable number of tandem repeats) beeinflusst die Expression von Insulin im Thymus und ist in unterschiedlicher Weise mit dem Risiko assoziiert, an Diabetes zu erkranken: Homozygotie für eine niedrige Zahl von Wiederholungseinheiten (26‒63 Wiederholungen: Klasse I) ist mit einem hohen Risiko für Diabetes verbunden, wohingegen die hohe Zahl von Wiederholungseinheiten (140‒200 Wiederholungen: Klasse III) eher eine dominante Schutzwirkung hat. Die Klasse-I-Wiederholungen kommen bei Europäern zu etwa 70 % vor; Klasse-III-Wiederholungen dagegen nur zu etwa 30 % (die mittlere Häufigkeitsgruppe – Klasse II – spielt bei Europäern keine Rolle). Klasse-III-Allele führen zu höherer Expression von Insulin im Thymus. Im Gegensatz zum Typ-I-Diabetes hat der Typ II eine wesentlich klarere genetische Komponente; die

Tabelle 12.8 Gene für MODY-Diabetes Krankheit

Protein/Gen (OMIM)

Chromosom

MODY 1

HepatocytenKernfaktor 4α (HNF4A)

20q12

MODY 2

Glucokinase (GCK)

7p15

MODY 3

HepatocytenKernfaktor 1α (TCF1)

12q24

MODY 4

Insulin-PromotorFaktor 1 (IPF1)

13q12

MODY 5

HepatocytenKernfaktor 2α (TCF2)

17q12

MODY 6

Neurogene Differenzierung (NeuroD1)

2q32

Nach Gloyn (2003) und OMIM 606391

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Abb. 12.50 Genomweite Assoziationsstudien für DiabetesTyp-II-Gene. Die Abbildung gibt eine Übersicht über die chromosomalen Regionen, die mögliche Kandidatengene für Diabetes Typ II enthalten. Die y-Achse repräsentiert die −log10-pWerte und die x-Achse jeden der 400.000 untersuchten SNPs. Der Punkt an den Pfeilen gibt den Ort des am höchsten assoziierten SNPs in jeder der 9 bekannten Diabetes-Typ-II-Regionen an. CDKAL1: CDK5 regulatory-subunit-associated protein 1-like 1; CDKN2A–2B: CDK-Inhibitor; FTO: fat mass and obesity-

associated; HHEX: haematopoietically expressed homeobox; IDE: Insulin-abbauendes Enzym; IGF2BP2: insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 2; KCNJ11: K+ inwardly-rectifying channel, subfamily J, member 11; PPARG: peroxisome proliferator-activated receptor-γ-gene; TCF7L2: transcription factor 7-like 2 (spezifisch für T-Zellen, HMG-Box); WFS1: Wolframin (Mutationen führen zum Wolfram-Syndrom). (Nach Frayling 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Konkordanzrate bei eineiigen Zwillingen liegt hier bei 80–100 %. Typ-II-Diabetes hat einen klaren Bezug zu Fettleibigkeit (gemessen als Körpermassenzahl; engl. body mass index; Risiko ab 30 kg/m2), und die klinischen Bilder zeigen ein vermindertes Ansprechen in den peripheren Geweben auf Insulin („Insulin-Resistenz“). Wie bei vielen komplexen Krankheiten ist auch das Auftreten von Diabetes Typ II von Umweltfaktoren abhängig. So nimmt dieses Krankheitsbild zu, wenn bäuerliche Gesellschaften sich mehr an städtische Gewohnheiten und einen westlichen Lebensstil anpassen. Allerdings haben die Untersuchungen der (relativ) wenigen Fälle des MODY-Diabetes dazu geführt, die genetischen Komponenten besser zu verstehen, weil diese klar abgrenzbaren Krankheitsbilder auch genetisch einheitlicher sind; Tabelle 12.8 gibt einige Beispiele dazu. Aber auch die Anwendung der schon mehrfach erwähnten SNP-Technologie bei systematischen, genomweiten Reihenuntersuchungen hat einige Hinweise auf bestimmte Chromosomenabschnitte gebracht (Abb. 12.50). Insgesamt haben diese Studien 11 Regionen identifiziert, die das Risiko für Typ-IIDiabetes in der europäischen Bevölkerung beeinflussen. Den größten Einzelbeitrag leistet das Gen TCF7L2 (frühere Bezeichnung TCF4; Chromosom 10q25; OMIM 602228), das für einen Transkriptionsfaktor codiert und über die Proglucagon-Hemmung die

Insulin-Sekretion beeinflusst; das Risiko-Allel trägt etwa ein Drittel der Bevölkerung. TCF7L2 ist darüber hinaus auch an der Entstehung von Dickdarmkrebs beteiligt.

Diabetes führt zu einer dauerhaften Erhöhung des Blutglucose-Spiegels. Diabetes Typ I ist insulinabhängig und ist im Wesentlichen eine Autoimmunerkrankung. Diabetes Typ II ist insulinunabhängig und beruht auf verschiedenen Störungen in der Insulin-Signalkette. In den letzten Jahren haben epidemiologische Studien darauf hingewiesen, dass ein deutlicher Zusammenhang besteht zwischen dauerhafter Mangelernährung des Embryos und einem erhöhten Risiko einer Glucose-Intoleranz und an Diabetes zu erkranken. Ohne dass man bisher die Zusammenhänge genau kennt, scheint klar zu sein, dass unterernährte Embryonen mit geringeren β-Zellen geboren werden; dieses Defizit kann in der weiteren Entwicklung offensichtlich nicht aufgeholt werden (Abb. 12.51). Als Ursachen werden auch epigenetische Mechanismen diskutiert (Remacle et al. 2007).

12.5 Genbasierte Diagnose- und Therapieverfahren

Abb. 12.51 Schwangerschaft und Diabetes in den Kindern. Die Abbildung zeigt mögliche Mechanismen, durch die Mangelernährung durch die Mutter (wenig Kalorien, wenig Proteine) die Masse der β-Zellen im Pankreas des Embryos (und damit auch des späteren Erwachsenen) beeinflussen kann. Die

Mangelernährung des Embryos kann durch Fehlernährung, Rauchen oder Alkoholgenuss der Mutter, aber auch durch Infektionen oder Fehlfunktion der Plazenta verursacht werden. (Nach Reusens u. Remacle 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

12.5 Genbasierte Diagnoseund Therapieverfahren

Erbkrankheit vorhanden ist. Da die heutigen molekularen Marker (Mikrosatelliten und SNPs) einfach zu handhaben sind, werden sicherlich in der nächsten Zeit Familienanalysen zunehmen. Außerdem können durch eine Optimierung der statistischen Analysen auch eher Aussagen für kleine Familien gemacht werden. Bei Vorliegen einer positiven Stammbaumanalyse wird sicherlich auch in der Zukunft zu einer pränatalen Diagnostik geraten (Abb. 12.52). Dabei können nicht nur Untersuchungen auf Chromosomenaberrationen durchgeführt werden. Die einfache, schnelle und präzise Durchführung der Polymerasekettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR; Technik-Box 4) hat das Anwendungsspektrum deutlich erweitert und damit zu einer rasanten Zunahme gendiagnostischer Verfahren geführt. In der humangenetischen Beratung spielt die PCR-basierte Gendiagnostik eine immer größere Rolle, da sie in vielen Fällen andere diagnostische Verfahren ergänzt und auch Voraussetzung für eine effiziente Therapie ist. So ist z. B. in manchen Fällen eine Abgrenzung der Hämophilie A von bestimmten Formen der vonWillebrand-Jürgens-Erkrankungen nur über eine entsprechende molekulare Diagnostik möglich. Technisch ist es dabei unerheblich, ob die PCR an Präimplantationsembryonen, pränatal, an Kleinkindern oder Erwachsenen durchgeführt wird, da die Empfindlichkeit der analytischen Methodik außerordentlich hoch ist.

12.5.1 Molekulare Diagnostik, Familienberatung und Reihenuntersuchungen Die vorangegangene Besprechung erblicher Krankheiten und im weiteren Sinne genetisch bedingter Fehlentwicklungen (im Mittel zeigen etwa 2 % aller Neugeborenen solche Abweichungen) macht deutlich, welchen wichtigen Stellenwert die Kenntnis von diesen Erkrankungen hat, um so rechtzeitig die angemessene medizinische Hilfe anbieten zu können. Erbkrankheiten werden auf absehbare Zeit ein schwerwiegendes medizinisches Problem bleiben – daran werden auch alle Fortschritte der Gentechnologie in nächster Zeit noch nichts Grundsätzliches ändern. Die an sie gestellten Erwartungen werden allerdings häufig durch unangemessene Übertreibungen zu hoch angesetzt. Ein wesentliches Kriterium für eine genetische Diagnostik ist die Frage, ob bestimmte Krankheitsbilder in einer Familie gehäuft auftreten. Stammbäume dienen dabei nicht nur der theoretischen Analyse möglicher erblicher Erkrankungen, sondern sind entscheidend für die Erkenntnis, dass in einer Familie eine bestimmte

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen a Fruchtwasserpunktion (Amniozentese) Plazenta Nabelschnur Uterus Amnionhöhle Ultraschallgerät

Amniozentesenadel

b Chorionzottenbiopsie Ultraschallgerät

Amnionhöhle villöses Chorion Chorionhöhle Biopsie-Nadel (Spinalnadel) Uterushöhle Uteruswand

Abb. 12.52 a, b Amniozentese und Chorionzottenbiopsie. a Amniozentese (~ 15. Schwangerschaftswoche): Das Fruchtwasser enthält embryonale Zellen. Zu deren Analyse werden etwa 10–20 ml Fruchtwasser entnommen, die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und in vitro kultiviert. Nach etwa 2 Wochen können Zellen auf ihren Karyotyp (Abb. 6.2 und 6.5) und mit biochemischen und molekulargenetischen Methoden analysiert werden. b Chorionzottenbiopsie (ab der 11. Schwangerschaftswoche): Es wird etwa 10–15 mg Zottengewebe entnommen; daraus kann direkt DNA zur molekulargenetischen Untersuchung gewonnen werden. Für weitere Untersuchungen müssen verschiedene Kulturen angelegt werden. (Nach Schaaf u. Zschocke 2008, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Eingesetzt wird diese Technik nicht nur in der Diagnostik von familiären Erbkrankheiten, sondern auch in der forensischen Medizin und Kriminalistik. Hier nutzte man schon bisher die hohe Empfindlichkeit der PCR-Reaktionen, da einzelne Haare, Blutflecken auf der Kleidung oder auch Schleimhautabstriche im Mund ausreichen, um genügend DNA für eine molekularbiologische Analyse zu gewinnen. Beim genetischen Fingerabdruck führt eine Spur zu einem unter 100 Milliarden Menschen. Es gibt keine zwei gleichen genetischen Fingerabdrücke (Ausnahme: eineiige Zwillinge). Es besteht insofern kein Zweifel daran, dass

beim Vergleich verschiedener Marker eine eindeutige Zuordnung zu einer individuellen Person möglich ist (Vec 2001). Die Verfeinerung dieser Methoden wird in naher Zukunft die Aufklärungsraten von Verbrechen deutlich erhöhen. Die Methode des „genetischen Fingerabdrucks“ verwendet im Wesentlichen Mikrosatelliten (engl. short tandem repeats, STR), die über PCR amplifiziert und danach in einem Elektropherogramm analysiert werden. Die STRs enthalten dabei im Allgemeinen bis zu 50-mal kurze DNA-Wiederholungseinheiten, die aus 2 bis 6 Basen bestehen. Um ein „Stottern“ der DNA-Polymerase während der PCR-Reaktion zu vermeiden, werden gerne STRs mit 4er-Wiederholungssequenzen verwendet (z. B. GATA). Die unterschiedliche Häufigkeit der Wiederholungssequenz führt zu unterschiedlichen Längen der Fragmente (vgl. Abb. 10.27). Dieser Fragmentlängenpolymorphismus von STRs zeigt ein hohes Maß an Heterozygotie. Dennoch müssen, um eine hohe Spezifität zu erzielen, in einer Probe mehrere solcher STRs oder Mikrosatelliten untersucht werden. Die chromosomale Verteilung verschiedener Marker zeigt Abb. 12.53. Die Wahrscheinlichkeit, dass zwei Menschen bei 8 verschiedenen STRs das gleiche Muster haben, liegt bei etwa 1:1013. Zur Bestimmung des männlichen Geschlechts wird eine kleine Deletion im 1. Intron der Y-spezifischen Form des Amelogenin-Gens verwendet (Gensymbol: AMELY; Abb. 12.35). Der Marker D21S11 kann auch verwendet werden, um eine Trisomie 21 (Kapitel 12.2.1) zu identifizieren. In Abb. 12.54 wird ein Beispiel eines automatischen STR-Profils gezeigt. Der Übergang sowohl von der humangenetischen Beratung als auch der gruppenweisen Untersuchung bei Gewaltverbrechen bis hin zu einem bevölkerungsweiten Screening ist fließend. Schon seit langer Zeit wird von jedem Neugeborenen in Deutschland innerhalb weniger Tage nach der Geburt ein Tropfen Blut aus der Ferse abgenommen und in einem enzymatischen Test auf das Vorliegen von Phenylketonurie (Kapitel 12.3.1) getestet. Durch das Einleiten einer frühen Diät können Schäden durch diese Erbkrankheit vermieden werden. Es gibt Überlegungen, solche Reihenuntersuchungen auch auf andere Erkrankungen auszuweiten; so ist beispielsweise die Allelhäufigkeit für die Δ508-Mutation bei der Zystischen Fibrose (Mukoviszidose) mit ca. 1:25 in der deutschen Bevölkerung sehr hoch. Da die therapeutischen Verfahren natürlich umso besser wirken, je früher sie angewendet werden, kann eine derartige Reihenuntersuchung durchaus gerechtfertigt werden. Dagegen wird immer wieder auch das „Recht auf Nicht-Wissen“ über die genetische Konstitution eines Individuums ins Feld

12.5 Genbasierte Diagnose- und Therapieverfahren

Abb. 12.53 Quellen menschlicher DNA für die forensische Analytik. Die aus den Zellkernen von Blutstropfen (oder von anderen Körperflüssigkeiten bzw. Geweben) isolierte DNA wird mithilfe verschiedener Marker untersucht, die über das ganze Genom verteilt sind. Verschiedene Kombinationen sind angedeutet (FBI CODIS: Combined DNA-Index System des FBI der USA; SGM: second generation multiplex; Y-spez.: spezifische Wiederholungseinheiten für das Y-Chromosom aus dessen

pseudoautosomaler Region). Die ringförmige mitochondriale DNA (mtDNA) kommt in hoher Kopienzahl im Organismus vor und zeigt besonders in alten oder beschädigten Proben eine gute Stabilität; hier werden vor allem Variationen in den Kontrollregionen untersucht (HVS: hypervariable Sequenz). (Nach Jobling u. Gill 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

geführt. Allerdings sollte bei diesem Argument im Zusammenhang von Reihenuntersuchungen an Neugeborenen immer wieder auch bedacht werden, dass dem Kind auch ein möglicher Vorteil durch eine frühe Diagnose verloren gehen kann, wenn man sich gegen

eine Reihenuntersuchung entscheidet. Dieser Punkt wird sicherlich noch für viele weitere Erbkrankheiten zu diskutieren sein, und zwar in dem Maße, wie die Möglichkeiten der Diagnostik und der Therapie verbessert werden. In Deutschland wurde diese Debatte

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Abb. 12.54 a, b DNA-Fingerabdruck. a Der DNA-Fingerabdruck einer Multiplex-Analyse mit der Markerkombination „SGMPlus“ (Abb. 12.53) identifiziert einen Mann anhand der beiden X- und Y-spezifischen Markerlängen für das Amelogenin-Gen (106 bzw. 112 bp). Die meisten übrigen STRs sind heterozygot und zeigen etwa eine 1:1-Verteilung (charakterisiert durch die Peakhöhe); der Marker D19S433 ist dagegen homozygot. Die Zahlen unterhalb des Peaks bezeichnen die Nummer des jeweiligen Alles, wie es sich aus seiner Länge bestimmen lässt. Es

sind drei Fluoreszenz-Kanäle angegeben (grün, blau und gelb). Die rote Markerspur ist nicht gezeigt. b Die Mischung zweier männlicher DNA-Proben (nur der grüne Kanal ist gezeigt) wird deutlich am Auftreten von mehr als zwei Allelen in unterschiedlichem Mischungsverhältnis: vier Allele von D21S11 in einem 1:1:1:1-Verhältnis sind dafür der deutlichste Hinweis; die Marker D8S1179 und D18S51 zeigen davon abweichende Verhältnisse (2:1:1 bzw. 3:1). (Nach Jobling u. Gill 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

besonders in den Jahren 2007 bis 2009 geführt, als im Deutschen Bundestag das Gendiagnostik-Gesetz beraten und schließlich beschlossen wurde. Leider beschränkt das Gendiagnostik-Gesetz genetische Diagnostik nicht auf die genetische Untersuchung (DNAund Chromosomenuntersuchungen), sondern schließt auch bildgebende und Protein-analytische Verfahren ein, sodass jede biochemische oder Ultraschalluntersuchung zu einer gendiagnostischen Untersuchung wird. Hier besteht sicherlich noch Änderungsbedarf.

liegt. Ein großes Problem wird sein, dass viele Einsender mit der Interpretation der Ergebnisse überfordert sind und vielmehr der Unterstützung eines fachlich ausgebildeten Genetikers bedürfen.

Ende des Jahres 2007 haben zwei Firmen eine 1000-Dollar-Analyse des menschlichen Erbguts angeboten (http://www.decodeme. com/; https://www.23andme.com/): Dazu muss der Interessent eine Speichelprobe einschicken. Untersucht werden etwa 1 Million SNPs; der Einsender bekommt nach etwa 4 Wochen die Informationen über Hinweise auf Risiken bei einigen ausgewählten Krankheiten. Die Liste der Krankheiten wird dabei ständig erweitert, sodass der Einsender mit dem wissenschaftlichen Fortschritt auch ein „Update“ seiner eigenen Daten erhält. Das zeigt einerseits den enormen technischen Fortschritt, aber auch mögliche Gefahren, die nicht nur im möglichen Missbrauch der genetischen Daten durch Versicherungen, Arbeitgeber oder andere Interessierte

Die Verfeinerung genbasierter Diagnose-Verfahren ermöglicht es heute in vielen Fällen, frühzeitig und präzise Krankheiten zu diagnostizieren; entsprechende Verfahren können auch dazu verwendet werden, unklare Familienverhältnisse zu klären und in der Kriminaltechnik Personen zweifelsfrei zu identifizieren. 12.5.2 Gentechnische Aspekte bei der Behandlung von Krankheiten In den vergangenen Jahren wurden viele gentechnische Prozesse in Gang gesetzt, die zunächst nur als Verheißung gesehen worden waren. Wie diese biotechnischen Herausforderungen realisiert werden könnten, war zunächst oft unklar. Meilensteine in der biotechnischen Herstellung von Medikamenten waren einmal die Herstellung von Insulin zur Diabetesbehandlung (Diabetes, Kapitel 12.4.3) und zum anderen des Blutgerinnungsfaktors VIII zur Behandlung der Hämophi-

12.5 Genbasierte Diagnose- und Therapieverfahren

lie A (Hämophilie A, Kapitel 12.3.3). Durch regelmäßige Injektion von Insulin können viele Komplikationen des Diabetes vermieden werden. Insulin zur Therapie wurde lange aus dem Pankreas von Rindern oder Schweinen gewonnen, was jedoch mit mehreren Problemen verbunden war. Erstens unterscheiden sich Schweine- und Rinderinsulin in einer bzw. drei Aminosäuren vom menschlichen Protein. Zweitens war die Reinheit der Präparate nicht immer gesichert, sodass sich bei langfristiger Applikation durch die mehrfache tägliche Injektion oft Komplikationen durch Immunreaktionen ergaben. Außerdem können Kontaminationen des aus Tieren gewonnenen Insulins, beispielsweise durch Viren, weitere Gesundheitsprobleme auslösen. Die gentechnologische Herstellung von Insulin in Bakterien oder Hefen vermeidet solche Probleme und gewährleistet prinzipiell, dass menschliches Insulin mit großer Reinheit in ausreichender Menge zur Verfügung steht. Einen ähnlichen Weg hat die Bluterbehandlung genommen: Zunächst wurden in den 1970er-Jahren Präparate entwickelt, die darauf basierten, dass aus menschlichem Blut der Gerinnungsfaktor VIII in relativ guten Ausbeuten und Reinheit isoliert werden konnte. Allerdings deutete sich Ende der 1980er-Jahre eine Katastrophe an, als immer mehr Bluter an HIV erkrankten, weil die Kontamination des Spenderblutes mit HIV zunächst nicht erkannt und später nicht ausreichend überwacht wurde. Dies hatte zur Folge, dass fast eine ganze Generation von Hämophilie-Patienten gestorben ist. Die gentechnische Alternative beruht auf der Nutzung von tierischen Zellkulturen, die allerdings zunächst Rinderserum zum optimalen Wachstum benötigten. Aufgrund der BSE-Krise am Ende des 20. Jahrhunderts wurde dann die Herstellung rekombinanter Faktor-VIII-Präparate weitgehend auf eine serumfreie Produktion umgestellt. Dieses Beispiel zeigt deutlich, wie die gentechnischen Verfahren die Herstellung von Medikamenten nicht nur vereinfachen und standardisieren, sondern auch von äußeren Risikofaktoren abkoppeln können. Die Arbeiten bei vielen gentechnischen Präparaten gehen jetzt dazu über, die Produkte in ihren Eigenschaften zu verbessern (z. B. die Wirkungsdauer zu verlängern oder ihr antigenes Potenzial zu vermindern). Die Entwicklung monoklonaler Antikörper war in der Mitte der 1970er-Jahre enthusiastisch begrüßt worden, weil man sich davon deutliche Fortschritte in der Therapie versprochen hatte. Es stellte sich aber sehr schnell heraus, dass monoklonale Antikörper zwar in der Grundlagenforschung sehr effizient eingesetzt werden können, aber in der Therapie war es zunächst schwierig, die richtigen Angriffsziele zu definieren. Ein gelungenes Beispiel ist die Entwicklung von Antikörpern gegen den Tumornekrosefaktor TNFα, um so

Autoimmunsymptome in Krankheiten wie rheumatischer Arthritis oder der Crohn’schen Erkrankung vermindern zu können. Eine wesentliche Voraussetzung für die Durchsetzung derartiger biologischer Produkte am Markt bestand in der zunehmenden Verbesserung ihrer Produktionstechnologien: Reinheit des Produktes, keine viralen Erreger (vor allem HIV und Hepatitis C), aber auch serumfreie Zellkulturen, um eine Übertragung von BSE zu vermeiden. Eine weitere wichtige treibende Kraft besteht in der „Humanisierung“ der Antikörper, die ja in Mauszellen hergestellt werden und damit selbst ein eigenes, immunogenes Potenzial aufweisen. Ein großes Entwicklungspotenzial haben auch Antikörper-gestützte Therapieverfahren gegen bestimmte Krebserkrankungen. Dabei zielen die Antikörper besonders auf Oberflächenantigene (CD20, CD33, CD52), Wachstumsfaktoren oder deren Rezeptoren (z. B. EGF, Her2/neu, VEGF), die in Krebszellen in besonderer Weise aktiv sind. Die Entwicklung derartiger Antikörper nimmt ständig zu: Zwischen 1980 und 2005 befanden sich 206 verschiedene Antikörper in klinischen Untersuchungen. Allerdings sind nur 12 davon in mindestens einem Land zugelassen (Reichert u. Valge-Archer 2007). Ein Gebiet, dem einerseits großes Entwicklungspotenzial eingeräumt wird, das andererseits aber auch mit großen technischen Schwierigkeiten zu kämpfen hat, ist der therapeutische Einsatz der RNAi-Technologie (Kapitel 7.5) in der Krebsbekämpfung. Die Möglichkeit, durch RNAi relativ einfach die Expression bestimmter Gene spezifisch auszuschalten, ist zunächst natürlich faszinierend. Diese Therapieform muss aber noch zeigen, dass sie so effektiv ist (oder sogar besser) als andere Therapieverfahren. Bisher beobachtete Nebenwirkungen bestehen in einer unspezifischen Aktivierung von InterferonAntworten bei Säugern und in einer Beeinflussung von Genen mit ähnlichen Sequenzen. Weitere technische Schwierigkeiten bestehen darin, dass auch die therapeutisch eingesetzte RNA ihr Zielgewebe, den Tumor, in adäquaten Konzentrationen erreichen muss, dass sie durch das Immunsystem nicht neutralisiert werden darf und dass Resistenzen vermieden werden. So wurde berichtet, dass eine Punktmutation in einem Gen für einen Tyrosinkinase-Inhibitor die Wirkung des RNAigetriebenen Abbaus der entsprechenden mRNA verhindert hat (Mocellin et al. 2006). Impfstoffe repräsentieren historisch gesehen die etabliertesten und kosteneffizientesten Behandlungsmethoden in der Medizin. So haben die Impfstoffe gegen Pocken die Infektionen von Menschen durch das Variola-Virus eliminiert und die natürliche Übertragung

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

dieses Virus ausgerottet, dessen Beitrag zur Sterblichkeit allein im letzten Jahrhundert 300 Millionen Menschenleben überstieg. Die jüngsten Entwicklungen in vielen Gebieten der Biologie, vor allem aber auch in der Genetik, führten zu einer Renaissance der ImpfstoffForschung. Zweifellos wird dabei das Gebiet der Impfstofftechnologie von den Fortschritten in der Genomforschung und Bioinformatik profitieren. Insbesondere die Möglichkeiten der individuellen Genotypisierung werden es ermöglichen, die Immunantwort von Patientengruppen im Vorfeld abzuschätzen, um die Impfstoffe entsprechend zu optimieren. Waren Impfstoffe ursprünglich dazu gedacht, das Ausbrechen von Krankheiten durch Prävention zu vermeiden (hier liegt auch nach wie vor der Forschungsschwerpunkt für Infektionen durch HIV, Ebola-Virus, Influenza-Viren u. a.), so kommen auch neue Möglichkeiten in Betracht, wie die Modulation der Immunantwort auf andere pathologische Situationen, wie beispielsweise bei neurodegenerativen Erkrankungen (z. B. Alzheimer’sche Erkrankung, Kapitel 13.4.4). Dabei besteht die Möglichkeit, dass Antikörper die Bildung neurologischer Schäden vermeiden. Andere Anwendungsmöglichkeiten zeichnen sich in der Behandlung der Atherosklerose (Antikörper gegen das Cholesterin-bindende Transportprotein), von Allergien und Autoimmunerkrankungen sowie bei der Krebstherapie ab.

Durch gentechnologische Verfahren ist es in vielen

Fällen (z. B. Insulin, Faktor VIII) möglich, Medikamente in ihrer humanen Form und hochrein herzustellen. In weiteren Schritten können die Präparate dann zusätzlich optimiert werden (z. B. Verlängerung der Halbwertszeit). Dadurch wird die Wirkungsweise dieser Medikamente standardisiert und die Möglichkeit von Nebenwirkungen reduziert.

12.5.3 Pharmakogenomik und individualisierte Medizin Eine Perspektive der Genomforschung beinhaltet auch die „personalisierte“ Medizin, d. h. dass Medikamente entwickelt werden, die nicht nur auf eine bestimmte Krankheit abzielen, sondern darüber hinaus auch noch weitere Polymorphismen des Patienten berücksichtigen und damit mögliche Nebenwirkungen vermeiden. Dazu muss die zukünftige Entwicklung von Pharmaka folgende Punkte berücksichtigen: ï Die Wechselwirkung des Medikaments mit seinen entsprechenden „Rezeptoren“ bzw. Interaktionspartnern: Durch Mutationen der entsprechenden Bindestellen können diese Wechselwirkungen von der Medikamentenseite her verstärkt werden; umge-

kehrt können Patienten bei der Anwesenheit von Polymorphismen auf den Reaktionspartner unterschiedlich reagieren. Die Entwicklung leistungsfähiger SNP-Hochdurchsatzverfahren kann diese Unterschiede erkennen. ï Die Aufnahme und Verteilung des Medikaments im Körper: Daran sind in vielfacher Weise Transportprozesse beteiligt, die von entsprechenden Proteinen gesteuert werden. Es ist denkbar, dass SNPs in Transportergenen die pharmakokinetischen Eigenschaften von Stoffen entscheidend beeinflussen; diese müssen daher mit untersucht werden bzw. schon bei der Herstellung der Medikamente berücksichtigt werden. ï Die Ausscheidung des Medikaments aus dem Körper: Dazu gehören aktive und passive Prozesse. Die vielfache Arzneimittelresistenz (engl. multiple drug resistance, MDS) ist ein Phänomen, das bei Krebspatienten bekannt ist und das nicht nur bei der Therapie berücksichtigt werden muss, sondern auch schon bei der Entwicklung neuer Medikamente. Pharmakogenetische Unterschiede von Patienten haben oft ihre Ursache in populationsbedingten Unterschieden in Fremdstoff-metabolisierenden Enzymen. Daher werden zukünftig Medikamente nicht nur auf ihre möglichen Einflüsse auf den Metabolismus am Computer getestet werden (solche Vorhersage-Programme gibt es bereits), sondern auch mit ihren zum jeweiligen Zeitpunkt vorhandenen Varianten verglichen werden. Umgekehrt wird sich auf der Patientenseite eine genomische Voruntersuchung entwickeln, wobei bestimmte Allele routinemäßig überprüft werden, von denen bekannt ist, dass sie bei der Antwort des Körpers auf ein Medikament die Wirkung beeinflussen (siehe oben: Aufnahme, Transport und Elimination). Damit wird sich das Bild der pharmazeutischen Industrie in den nächsten Jahren deutlich ändern. Es scheint allerdings, dass dieser Prozess nicht so schnell abläuft, wie von vielen erwartet, da sich oft Erkenntnisse aus den Labors der Grundlagenwissenschaften nur langsam umsetzen lassen (Valdes et al. 2003). Ein Beispiel ist das nicht-kleinzellige Lungenkarzinom. Daran erkranken in Deutschland jährlich 32.000 Menschen. Die meisten Patienten sterben trotz Chemotherapie innerhalb eines Jahres; in nur ca. 10 % der Fälle wird der Krebs mit Iressa erfolgreich therapiert. Iressa (allgemeiner Name: Gefitinib, ein Anilinchinazolin) hemmt die KinaseAktivität des Rezeptors für den epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR). In den klinischen Studien wurde beobachtet, dass der Lungenkrebs bei Japanern besser

12.5 Genbasierte Diagnose- und Therapieverfahren

Tabelle 12.9 Individualisierte Medizin: einige wichtige Gene Gen

Medikament

FDA-lizenzierter Test?

Krankheit/ Therapieform

Her2

Trastuzamab

ja

Krebs

EGFR

Erlotinib

ja

Krebs

TPMT

6-Mercaptopurin

ja

Leukämie

TPMT

Azathioprin

ja

Crohn,sche Erkrankung

UGT1A1

Irinotecan

ja

Gilberts-Syndrom

CYP2D6

Atomoxetin

ja

Depression

CYP2D6

andere Substanzen außer Atomoxetin (z. B. Codein, Trizyklische Antidepressiva und Antipsychotika)

ja

Schmerzbehandlung, Depression

CYP2C19

Voriconazol

ja

Pilzerkrankung

CYP2C19

andere Substanzen außer Voriconazol (z. B. Inhibitoren von Protonpumpen)

ja

Beruhigungsmittel, Blutgerinnungsstörung

CYP2C9/VKORC1

Warfarin

nein

Bluthochdruck

CYP2C9

Celecoxib

nein

Entzündungen

HLA-B*5701

Abacavir

nein

HIV-Infektion

CYP3A5

Tacrolimus

nein

Immunsuppression

b2-Adrenoceptor

β2-Agonisten

nein

Asthma

CYP: Gen des Cytochrom P450; EGFR: Gen des Rezeptors des epidermalen Wachstumsfaktors; FDA: Food and Drug Administration (USA); HER2: Gen des humanen Rezeptors (2) des epidermalen Wachstumsfaktors; HLA: Gen des humanen Leukocyten-Antigens; TPMT: Gen der Thiopurin-S-Methyltransferase; UGT: Gen der Uridindiphosphat-Glucuronyltransferase. Nach Daly (2007)

auf Iressa ansprach als bei Amerikanern. Es wurden daraufhin 58 Japaner und 61 Amerikaner auf somatische Mutationen im EGFR-Gen untersucht. In 15 japanischen und in einem amerikanischen Patienten wurden Mutationen in der Kinasedomäne identifiziert, die zu einer erhöhten Aktivität führen. Die weiteren Untersuchungen zeigten, dass nur die Patienten mit einer Mutation, die die EGFR-Kinasedomäne betrifft, auf Iressa ansprechen, und erklären damit die geringen Therapieerfolge. Umgekehrt können jetzt Untersuchungen auf Mutationen im EGFR-Gen den Sinn einer Iressa -Therapie begründen (Lynch et al. 2004; Paez et al. 2004). In Tabelle 12.9 sind einige Beispiele von Genen gelistet, von denen wir heute schon wissen, dass bestimmte Allelvariationen die Wirkung von Arzneimitteln beeinflussen. Es ist natürlich nicht überraschend, dass dabei nicht nur das erwähnte EGFR-Gen auftaucht, sondern vor allem eine große Gruppe von Genen, die für Enzyme der Cytochrom-P450-Superfamilie codieren. Für Details sei der interessierte Leser auf die in der Tabelle angegebene Literatur verwiesen.

Bei manchen Erkrankungen reagieren Patienten auf bestimmte Therapieformen nicht oder sehr unterschiedlich. „Personalisierte Medizin“ versucht, die individuelle genetische Konstitution zu berücksichtigen und so eine „maßgeschneiderte“ Therapie zu ermöglichen.

12.5.4 Somatische Gentherapie Ein Kernstück zukünftiger Genetik liegt sicher in der somatischen Gentherapie. Obwohl das Konzept einfach erscheint, zeigte sich bald, dass die Übertragung in die klinische Praxis wesentlich schwieriger ist, als zunächst angenommen wurde. Bisher scheiterten viele Ansätze daran, dass man entweder das Zielgewebe nicht erreicht hat, dort die Expression der rekombinanten Gene nicht regulieren oder die Immunantwort auf den Vektor nicht kontrollieren konnte. Der erste Versuch einer Gentherapie wurde 1990 mit der Heilung der Adenosindeaminase-Defizienz (OMIM 102700) unternommen. Dabei führt die Unfähigkeit der Patienten, Adenosin abzubauen, letztlich zu einer Immun-

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

schwäche. Allerdings wurde trotz der Anwesenheit des reparierten Gens keine Verbesserung der Symptome erreicht, was nicht nur an der schwachen Expression des rekombinierten Gens und dem fehlenden Durchsetzungsvermögen der reparierten T-Zellen liegt, sondern auch an einer Immunantwort gegen das bakterielle Resistenzgen Neomycin, das ursprünglich zur Selektion eingefügt wurde (Muul et al. 2003). Andere Beispiele zeigen aber die prinzipiellen Möglichkeiten einer Gentherapie auf. Dazu gehören auch die Bluterkrankheiten (z. B. Hämophilie A; Kapitel 12.3.3). Diese Erkrankungen sind unter gentherapeutischen Gesichtspunkten besonders Erfolg versprechend, da die fehlenden (bzw. in ihrer Aktivität verminderten) Proteine im Blut zirkulieren und dadurch (wenigstens in der Theorie) viele Zellen genutzt werden können, um die rekombinanten Gene zu exprimieren. Erste Versuche waren hier durchaus vielversprechend; allerdings ist die Expressionsrate noch deutlich zu niedrig (vor allem für das F8-Gen) und die Stabilität der transfizierten Zellen zu gering, d. h. das rekombinante Gen geht innerhalb weniger Monate wieder verloren. Der vielversprechendste Ansatz einer somatischen Gentherapie gelang bisher bei der Behandlung der X-gekoppelten, angeborenen, schweren kombinierten Immunschwäche (engl. severe combined immunodeficiency, SCID; OMIM 300400). Diese Krankheit wird durch eine Mutation in der γ-Kette des Interleukin-2-Rezeptors hervorgerufen. Hacein-Bey-Abina und Mitarbeiter (2002) entnahmen bei 5 betroffenen Kindern Knochenmark und behandelten die Knochenmarkszellen ex vivo mit einem Replikations-defizienten retroviralen Vektor, der die funktionelle γ-Kette exprimiert. Die so behandelten Knochenmarkszellen wurden wieder reimplantiert, besiedelten das lymphoide System und stellten die Funktion des Immunsystems wieder her. Allerdings hatte diese Methode eine unerwartete Nebenwirkung, nämlich eine unkontrollierte Proliferation der rekombinanten T-Zellen (vermutlich ausgelöst durch eine Insertion in ein Onkogen in den behandelten Zellen). Diese Arbeiten unterstreichen die Notwendigkeit, die Expression der rekombinanten Gene präzise zu regulieren und die Integrationsorte genau zu überwachen, um solche Nebenreaktionen zu vermeiden (Nabel 2004). Die Gentherapie-Forschung ist in den vergangenen Jahren rapide angewachsen, und es ist zu erwarten, dass sie weiter zunimmt. Die ursprünglichen retroviralen Vektoren wurden durch eine Reihe anderer Vektoren ergänzt, und jedes System hat seine spezifischen Vor- und Nachteile, die auch von der jeweiligen Krankheit abhängen, die behandelt werden soll. So sind bei-

spielsweise Vektoren auf der Basis von Lentiviren sehr gut geeignet, um einen stabilen Gentransfer in Zellen zu erzielen, die sich nicht mehr teilen, aber ihre Integrationsstellen im Genom sind nicht spezifisch, und es besteht der Verdacht, dass unbeabsichtigte Inaktivierungen benachbarter Gene vorkommen. Auf der anderen Seite sind Adeno-assoziierte Viren relativ sicher (keine Integration ins Genom) und werden als weniger immunogen betrachtet – sie sind aber bei der Infektion von Zellen, die sich nicht mehr teilen, weniger effizient und können nur kurze therapeutische Gene tragen. Eine Übersicht über einige Schlüsseleigenschaften viraler Vektoren in der somatischen Gentherapie gibt Tabelle 12.10. Ein wichtiges Entwicklungsfeld ist die spezifische Veränderung der Virusoberflächen, um so die Zielgenauigkeit viraler Vektoren zu erhöhen. Für die Jahre 1989-2009 wurden mehr als 1400 klinische Untersuchungen zur somatischen Gentherapie bereits begonnen oder sind abgeschlossen (siehe http:// www.wiley.co.uk/genmed/clinical). Obwohl in den letzten Jahren große Fortschritte gemacht wurden, bleiben die bisherigen Ansätze zur Gentherapie noch weit hinter ihren Versprechungen zurück. Die Technologie entwickelt sich aber weiter ‒ wichtige Ansätze beruhen auf dem Einsatz von RNAi (Kapitel 7.5.1) zum Abschalten unerwünschter Genexpression und auf der Verwendung gewebespezifischer Promotoren, um die Expression des zugeführten Gens auf das Zielgewebe zu beschränken und dadurch unerwünschte Nebenwirkungen zu vermeiden.

Somatische Gentherapie bietet eine realistische Zukunftschance, viele erbliche Erkrankungen kausal und dauerhaft bei Patienten zu behandeln.

12.5.5 Genetik und Reproduktionsmedizin Im Unterschied zur somatischen Gentherapie ist die Keimbahntherapie auf eine Veränderung der genetischen Konstitution der Keimzellen gerichtet und beabsichtigt damit die Veränderung der Erbeigenschaften der zukünftigen Generationen. Experimente in dieser Richtung sind derzeit unter Wissenschaftlern geächtet und in Deutschland verboten. Allerdings sind Tendenzen im Zusammenhang mit der modernen Reproduktionsmedizin zu beobachten, die Veränderungen im allgemeinen ethischen Konsens andeuten. Neben der Genetik haben in den letzten Jahren die Fortschritte in der Reproduktionsbiologie bzw. -medizin immer wieder für großes öffentliches Interesse gesorgt. Künstliche Befruchtungen für Paare, die sonst keine Kinder bekommen können, sind heute schon Routinemaßnahmen geworden. Dabei stellt sich immer

12.5 Genbasierte Diagnose- und Therapieverfahren

Tabelle 12.10 Schlüsseleigenschaften viraler Vektoren in der somatischen Gentherapie Eigenschaft

Adenoviraler Vektor

Adenoviraler Vektor, abhängig von Helferzellen

Adenoassoziierter VirusVektor

Retroviraler Vektor

Lentiviraler Vektor

Partikelgröße (nm)

70–100

70–100

20–25

100

100

Klonierungskapazität (kb)

8–10

~ 30

4,9 (10 – nach Heterodimerisierung zweier Virionen)

8

9

Chromosomale Integration

nein

nein

nein (ja, wenn das rep-Gen einbezogen wird)

ja

ja

Vektorausbeute (Transduzierende Einheiten/ml)

hoch (1012)

hoch (1012)

hoch (1012)

mittel (1010)

mittel (1010)

Eintrittsmechanismus

Rezeptor-vermittelte Endocytose und Mikrotubulin-abhängiger Transport in den Zellkern

Rezeptorvermittelte Endocytose und Transport in den Zellkern

Rezeptor-Bindung, Konformationsänderung von Env, Membranfusion, Aufnahme in die Zelle, Entpackung, Kerneintritt von revers transkribierter DNA

Expression des Transgens und praktische Anwendung

Wochen bis Monate; hocheffiziente kurzzeitige Expression (z. B. für Krebs- oder akute Herz-KreislaufErkrankungen

> 1 Jahr, hocheffizient für mittel- bis langfristige Expression

> 1 Jahr; mittelbis langfristige Expression für nicht-akute Erkrankungen (Beginn der Transgenexpression nach ~ 3 Wochen)

Langfristige Korrektur genetischer Erkrankungen

Onkolytisches Potenzial

ja

nein

nein

nein (es besteht aber die Möglichkeit, dass sich der Vektor in den Tumorzellen ausbreitet und dabei ein Selbstmord-Gen verbreitet, das für ein Enzym codiert, das eine Arzneimittelvorstufe in die aktive Form überführen kann)

Entstehung Replikationskompetenter Vektoren in vivo?

möglich, aber ohne größere Bedeutung

vernachlässigbar, geringes Risiko

möglich, aber ohne größere Bedeutung

bedeutsames Risiko

Infektion ruhender Zellen?

ja

ja

ja

nein

ja

Steuerung der Transkriptionsaktivität beeinflusst durch chromosomale Integration?

nein

nein

nein

ja

ja

Risiko einer OnkogenAktivierung durch den Vektor?

nein

nein

nein

ja

ja

CAR: Coxsackie- und Adenovirus-Rezeptor; Env: virales Hüllprotein Nach Waehler et al. (2007)

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

wieder neu die Frage, wann individuelles menschliches Leben beginnt (und damit dem Schutz der allgemeinen Menschenwürde unterliegt): mit der Befruchtung oder erst mit der Einnistung in die Gebärmutter einige Tage später? Diese Frage ist nicht rein akademischer, sondern von eminenter praktischer Bedeutung, weil nämlich für die künstliche Befruchtung durch Superovulation eine größere Zahl von Eizellen gewonnen und auch befruchtet werden – es wird aber nur ein Embryo jeweils wieder zurückübertragen. Hier setzt dann auch die zweite Frage an: Soll man den Embryo vor der Rückübertragung auf mögliche Erbkrankheiten untersuchen und gegebenenfalls nur gesunde Embryonen übertragen, oder soll man mit dieser Untersuchung einige Monate warten und dann den größeren Embryo aufgrund einer medizinischen Indikation abtreiben? Wenn man die Schutzwürdigkeit menschlichen Lebens erst ab Einnistung definiert, gäbe es natürlich auch keinen Grund, die Verwendung „überzähliger Embryonen“ für Forschungszwecke zu verbieten und daraus z. B. embryonale Stammzellen herzustellen (das ist derzeit in Deutschland aufgrund des Embryonenschutzgesetzes verboten und die überzähligen Embryonen müssen aufbewahrt werden). Dazu kommt eine weitere neue Entwicklung, die wir im Kapitel 11.7.1 über die Totipotenz von Zellen bereits angesprochen haben: das Klonen von Organismen über somatische Zellen bzw. über entkernte Eizellen. Bereits im Jahr 2004 hatte ein japanisch-koreanisches Forscherteam (Kono et al. 2004) eine Eizelle der Maus hergestellt, in die zwei weibliche Chromosomensätze implantiert wurden. Darüber hinaus wurden in den verwendeten weiblichen Zellkernen die paternal bzw. maternal geprägten Gene Igf2 und H19 (Abb. 11.59) so verändert, dass der Eizelle und dem gesamten Entwicklungsapparat die übliche Anwesenheit eines väterlichen und eines mütterlichen Chromosomensatzes vorgegaukelt wurde. Das Experiment ist geglückt – es wurden Mäuse geboren, die sich normal entwickelten und auch auf „klassischem“ Wege Nachwuchs erhalten haben. Im Jahr 2007 berichtete dann erstmals ein Team aus Oregon/USA (Byrne et al. 2007) über die erfolgreiche Herstellung von Stammzellen von Rhesus-Affen: Dazu verwendeten die Forscher im Prinzip dieselbe Methode wie bei dem ersten Klon-Schaf Dolly (Abb. 11.53), nämlich den somatischen Kerntransfer, hier allerdings aus Hautzellen eines 9-jährigen männlichen Rhesus-Affen. Der Zellkern aus diesen Hautzellen wurde in weibliche Eizellen übertragen, denen der eigene Zellkern vorher entfernt wurde. Aus diesen Eizellen konnten Stammzellen gewonnen werden, die sich unbegrenzt teilen und in jede Körperzelle differenzieren können. Damit

ist die Möglichkeit nähergerückt, dass auch aus menschlichen Körperzellen Gewebe aller Art für Therapiezwecke hergestellt werden kann, ohne den „Umweg“ über ethisch problematische embryonale Stammzellen gehen zu müssen. Allerdings ist es hiervon auch nicht weit, einen anderen Weg zu gehen, nämlich die so gewonnenen Stammzellen als embryonale Stammzellen zu verwenden, wachsen zu lassen und zu einem geeigneten Zeitpunkt in die Gebärmutter einzupflanzen. Und wenn es bei Schafen (Dolly) funktioniert, wird es auch bei Affen gehen, und es gibt wahrscheinlich ähnliche technische Möglichkeiten auch beim Menschen. Und man wird mit Sicherheit davon ausgehen können, dass dieses „Experiment“ irgendwo auf der Welt auch durchgeführt werden wird.

Die Verbindung molekulargenetischer Techniken mit entsprechenden verbesserten Möglichkeiten der Reproduktionsmedizin wird es erlauben, auch Menschen zu klonen. Auch wenn viele dieses „Experiment“ ablehnen, zeigt die erfolgreiche Durchführung entsprechender Arbeiten an Affen 2007, dass nicht alle Wissenschaftler dieser Meinung sind.

Kernaussagen ï Die Methoden der klassischen Humangenetik beruhten im Wesentlichen auf der Stammbaum- und Zwillingsforschung. Dieser Ansatz wird heute ergänzt durch Geschwisterpaar-Analysen und Methoden der genetischen Epidemiologie. ï Für Kopplungsanalysen steht eine Vielzahl von Mikrosatelliten-Markern und von SNPs zur Verfügung; computergestützte Auswerteverfahren erlauben die Berechnung von LOD-Werten. Kartierungen mit LODWerten > 3 sind statistisch signifikant. ï Fehlerhafte Chromosomenverteilungen während der meiotischen Teilungen sind häufig. Von den möglichen Aneuploidien sind jedoch nur wenige lebensfähig (vor allem Trisomie 21 und Monosomie X). Chromosomenaberrationen führen häufig zu spontanen Aborten. ï Die meisten Erbkrankheiten sind autosomal-rezessiv und damit schwer zu diagnostizieren; die Gefahr der Homozygotie ist bei Verwandtenehen besonders hoch. Die häufigste autosomal-rezessive Erkrankung in Mitteleuropa ist die Zystische Fibrose (Mukoviszidose). ï Autosomal-dominante Erkrankungen haben eine Häufigkeit von ca. 1:10.000; die häufigste autosomaldominante Erkrankung ist die familiäre Hypercholesterinämie.

Technik-Box

ï X-chromosomal-dominante Erbkrankheiten sind selten; häufiger sind X-chromosomal-rezessive Erkrankungen, die bei Männern immer zum Ausbruch kommen (Hemizygotie). ï Eine besondere Gruppe von Krankheiten zeichnet sich durch Triplettwiederholungen aus, die von einer Generation zur nächsten massiv zunehmen können. Die Zunahme der Triplettwiederholungen führt in vielen Fällen zu einem früheren Eintrittsalter und einer schwereren Erkrankung. Beispiele sind die Chorea Huntington und das Fragile-X-Syndrom. ï Mitochondriale Erkrankungen mit Mutationen in der mitochondrialen DNA werden matrilinear vererbt und weisen häufig eine unvollständige Penetranz auf. ï Eine Vielzahl von Krebserkrankungen beruht auf Mutationen in Keim- und Somazellen. Wir unterscheiden Onkogene (z. B. RAS, FOS, MYC), Tumorsuppressorgene (z. B. TP53, RB) und Mutatorgene (z. B. XP-A bis XP-G).

ï Viele Krankheiten haben „komplexe“ Ursachen, d. h. an ihrer Entstehung sind mehrere Gene und/oder Gen-Umwelt-Wechselwirkungen beteiligt. Sie gehorchen nicht den Mendel’schen Regeln für monogene Erkrankungen. Beispiele sind Asthma oder Diabetes. ï Bei manchen Erkrankungen reagieren Patienten auf bestimmte Therapieformen nicht oder sehr unterschiedlich. „Personalisierte Medizin“ versucht, die individuelle genetische Konstitution zu berücksichtigen und so eine „maßgeschneiderte“ Therapie zu ermöglichen. ï Somatische Gentherapie bietet eine realistische Zukunftschance, viele erbliche Erkrankungen kausal und dauerhaft bei Patienten zu behandeln.

Technik-Box 27

Differenzielle Genexpression Anwendung: Methode zur Untersuchung der Genexpression in unterschiedlichen Geweben, zu unterschiedlichen Zeiten oder zwischen Wildtypen und Mutanten. Voraussetzungen: Quantitativ und qualitativ reproduzierbare RNA-Isolierung. Methoden: Die erste einfache Technik zur Analyse von Genexpressionsprofilen war das differential display. Dieses Verfahren vergleicht die Genexpression von zwei oder mehreren Experimenten miteinander, die sich aus den Basistechniken der reversen Transkription (Technik-Box 6) und PCR (TechnikBox 4) zusammensetzen:

Durch die Auswahl der Primer wird festgelegt, welche Untermenge der mRNA-Proben in cDNA-Kopien überführt wird. Zufällige Fragmente dieser cDNA-Sequenzen (in der Regel so viele, wie auf einem Polyacrylamidgel nebeneinander charakterisiert werden können) mit einer Größe von einigen Hundert Basenpaaren werden in einer PCR-Reaktion mithilfe von Zufallsprimern amplifiziert. Die Bandenmuster werden ausgewertet, indem die relativen Intensitäten von Banden aus verschiedenen experimentellen Proben verglichen werden. Nur in einer Probe existierende Banden oder mit unterschiedlicher relativer Intensität in mehreren Proben existierende Banden repräsentieren potenziell unterschiedlich synthetisierte

mRNA-Sequenzen. Um diese zu identifizieren, werden die entsprechenden Gelstücke ausgeschnitten, gereinigt und die erhaltenen cDNA-Fragmente mittels PCR erneut amplifiziert und sequenziert. Durch den Vergleich der Bandenintensität der verschiedenen Proben können solche Gene erkannt werden, die unterschiedlich stark exprimiert werden. Die differential-display-Methode neigt allerdings zu einem großen Anteil falsch-positiver Kandidaten, sodass diese Ergebnisse durch unabhängige Experimente, etwa Hybridisierung mit Northern-Blot (Technik-Box 11) oder Real-Time-PCR (Technik-Box 4) bestätigt werden müssen. Eine andere Möglichkeit ist die Analyse differentieller Genexpression auf Chips (Technik-Box 30).

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Kapitel 12: Genetik menschlicher Erkrankungen

Technik-Box 28

Geninaktivierung bei Mäusen Anwendung: Funktionelle Genanalyse durch Ausschalten von Genen in Mäusen (Knock-out). Voraussetzungen: Zellkultur von embryonalen Stammzellen der Maus, Tierhaltungskapazitäten. Methoden: Eine der wichtigsten Methoden zur funktionellen Genanalyse ist die Untersuchung der Auswirkungen von Mutationen auf den Phänotyp des betroffenen Organismus. Die Analyse spontaner oder durch ein mutagenes Agens induzierter Mutationen erfordert jedoch immer als ersten Schritt die Kartierung und Identifikation des betroffenen Gens. Die Ausschaltung eines definierten Gens aufgrund homologer Rekombination in embryonalen Stammzellen (Capecchi 1989, Nobelpreis für Medizin 2007) erlaubt dagegen die präzise Analyse des Phänotyps, der durch den Verlust der jeweiligen Genaktivität entsteht (engl. loss-of-function; knock-out; gene targeting). Allerdings kann die Funktion des ausgeschalteten Gens auch von anderen Genen übernommen werden, sodass keine besonderen Auffälligkeiten beobachtet werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass die Funktion des untersuchten Gens so wichtig ist, dass die Maus bestimmte Phasen in der Embryonalentwicklung nicht überlebt. Besonders für solche Fälle bieten sich konditionale Systeme an (siehe unten). Es wird auch häufig beobachtet, dass sich Knock-out-Allele von anderen Allelen des jeweiligen Gens in Bezug auf den ausgebildeten Phänotyp unterscheiden, sodass zum vollen Verständnis einer Genfunktion immer mehrere Allele eines Gens betrachtet werden sollten („allelische Reihe“).

Die gezielte Ausschaltung eines Gens beruht auf der Induktion homologer Rekombination zwischen einem geeigneten Vektorkonstrukt mit der gewünschten Mutation und dem endogenen, homologen Gen in Zellkulturzellen (siehe Abbildung). Durch Verwendung von Markern im Vektorkonstrukt (z. B. NeomycinResistenz) können nach Einführung des Vektorkonstrukts in die Zelle (z. B. durch Elektroporation) transformierte Zellen durch Hinzufügung des Neomycin-Derivats G418 zum Medium selektiert werden (nicht transformierte Zellen sterben in Gegenwart von G418). Durch PCR (Technik-Box 4) oder Southern-Blot (Technik-Box 10) kann experimentell überprüft werden, ob die gewünschte homologe Rekombination stattgefunden hat, d. h. ob die Mutation sich nunmehr anstelle des ursprünglichen Allels im Genom befindet. Als Zellen für solche Transformationsexperimente werden embryonale Stammzellen verwendet (ES-Zellen), die man aus der inneren Zellmasse früher Mausembryonen erhält (Abb. 11.40) und die sich leicht in Zellkultur halten lassen. Erfolgreich transformierte ES-Zellen kann man anschließend in Mäuse-Blastocysten injizieren, um auf diese Weise transformierte Mäuse zu erhalten. Diese Mäuse sind Mosaike (Chimären), da nur ein Teil von der transformierten Zelle abstammt. Wenn auch Keimbahnzellen von einer transformierten Zelle abgeleitet sind, erhält man unter den Nachkommen heterozygote, stabile Transformanten. Spezialfall: Konditionale Systeme: Um das zu untersuchende Gen nur ab einem bestimmen Zeitpunkt oder

in einem bestimmten Gewebe auszuschalten, wurde ein binäres System entwickelt, das die Deletion eines Gens nur dann zulässt, wenn zwei Gen-codierte Komponenten gleichzeitig exprimiert werden (Kapitel 9.7.2; Lewandoski 2001). Das zu inaktivierende Gen wird dazu in einem Vektor von Schnittstellen für erkennungsspezifische Rekombinasen (engl. sitespecific recombinases) flankiert; breite Verwendung findet dabei das Cre/ loxP-System. Dabei schneidet die CreRekombinase des Bakteriophagen P1 (Kapitel 4.3.3) eine DNA-Sequenz aus, die zwischen zwei antiparallelen loxPStellen liegt; dabei bleibt eine der beiden loxP-Stellen zurück (loxP-Stellen sind kurze DNA-Fragmente mit 34 bp; die Core-Sequenz mit 8 bp bestimmt die Orientierung der jeweiligen loxPStelle). Durch die regulierte Expression der Cre-Rekombinase (durch die geeignete Wahl eines Promotors) kann man das Zielgen gewebespezifisch ausschalten. Dies geschieht in der Regel durch die Herstellung eines zweiten Mausstamms, der den RekombinaseExpressionsvektor unter der Kontrolle eines gewebespezifischen oder induzierbaren (Technik-Box 22) Promotors trägt. Nach Kreuzung der zwei Mausstämme wird in den F1-Tieren Cre-Rekombinase nur zu einem gewünschten Zeitpunkt (induzierbares System) oder in einem gewünschten Gewebe (gewebespezifischer Promotor) exprimiert; nur unter diesen Bedingungen wird das Zielgen deletiert. Ein anderes, aber ähnliches System verwendet die Flp-Rekombinase und ihre FRT-Erkennungsstellen aus Hefe.

Technik-Box

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Geninaktivierung bei Mäusen (Fortsetzung) a Die 34-bp-Fragmente der loxP- und FRTErkennungsstellen bestehen aus 13 bp als invertierte Wiederholungseinheiten (schwarz), die die rote Core-Sequenz aus 8 bp flankieren. Diese Core-Sequenz bestimmt die Orientierung dieser Erkennungsstellen (rote Pfeile). b Dimere der Cre- oder Flp-Rekombinase (rosa) katalysieren die Rekombination zwischen den beiden gleichsinnigen Erkennungsstellen (hell- und dunkelrote Pfeilspitzen). Das führt zunächst zu einer Schlaufenbildung und dann zu einer direkten Verbindung der Regionen A und C; dabei geht die Region zwischen den beiden Erkennungsstellen zusammen mit einer der beiden Erkennungsstellen verloren. Wenn B eine essenzielle Region eines Gens ist, führt die Rekombination zu einer Inaktivierung des Gens. TSP: gewebespezifischer Promotor, cre/FLP: Gene der Cre- bzw. FLP-Rekombinase; pA: Polyadenylierungsstelle. (Nach Lewandoski 2001, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Kapitel 13

Verhaltens- und Neurogenetik Inhaltsverzeichnis 13.1 Endogene Rhythmik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 692 13.2 Lernen und Gedächtnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 704 13.3 Angst, Sucht und psychiatrische Erkrankungen . . . . . 713 13.4 Neurodegenerative und neurologische Erkrankungen . . . . . . . . . . . . . . . . 729

Mönchsgrasmücken dienen zur Untersuchung der genetischen Grundlagen des Zugverhaltens der Vögel. (Foto: Peter Berthold, Radolfszell)

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Überblick Verhaltensgenetische Experimente, die in den letzten Jahren systematisch an verschiedenen Modellorganismen durchgeführt wurden, zeigen, dass wesentliche Teile tierischen und menschlichen Verhaltens genetisch bestimmt werden. Das gilt für verschiedene rhythmische Verhaltensweisen bei Pflanzen, Pilzen, Insekten und Säugern genauso wie für so schwer verständliche und komplexe Verhaltensweisen wie z. B. das Zugverhalten von Vögeln. Verhalten ist vielfach genetisch in polygenen Regulationssystemen festgelegt; die individuelle Ausprägung von Verhaltensweisen wird jedoch in unterschiedlichem Ausmaß durch Umwelteinflüsse mitbestimmt. Das macht es zunächst schwierig, festzustellen, wie hoch die erblichen Komponenten solcher Verhaltensweisen sind. Vergleichende Untersuchungen an verschiedenen Modellorganismen und dem Menschen haben aber auch gezeigt, dass viele genetische Elemente auch beim Menschen konserviert sind und so beispielsweise Einfluss auf unseren Schlaf haben („innere Uhr“ und „zirkadiane Rhythmik“) oder unser Gedächtnis und Lernverhalten beeinflussen. Die Komplexität dieser Regelsysteme gestattet

Eine der interessantesten, aber zugleich meist umstrittenen Fragen in der Biologie ist diejenige nach den genetischen Grundlagen des Verhaltens: Wird Verhalten überhaupt – und wenn ja, in welchem Ausmaß – genetisch gesteuert? Die Beantwortung dieser Frage hat nicht allein Konsequenzen auf rein biologischer Ebene, sondern berührt zugleich viele Gesichtspunkte unserer eigenen Existenz, deren vielleicht bedeutsamste mit den Fragen „Gibt es einen freien Willen?“ oder „Sind bestimmte – so z. B. kriminelle – Verhaltensweisen genetisch programmiert?“ umschrieben werden können. Offensichtlich kann die Beantwortung solcher Fragen auch für den menschlichen Alltag, z. B. in der Rechtsprechung, schwerwiegende Konsequenzen haben. Auf der Grundlage der Untersuchungen von Verhaltensforschern kann es keinen Zweifel geben, dass tierisches (und natürlich somit auch menschliches) Verhalten auf einer genetischen Grundlage beruht. Man kann sich hierbei die Tatsache des artspezifischen Paarungsverhaltens von Tieren ebenso vor Augen halten wie das universelle Verständnis menschlicher Gestik in verschiedenen Kulturkreisen – beides Verhaltensweisen, die offenbar genetisch weitgehend festgelegt sind. Bestimmte Verhaltensweisen, wie etwa das von Lorenz untersuchte Verhalten von Graugänsen – sie werden nach dem Schlüpfen auf ein bestimmtes Bild als „Muttertier“ festgelegt – sind zwar genetisch streng

eine schnelle mikroevolutive Anpassung an geänderte Umweltbedingungen. Besonders der Vergleich von Mausmutanten mit ähnlichen Erkrankungen des Menschen hat viel zum neuen Verständnis der genetischen Komponenten bei noch komplexeren Verhaltensweisen beigetragen. Dazu gehören Angst und Depression genauso wie das Suchtverhalten, z. B. gegenüber Alkohol. Die eher im Alter auftretenden neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson waren zwar als Krankheit schon lange akzeptiert (im Gegensatz etwa zu Suchtverhalten), allerdings hat auch hier erst die Genetik wesentlich dazu beigetragen, die Entstehung der jeweiligen Krankheit besser zu verstehen. Bei psychiatrischen Erkrankungen wie der Schizophrenie steht man dagegen in diesem Punkt noch am Anfang. Aber auch hier ist es so, dass es nicht nur bestimmte chromosomale Kandidatenregionen gibt, in denen wir Empfindlichkeitsgene für Schizophrenie vermuten können, sondern dass bereits erste Gene mit ihren Mutationen identifiziert wurden – ähnlich wie wir das bei anderen komplexen Erkrankungen (Diabetes, Asthma) bereits kennengelernt haben.

festgelegt, aber auch in begrenzter Weise in ihrer spezifischen Ausprägung durch Wechselwirkungen mit einer (variablen) Umwelt veränderbar (umweltbedingte Variabilität, Kapitel 1.2.1; komplexe Erkrankungen, Kapitel 12.4): Genetisch sind bestimmte Gegebenheiten programmiert, die aber erst durch das Einwirken von spezifischen Umwelteinflüssen in der einen oder anderen Form zur Ausprägung kommen. Verhalten kann daher als ein den gleichen genetischen Regeln unterworfener Phänotyp von Tieren angesehen werden wie alle übrigen biologischen Funktionen. Wenn es feststeht, dass wesentliche Teile tierischen Verhaltens genetisch programmiert sind, ist die zentrale Frage, in welchem Ausmaß Verhaltensweisen unwiderruflich festgelegt bzw. in ihrer Ausprägung von Umwelteinflüssen abhängig sind. Die Frage muss ähnlich beantwortet werden wie die nach der genetischen Grundlage von Krankheiten: Für unterschiedliche Verhaltensweisen ist das Ausmaß der genetisch festgelegten Programmierung unterschiedlich. In vielleicht noch größerem Ausmaß als Krankheiten sind Verhaltensweisen polygen beeinflusst und daher bezüglich ihres genetischen und ihres umweltbedingten Anteils im Detail sehr schwer analysierbar. Dazu kommt: Die Analyse von Verhalten und seiner genetischen Komponenten macht die Zusammenarbeit auf Gebieten notwendig, die bisher wenig miteinander zu tun hatten. Die Zusammenarbeit von Genetikern mit Biochemikern, mit Mathematikern, mit

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Abb. 13.1 Regionale Zuordnung von Verhalten im Gehirn. Studien an Gehirnverletzungen, pharmakologische Ansätze und die Analyse genetisch veränderter Mäuse sowie von Patienten mit Gehirnerkrankungen haben zur funktionellen Definition verschiedener Gehirnareale in Bezug auf Verhalten geführt: Der Hippocampus ist wichtig für räumliches und kontextabhängiges Lernen, wohingegen die Amygdala (Mandelkern) bei Furcht und Angst eine wichtige Rolle spielt. Der

Hypothalamus ist für die zirkadiane Rhythmik verantwortlich und reguliert Schlaf-Wach-Zyklen sowie die physiologische Homöostase. Das Cerebellum (Kleinhirn) ist für das Lernen von Bewegungsabläufen und ihre Koordination bedeutsam. Durch geeignete Verhaltenstests kann die Funktion einzelner neuraler Systeme in mutanten Mäusen getestet werden. (Nach Bućan u. Abel 2002, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Anatomen und mit klinischen Medizinern aller Spezialgebiete ist etabliert. Kooperationen im Bereich der Verhaltensbiologie, Psychologie und gar Psychiatrie sind noch eher etwas ungewohnt, finden sich aber immer mehr, wobei die Maus als zentrales Modellsystem große Bedeutung gewinnt. Mit der Maus lassen sich nämlich viele Verhaltenstests, die man früher an Ratten unternommen hatte, ähnlich durchführen. Andererseits können in der Maus die Ressourcen optimal genutzt werden, die in der Genomforschung entwickelt wurden. Damit ist eine (relativ) schnelle Identifizierung von mutierten Genen möglich, die dadurch zu einem unterscheidbaren Phänotyp führen. Im Vordergrund steht dabei, den Phänotyp so genau zu definieren, dass eine genetische Charakterisierung möglich wird. Ergänzt wird diese genetische Analyse durch einen enormen Fortschritt in der Auflösung der morphologischen Analyse der Genexpression. Die regionale und zelltypspezifische Expression von Genen im Gehirn – während der Embryonalentwicklung und später – haben dazu geführt, dass bestimmte Gruppen von Verhaltensweisen einzelnen Regionen zugeordnet werden können (z. B. Angst und Furcht der Amygdala,

zirkadiane Rhythmik dem Hippocampus usw.; Abb. 13.1). Im Folgenden sollen nun einzelne Beispiele aus der Neuro- und Verhaltensgenetik im Detail betrachtet werden. Dabei werden auch Hinweise aus dem Vergleich verschiedener Spezies herangezogen.

Verhaltensweisen sind komplex und damit experimentell schwieriger zu analysieren als monogene Phänotypen. Sie gehorchen aber prinzipiell den gleichen Gesetzen wie andere komplexe Phänotypen. Die aktuelle Kombination präziser phänotypischer Charakterisierung mit genomorientierten Methoden der Genetik ermöglicht eine rasante Zunahme unseres Wissens über genetische Grundlagen von Verhalten.

Das Balzverhalten von Drosophila erscheint als ein äußerst komplexes stereotypisches Verhaltensmuster und beinhaltet den Austausch vieler Sinneseindrücke über einen längeren Zeitraum. Genetische Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass eine Männchen-spezifische Spleißform des Gens fruitless (Gensymbol: fru) notwendig und ausreichend ist, dieses Verhaltensmuster zu erklären.

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

fru ist ein großes und komplexes Gen, das ungefähr 140 kb umfasst. Das Gen enthält vier verschiedene Promotoren (P1‒P4); allerdings wird nur das Transkript des P1-Promotors geschlechtsspezifisch gespleißt. Das „männliche“ P1-fru-Transkript codiert für das FruM-Protein, das eine BTB-Dimerisationsdomäne und eines von drei alternativen Zinkfingerpaaren enthält; vermutlich wirkt es als Transkriptionsfaktor. In Weibchen führt das alternative Spleißen zusammen mit einer Unterdrückung der Translation zur Abwesenheit des P1-abgeleiteten Produktes. FruM programmiert im männlichen zentralen und peripheren Nervensystem die Neurone, die dem Sexualverhalten zugeordnet sind. Diese Schaltkreise integrieren offensichtlich sensorische Informationen, um Verhaltenszustände zu definieren, und regulieren konservierte neurale Elemente für eine geschlechtsspezifische Verhaltensleistung. Ein besonders wichtiges Ergebnis dieser Arbeiten ist, dass in Drosophila-Weibchen männliches Balzverhalten durch die Ausschaltung der Translationshemmung von P1-fru ausgelöst werden kann (eine ausführliche Übersicht dieser Thematik findet sich bei Manoli et al. 2006).

13.1 Endogene Rhythmik 13.1.1 Zugverhalten bei Vögeln Es gibt Verhaltensweisen, bei denen wir zunächst eher an einen starken Umwelteinfluss denken würden, die aber tatsächlich strikt genetisch festgelegt sind. Als ein eindrucksvolles Beispiel für eine solche Situation hat sich in letzter Zeit die genetische Programmierung des Vogelzuges herausgestellt. Die Genetik dieses Verhaltens soll im Folgenden in einigen Grundaspekten zusammengefasst werden, da sie bemerkenswerte Parallelen zu anderen Erkenntnissen der Biologie aufweist; sie verspricht neue Einsichten in bisher ganz unverstandene biologische Mechanismen. Die Existenz von Zugvögeln und Standvögeln ist ein biologisches Phänomen, das bereits seit Jahrtausenden Interesse gefunden hat. Nach heutiger Sicht ist die verfügbare Futtermenge ein wesentliches Kriterium, das die Entscheidung zwischen Verbleib am Brutort und der Wanderung in Winterquartiere bestimmt. Bisher wurde es als nahezu selbstverständlich angesehen, dass das Zugverhalten ein abgeleitetes, d. h. sekundäres erworbenes Verhalten ist. Das würde zugleich auf eine polyphyletische (d. h. mehrfache und voneinander unabhängige) Entstehung deuten. Diese Annahme wird durch die neuere genetische Analyse des Zugverhaltens und damit verbundener anderer Merkmale infrage gestellt. Ähnlich wie es sich bereits

für die entwicklungsgenetischen Vorgänge der Augenentstehung von Insekten und Säugern (Abb. 11.34) gezeigt hatte, scheint das Zugverhalten der Vögel evolutionär sehr alt und daher monophyletischen Ursprungs zu sein. Für das Vogelzugverhalten sind mindestens zwei genetische Merkmalskomplexe getrennt zu betrachten: ï Zum einen sind es die sich jährlich wiederholenden Zugrhythmen, die genetisch programmiert sind. Dass es eine genetisch festgelegte Verhaltensperiodizität gibt, ist für den Tagesrhythmus bereits seit Langem bekannt. Man bezeichnet sie als Tagesperiodizität (engl. circadian rhythm). Beim Vogelzug zeigt sich nun eine genetisch bedingte Jahresperiodizität oder zirkannuale Rhythmik (engl. circannual rhythm). Bestimmend ist in beiden Fällen die Lichtperiodik (Tageslichtdauer). ï Ein zweites genetisch festgelegtes Element des Vogelzuges ist die Wanderungsrichtung und -dauer. Beide Parameter sind in einem – in seiner sinnesphysiologischen Basis unbekannten – Navigationssystem genetisch festgelegt. Die Genetik beider Merkmalskomplexe, die wahrscheinlich eng miteinander verknüpft sind, wurde durch P. Berthold und Mitarbeiter (Pulido et al. 1996) vor allem am Zugverhalten der Mönchsgrasmücke (Sylvia atricapilla) und des Garten- und Hausrotschwanzes (Phoenicurus phoenicurus und P. ochruros) (Abb. 13.2) untersucht. Während die Mönchsgrasmücke sowohl als Zugvogel als auch als Standvogel und mit unterschiedlichen Zugrichtungen in Eurasien und Afrika vorkommt, ist der Gartenrotschwanz ein Langstreckenzugvogel (Zugziel: Afrika südlich der Sahara), der Hausrotschwanz jedoch ein Kurzstreckenzieher (in den Mittelmeerraum). Die Rotschwanzarten sind miteinander kreuzbar, sodass Hybride untersucht werden können. Die Versuche zur Erblichkeit des Zugverhaltens wurden an südfranzösischen Mönchsgrasmücken durchgeführt, deren Population etwa 25 % Standvögel enthielt. Die Ermittlung des Charakters (d. h. Standoder Zugvogel) kann durch Messung der Migrationsaktivität der Individuen während der Zugperioden erfolgen, d. h. es werden die Bewegungshäufigkeiten des Vogels im Käfig registriert. Kreuzt man Individuen mit hoher Migrationsaktivität, so erhält man bereits in der F3 praktisch ausschließlich Individuen, die sich wie Zugvögel verhalten. Kreuzt man hingegen Individuen mit Standvogelcharakter (keine Migrationsaktivität), so besteht die F3 zu 80 % aus Standvögeln und nach 6 Generationen sind ausschließlich Nichtzieher vorhanden (Abb. 13.3a). Dieses Ergebnis belegt einerseits,

13.1 Endogene Rhythmik

Abb. 13.2 Rotschwänze eignen sich für Artkreuzungen, sodass die genetischen Grundlagen des Zugverhaltens untersucht werden können: Der Gartenrotschwanz (links) ist ein Langstreckenzieher, der Hausrotschwanz (2. von links) ein Kurz-

streckenzieher. Hybride (3. und 4. von links) und der Rückkreuzungshybrid mit einem Hausrotschwanz (rechts) gestatten ein detailliertes Studium der genetischen Komponenten des Zugverhaltens. (Foto: Peter Berthold, Radolfszell)

Abb. 13.3 a, b Erblichkeit des Zugverhaltens. a Durch Selektion gelingt es, aus teilziehenden Mönchsgrasmücken aus Südfrankreich innerhalb weniger Generationen entweder ein Verhalten zum Nichtzieher oder zum ausschließlichen Zugverhalten zu erreichen. Die Mikroevolution verläuft mit einer überraschenden Geschwindigkeit innerhalb von 3 Generationen. b Links ist die Beziehung der Zugaktivität der ersten Wegzugperiode von Mönchsgrasmücken, die in Volieren gezüchtet wurden („Nachkommen“) in Beziehung zu der ihrer Elternvögel gezeigt. Die Steigung der Regressionsgeraden der positiven Korrelation ergibt

die Erblichkeit (Heritabilität); sie beträgt etwa 0,4. Basierend auf diesen Daten wurde eine Modellrechnung durchgeführt (rechts): Würde die Zugaktivität der ersten Wegzugperiode auf niedrigere Werte selektiert, könnten die jetzigen Populationen der Mönchgrasmücken (450 Stunden Zugaktivität) bereits nach etwa 10 Generationen aus Kurzstreckenziehern (150 Stunden Zugaktivität) bestehen (gestrichelte Linie); das gilt für die Voraussetzung, dass sich 70 % der Vögel erfolgreich fortpflanzen (die Alternativen mit 50 und 90 % sind ebenfalls gezeigt). (Nach Berthold 2001, mit freundlicher Genehmigung der Max-Planck-Gesellschaft)

dass das Zugverhalten genetisch festgelegt ist. Andererseits zeigt es, dass genetisch bedingte Verhaltensänderungen in einer Population sehr schnell erfolgen kön-

nen, d. h. dass eine Adaption an Milieuveränderungen durch Selektion mit großer Effektivität erreicht werden kann.

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Wie Abb. 13.3b zeigt, betrifft das aber nicht nur die Zugaktivität an sich, sondern auch ihre Dauer. Aus den quantitativen Beziehungen zwischen Elterntieren und ihren Nachkommen in Bezug auf die Zugaktivität kann man abschätzen, dass etwa 40 % erblich bedingt sind (Heritabilität = 0,4). In der Anwendung bedeutet das, dass bei einer mittleren Fortpflanzungsrate von 70 % bei Anwesenheit geeigneter Umweltbedingungen als Selektionsfaktoren innerhalb weniger Generationen eine vollständige Änderung des Zugverhaltens möglich wäre. In ähnlichen Versuchen lässt sich die Richtungspräferenz des Zugverhaltens ermitteln. Durch Messung der Richtungspräferenz im Orientierungskäfig wurde gezeigt, dass sie ebenfalls genetisch fixiert ist. In den Experimenten wurden Mönchsgrasmücken aus Süddeutschland einerseits (Zugrichtung: Südwesten) oder Österreich (Zugrichtung: Südosten) gepaart. Die Nachkommen zeigten eine Orientierung ihrer Zugpräferenz, die etwa in der Mitte der Elternindividuen liegt (Abb. 13.4a). Dass sich die genetisch festgelegte Zugrichtung in kurzer Zeit ändern kann, wurde ebenfalls an Mönchsgrasmücken festgestellt. Vögel aus Süddeutschland ziehen gewöhnlich in den Mittelmeerraum. In den letzten 30 Jahren hat sich jedoch eine Teilpopulation entwickelt, die nach England zieht. Die bevorzugte Wanderungsrichtung von Mönchsgrasmücken, die in England gefangen wurden, wurde mit denen aus Süddeutschland verglichen. Die englischen Vögel bevorzugten dabei eine westliche Richtung, wohingegen die süddeutschen Vögel eher in Richtung Südwesten starteten. Diese Vorzugshaltung wurde auch bei den Nachkommen der in England gefangenen Vögel beibehalten (Abb. 13.4b). Der populationsgenetische Vorteil, d. h. eine höhere Fitness, dürfte darin liegen, dass der Abstand zum Winterquartier (England) kürzer und die Konkurrenz um Futter geringer ist. Der kürzere Abstand ermöglicht eine frühere Rückkehr, die einen zeitigeren Brutbeginn zur Folge hat und dadurch günstigere Brutpflegebedingungen ergibt. Die daraus resultierende Auswahl mit gleichartigen Artgenossen (engl. assortative mating) beschleunigt dabei solche Evolutionsprozesse (Bearhop et al. 2005). Eine große ‒ und noch immer im Prinzip ungelöste Frage ‒ ist die, wie die Zugvögel sich über die weiten Strecken orientieren können. Infrage kommen dafür das magnetische Feld der Erde, der Sonnenstand, Muster des Sternenhimmels und Muster polarisierten Lichts. Viele Arbeiten deuten darauf hin, dass in der Vorbereitungsphase die visuellen Eindrücke wichtig sind, um ein magneto-sensorisches System zu kalibrieren. Während des Zuges verwenden die Vögel wohl eher das magnetische System zu ihrer Orientierung (für eine übersichtliche Darstellung der verschiedenen

Abb. 13.4 a–c Zugrichtung von Mönchsgrasmücken. a In Orientierungskäfigen können die Richtungspräferenzen bei Startversuchen von Mönchsgrasmücken und deren Hybriden durch Messungen zur Zugzeit ermittelt werden. Der innere Kreis zeigt die Richtungspräferenzen von Mönchsgrasmücken aus Süddeutschland (grün, SW) und Österreich (rot, SO) sowie außen die Richtungspräferenz von Hybriden aus beiden Populationen, die sich intermediär verhalten. Jedes Dreieck stellt ein Individuum dar; große Dreiecke: Mittelwerte. b Der linke Kreis zeigt die Richtungspräferenz von Mönchsgrasmücken, die in England gefangen und in Süddeutschland getestet wurden: Ihre Richtungspräferenz ist nicht standortgebunden, sondern bleibt erhalten. Das bestätigt sich auch bei ihren Nachkommen (rechter Kreis). Unten: Kontrollvögel aus Süddeutschland. Jedes Dreieck stellt ein Individuum dar; Pfeile: Mittelwerte. c Ein kurzer, aber starker magnetischer Puls kann bei adulten Zugvögeln (hier australische Silberaugen: Zosterops I. lateralis; links) die Orientierung verändern, nicht aber bei juvenilen Tieren (rechts). Die offenen Symbole zeigen die Kontrolldaten vor dem Magnetpuls, die schwarzen Symbole danach. (a, b nach Berthold 2001, mit freundlicher Genehmigung der Max-Planck-Gesellschaft; c nach Wiltschko u. Wiltschko 2006, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

13.1 Endogene Rhythmik

Abb. 13.5 a, b Magnetische Eigenschaften von MagnetitKristallen. a Magnetit-Kristalle aus Einzeldomänen (SD) und superparamagnetischen Clustern (SP) haben unterschiedliche magnetische Eigenschaften. Einzeldomänen haben ein permanentes Magnetmoment (roter Pfeil) auch in Abwesenheit eines externen Magnetfeldes (B = 0). Wenn ein externes Feld (schwarzer Pfeil) angelegt wird und sie frei rotieren können, werden sie sich nach dem Magnetfeld ausrichten. Die superparamagnetischen Cluster können sich dagegen bei Anwesenheit eines äußeren Feldes auch ohne freie Rotationsmöglichkeit nach

dem äußeren Feld ausrichten. b Ein hypothetisches Modell eines Signalübertragungsmechanismus basiert auf dem Zusammenwirken von superparamagnetischen Clustern in den Membranen von Neuronen. Dabei werden sich die Cluster in Abhängigkeit vom äußeren Feld anziehen oder abstoßen und dabei die Form der Membran verändern und möglicherweise Ionenkanäle öffnen oder schließen. Solche superparamagnetischen Cluster wurden in Nervenenden von Tauben gefunden. (Nach Johnsen u. Lohmann 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Details sei der interessierte Leser auf die Arbeit von Muheim et al. 2006 verwiesen). Interessante Einblicke in das magneto-sensorische System vermittelten Experimente, bei denen australische Silberaugen (Zosterops I. lateralis) in verschiedenem Alter magnetischen Pulsen ausgesetzt wurden (Abb. 13.4c). Dabei reagierten nur solche Vögel auf ein verändertes Magnetfeld, die schon eine Zugsaison hinter sich gebracht hatten („adulte Vögel“), wohingegen jugendliche Vögel nicht reagierten. Dies zeigt, dass die Magnetsensoren offensichtlich Teil eines erfahrungsbasierten Systems sind. Abb. 13.5 zeigt, wie man sich ein solches System vorstellen kann. Dabei spielen Magnetiteinschlüsse in Nervenzellen eine wichtige Rolle, da sie sich in einem magnetischen Feld entsprechend anordnen können. Eine wichtige Rolle spielt bei der Verarbeitung offensichtlich auch der Nervus ophthalmicus (Abb. 13.6): Wenn er bei Tauben durch Pharmaka oder operativ ausgeschaltet wird, zeigen die behandelten Vögel keine Antwort auf Veränderungen im

Magnetfeld. Elektrophysiologische Untersuchungen deuten außerdem darauf hin, dass spezifische Neurone im Trigeminal-Ganglion (in das der Nervus ophthalmicus projiziert) auf kleine Veränderungen des Magnetfeldes reagieren. Zu gegensätzlichen Ergebnissen kommt dagegen die Gruppe um Henrik Mouritsen aus Oldenburg bei entsprechenden Untersuchungen an Rotkehlchen. Hier ist die Durchtrennung des Nervus ophthalmicus ohne Einfluss auf das Zugverhalten dieser Vögel. Bei Rotkehlchen sind vielmehr spezialisierte Fotopigmente in den Augen wichtig; werden die entsprechenden Projektionsareale im Vorderhirn (Region N) beidseitig ausgeschaltet, zeigen die Rotkehlchen keine Orientierung im Magnetfelkd (Zapka et al., 2009). Weiterführende Experimente unter Beteiligung von Genetikern, Verhaltensbiologen, Elektrophysiologen und anderen wird es erlauben, die Frage nach dem morphologischen Korrelat des Magnetsinns und seiner genetischen Komponente sowie ihrer Variabilität und Plastizität zu klären.

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Abb. 13.6 a, b Elektrophysiologie der Magnetorezeption. a Es ist der Trigeminus-Nerv des Bobolink (Dolichonyx oryzivorus, Reisstärling) mit seinen 3 Hauptästen gezeigt. Die Neuronen, die auf Veränderungen des Magnetfeldes in der Umgebung mit veränderter elektrischer Aktivität reagieren, sind durch Kreuze markiert. b Aufzeichnungen einer Ganglienzelle während unterschiedlicher Veränderungen in den Intensitäten des vertikalen Magnetfeldes: (1) Spontanaktivität; (2) Antwort auf Veränderungen um 200 Nanotesla (nT), (3) um 5000 nT, (4) um 15.000 nT, (5) um 25.000 nT, (6) um 100.000 nT. Zum Vergleich: Die Flussdichte des Magnetfeldes der Erde beträgt ~ 50.000 nT. Der Beginn des Reizes ist durch den Strich unterhalb der Messreihen angegeben. (Nach Johnsen u. Lohmann 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Neben Vögeln verfügen unter den Wirbeltieren auch Maulwürfe über einen Magnetsinn. Maulwürfe reagieren auf Veränderungen des Magnetfeldes mit erhöhter c-Fos-Expression in verschiedenen Gehirnregionen, darunter vor allem in den Colliculi superiores (die oberen zwei Hügel der Vierhügelplatte des Mittelhirndachs). Die Colliculi superiores werden von der Retina über den Sehnerv innerviert und gehören zum retino-tektalen System. Es bleibt zu zeigen, ob dieses System auch bei anderen Säugern Teil eines Magnetsinns ist (Němec et al. 2005).

Das Zugverhalten von Vögeln hat eine ausgeprägte

genetische Komponente, deren molekulare Basis noch unbekannt ist. Ein wesentlicher Bestandteil ist der Magnetsinn.

Die Orientierung an einem Magnetfeld ist nicht auf Zugvögel beschränkt. Schon seit einigen Jahren sind magnetotaktische Bakterien bekannt (z.B. Magnetospirillum gryphiswaldense aus Greifswald oder Magnetospirillum magne-

ticum), die ihre Bewegungsrichtung an einem Magnetfeld ausrichten. Gemeinsam ist diesen Bakterien, dass sie eisenreiche, Membran-umschlossene Strukturen bilden, die als Magnetosomen bezeichnet werden und eine bakterielle Organelle darstellen. Die genetische Grundlage dafür sind drei Operons, die als Insel von 35 kb im Genom angeordnet sind; da die Gene für den Aufbau des Magnetosoms codieren, sprechen wir auch von einer Magnetosom-Insel. Genominseln bei Bakterien enthalten viele IS-Elemente und sind flankiert von direkten Wiederholungselementen (Kapitel 8.1), sodass sie im Bakteriengenom beweglich sind; es ist aber auch horizontaler Gentransfer möglich. Die Gene des mamAB Genclusters in der Magnetosominsel codieren für Proteine, die für die Biogenese der Membran, den gezielten Einbau von Proteinen in das Kompartiment und für einige Schritte der Magnetit-Produktion benötigt werden – und Deletionen dieser Gene führen dazu, dass keine Magnetosomen aufgebaut werden können (Murat et al., 2010). Es wird interessant sein zu erfahren, ob es in höheren Organismen (wie Vögeln) Gene gibt, die mit den bakteriellen Genen der Magnetosom-Inseln verwandt sind.

13.1 Endogene Rhythmik

Abb. 13.7 a–c Grundsätzliche Eigenschaften eines zirkadianen Rhythmus. a Ein zirkadianer Rhythmus kann durch externe Reize eingestellt werden (z. B. Hell-Dunkel- oder Temperaturzyklen) und behält diesen Rhythmus auch unter konstanten Bedingungen bei. Eigenschaften der Kurven, die üblicherweise bestimmt werden, sind die Schwingungsdauer, die Amplitude und die Phase. Die negativen Werte bezeichnen den Zeitpunkt, zu dem die Uhr eingestellt wurde; positive Werte kennzeichnen die Zeit unter konstanten Bedingungen. b Die Phase des Rhythmus kann durch denselben Reiz wieder zurückgesetzt werden, durch den er eingestellt wurde: Ein 5-stündiger Dunkelheitspuls, der Cyanobakterien während ihres subjektiven Tages gegeben wird, kann die Phase des Rhythmus um 10 Stunden verschieben, wohingegen derselbe Puls während der subjektiven Nacht nur eine schwache Phasenverschiebung hervorruft. c Bei Temperaturen innerhalb der physiologischen Schwankungsbreite des Organismus bleibt der Rhythmus sehr nahe an einer Schwingungsdauer von 24 Stunden. (Nach Golden u. Canales 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

13.1.2 Zirkadiane Rhythmik Die zirkadiane Rhythmik ist in vielerlei Hinsicht ein gutes Beispiel, um die Verbindung zwischen Genen und Verhalten zu verdeutlichen. Außerdem wird hier auch klar, wie Umwelteinflüsse die Expression von Genen beeinflussen, sodass wir am Ende sehen können, wie das Wechselspiel zwischen Genen und äußeren Einflüssen das sichtbare Verhalten beeinflusst. Zirkadiane Rhythmik ist vielen Organismen eigen – von Bakterien bis hin zu Menschen. Sie ist wahrscheinlich zunächst als eine Konsequenz des ständigen Wechsels zwischen Tag und Nacht entstanden. Allerdings folgen die endogenen Rhythmen einer 24-Stunden-Periodizität auch in Abwesenheit fluktuierender äußerer Einflüsse. Für Pflanzen wurde von Bünning schon 1935

dafür eine genetische Grundlage beschrieben (für eine neuere Übersichtsarbeit siehe McWatters et al. 2001). Die Abhängigkeit der Blütenbildung von der Tageslänge hatten wir auch schon im Kapitel über Entwicklungsgenetik besprochen (Abb. 11.11). Bei Tieren wurde die „innere Uhr“ erst Ende der 1960er-Jahre entdeckt (Pittendrigh 1967). Pioniermodell war hier – wie oft in der Genetik – die Taufliege Drosophila, deren rhythmisches Verhalten ab Beginn der 1970erJahre (Konopka u. Benzer 1971) systematisch untersucht wurde. Diese Arbeiten wurden durch Experimente an Algen (Bruce 1972), Pilzen (Feldman u. Hoyle 1973) und schließlich an Mäusen ergänzt (Vitaterna et al. 1994). Um einen Prozess als zirkadianes Verhalten zu bezeichnen, muss er über drei Eigenschaften verfügen (Abb. 13.7):

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

ï ein Rhythmus, der Maxima und Minima hat sowie eine Periodizität von etwa 24 Stunden (auch in Abwesenheit eines Umweltreizes: frei schwingende Periode); ï die Phase der Maxima und Minima kann durch Umweltreize verschoben werden (Zurücksetzen der Phase); ï die Schwingungsdauer ist leicht von der Temperatur abhängig. In Abb. 13.8 sind einige Modellorganismen gezeigt, bei denen zirkadiane Rhythmen nachgewiesen wurden und einfache, nicht invasive Nachweisverfahren etabliert sind. So ähnlich die verschiedenen Systeme hinsichtlich ihres grundlegenden Ablaufs sind, so können sie dennoch nicht (noch nicht?) als ein einheitliches System betrachtet werden, das eine gemeinsame Evolution durchlaufen hätte. Das zirkadiane System bei Eukaryoten beruht in erster Linie auf einer Serie von

heterodimeren Transkriptionsfaktoren, die ihre eigene Expression (direkt oder indirekt) stimulieren oder hemmen. Einige dieser Proteine bewegen sich innerhalb der Zelle, und ihre Lebensdauer wird durch chemische Modifikationen (Phosphorylierung oder Abbau) oder durch Bindung an andere Partner so beeinflusst, dass eine Zu- oder Abnahme der aktiven Proteinkonzentrationen in einem annähernden 24-Stunden-Rhythmus bewirkt wird. Die meisten Komponenten in Drosophila haben eine Entsprechung bei Säugern, aber in einigen Fällen sehen wir Redundanz, in anderen Fällen sind die Funktionen der gleichen Proteine unterschiedlich. So gibt es in der Maus drei Homologe des period-Gens von Drosophila mit ähnlichen Funktionen ‒ andererseits sind die Cryptochrom-Proteine in Fliegen und Nagern von der Sequenz her sehr ähnlich, aber in ihren Funktionen unterschiedlich. Und für die Schlüsselkomponenten der Uhr von Neurospora crassa gibt es keine Homologien in den

Abb. 13.8 a–e Verschiedene Modellsysteme für die Erforschung zirkadianer Rhythmik. Jedes System bietet eine eigene Methode zur nicht-invasiven oder automatischen Aufzeichnung des Tagesrhythmus an. a Die Tagesaktivität von Nagern wird im Laufrad bei konstanter Dunkelheit gemessen und in der Form eines „Aktogramms“ aufgezeichnet. Zeiten der Aktivität erscheinen in Schwarz und geben Informationen über die Schwingungsdauer und Phase der inneren Uhr von Säugern. b Der Pilz Neurospora crassa bildet unter der Kontrolle einer biologischen Uhr asexuelle Sporen. Diese Konidienbildung kann in speziellen Wachstumskammern gemessen werden (diese race tubes sind 30–40 cm lange Glasröhrchen mit nach oben gebogenen Enden und einem Agarnährboden). c Pflanzen zeigen einen Tagesrhythmus der Blattbewegung. In Arabi-

dopsis thaliana kann der Rhythmus der Bioluminiszenz durch Fusionsproteine mit der Luciferase für mehrere Tage bei konstanter Helligkeit sichtbar gemacht werden. d Im einzelligen Cyanobakterium Synechococcus elongatus werden Fusionsprodukte mit Luciferase dazu benutzt, den Tagesrhythmus der Promotoraktivität im Hochdurchsatzverfahren zu testen. Diese Methode erlaubt es, alle Komponenten des Oszillators sowie der Ein- und Ausgangssignale zu bestimmen. e Durch die Flugbewegungen von Drosophila melanogaster wird ein Infrarotstrahl in einem speziellen Röhrchen unterbrochen; die Zahl der Unterbrechungen kann elektronisch aufgezeichnet werden, um so ein zirkadianes Muster der Bewegungsaktivität zu erhalten. (Nach Golden u. Canales 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

13.1 Endogene Rhythmik

sequenzierten Genomen von Säugern, Pflanzen und Cyanobakterien (Blaualgen). Und trotzdem regelt der Pilz die Bildung von Konidien (Sporen) und die entsprechende Genexpression mit ähnlichen Mechanismen, wie sie in Drosophila und Nagern charakterisiert wurden.

Als Konopka und Benzer Ender der 1960er-Jahre begannen, Drosophila-Mutanten auf gestörte zirkadiane Rhythmen zu untersuchen, waren viele Kollegen

skeptisch, ob die Mutation in einem Gen ein so komplexes Verhalten so massiv beeinflussen kann. Es wurden zunächst vor allem zwei Parameter untersucht: die Laufaktivität und die Periodizität des Schlüpfens der reifen Fliegen. Letzteres erfolgt in der Regel in den frühen Morgenstunden (daher auch der Name „Taufliege“). Beide Verhaltensweisen werden in einem HellDunkel-Rhythmus (12:12 Stunden) untersucht und anschließend unter konstanten Bedingungen (Dauerdunkel) weitergeführt, um so den Einfluss eines exogenen Zeitgebers auszuschalten. Konopka und Benzer hatten Erfolg und beschrieben 1971 ihre ersten drei Mutanten, die alle das period (per)-Gen betreffen: ein Nullallel (per0), das zu einem vollständigen Verlust rhythmischen Verhaltens führt, und zwei Allele, die den Rhythmus zwar intakt lassen, aber zu einer verkürzten (19 Stunden) bzw. verlängerten (27 Stunden) Schwingungsdauer im Dauerdunkel führen. Die Arbeiten der vergangenen 35 Jahre machen deutlich, dass das Herzstück der „inneren Uhr“ bei Drosophila aus zwei Rückkopplungsschleifen besteht. Dabei wird die Aktivierung der Uhr-Gene durch Proteine gehemmt, die durch eben diese Gene codiert werden – so entsteht eine rhythmische Genexpression. In Drosophila sind es neun Gene, die zur zentralen Funktion der „inneren Uhr“ beitragen: period (per), timeless (tim), Clock (Clk), cycle (cyc), cryptochrome (cry), shaggy (sgg), vrille (vri), double-time (dbt) und das Gen für das PAR-Domänenprotein 1ε (Pdp1e). Die Proteine, die von Clk und cyc codiert werden, gehören zur Familie der basischen Helix-Loop-Helix(bHLH)Transkriptionsfaktoren und binden als Heterodimere an spezifische Bindestellen in den Promotoren der perund tim-Gene, um deren Transkription zu aktivieren

Abb. 13.9 Modell der Tagesuhr bei Synechococcus. Ein ca. 24-Stunden-Rhythmus wird durch einen phosphorylierenden Oszillator erzeugt, der sowohl im Licht wie auch in der Dunkelheit oszillieren kann (grauer Bereich). KaiA (kleine grüne Kreise) wirkt dabei positiv auf die Phosphorylierung von KaiC (braune Kreise; nicht quantitativ dargestellt), die durch KaiB (rot) herunterreguliert werden kann. Dieser metabolische Zeitgeber reguliert die allgemeine Transkription herauf (+) oder herunter (−), wobei die zirkadiane Regulation auf das Transkriptom der

Cyanobakterien übertragen wird (ccgs: clock controlled genes). Damit ist die Regulation der Transkription by Synechococcus ein Ergebnis der Tagesuhr. Da Licht die Transkription hochreguliert (+) und Dunkelheit die Transkription eher hemmt (−), ist Genexpression ein „Input“ in die Tagesuhr, indem nämlich auch die Konzentrationen der Zeitgeber-Komponenten KaiA, KaiB und KaiC vorübergehend geändert werden. (Nach Roenneberg u. Merrow 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Die Cyanobakterien sind ein hervorragendes Beispiel für die Bedeutung genetischer Methoden, wenn über einen Vorgang nichts bekannt ist, außer dass er stattfindet: Erst die Isolation von Defektmutanten führte zur Charakterisierung des Uhrensystems bei den Blaualgen. Die Fusion des bakteriellen Luciferase-Enzyms mit dem Promotor des psbA-Gens (das für ein zentrales Protein des Photosystems-II der Blaualgen codiert) zeigte eine zirkadiane Rhythmik. Dieses System erlaubte es nun, nach Mutanten zu suchen, die die zirkadiane Rhythmik beeinflussen. Chemische Mutagenese (Kapitel 9.4.3) förderte eine Fülle von Mutanten zutage, die eine Störung der zirkadianen Rhythmik aufweisen ‒ und genetische Komplementationsexperimente zeigten schließlich, dass ein einziger Genort mit drei offenen Leserahmen die Rhythmik in den Defektmutanten wieder herstellen konnte. Die drei Gene innerhalb dieses Genorts werden als kaiA, kaiB und kaiC bezeichnet (sie wurden in Japan kloniert, und kaiten bedeutet im Japanischen einen Zyklus von Ereignissen; Ishiura et al. 1998). Eine Übersicht über die Regulationsmechanismen des kaiLocus gibt Abb. 13.9.

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Abb. 13.10 Die zwei Schleifen der molekularen Uhr bei Drosophila. In der ersten Schleife aktivieren CLK und CYK direkt die Transkription von per und tim. Dabei vermittelt CRY den Licht-abhängigen Abbau von TIM und ist teilweise dafür verantwortlich, dass sich keine PER/TIM-Heterodimere während des Tages anreichern. In der Nacht akkumulieren PER und TIM im Cytoplasma und gelangen in den Zellkern, wo PER die CLK/ CYK-Aktivität hemmt. Der Zeitpunkt des Eintritts in den Zell-

kern und die Stabilität von PER werden durch die SGG-abhängige Phosphorylierung von TIM und die DBT-abhängige Phosphorylierung von PER kontrolliert. In der zweiten Schleife wirkt PDP1ε als Aktivator und VRI als Repressor der Clk-Transkription. Da Pdp1ε und vri direkte Zielgene von CLK/CYC sind, stellt das einen zweiten Rückkopplungskreis dar. (Nach Collins u. Blau 2007, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

(Abb. 13.10). Die Akkumulation der Proteine PER und TIM und ihre Translokation in den Zellkern wird durch die Funktion der durch dbt codierten Proteinkinase verzögert. Als Ergebnis können CLK und CYC deren Transkription weiterhin aktivieren, während PER und TIM zunächst im Cytoplasma weiter akkumulieren. Erst wenn sie in den Zellkern gelangen, stoppen sie die Transkription ihrer Gene dadurch, dass sie als Heterodimere direkt an die CLK-CYC-Heterodimere binden. Diese Abschaltung bleibt so lange bestehen, bis PER und TIM wiederum selbst abgebaut werden, woran die bereits erwähnte Proteinkinase DBT beteiligt ist. Damit wird eine neue Runde der Transkription von per und tim ermöglicht. Dieser Rückkopplungsmechanismus wird durch einen zweiten verstärkt, der die Expression von Clk rhythmisch reprimiert; an diesem zweiten Mechanismus ist vri (vrille) beteiligt, das für einen bZip-Transkriptionsfaktor codiert. Zwar läuft die innere Uhr bei Drosophila auch im Dauerdunkel, dennoch reagiert die Uhr auf äußere Zeitgeber, um sich an verändernde Umweltsituationen anzupassen. Dazu gehören im Wesentlichen drei Komponenten: Licht, Wärme und soziale Signale. Das primäre Signal ist das Licht, das die Fliegen während des Tages aktiviert und während der Nacht schlafen lässt. Drosophila empfängt über zwei Wege Informationen über Licht: durch den Blaulicht-Rezeptor Cryptochrom und über das Auge. Projektionen von den

Photorezeptorzellen des Auges haben Kontakt mit den Lateralneuronen; der Rhythmus von Fliegenmutanten, denen Photorezeptoren und CRY fehlen, kann durch Licht nicht beeinflusst werden. Der am besten charakterisierte Effekt von Licht auf die Uhr von Drosophila besteht im Abbau von TIM, und dieser schnelle Abbau ermöglicht es der molekularen Uhr, auf die täglichen und saisonalen Schwankungen von Licht zu reagieren. Auf der Verhaltensebene verzögert oder beschleunigt ein Lichtpuls während der Nacht den Aktivitätsbeginn am nächsten Tag, abhängig davon, wann der Impuls gesetzt wird: Ein Lichtpuls am frühen Abend degradiert das cytoplasmatische TIM, das die PER-Anhäufung verzögert und damit das Fortschreiten der molekularen Uhr. Folglich ist damit auch die Aktivität für den nächsten Tag verzögert. Umgekehrt führt ein Lichtpuls spät in der Nacht zum Abbau von TIM im Zellkern und „befreit“ PER, sodass es die Aktivität von CLK/CYC früher am Tag reprimieren kann als normal und damit den Aktivitätsbeginn am nächsten Tag beschleunigt. Am CRY-abhängigen Abbau von TIM ist auch das kürzlich identifizierte F-Box-Protein JETLAG (Gensymbol: jet) beteiligt: hypomorphe jetc-Mutanten haben eine veränderte Aminosäure in der Leucin-reichen Wiederholungseinheit; sie sind rhythmisch im Dauerlicht, haben aber ein normales Verhalten im Dauerdunkel und zeigen verminderte

13.1 Endogene Rhythmik

Abb. 13.11 Rückkopplungsschleifen kontrollieren die Tagesuhr bei Säugern. Die Zentraleinheit der Tagesuhr bei Säugern ist eine negative Transkriptions-Translationsrückkopplungsschleife mit einer Verzögerung zwischen der Transkription und der negativen Rückkopplung. Die Uhr wird durch einen heterodimeren Transkriptionsfaktor gestartet, der aus CLOCK und BMAL1 besteht. Diese beiden Proteine treiben die Expression ihrer eigenen Repressoren, der beiden „period“-Proteine Per1 und Per2 sowie der Crytochrome CRY1 und CRY2, an. Im Tagesverlauf häufen sich die PER- und CRY-Proteine an und multimerisieren im Cytoplasma, wo sie durch die Caseinkinase Iε (CKIε) und die Glykogensynthase-Kinase-3 (GSK3) phosphory-

liert werden. In einer phosphorylierungsabhängigen Reaktion werden sie dann in den Zellkern transportiert, wo sie mit dem CLOCK-BMAL1-Komplex in Wechselwirkung treten und ihren eigenen Aktivator reprimieren. Am Ende des Tageszyklus sind PER- und CRY-Proteine in einer CKI-abhängigen Reaktion abgebaut; damit wird die Hemmung der Transkription aufgehoben und der Start der nächsten Runde ermöglicht. Eine zusätzliche, stabilisierende Rückkopplungsschleife beinhaltet den Aktivator Rora und den Inhibitor Rev-Erbα; sie kontrolliert die BMAL1-Expression und verstärkt die Oszillation. (Nach Gallego u. Virshup 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Antworten auf Lichtpulse, was auf einen Defekt im Licht-abhängigen Signalweg schließen lässt. Der Effekt ist abhängig vom genetischen Hintergrund der Fliegenmutanten: Er tritt nur dann auf, wenn die Fliegen das timls-Allel besitzen, das 23 andere Aminosäuren am N-Terminus hat und weniger lichtempfindlich ist (L-Tim) (Peschel et al. 2009).

wendung unterschiedlicher per-Allele erreicht, die sich in der Zahl von Thr-Gly-Wiederholungen unterscheiden und zu unterschiedlichen Temperaturoptima des Per-Proteins führen: Per-Proteine mit 20 Thy-GlyWiederholungseinheiten zeigen eine Schwingungslänge von ungefähr 23,7 Stunden über einen breiten Temperaturbereich und sind eher in Nordeuropa verbreitet; Per-Proteine mit 17 Thy-Gly-Wiederholungseinheiten finden sich dagegen eher im Süden, da diese Variante ein höheres Temperaturoptimum hat.

Drosophila-Fliegen zeigen auch während des Tages ein interessantes Phänomen: Sie halten in der heißen Mittagszeit des Sommers Siesta. Bei kühleren Temperaturen und wenn die Tage kürzer werden, ist auch die Siesta-Phase verkürzt. Diese Antwort wird durch ein alternatives Spleißen von per reguliert; dieses alternative Spleißen eines Introns in der 3'-UTR wurde zunächst intensiv in Photorezeptorzellen studiert. Die Regulation des alternativen Spleißens wird über die NorpA-Phospholipase-C vermittelt. NorpA ist ein Faktor, der allgemein ein Temperatur-abhängiges Verhalten vermittelt, und NorpA-Mutanten sind nicht in der Lage, ihr Verhalten an Temperaturänderungen anzupassen. Die Temperatur-Kompensation, d. h. die Unabhängigkeit der Rhythmik über einen engeren Temperaturbereich (Abb. 13.7c) wird dagegen durch die Ver-

Obwohl Drosophila im Allgemeinen nicht als ein soziales Tier gilt, wird die molekulare Uhr offensichtlich auch durch soziale Signale beeinflusst. Fliegen, die vor dem Test gemeinsam gehalten wurden, zeigen im Einzeltest unter Freilaufbedingungen eine größere Übereinstimmung als die Fliegen, die vorher schon getrennt gehalten wurden. Wenn man beispielsweise arhythmische per01-Mutanten zu einer Gruppe rhythmischer Fliegen gibt, wird die Synchronisation vermindert. Weitere Detailuntersuchungen zeigten schließlich, dass die entsprechenden Signale über die Luft übertragen werden und über das Geruchssystem verarbeitet werden.

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

In Säugetieren ist dasselbe Prinzip wie bei Drosophila verwirklicht, und auch die beteiligten Gene sind homolog (Abb. 13.11). In der entscheidenden morphologischen Struktur, den Suprachiasmatischen Kernen des Hypothalamus, sind auch mehrere Gene an der Wirkung der „inneren Uhr“ beteiligt, darunter mPer1, mPer2, die Cryptochromgene mCry1 und mCry2, mClk, Bmal1 (oder Mop3 als das Homolog zu cyc) sowie Ck1e (homolog zu dbt; codiert für Caseinkinase 1ε). Dabei erfüllen die mCRY-Proteine die repressive Funktion von tim: Wie bei Drosophila aktivieren die Genprodukte von mClk und Bmal1 die mPer-Promotoren, aber auch (im Gegensatz zu Drosophila) die mCry-Promotoren selbst. Die Caseinkinase Iε (CK1ε) wird durch CK1δ unterstützt und destabilisiert die PER-Proteine der Maus. Dadurch verzögert sich die Akkumulation dieser reprimierenden Proteine und ihre Translokation in den Zellkern. Nach dem Eintritt des mCRY-mPER-CK1εCK1δ-Komplexes in den Zellkern wird die Transkription durch die direkte Bindung an die mCLK-BMAL1Heterodimeren unterbunden. Wie bei den Fliegen existiert auch in der Maus ein zweiter, verstärkender Rückkopplungsmechanismus, wobei mPER2 die Bmal1Transkription positiv beeinflusst. Dabei spielt auch ein

Vrille-Homolog eine Rolle, das zur Gruppe der basischen Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktoren gehört (Gensymbol: vri). Wesentlichen Einblick in die Funktion der Gene haben wir durch die Untersuchung entsprechender Mutanten erhalten; einige davon werden in der Tabelle 13.1 vorgestellt. Auch wenn die Zusammenfassung insgesamt den Eindruck vermitteln mag, dass die zentralen Bereiche der „inneren Uhr“ klar und einfach geregelt sind, muss aber abschließend darauf hingewiesen werden, dass das Gesamtsystem wesentlich komplexer ist. So wirkt z. B. auch die Rhythmik der Nahrungsaufnahme als Zeitgeber und beeinflusst entsprechend die Rhythmik der Leber und damit der Körpertemperatur.

Zirkadiane Rhythmen werden bei Drosophila und der Maus durch autoregulatorische Rückkopplungsschleifen gesteuert. Daran sind Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen und Repressoren von Transkriptionsfaktoren essenziell beteiligt. Die zentrale morphologische Struktur der Säugetiere sind die Suprachiasmatischen Kerne des Hypothalamus.

Tabelle 13.1 Rhythmus-Mutationen bei Säugern Gen

Organismus

Molekulare Veränderung

Phänotyp

Clock

Maus

Basenaustausch an einer Spleißstelle (Verlust eines Exons und Deletion von 51 Aminosäuren)

Perioden von 26- bis 29-stündigen Bewegungen folgt ein vollständiger Verlust der zirkadianen Rhythmik nach 14 Tagen

Clock

Mensch

C/T-Polymorphismus an Pos. 3111 in der 3’-UTR der CLK-cDNA

Verzögerung der morgendlichen Aktivitäten bzw. des abendlichen Schlafbeginns

Csnk1e

Hamster

Arg178Cys

20-Stunden-Rhythmus des Verhaltens

Per1

Maus

Null-Mutante (Knock-out)

Verkürzung der Rhythmen um 0,6–1 Stunde

Per2

Maus

Null-Mutante (Knock-out)

Arhythmie nach einigen Tagen im Dauerdunkel

Per2

Mensch

Ser662Gly

CKIε-Bindestelle; verlängerte Schlafphasen

Per3

Maus

Null-Mutante (Knock-out)

Verkürzung der Rhythmen um 1/2 Stunde

Per3

Mensch

Val647Gly

schwache Kopplung mit verlängerten Schlafphasen

Bmal1 (Mop3)

Maus

Null-Mutante (Knock-out)

Arhythmie nach einigen Tagen im Dauerdunkel

Cry1

Maus

Null-Mutante (Knock-out)

Verkürzung der Rhythmen um 0,8–1,3 Stunden

Cry2

Maus

Null-Mutante (Knock-out)

Verlängerung der Rhythmen um 0,6–0,9 Stunden

dbp

Maus

Null-Mutante (Knock-out)

Verkürzung der Rhythmen um 1/2 Stunde

Nach Stanewsky (2003)

13.1 Endogene Rhythmik

Zwei Aspekte werden in den nächsten Jahren die Forschung über die zirkadiane Rhythmik bei Säugern begleiten: Sind die Suprachiasmatischen Kerne die einzigen rhythmischen Zentren oder gibt es noch weitere? In der Diskussion sind die Retina und der Riechkolben als ebenso wichtige Oberzentren sowie die lateralen Nuclei habenulae, der dorsomediale Hypothalamus und der Nucleus arcuatus (infundibularis) des Hypothalamus als semi-autonome Oszillatoren (für eine aktuelle Übersicht siehe Guilding u. Piggins 2007). Der zweite Aspekt ist das Zusammenspiel der molekularen Uhr mit Veränderungen der Chromatinstruktur. Neuere Arbeiten zeigen überraschende Zusammenhänge mit Histon-Modifikationen, insbesondere durch die Histonacetyltransferase-Aktivität des CLOCK-Proteins (für eine Übersicht dieses Aspekts siehe Nakahata et al. 2007).

zirkadianen System. Es wird interessant sein, die Entwicklung dieses Aspektes weiter zu verfolgen.

13.1.3 Schlafstörungen des Menschen

Außer der Sonne kann offensichtlich auch der Mond als Zeitgeber wirken: Der Kaninchenfisch (Siganus guttatus) lebt über Riffen des Indischen Ozeans und des westlichen Pazifiks und hat einen Laich-Zyklus, der sich an den Mondphasen orientiert (lunare Rhythmik). Sugama und seine Mitarbeiter haben 2008 darüber berichtet, dass die Expression des Gens Period2 (Gensymbol: Per2) in der Zirbeldrüse (Epiphyse) des Kaninchenfisches deutlich ansteigt, wenn der Fisch während der Nacht Licht ausgesetzt wird (erfolgt der Lichtreiz am Tag, hemmt er dagegen die Per2-Expression). Dabei ist die Per2-Expressionsstärke von der Stärke des Lichts in der Nacht abhängig und kann somit Vollmond von Neumond unterscheiden. Dieser Effekt ist auf die Nachtphase beschränkt, denn Per2 wirkt ansonsten als wichtiger Zeitgeber im

Ebenso wie bei Drosophila und der Maus sind bei Menschen eine Reihe physiologischer Funktionen durch endogene zirkadiane Rhythmik gesteuert. Dazu gehören nicht nur der Schlaf-Wach-Rhythmus, sondern auch kognitive Funktionen, die Körpertemperatur und die Sekretion von Hormonen. Als Zeitgeber fungieren dabei verschiedene Umweltreize, vor allem Licht. Patienten mit Störungen ihrer zirkadianen Rhythmik sind nicht in der Lage, ihren Schlaf-Wach-Rhythmus an diese Umweltsignale anzupassen. Jeder 3. Erwachsene leidet gelegentlich unter Einund/oder Durchschlafstörungen, allerdings liegt etwa bei jedem 10. Erwachsenen bereits eine chronische Schlafstörung vor, die die Stimmung und Leistungsfähigkeit am Tage erheblich beeinträchtigt. Schlafstörungen zählen damit (neben Kopfschmerzen) zu den häufigsten psychosomatischen Beschwerden. Offensichtlich nimmt die Häufigkeit dieser Symptome mit dem Alter zu, denn etwa 40 % der über 65-Jährigen klagt über unzureichenden Schlaf bzw. Schlafprobleme. Wir können verschiedene Formen der Schlafstörungen unterscheiden: ï Ein- und Durchschlafstörungen (Insomnien); ï Störungen mit vermehrter Tagesschläfrigkeit (Hypersomnien); ï Störungen des Schlaf-Wach-Rhythmus (wesentlich frühere oder spätere Einschlafrhythmen); ï Schlafstörungen (Parasomnien, z. B. Schlafwandeln).

Abb. 13.12 Schlafstörungen des Menschen. Die Phase des Tagesrhythmus wird durch Schlafunterbrechungen bestimmt; die schwarzen Balken symbolisieren die Aktivitätsphasen. Links wird die anomale Frühphase einer Schlafstörung mit vorgezogener Einschlafphase (engl. advanced sleep phase syndrome, ASPS)

gezeigt, in der Mitte eine Kontrolle und rechts die verzögerte Einschlafphase (engl. delayed sleep phase syndrome, DSPS). Mutationen in den PER-Genen und den Caseinkinase-Inhibitoren (CKI) sind dafür verantwortlich. (Nach Gallego u. Virshup 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Einige der Störungen des Schlaf-Wach-Rhythmus treten familiär gehäuft auf; Abb. 13.12 zeigt Beispiele für eine derartige Situation bei einzelnen Probanden. Dabei leiden die Patienten daran, dass sie bereits am frühen Abend einschlafen (engl. advanced sleep phase syndrome). Modelle in bestimmten Hamster- bzw. Mausmutanten zeigen ähnliche Verhaltensmerkmale, sodass auch hier auf vergleichbare Funktionen der beteiligten Gene geschlossen werden kann. Ein klassisches Beispiel für eine erbliche Veranlagung zum frühen Einschlafen ist ein Stammbaum über vier Generationen, von dem Toh et al. 2001 berichteten (OMIM 604348): Neben drei polymorphen Stellen im Exon 17 des PER2-Gens gibt es darüber hinaus eine Punktmutation (A2106G), die zu einem Austausch von Ser durch Gly an Position 662 führt (S662G). Diese Mutation wurde außerhalb der Familie nicht beobachtet und führt zu einer verringerten Phosphorylierung durch Caseinkinase Iε.

Aminosäureaustausch T44A im CSNK1D-Gen führt in vitro zu einer verminderten enzymatischen Aktivität. Transgene Drosophila-Fliegen, die diese Mutation tragen, zeigen eine verlängerte zirkadiane Rhythmik. Im Gegensatz dazu zeigen transgene Mäuse mit derselben Mutation eine verkürzte Periode, was eher der Situation beim Menschen entspricht. Dieses Ergebnis zeigt nicht nur, dass die Caseinkinase I eine zentrale Komponente der „inneren Uhr“ ist – offensichtlich haben wir hier ein interessantes Beispiel für unterschiedliche regulatorische Mechanismen bei den verschiedenen Klassen des Tierreiches vor uns (Xu et al. 2005).

Größere epidemiologische Untersuchungen konnten für zwei Polymorphismen eine Assoziation mit Veränderungen im Schlaf-WachRhythmus zeigen: In der 3’-flankierenden Region des menschlichen Clock-Gens CLK gibt es einen Polymorphismus (T3111C; Tabelle 13.1), der offensichtlich mit verschiedenen Schlaf-Wach-Rhythmen assoziiert ist. Homozygote Träger des C-Allels schlafen demnach später ein bzw. haben ein geringeres Schlafbedürfnis. Dabei sind diese Daten offensichtlich unabhängig von demographischen Größen wie Alter, Geschlecht und ethnischer Herkunft (Serretti et al. 2003). Ein zweiter Polymorphismus ist im menschlichen PER3-Gen beschrieben. Dieses Gen besteht aus 21 Exons; Exon 18 enthält eine repetitive Sequenz von 54 bp, die entweder 4- oder 5-mal hintereinander vorkommt. Dabei ist offensichtlich das längere Allel mit einem „Morgentyp“ und das kürzere mit einem „Abendtyp“ assoziiert; Homozygotie für das kürzere Allel ist darüber hinaus bei Patienten mit Einschlafstörungen (engl. delayed sleep phase syndrome) deutlich überrepräsentiert (Archer et al. 2003).

13.2 Lernen und Gedächtnis

Diese Beispiele zeigen, dass die moderne Genetik schrittweise durch die Kombination verschiedener methodischer Ansätze (Populationsgenetik bzw. genetische Epidemiologie, funktionelle Speziesvergleiche, Hochdurchsatzverfahren in der Sequenzanalyse) in der Lage ist, auch komplexe Verhaltensweisen wie Schlaf-WachRhythmen beim Menschen aufzuklären und die Einzelkomponenten zu identifizieren und zu charakterisieren. Eine weitere Mutation, die zu familiär gehäuftem frühen Einschlafen führt, wurde im Gen für die Caseinkinase Iδ beschrieben. Der

Zirkadiane Rhythmen des Menschen sind in ähnlicher Weise wie bei anderen Säugetieren genetisch kontrolliert. Polymorphismen in CLK- oder PER-Genen können mit unterschiedlichen Schlaf-Wach-Rhythmen assoziiert werden.

Erinnerung ist ein Prozess, durch den aufgenommene Informationen verarbeitet und gespeichert werden. Das kann nur für Minuten (Kurzzeitgedächtnis) oder für Stunden, Tage, Monate oder ein ganzes Leben sein (Langzeitgedächtnis). Unser Gehirn ist in der Lage, verschiedene Arten von Informationen zu speichern und verschiedene Formen von Gedächtnis zu bilden, die in zwei grundsätzliche Kategorien fallen: implizit und deklarativ. Das implizite Gedächtnis beinhaltet die einfache klassische Konditionierung, nicht-assoziatives Lernen, Wahrnehmungsvermögen und motorische Geschicklichkeit. Fahrradfahren und Klavierspielen erfordern ebenso die Entwicklung eines impliziten Gedächtnisses. Das deklarative Gedächtnis dagegen speichert Informationen über spezielle Ereignisse und dazugehörende zeitliche und persönliche Assoziationen. Diese Art von Gedächtnis benutzen wir täglich, um Leute, Gesichter und Plätze wiederzuerkennen und um uns an Geschehnisse aus unserer Vergangenheit zu erinnern. Diese Art von Erinnerung beinhaltet auch unsere sensorische Wahrnehmung, unsere Gefühle und Motivationen. Wenn wir uns an eine Erfahrung erinnern, rufen wir auch alles ab, was wir gesehen, gehört, gerochen, geschmeckt, gefühlt und erfühlt haben. In diesem Abschnitt werden in groben Zügen die genetischen Grundlagen unserer Erinnerung, des Gedächtnisses und auch des Lernens dargestellt. Auch hier kommen die grundlegenden Erkenntnisse zunächst von niederen Tieren wie der Schnecke Aplysia oder der Fliege Drosophila, und erst später konnten entsprechende Mausmutanten identifiziert und charakterisiert werden. Damit lassen sich jetzt auch kognitive Störungen bei Menschen besser verstehen.

13.2 Lernen und Gedächtnis

Abb. 13.13 a, b Geruchsvermeidungslernen bei Drosophila. a Während des Trainings erfahren die Fliegen einen Geruch im Zusammenhang mit einer Bestrafung durch einen elektrischen Schock. Durch wiederholtes Testen vermeiden die Fliegen vorzugsweise den mit Schock verbundenen Geruch. Eine Gruppe von ~ 100 Fliegen wird in der Kammer trainiert, wobei die innere Oberfläche mit einem elektrifizierbaren Metallgitter ausgekleidet ist. Die Gerüche werden mit dem Luftstrom eingeblasen, wobei die Tiere zunächst einem Geruch (z. B. OCT: 3-Oktanol) und einem Elektroschock ausgesetzt werden. Danach erfahren sie einen zweiten Geruch (z. B. MCH: 4-Methyl-

cyclohexanol) ohne Schock. b Die Fliegen werden dann auf ihre Lern- oder Gedächtnisleistung getestet. Dazu werden sie in eine Position gebracht, an der sie zwischen den beiden einströmenden Gerüchen wählen können. Nach 2 Minuten werden die Fliegen gefangen und gezählt, die zu dem jeweiligen Geruch gelaufen sind. Die jeweiligen Quotienten entsprechen der Lernleistung, wenn der Abstand zwischen Training und Test kurz war (2 Minuten). Gedächtnisleistungen können im Prinzip auf die gleiche Weise gemessen werden, nur wird dabei der zeitliche Abstand zum Training verlängert. (Nach Waddell u. Quinn 2001, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Abb. 13.14 a, b Bidirektionale Züchtung von Lernverhalten bei Drosophila. a Hungrige Fliegen wurden 15 Versuchen einer klassischen Konditionierung unterzogen, wobei einer von zwei chemosensorischen Reizen (Wasser oder Salzlösung; konditionierter Reiz) am Fuß mit einem Zucker-Reiz (unkonditioniertem Reiz) an den Rüssel verbunden wurde. Normalerweise bewirkt der Zucker-Reiz eine deutliche Verlängerung des Rüssels. Nach einigen paarweisen konditionierten/unkonditionierten Versuchen begann der konditionierte Reiz allein eine entsprechende Verlängerung des Rüssels hervorzulocken. Der Lerneffekt („Lernwert“) bestimmt sich aus der Zahl der Rüsselverlängerungen, die in den letzten 8 Trainingseinheiten durch den konditionierten Reiz hervorgerufen wurde. 8 Paare mit den höchsten bzw. niedrigsten Lernwerten wurden verpaart. Nach etwa 12 Generationen nähern sich die Lernwerte einer Asymptote, und die Mittelwerte der lebhaften und trägen Tiere unterscheiden sich signifikant voneinander sowie jeweils von der Ausgangspopulation. Diese lange Dauer spricht für eine polygene Grundlage der Verhaltensunterschiede. b Hungrige Fliegen (aber mit ausreichend Wasser) wurden am Fuß zunächst mit Wasser vorgetestet und unmittelbar darauf mit Zucker stimuliert. Nach 15, 30, 45 oder 60 Sekunden wurden sie erneut mit Wasser getestet und die Rüsselverlängerung bestimmt („Empfindlichkeitswert“). Jede Fliege wurde insgesamt 3-mal getestet. 8 Paare mit den höchsten bzw. niedrigsten Empfindlichkeitswerten wurden verpaart. Nach nur einer Generation nähern sich die Lernwerte einer Asymptote, und die Mittelwerte der hoch- und niedrigempfindlichen Tiere unterscheiden sich signifikant voneinander sowie jeweils von der Ausgangspopulation. Diese kurze Dauer spricht für die Beteiligung nur eines einzigen Gens. (Nach Tully 1996, mit freundlicher Genehmigung der Nationalen Akademie der Wissenschaften, USA)

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

13.2.1 Lernverhalten von Drosophila Systematische Untersuchungen zum Lernverhalten an Drosophila begannen zu Beginn der 1970er-Jahre, als Seymour Benzer mit seiner Gruppe (Quinn et al. 1974) Fliegen mithilfe eines Elektroschocks trainierte, bestimmte Gerüche zu meiden (klassische Konditionierung; Abb. 13.13). Eine andere Gruppe (Lofdahl et al. 1992) züchtete aus einer homogen erscheinenden Population von Fliegen nach über 20 Generationen zwei Gruppen heraus, die sich in ihrer Antwort auf konditionales Lernen signifikant unterscheiden: Hatte die Ausgangspopulation etwa 19 % Fliegen, die gut konditioniert werden konnten, so hatte die Gruppe der „guten Lerner“ am Ende 77 %, die der „schlechten Lerner“ dagegen nur 0 bis 4 %. Die lange Dauer, bis diese Züchtungsergebnisse erreicht wurden, deutet darauf hin, dass hier keine einfachen Mendel’schen Zusammenhänge vorliegen, sondern komplexe GenGen-Wechselwirkungen für den Phänotyp verantwortlich sind (Epistasie; Abb. 13.14). Benzers Experimente der klassischen Konditionierung führten schnell zur Identifikation und Charakterisierung von Genen, die zu einem erfolgreichen Lernverhalten beitragen. Die ersten Mutanten, die nicht in der Lage waren zu lernen, dass dem Wohlgeruch ein Elektroschock folgt, wurden als dunce (das Gen wurde später auf dem X-Chromosom von Drosophila lokalisiert) bzw. als rutabaga bezeichnet. Weitere biochemische und molekulare Analysen zeigten, dass dunce für eine cAMP-abhängige Phosphodiesterase und rutabaga für eine Adenylatcyclase codieren. In der Folgezeit wurden mit diesem System noch weitere DrosophilaMutanten mit Lerndefekten isoliert (z. B. radish, amnesiac, cabbage und turnip). Ihre molekulare Charakterisierung zeigte ein gemeinsames Grundmuster: Sie alle betreffen – auf unterschiedliche Weise – die cAMPSignalkaskade. Auch Mutationen in der cAMP-abhängigen Proteinkinase A (PKA) stören die olfaktorischen Lernerfolge. Ein Substrat der PKA-abhängigen Phosphorylierung ist CREB, ein Transkriptionsfaktor, der an cAMP-Antwortelemente (engl. cAMP-responsive elements) bindet, die in Promotoren entsprechender Zielgene vorhanden sind. Eine Übersicht über die biochemische Signalkaskade, die durch Lernmutanten definiert wird, gibt Abb. 13.15; in Tabelle 13.2 sind Ergebnisse verschiedener genetischer Ansätze zur Charakterisierung von Lern- und Gedächtnisprozessen bei Drosophila zusammengefasst. Die anatomische Lokalisation des olfaktorischen Lernverhaltens führte aufgrund verschiedener Experimente, nicht nur genetischer Untersuchungen, zu den Pilzkörpern (engl. mushroom bodies) im Gehirn von Drosophila (Abb. 13.15b). Die Pilzkörper haben eine enge Verbindung zu den Riechorganen, und so ist es

nicht verwunderlich, dass die Pilzkörper für das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis verantwortlich sind. Umgekehrt sind die Pilzkörper nicht notwendig, wenn Fliegen lernen, auf einfache visuelle Berührungs- oder Bewegungsreize zu reagieren. Allerdings gibt es auch Hinweise, dass komplexeres Lernverhalten die Beteiligung der Pilzkörper auch bei visuellen Stimuli erforderlich macht (z. B. beim Ausfiltern von Hintergrundrauschen). Offensichtlich sind die Pilzkörper nicht nur für die Integration des olfaktorischen Lernens wichtig, sondern auch für integratives Lernverhalten insgesamt. Dies wird deutlich, wenn bei Drosophila ein anderes Lernsystem verwendet wird, das einen Hitzeschock ohne zusätzlichen vorherigen äußeren Reiz verwendet (operante Konditionierung): Dabei sitzt die Fliege in einer Kammer, deren zweite Hälfte beim Betreten erhitzt wird (Abb. 13.15c). Nach kurzer Zeit hat die Fliege gelernt, diese Hälfte der Kammer zu meiden. Die Mutanten, die wir oben mit Defekten in den Genen der cAMP-Signalkaskade bereits kennengelernt haben, zeigen auch in der Hitzekammer deutliche Lerndefizite. Von besonderem Interesse waren in diesem Testsystem aber verschiedene ignorant-Allele, da sie unterschiedliche Phänotypen aufwiesen (das ignorant-Gen codiert für eine phosphorylierbare, ribosomale S6-Kinase mit einem Molekulargewicht von 90 kDa – daher „p90“). Die ursprüngliche Mutante (ignP1) enthält ein transposables P-Element im 1. Exon des Gens und zeigt in der Hitzekammer geschlechtsabhängige Veränderungen, denn unter diesen Bedingungen können nur die Männchen nicht lernen. Allerdings sind im klassischen olfaktorischen Konditionierungsexperiment beide Geschlechter dieser Linie von den Kontrollen nicht zu unterscheiden. Die zweite Mutante ist eine Null-Mutante (ign58/1), der die Kinase-Domäne fehlt. Dieses Allel führt zu Lerndefiziten in der klassischen Konditionierung, nicht aber in der Hitzekammer. Daraus lässt sich schließen, dass die Kinase-Aktivität und andere Domänen des Proteins für unterschiedliche Prozesse im Lernverhalten benötigt werden.

Genetische Untersuchungen zum Lernverhalten an Drosophila haben eine Reihe von Genen identifiziert, deren mutierte Allele die Lernfähigkeit deutlich vermindern. Diese Gene codieren in vielen Fällen für Enzyme, Rezeptoren oder Transkriptionsfaktoren in der cAMP-Signalkaskade.

13.2.2 Lernverhalten bei Mäusen Wie wir in früheren Kapiteln immer wieder gesehen haben, entwickelt sich die Maus in vielen Teilgebieten

13.2 Lernen und Gedächtnis

Abb. 13.15 a–d Operante Konditionierung und cAMP-Kaskade bei Drosophila. a Die Fruchtfliege Drosophila auf einer britischen Penny-Münze. b 3D-Rekonstruktion des DrosophilaGehirns. Die paarigen grünen Strukturen stellen die Pilzkörper dar. c Schematische Darstellung des Lernens in der Hitzekammer. 15 bis 30 solcher Kammern können gleichzeitig und parallel betrieben werden. Die Fliegen laufen dabei in einer kleinen, rechteckigen, geschlossenen Kammer in vollständiger Dunkelheit hin und her. Die obere und untere Oberfläche sind mit Peltier-Elementen zur schnellen Heizung und Kühlung ausgestattet. Die Position der Fliege wird automatisch bestimmt, und ein Thermosensor hält die Temperatur auf dem gewünschten Stand. Wenn die Fliege die „verbotene Zone“ erreicht, wird die ganze Kammer auf 40 °C aufgeheizt; wenn die Fliege diesen Bereich verlässt, wird die Kammer wieder auf 20 °C heruntergekühlt. Innerhalb von Minuten lernen die Fliegen, die verbotene Zone zu meiden. Sie behalten die Präferenz für die erlaubte Zone sogar dann bei, wenn die Bestrafung durch Hitze abgeschaltet wird. d Modell der postsynaptischen cAMP-

Kaskade. Einige ausgewählte Drosophila-Mutanten sind dabei herausgegriffen. Ein Rezeptor-gekoppeltes, cGMP-bindendes Protein („G-Protein“) und der Einstrom von Ca2+ aktivieren die rutabaga-Adenylatcyclase, die cAMP produziert. Das Ca2+- und cAMP-Signal vereinigen sich möglicherweise bei Raf, das durch das leonardo-codierte 14-3-3-Protein moduliert wird. Nach einem weiteren Phosphorylierungsschritt aktiviert die Mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) das CREB-Protein (engl. cAMPresponsive element binding protein) über P90, die ribosomale S6-Kinase (Rsk), die durch ignorant codiert wird. Durch die Bindung von CREB an Promotoren verschiedener Gene werden neue Proteine synthetisiert, die für das Langzeitgedächtnis wichtig sind (LTM; engl. long-term memory). Die dunce-Phosphodiesterase (PDE) vermindert dann die cAMP-Konzentration wieder. Diese Kaskade führt zu Veränderungen an vielen zellulären Strukturen wie z. B. den Zelladhäsionsmolekülen (CAM) oder an Ionenkanälen (wie dem K+-Kanal, der durch ether-ago-go codiert wird). (Nach Brembs 2003, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

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708 708

Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Tabelle 13.2 Genetische Untersuchungen zur Charakterisierung von Lern- und Gedächtnisleistungen bei Drosophila Mutante (Gensymbol)

Produkt

Biochemischer Weg

Expression

Verhaltensdefizit

Vorwärts-Screen (EMS) dunce (dnc)

cAMP-PDE

cAMP

Pilzkörper

Lernen

rutabaga (rut)

Ca2+/Calmodulin-aktivierte Adenylatcyclase

cAMP

Pilzkörper

Kurzzeitgedächtnis

amnesiac (amn)

Neuropeptid

cAMP

Dorsale paarweise mediale Neurone

Kurzzeitgedächtnis

ala

α-Lappen abwesend

PilzkörperEntwicklung

Langzeitgedächtnis

Screen mit P-Elementen linotte (lio)

Rezeptor-Tyrosinkinase

PilzkörperEntwicklung

Pilzkörper, Zentralkomplex

Lernen

latheo (lat)

Bestandteil des Komplexes zur origin-Erkennung

PilzkörperEntwicklung

Pilzkörper, neuromuskuläre Verbindungen

Lernen

milord (pum)

Ribonukleoprotein

RNA-Transport

Pilzkörper

Langzeitgedächtnis

norka (osk)

Ribonukleoprotein

RNA-Transport

Pilzkörper

Langzeitgedächtnis

krasavietz (eIf-5C)

Translationsfaktor

RNA-Transport

Pilzkörper

Langzeitgedächtnis

katalytische Untereinheit der PKA

cAMP

Pilzkörper

Kurzzeitgedächtnis

Enhancer-Screens DC0 leonardo (leo)

14-3-3

Ras/Raf/MAPK?

Pilzkörper

Lernen

volado (Vol)

α-Integrin

Zelladhäsion

Pilzkörper

Kurzzeitgedächtnis

fasciclinII (FasII)

Fasciklin II

Zelladhäsion

Pilzkörper

Kurzzeitgedächtnis

pumillio (pum)

Ribonukleoprotein

RNA-Transport

Pilzkörper

Langzeitgedächtnis

oskar (osk)

Ribonukleoprotein

RNA-Transport

Pilzkörper

Langzeitgedächtnis

eIf-5C

Translationsfaktor

RNA-Transport

Pilzkörper

Langzeitgedächtnis

CamKII

Ca2+/Calmodulin-abhängige Kinase II

CamKII

Gehirn

Lernen

PKA-RI

Regulatorische Untereinheit der Proteinkinase A

cAMP

Pilzkörper

Kurzzeitgedächtnis

Mikroarray-Screens

Kandidaten-Ansatz

synapsin (syn)

Synapsin

cAMP

Gehirn

Lernen

TH-Dopamin

Dopamin-Rezeptoren

cAMP

Gehirn

Lernen

Nach Skoulakis u. Grammenoudi (2006) und Keene u. Waddell (2007)

13.2 Lernen und Gedächtnis

der modernen Genetik zu einem der wichtigsten Modellorganismen. Dies gilt auch für die Neurogenetik, wo sie zwischen Erkenntnissen an Invertebraten und den Fragestellungen vermittelt, die wir im Hinblick auf die Humangenetik haben. Die für Lernen und Gedächtnis wichtige morphologische Struktur im Mausgehirn ist der Hippocampus (hier insbesondere der Gyrus dentatus und die Regionen CA1‒CA4). Der Hippocampus gehört zu den entwicklungsgeschichtlich alten Teilen des Säugergehirns, den es auch im menschlichen Gehirn gibt. Um bei der Maus den am Lernvorgang beteiligten Mechanismen auf die Spur zu kommen, werden verschiedene Verhaltenstests angewendet; in Abb. 13.16 werden dazu Beispiele vorgestellt. Bei dem „WasserLabyrinth“ (engl. water maze) muss die Maus beispielsweise lernen, in einem großen Wasserbehälter eine Unterwasserplattform wiederzufinden. Derartige Unter-

Abb. 13.16 a, b Lern- und Gedächtnistraining bei Mäusen. a Ein Wasser-„Labyrinth“ (engl. water maze) wird verwendet, um das Hippocampus-abhängige räumliche Lernen zu testen. Dabei müssen Mäuse eine untergetauchte Plattform in einem kreisförmigen Pool lokalisieren. b Links: Kontextabhängiges Angsttraining wird verwendet, um assoziatives Lernen zu untersuchen. Dabei wird ein Elektroschock am Fuß appliziert, und es muss gelernt werden, in welchem Zusammenhang der Elektroschock eintritt. Rechts: Die dreieckige Box stellt für die Maus eine neue Umgebung dar; sie wird verwendet, um episodisches Gedächtnis zu testen (engl. cue memory). (Nach Crawley 2008, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

suchungen werden bei der Maus noch nicht sehr lange systematisch durchgeführt, deshalb steht zunächst einmal die Erhebung von Basisdaten im Vordergrund, z. B. der Vergleich verschiedener Inzuchtstämme der Maus. Dabei zeigen sich interessante Unterschiede: Beispielsweise sind C57BL/6J-Mäuse offensichtlich „gute Lerner“, wohingegen CBA/J-Mäuse eher zu den „schlechteren Lernern“ gehören (Nguyen u. Gerlai 2002). Da es bisher nur sehr wenige spontane oder ENUinduzierte Lernmutanten der Maus gibt (zur chemischen Mutagenese vgl. Kapitel 9.4.3), hat man sich im Wesentlichen zunächst einmal darauf beschränkt, einige Gene auszuschalten, deren Produkte aufgrund von pharmakologischen oder elektrophysiologischen Untersuchungen als wichtige Kandidaten infrage kamen. Dabei ergab sich auch schon eine gewisse Übereinstimmung mit den Untersuchungen an Drosophila, sodass auch die genetische Lernforschung an der Maus das cAMP-System in den Mittelpunkt stellt. Allerdings zeigt sich hierbei ein wesentlicher Unterschied zu Drosophila in der Komplexität des Säugerorganismus: Das cAMP-System ist ja an vielen zellulären Antworten auf verschiedene Reize als Signalüberträger beteiligt. So sind zunächst einmal viele Mutanten überhaupt nicht lebensfähig, bei denen ein beteiligtes Gen ausgeschaltet wurde. Oder sie zeigen keinen auffälligen Phänotyp, weil ein anderes, ähnliches Gen die Funktion übernommen hat. Daher kommt bei diesen Untersuchungen in besonderem Maße die gewebespezifische Form der Knock-out-Technologie zum Einsatz (Cre/ lox-System oder induzierbare Mutationen über das tTA-System; Technik-Box 28). Die aktuelle Datenbank des Jackson-Labors enthält zur Zeit der Drucklegung dieses Buches (April 2010) Hinweise auf 531 verschiedene Phänotypen zum Stichwort „learning and memory“; ein Teil davon ist in Tabelle 13.3 aufgeführt. Im Folgenden werden einige Beispiele vorgestellt werden, wobei zunächst von den Signalrezeptoren (im Wesentlichen ein Glutamat-Rezeptor – NMDA) die Rede sein soll, dann von der Umschaltung des Signals via αCaMKII und PKA auf CREB und die Synthese der Transkriptionsfaktoren Zif268 und C/EBP. Die wichtige Rolle des NMDA-Rezeptors (N-Methyl-D-Aspartat) ist in der Lern- und Gedächtnisforschung schon lange bekannt, vor allem durch Untersuchungen seiner Inhibitoren. Es handelt sich um einen Ionenkanal für Na+, K+ und Ca2+, der allerdings bei normalem Membranpotenzial durch Mg2+-Ionen „verstopft“ ist. Erst bei leichter Depolarisation verlassen mehr und mehr Mg2+-Ionen den Kanal, und er kann durch die Agonisten Glutamat und Glycin geöffnet werden. Die Potenzial-abhängige Funktionsweise des NMDA-Rezeptors entspricht damit einer logischen „UND“-Verknüpfung und verleiht der Informationsübertragung durch NMDA-Rezeptoren die Plastizität,

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710 710

Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik Tabelle 13.3 Auswahl einiger Lernmutanten bei der Maus Allel

Konstruktion und biochemische Folge

Phänotyp

Aal

spontan (Gen unbekannt; Chromosom 1)

Lerndefekt bei aktivem Vermeidungsverhalten

Camkk2tm1Kpg

Entfernung von Exon 5 durch Cre/lox; Verlust der katalytischen Domäne in allen β-Isoformen der CaM-Kinase-Kinase

Verlust von LPT und Langzeitgedächtnis

Creb1tm1Gsc

Knock-out durch Neomycin-Kassette in Exon 2; Verlust der α- oder δ-Isoform von CREB, aber Kompensation durch Erhöhung der β-Isoform

Verlust von Lernfähigkeit und Langzeitgedächtnis

Creb1tm2Gsc

Knock-out durch Neomycin-Kassette in Exon 10; Verlust der DNA-Bindedomäne und des Leucin-Zippers

Verlust von Lernfähigkeit und Langzeitgedächtnis

CrebbpGt(U-san)112Imeg

Genfallen-Mutation; Expression eines verkürzten CREB-Bindeproteins

Verlust des Langzeitgedächtnisses (heterozygot)

Egr1tmLch

Knock-out durch Neomycin-Kassette zwischen Promotor und Exon 1; Abwesenheit des Genproduktes

Stimulation der Genexpression durch LTP; Verlust des Langzeitgedächtnisses

Pde1btm1Cvv

Knock-out durch PGK-HPRT-Kassette anstelle der Exons 6–9

Lerndefizit und Hyperaktivität

tmgc31

ENU-induziert, Gen unbekannt (Chromosom 7)

Lern- und Gedächtnisanomalie

2+

CaMKK: Ca /Calmodulin-Kinase-Kinase-β; CREB: cAMP responsive Element binding protein; CREBBP: CREB-bindendes Protein; Egr: early growth response; ENU: Ethylnitrosoharnstoff; HPRT: Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase; LTP: hippocampale Langzeitpotenzierung; Pde: Phosphodiesterase; PGK: Phosphoglyceratkinase; tmgc: Tennessee Mouse Genome Consortium Nach The Jackson-Laboratory: Mouse Genome Informatics (Datenbank Learning/memory; Stand 08.04.2010)

die für Lernen und Gedächtnis wichtig ist. Glutamat wirkt dabei als Neurotransmitter, da es von den präsynaptischen Membranen aktivitätsabhängig ausgeschüttet wird. Glycin dagegen ist ständig in geringen Konzentrationen in der extrazellulären und cerebrospinalen Flüssigkeit anwesend; diese Konzentration reicht zur Sättigung des Rezeptors im Prinzip aus. Allerdings können Glycin-Transporter diese Konzentration lokal verändern. Der NMDA-Rezeptor besteht aus 4 bis 5 Untereinheiten (Gensymbole: Grin1, Grin2a-d), die zu unterschiedlichen Zeiten exprimiert werden. Das Ausschalten eines dieser Gene führt in der Regel zur Letalität der Maus. Um dennoch bestimmte Effekte des NMDARezeptors untersuchen zu können, haben Kew und seine Mitarbeiter (2000) eine Punktmutation eingefügt, die die Aminosäure Asparagin (N) an der Position 481 des NMDA-Rezeptors 1 anstelle von Asparaginsäure (D) in der Glycin-Bindestelle enthält. Die entsprechenden Mutanten sind lebensfähig; biochemisch bewirkt diese Mutation eine leichte Abnahme der Bindung von Glycin an diese Untereinheit (aber

nicht von Glutamat). Diese Mutanten zeigten keine Unterschiede in ihren Reflexen und in ihrer Antwort auf Licht-Dunkel-Reize. Allerdings konnte in diesen Mäusen elektrophysiologisch keine Langzeitpotenzierung erzeugt werden – und der Verhaltenstest mit der Unterwasserplattform ergab deutliche Lerndefizite dieser Mutanten. Es gibt eine ganze Reihe verschiedener Proteine, die mit dem NMDA-Rezeptor in Wechselwirkung treten können. Eine große Familie sind die Rezeptor-Tyrosinkinasen – Membran-assoziierte Proteine, die sich selbst phosphorylieren, wenn ihr jeweiliger Ligand gebunden hat. Wichtige Mitglieder dieser Familien, die im Hippocampus zusammen mit dem NMDA-Rezeptor exprimiert werden, sind Ephrin-Rezeptoren A und B sowie der Tyrosinkinase-Rezeptor B (TrkB), der durch die Protease Presenilin 1 prozessiert wird (wir werden die wichtige Rolle der Preseniline bei der Alzheimer’schen Erkrankung später noch kennenlernen, Kapitel 13.4.4). Mutationen in den Genen, die für diese Proteine codieren, ergeben in verschiedenen Tests Defizite im Lernverhalten.

13.2 Lernen und Gedächtnis

Ein weiteres Enzym, das mit dem NMDA-Rezeptor interagiert, ist die αCaMKII, eine Ca2+/Calmodulinabhängige Kinase, die im Hippocampus und im Cortex des Gehirns stark exprimiert ist. Diese Kinase nimmt eine weitere zentrale Position beim Lernen ein. Der durch die Aktivierung des NMDA-Rezeptors hervorgerufene Ca2+-Einstrom bewirkt auch eine Autophosphorylierung der αCaMKII am Threonin der Position 286 – damit wird diese Kinase Ca2+/Calmodulin-unabhängig und aktiv. Heterozygote Null-Mutanten (also CaMK2a+/−) zeigen unter verschiedenen Testbedingungen normales Lernverhalten im Hippocampus. Allerdings sind diese Mäuse nicht in der Lage, sich das Gelernte über einen längeren Zeitraum (hier 3 Tage) zu merken. An diesem Langzeitgedächtnis sind offensichtlich noch zusätzliche Strukturen im Neocortex beteiligt; hier ist die Expression von αCaMKII geringer als im Hippocampus, und die Verminderung um ca. 50 % in den heterozygoten Null-Mutanten ist offensichtlich nicht mehr ausreichend, um die Funktion im Neocortex aufrechtzuerhalten. Homozygote CaMK2a-Null-Mutanten dagegen hatten auch deutliche Defizite in kurzzeitigen Lerntests: Sie versagten völlig darin, die Unterwasserplattform (Abb. 13.16a) wiederzufinden (wenn die Plattform allerdings sichtbar blieb, hatten sie auch keine Probleme). Einen interessanten Ansatz zur Untersuchung der αCaMKII-Funktion wählten Ohno und Mitarbeiter (2001): Eine Maus, heterozygot für die T286A-Mutation in CaMK2a, unterscheidet sich im kurzzeitigen Lerntraining nur geringfügig von den Wildtyp-Geschwistern. Der Austausch von Threonin durch Alanin verhindert die Autophosphorylierung an der Aminosäure-Position 286. Wird dieser heterozygoten Maus nun vor dem Lerntraining ein Antagonist des NMDA-Rezeptors in einer Konzentration verabreicht, der bei Wildtypen keine veränderte Lernreaktion hervorruft, so ist bei den heterozygoten CaMK2a-Mutanten eine deutliche Verschlechterung der Lern- und Gedächtnisleistung zu beobachten. Dies ist nicht der Fall, wenn der Antagonist später zugegeben wird. Diese Kombination von pharmakologischen und genetischen Ansätzen erlaubt nicht nur, Einzelaspekte des Lernund Gedächtnismechanismus voneinander zu trennen, sondern erklärt auch unterschiedliche Reaktionsprofile auf gleiche Umwelteinflüsse. Der Einstrom von Ca2+-Ionen über den NMDARezeptor kann aber auch die Signalkette aktivieren, in der die Proteinkinase A (PKA) eine zentrale Rolle einnimmt. Hohe cAMP-Konzentrationen (hervorgerufen beispielsweise durch Ca2+-abhängige Adenylatcyclasen, AC) aktivieren die PKA, die dann wiederum verschiedene Substrate phosphorylieren kann (z. B.

den NMDA-Rezeptor oder CREB); verschiedene Phosphatasen (z. B. Protein-Phosphatase 1A oder Calcineurin) arbeiten entgegengesetzt, da sie die PKASubstrate wieder dephosphorylieren können. Calcineurin ist eine Ca2+-sensitive Ser/Thr-Phosphatase und in hohen Konzentrationen im Hippocampus vorhanden. Wir kennen etwa 10 verschiedene Adenylatcyclasen, die in vielen Geweben gleichzeitig exprimiert werden; im Hippocampus sind 9 ACs vorhanden. Zwei davon, AC1 und AC8, werden durch Ca2+/ Calmodulin stimuliert. Deletionen eines der beiden AC1- bzw. AC8-codierenden Gene haben keinen Einfluss auf das Lernverhalten der Mäuse; werden aber beide Gene gemeinsam ausgeschaltet, so zeigen sich deutliche Auswirkungen auf die späte Phase der Langzeitpotenzierung. Der Unterschied zu den Wildtypen wird noch deutlicher, wenn das Langzeitgedächtnis nach 8 Tagen untersucht wird. Durch Gabe von Forskolin, einem chemischen Aktivator aller Adenylatcyclasen, kann das Defizit der Ca2+-abhängigen ACs ausgeglichen werden. Wie Abb. 13.17 zeigt, münden alle Signalketten in eine Aktivierung von CREB, einem Transkriptionsfaktor, dessen phosphorylierte Form spezifisch an Promotoren bindet, die über cAMP-Antwortelemente verfügen (engl. cAMP responsive elements, CRE). CREs sind in den Promotoren einer Vielzahl von Genen enthalten und spiegeln damit die Funktionsvielfalt des cAMP-Systems, das nicht nur auf Lernen und Gedächtnis beschränkt ist. Allerdings zeigen die Deletionen der α- und δ-Isoformen von Creb in der Maus deutliche Effekte auf das Langzeitgedächtnis, jedoch nicht auf das Kurzzeitgedächtnis. Gleichzeitig versucht der Organismus offensichtlich, den Ausfall dieser beiden Isoformen durch eine verstärkte Expression der β-Isoform und anderer Spleißvarianten zu kompensieren, sodass Unterschiede der Wirkung dieser Deletionen in verschiedenen Mausstämmen beobachtet werden können. Umgekehrt erleichtert eine Erhöhung der CREB-Konzentrationen durch virale Expressionssysteme die Trainingsbedingungen für die Bildung des Langzeitgedächtnisses. Verfeinerte experimentelle Bedingungen deuten darauf hin, dass CREB insbesondere dafür benötigt wird, Wissen zu verfestigen. Die Zielgene von CREB können, wie schon erwähnt, sehr vielfältig sein. In Bezug auf Lernen und Gedächtnis spielen offensichtlich zwei Gene eine wichtige Rolle, die als Zif268 und Cebpa bezeichnet werden und ebenso für Transkriptionsfaktoren codieren. Cebpa codiert für das CCAA//enhancer binding protein α; das Protein wird daher als C/EBP abgekürzt. Da das C/EBP-Protein an dieselben CREs bindet wie CREB selbst, wird hier ein negativer Rückkopplungsmechanismus vermutet. Diese Interpretation wird

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Abb. 13.17 CREB als zentraler Transkriptionsfaktor für Lernen und Gedächtnis bei Mäusen. Ausgehend von verschiedenen Rezeptoren (NMDAR, AMPAR, EphB2, TrkB) werden über Ca2+abhängige oder über G-Protein-abhängige Signalwege eine Reihe von Kinasen aktiviert (CaMKIV, CaMKK, MAPK, PKA, RSK), die schließlich alle zur Phosphorylierung und damit Aktivierung des Transkriptionsfaktors CREB führen. Die anschließende Expression von C/EBP leitet eine negative Rückkopplungsschleife ein, wohingegen die Aktivierung des Zinkfinger-Transkriptionsfaktors Zif268

für die Verfestigung des Gelernten wichtig ist. ATF4: Aktivierender Transkriptionsfaktor 4; CaMKIV: Ca2+/Calmodulin-abhängige Kinase IV; CaMKK: Ca2+/Calmodulin-abhängige Kinase-Kinase; C/ EBP: CCAAT/Enhancer-bindendes Protein; CN: Calcineurin; CREB: cAMP-responsive element binding protein; GCN2: general control, non depressible-2; IEGs: unmittelbar frühe Gene; PKA: Proteinkinase A; MAPK: Mitogen-aktivierte Proteinkinase; PP1: Proteinphosphatase 1; RSK: ribosomale S6-Kinase. (Nach Lee u. Silva 2009, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

durch Untersuchungen an Cebpa−/−-Mäusen gestützt, die räumliche Informationen offensichtlich schneller verarbeiten können als Wildtyp-Mäuse. Das zweite Gen, dessen Expression durch CREB hochreguliert wird, codiert für den Transkriptionsfaktor Zif268 (auch bekannt unter den Abkürzungen Egr-1, Krox24, NGFI-A oder Zenk) und wurde ursprünglich als frühe Antwort auf einen Nervenwachstumsfaktor in Zellkulturen identifiziert. Dieser Transkriptionsfaktor enthält drei Zinkfingermotive und erkennt GC-reiche Elemente in den Promotoren seiner Zielgene. Zif268 wird in verschiedenen Arealen des Neocortex, des Hippocampus, der Amygdala, des Striatum und des Cerebellums exprimiert. Deletionen von Zif268 führen in der Maus nicht zu offensichtlichen histologischen Veränderungen, aber diese Deletionsmutanten zeigen Defizite im Langzeitgedächtnis, ohne dass das Kurzzeitgedächtnis betroffen ist. Wenn allerdings das Trainingsverhalten in längere Intervalle unterteilt wird, führt diese Lernform bei den Zif268−/−-Mutanten zu Ergebnissen, wie wir sie vom Wildtyp her kennen. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Zif268 Teil der Signalkette ist, die das Langzeitgedächtnis in Abhängigkeit von Proteinsynthese ausbildet. Zif268 ist offensichtlich wichtig, um Erinnerun-

gen zu festigen und reaktivierte Erinnerungen erneut zu speichern (Bozon et al. 2003).

Lernen und Gedächtnis sind vielschichtige Phänomene, die zunehmend auf der genetischen Ebene untersucht werden können. Ergebnisse mit Knock-out-Mutanten der Maus machen deutlich, dass die cAMP-Signalkette im Hippocampus dabei eine zentrale Rolle spielt. Wesentliche Komponenten dabei sind der NMDA-Rezeptor, αCaMKII, PKA und CREB und schließlich die Synthese von Transkriptionsfaktoren wie Zif268 und C/EBPs. Damit wurde bei der Maus ein ähnliches System charakterisiert wie bei Drosophila.

13.2.3 Kognitive Störungen bei Menschen Lernunfähigkeit bei Menschen ist ein deskriptives Konzept, mit dem Ursachen und Bedingungen menschlicher Lernschwierigkeit beschrieben werden. Schwere Lernunfähigkeit wurde schon länger als pathologisch charakterisiert, wohingegen milde Formen der Lernunfähigkeit weitgehend als soziokulturell und multifaktoriell bedingt betrachtet wurden. Im

13.3 Angst, Sucht und psychiatrische Erkrankungen

Gegensatz dazu mehren sich Berichte, die zeigen, dass auch Veränderungen bei einzelnen Genen und kleinere chromosomale Rearrangements für Lernunfähigkeiten verantwortlich sind. Die Tatsache, dass mehr Männer als Frauen von Lernunfähigkeiten betroffen sind, ist seit über 100 Jahren bekannt und hat viel damit zu tun, dass auf dem X-Chromosom eine Reihe von Genen liegt, deren Mutationen zu mentaler Retardierung führen (z. B. das Fragile-X-Syndrom; S. 652). Ein Beispiel für Lernunfähigkeit, die durch ein einzelnes Gen verursacht wird, ist die Neurofibromatose I (NF1; früher auch als „vonRecklinghausen-Erkrankung“ bezeichnet). NF1 ist eine dominante Erkrankung (OMIM 162200, Chromosom 17q11, Häufigkeit 1:3000 bis 1:4000), die zunächst durch gutartige und bösartige Tumore des Nervensystems gekennzeichnet war. Es zeigte sich aber bald, dass der Phänotyp sehr variabel ist; weitere häufige Merkmale sind Lisch-Knötchen in der Iris und Café-au-laitFlecken auf der Haut, seltener dagegen verschiedene Skelettanomalien. In unserem Zusammenhang hier ist aber hervorzuheben, dass etwa 30 bis 65 % der Kinder mit NF1-Mutationen auch an Lerndefiziten leiden. Die im Kindesalter beobachteten Einschränkungen werden in qualitativ identischer Form ins Erwachsenenalter tradiert (Uttner et al. 2003). Verständlicherweise konzentrierten sich die früheren Arbeiten vor allem auf das Verständnis der Tumorerkrankung. Neuere Arbeiten zeigen aber, dass derselbe Signalweg, der zur Bildung von Nerventumoren führt, auch bei Lernprozessen benötigt wird: Es ist der Ras-Signalweg (Abb. 12.40). Neurofibromin, das Protein, das durch NF1 codiert wird, ist für eine Reihe biochemischer Funktionen verantwortlich (z. B. GTPase-Aktivierung, Modulation der Adenylatcyclase und Bindung an Mikrotubuli) und in diesen Funktionen hochkonserviert bei Drosophila, der Maus und dem Menschen. Der vollständige Verlust des NF1-Gens in Homozygoten ist sowohl bei der Maus als auch beim Menschen letal, und ältere, heterozygote Nf1+/−-Mäuse weisen klinische Symptome auf, die wir von NF1-Patienten kennen. Es zeigte sich nun, dass eine der verschiedenen Funktionen des Nf1-Genproduktes für das Lernverhalten der Mäuse wichtig ist. Es handelt sich dabei um die Regulation der GTPase-aktivierenden Funktion von Nf1 durch die Wechselwirkung zwischen Nf1 und Ras. Der Verlust dieser Nf1-Funktion führt zur Überaktivierung von Ras und in Konsequenz dessen zu einer unangemessenen Aktivierung der Erk-Kaskade (Abb. 12.40). Costa et al. (2002) konnten in einem eleganten Experiment zeigen, dass durch Gabe eines pharmakologisch wirksamen Ras-Inhibitors in den heterozygoten Nf1+/−Mäusen die Lerndefizite erfolgreich behandelt werden konnten.

Der Ras-Signalweg ist übrigens noch für weitere Erbkrankheiten wichtig, die mit Syndromen geistiger Retardierung beim Menschen verbunden sind. Es handelt sich dabei um das Coffin-Lowry-Syndrom (OMIM 303600; chromosomale Lokalisation: Xp22.2) und das Rubinstein-Taybi-Syndrom (OMIM 189849; chromosomale Lokalisation: 16p13.3). Im ersten Fall ist das RSK2-Gen mutiert (dessen Genprodukt CREB phosphoryliert) und im zweiten das CREBBP-Gen, dessen Genprodukt an CREB bindet und mit CREB die Expression der Zielgene steuert (Sweatt u. Weeber 2003); eine Übersicht über verschiedene kognitive Erkrankungen des Menschen gibt Abb. 13.18. Das Rubinstein-Taybi-Syndrom ist durch mentale Retardierung (IQ von ~ 34 im Alter von 25 Jahren), breite Daumen und Zehen, sowie Gesichtsanomalien charakterisiert, häufig verbunden mit einem Glaukom. Es ist eine seltene Erkrankung, die mit einer Häufigkeit von 1:125.000 bis 1:720.000 Geburten vorkommt; etwa einer unter 300 Patienten, die wegen mentaler Retardierung in eine geschlossene Anstalt eingewiesen werden, leidet an dem Rubinstein-Taybi-Syndrom. Die molekulargenetische Analyse zeigt häufig chromosomale Brüche und Mikrodeletionen, aber auch heterozygote Funktionsverlustmutationen im CREBBP-Gen. Es gibt jedoch auch vereinzelt Mutationen in einem Gen, das für das Protein EP300 codiert und auf dem Chromosom 22q13 lokalisiert ist; dieses Protein hat funktionelle und strukturelle Ähnlichkeiten mit CREB. Dieser Befund zeigt die genetische Heterogenität des RubinsteinTaybi-Syndroms (Hallam u. Bourtchouladze 2006).

Genetische Untersuchungen von Krankheiten, die mit Lernstörungen und kognitiven Defiziten bei Menschen verbunden sind, zeigen deutliche Parallelen zu den molekularen Mechanismen, die von der Maus bekannt sind. Detaillierte Analysen zeigen die Beteiligung des Ras-Signalweges.

13.3 Angst, Sucht und psychiatrische Erkrankungen Wir haben bis jetzt einige genetische Komponenten kennengelernt, die für rhythmisches Verhalten, für Lernen und Gedächtnis (mit)verantwortlich sind. Wie sieht das aber mit noch komplexeren Verhaltensweisen aus, mit Stimmungen und Gefühlen? Beispielsweise macht man die Erfahrung, dass jeder mit Stress anders umgeht oder dass verschiedene Menschen in vergleichbaren Situationen ganz unterschiedlich reagieren. Es soll im Folgenden versucht werden, an einigen Beispie-

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

len herauszufinden, welche genetischen Aspekte bei derart komplexen Verhaltensweisen eine Rolle spielen können. Eine wichtige Rolle bei diesen Überlegungen werden die Vorgänge an den Übergängen von einer Nervenzelle auf die andere spielen: an den Synapsen. Je nach Transmittertyp werden dopaminerge, adrenerge oder serotonerge Synapsen unterschieden (Abb. 13.19); für weiterführende Details sei jedoch auf Lehrbücher der Physiologie verwiesen. Mit der Untersuchung von Mutationen, die Synthese, Bindung, Transport und Abbau der Transmitter beeinflussen, können wichtige Informationen über Krankheiten, aber auch über veränderte Verhaltensweisen gewonnen werden. Damit soll natürlich nicht einer genetischen Determination das Wort geredet werden – aber es kann den Rahmen

aufzeigen, innerhalb dessen wir uns bewegen – und welche Möglichkeiten (aber auch Unmöglichkeiten) sich daraus für Therapien abzeichnen.

Abb. 13.18 Unterbrechungen der molekularen Signalkaskade der Gedächtnisbildung führen zu kognitiven Störungen des Menschen. Die Gedächtnisbildung beginnt mit der Aktivierung der Signalwege an der Membran der dendritischen Dornfortsätze. Die Signalkaskade erreicht den Zellkern, wo die Aktivität der Transkriptionsfaktoren moduliert wird und sich dadurch die Genexpression ändert. Neu synthetisierte Proteine bewirken langdauernde Veränderungen der Zellfunktion. Störungen einzelner Schritte führen zu bestimmten Erkrankungen. APP: amyloid precursor protein; CBP: CREB-bindendes Protein (alternative

Abkürzung: CREBBP); CREB: cAMP-Antwortelement-bindendes Protein; DMPK: Dystrophia-myotonica-Proteinkinase; DYRK1A: dual specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A; ERK: extrazelluläre Signal-regulierte Kinase; FMR: Fragiles-X-Chromosom/mentale Retardierung; MEK: MAPK(Mitogen-aktivierte Proteinkinase)/ERK-Kinase; Rac: GTPase-aktivierendes Protein; Ras: Onkogen des Ratten-Sarkom-Virus (G-Protein); RSK2: ribosomale S6-Kinase-2; SOD1: Superoxiddismutase-1. (Nach Weeber et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung der American Society of Pharmacology and Experimental Therapeutics)

13.3.1 Angst und Depression Angst ist ein Gefühl der Bedrängtheit, das von der Vorstellung zukünftigen Übels verursacht wird. Im Gegensatz zur Furcht ist die Angst auf keinen bestimmten Gegenstand bezogen und damit anonym und unbestimmbar. Weil Angst auch in Situationen auftritt, in denen keine konkrete, objektive Bedrohung feststellbar ist, wird sie von der Psychologie als krankhafte Störung aufgefasst (Angststörung), bei der körperliche Symp-

13.3 Angst, Sucht und psychiatrische Erkrankungen

tome wie Beschleunigung von Atmung und Herzfrequenz, Schweißausbruch usw. mit einer Beeinträchtigung des problemlösenden Denkens einhergehen. Als Depression bezeichnet man eine Krankheit, die mit Niedergeschlagenheit und vielen weiteren körperlichen und psychischen Störungen einhergeht. Derzeit sind schätzungsweise 5 % der Bevölkerung in Deutschland an einer behandlungsbedürftigen Depression erkrankt. Etwa dreimal so groß ist die Zahl derjenigen, die irgendwann im Laufe ihres Lebens an einer Depression erkranken. Hat man bereits einmal eine Depression durchlebt, so besteht ein erhöhtes Risiko für das erneute Auftreten dieser Krankheit. Wenn sich depressive Phasen mit Phasen gehobener Stimmung, Aggression, Reizbarkeit, gesteigerter Impulsivität und Spontaneität abwechseln, spricht man von einer manischen Depression (auch bipolare affektive Störung). Diese Krankheit hat eine Häufigkeit von etwa 1 % in allen untersuchten Kulturkreisen. Beiden Krankheitsformen (Angst und Depression) ist gemeinsam, dass sie sich durch Medikamente behandeln lassen, die mit der Funktion des Neurotransmitters Serotonin zusammenhängen.

Aufgrund früherer neuroanatomischer Untersuchungen und Reizungen bestimmter Gehirnareale mit Stromstößen bei Tierversuchen konnte man davon ausgehen, dass „Angst“ in der Amygdala (Mandelkern), einer Gehirnregion unterhalb des Schläfenlappens, lokalisiert ist. Weitere Hinweise kamen aus pharmakologischen Erfahrungen, die zeigten, dass man mit Hemmstoffen der Wiederaufnahme des Neurotransmitters Serotonin wirkungsvoll Ängste und Depression behandeln kann. In Abb. 13.19 sind einige Komponenten des serotonergen Systems dargestellt, dabei spielt der Biosyntheseweg des Serotonins (auch als 5-Hydroxytryptamin bezeichnet, Abk.: 5-HT) aus Tryptophan eine wichtige Rolle. Ergänzt wird das System durch Rezeptoren (5-HT1, 5-HT2 und 5-HT3), die postsynaptisch das Serotonin wieder aufnehmen, und die Transporter und Autorezeptoren, die es aus der Synapse wieder wegfangen. Serotonerge Neurone entspringen den Raphe-Kernen in Mesencephalon, Pons und Medulla oblongata. Aszendierende Bahnen verlaufen zum Hypothalamus, Thalamus, Neostriatum, den Strukturen des limbischen Systems und dem Neocortex. Eine cerebellare Bahn

Abb. 13.19 a–c Neurotransmitter an Synapsen. a Dopaminerge Neurone. Aus Tyrosin entsteht zunächst Dihydroxyphenylalanin (Dopa) und dann Dopamin (DA); DA wird von entsprechenden Rezeptoren postsynaptisch gebunden. Dopamin kann seine eigene Freisetzung über präsynaptische Autorezeptoren hemmen. Über den Dopamin-Transporter (DAT) kann die Nervenzelle Amphetamine (Amph) und 1-Methyl-4-phenylpyridin (MPP+) aufnehmen; der DAT wird durch Kokain und synthetische Inhibitoren gehemmt. Dopamin wird zu Dihydroxyphenylessigsäure, Methoxytyramin und Homovanillinsäure metabolisiert. b In adrenergen Neuronen mit Noradrenalin (NA) als Transmitter wird NA aus Dopamin durch Hyxdroxylierung in der Seitenkette gebildet. Postsynaptisch wird NA durch adrenerge Rezeptoren gebunden; NA kann seine eigene Freisetzung über präsynaptische Autorezeptoren hemmen. Über den Noradrenalin-Transporter (NAT) kann die Nervenzel-

le Amphetamine aufnehmen; der NAT wird durch Kokain und synthetische Inhibitoren gehemmt. c Serotonerge Transmission an Synapsen. Der erste wichtige Schritt in der Serotonin (5-HT, 5-Hydroxytryptamin)-Biosynthese ist die Aufnahme von Tryptophan (Trp) in die präsynaptische Zelle. Die Umwandlung von Trp in 5-Hydroxytryptophan wird durch die TryptophanHydroxylase katalysiert; der letzte Schritt ist eine Decarboxylierung zu 5-Hydroxytryptamin (5-HT). 5-HT wird anschließend in den synaptischen Spalt freigesetzt und kann an die postsynaptischen 5-HT-Rezeptoren oder an die präsynaptischen Autorezeptoren binden. Über den Serotonin-Transporter (SERT) kann die Nervenzelle Amphetamine (Amph) und 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA) aufnehmen; der SERT wird durch Kokain und synthetische Inhibitoren gehemmt. (Nach Torres et al. 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

versorgt Kerne und den Cortex cerebelli. Deszendierende Bahnen versorgen die pontine und medulläre Formatio reticularis sowie den Locus coeruleus. Bulbo-

Abb. 13.20 a, b Test auf Angstverhalten bei der Maus. a In der Hell-Dunkel-Box kann die Maus zwischen einem hellen, größeren und einem dunklen, kleineren Areal wählen. Die Aufenthaltsdauer in dem jeweiligen Kompartiment erlaubt Rückschlüsse über den jeweiligen emotionalen Zustand. b Bei dem erhöhten Kreuz besteht ebenfalls die Wahl zwischen geschützten und ungeschützten Arealen. (Foto: M. E. Keck, München)

Abb. 13.21 Polymorphismus im Promotor des humanen 5HTTransporter-Gens. Das Gen für den humanen Serotonin-Transporter (Gensymbole: 5-HTT, SERT, SLC6A4) ist auf dem langen Arm des Chromosoms 17 lokalisiert und besteht aus 14 Exons. Eine 44-bp-Insertion bzw. -Deletion repetitiver Sequenzen in seinem Promotor kennzeichnet das lange (L, rot) bzw. kurze (S, violett) Allel (5-HTTLPR: 5-HTT-linked polymorphic region). Die kurze Variante produziert signifikant weniger 5-HTT-mRNA

spinale deszendierende Bahnen laufen zu den Vorderund Hinterhörnern des Rückenmarks sowie zum Nucleus intermediolateralis. Serotonin wird außerdem in der Retina als Transmittersubstanz verwendet. Wir haben uns bei unseren vorherigen Überlegungen oft von Mutanten bei Drosophila und Mäusen leiten lassen, wenn wir etwas über die genetischen Hintergründe von Krankheiten wissen wollten. Auch in diesem Fall hilft das weiter, da die moderne Verhaltensbiologie durchaus in der Lage ist, bei Tieren – z. B. bei der Maus – Angstverhalten nachzuweisen. Ein Testverfahren beruht auf dem Vermeidungsverhalten der Maus gegenüber unbekannten und ungeschützten Arealen: Je ängstlicher eine Maus ist, desto eher wird sie diese Bereiche vermeiden. In der HellDunkel-Box (Abb. 13.20a) kann die Maus zwischen einem hellen, größeren und einem dunklen, kleineren Areal wählen, wobei die Aufenthaltsdauer des Tieres in dem jeweiligen Bereich Rückschlüsse über dessen emotionalen Zustand erlaubt. Ähnlich verhält es sich bei dem Test auf erhöhten, kreuzweise angeordneten schmalen Plattformen (engl. elevated plus maze; Abb. 13.20b).

und führt damit auch zu einer geringeren Konzentration des Serotonin-Transporters als die lange Variante des Promotors. Die kurze Variante ist mit Persönlichkeitsmerkmalen assoziiert, die mit Angstgefühlen verbunden sind und Risikofaktoren für Gemütskrankheiten darstellen. MAOA: Monoaminoxidase A. (Nach Canli u. Lesch 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

13.3 Angst, Sucht und psychiatrische Erkrankungen

Aus klinischen Untersuchungen ist bekannt, dass Agonisten des Serotonin-1A-Rezeptors Angst auflösen können. René Hen und seine Mitarbeiter (Gross et al. 2002) haben nun das Gen für den Serotonin-Rezeptor 1A in der Maus ausgeschaltet mit dem Ergebnis, dass die entsprechenden Knockout-Mäuse erhöhtes Angstverhalten zeigten. Durch gewebespezifisches Wiedereinschalten des Gens konnten Hen und seine Mitarbeiter zeigen, dass das Ausschalten des Serotonin-1A-Rezeptors nur im Hippocampus und im Cortex, nicht aber in den Raphe-Kernen für das Angstverhalten verantwortlich ist. Außerdem deuten die Ergebnisse darauf hin, dass eine kritische Phase (in der Maus zwischen dem 5. und 21. Tag nach der Geburt) darüber entscheidet, ob eine Maus als erwachsenes Tier ängstlich ist oder nicht. Wurde der Serotonin-Rezeptor hingegen erst bei erwachsenen Tieren inaktiviert, schien sich das nicht auf das Verhalten auszuwirken. Die Ergebnisse legen die Interpretation nahe, dass gängige Medikamente nicht unbedingt die Ursache der Störung behandeln, sondern die Symptome eines Ereignisses lindern, das vor langer Zeit eingetreten ist. Für eine Zusammenfassung dieser Überlegungen sei auf die Arbeit von Leonardo und Hen (2006) verwiesen. Neben Mutationen im codierenden Bereich eines Gens können natürlich auch Veränderungen in Promotoren zu unterschiedlichen Genaktivitäten führen. Ein funktioneller Polymorphismus (C1019G) in der Kontrollregion des Gens, das für den Serotonin-Rezeptor 1A codiert (OMIM 109760; Chromosom 5q11; Gensymbol HTR1A, engl. 5-Hydroxytryptamin-receptor 1A), ist mit Persönlichkeitsmerkmalen verbunden, die mit Angst und Depressionen verwandt sind. In-vitro-Experimente zeigten dann, dass das G-Allel eine andere Bindungseffizienz für Regulatoren der Transkriptionsaktivität hat und damit zu einer veränderten Expression des Rezeptors führen kann. Ein solcher funktioneller Polymorphismus wurde auch im Falle des Serotonin-Transporter-Gens des Menschen (und Affen) festgestellt (Abb. 13.21). Dieses Gen ist auf dem Chromosom 17q11 lokalisiert und umfasst 14 Exons (OMIM 182138; Gensymbol SCL6A4, engl. solute carrier family 6, member 4; alternativ verwendete Gensymbole sind SERT [engl. serotonin transporter] oder 5-HTT [engl. 5-hyxdroxytryptamine transporter]). Es gibt zwei Allele, die sich in der Länge des Promotors unterscheiden; die Häufigkeit des homozygoten kurzen Genotyps beträgt 19 % (heterozygot lang/ kurz: 49 %, homozygot lang: 32 %). Frühere Studien deuten darauf hin, dass Menschen mit der kürzeren Version ängstlicher sind. David Weinberger und seine Mitarbeiter (Hariri et al. 2002) zeigten nun Probanden Bilder von erschreckten Gesichtern. Dies gilt als Stan-

dardmethode, um im menschlichen Gehirn unter experimentellen Bedingungen eine Reaktion auf eine Angstsituation auszulösen. Mittels funktioneller Magnetresonanztomographie wurde untersucht, wie energisch die Amygdala auf die verängstigten Gesichter reagiert. Es zeigte sich, dass Probanden, die für den kurzen Promotor hetero- oder homozygot waren, eine „hyperaktive“ Amygdala hatten. Eine ähnliche Untersuchung hatten Psychologen und Genetiker an 847 Neuseeländern durchgeführt. Auch diese prospektive Langzeitstudie zeigte, dass Individuen, die heterozygot oder homozygot für die kurze Version des 5-HTT-Promotors waren, in StressSituationen eher depressive Symptome entwickelten als die Homozygoten der Langform. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass auch beim Menschen eine genetische Variation innerhalb des Serotonin-Systems mit Angst und Depressionen in Zusammenhang steht. Die Studien weisen aber darüber hinaus auch darauf hin, dass es offensichtlich Gen-Umwelt-Wechselwirkungen gibt, wobei die Möglichkeiten der individuellen Reaktion durch die genetische Konstitution des Individuums festgelegt werden. Außer dem schon erwähnten kurzen oder langen Polymorphismus im 5-HTT-Promotor gibt es noch eine Reihe weiterer Polymorphismen im 5-HTT-Gen: Dazu gehören zusätzliche SNPs im Promotor und eine unterschiedliche Anzahl von Wiederholungseinheiten im Intron 2. Aber auch auf der RNA-Ebene gibt es vier verschiedene Spleißvarianten im Exon 1 sowie zwei verschiedene Polyadenylierungsstellen, die die Stabilität der mRNA beeinflussen können (Abb. 13.22a). Dennis Murphy und KlausPeter Lesch (2008) haben aus den zugänglichen funktionellen Daten der verschiedenen Gen-Varianten abgeschätzt, dass sich aus unterschiedlichen Kombinationen der Polymorphismen ein 4- bis 5facher Unterschied der Konzentration des Serotonin-Transporters ergeben kann (Abb. 13.22b). Sie sehen darin eine Möglichkeit, die Vielfalt der Krankheitssymptome zu erklären, die mit dem 5-HTT-Gen assoziiert sind. Außerdem kann man über die Bedeutung solcher relativ präziser Regulationsmöglichkeiten unter evolutionären Gesichtspunkten nachdenken. In Rhesus-Affen unterliegt die Metabolisierungsrate von Serotonin im Gehirn einer starken erblichen Komponente und verhält sich wie ein Merkmal, das über die gesamte Lebensdauer eines Individuums stabil ist. Allerdings haben frühe Erfahrungen lang andauernde Konsequenzen für die Funktion des Serotonin-Systems, wie aus der Metabolit-Analyse deutlich wird. Eine solche wichtige Erfahrung ist die Trennung des Affenbabys von der Mutter nach der Geburt und das

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Abb. 13.22 a–c Polymorphismen im humanen 5HT-Transporter-Gen. a Das 5-HTT-Gen enthält außer 5-HTTLPR (5-HTT-linked polymorphic region; Abb. 13.21) noch weitere einzelne NukleotidPolymorphismen (SNPs, mit Datenbank-Nummern), eine variable Anzahl von Wiederholungseinheiten im Intron 2 (VNTR) sowie verschiedene Spleißvarianten des ersten Exons. b Es sind relative, möglicherweise additive, Werte der 5-HTT-Expression für Kombinationen der wichtigsten 5-HTT-Polymorphismen angegeben. Dabei besteht theoretisch ein 4,65-facher Unterschied in der SERTKonzentration zwischen der Kombination der Varianten mit den geringsten Aktivitäten und den Varianten mit der höchsten Aktivität: Die beiden linken Balken zeigen die gemessenen Unterschiede der 5-HTT-Expression (Abb. 13.21) für die homozygoten Situatio-

nen (SS: kurzes 5-HTTLPR-Element, hellblau; LL: langes 5-HTTLPRElement, gelb), verbunden jeweils mit dem SNP rs25531. Die folgenden 6 Balken kombinieren diese Information mit funktionellen Konsequenzen zusätzlicher Varianten (G56A, I425V und den variablen Wiederholungseinheiten im Intron 2), die aus in-vitro-Untersuchungen abgeleitet sind (dunkelblau). c Die Proteinstruktur des Serotonin-Transporters zeigt den N- und C-Terminus auf der intrazellulären Seite, die 12 Transmembrandomänen sowie die Schlaufen im extrazellulären Bereich. SNPs, die eine Aminosäure verändern, sind in Rot angegeben (Ausnahme: die funktionell bestätigten Austausche G56A und I425V sind gelb dargestellt); synonyme Austausche sind blau. (Nach Murphy u. Lesch 2008, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Aufwachsen unter Gleichaltrigen. Diese frühe Erfahrung beeinflusst offensichtlich die Rate des SerotoninMetabolismus und damit auch die Funktion des Serotonin-Systems. Wie oben bereits angedeutet, gibt es auch bei den Rhesus-Affen das lange und kurze Allel im Promotor des Serotonin-Transporters, und so ist es möglich, den Einfluss dieser beiden Allele auf die Reaktion der Affen gegenüber der frühkindlichen Trennung von der Mutter zu untersuchen. Dabei zeigten die Affen mit der kurzen Variante eine stärkere Stressantwort als die homozygoten Träger der langen Variante. Eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse zeigt Abb. 13.23. Aus den bisher vorliegenden Untersuchungen an Knock-out-Mäusen zeichnet sich aber neben dem Serotonin-System noch ein ganz anderer Bereich ab, der mit Angstverhalten in Zusammenhang steht, und

zwar die Rezeptoren von Peptidhormonen. Als ein Beispiel soll hier der Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid (engl. gastrin-releasing peptide, Gensymbol: Grp; OMIM 137260) vorgestellt werden. Grp ist auf dem Chromosom 18q21 lokalisiert und wird stark im Seitenkern der Amygdala exprimiert, wo die Assoziationen für das erlernte Angstverhalten gebildet werden, aber auch in den Regionen, die angstbesetzte akustische Informationen an den Seitenkern weiterleiten. Grp wirkt über die Bindung an seinem Rezeptor; dieser Grp-Rezeptor (Gen: Grpr) wird in Neuronen exprimiert, die GABA (γ-Aminobuttersäure) als Transmittersubstanz verwenden (man spricht daher auch von GABAergen Neuronen; Abb. 13.24). Beim Menschen ist GRPR auf dem X-Chromosom lokalisiert (Xp22.3; OMIM 305670). Grpr−/−-Mäuse erinnern sich länger an erlernte Angst: Die Wissenschaftler brachten

13.3 Angst, Sucht und psychiatrische Erkrankungen

Abb. 13.23 Einfluss der Trennung von der Mutter und des Promotortyps des 5-HTT-Gens auf die psychosoziale Entwicklung einschließlich der Gehirn-Funktion, der Regulation der Emotion, sozialer Kompetenzen, der Stressantwort, des Verhaltens

und der Psychopathologie. rh5-HTTLPR: 5-HTT-linked polymorphic region des Rhesus-Affen; S: kurze Form der Wiederholungssequenz im Promotor (Abb. 13.21). (Nach Lesch 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Abb. 13.24 Synaptische Übertragung durch GABA. Der Neurotransmitter GABA (γ-Aminobuttersäure) wird aus Vesikeln freigesetzt und aktiviert postsynaptisch GABAA-Rezeptoren (braun). Dadurch entsteht vorübergehend ein geringer inhibitorischer Stromfluss (phasische Antwort). Neurosteroide, die lokal von Neuronen oder Gliazellen freigesetzt werden, verlängern und verstärken die inhibitorische Wirkung. Zusätzlich besitzen manche Neurone extrasynaptische GABA-Rezeptoren

(blau) und erzeugen dadurch einen „tonischen“ Hintergrundstrom. Dies manifestiert sich bei Spannungsmessungen (engl. voltage clamp) als eine unruhige Basislinie und wird bei der Zugabe des GABAA-Rezeptor-Agonisten Bicucullin (Bic) sichtbar, da Bicucullin diese extrasynaptischen Rezeptoren schließt. 3α,5α-THPROG: 3α,5α-Tetrahydroprogesteron; 5α-DHPROG: 5α-Dihydroprogesteron. (Nach Belelli u. Lambert 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Knock-out-Mäuse

Abb. 13.25 Grp-Rezeptor(Grpr)-abhängige negative Rückkopplung für gelernte Angst. Modell der Grpr-abhängigen negativen Rückkopplung zu den Hauptneuronen in der Amyg-

dala im Wildtyp (links) und in Grpr-Knock-out-Mäusen (rechts). (Nach Shumyatsky et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

den Tieren bei, Angst vor einem bestimmten Ton zu bekommen. Dazu spielten sie den Tieren einen Ton vor und lösten daraufhin mit einem unangenehmen Elektroschock Angst aus. Danach beobachteten sie, wie die Nager auf den Ton allein reagierten. Die Knock-outMäuse reagierten deutlich ängstlicher auf den Ton als die Wildtyp-Tiere. Der Defekt betraf nur die erlernte Angst; weder die instinktive Angst noch die Schmerzfähigkeit der Tiere sind durch die Mutation beeinflusst. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es einen negativen Rückkopplungsmechanismus gibt, der Angst reguliert, und bei dem der Rezeptor für Grp eine wichtige Rolle spielt (Abb. 13.25).

hafte Handlungen anderer Art berücksichtigen (z. B. Spielsucht); diese sollen hier jedoch nicht betrachtet werden. Es geht in diesem Abschnitt auch nicht darum, die gesamte Bandbreite von Suchtproblemen darzustellen, sondern nur um den Anteil, den die Genetik zur Charakterisierung des Problems beitragen kann (und damit auch Lösungsansätze aufzeigen kann). Dieser Anteil beträgt für verschiedene Suchtkrankheiten etwa 50 % (Abb. 13.26). Beispielhaft sollen hier Phänomene des Alkoholismus, des Kokain- und Cannabismissbrauchs dargestellt werden. Alkoholismus (OMIM 103780) kann man definieren als Konsum von Alkohol, der über das sozial tolerierte, für Individuum und/oder Gesellschaft ungefährliche Maß hinausgeht. Dabei wird sowohl der gewohnheitsmäßige, übermäßige Alkoholkonsum ohne Abhängigkeitsentwicklung als auch die echte Alkoholabhängigkeit unter dem Begriff Alkoholismus zusammengefasst. In Deutschland schätzt man die Zahl der Alkoholiker auf etwa 2 Millionen; Alkoholmissbrauch ist der Grund für etwa 30 % der Einweisungen in psychiatrische Kliniken. Während vor 50 Jahren Männer noch 8-mal so häufig betroffen waren wie Frauen, steigt der Anteil der alkoholabhängigen Frauen seither ständig an. Die Diagnose Alkoholismus ist oft nicht leicht zu stellen, da auch verschiedene Formen des Alkoholismus unterschieden werden. Bei abhängigen Alkoholikern treten bei einem erzwungenen Alkoholverzicht (z. B. durch einen Krankenhausaufenthalt wegen einer anderen Erkrankung) sehr bald Entzugserscheinungen auf. Der Grenzwert, ab dem mit schädlichen Wirkungen zu rechnen ist, liegt für Männer bei 60 bis 80

Angststörungen und Depressionen lassen sich beide

mit Medikamenten behandeln, die mit der Funktion des Neurotransmitters Serotonin zusammenhängen. Ursachen sind unter anderem Mutationen in Genen, die für Rezeptoren bzw. Transporter des Serotonins codieren.

13.3.2 Suchtkrankheiten Unter Sucht versteht man im Allgemeinen eine chronische Abhängigkeit, die durch wiederholtes und zwanghaftes Begehren und Aufnehmen von Stoffen wie Alkohol, Koffein, Opiaten, Kokain etc. gekennzeichnet ist, und zwar unabhängig von negativen physikalischen, psychologischen oder sozialen Konsequenzen. Zu den Charakteristika von Sucht gehört auch die Schwierigkeit des Entzugs (z. B. Unruhe, Schwitzen, Herzrasen). Sicherlich gibt es auch noch weitere Definitionen, die auch zwang-

13.3 Angst, Sucht und psychiatrische Erkrankungen

Abb. 13.26 Erblichkeit von Suchtkrankheiten. Aufgrund verschiedener Daten nationaler Zwillingsstudien wurde die Erblichkeit von 10 wichtigen Suchtkrankheiten mit den entsprechenden Schwankungsbreiten berechnet. (Nach Goldman et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Gramm Alkohol (etwa drei Flaschen Bier) und für Frauen bei 40 bis 60 Gramm Alkohol täglich. Als Folge des chronischen Alkoholmissbrauchs können neben der Sucht zahlreiche Komplikationen auftreten: So zeigen Alkoholiker im psychischen Bereich nicht selten zugleich Depressionen, eine übermäßige Aggressivität und eine allgemeine Veränderung ihrer Persönlichkeit; es kann zu optischen und akustischen Halluzinationen kommen. Sehr ernste Komplikationen des Alkoholismus sind das Korsakow-Syndrom und die Wernicke-Encephalopathie, die mit einem Verlust von Raum- und Zeitgefühl sowie Gedächtnislücken verbunden sind. Daneben kommt es außerdem zu Nervenschädigungen, die sich in Gangunsicherheit (Ataxie), Empfindungsstörungen an Armen und Beinen sowie Zittern und epileptischen Anfällen zeigen können. Außerdem sind oft Schädigungen der inneren Organe Folge des Alkoholismus: Neben Fettleber oder Leberzirrhose kann es auch zu Magen- und Darmgeschwüren, einer Entzündung der Bauchspeicheldrüse (Pankreatitis) sowie zu Erkrankungen des Herzmuskels kommen. Wenn wir uns den genetischen Aspekten des Alkoholismus zuwenden, ist es zunächst wieder hilfreich,

Abb. 13.27 Alkoholtests bei Drosophila. Der Alkohol wird mit Luft gemischt, um einen Ethanoldampf zu erzeugen (Kanister links). Das Ethanolgemisch wird durch die Säule und über die Plastikablenkplatte geschickt. Unbehandelte Fliegen werden oben in die Säule hineingegeben und können auf den Platten bleiben, bis sie betäubt sind. Wenn sie betäubt sind, fallen sie die Säule hinunter und auf den Boden. Die Zeit, die die Fliegen brauchen, um aus der Säule herauszufallen, kann gemessen werden und variiert erheblich zwischen Wildtypen und Mutanten (z. B. cheap date). (Nach Browman u. Crabbe 1999, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Modellorganismen wie Drosophila und die Maus zu betrachten. Zu den natürlichen Habitaten von Drosophila gehören fermentierende Pflanzen, die oft einen gewissen Alkoholgehalt (~ 3 %) aufweisen. Daher ist die Fruchtfliege resistent gegenüber den toxischen Wirkungen des Alkohols und kann Alkohol effizient zur Energiegewinnung oder als Ausgangssubstanz zur Herstellung von Lipiden nutzen. Unter verschiedenen experimentellen Bedingungen hat sich die Exposition von Drosophila gegenüber Alkoholdampf (Abb. 13.27) als diejenige erwiesen, die der akuten Alkoholvergiftung von Säugetieren (z. B. Verlust der motorischen Kontrolle oder sedierende Wirkung) am nächsten kommt. Auf diese Weise konnten verschiedene Mutanten isoliert werden, die sich deutlich in der Menge Alkohol unterscheiden, die für eine sedierende Wirkung nötig ist: So brauchen barfly-Mutanten größere

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

und tipsy-Mutanten geringere Mengen an Alkohol als eine Wildtyp-Fliege. Eine interessante Mutante ist cheap date: Diese Mutanten haben eine erhöhte Sensitivität gegenüber Alkohol und die Detailanalyse zeigte, dass dem Verhalten eine Mutation in dem Gen amnesiac zugrunde liegt; amnesiac codiert für ein Neuropeptid, das die Adenylatcyclase aktiviert. Dieses System ist uns von der Genetik der Lernvorgänge bereits bekannt (Tab. 13.2). Weitere Untersuchungen bestätigten den Zusammenhang zwischen dem cAMP-System und einer erhöhten Sensitivität gegenüber Alkohol. Aber auch Nager zeigen genetische Unterschiede in ihrem Verhalten gegenüber Alkohol. Wenn man verschiedene Mausstämme hinsichtlich ihrer Alkoholpräferenz betrachtet, findet man große Unterschiede zwischen verschiedenen Inzuchtstämmen: So mögen DBA/2-Stämme keinen Alkohol, wohingegen C57BLStämme Alkohol gegenüber Wasser deutlich bevorzugen (Abb. 13.28). Auch bei Ratten kann man aus einer homogenen Population durch bidirektionale Selektion „starke“ (HAD) und „schwache Trinker“ (LAD) herauszüchten, was zunächst nur auf das Vorhandensein genetischer Komponenten hindeutete. Eine erste genetische Analyse zeigte, dass der Phänotyp des „starken

Abb. 13.28 Unterschiede in der Alkoholpräferenz verschiedener Mausstämme. Es ist das Verhältnis der aufgenommenen Alkoholmenge im Verhältnis zur aufgenommenen Wassermenge über 14 Tage bei der angegebenen Anzahl von Mäusen verschiedener Stämme dargestellt. Die horizontalen Linien geben die Standardabweichung an. (Nach Vogel u. Motulsky 1997, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Trinkers“ bei diesen Ratten mit mehreren chromosomalen Regionen assoziiert ist; besonders mit Regionen auf den Chromosomen 10 und 16, aber auch auf den Chromosomen 5 und 12 (Carr et al., 2003). Die weitere Untersuchung der HAD-Ratten brachte zusätzlich das Neuropeptid Y (NPY) ins Spiel. Dabei handelt es sich um ein kleines Protein, das aus 36 Aminosäuren besteht und offensichtlich neurobiologische Antworten auf Alkohol moduliert. Seine Wirkung entfaltet es über die Bindung an verschiedene Rezeptoren, die alle mit G-Proteinen gekoppelt sind und über das cAMP-System wirken. Die HAD-Ratten zeigen geringere Spiegel des NPY in der Amygdala; wird aber NPY zentral infundiert, sinkt die Alkoholaufnahme dieser Ratten (bei den LAD-Ratten zeigt sich dagegen kein Effekt). Ergänzende Untersuchungen wurden an Mäusen durchgeführt, bei denen die NPY-Rezeptoren ausgeschaltet wurden. Dabei führte das Ausschalten des NPY-Rezeptors 1 zu einer Erhöhung, das Ausschalten des Rezeptors 2 dagegen zu einer Verminderung der Ethanolaufnahme der Mäuse. Untersuchungen an Polymorphismen des NPY-Gens bei Menschen ergänzen die Ergebnisse aus den Tiermodellen zur Beteiligung von NPY und seinen Rezeptoren zur Modulation der Alkoholantworten und deuten an, dass eine Substitution von Leucin an der Position 7 durch Prolin (Leu7Pro) mit einer deutlich höheren durchschnittlichen Alkoholaufnahme korreliert ist (OMIM 162640). Untersuchungen, die an einem anderen Rattenstamm gewonnen wurde, der dem oben erwähnten HAD/LAD-System ähnlich ist (alcohol-preferring: P, alcohol non-preferring: NP), führten zu der Entdeckung eines weiteren Gens und seines Proteins, α-Synuclein (Gensymbol: Snca), das im Hippocampus der P-Ratten stärker exprimiert war als bei den NP-Ratten. Die molekulare Analyse ergab einen A679G-Polymorphismus in der 3’-UTR des Snca-Gens, der in Reportergenassays mit einer höheren Reportergen-Aktivität und höheren Proteinkonzentration verbunden ist (verursacht möglicherweise durch die erhöhte Stabilität der mRNA; Liang et al. 2003). Eine genomweite QTLKartierung (Kapitel 10.4.6) ergab für diese Region auf dem Chromosom 4 einen sehr hohen LOD-Score von 9.2 und einen Anteil an dem Gesamtphänotyp des „starken Trinkers“ von etwa 10%. In der Ratte und in der Maus liegt das Snca-Gen nicht weit entfernt vom Npy-Gen auf demselben Chromosom (Ratte: Chromosom 4, Maus: Chromosom 6). Beim Menschen sind diese beiden Gene zwar getrennt (NPY: Chromosom 7p15; SNCA: Chromosom 4q21), genomweite Untersuchungen haben aber gezeigt, dass die chromosomale Region um 4q21 auch ein Cluster von Alkoholdehydrogenase-Genen (Gensymbol: ADH) beherbergt. Polymorphismen in den ADH-Genen sind ebenfalls mit der Verminderung des Risikos für Alkoholismus verbun-

13.3 Angst, Sucht und psychiatrische Erkrankungen

den, sodass die Region um 4q21 in diesem Zusammenhang durchaus interessant sein dürfte. Ähnliche Untersuchungen wurden auch an der Maus durchgeführt. Auch hier konnten aus einem heterogenen Hintergrund (d.h. keine Inzucht-Mäuse) Kolonien als „starke Trinker“ (HAD1) bzw. „schwache Trinker“ (LAD1) gezüchtet werden. Eine genomweite Kartierung zeigte eine Kopplung des „starken Trinkers“ vor allem mit Chromosom 9, aber auch mit Regionen auf den Chromosomen 1, 3 und 5 (Bice et al., 2009). Weitere konkrete Hinweise über die Beteiligung bestimmter Gene kommen aus Untersuchungen von Knock-out-Mäusen, bei denen Gene für DopaminRezeptoren bzw. für den GABAA-Rezeptor ausgeschaltet wurden (Tabelle 13.4). Diese Daten werden im Übrigen auch von Kopplungsanalysen in betroffenen Familien durch Zwillingsstudien und GeschwisterpaarAnalysen gestützt, die darauf hindeuten, dass Alkoholabhängigkeit mit Regionen auf dem Chromosom 11p und 4p gekoppelt ist. Dort kartieren auch die Gene für einen Dopamin-Rezeptor (DRD4) und für die TyrosinHydroxylase (TH) bzw. für den GABA-β1-Rezeptor. Diese Arbeiten zeigen insgesamt, dass wir uns schrittweise an die genetischen Bedingungen zum Verständnis der Alkoholabhängigkeit herantasten. Alkoholismus entwickelt sich oft als Reaktion auf bestimmte Lebenssituationen, z. B. Stress. Um den Zusammenhang zwischen Stress und

der Entwicklung von Suchtverhalten zu untersuchen, haben Inge Sillaber und ihre Mitarbeiter (2002) bei Mäusen ein Gen aus der zentralen Schaltstelle für die Stressreaktion ausgeschaltet: Das Corticotropin-freisetzende Hormon (engl. corticotropin-releasing hormon, CRH) steuert normalerweise nicht nur die hormonelle Stressantwort, sondern koordiniert auch eine ganze Reihe von Verhaltensweisen, die geeignet sind, eine Stress-Situation zu bewältigen. Es beeinflusst auch Regionen, die für emotionales Verhalten wie Angst relevant sind. Damit CRH wirken kann, muss es an einen Rezeptor gebunden werden. Wenn man nun Mäusen, bei denen das Gen für den CRH-Rezeptor-1 ausgeschaltet wurde, Alkohol anbietet, so unterscheiden sie sich in ihrem Trinkverhalten nicht von den Wildtyp-Mäusen. Wurden die Knock-out-Mäuse jedoch durch die Anwesenheit einer fremden Maus im Käfig oder durch Schwimmen in einem Becken gestresst, so reagierten die Tiere nach 3 Wochen mit einer vermehrten Aufnahme von Alkohol, die auch 5 Monate nach der Stresseinwirkung noch erhalten blieb. Im Gehirn dieser Crhr1−/−-Mäuse ist – vermutlich bedingt durch das Fehlen des CRH-Rezeptors – das Grin2b-Gen überexprimiert, und zwar vor allem im Nucleus accumbens, einem Teil des Hippocampus, der für das Belohnungssystem beim Lernen verantwortlich ist. Dadurch wird offensichtlich das Verlangen der Mäuse nach Alkohol gesteigert. Dieser neurogenetische Mechanismus erklärt ein spezifisches Erschei-

Tabelle 13.4 Eigenschaften genetisch veränderter Mäuse und Fliegen in der Alkoholismusforschung Gen

Protein

Eigenschaften

Pkcc

PKC-γ

verringerte Sensitivität gegenüber den hypnotischen und hypothermischen Effekten des Alkohols

Htr1b

5-HT1b-Rezeptor

erhöhter Alkoholgenuss, verminderte Sensitivität gegenüber Alkoholinduzierter Ataxie

Drd2

Dopamin-Rezeptor 2

verminderter Alkoholkonsum, Unempfindlichkeit gegenüber den bewegungshemmenden Effekten von Alkohol, verminderte Sensitivität gegenüber Alkohol-induzierter Ataxie

Drd4

Dopamin-Rezeptor 4

gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber den bewegungsstimulierenden Effekten von Alkohol

Fyn

Tyrosinkinase

verstärkte Sensitivität gegenüber dem Alkohol-induzierten Reflex des Liegenbleibens (engl. loss of righting)

Npy

Neuropetid Y

in Null-Mutanten erhöhte Alkoholaufnahme; bei transgener Überexpression verminderte Alkoholaufnahme

Amnesiac (cheap date)

Neuropeptid

erhöhte Sensitivität gegenüber Alkohol-induziertem Verlust der posturalen Kontrolle

Tgfa

TGF-α

bei transgener Überexpression erhöhte Empfindlichkeit gegenüber der sedierenden Wirkung von Alkohol

Nach Browmann u. Crabbe (1999)

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

nungsbild von alkoholkranken Patienten, die besonders anfällig für Stress sind und darauf mit dem Trinken von Alkohol reagieren. Therapien zur Bewältigung von Stress-Situationen könnten eine Hilfe sein, Alkoholismus in dieser Form zu vermeiden. Ein neuer Aspekt der Funktion dopaminerger Neurone wurde durch die Leipziger Gruppe um Markus Ullsperger in die Diskussion eingeführt (Klein et al. 2007). Sie beobachteten, dass Träger des DR2R-TAQ-1A-Allels, für die eine verminderte Dichte von Dopamin-D2-Rezeptoren diskutiert wird, schlechter lernen, Verhaltensweisen mit negativen Konsequenzen zu vermeiden. Die Autoren bringen das auch in Zusammenhang mit einem höheren Risiko, Suchtverhalten zu entwickeln. Der erwähnte Polymorphismus DR2R-TAQ liegt aber nicht im Gen des Dopamin-Rezeptors selbst, sondern ca. 10 kb unterhalb. Nähere Untersuchungen ergaben, dass es sich um eine Region handelt, die für eine Proteinkinase codiert (Gensymbol: ANKK1, engl. ankyrin repeat and kinase domain containing 1). Der SNP (C→T) führt zu einem Aminosäureaustausch (Glu713Lys), der wahrscheinlich nicht die strukturelle Integrität, sondern die Substratbindung beeinflusst (Neville et al. 2004) und auf diese Weise in die Signalkette zur Bildung dopaminerger Neurone eingreift. Insgesamt machen diese Untersuchungen deutlich, dass Alkoholismus einer Vielzahl von genetischen Einflüssen unterliegt; Schätzungen gehen davon aus, dass der genetische Beitrag für etwa 40 bis 60 % der Schwankungen verantwortlich ist, die die Unterschiede im Risiko gegenüber Alkoholismus ausmachen. Dabei muss man sich aber auch klar machen, dass die jeweils betroffenen Gene und ihre Translationsprodukte nicht nur in einem einzigen Signalweg tätig sind, sondern oft an verschiedenen Stellen ihre Wirkungen entfalten, sodass in der Summe die bekannten komplexen Verhaltensmuster zu beobachten sind. Die hier dargestellten Zusammenhänge sind insoweit natürlich eine (notwendige) Vereinfachung.

Alkoholismus ist eine komplexe Erkrankung mit ho-

her Prävalenz. Genetische Untersuchungen an Drosophila, Mäusen und Ratten deuten darauf hin, dass neben dem cAMP-System auch Polymorphismen in den Npy- und SncaGenen für eine Alkoholbevorzugung verantwortlich sind. Alkoholabhängigkeit steht auch im Zusammenhang mit den dopaminergen und GABAergen Neurotransmittersystemen sowie mit der Hypothalamus-Hypophyse-Nebenniere-Achse. Genomweite Untersuchungen am Menschen stimmen gut mit den Daten der Tiermodelle überein.

Kokain ist ein weit verbreitetes Rauschmittel mit hohem Abhängigkeitspotenzial. Es wurde Mitte des 19. Jahrhunderts in verschiedenen Labors aus Cocasträuchern isoliert; 1923 publizierte der Chemie-Nobelpreisträger des Jahres 1915, Richard Willstätter, mit seinen Mitarbeitern die Reinsynthese des Alkaloids. Kokain ist das älteste bekannte Lokalanästhetikum; seine Verwendung als Rauschmittel basiert aber auf der Eigenschaft, Stimmungsaufhellungen, Euphorie und Gefühle gesteigerter Leistungsfähigkeit und Aktivität hervorzurufen ‒ dabei verschwinden Hunger- und Müdigkeitsgefühle. Nach dem Ausklingen der Wirkung kommt es häufig zu depressionsartigen Zuständen. Kokain hemmt die Wiederaufnahme von Transmittern an dopaminergen, adrenergen und serotonergen Neuronen (Abb. 13.19). Der verhinderte Transport (und somit die Wiederaufnahme) von Dopamin, Noradrenalin und Serotonin in die präsynaptische Zelle führt zu einer Erhöhung der Transmitterkonzentration im synaptischen Spalt und damit zu einem erhöhten Signalaufkommen am Rezeptor (Abb. 13.29). Ähnlich wie bei der Alkoholwirkung, können auch Fliegen zur Untersuchung der Kokainwirkung herangezogen werden. Wenn Fliegen geringen Dosen von (flüchtigem) Kokain ausgesetzt werden, so äußert sich das in einem exzessiven Putzverhalten; mittlere Dosen bewirken schnelle Drehungen sowie Seitwärts- und Rückwärtslaufen; starke Dosen verursachen Zittern (Tremor) und Lähmung (Paralyse). Diese Effekte können in der Fliege durch akute Gaben von Inhibitoren der Dopamin-Synthese vermindert werden. Werden dagegen dopaminerge und serotonerge Neuronen chronisch während der Entwicklungsphase gehemmt, so werden die Fliegen empfindlicher gegenüber Kokain. Das gilt aber nicht für Fliegen, die eine verminderte Konzentration von Tyramin aufweisen oder für Mutanten mit verminderter cAMP-vermittelter PKA-Aktivität (für eine Übersicht siehe Greenspan u. Dierick 2004). Weiterführende Informationen geben wieder Untersuchungen an Mäusen und Ratten. Wie bei der unterschiedlichen Präferenz verschiedener Mausstämme gegenüber Alkohol finden wir ähnliche stammspezifische Unterschiede auch gegenüber Kokain. So zeigen im Allgemeinen die C57BL/6 und BALB/c ein starkes Belohnungsverhalten gegenüber Kokain, wohingegen bei DBA/2-Mäusen keine Reaktion beobachtet wird. Andere Stämme, wie AKR, C3H, CBA oder SJL, zeigen eher mittlere Antworten (Crawley et al. 1997). Ebenso gibt es Rattenstämme, die unterschiedlich auf Kokain reagieren (Haile et al. 2007). Die genetischen Ursachen dieses unterschiedlichen Belohnungsverhaltens gegenüber Kokain sind allerdings noch nicht geklärt.

13.3 Angst, Sucht und psychiatrische Erkrankungen

Einige Aspekte können aber aus der Analyse unterschiedlicher Knock-out-Mutanten der Maus abgeleitet werden. Insbesondere das Ausschalten der Gene für die verschiedenen Rezeptoren und Transporter für Serotonin, Dopamin und Noradrenalin eröffnete die Möglichkeit, die Beteiligung der jeweiligen Transmitter, ihrer Agonisten und der damit verbundenen Signalwege zu untersuchen. Für die Kokain-Abhängigkeit scheint ‒ zumindest bei Mäusen ‒ der Dopamin-D1-Rezeptor eine wichtige Rolle zu spielen: Mäusen, denen das Gen für den Dopamin-D1Rezeptor (Drd1a) fehlt, verzichten in entsprechenden Verhaltenstests darauf, sich Kokain selbst zu verabreichen (dies gilt aber nicht für Nahrung oder Opiate; Caine et al. 2007).

Kokain führt zur verstärkten Freisetzung von Dopa-

min aus synaptischen Vesikeln und zur Hemmung seiner Wiederaufnahme aus der Synapse. Kokain ist durch ein starkes Abhängigkeitspotenzial gekennzeichnet.

Cannabis, ein Rauschmittel der Hanfpflanze, ist seit über 4000 Jahren dafür bekannt, dass es starke psychiche Auswirkungen hat. Es ist für Patienten mit chronischen Schmerzen oder Multipler Sklerose (zur Kontrolle der Spasmen) von großer Bedeutung ‒ umgekehrt gibt es eine Reihe von Arbeiten, die darauf hinweisen, dass der Genuss von Cannabis das Risiko für Psychosen vergrößert. Der wichtigste psychoaktive Bestandteil des Cannabis ist Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC), dessen Struktur in den 1960er-Jahren aufgeklärt wurde. THC wirkt über den Cannabinoid-1(CB1)-Rezeptor, der 1988 identifiziert und 1990 kloniert wurde. Der CB1-Rezeptor ist der häufigste mit einem G-Protein gekoppelte Rezeptor im Gehirn; seine Expression ist besonders stark im Hippocampus, Kleinhirn, den Basalganglien und im Neocortex. Endogene Liganden des CB1-Rezeptors sind Arachidonylethanolamid und 2-Arachidonylglycerol, die bei Bedarf aus den Phospholipiden der Membranen hergestellt werden. Diese Endocannabinoide wirken als retrograde Signale an Synapsen und hemmen die Ausschüttung von schnell wirkenden Neurotransmittern. Sie werden in Nervenzellen synthetisiert, die Information übermitteln, wie den Purkinje-Zellen des Kleinhirns, den PyramidenNeuronen des Hippocampus und des Cortex oder den dopaminergen Neuronen des Mittelhirns. In der Diskussion um Cannabis ist eine wichtige Frage, inwieweit der fortdauernde Gebrauch zur Entwicklung von Psychosen beiträgt. Epidemiologische Studien deuten sehr deutlich darauf hin, wenngleich auch offensichtlich ist, dass es sich nicht um ein grundsätzliches Phänomen handelt, sondern nur einen Teil

Abb. 13.29 Modell für die relativen Beiträge der Blockade der Transporter für Dopamin (DAT), Serotonin (SERT) und Norepinephrin/Noradrenalin (NET) auf die Kokain-Belohnung bzw. -Ablehnung in Wildtyp-Mäusen. DAT (oben): Die Blockade des Dopamin-Transporters trägt wesentlich zum Belohnungsverhalten bei. SERT (Mitte): Die Serotonin-Transporter-Blockade führt zu einer Kombination aus Belohnungs- und Ablehnungsverhalten; die ungleiche Verteilung der Einflüsse verdeutlicht die unterschiedlichen Beiträge einzelner Serotonin-Rezeptoren. NET (unten): Die Blockade des Norepinephrin/Noradrenalin-Transporters führt zunehmend zu ablehnendem Verhalten. (Nach Uhl et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

der Population betrifft. In solchen Situationen ergibt sich der Verdacht auf eine genetische Prädisposition. Und tatsächlich zeigte die Untersuchung der CatecholO-Methyltransferase (COMT) einen Zusammenhang mit der Entwicklung von Psychosen durch CannabisGebrauch auf: COMT ist am Abbau von Dopamin beteiligt, und es gibt einen funktionellen Polymorphismus im COMT-Gen (OMIM 116790), der zu einem Austausch von Valin durch Methionin im Codon 158 führt (V158M). Die COMT-Aktivitäten unterscheiden sich um das 3-bis 4fache, wenn sie in roten Blutkörperchen oder auch in der Leber gemessen werden, wobei drei Stufen unterschieden werden können (niedrig, mittel, hoch). Dieser stufenartige Unterschied lässt sich gut mit der Anwesenheit eines autosomalen semidominanten Allels erklären ‒ nämlich der G→ATransition im Codon 158 des COMT-Gens, die zu dem oben erwähnten V158M-Austausch führt. Die beiden Allele können übrigens leicht durch einen Restriktionsverdau mit dem Enzym NlaIII nachgewiesen werden; das Val-Allel ist mit einem höheren DopaminSpiegel in den Mittelhirn-Neuronen assoziiert, die zum ventralen Striatum projizieren. Den möglichen Zusammenhang zwischen der genetischen Konstitution hinsichtlich des V158M-Polymorphismus im COMT-Gen und dem Risiko, bei Cannabis-Anwendungen an Schizophrenie zu erkranken, zeigt Abb. 13.30; es sei an dieser Stelle aber auch an die Diskussion des V158M-

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

des Suchtprozesses ist. Die Fähigkeit von Alkohol, Nikotin und Opiaten, die Dopamin-Freisetzung im Nucleus accumbens zu erhöhen, wird durch Agonisten des CB1-Rezeptors blockiert und fehlt vollständig in Mausmutanten, denen der CB1-Rezeptor fehlt. So zeigen Mäuse ohne den CB1-Rezeptor keine konditionierte Platzpräferenz und keine „Selbstbedienung“ mit Alkohol, Nikotin und Opiaten.

Cannabis ist ein Rausch- und Anästhesiemittel. Bei Vorliegen des Val/Val-Genotyps in Bezug auf den V158MPolymorphismus im COMT-Gen erhöht sich das Risiko deutlich, bei Cannabis-Gebrauch zusätzlich an Schizophrenie zu erkranken. Abhängigkeit wird über den CB1Rezeptor vermittelt.

13.3.3 Schizophrenie

Abb. 13.30 Modulation der Entstehung von Schizophrenie bei Cannabis-Konsumenten durch einen Polymorphismus im COMT-Gen. Das Gen für Catechol-O-Methyltransferase (Gensymbol: COMT) hat am Codon 158 einen Polymorphismus, der zum Austausch von Valin (Val) durch Methionin (Met) führt (V158M). Der Aminosäureaustausch beeinflusst die Geschwindigkeit, mit der Dopamin abgebaut wird. Bei einer Untersuchung von 800 Cannabis-Konsumenten im Alter von 26 Jahren zeigte sich, dass die Träger des Val-Allels ein deutlich höheres Risiko haben, an Schizophrenie zu erkranken, als die Nicht-Konsumenten. (Nach Murray et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Polymorphismus im Zusammenhang mit der allgemeinen Entstehung von Schizophrenie verwiesen (Kapitel 13.3.3). In diesem Zusammenhang ist natürlich auch die Frage nach der Suchtwirkung von Cannabis wichtig. Epidemiologische Studien zeigen, dass etwa einer von 9 Anwendern von Cannabis den klinischen Kriterien für eine Cannabis-Abhängigkeit genügt, wobei diese Abhängigkeit eher mittelmäßig als schwer ist. Andererseits scheinen die Entzugserscheinungen nicht so dramatisch zu sein wie bei anderen Suchtmitteln, was aber möglicherweise durch den langsamen Abbau von Cannabis begründet ist. Drogen, die zur Abhängigkeit führen, haben eines gemeinsam: Sie erhöhen die Freisetzung von Dopamin im Nucleus accumbens, und man glaubt, dass diese Eigenschaft zentral für die Entfaltung

Emil Kraepelin beschrieb 1899 ein Symptom, das er Dementia praecox nannte und das heute als Schizophrenie (Gensymbol: SCZD; OMIM 181500) bezeichnet wird. Es ist durch Halluzinationen, Wahnvorstellungen, unorganisierte Sprache, Affekt- und Antriebsstörungen sowie kognitive Störungen (z. B. der Aufmerksamkeit, des Gedächtnisses, allgemeiner intellektueller Fähigkeiten) gekennzeichnet. Psychiatrische Erkrankungen wie Schizophrenie wurden jedoch lange Zeit nicht unter genetischen Gesichtspunkten betrachtet. Allerdings gab es am Ende des 20. Jahrhunderts zunehmend Berichte über familiäre Häufungen psychiatrischer Erkrankungen, sodass eine starke genetische Komponente offensichtlich war. Heute gilt eine positive Familiengeschichte als das größte Risiko für Schizophrenie: Beträgt das Lebenszeitrisiko in der allgemeinen Bevölkerung etwa 1 %, so steigt es auf 6,5 % bei Verwandten 1. Grades und auf 40 bis 50 % bei eineiigen Zwillingen betroffener Eltern. Die Erblichkeit (Heritabilität) der Schizophrenie wird heute mit ungefähr 80 % angegeben. Allerdings zeigte sich auch, dass diese genetische Komponente nicht den klassischen Mendel’schen Gesetzen folgt, sondern eher den Gesetzen komplexer Erkrankungen, wie wir es vorher bereits bei Asthma und ähnlichen Erkrankungen mit vielfältigen genetischen Ursachen kennengelernt haben. Im Gegensatz zu den oben besprochenen Krankheiten wie Alzheimer oder Parkinson kommt bei der Schizophrenie eine weitere Schwierigkeit dazu, nämlich das Fehlen einer diagnostischen Neuropathologie oder anderer biologischer Marker des Syndroms. Allerdings erlauben moderne bildgebende Verfahren wie die funktionelle Kernspintomographie (engl. functional magenetic resonance imaging, fMRI) auch einen Ein-

13.3 Angst, Sucht und psychiatrische Erkrankungen

Abb. 13.31 Strukturveränderungen bei der Schizophrenie. Die Voxel-basierte Morphometrie lokalisiert signifikante Volumenverminderungen im medialen Schläfenlappen (einschließlich der Amygdala und des Hippocampus) in SchizophreniePatienten. Die oberen Bilder stellen 3D-Bilder von der rechten

bzw. linken Seite dar; das Bild links unten ist eine coronare Ansicht, das Bild rechts unten eine axiale Darstellung. Die Farbskala deutet die statistische Stringenz der Studien an. (Nach Ross et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

blick in die Gehirne schizophrener Patienten. Die am besten übereinstimmenden strukturellen Veränderungen bei Schizophrenie beinhalten eine laterale Vergrößerung des 3. Ventrikels, aber eine Volumenminderung des medialen Schläfenlappens (Formatio hippocampi, Subiculum, Gyrus parahippocampalis) und des Gyrus temporalis superior. Ein typisches Beispiel zeigt Abb. 13.31. Die genetisch-epidemiologischen Untersuchungen mit Geschwisterpaar-Analysen zeigen eine Vielzahl möglicher Genorte an, oft allerdings mit niedrigen LOD-Werten (Kapitel 12.1.4), und viele Studien fügen der langen Liste neue Kandidatenregionen hinzu, ohne dass frühere Arbeiten bestätigt werden können. Unter der Vielzahl dieser Kandidatenregionen (Abb. 13.32) ragen aber einige heraus, bei denen die Ergebnisse mit früheren Kartierungsdaten übereinstimmen, die wiederholbar und biologisch plausibel sind und zu denen es einen vergleichbaren Phänotyp in einer transgenen Maus gibt. Die Untersuchungen bei der Maus werden dadurch erleichtert, dass es inzwischen einige objektivierbare Verhaltenstests gibt; dazu gehören die Messung der sozialen Interaktion, Präpuls-Hemmung, Aggression und Bewegungsaktivität.

Große, isolierte Bevölkerungsgruppen sind für Humangenetiker häufig eine wahre Fundgrube. Das trifft beispielsweise für die Bevölkerung Islands zu, deren Gene in vielerlei Hinsicht durch die Islandic deCODE Genetics Group analysiert werden. Diese Gruppe führte zunächst eine genomweite Übersicht durch und fand das Chromosom 8p als eine Kandidatenregion für Schizophrenie. Sie identifizierten daraufhin mehrere Marker im Gen Neuregulin-1 (NRG1), die den harten Kern eines Haplotyps aufbauen, der mit Schizophrenie assoziiert ist und das Risiko für Nachkommen, an Schizophrenie zu erkranken, um den Faktor 2,1 erhöht (Stefansson et al. 2002). Die gleiche Gruppe hat diese Ergebnisse später an schottischen (Stefansson et al. 2003) und chinesischen (Li et al. 2004) Patienten bestätigt. Neuregulin kommt in glutaminergen synaptischen Vesikeln vor und wirkt auf die Expression der NMDA-Rezeptoren über ErbBRezeptoren. Eine Neuregulin-hypomorphe Maus zeigt außerdem Verhaltensweisen, die der Schizophrenie ähnlich sind. Das zweite Gen, das den oben genannten Kriterien genügt, codiert für die Catechol-O-Methyltransferase (Gensymbol: COMT; Chromosom 22q11). Das Enzym ist am Abbau von Catecholaminen beteiligt und spielt im Dopamin-Stoffwechsel eine wichtige Rolle (Abb.

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

13.19). Ein SNP im COMT-Gen (V158M) beeinflusst die Aktivität des Enzyms und die präsynaptische Dopaminwirkung. Wir haben diesen Polymorphismus bereits in anderem Zusammenhang kennengelernt: nämlich im Zusammenhang mit Cannabis-Rauchern, die zugleich an Schizophrenie erkranken (Kapitel 13.3.2; Abb. 13.30). Weitere Gene, für die eine Beteiligung an Schizophrenie diskutiert wird, sind Dysbindin (Chromosom 6p; Gensymbol: DTNBP1) und G72 auf dem Chromosom 13q22‒34, das mit der D-Aminosäure-Oxidase (DAAO) interagiert. Eine Kombination der beiden Risikogruppen hat synergistische Effekte in Bezug auf das Risiko, an Schizophrenie zu erkranken. Weiterhin gibt es Hinweise darauf, dass ein G-Protein an der Ausprägung von Schizophrenie beteiligt ist (Gensymbol: RGS4; auf Chromosom 1q21‒22) sowie eine Prolin-Dehydrogenase (Gensymbol: PRODH; Chromosom 22q11). Eine Übersicht über die genetische Heterogenität der Schizophrenie gibt Tabelle 13.5. Durch Analyse einer balancierten Translokation zwischen den Chromosomen 1 und 11 wurde in einer großen schottischen Familie

Abb. 13.32 Chromosomale Lokalisation von SchizophrenieGenen. Chromosomale Regionen mit signifikanter Kopplung mit Schizophrenie sind durch blaue Balken gekennzeichnet, Deletionen durch rote Balken. Die gelben Pfeile und Kreise geben die Regionen an, die durch Kopplungsanalysen und As-

auf dem Chromosom 1 das Gen DISC1 identifiziert (engl. disrupted in schizophrenia 1) ‒ das Gen wird durch die Translokation zwischen den Exons 8 und 9 gespalten; auf dem Chromosom 11 gibt es kein Gen an dieser Stelle, sodass es zu einem reinen Funktionsverlust kommt, ohne dass neue Hybridproteine gebildet werden, wie wir das bei vielen Translokationen gesehen haben, die zur Aktivierung von Onkogenen führen (Kapitel 12.4.1). In dieser Familie segregiert die Translokation mit einem breiten Spektrum psychischer Erkrankungen (Schizophrenie, bipolaren Erkrankungen und anderen schweren psychischen Erkrankungen). Die Translokation selbst wurde bisher bei keiner anderen Familie gefunden. Eine Mausmutante mit einer Deletion im Exon 6 des Disc1-Gens zeigt Defekte im Kurzzeitgedächtnis. DISC1 wird in mehreren Isoformen exprimiert; die stärkste Expression ist im Hippocampus zu finden. Die Proteinsequenz gibt einige Hinweise auf die Funktion: Die vielen coiled-coil-Proteindomänen (umeinander gewundene α-Helices) am C-Terminus bieten gute Interaktionsmöglichkeiten mit anderen Proteinen; bestätigte Interaktionspartner sind die Phosphodiesterase 4B (Gensymbol: PDE4B), eine Endooligopeptidase (engl. nuclear distribution element-

soziationsstudien identifiziert wurden. Die roten Pfeile und Kreise deuten Gene an, die durch Translokationen identifiziert wurden. Einige Gensymbole sind angegeben. (Nach Ross et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

13.4 Neurodegenerative und neurologische Erkrankungen

Tabelle 13.5 Genetische Heterogenität der Schizophrenie Bezeichnung

OMIM

Chromosom

Gen

SCZD1

181510

5q23-35

?

SCZD2

603342

11q14

FXYD6

SCZD3

600511

6p23

Dysbindin?

SCZD4

600850

22q11

PRODH

SCZD5

603175

6q23

TRAR4?

SCZD6

603013

8p21

NRG1, PPP3CC

SCZD7

603176

13q32

DAOA/G30?

SCZD8

603206

18p

GNAL?

SCZD9

604906

1q42

DISC1

SCZD10

605419

15q15

?

SCZD11

608078

10q22

NRG3?

SCZD12

608543

1p36

?

SCZD13

613025

15q13

CHRNA7?

SCZD14

612361

2q32

ZNF804A?

Nach OMIM 181500 (April 2010)

like, Gensymbol: NUDEL), eine Acetylhydrolase (engl. platelet-activating factor acetylhydrolase isoform 1B, Gensymbol: PAFAH1B1; auch bezeichnet als lissencephaly-1, Gensymbol: LIS1) und das Faszikulations- und Elongationsprotein ζ1 (Gensymbol: FEZ1). Es wird vermutet, dass das DISC1-Protein sowohl eine wichtige Funktion während der Entwicklung des Gehirns als auch im adulten Gehirn bei Lern- und Gedächtnisprozessen hat; eine Übersicht über die Mechanismen gibt Abb. 13.33. DISC1 ist ein vielversprechendes Kandidatengen für Schizophrenie: Es ist sehr gut durch experimentelle Befunde abgesichert und hat daher ein großes „Potenzial“ für tiefer gehende Untersuchungen. Eine interessante Verbindung zwischen DISC1 und dem oben erwähnten Neuregulin 1 stellten Seshadri et al. (2010) her: Sie beobachteten in Nrg1-Knock-out Mäusen eine Verminderung der Disc1 Expression und haben damit einen funktionellen Zusammenhang zwischen diesen beiden Genen hergestellt.

Schizophrenie ist eine psychische Erkrankung, die durch Halluzinationen, Wahnvorstellungen, Störungen in der sozialen Interaktion und kognitive Störungen gekennzeichnet ist. Es gibt keine klare neuropathologische Diagnostik. Kopplungsanalysen bei Familien von Patienten sowie transgene bzw. Knock-out-Mutanten der Maus deuten darauf hin, dass Mutationen in den Genen für DISC1, NRG1 und COMT das Risiko erhöhen, an Schizophrenie zu erkranken. Es sind aber sicherlich noch eine Reihe weiterer Gene an dieser Erkrankung beteiligt; Umweltfaktoren haben einen modulierenden Einfluss.

Epigenetische Mechanismen werden immer wieder als eine mögliche Ursache einer Schizophrenie-Erkrankung diskutiert. Experimentelle Hinweise gibt es bereits für DNA-Methylierungen in den Promotoren des Reelin-Gens sowie der COMT und SOX10-Gene: Eine verminderte Expression von Reelin in GABAergen Synapsen führt zu Fehlfunktionen in deren Schaltkreisen. In einer weiteren Studie konnten H.-S. Huang et al. (2007) zeigen, dass die Histon-H3-Lys4-Methylierung am GAD1-Promotor (engl. glutamic acid decarboxylase-1) im präfrontalen Cortex mit dem Alter zunimmt. Veränderungen bei Schizophrenie beinhalten auch eine verminderte GAD1-Expression und H3K4-Methylierung, bevorzugt bei Frauen und in Verbindung mit einem Risiko-Allel im 5’-Bereich des GAD1-Gens. Es bleibt abzuwarten, ob sich derartige epigenetische Effekte bestätigen und zur Ausgestaltung eines funktionellen Gesamtkonzeptes der Schizophrenie beitragen können.

13.4 Neurodegenerative und neurologische Erkrankungen Neurodegenerative Erkrankungen zeichnen sich durch einen schleichenden Verlust zentraler Funktionen des Gehirns aus, wobei das Eintrittsalter der Erkrankung stark schwankt (oft auch unter eineiigen Zwillingen), sodass man lange Zeit nicht wusste, welche genetischen Komponenten hier eine Rolle spielen könnten. Dazu kommt, dass aufgrund des vielschichtigen Krankheitsbildes einheitliche diagnostische Kriterien nicht immer klar waren. Nach der vollständigen Analyse des menschlichen Genoms und vieler Modellorganismen hat jedoch die molekulare Analyse neurodegenerativer Erkrankungen einen Aufschwung erfahren, und es zeichnet sich ab, dass wir auch diese Erkrankungstypen bald verstehen können und damit auch eine kausale Therapie möglich wird. Zu diesem Mosaikbild, das sich zurzeit vor unseren Augen entwickelt und in seinen Details immer klarer wird, gehört aber auch, dass es

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730 730

Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

a

b

Reelin VLDLR

Mikrotubulus

Kinase Dab1 PhosphoDab1 Aktin Stress-Fasern

Dendrit

DynactinKomplex

CITRON

Lis1 DISC1

DISC1 PSD95

NUDEL

DISC1 DISC1 FEZ1

DynactinKomplex NeurotransmitterRezeptor

NUDEL

Wachstumskegel

Lis1

DISC1

G-Protein

Centrosom cAMP Lis1

AdenylatCyclase DISC1 Centrosom

Nukleokinese

Mikrotubulus

Glutamat-Rezeptoren

NUDEL

Lis1

synaptische Vesikel

Gen Transkription

ATP PDE4B AMP

DNA NLS ATF4

DISC1

ATF5 PDE4B

DISC1 Zellkern

DISC1

Mitochondrium

Kernmembran

Abb. 13.33 a, b Funktion von DISC1. a In der sich entwickelnden Nervenzelle ist DISC1 Teil eines Komplexes mit NudEL und Lis1 und steht dabei in Wechselwirkung mit dem Dynein/Dynactin-Motorkomplex, der am Transport der Mikrotubuli und ihrer Organisation am Centrosom beteiligt ist. Dieser Komplex ist für die Nukleokinese und damit auch für die Wanderung der Neuronen verantwortlich; dieser Prozess ist dem Reelin-Signalweg über Dab1 (engl. disabled) nachgeordnet. DISC1 hat auch eine Schlüsselfunktion beim Auswachsen der Neurite und ihrer Organisation über die Wechselwirkung mit FEZ1 und den Aktin-haltigen Stressfasern. b In der erwachsenen Nervenzelle

hat DISC1 weiterhin eine wichtige Funktion beim Transport über die Mikrotubuli; DISC1 interagiert auch mit Citron (eine postsynaptische Serin-/Threoninkinase) und beeinflusst damit die synaptischen Antworten. DISC1 moduliert wahrscheinlich auch die Neurotransmission und Neuroplastizität durch seine Fähigkeit, die Hydrolyse von cAMP durch PDE4B zu regulieren (wahrscheinlich an der äußeren Mitochondrienmembran). Im Zellkern interagiert DISC1 mit Transkriptionsfaktoren und beeinflusst auf diese Weise insbesondere die Stress-induzierte Transkription. (Nach Ross et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

nicht ein Gen gibt, das für die jeweilige neurodegenerative Erkrankung verantwortlich ist, sondern dass Mutationen in verschiedenen Genen dazu beitragen und damit die klinische Heterogenität begründen. Umgekehrt werden wir auch sehen, dass Mutationen in einem Gen für unterschiedliche Krankheitsbilder verantwortlich sind. Das kann mittelfristig auch dazu führen, dass die Krankheiten von den betroffenen Genen her definiert werden und nicht mehr über ihr klinisches Erscheinungsbild. Wir wollen aber zunächst einmal der „alten“ Nomenklatur folgen und einige Aspekte des Rett-Syndroms, der Epilepsie und des Autismus diskutieren, bevor wir uns der Alzheimer’schen und Parkinson’schen

Krankheiten als klassischen Beispielen neurodegenerativer Erkrankungen zuwenden. In diesem Zusammenhang muss natürlich auch die Chorea Huntington als progressive neurodegenerative Erkrankung erwähnt werden. Es handelt sich hier um expandierende Triplett-Mutationen, die bereits im Zusammenhang mit autosomal-dominanten Erkrankungen besprochen wurden (Kapitel 12.3.2).

13.4.1 Das Rett-Syndrom Das Rett-Syndrom (OMIM 312750) wurde zuerst 1966 von dem Wiener Kinderarzt Andreas Rett als eine

13.4 Neurodegenerative und neurologische Erkrankungen

Abb. 13.34 Klinische Merkmale des Rett-Syndroms. Nach einer unauffälligen Entwicklungsphase stagniert die Entwicklung und führt schnell zu einer deutlichen Verschlechterung des Zustands: Verlust der bisher erworbenen Sprache und Ersatz zielgerichteter Bewegungen der Hände durch unablässige Stereotypien. Die Patientinnen entwickeln außerdem soziale Verhaltensauffälligkeiten, die häufig fälschlicherweise als Au-

tismus diagnostiziert werden. Der Gesundheitszustand verschlechtert sich mit dem Verlust der motorischen Fähigkeiten und tief greifenden cognitiven Beeinträchtigungen. Zusätzlich haben die Patientinnen Angstgefühle und Schlaganfälle. (Nach Chahrour u. Zoghbi 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

schwere neuronale Entwicklungsstörung beschrieben, die fast ausschließlich Mädchen betrifft. Es dauerte allerdings 17 Jahre, bis der deutschsprachige Bericht in der englischen Fachliteratur bekannt wurde. Wir wissen heute, dass das Rett-Syndrom eine der häufigsten Erkrankungen mit mentaler Retardierung bei Frauen ist – die Häufigkeit beträgt 1:10.000. Die Krankheit zeichnet sich durch eine unauffällige Prä- und Perinatalperiode aus; ab dem Alter von etwa 6 Monaten verlangsamt sich das Schädelwachstum (bis hin zur Entwicklung einer Mikrocephalie) und sinnvolle Handbewegungen gehen verloren; stattdessen zeigen die Patientinnen typische waschende bzw. knetende Bewegungen. Es folgen ein Verlust der Sprache und eine zunehmende soziale Isolierung. Später entwickeln sich weitere körperliche und geistige Behinderungen, z. B. Skoliosen, vermindertes Wachstum und Epilepsien. Das Endstadium der Erkrankung ist oft schon im Alter von 10

Jahren erreicht und durch Mobilitätsverlust gekennzeichnet. Obwohl manche Patientinnen ein Alter von 60 bis 70 Jahren erreichen, sterben viele plötzlich an Herzversagen oder Atmungsstörungen; eine kausale Therapie für das Rett-Syndrom ist nicht bekannt. Eine Übersicht über den Krankheitsverlauf gibt Abb. 13.34. Das Gen, dessen Mutationen für die Erkrankung verantwortlich ist, wurde auf dem langen Arm des X-Chromosoms lokalisiert (Xq28). Krankheitsursache sind überwiegend spontane Mutationen (bevorzugt in der männlichen Keimbahn), die das MECP2-Gen betreffen, das für ein Methyl-CpG-bindendes Protein codiert. Der Erbgang ist dominant, d. h. für Jungen ist eine Mutation im MECP2-Gen in der Regel letal. Wir kennen heute über 300 verschiedene Mutationen, die das gesamte Gen betreffen. Es ist allerdings auffallend, dass 8 missense oder nonsense Mutationen für ca. 70 % aller beobachteten Mutationen verantwortlich sind.

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Abb. 13.35 Mutationen im MECP2-Gen. Das MeCP2-Protein enthält drei Domänen: eine Methyl-bindende Domäne (MBD), eine Domäne zur Hemmung der Transkription (TRD; engl. transcription repression domain) und eine C-terminale Domäne. Das Kernlokalisationssignal liegt in der TR-Domäne und ist durch eine gestrichelte Ellipse gekennzeichnet. Mutationen, die zum Rett-Syndrom führen, sind oberhalb der schematischen

Darstellung angegeben; Mutationen, die zu einer rezessiven X-gekoppelten mentalen Retardierung (XLMR) führen, sind unterhalb dargestellt. Es sind Mutationen bekannt, die einen frühen (grau) oder späten (weiß) Translationsstopp bewirken; Mutationen, die zu einem Aminosäureaustausch führen, sind hellgrau dargestellt. (Nach Renieri et al. 2003, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Abb. 13.36 a, b Modell der MeCP2-Wirkungen. a In ruhenden Neuronen reguliert MeCP2 die Genexpression, indem es selbst an methylierte CpG-Dinukleotide bindet und dadurch die weitere Bindung von Chromatin-modifizierenden Proteinen ermöglicht. Das bewirkt eine Verdichtung des Chromatins und macht den Promotor für Transkriptionsfaktoren unzugänglich. Neuronale Aktivität führt dagegen zur Phosphorylierung des MeCP2-Proteins, zur Ablösung von der Promotorregion der

Zielgene und zur Freisetzung der Chromatin-modifizierenden Proteine. Das hyperacetylierte Chromatin erlaubt den Zugang zur Transkriptionsmaschinerie und die Expression der Zielgene. b MeCP2 tritt in Wechselwirkung mit dem YB1-Protein (YBox-bindendes Protein-1) und reguliert alternatives Spleißen der Zielgene. In Abwesenheit von MeCP2 werden diese Transkripte falsch gespleißt. (Nach Chahrour u. Zoghbi 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

13.4 Neurodegenerative und neurologische Erkrankungen

Klinische Unterschiede können unter Umständen darauf zurückgeführt werden, dass das Protein verschiedene funktionelle Domänen besitzt (Abb. 13.35). Es gibt verschiedene Genotyp-Phänotyp-Korrelationen, die darauf hindeuten, dass Mutationen, die zu einem Translationsstopp im N-terminalen Bereich des Proteins führen oder die Kernlokalisationssequenz betreffen, zu schwereren Krankheitsbildern führen als Mutationen, die zu Aminosäureaustauschen führen oder zu einem Verlust der C-terminalen Domäne. Die R133C-Mutation bewirkt einen allgemein milden Krankheitsverlauf, wohingegen die R270X-Mutation mit einer erhöhten Sterblichkeitsrate verbunden ist. Es muss an dieser Stelle aber auch darauf hingewiesen werden, dass es Mutationen im MECP2-Gen gibt, die zu anderen neurologischen Erkrankungen führen, z. B. die X-gekoppelte mentale Retardierung (XLMR; OMIM 300260). Das MECP2-Gen wird vor allem im Gehirn exprimiert; das entsprechende Protein findet sich im Zellkern und hat vermutlich wichtige Funktionen in der Hemmung der Transkription sowie beim Spleißen (Abb. 13.36). Das MeCP2-Protein gehört zur Familie der Methyl-CpG-bindenden Proteine und führt im Zusammenspiel mit anderen, Chromatinmodifizierenden Enzymen (z. B. Histondeacetylasen) zu einer dichteren Verpackung des Chromatins. Neuere Daten von Mecp2-Mausmutanten deuten darauf hin, dass das MeCP2-Protein im Zusammenspiel mit dem Y-Box-Bindungsprotein YB1 auch an Spleißvorgängen beteiligt ist. Die genauen Mechanismen dieses Multifunktionsproteins MeCP2 bedürfen aber noch der Aufklärung.

Das Rett-Syndrom ist eine X-gekoppelte, dominante,

schwere neurodegenerative Erkrankung. Ursache sind überwiegend spontane Mutationen im MeCP2-Gen, das für ein Methyl-CpG-bindendes Protein codiert. Das entsprechende Protein findet sich im Zellkern und hat vermutlich wichtige Funktionen in der Hemmung der Transkription sowie beim Spleißen.

13.4.2 Epilepsie Epilepsie (Fallsucht, Krampfleiden) ist eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen (Prävalenz 0,5‒1 %) und durch spontan auftretende Krampfanfälle gekennzeichnet. Die Anfälle sind klinische Manifestationen eines vorübergehenden cortikalen neuronalen Ungleichgewichts, und ihr Erscheinungsbild ist durch den Ausgangspunkt der Übererregbarkeit und deren Ausbreitungsgeschwindigkeit festgelegt. Üblicherweise erfordert die Diagnose des Krankheitsbildes „Epilep-

sie“, dass der Patient mindestens zwei nicht provozierte Anfälle erlitten hat. Dabei können die Anfälle wenige Sekunden dauern, aber auch bis zu einigen Minuten anhalten. Wir können bei Epilepsien unterscheiden zwischen fokalen Anfällen, bei denen das Anfallsgeschehen in einer umschriebenen Region der Hirnrinde stattfindet, und generalisierten Anfällen, bei denen das gesamte Gehirn betroffen ist. Bei einem generalisierten Anfall ist der Patient in der Regel deutlich bewusstseinsgetrübt oder bewusstlos; diese Anfälle können mit Muskelzuckungen verbunden sein. Zu den generalisierten Anfällen rechnet man Absencen, myoklonische Anfälle, klonische Anfälle, tonische Anfälle, tonisch-klonische Anfälle und atonische Anfälle. Für Epilepsien gibt es deutliche Hinweise auf eine erbliche Komponente: Die Konkordanzrate bei Epilepsien beträgt bei eineiigen Zwillingen ungefähr 76 % und bei zweieiigen Zwillingen ungefähr 33 %. Autosomal-rezessive Erbgänge sind häufig bei Epilepsien mit einem frühen Eintrittsalter der Erkrankung und einem progressiven Verlauf. Dagegen folgen ca. 2 % der Epilepsien einem dominanten Erbgang. Diese sind meist monogenen Ursprungs und weisen mildere Verlaufsformen auf; allerdings ist die Penetranz nicht immer 100 %, was auf modifizierende Faktoren hindeutet. Wir kennen aber auch autosomale und X-chromosomale Formen, mitochondriale Erbgänge und komplexe Vererbungsmuster der Epilepsie. Mutationen im SCN1A-Gen sind die häufigste bisher bekannte genetische Ursache von Epilepsien (Abb. 13.37). Das SCN1A-Gen ist Teil eines Genclusters von drei Genen (SCN1A-SCN2A-SCN3A) auf dem langen Arm des Chromosoms 2 (2q24; OMIM 182389) und codiert für die α-Untereinheit eines spannungsgesteuerten Natrium-Kanals (engl. sodium channel, neuronal type I, α subunit). Das Gen enthält 26 Exons in über 100 kb. Wir kennen mehr als 100 Mutationen, die überwiegend zu einer generalisierten Epilepsie mit fiebrigen Anfällen führen (engl. generalized epilepsy with febrile seizurs plus; GEFS+). Es sind aber auch bei Kindern eine Reihe von epileptischen Gehirnerkrankungen mit unterschiedlichem Schweregrad bekannt, die durch Mutationen im SCN1A-Gen verursacht werden. Weitere Epilepsie-relevante Gene codieren ebenfalls für Ionenkanäle und sind teilweise zugleich Rezeptoren für Neurotransmitter (Abb. 13.38). Dazu gehören die Gene, die für neuronale nicotinerge AcetylcholinRezeptoren codieren (CHRNA4: Chromosom 20q13, OMIM 118504; CHRNB2: Chromosom 1q21, OMIM: 118507) sowie für GABA-Rezeptoren (GABRG2: Chromosom 5q31, OMIM 137164; GABRA1: Chromosom 5q34, OMIM 137160), für Kalium-Kanäle (KCNQ2: Chromosom 20q13, OMIM 602235; KCNQ3: Chromo-

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734 734

Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

som 8q24, OMIM 602232) und für Chlorid-Kanäle (CLCN2: Chromosom 3q26, OMIM 600570). Andere Formen der Epilepsie sind komplexer Natur und durch Mutationen in mehreren Genen verursacht (Polygenie). Wir kennen auch mitochondriale Erkrankungen mit epileptischen Komponenten (z. B. das MERRFSyndrom; Kapitel 12.3.5).

Migräne ist eine chronische neurovaskuläre Erkrankung, die in jedem Alter auftreten kann; es sind etwa 18 % der Frauen und 6 % der Männer betroffen. Wir unterscheiden Migräne mit Aura (~ 20 %) und Migräne ohne Aura (~ 80 %). Aufgrund einiger familiärer Formen ist es gelungen, drei Gene zu identifizieren, deren Mutationen für das Auf-

Abb. 13.37 a–c Schematische Repräsentationen von Mutationen im SCN1A-Gen. Das Protein besteht aus 4 Bereichen mit je 6 Transmembrandomänen. Die veschiedenen Mutationstypen sind angegeben: Verkürzungen sind auf ein vorzeitiges Stoppcodon zurückzuführen und missense-Mutationen bewirken Aminosäureaustausche. a Es sind Mutationen dargestellt, die zu einer generalisierten Epilepsie mit Fieberkrämpfen führen

(GEFS+). b Es sind Mutationen dargestellt, die zu schwerer myoklonischer Epilepsie im Kindesalter führen (SMEI). c Es sind Mutationen dargestellt, die zu hartnäckiger Epilepsie im Kindesalter mit generalisierten tonisch-klonischen Anfällen (ICEGTC), grenzwertiger SMEI (SMEB) oder zu kindlichen Spasmen (IS) führen. (Nach Mulley et al. 2005, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

13.4 Neurodegenerative und neurologische Erkrankungen

treten von Migräne verantwortlich sind. CACNA1A (Chromosom 19p13; OMIM 601011) codiert für einen Calcium-Kanal und ATP1A2 (Chromosom 1q21;

OMIM 182340) für eine ATPase. Das dritte Gen ist das uns schon bekannte Gen SCN1A (Chromosom 2q24; OMIM 182389) (deVries et al. 2006). Dieser genetische Zusammenhang zwischen Migräne und Epilepsie fordert eine intensive Forschung über die zugrunde liegenden neuronalen Mechanismen geradezu heraus.

Epilepsie ist eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen und durch spontan auftretende Krampfanfälle gekennzeichnet. Mutationen im SCN1A-Gen sind die häufigste bisher bekannte genetische Ursache von Epilepsien. Weitere Epilepsie-relevante Gene codieren für Ionenkanäle und sind teilweise zugleich Rezeptoren für Neurotransmitter.

13.4.3 Autismus

Abb. 13.38 Mutationen in Genen für Ionenkanäle. Die Abbildung zeigt ein stark vereinfachtes Modell für Mutationen, die zum Funktionsgewinn (engl. gain-of-function; GoF) oder zum Funktionsverlust (engl. loss-of-function; LoF) bei Ionenkanälen führen, die im Zusammenhang mit verschiedenen Formen der Epilepsie stehen. Von links nach rechts: neuronaler nicotinerger Acetylcholin-Rezeptor (nAChR; Gene: CHRNA4 und CHRNB2), GABAA-Rezeptor (γ-Aminobuttersäure, Subtyp A; Gene: GABRG2 und GABRA1), spannungsgesteuerter NatriumKanal (SCN; Gene: SCN1A, SCN2A und SCN1B), spannungsgesteuerter Kalium-Kanal (KCNQ; Gene: KCNQ2 und KCNQ3) und spannungsgesteuerter Chlorid-Kanal (CLC; Gen: CLCN2). Für jeden Kanaltyp stellt das Modell nur einen von verschiedenen Mechanismen dar. Die hauptsächlichen Ionenströme sind durch Pfeile dargestellt. (Nach Steinlein 2004, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Autismus (OMIM 209850) ist eine häufige Entwicklungsstörung des Nervensystems (Prävalenz 0,2‒0,6 %); es sind mehr Jungen als Mädchen betroffen (3:1). Das Krankheitsbild ist vielseitig, sodass wir heute eher von „Krankheiten aus dem Autismus-Spektrum“ sprechen. Dazu gehören stereotype Verhaltensweisen, Kommunikationseinschränkungen, verändertes Sozialverhalten, Kognitionsstörungen, Probleme in der Sprachentwicklung, geistige Retardierung und auch Epilepsie. Eine Diagnose ist zwischen 14 Monaten und 3 Jahren möglich, vor allem aufgrund des veränderten Wachstums des Gehirns: Zwar ist die Kopfgröße bei der Geburt vermindert, aber im Alter von etwa einem halben Jahr zeigt das Gehirn plötzlich ein exzessives Wachstum. Später (zwischen dem 2. und 4. Lebensjahr) wachsen vor allem die Frontallappen, das Kleinhirn und das limbische System. extrazellulär

Esterase-Domäne

intrazellulär CH

PDZ-BM Neuroligin-3/4

LNS(A)

EGF

LNS(B)

LNS(A)

EGF

LNS(B)

LNS(A)

EGF

LNS(B)

CH

PDZ-BM Neurexin-1α

LNS(B)

CH

PDZ-BM Neurexin-1β

ANK

SH3

PDZ

PRC

ppl

SAM SHANK3

Abb. 13.39 Domänenstrukturen von Neuroligin-3 und -4, Neurexin-1α und -1β sowie von SHANK3. Pfeile unter den jeweiligen Domänenstrukturen zeigen die Sequenzbereiche von Neuroligin-4 und SHANK3 an, in denen die in autistischen Patienten identifizierten Mutationen zu Abbrüchen führen. Die Position der Mutation R451C im NL-3-Gen ist durch eine Pfeilspitze gekennzeichnet. ANK: Ankyrin-Wiederholungseinheiten;

CH: O-Glykosylierungsstellen; EGF: EGF-ähnliche Domäne; LNS: laminin-A/neurexin/sex-hormone-binding-globulin repeats; PDZ: postsynaptic-density-95/discs-large/zona-occludens-1-Domäne; PDZ-BM: PDZ-Domänen-Bindungsmotiv; ppI: CortactinBindungsdomäne; PRC: Prolin-reiche Region; SAM: sterile alpha motif; SH3: Src-Homologiedomäne 3. (Nach Brose 2007, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

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736 736

Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik Präsynaptische aktive Zone

Mint

CASK

Velis

Neurexin NMDARezeptor

N-Typ-Ca2+-Kanal mGlu-Rezeptor

Neuroligin

Kainat-Rezeptor

GKAP/ SAPAP

SAP90/PSD95

Homer

Postsynaptische Plasmamembran ProSap/SHANK

Cortactin

Abb. 13.40 Neuroligine (NLs) bilden mit Neurexinen (NXs) eine transsynaptische Adhäsionsbrücke, die eine zentrale Rolle bei der Ausbildung funktionell wichtiger synaptischer Proteinnetzwerke spielt. Über intrazelluläre Interaktionen mit Gerüst- und Cytoskelettproteinen rekrutieren NXs spannungsabhängige Ca2+-Kanäle und Komponenten des Sekretionsapparats zur Präsynapse. Auf analoge Weise rekrutieren postsynaptische NLs postsynaptische Rezeptoren. SHANK-Proteine sind postsynaptische Gerüstproteine, die ebenfalls über definierte Protein-Protein-Interaktionen zur Rekrutierung postsynaptischer Rezeptoren und anderer

Signalproteine sowie zu deren Verankerung im Cytoskelett beitragen. CASK: calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase; GKAP: guanylate kinase domain-associated protein; mGluRezeptor: metabotroper Glutamat-Rezeptor; Mint: Munc18 interacting protein; NMDA: N-Methyl-D-Aspartat; ProSap: proline-rich synapse-associated protein; PSD95: postsynaptic density protein of 95 kDa; SAP90: synaptosome associated protein of 90 kDa; SAPAP: SAP90/PSD95-associated protein; SHANK: SH3 domain and ankyrin repeat containing protein; Velis: vertebrate Lin 7. (Nach Brose 2007, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

Insgesamt gesehen zeigen verschiedene Untersuchungsverfahren, dass die Krankheiten aus dem AutismusSpektrum auf Fehlern der neuronalen-cortikalen Organisation beruhen, die zu Veränderungen der Informationsverarbeitung auf verschiedenen Stufen des Nervensystems führen: die synaptische und dendritische Organisation, die Verbindung der Signalübertragungswege und die Gehirnstruktur insgesamt. Die besondere Rolle der Genetik bei Autismus wurde durch Zwillingsuntersuchungen deutlich: Die Konkordanzrate beträgt bei eineiigen Zwillingen 60 bis 90 %, bei dizygoten Zwillingen dagegen nur 10 %. Die ersten Hinweise auf Kandidatengene erhielt man durch Untersuchungen von Geschwisterpaaren. So sind einige monogene Formen des Autismus durch Mutationen in Genen verursacht, die für synaptische Adhäsionsmoleküle codieren (Abb. 13.39): Neuroligin-3 und -4 (Gen: NLGN3, Chromosom: Xq13, OMIM 300336; Gen: NLGN4, Chromosom: Xp22, OMIM 300427), SHANK3

(Chromosom: 22q13, OMIM 606230), Neurexin-1α und -1β (codiert von einem Gen, NRXN1, Chromosom 2p16, OMIM 600565). Ein Modell, das die verschiedenen Autismus-Gene funktionell an der Synapse zusammenführt, zeigt Abb. 13.40. Insgesamt müssen wir aber zur Kenntnis nehmen, dass die bisher gefundenen Mutationen in einzelnen Genen eher die Spitze eines Eisbergs darstellen, und es bleibt abzuwarten, ob noch weitere wichtige Gene identifiziert werden können, die mit Autismus assoziiert sind.

Autismus ist eine häufige Entwicklungsstörung des Nervensystems, die sich im veränderten sozialen Umgang mit Mitmenschen und in sich stets wiederholenden Handlungen äußert. Autismus betrifft mehr Jungen als Mädchen (3:1). Monogene Formen des Autismus sind durch Mutationen in Genen verursacht, die für synaptische Adhäsionsmoleküle codieren.

13.4 Neurodegenerative und neurologische Erkrankungen

13.4.4 Die Alzheimer’sche Erkrankung Mehr als ein Jahrhundert ist vergangen, seit der bayerische Nervenarzt Alois Alzheimer 1906 die Beschreibung seiner Patientin „Auguste“ publizierte und damit die Grundlage für die Alzheimer’sche Erkrankung (OMIM 104300) schuf: „Eine Frau von 51 Jahren zeigte als erste auffällige Krankheitserscheinung Eifersuchtsideen gegen den Mann. Bald machte sich eine rasch zunehmende Gedächtnisschwäche bemerkbar, sie fand sich in ihrer Wohnung nicht mehr zurecht, schleppte Gegenstände hin und her, versteckte sie, zuweilen glaubte sie, man wolle sie umbringen und begann, laut zu schreien.” Heute ist „Alzheimer“ die häufigste neurodegenerative Erkrankung. Die Häufigkeit nimmt mit dem Alter zu (Abb. 13.41), und die früh einsetzenden Formen unterscheiden sich nicht von denen, die erst bei höherem Alter auftreten. Es wird angenommen, dass in der Gruppe der 60- bis 64-Jährigen etwa 1 % erkrankt sind. Die Häufigkeit nimmt dann bei steigendem Alter gleichmäßig zu und bei den über 85-Jährigen sind etwa 35 bis 40 % betroffen. Die alltägliche klinische Praxis zeigt, dass in etwa 40 bis 60 % der Fälle eine positive Familiengeschichte mit einer ähnlichen Demenz bei Verwandten ersten Grades beobachtet werden kann. Da allerdings nur in wenigen Fällen eine Bestätigung der Diagnose über eine Autopsie vorliegt, kann man nur in etwa 10 bis 15 % der Fälle von einem bestätigten autosomal-dominanten Erbgang sprechen (Selkoe u. Podlisny 2002).

Abb. 13.41 Altersabhängigkeit der Alzheimer’schen Erkrankung. Die Abbildung zeigt die Prävalenz der Alzheimer’schen Erkrankung als Funktion des Alters bei Frauen und Männern. (Nach Nussbaum u. Ellis 2003, mit freundlicher Genehmigung der Massachusetts Medical Society)

Die ersten klinischen Anzeichen sind Defizite im Kurzzeitgedächtnis, die sich zu Sprachproblemen ausweiten und den Rückzug von sozialen Kontakten sowie Verfall geistiger Funktionen zur Folge haben. Obwohl die Demenz im Allgemeinen erst ab einem Alter von 65 Jahren einsetzt, gibt es eine Untergruppe von Patienten, deren Erkrankung deutlich früher beginnt. Zwar schließt eine definitive Diagnose die neuropathologische Diagnose post mortem ein (Abb. 13.42 zeigt ein typisches Bild), aber Neurologen und Neuropsychologen haben heute klinische Kriterien entwickelt, die zu einer Trefferquote von ca. 90 % in der Diagnose führen. Dazu tragen auch massive Verbesserungen nicht-invasiver, bildgebender diagnostischer in-vivo-Verfahren bei. Die Genetik der Alzheimer’schen Erkrankung erscheint zunächst nicht ganz klar. Wie oben bereits angedeutet, unterscheiden viele Autoren zwischen „familiären“ Formen von Alzheimer und „spontanen“ Formen. Wenn eine Autopsie vorgenommen wird, unterscheiden sich die beiden Typen allerdings nicht hinsichtlich ihrer pathologischen Befunde. Dazu kommt: Wenn wir wie in den früheren Kapiteln zunächst einmal nach Drosophila- oder Mausmutanten für dieses Krankheitsbild suchen, so werden wir enttäuscht – Mäuse entwickeln spontan keine Erkrankungen, deren neuropathologisches Bild mit der klassischen Alzheimer-Diagnostik übereinstimmt. Wir werden daher in diesem Fall einen anderen Weg beschreiten und zunächst einmal feststellen, welche Erkenntnisse die Humangenetik zusammengetragen hat, um dann zu sehen, dass sich über die Herstellung von transgenen und Knock-out-Mäusen hervorragende Modelle züchten lassen. Die ersten biochemischen Beobachtungen bei der Alzheimer’schen Erkrankung zeigten einen Verlust cholinerger Neurone im basalen Vorderhirn. Entsprechend konzentrierten sich die therapeutischen Interventionen zunächst auf die Verlängerung der Lebenszeit des freigesetzten Acetylcholins als zentralem Transmitter cholinerger Neuronen durch Applikation von Hemmstoffen der Acetylcholinesterase. Das zweite biochemische Charakteristikum ist die Bildung der amyloiden Fibrillen. Die auffälligen sternförmigen amyloiden Fibrillen in den extrazellulären Ablagerungen und die intrazellulären neurofibrillären Knäuel (engl. neurofibrillary tangles, NFT) in den Gehirnen der Patienten enthielten offensichtlich den Schlüssel zum Verständnis des pathogenen Mechanismus. In den amyloiden Fibrillen wurde vor allem das amyloide Vorläuferprotein (engl. amyloid precursor protein, Gensymbol: APP) identifiziert, und die neurofibrillären Knäuel enthalten vor allem hyperphosphoryliertes Tau, ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein. Tau ist am Aufbau der Mikrotubuli beteiligt und für

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Abb. 13.42 Klassischer neuropathologischer Befund bei der Alzheimer’schen Erkrankung. Es sind die typischen neuropathologischen Schädigungen der Krankheit zu sehen: Aβpositive Plaques. (Nach Haass u. Selkoe 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

ihre Stabilität mitverantwortlich. Das Gen ist auf dem Chromosom 17q21 lokalisiert (OMIM 157140); im menschlichen Gehirn gibt es 6 Isoformen, die durch alternatives Spleißen entstehen: Die Proteine enthalten 352 bis 441 Aminosäuren. Die Isoformen unterscheiden sich durch die An- oder Abwesenheit von Einschüben mit 29 bzw. 58 Aminosäuren in der Nähe des N-Terminus und einer Wiederholungseinheit von 31 Aminosäuren am C-Terminus. Filamentöse Tau-Ablagerungen finden sich in vielen neurodegenerativen Erkrankungen; es ist unklar, ob Fehlfunktionen für die Entstehung der Alzheimer‘schen Erkrankung (mit)verantwortlich sind. Mutationen im TAU-Gen sind zwar beschrieben, sie führen aber nicht zu Alzheimer’schen Erkrankungen, sondern zu einer weniger häufigen Demenz, die einige klinische und neuropathologische Gemeinsamkeiten mit Alzheimer hat. Sie wird als frontotemporale Demenz mit Parkinsonismus (FTDP-17) bezeichnet (Kapitel 13.4.5); einzig die R406W-Mutation im TAU-Gen kann ein klinisches Bild verursachen, das stark an die Alzheimer‘sche Krankheit erinnert. Humangenetische Untersuchungen konzentrierten sich zunächst auf die früh einsetzenden Formen der Alzheimer’schen Erkrankung. Außer im Zeitpunkt des Erkrankungsalters unterscheidet sich der neuropathologische Befund nicht von dem klassischen Bild. In einigen dieser Fälle wurden Punktmutationen im APPGen identifiziert, und in einigen großen Familien konnte gezeigt werden, dass diese Mutationen mit dem Krankheitsbild co-segregieren. Es ist überraschend, dass diese Mutationen überwiegend in den Exons 16 und 17 des APP-Gens auftreten und durch Basenpaar-

austausche charakterisiert sind. Das APP-Gen ist auf dem Chromosom 21q21 lokalisiert (OMIM 104760) und codiert für drei Spleißvarianten des APP-Proteins von jeweils ungefähr 700 Aminosäuren. In diesem Zusammenhang soll auch darauf hingewiesen werden, dass schon seit der Mitte des 20. Jahrhunderts bekannt war, dass Patienten mit Down-Syndrom (Trisomie 21; Kapitel 12.2.1) unabwendbar die klassischen neuropathologischen Befunde der Alzheimer’schen Erkrankung entwickeln, sodass schon damals das Chromosom 21 als ein Kandidat für die genetische Lokalisation dieser Erkrankung diskutiert wurde. Heute wird das Auftreten der Alzheimer’schen Erkrankung bei Patienten mit Down-Syndrom über einen „Gendosis-Effekt“ erklärt. Ein weiterer Durchbruch gelang mit den Charakterisierungen von Mutationen in den Presenilin-Genen PSEN1 und PSEN2 auf den Chromosomen 14q24 (OMIM 104311) und 1q31 (OMIM 600759). Mutationen in diesen Genen, die für Membranproteine mit mehreren Transmembrandomänen codieren, sind für etwa 90 % der Fälle der früh einsetzenden AlzheimerErkrankungen verantwortlich. Die Preseniline interagieren mit verschiedenen Proteinen und Enzymen, die an der Membran assoziiert sind. Dazu gehören vor allem Proteasen, die unterschiedliche Schnittstellen im APP-Protein haben und als α-, β- oder γ-Sekretase bezeichnet werden. Da die Preseniline Bestandteil des γ-Sekretase-Komplexes sind, beeinflussen Mutationen im PSEN1-Gen die γ-Sekretase-Aktivität, sodass APP nicht mehr richtig prozessiert werden kann und das Amyloidβ42-Protein (Aβ42) gegenüber dem Amyloidβ40Protein (Aβ40) überrepräsentiert ist – eine der biochemischen Charakteristika der Alzheimer’schen Erkrankung. Aufgrund der höheren Hydrophobizität des Aβ42-Peptids kommt es damit schneller zur Bildung der amyloiden Fibrillen. Einen Überblick über die normale Spaltung von APP, die Lage der verschiedenen Schnittstellen und die Entstehung unterschiedlicher Spaltprodukte gibt Abb. 13.43. Wenn wir nun die oben erwähnte, auffällige Konzentration der Mutationen in den Exons 16 und 17 des APP-Gens genauer betrachten, so stellen wir fest, dass sie die Schnittstellen der β- oder γ-Sekretase entweder genau treffen oder zumindest dicht in der Nähe liegen. So führt eine Doppelmutation, die die β-SekretaseSchnittstelle des APP-Proteins betrifft, zu einer effizienteren Spaltung, sodass die beiden kleinen Fragmente Aβ40 und Aβ42 verstärkt gebildet werden. Andere Mutationen, die das C-terminale Ende des APP-Proteins betreffen, erhöhen das Verhältnis von Aβ42:Aβ40. Eine Übersicht über die biochemischen Konsequenzen einiger bekannter Mutationen im APP-Gen zeigt Abb. 13.44.

13.4 Neurodegenerative und neurologische Erkrankungen

Abb. 13.43 a, b Generierung des β-Amyloid-Proteins durch normale proteolytische Spaltung des β-AmyloidVorläuferproteins. a Spaltung des β-Amyloid-Vorläuferproteins (APP) durch spezifische Spaltung durch β-Sekretase (BACE). Das APP (links) wird zuerst durch BACE geschnitten, und die große extrazelluläre Domäne wird sezerniert. Der in der Membran verbleibende Stummel (CTFβ: carboxyterminales Fragment) bindet an die Oberfläche des β-Sekretase-Komplexes und wird dann an das aktive Zentrum der Transmembrandomänen 6 und 7 von Presenilin-1 (PS1) oder 2 (PS2) transportiert. PS1 und PS2 werden vermutlich durch autoproteolytische Spaltungen aktiviert, die ihre N- und C-terminalen Fragmente generieren (NTF und CTF). Beide Fragmente bilden den γ-SekretaseKomplex zusammen mit drei weiteren Proteinen: APH1a (oder APH1b; homolog zu den C. elegans-Proteinen anterior pharynx defective), PEN2 (Presenilin-Verstärker-2; engl. presenilin enhancer; Achtung: Hier handelt es sich um keinen „Enhancer“ der Transkriptionsaktivierung, sondern um ein Protein, das die Wirkung der Preseniline verstärkt) und Nicastrin (NCT; ein Transmembran-Glykoprotein). Alle vier Proteine bilden das Herzstück des Komplexes, der für die γ-Sekretase-Aktivität

benötigt wird (gestrichelte Linie). Die beiden Aspartat-Reste in den Membrandomänen 6 und 7 (D) der beiden Presenilin-Fragmente NTF und CTF sind die entscheidenden Bestandteile des ungewöhnlichen katalytischen Zentrums dieser Protease. Die Spaltung durch die γ-Sekretase geschieht innerhalb der Membran und setzt das Amyloid-β-Protein (Aβ) und die intrazelluläre Domäne des APP (AICD) frei. b Verschiedene vermutliche Schnittstellen der γ-Sekretase in der Membran. Es ist die Aminosäure-Sequenz in der Umgebung der Schnittstelle des APP gezeigt (die Zahlen entsprechen der Sequenz des Aβ; die dunkel hinterlegten Aminosäuren befinden sich in der Membran). Die γ-Sekretase schneidet ihr Substrat mehrere Male; die verschiedenen Schnittstellen sind als ε, ζ, und γ bezeichnet (vom C- zum N-Terminus). Dabei ist die γ-Schnittstelle variabel und kann mindestens nach den Aminosäuren 38, 40 und 42 auftreten. Diese Spaltung ist besonders bedeutsam für die folgende Aggregationsneigung von Aβ: Manche Arzneimittel, die die γ-Sekretase beeinflussen, verschieben die Spaltung von Aβ42 zur Aminosäure 38, und das resultierende Peptid aggregiert in weitaus geringerem Ausmaß. (Nach Haass u. Selkoe 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Weiter gehende biochemische Untersuchungen der amyloiden Ablagerungen zeigten, dass das Apolipoprotein E (ApoE) an das β-amyloide Protein gebunden ist. ApoE ist das wichtigste Apolipoprotein im Gehirn (LDL und ApoB werden im Gehirn nicht exprimiert); es ist an der Neuverteilung der Lipide und des Cholesterols beteiligt. Genetische Untersuchungen machten dann deutlich, dass insbesondere die Allelvariante E4 zum Ausbruch der Alzheimer’schen Erkrankung prädisponiert. ApoE ist ein polymorphes Protein mit 299 Aminosäuren. Das Gen auf dem Chromosom 19q13 (OMIM 107741) codiert für drei Hauptallele: APOE2 (Frequenz in der Bevölkerung 5‒10 %), APOE3 (Frequenz in der Bevölkerung 60‒70 %) und APOE4 (Fre-

quenz in der Bevölkerung 15‒20 %). Die verschiedenen Proteine unterscheiden sich nur in den Aminosäuren 112 und 158: ApoE3 hat an der Position 112 ein Cystein und an 158 ein Arginin, wohingegen ApoE4 ein Arginin an beiden Positionen hat und ApoE2 ein Cystein an beiden Positionen. Das Cys-158 in ApoE2 führt zu einer verminderten Bindung an den Rezeptor und einer Hyperlipoproteinämie. Das Arg-112 in ApoE4 führt dagegen zu einer starken Wechselwirkung mit dem C-terminalen Ende des Proteins und damit zu einer kompakten Struktur. Außerdem bilden sich stabile, reaktive Intermediate mit potenziell pathologischen Aktivitäten.

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Abb. 13.44 Es ist die proteolytische Spaltung des β-AmyloidVorläuferproteins (APP) in der Wildtyp-Situation (links) und in den veränderten Formen des APP (Mitte und rechts) dargestellt. Die ausgetauschten Aminosäuren (gelbe Balken) interferieren dabei mit der Spaltung durch die α-Sekretase oder erhöhen die

Spaltung durch die β- oder γ-Sekretase, was zur (verstärkten) Bildung des toxischen Aβ42-Proteins führt. Die Stärke der Pfeile entspricht der relativen Menge der gebildeten Proteine. (Nach Nussbaum u. Ellis 2003, mit freundlicher Genehmigung der Massachusetts Medical Society)

Neurone bilden ApoE als Antwort auf Stressoren (wie z. B. oxidativen Stress, siehe unten) oder Verletzungen, aber nur die ApoE4-Form wird dabei proteolytisch abgebaut; die sich bildenden bioaktiven toxischen Fragmente gelangen ins Cytosol, verändern das Cytoskelett, stören die Energiebalance der Mitochondrien und bewirken schließlich den Tod der Zelle. ApoE4 stimuliert auch die Synthese und Ablagerung von Aβ und/oder hemmt dessen Beseitigung. 40 bis 80 % der Alzheimer-Patienten besitzen mindestens ein ApoE4-Allel; epidemiologische Studien unter Alzheimer-Patienten zeigen eine starke Assoziation zwischen Spätformen der Alzheimer’schen Erkrankung und dem ApoE4-Allel; das hat auch zur Bezeichnung „Alzheimer-2“ oder „ApoE4-assoziierte Alzheimer-Erkrankung“ geführt (OMIM 104310). Aufgrund des vielfäl-

tigen Eingriffs in den Lipid-Stoffwechsel der Neuronen (Abb. 13.45) ist es allerdings nicht verwunderlich, dass das ApoE4-Allel auch bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen eine wichtige Rolle spielt (z. B. Parkinson; Kapitel 13.4.5). Eine zusammenfassende Darstellung der verschiedenen Mechanismen, die an der Entstehung der Alzheimer’schen Erkrankung beteiligt sind, zeigt Abb. 13.46. Aufgrund der Sequenzierung ganzer Genome verschiedener Modellorganismen einschließlich Drosophila und Caenorhabditis elegans wurden auch in diesen Spezies Gene gefunden, die den „AlzheimerGenen“ des Menschen entsprechen – einschließlich ihrer mutierten Allele. So codieren die Genome von Drosophila und C. elegans jeweils ein Gen, das mit dem menschlichen APP verwandt ist (C. elegans:

13.4 Neurodegenerative und neurologische Erkrankungen

Abb. 13.45 Die Rolle von ApoE in der Lipid-Verteilung zwischen den Zellen des Gehirns und Unterschiede in der Neuropathologie zwischen den ApoE-Isoformen. ApoE wird von Astrocyten, aktivierter Mikroglia und Neuronen synthetisiert. Es gibt drei schädliche Funktionen von ApoE: (1) erhöhte AβProduktion; (2) Verstärkung der Aβ42-induzierten lysosomalen

Undichtigkeit und Apoptose; (3) verstärkte Neuronen-spezifische Proteolyse, die zur Translokation von neurotoxischen ApoE4-Fragmenten ins Cytosol führt und dort zur Zersetzung des Cytoskeletts und Fehlfunktion der Mitochondrien beiträgt. (Nach Mahley et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nationalen Akademie der Wissenschaften, USA)

apl-1; Drosophila: Appl). Ähnlich wie bei Menschen sind die invertebraten Mitglieder der APP-Familie Transmembranproteine, die mit einer Domäne in der Membran verankert sind und deren lange C-terminale Domäne sich im Cytoplasma befindet. Die kürzere N-terminale Domäne reicht in den intrazellulären Bereich, und durch Proteasen werden Fragmente in den intrazellulären und extrazellulären Bereich freigesetzt. Da die APP-ähnlichen Proteine der Invertebraten kein cytotoxisches Fragment wie Amyloidβ42 enthalten, können sie nicht direkt als Modell für die Alzheimer’sche Erkrankung verwendet werden. Dennoch kann die Analyse des neuronal exprimierten Appl-Gens in Fliegen dazu dienen, die zugrunde liegenden Mechanismen besser zu verstehen. Drosophila-Mutanten, denen das Appl-Gen fehlt, zeigen Verhaltensänderungen gegenüber Schock, die durch die transgene Expression des humanen APP-Gens wieder normalisiert werden können. DrosophilaAppl-Mutanten zeigen außerdem Defekte, die offensichtlich auf der Störung des axonalen Transports beruhen, an dem das Appl-Protein beteiligt ist. Auch für das oben erwähnte Tau-Protein, das in den neurofibrillären Knäueln gefunden wurde, gibt es entsprechende Drosophila-Gene.

Sowohl C. elegans als auch Drosophila codieren außerdem Homologe zu Presenilin, die dazu beitragen, dass Mitglieder der LIN-12/Notch-Transmembranrezeptorfamilie proteolytisch gespalten und so Informationen der Zell-Zell-Kommunikation weitergeben können. Umgekehrt können die invertebraten Preseniline die Amyloidβ42-Herstellung in Säugerzellen beeinflussen. Ähnliches gilt auch für das C. elegans-Gen sel-12, dessen Funktion durch Säuger-Preseniline komplementiert werden kann. Und weiterhin konnten durch genaue Analyse der beteiligten Proteine in Drosophila neue Kandidaten für die humane Alzheimer’sche Erkrankung identifiziert werden. Die Weiterbearbeitung durch α- und γ-Sekretasen ist ebenso für das Signalprotein Notch notwendig (Kapitel 11.3.1 und 11.5.6). Die dadurch aus der Membran herausgelöste intrazelluläre Domäne von Notch (engl. Notch intracellular domain; NICD) gelangt zum Zellkern und reguliert dort die Expression seiner Zielgene. In einem Prozess, der der APP-Weiterverarbeitung entspricht, wird das verbleibende, in der Membran verankerte Protein nachfolgend innerhalb der Membran durch γ-Sekretasen geschnitten.

741

742 742

Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Unter den üblichen Modellsystemen ist die Maus normalerweise dem Menschen am ähnlichsten. Allerdings entwickelt sie spontan keine Neuropathie, die der Alzheimer’schen Erkrankung vergleichbar ist. Durch die Konstruktion von transgenen und Knock-outMäusen konnten jedoch interessante Modelle in der Maus hergestellt werden, die dieselben neuropathologischen Charakteristika aufweisen wie betroffene Patienten. Amyloide Ablagerungen waren – je nach der Art des Transgens – nach 3 bis 13 Monaten zu sehen. Die Untersuchungen dieser Mausmodelle ergaben dann auch noch einen weiteren wichtigen Mechanismus, nämlich die Beteiligung des APP an der Aufrechterhaltung der Cu2+-Homeostase im Körper. Offensichtlich besteht eine inverse Beziehung zwischen den Cu2+-Spiegeln und den amyloiden Ablagerungen. Dies ist insofern nicht weiter verwunderlich, da Aβ ein Metalloprotein ist und eine hohe Bindungsaffinität für Cu2+-, Zn2+- und Fe3+-Ionen besitzt. Außerdem verfügt Aβ über ein starkes Reduktionspotenzial und reduziert Cu2+ und Fe3+ schnell zu Cu+

Abb. 13.46 Wichtige Pathogenese-Faktoren der Alzheimer’schen Erkrankung. Die Analyse der erblichen Formen der Alzheimer’schen Erkrankung mit Mutationen in APP- und PS-Genen basiert auf etwa 400 Familien weltweit, verglichen

und Fe2+. Der dabei entstehende molekulare Sauerstoff wird eingefangen und generiert freie Radikale und Peroxide, wobei die Aβ42-Proteine die höchste Aktivität zeigen. Eine entscheidende Rolle spielt dabei das Methionin an Position 35: Wird es durch Norleucin ersetzt, verschwindet auch die Redox-Aktivität und die neurotoxische Aktivität (Smith et al. 2007).

Die Alzheimer’sche Erkrankung ist eine progressive Neurodegeneration, die über Defizite im Kurzzeitgedächtnis schließlich zu Demenz führt. Neuropathologisch zeichnet sie sich durch amyloide Ablagerungen und neurofibrilläre Knäuel im Gehirn ab. Die amyloiden Ablagerungen enthalten in hoher Konzentration das Fragment Aβ42 des amyloiden Vorläuferproteins APP. Einige bekannte Ursachen dafür sind Mutationen im APP-Gen oder in den Presenilin-codierenden Genen PSEN1 bzw. PSEN2, die mit Proteasen in Wechselwirkung treten, die APP prozessieren.

mit den Millionen Patienten mit „sporadischen“ Formen, bei denen etwa 20 bis 40 % genetische Faktoren eine Rolle spielen. (Nach Jellinger 2006, mit freundlicher Genehmigung von Springer)

13.4 Neurodegenerative und neurologische Erkrankungen

13.4.5 Die Parkinson’sche Erkrankung Die Parkinson’sche Erkrankung (OMIM 168600; benannt nach ihrem Entdecker James Parkinson 1817) ist nach der Alzheimer’schen Krankheit die zweithäufigste progressive neurodegenerative Erkrankung und betrifft etwa 1 bis 2 % der über 50-jährigen Bevölkerung und über 4 % der über 85-Jährigen. Sie zeichnet sich durch eine Degeneration der dopaminergen Neuronen (Abb. 13.19) aus und betrifft überwiegend die Substantia nigra. Das klinische Charakteristikum ist eine Trias aus Zittern, Gesichtsstarre und einer Verlangsamung der Bewegungen. Neuropathologische Befunde zeigen charakteristische cytoplasmatische Einschlüsse (Lewy-Körperchen) in den Neuronen der Substantia nigra, die überwiegend durch Fibrillen aus α-Synuclein (Gensymbol: SNCA) und Ubiquitin angefüllt sind (Abb. 13.47). Bis vor wenigen Jahren galt die Parkinson’sche Erkrankung als der Archetyp einer nicht genetischen Erkrankung; unter den umweltbedingten Faktoren werden Pestizide besonders intensiv diskutiert. Aller-

Abb. 13.47 a–f. Immunhistochemische Analyse der Lewy-Körperchen. Lewy-Körperchen sind mit Antikörpern gegen Ubiquitin (a, grün) bzw. α-Synuclein (b, rot) angefärbt; die Überlagerung der beiden Aufnahmen (c) zeigt, dass die Ringe um die LewyKörperchen im Zentrum überwiegend ubiquitinierte Proteine enthalten, wohingegen die Peripherie überwiegend α-Synuclein

dings hat die Genetik inzwischen mehrere Gene identifiziert, deren Mutationen für den Ausbruch der Erkrankung verantwortlich sind. Die Charakterisierung verschiedener Gene und Kandidatenregionen erklärt auch in gewisser Weise die klinische Heterogenität der Erkrankung, insbesondere in Bezug auf den Zeitpunkt des Beginns der Erkrankung als auch in Bezug auf die Geschwindigkeit ihres Fortschreitens. Eine Übersicht über die genetische Heterogenität der Parkinson’schen Erkrankung vermittelt Tabelle 13.6. Die erste genetische Kopplung der Parkinson’schen Erkrankung wurde von Polymeropoulos und Mitarbeitern 1996 für das Chromosom 4q berichtet und zunächst als PARK1 bezeichnet, eine dominante Form der Parkinson’schen Erkrankung. Diese Region enthält das oben schon erwähnte Gen SNCA, das für α-Synuclein codiert. In den beiden Folgejahren wurden dann die ersten beiden Mutationen als Punktmutationen im SNCA-Gen molekular charakterisiert (A53T und A30P). Es gibt außerdem Hinweise, dass Mutationen im Promotor des

enthält (Vergrößerung 3000fach). Die unteren Bilder (d–f) zeigen Neurone aus der Substantia nigra eines Parkinson-Patienten, in dem die Neuriten aufgebläht erscheinen und mit Antikörpern gegen α-Synuclein (hier schwarz) angefärbt werden können; der weiße Balken entspricht 10 μm. (Nach Nussbaum u. Ellis 2003, mit freundlicher Genehmigung der Massachusetts Medical Society)

743

744 744

Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik Tabelle 13.6 Genetische Heterogenität der Parkinson’schen Erkrankung Bezeichnung

OMIM

Art der Vererbung

Chromosom

Gen

PARK1

168601

dominant

4q21

SNCA

PARK2

600116

rezessiv

6q25

PARKIN

PARK3

602404

dominant

2p13

SPR?

PARK4

163890

dominant

4q21

SNCA

PARK5

191342

dominant

4p14

UCHL1

PARK6

605909

rezessiv

1p36

PINK1

PARK7

606324

rezessiv

1p36

DJ1

PARK8

607060

dominant

12q12

Dardarin (LRRK2)

PARK9

606693

rezessiv

1p36

ATP13A2

PARK10

606852

dominant

1p32

USP24?

PARK11

607688

dominant

2q37

GIGYF2?

PARK12

300557

modifizierend

Xq21

?

PARK13

610297

dominant

2p12

HTRA2

?

18q11

?

PARK14 PARK15

260300

rezessiv

22q12

FBOX7

PARK16

613164

?

1q32

?

Nach OMIM 168600 (April 2010)

SNCA-Gens, die eine Erhöhung seiner Genexpression bewirken, ebenfalls für die Parkinson’sche Erkrankung verantwortlich sind. In diesem Zusammenhang soll ein transgenes Mausmodell vorgestellt werden, das die humane A53T-αSynuclein-Mutation trägt. Wenn in Neuronen des Zentralnervensystems nur die mutierte Form exprimiert wird, entwickeln die Mäuse schwere und komplexe motorische Störungen, die zu Paralyse und Tod führen. Altersabhängig und parallel mit dem Einsetzen der Erkrankung entwickeln diese Mäuse außerdem Einschlusskörperchen von α-Synuclein im Cytoplasma von Neuronen, die Fibrillen bilden, wie wir sie von der Situation bei Patienten kennen. Diese Mausmutanten zeigen, dass die A53T-Mutation im α-Synuclein-Gen zur Bildung „toxischer“ Filamente führt, die eine neuronale Degeneration verursacht. PARK2, der zweite Genort, der für die Parkinson’sche Erkrankung verantwortlich ist, befindet sich auf dem Chromosom 6q. Dieser Genort enthält das ParkinGen, dessen Mutationen zu juvenilen, rezessiven Formen des Parkinsonismus führen. Die Beziehung zwi-

schen den Mutationen im Parkin-Gen und Parkinsonismus sind allerdings etwas komplexer: Der ParkinPromotor enthält funktionelle Varianten (ähnlich dem des SNCA-Gens): Diejenigen Menschen, deren ParkinPromotor zu einer verminderten Transkriptionsaktivität führt, tragen ein erhöhtes Risiko, an Parkinsonismus zu erkranken. Parkin selbst ist ein großes Gen (> 1 Mb) und enthält 12 Exons, die in ein 52-kDaProtein translatiert werden. In Patienten mit rezessivem, juvenilem Parkinsonismus wurden große Deletionen gefunden; viele Patienten sind entweder hemizygot oder repräsentieren Null-Mutationen und damit klassische Funktionsverlust-Mutationen. Andererseits gibt es auch eine Reihe von Punktmutationen, die zu Aminosäureaustauschen und dominanten Krankheitsbildern führen – sie werden als „dominant negative“ Formen angesehen. Wir haben es hier also mit einer Allelserie zu tun, die zu unterschiedlichen Schweregraden der Erkrankung führen kann (ähnliches haben wir ja auch bereits bei anderen Krankheitsbildern gesehen, z. B. der Hämophilie; Kapitel 12.3.3). Die biochemische Charakterisierung des ParkinGenproduktes als eine Ubiquitin-Ligase verbindet

13.4 Neurodegenerative und neurologische Erkrankungen

PARK2 funktionell mit PARK5, die mit einer Mutation im Gen der carboxyterminalen Ubiquitin-Hydrolase L1 (Gensymbol: UCHL1; Chromosom 4p14) assoziiert ist. Offensichtlich ist also eine Störung der ProteasomFunktion für die Akkumulation toxischer Proteine in bestimmten Gehirnregionen (hier die Substantia nigra) von entscheidender Bedeutung. Eine weitere rezessive, früh einsetzende Form des Parkinsonismus (PARK7) ist auf dem Chromosom 1p36 lokalisiert und mit Mutationen im Gen DJ1 verbunden, das ursprünglich als Onkogen charakterisiert wurde. Die genetischen Defekte, die mit den familiären Formen der Parkinson’schen Erkrankung verbunden sind, erlauben uns, einige Aspekte der biochemischen Zusammenhänge zu verstehen, die zum Absterben der Neurone führen. Eine detaillierte Übersicht bietet Abb. 13.48; die beiden wichtigsten Aspekte sind hier zusammengefasst: ï SNCA-Mutationen führen zu einer Anhäufung toxischer Proteine mit pleiotropen Effekten, die auch die Hemmung der Proteasom-Funktion und die Permeabilisierung von Vesikeln einschließen. Dabei sind offensichtlich zwei Mechanismen betroffen: einmal die Entleerung der ATP-Vorräte, die die Fehlfunktion der Proteasomen verstärken, und zum anderen die Freisetzung von Dopamin in das Cytosol, womit weitere Oligomerisierungen gefördert werden. ï Parkin-Mutationen vermindern die Fähigkeit der Neuronen der Substantia nigra, zellulärem Stress zu widerstehen, vermutlich bedingt durch den Verlust der Parkin-Funktion als Protein-Ubiquitin-Ligase. Damit ist die Bildung der fibrillären α-SynucleinEinschlüsse nicht das hauptsächliche pathogene Ereignis, obwohl die Bildung dieser Lewy-Körperchen im Verlauf der Krankheit erfolgt. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Beobachtung von post-mortem-Veränderungen in der Substantia nigra, die als Anzeichen eines oxidativen Stresses gedeutet werden können, wie die Erhöhung der Konzentrationen von Eisen, Ferritin und Stickoxid (NO) sowie Markern allgemeiner oxidativer Schäden an Proteinen, Lipiden und DNA (so liegt z. B. das α-Synuclein in den Lewy-Körperchen in nitrierter Form vor). Umgekehrt sind die Konzentrationen der Marker eines Oxidationsschutzes vermindert (z. B. reduziertes Glutathion, der mitochondriale Komplex I, Calbindin oder Transferrin). Offensichtlich wird so der Apoptose-Weg initiiert. Im Gegensatz zur Alzheimer’schen Erkrankung gibt es spontane Mausmutanten, die Symptome aufweisen, die mit Parkinsonismus vergleichbar sind. Das ist einmal die weaver-Maus, deren Mutation ein Gen betrifft, das für einen Kaliumkanal codiert (Gensym-

bol: Kcnj6). Weaver-Mäuse zeigen in der Substantia nigra einen deutlichen Verlust von Dopamin-D2-Rezeptoren, weniger Dendriten und Synapsen sowie degenerative Veränderungen. Dadurch wird die funktionelle Wirksamkeit der Basalganglien beeinflusst und später treten Parkinson-ähnliche Symptome in diesen Mutanten auf (Xu et al. 1999). Die zweite Mutante wird als gad-Maus bezeichnet (engl. gracile axonal dystrophy) und zeigt in frühen Stadien eine sensorische Ataxie, der in späteren Stadien eine motorische Ataxie folgt. Pathologische Charakteristika sind axonale Degenerationen und sphärische Körperchen an den Nervenendigungen. Biochemische Untersuchungen zeigten eine retrograd-progressive Anhäufung ubiquitinierter Proteinkonjugate und von β-Amyloid-Proteinen entlang den sensorischen und motorischen Nervenbahnen. Ursache dafür ist eine Deletion im Gen, das für die carboxyterminale Ubiquitin-Hydrolase L1 codiert (Gensymbol: Uchl1) – wir haben oben gesehen, dass Mutationen im homologen Gen des Menschen für Parkinsonismus verantwortlich sind. Eine dritte spontane Mausmutante ist die aphakia-Maus, die zwei Deletionen im Pitx3-Promotor aufweist, sodass dieser Transkriptionsfaktor nicht exprimiert wird. Die Mutante wurde zunächst wegen ihrer massiven Entwicklungsstörung am Auge identifiziert (aphak: ohne Linse); weitere Untersuchungen zeigten, dass sie auch keine dopaminergen Neuronen im Striatum bildet, weil Pitx3 auch die Tyrosin-HydroxylaseExpression beeinflusst; heute ist die aphakia-Maus ein etabliertes Parkinson-Modell. Viele weitere Mausmodelle beruhen auf dem gezielten Ausschalten der Gene, die für die Parkinson-Erkrankung im Menschen diskutiert werden (Tabelle 13.6). Eine detaillierte Übersicht würde den Rahmen dieses Buches sprengen, sodass hier nur auf entsprechende Review-Artikel (und die dort zitierte Literatur) verwiesen werden kann (z. B. Hardy et al. 2006).

Die Parkinson’sche Erkrankung ist eine progressive, neurodegenerative Erkrankung mit unterschiedlichen Verlaufsformen. Aus genetischen Untersuchungen ist bekannt, dass Mutationen in mehreren Genen die Krankheit verursachen, z. B. im SNCA-, Parkin-, UCHL1-, PINK1-, LRRK2-, und DJ1-Gen. Eine Beteiligung von Umweltfaktoren (z. B. Pestizide) wird diskutiert. Parkinsonismus kann durch Dopamin-Agonisten behandelt werden.

Eine besondere Form der Parkinson’schen Erkrankung ist auf dem Chromosom 17 lokalisiert, nämlich die erbliche frontotemporale Demenz mit Parkinsonismus (FTDP-17). Es handelt sich hierbei um eine sehr variable Erkrankung, wobei

745

Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Dardarin (LRRK2)

Kinase-Aktivität + ? selten

häufig, viele Mutationen

Tau

DJ-1

?

PINK1

Parkin

viele Funktionsverlust-Mutationen

746 746

Fibrilläre Knäuel

α-Synuclein I2020T und andere

A30P, E46K, A53T Multiplikationen Proteinaggregation

„antioxidativ” ? LewyKörper + Neuriten

Zell-Verlust

Kinase-Aktivität

E3-Ligase-Funktion Substantia nigra = Parkinsonismus

Abb. 13.48 Zusammenhang zwischen den verschiedenen Parkinson-Genen. Es gibt fünf klar definierte genetische Ursachen der Parkinson’schen Erkrankung. Das Diagramm ist farbcodiert mit dominanten Genen in Rot, rezessiven Genen in Grün, und Proteinfunktionen in Blau; die pathologischen Ergebnisse des Zell-Verlustes und der Bildung von Lewy-Körpern ist schwarz. Alle Mutationen in LRRK2 (Dardarin) führen zu Verlust von Neuronen; es erscheint wahrscheinlich, dass dafür die KinaseAktivität (und eine mögliche weitere Aktivität des Proteins) verantwortlich ist. In vielen Fällen findet man Einschlusskörper mit α-Synuclein. Mutationen in dem α-Synuclein-codierenden Gen

Cortex = Demenz

führen ebenfalls zum Zell-Verlust und sind immer mit Proteinablagerungen in Lewy-Körpern verbunden. Zell-Verlust und Bildung von Lewy-Körpern kann in verschiedenen Regionen des Gehirns vorkommen: in der Substantia nigra führt er in erster Linie zur Parkinson’schen Erkrankung und im Cortex zu Demenz. Auf der linken Seite sind drei rezessive Gene dargestellt, von denen bekannt ist, dass sie an der Entstehung der Parkinson’schen Erkrankung beteiligt sind. Die Beziehung der entsprechenden Proteine untereinander ist noch nicht vollständig verstanden; es sind einige Möglichkeiten angedeutet. (Nach Hardy et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

Abb. 13.49 a, b TAU-Mutationen bei Frontotemporaler Demenz mit Parkinsonismus. a Es sind sechs Isoformen von TAU dargestellt (Aminosäuren 352–441), die im adulten menschlichen Gehirn vorkommen. Mutationen im codierenden Bereich sind angegeben, wobei sich die Nummerierung auf die 441-Aminosäure-Form bezieht. Es sind 20 Mutationen mit Aminosäure-Austauschen gezeigt sowie zwei Deletionen und drei stille Mutationen. Die sechs TAU-Isoformen entstehen durch alternatives Spleißen eines einzigen Gens. Sie unterscheiden sich in der An- oder Abwesenheit von drei Einschüben (rot: Exon 2; grün: Exon 3; gelb: Exon 10). b Die Schlaufenstruktur der Vorläufer-mRNA am Übergang zwischen Exon 10 und Intron 10 ist dargestellt. Neun Mutationen sind gezeigt, davon sind zwei (S305N und S305S) im Exon 10 lokalisiert. Die Sequenzen des Exons befinden sich in Großbuchstaben innerhalb des Kästchens; die Basen des Introns sind in kleinen Buchstaben angegeben. (Nach Goedert u. Jakes 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

13.4 Neurodegenerative und neurologische Erkrankungen

der Schwerpunkt einmal eher auf der Demenz oder eher auf der Parkinson’schen Form liegen kann. Als genetische Ursache wurden Mutationen im TAU-Gen identifiziert, und in Abhängigkeit von der Lokalisation der Mutation im Gen werden die entsprechenden Ablagerungen in Nervenzellen und/oder Gliazellen gefunden, da die sechs verschiedenen Spleißformen gewebespezifisch gebildet werden. Die verschiedenen Isoformen der Tau-Proteine unterscheiden sich im Wesentlichen in der Zahl der Wiederholungseinheiten, die für die Bindung an die Mikrotubuli verantwortlich

sind (3 oder 4); das richtige Verhältnis dieser beiden Grundformen ist notwendig, um Neurodegeneration und Demenz zu vermeiden. Die Mutationen in den beiden Introns um Exon 10 sowie die meisten Mutationen im Exon 10 selbst verändern jedoch das Spleißen, damit auch das relative Verhältnis der Proteine mit drei und vier Wiederholungseinheiten und führen deshalb zur verstärkten Bildung von filamentösen Tau-Ablagerungen. Die sechs verschiedenen Spleißvarianten von TAU und eine Übersicht über einige wichtige Mutationen sind in Abb. 13.49 dargestellt.

Kernaussagen ï Verhaltensweisen sind komplex und damit experimentell schwieriger zu analysieren als monogene Phänotypen. Sie gehorchen aber prinzipiell den gleichen Gesetzen wie andere komplexe Phänotypen. ï Mikroevolutive Prozesse können zu schnellen Verhaltensänderungen ganzer Populationen führen. ï Zirkadiane Rhythmen werden bei Drosophila, der Maus und dem Menschen durch autoregulatorische Rückkopplungschleifen gesteuert. Daran sind Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen und Repressoren von Transkriptionsfaktoren essenziell beteiligt. ï Gedächtnisleistungen lassen sich auf cAMP-abhängige Signaltransduktionskaskaden zurückführen, die über Transkriptionsfaktoren spezifische, an den Speichervorgängen beteiligte Gene aktivieren. ï Angststörungen und Depressionen ist gemeinsam, dass sie sich mit Medikamenten behandeln lassen, die mit der Funktion des Neurotransmitters Serotonin zusammenhängen. Ursachen sind unter anderem Mutationen in Genen, die für Rezeptoren bzw. Transporter des Serotonins und des Corticotropin-freisetzenden Hormons codieren. ï Alkoholismus ist eine komplexe Erkrankung mit hoher Prävalenz. Genetische Untersuchungen an Modellorganismen und dem Menschen zeigen, dass Alkoholbevorzugung im Wesentlichen auf Mutationen zurückzuführen ist, die die cAMP-Signalkette beeinflussen, während die Alkoholabhängigkeit mit genetischen Veränderungen der dopaminergen und GABAergen Signaltransduktion assoziiert ist. ï Schizophrenie ist eine psychische Erkrankung, die durch Halluzinationen, Wahnvorstellungen, Störungen in der sozialen Interaktion und durch kognitive Störungen gekennzeichnet ist. Kopplungsanalysen bei Familien von Patienten sowie Untersuchungen an Mausmodellen deuten darauf hin, dass Mutationen in den Genen für DISC1, Neuregulin-1 und die Catechol-O-Methyltransferase ein erhöhtes Risiko darstellen, an Schizophrenie zu erkranken; Umweltfaktoren haben einen modulierenden Einfluss.

ï Das Rett-Syndrom ist eine X-gekoppelte, dominante, schwere neurodegenerative Erkrankung. Ursache sind überwiegend spontane Mutationen im MeCP2Gen, das für ein Methyl-CpG-bindendes Protein codiert. Das entsprechende Protein findet sich im Zellkern und hat vermutlich wichtige Funktionen in der Hemmung der Transkription sowie beim Spleißen. ï Epilepsie ist eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen und durch spontan auftretende Krampfanfälle gekennzeichnet. Mutationen im SCN1A-Gen sind die häufigste bisher bekannte genetische Ursache von Epilepsien. Weitere Epilepsie-relevante Gene codieren für Ionenkanäle und sind teilweise zugleich Rezeptoren für Neurotransmitter. ï Autismus ist eine häufige Entwicklungsstörung des Nervensystems, die sich im veränderten sozialen Umgang mit Mitmenschen und in sich stets wiederholenden Handlungen äußert. Autismus betrifft mehr Jungen als Mädchen (3:1). Monogene Formen des Autismus sind durch Mutationen in Genen verursacht, die für synaptische Adhäsionsmoleküle codieren. ï Die Alzheimer’sche Erkrankung ist eine progressive Neurodegeneration, die sich neuropathologisch durch amyloide Ablagerungen und neurofibrilläre Knäuel im Gehirn auszeichnet. Ursachen sind entweder Mutationen im APP-Gen oder in den Presenilincodierenden Genen PS1 bzw. PS2, die bei Drosophila am Notch-Signalweg beteiligt sind. ï Die Parkinson’sche Erkrankung ist eine progressive, neurodegenerative Erkrankung mit unterschiedlichen Verlaufsformen. Aus genetischen Untersuchungen ist bekannt, dass Mutationen in mehreren Genen die Krankheit verursachen. Eine Beteiligung von Umweltfaktoren wird diskutiert.

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Technik-Box 29

In-vivo-Reportergen: das grün-fluoreszierende Protein (GFP) Anwendung: Das grün-fluoreszierende Protein (GFP) wird als Markermolekül verwendet. Das Protein ist von Cofaktoren zur Induktion von Fluoreszenz unabhängig, da es autokatalytisch ein Chromatophor bildet, das in beliebigen Zellen als fluoreszierender Marker dienen kann. Daher wird es als Marker (Reportergen) für Genexpression nach Transformationsexperimenten, als Marker in Zelldifferenzierungsprozessen oder als Marker für die Lokalisation von Proteinen in der Zelle verwendet. Ein Beispiel gibt die Abbildung. Voraussetzungen · Materialien: Durch posttranslationale Modifikation, Zyklisierung und Oxidation eines Tripeptids aus Ser-Tyr-Gly wird das Chromatophor im Inneren des Proteins autokatalytisch gebildet. Diese Reaktion ist temperaturabhängig, und das Protein ist in seiner gefalteten Form sehr stabil. Es hat Anregungswellenlängen von 395 und 475 nm und emittiert grünes Licht bei 509 nm

(Name!). Das Protein stammt von der Qualle Aequorea victoria. In letzter Zeit wurden Varianten von anderen Organismen isoliert, und das ursprüngliche GFP wurde gentechnologisch umgeformt, sodass alternative Emissionswellenlängen bzw. erhöhte Fluoreszenz erzielt werden können (z. B. rote oder gelbe Fluoreszenz). Für die Entdeckung des GFP und die Etablierung seiner Anwendungsmöglichkeiten bekam Roger Tsien im Jahr 2008 den Nobelpreis für Chemie. Methode: GFP kann in unterschiedlicher Weise verwendet werden: • Es kann als Reportergen dienen, um Promotorregionen von Genen auf ihre Funktion und Gewebespezifität zu testen. So lässt sich z. B. ermitteln, zu welchem Zeitpunkt in der Entwicklung ein Gen angeschaltet wird. In gleicher Weise können Enhancer und andere Regulationselemente untersucht werden, indem man das GFP-Gen mit den zu untersuchenden DNA-Sequenzen kombi-

GFP-Expression in der anterioren (obere Reihe) oder posterioren (untere Reihe) Hemisphäre der Linse einer Maus 2 bis 24 Wochen nach Aktivierung des GFP-Reportergens. (Nach

niert und transformiert. Fluoreszenz der transformierten Zellen zeigt die Funktion der Regulationselemente an, da diese nunmehr – statt der ursprünglichen Gene – das GFP-Gen regulieren. • Viele Proteine bleiben funktionsfähig, wenn man den GFP-ORF an das C-terminale Ende eines Proteins anfügt. Auf diese Weise lässt sich die intrazelluläre Lokalisation eines Proteins ermitteln, da sie nun durch das angehängte GFP sichtbar wird. Durch Kontrollen muss sichergestellt werden, dass das GFP die Lokalisation eines anderen Proteins nicht beeinflusst. • Das GFP kann auch als reines Markergen für Transformationen dienen, wenn es z. B. anstelle des white-Gens in einen P-ElementTransformationsvektor (TechnikBox 18) eingefügt wird. Man selektiert dann Fliegen unter dem Fluoreszenz-Stereomikroskop auf grüne Fluoreszenz.

Shi u. Bassnett 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Technik-Box

Technik-Box 30

Mikroarrays und DNA-Chips Anwendung: Mutationsanalyse (SNPAnalyse); Untersuchung der Genexpression. Voraussetzungen: Auftrag von sehr vielen DNA-Proben (Oligonukleotide oder cDNA) auf Trägermaterial (Glas, Nylon); Bildanalyse. Methoden: Auf Trägermaterialien wie Glas oder Nylon wird DNA (10–150 pMol) punktförmig (Radius 50–250 μm) aufgetragen (engl. to spot; Laborslang: „gespottet“; verwendeter Laborroboter: Spotter). Durch diese kleine Auftragsfläche ist es möglich, auf einem Objektträger (Chip) 5000 bis zu mehr als 1 Million Proben unterzubringen. Diese DNA kann für Hybridisierungsexperimente verwendet werden. Chips mit Oligonukleotiden können auch durch direkte Synthese der benötigten Sequenzen auf der Glasmatrix hergestellt werden. Die Synthese erfolgt dabei über ortsspezifische Photoreaktivierung des zuletzt eingebauten Nukleotids unter Verwendung

von Masken, die festlegen, welche Positionen in der Matrix beim nächsten Syntheseschritt aktiviert werden. Die Hybridisierungsproben werden meist mit fluoreszierenden Farbstoffen (z. B. CY5-dUTP oder CY3dUTP) markiert. Die Auswertung erfolgt photometrisch und gestattet die Quantifizierung der Signale. Als Beispiel sind zwei Einsatzbereiche dargestellt: • Mutationsanalyse (Analyse einzelner Basenpaaraustausche; engl. single nucleotide polymorphism, SNP); • Genexpressionsstudien. Die SNP-Analyse (siehe Abbildung) beruht darauf, dass Hybridisierungseigenschaften von Oligonukleotiden anders sind als die längerer Nukleinsäuremoleküle. Unter geeigneten stringenten Hybridisierungsbedingungen (Salzkonzentration, Temperatur) kann nur ein vollständig komplementäres Molekül hybridisieren, wobei insbesondere die Positionen in der Mitte des Moleküls hierfür kritisch sind. Durch geeignete

Serien von Oligonukleotiden lassen sich daher auch längere DNA-Sequenzen testen (Abb. a der SNP-Analyse). – In der routinemäßigen Diagnostik von Erbkrankheiten ist es dagegen wichtig, bestimmte (bereits bekannte) Mutationen festzustellen; die jeweiligen Allele sind durch entsprechende Oligonukleotide auf dem Chip repräsentiert. Abb. b zeigt ein Beispiel für eine heterozygote DNA-Sequenz. Zur Untersuchung quantitativer Unterschiede in der Genexpression verwendet man DNA-Chips, auf denen sich Proben vieler oder aller Gene eines Genoms befinden (siehe Abbildung DNA-Chips). Hybridisiert man diese Chips mit fluoreszenzmarkierter RNA, so lässt sich ermitteln, welche Gene aktiv sind. Bei Verwendung unterschiedlich markierter RNA (z. B. grün und rot) aus verschiedenen Geweben (z. B. Leber vs. Niere; Krebsgewebe vs. gesundes Gewebe; Mutante vs. Wildtyp) lässt sich die Expressionsrate von Genen in beiden Zelltypen direkt vergleichen.

SNP-Analyse. a Auf dem Mikroarray befinden sich untereinander angeordnet kurze Oligonukleotide, die sich in jeweils einer Base unterscheiden. Bei Hybridisierung unter geeigneten Bedingungen mit einem fluoreszenzmarkierten Ziel-Genom kann dieses aufgrund der besonderen Hybridisierungseigenschaften von kurzen Oligonukleotiden nur an das vollständig komplementäre Oligonukleotid binden, im oberen Beispiel also an das T-enthaltende Oligonukleotid. Ordnet man nebeneinander verschiedene Oligonukleotidserien an, die jeweils ein anderes Nukleotid einer bekannten Sequenz betreffen (orange), so lässt sich eine gegebene Sequenz verifizieren. b Auf der gleichen experimentellen Grundlage lassen sich Homozygotien von Heterozygotien unterscheiden

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Kapitel 13: Verhaltens- und Neurogenetik

Technik-Box 30

Mikroarrays und DNA-Chips (Fortsetzung)

Expressionsanalyse mit DNA-Chips. a Überblick über die Schritte bei der Expressionsanalyse durch DNA-Chips. b So sieht ein DNA-Chip aus: Auf einer Glasplatte (5,5 × 1,8 cm) befinden sich 21.168 DNA-Proben. Jeder Auftragspunkt hat einen Durchmesser von ~ 100 μm. Jeweils 21 × 21 Punkte sind in einem Block zusammengefasst; insgesamt befinden sich auf dem Chip 4 × 12 solcher Blöcke. (a nach Beckers 2003; b Foto: Johannes Beckers, Neuherberg)

Kapitel 14

Genetik und Anthropologie Inhaltsverzeichnis 14.1 Genetische Aspekte zur Evolution des Menschen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 752 14.2 Der Mensch und sein Gehirn . . . . . . . . . . . . . . . . 777

In unserer Ahnengalerie befinden sich (oben, von links nach rechts) Homo neanderthalensis, Homo habilis, Paranthropus boisei und Australopithecus afarensis. In der unteren Reihe (von links nach rechts) sind Homo rudolfensis, Australopithecus anamensis, Homo erectus und Australopithecis africanus abgebildet.(Nach Schrenk et al. 2002, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

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Kapitel 14: Genetik und Anthropologie

Überblick Dieses Kapitel ist ein Versuch, sich der Frage nach der conditio humana von der genetischen Seite zu nähern. Der Blick des Genetikers wird dabei notwendigerweise etwas eingeschränkt sein, da er sich im Wesentlichen auf das beschränkt, was seine Thematik ist: die Beobachtung der Veränderung des Erbmaterials in der Zeit, aber auch in verschiedenen geographischen Bereichen und in verschiedenen Spezies. Daraus lassen sich interessante Rückschlüsse ziehen, die anderen Disziplinen so nicht möglich sind – und so kann die Genetik viel dazu beitragen, Licht in die grauen Vorzeiten der Menschwerdung zu bringen und dadurch auch die Rahmenbedingungen zu zeigen, wie wir geworden sind, was wir heute sind. Die vergleichende Untersuchung des mitochondrialen Genoms, aber auch einzelner Bereiche des Genoms der großen Affen mit denen des Menschen machen klar, dass der Schimpanse unser nächster Verwandter ist; die Entwicklungslinien haben sich vor etwa 7 bis 5 Millionen Jahren getrennt. Nachdem nun auch das Genom des Schimpansen sequenziert ist, werden wir sicherlich bald Genaueres über die knapp 3 % der unterschiedlichen DNA-Sequenzen erfahren. Die Aussage, dass die Wiege der Menschheit in Afrika stand, findet sich heute in den meisten Lehrbüchern. Allerdings häufig verknüpft mit der Hypothese, dass nur eine

Die vorangegangenen Kapitel dieses Buches haben uns gezeigt, dass die Genetik als Wissensgebiet ihre gesamte Entwicklung in nur etwas mehr als 100 Jahren durchlaufen hat: Am Ende des 19. Jahrhunderts standen die „Mendel’schen Gesetze“ ‒ entdeckt an Erbsen im Klostergarten von Brünn. Sie markierten den Beginn der modernen Genetik – und am Anfang des 21. Jahrhunderts gelang die Entschlüsselung des menschlichen Genoms als bisheriger Höhepunkt. Die überraschend niedrige Zahl von „nur“ ca. 30.000 Genen bei Säugetieren und Menschen schärft allerdings den Blick auch für andere genetische Mechanismen, die den Komplexitätsgrad der Information erhöhen können. Die starken Übereinstimmungen der genomischen DNASequenzen zwischen den Säugetieren im Allgemeinen, aber auch zwischen dem Menschen und seinen nächsten Verwandten, den Affen, wirft erneut die alte Frage auf, was denn den Menschen zum Menschen macht und ihn von den Affen unterscheidet (Abb. 14.1). Die Genetik kann heute einige neue Aspekte zur Antwort auf die Frage nach dem „Wesen des Menschen“ beisteuern. In diesem Kapitel soll der Versuch gemacht werden, wichtige Ergebnisse der Genetik zur Anthropologie zusammenzutragen ‒ wobei uns aber immer klar sein muss, dass die genetische Sicht auf den Menschen nur ein Ausschnitt aus dem Spektrum verschiedener

relativ kleine Population, die vor ungefähr 100.000 Jahren von dort ausgewandert ist, die Grundlage der modernen Menschen sei und diese alle anderen, vorher in verschiedenen Bereichen der Welt bereits existierenden Menschenformen vollständig verdrängt habe. Die Aussage lässt sich in dieser absoluten Form sicherlich nicht halten, sondern bedarf der Nuancierung, da etliche Genvarianten des modernen Menschen nicht in dieses starre Schema passen. Ähnlich aufregend verläuft zurzeit auch die Diskussion über das Verhältnis des modernen Menschen zum Neandertaler. Hatten die Ausgrabungen darauf hingedeutet, dass die Neandertaler vor knapp 30.000 Jahren in Europa einfach verschwanden, so schien die Genetik auf der Basis der Untersuchungen des Mitochondrien-Genoms diese These zu bestätigen. Allerdings zeigt sich bei genauerer Betrachtung des gesamten Genoms, dass einzelne Bereiche des Genoms der Neandertaler – unterstützt durch positive Selektion – sich bei modernen Menschen wiederfinden. Verändert die Genetik damit unser Menschenbild? Die Würde des Menschen wird an ihrem Anfang und Ende infrage gestellt, und in zentralen Bereichen scheint die Kombination der Polymorphismen die Individualität und Freiheit eines Menschen zu bestimmen. Ist der Mensch mehr als das Ensemble seiner genetischen Bedingungen?

Ansichten sein kann und die der Psychologie, der Soziologie, der Philosophie oder der Theologie nicht ersetzt, aber um interessante Facetten ergänzen kann.

14.1 Genetische Aspekte zur Evolution des Menschen Die Geschichte des Lebens zeigt, dass die Evolution von komplexen Organismen wie Tiere und Pflanzen grundlegende Veränderungen in der Morphologie und das Auftreten neuer Erscheinungsformen beinhaltet. Dennoch sind die evolutionären Veränderungen nicht eine direkte Transformation der erwachsenen Vorgängerformen in die erwachsenen Formen der Nachfahren.

14.1.1 Menschen und Affen In der zoologischen Ordnung gehört der Mensch zu den Primaten. Zu den wichtigsten Unterscheidungsmerkmalen des Menschen von anderen Primaten gehören die Bipedie, das hoch entwickelte Gehirn, veränderte Lebenslaufparameter (z. B. lange Kindheits- und Jugendphase), der Gebrauch und die Herstellung von

14.1 Genetische Aspekte zur Evolution des Menschen

Werkzeug, das Vorkommen entwickelter und stabiler Sozialsysteme und die Sprache. Diese Parameter sind aber im Wesentlichen morphologische oder sozio-biologische und daher einer genetischen Analyse nicht so ohne Weiteres zugänglich. Um von der genetischen Seite her einen Zugang zu bekommen, werden wir uns auf die Parameter konzentrieren, die die Genetik im Fokus ihrer Untersuchungen hat, und das ist die DNA. Die Aufklärung der DNA-Struktur und die Entschlüsselung des menschlichen Erbguts haben es möglich gemacht, die Evolution des Menschen genauer nachzeichnen zu können. Das erste grundlegende Verständnis vom Ursprung des Menschen kommt aus dem Vergleich von DNA-Fragmenten mit denen der großen Affen. Diese Analysen zeigen, dass die afrikanischen Affen, besonders die Schimpansen und Bonobos (Zwergschimpanse, Pan paniscus), aber auch die Gorillas, mit dem Menschen näher verwandt sind als die Orang-Utans in Asien (Abb. 14.2). Obwohl die Schimpansen die nächsten Verwandten des Menschen sind, gibt es chromosomale Regionen, die eine größere Verwandtschaft zwischen Mensch und Gorilla (oder zwischen Gorilla und Schimpansen) zeigen. Vor diesem Hintergrund kann man den Menschen als einen afrikanischen Affen bezeichnen (Pääbo 2003). Auf der Basis dieser Analysen beginnen wir auch zu verstehen, was uns – unter genetischen Gesichtspunkten – vom Affen unterscheidet und welche Gene unterschiedlich sind. Im Durchschnitt unterscheiden sich die humanen DNA-Elemente, die in nur einer Kopie vorliegen, nur zu 1,2 % von denen des Schimpansen (die DNA-Sequenzen der Menschen sind dagegen zu 99,9 % identisch – d. h. die Individualität hat ihre genetische Ursache in 0,1 % der DNA). Es zeichnet sich ab, dass diese Unterschiede unter formalgenetischen Gesichtspunkten eher als quantitative oder komplexe Merkmale zu beschreiben sind, denn als Merkmale, die einem einzigen Gen zugeordnet werden können. Umgekehrt ist es aber auch notwendig, die Entwicklung der Affen besser zu verstehen. Eine Voraussetzung dafür ist jetzt erfüllt, da inzwischen auch das Genom des Schimpansen (Chimpanzee Sequencing and Analysis Consortium 2005) und des Makaken (Rhesus Macaque Genome Sequencing and Analysis Consortium 2007) ermittelt wurde und auch große Abschnitte der Orang-Utan- und Gorilla-Genome bereits sequenziert sind. Patterson und seine Kollegen haben 2006 in einem Bereich von 20 MB die genomischen Sequenzen von Menschen, Schimpansen, Gorillas, Orang-Utans und Makaken verglichen. Sie fanden auch, dass die Unterschiede zwischen Menschen und Schimpansen in verschiedenen Regionen des Genoms beträchtlich variieren, nämlich zwischen 84 % und

Abb. 14.1 Warum bin ich nicht so wie er? (Foto: Knut Finstermeier, Max-Planck-Institut für Molekulare Anthropologie, Leipzig)

Abb. 14.2 Gemeinsamer Stammbaum des Menschen und der großen Affen. Der gemeinsame Stammbaum der Evolution von großen Affen und Menschen zeigt auch den ungefähren Zeitrahmen an, ab wann von einer getrennten Entwicklung der verschiedenen Spezies ausgegangen werden kann. Von links nach rechts: Orang-Utan, Gorilla, Mensch, Bonobo und Schimpanse. (Nach Pääbo 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

147 % (wenn man den durchschnittlichen Unterschied mit 100 % ansetzt). Der Unterschied am X-Chromosom fällt noch einmal um ca. 10 % gegenüber dem erwarteten Durchschnittswert ab (ein geringerer Unterschied ist zu erwarten, da die Kopienzahl der X-Chro-

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754 754

Kapitel 14: Genetik und Anthropologie

mosomen in einer Säugerpopulation geringer ist als die der Autosomen; daher beträgt der Erwartungswert 93 % ‒ der tatsächliche Durchschnittswert des X-Chromosoms liegt aber bei nur 83,5 % Unterschied und ist in manchen Bereichen noch niedriger). Das Gleiche gilt in noch stärkerem Ausmaß für das Y-Chromosom und das mitochondriale Genom. Die Autoren interpretieren diesen Befund dahin gehend, dass sie annehmen, dass Menschen und Schimpansen in den ersten ca. 1,2 Millionen Jahren nach der Trennung der Entwicklungslinien noch genetisches Material ausgetauscht haben (Abb. 14.3). Eine derartige „unordentliche“ Trennung zwischen Schimpansen und Menschen ist nicht so überraschend, da es unter den Altweltaffen viele Beispiele für Kreuzungen zwischen verschiedenen Spezies und daraus folgend entsprechende Hybride gibt. So ist es möglich, dass sich die Art Macaca arctoides durch Hybridisierung aus den Arten Macaca fascicularis und M. assamensis gebildet hat. Außerdem hybridisieren in der Wildnis die verschiedenen Spezies der Paviane, die sich vor ca. 2 Millionen Jahren getrennt haben. So sollte es nicht allzu schockierend sein, davon auszugehen, dass auch bei der Trennung der Schimpansen- und Menschenlinie ein gewisses Zeitfenster anzunehmen ist,

Abb. 14.3 Vermutliches Szenario zur Trennung der Entwicklungslinien von Schimpansen und Menschen. Der anfänglichen Trennung der beiden Linien folgte eine Periode der Hybridisierung und schließlich die endgültige Bildung der unabhängigen Spezies. (Nach Disotell 2006, mit freundlicher Genehmigung des Autors)

innerhalb dessen es noch zu Kreuzungen kommen konnte. Wenn man verschiedene Datierungstechniken anwendet, schließen die Autoren, dass sich Menschen und Schimpansen frühestens vor etwa 6,3 Millionen Jahren getrennt haben; der späteste Zeitpunkt liegt etwa 5,4 Millionen Jahre zurück. Diese immer präzisere Datierung ist bedeutsam, weil nach der bisher am stärksten favorisierten Interpretation der fossile Fund des Sahelanthropus tchadensis (datiert in die Zeit von vor 7,4 bis 6,5 Millionen Jahren) als ein Hominide betrachtet wird; Ähnliches gilt für den Orrorin tugensis (vor ca. 5,8 Millionen Jahren). Die bisherige Zuordnung basiert im Wesentlichen auf morphologischen Kriterien, wie unterschiedliche Zahnformen und Bipedie, die für Schimpansen nicht zutreffen. Auf der cytogenetischen Ebene fällt zunächst auf, dass Schimpansen (und alle großen Affen) einen Karyotyp mit 2n = 48 haben, wohingegen der moderne Mensch einen Karyotyp von 2n = 46 hat. In der Evolution des Menschen sind die ehemaligen akrozentrischen Chromosomen 2 und 3 miteinander verschmolzen und bilden jetzt das große metazentrische menschliche Chromosom 2. Einen Überblick über die wichtigsten cytogenetischen Veränderungen in der Primatenevolution gibt Abb. 14.4. Darüber hinaus gibt es einige Duplikationen, Deletionen, Insertionen und Inversionen, die natürlich auch in der Nukleotidsequenz sichtbar sind. Abb. 14.5 zeigt, wie sich Unterschiede auf der Nukleotidebene über die verschiedenen Chromosomen verteilen. Dabei fällt auf, dass sich die beiden Geschlechtschromosomen deutlich von den Autosomen unterscheiden: Das X-Chromosom zeigt einen geringeren Unterschied zwischen Menschen und Schimpanse als das Y-Chromosom. Als Ursache kann man die größere Zahl von Zellteilungen bei der Entwicklung männlicher Keimzellen diskutieren (Kapitel 11.6.5), die in der Summe zu mehr Replikationsfehlern führt. Wenn man aber alle Unterschiede zusammen nimmt (und sich nicht auf die Bereiche beschränkt, die nur in einer Kopie vorliegen), so addieren sich die Differenzen auf 2,7 %: Das sind absolut ca. 5 Millionen Insertionen/Deletionen und andere Chromosomenmutationen sowie 33,6 Millionen Nukleotidpaare. Ein wichtiges Maß für die Evolutionsgeschwindigkeit ist das Verhältnis nicht-synonymer (KA) zu synonymen Basenaustauschen (KS). Wenn in Proteincodierenden Genen KA/KS signifikant kleiner als 1 ist, gibt es eine starke negative Selektion gegen das fragliche Allel in der menschlichen Linie (siehe dazu auch frühere allgemeine Betrachtungen im Kapitel 10.5.5). Das Konsortium zur Sequenzierung des Schimpansengenoms hat nun 13.454 orthologe Genpaare von Mensch und Schimpanse miteinander verglichen (das entspricht etwa der Hälfte der Gene) und erhält in der

14.1 Genetische Aspekte zur Evolution des Menschen

Abb. 14.4 Charakteristische Chromosomen-Rearrangements in der Primaten-Entwicklung an jedem Verzweigungspunkt: (1) Nach der Trennung der Halbaffen und Affen können drei größere Veränderungen beobachtet werden, die alle höheren Primaten phylogenetisch verbinden. Dazu gehören eine reziproke Translokation, die die Homologen der menschlichen Chromosomen 12 und 22 bildet, eine Fusion, durch die das Homologe des menschlichen Chromosoms 19 entsteht, und eine Spaltung, die die „Vorläufer“ der Chromosomen 7 und 16 bildet. (2) Nach der Trennung

der Neuweltaffen und der höheren Altweltprimaten entwickeln sich die menschlichen Chromosomen 3 und 21 durch eine Spaltung und die Chromosomen 7 und 16 durch eine entsprechende Fusion. (3) Die Trennung der höheren Altweltaffen von den Hominoiden ist gekennzeichnet durch die Entstehung der Homologen der Chromosomen 14 und 15. (4) Der einzige cytogenetische Unterschied, der Menschen von Affen unterscheidet, ist die Fusion, die zur Bildung des menschlichen Chromosoms 2 führt. (Nach Wienberg 2005, mit freundlicher Genehmigung von Karger)

Abb. 14.5 Relative Unterschiede in der DNA-Sequenz zwischen Menschen und Schimpansen in den einzelnen Chromosomen. Die Chromosomen 2A und 2B des Schimpansen fusionierten und bilden das Chromosom 2 des Menschen (Abb. 14.4). Die Ränder der Boxen entsprechen den Quartilswerten, die Einbuchtungen kennzeichnen den Median und dessen Standardfehler, und die vertikalen Balken erstrecken sich über den gesamten Wertebereich. Die Stärke der Variation innerhalb eines Autosoms ist über alle Autosomen betrachtet nicht homogen. Die Werte für die X- und Y-Chromosomen weichen deutlich nach unten bzw. nach oben ab. (Nach Chimpanzee Sequenzing and Analysis Consortium 2005; mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

gemeinsamen Linie von Schimpansen und Menschen einen Wert von 0,23 ‒ was im Durchschnitt eine starke negative Selektion gegen Neumutationen in codierenden Regionen bedeutet. Anders gesagt, 77 % der Aminosäuresubstitutionen in menschlichen Peptiden haben

negative Auswirkungen. Wenn man nun die menschliche Linie allein betrachtet, erhält man einen Wert von 0,208 und bei den Schimpansen 0,194 ‒ was keinen signifikanten Unterschied bedeutet. Dies ist aber deutlich höher als beispielsweise bei der Maus, deren Wert

755

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Kapitel 14: Genetik und Anthropologie

mit 0,142 angegeben wird. Das bedeutet, dass die negative Selektion in der Mauslinie noch wesentlich stärker ist als bei Schimpansen und Menschen. Von besonderem Interesse in diesem Zusammenhang ist aber die Frage, welche Gene sich in der Evolution besonders schnell entwickelt haben, d. h. einer positiven Selektion unterliegen. Dazu vergleicht man die KA-Werte der codierenden Regionen mit den entsprechenden Werten der nicht-codierenden Regionen (KI); ein Wert über 1 deutet dabei eine positive Selektion an. Unter den untersuchten 13.454 Genen gibt es 585 Gene, die eine deutliche positive Selektion zeigen ‒ dies sind die Kandidaten, die das Spezifische der jeweiligen Spezies ausmachen können. Interessante Kandidatengene für spezifische Entwicklungen im Menschen sind natürlich auch solche Gene, die spezifisch beim Mensch dupliziert oder deletiert (bzw. als Pseudogene inaktiviert) sind. Neben dem Vergleich codierender Regionen und ihrer adaptiven Veränderungen durch Selektionsmechanismen ist die Veränderung der Genexpression ein schneller Weg, den die Evolution einschlagen kann, um zu relativ großen Veränderungen zu kommen (Portin 2007). Die vergleichende Genomforschung bietet dafür jetzt erste Ansatzpunkte. Sequenzvergleiche zeigen Unterschiede bei den nicht-synonymen Austauschen vor allem bei solchen Genen, die an der Immunabwehr, Reproduktion und sinnlichen Wahrnehmung beteiligt sind, wohingegen Gene, die an intrazellulärer Signalweitergabe, Metabolismus, Neurogenese und synaptischer Transmission beteiligt sind, häufig hochkonserviert sind. Bei den olfaktorischen Genfamilien haben Menschen und Schimpansen einen höheren Anteil an Pseudogenen (51 % bzw. 41 %) als andere Primaten. Allerdings ist noch unklar, wie sich der Verlust der olfaktorischen Gene auswirkt. Im Gegensatz zu vielen anderen ist das Gen, das für die Erkennung des Geschmacks „bitter“ verantwortlich ist, in der Evolution der Menschen und Schimpansen nicht verloren gegangen. Beide Spezies verfügen über „Schmecker“ und „Nicht-Schmecker“-Varianten im Gen TAS2R38 (engl. taste receptor, type 2, member 38), das für die Sensitivität gegenüber Phenylthiocarbamid verantwortlich ist. Interessanterweise sind die Varianten bei Schimpansen und Menschen unabhängig entstanden. Gene, die an der Immunabwehr beteiligt sind, können uns erzählen, wie sich Affen unterschiedlich an Krankheiten adaptiert haben. Das Gen Trim5a (engl. tripartite motif-containing protein 5 variant α) hat eine erhöhte nicht-synonyme Austauschrate bei den Hominiden; es ist offensichtlich für die Hemmung von Lentiviren (Kapitel 8.2.2), inklusive SIV und HIV, und für die Unterdrückung endogener Retroviren wichtig.

Außerdem sind viele Primaten von Malaria betroffen (Kapitel 10.5.3 und 12.3.1), aber nur die Menschen zeigen eine positive Evolution im G6PD-Gen (Glucose6-phosphat-Dehydrogenase), das mit Malaria-Resistenz assoziiert ist. Interessanterweise ist übrigens auch das α-Globin-Gen des Menschen (und wahrscheinlich des Orang-Utans) unter positiver Selektion für Malaria-Resistenz. Eine ausführliche Zusammenfassung mit entsprechenden Hinweisen auf die Primärliteratur findet sich in der Übersicht von Stone und Verrelli (2006).

Menschen und die großen Affen sind durch eine lange gemeinsame Evolution verbunden; die Schimpansen sind die nächsten Verwandten des Menschen. Durch den Vergleich der Genome werden die genetischen Gemeinsamkeiten und Unterschiede sichtbar; erste Hinweise für unterschiedliche Entwicklungen gibt es vor allem für Gene des Immunsystems und der Reproduktion.

Ein Vergleich genomischer Sequenzen von Menschen, Schimpansen, Gorillas, Gibbons und Makaken ergab kürzlich einen überraschenden Befund: Drei Protein-codierende Gene haben sich in der menschlichen Linie offensichtlich nach der Trennung vom Schimpansen neu aus nicht-codierenden DNASequenzen entwickelt. Die Gene sind noch nicht genau charakterisiert; ein Gen ist jedoch aufgefallen, weil es bei chronischer Leukämie verstärkt exprimiert wird. Die Autoren schätzen, dass es insgesamt etwa 18 solcher Fälle im gesamten Genom gibt (Knowles and McLysaght 2009).

14.1.2 Out of Africa Die Entwicklung der Menschen nach der Abspaltung der Schimpansenlinie vor 7 bis 5 Millionen Jahren ist in vielen Bereichen noch unverstanden. Es gibt einige unvollständige fossile Funde, die als die frühesten Vertreter der menschlichen Linie gelten: Dazu gehören der Sahelanthropus tchadensis (Fundort: Tschad, Alter: 6 bis 7 Millionen Jahre), der Ardipithecus ramidus kaddaba (Fundort: Äthiopien, Alter: 4,4 bis 5,8 Millionen Jahre) und Orrorin tugenensis (Fundort: Kenia, Alter: 6 Millionen Jahre). Auf der nächsten Stufe stehen dann die Australopithecinen (auch Vormenschen genannt), die sich durch eine erhebliche Formenvielfalt auszeichnen. Sie lebten vor etwa 4 bis 3 Millionen Jahren und wurden bisher nur in Äthiopien, Ost- und Südafrika und im Tschad nachgewiesen (Abb. 14.6a). Die ersten Angehörigen der Gattung Homo entstanden wohl vor 2,5 Millionen Jahren in Ostafrika; als Ursprungsart werden Australopithecus garhi oder africanus angenommen. Eine mögliche Übergangsform, Australopithecus sediba, wurde kürzlich in Südafrika entdeckt;

14.1 Genetische Aspekte zur Evolution des Menschen

Abb. 14.6 a, b Fossile Menschenfunde. a Fundstellen von frühen Menschen befinden sich in Süd-, Ost- und Nordwestafrika sowie im Nahen Osten. b Homo heidelbergensis: Dieser Unterkiefer wurde in Mauer (in der Nähe von Heidelberg) gefunden und gab dieser Art ihren Namen. Er ist etwa 500.000 Jahre alt und damit eines der ältesten menschlichen Fossilien in Europa. (a nach Storch et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung von Springer; b Foto: K. Schacherl, Archiv Homo heidelbergensis von Mauer e. V.)

das Alter der beiden Skelettfragmente wurde auf etwa 1,95–1,78 Millionen Jahre geschätzt (Berger et al. 2010). Die ältesten Formen der Gattung Homo sind der Homo habilis (vor 2,3 bis 1,6 Millionen Jahren in Ostafrika) und der Homo ergaster (vor 1,9 bis 1 Million Jahren in Ost- und Südafrika). Die ersten Funde, die der Gattung Homo zugerechnet werden und die außerhalb Afrikas gefunden wurden, sind etwa 1,8 Millionen Jahre alt; nach ihrem Fundort im Kaukasus werden sie als Homo georgicus bezeichnet. Auch in Asien (Java, China, Indien, Thailand) wurden Skelette und Skelettreste gefunden, denen ein Alter von etwa 85.000 bis 1,8 Millionen Jahren zugeschrieben wird; manche neueren Funde (Homo floresiensis) werden allerdings in noch jüngere Zeiten datiert (12.000 bis 95.000 Jahre alt). Diese heute als Homo erectus bezeichneten Menschen haben sich wahrscheinlich aus dem afrikanischen Homo ergaster entwickelt. Eine grobe Abschätzung ergibt, dass bei einer durchschnittlichen Wanderungsgeschwindigkeit von 1 km pro Jahr Homo ergaster in 15.000 Jahren von Kenia nach Java gelangt sein könnte.

In Europa wurden die ältesten Überreste menschlicher Skelette bei Burgos in Spanien und bei Rom in Italien entdeckt; sie sind knapp 800.000 Jahre alt und werden als Homo antecessor bezeichnet. In Nordwestafrika (Tanger, Casablanca, Rabat) gibt es vergleichbare Funde, die etwa 400.000 Jahre alt sind. In dieses Zeitfenster (200.000 bis 600.000 Jahre) fällt aber auch eine Reihe von Funden aus Europa, die dem Homo heidelbergensis zugeordnet werden. Diese Art hat ihren Namen nach einem Unterkieferknochen (Abb. 14.6b), der 1907 in einem Steinbruch in Mauer bei Heidelberg entdeckt wurde. Morphologisch ähnliche Funde gibt es auch aus dem Süden Afrikas (Homo rhodesiensis), Indien, China und Indonesien. Vor etwa 200.000 bis 30.000 Jahren lebte in Europa und im Nahen Osten der Neandertaler (Homo neanderthalensis), benannt nach dem Ort Neanderthal in der Nähe von Düsseldorf, wo 1856 zwei Skelette gefunden wurden (Kapitel 14.1.3). Die ältesten Funde, die dem Homo sapiens zugerechnet werden, sind etwa 160.000 Jahre alt und stammen aus

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758 758

Kapitel 14: Genetik und Anthropologie

Abb. 14.7 Die Entwicklung der frühen Menschen. Die Kästen deuten die Perioden an, in denen die angegebenen Arten wahrscheinlich existierten. Drei hypothetische Zeitfenster von jeweils ungefähr 1,5 Millionen Jahren, in denen möglicherweise Kreuzungen zwischen homininen Arten stattgefunden haben, sind grau unterlegt. (Nach Disotell 2006, mit freundlicher Genehmigung des Autors)

Äthiopien. In ganz Afrika wurden Überreste des Homo sapiens entdeckt, die nur unwesentlich jünger sind (Alter: 80.000 bis 130.000 Jahre). Der älteste Homo sapiens außerhalb Afrikas wurde am See Genezareth in Israel gefunden und ist etwa 90.000 bis 100.000 Jahre alt; in Europa liegt die Fundstätte des ältesten Homo sapiens in Südwestfrankreich (Cro-Magnon-Mensch); sein Alter wird auf ca. 40.000 Jahre geschätzt. Relativ alte Funde (31.000 bis 36.000 Jahre) stammen aber auch aus Rumänien, Kroatien, der Tschechischen Republik, Bulgarien, England und Russland. In Asien wurden Überreste des Homo sapiens gefunden, die 35.000 bis 50.000 Jahre alt sind. Eine zusammenfassende Übersicht über die frühe Entwicklung der Menschen zeigt Abb. 14.7; es soll aber an dieser Stelle betont werden, dass sowohl die Klassifikation als auch die Zeitangaben in verschiedenen Quellen variieren können ‒ das ist Ausdruck der Unsicherheiten in der Interpretation der Daten aufgrund der oft fragmentarischen Funde und der schwierigen Altersbestimmung. Für viele Details sei auch auf einschlägige Fachliteratur verwiesen (z. B. Storch et al. 2007); hervorragende Bilder und ausführliche Beschreibungen archäologischer Funde gibt es in Johanson und Edgar (2006). Eine molekulargenetische Analyse der menschlichen Evolution ist naturgemäß von hohem Interesse, aber wegen der großen Zeiträume nicht trivial; Amorim hat dafür 1999 den eleganten Begriff der „Archäogenetik“ geprägt. Die direkte Untersuchung von DNA aus Mumien wurde zum ersten Mal 1985 von Svante Pääbo berichtet, aber bei fossilen Funden steckt sie noch in den Anfängen. Neue technische Methoden haben es jedoch möglich gemacht, DNA aus Zähnen und Knochen so zu isolieren, dass daraus kurze DNAFragmente mithilfe der PCR amplifiziert und danach sequenziert werden können. Für die Untersuchung der früheren Abstammungsverhältnisse wird auch noch auf andere Verfahren

zurückgegriffen. Dabei werden die DNA-Sequenzen heute lebender Menschen in den verschiedenen Regionen der Welt untersucht (Kapitel 14.1.4), und man versucht zu ermitteln, wann der „letzte gemeinsame Vorfahre“ (engl. most recent ancestor) gelebt hat bzw. wann die heute getrennten Entwicklungslinien in der Vergangenheit zusammenlaufen (engl. coalescence). Aufgrund seiner geringen Größe, aber der großen Anzahl der Mitochondrien in den Zellen war das Mitochondriengenom (Kapitel 5.2.3 und 12.3.5) natürlich das erste Untersuchungsobjekt. In einer klassischen Arbeit berichteten Cann und Mitarbeiter 1987 von ihren Arbeiten an 147 Personen, die aus 5 geographischen Populationen stammten. Sie isolierten die mitochondriale DNA (mtDNA) und untersuchten sie auf unterschiedliche Restriktionsschnittstellen. Sie konnten zeigen, dass alle Mitochondrien auf eine Frau zurückgehen, die vermutlich vor 200.000 Jahren in Afrika gelebt hat („afrikanische Eva“). Alle untersuchten Populationen ‒ mit Ausnahme der afrikanischen ‒ haben vielfache Ursprünge, sodass die Autoren davon ausgehen, dass die verschiedenen Gebiete mehrfach kolonisiert wurden. Damit zeigte die erste genetische Analyse eine Übereinstimmung mit der oben grob skizzierten zeitlichen Abfolge der fossilen Funde und ihrer Fundorte. Beide machen es wahrscheinlich, dass der Mensch seinen Ursprung in Afrika hat (Out-of-Africa-Hypothese). Die genetischen Untersuchungen wurden in der Folgezeit verfeinert: Zunächst umfassten sie das gesamte Mitochondriengenom, später nicht-rekombinierende Stellen auf dem Y-Chromosom, variable Bereiche auf dem X-Chromosom und einiger Autosomen; einen Überblick gibt Tabelle 14.1. Sie belegen im Kern den Ursprung des Menschen in Afrika und seine Wanderung nach Asien (vor 1,7 Millionen Jahren). Eine

14.1 Genetische Aspekte zur Evolution des Menschen

Tabelle 14.1 Wichtige Evolutionsmarker Ort

Gen

Länge (Kb)

da

Nb

Zeitc (1000 Jahre)

MtDNA

gesamtes Genom

16,5

-

53

MtDNA

HVRI (nicht-codierend)

0,4

62

2778

MtDNA

codierendes Genom

15,5

5

179

Yp11.3

ZFY

0,7

15

205

NRY

SMCY

40

5

53

NRY

DBY

9

5

70

39–100

-2,04

NRY

DFFRY

15

5

70

40–65

-1,79

Xp11.4-3

MAO-A (5 Segmente)

18,8

8

56

Xp21.3

GK (Intron1)

1,9

8

10

410

0,02

Xp21.3

ZFX (Intron)

1,1

15

336

1090

-0,95

170

Dd -1,22Aƒ -2,28 nAƒ

-

-1,18 240

-0,95

41–68

-2,31

0,33

Xp22.2-1

PDHA1 (Introns 9, 10)

1,7

8

10

1050

1,13

Xp22.2-1

PDHA1 (Exons 7–10)

4,2

8

35

1780

0,78

Xq13.3

nicht-codierende Region

10

69

540

-1,61

Xq21

DMD (Intron 7)

2,3

41

210

-1,79

4

Xq21

DMD (Intron 44)

1,4

8

10

1350

0,06

Xq21

DMD (Intron 44)

3

4

41

1560

-0,16

Xq21-22

PLP (Intron 5)

0,7

8

10

1280

0,12

Xq26.1

HPRT (Introns 2, 8)

2,7

8

10

530

-125

Xq27.2-1

F9 (Intron 4)

3,7

11

36

282

-171

1q24

meist Introns

10

3

61

1q21

ΨGBA

5,4

12

100

8p22

LPL

10

3

71

11p15.5

HBB

3

9

326**

14q24

EDN

1,2

4

14q31

ECP

1,2

16q24.3

MC1R

0,95

1376

-1,22

91–199

-0,76

-

0,91 800

1,06

67

1150

-1,28

4

54

1090

0,04

16

672**

1000

-0,28 Aƒ -0,07 As -0,97 Eu

16q24.3

MC1R (Promotor)

16p13.3

MS205 (5´-Region, Intron)

6,7

3

54

1520

-1,64

11,7

5

50

1040

-1,54 Aƒ -2,18 nAƒ

a

17q23

ACE

24

2

11

1113

0,32

19q13.2

APOE

5,5

4

96

311

-0,62

22q11.2

nicht-codierende Region

9,9

16

64

1288

-1,03

Zahl der gesammelten Populationen; bZahl der gesammelten Individuen; cZeit bis zum letzten gemeinsamen Vorfahren aller gesammelten Gene; d Tajima‘s D Statistik; berechnet auf alle Proben; Durchschnittliche D-Statistik für 62 Populationen; * Zahl der sequenzierten Chromosomen. Af: Afrikaner; nAf: Nicht-Afrikaner; As: Asiaten; Eu: Eurasier ; NRY: nichtrekombinierende Region auf dem Y-Chromosom Nach Excoffier (2002)

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760 760

Kapitel 14: Genetik und Anthropologie

zweite (vor 840.000 bis 420.000 Jahren) und dritte Welle (vor 150.000 bis 80.000 Jahren) aus Afrika nach Südasien folgte, bevor dann Nordafrika und Südeuropa, später auch Nordasien, der pazifische Raum und zuletzt Amerika von Menschen besiedelt wurde. Von einer interessanten Korrelation zwischen einer Genmutation und morphologischen Veränderungen bei der Auseinanderentwicklung von Affen und Menschen haben Stedman und Mitarbeiter (2004) berichtet: Sie analysierten die Sequenz des Gens MYH16, ein Mitglied der Genfamilie, die für die schwere Kette des Myosins codiert (engl.

myosin heavy chain). Dabei stellten sie fest, dass das Gen beim Menschen im Exon 18 eine Deletion von 2 Basen hat, die zu einer Rasterverschiebung und kurz darauf zu einem vorzeitigen Stoppcodon führt. Bei allen Affen läuft dagegen der Leserahmen durch. Die Mutation ist wahrscheinlich vor ca. 2,4 Millionen Jahren entstanden, als sich die ersten Mitglieder der Gattung Homo entwickelten. Die vorher existierenden Arten Australopithecus und Paranthropus zeichnen sich dagegen alle noch durch einen mächtigen Kaumuskel aus ‒ und das ist genau der Muskel, in dem MYH16 exprimiert wird. Im Gegensatz dazu ist dieser Muskel bei den modernen und fossilen Menschen deutlich kleiner; der Verlust

Abb. 14.8 a–d Verschiedene Modelle der menschlichen Evolution. a Kürzlicher afrikanischer Ursprung; die grauen Pfeile deuten einen Genfluss an, der zwischen verschiedenen Homo erectus-Populationen verschiedener Kontinente stattgefunden haben könnte. Seine Wirkung wurde jedoch ausgelöscht durch die Verdrängung der alten europäischen und asiatischen Bevölkerung durch den modernen Menschen. Die schwarzen Pfeile deuten weiterbestehenden Genfluss zwischen verschiedenen Populationen an. b Unter dem Modell der multiregionalen Evolution haben sich die Populationen in Afrika, Europa und Asien im mittleren Pleistozän auseinanderentwickelt; durch konstanten Genfluss haben sie sich jedoch weiterhin gemeinsam entwickelt. Dieses Modell widerspricht diametral dem Modell in

a. c Schematische Darstellung von mehreren großen Auswanderungen aus Afrika mit einem konstanten, aber räumlich und zeitlich jeweils begrenzten Genfluss (siehe dazu auch Abb. 14.10 für einige Details). d Die Hypothese einer erst kürzlichen Auswanderung aus Afrika (nach einem Flaschenhals) mit anschließend rascher Ausbreitung und Untergliederung der Populationen in verschiedenen Kontinenten. Die Flammen deuten eine besonders dynamische Unterteilung in Subpopulationen an. Die Theorie beinhaltet ebenfalls eine vollständige Auslöschung des Homo erectus durch den modernen Menschen auf allen drei Kontinenten; sie unterscheidet sich von a durch die Annahme besonders schnellen Wachstums der Bevölkerung. (Nach Excoffier 2002, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

14.1 Genetische Aspekte zur Evolution des Menschen

dieses Muskelproteins ist also mit einer deutlichen Verminderung der Größe der individuellen Muskelfasern und des ganzen Kaumuskels verbunden. Eine der Hauptfragen, die in der Literatur zurzeit diskutiert werden, ist, ob nur die letzte Auswanderungswelle des Homo erectus schließlich zum modernen Menschen führte und alle anderen Formen sozusagen ersetzte (uniregionale oder replacement-Hypothese) oder ob es aufgrund der zeitlichen und räumlichen Nähe doch Durchmischungen der Menschen gab, die aus den verschiedenen Migrationswellen hervorgegangen sind (multiregionale Hypothese). Abb. 14.8 gibt eine Übersicht über die verschiedenen Szenarien, wobei Abb. 14.8a und b die beiden Hypothesen in ihrer Reinform darstellen. Beide Modelle sind wahrscheinlich zu stark vereinfacht, da sie verschiedenen Aspekten im Detail nicht Rechnung tragen (z. B. Untergliederung innerhalb der Kontinente, mögliche klimatische Einflüsse auf Wanderungsbewegungen, Populationsgrößen, technische, kulturelle und soziale Veränderungen einschließlich des Paarungsverhaltens). In einer ausführlichen statistischen Untersuchung hat Templeton (2002) gezeigt, dass die Menschwerdung komplex verlaufen ist und dass ein permanenter, wenn auch nicht immer gleichmäßiger, Genfluss zwischen den verschiedenen Populationen stattgefunden hat.

Abb. 14.9 Haplotyp-Baum und relative Haplotyp-Häufigkeit des MC1R-Gens (Melanocortin-1-Rezeptor) in Afrika (AF), Asien (AS), Europa (EU) und Nordamerika (NA). Es sind 7 Haplotypen dargestellt, die als 942, 92, CON, 84, 151, 67 und 163 bezeichnet werden. Ein „X“ im Baum markiert einen Nukleotidaustausch. Die Ausdehnung außerhalb Afrikas und die anschließende Ausbreitung von Ost- und Südostasien nach Europa in der geschachtelten Stamm-Analyse sind jeweils mit den Haplotypen 92 und 942 bzw. CON und 163 assoziiert. Beachte, dass die Schlussfolgerung eine Ausbreitung vorhersagt, wenn der ältere Haplotyp in einem Stamm auf eine einzelne Population beschränkt ist, während der jüngere Haplotyp geographisch weit verbreitet oder räumlich von dem ursprünglichen Haplotyp weit entfernt ist. (Nach Satta u. Takahata 2002, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

Dabei gibt es selbstverständlich zeitweise isolierte Populationen, aber auch eine rasche Ausdehnung der Siedlungsgebiete. Die Hauptargumente gegen die Ablehnung der reinen replacement-Hypothese und für eine deutlich ältere Expansion aus Afrika basiert im Wesentlichen auf drei Genorten, dem Gen für β-Globin (HBB), dem MC1R (Melanocortin-Rezeptor 1) und dem Minisatellitenmarker MS205. Die Methode ist am Beispiel des MC1R-Gens erläutert (Abb. 14.9). Insbesondere der Haplotyp 92 des MC1R-Gens im Verhältnis zum älteren Haplotyp 942 zeigt eine Aufspaltung, die etwa 640.000 Jahre zurückliegt. In ähnlicher Weise zeigen das HBB-Gen und vier weitere Gene einen frühen und immer wiederkehrenden Genfluss. Damit hat die Expansion aus Afrika heraus, die durch die Untersuchungen der mtDNA und des Y-Chromosoms schon in früheren Arbeiten angedeutet wurde, die Signale einer früheren Expansion und den wiederholten Genfluss zwischen afrikanischen und nichtafrikanischen Bevölkerungen nicht ausgelöscht. Es ist daher vernünftig, anzunehmen, dass auch die jüngste Ausbreitung aus Afrika mit Kreuzungen verbunden war. Für weitere Details siehe Abb. 14.10. Es bleibt allerdings die Frage, wie der Effekt einer mehrfachen Out-of-Africa-Expansion aussähe, wenn er in eine multiregionale Hypothese eingefügt würde. Wenn einerseits jede Expansion zu einem vollständigen Ersatz der vorher bestehenden Populationen führt, dann führen alle nichtafrikanischen Haplotypen letztlich doch nach Afrika zurück, und diese Möglichkeit kann von der uniregionalen Hypothese nicht unterschieden werden. Wenn aber andererseits der Ersatz unvollständig ist und Kreuzungen möglich sind, könnte eine unterschiedliche Situation entstehen. Allerdings würde selbst ein großes Ausmaß von Kreuzungen nicht den hohen Anteil afrikanischer Populationen erklären, der in dem letzten gemeinsamen Vorfahren enthalten ist. Daniel Garrigan und Michael Hammer haben 2006 ein Modell vorgestellt, das zwischen verschiedenen Möglichkeiten unterscheiden kann (Abb. 14.11). Dabei zeigt eine Version dieses Rechenmodells, das neben Phasen der Isolation von Populationen auch Phasen der Vermischung von Populationen enthält (engl. isolation and admixture, IAA), eine bimodale Verteilung der Zeit, zu der der letzte gemeinsame Vorfahre auftritt. Bei diesem Modell wurden der Vermischungsgrad mit 5 % und eine Trennung der Populationen vor 2 Millionen Jahren angenommen; eine Veränderung des Vermischungsgrades führt auch zu einer Veränderung der relativen Verteilungsmaxima. Aufgrund der vorliegenden Daten schließen die Autoren entweder auf einen Flaschenhals-Effekt oder auf häufiges Aussterben und Wiederbesiedeln von Kleinbezirken, die als Fortpflanzungsgemeinschaften

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Kapitel 14: Genetik und Anthropologie

Abb. 14.10 Ein neues Modell der menschlichen Evolution. Alle statistisch signifikanten Interferenzen sind in dieses eine Modell eingebaut. Die größeren Ausdehnungen der menschlichen Populationen sind durch rote Pfeile gekennzeichnet. Ge-

netische Abstammung ist durch vertikale Linien und Genfluss durch diagonale Linien angedeutet. (Nach Templeton 2002, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Abb. 14.11 Genetische Vorhersagen verschiedener Modelle über die Ursprünge der Menschen. Dabei wurde für vier Modelle (vgl. Abb. 14.8) die Zeit berechnet, bis ein letzter gemeinsamer Vorfahre ermittelt werden kann. Alle Modelle mit einem einzigen Ursprung und mehr oder weniger langen Wanderungszeiten zeigen einen unimodalen Verlauf; der letzte ge-

meinsame Vorfahre ist bei etwa 800.000 Jahren erreicht. Allein das Isolations- und Mischungsmodell (engl. isolation-and-admixture, IAA) zeigt einen bimodalen Verlauf (die Annahmen hier sind 5 % Durchmischungsgrad und Trennung der Populationen vor ca. 2 Millionen Jahren). (Nach Garrigan u. Hammer 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

14.1 Genetische Aspekte zur Evolution des Menschen

Abb. 14.12 Illustration des Alters der letzten gemeinsamen Vorfahren für verschiedene genomische Regionen. Ein Flaschenhals ist angegeben, wie er wahrscheinlich mit der Entwicklung des modernen Menschen verbunden ist. Danach beginnt die Ausbreitung der Populationen, wie es sich

in den Allelfrequenzen der verschiedenen Marker widerspiegelt. Die neolithische Expansion wurde durch die Entwicklung der Landwirtschaft im Nahen Osten begünstigt. (Nach Kaessmann u. Pääbo 2002, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

wirkten. Die Autoren verweisen darauf, dass eine zunehmende Anzahl von Genen gegen ein Modell mit einem einzigen Ursprung spricht; sie schließen aus ihren Daten eher, dass die Ablösung des archaischen Menschen durch Populationen anatomisch moderner Menschen von einem gewissen Maß an genetischer Assimilation begleitet war. Man darf dabei nicht vergessen, dass die effektive Populationsgröße des Menschen außerhalb Afrikas in diesen Zeiten in der Größenordnung von etwa 10.000 lag (Kaessmann u. Pääbo 2002).

verschiedene Populationen, die zwar unter sich im Austausch standen, aber von einer weiteren Population in Nordostafrika weitgehend isoliert waren; Kreuzungsereignisse in Afrika waren also nicht zufällig, und die südlicheren Populationen könnten alte HaplotypLinien erhalten haben. Populationen südlich der Sahara zeigen eine größere genetische Vielfalt als Nordostafrikaner oder Populationen außerhalb Afrikas. Daraus kann man schließen, dass nordostafrikanische Populationen in regem Austausch mit den nach Asien und Europa auswandernden Populationen standen, sodass hier immer ein gewisser Genfluss möglich war. Es kommt darauf an, die statistische Aussagekraft der bisherigen Untersuchungen weiter zu verbessern, um derartige Modelle zu überprüfen.

Die Bestimmung des „letzten gemeinsamen Vorfahren“ hängt von den Markern ab, die betrachtet werden. Die Marker weisen ein unterschiedliches Maß an Heterogenität auf, wobei mittels MitochondrienDNA nur etwa 150.000 Jahre zurückgeschaut werden kann ‒ autosomale Loci erlauben dagegen fast 1 Million Jahre. Der Flaschenhals-Effekt (vermutlich durch die kleine Auswanderergruppe aus Afrika) verschärft diese Schwierigkeit, weil dadurch die Heterogenität der Ausgangspopulation stark eingeschränkt war. Einen Überblick dazu gibt Abb. 14.12. Die aktuellen Interpretationen der Daten lassen sich in Modellen zusammenfassen, die in Abb. 14.13 gezeigt sind. Hier gibt es im südlichen Zentralafrika

Die Phylogenie der mütterlich vererbten mitochondrialen DNA spielt bei der Evolutionsanalyse der Menschheit eine zentrale Rolle. Ein großes internationales Team um Dahor Behar (2008) hat aus 624 vollständigen mitochondrialen Genomen verschiedener heute südlich der Sahara lebender Populationen einen Stammbaum konstruiert. Dabei legten die Autoren besonderen Wert auf die Khoi- und San-Völker in Südafrika, weil diese als einzigartige Überreste einer Jäger-und-Sammler-Kultur gelten. Die Daten zeigen, dass

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Kapitel 14: Genetik und Anthropologie a

Modernisierung der späten Steinzeit; Wanderungen

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Vor Jahren

BantuExpansion

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Entwicklung von L0 und L1

Trennung von L0d und L0k

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3 Lokalisierung von L0d und L0k

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Modernisierung der späten Steinzeit; Wanderungen

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2 Frühe Wanderungszone des Homo sapien

Lokalisierung von L1’5

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Vor Jahren 200.000 100.000

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BantuExpansion

2 Lokalisierung von L0

Rückkehr von L0abf

14.1 Genetische Aspekte zur Evolution des Menschen

Abb. 14.13 a, b Maternaler Genfluss in Afrika. Die graduellen maternalen Bewegungen in Afrika sind durch aufsteigende Zahlen markiert. Ein Gradienten-Farbsystem wird verwendet, um die zeitliche Abfolge der Ereignisse zu illustrieren. Dier Richtung der Pfeile sowie die Zeitangaben sind allgemein und sollen nicht als genaue Wanderrouten verstanden werden. Für die Verwandtschaftsbeziehungen der verschiedenen mitochondrialen Haplotypen siehe auch Abb. 14.20. a Einer ersten längeren Kolonialisierung (grau) durch den modernen Menschen (1) folgt eine Ausbreitungswelle (grün) und ein Auseinanderbrechen der Population (2); die mitochondrialen Haplotypen L0d und L0k befinden sich jetzt im südlichen Afrika. b Eine frühe Aufspaltung des Homo sapiens in einer hypothetischen Wanderungszone führt zu zwei Populationen, die sich unabhängig vonei-

nander entwickeln; der mitochondriale Haplotyp L0 (grün) befindet sich dann im südlichen Afrika und der Haplotyp L1’5 (rot) im östlichen Afrika. Es wird vermutet, dass darauf die Aufspaltung der L0abf-Untergruppe aus der südlichen Population erfolgte und eine Verschmelzung mit der östlichen Population (grau; 3), sodass die erste Population nur noch aus den mitochondrialen Haplotypen L0d und L0k besteht und die zweite aus L1’5 und L0abf. Spätere Ausbreitungswellen vom östlichen Afrika her erfolgen parallel mit der späten Steinzeit in Afrika (vor ca. 70.000 Jahren). Schnelle Wanderungen während der späten Steinzeit (5) bringen Abkömmlinge der ostafrikanischen Population in wiederholten Kontakt mit der südlichen Population (hauptsächlich während der Bantu-Expansion). (Nach Behar et al. 2008, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

sich die mitochondriale DNA dieser beiden Völker vor etwa 150.000 bis 90.000 Jahren vom Rest des menschlichen Genpools abgespalten hat. In dieser Zeit bildeten sich offensichtlich ca. 40 verschiedene Abstammungslinien im südafrikanischen Raum. Erst viel später, nämlich während der späten Steinzeit vor etwa 40.000 Jahren, wurden wieder Allele anderer Populationen durch wiederholte Kreuzungen und Rückkreuzungen in den mitochondrialen Genpool eingefügt (engl. introgression); dieser Prozess hat sich durch die jüngere Expansion der Bantu weiter beschleunigt. Diese Arbeit gibt natürlich Anlass zu vielfältigen Spekulationen: Hätten sich zwei Menschheiten entwickeln können, wenn die Isolation der ursprünglichen Populationen im südlichen Afrika noch länger angedauert hätte? Im Übrigen stimmen die Untersuchungen der mitochondrialen DNA mit denen männlicher Y-Chromosomen überein: Der ursprünglichste Ast des Y-chromosomalen Stammbaums ist unter den KhoiSan-Völkern weit verbreitet, kommt aber in anderen Populationen nur selten vor. Auch bei linguistischen Merkmalen haben diese Völker eine größere Ähnlichkeit untereinander als mit anderen Populationen in Afrika. Diese Arbeiten wurden kürzlich ergänzt durch vollständige Genom-Sequenzierungen von einem Vertreter der Khoisan und einem Vertreter der Bantus; bei drei weiteren Khoisan-Männern wurden alle Exons sequenziert. Dabei zeigte sich, dass die genetische Heterogenität der Khoisan untereinander größer ist als die Unterschiede zwischen anderen Populationen, z.B. zwischen Europäern und Asiaten (Schuster et al. 2010).

es eine Route entlang der asiatischen Küste nach Indien gegeben hat und von dort nach Südostasien und Australien (Abb. 14.14). Modellrechnungen zeigten außerdem, dass ursprünglich etwa 500 bis 2000 Frauen an diesem Auszug aus Afrika beteiligt waren. Die Detailanalyse der mitochondrialen Genome ergab auch, dass die Besiedelung des Nahen Ostens und Europas durch den modernen Menschen von Indien aus erfolgte (sozusagen auf dem „Rückweg“); allerdings ging die Hauptrichtung vor ca. 65.000 Jahren von Indien nach Australien und dauerte bei einer Wanderungsgeschwindigkeit von 0,7 bis 4 km pro Jahr wohl nur wenige Tausend Jahre (Stanyon et al. 2009).

Die molekulare Analyse ermöglicht es auch, den Weg nach Asien nachzuzeichnen, den die Menschen bei ihrem (dritten) Auszug aus Afrika wohl genommen haben. Der Auszug aus Afrika fand vor ungefähr 85.000 bis 55.000 Jahren statt und die „Wegbeschreibung“ ergibt sich aus der Analyse von mtDNA (L2und L3-Typen, vgl. Abb. 14.20) sowie des Y-Chromosoms. Die Analyse isolierter, ursprünglicher Bevölkerungsgruppen in Südostasien unterstützt die Hypothese, dass

Die Entwicklung des modernen Menschen begann wohl im südlichen zentralen Afrika: Danach hat sich der Mensch in mehreren Wellen aus Afrika nach Asien, Europa und später Amerika ausgebreitet. Die Untersuchung verschiedener charakteristischer Genorte legt es nahe, auf allen Stufen dieser Entwicklung ein gewisses Maß an Durchmischung der verschiedenen Populationen anzunehmen.

Wie wir gesehen haben, lässt die Analyse der Daten mitochondrialer DNA, die nur matrilinear vererbt wird, Rückschlüsse auf den Frauenanteil in der ursprünglichen Population zu, in verschiedenen Arbeiten wird er in einer Größenordnung von etwa 1000 Frauen angegeben. Entsprechend lässt sich natürlich auch der Anteil der Männer über die Evolution des Y-Chromosoms abschätzen. Dabei zeigt sich, dass die effektive männliche Populationsgröße (Kapitel 10.5.2) lange Zeit kleiner war als die der Frauen – offensichtlich haben in jeder Generation wenige Männer einen relativ großen Anteil zum Pool des Y-Chromosoms beigetragen. Die Autoren (Dupanloup et al. 2003) interpretieren ihre Daten dahin gehend, dass über weite Teile der menschlichen Entwicklung Polygynie das vorherrschende Charakteristikum der Fortpflan-

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Kapitel 14: Genetik und Anthropologie

Abb. 14.14 Ein vereinfachtes Szenario der menschlichen Wanderungsrouten. In einer (dritten) Wanderungswelle verließen die modernen Menschen vor etwa 200.000 Jahren Afrika. Es waren mehrere Wege möglich, aber die Zahl der beteiligten Individuen war begrenzt (etwa 600 Frauen). Die Wanderung erfolgte wahrscheinlich entlang der Küste des Indischen Oze-

ans, und die modernen Menschen erreichten Indien vor etwa 70.000 Jahren und etwa 10.000 Jahre später Südostasien. Von dort wandten sie sich nach Norden und besiedelten Nordostasien und Japan. KYA: vor 1000 Jahren. (Nach Stanyon et al. 2009, mit freundlicher Genehmigung des Autors)

zungsgemeinschaften war. Erst evolutionsgeschichtlich kurz habe der Umschwung zu einer monogamen Form stattgefunden, was sich in einer Vergrößerung der effektiven männlichen Populationsgröße ausdrückt und von den Autoren mit dem Übergang von einer mobilen zu eher sesshaften Kulturformen erklärt wird.

den, die vor kürzerer Zeit als vor ca. 28.000 Jahren gelebt haben; der Schädel eines typischen Neandertalers ist in Abb. 14.15a dargestellt. Viele Anthropologen argumentieren, dass die Neandertaler ausgestorben und durch moderne Menschen ersetzt worden seien. Lange Zeit war man ‒ wie auch bei der Out-of-AfricaHypothese ‒ nur auf Knochenfunde und ihre entsprechende Einordnung aufgrund morphologischer und archäologischer Befunde angewiesen. In den letzten Jahren hat man natürlich die Untersuchung nach dem „letzten gemeinsamen Vorfahren“ auch auf den Neandertaler ausgedehnt. Das war aber insofern nicht ganz zielführend, weil die Zeiten der gemeinsamen Vorfahren zeitlich weiter zurückliegen ‒ der genetische Unterschied zu den Neandertalern ist dafür zu gering. Andererseits sind die fossilen Funde unter erdgeschichtlicher Betrachtung noch relativ jung. Von daher versucht man seit einiger Zeit, aus den Knochenresten DNA zu isolieren und zu sequenzieren, um so durch den direkten Sequenzvergleich Informationen darüber zu erhalten, ob im Genom des modernen Menschen noch Spuren des Neandertalers zu finden sind. Dabei steht man vor zwei Problemen: Das erste ist das der Verunreinigung durch DNA des modernen Menschen, besonders durch die Untersuchenden selbst. Hier hat man schon gelernt, durch geeignete technische Schutzmaßnahmen Kontaminationen weitgehend zu vermeiden. Zum zweiten kommt es durch den Abbau der DNA nach dem Tod häufig zur Deamidierung am Cytosin ‒ es entsteht Uracil, das bei der Sequenzierung als Thymin erkannt wird

14.1.3 Der Neandertaler: ausgerottet oder assimiliert? In Europa gibt es einige Funde, die sich sehr ursprünglichen Formen des Menschen zuordnen lassen; die Homo antecessor Funde in Spanien sind ca. 800.000 Jahre alt. Etwas jünger ist der Homo heidelbergensis; der Unterkieferknochen, der dieser Art den Namen gab, ist etwa 500.000 Jahre alt. Vom Homo heidelbergensis leitet sich vermutlich der Homo neanderthalenis ab, der vor ca. 200.000 Jahren auftrat und vor etwa 30.000 Jahren untergegangen ist. Vor ca. 40.000 Jahren wanderten die modernen Menschen in Europa ein; die Cro-Magnon-Menschen gehören zu den frühesten Repräsentanten dieser Gruppe. Neben dieser - hier nur sehr grob und oberflächlich skizzierten zeitlichen Abfolge, die sich aus den archäologischen Funden ergibt - steht natürlich die Frage nach den verwandtschaftlichen Beziehungen. Ein besonders großes Fragezeichen der humanen Evolutionsforschung steckt hinter der Beobachtung, dass in Europa keine Spuren der Neandertaler gefunden wer-

14.1 Genetische Aspekte zur Evolution des Menschen Abb. 14.15 a–d Fundorte und Verwandtschaftsbeziehungen der Neandertaler-Proben auf der Ebene mitochondrialer DNA. a Schädel eines Neandertalers (Fundstätte: La Ferrassie, Frankreich). b Die Fundorte der Neandertaler-Proben, deren mtDNA sequenziert wurde. c Verwandtschaftsbäume basierend auf 304 bp aus der D-Schleife der mtDNA (Nukleotide 16.076–16.378). d Verwandtschaftsbäume basierend auf 123 bp aus der D-Schleife der mtDNA (Nukleotide 16.210–16.331); das Alter der sequenzierten Fossilien ist in Klammern in 1000 Jahren angegeben; die Zahlen in den Stammbäumen geben Bootstrap-Werte an. (a nach Storch et al. 2007, mit freundlicher Genehmigung von Springer; b–d nach Excoffier 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

und damit eine C→T- bzw. G→A-Mutation vortäuscht. Dieses Problem kann durch wiederholte Sequenzierung unterschiedlicher Proben erkannt werden. Unter Berücksichtigung der oben genannten methodischen Schwierigkeiten ist es damit in den letzten Jahren gelungen, einige interessante Informationen über die Neandertaler und ihre Beziehung zu den modernen Menschen zu erhalten. Das Mitochondriengenom (Kapitel 5.2.3 und 12.3.5) war natürlich das erste Untersuchungsobjekt für Sequenzuntersuchungen bei Neandertaler-Funden. Dabei wurden in der Regel kurze, nicht-codierende mtDNA-Sequenzen von Neandertalern mit alten, aber anatomisch modernen Menschen aus verschiedenen Regionen Europas und Australiens verglichen. Erste Ergebnisse von mitochondrialen und einigen genomischen DNA-Sequenzdaten liegen für Neandertaler inzwischen vor. Ein Sequenzierprojekt des vollstandigen Neandertaler-Genoms wurde 2006 am Leipziger

Max- Planck-Institut fur Evolutionare Anthropologie (MPI-EVA) begonnen. Diese Studien zeigten, dass die mtDNA der Neandertaler sich von der mtDNA heutiger Menschen, aber auch von der aus Fossilien der anatomisch modernen Menschen sehr stark unterscheidet. Gleichzeitig mehren sich aber auch die Hinweise auf die Heterogenität der Neandertaler selbst. Abb. 14.15b‒d zeigt das Ergebnis einiger mtDNA-Sequenzuntersuchungen an Neandertaler-Proben aus verschiedenen Gebieten Europas, die auch zu verschiedenen Zeiten gelebt haben. Insbesondere eine Probe aus der Nähe von Rom, deren Alter auf ca. 50.000 Jahre datiert wird, zeigt eine relativ große Nähe zu den entsprechenden Sequenzen moderner Menschen. Abb. 14.16 zeigt die Verteilung von paarweisen Sequenzvergleichen bei mitochondrialer DNA unter 53 Menschen aus der ganzen Welt – zunächst untereinander, dann im Vergleich mit Neandertalern und schließlich mit Schimpansen. Innerhalb der moder-

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Kapitel 14: Genetik und Anthropologie

Abb. 14.16 a–c Verteilung von paarweisen Sequenzunterschieden in der mitochondrialen DNA (mtDNA). Es sind Häufigkeiten von Sequenzunterschieden in der mtDNA innerhalb von 53 modernen Menschen (grün), zwischen modernen Menschen und Neandertalern (rot) sowie zwischen modernen

Menschen und Schimpansen (blau) angegeben. a Die vollständige mtDNA. b Die hochvariable Region 1 (HVRI; NeandertalerPosition 16.044–16.411). c Die hochvariable Region 2 (HVRII; Neandertaler-Position 57–372). (Nach Green et al. 2008, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

nen Menschen gibt es 2‒118 Unterschiede mit zwei Gipfeln. Im Gegensatz dazu ist die Zahl der Unterschiede zu den Neandertalern größer (201‒235) und zeigt nur einen Gipfel. Damit fällt die mitochondriale DNA der Neandertaler außerhalb der Variationsbreite menschlicher DNA. Wenn man allerdings den Vergleich auf die hypervariablen Regionen beschränkt, so überlappen die Verteilungen der paarweisen Unterschiede (knapp bei HVRI und deutlich bei HVRII). Der Vergleich mit den Schimpansen zeigt jeweils große Unterschiede. Diese Daten der mtDNA wurden meistens dahin gehend interpretiert, dass die Neandertaler und die modernen Menschen zwar in einem gewissen Zeitfenster im gleichen Gebiet nebeneinander gelebt haben (Sympatrie, Kapitel 10.5.5), dass aber keine Vermischung stattgefunden habe ‒ zumindest nicht über die weibliche Seite der Neandertaler. Wenn man jedoch annimmt, dass sich die beiden Gruppen kreuzten und die mitochondriale DNA der Neandertaler durch Zufallseffekte aufgrund genetischer Drift (Kapitel 10.5.4) verloren ging, so können dennoch bis zu 25 % des modernen mitochondrialen Genpools auf Neandertaler zurückgehen (Wall u. Hammer 2006).

Knochen stammt aus einer Schicht, die etwa 48.00030.000 alt ist und somit dem Zeitrahmen entspricht, in dem die Neandertaler auch in dieser Region lebten. Die Überraschung war aber groß, als sich zeigte, dass diese mitochondriale DNA mit durchschnittlich 385 Austauschen etwa doppelt soviele Unterschiede zum modernen Menschen aufweist wie die mitochondriale DNA des Neandertalers (siehe auch Abb. 14.16). Daraus kann man schließen, dass der letzte gemeinsame weibliche Vorfahre der Altai-Menschen, der Neandertaler und der modernen Menschen etwa vor 1 Million Jahren lebte. Andererseits zeigen andere Funde aus derselben Region des Altai Gebirges, dass dort in der Zeit vor etwa 40.000 Jahren Neandertaler, moderne Menschen und eben die „alten“ Altai-Menschen zusammen gelebt haben. Genaue Klärung der Frage, ob es sich um eine bisher unbekannte neue Menschenart handelt, kann aber erst die Analyse des Kerngenoms ergeben.

Im März 2010 berichtete die Gruppe um Svante Pääbo aus Leipzig von der molekularen Analyse der mitochondrialen DNA aus einem menschlichen Knochen, der im Altai Gebirge in Russland gefunden wurde (Krause et al. 2010). Der

Im Mai 2010 stellte ein großes internationales Konsortium unter der Federführung von Svante Pääbo (MPI für Evolutionäre Anthropologie - EVA, Leipzig) einen ersten „Entwurf “ für die Analyse der genomischen DNA des Neandertalers vor und haben es mit dem von 5 modernen Menschen verglichen. Die Autoren beantworten darin die Frage nach den Gemeinsamkeiten zwischen dem Neandertaler und dem modernen Menschen mit etwa 1-4% Dieses Ergebnis ist nicht vereinbar mit der Hypothese, dass alle

14.1 Genetische Aspekte zur Evolution des Menschen

modernen Menschen nur auf eine kleine afrikanische Population zurückgehen, die sich ohne Vermischung mit früheren homininen Formen über die Erde ausgebreitet hat. Vielmehr ist es eine Bestätigung der Vermutung, dass es zu Vermischungen gekommen ist – wie wir das auch an anderer Stelle schon gesehen haben. Die Frage nach der positiven Selektion von Genen des modernen Menschen kann mit der Neandertaler-Sequenz auch in einem ersten Ansatz beantwortet werden: es gibt 78 Nukleotid-Substitutionen in Protein-kodierenden Bereichen, an denen sich das Genom des modernen Menschen von dem des Neandertalers und des Schimpansen unterscheidet; insgesamt sind es 5 Gene, in denen mehr als eine fixierte Substitution die Primärstruktur des UrGens verändert (Green et al. 2010). Die Veröffentlichung des Neandertal-Genoms ist ein Meilenstein in der noch jungen Disziplin der Paläogenetik, und sie relativiert unsere bisherigen Vorstellungen von „klaren Verhältnissen“ bei unseren Vorfahren doch etwas. Eine weitere Methode, mit den bereits vorhandenen Sequenzdaten etwas Licht ins Dunkel der Neandertalergeschichte zu bringen, ist die Untersuchung des Kopplungsungleichgewichts (Kapitel 10.5.1) in verschiedenen menschlichen Populationen. Bei sehr unterschiedlichen Populationen ist dieses Kopplungsungleichgewicht so deutlich ausgeprägt, dass selbst nach Zehntausenden von Jahren, in denen die Kreuzungen zufällig geschahen, die Spuren noch nicht verwischt sind. Das möge folgendes Gedankenexperiment verdeutlichen: Wenn wir zum Zeitpunkt der Vermischung ein starkes Kopplungsungleichgewicht über das gesamte Genom zwischen den beiden Ausgangspopulationen annehmen, so besteht nach 15.000 Generationen (ca. 37.500 Jahren bei einer angenommenen Generationszeit von 25 Jahren) immer noch ein durchschnittliches Kopplungsungleichgewicht

von 0,07 cM ‒ das entspricht etwa 50 kb, wenn man eine durchschnittliche Rekombinationsrate von 1,25 cM/Mb annimmt (Wall u. Hammer 2006). Plagnol und Wall (2006) verglichen dazu die Polymorphismen in 135 Genen von 12 YorubaIndividuen aus Westafrika und 22 Europäern der CEPH-Datenbank (Centre d‘Etude du Polymorphisme Humain; http://www.cephb.fr/en/hgdp/. Sie verwendeten dazu verschiedene Evolutionsmodelle und verglichen diese mit der Verteilung der SNPs in beiden Populationen. Dabei zeigt sich, dass ein Modell mit folgenden Annahmen die beste Übereinstimmung mit den bekannten Sequenzdaten liefert (Abb. 14.17): ï geringe Wanderungsbewegungen zwischen der afrikanischen und europäischen Population auch nach der Trennung vor 130.000 Jahren; ï der Flaschenhals-Effekt in der europäischen Population ist älter als eine mögliche Vermischung; ï eine Populationsgröße von 10.000 diploiden Individuen mit einer Generationszeit von 20 Jahren. Das Modell erlaubt, die Nullhypothese (keine Vermischung) gegen die These mit Vermischung zu testen: Das Ergebnis zeigt, dass die Nullhypothese statistisch signifikant zurückgewiesen wird und eine Vermischungsrate von 5 % als wahrscheinlich angesehen wird. Dieses Ergebnis ist in hervorragender Übereinstimmung mit den experimentellen Daten aus der oben beschriebenen Sequenzanalyse der genomischen DNA des Neandertalers. Die Arbeit der Gruppe um Patrick Evans (2006) ergänzte dann diese statistische Betrachtung durch Untersuchungen einer chromosomalen Region (~ 29 kb), die das Gen Mikrocephalin (MCPH1) enthält. MCPH1 ist ein wichtiger

Abspaltung der Neandertaler vor ca. 400.000 Jahren Abzweigung vor ca. 130.000 Jahren

Beginn des Wachstums vor 80.000 Jahren

130facher Flaschenhals vor 60.000 Jahren Vermischung vor 50.000 Jahren Wanderung 1 Migration pro Individuum und 25.000 Generationen

Afrika

Abb. 14.17 Demographisches Modell für europäische und afrikanische Populationen mit den Angaben für die Parameter, die den Daten am besten angepasst sind. Die gestrichelten Li-

Beginn des Wachstums vor 10.000 Jahren Europa

nien repräsentieren die mögliche Vermischung mit einer alten Population. (Nach Plagnol u. Wall 2006)

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Kapitel 14: Genetik und Anthropologie

Regulator für die Gehirngröße; Mutation führen bei Menschen zu einer 3- bis 4fachen Verringerung des Gehirnvolumens, wobei allerdings die grundsätzliche neuronale Architektur nicht verändert ist. Außerdem zeigt das MCPH1-Gen eine starke positive Selektion in der Abstammungslinie des Menschen. Evans und seine

Mitarbeiter haben eine Haplotyp-Analyse (Abb. 10.42) in 89 menschlichen DNA-Proben durchgeführt, die die globale Verteilung der wichtigsten menschlichen Populationen repräsentieren. Die Analyse ergab, dass ein bestimmter Haplotyp („D“; Abb. 14.18a) vor ca. 37.000 Jahren aus einer Kopie entstanden ist und heute mit

Abb. 14.18 a–c a Verteilung der Bereiche, die in der 29-kb-Region des Mikrocephalin-Gens kongruent oder nahezu kongruent segregieren. Kongruente Bereiche sind so definiert, dass sie immer unterschiedliche Allele zwischen den „D“- und „Nicht-D“-Haplotypen zeigen; nahezu kongruente Bereiche sind solche, die sich in nicht mehr als vier Basen von den kongruenten Bereichen unterscheiden. Die Abschnitte, die für das abgeleitete D-Chromosom charakteristisch sind, sind durch lange blaue Striche gekennzeichnet; die Bereiche, die für das alte („Nicht-D“-)Chromosom charakteristisch sind, sind mit kurzen roten Strichen gekennzeichnet. Der SNP G37995C kann als diagnostischer Marker verwendet werden: G ist das alte Allel und C das neue. b, c Schematische Darstellung von zwei möglichen demographischen Szenarien, die mit der beobachteten Genealogie des Mikrocephalin-Locus vereinbar sind. In beiden Annahmen teilt sich eine ursprüngliche Population (grün) in zwei reproduktiv isolierte Populationen. Eine Population (rot) fixiert das „Nicht-D“-Allel, während die andere (blau) das

„D“-Allel fixiert. b Im ersten Szenario wird die blaue Population stark verkleinert, was auch die genetische Diversität deutlich vermindert (Flaschenhals-Effekt). Danach expandiert sie aber wieder und verschmilzt mit der anderen Population. c Im zweiten Fall ereignet sich eine seltene Kreuzung zwischen den beiden Populationen, die eine Kopie des „D“-Allels von der blauen in die rote Population bringt. Diese Kopie vervielfältigt sich anschließend in hoher Frequenz aufgrund eines positiven Selektionsdrucks. Da das erste Modell nur von der Demographie abhängt und keinerlei Selektion benötigt, sollte es sich auf das gesamte Genom in gleicher Weise auswirken. Das zweite Szenario benötigt stattdessen die Wirkung positiver Selektionskräfte in Bezug auf das eingekreuzte Allel und sollte daher keinen genomweiten Effekt haben. Die Beobachtung, dass die Genealogie von Mikrocephalin nicht repräsentativ für das gesamte Genom ist, spricht für die zweite Variante. (Nach Evans et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nationalen Akademie der Wissenschaften, USA)

14.1 Genetische Aspekte zur Evolution des Menschen

einer großen Häufigkeit von 70 % in der Menschheit verbreitet ist; dies ist ein deutliches Zeichen für eine „positive Selektion“ und nicht kompatibel mit der Annahme einer neutralen genetischen Drift. Die Autoren zeigen weiterhin, dass sich dieser Haplotyp D vor ca. 1,1 Millionen Jahren zunächst von der Linie des modernen Menschen getrennt hatte, aber vor ca. 37.000 Jahren wieder „eingekreuzt“ wurde (Abb. 14.18b, c). Als weitere Beispiele für „eingekreuzte“ Gene werden zurzeit der Bereich um das Gen für das Mikrotubulinassoziierte Protein Tau (MAPT) und das nicht funktionelle Pseudogen RRM2P4 auf dem X-Chromosom diskutiert (für eine Übersicht siehe Hawks et al. 2008). Für das MAPT-Gen existieren zwei unterschiedliche Haplogruppen (H1 und H2) in der Bevölkerung, die sich vor ungefähr 3 Millionen Jahren getrennt haben. Die H2-Haplogruppe ist bei Europäern relativ häufig, kommt aber bei Afrikanern sehr selten vor. Im Gegensatz zur H1-Gruppe, die viele Polymorphismen aufweist, sind derartige Sequenzunterschiede bei der H2-Gruppe eher selten. Die Entstehung der H2-Gruppe wird auf einen Zeitraum vor ungefähr 30.000 Jahren geschätzt, sodass eine Einkreuzung über den Neandertaler möglich erscheint. Die H2-Haplogruppe hat offensichtlich eine deutliche Schutzwirkung gegenüber der Parkinson‘schen Erkrankung (Kapitel 13.4.5) und anderer Neuropathien, was einen deutlichen Selektionsdruck erklärt. Es scheint also so zu sein, dass die bisher weit verbreitete Theorie der Verdrängung des Neandertalers durch den modernen Menschen neu durchdacht und zumindest in Teilen neu geschrieben werden muss. Allerdings scheinen solche adaptive Allele von archaischen Menschen eine gewisse Paradoxie darzustellen: Wir erkennen ja die archaischen Menschen gerade an ihrer Morphologie, und diese Morphologie ist ausgestorben. Wenn daher moderne Menschen noch adaptive Allele von archaischen Menschen enthalten, müssen wir für diese Vorläufer nach Fossilien suchen, die gerade nicht als archaisch angesehen werden ‒ sie müssen vielmehr den modernen Menschen ähnlicher sein, und so werden sie nicht unbedingt als archaisch erkannt. Hier kann also die moderne Genetik eine neue Sichtweise in die evolutionäre Anthropologie einbringen.

In Europa ist der Neandertaler ein Vorgänger des mo-

dernen Menschen; für etliche Jahrtausende bewohnten beide Arten denselben Lebensraum (Sympatrie). Die Analyse des mitochondrialen Genoms gibt keinen Hinweis darauf, dass es zu einer Durchmischung des genetischen Materials gekommen ist. Es gibt aber Hinweise auf eine Durchmischung aus einzelnen genomischen Regionen; der Gesamtbeitrag des Neandertalers am Genom des modernen Menschen wird auf 1–5 % geschätzt.

Eine besondere Herausforderung stellt die kürzliche Entdeckung der Skelette von Zwergmenschen in Indonesien dar, die nach ihrem Fundort als Homo floresiensis bezeichnet werden. Es handelt sich dabei um Menschen, die mit den modernen Menschen während des späten Pleistozäns zusammengelebt haben. Für ihre Existenz werden verschiedene Erklärungsmöglichkeiten diskutiert, z. B. eine Abstammung von Homo erectus oder eines früheren Vorfahren, pathologische Individuen einer Homo sapiens-Population oder eine zwergwüchsige Evolution aufgrund der isolierten Insellage aus einer ursprünglichen Homo sapiens-Population. In einer ausführlichen Übersicht diskutiert Gary Richards (2006) die Möglichkeit, dass es sich hierbei um eine Homo sapiens-Population handelt, bei der eine Kombination von Mutationen vorliegt, die einmal über die Wirkungsachse des Wachstumshormons (GH) und des Insulin-ähnlichen Wachstums-Faktors I (IGF1) zu einer Wachstumsreduktion führt und außerdem durch Mutationen in der Mikrocephalin-Genfamilie (MCPH; Kapitel 14.2.1) zu einer dramatischen Reduktion des Gehirnvolumens.

14.1.4 Die Unterschiedlichkeit moderner Menschen Seit 1919 werden Daten zur genetischen Variabilität des Menschen gesammelt ‒ zunächst auf Proteinebene, in jüngerer Zeit selbstverständlich über die DNA. Seit der Mitte der 1980er-Jahre dient dabei das Centre d`Etude du Polymorphisme Humain (CEPH) in Paris als zentrale Sammelstelle. Zunächst wurden hier Lymphoblasten-Zelllinien von 40 großen Familien gehalten, aus denen beliebige Mengen DNA gewonnen werden kann. Später wurden weitere Zelllinien angelegt; es sind derzeit (2009) 52 Populationen von allen 5 Kontinenten mit insgesamt 1063 Zelllinien vertreten (Abb. 14.19a). Diese Datensammlung hat viele der in den früheren Kapiteln beschriebenen Schlussfolgerungen über die Evolution des Menschen erst ermöglicht. Dabei sollte berücksichtigt werden, dass sich die mitochondriale DNA und die DNA aus dem nicht rekombinierenden Teil des Y-Chromosoms (Abb. 12.35 anders verhalten als DNA aus Autosomen: Beide werden nur über ein Elternteil vererbt (Mitochondrien über die Mutter; das Y-Chromosom über den Vater), sie sind haploid, und es findet keine Rekombination statt. Ihre Evolution über genetische Drift ist daher 4fach schneller als die bei autosomalen Genen. Beide Ansätze haben es ermöglicht, das Zeitfenster für den Ursprung des modernen Menschen abzuschätzen: vor etwa 160.000 Jahren (± 14 %), wenn man die mitochondriale DNA der modernen Menschen zugrunde legt, oder vor etwa 100.00 Jahren (± 20 %), wenn man die heutige Variabili-

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772 772

Kapitel 14: Genetik und Anthropologie

a a

Afrikaner 1 2 3 4 5 6 7

Bantu Mandenka Yoruba San Pygmäen (Mbuti) Pygmäen (Biaka) Mozabiten

Europäer 8 9 10 11 12 13 14 15

Orkadier Adygei Russen Basken Franzosen Norditaliener Sardinier Toskaner

Westasiaten

Ostasiaten

16 Beduinen 17 Drusen 18 Palästinenser

Zentral- und Südasiaten 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Balochi Brahui Makrani Sindhi Pathan Burusho Hazara Uygur Kalash

tät des Y-Chromosoms zugrunde legt. In Ergänzung zu der zeitlichen Abschätzung ermöglicht die Analyse der verschiedenen Populationen natürlich auch eine geographische Abschätzung und die Rekonstruktion von Wanderungsbewegungen. Eine erste Analyse der genetischen Struktur menschlicher Populationen auf der Basis von 377 Mikrosatelliten-Polymorphismen zeigt Abb. 14.19b. Wenn man dabei die Populationen nur in zwei Gruppen unterteilen möchte, fallen die Populationen aus Afrika, Europa, Mittel-, Süd- und Westasien zusammen ‒ die andere Gruppe wird aus Ostasien, Ozeanien und Amerika gebildet. Erlaubt man dagegen eine Unterteilung in 5 Gruppen, so spalten sich in der ersten Gruppe Population aus Afrika südlich der Sahara ab; in der zweiten Gruppe trennen sich die Bevölkerungsgruppen aus Ame-

28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Han (S. China) Han (N. China) Dai Daur Hezhen Lahu Miao Oroqen She Tujia Tu Xibo Yi Mongola Naxi Kambodschaner Japaner Jakuten

Ozeanier 46 Melanesier 47 Papuaner

Ureinwohner Amerikas 48 49 50 51 52

Karitiana Surui Kolumbianer Maya Pima

rika und die aus Ozeanien von den ostasiatischen Populationen. In Europa ist es wegen häufiger Wanderungsbewegungen offensichtlich schwierig, Substrukturen der Bevölkerungen zu erkennen. Mit geeigneten Verfahren lassen sich allerdings die Basken und Sardinier als ausgeprägte Gruppen erkennen (Rosenberg et al. 2002). Eine wesentlich detailliertere Analyse erlaubt heute die Tatsache, dass schon mehr als 2000 mitochondriale Genome sequenziert sind, sodass die grundlegende Verzweigungsstruktur in den meisten Teilen der Welt verstanden werden kann. Wie aber schon weiter oben angedeutet, lässt sich über die Zeit von vor 200.000 Jahren hinaus keine Aussage machen, da der letzte gemeinsame Vorfahr (die „afrikanische Eva“) schon zu etwa dieser Zeit gelebt haben muss; es gibt keine Sequenzda-

14.1 Genetische Aspekte zur Evolution des Menschen

Abb. 14.19 a, b Populationen im Human Genom Diversity Project. a Geographische Verteilung der untersuchten Populationen. b Analyse der genetischen Struktur verschiedener Bevölkerungsgruppen. Es wurden dafür 1056 Individuen aus 52 Populationen und allen Kontinenten in Bezug auf Polymorphismen an 377 Mikrosatelliten untersucht. Die Farben sind willkürlich gewählt, um den Grad der Mischung bei Individuen darzustellen; jeder Strich bedeutet ein Individuum. Wenn man alle Daten auf nur zwei Gruppen aufteilt, trennt sich Ostasien und Ozeanien/ Amerika von den westlichen Populationen in Afrika, Europa und West-, Süd- und Zentralasien. Diese Verteilung spiegelt die Tatsache wider, dass die erste Wanderung aus Afrika nach Ostasien ging. Bei einer Aufteilung auf drei Gruppen spalten sich die Populationen aus dem südlichen und zentralen Afrika von den anderen ab. Bei einer Unterteilung in vier Gruppen gibt es die Spaltung der ostasiatischen Populationen von denen der amerikanischen Ureinwohner, und bei fünf Gruppen erscheinen die ozeanischen Populationen als deutlich unterscheidbar von den anderen. (Nach Cavalli-Sforza 2005, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

b

ten der mitochondrialen DNA der heutigen Menschen, die einen Rückschluss auf frühere Ereignisse zulassen. Der Stammbaum der afrikanischen Menschen ist in Abb. 14.20 dargestellt; dabei zeigt die Haplogruppe L3

die meisten Verzweigungen; diese Haplogruppe repräsentiert die heute lebenden Äthiopier und bestätigt erneut die These, dass die letzte Auswanderungswelle am Horn von Afrika ihren Ursprung hat.

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Abb. 14.20 Phylogenie afrikanischer mtDNA-Haplogruppen mit einer Zeitachse (links) auf der Basis von 25 individuellen Sequenzen. Die Mutationen (Zahlen) sind im Vergleich zu der überarbeiteten Cambridge-Referenz-Sequenz (rCRS; rechts, gestrichelte Linien) angegeben; angehängte Buchstaben geben die neue Base an; +/− bedeutet Insertion/Deletion, und Mutationen, die wiederholt vorkommen, sind unterstrichen.

Die Verzweigungspunkte im Stammbaum sind gelb unterlegt. Die hellblauen Sequenzen stammen von Äthiopiern, die weißen von Nigerianern (13, 18, 21) bzw. Personen aus der Dominikanischen Republik (1, 2, 5, 14–16, 22). (Nach Torroni et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

774 774 Kapitel 14: Genetik und Anthropologie

14.1 Genetische Aspekte zur Evolution des Menschen

Die Haplogruppen M, N und R leiten sich von L3 ab und sind die „Gründer“ aller anderen Haplogruppen außerhalb von Afrika. Ihre Entwicklung ist im afrikanischen Stammbaum nur am Rande dargestellt; eine grobe Übersicht für die Entwicklung der europäischen Haplogruppen N und R zeigt Abb. 14.21a. Die komplette mtDNA-Phylogenie bestätigt, dass die europäischen Variationen in die westliche eurasische Variation eingebettet sind. Wenn man sie aber mit der südasiatischen Variation vergleicht, fällt eine Verarmung in der Zahl der unabhängigen basalen Linien auf. Die meisten europäischen mtDNA-Variationen starten von drei Linien (Abb. 14.21a): R, JT und U ‒ sowie in geringem Ausmaß von den drei N-Linien (N1, N2 und X). Diese geringe Zahl an basaler Variation lässt auf eine eher bescheidene Rolle Europas innerhalb der ursprünglichen Wanderung out of Africa schließen. Der Ursprung der europäischen Linien wird auf den Zeitraum von vor 50.000 bis 40.000 Jahren datiert. Wenn man nun die geographische Verteilung der europäischen Haplogruppen genauer betrachtet, dann fällt auf, dass die ältesten Haplogruppen in der baskischen Region des Golfs von Biskaya liegen (Abb. 14.21b‒e). Die Daten können so interpretiert werden, dass diese Region während der letzten Eiszeit einer Population als Rückzugsraum gedient hat und diese sich nach dem Ende der Eiszeit von dort wieder über den Kontinent ausgedehnt hat; etwa drei Viertel der mtDNA der heutigen Europäer stammt von ursprünglichen mesolithischen oder paläolitischen Vorläufern. Allerdings bedarf eine noch feinere Auflösung der Populationsstrukturen und Wanderungsbewegungen einer noch wesentlich größeren Anzahl von Proben. Eine etwas andere Strategie verfolgt das HapMap-Projekt (http://www.hapmap.org/index. html.en). Hier geht es darum, auf der Basis von SNPs Haplotypen zu erstellen. Die Basis dafür ist die Tatsache, dass wir unter 1000 Basen etwa 1 SNP finden; das bedeutet eine Gesamtzahl von etwa 3 Millionen SNPs. Aus den Arbeiten über Rekombinationshäufigkeiten wissen wir, dass Marker immer in Gruppen übertragen werden; dafür hat sich der Begriff der Haplotypen eingebürgert (Abb. 10.42); ein Haplotyp umfasst im Mittel etwa 20 SNPs. Abb. 14.22 zeigt die daraus folgende „mosaikartige Struktur“ des menschliAbb. 14.21 a–e mtDNA-Haplogruppen in Europa. a Stammbaum der wichtigsten europäischen mtDNA-Haplogruppen. Knotenpunkte mit vielen Verzweigungen sind orange dargestellt. b–e Die geographische Verteilung verschiedener Häufigkeiten einzelner mtDNA-Haplogruppen ist gezeigt: b H1; c H3; d V; e U5b. Rechts ist eine Farbskala der relativen Häufigkeiten zu sehen. (Nach Torroni et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

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Kapitel 14: Genetik und Anthropologie a

Haplotyp-Block b Individuum 1

Individuum 2

Abb. 14.22 a, b Die Mosaik-Struktur unseres Genoms. a Jedes menschliche Chromosom besteht aus DNA-Abschnitten (Haplotyp-Block) mit 3 bis 7 Allelen (mit Häufigkeiten über 5 % in der Population), die auch für die meisten Unterschiede zwischen den Menschen verantwortlich sind. Jeder Haplotyp ist hier mit einer anderen Farbe dargestellt. Der Katalog der Haplotypen ergibt die „Haplotyp-Karte“ des Menschen. b Es sind die Chromosomen zweier hypothetischer Individuen ge-

zeigt. Jedes Individuum trägt zwei Kopien von jedem Block. Die Chance, dass die zwei Haplotypen eines Blocks identisch sind, liegt bei etwa 20 %; es gibt im Mittel etwa 5,5 verschiedene Haplotypen pro Block. Die Haplotyp-Blöcke in Afrika sind tendenziell kürzer; die speziesspezifische Blocklänge liegt bei etwa 10.000 bp. Beachte, dass es nicht im gesamten Genom definierbare Haplotyp-Strukturen gibt. (Nach Pääbo 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Abb. 14.23 a, b Rekombinationsraten in der Nachbarschaft von Genen. a Es sind die Rekombinationsrate, die Häufigkeit des Sequenzelementes (5´-CCTCCCTNNCCAC-3´), das mit hoher Rekombinationshäufigkeit assoziiert ist, und der G+CGehalt in der Umgebung von Genen angegeben; die blaue Linie markiert den Mittelwert. Für die Rekombinationsrate geben die grauen Linien die Quartilen der Verteilung an (d. h. 50 % aller Werte liegen zwischen diesen beiden Kurven). Die mittlere punktierte Linie gibt den medianen Mittelpunkt der Transkriptionseinheit an; die Linie links davon den 5´-Bereich

und rechts den 3´-Bereich. Beachte den scharfen Abfall der Rekombinationshäufigkeit innerhalb der Transkriptionseinheit sowie die lokalen Anstiege in der Umgebung des Transkriptionsstarts und der langsame Abfall am 3´-Ende. b Rekombinationsraten innerhalb von Genen mit unterschiedlichen Aufgaben. Die Abbildung zeigt die Abweichungen vom genomischen Mittelwert. Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der untersuchten Gene an. (Nach International HapMap-Consortium 2007, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

14.2 Der Mensch und sein Gehirn

chen Genoms. Das HapMap-Konsortium analysiert SNPs in drei Populationen (Ostasien: China/Japan; Amerika/Europa: Utah; Westafrika: Nigeria) und stellt sie der Öffentlichkeit zur Verfügung. Zurzeit (2010) enthält die Sammlung die DNA von 270 verschiedenen Personen aus den drei Populationsbereichen; darin sind etwa 3,1 Millionen SNPs analysiert. Es kann erwartet werden, dass mit diesem Ansatz nicht nur Referenzmaterial für eine Reihe epidemiologischer Studien zur Verfügung steht, sondern auch zusätzliche Informationen über Wanderungsbewegungen während der Evolution des Menschen gewonnen werden können. Aktuelle Informationen finden sich im Internet unter http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/abouthapmap. html. Unabhängig von den globalen evolutionären Aspekten hat die Analyse der Haplotypen auch deutliche Hinweise auf Bereiche in menschlichen Genomen ergeben, an denen besonders häufig Rekombinationsereignisse stattfinden ‒ es sind knapp 33.000! Offensichtlich sind die Stellen hoher Rekombinationshäufigkeit (engl. recombination hot spots) besonders häufig in den G/Chaltigen Promotorbereichen von Genen, wohingegen innerhalb der codierenden Sequenz deutlich weniger Rekombinationsereignisse stattfinden. Ein zweiter Gipfel erhöhter Rekombinationshäufigkeit findet sich am 3`-Ende der Gene. Allerdings scheinen unterschiedliche Gene in verschiedenem Ausmaß von der Rekombinationshäufigkeit betroffen zu sein: Dabei liegen die Gene der Immunabwehr an der Spitze (Kapitel 8.4), gefolgt von Genen für Zelladhäsionsmoleküle und für Proteine der extrazellulären Matrix; am anderen Ende der Skala, d. h. Gene mit ausgesprochen niedriger Rekombinationsrate, stehen Gene, die für Chaperone, Ligasen oder Isomerasen codieren (Abb. 14.23).

Die Sequenzierung der menschlichen mtDNA in vielen

Bevölkerungsgruppen der Welt bestätigt den Ursprung der Menschheit in Afrika. Eine genaue Analyse ergibt, dass nur ein kleiner Teil davon nach Europa eingewandert ist. Am Ende der letzten Eiszeit erfolgte die Wiederbesiedelung Europas aus den Rückzugsgebieten in Südwestfrankreich/Nordspanien.

Auch das menschliche Y-Chromosom ist für evolutionsgenetische Untersuchungen hervorragend geeignet (zur Evolution des menschlichen Y-Chromosoms siehe auch Abb. 12.34). Im Gegensatz zur mtDNA wird das Y-Chromosom nur über die väterliche Linie vererbt und bietet damit ein komplementäres Abbild zu den Erkenntnissen, die über die mtDNA gewonnen werden. Der Bereich, der nicht zur pseudoautosomalen

Region gehört (und das sind immerhin ca. 57 Mb der insgesamt 60 Mb; Abb. 12.35), liegt als haploide Region in männlichen Zellen vor. Damit fehlt ihm der natürliche Rekombinationspartner, und so bleiben die Kombinationen der verschiedenen Allele auf dem Y-Chromosom in der Regel über Generationen männlicher Verwandter hinweg unverändert. Chromosomale Rearrangements sind also selten, sodass die überwiegende Zahl der Mutationen einfach verfolgt werden kann. Studien an Y-Chromosomen sind daher besonders interessant, weil sie überwiegend nur solche Mutationen zeigen, die das Ergebnis intra-alleler Prozesse sind ‒ andere Faktoren, die in anderen Chromosomen hinzukommen, entfallen hier. Daher kann man in populationsgenetischen Untersuchungen erwarten, dass im Y-Chromosom eine geringere Häufigkeit von Sequenzunterschieden als im übrigen Genom zu finden ist, was auch tatsächlich beobachtet wurde. Auf der Basis dieser Untersuchungen ist es auch möglich, verwandtschaftliche Zusammenhänge verschiedener menschlicher Populationen im evolutionären Zusammenhang darzustellen. Auch die Forschung am Y-Chromosom stützt die These, dass Vorfahren der heutigen Menschen vor etwa 70.000 bis 50.000 Jahren aus Afrika ausgewandert sind und dass offensichtlich zwei verschiedene Untergruppen den Rest der Welt besiedelten: eine Südostasien und Australien und die andere Nordwestasien und Europa (Nord- und Südamerika wurden erst wesentlich später besiedelt; Abb. 14.24).

14.2 Der Mensch und sein Gehirn Unter den Merkmalen, die den modernen Menschen von den anderen Primaten, aber auch von seinen früheren Vorfahren unterscheidet, ist das größere (und leistungsfähigere) Gehirn von herausragender Bedeutung. Wir wollen uns in diesem Kapitel zunächst noch einmal der Evolution zuwenden und der Frage nachgehen, ob es Gene gibt, die sich auf die Gehirnentwicklung auswirken und sich durch besondere Charakteristika während der Evolution auszeichnen. Mit der Gehirnentwicklung unmittelbar verknüpft sind Leistungen wie Sprache und Schrift, die auch vielfach als spezifisch menschlich betrachtet werden. Auch die Frage des Bewusstseins wird häufig als ein Charakteristikum des Menschen bezeichnet, das untrennbar mit der besonderen Komplexität seines Gehirns verbunden sei. Schließlich wird uns dieses Kapitel zu der häufig diskutierten Frage der Willensfreiheit führen. Auch wenn die Genetik hier (noch) keine befriedigenden Antworten geben kann, können vielleicht doch einige Ansätze aufgezeigt werden, wie man eine Antwort finden könnte.

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Kapitel 14: Genetik und Anthropologie

14.2 Der Mensch und sein Gehirn

Abb. 14.24 a, b Evolution des Y-Chromosoms und geographische Verteilung seiner Haplotypen. a Der Stammbaum des Y-Chromosoms ist als Funktion seiner Haplotypen A bis R dargestellt. Untergruppen, die nicht durch die Existenz von Markern belegt werden können, sind durch ein Sternchen hervorgehoben (z. B. P*). Das Nomenklatursystem erlaubt auch die Vereinigung zweier Haplotypen wie D und E (= DE). b Die weltweite Verteilung der Y-chromosomalen Haplotypen ist durch die bunten Kreise angedeutet; jeder Kreis entspricht einer Bevölkerungsgruppe mit einem definierten Haplotyp (siehe a). Es ist auffallend, dass zwischen direkt benachbarten Bevölkerungsgruppen große Ähnlichkeiten herrschen, dass aber große Unterschiede zu weiter entfernt wohnenden Populationen bestehen. Die Populationen sind folgendermaßen bezeichnet:

1, !Kung; 2, Pygmäen; 3, engl. Bamileke; 4, engl. Fali; 5, Senegalesen; 6, Berber; 7, Äthiopier; 8, Sudanesen; 9, Basken; 10, Griechen; 11, Polen; 12, Samen; 13, Russen; 14, Libanesen; 15, Iraner; 16, Georgier; 17, Kasachen; 18, Punjabis; 19, Usbeken; 20, Nentsi (Ural); 21, Chanten; 22, Östliche Evenken; 23, Burjaken; 24,. Evenen; 25, Eskimos; 26, Mongolen; 27, Evenken; 28, Han (Nordchina); 29, Tibeter; 30, Taiwanesen; 31, Japaner; 32, Koreaner; 33, Philipinos; 34, Javanesen; 35, Malayen; 36, Neu-Guineaner (Hochland); 37, Neu-Guineaner (Küste); 38, Australier (Arnhem); 39, Australier (Sandwüste); 40, Bewohner der Cook-Inseln; 41, Tahitianer; 42, Maori; 43, Navajo-Indianer; 44, Cheyenne-Indianer; 45, Mixteken; 46, Makiritare; 47, Cayapa-Indianer; 48, Grönländische Inuit. (Nach Jobling u. Tyler-Smith 2003, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

14.2.1 Evolution des menschlichen Gehirns

Expressionsmuster bzw. der Expressionsstärke von Genen zwischen den verschiedenen Spezies zu suchen. Unter den Genen, die einzigartige Muster in Bezug auf ihre Evolution zeigen, sind einige, die mit besonderen kognitiven Fähigkeiten des Menschen in Verbindung gebracht werden. In Bezug auf die Gehirngröße werden besonders zwei Gene diskutiert: MCPH1 (Mikrocephalin) und ASPM, ebenfalls ein Mikrocephalieassoziertes Gen, das Homologien zum Drosophila-Gen abnormal spindle aufweist (engl. abnormal spindle-like, microcephaly associated). Mutationen in beiden Genen führen bei Menschen zu primärer Mikrocephalie, einer Entwicklungsstörung des Gehirns, die zu einer Verminderung der Gehirngröße auf ein Drittel führt; die Gehirngröße dieser Menschen liegt damit in der Grö-

Nachdem die entscheidenden genomweiten DNASequenzen nicht nur des modernen Menschen, sondern auch des Neandertalers, des Schimpansen und des Makaken jetzt vorliegen, gibt es erstmals die Möglichkeiten, gezielt nach Unterschieden zu suchen, die mit der beschleunigten Entwicklung des Gehirnwachstums zusammenhängen könnten. In den nächsten Jahren werden auch noch weitere Affengenome für diese Analyse zur Verfügung stehen, sodass wir mit detaillierteren Informationen rechnen können. In Ergänzung dieses Ansatzes, der zunächst nur auf dem reinen Sequenzvergleich beruht, werden auch verstärkt Anstrengungen unternommen, systematisch nach Unterschieden im

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Kapitel 14: Genetik und Anthropologie

Abb. 14.25 a, b Die evolutionäre Vergrößerung des Primatenhirns steht in starkem Kontrast zur pathologischen Reduktion der Gehirngröße bei primärer Mikrocephalie. a Die Primatenschädel zeigen eine deutliche Zunahme der Gehirngröße während der Evolution (von unten nach oben: Makake: 100 g; Orang-Utan: 400 g; Schimpanse: 400 g; Mensch: 1350 g). b Magnetresonanz-Bilder eines gesunden Menschen (links)

und eines Patienten mit primärer Mikrocephalie und einer MCPH1-Mutation (rechts). In der primären Mikrocephalie ist das Gehirnvolumen deutlich vermindert; insbesondere ist der cerebrale Cortex wesentlich kleiner und zeigt eine verminderte Faltung und ein vereinfachtes gyrales Muster. (Nach Ponting u. Jackson 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

ßenordnung früher Hominiden (Abb. 14.25). Die Erkrankung folgt einem klassischen rezessiven Erbgang und ist mit einem moderaten Verlust kognitiver Fähigkeiten verbunden, aber überraschenderweise nicht mit signifikanten neurologischen Fehlfunktionen. Der cerebrale Cortex hat dabei ein vereinfachtes gyrales Muster ohne größere Veränderungen der cortikalen Architektur. Zusammen mit den charakteristischen Veränderungen der Gesichtsform haben diese Befunde zu der Annahme geführt, dass es sich bei der primären Mikrocephalie um eine atavistische Erkrankung handelt, die zu

einer Urform zurückführt. Kopplungsanalysen haben gezeigt, dass es insgesamt sechs Genorte für primäre Mikrocephalie gibt; zwei Gene wurden identifiziert und sollen im Folgenden diskutiert werden: MCHP1 und ASPM. Es sei an dieser Stelle auch noch einmal auf die Hypothese hingewiesen, dass die „Flores-Menschen“ an einer derartigen Erkrankung gelitten haben können. Das MCPH1-Gen (OMIM 607117; chromosomale Lokalisation 8p23) besteht aus 14 Exons und codiert für ein Protein aus 835 Aminosäuren. Sequenzvergleiche mit anderen humanen Genen deuten auf eine

14.2 Der Mensch und sein Gehirn

Abb. 14.26 a, b Die MCPH1- und ASPM-Gene. a Mikrocephalin (MCPH1) besteht aus 14 Exons und codiert für ein Protein aus 835 Aminosäuren. Es soll drei BRCA1-C-terminale (BRCT) Domänen enthalten, die erste und zweite sind durch ca. 500 Aminosäuren voneinander getrennt (IBS: Inter-BRCT-Domänen-Sequenz). Die roten Exons waren in hohem Maße einer adaptiven Evolution ausgesetzt (KA/KS > 3 zwischen den Vorfahren der Altweltaffen und den Menschenaffen), wohingegen Selektionsmechanismen vor allem im Bereich der BRCT-Domänen wirksam waren. b Das ASPM-Gen (engl. abnormal spindle-

like microcephaly-associated) hat 28 Exons und codiert für ein sehr großes Protein (3477 Aminosäuren), das in vier Bereiche eingeteilt werden kann: eine N-terminale Mikrotubulin-bindende Region (violett), eine Calponin-homologe Region (gelb), viele IQ-Calmodulin-bindende Regionen (IQ: Isoleucin- und Glutamin-haltige Bereiche; rot) und eine C-terminale Region (blau). Die Exons 3 und 18 (rot) waren in hohem Maße einer adaptiven Evolution ausgesetzt (signifikante Erhöhung des KA/ KS–Verhältnisses). (Nach Ponting u. Jackson 2005, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Verwandtschaft zu Genen, die für das TopoisomeraseII-Bindungsprotein und das Tumorsuppressorprotein BRCA1 codieren. Das Protein enthält drei BRCTDomänen (engl. BRCA1 C-terminal domain; Abb. 14.26a), die häufig in Proteinen vorkommen, die an DNA-Reparatur und Zellzyklus-Kontrolle beteiligt sind. In Familien mit Mikrocephalie-Patienten wurden zwei rezessive Mutationen in diesem Gen gefunden, die jeweils zu einem vorzeitigen Stoppcodon und damit einem vollständigen Funktionsverlust führen. Es ist allerdings noch unklar, wie eine mögliche Funktion bei DNA-Reparatur und Zellzyklus-Kontrolle zu der beobachteten massiven Veränderung der Gehirngröße führt; es wird diskutiert, dass ein verstärktes Absterben von Zellen während der Neurogenese daran beteiligt sein könnte (Ponting u. Jackson 2005). Aber das MCHP1-Gen ist nicht nur wegen seiner pathologischen Mutationen interessant ‒ es zeigt auch eine beschleunigte Evolution in der Entwicklungslinie der gemeinsamen Vorläufer von Affen und Menschen. In den vergangenen 25 bis 30 Millionen Jahren wurden etwa 45 vorteilhafte Aminosäureveränderungen fixiert, was die Hypothese unterstützt, dass das MCPH1-Gen für die Vergrößerung des Gehirns in der menschlichen Entwicklung bedeutsam war. Auch das MCPH1-Gen des modernen Menschen zeigt eine auffällige Heterogenität, nämlich 22 SNPs in der codierenden Region, wovon 15 zu Aminosäureveränderungen führen. Sta-

tistische Analysen deuten darauf hin, dass die Sequenzunterschiede im MCPH1-Gen durch eine Kombination der jüngeren Ausdehnung der Populationsgröße als auch durch starke positive Selektion verursacht sind. Von besonderer Bedeutung scheint das C-Allel des SNPs G940C (Position der mRNA; im Exon 8) zu sein, das die Aminosäure 314 von Asparaginsäure zu Histidin verändert; allerdings ist zurzeit (April 2010) noch umstritten, ob bei diesem SNP tatsächlich eine positive Selektion wirksam war oder ob die Anhäufung dieses SNPs allein durch das Wachstum der Population erklärt werden kann (siehe auch den Hinweis über die Einkreuzung eines MCPH1-enthaltenden Haploblocks aus dem Neandertaler-Genom; Abb. 14.18). Wie MCPH1 wurde auch ASPM durch positionelle Klonierung konsanguiner Familien mit MikrocephalieErkrankungen als betroffenes Gen identifiziert. Bisher wurden über 20 Mutationen in diesem Gen identifiziert ‒ alle führen zu vorzeitigem Kettenabbruch und dem vollständigen Funktionsverlust des Gens. Das ASPM-Gen (OMIM 605481; Chromosom 1q31) umfasst 28 Exons in über 60 kB und bildet eine mRNA von ~ 9,5 kb; es codiert entsprechend für ein sehr großes Protein von 3477 Aminosäuren (Abb. 14.26b). Die Funktion des ASPM-Gens ist noch weitgehend unbekannt; bei Mäusen wird es überwiegend während der embryonalen Entwick-

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Kapitel 14: Genetik und Anthropologie

lung des Gehirns in der cortikalen ventrikulären Zone exprimiert, aber auch nach der Geburt in den Bereichen, in denen weiterhin Neurogenese stattfindet. Das homologe Protein bei Drosophila hat eine wichtige Aufgabe bei der Organisation der Mikrotubuli und dem Aufbau des Spindelapparates während der Mitose. In Neuroblasten der Fliege muss die mitotische Spindel rechtwinklig zur Epitheloberfläche angeordnet sein, um so eine korrekte Orientierung der Furchung während der asymmetrischen Zellteilung zu ermöglichen. Es wird daher derzeit darüber spekuliert, dass die bekannten ASPM-Mutationen die Orientierung der Spindel während der Mitose beeinflussen und dadurch die Zahl der neuralen Zellen aufgrund eines veränderten Verhältnisses von asymmetrischen zu symmetrischen Zellteilungen vermindert wird. In der Summe kann dies zu einer Verringerung der Gehirngröße führen. Das ASPM-Gen hat offensichtlich einige adaptive Veränderungen in der jüngeren Phase der menschlichen Evolution erfahren. Seit der Abspaltung vom gemeinsamen Vorfahren mit den Schimpansen haben sich an 15 Stellen Veränderungen ergeben. Besonders betroffen davon sind die beiden großen Exons 3 und 18, wohingegen die konservierten Domänen von evolutiven Veränderungen nur in geringerem Ausmaß erfasst wurden. Eine besondere genetische Variante entstand im ASPMGen erst vor etwa 5800 Jahren und ist heute mit hoher Frequenz in den menschlichen Populationen verbreitet, was auf eine starke positive Selektion hindeutet. Es konnte bisher jedoch keine Assoziation der verschiede-

nen nicht-pathogenen Allele zur Größe des Gehirns nachgewiesen werden. Eine interessante Beobachtung ist allerdings, dass die entwicklungsgeschichtlich älteren Allele in Populationen vorkommen, die eine tonale Sprache entwickelt haben (Bishop 2009).

Abb. 14.27 HAR1F und die Entwicklung des cerebralen Cortex. Links: In der HAR1-Region, die in einem mutmaßlich nicht-codierenden RNA-Gen liegt, sind 18 humanspezifische Nukleotid-Substitutionen fixiert (hellgrün), seit sich die Entwicklungslinien des Menschen und des Schimpansen vor ca. 7 Millionen Jahren getrennt haben. Die vorhergesagte Sekundärstruktur dieser Region ist für das Vorwärts-Transkript (HAR1F) des Menschen und des Schimpansen dargestellt. In der humanen Struktur ist eine RNA-Helix selektiv verlängert (Pfeil). Mitte: Es ist ein Ausschnitt aus dem sich entwickelnden Cortex gezeigt. Neurone (grün) wandern entlang der radialen

Glia (blau; VZ: ventrikuläre Zone; BL: Basallamina; CP: cortikale Platte; IZ: intermediäre Zone). Cajal-Retzius-Zellen (rot) in der marginalen Zone (MZ) exprimieren sowohl HAR1F als auch Reelin; Reelin ist an der richtigen Ausbildung der Schichtung des Cortex beteiligt. Rechts: In Wildtyp-Mäusen bilden sich 6 Schichten, die die weiße Substanz überlagern (engl. white matter, WM). In Reelin-Mutanten (Reeler) erscheinen diese Schichten desorganisiert bzw. invertiert; weitere Arbeiten müssen zeigen, inwieweit auch HAR1 an dieser Musterbildung beteiligt ist. (Nach Amadio u. Walsh 2006, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

Ein Gen ganz anderer Art wurde von Pollard et al. 2006 beschrieben: eine nicht-codierende RNA, die als HAR1F bezeichnet wird (engl. human accelerated region 1F). Dazu wurde eine genomweite Überprüfung auf Regionen durchgeführt, die bei Säugern hochkonserviert sind und die in der humanen Linie einer plötzlichen und schnellen Evolution ausgesetzt waren. Unter 49 Regionen, die in der menschlichen Region einer beschleunigten Evolution ausgesetzt waren, ist HAR1 diejenige, die sich am schnellsten entwickelt hat: Es handelt sich dabei um einen Abschnitt von 118 bp in der letzten Bande des langen Arms auf dem Chromosom 20. Die HAR1Sequenz (Abb. 14.27) ist unter den Amnioten hochkonserviert und unterscheidet sich in nur zwei Positionen zwischen Hühnern und nicht menschlichen Primaten ‒ sie hat aber 18 fixierte Substitutionen in der kurzen Entwicklungszeit, die die Menschen von seinen gemeinsamen Vorfahren mit den Schimpansen trennt. HAR1 wird als Teil zweier überlappender Gene transkribiert: HAR1F, das HAR1 in seinem ersten Exon enthält, und HAR1R, ein alternativ gespleißtes Gen, das HAR1 in seinem letzten Exon enthält. Mit Ausnahme des HAR1-Segmentes sind die beiden Transkripte HAR1F und HAR1R nur schwach konserviert. Da weder

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HAR1F noch HAR1R für Proteine codieren, stellt sich die Frage nach der biologischen Funktion dieser nichtcodierenden RNA (ncRNA), die auch keinerlei Homologie zu bekannten tRNAs oder miRNAs aufweist (Kapitel 7.4 und 7.5). Für das HAR1-Segment wird eine stabile Sekundärstruktur vorhergesagt, die fünf Helices enthält. Die Sequenz des Schimpansen unterscheidet sich in ihrer Struktur deutlich von der humanen Sequenz, bei der eine Helix sich auf Kosten der benachbarten deutlich vergrößert hat. Genaue Sequenzvergleiche machen auch deutlich, dass alle 18 humanspezifischen Austausche von A/T nach G/C erfolgt sind, also eine Verstärkung der Basenpaarbindung bewirken (Kapitel 2.1). Erstaunlicherweise betrifft diese Verstärkung der Basenpaarbindung nicht nur das HAR1-Element, sondern umfasst eine wesentlich größere Region von insgesamt 1,2 kb. HAR1F (nicht aber HAR1R!) wird während der Embryonalentwicklung im menschlichen Gehirn zwischen der 7. und 19. Schwangerschaftswoche exprimiert ‒ einer Zeit, die für die Wanderung cortikaler Neuronen als besonders kritisch angesehen wird. Außerdem wird

HAR1F offensichtlich zusammen mit Reelin exprimiert, das an der Ausbildung der verschiedenen Schichten des cerebralen Cortex beteiligt ist. Es wird diskutiert, das HAR1R möglicherweise später exprimiert wird und als antisense-Transkript die Expression von HAR1F reguliert. Das Beispiel der nicht-codierenden HAR1F/ HAR1R-Gene zeigt, dass es jenseits der Protein-codierenden Gene wichtige Aspekte gibt, die sicherlich ihren Beitrag zur spezifischen Evolution des Menschen und seines Gehirns leisten ‒ es ist aber noch ein weiter Weg bis zum vollen Verständnis ihrer Funktion. Neben der spezifischen Änderung einzelner Basen spielen zwei andere Mechanismen in der Evolution allgemein, aber auch in der Evolution des Menschen eine wichtige Rolle: Duplikationen im Genom, die zu einer Erhöhung der Gendosis führen und in vielen Fällen auch zu einer entsprechenden Erhöhung der Zahl entsprechender Transkripte, aber auch die Veränderung der Regulation der Genexpression, die sich natürlich auch auf die Transkriptzahl auswirkt. Beide Mechanismen können durch entsprechende gewebespezifische Untersuchungsverfahren nachgewiesen werden, die auf der Basis von Hybridisierungsarrays basieren (Technik-Box 30). Solche Untersuchungen der Genexpression sind immer relativ, d. h. die Frage nach Ursache und Wirkung bleibt oft unklar. Dennoch bleibt es interessant, festzuhalten, dass im menschlichen Gehirn relative Veränderungen der Genexpression sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Proteinebene bei etwa 30 % der exprimierten Gene anzutreffen sind (Carroll 2003). Ein aktuelles experimentelles Beispiel zeigt Abb. 14.28.

Einige Gene, die an der Entwicklung des Gehirns beteiligt sind, zeigen eine positive Selektion in der menschlichen Linie. Dazu gehören Gene wie MCPH1 und ASPM, bei denen Mutationen zu Mikrocephalie führen, als auch Gene, die die Information für nicht-codierende RNAs enthalten (HAR1F).

14.2.2 Genetische Aspekte zur Evolution der Sprache

Abb. 14.28 Array-basierte genomweite Untersuchung von cDNA für Gene, die in der humanen Entwicklungslinie verändert exprimiert werden und mit der Gehirnentwicklung assoziiert sein können. Die Gensymbole sind angegeben. H: Mensch; B: Bonobo; C: Schimpanse; G: Gorilla; O: Orang-Utan. (Nach Sikela 2006)

Die menschliche Sprache erscheint in der Natur einzigartig. Die tierische Kommunikation ist überwiegend auf einfache Botschaften wie Alarmrufe und Identifikationssignale beschränkt. Im Gegensatz dazu verfügt der Mensch über ein Vokabular von Zehntausenden von Worten und kann diese in einer komplexen grammatikalischen Struktur benutzen. Auch wenn einige Schimpansen ein gewisses Sprachverständnis entwickeln, so bleibt ihr Wortschatz doch sehr beschränkt (etwa 500 Worte) und kommt über den eines Kleinkindes nicht hinaus.

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Gehirnhälfte sind dagegen eher für die Sprachmelodie verantwortlich. Allerdings sind weder das Broca- noch das Wernicke-Areal vollständig der Sprachverarbeitung gewidmet, und sie sind auch nicht spezifisch für den Menschen. Es ist vielmehr allgemein akzeptiert, dass die Sprachfähigkeit die Beteiligung eines komplexen Netzwerks cortikaler und subcortikaler Schaltkreise erfordert. Weitere wichtige Regionen für die Sprachfähigkeit sind Bereiche des Striatum, Thalamus und Cerebellum. Wenn wir uns jetzt den genetischen Aspekten der Evolution unserer Sprache zuwenden wollen, so werden wir analog vorgehen müssen wie in anderen Bereichen auch. Dazu gehören Fragen nach der Evolution der morphologischen Strukturen, des Weiteren genomweite Sequenzvergleiche unter Primaten, aber auch die Untersuchung spezifischer Krankheitsbilder, die die Sprechfähigkeit massiv beeinträchtigen und außerdem eine erbliche Grundlage haben.

Abb. 14.29 a, b Die neuronale Basis der Sprache. a Die neuronale Basis wird häufig in zwei diskreten Regionen des lateralen Cortex gesehen: dem Broca-Areal am Gyrus inferior frontalis und das Wernicke-Areal im Gyrus superior temporalis und in den verbindenden Fasern (Fasciculus arcuatus). Beide Regionen wurden aufgrund von Ausfallserscheinungen nach Gehirnverletzungen definiert: Die Broca-Aphasie erlaubt nur eine schlecht artikulierte Sprache mit wenigen Worten, wohingegen die Wernicke-Aphasie zwar eine flüssige Sprache ermöglicht, die aber durch zerrissene Inhalte und von Defiziten im Sprachverständnis gekennzeichnet ist. Weitere Gehirnregionen, die an der Sprachfähigkeit möglicherweise beteiligt sind, sind farbig dargestellt. b Sagittaler Schnitt durch ein menschliches Gehirn; es sind einige weitere Strukturen angegeben, die möglicherweise an der Ausbildung von Sprache beteiligt sind. (Nach Fisher u. Marcus 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Als Sprachzentren (Abb. 14.29) werden in der Hirnrinde (auf der linken Seite) das Broca-Areal (für die motorische Erzeugung von Sprache und Grammatik) und das Wernicke-Areal bezeichnet (für das Verstehen von Sprache); sie sind über den Fasciculus arcuatus verbunden. Die entsprechenden Regionen der rechten

Einer der aufregendsten Berichte der jüngeren Zeit beschreibt in einer 3-Generationen-Familie die Analyse eines Gens für Sprachschwächen (engl. language impairment; developmental verbal dyspraxia; OMIM 602081), das zunächst auf dem langen Arm des Chromosoms 7 (7q31) lokalisiert wurde. Die betroffenen Patienten haben massive Artikulationsstörungen, die von sprachlichen und grammatikalischen Beeinträchtigungen begleitet werden. Genauere molekulare Analysen machten eine Punktmutation im FOXP2-Gen (OMIM 605317) dafür verantwortlich (Abb. 14.30a). FOXP2 ist ein Transkriptionsfaktor mit einem Polyglutamin-Bereich und einer „Forkheadbox“-DNA-Bindedomäne (benannt nach dem Drosophila-Gen forkhead). Wie viele Gene für Transkriptionsfaktoren kommt auch das FOXP2-Gen in anderen Spezies vor. Expressionsstudien (in der Maus) zeigen, dass das FoxP2-Gen im Cerebellum, der Medulla, dem Nucleus caudatus und in der cortikalen Platte exprimiert wird. Das menschliche Protein unterscheidet sich von dem des Gorillas oder des Schimpansen nur in zwei Aminosäuren – der Abstand zum Orang-Utan und zur Maus beträgt drei Aminosäuren (Abb. 14.30b). Damit gehört das FOXP2Gen zu den 5 % von Genen, die am höchsten konserviert sind (Vargha-Kadem et al. 2005; Enard et al. 2002). Derzeit wird intensiv darüber diskutiert, ob der Unterschied in den zwei Aminosäuren der menschlichen Linie gegenüber den Affen für die Ausbildung der Sprache von funktioneller Bedeutung ist. Eine Abschätzung der Zeitspanne, wann der Unterschied im FOXP2-Gen zwischen Affen und Menschen fixiert wurde, ergibt eine Größenordnung von ca. 100.000 bis 200.000 Jahren und hat damit möglicherweise die kulturelle Explosion ausgelöst, die vor etwa 50.000 Jahren begann. Ein wichtiger Punkt ist die Tatsache, dass durch die veränderte Sequenz eine zusätzli-

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Abb. 14.30 a–c Ein multidisziplinärer Blick auf die Evolution von Sprache. a Genetik: Die genomische Struktur des menschlichen Forkheadbox-Gens P2 (FOXP2) zeigt die Stellen der Mutationen, die verbale Dyspraxie verursachen, und die sich von den Stellen unterscheiden, an denen in der Evolution der menschlichen Linie Substitutionen aufgetreten sind (gefüllte Rechtecke: codierende Exons; ungefüllte Rechtecke: nicht-codierende Exons). Der rote Balken weist auf die Region hin, die Hinweise auf selektive Entwicklung erkennen lässt. Einige Exons codieren für Polyglutamin-Bereiche (Q40, Q10), ein Zinkfinger-Motiv (ZnF), einen Leucin-Zipper (LeuZ), die Forkhead-Domäne (FOX) und einen sauren C-terminalen Bereich (sauer); s1–s3 sind alternativ gespleißte, nicht-translatierte 5´-Exons. b Evolution: Die Nukleotid-Substitutionen (schwarze Punkte) in der codierenden

Region von FOXP2 verschiedener Entwicklungslinien der Primatenevolution sind als Verhältnis nicht-synonymer Austausche zu synonymen Austauschen dargestellt (Vergleichssequenz: Maus; rote gestrichelte Linie). Die hellblauen Balken deuten das Gen an und die schwarzen Punkte darin die Lage der veränderten Aminosäuren. c Bildgebende Verfahren der Neurobiologie: Patienten mit funktionsunfähigem FOXP2-Gen zeigen funktionelle Veränderungen, wenn sie sprachliche Prozesse durchführen, sogar wenn sie Wortbildungen nur gedanklich und nicht laut durchführen. Die Veränderungen beinhalten eine zu geringe Aktivierung des Broca-Areals und im Gegensatz dazu eine beidseitige Aktivierung in verschiedenen cortikalen Regionen (L: links; R: rechts). (Nach Fisher u. Marcus 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

che Phosphorylierungsstelle eingeführt wird. Um der Frage nachzugehen, warum Affen nichts sagen, wohl aber Menschen, untersuchten Gruppen in Los Angeles und Atlanta mögliche Zielgene des menschlichen FOXP2-Transkriptionsfaktors und verglichen sie mit denen des Schimpansen (Konopka et al. 2009). Dabei fanden sie, dass der menschliche FOXP2-Transkriptionsfaktor einen anderen Einfluss auf die Regulation nachgeschalteter Gene hat als FOXP2 des Schimpansen.

Auch wenn die menschliche Form des FOXP2-Gens in der Maus exprimiert wird, verändert sich in den transgenen Mäusen deren Ausdrucksmöglichkeit (ultrasonic vocalization) sowie die Länge der Dendriten und die synaptische Plastizität in den Neuronen des Striatums. Wir werden sicherlich bald mehr darüber erfahren, wie der Austausch der zwei Aminosäuren im FOXP2-Transkriptionsfaktor zur Evolution der Sprache des Menschen beigetragen hat (Holden 2004; Enard et al. 2009).

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Mutationen im FOXP2-Gen sind kausal für schwere

Sprachstörungen des Menschen. Da das Gen eine spezifische Evolution in der menschlichen Linie zeigt, wird es als essenziell für die Evolution von Sprachfähigkeit des Menschen angesehen.

Außer der oben erwähnten Erkrankung sind noch zwei weitere Spracherkrankungen erwähnenswert, aus deren Untersuchung möglicherweise ähnliche Hinweise auf die Evolution von Sprachfähigkeit folgen können. Dazu gehören SLI1 und SLI2 (engl. specific language impairment) sowie DYX1‒DYX9 (Dyslexie). Die spezifische Sprachunfähigkeit ist charakterisiert durch eine Diskrepanz zwischen den verbalen und nicht verbalen Fähigkeiten trotz angemessener Erziehung und Ausbildung; andere neurologische Schäden sind ausgeschlossen. Genomweite Untersuchungen haben zwei chromosomale Bereiche für SLI1 und SLI2 besonders beleuchtet: 16q24 und 19q13 (OMIM 606711 bzw. 606712). Diese Bereiche enthalten einige Gene, die in der menschlichen Entwicklungslinie eine spezifische Zunahme der Kopienzahl zeigen; ein derartiges Kandidatengen ist USP10 (das USP10-Protein ist am Auswachsen von Synapsen beteiligt). Patienten, die unter Dyslexie leiden, lernen schwer zu lesen und haben Schwierigkeiten beim Buchstabieren, obwohl ihre sonstigen verbalen Fähigkeiten der Ausbildung und Erziehung entsprechen. Dyslexie findet man in verschiedenen Formen und Schweregraden bei etwa 5 bis 17 % der Bevölkerung mit einer nennenswerten familiären Häufung. Oft tritt sie das erste Mal im Rahmen einer Lese-Rechtschreib-Schwäche in den ersten Schuljahren zutage, obwohl die Patienten über eine normale Intelligenz verfügen. Für dieses Krankheitsbild werden 9 Genorte diskutiert; für zwei gibt es schon vielversprechende Kandidatengene (DYX1 auf 15q21: DYX1C1 [OMIM 127700]; DYX2 auf 6p22.2: KIAA0319 [OMIM 600202]). Es ist durch die Untersuchung dieser Krankheiten und den ihnen zugrunde liegenden genetischen Mechanismen zu erwarten, dass es in naher Zukunft neue zusätzliche Hinweise auf die Evolution der Sprach- und Sprechfähigkeit des Menschen geben wird, wie wir das bei FOXP2 beispielhaft gesehen haben.

14.2.3 Genetische Aspekte des Bewusstseins Ein „Markenzeichen“ des Gehirns der Wirbeltiere ist seine Organisation aufgrund geordneter Topographie, wobei ein bestimmter Satz neuronaler Verbindungen die relative Organisation von Zellen zwischen zwei Regionen bewahrt („topographische Organisation“). Eine derartige topographische Ordnung wird oft in Projektionen von peripheren Sinnesorganen zum Gehirn gefunden;

sie scheint aber auch an der anatomischen und funktionellen Organisation höherer Gehirnzentren beteiligt zu sein. Die vergleichende Analyse verschiedener Säugetiere hat gezeigt, dass es Anordnungen cortikaler Felder gibt, die allen Säugern gemeinsam ist. So besitzen alle Säuger primäre und sekundäre sensorische Areale sowie thalamo-cortikale und cortiko-cortikale Verbindungen. Es sei in diesem Zusammenhang auch erwähnt, dass selbst dann, wenn ein sensorisches System nicht genutzt wird, die entsprechenden cortikalen Felder weiterbestehen, die mit diesem System assoziiert sind. So besitzt der unterirdisch lebende Nacktmull (engl. mole rat; Familie Spalacinae) nur noch stark verkleinerte und funktionslose Augen, die von Haut überzogen sind; das visuelle System dieser Tiere wird nur noch für zirkadiane Funktionen benutzt. Dennoch besitzen auch diese Tiere eine Sehbahn und ein primäres visuelles Areal; sie orientieren sich in ihren unterirdischen Gängen anhand des Magnetfeldes („Magnetsinn“; Kimchi et al. 2004). So wird die Evolution der Augen seit Darwins Veröffentlichung Über den Ursprung der Arten immer noch diskutiert. Morphologische Vergleiche der Anatomie der Augen insgesamt und der Photorezeptoren im Besonderen führten zunächst zu der Annahme, dass sich die tierischen Augen mehrfach und unabhängig voneinander entwickelt hätten. Neuere genetische Untersuchungen machten aber im Gegensatz dazu deutlich, dass die durch Pax6 eingeleitete Signalkette (Abb. 11.34b) der Augenentwicklung im gesamten Tierreich konserviert ist und dass die tierischen Augen von einem gemeinsamen, einfachen Vorläufer abstammen – dem „Ur-Auge“. Dieses Ur-Auge kann einfach aus zwei Zellen bestanden haben – einer Photorezeptorzelle und einer Pigmentzelle. Solch ein primitives „Auge“ kann die Richtung erkennen, aus der Licht kommt. Es erlaubt somit Phototaxis und kann auch eine einfache zirkadiane Rhythmik begründen. Wenn man nun die verschiedenen Differenzierungsprogramme vergleicht, die kombinatorischen „Codes“ der einzelnen Zelltypen dabei einbezieht, die Regulation der Expression spezifischer Gene beachtet (z. B. des Opsin-Gens in den Photorezeptoren) und den Metabolismus von Neurotransmittern berücksichtigt, kann man die evolutionäre Geschichte des Auges rekonstruieren. Am Beispiel der Retina bedeutet das, dass die Ganglienzellen, die amakrinen Zellen und die horizontalen Zellen unter evolutionären Gesichtspunkten Geschwister sind, die sich aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle heraus entwickelt haben, die wohl als Photorezeptorzelle fungierte (Arendt 2003). Eine mögliche Funktion der oben erwähnten topographischen Organisation könnte darin bestehen, die Verschaltungsgrundlagen für eine präzise 1:1-Verknüpfung zwischen verschiedenen abstrakten kognitiven Repräsentationen zu liefern. Allerdings gibt es neben den

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1:1-Verschaltungen, wie wir sie beispielsweise in den retinocollicularen Projektionen kennen, noch weitere „Schaltpläne“, z. B. konvergente Verschaltungen („viele zu einem“: Konvergenz der olfaktorischen Information im temporalen Cortex), divergente Verschaltungen („einer zu vielen“: thalamo-cortikale Afferenzen zu den prämotorischen und supplementär-motorischen Arealen), reziproke Verschaltungen (z. B. cortiko-thalamische Projektionen) und lokal hemmende Verschaltungen (z. B. zwischen den Pyramidenzellen im primären visuellen Cortex). Wegen der besonderen Bedeutung der topographischen (d. h. der „1:1“-Organisation) wollen wir uns ein Beispiel etwas genauer betrachten, nämlich das retinotectale (oder auch retinocolliculare) System. Visuelle Informationen werden zunächst von den Photorezeptorzellen der Retina zu den retinalen Ganglienzellen geleitet; diese sind im Sehnerv gebündelt und verlaufen zum Chiasma opticum. Dort ziehen die Nervenfasern der nasalen Retinahälften beider Augen zur gegenüberliegenden Hirnhälfte, während die Fasern der temporalen Retinahälften ungekreuzt bleiben. Über den Tractus opticus erreichen etwa 90 % der ursprünglichen retinalen Ganglienzellen den Nucleus geniculatus lateralis (Abb. 14.31). Von dort projizieren sie als Sehstrahlung (Radiatio optica) in den primären visuellen Cortex (V1‒V4). Dabei wird in allen Fällen die Links-rechts- und Oben-unten-Orientierung aufrechterhalten. Detaillierte morphologische Untersuchungen in vielen Organismen zeigen, dass diese topographische Organisation eine gemeinsame Eigenschaft im Tierreich darstellt. Das „richtige“ Auswachsen der beteiligten Nervenzellen wird im Wesentlichen durch verschiedene Ephrine (A und B und ihre Untergruppen) und ihre Rezeptoren (Tyrosinkinasen) reguliert; einige Knock-outMutanten der Maus sind zwar bekannt, aber funktionell schwierig zu charakterisieren (in der Regel nur anatomisch; möglicherweise sind die Wirkungen der einzelnen Gene auch redundant). Weitere Spieler sind die Adenylatcyclase (wichtig für die Ephrin-A5-abhängige Zurückentwicklung überzähliger retinaler Axone), Foxd1 (für die Bildung des Chiasma opticum) und Foxg1 (für die contralaterale Ausrichtung der Sehnerven; Abb. 14.31). Im primären visuellen Cortex (V1) reagiert eine große Zahl der Zellen auf bestimmte räumliche Orientierungen; so feuert eine „einfache Zelle“ beispielsweise bei länglichen Mustern (z. B. Balken) an einer bestimmten Position und Orientierung. Dies steht in scharfem Gegensatz zu den Zellen der Retina und auch des Nucleus geniculatus lateralis, die keine Orientierungspräferenz haben. Daneben gibt es in V1 aber auch „komplexe Zellen“, für die die räumliche Position des Reizes innerhalb des rezeptiven Feldes von geringerer Bedeutung ist. Die Zunahme an Komplexität und Spezifität hält auch im weiteren Verlauf der Sehbahn an: Von V1

Abb. 14.31 a, b Die Sehbahn. a Allgemeine Ansicht des visuellen Systems. Axone (rot) kommen aus verschiedenen Gebieten der Retina (retinale Ganglienzellen), sammeln sich und verlassen das Auge an der Papille als Sehnerven. Am Chiasma opticum (Chias.) kreuzen sie teilweise die Mittellinie und projizieren ipsilateral oder contralateral zu den wichtigsten Zielregionen des visuellen Systems, dem Nucleus geniculatus lateralis (LGN) im Thalamus oder zu dem Colliculus superior (SC). b Es sind einzelne Moleküle dargestellt, die an bestimmten Entscheidungspunkten der axonalen Wegfindung beteiligt sind. Die relativen Konzentrationen der EphA-Rezeptoren an den retinalen Ganglienzellen und Gradienten der Ephrin-A-Liganden (Eph As) im SC bestimmen die topographische Anordnung der Axone entlang der anteriorposterioren Achse des SC. Das Gleichgewicht der attraktiven EphB-Rezeptoren (Eph Bs) mit den entsprechenden Liganden, den Ephrin-Bs, sowie der repulsiven Wnt/Ryk-Signale reguliert die Anordnung entlang der medial-lateralen Achse. D: dorsal; L: lateral; M: medial; N: nasal; T: temporal; V: ventral. (Nach Erskine u. Herrera 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

wird die Information an V2 und V4 vermittelt, wo die Neurone größere rezeptive Felder haben als in V1. Außerdem sind in V4 viele Neurone für die Orientie-

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rung von Umrisslinien sensitiv und antworten auf Winkel und Kurven, die in eine bestimmte Richtung deuten. An der Spitze der visuellen Hierarchie stehen die Neurone des inferotemporalen Cortex (IT), die oft sehr große rezeptive Felder haben und auf komplexe Reize wie Gesichter reagieren. Nachdem wir nun grob den Informationsfluss des visuellen Systems insgesamt kennengelernt haben, soll noch auf eine Eigenschaft hingewiesen werden, die den meisten sensorischen Systemen gemein ist, nämlich die 1:1-Übertragung bis zum jeweiligen primären Zentrum. Im visuellen System sprechen wir von einer retinotopen Orientierung und verstehen darunter die Aufrechterhaltung der räumlichen Verhältnisse bei der Signalübermittlung zwischen dem Auge und dem Gehirn (Abb. 14.32). Ähnliches kennen wir auch von der Hörbahn (tonotope Orientierung: Anordnung entsprechender Frequenz) und vom Geruchssystem (chemotope Orientierung). Über die besondere Bedeutung dieser topographischen Abbildungen wird derzeit viel spekuliert; Details würden aber den Rahmen eines genetischen Lehrbuches sprengen. Einer der spannenden aktuellen Fragen wollen wir aber noch etwas weiter nachgehen, nämlich wie die Reize der Sinnesorgane zu Bewusstsein werden. Auch wenn sich diese Frage noch nicht beantworten lässt, gibt es aber Hinweise, wie wir dieser Antwort näher-

kommen können. Am Beispiel des visuellen Systems soll das erläutert werden: Man kann Probanden für das linke und das rechte Auge unterschiedliche Muster anbieten. Dabei rivalisieren beide Augen um die Domi-

Abb. 14.33 Wenn jedem Auge widersprüchliche Signale angeboten werden, können diese nicht zu einem gemeinsamen Bild verarbeitet werden. Stattdessen wechselt die Wahrnehmung spontan zwischen den beiden Bildern des jeweiligen Auges. In diesem Beispiel wird dem linken Auge (L) ein rotierendes rotes Gitter angeboten und gleichzeitig dem rechten Auge ein blaues Gitter (R). Die Verteilung der fMRI-Antworten zeigt Regionen der primären (V1) und sekundären Sehrinde (V2, V3) mit höherer Aktivität bei der Wahrnehmung des

roten Gitters und andere bei der Wahrnehmung des blauen Gitters. Hieran kann ein geübter Beobachter ablesen, welches Signal der Proband gerade bewusst wahrnimmt. Durch Drücken eines von zwei Knöpfen deuten die Probanden an, welches der beiden Muster sie gerade wahrnehmen (Balken im unteren Bildteil). v: ventral; d: dorsal; F: Fovea; fMRI: funktionelle Magnetresonanztomographie. (Nach Haynes u. Rees 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

Abb. 14.32 Retinotope Transformation: vom visuellen Reiz zur Aktivierung der Sehrinde (Area striata) bei Makaken. Während ein visueller Reiz gegeben wird, werden die Antworten der Sehrinde aufgezeichnet: Die Aktivität der cortikalen Zellen ist systematisch korreliert mit der anatomischen Topographie im visuellen System. 1, 2, 3: ausgewählte Regionen von der Fovea zur Peripherie. (Nach Thivierge u. Marcus 2007, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)

14.2 Der Mensch und sein Gehirn

nanz in der Wahrnehmung, sodass der Proband jedes Bild abwechselnd für einige Sekunden „sieht“, während das andere unterdrückt wird ‒ diese „binokulare Rivalität“ ist ein beliebtes experimentelles Design, um spontane und dynamische Veränderungen in der bewussten Wahrnehmung zu untersuchen. Da die Übergänge in der Wahrnehmung zwischen beiden monokularen Sichtweisen spontan und ohne Veränderung der physikalischen Stimulation erfolgen, können die neuronalen Antworten, die mit der bewussten Wahrnehmung verbunden sind, von den reinen sensorischen Prozessen unterschieden werden. Eine moderne Methode, die Gehirnaktivität an verschiedenen Stellen zu bestimmen, ist die funktionelle Magnetresonanztomographie (engl. functional magnetic resonance imaging, fMRI). Abb. 14.33 zeigt einen derartigen Versuchsaufbau und die damit erzielbaren Ergebnisse. Von besonderer Bedeutung ist dabei nicht nur, dass die Analyse der unterschiedlichen fMRI-Muster für die Wahrnehmung durch das linke und rechte Auge eine weitgehende Übereinstimmung mit der berichteten Wahrnehmung durch den Probanden zeigt ‒ aufgrund des zeitlichen Verlaufs der Messung ist es vielfach möglich, die Antwort des Probanden vorherzusagen: Die Änderung des fMRI-Musters erfolgt vor der Antwort durch den Probanden. Die fMRI-Methode verfügt zwar nur über ein begrenztes zeitliches und räumliches Auflösungsvermögen, sie erlaubt es aber dennoch, nicht nur die

Bewusstwerdung der Reize nachzuzeichnen, sondern auch die verschiedenen Gehirnregionen zu lokalisieren, die bei der Erkennung verschiedener Muster eine Rolle spielen. Abb. 14.34 zeigt, dass unterschiedliche Gehirnregionen aktiv sind, wenn Probanden Objekte (Gebäude) gezeigt werden oder wenn es sich um Gesichter handelt. Auch hier kann ein geübter Beobachter anhand des fMRI-Musters erkennen, was der Proband gerade bewusst wahrnimmt. Man kann nun aber die Auflösung noch weiter treiben und fragen, welches Gesicht erkannt wird. Ingo Kennerknecht vom Institut für Humangenetik der Universität Münster hat eine ganze Reihe von Familien charakterisiert, die an einer angeborenen Unfähigkeit leiden, Gesichter zu erkennen (kongenitale Prosopagnosie). Die Stammbäume gehen über mehrere Generationen und zeigen einen klassischen autosomal-dominanten Erbgang mit vollständiger Penetranz; ein Beispiel ist in Abb. 14.35 dargestellt. Auch wenn die entsprechenden Gene und die verantwortlichen Mutationen noch nicht identifiziert sind, so macht dies doch deutlich, dass es für die Gesichtserkennung des Menschen eine einfache und von Umwelteinflüssen weitgehend unabhängige genetische Grundlage gibt. Experimentell ist die Untersuchung der Fähigkeit zur Gesichtserkennung auf verschiedenen Wegen zugänglich. Einzelzell-Ableitungen in verschiedenen Arealen des mittleren Schläfenlappens zeigten, dass es nicht nur Kategorien-spezifische Neurone gibt (wie wir

Abb. 14.34 Aufschlüsselung der Gesichtserkennung. Der Inhalt visueller Vorstellung kann durch räumlich unterschiedliche Signale im Gyrus fusiformis (engl. fusiform face area, FFA; rot) und im Gyrus parahippocampalis (engl. parahippocampal place area, PPA; blau) in der funktionellen Magnetresonanztomographie (fMRI) aufgeschlüsselt werden. Während der Perioden, in denen Gesichtsbilder gezeigt werden (rote Pfeile), sind die Sig-

nale aus dem Gyrus fusiformis erhöht; dagegen sind während der Perioden, in denen Bilder von Gebäuden gezeigt werden (blaue Pfeile), die Signale im Gyrus parahippocampalis erhöht. Ein Beobachter, dem nur die Aktivitätsdaten eines Probanden gezeigt werden, kann mit 85%iger Genauigkeit die Kategorie erkennen, die der Proband sieht. (Nach Haynes u. Rees 2006, mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group)

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es oben gesehen haben, z. B. solche für Gesichter oder für Landschaften oder für Tiere), sondern dass auch unter den Neuronen, die für Gesichter spezifisch sind, offensichtlich einzelne oder wenige Neurone für einzelne Gesichter verantwortlich sind. Abb. 14.36 zeigt ein Beispiel für ein Neuron, das immer nur dann feuert, wenn der Betrachter die Schauspielerin Whoopi Goldberg erkennt, aber nicht bei anderen Personen und auch nicht bei irgendwelchen Objekten.

Abb. 14.35 Prosopagnosie in einer Familie über drei Generationen mit autosomal-dominantem Erbgang. Die Träger sind grau dargestellt; der Pfeil deutet auf den Indexpatienten. (Kennerknecht et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Wiley)

Untersuchungen von Jason Barton in Vancouver können Hinweise auf die Prozesse geben, die bei der Erkennung eines Gesichts ablaufen (Abb. 14.37): Er studierte die Augenbewegungen von Probanden beim Betrachten von Gesichtern. Dabei wird das zu betrachtende Gesicht in verschiedene Bereiche „zerlegt“ (Stirn, linkes/rechtes Auge, Nase, Mund, Kinn, rechte/linke Wange). Er konnte zunächst zeigen, dass bei Prosopagnosie-Patienten die Augenbewegungen wesentlich ungeordneter ablaufen als bei

Abb. 14.36 Gesichtserkennung und Einzelzellableitung. Eine einziges Neuron im rechten posterioren Hippocampus antwortet selektiv auf verschiedene Bilder der Schauspielerin Whoopi Goldberg, aber nicht auf andere Bilder. Für jedes Foto sind die Rasterdiagramme und die Zeitdiagramme nach der Stimulierung

gezeigt (Δt). Die Versuche, bei denen die Bilder erkannt wurden, sind in Blau dargestellt. Die gestrichelten vertikalen Linien (1 Sekunde Abstand) geben das An- und Ausschalten der Bilderpräsentation an. (Nach Quiroga et al. 2008, mit freundlicher Genehmigung der Nationalen Akademie der Wissenschaften, USA)

14.2 Der Mensch und sein Gehirn

Abb. 14.37 Gesichtserkennung. Oben wird ein Beispiel von Gesichtsbildern gezeigt, in denen eine Serie von Gestaltveränderungen von Demi Moore zu Julia Roberts führt. Unten werden die 8 wichtigen Gesichtsregionen gezeigt: die Stirn, die Augen, die Nase, Mund, Kinn und die Wangen. Im Experiment

werden die Augenbewegungen des Betrachters aufgezeichnet, sodass festgestellt werden kann, welchen der dargestellten Abschnitte der Betrachter wie oft und wie lange fixiert. Patienten mit Prosopagnosie zeigen ein deutlich unterscheidbares Muster der Fixierungen. (Nach Barton et al. 2007)

gesunden Patienten. Dieser Prozess des „Scannens“ eines Gesichts erfolgt also offensichtlich nach einem vorgegebenen „Raster“, das aber auch immer die Rückkopplung mit bekannten Mustern braucht. Die genetische Analyse der Prosopagnosie-Patienten wird uns die Informationen liefern, auf welchen Stufen hier entscheidende Schlüsselereignisse stattfinden. Wenn die entsprechenden Gene charakterisiert sein werden, gibt es damit zum ersten Mal die Möglichkeit, Genetik, Elektrophysiologie und höhere kognitive Funktionen des Menschen in einem gemeinsamen Ansatz zu beschreiben und auch unter evolutionären Gesichtspunkten vergleichend zu untersuchen. Es ist zu erwarten, dass damit ein Paradigma für humanspezifische, kognitive Funktionen entwickelt werden kann.

Menschwerdung aufzuzeichnen: zunächst die allgemeine Entwicklung des Menschen aus einem gemeinsamen Vorläufer mit Affen, um dann einige spezifischere Aspekte genauer zu beleuchten, das Gehirnwachstum, die Entwicklung der Sprache und das Bewusstwerden von Sinneseindrücken am Beispiel der Gesichtserkennung. Im letzteren Fall stehen wir noch am Anfang, was die genetische Analyse betrifft. Aber mit der Verfeinerung elektrophysiologischer und bildgebender Verfahren wird es möglich werden, auch in diesen Fällen zunächst das allgemeine Prinzip besser zu beschreiben, um sodann auch die Unterschiede zwischen einzelnen Individuen genauer zu erfassen. Und mit dieser Charakterisierung von unterschiedlichen Phänotypen wird es möglich sein, auch die genetische Konstitution dahinter zu erkennen. Diese Erkenntnis wird zweierlei ermöglichen: zum einen die Identifikation homologer Gene im Tierreich und damit die Beschreibung ihrer Funktionen in anderen Organismen. Durch den Vergleich mit „dem“ Menschen werden wir auch deutlicher erfahren, worin wir uns unterscheiden ‒ und worin nicht. Dies wird uns erlauben, die Bedingungen vieler unserer Verhaltensweisen besser zu verstehen ‒ außerdem welche Modifikationen möglich sind, und welche durch die „Natur“ des Menschen wohl nicht zu ändern sein werden. Zum anderen werden wird durch den Vergleich der Gene bei der Vielfalt der heutigen Menschen sehen, welche spezifisch menschlichen Mutationen zu den Funktionsänderungen beim Menschen in der Evolution beigetragen haben ‒ wir haben das oben am Beispiel des FOXP2-

Die Erkennung eines Gesichts ist eine wichtige Eigen-

schaft des Menschen, die jeweils einzelnen Neuronen im seitlichen Schläfenlappen zugeordnet werden kann. Die Genetik der kongenitalen Prosopagnosie, einer autosomal-dominanten Erbkrankheit, wird wichtige genetische Hinweise geben, welche Prozesse für die Gesichtserkennung notwendig sind – und wie sie sich in der Evolution entwickelt haben.

14.2.4 Quo vadis, Homo sapiens? Wir haben in den vergangenen Kapiteln versucht, an einigen Beispielen wichtige Entwicklungslinien der

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Kapitel 14: Genetik und Anthropologie

Gens in der Evolution der Sprache beispielhaft gesehen. Aus der Summe der Einzelbefunde könnte sich dann insgesamt ein Bild davon ergeben, was unter genetischem Blickwinkel den Menschen zum Menschen macht. Wir werden dann sehen, ob diese Sichtweise mit denen anderer Disziplinen kompatibel ist, vor allem der Philosophie, aber auch der Theologie, der Soziologie, der Psychologie und der Pädagogik. Es wird verstärkt die Frage zu diskutieren sein, ob Willensfreiheit (wie vom Christentum und der europäischen Aufklärung propagiert) als Wesensmerkmal des Menschen weiterhin aufrechterhalten werden kann ‒ oder ob wir uns nur einbilden, zu wollen, was wir tun. Alles in allem wird die Genetik in den nächsten Jahren in herausragender Weise dazu beitragen, das Wesen des Menschen zu beschreiben – die conditio humana, über die Generationen von Philosophen sich den Kopf zerbrochen haben. Es könnte sein, dass wir dabei einige Illusionen verlieren über unsere Individualität und über unsere Möglichkeiten, bewusst und frei zu entscheiden. War die „Freiheit eines Christenmenschen“ nur ein Traum?

Kernaussagen ï Menschen und die großen Affen sind durch eine lange gemeinsame Evolution verbunden; die Schimpansen sind die nächsten Verwandten des Menschen. Erste Hinweise für unterschiedliche Entwicklungen gibt es vor allem für Gene des Immunsystems und der Reproduktion. ï Die Entwicklung des modernen Menschen begann im südlichen zentralen Afrika; die Ausbreitung erfolgte in mehreren Wellen nach Asien, Europa und Amerika. Die Untersuchung verschiedener charakteristischer Genorte legt es nahe, auf allen Stufen dieser Entwicklung ein gewisses Maß an Durchmischung der verschiedenen Populationen anzunehmen. ï In Europa ist der Neandertaler ein Vorgänger des modernen Menschen; für etliche Jahrtausende bewohnten beide Arten denselben Lebensraum (Sympatrie). Es gibt Hinweise auf eine Durchmischung einzelner genomischer Regionen; der Gesamtbeitrag des Neandertalers am Genom des modernen Menschen wird aber höchstens auf 5 % geschätzt. ï Die Sequenzierung der menschlichen mtDNA in vielen Bevölkerungsgruppen der Welt bestätigt den Ursprung der Menschheit in Afrika. Eine genaue Analyse ergibt, dass nur ein kleiner Teil davon nach Europa eingewandert ist; am Ende der letzten Eiszeit erfolgte die Wiederbesiedelung Europas aus den Rückzugsgebieten in Südwestfrankreich/Nordwestspanien. ï Einige Gene, die an der Entwicklung des Gehirns beteiligt sind, zeigen eine positive Selektion in der menschlichen Linie. Dazu gehören Gene wie MCPH1 und ASPM, bei denen Mutationen zu Mikrocephalie führen, als auch Gene, die die Information für nichtcodierende RNAs enthalten (HAR1F). ï Mutationen im FOXP2-Gen sind kausal für schwere Sprachstörungen des Menschen. Da das Gen eine spezifische Evolution in der menschlichen Linie zeigt, wird es als essenziell für die Evolution von Sprachfähigkeit des Menschen angesehen. ï Die Erkennung eines Gesichts ist eine wichtige Eigenschaft des Menschen, die jeweils einzelnen Neuronen im seitlichen Schläfenlappen zugeordnet werden kann. Die Genetik der kongenitalen Prosopagnosie, einer autosomal-dominanten Erbkrankheit, wird wichtige Hinweise auf die Mechanismen geben, die für die Gesichtserkennung notwendig sind.

Literaturverzeichnis

Literaturverzeichnis

Abb. 1.1 Homunculus, den man früher im menschlichen Sperma zu sehen glaubte; Zeichnung von Hartsoeker aus seinem Essay de dioptrique (1694). (Nach Hilscher 1999)

Kapitel 1 Was ist Genetik? Alonso-Blanco C, Mendez-Vigo B, Koornneef M (2005) From phenotypic to molecular polymorphisms involved in naturally occurring variation of plant development. Int J Dev Biol 49: 717–732 Avery OT, MacLeod CM, McCarty M (1944) Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a deoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J Exp Med 79: 137–158 Berg P, Baltimore D, Brenner S et al. (1975) Asilomar Conference on recombinant DNA molecules. Science 188: 991–994 Boveri T (1904) Ergebnisse über die Konstitution der chromatischen Substanz des Zellkerns. G. Fischer, Jena Brink RA (1956) A genetic change associated with the R locus in maize which is directed and potentially reversible. Genetics 41: 872–879 Chandler VL (2007) Paramutation: from maize to mice. Cell 128: 641–645 Clausen J, Keck DD, Hiesey WM (1940) Experimental studies on the nature of species. I. Effect of varied environments on western North American plants. Carnegie Institution of Washington, Washington DC, publication no. 520, reprinted 1971 Clausen J, Keck DD, Hiesey WM (1948) Experimental studies on the nature of species. III. Environmental responses of climatic races of Achillea. Carnegie Institution of Washington, Washington DC, publication no. 581, 3rd printing 1972 Cohen SN, Chang ACY, Boyer HW et al. (1973) Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 70: 3240–3244 Correns C (1900) G. Mendel’s Regel über das Verhalten der Nachkommenschaft der Rassenbastarde. Ber Dt Bot Ges 18: 158–168 Darwin C (1859) On the Origin of Species by Natural Selection. John Murray, London De Vries H (1900) Das Spaltungsgesetz der Bastarde. Vorläufige Mitteilung. Ber Dt Bot Ges 18: 83–90 Galton F (1883) Inquiries into human faculty and its development. MacMillan, London Gregory TR (2005) Synergy between sequence and size in largescale genomics. Nat Rev Genet 6: 699–708 Hardy GH (1908) Mendelian proportions in mixed populations. Science 28: 49–50 Haynes RH (1998) Heritable variation and mutagenesis at early International Congresses of Genetics. Genetics 148: 1419– 1431 Hilscher W (1999) Some remarks on the female and male Keimbahn in the light of evolution and history. J Exp Zool 285: 197–214

International Human Genome Sequencing Consortium (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860–921 International Human Genome Sequencing Consortium (2004) Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 431: 931–945 Johannsen W (1909) Elemente der exakten Erblichkeitslehre. Gustav Fischer, Jena Kossel A (1891) Ueber die chemische Zusammensetzung der Zelle. Du Bois-Reymond’s Archiv/Arch Anat Physiol Physiol Abt: 181–186 Lamarck JB (1809) Philosophie zoologique (2 Bände). Paris Mahner M, Bunge M (2000) Philosophische Grundlagen der Biologie. Springer, Berlin, Heidelberg Martin RG, Matthaei JH, Jones OW, Nirenberg MW (1962) Ribonucleotide composition of the genetic code. Biochem Biophys Res Commun 6: 410–414 Maxam AM, Gilbert W (1977) A new method for sequencing DNA. Proc Natl Acad Sci USA 74: 560–564. Mendel G (1866) Versuche über Pflanzenhybride. Verhandlungen des naturforschenden Vereines, Bd IV. Brünn Meselson M, Stahl FW (1958) The replication of DNA in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 44: 671–682 Miescher F (1871) Über die chemische Zusammensetzung der Eiterzellen. Med Chem Unters 4: 441–460 Morgan TH (1910) Sex linked inheritance in Drosophila. Science 32: 120–122 Muller HJ (1930) Radiation and genetics. Am Nat 64: 220–251 Mullis K, Faloona F, Scharf S et al. (1986) Specific enzymatic amplification of DNA in vitro. The polymerase chain reaction. Cold Spring Harbour Symp Quant Biol 51: 263–273. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA sequencing with chain-terminating methods. Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463–5467 Soyfer VN (2001) The consequences of political dictatorship for Russian science. Nat Rev Genet 2: 723–729 Sutton WS (1903) The chromosomes in heredity. Biol Bull 4: 213–251 Storch V, Welsch U, Wink M (2007) Evolutionsbiologie, 2. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg Tschermak E (1900) Über künstliche Kreuzung bei Pisum sativum. Ber Dt Bot Ges 18: 232–239 Vavilov NJ (1928) Geographische Genzentren unserer Kulturpflanzen. Z indukt Abstam Vererbl Suppl 1: 342–369 Venter JC, Adams MD, Myers EW et al. (2001) The sequence of the human genome. Science 291: 1304–1351 Watson JD, Crick FHC (1953) Molecular structure of nucleic acids. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171: 737–738 Weinberg W (1908) Über den Nachweis der Vererbung beim Menschen. Jahreshefte Verein vaterl Naturk Württemberg 64: 369–382

793

794 794

Literaturverzeichnis

Kapitel 2 Molekulare Grundlagen der Vererbung Avery OT, MacLeod CM, McCarthy M (1944) Studies on the chemical nature of the substance introducing transformation of pneumococcal types. J Exp Med 79: 137–158 Bacolla A, Wells RD (2009) Non-B DNA conformations as determinants of mutagenesis and human disease. Mol Carcinogen 48: 273–285 Bessman MJ, Lehman IR, Simms ES et al. (1958) Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. II. General properties of the reaction. J Biol Chem 233: 171–177 Chargaff E, Lipshitz R, Green C et al. (1951) The composition of the desoxyribonucleic acid of salmon sperm. J Biol Chem 192: 223–230 Condon A (2006) Designed DNA molecules: principles and applications of molecular nanotechnology. Nat Rev Genet 7: 565–575 De Lange T (2004) T-loops and the origin of telomeres. Nat Rev Mol Cell Biol 5: 323-329 Dickerson RE, Drew HR, Conner BN et al. (1983) Helix geometry of A-DNA, B-DNA, and Z-DNA. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 47: 13–24 Ha SC, Lowenhaupt K, Rich A et al. (2005) Crystal structure of a junction between B-DNA and Z-DNA reveals two extruded bases. Nature 437: 1183–1186 Hershey AD, Chase M (1951) Genetic recombination and heterozygosis in bacteriophage. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 16: 471–479 Huberman JA, Tsai A (1973) Direction of DNA replication in mammalian cells. J Mol Biol 75: 5–12 Kato JI (2005) Regulatory network of the initiation of chromosomal replication in Escherichia coli. Crit Rev Biochem Mol Biol 40: 331–342 Kelman Z (2000) DNA-Replication in the third domain (of life). Curr Prot Pept Sci 1: 139–154 Langston LD, O’Donnell M (2006) DNA replication: keep moving and don’t mind the gap. Mol Cell 23: 155–160 Lehman IR, Bessman MJ, Simms ES et al. (1958) Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. I. Preparation of substrates and partial purification of an enzyme from Escherichia coli. J Biol Chem 233: 163–170. Lei M, Tye BK (2001) Initiating DNA synthesis: from recruiting to activating the MCM complex. J Cell Sci 114: 1447–1454 Leppard JB, Champoux JJ (2005) Human DNA topoisomerase I: relaxation, roles, and damage control. Chromosoma 114: 75–85 Lima-de-Faria A (1959) Incorporation of tritiated thymidine into meiotic chromosomes. Science 130: 503–504 Löffler G, Petrides PE (2003) Biochemie und Pathobiochemie, 7. Aufl. Springer, Berlin Heidelberg New York Tokyo Marmur J, Doty P (1962) Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature. J Mol Biol 5: 109–120 McKnight SL, Miller OL jr (1977) Electron microscopic analysis of chromatin replication in the cellular blastoderm Drosophila melanogaster embryo. Cell 12: 795–804 Meselson M, Stahl FW (1958) The replication of DNA in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 44: 671–682 Messer W (2002) The bacterial replication initiator DnaA. DnaA and oriC, the bacterial mode to initiate DNA replication. FEMS Microbiol Rev 26: 355–374

Munk K (2001) Grundstudium Biologie: Genetik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin Novick RP (1998) Contrasting lifestyles of rolling-circle phages and plasmids. Trends Biochem 23: 434–438 Okazaki T, Okazaki R (1969) Mechanism of DNA chain growth. IV Direction of synthesis of T4 short DNA chains as revealed by exonucleolytic degradation. Proc Natl Acad Sci USA 64: 1242–1248 Stack SM, Comings DE (1979) The chromosomes and DNA of Allium cepa. Chromosoma 70, 161–181 Strahs D, Schlick T (2000) A-tract bending: Insights into experimental structures by computational models. J Mol Biol 301: 643–663 Taylor JH, Woods PS, Hughes WL (1957) The organization and duplication of chromosomes as revealed by autoradiographic studies using tritium-labeled thymidine. Proc Natl Acad Sci USA 43: 122–128 Wang AHJ, Quigley GJ, Kolpak FJ et al. (1979) Molecular structure of a left-handed double helical DNA fragment at atomic resolution. Nature 282: 680–686 Watson JD, Crick FHC (1953a) Molecular structure of nucleic acids. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171: 737–738 Watson JD, Crick FHC (1953b) Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature 171: 964–967 Wells RD, Dere R, Hebert ML et al. (2005) Advances and mechanisms of genetic instability related to hereditary neurological diseases. Nucl Acids Res 33: 3785–3798 Kapitel 3 Verwertung genetischer Informationen Abbott CM, Proud CG (2004) Translation factors: in sickness and in health. Trends Biochem Sci 29: 25–31 Agris PF, Vendeix FAP, Graham WD (2007) tRNA’s wobble decoding of the genome: 40 years of modification. J Mol Biol 366: 1–13 Beadle GW, Tatum EL (1941) Genetic control of biochemical reactions in Neurospora. Proc Natl Acad Sci USA 27: 499–506 Beringer M, Rodnina MV (2007) The ribosomal peptidyl transferase. Mol Cell 26: 311–321 Boeger H, Bushnell DA, Davis R et al. (2005) Structural basis of eucaryotic gene transcription. FEBS Lett 579: 899–903 Brenner S, Jacob F, Meselson M (1961) An unstable intermediate carrying information from genes to ribosomes for protein synthesis. Nature 190: 576–581 Chester A, Scott J, Anant S et al. (2000) RNA editing: cytidine to uridine conversion in apolipoprotein B mRNA. Biochim Biophys Acta 1494: 1–13 Conticello SG (2008) The AID/APOBEC family of nucleic acids mutators. Genome Biol 9: 229 (doi: 10.1186/gb-2008-9-6229) Cramer P, Bushnell, DA, Kornberg, RD (2001) Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 Ångstrom resolution. Science 292: 1863–1876 Crick FHC, Barnett L, Brenner S et al. (1961) General nature of the genetic code for proteins. Nature 192: 1227–1232 Cropp TA, Schultz PG (2004) An expanding genetic code. Trends Genet 20: 625–630 Deutscher MP (2006) Degradation of RNA in bacteria: comparison of mRNA and stable RNA. Nucl Acids Res 34: 659–666

Literaturverzeichnis

Francke C, Edström JE, McDowall AW et al. (1982) Electron microscopic visualization of a discrete class of giant translation units in salivary gland cells of Chironomus tentans. EMBO J 1: 59–62 Goldstein L, Plaut W (1955) Direct evidence for nuclear synthesis of cytoplasmic ribose nucleic acid. Proc Natl Acad Sci USA 41: 874–880 Grosjean H, Fiers W (1982) Preferential codon usage in procaryotic genes: The optimal codon-anticodon interaction energy and the selective codon usage in efficiently expressed genes. Gene 18: 199–209 Grunberg-Manago M, Ochoa S (1955) Enzymatic synthesis and breakdown of polynucleotides: Polynucleotide phosphorylase. J Amer Chem Soc 77: 3165–3166 Hatfield DL, Gladyshev VN (2002) How selenium has altered our understanding of the genetic code. Mol Cell Biol 22: 3565– 3576 Hoagland MB, Stephenson ML, Scott JF et al. (1958) A soluble ribonucleic acid intermediate in protein synthesis. J Biol Chem 231: 241–257 Holbrook JA, Neu-Yilik G, Hentze MW et al. (2004) Nonsensemediated decay approaches the clinic. Nat Genet 36: 801–808 Holley RW, Apgar J, Everett GA et al. (1965) Structure of a ribonucleic acid. Science 147: 1462–1465 Hurwitz J, Bresler A, Diringer R (1960) The enzymic incorporation of ribonucleotides into polyribonucleotides and the effect of DNA. Biochem Biophys Res Commun 3: 15–19 Jepson JEC, Reenan RA (2008) RNA editing in regulating gene expression in the brain. Biochim Biophys Acta 1779: 459–470 Jonikas MA, Radmer RJ, Laederach A et al. (2009) Coarsegrained modeling of large RNA molecules with knowledgebased potentials and structural filters. RNA 15: 189–199 Knight RD, Freeland SJ, Landweber LF (2001) Rewiring the keyboard: evolvability of the genetic code. Nat Rev Genet 2: 49–58 Kolev NG, Steitz JA (2006) In vivo assembly of functional U7 snRNP requires RNA backbone flexibility within the Smbinding site. Nat Struct Mol Biol 13: 347–353 Lerner MR, Steitz JA (1979) Antibodies to small nuclear RNAs complexed with proteins are produced by patients with systemic lupus erythromatosus. Proc Natl Acad Sci USA 76: 5495–5499 Lloyd G, Landini P, Busby S (2001) Activation and repression of transcription in bacteria. Essays Biochem 37: 17–31 Losson R, Lacroute F (1979) Interference of nonsense mutations with eucaryotic messenger RNA stability. Proc Natl Acad Sci USA 76: 5134–5137 Mandel CR, Bai Y, Tong L (2008) Protein factors in pre-mRNA 3’-end processing. Cell Mol Life Sci 65: 1099–1122 Mangus DA, Evans MC, Jacobson A (2003) Poly(A)-binding proteins: multifunctional scaffolds for the post-transcriptional control of gene expression. Genome Biol 4: 223 Meinhart A, Kamenski T, Hoeppner S et al. (2005) A structural perspective of CTD function. Genes Dev 19: 1401–1415 Munk K (2001) Grundstudium Biologie: Genetik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin Nirenberg MW, Leder P (1964) RNA codewords and protein synthesis. Science 145: 1399–1407 Nirenberg MW, Matthaei JH (1961) The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotide. Proc Natl Acad Sci USA 47: 1588– 1602

Nishimura S, Jones DS, Khorana HG (1965) The in vitro synthesis of a copolypeptide containing two amino acids in alternating sequence dependent upon a DNA-like polymer containing two nucleotides in alternating sequence. J Mol Biol 13: 302–324 Palade GE (1955) Studies on the endoplasmatic reticulum. II. Simple dispositions in cells in situ. J Biophys Biochem Cytol 1: 567–582 Pan YX (2005) Diversity and complexity of the Mu opioid receptor gene: alternative pre-mRNA splicing and promoters. DNA Cell Biol 24: 736–750 Ramakrishnan V (2002) Ribosome structure and the mechanism of translation. Cell 108: 557–572 Richardson JP (2002) Rho-dependent termination and ATPases in transcript termination. Biochim Biophys Acta 1577: 251– 260 Roeder RG, Rutter WJ (1969) Multiple forms of DNA-dependent RNA polymerase in eucaryotic organisms. Nature 224: 234– 237 Seyffert W (2003) Lehrbuch der Genetik, 2. Aufl. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin Shine J, Dalgarno L (1974) The 3’-terminal sequence of E. coli 16S rRNA: Complementary to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc Natl Acad Sci USA 71: 1342–1346 Simonetti A, Marzi S, Jenner A et al. (2009) A structural view of translation initiation in bacteria. Cell Mol Life Sci 66: 423– 436 Singer M, Berg P (1991) Genes and Genomes. Blackwell Scientific Publisher, Oxford Stevens A (1960) Incorporation of the adenine ribonucleotide into RNA by cell fractions from E. coli B. Biochem Biophys Res Commun 3: 92–96 Sultan M, Schulz MH, Richard H et al. (2008) A global view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptom. Science 321: 956–960 Tan EM, Kunkel HG (1966) Characteristics of a soluble nuclear antigen precipitating with sera of patients with systemic lupus erythematosus. J Immunol 96: 464–471 Tazi J, Durand S, Jeanteur P (2005) The spliceosome: a novel multi-faceted target for therapy. Trends Biochem Sci 30: 469–478 Wang Q, Parrish AR, Wang L (2009) Expanding the genetic code for biological studies. Chem Biol 16: 323–336 Weiss SB, Gladstone L (1959) A mammalian system for the incorporation of cytidine triphosphate into ribonucleic acid. J Am Chem Soc 81: 4118–4119 Wilson DN, Nierhaus KH (2003) The ribosome through the looking glass. Angew Chem Int Ed 42: 3464–3486 Wilson EB (1900) The cell in development and inheritance, 2nd edn. Macmillan, New York Wittek D, Nierhaus KH (2006) Die ribosomale E-Stelle. BIOspektrum 12: 723–725 Xing Y, Lee C (2006) Alternative splicing and RNA selection pressure – evolutionary consequences for eucaryotic genomes. Nat Rev Genet 7: 499–509 Yamashita A, Kashima I, Ohno S (2005) The role of SMG-1 in nonsense-mediated mRNA decay. Biochim Biophys Acta 1754: 305–315 Yankofsky SA, Spiegelman S (1962) The identification of ribosomal RNA cistron by sequence complementarity: II. Saturation of and competitive interaction at the RNA cistron. Proc Natl Acad Sci USA 48: 1466–1472

795

796 796

Literaturverzeichnis

Yong J, Wan L, Dreyfuss G (2004) Why do cells need an assembly machine for RNA-protein complexes? Trends Cell Biol 15: 226–232 Kapitel 4 Molekulare Struktur und Regulation prokaryotischer Gene Amundsen SK, Smith GR (2003) Interchangeable parts of the Escherichia coli recombination machinery. Cell: 741–744 Arber W, Linn S (1969) DNA modification and restriction. Annu Rev Biochem 38: 467–500 Benzer S (1957) The elementary unit of heredity. In: McElry WD, Glas B (eds) The Chemical Basis of Heredity. John Hopkins Press, Baltimore/MD, pp 70–93 Berlyn MKB (1998) Linkage map of Escherichia coli K-13, edition 10: the traditional map. Microbiol Mol Biol Rev 62: 814–984 Blattner FR, Plunkett G 3rd, Block CA et al. (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 277: 1453– 1474 Boccard F, Esnault E, Valens M (2005) Spatial arrangement and macrodomain organization of bacterial chromosomes. Mol Microbiol 57: 9–16 Campbell A (2003) The future of bacteriophage biology. Nat Rev Genet 4: 471–477 Chen I, Dubnau D (2004) DNA uptake during bacterial transformation. Nat Rev Microbiol 2: 241–249 Cohen SN, Chang ACY, Boyer HB et al. (1973) Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc Natl Sci USA 70: 3240–3244 Connolly B, West S (1990) Genetic recombination in Escherichia coli: Holliday junctions made by RecA protein are resolved by fractionated cell-free extracts. Proc Natl Acad Sci USA 87: 8476–8480 Dodd IB, Shearwin KE, Egan JB (2005) Revisited gene regulation in bacteriophage λ. Curr Opin Genet Dev 15: 145–152 Ebersbach G, Gerdes K (2005) Plasmid segregation mechanisms. Annu Rev Genet 39: 453–479 Eggleston AK, West SC (1997) Recombination initiation: easy as A, B, C, D...χ? Curr Biol 7: R745–R749 Escobar MA, Civerolo EL, Summerfelt KR et al. (2001) RNAimediated oncogene silencing confers resistance to crown gall tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci USA 98: 13437–13442 Evguenieva-Hackenberg E (2005) Bacterial ribosomal RNA in pieces. Mol Microbiol 57: 318–325 Folkhard W, Leonard KR, Malsey S et al. (1979) X-ray diffraction and electron microscope studies on the structure of bacterial F pili. J Mol Biol 130: 145–160 Gibson DG, Glass JI, Lartigue C et al. (2010) Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science, im Druck Gilbert W, Müller-Hill B (1966) Isolation of the Lac Repressor. Proc Natl Acad Sci USA 56: 1891–1898 Goodner B, Hinkle G, Gattung S et al. (2001) Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science 294: 2323–2328 Hayes F, Barillà D (2006) The bacterial segrosome: a dynamic nucleoprotein machine for DNA trafficking and segregation. Nat Rev Microbiol 4: 133–143 Hershey AD, Chase M (1951) Genetic recombination and heterozygosis in bacteriophage. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 16: 471–479

Hershey AD, Rotman R (1949) Genetic recombination between host-range and plaque-type mutants of bacteriophage in single bacterial cells. Genetics 34: 44–71 Hillebrand A, Wurm R, Menzel A et al. (2005) The seven E. coli ribosomal RNA operon upstream regulatory regions differ in structure and transcription factor binding efficiencies. Biol Chem 386: 523–534. Himmelreich R, Hilbert H, Plagen H et al. (1996) Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae. Nucl Acids Res 24: 4420–4449 Holliday R (1974) Molecular aspects of genetic exchange and gene conversion. Genetics 78: 273–287 Ioannou PA, Amemiya CT, Garnes J et al. (1994) A new bacteriophage P1-derived vector for the propagation of large human DNA fragments. Nat Genet 6: 84–89 Irwin N, Ptashne M (1987) Mutants of the catabolite activator protein of Escherichia coli that are specifically deficient in the gene activator function. Proc Natl Acad Sci USA 60: 1282– 1287 Jacob F, Monod J (1961) Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol 3: 318–356 Jacob F, Wollman EL (1958) Genetic and physical determinations of chromosomal segments in Escherichia coli. Symp Soc Exp Biol 12: 75–92 Jacob F, Wollman L (1961) Sexuality and the Genetics of Bacteria. Academic Press, New York Kempken F, Kempken R (2004) Gentechnik bei Pflanzen – Chancen und Risiken, 2. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo Kleinschmidt AK, Lang D, Jacherts D et al. (1962) Darstellung und Längenmessung des gesamten DesoxyribonukleinsäureInhaltes von T2-Bakteriophagen. Biochim Biophys Acta 61: 857–864 Kück U (2005) Praktikum der Molekulargenetik. Springer, Berlin, Heidelberg, New York Kumari A, Pasini P, Daunert S (2008) Detection of bacterial quorum sensing N-acyl homoserine lactones in clinical samples. Anal Bioanal Chem 391: 1619–1627 Lacroix B, Tzfira T, Vainstein A et al. (2006) A case of promiscuity: Agrobacterium’s endless hunt for new partners. Trends Genet 22: 29–37 Lamarck JB (1809) Philosophie zoologique (2 Bände). Paris Lederberg EM, Lederberg J (1953) Genetic studies of lysogenicity in Escherichia coli. Genetics 38: 51–64 Lederberg J (1947) Gene recombination and linked segregations in Escherichia coli. Genetics 32: 502–525 Lederberg J, Cavalli LL, Lederberg EM (1952) Sex compatibility in Escherichia coli. Genetics 37: 720–730 Lederberg J, Tatum EL (1946) Novel genotypes in mixed cultures of biochemical mutans of Escherichia coli. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 11: 113–114 Lee G, Saito I (1998) Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cre-mediated recombination. Gene 216: 55–65 Lewis RJ, Brannigan JA, Offen WA et al. (1998) An evolutionary link between sporulation and prophage induction in the structure of a repressor:anti-repressor complex. J Mol Biol 283: 907–912 Liu Y, West SC (2004) Happy hollidays: 40th anniversary of the Holliday junction. Nat Rev Mol Cell Biol 5: 937–946 Lukowski R, Weber S, Weinmeister P et al. (2005) Cre/loxPvermittelte konditionale Mutagenese des cGMP-Signalwegs in der Maus. BIOspektrum 11: 287–290

Literaturverzeichnis

Luria SE, Delbrück M (1943) Mutations in bacteria from virus sensitivity to virus resistance. Genetics 28: 491–511 Lutz KA, Knapp JE, Maliga P (2001) Expression of bar in the plastid genome confers herbicide resistance. Plant Physiol 125: 1585–1590 Merino E, Jensen RA, Yanofsky C (2008) Evolution of bacterial trp operons and their regulation. Curr Opin Microbiol 11: 78–86 Meselson M, Weigle JJ (1961) Chromosome breakage accompanying genetic recombination in bacteriophage. Proc Natl Acad Sci USA 47: 857–868 Müller-Hill B (1990) The isolation of the lac repressor. Bioessays 12: 41–43 Munk K (2001) Grundstudium Biologie: Genetik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin Nakajima N, Ozeki H, Shimura Y (1981) Organization and structure of an E. coli tRNA operon containing seven tRNA genes. Cell 23: 239–249. Nathans D, Smith HO (1975) Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules. Annu Rev Biochem 44: 273–293 Nealson KH, Platt T, Hastings JW (1970) Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system. J Bacteriol 104: 313–322 Otsuji N, Iyehara H, Hideshima Y (1974) Isolation and characterization of an Escherichia coli ruv mutant which forms nonseptate filaments after low doses of ultraviolet light radiation. J Bacteriol 117: 337–344 Ptashne M (2006) Lambda’s switch: lessons from a module swap. Curr Biol 16: R459–R462 Reading NC, Sperandino V (2006) Quorum sensing: the many languages of bacteria. FEMS Microbiol Lett 254: 1–11 Redfield RJ (2001) Do bacteria have sex? Nat Rev Genet 2: 634–639 Roberts RJ, Belfort M, Bestor T et. al. (2003) A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucl Acids Res 31: 1805–1812 Rosenberg SM (2001) Evolving responsively: adaptive mutation. Nat Rev Genet 2: 504–515 Sanger F, Coulson AR, Friedmann T et al. (1978) The nucleotide sequence of bacteriophage ΦX174. J Mol Biol 125: 225–246 Sanger F, Coulson AR, Hong GF et al. (1982) Nucleotide sequence of bacteriophage lambda DNA. J Mol Biol 162: 729–773 Seyffert W (2003) Lehrbuch der Genetik, 2. Aufl. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin Sherman JM, Wing HU (1937) Attempts to reveal sex in bacteria; with some light on fermentative variability in the Coli-aerogenes group. J Bacteriol 33: 315–321 Shizuya H, Birren B, Kim UJ et al. (1992) Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci USA 89: 8794–8797 Shuman HA, Silhavy TJ (2003) The art and design of genetic screens: Escherichia coli. Nat. Rev Genet 4: 419–431 Smith JD, Arber W, Kühnlein U (1972) Host specificity of DNA produced by E. coli. XIV. The role of nucleotide methylation in in vivo B-specific modification. J Mol Biol 63: 1–8 Suckow J, Markiewicz P, Kleina LG et al. (1996) Genetic studies of the Lac repressor. XV: 4000 single amino acid substitutions and analysis of the resulting phenotypes on the basis of the protein structure. J Mol Biol 261: 509–523

Tatum EL, Lederberg J (1947) Gene recombination in the bacterium Escherichia coli. J Bact 53: 673–684 Thomas CM, Nielsen KM (2005) Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nat Rev Microbiol 3: 711–721 Van Gool AJ, Shah R, Mézard C et al. (1998) Functional interactions between the Holliday junction resolvase and the branch migration motor of Escherichia coli. EMBO J 17: 1838–1845 Van Houdt R, Givskov M, Michiels CW (2007) Quorum sensing in Serratia. FEMS Microbiol Rev 31: 407–424 Willenbrock H, Ussery DW (2007) Prediction of highly expressed genes in microbes based on chromatin accessibility. BMC Mol Biol 8: 11 (doi: 10.1186/1471-2199-8-11; nur online) Xie G, Keyhani NO, Bonner CA et al. (2003) Ancient origin of the tryptophan operon and the dynamics of evolutionary change. Microbiol Mol Biol Rev. 67: 303–342 Yanofsky C (2004) The different roles of tryptophan transfer RNA in regulating trp operon expression in E. coli versus B. subtilis. Trends Genet 20: 367–374 Zinder ND, Lederberg J (1952) Genetic exchange in Salmonella. J Bact 64: 679–699 Kapitel 5 Zelle, Zellteilungen und Zellzyklus Adams MD, Celniker SE, Holt RA et al. (2000) The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science 287: 2185–2195 Ahn SH, Diaz RL, Grunstein M et al. (2006) Histone H2B deacetylation at Lysine 11 is required for yeast apoptosis induced by phosphorylation of H2B at Serine 10. Mol Cell 24: 211–220 Ankeny RA (2001) The natural history of Caenorhabditis elegans research. Nat Rev Genet 2: 474–479 Argmann CA, Chambon P, Auwerx J (2005) Mouse phenogenomics: the fast track to “systems metabolism”. Cell Metab 2: 349–360 Aubert G, Lansdorp PM (2008) Telomeres and aging. Physiol Rev 88: 557–579 Barlow AL, Hultén MA (1996) Combined immunocytogenetic and molecular cytogenetic analysis of meiosis I human spermatocytes. Chrom Res 4: 562–573 Bischof JM, Chiang AP, Scheetz TE et al. (2006) Genome-wide identification of pseudogenes capable of disease-causing gene conversion. Hum Mutat 27: 545–552 Bishop DK, Zickler D (2004) Early decision: meiotic crossover interference prior to stable strand exchange and synapsis. Cell 117: 9–15 Brenner S (1974) The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics 77: 71–94 Burger G, Gray MW, Lang BF (2003) Mitochondrial genomes: anything goes. Trends Genet 19: 709–716 Carle GF, Olson MV (1985) An electrophoretic caryotyp for yeast. Proc Natl Acad Sci USA 82: 3756–3760 Castro A, Lorca T (2005) Exploring meiotic divisions in Cargèse. Meeting on meiotic divisions and checkpoints. EMBO Rep 6: 821–825 Christensen K, Johnson TE, Vaupel JW (2006) The quest for genetic determinants of human longevity: challenges and insights. Nat Rev Genet 7: 436–448 Coop G, Przeworski M (2007) An evolutionary view of human recombination. Nat Rev Genet 8: 23–34 De Besson A, Dowdy SF, Roberts JM (2008) CDK inhibitors: cell cycle regulators and beyond. Dev Cell 14: 159–169

797

798 798

Literaturverzeichnis

De Celis JF (2003) Pattern formation in the Drosophila wing: the development of the veins. BioEssays 25: 443–451 De Veylder L, Beeckman T, Beemster GTS et al. (2002) Control of proliferation, endoreduplication and differentiation by the Arabidopsis E2Fa-DPa transcription factor. EMBO J 21: 1360–1368 Doebley JF, Gaut BS, Smith BD (2006) The molecular genetics of crop domestication. Cell 127: 1309–1321 Farmer JB, Moore JES (1905) On the meiotic phase (reduction division) in animals and plants. Quart J Microsc Sci 48, 489-557 Flemming W (1882) Zellsubstanz, Kern und Zelltheilung. F. C. W. Vogel-Verlag, Leipzig Folle GA (2008) Nuclear architecture, chromosome domains and genetic damage. Mutat Res 658: 172–183 Friedman DB, Johnson TE (1988) A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertiliy. Genetics 118: 75–86 Furutani-Seiki M, Wittbrodt J (2004) Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study. Mech Dev 121: 629–637 Gaut BS, Wright SI, Rizzon C et al. (2007) Recombination: an underappreciated factor in the evolution of plant genomes. Nat Rev Genet 8: 77–84 Goffeau A, Barrell BG, Bussey H et al. (1996) Life with 6000 genes. Science 274: 646–563 Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ et al. (1980) Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci USA 77: 7380–7384 Green EL (Hrsg) (1966) Biology of the Laboratory Mouse, 2. Aufl. McGraw-Hill, New York Haffter P, Granato M, Brand M et al. (1996) The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development 123: 1–36 Handwerger KE, Gall JG (2006) Subnuclear organelles: new insights into form and function. Trends Cell Biol 16: 19–26 Haskins FA, Tissieres A, Mitchell HK et al. (1953) Cytochromes and the succinic acid oxidase system of poky strains of Neurospora. J Biol Chem 200: 819–826 Hinnen A, Hicks JB, Fink GR (1978) Transformation of yeast. Proc Natl Acad Sci USA 75: 1929–1933 Holliday R (1964) A mechanism for gene conversion in fungi. Genet Res 5: 282–304 Holt IJ, Harding AE, Morgan-Hughes JA (1988) Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature 331: 717–719 Howard A, Pelc SR (1953) Synthesis of deoxyribonucleic acid in normal and irradiated cells and its relation to chromosome breakage. In: Symposium on chromosome breakage. Heredity 6 (Suppl): 261–273 International Human Genome Sequencing Consortium (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860–921 Johnston DS (2002) The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet 3: 176–188 Jorgensen EM, Mango SE (2002) The art and design of genetic screens: Caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet 3: 356–369 Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR (1972) Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 26: 239–257 Kiefel BR, Gilson PR, Beech PL (2006) Cell biology of mitochondrial dynamics. Intern Rev Cytology 254: 151–213

Kihlman B, Eriksson T, Odmark G (1967) Studies on the effects of phleomycin on chromosome structure and nucleic acid synthesis in Vicia faba. Mutat Res 4: 783–790 Kuro-o M, Matsumura Y, Aizawa H et al. (1997) Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature 390: 45–51 Kurosu H, Kuro-o M (2009) The Klotho gene family as a regulator of endocrine fibroblast growth factors. Mol Cell Endocrinol 299: 72–78 Kyriakouli DS, Boesch P, Taylor RW et al. (2008) Progress and prospects: gene therapy for mitochondrial DNA disease. Gene Therapy 15: 1017–1023 Laibach F (1907) Zur Frage nach der Individualität der Chromosomen im Pflanzenreich. Beih Bot Cbl 22, Abt. I: 191−210 Leister D (2003) Chloroplast research in the genomic age. Trends Genet 19: 47–56 Lieschke GJ, Currie PD (2007) Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet 8: 353–367 Lindgren CC, Lindgren G (1949) Unusual gene-controlled combinations of carbohydrate fermentations in yeast hybrids. Proc Natl Acad Sci USA 35: 23–27 Liu Y, West SC (2004) Happy Hollidays: 40th anniversary of the Holliday junction. Nat Rev Mol Cell Biol 5: 937–946 Lundberg AS, Weinberg RA (1999) Control of the cell cycle and apoptosis. Eur J Cancer 35: 1886–1894 Lyon MF (1961) Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature 190: 372–373 Marston AL, Amon A (2004) Meiosis: cell-cycle controls shuffle and deal. Nat Rev Mol Cell Biol 5: 983–997 Mazia D (1961) Mitosis and the physiology of cell division. In: Brachet J, Mirskey AE (eds) The Cell, vol 3. Academic Press, New York Mereschkowsky C (1905) Über Natur und Ursprung der Chromatophoren im Pflanzenreiche. Biol Centralbl 25: 593–604 Morris JZ, Tissenbaum HA, Ruvkun G (1996) A phosphatidylinositol-3-OH kinase family member regulating longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Nature 382: 536–539 Müller WA, Hassel M (2006) Entwicklungsbiologie und Reproduktionsbiologie von Mensch und Tieren, 4. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo Munk K (2000) Grundstudium Biologie: Biochemie, Zellbiologie, Ökologie, Evolution. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin Neretti N, Wang PY, Brodsky AS et al. (2009) Long-lived Indy induces reduced mitochondrial reactive oxygen species production and oxidative damage. Proc Natl Acad Sci USA 106: 2277–2282 Nüsslein-Volhard C, Wieschaus E (1980) Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature 287: 795–801 Paaby AB, Schmidt PS (2008) Functional significance of allelic variation at methuselah, an aging gene in Drosophila. PLoS ONE 3: e1987 (doi: 10.1371/journal.pone.0001987) Page DR, Grossniklaus U (2002) The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nat Rev Genet 3: 124–136 Page SL, Hawley RS (2003) Chromosome Choreography: the meiotic ballet. Science 301: 785–789 Paigen K (2003a) One hundred years of mouse genetics: an intellectual history. I. The classical period (1902-1980). Genetics 163: 1–7

Literaturverzeichnis

Paigen K (2003b) One hundred years of mouse genetics: an intellectual history. II. The molecular revolution (1981–2002). Genetics 163: 1227–1235 Peters JM (2006) The anaphase promoting complex/cyclosome: a machine designed to destroy. Nat Rev Mol Cell Biol 7: 644–656 Peters LL, Robledo RF, Bult CJ et al. (2007) The mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet 8: 58–69 Raven JA, Allen JF (2003) Genomics and chloroplast evolution: what did cyanobacteria do for plants? Genome Biol 4: 209 (nur online) Rosenthal N, Ashburner M (2002) Taking stock of our models: the function and future of stock centers. Nat Rev Genet 3: 711–717 Schmekel K, Daneholt B (1998) Evidence for close contact between recombination nodules and the central element of the synaptonemal complex. Chromosome Res 6: 155–159 Schnittger A, Hülskamp M (2002) Trichome morphogenesis: a cell-cycle perspective. Phil Trans R Soc Lond B 357: 823–826 Schwarz-Sommer Z, Davis B, Hudson A (2003) An everlasting pioneer: the story of Antirrhinum research. Nat Rev Genet 4: 655–664 Shinohara M, Oh SD, Hunter N et al. (2008) Crossover assurance and crossover interference are distinctly regulated by the ZMM proteins during yeast meiosis. Nat Genet 40: 299–309 Sommerville C, Koornneef M (2002) A fortunate choice: the history of Arabidopsis as a model plant. Nat Rev Genet 3: 883–889 Stanfel MN, Shamieh LS, Kaeberlein M et al. (2009) The TOR pathway comes of age. Biochim Biophys Acta 1790:1067-1074 Stern C (1936) Somatic crossing over and segregation in Drosophila melanogaster. Genetics 21: 625–730 Streisinger G, Walker C, Dower N et al. (1981) Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature 291: 293–296 Taylor JH, Woods PS, Hughes WL (1957) The organization and duplication of chromosomes as revealed by autoradiographic studies using tritium-labeled thymidine. Proc Natl Acad Sci USA 43: 122–128 The Arabidopsis Genome Initiative (2000) Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408: 796–815 The C. elegans Sequencing Consortium (1998) Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigative biology. Science 282: 2012–2018 Toivonen JM, Gems D, Partridge L (2009) Longevity of Indy mutant Drosophila not attributable to Indy mutation. Proc Natl Acad Sci USA 106: E53 Twomey C, McCarthy JV (2005) Pathways of apoptosis and importance in development. J Cell Mol Med 9: 345–359 Van Steensel MAM, Steijlen PM, Maessen-Visch MB (2005) New type of twin spot. Am J Med Genet 133A: 108–111 Venter JC, Adams MD, Myers EW et al. (2001) The sequence of the human genome. Science 291: 1304–1351 Wagner TE, Hoppe PC, Jollick JD et al. (1981) Microinjection of a rabbit beta-globin gene into zygotes and its subsequent expression in adult mice and their offspring. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6376–6380 Wallace DC, Singh G, Lott MT et al. (1988) Mitochondrial DNA mutation associated with Leber’s hereditary optic neuropathy. Science 242: 1427–1430

Wang PY, Neretti N, Whitaker R et al. (2009) Long-lived Indy and calorie restriction interact to extend life span. Proc Natl Acad Sci USA 106: 9262–9267 Weismann A (1885) Die Continuität des Keimplasmas als Grundlage einer Theorie der Vererbung. Fischer, Jena Yu F, Fu A, Aluru M et al. (2007) Variegation mutants and mechanisms of chloroplast biogenesis. Plant Cell Environ 30: 350–365 Kapitel 6 Molekulare Struktur eukaryotischer Chromosomen Aubert G, Lansdorp PM (2008) Telomeres and aging. Physiol Rev 88: 557–579 Aulard S, Monti L, Chaminade N et al. (2004) Mitotic and polytene chromosomes: comparisons between Drosophila melanogaster and Drosophila simulans. Genetica 120: 137–150 Avner P, Heard E (2001) X chromosome inactivation: counting, choice and initiation. Nat Rev Genet 2: 59–67 Balbiani EG (1981) Sur la structure du noyau des cellules salivaires chez les larves de Chironomus. Zool Anz 4: 637–641 Barr ML, Bertram EG (1949) A morphological distinction between neurons of the male and female, and the behaviour of the nucleolar satellites during accelerated nucleoprotein synthesis. Nature 163: 676–677 Beermann W (1952) Chromosomenkonstanz und spezifische Modifikation der Chromosomenstruktur in der Entwicklung und Organdifferenzierung von Chironomus tentans. Chromosoma 5: 139–198 Belote JM, Lucchesi J (1980) Control of X chromosome transcription by the maleless gene in Drosophila. Nature 285: 573–575 Bertuch AA, Lundblad V (2006) The maintenance and masking of chromosome termini. Curr Opin Cell Biol 18: 247–253 Blackburn EH, Greider CW, Szostak JW (2006) Telomeres and telomerase: the path from maize, Tetrahymena and yeast to human cancer and aging. Nature Med 12: 1133–1138 Blasco MA (2005) Telomeres and human disease: ageing, cancer and beyond. Nat Rev Genet 6: 611–622 Boveri T (1888) Zellenstudien II. Die Befruchtung und Teilung des Eies von Ascaris megalocephala. Jena Zeit Naturw 22: 685–882 Boveri T (1909) Über Geschlechtschromosomen bei Nematoden. Arch Zellf 4: 132–141 Bromley SE, Gall JG (1987) Transcription of the histone loci on lampbrush chromosomes of the newt Notophthalmus viridescens. Chromosoma 95: 396–402 Camacho JPM, Sharbel TF, Beukeboom LW (2000) B-chromosome evolution. Phil Trans R Soc Lond B 355: 163–178 Carle GF, Olsen MV (1985) An electrophoretic karyotype for yeast. Proc Natl Acad Sci USA 82: 3756–3760 Catez F, Ueda T, Bustin M (2006) Determinants of histone H1 mobility and chromatin binding in living cells. Nat Struct Mol Biol 13: 305–310 Cheeseman IM, Desai A (2008) Molecular architecture of the kinetochore – microtubule interface. Nat Rev Mol Cell Biol 9: 33–46 Cline T (1978) Two closely linked mutations in Drosophila melanogaster that are lethal to opposite sexes and interact with daughterless. Genetics 90: 683–698

799

800 800

Literaturverzeichnis

Cooke HJ, Smith BA (1986) Variability at the telomeres of the human X/Y pseudoautosomal region. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 51: 213–219 Cremer T, Cremer C (2001) Chromosome territorries, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat Rev Genet 2: 292–301 Disteche CM, Filippova GN, Tsuchiya KD (2002) Escape from X inactivation. Cytogenet Genome Res 99: 36–43 Flemming W (1882) Zellsubstanz, Kern und Zelltheilung. F. C. W. Vogel-Verlag, Leipzig Ebert A, Lein S, Schotta G et al. (2006) Histone modification and the control of heterochromatic gene silencing in Drosophila. Chromosome Res 14: 377–392 Gall JG (1956) On the submicroscopic structure of chromosomes. Brookhaven Symp Biol 8: 17–32 Gall JG, Stephenson EC, Erba HP et al. (1981) Histone genes are located at the sphere loci of newt lampbrush chromosome. Chromosoma 84: 159–171 Gartler SM (2006) The chromosome number in humans: a brief history. Nat Rev Genet 7: 655–660 Gerbi SA (1986) Unusual chromosome movements in Sciarid flies. In: Hennig W (ed) Results and Problems in Cell Differentiation, vol 13. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, pp 71–104 Gilfillan GD, Dahlsveen IK, Becker PB (2004) Lifting a chromosome: dosage compensation in Drosophila melanogaster. FEBS Lett 567: 8–14 Hayflick L (1965) The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp Cell Res 37: 614–636 Heitz E (1928) Das Heterochromatin der Moose. I. Jb wiss Bot 69: 762–818 Hennig I (1978) Vergleichend-zytologische und -genetische Untersuchungen am Genom der Fruchtfliegen-Arten Drosophila hydei, neohydei und eohydei (Diptera, Drosophilidae). Ent Germ 4: 211–2230 Horn PJ, Peterson CL (2006) Heterochromatin assembly: a new twist on an old model. Chromosome Res 14: 83–94 Kossel A (1884) Über Nuclein. Arch Physiol 8: 177–178 Labrador M, Corces VG (2002) Setting the boundaries of chromatin domains and nuclear organization. Cell 111: 151–154 Lam AL, Pazin DE, Sullivan BA (2005) Control of gene expression and assembly of chromosomal subdomains by chromatin regulators with antagonistic functions. Chromosoma 114: 242–251 Larsson J, Meller VH (2006) Dosage compensation, the origin and the afterlife of sex chromosomes. Chromosome Res 14: 417–431 Laskey RA, Honda BM, Mills AD et al. (1978) Nucleosomes are assembled by an acidic protein, which binds histones and transfers them to DNA. Nature 275: 416–420 Lucchesi JC, Kelly WG, Panning B (2005) Chromatin remodeling in dosage compensation. Annu Rev Genet 39: 615–651 Luger K, Mäder AW, Richmond RK et al. (1997) Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature 389: 251–260 Lyon MF (1961) Gene action in the X-chromosome of the mouse. Nature 190: 372–373 Lyon MF (2003) The Lyon and the LINE hypothesis. Sem Cell Dev Biol 14: 313–318 McEwen BF, Dong Y, Vandenbeldt KJ (2007) Using electron microscopy to understand functional mechanisms of chro-

mosome alignment on the mitotic spindle. Meth Cell Biol 79: 259–293 Metz CW (1938) Chromosome behaviour, inheritance and sex determination in Sciara. Amer Nat 72: 485–520 Meyer GF, Hess O, Beermann W (1961) Phasenspezifische Funktionsstrukturen in den Spermatocytenkernen von Drosophila melanogaster und ihre Abhängigkeit vom Y-Chromosom. Chromosoma 12: 676–716 Miller OJ, Thermann E (2001) Human Chromosomes, 4. Aufl. Springer, New-York, Berlin, Heidelberg Morgan GT (2002) Lampbrush chromosomes and associated bodies: new insights into principles of nuclear structure and function. Chromosome Res 10: 177–200 Mukherjee AS, Beermann W (1965) Synthesis of ribonucleic acid by the X-chromosome of Drosophila melanogaster and the problem of dosage compensation. Nature 207: 785–786 Muller HJ (1930) Types of visible variations induced by X-rays in Drosophila. J Genet 22: 299–335 Muller HJ (1932) Some genetic aspects of sex. Amer Nat 66: 118–138 Ng K, Pullirsch D, Leeb M et al. (2007) Xist and the order of silencing. EMBO Rep 8: 34–39 Olovnikov OM (1973) A theorie of marginotomy. The incomplete copying of template margin in enzymic synthesis of polynucleotides and biological significance of the phenomenon. J Theor Biol 41: 181–190 Painter TS (1921) The Y-chromosome in mammals. Science 53: 503–504 Painter TS (1933) A new method for the study of chromosome rearrangements and the plotting of chromosome maps. Science 78: 585–586 Pelling C (1964) Ribonukleinsäure-Synthese der Riesenchromosomen. Chromosoma 15: 71–72 Pidoux AL, Allshire RC (2005) The role of heterochromatin in centromere function. Phil Trans R Soc B 360: 569–579 Rabl K (1885) Über Zelltheilung. Gegenbaurs Morphol Jahrb 10: 214–330 Reik W, Lewis A (2005) Co-evolution of X-chromosome inactivation and imprinting in mammals. Nat Rev Genet 6: 403– 410 Robert-Fortel I, Junera HR, Geraud G et al. (1993) Threedimensional organization of the ribosomal genes and AgNOR proteins during interphase and mitosis in PtK1 cells studied by confocal microscopy. Chromosoma 102: 146–157 Robinson PJJ, Rhodes D (2006) Structure of the ‘30nm’ chromatin fibre: a key role for the linker histone. Curr Opin Struct Biol 16: 336–343 Saha A, Wittmeyer J, Cairns BR (2006) Chromatin remodelling: the industrial revolution of DNA around histones. Nat Rev Mol Cell Biol 7: 437–447 Scheer U (1987) Contributions of electron microscopic spreading preparations („Miller spreads“) to the analysis of chromosome structure. In: Hennig W (ed) Structure and Function of Eucaryotic Chromosomes. Results and Problems in Cell Differentiation, vol 14. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, pp 27–58 Schultz J (1936) Variegation in Drosophila and the inert chromosome regions. Proc Natl Acad Sci USA 22: 27–33 Shaffer LG, Tommerup N: ISCN 2005 – An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. S. Karger, Basel Strahl BD, Allis CD (2000) The language of covalent histone modifications. Nature 403: 41–45

Literaturverzeichnis

Tjio JH, Levan A (1956) The chromosome number of man. Hereditas 42: 1–6 Traupe H (1999) Functional X-chromosomal mosaicism of the skin: Rudolf Happle and the lines of Alfred Blaschko. Am J Med Genet 85: 324–329 Vogel F, Motulsky AG (1997) Human Genetics, 3. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg, New York Wilson EB (1907) The supranumerary chromosomes of Hemiptera. Science 26: 870–871 Yasuhara JC, Wakimoto BT (2006) Oxymoron no more: the expanding world of heterochromatic genes. Trends Genet 22: 330–338 Zhan HC, Liu DP, Liang CC (2001) Insulator: from chromatin domain boundary to gene regulation. Hum Genet 109: 471– 478 Kapitel 7 Molekulare Struktur und Regulation eukaryotischer Gene Albig W, Doenecke D (1997) The human histone gene cluster at the D6S105 locus. Hum Genet 101: 284–294 Bieker JJ, Martin PL, Roeder RG (1985) Function of a ratelimiting intermediate in 5S RNA transcription. Cell 40: 119– 127 Bogenhagen DF, Sakonju S, Brown DD (1980) A control region in the center of the 5S RNA gene directs specific initiation of transcription: II. The 3’ border of the region. Cell 19: 27–35 Breathnach R, Chambon P (1981) Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Ann Rev Biochem 50: 349–383 Brittain T (2002) Molecular aspects of embryonic hemoglobin function. Mol Aspects Med 23: 293–342 Bumcrot D, Manoharan M, Koteliansky V et al. (2006) RNAi therapeutics: a potential new class of pharmaceutical drugs. Nat Chem Biol 2: 711–719 Cai M, Huang Y, Zheng R et al. (1998) Solution structure of the cellular factor BAF responsible for protective retroviral DNA from autointegration. Nat Struct Biol 5: 903–909 Carthew RW, Sontheimer EJ (2009) Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136: 642–655 Cashman SM, Bowman L, Christofferson J et al. (2006) Inhibition of choroidal neovascularization by adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNAs targeting VEGF as a potential therapy for AMD. Invest Ophthalmol Vis Sci 47: 3496–3504 Cave MD, Allen ER (1969) Extra-chromosomal DNA in early stages of oogenesis in Acheta domesticus. J Cell Sci 4: 593–609 Christen P, Jaussi R (2005) Biochemie. Springer, Berlin, Heidelberg Cogoni C, Macino G (1997) Isolation of quelling-defective (qde) mutants impaired in posttranscriptional transgene-induced gene silencing in Neurospora crassa. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10233–10238 Craig CL, Riekel C (2002) Comparative architecture of silks, fibrous proteins and their encoding genes in insects and spiders. Comp Biochem Physiol (Pt B) 133: 493–507 Dahlberg J, Lund E (2005) tRNA turnaround. Mol Cell 19: 292–294 D‘Alessio G (2002) The evolution of monomeric and oligomeric βγ-type crystallins. Eur J Biochem 269: 3122–3130 Davidson EH (1986) Gene Activity in Early Development, 3. Aufl. Academic Press, New York

Douet J, Tourmente S (2007) Transcription of the 5S rRNA heterochromatic genes is epigenetically controlled in Arabidopsis thaliana and Xenopus laevis. Heredity 99: 5–13 Dutcher SK (2003) Long-lost relatives reappear: identification of new members of the tubulin superfamily. Curr Opin Microbiol 6: 634–640 Efstratiadis A, Posakony JW, Maniatis T et al. (1980) The structure and evolution of the human β-globin family. Cell 21: 653–668 Fire A, Xu S, Montgomery MK (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806–811 Fulton C, Simpson PA (1976) Selective synthesis and utilisation of flagellar tubulin. The multi-tubulin hypothesis. In: Goldman R, Pollard T, Rosenbaum J (eds) Cell Motility, vol. 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp 987–1005 Giardina A (1901) Origine dell’ oocite e delle cellule nutruci nei Dytiscus. Int Monatsschr Anat Phys 18: 417–479 Grimm D, Streetz KL, Jopling CL et al. (2006) Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature 441: 537–541 Grummt I, Pikaard CS (2003) Epigenetic silencing of RNA polymerase I transcription. Nat Rev Mol Cell Biol 4: 641–649 Guo S, Kemphues KJ (1995) par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/ Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell 81: 611– 620 Hardison R (1998) Hemoglobins from bacteria to man: evolution of different patterns of gene expression. J Exp Biol 201: 1099–1117 Hopper AK, Phizicky EM (2003) tRNA transfers to the limelight. Genes Dev 17: 162–180 International Human Genome Sequencing Consortium (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860–921 Jinek M, Doudna JA (2009) A three-dimensional view of the molecular machinery of RNA interference. Nature 457: 405– 412 Juven-Gershon T, Hsu JY, Theisen JWM et al. (2008) The RNA polymerase II core promoter – the gateway to transcription. Curr Opin Cell Biol 20: 253–259 Kamath RS, Fraser AG, Dong Y et al. (2003) Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature 421: 231–237 Kærn M, Elston TC, Blake WJ et al. (2005) Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nat Rev Genet 6: 451–464 Knight RD, Shimeld SM (2001) Identification of conserved C2H2 zinc-finger gene families in the Bilateria. Genome Biol 2: 5 (nur online, http://genomebiology.com/2001/2/5/ research/0016) Kobayashi T (2006) Strategies to maintain the stability of the ribosomal RNA gene repeats. Genes Genet Syst 81: 155–161 Kuriyan J, Eisenberg D (2007) The origin of protein interactions and allostery in colocalization. Nature 450: 983–990 Lewis MA, Quint E, Glazier AM et al. (2009) An ENU-induced mutation of miR-96 associated with progressive hearing loss in mice. Nat Genet 41: 614–618 Li Q, Barkess G, Qian H (2006) Chromatin looping and the probability of transcription. Trends Genet 22: 197–202

801

802 802

Literaturverzeichnis

Löffler G, Petrides PE (2003) Biochemie und Pathobiochemie, 7. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo Mahajan MC, Karmakar S, Weissman SM (2007) Control of beta globin genes. J Cell Biochem 102: 801–810 Marsh RE, Corey RB, Pauling L (1955) An investigation on the structure of silk fibroin. Biochim Biophys Acta 16: 1–34 Mayr B, Montminy M (2001) Transcriptional regulation by the phosphorylation-dependent factor CREB. Nature Rev Mol Cell Biol 2: 599–609 McKean PG, Vaughan S, Gull K (2001) The extended tubulin superfamily. J Cell Sci 114: 2723–2733 McStay B, Grummt I (2008) The epigenetics of rRNA genes: from molecular to chromosome biology. Annu Rev Cell Dev Biol 24: 131–157 Meissner B, Hofmann A, Steinbeißer H et al. (1991) Faithful in vivo transcription termination of Xenopus laevis rDNA. Chromosoma 101: 222–230 Mencía Á, Modamio-Høybjør S, Redshaw N et al. (2009) Mutations in the seed region of human miR-96 are responsible for nonsyndromic progressive hearing loss. Nat Genet 41: 609– 613 Miranda I, Silva R, Santos MAS (2006) Evolution of the genetic code in yeasts. Yeast 23: 203–213 Mörner CT (1894) Untersuchungen der Proteinsubstanzen in den lichtbrechenden Medien des Auges. Z Physiol Chem 18: 61–106 Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R (1990) Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into Petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2: 279–289 Near TJ, Parker SK, Detrich HW III (2006) A genomic fossil reveals key steps in hemoglobin loss by the antarctic icefishes. Mol Biol Evol 23: 2008–2016 O’Donnell KA, Boeke JD (2007) Mighty Piwis defend the germline against genome intruders. Cell 129: 37–44 Otto SP, Yong P (2002) The evolution of gene duplicates. Adv Genet 46 451–483 Pesce A, Bolognesi M, Bocedi A et al. (2002) Neuroglobin and cytoglobin – fresh blood for the vertebrate globin family. EMBO Rep 3: 1146–1151 Preuss S, Pikaard CS (2007) rRNA gene silencing and nucleolar dominance: insights into a chromosome-scale epigenetic on/ off switch. Biochim Biophys Acta 1769: 383–392 Redko Y, Li de la Sierra-Gallay I, Condon C (2007) When all’s zed and done: the structure and function of RNase Z in prokaryotes. Nature Rev Microbiol 5: 278–286 Ritossa F, Spiegelman S (1965) Localization of DNA complementary to ribosomal RNA in the nucleolus organizer region of Drosophila melanogaster. Genetics 53: 737–745 Scharf SJ, Horn GT, Erlich HA (1986) Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic sequences. Science 233: 1076–1078 Seto AG, Kingston RE, Lau NC (2007) The coming of age for Piwi proteins. Mol Cell 26: 603–609 Singer M, Berg P (1991) Genes and Genomes. Blackwell Scientific Publ., Oxford Srivastava AK, Schlessinger D (1991) Structure and organization of ribosomal DNA. Biochimie 73: 631–638 Suzuki Y, Gage LP, Brown DD (1972) The genes for silk fibroin in Bombyx mori. J Mol Biol 70: 637–649 Venter JC, Adams MD, Myers EW et al. (2001) The sequence of the human genome. Science 291: 1304–1351

Wallace H, Birnstiel ML (1966) Ribosomal cistrons and the nucleolar organizer. Biochim Biophys Acta 114: 296–319 Wistow G, Wyatt K, David L et al. (2005) γN-crystallin and the evolution of the βγ-crystallin superfamily in vertebrates. FEBS J 272: 2275–2291 Wolffe AP (1994) Transcription: in tune with histones. Cell 77: 13–16 Kapitel 8 Instabilität des Genoms: Flexibilität und Variabilität Albertson DG (2006) Gene amplification in cancer. Trends Genet 22: 447–455 Ariën KK, Vanham G, Aarts EJ (2007) Is HIV-1 evolving to a less virulent form in humans? Nat Rev Microbiol 5: 141–151 Asante-Appiah E, Skalka AM (1997) Molecular mechanisms in retrovirus DNA integration. Antiviral Res 36: 139–156 Balvay L, Lastra ML, Sargueil B et al. (2007) Translational control of retroviruses. Nat Rev Microbiol 5, 128–140 Berg DE, Howe MM (1989) Mobile DNA. Am Soc Microbiol Press, Washington DC Bingham PM, Kidwell MG, Rubin GM (1982) The molecular basis of P-M hybrid dysgenesis: the role of the P element in a P-strain-specific transposon family. Cell 29: 995–1004 Boveri T (1899) Festschrift für Carl von Kupffer. Fischer-Verlag, Jena, 383–430 Broach JR (2004) Making the right choice – long-range chromosomal interactions in development. Cell 119: 583–586 Burnet FM (1959) The clonal selection theory of antibody formation. Cambridge University Press, Cambridge Butler G, Kenny C, Fagan A et al. (2004) Evolution of the MAT locus and its Ho endonuclease in yeast species. Proc Natl Acad Sci USA 101: 1632–1637 Castro JP, Carareto CMA (2004) Drosophila melanogaster P transposable elements: mechanisms of transposition and regulation. Genetica 121: 107–118 Chaboissier MC, Busseau I, Prosser J et al. (1990) Identification of a potential RNA intermediate for transposition of the LINE-like element I factor in Drosophila melanogaster. EMBO J 9: 3557–3563 Chowdhury D, Sen R (2004) Regulation of immunoglobulin heavy-chain gene rearrangements. Immunol Rev 200: 182– 196 Claycomb JM, Orr-Weaver TL (2005) Developmental gene amplification: insights into DNA replication and gene expression. Trends Genet 21: 149–162 Davis MM, Kim SK, Hood LE (1980) DNA sequences mediating class switching in alpha-immunoglobulins. Science 209: 1360–1365 Deininger PL, Moran JV, Batzer MA et al. (2003) Mobile elements and mammalian genome evolution. Curr Opin Genet Dev 13: 651–658 Dreesen O, Li B, Cross GAM (2007) Telomere structure and function in trypanosomes: a proposal. Nat Rev Microbiol 5: 70–75 Emmons SW, Yesner L, Ruan KS et al. (1983) Evidence for a transposon in Caenorhabditis elegans. Cell 32: 55–65 Feschotte C, Jiang N, Wessler SR (2002) Plant transposable elements: where genetics meets genomics. Nat Rev Genet 3: 329–341

Literaturverzeichnis

Frommolt R, Rohrbach F, Theobald M (2006) Sleeping beauty transposon system – future trend in T-cell-based gene therapies? Future Oncol 2: 345–349 Goday C, Esteban MR (2001) Chromosome elimination in sciarid flies. BioEssays 23: 242–250 Haber JE (1998) A locus control region regulates yeast recombination. Trends Genet 14: 317–321 Haber JE (2006) Transpositions and translocations induced by site-specific double-strand breaks in budding yeast. DNA Repair 5: 998–1009 Haber JE, Debatisse M (2006) Gene amplification: yeast takes a turn. Cell 125: 1237–1240 Haniford DB (2006) Transpososome dynamics and regulation in Tn10 Transposition. Crit Rev Biochem Mol Biol 41: 407–424 Harris LJ, Skaletsky E, McPherson A (1998) Crystallographic structure of an intact IgG1 monoclonal antibody. J Mol Biol 275: 861–872 Häsler J, Strub K (2006) Alu elements as regulators of gene expression. Nucl Acids Res 34: 5491–5497 Horn D, Barry JD (2005) The central roles of telomeres and subtelomeres in antigenic variation in African trypanosomes. Chromosome Res 13: 525–533 Ivics Z, Hackett PB, Plasterk RH et al. (1997) Molecular reconstitution of sleeping beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell 91: 501–510 Jönsson F, Postberg J, Lipps HJ (2009) The unusual way to make a genetically active nucleus. DNA Cell Biol 28: 71–78 Kaessmann H, Vinckenbosch N, Long M (2009) RNA-based gene duplication: mechanistic and evolutionary insights. Nat Rev Genet 10: 19–31 Karp G (2005) Molekulare Zellbiologie. Springer, Berlin, Heidelberg Kidwell MG (1983) Evolution of hybrid dysgenesis determinants in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA 80: 1655–1659 Krangel MS (2003) Gene segment selection in V(D)J recombination: accessibility and beyond. Nat Immunol 4: 624–630 Kuduvalli PN, Mitra R, Craig NL (2005) Site-specific Tn7 transposition into the human genome. Nucl Acids Res 33: 857–863 Loreto ELS, Carareto CMA, Capy P (2008) Revisiting horizontal transfer of transposable elements in Drosophila. Heredity 100: 545–554 McClintock B (1941) The stability of broken ends of chromosomes in Zea mays. Genetics 26: 234–282 McClintock B (1947) Cytogenetic studies of maize and Neurospora. Carnegie Inst Wash Year Book 46: 146–152 McClintock B (1948) Mutable loci in maize. Carnegie Inst Wash Year Book 47: 155–169 Meyer E, Garnier O (2002) Non-mendelian inheritance and homology-dependent effects in Ciliates. Adv Genet 46: 305– 337 Modrow S, Falke D (1997) Molekulare Virologie. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Müller WA, Hassel M (2006) Entwicklungsbiologie und Reproduktionsbiologie von Mensch und Tieren, 4. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo Niedermaier J, Moritz KB (2000) Organization and dynamics of satellite and telomere DNAs in Ascaris: implications for formation and programmed breakdown of compound chromosomes. Chromosoma 109: 439–452 Odegard VH, Schatz DG (2006) Targeting of somatic hypermutation. Nat Rev Immunol 6: 573–583

Papavasiliou FN, Schatz DG (2002) Somatic hypermutation of immunoglobulin genes: merging mechanisms for genetic diversity. Cell 109: S35–S44 Peters JE, Craig NL (2001) Tn7: smarter than we thought. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 806–814 Postberg J, Alexandrova O, Lipps HJ (2006) Synthesis of prerRNA and mRNA is directed to a chromatin-poor compartment in the macronucleus of the spirotrichous ciliate Stylonychia lemnae. Chromosome Res 14: 161–175 Prescott DM (2000) Genome gymnastics: unique modes of DNA evolution and processing in ciliates. Nat Rev Genet 1: 191– 198 Pringle CR (1999) Virus taxonomy. Arch Virol 144: 421–429 Rio DC (1991) Regulation of Drosophila P element transposition. Trends Genet 7: 282–287 Roth JF (2000) The yeast Ty virus-like particles. Yeast 16: 785– 795 Rous P (1911) Transmission of a malignant new growth by means of a cell-free filtrate. J Am Med Ass 56: 198 Rubin GM, Kidwell MG, Bingham PM (1982) The molecular basis of P-M hybrid dysgenesis: the nature of induced mutations. Cell 29: 987–994 Rubin GM, Spradling AC (1982) Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science 218: 348– 353 Ryder E, Russell S (2003) Transposable elements as tools for genomics and genetics in Drosophila. Brief Funct Genom Proteom 2: 57–71 Siguier P, Filée J, Chandler M (2006) Insertion sequences in procaryotic genomes. Curr Opin Microbiol 9: 526–531 Soll DR (2003) Mating-type locus homozygosis, phenotypic switching and mating: a unique sequence of dependencies in Candida albicans. BioEssays 26: 10–20 Spradling AC, Rubin GM (1982) Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science 218: 341– 347 Stoye JP (2006) Koala retrovirus: a genome invasion in real time. Genome Biol 7: 241 (doi: 10.1186/gb-2006-7-11-241; http:// genomebiology.com/2006/7/11/241; nur online) Talmage DW (1957) Allergy and immunology. Annu Rev Med 8: 239–257 Taylor JE, Rudenko G (2006) Switching trypanosome coats: what’s in the wardrobe? Trends Genet 22: 614–620 Thomson MM, Pérez-Alvarez L, Nájera R (2002) Molecular epidemiology of HIV-1 genetic forms and its significance for vaccine development and therapy. Lancet Infect Dis 2: 461– 471 Tobler H, Etter A, Müller F (1992) Chromatin diminution in nematode development. Trends Genet 8: 427–432 Toleman MA, Bennett PM, Walsh TR (2006) ISCR elements: novel gene-capturing systems of the 21st century? Microbiol Mol Biol Rev 70: 296–316 Toro N (2003) Bacteria and Archaea group II introns: additional mobile genetic elements in the environment. Environ Microbiol 5: 143–151 Uren AG, Kool J, Berns A et al. (2005) Retroviral insertional mutagenesis: past, present and future. Oncogene 24: 7656– 7672 Walsh TR (2006) Combinatorial genetic evolution of multiresistance. Curr Opin Microbiol 9: 476–482 Weiss RA (2006) The discovery of endogenous retroviruses. Retrovirology 3: 67 (doi: 10.1186/1742-4690-3-67)

803

804 804

Literaturverzeichnis

Winking H, Weith A, Boldyreff B et al. (1991) Polymorphic HSRs in chromosome 1 of the two semispecies Mus musculus musculus and M. m. domesticus have a common origin in an ancestral population. Chromosoma 100: 147–151 Yao MC, Chao JL (2005) RNA-guided DNA-deletion in Tetrahymena: an RNAi-based machanism for programmed genome rearrangements. Annu Rev Genet 39: 537–559 Yoshioka K, Honma H, Zushi M et al. (1990) Virus-like particle formation of Drosophila copia through autocatalytic processing. EMBO J 9: 535–541 Zafir-Lavie I, Michaeli Y, Reiter Y (2007) Novel antibodies as anticancer agents. Oncogene 26: 3714–3733 Zhang Z, Carriero N, Gerstein M (2004) Comparative analysis of processed pseudogenes in the mouse and human genomes. Trends Genet 20: 62–67 Kapitel 9 Veränderungen im Genom: Mutationen Acharya M, Mookherjee S, Bhattacharjee A et al. (2007) Evaluation of the OPTC gene in primary open angle glaucoma: functional significance of a silent change. BMC Mol Biol 8: 21 (doi: 10.1186/1471-2199-8-21; nur online) Adams KL, Wendel JF (2005) Polyploidy and genome evolution in plants. Curr Opin Plant Biol 8: 135–141 Adler ID, Schmid TE, Baumgartner A (2002) Induction of aneuploidy in male mouse germ cells detected by the sperm-FISH assay: a review of the present data base. Mutat Res 504: 173–182 Alonso JM, Stepanova AN, Leisse TJ et al. (2003) Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science 301: 653–657 Ames BN, Durston WE, Yamasaki E et al. (1973) Carcinogens are mutagens: a simple test system combining liver homogenates for activation and bacteria for detection. Proc Natl Acad Sci USA 70: 2281–2285 Andersson L (2001) Genetic dissection of phenotypic diversity in farm animals. Nat Rev Genet 2: 130–138 Andersson L, Georges M (2004) Domestic-animal genomics: deciphering the genetics of complex traits. Nat Rev Genet 5: 202–212 Auerbach C (1978) Forty years of mutation research: a pilgrim’s progress. Heredity 40: 177–187 Banerjee A, Yang W, Karplus M et al. (2005) Structure of a repair enzyme interrogating undamaged DNA elucidates recognition of damaged DNA. Nature 434: 612–618 Baron U, Bujard H (2000) Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol 327: 401–421 Benzer S (1961) On the topography of the genetic fine structure. Proc Natl Acad Sci USA 47: 403–415 Brennecke H (1937) Strahlenschäden von Mäuse- und Rattensperma, beobachtet an der Frühentwicklung der Eier. Strahlentherapie 60: 214–238 Brouwer JR, Willemsen R, Oostra BA (2009) Microsatellite repeat instability and neurological disease. BioEssays 31: 71–83 Cardis E, Howe G, Ron E et al. (2006) Cancer consequences of the Chernobyl accident: 20 years on. J Radiol Prot 26: 127– 140

Carrano AV, Thompson LH, Lindl PA et al. (1978) Sister chromatid exchanges as an indication of mutagenesis. Nature 271: 551–553 Cimino MC (2006) Comparative overview of current international strategies and guidelines for genetic toxicology testing for regulatory purposes. Environ Mol Mutagen 47: 362–390 Colman A (1999) Dolly, Polly and other “ollys”: likely impact of cloning technology on biomedical uses of livestock. Genet Anal 15: 167–173 Comai L (2005) The advantages and disadvantages of being polyploid. Nat Rev Genet 6: 836–846 Costa C, Zhao L, Burton WV et al. (2002) Transgenic pigs designed to express human CD59 and H-transferase to avoid humoral xenograft rejection. Xenotransplantation 9: 45–57 Cox MM (2002) The nonmutagenic repair of broken replication forks via recombination. Mutat Res 510: 107–120 Cummings CJ, Zoghbi HY (2000) Trinucleotide repeats: mechanisms and pathophysiology. Annu Rev Genomics Human Genet 1: 281–328 De Cort M, Dubois G, Fridman SD et al. (1998) Atlas of caesium deposition on Europe after the Chernobyl accident. Luxembourg: European Commission; Rept EUR 16733 De Vries H (1901) Die Mutationstheorie, Bd I. Veit, Leipzig Edwards AA (1997) The use of chromosomal aberrations in human lymphocytes for biological dosimetry. Radiat Res 148: S39–S44 Einsele A (2007) The gap between science and perception: the case of plant biotechnology in Europe. Adv Biochem Eng Biotechnol 107: 1–11 Essen LO, Klar T (2006) Light-driven DNA repair by photolyases. Cell Mol Life Sci 63: 1266–1277 Favor J (1994) Specific-locus mutation test in germ cells of the mouse: an assessment of the screening procedures and the mutational events detected. In: Mattison DR, Olshan AF (eds) Male-Mediated Developmental Toxicity. Plenum Press, New York, pp 23–36 Fenech M (2000) The in vitro micronucleus technique. Mutat Res 455: 81–95 Feuillet C, Langridge P, Waugh R (2007) Cereal breeding takes a walk on the wild side. Trends Genet 24: 24–32 Fromm M, Taylor LP, Walbot V (1985) Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc Natl Acad Sci USA 82: 5824–5828 Fujii J, Otsu K, Zorzato F et al. (1991) Identification of a mutation in the porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia. Science 253: 448–451 Gusella JF, MacDonald ME (2000) Molecular genetics: unmasking polyglutamine triggers in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci 1: 109–115 Haldane JBS (1935) The rate of spontaneous mutation in the human gene. J Genet 31: 317–326 Hastings PJ, Ira G, Lupski JR (2009) A microhomology-mediated break-induced replication model for the origin of human copy number variation. PLoS Genet 5: e1000327 Hegarty MJ, Hiscock SJ (2008) Genomic clues to the evolutionary success of polyploidy plants. Curr Biol 18: R435–R444 Hertwig P (1935) Sterilitätserscheinungen bei röntgenbestrahlten Mäusen. Z indukt Abstamm Vererbungsl 70: 517–523 Hillen W, Berens C (2002) Tetracyclin-gesteuerte Genregulation: Vom bakteriellen Ursprung zum eucaryotischen Werkzeug. BIOspektrum 4: 355–358

Literaturverzeichnis

Hrabé de Angelis MH, Flaswinkel H, Fuchs H et al. (2000) Genome-wide, large-scale production of mutant mice by ENU mutagenesis. Nat Genet 25: 444–447 James C (2008) Report 2008; International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA; http://www. isaaa.org/) Karekar V, Joshi S, Shinde SL (2000) Antimutagenic profile of three antioxidants in the Ames assay and the Drosophila wing spot test. Mutat Res 468: 183–194 Kellerer AM (2000) Risk estimates for radiation-induced cancer – the epidemiological evidence. Radiat Environ Biophys 39: 17–24 Kempken F, Kempken R (2004) Gentechnik bei Pflanzen – Chancen und Risiken, 2. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo Kremer EJ, Pritchard M, Lynch M et al. (1991) Mapping of DNA instability at the fragile X to a trinucleotide repeat sequence p(CCG)n. Science 252: 1711–1714 La Spada AR, Wilson EM, Lubahn DB et al. (1991) Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular dystrophy. Nature 352: 77–79 Leibeling D, Laspe P, Emmert S (2006) Nucleotide excision repair and cancer. J Mol Hist 37: 225–238 Leibenguth F (1982) Züchtungsgenetik. Georg Thieme, Stuttgart, New York Li W-H, Yi S, Makova K (2002) Male-driven evolution. Curr Opin Genet Dev 12: 650–656 Luch A (2005) Nature and Nurture – lessons from chemical carcinogenesis. Nat Rev Cancer 5: 113–125 Mallet J (2007) Hybrid speciation. Nature 446: 279–283 McGrew DA, Knight KL (2003) Molecular design and functional organization of the RecA protein. Crit Rev Biochem Mol Biol 38: 385–432 Mortelmans K, Zeiger E (2000) The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. Mutat Res 455: 29–60 Muller HJ (1930) Radiation and genetics. Am Nat 64: 220–251 Munk K (2001) Grundstudium Biologie: Genetik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin Nohmi T, Suzuki T, Masumura K-J (2000) Recent advances in the protocols of transgenic mouse mutation assay. Mutat Res 455: 191–215 Palmiter RD, Brinster RL, Hammer RE et al. (1982) Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes. Nature 300: 611–615 Pfeifer GP, You YH, Besaratinia A (2005) Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res 571: 19–31 Russell WL, Kelly EM (1982) Mutation frequency in male mice and the estimation of genetic hazards of radiation in men. Proc Natl Acad Sci USA 79: 542–544 Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA sequencing with chain-terminating methods. Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463–5467 Sauer B (1994) Site-specific recombination: developments and applications. Curr Opin Biotech 5: 521–527 Schäfer H (1939) Die Fertilität von Mäusemännchen nach Bestrahlung mit 200 r. Z Mikrosk Anat Forsch 46: 121–152 Schenkel J (2006) Transgene Tiere, 2. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg Singer TM, Lambert IB, Williams A et al. (2006) Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, trans-

genic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays. Mutat Res 598: 164–193 Soberón M, Gill SS, Bravo A (2009) Signaling versus punching hole: How do Bacillus thuringiensis toxins kill insect midgut cells? Cell Mol Life Sci 66: 1337–1349 Spradling AC, Rubin GM (1982) Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science 218: 341– 347 Stankiewicz P, Lupski JR (2002) Genomic architecture, rearrangements and genomic disorders. Trends Genet 18: 74–82 Sung YH, Song J, Lee HW (2004) Functional genomics approach using mice. J Biochem Mol Biol 37: 122–132 Sutton MD, Smith BT, Godoy VG et al. (2000) The SOS response: recent insights into umuDC-dependent mutagenesis and DNA damage tolerance. Annu Rev Genet 34: 479–497 Taylor NJ, Fauquet CM (2002) Microparticle bombardement as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA Cell Biol 21: 963–977 Thoma F (2005) Repair of UV lesions in nucleosomes – intrinsic properties and remodeling. DNA Repair 4: 855–869 UNSCEAR (United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation) Report to the General Assembly (2000) Sources and Effects of Ionizing Radiation, vol. II: Effects. United Nations, New York Verger P (1997) Down syndrome and ionizing radiation. Health Phys 73: 882–893 Warburton PE (2004) Chromosomal dynamics of human neocentromere formation. Chromosome Res 12: 717–626 Warwick SI, Beckie HJ, Hall LM (2009) Gene flow, invasivness, and ecological impact of genetically mofified crops. Ann NY Acad Sci 1168: 72–79 Wiesehahn G, Hearst JE (1978) DNA unwinding induced by photoaddition of psoralenderivatives and determination of dark-binding equilibrium constants by gel electrophoresis. Proc Natl Acad Sci USA 75: 2703–2707 Kapitel 10 Formalgenetik Allison AC (1956) The sickle-cell and haemoglobin C genes in some African population. Hum Genet 21: 67–89 Bateson W (1909) Mendel’s principles of heredity. Cambridge University Press, Cambridge Beadle GW, Ephrussi B (1937) Development of eye colors in Drosophila: diffusible substances and their interrelations. Genetics 22: 479–483 Bennett DC, Lamoreux ML (2003) The color loci of mice – a genetic century. Pigment Cell Res 16: 333–344 Biswas S, Akey JM (2006) Genomic insights into positive selection. Trends Genet 22: 437–446 Boyd WC (1950) Genetics and the Races for Man. DC Health, Boston Bridges CB (1913) Non-disjunction as a proof of the chromosome theory of heredity. Genetics 1: 1–52, 107–162 Buri P (1956) Gene frequency in small populations of Drosophila. Evolution 10: 367–402 Cain AJ, King JMB, Sheppard PM (1960) New data on the genetics of polymorphism in the snail Cepea nemoralis L. Genetics 45: 393–411 Charlat S, Hornett EA, Fullard JH et al. (2007) Extraordinary flux in sex ratio. Science 317: 214

805

806 806

Literaturverzeichnis

Charlesworth B (2009) Effective population size and patterns of molecular evolution and variation. Nat Rev Genet 10: 195– 205 Chenoweth SF, Blows MW (2006) Dissecting the complex genetic basis of mate choice. Nat Rev Genet 7: 681–692 Cordell HJ (2002) Epistasis: what it means, what it doesn’t mean, and statistical methods to detect it in humans. Hum Mol Genet 11: 2463–2468 Darwin C (1859) On the Origin of Species. John Murray, London Dobzhansky T (1951) Genetics and the Origin of Species, 3. Aufl. Columbia University Press, New York Doerge RW (2002) Mapping and analysis of quantitative trait loci in experimental populations. Nat Rev Genet 3: 43–52 Galvani AP, Novembre J (2005) The evolutionary history of CCR5-D32 HIV-resistance mutation. Microbes Infect 7: 302– 309 Garland T jr, Kelly SA (2006) Phenotypic plasticity and experimental evolution. J Exp Biol 209: 2344–2361 Graw J, Jung M, Löster J et al. (1999) Mutation in the βA3/ A1-crystallin encoding gene Cryba1 causes a dominant cataract in the mouse. Genomics 62: 67–73 Haldane JBS (1919) The combination of linkage values, and the calculation of distances between the loci of linked factors. J Genet 8: 299–309 Hardy GH (1908) Mendelian proportions in mixed populations. Science 28: 49–50 Hopkin M (2004) Dark prospects. Nature 430: 522 International HapMap Consortium (2005) A haplotype map of the human genome. Nature 437: 1299–1320 Johannsen W (1903) Über Erblichkeit in Populationen und reinen Linien. Ein Beitrag zur Beleuchtung schwebender Selektionsfragen. Fischer, Jena Kettlewell HBD (1958) A survey of the frequencies of Biston betularia (L.) (Lep.) and its melanic forms in Great Britain. Heredity 12: 51–72 Kocher TD (2004) Adaptive Evolution and explosive speciation: the cichlid fish model. Nat Rev Genet 5: 288–298 Kondrashov FA, Koonin EV (2004) A common framework for understanding the origin of genetic dominance and evolutionary fates of gene duplications. Trends Genet 20: 287–291 Kurar E, Barendse W, Bottema CDK et al. (2002) Consensus and comprehensive linkage map of bovine chromosome 24. Anim Genet 33: 460–463 Lander ES, Botstein D (1989) Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics 121: 185–199 (Corrigendum in: Genetics 1994, 136: 705) Landsteiner K (1901) Über Agglutinationserscheinungen normalen menschlichen Blutes. Wiener Med Wochenschrift 14: 1132–1134 Landsteiner K, Wiener AS (1940) An agglutinable factor in human blood recognized by immune sera for rhesus blood. Proc Soc Exp Biol Med 43: 223–246 Lerner IM (1958) The Genetic Basis of Selection. Wiley, New York Lerner IM (1968) Heredity, Evolution and Society. Freeman, San Francisco Lindegren CC (1932) The genetics of Neurospora. II. Segregation of the sex factors in the asci of N. crassa, N. sitophila, N tetrasperma. Bull Torrey Bot Cl 59: 119–138 Lippman ZB, Zamir D (2007) Heterosis: revisiting the magic. Trends Genet 23: 60–66

Little CC (1913) “Yellow” and “agouti” factors in mice. Science 38: 205 Lloyd V, Ramaswami M, Krämer H (1998) Not just pretty eyes: Drosophila eye-colour mutations and lysosomal delivery. Trends Cell Biol 8: 257–259 Lolle SJ, Victor JL, Young JM et al. (2005) Genome-wide nonmendelian inheritance of extra-genomic information in Arabidopsis. Nature 434: 505–509 Mendel G (1866) Versuche über Pflanzen-Hybride. Verhandlungen des naturforschenden Vereines, Bd IV. Brünn Masly JP, Jones CD, Noor MAF et al. (2006) Gene transposition as a cause of hybrid sterility in Drosophila. Science 313: 1448–1450 Masly JP, Presgraves DC (2007) High-resolution genome-wide dissection of the two rules of speciation in Drosophila. PLoS Biol 5: e243 (doi:10.1371/journal.pbio.0050243) Mayr E (1959) “Where are we?” Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 24: 1–14 Meissner PN, Dailey TA, Hift RJ et al. (1996) A R59W mutation in human protoporphyrinogen oxidase results in decreased enzyme activity and is prevalent in South Africans with variegate porphyria. Nat Genet 13: 95–97 Mercier R, Jolivet S, Vignard J et al. (2008) Outcrossing as an explanation of the apparent unconventional genetic behavior of Arabidopsis thalania hth mutants. Genetics 180: 2295–2297 Morgan TH (1911) Random segregation versus coupling in mendelian inheritance. Science 34: 384 Müller B, Hedrich K, Kock N et al. (2002) Evidence that paternal expression of the ε-sarcoglycan gene accounts for reduced penetrance in myoclonus-dystonia. Am J Hum Genet 71: 1303–1311 Muller HJ (1932) Further studies on the nature and causes of gene mutations. In: Jones DF (ed) Proceedings of the 6th International Congress of Genetics. Brooklyn Botanic Gardens, USA, pp 213–255 Nakamoto K, Wang S, Jenison RD et al. (2006) Linkage disequilibrium blocks, haplotype structure, and htSNPs of human CYP7A1 gene. BMC Genetics 7: 29 Nilsson-Ehle H (1909) Kreuzungsuntersuchungen an Hafer und Weizen. Lund Univ Aarskr, N F Afd Ser 2, 5: 1–122 Noor MAF, Feder JL (2006) Speciation genetics: evolving approaches. Nat Rev Genet 7: 851–861 Olsson ML, Chester MA (2001) Polymorphism and recombination events at the AB0 locus: a major challenge for genomic AB0 blood grouping strategies. Transfusion Med 11: 295–313 Plate L (1910) Vererbungslehre und Deszendenztheorie. Festschr f Hertwig R II. Fischer, Jena, 537 Punnett RC (1911) Mendelism. Macmillan, New York Saccheri IJ, Rousset F, Watts PC et al. (2008) Selection and gene flow on a diminishing cline of melanic peppered moths. Proc Natl Acad Sci USA 105: 16212–16217 Sachs L (2002) Angewandte Statistik, 10. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg, New York Salzburger W, Meyer A (2004) The species flocks of East African cichlid fishes: recent advances in molecular phylogenetics and population genetics. Naturwissenschaften 91: 277–290 Showalter HM (1934) Self flower-color inheritance and mutation in Mirabilis jalapa L. Genetics 19: 568–580 Shull GH (1908) The composition of a field of maize. Am Breed Assoc 4: 296–301 Srb AM, Owen RD, Edgar RS (1965) General Genetics, 2. Aufl. Freeman, San Francisco London

Literaturverzeichnis

Steingrimsson E, Moore KJ, Lamoreux ML et al. (1994) Molecular basis of mouse microphthalmia (mi) mutations helps explain their developmental and phenotypic consequences. Nat Genet 8: 256–263 Stine OC, Smith KD (1990) The estimation of selection coefficients in Africaners: Huntington disease, Porphyria variegata, and lipoid proteinosis. Am J Hum Genet 46: 452–458 Storch V, Welsch U, Wink M (2007) Evolutionsbiologie, 2. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg Strickberger MW (1988) Genetik. Carl Hanser, München, Wien Sturtevant AH (1913) The linear arrangement of six sexlinked factors in Drosophila, as shown by their mode of association. J Exp Zool 14: 43–59 Vogel F, Motulsky AG (1996) Human Genetics, 3. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo Wakamatsu K, Ito S (2002) Advanced chemical methods in melanin determination. Pigment Cell Res 15: 174–183 Weinberg W (1908) Über den Nachweis der Vererbung beim Menschen. Jahreshefte Verein vaterl Naturk Württemberg 64: 369–382 Wellems TE, Fairhurst RM (2005) Malaria-protective traits at odds in Africa? Nat Genet 37: 1160–1162 Wiener AS, Unger LJ, Cohen L et al. (1956) Type-specific cold auto-antibodies as a cause of aquired hemolytic anemia and hemolytic transfusion reactions: biologic test with bovine red cells. Ann Intern Med 44: 221–240 Woodworth CM, Leng ER, Jungenheimer RW (1952) Fifty generations of selection for protein and oil in corn. Agronomy J 44: 60–66 Yazer MH (2005) What a difference 2 nucleotides make: a short review of AB0 genetics. Transfusion Med Rev 19: 200–209 Yip SP (2002) Sequence variation at the human AB0 locus. Ann Hum Genet 66: 1–27 Zschocke J (2008) Dominant versus recessive: Molecular mechanisms in metabolic disease. J Inherit Metab Dis 31: 599–618 Kapitel 11 Entwicklungsgenetik Amabile G, Meissner A (2009) Induced pluripotent stem cells: current progress and potential for regenerative medicine. Trends Mol Med 15: 59–68 Babbs C, Furniss D, Morriss-Kay, GM, Wilkie AOM (2008) Polydactyly in the mouse mutant doublefoot involves altered Gli3 processing and is caused by a large deletion in cis to Indian hedgehog. Mech Dev 125: 517-526 Barlow DP, Stöger R, Hermann BG et al. (1991) The mouse insulin-like growth factor type-2 receptor is imprinted and closely linked to the Tme locus. Nature 349: 84–87 Bateson W (1894) Materials for the study of variation treated with especial regard to discontinuity in the origin of species. Macmillan, London Beis D, Stainier DYR (2006) In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends Cell Biol 16: 105–112 Blewitt ME, Vickaryous NK, Paldi A et al. (2006) Dynamic reprogramming of DNA methylation at an epigenetically sensitive allele in mice. PLoS Genet 2: e49 Cartolano M, Castillo R, Efremova N et al. (2007) A conserved microRNA module exerts homeotic control over Petunia hybrida and Antirrhinum majus floral organ identity. Nat Genet 39: 901–905

Cattanach BM, Jones J (1994) Genetic imprinting in the mouse: implications for gene regulation. J Inher Metab Dis 17: 403– 420 Chin-Sang ID, Chisholm AD (2000) Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans. Trends Genet 16: 544–551 Chitwood DH, Guo M, Nogueira FTS et al. (2007) Establishing leaf polarity: the role of small RNAs and positional signals in the shoot apex. Development 134: 813–823 Chopra VS, Mishra RK (2006) ”Mir”acles in hox gene regulation. Bioessays 28: 445–448 Cooley L, Verheyen E, Ayers K (1992) chickadee encodes a profilin required for intercellular cytoplasm transport during Drosophila oogenesis. Cell 69: 173–184 Copp AJ, Greene NDE, Murdoch JN (2003) The genetic basis of mammalian neurulation. Nat Rev Genet 4: 784–793 Crick AP, Babbs C, Brown JM et al. (2003) Develomental mechanisms underlying polydactyly in the mouse mutant Doublefoot. J Anat 202: 21–26 DeChiara TM, Robertson EJ, Efstratiadis A (1991) Parental imprinting of the mouse insulin-like growth factor II gene. Cell 64: 849–859 Driesch H (1900) Studien über das Regulationsvermögen der Organismen. 4. Die Verschmelzung der Individualität bei Echinidenkeimen. Arch Entw Mech 10: 411–434 Edwards JL, Schrick FN, McCracken MD et al. (2003) Cloning adult farm animals: a review of the possibilities and problems associated with somatic cell nuclear transfer. Am J Reprod Immunol 50: 113–123 Ephrussi A, St Johnston D (2004) Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell 116: 143–152 Evans MJ, Kaufman MH (1981) Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292: 154– 156 Favor J, Neuhäuser-Klaus A (2000) Saturation mutagenesis for dominant eye morphological defects in the mouse Mus musculus. Mamm Genome 11: 520–525 Fuchs J, Mueller JC, Lichtner P et al. (2009) The transcription factor PITX3 is associated with sporadic Parkinson’s disease. Neurobiol Ageing 30: 731-738 Gerlach M, Braak H, Hartmann A et al. (2002) Current state of stem cell research for the treatment of Parkinson’s disease. J Neurol 249 (Suppl 3): III/33–35 Graw J (2003) The genetic and molecular basis of congenital eye defects. Nat Rev Genet 4: 876–888 Graw J, Neuhäuser-Klaus A, Klopp N et al. (2004) Genetic and allelic heterogeneity of Cryg mutations in eight distinct forms of dominant cataract in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci 45: 1202–1213 Gurdon JB (1968) Transplanted nuclei and cell differentiation. Sci Amer 219: 24–35 Gurdon JB, Byrne JA, Simonsson S (2003) Nuclear reprogramming and stem cell creation. Proc Natl Acad Sci USA 100: 11819–11822 Halder G, Callaerts P, Gehring WJ (1995) Induction of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila. Science 267: 1788–1792 Hall JG (2003) Twinning. The Lancet 362: 735–743 Hanna J, Wernig M, Markoulaki S et al. (2007) Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin. Science 318: 1920-1923

807

808 808

Literaturverzeichnis

Imaizumi T, Kay SA (2006) Photoperiodic control of flowering: not only by coincidence. Trends Plant Sci 11: 550–556 Jaenisch J, Bird A (2003) Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet 33 (Suppl): 245–254 Jenik PD, Barton MK (2005) Surge and destroy: the role of auxin in plant embryogenesis. Development 132: 3577–3585 Jiménez G, Guichet A, Ephrussi A et al. (2000) Relief of gene expression by Torso RTK signaling: role of capicua in Drosophila terminal and dorsoventral patterning. Genes Dev 14: 224–231 Johnston DS, Nüsslein-Volhard C (1992) The origin of patterns and polarity in the Drosophila embryo. Cell 68: 201–219 Jones PA, Baylin SB (2007) The epigenomics of cancer. Cell 128: 683–692 Kessel M, Gruss P (1991) Homeotic transformation of murine vertebrae and concomitant alteration of Hox codes induced by retinoic acid. Cell 67: 89–104 King TJ, Briggs R (1956) Serial transplantation in amphibia. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 21: 271–289 Kipreos ET (2005) C.elegans cell cycles: invariance and stem cell divisions. Nat Rev Mol Cell Biol 6: 766–776 Kornfeld K (1997) Vulval development in Caenorhabditis elegans. Trends Genet 13: 55–61 Kratochvilova J, Ehling UH (1979) Dominant cataract mutations induced by γ-irradiation of male mice. Mutat Res 63: 221–223 Lamarck JB (1809) Philosophie zoologique (2 Bände). Paris Laux T, Würschum T, Breuninger H (2004) Genetic regulation of embryonic pattern formation. Plant Cell 16 (Suppl): S190– S202 Lederberg EM, Lederberg J (1953) Genetic studies of lysogenicity in Escherichia coli. Genetics 38: 51–64 Lenz W (1970) Medizinische Genetik, 2. Aufl. dtv und Thieme, Stuttgart Lenz W (1992) A personal perspective on the thalidomide tragedy. Teratology 46: 417–418 Leptin M, Grunewald E (1990) Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development 110: 73–84 Li E (2002) Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development. Nat Rev Genet 3: 662–673 Luria SE, Delbrück M (1943) Mutations in bacteria from virus sensitivity to virus resistance. Genetics 28: 491–511 Lyczak R, Gomes JE, Bowerman B (2002) Heads or tails: cell polarity and axis formation in the early Caenorhabditis elegans embryo. Dev Cell 3: 157–166 Maduro MF (2006) Endomesoderm specification in Caenorhabditis elegans and other nematodes. BioEssays 28: 1010–1022 McGrath J, Solter D (1983) Nuclear transplantation in the mouse embryo by microsurgery and cell fusion. Science 220: 1300– 1302 McKinnall RG (2002) Cloning of Homo sapiens? No! Differentiation 69: 150–153 Menegola E, Di Renzo F, Broccia ML et al. (2006) Inhibition of histone deacetylase as a new mechanism of teratogenesis. Birth Def Res (Part C) 78: 345–353 Morante J, Desplan C, Celik A (2007) Generating patterned arrays of photoreceptors. Curr Opin Genet Develop 17: 314– 319 Moreira J, Deutsch A (2005) Pigment pattern formation in zebrafish during late larval stages: a model based on local interactions. Dev Dyn 232: 33–42

Morgan HD, Sutherland HGE, Martin DIK et al. (1999) Epigenetic inheritance at the agouti locus in the mouse. Nat Genet 23: 314–318 Müller WA, Hassel M (2006) Entwicklungsbiologie, 3. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo Nakajima K, Benfey PN (2002) Signaling in and out: control of cell division and differentiation in the shoot and root. Plant Cell 14 (Suppl): S265–S276 Neuhauss SCF (2003) Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J Neurobiol 54: 148–160 Niessing D, Rivera-Pomar, R, La Rosée A et al. (1997) A cascade of transcriptional control leading to axis determination in Drosophila. J Cell Physiol 173: 162–167 Nir SG, David R, Zaruba M et al. (2003) Human embryonic stem cells for cardiovascular repair. Cardiovasc Res 58: 313–323 Nöthiger R (1972) The larval development of imaginal disks. In: Ursprung H, Nöthiger R (eds) Results and Problems in Cell Differentiation, 5. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, pp 1–34 Opiz PM (1821) 2. Capsella apetala Opiz. Eine neue merkwürdige Pflanze. Flora oder Botanische Zeitung 4: 436–443 Orlic D, Kajstura J, Chimenti S et al. (2001) Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 410: 701–705 Paquette AJ, Benfey PN (2001) Axis formation and polarity in plants. Curr Opin Genet Dev 11: 405–409 Passier R, Mummery C (2003) Origin and use of embryonic and adult stem cells in differentiation and tissue repair. Cardiovasc Res 58: 323–335 Perkins TJ, Jaeger J, Reinitz J et al. (2006) Reverse engineering the gap gene network of Drosophila melanogaster. PloS Comput Biol 2: e51 Pfendler KC, Kawase E (2003) The potential of stem cells. Obst Gynecol Surv 58: 197–208 Pick L (1998) Segmentation: painting stripes from flies to vertebrates. Dev Genet 23: 1–10 Placzek MR, Chung IM, Macedo HM et al. (2009) Stem cell bioprocessing: fundamentals and principles. J R Soc Interface 6: 209–232 Pruitt RE, Bowman JL, Grossniklaus U (2003) Plant genetics: a decade of integration. Nat Genet 33 (Suppl) 294–304 Reik W, Walter J (2001a) Genomic imprinting: parental influence on the genome. Nat Rev Genet 2: 21–32 Reik W, Walter J (2001b) Evolution of imprinting mechanisms: the battle of the sexes begins in the zygote. Nat Genet 27: 255–256 Reyes JC (2006) Chromatin modifiers that control plant development. Curr Opin Plant Dev 9: 21–27 Rivera-Pomar R, Jäckle H (1996) From gradient to stripes in Drosophila embryogenesis: filling the gaps. Trends Genet 12: 478–483 Rose LS, Kemphues KJ (1998) Early patterning of the C. elegans embryo. Annu Rev Genet 32: 521–545 Saedler H, Becker A, Winter KU et al. (2001) MADS-box genes are involved in floral development and evolution. Acta Biochim Polon 48: 351–358 Sanson B (2001) Generating patterns from fields of cells. EMBO Rep 2: 1083–1088 Schulz C, Tautz D (1994) Autonomous concentration-dependent activation and repression of Krüppel by hunchback in the Drosophila embryo. Development 120: 3043–3049

Literaturverzeichnis

Schramm FR (1999) The Dolly case, the Poly drug, and the morality of human cloning. Cad Saude Publica 15 (Supp. 1): 51–64 Schwarz-Sommer Z, Huijser P, Nacken W et al. (1990) Genetic control of flower development by homeotic genes in Antirrhinum majus. Science 250: 931–936 Scofield S, Murray JAH (2006) KNOX gene function in plant stem cell niches. Plant Mol Biol 60: 929–946 Sha K, Fire A (2005) Imprinting capacity of gamete lineages in Caenorhabditis elegans. Genetics 170: 1633–1652 Sharma RP, Chopra VL (1976) Effect of the wingless (wg1) mutation on wing and haltere development in Drosophila melanogaster. Dev Biol 48: 461-465 Sinclair AH, Berta P, Palmer MS et al. (1990) A gene from the human sex-determining region encodes a protein with homology to a conserved DNA-binding motif. Nature 346: 240–244 Skromne I, Prince VE (2008) Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Dev Dyn 237: 861–882 Smidt MP, Smits SM, Bouwmeester H et al. (2004) Early developmental failure of substantia nigra dopamine neurons in mice lacking the homeodomain gene Pitx3. Development 131: 1145-1155 Soltis DE, Ma H, Frohlich MW et al. (2007) The floral genome: an evolutionary history of gene duplication and shifting patterns of gene expression. Trends Plant Sci 12: 358–367 Spemann H (1938) Embryonic Development and Induction. Yale University Press, New Haven Steinhauer J, Kalderon D (2006) Microtubule polarity and axis formation in the Drosophila oocyte. Dev Dyn 235: 1455–1468 Struhl G, Johnston P, Lawrence PA (1992) Control of Drosophila body pattern by the hunchback morphogen gradient. Cell 69: 237–249 Tabata T, Takei Y (2004) Morphogens, their identification and regulation. Development 131: 703–712 Tanaka H, Dhonukshe P, Brewer PB et al. (2006) Spatiotemporal asymmetric auxin distribution: a means to coordinate plant development. Cell Mol Life Sci 63: 2738–2754 Tariverdian G, Buselmaier W (2004) Humangenetik, 3. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS et al. (1998) Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282: 1145–1147 Tickle C (2002) Molecular basis of vertebrate limb patterning. Am J Med Genet 112: 250–255 Tsiantis M, Hay A (2003) Comparative plant development: the time of the leaf? Nat Rev Genet 4: 169–180 Vierbuchen T, Ostermeier A, Pang ZP et al. (2010) Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 463: 1035-1041 Vroemen C, de Vries S (1999) Flowering plant embryogenesis. In: Russo VEA, Cove DJ, Edgar LG, Jaenisch R, Salamini (eds): Development. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, pp 121–132 Waddington C (1940) The genetic control of wing development in Drosophila. J Genet 41: 75–80 Wilkins JF, Haig D (2003) What good is genomic imprinting: the function of parent-specific gene expression. Nat Rev Genet 4: 1–10 Williamson CB, Blake A, Thomas S et al. (2009) MRC Harwell, Oxfordshire, World Wide Web site – Mouse Imprinting Data and References. http:www.har.mrc.ac.uk/research/genomic_ imprinting

Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J et al. (1997) Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385: 810–813 Zhao LR, Duan WM, Reyes M et al. (2002) Human bone marrow stem cells exhibit neural phenotypes and ameliorate neurological deficits after grafting into the ischemic brain of rats. Exp Neurol 174: 11–20 Kapitel 12 Genetik menschlicher Erkrankungen Aylon Y, Oren M (2007) Living with p53, dying of p53. Cell 130: 597–600 Balmer A, Zografos L, Munier F (2006) Diagnosis and current management of retinoblastoma. Oncogene 25: 5341–5349 Barker J (2007) Clinical Review: Type 1 diabetes-associated autoimmunity: natural history, genetic associations, and screening. J Clin Endocrinol Metab 91: 1210–1217 Beet EA (1949) The genetics of sickle cell trait in a Bantu tribe. Ann Eugenics 14: 279 Bolton-Maggs PHB, Pasi KJ (2003) Haemophilias A and B. Lancet 361: 1801–1809 Boomsma D, Busjahn A, Peltonen L (2002) Classical twin studies and beyond. Nat Rev Genet 3: 872–882 Boveri T (1902) Über mehrpolige Mitosen als Mittel zur Analyse des Zellkerns. Verh phys med Ges Würzburg, Neue Folge 35: 67–90 Byrne JA, Pedersen DA, Clepper LL et al. (2007) Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature 450: 497–502 Capecchi MR (1989) The new mouse genetics: altering the genome by gene targeting. Trends Genet 5: 70–76 Carelli V, Ross-Cisneros FN, Sadun AA (2002) Optic nerve degeneration and mitochondrial dysfunction: genetic and acquired optic neuropathies. Neurochem Intern 40: 573–584 Černá M (2008) Genetics of autoimmune diabetes mellitus. Wien Med Wochenschr 158: 2–12 Collins A, Frezal J, Teague J et al. (1996) A metric map of the humans: 23.500 loci in 850 bands. Proc Natl Acad Sci USA 93: 14771–14775 Collod-Bérou G, Bourdelles SL, Ades L et al. (2003) Update of the UMD-FBN1 mutation database and creation of an FBN1 polymorphism database. Hum Mutat 22: 199–208 Cooke RA, van der Veer A (1916) Human sensitization. J Immunol 1: 201–305 Daly AK (2007) Individualized drug therapy. Curr Opin Drug Discov Devel 10: 29–38 Dedoussis GVZ, Schmidt H, Genschel J (2004) LDL-receptor mutations in Europe. Hum Mutat 24: 443–459 Dulbecco R (1986) A turning point in cancer research: sequencing the human genome. Science 231: 1055–1056 Estivill X, Bancells C, Ramos C et al. (1997) Geographic distribution and regional origin of 272 Cystic Fibrosis mutations in European populations. Hum Mutat 10: 135–154 Farini A, Razini P, Erratico S et al. (2009) Cell based therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. J Cell Physiol 221: 526–534 Frayling TM (2007) Genome-wide association studies provide new insights into type 2 diabetes aetiology. Nat Rev Genet 8: 657–662 Friday BB, Adjei AA (2005) K-ras as a target for cancer therapy. Biochim Biophys Acta 1756: 127–144

809

810 810

Literaturverzeichnis

Gabriel SE, Brigman KN, Koller BH et al. (1994) Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the Cystic Fibrosis mouse model. Science 266: 107–109 Galton F (1875) The history of twins as a criterion of the relative powers of nature and nurture. J R Anthropol Inst GB Irland 5: 391–406 Gloyn AL (2003) The search for type 2 diabetes genes. Ageing Res Rev 2: 111–127 Gollamudi R, Ghalib MH, Desai KK et al. (2009) Intravenous administration of Reolysin®, a live replication competent RNA virus is safe in patients with advanced solid tumors. Invest New Drugs (doi: 10.1007/s10637-009-9279-8; nur online) Graw J, Brackmann HH, Oldenburg J et al. (2005) Haemophilia A: from mutation analysis to new therapies. Nat Rev Genet 6: 488–501 Grosse SD, Rosenfeld M, Devine OJ et al. (2006) Potential impact of newborn screening for cystic fibrosis on child survival: a systematic review and analysis. J Pediatr 149: 362–266 Hacein-Bey-Abina S, Le Deist F, Carlier F et al. (2002) Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. N Engl J Med 346: 1185–1193 Haldane JBS (1919) The combination of linkage values, and the calculation of distances between the loci of linked factors. J Genet 8: 299–309 Hassold T, Hunt P (2001) To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet 2: 280–291 Herrick JB (1910) Peculiar elongated and sickle-shaped blood corpuscules in a case of severe anemia. Arch Int Med 6: 517–521 Huoponen K (2001) Leber hereditary optic neuropathy: clinical and molecular genetic findings. Neurogenetics 3: 119–125 Ingram VM (1956) A specific chemical difference between the globins of normal human and sickle-cell anaemia haemoglobin. Nature 178: 792–794 Jobling MA, Gill P (2004) Encoded evidence: DNA in forensic analysis. Nat Rev Genet 5: 739–751 Khurana TS, Davies KE (2003) Pharmacological strategies for muscular dystrophy. Nat Rev Drug Discov 2: 379–390 Knudson AG (2001) Two genetic hits (more or less) to cancer. Nat Rev Cancer 1: 157–162, 170 Kono T, Obata Y, Wu Q et al. (2004) Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood. Nature 428: 860–864 Kooy RF, Oostra BA, Willems PJ (1998) The Fragile X Syndrome and other fragile site disorders. In: Ostra BA (ed) Trinucleotide Diseases and Instability. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, pp 1–46 Kunkel TA (1992) DNA replication fidelity. J Biol Chem 267: 18251–18254 Lahn BT, Pearson NM, Jegalian K (2001) The human Y chromosome, in the light of evolution. Nat Rev Genet 2: 207–216 Leibeling D, Laspe P, Emmert S (2006) Nucleotide excision repair. J Mol Hist 37: 225–238 Lewandoski M (2001) Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet 2: 743–755 Liao Z, Zhao J, Zhu Y et al. (2007) The ND4 G11696A mutation may influence the phenotypic manifestation of the deafnessassociated 12S rRNA A1555G mutation in a four-generation Chinese family. Biochem Biophys Res Commun 362: 670–676 Lu S, Zhao C, Jiao H et al. (2007) Two Chinese families with pulverulent congenital cataracts and ΔG91 CRYBA1 mutations. Mol Vis 13: 1154–1160

Lynch TJ, Bell DW, Sordella R et al. (2004) Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to Gefitinib. N Engl J Med 350: 2129–2139 MacDonald ME (1998) Molecular genetics of Huntington’s disease. In: Oostra BA (ed) Trinucleotide Diseases and Instability. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, pp 47–75 Manno CS (2002) Gene therapy for bleeding disorders. Curr Opin Hematol 9: 511–515 McCoy MS, Bargmann CI, Weinberg RA (1984) Human colon carcinoma Ki-ras2 oncogene and its corresponding protooncogene. Mol Cell Biol 4: 1577–1582 Mocellin S, Costa R, Nitti D (2006) RNA interference: ready to silence cancer? J Mol Med 84: 4–15 Morton NE (1955) Sequential tests for the detection of linkage. Am J Hum Genet 7: 277–318 Muller HJ (1951) Radiation damage to genetic material. Sci Prog 7: 93–165 Müller WA, Hassel M (2006) Entwicklungsbiologie und Reproduktionsbiologie von Mensch und Tieren, 4. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo Muul LM, Tuschong LM, Soenen SL et al. (2003) Persistence and expression of the adenosine deaminase gene for 12 years and immune reaction to gene transfer components: long-term results of the first clinical gene therapy trial. Blood 101: 2563–2569 Nabel GJ (2004) Genetic, cellular and immune approaches to disease therapy: past and future. Nat Med 10: 135–141 Neel JV (1949) The inheritance of sickle cell anaemia. Science 110: 64–66 Neel JV, Schull WJ (1954) Human Heredity. University of Chicago Press, Chicago Oostra BA, Verkerk AJMH (1992) The fragile X syndrome: Isolation of the FMR-1 gene and characterization of the fragile X mutation. Chromosoma 101: 381–387 Oostra BA, Willemsen R (2009) FMR1: A gene with three faces. Biochim Biophys Acta 1790: 467–477 Paez JG, Jänne PA, Lee JC et al. (2004) EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to Gefitinib therapy. Science 304: 1497–1500 Pauling L, Itano HA, Singer SJ et al. (1949) Sickle cell anemia, a molecular disease. Science 110: 543–548 Ramirez F, Pereira L (1999) The fibrillins. Intern J Biochem Cell Biol 31: 255–259 Reichert JM, Valge-Archer VE (2007) Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov 6: 349–356 Remacle C, Dumortier O, Bol V et al. (2007) Intrauterine programming of the endocrine pancreas. Diabetes Obes Metab 9 (Suppl 2): 196–209 Reusens B, Remacle C (2006) Programming of the endocrine pancreas by the early nutritional environment. Intern J Biochem Cell Biol 38: 913–922 Robinson PN, Booms P, Katzke S et al. (2002) Mutations of FBN1 and genotype-phenotype correlations in Marfan Syndrome and related fibrillinopathies. Hum Mutat 20: 153–161 Romey MC (2006) Caractérisation fonctionnelle de mutants CFTR naturels: intérêt pour la mucoviscidose. Ann Biol Clin 64: 429–438 Schaaf CP, Zschocke J (2008) Basiswissen Humangenetik. Springer Medizin Verlag, Heidelberg Schapira AHV (2006) Mitochondrial disease. Lancet 368: 70–82

Literaturverzeichnis

Schulz WA (2005) Molecular Biology of Human Cancers. Springer, Dordrecht, Niederlande Shaw RJ, Cantley LC (2006) Ras, PI(3)K and mTOR signalling controls tumour cell growth. Nature 441: 424–430 Siemens HW (1924) Die Zwillingspathologie: Ihre Bedeutung, ihre Methodik, ihre bisherigen Ergebnisse. Springer, Berlin Soutar AK, Naoumova RP (2007) Mechanisms of disease: genetic causes of familial hypercholesterolemia. Nat Clin Pract Cardiovasc Med 4: 214–225 Strachan T, Read AP (2005) Molekulare Humangenetik, 3. Aufl. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Täckholm G (1922) Zytologische Studien über die Gattung Rosa. Acta Horti Bergiani 7: 97–381 Tariverdian G, Buselmaier W (2004) Humangenetik, 3. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo Valdes R, Linder MA, Jortani SA (2003) What is next in pharmacogenomics? Translating it to clinical practice. Pharmacogenomics 4: 499–505 Valleix S, Jeanny JC, Elsevier S et al. (1999) Expression of human F8B, a gene nested within the coagulation factor VIII gene, produces multiple eye defects and developmental alterations in chimeric and transgenic mice. Hum Mol Genet 8: 1291– 1301 Van Dellen A, Hannan AJ (2004) Genetic and environmental factors in the pathogenesis of Huntington’s disease. Neurogenetics 5: 9–17 Van Eerdewegh P, Little RD, Dupuis J et al. (2002) Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial hyperresponsiveness. Nature 418: 426–430 Vec M (2001) Die Spur des Täters. Juridikum 2: 89–94 Vogel F, Motulsky AG (1997) Human Genetics, 3. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg, New York Waehler R, Russell SJ, Curiel DT (2007) Engeneering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet 8: 573–587 Wagener JS, Sontag MK, Accurso FJ (2003) Newborn screening for cystic fibrosis. Curr Opin Pediatr 15: 309–315 Wallace DC (2005) The mitochondrial genome in human adaptive radiation and disease: On the road to therapeutics and performance enhancement. Gene 354: 169–180 Walsh CE (2002) Gene therapy for the hemophilias. Curr Opin Pediatr 14: 12–16 Wang W (2007) Emergence of a DNA-damage response network consisting of Fanconi anaemia and BRCA proteins. Nat Rev Genet 8: 735–748 Wills-Karp M, Ewart SL (2004) Time to draw breath: asthmasusceptibility genes are identified. Nat Rev Genet 5: 376–387 Kapitel 13 Verhaltens- und Neurogenetik Alzheimer A (1906) Über einen eigenartigen schweren Krankheitsprozess der Hirnrinde. Zentralblatt für Nervenkrankheiten 25: 1134 Archer SN, Robilliard DL, Skene DJ et al. ( 2003) A length polymorphism in the circadian clock gene Per3 is linked to delayed sleep phase syndrome and extreme diurnal preference. Sleep 26: 413–415 Bearhop S, Fiedler W, Furness RW et al. (2005) Assortative mating as a mechanism for rapid evolution of a migratory divide. Science 310: 502–504 Beckers J (2003) Von der Sequenz zur Funktion. In: GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, Neuherberg

(Hrsg) Was verraten unsere Gene? Mensch + Umwelt Spezial 16: 11–20 Belelli D, Lambert JJ (2005) Neurosteroids: Endogenous regulators of the GABAA receptor. Nat Rev Neurosci 6: 565–576 Berthold P (2001) Vogelzug als Modell der Evolutions- und Biodiversitätsforschung. Jahrbuch der Max-Planck-Gesellschaft: 27–48 Bice P, Valdar W, Zhang L et al. (2009) Genomewide SNP screen to detect quantitative trait loci for alcohol preference in the high alcohol preferring and low alcohol preferring mice. Alcohol Clin Exp Res 33: 531-537 Bozon B, Davis S, Laroche S (2003) A requirement for the immediate early gene zif268 in reconsolidation of recognition memory after retrieval. Neuron 40: 695–701 Brembs B (2003) Operant conditioning in vertebrates. Curr Opin Neurobiol 13: 710–717 Brose N (2007) Autismus – wenn Nervenzellen kontaktscheu sind. BIOspektrum 13: 614–616 Browman KE, Crabbe JC (1999) Alcohol and genetics: new animal models. Mol Med Today 5: 310–318 Bruce VG (1972) Mutants of the biological clock in Chlamydomonas reinhardi. Genetics 70: 537–548 Bućan M, Abel T (2002) The mouse: genetics meets behaviour. Nat Rev Genet 3: 114–123 Bünning E (1935) Zur Kenntnis der erblichen Tagesperiodizität bei den Primärblättern von Phaseolus multifloras. Jb wiss Bot 81: 411–418 Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI et al. (2007) Lack of selfadministration of cocaine in dopamine D1 receptor knockout mice. J Neurosci 27: 13140–13150 Canli T, Lesch KP (2007) Long story short: the serotonin transporter in emotion regulation and social cognition. Nat Neurosci 10: 1103–1109 Carr LG, Habegger K, Spence J et al. (2003) Analyses of quantitative trait loci contributing to alcohol preference in HAD1/ LAD1 and HAD2/LAD2 rats. Alcohol Clin Exp Res 27: 17101717 Chahrour M, Zoghbi HY (2007) The story of Rett syndrome: from clinic to neurobiology. Neuron 56: 422–437 Collins B, Blau J (2007) Even a stopped clock tells the right time twice a day: circadian timekeeping in Drosophila. Pflügers Arch Eur J Physiol 454: 857–867 Costa RM, Federov NB, Kogan JH et al. (2002) Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1. Nature 415: 526–530 Crawley JN (2008) Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron 57: 809–818 Crawley JN, Belkamp JK, Collins A (1997) Behavioral phenotypes of inbred mouse strains: implications and recommendations for molecular studies. Psychopharmacol 132: 107–124 De Vries B, Haan J, Frants RR, van den Maagdenberg AMJM, Ferrari MD (2006) Genetic biomarkes for migraine. Headache 46: 1059–1068 Feldman JF, Hoyle MN (1973) Isolation of circadian clock mutants of Neurospora crassa. Genetics 75: 605–613 Gallego M, Virshup DM (2007) Post-translational modifications regulate the ticking of the circadian clock. Nat Rev Mol Cell Biol 8: 139–148 Goedert M, Jakes R (2005) Mutations causing neurodegenerative tauopathies. Biochim Biophys Acta 1739; 240–250 Golden SS, Canales SR (2003) Cyanobacterial circadian clocks – timing is everything. Nat Rev Microbiol 1: 191–199

811

812 812

Literaturverzeichnis Goldman D, Oroszi G, Ducci F (2005) The genetics of addictions: uncovering the genes. Nat Rev Genet 6: 521–532 Greenspan RJ, Dierick HA (2004) ‘Am not I a fly like thee?’ From genes in fruit flies to behavior in humans. Hum Mol Genet 13: R267–R273 Gross C, Zhuang X, Stark K et al. (2002) Serotonin1A receptor acts during development to establish normal anxiety-like behaviour in the adult. Nature 416: 396–400 Guilding C, Piggins HD (2007) Challenging the omnipotence of the suprachiasmatic timekeeper: are circadian oscillators present throughout the mammalian brain? Eur J Neurosci 25: 3195–3216 Haass C, Selkoe DJ (2007) Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer‘s amyloid β-peptide. Nat Rev Mol Cell Biol 8: 101–112 Haile CN, Kosten TR, Kosten TA (2007) Genetics of dopamine and its contribution to cocaine addiction. Behav Genet 37: 119–145 Hallam TM, Bourtchouladze R (2006) Rubinstein-Taybi syndrome: molecular findings and therapeutic approaches to improve cognitive dysfunction. Cell Mol Life Sci 63: 1725– 1735 Hardy J, Cai H, Cookson MR et al. (2006) Genetics of Parkinson’s disease and Parkinsonism. Ann Neurol 60: 389–398 Hariri AR, Mattay VS, Tessitore A et al. (2002) Serotonin transporter genetic variation and the response of the human amygdale. Science 297: 400–403 Huang HS, Matevossian A, Whittle C et al. (2007) Prefrontal dysfunction in Schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters. J Neurosci 27: 11254–11262 Ishiura M, Kutsuna S, Aoki S et al. (1998) Expression of a gene cluster kaiABC as a circadian feedback process in cyanobacteria. Science 281: 1519–1523 Jellinger KA (2006) Alzheimer 100 – highlights in the history of Alzheimer research. J Neural Transm 113: 1603–1623 Johnsen S, Lohmann KJ (2005) The physics and neurobiology of magnetoreception. Nat Rev Neurosci 6: 703–712 Keene AC, Waddell S (2007) Drosophila olfactory memory: single genes to complex neural circuits. Nat Rev Neurosci 8: 341–354 Kew JNC, Koester A, Moreau JL et al. (2000) Functional consequences of reduction in NMDA receptor glycine affinity in mice carrying targeted point mutations in the glycine binding site. J Neurosci 20: 4037–4049 Klein TA, Neumann J, Reuter M et al. (2007) Genetically determined differences in learning from errors. Science 318: 1642– 1645 Konopka RJ, Benzer S (1971) Clock mutants of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA 68: 2112–2116 Kraepelin E (1899) Psychiatrie – Ein Lehrbuch für Studierende und Ärzte. 5. vollst. umgearb. Aufl. Barth, Leipzig Lee YS, Silva AJ (2009) The molecular and cellular biology of enhanced cognition. Nat Rev Neurosci 10: 126–140 Leonardo ED, Hen R (2006) Genetics of affective and anxiety disorders. Annu Rev Psychol 57: 117–137 Lesch KP (2007) Linking emotion to the social brain. EMBO Rep 8: S24–S29 Li T, Stefansson H, Gudfinnsson E et al. (2004) Identification of a novel neuregulin 1 at-risk haplotype in Han schizophrenia Chinese patients, but no association with the Icelandic/Scottish risk haplotype. Mol Psychiatry 9: 698–704

Liang T, Spence J, Liu L et al. (2003) α-Synuclein maps to a quantitative trait locus for alcohol preference and is differentially expressed in alcohol preferring and -nonpreferring rats. Proc Natl Acad Sci USA 100: 4690–4695 Lofdahl KL, Holliday M, Hirsch J (1992) Selection for conditionability in Drosophila melanogaster. J Comp Psychol 106: 172–183 Mahley RW, Weisgraber KH, Huang Y (2006) Apolipoprotein E4: A causative factor and therapeutic target in neuropathology, including Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci USA 103: 5644–5651 Manoli DS, Meissner GW, Baker BS (2006) Blueprints for behavior: genetic specification of neural circuitry for innate behaviors. Trends Neurosci 29: 444–451 Matynia A, Kushner SA, Silva AJ (2002) Genetic approaches to molecular and cellular cognition: a focus on LTP and learning and memory. Annu Rev Genet 36: 687–720 McWatters HG, Roden LC, Staiger D (2001) Picking out parallels: plant circadian clocks in context. Phil Trans R Soc Lond 356B: 1735–1743 Muheim R, Moore FR, Phillips JB (2006) Calibration of magnetic and celestrial compass cues in migratory birds – a review of cue-conflict experiments. J Exp Biol 209: 2–17 Mulley JC, Scheffer IE, Petrou S et al. (2005) SCN1A mutations and epilepsie. Hum Mut 25: 535–542 Murat D, Quinlan A, Vali H, Komeili A (2010) Comprehensive genetic dissection of the magnetosome gene island reveals the step-wise assembly of a prokaryotic organelle. Proc Natl Acad Sci USA 107: 5593-5598 Murphy DL, Lesch KP (2008) Targeting the murine serotonin transporter: insights into human neurobiology. Nat Rev Neurosci 9: 85–96 Murray RM, Morrison PD, Henquet C et al. (2007) Cannabis, the mind and society: the hash realities. Nat Rev Neurosci 8: 885–895 Nakahata Y, Grimaldi B, Sahar S et al. (2007) Signaling to the circadian clock: plasticity by chromatin remodeling. Curr Opin Cell Biol 19: 230–237 Němec P, Burda H, Oelschläger HHA (2005) Towards the neural basis of magnetoreception: a neuroanatomical approach. Naturwissenschaften 92: 151–157 Neville MJ, Johnstone EC, Walton RT (2004) Identification and characterization of ANKK1: a novel kinase gene closely linked to DRD2 on chromosome band 11q23.1. Hum Mutat 23: 540–545 Nguyen PV, Gerlai R (2002) Behavioural and physiological characterization of inbred mouse strains: prospects for elucidating the molecular mechanisms of mammalian learning and memory. Genes Brain Behavior 1: 72–81 Nussbaum RL, Ellis CE (2003) Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. N Engl J Med 348: 1356–1364 Ohno M, Frankland PW, Chen AP et al. (2001) Inducible, pharmacogenetic approaches to the study of learning and memory. Nat Neurosci 4: 1238–1243 Parkinson J (1817) An essay on the shaking palsy. Sherwood Nesly & Jones, London Peschel N, Chen KF, Szabo G et al. (2009) Light-dependent interactions between the Drosophila circadian clock factors Cryptochrome, Jetlag, and Timeless. Curr Biol 19: 241–247 Pittendrigh CS (1967) Circadian systems. I. The driving oscillation and its assay in Drosophila pseudoobscura. Proc Natl Acad Sci USA 58: 1762–1767

Literaturverzeichnis

Polymeropoulos MH, Higgins JJ, Golbe LJ et al. (1996) Mapping of a gene for Parkinson’s disease to chromosome 4q21–q23. Science 274: 1197–1199 Pulido F, Berthold P, van Noordwijk AJ (1996) Frequency of migrants and migratory activity are genetically correlated in a bird population: Evolutionary implications. Proc Natl Acad Sci USA 93: 14642–14647 Quinn WG, Harris WA, Benzer S (1974) Conditional behavior in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA 71: 708–712 Renieri A, Meloni I, Longo I et al. (2003) Rett syndrome: the complex nature of a monogenic disease. J Mol Med 81: 346– 354 Rett A (1966) Über ein eigenartiges hirnatrophisches Syndrom bei Hyperammoniämie im Kindesalter. Wien Med Wschr 116: 723–738 Roenneberg T, Merrow M (2005) Circadian clocks – the fall and rise of physiology. Nat Rev Mol Cell Biol 6: 965–971 Ross CA, Margolis RL, Reading SAJ et al. (2006) Neurobiology of Schizophrenia. Neuron 52: 139–153 Selkoe DJ, Podlisny MB (2002) Deciphering the genetic basis of Alzheimer’s disease. Ann Rev Genomics Hum Genet 3: 67–99 Serretti A, Benedetti F, Mandelli L et al. (2003) Genetic dissection of psychopathological symptoms: insomnia in mood disorders and CLOCK gene polymorphism. Am J Med Genet 121B: 35–38 Seshadri S, Kamiya A, Yokota Y et al. (2010) Disrupted-inSchizophrenia-1 expression is regulated by β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1-neuregulin cascade. Proc Natl Acad Sci USA 107: 5622-5627 Shi Y, Bassnett S (2007) Inducible gene expression in the lens using tamoxifen and a GFP reporter. Exp Eye Res 85: 732–737 Shumyatsky GP, Tsvetkov E, Malleret G et al. (2002) Identification of a signaling network in lateral nucleus of amygdala important for inhibiting memory specifically related to learned fear. Cell 111: 905–918 Sillaber I, Rammes G, Zimmermann S et al. (2002) Enhanced and delayed stress-induced alcohol drinking in mice lacking functional CRH1 receptors. Science 296: 931–933 Skoulakis EMC, Grammenoudi S (2006) Dunces and da Vincis: The genetics of learning and memory in Drosophila. Cell Mol Life Sci 63: 975–988 Smith DG, Cappai R, Barnham KJ (2007) The redox chemistry of the Alzheimer’s disease amyloid β peptide. Biochim Biophys Acta 1768: 1976–1990 Stanewsky R (2003) Genetic analysis of the circadian system in Drosophila melanogaster and mammals. J Neurobiol 54: 111–147 Stefansson H, Sarginson J, Kong A (2003) Association of neuregulin 1 with schizophrenia confirmed in a Scottish population. Am J Hum Genet 72: 83–87 Stefansson H, Sigurdsson E, Steinthorsdottir V et al. (2002) Neuregulin 1 and susceptibility to schizophrenia. Am J Hum Genet 71: 877–892 Steinlein OK (2004) Genetic mechanisms that underlie epilepsy. Nat Rev Neurosci 5: 400–408 Sugama N, Park JG, Park YJ et al. (2008) Moonlight affects nocturnal Period2 transcript levels in the pineal gland of the reef fish Siganus guttatus. J Pineal Res 45: 133–141 Sweatt JD, Weeber EJ (2003) Genetics of childhood disorders: LII. Learning and memory, Part 5: Human cognitive disorders and the ras/ERK/CREB pathway. J Am Acad Child Adolesc Psychiatry 42: 873–876

Toh KL, Jones CR, He Y et al. (2001) An hPer2 phosphorylation site mutation in familial Advanced Sleep Phase Syndrome. Science 291: 1040–1043 Torres GE, Gainetdinov RR, Caron MG (2003) Plasma membrane monoamine transporters: structure, regulation and function. Nat Rev Neurosci 4: 13–25 Tully T (1996) Discovery of genes involved with learning and memory: an experimental synthesis of Hirschian and Benzerian perspectives. Proc Natl Acad Sci USA 93: 13460–13467 Uhl GR, Hall FS, Sora I (2002) Cocaine, reward, movement and monoamine transporters. Mol Psychiatry 7: 21–26 Uttner I, Wahlländer-Danek U, Danek A (2003) Kognitive Einschränkungen bei erwachsenen Patienten mit Neurofibromatose Typ 1. Fortschr Neurol Psychiat 71: 157–162 Vitaterna MH, King DP, Chang AM et al. (1994) Mutagenesis and mapping of a mouse gene, Clock, essential for circadian behavior. Science 264: 719–725 Vogel F, Motulsky AG (1997) Human Genetics. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo Waddell S, Quinn WG (2001) What can we teach Drosophila? What can they teach us? Trends Genet 17: 719–726 Weeber EJ, Levenson JM, Sweatt JD (2002) Molecular genetics of human cognition. Mol Interventions 2: 376–391 Willstätter R, Wolfes D, Mäder H (1923) Synthese des natürlichen Cocaïns. Justus Liebigs Ann Chem 434: 111–139 Wiltschko R, Wiltschko W (2006) Magnetoreception. BioEssays 28: 157–168 Xu SG, Prasad C, Smith DE (1999) Neurons exhibiting dopamine D2 receptor immunoreactivity in the substantia nigra of the mutant weaver mouse. Neuroscience 89: 191–207 Xu Y, Padiath QS, Shapiro RE et al. (2005) Functional consequences of a CKIΔ mutation causing familial advanced sleep phase syndrome. Nature 434: 640–644 Zapka M, Heyers D, Hein CM et al. (2009) Visual but not trigeminal mediation of the magnetic compass information in a migratory bird. Nature 461: 1274-1277 Kapitel 14 Genetik und Anthropologie Amadio JP, Walsh CA (2006) Brain Evolution and uniqueness in the human genome. Cell 126: 1033–1035 Amorim A (1999) Archaeogenetics. J Iber Archaeolo 1: 15–25 Arendt D (2003) Evolution of eyes and photoreceptor cell types. Int J Dev Biol 47: 563–571 Barton JJS, Radcliff N, Cherkasova MV et al. (2007) Scan patterns during the processing of facial identity in prosopagnosia. Exp Brain Res 181: 199–211 Behar DM, Villems R, Soodyall H et al. (2008) The dawn of human matrilineal diversity. Am J Hum Genet 82: 1130–1140 Berger LR, de Ruiter DJ, Churchill SE et al. (2010) Australopithecus sediba: a new species of Homo-like australopith from South Africa. Science 328: 195-204 Bishop DVM (2009) Genes, cognition and communication – insights from neurodevelopmental disorders. Ann NY Acad Sci 1156: 1–18 Cann RL, Stoneking M, Wilson AC (1987) Mitochondrial DNA and human evolution. Nature 325: 31–36 Carroll SB (2003) Genetics and the making of Homo sapiens. Nature 422: 849–857 Cavalli-Sforza LL (2005) The human genome diversity project: past, present and future. Nat Rev Genet 6: 333–340

813

814 814

Literaturverzeichnis Chimpanzee Sequencing and Analysis Consortium (2005) Initial sequence of the chimpanzee genome and comparison with the human genome. Nature 437: 69–87 Disotell TR (2006) ‘Chumanzee’ evolution: the urge to diverge and merge. Genome Biol 7: 240 Dupanloup I, Pereira L, Bertorelle G et al. (2003) A recent shift from polygyny to monogamy in humans is suggested by the analysis of worldwide Y-chromosome diversity. J Mol Evol 57: 85–97 Enard W, Gehre S, Hammerschmidt K et al. (2009) A humanized version of Foxp2 affects cortico-basal ganglia circuits in mice. Cell 137: 961–971 Enard W, Przeworski M, Fisher SE et al. (2002) Molecular evolution of FOXP2, a gene involved in speech and language. Nature 418: 869–872 Erskine L, Herrera E (2007) The retinal ganglion cell axon’s journey: insights into molecular mechanisms of axon guidance. Dev Biol 308: 1–14 Evans PD, Mekel-Bobrov N, Vallender EJ et al. (2006) Evidence that the adaptive allele of the brain size gene microcephalin introgressed into Homo sapiens from an archaic Homo lineage. Proc Natl Acad Sci USA 103: 18178–18183 Excoffier L (2002) Human demographic history: refining the recent African origin model. Curr Opin Genet Develop 12: 675–682 Excoffier L (2006) Neandertal genetic diversity: a fresh look from old samples. Curr Biol 16: R650–R652 Fisher SE, Marcus GF (2006) The eloquent ape: genes, brains and the evolution of language. Nat Rev Genet 7: 9–20 Garrigan D, Hammer MF (2006) Reconstructing human origins in the genomic era. Nat Rev Genet 7: 669–680 Green RE, Krause J, Briggs AW et al. (2010) A draft sequence of the Neandertal genome. Science 328: 710-722 Green RE, Malaspinas AS, Krause J et al. (2008) A complete Neandertal mitochondrial genome sequence determined by high-throughput sequencing. Cell 134: 416–426 Hawks J, Cochran G, Harpending HC et al. (2008) A genetic legacy from archaic Homo. Trends Genet 24: 19–23 Haynes JD, Rees G (2006) Decoding mental states from brain activity in humans. Nat Rev Neurosci 7: 523–534 Holden C (2004) The origin of speech. Science 303: 1316–1319 International HapMap Consortium (2007) A second generation human haplotype map of over 3.1 million SNPs. Nature 449: 851–861 Jobling MA, Tyler-Smith C (2003) The human Y chromosome: an evolutionary marker of age. Nat Rev Genet 4: 598–612 Johanson D, Edgar B (2006) Lucy und ihre Kinder, 2. Aufl. Spektrum Akademischer Verlag, Elsevier, München Kaessmann H, Pääbo S (2002) The genetical history of humans and the great apes. J Intern Med 251: 1–18 Kennerknecht I, Grueter T, Welling B et al. (2006) First report of prevalence of non-syndromic hereditary prosopagnosia (HPA). Am J Med Genet (Pt A) 140A: 1617–1622 Kimchi T, Etienne AS, Terkel J (2004) A subterranean mammal uses the magnetic compass for path integration. Proc Natl Acad Sci USA 101: 1105–1109 Knowles DG, McLysaght A (2009) Recent de novo origin of human protein-coding genes. Genome Res 19: 1752-1759 Konopka G, Bomar JM, Winden K et al. (2009) Human-specific transcriptional regulation of CNS development genes by FOXP2. Nature 462: 213–218

Krause J, Fu Q, Good JM et al. (2010) The complete mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia. Nature 464: 894-897 Noonan JP, Coop G, Kudaravelli S et al. (2006) Sequencing and analysis of Neanderthal genomic DNA. Science 314: 1113– 1118 Pääbo S (1985) Molecular cloning of ancient Egyptian mummy DNA. Nature 314: 644–645 Pääbo S (2003) The mosaic that is our genome. Nature 421: 409–412 Patterson N, Richter DJ, Gnerre S et al. (2006) Genetic evidence for complex speciation of humans and chimpanzees. Nature 441: 1103–1108 Plagnol V, Wall JD (2006) Possible ancestral structure in human populations. PLoS Genet 2: 972–979 Pollard KS, Salama SR, Lambert N et al. (2006) An RNA gene expressed during cortical development evolved rapidly in humans. Nature 443: 167–172 Ponting C, Jackson AP (2005) Evolution of primary microcephaly genes and the enlargement of primate brains. Curr Opin Genet Dev 15: 241–248 Portin P (2007) Evolution of man in the light of molecular genetics: a review. Part I. Our evolutionary history and genomics. Hereditas 144: 80–95 Quiroga RQ, Mukamel R, Isham EA et al. (2008) Human singleneuron responses at the threshold of conscious recognition. Proc Natl Acad Sci USA 105: 3599–3604 Rhesus Macaque Genome Sequencing and Analysis Consortium (2007) Evolutionary and biomedical insights from the Rhesus Macaque genome. Science 316: 222–234 Richards GD (2006) Genetic, physiologic and ecogeographic factors contributing to variation in Homo sapiens: Homo florensis reconsidered. J Evol Biol 19: 1744–1767 Rosenberg NA, Pritchard JK, Weber JL et al. (2002) Genetic structure of human populations. Science 298: 2381–2385 Satta Y, Takahata N (2002) Out of Africa with regional interbreeding? Modern human origins. BioEssays 24: 871–875 Schrenk F, Bromage TG, Kaessmann H (2002) Zurück zu den Wurzeln – die Frühzeit des Menschen. In: Wohin die Reise geht… Lebenswissenschaften im Dialog (Hrsg: Verband Deutscher Biologen). Wiley VCH, Weinheim, 94–101 Schuster SC, Miller W, Ratan A et al. (2010) Complete Khoisan and Bantu genomes from southern Africa. Nature 463: 943947 Sikela JM (2006) The jewels of our genome: the search for the genomic changes underlying the evolutionary unique capacities of the human brain. PLoS Genet 2: 646–655 Stanyon R, Sazzini M, Luiselli D (2009) Timing the first human migration into eastern Asia. J Biol 8: 18 (doi: 10.1186/jbiol115; nur online) Stedman HH, Kozyak BW, Nelson A et al. (2004) Myosin gene mutation correlates with anatomical changes in the human lineage. Nature 428: 415–418 Stone AC, Verrelli BC (2006) Focusing on comparative ape population genetics in the post-genomic age. Curr Opin Genet Dev 16: 586–591 Storch V, Welsch U, Wink M (2007) Evolutionsbiologie, 2. Aufl. Springer, Berlin, Heidelberg Templeton AR (2002) Out of Africa again and again. Nature 416: 45–51

Literaturverzeichnis

Thivierge JP, Marcus GF (2007) The topographic brain: from neural connectivity to cognition. Trends Neurosci 30: 251– 259 Torroni A, Achilli A, Macauly V et al. (2006) Harvesting the fruit of the human mtDNA tree. Trends Genet 22: 339–345 Vargha-Khadem F, Gadian DG, Copp A et al. (2005) FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language. Nat Rev Neurosci 6: 131–138

Wall JD, Hammer MF (2006) Archaic admixture in the human genome. Curr Opin Genet Dev 16: 606–610 Wienberg J (2005) Fluorescence in situ hybridization to chromosomes as a tool to understand human and primate genome evolution. Cytogenet Genome Res 108: 139–160

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Glossar

Glossar

Abb. 1.1 Homunculus, den man früher im menschlichen Sperma zu sehen glaubte; Zeichnung von Hartsoeker aus seinem Essay de dioptrique (1694). (Nach Hilscher 1999)

Aberration (lat. aberratio, Ablenkung, Abirren) Beispiel: Chromosomenaberration (S. 397), Chromosomenveränderung. Abort (lat. abortus, Fehlgeburt). Akron (gr. ἄκρος [akros], die Spitze, auch: am Ende befindlich) Vorderende eines Insektenembryos bzw. mehr allgemein im Articulatengrundbauplan. Akrozentrisches Chromosom (gr. ἄκρος [akros], Spitze, auch: am Ende befindlich; gr. κέντρον [kentron], die Mitte) →Chromosom, bei dem das →Centromer am Ende lokalisiert ist, dadurch ist die Länge der Chromosomenarme sehr unterschiedlich (S. 220). Allel (gr. ἀλλήλων [allelon], einander, gegenseitig) Eine bestimmte Ausführung eines Gens (S. 3). Allo(poly)ploid (gr. ἄλλος [allos], anders beschaffen, verschieden; gr. πολυπλοῦς [polyplous], vielfältig Allo(poly)ploidie, bei der sich →Genome verschiedener Pflanzenarten vereinigt haben (S. 400). Alu-Sequenz (lat. sequentia, Folge) →DNA-Abschnitt von ca. 300 bp, der 300.000‒600.000-mal verteilt im →Genom von Primaten vorkommt, durch das →Restriktionsenzym AluI herausgeschnitten werden kann und keine Protein-codierende Information trägt (→SINE). Amniozentese (gr. ἀμνίον [amnion], Opferschale, Gefäß zum Auffangen von Opferblut; gr. κεντεῖν [kentein], stechen) Fruchtwasseruntersuchung (S. 676). Amorphes Allel (gr. ἄμορφος [amorphos], missgestaltet, formlos) Inaktives →Allel; Synonym: →Null-Allel (S. 474). Amphidiploid (gr. ἄμφι [amphi], auf beiden Seiten; gr. πολυπλοῦς [polyplous], vielfältig) Allotetraploide Arthybride mit je einem →diploiden Genom jeder Elternart. Amphiploid (gr. ἄμφι [amphi], auf beiden Seiten; gr. πολυπλοῦς [polyplous], vielfältig) Allo(poly-)ploide Individuen mit einzelnen oder mehreren Chromosomen(bereichen) einer anderen Art. Amplifikation (lat. amplificatio, Vermehrung) Vermehrung bestimmter Gene (intra- oder extrachromosomal) (S. 364). Anämie (gr. ἧμος [hemos], Blut; gr. ἀν- [an-], „ohne“, d.h. Verneinung) Blutarmut (S. 485). Anaphase (gr. ἀνá [ana], nach; gr. φáσις [phasis], Anzeige) Bestimmtes Stadium während der Zellteilung (Mitose und Meiose) (S. 170). Androgynon (gr. ἀνδρός [andros], Mann; gr. γυνή [gyne], Frau) Embryonen, die aus zwei väterlichen →Pronuklei entstehen. Aneuploidie (gr. ἀν- [an-], „ohne“, d.h. Verneinung; gr. πολυπλοῦς [polyplous], vielfältig) Die von der normalen →Ploidie abweichende chromosomale Konstitution, bei der

engl.: englisch, gr.: griechisch, lat.: lateinisch

eines oder mehrere →Chromosomen in Über- oder Unterzahl auftreten (S. 396. Anterior (lat. anterior, der vordere, der frühere) Vorderende des Organismus. Antigen (gr. ἄντι [anti], gegen; gr. γένεσις [genesis], Entstehung) Immunogener Bereich eines Moleküls, der durch →Antikörper erkannt wird bzw. deren Produktion stimuliert; →Immunglobulin (Kapitel 8.4). Antikörper (gr. ἄντι [anti], gegen) Protein (→Immunglobulin), das als Antwort auf ein →Antigen gebildet wird und dieses spezifisch bindet (Kapitel 8.4). Antisense-RNA (gr. ἄντι [anti], gegen; engl. sense, Sinn) Transkript, das zur codierenden →mRNA komplementär ist und unter Verwendung des Nicht-Matrizenstrangs (Gegenstrang) eines →Gens synthetisiert wird; wichtige Regulatoren der Genexpression (Kapitel 6.3.3 und 7.4). Apoptose (gr. ἀπό [apo], herab; gr. πτόσις [ptosis], Fall) Genetisch programmiertes Programm zum Zelltod. Ascus (lat. ascus, Schlauch) Mutterzelle von Pilzen, enthält Ascosporen (S. 494). Assortative Paarung Nicht zufällige Paarung zwischen Männchen und Weibchen einer Spezies. Positive assortative Paarung bei Bevorzugung eines ähnlichen Partners, negative assortative Paarung bei Bevorzugung eines unähnlichen Partners. Attached-X-Chromosom (engl. attach, anhängen, anheften) Zwei im →Centromer fusionierte X-Chromosomen (→Chromosom; S. 494). Attenuation (lat. attenuare, schwächen, vermindern) Genregulationsmechanismus (S. 64). Autoallopolyploidie Polyploidie verschiedener →Genome in Arthybriden, vereinigt die Merkmale normaler Polyplodie und von Alloploidie (→allopolyploid; →polyploid). Autogamie (gr. αὖτος [autos], hier: selbst; gr. γαμέτης [gametes], der Gatte) Selbstbefruchtung, die zur Homozygotie führt (→homozygot). Autokatalytisch (gr. αὖτος [autos], hier: selbst; gr. κατάλυσις [katalysis], Auflösung, Vernichtung) Art der Wirkung von Regulationsprozessen, z. B. beim Spleißen (S. 68) oder der Aktivierung der Caspase-Signalkette (S. 193). Autonom replizierende Sequenzen (gr. αὖτος [autos], hier: selbst; gr. νόμος [nomos], Gesetz) Replikationsstartpunkte (~ 100 bp), die zunächst in Hefen gefunden wurden (S. 41), aber auch in Zellorganellen vorkommen (→Replikation; Abkürzung: ARS). Autoregulation (gr. αὖτος [autos], hier: selbst) Selbstregulation (S. 187). Autosom (gr. αὖτος [autos], hier: selbst, eigen; gr. σῶμα [soma], Körper) Alle Chromosomen, ausgenommen die Geschlechtschromosomen (→Heterosomen).

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Glossar

Auxotroph (lat. auxilium, Hilfe; gr. τροφεῖν [trophein], nähren) Bestimmte Wachstumseigenschaft z. B. von Bakterien, die bestimmte Stoffe im Wachstumsmedium benötigen (S. 98). Azentrisches Chromosom →Chromosom (oder Chromosomenfragment) ohne →Centromer. Bakteriophage (gr. φάγος [phagos], Fresser) Virus, das Bakterien infiziert (S. 109). Balbiani-Ring Besonders große Verdickung in →Riesenchromosomen (S. 250). Barr-Körper Inaktives X-Chromosom in Säugern (S. 260). Biotop (gr. βίος [bios], Leben; gr. τόπος [topos], Platz, Ort) Lebensbereich von daran angepassten Organismen. Bivalent (lat. bi-, zwei-; lat. valens, mächtig) Gepaarte homologe meiotische Prophasechromosomen (→Meiose, →Prophase) (S. 175). Blastoderm (gr. βλάστη [blaste], Keim; gr. δέρμα [derma], Haut, auch: Schlauch, verarbeitete Haut) Frühes Entwicklungsstadium eines Embryos, der nach den Furchungsteilungen nicht als kugelförmige →Blastula vorliegt, sondern als kompakte Zellschicht dem Dotter aufliegt (Beispiel: Drosophila) (S. 550). Blastula (gr. βλάστη [blaste], Keim) Hohlkugel aus einer Schicht von Epithelzellen; embryonales Entwicklungsstadium der Tiere nach den Furchungsteilungen. Bootstrap-Analyse Verfahren zur Bestimmung von Verzweigungen bei einem evolutionären Stammbaum. Vom ursprünglichen Datensatz werden sehr viele (100 bis 200) zufällig erzeugte Pseudodatensätze gleicher Größe erstellt. Dabei werden Basenpositionen des ursprünglichen Datensatzes durch willkürliches Sammeln und Weglassen so verändert, dass zufällig einzelne Positionen mehrfach vorkommen und andere wegfallen. CAAT-Box Hochkonserviertes DNA-Sequenzelement (CAAT) in der →Promotor-Region eukaryotischer →Gene. Die vier Basen werden von Proteinen erkannt, die an der Initiation der →Transkription beteiligt sind. cDNA →DNA, die von dem Enzym →reverse Transkriptase an einer →mRNA-Matrize synthetisiert wird; als Primer wird ein Desoxythymidin-Oligonukleotid („Oligo-dT“) verwendet, das zu dem →Poly(A)-Schwanz der mRNA komplementär ist. Centi-Morgan (cM) Genetische Einheit des Abstands zweier Gene auf einem Chromosom. 1 cM entspricht 1 % der Rekombinationsfrequenz; es ist keine physikalische Einheit des Abstands. Centriol Zylinderförmiges Element aus Mikrotubuli an jedem Ende der Teilungsspindel (S. 170). Centromer (gr. κέντρον [kentron], Mitte; gr. μέρος [meros], Teil) Spindelansatzstelle eines →Chromosoms; Region, an der die beiden →Schwesterchromatiden zusammengehalten werden; primäre Einschnürung eines Chromosoms, die den langen Arm vom kurzen Arm trennt (Kapitel 6.1.3). Chiasma (gr. χίασμα [chiasma], Kreuz) Chromosomenkonstitution in der meiotischen Prophase I als Folge eines →Crossingovers (S. 174). Chimäre (gr. χίμαιρα [chimaira], ein sagenhaftes Untier aus Lydien, Griechenland) Aus unterschiedlichen Zelltypen verschiedener Organismen künstlich zusammengesetzter Organismus (S. 596).

Chlorophyll (gr. χλωρός [chloros], grünlich; gr. φύλλον [phyllon], Blatt) Grüner Blattfarbstoff der Pflanzen, der zur Photosynthese benötigt wird. Chloroplast (gr. χλωρός [chloros], grünlich; gr. πλάσσειν [plassein], bilden) Cytoplasmatische, selbstreplizierende Organelle, in welcher →Photosynthese stattfindet. Chorion (gr. χόριον [chorion], Haut – um die Eingeweide) Embryonalhülle, bei Insekten Eihülle (S. 580). Chromatide Elementare, in der Zelle nicht unterteilbare Längseinheit des →Chromosoms (enthält eine DNA-Doppelhelix) (S. 169). Chromatin (gr. χρῶμα [chroma], Farbe) Färbbares Material im Inneren des Zellkerns, besteht aus →DNA, →RNA und Proteinen. Repräsentiert die dekondensierten →Chromosomen. Chromomer (gr. χρῶμα [chroma], Farbe; gr. μέρος [meros], Teil) Verdickung auf der Achse des meiotischen Prophasechromosoms (S. 174). Chromosom (gr. χρῶμα [chroma], Farbe; gr. σῶμα [soma], Körper) Träger der Erbanlagen (Kapitel 6). Cis-Konstitution Zwei oder mehr gekoppelte Allele, die in einer heterozygoten Konstitution auf demselben Chromosom liegen, sind in einer cis-Konstitution. Cis-trans-Test Ermittelt, ob zwei Mutationen im gleichen →Cistron liegen oder nicht (→Komplementation). Cistron Definition Benzers für eine genetische Funktionseinheit (→Gen). Stimmt meistens überein mit einer für ein Protein codierenden Region der DNA (S. 117). Codominant Zwei unabhängig voneinander im Phänotyp zur Ausprägung kommende Allele, die keine reine →rezessive oder →dominante Beziehung aufweisen (S. 473). Codon Drei aufeinanderfolgende →Nukleotide (Triplett), die die Information für eine Aminosäure oder ein Translationssignal (Start/Stopp) enthalten. Consensussequenz (lat. consensus, Einigkeit, Übereinstimmung) Funktionell wichtige DNA- oder Proteinsequenz, die bei verschiedenen Organismen weitgehend übereinstimmt, aber nicht identisch ist. Crossingover Genetischer Austausch zwischen (homologen) →Chromosomen (S. 174). Cytogenetik Spezialgebiet der Genetik, das vor allem die Struktur und Funktion der →Chromosomen analysiert. Cytoplasma (gr. κύτος [kytos], Höhlung (lat. cytus); gr. πλάσμα [plasma], Gebilde) Wässrige Substanz im Inneren der Zelle (S. 156). Deletion (lat. deletio, Vernichtung) Verlust eines größeren oder kleineren DNA-Fragments; Chromosomen- oder Genmutation (S. 396). Denominator (lat. denominare, benennen) Molekulare Elemente des Zählmechanismus bei der Geschlechtsbestimmung von Drosophila (S. 259). Deszendenztheorie (lat. descendere, abstammen) Abstammungslehre Darwins (S. 14). Determination (lat. determinare, abgrenzen) Festlegung des künftigen Schicksals einer Zelle während der Ontogenese (S. 528). Diagnose (gr. διάγνοσις [diagnosis], Unterscheidung, Entscheidung) Benennen einer Krankheit und Voraussetzung einer →Therapie. Diakinese (gr. διακινεῖν [diakinein], heftig bewegen) Chromosomenstadium während der meiotischen Prophase I (S. 175).

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Dictyotän (gr. δίκτυον [diktyon], Netz; gr. ταινία [tainia], Band) Ruhestadium während der meiotischen Prophase I bei weiblichen Keimzellen von Säugern (S. 592). Differenzierung (lat. differre, trennen, scheiden) Entwicklung des endgültigen →Phänotyps einer Zelle (S. 559). Dikaryon (gr. δι- [di-], zweifach, doppelt; gr. κάρυον [karyon], Nuss) Stadium der →Zygote nach der Befruchtung, vor der völligen Verschmelzung der Gametenkerne. Diminution (lat. diminuere, vermindern) Beispiel: Chromatindiminution, Ausschluss von chromosomalem Material aus somatischen Zellen (S. 361). Diözisch (gr. δι- [di-], zweifach, doppelt; gr. οἶκος [oikos], Haus) Zweihäusige Pflanzen mit männlichen und weiblichen Blüten auf getrennten Individuen. Diploid (gr. διπλόος [diploos] oder διπλοῦς [diplous], zweifach, doppelt) Zweifacher Chromosomensatz; das ist der normale genetische Zustand höherer Organismen (S. 173). Diplotän (gr. διπλόος [diploos], zweifach, doppelt; gr. ταινία [tainia], Band) Chromosomenstadium während der meiotischen Prophase I (S. 174). Diskordant (lat. discordare, nicht übereinstimmen) Unterschiedliche →Phänotypen bei Zwillingen (S. 616). Dizentrisches Chromosom →Chromosom mit zwei →Centromeren. Entsteht durch →Crossingover innerhalb einer →Inversion (S. 631). DNA (Desoxyribonukleinsäure) Makromolekül, das aus zwei antiparallelen Polynukleotidketten aufgebaut ist, der dabei verwendete Zucker ist Desoxyribose. DNA ist der Träger der Erbsubstanz (Kapitel 2.1). Dominant (lat. dominare, herrschen über) Art der phänotypischen Ausprägung eines →Allels; der →Phänotyp wird in →Heterozygoten sichtbar (Gegensatz:→rezessiv) (S. 456). Dosiskompensation Ausgleich der Aktivität von Genen auf Geschlechtschromosomen, sodass deren Produktmenge in beiden Geschlechtern gleich ist (S. 249). Drosophila melanogaster (gr. δρόσος [drosos], Tau; gr. φίλος [philos], Freund; gr. μέλανος [melanos], schwarz; gr. γαστήρ [gaster], Magen, Bauch) Fruchtfliege (Taufliege). Klassisches Untersuchungsobjekt der Genetik (S. 204). Duplikation (lat. duplicare, verdoppeln) Verdopplung von Abschnitten der →DNA, einzelnen →Chromosomen oder des ganzen →Genoms. Dysgenese (gr. δυσγένεσις [dysgenesis], unedle Entstehung) Fehlentwicklung der Nachkommen bei bestimmten Kreuzungen (S. 337). Dystrophie (gr. δύστροφος [dystrophos], schwer zu ernähren) Entwicklungsstörungen, die zu Fehlbildungen führen. Ektopisch (gr. ἔκτοπος [ektopos], fremd, außergewöhnlich) Abnormale Position, z. B. in Transplantationsversuchen (S. 555). Elongation (lat. elongare, verlängern) Verlängerung der wachsenden RNA- oder Polypeptidkette. Embryo Frühes Entwicklungsstadium eines Individuums. Beim Menschen von der zweiten bis siebten Woche der Entwicklung, danach →Fötus. Endomitose (gr. ἔνδον [endon], innerhalb; gr. μitός [mitos], Faden) Chromosomale Replikation ohne darauf folgende Zellteilung (→Mitose). Endonuklease (gr. ἔνδον [endon], innerhalb; lat. nucleus, Kern) Enzym, das interne Phosphodiester-Bindungen der →DNA schneidet.

Endosperm (gr. ἔνδον [endon], innerhalb; gr. σπέρμa [sperma], Same) Triploides Gewebe im Pflanzensamen (S. 202). Enhancer (engl. enhance, verstärken) →DNA-Sequenzen, die über große Distanzen und orientierungsunabhängig die Genexpression verstärken können. Gegensatz: →Silencer. Epigenetik (gr. ἐπί [epi], auf; gr. γενετή [genete], Geburt) Epigenetik (Kapitel 11.8) beschäftigt sich mit der Frage, welche Mechanismen den regulatorischen Zustand der →Gene bzw. den Expressionsgrad der Gene aufrechterhalten und wie dieser Zustand von Zelle zu Zelle weitergegeben wird (z. B. während der Embryonalentwicklung; genetische Prägung). Episom (gr. ἐπί [epi], auf; gr. σῶμα [soma], Körper) Zirkuläre →DNA in Bakterien, die unabhängig vom bakteriellen Chromosom replizieren kann; Episomen können aber auch in die chromosomale DNA integrieren und replizieren dann als Teil des Bakterienchromosoms. Epistasis (gr. ἐπίστασις [epistasis], Hemmung) Form der Genwechselwirkung, wobei ein Gen (A) mit der phänotypischen Expression eines anderen, nicht-allelen Gens (B) in Wechselwirkung tritt und der →Phänotyp im Wesentlichen durch das Gen B bestimmt wird (Kapitel 10.3.3). Epitop (gr. ἐπί [epi], auf; gr. τόπος [topos], Stelle) Region eines →Antigens, die von einem →Antikörper erkannt wird (S. 382). EST (expressed sequence tag) →cDNA (oder Teil davon), die für die Herstellung genetischer Karten verwendet wurde. Entsprechende Bibliotheken können aus verschiedenen Zellen bzw. Geweben hergestellt werden. Euchromatin (gr. εὔ [eu], gut; gr. χρῶμα [chroma], Farbe) Regionen der →Chromosomen, die sich leicht anfärben lassen und während der Interphase in einem aufgelockerten Zustand vorliegen. Euchromatische Regionen enthalten aktive Gene. Gegensatz: →Heterochromatin. Eugenik (gr. ἐυγένια [eugeneia], edle Herkunft) Unter Eugenik (Kapitel 1.1.1) versteht man Eingriffe des Menschen in das Erbgut seiner →Population mit dem Ziel, es im derzeitigen Zustand zu erhalten (negative Eugenik) oder diesen zu verbessern (positive Eugenik). Dies gilt sowohl für →Gene von Individuen (z. B. Abtreibung, Gentherapie) als auch für den →Genpool einer Population (z. B. Sterilisationsprogramme, Selektion von Samenspendern). Eukaryoten (gr. εὔ [eu], gut; gr. κάρυον [karyon], Nuss) Organismen mit einem Zellkern (S. 158; der oft gebrauchte Begriff Eukaryonten ist sprachlich falsch). Evolution (lat. evolutio, Entwicklung) Biologisch: Entwicklung der Organismen im Laufe der Erdgeschichte. Exon (gr. ἔκ- (ἔξ-) [ek-, (ex-)], aus, von etwas weg) Proteincodierende DNA-Teilsequenz eines →Gens (S. 67). Expressivität (lat. exprimere, ausdrücken, wiedergeben) Art der Ausprägung eines →Gens (S. 477). F1-Generation (lat. filia, Tochter) Erste Generation aus einer Serie von Kreuzungen; erste Filial-/Tochtergeneration. FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (Technik-Box 25). Fitness Relative Überlebenswahrscheinlichkeit und Fortpflanzungsrate eines →Phäno- oder →Genotyps; das →Allel mit der größeren durchschnittlichen Fitness breitet sich in einer →Population aus. Fötus (lat. fetus, Leibesfrucht, Junges) Frühes Entwicklungsstadium eines Organismus. Beim Menschen ab der siebten Woche als Fötus bezeichnet, vorher →Embryo.

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Gameten (gr. γαμέτης [gametes], Gatte; gr. γάμος [gamos], Hochzeit) Biologie: Keimzellen. Gastrula (gr. γαστήρ [gaster], Bauch, Magen; lat. gastrum, bauchiges Tongefäß) Frühes Entwicklungsstadium eines Organismus, bei dem der Urdarm eingestülpt wird (Entodermbildung). Gen Fundamentale physikalische Einheit der Vererbung, die einen spezifischen Platz auf einem →Chromosom einnimmt (Kapitel 1.1.3). Generation (lat. generatio, Familie) Beschreibt die einzelnen Glieder einer Abstammungslinie in aufsteigender oder absteigender Folge (Eltern ‒ Kinder ‒ Enkel, aber auch Eltern ‒ Großeltern). Genetik (gr. γενετική τέχνη [genetike techne], Wissenschaft von der Erzeugung, Entstehen) Gegenstand der Genetik (Kapitel 1.1) sind die Mechanismen der Vererbung (wie das genetische Material die Kontrolle über den Stoffwechsel und die Entwicklung eines Organismus erlangt und wie es das Wiedererscheinen elterlicher Eigenschaften in den Nachkommen bestimmt), die Natur des genetischen Materials und die Speicherung genetischer Information (einschließlich seiner →Replikation, →Mutation, →Rekombination und →Translation). Genetische Drift (engl. drift, Strömung, Tendenz) Zufällige Veränderung der Häufigkeit von →Allelen (Allelfrequenz) in einer →Population von Generation zu Generation; wird häufig in kleinen Populationen beobachtet. Genetischer Code (engl. code, Chiffrierschlüssel) Übersetzungsanleitung für Information der →DNA in die der Proteine; drei Nukleotide (→Codon, Triplett) enthalten die Information für eine Aminosäure bzw. ein Translationssignal (Start/Stopp). Genetischer Hintergrund Alle →Gene im →Genom mit Ausnahme desjenigen, das untersucht wird. Genkonversion (lat. convertere, umwandeln, übertragen, austauschen) Nicht-reziproker Austausch von →DNA im →Genom (S. 183). Genom Gesamtheit der genetischen Information einer Zelle (S. 7). Genomische Prägung Abhängigkeit der Genexpression davon, ob das →Allel über die väterliche oder mütterliche Keimbahn vererbt wurde (Kapitel 11.8). Genotyp (gr. γένος [genos], Abstammung; gr. τύπος [typos], Form) Konstitution eines Gens bzw. Gesamtheit der erblichen Eigenschaften eines Organismus (seine genetische Konstitution) (S. 10). Genpool (engl. pool, Reservoir, Vorrat) Gesamtheit aller →Allele einer →Population. Gentechnik-Gesetz (GenTG) Stellt den rechtlichen Rahmen für die Erforschung, Entwicklung und wirtschaftliche Nutzung der Gentechnik dar; es existieren in allen Staaten der OECD vergleichbare gesetzliche Regelungen. Gentransfer (engl. transfer, Übertragung) Übertragung eines →Gens von einem Organismus in einen anderen. Horizontaler Gentransfer: außerhalb der sexuellen Fortpflanzungswege und unabhängig von bestehenden Artgrenzen; vertikaler Gentransfer: Genübertragung durch →Gameten innerhalb einer Art. Geschlechtschromosom →Chromosom, das das Geschlecht eines Organismus bestimmt; bei Säugern X- bzw. Y-Chromosom. Goldberg-Hogness-Box Bei vielen →Eukaryoten kurze DNASequenz (→Consensussequenz: TATAAAA, daher auch

TATA-Box genannt) oberhalb der Initiationsstelle der →Transkription; Bindestelle der RNA-Polymerase II (→Polymerase). Gonocyten (gr. γόνος [gonos], Abkunft, Erzeugendes; gr. κύτος [kytos], Höhlung) Keimzellstadium nach Abschluss der mitotischen Teilung. Diese Zellen befinden sich vorwiegend in der (im →Zellzyklus relativ langen) meiotischen Prophase I (→Spermatocyten oder →Oocyten) (S. 520). GVO Gentechnisch veränderter Organismus; Begriff aus dem →Gentechnik-Gesetz (GenTG). Hämatopoietische Zellen (gr. αἷμα [haima], Blut; gr. ποῖειν [poiein] machen) Blutbildendes Stammzellsystem im Knochenmark von Säugern (Abb. 11.54). Haploid (gr. ἁplόος [haploos] oder ἁplοῦς [haplous], einzig, einmalig) Normaler genetischer Zustand von Prokaryoten und von eukaryotischen Keimzellen nach der →Meiose (S. 172). Die Zelle besitzt nur einen Satz von →Chromosomen (bzw. ein Chromosom bei Prokaryoten). Haploinsuffizienz (gr. ἁplόος [haploos] oder ἁplοῦς [haplous], einzig, einmalig; lat. insufficientia, Schwäche, ungenügende Leistung) Bei Funktionsverlust eines →Allels kann das andere Allel keinen lebensfähigen Organismus hervorbringen. Haplotyp (gr. ἁplόος [haploos] oder ἁplοῦς [haplous], einzig, einmalig; gr. τύπος [typos], Form) Gruppe von →Allelen benachbarter →Gene, die von einem Individuum getragen werden und üblicherweise gemeinsam vererbt werden. Haushaltsgen →Gen, das in allen Zelltypen eines Organismus aktiv ist. Gegensatz: gewebespezifisch exprimiertes Gen. Helix (gr. ἓλιξ [helix], Spirale) Zylindrische Spirale, besondere räumliche Konformation von Nukleinsäure- oder Proteinmolekülen (S. 21, 275). Hemizygot (gr. ἡμi- [hemi-], halb; gr. ζυγωτός [zygotos], wohlbespannt) Genetische Konstitution der Geschlechtschromosomen im →heterogametischen Geschlecht (S. 256), die weder als →homozygot noch als →heterozygot bezeichnet werden können, da sie →haploid vorhanden sind. Heterochromatin (gr. ἓτερος [heteros], anders; gr. χρῶμα [chroma], Farbe) Kondensierte Bereiche des →Chromatins mit intensiverer Färbung. Enthält genarme Regionen (z. B. →Centromer: konstitutives Heterochromatin), stillgelegtes X-Chromosom (→Barr-Körper: fakultatives Heterochromatin) bzw. abgeschaltete Gene (funktionelles Heterochromatin) (S. 226). Heterogametisches Geschlecht (gr. ἓτερος [heteros], anders; gr. γαμέτης [gametes], Gatte; gr. γάμος [gamos], Hochzeit) Geschlecht, das Keimzellen mit unterschiedlichen →Geschlechtschromosomen erzeugt (bei Säugern ist das das männliche Geschlecht). Heteropyknotisch (gr. ἓτερος [heteros], anders; gr. πυκνός [pyknos], dicht) Beschreibt den Färbungszustand von →Heterochromatin. Heterosis (gr. ἓτερος [heteros], anders) Bezeichnet die Überlegenheit von →Heterozygoten (→Hybride) in Bezug auf eine oder mehrere Eigenschaften im Vergleich zu den entsprechenden →Homozygoten (S.460). Heterosom (gr. ἓτερος [heteros], anders; gr. σῶμα [soma], Körper) Geschlechtschromosom. Zeichnet sich durch voneinander abweichende Morphologie der Homologen von den übrigen →Chromosomen (→Autosomen) aus (S. 256). Heterothallisch (gr. ἓτερος [heteros], anders; gr. θαλλός [thallos], Spross, Schössling) Genetischer Zustand bestimmter Hefezellen. Zellen sind durch defektes Gen (ho) nicht zur spontanen

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Bildung beider Paarungstypen imstande (→homothallisch; S. 373). Heterozygot (gr. ἓτερος [heteros], verschieden, anders; gr. ζυγωτός [zygotos], wohlbespannt) Genetischer Zustand eines →diploiden Organismus bei der Anwesenheit zweier verschiedener →Allele. Der alte deutsche Begriff „mischerbig“ wird nur noch vereinzelt gebraucht. (S. 456). Histone (gr. ἱστός [histos], Gewebe) Stark basische Proteine, die in den →Chromosomen aller →Eukaryoten eng mit der →DNA assoziiert sind und dabei →Nukleosomen bilden. Sie haben eine besondere Bedeutung bei der Verdichtung des →Chromatins (→Euchromatin, →Heterochromatin) (Kap. 7.2.2). Holandrisch (gr. ὅλος [holos], ganz; gr. ἀνδρός [andros], Mann) Vererbungsgang eines Y-chromosomalen Merkmals. Holistisch (gr. ὅλος [holos], ganz) Ovarientyp bei Insekten. Ovar besteht neben somatischen Hüllzellen fast vollständig aus Keimzellen (S. 548). Holokinetisches Chromosom (gr. ὅλος [holos], ganz; gr. κινεῖν [kinein], bewegen) →Chromosom mit vielen →Centromeren über die gesamte Länge (S. 363). Hominide (lat. homo, Mensch) Familie der Primaten, in der die großen Menschenaffen (Orang-Utan, Gorilla, Schimpanse/ Bonobo) und der Mensch zusammengefasst sind (Hominidae). Homogametisches Geschlecht (gr. ὁμοῖος [homoios], gleich/ ähnlich beschaffen; gr. γαμέτης [gametes], Gatte; gr. γάμος [gamos], Hochzeit) Geschlecht, das Keimzellen mit gleichen →Geschlechtschromosomen erzeugt (bei Säugern das weibliche Geschlecht). Homologe Gene oder Chromosomen (gr. ὁμοῖος [homoios], gleich/ähnlich beschaffen; gr. λόγος [logos] Rede, Wort) (1) Homologe →Chromosomen sind in Bezug auf ihre Zusammensetzung und ihre sichtbare Struktur identisch (Gegensatz: nicht homologe Chromosomen); (2) homologe Gene sind in verschiedenen Organismen ähnlich (Gegensatz: →orthologe bzw. →paraloge Gene). Homöobox (gr. ὁμοίωσις [homoiosis], Abbild) →DNA-Sequenz von ~ 180 bp, die für eine Domäne von ~ 60 Aminosäuren codiert (Homöodomäne), die Teil eines DNA-bindenden Transkriptionsfaktors ist. Sie ist charakteristisch für →homöotische Gene. Homöotische Gene (gr. ὁμοίωσις [homoiosis], Abbild) Homöotische Gene (Kapitel 11.4.6) bewirken (bei segmentierten Organismen) eine räumliche Identität von Zellgruppen in Bezug auf ihre morphogenetische Bestimmung; Mutationen in homöotischen Genen bewirken Umwandlungen von Strukturen eines Körpersegmentes in die entsprechenden Strukturen eines anderen Körpersegmentes. Homothallisch (gr. ὁμοῖος [homoios], gleich/ähnlich beschaffen; gr. θαλλός [thallos], Spross, Schössling) Genetischer Zustand bestimmter Hefezellen. Zellen sind durch die Funktion des Allels HO (Homothallic) zur spontanen Bildung beider Paarungstypen imstande (→heterothallisch; S. 373). Homozygot (gr. ὁμοῖος [homoios], gleich/ähnlich beschaffen; gr. ζυγωτός [zygotos], wohlbespannt) Genetischer Zustand eines →diploiden Organismus bei der Anwesenheit zweier gleicher →Allele. Der alte deutsche Begriff „reinerbig“ wird nur noch vereinzelt gebraucht. Hybrid (gr. ὕβρις [hybris], Übermaß) Durch Kreuzung zweier genetisch verschiedener Eltern entstandenes Individuum.

Hypomorph (gr. ὑπὸ [hypo], unter; gr. μορφή [morphe], Gestalt) Verminderte Ausprägungsform eines →Gens (S. 474). Hypothese (gr. ὑπόθεσις [hypothesis], Grundlage, Annahme) In der Wissenschaft begründete Annahme, die experimentell überprüft werden kann und muss (S. 13). Immunglobulin →Antikörpermolekül, bindet →Antigen. Imprinting (lat. imprimere und engl. imprint, aufdrücken, eindrücken) →Epigenetische Information im genetischen Material. Ist nur zeitlich begrenzt wirksam, kann aber Generationsgrenzen überschreiten (Kapitel 11.8). Induktor (lat. inducere, einführen) Regulationsmolekül, das eine Genfunktion aktiviert (S. 96). Initiation (lat. initium, Anfang) Hier: Beginn der →Transkription oder →Translation (S.61, 66). Interferenz (lat. interferre, unterbrechen) Die Erscheinung eines von der Erwartung zufälliger Rekombinationshäufigkeiten abweichenden Markeraustauschs (S. 493). Interkalierende Verbindung (lat. intercalare, einschieben) Verbindung, die in den Raum zwischen den Basenpaaren eines doppelsträngigen →DNA-Moleküls eintreten kann; wird häufig zum Anfärben von DNA verwendet (z. B. Ethidiumbromid) und kann Mutationen auslösen (Kapitel 9.4.3). Interphase (lat. inter, zwischen; gr. φáσις [phasis], Anzeige) Periode im →Zellzyklus; Zeitraum zwischen zwei →Mitosen (S. 168). Intron Bereich in der →DNA oder im primären Transkript zwischen zwei →Exons. Wird im Allgemeinen nicht in ein Protein übersetzt (S. 68). Inversion (lat. invertere, umdrehen) Veränderung eines →Chromosoms, bei der die Reihenfolge der →Gene umgedreht ist (S. 406). In vitro (lat. für im Glas) Außerhalb eines lebenden Organismus. In vivo (lat. für im Lebenden) In einem lebenden Organismus. Karyogamie (gr. κάρυον [karyon], Nuss; gr. γαμέτης [gametes], Gatte; gr. γάμος [gamos], Hochzeit) Verschmelzung der beiden Gametenkerne in der →Zygote. Karyoplasma (gr. κάρυον [karyon], Nuss; gr. πλáσμα [plasma], Gebilde) Nicht-chromosomaler flüssiger Inhalt des Zellkerns (S. 158). Karyotyp (gr. κάρυον [karyon], Nuss; gr. τύπος [typos], Form) Chromosomenkonstitution einer Zelle (S. 222). Keimbahn Zelllinien, die ausschließlich Keimzellen produzieren. Im Gegensatz zu somatischen Zellen (→Soma). Kinetochor (gr. κινεῖν [kinein], bewegen; gr. χορός [choros], Tanzplatz, die versammelte Schar von Tänzern) Ansatzstelle der Spindelfasern am →Chromosom, formt besondere Proteinstrukturen (S. 169). Klon (gr. κλών [klohn], Zweig) Gruppe von Zellen (oder Individuen), die sich von einer ursprünglichen Zelle ableiten. Knock-out-Mäuse (engl. knockout, etwas außer Gefecht setzen) Mäuse, bei denen ein Gen inaktiviert wurde (Technik-Box 28). Koinzidenz-Koeffizient (lat. coincidentia, das Zusammenfallen) Mathematischer Parameter in der Wahrscheinlichkeitsrechnung (S. 493). Kompartiment (lat. compartire, abteilen) (1) Membranumschlossener Reaktionsraum eukaryotischer Zellen (z. B. endoplasmatisches Reticulum); (2) begrenztes Areal in einem vielzelligen Organismus, das von mehreren Gründerzellen gebildet wird.

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Glossar

Komplementation (lat. complementum, Ergänzung) Die Entstehung eines Wildtyp-Phänotyps, wenn in einem diploiden Organismus zwei verschiedene →Mutationen miteinander kombiniert werden (→cis-trans-Test). Konditional (lat. conditio, Bedingung) Mutation, die nur unter bestimmten Bedingungen zur Ausprägung kommt (S. 445). Konjugation (lat. conjugare, paarweise zusammenbinden) Übertragung von DNA von einer Spenderzelle auf eine Empfängerzelle bei Bakterien (Kapitel 4.2). Konkordant (lat. concordare, übereinstimmen) Gleiche Merkmalsausprägung bei Zwillingen (S. 616); Gegensatz: →diskordant. Konstitutive Expression (lat. constituere, errichten, einrichten) Dauerhafte Aktivität eines →Gens (S. 128). Kopplung Zwei oder mehr →Gene werden in der Regel gemeinsam vererbt; gekoppelte Gene sind auf einem →Chromosom benachbart, können aber durch (seltene) →Rekombinationsereignisse getrennt werden. Leptotän (gr. λέπτος [leptos], dünn, fein; gr. ταινία [tainia], Band) Chromosomenstadium in der meiotischen Prophase I (S. 174). Letal (lat. letalis, tödlich) Art der Genwirkung. Ein Allel wird als letal bezeichnet, wenn der Tod des Individuums vor Erreichen der Geschlechtsreife eintritt. Ligand (lat. ligare, verbinden) Molekül, das an einen →Rezeptor binden muss, um ein Signal zu übertragen (S. 140). LINE-Element (engl. long interspersed nuclear element, langes verstreutes Kernelement) Klasse von →DNA-Wiederholungssequenzen, die häufig auch die Möglichkeit zur →Transposition besitzen (Kapitel 8.2.3). Locus (lat. locus, Ort) Stelle eines →Gens auf dem →Chromosom. LOD-Score (engl. logarithm of the odds, Logarithmus der Chancen; engl. score, Notenspiegel, Punktzahl) Statistische Methode (vor allem in der Humangenetik) zur Abschätzung der →Kopplung von Genen. Ein LOD-Score von 3 bedeutet, dass Kopplung zweier Gene 1000-mal wahrscheinlicher ist als keine Kopplung (Kapitel 10.4 und 12.1.4). Lyon-Hypothese Mary F. Lyon, englische Genetikerin. Die Inaktivierung eines der beiden X-Chromosomen bei weiblichen Säugern erfolgt zufällig und früh in der Embryonalentwicklung; die Inaktivierung wird auf die Tochterzellen weitergegeben und führt zu einem mosaikartigen Muster der Genexpression (→Barr-Körper; Kapitel 6.3.3). Lyse (gr. λύσις [lysis], Lösung, Auflösung) Zellzerstörung als Folge einer Infektion durch →Bakteriophagen oder →Viren (S. 111). Lysogener Zyklus (gr. λύσις [lysis], Auflösung) Während des lysogenen Zyklus enthält das Bakterium die →DNA eines →Bakteriophagen integriert im →Genom (Kapitel 4.3.1). Lytischer Zyklus (gr. λύσις [lysis], Auflösung) Während des lytischen Zyklus verliert die DNA eines →Bakteriophagen durch Induktion ihren integrierten Zustand im →Genom, repliziert, bildet neue infektiöse Bakteriophagen und zerstört die Zelle (→Lyse) (Kapitel 4.3.1). Makronukleus (gr. μακρός [makros], groß; lat. nucleus, Kern) Vegetativer Kern der Ciliata (S. 357). Makrosporen (gr. μακρός [makros], groß; gr. σπόρος [sporos], Saat, Samen) Weibliche Geschlechtszellen der Pflanzen (S. 201).

Marker, genetischer Jedes polymorphe, mendelnde Merkmal, das dafür geeignet ist, in einem Stammbaum einen chromosomalen Abschnitt zu verfolgen. Genetische Marker werden auch zur Analyse von →Kopplung verwendet. Maternaler Effekt (lat. mater, Mutter) Einfluss des mütterlichen →Genoms auf den →Phänotyp der Nachkommen. Meiose (gr. μεῖων [meion], verringern) Zellteilungen, die zur Bildung →haploider Keimzellen führen (S. 172). Meristem (gr. μερίζειν [merizein], (sich) teilen) Zellbereiche in Pflanzen, die zur kontinuierlichen Zellteilung befähigt sind. Merodiploid (gr. μέρος [meros], Teil; gr. διπλόος [diploos] oder διπλοῦς [diplous], zweifach, doppelt) Partiell →diploider genetischer Zustand von Bakterien (S. 114). Meroistisch (gr. μέρος [meros], Teil) Bestimmter Typ von Insektenovarien. Besteht aus Keimzellen und davon abgeleiteten Nährzellen (S. 548). Metaphase (gr. μετá [meta], zwischen; gr. φáσις [phasis], Anzeige) Bestimmter Zeitpunkt während der →Mitose oder →Meiose (S. 169). Metazentrisches Chromosom (gr. μετá [meta], zwischen; gr. κέντρον [kentron], Mitte) →Chromosom, bei dem das →Centromer in der Mitte liegt, dadurch sind beide Chromosomenarme gleich lang. Migration (lat. migrare, wandern) Populationsgenetischer Begriff. Austausch von Individuen zwischen zwei Populationen (S. 514). Mikronukleus (gr. μικρός [mikros], klein; lat. nucleus, Kern) Generativer Kern der Ciliata (S. 357). Mikrosporen (gr. μικρός [mikros], klein; gr. σπόρος [sporos], Saat, Samen) Männliche Keimzellen der Pflanzen (S. 201). Mitochondrium (gr. μιτός [mitos], Faden; gr. χόνδρος [chondros], Korn) Cytoplasmatische Organellen mit eigener genetischer Information. Verantwortlich für den Stoffwechsel der Atmungskette. Mitose (gr. μιτός [mitos], Faden) Zellteilungsperiode im →Zellzyklus (S. 168). Modifikation (lat. modificare, verändern) Umweltbedingte Veränderung im →Phänotyp. Monosomie (gr. μόνος [monos], einzig; gr. σῶμα [soma], Körper) →Haploider Zustand eines →Chromosoms in einem →diploiden (→polyploiden) Genom (S. 627). Monözisch (gr. μόνος [monos], allein, einzig; gr. οἶκος [oikos], Haus) Einhäusige Pflanzen mit männlichen und weiblichen Blüten auf einem Individuum (S. 457). Morphogen (gr. μορφή [morphe], Gestalt; gr. γένεσις [genesis], Entstehung) Moleküle, die morphologische Musterbildung induzieren (S. 528). mRNA (engl. messenger RNA, Boten-Ribonukleinsäure) RNAMolekül, das an der →DNA abgelesen (→Transkription) und in ein Protein übersetzt wird (→Translation). Multiple Allelie Mehr als zwei →Allele eines Gens, die in einer →Population vorkommen (S. 474). Mutagen (lat. mutare, verändern; gr. γένεσις [genesis], Entstehung) Physikalische Einwirkung (Strahlung) oder chemische Verbindung, die →Mutationen induziert (Kapitel 9.4). Mutation (lat. mutare, verändern) Die Veränderung von →Genen (Kapitel 9). Neomorph (gr. νέος [neos], neu; gr. μορφή [morphe], Gestalt) →Allel, dessen Wirkung sich qualitativ von der des →Wildtyps unterscheidet (S. 474); →Heterozygote zeigen üblicherweise die Produkte beider Allele.

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Nondisjunction (lat. disjunctio, Verteilung) Nichttrennung von →Chromatiden oder homologen →Chromosomen während →Mitose oder →Meiose (S. 486). Nuklease (lat. nucleus, Kern) Enzym, das Nukleinsäuren (→DNA, →RNA) abbaut. Nukleolus (lat. nucleus, Kern) Ort der Synthese von rRNA im Zellkern (Kapitel 5.2.4). Nukleosid (lat. nucleus, Kern) Purin- oder Pyrimidin-Base, die mit einem Zucker (Ribose oder Desoxyribose) kovalent verknüpft ist; Baustein der →RNA bzw. →DNA (Kapitel 2.1.2). Nukleosom (lat. nucleus, Kern; gr. σῶμα [soma], Körper) Elementare Struktureinheit der →Chromatide, in der zwei Windungen der →DNA um einen Proteinkomplex aus 8 →Histonmolekülen gewunden sind (Kapitel 6.2.3). Nukleotid (lat. nucleus, Kern) →Nukleosid, das mit einem Phosphatrest kovalent verknüpft ist; Baustein der →RNA bzw. →DNA (Kapitel 2.1.2). Nukleus (lat. nucleus, Kern) Zellkern. Null-Allel →Allel, aus dem kein funktionelles Genprodukt entsteht. Numerator (lat. numerare, zählen) Moleküle des Zählmechanismus bei der Geschlechtsbestimmung von →Drosophila (S. 259). Offener Leserahmen (engl. open reading frame, ORF) Sequenz von →Nukleotiden, die die Aminosäuren eines Proteins codiert. Der offene Leserahmen wird von einem Start- bzw. Stoppcodon begrenzt (→Codon). Okazaki-Fragment Kurze, diskontinuierliche Stücke von →DNA, die auf dem Gegenstrang bei der →Replikation der DNA entstehen (Kapitel 2.2). Oligonukleotid (gr. ὀλίγος [oligos], wenig, klein; lat. nucleus, Kern) Kurzes Fragment von ungefähr 10 bis 30 →Nukleotiden. Ommatidium (gr. ὄμμα [omma], Auge) Einheit der Komplexaugen von Insekten. Omnipotent (lat. omnis, alles; lat. potens, mächtig) Fähigkeit eines Zellkerns (einer Zelle), alle unterschiedlichen Zelltypen zu bilden (→ totipotent). Onkogene (gr. ὄνκος [onkos], Schwellung; gr. γένεσις [genesis], Entstehung) Gene, die potenziell (bei Mutation) Tumoren verursachen können (Kapitel 12.4.1). Ontogenese (gr. ὀντογένεσις [ontogenesis], Seinswerdung) Entwicklung eines Individuums von der befruchteten Eizelle zum erwachsenen Lebewesen. Oocyten (lat. ovum, Ei; gr. κύτος [kytos], Höhlung) Weibliche Keimzellen (Eizelle). Primäre Oocyten: weibliche Keimzellen nach Abschluss der mitotischen Teilung; sekundäre Oocyten: weibliche Keimzellen nach der meiotischen Teilung, aus der sich die reifen weiblichen Keimzellen entwickeln (Abb. 12.8). Operator (lat. operari, arbeiten, wirken) Ein cis-wirksames Regulationselement von →Genen (S. 129). Operon (lat. operari, arbeiten, wirken) Gruppe zusammenhängender, funktionell verwandter →Gene (in Bakterien), die in einer einzigen Transkriptionseinheit organisiert sind und durch eine einzelne, benachbarte regulatorische Region (→Operator) reguliert wird (Kapitel 4.5). Orthologe Gene (gr. ὀρθός [orthos], richtig; gr. λόγος [logos], Rede, Wort) Gene sind ortholog, wenn sie sich zur selben Zeit auseinanderentwickelten wie die betrachteten Organismen.

Pachytän (gr. παχύς [pachys], dick; gr. ταινία [tainia], Band) Chromosomaler Strukturzustand während der meiotischen Prophase I (S. 174). Palindrom (gr. παλίνδρομος [palindromos], rückwärtslaufend) Wort, Zahl, Satz, der vorwärts und rückwärts gelesen denselben Sinn ergibt. In Nukleinsäuren sind das Sequenzen, die in Strang und Gegenstrang identisch und häufig Erkennungsstellen für Proteine sind (→Transkriptionsfaktoren; →Restriktionsenzyme). Paraloge Gene (gr. παρá [para], neben; gr. λόγος [logos], Rede, Wort) Duplizierte Gene in einem Organismus (→homologe Gene, → orthologe Gene). Parazentrische Inversion (gr. παρá [para], neben) →Inversion, die kein →Centromer einschließt (S. 406). Paternaler Effekt (lat. pater, Vater) Einfluss des väterlichen →Genoms auf den →Phänotyp der Nachkommen. PCR Polymerasenkettenreaktion; Methode zur schnellen →Amplifikation von →DNA (Technik-Box 4) Penetranz (lat. penetrare, durchdringen) Ausprägungsweise eines →Allels (S. 477). Der Grad der Penetranz gibt an (in %), in welchem Anteil der Individuen mit der betreffenden genetischen Konstitution der →Phänotyp eines Allels zur Ausprägung kommt. Perizentrische Inversion (gr. περί [peri], um ... herum) →Inversion, die ein →Centromer einschließt (S. 407). Phänokopie (gr. φαίνειν [phainein], zeigen, erscheinen; gr. κόπος [kopos], Schlag; d. h. eigentlich: Scheindefekt) Simulation eines Gendefekts durch Umwelteinflüsse (S. 583). Phänotyp (gr. φαίνειν [phainein], erscheinen, ans Tageslicht kommen; gr. τύπος [typos], Form) Ausprägung eines bestimmten →Gens bzw. die Gesamtheit der sichtbaren Merkmale eines Organismus (S. 10). Phylogenie (gr. φῦλον [phylon], Stamm; gr. γένεσις [genesis], Entstehung) Stammesgeschichtliche Entwicklung von Organismen. Plasma (gr. πλáσμα [plasma], Gebilde) Wasserhaltige Substanz, die das Zellinnere oder den Zellkern füllt. Plasmid (gr. πλáσμα [plasma], Gebilde) Extrachromosomale, ringförmige DNA in Bakterien, die unabhängig vom Wirtsorganismus repliziert (Kapitel 4.2). Plastid (gr. πλασότς [plastos], gebildet) Organell im Cytoplasma von Pflanzenzellen, das im Dienste der Photosynthese steht. Plastom Genom von →Plastiden. In Anlehnung an →Genom. Pleiotrop (gr. πλείων [pleion], mehr; gr. τρόπος [tropos], Richtung) Offensichtlich vielfältige, aber nicht unmittelbar zusammenhängende Auswirkungen von →Genen oder →Allelen auf den →Phänotyp (S. 483). Ploidie Bezeichnung der Chromosomenzahl pro Zelle (→haploid, →diploid, →polyploid). Pluripotent (lat. plures, mehrere; lat. potens, mächtig) Die Fähigkeit eines Zellkerns (einer Zelle), unterschiedliche Zelltypen zu formen (jedoch nicht alle!, →omnipotent) (S. 596). Polkörper Während der →Meiose in der weiblichen Keimzellentwicklung entstehende degenerierte Zelle, die sich nicht weiterentwickelt. Poly(A)-Schwanz Besteht aus ungefähr 200 Adenin-Resten am 3’-Ende der eukaryotischen →mRNA und dient vor allem deren Stabilisierung. Für die Laborpraxis ist er als Startstelle der →cDNA-Herstellung wichtig (Technik-Box 6). Polycistronische mRNA (gr. πολύσ [polys], viel) →mRNA, die die Aminosäuresequenzen mehrerer hintereinander liegender Proteine codiert (→Cistron; S. 131).

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Polygen (gr. πολύσ [polys], viel) →Phänotyp, der durch mehrere →Gene hervorgerufen wird, wobei die Wirkung eines einzelnen Gens bzw. →Allels auf den Phänotyp nur gering ist. Polymerase (gr. πολύσ [polys], viel; gr. μέρος [meros], Teil) Enzym, das die Bildung von →DNA (DNA-Polymerase; →Replikation) bzw. →RNA (RNA-Polymerase; →Transkription) aus →Nukleotiden katalysiert (Kapitel 2.2 und 3.3). Polymorphismus (gr. πολύσ [polys], viel; gr. μορφή [morphe], Gestalt) Das gleichzeitige Vorkommen von zwei oder mehreren →Allelen in einer →Population mit Häufigkeiten, die nicht allein durch wiederholte →Mutationen erklärt werden können. Polyploid (gr. πολύσ [polys], viel; gr. πολυπλοῦς [polyplous], vielfältig) Mehrfache Ausführung des →haploiden Genoms in einem Zellkern (S. 399). Polytän (gr. πολύσ [polys], viel; gr. ταινία [tainia], Band) Zustand von →Riesenchromosomen in bestimmten Organen vor allem von Insekten, die aus mehreren bis vielen →Chromatiden bestehen (S. 249). Population (lat. populus, Volk) Gemeinschaft von Individuen, die sich innerhalb einer Region untereinander paaren können und einen gemeinsamen →Genpool besitzen (Kapitel 10.5); Begriff der Populationsgenetik. Posterior (lat. posterior, letzte, hintere) Hinterende des Organismus. Pribnow-Box Element aus 6 Basenpaaren, das oberhalb des Starts der →Transkription →prokaryotischer →Gene liegt; Bindestelle für die σ-Untereinheit der RNA-Polymerase. →Consensussequenz: TATAAT (Kapitel 3.3.2). Primordium (lat. primordium, Anfang) Ursprungszellen eines Organs während der →Ontogenese (S. 531). Prokaryoten (gr. προ- [pro-], vorher; gr. κάρυον [karyon], Nuss) Einzellige Organismen ohne Zellkern. Promotor (lat. promovere, vorrücken, (be)fördern) Regulationselement eines →Gens, initiiert die Funktion der RNA-Polymerase (Kapitel 4.5.2 und 7.3.1). Pronukleus (gr. προ- [pro-], vor; lat. nucleus, Kern) Väterlicher oder mütterlicher Gametenkern in der →Zygote vor der →Karyogamie. Prophase (gr. προ- [pro-], vorher; gr. φáσις [phasis], Anzeige) Bestimmte Periode während der →Mitose oder →Meiose (Kapitel 5.3.1 und 5.3.2). Pseudogen (gr. ψεύδος [pseudos], Lüge) Sequenz der →DNA mit signifikanter Homologie (75–80 %) zu einem funktionellen →Gen; die Sequenz ist aber so verändert, dass kein funktionelles Genprodukt entsteht (S. 279). Rekombination (lat. recombinare, neu verteilen) Austausch von →Allelen zwischen homologen →Chromosomen (Kapitel 4.4.2 und 5.3.3). Replikation (lat. replicatio, Kreisbewegung) Verdoppelung der →DNA (Kapitel 2.2). Reportergen →Gen ohne →Promotor, dessen Expression leicht nachweisbar ist (z. B. grün-fluoreszierendes Protein, Luciferase, lacZ). Nach der Fusion mit dem zu untersuchenden Gen oder Promotor wird das Konstrukt in die entsprechenden Zellen oder Organismen (Tier, Pflanzen) eingeschleust und die Expression gemessen (Technik-Box 29). Repressor (lat. reprimere, dämpfen, zurückdrängen) Regulationsmolekül der Genexpression, das die →Transkription des Gens verhindert oder vermindert (S. 126).

Restriktionsenzym (lat. restringere, einschränken, hemmen) →Nukleasen, die bestimmte Sequenzen der →DNA erkennen und schneiden (Kapitel 4.3.2). Retrovirus (lat. retro, rückwärts) →Virus mit →RNA als genetischem Material; benutzt die →reverse Transkriptase, um RNA in →DNA umzuschreiben. Reverse Transkriptase (lat. revertere, zurückwenden) Enzym, das an einer Matrize aus →RNA einen komplementären Strang aus →DNA synthetisiert (→cDNA, →Retrovirus). Reversion (lat. revertere, zurückwenden) Rückmutation eines →Allels zum →Wildtyp (S. 338). Rezeptor (lat. recipere, aufnehmen, zurücknehmen) Molekül, welches ein Signalmolekül (→Ligand) binden kann und so zur Signaltransduktion beiträgt. Rezessiv (lat. recedere, zurückweichen) Art der phänotypischen Ausprägung eines →Allels; der →Phänotyp wird nur in →Homozygoten sichtbar. Gegensatz: →dominant. Ribosom (gr. ἀραβινός [arabinos], Traube; gr. σῶμα [soma], Körper) RNA-Protein-Komplex, an dem die →Translation stattfindet. Riesenchromosom (gr. χρῶμα [chroma], Farbe; gr. σῶμα [soma], Körper) Entstehen durch Vervielfachung (→Replikation) eines Chromosoms während der →Interphase ohne nachfolgende Zellteilung (Vorkommen besonders in Speicheldrüsen von einigen Insekten; Kapitel 6.3.1). RNA Ribonukleinsäure; Nukleinsäure, die durch Ribose als Zuckerbestandteil charakterisiert ist. RNA kommt üblicherweise einzelsträngig vor, kann aber leicht Haarnadelstrukturen ausbilden, die doppelsträngige Bereiche enthalten. Es gibt verschiedene Formen, z. B. →mRNA (messenger-RNA; Kapitel 3.3), ribosomale RNA (rRNA; Kapitel 7.4), tRNA (transferRNA; Kapitel 3.4), kleine regulatorische RNAs (Kapitel 7.5). RNA-Interferenz (lat. interferre, unterbrechen) Abkürzung: RNAi. Methode zur Hemmung der Genexpression durch kleine RNA-Moleküle (Kapitel 7.5; Technik-Box 16). Rückkreuzung Kreuzung eines F1-Heterozygoten (→F1-Generation) mit einem Elternteil (oder mit einem Organismus, der mit einem der Eltern genetisch identisch ist). Satellit (lat. satelles, Leibwächter) Gestielter Fortsatz im →Chromosom, der beim Menschen in den kurzen Armen der →akrozentrischen Chromosomen vorkommt (Chromosomen 13, 14, 15, 21, 22). Satelliten-DNA (lat. satelles, Leibwächter) Ursprünglich Bezeichnung für DNA-Bande in der Gleichgewichtsdichtenzentrifugation; es handelt sich dabei um →DNA mit häufigen Wiederholungseinheiten. Schwesterchromatiden Durch →Replikation auseinander hervorgegangene →Chromatiden eines →Chromosoms. Sie sind genetisch identisch, ausgenommen für Neumutationen. Segregation (lat. segregare, absondern) Die Trennung von →Allelen in der →Meiose (gelegentlich, bei mitotischem →Crossingover, auch während der →Mitose). Sekundärstruktur Dreidimensionale Struktur von Nukleinsäure- oder Proteinmolekülen. Selektion (lat. selectio, Auswahl) Begriff der Populationsgenetik und wichtiger Mechanismus der Evolution, der auf der Auswahl bestimmter Merkmale für die Weitergabe an die nächste →Generation beruht. (Kapitel 10.5.3). Semikonservative Replikation (lat. semi, halb; lat. conservare, bewahren) Bei der →Replikation der →DNA wird der Doppelstrang geöffnet und jeweils ein neuer Strang an dem alten

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Strang synthetisiert; die alte DNA bleibt also im neu gebildeten Doppelstrang zur Hälfte erhalten. Silencer (engl. silence, abdämpfen, zum Schweigen bringen) →DNA-Sequenzen, die über große Distanzen und orientierungsunabhängig die Genexpression hemmen können. Gegensatz: →Enhancer. SINE-Element (engl. short interspersed nuclear element, kurzes verstreutes Kernelement) Klasse von →DNA-Wiederholungssequenzen, die häufig auch die Möglichkeit zur →Transposition besitzen; →Alu-Element (Kapitel 8.2.3). Soma (gr. σῶμα [soma], der Körper) Alle Zellen eines Organismus, ausgenommen Zellen der Keimbahn. Spermatocyten (gr. σπέρμα [sperma], Samen; gr. κύτος [kytos], Höhlung) Männliche Keimzelle. Primäre Spermatocyten: männliche Keimzellen nach Abschluss der mitotischen Teilung; sekundäre Spermatocyten: männliche Keimzellen nach der meiotischen Teilung, aus der sich die reifen männlichen Keimzellen entwickeln (Abb. 12.8). Spindel Zytoplasmatische Fasern, die während der Zellteilung gebildet werden und an der Trennung der →Chromatiden in der →Anaphase und ihrer Bewegung an die gegenüberliegenden Pole beteiligt sind. Spleißen (engl. splice, verbinden, zusammenfügen) Bei der Reifung der →mRNA werden in →Eukaryoten die →Introns herausgeschnitten und die →Exons entsprechend direkt miteinander verbunden (Kapitel 3.3.5). Synapsis (gr. συνáπτειν [synaptein], verknüpfen) Paarung zweier →homologer Chromosomen während der meiotischen Prophase I. Synaptonemaler Komplex (gr. συνáπτειν [synaptein], verknüpfen; gr. νῆμα [nema], Faden) Struktur, die in Zusammenhang mit →Rekombination zwischen zwei →homologen Chromosomen während der meiotischen Prophase I gebildet wird (S. 176). Synchron (gr. σύν [syn], zusammen; gr. χρόνοσ [chronos], Zeit) Gleichzeitig. Syncytium (gr. σύν [syn], zusammen; gr. κύτος [kytos], Höhlung) Cytoplasma mit mehreren Zellkernen ohne abtrennende Zellmembranen (S. 550). Syndrom (gr. συνδρόμη [syndrome], Zusammenlauf, Anhäufung) Medizinischer Begriff, Gesamtheit der Merkmale einer Krankheit. Synkaryon (gr. σύν [syn], zusammen; gr. κáρυον [karyon], Nuss) Gepaarte Gametenkerne in der →Zygote nach der Befruchtung. Syntenie (gr. σύν [syn], zusammen; lat. tenere, halten) →Kopplung von Genen auf demselben Chromosom. Von konservierter Syntenie spricht man, wenn die Reihenfolge von Genen auf den →orthologen Chromosomen in der Evolution erhalten geblieben ist.

Teratogenität (gr. τέρας [teras], (Vor-)Zeichen, (Schreckens-) Zeichen, Missgeburt) Giftige Wirkung einer Substanz auf Embryonen (Embryotoxizität), wodurch Missbildungen beim Embryo ausgelöst werden (Kapitel 11.6.3). Termination (lat. terminare, beenden) Hier: Abschluss der →Transkription oder →Translation (S. 62, 86). Tetrade (gr. τέτρας [tetras], Vierzahl) Ergebnis der meiotischen Teilungen einer →Gonocyte (S. 520). Aber auch: Paarung zweier →homologer Chromosomen in der meiotischen Prophase (S. 174). Tetraploid (gr. τέτρα [tetra], vier; gr. πολυπλοῦσ [polyplous], vielfältig) Genomzustand mit vier Chromosomensätzen. Therapie (gr. θεραπεία [therapeia], Pflege) Behandlung einer körperlichen oder psychischen Erkrankung mit dem Ziel der Heilung. Totipotent (lat. toti, alle; lat. potens, mächtig) Kerne (Zellen) mit der Fähigkeit, einen gesamten Organismus entstehen zu lassen (S. 593). Transduktion (lat. transducere, hinüberführen) Übertragung von →Genen mithilfe eines →Virus. Transfektion (lat. trans, hinüber; lat. facere, machen) Einschleusung von →Plasmid-DNA in eukaryotische Empfängerzellen, wobei es nicht zur Integration ins →Genom kommt. Transformation (lat. transformare, umformen, umwandeln) Erbliche Veränderung in einer Zelle oder in einem Organismus durch fremde →DNA. Transgene Organismen (lat. trans, über) Gentechnisch veränderte Organismen, die in ihrem →Genom zusätzlich arteigene oder artfremde →Gene integriert haben (Kapitel 9.7). Trans-Konstitution Zwei oder mehr →Allele gekoppelter →Gene, die in einer →heterozygoten Konstitution auf unterschiedlichen →homologen Chromosomen liegen, befinden sich in einer trans-Konstitution. Transkription (lat. transcriptio, Abschrift, Übertragung) Übertragung der genetischen Information von der →DNA auf ein →RNA-Molekül (S. 61). Translation (lat. translatio, Übertragung) Übertragung der genetischen Information von der →mRNA in eine Polypeptidstruktur (Kapitel 3.4). Translokation (lat. translocatio, Versetzung) (1) Übertragung von chromosomalen Bereichen zwischen nicht-homologen →Chromosomen (Kapitel 9.2.3). (2) Bewegung eines →Ribosoms entlang eines →mRNA-Moleküls während der →Translation (Abb. 3.26). Transposition (lat. transpositio, Versetzung, Verlagerung) Verlagerung genetischer Elemente im →Genom (Kapitel 8.1 und 8.2). Trisomie (gr. τρι- [tri-], drei-; gr. σῶμα [soma], Körper) Triploider Zustand eines →Chromosoms in einer nicht-triploiden genetischen Konstitution (S. 627).

Tautomerie (gr. ταυτὸ [tauto], dasselbe; gr. μέρος [meros], Teil) Alternative Konformationen chemischer Verbindungen (S.410). Telomer (gr. τέλος [telos], Ende; gr. μέρος [meros], Teil) Ende eines →Chromosoms (S. 229). Telophase (gr. τέλος [telos], Ende; gr. φáσις [phasis], Anzeige) Bestimmte Periode während der →Mitose oder →Meiose (Kapitel 5.3.1 und 5.3.2). Telozentrisch (gr. τέλος [telos], Ende; gr. κέντρον [kentron], Mitte) Form von →Chromosomen mit terminalen →Centromeren (S. 220).

Univalent (lat. unus, ein einziger; lat. valens, kräftig) Einzelchromosom bei der meiotischen Paarung (S. 400). Variabilität (lat. varius, verschieden) Häufigkeitsverteilung bestimmter →Genotypen in einer →Population. Maß der Variabilität ist der Betrag der →Heterozygotie in einer Population; Ursache der Variabilität sind →Mutationen. Vektor (lat. vector, Träger, Fahrer) In der Gentechnik ein Mittel (z. B. →Bakteriophage oder →Plasmid), in das ein fremdes DNA-Fragment eingefügt wird. Wird der Vektor mit dem fremden DNA-Fragment in ein Bakterium oder eine eukary-

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otische Zelle übertragen („Genfähre“), entsteht ein →gentechnisch veränderter Organismus (GVO) (Technik-Box 8). Virus (lat. virus, Gift) Ein infektiöses Partikel, das aus Proteinen und →DNA oder →RNA besteht. Es benötigt zu seiner Vermehrung eine geeignete Wirtszelle (Kapitel 8.2). Wildtyp Ein →Gen, ein →Genotyp oder ein →Phänotyp, der in der Wildpopulation oder unter standardisierten Laborbedingungen für einen bestimmten Organismus vorherrschend ist. Der Begriff „normal“ ist dagegen zu vermeiden, weil er zu falschen Schlussfolgerungen führt (→Eugenik).

Zellautonom (gr. αὐτόνομος [autonomos], unabhängig, nach eigenen Gesetzen) Art der Genwirkung, die auf die Zelle beschränkt bleibt, in der ein Gen aktiv ist (S. 260). Zellzyklus (gr. κύκλος [kyklos], lat. cyclus, Kreis, Kreislauf) Abfolge von Ereignissen, die in einer Zelle zwischen zwei Teilungen stattfinden (→Mitose, →Meiose) (Kapitel 5.3). Zygotän (gr. ζυγωτόß [zygotos], durch ein Joch verbunden, zweispännig; gr. ταινία [tainia], Band) Chromosomaler Strukturzustand während der meiotischen Prophase I (S. 174). Zygote (gr. ζυγωτόß [zygotos], durch ein Joch verbunden, zweispännig) Zelle, die aus der Fusion von →Gameten hervorgeht; befruchtete Eizelle.

Personenverzeichnis

Personenverzeichnis Abb. 1.1 Homunculus, den man früher im menschlichen Sperma zu sehen glaubte; Zeichnung von Hartsoeker aus seinem Essay de dioptrique (1694). (Nach Hilscher 1999)

A Allis, C. D. 247 Alzheimer, Alois 737 Ames, Bruce 427 Arber, Werner 4, 6, 97, 114 Auerbach, Charlotte 423 Avery, Oswald Theodore 4, 6, 18f, 28, 119

Chase, M. 28, 97 Clausen, Jens 10 Cline, Thomas 258 Cohen, Stanley 5f, 97 Connolly, Bernadette 125 Cooley, L. 549 Correns, Carl-Erich 3, 159, 457 Creighton, Harriet B. 179 Crick, Francis 2, 4, 6, 19, 21, 28ff, 46, 56f, 314

B Balbiani, E. G. 86, 220, 250 Baltimore, David 4 Barnett, L. 56 Barr, Murray L. 226, 236, 260, 266 Bateson, William 2, 478, 563 Bauer, Hans 220 Beadle, G. W. 52f, 478 Beermann, Wolfgang 250f, 253, 258 Beet, E. A. 633 Belote, J. M. 258 Benzer, Seymour 117f, 409, 697, 699, 706 Berg, Paul 5, 70, 310, 335 Bertram, Ewart G. 236, 260 Berthold, Peter 689, 692ff Bingham, P. M. 337 Birnstiel, Max 272, 298 Blackburn, Elizabeth 230 Botstein, David 500 Boveri, Theodor 3, 6, 157, 202, 218, 236, 362f, 665 Boyer, Herbert 5f Brennecke, H. 416 Brenner, Sidney 54ff, 202 Bridges, Calvin B. 486f Briggs, R. 594 Brown, Donald 306 Brown, Robert 156 Bünning, E. 697

C Cattanach, Bruce M. 601 Cavalli-Sforza, Luigi L. 773 Chang, Annie 5f Chargaff, Erwin 19

D Dalgarno, L. 82ff Darwin, Charles 5, 14f, 457, 508f, 519, 786 Delbrück, Max 97f, 115, 605 de Vries, Hugo 3, 394, 457 Dobzhansky, Theodosius 519 Driesch, Hans 593 Dulbecco, Renato 619

E Efstratiadis, A. 279 Ehling, Udo H. 586 Escherich, Theodore 96 Evans, M. J. 596

Grew, Nehemiah 156 Griffith, Frederick 18 Grosjean, Henri 58 Grunberg-Manago, Marianne 57 Guo, S. 313 Gurdon, John 594

H Haldane, John B. S. 432, 489, 491, 512, 622 Hardy, Godfrey H. 3, 6, 502ff, 512ff Hayflick, Leonhard 231 Heitz, Emil 220, 225f Hen, René 717 Hennig, Wolfgang 226, 250, 271, 327, 613 Hershey, Alfred D. 28, 97, 116 Hertwig, Oskar 157 Hertwig, Paula 416 Hess, O. 253 Heynold, Gustav 199 Hoagland, Mahlon B. 56 Holley, Robert W. 56 Holliday, Robin 124ff, 178ff, 367, 441 Hooke, Robert 156f Howard, Alma 185

I F Farmer, J. B. 157 Fiers, Walter 58 Flemming, Walther 157, 172, 190, 220, 240 Friedman, David 194

G Gall, Joseph G. 167, 252f Galton, Francis 5f, 616 Gehring, Walter 565, 569, 571, 588 Giardina, A. 301 Gilbert, Walter 5, 97, 129, 451, 619 Goldstein, Lester 53 Greider, Carol 230

Ingram, Vernon M. 634

J Jäckle, Herbert 559 Jacob, Francois 54, 97f, 128f Johannsen, Wilhelm 3, 502 Johnson, Thomas 194 Jones, J. 601, 604

K Kaufman, Thomas 596 Kemphues, K. J. 313 Kennerknecht, Ingo 798 Kerr, J. F. R. 191

827

828 828

Personenverzeichnis

Kew, J. N. C. 710 Khorana, Gobind 57 Kidwell, Mary 330, 337 King, T. J. 594 Konopka, Ronald J. 697, 699, 785 Kornberg, Arthur 37f, 65 Kornberg, Roger D. 37, 65 Kossel, Albrecht 3, 240 Kraepelin, Emil 726 Kratochvilova, Jana 586 Kremer, E. J. 410

Montgomery, Thomas H. 157 Moore, E. 157 Morgan, Thomas Hunt 3, 6, 204, 474, 489f, 491, 494 Mukherjee, A. S. 258 Muller, Herman Joseph 3, 6, 226, 258, 416f, 474, 493, 665 Müller-Hill, Benno 97, 129, 146 Mullis, Kary 5f

N L Lacroute, Francois 77 Laibach, F. 199 Lamarck, Jean-Baptiste 5, 97, 605 Lander, Eric 500 Landsteiner, K. 473, 513 Laskey, R. A. 241 La Spada, A. R. 410 Leder, P. 6, 57 Lederberg, Joshua 97f, 103, 112, 114, 121, 605 Lenz, W. 582f Levan, Albert 220 Lewis, Edwin, B. 552 Lima-de-Faria, Antonio 40 Lindegren, Carl C. 494 Little, C. C. 211, 483 Lolle, S. J. 471 Lorenz, Konrad 690 Losson, Regine 77 Lucchesi, John 258 Luria, Salvador 97f, 605 Lyon, Mary F. 210, 260, 264 Lyssenko, Trofim Denissowitsch 5f

M MacLeod, Colin 18 Matthaei, J. Heinrich 4, 6, 56 Maxam, Allan M. 5, 451, 619 Mayr, Ernst 519 McCarthy, Maclyn 18 McClintock, Barbara 179, 328, 330, 366 McGrath, James 599 Mendel, Johann Gregor 2ff, 6, 8, 14f, 18, 118, 157, 162, 210, 218f, 253, 319, 456ff, 491, 498, 502f, 514, 523f, 614, 622, 624, 655, 658, 685, 706, 726, 752 Mereschkowsky, Constantin 161 Meselson, Matthew 4, 6, 29ff, 54, 121f Meyer, G. F. 253 Miescher, Friedrich 2f, 6, 19, 52, 157, 240 Mitchell, Herschel 165 Mitchell, Mary 165 Monod, Jacques 97, 128f

Napoli, C. 313 Nathans, Daniel 4, 114 Nealson, K. H. 140 Neel, James V. 625, 633 Nilsson-Ehle, Hermann 481 Nirenberg, Marshall W. 4, 6, 56f Nüsslein-Volhard, Christiane 205, 207, 552

O Ochoa, Severo 4, 6, 37, 57 Okazaki, R. 33f, 36f, 43, 230, 412 Olovnikov, Alexei 231

Schäfer, H. 416 Schleiden, Matthias J. 156 Schull, James V. 625 Schultz, J. 227 Schwann, Theodor 156 Shine, J. 82ff Sillaber, Inge 723 Sinclair, A. H. 592 Smith, Hamilton 4, 114 Smithies, Oliver 596 Solter, Davor 599 Southern, Edwin M. 16, 48, 93, 149, 152ff, 446, 526, 622, 686 Spemann, Hans 593 Spiegelman, Sol 58, 300 Stahl, Franklin W. 4, 6, 29ff Steitz, Joan 70 Stern, Curt 183 Strahl, B. D. 47 Strasburger, Eduard 157 Streisinger, George 205f Sturtevant, Alfred H. 489 Sutton, Walter S. 3, 6, 157, 218 Suzuki, Yoshiaki 273 Svedberg, Theodor 8, 298 Szostak, Jack 30

T P Pääbo, Svente 758, 768 Painter, Theophilus S. 220, 249 Palade, Georg 54 Parkinson, James 588, 597, 657, 690, 726, 730, 738, 740, 743ff, 771 Pauling, Linus 633 Pelc, Stephen 185 Plaut, Walter 53 Ptashne, Marc 145f Punnett, R. C. 457, 459, 466, 486f, 502

Q, R Rabl, Carl 157, 220, 236 Radding, Charles 122 Rett, Andreas 730ff, 747 Ritossa, F. 300 Roeder, Ronald G. 306 Rotman, Raquel 116 Rous, Peyton 340, 659 Rubin, Edward 337, 340

S Saedler, Heinz 538 Sanger, Frederick 5f, 118, 148, 451f, 619

Täckholm, G. 627 Tatum, Edward L. 52f, 97f, 103 Taylor, Herbert 29ff, 121, 179 Thal, Johannes 199 Tijo, Joe Hin 220

U, V van Beneden, Eduard 157 van Leeuwenhoek, Antoni 156 Virchow, Rudolf L. 157 von Nägeli, Karl W. 157 von Tschermak-Seysenegg, Erich 3, 457 von Waldeyer-Hartz, Wilhelm 2f, 157

W Waddington, Conrad 599 Wallace, Alfred Russell 14 Wallace, H. 272, 298 Watson, James 2, 4, 6, 19, 21, 28ff, 46, 314, 619 Watts-Tobin, R. J. 56 Wawilow, Nikolai Iwanowitsch 6 Weigle, J. J. 121f Weinberg, Wilhelm Robert 3, 6, 502ff, 512ff, 518 Weinberger, David 717 Wiener, Alexander 474, 513

Personenverzeichnis

Weismann, August 157 West, Stephan 126 Wieschaus, Eric 205, 552 Wilkins, Maurice 4, 6 Wilson, Edmund B. 52, 157, 253 Wollmann, Ellie 98

X, Y, Z Yanofsky, Charles 58 Zinder, Norton D. 114

829

Sachverzeichnis

Sachverzeichnis

Abb. 1.1 Homunculus, den man früher im menschlichen Sperma zu sehen glaubte; Zeichnung von Hartsoeker aus seinem Essay de dioptrique (1694). (Nach Hilscher 1999)

A A (agouti) 196, 421f, 446f, 482ff, 607f aadA-Gen (Tn7) 332ff, 442 Aal (active avoidance learning) 710 AB0-Blutgruppensystem 472ff Abaxial 534ff ABC-Modell 539ff Abdomen 300, 548, 552, 553ff, 564f abdominal-A (abd A) 563 abdominal-B (abd B) 563 Abdominalsegment 559, 560ff – Segmentspezifität 564 Aberration 156, 251, 390, 397ff, 418, 424, 430f, 493, 628ff, 630f, 675, 684 – Chromosomenaberration 424, 430, 493, 628ff, 630f, 675, 684 ABL (Abelson murine leukemia viral oncogene) 659f Abort 627ff, 684, 817 (G) – Chromosomenanomalien 260, 625ff Abstammungslehre 14 AB-Zelle 544ff Adaxial 534ff ace (Acetylcholinesterase) 737, 659 Acetabularia mediterranea 301 Acetocytidin (ac4C) 311 Acetylcholin 733, 735ff Acetylierung 194, 218, 239ff, 264, 284f, 295, 309, 374, 602 Achaeta domesticus 301 Achillea lanulosa 10 Achillea millefolium 10 Achondroplasie 428 Achse – anterior-posterior 545, 548, 555ff – apikal-basal 529ff – Determination 528, 551, 609 – dorso-ventral 535, 545ff, 555ff, 574f, 589 – Drosophila 538, 548, 550ff Ackerschmalwand 12f, 156f, 160, 199 Acridinfarbstoffe 421, 425 – Acridinorange 222, 421, 425 Actinomycin 54, 65 ad (adenosin independence) 428 ADA (Adenosindeaminase) 681 ADAM33 (Metalloprotease) 667f Adaptation 405, 424 – Mechanismus 424 fett: Hauptfundstelle; Gensymbole sind kursiv gesetzt; (G) = Glossar

Adaptorprotein 192f – Caspase 192f adaptive response 424 ADAR (adenosine deaminase acting on RNA) 75f Additionsbastardisierung 404 Adenin 18ff, 75f, 111, 290, 396, 409, 422ff, 436, 656 Adenosindeaminase (ADA) 681 Adenovirus 342, 683 ADH (Alkoholdehydrogenase) 722 ADP-Ribosylierung 243 Aegilops speltoides = Triticum speltoides 403f Aegilops squamosum = Triticum tauschii 403 AER (apical epidermal ridge) 598, 368 Aflatoxin (Mutagenität) 421, 427, 429 agamous (ag) 199, 537ff Agglutination 474 Aggressivität 721 α-Globin 8, 277ff, 756 Ago (Argonaute) 314ff, 361 agouti (A) 196, 421f, 446f , 482ff, 607f Agrobacterium tumefaciens 101f, 108, 441, 443 AHL (acetyliertes Homoserinlacton) 140 AIDS 340ff – Virus 328, 341, 345, 381 – Wirtszellen 345, 381 ak (aphakia) 498, 588, 745 Akron 552ff, 817 (G) akrozentrisch 220f, 398, 631, 754, 817 (G) Aktivierungsdomäne 150 Aktivimpfung 381 Alanin 55f, 276f, 711 Albinismus 616, 634 – oculocutaner 634 – Albinismusflecken 634 albino (c; s. Tyrosinase) 428, 446, 482ff, 196, 210f Alkaloid 269, 443, 724 Alkoholdehydrogenase (ADH) 722 Alkoholismus 658, 720ff, 747 – Alkoholembryopathie 584 alkylierende Agenzien 420ff – (s. a. Nukleotidveränderungen) Alkylierung 423f Allel 3ff, 156, 172, 174, 177, 182, 199ff, 258ff, 356, 372, 634ff, 817 (G) – Arten von 3ff, 281, 474

– Ausprägung bei Hemizygotie 489, 618, 644, 685 – Ausschluss 380ff – dominant 459, 470ff, 482, 487f – Erhaltung durch Selektion 502f – Expressivität 477f, 608, 617, 638, 656 – Fixierung 507f, 522 – Frequenz 502ff, 514ff, 636, 763 – Häufigkeit 505, 514, 676 – Kennzeichnung 477 – Kombination 177f, 397ff, 405, 407 – Neukombination durch Rekombination 397ff – rezessiv 397ff – Verteilung 502ff Allergen 667f Allium cepa 27f, 219 Allopolyploidie 400ff, 817 (G) Altersabhängigkeit 737 Alterung 231f, 196 Alu-Element 72, 74,352f, 817 (G) Alzheimer’sche Erkrankung 657, 737f, 741ff Amanita phalloides 65 D-Amanitin 65 amber 60 Amelogenin (AMELY) 654, 676f Ames-Test 427, 429 Amethopterin 369, 371 AMH (anti-Müllerian duct hormone) 152, 593 Ammenmütter (s. transgene Mäuse) 453 Aminoacylbindungsstelle 84 Aminoacyl-tRNA 57, 60, 80ff Aminoacyl-tRNA-Synthetase 57, 60, 80ff Aminoform, Basen 409f 2-Aminopurin (AP) 421ff Aminosäure 4, 8, 52ff, 80ff, 118f, 132ff, 162, 194ff, 274ff, 307ff, 346ff, 396f, 518, 635ff, 700ff, 724ff, 732ff, 780ff amnesiac (amn) 708, 722f Amniozentese 676, 817 (G) Amnion 577ff, 676 Amoeba proteus 53 Amorph 158, 204, 273, 474, 478, 563, 566, 633 , 817 (G) Amphetamine 715 Amphibien 220, 252, 300, 349 Amphidiploidie 403f, 817 (G) Amphiploidie 817 (G) Ampicillin 108, 147

831

832 832

Sachverzeichnis Amplifikation 89ff, 252f, 273f, 300ff, 321, 358, 364ff, 399, 548, 659. 817 (G) – Gene 101, 273f, 300ff, 364ff – intrachromosomale 302, 365f – rRNA 300f Amygdala 691, 712, 715, 717ff amyloides Vorläuferprotein (APP) 737ff Anämie 278, 485, 512, 599, 633f, 665, 817 (G) Anaphase 170ff, 186ff, 220ff, 363ff, 401, 407, 495, 817 (G) – Homologentrennung 177 – meiotische 172ff, 186, 228, 365, 401, 407, 495 Androgen-Rezeptor (AR) 411 Androgynon 817 (G) Aneuploidie 177, 224, 396ff, 430f, 627ff, 684, 817 (G) Angelman-Syndrom 601, 603 Angst 689ff, 714ff animale Kappe 573 Aniridie 587 Ankerzelle 547 Anlagen 218, 358, 529, 533, 566, 573, 585, 593, 616 Anopheles 512 ANOVA (analysis of variance) 500 Antennapedia (Antp) 395, 563ff Antennapedia-Komplex (ANT-C) 563ff anterior 528, 544ff, 748, 787, 817 (G) Antheren 201, 463 Anthranilsynthetase 131 Antibiotikaresistenzgene 148 Anticodon 52ff, 81, 85ff, 311f Antigen 69, 77, 210, 231, 341f, 370, 377ff, 472ff, 668, 817 (G) – Determinante 377, 382, 386, 473 – Oberflächenantigen 377ff, 472, 668, 679 – Spezifität 383, 386f, 472 Antikörper 72, 91, 179, 260, 268f, 324, 345, 358, 380ff, 430, 448, 473f, 513, 526, 557, 563, 576, 610, 662, 672, 679f, 743, 817 (G) – Funktion 380ff – H-Kette 382ff, 526, 672 – Klassen 380ff, 672 – Klassenwechsel 383ff – L-Kette 382ff – monoklonaler 679 – Struktur 382ff, 526 – Variabilität 380ff antimorph 474f, 633 Antirrhinum majus 199ff, 527, 539 antisense-RNA 61ff, 94, 147, 210, 263, 316ff, 573, 611, 661, 783, 817 (G) – in-situ-Hybridisierung 94, 224f, 236, 251f, 269, 334, 364, 391, 560, 562, 610 – Genregulation 112, 131ff Antitrypsin (D1-A., AAT) 239, 448 2-AP (2-Aminopurin) 421f APC (anaphase promoting complex) 171, 186, 189ff AP-Endonuklease 387, 422, 437

AP3 (APETALA) 537f Apfel 400 aphakia (ak) 498, 588, 745 apical 589 Apis mellifera 219 Aplysia californica 704 ApoB (Apoliporotein B) 76, 239, 641f, 739 – RNA-Editierung 73, 77 apobec-1 (apolipoprotein B mRNA-editing enzyme, catalytic polypeptide) 76 ApoE 739ff, 759 Apoptose 156, 190ff, 313, 545, 587, 598, 656, 660ff, 741, 745, 817 (G) – Embryonalentwicklung 204, 545 – neurodegenerative Erkrankung 741, 745 APP (amyloides Vorläuferprotein) 737ff A-Protein 58 apterous (ap) 568 apx-1 (anterior pharynx in excess) 545f Äquationsteilung 172f, 214 Äquatorialebene 169f, 364 Arabidopsis thaliana 12f, 156, 189, 199f, 202, 272, 309, 399f, 435, 530, 535, 537, 619 Archaebakterien 58, 96, 332, 436 Arginin 55, 58, 240, 448, 739 Argonaute (Ago) 314ff ARS (autonom-replizierende Sequenz) 41, 197, 300, 368 Art – Bildung 518ff – Hybriden 404, 460, 471 Arteriosklerose 196, 518, 640 Arthritis 389, 679 artifizielles Chromosom 147 Arylsulfatase 635 Arzneimittelresistenz 680 Ascaris 219, 363 Ascomycet 494 Ascosporen 183f, 197f, 494ff – Neurospora crassa 183, 198, 494 – Tetradenanalyse 183f, 198, 494ff Ascus 183, 197f, 494ff, 817 (G) Asilomar, Konferenz von 5f Asparagin 55, 192, 710 Asparaginsäure 55, 710, 781 Aspergillus nidulans 219 ASPM (abnormal spindle-like, microcephaly associated) 779ff assortative Paarung 694, 817 (G) Assoziationsstudie 625 Asthma 476, 614, 658, 667ff, 681, 685, 690, 726 Astrocyt 598, 741 ASYMMETRIC LEAVES (AS1) 535ff Ataxie 411f, 656f, 721f, 745 Ataxin 411 Atherosklerose 640f, 680 Atmungskette 655ff Atombombe 418f atonal (ato) 571

ATPase 36, 41, 104, 181, 259, 315, 394, 519, 735 Atrophin 411 attB 113f attached-X-Chromosom 494, 817 (G) Attenuation 64, 135, 817 (G) – E. coli 64, 135 – trp-Operon 135 Aub (Aubergine) 316, 320f Augen – Entwicklung 477, 569ff, 786 – Evolution 588, 786 – Farbe 394, 480, 489, 494, 520 – Formen 628 – Linse 276, 287, 289, 497ff, 588 – Mutanten 587f AUG-Triplett 58 Australopithecus 751, 756 Autismus 652, 730, 736f, 747 Autoallopolyploidie 817 (G) Autogamie 817 (G) Autokatalytisch 68, 193, 230, 304, 349, 356, 748, 817 (G) Autopolyploidie 400 Autoimmunerkrankung 674 Autoinduktor 139ff autokatalytisch 748 autonom-replizierende Sequenz 41, 300, 368, 817 (G) Autoploidie 399f Autoradiographie 30f, 40, 153f, 258, 268, 526, 610 – DNA-Replikation 30f, 40 – Replikation in Riesenchromosomen 249, 251 Autoregulation 187, 817 (G) Autosom 254, 638, 817 (G) Autotetraploidie 400f Auxin 108, 530ff auxotroph 98, 101, 818 (G) Avian Sarcoma Virus (ASV) 340 – s. a. Rous Sarcoma Virus (RSV) Avidin 91, 268 Axon 741, 745, 787 azentrisches Chromosom 631, 818 (G) AZF (Azoospermie-Faktor) 654

B BAC (bacterial artificial chromosome) 147 Bacillus antracis 102 Bacillus cereus 102 Bacillus subtilis 59, 102, 119f, 818 (G) Bacillus thuringiensis 404 Bäckerhefe 156, 187, 197ff, 372, 374 Bakteriophage 58, 109ff, 428, 431, 441 – )X174 109ff, 342 – Lambda (O) 112 – M13 109, 111 – P1 114f – P22 114

Sachverzeichnis – Rekombination 114ff, 441 – T2 109, 115, 428 – T4 58, 109ff, 441 – Vektor in Gentechnologie 112 – Wirtsbereich 111 Balancer-Chromosom 206, 390f Balbiani-Ring 86, 250, 818 (G) Balzverhalten 691 Banane 400 Bänderungstechniken 222, 224 band-shift assay 324 barfly (brf) 721 Barr-Körper 226, 236, 260, 266f, 818 (G) Basal 528ff Basen 20 – Basenanaloga 420ff – Exzisionsreparatur (BER) 436ff – Paarung 9, 22, 26, 32, 44,47, 56f, 67, 70f, 81,85, 124, 132f, 146, 149, 154, 181, 235, 244, 311ff, 356, 410,414, 422, 437 – seltene B. in tRNA 81, 311 – Substitution 396, 408, 410, 422ff – Veränderung 409ff – Verlust 422 basische Zipper (bZIP) 293ff, 700 Bastard 404, 444 Bauchspeicheldrüse 636f, 721 Baumwolle 101, 444 bb (bobbed) 300 bcd (bicoid) 552ff bcl-2 192f B-Chromosom 253ff BCR (breakpoint cluster region) 659 BDL (BODENLOS) 531 Beckwith-Wiedemann-Syndrom 601ff Befruchtung 157, 172ff, 202, 208, 212, 339f, 362f, 373, 400, 416, 457ff, 483, 528ff, 549ff, 573, 576ff, 592, 596 Bellevalia romana 30f Benz(a)pyren 427 Benzolderivate 427 BER (Basen-Exzisionsreparatur) 436f Bestrahlung 145, 179, 193, 335, 415f, 426, 434, 439, 599, 665f Beuteltier 256f, 264f, 346, 601f E-Faltblatt 275f, 287, 289, 383 E-Galactosidase 128ff, 148, 150, 392, 635 bicoid (bcd) 552ff Big blue Mouse 431f bio-Gen 112f Bioinformatik 680 Bioreaktor 443, 595 Biostatistik 625 Biotechnologie 2, 102 Biotin 91, 98, 236, 268, 610 Biotop 10f, 818 (G) Birkenspanner 510f Birne 400 Biston betularia 510f Bithorax-Komplex (BX-C) 563, 566, 579 Bivalent 175, 252, 818 (G) B-Konformation (DNA) 21ff

Blaschko-Linien 261 Blasenkrebs 659, 661 Blastocyst 528, 578 Blastoderm 217, 259, 550ff, 818 (G) Blastomer 545 Blastula 210, 818 (G) Blatt 494, 535f, 542 Blattrosette 537 Blaualgen 699 Blindheit 504, 634, 671 Bloom-Syndrom 181, 231f Blühinduktion 529, 537, 540 Blutarmut 485 Blüte – Blütenhülle 537 – Entwicklung 537ff, 542 – Induktion 538 – Mutation 538f – Primordium 538 – Symmetrie 533, 537 Bluterkrankheit 433, 474, 645, 682 Blutgerinnung 185, 645f, 681 – Faktoren 646 – Defekt 185, 645f Blutgruppe – Allele 472ff, 503f, 513, 516, 622 – Antigen 472ff, 513 – Populationsstudien 516 Bluthochdruck 681 Blutkrankheit 277, 485 Bluttransfusion 474, 647 Bmal1 (brain and muscle Arnt-like protein 1; = Mop3: morphine preference 3) 701f BMP (bone morphogenetic protein) 523, 574ff, 584ff bobbed (bb) 300 BODENLOS (BDL) 531 Bodenplatte 576, 579 Bombyx mori 219, 273, 329, 335 Bonobo 753, 783 Bootstrap-Analyse 286, 767, 818 (G) Borrelia burgdorferi 102 Borrelia garinii 102 boss (bridge-of-sevenless) 570ff Bos taurus 219, 490 Bradyrhizobium japonicum 96 Brassica oleracea 219 BRCA (breast cancer) 664 5-BrdU (5-Bromodeoxyuridin) 421 brf (barfly) 721 BRE (transcription factor IIB recognition element) 289f bridge-of-sevenless (boss) 570ff 5-Bromodeoxyuridin (5-BrdU) 421f, 431 brown eyes (br, Drosophila) 428 Brustkrebs 210, 659, 662, 664 BT-Mais 444 5-Bromouracil (5-BU) 421f Bulle 448 Buntbarsche 520, 523 bw (brown eyes) 428 bZIP (basische Zipper) 293

C CAAT-Box 291, 818 (G) cabbage (cab) 706 CACNA1A (Calcium-Kanal) 735 cactus (cact) 551, 557 Caenorhabditis elegans 156, 191, 202ff, 219, 257, 329, 335, 363, 527, 544ff, 602, 619, 740 CAI (codon adaptation index) 99f Calbindin 745 Calcium 448, 639f, 735f Camkk2 (calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2) 710 cAMP 131, 187, 295, 706ff, 722, 724, 730, 747 Canamycin 108 Candida albicans 374 Canis domesticus 219 cap (Kappe; s. mRNA) 66ff, 131 Cannabis 725ff CAP (catabolite activator protein) 131 capicua (cic) 558 cappuccino (capu) 551 Capsid 109, 336, 341, 350 Carbendazim 431 Carrier 56, 646, 717 Caseinkinase IH (CKIH; Csnk1e) 701ff Caspari’sche Streifen 532 Caspase 192f Catechol-O-Methyltransferase (COMT) 725ff Caulobacter crescentus 102 Cavia porcellus 219 CD4 515, 672 CD8 672 CDAR (cytosine deaminase acting on RNA) 75 CDC 32, 42, 186ff, 230 – Cdc2 188, 194 – Cdc6 32, 41f – Cdc13 188, 230 – Cdc28 186, 188 – Cdc45 42 CDK (cyclin-dependent kinase) 186ff, 663, 674 – Cyclin-Komplex 188f – Inhibitoren 189 cDNA (copy DNA) 89ff, 150, 200, 282, 354, 450, 473, 685, 702, 749, 783, 818 (G) C/EBP (CCAAT/enhancer binding protein) 709ff ced 191f CENP (centromere proteins; s. Centromer) 228, 247ff, 399 Centi-Morgan (cM) 489, 619, 818 (G) Centriol 170, 818 (G) Centromer – Fehlen in B-Chromosomen 227f – Funktion 229, 238, 622 – Hefe 228f – Kartierungsmarker 405, 407, 494ff

833

834 834

Sachverzeichnis – Mensch 603 – Proteine 229 – repetitive DNA 229, 234 – Satelliten-DNA 228, 234 Centrosom 158, 169, 730 CEPH (Centre d’Etude du Polymorphisme Humain) 769, 771 Ceramid 635 Ceramidase 635 Cerebellum 611, 691, 784 CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) 636ff Chalkon-Synthase 313 cheap date (chpd) 721ff Checkpoint 185, 434, 440 Chemikaliengesetz 422 Chemotherapie 371, 664, 680 Chi-Quadrat-Test (F-Test) 468, 489 Chi-Sequenz 122 Chiasma 174ff, 577, 818 (G) Chiasma opticum 787 chickadee (chic) 549 Chimäre 352, 379, 446, 593, 596, 659, 686, 818 (G) Chironomus 86 – Nukleolus 225 – Riesenchromosom 250 Chlamydophila pneumoniae 102 Chlamydomonas 219, 285f, 428, 435 CLAVATA (CLV) 536f Chlorophyll 10, 159f, 436, 818 (G) Chloroplast 3, 158ff , 818 (G) CLV (CLAVATA) 536f Cholesterin 518, 640ff, 680 Cholesterol-7D-Hydroxylase (CYP7A1) 517f Chorea Huntington 411ff, 428, 620, 642ff, 730 Chorion 366ff, 548, 580f, 676, 818 (G) chpd (cheap date) 721ff Chromatide 818 (G) – Aufbau 169ff – Crossover 114, 122 – Interferenz 229, 493, 622 – Modell 30f, 170ff, 214, 238, 300f, 365ff, 440 – Trennung 169ff, 365, 369, 486f – Verteilung 30f, 156, 159, 169ff, 369, 622 Chromatin 41ff, 228, 235ff, 323, 361ff, 604, 732f, 818 (G) – Bestandteile 157, 240f – Diminution 361ff – Domänen 166, 218, 237f, 247, 565 – Elimination 361ff – inaktiv 166, 171, 218, 226ff, 374 – Interphase 156, 166ff, 239f, 260 – Kondensation 170, 194, 218, 226ff, 318, 323, 374 – Organisation 225, 235ff, 245, 247, 602 – Reparatur (DNA) 43, 214, 238, 438 – Replikation 41ff, 229ff, 236ff, 604 – Struktur 65, 218, 230, 236ff, 241ff, 259, 295, 297, 604

Chromomer 174, 818 (G) – Genlocus 250ff – Lampenbürstenchromosom 252f – Prophasechromosom 174, 252 Chromomycin 269 Chromosom 818 (G) – Aberration 251, 397f, 405, 407 , 409, 418, 424, 430ff, 493, 628ff, 675, 684, 817 (G) – Analyse 48, 147, 180, 222ff, 403 – Anomalie 625ff – Bänderung 222ff, 267, 269, 279 – Bestandteile 240f – C-Banden 222, 237ff, 269, 366 – Centromer 169ff, 218ff, 267, 361ff, 405ff, 431, 491ff, 631ff, 654 – Crossing-over 156, 174ff, 390, 400ff, 632 – Elimination 254ff, 359ff – Färbung 157, 222ff, 236, 250, 269, 430 – Domänen 166, 218, 236ff, 267, 406 – eukaryotisches 197 – Fission 397f – Fusion 229, 253, 397f, 631 – Gestalt 219f – holokinetisches 398 – homöologe Chromosomen 401ff – HSR (homogenously staining region) 365ff – Interphase 156, 166ff, 220ff, 250f – Karte 249ff, 489ff, 618 – Kondensation 169ff, 229, 323, 406 – Meiose 156ff, 172ff, 214, 218ff, 267, 365, 397ff, 486ff, 494 – Metaphase 31, 169ff, 214, 220ff, 236, 251, 256, 268ff, 365f – Morphologie 219ff – Mutation 393ff, 625 – Nomenklatur 224, 489 – Painting 224f, 269 – Ploidie 177, 627ff, 684 – polytän 249ff, 364 – polyzentrisch 398 – prokaryotisches 7, 103, 146 – Protein 96ff, 146, 176ff, 220, 227f, 229, 240ff, 267 – Rekombination 3, 103f, 156, 173ff, 338, 383ff, 408ff, 433f, 486ff, 614ff, 777 – ringförmiges 32, 103 – Scaffold 239 – Segregation 172, 185f, 402f – Struktur 173ff, 225, 235 – Territorium 236, 238 – Translokation 396ff, 601, 631, 653, 660, 728 – Trisomie 225, 396, 399, 627ff, 684, 738 – Ultrastruktur 168, 363 – Verteilung 256, 487, 519, 629, 684 – Zahl 219f, 257, 396ff, 627, 630 CHX10 (ceh-10 homeo domain containing homolog) 587 cI-Gen (O-Phage) 143 cic (capicua) 558

Cichliden 520ff Ciliaten 44, 59, 357ff, 390 Cin4-Element (Mais) 352 cinnabar (cn) 478ff Cip/Kip-Familie 189 cis-Konstitution 128f, 818 (G) cis-trans-Test 128ff, 146, 369, 818 (G) Cistron 117f, 127, 131f, 146, 818 (G) CKI (CDK-Inhibitor) 701, 703 CKIO (Caseinkinase IO; Csnk1e) Clock (Clk) 699ff cM (Centi-Morgan) 489, 619, 818 (G) cms (cytoplasmic male sterility; s. Pollensterilität) 166 c-myc (Onkogen) 187, 247, 598f cn (cinnabar) 478ff CO (CONSTANS) 540ff Cockayne’s Syndrom 666 Code (s. genetischer Code) 4, 51ff, 165 codominant 473, 503, 818 (G) Codon 52ff, 818 (G) Coffin-Lowry-Syndrom 713 Cohesin 181, 189 Colcemid 269 Colchicin 31, 269, 404 Colinearität (s. genetischer Code) 58 Colizine 108 Col-Plasmid 108 Columba livia 219 COMT (Catechol-O-Methyltransferase) 725ff c-onc (Onkogen) 343 Consensussequenz 64f, 137, 233, 289ff, 340, 368, 473, 639, 818 (G) Contergan 582 copia 329, 335, 349, 480 Core-Enzym 62ff Core-Histon (s. Histon) 241 Cornea 586 Corpus callosum 599 Corticotropin 723, 747 Cosmid 49, 147 cos-site (cohesive sites) 110, 113 c0t1/2-Wert 27 CpG-Insel 605 c-ras (Onkogen) 187, 661f CREB (cAMP responsive element binding) 293, 295, 706ff Cre-Rekombinase 114f, 445,686f CRH (corticotropin-releasing hormon) 723 Cricetulus griseus 219 cro (O-Phage) 143ff Crohn’sche Erkrankung 681 Crossingover 174, 818 (G) – Interferenz 622 – Mitose 156, 183, 434 – Chromosomenaberration 251 Crosslinking 420, 424ff CRP (cAMP receptor protein) 131 cry (Cryptochrom) 436, 699, 702 cry (crystal protein) 444

Sachverzeichnis Cryba1 (EA1-Kristallin) 287, 498ff, 620, 625 Cryg (J-Kristallin) 287ff, 588 CS (Cockayne’s-Syndrom) 666 C-Wert 7 cryptochrome (cry) 436, 699, 702 Csnk1e (Caseinkinase IH; CKIH) 701f ct (curly tail) 580 cuc (cup-shaped cotyledon) 54, 534, 537 Culex pipiens 219 Cuticula 544, 547, 556, 561 Cyanobakterien 161, 356, 697, 699 cyc (cycle) 187, 699 cyc (cyclops) 576 Cyclin 40, 156, 185ff, 369 – Induktion in der S-Phase 186f Cyclin-abhängige Kinase 186f, 194 Cyclobutanring 414, 426 Cyclops 363f, 576 CYP7A1 (Cholesterol-7DHydroxylase) 517f CYP21A (Steroid-21-Hydroxylase) 185 CYP26A (Cytochrom P450, Unterfamilie 26) 573f curly tail (ct) 580 Cystein 55, 192, 307, 448, 484,639f, 739 Cystein-Protease (s. Caspase) 192f Cystische Fibrose 636, 638, 684 Cytochrom b 163 Cytochrom c 163 Cytochromoxidase 163, 656 Cytogenetik 6, 220, 625, 818 (G) Cytoglobin 282 Cytokinese 172 Cytoplasma 52ff, 156ff, 214, 272, 293, 312ff, 550ff, 818 (G) – Erbeigenschaften 159 Cytosin 18ff, 76, 306, 396, 409ff, 424, 766 – Deaminase 75f, 388 Cytoskelett 158f, 214, 549 – Aufbau 159, 273 – Nährzellen 549 – Tubulin 171f, 550 Cytostatika 369, 371

D Dac (Dachshund) 572 DAF (decay accelerating factor) 194f Danio rerio 156, 205, 219, 435, 572 DAPI (4’,6-Diamino-2-phenylindol) 222, 269 DAX1 (orphan nuclear receptor) 654 DAZ (deleted in azospermia) 654 dbp (Albumin-D-Element bindendes Protein) 702 dbt (double-time) 699ff Deacetylierung 194, 247, 264 death-Domäne 192 decapentaplegic (dpp) 566, 569, 589 deficiens (def) 538 deformed (Dfd) 564

Degeneration (des genetischen Codes) 57, 81f Deletion 73f, 117, 251, 396ff, 476, 559, 631ff, 818 (G) Deletionskartierung 117 Delta (Dl) 545ff Delta/Notch-Signalweg 545ff Demethylase 266 Denaturierung 16, 26, 47, 153, 450 Dendrit 730 Denominator 818 (G) Dephosphorylierung 43, 71, 79 Depression 681, 690, 714ff Depurinierung 423 Dermatogenstadium 530 Dermatom 578 DES (Diethylsulfonat) 423 Desaminierung 409ff Desmin 159 Desoxyribonuklease (DNase) 61, 91f, 108, 119, 176, 226, 296f, 324, 604, 638 Desoxyribonukleinsäure (DNA) 2f, 18ff Desoxyribose 18ff Deszendenztheorie 14, 457, 509 Determinanten – anteriore 550, 560 – cytoplasmatische 550, 557 – posteriore 550f, 557, 560 Determination 528, 551, 573, 609, 671, 714, 518 (G) Deuteranopie 504f Dfd (deformed) 564 Dhfr (Dihydrofolatreduktase) 369ff Di-(2-chloroethyl)sulfid (s. Senfgas) 421 Diabetes 389, 608, 637, 656, 658 , 671ff D-Aminosäure-Oxidase (DAAO) 728 Diabetes 389, 608, 637, 656, 658 , 671ff Diacylglycerol 187 Diagnose 635ff, 737, 818 (G) Diakinese 175, 592, 818 (G) Diazepam 431 Dicer 314ff, 361 Dichtegradient 233 Dickdarmkrebs 419, 659, 661, 674 Dictyostelium discoideum 329, 335 Dictyotän 592, 818 (G) Didesoxy-Methode 451f Diethylsulfonat (DES) 423 Differenzierung 382, 384, 390, 538, 547, 559ff, 609, 673, 819 (G) Digoxigenin (DIG) 91, 268, 610 dihybride Kreuzung 463, 466, 478, 481, 489 Dihydrofolatreduktase (Dhfr) 369ff Dihydrouridin 81 Dikaryon 819 (G) Dimethylguanosin 311 Diminution 361ff, 819 (G) Diol-Epoxid-Derivate 421, 426f diözisch 819 (G) diploid 107, 114, 127f, 173ff, 197ff, 371ff, 403ff, 431, 466ff, 819 (G) Diplophase 198, 201 Diplotän 174f, 819 (G)

DISC (disrupted in Schizophrenia) 728ff Diskordanz 616, 819 (G) Disomie 430f Disposition 658, 667, 725 dizentrisches Chromosom 367, 407, 418, 631, 819 (G) Dl (Delta) 545ff dl (dorsal) 528ff D-loop 123, 163, 231, 311, 657 DMC1 441 DMPK (myotone Dystrophie) 411, 413, 714 DNA 18ff, 819 (G) – Basenpaarung 9, 22, 26, 32, 47, 410, 414, 422 – bidirektionale Replikation 37 – Bindungsdomäne 23, 150 – Brüche 16, 34, 122, 126, 405, 412ff – chemische Struktur 18f, 52, 61 – Chip 749 – c0t1/2-Wert 27 – curved-DNA 25 – Doppelhelix 2ff, 18ff – Duplikation 30, 114 – Erbinformation 4, 6, 18f, 46, 118 – Funktion 18ff – Glykosylasen 437 – Isolierung 16, 149 – Konformation 21ff, 243 – Körperchen 301 – Klonierung 6, 16, 90ff – Ligase 33, 93 – Menge im Genom 2, 27, 32 – Phosphat-Zucker-Rückgrat 4, 21ff, 52, 437 – Phosphodiesterbrücken 18, 25 – physikochemische Eigenschaften 18, 22, 48 – Polymerase 32ff, 62 – Reaktionskinetik 27f, 233f – Rearrangement 107, 166, 383ff – Reparatur 38, 43f – repetitive DNA 8, 27f, 47, 218ff – Replikation 2ff, 17ff, 103ff – Schäden 191, 193, 414f, 434ff, 664 – Schmelzpunkt 26 – Schwimmdichte 29f, 233f – Sequenzierung 5f, 90, 97ff, 440, 451f, 619, 769 – Stabilität 26 – supercoiling 22, 34 – Synthese 28ff – Transfer in Zellen 103ff, 444, 594 – zirkuläre DNA 103ff, 161ff, 214, 348, 657 dnaA-Protein 32, 35f DNase 61, 91f, 108, 119, 176, 226, 296f, 324, 604, 638 dnc (dunce) 708 Dnmt (DNA-Methyltransferase) 305, 607 DNS (Desoxyribonukleinsäure; s. DNA) 18ff, 819 (G) Dolly 444, 528, 594f, 684

835

836 836

Sachverzeichnis dominant 199ff, 456ff, 819 (G) dominant-negativ 475, 633 Dominanzreihe 505 Dopa 715, 724ff Dopamin 588, 597, 673, 708, 715, 723ff, 745 Dopamin-Rezeptor (Drd) 708, 723ff Doppelhelix 2ff, 18ff, 122ff Doppel-Rekombination 491ff Doppelstrangbruch 35, 122, 126, 366ff dorsal (bauchseitig) 528, 535, 544ff dorsal (dl) 528, 535, 544ff Dorsalisierung 556 Dosiskompensation 249ff, 645, 819 (G) Dottersack 278, 577f, 596 double minutes 361, 366, 369, 371 double-time (dbt) 699 Down-Syndrom 584, 627ff, 738 Doxycyclin 453f DPD (4,5-Dihydroxy-2,3-pentandion) 140 DPE (downstream promoter element) 289f dpp (decapentaplegic) 566, 589 dpy-1 (dumpy) 202 Drd (Dopamin-Rezeptor) 708, 723ff D-Region (s.Immunglobuline) 382ff Dreipunktkreuzung 491f Drift, genetische 272, 506ff, 635, 771 Drosha 316 Drosophila 204 – Achsendetermination 551 – Anzahl der Gene 219, 250ff, 310 – attached-X-Chromosom 494 – Chromosomen 3, 205, 217ff, 351ff – Dosiskompensation 249ff – genetische Karte 368, 489, 619 – Geschlechtsbestimmung 256ff, 609, 654 – Geschlechtschromosomen 256ff, 486 – Heterochromatin 226ff – Hybriddysgenese 330, 337ff, 350f, 391 – hydei 226, 253, 283, 300, 335 – Imaginalscheibe 566ff – Kompartimente 568 – Lampenbürstenchromosom 252f – mauritiana 335, 340, 519f – melanogaster 182, 186, 204f, 283, 301, 310, 335ff, 548ff, 819 (G) – Mutationen 196, 394ff – Paarregelgene 558ff – pseudoobscura – sechellia 519f – Segmentierung 558ff – Segmentpolaritätsgene 559ff – simulans 519f – Telomer 196, 267 – Transposon 205, 316, 328ff, 480 Drosopterine 478 DTNBP1 (Dysbindin) 728 Duchenne’sche Muskeldystrophie (DMD) 620, 649f dumpy (dpy-1) 202 dunce (dnc) 708 Duplikation 632, 641, 819 (G)

Dyadenachse 243 Dynein 169, 730 Dysbindin (DTNBP1) 728 Dysgenese 337ff, 391, 819 (G) Dystroglykan 650 Dystrophie 411, 413, 428, 437, 597, 620, 635, 645, 649ff, 819 (G) Dystrophin 649ff

E E2F (Transkriptionsfaktor) 156, 187ff, 369, 663 easter (ea) 551 Ebola-Virus 342, 680 Ecdyson 292, 566 EcoB-Nuklease 111 E. coli (s. Escherichia coli) 96ff, 286, 439ff Editieren (von RNA) 23, 72, 380 Edwards-Syndrom 627 EES (Ethylethansulfonat) 421 EF-G (Elongationsfaktor) 85ff EF-Ts (Elongationsfaktor) 85ff EF-Tu (Elongationsfaktor) 85ff EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) 547, 571, 598, 639ff, 661, 679, 735 EGFR (EGF-Rezeptor) 562, 572, 680f EGR (early growth response 1) 710, 712 Eikammer 548ff Einkorn-Weizen 403 Einzelstrang – DNA 105ff, 181f, 342f, 422, 436, 440f – RNA 46, 58, 109, 340ff Einzelstrangbruch 106, 126, 387, 437 Eizelle 544ff, 549ff, 573, 592ff Ektoderm 528, 566ff ektopisch 555, 569, 572, 590, 819 (G) Elektrophorese 18, 48f Elimination 254f, 361ff, 387, 390 Elongation 82, 85ff, 819 (G) – Elongationsfaktoren 80, 86 Embryo 529ff, 596ff, 819 (G) Embryogenese 529, 564, 566, 581, 601f, 609 Embryonalentwicklung 203f, 210, 278, 530ff – Arabidopsis 528, 530 – C. elegans 203f, 544ff – Drosophila 203f, 522ff – Säuger 577ff – Stammzelle 592, 595 – teratogene Effekte 582 – Zebrafisch 573, 576f, 584 Embryonalhäute 580 Embryonenschutzgesetz 684 Embryosack 201f Emmerweizen 403 Empfindlichkeitsgen 670, 690

EMS (Ethylmethansulfonat) 421, 423, 430 EMSA (electrophoretic mobility shift assay) 324 EMS-Zelle 544f Encephalomyelitis 501 Endocytose 641f, 683 Endomitose 819 (G) Endonuklease 819 (G) – Rekombination 356, 373, 384, 387, 441 – Reparatur 435, 437, 440f – Restriktionsenzym 111, 152 Endoplasmatisches Reticulum (ER) 158, 642 Endosperm 202, 461f, 529 , 819 (G) Endothel 596 Energiden 550 engrailed (en) 562ff Enhancer 293ff, 391f, 708, 819 (G) enhancer-trap 391f Enolform 409f, 422 Entoderm 363, 529, 573, 578, 580, 596 Entwicklung – Embryonalentwicklung 528ff, 627, 634, 643, 691, 783 – Evolution 516, 523, 565, 569, 588, 602, 752ff Entwicklungsgenetik 527ff Entwicklungsstörung 582, 731, 736, 745, 747, 779 ENU (Ethylnitrosoharnstoff) 210, 213, 420f, 423, 587, 710 envelope (env) 341f Ephrin 710, 787 Epibolie 208 Epiblast 578 Epidemiologie 345, 476, 501, 625, 667, 684 Epidermis 532f, 535, 544, 567, 570 Epigenetik 599ff, 819 (G) Epilepsie 730, 733ff, 747 Episom 97, 103, 146, 819 (G) Epistasie 478, 480, 499, 524, 574, 706, 819 (G) Epithelzelle 186, 273, 444, 586, 592, 668 Epitop 382, 672, 819 (G) Epoxid 421, 426f Equus asinus 219 Equus caballus 219 ERBA (erythroblastic leukemia viral oncogene; s. thyroid hormone receptor) 659 ERBB (avian erythroblastic leukemia viral oncogene; s. EGFR) 659, 727 Erbkrankheiten 632ff – autosomale 583, 632ff, 677 – Diagnostik 614, 677 – dominante 633, 638ff, 684f – rezessive 583, 633ff – X-gekoppelte 645 Erbse 210, 219, 456f, 752 Erdbeere 400

Sachverzeichnis Ertrag 405, 509 Erythrocyt 210, 240, 277f, 380f, 472, 474, 485, 503, 512, 598, 633f – Membran 380f – Sichelzellen 485 Escherichia coli 95ff, 286, 439ff – Anzahl der Gene 95f, 102 – Chi-Sequenz 122 – genetische Karte 97ff – Replikation 29, 35 – DNA-Polymerase 96 – RNA-Polymerase 96 – Transposon 105 Esel 219 EST (expressed sequence tag) 282,819 (G) ES-Zelle 594ff Ethidiumbromid 48, 153, 425 Ethylethansulfonat (EES) 421 Ethylguanin 423f Ethylmethansulfonat (EMS) 206, 421, 423, 430 Ethylnitrosoharnstoff (ENU) 210, 213, 420ff, 587, 710 Ethylthymin 424 Eubakterien 96, 164, 190, 332, 436 Euchromatin 205, 225f, 819 (G) Eugenik 5f, 819 (G) Eukaryoten 158, 819 (G) – DNA-Polymerase 42f, 53, 61f – Lebenszyklus 159, 197f, 201, 203, 212 – RNA-Polymerasen 62, 65 Euploidie 627 even-skipped (eve) 560 Evolution 819 (G) – Bedeutung von Rekombination 174, 356 – Chromosomen 174, 221, 402ff – Mais 402, 509 – Mensch 751ff – Mitochondrien 161, 192, 195 – Mutation 394f, 508, 516 – Polyploidisierung 400ff – RNA-Editing 73 – Theorie 5, 14 – Transposons 336, 434 – Weizen 400, 403 Exon 67ff, 272ff, 819 (G) exon shuffling 72 Exonuklease 32ff, 122, 440f expandierende Tripletts 410, 412 Expression 126ff Expressivität 477, 524, 608, 617, 638, 656 , 819 (G) Extrachromosomen 103ff – extrachromosomale DNA 5, 45, 95f, 103ff, 301 extramacrochaetae (emc) 333 Extrusion (s.Phagen) exuperantia (exu) 551ff Exzision 107, 112ff, 330, 338, 364, 390ff, 425f, 436ff, 666 Exzisionsreparatur 425, 436ff, 666

eyeless (ey) 569ff eyes absent (eya) 570ff

F F1-Generation 202, 457ff, 819 (G) F8 (Faktor VIII) 646f Fabry-Syndrom 635 Faktor VIII (s. Hämophilie) 646f Faktor IX (s. Hämophilie) 646f 9-Faktor (s. RNA-Polymerase) 62ff fakultativ 226, 260, 398 Falsifizierung 467 Familie – Beratung 675 – Stammbaum 614, 618ff, 675 Fanconi-Syndrom 583 Farbenblindheit 504 FBN1 (Fibrillin) 639 F-Duktion (s.Plasmid) 114 Felis domesticus 219 Fellfarbe 211, 482f female sterile 1pole hole, (fs(1)ph) 551 female sterile (1) Nasrat (fs(1)N) 551 FEN1 (flap endonuclease) 412 Ferritin 745 Fertilität – Chromosom 338, 519, 592, 654f – Drosophila 253, 338, 519, 645 – Mann 592, 654 – Zuchtformen 166 Fettleber 721 Fgf (Fibroblastenwachstumsfaktor) 196, 584, 589ff Fibrillarin 167f Fibrillin (FBN1) 639 Fibroin 273ff, 323 Filialgeneration 202, 457ff Fingerabdruck, genetischer 233, 676, 678 Fingerkraut 11 FISH (flurorescent in-situ hybridisation) 225, 262f , 819 (G) FITC (Fluoreszeinisothiocyanat) 236, 364, 526 Fitness 401, 475, 508ff, 694 , 819 (G) Fixierung 507f, 522, 791 fkh (forkhead) 374 Flagelle 142, 285 Flap-Endonuklease 412 Flaschenhalseffekt 516 Flemming-Körper 172 FLC (FLOWERING LOCUS C) 540, 542 flh (floating head) 576 Flores-Menschen 780 Flp-Rekombinase 197, 445, 686f FLT (FLOWERING LOCUS T) 540, 542 Flügel 205, 293, 387, 483, 489, 563, 566ff – Entwicklung 566ff

– Imaginalscheiben 566ff – zweites Paar 563 Fluktuationstest 97f, 605 Fluoreszenzfarbstoffe (s. Chromosomenfärbung) 222, 236, 269, 451 fMet-tRNA 82ff FMR1 (fragile X mental retardation 1) 652 fMRI (funktionelle Magnetresonanztomographie) 726, 788f FMS (feline sarcoma viral oncogene; s. CSF1R) 659 fng (fringe) 568 Foci (s. DNA-Replikation) 237 Folat-Operon 132f fold-back-Elemente (s. Transposon) 235 Follikelzellen 366, 370, 548ff, 626 forkhead (fkh) 195, 374, 784ff Formyl-Methionin 82f Fortpflanzungsgemeinschaft 502, 761 fos (FBJ murine osteosarcoma viral oncogene) 659 Fötus 278, 592, 819 (G) FOX-Gene (forkhead-Box) – FoxC1 587 – FoxD1 787 – FoxE3 587 – FoxG1 787 – FoxO3a 194f – FoxP2 784ff F-Plasmid 103ff fragiles X-Chromosom (FMR1, FRAXA) 411 Fragment (s.Chromosomen) – azentrisches 407, 631 – dizentrisches 407, 631 frameshift (s.Mutation) 425 Frataxin 411 Freiheitsgrad 468f Fremdaddition 404 Fremdbefruchtung 402 Fremdsubstitution 164, 215, 405, 514 Friedreich’sche Ataxie 411 fringe (fng) 568 frizzled (fzd) 545, 591 Frosch 219, 241, 297, 573, 596, 601 fru (fruitless) 691 Fruchtblätter 537f Fruchtfliege 219, 394, 707, 721 Fruchtknoten 463, 538f Fruchtkörper 494 Fruchtwasseruntersuchung 676 frühe Gene 548ff Frühentwicklung 40f, 255, 363, 553, 578, 609, 628 fruitless (fru) 691 fs(1)N (female sterile (1) Nasrat) 551 fs(1)ph, (female sterile 1) 551 ftz (fushi tarazu) 295, 560, 563 Fucosyltransferase (D1,2-F.) 448 FUGATO 446

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Sachverzeichnis Fugu 7f, 205 Fungizid 431 Funktionsverlust (loss of function) 443, 735 Furchungsteilung 544f fushi tarazu (ftz) 295, 560, 563 Fusion 150, 397f, 631 – Chromosomenaberrationen 397f, 631f – Telomere 229, 398f – Proteine 150, 165, 229, 279, 366 – zentrische 221, 253, 631f Fyn (Onkogen) 723 fzd (frizzled) 545, 591

G G1-Phase 38ff, 168ff, 302, 372, 385, 663f G2-Phase 38ff, 168ff G6PD (Glucose-6-phosphatDehydrogenase) 756 GABA (J-Aminobuttersäure) 718f, 735 gad (gracile axonal dystrophy) 745 gag (group-specific antigens) 342 gain-of-function-Mutation 475, 735 GAL4/UAS-System 151 Galactocerebrosid 635 Galactose 127, 131, 472 E-Galactosidase (E-Gal) 148, 150 Gallus domesticus 219 gal-Operon 113, 128ff gal-Repressor 145 Gameten 156, 159, 172f, 201f, 255f, 262, 395, 400ff, 456ff, 819 (G) Gametogenese 529 Gametophyt 529 gamma-Strahlung 416, 418, 421 Ganglienzelle 576f, 586, 658, 696, 786f Gangliosid 634f Gap-Gene 560ff Gartenrotschwanz 692f Gastrin 718 Gastrula 308, 557, 820 (G) Gastrulation 191, 208, 544, 551, 573ff gastrulation defective (gd) 551 Gaucher-Krankheit 635 G-Banden (s. Chromosomenfärbung) 222, 237f, 250, 269, 366 GC-Box 269, 291 GCK (Glucokinase) 673 gd (gastrulation defective) 551 Gedächtnis 704ff Gedächtniszelle 381, 387 Gehirn 579ff, 635ff, 691ff, 777ff Gelbrandkäfer 301 Gelelektrophorese 48f Gen(e) 820 (G) – Abstände 99ff, 116, 491ff – aktives 306, 473 – Amplifikation 101, 273f, 300ff, 364ff

– Anzahl 7ff, 103ff, 300ff, 486ff – Begriff 8 – Cis-trans-Test 128ff – Duplikation 272ff – eukaryotische 7ff, 27ff, 101ff, 196ff, 217ff – Expression 126ff, 685 – Familien 210f, 279ff, 310f, 323 – frühe 548ff – Funktion 279, 552f – homöotische 538ff, 563ff, 609 – Karte 99, 112, 222, 491, 497, 618 – Konversion 183ff, 372ff, 385ff – maternale 521ff, 545, 549ff – mitochondriale 58ff, 163ff, 655ff, 733f, 763, 765ff – Mutation 394ff – prokaryotische 7, 96ff – Regulation 126ff – überlappende 119, 146, 212 Gendiagnostik-Gesetz 678 Generation 29ff, 199ff, 412f, 433ff, 456ff, 820 (G) Generationszeit 97, 191, 199, 204f, 214, 346, 433, 769 Genetik 820 (G) – Geschichte 2ff genetische Prägung 599ff genetische Drift 272, 506ff, 518, 524, 635, 771, 820 (G) genetischer Code 820 (G) – Abweichungen 58, 165 – Colinearität 58 – Degeneration 82 – Entschlüsselung 56 – Mitochondrien 58, 86, 165 genetischer Hintergrund 212, 628, 643, 701, 820 (G) Genexpression 126ff, 289ff Genkonversion 176, 180, 183ff, 372ff, 820 (G) Genom 820 (G) – Anzahl von Genen 7f, 103, 310 – Arabidopsis 199f – Bakterien 2ff, 96ff – Bakteriophage 109ff – C. elegans 203f – Drosophila 58, 204ff, 300ff – Forschung 2, 204, 206, 355, 481, 483, 615, 680, 691, 756 – Fugu 7f, 205 – Huhn 283 – Maus 210ff – Mensch 2ff, 205, 619ff, 752ff – mitochondriales 656, 758, 767 – Mutation 396 – prokaryotisches 95ff – Ratte 8, 219, 282ff genomische Prägung 602ff, 820 (G) Genotyp 10ff, 121ff, 444ff, 820 (G) Genpool 5, 456, 502ff, 820 (G) Gentechnologie 112, 152, 337, 675 Gentechnik-Gesetz 5f, 820 (G)

gentechnisch veränderte Organismen (GVOs) 149 Gentherapie 334, 340, 599, 649, 651, 681ff Gentransfer 101, 118, 120, 137, 453, 682, 820 (G) Germarium 548 Gerste 219, 349, 404 Geschlechtsbestimmung – Drosophila 256ff – Keimbahn 593 – Mensch 256, 654 Geschlechtschromatin 260 Geschlechtschromosom 820 (G) – Aberrationen 630 – Aneuploidie 627ff – Dosiskompensation 257ff – Erbgang 157, 256, 486f, 638 geschlechtsgekoppelte – Merkmale 486ff, 618, 653 – Vererbung 486ff Geschlechtszellen 159, 172f, 466, 607 Geschwisterpaar-Analyse 616ff Gesichtserkennung 789ff Getreide 402 GFP (grün fluoreszierendes Protein) 445, 576, 748 giant (gt) 559, 561f Giardina bodies 301 Giemsa-Färbung 222, 224, 269, 430, 490 gir (giraffe) 573 gl (glossy) 491f GLABRA1 (GL1) 535 Gleichgewichtszentrifugation 30 Gli3 (GLI-Krüppel family member) 591 Gliazellen 586, 596, 719, 746 Gliedmaßen 588ff Globin 277ff – Genfamilie 277ff, 756 – Genstruktur 279 – Evolution 279ff – Locus-Kontroll-Region 280, 296ff – Mensch 277ff, 434, 485 – Mutation 634 – Regulation 277ff – Struktureigenschaften 281, 434 – Transkription 277ff Glossina palpalis 377 glossy (gl) 491f GLP-1 (germline proliferation defective) 545 Glucocerebrosid 635 Glucocorticoid-Response-Element 292 Glucocorticoid-Rezeptor 292 Glucokinase (GCK) 673 Glucose – Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PD) 756 – Stoffwechsel 127, 131 Glutamat-Rezeptor (Grin) 76, 644, 709f, 730, 736 Glutamin 55

Sachverzeichnis Glutaminsäure 55 Glutathion 60 Glycin 55 Glykoprotein 341, 377, 472f, 569 Glykosidgruppen 473 Glykosylase 387ff, 437f GNOM (GN) 530 Goldberg-Hogness-Box 65, 820 (G) Goldhamster 219 Golgi-Apparat 156, 158 Gonade 338, 547f, 593 Gonocyt 590, 820 (G) Gorilla 219, 753, 756, 783f G-Protein 195, 372, 530, 660, 712ff GRA (gel retardation assay) 324 Grauer Star 287, 497 GRE (glucocorticoid response element) 292 Grille 521 Grin (glutamate receptor, ionotropic) 710, 723 Griseofulvin 431 Größenwachstum 11 groucho (gro) 558 Grp (gastrin releasing peptide) 718 Grünalgen 59 Gründereffekt 456, 511, 515ff grün fluoreszierendes Protein (GFP) 445, 576, 748 gt (giant) 559, 561f GTPase 86f, 165, 659, 661, 713f Guanin 18ff Guanosintriphosphat 80, 82 Guppy 521 Guthrie-Test 636 GVO (gentechnisch veränderter Organismus) 149 gypsy 238f, 329, 335, 349 Gyrase 32, 36, 38

H H (hairless) 571 h (hairy) 560f H19 604, 684 Haarnadelschleife 133, 319, 325, 332 hairless (H) 571 hairy (h) 560 Halbtetraden 174 hämatopoietische Zellen 381, 596ff, 820 (G) Hämoglobin 277ff – Genfamilie 277ff, 756 – Genstruktur 279 – Evolution 279ff – Locus-Kontroll-Region 280, 296ff – Mensch 277ff, 434, 485 – Mutation 634 – Regulation 277ff – Struktureigenschaften 281, 434 – Transkription 277ff

Hämolyse 513 Hämophilie 406, 428, 433, 474, 632, 640, 645ff Haemophilus influenzae 102, 272 Halothan 448 Haltere 563, 566f Hamster 186, 219, 231, 430, 433, 476, 702, 704 Haploid 172ff, 251, 254, 256f, 371ff, 396ff, 466ff, 820 (G) Haploinsuffizienz 232, 412, 474, 633, 820 (G) Haplophase 198, 201 Haplotyp 373, 497ff, 617, 620, 624, 667, 672, 727, 761ff, 820 (G) Hap-Map-Konsortium 518, 775 HAR1 (human accelerated region) 782 Hardy-Weinberg-Regel/Gesetz 3, 6, 502ff HAT (Histon-Acetyltransferase) 258 Hausfliege 219 Haushaltsgen 237, 240, 654, 820 (G) Hausrotschwanz 692f Hautkrebs 634, 664f Häutung 204, 547 hb (hunchback) 556, 559ff HD (Chorea Huntington) 411f, 642ff hedgehog (hh) 562ff Hefe 41ff, 196ff Helicobacter pylori 102, 137 D-Helix 60, 145f, 277, 820 (G) Helikase 32ff, 177ff Helix-Loop-Helix-Motiv (HLH) 145f Helix-Turn-Helix-Motiv 145, 292ff hemizygot 256f, 644f, 820 (G) Hensen’s node (s. Primitivknoten) 578 Hepatitis 342, 668, 670, 679 Herbizid-Resistenz 109, 444 Herbstzeitlose 269 Hermaphrodit 191, 202f, 257f, 507f, 547 Herpes-simplex-Virus (HSV) 215, 342, 454 Herzfrequenz 715 Herz-Kreislauf-Erkrankungen 194, 476, 597, 616, 683 Herzmuskel 447, 656 Herzstadium 529ff HeT-A-Sequenzfamilie Heterochromatin 820 (G) – Centromer 227f, 238 – Cyclops 364 – Drosophila 226ff, 238 – Elimination 364 – fakultatives 226, 260 – Geschlechtschromatin 260 – konstitutives 226 – Positionseffekt 226 – Polytänisierung 364 – repetitive DNA 230 – Sammelchromosom 363f – Telomer 226ff – väterliche Chromosomen 264, 266 Heteroduplex 26, 47, 184f

heterogametisch 256f, 489, 519, 522, 630, 820 (G) heteromorph 222, 256 Heteroplasmie 655 heteropyknotisch 820 (G) Heterosis 400f, 460, 483ff, 634, 638, 820 (G) Heterosom 256, 820 (G) heterothallisch 199, 373, 820 (G) heterozygot 456, 821 (G) – Nachteil von Heterozygoten 512ff – Vorteil von Heterozygoten 512f Heuschnupfen 667 Hexosaminidase 634f Hfr-Stamm (high frequency of recombination) 107, 114 hh (hedgehog) 562ff hinge-Region (s. Immunglobuline) 382f Hippocampus 691ff, 790 Hiroshima (Strahlungseffekte) 418f his-Gen 427ff Histamin 386 Histidin 55 Histokompatibilitätsantigen 380 Histon 821 (G) – Acetylierung 218ff – Acetyltransferase (HAT) 258 – ADP-Ribosylierung 243, 245, 284 – Code 247ff – Core-Histon 241 – Dimerisierung 243 – Eigenschaften 226, 241ff – Falte 243 – Funktion 243ff – Gene 67, 218ff, 283ff – H1 220, 239, 241, 245ff – H2A 220, 241ff, 283f, 439 – H2B 220, 241ff, 283f, 389, 439 – H3 220, 226ff, 283ff, 540, 542, 729 – H4 220, 239, 241f, 247ff, 258, 283ff, 542 – Methylierung 230, 243ff, 283ff , 602, 608, 729 – Modifikationen 243ff, 283f, 438f, 602f, 703 – Phosphorylierung 243ff, 602 – Ubiquitinierung 243, 245, 284 – Varianten 438 Hitzeschock 290, 510, 706 HIV (Humanes ImmundefizienzVirus) 243, 328, 341ff, 345ff, 648, 679ff, 756 H-Kette (s.Immunglobuline) 382ff hkb (huckebein) 559, 561 HLA (humanes Leukocytenantigen) 210, 672, 681 HLH (s.Helix-Loop-Helix-Motiv) 145f HMG-CoA-Reduktase 640 HMG-Protein (high mobility group) 640, 674 HML (s. Paarungstypwechsel) 372ff HMR (s.Paarungstypwechsel) 372ff HO (homothallisch) 373

839

840 840

Sachverzeichnis Hochblätter 538 hochrepetitive DNA 233ff, 267, 620 holandrisch 821 (G) holistisch 548, 821 (G) Holliday-Modell 125, 179ff holokinetisches Chromosom 363, 398, 821 (G) Hominide 754, 780, 821 (G) Homo – antecessor 757, 766 – erectus 757, 760f, 771 – ergaster 757 – floresiensis 757, 771 – georgicus 757 – habilis 757 – heidelbergensis 757, 766 – neanderthalensis 757 – rhodesiensis 757 – sapiens 757f, 771, 791 homogametisch 256f, 821 (G) Homologenpaarung 177, 409 homologe Gene 375, 570, 665, 821 (G) Homöobox 293, 564ff, 821 (G) Homöodomäne 293, 564f homöolog 401 homöotisch 538ff, 821 (G) homoplastisch 655 Homoserinlacton 140 homothallisch (HO) 373, 821 (G) homozygot 195ff, 821 (G) Honigbiene 219, 447 Hordeum 219, 404 horizontale Ausbreitung 120, 349 Hornhaut 477, 585ff HOTHEAD (HTH) 472 Hox-Cluster 565, 579 Hox-Gene 434, 563ff HPRT (Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase) 215, 710, 759 H-ras (s. Onkogene; s. RAS) 659, 661 HSV (Herpes-simplex-Virus) 215, 342, 454 HTH (HOTHEAD) 472 5-HT (5-Hydroxytryptophan) 715 5-HTR1b (5-HT-Rezeptor; Htr1b) 723 5-HTT (5-HT Transporter) 716ff huckebein (hkb) 559ff Hüllprotein – Phagen 58 – Retroviren 348 Huhn 283, 526, 659 Humanes Leukocytenantigen (HLA) 210, 672, 681 Humangenomprojekt 5ff, 272 Humangenetik 6, 614ff hunchback (hb) 556ff Hund 219 Huntingtin 411, 413, 642ff Hyacinthus romanus 30 Hyazinthe 31 Hybrid 403, 460, 821 (G) Hybriddysgenese 330, 337ff

Hybridisierung 26, 48, 91, 94, 175, 224f, 236, 253, 262, 269, 334, 391, 399, 404, 560, 610, 685, 754 Hydroxylamin 421, 424 Hydroxylaminocytosin 424 5-Hydroxytryptophan (5-HT) 715 hyperacetyliert 263, 305, 732 Hyperaktivität 258f, 652, 710 Hypercholesterinämie 518, 640ff hypermorph 474f, 633 Hypermutation 385ff Hyperploidie 627 Hypersomnie 703 Hyperthermiesyndrom 447 Hypertonie 658 hypervariabel 383, 677, 768 hypomorph 474, 633, 727, 821 (G) Hypoacetylierung 265 Hypokotyl 530ff Hypophyse 530ff, 724 Hypoploidie 627 Hypothalamus 691ff Hypothese 8ff, 13, 53ff, 821 (G) Hypoxanthin 215, 424, 710 Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT) 710

I IAP (intracisternal A-particle) 192f, 329, 607f IC (imprinting center) 604 Idiotyp 386 I-Faktor 350ff Ig (Immunglobulin) 382ff IgA 385f IgD 385ff IgE 385ff, 667ff Igf (insulin-like growth factor) 194f, 447, 601ff Igf2r (insulin-like growth factor 2 receptor) 601ff IgG 383ff, 526 IgM 385ff IHF (integration host factor) 332f Ihh (Indian hedgehog) 590f Imaginalscheiben 566ff Imago 566f Iminoform 409f, 422 Immunabwehr 370, 380ff, 514f, 756, 777 Immunglobulin 821 (G) – Antikörperklassen 386 – Gene 382ff – H-Kette 382ff – L-Kette 382ff – Spleißen 386 – Struktur 382ff – Transkription 385, 387 – V-D-J-Rearrangement 382ff Immunologie 213, 526 immunologische Nachweismethoden 526

Immunreaktion 380f, 526 Immunsystem 376ff, 474, 514, 628 Impfung 317, 381 Imprinting (s. genetische Prägung) 605ff, 821 (G) iN (induzierte neuronale Stammzelle) 598 Inaktivierung des X-Chromosoms 229, 248, 257, 261ff, 395, 604, 630, 645, 653 Indian hedgehog (Ihh) 590f Induktion – Entwicklungsgenetik 529ff – IPTG 128f, 148 – Induktor 96, 129, 139, 146, 821 (G) Industriemelanismus 511 Indy (I’am not death yet) 195f Information – positionelle 552, 556, 558 – Übertragung 52ff Ingi-Element (s. Trypanosoma; s. Transposon) 329, 335, 378 Initiation 821 (G) – Codon 82ff – Komplex 35ff, 291ff – Transkription 61ff, 133ff – Translation 66, 82ff, Initiationsfaktor 82ff, 320 Initiator 41, 290ff Inkompatibilität 513, 519 innere Uhr 542, 690, 697, 700 innere Zellmasse (s. Morula) 578, 596 Inosin 73, 75 Inositoltriphosphat 187 Insertion – Element 330, 336, 338, 349, 352f – Mechanismus 330, 332, 338, 349, 361, 608 – Retrovirus 345 in-situ-Hybridisierung 94, 610 Insomnie 703 Instabilität – chemische 61, 394 – genetische Loci – mitotische 361 – Transposon 328ff Insulator 237ff, 291ff, 565, 604 Insulin 671f – Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 194 – Insulin-ähnlicher-WachstumsfaktorRezeptor 194 – rekombinantes Insulin 679f – Resistenz 194, 671, 679f Integrase 113, 243, 336, 345, 348, 350, 355 Integration – Plasmid 105ff, 332 – O-Phage 112 – Retrovirus 343 – Transposon 235, 332ff Interbanden 238, 249ff Interferenz 229, 313ff, 493, 622, 821 (G)

Sachverzeichnis Interferon 75, 239, 313, 679 Intergenregionen 164 interkalierende Agenzien 420, 425, 821 (G) Interleukinrezeptor 668, 682 Intermediärfilamente 159 Interphase 168, 821 (G) – Chromosomen 166ff, 220, 224ff – Riesenchromosomen 250f – Zellkern 156, 166ff, 220, 236, 245, 365 IPTG (Isopropyl-EDThiogalactopyranosid) 127ff Intron 68, 821 (G) – Funktion 72ff, 351ff – Grenze 72ff – Lariat 72 Inversion 821 (G) – heterozygote 251, 390, 406f – parazentrisch 398, 406 – perizentrisch 398, 407 – Riesenchromosom 251 in-vitro 821 (G) in-vivo 821 (G) Ionenkanäle 695, 733, 735, 747 ionisierende Strahlung 414, 416 iPS (induzierte pluripotente Stammzelle) 598f I-R-Hybriddysgenesesystem 351 IS-Element 105, 330 Isoakzeptor-tRNA 82 Isolation 514ff, 761ff Isoleucin 55 Isopropylthiogalactosid (IPTG) 127f Isotyp 386

J Jahresperiodizität 692 jet (jetlag) 700 J-Region (s. Immunglobuline) 382ff JUN (s. Onkogene; s. AP1) 659

K Kaffeesäure 429 kai (kaiten) 699 Kainat-Rezeptor 736 Kaliumkanal (Kcnj6) 745 Kaninchen 219, 280, 473, 526 Karpelle 537ff Kartierung 486ff – Bakterien 97f – Chromosomenbänderung 222, 224 – Funktion 491ff – Intervall-Kartierung 500f – Rekombinationshäufigkeit 491ff, 525, 622, 624 – Riesenchromosomen 250ff – Tetradenanalyse 198, 494f

Kartoffel 219, 342, 400, 444 Karyogamie 821 (G) Karyoplasma 158ff, 821 (G) Karyotyp 222, 254, 821 (G) Katarakt 185, 287, 353, 498, 586ff Katze 219, 260, 433, 659 Kaulquappe 298, 308, 594 Kcnj6 (Kaliumkanal) 745 Keimbahn 821 (G) – Chromosomenelimination 255 – Determinanten 550ff – Gentherapie 682 – männliche 166, 173, 254f, 338, 351, 413, 472, 590ff – Mosaik 395, 608, 686 – Mutation 395ff – Ontogenese 395 – weibliche 166, 252, 254, 351, 413, 548, 592ff Keimbläschen 463 Keimblatt 442f, 528ff Keimling 159, 201, 529ff Keimplasma 157 Keimscheibe 208, 573 Keimstreifen 590 Keimzellen 159ff – Chromosomenzahl 172 – Drosophila 548ff – Entwicklung 156, 159, 592, 606ff – primordiale Keratin 159, 273 Kerndualismus (s. Ciliaten) 390 Kern-Lokalisationssignal 652 Kernmatrix 167, 239 Kernmembran 158ff – Telomer-Anheftung 229 – Meiose 172ff Kernporen 166f, 172, 237, 239f Kernproteine 659 Kernskelett 159, 167, 172, 214, 239 Kernteilung 40f, 550f, 559 Kerntransplantation 593ff Ketoform 409f, 422 Kettenabbruch 451f, 781 Kettenverlängerung 85 Killer-T-Zellen 380 Kinetochor 169ff, 218ff, 821 (G) Ki-ras (s. Onkogene) 659 Kit-Rezeptor 448, 574 kl (klotho) 195f Klammerlader 32, 37, 42 Klassenwechsel 383ff Kleinhirn 611, 691, 725, 735 Klenow-Enzym 38, 91 Klf4 (Transkriptionsfaktor) 599 Klinefelter-Syndrom 627, 630 Kloakentier 601f Klon 684, 821 (G) klonale Selektion 380 Klonierung (DNA) 147f klotho (kl) 195f kn1 (knotted-1) 537

KNAT1 (KN1-like in Arabidopsis thaliana) 535ff knirps (kni) 559ff Knochenmark – Stammzellen 278, 380f, 598f – Immunsystem 380f Knock-out-Mäuse 193, 213, 262, 313, 585, 589, 672, 686, 702, 709ff, 821 (G) Knollenblätterpilz 65 Knospung 197, 578 knotted-1 (kn1) 537 KNOX 200, 535ff Kohl 219, 402 Koinzidenz-Koeffizient 493, 821 (G) Koinzidenzmodell 540 Kokain 715, 720, 724f Kokon 252, 273 Kompartiment 821 (G) – Flügel 566ff – Grenze 237f, 565ff – Kern 158, 161, 166, 218, 236ff, 565, 716 Komplementation 107, 202, 442, 665f, 699, 822 (G) Komplementsystem 383 Komplexauge 478, 480, 569, 572, 583 komplexe Krankheiten 613f, 624f, 658, 674, 685, 690, 713f, 730 Komplexe, synaptonemale 176f Kondensation 169, 174f, 194, 218, 250, 306, 318, 323, 406 konditionale Mutagenese 445, 822 (G) Konditionierung 704ff Konjugation 822 (G) – Bakterien 103, 118, 121 – Ciliaten 357f Konkordanz 616, 667, 672, 733, 822 (G) konstante Region (s. Immunglobuline) 383ff konstitutive Expression 128ff, 822 (G) Konstriktion – primäre 224, 228 – SAT-Chromosom 225 – sekundäre 167, 224f, 300 Kontrollgene 474, 477 Kontrollpunkte 156, 185, 189, 193 Kopplung 822 (G) – Kartierung 486ff, 622ff – Rekombination 486ff, 622ff Kopplungsgruppe 98, 210, 402, 489, 493, 631 Kopplungsungleichgewicht 514, 517, 769 Körnerfarbe (s. Weizen) 481 Korrektur – Rekombination 177ff , 408f – Replikation 179, 185, 408f, 683 Korsakow-Syndrom 721 KpnI-Familie (s. Transposon) 234, 351 Krabbe-Syndrom 635 Krallenfrosch 219, 297, 596 Krebs (s. Tumorbildung) 664

841

842 842

Sachverzeichnis Kreuzung – reziproke 159, 337ff, 457, 460, 466, 486ff – Schema 457ff Kriminalistik 676 Kristalline 274, 276, 287, 289, 586, 588 Krüppel (Kr) 559ff Kugelstadium 208, 530 Kulturpflanzen – Hybride 402 – Polyploidie 400, 402 – Selektion 509 – Zucht 400ff Kurzzeitgedächtnis 704ff Kynurenin 478 Kynurenin-3-Hydroxylase 478

L L1-Element (s. Transposon) 205, 351ff labial (lab) 564 Labium 567 lacA-Gen (Transacetylase) 128, 131 Lachssperma 19, 241 lacI-Gen (Inhibitor) 130f lac-Operon 97, 128ff Lactococcus lactis 102 Lactose 127ff Lactosylceramid 635 lacY-Gen (Permease) 128, 130f lacZ-Gen (E-Galactosidase) 128, 131, 148, 150, 392 lagging strand (s.Replikation) 230 O (s. Phage) 112, 143 O-Repressor 96, 143ff Lamin 176 Lampenbürstenchromosom – Drosophila 253 – RNA-Synthese 253 – Chromosomere 252f – Schema 252 – Y-chromosomale 253 Längsachse 52, 532, 535, 557, 560f, 609 Langzeitgedächtnis 704ff Lariat 72 Larve 86, 203ff, 253, 273, 349, 444, 544, 546ff laterale Inhibition 535, 547 L-Chromosomen 146, 253ff LCR (locus control region) 296 LDL (low density lipoprotein) 617, 640 Leader-Sequenz 83, 132, 138, 310 leading-Strang 33ff, 99, 230 Leber’sche Opticusneuropathie 656f Leberzirrhose 721 Leghämoglobin 281 Legionella pneumophilia 102 leichte Kette (s. Immunglobulin) 382ff Leitgewebe 532 Lemur 602

Lentiviren 341, 682f, 756 Leptospira interrogans 102 Leptotän 174, 822 (G) Lernen 704ff Leserasterverschiebung 291, 421, 425 Leseschwäche 786 letal 390, 405, 407, 627ff, 822 (G) Letalfaktor 390 Letalmutation 338ff Leucin 55 Leucin-Zipper 292ff, 559, 702, 785 Leukämie – Hühner 340 – Retrovirus 340, 659 – strahlungsinduziert 418ff – Translokation 660 Leukocyten 598, 672, 681 Lewy-Körperchen 743, 745f lexA 439 Leydig-Zellen 593 Li-Fraumeni-Syndrom 662, 664 Ligand 140f, 193, 372, 448, 546, 557f, 568, 570, 710, 822 (G) limbisches System 715, 735 limitierte Chromosomen 253f, 361, 369 LINEs (long interspersed nuclear elements; s. Transposon) 234f, 341, 336, 350f, 444, 620, 822 (G) Linie, reine 212, 457ff Linsenauge 569, 588 Linsenplakode 586 Lipoprotein 76, 617, 640ff, 739 Listeria monocytogenes 102 O-Ketten 383, 386 L-Kette (s. Immunglobuline) 382f, 483 Lmx1 (LIM homeobox transcription factor 1) 591 Locus 296ff, 411, 822 (G) Locus-Kontroll-Region 296ff, 385 LOD-Score (logarithm of the odds) 500, 623, 822 (G) loxP 114f, 213, 445, 686f Löwenmäulchen 199, 219 LTR (long terminal repeat; s. Retroviren; s. Transposon) 335ff, 608 – Entstehung 343 – Primerbindungsstelle 342f – Promotoraktivität 343 – Retrovirus 342f Luciferase 140f, 698f Luciferase-Operon (lux) 140f Lungenemphysem 448 Lungenkrebs 659, 680 Lupus erythematosus 72, 389 lux (Luciferase-Operon) 140 Lycopersicum esculentum 219 Lymphocyt 380ff Lyon-Hypothese 210, 260, 264, 822 (G) Lysandra atlantica 219 Lyse 111ff, 822 (G) Lysin 55

lysogener Zyklus (s. Bakteriophage) 112, 822 (G) Lysozym 239 lytischer Zyklus (s. Bakteriophage) 111, 114, 822 (G)

M M13 (s. Bakteriophage) 111 Macaca mulatta 219 Machado-Joseph-Erkrankung (MUD; = SCA3) 412 MADS-Box 538ff Maf (Transkriptionsfaktor) 297 Magnetsinn 659f mago nashi (mago) 551 Mais 199ff, 219, 444 – Dreipunktkreuzung 491f – Kartierung 491ff – Polyploidie 402 – Transposon 328ff – Varietäten 200 Makake 753, 756, 779f, 788 Makronukleus 298, 301, 357ff, 390, 822 (G) Makrophage 383, 672 Makrosporen 201, 822 (G) Malaria 512f, 634, 756 male specific lethal (msl) 258 maleless (mle) 258 males-absent-on-the-first (mof) 258 male-specific-lethal 3 (msl3) 258 Mandelkern 715 MAO (Monoamin-Oxidase) 759 MAPK (Mitogen-aktivierte Proteinkinase) 661, 707, 712, 714 MAR (matrix attachment region) 239 MARE (Maf recognition element) 297 Marfan-Syndrom 638f Mariner 335, 340 Marker 489ff, 822 (G) Marsupialia 225, 227 Martin-Bell-Syndrom 652 Mastzellwachstumsfaktor (MGF) 448 maternale Effekte 552, 822 (G) maternale Gene 545ff maternales Imprinting (genetische Prägung) 477 MAT-Locus (s. Hefe; s. Paarungstyp) 372ff matrilineare Vererbung 655 matrokline Vererbung 160, 164 Maturase 356 Maus 210ff – Chimäre 446, 596, 659 – Genom 211ff – Imprinting 601f – Modellorganismus 207, 416, 446, 525 – Mosaike 445, 608, 686 – transgene 6, 210, 213, 325, 444ff

Sachverzeichnis – X-Inaktivierung 229, 257, 262ff, 445, 604 Maxam-Gilbert-Methode 5, 451, 619 MCM (minichromosome maintenance complex) 32, 41ff, 369, 374, 538 MCPH1 (Mikrocephalin) 769ff M-Cytotyp 338f MECP2 (Methyl-CpG-bindendes Protein) 731ff, 747 Medulla oblongata 715 Meerschweinchen 219 Megaspore 201 Mehrfaktorenkreuzung 466 Meiocyten 174f, 487f Meiose 172ff, 822 (G) – Abweichungen 172f, 183 – Chromatidentrennung 189 – Chromosomenverteilung 172ff, 397 – Homologentrennung 172ff, 486 – Nondisjunction 227, 487ff – Paarung von Autotetraploiden 400f – Segregation 172, 183ff, 400, 601 Melanin 634 melanogaster 204f, 548ff Melanom 662 MELAS-Syndrom 656 Membranproteine 108, 738 memory-Zellen 381 Mendel’sche Regel 456ff – Dihybride Kreuzung 463, 466 – Erweiterungen 466 – Punnett-Viereck 457, 459, 466, 486f, 502 – Statistik 466 – Wiederentdeckung 3, 157, 218, 481, 502 Mensch 752ff – Chromosomen 174, 211f, 219ff – Embryonalentwicklung 577ff, 783 – Evolution 752ff – Genom 2ff, 40, 245 – Genpool 5, 514, 516, 765, 768, 769 – Lebenszyklus 165, 212, 377, 577 Menschenwürde 596, 684 mentale Retardation 584, 628ff Meristem 200, 529ff, 822 (G) Merkmal, genetisches 573 – Abgrenzbarkeit 573 – Expressivität 573 – Penetranz 573 merodiploid 114, 127, 822 (G) meroistisch 548, 822 (G) MERRF-Syndrom 656, 734 Mesenchym 586ff Mesocricetus aureatus 219 Mesoderm 544ff Mesothorax 563 Metalloprotease 667f Metamorphose 204, 478, 563, 566 Metaphase 169ff, 220f, 269 Metathorax 563 Metazentrisch 220f, 822 (G) Methionin 55

Methotrexat 369, 371 methuselah (mth) 195 Methyladenosin (m1A) 70 Methylase 266, 436, 604, 607 Methylcytidin (m3C) 311 Methylcytosin 409ff Methylguanosin (m1G) 66, 70, 81, 311 Methylguanosin (O6G) 424 Methylierung – Abwehrmechanismus 111 – DNA 111, 114, 243ff, 602ff – Epigenetik 601ff – fragiles X-Syndrom 653 - Histon 229ff, 239f, 243, 245, 247f, 264f, 284, 310, 318, 540, 602, 608, 729 – Replikation 111, 114, 229ff, 604, 607 – X-Inaktivierung 264, 604, 606 Methylinosin (m1I) 311 Methylmethansulfonat (MMS) 421, 423 Methyltransferase 424 Met-tRNA 84 MEX-3 (muscle in excess) 545 MGF (Mastzellwachstumsfaktor) 448 MHC (major histocompatibility complex) 384, 672 Micropia 335 Migration 514ff, 524, 692, 761, 822 (G) Mikroarray 90, 708, 749 Mikrocephalie 779ff Mikrocephalin (MCPH1) 770f Mikrofibrillen 158, 549, 640 Mikronukleus 357ff, 390, 822 (G) Mikrophthalmie 476, 586ff Mikrosatelliten 233, 494ff, 620, 622, 624, 675f, 772 Mikrosomen 428f Mikrosporen 201, 822 (G) Mikrotubuli 104, 155, 158, 285, 737 Milch 448, 453, 595 Miller-Spreitung 271 Minichromosom 365 Minimalmedium 98, 131, 429 Mirabilis jalapa 160, 471 miRNA (microRNA) 316ff, 320, 323, 540, 565 mismatch-Reparatur 43, 388, 436 Missbildungen 533, 583, 587f missense-Mutation 396f Mitf (microphthalmia-associated transcription factor) 476f, 587 Mithramycin 222, 269 Mitochondrium 163ff, 655ff, 822 (G) – genetischer Code 163ff – Genom 163f, 655, 752, 771 Mitogene 187 Mitomycin 430 Mitose 168, 822 (G) – Chromatidencohesion 171, 189 – Chromatidentrennung 169ff, 251, 369 – Hemmung 167 – Kontrollpunkte 185 – monozentrische 254

– Nondisjunction 277, 399, 489 – postmeiotische 167ff – Rekombination 156, 175, 183, 185, 214 Mitteldarm 377 mle (maleless) 258 MMS (Methylmethansulfonat) 421, 423 MMTV (mouse mammary tumor virus) 210 MNNG (N-Methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidin) 421 Mobile Elemente 105, 316f, 328, 330, 356, 390 Modifikation 822 (G) – posttranskriptionell 310 – posttranslational 246f, 285, 323, 565, 642, 661, 748 MODY (maturity onset diabetes of the young) 671 mof (males-absent-on-the-first) 258 mom (more mesoderm) 545 Monoamin-Oxidase (MAO) 716, 759 Mönchsgrasmücke 689, 692ff Mongolismus 628 monohybride Kreuzung 459, 462ff MONOPTEROS (MP) 531 Monosomie 627ff, 684, 822 (G) monözisch 457, 822 (G) Morgan-Einheit (cM) 489 Morphogen 528f, 552ff, 822 (G) Morphogenese 529, 536 morphogenetische Furche 570ff Morpholinos 210, 573, 611 Morula 265, 577f, 596 Mosaik 218, 347 MP (MONOPTEROS) 531 M-Phase 38, 40, 92, 168ff mRNA 52ff, 822 (G) msl (male specific lethal) 258 msl3 (male-specific-lethal 3) 258 Msx2 (msh homeo box homolog 2) 587 mth (methuselah) 195 Mücke 219 MUD (Machado-Joseph-Erkrankung; = SCA3) 412 Mukoviszidose 636ff, 676 Müller’sche Gänge 593 multifaktorielle Vererbung 471 Multigenfamilien 277ff – Evolution 279ff – Globin-Gene 277ff – Hox-Gene 434, 559, 565f – Kristallin-Gene 287ff – Pax-Gene 569 – Tubulin-Gene 285f – VSGs (variable surface glycoproteins) 377 multiple Allelie 474ff Multiple Sklerose 389, 501, 725 multipotent 528, 598 Multiproteinkomplex 189, 193, 258f Mumps 77 Musa sapientum 400

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Sachverzeichnis Mus domesticus 351, 366 Mus musculus 156, 210f, 219, 335, 366, 428, 497 Musca domestica 219 Muskeldystrophie – Becker 649ff – Duchenne (DMD) 620, 649f – Gen 428, 620, 645, 649ff Muskelmyosin 272 Muskelzellen 273, 595ff, 651, 668 Musterbildung 528ff Mutabilität 328 Mutagen 822 (G) – chemische 145, 419ff – krebserzeugend 426 – Strahlenwirkung 414, 419f, 431, 434 – Testsysteme 422, 426, 431 – Transposon 205, 340, 434, 443 Muta-Mouse 477 Mutation 822 (G) – Basensubstitution 396, 408, 410, 422, 428ff – dynamische 165, 397, 410ff, 620, 642, 760 – Häufigkeit 408ff, 633 – homöotische 199, 538f, 563ff – hot spots 409 – Klassifikation 394ff – konditionale 445 – letale 199, 338, 390, 407, 416 – missense 396f, 639, 734 – mitochondriale 165f, 199, 655ff – nonsense 328, 396f – Rasterschub (frameshift) 397 – Rate 408f – somatische 383ff – Spektrum 415ff – spontane 408ff – stille 374, 396f – strahleninduzierte 414ff, 586 – Translokation 396, 398, 405ff, 649, 660, 666, 702 – Transposon 205, 328, 330, 334ff, 607 Mutator-Gene 436, 665 mutD 408 MYB (myeloblastosis viral oncogene) 368, 369, 535, 659 MYC (myelocytomatosis viral oncogene) 293, 659f, 685 Mycobacterium leprae 102 Mycobacterium tuberculosis 102 Mycoplasma genitalium 96, 102 Mycoplasma pneumoniae 101f Mycoplasma pulmonis 102 Myoclonus-Dystonie 477 Myoglobin 281f Myosin 272, 576, 760 Myostatin 448 Myotom 578 myotone Dystrophie (DMPK) 411

N N (Notch) 547, 572, 741 N-Acetyl-D-glucosamin 472f N-Acetyltransferase 258 Naevus 182 Nagasaki (Strahlungseffekte) 418f Nahrungspflanzen 404, 509 Nährzellen 548ff nanos (nos) 555 NAT1 (N-Acetyltransferase 1) 76 Naturfaser 273 Neandertaler 752, 757, 766ff Neisseria meningitidis 102 Nematoceren 254 Neocentromer 399 neomorph 395, 474ff, 822 (G) NER (Nukleotid-Exzisionsreparatur) 436f Nervenwachstumsfaktor 712 Netzhaut 586 Nervenzellen 142, 282, 580, 588, 594, 599, 635, 695, 746 Neuralleiste 574, 579, 586 Neuralplatte 579 Neuralrohr 579f Neuraminidase 635 Neuregulin-1 (NRG1) 727 neurodegenerative Erkrankung 729ff Neurodermitis 667 Neurofibromatose 428, 662 Neurofibromin (NF1) 713 Neuroglobin 282 Neuropeptid Y (NPY) 722f Neurospora crassa 52, 192, 375, 435, 698 – Lebenszyklus 52, 198 – Mitochondrien 165 – Mutationen 313, 428 – Ascosporenanalyse 184, 494ff Neurotransmitter 588, 597, 710, 715, 720, 724f, 730, 733, 735, 747 Neurulation 573, 579f Neutronenstrahlung 416 NF1 (Neurofibromatose Typ I; Neurofibromin) 76, 291f, 661f, 713 N-Gen (O-Phage) 143 NGF (Nervenwachstumsfaktor) 187 N-Glykosidbindung 451 nicht-homologe Paarung 174f, 177, 251 Nicastrin 739 Nick Translation 91 Nicotiana tabacum 219, 400 Niemann-Pick-Krankheit 635 Nikotin 584, 726 Nitrosoguanidin 421 Nkx2.5 (Transkriptionsfaktor) 576 NLGN (Neuroligin) 736 NLS (Kern-Lokalisationssignal) 652 NMDA (N-Methyl-D-aspartat)-Rezeptor 709ff N-Methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) 421

Nondisjunction 227, 257, 399, 486ff, 494, 601, 614, 627, 823 (G) nonsense-mediated decay 77, 80, 88 nonsense-Mutation 328, 396f NOR (nucleolus organizer region) 224 Noradrenalin 715, 725 Normalverteilung 467f, 501 Northern-Blot 154 no tail (nt) 576 Notch (N) 547, 572, 741 Notophthalmus 252f, 283 notochord (s. Chorda dorsalis) 578 NPY (Neuropeptid Y) 722f N-ras (s. Onkogene) 659ff NRG1 (Neuregulin-1) 727 nt (no tail) 576 NTS (non-transcribed spacer) 299ff Nucleus caudatus 642, 784 nudel (ndl) 551, 729f Nuklease 62, 111ff, 823 (G) Nuklein 19 Nukleinsäure 2ff nukleoläre Dominanz 306 Nukleolus 158ff, 823 (G) – Organisator 167f, 226, 300 – rDNA 168, 298, 300 – Riesenchromosom 238 – snRNAs 69 Nukleoproteinfibrillen 244 Nukleosid 20, 57, 61, 64, 81, 103, 387, 823 (G) Nukleosom 241ff, 823 (G) – Atomstruktur 242 – Core 38, 241 – Kette 218, 220, 243ff – Organisation im Chromosom 235ff – Positionierung 292, 438 – Röntgenstruktur 243 – Struktur 241ff – Verkürzung der DNA 245 Nukleotid 20ff, 410, 422, 823 (G) Nukleus (s. Zellkern) 166ff, 357ff, 823 (G) Nullallel 474, 699, 823 (G) Nullhypothese 467f, 501, 769 Nullisomie 630 Numerator 823 (G) NX (Neurexin) 735f

O Oberflächenglykoprotein 377, 472 OCA (oculocutaner Albinismus) 634 Oc-Mutanten 128ff Oct4 (Transkriptionsfaktor) 599 offener Leserahmen 68, 99, 823 (G) Okazaki-Fragment 34, 37, 43, 823 (G) Oktantstadium 530 Oligonukleotid 38ff, 823 (G) Olivomycin 269

Sachverzeichnis OMIM (online Mendelian Inheritance in Man) 44 Ommatidium 569f, 823 (G) Ommochrome 478ff Omnipotent 823 (G) Onkogene 823 (G) – Carcinombildung 658ff – Dysfunktion 728 – Tumorentstehung 390, 661, 666, 685 – virale 658f Onkovirus 340ff, 659, 661 Ontogenese 261, 277, 279ff, 395, 594, 823 (G) Oocyte 823 (G) – Drosophila 548ff – Maus 444, 594, 607, 655 – Mensch 592, 626 – Xenopus 167, 234, 301, 306, 308, 594 Oogenese 548ff Oogonie 548f, 592 Operator 129ff, 823 (G) Operon 113, 128ff, 328, 440, 823 (G) Opsin 522f Oram-Holt-Syndrom 583, 591 Orang-Utan 74, 219, 753, 780, 783f ORC (origin recognition complex) 41 ORF (open reading frame) 68, 99, 331, 337, 351, 748 Organellen 158ff orthodenticle (otd) 554, 572 ortholog 375, 440, 540, 566, 603, 754, 823 (G) Oryctolagus cuniculus 219 Oryza sativa 219 oskar (osk) 708 Osteosarkom 659, 664 otd (orthodenticle) 572 Out of Africa 756ff Ovar 548ff Ovariolen 548 Ovis aries 219 Ovulation 445, 592 oxidativer Stress 101, 745 8-Oxoguanin 437 Oxygenase 427, 478

P p15 189 p16 189 p18 189 p19 189 p21 189, 194 p27 189 p34 663 p53 193f, 214, 295, 663f p57 189 p110 189 P1-Phage 114f Paarregelgene 558ff Paarung – meiotische 175ff

– somatische 251 Paarungslücke 251 Paarungstyp 43, 179, 197f, 371ff Pachytän 174ff, 823 (G) paired (pd) 211, 560, 569 Paläogenetik 769 Palindrom 28, 64, 67, 114, 152, 235, 367, 387, 823 (G) Panda 506 Pankreas 573, 596, 598ff Panmixie 502, 506 Pan – paniscus 753 – troglodytes 219 par (partitions defective) 545 PAR (pseudoautosomale Region) 654 Paradigma 340, 537, 561, 563, 791 paralog 207, 440, 565, 823 (G) Paramutation 14 Paramyxoviren 77 Paranthropus 760 Parascaris equorum 362 Parasegmente 562ff Parasiten 214, 349, 377, 380, 512 Parasomnie 703 Parazentrisch 398, 406, 823 (G) Parentalgeneration 457, 459, 489, 498 Parkin (PARK) 743ff Parkinson’sche Krankheit (PARK) 743ff Parsinomie 282 Pasteurella multocida 102 passenger-Proteine 317 Pätau-Syndrom 627 patched (ptch) 568, 591 paternal 264f, 365, 601ff, 823 (G) Pax-Gene (paired-box) 569ff – Pax2 587f – Pax3 475 – Pax6 475, 477, 569ff PAZ-Domäne (Piwi-ArgonautZwille) 315 pb (proboscipedia) 564 PCNA (proliferating cell nuclear antigen) 370 PCR (polymerase chain reaction) 89, 823 (G) pd (paired) 211, 560, 569 PDE (Phosphodiesterase) 710 PDGF (platelet-derived growth factor) 187 PDK (PyruvatdehydrogenaseKinase) 195 pebf (pre-B cell enhancing factor) 101 P-Element (Transposon) 205, 337ff pelle (pll) 551, 557 pen (Penicillin resistance) 428 Penetranz 477f, 655, 823 (G) Peptidylbindestelle 84, 86 Peptidyltransferase 80ff Peptidyl-tRNA 86f Perianth 537, 539 period (per) 699, 701 Perivitellinflüssigkeit 557

perizentrisch 228, 248, 253, 398, 407 Permease 128ff Peroxidase 58, 60, 656 personalisierte Medizin 680ff Pestizid 120, 431, 433, 743, 745 Petalen 537ff Peter’s Anomalie 587f Petunie 313, 539 P-Faktor (Transposon) 335ff Pferd 219, 280 Pferdespulwurm 361f Pflanzen 199ff – Alloploidie 399ff – Arabidopsis 199ff, 400ff – B-Chromosomen 253 – Differenzierung 563, 609 – Entwicklung 159, 529 – Hybrid 5f, 166, 400ff – Schädlinge 443f – Zucht 400ff Pflaume 400 PGK1 (Phosphoglyceratkinase) 710 Phagen 109ff – filamentöse 109ff – Genom 109ff – ikosaedrische 109 – Kopf 109, 112 – O (Lambda) 112 – M13 109ff, 147 – P1 114f, 147, 445 – IX 174 – T2 54, 109, 115f – T4 58, 109ff, 409 – T6 115 – temperente 110ff – virulente 110, 117 Phagocytose 192, 383, 485 Phänokopie 12, 15, 583, 823 (G) Phänotyp 10ff, 159f, 459ff, 823 (G) Pharynx 523, 545f, 739 Phaseolus multiflorus 471 Phenylalanin 57, 131, 133, 504, 634ff Phenylalanin-Hydroxylase 635 Phenylketonurie (PKU) 504, 635f Phenylpyruvat 635 Pheromon 372 Philadelphia-Chromosom 659 Phloem 532 Phocomelie 582 Phoenicurus phoenicurus 692 Phosphat-Zucker-Rückgrat 20ff Phosphodiesterase (PDE) 710 Phosphodiesterbindung 19, 20, 35, 61 Phospholipase C (PLC) 661 Phosphoribosyl-AnthranilatIsomerase 131 Phosphoribosyl-AnthranilatTransferase 131 Phosphorylierung 185ff, 243 Photobacterium profundum 102 Photolyase 434ff

845

846 846

Sachverzeichnis Photoreaktion 414, 426 Photoreaktivierung 749 Photorezeptor 569ff, 786f Photosynthese 160, 162 Phylogenie 763, 775, 823 (G) Physarum 73, 186 Phytohormon 103, 200, 442, 529, 531 PI (PISTILLATA) 538 PID (PINOID) 533 PIE-1 (pharynx and intestine in excess) 545 Pigmentierung 313, 328, 446, 476, 665 Pigmentzellen 569f Pilin 105, 120 Pilus 105f Pilzkörper 706ff PIN1 (PIN-FORMED) 533 PINK (PTEN-induced putative kinase) 421 PINOID (PID) 533 Pinus ponderosa 219 pipe (pip) 551 piRNA (Piwi-interacting RNA) 316 Pisum sativum 219, 455ff PITX-Gene (paired-like homeodomain transcription factor) 587f, 754 – PITX2 587 – PITX3 587f, 745 Piwi (P-element induced wimpy testis) 315ff, 361f PKA (Proteinkinase A) 706ff PKCC (Proteinkinase CJ) 723 PKU (Phenylketonurie) 504, 634ff Planaria torva 219 Plasma 158ff, 823 (G) Plasmazelle 380, 385, 387 Plasmid 823 (G) – F-Plasmid 103ff – Ti-Plasmid 108f, 442 Plastid 160ff, 214, 823 (G) Plastom 162, 823 (G) Plazenta 262, 264f, 601f, 675f PLC (Phospholipase C) 661 Pleiotropie 483ff, 823 (G) Pleurodeles waltlii 241 pll (pelle) 551, 557 Ploidie 103, 396, 400ff, 823 (G) pluripotent 445, 595ff, 823 (G) Pneumococcus pneumoniae 18 poky (s. Mitochondrium) 165 pol (Polymerase; s. Transposon) 32ff, 336 polarer Effekt 328 Polarfibrillen 169ff, 221 Polarität 529ff Polaritätsachse 529, 531 Polaritätszone 589 Polfaser 169 Polkörper 544, 578, 592, 823 (G) Pollen – Entwicklung 159f, 201f – Kern 159, 166, 201f, 444 – Schlauch 160, 201f

– Sterilität 166 Polplasma 550 Poly(A)-Schwanz (s. Transkription) 57, 85ff, 316, 823 (G) Polyadenylierung 66f, 342 polycistronisch 130f, 378, 380, 823 (G) Polygenie 481f, 524, 824 (G) polyhybride Kreuzung 463 Polymerasen 824 (G) – DNA 32ff – RNA 62ff Polymerasenkettenreaktion (PCR) 89, 90, 92 Polymorphismus 588, 702, 704, 716f, 725ff, 824 (G) polynomische Entwicklung 505 Polynukleotidphosphorylase 57 Polypeptid 52, 56f, 80ff Polyploidie 399ff, 627, 824 (G) Polyposis 662 Poly(ribo)somen 85, 253 polytän 238, 249ff, 358, 407, 549, 824 (G) polyzyklische Verbindungen 425f, 436 Polzellen 320, 550ff Pongo pygmaeus 219 POP-1 (posterior pharynx defective) 545 Population 501ff, 824 (G) Populationsgenetik 6, 501ff, 704 Porphyrie 516 positionelle Information 528, 552, 556, 558 Positionseffekt 226 Positionspräferenz 100 posterior 528, 544ff, 824 (G) postreplikative Reparatur 439 Potentilla 10f pr (purple) 489f Prader-Willi-Syndrom 601, 603 Prädisposition 658, 667, 725 Prägungszentrum 604 Präimplantationsphase 262 Prämutation 411, 413, 652 pränukleolärer Körper 167 Presenilin (PS) 742 Primase 32, 36, 42ff PriA 441 Pribnow-Box 62, 824 (G) Primitivknoten 578 Primitivstreifen 578 Primordium 531, 535, 538, 824 (G) Primosom 441 proboscipedia (pb) 564 Profilin 549 Proflavin 421, 425, 430 Prokaryoten 32ff, 62ff, 158, 824 (G) Prolin 55 Prometaphase 170, 191 Promotor 61ff, 289ff, 824 (G) Pronukleus 358, 592, 599, 824 (G) proof reading (s. Korrektur) 408, 440 Prophage 110ff, 335 Prophase 824 (G) – Chromosom 169ff, 220ff

– Meiose 172ff, 494ff – Mitose 169ff, 220 Pros (prospero; Transkriptionsfaktor) 572 Prosopagnosie 790ff Protamin 241 Protanopie 504 Protease – Alzheimer’sche Erkrankung 710, 738ff – Apoptose 191ff, 741 – Entzündung 667f – Transposon 336, 348ff – RecA-Protein 439 – Zellzykluskontrolle 185, 191 Protein – D-Helix-Struktur 145f – E-Faltblattstruktur 276 – fibrilläre Proteine 167ff, 273 – ribosomale 320, 355, 661 – Struktur 80ff – Synthese 80ff Proteinkinasen – Protein Kinase A (PKA) 711f – Protein Kinase CJ (PKCC) 723 – Signalkette 661, 711ff – Zellzyklus 185, 189, 194, 214 Prothorax 563 Protonen-Strahlung 416 Protoplasma 157 Protoplasten 441ff, 593 prototroph 98, 121, 429 Protozoen 7, 73, 576 Provirus 343ff prozessierte Pseudogene 353ff PS (Presenilin) 742 pseudoautosomale Region 434, 654, 677, 777 Pseudogen 185, 279ff, 353ff, 824 (G) Pseudomonas putida 102 Pseudouridin 70, 81, 304 Psoralen 425f Psychose 725 ptc (patched) 568, 591 Pten (phosphatase and tensin homolog) 195 Pteridinfarbstoffe 478 Puffs 250 Pulsfeld-Elektrophorese 48f Pulsmarkierung 53 pumilio (pum) 551, 555 Punktmutation 396ff, 659 Punnett-Viereck 457, 459, 466, 486f, 502 Puppe 204, 252, 257 Purkinje-Zellen 725 purple (pr) 489f Putamen 642 Pyrimidin-Dimere 414, 434ff

Sachverzeichnis Q Q-Banden 222ff, 269 QTL (quantitative trait loci) 481ff Quadrivalent 400 quantitative Merkmale 481ff Querscheiben 249ff Quinacrinfärbung 222, 269 quorum sensing 96, 139ff

R RACE (rapid amplification of cDNA ends) 92f Rachitis 645 RAD-Gene (Hefe) – RAD1 434 – RAD27 412 Radikal 416, 421, 436, 656, 742 Radioisotope 91, 268, 416 radish (rad; Drosophila) 706 Rana pipiens 219, 594 Raps 443f RAS (rat sarcoma viral oncogene) 659ff Ras-Map-Kinase-Signalkette 547 Ras-Raf-Signalkaskade 558, 659, 661, 708 Rasse 471, 483, 509 Rasterverschiebung 291, 421, 425, 429, 760 Ratte 8, 61, 70, 186, 219, 282f, 297, 325, 428, 430, 432, 446, 496, 526, 599, 619, 659, 661, 691, 714, 722, 724 Rattus norvegicus 219, 310 RB1 (Retinoblastom-Gen) 662f R-Banden (s. Chromosomen) 222ff RBM (RNA-binding motif) 75 rDNA 9, 137, 163, 168, 234, 273, 298, 300ff RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) 318 Reaktionskinetik – 1. Ordnung 27, 234 – 2. Ordnung 27, 234 – bimolekular 27 – DNA-Renaturierung 27, 234 – monomolekular 234 – Reaktionskonstante 27 Reaktionsnorm 11, 477 Real-Time-PCR 90, 685 Reassoziation 26 RecA 123ff, 439ff RecB 36, 122ff, 441 RecD 36, 123 Reduktionsteilung 172ff Regeneration 85, 438, 442, 593 Regressionsanalyse 500 Reifefaktor 43 Reifeteilung 172ff, 486ff, 592 Reifung (von mRNA) 65ff reine Linie 457 Reis 219, 443f

Rekombination 119ff 177ff, 824 (G) Renaturierung (s. Reaktionskinetik) 26f, 234 Reparatur 424ff repetitive DNA 230ff Replichor 99 Replika-Plattierungstest 605 Replikation 824 (G) – Basenanaloga 421ff – bidirektionale 37, 368 – differenzielle 604 – Faktor 32ff – Fehlerrate 33f, 408ff – Geschwindigkeit 37f, 41f – Hemmung 316, 371, 424 – Histonsynthese 41, 230, 283, 439 – Initiation 33ff, 61ff, 302, 304 – interkalierende Verbindungen 420, 425 – Kontrolle 41, 43, 300, 664 – Mechanismus 2, 31ff, 104ff, 116f – origin 32, 41 – Replikationsauge 33ff – Replikationsblase 33 – Replikationsgabel 33ff, 408, 439ff – rolling circle-Mechanismus 38, 45, 104ff, 366 – semikonservative R. 4, 6, 29ff, 121, 179 – Startpunkt 32ff, 103ff – Telomer 43ff, 229ff, 359 Replikon 39, 237 Replisom 36, 39 Reportergen 109, 150, 229, 415, 431, 453, 722, 748, 824 (G) Repressor 126ff, 558f, 824 (G) Reproduktionsmedizin 682ff Repulsion 175 Resistenz 97, 108, 120, 334, 369, 371, 392f, 424, 448, 512, 515, 605, 645, 686, 756 Restriktionsanalyse 152f, 651 Restriktionsenzym 94, 114, 148, 152f, 234, 353, 824 (G) Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) 622 Restriktionspunkt 185ff RET (receptor tyrosine kinase) 660 Retikulocyten 85, 278 Retina 522f, 576ff, 786f Retinoblastom (RB1) 662f Retroelemente 341, 347ff Retroposon 329, 351 Retrotransposon 329, 349, 378 Retroviren 340ff, 824 (G) Rett-Syndrom 730ff REV1 440 REV3 440 REV7 440 reverse Transkriptase 4, 45, 53, 92,111, 230ff, 341ff, 824 (G)

Reversion 117, 328, 338, 391f, 428f, 472, 553, 824 (G) Revertanten 392, 427, 429 Rezeptor 111, 140f, 292f, 558, 568ff, 601f, 640ff, 824 (G) rezessiv 460ff, 824 (G) reziproke Kreuzung 338, 460 Reziprozitätsregel 457 Rf (restore fertility) 166 RFLP (RestriktionsfragmentlängenPolymorphismus) 622 Rhesusaffe 219 Rhesusfaktor 513f Rhynchosciara angelae 252 Ribonuklease – Ribonuklease H 138, 348 – Ribonuklease III 138f, 303 – Ribonuklease P 138f, 303, 310 Ribonukleinsäure (RNA) 19ff, 61ff Ribonukleoproteinpartikel (RNP) 61, 70, 259, 308 Ribose 19f, 61ff Ribosom 78ff, 824 (G) ribosomale DNA (rDNA) 163, 234, 298, 300ff ribosomale RNA (rRNA) 8, 54, 56, 138, 163, 272, 297ff Ribosylierung 243, 245, 284 Ribothymin 311 Riesenchromosomen 249ff, 824 (G) Rifampicin 63 rII-Gen (s. Bakteriophage) 117f Ringchromosom 398 Ringklemme 42 RISC (RNA-induced silencing complex) 314ff RMP (replication-mediated proteins) 441 RNA (Ribonukleinsäure) 20, 824 (G) – chemische Instabilität 61 – Editing 73 – Interferenz (RNAi) 313ff, 361, 824 (G) – Maturase 356 – Spleißen 66ff, 303f, 380, 386 – Transkription 4, 61ff – Viren 342ff RNA-Polymerase – Core-Enzym 38, 62ff – RNA-Polymerase I 34ff, 290ff – RNA-Polymerase II 34ff, – RNA-Polymerase III 36ff, 310f RNase H 32, 43, 92f, 138, 336, 342f, 351 RNP (Ribonukleoproteinpartikel) 61, 70, 259, 308 ro (rough) 18 Robertson’sche Translokation 631 Roggen 219, 404 rolling-circle-Mechanismus (s. Replikation) 38, 45, 104ff, 366 Röntgenstrahlung 405, 416 Rosaceae 10

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Sachverzeichnis rosy (ry) 391 Rot-Grün-Farbenblindheit 504 Rotschwänze 693 rough (ro) 18 Rous Sarcoma Virus (RSV) 340 roX (RNA-Gen) 259 R-Plasmid 108 R-Punkt 185ff rRNA – 5 S 137f, 298f, 306ff – 5,8 S 297ff, 306ff – 16 S 80, 83, 137ff – 18 S 65, 80, 137, 297ff – 23 S 80, 137ff, 298 – 28 S 9, 80, 297ff – autokatalytische Eigenschaften 304 rrn-Operon 137 RTS1 (replication termination site) 43 Rubinstein-Taybi-Syndrom 713 Rückkopplung 287, 537, 701, 720, 791 Rückkreuzung 489ff, 824 (G) Ruhekern 168 Ruhezentrum 530ff runt (run) 560 RuvA 124ff RuvB 124f, 181 RuvC 124ff, 441 Rus 441 rutabaga (rut) 708 rx (retinal homeobox) 587 Ryanodin-Rezeptor (RYR1) 448

S S1-Protein 80 Saccharomyces cerevisiae 197ff – Aktin-Gen 272 – HO-Gen 374 – Lebenszyklus 198 – RNA-Polymerase II 272 – SIR-Gene 374 Sahelanthropus 754, 756 Salamander 7, 219, 241 sal (spalt) 566, 568, 572, 626 Salmonella typhimurium 102, 114, 133, 429, 435 Samenpflanze 459, 464 Sammelchromosom 363 Sandhoff-Syndrom 635 Sanger-Methode 148, 451f SAR (scaffold attachment region) 239 Sarkom-Viren 659, 714 Satelliten-DNA 225ff, 654, 824 (G) Saubohne 219 Säugetier – Dosiskompensation 218, 258, 265 – Evolution 73, 192, 221, 264, 279ff, 595, 601f, 752ff – Globin-Gene 8, 210, 279ff – Immunsystem 328, 380, 679

SBMA (spino-bulbare Muskelatrophie) 412 SC (synaptonemaler Komplex) 177 SCA (spino-cerebellare Ataxie) 412 scabrous (sca) 571 scarecrow (scr) 532 scarlet (st) 480 SCE (Schwesterchromatid-Austausch) 430 Schaf 219, 346, 444, 446, 448, 594f, 684 Schafgarbe 10f Schilddrüsenkrebs 419f Schimmelpilz 52, 494 Schimpanse 219, 433, 752, 754, 780, 783 Schistosaccharomyces pombe 70 Schizophrenie (SCZD) 726ff Schlafkrankheit 73, 377, 380 Schlafstörung 582, 703ff Schmelzkurve 26, 47 Schmetterling 219, 256, 273, 444, 519, 523 Schweißdrüse 637 Schwesterchromatiden 171, 177ff, 430, 824 (G) Schwimmdichte 29f, 121, 233f Sciara coprophila 254f SCID (severe combined immunodeficiency) 682 SCN1A (spannungsgesteuerter Natriumkanal) 733ff Scr (sex combs reduced) 295 scr (scarecrow) 532ff Secale cereale 219 Securin 171, 188ff SEEDSTICK (STK) 540 Seeigel 67, 70, 593 Segmentierung 558ff Segmentpolaritätsgene 559ff Segregation 172, 183ff, 463, 824 (G) Sehbahn 786f Sehnerv 577, 586, 656, 696, 787 Seidenspinner 219, 273, 323, 364 Sekretase 738ff Sekundärstruktur 310, 824 (G) Selbstbefruchtung 166, 460ff Selektion 824 (G) – Allelfrequenz 502ff – disruptive 524 – gerichtete 509f – Koeffizient 508ff – natürliche 508ff – negative 446, 508, 514, 754f – positive 446, 508ff, 752, 756, 770f, 781ff – stabilisierende 509, 524 – Vorteil 508ff, 635, 638, 781 Selektorgene 563, 566 Selenocystein 55, 58 Semikonservativ 4, 6, 18, 29, 31, 121, 179, 824 (G) Senfgas 421 sens (senseless) 572 SEP (SEPALLATA) 538

Separase 171, 188f, 191 Serin 55 Serizin 273 Serotonin 715ff Serotonintransporter (SERT) 715ff Serrate (Ser) 562, 564 Sertolizellen 592f Sequenzierung (DNA) 451f sevenless (sev) 572 Sex-combs-reduced (Scr) 295 sex lethal (sxl) 258 Sex-Plasmid 104 Sexualhormone 593 sgg (shaggy) 699f Sh (shrunken) 428 Shh (sonic hedgehog) 578ff Shigella flexneri 102 Shine-Dalgarno-Sequenz 82ff SHOOTMERISTEMLESS (STM) 533ff shortroot (shr) 532f short interspersed nuclear elements; (SINEs; s. Transposons) 234, 329, 336, 341, 350, 353f, 620, 825 G SHOX (short stature homeobox) 655 Siamesische Zwillinge 615 Sichelzellenanämie 278, 485, 512, 599, 633f V-Faktor 62ff Signalpeptid 385 Silencer 291, 372, 447, 604f, 825 (G) Signifikanz 468, 501, 623 sine oculis (so) 570ff SINEs 234, 329, 336, 341, 350, 353f, 620, 825 (G) singed (sn) 182 SIR (silent information repressor) 374 siRNA (small interfering RNA) 65, 228, 316ff, 445, 611 SIS (simian sarcoma viral oncogene; s. PDGF) 659 sisterless (sis; Drosophila) 659 SIV (simian immunodeficiency virus) 347, 756 Sklerotom 578f SKN-1 (skin in excess) 545 smoothened (smo) 591 sn (singed) 182 snail (sna) 557 snake (snk) 551 SNCA (D-Synuclein) 722, 724, 743ff snf (sans fille) 244 SNP (single nucleotide polymorphism) 494, 499, 517f, 525, 620, 674, 680, 718, 724, 728 snRNA (small nuclear RNA) 67ff, 235, 353 so (sine oculis) 570, 572 Sojabohne 101 Solanum tuberosum 219, 400 Solenoid 245 Soma 254f, 267, 361ff, 825 (G) Somazelle 254, 363, 551, 593, 685 Somit 208, 573, 576, 578ff

Sachverzeichnis sonic hedgehog (Shh) 578ff Sordaria brevicollis 183 SOS-Reparatur 110, 434, 439f Southern-Blot 153 SOX-Gene (SRY-box) 587, 598f, 654, 729 – SOX2 587, 598f – SOX3 654 – SOX9 654 spalt (sal) 566, 568, 572, 591 Spaltungsregel 462f spätzle (spz) 551, 557 Spectinomycin 334 Speicheldrüsen 41, 86, 205, 251, 258 Spermatocyten 176, 252ff, 365, 592, 626, 825 (G) Spermatogonien 220, 254, 395, 417, 592, 607, 626 Spermatozoen 173, 254, 416, 592, 601, 615 S-Phase 38ff, 168ff, 663f Sphingomyelin 635 Spina bifida 580, 584, 604 Spindel 825 (G) – Ansatz 175, 218, 228, 267, 631 – Apparat 156, 169, 172, 189, 191, 214, 218, 365 – Fasern 169, 228, 363, 545, 631 – Gift 269, 431 – Kontrolle durch APC 191 – monopolare 255, 365 – Pol 156, 169ff, 220f, spineless (ss) 572 Spinnen 273 spinocerebellare Ataxie 412 spire (spir) 551 spitz (spi) 562, 571 Spleißen 825 (G) – autokatalytisches 356 – Globin-Gene 72, 277ff – Immunglobulin-Gene 386 – Mechanismen 67ff, 312f, 386, 397 Spleißosom 68ff splicing (s. Spleißen) 67ff Sporen 183f, 197f, 201, 371, 428, 494ff, 688, 699 Sporophyt 201 Sprache 783ff Sprachschwäche 784 Spross – Achse 200 – Meristem 200, 529ff Spulwurm 202, 219, 361ff Spumaviren 341 spz (spätzle) 551, 557 SRC (sarcoma viral oncogene) 659, 735 SRF (serum response factor) 538 SRY (sex-determing region Y chromosome) 592f, 609, 654f ss (spineless) 572 SSB (single strand binding) 32, 35, 123f, 436, 440f

SSCP (single strand conformation polymorphism) 450 S-Sequenzen (s. Immunglobuline) 387, 389 st (scarlet) 480 Stammbaum – Analyse 618, 645, 675 – Familie 618ff, 646, 655, 704 – Forschung 618, 684 – Kartierung 620, 622, 684 – Symbole 618 Stammzellen – adulte 598f – embryonale (ES-Zelle) 595ff, 684, 686 – erythroide 278, 380f, 598 – hämatopoietische 380f, 596ff – induzierte 598f – mesenchymale 595, 598 – neuronale 595, 598f – retinale 595 – ethische Probleme 684 Staphylococcus aureus 64, 102 Startcodon 58 Statistik 466, 468, 501, 623, 625, 759 Staubblätter 537f staufen (stau) 551ff, 708 Sterblichkeitsrisiko (Atombombe) 418 Sterilität 166, 338f, 351, 400, 402, 519f, 630 Steroidhormone 292 Steroid-21-Hydroxylase 185 STI (STICHEL) 190 Stickoxid (NO) 650, 745 Stier 219 STK (SEEDSTICK) 540 STM (SHOOTMERISTEMLESS) 536 Stoppcodon 76ff Strahlenbelastung 416ff – Dosis 418 – Harrisburg 419 – Hiroshima 418f – Mutationsrate 416ff – Tschernobyl 419f Streptavidin 91, 236, 268 Streptococcus agalactiae 102 Streptococcus pneumoniae 18, 102, 120 Streptolydigin 63 Streptomycin 334 Stress 63, 101, 447, 723ff Strongylocentrotus purpuratus 283 Stylonychia mytilus 219, 361 su (sugary) 428 submetazentrisch 221 Substantia nigra 588, 743ff subtelozentrisch 221 Sucht 713ff Suicide-Enzyme 424 supercoiling 22, 34 Suppressor 60, 182, 380, 523 Suspensor 529ff Suszeptibilitätsgen (s. Empfindlichkeitsgen) 670, 690

SV40-Virus 290, 342 swallow (swa) 551ff Sylvia atricapilla 692 Sympatrie 768, 771, 792 Synapse 182, 715, 725, 736 Synapsis 172ff, 825 (G) synaptonemaler Komplex 176f, 182, 825 (G) synchron 550, 604, 607, 825 (G) syncitiales Blastoderm (Drosophila) 259, 551ff Syncytium 550f, 825 (G) Syndrom 447, 583ff, 627ff Synechococcus 698f Synergide 201 Synkaryon 358, 825 (G) Syntenie 211, 825 (G) D-Synuclein (SNCA) 722, 743ff

T Tabak 58, 93, 219, 342, 400, 402, 443 Tabakmosaikvirus 58 TAF (TATA-box associated factor) 290 Tagesperiodizität 698f tailless (tll) 558ff TATA-Box 65f, 289ff Tau-Protein (Tubulin-assoziertes Protein) 737ff Taube 219 Tautomerie 410, 421f, 825 (G) Tay-Sachs-Syndrom 634f T-Bande 237ff TBP (TATA-box binding protein) 65f, 289f, 413 TDF (testis determining factor) 592, 654 Teilung – meiotische 156f, 172ff – mitotische 172ff – Spindel 169ff Telomer 43ff, 229ff, 825 (G) Telomerase (TERT) 44ff, 196, 230ff Telophase 170ff, 825 (G) telozentrisch 220f, 825 (G) Telson 552ff Teosinte 200 Teratogen 579, 582f, 589, 825 (G) Terminase 64ff Termination 62, 86, 825 (G) – Codon 58 – Faktor 64ff – Signal 62ff, 86, 164 – Sequenz 43ff – Transkription 62ff, 306 – Translation 82, 88, 164 TERT (Telomerase) 44ff, 196, 230ff Tertiärstruktur 49 testis X-linked (Tsx) Testkreuzung 487f, 491f Testosteron 593 tet-on/tet-off-System 14, 453f

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850 850

Sachverzeichnis tetR (Tetracyclin-Resistenz) 453f Tetracyclin 108, 196, 453 Tetrade 174f, 198, 494, 825 (G) Tetradenanalyse 183f, 198f, 494ff Tetrahydrofolat 369, 371 Tetrahymena 44, 231, 301, 310 tetraploid 376, 399ff, 598, 825 (G) TFIII (s. Transkriptionsfaktoren) 293, 306ff, 559 TFM (testicular feminization syndrome) 593 TGF (transforming growth factor) 186, 566, 660, 723 Thalamus 715, 784 Thalassämie 278, 296, 634 Thalidomid 582 T-Helfer-Zellen 380 Theoriebildung 13ff Therapie 635ff, 664, 825 (G) Thermococcus kodakarensis 102 Thermus aquaticus 89 Thiobendazol 431 Thioguanin 215, 432 Thiouridin (s4U) 81, 311 Thorax 548, 552f, 555, 559, 563, 567 Threonin 55 Thrombocyt 598 Thymidinkinase (tk) 215 Thymidylatsynthetase 371 Thymin 18ff Thymindimere 414, 666 Thymus 180, 380, 659, 673 Tierschutz 447 Tierzucht 446 TIM1 (T-cell immunoglobulin and mucindomains containing protein) 668, 670 timeless (tm) 699 Ti-Plasmid 108f, 442 tipsy (tps) 722 tk (Thymidinkinase) 215 tl (toll) 557 tll (tailless) 558ff TLS (Transläsions-Synthese) 439f T-Lymphocyten 380, 384 TMV (Tabak-Mosaik-Virus) 58 Tn3 (s. Transposon) 329, 331 Tn7 (s. Transposon) 332, 334, 442 Tn10 (s.Transposon) 329ff TNFD (Tumornekrosefaktor D) 679 toll (tl) 557 Tollkirsche 443 Tomate 219, 443, 483, 536 Topoisomerase – Topoisomerase I 32ff, 168 – Topoisomerase II 32ff, 113, 177, 239, 781 Tor (target of rapamycin) 194f, 551 torso (tor) 553, 558f torsolike (tsl) 551 Totipotenz 159, 593f, 684, 825 (G) toy (twin of eyeless) 570, 572 TP53 (tumor protein p53) 662ff, 685

TRAP (tryptophan-RNA-binding protein) 133ff Tracy 448 trailer-Sequenz 310 Transacetylase 128f, 131 Transdifferenzierung 598 Transduktion 114, 118, 121, 126f, 825 (G) Transfektion 316, 445, 825 (G) Transferrin 745 transfer-RNA (tRNA) 54ff, 80f, 88, 137 Transformation 825 (G) – Bakterien 18, 95, 118f, 121, 147, 392 – biolistische T. 443 – Säugerzellen 433 transgen 441ff, 453f, 825 (G) Transition 388, 396, 415, 421, 425, 433, 725 trans-Konstitution 128f, 825 (G) Transkription 61, 825 (G) – Einheit 137, 301, 776 – Elongation 63f – Initiation 61ff – Mechanismus 65ff – Termination 62, 64 Transkriptionsfaktor – Bindung an DNA 63, 65f, 291ff – Homöobox 554f – MADS-Box 540 – Paarregelgene 558ff – TFIIB 65f, 289f – TFIIF 65f, 295 – TFIIIA 293, 306ff, 559 – TFIIIB 306f – TFIIIC 306f Transläsions-Synthese (TLS) 439f Translation 80, 825 (G) – Elongation 82, 85ff – Initiation 82ff – Mechanismus 80ff – Peptidbindung 81, 84, 87 – Startcodon 82f – Termination 86ff Translokation 825 (G) – balancierte 631, 728 – reziproke 367, 407, 631 TRANSPARENT TESTA GLABRA (TTG) 535 Transplantation 593ff Transposase 330ff Transposition 330ff, 825 (G) Transposon 328ff – Bakterien 105, 121, 328, 332, 334, 442 – Eukaryoten 334ff – Exzision 330, 338, 390 – Funktion 328ff – Integration 332ff – repetitive Sequenzen 334f – Struktur 334ff Transversion 396, 415, 425, 427, 433, 661

TRF (Telomerenprotein) 45, 229ff Trichlorfon 431 trihybride Kreuzung 463 Trimethoprim 334 Trinukleotid-Wiederholungen 411f Tripelhelix 26 Triplett 56ff Triple-X-Syndrom (= Trisomie des X-Chromosoms) 627, 630 Triplettcode 56ff Triploidie 627, 630 Trisomie 225, 396, 399, 627ff, 676, 684, 738, 825 (G) Triticale 404 Triticum (Weizen) – aestivum 219, 400, 403f – monococcum 403f – speltoides 403f – tauschii 403f – turgidum 403f Triturus 219, 253 Trivalent 400 trk (trunk; Drosophila) 551 tRNA – Anticodon 52, 56f, 81, 85ff, 311f – Gene 137ff, 310ff – Methylierung 310 – Sekundärstruktur 310ff – sterisches Modell 81 – T\C-Loop 311 Trophektoderm 264, 577ff Tropheryma whipplei 102 Trophoblast 578, 602, 606 trpA (Tryptophan-Synthetase D) 131f trpB (Tryptophan-Synthetase E) 131f trpC (Phosphoribosyl-Anthranilat-Isomerase und Indol-GlycerolphosphatSynthetase) 131f trpD (Phosphoribosyl-Anthranilat-Transferase) 131f trpE (Anthranilatsynthetase) 131f, 134 trpF (Isomerase) 132f trpG (Glutaminaminotransferase) 131ff trpL (leader sequence) 132, 134 trp-Operon 128ff trp-Repressor 132ff, 145 trunk (trk) 551 Try (Tryptophansynthetase) 428 Trypanosoma brucei 73, 329, 335, 377 Tryptophan – Biosynthese 127, 131ff – Repressor 127, 132f, 135 – Stoffwechsel 58, 127, 131, 133, 478f Tryptophanhydroxylase 715 Tryptophanoxygenase 478 Tryptophanpyrrolase 478 Tryptophansynthetase 58, 131, 428 Tschernobyl 419f Tsetse-Fliege 377f TsiX (Gegenstrang-Transkript zu Xist) 604 tsl (torsolike) 551 tTA-System 454

Sachverzeichnis t-Test 500 TTG (TRANSPARENT TESTA GLABRA) 535 tube (tub) 551 Tubulin 285ff tudor (tud) 551 Tumor – Bildung 108, 662ff – familiäre Häufung 658, 664 – Gene 658ff – Induktion 103, 108, 187, 340, 442, 667 – Onkogen 343, 658ff – Prädisposition 658, 667 – Suppressorgene 193, 230, 658, 661f, 685 – Zelle 351, 369, 683 Tumornekrosefaktor D (TNFD) 679 Turgor 158 Turner-Syndrom 627, 630, 654 turnip (tur) 706 twin of eyeless (toy) 570ff twist (twi) 557 Two-Hybrid-System 150 Ty (Retroposon) 329 Tyrosin 55 – Albinismus 634 – Hydroxylase 673, 745 – Kinase 659ff, 708, 710, 714, 723 – Tyrosinase 476, 482ff, 634 T-Zelle 380ff T-Zell-Rezeptor 293, 380ff

U U1-snRNA 69f U3-snRNA 69f, 304, 353 U6-snRNA 69f, 310, 353 U7-snRNA 67ff U8-snRNA 69, 304 U13-snRNA 69, 304 UAS (upstream activating sequence) 138, 151 Überdominanz 460, 483, 513 Überreplikation 366 Ubiquitinierung 243, 245, 284, 665 UCHL1 (Ubiquitin-Hydrolase 1) 744f UDP-Glykosyltransferase 472, 568 UFO (UNUSUAL FLORAL ORGANS) 536 Ultrabithorax (Ubx) 293, 563 ultraviolette Strahlung (UV) 414ff umuC 38, 440 umuD 38, 440 Umwelt – Anpassung an Umwelt 10ff, 97, 133, 356, 394, 511, 690 – Einfluss auf Phänotyp 10ff, 616 – Zwillingsforschung 614, 616 Unabhängigkeitsregel 463 uncoordinated (unc) 202 Uniformitätsregel 523

Univalent 400, 825 (G) UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO) 536 unvollständige Dominanz 456, 471f, 476, 481, 513 Uracil 19f, 61f, 424f Uracil-Glykosylase 388, 409f Uridin 20 UTR (untranslated region) 66, 74, 77, 411ff Uvr (UV-Reparatur) 436, 666 UV-Strahlung 193, 349, 414, 434

vls (valois) 551 Vögel 219, 659, 692ff Vogelzug 692 v-onc (s.Onkogene) 343 von-Willebrand-(Jürgens-)Erkrankung 185, 675 VP16 150, 454 V-Region 383 vrille (vri) 699ff Vulva 203, 545, 547

W V v (vermilion; Drosophila) 478ff v (virescent; Mais) 491f va (variable sterile) 491f Vakuolen 158 Valin 55 Valium 431 valois (vls) 551 Variabilität 9ff, 825 (G) variable Region (s. Immunglobuline) 382ff variable sterile (va) 491f Varianz 500, 616f Varianz-Analyse (ANOVA) 500 vasa (vas) 551 V-D-J-DNA-Rearrangement 383ff Vegetationskegel 200 vegetative Fortpflanzung (Vermehrung) 10f, 357, 444 vegetative Phase 13, 198 Veitstanz (s. Chorea Huntington) 642 Vektor 112, 115, 147ff, 825 (G) ventral 528, 535, 544ff Vererbung – cytoplasmatische 14, 162 – erworbener Eigenschaften 5, 97, 605 – Grundregeln 3, 455ff – intermediäre 471, 633, 694 – menschliche 3ff, 164, 614 – molekulare Grundlage 6, 17ff – multifaktorielle 471 Verhaltensgenetik 691 Vermehrungszyklen 110f vermilion (v) 478ff Verpuppung 204, 273 Verwandtenehen 633, 638, 684 Verzweigungspunkt 71f, 124f, 181 vg (vestigal) 489ff Vibrio cholerae 102 Vicia faba 185f, 219, 301 Vimentin 159 virescent (v) 491f Virus (Plural: Viren) 340ff, 826 (G) visueller Cortex 788 Vitamin A 579, 589, 645 Vitamin-D-Resistenz 579, 589, 645

w (white) 477, 480, 486ff Wachstumsfaktoren 187, 193, 589 Wahrscheinlichkeit 295, 467f Wasserfloh 363 Wasserstoffbrücken 18ff Watson-Crick-Modell 2, 4, 6, 19ff wbl (windbeutel) 551 W-Chromosom 256f weaver (s. Kcnj6) 745 Weißbuntheit 159 Weizen – Evolution 400, 403 – Hybride 403 – Körner 404 – Polygenie 481 – Zucht 400, 481 Wernicke-Encephalopathie 721 WD40-Domäne 535 wg (wingless) 562ff white (w) 477, 480, 486ff white-apricot 477, 480 Wildtyp (Definition) 394, 826 (G) windbeutel (wbl) 551 Windungszahl 34f wingless (wg) 562ff Wirtel 537ff Wnt (wingless-related MMTV integration) 545f, 589, 591 Wnt-Signalweg 545 wobble-Hypothese 57, 82, 137 WOL (WOODENLEG) 533 Wunderblume 159, 471 Wurmmittel 431 Wurzel 200 – Haare 200, 532, 535 – Haube 530, 532 – Meristem 186, 200, 529ff Wurzelhalsgalle 101, 108 WUS (WUSCHEL) 537

X Xanthin 424 Xanthommatin 479f X-Chromosom – attached-X 494 – Dosiskompensation (Säuger) 260ff

851

852 852

Sachverzeichnis – Drosophila 256ff – genetische Karte 489 – Hyperaktivität 258f – Inaktivierung 260ff, 630, 645 – Monosomie X 627 – pseudoautosomale Region (PAR) 654 – Trisomie X 627, 630 Xenopus borealis 305 Xenopus laevis – Mutanten 300 – Oocyten 241, 300f – rDNA 300f, 305 Xeroderma pigmentosum (XP) 437, 665 X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-EDgalactopyranosid) 148, 150, 431 Xic (X-Inaktivierungszentrum) 262ff Xist (X-inactivation specific transcript) 262ff Xylem 532 X0-Genotyp 630 XXY-Genotyp 630

Y y (yellow) 182, 428 YAC (yeast artificial chromosome) 147 Yates-Korrektur 468 Y-Chromosom – Aneuploidie 430 – Gene 256, 609, 654 – Geschlechtsbestimmung 256, 609, 654 – Lampenbürstenschleife 253 – menschliche Populationen 765 – pseudoautosomale Region 654 yellow (y) 182, 428 Yersinia pestis 102

Z Zählmechanismus (s. Geschlechtsbestimmung) 259, 609 Z-Chromosom 256ff Z-DNA 21ff Zea mays 199ff – Lebenszyklus 201 – Transposition 335 Zebrafisch 205ff – Frühentwicklung 210, 572ff – Mutanten 156, 206, 209f, 573ff, 611 Zellautonomie 260, 593, 826 (G) Zelldifferenzierung 528f Zelle 156ff – eukaryotische 158ff – Interaktionen 589 – Kern 156ff – Membran 159 – Oberfläche 380, 641, 661 – präneoblastische 661 – Proliferation 186ff, 381 – Teilung 157ff – Tod 190ff – Wanderung 575f Zellgenealogie 202, 544ff Zellklon 261, 446 Zellularisierung 550 Zellzyklus 826 (G) – Blockierung durch APC 189 – Dauer 169, 185ff – Histonsynthese 283 – Kontrolle 185, 230, 664, 781 – Kontrollpunkte 185, 189, 193 – Regulation 185ff Zigarettenrauch 426 Zinkfinger 290ff, 540, 692, 712, 785

Zink-Metalloprotein 307 Zirbeldrüse 703 zirkadiane Rhythmik 690f, 697ff zirkuläre Permutation 116f Z-Konformation 21ff Zona pellucida 578 ZPA (zone of polarizing activity) 589 Züchtungserfolge 509 Zucker-Phosphat-Rückgrat 4, 21ff, 437 Zuckmücken 250 Zufallsdrift 507, 511, 516, 524 Zufallspaarung 507, 646 Zufallsschwankungen 466 Zufallsverteilung 179, 227, 369, 467ff Zugvögel – Erblichkeit des Zugverhaltens 692 – Richtungspräferenz 694 Zwergschimpanse 753 ZWI (ZWICHEL) 190 Zwiebel 27f, 219 Zwillinge 616ff – dizygote 580f, 615ff, 736 – Forschung 580, 614ff – Merkmalsausprägung 582, 616 – monozygote 580f, 615f – siamesische 615 – Verschiedenheit 733 Zwillingsfleck 182f Zwitter 202, 545f Zygospore 198 Zygotän 174ff, 229, 826 (G) Zygote 160, 172, 202, 208, 254, 262, 403, 445, 550, 826 (G) Zyklopenauge 585, 587 zystische Fibrose 448, 636f, 676, 684